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Biotechnologie-Forscher DNA-Fingerprinting-Kit Anleitung - Bio-Rad

1. Gr e Basenpaare is 8 IT E Faass 8 000 N ptt EE EE A 7 000 f 4 a WE eee ee E Entfernung mm 67 4 Stunde Analyse der DNA Bandenmuster Abschlu fragen 1 Was soll hier bestimmt werden Formulieren Sie noch einmal unsere zentrale Frage Es wird versucht zu bestimmen ob die DNA die wir erhalten haben von ein und demselben Individuum stammt oder von verschiedenen 2 Welche der DNA Proben sind fragmentiert worden Wie w rde das Gel aussehen wenn keine Fragmentierung stattgefunden h tte Die Anzahl der Fragmente wird von Fall zu Fall verschieden sein Falls die DNA nicht hydrolysiert wurde enth lt jede Bahn nur eine Bande 3 Wodurch wurde die DNA fragmentiert Durch die hinzugef gten Restriktionsenzyme 4 Wovon h ngt es ab an welcher Stelle eine Restriktionsendonuklease ein DNA Molek l schneidet Eine spezifische Basensequenz auf der DNA die Restriktionsstelle genannt wird 5 Eine Restriktionsendonuklease schneidet zwei DNA Molek le an der gleichen Stelle Was haben diese beiden Molek le an dieser Stelle demnach gemeinsam Die Restriktionsstellen sind identisch 6 Sieht es so aus als h tte die DNA von ir
2. chemischen Scheren des Molekularbiologen da sie die DNA schneiden Wenn ein bestimmtes Restriktionsenzym eine bestimmte Erkennungssequenz aus vier bis sechs Basenpaaren Bp auf einem DNA Abschnitt erkennt wird das DNA Molek l an dieser Stelle geschnitten Die Erkennungssequenzen f r zwei h ufig verwendete Enzyme EcoRI und PstI sind unten abgebildet Die Stellen an denen das DNA R ckgrat tats chlich geschnitten wird sind mit dem 3 lt Symbol gekennzeichnet GIAAATTC CTTAAIG For the enzyme EcoRl CTGCAIG For the enzyme Psil GIAC GTC Wie alle Enzyme funktionieren Restriktionsenzyme am besten mit spezifischen Puffern und bei bestimmten Temperaturen Der fiir das Restriktionsenzym geeignete Puffer ist bereits in der DNA Probe enthalten so da beim Mischen der rehydrierten DNA mit den Enzymen die idealen Bedingungen f r die Enzyme geschaffen werden die ein optimales Funktionieren erm glichen Der endg ltige Reaktionspuffer besteht aus 50 mM Tris 100 mM NaCl 10 mM MgCh 1 mM DDT pH 8 0 was die ideale Bedingung fiir die Funktion von EcoRI und PstI darstellt 5 Sichtbarmachen der DNA Restriktionsfragmente Die DNA ist farblos und daher sind die DNA Fragmente im Gel nicht zu erkennen Der DNA wird zum Auftragen ein blauer Puffer zugef gt der zwei blaue Farbstoffe enth lt Die Farbstoffe f rben nicht die DNA an aber sie machen das Beladen des Gels einfacher und lassen das Fortschreiten der Elektrophorese besser berw
3. 3309 Verd chtiger 5 DNA Probe 76 SOOLE 154 9S7TE 154 600 154 TE69T 154 STHTT 820 154 LEBGI 6ELI Sd 56591 54 58091 PSd 154 86 154 6 811 PSd 19111 4 18 6 154 1196 7258 1154 9895 184 BITS Hd 784 lot 754 EILH Psd N 098 PSd Fa Sd 6096 14 8 1054 0957 154 5 2 BamHl 276 298 401 5 EcoRI 2 306 55 Lambda Bakteriophagengenom 48502 bp 1366 Seal 77 Plasmid Elternvektor Life Science Group Bio Rad Laboratories Inc Web site www bio radcom USA 800 4BIORAD Australia 02 9914 2800 Austria 01 877 8901 Belgium 09 385 55 11 Brazil 55 21 2527 3454 Canada 905 712 2771 China 96 21 63052255 Czech Republic 420 2 41 43 05 32 Denmark 44 52 1000 Finland 09 804 2200 France 01 4795 69 65 Germany 080 318 84 0 Hong Kong 852 2789 2300 Hungary 36 1 455 8800 India 91 124 6308112 113 114 6450002193 Israel 03 951 4127 Italy 39 02 216091 Japan 03 5811 6270 Korea 82 2 3473 4460 Latin America 305 894 5950 Mexico 55 52 00 05 20 The Netherlands 0318 540666 New Zealand 649 415 2290 Norway 23 38 41 30 Poland 48 22 331 99 99 Portugal 351 21 472 7700 Russia 7 095 721 1404 Singapore 65 6415 3188 South Africa 00 27 11 4428508 Spain 34 91 590 5200 Sweden 08 555 12700 Switzerland 061 717 9555 Taiwan 5862 2578 7
4. V4 V5 1 2 3 4 5 6 7 8 ist unschwer festzustellen da die DNA vom Tatort und vom Tatverd chtigen Nr 3 identisch ist Sie k nnen an dieser Stelle darauf eingehen wie stark bzw schwach dieser Beweis f r die Verurteilung eines Tatverd chtigen ist Die Beweiskraft des DNA Nachweises kann u U dazu ausreichen den Tatverd chtigen mit dem Tatort in Verbindung zu bringen aber um ihn bzw sie schuldig zu sprechen wird m glicherweise noch zus tzliches Beweismaterial ben tigt Sie sollten ihre Sch ler darauf aufmerksam machen da es sich hierbei nur um eine Simulation handelt Bei einem tats chlichen DNA Fingerprinting werden im Labor sehr viel gr ere DNA Abschnitte eingesetzt und es werden viel mehr Bahnen und Banden produziert Es wird dann nach einem spezifischen DNA Abschnitt gesucht der bei einer gegebenen Population immer vorhanden ist aber f r jedes Individuum ein spezifisches Bandenmuster ergibt Zuverl ssigkeit der DNA Beweisf hrung Bei der Einsch tzung der Zuverl ssigkeit der DNA Fingerprinting Methode im Rahmen der Gerichtsmedizin spielen Populationsgenetik und genetische Statistik eine wichtige Rolle Beim Menschen gibt es Tausende von RFLP Loci oder von DNA Abschnitten die f r die Fingerprint Analyse ausgew hlt und verwendet werden k nnen Abh ngig von demographischen Faktoren wie die Zugeh rigkeit zu einer bestimmten Kulturgemeinschaft und geographischer Isolation werden einige Abschnitt
5. Vergleichen Sie das R ckgrat aus Zucker und Phosphatbausteinen in allen drei oben abgebildeten Seitenketten Gibt es irgendwelche Unterschiede Enthalten alle drei Proben der obigen Abbildung dieselben Basen Beschreiben Sie Ihre Beobachtungen Sind die Basen in allen drei Proben in gleicher Weise gepaart Beschreiben Sie das Muster der Basenpaarung Welche Annahmen k nnen Sie bei Ihrem Versuch die DNA Proben von drei verschiedenen Individuen zu analysieren ber die Gemeinsamkeiten und Unterschiede der DNA Proben machen Was genau mu zwischen diesen Proben verglichen werden um eine Aussage dar ber treffen zu k nnen ob sie identisch sind oder nicht 24 2 Stunde Verdau der DNA Proben mit Restriktionsenzymen Voriiberlegung 2 Wie konnen wir Unterschiede bei den Basensequenzen feststellen Auf den ersten Blick erscheint diese Aufgabe ziemlich schwierig Es mu n mlich bestimmt werden ob die lineare Basensequenz von verschiedenen DNA Proben identisch ist oder nicht Hier k nnte vielleicht die Erkenntnis aus einigen relativ neuen Entwicklungen bei Techniken mit rekombinanter DNA helfen einen strategischen Plan zu entwickeln 1968 entdeckten Dr Werner an der Universit t Basel Schweiz und Dr Hamilton Smith an der Johns Hopkins Universit t Baltimore eine Gruppe von Enzymen in Bakterien die wenn sie zu irgendeiner DNA gegeben wurden zwischen bestimmten Nukleotidbasen Erkennungsstellen zu einer Spaltung Hydr
6. 10 man die Anzahl der Basenpaare ist dann das rechte Fragment genauso gro wie das linke Nein es ist gr er Wie k nnen Sie die Fragmentgr e in Bezug auf die Anzahl der im Fragment enthaltenen Basenpaare beschreiben Fragment 1 ist ein 4 Bp Fragment Fragment 2 ist ein 10 Bp Fragment Wenn das GAATTC Palindrom viermal auf demselben St ck DNA wiederholt wird und das Restriktionsenzym das diese Basenpaare erkennt vorhanden ist Wie viele DNA Fragmente werden entstehen 5 Wird das GAATTC Palindrom in willk rlichen Abst nden entlang des DNA Stranges wiederholt welche Aussage k nnen Sie dann ber die Gr e der entstehenden Fragmente machen Die Gr e der Fragmente wird auch zuf llig sein 69 Anwendung des Erlernten Besitzt DNA Molekiil die Restriktionsstellen A und f r ein bestimmtes Palindrom wie viele Fragmente werden entstehen 3 Numerieren Sie jedes Fragment t 2 4 3 Welches Fragment w re das gr te Fragment 3 Welches Fragment w re das kleinste Fragment 2 Zeichnen Sie ein DNA Molek l das f r ein spezifisches Palindrom in willk rlichen Abst nden 5 Restriktionsstellen besitzt Wie viele Fragmente w rden entstehen wenn jede Restriktionsstelle von einem Restriktionsenzym gespalten wird Verschiedene Antworten sind m glich Numerieren Sie alle Fragmente Verschiedene Antworten sind m glich Listen Sie sie de
7. Andere Methoden werden ausf hrlich in der Bedienungsanleitung zur Sub Cell GT Cell Elektrophoresekammer beschrieben Schritt 1 Verschlie en Sie die Seiten des Geltr gers mit normalem Laborklebeband kein Scotch oder ein hnliches Band Dr cken Sie das Band fest auf die Ecken des Geltr gers so da keine Fl ssigkeit austreten kann Schritt 2 Richten Sie den Geltr ger auf einem Nivelliertisch oder mit der mitgelieferten Wasserwaage auf einer normalen Arbeitsbank aus Schritt 3 L sen Sie die Agarose in der gew nschten Konzentration und Menge in 1x TAE Elektrophoresepuffer auf Schritt 4 Lassen Sie die Agarose auf wenigstens 60 C abk hlen ehe Sie mit dem Gie en beginnen Schritt 5 W hrend die Agarose auf 60 C abk hlt setzen Sie den Gelkamm in den entsprechenden Schlitz des Geltr gers Gelk mme sollten nicht weiter als 2 cm vom Ende des Geltr gers positioniert werden wenn ein Gel mit nur einem Kamm gegossen wird 7x7cm Geltr ger Wenn ein Gel mit zwei 8 Well K mmen gegossen wird 7x10 cm Geltr ger plazieren Sie einen Kamm an das eine Ende und den anderen Kamm in die Mitte des Geltr gers Die K mme formen die Taschen in die die Proben geladen werden Schritt 6 Geben Sie dem Gel 10 bis 20 Minuten Zeit sich zu verfestigen es erscheint tr b bzw opak wenn es gebrauchsfertig ist Schritt 7 Ziehen Sie den Gelkamm vorsichtig aus dem fest gewordenen Gel Schritt 8 Ziehen Sie das Klebeband von den offen
8. Legen Sie das Gel in die Mitte des Films und entfernen Sie Luftblasen die sich zwischen Gel und Film gebildet haben Legen Sie den Film auf ein Papiertuch und lassen Sie das Gel an einer gut bel fteten Stelle trocknen Vermeiden Sie direkte Lichteinwirkung W hrend des Trocknens bindet sich das Gel an den Film schrumpft aber nicht Der Trocknungsvorgang ist nach 2 3 Tagen bei Raumtemperatur abgeschlossen Das Ergebnis ist ein transparenter und dauerhafter Beleg ber das Experiment Gel support film 40 Protokoll II F rbung ber Nacht 1x Fast Blast DNA F rbel sung Zur F rbung ber Nacht muss die Fast Blast DNA F rbel sung 500 auf eine 1x Konzentration verd nnt werden Wir empfehlen 120 ml verd nnte 1x Fast Blast L sung um zwei Gele von 7x7 cm oder 7x10 cm in einer F rbeschale anzuf rben Wenn Sie andere F rbeschalen verwenden nehmen Sie bitte eine ausreichende Menge F rbel sung so dass das Gel vollst ndig bedeckt ist Zum Anf rben wird das Gel aus dem Geltr ger genommen Dies geht leicht indem sie mit einer Hand das untere Ende des Gels halten w hrend sie mit der anderen Hand das Gel vorsichtig mit dem Daumen herausdr cken Besondere Aufmerksamkeit muss der Unterst tzung des Gelteils gewidmet werden der die Starttaschen enth lt da das Gel leicht der Startlinie entlang bricht 1 Markieren Sie die F rbeschalen mit Ihren Initialen und der Klasse Sie f rben zwei Gele in einer Schale 2 F rbun
9. Molek len bildet Zonen mit erh hter Konzentration die auch Banden genannt werden Ein lineares St ck DNA wird wie unten gezeigtin 4 Fragmente geschnitten Eine L sung mit den 4 Fragmenten wird in eine Starttasche eines Agarosegels pipettiert Zeichen Sie auf der rechten Seite ein was Sie aufgrund der obigen Informationen bez glich der Auftrennung der Fragmente erwarten Markieren Sie jedes Fragment mit dem ihm zugeh rigen Buchstaben Well A B 0 32 0 Agarose gel Positive Lassen Sie die Lehrkraft das Diagramm berpr fen bevor Sie fortfahren Wo w rden sich die gr eren Fragmente die mit der gr eren Anzahl an Basenpaaren befinden mehr im oberen oder mehr im unteren Teil des Gels Warum Angenommen Sie h tten von allen vier Fragmenten je 500 St ck wie w rde in diesem Fall das Gel aussehen Wenn es m glich w re jedes Fragment zu wiegen welches Fragment w re das schwerste Warum Vervollst ndigen Sie diese Regel zur Wanderung der DNA Fragmente durch ein Agarosegel Je gr er die DNA Fragmente desto 57 Dieses Diagramm stellt ein St ck DNA dar das mit Hindlll an allen durch die Pfeile gekennzeichneten Restriktionsstellen geschnitten wird Die Zahlen geben die Anzahl der in jedem Fragment vorhandenen Basenpaare an 2 027 d 23 130 p 9 416 4 361 2 322 co Wieviele Fragmente werden durch das Restriktionsenzym HindIII produziert Zeich
10. sie haben also gewisserma en die Funktion von molekularen Scheren die die DNA an bestimmten Basenpaarsequenzen schneiden Tritt eine spezifische Restriktionsschnittstelle mehr als einmal in einem DNA Molek l auf so wird das entsprechende Restriktionsenzym an allen diesen Stellen schneiden und es entstehen mehrere Fragmente Wenn also z B ein lineares St ck DNA Molek l mit einem Restriktionsenzym verdaut wird dessen spezifischer Erkennungscode an zwei verschiedenen Stellen auf dem DNA Molek l vorkommt entstehen drei Fragmente unterschiedlicher L nge Ist die DNA ringf rmig und wird sie mit einem Restriktionsenzym geschnitten dessen spezifische Erkennungsstelle an zwei verschiedenen Stellen des DNA Molek ls auftritt so entstehen zwei Fragmente unterschiedlicher L nge Die L nge der einzelnen Fragmente h ngt davon ab wo sich die Restriktionsschnittstellen auf dem DNA Molek l befinden Werden Restriktionsenzyme dazu benutzt Einzelstr nge ringf rmiger DNA zu schneiden wie in diesem Kit vorgesehen so entstehen Fragmente unterschiedlicher Gr e Durch Restriktionsenzyme geschnittene DNA kann durch Agarose Gel Elektrophorese aufgetrennt und sichtbar gemacht werden Der Begriff Elektrophorese steht f r Wanderung unter dem Einflu elektrischer Spannung Agarose Gel Elektrophorese Bei der Elektrophorese werden die DNA Fragmente nach ihrer Gr e getrennt Die DNA Fragmente werden auf ein Agarose Trenngel geladen das in eine Ka
11. um sich das Vorgehen zu verdeutlichen Dort wo die Waagrechte die Y Achse schneidet kann die ungef hre Gr e des unbekannten DNA Fragments abgelesen werden Verfahren Sie entsprechend f r alle DNA Fragmente vom Tatort und von den Verd chtigen Vergleichen Sie die Fragmentgr en der DNA vom Tatort mit denen der Tatverd chtigen Stimmen die Fragmentgr en der DNA irgendeines Tatverd chtigen mit denen der DNA vom Tatort berein Wie sicher sind Sie da hier eine bereinstimmung vorliegt 44 Elektrophorese Daten Messen Sie die Entfernung in Millimetern die jedes Fragment aus der Geltasche gelaufen ist und halten Sie dies in der Tabelle fest Sch tzen Sie seine Gr e Basenpaaren Bp in dem Sie seine Position mit den Lambda HindIII Gr enmarkern vergleichen Achtung manche Spuren haben weniger als 6 Fragmente fame Abstand mm wirkliche 23 130 9 416 6 557 4 361 2 322 Lambda Hind Gr e Gr enmarker Bp Abstand mm Gr e Tatort ca Bp Abstand mm Gr e Verd chtiger 1 ca Bp Abstand mm 2 027 Abstand mm Gr e Verd chtiger 3 ca Bp Abstand mm Gr e Verd chtiger 4 ca Bp Verd chtiger 5 Gr e Verd chtiger 2 ca Bp 45 DNA Standard Laufstrecken der Banden Semi Graph 80 000 60 000 40 000 20 000 1 0 000 8 000 6 000 4 000 Gr e Basenpaare 2 000 Entfernung mm Zur Absch tz
12. 10 ul Spur 2 CS griin 20 pl Spur 3 S1 blau 20 ul Spur 4 52 orange 20 ul Spur 5 53 violet 20 ul Spur 6 S4 rot 20 pl Spur 7 55 gelb 20 ul 6 Der Deckel wird auf die Elektrophorese Kammer gesetzt das ist nur in einer Orientierung m glich die roten u schwarzen Kabel m ssen zu den roten u schwarzen Elektroden der Elektrophorese Kammer passen Die Kabel stellen die Verbindung zum Netzger t her DNA Loading Dye 7 Centrifuge 7 Am Netzger t wird eine Spannung von 100 V eingestellt die Laufzeit betr gt ca 30 40 min 8 Soll die Elektrophorese gestoppt werden ist das Netzger t auszuschalten und der Deckel von der Elektrophorese Kammer zu entfernen Das Gel kann nun sehr vorsichtig mit dem Geltr ger aus der Kammer geholt Achtung Das Gel rutscht sehr schnell weg und in die F rbeschale berf hrt werden 9 Das Gel wird mit ca 60 ml DNA Stain gef rbt mind 2 h F rbung ber Nacht ist auch m glich 20 Sichtbarmachen der DNA Fragmente 1 Ist der Elektrophoreselauf beendet schalten Sie das Netzgerat aus und entfernen den Deckel von der Elektrophorese Kammer Das Gel kann nun sehr vorsichtig mit dem Geltr ger aus der Kammer geholt Achtung Das Gel rutscht sehr schnell weg und in die F rbeschale berf hrt werden 2 Es gibt zwei M glichkeiten die F rbung des Gels durchzur hren SCHNELL F RBUNG 12 15 min 120 ml 100 Fast Blast
13. Aufgrund der zur Verf gung stehenden Daten sollten Sie in der Lage sein zu entscheiden ob die DNA Proben von ein und demselben Individuum stammen oder von verschiedenen F r dieses Experiment ist es wichtig sich nochmals die Struktur der DNA ins Ged chtnis zu rufen DNA besteht aus einer Serie von Stickstoffbasen die durch schwache Wasserstoffbr cken Bindungen zusammengehalten werden Diese Basenpaare sind eine nach der anderen an das Zucker Phosphat R ckgrat gebunden Die vier Stickstoffbasen sind Adenin Thymin Guanin und Cytosin A T G und C Erinnern Sie sich an die Basenpaar Regel A T und G C Siehe Abbildung unten zum DNA Molek l Die Struktur der DNA DNA Molek l I DNA Molek l DNA Molek l III Pflanze Mensch Bakterium Die oben abgebildeten Molek lstrukturen stellen nur einen sehr kleinen Teil der DNA von drei verschiedenen Individuen dar In dieser Darstellung der DNA wurden folgende Symbole verwendet Seitenketten S ZUCKERmolek l mit f nf Kohlenstoffatomen bekannt als Desoxyribose P PHOSPHATmolekiil bestehend aus Phosphor und Sauerstoffatomen DNA Nukleotidbasen A AdeninC Cytosin G Guanin T Thymin Die Analyse der drei DNA Proben siehe n chste Seite kann m glicherweise helfen hnlichkeiten und Unterschiede in den DNA Proben verschiedener Personen zu erkennen 23 1 Stunde Einf hrung zum DNA Fingerprinting Vor berlegung 1 Was sind die typischen Strukturmerkmale der DNA 1
14. DNA Fingerprinting Aktivit t Vortrag und Diskussion Vor berlegung zu Experiment 1 und 2 2 Stunde Verdau der DNA Proben mit Restriktionsenzymen Aktivit t Gie en von Gelen Durchf hrung der enzymatischen Spaltung Abschlu der vorl ufigen Analyse und Beantwortung von Fragen 3 Stunde Elektrophorese der DNA Proben Aktivit t Beladen und Laufenlassen der Gele Anf rben der Gele ber Nacht Durchf hrung der Analyse und Beantwortung von Fragen 4 Stunde Analyse und Interpretation der Ergebnisse Aktivit t Entf rben der Gele Fragen zur Durchf hrung der Analyse Anfertigen der Standardkurve Diskussion der Ergebnisse und Abw gen der Beweiskraft berblick ber die Vorbereitungen der Lehrkraft In diesem Abschnitt wird der empfohlene Zeitplan f r die von der Lehrkraft durchzuf hrenden Vorbereitungen zusammengefa t Eine ausf hrliche Beschreibung der durchzuf hrenden Vorbereitungen finden Sie auf den Seiten 11 18 Aktivit t Wann Ben tigte Zeit Lekt re der Fingerprinting Anleitung sofort 1 Stunde Vorbereiten des TAE vor oder w hrend Elektrophoresepuffers Gie en der der 2 Stunde 1 Stunde Agarosegele Rehydrieren der lyophilisierten DNA vor der 2 Stunde 20 Minuten Probenpuffer und Enzyme mischen und aliquotieren Vorbereiten des Fast Blast DNA vor der 3 Stunde 10 Minuten Anf rbemittels Vorbereiten der Arbeitspl tze am Tag der 10 Minuten Tag Versuchsdurchf hrung Checkliste f r den Arbeitsplatz Ar
15. erwarten Sie in jeder separaten Bahn Was w re eine logische Erkl rung daf r dass f r alle DNA Proben mehr als eine Bande zu sehen ist Wodurch entstanden die DNA Fragmente Welche DNA Proben hatten fiir die verwendeten Restriktionsendonukleasen die gleiche Anzahl an Schnittstellen Schreiben Sie die Nummern der entsprechenden Bahnen auf Welche Probe weist das kleinste DNA Fragment auf Geht man von einer ringformigen DNA aus Plasmid die als Startmaterial eingesetzt wurde wie viele Restriktionsschnittstellen hatte dann Bahn 3 Welche DNA Proben wurden anscheinend Fragmente von gleicher Anzahl und Gr e geschnitten Welche Schlussfolgerungen bez glich der DNA Proben in der Abbildung ziehen Sie auf Grund Ihrer Gelanalyse Stammen irgendwelche Proben anscheinend aus der gleichen Quelle Wenn ja welche Erl utern Sie Ihre Schlussfolgerung 38 Gel Farbe und Entfarbungsschritte Es gibt zwei verschiedene Protokolle um DNA mit der Fast Blast F rbung sichtbar zu machen Um Gele sehr schnell innerhalb von 12 15 Minuten zu f rben verwenden Sie bitte Protokoll I zur F rbung ber Nacht w hlen Sie Protokoll II Ihre Lehrkraft wird abh ngig von der verf gbaren Zeit entscheiden welches Protokoll verwendet wird Zwei Sch lerteams pro F rbeschale werden die Gele f rben die Ecken der Gele sind so abzuschneiden dass man sie voneinander unterscheiden kann Beschriften Sie die Gelf rbeschalen mit Initialen und der Kl
16. ren trotzdem nur 4 Banden zu sehen Wenn es m glich w re jedes Fragment zu wiegen welches Fragment w re das schwerste Warum Fragment D w re das schwerste weil es aus dem gr ten St ck DNA besteht und daher die gr te Masse h tte Vervollst ndigen Sie diese Regel zur Wanderung der DNA Fragmente durch ein Agarosegel Je gr er die DNA Fragmente desto langsamer wandert es durch ein Agarosegel 71 Dieses Diagramm stellt ein St ck DNA dar das mit an allen durch die Pfeile gekennzeichneten Restriktionsstellen geschnitten wird Die Zahlen geben die Anzahl der in jedem Fragment 5 vorhandenen Basenpaare an SS 23 130 6 557 9 416 4 361 2 322 co Wieviele Fragmente werden durch das Restriktionsenzym HindIII produziert 6 Zeichnen Sie in dem unten abgebildeten Gel die Fragmente an den Stellen ein an denen sie sich Ihrer Meinung nach am Schlu der Elektrophorese befinden Well Negative Positive Agarose gel co Beschriften Sie jedes Fragment mit seiner korrekten Anzahl an Basenpaaren 72 Anhang D Plasmid DNA und Restriktionsenzyme Die DNA Proben vom Tatort und der Verd chtigen die in diesem Kit enthalten sind enthalten keine menschliche DNA sondern Plasmid DNA die aus Bakterien isoliert wurde Plasmide sind kleine ringf rmige DNA St cke die sich in Bakterienzellen vermehren k nnen In der Evolution entwickelten Bakterien Plasmide die Gene enthielten die es ihnen e
17. 189 2578 7241 United Kingdom 020 8328 2000 0104 Sig 1103 4006096 Rev 78
18. 3EDU 1 m Hintergrundinformation fiir die Lehrkraft Einf hrung Angestellte in gerichtsmedizinischen Labors werden oft im Rahmen der Indizienanalyse bei Strafverfolgungen und anderen Anwendungen gebeten ein DNA Profil bzw einen DNA Fingerabdruck zu erstellen DNA Fingerprinting k nnte zus tzlich eine Anreicherung durch die Polymerase Kettenreaktion polymerase chain reaction PCR erforderlich machen um auch kleine Mengen DNA analysieren zu k nnen bzw eine Restriktions Fragment L ngen Polymorphismus Analyse restriction fragment length polymorphism RFLP wenn gro e Mengen DNA vorliegen Ein Schritt in der RFLP Analyse mit menschlichem Material erfordert den Vergleich von Bandenmuster die fragmentierte DNA Proben nach Auftrennung mit Agarosegelen ergeben Die Bandenmuster in diesem Versuch stammen von einer Probe der sogenannten Tatort DNA und von 5 Proben die in diesem Fall von Verd chtigen stammen Es ist wichtig die Sch ler darauf hinzuweisen da dieser Laborversuch eine Vereinfachung der wesentlich anspruchsvolleren Technik die bei komplexen menschlichen DNA Proben angewandt wird darstellt Restriktionsenzyme Restriktionsenzyme sitzen auf einem DNA Molek l und gleiten entlang der Helix bis sie spezifische Basenpaarsequenzen erkennen die dem Enzym signalisieren anzuhalten An dieser Stelle der sogenannten Restriktionsschnittstelle verdauen die Enzyme dann das DNA Molek l spalten es chemisch
19. 5 angegeben werden Wie k nnen Sie die Abweichung erkl ren Wie k nnen Sie zu einer genaueren Absch tzung der Plasmidgr en kommen unter Verwendung von Restriktionsanalyse und Agarose Elektrophorese Hinweis Vielleicht f hren andere Restriktionsenzyme zu anderen Bandenmuster auf dem Gel Welche Enzyme w rden Sie ausw hlen 73 Plasmid Karten 55 EcoRI 255 Bamlil 276 PsA 298 BamHI 369 EcoRV 1448 Seal 3506 EcoRI 1489 2022 2438 2541 2446 Verd chtiger 1 DNA Probe 55 EcoRI 255 BamHI 276 298 Scal 4375 1993 1998 Pstl 2148 3410 Scal 2336 3313 Pet 3307 Verd chtiger 2 DNA Probe 74 Puull 55 EcoRI 255 BamHI 276 298 EcoRV 403 EcoRI 1118 Seal 5873 Seal 1539 Aine IL 2065 Pyull 4908 Hindili 4813 4805 EcoRV 427 4233 Hindili 4092 Tatort Verd chtiger 3 DNA Probe EcoRI 255 BamHI 276 298 BamHI 585 Pet 766 Scal 5765 54 EcoRV 1763 7259 bp 4800 Hind 4705 Pail 4697 Prull 2913 EcoRV 3166 EcoRV 3904 Verd chtiger 4 DNA Probe 75 55 EcoRI 255 BamHi 276 298 370 Seal 7987 2356 7022 6927 2520 6919 BamHI 6624 Pstl 6451 EcoRV
20. 7 C optional 1 Klasse Mikrozentrifuge oder 1 Klasse LI Minizentrifuge 4 Klasse LI 27 2 Stunde Labor Restriktionsverdau der DNA Proben 1 Beschriften der Reaktionsgef e A Holen Sie sich je eines der folgenden farbigen Reaktionsgef e Beschriften Sie die 5 farbigen Reaktionsgef e wie folgt Gr n TO Tatort Blau V1 Tatverd chtiger Nr 1 Orange V2 Tatverd chtiger Nr 2 Violett V3 Tatverd chtiger Nr 3 Rot V4 Tatverd chtiger Nr 4 Gelb V5 Tatverd chtiger Nr 5 Schreiben Sie Ihren Namen und die Kursbezeichnung auf die Reaktionsgef e Der Restriktionsverdau findet in diesen Gef en statt Behalten Sie diese Gef e auf Ihrem Arbeitsplatz TO V2 V4 V5 2 Holen Sie sich das farblose Reaktionsgef mit der Aufschrift ENZ ENZ Enzymmischung ENZ 3 Holen Sie sich Ihre DNA Proben Pipettieren Sie je 10 ul jeder DNA Probe aus der farbigen Stamml sung in jedes entsprechend gekennzeichnete und gef rbte Reaktionsgef Verwenden Sie dabei f r jede Probe eine frische Pipettenspitze DNA e 1717171717 DNA Stamml sung V2 v4 5 28 Beobachtungen 1 Beschreiben Sie die physikalische Eigenschaften der DNA Proben 2 Sie irgendwelche Unterschiede zwischen den DNA Proben feststellen 3 Beschreiben Sie das Aussehen der Restriktionsendonukleasemischung 4 Kombinieren Sie die L sungen und lassen Sie sie reagieren Pipettieren Sie mi
21. Biotechnologie Forscher DNA Fingerprinting Kit Anleitung Bestellnummer 166 0007 EDU www explorer bio rad com Lyophilisierte Reagenzien bei Raumtemperatur aufbewahrt werden Lagern Sie die DNA Marker bei 4 C oder k lter innerhalb von 4 Wochen nach Lieferung Das Vervielf ltigen von Teilen dieses Dokuments ist nur f r den Schulgebrauch erlaubt Wie k nnen DNA Bandenmuster bei der L sung menschlicher Probleme helfen DNA Fingerprinting wird nun routinem ig bei der Aufkl rung von Verbrechen eingesetzt In den vergangenen Jahren gab es neue Berichte wie mit kleinsten Mengen DNA einerseits Individuen identifiziert wurden die in Vorf lle verwickelt waren die sogar Jahre zur cklagen andererseits Unschuldige von Anschuldigungen entlastet werden konnten Die Sch ler sind begeistert davon wie DNA zur Identifizierung von Individuen eingesetzt werden kann Dieser Versuch erm glicht eine Vertiefung des Stoffes wie Restriktionsenzyme die DNA schneiden wie Elektrophorese zur Auftrennung und zum sichtbar machen von DNA Fragmenten eingesetzt wird und wie diese Techniken zu einem DNA Fingerprint kombiniert werden k nnen Die Prinzipien der Restriktionsanalyse des Plasmid Mappings und der Gr enbestimmung von DNA Fragmenten k nnen mit diesem Kit auch dokumentiert werden Er ffnen Sie eine Diskussion um wissenschaftliche ethische und rechtliche Aspekte des DNA Profilings DNA Fingerprinting wird eingesetzt sowohl in me
22. DNA Marker 0 2 ug ul 100 ul 1 Fl schchen LI 10 Anf rbemittel f r DNA Probe 1 Fl schchen 11 Fast Blast DNA F rbel sung 500 100 ml 1 Fl schchen 12 Reaktionsgef e 1 5 ml verschiedene Farben 60 LI 13 Farblose Reaktionsgef e 30 LI 14 Agarose 5 g 1 LI 15 Elektrophorese Puffer 50x 100 ml 1 16 Styroporst nder f r Reaktionsgef e 16 LI 17 Schalen zum Anf rben der Gele 10 LI Ben tigtes Zubeh r das nicht diesem Kit enthalten ist Anzahl pro Klasse v Einstellbare Mikropipette 2 20 ul 166 0506EDU Pipettenspitzen 1 Box 5 Racks zu 200 223 9338EDU Horizontale Elektrophoresekammer 166 4000EDU Netzger t PowerPac Basic 164 5050EDU oder PowerPac Junior 165 5048EDU Einstellbare Mikropipette 20 200 ul 166 0509EDU 1 1 Einstellbare Mikropipette 100 1000 ul 166 0508EDU 1 Pipettenspitzen 100 1000 ul 5 Racks zu 200 223 9350EDU 1 Filzschreiber 1 Mikrowellenofen oder hei e Platte 1 Destilliertes Wasser 1 250 ml Erlenmeyerkolben zum Erhitzen der Agarose 1 500 ml Kolben oder Becher zum Verdiinnen des DNA Farbstoffes 1 Kiibel mit Eis 1 Laborband nicht Marke Scotch 3M oder ein hnliches Band 1 Optionales Zubeh r Anzahl pro Klasse 37 C Wasserbad 166 0504EDU oder Mini Inkubationsofen 166 0501 EDU 1 Gel Support Film 50 Blatt 170 2984EDU 1 Mikrozentrifuge 166 0612EDU oder Mini Zentrifuge 166 061
23. DNA Stain werden ein F rbesch lchen gegossen 1 Sch lchen f r 2 Gele b Die Gele werden 2 min gef rbt dabei das F rbesch lchen leicht gesch ttelt Der Farbstoff kann wiederverwendet werden c Waschen der Gele mit warmem Wasser 40 55 C f r 10 sec d Entf rben der Gele durch zweimaliges Waschen mit warmem Wasser f r je 5 min dabei leicht sch tteln e Ergebnisse dokumentieren f Unbenutzte Spuren wegschneiden g Das Gel kann auf einem Support Film an der Luft getrocknet und aufbewahrt werden BERNACHT F RBUNG a 120 ml 1x Fast Blast DNA Stain werden in ein F rbesch lchen gegossen 1 Sch lchen f r 2 Gele b Die Gele bleiben ber Nacht in der F rbel sung wenn m glich auf einem Sch ttler eine Entf rbung ist nicht n tig c Sollte der Hintergrund zu stark gef rbt sein kurz mit Wasser waschen d Ergebnisse dokumentieren e Unbenutzte Spuren wegschneiden f Das Gel kann auf einem Support Film an der Luft trocknen und aufbewahrt werden 21 DNA Fingerprinting Schiilerhandbuch Inhalt Stunde 1 Einf hrung zum DNA Fingerprinting Stunde 2 Verdau der DNA Proben mit Restriktionsenzymen Stunde 3 Elektrophorese und Anf rben der DNA Proben Stunde 4 Trocknen der Gele und Analyse der DNA Bandenmuster 22 Seite 23 25 32 37 1 Stunde Einf hrung zum DNA Fingerprinting Sie werden in K rze eine Analyse durchf hren die als DNA Fingerprinting bekannt ist
24. Die Basensequenzen in den individuellen Proben 59 2 Stunde Verdau der DNA Probe mit Restriktionsenzymen 1 2 Wie viele DNA Stiicke wiirden bei diesem Schnitt entstehen 2 Schreiben Sie die Basensequenz sowohl des rechten als auch des linken DNA Fragments auf ATG AATTCTCAATTACCT TACTTAA GAGTTAATGGA Welche Unterschiede bestehen zwischen diesen beiden Fragmenten Die Fragmente sind verschieden gro Die Gr e eines DNA Fragments kann durch die Anzahl der Basenpaare in diesem Fragment ausgedr ckt werden Geben Sie die Gr e der Fragmente an Notieren Sie alle Abweichungen die Sie entdecken k nnen Ein Fragment ist kurz das andere lang weiterhin sind einige Basen ungepaart a Das kleinere Fragment besteht aus 3 Basenpaaren b Wie lang ist das l ngere Fragment 11 Betrachten Sie die beiden unten gezeigten DNA Proben der Einfachheit halber sind nur Einzelstr nge abgebildet Probe Nr 1 CAGTGATCTCGAATTCGCTAGTAACGTT Probe Nr 2 TCATGAATTCCTGGAATCAGCAAATGCA Geben Sie f r den Fall da beide Sequenzen mit einem Restriktionsenzym mit der Erkennungssequenz GAATTC behandelt w rden die Anzahl und Gr e der sich ergebenden Fragmente an Probe Nr 1 Probe Nr 2 Anzahl der Fragmente 2 Anzahl der Fragmente 2 Listen Sie die Fragmente der Gr e nach auf das gr te zuerst Probe Nr 1 Probe Nr 2 17 Bp Fragment 23 Bp Fragment 11 Bp Fragment 5 Bp Fragment 60 2 Stunde Verdau der DNA Proben m
25. TCGAA CTGCAG Pstl GACGTC 54 Fassen wir zusammen was wir bisher gelernt haben co Die Basensequenz auf einem Strang der DNA kann ein Palindrom auf dem anderen Strang haben 7 AATTC Palindrome werden von Restriktionsenzymen erkannt Restriktionsenzyme schneiden die Palindrome an den Restriktionsstellen Ein Restriktionsenzym erkennt nur eine bestimmte Art von Palindrom Durch das Schneiden der DNA an Restriktionsstellen entstehen DNA Fragmente Die Gr e der Fragmente kann durch die Anzahl der in ihnen enthaltenen Basenpaare beschrieben werden Wenden Sie das bisher Gelernte an Eine lineares DNA Molek l wird unten als durchgezogene Linie dargestellt obwohl die DNA in Wirklichkeit aus zwei Str ngen besteht Wenn ein DNA Molek l die Restriktionsstellen A und B f r ein bestimmtes Restriktionsenzym besitzt wie viele Fragmente werden entstehen wenn die DNA von diesem Enzym geschnitten wird A Numerieren Sie jedes Fragment Welches Fragment w re das gr te sein Welches Fragment w re das kleinste 55 Zeichnen Sie ein DNA Molekiil das f r ein spezifisches Palindrom in willk rlichen Abst nden 5 Restriktionsstellen besitzt Wie viele Fragmente wiirden entstehen wenn jede Restriktionsstelle von einem Restriktionsenzym gespalten wird co Numerieren Sie alle Fragmente co Listen Sie sie der Gr e nach auf Das gr te Fragment zuerst to In diesem Diagramm stehen A
26. a viele sogenannte Unterarten in Wirklichkeit zu einer einzigen Art geh ren Der hohe Verwandtschaftsgrad der m nnlichen Schimpansen kann vielleicht erkl ren warum sich anders als bei Primaten die m nnlichen Schimpansen durchaus freundlich gesonnen sind DNA Analyse von Pflanzenmaterial weist nach da ein Tatverd chtiger am Tatort war Zwei kleine Samenschoten auf der Ladefl che eines Kleinlastwagens bewiesen da ein des Mordes Angeklagter am Tatort war Genetische Tests ergaben da die DNA der Samenschote identisch war mit der DNA einer am Tatort gefundenen Pflanze Der Angeklagte hatte bisher zwar zugegeben dem Opfer eine Mitfahrgelegenheit geboten zu haben aber abgestritten jemals in der N he des Tatorts gewesen zu sein 51 Anhang Vorbereitung auf die 1 Laborstunde Ein Uberblick iiber Restriktionsenzyme DNA besteht aus einer Serie von stickstoffhaltigen Molek len die durch schwache Wasserstoffbr ckenbindungen zusammengehalten werden Diese Basenpaare wiederum sind an ein R ckgrat aus Zucker und Phosphat gebunden Es gibt vier verschiedene Nukleobasen Adenin Thymin Guanin und Cytosin A T G und C erinnern Sie sich an die Regel f r die Basenpaarung A T und G C Abbildung 1 zeigt die Struktur eines DNA Molek ls Abb 1 Die Struktur der DNA DNA Molek l I DNA Molek l II DNA Molek l III Pflanze Mensch Bakterium Wird ein Segment der DNA ohne Zucker und Phosphat angegeben so erscheint die Basenpa
27. achen Die gef rbte Front l uft wie auch die DNA Fragmente zum positiv geladenen Ende des Gels Der schnellere Farbstoff l uft wie DNA Fragmente mit ca 500 Bp w hrend der langsamere Farbstoff mit DNA Fragmenten von ca 5 kb Gr e mitwandert Die genaue Position der DNA im Gel wird durch Anf rben sichtbar gemacht Wenn das Gel in eine verd nnte L sung des Fast Blast DNA Anf rbemittels getaucht wird lagern sich die Farbmolek le an die im Agarosegel eingeschlossenen DNA Molek le an Zum Verbessern des Kontrasts und zum leichteren Erkennen der DNA Banden kann bersch ssige Hintergrundf rbung durch Entf rben des Gels in Wasser entfernt werden Nachdem die Banden sichtbar gemacht worden sind k nnen die Sch ler die DNA Restriktionsmuster der verschiedenen DNA Proben miteinander vergleichen Das unten abgebildete Gel zeigt die Bandenmuster die die Sch ler nach der Elektrophorese erhalten Die DNA vom Tatort ist mit TO gekennzeichnet die vom Tatverd chtigen Nr 1 mit V1 usw Die DNA vom Tatort ist in Bahn 2 aufgetragen die DNA der Tatverd chtigen in Bahn 3 4 5 6 und 7 In Bahn 1 ist der HindIlI Lambda Verdau DNA Gr enmarker mit aufgetragen Es ist blich mit der Numerierung der Bahnen oben links anzufangen Die Aufgabe der Sch ler ist es die DNA Bandenmuster anzuschauen und festzustellen ob die Banden eines Verd chtigen mit dem DNA Bandenmuster der am Tatort gefundenen Probe bereinstimmen M TO V2
28. arkieren Sie die Gele zur besseren Unterscheidung in dem Sie eine Ecke abschneiden Wenn Sie andere F rbeschalen verwenden nehmen Sie bitte eine ausreichende Menge F rbel sung so dass das Gel vollst ndig bedeckt ist Nach der Elektrophorese m ssen die Agarosegele aus dem Geltr ger genommen werden bevor sie in die F rbel sung gelegt werden Dies geht leicht wenn Sie mit einer Hand den Boden des Geltr gers halten und das Gel vorsichtig mit dem Daumen der anderen Hand herausdr cken co Weil das Gel leicht rei en kann mu man sehr vorsichtig damit umgehen Wir empfehlen einen Spatel oder eine andere Auflagefl che zu verwenden wenn das Gel w hrend der Entf rbungsschritte bei der Schnellf rbung von einem Beh lter in einen anderen berf hrt wird Zum bei der Schnellf rbung ben tigen Sie f r jeden Sch lerarbeitsplatz einen gro en Beh lter der mindestens 500 ml Jedes Sch lerteam kann entweder unterschiedliche Beh lter f r jeden Waschschritt nehmen oder einen Beh lter nehmen der nach jeder W sche geleert wird Die 100x Fast Blast F rbel sung kann mindestens 7x verwendet werden F r die F rbung ber Nacht sind keine Wasch und Entf rbungsschritte notwendig Am besten ist es die Gele zu sch tteln w hrend sie ber Nacht f rben Steht ein Sch ttler zur Verf gung k nnen mehrere Gele in einem gro en Beh lter gef rbt werden falls sie so z B durch Abschneiden vers
29. arsequenz wie folgt Von links nach rechts zu lesen ACTCCGTAGAATTC gt lt TGAGGCATCTTAAG lt Von rechts nach links zu lesen Betrachten Sie die linearen Basensequenzen As Ts usw auf beiden Str ngen Beschreiben Sie alle Muster die Sie der oberen Basensequenz erkennen Vergleichen Sie die Basen im oberen Teil des Molek ls mit denen im unteren Teil Beschreiben Sie alle Beziehungen die Sie erkennen k nnen Betrachten Sie die obere Basensequenz und vergleichen Sie sie mit der unteren Erkennen Sie eine Gruppierung von Basen bei der beim Lesen nach rechts bzw nach links die Basen in derselben Reihenfolge erscheinen 52 Sie haben vielleicht erkannt da die Basensequenz willk rlich angeordnet ist und da sich beide Str nge anscheinend komplementieren die As sind mit den Ts gepaart usw Sie haben vielleicht auch erkannt da ein Teil des oberen Stranges GAATTC von links nach rechts gelesen ein Gegenst ck im unteren Strang hat CTTAAG von rechts nach links gelesen hnliche Sequenzen sind und TTCGAA sowie CTGCAG und GACGTC Wenn eine solche Sequenz zusammen mit ihrer komplement ren Sequenz angesehen wird liest sich die Gruppe in beiden Richtungen gleich Diese Sequenzen Palindrome genannt kommen in einem DNA Molek l recht h ufig vor Restriktionsenzyme Molekulare Scheren Ein Haupt Feind von Bakterien sind Viren sogenannte Bakteriophagen wie z B Lambda Diese Viren infizie
30. asse bevor Sie mit der F rbung beginnen Achtung Die Fast Blast DNA F rbel sung ist ungiftig und nicht krebserregend Trotzdem sollten Vinyl bzw Latexhandschuhe und Schutzkleidung getragen werden wenn mit der F rbel sung oder gef rbten Gelen hantiert wird Damit vermeiden Sie eine Anf rbung der H nde und der Kleidung Protokoll I Schnelle F rbung von Agarose Gelen in 100x Fast Blast DNA F rbel sung Mit diesem Protokoll k nnen DNA Banden innerhalb von 15 Minuten sichtbar gemacht werden Dazu muss die Fast Blast DNA F rbel sung 500x auf eine 100x Konzentration verd nnt werden Wir empfehlen 120 ml verd nnte 100 x Fast Blast L sung um zwei Gele von 7x7 oder 7x10 cm in einer F rbeschale anzuf rben die im Bio Rad Klassenzimmer Kit enthalten sind Wenn Sie andere F rbeschalen verwenden nehmen Sie bitte eine ausreichende Menge F rbel sung so dass das Gel vollst ndig bedeckt ist Zum Anf rben wird das Gel aus dem Geltr ger genommen Dies geht leicht indem sie mit einer Hand das untere Ende des Gels halten w hrend sie mit der anderen Hand das Gel vorsichtig mit dem Daumen herausdr cken Besondere Aufmerksamkeit muss der Unterst tzung des Gelteils gewidmet werden der die Starttaschen enth lt da das Gel leicht der Startlinie entlang bricht Wir empfehlen einen Spatel oder eine andere Auflagefl che zu verwenden wenn das Gel von einem Beh lter in einen anderen berf hrt wird Zum Entf rben ben tigen Sie einen Beh l
31. beitspl tze der Sch ler Materialien und Zubeh r die zu Beginn jedes Versuchstages an jedem Sch lerarbeitstag vorhanden sein sollten sind unten aufgelistet Die mit diesem Kit bereitgestellten Komponenten reichen f r 8 Sch lerarbeitspl tze 4 Sch ler pro Arbeitsplatz Arbeitsplatz der Lehrkraft von allen genutzte Materialien Eine ebenfalls unten aufgef hrte Liste von Materialien und Ausr stungsgegenst nden die an einem Ort aufgestellt werden m ssen der allen Sch lern zug nglich ist Es bleibt der Lehrkraft berlassen ob die Sch ler Zugang zu den gemeinsam genutzten Pufferl sungen und Materialien haben oder ob die Lehrkraft die L sungen aliquotiert und die Ger te selbst bedient 2 Stunde Verdau der DNA Proben mit Restriktionsenzymen Sch lerarbeitspl tze Anzahl Arbeitsplatz Agarosegel Elektrophorese System Elektrophorese Kammer GelgieBstand 8 Well Kamm 1 EcoRVPstl Enzym Mix 1 Reaktionsgef 80 ul LI Pipettenspitzen 2 200 pl 15 Spitzen LI Mikropipette 2 20 pl 1 LI Farbcodierte ReaktionsgefaBe griin blau orange violett rot gelb 1 Filzschreiber 1 Abfallbeh lter 1 ReaktionsgefaBstander aus Styropor 1 LI Kiibel mit Eis 1 Laborklebeband nicht Marke Scotch 3M oder ein hnliches Band 1 Arbeitsplatz Lehrkraft DNA vom Tatort mit Puffer rehydriert 1 Fl schchen DNA vom Tatverd chtigen Nr 1 mit Puffer rehydriert 1 Flaschchen LI DNA vom Tatverd chtigen Nr 2 mi
32. chiedener Ecken markiert sind dass sich die Gele der verschiedenen Sch lergruppen unterscheiden lassen 4 Unterrichtsstunde Trocknen der Gele und Analyse der DNA Muster Unterrichtsvorbereitung Ziel Vorbereitung der Arbeitspl tze Ben tigte Zeit 10 Minuten Verfahren F r diese Laborstunde m ssen keine Reagenzien hergestellt oder aliquotiert werden Um einen permanenten Beleg des Gels vor dem Trocknen zu erhalten fertigen Sie entweder eine Skizze des Gels einschlie lich der Probentaschen und DNA Banden an fotografieren Sie das Gel wobei Sie Standardkameras und Filme benutzen Bio Rads Standard Polaroid Gel Dokumentationssystem oder fotokopieren Sie das gef rbte Gel Trocknen des Agarosegels als permanenten Beleg des Experiments Hinweis Das Trocknen der Agarosegele setzt voraus da f r die Elektrophorese die spezielle High Strength Analytical Grade Agarose von Bio Rad verwendet wurde Andere Gelmedien eignen sich u U nicht f r diesen Zweck Zum Trocknen von Agarosegelen gibt es zwei Methoden Methode 1 Methode 1 wird bevorzugt und erfordert den Gel Support Film Katalog Nummer 170 2984 EDU der nur von Bio Rad erh ltlich ist Nehmen Sie einfach das entf rbte Gel aus der F rbeschale und schneiden Sie nicht benutzte Bahnen mit einem Messer oder einer Rasierklinge ab Legen Sie das Gel direkt auf die hydrophile Seite eines Gel Support Films Das Wasser bildet Tropfen auf der hydrophoben Seite aber auf der hydrophil
33. chlagen Sie die Reaktionsgef e wie ein Thermometer nach unten aus einmal reicht Indem man die Gef e leicht auf die Laborbank klopft wird der Inhalt auch kombiniert und gemischt 171777 V2 4 V5 schnipsen oder 1x ausschlagen 6 Inkubation der Proben Setzen Sie die Reaktionsgef e in einen schwimmenden Reaktionsgef st nder und inkubieren Sie die Proben 45 Minuten bei 37 C Alternativ k nnen die Proben auch in einem gro en Volumen 37 C warmen Wassers ber Nacht inkubiert werden das Wasser k hlt hierbei langsam auf Raumtemperatur ab Nach der Inkubation werden die Proben bis zur n chsten Laborstunde im K hlschrank aufbewahrt Wasserbad Hinweis W hrend Sie warten haben Sie genug Zeit ein Agarosegel zu gie en es sei denn sie wurden f r Sie schon vorbereitet Fragen Sie Ihren Lehrer 30 2 Stunde Verdau der DNA Proben mit Restriktionsenzymen Abschlu fragen 1 Beschreiben Sie alle sichtbaren Ver nderungen des Inhalts der DNA Proben nachdem diese mit den Restriktionsenzymen versetzt aber noch nicht inkubiert worden sind 2 K nnen Sie irgendwelche Anzeichen daf r erkennen da die DNA Proben durch die Zugabe von EcoRI PstI fragmentiert oder sonstwie ver ndert wurden Erkl ren Sie Ihre Antwort 3 Ist es m glich da die DNA Proben fragmentiert wurden obwohl es keine erkennbaren Anzeichen daf r gibt Begr nden Sie Ihre Antwort 4 Am n chsten Tag zu beantwort
34. dizinischen und forensischen Anwendungen als auch in Vaterschaftstests um die genetischen Beziehungen zwischen Individuen auf molekularer Ebene darzustellen Dieser Kit erm glicht es den Sch lern in die Rolle eines forensischen Wissenschaftlers zu schl pfen und einen positiven ID durchzuf hren Ganz konkret bedeutet das die Sch ler simulieren einen Fall wobei sie echte DNA als Beweis einsetzen und selbst herausfinden wer der T ter war Im Rahmen dieses Versuchs analysieren die Sch ler sechs verschiedene Plasmid DNA Proben Eine dieser Proben von einem hypothetischen Tatort eines Verbrechens und f nf Proben von Verd chtigen werden mit zwei Restriktionsenzymen verdaut Die dabei entstandenen DNA Fragmente werden mit einem Agarosegel aufgetrennt und mit der Bio Rad Fast Blast DNA F rbel sung sichtbar gemacht Nach Analyse der Muster der Restriktionsverdaus vergleichen die Sch ler die Beweise und ordnen dann die DNA eines Verd chtigen der am Tatort gefundenen DNA Probe zu Als Alternative zur klassischen Anwendung dieses Kits im Rahmen der Gerichtsmedizin K nnen sich die Sch ler vorstellen sie w ren High Tech Pathologen die das Ausbrechen einer zum ersten Mal aufgetretenen gef hrlichen Infektionskrankheit untersuchen Das Zentrum zur Kontrolle und Prevention von Krankheiten vermutet da ein neuer Bakterienstamm aufgetreten ist der nicht nur eine neue Krankheit verursacht sondern auch verschiedene Resistenzplasmide vo
35. dschuhe Schutzbrille und einen Laborkittel Kochend hei e geschmolzene Agarose oder Beh lter die hei e Agarose enthalten k nnen bei Kontakt mit der Haut zu schweren Verbrennungen f hren Methode mit dem Mikrowellenherd Diese Technik ist die schnellste und sicherste um die Agarose zum Schmelzen zu bringen Stellen Sie die Gell sung in einer geeigneten Flasche oder in einem Kolben in die Mikrowelle LOCKERN SIE DEN DECKEL FALLS SIE EINE FLASCHE BENUTZEN W hlen Sie eine mittlere Einstellung und stellen sie auf 3 Minuten Stoppen Sie den Mikrowellenherd alle 30 Sekunden und schwenken Sie die Flasche um noch nicht gel ste Agarose zu suspendieren Kochen und schwenken Sie die Agarose solange bis alle kleinen durchsichtigen Agaroseteilchen gel st sind Stellen Sie die L sung zur Seite und lassen Sie sie auf 55 60 C abk hlen ehe Sie sie verwenden Geeignete vorgegossene Agarosegele 166 3057EDU sind bei Bio Rad erh ltlich Dies sind 1x TAE Gele mit 8 Taschen 2 St ck und passen in die Bio Rad Mini Sub Cell GT Kammer oder in jede andere horizontale Gel Elektrophorese Kammer f r 7x10 cm gro e Gele 12 Methode mit der Magnetr hrerheizplatte Geben Sie einen R hrfisch zur noch nicht gel sten Agarosemischung Heizen Sie die Mischung unter R hren des Magnetr hrers bis zum Sieden auf Blasen und Schaum sollten platzen bevor sie bis zum Kolbenhals aufsteigen Kochen Sie die Mischung bis alle kleinen durchsichtigen Agarosepar
36. e mehr Variationen aufweisen als andere Einige Populationen zeigen viel weniger Variabilit t bei bestimmten DNA Abschnitten als andere Der Grad der Variabilit t bestimmt die statistische Wahrscheinlichkeit da mehr als ein Individuum dieselbe DNA Sequenz aufweist Weisen 90 der Individuen einer gegebenen Population bei einem bestimmten DNA Abschnitt dasselbe Muster des DNA Fingerprintings auf so kann nur wenig an Informationen gewonnen werden Ist aber die Wahrscheinlichkeit da in einer gegebenen Population f r einen gegebenen DNA Abschnitt ein bestimmtes DNA Bandenmuster auftritt u erst gering so kann dieser Abschnitt als sehr aussagekr ftiges Hilfsmittel dazu dienen die Individuen dieser Population zu unterscheiden Unterschiedliche Populationen weisen unterschiedliche Muster in ihren Genotypen auf die auf die im Laufe der Zeit erfolgten Einfl sse auf den Genpool zur ckzuf hren sind Bei der Analyse wie schwer die Beweislast eines bestimmten DNA Bandenmusters wiegt mu daher folgende Frage gestellt werden Wie viele Individuen einer Population k nnten statistisch gesehen dasselbe DNA Bandenmuster wie das der am Tatort gefundenen Probe aufweisen 1 von 1 000 000 1 von 10 000 oder 1 von 10 Literaturhinweise 1 DNA Profiling Fast Becoming Acceptied Tool For Identification Pamela Zurer Chemical and Engineering News 10 Okt 1994 2 PCR steht fiir Polymerase Chain Reaction dies ist eine Methode mit der kleine Men
37. el als einen dauerhaften Beleg Ihres Experimentes i Schneiden Sie alle leeren Bahnen des Gels mit einem Messer oder mit einer Rasierklinge ab Schneiden Sie die unbenutzten Spuren in Ihrem Gel von oben bis unten ab so dass nur die Spuren 1 4 brig bleiben ii Legen Sie das Gel auf die hydrophile Seite des Gel Support Films Auf der hydrophoben Seite des Gel Support Films bilden sich Wassertropfen Legen Sie das Gel in die Mitte des Films und entfernen Sie Luftblasen die sich zwischen Gel und Film gebildet haben Legen Sie den Film auf ein Papiertuch und lassen Sie das Gel an einer gut bel fteten Stelle trocknen Vermeiden Sie direkte Lichteinwirkung W hrend des Trocknens bindet sich das Gel an den Film schrumpft aber nicht Der Trocknungsvorgang ist nach 2 3 Tagen bei Raumtemperatur abgeschlossen Das Ergebnis ist ein transparenter und dauerhafter Beleg ber das Experiment Gel support film Zur Beachtung Sch tzen Sie die getrockneten Gele vor direktem Licht um ein Ausbleichen der Banden zu vermeiden Die ausgeblichenen Banden erscheinen jedoch wieder wenn man die getrockneten Gele 2 3 Wochen im Dunklen lagert 42 4 Unterrichtsstunde Analyse der Ergebnisse Wenn Sie das ber Nacht Protokoll zum F rben Ihrer Gele verwendet haben zeichnen Sie Ihre Ergebnisse auf und trocknen sie die Gele wie es in den Gelf rbe Anleitungen zur 3 Unterrichtsstunde auf Seite 42 beschrieben wurde F gen Sie unten das Kunststoffblatt
38. elf rbeschale 1x TAE Elektrophoresepuffer Arbeitsplatz der Lehrkraft Mikrozentrifuge oder Minizentrifuge optional Sch ttler Anzahl Arbeitsplatz bet Ch ke 120 ml pro 2 Arbeitsplatze 1 3 pro 2 Arbeitsplatze 1 1 1 pro 2 Arbeitspl tze 275 ml Gel Kammer nachdem ob die Schnellf rbung oder die ber Nacht F rbung verwendet wird 33 mE mE nininini nE nE nining nininini niey 3 Stunde Labor Elektrophorese der DNA Proben 1 Holen Sie sich ein bereits gegossenes Agarosegel von Ihrer Lehrkraft oder gieBen Sie auf Anweisung Ihrer Lehrkraft Ihr eigenes Gel 2 Nehmen Sie anschlie end die verdauten DNA Proben aus dem K hlschrank Pipettieren Sie in jedes Reaktionsgef 5 ul der Frontmarkerl sung wobei Sie f r jede Probe eine frische Pipettenspitze verwenden DNA Proben Frontmarker Tatort TO 5 ul Tatverd chtiger Nr 1 V1 5 ul Tatverd chtiger Nr 2 V2 5 wl Tatverd chtiger Nr 3 V3 5 ul Tatverd chtiger Nr A V4 5 ul Tatverd chtiger Nr 5 V5 5 wl Frontmarkerl sung if 8 TO 2 V4 V5 schnipsen oder 1x ausschlagen Schlie en Sie bei allen Reaktionsgef en den Deckel Mischen Sie die Komponenten indem Sie leicht mit dem Finger gegen das Reaktionsgef schnipsen Ist eine Mikrozentrifuge verf gbar kann durch kurzes Zentrifugieren alle Fl ssigkeit am Boden der Reaktionsgef e gesammelt werden Andernfalls klo
39. emder DNA aus beliebiger Quelle verbunden werden die mit dem gleichen Enzym geschnitten wurde Die daraus entstandene Hybrid DNA kann dann in Bakterienzellen transformiert werden Die Hybrid Plasmide k nnen sich selbst wie vorher in Bakterienzellen vermehren mit der Ausnahme da fremde DNA mit angeh ngt wurde die nun mit vermehrt wird Jedes Hybrid Plasmid enth lt nun eine vollst ndige Kopie des St ckes fremder DNA das eingesetzt wurde Man sagt das fremde DNA St ck wurde geklont und die Plasmid DNA mit der sie verbunden ist hei t Vektor Die DNA Proben vom Tatort und von den Verd chtigen die in diesem Kit enthalten sind entstanden indem DNA des Bakteriophagen Lambda die PstI verdaut wurde mit dem PstI verdauten Plasmid Vektor pTZ18U verbunden wurde Es wurden die rekombinanten Plasmide ausgew hlt die ein speziell zutreffendes Bandenmuster aufweisen oder RFLPs Restriktions L ngen Polymorphismus nach dem Verdau mit den Restriktionsenzymen PstI und EcoRI und der Analyse mittels Agarosegelen Komplette Restriktionskarten von jedem Plasmid des Tatorts oder der Verd chtigen der Vektor pTZ18U und der Spender Phage Lambda sind angef gt zur weiteren Diskussion und Untersuchung im Klassenzimmer Versuchen Sie Folgendes Geben Sie die Zahl an Basenpaaren in den S4 und S5 Plasmiden an basierend auf den Ergebnissen Ihrer Gele Wie lassen sich diese Gr en vergleichen mit der Anzahl an Basenpaaren die in den Plasmidkarten von S4 und S
40. en Gibt es nach der 24 st ndigen Inkubation irgendwelche Anzeichen daf r da die Restriktionsenzyme die DNA in einem der Reaktionsgef e ver ndert haben k nnten Begr nden Sie Ihre Antwort 31 3 Stunde Elektrophorese und Anfarben der DNA Proben Vor berlegung 3 Wie lassen sich die Positionen der EcoRI und PstI Restriktionsschnittstellen auf den DNA Proben feststellen Da wir versuchen Anderungen auf der molekularen Ebene festzustellen und es keine sichtbaren Anzeichen gibt die wir analysieren k nnten scheint diese Aufgabe unsere F higkeiten zu bersteigen und nicht l sbar zu sein Lassen Sie es uns aber dennoch versuchen Eine M glichkeit die Lage der Restriktionsstellen zu bestimmen k nnte in der Beantwortung folgender Fragen liegen 1 Wie viele verschiedene Gr en von DNA Fragmenten gibt es in jeder Probe 2 Wie gro ist jedes Fragment relativ gesehen Es mu daher versucht werden eine Antwort auf folgenden Frage zu bekommen Liegen die Restriktionsschnittstellen von EcoRI und PstI bei irgendwelchen DNA Proben an den gleichen Stellen Die folgende Informationen helfen den tats chlichen Gr enbereich der DNA Fragmente Ihrer Proben zu bestimmen Analyse der Spaltungen mit Restriktionsenzymen Die dreidimensionale Struktur der Restriktionsenzyme erlaubt es ihnen sich an eine doppelstr ngiges DNA Molek l zu binden und an der Helix entlang zu gleiten bis sie eine spezifische Basenpaarsequenz erkenne
41. en werden aber nicht eingefroren werden Die rehydrierten Enzyme sollten innerhalb von 12 Stunden verbraucht werden 3 Aliquotieren der Enzymmischung Pipettieren Sie 80 ul der rehydrierten Enzymmischung in jedes der acht 1 5 ml Reaktionsgef e die mit ENZ markiert wurden 4 Vorbereiten von Agarosegelen Die f r diesen Versuch empfohlene Gelkonzentration betr gt 1 Agarose Mit dieser Agarosekonzentration wird f r die elektrophoretische Trennung der DNA Fragmente eine ausgezeichnete Aufl sung und eine minimale Laufzeit erreicht F r ein leichtes Auftragen der Probe sowie eine leichte Handhabung des Gels wird eine Geldicke von 0 75 1 0 cm empfohlen Die Agarose mu mit Elektrophoresepuffer und darf nicht mit Wasser angesetzt werden Zubereitung des Elektrophoresepuffers Der Elektrophoresepuffer Tris Acetat EDTA ist als 50x konzentrierte L sung erh ltlich Au er dem 1x Puffer zur Herstellung der Agarosegele werden 275 ml f r jede Elektrophoresekammer ben tigt Drei Liter des 1x TAE Puffers reichen aus um 8 Elektrophoresekammern zu fiillen und 8 Agarosegele zu gie en Zur Herstellung von 3 Litern 1x aus einem 50x Konzentrat f gen Sie 60 ml des 50x Konzentrates zu 2 94 Litern destilliertem Wasser b Vorbereiten der Agarose Diese Arbeitsschritte k nnen 1 bis 2 Tage vor dem Versuch von der Lehrkraft oder w hrend des Unterrichts von einzelnen Sch lerteams durchgef hrt werden 1 Zur H
42. en Seite des Films wird es sich flach ausbreiten Zentrieren Sie das Gel auf dem Film Legen Sie den Film auf ein St ck Papiertuch und lassen Sie ihn trocknen wobei Sie direktes Sonnenlicht vermeiden W hrend das Gel trocknet verbindet es sich mit dem Film und schrumpft daher nicht L t man das Gel ruhig auf dem Tr gerfilm liegen trocknet es bei Raumtemperatur innerhalb von 2 3 Tagen aus Sie erhalten so einen flachen transparenten und haltbaren Nachweis des Experiments Gel Support Film Methode 2 Nachdem Sie das Gel gef rbt und entf rbt haben lassen Sie es einfach in der Plastikf rbeschale liegen Lassen Sie es an der Luft 2 3 Tage lang trocknen Beim Trocknen schrumpft das Gel betr chtlich aber proportional Sofern das Gel in der Schale nicht bewegt wird sollte es relativ flach bleiben jedoch werden sich Falten bilden Hinweis Vermeiden Sie es das Gel l ngere Zeit direktem Licht auszusetzen da sonst die Banden verblassen Graphische Darstellung der Daten Viele Ihrer Sch ler sind wahrscheinlich nicht mit Logarithmen und halblogarithmischem Zeichenpapier vertraut Wir schlagen deshalb einen kurzen Vortrag mit Hilfe eines Overhead Projektors oder eines Computers vor um Ihren Sch lern zu zeigen wie die Achsen beschriftet und die Datenpunkte eingetragen werden Sie k nnen an dieser Stelle auch auf die unterschiedliche Anwendung von halblogarithmischem und Standardmillimeterpapier eingehen Weiterhin k nnten Sie diese Ge
43. en Seiten des Geltr gers ab Schritt 9 Sie haben zwei Auswahlm glichkeiten Option 1 Wenn Sie nicht genug Zeit haben mit der 2 Unterrichtsstunde fortzufahren lagern Sie die Gele in einer verschlie baren Plastikt te 1 Tag bei Raumtemperatur oder im K hlschrank bis zu einer Woche lang bis zum weiteren Gebrauch Die Sch ler sollen ihre Plastikt ten beschriften Option 2 Haben Sie genug Zeit mit der 2 Unterrichtsstunde fortzufahren setzen Sie den Geltr ger so auf die nivellierte DNA Elektrophoresezelle da die Probentaschen sich am Kathodenende des Sockels schwarz befinden Die DNA Proben wandern w hrend der Elektrophorese zum Anodenende des Sockels rot Verdau mit dem Restriktionsenzymgemisch Optimale Bedingungen f r den Verdau sind 45 Minuten Inkubation bei 37 C Steht kein 37 C Heizblock Wasserbad oder Inkubator zur Verf gung stellen Sie die Proben zum Verdau in Styroporst nder die von einem gro en Volumen 1 Liter oder mehr 37 C warmen Wassers umsp lt werden Lassen Sie die Proben ber Nacht inkubieren wobei das Wasser auf Raumtemperatur abk hlt Verwendung von Mikropipetten optional Wir empfehlen dass Sie Ihre Sch ler vor der 1 Unterrichtsstunde mit korrekten Pipettierungstechniken vertraut machen Ihre Schiiler sollen lernen wie sie verschiedene Volumina einer L sung von einem in ein anderes R hrchen mit einer Mikropipette berf hren Die Sch ler k nnen dies ben in dem sie entweder die Farb
44. er bestehende Unterschiede bei der linearen Basensequenz verhelfen kann Nachdem diese drei Punkte gekl rt sind k nnen Sie jetzt mit dem ersten Schritt der DNA Fingerprinttechnik beginnen n mlich der Durchf hrung eines Verdaus der DNA Proben mit Restriktionsenzymen Checkliste f r den Arbeitsplatz Vergewissern Sie sich da alle unten angef hrten Materialen vor Versuchsbeginn am Arbeitsplatz vorhanden sind Sch lerarbeitspl tze 8 Anzahl 4 Agarosegel Elektrophorese System Elektrophorese Kammer Gelgie stand 8 Well Kamm 1 LI EcoRVPstl Enzym Mix 1 Reaktionsgef 80 ul LI Pipettenspitzen 2 200 pl 15 Spitzen LI Mikropipette 2 20 ul 1 LI Farbcodierte ReaktionsgefaBe griin blau orange violett rot gelb 1 Filzschreiber 1 Abfallbeh lter 1 Reaktionsgef st nder aus Styropor 1 LI Laborklebeband nicht Marke Scotch 3M oder ein hnliches Band 1 Arbeitsplatz Lehrkraft DNA vom Tatort mit Puffer rehydriert 1 Fl schchen DNA vom Tatverd chtigen Nr 1 mit Puffer rehydriert 1 Fl schchen DNA vom Tatverd chtigen Nr 2 mit Puffer rehydriert 1 Flaschchen LI DNA vom Tatverd chtigen Nr 3 mit Puffer rehydriert 1 Flaschchen LI DNA vom Tatverd chtigen Nr A mit Puffer rehydriert 1 Fl schchen LI DNA vom Tatverd chtigen Nr 5 mit Puffer rehydriert 1 Flaschchen LI Geschmolzene 1 ige Agarose 1x TAE siehe Unterrichtsvorbereitung 40 50 ml Gel m Brutschrank oder Wasserbad 3
45. er vor wenn Sie es nicht schon vorbereitet haben Tauchen Sie das Gel etwas 2mm unter den 1x TAE Puffer d Bereiten Sie die Proben zum Auftragen auf das Gel vor Siehe Laborprotokoll im Sch lerhandbuch Achtung Der Energiebedarf kann je nach Geldicke Laufzeit Konzentration und Art des Elektrophoresepuffers variieren F r diesen Versuch betr gt die empfohlene Laufzeit 30 Minuten bei einer Spannung von 100 V konstant 4 Vorbereiten der Fast Blast DNA Farbel sung A Zur Herstellung der 100x F rbel sung zum schnellen F rben Verd nnen Sie in einem Kolben von geeigneter Gr e 100 ml der 500x DNA F rbel sung mit 400 ml destilliertem Wasser Verschlie en Sie den Kolben und halten Sie ihn bis zum Gebrauch bei Raumtemperatur B Zur Herstellung der 1x F rbel sung F rbung ber Nacht Verd nnen Sie in einem Kolben von geeigneter Gr e 1 ml der 500x DNA F rbel sung mit 499 ml destilliertem Wasser Verschlie en Sie den Kolben und halten Sie ihn bis zum Gebrauch bei Raumtemperatur DNA F rbeverfahren Fast Blast DNA F rbung Die Fast Blast DNA F rbung ist eine praktische sichere und ungiftige Alternative zur F rbung mit Ethidiumbromid Die F rbel sung besteht aus einem kationischen Farbstoff aus der Familie der Thiazine Die positiv geladenen Farbstoffmolek le haben eine sehr hohe Affinit t zu den negativ geladenen Phosphatgruppen der DNA Molek le So entsteht eine feste Bindung bei der die DNA durch eine
46. erstellung einer 1 L sung werden 1g Agarose in 100 ml 1x TAE Elektrophoresepuffer gel st Die Agarose mu mit Elektrophoresepuffer und darf nicht mit Wasser angesetzt werden Falls die Elektrophoresekammern nicht ausreichen k nnen Sie eine 7 x 10 cm Schale und zwei K mme mit 8 Taschen benutzen um ein Gel zu gie en das f r zwei Ans tze des von den Studenten durchgef hrten Verdaus ausreicht Nehmen Sie die folgende Tabelle als Anhaltspunkt f r die Volumina die zum Gie en von einem oder mehreren 1 igen Agarose Gelen ben tigt werden Anzahl der Gele 7 7 cm Geltr ger 7x 10 cm Geltr ger 1 40 ml 50 ml 2 80 ml 100 ml 4 160 ml 200 ml 8 320 ml 400 ml ii Geben Sie das Agarosepulver in einen geeigneten Beh lter z B einen 500 ml Erlenmeyerkolben f r 200 ml oder weniger Geben Sie die richtige Menge an 1x TAE Elektrophoresepuffer hinzu und schwenken Sie den Kolben um das Agarosepulver im Puffer aufzul sen Falls Sie einen Erlenmeyerkolben verwenden st lpen Sie ein 25 ml Erlenmeyerk lbchen kopf ber ber den Hals des die Agarose enthaltenden Kolbens Das K lbchen wirkt als R ckflu kammer und erlaubt so ein langes bzw heftiges Kochen ohne allzu gro e Verluste durch Verdunsten Die Agarose kann zum Gie en der Gele durch Kochen auf einer Magnetr hrerheizplatte in einem hei en Wasserbad oder in einem Mikrowellenherd geschmolzen werden Vorsicht Tragen Sie beim Zubereiten und Gie en der Agarosegele immer Schutzhan
47. es w re ein Fingerprinting Gel wie viele DNA Proben erwarten Sie in jeder separaten Bahn Eine Was w re eine logische Erkl rung daf r da f r alle DNA Proben mehr als eine Bande zu sehen ist Die DNA ist wahrscheinlich durch Restriktionsenzyme fragmentiert worden Wodurch entstanden die DNA Fragmente Die chemische Reaktion von Restriktionsenzymen die die DNA an spezifischen Basensequenzen geschnitten hat Welche DNA Proben hatten f r die verwendeten Restriktionsendonukleasen die gleiche Anzahl an Schnittstellen Schreiben Sie die Nummern der entsprechenden Bahnen auf Die Bahnen 2 3 und 4 TO V1 und V2 Welche Probe weist das kleinste DNA Fragment auf Die Probe in Bahn 5 V3 Geht man von einer ringf rmigen DNA aus Plasmid die als Startmaterial eingesetzt wurde wie viele Restriktionsschnittstellen hatte dann Bahn 3 Zwei Restriktionsschnittstellen aufgrund deren die Proben in zwei Fragmente geschnitten wurden Welche DNA Proben wurden anscheinend in Fragmente von gleicher Anzahl und Gr e geschnitten DNA der Bahnen 2 und 4 TO und V2 Welche Schlu folgerungen bez glich der DNA Proben in der Abbildung ziehen Sie auf Grund Ihrer Gelanalyse Stammen irgendwelche Proben anscheinend aus der gleichen Quelle Wenn ja welche Erl utern Sie Ihre Schlu folgerung Die DNA in den Bahnen 2 und 4 TO und V2 stammen von ein und demselben Individuum da sie identische Restriktionsschnittstellen besitzt die zu
48. folgenden Seite beginnen 9 Ist die Elektrophorese beendet schalten Sie das Netzger t ab und entfernen den Deckel von der Elektrophoresekammer Nehmen Sie vorsichtig den Geltr ger mit dem Gel aus der Elektrophoresekammer heraus Vorsicht das Gel ist sehr glitschig 10 Bitte gehen Sie auf Seite 39 Dort finden Sie die genaue Anleitung zur F rbung Ihrer Gele 35 3 Stunde Elektrophorese der DNA Proben Abschlu fragen 1 Das Elektrophoreseger t erzeugt ein elektrisches Feld mit positiven und negativen Polen an den Enden des Gels DNA Molek le sind negativ geladen Zu welchem Pol des elektrischen Feldes wird die DNA Ihrer Meinung nach wandern oder Erkl ren Sie Ihre Antwort Welche Farbe steht f r den negativen Pol Nachdem die DNA Proben in die Starttaschen geladen wurden werden sie gezwungen durch die Gelmatrix zu wandern Welche Fragmente wandern am schnellsten zum anderen Ende des Gels gro e oder kleine Begr nden Sie Ihre Antwort Welche Fragmente wandern die k rzeste Strecke von den Geltaschen aus gesehen Begr nden Sie Ihre Meinung 36 4 Stunde Labor Anf rbung der DNA mit Fast Blast DNA Farbung Vor berlegung 4 Sind irgendwelche DNA Proben der Tatverd chtigen identisch mit der am Tatort sichergestellten DNA Probe Nehmen Sie sich einen Moment Zeit dar ber nachzudenken wie Sie Ihr Gel analysieren werden In den beiden letzten Schritten werden Sie A Die DNA Fragmente in Ihrem Ge
49. g der Gele ber Nacht Lassen Sie die Gele vom Geltr ger in die F rbeschale gleiten Gie en Sie 120 ml der 1x F rbel sung in die F rbeschale Wenn n tig geben Sie mehr F rbemittel hinzu bis das Gel komplett bedeckt ist Stellen Sie die F rbeschale auf einen Sch ttler und bewegen das Gel ber Nacht Wenn kein Sch ttler vorhanden ist bewegen Sie das Gel einige Male zu Beginn der F rbung Nach 2 Stunden sollte man die ersten Banden sehen Wir empfehlen eine F rbung von 8 Stunden F rbung ber Nacht Es ist u erst wichtig dass Sie die Gele w hrend der ber Nacht F rbung mit dem 1x Fast Blast Farbstoff sanft und periodisch hin und her schwenken lassen da kleinere Fragmente sonst dazu neigen zu diffundieren 41 3 Aufzeichnen der Ergebnisse Nach der F rbung mit 1x Fast Blast ist eine Entf rbung ist nicht notwendig Die Gele k nnen sofort nach der F rbung analysiert werden a Legen Sie das Gel auf einen hellen Hintergrund und zeichnen Sie Ihre Ergebnisse in einem Diagramm wie folgt auf Legen Sie ein durchsichtiges Blatt aus Kunststoff oder Acetat ber das Gel Mit einem Permanentmarker zeichnen Sie die Wells und Bandenmuster auf das Kunststoffblatt um eine Kopie Ihres Gels zu bekommen Entfernen Sie das Kunststoffblatt f r eine sp tere Analyse Alternativ k nnen Gele auch auf einem gelben St ck f r einen optimalen Kontrast eines transparenten Films fotokopiert werden b Trocknen Sie das Agaroseg
50. gen DNA amplifiziert vermehrt werden k nnen in diesem Fall um weitere Analysen an der DNA durchf hren zu 3 RFLP steht f r Restriktion Fragment Length Polymorphism riff lips im Biotech Jargon DNA Abschnitte werden mit Restriktionsenzymen in unterschiedlich lange Fragmente gespalten Verschiedene Individuen besitzen unterschiedliche Erkennungsstellen so da zwei DNA Abschnitte aus unterschiedlichen Quellen unterschiedlich lange Fragmente ergeben k nnen wenn ihre DNA von demselben Enzym geschnitten wird 4 Eine ausgezeichnete Quelle f r die Lehrkraft ist Genetic Fingerprinting Pauline Lowrie and Susan Wells New Scientist 16 Nov 1991 5 Is DNA Fingerprinting ready for use in courts William Thompson and Simon Ford New Scientist 31 Marz 1990 6 When Science Takes the Witness Stand Peter Neufeld and Nevelle Coleman Scientific American Vol 262 5 Mai 1990 Zeitplan f r die Durchf hrung Zu diesem Fingerprinting Lehrplan geh ren vier Unterrichtsstunden Alle Unterrichtspl ne sind so angelegt da sie innerhalb von je 50 Minuten durchgef hrt werden k nnen Alle Unterrichtspl ne beinhalten Eine Reihe von berlegungen die die Sch ler vor der Durchf hrung des eigentlichen Experiments anstellen sollten Eine von den Sch lern aktiv durchzuf hrende Untersuchung Fragen zur Auswertung und Interpretation der Ergebnisse Unterrichtsplan f r die Sch ler 1 Stunde Einf hrung zum
51. gendeinem Tatverd chtigen EcoRI oder PstI Erkennungsstellen an derselben Stelle auf dem Molek l wie die DNA vom Tatort Die Proben in den Bahnen 2 und 5 haben ein identisches Bandenmuster TO und V3 7 Sieht es aufgrund der obigen DNA Sequenzanalyse so aus als stamme die DNA von einem der Tatverd chtigen und die vom Tatort vom gleichen Individuum Beschreiben Sie die wissenschaftliche Unterlage auf die sich Ihre Schlu folgerung st tzt Die Proben TO und V3 scheinen identisch zu sein Beide ergeben auf dem Gel hnliche Bandenmuster 68 Vorbereitung auf die 1 Laborstunde von Anhang Betrachten Sie die linearen Basensequenzen As Ts usw auf beiden Str ngen Beschreiben Sie alle Muster die Sie in der oberen Basensequenz erkennen In der obigen Basensequenz ist kein spezifisches Muster erkennbar Vergleichen Sie die Basen im oberen Teil des Molek l mit denen im unteren Teil Beschreiben Sie alle Beziehungen die Sie erkennen k nnen A ist immer mit T gepaart G immer mit C Betrachten Sie die obere Basensequenz und vergleichen Sie sie mit der unteren Erkennen Sie eine Gruppierung von Basen bei der beim Lesen nach rechts bzw nach links die Basen in derselben Reihenfolge erscheinen CTTAAG Ein Restriktiosenzym hat die DNA in einem GAATTC Palindrom zwischen dem G und dem A geschnitten Wie viele Basenpaare befinden sich links vom Schnitt 4 Wie viele Basenpaare befinden sich rechts vom Schnitt
52. h ler und Lehrerarbeitspl tze Zeitaufwand 45 Minuten Erforderlich Stamml sung DNA Gr enmarker Lambda Hindlll Verdau Stamml sung DNA Frontmarker Elektrophoresekammer Gei st nde und K mme Elektrophoresepuffer 1x TAE Stamml sung Fast Blast DNA F rbel sung 500x Abl ufe 1 Vorbereiten des Lambda HindIII Verdaus DNA Gr enmarker und Aliquotieren optional Geben Sie 20 ul Frontmarker zum R hrchen mit der Stamml sung der HindlIl DNA Gr enmarker Wenn m glich erhitzen Sie den Marker 5 Minuten bei 65 C und k hlen ihn dann auf Eis dies bewirkt eine bessere Trennung der Markerbanden Beschriften Sie 8 farblose Reaktionsgef e mit M Aliquotieren Sie in diese mit beschrifteten Reaktionsgef e je 15 ul der DNA Gr enmarker Frontmarker L sung 2 Aliquotieren des Frontmarkers Beschriften Sie 8 farblose Reaktionsgef e mit FM Aliquotieren Sie je 50 ul Frontmarker in diese 8 markierten Reaktionsgef e Verteilen Sie sie auf die Arbeitspl tze der Sch ler 3 Vorbereitung der Elektrophoresekammer Wenn das Agarosegel fest geworden ist kann man mit dem Auftragen der Probe und der Elektrophorese beginnen a Wenn Sie den Geltr ger in die Elektrophoresekammer setzen stellen Sie sicher dass sich die Probentaschen am schwarzen Kathodenende befinden Die DNA Proben wandern w hrend der Elektrophorese zum roten Anodenende b Bereiten Sie das erforderliche Volumen von 1x TAE Puff
53. h ist sollten Latex oder Vinylhandschuhe w hrend des Arbeitens mit dem Farbstoff getragen werden damit die H nde nicht gef rbt werden Es wird empfohlen Laborkittel oder andere Schutzkleidung zu tragen um zu verhindern dass die Kleidung gef rbt wird Lagerungstemperaturen Der Kit wird in zwei Modulen verpackt und verschickt Bitte ffnen Sie die Module sofort nach Erhalt und lagern Sie die einzelnen Bestandteile bei 20 C 4 C oder bei Raumtemperatur wie angezeigt Zeitplan f r die Durchf hrung Zu diesem Fingerprinting Lehrplan geh ren vier Unterrichtsstunden Alle Unterrichtspl ne sind so angelegt dass sie innerhalb von 50 Minuten durchgef hrt werden k nnen Alle Unterrichtspl ne beinhalten co Eine Reihe von berlegungen die die Sch ler vor der eigentlichen Durchf hrung des Experiments anstellen sollten Eine von den Sch lern aktiv durchzuf hrende Untersuchung co Fragen zur Auswertung und Interpretation der Ergebnisse Unterrichtsstunde 1 Aktivit t Unterrichtsstunde 2 Aktivit t Unterrichtsstunde 3 Aktivit t Unterrichtsstunde 4 Aktivit t Einf hrung in das DNA Fingerprinting Vortrag und Diskussion Vor berlegung zu Experiment 1 und 2 Verdau der DNA Proben mit Restriktionsenzymen Agarosegele gie en DNA Proben verdauen Vollst ndige Voranalyse und Beantwortung der Fragen Elektrophorese der DNA Proben Beladen der Gele und Durchf hrung der Elektrophorese F rben der Ge
54. hnitt Wie viele Basenpaare befinden sich rechts vom Schnitt Z hlt man die Anzahl der Basenpaare ist dann das rechte Fragment genauso gro wie das linke 53 co Wie k nnen Sie die Fragmentgr e Bezug auf die Anzahl der im Fragment enthaltenen Basenpaare beschreiben Eine wichtige Tatsache die man von Restriktionsenzymen wissen mu ist da jedes Enzym nur ein spezifisches Palindrom erkennt und die DNA nur an dieser spezifischen Basensequenz spaltet Ein Palindrom kann auf einem DNA Strang mehrere Male vorkommen und die spezifischen Restriktionsenzyme schneiden alle diese Palindrome an ihrer Restriktionsstelle egal aus welcher Art die DNA stammt co Das GAATTC Palindrom wird viermal auf demselben St ck linearer DNA wiederholt und das Restriktionsenzym das diese Basenpaare erkennt ist vorhanden und verdaut die DNA Wieviele DNA Fragmente werden entstehen co Das GAATTC Palindrom wird in willk rlichen Abst nden entlang des DNA Stranges wiederholt Welche Aussage k nnen Sie dann ber die Gr e der entstehenden Fragmente machen die durch den Verdau mit dem Restriktionsenzym entstehen das diese Sequenz erkennt Die folgende Tabelle zeigt zwei Arten von Palindromen die in einem DNA Strang vorkommen k nnen zusammen mit dem spezifischen Enzym das diese Sequenz erkennt Name des Enzyms das Palindromsequenz auf dem DNA Molek l dieses Palindrom erkennt GAATTC CTTAAG AAGCTT Hindill T
55. identischen Fragmenten f hren 64 Abstand 1 13 0 mm Gr enmarker 23 130 9 416 6 557 4 361 2 322 Abstand 19 20 5 Tatort mm Gr e 3 679 2 860 Abstand 2 3 5 Verd chtiger 1 mm 0 19 5 5 0 2 027 ed Gr e 2 860 1 199 ca Bp N Es Lu N Gr e 3 679 2 860 ca Bp Abstand 2 2 Verd chtiger 4 mm Gr e 2 860 1 093 Abstand 2 2 Verd chtiger 5 mm KKK Gr e 2 860 1 986 ca Bp Dieses Fragment kann schwach erscheinen wenn die Marker nicht auf 65 C erhitzt wurden Der Lambda HindIII Verdau erzeugt auch Banden mit 564 und 125 Bp die normalerweise zu schwach sind um auf dem Gel sichtbar zu sein Die gemessene Wanderungsstrecke dieser Banden variiert in Abh ngigkeit der Dicke der Banden vgl Anhang um zu verstehen warum die Banden in V4 und 5 so intensiv sind Die V4 und V5 DNA Bahnen k nnen auch eine sehr schwache Bande von 500 Bp enthalten 1 1 0 Verd chtiger 2 mm 0 0 5 Verd chtiger 3 mm 9 4 Gr e 2 860 1 700 1 159 ca Bp 65 DNA Standard Laufstrecken der Banden wm FEE 10 800 sa F EN i NE 1 000 Gr e Basenpaare Entfernung mm Zur Absch tzung der Gr e eines Fragments das von der unbekannten DNA am Tatort oder der eines Tatverd chtigen stammt muss zun chst die Wanderungsstrecke dieses spezifischen F
56. ieren kann aber auch f r eine breite Palette anderer Anwendungen genetischer Analysen eingesetzt werden Die Auswahl des tats chlich genutzten Anwendungsgebietes bleibt der Lehrkraft berlassen Siehe alternative Anwendungsgebiete in Anhang A Bei diesem Experiment sollen Sch ler durch eigene Analyse den Entdeckungsproze nachvollziehen k nnen sowie bei jedem einzelnen Schritt die f r die Methode und die Datenanalyse wichtigen Konzepte verstehen lernen Wir hoffen mit diesem Versuch m glichst vielen Sch lern das Verst ndnis zu erleichtern und eine h here Erfolgsquote zu erreichen als wenn die Lehrkraft alle Hintergrundinformationen vermittelt Indem es der Lehrkraft erm glicht wird den Fortschritt und Kenntnisstand der einzelnen Gruppen zu berpr fen k nnen die Sch ler in gewissen Grenzen ihre Lerngeschwindigkeit selbst bestimmen Wir haben festgestellt da dieser Ansatz einer gr eren Anzahl von Sch lern mit unterschiedlichem Kenntnisstand erm glicht die oben beschriebenen Lernziele zu erreichen Sicherheitsfragen Essen Trinken Rauchen und Verwendung von Kosmetika sind in Arbeitsbereich nicht erlaubt Es wird dringend empfohlen Schutzbrillen und Handschuhe zu tragen Die Sch ler sollten ihre H nde vor und nach diesem Versuch mit Seife waschen Falls ein Sch ler irgendeine der L sungen ins Auge bekommt soll das Auge sofort 15 Minuten lang mit Wasser gesp lt werden Obwohl der Fast Blast DNA Farbstoff nicht toxisc
57. ieren und vergleichen Diese Sonde kann als ein radioaktives Etikett beschrieben werden das sich an ein einzelstr ngiges DNA Fragment anlagert und in einem Gel oder auf einem St ck Nylonpapier das das Gel abbildet auch als Southern Blot bekannt als Bande zu erkennen ist Aufgrund ihrer Spezifit t kann eine radioaktive Sonde dazu dienen genotypische Gemeinsamkeiten zwischen Individuen aufzuzeigen Beim DNA Fingerprinting ist die relative Lage der radioaktiv markierten Banden in einem Gel durch die Gr e der DNA Fragmente in den einzelnen Banden festgelegt Die Gr e der Fragmente wiederum h ngt von den Variationen in der DNA einzelner Individuen ab Wir verschaffen einen schnellen berblick ber den Rahmen und die Intention dieses Handbuches Detailliertere Information bietet ein Blick auf die Referenzliste auf Seite 7 Das f r das DNA Fingerprinting ben tigte Beweismaterial kann aus jedem biologischen Material gewonnen werden das DNA enth lt K rpergewebe K rperfl ssigkeit Blut und Samenfl ssigkeit Haarbalg usw Die DNA Analyse kann sogar mit getrocknetem Material wie z B Blutflecken oder mumifiziertem Gewebe durchgef hrt werden Falls nicht gen gend DNA Material vorhanden ist kann es mit Hilfe von PCR Methoden amplifiziert werden Anschlie end wird die DNA mit Restriktionsenzymen behandelt die diese in verschieden lange Fragmente schneiden Verdau der DNA mit Restriktionsenzymen Restriktionsenzyme sind die
58. in den DNA Gef en locker pulvrig erscheint Die lyophilisierten DNA Proben haben farbige Markierungen auf durchsichtigen Glasgef en Die lyophilisierte Mischung der EcoRI PstI Enzyme befindet sich in einem bernsteinfarbenen Gef 1 Rehydrieren der Proben Um die DNA Puffer Proben zu rehydrieren f gen Sie 200 ul steriles Wasser zu jedem Gef mit lyophilisierter DNA und mixen Sie sie um sie in L sung zu bringen Lassen Sie die DNA Puffer Proben 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen oder solange bis sie gel st sind M glicherweise ist ein vorsichtiges Erhitzen auf 37 C f r 10 Minuten erforderlich Um den Sch lern das Pipettieren zu erleichtern k nnen Sie die rehydrierten DNA Puffer Proben in farbige beschriftete 1 5 ml Reaktionsgef e berf hren Die rehydrierten DNA Proben haben nun eine Konzentration von 0 3 ug ul in 100 mM Tris 200 mM NaCl 20 mM MgCl 2 mM DTT pH 8 0 Wird die DNA Pufferl sung zu den Enzymen gebracht entsteht eine Endkonzentration von Puffern aus 50 mM Tris 100 mM NaCl 10 mM MgCl 1 mM DTT pH 8 0 was die optimale Reaktionsbedingung f r die Enzyme EcoRI und PstI darstellt 2 Rehydrieren des lyophilisierten EcoRI PstI Enzym Mixes Um die EcoRI Pstl Enzymmischung zu rehydrieren f gen Sie 750 ul steriles Wasser hinzu und mixen um die Enzyme zu resuspendieren Lassen sie die Enzyme 5 Minuten lang auf Eis rehydrieren Es ist entscheidend da die Enzyme nachdem sie rehydriert wurden auf Eis gehalt
59. innerhalb von 5 15 Minuten sch rfer Das kommt von Fast Blast Molek len die in das Gel wandern und sich fester an die DNA binden Um einen m glichst gro en Kontrast zu bekommen kann es n tig sein zus tzliche Waschschritte mit warmem Wasser durchzuf hren Entf rben Sie bis zum gew nschten Ergebnis aber lassen Sie das Gel nicht ber Nacht im Wasser Wenn Sie die Entf rbung nicht abschlie en k nnen geben Sie das Gel in Fast Blast F rbemittel f r die F rbung ber Nacht Siehe Protokoll a Legen Sie das Gel auf einen hellen Hintergrund und zeichnen Sie Ihre Ergebnisse in einem Diagramm wie folgt auf Legen Sie ein durchsichtiges Blatt aus Kunststoff oder Acetat ber das Gel Mit einem Permanentmarker zeichnen Sie die Wells und Bandenmuster auf das Kunststoffblatt um eine Kopie Ihres Gels zu bekommen Entfernen Sie das Kunststoffblatt f r eine sp tere Analyse Alternativ k nnen Gele auch auf einem gelben St ck f r einen optimalen Kontrast eines transparenten Films fotokopiert werden b Trocknen Sie das Agarosegel als einen dauerhaften Beleg Ihres Experimentes 1 Schneiden Sie alle leeren des Gels mit einem Messer oder mit einer Rasierklinge ab Schneiden Sie die unbenutzten Spuren in Ihrem Gel von oben bis unten ab so dass nur die Spuren 1 4 brig bleiben ii Legen Sie das Gel auf die hydrophile Seite des Gel Support Films Auf der hydro phoben Seite des Gel Support Films bilden sich Wassertropfen
60. it Restriktionsenzymen Beobachtungsfragen 1 Beschreiben Sie physikalische Eigenschaften der DNA Proben Die DNA Proben bestehen aus einer durchsichtigen farblosen Fliissigkeit Sie irgendwelche Unterschiede zwischen den Proben feststellen Nein alle Proben sehen gleich aus Beschreiben Sie das Aussehen der Restriktionsendonukleasemischung Die Restriktionsenzyme erscheinen als durchsichtige farblose Fliissigkeiten 61 2 Stunde Verdau der DNA Proben mit Restriktionsenzymen Abschlu fragen 1 Beschreiben Sie alle sichtbaren Ver nderungen des Inhalts der DNA Proben nachdem diese mit den Reaktionsenzymen versetzt aber noch nicht inkubiert worden sind DNA und EcoRV PstI Enzymmischung In den Reaktionsgef en ist keine Anderung zu erkennen K nnen Sie irgendwelche Anzeichen daf r erkennen da die DNA Proben durch die Zugabe von EcoRI PstI fragmentiert oder sonstwie ver ndert wurden Erkl ren Sie dies Nein in den Reaktionsgef en ist keine nderung zu erkennen Ist es m glich da die DNA Proben fragmentiert wurden obwohl es keine erkennbaren Anzeichen daf r gibt Begr nden Sie Ihre Antwort Ja Die DNA Proben sind m glicherweise chemisch ver ndert aber die nderungen sind nicht erkennbar Die Enzyme haben m glicherweise die DNA hydrolysiert Am n chsten Tag zu beantworten Gibt es nach der 24 st ndigen Inkubation irgendwelche Anzeichen daf r da die Restriktionsen
61. k l schneidet Eine Restriktionsendonuklease schneidet zwei DNA Molek le an der gleichen Stelle Was haben diese beiden Molek le an dieser Stelle demnach gemeinsam Sieht es so aus als h tte die DNA von irgendeinem Tatverd chtigen EcoRI oder PstI Erkennungsstellen an derselben Stelle auf dem Molek l wie die DNA vom Tatort Sieht es aufgrund der obigen Analyse so aus als stamme die DNA von einem der Tatverd chtigen und die vom Tatort vom gleichen Individuum Beschreiben Sie die wissenschaftliche Grundlage auf die sich Ihre Schlu folgerung st tzt 48 Anhang Alternative DNA Fingerprinting Szenarien DNA Typing DNA Profiling und DNA Fingerprinting sind alles Namen fiir ein und dasselbe Verfahren n mlich ein Verfahren bei dem DNA verwendet wird um eine Verwandtschaft oder Identit t von menschlichen tierischen oder pflanzlichen Individuen aufzuzeigen DNA Typing ist zu einem viel diskutierten Thema geworden und hat gro es Interesse geweckt weil in gerichtsmedizinischen Analysen in prominenten Strafprozessen wie dem Fall von O J Simpson davon Gebrauch gemacht worden ist DNA Typing findet jedoch eine viel breitere Anwendung als nur in der Gerichtsmedizin und hat einen tiefgreifenden Einflu auf unsere Gesellschaft DNA Typing wird in der Gerichtsmedizin Anthropologie und in der Biologie im Bereich Naturschutz nicht nur dazu benutzt die Identit t eines Individuums zu bestimmen sondern auch um Verwandtschaftsbe
62. l sichtbar machen B Die Anzahl und Lage der sichtbaren DNA Banden im Gel analysieren Sichtbarmachen der DNA Fragmente Da die DNA farblos ist kann man sie im Gel nicht sofort sehen Ohne weitere Hilfsmittel sind auf den Gelen nur die Positionen der Frontmarker nicht aber die der DNA Fragmente zu erkennen Die DNA Fragmente werden durch Anf rben des Gels mit dem blauen Fast Blast DNA Farbstoff sichtbar gemacht Die blauen Farbstoffmolek le sind positiv geladen und haben eine hohe Affinit t zur DNA Diese blauen Farbstoffmolek le binden sich sehr fest an die DNA Fragmente so dass diese dadurch sichtbar werden Die sichtbaren DNA Fragmente k nnen anschlie end abgepaust fotografiert oder abgezeichnet werden Au erdem k nnen die Gele mit den DNA Fragmenten in getrockneter Form zur Analyse aufgehoben werden Die unten abgebildete Zeichnung ist ein Beispiel eines getrockneten Gels nach der Elektrophorese F r die Fingerprinting Analyse ist es wichtig sich an folgende Tatsachen zu erinnern Jede Bahn enth lt eine andere DNA Probe Jede DNA Probe wurde mit denselben Restriktionsendonukleasen behandelt Analysieren Sie die DNA Banden in der unten abgebildeten Zeichnung eines Geles und beantworten Sie die Fragen auf der folgenden Seite TO V2 V3 Spur 37 4 Stunde Verst ndnisfragen 1 Was ist h chstwahrscheinlich in jeder Bande enthalten Angenommen dies ware ein Fingerprinting Gel wieviele DNA Proben
63. latz v Lineal mit Millimetereinteilung 1 LI Halblogarithmisches Zeichenpapier 1 LI Gel Support Film ggf 1 LI Arbeitsplatz der Lehrkraft Nicht erforderlich nachdem ob die Schnellf rbung oder die ber Nacht F rbung verwendet wird Unterrichtsvorbereitung durch die Lehrkraft In diesem Abschnitt wird beschrieben welche Vorbereitungen die Lehrkraft vor jeder Unterrichtsstunde treffen mu F r jeden Abschnitt wird die gesch tzte Arbeitszeit angegeben 2 Unterrichtsstunde Labor Verdau der DNA Proben mit Restriktions enzymen Unterrichtsvorbereitung Ziele Rehydrieren der DNA Puffer Proben und der Restriktionsenzyme Aliquotieren der Restriktionsenzyme Gie en der Agarosegele Falls die Sch ler ihre eigenen Gele w hrend der Unterrichtsstunde gie en sollen ist ein rechtzeitiges Vorbereiten der Agarose notwendig Nachdem die Agarose vorbereitet ist kann sie in einem Wasserbad von 50 55 C aufbewahrt werden bis die Sch ler sie benutzen Stellen Sie die Temperatur des Wasserbades auf 37 C ein Vorbereiten der Sch ler und Lehrerarbeitspl tze Zeitaufwand Eine halbe bis eine Stunde je nachdem wie Sie die Agarosegele vorbereiten Erforderlich Elektrophoresekammern Geltr ger und Gelk mme Elektrophoresepuffer SOxTAE Agarosepulver 8 farblose Reaktionsgef e 3 Liter Destilliertes Wasser Vorgehensschritte Beachten Sie Alle Gef e mit DNA und Enzymen sollten einen wei en R ckstand enthalten der
64. le Protokollieren der Ergebnisse und Trocknen der Gele wenn das Kurz F rbe Protokoll verwendet wird Vollst ndige Auswertung der Ergebnisse und Beantwortung der Fragen Analyse und Interpretation der Ergebnisse Protokollieren der Ergebnisse und Trocknen der Gele wenn das ber Nacht Protokoll verwendet wird Auswertung der Ergebnisse Fragen zur Durchf hrung der Analyse Generieren einer Standardkurve Diskutieren der Ergebnisse und Abw gen der Beweiskraft Der Lehrplan f r diesen Versuch wurde entwickelt in Zusammenarbeit mit Len Poli und Russ Janigian S F Base Biotechnologieprogramm San Francisco Die oben erw hnten Labort tigkeiten Unterrichtsstunde 2 4 k nnen auch innerhalb eines 3 Stunden Einzelblocks durchgef hrt werden 2 Kit Inhalt Checkliste In diesem Kit enthaltene Komponenten Mengen pro Kit 1 Tatort DNA DNA mit Puffer lyophilisiert 60 ug 1 Flaschchen LI 2 Verd chtiger 1 V1 DNA mit Puffer lyophilisiert 60 ug 1 Flaschchen LI 3 Verd chtiger 2 V2 DNA mit Puffer lyophilisiert 60 ug 1 Flaschchen LI 4 Verd chtiger 3 V3 DNA mit Puffer lyophilisiert 60 ug 1 Flaschchen LI 5 Verd chtiger 4 V4 DNA mit Puffer lyophilisiert 60 ug 1 Flaschchen 6 Verd chtiger 5 V5 DNA mit Puffer lyophilisiert 60 ug 1 Flaschchen LI 7 EcoRI Pstl Restriktionsenzymmischung lyophilisiert 1800 units 1 Flaschchen 8 Steriles Wasser 2 5 ml 1 Fl schchen 9 Lambda HindIII Verdau
65. legenheit nutzen einen mathematischen Exkurs ber lineare und exponentielle arithmetische und geometrische Zahlenreihen anzuf gen Wir haben in diesem Handbuch sowohl halb logarithmisches Zeichenpapier als auch Standardmillimeterpapier abgebildet siehe Seite 46 u 47 18 Kurzanleitung fiir den DNA Fingerprinting Kit 2 Stunde Restriktionsverdau 1 Die ReaktionsgefaBe die den Enzym Mix ENZ und den Restriktions Puffer RB enthalten werden auf Eis gestellt 2 Die bunten Reaktionsgef e werden wie folgt beschriftet grin CS Tatort crime scene blau S1 Verd chtiger 1 orange S2 Verd chtiger 2 violet 53 Verd chtiger 3 rot S4 Verd chtiger 4 gelb 55 Verd chtiger 5 Zus tzlich sollte Name Datum u ggf Kursnummer vermerkt werden 3 Je 10 ul von jeder DNA Probe werden von dem VorratsgefaB das entsprechende bunte Reaktionsgef pipettiert F r jede Probe ist eine neue Pipettenspitze zu verwenden Es sollte berpr ft werden dass die Probe auf den Boden des Reaktionsgef es gelangt ist 4 Je 10 ul Restriktionsenzym Mix ENZ wird in jedes Reaktionsgef zu den DNA Proben pipettiert F r jeden Pipettierschritt eine neue Spitze verwenden 5 Die Reaktionsgef e werden verschlossen und DNA und Enzymgemisch vorsichtig gemischt indem man leicht mit dem Finger gegen das Gef schl gt Wichtig die gesamte Fl ssigkeit muss sich auf dem Gef boden befinden ggf kurz zentrifugiere
66. m 7 Januar 1943 ihrem 18 Geburtstag von ihrem Arbeitgeber vergewaltigt worden war wurde daraufhin schwanger Das Kind wuBte wer sein Vater war aber dieser bestritt die Vaterschaft solange er lebte Nach dem Tod des Mannes wurde mittels DNA Analyse nachgewiesen da sie seine Tochter war und so erbte sie die H lfte seines Nachlasses Child of Rape Wins Award from Estate of Her Father New York Times 10 Juli 1994 Bestimmung des Erfolgs einer Knochenmarktransplantation DNA Fingerprinting kann rzten helfen Knochenmarktransplantationen zu berwachen Leuk mie ist ein Knochenmarkkrebs und das kranke Mark mu deshalb entfernt werden Das Knochenmark ist aber f r die Herstellung neuer Blutzellen notwendig Ohne eine Transplantation von gesundem Knochenmark m te ein Leuk miekranker also sterben Durch DNA Typisierung von Patient und Spender k nnen rzte schnell erkennen ob eine Transplantation erfolgreich war Im Erfolgsfall weist ein DNA Fingerprint vom Blut des Patienten das DNA Muster des Spenders auf Wurde aber das krebsbefallene Knochenmark nicht vollst ndig zerst rt so werden sich die 50 11 12 13 Krebszellen schnell vermehren und die DNA Banden des Patienten werden berwiegen Our Ultimate Identity Card in Sickness and in Health In Inside Science New Scientist 16 Nov 1991 Nachweis der Verwandtschaft zwischen Einwanderern DNA Fingerprinting ist auch als Vaterschaftsnach
67. mente an Noperen Sie alle Abweichungen die Sie entdecken k nnen a Das kleinere Fragment besteht aus Basenpaaren Bp b Wie lang ist das l ngere Fragment 5 Betrachten Sie die beiden unten gezeigten DNA Proben der Einfachheit halber sind nur Einzelstr nge abgebildet Probe Nr 1 CAGTGATCTCGAATTCGCTAGTAACGTT Probe Nr 2 TCATGAATTCCTGGAATCAGCAAATGCA Geben Sie f r den Fall da beide Sequenzen mit einem Restriktionsenzym mit der Erkennungssequenz GAATTC behandelt werden die Anzahl und Gr e der sich ergebenden Fragmente an Probe Nr 1 Probe Nr 2 Anzahl der Fragmente Anzahl der Fragmente Listen Sie die Fragmente der Gr e nach auf das gr te zuerst Probe Nr 1 Probe Nr 2 26 2 Stunde Verdau der DNA Proben mit Restriktionsenzymen Experimenteller Teil Bei sorgf ltiger Analyse wird klar da der einzige Unterschied zwischen der DNA verschiedener Individuen in der linearen Sequenz ihrer Basenpaare besteht Im Labor erh lt Ihr Team 6 DNA Proben Zur Erinnerung die Aufgabe besteht darin herauszufinden ob eine davon vom gleichen Individuum kommt oder ob sie von verschiedenen Individuen stammen Bisher hat die vorl ufige Analyse folgende Erkenntnisse gebracht Die hnlichkeiten und Unterschiede der DNA verschiedener Individuen Wie Restriktionsendonukleasen DNA Molek le schneiden hydrolysieren Wie die Zugabe derselben Restriktionsendonuklease zu zwei verschiedenen DNA Proben zu Erkenntnissen b
68. mit der Aufzeichnung Ihrer Bandenmuster von der DNA Elektrophorese bei Aufzeichnung des Elektrophorese Gels F gen Sie unten das getrocknete Gel bei das die Bandenmuster der DNA Elektrophorese zeigt Getrocknetes Elektrophorese Gel 43 4 Stunde Analyse der DNA Bandenmuster Experimenteller Teil Sch lerarbeitspl tze Anzahl v Lineal mit Millimetereinteilung 1 Zeichenpapier mit linearer Einteilung 1 Zeichenpapier mit halblogarithmischer Einteilung 1 Arbeitsplatz der Lehrkraft Nicht erforderlich Quantitative Analyse der DNA Fragmente Wenn Sie sich vor Gericht verantworten m ten w rden Sie einer bereinstimmung aufgrund der groben Absch tzung eines Laboranten vertrauen oder w rden Sie auf einer genaueren Me methode bestehen F r einen genauen Vergleich zwischen der DNA vom Tatort und der DNA des Tatverd chtigen kann man sich nicht nur auf eine bereinstimmung nach Augenma verlassen sondern man mu die Fragmentgr e quantitativ oder numerisch bestimmen Dies ist im Folgenden beschrieben 1 Mit einem Lineal wird die Wanderungsstrecke jeder einzelnen Bande ausgemessen Es wird die Strecke in Millimetern von der Unterkante der Starttasche bis zur Mitte der entsprechenden DNA Bande gemessen und in die Tabelle auf der folgenden Seite eingetragen Die Daten in der Tabelle werden benutzt um eine Standardkurve zu erstellen und so die Gr en der Restriktionsfragmente der DNA vom Tatort und de
69. mmer gestellt wird die mit einer elektrisch leitenden Pufferl sung gef llt ist Zwischen zwei Drahtelektroden an den beiden Enden der Kammer flie t Gleichstrom DNA Fragmente sind negativ geladen und werden daher in einem elektrischen Feld vom positiven Pol angezogen Die Matrix des Agarosegels dient dabei als molekulares Sieb durch das k rzere DNA Fragmente leichter hindurchwandern k nnen als gr ere In einem bestimmten Zeitabschnitt wandern kleinere Fragmente weiter als gr ere Fragmente von der gleichen Gr e bleiben zusammen und wandern in separaten DNA Banden Diese Banden kann man im Gel sehen nachdem die DNA angef rbt wurde Diese Situation kann verglichen werden mit einer Situation im Klassenzimmer bei der alle Tische willk rlich zusammengeschoben sind Ein einzelner Sch ler kann sich durch das St hlelabyrinth relativ schnell und ohne gro e Schwierigkeiten hindurchwinden w hrend eine Kette von vier Sch lern l nger braucht und gr ere Schwierigkeiten hat sich den Weg durch den Stuhlirrgarten zu bahnen DNA Fingerprinting Zwischen den DNA Sequenzen einzelner Personen gibt es Gemeinsamkeiten und Unterschiede Zum Nachweis da ein bestimmter Abschnitt der DNA eine spezifische Nukleotidsequenz enth lt kann eine radioaktive DNA Sonde hergestellt werden die diese Sequenz erkennt und an sie bindet Mit Hilfe von radioaktiven Sonden k nnen Molekularbiologen die DNA verschiedener Individuen sichtbar machen identifiz
70. n 6 Reaktionsgef Be werden in den schwimmf higen Kunststoffhalter gesetzt und 45 min bei 37 C im Wasserbad inkubiert alternativ ber Nacht bei Raumtemperatur Die werden aus dem Wasserbad geholt und bei 4 C gelagert bis der Versuch fortgesetzt wird ENZ Ice DNA Samples Enzyme Mix x 24111 Stock cs TuS Flick Tap Water bath 3 Stunde Agarose Gel Elektrophorese 1 Die DNA Proben werden aus dem K hlschrank geholt und berpr ft dass sich die L sungen auf dem Gef boden befinden Falls m glich kurz zentrifugieren 2 5 wl Loading Dye LD werden mit jeweils einer neuen Pipettenspitze zu allen Ans tzen pipettiert Die Gef e werden verschlossen und wieder vorsichtig gemischt indem leicht mit dem Finger gegen die Gef wand geschlagen wird 3 Ein Agarose Gel wird in die Elektrophorese Zelle gesetzt u die Kammer mit 1 x TAE Puffer gef llt so dass das Gel vollst ndig bedeckt ist ca 275 ml Puffer 4 Es sollte berpr ft werden dass sich die Taschen in dem Gel auf der Seite der schwarzen Elektrode befinden und das untere Ende des Gels in der N he der roten Elektrode 5 Aus jedem Reaktionsgef werden nun die Proben mit jeweils einer neuen Pipettenspitze in je eine Tasche des Agarose Gels pipettiert und zwar in folgender Reihenfolge Spur 1 HindIII DNA Standard M
71. n die das Enzym anhalten l t An dieser Stelle die Restriktionsschnittstelle genannt wird verdauen spalten chemisch die Enzyme dann das DNA Molek l sie haben also gewisserma en die Funktion von molekularen Scheren die die DNA an bestimmten Basenpaarsequenzen schneiden Kommt eine spezifische Restriktionsschnittstelle mehr als einmal in einem DNA Molek l vor so wird das entsprechende Restriktionsenzym an allen diesen Stellen einen Schnitt vornehmen und es entstehen mehrere Fragmente Wenn also ein vorgegebenes lineares DNA St ck mit einem Restriktionsenzym geschnitten wird dessen spezifische Erkennungssequenz an f nf verschiedenen Stellen auf dem DNA Molek l zu finden ist gibt es sechs Fragmente unterschiedlicher L nge Die L nge der einzelnen Fragmente h ngt davon ab wo auf dem DNA Molek l sich die Restriktionsschnittstellen befinden Werden Restriktionsenzyme dazu benutzt einen langen DNA Strang zu schneiden k nnen Fragmente unterschiedlicher Gr e entstehen Diese Fragmente k nnen durch einen Agarose Gelelektrophorese genannten Proze aufgetrennt und sichtbar gemacht werden Die Begriff Elektrophorese steht dabei f r Wanderung unter Einflu elektrischer Spannung Bei der Elektrophorese werden die DNA Fragmente nach ihrer relativen Gr e getrennt Die DNA Fragmente werden in eine Agarose Trenngel geladen das in eine Kammer kommt die mit einer elektrisch leitenden Pufferl sung gef llt ist Zwischen zwei Drahtelekt
72. n einigen anderen Bakterienst mmen bernommen hat Ihre Aufgabe ist es nun eine DNA Diagnose aufzubauen die die schuldigen Plasmide identifiziert Sie entscheiden sich die Analyse mit Restriktionsenzymen und DNA Fingerprinting mittels Elektrophorese einzusetzen um verschiedene verd chtige Plasmide zu identifizieren und zu unterscheiden und ihre Verbreitung nachvollziehen zu k nnen DNA aus Kulturen einer Reihe betroffener Patienten wurde isoliert K nnen die Sch ler den neuen Killer identifizieren ehe das Pathogen die Bev lkerung bef llt und eine wahre Epidemie ausl st Wir bem hen uns unseren Lehrplan und unsere Produkte st ndig zu verbessern Wir freuen uns ber Ihre Anmerkungen Kommentare und Vorschl ge Ron Mardigian Dr Patti Taranto Bio Rad Laboratories ron_mardigan bio rad com patti_taranto bio rad com 1 800 424 6723 Inhaltsverzeichnis Unterlagen fiir die Lehrkraft Kit Inhalt Checkliste Kit Bestandteile und erforderliches Zubeh r Hintergrundinformationen Einstimmen der Schiiler auf den Versuch fiir die Lehrkraft Zeitplan fiir die Durchfiihrung Vorbereitung und Unterrichtsstunden Arbeitsplatz Checkliste Einrichten der Sch ler und Lehrerarbeitspl tze Vorbereitung Vorbereitung der Arbeitspl tze und Kernpunkte der Unterrichtsstunden Schnell berblick Grafisches Laborprotokoll Sch lerhandbuch 1 Unterrichtsstunde Einf hrung zum DNA Fingerprinting 2 Unterrichtsstunde Verdau der DNA Proben mit Rest
73. nen Sie in dem unten abgebildeten Gel die Fragmente an den Stellen ein an denen sie sich Ihrer Meinung nach am Schlu der Elektrophorese befinden Well Negative Positive co Beschriften Sie jedes Fragment mit seiner korrekten Anzahl an Basenpaaren 58 Anhang Antwort Teil fiir die Lehrkraft 1 1 Stunde Einf hrung zum DNA Fingerprinting Vergleichen Sie das R ckgrat aus Zucker und Phosphatbausteinen in allen drei oben abgebildeten Seitenketten Gibt es irgendwelche Unterschiede Die Anordnung ist in allen drei Beispielen identisch Enthalten alle drei Proben der obigen Abbildung dieselben Basen Beschreiben Sie Ihre Beobachtungen Alle drei Beispiele enthalten die selben Nukleobasen Adenin Thymin Guanin und Cytosin Sind die Basen in allen drei Proben in gleicher Weise gepaart Beschreiben Sie das Muster der Basenpaarung Adenin ist immer an Thymin gebunden und Cytosin immer an Guanin Welche Annahmen k nnen Sie bei Ihrem Versuch die DNA Proben von drei verschiedenen Individuen zu analysieren ber die Gemeinsamkeiten und Unterschiede der DNA Proben machen Die Anordnung der Zuckerphosphate ist f r alle drei Beispiele gleich dasselbe gilt f r die Art der Basen Der einzige Unterschied zwischen den drei Beispielen liegt in der Anordnung der Basen Was genau mu zwischen diesen Proben verglichen werden um eine Aussage dar ber treffen zu k nnen ob sie identisch sind oder nicht
74. nte nachgewiesen werden da ein 5000 Jahre alter Eismann der in einem schmelzenden Gletscher gefunden wurde mit modernen Europ ern eng verwandt ist Iceman Gets Real Science Bd 264 S 1669 17 Juni 1994 Die durch das DNA Typing erhaltenen Daten machen auch Schlu mit allen Ger chten da der K rper ein Schwindel ist d h da er dort auf das Eis gelegt wurde so Svante Paabo von der Universit t M nchen Science Bd 264 S 1775 17 Juni 1994 Untersuchung des Verwandtschaftsgrades zwischen alten Kulturen Bei arch ologischen Ausgrabungen im westlichen Montana gefundene DNA wird dazu benutzt festzustellen wie viele verwandte Menschengruppen Familien an einer bestimmten Stelle gelebt haben Morell Virginia Pulling Hair from the Ground Science Bd 265 S 741 745 August 1994 DNA Untersuchungen der Familienzugeh rigkeit DNA Untersuchungen der Familienzugeh rigkeit sind in Argentinien und El Salvador dazu herangezogen worden die Kinder von mindestens 9000 B rgern dieser L nder die zwischen 1975 und 1983 verschwunden d h von Spezialeinheiten des herrschenden Milit rs und der Polizei entf hrt wurden zu identifizieren Viele leibliche Kinder dieser verschwundenen Erwachsenen wurden gekidnappt und von milit rischen Eltern adoptiert die vorgaben ihre leiblichen Eltern zu sein Nachdem durch genetische Untersuchungen der Gro familie die wahre Identit t eines Kindes festgestellt
75. olyse der Zuckerphosphatbindungen f hren Dies wiederum f hrt dazu da der Doppelstrang der DNA an der Erkennungsstelle bricht und das DNA Molek l in zwei Teile gespalten wird Diese Molek lscheren oder Schneide Enzyme nennt man Restriktions Endonukleasen K nnen Sie es sich erkl ren warum sie Restriktionsendonukleasen genannt werden Zwei h ufige Restriktionsendonukleasen sind EcoRI und PstI die Sie in diesem Experiment erhalten Zum besseren Verst ndnis der Wirkungsweise von EcoRI und im DNA Fingerprintingtest mu man erst den Schneideeffekt der Restriktionsendonukleasen an der DNA verstehen und sich vor Augen f hren ATGIAATTCTCAATTACCT TACTTAAIGAGTTAATGGA Die durch die Basenpaare gezogene Linie repr sentiert die Stellen an denen Bindungen gespalten werden wenn eine Restriktionsendonuklease die Sequenz GAATCC erkennt Die folgenden analytischen Fragen beziehen sich auf das weitere Schicksal eines DNA Molek ls nachdem es von einer Restriktionsendonuklease in der oben gezeigten Art und Weise geschnitten wurde 1 Wie viele DNA St cke w rden bei diesem Schnitt entstehen 2 Schreiben Sie die Basensequenz sowohl des rechten als auch des linken DNA Fragments auf Links Rechts 3 Welche Unterschiede bestehen zwischen diesen beiden Fragmenten 25 4 Die Gr e eines DNA Fragments kann durch die Anzahl der Basenpaare diesem Fragment ausgedr ckt werden Geben Sie die Gr e der Frag
76. pfen Sie dazu die Reaktionsgef e sanft auf den Tisch 3 Setzen Sie den Geltr ger mit dem darin fest gewordenen Gel auf die Plattform in der Elektrophoresekammer Die Geltaschen kommen dabei ans Kathodenende der Kammer mit dem schwarzen Anschlu kabel Entfernen Sie ganz vorsichtig den Gelkamm indem Sie ihn gerade nach oben abziehen 4 Gie en Sie ca 275 ml Elektrophoresepuffer in die Elektrophoresekammer F llen Sie soviel Puffer ein bis die Geltaschen knapp bedeckt sind 34 5 Legen Sie das mit markierte Reaktionsgef mit den Lambda HindIII DNA Gr enmarker bereit Gele werden von links nach rechts gelesen Die erste Probe wird also in der Geltasche in der linken Ecke des Gels aufgetragen 6 Unter Verwendung einer neuen Pipettenspitze f r jede Probe beladen Sie Ihr Gel folgenderma en Bahn 1 Gr enmarker farblos 10 ul Bahn 2 TO gr n 20 ul Bahn 3 V1 blau 20 ul Bahn 4 V2 orange 20 ul Bahn 5 V3 violett 20 ul Bahn 6 V4 rot 20 ul Bahn 7 V5 gelb 20 ul 7 Setzen Sie den Deckel auf die Elektrophoresekammer Der Deckel pa t nur in einer Orientierung auf das Unterteil rot geh rt zu rot schwarz zu schwarz Verbinden Sie die Elektroden mit dem Netzger t 8 Schalten Sie das Netzger t ein Stellen Sie die Spannung auf 100 V ein und lassen Sie die Elektrophorese 30 40 Minuten lang laufen W hrend das Gel l uft k nnen Sie mit der Beantwortung der Fragen auf der
77. r Gr e nach auf das gr te Fragment zuerst Verschiedene Antworten sind m glich A B In diesem Diagramm stehen A und B fiir unterschiedliche Palindromsequenzen auf einem DNA Strang Es ist nur das Restriktionsenzym vorhanden das die Restriktionsstelle B erkennt Erkl ren Sie warum nur zwei Fragmente entstehen w rden Das Enzym w rde der Stelle schneiden und daher 2 DNA Fragmente erzeugen 70 Vorbereitung auf die 2 Laborstunde Uberblick die Elektrophorese Ein lineares St ck DNA wird wie unten gezeigt in 4 Fragmente geschnitten Eine L sung mit den 4 Negative Fragmenten wird in eine Starttasche eines Agarosegels pipettiert Zeichen Sie auf der rechten Seite ein was Sie aufgrund der obigen Informationen bez glich der Auftrennung der Fragmente erwarten Markieren Sie jedes Fragment mit dem ihm zugeh rigen Buchstaben Well Agarose gel A B 0 Positive Lassen Sie die Lehrkraft das Diagramm tiberpriifen bevor Sie fortfahren Wo w rden sich die gr eren Fragmente die mit der gr eren Anzahl an Basenpaaren befinden mehr im oberen oder mehr im unteren Teil des Gels Warum Die gro en Fragment w rden sich mehr am oberen Ende des Gels befinden weil es f r die gr eren Fragmente schwieriger ist durch das Gel zu wandern Angenommen Sie h tten von allen vier Fragmenten je 500 St ck wie w rde in diesem Fall das Gel aussehen Es w
78. r Tatverd chtigen abzusch tzen Zur genauen Absch tzung der Fragmentgr e der Tatort DNA und der DNA der Tatverd chtigen wird eine Standardkurve erstellt unter Verwendung der Abstands X Achse und Fragmentgr endaten der Lambda HindIII Gr enmarker Tragen Sie f r die Banden 2 6 die Abst nde in Abh ngigkeit von der Gr e sowohl auf Millimeterpapier als auch auf halblogarithmisches Papier auf Verbinden Sie mit Hilfe eines Lineals auf allen Diagrammen die Datenpunkte mit einer Linie Verl ngern Sie die Linie bis zur rechten Seite des Diagramms Welches Diagramm bietet die geradeste Linie die Sie verwenden k nnen um die Fragmentgr e der DNA vom Tatort und der Tatverd chtigen abzusch tzen Warum denken Sie dass die eine graphische Darstellung gerader ist als das andere Entscheiden Sie welches Diagramm das lineare oder das halblogarithmische zur Absch tzung der DNA Fragmentgr en der Tatort DNA und der Tatverd chtigen DNA verwendet werden soll Begr nden Sie Ihre Wahl Zur Absch tzung der Gr e eines unbekannten Tatort oder Tatverd chtigen Fragments bestimmen Sie die Wanderungsstrecke die das Fragment zur ckgelegt hat Tragen Sie diesen Punkt auf der X Achse der Standardkurve ein Denken Sie sich von diesem Punkt auf der X Achse eine Senkrechte bis zur Standardkurve und von da eine Waagrechte bis zur Y Achse Sie k nnen die entsprechenden Hilfslinien auch mit d nnen Bleistiftstrichen einzeichnen
79. ragments bestimmt werden Tagen Sie diese Strecke auf der X Achse der Standardkurve ein Nehmen wir einmal an die 2 Bande des Tatverd chtigen Nr 5 sei 24 mm gewandert A Gehen Sie von der 24 mm Marke auf der X Achse senkrecht nach oben zur Standardkurve und markieren Sie die Schnittstelle mit der Standardkurve durch einen schraffierten Kreis B Zeichnen Sie durch diese Schnittstelle eine Waagrechte bis zur Y Achse dieser Wert entspricht der ungef hren Gr e des Fragments C Die 2 Bande des Tatverd chtigen 5 hat demnach ungef hr die Gr e von 2000 Bp Wiederholen Sie dieses Verfahren f r alle Fragmente der DNA vom Tatort und der Tatverd chtigen Tragen Sie die ungef hren Fragmentgr en in die Datentabelle ein 66 Fingerprinting Standard Kurve Linear Fingerprinting Standard Curve Linear 23 000 oof 11 144 21 000 ke 19 000 11 11 2112 18 000 17 000 eh ee 1 16 000 LL LEI LGE LL 14 000 oo E 4 E EE EE 18 000 11
80. ren Bakterien indem sie ihre eigene DNA in die Bakterien injizieren und so versuchen die Kontrolle ber die Bakterienzelle zu bernehmen Die Bakterien haben darauf mit der Entwicklung eines nat rlichen Verteidigungssystems den sogenannten Restriktionsenzymen reagiert um so die eindringende DNA zu zerschneiden und zerst ren zu k nnen Die Bakterien verhindern den Verdau ihrer eigenen DNA indem sie bestimmte DNA Basen innerhalb der bestimmten Enzymerkennungssequenz modifizieren So K nnen sie ihre eigene DNA sch tzen w hrend sie die Fremd DNA zerschneiden Dies kann als ein sehr primitives Immunsystem betrachtet werden Diese Enzyme suchen die virale DNA nach bestimmten Palindromen ab z B und schneiden die DNA an solchen Stellen in St cke Die genaue Stelle in einem Palindrom an der die DNA geschnitten wird wird Restriktionsschnittstelle genannt Einige Restriktionsenzyme hinterlassen an der Schnittstelle kurze St cke von ungepaarten Nukleotidbasen sogenannte sticky ends Andere Restriktionsenzyme schneiden glatt ber beide Str nge und hinterlassen stumpfe Enden an den doppelstr ngigen DNA Fragmenten Betrachten Sie folgende DNA Sequenz Palindrome GT ATTCACGCA CAT TAAGTGCGT Restriction site GTAG ATTCATTCACGCA CATCTTAA GTAAGTGCGT Fragment 1 Fragment 2 Ein Restriktionsenzym hat die DNA in einem GAATTC Palindrom zwischen dem G und dem A geschnitten Wie viele Basenpaare befinden sich links vom Sc
81. riktionsenzymen 3 Unterrichtsstunde Elektrophorese und Anf rben der DNA Proben 4 Unterrichtsstunde Trocknen der Gele und Analyse der Ergebnisse Anhang Anhang A Alternative Einsatzm glichkeiten von DNA Fingerprinting Anhang B Vorbereitung der Laborstunden berblick ber Restriktionsenzyme berblick ber die Elektrophorese Anhang C Antworten f r die Lehrkraft Anhang D Plasmid DNA und Restriktionsenzyme Seite 23 32 37 49 52 52 57 59 73 Uberblick fiir den Lehrer Zielgruppe Dieser Versuch ist f r alle Sch ler der Mittel und der Oberstufe geeignet unabh ngig von ihrem Wissensstand bez glich der Chemie der Nukleins uren Zielsetzungen f r die Sch ler Alle Sch ler die an diesem Experiment teilnehmen sollten 1 von dieser Aufgabe gefordert werden und ihr Interesse der Untersuchungsmethode sollte geweckt werden 2 ein Verst ndnis f r einige der wissenschaftlichen Grundlagen entwickeln die beim DNA Fingerprinting eine Rolle spielen SP Beweise gegeneinander abw gen k nnen und in der Lage sein in diesem Experiment gewonnenen Daten klar zu analysieren und zu interpretieren 4 die bei wissenschaftlichen Arbeiten auftretenden Gedankenprozesse nachvollziehen k nnen 5 Neugierde und Vertrauen in ihre F higkeit entwickeln sich mit weiteren wissenschaftlichen Fragen und Themen auseinanderzusetzen Unterrichtsstrategien Dieser Lehrplan soll eine gerichtsmedizinische Untersuchung simul
82. rm glichten Antibiotika die von anderen Mikroorganismen entwickelt wurden zu berleben Diese Resistenz gegen Antibiotika verschaffte den Bakterien mit Plasmiden einen selektiven Vorteil gegen ber ihren Konkurrenten Bakterien waren in der Lage ber Konjugation die vorteilhafte Plamid DNA anderen Bakterien weiterzugeben F r Wissenschaftler hat Plasmid DNA den Vorteil da ihre geringe Gr e die Aufreinigung erleichtert und da sie mit Hilfe eines Transformation genannten Prozesses wieder in Bakterienzellen eingef hrt werden kann Die Wissenschaftler haben auch von einem anderen nat rlichen Verteidigungsmechanismus der Bakterien profitiert dem Restriktionsenzym Bakterien entwickelten Enzyme um injizierte DNA von Viren oder Bakteriophagen zu zerst ren Restriktionsenzyme erkennen spezifische DNA Sequenzen auf der Phagen DNA und schneiden dann die DNA an dieser Stelle Die fragmentierte Phagen DNA stellt dann keine Bedrohung mehr f r die Bakterien dar Sind sie einmal im Labor aufgereinigt werden diese Restriktionsendonukleasen Nuklease Enzym das schneidet endo innerhalb Nukleins uren nach dem Bakterium benannt aus dem sie isoliert wurden Zum Beispiel wurde EcoRI aus Escherichia coli isoliert Aufgereinigte Restriktionsenzyme k nnen dann im Labor eingesetzt werden um DNA aus irgendeiner Quelle an eindeutig vorhersehbaren Stellen zu schneiden Nachdem Plasmide mit einem Restriktionsenzym geschnitten wurden k nnen sie mit fr
83. roden an den beiden Enden der Kammer wird Gleichstrom angelegt DNA Fragmente sind negativ geladen und werden daher im elektrischen Feld vom positiven Pol Anode angezogen Die Matrix des Agarosegels dient dabei als molekulares Sieb durch das k rzere DNA Fragmente leichter hindurchwandern k nnen als gr ere Pro Zeiteinheit wandern kleinere Fragmente weiter als gr ere Fragmente der gleichen Gr e bleiben zusammen und wandern in separaten DNA Banden Diese Banden kann man im Gel sehen nachdem die DNA angef rbt wurde Ein Vergleich Dieser Vorgang kann mit einer Situation im Klassenzimmer verglichen werden indem alle Tische und St hle willk rlich zusammengeschoben wurden Ein einzelner Sch ler kann sich durch das Stuhl und Tischelabyrinth relativ schnell und ohne gro e Probleme durchwinden w hrend eine Kette von vier Sch lern l nger br uchte und mehr Probleme h tte sich den Weg durch den Irrgarten zu bahnen Versuchen Sie es 32 3 Stunde Elektrophorese der DNA Proben Labor Checkliste Sch lerarbeitspl tze Agarosegel Elektrophorese System Agarose Gel Verdaute DNA Proben ambda Verdau DNA Marker DNA Frontmarker Sample Loading Dye Filzschreiber Permanent Marker Pipettenspitzen 2 20 ul Mikropipette 2 20 ul Abfallbeh lter Gel Support Film ggf Fast Blast DNA Anf rbel sung 1x oder 100x Gro e Beh lter zum Entf rben ggf Reaktionsgef st nder aus Styropor Netzger t G
84. stoffl sung zum Auftragen der Probe verwenden oder stark ges ttigte Zucker oder Glycerinl sung die mit Lebensmittelfarbe angef rbt wurde Im Folgenden finden Sie eine Zusammenfassung wie man Mikropipetten verwendet 1 Schauen Sie auf die Mikropipette um den Volumenbereich festzulegen 2 Drehen Sie die Scala auf der Mikropipette um Ihr gew nschtes Volumen einzustellen 3 Stecken Sie eine saubere Pipettenspitze auf die Mikropipette 4 Dr cken Sie den Mikropipettenkolben bis zum ersten weichen Widerstand 5 F hren Sie die Pipettenspitze in die zu berf hrende L sung ein 6 Lassen Sie den Kolben langsam in die Ausgangsposition zur ckkehren um die Fl ssigkeit hinaufzuziehen 7 F hren Sie die Pipettenspitze in das gew nschte R hrchen 8 Dr cken Sie den Kolben nach dem ersten Widerstand weiter zum zweiten Widerstand um die Fl ssigkeit in das R hrchen zu berf hren Stellen Sie sicher da der Kolben gedr ckt bleibt wenn Sie die Pipettenspitze aus dem R hrchen ziehen 9 Dr cken Sie die Pipettenspitze von der Mikropipette 3 Unterrichtsstunde Labor Elektrophorese und Anf rben der DNA Proben Unterrichtsvorbereitung Ziel Vorbereiten des Lambda HindIII Verdaus DNA Gr enmarker und Aliquotieren optional Aliquotieren des DNA Frontmarkers sample loading dye Verd nnung der 1x Fast Blast DNA F rbel sung F rbung ber Nacht oder 100x f r schnelles F rben Vorbereiten der Sc
85. t Puffer rehydriert 1 Fl schchen LI DNA vom Tatverd chtigen Nr 3 mit Puffer rehydriert 1 Flaschchen LI DNA vom Tatverd chtigen Nr A mit Puffer rehydriert 1 Fl schchen LI DNA vom Tatverd chtigen Nr 5 mit Puffer rehydriert 1 Flaschchen LI Geschmolzene 1 ige Agarose 1x siehe Unterrichtsvorbereitung 40 50 ml Gel m Brutschrank oder Wasserbad 37 C optional 1 Klasse m Mikrozentrifuge oder 1 Klasse LI Minizentrifuge 4 Klasse LI Bitte tragen Sie im Labor immer eine Schutzbrille Bitte beachten Sie immer die angemessenen Sicherheitsvorschriften wie z B Verbot von Essen und Trinken 3 Unterrichtsstunde Elektrophorese der DNA Proben Sch lerarbeitspl tze Anzahl Arbeitsplatz v Agarosegel Elektrophorese System 1 LI Agarose Gel 1 LI Verdaute DNA Proben 6 LI Verdau DNA Marker 1 DNA Frontmarker 1 LI Filzschreiber Permanent Marker 1 Pipettenspitzen 2 20 ul 13 LI Mikropipette 2 20 pl 1 LI Abfallbeh lter 1 LI Gel Support Film ggf 1 LI Fast Blast DNA Anf rbel sung 1x 120 ml pro 2 Arbeitspl tze LI Gro e Beh lter zum Entf rben ggf 1 3 pro 2 Arbeitspl tze LI Reaktionsgef st nder aus Styropor 1 LI Netzger t 1 m Gelf rbeschale 1 LI 1x TAE Elektrophoresepuffer 275 ml Gel Kammer LI Arbeitsplatz der Lehrkraft Mikrozentrifuge oder Minizentrifuge optional 1 LI Schiittler 1 LI 4 Unterrichtsstunde Analyse der Ergebnisse Sch lerarbeitspl tze Anzahl Arbeitsp
86. t einer Mikropipette und jeweils frischen Pipettenspitzen je 10 wl der Enzymmischung ENZ zu einem Reaktionsgef nach dem unten angegebenen Schema Hinweis Wechseln Sie jedesmal wenn Sie zu einem anderen Reagenz bergehen die Pipettenspitze ebenso falls Sie versehentlich mit der Pipettenspitze die Fl ssigkeit in einem der Reaktionsgef e ber hren Im Zweifelsfall lieber die Pipettenspitze wechseln Die DNA kommt vor dem Enzym in das Reaktionsgef Das Enzym wird immer zuletzt zugegeben 171771717 ENZ TO V1 V2 v4 V5 29 Die Reaktionsgef e mit den DNA Proben sollten jetzt folgendes enthalten DNA Proben EcoRVPstl gesamtes je 10 ul Enzymmischun Reaktionsvolumen Tatort TO 10 ul 20 ul Tatverd chtiger Nr 1 V1 10 ul 20 ul Tatverd chtiger Nr 2 V2 10 ul 20 ul Tatverd chtiger Nr 3 V3 10 ul 20 ul Tatverd chtiger Nr 4 V4 10 pl 20 ul Tatverd chtiger Nr 5 V5 10 ul 20 ul 5 Mischen Sie den Inhalt aller Reaktionsgef e Schlie en Sie bei allen Reaktionsgef en den Deckel Mischen Sie die Komponenten indem Sie mit den Finger leicht gegen die Reaktionsgef e schnipsen Steht eine Mikrozentrifuge zur Verf gung kann sie dazu benutzt werden alle Fl ssigkeit durch kurzes 2 Sekunden Zentrifugieren auf dem Boden des Reaktionsgef es zu sammeln und so zu kombinieren und mischen Die Reaktionsgef e m ssen gegeneinander austariert in den Rotor positioniert werden Ist keine Zentrifuge verf gbar s
87. ter f r jedes Sch lerteam der mindestens 500 ml fa t Jedes Team kann einen Beh lter nehmen der nach jedem Waschschritt geleert wird oder unterschiedliche Beh lter f r die einzelnen Waschschritte 1 Markieren Sie die F rbeschalen mit Ihren Initialen und der Klasse Sie f rben zwei Gele in einer Schale 2 F rbung der Gele Lassen Sie die Gele vom Geltr ger in die F rbeschale gleiten Gie en Sie ca 120 ml der 100x F rbel sung in die F rbeschale Wenn n tig geben Sie mehr F rbemittel hinzu bis das Gel komplett bedeckt ist F rben Sie das Gel f r 2 3 Minuten aber nicht l nger als 3 Minuten Gie en Sie die 100x L sung mit einem Trichter in eine Aufbewahrungsflasche Die 100x Fast Blast F rbel sung kann mindestens 7x verwendet werden 2 3 Minuten 3 Gele aussp len Lassen Sie die Gele in einen Beh lter gleiten der 500 700 ml sauberes warmes Leitungswasser 40 55 C enth lt Bewegen Sie das Gel sanft im Wasser f r ca 10 Sekunden 10 Sekunden 39 4 Gele waschen Lassen Sie die Gele in einen Beh lter gleiten der 500 700 ml sauberes warmes Leitungswasser 40 55 C enth lt Bewegen Sie das Gel auf einem Sch ttler f r 5 Minuten Wenn kein Sch ttler 5 Wiederholen Sie Schritt 4 5 Minuten 6 Aufzeichnen der Ergebnisse Gie en Sie das Wasser ab und untersuchen Sie die gef rbten Gele nach zu erwarteten DNA Banden Nach dem 2 Waschschritt k nnen die DNA Banden unscharf sein Sie werden
88. tiefe Blauf rbung sichtbar wird Die Fast Blast DNA F rbel sung wird als 500x Konzentrat geliefert und mu vor der Verwendung verd nnt werden Verd nnen Sie den Farbstoff auf 100x um DNA innerhalb von 12 15 Minuten anzuf rben oder auf 1 wenn Sie ber Nacht f rben m chten Wenn das Agarosegel in den Fast Blast Farbstoff eingetaucht wird lagern sich die die Farbstoffmolek le an die DNA Molek le im Agarosegel Wenn die DNA Banden sichtbar sind K nnen Ihre Sch ler die DNA Restriktionsmuster von den verschiedenen DNA Proben vergleichen Detaillierte Anweisungen zur Fast Blast F rbung finden Sie im Sch lerhandbuch ACHTUNG Die Fast Blast DNA F rbel sung ist ungiftig und nicht krebserregend Trotzdem sollten Laborhandschuhe aus Latex oder Vinyl getragen werden wenn mit der F rbel sung oder gef rbten Gelen hantiert wird um eine Anf rbung der H nde zu vermeiden Schutzkleidung wie Laborkittel sollten getragen werden um eine F rbung der Kleidung zu vermeiden Entsorgen Sie die F rbel sung entsprechend den Vorschriften Ihrer Einrichtung Verwenden Sie eine 10 Bleichl sung oder 70 Alkohol um F rbel sung von den meisten Oberfl chen zu entfernen berpr fen Sie bitte vorher dass diese Stoffe die Oberfl che nicht besch digen Bemerkungen co Wir empfehlen 120 ml verd nnte Fast Blast L sung um zwei Gele von 7x7 cm oder 7x10 cm in den einzelnen F rbeschalen anzuf rben die mit diesem Kit geliefert werden Bitte m
89. tikel sich gel st haben Stellen Sie die L sung zur Seite und lassen Sie sie auf 55 60 C abk hlen ehe Sie sie verwenden Sie k nnen die Agarose auch einige Stunden im voraus schmelzen und dann in einem Wasserbad bei 55 60 C halten ehe Sie oder die Sch ler die Gele gie en c Anleitung zum Gie en der Agarosegele F r diesen Versuch mu jedes Gel mindestens 7 Geltaschen besitzen Folgen Sie den obigen Anweisungen zur Zubereitung der Agarose und entscheiden Sie welches Volumen an 1 iger Agarose Sie f r Ihre Klasse n ben tigen F llen Sie soviel Agarose ein da die Z hne des Gelkamms vollst ndig bzw bis zu einer Tiefe von 0 5 0 75 cm bedeckt sind Solange das Gel noch nicht fest geworden ist d rfen Sie den Geltr ger nicht ber hren oder bewegen Nachdem die Gele fest geworden sind K nnen Sie sie in verschlie baren Plastikbeuteln einen Tag bei Raumtemperatur oder bis zu einer Woche im K hlschrank bis zum Gebrauch aufbewahren Lassen Sie die Sch ler ihre Plastikbeutel beschriften F r das Gie en der f r die ganze Klasse ben tigten Gele sollten Sie ca 30 Minuten einplanen Gie en Sie nach M glichkeit ein oder zwei Gele als Ersatz Dieser Abschnitt stellt kurz die konventionelle Gel Tr ger Abklebemethode zum Gie en von Gelen dar Verwenden Sie das Bio Rad Mini Sub Cell GT System so k nnen die Gele direkt in der Elektrophoresekammer gegossen werden indem sie die f r den Geltr ger vorgesehenen Seitentr ger verwenden
90. und fiir unterschiedliche Palindromsequenzen auf einem DNA Strang Es ist nur das Restriktionsenzym vorhanden das die Restriktionsstelle B erkennt Erkl ren Sie warum nur zwei Fragmente entstehen w rden 56 Vorbereitung auf die 2 Laborstunde Uberblick die Elektrophorese Wie kann man DNA Fragmente sichtbar machen Bei der Agarose Gelelektrophorese handelt es sich um eine Methode zur Trennung von DNA Fragmenten nach ihrer Gr e Die DNA ist eine S ure und hat viele negative elektrische Ladungen Wissenschaftler haben dies ausgenutzt um eine Methode zu entwickeln mit der DNA Fragmente getrennt werden k nnen Eine L sung die eine Mischung von DNA Fragmenten enth lt wird in eine kleine Starttasche pipettiert die aus dem Gel ausgespart wurde Das Gel erinnert an Wackelpudding Die Molek le werden durch Anlegen einer elektrischen Spannung in Bewegung gesetzt Entgegengesetzte elektrische Ladungen ziehen sich gegenseitig an negative Ladungen wandern zur positiven Ladung Stellen Sie sich das Gel als Sieb mit kleinen Poren vor durch das kleine Partikel sehr schnell hindurchgehen k nnen Je gr er allerdings die Partikel sind desto langsamer werden sie durch das Gel gesicht Nachdem die Molek le eine Weile dem elektrischen Feld ausgesetzt waren trennen sich die Fragmente der Gr e nach auf Fragmente gleicher Gr e haben die Tendenz zusammen durch das Gel zu wandern Eine solche Gruppe von gleich gro en
91. ung der Gr e eines Fragments das von der unbekannten DNA am Tatort oder der eines Tatverd chtigen stammt mu zun chst die Wanderungsstrecke dieses spezifischen Fragments bestimmt werden Tagen Sie diese Strecke auf der X Achse der Standardkurve ein Nehmen wir einmal an die Bande Nr 2 des Tatverd chtigen Nr 5 sei 24 mm gewandert A Gehen Sie von der 24 mm Marke auf der X Achse senkrecht nach oben zur Standardkurve und markieren Sie die Schnittstelle mit der Standardkurve durch einen schraffierten Kreis B Zeichnen Sie durch diese Schnittstelle eine Waagrechte bis zur Y Achse dieser Wert entspricht der ungef hren Gr e des Fragments C Bande 2 des Tatverd chtigen 5 hat demnach ungef hr die Gr e von 2000 Bp Wiederholen Sie dieses Verfahren f r alle Fragmente der DNA vom Tatort und der Tatverd chtigen Tragen Sie die ungef hren Fragmentgr en in die Datentabelle ein 46 Fingerprinting Standard Kurve Linear Graph Paper m m oe et Entfernung mm 47 Interpretation der Ergebnisse 1 Was soll hier bestimmt werden Formulieren Sie noch einmal unsere zentrale Frage Welche der DNA Proben sind fragmentiert worden Wie w rde das Gel aussehen wenn keine Fragmentierung stattgefunden h tte Wodurch wurde die DNA fragmentiert Wovon h ngt es ab an welcher Stelle eine Restriktionsendonuklease ein DNA Mole
92. weis zu Einwanderungszwecken verwendet worden 1986 erhielt das Britische Innenministerium 12000 Einwanderungsantr ge von Witwen und Kindern von M nnern aus Bangladesch und Pakistan die im Vereinigten K nigreich lebten Die Beweislast f llt dem Antragsteller zu wobei der Nachweis der Familienzugeh rigkeit auf Grund l ckenhafter Dokumente schwierig sein kann Bluttests sind mitunter ohne Beweiskraft aber Ergebnisse des DNA Fingerprintings werden als Vaterschaftsnachweis vom Innenministerium akzeptiert DNA fingerprints source unknown Based on A J Jeffreys et al Positive Identification of an Immigration Test Case Using Human DNA Fingerprints Nature 317 818 819 1985 Best tigung der Verwandtschaft zwischen Tieren Wissenschaftler die DNA aus Haaren von Schimpansen aus verschiedenen Teilen Afrikas extrahiert haben erhielten so Hinweise da m glicherweise eine dritte Art von Schimpansen existiert Gleichzeitig haben sie Einsicht in das Verhalten von Schimpansen und deren Familienbeziehungen gewonnen die zu theoretisieren fr her Jahre gedauert h tte Sie entdeckten da eine in Westafrika lebende Schimpansengruppe sich genetisch von den in anderen Teilen Afrikas lebenden Schimpansen unterscheidet was vermuten l t da es sich hierbei um eine gef hrdete Art handeln k nnte Die Wissenschaftler entdeckten da die in einem vorgegebenen Bereich lebenden m nnlichen Schimpansen oft so nahe verwandt sind wie Halbbr der und d
93. weisen da als Sushi angebotener Fisch in Wirklichkeit Wal oder Delphinfleisch war Oft handelt es sich hier um gef hrdete Arten die durch internationale Gesetze gesch tzt sind 2 Angeklagte und verurteilte Verbrecher werden aufgrund von DNA Typing auf freien Fu gesetzt Ein Mann der seit 10 Jahren im Gef ngnis sa wurde entlassen nachdem mit Hilfe von DNA Analysen die zum Zeitpunkt der Verurteilung noch nicht zur Verf gung standen bewiesen werden konnte da er die Vergewaltigung nicht begangen haben konnte Statistiken zeigen da etwa ein Drittel aller mutma licher Sittlichkeitsverbrecher aufgrund der DNA Analyse freigesprochen werden 3 Identifizierung sterblicher berreste Wissenschaftler konnten mit Hilfe von DNA Typing best tigen da ein K rper im Grab die Person war oder auch nicht die dort begraben sein sollte In Russland wurden Knochen gefunden von denen angenommen wurde da sie von den Romanovs Ru lands letzter k niglichen Familie stammten Zar Nikolaus und seine Familie wurden von den Bolschewisten 1918 hingerichtet Experten aus der ganzen Welt studierten die Knochen um Sch del Z hne und andere Merkmale mit Fotografien in Einklang zu bringen DNA aus den Knochen wird mit der von bekannten Nachkommen der Familie verglichen um zu bestimmen ob die Knochen in der Tat vom Zaren und seiner Familie stammen 49 10 Bestimmung des Verwandtschaftsgrades zwischen Menschen Durch DNA Typing kon
94. wurde konnte es zu seinen biologischen Verwandten gebracht werden Es wurde zun chst bef rchtet da der Transfer eines Kindes von seinen milit rischen Eltern die zwar Kidnapper waren aber das Kind jahrelang aufgezogen hatten traumatisch sein k nnte In der Praxis wurden die Kinder mit geringem Trauma in ihre biologischen Familien integriert Identifizierung von Krankheiten verursachenden Organismen Eva Harris eine Wissenschaftlerin der Universit t von Kalifornien in San Francisco hilft Wissenschaftlern in Nicaragua und Ecuador die DNA Methoden zu erlernen um damit Tuberkulose entdecken sowie das Dengue Virus und verschiedene Leishmania St mme identifizieren zu k nnen Auf die Ergebnisse derzeit angewandter Methoden bei denen die Krankheitserreger kultiviert und dann zur Identifizierung an ausl ndische Labors geschickt werden mu wochenlang gewartet werden Marcia Barinaga A Personal Technology Transfer Effort in DNA Diagnostics Science 266 S 1317 1318 25 November 1994 Identifizierung der biologischen Eltern Vaterschaftsbestimmungen Als in Florida ein M dchen an einer Erbkrankheit starb stellte es sich heraus da es mit einem anderen M dchen bei der Geburt vertauscht worden war Die Krankheit kam in ihrer Familie nicht vor aber es war bekannt da sie bei der Familie eines anderen M dchens das im selben Krankenhaus zu etwa derselben Zeit geboren worden war auftrat Vaterschaftstest Eine Frau die a
95. ziehungen nachzuweisen Diese Methode hat dabei geholfen unschuldige Tatverd chtige wieder auf freien Fu zu setzen Kinder mit ihren Verwandten zusammenzuf hren gestohlene Tiere zu identifizieren und nachzuweisen da anstelle von Fisch Walfleisch zu Sushi verarbeitet wurde Sie wird in Kriegszeiten dazu benutzt sterbliche berreste von Gefallenen zu identifizieren Sie wird weiterhin dazu verwendet genetische Merkmalskopplungen f r vererbliche Krankheiten zu finden Dar ber hinaus lernen Wissenschaftler mit Hilfe der DNA Analyse eine Menge ber die Entwicklungsgeschichte des Menschen Jeder der folgenden Abschnitte beschreibt ein Szenarium bei dem aufgrund einer DNA Analyse gezeigt werden konnte da Individuen miteinander verwandt sind oder da eine Person eine Straftat begangen bzw nicht begangen hat Diese Szenarien liefern einen Kontext f r die Erl uterung des DNA Typing in den F chern Molekularbiologie Naturschutz Biologie und Biotechnologie Lassen Sie die Sch ler sich ein Gebiet aussuchen das sie interessiert und anschlie end ihre Ergebnisse der Klasse vortragen 1 Identifizierung von Nahrungsmitteln Identifizierung gef hrdeter Arten Die Reinheit oder Unreinheit von Rinderhack ist mit Hilfe von DNA Typing nachgewiesen worden Bei Hamburgern wurde gezeigt da sie oft eine Mischung aus Schweinehack und anderen Fleischarten enthalten Mit Hilfe von DNA Typing und tragbaren Analyseger ten konnten Aufsichtsbeamte nach
96. zyme die DNA in einem der Reaktionsgef e ver ndert haben k nnten Begr nden Sie Ihre Antwort Nein es sind keine Ver nderungen in den Reaktionsgef en zu erkennen aber die Enzyme haben m glicherweise die DNA hydrolysiert Die Reaktionen spielen sich auf molekularer Ebene ab deren Dimensionen zu gering sind um mit blo em Auge erkannt zu werden 62 3 Stunde Elektrophorese der DNA Proben Abschlu fragen 1 Das Elektrophoreseger t erzeugt ein elektrisches Feld mit positiven und negativen Polen den Enden des Gels DNA Molek le sind negativ geladen Zu welchem Pol des elektrischen Feldes wird die DNA Ihrer Meinung nach wandern oder Erkl ren Sie Ihre Antwort Positiv 2 Welche Farbe steht f r den negativen Pol Schwarz 3 Nachdem die DNA Proben in die Starttaschen geladen wurden werden sie gezwungen durch die Gelmatrix zu wandern Welche Fragmente wandern am schnellsten zum anderen Ende des Gels gro e oder kleine Begr nden Sie Ihre Antwort Die kleineren Fragmente Diese erfahren bei ihrer Wanderung durch die Gelmatrix den geringeren Widerstand 4 Welche Fragmente wandern die k rzeste Strecke von den Geltaschen aus gesehen Begr nden Sie Ihre Meinung Die gr eren Fragmente Diese erfahren bei ihrer Wanderung durch die Gelmatrix den gr eren Widerstand 63 4 Stunde Verst ndnisfragen 1 Was ist h chstwahrscheinlich in jeder Bande enthalten DNA Fragmente Angenommen di

Biotechnologie-Forscher DNA-Fingerprinting-Kit Anleitung - Bio-Rad

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