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SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit

1. Beachten Sie dass ein positives SURVEYOR SCAN Ergebnis aus der WAVE MceE Viewer Software NICHT die Mutationsidentit t best tigt Probenqualit t nicht standardm ige Durchlaufbedingungen und die Chip Bedingung k nnen die Ergebnisgenauigkeit beeinflussen Zus tzlich gibt es sehr seltene Mutationen in anderen Codons als in 12 und 13 z B in den Codons 11 und 14 die beim SURVEYOR SCAN als positiv bewertet werden k nnen Falls die Sequenz einer KRAS Exon 2 Mutation ben tigt wird ist eine Best tigung aller positiven Resultate durch DNA Sequenzierung oder einer vergleichbaren Methode erforderlich Seite 18 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System SURVEYOR Scan Aufrufverfahren 1 Lassen Sie den KRAS Probensatz auf dem WAVE MCE System laufen und verwenden Sie dazu die unten aufgef hrte 96 N pfchen Anordnung a W hlen Sie in der Kontrollsoftware Probeneingabe gt Neu b W hlen Sie in Probeneingabe Neues Fenster das SURVEYOR_Scan Projekt und klicken Sie auf die OK Taste C Standardm ig wird das KRAS Exon 2 Probenfach Layout in das Proben Eingangsfenster geladen Eine Ladder f r jeden der vier Chips und die Exon 2 Kontrollen wird automatisch bef llt Wenn keines der Chips verwendet wird entfernen Sie die dazugeh rigen Ladder Geben Sie die gew nschten Proben in die verbliebenen ffnungen d Wenn das Probeneingabeformular bef llt ist
2. Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE MCE System CE e Bitte lesen Sie diese Bedienungsanleitung sorgf ltig durch bevor Sie dieses Produkt verwenden Heben Sie diese Bedienungsanleitung f r zuk nftige Informationen auf Transgenomic Advancing Personalized Medicine Diese Seite ist absichtlich leer Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System Inhaltsverzeichnis Hersteller ai eiserne 2 SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE MCE System 2 Verwendungszweck re En RER nl 2 Angaben zum Gebrauch 2 2 2 22222 sl AL rel 2 Testprinzip des SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Assay 22u0022220022nnenennennnnennnnn 3 KRA Siurana ee E N E E T R 3 SURVEYOR NUCCI S O cpe a ee 3 R ckverfolgbarkeit der Kit Kontrollen 200222200000000200000000n0nnnnn nn nnnnnnnn nn nnnnnnnnnnnnnnnnnnn san 5 KIl Komponenten ed 5 Anzahl der Proben die mit dem Kit getestet werden k nnen 222200s220nssennennnennnnnneennnnnnennenn 6 BNAFSEOLENZIELUNG San en 6 Zus tzlich erforderliche Ausr stung und Reagenzien 24uus040ssneonennnnennnnnnn nennen nennen nnennnn nennen 6 ReagenziehVv rbereillinge a Nee len Releaseliste 7 agerine und Hallbarkeil nenne ae Eee 7 Warnhinweise amp V rsichisma nanmena aa 7 Prim re Probene
3. Peaks des SURVEYOR Nuclease Verdaus bei Negativkontrollen Verdauungs Peaks bei Negativkontrollen MOGLICHE LOSUNG URSACHE Kontamination Entsorgen Sie alle Kit von Kit Inhalten Komponenten und mit KRAS benutzen Sie ein neues Amplikonen oder Kit Plasmid Kontaktieren Sie den Kontrollen Technischen Kundendienst von Transgenomic um potenzielle Ursachen und r AON IN Quellen der mn a a a a o Kontamination zu f besprechen Unterer Oberer Marker Ungeschnittener Marker Homoduplex Peak Problem 6 Aufspaltung des oberen Markers UM Upper Marker bei der Analyse von Leitern oder Proben Der obere Marker UM beginnt sich als MOGLICHE LOSUNG zweiter Peak zu l sen oder sich in einen URSACHE Doppel Peak aufzuspalten F r gew hnlich Stoppen Sie den Durchlauf l durch bereiten Sie einen frischen Einfach Verwendung von Trennpuffer zu und starten Sie 01 Peaks altem oder den Durchlauf erneut beeintr chtigtem Ma Gespaltene Trennpuffer oder Bereiten Sie vor der Analyse a Peaks abgelaufenen immer frische Reagenzien vor U V Reagenzien verursacht Verwenden Sie zur Erzielung optimaler Resultate die Trennpuffer F rbungsreagenz Mischung innerhalb von 4 Stunden ab der Zubereitung E WCE Sie Snad Inn 3 f Peak Aufspaltung eines WAVE MCE Size Standard im Vergleich zu einem normalen Gr en Standard Anmerkung Die Peak Aufspaltung kann zu einem Fehler bei der
4. Warnhinweise amp Vorsichtsma nahmen Keines der Reagenzien in diesem Kit stellt in den gelieferten Mengen eine Gesundheitsgef hrdung dar Die Dokumentnummer von Transgenomic MSD 710105 steht als Download zur Verf gung http www transgenomic com lib msds WAVEMCEMSD asp Dieses Kit enth lt keine Substanzen tierischen oder menschlichen Ursprungs die ein Infektionsrisiko darstellen k nnen Dieses Kit darf nur von Personen verwendet werden die in den entsprechenden Labortechniken ausgebildet wurden Beim Arbeiten mit den Kitkomponenten immer einen passenden Laborkittel Einmalhandschuhe und Augenschutz tragen Nach dem Gebrauch m ssen die Kitkomponenten als klinischer Abfall und gem der f r sie anwendbaren Gesetze und Verordnungen entsorgt werden Aus den Gef en pipettierte Reagenzienaliquots dieses Kits sind nur zum einmaligen Gebrauch bestimmt Es konnte validiert werden dass Kitkomponenten auch nach 25 Auftau Einfrierzyklen noch stabil sind Verwenden Sie das Kit nicht wenn diese Anzahl Zyklen berschritten wurde Prim re Probenentnahme Handhabung und Lagerung Das SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE MCE System ben tigt DNA die aus formalinfixierten paraffineingebetteten FFPE kolorektalen Tumorproben extrahiert wurde F r eine optimale DNA Extraktion muss das Gewebe 14 24 Stunden in Formalin fixiert werden Tumorbiopsien sind eine heterogene Mischung von Tumorzellen und Nicht Tumo
5. Die Analyse von DNA Matrize die aus paraffineingebettetem Gewebe extrahiert wurde erfordert mehrere Vorsichtsma nahmen Die DNA kann mit Uracil DNA Glycosylase behandelt werden um eine Amplifikation von DNA Fragmenten zu vermeiden die deaminierte C Reste enthalten H ufig Seite 38 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System wird ein hoher Prozentsatz des aus dem paraffineingebetteten Gewebe extrahierten A260 Adsorptionsmittels bei der PCR nicht gut amplifiziert Oft hilft eine gr ere Menge Start DNA um ein geeignetes Amplifikationsprodukt zu erhalten Problem 2 Mehrere PCR Produkte wenn auf Agarosegel analysiert Mehrere PCR Produkte M GLICHE URSACHE L SUNG Anlagerungstemperatur zu berpr fen Sie die Kalibrierung des niedrig Thermalcyclers Gute Mehrfach PCR Band Ausbeute PCR Anmerkung PCR sollte einen ausreichend hohen Ertrag gr er als 20 ng uL einer EINZELNEN amplifizierten Species der richtigen L nge erzeugen F r die PCR muss die in diesem Kit mitgelieferte DNA Polymerase und der DNA Polymerase 10X PCR Buffer verwendet werden Amplikons aus Kontrollen m ssen mit der SURVEYOR Nuclease verdaut und analysiert werden um durch Sichtpr fung der Chromatogrammprofile st rendes Hintergrundrauschen auszuschlie en siehe Ergebnisbeispiele Abbildung 2 Kontrollieren Sie vor dem Verdau jedes amplifizierte DNA Produkt durch Gelel
6. Falls dies zu keinem Ergebnis f hrt wiederholen Sie PCR und den SURVEYOR Nuclease Verdau berpr fen Sie das Ger t und sonstige Kontrollvorrichtungen Falls dies zu keinem Ergebnis f hrt berpr fen Sie ob ein geeignetes Muster f r PCR vorhanden ist Wiederholen Sie gegebenenfalls PCR und SURVEYOR Nuclease Verdau F gen Sie eine Wildtyp Kontrolle f r Exon 2 ein und wiederholen Sie die Analyse F gen Sie eine Wildtyp Kontrolle f r Codon 12 von Exon 2 ein und wiederholen Sie die Analyse F gen Sie eine Wildtyp Kontrolle f r Codon 13 von Exon 2 ein und wiederholen Sie die Analyse F gen Sie einen ordnungsgem verd nnten WAVE Mmce Optimized DNA Size Standard f r die Leiter hinzu und wiederholen Sie die Analyse Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System Einzelheiten zur Bestellung Produktnummer Produktname Gr e 710105 CEIVD SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit 100 Analysen Exon 2 CE IVD MCE 99 2020B WAVE MmceEMicroChip Electrophoresis System Einzeln MCE 99 3600 WAVE MCE Optimized Microchip Einzeln MCE 99 5000 WAVE MCE Optimized Separation Buffer Kit 1 000 Analysen MCE 99 5500 WAVE MCE Optimized Marker Kit 1 000 Analysen MCE 99 5600 WAVE MCE Optimized Cleaning Reagents Kit 1 Kit Seite 45 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System Kontak
7. NG_007524 Exon 2 loci 10 428 10 706 Amplikongr e 190 bp mit Schw nzen 153 bp ohne Schw nze Seite 16 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System EISOELTLITSLELZIISTCTEL IST SIT TTITTLSTTEL TEL STETTLEEL ZZ CET REIT ILSET IC ST Ss tet as tatagtcacattttcattatttt TATAAACTTGTGGTAGT TGGAGCTEM TEAC CCTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATA TGATCCAA ctcattactggtgcaggaccattetttgataca gataaacccg KRAS Positive Control Codon 12 NCBI Reference Sequence NG_007524 Exon 2 loci 10 428 10 706 Amplikongr e 190 bp mit Schw nzen 153 bp ohne Schw nze COISOTLLLISLELLIESISTgTLETCTLISTTTTATCESRFETL TIL STIL TEIELI SC ce T LIT TLT LT ICH ESLT ET 33 tatagtcacattttcattatttt BB TA TA AACTTGTGGTAGT TGGAGCT GTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACG AATATGATCCAA LITLLLSCELIILTEITTS CE IL LEE EEE 3 Lacagataaacccg KRAS Positive Control Codon 13 NCBI Reference Sequence NG_007524 Exon 2 loci 10 428 10 706 Amplikongr e 190 bp mit Schw nzen 153 bp ohne Schw nze SOOGIELLGLAIELSSILOTTIETTTILTTATTSELE SZ LISTET TETT STEEL EL TETSETSAICT GEL EL 38 ta atagtcacatttteattatttt TATAAACTTGTGGTAGT TGGAGCTGGTG CGTAGGCAAGAGTGCCETTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTIGTGGACG AATATGATCCAA LILLdclLIgLg caggSsceatLertege Lacagalaaacccg Bitte befolgen Sie f r den Gebrauch dieser Kontrollen die Anleitungen in Amplifikationsprotokol
8. ie a Fragmentgr enberechnung f r den Gr en Standard En irn rn nn nun f hren wodurch eine Probenanalyse mit der Peak Aufspaltung des manuelle Einstellung des oberen Markers oberen Markers erforderlich sein kann A ak ei Problem 7 Fehlercodes in WAVE MCE Viewer f r SURVEYOR Call Software Bei der Verwendung des WAVE MCE Viewer f r die SURVEYOR Call Software k nnen Fehlercodes wie die in Abbildung 24 angezeigten auftreten Siehe untenstehende Tabelle f r eine Erkl rung der Fehlermeldungen und entsprechende Abhilfema nahmen Seite 42 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System WITT I Position Probenname Analyse Position Probenname Mutationsruf xi WAYE MCE Size Standard x1 WAYE MCE Size Standard x1 WAYE MCE Size Standard Al Exon 2 Wild Type Control W O1 Ung ltiger Marker B1 Ci D1 Ei Fi Gl Hi Az B2 C2 Codon 125 Control W 01 Ung ltiger Marker Codon 13D Control W O1 Ung ltiger Marker K17 WAVE MCE Ansichter 1 WAYE MCE Size Standard MCE Auswertung Ye Abbildung 24 Beispiel f r eine Fehlermeldung mit dem Fehlercode W 01 Tabelle WAVE MCE Software Fehlercode Meldungen Ung ltiger Marker Ung ltige WT Kontrolle Die Marker Peaks f r die Kontrolle lt Name gt verf gen ber eine ungeeignete Gr e und oder Position innerhalb des Elektropherogramms Die Analyse kan
9. klicken Sie auf die Enter Taste um das Fach zu schaffen Lassen Sie die Proben auf dem Instrument laufen Sehen Sie im WAVE mce System Bedienungshandbuch f r Details ber den Betrieb der Instrumente nach Probeneingabe Transgenomic fuelranwang Porsonaizzed Iin dioine a J DatenDateiname K RAS_Exon_2 K RAS_Exon_2 mit DatendateiKkommentar K RAS Exon 2 Sample Tray Loyout Projektname Surveyor_Scan Trennpuffer Projektkommentar Markermischart Farbe GelStar Position Probenname Kommentar _Typ WAVE MCE Size Standard Chip 1 Leiter MCE X1 WAVE MCE Size Standard Chip 2 Leiter MCE x1 WAVE MCE Size Standard Chip 3 Leiter MCE X1 WAVE MCE Size Standard Chip 4 Leiter MCE Al Exon 2 Wild Type Control K RAS Control Probe Bi Codon 125 Control K RAS Control Probe c1 Codon 13D Control K RAS Control Probe A2 Sample ID Exon 2 Probe A3 Sample ID Exon 2 Probe A4 Sample ID Exon 2 Probe AS Sample ID Exon 2 Probe A6 Sample ID Exon 2 Probe A7 Sample ID Exon 2 Probe A8 Sample ID Exon 2 Probe A9 Sample ID Exon 2 Probe A10 Sample ID Exon 2 Probe a LAHM e Sa a GE u s a I2229 I2229 500000 50000099 500009 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Trennpuffer 920uL Markersol g8uL m Importieren _ Als Default Probenliste speichern Abbildung 3 Probenfach Setup Seite 19 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE M
10. 46 68 269 41 222 49 04 11 32 0 10 20 30 40 50 60 70 30 90 100 110 120 130 UM 100 00 55 30 2 j rn re a i a Migrationszeit sec Spitzenwerttabelle einzeln vielfach Surveyo 6 B1 E2 C12 Pos Control T5F_T5 8R Control 10 27 2011 11 43 53 AM Microchip Pos 2 ID 3987 gebrauchte 807 Zeit 67 4 sec 21 1 mV Abbildung 11 SURVEYOR Call Ergebnisse 8 Datenpr fung KRAS SURVEYOR Call Ergebnisse a berpr fen Sie jedes in der Probentabelle pr sentierte Ergebnis indem Sie den Probennamen mit dem SURVEYOR Call in Verbindung bringen F r jedes SURVEYOR Scan Ergebnis werden eine MCE Auswertung und Ratio f r die Probe berechnet b W hlen Sie zuerst die Quelle in der Probentabelle unter der SURVEYOR Aufruftabelle wie in Abbildung 11 oben gezeigt Das Elektropherogramm und Gelbild f r die Probe werden angezeigt Pr fen Sie das Elektropherogramm unter Verwendung der graphischen Softwarefunktionen Falls erforderlich zoomen Sie in den interessierenden Bereich und berlappen Sie das Elektropherogramm mit der Exon 2 Wild Type Kontrolle c Notieren Sie alle Unterschiede zwischen der Wild Type Kontrolle und der analysierten Probe d berlappen Sie als n chstes die Exon 2 Codon 12 Positive Control und Exon 2 Codon 13 Positive Control mit der Probe Notieren Sie alle beobachteten Unterschiede e Durch Verwendung dieser Tools kann der Datenpr fer dann die Pr senz oder Abwesenheit einer genetischen Variation beurtei
11. 60 70 50 g0 100 Migrationszeit sec Abbildung 2 SURVEYOR Nuclease Verdauungsprodukte aus den 190 bp Exon 2 Codon 12 und 13 Amplikon Heteroduplices analysiert auf dem WAVE mCE System Die in diesen Analysen verwendeten Matrizen waren 1 eine Mischung der KRAS Control Wild Type Exon 2 und KRAS Exon 2 Positive Control Codon 12 2 eine Mischung aus der KRAS Control Wild Type Exon 2 und KRAS Exon 2 Positive Control Codon 13 und 3 der KRAS Control Wild Type Exon 2 Die G12S Mutation produziert G T und A C Heteroduplices die nach der SURVEYOR Nuclease Verdauung 73 amp 117 bp Fragmente ergeben Die G13D Mutation produziert G T und A C Heteroduplices die nach der SURVEYOR Nuclease Verdauung 77 amp 113 bp Fragmente ergeben Die Spitzen aus diesen speziellen Fragmenten sind gut getrennt Verwendung des WAVE MCE Viewers f r den SURVEYOR Scan Aufruf Das WAVE MCE System wird mit der WAVE MCE Kontrollsoftware und der WAVE MCE Viewer Software geliefert Die Kontrollsoftware wird verwendet um Proben auf dem WAVE MCE System einzustellen und laufen zu lassen Die Viewer Software wird zur Daten berpr fung Elektropherogramm Verarbeitung und zur Report Erzeugung verwendet Innerhalb der Viewer Software wird eine KRAS Analysefunktion verwendet um Analysten dabei zu helfen die Pr senz einer Mutation zu identifizieren Diese Informationen werden in den SURVEYOR Scan Reports f r die KRAS Analyse zusammen mit dem Daten berpr fungsstatus geliefert
12. Exon 2 CE IVD mit dem WAVE MCE System auftreten k nnen sowie Vorschl ge wie sie zu l sen sind Konsultieren Sie das WAVE mce System Bedienungshandbuch f r detaillierte Anleitungen in Bezug auf den Instrumentenbetrieb und die Wartung Das Handbuch enth lt spezifische Verfahren f r das Testen und die Wartung der Mikrochipleistung und beinhaltet Details zur Fehlersuche Problem 1 Niedrige PCR Ausbeute oder kein PCR Produkt wenn auf Agarosegel analysiert Ausbeute URSACHE Schlechte Qualit t der Wiederholen Sie die Aufreinigung der DNA DNA Matrize berpr fen Sie die verwendete Aufreinigungsmethode Wenn die FFPE De extrahierte DNA zu fragmentiert ist k nnen PCR alternative FFPE Blocks erforderlich sein Yield Zu viel RNA in der Wiederholen Sie die RNase Behandlung der DNA Probe verursacht die Probe und reinigen Sie die DNA erneut Ubersch tzung der DNA Konzentration Thermalcycler nicht F hren Sie die Kalibrierung des Thermalcyclers kalibriert durch Nicht ausreichende Erh hen Sie die Matrizenmenge Matrize Anmerkung Es sollte hochwertige DNA aus FFPE verwendet werden Die DNA sollte eine durch Absorption bei 260 nm gemessene Konzentration von 25 ng uL aufweisen sowie ein Absorptionsverh ltnis von 260 280 nm von gr er 1 8 haben und gr er als 90 DNA sein d h nahezu frei von tRNA und rRNA Kontamination laut Agarosegelauswertung DNA Proben bei einer Temperatur zwischen 20 C und 80 C aufbewahren
13. Kontrollverfahren Qualit tskontrolle des SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD Zur Qualit tskontrolle bestimmter Schritte des Testverfahrens sind diesem Kit Kontrollplasmid DNAs beigef gt F r das Amplifikationsprotokoll bietet diese Kontrolle die M glichkeit zu gew hrleisten dass der Master Mix korrekt vorbereitet ist und die Amplifikation richtig funktioniert hat Matrizenfreie Kontrollen wo anstelle der Matrizen DNA Wasser hinzugef gt wird werden ebenfalls empfohlen um eine m gliche Kontamination der Kitkomponenten mit einer DNA Matrize nachzuweisen Bei dem Schritt des SURVEYOR Nuclease Verdaus zeigen die Amplikons dieser drei Kontrollplasmid DNAs effektiv ob die Bedingungen der Spaltungsreaktion Vorbereitung des SURVEYOR Nuclease Verdauungs Master Mix und Inkubationsbedingungen zufriedenstellend waren Bei der Analyse liefern die Chromatogramme dieser SURVEYOR Nuclease verdauten Kontrollamplikons auf dem WAVE MCE System einen Hinweis darauf wo die Codon 12 und 13 Mutationen auch bei niedrigem Vorkommen eluieren werden siehe Abbildung 2 Wenn die PCR Amplikons nicht den Ergebnissen in Qualit tskontrolle von PCR Produkten entsprechen sehen Sie in der Anlage Fehlersuche nach oder setzen Sie sich mit dem Kundendienst von Transgenomic in Verbindung bevor Sie weitere Schritte der Probenanalyse durchf hren Wenn die SURVEYOR Scan KRAS Analyse innerhalb der WAVE MCE Viewer Software die KRAS Kontrollplasmid S
14. Nuclease Master Mix bis zur Weiterverarbeitung auf Eis Anmerkung Der in Schritt 7 vorbereitete SURVEYOR Nuclease Verdauungs Master Mix muss sofort verwendet werden da SURVEYOR Nuclease W mit der Zeit inaktiv wird wenn er in Gegenwart der anderen Komponenten des SURVEYOR Nuclease Verdauungs Mastermix ist 8 10 11 12 Pipettieren Sie je 5 0 uL Aliquot des SURVEYOR Nuclease Master Mix in jedes R hrchen oder Well das 10 0 uL Aliquot des amplifizierten PCR Produkts enth lt siehe Schritt 3 oben Wenn Sie mit dem Pipettieren fertig sind zentrifugieren Sie die 0 2 mL PCR R hrchen oder 96 N pfchen Platten 10 Sekunden lang Vortexen Sie leicht die 0 2 mL PCR Probenr hrchen oder die 96 N pfchen Platte 10 Sekunden lang Zentrifugieren Sie 10 Sekunden lang bei niedriger Geschwindigkeit dieser Schritt ist besonders wichtig wenn die Verdauung in einem Instrument ohne einen erhitzten Deckel durchgef hrt wird Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 42 C Seite 15 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System 13 F gen Sie jedem R hrchen oder N pfchen 1 0 uL Stop Solution PN 708030 hinzu und vortexen Sie leicht das Gesamtreaktionsvolumen der SURVEYOR Nuclease betr gt 16 0 uL TIPP Die SURVEYOR Verdauungsprodukte k nnen bei lt 20 C bis zu einer Woche gelagert werden 14 Laden Sie die Probeverdauungen auf das WAVE MCE System
15. aufgrund von Base Ver nderungen von denen unterscheiden die KRAS aktivieren z B a stille Mutationen von Kodon 12 GGT Wildtyp zu GGC GGA bzw GGG oder Kodon 13 GGC Wildtyp zu GGA GGT bzw GGG oder b eine Mutation in einem anderen Kodon als 12 oder 13 Obwohl diese Mutationen selten sind ist eine Best tigung durch eine andere Methode wie z B DNA Sequenzierung erforderlich falls der Verwender des Kits die Sequenzidentit t von Exon 2 Mutationen ben tigt bevor ein positives SURVEYOR Scan Resultat al seine KRAS aktivierende Mutation aufgezeichnet werden kann Anmerkung der Formalinfixierungsprozess der f r die Vorbereitung von FFPE Tumorbiopsieproben verwendet wird kann Cytosin Desaminierung zur Folge haben Diese Desaminierung wandelt Cytosin in Uracil um Die Polymerase liest dieses Uracil als ein Thymin und bindet ein Adenin in die Seite 11 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System duplizierten Str nge ein Dies scheint dann eine Mutation zu sein wo das normale G jetzt durch ein A ersetzt wird und eine GC zu AT Mutation verursacht die eine Artefaktmutation durch den Fixierungsprozess und keine echte somatische Mutation ist Diese Vorf lle sind selten wenn sie jedoch f r im PCR Cycling dupliziert werden sehen Sie wie Mutationen aus Sie reagieren nicht auf eine erneute Analyse KRAS Mutationen die aus Cytosin Desaminierung entst
16. den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System Vorhandensein von mutations hnlichen Spitzen hindeutet sollte die Probe einer weiteren Analyse f r Sequenzbest tigung unterzogen werden Anmerkung Durch die Analyse der Probe 7 wurde best tigt dass diese eine G13D Mutation enthielt Sequenzierungsergebnisse werden in Abbildung 21 gezeigt 0 10 20 30 40 50 60 70 80 So Migration Index Abbildung 19 Manuelle Analyse von Proben mit SURVEYOR Scan negativ MCE Score 1 Ratio lt 5 Probe 7 zeigt m gliche SURVEYOR Nuclease Spaltprodukte ber dem Basislinien Rauschen 1 2 3 4 5 6 98 9 G12S G13D _ Abbildung 20 Virtuelle Gel Analyse der Proben in Abbildung 19 Probe 7 zeigt schwache B nder in einer hnlichen Position zu den Kontrollproben 2 und 3 was darauf hindeutet dass eine niedrigstufige Mutation in dieser Probe vorhanden ist Seite 31 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System _R_TSF_TS SR_001 129_ E06 1 Fragment bases 29 24 _R_TSF_TS amp R_001 132_HOR_1 Fragment bases 20 35 1 5 AGC TEE GOO T amp G GEA EG AG TE G Tal GEA GGAGLTGGETITGGEG TAG GEAF GGAGETGGTGGEGTAGGEAI T05 10656 T05 14328 aan Neal T5 5R_001 128 EI 1 Fragment bases r7479 F_TAF_TS 3R_001 132_HO6_1 Fragment bases r2 77 EGAL C TEE Tai Ca J3TI34AJJAIIUdIATII4UT MINIMUM Abbi
17. gestoppt werden muss sollte die DNA an den angegebenen Orten bei 20 C gelagert werden Dennoch sollten die gefrorenen Proben nicht wiederholten Einfrier Auftauzyklen ausgesetzt werden und die Tiefk hllagerung 18 bis 25 C von PCR amplifizierter DNA bzw SURVEYOR Nuclease Verdauungsprodukten ber l ngere Zeitr ume gt 1 Woche sollte vermieden werden Die Probenanalyse sollte dem unten aufgef hrten Arbeitsablauf folgen Kratzen Sie b 2 Gel Elektrophorese Pa 8 Robuste SchwachePCR ee bewerten Analyse SURVEYOR Nuclease amp WAVE MCE wer N SURVEYOR Scan SURVEYOR Scan Positiv negativ MCE Score 1 Kein MCE Score Score as Anteil lt 5 amp Verh ltnis KRAS Exon 2 manuelle Analyse angegeben Positive 7 Sequenz best tigung u Versagen bestanden Mutant G12X oder G13X Abbildung 1 Arbeitsablauf der SURVEYOR Scan KRAS Kit Analyse Ss N SURVEYOR Scan nicht bestanden Anmerkungen zu Abbildung 1 1 Isolieren Sie die DNA von FFPE und verwenden Sie dazu Standardlabortechniken 2 F hren Sie die PCR durch und pr fen Sie die DNA Qualit t durch Gel Elektrophorese 3 Zeichnen Sie auf ob das PCR Band robust 220 ng uL oder schwach lt 20 ng uL ist Bereiten Sie frische genomische DNA aus FFPE vor wenn es Mehrfach PCR B nder gibt Seite 10 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System 4 Ge
18. i A N N Fay AL Fat A en Yy Be ji N Na A A l Ri A4 r r AI i ER Mas Au el 0 10 20 30 40 50 60 70 50 90 100 Migration Index Abbildung 22 SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD Titration der KRAS Exon 2 G12S Mutation Variierende mutante Niveaus werden durch Mischen der KRAS Control Wild Typ Exon 2 PN 710141 und KRAS Positive Control Codon 12 PN 710143 vorbereitet dann wird das Gemisch erhitzt und abgek hlt um Heteroduplices zu bilden Diese Gemische werden anschlie end mit SURVEYOR Nuclease gespalten und auf dem WAVE MCE System analysiert ANMERKUNG um einen 90 Wildtyp 10 Mutant zu erzielen muss eine Mischung aus 80 PN 710141 und 20 PN 710143 vorbereitet werden Beachten Sie ferner dass die Mehrheit des Amplikon Gemischs aus Wildtyp Homoduplices besteht die nicht von der SURVEYOR Nuclease gespalten werden Die Erfassungsgrenze des mutanten G12D Amplikons mit SURVEYOR Nuclease WAVE MCE System betr gt 2 Erfassungsgrenzen Sequenzierungsergebnisse f r die KRAS Exon 2 G12S Mutation Die Elektropherogramme zeigen die DNA Sequenzierungsergebnisse f r PCR Produkte die von der SURVEYOR Nuclease analysiert wurden Dem automatischen Sequenzierungsaufruf der Vorw rts und auch R ckw rtsstr nge gelingt es h ufig nicht G12S Mutationen auf Niveaus unter 10 in Gemischen mit Wildtyp zu erfassen Zusammen mit den SURVEYOR Nuclease Ergebnissen is
19. 3 nur Nordamerika 1 402 452 5400 oder 44 0 141 892 8800 Europa an und fragen Sie nach dem KRAS Support Alternativ k nnen Sie eine E Mail senden an SURVEYORscan Transgenomic com Seite 4 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System R ckverfolgbarkeit der Kit Kontrollen Die mit diesem Kit mitgelieferten Kontrollen sind Plasmidklone der KRAS Exon 2 Sequenzen Alle Klone wurden sequenziert um sie im Vergleich zur NOBI Referenzsequenz auf Sequenztreue zu berpr fen NG_007524 1 Die KRAS Control Wild Type Exon 2 wurde durch PCR des KRAS Exon 2 aus einer genomischen Wildtyp DNA Pr paration und Klonierung konstruiert Die KRAS Positive Control Codon 12 wurde durch ortsspezifische Mutagenese der KRAS Kontrolle konstruiert Wild Type Exon 2 Klon Durch DNA Sequenzierung wurde best tigt dass die einzige nderung in der Sequenz von Codon 12 in einer GGT gt AGT Alteration vorliegt Dies wird dann im Verh ltnis 50 50 mit der KRAS Control Wild Type Exon 2 DNA gemischt um eine heterozygote Mischung zu erhalten Die KRAS Positive Control Codon 13 wurde durch ortsspezifische Mutagenese der KRAS Kontrolle konstruiert Wild Type Exon 2 Klon Durch DNA Sequenzierung wurde best tigt dass die einzige nderung in der Sequenz von Codon 13 in einer GGC gt GAC Alteration vorliegt Dies wird dann im Verh ltnis 50 50 mit der KRAS Control
20. 41 49 04 11 32 100 00 55 30 60 70 80 Migrationszeit sec 90 einzeln vielfach _ 10 27 2011 11 43 53 AM Microchip Pos 2 1D W3987 gebrauchte 807 Zeit 53 1 sec 100 0 mV Spitzenwerttabelle Surveyo 6 B1 E2 C12 Pos Control T5F_T5 8R Control Abbildung 7 Beispiel der geladenen MLT Datendatei 4 Die Proben werden in die Viewer Software geladen Wenn die Proben zum ersten Mal geladen werden erscheint ein Prompt das den Benutzer auffordert die Analyse laufen zu lassen Siehe Abbildung 8 WAVE MCE Viewer s Um die analysierten Daten zu sehen w hlen sie automatisch aus dem Reanalyse Pulldown Menu Abbildung 8 die Analyse laufen lassen 5 W hlen Sie erneute Analyse Automatisch um die Spitzenermittlungsanalyse laufen zu lassen Lassen Sie die Standardanalyse Abbildung 9 laufen und w hlen Sie dazu die Standard Option Klicken Sie auf erneute Analyse und Automatisch Dies ermittelt die Spitzen in jedem Elektropherogramm in Bezug auf den verwendeten Ladder WAVE MCE Optimized DNA Size Standard bei der Vorbereitung der SURVEYOR Scan KRAS Analyse Seite 22 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System De Neuanalyse en a a xej Spitzenermittlung Fein Standard grob Benutzerdefiniert Spitzenermittiung Empfindlichkeitsparameter Spitzenh he S N Untergrenze Spitzenkonz Unter
21. DNA uL bei 2 0 12 5 ng uL l Gesamtvolumen PCR Reaktion 50 0 Hinweis Der Anwender sollte darauf zielen ein Minimum von 25 ng DNA je 50 uL Reaktion zu haben Erh hen Sie f r extrahierte DNA Konzentrationen mit weniger als 12 5 ng uL proportional das Volumen extrahierter DNA um je Reaktion 25 uL zu erhalten Reduzieren Sie auch das Volumen an Wasser in dem Master Mix um dieselbe Menge um je Reaktion 50 uL zu erhalten Alle mit diesem Master Mix vorbereiteten Proben brauchen extrahiertte DNA die auf ann hernd dasselbe niedrigste Konzentrationsniveau verd nnt ist Es ist nicht empfehlenswert Konzentrationen extrahierter DNA mit weniger als 5 ng uL einzusetzen Berechnen Sie das erforderliche Volumen f r den Master Mix indem Sie die in der Tabelle oben angegebenen Volumen mit der Gesamtzahl zu testender Proben plus 4 zus tzlichen Reaktionen f r die Kontrollen multiplizieren Ber cksichtigen Sie dass ein leicht gr erer Mastermix als in dieser Berechnung ben tigt wird um Verluste w hrend des Pipettierens anzurechnen Seite 12 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System 8 11 12 193 14 19 16 17 18 19 20 21 22 29 24 23 26 Beschriften Sie 0 2 mL PCR Reaktionsgef e oder die N pfchen einer 96 N pfchen Platte mit den erforderlichen Probeninformationen Beschriften Sie ein 2 0 mL Ze
22. Die unbekannten Proben 2 3 und 4 sollten zu einer DNA Sequenzbest tigung gesandt werden Zusammen mit einer Sichtkontrolle der Gelbilder kann es n tzlich sein die Proben Elektropherogramme mit den positiven und Wildtypkontrollen zu vergleichen die im Kit mitgeliefert werden Es ist am besten das Overlay Merkmal f r die Elektropherogramme zu verwenden F r die Parameter der X Achse kann entweder Migration oder Gr e verwendet werden Abbildung 18 unten zeigt die Elektropherogramme f r die Proben die in der Betriebsart Gelbild oben angesehen wurden Abbildung 17 Ungeschnittenes PCR Produkt Unterer SURVEYOR Unterer SURVEYOR Marker Verdaungs Spitzen Marker Verdaungs Spitzen I Unbekannte Probe 4 Unbekannte Probe 3 Unbekannte Probe 2 Unbekannte Probe 1 KRAS Ex 2 Positive Control Codon 13 KRAS Ex 2 Positive Control Codon 12 KRAS Control Wild Type Exon 2 Migrationsindex Gr e bp Abbildung 18 Die Elektropherogramme desselben Probensatzes die auf dem Gelbild in Abbildung 17 visualisiert wird wird durch Gebrauch des Migrationsindexes und der Gr enkennzeichnung f r die X Achse angezeigt In diesem Fall ist es klar dass die Spitzenmuster in den unbekannten Proben 3 und 4 den Spitzenmustern entsprechen die f r die mit dem Kit mitgelieferten positiven Kontrollen beobachtet werden Die DNA Sequenzbest tigung ist als Identifizierung dieser spezifischen Basis nderung erforderlich Ein
23. Inc Hersteller 12325 Emmet Street Omaha NE 68164 USA Tel 1 402 452 5400 Vertreter in der T gt Transgenomic Limited EU 40 Watt Road Hillington Park Glasgow G52 4RY GB Tel 44 141 892 8800 SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE MCE System Verwendungszweck Anwendung nur durch Fachpersonal Das SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit von Transgenomic mit dem WAVE MCE System ist ein In vitro Diagnostikum das somatische Mutationen in Exon 2 des KRAS Gens nachweist Diese Mutationen werden durch SURVEYOR Nuclease Zellteilungs Spitzenwerte angezeigt und enthalten jene Mutationen mit bekanntem Potenzial f r klinische Bedeutung Dieses Kit ist f r den Gebrauch in einem Labor f r klinische Diagnostik durch entsprechend ausgebildetes Fachpersonal vorgesehen Getestet wird DNA die aus formalinfixiertem und in Paraffin eingebettetem Gewebe extrahiert wird Dieses Kit Katalognummer 710105 CEIVD wird in einem Karton geliefert der die nachstehend aufgef hrten Komponenten enth lt Diese Bedienungsanleitung ist auch als Download unter http www Transgenomic com pd surveyor SURVEYORKRAS_MCE CEIVD asp erh ltlich Angaben zum Gebrauch Mediziner k nnen den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE MCE System als Hilfe bei der Entscheidung verwenden ob Patienten mit kolorektalem Karzinom auf eine Therapie mit Anti EGFR Epidermal Growth Factor Receptor bzw epidermalen Wa
24. R Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System AR WAVE MCE Viewer 102711001 alt C o xX Datei Bearbeiten Ansicht Gel Bild Elektropherogramm Neuanalyse SURVEYOR Scan Hilfe Pr 4 TER Porm soa zessal 102711001 a copy mit z Position Probenname Analyse Alles zeigen Alles ausw hlen Stornieren Alles l schen zuf gen S 102711001 H A n 1 X1 1 WAVE MCE Size Standard Fi a a X g m H g C g H g g m g i 2 X1 2 WAVE MCE Size Standard 1 4 3 X1 3 WAVE MCE Size Standard 4 X1 4 WAVE MCE Size Standard 5 A1 E2 WT Pos Control TSF_T5 8R S 6 B1 E2C12Pos Control TSF_T5 8R 7 C1 E2 C13 Pos Control T5F_T5 8R 8 A2 Ke2 T5F_T5 8R 001 093 4 9 B2 Ke2 T5F_T5 8R 001 094 4 10 C2 Ke2T5F_T5 8R 001 095 i 11 D1 Ke2T5F_T5 8R C12 50 Mutant 12 E1 Ke2T5F_T5 8R C12 25 Mutant 13 F1 Ke2 T5F_T5 8R C12 10 Mutant 14 G1 Ke2T5F_T5 8R C12 5 Mutant Bere 20 um ED a 0 m nn u 16 D2 Ke2T5F_T5 8R 001 096 U 4 17 E2 Ke2 T5F_T5 8R 001 097 14 m t 18 F2 Ke2T5F_T5 8R 001 098 19 G2 Ke2 T5F_T5 8R 001 099 20 H2 Ke2 T5F_T5 8R 001 100 i 21 A3 Ke2 T5F_T5 8R 001 101 22 B3 Ke2T5F_T5 8R 001 102 23 C3 Ke2 T5F_T5 8R 001 103 X Aussew hltes zeigen m 0 00 13 87 24 30 17 12 33 62 40 06 Intensit t m 41 73 7 80 46 68 269
25. Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System Literaturnachweis Siehe http www Transgenomic com lib PL 482146 pdf f r Literaturnachweise ber SURVEYOR Nuclease und seine Anwendungen Seite 37 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System Anhang Fehlersuche Ein effektiver Einsatz des SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE MCE System h ngt von der erfolgreichen Ausf hrung einer Anzahl von Schritten ab Einer der entscheidendsten ist die PCR Amplifikation die zur Produktion einer ausreichenden Menge spezifischer gleichm ig langer DNA f hren muss um nach der Hybridisierung und Spaltung nachgewiesen zu werden Das wiederum h ngt von der Qualit t der Ausgangsprobe ab Die Durchf hrung dieses Tests mit DNA die nicht den Qualit t und Quantit tskriterien entspricht ist nicht empfehlenswert Anmerkung Wenn Sie zum ersten Mal mit SURVEYOR Nuclease arbeiten f hren Sie die Untersuchungen im Abschnitt Verwendung der KRAS Kontrollplasmid DNAs durch nachdem Sie den Abschnitt Schritt f r Schritt Anleitung gelesen und verinnerlicht haben Bevor Sie sich an den technischen Kundendienst von Transgenomic wenden warten Sie bitte die Ergebnisse f r die KRAS Kontrollplasmid DNAs ab Diese Fehlersuche deckt eine Liste von Problemen ab die bei der Arbeit mit dem SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit
26. URVEYOR Nuclease Verdauungsergebnisse identifiziert erscheint ein Fehlercode Bitte beziehen Sie sich auf die relevanten Abschnitte in Anlage Fehlersuche oder setzen Sie sich mit dem Kundendienst von Transgenomic in Verbindung bevor Sie weitere Schritte der Probenanalyse durchf hren Verwendung der KRAS Kontrollplasmid DNAs Mit dem Kit werden drei Kontroll DNAs geliefert KRAS Control Wild Type Exon 2 PN 710141 KRAS Positive Control Codon 12 PN 710143 KRAS Positive Control Codon 13 PN 710144 Diese Kontroll DNAs sind Plasmide mit Insertionen Die Positivkontrolle enth lt zwei Plasmide ein 50 50 Gemisch aus KRAS Control Wild Type Exon 2 und einem Mutationsklon der in einem Basenpaar vom Wildtyp abweicht Die Kontrollen werden in getrennten Reagenzgef en geliefert jede in einer Konzentration von 2 5 ng uL Die f r die PCR Amplifikation ben tigten KRAS Exon 2 Forward und Reverse Primer werden im Kit getrennt geliefert Die Sequenz der Wild Type und Positivkontrollen ist weiter unten abgebildet Die bindende Stelle des Forward Primer ist in f hervorgehoben Das Reverse Complement der bindenden Stelle der Reverse Primer ist markiert Kodierende Regionen sind gro geschrieben und unterstrichen Die h ufigsten Mutationsregionen sind Mole markiert Gro buchstaben die nicht unterstrichen sind sind nichtkodierende exonische DNA Bereiche Die Amplikonsequenz ist wie folgt KRAS Control Wild Type Exon 2 NCBI Reference Sequence
27. URVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Assay KRAS Neu entwickelte auf den Epidermal Growth Factor Receptor EGFR gerichtete therapeutische Wirkstoffe wie Cetuximab Erbitux und Panitumumab Vectibix haben sich bei kolorektalem Karzinom als wirksam erwiesen Forscher berichten dass rund 40 der kolorektalen Tumore somatische KRAS Genmutationen tragen und diese Mutationen wurden mit dem schlechten Ansprechen auf EGFR Antagonisten in Verbindung gebracht Der K RAS Mutationsstatus kann daher eingesetzt werden um zu bestimmen ob ein Tumor auf die Anti EGFR Therapie ansprechen wird Dieses Kit wurde f r den Gebrauch in der diagnostischen Analyse von somatischen KRAS Exon 2 Mutationen die eine Auswirkung auf die Drogeneffizienz haben entworfen Das SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD f r das WAVE mce MicroChip Electrophoresis System ist ein diagnostisches Testkit f r den Nachweis aller Sequenzen und kleiner Insertions Deletionsmutationen in Exon 2 des KRAS Gens Positivkontrollen f r Exon 2 Mutationen in Codon 12 und 13 die mit der mangelnden Wirksamkeit der Anti EGFR Wirkstoffe in Verbindung gebracht wurden werden mitgeliefert Dieses Kit verwendet die patentrechtlich gesch tzten Technologien SURVEYOR Nuclease und das WAVE MCE System von Transgenomic die einen einfachen und empfindlichen Mutationsnachweis bieten Damit kann ein Gemisch aus 2 5 mutanter vor einem Hintergrund von nicht mutanter DNA nachweisen k n
28. VE MCE Optimized Separation Buffer Kit PN MCE 99 5000 WAVE MCE Optimized Marker Kit PN MCE 99 5500 Hochreines Wasser f r die Molekularbiologie 0 2 mL PCOR R hrchen Streifen oder 96 Lochtiterplatte Mikropipetten Pipettenspitzen Eisbad Vortexer Mikrozentrifuge Thermal cycler Agarosegele und Ausr stung f r Agarosegel Elektrophorese 10 Bleich oder hnliches Reinigungsmittel Seite 6 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System Reagenzienvorbereitung Alle Reagenzien dieses Kits sind gebrauchsfertig Einige Komponenten m ssen vor Gebrauch aufgetaut mit dem Vortexer gemischt oder in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert werden Einzelheiten siehe weiter unten unter Testverfahren Reagenzien m ssen zur Herstellung von Master Mix und Reaktionsgemischen gemischt werden Eine genaue Anleitung finden Sie im Abschnitt Testverfahren Lagerung und Haltbarkeit Das Kit muss bis zu seinem Gebrauch zwischen 18 C und 25 C in einem Gefrierschrank mit konstanter Temperatur aufbewahrt werden Beachten Sie bei jedem erhaltenen Kit das Verfalldatum Das Kit nicht mehr verwenden wenn das Verfallsdatum berschritten ist Das in Schritt 7 des SURVEYOR Nuclease Verdaus vorbereitete SURVEYOR Nuclease Gemisch muss sofort verwendet werden da die Anwesenheit anderer Komponenten im SURVEYOR Nuclease Reaktionsgemisch die SURVEYOR Nuclease W mit der Zeit inaktiviert
29. Wild Type Exon 2 DNA gemischt um eine heterozygote Mischung zu erhalten N here Angaben zu den DNA Sequenzen der Kontrollen siehe Verwendung der KRAS Kontrollplasmid DNAs Kit Komponenten Das SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE MCE System besteht aus einem Karton mit 18 Reagenzgef en In jedem Karton bleiben 7 L cher leer Farbe Kit f r 100 deckel gelieferte Menge 703310 DNA Polymerase 2 5 U uL Rot 100 uL 703315 DNA Polymerase 10X PCR Buffer Wei 1000 uL 703065 dNTPs 10 mM Durchsichtig 500 uL 710155F u Primer Exon 2 Forward 10 Blau 2x125 uL 710155R a Primer Exon 2 Reverse 10 Blau 2x125 uL 710153F Universal Seq Primer 1 10 uM Orange 125 uL 710153R Universal Seq Primer 2 10 uM Orange 125 uL 710160 SURVEYOR Nuclease W Violett 2 x 105 uL 710161 SURVEYOR Enhancer W2 Schwarz 105 uL 708049 SURVEYOR Enhancer Cofactor Rosa 105 uL 708027 0 15 M MgCl2 Solution Braun 105 uL 708030 Stop Solution Rot 250 uL 710141 KRAS Control Wild Type Exon 2 Gelb 40 uL 710143 Ex 2 Positive Control Codon Gr n 40 uL 710144 i Ex 2 Positive Control Codon Gr n 40 uL 482356 Bedienungsanleitung Download von der Webseite http www Transgenomic com pd surveyor SURVEYORKRAS MCE CEIVD asp Seite 5 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System Anzahl der Proben die mit dem Kit getestet werden k nnen Mit dem SURVEYOR Scan KRAS Mutatio
30. an Negativ 0 Ke2 T5F_T5 8R 001 098 SURVEYOR Scan Negativ 0 Ke2 TSF_T5 8R 001 099 SURVEYOR Scan Negativ 1 1 Ke2 TSF_T5 8R 001 100 SURVEYOR Scan Negativ 0 Ke2 TSF_T5 8R 001 101 SURVEYOR Scan Negativ 0 Ke2 TSF_T5 8R 001 102 SURVEYOR Scan Negativ 0 an Abbildung 12 Beispiele f r SURVEYOR Call Ergebnisse f Wichtig Siehe Manuelle Pr fung der MCE Score 1 Resultat f r Beispiele einer manuellen Pr fung von Proben mit einem MCE Score 1 und einer Ratio lt 5 g Wichtig F r eine sorgf ltige Pr fung jeder Probe sollte der Pr fer kontrollieren ob nebeneinander liegende Proben in der Analyseplatte identische positive SURVEYOR Scan Ergebnisse haben Wenn identische positive Ergebnisse auftreten k nnen Sie das Ergebnis der Proben oder Kreuzkontrollkontamination sein und die Analyse muss wiederholt werden N Wichtig F r eine sorgf ltige Pr fung jeder Probe hat der Pr fer die M glichkeit das SURVEYOR Scan Ergebnis zu ndern wenn er das SURVEYOR Aufruf Drop Down Menu verwendet Alle manuellen nderungen an der Analysesoftware SURVEYOR Aufruf werden auf den Probeberichten notiert Die MCE Score wird auf Manuell aktualisiert um anzugeben dass der Pr fer eine Anderung manuell durchf hrte siehe das folgende Beispiel f r Probe 4553 11 in Kavit t C2 Seite 26 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System Position Probenname Ana
31. ant N N N lA 1 NAANA A I FAVE ZN FA AWATA f IN PNZAFAFAN 2 FIT ka ws ERW d Weir j N N N O A N II f x A arra i N z x Muram j i j N N N a Au fr i z N N P Eh Ses Hai s nd NEN i ihka n 2 u 100 WT N N N N N N N N I N N j 0 10 20 30 40 50 50 70 30 90 100 Migration Index Abbildung 23 SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD Titration der KRAS Exon 2 G13D Mutation Variierende mutante Niveaus werden durch Mischen der KRAS Control Wild Typ Exon 2 PN 710141 und KRAS Positive Control Codon 13 PN 710144 vorbereitet dann wird das Gemisch erhitzt und abgek hlt um Heteroduplices zu bilden Diese Gemische werden anschlie end mit SURVEYOR Nuclease gespalten und auf dem WAVE MCE System analysiert ANMERKUNG Um einen 90 Wildtyp 10 Mutant zu erzielen muss eine Mischung aus 80 PN 710141 und 20 PN 710144 vorbereitet werden Beachten Sie ferner dass die Mehrheit des Amplikon Gemischs aus Wildtyp Homoduplices besteht die nicht von der SURVEYOR Nuclease gespalten werden Die Erfassungsgrenze des mutanten G12D Amplikons mit SURVEYOR Nuclease WAVE MCE System betr gt 5 Erfassungsgrenzen Sequenzierungsergebnisse f r die KRAS Exon 2 G13D Mutation F r den Vergleich werden Elektropherogramme mit den Sanger Sequenzierungsergebnissen f r PCR Produkte auf den variierenden mutanten Ebenen angezeigt Dem automatis
32. as Verh ltnis Wasser Reaktion auf 31 0 uL In der Kontrollprobe ohne Matrize d rfen keine PCR Produkte zu sehen sein Wenn DNA Produkte nachweisbar sind ist diese Kontrolle wahrscheinlich kontaminiert Anhang Fehlersuche 8 Bewerten Sie die PCR als robuste PCR oder schwache PCR a Eine robuste PCR muss ein Einzelband haben dass gleich oder gr er als 20 ng uL ist b Eine schwache PCR muss ein Einzelband haben dass kleiner als 20 ng uL ist c F hren Sie den SURVEYOR Nuclease Verdau mit Robusten und Schwachen PCR Schnitten durch TIPP In diesem Stadium k nnen PCR Produkte bei weniger oder gleich 20 C bis zu einer Woche gelagert werden SURVEYOR Nuclease Verdau 1 Nachdem sich die Probe PCR in Qualit t und Quantit t als ausreichend erwiesen hat f hren Sie die SURVEYOR Nuclease Verdauungsreaktion wie nachstehend beschrieben durch Tauen Sie die 0 15 M MgCl2 Solution und den SURVEYOR Enhancer Cofactor auf Eis auf F gen Sie 10 0 uL von allen obengenannten PCR amplifizierten Proben in ein neues 0 2 mL PCR R hrchen oder in die Kavit t einer 96 Z pfchen Platte Seite 14 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System 4 Bereiten Sie aus 0 15 M MgCl2 Solution SURVEYOR Enhancer Cofactor SURVEYOR Enhancer W2 und SURVEYOR Nuclease W eine frische Mischung zu SURVEYOR Nuclease Mischung Verwenden Sie di
33. be N pfchen Die Kavit tenposition der Probe SURVEYOR Call Der von der Software abgeleitete Aufruf aus dem Vergleich der unbekannten Proben mit den Kontrollen Die m glichen SURVEYOR Call Ergebnisse beinhalten SURVEYOR Scan positiv Genetische Variation ermittelt SURVEYOR Scan negativ Genetische Variation nicht ermittelt Unbekannt in dem interessierenden Bereich befinden sich zu viele Spitzen und die Software ist nicht in der Lage ein SURVEYOR Scan Ergebnis festzulegen Die Proben Aufrufe sind auch farbbasierend auf dem SURVEYOR Scan Ergebnis Rot gibt an dass eine genetische Variation ermittelt wurde und gr n gibt an dass keine genetische Variation vom Wild Type ermittelt wurde MCE Score Die MCE Score stammt aus der Verwendung der Spitzencharakteristiken f r jedes SURVEYOR Scan Ergebnis Diese Auswertung basiert auf der Signalintensit t und dem Hintergrundievel Die Auswertung liegt zwischen 0 100 Je h her die Bewertungsziffer ist desto mehr stimmt die unbekannte Probe mit dem erwarteten Muster einer mutanten Variation berein Das Verh ltnis zwischen der Spitzenh he des genetischen Variantenschnittfragments und der Spitzenh he des Wildtyp Fragments ungeschnitten Seite 24 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System WAVE MCE Viewer 102711001 a copy r m m gen Datei Bearbeiten Ansicht Gel Bild Elektrophero
34. cE System 2 Wenn alle Proben auf dem WAVE MCE System gelaufen sind ffnen Sie die WAVE MCE Betrachter Applikation unter Verwendung einer der folgenden Methoden a Klicken Sie auf das WAVE mCE Viewer Symbol auf dem Desktop r P l S b W hlen Sie Start gt WAVE MCE gt WAVE MCE Viewer Auf die WAVE MCE Viewer Software kann ebenso von der WAVE MCE Control Software w hrend der Datenerfassung zugegriffen werden wenn Sie auf das Symbol Ansicht gt Datendatei klicken Ta WAVE O x Probeneingabe Aufbereiten Busan Ger t Analyse Hilfe ETA Mi rochjpstatus F amp hak ja UN eo e ul Transgenomio _ Protokoll 123456 7 bamur g Kommentar Typ Trennpuffer_ Betriebsart __ Microchip Status Ladder MCE DNA 500 Chip Ein 1 A SOOOOOOOODOC Probe DNA 500 Chip Ein 2 BSEOTVOOOOCOOOOCOC Probe DNA 500 Chip Ein 1 C SE EOOOOOOOOOOC Probe DNA 500 Chip Ein 2 DOCOOoco0COoOOCCOc Probe DNA 500 Chip Ein 1 E OCOoOOoccoOoOCcCcoC Probe DNA 500 Chip Ein 2 FOOOOCOCOCOoOSOCOococ Probe DNA 500 Chip Ein 1 e OCOOOCOCOOCOAOAOCOCOC orobe DNA 500 Sen 2 Probe DNA 500 Chip Ein 1 HOCOOCccocCOoOoCcCcOoc Probe DNA 500 Chip Ein Probe DNA 500 Chip Ein 1 SB OCOococoococCcoCcc Chip 1 W5121 te ee wg MV Y 50 100 150 sec Abbildung 4 Zugriff auf die WAVE mce Viewer Software Seite 20 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE MCE Syste
35. chen Sequenzierungsaufruf der Vorw rts und auch R ckw rtsstr nge gelingt es h ufig nicht G13D Mutationen auf Niveaus unter 10 in Gemischen mit Wildtyp zu erfassen Zusammen mit den SURVEYOR Nuclease Ergebnissen ist es m glich die mutanten 90 10 Wildtyp 10 Mutation Sequenzierungs Elektropherogramme f r Codon 13 sicherer als mutationstragend zu interpretieren Wenn eine Probenanalyse ein positives SURVEYOR Scan Ergebnis zeigt es aber keine durch den Gebrauch der DNA Sequenzierung erfassbare KRAS Mutation gibt empfehlen wir dass keine Variante erfasst aufgezeichnet wird Siehe berlegungen zum Arbeitsablauf f r mehr Details Sequenzbest tigung F hren Sie die Sequenzbest tigung durch wenn 1 die Sequenzidentit t der KRAS Exon 2 Mutation erforderlich ist 2 die Probe ber eine negative SURVEYOR Scan Bewertung mit einem MCE Score 1 verf gt und manuelle Analysen nahelegen dass SURVEYOR Nuclease Spaltprodukte vorhanden sind 3 die Probe einen Fehlercode W 01 aufweist und manuelle Analysen nahelegen dass SURVEYOR Nuclease Spaltprodukte vorliegen Seite 35 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System F hren Sie die Sequenzierungsbest tigung nicht durch wenn 1 die Sequenzidentit t der Mutation nicht erforderlich ist und ein Resultat der KRAS Exon 2 Mutation ausreicht 2 die Probe als SURVEYOR Scan negativ mit e
36. chstumsfaktor Rezeptor Therapeutika wie Vectibix oder Erbitux ansprechen Das SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE MCE System darf nicht zur Diagnose von kolorektalen oder anderen Krebsarten verwendet werden Der SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE MCE System weist auf die Anwesenheit von Mutationen im K RAS Gen Exon 2 hin best tigt aber nicht die Sequenzidentit t der Mutation Um nachzuweisen um welche Mutation es sich genau handelt sind weitere Untersuchungen wie zum Beispiel eine DNA Sequenzierung erforderlich Die mit diesem Kit erhaltenen Ergebnisse sollten f r den Arzt ein Hinweis auf den Mutationsstatus eines Patienten sein Es m ssen weitere klinische Faktoren ber cksichtigt werden die Ergebnisse des SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE MCE System d rfen nicht als einzige Methode zur Entscheidungsfindung einer Behandlung von Patienten mit kolorektalem Karzinom herangezogen werden Genauer gesagt sollte der Gebrauch der WAVE MCE Software um mit diesem Kit Proben mit positivem Testergebnis f r eine KRAS Mutation zu identifizieren nur als Richtlinie verwendet werden und alle Mutationen m ssen durch eine weitere Analyse wie zum Beispiel durch eine DNA Sequenzierung best tigt werden Seite 2 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System Testprinzip des S
37. de Stelle des Forward Primer ist in Gr n hervorgehoben Das Reverse Complement der bindenden Stelle des Reverse Primer ist I amp i markiert Kodierende Regionen sind gro geschrieben und unterstrichen Die h ufigsten Mutationsregionen sind Mole markiert Gro buchstaben die nicht unterstrichen sind sind nichtkodierende exonische DNA Bereiche KRAS Control Wild Type Exon 2 NCBI Reference Sequence NG_007524 Exon 2 loci 10 428 10 706 Amplikongr e 190 bp mit Schw nzen 153 bp ohne Schw nze cgggtttgtattaaaaggtactggtggagtatttgatagtgtattaaccettatgtgtgacatgttoetaa tatagtca catet tatta tte 1AT Tc Tec TACT TGGAGCTBETEECGTAGGCAAGAGCTGCCETTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATA TGATCCAA LIELIOCLTTLTEITGACSCAa LEE EL 93 L3cC 2 gJaLadaccecg Seite 9 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System berlegungen zum Arbeitsablauf Das Kit ist f r die Analyse von 100 Reaktionen ausgelegt Kleinere Probenserien k nnen ausgef hrt werden aber die Kit Kontrolle und eine keine Matrize Kontrolle m ssen bei jeder Probenserie enthalten sein Im Kit ist ausreichend Kontrollmaterial f r 100 Reaktionen aller Kombinationen der zu verwendenden Probenseriengr en Im Allgemeinen sollte die Probenverarbeitung von Anfang bis Ende so ausgef hrt werden wie in dieser Bedienungsanleitung beschrieben Wenn die Verarbeitung einer Probe vor der Fertigstellung aller Schritte
38. dt werden Setzen Sie sich f r jegliche Fragen in Bezug auf die manuelle Pr fung mit dem Transgenomic Support in Verbindung Siehe Kontaktdetails Seite 32 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System Leistungsmerkmale Nachweisgrenze des SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD Eine Validierung des SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE MCE System mit Plasmidklonen der h ufigsten KRAS Exon 2 Mutationen hat gezeigt dass SURVEYOR Nuclease Peaks in einem Gemisch aus 2 5 Mutant auf einem Wildtyphintergrund nachgewiesen werden k nnen Die Ergebnisse unten zeigen die WAVE MCE System Spuren von Verd nnungsserien f r Beispielmutationen in Codon 12 und 13 und die Sequenz Elektropherogramme der gew hlten Verd nnungen Beachten Sie dass die Spitzenprofile f r spezifische Mutationen je nach Anzahl der Proben variieren k nnen die auf einem individuellen Chip liefen KRAS Exon 2 G12S Mutationsniveau von Ermittlungs Verd nnungsserien v 73 und 117 bp 50 G12S Positivkontrolle 25 G12S Positivkontrolle SURVEYOR Nuclease 10 G12S Positivkontrolle Spaltprodukte 5 G12S Positivkontrolle 2 G12S Positivkontrolle 1 G12S Positivkontrollel Unterer Exon 2 Wildtyp kontrolle Marker Ungespaltenes IVN VAU VAT AZVA Amplikon mit Oberer WE j ASERI 5 A a voller L nge 190 Marker CACECT CGT A z i kA A
39. dtyp Fehlende Kontrolle Codon 12 Fehlende Kontrolle Codon 13 Fehlende Leiter Die Peaks der Codon 12 Positivkontrolle verf gen entweder ber eine ungeeignete Trennung oder Peakh he bzw ber einen ungeeigneten Migrations Index Es kann keine KRAS Analyse von Exon 2 durchgef hrt werden Die Peaks der Codon 13 Positivkontrolle verf gen entweder ber eine ungeeignete Trennung oder Peakh he bzw ber einen ungeeigneten Migrations Index Die KRAS Analyse kann nicht durchgef hrt werden Der ungeschnittene Peak f r die Probe verf gt entweder ber eine untypische Peak H he oder einen untypischen Migrationsindex KRAS Analyse erf llt nicht alle Kriterien f r Keine Variante festgestellt No Variant Detected Wildtyp Kontrolle Exon 2 fehlt auf der Proben Platte Die KRAS Analyse kann nicht durchgef hrt werden Die Positivkontrolle f r Exon 2 Codon 12 fehlt auf der Probenplatte Die KRAS Analyse kann nicht durchgef hrt werden Die Positivkontrolle f r Exon 2 Codon 13 fehlt auf der Probenplatte Die KRAS Analyse kann nicht durchgef hrt werden Es ist kein Leiter Durchlauf Gr enstandard vorhanden Die KRAS Analyse kann nicht durchgef hrt werden Seite 44 von 46 berpr fen Sie das Ger t und sonstige Kontrollvorrichtungen Falls dies zu keinem Ergebnis f hrt wiederholen Sie PCR und den SURVEYOR Nuclease Verdau berpr fen Sie das Ger t und sonstige Kontrollvorrichtungen
40. e Sichtkontrolle der Elektropherogramme der unbekannten Probe 1 zeigt dass eine Niveau Basislinie und DNA Sequenzbest tigung nicht erforderlich sind Die Sichtkontrolle des Elektropherogramms f r die unbekannte Probe 2 zeigt zwei Bereiche in denen es m glicherweise Teilungs Spitzensignale gibt und da diese Bereiche der Position den Verdauungsspitzen der positiven Kontrolle entsprechen sollte diese Probe zur DNA Sequenzbest tigung gesandt werden Manuelle Pr fung des MCE Score 1 Resultat Proben mit einem negativen SURVEYOR Scan Resultat aber mit einem MCE Score 1 und einer Ratio von lt 5 sollten manuell analysiert werden da diese Grenzfall Resultate vom Benutzer als falsche negative Resultate interpretiert werden k nnten Das Beispiel von Probe 7 in Abbildung 19 unten illustriert einen solchen Fall Bei der manuellen Analyse weist die Probe zwei Spitzenwerte gerade ber dem Basislinien Rauschen in hnlichen Positionen zu den Kontrollen auf Es ist wichtig festzuhalten dass die Proben 3 6 und 8 9 nicht zwei Spitzenwerte mit hnlicher Amplitude in denselben Positionen wie die Kontrollen aufweisen Abbildung 20 zeigt denselben Probensatz in virtuellem Gelmodus analysiert und deutet auf hnliche Weise darauf hin dass eine Mutation in Probe 7 vorhanden ist Wo solche Proben durch die KRAS Analyse als SURVEYOR Scan negativ bewertet wurden aber die manuelle Analyse auf das Seite 30 von 46 Bedienungsanleitung f r
41. e folgende Tabelle als Anleitung um ein SURVEYOR Nuclease Verdau Master Mix von Mehrfachproben vorzubereiten Das Beispiel unten hat die Volumen f r ein 10 Proben Mastermix Ber cksichtigen Sie dass ein leicht gr erer Mastermix als in dieser Berechnung ben tigt wird um Verluste w hrend des Pipettierens anzurechnen T Anzahl der SURVEYOR Nuclease Verdaureaktionen Volumenberechnung 0 15 M MgCl2 Solution SURVEYOR Enhancer Cofactor uL SURVEYOR Nuclease W F gen Sie jeder PCR amplifizierten Probe pL 5 uL SURVEYOR Nuclease Mastermix hinzu Gesamtvolumen SURVEYOR Nuclease Verdaureaktion a Vor dem Gebrauch jedes Reagenz zentrifugieren HL HL SURVEYOR Enhancer W2 uL UL Mastermix Gesamtvolumen 50 0 Vor dem Pipettieren jedes Reagens leicht vortexen Zentrifugieren Sie nach jedem Vortexschritt leicht 10 Sekunden lang c F gen Sie f r jede Verdauung einem 0 2 mL PCR oder breiteren Mikrozentrifugenr hrchen die folgenden Komponenten hinzu 1 0 uL 0 15 M MgCl2 Solution PN 708027 1 0 uL SURVEYOR Enhancer Cofactor PN 708049 1 0 uL SURVEYOR Enhancer W2 PN 710161 2 0 uL SURVEYOR Nuclease W PN 710160 Oder f gen Sie 5 uL Mastermix hinzu das wie in der Tabelle oben vorbereitet wurde Vortexen Sie den SURVEYOR Nuclease Master Mix 10 Sekunden bei niedriger Geschwindigkeit Zentrifugieren Sie den SURVEYOR Nuclease Master Mix 10 Sekunden bei niedriger Geschwindigkeit Legen Sie den SURVEYOR
42. ehen k nnen beinhalten Codon 12 AGT G12S und GAT G12D Codon 13 AGC G13S GAC G13D und GGT G13G eine stille Mutation Daher wird empfohlen dass all diese Mutationen durch die Duplikatanalyse f r dieselbe genomische DNA best tigt oder dass alle Proben ab Analysebeginn der Duplikatanalyse unterzogen werden Amplifikationsprotokoll 1 Die vorgemischte dNTP L sung PN 703065 von Transgenomic wird in einer Gebrauchskonzentration von 10 mM Gesamtdeoxynucleotid je 2 5 mM der vier Deoxynucleotide geliefert Die Exon 2 Forward und Reverse PCR Primer PN 710155F und 710155R werden bei 10 uM geliefert Nehmen Sie die 10 uM Primer 10 mM vorgemischte dNTP L sung und den DNA Polymerase 10X PCR Buffer PN 703315 aus dem Gefrierschrank und lassen Sie alles auf Eis auftauen Nach dem Auftauen geben Sie alle Kit Komponenten in den Vortexierer 10 Sekunden um sorgf ltig zu mischen zentrifugieren Sie kurz 10 Sekunden um zu gew hrleisten dass keine Fl ssigkeit auf den Beh lterdeckeln bleibt und legen Sie sie auf Eis Bereiten Sie auf Eis den Master Mix vor Bereiten Sie den Master Mix f r KRAS Exon 2 anhand der folgenden Tabelle vor Anzahl der Reaktionen 11067 Volumenberechnung DNA Polymerase 10X PCR Buffer pL 50 anso OO o KRAS Primer Exon 2 Forward p 25 KRAS Primer Exon 2 Reverse u 25 10 DNA Polymerase uL Mastermix Gesamtvolumen Volumen hinzuzuf gender extrahierter
43. ektrophorese oder durch die WAVE MCE System Analyse um sicherzugehen dass es eine einzelne Spezies der erwarteten L nge ist Seite 39 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System Problem 3 Keine Spaltprodukte bei der Analyse nach SURVEYOR Nuclease Behandlung der Heteroduplices Keine Spaltprodukte MOGLICHE LOSUNG URSACHE Anteil an Test anhand der Mismatch Ziel Kontrollen berpr fen zu gering Position Ineffiziente F hren Sie das PCR und ee Bildung von Hybridisierungsverfahren Heteroduplices genau nach Anleitung durch Verwenden Sie bei den SURVEYOR To Te Ta eo ee Tr Nuclease Verdauungen t f 4 Frisch hybridisierte DNA Inaktive F hren Sie eine Reaktion Untere Marker Ungeschnittener Marker Homoduplex Peak Oberer SURVEYOR mit Kontrollen durch um Nuclease die Enzymleistung zu verifizieren Verwenden Sie nur frisch zubereitetes SURVEYOR Nuclease Master Mix Anmerkung SURVEYOR Nuclease spaltet berwiegend Mismatches in Heteroduplices Das Verh ltnis von Heteroduplex zu Homoduplex in der hybridisierten Probe bestimmt das Verdauungssignal in der SURVEYOR Nuclease Wenn die KRAS Mutation in einer sehr geringen Konzentration in der genomischen DNA Probe vorliegt kann das Signal f r ein positives Ergebnis zu niedrig sein Es ist wichtig darauf zu achten dass der Hybridisierungsschritt im Thermocycler Programm enthalten ist siehe Amp
44. em Schritt 1 Vorbereiten der PCR Amplikons aus mutanter Test und normaler Referenz DNA Anschlie end an den letzten PCR Amplifikationszyklus wird zum Schmelzen s mtlicher Doppelstr nge das PCR Produkt erhitzt und dann zur optimalen Bildung von Hetero und Homoduplices langsam abgek hlt Heteroduplices kommen vor wenn ein Strang einer Wildtyp Sequenz mit einem Strang einer mutanten Sequenz abk hlt Schritt 2 Behandlung des hybridisierten Heteroduplex Homoduplex Gemischs mit SURVEYOR Nuclease SURVEYOR Nuclease schneidet die Hetereroduplex DNA und l sst DNA Fragmente entstehen Die gleichbehandelte Wild Type Referenz DNA dient als Hintergrundkontrolle Schritt 3 Analyse der DNA Fragmente mit dem WAVE MCE System Die Bildung neuer Spaltprodukte aufgrund von einem bzw mehreren Mismatch wird durch die Anwesenheit weiterer Elektropherogramm Peaks angezeigt Die Retentionszeit der Spaltprodukte weist auf die Gr e der Fragmente und daher den Ort des der Mismatches hin Schritt f r Schritt Anleitung Setup Kalibrierung des WAVE MCE Systems Wenn Sie den SURVEYOR Nuclease Objekttr ger auf dem WAVE mce System einstellen nehmen Sie bitte auf das WAVE mce System Bedienungshandbuch Bezug ANMERKUNG Das Objekttr ger Setup mit den Bedienelementen ist f r den Gebrauch der Software f r die Analyse erforderlich Seite 8 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit de
45. ge ist einen Aufruf als SURVEYOR Scan positiv vorzunehmen e entschieden wird ein SURVEYOR Scan Resultat manuell zu ndern Der Vergleich der SURVEYOR Nuclease Verdauungen der unbekannten Probe mit den Verdauungen der positive und Wildtypkontrolle f gt jenen Proben eine zus tzliche Verifizierung hinzu die sequenziert werden m ssen Wenn Proben Verdauungsspitzen auf niedrigem Niveau haben sollten Sie durch DNA Sequenz best tigt werden KRAS Control Wild Type Exon 2 KRAS Ex2 Positive Control Codon 12 KRAS Ex 2 Positive Control Codon 13 Unbekannte Probe 1 Unbekannte Probe 2 Unbekannte Probe 3 Unbekannte Probe 4 Oberer Marker g c S d9 N y Q LLI gt lt gt p E A Ungeschnittenes PCR Fragment SURVEYOR Nuclease Verdauungsfragmente im KRAS Codon 12 und 13 Bereich Unterer Marker Abbildung 17 Ein WAVE mce Gelbild der SURVEYOR Nuclease Verdauungsfragmente im Anschluss an die PCR Amplifikation von KRAS Exon 2 Eine Sichtkontrolle zeigt zwei Teilungsbande in den unbekannten Proben 3 und 4 die den Bandmustern f r die positiven Kontrollen entsprechen Die unbekannte Probe 1 zeigt nur schwache nichtspezifische Bande Die unbekannte Probe 2 kann zwei niedrige Konzentrationsbande entsprechend den positiven Seite 29 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System Kontrollen haben
46. genomic Inc Alle anderen Warenzeichen sind Warenzeichen ihrer jeweiligen Eigent mer 2012 Transgenomic Inc Alle Rechte vorbehalten Gedruckt in den USA Dokumentteilnr 482356 03 DE Seite 46 von 46
47. gramm WNeuanalyse SURVEYOR Scan Hilfe gt ransgenomic dvanang Porsonaissed Motcino 102711001 a copy mit m wo 7 P osition Probenname Analyse Alles zeigen Ausgew hltes zeigen Alles ausw hlen Stornie Zu Vergleich hinzuf gen x Position Probenname Mutationsruf MCE Auswertung Verh ltnis i 5 ma a 3 8 DD o n n s ni on o nlals o o WAVE MCE Size Standard Leiter x x x x At 8t C1 AZ BZ C2 D1 Et F1 Gt H1 D2 E2 F2 G2 H2 WAVE MCE Size Standard Leiter WAVE MCE Size Standard Leiter t ai t i ee WAVE MCE Size Standard Leiter mm E2 WT Pos Control T5F_T5 8R Wildtypkontrolle 2004 m ee a a C12 Pos Kontrolle d A a an m e E2 C13 Pos Control TSF_T5 8R C13 Pos Kontrolle Yl SO amm am e am Ke2 TSF_T5 8R 001 093 SURVEYOR Scan Negativ Ke2 TSF_T5 8R 001 094 SURVEYOR Scan Negativ Ke2 T5F_T5 8R 001 095 SURVEYOR Scan Negativ Ke2 T5F_T5 8R C12 50 Mutant SURVEYOR Scan Positiv CLM BED IR DEREN BR m m au am m u m m E a R Ke2 T5F_T5 8R C12 25 Mutant SURVEYOR Scan Positiv ur m Ke2 T5F_T5 8R C12 10 Mutant SURVEYOR Scan Positiv 6 m Ke2 T5F_T5 8R C12 5 Mutant SURVEYOR Scan Positiv Ke2 T5F_T5 8R C12 2 Mutant SURVEYOR Scan Negativ Ke2 T5F_T5 8R 001 096 SURVEYOR Scan Negativ Ke2 T5F_T5 8R 001 097 SURVEYOR Scan Negativ Intensit t m LM 0 00 13 87 77 24 30 17 12 120 33 62 40 06 173 gt 41 73 7 80 209
48. grenze ng L 0 1 Baseline Subtraktionsparameter Baseline Variationskorrektur i Gr en Eichkurve Gr eneichkurve 2 Punkt zu Punkt 2 rn Abbildung 9 Spitzenanalyse 6 Lassen Sie die spezifische KRAS Analyse laufen und w hlen Sie dazu SURVEYOR Scan KRAS Analyse a Inder KRAS Analyse Dialogbox sind die Default Well Orte f r die Kontrollen die folgenden A1 KRAS Control Wild Type Exon 2 B1 KRAS Exon 2 Positive Control Codon 12 C1 KRAS Exon 2 Positive Control Codon 13 b Wenn der Benutzer diese Kontrollen in andere Quellen als die oben angegebenen setzt w hlen Sie die neuen Offnungspositionen von der Drop down Selektion aus C Geben Sie den Namen des Pr fers ein Dieser Name wird in allen Berichten zusammen mit den SURVEYOR Call Berichten enthalten sein Klicken Sie abschlie end auf die Analyse ausf hren Taste Seite 23 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System KRAS Analyse Drucken Sie auf Analyse starten um ein SURYERY OR Scan durchzuf hren Eson 2 wildtyp Ampulle 21 Codon 12 Ampulle B1 Codon 13 Ampulle C1 Pr fer F hren Sie die Analyse aus L schen Abbildung 10 KRAS Analyse Die Ergebnisse erscheinen auf der SURVEYOR Call Tabelle siehe Abbildung 11 f r ein Beispiel Die m glichen Felder werden in der Tabelle unten beschrieben Probenname Der Name der Pro
49. handlung Hohes Hintergrundrauschen MOGLICHE URSACHE LOSUNG Hohes Nicht optimaler F hren Sie folgende Schritte durch Hybridisierungsschritt 1 Vergewissern Sie sich dass sich die DNA Konzentration im Bereich gt 25 ng uL befindet Wiederholen Sie den Hybridisierungsschritt und achten Sie dabei darauf den Hybridisierungsprozess genau einzuhalten Unterer Oberer berpr fen Sie die Ergiebigkeit Marker Marker und Qualit t der DNA Matrize Homoduplex Peak Produkte Qualit t SURVEYOR Enhancer W2 berpr fen Sie das Ablaufdatum und oder SURVEYOR des Kits Enhancer Cofactor wurden deaktiviert Hinweis Die SURVEYOR Nuclease schneidet gelegentlich bei doppelstr ngigen DNAs bei zuf llig ausgew hlten Gen Orten ein Dies erzeugt nach der Verdauung ein Hintergrundrauschen Diese Aktivit t wird durch den SURVEYOR Enhancer W2 und seinen Kofaktor unterdr ckt ohne ansonsten die Mismatch Spaltreaktionen negativ zu beeintr chtigen SURVEYOR Enhancer W2 und SURVEYOR ENHANCER Cofactor sind in diesem Kit enthalten und sollten immer verwendet werden Wenn dieses Anschneiden weiter eintritt werden kleine Peaks auf dem WAVE MCE System erzeugt Durch Vergleich des Kontrollverdaus von Homoduplices mit dem Probenverdau k nnen diese erkannt und mit der WAVE MCE System Software normalisiert werden Seite 41 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System Problem 5
50. hen Sie mit Proben die nach der PCR Amplifizierung als robuste PCR oder schwache PCR bewertet wurden zur SURVEYOR Nuclease Behandlung und WAVE MCE System Analyse ber Beachten Sie dass mit einem schwachen PCR Aufruf unzureichende DNA f r die Erzeugung aussagef higer Ergebnisse auf der WAVE mce Plattform aber genug DNA f r die Sequenzierung vorhanden sein kann 5 Alle Proben mit einem positiven SURVEYOR Scan Resultat sollten entweder a als KRAS Exon 2 positiv gekennzeichnet werden bzw b f r die DNA Sequenzbest tigung eingesendet werden falls die pr zise Identit t einer Mutation erforderlich ist 6 Es gibt zwei Kategorien von Proben mit einem negativen SURVEYOR Scan Resultat a Proben mit keiner MCE Bewertung werden und einem angegebenen Verh ltnis werden als NVD No Variant Detected keine Variante nachgewiesen bewertet b Proben mit einer MCE Bewertung 1 und einem Spitzenverh ltnis von lt 5 sind Grenzf lle Diese Resultate sollten manuell analysiert werden F r Beispiele sehen Sie in der Manuellen Pr fung des MCE Scores 1 Resultat nach 7 Nach der manuellen Analyse von Proben mit einer MCE Score 1 Ratio lt 5 sollten alle Proben bei denen etwaige SURVEYOR Nuclease Spaltprodukte festgestellt werden f r die Sequenzbest tigung eingesendet werden Proben mit keinen sichtbaren Bereichen sollten als NVD No Variant Detected keine Variante nachgewiesen bewertet werden 8 Bei einer a
51. inem MCE Score 0 Ratio 0 bezeichnet wird Die in diesem Kit enthaltenen Universal Sequenzierungs Primer sollten zur Sequenzbest tigung verwendet werden Der Vorw rts Primer ist PN 710153F Universal Seq Primer 1 und der R ckw rts Primer ist PN 710153R Universal Seq Primer 2 Verfahrensbeschr nkungen Von der Extraktion der formalinfixierten paraffineingebetteten Proben bertragene Kontaminierungsstoffe k nnen ebenfalls PCR Amplifikations und SURVEYOR Nuclease Verdauungsvorg nge st ren Die in der Qualit tskontrolle der PCR Produkte beschriebenen Verfahren zur Qualit tskontrolle gew hrleisten dass die extrahierte DNA zur Verwendung mit diesem Kit geeignet ist Dieses Kit wurde f r die Verwendung mit formalinfixierten paraffineingebetteten Biopsieproben von Kolorektaltumoren validiert Eine Validierung f r eine Verwendung mit anderen Krebsarten oder frischen bzw tiefgefrorenen Biopsieproben besteht nicht Zur Fehlersuche nicht standardm iger Ergebnisse und Einzelheiten zu Faktoren die diesen Test beeintr chtigen k nnen siehe Anhang Fehlersuche weiter unten Bei diesem Kit muss besonders darauf geachtet werden bertragung und Kreuzkontamination zu vermeiden Die hohe Empfindlichkeit der Testmethode erfordert Vorsichtsma nahmen f r folgende Punkte e Achten Sie darauf dass alle Proben so gehandhabt werden dass eine Kreuzkontamination zwischen ihnen nicht vorkommt e Arbeiten Sie in einer PCR Workstati
52. kzeptablen Best tigungsanalyse sollten eines der folgenden Resultate zutreffen a Wildtyp Sequenz d h No Variant Detected keine Variante nachgewiesen NVD oder b Variante nachgewiesen Variant detected Wenn die Sequenzbest tigung eine Basis nderung in Position 1 oder 2 von Codon 12 bzw 13 anzeigt kann eine Mutation Anderung in Aminos ure d h KRAS Aktivierung bewertet werden C Wenn die Sequenzbest tigung eine nderung in Basis Position 3 von Codon 12 bzw 13 anzeigt ist eine stille Mutation vorhanden Laut Definition ndert eine stille Mutation die Aminos ure des KRAS Proteins nicht und wirkt daher als Wild Type Protein 9 Wenn bei der Sequenzbest tigung kein berichtenswertes Ergebnis gefunden werden kann a Wiederholen Sie die PCR wenn noch ausreichend genomische DNA vorhanden ist b Extrahieren Sie erneut DNA aus FFPE dies muss die zweite Wahl sein da es normalerweise nicht w nschenswert ist einen FFPE Block nachzuschneiden Anmerkung Es ist m glich einen positiven SURVEYOR Scan Abruf zu haben aus dem auch No Variant Detected keine Variante festgestellt aus der Sequenzbest tigungspr fung hervorgeht Das Erfassungsniveau LOD der SURVEYOR Nuclease auf WAVE MCE ist so niedrig wie 2 Mutant in 98 Wildtyp DNA f r einige Mutationen wohingegen das Sequenzierungs LOD circa 10 25 Mutant in 90 75 Wildtyp DNA betr gt Anmerkung Positive SURVEYOR Scan Resultate k nnen sich
53. l SURVEYOR Nuclease Verdau und Analyse des KRAS Exon 2 CE IVD mit der SURVEYOR Nuclease ES WIRD PERSONEN DIE DIESEN TEST ERSTMALS AUSF HREN DRINGEND EMPFOHLEN ZUN CHST TESTS MIT KONTROLLEN DURCHZUF HREN BEVOR SIE GENOMISCHE PROBEN BEARBEITEN Interpretation der Ergebnisse Analyse des KRAS Exon 2 mit der SURVEYOR Nuclease Beachten Sie dass Sie zu Vergleichs und Kontrollzwecken den SURVEYOR Nuclease Verdau IMMER mit Kontroll Wildtyp und Positivkontrollen und Proben DNAs und auf derselben Platte auf dem WAVE MCE System testen Im SURVEYOR Nuclease Verdauungsstadium liefern die Amplikons dieser Kontrollpflasmid DNAs eine effektive berpr fung ob die Bedingungen der Spaltungsreaktion SURVEYOR Nuclease Gemischvorbereitung und Inkubationsbedingungen zufriedenstellend waren Im Analysestadium liefern das WAVE MCE System Spuren dieser verdauten Kontrollamplikons der SURVEYOR Nuclease eine Hilfe dabei wo die DNA Fragmente aus der Spaltung an den Mutations Mismatch Stellen in Codon 12 und 13 auch auf niedrigen Ebenen eluieren siehe Abbildungen 19 20 Wenn die PCR Amplikons oder die aus den Kontrollplasmid DNAs stammenden SURVEYOR Nuclease Spaltungsfragmente nicht den erl uterten Ergebnissen entsprechen sehen Sie in der Anlage Fehlersuche nach oder setzen Sie sich mit dem Kundendienst von Transgenomic in Verbindung bevor Sie weitere Schritte der Probenanalyse durchf hren Die Beispiele unten dienen nur zu Demonstratio
54. ldung 15 erscheint W hlen Sie den gew nschten Bericht und klicken Sie auf Vorschau um den Bericht vor dem Drucken anzusehen Dr cken Sie auf die Drucken Taste um den Bericht zum Drucker zu senden Den en as gt Ts Alle Probe Seite Bereich 120 Probe Seite 24 Probe Seite se ae erai Alles 12 Probe Seite Elektropherogramm Gel Bild Ergebnisliste Gel Bild 1 Probe Seite berlagern Sie die ausgew hlten Daten Andere Ausgew hlt E Abbildung 15 Druckdialog Abbildung 16 zeigt ein Beispiel eines berlappungs Elektropherogramm Berichts mit einer Zusammenfassung von Analyseresultaten des SURVEYOR Scans ogramm Analysiere Daan Migratiorsze Abbildung 16 berlagerungs Elektropherogramm Bericht Seite 28 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System Manuelle Pr fung von WAVE MCE Gelbildern und Elektropherogrammen Der Pr fer sollte die Gelbilder und Elektropherogramme f r alle Proben als eine zus tzliche Verifizierung visuell kontrollieren und dazu das Verfahren der KRAS Analyse Software befolgen Dies ist besonders wichtig wenn e ein negatives SURVEYOR Scan Resultat mit einem MCE Score 1 und einer Ratio von lt 5 vorliegt Solche Bewertungen k nnen auf eine sehr niedrigstufige Mutation hinweisen wobei aufgrund von Basislinien Rauschen die Software nicht in der La
55. ldung 21 Sequenzanalyse der Proben 6 und 7 aus Abbildung 19 Die Proben 6 und 7 aus Abbildung 19 wurden durch DNA Sequenzierung weiter analysiert Wie die manuelle Analyse der WAVE mCE Spuren und die virtuelle Gelanalyse bereits vermuten lie en handelt es sich bei Probe 6 um einen vollst ndigen Wildtyp w hrend Probe 7 eine KRAS G13D Mutation enth lt Fehlercode W 01 Manuelle Pr fung Wenn ein Fehlercode W 01 von SURVEYOR Scan Aufrufen angezeigt wird sollte der Benutzer das WAVE MCE Elektropherogramm und Gelbild der Probe berpr fen um festzulegen ob die Spitzen Bande des oberen und unteren Markers und das ungeschnittene Homoduplex PCR Spitze Band in den positive Kontrollen und auch den Proben angeglichen sind Wenn diese Spitzen Bande korrekt angeglichen sind und die Gelbilder und Elektropherogramme der positiven Kontrollen zeigen dass die Spitzen ein 0 6 mV Signal ber dem Hintergrundpegel der Umgebungsspitzen haben kann der Benutzer visuell die SURVEYOR Nuclease Verdauungsmuster der Proben mit denen der positiven Kontrollen vergleichen Diese Proben die den Verdauungsmustern der positiven Kontrollen hnlich sind siehe Abbildung 18 sollten als positiv betrachtet werden und zur Sequenzbest tigung gesandt werden Wenn der Benutzer denkt dass eine Probe vielleicht ein hnliches Verdauungsmuster als die der positiven Kontrollen hat sollte diese Probe als unbekannt angesehen und zur Sequenzbest tigung gesan
56. len indem er die MCE Auswertung und ihre dazugeh rige Ratio f r jede Probe mit der der Exon 2 Kontrollen vergleicht Die Ratio wird als die Summe der mutanten Spitzenh hen geteilt durch die H he der ungeschnittenen Exon 2 Wildtyp Spitze definiert Die Ratio wird nur f r jene Proben berechnet und angezeigt die einen SURVEYOR Call haben Als Unbekannt bezeichnete Proben haben weder eine MCE Auswertung noch eine Ratio Seite 25 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System Position Probenname Analyse Position Probenname x1 WAVE MCE Size Standard E2 WT Pos Control TSF_T5 8R E2 C12 Pos Control TSF_T5 8R E2 C13 Pos Control TSF_T5 8R Mutationsruf Fe Nn Tre Tr nn AA 497 Leiter Wildtypkontrolle C12 Pos Kontrolle C13 Pos Kontrolle TEN A e M in MCE Auswertung Verh ltnis gt J 15 7 Ke2 TSF_T5 8R 001 093 SURVEYOR Scan Negativ 0 Ke2 TSF_T5 8R 001 094 SURVEYOR Scan Negativ 0 Ke2 TSF_T5 8R 001 095 SURVEYOR Scan Negativ 0 Ke2 T5SF_T5 8R C12 50 Mutant SURVEYOR Scan Positiv 97 22 Ke2 TSF_T5 8R C12 25 Mutant SURVEYOR Scan Positiv 34 14 Ke2 T5F_T5 8R C12 10 Mutant SURVEYOR Scan Positiv 67 7 Ke2 TSF_T5 8R C12 5 Mutant SURVEYOR Scan Positiv 24 3 Ke2 TSF_T5 8R C12 2 Mutant SURVEYOR Scan Negativ 1 2 Ke2 TSF_T5 8R 001 096 SURVEYOR Scan Negativ 0 Ke2 TSF_T5 8R 001 097 SURVEYOR Sc
57. lifikationsprotokoll um die Leistung der Heteroduplexbildung zu optimieren Heteroduplices werden bei Standard PCR Reaktionen mit sehr geringem Ertrag gebildet Anmerkung Der Signal Rausch Abstand ist im Allgemeinen hoch genug um Mutationen mit einem geringeren Prozentsatz der Gesamt DNA Matrize nachzuweisen Es ist m glich bis 2 mutante DNA zu detektieren Die Abbildungen 19 20 zeigen die Detektion der Mutationen KRAS Exon 2 Codon 12 und 13 4 10 Heteroduplex mit einem WAVE MCE System Abbildung 2 zeigt die mit Homoduplex und Heteroduplex KRAS Positivkontroll DNAs in diesem Kit enthalten generierten Verdauungsprodukte auf einem WAVE MCE System Die mutationsspezifischen Schaltprodukte sind deutlich als zwei neue Peaks zu erkennen die mit der erwarteten L nge eluiert wurden die anhand des DANN L ngenstandards berechnet werden k nnen Achtung Im Handel erh ltliche PCR Puffer variieren extrem in ihrer Zusammensetzung und die Zubereitungen werden durch den Hersteller oft nicht genau bezeichnet Mehrere Puffer sind aufgrund von pH oder Zusatzstoffen Tensiden oder anderen herstellereigenen Inhaltsstoffen mit der SURVEYOR Nuclease NICHT kompatibel Verwenden Sie KEINE andere als die im Kit enthaltenen n Polymerase oder 10X Polymerase Puffer Seite 40 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System Problem 4 Hohes Hintergrundrauschen nach SURVEYOR Nuclease Be
58. lyse DD Position Probenname Mutationsruf MCE Auswertung Verh ltnis WAVE MCE Size Standard Leiter E2 WT Pos Control TSF_T5 8R Wildtypkontrolle E2 C12 Pos Control TSF_T5 SR C12 Pos Kontralle 15 E2 C13 Pos Control T5F_T5 8R C13 Pos Kontrolie 7 Ke2 T5F_T5 8R 00 1 093 SURVEYOR Scan Negativ 0 Ke2 T5F_T5 8R 00 1 094 SURVEYOR Scan Negativ Ke2 T5F_T5 8R 001 095 SURVEYOR Scan Negativ Ke2 T5F_T5 8R C12 50 Mutant SURVEYOR Scan Positiv Ke2 T5F_T5 8R C12 25 Mutant SURVEYOR Scan Positiv Ke2 T5F_T5 8R C12 10 Mutant SURVEYOR Scan Positiv Ke2 TSF_T5 8R C12 5 Mutant SURVEYOR Scan Positiv Ke2 TSF_T5 8R C12 2 Mutant SURVEYOR Scan Negativ Ke2 TSF_T5 8R 001 096 SURVEYOR Scan Negativ E2 Ke2 T5F_T5 8R 001 097 EYOR Scan Negativ F2 Ke2 T5F_T5 8R 001 098 ERRANG Gele Reel SURVEYOR Scan Positiv G2 Ke2 T5F_T5 8R 001 099 Unbekannt H2 Ke2 T5F_T5 8R 001 100 LEtS A3 Ke2 T5F_T5 8R 001 101 SURVEYOR Scan Negativ B3 Ke2 TSF_T5 8R 001 102 SURVEYOR Scan Negativ me Zen Tre Tr nm ANAA anaon NAAA a Mio amn o 22 14 7 3 2 nn 00 DN eN O 1 9 0 0 m 0 10 10 Im 3 J 1n Abbildung 13 Pr fer nimmt eine Ver nderung am SURVEYOR Aufruf vor Position Probenname Analyse Position Probenname Mutationsruf MCE Auswertung Verh ltnis WAVE MCE Size Standard Leiter E2 WT Pos Control TSF_TS 8R Wildtypkontrolle E2 C12 Pos Control TSF_T5 8R C12 Pos Kontrolle 15 E2 C13 Pos Control TSF_T5 8R C13 P
59. m Die WAVE MCE Viewer Applikation ffnet sich wie in Abbildung 5 gezeigt eg ransgenomic Alles zeigen Aussew hltes zeigen Alles ausw hlen Stornieren Alles l schen zuf gen x t Aer E55 EEE BI OR OO00000000000 oOoOo00000000060 O0O000000000060 OO0O00000000000 O0O0000000000 OoO0000000000 O000000000060 OO0O0000000000 x OO0000000000 j Spitzenwerttabelle einzeln Abbildung 5 WAVE Mce Viewer 3 ffnen Sie die Injektions MLT Datei im WAVE mce Viewer W hlen Sie Datei gt ffnen W hlen Sie dann die gew nschte Datei und dr cken Sie auf die Taste Offnen Suchenin OMAHAmlt 02r m S Name nderungsdatum Typ 102711001 9 24 2012 2 25PM MuktiNA I 2 102711001 a copy 9 25 201212 57 PM MultiNA 102711001 a copy 1 9 24 2012 3 24 PM _MultiNA 102711001 a copy 1 1 9 24 2012 3 24 PM _MultiNA N 102711001 a copy 3 9 25 201212 53 PM MultiNA Bibliotheken iMa Computer 4 Dateiname 102711001 v Datetyp Projekt Surveyor_Scan Trennpuffer DNA 500 endatei Kommentar Menarini Samples T5F_T5 8R primers 102711 102711001 Bu DAS S Seeman 1 X1 1 WAVE eT 4 2 X1 2 WAVE MCE 3 X1 3 WAVE MCE 4 X1 4 WAVE MCE 5 A1 E2WT PosC 4 6 B1 E2C12 PosC MC1 E2C13 PosC 8 A2 Ke2 T5F_T5 MR Ke T5F me Netzwerk Abbildung 6 MLT Dateidialog ffnen Seite 21 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYO
60. m WAVE McE System berlegungen vor Beginn der KRAS Probenanalyse Bevor Sie Proben auf dem WAVE MCE System laufen lassen muss der WAVE MCE Optimized DNA Size Standard laufen Es muss jeder im System geladene Mikrochip verwendet werden um zu garantieren dass das WAVE MCE System einwandfrei l uft Das Laborpersonal das das Instrument verwendet sollte die Qualit t des WAVE MCE Optimized DNA Size Standard pr fen siehe WAVE MCE System Bedienungshandbuch berlegungen zu den Matrizen 1 Verwenden Sie f r die FFPE isolierte Matrizen DNA die blichen Labortechniken um die Qualit t und Quantit t der extrahierten DNA zu bewerten und um zu gew hrleisten dass f r die PCR eine amplifizierbare Matrize vorhanden ist Das 260 280 Absorptionsverh ltnis muss gr er als 1 80 sein Um das PCR Setup zu beschleunigen regeln Sie die Gebrauchskonzentration der Matrize auf ungef hr 12 5 ng uL Verd nnen Sie ggf die Matrizen DANN mit hochreinem Wasser f r die Molekularbiologie Primerdesign 1 Die Sequenzen der in diesem Kit gelieferten Primer sind wie folgt Forward aggaaacagctatgaccatTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAA Reverse tgtaaaacgacggccagtTGCATATTAAAACAAGATTTACCTCTATTG Universal Seq Primer 1 aggaaacagctatgaccat Universal Seq Primer 2 tgtaaaacgacggccagt ANMERKUNG Die KRAS Exon 2 Primer haben Universal Sequenzierungsschw nze wie in Kleinschrift angegeben Die Amplikonsequenz ist wie folgt a Die binden
61. n Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE MCE System k nnen 100 Reaktionen getestet werden Die Gesamtprobenanzahl h ngt von der Gr e der jeweiligen durchschnittlichen Seriengr en zu testender Proben ab da mit jeder Probenserie jeweils ein Satz Kontrollen getestet werden muss In der nachstehenden Tabelle ist die Anzahl Proben aufgef hrt die mitdem KRAS Kit je nach durchschnittlicher Seriengr e getestet werden k nnen Die Berechnung beruht auf der Basis dass a jede Serie 4 Kontrollen ben tigt und b jedes Kit f r 100 Reaktionen ausgelegt ist Mit Ansteigen der Seriengr e erh ht sich auch die Anzahl der Proben die insgesamt getestet werden k nnen was die durchschnittlichen Reagenzienkosten je Probe reduziert Seriengr Anzahl der Tests La Gesamttestl Getestete Be KONTONR uf ufe Kit Proben Kit Probenamplikons DNA Sequenzierung EEE ee BEL BEE Le T BEE Sequenzierungsprimer PN 710153F und 710153R werden auf Wunsch f r die DNA Sequenzierung aller getesteten Proben geliefert Die vor der SURVEYOR Nuclease digestion geschaffenen PCR Amplikons sollten f r die Sequenzierung verwendet werden Zus tzlich erforderliche Ausr stung und Reagenzien Folgende Komponenten bzw Ausr stungen sind f r die Verwendung des SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE mcE System zus tzlich erforderlich WAVE MCE System PN MCE 99 2020B WAVE MCE Optimized Microchip PN MCE 99 3600 WA
62. n Sie die Platte auf Eis F gen Sie in den entsprechenden N pfchen 2 0 uL siehe Anmerkung oben in Schritt 6 der Probenmatrizen DNAs oder Wasser keine Matrizenkontrolle NTC hinzu Verwenden Sie Pipettenspitzen f r jede Probe und vermeiden Sie die Kreuzkontamination durch Verspritzen Verschlie en Sie die Wells mit den Proben DNAs und dem NTC mit dem 8 Verschlussstreifen bei Verwendung einer 96 N pfchen Platte bzw die 0 2 mL PCR Reaktionsgef e mit ihren Deckeln Vergewissern Sie sich dass die Deckel fest verschlossen sind ffnen Sie erst dann die DNA Kontroll Matrize des Kits PNs 710141 710143 710144 Pipettieren Sie diese Kontrollmatrizen als letzte um das Risiko Proben DNA zu kontaminieren zu senken Verschlie en Sie jedes N pfchen wieder mit den 8 Verschluss Streifen wenn Sie eine 96 N pfchen Platte verwenden schlie en Sie die 0 2 mL PCR R hrchen mit dem Deckel Vergewissern Sie sich dass die Deckel fest verschlossen sind ANMERKUNG Wenn Sie die Matrize der WAVE MceE Platte verwenden gehen die Kitkontrollen in die N pfchen A1 B1 und C1 Setzen Sie die Nicht Matrizenkontrolle NTC in N pfchen H12 Vortexen Sie 1 2 Geschwindigkeit 10 Sekunden lang Zentrifugieren Sie 1 2 Minuten lang um zu garantieren dass alle L sungen auf dem Boden der N pfchen oder R hrchen gesammelt werden Vergewissern Sie sich dass alle L sungen auf dem Boden jedes N pfchens oder R hrchens sind Wenn dies nicht der Fall is
63. n f r diese Probe nicht fortgef hrt werden Der als Leiter verwendete Gr enstandard entsprach den Betriebsparametern nicht Die Analyse kann nicht durchgef hrt werden Der die Peak s f r die Exon 2 WildTyp Kontrolle eignet eignen sich nicht f r die Analyse Er verf gt entweder ber einen untypischen Peak oder Migrationsindex Es kann keine KRAS Analyse der Proben durchgef hrt werden Seite 43 von 46 berpr fen Sie das WAVE MCE System indem Sie die Ger tefunktion Analyseleistung berpr fen ausf hren Sehen Sie auch nochmals im Abschnitt Manuelle berpr fung von WAVE mce Gel Bildern und Elektropherogrammen nach um die Resultate manuell auszuwerten bzw im Anschluss daran im Abschnitt SURVEYOR Scan Aufruf Verfahren Schritt 8g um einen Aufruf zu ver ndern falls einer der beiden Marker die Kriterien f r den SURVEYOR Scan Aufruf nicht erf llt berpr fen Sie die ordnungsgem e 10 fache Verd nnung des WAVE MCE Optimized Size Standard berpr fen Sie das Ger t und sonstige Kontrollvorrichtungen Falls dies zu keinem Ergebnis f hrt wiederholen Sie PCR und den SURVEYOR Nuclease Verdau Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System Gr meaa Tennngsermin hei EO fe la m en nen 0 Mn o ung W 09 W 10 W 11 Ung ltige Positivkontrolle Ung ltige Positivkontrolle Fehlende Kontrolle Exon 2 Wil
64. nen Validierungsuntersuchungen haben eine extrem hohe bereinstimmung mit der Sequenzierung von gut untersuchten kolorektalen Tumorproben gezeigt Durch die Verwendung des SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD reduziert sich f r den Anwender die Sequenzierungsarbeit und erm glicht dar ber hinaus aggressive Sequenzzuordnung wo eine automatische Sequenzierungssoftware eine Mutation oft nicht kl ren kann SURVEYOR Nuclease Die SURVEYOR Nuclease von Transgenomic ist eine mismatch spezifische Pflanzen DNA die Heteroduplex DNA auf bekannte und unbekannte Mutationen und Polymorphismen durchsuchen kann Das Enzym schneidet mit hoher Spezifizit t einen DNA Doppelstrang an Stellen wo durch einen Basenaustausch oder andere Sequenzver nderungen Basen nicht miteinander paaren k nnen Diese DNA Nuclease spaltet beide Str nge eines DNA Heteroduplex am 3 Ende der Mismatch Stelle Insertions Deletion Mismatches und alle Basenaustausch Mischmatches werden erkannt aber die Spaltungseffizienz variiert mit der Mismatch Sequenz Location of mismatch Mi h ll ismatch Stelle Wirkungsweise der SURVEYOR Nuclease Die Endonuclease erkennt ein Mismatch und spaltet am 3 Ende der Mismatch Basen Damit wird der DNA Doppelstrang gespalten was 3 einen einzigen 3 f Resulting fragments sy Resultierenden Fragmente a n hinterl sst 3 5 Abbildung A Die SURVEYOR Nuclease wurde in einer ganzen Reihe von Projekten eingesetz
65. nszwecken und d rfen NICHT verwendet werden um die Identit t einer gegebenen Mutation festzulegen Die Best tigung der Identit t einer Mutation ist erforderlich um eindeutig die Pr senz einer spezifischen Basis nderung in Codon 12 oder 13 des KRAS Gens zu bestimmen Seite 17 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System SURVEYOR Nuclease spaltet an allen Mismatches die sich aus der Heteroduplex Bildung zwischen Wildtyp und mutanten DNAs und nicht nur Mutationen in Codon 12 und 13 ergeben Die SURVEYOR Nuclease best tigt dass ein Mismatch pr sent ist Falls die mutationsspezifische Basis nderungsidentit t f r Berichtszwecke erforderlich ist muss die Best tigung durch eine andere Methode wie zum Beispiel Sequenzierung erfolgen Beispielergebnisse Beispiele von Ergebnissen mit dem SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE MCE System zeigt die Abbildung 2 unten F r diese Beispiele wurde der in dem Abschnitt bersicht beschriebene Prozess genau eingehalten or 7 50 KRAS G13D Mutation 50 KRAS G12S Mutation Wildtyp Kontrollel gespaltenes 190 bp G13D Ausbeute 77 und 113 bp Amplikon em J Oberer r nterer Mark E Miia Marker A 1E N aa i ME j I N N j J j i 2 f j r eg i Pa nn O eA ik A Na G12S Ausbeute N 73 und 117 2 I an Fragmente Hf 40 s0
66. ntnahme Handhabung und Lagerung uus02420400000nnennnnnnnnennnnnnennennnnnn nenne 7 TESIVerlankeneae een ne NR Ei PE E E 8 Somatischer Mutationsnachweis mit SURVEYOR Scan Kits Ein berblick 8 Selup Kalibrierung des WAVE MCE Systems uansenunsniin 8 berlegungen vor Beginn der KRAS Probenanalyse sscscissseiisriaii ieina an 9 Uberlegungen zu den Matrizen an ee einen 9 PUMETOO SION es ee a a 9 berlegungen zum Arbeitsablauf uuus00200400000n0ennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnennnennnnnnnnnennnnnnnnnnnnnnennnenn 10 AmplfikationsprotoKoll sn ea arena 12 Thermalcycler Programm f r Amplifikationsprotokoll 2uu004244000BRennnRRnennn ne nnnnnn nennen 14 Qualit tskontrolle der PER Produkte en a 14 SURVEYOR Nuclease Verd u u Bun eia EA EE aR ATENa RR 14 KOnTOlVernah eN asea een eier ee 16 Qualit tskontrolle des SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD 16 Verwendung der KRAS Kontrollplasmid DNAs 2200000402400000000nnnnnnnnennnnnnnnennnnne nennen 16 Interpretation der Ergebnisses esse ee 17 Analyse des KRAS Exon 2 mit der SURVEYOR Nuclease uuus02202400snnnennnnnennennnnee nennen 17 BEISPIEIETGEBNISSE nn ea genen eh Aa E 18 SURVEYOR Sean Aufruflverlahren en er 19 Manuelle Pr fung von WAVE MCE Gelbildern und Elektropherogrammen u0222200s2nnee neo 29 Manuelle Pr fung des MCE Score 1 Resul
67. ntrifugenr hrchen f r den vorbereiteten Master Mix F gen Sie diesem 2 0 mL Zentrifugenr hrchen mit der Beschriftung Master Mix das erforderliche Volumen hochreinen Wassers f r die Molekularbiologie hinzu F gen Sie dem Master Mix R hrchen die erforderliche Menge DNA Polymerase 10X PCR Buffer hinzu F gen Sie dem Master Mix R hrchen das erforderliche Volumen der 10 0 mM vorgemischten ANTPs Gebrauchsl sung hinzu F gen Sie dem Master Mix R hrchen das erforderliche Volumen KRAS Primer Exon 2 Forward hinzu F gen Sie dem Master Mix R hrchen das erforderliche Volumen KRAS Primer Exon 2 Reverse hinzu Nehmen Sie die DNA Polymerase PN 703310 aus dem Gefrierschrank Zentrifugieren Sie die DNA Polymerase f r 10 Sekunden Mischen Sie die DNA Polymerase f r 10 Sekunden mit dem Vortexer F gen Sie dem Master Mix Zentrifugenr hrchen das erforderliche Volumen DNA Polymerase hinzu Schlie en Sie das Master Mix Zentrifugenr hrchen mit dem Deckel Mischen Sie vor dem Gebrauch das Master Mix Zentrifugenr hrchen 30 Sekunden mit dem Vortexer und zentrifugieren Sie es dann kurz 10 Sekunden lang Lagern Sie es bis zum Gebrauch auf Eis Pipettieren Sie 48 0 uL siehe Anmerkung oben in Schritt 6 Master Mix in die entsprechenden Wells Wechseln Sie bei Verwendung einer Einkanalpipette jedes Mal die Spitze Wenn Sie eine Dispenserpipette verwenden achten Sie darauf dass von Well zu Well nichts verspritzt wird Halte
68. on oder in einem anderen passenden Raum wo der Arbeitsbereich vor dem Setup PCR Amplifikationsreaktionen UV Licht ausgesetzt werden kann e Verwenden Sie eine getrennte PCR Workstation oder Raum um die Proben nach der PCR Amplifikation f r die Qualit tskontrolle durch Gel Elektrophorese zu ffnen e Das SURVEYOR Nuclease Verdauungs Setup sollte in einem getrennten Raum bzw an einer anderen Workstation als der durchgef hrt werden in der das Anfangs PCR angelegt wurde e Achten Sie darauf dass bei allen Testschritten die Plasmidkontrollen des Kits von den Testproben getrennt gehandhabt werden o Stellen Sie sicher dass alle L sungen Nicht Vorlage Kontroll und Proben DNA Kavit ten verschlossen waren bevor Sie die R hrchen mit der Kontrollplasmid DNA ffnen o BEARBEITEN SIE DIE KONTROLLEN ZULETZT F gen Sie den passenden R hrchen Kontrollplasmid DNA hinzu NACHDEM ALLE Nicht Vorlage Kontroll und Proben Kavit ten verschlossen wurden o Wischen Sie ALLE R hrchen und Kappen nach dem Verschlie en der Kontroll DNA R hrchen mit einem DNA Zerst rungsmittel ab z B 10 Bleichmittel bevor Sie sie in einen anderen Bereich bringen e Achten Sie darauf dass es beim Pipettieren in die 96 Kavit ten Platten durch Verspritzen w hrend des Mischens oder durch nicht gewechselte Pipettenspitzen nicht zu einer Kontamination der Proben mit angrenzenden Kavit ten kommt Seite 36 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR
69. os Kontrolle 7 Ke2 TSF_T5 8R 001 093 SURVEYOR Scan Negativ 0 Ke2 T5F_T5 8R 00 1 094 SURVEYOR Scan Negativ Ke2 TSF_T5 8R 001 095 SURVEYOR Scan Negativ Ke2 T5F_T5 8R C12 50 Mutant SURVEYOR Scan Positiv Ke2 T5F_T5 8R C12 25 Mutant SURVEYOR Scan Positiv Ke2 TSF_T5 8R C 12 10 Mutant SURVEYOR Scan Positiv Ke2 TSF_T5 8R C12 5 Mutant SURVEYOR Scan Positiv Ke2 T5F_T5 8R C12 2 Mutant SURVEYOR Scan Negativ Ke2 T5F_T5 8R 001 096 SURVEYOR Scan Negativ E2 SURVEYOR Scan Negat F2 Ke2 T5F_T5 8R 001 098 SURVEYOR Scan Negativ G2 Ke2 TSF_T5 8R 001 099 SURVEYOR Scan Negativ H2 Ke2 TSF_T5 8R 001 100 SURVEYOR Scan Negativ A3 Ke2 T5F_T5 8R 001 101 SURVEYOR Scan Negativ B3 Ke2 T5F_T5 8R 00 1 102 SURVEYOR Scan Negativ mn Fen Tr Tr nn ANa nn m MUYA O ee M rs e S lo lo 22 14 7 3 2 u 0 AN 1 ojo jo ejo oo gt J yon Abbildung 14 Am SURVEYOR Aufruf vorgenommen Ver nderung 9 Der SURVEYOR Aufruf und die MCE Score erscheinen in den folgenden Berichten a 120 Proben Seite Probenblatt b 24 Proben SeiteProbenblatt Seite 27 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System C d e 12 Probe Seite Elektropherogramm Gelbild 12 Probe Seite Ergebnistabelle Gelbild 1 Probe Seite Elektropherogramm Ergebnistabelle berlappung Elektropherogramm Zum Erstellen eines Berichts w hlen Sie Datei Drucken Das Druckdialogfenster Abbi
70. rzellen Au erdem ist der Tumor an sich eine heterogene Mischung von Tumorzellen mit Mutationen und Tumorzellen ohne Mutationen Da diese somatischen Mutationen nicht gleichm ig auf den Tumor verteilt werden k nnen kann die aus verschiedenen Bereichen desselben Tumors resultierende Mutationsanalyse unterschiedlich sein Um die Wahrscheinlichkeit eine Mutation zu ermitteln zu steigern sollte die DNA aus der Tumorregion des Gewebes isoliert werden indem nur der Tumorbereich von dem Glasobjekttr ger abgeschabt und dazu ein frisches steriles Skalpell f r jeden neuen Objekttr ger verwendet wird F r eine erfolgreiche Verwendung dieses Kits sollte die entnommene DNA den Kriterien entsprechen die in den berlegungen zur Vorlage aufgelistet sind ANMERKUNG Entnommene DNA Proben die mit diesem Kit nicht sofort analysiert werden m ssen bei 20 C bis 80 C gefroren aufbewahrt werden Seite 7 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System Testverfahren Somatischer Mutationsnachweis mit SURVEYOR Scan Kits Ein berblick Nachweis und Best tigung einer Mutation mit der SURVEYOR Nuclease umfasst drei Schritte SURVEYOR Scan Vorscreen in drei einfachen Schritten Schritt 1 PCR DNA Probe verst rken Erhitzen K hlen um Heteroduplices zu bilden Schritt 2 SURVEYOR Nuclease Spaltung Schritt 3 Gr enbasierende Fragmentanalyse auf dem WAVE MCE Syst
71. t wiederholen Sie die Zentrifugation Seite 13 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System Thermalcycler Programm f r Amplifikationsprotokoll 1 Verwenden Sie folgendes Thermocycler Protokoll f r die PCR Amplifikation und Heteroduplex Bildung Initiale j 95 C 30 Sekunden 15 Zykl Do G EE aa 62 C 0 5 C Zyklus 30 Sekunden 25 Sekunden 30 Zyklen 30 Sekunden aa Heteroduplex Bildung Qualit tskontrolle der PCR Produkte 1 Bevor Sie mit dem SURVEYOR Nuclease Verdau fortfahren m ssen Qualit t und Quantit t des Amplikons durch Gel Elektrophorese oder quivalente Mittel gepr ft werden 2 Analysieren Sie ein Aliquot des PCR Produkts zusammen mit mehreren verschiedenen Mengen einer 100 bp DNA Basenpaarleiter Verwenden Sie die Basenpaarleiter um die Konzentration amplifizierter DNA zu berechnen Es sollte nur eine einzige dem Haupt PCR Produkt entsprechende Bande gr er als 20 ng uL verzeichnet werden 5 Falls mehrere Bande vorhanden sind vergewissern Sie sich dass die Qualit t der Eingangsmatrizen DNA ausreichend war siehe Anhang Fehlersuche 6 Falls kein Produkt zu sehen ist vergewissern Sie sich dass die Qualit t der Eingangsmatrizen DNA ausreichend war siehe Anhang Fehlersuche Wenn die Qualit t den Spezifikationen entspricht erh hen Sie das Volumen der Matrize auf 4 0 uL je 50 uL Reaktion verringern Sie d
72. t um in Genen eine Vielzahl von Mutationen und Polymorphismen nachzuweisen Insbesondere wird die SURVEYOR Nuclease verwendet um bekannte Mutationen in einer Reihe von Genen zu best tigen die mit Nieren Lungen Kopf und Halskrebs sowie Leuk mie und Endometriumkarzinom in Verbindung gebracht werden Ebenso wurde das Enzym zur Ergebnisprognose einer Strahlentherapie eingesetzt Das SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD f r WAVE MCE Systeme ist zur Spaltung von Mismatches im KRAS Exon 2 und der anschlie enden Analyse durch die Microchip Kapillarelektrophorese vorgesehen SURVEYOR Nuclease SURVEYOR Nuclease Seite 3 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System Anmerkung F r diesen Test ausschlie lich die mit diesem Kit mitgelieferte DNA Polymerase verwenden Anmerkung Befolgen Sie bitte die spezifischen Anleitungen im WAVE mceE System Schnellhandbuch und das WAVE mce System Bedienungshandbuch Um dieses Kit erfolgreich einzusetzen wird dringend angeraten diese Bedienungsanleitung sorgf ltig durchzulesen und alle darin gegebenen Anleitungen und Richtlinien genau zu befolgen Personen die diesen Test zum ersten Mal durchf hren sollten die in Abschnitt Verwendung der KRAS Kontrollplasmid DNAs beschriebenen Kontrolluntersuchungen durchf hren Falls Sie weitere Fragen haben oder Hilfe ben tigen rufen Sie 888 233 928
73. t es m glich die mutanten 5 10 Sequenzierungs Elektropherogramme f r Codon 12 sicherer zu interpretieren Seite 33 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System Wenn eine Probenanalyse ein positives SURVEYOR Scan Ergebnis zeigt es aber keine durch den Gebrauch der DNA Sequenzierung erfassbare KRAS Mutation gibt empfehlen wir dass keine Variante erfasst aufgezeichnet wird Siehe berlegungen zum Arbeitsablauf f r mehr Details Seite 34 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System KRAS Exon 2 G13D Mutationsniveau von Erfassungs Verd nnungsserien v 50 G13D Positivkontrolle 77 und 113 bp 25 G13D Positivkntrolle SURVEYOR Nuclease 10 G13D Positivkontrolle Unterer Spaltprodukte 5 G13D Positivkontrolle partp A 2 G13D Positivkontrolle Marker 1 G13D Positivkontrolle ETNA Exon 2 Wildtvp kontrolle DET ae Ta N 50 Mutant N Y N N A j N 2 f Ungespaltenes AVMHANAMa j Amplicon mi HH er L nge 190 An N 4 bp Oberer 25 Mutant N N nn N j Marker G G 1 ENT l P e H G A N N N D W 0 Mutant N N wi Y AAN j N J N N VVUAMVAALN MV VNAAJ nn I Tl f a a u 1e TEC ER Tag I T N j N N N Un PR N AM r m 5 Mut
74. tat uuuss2202200ssennennnnennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn nenn 30 Fehlercode W 01 Manuelle Pr fung 0000020040000RRnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn nenn 32 Leistungsmerkmale 2222400002000000000n0onnnnnnnnnnnnnn nennen nnnnnnennennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnennnnnnnnnnnnnnennnnnnennn 33 Nachweisgrenze des SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD 33 KRAS Exon 2 G12S Mutationsniveau von Ermittlungs Verd nnungsserien u 44 gt 33 KRAS Exon 2 G13D Mutationsniveau von Erfassungs Verd nnungsserien 44444 seen 35 SEAUENZbBESLAH HUNG a ee nee ee enreerz 35 Verfahrensbeschr nk ngen u ee 36 EItST AUUEDACHWEI SE ee ee een een nern 37 ARDAN aa a a A A a 38 FENIEISUCHE A a een ee ses ae a 38 Einzelheiten Zur Bestellundg 22 an a n a a e a 45 Ko ntaktdalen aan een en a 46 Lizenzen Handelsmarken amp Copyright 2 242400024000000RRnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnennnennnnnnnnnennnnnnnnnennnnnn 46 Anmerkung In diesem Dokument kann auf alle Kapitel und Abschnittstitel im Inhaltsverzeichnis auf die im Flie text entsprechend Bezug genommen wird leicht zugegriffen werden indem man die STRG Taste gedr ckt h lt und mit der linken Maustaste auf den Titel dr ckt Seite 1 von 46 Bedienungsanleitung f r den SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD mit dem WAVE McE System Hersteller Transgenomic
75. tdaten Unternehmenszentrale Europa wi Transgenomic Inc Autorisierte EU Vertretung 12325 Emmet Street Transgenomic Limited Omaha 40 Watt Road Hillington Park Hillington Nebraska 68164 Glasgow G52 ARY USA Gro britannien Tel 1 402 452 5400 Tel 44 141 892 8800 Fax 1 402 452 5401 Fax 44 141 883 5967 E Mail SURVEYORscan Transgenomic com E Mail SORVEYORscan Transgenomic com ISO 9001 2003 Zertifizierung Transgenomic Inc wendet ein Qualit ts Managementsystem an das den Anforderungen von ISO 9001 2008 wie vom BSI zertifiziert entspricht Zertifizierung FM 538914 www Transqenomic com Transgenomic Advancing Personalized Medicine Lizenzen Handelsmarken amp Copyright SURVEYOR Nuclease Dieses Produkt wurde unter exklusiver Lizenz der US Patente 6 699 980 6 391 557 5 869 245 ihrer ausl ndischen Entsprechungen und weiterer anh ngiger Patente hergestellt F r die Verwendung von SURVEYOR Nuclease ist eine Lizenz von Transgenomic erforderlich Wissenschaftsorganisationen nicht gewinnorientierte und gewinnorientierte Organisationen und Unternehmen verf gen mit dem Kauf dieses Produkts ber beschr nkte Rechte zur Verwendung von SURVEYOR Nuclease f r Forschungszwecke Ein Weiterverkauf bzw eine anderweitige Verwendung sind streng verboten Bitte kontaktieren Sie Transgenomic f r weitere Informationen DNA Polymerase Die Verwendung dieses Produkts ist durch eine oder mehrere der folgenden US Patente sowie z
76. ugeh rige Patentanspr che au erhalb der USA gesch tzt 5 789 224 5 618 711 6 127 155 sowie Anspr che au erhalb der USA zugeh rig zu US Patent Nr 4 889 818 Der Kauf dieses Produkts schlie t ein eingeschr nktes nicht bertragbares Nutzungsrecht dieses Produkts f r den eigenen unternehmensinternen Forschungszweck des K ufers ein Mit Ausnahme der Ihnen gew hrten beschr nkten Lizenz werden Ihnen an Patenten wie den Patentanspr chen f r das 5 Nuclease Verfahren in den US Patenten 5 210 015 und 5 487 972 keinerlei weiteren Rechte zur Anwendung einer der patentierten Methoden und zur Erbringung gewerblicher Dienstleistungen welcher Art auch immer einschlie lich und ohne Beschr nkung der Berichterstattung ber die Resultate der T tigkeiten des K ufers f r eine Geb hr oder eine sonstige wirtschaftliche Gegenleistung gew hrt und zwar gleich ob ausdr cklich stillschweigend oder durch Klagehemmung Dieses Produkt dient ausschlie lich Forschungszwecken F r die diagnostische Verwendung f r welche die Roche Patente gelten ist eine separate Lizenz von Roche erforderlich Weitere Informationen ber den Erwerb von Lizenzen k nnen Sie erhalten indem Sie den Leiter der Abteilung f r Lizenzierung Applied Biosystems 850 Lincoln Centre Drive Foster City California 94404 USA kontaktieren Transgenomic SURVEYOR und WAVE sind eingetragene Warenzeichen und das Helix Logo und Advancing Personalized Medicine sind Warenzeichen f r Trans

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