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Skript Praktikum Biochemie

1. Dissoziationgleichungen S ure HA H20 S A H30 beachte H30 S H H2O Dabei ist HA die S ure und A die konjugierte zugeh rige Base S urerest Base B H20 S BH OH Dabei ist B ist die Base und BH ihre konjugierte S ure pH log H30 pOH log OH Fur Saure Basenpaare gilt dabei pH pOH 14 pH Wert f r starke S uren dissoziiert vollst ndig pH log co S ure pH Wert f r schwache S uren teilw dissoziiert pH pKs log co S ure pH Wert einer L sung des Salzes eine schwachen S ure pH 14 pKs log co S urerest result Base S ure e Stellen Sie folgende berlegung im Allgemeinen an und wenden Sie diese sp ter auf die Aufgabenstellung des nachfolgenden Versuches an x atb y a b x und y sind bekannt gesucht sind a und b e Berechnen Sie im Vorfeld f r Ihr Protokoll welche Menge an Trockensubstanz in destilliertem Wasser gel st werden mu um eine im Versuch gegebene Konzentration zu erreichen Beachte Die Konzentration ist in M gegeben das bedeutet in mol l Die Angabe f r einen Puffer bezieht sich auf die Gesamtkonzentrationen von S ure und konjugierter Base meist S urerest Die molare Masse der Trockensubstanz ist auf ihrem Beh lter in g mol gegeben Das zu mischende Volumen ist im Versuch unten in Millilitern gegeben Welche Trockenmasse in Gramm ben tigen Sie f r Ihr Volumen Recherchieren Sie f r Ihr Protokoll die chemische Struktur der v
2. unter heftiger Bewegung aufgeschlossen werden Ihre Aufgabe besteht darin ADH aus B ckerhefe zu isolieren Stellen Sie hierzu f r jede Gruppe 10 ml 70 mM Na gt HPO L sung bereit Verr hren Sie 10g B ckerhefe in 10ml 70 mM NazHPO Losung Geben 10 g bis 15 g Quarzsand hinzu Zerreiben die Mischung mindestens 5 Minuten lang kr ftig im Porzellanm rser Lassen Sie die Hauptmenge Sand im M rser zur ck und zentrifugieren aus dem Homogenat die Zellen und Zellfragmente mind 10 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit ca 4000 g ab gegen berliegendes Zentrifugenr hrchen m glichst genau austarieren e Pipettieren Sie vorsichtig den gelblich klaren Uberstand ab und notieren Sie f r Ihr Protokoll das ungef hre Volumen e Stellen Sie diese Probe bereit zur Enzymaktivit tsmessung f r 4 2 1 00 Versuch Aktivitatsmessung von ADH Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 68 4 2 1 00 Versuch Aktivit tsmessung von ADH Ihre Aufgaben bestehen aus einem spektroskopischen ADH Test mit aus Hefe gewonnenem Enzym aus 4 2 1 NNVersuch Alkoholdehydrogenase ADH aus Hefe daraus resultierend die Berechnung der Enzym Aktivit t und der Bestimmung des K Wertes fur Ethanol Der Enzymtest wird dabei mit Ethanol als Substrat im berschu durchgef hrt Bei alkalischem pH Wert und durch Abfangen des Reaktionsproduktes ist die Geschwindigkeit der NAD Reduktion der Enzymmenge proportional Me gr e ist die Extinktionszun
3. 22272 Versuch Isoelektrischer Punkt und L slichkeit von Casein 2 3 Platz 3 Protein F llung und Chromatographie 2 200022200020n0 nennen 29 1 Protem Faltings a a 2 3 1 AA Versuch Fallungsarten von Proteinen VL 26 5 Altskript V 21 ersnennenenennenn 2 3 1 BB Versuch Biuret Reaktion VL 26 2 Altskript V 2 18 seeasnnennnnonnnnnnnnunnnnonnnnennnennnne 2 3 1 CC Versuch Proteinbestimmung VF 3 5 Altskript V 2 19 esscccsssseeeceeseeeceeseeeesees 2 3 2 Protein Chromatographie ccccccccssscecceeseecceesececseueesseseeeseeseeessegeeessegseesees 2 3 2 DD Versuch Papierchromatographie Rundfiltermethode 2 4 Platz 4 Proteinbestimmung durch Elektrophorese cccseceeeseeeeeseeeeseeeeeneeens 24 1 GelElektrophotese n ee bance alta a i E io eee ete ce eee 2 4 1 EE Versuch Protein Fingerprinting durch Gel Elektrophorese PAGE Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 S Versuch Silberspiegel VL 14 2 Altskript V 2 8 bzw 2 9 ssccccsssseecceeseeecseseeeseees T Versuch Hydrolyse von Starke VL22 3 Altskript V 2 10 ccccssseecceeseeeceeseeeseeees U Versuch Glucosenachweis VL22 4 Altskript V 2 11 ccccsssseccessseecceeseeeseeseeeseaes 27152 V lamine lskipti2 S raira a aa e a 2 1 2 V Versuch Ascorbins ure VF 5 6 Altskript V 2 12 ccsscccsseeceseesseeeceeeseeeseeeees 2 1 2 W Versuch Fehling Test VL 68 4 Altskript V 2 14 aueeeasnenenenenonnnennnnnnn
4. Keep all reagent and reagent mixes refrigerated at 4 C when not in use Allow all reagents and samples to equilibrate to room temperature for 30 minutes before use Protect dye and dye mixtures from light Remove light covers only when pipetting The dye decomposes when exposed to light and this reduces the signal intensity Always insert the pipette tip to the bottom of the well when dispensing the liquid Placing the pipette at the edge of the well may lead to poor results Use a new syringe and electrode cleaners with each new Kit Use loaded chips within 5 minutes after preparation Reagents might evaporate leading to poor results Do not touch the Agilent 2100 bioanalyzer during analysis and never place it on a vibrating surface Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 51 Agilent DNA 1000 Kit Quick Start Guide Agilent DNA 1000 Assay Protocol Edition April 2007 Handling DMSO WARNING Kit components contain DMSO Because the dye binds to nucleic acids it should be treated as a potential mutagen and used with appropriate care Wear hand and eye protection and follow good laboratory practices when preparing and handling reagents and samples Handle the DMSO stock solutions with particular caution as DMSO is known to facilitate the entry of organic molecules into tissues Preparing the Gel Dye Mix 1 Allow DNA dye concentrate blue and DNA gel matrix red to equilibrate to gel dye mix room temperatu
5. f r eine einzelne absorbierende Gruppe in einem Molek l oder ein lon betragen Rechts Probe Referenz Differenzspektrum Zusammenfassung e Jede Substanz absorbiert und reflektiert Licht bestimmter Wellenl ngen st rker oder schw cher dies f hrt unter anderem zur Farbgebung einer Substanz e Ein Photometer kann auf Licht bestimmter Wellenl nge A eingestellt werden es kann auch viele Wellenl ngen nacheinander durchlaufen e Im Photometer wird Licht mit der gew nschten Wellenl nge durch eine Probe in einem transparenten Probenbeh lter sog K vette gesendet e Dabei wird gemessen wieviel von dem gesendeten Licht die Probe mit der zu untersuchenden Substanz durchdringt im Vergleich zu einer Referenzprobe ohne die zu untersuchende Substanz Transmission T in Referenz hier destilliertes Wasser e 100 minus Transmission Absorption e Dargestellt wird wegen der linearen Abh ngigkeit von der Konzentration Lambert Beersches Gesetz meist aber die logarithmische Gr e die Extinktion E engl Absorbance A nicht zu verwechseln mit Absorption in Literatur kommt es gelegentlich zu eben dieser Verwechslung e Extinktion E log T in der Biologie auch OD optical density genannt e F r monochromatisches Licht gilt das Lambert Beersche Gesetz E log T c d dabei ist d die Dicke der K vette i d R 1 cm c die Konzentration der Extinktionskoeffizient der zu untersuchenden Substanz f r eine bestimmte Wel
6. il I i gt HOCHSCHULE F R TECHNIK UND WIRTSCHAFT DES SAARLANDES UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES Bio Chemie Praktikums Skript Dozent Ko Autoren Prof Dr Rainer Eisenmann Ehrlich Lehmberg Fakultat Ingenieurswesen Studiengang BMB Biomedizinische Technik Bachelor Fach Biochemie Stand Sommersemester 2010 Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 1 Inhalt 0 Allgemeine Hinweise u02 00000000000000000n0nonennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnennnnnenennnnnnnnnennnnnnn 0 1 Dokumentationshinweise unuuussssensnnenennnnennnnnnennnnenennnnnnonennonennnnnnenennenennenenennen 0 2 Arbeitssicherheitshinweise u0 2000240002000nenn nenn nano nnnne nenne nenne nenn enenn nenn nennen 1 Versuchstag 1 Physikalische und chemische Grundlagen 2 200022200022see no 1 1 Platz 1 Molekularbewegung cccceseceseseecseseeceeeceseueeseueceseueessageeeseeessaeeeneneeens 1 1 1 L slichkeit von hydrophilen und hydrophoben Biomolekulen Alt 1 1 1 1 1 A Versuch L slichkeit VF 2 1 Altskript V1 1 c ccccsscecsseceseeeceeesaesesaseesseeeneeeees 1 1 1 B Versuch Emulgatoren VL 7 2 Altskript V1 2 ccccsesecessseeceeseeseeseeneseeenseeeenes 1 1 2 Diffusion und Dialyse Altskript 1 2 ccc sscccceesseeceeeseeeceseeeceeeseeecaseeeceasseeeseaseeeees 1 1 2 C Versuch Diffusion VF 2 2a Altskript V1 4 ccccssececeseecc
7. 2 e Nehmen Sie das entsprechend mit prot a beschriftete Flipdeckel Gef welches Salzl sung protense raat h Sy mit Protease enth lt zur Hand und pipettieren Sie ca z 50 ul 5 Tropfen davon in Ihr Schraubdeckelgef mit den lysierten Wangenepithelien e Verschlie en Sie den Deckel Ihres Schraubdeckelgef es mit den in Lyse befindlichen Wangenepithelien fest und wenden Sie es 5x langsam NICHT fest sch tteln e Inkubieren Sie Ihr Schraubdeckelgef lysiertes Epithel Protease Salzl sung bei 50 C indem Sie es in einen auf diese Temperatur m glichst genau Water bath vorgeheizten Inkubator stellen Steht ein solcher nicht zur Vef gung stellen Sie Ihr Gef stattdessen in ein warmes Wasserbad kontrollieren Sie die Temperatur 50 C for 10 min mit dem Thermometer Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 55 Schritt 4 Nach Entfernung der Proteine kann sich die DNA losen entfalten und sich mit der ubrigen DNA der anderen Zellen zusammenklumpen DNA Strange sind zwar zu d nn um Sie mit blo amp em Auge zu sehen wenn Sie in der L sung verteilt sind zusammengeklumpt werden Sie aber sichtbar In diesem Laborexperiment benutzen Sie Salz und kalten Alkohol um die DANN aus der Losung auszufallen e Transferieren Sie ca 10 ml kaltes hochprozentiges Ethanol aus dem Kuhlschrank e Halten Sie die Pipettenspitze dabei schr g gegen die A Innenwandung Ihres Schraubdeckelgef es lysi
8. Zun chst wird auf die Kennzeichnung gef hrlicher Stoffe hingewiesen Grunds tzlich ist jedoch auch beim Umgang mit nicht gekennzeichneten Stoffen Vorsicht geboten da Kennzeichnungen fehlen und Kenntnisse ber die gef hrlichen Eigenschaften unvollst ndig sein k nnen Daher gelten als elementare Regeln Im Labor nicht essen trinken oder rauchen Schutzkleidung und Schutzbrille tragen nicht mit dem Mund pipettieren Chemikalien nicht versch tten Ber hrung mit Haut oder Schleimh uten vermeiden bei versehentlichem Kontakt sofort mit viel Wasser absp len Sehr gittig Giftig An Xi 3 E oer 2 gs z A wem Hakan en en arm DIE Mindergiftig heband Explosionsgef htlich O F t a A o Be a Ree ti ds TE os z tC eie R e Boe SE Sa NORE oe le i a Se 5 tee oF Beg Fi a r Brandf rdernd hochentz ndlich Abbildung 1 Juania omeri eo aaam a e t eaaa Brennbar Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 4 1 Versuchstag 1 Physikalische und chemische Grundlagen 1 1 Platz 1 Molekularbewegung 1 1 1 Loslichkeit von hydrophilen und hydrophoben Biomolekulen 1 1 1 A Versuch Loslichkeit Die Loslichkeit von Biomolekulen verschiedener Struktur in verschiedenem Milieu ist sowohl f r ihre Verteilung in der Zelle wie fur ihre Extrahierbarkeit f r Experimente und analytische Zwecke von Bedeutung Entsorgung der Petroleum Phasen nur in die vorgesehene Ab
9. crime scene and the suspect s DNA samples contain the target sequence PCR relies on three principles of molecular biology 1 Denaturation melting double stranded DNA template into single stands 2 Annealing complementary DNA strand hybridization via DNA primers 3 Extension DNA strand synthesis via DNA polymerase Denaturation Before new DNA synthesis can begin the double stranded DNA template must be unwound and separated into single strands In cells this is carried out by a family of enzymes In PCR heat is used to melt apart or denature the double stranded DNA template Annealing Before a target region of DNA can be amplified one must determine short sequences of DNA upstream at the 5 end and downstream at the 3 end of the target loci region of interest These areas are then used to make short pieces of DNA called primers or oligonucleotides which are complementary to regions upstream and downstream of the target loci region Abbildung 13 Primers serve as start and stop points for amplifying the target region of the DNA to be copied Reverse primer En 5 5 Forward primer E T A a POM Target sequence Abbildung 13 Primers annealed to a target DNA sequence during PCR Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 45 In PCR complementary strand hybridization takes place when oligonucleotide primers anneal or bind to their respective complementary base pair sequences on the templa
10. her z B 200 mg Zucker auf 20 ml destilliertes Wasser f r jede zu untersuchende Zuckerart e Mischen Sie 10 ml Fehling mit 10 ml Fehling ll e Notieren Sie Ihre Beobachtung e Fugen Sie zu ca 3ml dieser Fehling I ll Mischung die zu analysierende Probe zu ca 2ml Einmalpipette e Erwarmen Sie die Mischung mit der Probe im siedenden Wasserbad e Erwarmen Sie zum Vergleich als Blindprobe auch eine Fehling I 1l Mischung ohne Zucker Blindprobe e Notieren Sie fur Ihr Protokoll Ihre Beobachtungen e Vergleichen Sie Proben auf ihre Reduktionskraft e Identifizieren Sie die Strukturen der jeweiligen Zucker Mat Becherglas 50ml Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 19 2 1 1 5 Versuch Silberspiegel e Geben Sie in ein sauberes neues Reagenzglas ca 2ml AgNO w 10 e Setzen Sie unter st ndigem Sch tteln mit der Tropfflasche langsam soviel NH3 zu ca 1 1 bis sich der gerade gebildete Niederschlag gerade wieder gel st hat e Geben Sie nun ca 2ml Glucosel sung w 1 zu e Erhitzen Sie das Reagenzglas unter leichtem Drehen im Wasserbad oder ber dem Bunsenbrenner e Notieren Sie f r Ihr Protokoll Ihre Beobachtung Welche Schlu folgerung Reaktion k nnen Sie daraus ziehen 2 1 1 T Versuch Hydrolyse von St rke e Geben sie 0 5 g St rke in ein Becherglas e Geben Sie ca 5 ml HCI 5M zu e Entnehmen Sie mit einer Pipette 0 1 ml und geben Sie diese in ein frisches Reagenzglas 16X100 e Erhit
11. lfte mit dem Laufmittel Legen Sie Ihr Rundfilterpapier so auf den R ndern der Petrischale mit dem Laufmittel auf da der Docht in das Laufmittel taucht das Rundfilterpapier jedoch nicht mit dem Laufmittel in Ber hrung kommt Decken Sie das Ganze vorsichtig mit der zweiten Petrischale ab Das Laufmittel flie t nun durch den Docht in die Mitte des Rundfilterpapiers und von dort randw rts dabei werden Teilchen transportiert Wenn das Laufmittel den Rand der Petrischale erreicht hat nach ca 10 bis 12 Minuten allerh chstens nach 15 Minuten nehmen Sie vorsichtig die Abdeckung und entfernen Sie ihr Filterpapier aus der Petrischale Zu langes Warten schwemmt alle Teilchen an den Rand des Papiers und der gesamte Versuch mu wiederholt werden Entfernen Sie vorsichtig den Docht Pinzette nicht mit Fingern anfassen achten Sie dabei darauf das feucht Rundfilterpapier nicht einzurei en Legen Sie das Rundfilterpapier zum Trocken unter den Abzug Ihr Dozent bespr ht das Chromatogramm sp ter mit einem als F rbemittel dienenden Ninhydrinreagenz und trocknet es anschlie end bei 110 C mittels eines F ns Nun erst zeigen sich die Aminos uren mit charakteristischen F rbungen Ihr Dozent scannt das Ergebnis optisch als Datei ein Sichern Sie dieses Bild auf einem Datentr ger und f gen Sie es in Ihr Protokoll ein Kommentieren Sie was auf dem Chromatogramm zu sehen ist Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 29 2 4 Pl
12. placed in an electric field will be drawn toward the positive pole and repelled by the negative pole The matrix of the agarose gel acts as a molecular sieve through which smaller DNA fragments can move more easily than larger ones Over a period of time smaller fragments will travel farther than larger ones Fragments of the same size stay together and migrate in what appears as a single band of DNA in the gel In the sample gel below Abbildung 18 PCR amplified bands of 941 bp and 641 bp are separated based on theirs sizes 1 2 3 4 5 G i 8 bp io 700 _ aa 500 _ u 200 100 Abbildung 18 Electrophoretic separation of DNA bands based on size EL Load DNA molecular mass ruler which contains 1 000 bp 700 bp 500 bp 200 bp and 100 bp fragments lane 1 two homozygous individuals with 941 bp fragments lanes 2 6 three homozygous individuals with 641 bp fragments lanes 3 5 and 8 and two heterozygous individuals with 941 and 641 fragments lanes 4 and 7 Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 58 Alu insert 200 bases __ S41 bases BERR SERRE 641 bases Heteroduplex formed between 941 and 641 nucleotide strands Abbildung 19 a Cheek Cell DNA Template Preparation e Beschriften Sie ein Flipdeckel Mikroprobenr hrchen Bo mit ihrem Namen bzw Ihren Initialen u 10 u A Nehmen Sie die in Versuch 3 3 1 HH Versuch eed Wangenzellen DNA Extraktion Gen in de
13. verwenden Sie hier die langsame F rbung ber Nacht Ihr Dozent nimmt die Gele dann am folgenden Tag aus der F rbeschale sp lt und w scht sie aus und scannt die Ergebnisse als Bilddatei f r Sie ein Tragen Sie Handschuhe und Kittel um eine Anf rbung der H nde und der Kleidung zu vermeiden F rbung ber Nacht in 1x Fast Blast DNA F rbel sung e Verdunnen Sie die Fast Blast DNA F rbel sung 500x auf eine 1x Konzentration e Stellen Sie dabei in R cksprache mit Ihrem Betreuer eine ausreichende Menge f r alle Teilnehmer des Versuchstages her insg ca 300 ml e Kennzeichnen Sie die F rbeschalen mit einem K rzel Ihrer Gruppe e Zum Anfarben wird das Gel vorsichtig aus dem Geltr ger genommen Dies geht leicht indem Sie mit einer Hand das untere Ende des Gels halten w hrend sie mit der anderen Hand das Gel vorsichtig mit dem Daumen herausdr cken Besondere Aufmerksamkeit mu der Unterst tzung des Gelteils gewidmet werden der die Starttaschen enth lt da das Gel leicht der Startlinie entlang bricht e F rbung der Gele Lassen Sie die Gele vom Geltr ger in die F rbeschale gleiten In jeder Schale werde zwei Gele gef rbt Legen Sie die Gele in eine F rbeschale und bedecken Sie sie soweit mit F rbel sung da die F rbeschale auch auf dem automatischen Kipp Sch tteltisch nicht berlaufen kann e Bewegen Sie die F rbeschale mit dem Gel einige Male zu Beginn der F rbung e Stellen Sie die F rbeschale auf einen au
14. 1 1 KK Versuch Enzymatische Spaltung von St rke VL 46 4 Altskript V 3 3 ennennnennennnernenn 66 4 1 1 LL Versuch Milchsauregarung VL 132 1 Altskript V 3 6 cccssseccssseeceeseeceeeeeceeseseueeeneaess 67 4 1 1 MM Versuch Reduktion von Methylenblau durch Reduktions quivalente aus der bakteriellen Milchsauregarung VL 133 4 Altskript V 3 7 cccccsssceceseccnssecceeseeceeseeseseeseusesseeeeneneeens 67 4 2 PAN De ee onen Te ee adden inca tendon enon ea 68 4 2 1 Isolierung von Enzymen aus biologischem Material Altskript 3 Dernereeenennenneneennennenennnenennenn 68 4 2 1 NN Versuch Alkoholdehydrogenase ADH aus Hefe 68 4 2 1 00 Versuch Aktivitatsmessung von ADH VF 4 4 bzw 3 9 1 anennnenennunnennennennnnnnnnnnennnnenn 69 4 3 PAZ raster cetera eae eaten cdi ean O sa uae eee te oewameaiinatn ae 70 4 3 1 sEAZYMAKINGUK Tell li Alk dann 70 4 3 1 PP Versuch Aktivit t und Kinetik von Alkoholdehydrogenase Teil Il 70 4 3 1 QQ Alkoholische Garung Teil VL 133 1 2 V 3 5 bzw 3 9 ssccccsseeeceesseeecsaseeesseeeeseeaes 70 4 3 1 RR Alkoholische G rung Teil Il VF 4 4 Altskript V 3 9 3 ccccsssececessseeceeeseeeceeeeseaseeesneaes 71 4 4 PAZA seele sales ahoaterauig sade maatunewpiesalaeereaee 72 44 1 EnZymkinetik FeillL Altskipt as ta 72 4 4 1 55 Versuch Substrathemmung der Urease Reaktion VL 47 6 Altskript V 3 10 eenennnennenenn 72 4 4 1 TT Versuch Vergiftung und Reaktivierung eines Enzyms Urease 13 Que
15. Gruppe von Versuchstag 4 diese L sung ansetzt Der erste Labortermin Gruppe von Versuchstag 4 setzt diese dann f r die zweite Labortermin Gruppe von Versuchstag 4 an usw Nehmen Sie 3 Erlenmeyerkolben a 250 ml zur Hand Geben Sie in den ersten Kolben 10 g Glucose Geben Sie in den zweiten Kolben 10 g Saccharose Geben Sie in den dritten Kolben 10 g Fructose F llen Sie die Erlenmeyerkolben mit je 100 ml Leitungswasser auf Suspendieren Sie darin je 5 g Hefe Verschlie en Sie die Kolben mit G hrr hrchen die Bariumhydroxidlosung zum CO Nachweis als Absperrfl ssigkeit enthalten e Lassen Sie die Kolben 2 Tage auf der Sch ttelplatte g ren 3 5 2 Vorbereitung zur MilchS ure G rung Teil I aus Enzymkinetik Teil 3 9 1 4 1 1 LL Versuch Reduktion von Methylenblau durch Reduktions quivalente aus der bakteriellen Milchsauregarung An Versuchstag 4 wird geronnene Milch ben tigt die zu ihrer Herstellung 2 Tage g ren mu Es ist daher unbedingt erforderlich da die letzte Labortermin Gruppe von Versuchstag 3 f r die erste Labortermin Gruppe von Versuchstag 4 diese ansetzt Der erste Labortermin Gruppe von Versuchstag 4 setzt diese dann f r die zweite Labortermin Gruppe von Versuchstag 4 an usw e Vergewissern Sie sich da die f r diesen Versuch n tige Milch und Naturjoghurt vorr tig sind kaufen Sie diese bei Bedarf im n chsten Lebensmittelgeschaft Aldi Edeka e Nehmen Sie 2 Erlenmeyerkolben mit dazugeh
16. Widerstand sp ren k nnen es ist aber absolut nicht n tig so fest zu kauen da Sie dabei Schmerzen empfinden es ist auch nicht angedacht da dabei Blut flie t e Nehmen Sie ein 15 ml Schraubdeckel Gef zur Hand e Befullen Sie es mit 3ml Leitungswasser e Beschriften Sie es mit Ihrem Namen e Verunreinigungen des f r diesen Versuch zu verwendenden Speichels durch Mikroorganismen und oder rote Blutk rperchen sind nicht erw nscht Putzen sie daher nun ihr Z hne ohne Zahnpasta Vermeiden Sie Kontakt der B rste mit Ihren Wangeninnenseiten vermeiden Sie auch zu festes B rsten des Zahnfleisches e Schaben Sie etwas auf Ihren Wangen herum e Nehmen Sie die 3 ml Wasser aus Ihrem Schraubdeckelgef in den Mund und sp len Sie gr ndlich aus Verschlucken Sie keine Fl ssigkeit e Geben die ausgesp lte Fl ssigkeit zur ck in das Schraubdeckelgef Nehmen Sie bei Bedarf ein 50 ml Gef zur Hilfe e Achtung Entnehmen Sie bevor Sie weiterarbeiten mit einer geeigneten Pipette 200 ul der Speichell sung mit den Wangenepithelien und geben Sie dies in ein Flipdeckel Mikrogef zur sp teren Verwendung im Versuch 3 4 1 11 PV92 Genlocus Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 54 Schritt 2 Aufbrechen der Zellen durch Lyse der Zellwande Nachdem Sie wie oben geschildert Ihre Zellen gesammelt haben mussen die Zellen aufgebrochen werden damit sich die DNA aus dem Zellinneren in die umgebende Fl ssigkeit
17. ergie t Ein Detergens eine Art Spulmittel f r die Biochemie lost die Zellemembranen auf ahnlich wie ein gewohnliches Spulmittel Fette und Proteine von dreckigem Geschirr lost da Zellwande und Organell Membranen im Wesentlichen aus Fetten und Proteinen bestehen Das Auflosen der Membranen resultiert in der Freisetzung der DNA Dieser Proze wird Lyse lysis genannt und die L sung welche das Detergens enth lt wird Lyse Puffer genannt CN e Nehmen Sie ein 15 ml Schraubdeckelgef zu Hand ha tm das die Lysis enth lt und entsprechend beschriftet x ist Benutzen Sie eine frische Plastik Einwegpipette 1ml und transferieren Sie damit 2ml 2x1ml des Lyse Puffers in das Schraubdeckelgef mit Ihren Wangenepithelien 5 e Verschlie en Sie den Deckel Ihres Schraubdeckelgef es mit den in Lyse befindlichen Wangenepithelien fest und wenden Sie es 5x langsam NICHT fest sch tteln IIJ BEER Fa Fa e Notieren Sie f r Ihr Protokoll etwaige Beobachtungen Schritt 3 Proteine entfernen Die DNA ist zun chst von Proteinen eng umwunden Diese Proteine halten hnlich wie Garnrollen die DNA eng gewunden und strukturiert so da diese im Zellkern keine Knoten bilden kann Damit Sie die DNA mit blo em Auge sehen k nnen ist es hilfreich zun chst die Proteine zu entfernen Die Protease zerlegt die mit der DNA verkn pften Proteine und ist au erdem n tzlich verbleibende Membranproteine zu verdauen
18. haben halten Sie sich vorrangig an die Kammern in der Mitte des Gels und plazieren sie den KS und den KM Standard in je einer randw rtig benachbarten Kammer I Spur Volumen _ Pobe __ pT Fischprobel SS po Fischprobe S pA Fischprobe lll S po Fischprobe IV po Fischprobe VV po Fischprobe VIE 9 Fischprobe VIE 10 Tabelle 7 Beispiel zu Beladung der Kammern e Benutzen zum Beladen der Gelkammern moglichst dunne feine Pipettespitzen e Geben Sie langsam je 10 ul jeder Probe und jedes Standards in je eine Gelkammer Durch h here Dichte sinkt die Probe unter den Puffer Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 33 Fini Tip Lemberg Nachdem Sie alle Proben und Standards in ihre jeweiligen Gelkammern geladen haben entfernen Sie so vorhanden die Ladef hrung und schlie en Sie den Deckel Schlie en sie die Spannungsversorgung richtig gepolt an Dabei ist das schwarze Kabel Minus Masse ausschlie lich in die schwarze Buchse und das rote Kabel Plus ausschlie lich in die rote Buchse einzustecken Stellen Sie die Spannung auf 200 V DC ein starten Sie und lassen sie die Gelelektrophorese nun ca 30 Minuten laufen Wenn die Gelelektrophorese vollst ndig abgelaufen ist schalten Sie das Ger t ab und trennen Sie es von der Spannungsversorgung ab Lassen Sie keine potentiell spannungsf hrenden Teile offen liegen ziehen Sie alle PTs j aan Kabel ab rt E Schritt 3 Sichtbarmachen der Proteinbande d
19. is a DNA sequence about 300 base pairs long that is repeated almost 500 000 times throughout the human genome The origin and function of these repeated base pairs is not yet known 54 ALU Noy Intron Abbildung 16 Location of an Alu repetitive element within an intron Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 57 In this laboratory activity you will look at an Alu element in the PV92 region of chromosome 16 This particular Alu element is dimorphic meaning that the element is present in some individuals and not others Some people have the insert in one copy of chromosome 16 one allele others may have the insert in both copies of chromosome Abbildung 17 The presence of absence of this insert can be detected using PCR followed by agarose gel electrophoresis Since you are amplifying a region of DNA contained within an intron the region of DNA is never really used in your body So if you don t have it don t worry Fvs2 Genotype DNA Size of PCR Products o ALU Homozygous 341 base pairs a Homozygous 641 base pairs ALU Heterozygous 941 and 641 base pairs Abbildung 17 Electrophoresis separates DNA fragments according to their relative sizes DNA fragments are loaded into an agarose gel slab which is placed into a chamber filled with a conductive buffer solution A direct current is passed between wire electrodes at each end of the chamber DNA fragments are negatively charged and when
20. ne Denature 94 2 min x enature Thermal Denature 94 30 sec ven Anneal 30 sec x35 yeng Extend 1 min Final extend a Hold Hold forever x 4 Das Programm des Thermocyclers benotigt ca 2 Stunden Ihr Dozent wird Ihre Proben anschlie end entnehmen und im K hlschrank zwischenlagern Der Versuch wird dann an Versuchstag 4 zuendegef hrt Schreiben Sie sich daher unbedingt auf wie Sie Ihre Proben gekennzeichnet haben Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 49 Teil 2 wird durchgefuhrt an Versuchstag 4 Elektrophorese vervielfaltigter PCR Proben und Farbung der Agarose Gele Nehmen Sie Ihre im Thermocycler PCR amplifizierten Proben aus dem K hlschrank und lagern Sie diese auf Eis solange sie sich auf Ihrer Werkbank befinden Z gp o Zentrifugieren Sie die Proben f r einige Sekunden in der a Mikrozentrifuge Centrifuge Machen Sie sich mit dem Verfahren der apparativen OnChip Elektrophorese Technik mit dem Agilent BioAnalyzer vertraut Lesen Sie hierzu den unten anhangenden Quick Guide Quelle http www chem agilent com en US Search Library _layouts Agilent PublicationSummary aspx whid 50849 amp liid 1648 Besuchen Sie ggf die Internet Seite von Agilent www agilent chem labonachip und lesen Sie die vollstandige Bedienungsanleitung http www chem agilent com en US Search Library _layouts Agilent PublicationSummary aspx whid 46764 amp liid 1270 Sollte der Bioanalyzer nicht zur Verfugung stehen wird
21. nge in der Praxis mit Licht eines schmalen Wellenl ngenbereiches von wenigen nm bestrahlt und die Absorption bei jeder der verschiedenen Wellenl ngen wird gemessen Durch Auftragen der Absorption der prozentualen Transparenz Transmission oder der Extinktion Absorbanz engl Absorbance gegen die Wellenl nge erh lt man ein Spektrum F r die Messungen wird ein Spektralphotometer verwendet Die Absorptionsspektren von zwei Verbindungen die sichtbares Licht absorbieren sind in Abbildung 2 dargestellt F r die quantitative Analyse verwendet man eine Wellenl nge bei der die zu bestimmende Substanz selbst stark absorbiert und die Absorption anderer Verbindungen vernachl ssigbar ist Bei einer jeden Wellenl nge eines Spektrums wird die Extinktion einer L sung von zwei Faktoren bestimmt Zum einen ist dies die Konzentration der absorbierenden Substanz in L sung je h her die Konzentration desto gr er die Extinktion Einige chemische Verbindungen absorbieren bei gleicher Stoffmengenkonzentration mehr Licht als andere dies bedeutet eine f r jede einzelne Verbindung charakteristische Proportionalit t zwischen Extinktion und Konzentration Der andere Faktor ist die Dicke der absorbierenden Schicht je dicker die absorbierende Schicht je l nger der Strahlengang durch die L sung um so gr er ist die Extinktion Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 11 Das Lambert Beersche Gesetz Aus der Diskussion im vorangegangen
22. sie den zu ihrer L sung passenden pKs Wert aus der Tabelle aus berlegen Sie welcher pKs Wert bei S uren mit mehreren Dissoziationsstufen konkret gilt Hinweis Abh ngigkeit vom pH Wert Achtung Tris ist eine Base e Treffen Sie eine Aussage ber das Verh ltnis von Salzkonzentration zu S urekonzentration indem Sie ihre pH und pKs Werte in die Puffergleichung einsetzen e berlegen Sie welcher Zusammenhang zwischen den Konzentrationen von Salz S ure und Puffer besteht e Berechnen Sie f r Ihr Protokoll die Konzentration von Salz und S ure Mat Bechergl ser Flaschen pH Meter Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 9 1 2 2 Redoxvorgange Reduktion Aufnahme von Elektronen bed praktisch oft Aufnahme von Wasserstoff Oxidation Abgabe von Elektronen bed praktisch oft Aufnahme von Sauerstoff Reduktionsmittel Elektronendonator oft elementarer Wasserstoff Oxidationsmittel Elektronenakzeptor oft Sauerstoff 1 2 2 H Versuch Elektrochemische Redoxreaktion Stellen Sie 20 ml 1 iger St rkel sung bereit heben Sie diese auf F llen Sie den Mittelteil eines Doppel U Rohres bis zur Markierung mit Kaliumchloridl sung KCI 1M Stellen Sie Kaliumjodidl sung 0 1M her setzen Sie ihr einige Tr 1 ige Starkelosung Zu Fullen Sie den ersten Schenkel des Doppel U Rohres mit der starkeversetzten Kaliumjodidl sung Setzen Sie unter dem Abzug ges ttigte Bromwasserl sung an F llen Sie den zwei
23. the negatively charged DNA with it toward the positive anode In addition to your PCR products you will also be running a DNA Allele Ladder that represents all of the possible alleles at the BXP007 locus This is a reference or marker that you can compare your PCR reactions to so you can judge their relative sizes and their identities In the following drawing of a gel the samples or bands seen in the first track or lane all come from the BXP007 Allele Ladder These are the standard sizes of all the alleles know to occur at this locus There are 8 possible alleles with the largest at the top of the gel and the smallest at the bottom The sizes are from top to bottom 1500 1000 700 500 400 300 200 and 100 base pairs bps Allele names are indicated in the figure In the next several lanes we see PCR products that come from DNA samples that have been tested for what alleles they carry at this particular locus As shown in figure 12 the sample in the lane next to the Allele Ladder the Crime Scene Sample CS has a genotype that corresponds to alleles 5 and 2 on the allele ladder We would say that the genotype for this sample is 5 2 For the next sample the genotype would be 7 4 and so on AL CS A B L D 15 m 10 AL Allele ladder 2 f CS Crime Scene Ef 5 A Suspect A o 4 B Suspect B gt 7 C Suspect C 4 D Suspect D 2 1 genotype Abbildung 14 A cartoon of potential Crime Scene Investigator PCR Basics kit results
24. und Farbe von Molekulen Jede Substanz absorbiert und reflektiert Licht bestimmter Wellenlangen starker oder schwacher Die Farbe eines Stoffes hangt von der Wellenlange des absorbierten Lichts ab Wenn ein Stoff mit wei em Licht polychromatischem Licht Licht aller Farben ausgesetzt wird so werden bestimmte Wellenl ngen absorbiert die brigen erreichen das Auge Welche Farbe das Auge wahrnimmt h ngt nur von den transmittierten nicht absorbierten Wellenl ngen ab Anders gesagt der Beobachter sieht die Komplement rfarbe n der absorbierten Farbe n Wenn mehr als eine Farbe durchgelassen wird bestimmt die jeweilige Empfindlichkeit des Auges welche Farbe oder welche Farben wahrgenommen werden So absorbiert z B die Chromat in oe 2 blaues und violettes Licht und erscheint dem Auge gelb TUT TTT TTT PNEHEHEHEHEBER PAC Extinktion D un za ON o Ped El ERGAB EEE FE GE BEE er Extinktion oO BE Ls al gt mann ea BE De a Ld Po al a gt 0 400 440 480 520 560 600 640 680 Wellenl nge in nm 400 440 480 520 560 600 640 680 Wellenl nge in nm a Abbildung 2 Lichtabsorption in Abh ngigkeit von der Wellenl nge des eingestrahlten Lichts a Spektrum des Eisen Phenanthrolin Komplexes rot b Spektrum von Kaliumchromat gelb Absorptionsspektren Bei der photometrischen Analyse wird die Probenl sung idealerweise mit monochromatischem Licht das ist Licht einer einzigen Wellenl
25. und Pstl die Sie in diesem Experiment erhalten e Recherchieren Sie zum besseren Verst ndnis von EcoRl und Pstl im DNA Fingerprinting Test fur Ihr Protokoll wie genau der Schneideeffekt der Restriktionsendonukleasen an der DNA wirkt e Die durch die Basenpaare gezogene Linie reprasentiert die Stellen an denen Bindungen gespalten werden wenn eine Restriktionsendonuklease die entsprechende Erkennungssequenz erkennt im folgenden Beispiel ist diese Erkennungssequenz GAATTC Betrachten Sie die beiden unten gezeigten DNA Proben der Einfachheit halber sind nur Einzelstr nge abgebildet Probe Nr 1 CAGTGATCTCGAATTCGCTAGTAACGTT Probe Nr 2 TCATGAATTCCTGGAATCAGCAAATGCA e Welche Sequenz zeigt der komplementare Strang Wo wird dieser geschnitten e Geben Sie f r den Fall da beide Sequenzen mit einem Restriktionsenzym mit der Erkennungssequenz GAATTC behandelt werden die Anzahl und Gr e der sich ergebenden Fragmente an Experimenteller Teil Im Labor erh lt Ihre Gruppe 6 DNA Proben Die Aufgabe besteht darin herauszufinden ob eine davon vom gleichen Individuum kommt oder ob sie von verschiedenen Individuen stammen Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 38 Nehmen Sie die Flipdeckel Mikro Probenr hrchen zur Hand Lassen Sie dabei eine Reihe dieser Gef lse zun chst an den Kunststoffstegen zusammen trennen Sie die einzelnen Gef e noch nicht am St ck sind die Gef e vorerst handlicher Markieren Sie den Deckel d
26. which lives in high temperature steam vents such as those found in Yellowstone National Park Two template strands are created from the original template after each complete cycle of the strand synthesis reaction denaturation annealing and extension It is called the polymerase chain reaction because exponential growth of the number of template molecules occurs after each cycle is complete i e the number of DNA copies doubles at each cycle Therefore after 35 cycles there will be 2 times that is 34 359 738 368 times more copies than at the beginning After 35 cycles the DNA of interest has been amplified sufficiently to be visualized using gel electrophoresis and DNA stains This allows researchers to determine the presence or absence of the desired PCR products In order for PCR to happen efficiently several components are needed In addition to the template the oligonucleotide primers and the enzyme Taq DNA polymerase a special reaction buffer is also required called a master mix The master mix contains all of the components for PCR to occur including the individual building blocks of DNA nucleotides or dNTPs a special buffer to maintain optimum pH salts and MgClo Salts and magnesium ions also known as cofactors are needed for the Taq DNA polymerase to perform optimally In this experiment your instructor will provide you with a master mix that comes prepared with all of the ingredients listed above but also includes c
27. 1 Versuch Analyse des PV 92 Genlocus Teil 1 wird durchgefuhrt an Versuchstag 3 e Recherchieren Sie im Vorfeld was eine Polymerase Kettenreaktion PCR polymerase chain reaction ist und wie diese funktioniert insb in punkto fur die Reaktion geeigneter Temperatur e Informieren Sie sich uber die wichtigsten Englisch Vokabeln in punkto Genetik und lesen Sie folgende Informationen Biomedizinische Publikationen sind heutzutage in aller Regel auf Englisch von daher ist dies seitens Ihres Dozenten ausdr cklich erw nscht When RNA is first transcribed from DNA it contains both coding and noncoding sequences While RNA is still the nucleus the noncoding introns in stay within the nucleus are removed from the RNA while the exons ex exit the nucleus are soliced together to form the complete messenger RNA coding sequence for the protein Abbildung 15 This process is called RNA splicing and carried out by specialized enzymes called spliceosomes Intron 1 Intron 2 te Eroni Exon Exon 3 eS AAA y Genomic DNA Transcription yy Exoni Erona Splicing _ Exon mRNA Translation Protein Phenotype Abbildung 15 Splicing introns from genes Exon tw 7 Pre mRNA Genotype The target sequence The human genome contains small repeptitive DNA elements or sequences that have become randomly inserted into it over millions of years One such repetitive element is called the Alu sequence Abbildung 16 This
28. 7 e Entscheiden Sie welches Diagramm das lineare oder das halblogarithmische zur Absch tzung der DNA Fragmentgr en der Tatort DNA und der Tatverd chtigen DNA verwendet werden soll Begr nden Sie Ihre Wahl in Ihrem Protokoll e Bestimmen Sie zur Absch tzung der Gr e eines unbekannten Tatort oder Tatverd chtigen Fragments die Wanderungsstrecke die das Fragment zur ckgelegt hat e Tragen Sie diesen Punkt auf der X Achse der Standardkurve ein e Projizieren Sie von diesem Punkt auf der X Achse eine Senkrechte bis zur Standardkurve und von dort eine Waagrechte bis zur Y Achse z B mit d nnen Bleistiftstrichen Dort wo die Waagrechte die Y Achse schneidet kann die ungef hre Gr e des unbekannten DNA Fragments abgelesen werden e Verfahren Sie entsprechend fur alle DNA Fragmente vom Tatort und von den Verd chtigen e Vergleichen Sie die Fragmentgr en der DNA vom Tatort mit denen der Tatverd chtigen e Ermitteln Sie f r Ihr Protokoll ob die Fragmentgr en der DNA irgendeines Tatverd chtigen mit denen der DNA vom Tatort bereinstimmen e Wie sicher sind Sie da hier eine bereinstimmung vorliegt Begr nden Sie dies in Ihrem Protokoll Beispiel Nehmen wir einmal an die Bande Nr 2 des Tatverd chtigen Nr 5 sei 24 mm gewandert Gehen Sie von der 24 mm Marke auf der X Achse senkrecht nach oben zur Standardkurve und markieren Sie die Schnittstelle mit der Standardkurve Zeichnen Sie durch diese Schnittste
29. CUOCOCIAAA 3 CCCCoOCICICAICACIACICICACAAAA 10 Number of TOCAT repeats Abbildung 12 Two sample THO1 genotypes Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 44 How are STR alleles detected The key to DNA profiling is amplification of the copies present in the small amounts of evidentiary DNA by polymerase chain reaction PCR Using primers specific to the DNA sequences on either side of the TCAT STR billions of copies of each of the two original THO1 alleles in any one person s DNA type are synthesized in the reaction These copies contain the same number of STRs present in the original DNA copies and can be visualized using agarose gel electrophoresis By comparison with a DNA size standard or allele ladder that corresponds to the known sizes of TH0O1 alleles the exact sizes of the PCR products from the sample DNAs can be determined and compared A diagram of the results for THO1 typing of Suspect A and Suspect B is shown in Abbildung 12 In this cartoon example PCR has been performed on DNA from 2 suspects using primers specific for the TH01 locus Following gel electrophoresis which separates the PCR products according to their size the pattern of bands is compared to the Allele Ladder to identify the alleles present in the original samples PCR Amplification PCR amplification is DNA replication in a test tube The portion of the DNA you want to make copies of is called the target sequence The sample of DNA obtained at a
30. Konzentration der Probel sung berechnet Wegen der Existenz von mehreren pK Werten mit entsprechenden Pufferbereichen pH pK sind die Titrationskurven von Aminos uren mehrfach zusammengesetzt und die pH Spr nge an den quivalenzpunkten bei 100 Titration nur schwach ausgepr gt Eine einfache titrimetrische Bestimmung von freien Aminos uren mit S uren oder Laugen und den blichen Indikatoren gelingt daher nicht In Gegenwart von Formaldehyd Formalin wird die Aminogruppe in eine schwach basische Methylenverbindung umgewandelt so da nur noch die Karbons ure titriert wird Titration nach S rensen e Recherchieren Sie den Umschlagspunkt pH Wert von Thymolphthalein e L sen Sie in einem 250 ml Becherglas 20 mmol kristallisiertes Glycin in ca 100 ml H20 Bestimmen Sie anhand der molaren Masse auf dem Etikett des Glycin wieviel Gramm sie benotigen e Kalibrieren Sie das pH Meter mit Ma l sung Sp len Sie den Pr fkopf vor und nach Gebrauch gr ndlich mit destilliertem Wasser Achten Sie darauf den Pr fkopf des pH Meters in ein Reagenzglas mit destilliertem Wasser abzustellen wenn er nicht in Gebrauch ist e Messen Sie den pH Wert und notieren Sie diesen f r Ihr Protokoll Warten Sie einige Momente bis sich aufgrund der Durchmischung der entsprechende pH Wert stabil eingestellt hat Begr nden Sie f r Ihr Protokoll warum der pH Wert hier gleich dem isoelektrischen Punkt ist e Versetzen Sie mit einigen Tropfen
31. L sungen mit je 1 bestimmten Aminos ure verwendet wie z B Alanin Glycin Tyrosin je eine Spatelspitze auf ein Reagenglas 16X160 mit destiliertem Wasser auff llen gut sch tteln Beschriften Sie die Segmente am u eren Rand des Rundfilterpapiers mit der Bezeichnung oder einem K rzel jeweils f r die Probe und die jeweilige Referenz z B Ei A G T Fugen Sie der Probenbezeichnung au erdem das Datum und Ihre Gruppenbezeichnung hinzu so da Ihr Papier sp ter f r Sie wiedererkennbar sein wird Nehmen Sie ein weiteres Filterpapier zur Hand schneiden Sie ein St ck daraus aus und rollen Sie damit eng einen ca 2 cm langen Docht Stechen Sie ein kleines Loch in die Mitte Ihres segmentierten Filterpapiers durch das sie sp ter den Docht stecken k nnen Tragen sie nun mithilfe von je 1 Glaskapillare auf den Startkreis in jedem Segment die zur dort eingetragenen Beschriftung passende Referenz bzw die Probe auf zwei bis drei kleine Tropfen aus der Kapillare reichen v llig aus Tropfen Sie diese auf den mittleren Teil des jeweiligen Segmentes des Startkreises lassen sie die R nder frei so da nicht eine Substanz in das Nachbarsegment hin berlaufen kann Stecken Sie Ihren vorbereiteten Docht in das daf r vorgesehene Loch im Rundfilterpaper Nehmen Sie 2 gleichgro e Petrischalen zur Hand deren Durchmesser nur wenig kleiner ist als der des Rundfilterpapiers Bef llen Sie eine der beiden Petrischalen unter dem Abzug bis zur H
32. Thymolphthaleinl sung 0 1 e berlegen Sie welches Volumen Natronlauge 1M theoretisch erforderlich ware um eine deutliche Blauf rbung des Indikators hervorzurufen und legen Sie Ihre Rechnung im Protokoll dar e Titrieren Sie mit NaOH 1M Messen Sie dabei in Intervallen von 1ml den pH Wert und notieren Sie diesen f r Ihr Protokoll Warten Sie bis sich der pH Wert einigerma en stabil eingestellt hat Titrieren Sie bis zur deutlich erkennbaren Blauf rbung Notieren Sie f r Ihr Protokoll welches Volumen NaOH hierf r erforderlich war Vergleichen Sie den Verbrauch mit dem theoretischen Wert Nun geben Sie ca 20ml s urefreie 20 Formaldehydl sung zu Unter dem Abzug leicht fl chtig und giftig und titrieren Sie erneut bis zum Umschlag e Messen Sie wieder zus tzlich parallel mit dem pH Meter Geben Sie in der N he des quivalenzpunktes nur kleine Volumina Natronlauge hinzu im Zweifelsfalle tropfenweise da es hier zu einer schnellen pH nderung kommt messen sie nach jeder Laugenzugabe nach in ebenso kleinen Schritten Messen Sie bis 25ml NaOH e Tragen Sie f r Ihr Protokoll die gemessenen pH Werte in Abh ngigkeit von der NaOH Zugabe graphisch auf z B mit Hilfe einer Tabellenkalkulation Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 23 2 2 2 Typische Reaktionen von Proteinen Ausfallung Bei einem Protein sind bei einem bestimmten pH Wert dem sog isoelektrischen Punkt IEP oder pl gleich viele Saure
33. Versuch Aktivitat und Kinetik von Alkoholdehydrogenase Teil Il Bestimmung von Kpm e L sen Sie 2 Reagenztabletten in 20 ml Puffer e Geben Sie in 8 Reagenzglaser je 2 ml des Puffers e Geben Sie in die ersten 4 Reagenzglaser 10 ul 20 ul 50 ul 100 ul des 3 mM Alkoholstandards zu und die die verbleibenden 4 Reagenzglaser 10 ul 20 ul 50 ul 100 ul des 30 mM Alkoholstandards e Beschriften Sie die Gl ser mit Konzentration UND Menge e Nehmen Sie eine Stopuhr zur Hand und bereiten Sie ein Zeittabelle vor e Mischen Sie zum Zeitpunkt t 0 Stoppuhr 10 ul reiner vorgefertigter Enzyml sung NICHT aus Hefe zum ersten Reagenzglas hinzu Mischen Sie dabei z gig ein e Messen Sie die Extinktion nach 15 s 30 s 1 min 2 min 3 min 4 min 5 min Beenden Sie die aktuelle Messung sobald die Extinktion 21 betr gt Meist ist dies lange vor Ablauf der Maximaldauer von 5 Minuten der Fall e Tragen Sie die Substratkonzentrationen gegen die Geschwindigkeiten v umol min direkt auf und zeichnen Sie die doppelt reziproke Auftragung nach Lineweaver Burk aus der Sie Km 1 Km und Vmax 1 Vmax entnehmen k nnen Vergleichen Sie mit Angaben aus Literatur bzw Internet 4 3 1 QQ Alkoholische Garung Teil I An Versuchstag 4 wird eine alkoholische L sung ben tigt die zu ihrer Herstellung 2 Tage g ren mu Es ist daher unbedingt erforderlich da die letzte Labortermin Gruppe von Versuchstag 3 f r die erste Labortermin Gruppe von Versuchst
34. ag 4 diese L sung ansetzt Der erste Labortermin Gruppe von Versuchstag 4 setzt diese dann f r die zweite Labortermin Gruppe von Versuchstag 4 an usw e Nehmen Sie die beim letzten Labortermin angesetzten vergorenen Zuckerl sungen zur Hand Die G rr hrchen werden unter Aufsicht Ihres Dozenten i d R f r alle Gruppen zusammen im H rsaal durch ein d nnes Glasrohr von 50 cm L nge ersetzt Die Kolben werden bis zum Sieden erhitzt Die entweichenden D mpfe lassen sich entz nden qualitativer Alkoholnachweis Notieren und kommentieren Sie in Ihrem Protokoll Ihre Beobachtungen Nehmen Sie 3 Erlenmeyerkolben a 250 ml zur Hand Geben Sie in den ersten Kolben 10 g Glucose Geben Sie in den zweiten Kolben 10 g Saccharose Geben Sie in den dritten Kolben 10 g Fructose F llen Sie die Erlenmeyerkolben mit je 100 ml Leitungswasser auf Suspendieren Sie darin je 5 g Hefe Verschlie en Sie die Kolben mit G hrr hrchen die Bariumhydroxidlosung zum CO 2 Nachweis als Absperrfl ssigkeit enthalten e Lassen Sie die Kolben 2 Tage auf der Sch ttelplatte g ren Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 70 4 3 1 RR Alkoholische Garung Teil Il Alkohol Bestimmung Verd nnen Sie die Proben der alkoholischen G rung 4 3 1 QQ Alkoholische G rung Teil bzw 3 5 1 Vorbereitung zur Alkoholischen Garung Teil I im Verh ltnis 1 500 bzw 1 1000 L sen Sie eine Reagenztablette in 10ml Puffer und geben Sie 100 ul Enzyml sung zu F
35. ahme bei 340 nm e Stellen Sie 3 M Ethanol Losungen bereit e Stellen Sie 0 1 M Na pyrophosphat Glycin Puffer pH 9 bereit e Stellen Sie Reagenztabletten bereit enthalten NAD Aldehyd Dehydrogenase Aktivitatsmessung e L sen Sie eine Reagenztablette in 10 ml Puffer e Geben Sie in ein Reagenzglas 2 ml dieser Mischung und 20 ul 3 M Alkoholstandard e Nehmen Sie eine Stoppuhr zur Hand Bereiten Sie eine Zeittabelle vor s u e Mischen Sie zum Zeitpunkt t O Stoppuhr 20ul Enzyml sung zu e Messen Sie die Extinktion nach 15 s 30 s 1min 2min 3 min 4 min 5min und notieren Sie diese f r Ihr Protokoll e Wiederholen Sie den Versuch noch 2 weitere Male dann allerdings mit 50 ul und dann mit 100 ul Enzyml sung anstelle der zuerst verwendeten 20 ul e Variieren Sie ggf die Menge an Enzymlosung bzw die Verd nnung der ausgegebenen ADH so da die Extinktions nderung 0 1 pro Minute bei Anfangsgeschwindigkeit nicht berschreitet h here Geschwindigkeiten sind schlecht auszuwerten Die Anfangsgeschwindigkeit wird mit einer Tangente grafisch bestimmt e Rechnen Sie die gemessenen Extinktions nderungen AE min in Ac und Stoffmenge min um und tabellieren die Werte als Anfangsgeschwindigkeit Vo bei der jeweiligen Substratkonzentration c e Berechnen Sie die Aktivit t bez Auf 1 g Hefe in Units min oder in kat 1 mol sek Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 69 4 3 Platz 3 4 3 1 Enzymkinetik Teil 4 3 1 PP
36. am damit und durchmischen Sie sie gut Versetzen Sie unter dem Abzug Probe f mit 1ml 70 iger Trichlor Essigs ure L sung Vorsicht atzend Tragen Sie dabei Handschuhe und Schutzbrille Was ist zu beobachten Wie nennt man solche Niederschl ge im Gegensatz zu einem kristallinen Salz Nun pr fen Sie f r alle Proben a f ob sich das Protein beim Verd nnen mit Wasser wieder aufl st Nach dem alle Proben auf Bildung eines Niederschlags gepr ft sind gibt man jede der Probe einzeln in ein jeweils neues Becherglas mit 30 ml und beobachtet den Effekt Ziehen Sie f r Ihr Protokoll Schlu folgerungen aus Ihren Beobachtungen Stichwort Reversibilit t Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 26 2 3 1 BB Versuch Biuret Reaktion Stellen Sie 2ml des Eifiltrats aus Versuch 2 3 1 AA bereit Geben Sie 2ml NaOH 1M dazu Handschuhe Brille Geben Sie tropfenweise CuSO 0 01M zu bis eine Violettf rbung zu sehen ist Erw rmen Sie das Ganze bis sich eine braune F rbung einstellt Wiederholen Sie den Versuch mit einer Blindprobe OHNE Eiwei d h Sie geben nur 2 ml NaOH 1M in ein Reagenzglas und tropfen CuSO 0 01M zu bis eine Blauf rbung zu sehen ist und erw rmen das ganze bis sich erste Schlieren bilden 2 3 1 CC Versuch Proteinbestimmung Photometrische Proteinbestimmung bei 280nm Wiederholen Sie im berblick die Grundlagen der Photometrie vom ersten Versuchstag insb das Lambert Beersche Gesetz Die in jede
37. aseeceseeceeseeceeeeeeaeeesaes 1 1 2 0 Versuch Dialyse VF2 2b Altskript V1 5 ccccccceseceseseecceseeceseeeeeeeseueeseueeenees 1 1 3 Grundlagen der Chromatographie Altskript 1 3 annereeeenensnnennennnnnnennnnnnnnnnnennennnn nennen 1 1 3 E Versuch Adsorption VL 157 1 Altskript V1 6 ccscecsseceseecceeeseeesaseeeseeeeeeeees 1 1 3 F Versuch Verteilung VL 157 2 Altskript V1 7 ccssscccsesececsseeceeseecesseeseueeeneseesees 1 2 Platz 2 Chemische Reaktionen mit Ladungsubertragung ccccesseeeeeeeeeeeeeees 1 2 1 S uren Basen und Puffer Altskript Ta nase ee a 1 2 1 G Versuch Pufferl sungen VF 2 3 Altskript V1 8 cccsssseecccsseeeeseseeeseeseeeeseees 1 22 RedoWVorgange Aliskript TS alle sin 1 2 2 H Versuch Elektrochemische Redoxreaktion VL 91 2 Aliskript VO anennenennerens 1 2 2 1 Versuch Methylenblau Leukomethylenblau VF 2 8 Altskript V 1 10 eeeeeeeeees 1 3 Platz 3 Spektroskopie PHOtoMetrie ccccssccccsececeeececeeeeceaseceaseeseaseeseeseeseueeess 1 3 1 Spektrale Eigenschaften Absorptionsspektrum und Farbe von Molekulen Lay Versuch Spektren der Nicotinamidnucleotide VF 2 11 Altskriot V 1 174 1 3 1 K_ Versuch Spektren von H moglobinspezies Altskript VI Marereeeenssnneennennenenn 1 4 Platz 4 Einf hrung einfache Biomolek le cccccccseeeeeeseeeeeeceeeeeeeaeeeeeseeeeeeeaees 1 4 1 Fette und Lipide Alskipt Vals a 1 4 1 L Versuch Ba
38. at the BXP007 locus Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 47 An Ihrem Platz sollten vorhanden sein 6 Mikroflipdeckelgef e in Schaumstoff auf Eis gelagert 1 Mikroflipdeckelgef beschriftet mit MMP MasterMix Primer 5 Mikroflipdeckelgef e beschriftet mit CS Crime Scene sowie A B C and D PCR tubes labelled DNA templates MasterMix Primers blue liquid u Keen 20 ul Crime Scene DNA 20 ul MMP 20 ul Suspect ADNA 20 ul MMP 20 ul Suspect ADNA 20 ul MMP c AT 20 ul Suspect A DNA 20 ul MMP D initials 20 ul Suspect A DNA 20 ul MMP i PCR tube Capless tube Vorgehen e Kennzeichnen Sie die Gef e so da Sie Ihre Gef e eindeutig zuordnen k nnen und nicht mit den Gef en einer anderen Gruppe verwechseln k nnen e Lagern Sie die Gef e k hl d h solange Sie auf der Werkbank verwendet werden sollten sie auf Eis gelagert werden e Tragen Sie Handschuhe und benutzen Sie unbedingt f r jeden Pipettiervorgang eine neue Pipettenspitze Arbeiten Sie sauber und sorgf ltig und vermeiden Sie jede Verunreinigung Ihrer Proben Vermeiden sie insbesondere jeden Kontakt mit den Deckelinnenseiten der Flipdeckel Gef e e Wenn m glich verwenden Sie 20 ul Kolbenpipetten und Pipettenspitzen mit Luftfilter e Achten Sie sorgf ltig darauf f r jeden Pipettiervorgang eine neue Pipettenspitze zu verwenden e Stellen Sie sicher da Ihre Tatort DNA Probe und Ihre Verdachtigen DNA sich in Mikroge
39. atz 4 Proteinbestimmung durch Elektrophorese 2 4 1 Gel Elektrophorese UUU HUUU UUU 1 Stacking Gel Direction of Separation Separating Gel Abbildung 8 Diagramm eines Elektrophorese Gels Bei der Elektrophorese werden Teilchen unterschiedlicher Ladung und Gr e mithilfe eines elektrischen Feldes voneinander getrennt Aufgrund ihrer Ladung wandern sie im elektrischen Feld dabei weisen verschiedene Teilchen unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeiten auf Teilchen mit gleicher Wanderungsgeschwindigkeit bilden dabei jeweils Bande die dann durch Anf rbung sichtbar gemacht werden k nnen 2 4 1 EE Versuch Protein Fingerprinting durch Gel Elektrophorese PAGE Verwendetes System Biotechnology Explorer Protein Fingerprinting Catalog Number166 0100EDU explorer bio rad com A Probenvorbereitung Muskel Protein Extraktion e Wenden Sie sich an Ihre Betreuer um Proben unterschiedlicher Protein Extrakte zu erhalten i d R von verschiedenen Fischarten Die Proteine werden mit einer geeigneten Methode extrahiert und denaturiert s u e Pr fen Sie anhand folgender Check Liste ob alle f r die Versuchsvorbereitung erforderlichen Arbeitsmittel zur Verf gung stehen Arbeitsmittel Stuckzahl pro Fa Steza pro Gruppe v Mikro Probenrohrchen Flipp Deckel Mikro Probenrohrchen Schraubdeckel a 1 0 ml Einwegpipette Wasserfester Stift Laemmli Proben Pufferl sung ee ET Fisch Proben BEE ee Tabelle 5 Labor Check
40. che Aufgabe ist z B in der Lebensmittelchemie Die prim ren Umsetzungen der verschiedenen Substrate Zucker m ssen meist mit physiologischen oder nichtphysiologischen Farbreaktionen gekoppelt werden um eine Detektion der farblosen Substrate und oder Produkte zu erreichen Aufgabe e Bestimmen Sie Glucose enzymatisch mit Merck Reflectoquant Glucose Test Nr 1 16720 Me bereich 1 100mg l e Verdunnen Sie die Glucosel sung aus 1 4 2 P entsprechend dem Me bereich so da Sie sich im oberen Drittel des Me bereiches bewegen Der pH Wert mu zwischen 2 und 10 liegen Neutralisieren Sie die Proben ggf mit NaHCOs e Stellen Sie am Reflektometer Methode 511 ein Me ablauf A s a Bedienungsanleitung e Entnehmen Sie 1 Analysenst bchen verschlie en Sie das R hrchen sofort wieder e Tauchen Sie das Testst bchen in Probe ein so da beide Reaktionszonen vollst ndig benetzt werden dr cken Sie gleichzeitig die START Taste e Nehmen Sie nach 15s das St bchen aus der L sung e Schutteln Sie bersch ssige Fl ssigkeit kr ftig ab e Wenn das akustische Signal ert nt dr cken Sie den Stabchenadapter nach rechts und f hren das St bchen mit den Reaktionszonen zum Display hin bis zum Anschlag ein e Lesen Sie den Me wert ab e Vergleichen Sie f r Ihr Protokoll das Ergebnis mit dem erwarteten Wert und kommentieren Sie dies Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 18 2 Versuchstag 2 Einfache und komplexe Biomo
41. den Sie einen fF S automatischen Sch ttler Nicht von Hand wenden und sch tteln Achten Sie i darauf da keine Klumpchen ungelost T bleiben pA e Nehmen Sie das Schraubdeckelgef welches das InstaGene enth lt zur Hand e Sch tteln Sie das InstaGene gr ndlich direkt kurz vor jeder Verwendung e Transferieren Sie mittels einer geeigneten Pipette Ihre Zell L sung in das Schraubdeckelgef mit dem InstaGene e Wenn alle Proben Ihrer Gruppe so bereitstehen stellen Sie diese in einer Schaumstoffhalterung fur ca 10 Minuten bei 56 C in den Inkubator oder falls dieser nicht zur Verf gung steht in ein D warmes Wasserbad Nehmen Sie Water bath 56 C 10 min zwischendurch nach ca 5 Minuten die g Proben kurz aus dem Inkubator heraus und sch tteln Sie diese dann vorsichtig kurz auf Schnippen oder automatischer za Sch ttler nicht wenden und geben Sie p sie schlie lich f r die verbleibenden 5 gt y Minuten zur ck zum Inkubieren 42 e Zentrifugieren Sie nach jedem Misch oder Sch ttelvorgang f r einige Sekunden in der Mikrozentrifuge u V Water bath 100 C 5 min e Entfernen Sie nach dem Inkubieren die ep cab Proben sch tteln Sie diese erneut WY en vorsichtig auf Inkubieren Sie sie dann erneut diesmal aber bei 100 C f r ca Centrifuge 5Minuten e Entfernen Sie dann die Proben aus dem kochenden Wasserbad und sch tteln Sie sie erneut vorsichtig auf Bring
42. den abgedeckten Erlenmeyerkolben dann in ein gro es Becherglas so da etwaige Fl ssigkeitstropfen an seiner Au enseite beim sp teren Erhitzen nicht in den Mikrowellenherd laufen k nnen e L sen Sie nun die Agarose in dem Puffer durch vorsichtiges Erhitzen in der Mikrowelle 1 bis 1 5 min auf Stufe 6 e Stellen Sie mithilfe einer Wasserwaage den Geltr ger auf Ihrem Arbeitstisch exakt waagrecht auf setzen Sie metallenen Endplatten und den Probenkamm ein e Gie en Sie zun chst nur wenige Milliliter der gel sten Agarose ein und dichten Sie durch Kippen die Endplatten ab Warten Sie bis die Gele abgek hlt sind e F llen Sie dann die restliche L sung ein Gelh he ca 6mm e Lassen Sie die Gele vollst ndig abk hlen und erstarren bevor Sie das Ger t bewegen Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 40 Nehmen Sie nun Ihre mit ENZ vermengten DNA Proben zur Hand und mischen Sie mit einer Mikro Kolbenpipette in jedes Reaktionsgef je 5 ul der Frontmarkerlosung FM ein wobei Sie f r jede Probe eine frische Pipettenspitze verwenden Schlie en Sie die Flipdeckel fest Stellen Sie die Mikro Probenr hrchchen f r einige Sekunden austariert in die Mikrozentrifuge Sorgen Sie dann f r eine gute Durchmischung des Inhalts anschnippen Zentrifugieren Sie erneut Setzen Sie den Geltr ger mit dem darin fest gewordenen Gel auf die Plattform in der Elektrophoresekammer Die Geltaschen kommen dabei ans Kathodenende Min
43. doc 22 06 2010 Seite 6 1 1 3 E Versuch Verteilung Anmerkung Dieser Versuch wird aus Zeitgr nden nicht praktisch durchgef hrt sondern nur theoretisch betrachtet siehe auch Vorlesung e Eine w rige Jod Kaliumiodidl sung 30ml 0 05M wird in einem Scheidetrichter mit dem gleichen Volumen Dichlormethan ausgesch ttelt Handschuhe e Nach dem Einf llen Stopfen aufsetzen umdrehen und ber den Hahn mehrfach Druckausgleich durchf hren dabei Hahnk cken und Stopfen festhalten e Die Dichlormethanphase l t man ablaufen und wiederholt den Vorgang mehrere Male e berlegen Sie was zu beobachten w re und welche Stoffe dabei entst nden Materialien Bechergl ser 50ml 100ml Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 7 1 2 Platz 2 Chemische Reaktionen mit Ladungsubertragung 1 2 1 Sauren Basen und Puffer Die Starke oder Schwache einer Saure oder Base hangt von deren Molekulstruktur ab In Dicarbonsauren z B Bernsteinsaure ist die erste COOH Gruppe starker die zweite schwacher sauer als in einer Referenz Monocarbonsaure z B Essigs ure e Recherchieren Sie f r Protokoll was man unter dem pH Wert versteht Erkl ren Sie in Worten was pH Ig H30 bedeutet e Recherchieren Sie f r Ihr Protokoll was der K bzw K Wert und der pK bzw pK Wert engl pKa pK bedeuten Allgemeine Formeln zu Erinnerung und Herleitung Eckige Klammern sind eine Kurzschreibweise f r Konzentration von c
44. e f r Ihr Protokoll welchen pH Wert eine 0 2 M Acetatl sung theoretisch hat pKs von Essigs ure ist 4 8 e Der zu erstellende Befund der Casein L sung wird mit dem Naturprodukt verglichen Mischen Sie hierzu 25ml Magermilch und 25ml 0 4M Natriumacetat und f hren Sie den gesamten Versuch insg 2x durch einmal mit der Casein L ung und auch einmal mit der Milch Natrium Acetat Mischung durch e Bereiten Sie 2 Reihen a 8 numerierte Reagenzglaser 16X160 oder 16X130 vor legen eine kleine Tabelle an und beschicken die Gl ser mit Essigs ure 0 2 M in jeweils folgenden Volumina 0 1 ml 0 3 ml 0 6 ml 1 0 ml 2 0 ml 4 0 ml 6 0 ml und 9 0 ml und f llen Sie jedes Reagenzglas auf 9 ml auf also dann in derselben Reihenfolge mit 8 9 ml 8 7 ml 8 4 ml 8 0 ml 7 0 ml 5 0 ml 3 0 ml und O ml Wasser e Pipettieren Sie in die erste Reihe 8 Reagensglaser nun z gig je 1 0 ml der Casein Losung und schutteln um e Pipettieren Sie in die zweite Reihe 8 Reagensglaser nun zugig je 1 0 ml der Milch Natrium Acetat Mischung und schutteln um e Notieren Sie den Ausf llungsgrad in den einzelnen Gl sern 000 nicht nennenswert coee erkennbar ceee stark eeee st rker e Notieren Sie fur Ihr Protokoll ihre Beobachtungen der Vorgang der Gerinnung ist im Detail komplex weil das Casein kein einheitliches Protein ist e Berechnen Sie die pH Werte der entstandenen Puffer Mischungen auf eine Stelle hinter dem Komma pKs 4 8 Bi
45. eine Gel Elektrophorese fast genau wie in 3 1 1 FF Versuch DNA Fingerprinting durchgef hrt allerdings mit 3 igen Agarose Gel statt 1 igem Beachten Sie in diesem Falle auch da Sie zu jeder Probe 10 ul des fur die herk mmliche Gelelektrophorese vorgesehenen orange G loaging dye hinzuf gen und auch die fur dieses Verfahren vorgesehene Allel Leiter verwenden Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 50 Agilent DNA 1000 Kit Quick Start Guide Setting up the Chip Priming Station 1 2 Adjust the base plate 3 Essential Measurement Practices Replace the syringe a Unscrew the old syringe from the lid of the chip priming station Release the old syringe from the clip Discard the old syringe Remove the plastic cap of the new syringe and insert it into the clip a oO Slide it into the hole of the luer lock adapter and screw it tightly to the priming station a Open the chip priming station by pulling the latch b Using a screwdriver open the screw at the underside of the base plate c Lift the base plate and insert it again in position C Retighten the screw Adjust the syringe clip a Release the lever of the clip and slide it down to the lowest position Handle and store all reagents according to the instructions on the label of the individual box Avoid sources of dust or other contaminants Foreign matter in reagents and samples or in the wells of the chip will interfere with assay results
46. el verglichen werden Bei der Papierchromatographie werden Teilchen aufgrund ihrer Gr e differenziert Verschieden gro e Teilchen wandern unterschiedlich schnell durch die Poren eines Filterpapiers Bereiten Sie eine Flasche Laufmittel in ausreichender Menge f r alle Teilnehmer des Praktikums vor Das Laufmittel besteht aus einer Mischung aus Butanol Essigs ure Wasser destilliert im Volumen Verh ltnis 4 1 1 d h 4 Teile Butanol auf je 1 Teil Essigs ure und Wasser Eine Menge von 200 ml sollte ausreichen Das Laufmittel riecht stark stellen Sie es also unter dem Abzug her verwenden Sie es nur dort und belassen sie es dort Nehmen Sie ein rundes Filterpapier einen Bleistift und einen Zirkel oder als Ersatz eine M nze zur Hand Markieren Sie das Zentrum des Rundfilterpapiers und Zeichnen Sie optisch korrekt mit dem Bleistift mittig einen Kreis mit ca 1 cm Radius um den Mittelpunkt den sog Startkreis Informieren Sie sich wieviele Proben und Referenzen verwendet werden und teilen Sie das Rundfilterpapier mit dem Bleistift in entsprechend viele Kuchenst cke Im vorliegenden Versuch werden i d R 1 Probe und 3 Referenzen betrachtet Sie m ssen das Rundfilterpapier also i d R nur mit 2 rechtwinklig zueinander stehenden Strichen in 4 Segmente teilen sollten 4 Referenzen zur Verf gung stehen teilen Sie das Papier dementsprechend in 5 Segmente Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 28 Als Proben werden i d R 3
47. elscheibe bis ein deutlicher Geruch nach Bratkartoffel auftritt e Tropfen Sie erneut eininge Tropfen der H2O2 Losung auf und notieren Sie Ihre Beobachtung Wo kommt es im Vergleich zu vorher nun zu Schaumbildung e berlegen Sie f r Ihr Protokoll welche Art von Reaktion stattgefunden hat Woraus besteht der Schaum Wodurch kommt es zur Schaumbildung Was erm glicht diese Reaktion Was verhindert die Reaktion 4 1 1 KK Versuch Enzymatische Spaltung von St rke e Stellen Sie f r jede Gruppe 5 ml einprozentiger St rkel sung bereit w 1 e Erw rmen Sie die St rkel sung im Wasserbad bei 37 C e F llen Sie als Blindprobe 1 ml St rkel sung OHNE Amylase bzw Speichelzugabe in ein separates Reagenzglas e Tropfen KJ3 Losung zur Blindprobe und notieren Sie Ihre Beobachtung e Geben Sie etwas von Ihrem Speichel enth lt Amylase direkt in die erw rmte St rkel sung e Geben Sie in ein separates Reagenzglas 1 ml der St rke Amylase L sung und einige Tropfen KJ3 Losung und notieren Sie Ihre Beobachtungen Ziehen Sie zum Vergleich 2 1 1 T Versuch Hydrolyse von St rke Abbildung 6 Jod St rke Einschlussverbindung heran e Wiederholen Sie den KJ3 Test alle 2min insg 5x e Notieren Sie erneut Ihre Beobachtungen e berlegen Sie f r Ihr Protokoll welche Schlu folgerung sich aus Ihren Beobachtungen ziehen l t Welche Reaktion hat stattgefunden Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 66 4 1 1 LL Versuch Milch
48. en Abschnitt kann intuitiv entnommen werden da die Menge des durch eine Spezies in L sung absorbierten Lichtes von der Anzahl der lonen oder Molek le dieser Spezies im Strahlengang des Photonenstrahls abh ngt Hieraus folgt da mehr Licht absorbiert wird wenn die Konzentration der absorbierenden Spezies steigt Analog werden um so mehr Photonen absorbiert je l nger der Lichtweg des Photonenstrahls durch die L sung ist Der dritte Faktor der die Menge des absorbierten Lichts bestimmt ist die Wahrscheinlichkeit da ein Photon absorbiert wird und einen Elektronen bergang in einer chemischen Verbindung verursacht Verschiedene chemische Verbindungen haben unterschiedliche Wahrscheinlichkeiten f r Elektronenubergange die Verbindung mit der h chsten Wahrscheinlichkeit absorbiert mehr Licht als andere Verbindungen bei der gleichen Konzentration Licht quelle Foto detektor Blende abe BEA Intensitat des he eingestrahlten Lichts atakan Hoti Filter K vette mit substanzprobe ER Abbildung 3 Schema einer Mef amp zelle mit einer L sung die Photonen hf absorbiert Um diese Aussagen in mathematischer Form auszudr cken wollen wir einen Photonenstrahl einer einzigen Wellenl nge betrachten der eine L sung durchl uft Wir wollen die Anzahl der die Zelle pro Sekunde passierenden Photonen als lo bezeichnen die Intensit t des Lichtstrahls vor der Probe einfallende Lichtintensit t Eine bestimmte Anzahl
49. en sie die Zellmatrix erneut in Form eines Pellets indem Sie sie erneut zentrifugieren bei 6000 g f r ca 15 Minuten e Nehmen Sie einige von der Gr e her f r den von Ihnen zu verwendenden F N pi u Thermocycler geeignete PCR u J U Mikroproben Flipdeckelgef e und PCRtube Capless beschriften Sie diese mit Ihren Initialen tube Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 60 Transferieren Sie 20 ul Ihrer in der L sung befindlichen DNA mittels einer geeigneten Pipette auf den Boden des PCR Gef es Achten Sie 4 diesmal darauf anders als bei ersten Mal vom TA K Uberstand und auf keinen Fall vom Pellet zu nehmen x Y berlegen Sie f r Ihr Protokoll was beim ersten rat Mal Zentrifugieren im Pellet und in der L sung enthalten war und was beim zweiten Mal Zentrifugieren im Pellet und in der L sung a er Supernatant Y x e Q eA enthalten ist T y Master mix berlegen Sie f r Ihr Protokoll woraus der Mastermix besteht Nehmen Sie das Probengef s mit dem gelben Mastermix aus dem K hlschrank lagern Sie diesen auf Eis solange er sich auf Ihrer Werkbank befindet Geben Sie 20 ul Mastermix in jedes PCR Probenrohrchen auch in die Kontrollproben Lassen Sie sich ggf von Ihrem Betreuer zeigen wie man mit der Pipettenspitze geschickt einmischt Nehmen Sie fur jeden Pipettiervorgang eine neue Pipettenspitze Verschlie en sie die Flipdeckel dann fest Uberlegen Sie fur Ihr Protokoll welche Funkt
50. ertes Epithel Protease Salzl sung und setzen Sie langsam den Alkohol zu e Lassen Sie das Gef dann ruhig stehend ca 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren Wie sieht ausgef llte DNA aus Schritt 5 Aufbewahrung der sichtbar gemachten DNA hnlich wie Salz oder Zucker ist DNA in gel stem Zustand farblos aber wei wenn sie in ausreichender Menge ausgefallen ist Wenn Sie ausf llt erscheint Sie als feine wei e in L sung suspendierte F den Die F den sind etwas bruchig wenn Sie zu grob behandelt werden k nnen Sie brechen Wenn diese Masse dann aus der Fl ssigkeit genommen wird klumpt sie weiter zusammen e Wenn nicht nur Flipdeckel Plastik Gef e sondern auch herzf rmige Glas Gef e fur eine Halskette zur Verf gung stehen transferieren Sie mittels einer 5 Plastik Einwegpipette die ausgefallene DNA mit ca 0 75 ml bis 1 ml der L sung in die Herz Phiole e Ihr Betreuer stellt Ihnen eine M glichkeit zum Versiegeln der Phiole zur Verf gung Bitte beachten Sie da der verwendete Klebstoff st rker ist als herk mmlicher Sekundenkleber aus dem Haushalt das Tragen von Schutzkleidung insb von Handschuhen und Schutzbrille ist daher Vorschrift e Versiegeln Sie das Gef und begl cken Sie Ihre Freunde mit Ihrer DNA Anmerkung der letzte Kurs von Tag 3 setzt die Proben an f r 4 1 1 LL und 4 3 1 QQPlatz 2 Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 56 3 4 Platz 4 3 4 1 Genloci 3 4 1 1
51. erwendeten Substanzen e Puffergleichung pH pK log Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 8 1 2 1 6 Versuch Pufferl sungen e Stellen Sie eine der unter a d spezifizierten Pufferl sungen her Jede Gruppe stellt dabei nur eine der L sungen her e Kalibrieren Sie das pH Meter mit Ma l sung Zweipunkt Kalibrierung erst pH 7 dann pH 4 Sp len Sie den Pr fkopf des pH Meters Vorsicht Sehr zerbrechlich vor und nach Gebrauch gr ndlich mit destilliertem Wasser Achten Sie darauf den Pr fkopf des pH Meters in ein Reagenzglas mit destilliertem Wasser abzustellen wenn er nicht in Gebrauch ist Vermeiden Sie Verunreinigung und Austrocknung des Pr fkopfes e berpr fen Sie den pH Wert der von ihnen hergestellten L sung mit Hilfe des von Ihnen kalibrierten pH Meters e Stellen Sie mit S ure oder Lauge den gew nschten pH Wert ein messen und dokumentieren Sie die daf r erforderliche Menge Warum mu in der Praxis fast immer korrigiert werden Pufferl sungen je eine pro Gruppe a 200ml 125 mM Na Phosphatpuffer pH 7 5 b 200ml 0 5 M Tris HCl Puffer pH 7 8 c 250ml 100 mM K Citratpuffer pH 5 0 aus Zitronensaure d 100ml 0 25 M Citratpuffer pH 6 5 aus Trinatriumcitrat Substanz Dissoziationsgleichgewicht pKs Werte Phosphors ure H3PO S Ht HoPO g 2 0 12 3 Zitronensaure C3Hs COOH 5 3H C3Hs0 COO s Tris Tris hydroxymethl C4H4 gt NO3 5 C4H11NO 3 H 8 3 m aminomethan Tabelle 2 e Suchen
52. es ersten Gef es mit einem wasserfesten Stift mit Ihrer Gruppennummer Stellen dabei sicher da Ihr K rzel von keiner anderen Gruppe ebenfalls benutzt wird Kennzeichnen Sie die Reaktionsgef e auf den Deckeln so da Sie sie sp ter eindeutig zuordnen k nnen Tragen Sie Handschuhe und benutzen Sie unbedingt fur jeden Pipettiervorgang eine neue Pipettenspitze Arbeiten Sie sauber und sorgf ltig und vermeiden Sie jede Verunreinigung Ihrer Proben Vermeiden sie insbesondere jeden Kontakt mit den Deckelinnenseiten der Flipdeckel Gef e Es ist im Vorfeld des Versuches erforderlich je 10 ul jeder DNA Probe in jedes entsprechend gekennzeichnete und gef rbte Reaktionsgef zu pipettieren dies wird i d R bereits im Vorfeld von Ihrem Dozenten ausgef hrt Sie erhalten daher von Ihren Betreuern eine Reihe Flipdeckel Mikrogef sen mit folgendem Inhalt von links nach rechts gesehen mit dem Deckelscharnier auf der Ihnen abgewandten Seite also hinten rechts TO V1 V2 V3 V4 V5 M FM ENZ Gef Nr von links nach rechts l Il Ill IV V VI VII VIII IX Inhalt V1 Tatverd chtiger Nr 1 10 ul V2 Tatverdachtiger Nr 2 10 ul V3 Tatverdachtiger Nr 3 10 ul V4 Tatverd chtiger Nr 4 10 ul V5 Tatverdachtiger Nr 5 10 ul TO Tatort DNA 10 ul M Lambda HIND Ill Gr enmarker 20 ul FM Frontmarker 70 ul ENZ EcoRI Pstl Enzymmischung 80 ul e Der Restriktions Verdauu
53. eyer Probe VL 7 4 Altskript V 2 1 ccccssscccseseecesseeseeeeeseeeeeneeeeens 1 4 1 M Versuch Verseifung von Fett VL 10 1 AltskriptV 2 2 sccccsssseeeceeseeeceeseeeesees 1 4 1 N Versuch Kalkseife VL 11 1 Altskript V 2 3 ccceccececcececeececeececeecececceceeeeneees 1 4 1 0 Versuch Fetts uren VL 11 2 Altskript V 2 4 cccssssecccseseeeccesseeceeseeeseseeeseees 1 4 2 Kohlehydrate und verwandte Verbindungen Teil Aliskript 2 2 eeeeeeeeeeeseeeeeeeeeees 1 4 2 P Versuch Fructose und Glucose VL19 1 4 Altskript V 2 6 sssccccssseeeeeeseeeeeeees 1 4 2 Q Versuch Glucosebestimmung mit Glucoseoxidase GOD NAD Test 2 Versuchstag 2 Einfache und komplexe BioMolekule cccccceeeceeseeeeeeeaeeeeeeaeeeeesaees 2 1 Platz 1 Weiterf hrung einfache Biomolek le cccccecseeeeeeceeeeeeeaeeseeeaeeeesaees 2 1 1 Kohlehydrate und verwandte Verbindungen Teil Il Altskript 2 2 eneenenneeneneenneneenenens R Versuch Reduzierende und nicht reduzierende Zucker 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 X Versuch Reduzierende Wirkung von Ascorbins ure 2 2 Platz 2 Aminos uren und Proteine PH Messungen u s0444snnene nennen 2 2 1 AminosaurenAlskipt 241 ns eattaonsaverdeste 2 2 1 Y Versuch Titration von Glycin VF 3 2 Altskript VD AS erneeennennunnnennnnenennnnnnnennnnnn 2 2 2 Typische Reaktionen von Proteinen Altskript 2 4 2 cccceccccseseeeseeeeeeeeeeseeeeeeeeeeeseees
54. f en befinden die in Ihren Thermocycler passen e berlegen Sie f r Ihr Protokoll woraus der Mastermix und der Primer bestehen e Geben Sie zu jeder Probe Pipettenspitzenwechsell je 20 ul des MasterMix Primer e Nutzen Sie die Pipette durch vorsichtiges Wiederansaugen und Wiederauswerfen zum Durchmischen des Gef inhaltes Achten Sie beim Einpipettieren darauf den Inhalt nah am Gef lsboden auszuwerfen er sollte nicht am oberen Gef lsrand kleben bleiben e Schlie en Sie die Gef deckel fest Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 48 Lagern Sie die Gef e mit DNA und MMP auf Eis zwischen Al IB i Master mix primers MMP Wenn alle Proben aller Teilnehmer aller Gruppen des Versuchstages bereitstehen stellen sie diese alle in den Thermocycler schlie en Sie den Deckel des Thermocyclers fest achten Sie auf festen Kontakt des Deckels mit den Proben Ihr Betreuer startet dann das entsprechende Programm des Thermocyclers berlegen Sie f r Ihr Protokoll welche Funktion der Thermocycler hat und warum diese ben tigt wird Wenn der Thermocycler nicht bereits vorprogrammiert ist erstellen Sie ein Programm das 3 Schritte in Zyklus 2 beinhaltet Der abschlie ende Zyklus 3 stellt sicher da die abschlie ende Kettenvervollst ndigungsreaktion vollendet wird und alle potentiellen PCR Endprodukte synthetisiert werden Step Function Temperature Duration Number of cycles C
55. fallflaschel F r Oliven l nur Einmalpipetten verwenden verschmutzte Pipetten u Reagenzglas werden nicht gesp lt sondern separat entsorgt e Pr fen Sie mit kleinen Proben 1 Tr bzw 72 kleiner Spatel der untenstehenden Stoffe ihre L slichkeit e Verwenden Sie Rgl 14x160 mit je ca 5ml 4cm hoch Wasser bzw Petroleum e Geben Sie die jeweils zu pr fende Substanz je einmal in Wasser und einmal in Petroleum e Vermerken Sie ihre Beobachtungen in der nachfolgenden Tabelle e berlegen Sie warum die Substanzen sich in manchen F llen l sen in anderen nicht Stichwort Polarit t e Recherchieren Sie f r Ihr Protokoll die Strukturformeln der Substanzen und interpretieren Sie die L slichkeiten auf Basis der verschiedenen m glichen inter molekularen Wechselwirkungen sowie der Enthalpie und Entropiebeitr ge zu AG Substanz l slich in _Wasser Petroleum Ammoniumsulfat NH4 2504 ey EEE Glucose oS o Oliven l o o S Od O S Tabelle 1 Material Reagenzglas Bechergl ser 50ml f Petroleum Spatel Pasteurpipetten Abfallflasche 1 1 1 B Versuch Emulgatoren e Inje 2 Reagenzglas 16X100 Schraubverschlu mit je 5ml H20 wird je 1Tr Oliven l gegeben Dann setzt man einem Reagenzglas 1Tr Sp lmittel zu und sch ttelt beide Gl ser intensiv e Notieren Sie ihre Beobachtung vor und nach Zugabe des Spulmittels e Welche Eigenschaften hat im Allgemeinen ein Stoff den man als Emulgator bezeichnet Stichwort P
56. gruppen negativ geladen wie Aminogruppen positiv geladen sind Die Loslichkeit von Proteinen wird nicht nur von den geladenen Gruppen und dem isoelektrischen Punkt bestimmt sondern auch von der Art und Anzahl weiterer polarer mehr oder weniger hydrophiler bzw hydrophober Gruppen also der Aminos urezusammensetzung ferner von deren r umlicher Verteilung Bei pH Werten abseits des IP sind die Molek le alle gleichsinnig geladen und sto en sich ab Am IP f llt diese Absto ung weg und die Molek le k nnen unter intermolekularer Wechselwirkung zwischen und Ladungen aggregieren Die Proteine fallen aus oder flocken aus Da die native Struktur eines Proteins in L sung durch eine Kombination vieler verschiedener Wechselwirkungskr fte ionische und dipolare Kr fte Wasserstoffbr cken hydrophobe Wechselwirkungen sowie eine geordnete Hydrath lle aufrechterhalten wird ist sie st ranf llig Bei nderungen der Zusammensetzung der L sung und der u eren Bedingungen pH Wert Ionenst rke Temperatur fallen viele Proteine unl slich aus und denaturieren Casein ist der Haupteiwei bestandteil der Milch in Kuhmilch 3 Casein ist bei schwach alkalischem pH l slich e Recherchieren Sie f r Ihr Protokoll welche physiologische Funktion Casein hat 2 2 2 2 Versuch Isoelektrischer Punkt und L slichkeit von Casein e Sie erhalten eine vorbereitete L sung von Casein in 0 2 M Natriumacetat Gehalt ca 5mg ml berlegen Si
57. heit RR Da die Gl 3a die bevorzugte Form des Gesetzes ist wird in wissenschaftlichen Zeitschriften stets der molare dekadische Extinktionskoeffizient als Kenngr se von Stoffen angegeben Wenn eine Messung durchgef hrt werden soll wird das Spektralphotometer zun chst so justiert da die Skala prozentuale Transmission T in Abwesenheit von Strahlung aus der Strahlungsquelle 0 anzeigt sowie 100 f r eine reine Losungsmittelprobe bei der f r die sp tere Probenmessung verwendeten Wellenl nge F r diese Referenzmessung Blindwert ist also 100 Anschlie end wird die Probenl sung in den Strahlengang gebracht und gemessen Die Skala f r die prozentuale Transparenz gibt dann Ip an In einigen F llen absorbieren auch zugesetzte Reagenzien in gewissem Ma e Dann wird zur Bestimmung des Blindwertes die reine Reagenzl sung verwendet und so die durch die Reagenzien verursachte Absorption kompensiert Abbildung 4 Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 13 log 6 0 Lanthan Arsenazo Komplex mit H O als Blindwert 204 Lanthan Arsenazo ae E Komplex mit Arsen X 0 3 azo Reagenz als K Blindwer BAAP ARTANA TE 0 1 KS b STK 7 ol U NAAN 400 440 480 520 560 600 640 680 1 6 210 300 350 390 Wellenl nge in nm Wellenl nge in nm Abbildung 4 Links Die molaren dekadischen Extinktionskoeffizienten verschiedener chemischer Verbindungen k nnen bis etwa 10 1 mol cm
58. ich in kleinen Mengen umf llen zu lassen unbehandeltes Eiklar ist zu z hfl ssig f r den weiteren Versuchsverlauf Bef llen Sie 6 Reagenzgl ser a f mit jeweils ca 5 ml des Eifiltrats Beschriften Sie mit einem geeigneten Stift jedes der Reagenzgl ser mit dem entsprechenden Buchstaben F hren Sie nun mit jedem der Reagenzgl ser zun chst untenstehende Behandlung einmal durch und notieren Sie Ihre Beobachtung f r Ihr Protokoll wie steht es mit der L slichkeit bzw in welchen F llen kommt es zu Niederschlagsbildung Bewahren Sie die Reagenzgl ser zun chst noch auf S U Erhitzen Sie Probe a im Wasserbad langsam bis zum Sieden Messen Sie dabei die Temperatur mittels eines Thermometers Notieren Sie f r Ihr Protokoll die Temperatur bei der erstmals Niederschlagsbildung sichtbar erfolgt Versetzen Sie Probe b mit 5ml Ethanol w 96 und sch tteln Sie diese gut Stellen Sie 30 ml NH4 2SO bereit 15g pro 30 ml wird von der ersten Gruppe f r alle Teilnehmer an diesem Versuchstag hergestellt Versetzen Sie Probe c mit 5ml der konz Ammoniumsulfatl sung Unterschichten Sie Probe d unter dem Abzug vorsichtig und langsam mit 2ml konz HNO3 Tragen Sie dabei Handschuhe und Schutzbrille Beobachten Sie dabei besonders die Grenzfl che Sobald sich keine weitere neue Beobachtung einstellt verschlie en Sie das Reagenzglas fest und sch tteln Sie es gr ndlich Stellen Sie 30ml CuSO 1M bereit Versetzten Sie Probe e langs
59. igter PCR Proben und Farbung der Agarose Gele e Nehmen Sie Ihre im Thermocycler PCR amplifizierten Proben aus dem K hlschrank und lagern Sie diese auf Eis solange sie sich auf Ihrer Werkbank befinden e Zentrifugieren Sie die Proben f r einige Sekunden in der Mikrozentrifuge e Nehmen Sie das Mikroprobengef mit dem MMR DNA Standard zur Hand lassen Sie es aber zun chst geschlossen und unver ndert e Nehmen Sie die 3 Kontrollproben mit bekannter Kontroll DNA zur Hand DNA DNA und DNA e Nehmen Sie das Mikroprobengef mit der Centrifuge blauen PV92 XC loading dye zur Hand e Pipettieren Sie zu jeder Kontroll DNA Probe und zu jeder Ihrer Proben 10 ul des loading dye zu jeder Ihrer Proben aber nicht zum MMR Standard und mischen Sie es vorsichtig mit der Pipettenspitze ein e Machen Sie sich mit unten anhangender Bedienungsanleitung fur das Lonza Flash Gel System vertraut Quelle www lonza com bzw http www lonza com group en products_services products catalog_new ParSys 0007 FileO tmp path eshop Instructions tech_sheets Primary_cells media electrophoresis FlashGel_System_Quick_Start_Guide _18331_ pdf e Fuhren Sie eine Schnell Elektrophorese mit Lonza Fertig Gelen durch Sollten Lonza Schnell Gele nicht zur Verfugung stehen fuhren Sie stattdessen eines der anderen in den vorangegangenen Versuchen beschriebenen Gel Elektrophorese Verfahren durch Biochemie_Skript22Jun2010 d
60. inen schwimmenden Reaktionsgef st nder setzen und mindestens 45 Minuten in 37 C warmen Heizblock oder ersatzweise ein warmes Wasserbad falls kein Heizblock zur Verf gung steht e Bewahren Sie die Proben danach gek hlt auf DNA Gelelektrophorese in Agarose Die DNA Fragmente werden nun durch Elektrophorese nach ihrer relativen Gr e getrennt Die DNA Fragmente werden hierzu in ein Agarose Trenngel geladen das in eine Kammer kommt die mit einer elektrisch leitenden Pufferl sung gef llt ist Zwischen zwei Drahtelektroden an den beiden Enden der Kammer wird Gleichstrom angelegt DNA Fragmente sind negativ geladen und werden daher im elektrischen Feld vom positiven Pol angezogen Die Matrix des Agarosegels dient dabei als molekulares Sieb durch das k rzere DNA Fragmente leichter hindurchwandern k nnen als gr ere Pro Zeiteinheit wandern kleinere Fragmente somit weiter als gr ere Fragmente der gleichen Gr e bleiben zusammen und wandern in separaten DNA Banden Elektrophorese der DNA Proben e Gie en Sie 1 ige Agarose Gele wie folgt e Geben Sie dazu pro Gel je 50ml 1xTAE Puffer wie wird dieser hergestellt in einen 100ml Erlenmeyer Kolben Geben Sie dorthinein eine entsprechende Menge Agarose um die gew nschte Konzentration hier w 1 zu erreichen e Decken Sie die ffnung des Erlenmeyer Kolbens mit einem kleinen Becherglas ab so da beim sp teren Erhitzen keine Fl ssigkeit herausspritzen kann Stellen Sie
61. ins ure auf 40 ml destilliertes Wasser e Fugen Sie zu ca 3ml der Fehling I 1l Mischung aus 2 1 1 R die zu analysierende Probe zu e Erwarmen Sie die Mischung mit der Probe im siedenden Wasserbad auf ca 100 C geben sie ggf einen weiter Spatel Ascorbins ure hinzu e Erw rmen Sie zum Vergleich als Blindprobe auch eine Fehling I 1l Mischung ohne Ascorbins ure Blindprobe e Notieren Sie f r Ihr Protokoll Ihre Beobachtungen e Vergleichen Sie Proben auf ihre Reduktionskraft Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 21 2 1 2 X Versuch Reduzierende Wirkung von Ascorbins ure Silberspiegel e Geben Sie in ein sauberes neues Reagenzglas ca 2ml 10 AgNO L sung e F gen Sie tropfenweise mit der Pasteurpipette Ammoniakl sung zu bis sich der zuerst entstehende Niederschlag wieder aufgel st hat ca 1 1 e Geben Sie dazu Ascorbins urel sung ca 5ml mit 1mg ml e Erwarmen Sie das ganze vorsichtig im Wasserbad Achtung wird zu schnell erhitzt f llt ein schwarzer Silberniederschlag aus Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 22 2 2 Platz 2 Aminosauren und Proteine pH Messungen 2 2 1 Aminosauren 2 2 1 Y Versuch Titration von Glycin Bei der Titration wird ein bekannter Stoff mit unbekannter Konzentration in einer gezielten chemischen Reaktion mit einer Ma l sung bekannter Konzentration umgesetzt Das Volumen der verbrauchten Ma l sung wird dabei gemessen und anhand der St chiometrie die unbekannte
62. ion der Thermocycler hat und warum diese benotigt wird Wenn alle Proben aller Teilnehmer aller Gruppen inklusive der zugeh rigen Kontrollproben des Versuchstages bereitstehen stellen sie diese alle in den Thermocycler schlie en Sie den Deckel des Thermocyclers fest achten Sie auf festen Kontakt des Deckels mit den Proben Ihr Betreuer startet dann das entsprechende Programm des Thermocyclers berlegen Sie f r Ihr Protokoll welche Funktion der Thermocycler hat und warum diese ben tigt wird Wenn der Thermocycler nicht bereits vorprogrammiert erstellen Sie ein Programm das 3 Schritte in Zyklus 2 beinhaltet Der abschlie ende Zyklus 3 stellt sicher da die abschlie ende Kettenvervollst ndigungsreaktion vollendet wird und alle potentiellen PCR Endprodukte synthetisiert werden Cycle Step Function Temperature Time 1 Step 1 Pre denaturation 94 C 2 minutes Repeat 1 time Step 1 Denature 94 C 1 minute step 2 Anneal 60 C 1 minute Step 3 Extend IC 2 minutes Repeat 40 times step 1 Final extension TC 10 minutes Repeat 1 time Das Programm des Thermocyclers ben tigt ca 3 5 Stunden Ihr Dozent wird Ihre Proben anschlie end entnehmen und im K hlschrank zwischenlagern Der Versuch wird dann an Versuchstag 4 zuendegef hrt Schreiben Sie sich daher unbedingt auf wie Sie Ihre Proben gekennzeichnet haben Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 61 Teil 2 wird durchgefuhrt an Versuchstag 4 Elektrophorese vervielfalt
63. ite 27 2 3 2 Protein Chromatographie 2 3 2 DD Versuch Papierchromatographie Rundfiltermethode Im Vorfeld wurden von ihrem Dozenten einige Milliliter Eiklar aus Versuch 2 3 1 AA oder anderweitige Eiwei e mit dem gleichen Volumen konz Salzs ure HCI ber eine Dauer von 6 Stunden am R ckflu bei 120 C gekocht Abzug Die S ure wurde im Rotationsverdampfer abgezogen und vom festen R ckstand abfiltriert Das Filtrat wurde noch weiter eingeengt Vergewissern Sie sich da am Ende ihres Versuches noch eine ausreichende Menge dieses Filtrats f r alle Gruppen des folgenden Versuchstages verbleibt und informieren Sie rechtzeitig Ihren Betreuer falls neues Filtrat hergestellt werden sollte berlegen Sie welche Folgen diese Behandlung f r die Inhaltsstoffe hat ffnen Sie die Eiwei probe und riechen Sie vorsichtig daran Notieren Sie f r Ihr Protokoll wonach es riecht bzw woran Sie der Geruch erinnert berlegen Sie woher diese olfaktorische hnlichkeit kommt Bei verschiedensten Arten der Chromatographie werden unterschiedliche Teilcheneigenschaften genutzt Teilchen werden in einer mobilen Phase L sungsmittel gegen ber einer festen Phase in Bewegung versetzt und weisen dabei aufgrund ihrer Eigenschaften unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeiten auf Teilchen mit gleichen Eigenschaften wandern gleich schnell und bilden Streifen die sichtbar eingef rbt sog Bande bilden Diese k nnen mit den Banden bekannter Referenzmitt
64. lekule 2 1 Platz 1 Weiterfuhrung einfache Biomolekule 2 1 1 Kohlehydrate und verwandte Verbindungen Teil Il 2 1 1 R Versuch Reduzierende und nicht reduzierende Zucker Fehling sche L sung Alkalische Kupfer Il salzl sungen werden durch reduzierende Zucker unter Abscheidung von rotem unl slichem Kupfer l oxid reduziert Durch einen zugesetzten Komplexbildner Tartrat Salz der Weins ure mu verhindert werden da in der alkalischen L sung auch Kupfer Il hydroxid ausgefallt wird Die Fehling Probe hat noch immer Bedeutung als qualitativer Test auf reduzierende Zucker Reaktionsgleichung 2 Cu R CHO 5 OH CuzO R COO 3 H20 e Stellen sie sicher das pro Gruppe je 10 ml Fehling und 10 ml Fehling II zur Verf gung stehen e Stellen Sie ggf 200 ml Fehling sche L sung bereit 70g CuSO 5 H20 in 11 Wasser e Stellen Sie ggf 200 ml Fehling sche L sung II bereit 340g KNa Tartrat in 11 2 5M NaOH Durchf hrung Die Bereitstellung von Fehling L sung f r 2 1 1 R und Fehler Verweisquelle konnte nicht gefunden werden erfolgt jeweils f r alle Teilnehmer an einem Versuchstag durch die erste Gruppe die diesen Versuch durchf hrt e Stellen Sie mehrere Proben mit unterschiedlichen Zuckern her Verwenden Sie hierzu Glucose Fructose Saccharose je 10mg ml e In Absprache mit dem Betreuer stellt an dieser Stelle die erste Laborgruppe eine ausreichende Menge an Zuckerl sungen f r alle Anwesenden plus etwas Reserve
65. len Sie f r jede Gruppe 0 1 ml Urease L sung 10U ml bereit e Pipettieren Sie im Abstand von jeweils genau 30s je 0 1 ml der Urease L sung zu mischen Sie und stellen Sie diese wieder ins Wasserbad e Bestimmen Sie f r jede Probe die Reaktionszeit bis zum Umschlag des Indikators und tragen Sie sie als bei der Auswertung in Ihrem Protokoll Graph gegen die Harnstoffmenge auf Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 72 4 4 1 TT Versuch Vergiftung und Reaktivierung eines Enzyms Urease Stellen Sie fur jede Gruppe je 3 Reagenzglaser mit je 2 ml zehnprozentiger Harnstoff L sung w 10 bereit Versetzen Sie diese jeweils mit 0 5 ml des Indikators Bromthymolblau Dieser Indikator schl gt w hrend einer pH Wert Erh hung bei pH 6 von gelb nach gr n und bei pH 7 6 von gr n nach blau um Stellen Sie f r jede Gruppe je 1 ml Urease Losung 10U ml bereit F gen Sie zu einem der Reagenzglaser 1 ml der Urease L sung zu und beobachten Sie die Farbver nderung Notieren Sie Ihre Beobachtung f r Ihr Protokoll Steht ein Leitf higkeitsmel ger t zur Verf gung so verfolgen Sie die Harnstoffspaltung auch damit berlegen Sie f r Ihr Protokoll wieso sich die Leitf higkeit der L sung ndert Wie viele andere Katalysatoren wird Urease durch kleine Mengen von Schwermetallen vergiftet die an Enzymgruppen binden die f r die Katalyse essentiell und besonders exponiert und reaktiv sind h ufig sind dies SH Gruppen der Amino
66. lenl nge A e ist also eine Stoffeigenschaft e Wenn sie die Extinktion gemessen haben und die Kuvettendicke kennen k nnen Sie also entweder bei bekannter Konzentration den Extinktionskoeffizienten bestimmen oder bei bekanntem Extinktionskoeffizienten die Konzentration e Informieren Sie sich ber die Wellenl ngen von Licht und dessen Farben im fur das menschliche Auge sichtbaren Bereich e Beachten Sie da nicht jede K vette f r jede Wellenl nge geeignet ist verbreitet sind verschiedene Kunststoffe Glas bzw Quarzarten Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 14 1 3 1 J Versuch Spektren der Nicotinamidnucleotide e Die Haufigkeit der Nicotinamidnucleotid Koenzyme in der gesamten Biochemie und die charakteristischen spektralen Eigenschaften machen sie zu einem der im Labor am haufigsten analysierten Systeme e Die oxidierte bzw reduzierte Form NAD bzw NADH unterscheiden sich sehr charakteristisch im UV Spektrum e Die oxidierte Form zeigt nur die typische Absorption bei 260 nm e Dagegen hat NADH eine starke Lichtabsorption bei 340 nm Abbildung 5 PGA SRN NH Dee a en ini ae inet 2 i ei Hans ar P OSHE 0 a Se ng Bic aif i i r E Sie an i 1 BAN fi s OH OH Abbildung 5 Absorptionsspektren 0 1 millimolarer Losungen von NAD und NADH Aufgabe e Nehmen Sie die Spektren von NADH und NAD auf und pr gen sie sich ein e Da Sie eine NADH L sung bekannter Konzentration erhalten k n
67. liste Vv Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 30 Schritt 1 Vorgehensweise bei Vorbereitung der Muskelproteinproben 8 0 us Flippdeckel Mikro Probenr hrchen mit den Namen der f r die Probe jeweils verwendeten II I Fisch Spezies Bereiten Sie ein Probenr hrchen eu 8 pro Fisch Spezies pro Gruppe vor F gen Sie jedem dieser Probenr hrchen mit einer geeigneten Pipette 250 ul Bio Rad Laemmli Probenpuffer Losung zu Geben sie in jedes dieser Probenrohrchen ein kleines St ck ca 3mm Kantenl nge des jeweiligen Fisch Muskelgewebes Befreien Sie das St ck so gut wie m glich von Haut Fett und Knochen Schlie en Sie den Deckel fest Beschriften Sie mit einem Wasserfesten Stift die Schnippen Sie mit dem Finger ca 15x an das SJ Probenr hrchen um das Gewebe gut mit Puffer u zu tr nken A Inkubieren Sie die Proben ca 5 Minuten lang bei Raumtemperatur um die Proteine zu extrahieren und zu l sen Gie en sie den gel ste Proteine enthaltenden Puffer OHNE das Gewebest ck in ein Schraubdeckel Mikro Probenr hrchen Es ist a an dabei nicht unbedingt erforderlich die Fl ssigkeit 7 restlos zu transferieren da das Gel sp ter ohnehin nur mit einer kleinen Menge jeder Probe je lt 20ul beladen wird 5 e J i P Bei Raumtemperatur k nnen die Proben h chstens 3 Stunden aufbewahrt werden bevor sie in die Gelkammer gegeben werden Bei 20 C k nnen Sie einige Wochen aufbewahr
68. lle eine Waagrechte bis zur Y Achse dieser Wert entspricht der ungef hren Gr e des Fragments Bande 2 des Tatverd chtigen 5 k nnte so ungef hr die Gr e von 2000 Bp aufweisen Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 43 3 2 Platz 2 3 2 1 DNA Vergleich 3 2 1 6G Teilversuch BioRad Crime Scene Investigator Kit Crime Scene Investigator PCR Basics Kit Catalog 166 2600EDU explorer bio rad com Duplication of any part of this document is permitted for classroom use only Teil 1 wird durchgefuhrt an Versuchstag 3 e Recherchieren Sie im Vorfeld was eine Polymerase Kettenreaktion PCR polymerase chain reaction ist und wie diese funktioniert insb in punkto fur die Reaktion geeigneter Temperatur e Informieren Sie sich uber die wichtigsten Englisch Vokabeln in punkto Genetik und lesen Sie folgende Informationen Biomedizinische Publikationen sind heutzutage in aller Regel auf Englisch von daher ist dies seitens Ihres Dozenten ausdr cklich erw nscht What kinds of human DNA sequences are used in crime scene investigations There are 3 billion base pairs in the human genome greater than 99 5 do not vary between different human beings However a small percentage of the human DNA sequence lt 0 5 does differ and these are the special polymorphic many forms sequences used in forensic applications By universal agreement DNA sequences used for forensic profiling are anonymous that is they come from regions of
69. llenhinweise VL Versuch nach Bernd Lowe Biochemie Bamberg C C Buchner VF Versuch nach Hartmut Follmann Biochemie Stuttgart B G Teubner VB Versuch von BioRad 0 Allgemeine Hinweise 0 1 Dokumentationshinweise Volumenmessung e Beica Angaben sch tzen oder im Becherglas e Genaue Angaben mit Me Rzylinder bzw Pipetten abmessen e Verdunnte wakrige L sungen oder Stoffe mit bekannter Dichte kann man auch abwiegen Protokollhinweis e Ziel ist zu jedem Versuch im Vorfeld vor dem Labortermin mit Skript und anderen Quellen z B Wikipedia zu recherchieren worum es geht sich dann im Labor Beobachtungen zu notieren und sp ter dann nach dem Labortermin im Protokoll daraus Schlu folgerungen ber die chemischen Abl ufe zu ziehen e Die Leitfragen sollen Ihnen dabei als roter Faden dienen es gen gt jedoch nicht sich ausschlie lich mit der Beantwortung der Leitfragen zu begn gen in der Ausarbeitung ihres Laborprotokolls sollte man bei jedem Versuch ersehen k nnen was beobachtet bzw gemessen wurde und welche Bedeutung dies hat auch bei Versuchen die nicht durch Leitfragen abgedeckt sind Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 3 0 2 Arbeitssicherheitshinweise Bei chemischen Untersuchungen m ssen h ufig gef hrliche Stoffe eingesetzt werden Obwohl f r das Praktikum m glichst unbedenkliche Versuche ausgew hlt wurden sind doch die allgemeinen Regeln f r den Umgang mit Gefahrstoffen zu beachten
70. lten nun wie folgt beladen sein Lane Sample Load Volume 1 MMR DNA standard 10 ul 2 Homozygous control 10 pl 3 Homozygous control 10 ul 4 Heterozygous control 10 ul D student 1 20 ul G Student 2 20 ul f student 3 20 ul 3 Student 4 20 ul e Beladen Sie analog dazu die Bahnen 9 bis 16 mit den Proben der n chsten Laborgruppe bevor Sie die Elektrophorese starten e Vergewissern Sie sich da alle Verschl sse korrekt eingerastet und alle Kabel korrekt angeschlossen sind e Starten Sie die Elektrophorese e Schalten Sie die im Ger t implementierte UV Lampe nur ein wenn sich ein Gel in der Kammer befindet e Nehmen Sie eine Digital Kamera zur Hand Handy Kamera ist ausreichend und machen Sie f r Ihr Protokoll ein Bild Ihres Gels Gehen Sie dazu ggf in einen unbeleuchteten Nebenraum e Interpretieren Sie f r Ihr Protokoll die Bande Ihres Bildes Welcher Proband hat welchen PV92 Gentyp Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 64 3 5 Vorbereitung fur Versuchstag 4 nur durchzufuhren am letzten Labortermin von Versuchstag 3 3 5 1 Vorbereitung zur Alkoholischen Garung Teil I aus Enzymkinetik Teil 3 5 1 4 3 1 QQ Versuch Aktivitat und Kinetik von Alkoholdehydrogenase Teil An Versuchstag 4 wird eine alkoholische L sung ben tigt die zu ihrer Herstellung 2 Tage g ren mu Es ist daher unbedingt erforderlich da die letzte Labortermin Gruppe von Versuchstag 3 f r die erste Labortermin
71. m Protein enthaltenen aromatischen Aminos uren Phenylalanin Tyrosin und Tryptophan absorbieren UV Licht im Bereich um 280nm Eine f r viele Proteine zutreffende und oft ausreichende berschl gige Proteinbestimmung gelingt mit der Faustformel E2g0 1 entspricht 1mg ml Protein Diese Methode setzt nat rlich die Abwesenheit von anderen UV absorbierenden Stoffen z B Nucleins uren voraus berlegen Sie was ein Extinktionswert von 1 bedeutet Welche Transmission T herrscht bei E 1 Welche Absorbtion dementsprechend Welcher Art ist nach dem Lambert Beerschen Gesetz die Beziehung zwischen Extinktion und Konzentration Machen Sie sich erneut mit den zu verwendenden Kolbenpipetten vertraut Stichwort erster bzw zweiter Druckpunkt und stellen Sie sicher da diese einwandfrei funktionieren Verd nnen Sie das Eifiltrat aus 2 3 1 AA jeweils in den Verh ltnissen 1 20 1 50 und 1 200 Achten Sie darauf die Proben nicht zu vertauschen Bef llen Sie je 1 Quarzkuvette 1cm mit den verd nnten Proben F llen Sie eine Quarzk vette mit destilliertem Wasser Referenz Stellen Sie die Wellenl nge des Spektroskops auf 280 nm ein F hren Sie mit der Referenz einen Nullabgleich 100 T E 0 durch Messen Sie dann f r beide Proben die Extinktion E Berechnen Sie f r Ihr Protokoll bei den gemessenen Extinktionswerten den Proteingehalt der Filtrat Verd nnungen bzw des urspr nglichen Filtrats Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Se
72. mbert Beersche Gesetz kann nun angegeben werden 3 E A ey cd In dieser Gleichung ist der Extinktionskoeffizient eine fur jede chemische Verbindung bei einer bestimmten Wellenlange charakteristische Konstante d ist die Weglange des Lichtes durch die Losung in cm Abbildung 3 und c ist die Konzentration an absorbierender Spezies in der Losung Der Extinktionskoeffizient a ist charakteristisch fur eine bestimmte absorbierende Spezies bei einer bestimmten Wellenlange er verandert sich wenn die Wellenlange verandert wird Mit anderen Worten das Lambert Beersche Gesetz kann nur auf monochromatische Strahlung angewendet werden Der numerische Wert des Extinktionskoeffizienten hangt von den Einheiten ab in denen die Konzentration der absorbierten L sung angegeben ist Man erh lt also eine Gerade mit positiver Steigung wenn man den negativen Logarithmus der Transmission gegen die Stoffmengenkonzentration auftr gt Der molare dekadische Extinktionskoeffizient Gibt man die Konzentration der L sung als Stoffmengenkonzentration mol l an so wird das Lambert Beersche Gesetz in der Form 3a E A e cd geschrieben wobei der molare dekadische Extinktionskoeffizient ist Dieser ist wie e charakteristisch f r eine bestimmte chemische Spezies bei einer vorgegebenen Wellenl nge h ufig wird er f r die Wellenl nge der maximalen Extinktion angegeben Der molare dekadische Extinktionskoeffizient hat blicherweise die Ein
73. n Extinktion und Extinktionskoeffizient dar sinnvolle Skalierung e Achten Sie dabei besonders auf die Wellenl ngen der Absorptionsmaxima Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 15 1 3 1 K Versuch Spektren von Hamoglobinspezies Hamoglobin hat in der reduzierten Form sowie mit Bindung an Sauerstoff oder Kohlenmonoxid jeweils verschiedene spektrale Eigenschaften Messen Sie diese in folgender Weise Durchfuhrung Machen Sie sich mit den zu verwendenden Kolbenpipetten vertraut Stichwort erster bzw zweiter Druckpunkt und stellen Sie sicher da diese einwandfrei funktionieren berpr fen Sie die korrekte Handhabung indem Sie ein dosiertes Volumen Wasser nachwiegen z B 1 ml entspr 19 F llen Sie eine Kunststoffk vette mit destilliertem Wasser Referenz Stellen Sie den Wellenl ngenbereich des Spektroskops auf 400 bis 800 nm ein F hren Sie mit der Referenz einen Nullabgleich 100 T durch 100ul heparinisiertes nichtgerinnendes Blut werden in 10ml 0 5 NaHCO pipettiert Geben sie die H moglobinl sung in eine K vette und verschlie en Sie diese mit dem K vettendeckel oder mit Parafilm Messen Sie dann f r das komplette Hb Spektrum die Transmission T Das Ger t verf gt zwar auch ber eine Funktion die Extinktion E direkt zu messen diese sollen Sie aber im zur bung Rahmen der Protokollausarbeitung sp ter selbst aus der Transmission T ermitteln z B mittels Tabellenkalkulation Die Kuvette nicht e
74. n in den Gelbox Behalter e Fullen Sie die innere obere Pufferkammer zwischen den beiden Gelen mit ca 150 ml 1x TGS Elektrophoresepuffer Verdunnung beachten so da der Fullstand des Puffers oberhalb der inneren kurzen Streifen liegt und die Streifen so vollst ndig mit Puffer bedeckt sind e Entfernen Sie den Kamm sehr vorsichtig der die Gelkammern formt aus der Gelkassette e Pr fen Sie auf Undichtigkeiten Wenn die Anordnung undicht sein sollte entfernen Sie den zusammengesetzten Klemmrahmen leeren Sie den Puffer aus ffnen Sie die Arretierung und dr cken sie erneut die Elektrodenanordnung herab w hrend Sie die Arretierung schlie en e Gie en Sie ca 200 ml 1x TGS Elektrophorese Puffer Verd nnung beachten in die u ere untere Pufferkammer des Beh lters so da diese ca 4 cm hoch bef llt ist und den Metallstreifen der inneren Kammer bedeckt e Anm Wenn eine Undichtigkeit so nicht bereinigt wird kann man ersatzweise die au ere Kammer bis ber die inneren kleinen Streifen bef llen um so den F llstand in beiden Kammern abzugleichen Dazu ben tigt man ca 900 ml 1x TGS Elektrophorese Puffer Schritt 3 Beladen der Gelkammern mit den Protein Proben und Start der Elektrophorese e Plazieren Sie die gelbe Ladef hrung oberhalb der Elektrodenanordnung Die Ladef hrung f hrt die Pipettenspitze in die korrekte Position zur Beladung der jeweiligen Kammer e Wenn Sie weniger Proben als freie Kammern
75. nen Sie aus der gemessenen Extinktion bei Amax 34Onm nach Lambert Beer den molaren dekadischen Extinktionskoeffizienten 340 berechnen Durchf hrung e Machen Sie sich mit den zu verwendenden Kolbenpipetten vertraut Stichwort erster bzw zweiter Druckpunkt und stellen Sie sicher da diese einwandfrei funktionieren berpr fen Sie die korrekte Handhabung indem Sie ein dosiertes Volumen Wasser nachwiegen z B 1 ml entspr 19 e Stellen Sie aus einer 10 ml NADH Stamm L sung bekannter Konzentration 10 mM bereit Stellen Sie aus der Stamml sung dann in 10 ml destilliertem Wasser ein Verd nnung von ca 0 1 mM her Um welchen Faktor m ssen sie verdunnen Wie geht das einfach und materialsparend F llen Sie eine Quarzk vette mit destilliertem Wasser Referenz Stellen Sie den Wellenl ngenbereich des Spektroskops auf 400 bis 230 nm ein Fuhren Sie mit der Referenz einen Nullabgleich 100 T durch Messen Sie dann fur das komplette NADH Spektrum die Transmission T Das Gerat verfugt zwar auch uber eine Funktion die Extinktion E direkt zu messen diese sollen Sie aber zur Ubung im Rahmen der Protokollausarbeitung sp ter selbst aus der Transmission T ermitteln z B mittels Tabellenkalkulation e Berechnen Sie f r Ihr Protokoll die Koeffizienten s bei den gemessenen Absorptionsmaxima und vergleichen Sie das Ergebnis mit den Literaturwerten e Stellen Sie in ihrem Protokoll jeweils f r NAD und NADH graphisch Transmissio
76. ngsproze wird im Folgenden in diesen Gef en stattfinden Behalten Sie daher diese Gef e auf Ihrem Arbeitsplatz e Nehmen Sie Ihre DNA Proben und das Reaktionsgef mit der Enzymmischung ENZ zur Hand e Geben Sie nun zu jeder zu analysierenden Probe also zu TO und V1 bis V5 mit je 1 neuen Pipettenspitze je 10 ul der Enzymmischung ENZ hinzu es wird KEIN ENZ zu den anderen beiden Proben M bzw FM gegeben Lassen Sie sich von Ihrem Betreuer zeigen wie man mithilfe einer Kolbenpipette korrekt einmischt Achten Sie darauf das zu pipettierende Volumen im unteren Bereich des Probengef es zu plazieren es sollte nicht im oberen Bereich an der Gef lswand haften bleiben e Schlie en Sie die Flipdeckel fest e Stellen Sie die Mikro Probenr hrchchen f r einige Sekunden in die Mikrozentrifuge um ggf an der Gef wand haftende Substanzen nach untern zu dr cken Die Reaktionsgef e m ssen symmetrisch gegeneinander austariert in den Rotor positioniert werden sonst entsteht eine f r das Ger t sch dliche Unwucht Ist keine Zentrifuge verf gbar schlagen Sie die Reaktionsgef lse wie ein Thermometer nach unten aus Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 39 e Sorgen Sie dann fur eine gute Durchmischung des Inhalts mit dem Finger dagegen schnippen einige Male wenden oder mithilfe eines elektrischen Sch ttlers e Zentrifugieren Sie erneut e Inkubieren Sie die Proben indem Sie die Reaktionsgef e in e
77. nnnnnonenennnenene SER EN 3 Seite 2 3 Versuchstag 3 Nucleotide und Nucleins uren Altskript 2 S eearneenenunensonenenennnnennonennnnnnennnnenenenennenennn 38 3 1 PZ Mae nee sate ers ace anes ask aero a tes na ace geen E cee eee 38 Sal DNAN IVS ee E a 38 3 1 1 FF Versuch DNA Fingerprinting VB4 Altskript V 2 27 ccccsecessseccssseeceeseeceeeeseseeeseneeenees 38 3 2 PI 2 a ne ee an ete ee ee ee eee ee 44 32 _SDNAEVSIGIEICH Eee nee trod tacceaecte Cnanaver Cases 44 3 2 1 GG Teilversuch BioRad Crime Scene Investigator Kit VB3 Aliskript V 2 26 erereenenereens 44 3 3 Paz ssh idan aad sce Rz year 54 334 DNAExrakioN er e aesna 54 3 3 1 HH Versuch Wangenzellen DNA Extraktion Gen in der Flasche 54 3 4 Pla A canaaee a A 57 SAN Genot sanesa iind 57 3 4 1 11 Versuch Analyse des PV 92 Genlocus VB4 Altskript 2 28 eeennnnnnnennnonennonnennonennenneneenn 57 3 9 Vorbereitung f r Versuchstag 4 nur durchzuf hren am letzten Labortermin von Versuchstag 3 65 3 5 1 Vorbereitung zur Alkoholischen G rung Teil 0 00 ceeccceeeeeeeeeeeeeeeaeeeeeeseeeeesaeeseesaeeeees 65 3 5 2 Vorbereitung zur MilchS ure G rung Teil ccc cceecccceceeeeeeeeeeeeeaeeeeessaeeeeaeeseesaaeeees 65 4 Versucnsiag 4 Enzyme Alekipt anne 66 4 1 Paz Ta er 66 4 1 1 Katalyse und Enzymatische Reaktionen Altskript 3 1 annennennsnnnnennnnennnonennennenn nenne nnenne nennen 66 4 1 1 JJ Versuch Katalase in Gewebe Zerst rung von Enzymen durch Hitze 66 4
78. nthetische semipermeable Membranen stehen als Folien oder Dialysierschl uche in gro er Vielfalt zur Verf gung e F llen Sie etwa 6ml einer Mischung von Methylenblau 0 1g l und H moglobin 10mg ml in 0 9 NaCl Losung in einen vorgequollenen Dialyseschlauch binden knapp uber dem Flussigkeitsstand oben ab Luftblase lassen und tauchen ihn in ein wassergefulltes Becherglas auf dem Magnetruhrer e Beobachten Die die im Verlauf einiger Stunden eintretende Anderung im Dialysat u ere L sung und im Dialysierschlauch Retentat e Begrunden Sie in Ihrem Protokoll aus welcher Art von Stoffen erforderliche Eigenschaften der Schlauch besteht und warum er quillt Materialien Klammern R hrfisch 1 1 3 Grundlagen der Chromatographie e Recherchieren Sie was im Allgemeinen als Chromatographie bezeichnet wird und warum diese so genannt wird Stichwort Bande 1 1 3 E Versuch Adsorption e Unter dem Abzug werden in einen 250ml Erlenmeyerkolben mit Stopfen einige Spatelspitzen gek rnte Aktivkohle gegeben e Dann werden unter dem Abzug unter Aufsicht zus tzlich einige Tropfen Brom zugegeben Pasteur Pipette Handschuh Vorsicht leicht fl chtig und giftig NICHT einatmen Verschlie en sie das Gef gr ndlich und sch tteln Sie es dann einige Male e Entsorgung nur im Abzug e Notieren und begr nden sie ihre Beobachtung e Recherchieren Sie wo in der Medizin u a Aktivkohle eingesetzt wird Biochemie_Skript22Jun2010
79. ntleeren sondern f r 2 Messung s u aufbewahren Berechnen Sie f r Ihr Protokoll die Koeffizienten s bei den gemessenen Absorptionsmaxima und vergleichen Sie das Ergebnis mit den Literaturwerten Messung des reduzierten Hb Reduzieren Sie das Oxyhamoglobin durch Zugabe von einigen Kristallen Na2S204 Messen Sie erneut jeweils das Spektrum im Bereich 400 800nm und werten Sie es aus Stellen Sie in ihrem Protokoll jeweils f r oxygeniertes und desoxygeniertes Hb graphisch Transmission Extinktion und Extinktionskoeffizient dar Achten Sie dabei besonders auf die Wellenl ngen der Absorptionsmaxima Recherchieren Sie zur Berechnung des Extinkionskoeffizienten die molare Masse von H moglobin aus Literatur bzw akzeptablen Internetquellen wie z B Wikipedia Gehen Sie dabei von sauerstoffges tigtem H moglobin aus und rechnen Sie in Dalton gegebene Massen zun chst in Gramm um Vernachl ssigen Sie dabei das Vorhandensein des Natriumhydrogencarbonats bzw die Natriumdithionits Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 16 1 4 Platz 4 Einfuhrung einfache Biomolekule 1 4 1 Fette und Lipide 1 4 1 L Versuch Baeyer Probe Geben Sie f nf Tr Oliven l in ca 5ml NazCO3 w 5 Erw rmen Sie dieses Gemisch Sch tteln Sie dann dieses Gemisch kr ftig um es so zu emulgieren F gen Sie unter weiterem Sch tteln tropfenweise stark verd L sung von KMnO solange zu bis die Violettf rbung erhalten bleibt e Notieren Sie fur Ihr Pro
80. oc 22 06 2010 Seite 62 Biochemie_Skript22Jun2010 doc FlashGel System Quick Start Guide Important Points Refer to Table 1 for recommended sample preparation and run conditions Do not exceed 5 ul sample volume per lane Optimal sample concentrations are approximately 1 5 the typical per band concentration of an ethidium bromide gel For best results flood sample wells with water prior to loading and use FlashGel Loading Dye and FlashGel Markers Use the FlashGel Mask when running double tier cassettes CAUTION Hazardous Voltage Contact may cause death or serious injury Caution should be exercised in the operation of this system as it can develop sufficient voltage and current to produce a lethal shock To avoid any risk of injury the system should only be operated by properly trained personnel and always in accordance with the instructions provided Prior to turning on the DC power source ensure that the black lead is connected to the negative terminal and the red lead is connected to the positive terminal Do not touch the FlashGel Dock or Cassette while the high voltage supply is turned on Do not flood wells or add samples to the FlashGel Cassette while the high voltage leads are connected to the power supply Technical Service 800 521 0390 biotechserv lonza com Separation range 22 06 2010 LONZG Lonza Rockland Inc www lonza com biotechsev lonz a com Tech Service 800 638 81 74 Cust
81. ochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 24 e Benutzen Sie keine Glaselektrode Die Glasmembran einer pH Elektrode wird durch Fett Proteinfilme stark verschmutzt Benutzen Sie daher NUR Spezial indikatorpapier und stellen Sie so den isoelektrischen Punkt des Proteins fest e Begr nden Sie in Ihrem Protokoll warum durch welche Zusammensetzung er in diesem pH Bereich liegt 2 2 2 2 Nr Essigs ure H O Casein Lsg bzw Gesamtvol Milchmisch ml 0 1 8 9 1 0 m 03 87 10 100 m 06 84 10 100 v 10 1801 40 100 ooj 10 100 Ausfallung Casein Tabelle 4 Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 25 2 3 Platz 3 Protein Fallung und Chromatographie 2 3 1 Protein F llung 2 3 1 AA Versuch F llungsarten von Proteinen Nehmen Sie ein Ei pro 2 Gruppen und zwei ausreichend gro e Bechergl ser zur Hand das Eifiltrat wie folgt wird von der ersten Gruppe f r alle Versuchsteilnehmer an diesem Versuchstag hergestellt und wiegen sie die Bechergl ser vorsorglich ab Trennen Sie das Ei in Eiklar und Eigelb und bewahren Sie diese zun chst getrennt voneinander auf Wiegen Sie das Eiklar ab Geben Sie zu dem Eiklar pro Ei 100 ml Wasser und 2g Kochsalz du verr hren Sie das ganze mit einem R hrstab elektrisch Legen Sie eine Schicht Glaswolle in einen Trichter und filtrieren Sie die Eiklar Wasser Salz Mischung durch diese in ein neues Becherglas Pr fen Sie ob das Filtrat d nnfl ssig genug ist um s
82. olaritat Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 5 1 1 2 Diffusion und Dialyse 1 1 2 C Versuch Diffusion Diffusion wird mit farbigen Substanzen sichtbar gemacht e Geben Sie in zwei Reagenzglaser gleich hoch etwa 3 cm eine gelbe w rige L sung von Methylenblau bzw die br unliche L sung von Hamoglobin in physiologischer Kochsalzlosung 0 9 NaCl e Unterschichten Sie diese L sungen mit etwa dem gleichen Volumen einer spezifisch schwereren Glycerin Wassermischung Volumenverh ltnis ca 1 1 e Stellen Sie die Reagenzgl ser ohne Ersch tterung zur Seite e Beobachten Sie ber l ngere Zeit die nderungen der scharfen Phasengrenze und der Farbe und notieren Sie die Wanderungsstrecken in Abh ngigkeit von der Zeit Welche Molek le diffundieren in welche Richtungen und wie schnell Materialien Reagenzglas Pasteur Pipetten Becherglas 50ml 1 1 2 D Versuch Dialyse Sind zwei mischbare L sungen nicht durch eine diffuse Grenzschicht sondern durch eine semipermeable Membran getrennt so kann ein Ausgleich von Konzentrationsunterschieden nur f r solche Teilchen erfolgen die durch die Membran wegen ihrer passenden Gr e oder Struktur hindurchdiffundieren k nnen Dialysieren ist eine wichtige biochemische und medizinische M glichkeit zum Entfernen kleiner Molek le aus L sungen von Makromolek len z B von Salzen aus Proteinl sungen Entsalzen von Enzympr parationen H modialyse bei Nierenversagen Sy
83. oloured primers and Taq polymerase mixed in For this reason it s important to keep the master mix cold before use so that the enzyme doesn t start to work before you add your DNA templates In this part of the experiment you will obtain DNA samples which have been collected from a crime scene and four individuals suspected of being involved in the crime Your task is to amplify the region of interest the BXP007 locus a polymorphic allele from the DNA samples Once complete you will analyze your PCR products using gel electrophoresis to determine the genotypes of the samples at the BXP007 locus and match the crime scene DNA to one of the suspects Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 46 Electrophoresis of PCR Products Since DNA is negatively charged it can be separated using an electric current In fact electrophoresis means carry with current In agarose gel electrophoresis DNA is placed in solidified agarose which forms sieves containing pores that vary in size depending on the concentration of the agarose The higher the concentration of agarose the smaller the pore size and the longer it takes for larger molecules to move through This is particularly useful when you want to compare DNA molecules of different sizes contained in the same sample Movement through the gel occurs when an electric current is applied across the gel Since the gel is immersed in buffer the current will travel through the buffer and gel carrying
84. om e Wie sicher sind Sie da hier eine bereinstimmung vorliegt Begr nden Sie dies in Ihrem Protokoll Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 53 3 3 Platz 3 3 3 1 DNA Extraktion 3 3 1 HH Versuch Wangenzellen DNA Extraktion Gen in der Flasche Cheek Cell DNA Extraction Capture Your Genetic Essence in a Bottle Biotechnology Explorer Genes in a Bottle Kit DNA Extraction Module Catalog Number 166 2000EDU DNA necklace module 166 2200EDU e Recherchieren Sie f r Ihr Protokoll die Struktur von DNA Desoxyribonukleins ure auch DNA von engl desoxy ribo nuclein acid e Bringen sie zum Versuch m glichst eine eigene Zahnb rste mit Wie kann man DNA sichtbar machen Um Ihre DNA mit blo amp em Auge sehen zu k nnen werden Sie im Rahmen dieses Versuches Wangen Epithelgewebe aus dem Innenbereich Ihrer Wange ausschaben die Zellw nde aufbrechen und die gesamte DNA der Zellen eindicken Schritt 1 Zellen sammeln An dem Epithelgewebe Ihrer Wangeninnenseiten befinden sich st ndig abgestorbene Zellen in Abl sung und werden durch neu gewachsene Zellen ersetzt insbesondere bei jedem Kauvorgang Sie bekommen eine ausreichende Menge also einige tausend Zellen von der Innenseite Ihrer Wangen indem Sie in angemessener Weise mit den Z hnen auf Ihrer Wange kauen und dann die so in den Speichel gewanderten Zellen durch Ausspulen mit Wasser gewinnen Kauen Sie dabei zwar durchaus einige Male fest genug da Sie den
85. omer Service 800 341 1574 Document 18331 1007 06 Rockland ME 04841 USA Instructions 1 Tear open pouch and remove cassette 2 Remove white well seals from cassette Do not remove the clear side vent seals 3 Flood sample wells with distilled or deionized water Tilt cassette to move excess fluid to the edge and blot off with a lint free wipe Do not blot wells 4 Insert cassette into dock 5 Load samples 6 Plug in high voltage cables and set to recommended voltage 7 Plug in low voltage power supply and turn on light 8 Run cassette for recommended time or until separation of desired fragments is complete 9 Photograph using standard camera and transilluminator DNA Cassettes RNA Cassettes 1 2 50 bp 4 kb 1 2 0 5 kb 9 kb 2 2 10 bp 1 kb Denatured RNA dilute DNA samples in samples Prepare 1X FlashGel Loading samples in 50 Dye formaldehyde sample buffer and RNase free water Denature 5 minutes at 65 C TABLE 1 Sample preparation For best results Native RNA samples Use FlashGel Loading Dye Sample conc and detection limits Voltage amp Optimal DNA load levels are 5 20 ng per band in a 5pl load lt 200 ng per bandin a 5ul load Single tier 275 V for 2 7 minutes Single tier 225 V for 4 8 minutes run time Double tier 275 V for 2 5 minutes Double tier 225 V for 3 5 minutes Seite 63 Die Bahnen 1 bis 8 sol
86. our chromosomes also called loci that do not control any known traits and have no known functions Loci are basically genetic addresses or locations A single locus may have different forms or types these different forms are called alleles A locus may be bi allelic having only two different forms or it may be polymorphic as described above The DNA sequences used in forensic labs are non coding regions that contain segments of Short Tandem Repeats or STRs STRs are very short DNA sequences that are repeated in direct head to tail fashion The example below shows a locus known as THO1 found on chromosome 11 its specific DNA sequence contains four repeats of TCAT OCCCTCATTCATTCATTCATICA Abbildung 11 For the THO1 STR locus there are many alternate polymorphic alleles that differ from each other by the number of TCAT repeats present in the sequence Although more than 20 different alleles of THO1 have been discovered in people worldwide each of us still has only two of these one inherited from our mother and one inherited from our father For example as shown in Abbildung 12 suspect A has one allele with 6 repeats and one allele with 3 repeats giving a DNA profile for the THO1 locus of 6 3 Suspect A s DNA type for the THO1 locus is 5 3 Suspect B s DNA type for THO1 locus is 6 10 suspect A s DNA type for the THO locus is 5 3 Suspect B s DNA type for THO1 locus is 6 10 C e COOCOO AA 5 CC C oA AA 6 CCC
87. r Flasche VB2 Altskript 2 25 g bereitgestellte Probe zur Hand die Wangenzellen nt von Ihnen enth lt Stellen Sie die Mikro Probenr hrchchen in die Zentrifuge Die Reaktionsgef e m ssen rn symmetrisch gegeneinander austariert in den Rotor nn a gt positioniert werden sonst entsteht eine fur das gt Gerat schadliche Unwucht Lassen Sie die Zentrifuge ca 10 Minuten mit 6000 g laufen achten Cenirifuge Sie darauf ob Gravitaion g oder Umdrehungen pro Minute rpm gestellt ist Am Ende des Zentrifugiervorgangs sollte am GefaRboden ein kleines bla wei es Kl mpchen ein gi sog Pellet zu sehen sein Sollte dies nicht der Fall sein wiederholen Sie das Zentrifugieren sollte dann immer noch kein Pellet sichtbar sein wiederholen Sie auch die Entnahme von Wangenzellen Entfernen Sie vorsichtig den Uberstand Verwenden Sie zur Sicherheit lieber keine Pipette sondern dekantieren Sie das Gros der Fl ssigkeit und entfernen Sie den Rest der Fl ssigkeit mit einem saugf higen Papiertuch Saugen Sie auf gar keinen Fall das Pellet an Das Pellet enth lt n mlich Ihre DNA die es zu untersuchen gilt Eine kleine Flussigkeitsmenge ca 50 ul verbleibt dabei uber dem Pellet Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 59 e Schlie en Sie den Flipdeckel fest und u resuspendieren Sie das Pellet in den A verbliebenen Fl ssigkeits berstand N Schnippen Sie dazu einige Male gegen et das Gef bzw verwen
88. r die Messung verwenden Sie je 2 ml der Mischung und 100 ul der verd nnten Probe Setzen Sie zus tzlich einen Blindwert mit 100 ul Wasser an Messen Sie die Extinktion nach 20 min molarer Extinktionskoeffizient von NADH 6400 M cm 340 nm pro mol Alkohol werden 2 mol NADH gebildet Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 71 4 4 Platz 4 4 4 1 Enzymkinetik Teil Il 4 4 1 55 Versuch Substrathemmung der Urease Reaktion Ein in Mikroorganismen und Pflanzen verbreitetes sehr aktives Enzym ist die Harnstoff spaltende Urease EC 3 5 1 5 NH gt CO NH gt 2 H20 gt 2 NH4 CO3 e Stellen Sie 1mM Citratpuffer mit pH 6 bereit e L sen Sie hierzu 100 mg Zitronensaure in 500 ml Wasser und stellen Sie diese mithilfe eines zuvor kalibrierten pH Meters durch Zugabe von 1M NaOH auf pH 6 0 ein e L sen Sie 10 g Harnstoff in 100 ml des Citratpuffer und stellen dies erneut auf pH 6 ein indem Sie ggf mit 1M HCI und oder 1M NaOH korrigieren e Geben Sie in 6 Reagenzgl ser steigende Mengen dieser Harnstoffl sung 50 ul 200 ul 500 ul 1 ml 2 ml und 5 ml f llen Sie mit dem Citratpuffer jeweils auf 5 ml auf und stellen Sie die Proben in ein auf 37 C temperiertes Wasserbad e Stellen Sie 0 5 ml Bromthymolblau 20 mg auf 50 ml H20 bereit e Geben Sie dann je 0 5 ml der Bromthymolblaul sung hinzu Dieser Indikator schl gt w hrend einer pH Wert Erh hung bei pH 6 von gelb nach gr n und bei pH 7 6 von gr n nach blau um e Stel
89. ragen Sie Wanderungsgeschwindigkeit der bekannten Proteinmarker auf die X Achse und deren Molekulargewichte logarithmisch auf die Y Achse auf e Benutzen Sie hierf r semilogarithmisches Papier e Durch die logarithmische Auftragung ergibt die resultierende Kurve im Mittel eine Gerade hnlich wie in untenstehender Abbildung zum Vergleich zu sehen ist e Ausgehend von der Standard Kurve kann das Molekulargewicht eines unbekannten Proteins abgeschatzt werden Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 35 Zuerst mi t man die Wanderungsentfernung einer Proteinbande vom Kammerboden bis zum unteren Rand der Bande Diesen Wert markiert man auf der X Achse und projiziert von diesem Wert ausgehend vertikal eine Linie auf die Standard Kurve Projizieren Sie vom Kreuzungspunkt dieser Linie mit der Kurve eine weitere Linie horizontal auf die Y Achse und lesen Sie dort das dem Protein zugehorige Molekulargewicht ab Ermitteln Sie auf diese Weise nun das Molekulargewicht von Aktin und Myosin anhand der AM Kontroll Spur Ihres Gels Size of standards known Size of unknown protein un 3 ir a N Distance mm Abbildung 10 Die Wanderungsentfernung der vorgef rbten Proteine wurde auf semi logarithmischem Papier gegen die Proteingr e aufgetragen um so eine Standardkurve f r das Gel zu erzeugen Informieren Sie sich ber die Einheit Dalton die in der Biologie traditionell f r das Molekulargewicht verwendet wi
90. rd Nachdem dem Sie die Absch tzung der Molekulargewichte von Aktin und Myosin vorgenommen haben treffen Sie f r Ihr Protokoll eine Aussage ber die Anzahl an Aminos uren in Aktin Gehen Sie hierzu von einem mittleren Molekulargewicht von 110 Dalton pro Aminos ure aus Treffen Sie f r Ihr Protokoll eine Aussage dar ber wieviele DNA Basenpaare das Gen enth lt das Aktin kodiert Im Vergleich haben DNA Basenpaare brigens ein mittleres Molekulargewicht von ca 660 Dalton Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 36 Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 37 3 Versuchstag 3 Nucleotide und Nucleinsauren 3 1 Platz 1 3 1 1 DNA Analyse 3 1 1 FF Versuch DNA Fingerprinting Biotechnologie Forscher DNA Fingerprinting Kit Best Nr 166 0007EDU www bio rad com Das Vervielf ltigen von Teilen dieses Dokuments ist nur zu Lehrzwecken erlaubt Verdauungs Proze der DNA Proben mittels Restriktionsenzymen Die dreidimensionale Struktur von Restriktionsenzyme erlaubt es ihnen sich an eine doppelstr ngiges DNA Molek l zu binden und an der Helix entlangzugleiten bis sie eine spezifische Basenpaarsequenz erkennen die das Enzym anhalten l t An dieser Stelle die Restriktions schnitt stelle genannt wird verdauen spalten chemisch die Enzyme dann das DNA Molek l Vorbereitung e Informieren Sie sich genauer ber die Enzymklasse Restrikitions Endonukleasen e Zwei h ufige Restriktionsendonukleasen sind EcoRI
91. re for 30 min 25ul dye 2 Vortex DNA dye concentrate blue and add 25 ul of the dye to a DNA gel matrix vial red 3 Vortex solution well and spin down Transfer to spin filter 4 Centrifuge at 2240 g 20 for 15 min Protect solution from light Store at 4 C Loading the Gel Dye Mix 1 Allow the gel dye mix equilibrate to room temperature for 30 min before use Put a new DNA chip on the chip priming station Pipette 9 0 ul of gel dye mix in the well marked Make sure that the plunger is positioned at 1 ml and then close the chip priming station Press plunger until it is held by the clip Wait for exactly 60 s then release clip Wait for 5 s Slowly pull back plunger to 1ml position Open the chip priming station and pipette 9 0 ul of gel dye mix in the wells marked G a GY NO ou a oO Loading the Markers 1 Pipette 5 ul of marker green in all 12 sample wells and ladder well Do not leave any wells empty Loading the Ladder and the Samples 1 Pipette 1 ul of DNA ladder yellow in the well marked amp 2 Ineach of the 12 sample wells pipette 1 ul of sample used wells or 1 ul of de ionized water unused wells ipl ladder 3 Put the chip horizontally in the adapter and vortex for 1 min at the indicated setting 2400 rpm 4 Run the chip inthe Agilent 2100 bioanalyzer within 5 min Technical Support n the U S Canada 1 800 227 9770 toll free Isca ibs support agilent com In Europe call yo
92. rigem Glasstopfen zur Hand F llen Sie in eines davon etwas Naturjoghurt F llen Sie nun beide Gef e mit Milch auf Verschlie en Sie die Kolben luftdicht Stellen Sie die Gef e separat beiseite und lassen Sie diese bis zum ersten Termin des vierten Versuchstages stehen so da es zur Gerinnung kommen kann Beschriften Sie die Gef e Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 65 4 Versuchstag 4 Enzyme 4 0 Platz 0 e F hren Sie an Versuchstag 3 begonnenen Versuche 3 2 1 GG Teilversuch BioRad Crime Scene Investigator Kit und 3 4 1 1 Versuch Analyse des PV 92 Genlocus zuende Wiederholen Sie im Vorfeld die theoretische Betrachtung dieser Versuchen 4 1 Platz 1 4 1 1 Katalyse und Enzymatische Reaktionen 4 1 1 JJ Versuch Katalase in Gewebe Zerst rung von Enzymen durch Hitze e Vergewissern Sie sich da die f r diesen Versuch n tige Kartoffel vorr tig ist kaufen Sie bei Bedarf eine im n chsten Lebensmittelgesch ft Aldi Edeka e Schneiden Sie eine Kartoffel mittig durch und trennen sie eine Scheibe der Kartoffel von der Mitte ab e Stellen sie eine dreiprozentige Wasserstoffperoxidverd nnung bereit H202 w 3 e Tropfen Sie eininge Tropfen der H202 L sung auf und notieren Sie Ihre Beobachtung Kommt es zu Schaumbildung e Schneiden Sie eine weitere Kartoffelscheibe ab e Erhitzen Sie mit einem geeigneten Halter ein Geldstuck ber dem Bunsenbrenner e Pressen Sie das Geldst ck auf die Kartoff
93. s ure Cystein Stellen Sie 0 1 M CuSO L sung bereit Stellen Sie 0 1 M Cystein L sung bereit Geben Sie zu den weiteren Reagenzgl sern mit Harnstoff L sung und Indikator 1 nur 1 Tr 0 1 M CuSO bzw 2 erst je 0 5 ml einer neutralisierten pH 6 0 1 M Cystein L sung und dann wiederum 1 Tr 0 1 M CuSOu Dann versetzen Sie auch diese Gl ser mit der Enzym L sung und vergleichen die Urease Wirkung Erkl ren Sie in Ihrem Protokoll die Schutzfunktion von Cystein gegen Schwermetall Inaktivierung Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 73
94. sauregarung An Versuchstag 4 wird geronnene Milch benotigt die zu ihrer Herstellung 2 Tage garen mu Es ist daher unbedingt erforderlich da die letzte Labortermin Gruppe von Versuchstag 3 f r die erste Labortermin Gruppe von Versuchstag 4 diese ansetzt Der erste Labortermin Gruppe von Versuchstag 4 setzt diese dann f r die zweite Labortermin Gruppe von Versuchstag 4 an usw e Vergewissern Sie sich da die f r diesen Versuch im weiteren Verlauf n tige Milch und Naturjoghurt vorr tig sind kaufen Sie diese bei Bedarf im n chsten Lebensmittelgesch ft Aldi Edeka e Nehmen Sie die beim letzen Labortermin angesetzte Gef e mit Milch bzw Milch Naturjoghurt zur Hand e Trennen Sie ggf das Eiwei von der Molkefl ssigkeit ab indem Sie die Milch jeweils durch ein feines Tuch filtrieren e Nehmen Sie pH Indikator zur Hand e Nehmen Sie NICHT das pH Meter damit dessen Elektroden nicht verunreinigt werden e Messen Sie den pH Wert der Molkefl ssigkeit m glichst nur mit Indikator und notieren Sie das Ergebnis f r Ihr Protokoll Warten Sie einige Momente bis sich aufgrund der Durchmischung der entsprechende pH Wert stabil eingestellt hat e Nehmen Sie 2 Erlenmeyerkolben mit dazugeh rigem Glasstopfen zur Hand F llen Sie in eines davon etwas Naturjoghurt F llen Sie nun beide Gef e mit Milch auf Verschlie en Sie die Kolben luftdicht Stellen Sie die Gef e separat beiseite und lassen Sie diese bis zum ersten Termin des
95. streifen entfernen siehe Abbildung und Beschriftung auf der jeweiligen Gelkassette e Stellen Sie sicher da vor Beginn der eigentlichen Elektrophorese weder Kamm noch Klebeband in der Gelkassette sind e Wenn Sie zwei Gele simultan laufen lassen plazieren Sie je 1 Gelkassette auf jeder Seite der Elektrodenanordnung und zwar mit der kurzen Platte mit dem k rzeren Streifen gekennzeichnet nach innen gerichtet in Richtung der Elektrodenanordnung Wenn Sie nur 1 Gel laufen lassen plazieren Sie 1 Gelkassette auf einer Seite der Elektrodenanordnung und die Puffer Abgrenzung Buffer Dam auf der anderen Seite mit der Kerbe der Pufferabgrenzung nach innen Stellen Sie dabei sicher da die Beschriftung Buffer Dam in Richtung der Elektrodenanordnung zeigt e L sen die Arretierung der vorderen ffnung des Klemmrahmens und ffnen Sie diese e Halten Sie die Gelkassetten bzw die Gelkassette und die Pufferabgrenzung gegen die Elektrodenanordnung und schieben Sie die Elektrodenanordnung mit Gelkassette n und ggf mit Pufferabgrenzung in den Klemmrahmen e Dr cken Sie den u eren Rand der Elektrodenanordnung herab nicht die Gele und sorgen Sie daf r da die beiden Rasthebel des Klemmrahmen einrasten um eine Versiegelung des unteren Randes der Gelkassette n zu erm glichen Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 32 e Drucken Sie den nun so zusammengesetzten die Gele enthaltenden Klemmrahme
96. t werden Stellen Sie mit Hilfe Ihrer Betreuer eine definierte Menge von KS Kaleidoskop Standard und AM Actin Myosin Standard bereit Uberlegen Sie f r Ihr Protokoll wozu diese Standards dienen Erhitzen sie Die Schraubdeckel Probenr hrchen sowie den AM Standard im Schraubdeckel Probenr hrchen f r ca 5 Minuten bei 95 C um die Proteine zu denaturieren und so in eine f r die Elektrophorese geeignete Form zu berf hren Was passiert dabei Elektrophorese Gel beladen Elektrophorese starten und Bande f rben Bereiten Sie die Elektrophorese Gel Boxen vor s u Beladen Sie die Gelkammern und starten Sie die Elektrophorese s u F rben Sie die nach der Elektrophorese die Gele and um die Proteinbande sichtbar zu machen Pr fen Sie anhand folgender Check Liste ob alle f r den weiteren Versuchsverlauf erforderlichen Arbeitsmittel zur Verf gung stehen Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 31 sceehemitel___stekaahl pre ruppe Y_ n BEE HE 27 Feine Pipettespitzen zum Gel Beladen 1 1m Dinner Abwiege Metaltspatel 1 on Mini Protein 3 Electrophorese Modul Gelbox 4 Z 1m Puffer Abgrenzung Buffer Dam 1 In Vorgegossenes Gel 15 ig 10 Kammem 1Gelf r 2 Gruppen o Tabelle 6 Labor Checkliste VW Schritt 2 Vorbereiten der Gelkammern e Bereiten Sie eine Gelkassette vor indem sie mit einer scharfen Klinge entlang der schwarzen Linie am Boden der Kassette entlangschneiden und den Plastik
97. te Hybridization is the process that describes the binding of the oligonucleotide primer to the template DNA The two strands anneal to each other forming a hybrid Like bookends the two primers are designed and synthesized in the laboratory with a specific sequence of nucleotides so they will anneal at the opposite ends and on the opposite strands bracketing the target stretch of double stranded DNA template strand to be amplified Therefore the target sequence is determined by the location that the primers anneal to Extension Primers are needed because the DNA polymerase requires an already existing nucleotide chain to bind and add nucleotides to one at a time Once the polymerase locates and binds to template DNA and the primer it initiates the addition of nucleotides and synthesizes new copies of the double stranded template DNA by adding nucleotides onto the primer and extending it Therefore primers provide a starting point for the DNA polymerase These 3 steps denaturation annealing and extension together make up one PCR cycle A complete PCR reaction involves many repetitious of a single PCR cycle In this experiment your PCR reactions will cycle 35 times The enzyme DNA polymerase which is used in PCR must be thermally stable because PCR cycles between temperatures of 52 C and 94 C The thermostable DNA polymerase that performs the polymerization was isolated from a thermophilic bacterium Thermus aquaticus Taq
98. ten Schenkel des Doppel U Rohres mit dem ges ttigten Bromwasser Tauchen sie je eine Platinelektrode in jeden der beiden Schenkel des Doppel U Rohres ein Verbinden Sie die beiden Elektroden mit ihrem jeweiligen elektrischen Me ger t Messen Sie mit dem Voltmeter die Spannung zwischen den beiden Elektroden Messen Sie mit dem Amperemeter den Stromflu zwischen den beiden Elektroden Notieren Sie f r Ihr Protokoll diese beiden Mefswerte Entsorgung mu im Abzug erfolgen Recherchieren Sie f r Ihr Protokoll die Begriffe Kathode Anode inerte Elektrode berspannung und Redox Reaktion Ermitteln Sie daraus was hier die Kathode bzw die Anode ist welche Reaktion dort jeweils stattfindet und welche Gesamt Redox Reaktion stattfindet 1 2 2 1 Versuch Methylenblau Leukomethylenblau Das blaue Wunder L sen Sie in einer Flasche mit Stopfen 5g Glucose in ca 150ml NaOH 1M Geben Sie dazu ca 1ml Methylenblau L sung 0 1 in Wasser Beobachten Sie die Reaktionsmischung Der Farbwechsel ist reversibel Ist sie farblos geworden so sch tteln Sie kr ftig und lassen wiederum stehen Notieren Sie f r Ihr Protokoll wie oft Sie den Farbwechsel wiederholen k nnen Welche Stoffe dienen als Reduktions bzw als Oxidationsmittel L slichkeit von Sauerstoff in Wasser bei 20 C ca 10mg l Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 10 1 3 Platz 3 Spektroskopie Photometrie 1 3 1 Spektrale Eigenschaften Absorptionsspektrum
99. tokoll Ihre Beobachtung e Auf welche Eigenschaften von KMnO la t sich schlie en Mat Erlenmeyer 50ml Wasserbad 1 4 1 M Versuch Verseifung von Fett e In einem 100ml Erlenmeyerkolben werden ca 6ml Oliven l ca 20ml KOH w 30 ca 60ml Ethanol als Losungsvermittler und einige Siedesteinchen gemischt Vorsicht Kalilauge ist stark tzend Schutzbrille oder Gesichtsschirm Erw rmen Sie das Gemisch ca 20min im kochenden Wasserbad Geben Sie ca 2 ml des Gemisches in ein Reagenzglas mit Schraubdeckel Lassen Sie dieses abk hlen Versetzen Sie das abgek hlte Gemisch mit ca 5ml H20 Verschlie en Sie den Schraubdeckel fest und sch tteln Sie das Gemisch kr ftig so da es zu Seifenschaumbildung kommt Notieren Sie f r Ihr Protokoll Ihre Beobachtung e Auf was f r eine Reaktion k nnen Sie daraus schlie en 1 4 1 N Versuch Kalkseife e Geben Sie ca 3ml der Gemisches aus 1 4 1 M in ein weiteres Reagenzglas mit Schraubdeckel Geben Sie ca ml CaCl w 5 zu Verschlie en Sie den Schraubdeckel fest und sch tteln Sie das Gemisch kr ftig Notieren Sie f r Ihr Protokoll Ihre Beobachtung Auf was f r eine Reaktion k nnen Sie daraus schlie en 1 4 1 0 Versuch Fetts uren e Geben Sie 2ml der Reaktionsmischung aus 1 4 1 M und 2ml HCI in ein weiteres Reagenzglas mit Schraubdeckel e Verschlie en Sie dieses fest und sch tteln sie es freie Fetts uren fallen aus e L sen Sie den Niederschlag wieder d
100. tomatischen Kipp Sch ttler und bewegen die Schale mit dem Sch ttler ber Nacht e Nach ca 2 Stunden soll man die ersten Bande sehen nach ca 8 Stunden ist die F rbung abgeschlossen Quantitative Analyse der als Bandenmuster visualisierten DNA Fragmente e Fur einen genauen Vergleich zwischen der DNA vom Tatort und der DNA des Tatverd chtigen kann man sich nicht nur auf eine bereinstimmung nach Augenma verlassen sondern man mu die Fragmentgr e quantitativ bestimmen e Messen Sie mit einem Lineal die Wanderungsstrecke jeder einzelnen Bande in Millimetern von der Unterkante der Starttasche bis zur Mitte der entsprechenden Bande Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 42 e Fertigen Sie fur Ihr Protokoll eine Tabelle der gemessenen bp Wanderungsstrecken an 23 130 e Erstellen Sie aus den Wanderungs Daten des FM Gr enmarkers sane eine Standard Kurve in halblogarithmischer Darstellung Tragen Sie dabei auf die X Achse die Wanderungsstrecken auf und die Fragmentgr endaten des FM Markers logarithmisch auf die Y Achse e Tragen Sie fur die Banden 2 6 die Abst nde in Abh ngigkeit von der Gr e sowohl auf linear z B auf Millimeterpapier als auch auf halblogarithmisches z B auf halblogarithmisches Papier auf Verbinden Sie z B mit Hilfe eines Lineals auf allen Diagrammen die Datenpunkte mit einer Linie Verl ngern Sie die Linie bis zur rechten Seite des Diagramms 6 557 4361 2322 202
101. un2010 doc 22 06 2010 Seite 34 C Interpretation einzelner Bande e Lassen Sie sich im Anschlu daran die Bilddatei fur Ihr Protokoll aush ndigen und kommentieren Sie in Ihrem Protokoll was zu sehen ist Proteinbande s u Bestimmung von Molekulargewichten der Proteine e Sehen Sie sich das im Folgenden abgebildete Beispiel Gel an e Proteine bekannter Gr en wurden parallel zu 5 verschiedenen Proben Fischmuskelextrakt einer Gelelektrophorese unterzogen e Die Fischmuskelextrakte sind komplexe Mischungen verschiedenster unbekannter Proteine e Indem man die Wanderungsentfernung entspricht bei gleicher Zeit der Wanderungsgeschwindigkeit der unbekannten Proteine mit einer Reihe bekannter Proteinstandards mit bekannten Molekulargewichten vergleicht kann man die Masse des Proteins sch tzen e Die genaue Identifizierung eines bestimmten Proteins ist so allerdings nicht m glich 203 Myosin heavy chain 135 Y vy a Actin 2 41 5 Tropomyosin _ o 33 4 19 5 Myosin light chains 8 0 Abbildung 9 Protein Standards und Fisch Extrakte wurden in einem 15 igen Polyacrylamid Gel 30 Minuten bei 200 V einer Elektrophorese unterzogen und mit biosicherem Coomassie Blau gefarbt Konstruieren Sie Ihre Standard Kurve e Um das Molekulargewicht der unbekannten Proteine zu bestimmen konstruieren sie zun chst eine Wanderungseschwindindigkeits Masse Standardkurve der bekannten Proteine des von Ihnen verwendeten Standards KS e T
102. unktion HO 9 O HO O 2H 02 O HO C H 2H HO C H CHOH CH OH Ascorbinsaure Dehydroascorbinsaure Abbildung 7 Ascorbinsaure Aufgabe Bestimmen Sie nach Absprache den Ascorbinsauregehalt a in einem klaren hellen Fruchtsaft b in frisch ausgepref amp tem Zitronensaft bei Bereichs berschreitung mit H2O verd nnen Durchf hrung e Benutzen Sie hierzu Teststreifen vom Typ Merck 1 10023 Die Bestimmung beruht auf der Reduktion des gelb gef rbten Phosphor molybdato komplexes durch Ascorbins ure zu Molybd n blau e Tauchen Sie ein Testst bchen ca 1 Sekunde in die zu untersuchende L sung so ein da die Reaktionszone voll benetzt wird e Schutteln Sie bersch ssige Fl ssigkeit nach Herausnehmen des Teststabchens ab e Vergleichen Sie nach ca 10 Sekunden die Reaktionszone mit der Farbskala e Berechnen Sie die Ascorbins ure Menge in der Probe in einem Liter Getr nk und einer ganzen vollst ndig ausgepre ten Zitrone e Recherchieren Sie f r Ihr Skript den Tagesbedarf eines erwachsenen Menschen Wie viel Zitrone bzw Fruchtgetr nk brauchen Sie demnach zur Deckung des Tagesbedarfs 2 1 2 W Versuch Fehling Test e Stellen Sie die zu analysierenden Probe her Pro Gruppe werden ca 5ml Ascorbins ure mit Img ml ben tigt e In Absprache mit dem Betreuer stellt an dieser Stelle die erste Laborgruppe eine ausreichende Menge an Ascorbins urel sung f r alle Anwesenden plus etwas Reserve her z B 40 mg Ascorb
103. ur local Customer Care Center bio_solutions agilent com In Japan 0120 477 111 yan_ccr agilent com In Asia Pacific call your local Customer Care Center Bioanalyzer_ap agilent com Further Information Visit Agilent Technologies unique Lab on a Chip web site It is offering useful information support and current developments about the products and the technology http www agilent com chem labonachip OMIM TOTT INN Part Number 62938 90015 Agilent Technologies Inc 2000 2000 2007 AAA AA Edition 04 2007 Agilent Technologies G2938 90015 Printed in Germany Hewlett Packard Stra e 8 76337 Waldbronn Germany Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 52 Das Gel sollte nun vor Start der Messung mit den Proben von 2 Laborgruppen wie folgt beladen sein Chip Slot Gruppe _Inhalt EEE Quantitative Analyse der als Bandenmuster visualisierten DNA Fragmente e Fur einen genauen Vergleich zwischen der DNA vom Tatort und der DNA des Tatverd chtigen kann man sich nicht nur auf eine bereinstimmung nach Augenma verlassen sondern man mu die Fragmentgr f se quantitativ bestimmen e Bestimmenen Sie anhand Ihrer Me daten die relativen Wanderungsstrecken jeder einzelnen Bande e Vergleichen Sie die DNA Bande mit der zugeh rigen On Chip Allel Leiter bzw untereinander und dokumentieren Sie dies in Ihrem Protokoll Schlu folgern Sie welche der DNA Proben der Tatort DNA entspricht siehe dazu auch 3 1 1 FF bzw biorad c
104. urch Einf rben Ziehen Sie Handschuhe an um Kontaminierungen Ihrer Gele zu vermeiden Vermeiden Sie Kontakt der Gele mit blofser Haut Leeren Sie den Puffer aus der Elektrodenanordnung ffnen Sie die Rasthebel und entfernen Sie die Gelkassetten Legen Sie die Gelkassette flach auf die Arbeitsfl che mit den kurzen Streifen nach oben Schneiden Sie das Klebeband entlang der Seite der Gelkassette auf Trennen Sie vorsichtig die Gelplatten mit einem Spatel oder auch unter Zuhilfenahme Ihrer Fingerspitzen Handschuhe Das Gel bleibt i d R an einer der Platten haften Warum d rfen die Gele nicht mit der Haut in Ber hrung kommen Legen Sie die Gelplatten in eine Schale mit Leitungswasser so da die Fl ssigkeit die Abl sung des Gels von der Platte ia ermoglicht oe Heben Sie das Gel vorsichtig mit dem Spatel ab Legen Sie das Gel in die Schale mit Leitungswasser und stellen Sie diese f r ca 5 Minuten auf einen automatischen Kipp Mischer um Verunreinigungen abzusp len Gie en Sie das Wasser vorsichtig ab Geben Sie ca 20 ml Biosafe Coomassie Blue hinzu Lassen Sie den automatischen Kippmischer auf niedriger Stufe min 1 Stunde laufen Sie k nnen zur besseren F rbung auch l nger laufen lassen Danach werden die Gele ber Nacht auf dem automatischen Kippmischer gesp lt dabei mind 2x die Fl ssigkeit wechseln Danach werden die Gele entfernt und das Ergebnis als Grafikdatei eingescannt Biochemie_Skript22J
105. urch Zugabe von 3ml Trichlorethan und kr ftiges Sch tteln e Notieren Sie Ihre Beobachtungen f r Ihr Protokoll e Warum sind freie Fetts uren in Wasser schwerl slich in Trichlorethan l slich Vorsicht Trichlorethan mu in einen gesonderten Abfallbeh lter e Notieren Sie nach Ablauf von 10 min erneut Ihre Beobachtungen fur Ihr Protokoll Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 17 1 4 2 Kohlehydrate und verwandte Verbindungen Teil I 1 4 2 P Versuch Fructose und Glucose e Geben Sie in ein Reagenzglas 16x100 Schraubdeckel ca 5ml Fructose L sung w 1 Pr fen Sie diese mit einem Glucoseteststreifen GOD Test Geben Sie 50uL NaOH 1M zu Notieren Sie f r Ihr Protokoll Ihre Beobachtungen Erhitzen Sie kurz auf 100 C Heizblock Neutralisieren Sie die Natronlauge durch Zugabe von 50uL HCI 1M und geben Sie als Puffersubstanz noch ca 200mg 2 kl L ffelspatel NaHCO zu Lassen Sie die L sung abk hlen e berlegen Sie f r Ihr Protokoll welchen Zweck das Neutralisieren und Abk hlen hat e F hren Sie erneut einen Test durch e Notieren Sie erneut f r Ihr Protokoll Ihre Beobachtungen 1 4 2 Q Versuch Glucosebestimmung mit Glucoseoxidase GOD NAD Test Die Analytik von Zuckern beruht heute berwiegend auf ihrer Umsetzung mit spezifischen Enzymen Solche Enzyme sind in gro er Vielzahl kommerziell erh ltlich weil die Bestimmung von Zuckern in Lebensmitteln und Getr nken eine h ufige praktis
106. uspol der Kammer mit dem schwarzen Anschlu kabel berlegen sie wie und aus welchem Grund die entsprechende Polung erfolgen mu Welche Wanderungsrichtung haben die Partikel in ihrem Gel Ziehen Sie die Endplatten ab und entfernen Sie ganz vorsichtig den Gelkamm indem Sie ihn gerade nach oben abziehen Gie en Sie soviel Elektrophoresepuffer in die Elektrophoresekammer da die Geltaschen knapp bedeckt sind ca 275 ml keinesfalls h her als die Fullstandsmaximum Markierung an der Au enseite der Anordnung blicherweise werden Gele von links nach rechts gelesen Die erste Probe wird also normalerweise in der Geltasche in der linken Ecke des Gels aufgetragen Vergewissern Sie sich bei Ihrem Betreuer da in dem von Ihnen verwendeten Gel wie unten beschrieben ein Probenvolumen von 20 ul Platz findet Sollten Sie andere Geltaschen verwenden passen Sie das Volumen entsprechend an Beladen Sie nun mithilfe von schmalen feinen Pipettenspitzen f r jede Probe eine neue Spitze die erste Gelkammer mit dem Gr senmarker die zweite Gelkammer mit der TO Probe und die dritte bis siebte mit den Proben V1 bis V5 F hren Sie die Pipettenspitze senkrecht ca 2mm in die Kammer ein Stechen Sie nicht in das Gel da die Spitze dann leicht verstopft wird Hantieren Sie dabei vorsichtig mit der Pipettenspitze Verletzen Sie die Wandungen der Gelkammern nicht achten Sie darauf da kein Probeninhalt au erhalb der Gelkammer landet Das Gel sollte nun
107. vierten Versuchstages stehen so da es zur Gerinnung kommen kann Beschriften Sie die Gef e 4 1 1 MM Versuch Reduktion von Methylenblau durch Reduktions quivalente aus der bakteriellen Milchs ureg rung e Nehmen Sie das beim letzen Labortermin angesetzte Gef mit Sauermilch zur Hand siehe 4 1 1 LL Versuch Milchs ureg rung bzw 3 9 2 Vorbereitung zur MilchS ure G rung Teil e Nehmen Sie Methylenblaul sung zur Hand 25 mg auf 250 ml destilliertes H20 e Geben Sie 10ml der Sauermilch in ein Schraubdeckelreagenzglas 16X100 und tropfen Sie solange von der Methylenblaul sung hinzu bis eine deutliche Blauf rbung auftritt e Stellen Sie das Reagenzglas in ein Wasserbad mit 25 C e Beobachten Sie die Farbver nderung in Laufe des verbleibenden Labortages und notieren Sie Ihre Beobachtung e berlegen Sie weshalb die Farbe in der Milchprobe nicht gleichm ig verschwindet e Welche Beobachtung ergibt sich bei raschem Umschutteln der Probe e Wie lassen sich die Farb nderungen deuten welche Ursachen k nnten daf r ma geblich sein Methylenblau wird leicht zu farblosem Leukomethylenblau reduziert von Luftsauerstoff aber wieder oxidiert Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 67 4 2 Platz 2 4 2 1 Isolierung von Enzymen aus biologischem Material 4 2 1 NN Versuch Alkoholdehydrogenase ADH aus Hefe Hefen haben sehr widerstandsf hige Zellw nde und m ssen daher mechanisch durch Zusatz von Sand o
108. von Photonen wird absorbiert und eine dadurch festgelegte Anzahl passiert die Zelle und f llt auf den Detektor Die Anzahl der pro Sekunde auf den Detektor auftretenden Photonen wollen wir mit Ip bezeichnen sie steht f r die transmittlerte Strahlungsintensit t f r die Intensit t hinter dem Absorber Transmission prozentuale Transmission und Extinktion Wir definieren die Transparenz bzw Transmission Durchl ssigkeit 1 T Ip lo bzw T 100 T Die zugeh rige negative logarithmische Gr e Exponentialwert bezeichnet man als Extinktion oder Absorbanz engl Absorbance 2 E IgT bzw E 2 Ig T Welche Wertebereiche k nnen Extinktion und Transmission nun annehmen Wenn eine L sung praktisch kein Licht absorbiert wird Ip lo und somit mit Gl 1 T 1 bzw T 100 Bei einer stark absorbierenden L sung dagegen ist Ip 0 folglich ist die Transparenz und auch die prozentuale Durchl ssigkeit praktisch gleich 0 Damit reicht T von O bis 1 und T von O bis 100 Die gleiche Betrachtung zeigt dal die Extinktion von O bis unendlich reicht obwohl in der Praxis eine Extinktion gr er als 2 oder 3 nur mit Schwierigkeiten und geringer Genauigkeit und Pr zision gemessen werden kann Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 12 Auf einem Spektralphotometer mit analoger Skala ist die Transmissionsskala linear und die Extinktionsskala logarithmisch angeordnet Das Grundgesetz der Spektralphotometrie bekannt als das La
109. wie folgt beladen sein Setzen Sie den Deckel auf die Elektrophoresekammer Der Deckel pa t nur in einer Orientierung auf das Unterteil Rot geh rt zu rot schwarz zu schwarz Verbinden Sie die Elektroden polrichtig mit dem Netzger t Schalten Sie das Netzger t ein Stellen Sie die Spannung auf 100 V ein und lassen Sie die Elektrophorese 30 bis 40 Minuten lang laufen Achten Sie darauf die Zeit nicht so zu berschreiten da die gef rbten Partikel ber das Gel hinausgetrieben werden Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 41 Sichtbarmachen der DNA Fragmente durch Anfarbung der DNA mit Fast Blast DNA Farbung Ohne weitere Hilfsmittel sind auf den Gelen nur die Positionen der Frontmarker nicht aber die der DNA Fragmente zu erkennen Die DNA Fragmente werden durch Anfarben des Gels mit einem blauen Farbstoff sichtbar gemacht Die blauen Farbstoffmolekule haben eine hohe Affinitat zur DNA d h sie binden sehr fest an die DNA Fragmente so da diese dadurch sichtbar werden Die sichtbaren DNA Fragmente k nnen anschlie end photographiert oder eingescannt werden oder die Gele konnen in getrockneter Form zur Analyse aufgehoben werden Gel Farbe und Entfarbungsschritte Es gibt zwei verschiedene Protokolle um DNA mit der Fast Blast Farbung sichtbar zu machen ein schnelles und eine langsames Da bei der Schnellf rbung zwar innerhalb von 12 15 Minuten eine F rbung eintritt das Ergebnis aber h ufig optisch undeutlich ist
110. zen Sie nun die St rkel sung im siedenden Wasserbad e Entnehmen Sie im Laufe der Erw rumung alle 2 min mit einer Pipette je 0 1 ml und geben Sie diese in ein frisches Reagenzglas Abbildung 6 Jod St rke Einschlussverbindung e Geben Sie zu jeder dieser entnommenen Proben je ca 1ml H20 und je 1 Tropfen Kl3 Losung e Geben Sie zu jeder nach jeweils nach 2 weiteren Minuten entnommenen Probe separat wiederum je ca 1ml destilliertes Wasser und je 1 Tr Kl3 LoOsung e Wiederholen Sie dieses Vorgehen solange bis bei Zusetzen der Kl3 LOsung zur entnommenen Probe keine Blaufarbung mehr auftritt e Notieren Sie fur Ihr Protokoll Ihre Beobachtung e Kommentieren Sie Ihre Beobachtungen im Bezug auf die Struktur Abbildung 6 Mat Reagenzglas 16x100 2 1 1 U Versuch Glucosenachweis e Stellen Sie 1 ml der abgek hlten L sung aus 2 1 1 T bereit e Neutralisieren Sie diese Geben Sie hierzu 4 5 ml NaOH 1M zu und danach festes NaHCO bis zum Ende der Gasbildung e Pr fen Sie die neutralisierte L sung mit Fehlingscher L sung sowie mit Glucoseteststreifen siehe 1 4 2 Q Versuch Glucosebestimmung mit Glucoseoxidase GOD NAD Test Mat Reagenzglas 16x100 Biochemie_Skript22Jun2010 doc 22 06 2010 Seite 20 2 1 2 Vitamine 2 1 2 V Versuch Ascorbinsaure L Ascorbinsaure oder Vitamin C CgHgQ0g ist biosynthetisch und strukturell mit den Zuckern verwandt unterscheidet sich aber erheblich in der chemischen Reaktivitat und F

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