Bedienungsanleitung für das SURVEYOR® Scan
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1. Probe 1 NVD in Codon A01_1 Fra mt hae cae 141 12 amp 13 GGAA TRTIAT ARIAT Stempel nachgewiesen Er F FOS 1 Fra part bees Fio1 104 TTGGGq AARAA Probe 2 N c 34G gt T ari P G12C 30 41 Kein Stempel nachgewiesen FOO 1 Fra men bases 1 GTTGGG JAJ JATAAIII Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 32 Einzelheiten zur Bestellung Einzelheiten zur Bestellung Produkt nummer Produktname Gr e 710104 SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD 100 Reaktionen 710106 SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 amp 4 CE IVD 100 Reaktionen 710400 SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE IVD 100 Reaktionen 710077 CRC RAScan Combination Kit for KRAS and NRAS Exons 2 3 230 Reaktionen amp 4 CE IVD Kontaktdaten Hauptniederlassung Europa Transgenomic Inc Transgenomic Limited 12325 Emmet Street 40 Watt Road Omaha Hillington Park Hillington Nebraska 68164 Glasgow G52 4RY United States of America United Kingdom Tel 888 233 9283 oder 1 402 452 5400 Tel 44 141 892 8800 Fax 1 402 452 5401 Fax 44 141 883 5967 E Mail support transgenomic com E Mail support transgenomic com Nur in Nordamerika www Transgenomic com Transgenomic Advancing Personalized Medicine bersetzung Verzicht Transgenomic Inc hat alle Anstrengungen unternommen um die Genauigkeit dieser bersetzung sorgen g2. Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Systeme CE L Bitte lesen Sie diese Bedienungsanleitung sorgf ltig durch bevor Sie dieses Produkt verwenden Bewahren sie diese Bedienungsanleitung auf vielleicht m chten Sie sp ter etwas nachschlagen Transgenomic Advancing Personalized Medicine Diese Seite ist absichtlich leer Inhaltsverzeichnis 1 Hersteller z 0u002E ums aa ana nn Ban nn anna ana wanna Banden 3 2 SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD uu2u22220200200000nnnnnnnannnnnnnnnnnnnnannnnnnnnnnnnnnnannnnnnnnn 3 2 1 Verwendungszweck esines rse nea Ee canes na a shacnesh oa sah rn EES AEEA E EERE 3 2 2 Angaben zum GEDRAUCH s ces cedsscxnvecsaceovesccsscensedesaveentinveeesaavesncaseedcensdaes aude sata EEA Pena Ea era Ra rear eher 3 3 Testprinzip des SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Assay nennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn 4 3 1 KRAS WING RAS oiiro agesin i t aen a aoaea ea aaa aa aao s N 4 3 2 Analyse von Patientenproben mit den SURVEYOR Scan Kits 2ucssseenenssensnnnsnennnnnnnnnnnnnennnnnnnnnesennnnnnn 4 3 3 SURVEYOR N clease 3 nennen ehihrre en heisse here Ir 5 4 R ckverfolgbarkeit der Kit Kontrollen 22urr0000400000n00nnnn0nnnnnnnnnnnnnnnannnnnannnnnnnnnnnnnnnannnnnannn 6 5 Komponenten 2 2 cece eect earch ace ests ah eat ences en eset ace cet aera cs eet ene el eee 6 5 1 Anzahl der Proben die mit dem Kit
3. Falls kein Produkt zu sehen ist vergewissern Sie sich dass die Qualit t der Ausgangs DNA ausreichend war siehe Anhang B Fehlersuche Wenn die Qualit t den Spezifikationen entspricht erh hen Sie das Volumen der Matrize auf 4 0 uL je 50 uL Reaktion Verh ltnis von Wasser zu Reaktion auf 31 0 uL reduzieren In der No Template Control d rfen keine PCR Produkte zu sehen sein Wenn bei dieser Kontrolle DNA Produkte nachweisbar sind liegt wahrscheinlich eine Kontamination vor siehe Anhang B Fehlersuche Bewerten Sie die PCR als starke PCR oder schwache PCR a Eine starke PCR muss eine Einzelbande haben die gleich oder gr er als 20 ng uL ist b Eine schwache PCR muss eine Einzelbande haben die kleiner als 20 ng uL ist Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 15 12 Schritt f r Schritt Anleitung c F hren Sie den SURVEYOR Nuclease Verdau sowohl mit starken als auch schwachen PCR Ergebnissen durch B TIPP In dieser Phase k nnen PCR Produkte bei unter bzw gleich 20 C bis zu einer Woche gelagert werden 12 9 SURVEYOR Nuclease Verdau 1 Nachdem sich die Proben PCR in Qualit t und Quantit t als ausreichend erwiesen hat f hren Sie die SURVEYOR Nuclease Verdaureaktion wie nachstehend beschrieben durch 2 Tauen Sie die Reaktionsgef e mit 0 15 M MgCl Solution und den SURVEYOR Enhancer Cofactor auf Eis auf 3 Geben Sie 10 0 uL von a
4. e mit der Kontrollplasmid DNA ffnen o DIE KONTROLLEN ZULETZT BEARBEITEN F gen Sie den entsprechenden Reaktionsgef en erst dann Kontrollplasmid DNA hinzu NACHDEM ALLE anderen Reaktionsgef e mit No Template Control und Proben verschlossen worden sind o Wischen Sie ALLE R hrchen und Verschlusskappen nach dem Verschlie en der Kontroll DNA R hrchen mit einem DNA Zerst rungsmittel ab z B 10 Bleichmittel bevor Sie sie in einen anderen Bereich bringen e Achten Sie darauf dass es beim Pipettieren in die 96 Proben Mikrotiterplatte beispielsweise durch Verspritzen w hrend des Mischens oder durch nicht gewechselte Pipettenspitzen nicht zu einer Kontamination der Proben in den angrenzenden Proben kommt Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 22 Anhang A Anhang A A 1 Plattenlayout f r SURVEYOR Scan Kits Das vorgeschlagene Plattenlayout gilt f r die gleichzeitige Durchf hrung aller sieben KRAS und NRAS Exons mit der SURVEYOR Scan Analyse f r 10 Proben F AS Probe Probe Probe Probe Probe Probe X2 2 3 4 8 9 10 Ex 4B 4B WT 4B Mut Schl ssel Ex Exon WT Wild Type Mut Mutation NTC No Template Control A 2 Kontroll DNA Stempel Im Folgenden werden die Sequenzen mit einem Stempel angegeben Schl ssel Die h ufigsten Mutationsregionen sind Mole markiert Die Sequenz in GROSSBUCHSTABEN stellen codierende Basen dar die Sequenz in Kleinbuchstaben stellen n
5. hrchen gesammelt werden Vergewissern Sie sich dass alle L sungen auf dem Boden jeder Vertiefung bzw jeden Reaktionsgef es sind Wenn dies nicht der Fall ist wiederholen Sie die Zentrifugation 12 7 Thermocycler Programm f r Amplifikationsprotokoll 1 Verwenden Sie folgendes Thermocycler Protokoll f r die PCR Amplifikation und Heteroduplex Bildung Initiale Denaturierung 95 C 5 Minuten Touchdown Amplifikation 95 C 30 Sekunden 15 Zyklen 62 C 0 5 C Zyklus 30 Sekunden 72 C 25 Sekunden Amplifikation 95 C 30 Sekunden 30 Zyklen 55 C 30 Sekunden 72 C 25 Sekunden Finale Extension 1 Zyklus 72 C 2 Minuten Heteroduplex Bildung 95 C 2 Minuten lt 12 C Hold 12 8 Qualit tskontrolle der PCR Produkte 1 Bevor Sie mit dem SURVEYOR Nuclease Verdau fortfahren m ssen Qualit t und Quantit t des Amplikons durch Gelelektrophorese oder quivalente Mittel gepr ft werden Analysieren Sie ein Aliquot des PCR Produkts zusammen mit mehreren verschiedenen Mengen einer 100 bp DNA Basenpaarleiter Verwenden Sie die Basenpaarleiter um die Konzentration amplifizierter DNA zu berechnen Es sollte nur ein Fragment mit der zu erwartetenden Groesse des Haupt PCR Produkts in einer Konzentration von mehr als 20 ng ul gefunden werden Falls mehrere Bande vorhanden sind vergewissern Sie sich dass die Qualit t der Eingangsmatrizen DNA ausreichend war siehe Anhang B Fehlersuche
6. Bereiten Sie aus FFPE frische genomische DNA vor wenn mehrere PCR Banden vorliegen 4 Bei Proben die nach der PCR Amplifizierung als starke PCR bzw schwache PCR bewertet wurden kann die Behandlung mit SURVEYOR Nuclease und Analyse mit dem DHPLC System angeschlossen werden Beachten Sie dass mit einer schwachen PCR Zuordnung unzureichende DNA f r das Erzielen aussagef higer Ergebnisse mit DHPLC aber genug DNA f r die Sequenzierung vorhanden sein kann 5 Siehe Anhang B Fehlersuche f r Beispiele fehlgeschlagener SURVEYOR Scan Ergebnisse Alle Proben mit dem Ergebnis SURVEYOR Scan fehlgeschlagen sollten noch mal neu bearbeitet werden a Wenn noch ausreichend genomische DNA vorhanden ist die PCR wiederholen b Aus FFPE erneut DNA extrahieren dies muss die zweite Wahl sein da es normalerweise nicht w nschenswert ist einen FFPE Block nachzuschneiden c Wenn ein anderer Gewebeschnitt oder Block verwendet wird muss der gesamte Test wiederholt werden da es aufgrund der Tumorheterogenit t zu Abweichungen im Verdau kommen kann 6 Wenn keine Spalt Peaks sichtbar sind f r den SURVEYOR Scan ein negatives Ergebnis angeben d h NVD No Variant Detected keine Variante nachgewiesen 7 Wenn eine Probe SURVEYOR Nuclease Spaltprodukte anzeigt entspricht nicht der jeweiligen Wild Type Control sollte sie zur Sequenzbest tigung gesandt werden 8 Wenn die Sequenzbest tigung nicht erfolgreich ist dann a Wenn noch aus
7. Matrizen o c ccccceccccccssscsscsecscsscsesscsscsecscsecsesseseusesecsessesecsessesecsessesecsesessecsaseeseses 10 12 4 berlegungen zum Arbeitsablauf cc cccccccccccccsscesscsscecscecsesecsecsesscsevseseusessesssseveeseusessesesseseusesseseesenss 11 12 5 Amplifikationsprotokoll cccccccssssesccccecsesseesecececseseeessesececeesesessesececeesesaeseseescecsesesaeseeececeesesaeseseesees 13 12 7 Thermocycler Programm f r Amplifikationsprotokoll cccccccecccecessssseseceeececsesseaeeeeeeessesesaeeeeeeeees 15 12 8 Qualit tskontrolle der PCR Produkte ccccecesssececssececeeseeeeceeaaececseeeeceeaeeecseauececeeeeecseceseceeueeeseeaaeess 15 12 9 SURVEYOR N cle se Verda canici csi c coscassacencctesstezateassienisesedeedsvsssactesnascctentad aesae aiaia aE nai aaea 16 13 Kontr llverf hren 2 82 5502 aan ha Bea na cxvsicuapananceakcendctdnen 17 13 1 Qualit tskontrolle f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD ueeneeesssenessnnensennnnnnnnnnnennnnnnnennn 17 13 2 Verwendung von Kontrollplasmid DNAsS c cccccccsssssssecececeeseseeesececeeseseeseseeecessesesaeseeeesceesesaeaeeeeeees 18 14 Interpretation der Ergebnisse unnesnnsennnnnnnennnnnnennnnnnnennnnnnnennnnannennnnanneennnannennnnenneennnenneennn anne 18 14 1 Analyse des KRAS Exon 2 mit der SURVEYOR Nuclease cccsssccccceceesssssceceescessesssaeeeeeesceesesaeeeeeeeees 18 14 2 Auswertung der SURVEYOR Scan Ergebnisse ccccssssccccec
8. bevor Sie weitere Schritte der Probenanalyse durchf hren Die Beispiele unten dienen nur zu Darstellungszwecken und d rfen NICHT verwendet werden um die DNA Sequenz einer gegebenen Mutation festzulegen Die Best tigung der der DNA Sequenz einer Mutation ist erforderlich um eindeutig die Pr senz einer spezifischen Basen nderung in Exon 2 des KRAS Gens zu bestimmen SURVEYOR Nuclease spaltet an jedem Mismatch das sich aus der Heteroduplex Bildung von Wild Type und Mutanten DNAs ergeben nicht nur Mutationen in Exon 2 Die SURVEYOR Nuclease best tigt dass ein Mismatch vorhanden ist Die mutationsspezifische DNA Sequenz der Basen nderung ist zur Bestimmung des KRAS Aktivierungsstatus erforderlich und muss durch eine zweite Methode z B Sequenzierung best tigt werden Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 18 14 Interpretation der Ergebnisse 14 2 Auswertung der SURVEYOR Scan Ergebnisse berpr fen Sie die Chromatogramme und vergleichen Sie die Chromatogramme von Wild Type und Positive Controls mit denen der Probe Bestimmen Sie ob das Chromatogramm der Probe mit dem Wild Type Muster bereinstimmt oder differiert Wenn es sich unterscheidet dann sollte die Probe als SURVEYOR Scan positiv bewertet und zur DNA Sequenzbest tigung geschickt werden Siehe Beispiele in Abbildung 4 sowie Anhang B Fehlersuche Probleme 7 amp 8 f r Beispiele solcher Proben Jede Probe mit einem SURVEYO
9. deaktiviert Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 29 Anhang B Anmerkung Die SURVEYOR Nuclease schneidet gelegentlich bei doppelstr ngigen DNAs an zuf llig ausgew hlten Gen Orten Dies erzeugt nach dem Verdau ein Hintergrundrauschen Diese Aktivit t wird durch den SURVEYOR Enhancer W2 und seinen Cofactor unterdr ckt ohne ansonsten die Mismatch Spaltreaktionen negativ zu beeintr chtigen SURVEYOR Enhancer W2 und SURVEYOR Enhancer Cofactor sind in diesem Kit enthalten und sollten immer verwendet werden Wenn dieses Anschneiden weiter auftritt werden kleine unspezifische Peaks auf dem DHPLC System erzeugt Durch Vergleich der Kontrollverdaus von Homoduplices mit dem Probenverdau k nnen diese unspezifischen Peaks erkannt werden Problem 5 Peaks des SURVEYOR Nuclease Verdaus bei Negativkontrollen M GLICHE r VERDAU PEAKS BEI NEGATIVKONTROLLEN URSACHE LOSUNG Verdau Peaks Kontamination von Alle Kit see Kit Bestandteilen Komponenten _ Kontrolle mit KRAS entsorgen und ein Amplikons oder neues Kit Plasmid Kontrollen verwenden Kontaktieren Sie den Technischen Kundendienst von Transgenomic um DHPLC P DHPLC potenzielle Durchfluss an Wash Ursachen und Se Peak Quellen der Kontamination zu besprechen Problem 6 Fehlgeschlagene SURVEYOR Nuclease Ergebnisse bzw SURVEYOR Nuclease Verdau DER SURVEYOR NUCLEASE VERDAU DER M GLICHE L SUNG POSITIVK
10. dem Wild Type das im Chromatogramm unverdaut ist ist es offensichtlich dass Proben 1 und 2 rote und t rkisfarbene Linie m glicherweise Mutationen enthalten und zur DNA Sequenzanalyse geschickt werden sollten um die Anwesenheit oder das Fehlen einer Mutation am entsprechenden Codon zu best tigen Die Probe 3 gr ne Linie hat im Vergleich zur Wild Type Control hnliche Chromatogramme und muss nicht zur DNA Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 20 14 Interpretation der Ergebnisse Sequenzanalyse geschickt werden Bitte beachten Sie dass das Sequenzierungsergebnis das endg ltige Ergebnis darstellt da es in derselben Fragmentgr e weitere nicht relevante Mutationen geben kann 15 Leistungsmerkmale 15 1 Nachweisgrenze von Mutationen mit SURVEYOR Scan Kits Die Validierung der SURVEYOR Scan Kits f r DHPLC Plattformen mit Plasmidklonen aller angezeigten Mutationen hat gezeigt dass SURVEYOR Nuclease Peaks in einer Konzentration von 2 5 mutierte DNA innerhalb von Wild type DNA nachgewiesen werden k nnen Der automatischen Sequenzierungszuordnung der Vorw rts und auch R ckw rtsstr nge gelingt es h ufig nicht Mutationen mit Werten unter 10 in Gemischen mit Wild Type DNA zu erfassen Zusammen mit den SURVEYOR Nuclease Ergebnissen ist es m glich die 5 10 Sequenzierungselektropherogramme der Mutanten mit mehr Sicherheit zu interpretieren Wenn eine Probenanalyse ein positives SURV
11. 36 702 707 9 Kuang Y et al 2009 Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non small cell lung cancer Clin Cancer Res 15 2630 6 10 Mitani N et al 2007 Surveyor nuclease based detection of p53 gene mutations in haematological malignancy Ann Clin Biochem 44 557 9 11 Engelman JA et al 2006 Allelic dilution obscures detection of a biologically significant resistance mutation in EGFR amplified lung cancer J Clin Invest 116 2695 2706 Siehe auch http world transgenomic comffiles literature 482146 pdf f r Literaturhinweise zur SURVEYOR Nuclease und ihrer Anwendungen MMMM III I III III ooo Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 26 Anhang B Anhang B Fehlersuche Die effektive Verwendung der SURVEYOR Scan Kits f r DHPLC h ngt von der erfolgreichen Ausf hrung einer Reihe von Arbeitsschritten ab Einer der entscheidendsten ist die PCR Amplifikation die zur Produktion einer ausreichenden Menge spezifischer gleichm ig langer DNA f hren muss um nach der Hybridisierung und dem Surveyor Verdau die entstandenen DNA Spaltprodukte nachweisen zu k nnen Das wiederum h ngt von der Qualit t der Ausgangsprobe ab Die Durchf hrung dieses Tests mit DNA die nicht den Qualit t und Quantitatskriterien entspricht ist nicht empfehlenswert Anmerkung Wenn Sie zum ersten Mal mit SURVEYOR Nuclease arbeiten f hren Sie die Untersuchungen im Abschni
12. EYOR Scan Ergebnis zeigt aber mit der DNA Sequenzierung keine KRAS oder NRAS Mutation detektiert wird empfehlen wir dass Keine Variante erfasst als Ergebnis angegeben wird F r weitere Einzelheiten siehe berlegungen zum Arbeitsablauf 15 2 Sequenzbest tigung F r alle SURVEYOR Scan positiven Ergebnisse mu mit der Sequenzbest tigung fortgefahren werden um die Sequenzidentit t der KRAS Exon 2 Mutationen zu bestimmen Bei einem negativen Ergebnis des SURVEYOR Scans muss keine Sequenzbest tigung durchgef hrt werden Die Probe kann als Wild Type oder Keine Variante festgestellt No Variant Detected angegeben werden Die in diesem Kit enthaltenen Universal Sequencing Primer k nnen zur Sequenzbest tigung verwendet werden Der Vorw rts Primer hat die PN 710153F Universal Sequencing Primer 1 der R ckw rts Primer die PN 710153R Universal Sequencing Primer 2 15 3 Verfahrensbeschr nkungen Bei der Extraktion der formalinfixierten paraffineingebetteten Proben bertragene Kontaminierungsstoffe k nnen ebenfalls die PCR Amplifikation und SURVEYOR Nuclease Verdauungsvorg nge st ren Die in Verfahren zur Qualit tskontrolle beschriebenen Vorgehensweisen zur Qualit tskontrolle gew hrleisten dass die extrahierte DNA zur Verwendung mit diesem Kit geeignet ist Dieses Kit wurde f r die Verwendung mit formalinfixierten paraffineingebetteten Biopsieproben von Kolorektaltumoren validiert Eine Validierung f r eine Verw
13. ONTROLLEN IST FEHLGESCHLAGEN URSACHE SURVEYOR Eine neue Probe Nuclease nicht verdauen hinzugef gt Ungeschnittener Homoduplex Undeutliche Peak SURVEYOR Eine neue Probe Verdau Nuclease Verdau verdauen Peaks wurde bei falscher Temperatur durchgef hrt FARLIN Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 30 Problem 7 Unerwartete Peaks beim SURVEYOR Nuclease Verdau DER SURVEYOR NUCLEASE VERDAU DER MOGLICHE LOSUNG POSITIVKONTROLLEN IST FEHLGESCHLAGEN URSACHE E Mutation Probe befindet sich an sequenzieren Ungeschnittener ungew hnlicher um Mutation zu ce Stelle bestatigen 10 Unerwarteter Verdau aol N Y DHPLC Unerwartete DHPLG Durchfluss Verdau Peaks Wash Peak Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 31 Problem 8 Kontamination von Probe mit Positive Controls Verdaumuster stimmen mit Anwesenheit von M GLICHE N gestempelten Regionen der gemischten Positive URSACHE LOSUNG Controls und Wild Type Heteroduplices berein Probe 1 Schlechte Beim Pipettieren Pipettiertechnik der Proben Probe 2 Probe 3 besonders darauf achten dass es nicht zu Kreuzkontaminatio nen kommt berpr fen Sie die Regionen der Kontrollstempelseq uenz auf i L Kontamination der Positive Control
14. OR Enhancer W2 PN 710161 2 0 uL SURVEYOR Nuclease W PN 710160 Oder f gen Sie 5 uL Master Mix hinzu der wie in der Tabelle oben vorbereitet wurde 5 Vortexen Sie den SURVEYOR Nuclease Digest Master Mix 10 Sekunden bei niedriger Geschwindigkeit 6 Zentrifugieren Sie den SURVEYOR Nuclease Digest Master Mix 10 Sekunden bei niedriger Geschwindigkeit 7 Legen Sie den SURVEYOR Nuclease Digest Master Mix bis zur Weiterverarbeitung auf Eis Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 16 12 Schritt f r Schitt Anleitung Anmerkung Der in Schritt 7 vorbereitete SURVEYOR Nuclease Digest Master Mix muss sofort verwendet werden da SURVEYOR Nuclease W mit der Zeit inaktiv wird wenn sie mit den anderen Komponenten des SURVEYOR Nuclease Digest Master Mix in Ber hrung kommt 8 Pipettieren Sie je 5 0 uL Aliquot des SURVEYOR Nuclease Master Mix in jedes Reaktionsgef bzw jede Vertiefung das bzw die 10 0 uL Aliquot des amplifizierten PCR Produkts enth lt siehe Schritt 3 oben 9 Wenn Sie mit dem Pipettieren fertig sind zentrifugieren Sie die 0 2 mL PCR Reaktionsgef e bzw die 96 Loch Mikrotiterplatte 10 Sekunden lang 10 Vortexen Sie die 0 2 mL PCR ReaktionsgefaBe bzw die 96 Loch Mikrotiterplatte vorsichtig 10 Sekunden lang 11 Zentrifugieren Sie 10 Sekunden bei niedriger Geschwindigkeit dieser Schritt ist besonders wichtig wenn der Verdau in einem Instrument ohne beheizten Deckel d
15. Patientenproben mit den SURVEYOR Scan Kits Das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD darf nur zusammen mit einem der unten genannten Arbeitsabl ufen verwendet werden Arbeitsablauf B Arbeitsablauf A Patientenprobe Patientenprobe M Ergebnis 4 Test KRAS Exon2 gt KRAS Codon 12 Test KRAS Exons 2 3 amp 4 und NRAS Exons 2 3 amp 4 Ergebnis 4 KRAS Codon 12 aia oder 13 Wild Type ausgeben Ergebnis 4 ausgeben Test See Exons 3 amp 4 und See Exons 2 3 amp 4 ausgeben oder 13 Mutation Abbildung 1 SURVEYOR Scan Mutation Detection Kit Arbeitsablaufe fur das Screening auf KRAS und NRAS Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 4 3 Testprinzip des SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Assay Als Vorschlag wie eine 96 Loch Mikrotiterplatte f r die Analyse von KRAS Exon 2 4 und NRAS Exon 2 4 anzulegen ist siehe Anhang A 1 Plattenlayout f r SURVEYOR Scan Kits 3 3 SURVEYOR Nuclease Die SURVEYOR Nuclease von Transgenomic ist eine mismatch spezifische Pflanzen DNA Endonuclease die die Heteroduplex DNA auf bekannte und unbekannte Mutationen und Polymorphismen durchsuchen kann Das Enzym schneidet mit hoher Spezifitat einen DNA Doppelstrang an Stellen wo durch einen Basenaustausch oder andere Sequenzveranderungen Basen nicht miteinander paaren k nnen Diese DNA Nuclease spaltet beide Strange eines DNA Heteroduplex am 3 Ende der Mismatch Stelle Insertion Deletion Mism
16. R Nuclease Muster dass sich von dem des Wild Type unterscheidet sollte f r eine Sequenzbest tigung eingeschickt werden selbst wenn sie nicht mit der Kontrolle identisch ist Siehe Anhang B Fehlersuche Problem 7 f r ein Beispiel einer solchen Probe Falls erforderlich vergr ern Sie bitte den Bildausschnitt und berlagern Sie das Chromatogramm Ihrer Probe mit dem Chromatogramm der Wild Type Control Vermerken Sie alle Unterschiede zwischen der Wild Type Control und der analysierten Probe Wichtig F r eine sorgf ltige Pr fung jeder Probe sollte der Pr fer kontrollieren ob nebeneinanderliegende Proben in der Analyseplatte identische positive SURVEYOR Scan Ergebnisse ausweisen Das Auftreten identischer positiver Ergebnisse kann das Resultat einer Kreuzkontamination von Probe und Kontrolle sein Die Analyse muss in diesem Fall wiederholt werden MMMM III I I III IIIo Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 19 14 Interpretation der Ergebnisse 14 3 Beispielergebnisse Abbildung 4a und 4b zeigen Beispielergebnisse die mit dem SURVEYOR Scan KRASKit Exon 2 CE IVD f r DHPLC erzielt wurden Bei diesen Beispielen wurde unter Verwendung des WAVE 4500 Systems mit UV und Fluoreszenz Detektoren das im Abschnitt Schritt f r Schritt Anleitung dargestellte Verfahren genau eingehalten F r Hinweise zu empfohlenen Gradienteneinstellungen f r die Analyse von SURVEYOR Nuclease Verdauproduk
17. S Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 23 Anhang A e Entwickelt f r die Gr entrennung von dsDNA Fragmenten Fragmentgr e 50 bp bis 250 bp S ulenofen mit hoch pr ziser Temperaturregelung e Temperaturbereich 40 bis 70 C e Temperaturgenauigkeit 0 2 C e Temperaturreproduzierbarkeit 0 2 C e Linearit t ber vollst ndigen Temperaturbereich 2 0 C Alternative Nachweismethode 1 e UV VIS Detektor e Wellenlangenbereich 190 700 nm e UV Quelle Deuteriumlampe Alternative Nachweismethode 2 e Fluoreszenz Detektor e Wellenlangenbereich Anregung 200 850 nm Emission 250 900 nm e Fluoreszenzquelle 150 W Xenonlampe e Pumpe f r Fluoreszenzfarbstoff e Feste Durchflussrate bei 0 1 mL min 20 50 e Pulsationsarmer Durchfluss A 3 2 Systembetrieb Zur Installation und Betrieb des DHPLC Systems richten Sie sich nach den Empfehlungen des Herstellers zur Analyse von dsSDNA Fragmenten in der Gr enordnung von 50 bp bis 250 bp mit einer Zielaufl6sung von mindestens 10 bp Dies ist der Gr enbereich f r Fragmente nach SURVEYOR Nuclease Verdau mit diesem Kit F r Hinweise zu empfohlenen Gradienteneinstellungen f r die Analyse von SURVEYOR Nuclease Verdauprodukten mit dem DHPLC System gehen Sie auf http world transgenomic com diagnostic tools genetic analysis kits crc rascan kits eu dhpicsystemsettings A 3 3 Wartung der DHPLC Trenns ule F r die Wartung der DHPLC Trenns ule befolgen Sie die Empfeh
18. arbiologie hinzu F gen Sie dem Master Mix R hrchen die erforderliche Menge DNA Polymerase 10X PCR Buffer hinzu F gen Sie denm Master Mix Reaktionsgef das erforderliche Volumen an 10 mM dNTPs hinzu F gen Sie den jeweiligen Master Mix Reaktionsgef das erforderliche Volumen KRAS Forward Primer hinzu F gen Sie den jeweiligen Master Mix Reaktionsgef das erforderliche Volumen KRAS Reverse Primer hinzu Nehmen Sie die DNA Polymerase PN 703310 aus dem Gefrierschrank Zentrifugieren Sie die DNA Polymerase f r 10 Sekunden Mischen Sie die DNA Polymerase f r 10 Sekunden mit dem Vortexer F gen Sie dem Master Mix Reaktionsgef das erforderliche Volumen DNA Polymerase hinzu Schlie en Sie das Master Mix Zentrifugenr hrchen mit dem Deckel Mischen Sie vor dem Gebrauch das Master Mix Zentrifugenr hrchen 30 Sekunden mit dem Vortexer und zentrifugieren Sie es dann kurz 10 Sekunden lang Lagern Sie es bis zum Gebrauch auf Eis Pipettieren Sie 48 0 uL siehe Anmerkung oben in Schritt 6 Master Mix in die entsprechenden Vertiefungen Wechseln Sie bei Verwendung einer Einkanalpipette jedes Mal die Spitze Wenn Sie eine Dispenserpipette verwenden achten Sie darauf dass von Vertiefung zu Vertiefung nichts verspritzt wird Halten Sie die Platte auf Eis F gen Sie in die entsprechenden Vertiefungen 2 0 uL siehe Anmerkung oben in Schritt 6 der Probenmatrizen DNAs oder Wasser No Template Control NTC hinzu Verwende
19. atches und alle Basenaustausch Mischmatches werden erkannt aber die Spalteffizienz variiert mit der Mismatch Sequenz Ort des Mismatches u w Abbildung 2 Wirkungsweise der SURVEYOR Nuclease Die Endonuclease erkennt ein Mismatch und spaltet am 3 Ende der Mismatch Basen Das spaltet den DNA Doppelstrang was einen Entstandene Fragmente einzigen 3 Basentberhang k T A 3 hinterl sst 3 5 Die SURVEYOR Nuclease wurde in einer ganzen Reihe von Projekten eingesetzt um in Genen eine Vielzahl von Mutationen und Polymorphismen nachzuweisen Insbesondere wird die SURVEYOR Nuclease verwendet um in einer Reihe von Genen bekannte Mutationen zu best tigen die mit Nieren Lungen Kopf und Halskrebs sowie Leuk mie und Endometriumkarzinom in Verbindung gebracht werden Ebenso wurde sie zur Ergebnisprognose einer Strahlentherapie eingesetzt Das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD ist zur Spaltung von Mismatches im KRAS Exon 2 und der anschlie enden Analyse durch die DHPLC Technologie vorgesehen SURVEYOR Nuclease wu w Anmerkung Wenn eine Probe 100 mutante DNA enth lt k nnen keine Heteroduplices gebildet werden und die Probe erscheint als Wild Type Allerdings enthalten aufgrund von Tumorheterogenit t und oder kontaminierendem normalen Gewebe Biopsieproben von Tumoren Wild Type Zellen bitte beachten Sie dass mit diesem Kit das Ergebnis f r 5 Wild Type identisch zu Ergebnissen mit 5 mutanter DNA sind A
20. der Analyse liefern die Chromatogramme dieser SURVEYOR Nuclease verdauten Kontrollamplikons auf dem DHPLC System einen Hinweis darauf wo die Peaks der Spaltprodukte die der Mutation in KRAS Exon 2 entsprechen sogar bei geringer Konzentration eluieren werden siehe Abbildung 4 6 Peaks von Spaltprodukten die anderen Mutationen in KRAS Exons 2 entsprechen k nnen zu leicht unterschiedlichen Retentionszeiten eluieren Wenn die PCR Amplikons nicht den Ergebnissen in Abschnitt Qualit tskontrolle der PCR Produkte entsprechen sehen Sie in Anhang B Fehlersuche nach oder setzen Sie sich mit dem Kundendienst von Transgenomic in Verbindung bevor Sie weitere Schritte der Probenanalyse durchf hren Et en Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 17 13 Kontrollverfahren 13 2 Verwendung von Kontrollplasmid DNAs Mit dem Kit werden zwei Kontroll DNAs geliefert KRAS Control Wild Type PN 710131 KRAS Positive Control Exon 2 PN 710135 Diese Kontroll DNAs sind Plasmide mit Insertionen Die Positive Control enth lt zwei Plasmide eine Mischung aus KRAS Control Wild Type und einem Mutationsklon der sich vom Wild Type in einem einzigen Basenpaar unterscheidet Die Kontrollen werden in getrennten Reagenzgef en geliefert jede mit einer Konzentration von 10 Kopien uL Die f r die PCR Amplifikation ben tigten KRAS Exon 2 Forward und Reverse PCR Primer werden im Kit getrennt geliefert Bitte befolgen Si
21. diagnostischen Analyse von somatischen KRAS Exon 2 Mutationen entwickelt Das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD ist ein Test f r den Nachweis aller Sequenzen und kleiner Insertions Deletionsmutationen in Exon 2 des KRAS Gens Mutationen im KRAS Codon 12 und 13 wurden mit der mangelnder Wirksamkeit von Panitumumab in Verbindung gebracht Mit diesem Kit werden Positive Control f r Mutationen in Codon 12 mitgeliefert Dieses Kit verwendet die patentrechtlich gesch tzte Technologie SURVEYOR Nuclease von Transgenomic und bietet in Verbindung mit der DHPLC Technologie einen einfachen und empfindlichen Mutationsnachweis Damit kann vor einem Hintergrund aus nicht mutanter DNA ein Gemisch aus 2 5 mutanter DNA nachgewiesen werden Untersuchungen zur Validierung haben eine sehr hohe bereinstimmung mit der Sequenzierung von gut charakterisierten kolorektalen Tumorproben gezeigt Durch die Verwendung des SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD reduziert sich f r den Anwender die Sequenzierungsarbeit und erm glicht dar ber hinaus eine sehr genaue Sequenzzuordnung wo eine automatische Sequenzierungssoftware eine Mutation oft nicht kl ren kann Aufgrund der hohen Empfindlichkeit verglichen mit der Sanger Sequenzierung wird empfohlen die Laboreinrichtung zu optimieren um eine Kreuzkontamination von Proben oder Kontrollen zu vermeiden Ein Beispiel einer idealen Laboreinrichtung finden Sie im Anhang A 4 Laboreinrichtung f r PCR Tests 3 2 Analyse von
22. e f r den Gebrauch dieser Kontrollen die Anleitungen in Amplifikationsprotokoll SURVEYOR Nuclease Verdau und Analyse des KRAS Exon 2 mit der SURVEYOR Nuclease PERSONEN DIE DIESEN TEST ZUM ERSTEN MAL DURCHFUHREN WIRD DRINGEND EMPFOHLEN ZUNACHST TESTS MIT DEN KONTROLLEN DURCHZUFUHREN BEVOR SIE GENOMISCHE PROBEN BEARBEITEN 14 Interpretation der Ergebnisse 14 1 Analyse des KRAS Exon 2 mit der SURVEYOR Nuclease F hren Sie zu Vergleichs und Kontrollzwecken bei allen Kontrollen Wild Type und Positive Controls einer No Template Control sowie bei den Proben DNAs IMMER auch den SURVEYOR Nuclease Verdau durch und analysieren sie diesen Verdau auf derselben Probenplatte auf dem DHPLC System Beim SURVEYOR Nuclease Verdau zeigen die Ergebnmisse dieser Kontrollplasmid DNAs ob die Bedingungen der Spaltreaktion Herstellung des SURVEYOR Nuclease Gemisches und Inkubationsbedingungen zufriedenstellend waren Bei der Analyse liefert das DHPLC System Spuren dieser verdauten Kontrollamplikons der SURVEYOR Nuclease einen Anhaltspunkt wo die DNA Fragmente aus der Spaltung an diesen spezifischen Mutations Mismatch Stellen auch bei geringer Konzentration eluieren werden siehe Abbildung 4 Wenn entweder die PCR Amplikons oder die aus den Kontroll DNAs stammenden SURVEYOR Nuclease Spaltfragmente nicht den dargestellten Ergebnissen entsprechen sehen Sie im Anhang B Fehlersuche nach oder wenden Sie sich an den technischen Kundendienst von Transgenomic
23. emacht Wenn Sie Fragen zu Angaben in dieser bersetzte Version des Handbuchs haben auf die englische Version Instructions for Use for the SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC Systems 482404 EN http world Transgenomic com files literature 482404 EN pdf_ und oder Kontakt zu verweisen Transgenomic support transgenomic com Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 33 Be Lizenzen Handelsmarken amp Copyright Lizenzen Handelsmarken amp Copyright SURVEYOR Nuclease Dieses Produkt wurde unter exklusiver Lizenz der US Patente 6 699 980 6 391 557 5 869 245 sowie zugeh riger Patentanspr che au erhalb der USA und weiterer anh ngiger Patente hergestellt F r die Verwendung von SURVEYOR Nuclease ist eine Lizenz von Transgenomic erforderlich Akademische Non Profit und For Profit Organisationen besitzen mit Kauf dieses Produkts eingeschr nkte Rechte die SURVEYOR Nuclease zu Forschungszwecken zu nutzen Ein Weiterverkauf bzw eine anderweitige Verwendung sind streng verboten F r weitere Informationen wenden Sie sich bitte an Transgenomic DNA Polymerase Die Verwendung dieses Produkts ist durch eine oder mehrere der folgenden US Patente 5 789 224 5 618 711 6 127 155 sowie zugeh riger Patentanspr che au erhalb der USA gesch tzt US Patent Nr 4 889 818 gesch tzt Der Kauf dieses Produkts schlie t ein eingeschranktes nicht bertragbares Nutzungsrecht dieses Produkts
24. en Komponenten enth lt Diese Bedienungsanleitung ist auch als Download erh ltlich unter http world transgenomic com files literature 482404 DE pdf 2 2 Angaben zum Gebrauch Mediziner k nnen den SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD mit den DHPLC Systemen als Hilfe bei der Entscheidung verwenden ob Patienten mit kolorektalem Karzinom auf eine Therapie mit einem Anti EGFR Epidermal Growth Factor Receptor bzw epidermalen Wachstumsfaktor Rezeptor Therapeutikum wie Panitumumab ansprechen Das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD muss zusammen mit dem SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 amp 4 CE IVD und dem SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE IVD verwendet werden Das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD darf nicht zur Diagnose von kolorektalem Karzinom oder anderer Krebsarten verwendet werden Das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD weist auf die Anwesenheit von potenziellen somatischen Mutationen im KRAS Gen Exon 2 hin best tigt aber nicht die Sequenzidentit t der Mutation Um nachzuweisen um welche Mutation es sich genau handelt sind weitere Untersuchungen wie zum Beispiel eine DNA Sequenzierung erforderlich Die mit diesem Kit erhaltenen Ergebnisse sollten ein Hinweis auf den Mutationsstatus eines Patienten sein es m ssen jedoch weitere klinische Faktoren ber cksichtigt werden einschlie lich Mutationen in KRAS Exons 3 amp 4 und NRAS Exons 2 3 amp 4 Ergebnisse mit dem SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD d rfen nic
25. endung mit anderen Krebsarten oder frischen bzw tiefgefrorenen Biopsieproben besteht nicht Zur Fehlersuche nicht standardm iger Ergebnisse und Einzelheiten zu Faktoren die diesen Test beeintr chtigen k nnen siehe Anhang B Fehlersuche weiter unten Bei diesem Kit muss besonders darauf geachtet werden bertragung und Kreuzkontamination zu vermeiden Die hohe Empfindlichkeit der Testmethode erfordert besondere Vorsichtsma nahmen in folgenden Punkten e Achten Sie darauf dass alle Proben so gehandhabt werden dass eine Kreuzkontamination zwischen ihnen nicht vorkommen kann e Arbeiten Sie an einem PCR Arbeitsplatz oder in einem anderen geeigneten Raum wo der Arbeitsbereich vor dem Aufbau von PCR Amplifikationsreaktionen UV Licht ausgesetzt werden kann e Verwenden Sie einen getrennten PCR Arbeitsplatz bzw Raum um die Proben nach der PCR Amplifikation f r die Qualit tskontrolle durch Gelelektrophorese zu ffnen e Der SURVEYOR Nuclease Verdau sollte in einem Raum oder an einem PCR Arbeitsplatz stattfinden wo die erste PCR nicht stattgefunden hat Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 21 15 Leistungsmerkmale e Achten Sie darauf dass bei allen Testschritten die Plasmidkontrollen des Kits von den Testproben getrennt gehandhabt werden o Stellen Sie sicher dass alle L sungen No Template Controls und fertig pipettierte DNA Proben verschlossen sind bevor Sie die Reaktionsgef
26. enge Matrize Anmerkung Es sollte hochwertige DNA aus FFPE verwendet werden Die DNA sollte eine durch Absorption bei 260 nm gemessene Konzentration von 25 ng uL aufweisen sowie ein Absorptionsverh ltnis von 260 280 nm von gr er 1 8 haben und gr er als 90 DNA sein d h nahezu frei von tRNA und rRNA Kontamination laut Agarosegelauswertung DNA Proben zwischen 20 C und 80 C aufbewahren Die Analyse von DNA Template das aus paraffineingebettetem Gewebe extrahiert wurde erfordert mehrere Vorsichtsma nahmen Die DNA kann mit Uracil DNA Glycosylase behandelt werden um eine Amplifikation von DNA Fragmenten zu vermeiden die deaminierte C Reste enthalten H ufig wird ein hoher Prozentsatz des aus dem paraffineingebetteten Gewebe extrahierten Azco Adsorptionsmittels bei der PCR nicht gut amplifiziert Oft hilft eine gr ere Menge Start DNA um ein geeignetes Amplifikationsprodukt zu erhalten Eine weitere berlegung w re FFPE Tumorschnitte mit einem hohen Prozentanteil an Tumorzellen zu w hlen Mikrodissektion kann ebenfalls verwendet werden ist aber zeitaufwendig und f r das normale Routinelabor nicht empfehlenswert Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 27 Anhang B Problem 2 Mehrere PCR Produkte wenn auf Agarosegel analysiert bzw verifiziert wurde MEHRERE PCR PRODUKTE M GLICHE URSACHE L SUNG Anlagerungstemperatur zu berpr fen Sie die Kalibrier
27. er wird empfohlen dass alle diese Mutationen durch Doppelanalyse f r dieselbe genomische DNA best tigt oder alle Proben ab Analysebeginn im Doppelansatz durchgef hrt werden 12 5 Amplifikationsprotokoll 1 Die vorgemischte dNTP L sung PN 703065 von Transgenomic wird in einer Gebrauchskonzentration von 10 mM Gesamtdeoxynucleotid je 2 5 mM der vier Deoxynucleotide geliefert 2 Die KRAS Exon 2 Forward und Reverse PCR Primer PN 710155F und 710155R sind 10 uM 3 Nehmen Sie die 10 uM Primerloesung 10 mM dNTPs und den DNA Polymerase 10X PCR Buffer PN 703315 aus dem Gefrierschrank und lassen alles auf Eis auftauen 4 Nach dem Auftauen Mischen Sie alle Kit Komponenten im Vortexer 10 Sekunden zentrifugieren Sie kurz an 10 Sekunden um zu gew hrleisten dass keine Fl ssigkeit an den Beh lterdeckeln bleibt und lagern Sie sie auf Eis Bereiten Sie auf Eis den Master Mix vor 6 Bereiten Sie einen Master Mix f r KRAS Exon 2 Reaktionen anhand der folgenden Tabelle vor Anzahl der Reaktionen 10 Volumenberechnung Volumen Wasser uL 330 DNA Polymerase 10X PCR Buffer uL 50 dNTPs uL 40 KRAS Primer Exon 2 Forward uL 25 KRAS Primer Exon 2 Reverse uL 25 DNA Polymerase uL 10 Master Mix Gesamtvolumen 48 0 Anmerkung Der Anwender sollte auf ein Minimum von 25 ng DNA je 50 uL Reaktion abzielen Erh hen Sie f r extrahierte DNA Konzentrationen mit weniger als 12 5 ng L proportional das Volumen ex
28. erenz DNA Anschlie end an den letzten PCR Amplifikationszyklus wird zum Aufschmelzen s mtlicher Doppelstrange das PCR Produkt erhitzt und dann zur optimalen Bildung von Hetero und Homoduplices langsam abgek hlt Heteroduplices kommen vor wenn ein Strang einer Wild Type Sequenz mit einem Strang einer mutanten Sequenz hybridisiert Schritt 2 Behandlung des hybridisierten Heteroduplex Homoduplex Gemischs mit SURVEYOR Nuclease SURVEYOR Nuclease schneidet beide Str nge der Hetereroduplex DNA und l sst DNA Fragmente entstehen Die gleichbehandelte Control Wild Type DNA dient als Hintergrundkontrolle Schritt 3 Analyse der DNA Fragmente mit dem DHPLC System Die Bildung neuer Spaltprodukte aufgrund von einem bzw mehreren Mismatch wird durch zus tzliche chromatografische Peaks angezeigt Die Retentionszeit der Spaltprodukte weist auf die Gr e der Fragmente und daher den ungef hren Ort des der Mismatches hin Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 9 12 Schritt f r Schitt Anleitung 12 Schritt f r Schritt Anleitung 12 1 DHPLC Grundeinstellung Kalibration Bei der Vorbereitung der SURVEYOR Nuclease Platte zur Analyse mit dem DHPLC schlagen Sie bitte nach im Anhang A 3 HPLC DHPLC Systemanforderungen f r die Denaturierung 12 2 berlegungen vor Beginn der KRAS Probenanalyse Bevor Sie Proben auf einem DHPLC System laufen lassen muss ein geeigneter DNA Gr enstandard getest
29. esem Kit Hochreines Wasser f r die Molekularbiologie 0 2 mL PCR Reaktionsgef e Streifen oder 96 Loch Mikrotiterplatte Mikropipetten Pipettenspitzen Eisbad Vortexer Mikrozentrifuge Thermocycler Agarosegele und Ausr stung f r Agarosegel Elektrophorese 10 Bleiche oder hnliches Reinigungsmittel Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 7 7 Reagenzienvorbereitung 7 Reagenzienvorbereitung Alle Reagenzien dieses Kits sind gebrauchsfertig Einige Komponenten m ssen vor Gebrauch aufgetaut mit dem Vortexer gemischt oder in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert werden Einzelheiten siehe weiter unten unter Testverfahren Reagenzien m ssen zur Herstellung von Master Mix und Reaktionsgemischen gemischt werden Eine genaue Anleitung finden Sie im Abschnitt Testverfahren 8 Lagerung und Haltbarkeit Das Kit muss bis zu seinem Gebrauch zwischen 18 C und 25 C in einem Gefrierschrank mit konstanter Temperatur aufbewahrt werden Achten Sie bei jedem erhaltenen Kit auf das Verfallsdatum Das Kit nicht mehr verwenden wenn das Verfallsdatum berschritten ist Das in Schritt 7 des SURVEYOR Nuclease Verdaus vorbereitete SURVEYOR Nuclease Reaktionsgemisch muss sofort verwendet werden da die Anwesenheit bestimmter Komponenten im SURVEYOR Nuclease Reaktionsgemisch die SURVEYOR Nuclease W mit der Zeit inaktiviert 9 Warnhinweise amp Vorsichtsma nahmen Keines der Reagenzien in diesem Kit
30. et werden um zu gew hrleisten dass das System einwandfrei funktioniert Das Laborpersonal das mit dem Instrument arbeitet sollte vor Durchf hrung der Analyse die Qualit t mit dem DNA Gr enstandards pr fen 12 3 berlegungen zu den Matrizen 1 Verwenden Sie f r die FFPE isolierte Matrizen DNA die blichen Labortechniken um die Qualit t und Quantit t der extrahierten DNA zu bewerten und um zu gew hrleisten dass f r die PCR ausreichend Matrize vorhanden ist 2 Das 260 280 Absorptionsverh ltnis muss gr er als 1 80 sein 3 Um das PCR Setup zu beschleunigen stellen Sie die Gebrauchskonzentration der Matrize auf ungef hr 12 5 ng uL ein Verd nnen Sie bei Bedarf die Matrizen DNA mit hochreinem Wasser f r die Molekularbiologie EE Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 10 12 Schritt f r Schritt Anleitung 12 4 berlegungen zum Arbeitsablauf Das Kit ist f r die Analyse von 100 Reaktionen ausgelegt Kleinere Probenserien k nnen ausgef hrt werden aber die Kit Kontrollen und eine No Template Control m ssen bei jeder Probenserie mitgef hrt werden Im Kit ist ausreichend Kontrollmaterial f r 100 Reaktionen aller Kombinationen der zu verwendenden Probenseriengr en vorhanden Im Allgemeinen sollte die Probenverarbeitung von Anfang bis Ende so ausgef hrt werden wie in dieser Bedienungsanleitung beschrieben Wenn die Verarbeitung einer Probe vor der Fertigstellung a
31. f r eigene Forschungszwecke des K ufers ein Es wird damit kein Recht unter einem anderen Patentanspruch wie die patentierten 5 Nuclease Verfahrensanspr che unter US Patent Nummern 5 210 015 und 5 487 972 kein Recht zur Durchf hrung einer patentierten Methode sowie kein Recht zur Durchf hrung jedweder kommerzieller Dienstleistungen insbesondere die bermittlung von Ergebnisse der T tigkeiten von Erwerbern gegen ein Honorar oder andere wirtschaftliche Gegenwerte weder ausdr cklich noch implizit bzw durch Rechtsverwirkung abgetreten Dieses Produkt dient ausschlie lich Forschungszwecken F r die diagnostische Verwendung unter Roche Patenten ist eine separate Lizenz von Roche erforderlich F r weitere Informationen ber den Erwerb von Lizenzen wenden Sie sich an den Director of Licensing Applied Biosystems 850 Lincoln Centre Drive Foster City California 94404 USA Transgenomic SURVEYOR und WAVE sind eingetragene Marken und Navigator CRC RAScan das Helix Logo und Advancing Personalized Medicine sind Marken von Transgenomic Inc Alle anderen Marken sind das Eigentum ihrer jeweiligen Inhaber 2013 Transgenomic Inc Alle Rechte vorbehalten Gedruckt in den USA Dokument Nr 482404 DE rev 04 ee Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 34
32. getestet werden k nnen ccccscccccesesssssseeeeeeceeseeeeeceeeceeseeteaeees 6 5 2 DNASSEAUENZIErUNB rannte inne ande name ande nn ande sien Re here ne RR re ren Re ee Re ee 7 6 Zus tzlich erforderliche Ausr stung und Reagenzien uuesunsnsansnnnnnnnannnnnannnnnnnnnnnnnnnannnnnannn 7 7 Reagenzienvorbereitung nnunssrrnennnennnnnnnennnnnnennnnnnnnennnan nennen nennen nennen nennen nennen nennen 8 8 Lagerung Und H ltbarkeit 244 z042022420020 00a nenn nn nnmnnn nnmnnn nnmnnn nnmnnn nnn nana 8 9 Warnhinweise amp Vorsichtsma nahmen 0cccceceseeeeeeeeeeeeeenneeeaeeeceeeeeensesnaneeseeeenennesneeeeeesees 8 10 Prim re Probenentnahme Handhabung und Lagerung uuusuresnsnnnnnnnannnnnannnnnnnnnnnnnnnannnnnannnnn 8 11 Testverfahren wcceds se sceceniinnsxenanensenecesesSenenenteceantssaseanasnuchuenssannatosdncetenssannapncctdsasessenaseescecsseennsnonnnens 9 11 1 Somatischer Mutationsnachweis mit SURVEYOR Scan Kits Ein Uberblick ccccccccccssssessesescssseeseeeees 9 12 Schritt f r Schritt Anleitung nuesusnsssnsnnnnnnnannnnnnnnnnnnnnnnnnnnnannnnnannnnnnnnnnnnnnnannnnnnnnnnnnnnnannnnn nn 10 12 1 DHPLC Grundeinstellung Kalibration ccccccsscsscssscssscssecssecssccsescsescsssseseessesseeeseesceaeceascsuecaaecseeeaeeees 10 12 2 berlegungen vor Beginn der KRAS Probenanalyse c ccccccccecessessscsscsesecsscsesecsessesscsessesecsessesessesseseens 10 12 3 berlegungen zu den
33. h Positive Controls zu erkennen Siehe Anhang B Fehlersuche Problem 8 f r ein Beispiel eines SURVEYOR Scan Ergebnisses einer solchen Kontamination Der KRAS Control Wild Type wurde durch Synthese und Klonierung von KRAS Exon 2 unter Verwendung der NCBI Referenzsequenz oben konstruiert Das KRAS Positive Control Exon 2 wurde durch Synthese von KRAS Exons 2 3 und 4 unter Verwendung der NCBI Reference Sequence oben konstruiert enth lt aber die G12D Mutation DNA Sequenzierung bestatigte dass die einzige Anderung in der Sequenz von Codon 12 in einer G12D Alteration GGT gt AGT vorliegt Dieser Klon wird dann mit KRAS Control Wild Type DNA gemischt um eine heterozygote Mischung zu erhalten 5 Komponenten Das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD besteht aus 1 einer SURVEYOR Box mit Verdau Komponenten mit 10 Reagenzgef en ohne leere L cher und 2 einer Schachtel f r PCR Komponenten und Kontrollr hrchen mit 11 Reagenzgef en und 9 leeren L chern T Kit f r 100 eae Kit Komponente Toone te oa Testreaktionen gelieferte Menge SURVEYOR Box mit Verdau Komponenten 710160 SURVEYOR Nuclease W Violett 2x 105 uL 710161 SURVEYOR Enhancer W2 Schwarz 105 uL 708049 SURVEYOR Enhancer Cofactor Rosa 105 uL 708027 0 15 M MgCl Solution Braun 105 uL 708030 SURVEYOR Stop Solution Rot 250 uL 710153F Universal Sequencing Primer 1 10 uM Orange 2x 125 uL 710153R Universal Sequencing Primer 2 10 uM Orange 2x 125 uL PCR Box mit Ko
34. ht als die einzige Methode zur Entscheidungsfindung einer Behandlung von Patienten mit kolorektalem Karzinom herangezogen werden Es ist wichtig darauf hinzuweisen dass Die Anwendung der DHPLC Methode mit diesem Kit zur Identifikation von Proben mit positivem Testergebnis f r eine KRAS Mutation nur als Richtlinie zu verwenden ist und alle Mutationen durch weitere Analyse wie zum Beispiel durch eine DNA Sequenzierung best tigt werden m ssen 7 Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 3 3 Testprinzip des SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Assay 3 Testprinzip des SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Assay 3 1 KRAS und NRAS Auf den Epidermal Growth Factor Receptor EGFR gerichtete therapeutische Wirkstoffe haben sich bei kolorektalem Karzinom als wirksam erwiesen Die Forschung hat gezeigt dass rund 40 der kolorektalen Tumoren somatische KRAS Genmutationen tragen und klinische Studien haben bewiesen dass Mutationen in KRAS Exon 2 Codon 12 und 13 mangelndes klinisches Ansprechen auf Anti EGFR Therapien voraussagen Neueste explorative Studien haben gezeigt dass Patientenpopulationen weiter differenziert werden k nnen da Patienten deren mCRC Tumoren eine zus tzliche Mutation in KRAS Exon 3 und 4 oder NRAS Exon 2 3 und 4 bergen ebenfalls dazu neigen nicht auf eine Therapie mit Anti EGFR anzusprechen Dieses Kit wurde f r den Gebrauch in der
35. icht codierende Basen dar Die Kontrollen haben genetische Stempel die Gelb markiert sind diese Variationen von der KRAS Wild Type Sequenz in einem Bereich in dem keine Mutationen erwartet werden k nnen verwendet werden um Probleme mit der Probenkontamination durch Positive Controls zu erkennen Siehe Anhang B Fehlersuche Problem 8 f r ein Beispiel einer SURVEYOR Scan Spur einer solchen Kontamination KRAS Exon 2 Stempel Amplikongr e 190 bp F r die Herstellung des genetischen Stempels des KRAS Exon 2 Kontrollplasmids wird TAT gegen ATA ausgetauscht Codon 12 und 13 sind unten ebenfalls markiert GC TGRBEEs TAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAAATAGAT A 3 HPLC DHPLC Systemanforderungen fur die Denaturierung A 3 1 DHPLC Spezifikationen fur SURVEYOR Scan Anwendungen Die folgenden Spezifikationen stellen die Mindestanforderungen f r die DHPLC Systemspezifikationen f r die Durchf hrung der Tests mit dem SURVEYOR Scan KRAS amp NRAS Kit dar Abgabesystem f r Hochleistungsl sungsmittelgradienten e Binare Gradientenkapazit t Hochdruck oder Niederdruck e Durchflussregulierung Mindestbereich 0 7 1 6 mL min e Durchflussgenauigkeit 2 H2O bei 20 C e L sungsmittelentgaser Autosampler bzw Probengeber e Temperaturregulierung zum Abk hlen der Platten einstellbar 4 bis 14 C e Injektionsvolumen 5 50 uL Trennkartusche bzw Trenns ule Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRA
36. iftsm ige Schutzkleidung tragen h ufig Handschuhe wechseln und bevor man sich zum Arbeitsbereich begibt die behandschuhten H nde mit 10 v v Bleichmittel abwischen Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 24 Die Einrichtung sollte zumindest der Zweiraumaufteilung in dem dargestellten Diagramm unten entsprechen welches speziell f r PCR und Analysen mit der SURVEYOR Nuclease entwickelt wurde Empfohlene Organisation eines PCR Labors SURVEYOR Scan Analyse plattform UV Cross linker PCR Arbeits PCR platz mit 20 C Arbeits HERA Gefrier Leichter platz mit Filter und HEPA 80 C 2 Gefrier Leichter schank Luft berdruck UV Licht schank Luftunterdruck Sitenin UV Licht 20 C i Thermo Gefrier Micro 1 Micro schank 2 Unterbauk hlschr nke zentrifuge 2 Unterbauk hlschr nke zentrifuge mit4 2C Mikro Lichtkasten zur Mikro zentrifuge zentrifuge f r Mikro phorese Gelelektro f r Mikro titerplatten phoresen titerplatten PCR Arbeitsplatz mit HEPA Filter und UV Licht Labor f r PCR Extraktion lifikati Probendurchkuff rrerung gt Fost PCR Labor und Amplifikation SURVEYOR Scan Analyse Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 25 Anhang A A 5 Literaturnachweis 1 Amgen News Release 2013 New analyses identify predictive biomarkers for Vectibix panitumumab in patients with metastatic colorecta
37. l cancer http wwwext amgen com media media pr detail ijsp year 2013 amp releaselID 1820728 2 Peeters M et al 2013 Massively parallel tumor multigene sequencing to evaluate response to panitumumab in a randomized phase III study of metastatic colorectal cancer Clin Cancer Res 19 1902 12 3 De Roock W et al 2010 Association of KRAS p G13D mutation with outcome in patients with chemotherapy refractory metastatic colorectal cancer treated with cetuximab JAMA 304 1812 20 4 Peeters M et al 2013 Mutant KRAS codon 12 and 13 alleles in patients with metastatic colorectal cancer assessment as prognostic and predictive biomarkers of response to panitumumab J Clin Oncol 31 759 65 5 Andre T et al 2013 Panitumumab combined with irinotecan for patients with KRAS wild type metastatic colorectal cancer refractory to standard chemotherapy a GERCOR efficacy tolerance and translational molecular study Ann Oncol 24 412 9 6 Loupakis F et al 2009 KRAS codon 61 146 and BRAF mutations predict resistance to cetuximab plus irinotecan in KRAS codon 12 and 13 wild type metastatic colorectal cancer Br J Cancer 101 715 21 7 De Roock W et al 2010 Effects of KRAS BRAF NRAS and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy refractory metastatic colorectal cancer a retrospective consortium analysis Lancet Oncol 11 753 62 8 Qiu P et al 2004 Mutation detection using Surveyor nuclease Biotechniques
38. late DNA oder 3 isolieren Sie frische DNA von demselben oder einem anderen FFPE Schnitt Inaktive F hren Sie eine Reaktion SURVEYOR mit Kontrollen durch um die Nuclease Enzymleistung zu verifizieren Nur frisch hergestellten SURVEYOR Nuclease Master Mix verwenden Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 28 Anhang B Anmerkung SURVEYOR Nuclease spaltet berwiegend bei Mismatches in Heteroduplices Das Verh ltnis von Heteroduplex zu Homoduplex in der hybridisierten Probe bestimmt das Verdausignal in der SURVEYOR Nuclease Wenn die KRAS Mutation in der genomischen DNA Probe in sehr geringer Konzentration vorliegt kann das Signal f r ein positives Ergebnis zu niedrig sein Es ist wichtig darauf zu achten dass der Hybridisierungsschritt im Thermocycler Programm enthalten ist siehe Amplifikationsprotokoll um die Leistung der Heteroduplexbildung zu optimieren Heteroduplices werden bei Standard PCR Reaktionen mit sehr geringem Ertrag gebildet Anmerkung Der Signal Rausch Abstand ist im Allgemeinen hoch genug um Mutationen mit einem geringeren Prozentsatz der Gesamt DNA Matrize nachzuweisen Es ist m glich bis 2 mutante DNA zu detektieren Abbildung 4 zeigt die mit Homoduplex und Heteroduplex KRAS Positive Control DNAs in diesem Kit enthalten und FFPE Proben generierten Verdauprodukte auf einem WAVE DHPLC 4500 System Die Spaltprodukte sind deutlich als z
39. lheiten zur Bestellung unnssnnssnnnnnnnnnnnnnnennnnnnnennnnannennnnannnnnnnannennnnanneennnenneennnanneennnennern nennen 33 KONTAKT ALC PORERERRESSARSEHEREENER EEE PANSERNEE EEENEEEEEOFERECEEEEREFEEEHLEREEENEENEEEEEREEREEEEEFEFSEEREEREETEFENEEEEEBEEHEEREFEREERERBEEREST 33 bersetzung Verzicht ensnare aeneis ae a e NEA 33 Lizenzen Handelsmarken amp Copyright urr220n440000n000nnnannnnnannnnnannnnnnnnnannnnnannnnnnnnnnnnnnnnnnnnn ann 34 1 Hersteller 1 Hersteller ull Transgenomic Inc Hersteller 12325 Emmet Street Omaha NE 68164 USA Tel 1 402 452 5400 Vertreter in der Transgenomic Limited EU 40 Watt Road Hillington Park Glasgow G52 4RY UK Tel 44 141 892 8800 2 SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD 2 1 Verwendungszweck Anwendung nur durch Fachpersonal Transgenomics SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD ist ein In vitro Diagnostikum das die somatischen Mutationen in Exon 2 of des KRAS Gens nachweist Diese Mutationen werden durch SURVEYOR Nuclease Spaltprodukte angezeigt und enthalten Mutationen die bekannte Auswirkungen auf klinische Anwendungen haben Dieses Kit ist f r den Gebrauch in einem Labor f r klinische Diagnostik durch entsprechend ausgebildetes Fachpersonal vorgesehen Getestet wird DNA die aus formalinfixiertem und in Paraffin eingebettetem Gewebe extrahiert wird Dieses Kit Katalognummer 710104 wird in einem Karton geliefert der die nachstehend aufgef hrt
40. llen oben genannten PCR amplifizierten Proben in ein neues 0 2 mL PCR ReaktionsgefaB oder in die Vertiefung einer 96 Loch Mikrotiterplatte 4 Bereiten Sie frisch eine Mischung aus 0 15 M MgCl Solution SURVEYOR Enhancer Cofactor SURVEYOR Enhancer W2 und SURVEYOR Nuclease W SURVEYOR Nuclease Gemisch zu Bereiten Sie anhand der folgenden Tabelle den SURVEYOR Nuclease Digest Master Mix f r die Analyse mehrerer Proben vor Das Beispiel unten zeigt die Volumina f r ein 10 Proben Master Mix Ber cksichtigen Sie dass etwas mehr Master Mix als in dieser Berechnung angezeigt ben tigt wird um Verluste w hrend des Pipettierens auszugleichen Anzahl der SURVEYOR Nuclease Verdaureaktionen 10 Volumenberechnung 0 15 M MgCl Solution uL 10 0 SURVEYOR Enhancer Cofactor uL 10 0 SURVEYOR Enhancer W2 uL 10 0 SURVEYOR Nuclease W uL 20 0 Master Mix Gesamtvolumen 50 0 F gen Sie je 5 yL SURVEYOR Nuclease Master Mix den einzelnen PCR amplifizierten Proben hinzu uL 10 0 Gesamtvolumen SURVEYOR Nuclease 15 0 Verdaureaktion a Vor dem Gebrauch alle Reagenzien zentrifugieren b Vor dem Pipettieren jedes Reagenz leicht vortexen Zentrifugieren Sie nach jedem Vortexschritt 10 Sekunden leicht an c F gen Sie f r jeden Verdau einem 0 2 mL oder gr eren PCR Reaktionsgef folgende Komponenten hinzu 1 0 uL 0 15 M MgCl Solution PN 708027 1 0 uL SURVEYOR Enhancer Cofactor PN 708049 1 0 uL SURVEY
41. ller Schritte unterbrochen werden muss sollte die DNA bei angegebener Stelle bei 20 C gelagert werden Allerdings sollten gefrorene Proben nicht wiederholten Einfrier Auftauzyklen ausgesetzt werden und die Tiefk hllagerung 18 bis 25 C von PCR amplifizierter DNA bzw SURVEYOR Nuclease Verdauprodukten ber einen Zeitraum gt 1 Woche sollte vermieden werden Die Probenanalyse sollte dem unten aufgef hrten Arbeitsablauf folgen DNA Gewebe meted HOXH Isolation K2 Gel Elektrophorese x amp PCR I 1 t g Bewertung starke schwache PCR Q I i SURVEYOR I Scan SURVEYOR Nuclease amp 5 fehlgeschlagen DHPLC Analyse N SURVEYOR Scan SURVEYOR Scan Positiv Negativ NVD Sequenzbest tigung 8 Sequenzqualit t Sequenzqualit t e nicht ausreichend ausreichend EN Mutationen in NVD codons G12 oder G13 Abbildung 3 Arbeitsablauf der SURVEYOR Scan KRAS Kit Analyse Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 11 12 Schritt f r Schritt Anleitung Anmerkungen zu Abbildung 3 1 Isolieren Sie die DNA von FFPE und verwenden Sie dazu Standardlabortechniken 2 F hren Sie die PCR durch und pr fen Sie die DNA Qualit t durch Gelelektrophorese 3 Dokumentieren Sie ob die Bande stark 220 ng oder schwach lt 20 ng ist
42. lnen Mikrotiterplatten ein Satz der oben angegebenen Kontrollen mitgef hrt werden Daher ben tigen zwei Mikrotiterplatten insgesamt 6 Kontrollreaktionen 3 Mikrotiterplatten ben tigen 9 Kontrollreaktionen usw Mit Ansteigen der Gr e der Probenserie erh ht sich auch die Anzahl der Proben die insgesamt mit einem Kit getestet werden k nnen wodurch sich die Reagenzienkosten je Probe im Durchschnitt reduzieren Die Tabelle unten dient als Orientierung daf r wie viel Proben mit einem einzigen Kit getestet werden k nnen Gr e der Anz Kontrollreaktionen Anz erforderl Gesamt oun anz Proben getesteter Proben Anz Proben Reaktionen ages serie Amplikons pro Lauf Seriemaule Proben pro Kit pro Kit 1 3 1 4 25 25 2 3 2 5 20 40 3 3 3 6 16 48 4 3 4 7 14 56 5 3 5 8 12 60 5 2 DNA Sequenzierung Universal Sequencing Primers PNs 710153F und 710153R werden f r die DNA Sequenzierung aller getesteten Proben mitgeliefert Die vor dem SURVEYOR Nuclease Verdau erzeugten PCR Amplikons sollten f r die Sequenzierung verwendet werden 6 Zus tzlich erforderliche Ausr stung und Reagenzien Folgende Komponenten bzw Ausr stungen sind f r die Verwendung des SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD mit dem DHPLC zus tzlich erforderlich DHPLC System S ulen Puffer DNA Gr enstandard siehe Anhang A 3 1 DHPLC Spezifikationen f r SURVEYOR Scan Anwendungen f r Merkmale eines geeigneten DHPLC System zur Verwendung mit di
43. lungen des Herstellers Anmerkung Die Analyse von SURVEYOR Nuclease Reaktionen erfordert h ufigere und strengere Reinigungsprotokolle als bei der normalen PCR Probenanalyse F r weitere Einzelheiten siehe die Anweisungen Ihres DHPLC Systems A 4 Laborbedingungen f r PCR Tests Um zuverl ssige und kontaminationsfreie PCR Ergebnisse zu erhalten etablieren Sie bei der Einrichtung der PCR Labors eine gute Laborpraxis Denken Sie bei der Planung des Laboraufbaus an den Bedarf von r umlicher Trennung der Arbeitsbereiche PCR Amplifikation und Post Amplifikation Es ist wichtig Folgendes zu trennen i DNA Isolierung ii PCR Amplifikation und iii Post PCR Aktivit ten wie das ffnen von amplifizierten Proben f r die Durchf hrung von Gelelektrophoresen oder zum Vorbereiten anderer Tests wie SURVEYOR Nuclease Verdau und DNA Sequenzierung Es ist auch wichtig dass Laborverbrauchsmaterial und Laborausr stung speziell f r diese Arbeitsbereiche gekennzeichnet sind und ausschlie lich in diesem Bereich verwendet werden Abwischen von Oberfl chen mit einem w chentlich frisch zubereiteten Bleichmittel 10 v v ist hilfreich bei der Elimination von DNA Fragmenten lt 500 bp Dar ber hinaus kann es n tzlich sein Kunststoffprodukte und L sungen 7 10 Minuten kurzwelliger UV Strahlung auszusetzen Anmerkung Enzyme und DNA die amplifiziert werden soll d rfen nicht mit UV Strahlung behandelt werden Zur Reduzierung von Kontamination vorschr
44. mponenten und Kontrollen 703310 DNA Polymerase Rot 100 uL 703315 DNA Polymerase 10X PCR Buffer Durchsichtig 1mL 703065 dNTPs 10 mM Durchsichtig 500 uL 710155F KRAS Primer Exon 2 Forward 10 uM Blau 3 x 90 uL 710155R KRAS Primer Exon 2 Reverse 10 uM Blau 3 x 90 uL 710131 KRAS Control Wild Type Gelb 120 uL 710135 KRAS Positive Control Exon 2 Gr n 40 uL 482404 Bedienungsanleitung Download von der Webseite http world transgenomic com files literature 482404 DE pdf 5 1 Anzahl der Proben die mit dem Kit getestet werden k nnen Mit dem SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD k nnen 100 Reaktionen durchgef hrt werden Die Gesamtprobenanzahl h ngt von der Gr e der jeweiligen durchschnittlichen Seriengr en zu testender Proben ab da mit jeder Probenserie jeweils ein Satz Kontrollreaktionen Wild Type Control Positive Control und No Template Control auf jeder Mikrotiterplatte mitgef hrt werden muss In der nachstehenden Tabelle ist die Anzahl Proben aufgef hrt die mit dem KRAS Kit je nach durchschnittlicher Gr e der Probenserie getestet Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 6 5 Komponenten werden k nnen Die Berechnung beruht auf der Basis dass a f r jeden Lauf 3 Kontrollen 1x Wild Type 1x Positive Control 1x No Template Control ben tigt und b jedes Kit f r 100 Reaktionen ausgelegt ist Anmerkung Wenn mehrere Mikrotiterplatten laufen sollen muss auf jeder einze
45. n Sie neue Pipettenspitzen f r jede Probe und vermeiden Sie die Kreuzkontamination durch Verspritzen Verschlie en Sie die Vertiefungen mit den Proben DNAs und dem NTC mit dem 8er Cap Strips bei Verwendung einer 96 Loch Mikrotiterplatte bzw die 0 2 mL PCR Reaktionsgef e mit ihren Deckeln Vergewissern Sie sich dass die Deckel fest verschlossen sind ffnen Sie erst jetzt die Reaktionsgef e mit den Kontrollmatrizen DNAs PNs 710131 710135 und zwar eines nach dem anderen Pipettieren Sie diese Kontrollmatrizen zuletzt um das Risiko einer Kontamination der Proben DNA zu verringern Verschlie en Sie jede Vertiefung wieder mit den 8er Cap Strips wenn Sie eine 96 Loch Mikrotiterplatte verwenden bzw schlie en die 0 2 mL PCR ReaktionsgefaBe mit dem Deckel Vergewissern Sie sich dass die Deckel fest verschlossen sind ANMERKUNG Zur guten Laborpraxis geh rt die No Template Controls NTC in Vertiefungen zu geben die an Positive Control oder Proben angrenzen Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 14 25 26 12 Schritt f r Schritt Anleitung ANMERKUNG Als Vorschlag wie 96 Loch Mikrotiterplatte f r die Analyse von KRAS und NRAS Exon 2 4 anzulegen ist siehe Anhang A 1 Plattenlayout f r SURVEYOR Scan Kits Vortexen Sie 1 2 Geschwindigkeit 10 Sekunden lang Zentrifugieren Sie 1 2 Minuten lang um zu garantieren dass alle L sungen auf dem Boden der Vertiefung oder der R
46. nmerkung F r diesen Test ausschlie lich die mit diesem Kit mitgelieferte DNA Polymerase verwenden Anmerkung Befolgen Sie bitte die spezifischen Anleitungen im Bedienungshandbuch Ihres DHPLC Systems Um dieses Kit erfolgreich einzusetzen wird dringend angeraten diese Bedienungsanleitung sorgf ltig durchzulesen und alle darin gegebenen Anleitungen und Richtlinien genau zu befolgen Personen die diesen Test zum ersten Mal durchf hren sollten die in Abschnitt Verwendung der Kontrollplasmid DNAs beschriebenen Kontrolluntersuchungen durchf hren Falls Sie weitere Fragen haben oder Hilfe ben tigen rufen Sie 888 233 9283 nur Nordamerika 1 402 452 5400 oder 44 0 141 892 8800 Europa an und fragen nach dem KRAS Support Alternativ k nnen Sie eine E Mail senden an SURVEYORscan Transgenomic com Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 5 4 R ckverfolgbarkeit der Kit Kontrollen 4 R ckverfolgbarkeit der Kit Kontrollen Die mit diesem Kit mitgelieferten Kontrollen sind Plasmidklone der KRAS Exon 2 Sequenzen Alle Klone wurden sequenziert um sie durch Vergleich mit der NCBI Reference Sequence auf Sequenztreue zu berpr fen NG_007524 1 Die Kontrollen haben einen genetischen Stempel Siehe Anhang A 2 Kontroll DNA Stempel diese Variationen von der KRAS Wild Type Sequenz wo keine Mutationen erwartet werden k nnen verwendet werden um Probleme mit Probenkontamination durc
47. reichend genomische DNA vorhanden ist die PCR wiederholen b Aus FFPE erneut DNA extrahieren dies muss die zweite Wahl sein da es normalerweise nicht w nschenswert ist einen FFPE Block nachzuschneiden 9 Bei einer akzeptablen Best tigungsanalyse sollte eines der folgenden Resultate zutreffen a Wild Type Sequenz das hei t No Variant Detected NVD keine Variante nachgewiesen oder b Variant Detected Variante nachgewiesen Wenn die Sequenzbest tigung eine Anderung der Basensequenz anzeigt die zu einer Ver nderung einer Aminos ure f hrt bei i Codon 12 oder ii Codon 13 ist dies als KRAS Mutation positiv zu bewerten Anmerkung Es ist m glich eine positive SURVEYOR Scan Zuordnung zu haben die bei der Sequenzbestatigung in No Variant Detected keine Variante festgestellt ergibt Die Nachweisgrenze Level of Detection LoD der SURVEYOR Nuclease f r ein DHPLC System i betraegt fuer einige Mutationen 2 Mutation in 98 Wild Type DNA wohingegen die LoD der Sequenzierung circa 10 25 Mutation in 90 75 Wild Type DNA betr gt Anmerkung Wenn eine Probe 100 mutante DNA ist k nnen keine Heteroduplices gebildet werden und die Probe erscheint als Wild Type Proben aus Tumorbiopsien enthalten allerdings aufgrund der Tumorheterogenit t und oder kontaminierendem normalen Gewebe Wild Type Zellen mit diesem Kit sind 5 Wild Type nachweisbar Ein Ergebnis mit 5 mutanter DNA wuerde identisch erscheinen Bedienungsanlei
48. sssssescecececeeseeeseseesescsesesaeseeeeeseesesaeeeeeeeees 19 14 3 BEISPIGIEFSEDINISSC ee cevcdecessets concen dedeoanterceswoos cash ects cddeducaneecesanceeeenndacsyecsdweacnnd dea aE Ea eraai anene 20 15 Leistungsmerkma le 2 00444004 nn anna anna nn an AEEA 21 15 1 Nachweisgrenze von Mutationen mit SURVEYOR Scan Kits ueeeeseneesssnansenennnnnennnnennennnnnnnennennannnnnn nn 21 15 2 SEQUENZDESTATISU IN Ges cctees anceascdedetvesvehd cencetnesdedacadacheucdsanadsa sites naeh wehren nern 21 15 3 Verf hrensbeschr nkungen sccsesscccescavencedevoeveenccnnscorwsvensencecededsednesacacenesvecetens dessenrasvedanaduccevoederevaraedceenee 21 PROVING Paso coos cesta was EREAEREEE ocak ceased T A 23 A 1 Plattenlayout f r SURVEYOR Scan Kits ccccccccccccssssssceccceceesesesceeececeeseeeeesecsceeseseeaeseeseseseeeaeseeeeeseegeea 23 A 2 Kontroll DNA Stem pe lesernes eien ventecdsVooeadvacuedeceavadsbanedeessaseavecaieaseeowa eataceatatecssvennte 23 A 3 HPLC DHPLC Systemanforderungen f r die DenaturierUng ccccccccssscccesssececessseceeseeecsessececsesseeeees 23 A 4 Laborbedingungen f r PCR TeSts cccccsessscccccecsessessecececeeseeessesecscsesesessesecscecsesesaeseeeeeeseseeaeseeseeseeseea 24 A 5 Literaturnachweisi n aeneeee nen binnen nenn een EEEE EEA TOERNEE 26 Anhang Seep nee meee Se Eee SN oe SE oo a SIEHE SERIE EHEN SS a Bo oo BR a Bee EEN 27 Fehlersuche se e ia a A e ie aAa AEE e Ean a a aE AES 27 Einze
49. stellt in den gelieferten Mengen eine Gesundheitsgef hrdung dar Die Dokumentennummer der Transgenomic MSD 710104 steht als Download zur Verf gung http world transgenomic com files literature 710104 DE pdf Dieses Kit enth lt keine Substanzen tierischen oder menschlichen Ursprungs die ein Infektionsrisiko darstellen k nnen Dieses Kit darf nur von Personen verwendet werden die in den entsprechenden Labortechniken ausgebildet wurden Beim Arbeiten mit den Kitkomponenten immer einen geeigneten Laborkittel Einmalhandschuhe und Augenschutz tragen Nach dem Gebrauch m ssen die Kitkomponenten als klinischer Abfall und gem der f r sie anwendbaren Gesetze und Verordnungen entsorgt werden Aus den Gef en pipettierte Reagenzienaliquots dieses Kits sind nur zum einmaligen Gebrauch bestimmt Es konnte validiert werden dass Kitkomponenten auch nach 25 Auftau Einfrierzyklen noch stabil sind Verwenden Sie das Kit nicht wenn diese Anzahl Zyklen berschritten wurde 10 Prim re Probenentnahme Handhabung und Lagerung Das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 2 CE IVD f r das DHPLC System ben tigt DNA die aus formalinfixierten paraffineingebetteten FFPE kolorektalen Tumorproben extrahiert wurde F r eine optimale DNA Extraktion muss das Gewebe 14 24 Stunden in Formalin fixiert werden Tumorbiopsien sind eine heterogene Mischung aus Tumorzellen und Nicht Tumorzellen Au erdem ist der Tumor an sich eine heterogene Mischung aus Tumorzellen mi
50. t Mutationen und Tumorzellen ohne Mutationen Da diese somatischen Mutationen m glicherweise nicht gleichm ig im Tumor verteilt sind kann die aus verschiedenen Bereichen desselben Tumors resultierende Mutationsanalyse unterschiedlich ausfallen Um die Wahrscheinlichkeit f r einen Mutationsnachweis zu erh hen sollte die DNA aus der Tumorregion des Gewebes isoliert werden indem nur der Tumorbereich von dem Glasobjekttrager abgeschabt wird Dazu f r jeden neuen Objekttr ger ein frisches steriles Skalpell verwenden F r eine erfolgreiche Verwendung dieses Kits sollte die entnommene DNA den Kriterien entsprechen die in den berlegungen zu den Matrizen aufgelistet sind Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 8 iii 10 Primare Probenentnahme Handhabung und Lagerung ANMERKUNG Entnommene DNA Proben die mit diesem Kit nicht sofort analysiert werden m ssen bei 20 C bis 80 C eingefroren aufbewahrt werden 11 Testverfahren 11 1 Somatischer Mutationsnachweis mit SURVEYOR Scan Kits Ein berblick Nachweis und Best tigung einer Mutation mit der SURVEYOR Nuclease umfasst drei Schritte SURVEYOR Scan Vorbereitung zum Screening in drei einfachen Arbeitsschritten Schritt 1 Mit PCR Proben DNA amplifizieren Schritt 2 SURVEYOR Nuclease Spaltung Schritt 3 Fragmentanalyse nach Gr e mit DHPLC Schritt 1 Vorbereiten der PCR Amplikons aus mutanter Test und normaler Ref
51. ten mit dem DHPLC System gehen Sie bitte auf http world transgenomic com diagnostic tools genetic analysis kits crc rascan kits eu dhplcsystemsettings KRAS Control Wild Type Abbildung 4A KRAS Control Exon 2 Probe 1 KRAS Exon 2 DHPLC Probe 2 KRAS Exon 2 Probe 3 KRAS Exon 2 Durchfluss ma DNA Gr enstandard G12D ergibt Fragmente von 74 Ungespaltenes und 116 bp 190 bp Amplikon DHPLC gt Wash off KRAS Control Wild Type KRAS Control Exon 2 G12D ergibt Probe 1 KRAS Exon 2 Probe 2 KRAS Exon 2 Probe 3 KRAS Exon 2 DNA Gr enstandard Fragmente von 74 und 116 bp Ungespaltenes 190 bp Amplikon Abbildung 4A und 4B WAVE DHPLC Analyse mit UV Abbildung 4A und Fluoreszenz Abbildung 4B Nachweis von SURVEYOR Nuclease Verdauungsprodukten von KRAS Positive Control Exon 2 KRAS Control Wild Type und CRC DNA isoliert aus FFPE Schnitten Bei der Sichtpr fung der Chromatogramme sollten die verdauten Proben mit der Wild Type Control braune Linie verglichen werden Die KRAS Positive Control Exon 2 blaue Linie ist eine Mischung aus Wild Type und mutanten G12D Plasmiden die in Verdauungsprodukten mit 74 und 116 bp resultiert Diese Kontrolle zeigt an dass der SURVEYOR Nuclease Verdau funktioniert hat und weist auf dem Chromatogramm auf die Region zur Sichtpr fung hin die bestimmt ob eine Probe zur DNA Sequenzanalyse geschickt werden sollte Beim Vergleich der Verdauungsmuster der Proben 1 3 mit
52. trahierter DNA um je Reaktion 25 ng zu erhalten Reduzieren Sie auch das Volumen an Wasser in dem Master Mix um dieselbe Menge um je Reaktion 50 uL zu erhalten Alle mit diesem Master Mix vorbereiteten Proben brauchen extrahierte DNA die auf ann hernd dasselbe niedrigste Konzentrationsniveau verd nnt ist Es ist nicht empfehlenswert Konzentrationen extrahierter DNA mit weniger als 5 ng uL einzusetzen Bedienungsanleitung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 13 12 Schritt f r Schritt Anleitung 7 Berechnen Sie die erforderlichen Volumina f r alle Master Mix L sungen anhand der Tabelle oben Beachten Sie dabei Folgendes F r diesen Master Mix werden drei zus tzliche Reaktionen ben tigt f r KRAS Control Wild Type KRAS Positive Control Exon 2 und die KRAS Exon 2 No Template Control NTC Anmerkung Ber cksichtigen Sie dass etwas mehr Master Mix als in dieser Berechnung angegeben ben tigt wird um Verluste w hrend des Pipettierens auszugleichen 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Beschriften Sie 0 2 mL PCR ReaktionsgefaBe oder die Vertiefungen einer 96 Loch Mikrotiterplatte mit den erforderlichen Probeninformationen Beschriften Sie ein 2 0 mL Zentrifugenr hrchen f r den vorbereiteten Master Mix F gen Sie diesen 2 0 mL Zentrifugenr hrchen mit der Beschriftung Master Mix das erforderliche Volumen an hoch reinem Wasser f r die Molekul
53. tt Verwendung von Kontrollplasmid DNAs durch nachdem Sie den Abschnitt Schritt f r Schritt Anleitung gelesen und verinnerlicht haben Bevor Sie sich an den technischen Kundendienst von Transgenomic wenden warten Sie bitte die Ergebnisse f r die Kontrollplasmid DNAs ab Diese Fehlersuche deckt eine Liste von Problemen ab die bei der Arbeit mit den SURVEYOR Scan Kits f r DHPLC auftreten k nnen sowie Vorschl ge wie sie zu l sen sind Konsultieren Sie das Bedienungshandbuch des DHPLC Systems f r detaillierte Anleitungen in Bezug auf Ger tebetrieb und Wartung Das Bedienungshandbuch enth lt spezifische Verfahren zur berpr fung und Wartung der S ulenleistung und beinhaltet Einzelheiten zur Fehlersuche Problem 1 Niedrige PCR Ausbeute oder kein PCR Produkt wenn auf Agarosegel analysiert bzw verifiziert wurde NIEDRIGE PCR M GLICHE AUSBEUTE URSACHE as Schlechte Qualit t der Wiederholen Sie die Aufreinigung der DNA DNA Matrize berpr fen Sie die verwendete Aufreinigungsmethode Wenn die FFPE a Schicch extrahierte DNA zu fragmentiert ist k nnen PCR Sch E alternative FFPE Blocks erforderlich sein Ausbeute Ausbeute A Zu viel RNA in der Wiederholen Sie die RNase Behandlung der Probe verursacht die DNA Probe und reinigen Sie die DNA erneut Uberbewertung der DNA Konzentration Thermocycler nicht F hren Sie die Kalibrierung des kalibriert Thermocyclers durch Nicht ausreichende Erh hen Sie die Matrizenm
54. tung f r das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD f r DHPLC Seite 12 12 Schritt f r Schritt Anleitung Anmerkung Positive SURVEYOR Scan Ergebnisse k nnen sich aufgrund von Ver nderungen in der Basensequenz von denen unterscheiden die KRAS aktivierend sind Obwohl diese Mutationen selten sind ist eine Best tigung durch eine andere Methode z B DNA Sequenzierung erforderlich um festzustellen ob ein positives SURVEYOR Scan Ergebnis tats chlich eine KRAS aktivierende Mutation ist Anmerkung Das Formalinfixierungsverfahren das f r die Vorbereitung von FFPE Tumorbiopsieproben verwendet wird kann zu einer Cytosin Desaminierung f hren Diese Desaminierung wandelt Cytosin in Uracil um Die Polymerase liest dieses Uracil als ein Thymin und bindet ein Adenin in die duplizierten Str nge ein Dies scheint dann eine Mutation zu sein bei der das normale G jetzt durch ein A ersetzt wird und eine G C zu A T Mutation verursacht die eine Artefaktmutation durch den Fixierungsprozess und keine echte somatische Mutation ist Diese Vorf lle sind selten Falls sie jedoch in einem fruehen PCR Zyklus auftreten sehen sie wie Mutationen aus Bei einer erneuten Amplifikation sollten sie nicht auftreten Beispiele f r m gliche Cytosin Desaminierungsmutationen die f r eine Bestimmung der Patiententherapie herangezogen w rden sind Codon 12 AGT G12S und GAT G12D Codon 13 AGC G13S GAC G13D und GGT G13G eine stille Mutation Dah
55. ung Gute Multiple i j EEN Besa niedrig des Thermocyclers Ausbeute PCR Anmerkung PCR sollte einen ausreichend hohen Ertrag gr er als 20 ng uL eines EINZELNEN amplifizierten Amplikons der richtigen L nge erzeugen F r die PCR muss die in diesem Kit mitgelieferte DNA Polymerase und der DNA Polymerase 10X PCR Buffer verwendet werden Amplikons aus Kontrollen m ssen mit der SURVEYOR Nuclease verdaut und analysiert werden um durch Sichtprifung der Chromatogrammprofile st rendes Hintergrundrauschen auszuschlie en siehe Beispielergebnisse Abbildung 4 Kontrollieren Sie vor dem Verdau jedes amplifizierte DNA Produkt durch Gelelektrophorese oder durch Analyse mit dem DHPLC System um sicherzugehen dass es ein einzelnes Amplikon der erwarteten L nge ist Problem 3 Keine DNA Spaltprodukte bei der Analyse nach SURVEYOR Nuclease Behandlung der Heteroduplices M GLICHE URSACHE LOSUNG KEINE DNA SPALTPRODUKTE Anteil an Test anhand der Kontrollen Mismatch Ziel berpr fen zu gering Ineffiziente F hren Sie das PCR und Bildung von Hybridisierungsverfahren Sas Heteroduplices genau nach Anleitung enienaen u durch Verwenden Sie f r H l PR es den SURVEYOR Nuclease Verdau frisch hybridisierte C ee BB N es PINA 1 Ne Ear a t Wiederholen Sie die PCR 7 8 9 10 n 12 r Amplifikation mit 1 Ungeschnittener derselben Menge DNA Homoduplex Template 2 erh hen Sie Peak die Menge der Temp
56. urchgef hrt wird 12 Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 42 C 13 F gen Sie jedem R hrchen bzw jeder Vertiefung 1 0 uL SURVEYOR Stop Solution PN 708030 hinzu leicht vortexen das SURVEYOR Nuclease Gesamtreaktionsvolumen betr gt 16 0 uL TIPP Die SURVEYOR Verdauprodukte k nnen bei lt 20 C bis zu einer Woche gelagert werden 14 Laden Sie die Probenverdaus auf das DHPLC System Anmerkung Empfohlene Gradienteneinstellungen f r die Analyse von SURVEYOR Nuclease Verdauprodukte mit dem DHPLC System finden Sie auf http world transgenomic com diagnostic tools genetic analysis kits crc rascan kits eu dhpicsystemsettings 13 Kontrollverfahren 13 1 Qualitatskontrolle fur das SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD Zur Qualit tskontrolle bestimmter Schritte des Testverfahrens sind diesem Kit Kontrollplasmid DNAs beigef gt F r das Amplifikationsprotokoll bieten diese Kontrollen ein Mittel zur Gew hrleistung dass der Master Mix korrekt hergestellt ist und die Amplifikation richtig funktioniert hat No Template Controls wo anstelle der Matrizen DNA Wasser hinzugef gt wird werden ebenfalls empfohlen um eine m gliche Kontamination der Kitkomponenten mit einer DNA Matrize nachzuweisen Bei dem Schritt des SURVEYOR Nuclease Verdaus zeigt das Amplikon der Kontrollplasmid DNA ob die Bedingungen der Spaltreaktion Herstellung des SURVEYOR Nuclease Digest Master Mix und Inkubationsbedingungen zufriedenstellend waren Bei
57. wei neue Peaks zu erkennen die mit der erwarteten L nge bzw Gr e eluiert wurden Die L nge bzw Gr e kann anhand des DNA L ngenstandards berechnet werden Achtung Im Handel erh ltliche PCR Puffer unterscheiden sich stark in der Zusammensetzung und h ufig ist die Zubereitung vom Hersteller nicht genau gekennzeichnet Mehrere Puffer sind aufgrund von pH Wert oder Zusatzstoffen Tensiden oder anderen herstellereigenen Inhaltsstoffen mit der SURVEYOR Nuclease NICHT kompatibel Verwenden Sie KEINE anderen als die im Kit enthaltenen Polymerase oder 10X Polymerase Puffer Problem 4 Hohes Hintergrundrauschen nach SURVEYOR Nuclease Behandlung M GLICHE m HOHES HINTERGRUNDRAUSCHEN URSACHE LOSUNG Nicht optimaler F hren Sie folgende Hybridisierungsschritt Schritte durch 1 Vergewissern Sie sich dass sich die DNA Konzentration im Bereich gt 25 ng uL befindet 2 Wiederholen Sie den Schritt Heteroduplex Bildung achten Sie dabei darauf das t t J empfohlene Verfahren Probe mit einzuhalten siehe DHPLC verrauschter DHPLC 12 7 1 Durchfluss Basislinie Wash aan Peak DNA Menge zu berpr fen Sie die niedrig Ergiebigkeit und Qualit t der DNA Matrize bzw der Template DNA Nicht spezifische berpr fen Sie die PCR Produkte Ergiebigkeit und Qualit t der DNA Matrize bzw der Template DNA SURVEYOR berpr fen Sie das Enhancer W2 Ablaufdatum des Kits und oder SURVEYOR Enhancer Cofactor wurden
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