Home

Bedienungsanleitung für das SURVEYOR® Scan

Contents

1. Bedienungsanleitung fur das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exon 2 3 amp 4 CE IVD fur DHPLC Systeme CE L Bitte lesen Sie diese Bedienungsanleitung sorgf ltig durch bevor Sie dieses Produkt verwenden Heben Sie diese Bedienungsanleitung auf vielleicht m chten Sie sp ter etwas nachschlagen Transgenomic Advancing Personalized Medicine Diese Seite ist absichtlich leer Inhaltsverzeichnis 1 Hersteller 22 0uu0u2 sum ann a Een nn anna ana wanna anna 3 2 SURVEYOR Scan NRAS Kit Exon 2 3 amp 4 CE IVD 2 u2u200u00022a020a20n0n0nunnnnnannnnnunnnnnnnnnannnnnnnnn 3 2 1 ene 3 2 2 Angaben z m GEDPAUCH issira rear ei aa en aan EEEE R Eea ENE aa ERAEN EEEE 3 3 Testprinzip des SURVEYOR Scan NRAS Mutation Detection Assay nunnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn 4 3 1 KRAS Und NRAS E 4 3 2 Analyse von Patientenproben mit den SURVEYOR Scan Kitz 4 3 3 SURVEYOR He 5 4 R ckverfolgbarkeit der Kit Kontrollen ssssssnsseunenunnnunnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnunnnnnnnannnnnnnnnnnnnnn en 6 5 Komponenten 3 4 02 see a nel eee 7 5 1 Anzahl der Proben die mit dem Kit getestet werden k nnen 7 52 RR TE EE TEE 8 6 Zus tzlich erforderliche Ausr stung und Reagenzien cseccescesseeseseeeeeseeeseeesesseeenseeeeeeees 8 7 Reagenzienvorbereitung nesnnserrnennnennnnnneennnnnnnnnnnnn nennen nennen nennen nennen nennen nennen nennen 8 8 Lagerung Und H ltbarkeit 42 4 440
2. Eisbad Vortexer Mikrozentrifuge Thermocycler Agarosegele und Ausr stung f r Agarosegel Elektrophorese 10 Bleiche oder hnliches Reinigungsmittel 7 Reagenzienvorbereitung Alle Reagenzien dieses Kits sind gebrauchsfertig Einige Komponenten m ssen vor Gebrauch aufgetaut mit dem Vortexer gemischt oder in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert werden Einzelheiten siehe weiter unten unter Testverfahren Reagenzien m ssen zur Herstellung von Master Mix und Reaktionsgemischen gemischt werden Eine genaue Anleitung finden Sie im Abschnitt Testverfahren m nn Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE IVD f r DHPLC Seite 8 8 Lagerung Haltbarkeit 8 Lagerung und Haltbarkeit Das Kit muss bis zu seinem Gebrauch zwischen 18 C und 25 C in einem Gefrierschrank mit konstanter Temperatur aufbewahrt werden Beachten Sie bei jedem erhaltenen Kit das Verfallsdatum Das Kit nicht mehr verwenden wenn das Verfallsdatum Uberschritten ist Das in Schritt 7 des SURVEYOR Nuclease Verdaus vorbereitete SURVEYOR Nuclease Reaktionsgemisch muss sofort verwendet werden da die Anwesenheit anderer Komponenten im SURVEYOR Nuclease Reaktionsgemisch die SURVEYOR Nuclease W mit der Zeit inaktiviert 9 Warnhinweise amp VorsichtsmaBnahmen Keines der Reagenzien in diesem Kit stellt in den gelieferten Mengen eine Gesundheitsgef hrdung dar Die Dokumentnummer von Transgenomic MSD 710400 steht als Download zur Verf gun
3. Biotechniques 36 702 707 9 Kuang Y et al 2009 Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non small cell lung cancer Clin Cancer Res 15 2630 6 10 Mitani N et al 2007 Surveyor nuclease based detection of p53 gene mutations in haematological malignancy Ann Clin Biochem 44 557 9 11 Engelman JA et al 2006 Allelic dilution obscures detection of a biologically significant resistance mutation in EGFR amplified lung cancer J Clin Invest 116 2695 2706 Siehe auch http world Transgenomic comffiles literature 482146 pdf f r Literaturhinweise zur SURVEYOR Nuclease und ihrer Anwendungen SE eo a Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE IVD f r DHPLC Seite 29 Anhang B Anhang B Fehlersuche Die effektive Verwendung der SURVEYOR Scan Kits f r DHPLC h ngt von der erfolgreichen Ausf hrung einer Reihe von Arbeitsschritten ab Einer der entscheidendsten ist die PCR Amplifikation die zur Produktion einer ausreichenden Menge spezifischer gleichm ig langer DNA f hren muss um nach der Hybridisierung und Spaltung nachgewiesen zu werden Das wiederum h ngt von der Qualit t der Ausgangsprobe ab Die Durchf hrung dieses Tests mit DNA die nicht den Qualit t und Quantit tskriterien entspricht ist nicht empfehlenswert Anmerkung Wenn Sie zum ersten Mal mit SURVEYOR Nuclease arbeiten f hren Sie die Untersuchungen im Abschnitt Verwendung von Kontrollplasmid
4. 2 3 amp 4 CE IVD for DHPLC Systems 482296 EN http world Transgenomic com files literature 482296 EN pdf und oder Kontakt zu verweisen Transgenomic support transgenomic com ee en Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE IVD f r DHPLC Seite 37 E Einzelheiten zur Bestellung Lizenzen Handelsmarken amp Copyright SURVEYOR Nuclease Dieses Produkt wurde unter exklusiver Lizenz der US Patente 6 699 980 6 391 557 5 869 245 ihrer ausl ndischen Entsprechungen und weiterer anh ngiger Patente hergestellt F r die Verwendung von SURVEYOR Nuclease ist eine Lizenz von Transgenomic erforderlich Akademische Non Profit und For Profit Organisationen besitzen mit Kauf dieses Produkts eingeschr nkte Rechte die SURVEYOR Nuclease zu Forschungszwecken zu nutzen Ein Weiterverkauf bzw eine anderweitige Verwendung sind streng verboten F r weitere Informationen wenden Sie sich bitte an Transgenomic DNA Polymerase Die Verwendung dieses Produkts ist durch eine oder mehrere der folgenden US Patente sowie zugeh rige Patentanspr che au erhalb der USA gesch tzt 5 789 224 5 618 711 6 127 155 sowie Anspr che au erhalb der USA zugeh rig zu US Patent Nr 4 889 818 Der Kauf dieses Produkts schlie t ein eingeschr nktes nicht bertragbares Nutzungsrecht dieses Produkts f r eigene Forschungszweck des K ufers ein Es wird damit kein Recht unter einem anderen Patentanspruch wie die patentierten 5 Nucleas
5. Aktivit t wird durch den SURVEYOR Enhancer W2 und seinen Cofactor unterdr ckt ohne ansonsten die Mismatch Spaltreaktionen negativ zu beeintr chtigen SURVEYOR Enhancer W2 und SURVEYOR Enhancer Cofactor sind in diesem Kit enthalten und sollten immer verwendet werden Wenn dieses Anschneiden weiter auftritt werden kleine Peaks auf dem DHPLC System erzeugt Durch Vergleich der Kontrollverdaus von Homoduplices mit dem Probenverdau k nnen diese erkannt werden III IIa IIIma ooo Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE IVD f r DHPLC Seite 33 Anhang B Problem 5 Peaks des SURVEYOR Nuclease Verdaus bei Negativkontrollen VERDAU PEAKS BEI NEGATIVKONTROLLEN DHPLC Ungeschnittener Durchfluss Homoduplex DHPLC Peak Wash Verdau Peaks Schwaches Signal bei Wild Type Kontrolle MOGLICHE URSACHE Kontamination von Kit Bestandteile mit KRAS Amplikons oder Plasmid Kontrollen LOSUNG Alle Kit Komponenten entsorgen und ein neues Kit verwenden Kontaktieren Sie den Technischen Kundendienst von Transgenomic um potenzielle Ursachen und Quellen der Kontamination zu besprechen Problem 6 Fehlgeschlagene SURVEYOR Nuclease Ergebnisse DER SURVEYOR NUCLEASE VERDAU DER POSITIVKONTROLLEN IST FEHLGESCHLAGEN Undeutliche Verdau Peaks Ungeschnittener Homoduplex Peak ma AM M GLI
6. Bee CHEN EE E H RASe _dup R FOS T Fra men bases 1 AGCA ESEARKEKIEIUN Kein Stempel nachgewiesen NEE Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE IVD f r DHPLC Seite 36 Einzelheiten zur Bestellung Einzelheiten zur Bestellung Produkt Summer Produktname Menge 710104 SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD 100 Reaktionen 710106 SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 amp 4 CE IVD 100 Reaktionen 710400 SURVEYOR Scan NAAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE IVD 100 Reaktionen 710077 CRC RAScan Combination Kit for KRAS and NRAS Exons 2 3 230 Reaktionen amp 4 CE IVD Kontaktdaten Hauptniederlassung Europa Transgenomic Inc Transgenomic Limited 12325 Emmet Street 40 Watt Road Omaha Hillington Park Hillington Nebraska 68164 Glasgow G52 4RY United States of America United Kingdom Tel 888 233 9283 oder 1 402 452 5400 Tel 44 141 892 8800 Fax 1 402 452 5401 Fax 44 141 883 5967 E Mail support Transgenomic com E Mail support Transgenomic com Nur in Nordamerika www Transgenomic com Transgenomic Advancing Personalized Medicine bersetzung Verzicht Transgenomic Inc hat alle Anstrengungen unternommen um die Genauigkeit dieser bersetzung sorgen gemacht Wenn Sie Fragen zu Angaben in dieser bersetzte Version des Handbuchs haben auf die englische Version Instructions for Use for the SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons
7. IVD f r DHPLC Seite 16 12 Schritt f r Schritt Anleitung Falls mehrere Bande vorhanden sind vergewissern Sie sich dass die Qualit t der Eingangsmatrizen DNA ausreichend war siehe Anhang B Fehlersuche Falls kein Produkt zu sehen ist vergewissern Sie sich dass die Qualit t der Eingangsmatrizen DNA ausreichend war siehe Anhang B Fehlersuche Wenn die Qualit t den Spezifikationen entspricht erh hen Sie das Volumen der Matrize auf 4 0 uL je 50 uL Reaktion Verh ltnis von Wasser zu Reaktion auf 31 0 uL reduzieren In der No Template Control d rfen keine PCR Produkte zu sehen sein Wenn bei dieser Kontrolle DNA Produkte nachweisbar sind liegt wahrscheinlich eine Kontamination vor siehe Anhang B Fehlersuche Bewerten Sie die PCR als starke PCR oder schwache PCR a Eine starke PCR muss eine Einzelbande haben die gleich oder gr er als 20 ng uL ist b Eine schwache PCR muss eine Einzelbande haben die kleiner als 20 ng uL ist c F hren Sie den SURVEYOR Nuclease Verdau sowohl mit starken als auch schwachen PCR Ergebnissen durch TIPP In dieser Phase k nnen PCR Produkte bei unter bzw gleich 20 C bis zu einer Woche gelagert werden 12 8 SURVEYOR Nuclease Verdau 1 Nachdem sich die Probe PCR in Qualit t und Quantit t als ausreichend erwiesen hat f hren Sie die SURVEYOR Nuclease Verdaureaktion wie nachstehend beschrieben durch Tauen Sie die 0 15 M MgCl Solution und de
8. PCR ausreichend Matrize vorhanden ist 2 Das 260 280 Absorptionsverh ltnis muss gr er als 1 80 sein 3 Um das PCR Setup zu beschleunigen stellen Sie die Gebrauchskonzentration der Matrize auf ungef hr 12 5 ng uL ein Verd nnen Sie bei Bedarf die Matrizen DNA mit hoch reinem Wasser f r die Molekularbiologie EEE ABER Er EEE EEE EEE ir EEE EEE EEE Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE IVD f r DHPLC Seite 11 12 Schritt f r Schritt Anleitung 12 4 berlegungen zum Arbeitsablauf Das Kit ist f r die Analyse von 100 Reaktionen ausgelegt Kleinere Probenserien k nnen ausgef hrt werden aber die Kit Kontrolle und eine No Template Control m ssen bei jeder Probenserie mitgef hrt werden Im Kit ist ausreichend Kontrollmaterial f r 100 Reaktionen aller Kombinationen der zu verwendenden Probenseriengr en Im Allgemeinen sollte die Probenverarbeitung von Anfang bis Ende so ausgef hrt werden wie in dieser Bedienungsanleitung beschrieben Wenn die Verarbeitung einer Probe vor der Fertigstellung aller Schritte unterbrochen werden muss sollte die DNA bei angegebener Stelle bei 20 C gelagert werden Allerdings sollten gefrorene Proben nicht wiederholten Einfrier Auftauzyklen ausgesetzt werden und die Tiefk hllagerung 18 bis 25 C von PCR amplifizierter DNA bzw SURVEYOR Nuclease Verdauprodukten ber einen Zeitraum gt 1 Woche sollte vermieden werden Die Probenanalyse sollte dem un
9. der Verdauungsmuster der Proben 1 und 2 mit dem Wild Type verdauten Elektropherogramm ist es offensichtlich dass Probe 1 rot Linie m glicherweise eine Mutation enth lt und sequenziert werden sollte um Anwesenheit oder Fehlen einer Mutation am entsprechenden Codon zu best tigen Die Probe 2 schwarze Linie hat im Vergleich zur NRAS Control Wild Type ein Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE IVD f r DHPLC Seite 21 Bu 14 Interpretation der Ergebnisse hnliches Chromatogramm und muss nicht zur DNA Sequenzanalyse geschickt werden Bitte beachten Sie dass das Sequenzierungsergebnis das endg ltige Ergebnis darstellt da es in derselben Fragmentgr e weitere nicht relevante Mutationen geben kann Abbildung 5A NRAS Control Wild Type NRAS Control Exon 3 Probe 1 NRAS Exon 3 Probe 2 NRAS Exon 3 DNA Gr enstandard DHPLC Durchfluss a DHPLC S ule sp len N Ungespaltenes 203 bp Amplikon Q61K ergibt Fragmente von 78 und 125 bp Abbildung 5B Ke Q61K ergibt NRAS Control Wild Type Fragmente NRAS Control Exon 3 von 78 und Probe 1 NRAS Exon 3 Ka 125 bp Probe 2 NRAS Exon 3 DNA Gr enstandard 500 Ungespaltenes 203 bp Amplikon Abbildung 5A und 5B WAVE DHPLC Analyse mit UV Abbildung 5A und Fluoreszenz Abbildung 5B Nachweis von SURVEYOR Nuclease Verdauprodukten NRAS Positive Control Exon 3 Wild Type
10. die Analyse von SURVEYOR Nuclease Verdauprodukten mit dem DHPLC System gehen Sie auf http world Transgenomic com diagnostic tools genetic analysis kits crc rascan kits eu DHPLCsystemsettings Abbildung 4A NRAS Control Wild Type NRAS Control Exon 2 Probe 1 NRAS Exon 2 Probe 2 NRAS Exon 2 DHPLC DNA Gr Benstandard EES Ungespaltenes 236 bp Amplikon G12D ergibt Fragmente von 88 und 148 bp DHPLC S ule sp len NRAS Control Wild Type NRAS Control Exon 2 Probe 1 NRAS Exon 2 Probe 2 NRAS Exon 2 DNA Gr enstandard G12D ergibt Fragmente von 88 und 148 bp Ungespaltenes lt 236 bp Amplikon Abbildung 4A und 4B WAVE DHPLC Analyse mit UV Abbildung 4A und Fluoreszenz Abbildung 4B Nachweis von SURVEYOR Nuclease Verdauprodukten von NRAS Positive Control Exon 3 Wild Type Controls und CRC DNA isoliert aus FFPE Schnitten Bei der Sichtpr fung der Chromatogramme sollten die verdauten Proben mit der NRAS Control Wild Type blaue Linie verglichen werden Die NRAS Positive Control Exon 2 gr ne Linie ist eine Mischung aus Wild Type und mutanten G12D Plasmiden die in Verdauungspeaks zu 88 und 148 bp resultieren diese Kontrolle weist darauf hin dass der SURVEYOR Nuclease Verdauschritt funktioniert hat und weist auf dem Chromatogramm auf die Region zur Sichtpr fung hin die bestimmt ob eine Probe zur DNA Sequenzanalyse geschickt werden sollte Beim Vergleich
11. oder 3 isolieren Sie frische DNA von demselben oder einem anderen FFPE Schnitt Inaktive F hren Sie eine Reaktion SURVEYOR mit Kontrollen durch um die Nuclease Enzymleistung zu verifizieren Nur frisch hergestellten SURVEYOR Nuclease Master Mix verwenden Anmerkung SURVEYOR Nuclease spaltet berwiegend bei Mismatches in Heteroduplices Das Verh ltnis von Heteroduplex zu Homoduplex in der hybridisierten Probe bestimmt das Verdausignal in der SURVEYOR Nuclease Wenn die NRAS Mutation in der genomischen DNA Probe in sehr geringer Konzentration vorliegt kann das Signal f r ein positives Ergebnis zu niedrig sein Es ist wichtig darauf zu achten dass der Hybridisierungsschritt im Thermocycler Programm enthalten ist siehe Amplifikationsprotokoll um die Leistung der Heteroduplexbildung zu optimieren Heteroduplices werden bei Standard PCR Reaktionen mit sehr geringem Ertrag gebildet Anmerkung Der Signal Rausch Abstand ist im Allgemeinen hoch genug um Mutationen mit einem geringeren Prozentsatz der Gesamt DNA Matrize nachzuweisen Es ist m glich bis 2 mutante DNA zu detektieren Abbildung 4 zeigt die mit Homoduplex und Heteroduplex NRAS Positive Control DNAs in diesem Kit enthalten und FFPE Proben generierten Verdauprodukte auf einem WAVE DHPLC 4500 System Die Spaltprodukte sind deutlich als zwei neue Peaks zu erkennen die mit der erwarteten Lange eluiert wurden die anhand des DNA L ngenstandards berec
12. 420 22420042020 cenneste censeeeceectusee nnmnnn nnmnnn nnmnnn nnana nnna 9 9 Warnhinweise amp Vorsichtsma nahmen 22 ccccceceseeeeeeeeeeeeeenneeeeeeeceeeeesnsesnaeeeeeeeenenseensneeeesees 9 10 Prim re Probenentnahme Handhabung und Lagerung uussresnsnnnnnnnannnnnannnnnnnnnnnnnnnannnnnannnnn 9 ART El E 10 11 1 Somatischer Mutationsnachweis mit SURVEYOR Scan Kits Ein berblick ccccccccssesessssescsesseseseeeeess 10 12 Schritt fUr Schritt AmleitUng nnessssssnsnnnnnnnannnnnnnnnnnnnnnnnnnnnannnnnannnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnannnnnnan 10 12 1 DHPLC Grundeinstellung Kalibration ccccsccesssccssscesssecsseceestecaecesssecsaecesssecsaeceestecsaeceseecsaeceeseeesaeeesaes 10 12 2 berlegungen vor Beginn der NRAs Probenanalyse 10 12 3 berlegungen zu den Matrize sisisi srecssisoreshiis sket n osnidakudakeaniosnkee kiss uksan os idikia ieaiaia kidak dak osii dikis 11 12 4 berlegungen zum Arbeltsablaut ir irri eA Er NEA E 12 12 5 Amplifikationsprotokolll cccccccsssssssssecsssesssssseseceseesensnessecesecsessnessececessessnansacecessessnassesecessessnansasecess 14 12 6 Thermocycler Programm f r Amplifikationsprotokoll c cccccccecssssscecececsessssececeeecesseeeesececeesssesaeeeeees 16 12 7 Qualit tskontrolle der DCH Produkte 16 12 8 SURVEYOR NUGCICASE Ver all acc ceicss cccsssscnseasctencnnsntecsascedeesstees nieste oianean na ois cobs senken nassen here 17 13 Kontro llverf hre
13. Anmerkung PCR sollte einen ausreichend hohen Ertrag gr er als 20 ng uL einer EINZELNEN amplifizierten Spezies der richtigen L nge erzeugen F r die PCR muss die in diesem Kit mitgelieferte DNA Polymerase und der DNA Polymerase 10X PCR Buffer verwendet werden Amplikons aus Kontrollen m ssen mit der SURVEYOR Nuclease verdaut und analysiert werden um durch Sichtprifung der Chromatogrammprofile st rendes Hintergrundrauschen auszuschlie en siehe Beispielergebnisse Abbildung 4 Kontrollieren Sie vor dem Verdau jedes amplifizierte DNA Produkt durch Gelelektrophorese oder durch Analyse mit dem DHPLC System um sicherzugehen dass es eine einzelne Spezies der erwarteten L nge ist ae ee Te Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE IVD f r DHPLC Seite 31 Anhang B Problem 3 Keine Spaltprodukte bei der Analyse nach SURVEYOR Nuclease Behandlung der Heteroduplices MOGLICHE URSACHE LOSUNG KEINE SPALTPRODUKTE ep Anteil an Test anhand der Kontrollen Mismatch Ziel berpr fen zu gering Ineffiziente F hren Sie das PCR und Bildung von Hybridisierungsverfahren Sia Heteroduplices genau nach Anleitung enienaen D durch Verwenden Sie f r H l oe den SURVEYOR Nuclease Verdau frisch hybridisierte DNA VQ ey SS Pere a t Wiederholen Sie die PCR s no ai Amplifikation mit 1 Ungeschnittener derselben Menge DNA Homoduplex Matrize 2 erh hen Sie die SEH Menge Start DNA
14. CHE e URSACHE Bok AS SURVEYOR Eine neue Probe Nuclease nicht hinzugef gt verdauen SURVEYOR Nuclease Verdau wurde bei falscher Temperatur durchgef hrt Eine neue Probe verdauen Problem 7 Unerwartete Peaks in SURVEYOR Nuclease Verdauspur DER SURVEYOR NUCLEASE VERDAU DER MOGLICHE LOSUNG POSITIVKONTROLLEN IST FEHLGESCHLAGEN URSACHE E Mutation Probe befindet sich an sequenzieren Ungeschnittener ungewohnlicher um Mutation zu Homoduplex Stelle bestatigen Peak Unerwarteter Verdau DHPLC Unerwartete j SDHPLC Durchfluss Verdau Peaks Wash RE Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE IVD f r DHPLC Seite 35 Problem 8 Kontamination von Probe mit Positive Controls Verdaumusier stimmen mit Anwesenheit von gestempelten Regionen der gemischten Positive Controls und Wild Type Heteroduplices berein M GLICHE URSACHE LOSUNG Probe 1 Schlechte Beim Pipettieren Pipettiertechnik der Proben Probe 2 Probe 3 besonders darauf achten dass es nicht zur Kreuzkontaminatio n kommt berpr fen Sie die Regionen der Kontrollstempelseq uenz auf A Kontamination der Positive Control an Codon 12 amp 13 Probe 1 NVD in Codon A011 Fras GI Leg cae 141 GGAA 12 amp 13 TAT IAI AALS IT T Stempel nachgewiesen RAS S F FOO 1 Frat ge Fioi i0q GAG TTGGG4
15. Controls und CRC DNA isoliert aus FFPE Schnitten Bei der Sichtpr fung der Chromatogramme sollten die verdauten Proben mit der NRAS Control Wild Type gr ne Linie verglichen werden Die NRAS Positive Control Exon 3 blaue Linie ist eine Mischung aus Wild Type und mutanten Q61K Plasmiden die in Verdauungspeaks zu 78 und 125 bp resultieren diese Kontrolle weist darauf hin dass der SURVEYOR Nuclease Verdauungsschritt funktioniert und gibt auf dem Chromatogramm die Region zur Sichtpr fung an mit der bestimmt werden sollte ob eine Probe zur DNA Sequenzanalyse geschickt werden sollte Beim Vergleich der Verdauungsmuster der Proben 1 und 2 mit dem Wild Type das im Elektropherogramm verdaut ist ist es offensichtlich dass Probe 1 rot Linie m glicherweise eine Mutation enth lt und sequenziert werden sollten um die Anwesenheit oder das Fehlen einer Mutation am entsprechenden Codon zu best tigen Die Probe 2 schwarze Linie hat im Vergleich zur NRAS Control Wild Type ein hnliches Chromatogramm und muss nicht zur DNA Sequenzanalyse geschickt werden Bitte beachten dass das Sequenzierungsergebnis das endg ltige Ergebnis darstellt da es in derselben Fragmentgr e weitere nicht relevante Mutationen geben kann Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE IVD f r DHPLC Seite 22 14 Interpretation der Ergebnisse NRAS Control Wild Type NRAS Control Exon 4 Probe 1 NRAS Exon 4 Probe 2 NRAS Exon 4 DHPLC Unge
16. DNAs durch nachdem Sie den Abschnitt Schritt f r Schritt Anleitung gelesen und verinnerlicht haben Bevor Sie sich an den technischen Kundendienst von Transgenomic wenden warten Sie bitte die Ergebnisse f r die Kontrollplasmid DNAs ab Diese Fehlersuche deckt eine Liste von Problemen ab die bei der Arbeit mit den SURVEYOR Scan Kits f r DHPLC auftreten k nnen sowie Vorschl ge wie sie zu l sen sind Konsultieren Sie das Bedienungshandbuch des DHPLC Systems f r detaillierte Anleitungen in Bezug auf Ger tebetrieb und Wartung Das Bedienungshandbuch enth lt spezifische Verfahren zur berpr fung und Wartung der S ulenleistung und beinhaltet Einzelheiten zur Fehlersuche Problem 1 Niedrige PCR Ausbeute oder kein PCR Produkt wenn auf Agarosegel analysiert NIEDRIGE PCR M GLICHE R AUSBEUTE URSACHE u Schlechte Qualit t der Wiederholen Sie die Aufreinigung der DNA DNA Matrize berpr fen Sie die verwendete Aufreinigungsmethode Wenn die FFPE A E extrahierte DNA zu fragmentiert ist k nnen A rar PCR alternative FFPE Blocks erforderlich sein usbeute Ausbeute Zu viel RNA in der Wiederholen Sie die RNase Behandlung der zz Probe verursacht die DNA Probe und reinigen Sie die DNA erneut berbewertung der DNA Konzentration Thermocycler nicht F hren Sie die Kalibrierung des kalibriert Thermocyclers durch Nicht ausreichende Erh hen Sie die Matrizenmenge Matrize Anmerkung Es sollte hochwertige DNA aus
17. Die Analyse von SURVEYOR Nuclease Reaktionen erfordert h ufigere und strengere Reinigungsprotokolle als f r die normale PCR Probenanalyse F r weitere Einzelheiten siehe die Anweisungen Ihres DHPLC Systems Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE IVD f r DHPLC Seite 27 AA Laborbedingungen f r PCR Tests Um zuverlassige und kontaminationsfreie PCR Ergebnisse zu erhalten halten Sie sich bei der Einrichtung der PCR Labors an die gute Laborpraxis Denken Sie bei der Planung des Laboraufbaus an den Bedarf an r umlicher Trennung der Arbeitsbereiche PCR Amplifikation und Post Amplifikation Es ist wichtig Folgendes zu trennen i DNA Isolierung ii PCR Amplifikation und iii Post PCR Aktivitaten wie das Offnen von R hrchen mit amplifizierter Probe f r die Durchf hrung von Gelelektrophoresen und Vorbereiten anderer Tests wie SURVEYOR Nuclease Verdau und DNA Sequenzierung Es ist auch wichtig dass Laborverbrauchsmaterial und Laborausr stung speziell f r diese Arbeitsbereiche gekennzeichnet sind und ausschlie lich in diesem Bereich verwendet werden Abwischen von Oberfl chen mit einer w chentlich frisch zubereiteten Bleiche 10 v v ist hilfreich bei der Elimination von DNA Fragmenten lt 500 bp als Matrizen f r PCR Dar ber hinaus kann es n tzlich sein Kunststoffprodukte und L sungen mit einem UV Crosslinker 7 10 Minuten kurzwelliger UV Strahlung auszusetzen Anmerkung Enzyme und DNA die am
18. FFPE verwendet werden Die DNA sollte eine durch Absorption bei 260 nm gemessene Konzentration von 25 ng uL aufweisen sowie ein Absorptionsverh ltnis von 260 280 nm von gr er 1 8 haben und gr er als 90 DNA sein d h nahezu frei von tRNA und rRNA Kontamination laut Agarosegelauswertung DNA Proben zwischen 20 C und 80 C aufbewahren Die Analyse von DNA Matrize die aus paraffineingebettetem Gewebe extrahiert wurde erfordert mehrere Vorsichtsma nahmen Die DNA kann mit Uracil DNA Glycosylase behandelt werden um eine Amplifikation von DNA Fragmenten zu vermeiden die deaminierte C Reste enthalten H ufig wird ein hoher Prozentsatz des aus dem paraffineingebetteten Gewebe extrahierten Azco Adsorptionsmittels bei der PCR nicht gut amplifiziert Oft hilft eine gr ere Menge Start DNA um ein geeignetes Amplifikationsprodukt zu erhalten Eine weitere berlegung w re FFPE Tumorschnitte mit einem hohen Prozentanteil an Tumorzellen zu w hlen Mikrodissektion kann ebenfalls verwendet werden ist aber zeitaufwendig und f r das normale Routinelabor nicht Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE IVD f r DHPLC Seite 30 empfehlenswert Problem 2 Mehrere PCR Produkte wenn auf Agarosegel analysiert MEHRERE PCR PRODUKTE M GLICHE URSACHE L SUNG Anlagerungstemperatur zu berpr fen Sie die Kalibrierung niedrig des Thermocyclers Gute Multiple PCR Bande Ausbeute PCR
19. L zu erhalten Alle mit diesen Master Mix vorbereiteten Proben brauchen extrahierte DNA die auf ann hernd dasselbe niedrigste Konzentrationsniveau verd nnt ist Es ist nicht empfehlenswert Konzentrationen extrahierter DNA mit weniger als 5 ng uL einzusetzen 7 Berechnen Sie die erforderlichen Volumina f r alle Master Mix L sungen anhand der Tabelle oben Beachten Sie dabei Folgendes a F r Master Mix 1 NRAS Exon 2 sind drei zus tzliche Reaktionen erforderlich f r NRAS Control Wild Type NRAS Positive Control Exon 2 und NRAS Exon 2 No Template Control NTC1 b F r Master Mix 2 NRAS Exon 3 sind drei zus tzliche Reaktionen erforderlich f r NRAS Control Wild Type NRAS Positive Control Exon 3 und NRAS Exon 3 No Template Control NTC1 c F r Master Mix 3 NRAS Exon 4 sind drei zus tzliche Reaktionen erforderlich f r NRAS Control Wild Type NRAS Positive Control Exon 4 und NRAS Exon 4 No Template Control NTC1 Anmerkung Ber cksichtigen Sie dass etwas mehr Master Mix als in dieser Berechnung angegeben ben tigt wird um Verluste w hrend des Pipettierens auszugleichen 8 Beschriften Sie 0 2 mL PCR Reaktionsgef e oder die Vertiefungen einer 96 Loch Mikrotiterplatte mit den erforderlichen Probeninformationen 9 Beschriften Sie 2 0 mL Zentrifugenr hrchen f r den jeweiligen vorbereiteten Master Mix 10 F gen Sie diesen 2 0 mL Zentrifugenr hrchen mit der Beschriftung Master Mix das erforderliche Volumen an h
20. NA Nuclease spaltet beide Str nge eines DNA Heteroduplex am 3 Ende der Mismatch Stelle Insertion Deletion Mismatches und alle Basenaustausch Mischmatches werden erkannt aber die Spalteffizienz variiert mit der Mismatch Sequenz Ort des Mismatches Abbildung 2 Wirkungsweise der SURVEYOR Nuclease Die SURVEYOR Nuclease Endonuclease erkennt ein Mismatch 5 e und spaltet am 3 Ende der Mismatch Basen Das spaltet den gd A DNA Doppelstrang was einen einzigen 3 Basen berhang Entstandene Fragmente hinterl sst SOC DOC Die SURVEYOR Nuclease wurde in einer ganzen Reihe von Projekten eingesetzt um in Genen eine Vielzahl von Mutationen und Polymorphismen nachzuweisen Insbesondere wird die SURVEYOR Nuclease verwendet um in einer Reihe von Genen bekannte Mutationen zu best tigen die mit Nieren Lungen Kopf und Halskrebs sowie Leuk mie und Endometriumkarzinom in Verbindung gebracht werden Ebenso wurde sie zur Ergebnisprognose einer Strahlentherapie eingesetzt Das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exon 2 3 amp 4 CE IVD ist zur Spaltung von Mismatches im NRAS Exon 2 3 amp 4 und der anschlie enden Analyse durch das DHPLC vorgesehen Anmerkung Wenn eine Probe 100 mutante DNA ist k nnen keine Heteroduplices gebildet werden und die Probe erscheint als Wild Type Allerdings enthalten aufgrund von Tumorheterogenit t und oder kontaminierendem normalen Gewebe Biopsieproben von Tumoren Wild Type Zellen bitte beachten Sie dass mit d
21. Wenn die Sequenzbest tigung eine Anderung der Basensequenz anzeigt die zu einer Ver nderung einer Aminos ure f hrt bei i Codon 12 ii Codon 13 iii Codon 59 iv Codon 61 v Codon 117 oder vi Codon 146 ist dies als NRAS Mutation positiv zu bewerten Anmerkung Es ist m glich eine positive SURVEYOR Scan Zuordnung zu haben der bei der Sequenzbestatigung zudem in ein No Variant Detected keine Variante festgestellt resultiert Die Nachweisgrenze Level of Detection LoD der SURVEYOR Nuclease auf einem DHPLC System Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE IVD f r DHPLC Seite 13 12 Schritt f r Schritt Anleitung ist f r einige Mutationen so gering wie 2 Mutant in 98 Wild Type DNA wohingegen das LoD der Sequenzierung circa 10 25 Mutant in 90 75 Wild Type DNA betr gt Anmerkung Wenn eine Probe 100 mutante DNA ist k nnen keine Heteroduplices gebildet werden und die Probe erscheint als Wild Type Proben aus Tumorbiopsien enthalten allerdings aufgrund der Tumorheterogenit t und oder kontaminierendem normalen Gewebe Wild Type Zellen mit diesem Kit ist 5 Wild Type nachweisbar mit Spuren die mit 5 mutanter DNA identisch sind Anmerkung Positive SURVEYOR Scan Ergebnisse k nnen sich aufgrund von Ver nderungen in der Basensequenz von denen unterscheiden die NRAS aktivierend sind Obwohl diese Mutationen selten sind ist eine Best tigung durch eine andere Methode z B DNA Sequ
22. atic colorectal cancer http wwwext amgen com media media or detail jsp year 2013 amp releaselD 1820728 2 Peeters M et al 2013 Massively parallel tumor multigene sequencing to evaluate response to panitumumab in a randomized phase III study of metastatic colorectal cancer Clin Cancer Res 19 1902 12 3 De Roock W et al 2010 Association of KRAS p G13D mutation with outcome in patients with chemotherapy refractory metastatic colorectal cancer treated with cetuximab JAMA 304 1812 20 4 Peeters M et al 2013 Mutant KRAS codon 12 and 13 alleles in patients with metastatic colorectal cancer assessment as prognostic and predictive biomarkers of response to panitumumab J Clin Oncol 31 759 65 5 Andre T et a 2013 Panitumumab combined with irinotecan for patients with KRAS Wild Type metastatic colorectal cancer refractory to standard chemotherapy a GERCOR efficacy tolerance and translational molecular study Ann Oncol 24 412 9 6 Loupakis F et al 2009 KRAS codon 61 146 and BRAF mutations predict resistance to cetuximab plus irinotecan in KRAS codon 12 and 13 Wild Type metastatic colorectal cancer Br Cancer 101 715 21 7 De Roock W et al 2010 Effects of KRAS BRAF NRAS and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy refractory metastatic colorectal cancer a retrospective consortium analysis Lancet Oncol 11 753 62 8 Qiu P et al 2004 Mutation detection using Surveyor nuclease
23. die Sequenzierung vorhanden sein kann Siehe Anhang B Fehlersuche f r Beispiele fehlgeschlagener SURVEYOR Scan Ergebnisse Alle Proben mit dem Ergebnis SURVEYOR Scan fehlgeschlagen sollten noch mal neu bearbeitet werden a Wenn noch ausreichend genomische DNA vorhanden ist die PCR wiederholen b Aus FFPE erneut DNA extrahieren dies muss die zweite Wahl sein da es normalerweise nicht w nschenswert ist einen FFPE Block nachzuschneiden c Wenn ein anderer Gewebeschnitt oder Block verwendet wird muss der gesamte Test wiederholt werden da es aufgrund der Tumorheterogenitat zu Abweichungen im Verdau kommen kann Wenn keine Spalt Peaks sichtbar sind f r den SURVEYOR Scan ein negatives Ergebnis angeben d h NVD No Variant Detected keine Variante nachgewiesen Wenn eine Probe SURVEYOR Nuclease Spaltprodukte anzeigt entspricht nicht der jeweiligen Wild Type Control sollte sie zur Sequenzbest tigung gesandt werden Wenn die Sequenzbest tigung nicht annehmbar ist dann a Wenn noch ausreichend genomische DNA vorhanden ist die PCR wiederholen b Aus FFPE erneut DNA extrahieren dies muss die zweite Wahl sein da es normalerweise nicht w nschenswert ist einen FFPE Block nachzuschneiden Bei einer akzeptablen Best tigungsanalyse sollte eines der folgenden Resultate zutreffen a Wild Type Sequenz das hei t No Variant Detected NVD keine Variante nachgewiesen oder b Variant Detected Variante nachgewiesen
24. e durch Verspritzen w hrend des Mischens oder durch nicht gewechselte Pipettenspitzen nicht zu einer Kontamination der Proben in den angrenzenden Vertiefungen kommt Zee TFT TFT Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE IVD f r DHPLC Seite 25 Anhang A A 1 Plattenlayout fur SURVEYOR Scan Kits Das vorgeschlagene Plattenlayout gilt f r die gleichzeitige Durchf hrung aller sieben KRAS und NRAS Exons mit der SURVEYOR Scan Analyse an 10 Proben g Sir Baz roves provez provea proves proves ke Schl ssel Ex Exon WT Wild Type Mut Mutation NTC No Template Control A 2 Kontroll DNA Stempel Im Folgenden werden die Sequenzen mit einem Stempel angegeben Schl ssel Die h ufigsten Mutationsregionen sind Mole markiert Die Sequenz in GROSSBUCHSTABEN stellen codierende Basen dar die Sequenz in Kleinbuchstaben stellen nicht codierende Basen dar Die Kontrollen haben genetische Stempel die Gelb markiert sind diese Variationen von der NRAS Wild Type Sequenz in einem Bereich in dem keine Mutationen erwartet werden k nnen verwendet werden um Probleme mit der Probenkontamination durch Positive Controls zu erkennen Siehe Anhang B Fehlersuche Problem 8 f r ein Beispiel einer SURVEYOR Scan Spur einer solchen Kontamination NRAS Exon 2 Stempel Amplikongr e 236 bp F r die Herstellung des genetischen Stempels des NRAS Exon 2 Kontrollplasmids wird aca gegen tgt ausgetau
25. e Achten Sie darauf dass alle Proben so gehandhabt werden dass eine Kreuzkontamination zwischen ihnen nicht vorkommt e Arbeiten Sie an einem PCR Arbeitsplatz oder in einem anderen geeigneten Raum wo der Arbeitsbereich vor dem Aufbau von PCR Amplifikationsreaktionen UV Licht ausgesetzt werden kann e Verwenden Sie einen getrennten PCR Arbeitsplatz bzw Raum um die Proben nach der PCR Amplifikation f r die Qualit tskontrolle durch Gelelektrophorese zu ffnen e Der Testaufbau f r die SURVEYOR Nuclease Verdauung sollte in einem anderen Raum oder an einem anderen PCR Arbeitsplatz von dem stattfinden wo die erste PCR durchgef hrt wurde e Achten Sie darauf dass bei allen Testschritten die Plasmidkontrollen des Kits von den Testproben getrennt gehandhabt werden o Stellen Sie sicher dass alle L sungen No Template Controls und Proben DNA Vertiefungen verschlossen sind bevor Sie die Reaktionsgef e mit der Kontrollplasmid DNA ffnen o DIE KONTROLLEN ZULETZT BEARBEITEN F gen Sie den entsprechenden Reaktionsgef en erst dann Kontrollplasmid DNA hinzu NACHDEM ALLE Vertiefungen mit No Template Control und Proben verschlossen wurden o Wischen Sie ALLE R hrchen und Verschlusskappen nach dem Verschlie en der Kontroll DNA R hrchen mit einem DNA Zerst rungsmittel ab z B 10 Bleiche bevor Sie sie in einen anderen Bereich bringen e Achten Sie darauf dass es beim Pipettieren in die 96 Loch Mikrotiterplatte beispielsweis
26. e Verfahrensanspr che unter US Patent Nummern 5 210 015 und 5 487 972 kein Recht zur Durchf hrung einer patentierten Methode sowie kein Recht zur Durchf hrung jedweder kommerzieller Dienstleistungen insbesondere die bermittlung von Ergebnisse der T tigkeiten von Erwerbern gegen ein Honorar oder andere wirtschaftliche Gegenwerte weder ausdr cklich noch implizit bzw durch Rechtsverwirkung abgetreten Dieses Produkt dient ausschlie lich Forschungszwecken F r die diagnostische Verwendung unter Roche Patenten ist eine separate Lizenz von Roche erforderlich F r weitere Informationen ber den Erwerb von Lizenzen wenden Sie sich an den Director of Licensing Applied Biosystems 850 Lincoln Centre Drive Foster City California 94404 USA Transgenomic SURVEYOR und WAVE sind eingetragene Marken und Navigator das Helix Logo und Advancing Personalized Medicine sind Marken von Transgenomic Inc Alle anderen Marken sind das Eigentum ihrer jeweiligen Inhaber 2013 Transgenomic Inc Alle Rechte vorbehalten Gedruckt in den USA Dokument Nr 482296 DE rev2 ee Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE IVD f r DHPLC Seite 38
27. ease Verdaus zeigen die Amplikons dieser drei Kontrollplasmid DNAs effektiv ob die Bedingungen der Spaltreaktion Herstellung des SURVEYOR Nuclease Digest Master Mix und Inkubationsbedingungen zufriedenstellend waren Bei der Analyse liefern die Chromatogramme dieser SURVEYOR Nuclease verdauten Kontrollamplikons auf dem DHPLC System einen Hinweis darauf wo die Peaks der Spaltprodukte die den Mutationen in NRAS Exon 2 3 und 4 entsprechen sogar bei geringer Konzentration eluieren werden siehe Abbildung 4 6 Peaks von Spaltprodukten die anderen Mutationen in NRAS Exons 2 3 und 4 entsprechen k nnen in leicht unterschiedlichen Positionen eluieren Wenn die PCR Amplikons nicht den Ergebnissen in Abschnitt Qualit tskontrolle der PCR Produkte entsprechen sehen Sie in Anhang B Fehlersuche nach oder setzen Sie sich mit dem Kundendienst von Transgenomic in Verbindung bevor Sie weitere Schritte der Probenanalyse durchf hren 13 2 Verwendung von Kontrollplasmid DNAs Mit dem Kit werden vier Kontroll DNAs geliefert NRAS Control Wild Type PN 710441 NRAS Positive Control Exon 2 PN 710442 NRAS Positive Control Exon 3 PN 710443 NRAS Positive Control Exon 4 PN 710444 Diese Kontroll DNAs sind Plasmide mit Insertionen Die Positive Controls enthalten jeweils zwei Plasmide eine Mischung aus NRAS Control Wild Type und einem Mutationsklon der sich vom Wild Type in einem einzigen Basenpaar unterscheidet Die Kontrollen werden in getrennten Reagen
28. ebenfalls dazu neigen nicht auf eine Therapie mit Anti EGFR anzusprechen Dieses Kit wurde f r den Gebrauch in der diagnostischen Analyse von somatischen NRAS Exon 2 3 amp 4 Mutationen entwickelt Das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exon 2 3 amp 4 CE IVD ist ein Test f r den Nachweis aller Sequenzen und kleiner Insertions Deletionsmutationen in Exon 2 3 amp 4 des NRAS Gens Mutationen im NRAS Codon 12 13 59 61 und 146 wurden mit der mangelnden Wirksamkeit von Panitumumab in Verbindung gebracht Mit diesem Kit werden Positive Controls f r Mutationen in Codon 12 61 und 146 mitgeliefert Dieses Kit verwendet die patentrechtlich gesch tzten Technologien SURVEYOR Nuclease von Transgenomic und bietet in Verbindung mit dem DHPLC eine einfache und empfindlichen Mutationsnachweis Damit kann vor einem Hintergrund aus nicht mutanter DNA ein Gemisch aus 2 5 mutanter DNA nachgewiesen werden Untersuchungen zur Validierung haben eine sehr hohe Ubereinstimmung mit der Sequenzierung von gut charakterisierten kolorektalen Tumorproben gezeigt Durch die Verwendung des SURVEYOR Scan NRAS Kit Exon 2 3 amp 4 CE IVD reduziert sich f r den Anwender die Sequenzierungsarbeit und erm glicht dar ber hinaus aggressive Sequenzzuordnung wo eine automatische Sequenzierungssoftware eine Mutation oft nicht kl ren kann Aufgrund der hohen Empfindlichkeit hinsichtlich der Sanger Sequenzierung wird empfohlen die Laboreinrichtung zu optimieren um eine Kreuzkontami
29. ei einem negativen Ergebnis des SURVEYOR Scans keine Sequenzbest tigung durchf hren Die Probe kann als Wild Type oder Keine Variante festgestellt No Variant Detected angegeben werden Die in diesem Kit enthaltenen Universal Sequencing Primers sollten zur Sequenzbest tigung verwendet werden Der Vorw rts Primer hat die PN 710153F Universal Sequencing Primer 1 der R ckw rts Primer die PN 710153R Universal Sequencing Primer 2 15 3 Verfahrensbeschr nkungen Von der Extraktion der formalinfixierten paraffineingebetteten Proben bertragene kontaminierende Stoffe k nnen ebenfalls PCR Amplifikation und SURVEYOR Nuclease Verdauungsvorg nge st ren Die in Verfahren zur Qualit tskontrolle beschriebenen Vorgehensweisen zur Qualit tskontrolle gew hrleisten dass die extrahierte DNA zur Verwendung mit diesem Kit geeignet ist Dieses Kit wurde f r die Verwendung mit formalinfixierten paraffineingebetteten Biopsieproben von Kolorektaltumoren validiert Eine Validierung f r eine Verwendung mit anderen Krebsarten oder frischen bzw tiefgefrorenen Biopsieproben besteht nicht Zur Fehlersuche nicht standardm iger Ergebnisse und Einzelheiten zu Faktoren die diesen Test beeintr chtigen k nnen siehe Anhang B Fehlersuche weiter unten Bei diesem Kit muss besonders darauf geachtet werden bertragung und Kreuzkontamination zu vermeiden Die hohe Empfindlichkeit der Testmethode erfordert Vorsichtsma nahmen f r folgende Punkte
30. enten enth lt Diese Bedienungsanleitung ist auch als Download erh ltlich unter http world transgenomic com files literature 482296 DE pdf 2 2 Angaben zum Gebrauch Mediziner k nnen den SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 GE IVD mit den DHPLC Systemen als Hilfe bei der Entscheidung verwenden ob Patienten mit kolorektalem Karzinom auf eine Therapie mit einem Anti EGFR Epidermal Growth Factor Receptor bzw epidermalen Wachstumsfaktor Rezeptor Therapeutikum wie Panitumumab ansprechen Dase SURVEYOR Scan NRAS Kit Exon 2 3 amp 4 CE IVD ist f r die Analyse der Proben vorgesehen die nach Analyse mit dem SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD als KRAS Exon 2 Wild Type bestimmt wurden Dieses Kit sollte auch zusammen mit dem SURVEYOR Scan Kit KRAS Exon 3 amp 4 CE IVD verwendet werden Das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exon 2 3 amp 4 CE IVD darf nicht zur Diagnose von kolorektalem Karzinom oder anderer Krebsarten verwendet werden Das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exon 2 3 amp 4 CE IVD weist auf die Anwesenheit von potenziellen somatischen Mutationen im NRAS Gen Exon 2 3 amp 4 hin best tigt aber nicht die Sequenzidentit t der Mutation Um nachzuweisen um welche Mutation es sich genau handelt sind weitere Untersuchungen wie zum Beispiel eine DNA Sequenzierung erforderlich Die mit diesem Kit erhaltenen Ergebnisse sollten ein Hinweis auf den Mutationsstatus eines Patienten sein es m ssen jedoch weitere klinische Faktoren ber cksichti
31. enzierung erforderlich um zu bestimmen ob ein positives SURVEYOR Scan Ergebnis tats chlich eine NRAS aktivierende Mutation ist Anmerkung Das Formalinfixierungsverfahren das f r die Vorbereitung von FFPE Tumorbiopsieproben verwendet wird kann zu einer Cytosin Desaminierung f hren Diese Desaminierung wandelt Cytosin in Uracil um Die Polymerase liest dieses Uracil als ein Thymin und bindet ein Adenin in die duplizierten Str nge ein Dies scheint dann eine Mutation zu sein bei der das normale G jetzt durch ein A ersetzt wird und eine G C zu A T Mutation verursacht die eine Artefaktmutation durch den Fixierungsprozess und keine echte somatische Mutation ist Diese Vorf lle sind selten wenn sie jedoch f r im PCR Cycling dupliziert werden sehen sie wie Mutationen aus Sie reagieren nicht auf eine erneute Analyse Ein Beispiel f r eine m gliche Mutation durch Cytosin Desaminierung die f r eine Bestimmung der Patiententherapie herangezogen w rde ist NRAS A146T Codon 146 GCC gt ACC A146T Daher wird empfohlen dass alle diese Mutationen durch Doppelanalyse f r dieselbe genomische DNA best tigt oder alle Proben ab Analysebeginn im Doppelansatz durchgef hrt werden 12 5 Amplifikationsprotokoll 1 Die vorgemischte dNTP L sung PN 703065 von Transgenomic wird in einer Gebrauchskonzentration von 10 mM Gesamtdeoxynucleotid je 2 5 mM der vier Deoxynucleotide geliefert 2 Die NRAS Exon 2 Exon 3 und Exon 4 Forward u
32. eren Sie 1 2 Minuten lang um zu garantieren dass alle L sungen auf dem Boden der Vertiefung oder der R hrchen gesammelt werden Vergewissern Sie sich dass alle L sungen auf dem Boden jeder Vertiefung bzw jeden Reaktionsgef es sind Wenn dies nicht der Fall ist wiederholen Sie die Zentrifugation 12 6 Thermocycler Programm f r Amplifikationsprotokoll 1 Verwenden Sie folgendes Thermocycler Protokoll f r die PCR Amplifikation und Heteroduplex Bildung Initiale Denaturierung 95 C 5 Minuten Touchdown Amplifikation 95 C 30 Sekunden 15 Zyklen 62 C 0 5 C Zyklus 30 Sekunden 72 C 25 Sekunden Amplifikation 95 C 30 Sekunden 30 Zyklen 55 C 30 Sekunden 72 C 25 Sekunden Finale Extension 1 Zyklus 72 C 2 Minuten Heteroduplex Bildung 95 C 2 Minuten lt 12 C Hold 12 7 Qualit tskontrolle der PCR Produkte 1 Bevor Sie mit dem SURVEYOR Nuclease Verdau fortfahren m ssen Qualit t und Quantit t des Amplikons durch Gel Elektrophorese oder quivalente Mittel gepr ft werden Analysieren Sie ein Aliquot des PCR Produkts zusammen mit mehreren verschiedenen Mengen einer 100 bp DNA Basenpaarleiter Verwenden Sie die Basenpaarleiter um die Konzentration amplifizierter DNA zu berechnen Es sollte nur eine einzige dem Haupt PCR Produkt entsprechende Bande gr er als 20 ng uL verzeichnet werden Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE
33. f r jeden Verdau einem 0 2 mL oder gr eren PCR Reaktionsgef folgende Komponenten hinzu 1 0 uL 0 15 M MgCl Solution PN 708027 1 0 uL SURVEYOR Enhancer Cofactor PN 708049 1 0 uL SURVEYOR Enhancer W2 PN 710161 2 0 uL SURVEYOR Nuclease W PN 710160 Oder f gen Sie 5 uL Master Mix hinzu der wie in der Tabelle oben vorbereitet wurde 5 Vortexen Sie den SURVEYOR Nuclease Digest Master Mix 10 Sekunden bei niedriger Geschwindigkeit 6 Zentrifugieren Sie den SURVEYOR Nuclease Digest Master Mix 10 Sekunden bei niedriger Geschwindigkeit 7 Legen Sie den SURVEYOR Nuclease Digest Master Mix bis zur Weiterverarbeitung auf Eis Anmerkung Der in Schritt 7 vorbereitete SURVEYOR Nuclease Digest Master Mix muss sofort verwendet werden da SURVEYOR Nuclease W mit der Zeit inaktiv wird wenn sie mit den anderen Komponenten des SURVEYOR Nuclease Digest Master Mix in Ber hrung kommt 8 Pipettieren Sie je 5 0 uL Aliquot des SURVEYOR Nuclease Master Mix in jedes Reaktionsgef oder jede Vertiefung das bzw die 10 0 uL Aliquot des amplifizierten PCR Produkts enth lt siehe Schritt 3 oben 9 Wenn Sie mit dem Pipettieren fertig sind zentrifugieren Sie die 0 2 mL PCR Reaktionsgef e bzw die 96 Loch Mikrotiterplatte 10 Sekunden lang 10 Vortexen Sie die 0 2 mL PCR Reaktionsgef e bzw die 96 Loch Mikrotiterplatte vorsichtig 10 Sekunden lang 11 Zentrifugieren Sie 10 Sekunden bei niedriger Geschwindigkeit dieser Schritt
34. g http world Transgenomic com files literature 710400 DE pdf Dieses Kit enth lt keine Substanzen tierischen oder menschlichen Ursprungs die ein Infektionsrisiko darstellen k nnen Dieses Kit darf nur von Personen verwendet werden die in den entsprechenden Labortechniken ausgebildet wurden Beim Arbeiten mit den Kitkomponenten immer einen geeigneten Laborkittel Einmalhandschuhe und Augenschutz tragen Nach dem Gebrauch m ssen die Kitkomponenten als klinischer Abfall und gem der f r sie anwendbaren Gesetze und Verordnungen entsorgt werden Aus den Gef en pipettierte Reagenzienaliquots dieses Kits sind nur zum einmaligen Gebrauch bestimmt Es konnte validiert werden dass Kitkomponenten auch nach 25 Auftau Einfrierzyklen noch stabil sind Verwenden Sie das Kit nicht wenn diese Anzahl Zyklen berschritten wurde 10 Prim re Probenentnahme Handhabung und Lagerung Das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE IVD ben tigt DNA die aus formalinfixierten paraffineingebetteten FFPE kolorektalen Tumorproben extrahiert wurde F r eine optimale DNA Extraktion muss das Gewebe 14 24 Stunden in Formalin fixiert werden Tumorbiopsien sind eine heterogene Mischung aus Tumorzellen und Nicht Tumorzellen Au erdem ist der Tumor an sich eine heterogene Mischung aus Tumorzellen mit Mutationen und Tumorzellen ohne Mutationen Da diese somatischen Mutationen m glicherweise nicht gleichm ig im Tumor verteilt sind kann die aus versc
35. gt werden einschlie lich Mutationen in Exon 2 3 amp 4 des NRAS Gens Ergebnisse mit dem SURVEYOR Scan NRAS Kit Exon 2 3 amp 4 CE IVD d rfen nicht als die einzige Methode zur Entscheidungsfindung einer Behandlung von Patienten mit kolorektalem Karzinom herangezogen werden Es ist wichtig darauf hinzuweisen dass der Gebrauch desDHPLC um mit diesem Kit Proben mit positivem Testergebnis f r eine NRAS Mutation zu identifizieren nur als Richtlinie verwendet und alle Mutationen m ssen durch weitere Analyse wie zum Beispiel durch eine DNA Sequenzierung best tigt werden m mmm ooo Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE IVD f r DHPLC Seite 3 3 Testprinzip des SURVEYOR Scan NRAS Mutation Detection Assay 3 Testprinzip des SURVEYOR Scan NRAS Mutation Detection Assay 3 1 KRAS und NRAS Auf den Epidermal Growth Factor Receptor EGFR gerichtete therapeutische Wirkstoffe haben sich bei kolorektalem Karzinom als wirksam erwiesen Die Forschung hat gezeigt dass rund 40 der kolorektalen Tumoren somatische KRAS Genmutationen tragen und klinische Studien haben bewiesen dass Mutationen in KRAS Exon 2 Codon 12 und 13 mangelndes klinisches Ansprechen auf Anti EGFR Therapien voraussagen Neueste explorative Studien haben gezeigt dass die Patientenpopulation weiter differenziert werden kann da Patienten deren mCRC Tumoren eine zus tzliche Mutation in KRAS Exon 3 und 4 oder NRAS Exon 2 3 und 4 bergen
36. hiedenen Bereichen desselben Tumors resultierende Mutationsanalyse unterschiedlich ausfallen Um die Wahrscheinlichkeit f r einen Mutationsnachweis zu erh hen sollte die DNA aus der Tumorregion des Gewebes isoliert werden indem nur der Tumorbereich von dem Glasobjekttrager abgeschabt wird Dazu f r jeden neuen Objekttr ger ein frisches steriles Skalpell verwenden F r eine erfolgreiche Verwendung dieses Kits sollte die entnommene DNA den Kriterien entsprechen die in den berlegungen zu den Matrizen aufgelistet sind ANMERKUNG Entnommene DNA Proben die mit diesem Kit nicht sofort analysiert werden m ssen bei 20 C bis 80 C eingefroren aufbewahrt werden 11 Testverfahren 11 1 Somatischer Mutationsnachweis mit SURVEYOR Scan Kits Ein Uberblick Nachweis und Bestatigung einer Mutation mit der SURVEYOR Nuclease umfasst drei Schritte SURVEYOR Scan Vorbereitung zum Screening in drei einfachen Arbeitsschritten Schritt 1 Mit PCR Proben DNA amplifizieren Schritt 2 SURVEYOR Nuclease Spaltung Schritt 3 Fragmentanalyse nach Gr e mit DHPLC Schritt 1 Vorbereiten der PCR Amplikons aus mutanter Test und normaler Referenz DNA Anschlie end an den letzten PCR Amplifikationszyklus wird zum Schmelzen s mtlicher Doppelstrange das PCR Produkt erhitzt und dann zur optimalen Bildung von Hetero und Homoduplices langsam abgek hlt Heteroduplices kommen vor wenn ein Strang einer Wild Type Sequenz mit einem Strang einer
37. hnet werden k nnen Achtung Im Handel erh ltliche PCR Puffer unterscheiden sich stark in der Zusammensetzung und h ufig ist die Zubereitung vom Hersteller nicht genau gekennzeichnet Mehrere Puffer sind aufgrund von pH oder Zusatzstoffen Tensiden oder anderen herstellereigenen Inhaltsstoffen mit der SURVEYOR Nuclease NICHT kompatibel Verwenden Sie KEINE andere als die im Kit enthaltenen Polymerase oder 10X Polymerase Puffer Anhang B Problem 4 Hohes Hintergrundrauschen nach SURVEYOR Nuclease Behandlung MOGLICHE HOHES HINTERGRUNDRAUSCHEN URSACHE LOSUNG Nicht optimaler F hren Sie folgende Hybridisierungsschritt Schritte durch 1 Vergewissern Sie sich dass sich die DNA Konzentration im Bereich gt 25 ng uL befindet 2 Wiederholen Sie den Schritt Heteroduplex Bildung achten Sie dabei darauf das t t empfohlene Verfahren Probe mit einzuhalten siehe DHPLC verrauschter DHPLC 12 7 1 Durchfluss Basislinie Wash DNA Menge zu Uberpr fen Sie die niedrig Ergiebigkeit und Qualit t der DNA Matrize Nicht spezifische berpr fen Sie die PCR Produkte Ergiebigkeit und Qualit t der DNA Matrize SURVEYOR berpr fen Sie das Enhancer W2 Ablaufdatum des Kits und oder SURVEYOR Enhancer Cofactor wurden deaktiviert Anmerkung Die SURVEYOR Nuclease schneidet gelegentlich bei doppelstrangigen DNAs an zuf llig ausgew hlten Gen Orten ein Dies erzeugt nach dem Verdau ein Hintergrundrauschen Diese
38. iesem Kit 5 Wild Type nachweisbar ist mit Spuren die mit 5 mutanter DNA identisch sind Anmerkung F r diesen Test ausschlie lich die mit diesem Kit mitgelieferte DNA Polymerase verwenden Anmerkung Befolgen Sie bitte die spezifischen Anleitungen im Bedienungshandbuch Ihres DHPLC Systems Um dieses Kit erfolgreich einzusetzen wird dringend angeraten diese Bedienungsanleitung sorgf ltig durchzulesen und alle darin gegebenen Anleitungen und Richtlinien genau zu befolgen Personen die diesen Test zum ersten Mal durchf hren sollten die in Abschnitt Verwendung der Kontrollplasmid DNAs beschriebenen Kontrolluntersuchungen durchf hren Falls Sie weitere Fragen haben oder Hilfe ben tigen rufen Sie 888 233 9283 nur Nordamerika 1 402 452 5400 oder 44 0 141 892 8800 Europa an und fragen Sie nach dem NRAS Support Alternativ k nnen Sie eine E Mail senden an SURVEYORscan Transgenomic com Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE IVD f r DHPLC Seite 5 4 Ruckverfolgbarkeit der Kit Kontrollen 4 Ruckverfolgbarkeit der Kit Kontrollen Die mit diesem Kit mitgelieferten Kontrollen sind Plasmidklone der Sequenzen NRAS Exon 2 3 amp 4 Alle Klone wurden sequenziert um sie durch Vergleich mit der NCBI Reference Sequence auf Sequenztreue zu berpr fen NG_007572 Die Kontrollen haben einen genetischen Stempel Siehe Anhang A 2 Kontroll DNA Stempel diese Variationen von der NRAS W
39. ild Type Sequenz in einem Bereich in dem keine Mutationen erwartet werden k nnen verwendet werden um Probleme mit der Probenkontamination durch Positive Controls zu erkennen Siehe Anhang B Fehlersuche Problem 8 f r ein Beispiel einer SURVEYOR Scan Spur einer solchen Kontamination Der NRAS Control Wild Type wurde durch Synthese und Klonierung von NRAS Exon 2 3 und 4 unter Verwendung der NCBI Reference Sequence oben konstruiert Das NRAS Positive Control Exon 2 wurde durch Synthese von NRAS Exon 2 unter Verwendung der NCBI Reference oben konstruiert enth lt aber die G12D Mutation Durch DNA Sequenzierung wurde best tigt dass die einzige nderung in der Sequenz von Codon 12 in einer G12D GGT gt GAT Alteration vorliegt Dieser Klon wird dann mit NRAS Control Wild Type DNA gemischt um eine heterozygote Mischung zu erhalten Das NRAS Positive Control Exon 3 wurde durch Synthese von NRAS Exon 3 unter Verwendung der NCBI Reference oben konstruiert enth lt aber die Q61K Mutation Durch DNA Sequenzierung wurde best tigt dass die einzige nderung in der Sequenz von Codon 61 in einer Q61K Alteration CAA gt AAA vorliegt Dieser Klon wird dann mit NRAS Control Wild Type DNA gemischt um eine heterozygote Mischung zu erhalten Das NRAS Positive Control Exon 4 wurde durch Synthese von NRAS Exon 4 unter Verwendung der NCBI Reference oben konstruiert enth lt aber die A146T Mutation Durch DNA Sequenzierung wurde best tigt da
40. ist besonders wichtig wenn der Verdau in einem Instrument ohne beheizten Deckel durchgef hrt wird 12 Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 42 C 13 F gen Sie jedem R hrchen bzw jeder Vertiefung 1 0 uL SURVEYOR Stop Solution PN 708030 hinzu leicht vortexen SURVEYOR Nuclease Gesamtreaktionsvolumen betr gt 16 0 uL TIPP Die SURVEYOR Verdauprodukte k nnen bei lt 20 C bis zu einer Woche gelagert werden 14 Laden Sie die Probenverdaus auf das DHPLC System Anmerkung Empfohlene Gradienteneinstellungen f r die Analyse von SURVEYOR Nuclease Verdauprodukte mit dem DHPLC System gehen Sie auf http world Transgenomic com diagnostic tools genetic analysis kits crc rascan kits eu DHPLCsystemsettings SS 7 Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE IVD f r DHPLC Seite 18 13 Kontrollverfahren 13 Kontrollverfahren 13 1 Qualitatskontrolle f r das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exon 2 3 amp 4 CE IVD Zur Qualit tskontrolle bestimmter Schritte des Testverfahrens sind diesem Kit Kontrollplasmid DNAs beigef gt F r das Amplifikationsprotokoll gew hrleisten diese Kontrollen dass der Master Mix korrekt hergestellt wurde und die Amplifikation richtig funktioniert hat No Template Controls wo anstelle der Matrizen DNA Wasser hinzugef gt wird werden ebenfalls empfohlen um eine m gliche Kontamination der Kitkomponenten mit einer DNA Matrize nachzuweisen Bei dem Schritt des SURVEYOR Nucl
41. mutanten Sequenz abk hlt Schritt 2 Behandlung des hybridisierten Heteroduplex Homoduplex Gemischs mit SURVEYOR Nuclease SURVEYOR Nuclease schneidet beide Str nge der Hetereroduplex DNA und l sst DNA Fragmente entstehen Die gleichbehandelte Control Wild Type DNA dient als Hintergrundkontrolle Schritt 3 Analyse der DNA Fragmente mit dem DHPLC System Die Bildung neuer Spaltprodukte aufgrund von einem bzw mehreren Mismatch wird durch zus tzliche chromatografische Peaks angezeigt Die Retentionszeit der Spaltprodukte weist auf die Gr e der Fragmente und daher den ungef hren Ort des der Mismatches hin 12 Schritt f r Schritt Anleitung 12 1 DHPLC Grundeinstellung Kalibration Wenn Sie die SURVEYOR Nuclease Platte zur Analyse mit dem DHPLC einstellen schlagen Sie bitte im Anhang A 3 HPLC DHPLC Systemanforderungen f r die Denaturierung 12 2 berlegungen vor Beginn der NRAS Probenanalyse Bevor Sie Proben auf einem DHPLC System laufen lassen muss ein geeigneter DNA Gr enstandard getestet werden um zu gew hrleisten dass das System einwandfrei funktioniert Das Laborpersonal das mit dem Instrument arbeitet sollte vor Durchf hrung der Analyse die Qualit t des DNA Gr enstandards pr fen 12 3 Uberlegungen zu den Matrizen 1 Verwenden Sie f r die FFPE isolierte Matrizen DNA die blichen Labortechniken um die Qualit t und Quantit t der extrahierten DNA zu bewerten und um zu gew hrleisten dass f r die
42. n 2 22 EENS EES NEEN 18 13 1 Qualit tskontrolle f r das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exon 2 3 amp 4 EEN een dee 19 13 2 Verwendung von Kontrollolasrmid DNA 19 14 Interpretation der Ergebnisse unneunnssnnnnnnnennnnnnennnnnnnennnnnnnennnnannennnnanneennnannennnnenneennnenneennnennne 20 14 1 Analyse von NRAS Exons 2 3 amp 4 mit SURVEYOR Nuclease ceccccescecececesssssececeeececsesnsaeseeeeeseeseeaeeeeees 20 14 2 Datenpr fung der SURVEYOR Scan Ergebnisse 20 14 3 BEISPIGIEFEEDINISSC breer ddseevanstedien suede che Erde enter deg ect SEET e ege eC E 21 15 Leistungsmerkmale nosiai K AE aa EEE E E ANEA 24 15 1 Nachweisgrenze von Mutationen mit SURVEYOR Scan Kits 0 cccccccccecessssseseceeecessesssaeeeeeeessessaeeeeees 24 15 2 E EBI E E TT 24 15 3 VerfahrenSbeSchrankUnBeMsrcencnercescevencceecnervesenan aE e e e i E EE ara Eai EE REE EEE 24 Te BE 26 A 1 Plattenlayout f r SURVEYOR Scan Kits isinaka aisanana akanai 26 A 2 Kontroll DNA Stem pe leicne ea a a a e AEE aE EE Ea EE E A EEE EEE NENE Eai Eiet 26 A 3 HPLC DHPLC Systemanforderungen f r die Denaturierung ccceccccccsssccceesececsesceceessseceeaeeecessaeeees 27 AA Laborbedingungen f r DCH Tests 28 ALS Literaturmachwels cccasicccesseoddiseciesssensiodeaeniveeetacecd EEN SEENEN EEN OETA A ONEN O EEEE EEEa KOREAR AR 29 Anhang RER em eee ee iS A 30 Fehlersuche araa aa a aeae a eaaa a aa aaa are aia iaaa e aaa a e e aae NE 30 Einzelheiten zur Be
43. n SURVEYOR Enhancer Cofactor auf Eis auf Geben Sie 10 0 uL von allen oben genannten PCR amplifizierten Proben in ein neues 0 2 mL PCR ReaktionsgefaB oder in die Vertiefung einer 96 Loch Mikrotiterplatte Bereiten Sie frisch eine Mischung aus 0 15 M MgCl SURVEYOR Enhancer Cofactor SURVEYOR Enhancer W2 und SURVEYOR Nuclease W SURVEYOR Nuclease Reaktionsgemisch zu Bereiten Sie den SURVEYOR Nuclease Digest Master Mix f r die Analyse mehrerer Proben anhand der folgenden Tabelle vor Das Beispiel unten zeigt die Volumina f r ein 10 Proben Master Mix Ber cksichtigen Sie dass etwas mehr Master Mix als in dieser Berechnung angezeigt ben tigt wird um Verluste w hrend des Pipettierens auszugleichen Anzahl der SURVEYOR Nuclease Verdaureaktionen 10 Volumenberechnung 0 15 M MgCl Solution uL 10 0 SURVEYOR Enhancer Cofactor uL 10 0 SURVEYOR Enhancer W2 uL 10 0 SURVEYOR Nuclease W uL 20 0 Master Mix Gesamtvolumen 50 0 F gen Sie je 5 yL SURVEYOR Nuclease Master Mix den einzelnen PCR amplifizierten Proben hinzu uL 10 0 Gesamtvolumen SURVEYOR Nuclease 15 0 Verdaureaktion 2 a Vor dem Gebrauch jedes Reagenz zentrifugieren b Vor dem Pipettieren jedes Reagenz leicht vortexen Zentrifugieren Sie nach jedem Vortexschritt 10 Sekunden leicht an Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE IVD f r DHPLC Seite 17 12 Schritt f r Schritt Anleitung c F gen Sie
44. nation von Proben oder Kontrollen zu vermeiden Ein Beispiel einer idealen Laboreinrichtung finden Sie im Anhang A 4 Laboreinrichtung f r PCR Tests 3 2 Analyse von Patientenproben mit den SURVEYOR Scan Kits Das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exon 2 3 amp 4 CE IVD darf nur zusammen mit einem der unten genannten Arbeitsabl ufen verwendet werden Arbeitsablauf B Arbeitsablauf A Patientenprobe Patientenprobe Ergebnis A Test KRAS Exon2 gt KRAS Codon 12 A oder 13 Mutation Test KRAS Exons 2 3 amp 4 und NRAS Exons 2 3 amp 4 Ergebnis Ergebnis KRAS Codon 12 ausgeben oder 13 Wild Type A Test KRAS Exons3 amp 4 _ Ergebnis und NRAS Exons 2 3 amp 4 ausgeben Abbildung 1 SURVEYOR Scan Mutation Detection Kit Arbeitsablaufe fur das Screening auf KRAS und NRAS Ergebnis ausgeben 3 Testprinzip des SURVEYOR Scan NRAS Mutation Detection Assay Als Vorschlag wie 96 Loch Mikrotiterplatte f r die Analyse von KRAS und NRAS Exon 2 4 anzulegen ist siehe Anhang A 1 Plattenlayout f r SURVEYOR Scan Kits 3 3 SURVEYOR Nuclease Die SURVEYOR Nuclease von Transgenomic ist eine mismatch spezifische Pflanzen DNA Endonuclease die die Heteroduplex DNA auf bekannte und unbekannte Mutationen und Polymorphismen durchsuchen kann Das Enzym schneidet mit hoher Spezifit t einen DNA Doppelstrang an Stellen wo durch einen Basenaustausch oder andere Sequenzver nderungen Basen nicht miteinander paaren k nnen Diese D
45. nd Reverse PCR Primer PN 710452F R 710453F R und 710454F R werden bei 10 uM geliefert 3 Nehmen Sie die 10 uM Primer 10 mM dNTPs und den DNA Polymerase 10X PCR Buffer PN 703315 aus dem Gefrierschrank und lassen alles auf Eis auftauen 4 Nach dem Auftauen Geben Sie alle Kit Komponenten in den Vortexer 10 Sekunden um sorgf ltig zu mischen zentrifugieren Sie kurz an 10 Sekunden um zu gew hrleisten dass keine Fl ssigkeit auf den Beh lterdeckeln bleibt und legen Sie sie auf Eis Bereiten Sie auf Eis die jeweiligen Master Mix vor Richten Sie sich bei der Zubereitung eines Master Mix f r jede NRAS Exon 2 NRAS Exon 3 und NRAS Exon 4 Reaktion nach folgender Tabelle Anzahl der Reaktionen 10 Volumenberechnung Volumen Wasser uL 330 DNA Polymerase 10X PCR Buffer uL 50 dNTPs uL 40 NRAS Primer Exon 2 3 oder 4 Forward uL 25 NRAS Primer Exon 2 3 oder 4 Reverse uL 25 DNA Polymerase uL 10 Master Mix Gesamtvolumen 48 0 Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE IVD f r DHPLC Seite 14 12 Schritt f r Schritt Anleitung Anmerkung Der Anwender sollte auf ein Minimum von 25 ng DNA je 50 uL Reaktion abzielen Erh hen Sie f r extrahierte DNA Konzentrationen mit weniger als 12 5 ng uL proportional das Volumen extrahierter DNA um je Reaktion 25 ng zu erhalten Reduzieren Sie auch um dieselbe Menge den Wasseranteil in dem jeweiligen Master Mix um je Reaktion 50 u
46. nserie erh ht sich auch die Anzahl der Proben die insgesamt mit einem Kit getestet werden k nnen wodurch sich die Reagenzienkosten je Probe im Durchschnitt reduzieren Die Tabelle unten dient als Orientierung daf r wie viel Proben mit einem einzigen Kit getestet werden k nnen Ein gesch tzter Wert f r voraussichtliche Verluste durch Pipettieren wird mit einbezogen 5 Komponenten oe Anz Kontrollreaktionens Anz erforderl ann ee Anz Proben Amplikons Reaktionen Sen g WE Zugabe Pipettierverlust ro Lauf SEN Picar serie 9 p p pro Kit pro Kit 1 9 3 12 8 8 2 9 6 15 6 12 3 9 9 18 5 15 4 9 12 21 4 16 5 9 15 24 4 20 5 2 DNA Sequenzierung Universal Sequencing Primer PNs 710153F und 710153R werden f r de DNA Sequenzierung aller getesteten Proben geliefert Die vor dem SURVEYOR Nuclease Verdau erzeugten PCR Amplikons sollten f r die Sequenzierung verwendet werden 6 Zus tzlich erforderliche Ausr stung und Reagenzien Folgende Komponenten bzw Ausr stungen sind f r die Verwendung des SURVEYOR Scan NRAS Kit Exon 2 3 amp 4 CE IVD mit dem DHPLC zus tzlich erforderlich DHPLC System S ulen Puffer DNA Gr enstandard siehe Anhang A 3 1 DHPLC Spezifikationen f r SURVEYOR SCAN Anwendungen f r Merkmale eines geeigneten DHPLC System zur Verwendung mit diesem Kit Hochreines Wasser f r die Molekularbiologie 0 2 mL PCR Reaktionsgef e Streifen oder 96 Loch Mikrotiterplatte Mikropipetten Pipettenspitzen
47. och reinem Wasser f r die Molekularbiologie hinzu 11 F gen Sie den Master Mix R hrchen die erforderliche Menge DNA Polymerase 10X PCR Buffer hinzu 12 F gen Sie den Master Mix R hrchen das erforderliche Volumen an 10 mM dNTPs hinzu 13 F gen Sie den jeweiligen Master Mix R hrchen das erforderliche Volumen der NRAS Forward Primer hinzu 14 F gen Sie den jeweiligen Master Mix R hrchen das erforderliche Volumen der NRAS Reverse Primer hinzu 15 Nehmen Sie die DNA Polymerase PN 703310 aus dem Gefrierschrank 16 Zentrifugieren Sie die DNA Polymerase f r 10 Sekunden 17 Mischen Sie die DNA Polymerase f r 10 Sekunden mit dem Vortexer 18 F gen Sie den Master Mix R hrchen das erforderliche Volumen DNA Polymerase hinzu 19 Verschlie en Sie die Master Mix Zentrifugenr hrchen 20 Mischen Sie vor Gebrauch die Zentrifugenr hrchen mit dem Master Mix mit dem Vortexer 30 Sekunden und zentrifugieren sie dann kurz an 10 Sekunden 21 Lagern Sie es bis zum Gebrauch auf Eis 22 Pipettieren Sie 48 0 uL siehe Anmerkung oben in Schritt 6 Master Mix in die entsprechenden Vertiefungen Wechseln Sie bei Verwendung einer Einkanalpipette jedes Mal die Spitze Wenn Sie eine Dispenserpipette verwenden achten Sie darauf dass von Vertiefung zu Vertiefung nichts verspritzt wird Halten Sie die Platte auf Eis 23 F gen Sie in die entsprechenden Vertiefungen 2 0 uL siehe Anmerkung oben in Schritt 6 der Probenmatrizen DNAs oder Wa
48. plifiziert werden soll darf nicht mit UV Strahlung behandelt werden Zur Reduzierung von Kontamination vorschriftsm ige Schutzkleidung tragen h ufig Handschuhe wechseln und bevor man sich zum Arbeitsbereich begibt die behandschuhten H nde mit 10 v v Bleiche abwischen Die Einrichtung sollte zumindest der Zweiraumaufteilung in dem Diagramm unten entsprechen die speziell f r PCR und Analysen mit der SURVEYOR Nuclease entwickelt wurde Empfohlene Organisation eines PCR Labors SURVEYOR Scan Analyse plattform PCR Arbeits PCR platz mit 20 C Arbeits 80 C HEPA i e 8 platz mit Gefrier Leichter Tue Gefrier Leichter an schank Luft berdruck UV Licht sehank Luftunterdruck etter und UV Licht 20 C h N Thermo Gefrier Micro euer Micro schank 2 Unterbauk hlschr nke zentrifuge y zentrifuge mit4 2C PCR Arbeitsplatz en N Thermo mit HEPA Filter zentrifuge zentrifuge cycler i f r Mikro phorese Gelelektro i f r Mikro und Uyilieht titerplatten phoresen titerplatten Labor f r PCR Extraktion__ ds sg Probendurchlauf f r PCR und Post PCR Labor und Amplifikation SURVEYOR Scan Analyse ee BEER Eger er EI EEE EEE EEE BE EEE ER EEE a c Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE IVD f r DHPLC Seite 28 Anhang A A 5 Literaturnachweis 1 Amgen News Release 2013 New analyses identify predictive biomarkers for Vectibix panitumumab in patients with metast
49. r positive Ergebnisse mit dem SURVEYOR Scan das Sequenzierungsergebnis das endg ltige Ergebnis darstellt da es in derselben Fragmentgr e weitere nicht relevante Mutationen geben kann Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE IVD f r DHPLC Seite 23 15 Leistungsmerkmale 15 Leistungsmerkmale 15 1 Nachweisgrenze von Mutationen mit SURVEYOR Scan Kits Die Validierung der SURVEYOR Scan Kits f r DHPLC Plattformen mit Plasmidklonen aller angezeigten Mutationen hat gezeigt dass SURVEYOR Nuclease Peaks in einer Mischung von 2 5 Mutant vor einem Wild Type Hintergrund nachgewiesen werden k nnen Der automatischen Sequenzierungszuordnung der Vorw rts und auch R ckw rtsstr nge gelingt es h ufig nicht Mutationen mit Werten unter 10 in Gemischen mit Wild Type DNA zu erfassen Zusammen mit den SURVEYOR Nuclease Ergebnissen ist es m glich die 5 10 mutanten Sequenzierungselektropherogramme mit mehr Sicherheit zu interpretieren Wenn eine Probenanalyse ein positives SURVEYOR Scan Ergebnis zeigt aber mit der DNA Sequenzierung keine KRAS oder NRAS Mutation detektiert wird empfehlen wir dass Keine Variante erfasst als Ergebnis angegeben wird F r weitere Einzelheiten siehe berlegungen zum Arbeitsablauf 15 2 Sequenzbest tigung F r alle SURVEYOR Scan positiven Ergebnisse mit der Sequenzbest tigung fortfahren um die Sequenzidentit t der NRAS Exon 2 3 oder 4 Mutationen zu bestimmen B
50. scht Codon 12 und 13 sind unten ebenfalls markiert ccatgtggttettgetggtgtgaaATGACTGAGTACAAACTGGTGGTGGTTGGAGCH BE ST T NRAS Exon 3 Stempel Amplikongr e 203 bp F r die Herstellung des genetischen Stempels des NRAS Exon 3 Kontrollplasmids wird GAC gegen CTG ausgetauscht Codon 59 und 61 sind unten ebenfalls markiert ACAG EiccaGMAGAAGAGTACAGTGCCATGAGACTGCAA NRAS Exon 4 Stempel Amplikongr e 233 bp F r die Herstellung des genetischen Stempels des NRAS Exon 4 Kontrollplasmids wird CAAC gegen GTT ausgetauscht Codon 117 und 146 sind unten ebenfalls markiert AACHMIBT GTGATTTGCCAACAAGGACAGTTGATACAAAAGTTGCCCACGAACTGGCCAAGAGTTACGGG ATTCCATTCATTGAAACCTCAMBAAG Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE IVD f r DHPLC Seite 26 Anhang A A3 HPLC DHPLC Systemanforderungen f r die Denaturierung A 3 1 DHPLC Spezifikationen fur SURVEYOR Scan Anwendungen Die folgenden Spezifikationen stellen die Mindestanforderungen f r die DHPLC Systemspezifikationen f r die Durchf hrung der Tests mit dem SURVEYOR Scan KRAS amp NRAS Kit dar Abgabesystem f r Hochleistungsl sungsmittelgradienten e Binare Gradientenkapazit t Hochdruck oder Niederdruck e Durchflussregulierung Mindestbereich 0 7 1 6 mL min e Durchflussgenauigkeit 2 H2O bei 20 C e L sungsmittelentgaser Auto Sampler e Temperaturregulierung zum Abk hlen der Platten einstellbar 4 bis 14 C e Injektionsvolumen 5 50
51. spaltenes DNA Gr Benstandard 233 bp Durchfluss Amplikon DHPLC S ule sp len A146T ergibt Fragmente von 68 und 165 bp IN NRAS Control Wild Type NRAS Control Exon 4 Probe 1 NRAS Exon 4 A146T ergibt Probe 2 NRAS Exon 4 s00 Fragmente von 68 DNA Gr enstandard und 165 bp Ungespaltenes 233 bp Amplikon Abbildung 6A und 6B WAVE DHPLC Analyse mit UV Abbildung 6A und Fluoreszenz Abbildung 6B Nachweis von SURVEYOR Nuclease Verdauprodukten NRAS Positive Control Exon 4 Wild Type Controls und CRC DNA isoliert aus FFPE Schnitten Bei der Sichtpr fung der Chromatogramme sollten die verdauten Proben mit der NRAS Control Wild Type gr ne Linie verglichen werden Die NRAS Positive Control Exon 4 blaue Linie ist eine Mischung aus Wild Type und mutanten A146T Plasmiden die in Verdauungspeaks zu 68 und 165 bp resultieren diese Kontrolle weist darauf hin dass der SURVEYOR Nuclease Verdauungsschritt funktioniert und gibt auf dem Chromatogramm die Region zur Sichtpr fung an mit der bestimmt werden sollte ob eine Probe zur DNA Sequenzanalyse geschickt werden sollte Beim Vergleich der Verdauungsmuster der Proben 1 und 2 mit dem Wild Type verdauten Elektropherogramm ist es offensichtlich dass Proben 1 und 2 rot und schwarze Linie hnliche Chromatogramme wie f r die NRAS Control Wild Type zeigen und nicht zur DNA Sequenzanalyse eingeschickt werden m ssen Bitte beachten dass f
52. ss die einzige nderung in der Sequenz von Codon 146 in einer A146T Alteration GCC gt ACC vorliegt Dieser Klon wird dann mit NRAS Control Wild Type DNA gemischt um eine heterozygote Mischung zu erhalten 5 Komponenten 5 Komponenten Das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exon 2 3 amp 4 CE IVD besteht aus 1 einer SURVEYOR Box mit Verdau Komponenten mit 10 ReagenzgefaBen ohne leere L cher und 2 einer u eren Halterung f r PCR Komponenten und Kontrollr hrchen mit 13 Reagenzgef en und 7 leeren L chern Kit f r 100 Katalog ReaktionsgefaB A Kit Komponente Testreaktionen nummer Deckelfarbe gelieferte Menge SURVEYOR Box mit Verdau Komponenten 710160 SURVEYOR Nuclease W Violett 2x 105 uL 710161 SURVEYOR Enhancer W2 Schwarz 105 uL 708049 SURVEYOR Enhancer Cofactor Rosa 105 uL 708027 0 15 M MgCl Solution Braun 105 uL 708030 SURVEYOR Stop Solution Rot 250 uL 710153F Universal Sequencing Primer 1 10 uM Orange 2x 125 uL 710153R Universal Sequencing Primer 2 10 uM Orange 2x 125 uL PCR Box mit Komponenten und Kontrollen 703310 DNA Polymerase Rot 100 uL 703315 DNA Polymerase 10X PCR Buffer Durchsichtig 1 mL 703065 dNTPs 10 mM Durchsichtig 500 uL 710452F NRAS Primer Exon 2 Forward 10 uM 710452R NRAS Primer Exon 2 Reverse 10 uM Blau 90 uL Blau 90 uL 710453F NRAS Primer Exon 3 Forward 10 uM Blau 90 uL 710453R NRAS Primer Exon 3 Reverse 10 uM Blau 90 uL 710454F NRAS Primer Exon 4 Forward 10 uM Blau 90
53. sser No Template Control NTC hinzu Verwenden Sie Pipettenspitzen f r jede Probe und vermeiden Sie die Kreuzkontamination durch Verspritzen Verschlie en Sie die Vertiefungen mit den Proben DNAs und dem NTC mit Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE IVD f r DHPLC Seite 15 24 25 26 12 Schritt f r Schritt Anleitung dem 8 Verschlussstreifen bei Verwendung einer 96 Loch Mikrotiterplatte bzw die 0 2 mL PCR Reaktionsgef e mit ihren Deckeln Vergewissern Sie sich dass die Deckel fest verschlossen sind ffnen Sie erst jetzt die R hrchen mit den Kontrollmatrizen DNAs PNs 710131 710135 710136 710137 710138 und zwar eines nach dem anderen Pipettieren Sie diese Kontrollmatrizen zuletzt um das Risiko einer Kontamination der Proben DNA zu verringern Verschlie en Sie jede Vertiefung wieder mit den 8 Verschluss Streifen wenn Sie eine 96 Loch Mikrotiterplatte verwenden bzw schlie en die 0 2 mL PCR Reaktionsgef e mit dem Deckel Vergewissern Sie sich dass die Deckel fest verschlossen sind ANMERKUNG Zur guten Laborpraxis geh rt die No Template Controls NTC in Vertiefungen zu geben die nicht an Positive Controls oder Proben angrenzen ANMERKUNG Als Vorschlag wie 96 Loch Mikrotiterplatte f r die Analyse von KRAS und NRAS Exon 2 4 anzulegen ist siehe Anhang A 1 Plattenlayout f r SURVEYOR Scan Kits Vortexen Sie 1 2 Geschwindigkeit 10 Sekunden lang Zentrifugi
54. stellung cessecceseseeeceseeeeeeeeeeeeseseeneeseseeneeseseeneeseseeneeseseeneeseseeneesaseeneeseseenenes 37 Kkoptaktdaten euzesrgteegEgeACERSEEER EEEHEEEEEOFEREEEEEEFEFREEHLEREEENEENEEEEEREEREEEEEFEFSEEREEREETEFENEEEEEEEEHEEREEEREREEEBEERRER 37 bersetzung Verzicht eegent 37 Lizenzen Handelsmarken amp Copyright rr220s4400004000nnnannnnnannnnnannnnnnnnnannnnnannnnnnnnnnnnnnnnnnnnnann 38 1 Hersteller 1 Hersteller Transgenomic Inc all 12325 Emmet Street Omaha NE 68164 USA Tel 1 402 452 5400 Vertreter in der Transgenomic Limited EU 40 Watt Road Hillington Park Glasgow G52 4RY UK Tel 44 141 892 8800 2 SURVEYOR Scan NRAS Kit Exon 2 3 amp 4 CE IVD 2 1 Verwendungszweck Anwendung nur durch Fachpersonal Transgenomics SURVEYOR Scan NRAS Kit Exon 2 3 amp 4 CE IVD ist ein In vitro Diagnostikum das die somatischen Mutationen in Exon 2 3 amp 4 des NRAS Gens nachweist Diese Mutationen werden durch SURVEYOR Nuclease Zellteilungs Spitzenwerte angezeigt und enthalten jene Mutationen mit bekanntem Potenzial f r klinische Bedeutung Dieses Kit ist f r den Gebrauch in einem Labor f r klinische Diagnostik durch entsprechend ausgebildetes Fachpersonal vorgesehen Getestet wird DNA die aus formalinfixiertem und in Paraffin eingebettetem Gewebe extrahiert wird Hersteller Dieses Kit Katalognummer 710400 wird in einem Karton geliefert der die nachstehend aufgef hrten Kompon
55. ten aufgef hrten Arbeitsablauf folgen Gewebe ae gt Isolation K2 Gel Elektrophorese Sequenzbestatigung EE amp PCR l 1 t Bewertung starke schwache PCR I i SURVEYOR K Scan ge SURVEYOR Nuclease amp 5 fehlgeschlagen DHPLC Analyse i x I SURVEYOR Scan SURVEYOR Scan Positiv Negativ I I i NVD I I I I I I I I I 3 Sequenzqualit t Sequenzqualit t bw nicht ausreichend ausreichend Un Mutationen in codons NVD G12 G13 A59 Q61 K117 oder A146 Abbildung 3 Arbeitsablauf der SURVEYOR Scan NRAS Kit Analyse 12 Schritt f r Schritt Anleitung Anmerkungen zu Abbildung 3 1 2 3 Isolieren Sie die DNA von FFPE und verwenden Sie dazu Standardlabortechniken F hren Sie die PCR durch und pr fen Sie die DNA Qualitat durch Gelelektrophorese Dokumentieren Sie ob die Bande stark 220 ng uL oder schwach lt 20 ng uL ist Bereiten Sie aus FFPE frische genomische DNA vor wenn mehrere PCR Banden vorliegen 4 Bei Proben die nach der PCR Amplifizierung als starke PCR oder schwache PCR bewertet wurden kann die Behandlung mit SURVEYOR Nuclease und Analyse mit dem DHPLC System angeschlossen werden Beachten Sie dass mit einer schwachen PCR Zuordnung unzureichende DNA f r das Erzielen aussagef higer Ergebnisse mit DHPLC aber genug DNA f r
56. uL Trennkartusche e Entwickelt f r die Gr entrennung von dsDNA Fragmenten Fragmentgr e 50 bp bis 250 bp S ulenofen mit hoch pr ziser Temperaturregelung e Temperaturbereich 40 bis 70 C e Temperaturgenauigkeit 0 2 C e Temperaturreproduzierbarkeit 0 2 C e Linearitat ber vollst ndigen Temperaturbereich 2 0 C Alternative Nachweismethode 1 e UV VIS Detektor e Wellenlangenbereich 190 700 nm e UV Quelle Deuteriumlampe Alternative Nachweismethode 2 e Fluoreszenz Detektor e Wellenlangenbereich Anregung 200 850 nm Emission 250 900 nm e Fluoreszenzquelle 150 Xenonlampe e Pumpe f r Fluoreszenzfarbstoff e Feste Durchflussrate bei 0 1 mL min 20 50 e Pulsationsarmer Durchfluss A 3 2 Systembetrieb Zu Installation und Betrieb des DHPLC Systems richten Sie sich nach den Empfehlungen des Herstellers zur Analyse von dsDNA Fragmenten in der Gr enordnung von 50 bp bis 250 bp mit einer Zielaufl sung von mindestens 10 bp Dies ist der Gr enbereich f r Fragmente nach SURVEYOR Nuclease Verdau mit diesem Kit F r Hinweise zu empfohlenen Gradienteneinstellungen f r die Analyse von SURVEYOR Nuclease Verdauprodukten mit dem DHPLC System gehen Sie auf http world Transgenomic com diagnostic tools genetic analysis kits crc rascan kits eu DHPLCsystemsettings A 3 3 Wartung der DHPLC Kartuschen F r die Wartung der DHPLC Kartuschen befolgen Sie die Empfehlungen des Herstellers Anmerkung
57. uL 710454R NRAS Primer Exon 4 Reverse 10 uM Blau 90 uL 710441 NRAS Control Wild Type Mix Gelb 120 uL 710442 NRAS Positive Control Exon 2 Gr n 40 uL 710443 NRAS Positive Control Exon 3 Gr n 40 uL 710444 NRAS Positive Control Exon 4 Gr n 40 uL 482296 Bedienungsanleitung Download von der Webseite http world Transgenomic com files literature 482296 DE pdf 5 1 Anzahl der Proben die mit dem Kit getestet werden konnen Das SURVEYOR Scan NRAS Kit Exon 2 3 amp 4 CE IVD k nnen 100 Reaktionen getestet werden Die Gesamtprobenanzahl h ngt von der Gr e der jeweiligen durchschnittlichen Seriengr en zu testender Proben ab da mit jeder Probenserie jeweils ein Satz Kontrollreaktionen Wild Type Controls Positive Controls und No Template Controls auf jeder Mikrotiterplatte mitgef hrt werden muss In der nachstehenden Tabelle ist die Anzahl Proben aufgef hrt die mit dem NRAS Kit je nach durchschnittlicher Gr e der Probenserie getestet werden k nnen Die Berechnung beruht auf der Basis dass a jede Serie 9 Kontrollen 3x Wild Type 3x Positive Controls 3x No Template Controls ben tigt und b jedes Kit f r 100 Reaktionen ausgelegt ist Anmerkung Wenn mehrere Platten laufen sollen muss auf jeder einzelnen Platte ein Satz der 9 oben angegebenen Kontrollen mitgef hrt werden Daher ben tigen zwei Platten insgesamt 18 Kontrollreaktionen 3 Platten ben tigen 27 Kontrollreaktionen usw Mit Ansteigen der Gr e der Probe
58. ung 4 6 Wenn entweder die PCR Amplikons oder die aus den Kontroll DNAs stammenden SURVEYOR Nuclease Spaltfragmente nicht den dargestellten Ergebnissen entsprechen sehen Sie im Anhang B Fehlersuche nach oder wenden Sie sich an den technischen Kundendienst von Transgenomic bevor Sie weitere Schritte der Probenanalyse durchf hren Die Beispiele unten dienen nur zu Darstellungszwecken und d rfen NICHT verwendet werden um die Identit t einer gegebenen Mutation festzulegen Die Best tigung der Identit t einer Mutation ist erforderlich um eindeutig die Pr senz einer spezifischen Basen nderung in Exon 2 3 oder 4 des NRAS Gens zu bestimmen SURVEYOR Nuclease spaltet an allen Mismatches die sich aus der Heteroduplex Bildung von Wild Type und mutanten DNAs ergeben nicht nur Mutationen in Exon 2 3 oder 4 Die SURVEYOR Nuclease best tigt dass ein Mismatch vorhanden ist Die mutationsspezifische Identit t der Basen nderung ist zur Bestimmung des NRAS Aktivierungsstatus erforderlich und muss durch eine andere Methode z B Sequenzierung best tigt werden 14 2 Datenpr fung der SURVEYOR Scan Ergebnisse berpr fen Sie die Chromatogramme und vergleichen die von Wild Type und Positive Controls mit denen der Probe Bestimmen Sie ob das Chromatogramm der Probe mit dem Wild Type Muster bereinstimmt oder differiert Wenn es sich unterscheidet dann sollte die Probe als SURVEYOR Scan positiv bewertet und zur DNA Sequenzanalyse geschickt
59. werden Siehe Beispiele in Abbildung 4 6 sowie Anhang B Fehlersuche Probleme 7 amp 8 f r Beispiele solcher Proben Jede Proben mit einem SURVEYOR Nuclease Muster dass sich von dem des Wild Type unterscheidet sollte f r eine Sequenzbest tigung eingeschickt werden selbst wenn sie nicht mit der Positive Control identisch ist Siehe Anhang B Fehlersuche Problem 7 f r ein Beispiel einer solchen Probe Falls erforderlich zoomen Sie auf den Bildausschnitt und berblenden das Chromatogramm mit der Wild Type Control f r dieses Amplikon Dokumentieren Sie alle Unterschiede zwischen der Wild Type Control und der analysierten Probe Wichtig F r eine sorgf ltige Pr fung jeder Probe sollte der Pr fer kontrollieren ob nebeneinanderliegende Proben in der Analyseplatte identische positive SURVEYOR Scan Ergebnisse ausweisen Das Auftreten identischer positiver Ergebnisse kann das Resultat einer Kreuzkontamination von Probe und Kontrolle sein Die Analyse muss in dem Fall wiederholt werden 14 Interpretation der Ergebnisse 14 3 Beispielergebnisse Beispielergebnisse die mit dem SURVEYOR Scan NRAS Kit Exon 2 3 amp 4 CE IVD f r DHPLC erzielt wurden zeigen die Abbildung 4 6 unten In diesen Beispielen wurde unter Verwendung des WAVE 4500 Systems mit UV als auch Fluoreszenz Detektoren das im Abschnitt Schritt f r Schritt Anleitung dargestellt Verfahren genauestens eingehalten F r Hinweise zu empfohlenen Gradienteneinstellungen f r
60. zgef en geliefert jede mit einer Konzentration von 10 Kopien uL Die f r die PCR Amplifikation ben tigten NRAS Exons 2 3 und 4 Forward und Reverse PCR Primer f r werden getrennt im Kit geliefert Bitte befolgen Sie beim Gebrauch dieser Kontrollen mit der SURVEYOR Nuclease die Anleitungen in Amplifikationsprotokoll SURVEYOR Nuclease Verdau und Analyse von NRAS Exon 2 3 amp 4 ES WIRD PERSONEN DIE DIESEN TEST ERSTMALS AUSFUHREN DRINGEND EMPFOHLEN ZUNACHST TESTS MIT KONTROLLEN DURCHZUFUHREN BEVOR SIE GENOMISCHE PROBEN BEARBEITEN 14 Interpretation der Ergebnisse 14 Interpretation der Ergebnisse 14 1 Analyse von NRAS Exons 2 3 amp 4 mit SURVEYOR Nuclease F hren Sie zu Vergleichs und Kontrollzwecken bei allen Kontrollen Wild Type und Positive Controls einer No Template Control sowie bei den Proben DNAs IMMERden SURVEYOR Nuclease Verdau durch und lassen sie auf derselben Probenplatte auf dem DHPLC System durchlaufen Bei der Phase des SURVEYOR Nuclease Verdau berpr fen die Amplikons dieser Kontrollplasmid DNAs effektiv ob die Bedingungen der Spaltreaktion Herstellung der SURVEYOR Nuclease Mixtur und Inkubationsbedingungen zufriedenstellend waren Bei der Analyse liefert das DHPLC System Spuren dieser verdauten Kontrollamplikons der SURVEYOR Nuclease einen Anhaltspunkt wo die DNA Fragmente aus der Spaltung an diesen spezifischen Mutations Mismatch Stellen auch bei geringer Konzentration eluieren werden siehe Abbild

Download Pdf Manuals

Related Search

Related Contents

平成26年度計画基礎諸元調査等業務 業務仕様書    MULTI DRILL 130  

Copyright © All rights reserved. Failed to retrieve file