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Applied Biosystems StepOne™ System Real

1. Dokument BN Applied Biosystems High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol 4375575 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Installation Performance 4376791 Verification Protocol Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Installation Qualification 4376790 Operation Qualification Protocol Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Planned Maintenance 4376788 Protocol Custom TaqMan SNP Genotyping Assays Protocol 4334431 Custom TaqMan Genomic Assays Protocol 4367671 TaqMan SNP Genotyping Assays Protocol 4332856 TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays Protocol 4362038 Ordering TagqMan SNP Genotyping Assays Quick Reference Card 4374204 Performing a Custom TaqMan SNP Genotyping Assay for 96 Well Plates Quick 4371394 Reference Card Performing a TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assay for 96 Well Plates 4367636 Quick Reference Card vii Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Vorwort Zugriff auf Informationen Dokument BN Pre Developed TagMan Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol 4312214 Allelic Discrimination Pre Developed TaqMan Assay Reagents Quick Reference 4312212 Card Hinweis Weitere Informationen ber Dokumentationen finden Sie unter Technischer Support auf Seite 1x Auf Informationen In der Hilfefunktion der StepOne Software finden Sie eine Beschreibung aller Funkti
2. Cy In Positiv Negativ Analysen die Aufgabe die der IPC Zielsequenz in Wells zugewiesen wird welche IPC Inhibitoren statt des Proben Templates enthalten Siehe auch unter Negativkontrolle mit blockierter IPC Siehe unter Reagenzien Eine Systemkonfiguration bei der das StepOne System durch das gelbe StepOne System Kabel mit einem angeschlossenen Computer direkt verbunden ist Bei dieser Konfiguration wird das StepOne System durch die StepOne Software auf dem angeschlossenen Computer gesteuert Abk rzung f r Schwellenwert Zyklus Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 121 Glossar Datenerfassung Delta R AR Dissoziationskurve EFF Eigenstandige Konfiguration Endogene Kontrolle Endpunktanalyse Endpunktmessung Farbstoff Farbstoffe von Fremdanbietern Fern berwachung Forward Primer Ein Prozess w hrend des Ger telaufs bei dem eine Ger tekomponente von jedem Well der Reaktionsplatte Fluoreszenzdaten erfasst Das Ger t wandelt das Signal in elektronische Daten um und diese werden in der Analysedatei gespeichert Ein Datenerfassungspunkt wird durch ein Symbol im Thermoprofil angezeigt e Datenerfassung ein e Datenerfassung aus Abkurzung fur grundlinienkorrigiertes normalisiertes Reportersignal Siehe unter Schmelzkurve Siehe unter Amplifikationseffizienz EFF Eine Systemkonfiguration bei der das StepOne System n
3. 42 Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 3 Ansetzen der Reaktionen Vorbereiten der Reaktionsplatte e Wenn Sie f r die Versiegelung der Platten optischen Klebefilm verwenden versiegeln Sie jede Platte wie folgt Assay Beispiel 1 Legen Sie die Optical 48 Well Reaktionsplatte in die Mitte der 96 Well Spritzfreien Auflage Stellen Sie sicher dass die Platte mit der Oberfl che der Auflage abschlie t 2 Bef llen Sie die Optical 48 Well Reaktionsplatte wie gew nscht 3 Entnehmen Sei einen einzelnen optischen Klebefilm aus der Box Biegen Sie beide Seitenlaschen nach oben Halten Sie die R ckseite des Klebefilms nach oben 4 Ziehen Sie in einer flie enden Bewegung die sch tzende R ckseite des Klebefilms von der mittleren Versiegelungsoberfl che ab Ber hren Sie nicht die Mitte der Versiegelungsoberfl che 5 Halten Sie den optischen Klebefilm an den Endlaschen senken Sie den optischen Film auf die 48 Well Reaktionsplatte Klebeseite der Platte zugewandt Vergewissern Sie sich dass der Film alle Wells der Platte vollst ndig zudeckt 6 Bewegen Sie den Applikator langsam ber den optischen Klebefilm und dr cken Sie dabei waagerecht und senkrecht fest an um einen guten Kontakt zwischen Film und Platte ber die gesamten Oberfl che der Reaktionsplatte zu gew hrleisten 7 W hrend Sie mit dem Applikator den Rand des Films festhalten
4. Auto Show v Threshold _ Baseline Start Well Target Baseline End Well u Wells D 20 Unknown 2 Negative Control g2 Positive Control 24 Empty amp Analysis Summary Total Wells in Plate 48 Wells SetUp 24 Wells Processed 24 Wells Flagged 0 Wells Omitted from Analysis 0 Samples Used 20 SNP Assays Used 1 MR Home Genotyping Example eds x Disconnected Auswertungs Beachten Sie bei der Auswertung Ihrer eigenen Analyse Folgendes hinweise e Korrekte Werte f r Grundlinie und Schwellenwert StepOne Software berechnet die Werte f r Grundlinie und Schwellenwert automatisch auf Grundlage der Annahme dass die Daten eine typische Amplifikationskurve zeigen Eine typische Amplifikationskurve weist Folgendes auf Plateauphase a lineare Phase b exponentielle geometrische Phase c Hintergrund d Grundlinie nicht angezeigt Grundwerte werden f r jede Kurve individuell berechnet Hinweise 92 Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 5 Analyseauswertung Ansicht der Amplifikationsdarstellung AR A AN MU hi NN Vit 1 Inn T 2 4 6 8 10 12 14 6 188 MO 2 2B 28 2 34 B 4 4 amp 2 4 4 iae Cycle WICHTIG Versuchsfehler wie Kontaminationen oder Pipettierfehler k nnen atypische Amplifikationskurven verursachen die zu falschen Berechnungen von Grundlinie und Schwellenwert durch die
5. Hinweise Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 97 n Kapitel 5 Analyseauswertung Ansicht der Auswertungseinstellungen Bestimmungen automatisch zuweisen 1 2 Klicken Sie in der Analyse auf Analysis Settings Auswertungseinstellungen W hlen Sie den gew nschten SNP Assay aus der Tabelle Select a SNP Assay SNP Assay ausw hlen aus Klicken Sie auf Edit Default SNP Assay Settings Standard SNP Einstellungen bearbeiten Falls Sie manuelle Bestimmungen vorgenommen haben w hlen Sie Keep Manual Calls from Previous Analysis Manuelle Bestimmungen aus vorheriger Analyse bernehmen W hlen Sie zur automatischen Aktivierung der Auswertung Autocaller Enabled Autocaller aktiviert Falls Sie die Datenauswertung in zwei Clustern erwarten w hlen Sie 2 Cluster Calling Enabled 2 Cluster Bestimmung aktivieren Geben Sie im Feld Quality Value Qualit tswert einen Prozentwert ein der als Qualit tsintervall f r Autocalling Proben gilt Je h her der Wert desto strikter die Allelbestimmung Klicken Sie auf Save Changes Anderungen speichern um die Einstellungen zu speichern Optional Weisen Sie Markierungen zu a Wahlen Sie den Reiter Flag Settings Markierungseinstellungen b Weisen Sie die gew nschten Markierungen zu Hinweis Bei der Zuweisung von Markierungen k nnen Sie Bedingungen markieren und Wells herausnehmen sobald bestimm
6. WICHTIG Weist auf Informationen hin die f r die sachgem e Verwendung des Ger ts des Chemikalienkits oder die sichere Verwendung einer Chemikalie n tig sind CHT Weist auf eine potenzielle Gefahrensituation hin deren Missachtung zu kleineren oder moderaten Verletzungen f hren k nnte Dieser Begriff kann auch dazu verwendet werden um auf sicherheitsgef hrdende Handlungen hinzuweisen J Weist auf eine potenzielle Gefahrensituation hin deren Missachtung zu Fe oder schweren Verletzungen f hren k nnte GEFAH R Weist auf eine unmittelbare Gefahrdung hin die bei Missachtung lebensgef hrlich ist oder zu schweren Verletzungen f hrt Dieses Signalwort wird nur f r absolute Extremsituationen verwendet Mit Ausnahme der WICHTIG Hinweise werden die Sicherheitswarnbegriffe in den Applied Biosystems Dokumenten zusammen mit einem Dreieck angezeigt das ein Gefahrensymbol enthalt Diese Gefahrensymbole sind mit den Gefahrensymbolen identisch die an den Applied Biosystems Ger ten angebracht sind siehe Sicherheitssymbole auf Seite x1 Beispiele WICHTIG Sie m ssen f r jede 96 Well Platte eine eigene Tabellenkalkulation erstellen CHEMISCHE GEFAHREN TaqMan Universal PCR Master Mix kann Augen und Hautreizungen hervorrufen Durch Schlucken oder Einatmen k nnen Beschwerden verursacht werden Lesen Sie das Sicherheitsdatenblatt und befolgen Sie die Handhabungsanweisungen Tragen Sie eine geeig
7. zeigt VIC Farbstoff markierten Sondenfluoreszenz Homozygotie f r Allel 1 FAM Farbstoff markierten Sondenfluoreszenz Homozygotie fur Allel 2 VIC als auch FAM Farbstoff markierten Allel 1 Allel 2 Heterozygotie Sondenfluoreszenz Hinweise Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 7 udn Kapitel 1 Erste Schritte Verwendung dieses Handbuchs Verwendung dieses Handbuchs Verwendung des Anhand der mit der StepOne Software gelieferten Beispielanalysedaten k nnen Sie Handbuchs als dieses Handbuch als Tutorial f r die Durchf hrung einer Genotypisierungs Analyse mit Tutorial dem StepOne System verwenden Befolgen Sie die Anweisungen in den Kapiteln 2 bis 3 e Kapitel 2 Erstellen der Analyse mithilfe des Analysedesign Assistenten der Software e Kapitel 3 Vorbereiten der Analyse anhand der vom Analysedesign Assistenten in Kapitel 2 berechneten Reagenzien und Volumina e Kapitel 4 Durchf hren der Analyse auf einem StepOne System e Kapitel 5 Auswerten der Ergebnisse Weitere Informationen finden Sie unter Informationen zur Beispielanalyse auf Seite 9 Anhand der mit der StepOne Software gelieferten Beispielanalysedaten k nnen Sie dieses Handbuch als Tutorial f r die Durchf hrung einer Genotypisierungs Analyse mit dem StepOne System verwenden Befolgen Sie die Anweisungen in den jeweiligen Kapiteln Kapitel Verfahre
8. Die StepOne Software genotypisiert die DNA Proben einer Reaktionsplatte gleichzeitig Zuerst normalisiert die Software die Fluoreszenz des Reporter Farbstoffs auf die Fluoreszenz des pass ven Referenz Farbstoffs in jedem Well Anschlie end plottet die Software die normalisierten Intensit ten R der Reporter Farbstoffe in jedem Proben Well auf dem Alleldiskriminierungsplot welcher die Reporter Farbstoff Intensit ten der allelspezifischen Sonden vergleicht Schlie lich f gt die StepOne Software die Probendaten algorithmisch in Clustern zusammen und ordnet den Proben eines jeden Clusters je nach Position im Plot eine Genotypenbestimmung zu Hinweis Der Clustering Algorithmus der StepOne Software nimmt keine Genotypenbestimmung vor wenn in einer Analyse nur ein Genotyp vorkommt 6 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 1 Erste Schritte Informationen zu Genotypisierungsanalysen ee ee Allel 2 2 4 29 34 39 Allel 1 Die Clusterbildung von Datenpunkten kann entlang der horziontalen Axe Allel 1 vertikalen Achse Allel 2 oder diagonal Allel 1 Allel 2 variieren Die Variation entsteht aus Differenzen in dem Ausma der Fluoreszenzintensit t des Reporter Farbstoffs nach der PCR Amplifikation In der Tabelle unten ist die Korrelation zwischen Fluoreszenzsignalen und Sequenzen in einer Probe dargestellt Ein deutlicher Anstieg der
9. berwachen des Laufs Edit Run Method Adjust of Cycles _ Add Melt Curve Stage to End Run Method st PCR Read Holding e PCR Read Holding Stag Holding Stage Cycling Stage Number of les I5C Enable Auto A Starting Cycle _ Add Holding Stage to End Legend Data Collection On Data Collection Off A AutoAOn A Auto A Off Hinweis Wenn eine Warnung erscheint klicken S e auf den Fehler um weitere Informationen zu erhalten und beheben Sie das Problem entsprechend den Erl uterungen in der Hilfe der StepOne Software klicken Sie auf in der Symbolleiste oder w hlen Sie Help gt StepOne Help Hilfe gt StepOne Hilfe Weitere Informationen zur Lauftypanzeige finden Sie in der StepOne Software Help indem Sie auf klicken oder Help gt StepOne Help Hilfe StepOne Hilfe w hlen Hinweise Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 61 a Kapitel 4 Analysedurchfuhrung Uberwachen des Laufs Fern berwachung Wenn Ihr StepOne System an ein Netzwerk angeschlossen ist k nnen Sie die Fern berwachungsfunktion der StepOne Software verwenden um den Ablauf in Echtzeit auf einem beliebigen Computer des Netzwerks anzuzeigen WICHTIG Vernetzte Computer k nnen das StepOne System nicht steuern sondern nur berwachen Ziel Aktion A Amplifikationsdaten in Klicken Sie auf Am
10. nehmen Sie das eine Ende der Endlaschen und ziehen Sie es rasch nach oben ab Wiederholen Sie diesen Vorgang bei der anderen Lasche 8 Wiederholen Sie Schritt 7 Bewegen Sie den Applikator waagerecht und senkrecht mit festem Druck ber den optischen Klebefilm um eine dichte verdunstungssichere Versiegelung zu gew hrleisten 9 Um eine dichte Versiegelung sicherzustellen dr cken Sie den Applikator nochmals fest entlang aller vier Seiten des Au enrandes des optischen Klebefilms berpr fen Sie die Platte um sicherzustellen dass alle Wells versiegelt sind pr fen Sie ob von allen Wells ein Abdruck auf der Oberfl che des optischen Klebefilms zu erkennen ist WICHTIG Ein unsauberes Abziehen des Films kann zu Beschlagen der Wells f hren hat jedoch keine Auswirkungen auf die Testergebnisse Der Beschlag verschwindet sobald der Film mit dem Heizdeckel des Ger ts in Kontakt kommt Hinweis Optische Klebefilme bleiben bei Kontakt nicht haften Der Klebefilm muss angedr ckt werden damit eine dichte verdunstungssichere Versiegelung sichergestellt ist Weitere Weitere Informationen zur Vorbereitung derReaktionsplatte finden Sie in den jeweiligen Informationen Protokollen der Reagenzien die Sie bei den PCR Reaktionen verwenden siehe Weitere Informationen auf Seite 36 Hinweise Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 43 Q Kapitel
11. 14 Werten Sie die Analyse aus wie in Kapitel 5 Analyseauswertung auf Seite 71 beschrieben 106 Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Anhang A Alternative Analyseabl ufe N QuickStart Arbeitsablauf QuickStart Arbeitsablauf Wenn Sie eine Genotypisierungsanalyse ber QuickStart erstellen k nnen Sie die Reaktionen auf dem Ger t analysieren lassen ohne weitere Daten zur Einrichtung der Reaktionsplatte eingeben zu m ssen Informationen zur Die StepOne Software verf gt ber einen QuickStart Modus der die meisten Schritte QuickStart aus Kapitel 2 umgeht Wenn Sie mit den erforderlichen Aufgaben zur Einrichtung einer Einrichtung Analyse vertraut sind k nnen Sie Ihre Analysen ber QuickStart sofort ausf hren und sp ter bearbeiten So erstellen Sie 1 Bereiten S e die Reaktionen wie n Kapitel 3 Ansetzen der Reaktionen auf eine Analyse Seite 35 erl utert vor 2 Klicken Sie im Bildschirm Home Startseite auf 7 QuickStart 3 Geben Sie die Eigenschaften der Beispielanalyse ein a Klicken Sie in das Feld Enter Experiment Name Analysename und geben Sie dann Genotyping Example Genotypisierungs Beispiel ein b W hlen Sie als Analysetyp Genotyping Genotypisierung aus c W hlen Sie als Reagenzien TaqMan Reagents aus d W hlen Sie als Heiz Kthlgeschwindigkeit Standard 2 hours to complete a run Standard ca
12. Add Stage Phase hinzuf gen und anschlie end auf Holding Halten c Wahlen Sie den ersten Schritt 50 C 00 02 00 der neuen Haltephase und klicken Sie anschlie end auf Delete Selected Auswahl l schen um den Extraschritt zu l schen d Klicken Sie auf das Feld Number of Cycles Anzahl der Zyklen und geben Sie 50 ein e Klicken Sie auf die Temperatureinstellung f r den ersten Schritt der Cycling Phase 95 C 00 00 15 und geben Sie 92 C ein Hinweise 108 Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Anhang A Alternative Analyseablaufe QuickStart Arbeitsablauf A Z QuickStart Q Q Make selections and define the run method to run a new experiment with no plate setup information Load the reaction plate into the instrument then click Start Run Experirnent Properties Run Method Graphical View Tabular View 4a TH Reaction Volume Well 25 uL Collect Data Open Run Method Save Run Method II C Number of Cycles 40 C Enable AutoA Legend Data Collection On Data Collection Off A AutoA On A AutoA Off _ Save current settings as the default Cancel START RUN 9 Bereiten Sie die Reaktionen vor wie in Kapitel 3 Ansetzen der Reaktionen auf Seite 35 erlautert 6 Legen Sie die Reaktionen in das StepOne System wie unter Einlegen der Reaktionsplatte auf Seite
13. Anmelden und Abschicken oder klicken Sie auf Register Now Jetzt registrieren und befolgen Sie die Anweisungen zur Registrierung Nachdem Sie Ihre Bestellung aufgegeben haben klicken Sie auf Finish Designing Experiment Einrichtung des Analysedesigns fertigstellen 3A Optional Order Materials List Materials List Help 8 Instructions Review the list of materials recommended to prepare the PCR reaction plate To create a shopping basket on the Applied Biosystems Store add items to the shopping list enter a name for the shopping basket click Order Materials in List then log in Find Assay 1 g Enter Gene Name or RS Number Find Assay Enter a gene name or RS number to search the Applied Biosystems Store for a SNP assay Experiment Shopping List 4 items Remove Selected Items from Shopping List Shopping Basket Name Genotyping Example Order Materials in List Print Shopping List Experiment Materials List l Add Selected Items to Shopping List C Check All Item Part Number Description The MicroAmp Fast Optical 48 Well Reaction Plate constructed from MicroAmp Fast Optical 48 Well Reaction Plate 4375816 a single rigid piece of polypropylene in a 48 well format Increased thermal contact for faster more uniform heating An optically clear adhesive film used to seal the samples into the wells of a 48 well microplate This will reduce the possibility of TM F MicroAmp
14. Block Type 48 Well Block Notification Settings Type Applied Biosystems StepOne Experiment Type Serial Number 100010001 Host Name 192 168 0 1 LED Temperature Plot I B Current Temperatures Sample 25 0 105 3 Cover 105 0 100 Block 25 0 View Temperature 80 4 E Sample cover Block Zur Fern berwachung des StepOne Systems gehen Sie wie folgt vor 1 W hlen Sie in der StepOne Software Instrument gt Remote Monitor Ger t gt Fern berwachung Hinweise 62 Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 4 Analysedurchfuhrung A berwachen des Laufs 2 W hlen Sie in der Navigationsleiste Ihr StepOne System Falls die Navigationsleiste Ihr StepOne System nicht auflistet gehen Sie wie folgt vor a Klicken Sie auf Add Instrument Ger t hinzuf gen b Klicken Sie auf das Feld Instrument Name Ger tename und geben Sie dann den Namen des Ger ts ein c Klicken Sie auf das Feld Host Name Host Name und geben Sie die IP Adresse des Ger ts ein d Klicken Sie auf Save amp Exit Speichern und beenden Add Instrument T Enter an instrument name select the instrument type then enter the host name _ Reakad Click Save amp Exit to save the instrument profile and return to the remote monitor q 2b Instrument Name ExampleInstrument Instrume
15. Die Well Tabelle zeigt in Spalten QC Markierungen an die von den Analysedaten ausgel st wurden Wenn die Analysedaten keine QC Markierungen ausl sen zeigt die StepOne Software keine entsprechende Spalte f r die Markierungen an Ein A in einer der folgenden Spalten zeigt an dass der dazugeh rige Well die Markierung ausgel st hat BADROX Der Well erzeugte ein passives Referenzsignal das ber dem in den Auswertungseinstellungen festgelegten Grenzwert lag OFFSCALE Der Well erzeugte ein h heres Fluoreszenzniveau als das StepOne System messen konnte NOSIGNAL Der Well erzeugte kein erkennbares Fluoreszenzsignal CLUSTER Die Anzahl der durch die Analysedaten erzeugten Cluster ist gr er als der in den Auswertungseinstellungen definierte Grenzwert f r den im Well beurteilten SNP PCFAIL Die Positivkontrolle erzeugt kein R f r das dazugeh rige Allel das ber dem in den Auswertungseinstellungen definiertem Grenzwert lag Dies weist darauf hin dass die Amplifikation der Kontrolle m glicherweise fehlgeschlagen ist SMCLUSTER Die Anzahl der Datenpunkte in dem dazugeh rigen Cluster liegt unter dem in den Auswertungseinstellungen definierten Grenzwert AMPNC Die Negativkontrolle hat einen R erzeugt der ber dem in den Auswertungseinstellungen festgelegten Grenzwert liegt Dies weist auf eine m gliche Amplifikation hin NOAMP Der Well erzeugte f r keines der Allele einen R Wert der ber dem in den Ausw
16. Genotyping Example eds auf Ihren Computer daten unter lt drive Laufwerk gt Applied Biosystems StepOne System experiments examples wobei lt drive Laufwerk gt f r das Computerlaufwerk steht auf dem die StepOne Software installiert wurde Das Standardinstallationslaufwerk ist C Hinweise 10 Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 1 Erste Schritte 4 Arbeitsablauf der Beispielanalyse Arbeitsablauf der Beispielanalyse Informationen In der folgenden Abbildung ist der Arbeitsablauf der Genotypisierungs Beispielanalyse zum Arbeits dargestellt ablauf der An al se Analyse starten WwW Experimentelles Design Kapitel 2 Legen Sie eine neue Analyse an Legen Sie die Analyseeigenschaften fest Legen Sie die Methoden und Materialien fest Definieren Sie die SNP Assays Definieren Sie die Proben und Replikate Definieren Sie das Laufprofil berpr fen Sie das Pipettierprotokoll Bestellen Sie Materialien f r die Analyse oO ON Oo Pr OD Beenden Sie den Analysedesign Assistenten w Ansetzen der Reaktionen Kapitel 3 1 Setzen Sie die Probenverd nnungen an 2 Setzen Sie den Reaktionsmix an 3 Bereiten Sie die Reaktionsplatte vor v Analysedurchf hrung Kapitel 4 Bereiten Sie den Lauf vor Aktivieren Sie die Benachrichtigungen optional Starten Sie den La
17. Geschwindigkeit mit der die Temperaturrampe w hrend des Ger teslaufs erscheint M gliche Heiz K hlgeschwindigkeiten sind Fast schnell und Standard In Positiv Negativ Analysen ein kurzes synthetisches DNA Template das zu PCR Reaktionen hinzugegeben wird Die IPC kann dazu verwendet werden zwischen richtig negativen Ergebnissen und Reaktionen die durch PCR Inhibitoren eine fehlerhafte Assay Einrichtung oder einen Reagenzien bzw Ger tefehler beeinflusst wurden zu unterscheiden TaqMan Genomassays die hergestellt wurden die Anforderungen der Qualit tskontrolle bestanden haben und in ein Bestandsverzeichnis aufgenommen wurden Abk rzung f r Interne Positivkontrolle In Positiv Negativ Analysen auch die Aufgabe f r die IPC Zielsequenz in Wells die ein IPC Template enthalten Positiv Negativ Bestimmung wenn die interne Positivkontrolle IPC erfolgreich ist Reagenz das zu PCR Reaktionen hinzugegeben wird um die Amplifikation der internen Positivkontrolle zu unterdr cken In Positiv Negativ Analysen Wells die ein IPC Template und einen Puffer oder Wasser statt des Proben Templates in der PCR Reaktion enthalten In IPC Wells mit Negativkontrolle sollte nur das IPC Template amplifizieren da die Reaktion kein Proben Template enth lt siehe auch unter IPC Siehe unter Referenzprobe Softwarefeld das unter dem Reiter Sample Dilution Calculations Berechnung der Probenverd nnung des Bildschirms Reaction Setup R
18. Mix No AmpErase UNG kann Augen und Hautreizungen hervorrufen Durch Schlucken oder Einatmen konnen Beschwerden verursacht werden Lesen Sie das Sicherheitsdatenblatt und befolgen Sie die Handhabungsanweisungen Tragen Sie eine geeignete Schutzbrille sowie Schutzkleidung und handschuhe 1 Geben Sie f r den SNP Assay die erforderlichen Volumina von jeder Komponente in ein Reaktionsgef von entsprechender Gr e Reaktionsvolumen 24 Rxns einschl 10 mempeneure PTO WELL berschuss ul Getrocknet Fl ssig Getrocknet Fl ssig TaqMan Universal PCR Master 12 50 12 50 330 330 Mix 2 fach SNP Assay Mix 20 fach 1 25 1 25 33 33 H O DNAse frei 11 25 0 297 0 Gesamtvolumen des 25 00 13 75 660 363 Reaktionsmixes 2 Pipettieren Sie den Reaktionsmix vorsichtig von oben nach unten und verschlieBen Sie dann das Reaktionsgef chen 3 Zentrifugieren Sie das Reaktionsgef kurz 38 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 3 Ansetzen der Reaktionen Q Ansetzen des Reaktionsmix Vorbereitungs Wenn Sie einen Reaktionsmix f r Ihre eigene Analyse ansetzen achten Sie darauf dass hinweise folgende Bedingungen erf llt sind Die Reaktionen f r jeden SNP werden separat vorbereitet Ber cksichtigen Sie bei Ihren Berechnungen berschussvolumen mit dem Sie die beim Transfer von Reagenzien auftretenden Verluste kompensie
19. Verwendung die Kontrollkastchen aller Markierungen die Sie aktivieren mochten c Passen Sie die Werte der aktivierten Markierungen nach Bedarf an d Falls Sie m chten dass eine aktivierte QC Markierung Wells die f r die definierte Bedingung positiv ausfallen automatisch aus der Analyse herausnehmen soll aktivieren Sie f r diese Markierung das Kontrollk stchen Reject Well Well ablehnen Hinweis Mithilfe der QC Markierungen k nnen Sie Bedingungen kennzeichnen und Wells herausnehmen sobald bestimmte Kriterien erf llt sind zum Beispiel wenn bei einem Well Daten fehlen Weitere Informationen finden Sie in der StepOne Software Help 9 Klicken Sie auf Apply Analysis Settings Auswertungseinstellungen anwenden 10 Klicken Sie zur Auswertung der Daten anhand der neuen Einstellungen auf Reanalyze Neu auswerten In der Abbildung unten s nd die Auswertungseinstellungen f r die Genotypisierungs Beispielanalyse dargestellt Hinweise 96 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 5 Analyseauswertung Ansicht der Auswertungseinstellungen o StepOne v1 0 File Edit Instrument Analysis Tools Help Experiment Menu f Experiment Type Reagents J 7 setup Multiple Plots yi lt View Plate Layout View Well Table I Run Q En ID gt Select Wells With Select Item Jj Select Item v r m amp Analysis Settings for Genotyping
20. W hlen Sie aus dem Dropdown Men Plot Type Darstellungstyp Cy vs Well Cr ber dem Wells b Best tigen Sie dass die Replikat Wells eine hnliche Amplifikation erreicht haben In der Beispielanalyse werden keine Replikat Wells verwendet Hinweise Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 91 es Kapitel 5 Analyseauswertung Ansicht der Amplifikationsdarstellung o StepOne v1 0 _ File Edit Instrument Analysis Tools Help New Experiment 2 Open kaj Save DJ Close w Send Experiment to Instrument Eg Download Experiment from Instrument 49 Export Print Report Experiment Menu amp asc Experiment Type Amplification Plot Plot Settings Select Wells With Selectitem v Selectitem 2 Plot Type ARn vs Cycle Graph Type Log Color Plot By Well P P a Amplification Plot 1 Sample 1 Sample2 Sample3 Sample4 SampleS Sample6 Aj Le Let U c11 U c11 J c11 U c1 U c1 FJ c Multicomponent Plot Raw Data Plot E QC Summary Sample7 Sample8 Sample9 Sample 10 Sample 11 Sample 12 Sample 13 Sample 14 5 U cas U c11 M c11 M c11 cs cia J ci J c_11 as Multiple Plots View Sample 15 Sample 16 Sample 17 Sample 18 Sample 19 Sample 20 CV c1 pcs cai J cl J c_11 cs Bic Bc 0 0001 m a anm manan i 0 2 4 6 86 0 122 4 6 8WBMN2DRDwBMAANDRKHBABAMALQ HSH GB HM KL Cycle Options Target All v Threshold
21. e folgende Vorkehrungen einhalten Charakterisieren Sie den von den jeweiligen Anwendungen Reagenzien und Substraten Ihres Labors erzeugten Abfall gegebenenfalls anhand einer Analyse Sorgen S e f r die Gesundheit und Sicherheit aller Labormitarbeiter Vergewissern Sie sich dass bei Lagerung berf hrung Transport und Entsorgung von Ger teabf llen alle lokalen landesweiten regionalen bzw nationalen Auflagen eingehalten werden WICHTIG Radioaktive bzw biogef hrliche Stoffe erfordern u U spezielle Handhabungsma nahmen und es gelten evtl Entsorgungseinschr nkungen Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen xvii Vorwort Elektrische Sicherheit Elektrische Sicherheit Sicherungen Strom Uberspannungs nennwert N y L y 4N f We IN NEI STROMSCHLAGGEFAHR Wenn beim Betrieb des StepOne Systems die Verkleidung nicht ordnungsgem angebracht ist besteht die Gefahr eines Stromschlags Entfernen Sie die Ger teverkleidung nicht Beim Entfernen der Ger teverkleidung werden Hochspannungskontakte freigelegt S N WAR UNG BRANDGEFAHR Unsachgem installierte Sicherungen oder Hochspannungsversorgungen k nnen das Kabelsystem des Ger ts besch digen und einen Brand verursachen Vergewissern Sie sich vor Einschalten des Ger ts dass die Sicherungen ordnungsgem installiert sind und die Ger tespannung auf das Stromnetz in Ihrem L
22. experiment then create experiment using the design another experiment using the wizard design wizard Save this experiment then Use advanced setup to edit Start the run Make sure the the plate layout reaction plate is loaded into the instrument Sample 15 La Sample 16 My Recent c 44711420 C__11711420 Sample 5 Desktop 98 My Computer Hinweise File name My Network Places Files of type ab calib background 48 ab calib peak 48 ab calib theta 48 Example Experiment pure dye aztec 1 plate 1 e pure dye aztec 1 plate 2 e RNaseP_Run e RNaseP_Run2 Save in x Delele Genotyping Example Experiment Document Single files eds Lala 1420 I c__14711420 3 Sample 4 1420 I c__11711420 1420 EJ c_11711420 32 Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 2 Experimentelles Design pl Beenden des Analysedesign Assistenten Einrichtungs Wenn Sie eine eigene Analyse erstellen wird Ihre Analyse unter hinweise lt drive Laufwerk gt Applied Biosystems StepOne System experiments gespeichert wobei lt drive Laufwerk gt das Installationsverzeichnis der StepOne Software ist Hinweis Zum ndern des Standardordners w hlen Sie Tools gt Preferences Einstellungen ndern den Default Data Folder auf den ge
23. 2 Stunden ftir einen Lauf aus e Wahlen Sie Pre PCR Read Pra PCR Messung und Amplifikation Amplifikation um die Stadien des Lauftyps hinzuzuf gen Hinweise Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 107 N Anhang A Alternative Analyseabl ufe QuickStart Arbeitsablauf Zs QuickStart B Make selections and define the run method to run a new experiment with no plate setup information Load the reaction plate into the instrument then click Start Run Experiment Properties Run Method Enter Experiment Name and Location 3 a m Enter Experiment Name ple Genotyping Experiment Location C Applied Biosystems StepOne System experiments Example Genotyping Experiment eds Select Experiment Type a Quantitation Standard Curve _ Standard Curve Quantitation Relative Standard Curve Relative Standard Curve Quantitation Comparative CT Quantitation Comparative CT AACT 3b p e MA Nd PLES E Ab ee Select Reagents ET ae Select Ramp Speed Select Run Stages Q O Q oO Post PCR Read C ave current settings as the default Cancel START RUN 4 Wahlen Sie den Reiter Run Method Lauftyp und richten Sie anschlie end den Lauftyp ein a Klicken Sie in das Feld Reaction Volume Per Well Reaktionsvolumen pro Well und geben Sie 25 ein b Klicken Sie auf Pre PCR Read Holding Stage Pra PCR Messung Haltephase
24. 27 E Bestellen von Materialien f r die Analyse 0 0 0 0 00 cee eee 29 E Beenden des Analysedesign Assistenten 0 0 0000 eee ee ees 32 Hinweis Weitere Informationen uber ein Thema dieses Handbuchs finden Sie in der Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Software indem Sie entweder F1 dr cken in der Symbolleiste auf klicken oder Help gt StepOne Help Hilfe StepOne Hilfe w hlen Hinweise Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 13 Kapitel 2 Experimentelles Design Kapitelubersicht Kapitelubersicht In diesem Kapitel wird erklart wie der Analysedesign Assistent zur Einrichtung der Genotypisierungs Beispielanalyse verwendet werden kann Der Analysedesign Assistent fuhrt Sie wahrend der Einrichtung durch bewahrte Verfahren Arbeitsablauf Richten Sie die Analyse nach dem folgenden Arbeitsablauf ein Analyse starten v Experimentelles Design Kapitel 2 Legen Sie eine neue Analyse an Definieren Sie die Analyseeigenschaften Definieren Sie die Methoden und Materialien Definieren Sie die SNP Assays Definieren Sie die Proben und Replikate Definieren Sie das Laufprofil berpr fen Sie das Pipettierprotokoll Bestellen Sie Materialien f r die Analyse oO ON oO Pr OD Beenden Sie den Analysedesign Assistenten 4 Reaktionen ansetzen Kapitel 3 4 Analyse ausf hren Kap
25. 73 23 EEC Dieses Ger t wurde auf die Einhaltung der folgenden beiden Normen getestet EN 61010 1 2001 Sicherheitsbestimmungen f r elektrische Mess Steuer Regel und Laborger te Teil 1 Allgemeine Anforderungen EN 61010 2 010 Besondere Anforderungen an Laborger te f r das Erhitzen von Stoffen EN 61010 2 081 Besondere Anforderungen an automatische und semiautomatische Laborger te f r Analysen und andere Zwecke EMV Dieses Ger t h lt die europ ischen Sicherheitsbestimmungen f r St remissionen und Funkentst rung ein EMC Richtlinie 89 336 EEC Dieses Ger t wurde auf die Einhaltung der Norm EN 61326 Gruppe 1 Klasse B getestet Elektrische Betriebsmittel f r Leittechnik und Laboreinsatz EMV Anforderungen Dieses Ger t wurde auf die Einhaltung der Norm AS NZS 2064 getestet Limits and Methods Measurement of Electromagnetic Disturbance Characteristics of Industrial Scientific and Medical ISM Radio frequency Equipment Grenzwerte und Messverfahren f r elektromagnetische St reigenschaften von industriellen wissenschaftlichen und medizinischen Hochfrequenzger ten ISM XX Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 1 Erste Schritte Dieses Kapitel umfasst die folgenden Themen E Informationen zum StepOne System 000 00 c eee eee eee 2 E Informationen zu Genotypisierungsanalysen 0 000
26. Assay durchgef hrt wird M gliche Aufgaben in StepOne System Analysen sind e Unbekannt e Negativkontrolle e Standard Standardkurven und relative Standardkurven Analysen e Positivkontrolle Genotypisierungsanalysen e IPC Positiv Negativ Analysen e Blockierte IPC Positiv Negativ Analysen TaqMan Genomassays die zum Zeitpunkt des jeweiligen Auftrags hergestellt werden Nur Assays die die Anforderungen der Produktionsqualitatskontrolle erf llen werden ausgeliefert Entspricht bei der Definition einer Standardkurve oder Standardverd nnungsreihe der gr ten oder geringsten Menge Ein Datenpunkt in einem bestimmten Datensatz der signifikant kleiner oder gr er als die anderen ausf llt Einstellung zur Erh hung oder Reduzierung der Temperatur und oder Zeit mit jedem darauffolgenden Zyklus in einer Zyklusphase Wenn AutoA aktiviert ist werden die Einstellungen durch ein Symbol im Thermoprofil angezeigt e AutoA ein A e AutoA aus A Analyseeinstellung bei der die Grundlinien Start und Endwerte f r den Amplification Plot Amplifikationsdarstellung von der Software berechnet werden Die Software verwendet Grundlinie und Schwellenwert zur Berechnung des Schwellenwert Zyklus C Analyseeinstellung bei der Schwellenwert und Grundlinie in der Darstellung der Amplifikation von der Software automatisch berechnet werden Die Software verwendet Schwellenwert und Grundlinie zur Berechnung des Schwellenwert Zyklus
27. Assay 1 Unknowr Sample 1 SNP Assay 1 Unknowr gt Flag NOREPORTER No reporter dye signal in well Flag Detail Reporter dye produced low or no signal Flag Criteria Fluorescence lt 1000 0 Flagged Wells B8 C2 C7 D3 D6 E4 E5 View NOREPORTER Troubleshooting Information O d O O O O CO 0 O 0 O 0 O 0 O 0 O 0 O 0 O 0 O O O O 0 O 0 Fi Auswertungs Beachten Sie bei der Auswertung Ihrer eigenen Analyse Folgendes hinweise e W hlen Sie jede QC Markierung in der Ansicht Flag Details Markierungsdetails mit einer H ufigkeit von ber 0 aus pr fen Sie H ufigkeit und Ort der Wells die die Markierung ausgel st haben und klicken Sie anschlie end auf den Link zur Fehlerbehebung f r die Markierung Hinweis Wenn Sie eine Markierung aus der Tabelle Flag Details ausw hlen werden die Wells die die Markierung ausl sten in der Well Tabelle hervorgehoben Weitere Weitere Informationen zu QC Markierungen finden Sie in der StepOne Software Help Informationen indem Sie auf klicken oder Help gt StepOne Help Hilfe StepOne Hilfe w hlen Hinweise Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 85 n Kapitel 5 Analyseauswertung Ansicht der Rohdatendarstellung Ansicht der Rohdatendarstellung Pr fen Sie sofern erforderlich die Rohdatendarstellung auf Unregelm igkeiten in den vom StepOne System g
28. Daten in der Darstellung anzuzeigen B Die von der Darstellung W hlen Sie View Anzeigen gt Zeitdauer angezeigte Uhrzeit ndern C Y Achse des Plots fixieren W hlen Sie Fixed View Fixierte Ansicht Temperature Plot Current Temperatures Sample 60 Cover 105 Block 60 Temperature Plot View Temperature A Bi Sample cover BB Block Temperature Plot View all E y B Fixed View a gt oO a oO a Fr o 4 r 00 00 00 00 00 10 00 00 20 00 00 30 00 00 40 00 00 50 00 01 00 00 01 10 00 01 20 00 01 30 00 01 Time Der Temperaturgraph kann bei der Identifizierung von Hardware Fehlern helfen Pr fen Sie bei der berwachung des Temperaturgraphen die Darstellungen der Probe des Heizdeckels und des Heizblocks auf ungew hnliches Verhalten e Normalerweise sollten sich die Darstellungen von Probe und Block ungef hr widerspiegeln Eine erhebliche Abweichung der Darstellungen kann auf ein Problem hinweisen Hinweise Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 59 a Kapitel 4 Analysedurchfuhrung Uberwachen des Laufs Hinweise e Die Darstellung des Heizdeckels sollte die bei der Methode angegebene Temperatur konstant halten Eine Abweichung von der konstanten Temperatur kann auf ein Problem hinweisen Wenn Sie einen ungew hnlichen Temperaturgraphen feststellen beheben Sie den Fehle
29. Example Call Settings CT Settings Flag Settings ES Allelic Discrimin Q Review the default settings for analysis of the SNP assays in this experiment To edit the default settings click Edit Default Settings To use different settings for a SNP assay selectthe SNP assay from the table deselect the Use Default Settings checkbox then change the settings that are displayed Sample5 Sample6 Amplification Plo wy I m c11 M c11 Data Analysis Settings se Multicomponent Analyze Data from Post PCR Read Only Analyze Data from Pre PCR Read and Post PCR Read FF Si Default Call Settings SS Raw Data Plot f i Sample 13 Sample 14 Default call settings are used to make allele calls for SNP assays without custom settings To edit the default settings click Edit Default Settings a ae m c11 M c11 3 iocs Autocaller Enabled Yes 2 Cluster Calling Enabled N A Quality Value N A Edit Default Settings Select a SNP Assay l Edit Default Call Settings le A c By c SNP Assay Analysis Type Quality Value Apply Call Settings V Use Default Settings l i i Editthe default call settings then click Save a r Q 11711420_30 Default ge Changes Editing the default call settings does Keep Manual Calls from Previous Analysis not affect wells with custom settings ateraller cheba 4 2 Cluster Calling Enabled V Autocaller Enabled alih e BO 7 C 2 Cluster Calling Enabled 5 ualit
30. Fehlerbehebung Arbeitsablauf 72 Auswerten 72 Hinweise 76 79 82 85 87 89 92 97 Well Tabelle ansehen 80 Auswertungsbildschirme Allelic Discrimination Plot Alleldiskriminierungsplot 74 77 Amplification Plot Amplifikationsdarstellung 90 93 Bildschirm QC Summary Zusammenfassung der Qualit tskontrolle 84 85 Multicomponent Plot 88 89 Multiple Plots View Ansicht mit mehreren Plots 94 Plattenbelegung 78 80 Raw Data Plot Rohdatendarstellung 86 87 Well Tabelle 80 83 Auswertungseinstellungen 95 97 Auswertungshinweise 76 79 82 85 87 89 92 97 AutoA 121 automatische Allelbestimmung 98 Automatische Grundlinie 121 Automatischer Cy 121 B Beispielanalyse Arbeitsablauf 11 Auswerten 72 Beschreibung 9 Daten 73 74 78 80 84 86 88 90 95 Design 14 18 20 23 25 27 49 Lauf 46 Plattenbelegung 10 Reaktionen ansetzen 36 Speicherort der Daten 10 Benachrichtigungseinstellungen 49 51 Ben tigte Materialien 29 37 38 40 Bewegen und anheben Sicherheit xiii Bildschirm Experiment Properties Analyseeigenschaften 16 Bildschirm Materials List Materialliste 29 Bildschirm Reaction Setup Reaktionseinrichtung 27 Bildschirm Run Method Lauftyp 25 Bildschirm SNP Assays 20 biogef hrlicher Abfall Handhabung xvii C Chemie siehe unter Reagenzien Chemische Sicherheit xiv chemische Sicherheit xiv CLUSTER Marikierung 82 C siehe unter Schwellenwert Zyklus D Daten bertragen 52 67 D
31. Settings Standard SNP Assay Einstellungen bearbeiten Keep Manual Calls from Previous Analysis Manuelle Bestimmungen aus der vorherigen Auswertung bernehmen Geben Sie m Feld Quality Value Qualit tswert einen Prozentwert ein der als Qualit tsintervall f r Autocalling Proben gilt Je h her der Wert desto strikter die Allelbestimmung Klicken Sie auf Save Changes nderungen speichern um die Einstellungen zu speichern Passen Sie die C Einstellungen an a Wahlen Sie den Reiter Ct Settings C Einstellungen b Wahlen Sie aus der Tabelle zur Auswahl der Allele Allel A und deaktivieren Sie die Option Use Default Settings Standardeinstellungen verwenden c Deaktivieren Sie Automatic Threshold Automatischer Schwellenwert und geben Sie einen neuen Schwellenwert ein d Deaktivieren Sie Automatic Baseline Automatischer Grundlinienwert und geben Sie einen neuen Grundlinienwert ein e Wiederholen Sie die Schritte 7b bis 7d f r Allel C Hinweis Weitere Informationen zur Einrichtung der Schwellenwertzyklen f r Genotypisierungsl ufe finden Sie in der Hilfe der StepOne Software Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 95 Kapitel 5 Analyseauswertung Ansicht der Auswertungseinstellungen 8 Passen Sie die Markierungseinstellungen an a Wahlen Sie den Reiter Flag Settings Markierungseinstellungen b Aktivieren Sie in der Spalte Use
32. Sie Positivkontrollen verwenden best tigen Sie die Bestimmungen f r die Positivkontrollen a W hlen Sie aus der Well Tabelle die Wells aus die eine Positivikontrolle enthalten um die entsprechenden Datenpunkte in der Alleldiskriminierungs Darstellung zu markieren b Pr fen Sie dass sich die Datenpunkte f r die Positivkontrollen entlang der erwarteten Achse der Darstellung anh ufen Wenn Sie beispielsweise das Positivkontroll Allel 1 Allel 1 w hlen sollten sich die Kontrollen entlang der x Achse anh ufen c Wiederholen Sie die Schritte a und b f r die Wells die andere Positivkontrollen enthalten 76 Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 5 Analyseauswertung Ansicht der Amplifikationsdarstellung e Untersuchen Sie die Negativkontroll Cluster auf unbekannte Proben die nicht amplifiziert wurden a Wahlen Sie die Datenpunkte des Clusters in der Ecke unten links der Alleldiskriminierungs Darstellung um die entsprechenden Zeilen der Well Tabelle auszuwahlen b Prufen Sie dass die ausgewahlten Wells in der Well Tabelle Negativkontrollen und keine unbekannten Proben sind e F r Proben die sich mit den Negativkontrollen zusammengeh uft haben gilt m glicherweise Folgendes sie enthalten keine DNA sie enthalten PCR Inhibitoren sie sind homozygot f r eine Sequenzdeletion e Best tigen Sie die Ergebnisse der Proben die nic
33. Sie den Vorgang ansonsten bei Schritt 2 fort Instrument Analyse an Ger t schicken b Klicken Sie im Dialogfeld Send Experiment to Instrument Analyse an Ger t schicken auf Browse Suchen w hlen S e die Date Genotyping Example eds und klicken Sie dann auf Open ffnen c W hlen Sie das gew nschte StepOne System aus dem Dropdown Men Select Instrument Ger t ausw hlen Falls ihr StepOne System nicht aufgef hrt ist richten Sie Ihr Ger t zur berwachung wie im Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Installationshandbuch beschrieben ein Hinweise 92 Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 4 Analysedurchfuhrung A Starten der Analyse d Klicken Sie auf Send Experiment Analyse senden um die Analyse ber das Netzwerk an das StepOne System zu schicken Send Experiment to Instrument Select an experimentto send selectthe instrument to receive the experiment then click Send Experiment A 1 b 1 Select Experiment 19slidevuser Desktoplexperiments Example Experiment eds Browse 1 C 2 Select Instrument Y Local Instrument Default v 1 d Send Experiment Cancel e Klicken Sie bei Aufforderung auf OK um das Best tigungsfenster zu schlie en f Setzen Sie den Vorgang bei Schritt 3 fort 2 Wenn Ihr StepOne System nicht mit Ihrem Computer verbund
34. Sie unter Verwendung der exportierten Datei als Vorlage die gew nschte Platteneinrichtung a ffnen Sie die exportierte Textdatei in einem Tabellenkalkulationsprogramm z B Microsoft Excel b ndern Sie die gew nschten Parameter in der Textdatei je nach Bedarf Wenn Sie damit fertig sind speichern Sie die Datei als tabulatorgetrennte Textdatei ab WICHTIG Die Textdatei muss entsprechend dem Plattenbelegungsformat der StepOne Software formatiert sein Weitere Informationen zum Plattenbelegungsformat erhalten Sie in der Hilfe indem Sie in der Symbolleiste auf klicken oder Help gt StepOne Help Topics Hilfe gt StepOne Hilfethemen wahlen 4 Klicken Sie in der StepOne Software unterhalb der Spalte Setup auf und anschlie end auf Advanced Setup Setup f r Fortgeschrittene Hinweise 114 Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Anhang A Alternative Analyseablaufe N Arbeitsablauf f r den Export Import 9 Importieren Sie die Einrichtungsdaten a Wahlen Sie File gt Import Datei Importieren b Klicken Sie auf Browse Durchsuchen w hlen Sie die Datei Genotyping_Example_data txt und klicken Sie anschlie end auf Select Ausw hlen c Klicken Sie auf Start Import Import starten 6 Bereiten Sie die Reaktionen vor wie in Kapitel 3 Ansetzen der Reaktionen auf Seite 35 erl utert 7 Lassen Sie die Analyse wie
35. StepOne System Fern bertragung Wenn Ihr Computer und das StepOne System mit demselben Ethernet Netzwerk verbunden sind schicken Sie die Analysedaten ber das Netzwerk an das StepOne System 1 Klicken Sie in der StepOne Software auf 5 Download Experiment to Instrument Analyse in das Ger t herunterladen 2 W hlen Sie im Dialogfeld Download Experiment from Instrument Analyse vom Gerat herunterladen auf Select Instrument gt lt your instrument gt Gerat auswahlen gt lt Ihr Ger t gt 3 W hlen Sie Experiment gt Genotyping_Example eds 4 Klicken Sie im Feld Download File To Datei speichern unter auf Browse Suchen wahlen Sie den Ordner in dem die Analysedaten gespeichert werden sollen und klicken Sie auf Select Wahlen 5 Klicken Sie auf Download Experiment Analyse herunterladen um die Analyse ber das Netzwerk vom StepOne System auf den Computer herunterzuladen Download Experiment from Instrument T Selectthe instrument with the experiment select a location on this computer for the i experiment then click Download Experiment 1 Select Instrument Y Local Instrument Default v Experiment Experiment v 4 2 Download File To eAiVeye itellejferpeie iie EE E EEA EAL Browse 9 Download Experiment Cancel Hinweise Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsan
36. StepOne Software f hren k nnen Aus diesen Gr nden empfiehlt Applied Biosystems dass Sie sich nach Abschluss der Auswertung die Amplifikationsdarstellung ansehen und die zugewiesenen Werte f r Grundlinie und Schwellenwert f r jeden Well berpr fen Weitere Informationen finden Sie in der StepOne Software Help e Ausrei er Wenn Ihre Analyse die oben genannten Hinweise nicht erf llt beheben S e den Fehler wie folgt e Berichtigen Sie die Grundlinie und oder den Schwellenwert manuell siehe StepOne Software Help oder e Nehmen Sie einen Well aus indem Sie in der Plattenbelegung rechts klicken und Omit Ausnehmen w hlen Hinweise Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 93 es Kapitel 5 Analyseauswertung Ansicht der Amplifikationsdarstellung So zeigen Sie mehrere Darstellungen gleichzeitig an ber die Ansicht Multiple Plots View k nnen bis zu vier Darstellungen gleichzeitig ausgewertet werden Sie k nnen jede Darstellung einzeln zwei Darstellungen als Zeilen oder Spalten oder alle in einer 2 X 2 Matrix anzeigen lassen So pr fen Sie die Ergebnisse in mehreren Darstellungen 1 W hlen Sie in der Navigationsleiste Multiple Plots View aus 2 Klicken Sie auf um zwei Darstellungen parallel anzeigen zu lassen 3 W hlen Sie in der oberen Darstellung Amplification Plot AR vs Cycle um die Ergebnisse des Amplifikationslauf
37. Tabelle siehe Seite 80 durch um die von der StepOne Software erstellten Genotypbestimmungen zu beurteilen 2 Pr fen Sie die Zusammenfassung zur Qualit tskontrolle siehe Seite 84 um die Proben zu beurteilen die QC Markierungen erhalten haben Pr fen S e die Rohdaten siehe Seite 86 und die Amplifikationsdaten siehe Seite 90 auf Proben die eine anormale Amplifikation aufweisen 3 Falls n tig legen Sie die Auswertungseinstellungen fest siehe Seite 95 oder ndern S e die Bestimmungen manuell siehe Seite 99 Nach Beurteilung der Ergebnisse k nnen Sie diese wie unter Ver ffentlichen der Daten auf Seite 100 beschrieben ver ffentlichen Hinweise 72 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 5 Analyseauswertung ein ffnen der Analyse zur Auswertung ffnen der Analyse zur Auswertung Bereiten Sie sich auf die Auswertung vor indem Sie die Analyse ffnen Informationen zu Die Beispielanalyse finden Sie unter den Beispiel lt drive Laufwerk gt Applied Biosystems StepOne System experiments examples wobei lt drive Laufwerk gt f r das Computerlaufwerk steht auf dem die StepOne daten Software installiert wurde Das Standardinstallationslaufwerk ist C 1 Klicken Sie in der StepOne Software auf Open ffnen Analyse offnen 2 Wahlen Sie Genotyping Example eds 3 Klicken Sie auf Open ffnen t B Prin
38. Umweltsymbole Das folgende Symbol gilt f r alle elektrischen und elektronischen Produkte von an den Ger ten Applied Biosystems die nach dem 13 August 2005 auf den Markt gebracht wurden Symbol Beschreibung XI 6 Dieses Produkt darf nicht im unsortierten Hausmull entsorgt werden Halten Sie die lokalen Richtlinien der stadtischen Abfallverordnung fur eine ordnungsgem e Entsorgung ein um Umweltsch den durch Elektro und Elektronikger te zu minimieren WEEE Kunden aus der Europ ischen Union Wenden Sie sich f r Abholung und Recycling von Ger ten an Ihren lokalen Applied Biosystems Kundenservice Unter www appliedbiosystems com finden Sie eine Liste der Kundenservice Niederlassungen in der Europ ischen Union Sicherheitshinweise auf Ger ten Die Hinweise VORSICHT WARNUNG und GEFAHR k nnen in Kombination mit den im vorigen Abschnitt beschriebenen Sicherheitssymbolen an den Applied Biosystems Ger ten angebracht sein Englisch Franz sisch CAUTION Hazardous chemicals Read the Material Safety Data Sheets MSDSs before handling ATTENTION Produits chimiques dangeureux Lire les fiches techniques de s rete de materiels avant la manipulation des produits CAUTION Hazardous waste Referto MSDS s and local regulations for handling and disposal ATTENTION Dechets dangereux Lire les fiches techniques de s ret de mat riels et la regulation locale associ es a la manipula
39. Weitere Weitere Informationen zur Ver ffentlichung von Daten finden Sie in der StepOne Informationen Software Help indem Sie auf klicken oder Help gt StepOne Help Hilfe gt StepOne Hilfe w hlen Hinweise 100 Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Anhang A Alternative Analyseabl ufe Dieser Anhang umfasst die folgenden Themen E Arbeitsablauf f r Setup f r Fortgeschrittene 0 0000000 102 E QuickStart Arbeitsablauf 00 00 0000 0c ene 107 E Verwenden von Vorlagen 0 0 cee ene eens 112 E Arbeitsablauf f r den Export Import 0 anaana aanne eee eee 113 Hinweis Weitere Informationen uber ein Thema dieses Handbuchs finden Sie in der Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Software indem Sie entweder F1 dr cken in der Symbolleiste auf klicken oder Help gt StepOne Help Hilfe StepOne Hilfe w hlen Hinweise Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 101 A Anhang A Alternative Analyseabl ufe Setup f r Fortgeschrittene Setup f r Fortgeschrittene Informationen zum Setup f r Fortgeschrittene Wenn Sie mit der Nutzung der StepOne Software vertraut sind k nnen Sie die Genotypisierungsanalyse ohne den Analysedesign Assistenten ber das Setup f r Fortgeschrittene erstellen Im Setup f r Fortgeschrittene werd
40. auf amp Collapse All Alle ausblenden bzw Expand All Alle einblenden klicken e Um einen Well aus der Auswertung herauszunehmen aktivieren Sie das Kontrollk stchen Omit f r diesen Well Um den Well in die Auswertung einzubeziehen deaktivieren Sie das Kontrollk stchen Omit Hinweis Sie m ssen die Analyse nach jedem Herausnehmen oder Einbeziehen eines Wells neu auswerten Weitere Weitere Informationen zur Well Tabelle finden Sie in der StepOne Software Help Informationen indem Sie auf klicken oder Help gt StepOne Help Hilfe StepOne Hilfe w hlen Hinweise Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 83 n Kapitel 5 Analyseauswertung Ansicht der QC Zusammenfassung Ansicht der QC Zusammenfassung Pr fen S e die Zusammenfassung der QC Markierungen die von den Analysedaten ausgel st wurden und beheben Sie die gekennzeichneten Fehler Die Zusammenfassung zur Qualit tskontrolle zeigt die H ufigkeit und den Ort aller QC Markierungen an Sollte eine Markierung in einer Analyse nicht auftreten ist die H ufigkeit gleich 0 Ist die H ufigkeit nicht 0 erscheint die Markierung an der Well Position die in der Spalte Location aufgef hrt ist Durch Klicken auf die Markierung werden die Details angezeigt einschlie lich einer Liste aller gekennzeichneten Wells Informationen zu Da die Beispielanalyse keinerlei QC Markierungen A ausl st stamm
41. b Aktivieren Sie in der Liste der SNP Assays das Kontrollk stchen Assign Zuweisen f r den SNP Assay rs8039 um diesen den ausgew hlten Wells zuzuweisen Klicken Sie auf das Dropdown Men unter Task Aufgabe f r den SNP Assay rs8039 und w hlen Sie anschlie end Unknown Unbekannt um ausgew hlte Wells als solche zu markieren Wahlen Sie in der Plattenbelegung die Reihen Al und A2 Klicken Sie auf das Dropdown Men unter Task Aufgabe f r den SNP Assay rs8039 und w hlen S e anschlie end Negative Control Negativkontrolle um diese Aufgabe den ausgew hlten Wells hinzuzuf gen Erstellen Sie Proben und weisen Sie diese der Plattenbelegung zu a Klicken Sie wiederholt auf Create New Sample Neue Probe erstellen bis die Probenliste 20 Proben enth lt W hlen Sie in der Plattenbelegung die Reihe A4 Aktivieren Sie das Kontrollk stchen Assign Zuweisen f r Probe 1 um den Assay der Probe und dem ausgew hlten Well zuzuweisen Wiederholen Sie die Schritte 13a bis 13c um die Proben wie unten dargestellt Zuzuweisen 110 Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Anhang A Alternative Analyseablaufe QuickStart Arbeitsablauf T Instructions Define the SNP assays and samples for this experiment then assign them to wells in the plate For each SNP assay assignment select a task Assign SNP Assay s to the Selected Wells lt View P
42. cee eee eee 4 E Verwendung dieses Handbuchs 0 0 0 0 ccc eens 8 E Informationen zurBeispielanalyse 0 000 9 E Arbeitsablauf der Beispielanalyse 0 0 0 11 Hinweis Weitere Informationen zu einem Thema dieses Handbuchs finden Sie in der Hilfe der Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Software indem Sie entweder F1 dr cken in der Symbolleiste auf klicken oder Help gt StepOne Help Hilfe gt StepOne Hilfe w hlen Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 1 4 Kapitel 1 Erste Schritte Informationen zum StepOne System Informationen zum StepOne System Informationen Mithilfe fluoreszenzbasierter PCR Reagenzien erm glicht das Applied Biosystems zum System StepOne Real Time PCR System StepOne System die e Quantitative Detektion von Nukleins uresequenzen mit Echtzeit PCR Analyse e Quantitative Detektion von Nukleins uresequenzen mit Endpunkt und Schmelzkurvenanalyse Informationen zur Das StepOne System erfasst in Abh ngigkeit von dem gew hlten Laufprofil w hrend Datenerfassung einer PCR an verschiedenen Punkten Fluoreszenzrohdaten Laufprofil Datenerfassungspunkt Echtzeit L ufe Standardkurve Das System erfasst Daten nach jedem Extensionsschritt der PCR Relative Standardkurve Vergleichende C AAC Endpunkt Laufe Genotypisierung Das System erfasst Daten vor und nach der PCR Bei Genotypisierun
43. gibt es in den Negativkontroll Wells keine Amplifikation Hinweise 88 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 5 Analyseauswertung Ansicht der Multikomponentendarstellung o StepOne v1 0 File Edit Instrument Analysis Tools Help New Experiment 2 Open la Save DJ Close 4 Send Experiment to Instrument Eg Download Experiment from Instrument 4 Export Print Report Experiment Menu f Experiment Type I I Setup Multicomponent Plot lt View Plate Layout f Show in Wells 4 Bs En Er I Ss al A 1 P 2 un 4 5 6 7 0 fom Allelic Discrimination Plot Multicomponent Plot 3 gt 19 000 Amplification Plot A N Em N En Sample 1 Sample2 Sample3 Sample4 SampleS Sample6 18 000 cai c11 M c11 M c11 M c11 M c11 1 17 000 16 000 4 d Raw Data Plot 15 000 Sample7 Sample8 Sample9 Sample 10 Sample 11 Sample 12 Sample 13 Sample 14 a 14 000 m c1 M c1 W c11 M c1 M c11 M c11 W c11 M c11 o QC Summary a 12 000 4 g 11 000 Sample 15 Sample 16 Sample 17 Sample 18 Sample 19 Sample 20 o Z 5 B anann WS c cas Mer Men A c M c P cn P can oa w S 9 000 ras 0o 2 46 6 100 12 46 8BMN2RBHBABDRKRBHB WM 4H sanaa Cycle Legend WM Rox Bi vic BH Faw Wells I 20 Unknown 3 2 Negative Control J 2 Positive Control 24 Empty Analysis Summary Total Wells in Pla
44. in Positivkontroll Wells e nachweisbare Fluoreszenz zu einem bestimmten Zyklus ermittelt aus vorherigen hnlichen Analysel ufen mit den gleichen Reagenzien unter den gleichen Bedingungen Wenn S e eine ungew hnliche Amplifikation oder das vollst ndige Fehlen eines S gnals feststellen beheben Sie den Fehler entsprechend den Angaben in der Hilfefunktion der StepOne Software klicken Sie auf in der Symbolleiste oder w hlen Sie Help gt StepOne Help Hilfe StepOne Hilfe Hinweis Um Daten in der Amplifikationsdarstellung anzuzeigen w hlen Sie die gew nschten Wells unter dem Reiter View Plate Layout Plattenbelegung anzeigen 58 Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 4 Analysedurchfuhrung A berwachen des Laufs Weitere Informationen zur Amplifikationsdarstellung finden Sie in der StepOne Software Help indem Sie auf klicken oder Help gt StepOne Help Hilfe StepOne Hilfe wahlen Informationen zum Temperaturgraphen Wahrend eines Laufs zeigt der Temperaturgraph die Temperaturen des Heizblocks sowie des Heizdeckels und der Proben in Echtzeit berechnet an Das unten abgebildete Schaubild zeigt den Temperaturgraphen der Beispielanalyse Ziel Aktion A Temperaturgraphen W hlen Sie Sample Heated Cover Probe hinzuf gen entfernen Heizdeckel oder Sample Block Heizblock um die damit jeweils verbundenen
45. to print instructions on how to prepare the PCR reactions L Print Reaction Setup Reaction Volume Per Well 25 uL CACESS MeacuUIT volume um Reaction Mix Calculations Sample Dilution Calculations Diluted Sample Concentration 10x for Reaction Mix 30 0 ng uL v Sample Name Stock Concentration ng uL Sample Volume HL Diluent Volume HL Total Volume of Diluted Sample A nN nN Sampie 100 00 0 66 1 54 Sample 11 BETT gt Pipetting Report 1 54 N ho oO mi nm m Sn w N o o o You can use pipetting instructions to guide your pipetting Sample 13 and plate setup process Selectthe type of pipetting instructions to be printed Summary Pipetting Instructions Sample 15 J 2 20 Detailed Pipetting Instructions 55 007 include Plate Layout in the Instructions Plate Layout Options Sample 16 Sample 17 100 0 Sample 18 Sample 19 Sample 20 Use sample color as well color Use task color as well color Preview Print Cancel 1 5 t n nin rw nw rm rn rn te Sn vr re re rn ey te o o l gt 0 0 0 0 5 050 0 0 0 1 5 lt 28 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypi
46. von Applied Biosystems kann zu Verletzungen oder Sch den an dem Ger t f hren Ger t bewegen VERLETZUNGSGEFAHR Das Ger t darf nur von dem im geltenden und anheben Handbuch zur T E ine genannten Personal oder H ndler bewegt und aufgestellt werden Wenn Sie das Ger t nach seiner Installation an einen anderen Standort verlegen wollen versuchen Sie nicht das Ger t ohne Hilfe oder geeignete Hilfsmittel anzuheben oder zu bewegen und wenden Sie immer geeignete Hebetechniken an Unsachgem es Anheben kann zu schmerzhaften und bleibenden R ckenverletzungen f hren Je nach Gewicht kann das Anheben und Bewegen eines Ger ts mindestens zwei Personen erfordern f em Coie ss se ei ee cae ee ee a Computer und A A WARNUNG Versuchen Sie nicht den Computer oder Monitor allein zu heben oder Monitore bewegen zu bewegen Je nach Gewicht des Computers oder Monitors sind daf r mindestens zwei und anheben Personen erforderlich Bitte beachten Sie beim Anheben des Computers oder Monitors Folgendes e Stellen Sie sicher dass Sie den Computer oder Monitor beim Anheben fest im Griff haben e Vergewissern Sie sich dass der Weg vom Ausgangsort bis zum Bestimmungsort frei von Hindernissen ist e Drehen Sie beim Anheben eines Objekts nicht Ihren Oberk rper e Halten Sie Ihr R ckgrat gerade und f hren Sie die Hebebewegung aus den Beinen heraus aus Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisi
47. 0 gibt eine perfekte bereinstimmung zwischen der Regressionsgeraden und den Datenpunkten an Die Rate mit der sich die Temperatur w hrend des Ger telaufs ndert Mit Ausnahme des Schmelzkurven Schritts wird die Rampe als Prozentsatz definiert Beim Schmelzkurven Schritt hingegen wird die Rampe als Temperaturanstieg definiert In der grafischen Darstellung des Thermoprofils wird die Rampe durch eine diagonale Linie angezeigt Ein Kalibrierungstyp des StepOne Systems bei dem das System die Positionen der Wells im Heizblock abbildet R umliche Kal brierungsdaten dienen der Software zur Verkn pfung von Anstiegen der Fluoreszenz w hrend eines Laufs mit spezifischen Wells auf der Reaktionsplatte Anzeige der Fluoreszenzamplitude f r die ausgew hlten Wells f r alle Filter Zeigt die Fluoreszenzamplitude von allen Datenerfassungspunkten in einem Lauf an Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Reagenzien Reaktionsmix Real time PCR Referenzprobe refSNP ID Regressionsgerade Regressions Koeffizienten Reihe Relative Standardkurven Methode Replikate Replikat Gruppe Glossar Die PCR Reaktionskomponenten die Sie zur Amplifikation der Zielsequenz und zur Detektion der Amplifikation verwenden Arten von Reagenzien die auf dem StepOne System verwendet werden TaqMan Reagenzien e SYBR Green Reagenzien e Andere Reagenzien L sung die al
48. 0X TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assay 1 25 Genomisches DNA Template 3 bis 20 ng DNAse freies 11 25 Wasser Gesamtvolumen 25 00 Pipettier 1 Klicken Sie in das Feld Reaction Volume Per Well Reaktionsvolumen pro Well protokoll und geben Sie 25 ul ein einrichtungs i bildschirm 2 Klicken Sie auf das Feld Excess Reaction Volume bersch ssiges vervollst ndigen Reaktionsvolumen und geben S e 10 ein 3 Best tigen Sie die Mastermix Konzentration 2X 4 Best tigen Sie die TaqMan Assay Mix Konzentration 20X 2D Set Up Reaction Setup gt Reaction Mix Calculations Reaction Setup Help 12 Instructions FO each SNP assay in the reaction plate review the calculated volumes for preparing the PCR reactions If needed edit the reaction volume excess reaction volume component concentrations and or stock concentrations Click Print Reaction Setup to print instructions on how to prepare the PCR reactions Print Reaction Setup 1 Reaction Volume Per Well 25 uL 2 Excess Reaction Volume 10 Reaction Mix Calculations Sarnple Dilution Calculations Select SNP Assay Reactions for SNP Assay 1 3 Th Master Mix Concentration 2 0 x 4 Assay Mix Concentration 20 Component Volume uL for 1 Reaction Volume uL for 8 Reactions Including Exc 10 00 88 00 Hinweise Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungsh
49. 3 Ansetzen der Reaktionen J Vorbereiten der Reaktionsplatte Hinweise 44 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 4 Analysedurchtuhrung Dieses Kapitel umfasst die folgenden Themen E Kapitel bersicht 2 5 24 0 40 res yee dude hee ren are nd meds 46 E Vorbereiten des aie e rat pana cee eee adhe nennen 47 E Aktivieren der Benachrichtigungen optional 22222200 49 E St rten der Analyse a ote ne ya wee 2 Han cone ran aa nen rt 51 E berwachen der Analyse 00 0 ec ce cee eee een 55 E Entnehmen der Reaktionsplatte und bertragen der Daten 66 Hinweis Weitere Informationen ber ein Thema dieses Handbuchs finden Sie in der Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Software indem Sie entweder F1 dr cken in der Symbolleiste auf klicken oder Help gt StepOne Help Hilfe gt StepOne Hilfe w hlen Hinweise Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 45 A Kapitel 4 Analysedurchf hrung Kapitel bersicht Kapitel bersicht Dieses Kapitel erkl rt wie Sie eine Analyse auf dem Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System durchf hren Arbeitsablauf F hren Sie die Analyse nach dem folgenden Arbeitsablauf durch Analyse starten v Analysedesign einrichten Kapitel 2 v Reaktionen ansetzen Kapitel 3 w Analysedurch
50. 48 beschrieben 7 Klicken Sie in der StepOne Software auf START RUN LAUF STARTEN W hrend das StepOne System den Lauf ausf hrt richten Sie die Plattenbelegung wie unter Schritte 8 bis 13 beschrieben ein 8 W hrend das StepOne System die Platte analysiert klicken Sie in der Navigationsspalte auf Plate Layout Plattenbelegung 9 Erstellen Sie den SNP Assay rs8039 f r die Plattenbelegung a Klicken Sie auf Create New SNP Assay Neuen SNP Assay erstellen b Klicken Sie in das Feld SNP Assay Name und geben Sie rs8039 ein c Klicken Sie auf OK Hinweise Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 109 WW Anhang A Alternative Analyseabl ufe QuickStart Arbeitsablauf Z New SNP Assay Enter a SNP assay name then select a SNP assay color For each allele enter an allele name or base s then select the reporter quencher and allele color Click OK to add the SNP assay to the library Allele 1 Name or Base s Allele 1 i u Color a Reporter vic v Quencher NFQ MGB v Allele 2 Name or Basels Allele 2 i Color a v Reporter FAM v Quencher NFQ MGB v Required SNP Assay Name 158039 Color Al v Assay ID Comments Reset Fields OK Cancel 10 Richten S e die Unbekannten ein 11 12 13 Hinweise a W hlen Sie in der Plattenbelegung die Reihen A und B
51. Analysen an das Ger t zu schicken und abgeschlossene Analysen auf Ihren Computer herunterzuladen Oligonukleotid das an das 5 Ende der Zielsequenz bindet Der Reverse Primer und der Forward Primer werden zusammen in PCR Reaktionen eingesetzt um die Zielsequenz zu amplifizieren 122 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Grundlinie Grundlinienkorrigierter normalisierter Reporter AR Uber dem Zyklus Haltephase Haushaltsgen Heiz K hlgeschwindigkeit Interne Positivkontrolle IPC Inventarisierte Assays IPC IPC IPC Inhibitor IPC Wells mit Negativkontrolle Kalibrator Konzentration der verd nnten Probe 10X f r Reaktionsmix Glossar In der Darstellung der Amplifikation eine an die Fluoreszenz angepasste Linie f r eine bestimmte Reihe von Zyklen Wenn Sie die manuelle Grundlinienanalyseeinstellung verwenden empfiehlt Applied Biosystems dass Sie fr he PCR Zyklen f r die Festlegung der Grundlinie w hlen Die Intensit t des vom Reporter w hrend der PCR Amplifikation generierten normalisierten Fluoreszenzsignals AR R Endpunkt R Grundlinie wobei R normalisierter Reporter Phase im Thermoprofil die eine oder mehrere Schritte umfasst Zum Beispiel konnen Sie eine Haltephase zum Thermoprofil hinzuf gen um Enzyme zu aktivieren bzw zu deaktivieren oder um eine Reaktion zu inkubieren Siehe unter Endogene Kontrolle
52. Applied Einf hrungshandbuch Biosystems Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Genotypisierungsanalysen ee fan men XI gt Ap i Na B H I lico IOSySEMS Einfuhrungshandbuch Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Genotypisierungsanalysen BSS BES ystems Erste Schritte Experimentelles Design Ansetzen der Reaktionen Analyse durchfuhrung Analyse auswertung Copyright 2006 2010 Applied Biosystems All rights reserved Information in this document is subject to change without notice Applied Biosystems assumes no responsibility for any errors that may appear in this document APPLIED BIOSYSTEMS DISCLAIMS ALL WARRANTIES WITH RESPECT TO THIS DOCUMENT EXPRESSED OR IMPLIED INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THOSE OF MERCHANTABILITY OR FITNESS FOR A PARTICULAR PURPOSE IN NO EVENT SHALL APPLIED BIOSYSTEMS BE LIABLE WHETHER IN CONTRACT TORT WARRANTY OR UNDER ANY STATUTE OR ON ANY OTHER BASIS FOR SPECIAL INCIDENTAL INDIRECT PUNITIVE MULTIPLE OR CONSEQUENTIAL DAMAGES IN CONNECTION WITH OR ARISING FROM THIS DOCUMENT INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THE USE THEREOF Nur fiir Forschungszwecke Nicht fur diagnostische Verfahren verwenden NOTICE TO PURCHASER Label License The Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System is covered by US patents and corresponding claims in their non US counterparts owned by Applied Biosystems No ri
53. DITCIUDEFSICNL sur knit oO see So a ees oh teeta MSS rear 46 vorbereiten des Lauls zer us a RI I 47 Aktivieren der Benachrichtigungen optional 0000 eee ee eee eee 49 Starten der Analyse ee eee eee eens 51 berwachen des Laufs 222mm aaa anna nn 55 Entnehmen der Reaktionsplatte und bertragen der Daten 0000 66 Kapitel 5 Analyseauswertung 000 cee ann en nun 71 KADMCILIDCKSICAL zer Aine EEE ER ER Fe ee RE 12 ffnen der Analyse zur Auswertung 0 0000 cece cece eee eee eee ee 13 Ansicht der Amplifikationsdarstellung 00000 ce eee eee eee eee 74 Ansicht der Plattenbelegung 2 0 0 0 eee 78 Ansicht der Well Tabelle 2 2 ccc nn nn nennen nen 80 Ansicht der QC Zusammenfassung anaa cee cee eee ee eee 84 Ansicht der Rohdatendarstellung 22222 cee eee nennen nenne 86 Ansicht der Multikomponentendarstellung 000 0 c eee eee eee 88 Ansicht der Amplifikationsdarstellung 000 cece eee ee eee 90 Ansicht der Auswertungseinstellungen 0 000 eee eee 95 Ver ffentlichen der Daten 0 cc eee ees 100 Anhang A Alternative Analyseablaufe 0000008 101 Setup f r Fortgeschrittene 2 0 eee eens 102 QuickStart Arbeitsablauf 0 0 0 ee eee eens 107 Verwenden von Vorlagen 0 cc eee tees 112 Arbeitsablauf f r den Export Import 0 00 cece ee ees 113 BIDIOGFAN erweisen et een 117
54. F importieren und importieren Sie den SNP Assay aus der AIF mithilfe des Dialogfelds SNP Assays from AIF a Gehen Sie zu lt Laufwerk gt Applied Biosystems StepOne System experiments examples b Wahlen Sie aus dem Dropdown Men der Dateitypen Text Files txt c W hlen Sie DME_SNP_185457113_426781 1 txt d Klicken S e auf Import 20 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 2 Experimentelles Design D Definieren der SNP Assays amp Import SNP Assays from AIF Cal Ars 4a Lookin O examples LIEST 3 B DME_SNP_185457113_426781 1 tt My Recent Documents ie My Documents amp b a Filename DME_SNP_185457113_426781 1 tet Import 4d My Network Places Files of type Text Files bt v Cancel 5 Klicken Sie im Dialogfeld SNP Import Properties SNP Importeigenschaften auf OK 6 W hlen Sie den SNP Assay C__11711420_30 7 Klicken Sie auf Use Selected Marker s ausgew hlte Marker verwenden 8 W hlen Sie Next gt Weiter Hinweise Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 21 9 Kapitel 2 Experimentelles Design Definieren der SNP Assays 2A Set Up SNP Assays SNP Assays Help 12 Q Instructions Enterthe number of SNP assays to run in the reaction plate then
55. Farbstoff e ROX Farbstoff e SYBR Green Farbstoff VIC Farbstoff PCR Reaktionskomponenten die aus Primern zur Amplifikation der Zielsequenz und einer TaqMan Sonde zur Detektion der Amplifikation der Zielsequenz bestehen Anzeige der Temperaturen f r Probe Heizdeckel und Heizblock w hrend des Ger telaufs Nukleins uretyp der zur PCR Reaktion hinzugef gt wird Das zu empfehlende Template h ngt jeweils vom Analysentyp ab Teil der Lauftyps der Temperatur Zeit Rampe und Datenerfassungspunkte f r alle Schritte und Phasen des Ger telaufs angibt Abk rzung f r Schmelztemperatur Tm Ger teanzeige mit der Sie durch Ber hrung das Ger t steuern In Quantifizierungsanalysen die Aufgabe f r die Zielsequenz in Wells die ein Proben Template mit unbekannter Zielsequenzmenge enthalten In Genotypisierungsanalysen die Aufgabe f r den SNP Assay in Wells die ein Proben Template mit unbekanntem Genotyp enthalten In Positiv Negat v Analysen d e Aufgabe f r die Zielsequenz n Wells die ein Proben Template enthalten n dem ein Vorhandensein der Zielsequenz nicht bekannt ist S ehe unter Serienfaktor Reagenz das zur Verd nnung einer Probe oder eines Standards verwendet wird bevor diese zur PCR Reaktion hinzugegeben werden Als Verd nnungsmittel kann Wasser oder ein Puffer verwendet werden Quantifizierungsmethode f r Quantifizierungsanalysen Bei der vergleichenden C AAC Methode werden Ergebnisse v
56. Genotypisierungsanalyse um die Analyse auszuw hlen b Ber hren Sie D gt Start Run Lauf starten 9 Browse USB Experiments 1 Ta xample_Experiment uss Bones 09 Page 171 7b Selected 1 Start Run New View Edit Copy Delete Touch an experiment to select it then touch any of the buttons to perform an action 8 Nehmen Sie im Bildschirm Run Parameters Laufparameter die folgenden Einstellungen vor a Ber hren Sie das Feld Reaction Volume Reaktionsvolumen geben Sie ber den Tastenblock 25 ul ein und ber hren Sie dann Done Fertig b Ber hren Sie Start Run Lauf starten Hinweise 94 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 4 Analysedurchfuhrung A berwachen des Laufs Experiment Parameters xl se Cover Temperature 105 0 C Experiment Name Example_Experiment 8a Reaction Volume s Touch each field then use the keyboard to edit the contents When you are finished touch Start Run Uberwachen des Laufs berwachen Sie den Verlauf von einem Computer mit StepOne Software oder vom Touchscreen des StepOne Systems Wie Sie den Lauf berwachen h ngt von der Konfiguration Ihres StepOne Systems ab Konfiguration Beschreibung Siehe Computer Das StepOne Systemkabel verbindet den Kombinierte gesteuert Computer mit dem StepOne System berwachung unten Eigens
57. GlOSSAar a2 200 ER nern tnege 119 Stichwortverzeichnis 000 cence nun nn run 133 iv Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Vorwort Verwendung dieses Handbuchs Zweck dieses Handbuchs Zielgruppe Voraussetzungen Textkonventionen Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen In diesem Handbuch wird erl utert wie auf dem Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Genotypisierungsanalysen durchgef hrt werden Dieses Handbuch erf llt die folgenden Funktionen e Es ist ein Tutorial f r eine Beispielanalyse anhand von Daten die mit der Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Software erstellt wurden e Es dient au erdem als Anleitung fur Ihre eigenen Analysen Dieses Handbuch ist f r Labormitarbeiter und leiter bestimmt die mit dem StepOne System Genotypisierungsanalysen ausf hren Dieses Handbuch basiert auf folgenden Voraussetzungen Sie m ssen sich mit dem Microsoft Windows XP Betriebssystem auskennen Sie m ssen mit Internet und Internetbrowsern umgehen k nnen Sie m ssen sich mit DNA Proben und ihrer Vorbereitung f r den PCR Prozess auskennen Sie m ssen sich mit Datenspeicherung Daten bertragung Kopieren und Einf gen auskennen Wenn Sie vorhaben das StepOne System in den vorhandenen Datenfluss des Labors zu integrieren m ssen Sie ber Netzwerkerfahr
58. HREN BEI LAGERUNG Abfallprodukte niemals n Glasbeh ltern sammeln oder aufbewahren da diese zerbrechen oder zersplittern k nnen Reagenzien und Abfallflaschen k nnen Spr nge bekommen und lecken Alle Abfallflaschen sollten n einem Sicherheitsbeh lter aus Polyethylen niedriger Dichte mit befestigtem Deckel und in senkrechter Stellung arretierten Griffen gesch tzt werden Bei der Handhabung von Reagenzien und Abfallflaschen geeignete n Augenschutz Bekleidung und Handschuhe tragen So minimieren Sie die Gef hrdung durch Chemikalien e Vor Lagerung Handhabung oder Arbeiten mit Chemikalien oder Gefahrstoffen sind die vom Chemikalienhersteller bereitgestellten Sicherheitsdatenblatter MSDSs einzusehen und zu verinnerlichen siehe Informationen ber Sicherheitsdatenblatter MSDSs auf Seite xv e Der Kontakt mit Chemikalien ist m glichst gering zu halten Bei der Handhabung von Chemikalien entsprechende Personenschutzausr stung tragen wie z B Schutzbrille Handschuhe oder Schutzbekleidung Weitere Sicherheitsrichtlinien enth lt das entsprechende Sicherheitsdatenblatt Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Informationen uber Sicherheits datenblatter MSDSs Sicherheits datenbl tter MSDSs erhalten Vorwort Chemische Sicherheit e Atmen Sie m glichst keine Chemikalien ein Lassen Sie Chemikalienbehalter nicht offen stehen und verwenden Sie diese
59. Informationen Hilfe w hlen Definieren der Proben und Replikate Informationen zur Beispielanalyse Bildschirm Samples and Replicates vervollst ndigen Hinweise Geben Sie im Bildschirm Set Up Samples and Replicates Proben und Replikate einrichten die zu analysierende Anzahl der Proben die Probennamen und anschlie end die Anzahl der Positiv und Negativkontrollen ein In der Beispielanalyse wird Folgendes ausgewertet 20 unbekannte Proben 2 Negativkontrollen 2 Positivkontrollen eine Heterozygotie und eine Allel 2 Homozygotie Geben Sie als Anzahl der Proben 20 ein Geben Sie als Anzahl der Replikate 1 ein Klicken Sie auf All Sample SNP Assay Reactions Alle Proben SNP Assay Reaktionen Geben Sie als Anzahl der Negativkontrollen Wells die kein Template enthalten 2 ein Geben Sie als Anzahl der Positivkontrollen Wells die Proben bekannter Genotypen enthalten 2 ein Wahlen Sie als Positivkontrolle 1 Allele 1 Allele 2 Heterozygous Allel 1 Allel 2 heterozygot Wahlen Sie als Positivkontrolle 2 Allele 2 Homozygous Allel 2 homozygot Wahlen Sie Next gt Weiter Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 23 O Kapitel 2 Experimentelles Design Definieren der Proben und Replikate 2B Set Up Samples amp Replicates Samples amp Replicates Help X Instructions Enterthe number of samples to test in the reaction pla
60. N rs80 DJ rs80 T rs80 T rs80 D rs80 m rs80 m rs80 Sample Sample8 Sample9 Sample 10 Sample 11 Sample 12 Sample 13 Sample 14 u 9b fl sso rseo Hrseo I ss0 rsso rseo I sso I rsso Assign Sample to the Selected Wells Sample 15 Sample 16 Sample 17 Sample 18 Sample 19 Sample 20 vo i m A m A m A D A D A m E E sso E rs00 r Add New Sample Add Saved Sample Save Sample Delete Sample E F 2 2 E A E Assign Sample 14 se Sample 16 H Sample 17 Hu Sample 18 Sample 19 Sample 20 Selectthe dye to use as the passive reference Wells I 24 Unknown J 0 Negative Control BJ 0 Positive Control 24 Empty 10 Klicken Sie in der Spalte Navigation auf a Run Method Lauftyp und richten Sie den Lauftyp ein a Klicken Sie in das Feld Reaction Volume Per Well Reaktionsvolumen pro Well und geben Sie 25 ein Klicken Sie auf Pre PCR Read Holding Stage Pra PCR Messung Haltephase Add Stage Phase hinzuf gen und anschlie end auf Holding Halten Wahlen Sie den ersten Schritt 50 C 00 02 00 der neuen Haltephase und klicken Sie anschlie end auf Delete Selected Auswahl l schen um den Extraschritt zu l schen Klicken Sie auf das Feld Number of Cycles Anzahl der Zyklen und geben S e 50 ein Klicken Sie auf die Temperatureinstellung f r den erst
61. Optical 48 Well Adhesive Film 4375928 cross contamination between sample wells and help ensure consistent real time PCR data Display All Items v Print Materials List One ready to use premix Contains components needed to perform 5 nuclease assays using TaqMan probes with the standard ramp speed 4 AmpErase UNG i 6 TaqMan Universal PCR Master Mix 2 4304437 C Check All Item Part Number Quantity oO MicroAmp Fast Optical 48 Well Reaction Plate 4375816 1 E am O Hinweise 30 Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 2 Experimentelles Design 9 Bestellen von Materialien f r die Analyse Einrichtungs Beachten Sie beim Einrichten Ihres eigenen Analysedesigns Folgendes hinweise e Stellen Sie sicher dass Ihr Computer ber eine uneingeschr nkte Internetverbindung verf gt e Wahlen Sie alle Materialien aus die Sie f r Ihre Analyse ben tigen und f gen Sie sie zu Ihrer Einkaufsliste hinzu WICHTIG Das StepOne System l uft nur mit Fast Verbrauchsmaterialien Reaktionsplatten Reaktionsgef streifen und Reaktionsgef Wenn Sie eine Genotypisierungsanalyse durchf hren setzen Sie die Reaktionen mit Standard TaqMan Universal PCR Master Mix in Fast Verbrauchsmaterialien und unter Standard PCR Bedingungen an Weitere Weitere Informatione
62. R LIMITED LICENSE A license to perform the patented 5 Nuclease Process for research is obtained by the purchase of 1 both Authorized 5 Nuclease Core Kit and Licensed Probe 11 a Licensed 5 Nuclease Kit or 111 license rights from Applied Biosystems TaqMan Universal PCR Master Mix No AmpErase UNG is an Authorized 5 Nuclease Core Kit Use of this product is covered by US patent claims and corresponding patent claims outside the US The purchase of this product includes a limited non transferable immunity from suit under the foregoing patent claims for using only this amount of product for the purchaser s own internal research Separate purchase of a Licensed Probe would convey rights under the applicable claims of US patents and corresponding claims outside the United States No right under any other patent claim and no right to perform commercial services of any kind including without limitation reporting the results of purchaser s activities for a fee or other commercial consideration is conveyed expressly by implication or by estoppel This product is for research use only Diagnostic uses under Roche patents require a separate license from Roche Further information on purchasing licenses may be obtained by contacting the Director of Licensing Applied Biosystems 850 Lincoln Centre Drive Foster City California 94404 USA TRADEMARKS Applera Applied Biosystems AB Design MicroAmp and VIC are registered trademar
63. Stelle eine Probe QC Markierungen A ausl st Das Wissen ber die Position von Fehlern kann bei der Diagnose von eventuell auftretenden Ausf llen hilfreich sein Hinweise Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 79 n Kapitel 5 Analyseauswertung Ansicht der Well Tabelle e Sie k nnen die gesamte Reaktionsplatte Bereiche der Reaktionsplatte oder bestimmte Wells ausw hlen Klicken Sie auf die linke obere Ecke der Reaktionsplatte um alle 48 Wells auszuw hlen Klicken Sie mit der linken Maustaste und ziehen Sie die Maus ber einen Bereich um diesen auszuw hlen W hlen Sie Sample Probe Target Zielsequenz oder Task Aufgabe aus dem Men Select Items Artikel ausw hlen unter dem Reiter View Plate Platte anzeigen W hlen Sie nun Probe Zielsequenz oder Aufgabennamen aus dem zweiten Select Items Men um Wells eines bestimmten Typs mithilfe des Well Auswahl Tools auszuw hlen e Sie k nnen die Plattenbelegung anpassen Uber die Schaltfl chen Einblenden E Ausblenden und Alle einblenden k nnen Sie die Anzahl der angezeigten Wells erh hen bzw verringern Mithilfe der Pfeiltasten k nnen Sie die Plattenbelegungsansicht so erweitern das sie den gesamten Bildschirm bedeckt Weitere Weitere Informationen zur Plattenbelegung finden Sie in der StepOne Software Help Informationen indem Sie auf klic
64. StepOne System durchf hren e Standardkurve e Vergleichender Cy AAC e Relative Standardkurve e Schmelzkurve nicht verf gbar im Analysedesign Assistenten e Genotypisierung e Positiv Negativ Der von Ihnen ausgewahlte Analysetyp spiegelt sich in den Bildschirmen Setup Run und Analysis Einrichtung Lauf und Analyse wieder Im StepOne System eine PCR Reaktion die Primer zur Amplifikation einer Zielsequenz und ein Reagens zur Detektion amplifizierter Zielsequenzen enthalt Eine Gr e die TaqMan Genexpressions und TaqMan SNP Genotypisierungs Assays von Applied Biosystems zugewiesen wird Datei auf der CD die bei jedem Assay mitgeliefert wird Der Dateiname enth lt die Nummer des Strichcodes auf der Platte Die Informationen im AIF werden in einem tabulatorgetrennten Format bereitgestellt PCR Reaktionskomponente in TaqMan Genexpressions Assays und TagMan SNP Genotypisierungs Assays von Applied Biosystems die aus Primern zur Amplifikation einer Zielsequenz und einer TagMan Sonde zur Detektion der Amplifikation der Zielsequenz besteht 120 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Aufgabe task Auftragsbezogene Assays Ausgangsmenge Ausrei er AutoA Automatische Grundlinie Automatischer C Blockierte IPC Chemie Computergesteuerte Konfiguration Cy Glossar Reaktionstyp der in einem Well f r die Zielsequenz oder den SNP
65. _30 b Klicken Sie auf Apply Assay Selection Assay Auswahl anwenden Find Assay Results 1 Results Found for Assay rs8039 Please select one ofthe assays below to associate with rs8039 Gene Symbol Gene Name SNP Type Public Location 11711420 30 CYP51A1 cytochrome P450 family 51 subfamily A polypeptide 1 UTR 3 7 91580294 AKAPS A kinase PRKA anchor protein yotiao 9 li Next gt Last Apply Assay Selection Cancel 1b Hinweise Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 29 9 Kapitel 2 Experimentelles Design Bestellen von Materialien f r die Analyse F llen S e den Bereich Experiment Materials List Liste der Analysematerialien aus e C__11711420_30 e MicroAmp Optical 48 Well Adhesive Film e MicroAmp Fast Optical 48 Well Reaction Plates e TaqMan Universal PCR Master Mix No AmpErase UNG Klicken Sie auf Add Selected Items to Shopping List Ausgew hlte Artikel zur Einkaufsliste hinzuf gen Klicken Sie n das Feld Shopping Basket Name Name des Warenkorbs geben Sie dann Example Experiment Beispielanalyse ein Pr fen Sie dass in der Einkaufsliste alle gew nschten Materialien in der jeweils richtigen Menge aufgef hrt sind Klicken Sie auf Order Materials in List Materialien der Liste bestellen Geben Sie Ihre Anmeldedaten f r den Applied Biosystems Store ein und klicken Sie auf Login and Submit
66. abor ausgelegt ist i AN a a l a a na S NEIN BRANDGEFAHR Zur Aufrechterhaltung des Brandschutzes nur aufgef hrte und zertifizierte Ersatzsicherungen des angegebenen Typs und Nennwerts verwenden N omy I f f if Weiz R ELEKTRISCHE SPANNUNG Die Aufrechterhaltung der Erdung ist f r den sicheren Ger tebetrieb unerl sslich Das Ger t darf niemals bei unterbrochener Erdung betrieben werden IN ng I WEN ELEKTRISCHE SPANNUNG Verwenden Sie f r die Spannungs versorgung in Ihrem Labor nur entsprechend konfigurierte und genehmigte Kabel N y L y N J V IN d ELEKTRISCHE SPANNUNG Schlie en Sie das System an eine ordnungsgem geerdete Steckdose mit passender Stromst rke an Die Installationskategorie berspannungskategorie f r das StepOne System ist II es ist als tragbares Ger t klassifiziert LED Sicherheit So sorgen Sie f r einen sicheren LED Betrieb e Das System ist von einem technischen Vertreter von Applied Biosystems zu warten e Alle Schaltbretter m ssen beim Betrieb des Ger ts angebracht sein Bei korrekter Installation sollte keine Strahlung nachweisbar sein Wenn ein Schaltbrett beim Betrieb des LEDs entfernt wird bei Servicearbeiten mit deaktivierten Sicherheitsverriegelungen kann die LED Strahlung die f r die Klasse 3B zul ssigen Werte bersteigen e Entfernen Sie keine Sicherheitshinweise und deaktivieren Sie nicht die Sic
67. alysen 67 oe Kapitel 4 Analysedurchfuhrung Entnehmen der Reaktionsplatte und Ubertragen der Daten 6 Klicken Sie bei Aufforderung auf OK um das Best tigungsfenster zu schlie en Download Complete e 1 Experiment successfully downloaded from Local Instrument ok 6 Eigenst ndige Wenn Ihr Computer nicht mit dem StepOne System verbunden ist bertragen Sie die Daten bertragung Analysedaten mithilfe des USB Laufwerks vom StepOne System 1 Wenn das Ger t noch nicht mit einem USB Laufwerk verbunden ist schlie en Sie das Laufwerk an die USB Schnittstelle an 2 Aktivieren Sie den Touchscreen des StepOne Systems durch eine Ber hrung und ber hren Sie anschlie end 3 Ber hren Sie im Main Menu Hauptmen Collect Results Ergebnisse anzeigen um die Daten auf dem USB Laufwerk zu speichern Wenn das StepOne System das USB Laufwerk nicht finden kann dr cken Sie auf OK warten Sie 30 Sekunden und dr cken Sie dann noch einmal auf Collect Results Ergebnisse anzeigen 4 Sobald die erfolgreiche bertragung der Daten gemeldet wurde ber hren Sie OK 2006 11 16 2 15 PM 2 5 Entnehmen Sie das USB Laufwerk aus dem StepOne System und schlie en Sie es an die USB Schnittstelle des Computers an Hinweise 68 Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 4 Analysedurchfuhrung Entnehmen der Reaktionspla
68. alysis 0 Samples Used 20 SNP Assays Used 1 M Home E Genotyping Example eds x Disconnected Hinweise 94 Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 5 Analyseauswertung Ansicht der Auswertungseinstellungen Weitere Weitere Informationen zur Amplifikationsdarstellung oder zur Anzeige von mehrerenPlots finden Sie in der StepOne Software Help indem Sie auf klicken oder Help gt StepOne Help Hilfe StepOne Hilfe w hlen Informationen Ansicht der Auswertungseinstellungen Informationen zu den Beispiel daten Auswertungs einstellungen andern Hinweise Falls Sie mit der Art der Bestimmung von Genotypen oder den Schwellenwerten der QC Markierungen der StepOne Software nicht zufrieden sind pr fen und ndern Sie die Auswertungseinstellungen und oder Bestimmungen Calls nach Bedarf In der Beispielanalyse k nnen Sie die Auswertungseinstellungen pr fen und nach Bedarf anpassen und erfahren so wie die Bestimmungs Cy und Markierungseinstellungen zur Auswertung der Genoptypisierungsdaten beitragen 1 2 Klicken S e in der Analyse auf Analysis Settings Auswertungseinstellungen Wahlen Sie aus der Tabelle Select a SNP Assay SNP Assay ausw hlen C__11711420_30 Klicken S e auf Edit Default Settings Standardeinstellungen bearbeiten Falls Sie manuelle Bestimmungen vorgenommen haben w hlen Sie m Dialogfeld Edit Default SNP Assay
69. andard ramp speed Applied Biosystems recommends standard reagents for your PCR reactions Which stages do you want to include in the instrument run 4 Pre PCR Read Amplification PostPCR Read Einrichtungs Beachten Sie beim Einrichten Ihres eigenen Analysedesigns Folgendes hinweise e W hlen Sie Other Sonstige falls Sie nicht TagMan Reagenzien zur Amplifikation und Detektion von Zielsequenzen in Ihrer Analyse verwenden Hinweis Bei Auswahl von Other wird der Bildschirm f r das Pipettierprotokoll nicht angezeigt e Wenn Sie statt genomischer DNA gDNA bzw cDNA eine andere Vorlage verwenden w hlen Sie die Option Wet DNA bzw Dry DNA die den Zustand Ihrer Proben beschreibt e Wahlen Sie als Heiz Kthlgeschwindigkeit f r den Ger telauf Standard aus WICHTIG TaqMan SNP Genotypisierungsassays unterst tzen keine Fast Reagenzien Folglich unterst tzt der Analysedesign Assistent f r Genotypisierungsanalysen die Heiz Kuhlgeschwindigkeit Fast nicht Wenn Sie mit Fast Geschwindigkeiten arbeiten m chten richten Sie Ihre Genotypisierungsanalyse mithilfe des Arbeitsablaufs f r Fortgeschrittene ein Hinweise Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 19 O Kapitel 2 Experimentelles Design Definieren der SNP Assays Weitere Informationen e Falls Sie die PCR Amplifikation mit einem anderen als dem im StepOne System enthaltenen Thermocyc
70. andbuch zu Genotypisierungsanalysen 2 Dl Kapitel 2 Experimentelles Design berpr fen des Pipettierprotokolls Hinweise 8a 5 O NJ 5 Wahlen Sie den Reiter Sample Dilutions Calculations Berechnung der Probenverd nnungen aus 6 Klicken Sie in das Feld Diluted Sample Concentration 10X for Reaction Mix Konzentration der verd nnten Probe 10fach f r Reaktionsmix und geben Sie dann 30 ng ul ein 7 Best tigen Sie dass die Stammkonzentration aller Proben 100ng ul betr gt 8 Drucken Sie zur Referenz einen Bericht der Plattenbelegung aus a Klicken Sie auf Print Reaction Setup Pipettierprotokoll drucken b Wahlen Sie im Dialogfeld Folgendes aus e Detailed Pipetting Instructions Detaillierte Pipettieranweisungen e Include Plate Layout in the Instructions Plattenbelegung in Anweisungen integrieren e Use sample color as well color Probenfarbe als Well Farbe verwenden c Klicken Sie auf Print Drucken d Wahlen Sie im Dialogfeld Print Drucken den Drucker und die Druckoptionen aus und klicken Sie dann auf OK 9 Klicken Sie auf Next gt Weiter 2D Set Up Reaction Setup gt Reaction Mix Calculations Reaction Setup Help For each SNP assay in the reaction plate review the calculated volumes for preparing the PCR reactions If needed editthe reaction volume excess reaction volume Instructions 2 component concentrations and or stock concentrations Click Print Reaction Setup
71. atenerfassung 122 Delta Rn ARn 122 Dissoziationskurve siehe unter Schmelzkurve Dokumentation dazugeh rig vii E Echtzeit PCR 127 EFF siehe unter Amplifikationseffizienz EFF eigenst ndige Daten bertragung 68 Konfiguration 122 Lauf starten 52 Uberwachung eines Laufs 65 Einzelnukleotid Polymorphismus 4 Elektrische Sicherheit xviii EMV Normen xx Endogene Kontrolle 122 Endogene Kontrolle siehe auch unter Haushaltsgen Endpunktanalyse 2 4 122 Endpunktmessung siehe unter Post PCR Messung Ergebnisse Bestimmungen automatisch zuweisen 98 Bestimmungen manuell zuweisen 99 Ergebnisse interpretieren 72 Erweiterte Einrichtung 129 F Farbstoff 122 Farbstoff siehe auch unter Systemfarbstoff Farbstoffe von Fremdanbietern 122 Fehlerbehebung Amplifikationsdarstellung ansehen 90 Ansehen der Auswertungseinstellungen 95 Grundlinienwert anpassen 95 Markierungen 82 Multikomponentendarstellung ansehen 88 Raw Data Plot Rohdatendarstellung ansehen 86 Schwellenwert anpassen 95 Zusammenfassung der Qualit tskontrolle ansehen 84 Ferngesteuerte Daten bertragung 67 134 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Fern berwachung 122 Fett gedruckter Text wann zu verwenden v Fluoreszenz Markierung 82 Markierung NOISE 82 Markierung OFFSCALE 82 Markierung SPIKE 82 Forward Primer 122 G GEFAHR Beschreibung x Gefahrdung Siehe Sicherheit Gefahrensymbole Sie
72. automated genome wide polymorphism screening letter Nat Genet 9 341 342 Longo M C Berninger M S and Hartley J L 1990 Use of uracil DNA glycosylase to control carry over contamination in polymerase chain reactions Gene 93 125 128 Mullis K B and Faloona F A 1987 Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction Methods Enzymol 155 335 350 Saiki R K Scharf S Faloona F et al 1985 Enzymatic amplification of B globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia Science 230 1350 1354 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 117 Bibliografie 118 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen AIF Allel Allelic Discrimination Plot Alleldiskriminierungs plot Amplification Plot Darstellung der Amplifikation Amplifikation Amplifikationseffizienz EFF Amplikon Glossar Abk rzung f r Assay Informationsdatei Eine der verschiedenen in der Population auftretenden Auspr gungen einer bestimmten Zielsequenz Anzeige von Daten die bei der Post PCR Messung erfasst wurden Der sog Allelic Discrimination Plot ist eine grafische Darstellung des normalisierten Reportersignals der Sonde f r Allel 1 im Vergleich zum normalisierten Reportersignal der Sonde f r Allel 2 Anzeige von Daten die w hrend der Zyklusp
73. ave current display as the default www appliedbiosystems com eee Disconnected Weitere Weitere Informationen finden Sie in der StepOne Software Help indem Sie auf Informationen klicken oder Help gt StepOne Help Hilfe StepOne Hilfe w hlen Hinweise Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 15 ie Kapitel 2 Experimentelles Design Definieren der Analyseeigenschaften Definieren der Analyseeigenschaften Geben Sie im Bildschirm Experiment Properties Analyseeigenschaften kennzeichnende Angaben f r die Analyse ein und w hlen S e dann den Analysetyp den Sie einrichten wollen Bildschirm 1 Klicken Sie in das Feld Experiment Name Analysename und geben Sie dann vervollst ndigen Genotyping Example Genotypisierungs Beispielanalyse ein 2 Klicken Sie in das Feld Barcode geben Sie dann das Example Beispiel ein 3 Klicken Sie in das Feld User Name Benutzername geben Sie dann den Example User Beispielbenutzer ein 4 Klicken Sie in das Feld Comments Anmerkungen geben Sie dann Genotyping Getting Started Guide Einf hrungshandbuch zur Genotypisierung ein 9 Wahlen Sie als Analysetyp Genotyping Genotypisierung aus 6 Klicken Sie auf Next gt Weiter 1A Define Experiment Properties Experiment Properties Help 2 Instructions Enter identifying information then select the type of experimentto design Ho
74. ble Group By Flag Details Well Omit Flag Sample Name SNP Assay N Assay ID Task Negative Control amp Bi F Sample 1 SNP Assay 1 Negative B8 Sample 1 SNP Assay 1 Negative c2 Sample 1 SNP Assay 1 Negative C7 Sample 1 SNP Assay 1 Negative D3 Sample 1 SNP Assay 1 Negative D6 Sample 1 SNP Assay 1 Negative E4 Sample 1 SNP Assay 1 Negative ES Sample 1 SNP Assay 1 Negative Unknown Al A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 B2 B3 B4 B5 B6 B7 Gi c3 c4 cs C6 cs Di D2 D4 DS Name Frequency Wells Bad passive reference signal 0 JOFFSCALE uorescenceisoffscle SiO INOSIGNAL Nosignalinwel SCY JCLUSTER Number of dusters outside expected range o Poa Postveconrolfaed bo Multiple Plots View SMCLUSTER Small number of samples in uster o os au sun bbbbb gt Sample 1 SNP Assay 1 Unknowr Sample 1 SNP Assay 1 Unknowr Sample 1 SNP Assay 1 Unknowr Sample 1 SNP Assay 1 Unknowr Sample 1 SNP Assay 1 Unknowr Sample 1 SNP Assay 1 Unknowr Sample 1 SNP Assay 1 Unknowr Sample 1 SNP Assay 1 Unknowr Sample 1 SNP Assay 1 Unknowr Sample 1 SNP Assay 1 Unknowr Sample 1 SNP Assay 1 Unknowr Sample 1 SNP Assay 1 Unknowr Sample 1 SNP Assay 1 Unknowr Sample 1 SNP Assay 1 Unknowr Sample 1 SNP Assay 1 Unknowr Sample 1 SNP Assay 1 Unknowr Sample 1 SNP Assay 1 Unknowr Sample 1 SNP Assay 1 Unknowr Sample 1 SNP Assay 1 Unknowr Sample 1 SNP Assay 1 Unknowr Sample 1 SNP Assay 1 Unknowr Sample 1 SNP Assay 1 Unknowr Sample 1 SNP
75. block kontaminieren und ein ungew hnlich hohes Hintergrundsignal verursachen 40 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 3 Ansetzen der Reaktionen NR Vorbereiten der Reaktionsplatte Richtig Falsch Fl ssigkeit am e nicht kr ftig genug oder Boden des Wells e nicht lange genug zentrifugiert Reaktionsplatte 1 Verd nnen Sie alle gereinigten genomischen DNA Proben mit DNAse freiem vorbereiten Wasser so dass eine endg ltige DNA Masse im Bereich 3 bis 20 ng pro Reaktions Fl ssige gDNA Well entsteht Das Volumen von DNA Probe und DNAse freiem Wasser pro Reaktion sollte 11 25 ul betragen 2 Pipettieren Sie in jeden Well der Reaktionsplatte ein Kontroll oder Probenaliquot des f r den Reaktionsplattentyp geeigneten Volumens siehe Schritt 1 a Geben Sie f r jede unbekannte Reaktion 11 25 ul der Probe in die entsprechenden Wells b Geben Sie f r jede Negativkontrollreaktion 11 25 ul DNAse freies Wasser in die entsprechenden Wells c Geben Sie f r jede Positivkontrollreaktion 11 25 ul der Positivkontrolle in die entsprechenden Wells WICHTIG Achten S e darauf dass der Genotyp des Positivkontroll Templates dem Genotyp entspricht der dem Well zugeordnet ist 3 bertragen Sie 13 75 ul des Reaktionsmixes in die jeweiligen Wells 4 Versiegeln S e die Reaktionsplatte mit optischem Klebefilm 5 Vortexen Sie die Reaktions
76. ck View Chart View 10 Minutes v Fixed View 00 02 30 00 03 20 00 04 10 00 05 00 00 05 50 00 06 40 00 07 30 00 08 20 00 09 10 00 10 00 00 10 50 00 11 40 Time PE Home T Remote Monitor x En Local Instrument connected Hinweise 64 Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 4 Analysedurchfuhrung A berwachen des Laufs Eigenstandige Wenn Sie den Lauf auf dem StepOne System gestartet haben k nnen Sie den Ablauf berwachung auf dem Touchscreen verfolgen Der Lauftypbildschirm zeigt die Analysemethode an und hebt die vom Ger t ausgef hrten Thermoprofilphasen hervor Aktion Ziel A Dem Lauf eine Schmelzkurve hinzuf gen B Die verbleibende Zeit f r den Lauf anzeigen C Lauf stoppen Ber hren Sie i Schmelzkurve hinzuf gen und ber hren Sie dann OK Ber hren Sie Y Display Experiment Time Analysezeit anzeigen und ber hren Sie dann X um zum Bildschirm Run Method zur ckzukehren Ber hren Sie erst Stop und dann die folgenden Schaltfl chen e Stop um den Lauf zu stoppen bzw anzuhalten nachdem das StepOne System den aktuellen Zyklus beendet hat e Abort Abbrechen um den Lauf unverz glich abzubrechen e X um den Lauf unver ndert fortzusetzen D Analyseinformationen anzeigen Ber hren Sie erst View Experiment Information Analyseinformationen anzeigen und dann X um zum Lau
77. croficntlichen der Daten eres 000 44 as u Sera s Sun dan ad a anna 100 Hinweis Weitere Informationen ber ein Thema dieses Handbuchs finden Sie in der Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Software indem Sie entweder F1 dr cken in der Symbolleiste auf klicken oder Help gt StepOne Help Hilfe gt StepOne Hilfe w hlen Hinweise Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 71 Kapitel 5 Analyseauswertung Kapitelubersicht Kapitelubersicht In diesem Kapitel wird erlautert wie die Analyse eingesehen ausgewertet und ver ffentlicht werden kann Arbeitsablauf Analyse starten lt Analysedesign einrichten Kapitel 2 4 Reaktionen ansetzen Kapitel 3 4 Analyse durchf hren Kapitel 4 WwW Analyseauswertung Kapitel 5 Ansicht des Alleldiskriminierungsplot Ansicht der Plattenbelegung Ansicht der Well Tabelle Ansicht der QC Zusammenfassung Ansicht der Rohdatendarstellung Ansicht der Multikomponentendarstellung Ansicht der Amplifikationsdarstellung Ansicht der Auswertungseinstellungen O ON OO FW NY Daten auswerten v Analyse beenden So werden die Die Pr fung der Ergebnisse erfolgt in drei Schritten Ergebnisse a beurteilt 1 F hren S e zun chst eine erste Pr fung der Alleldiskriminierungs Darstellung siehe Seite 74 der Plattenbelegung siehe Seite 78 und der Well
78. eaktionseinrichtung angezeigt wird Geben Sie f r dieses Feld die Probenkonzentration ein die Sie bei allen Proben in einer Analyse zum Reaktionsmix hinzugeben m chten 10X for Reaction Mix gibt an dass die Software annimmt dass die Proben oder Standardkomponente des Reaktionsmix mit einer 10fachen Konzentration vorliegt Bei einer Konzentration der verd nnten Probe von 50 0 ng ul 10X betr gt die Endkonzentration der Probe in der Reaktion beispielsweise 5 ng ul 1X Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 123 Glossar Lauftyp Manuelle Grundlinie Manueller C Menge Multicomponent Plot Multikomponenten darstellung Negativkontrolle NC Negativkontrolle mit blockierter IPC Nicht fluoreszierender Quencher Minor Groove Binder NFQ MGB No Amplification Control NAC No Template Control NTC Normalisierte Menge Normalisierter Reporter R Definition des Reaktionsvolumens und des Thermoprofils f r den Ger telauf Analyseeinstellung bei der die Grundlinien Start und Endwerte f r die Amplifikationsdarstellung von der Software berechnet werden Die Software verwendet Grundlinie und Schwellenwert zur Berechnung der C Werte Analyseeinstellung bei der Sie den Schwellenwert eingeben und ausw hlen ob Sie die automatische oder manuelle Grundlinienberechnung verwenden m chten Die Software verwendet den von Ihnen eingegebenen Schwell
79. einrichten Klicken Sie auf Notification Settings Benachrichtigungseinstellungen W hlen S e Enable Notifications Benachrichtigungen aktivieren RA P SN Legen S e die Ereignisse fest bei denen Benachrichtigungen verschickt werden sollen a Wahlen Sie Instrument Error Ger tefehler b W hlen Sie Run Completed Lauf abgeschlossen 5 Klicken Sie auf das Feld Enter e mail addresses for notifications E Mail Adresse f r Benachrichtigungen eingeben und geben Sie scientist mycompany com supervisor mycompany com technician mycompany com ein 6 Geben Sie in das Feld Outgoing Mail Server SMTP Ausgangsserver smtp mycompany com ein Hinweise Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 49 anda Kapitel 4 Analysedurchf hrung Aktivieren der Benachrichtigungen optional 7 Legen Sie die Authentifizierungseinstellungen fest a W hlen Sie No Nein bei Server requires authentication Server verlangt Authentifizierung b Klicken Sie in das Feld User Name Benutzername geben Sie dann den Supervisor Laborleiter ein c Klicken Sie in das Feld Password und geben Sie ein Passwort ein Notification Settings Enable Notifications b Yes ONo Select the events to generate notifications Instrument Error 4 C Run Started Run Completed Enter e mail addresses for notifications scientist mycompany com supe
80. elsequenz zu amplifizieren PCR Reaktionskomponente die RNA in cDNA umwandelt Reverse Transkriptase wird zur PCR Reaktion hinzugegeben um eine 1 Schritt RT PCR durchzuf hren Abk rzung f r normalisierter Reporter Siehe unter refSNP ID Anzeige von Daten die in der Schmelzkurvenphase erfasst wurden Spitzenwerte in der Schmelzkurve konnen die Schmelztemperatur Tm der Zielsequenz angeben oder eine unspezifische PCR Amplifikation identifizieren Sie k nnen die Schmelzkurve als normalisierten Reporter R im Vergleich zur Temperatur oder als Reporter Derivat R im Vergleich zur Temperatur anzeigen lassen Phase im Thermoprofil mit einem Temperaturanstieg zur Generierung einer Schmelzkurve Punkt in der Schmelzkurve an dem die Fluoreszenzniveaus ein Hochstniveau erreichen und anzeigen dass sich die doppelstrangige DNA in einzelstrangige DNA auftrennt Komponente des Thermoprofils Ein Schritt wird durch die Temperatur die Zeit die Rampe und den Datenerfassungsstatus definiert Fur Zyklusphasen wird ein Schritt auch durch den AutoA Status definiert Fluoreszenzniveau ber der Grundlinie und innerhalb des exponentiellen Wachstumsbereichs des Amplification Plot Amplifikationsdarstellung Der Schwellenwert kann automatisch bestimmt werden siehe automatischer C oder er kann manuell festgelegt werden siehe manueller C Der PCR Zyklus bei dem AR den Schwellenwert in der Darstellung der Amplifikation erreicht Numeri
81. emikalienhersteller Sicherer Umgang mit Chemikalienabf llen My IN AN f Gef hrliche GEF HRLICHE ABFALLPRODUKTE Weitere Informationen Chemikalienabf lle finden Sie in den Sicherheitsdatenbl ttern und den lokalen Vorschriften zu Handhabung und Entsorgung gt C ll I M f y dp o te GEF HRLICHE CHEMIKALIENABFALLE Die Abfallprodukte von Applied Biosystems Geraten sind potenzielle Gefahrstoffe und konnen zu Verletzungen Erkrankungen und zum Tod f hren M A UNIT CHEMISCHE GEFAHREN BEI LAGERUNG Abfallprodukte niemals in Glasbehaltern sammeln oder aufbewahren da diese zerbrechen oder zersplittern k nnen Reagenzien und Abfallflaschen k nnen Spr nge bekommen und lecken Alle Abfallflaschen sollten in einem Sicherheitsbeh lter aus Polyethylen niedriger Dichte mit befestigtem Deckel und in senkrechter Stellung arretierten Griffen gesch tzt werden Bei der Handhabung von Reagenzien und Abfallflaschen geeignete n Augenschutz Bekleidung und Handschuhe tragen xvi Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Vorwort Sicherer Umgang mit Chemikalienabf llen Sicherheits So minimieren Sie die Gef hrdung durch Chemikalienabf lle hinweise f r i Chemikalienabf lle Vor der Lagerung Handhabung oder Entsorgung von Chemikalienabf llen sind die vom Chemikalienhersteller bereitgestellten Sicherheitsdatenblatter einzuse
82. en Anhang A Alternative Analyseablaufe aoe Setup f r Fortgeschrittene Experiment Properties Q Enter an experiment name selectthe type of experiment to set up then select materials and methods for the PCR reactions and instrument run How do you want to identify this experiment 3a IT Experiment Name Example Genotyping Experiment 3 b IT Barcode Optional 3c THY User Name Optional Example User 3d r r Comments Optional Example Genotyping Experiment s v What type of experiment do you want to set up Quantitation Standard Curve Quantitation Relative Standard Curve Quantitation Comparative Ct AACT 3e en sek Gane Detect single nucleotide polymorphism variants of a target nucleic acid sequence in samples Which reagents do you want to use to detect the target sequence gf LL Samana The PCR reactions contain primers designed to amplify the target sequence and a TaqMan probe designed to detect amplification of the target sequence Which ramp speed do you want to use in the instrument run For optimal results with the standard ramp speed Applied Biosystems recommends using standard reagents for your PCR reactions Which stages do you want to include in the instrument run lt ollect Data For Pre PCR Read Amplification Post PCR Read 3h 4 Klicken Sie in der Spalte Navigation auf S Plate Setup Platteneinrichtung 9 Erstellen Sie den SNP Assay
83. en Schritt der Cycling Phase 95 C 00 00 15 und geben Sie 92 C ein Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 105 A Anhang A Alternative Analyseabl ufe mn Setup f r Fortgeschrittene 10a 10b 10c 10d 10e Hinweise Run Method T Review the reaction volume and the thermal profile for the default run method If needed editthe default run method or select a run method from the library Graphical View Tabular View r r Reaction Volume Well 20 uL Add Stage Add Step 7 Delete Selected Undo Set Cycle Count nothina to Reds CollectData Open Run Method Save Run Method Collect Data For Pre PCR Read Amplification Post PCR Read Pre PCR Read Holding Stage Holding Stage Cycling Stage Post PCR Read Holding Stage Number of Cycles C Enable AutoA 100 Legend Data Collection On Data Collection Off A AutoA On A Autod Off 11 Klicken Sie auf jj Save Speichern und anschlie end im Dialogfeld Save Experiment Analyse speichern auf Save Speichern um die Analyse als Genotyping Example eds abzuspeichern 12 Bereiten Sie die Reaktionen vor wie in Kapitel 3 Ansetzen der Reaktionen auf Seite 35 erl utert vor 13 Lassen Sie die Analyse wie in Kapitel 4 Analysedurchf hrung auf Seite 45 dargestellt ablaufen
84. en Sie das StepOne System nach der Durchf hrung einer Analyse nicht ab Das Ger t schaltet automatisch in einen Ruhezustand wenn es nicht im Gebrauch ist Weitere Informationen zum Entladen des StepOne Systems finden Sie in der Hilfe der StepOne Software indem Sie auf klicken oder Help gt StepOne Help Hilfe StepOne Hilfe w hlen 66 Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 4 Analysedurchfuhrung A Entnehmen der Reaktionsplatte und bertragen der Daten Daten bertra Die bertragung der Analyse zur Auswertung auf den Computer erfolgt in Abh ngigkeit gungsmethode von der Konfiguration des StepOne Systems ausw hlen Konfiguration Beschreibung Siehe Computer Das StepOne Systemkabel verbindet den Computer gesteuerte gesteuert Computer mit dem StepOne System Daten bertragung unten Eigenst ndig Der Computer und das StepOne System Fern berwachung auf vernetzt sind mit demselben Netzwerk verbunden Seite 62 Eigenst ndig Der Computer und das StepOne System _ yEigenstandige Basis sind nicht miteinander verbunden Uberwachung auf Seite 65 Computer Wenn Ihr Computer ber das StepOne Systemkabel direkt mit dem StepOne System gesteuerte verbunden ist m ssen Sie nichts unternehmen Die StepOne Software bertr gt die Daten bertragung Analysedaten nach dem Lauf automatisch an das
85. en die meisten der Aufgaben die vom Analysedesign Assistenten ausgef hrt werden zusammengelegt Viele Punkte aus Kapitel 2 in dem die Erstellung einer Analyse mit Analysedesign Assistent erl utert wird werden hierbei umgangen So erstellen Sie 1 Klicken Sie auf der Startseite der StepOne Software auf unterhalb eine Analyse Hinweise der Spalte Setup Einstellungen 2 Klicken Sie auf Advanced Setup Setup f r Fortgeschrittene 3 Geben Sie die Eigenschaften der Beispielanalyse ein a Klicken Sie in das Feld Experiment Name Analysename und geben Sie dann Genotyping Example Genotypisierungs Beispielanalyse ein Klicken Sie in das Feld Barcode geben Sie dann das Example Beispiel ein Klicken Sie in das Feld User Name Benutzername geben Sie dann den Example User Beispielbenutzer ein Klicken Sie in das Feld Comments Anmerkungen geben Sie dann Genotyping Getting Started Guide Einf hrungshandbuch zur Genotypisierung ein Wahlen Sie als Analysetyp Genotyping Genotypisierung aus W hlen Sie als Reagenzien TaqMan Reagents aus Wahlen Sie als Heiz K hlgeschwindigkeit Standard 2 hours to complete a run Standard ca 2 Stunden fiir einen Lauf aus Wahlen Sie Pre PCR Read Pra PCR Messung und Amplification Amplifikation um die Stadien des Lauftyps hinzuzuf gen 102 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalys
86. en ist f hren Sie Schritte 2a bis 2d aus um die Analysedaten ber ein USB Laufwerk zu bertragen a Schlie en Sie das USB Laufwerk an eine USB Schnittstelle des Computers an b W hlen Sie in der StepOne Software H Save gt Save As Speichern gt Speichern unter c Gehen Sie im Dialogfeld Save Speichern auf das USB Laufwerk und klicken Sie dann auf Save Speichern d Entnehmen Sie das USB Laufwerk aus dem Computer und schlieBen Sie es an die USB Schnittstelle des StepOne Systems an 3 Ber hren Sie den Touchscreen des StepOne Systems und anschlie end 4 Ber hren Sie im Bildschirm Main Menu Hauptmen Browse Experiments Analysen durchsuchen 5 Ber hren Sie im Bildschirm Browse Methods Methoden durchsuchen 77 Ordner Hinweise Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 93 a Kapitel 4 Analysedurchfuhrung Starten der Analyse 6 Nehmen Sie im Bildschirm Choose an Experiment Category Analysekategorie wahlen die folgenden Einstellungen vor e Ber hren Sie USB wenn Sie die Analysedaten auf ein USB Laufwerk ubertragen haben e Ber hren Sie Default Standard wenn Sie die Analysedaten ber eine Netzwerkverbindung versandt haben 7 Nehmen Sie im Bildschirm Browse USB Default Experiments USB Standardanalysen durchsuchen die folgenden Einstellungen vor a Ber hren Sie Example Genotyping Experiment Beispiel
87. enwert und die Grundlinie zur Berechnung des Schwellenwert Zyklus C Die Zielsequenzmenge in den Proben bei Quantifizierungsanalysen Absolute Mengen k nnen s ch auf Kopienzahl Masse Molarit t oder Virusbelastung beziehen Relative Mengen beziehen sich auf das Vielfache um das sich die normalisierte Zielsequenzmenge in der Probe und die normalisierte Zielsequenzmenge in der Referenzprobe unterscheiden Anzeige von Daten die wahrend der Zyklusphase der Real time PCR erfasst wurden Die Multikomponentendarstellung zeigt die Fluoreszenz f r alle Zyklen in einem Lauf In StepOne System Analysen die Aufgabe die IPC Zielsequenzen oder SNP Assays in Wells zugewiesen ist welche Wasser oder einen Puffer statt des Proben Templates enthalten In Wells mit Negativkontrolle sollte keine Amplifikation der Zielsequenz erfolgen In Positiv Negativ Analysen Wells die IPC Inhibitoren statt des Proben Templates in der PCR Reaktion enthalten In den durch die Negativkontrolle gehemmten IPC Wells sollte keine Amplifikation erfolgen da die Reaktion kein Proben Template enth lt und die Amplifikation der IPC unterdr ckt wird Wird auch No Amplification Control NAC genannt Molek le die an das 3 Ende der TaqMan Sonden gebunden sind Bei intakten Sonden unterdr ckt der nicht fluoreszierende Quencher NFQ die Abgabe eines Fluoreszenzsignals durch den Reporterfarbstoff Da der NFQ nicht fluoresziert erzeugt er schw chere Hintergrundsigna
88. er Abbildung unten ist die Alleldiskriminierungs Darstellung der Beispielanalyse dargestellt Hinweise Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 19 en Kapitel 5 Analyseauswertung Ansicht der Amplifikationsdarstellung 3a Allelic Discrimination Plot lt View Plate Layout View Well Table Plot Settings Select Wells With Selectitem v Select Item v SNP Assay Plot Type eave B ih Allelic Discrimination Plot C__11711420_30 v Apply Call Undetermined v Cartesian v ample 1 Sample2 Sample3 Sample4 Sample5 Sample6 3b Allen Jen cai Pca Pci cl canl cin Sample7 SampleS Sample9 Sample 10 Sample 11 Sample 12 Sample 13 Sample 14 B m c11 U c11 M c11 U c11 U c_11 ci U c J c_1s m c11 U c11 M c11 M c11 M c11 U c P EERI Bc Sample 15 Sample 16 Sample 17 Sample 18 Sample 19 Sample 20 D E F Homozygous 1 1 Homozygous 2 2 Heterozygous 1 2 Undetermined Wells I 20 Unknown J 2 Negative Control J 2 Positive Control 24 Empty Analysis Summary Total Wells in Plate 48 Wells SetUp 24 Wells Processed 24 Wells Flagged 0 Wells Omitted from Analysis 0 Samples Used 20 SNP Assays Used 1 Auswertungs Beachten Sie bei der Auswertung Ihrer eigenen Analyse Folgendes Hinweise hinweise e Best tigen Sie dass alle Kontrollen den richtigen Genotyp aufweisen e Wenn
89. ertungseinstellungen definiertem Grenzwert lag Dies weist darauf hin dass die Amplifikation des Wells m glicherweise fehlgeschlagen ist NOISE Die durch den Well erzeugte Hintergrundfluoreszenz Rauschen ist h her als bei anderen Wells auf der Reaktionsplatte und zwar um einen Faktor der ber dem in den Auswertungseinstellungen definierten Grenzwert liegt SPIKE Die Amplifikationsdarstellung des Well enth lt eine oder mehr Datenpunkte die mit anderen Punkten der Darstellung nicht konsistent sind EXPFAIL Die Software kann den Exponentialbereich der Amplifikationsdarstellung f r den Well nicht erkennen BLFAIL Die Software kann die bestm gliche Grundlinie f r die Daten des Wells nicht berechnen THOLDFAIL Die Software kann keinen Schwellenwert f r den dazugeh rigen Well berechnen CTFAIL Die Software kann keinen Schwellenwertzyklus C f r den dazugeh rigen Well berechnen Auswertungs Beachten Sie bei der Auswertung Ihrer eigenen Analyse Folgendes hinweise e Wenn Sie Positivkontrollen verwenden best tigen Sie auch die Integrit t der Positivkontrollen a Wahlen Sie aus dem Men Group By Gruppieren nach Task Aufgabe um die Tabellenzeilen nach hrer Funktion auf der Reaktionsplatte zu organisieren Hinweise 82 Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 5 Analyseauswertung a Ansicht der Well Tabelle b Be
90. erungsanalysen xiii Vorwort Chemische Sicherheit Gerat bedienen Gerat reinigen oder dekontaminieren e Koordinieren Sie Hub und andere Bewegungen vor ihrer Ausf hrung mit allen Beteiligten e Heben Sie das Objekt nicht aus dem Verpackungskarton heraus sondern kippen Sie den Karton zur Seite und halten Sie ihn fest w hrend eine andere Person den Computer oder Monitor aus der Kiste zieht Stellen Sie sicher dass das gesamte Bedienpersonal des Ger ts folgende Voraussetzungen erf llt e Es muss in den allgemeinen Sicherheitsvorkehrungen f r Labors und den speziellen Sicherheitsvorkehrungen f r das Ger t unterwiesen worden sein e Es muss alle geltenden Sicherheitsdatenblatter MSDSs gelesen und verstanden haben Siehe Informationen ber Sicherheitsdatenbl tter MSDSs auf Seite xv 2 _ aul Halten Sie vor Verwendung einer anderen Reinigungs oder Dekontaminierungsmethode als der vom Hersteller empfohlenen Methode mit diesem R cksprache um sicherzustellen dass das Ger t durch diese Alternativmethode nicht besch digt wird Chemische Sicherheit Warnung bez glich chemischer Gefahren Chemische Sicherheits richtlinien XIV CHEMISCHE GEFAHREN Lesen Sie vor Handhabung der Chemikalien die vom Hersteller bereitgestellten Sicherheitsdatenbl tter MSDS und halten Sie alle relevanten Sicherheitsvorkehrungen ein M f N f AD f Y i FAR tte CHEMISCHE GEFA
91. esammelten Rohspektren Die Rohdatendarstellung zeigt die Amplitude der Rohfluoreszenz an die in jedem Kanal 1 bis 3 w hrend dem Laufzyklus generiert wurde den der Show Cycle Regler anzeigt Die Darstellung zeigt die Rohspektren f r die in der Plattenbelegung bzw in der Well Tabelle ausgew hlten Wells an Informationen zu In der Beispielanalyse pr fen Sie die Rohdatendarstellung auf einen stabilen den Beispiel Signalanstieg keine abrupten nderungen oder Einbr che f r den geeigneten Filter daten Darstellung 1 W hlen Sie im Navigationsbereich Ka Raw Data Plot prufen E 2 W hlen Sie in der Well Tabelle die zu untersuchenden Wells aus 3 Ziehen Sie den Show Cycle Zyklus anzeigen Regler um tempor re nderungen in jedem Filter des Rohdatenprofils anzeigen zu lassen Das StepOne System verf gt ber die folgenden Filter Filter 1 2 3 e FAM Farbstoff e JOE Farbstoff e ROX Farbstoff Farbsto e SYBR Green e VIC Farbstoff Farbstoff Hinweise 86 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 5 Analyseauswertung Ansicht der Rohdatendarstellung In der Abbildung unten sind Rohdaten aus der Beispielanalyse fur die Genotypisierung dargestellt StepOne v1 0 File Edit Instrument Analysis Tools Help New Experiment EF Open lal Save Close w Send Experiment to Instrument Eg Download Experime
92. ext wann zu verwenden v Kurven siehe Amplifikationskurve L Lauf starten eigenst ndige 52 kombinierte 51 Lauf berwachen Amplification Plot Amplifikationsdarstellung 58 eigenst ndige 65 Fern berwachung 62 Kombinierte Konfiguration 56 Lauftypanzeige 60 Temperaturgraph 59 Lauf vorbereiten 36 Laufhinweise 50 Lauftyp 123 Einrichten 25 berwachen 60 M manuelle Allelbestimmung 99 Manuelle Grundlinie 124 Manueller Cy 124 Markierung AMPNC 8 BADROX 8 BLFAIL 82 CLUSTER 82 CTFAIL 82 EXPFAIL 82 NOAMP 82 NOISE 82 NOSIGNAL 82 OFFSCALE 82 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 135 Stichwortverzeichnis PCFAIL 82 SMCLUSTER 82 SPIKE 82 THOLDFAIL 82 Markierung AMPNC 82 Markierung BADROX 82 84 Markierung BLFAIL 82 Markierung CTFAIL 82 Markierung EXPFAIL 82 Markierung NOAMP 82 Markierung NOISE 82 Markierung NOSIGNAL 82 Markierung OFFSCALE 82 Markierung PCFAIL 82 Markierung SMCLUSTER 82 Markierung SPIKE 82 Markierung THOLDFAIL 82 Markierungen 82 Mehrere Darstellungen ansehen 94 Menge 124 Men befehle Konventionen zur Beschreibung v Multicomponent Plot 88 124 N Negativkontrolle 78 89 124 anwenden 23 24 bestatigen 76 80 Markierung AMPNC 82 Nicht fluoreszierender Quencher Minor Groove Binder NFQ MGB 124 No Amplification Control NAC siehe unter ZPC Wells durch Negativkontrolle gehemmt NO SIGNAL Markierung 82 No Tem
93. f hrung Kapitel 4 Bereiten Sie den Lauf vor Aktivieren Sie die Benachrichtigungen optional Starten Sie den Lauf berwachen Sie den Lauf O A WwW N Entladen Sie die Reaktionsplatte und bertragen Sie die Daten v Analyse auswerten Kapitel 5 v Analyse beenden Hinweise 46 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 4 Analysedurchfuhrung Vorbereiten des Laufs Vorbereiten des Laufs Bereiten Sie den Lauf vor indem Sie die Analyse ffnen und die versiegelte MicroAmp Fast Optical 48 Well Reaction Plate in das StepOne System einlegen Analyse ffnen 1 Klicken Sie in der StepOne Software auf Open ffnen 2 W hlen Sie Genotyping Example eds 3 Klicken Sie auf Open ffnen 4 Ste pOne v1 0 File Edit Instrument Analysis Tools Help 1 EE New Cum ari emt OR Save BF Close 13 Send Experiment to Instrument Eg Download Experiment from Instrument S Eroi 8 Print Repor Run Analyze Design Wizard QuickStart Analyze Experiment 7 gt a amp Open Look in S experiments k J examples v 2 gt Wa Genotyping Example File name Genotyping Example eds My Network l Places Files oftype All SDS Files eds edt sds Save current display as the default www appliedbiosystems com ft Home Disconnected Hinweise Applied B
94. fiehlt f r jeden SNP Assay mindestens eine Negativkontrolle zu verwenden e Beschr nken Sie die Anzahl der Reaktionen insgesamt in jeder Analyse auf 48 oder weniger Wenn die Anzahl der erforderlichen Gesamtreaktionen h her als 48 ist beschr nken Sie die Anzahl der SNP Assays Proben Replikate oder Positiv und Negativkontrollen oder teilen Sie die Reaktionen auf zwei oder mehr Reaktionsplatten auf Weitere Informationen zum Bildschirm Samples amp Replicates finden Sie in der StepOne Software Help indem Sie auf klicken oder Help gt StepOne Help Hilfe gt StepOne Hilfe w hlen Weitere Informationen Hinweise 24 Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 2 Experimentelles Design Definieren des Laufprofils Definieren des Laufprofils Informationen zur Beispielanalyse Laufprofil Bildschirm berpr fen Hinweise Im Bildschirm zum Definieren des Laufprofils k nnen Sie das Reaktionsvolumen und das Standardlaufprofil berpr fen ndern Sie bei Bedarf Standardreaktionsvolumen und Laufprofil oder ersetzen Sie beides indem Sie ein Laufprofil aus der Bibliothek installieren In der Beispielanalyse werden 25 ul Reaktionen mit der unten dargestellten TagMan Drug Metabolism Genotyping Assay Methode analysiert Da das StepOne System zur Durchf hrung der Amplifikation verwendet wird verf gt das Laufprofil ber eine Cycling Phase f
95. ftypbildschirm zur ckzukehren E Fehlerprotokoll anzeigen Ber hren Sie die Statusleiste um das Fehlerprotokoll anzuzeigen Add Melt Curve View Experiment Display Experiment Information 5 Experiment Example_Experiment Time ne 7 Hinweise Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 65 A Kapitel 4 Analysedurchf hrung Entnehmen der Reaktionsplatte und bertragen der Daten Entnehmen der Reaktionsplatte und bertragen der Daten Entnehmen der Sobald das StepOne System das Hauptmen anzeigt entnehmen Sie die Reaktionsplatte aus dem StepOne System und bertragen Sie die Analysedaten zur Analyse auf den Computer VERLETZUNGSGEFAHR Beim Betrieb des Ger ts kann die Reaktionsplatte RENTE des Heizblocks auf ber 100 C ansteigen Halten Sie sich solange vom Hinweise Heizblock fern bis er auf Zimmertemperatur abgek hlt ist Hinweis Wenn das StepOne System einen Lauf abgeschlossen hat speichert das System die Laufinformationen bis zum Abschluss des n chsten Ger telaufs im Laufprotokoll 1 Wenn auf dem Touchscreen der StepOne System das Hauptmen erscheint ber hren Sie 2 ffnen Sie das Schubfach des Ger ts 3 Entnehmen Sie die Reaktionsplatte aus dem Heizblock 4 Schlie en Sie das Schubfach des Ger ts vorsichtig NN BMA VORSICH T WICHTIG Schalt
96. g von Markierungen k nnen Sie Bedingungen markieren und Wells herausnehmen sobald bestimmte Kriterien erf llt sind zum Beispiel wenn bei einem Well Daten fehlen Weitere Informationen finden Sie in der StepOne Software Help c Klicken Sie auf Apply Analysis Settings Auswertungseinstellungen anwenden Klicken S e zur Auswertung der Daten anhand der neuen Einstellungen auf Reanalyze Neu auswerten W hlen Sie im Navigationsbereich Allelic Discrimination Plot Wahlen Sie aus dem Men SNP Assay einen Marker aus In der Alleldiskriminierungsdarstellung werden f r die ausgew hlten Marker Kreuze x Unbestimmt angezeigt So weisen Sie einer Probe eine Bestimmung zu a Klicken Sie auf T Auswahlwerkzeug b Klicken und ziehen Sie ein Feld um die gew nschten Datenpunkte in der Darstellung c Aktivieren Sie im Men Apply Call Bestimmung bernehmen die gew nschte Bestimmung d Wiederholen Sie die Schritte 8b und 8c um den restlichen Datenpunkten Bestimmungen zuzuweisen Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 99 m Kapitel 5 Analyseauswertung Ver ffentlichen der Daten Ver ffentlichen der Daten Sie k nnen die Analysedaten auf verschiedene Weise ausgeben lassen e Speichern der Darstellung als Bilddatei e Drucken der Darstellung e Drucken der Plattenbelegung e Erstellen von Folien e Drucken eines Berichts e Datenexport
97. gef hrt und entsprechend des unter Performing a TagMan Drug Metabolism Genotyping Assay for 96 Well Plates Quick Reference Card BN 4367636A beschriebenen Protokolls ausgef hrt Hinweise Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 9 4 Kapitel 1 Erste Schritte Informationen zur Beispielanalyse Reaktionsplatten Die Reaktionsplattenbelegung der Beispielanalyse ist im Folgenden dargestellt belegung View Plate Layout View Well Table Select Wells With l Select Item v l Select item v Show in Wells Sample 1 Sample 2 Sample 3 Sample 4 Sample 5 Sample E c_11711420_30 J c_14711420_s0 M c_11711420_30 M c_11711420_30 M c_11711420_30 M c_11711420_30 M c_11711420_30 J c_11711420_s0 Sample 7 Sample 8 Sample 9 Sample 10 Sample 11 Sample 12 Sample 13 Sample 14 M c_11711420_30 M c_11711420_30 M c_11711420_30 M c_11711420_30 M c_11711420_30 M c_11711420_30 J c_11711420_30 J c__11711420_s0 Sample 15 Sample 16 Sample 17 Sample 18 Sample 19 Sample 20 M c_11711420_30 M c_11711420_30 M c_11711420_30 M c_11711420_30 M c_11711420_30 M c__11711420_30 Ed c_s1711420_30 E c_11711420_20 Wells 1 20 Unknown 3 2 Negative Control J 2 Positive Control 24 Empty Informationen zu Die in diesem Handbuch enthaltene Beispielanalyse ist in der StepOne Software den Beispiel enthalten Sie finden die Analysedatei
98. gegeben siehe Definieren der Proben und Replikate auf Seite 23 P p e Zentrifuge MicroAmp Fast Optical 48 Well Reaction Plate MicroAmp Optical 48 Well Adhesive Film Pipette und Pipettenspitzen Hinweis Das StepOne System l uft nur mit MicroAmp Fast Verbrauchsmaterialien Pipettieren Sie 1 ul der geeigneten Probe 3 bis 20 ng der gereinigten genomischen DNA in jeden einzelnen Well der Optical 48 Well Reaktionsplatte Alle Wells desselben Genotypisierungs Assays m ssen dieselbe Menge an Probe bzw Kontrolle enthalten Trocknen Sie die Proben durch Verdunstung bei Raumtemperatur an einem dunklen Amplikon freien Ort Decken S e die Reaktionsplatte beim Trocknen mit einem fusselfreien Tuch ab bertragen Sie 25 ul des Reaktionsmixes in jeden Well WICHTIG Stellen Sie sicher dass von Well zu Well keine Kreuzkontamination m glich ist Versiegeln Sie die Reaktionsplatte mit optischem Klebefilm Vortexen Sie die Reaktionsplatte f r 3 bis 5 Sek Zentrifugieren Sie die Reaktionsplatte kurz Stellen Sie sicher dass sich die Flussigkeit in allen Wells der Reaktionsplatte auf dem Boden befindet Wenn dies nicht der Fall ist zentrifugieren Sie die Platte noch einmal mit hoherer Geschwindigkeit und fur langere Zeit WICHTIG Achten Sie darauf dass der Boden der Reaktionsplatte nicht schmutzig wird Flussigkeiten und andere Kontaminanten die am Boden der Reaktionsplatte haften bleiben k nnen den Heiz
99. ght is conveyed expressly by implication or by estoppel under any other patent claim such as claims to apparatus reagents kits or methods such as 5 nuclease methods NOTICE TO PURCHASER LIMITED LICENSE A license to perform the patented 5 Nuclease Process for research is obtained by the purchase of 1 both Licensed Probe and Authorized 5 Nuclease Core Kit 11 a Licensed 5 Nuclease Kit or 111 license rights from Applied Biosystems The TaqMan SNP Genotyping and TaqMan Drug Metabolizing Genotyping Assays contain Licensed Probe Use of these products is covered by US patent claims and corresponding patent claims outside the US The purchase of these products includes a limited non transferable immunity from suit under the foregoing patent claims for using only this amount of product for the purchaser s own internal research Separate purchase of an Authorized 5 Nuclease Core Kit would convey rights under the applicable claims of US patents and corresponding patent claims outside the United States which claim 5 nuclease methods No right under any other patent claim and no right to perform commercial services of any kind including without limitation reporting the results of purchaser s activities for a fee or other commercial consideration is conveyed expressly by implication or by estoppel This product is for research use only Diagnostic uses under Roche patents require a separate license from Roche NOTICE TO PURCHASE
100. glichen Genotypen Allel 1 homozygot Allel 2 homozygot und Allel 1 2 heterozygot e Einen Cluster f r die Negativkontrolle Darstellung 1 W hlen Sie im Navigationsbereich Allelic Discrimination Plot pr fen 2 W hlen Sie aus dem Men SNP Assay C__11711420_30 e Falls der Autocaller aktiviert ist zeigt die Alleldikriminierungsdarstellung Allel Symbole f r jede Probe d e f r den gew hlten SNP anlaysiert wurde Die Proben sind in der Darstellung wie folgt gruppiert Symbol Gruppierung Genotypen der Proben rot x Achse der Darstellung Homozygot f r Allel 1 des ausgew hlten SNP Assay blau y Achse der Darstellung Homozygot fur Allel 2 des ausgew hlten SNP Assay gr n Mitte zwischen den Heterozygot f r beide Allels des homozygoten Clustern ausgew hlten SNP Assays Allele 1 und Allele 2 a linke untere Ecke der Negativkontrolle schwarz Darstellung x an einer beliebigen Stelle in unbestimmt schwarz der Darstellung e Ist der Autocaller nicht aktiviert zeigt die Alleldiskriminierungs Darstellung fur jede Probe ein Kreuz X unbestimmt an 3 Gehen Sie bei jedem Cluster in der Darstellung wie folgt vor a Klicken und ziehen Sie ein Feld um den Cluster um die dazugehorigen Wells in der Plattenbelegung und in der Well Tabelle auszuwahlen b berzeugen Sie sich dass die erwarteten Wells in der Well Tabelle ausgew hlt sind Wenn Sie beispielsweise den Clu
101. gsanalysen kann die StepOne Software Daten auch w hrend des Laufs anzeigen Echtzeit was bei der Problembehebung eine gro e Hilfe sein kann Positiv Negativ Das System erfasst Daten vor und nach der PCR Unabh ngig vom Laufprofil besteht ein Datenerfassungspunkt bzw eine Messung aus drei Phasen 1 Anregung Das StepOne System strahlt alle Wells der Reaktionsplatte innerhalb des StepOne Systems aus wodurch die Fluorophoren in jeder Reaktion angeregt werden 2 Emission Die Optik des StepOne Systems fokussiert die von den Wells der Reaktionsplatte abgegebene Restfluoreszenz Das daraus resultierende vom Ger t erfasste Bild besteht nur aus dem Licht eines Wellenl ngenbereichs 3 Erfassung Das StepOne System erstellt daraus eine digitale Darstellung der ber einen festgelegten Zeitraum erfassten Restfluoreszenz Die StepOne Software speichert die Fluoreszenzrohdaten f r die Analyse Falls erforderlich f hrt die Software zus tzliche Messungen durch entsprechend der Anforderungen der f r die Analyse verwendeten Fluoreszenzreagenzien Nach Durchf hrung eines Laufs bestimmt die StepOne Software anhand von Kalibrierungsdaten durch r umliche Farbstoff und Hintergrundkalibrierung den Ort und die Intensitat von Fluoreszenzsignalen in jeder Messung den mit dem jeweiligen Fluoreszenzsignal verbundenen Farbstoff und die Aussagefahigkeit des Signals Hinweise 2 Applied Biosystems StepOne Real Ti
102. hase der PCR Amplifikation erfasst wurden Diese k nnen wie folgt angezeigt werden e Grundlinienkorrigierters normalisiertes Reportersignal AR ber dem Zyklus e Normalisiertes Reportersignal R ber den Zyklus e Schwellenwert Zyklus C7 ber dem Well Teil des Ger telaufs w hrend dessen die PCR zur Amplifikation der Zielsequenz erfolgt F r Quantifizierungsanalysen werden die w hrend der Amplifikation gemessenen Fluoreszenzdaten in einem sog Amplification Plot dargestellt und zur Berechnung von Ergebnissen verwendet Wenn im StepOne System f r eine Genotypisierungs oder Positiv Negativ Analyse eine Amplifikation durchgef hrt wird werden die w hrend der Amplifikation gemessenen Fluoreszenzdaten in einem sog Amplification Plot dargestellt und k nnen zur Fehlerbehebung verwendet werden Berechnete Effizienz der PCR Amplifikation Die Amplifikationseffizienz wird mithilfe der Steigung der Regressionsgeraden in der Standardkurve berechnet Eine Steigung von etwa 3 3 bedeutet eine optimale 100 ige PCR Amplifikationseffizienz Faktoren die die Amplifikationseffizienz beeinflussen sind e Bereich der Standardkonzentrationen Um eine korrekte und genaue Effizienzbestimmung durchzuf hren verwenden Sie einen breiten Bereich von Standardkonzentrationen 5 bis 6 Log Stufen 10 bis 10 fach e Anzahl der Standardreplikate Um eine pr zise Effizienzbestimmung durchzuf hren f hren Sie Replikate durch um die Auswirkunge
103. he Sicherheitssymbole Gefahrensymbole siehe Sicherheitssymbole auf Geraten Gehemmte IPC 121 Gehemmte IPC siehe auch unter PC Wells durch Negativkontrolle gehemmt Ger tebetrieb Sicherheit xiv Grundlinie Automatische 121 Informationen 92 123 Grundlinienkorrigierter normalisierter Reporter ARn 123 H Haltephase 123 Haushaltsgen siehe unter Endogene Kontrolle Heiz K hlgeschwindigkeit 19 126 Hilfesystem zugreifen viii Hinweise Auswertung 76 79 82 85 87 89 92 97 Design 17 19 22 24 26 29 31 33 Lauf 50 sicherer Umgang mit Chemikalienabfallen xvii Vorbereitung 37 39 42 Installationskategorie xvili Interne Positivkontrolle IPC 123 Inventarisierte Assays 123 IPC 123 IPC 123 IPC Inhibitor 123 IPC Wells mit Negativkontrolle 123 IPC Wells mit Negativkontrolle siehe auch unter PC IPC Wells durch Negativkontrolle gehemmt 124 K Kalibrator siehe unter Referenzprobe Stichwortverzeichnis kombinierte Daten bertragung 67 Konfiguration 121 Lauf starten 51 berwachung eines Laufs 56 Kontrolle negativ 23 24 76 78 89 positiv 23 24 76 Konventionen Anwenderbeachtungsbegriffe vi fett gedruckter Text v Hinweise vi in diesem Handbuch v kursiv gedruckter Text v Sicherheit x WICHTIG vi zur Beschreibung von Men befehlen v Konzentration der verd nnten Probe 10X f r Reaktionsmix 123 Kunden Feedback ber Unterlagen von Applied Biosystems viii Kursiv gedruckter T
104. hen und zu verinnerlichen Stellen Sie prim re und sekund re Abfallbeh lter bereit Der prim re Abfallbeh lter ist f r die unmittelbar anfallenden Abf lle bestimmt Der sekund re Beh lter f ngt die aus dem prim ren Beh lter leckenden oder versch tteten Chemikalienabf lle auf Beide Beh lter m ssen mit dem Abfallmaterial kompatibel sein und die landesweiten nationalen und lokalen Richtlinien f r die Lagerung von Beh ltern einhalten Der Kontakt mit Chemikalien ist m glichst gering zu halten Bei der Handhabung von Chemikalien entsprechende Personenschutzausr stung tragen wie z B Schutzbrille Handschuhe oder Schutzbekleidung Weitere Sicherheitsrichtlinien enth lt das entsprechende Sicherheitsdatenblatt Atmen Sie m glichst keine Chemikalien ein Lassen Sie Chemikalienbehalter nicht offen stehen und verwenden Sie diese nur mit ausreichender Luftung zum Beispiel Abzugshauben Weitere Sicherheitsrichtlinien enthalt das entsprechende Sicherheitsdatenblatt Chemikalienabfalle unter einer Abzugshaube handhaben Verschlie en S e einen Abfallbeh lter nach seiner Leerung mit der dazugeh rigen Abdeckung Der Inhalt von Abfallschalen und flaschen ist gem den Regeln der Guten Laborpraxis sowie der lokalen landesweiten regionalen bzw nationalen Umweltschutz bzw Gesundheitsschutzauflagen zu entsorgen Abfallentsorgung Wenn beim Betrieb des Ger ts potenziell gef hrliche Abfallprodukte erzeugt werden m ssen S
105. herheitsverriegelungen xviii Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Vorwort Sicherer Umgang mit biologischen Gefahren Sicherer Umgang mit biologischen Gefahren M if N N m a v2 my U J N JM if Allgemeine Z S e BIOGEF HRDUNG Biologische Proben wie z B Gewebe biologische K rperfl ssigkeiten infekti se Substanzen sowie Menschen und Tierblut k nnen Gefahren ansteckende Krankheiten bertragen Beachten Sie alle geltenden lokalen landesweiten regionalen bzw nationalen Vorschriften Tragen Sie geeignete Schutzausr stung die sich unter anderem aus Folgendem zusammensetzt Schutzbrille Gesichtsschutz Schutzbekleidung Laborkittel und Handschuhe Alle Arbeiten sind in ordnungsgem ausgestatteten Einrichtungen unter Verwendung geeigneter Sicherheitsausr stung auszuf hren zum Beispiel Abfangvorrichtungen Die Mitarbeiter sind vor der Arbeit mit potenziell infekti sen Materialien gem der geltenden Gesetze und der Anforderungen des Unternehmens des Instituts zu schulen Lesen und befolgen Sie die im Folgenden aufgef hrten geltenden Gesetze und Richtlinien e Die vom US Gesundheitsministerium U S Department of Health and Human Services in Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Biologische Sicherheit n mikrobiologischen und biomedizinischen Laboratorien ver ffentlichten Richtlinien Stock Nr 017 040 00547 4 bmbl od nih go
106. hritt 2 bis die Plattenbelegung alle gew nschten Parameter enth lt Parameter Beschreibung Probenname Der Name der Probe die in den Well eingef llt wurde Aufgabe Die dem Well zugeordnete Aufgabe e A Unbekannte Probe e E Negativkontrolle e iJ Positivkontrolle SNP Assay Name Der Name des SNPs der im Well beurteilt wird Assay ID Die Assay Identifikationsnummer des SNPs der im Well beurteilt wird Allele 1 Allele 2 Der Name des dazugeh rigen Allels des im Well beurteilten SNPs Allele 1 Dyes Der Name der Reporter und Quencher Farbstoffe des Allels das zu dem Allele 2 Dyes im Well beurteilten SNP geh rt SNP Assay Color Die Farbe des SNPs der im Well beurteilt wird Sample Color Die Farbe der Probe oder Aufgabe die dem Well zugewiesen wurde Task Color 78 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 5 Analyseauswertung Ansicht der Plattenbelegung Parameter Beschreibung Genotype Call Die der Probe zugewiesene Allelbestimmung e Homozygot 1 1 e e Homozygot 2 1 e Heterozygot 1 2 e W Negativkontrolle e X Unbestimmt Markierung Die Anzahl der Markierungen die wie unter dem A Symbol aufgelistet ausgel st wurden In der folgenden Abbildung ist die Plattenbelegung f r die Genotypisierungs Beispielanalyse dargestellt 1 gt View Plate Layo
107. ht eng zusammengehauft oder mit Negativkontrollen zusammengehauft sind in dem Sie sie erneut testen e Sollten Sie Replikate Ihrer Reaktion getestet haben pr fen Sie Ihren Datensatz sorgf ltig auf Ausrei erwerte um die Richtigkeit der Genotypbestimmungen sicherzustellen Falls Ausrei er vorhanden sind best tigen S e die Ergebnisse der dazugeh rigen Proben indem S e sie erneut testen e Beobachten Sie die Anzahl der Cluster in der Darstellung Wenn die Alleldiskriminierungs Darstellung weniger als drei repr sentative Genotyp Cluster heterozyot homozygot Allel 1 und homozygot Allel 2 enth lt kann die StepOne Software die Proben m glicherweise nicht genotypisieren bis Sie die Funktion 2 Cluster Calling aktivieren Falls die Darstellung weniger als drei Cluster enth lt a Klicken Sie auf Analysis Settings Auswertungseinstellungen b Klicken Sie auf Edit Default SNP Assay Settings Standard SNP Einstellungen bearbeiten c W hlen Sie 2 Cluster Calling Enabled 2 Cluster Bestimmung aktiviert und anschlieBend auf Save Changes Anderungen speichern d Klicken Sie auf Apply Analysis Settings Auswertungseinstellungen anwenden e Klicken Sie auf Reanalyze Neu auswerten um die Analyse mithilfe der 2 Cluster Bestimmung neu auszuwerten Hinweis Die Ergebnisanzeigen sind synchronisiert Die Auswahl eines Wells n der Plattenbelegung w hlt beispielsweise die entsprechenden Daten in der Well Tabelle und in der Al
108. icht durch das gelbe StepOne Systemkabel mit einem Computer verbunden ist Stattdessen wird ein USB Laufwerk zur bertragung von Daten zwischen StepOne System Komponenten verwendet Bei dieser Konfiguration wird das StepOne System durch den Touchscreen des Ger ts gesteuert Zielsequenz die in allen analysierten Proben auf demselben Niveau vorhanden sein sollte Wird in relativen Standardkurven und vergleichenden Cy AAC Analysen zur Normalisierung des Fluoreszenzsignals f r die zu quantifizierende Zielsequenz verwendet Wird auch als Haushaltsgen bezeichnet Analyse bei der die bei einer Post PCR Messung erfassten Fluoreszenzdaten zur Berechnung von Ergebnissen f r Genotypisierungs oder Positiv Negativ Analysen verwendet werden Siehe unter Post PCR Messung Reagens das den Fluoreszenzfarbstoff enth lt Farbstoffe werden zur Durchf hrung einer Kalibrierung auf dem StepOne System verwendet siehe auch unter Systemfarbstoff Nicht von Applied Biosystems hergestellte Farbstoffe Sie k nnen zur Durchf hrung von Real Time PCR Analysen auf dem StepOne System Farbstoffe von Fremdanbietern verwenden Bevor Sie diese verwenden f hren Sie eine Kalibrierung der jeweiligen Farbstoffe durch WICHTIG Applied Biosystems empfiehlt nicht die Verwendung von TAMRA Farbstoff als Reporter oder Quencher mit dem StepOne System Funktion in der Software die es Ihnen erlaubt den Status eines vernetzten Ger tes anzusehen
109. ie von den Analysedaten ausgel sten Markierungen besser zu verstehen Auf dem Bildschirm Amplification Plot Amplifikationsdarstellung wird die Amplifikation aller Proben in den ausgew hlten Wells angezeigt Verwenden Sie die Amplifikationsdarstellungen um die Ergebnisse der Analyse zu best tigen e ARn ber dem Zyklus AR ist die Intensit t des w hrend des PCR Laufs generierten normalisierten Fluoreszenzsignals daraus wird der C berechnet Diese Darstellung zeigt AR als Funktion der Zyklusanzahl Sie k nnen diese Darstellung dazu verwenden eine unregelm ige Amplifikation zu erkennen und zu berpr fen und s ch die Werte f r Schwellenwert und Grundlinie anzusehen e Rn ber dem Zyklus R ist die normalisierte Fluoreszenz des Reporter Farbstoffs Diese Darstellung zeigt R als Funktion der Zyklusanzahl S e k nnen diese Darstellung dazu verwenden eine unregelm ige Amplifikation zu erkennen und zu berpr fen e C ber den Wells Der Schwellenwert Zyklus C ist der PCR Zyklus bei dem das Fluoreszenzniveau den Schwellenwert berschreitet Diese Darstellung zeigt C als Funktion der Well Position Sie k nnen diese Darstellung dazu verwenden eine extreme Amplifikation Ausrei er zu lokalisieren Jede Darstellung kann in Form eines der folgenden Graphentypen betrachtet werden linear oder log10 Hinweis Weitere Informationen zu Amplifikationsdarstellungen finden Sie im Real Time PCR Systems Chemistry Guide oder i
110. ied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Relative Standardkurven Methode 127 Replikate 127 Replikat Gruppe 128 Reporter 128 Reporter Derivat Rn 128 Reverse Primer 128 Reverse Transkriptase 128 Richtlinien chemische Sicherheit xiv Rn siehe unter Normalisierter Reporter 128 rs Nummer siehe unter refSNP ID S Schmelzkurve 128 Schmelzkurvenphase 128 Schmelztemperatur Tm 128 Schritt 128 Schulung Informationen ber ix Schwellenwert 128 Schwellenwert anpassen 95 Schwellenwert Zyklus C 128 Serienfaktor 128 Sicherer Umgang mit Chemikalienabfallen xvi xvii Sicherheit Arbeitsplatz xix Bewegen Anheben xiii biologische Gefahren xix Chemikalienabfalle xvi chemische xiv elektrische xviii Gerat bewegen und anheben xiii Ger tebetrieb xiv Hinweise xvii Konventionen x Normen xx Richtlinien xiv xvii vor Betrieb des Ger ts xili Vorschriften xvi Sicherheit am Arbeitsplatz xix Sicherheitsdatenbl tter MSDSs Beschreibung xv Sicherheitsdatenbl tter abrufen 1x Sicherheitsdatenbl tter erhalten xv Sicherheitshinweise auf Ger ten xii Sicherheitsnormen xx Sicherheitssymbole auf Ger ten x1 SNP 129 SNP Assay 4 129 Sonden Mix 129 Standard 129 Standard siehe auch unter Standardkurve und Standardverd nnungsreihe Stichwortverzeichnis Standardkurve 129 Standardkurve siehe auch unter Regressionsgerade und Standardverd nnungs
111. in Kapitel 4 Analysedurchf hrung auf Seite 45 dargestellt ablaufen 8 Werten Sie die Analyse aus wie in Kapitel 5 Analyseauswertung auf Seite 71 beschrieben aus 9 Wiederholen Sie die Schritte 3 bis 8 nach Bedarf um weitere Analysen aus der exportierten Datei zu erstellen Hinweise Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 115 A Anhang A Alternative Analyseabl ufe Arbeitsablauf f r den Export Import Hinweise 116 Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Bibliografie Afonina I Zivarts M Kutyavin I etal 1997 Efficient priming of PCR with short oligonucleotides conjugated to a minor groove binder Nucleic Acids Res 25 2657 2660 Kutyavin I V Lukhtanov E A Gamper H B and Meyer R B 1997 Oligonucleotides with conjugated dihydropyrroloindole tripeptides base composition and backbone effects on hybridization Nucleic Acids Res 25 3718 3723 Kwok S and Higuchi R 1989 Avoiding false positives with PCR Nature 339 237 238 Lakowicz J R 1983 Energy Transfer In Principles of Fluorescence Spectroscopy New York Plenum Press 303 339 Lee L G Connell C R and Block W 1993 Allelic discrimination by nick translation PCR with fluorogenic probes Nucleic Acids Res 21 3761 3766 Livak K J Marmaro J and Todd J A 1995 Towards fully
112. iner 10fachen Konzentration vorliegt Wenn das Reaktionsvolumen zum Beispiel 20 ul betr gt bel uft sich das berechnete Probenvolumen f r 1 Reaktion auf 2 ul Ein Standard in einer Standardkurve Die Standardmenge f r jeden Punkt in der Standardkurve wird auf der Grundlage der Ausgangsmenge und des Serienfaktors berechnet Die in Quantifizierungsanalysen verwendete Methode zur Bestimmung der Zielsequenzmenge in den Proben F r Quantifizierungsanalysen sind drei verschiedene Quantifizierungsmethoden verf gbar Standardkurve vergleichender Cy AAC und relative Standardkurve Molek l das an das 3 Ende der TaqMan Sonden gebunden ist um zu verhindern dass der Reporter ein Fluoreszenzsignal abgibt solange die Sonde intakt ist Bei TaqMan Reagenzien kann der nicht fluoreszierende Quencher Minor Groove Binder NFQ MGB als Quencher verwendet werden Bei SYBR Green Reagenzien wird kein Quencher eingesetzt WICHTIG Applied Biosystems empfiehlt nicht die Verwendung von TAMRA Farbstoff als Reporter oder Quencher mit dem StepOne System Funktion in der StepOne Software die es Ihnen erlaubt die Analyse ohne die Eingabe von Platteneinrichtungsinformationen vorzunehmen Regressionskoeffizient berechnet aus der Regressionsgeraden in der Standardkurve Der R Wert gibt den Grad der bereinstimmung zwischen der Regressionsgeraden der Standardkurve und den individuellen C Datenpunkten der Standardreaktionen an Ein Wert von 1 0
113. instellungen ben tigen bearbeiten S e das Standardlaufprofil nach Bedarf e Klicken Sie zur Anzeige einer Bibliothek von Laufprofilen auf Open Run Method Laufprofil ffnen M glicherweise enth lt die Bibliothek einen f r Ihre Analyse geeignetes Laufprofil e berlegen Sie sich ob Sie eventuell die Amplifikation in das Laufprofil einbeziehen m chten Echtzeitdaten k nnen zur Behebung bei fehlerhaften Genotypisierungsanalysen hilfreich sein Weitere Informationen zum Laufprofilbildschirm finden Sie in der StepOne Software Help indem Sie auf klicken oder Help gt StepOne Help Hilfe StepOne Hilfe w hlen 26 Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 2 Experimentelles Design Dl Uberpr fen des Pipettierorotokolls berpr fen des Pipettierprotokolls Im Einrichtungsbildschirm Set Up Reaction k nnen Sie das Reaktionsvolumen sowie das bersch ssige Reaktionsvolumen eingeben und anschlie end die Konzentrations einstellungen f r den PCR Mastermix den Assay Mix die verd nnte Proben Zielsequenz und die Proben Stamml sungen berpr fen und die notwendigen nderungen vornehmen Informationen zur Die Beispielanalyse erfordert Reaktionsmix f r 24 Reaktionen und 10 zur Beispielanalyse Pipettierfehlerkompensation Jede 25 ul Reaktion besteht aus Komponente ul Well 2X TaqMan Universal PCR Master Mix No AmpErase UNG 12 50 2
114. iosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 47 Kapitel 4 Analysedurchfuhrung Vorbereiten des Laufs 4 Einlegen der ll VERLETZUNGSGEFAHR Beim Betrieb des Ger ts kann die Reaktionsplatte Temperatur des Heizblocks auf ber 100 C ansteigen Wenn das Ger t vor kurzem in Betrieb war fassen Sie es erst wieder an wenn der Heizblock auf Zimmertemperatur abgek hlt ist WICHTIG Tragen Sie beim Arbeiten mit der Reaktionsplatte pulverfreie Handschuhe 1 ffnen Sie das Schubfach des Ger ts ie manne eg 2 Stellen Sie die Reaktionen in den Heizblock Die Ausrichtung der Reaktionsplatte hangt von der Art des verwendeten Verbrauchsmaterials ab e Wenn Sie eine Reaktionsplatte verwenden ist diese mit dem Al Well hinten links in den Heizblock einzulegen e Wenn Sie ReaktionsgefaBstreifen verwenden stellen Sie die Streifen in den Heizblock A1 3 Schlie en Sie das Schubfach des Ger ts vorsichtig A geme f iniii tiirat 4 Hinweise 48 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 4 Analysedurchfuhrung Aktivieren der Benachrichtigungen optional Weitere Weitere Informationen zum Einlegen der Reaktionsplatte finden Sie in der StepOne Informationen Software Help indem Sie auf klicken oder Help gt StepOne Help Hilfe gt Ste
115. isierungsanalysen 57 A Kapitel 4 Analysedurchf hrung berwachen des Laufs Hinweise Informationen zur Amplifikationsdarstellung Im Amplifikationsdarstellungsbildschirm k nnen S e w hrend eines Laufs ber vom StepOne System erfassten Fluoreszenzdaten die Amplifikationen Ihrer Proben verfolgen Wenn eine Methode f r die Anzeige von Daten in Echtzeit ausgew hlt wurde zeigt die Amplifikationsdarstellung die Daten der unter dem Reiter View Plate Layout Plattenbelegung anzeigen ausgew hlten Wells an Die Darstellung stellt die normalisierte Farbstofffluoreszenz AR der Zyklusnummer gegen ber Das unten abgebildete Schaubild zeigt die Amplifikationsdarstellung wie sie in der Beispielanalyse erscheint TODO GTRunGenericPlotPanel lt View Plate Layout Select Wells with Select Item Y Phfpawee i Amplification Plot O ShowinWells F ViewLegend ample 1 Sample 10 Sample 11 Sample 12 Sample 13 Sample 14 Ss AI Den MM Sample 15 Sample 16 Sample 17 Sample 18 Sample 19 Sample2 Sample 20 Sample3 m c_11 M c1 W c11 CH M c1 J c J c J c_11 Sample4 SampleS Sample Sample7 Samples Sample 9 c c11 0 c11 0 c11 J c11 E c1 J c_11 Bac E cn 0 42 aa Cycle Anhand der Amplifikationsdarstellung konnen ungewohnliche Amplifikationen identifiziert und untersucht werden Ungewohnliche Amplifikationen sind e erh hte Fluoreszenz in Negativkontroll Wells e keine erh hte Fluoreszenz
116. isse aus den Standards benutzen siehe auch unter Standardkurve Siehe unter Standardverd nnungsreihe Quantifizierungsmethode f r Quantifizierungsanalysen Bei der relativen Standardkurven Methode werden Ergebnisse von Standards einer Referenzprobe und einer endogenen Kontrolle zur Bestimmung der relativen Menge einer Zielsequenz n einer Probe verwendet Gesamtzahl identischer Reaktionen mit identischen Komponenten und identischen Volumina Ein Satz identischer Reaktionen in einer Analyse Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 127 Glossar Reporter Reporter Derivat Ry Reverse Primer Reverse Transkriptase R n rs Nummer Schmelzkurve Schmelzkurvenphase Schmelztemperatur Tm Schritt Schwellenwert Schwellenwert Zyklus Cy Serienfaktor Setup fur Fortgeschrittene Fluoreszierender Farbstoff der zur Detektion der Amplifikation verwendet wird Wenn Sie TaqMan Reagenzien verwenden ist der Reporterfarbstoff an das 5 Ende gebunden Wenn Sie SYBR Green Reagenzien verwenden ist der Reporterfarbstoff SYBR Green Farbstoff Angezeigt in der y Achse der Schmelzkurve Das Reporterderivat Signal ist das negative erste Derivat der normalisierten Fluoreszenz des Reporters Oligonukleotid das an das 3 Ende der Zielsequenz bindet Der Reverse Primer und der Forward Primer werden zusammen in PCR Reaktionen eingesetzt um die Zi
117. ist Folgendes zu beachten hinweise e Verwenden Sie DNAse freies Wasser zur Probenverd nnung e Nehmen Sie f r jede Analyse dieselbe Menge DNA pro Well e Erhitzen Sie die DNA Proben nicht Weitere Weitere Informationen ber das Vorbereiten von TaqMan SNP Genotypisierungs Informationen Assays finden Sie in den jeweiligen Protokollen der Reagenzien die Sie bei den PCR Reaktionen verwenden siehe Weitere Informationen auf Seite 36 Hinweise Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 37 NQ Kapitel 3 Ansetzen der Reaktionen Ansetzen des Reaktionsmix Ansetzen des Reaktionsmix Benotigte Materialien Reaktionsmix Hinweise ansetzen Setzen Sie den Reaktionsmix f r die Analyse anhand der Volumina an die von der StepOne Software errechnet werden Die StepOne Software bestimmt die zu verwendenden Reaktionsmixkomponenten anhand der in Bildschirm Methods and Materials gemachten Angaben siehe berpr fen des Pipettierprotokolls auf Seite 27 F r Genotypisierungsanalysen enth lt der Reaktionsmix alle Komponenten au er der Probe des Puffers und der Positivkontrolle e TaqMan Universal PCR Master Mix No AmpErase UNG 2X e TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assay 20X e DNAse freies Wasser e Mikrozentrifugen R hrchen e Pipetten e Pipettenspitzen e Zentrifuge A N VASH CHEMISCHE GEFAHREN TaqMan 2X Universal PCR Master
118. itel 4 4 Analyse auswerten Kapitel 5 v Analyse beenden Hinweis Dieser Arbeitsablauf stellt nur einen von verschiedenen Arbeitsabl ufen dar die von der StepOne Software f r die Einrichtung von Genotypisierungsanalysen verwendet werden Weitere Informationen finden Sie unter Anwendung des Handbuchs f r Ihre eigene Analysen auf Seite 9 Hinweise 14 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 2 Experimentelles Design Anlegen einer neuen Analyse Starten Sie die StepOne Software und ffnen Sie anschlie end zur Erstellung einer neuen Genotypisierungsanalyse den Analysedesign Assistenten Analyse anlegen 1 Doppelklicken Sie auf T oder w hlen Sie Start gt All Programs Alle Programme gt Applied Biosystems gt StepOne gt StepOne v1 0 um die StepOne Software zu starten 2 Klicken Sie im Bildschirm Home Startseite auf Design Wizard Analysedesign Assistent um den Analysedesign Assistenten aufzurufen Hinweis Zum Anlegen einer neuen Analyse mithilfe des Setups f r Fortgeschrittene einer Analysevorlage oder dem QuickStart Verfahren siehe auf amp stepOne v1 0 File Edit Instrument Analysis Tools Help New Experiment EF Open U a Close amp Send Experiment to Instrument Eg Download Experiment from Instrument 4 E t B Frin Repor en Run Analyze Design Wizard QuickStart S
119. iter row e oowe een e e e 6 SNP Assay Allele 1 Name Allele 1 Reporter Allele 1 Quenc Allele 2 Name I Allele 2 Reporter Allele 2 Quenc Color Comments Created On Last Modified NFQ MGB Nov 27 2006 Nov 27 2006 Use Selected 1 Assay s Exit SNP Assay Library Einrichtungs Beachten Sie beim Definieren Ihres eigenen Analysedesigns Folgendes hinweise e Applied Biosystems empfiehlt nicht mehr als sechs SNPs auf einer Reaktionsplatte auszuwerten Hinweis Der Analysedesign Assisten l sst nicht mehr als zwei SNPs pro Platte zu Bei den Arbeitsablaufen Advanced Setup oder Quickstart ist die Anzahl der auszuwertenden SNPs nicht eingeschrankt e Kennzeichnen Sie jeden SNP Assay mit einem eindeutigen Namen und einer Farbe e Falls Sie den SNP Assay nicht manuell einrichten vergewissern Sie sich dass die zum jeweiligen Allel zugewiesenen Reporter Farbstoffe richtig sind WICHTIG Applied Biosystems empfiehlt nicht die Verwendung von TAMRA Farbstoff als Reporter oder Quencher mit dem StepOne System Hinweise 22 Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 2 Experimentelles Design 9 Definieren der Proben und Replikate Weitere Weitere Informationen zum Bildschirm SNP Assays finden Sie in der StepOne Software Help indem Sie auf klicken oder Help gt StepOne Help Hilfe gt StepOne
120. iven Standardkurven Analysen 1 Die Kurve bester bereinstimmung in einer Darstellung der C Werte aus den Standardreaktionen die gegen die Standardmengen aufgetragen werden siehe auch unter Regressionsgerade 2 Ein Satz von Standards der eine Reihe bekannter Mengen enth lt Daten der Standardkurven Reaktionen werden zur Generierung der Standardkurve verwendet Die Standardkurve ist durch die Anzahl der Punkte in der Reihe die Anzahl der Standardreplikate die Ausgangsmenge und den Verd nnungsfaktor definiert siehe auch unter Standardverd nnungsreihe Quantifizierungsmethode f r Quantifizierungsanalysen Bei der Standardkurven Methode werden Ergebnisse von Standards zur Bestimmung der absoluten Menge einer Zielsequenz in einer Probe verwendet Eine bekannte Menge in der PCR Reaktion Bei Standardkurven Analysen die bekannte Menge der Zielsequenz Die Ma einheiten f r Standardmengen k nnen die Masse Kopienzahl Virusbelastung oder sonstige Gr en f r die Messung der Zielsequenzmenge betreffen Bei relativen Standardkurven Analysen eine bekannte Menge im Standard Die Standardmenge kann sich zum Beispiel auf die Menge der cDNA oder die Menge der Stamml sung beziehen Die Einheiten sind f r relative Standardkurven Analysen nicht relevant da sie aus den Berechnungen herausfallen In Standardkurven und relativen Standardkurven Analysen ein Satz von Standards der eine Reihe bekannter Mengen enth lt Die Standardverd
121. ken oder Help gt StepOne Help Hilfe StepOne Hilfe w hlen Ansicht der Well Tabelle Pr fen Sie die Einzelheiten der Analyseergebnisse in der Well Tabelle und identifizieren S e markierte Wells Die Well Tabelle zeigt die Assay spezifischen Einrichtungs und Auswertungseigenschaften f r die Analyse im Tabellenformat an Informationen zu Best tigen Sie f r die Beispielanalyse dass keine Wells der Reaktionsplatte QC den Beispiel Markierungen ausgel st haben daten Tabelle pr fen 1 W hlen Sie den Reiter View Well Table Well Tabelle ansehen 2 Klicken Sie auf die Spalte Flag Markierung um die Daten so zu sortieren dass ausgel ste Markierungen in der Tabelle oben angezeigt werden 3 Best tigen Sie die Integrit t der Kontrollen a Wahlen Sie aus dem Men Group By Gruppieren nach Task Aufgabe um die Tabellenzeilen nach hrer Funktion auf der Reaktionsplatte zu organisieren b Best tigen Sie dass keine der Kontrollen Markierungen 4 aufweisen c Klicken Sie auf die Symbole um die Negativ und Positivkontrollen anzuzeigen bzw auszublenden Hinweise 80 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 4 Kapitel 5 Analyseauswertung n Ansicht der Well Tabelle 4 Klicken Sie auf gt neben dem Reiter View Well Table Well Tabelle ansehen um die Alleldiskriminierungs Darstellung und die Well Tabelle gleichzeitig anzeigen zu lasse
122. ks and FAM StepOne and TAMRA are trademarks of Applied Biosystems or its subsidiaries in the U S and or certain other countries AmpErase AmpliTaq Gold and TaqMan are registered trademarks of Roche Molecular Systems Inc SYBR is a registered trademark of Molecular Probes Inc Excel Microsoft and Windows are registered trademarks of Microsoft Corporation All other trademarks are the sole property of their respective owners Bestell Nr 4377728 Version B 06 2010 Inhalt VOrWOH ve eee des Bene eter ne tes eee ee ese eee V Verwendung dieses Handbuchs ananena ena V Zugriff auf Informationen 0 0 nennen nennen een nn vii Technischer Support eerie rerirsiitini tiae ee ee eee Ix In diesem Dokument verwendete Sicherheitskonventionen 22222222220 x Symbole an den Ger ten 2 22 cc nennen ernennen xi Sicherheitshinweise auf Ger ten 0 0 0 ee eas xii Allgemeine Ger tesicherheit 0 0 0 0 aaa xiii Chemische Sicherheit 0 0 0 ee eee ees XIV Sicherer Umgang mit Chemikalienabf llen 00000 XVI Elektrische Sicherheit 22222 ce ee ee eee eens xviii EEFDSICHErNell zaubert bene ee Ap ods xviii Sicherer Umgang mit biologischen Gefahren 000 cece eee eee ee XIX Sicherheit am Arbeitsplatz 00 ee eens xix Normen zu Sicherheit und elektromagnetischer Vertraglichkeit EMV XX Kapitel 1 EISIE SCHHlle su una Baus Bene eaeweneeue 1 Informationen
123. late Layout View Results Table gt Select Wells With Select Item Select Item a 11 2 Allele 1 Allele 2 Assign SNP Assay Reporter 3 7 10b Oo 3 4 5 e 7 8 Sample2 Sample3 Sample4 Sample 5 Sample 6 1 Oc Bes og rs80 og rs80 og rs80 m rs80 m rs80 12 Sample Sample8 Sample9 Sample 10 Sample 11 Sample 12 Sample 13 Sample 14 u 1 3b D rs80 D rs80 D rs80 m rs80 D rs80 m rs80 m rs80 D rs80 Assign Sample to the Selected Wells Sample 15 Sample 16 Sample 17 Sample 18 Sample 19 Sample 20 E o PES 13a Add New Sample Add Saved Sample Save Sample Delete Sample FS Fj sso i sso i sso Bj rseo I rseo rseo Assign Sample Color 13c Select the dye to use as the passive reference Wells I 24 Unknown 5 0 Negative Control J 0 Positive Control 24 Empty 14 Wenn das StepOne System den Lauf abgeschlossen hat werten Sie die Analyse wie unter Kapitel 5 Analyseauswertung auf Seite 71 beschrieben aus Hinweise Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 111 N Anhang A Alternative Analyseabl ufe Verwenden von Vorlagen Verwenden von Vorlagen Wenn Sie ein Template f r eine Analyse erstellen k nnen Sie nachfolgende Anal
124. le und dies f hrt zu gr erer Pr zision in der Quantifizierung Der Minor Groove Binder MGB erh ht die Schmelztemperatur Tm ohne Zunahme der Sondenl nge Er erlaubt auch die Realisierung k rzerer Sonden Siehe unter Negativkontrolle mit blockierter IPC Siehe Negativkontrolle NC Menge einer Zielsequenz dividiert durch die Menge der endogenen Kontrolle Fluoreszenzsignal des Reporterfarbstoffs normalisiert auf das Fluoreszenzsignal der passiven Referenz 124 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Passive Referenz Phase Plattenbelegung Positivkontrolle Post PCR Messung Pra PCR Messung Primer Sonden Mix Primer Mix Probe Probe oder Standard 10X Probe SNP Assay Reaktion Glossar Farbstoff der ein Fluoreszenzsignal erzeugt Da das Signal der passiven Referenz in allen Wells konsistent sein sollte wird es verwendet um das Reporterfarbstoff Signal zu normalisieren und Fluoreszenzschwankungen die durch geringe Konzentrations oder Volumenunterschiede zwischen den Wells entstanden sind Das Normalisieren auf das Signal der passiven Referenz erm glicht eine hohe Datengenauigkeit Komponente des Thermoprofils Eine Phase besteht aus einem oder mehreren Schritten Abbildung der 6 x 8 Gitterstruktur der Vertiefungen Wells und des ihnen zugewiesenen Inhalts in der Reaktionsplatte In der Software k nnen Sie die Plattenbelegung als Auswahli
125. le Komponenten f r eine PCR Reaktion enth lt mit Ausnahme des Templates Probe Standard oder Kontrolle Prozess zur Erfassung von Fluoreszenzdaten w hrend der PCR Amplifikation Real time PCR Daten werden zur Berechnung von Ergebnissen f r Quantifizierungsanalysen oder zur Fehlerbehebung bei Genotypisierungs oder Positiv Negativ Analysen verwendet In relativen Standardkurven und vergleichenden Cy AAC Analysen die Probe die als Ausgangsbasis f r relative Quantifizierungen verwendet wird Wird auch als Kalibrator bezeichnet Zahl die die Referenz SNP refSNP Cluster ID Nummer bezeichnet Wird durch die Single Nucleotide Polymorphism Database dbSNP of Nucleotide Sequence Variation SNP Datenbank der Variationen in Nukleotidsequenzen generiert Sie dient unter anderem dazu in den Lagerbestanden von Applied Biosystems nach einem SNP Genotypisierungs Assay von Applied Biosystems zu suchen Wird auch als rs Nummer bezeichnet In Standardkurven und relativen Standardkurven Analysen die Gerade bester Ubereinstimmung aus der Standardkurve Formel f r die Regressionsgerade Cr m log Qty b wobei m die Steigung b der y Achsenabschnitt und Qty die Standardmenge ist Siehe auch unter Regressionskoeffizienten Aus der Regressionsgeraden in Standardkurven berechnete Werte dazu geh rt der R Wert die Steigung und der y Achsenabschnitt Sie k nnen die Werte der Regressionskoeffizienten zur Bewertung der Qualit t der Ergebn
126. leldiskriminierungs Darstellung aus Weitere Weitere Informationen zur Alleldiskriminierungs Darstellung finden Sie in der Informationen StepOne Software Help indem Sie auf klicken oder Help gt StepOne Help Hilfe gt StepOne Hilfe w hlen Hinweise Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 71 es Kapitel 5 Analyseauswertung Ansicht der Plattenbelegung Ansicht der Plattenbelegung Informationen zu den Beispiel daten Belegung ansehen Hinweise Prufen Sie die Analyseergebnisse in der Plattenbelegung Die Plattenbelegung zeigt die Assay spezifische Einrichtung und Auswertungseigenschaften f r die Analyse in einem Well Format an das dem f r den Lauf verwendeten Reaktionsplattentyp entspricht berzeugen Sie sich dass die StepOne Software f r die Bespielanalyse folgende Bestimmungen vorgenommen hat e 6 Proben als Allel 1 homozygot e 4 Proben als Allel 2 homozygot e 12 Proben als heterozygot e 2 Proben als Negativkontrollen MI Best tigen Sie dass keine Wells der Reaktionsplatte QC Markierungen ausgel st haben 1 Klicken Sie auf das Symbol lt neben der Alleldiskriminierungsdarstellung um die Plattenbelegung als Vollbild anzeigen zu lassen 2 Klicken Sie auf Show in Wells In Wells anzeigen und aktivieren bzw deaktivieren Sie anschlie end einen Parameter den die Wells anzeigen sollen 3 Wiederholen Sie Sc
127. lele in der Sonde vorkommen Hinweise Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 5 4 Kapitel 1 Erste Schritte Informationen zu Genotypisierungsanalysen Forward primer 5 3 Unspezifische Fluoreszenz minimieren Platten lesen und auswerten Hinweise DNA template G A TT Forward primer N GW 3 Polymerisation und Signalerzeugung Forward primer 1 Assay Komponenten und DNA Template 1 1 0 1 3 Sonde Sonde Reverse primer G A C T LEGENDE LT gt VIC Farbstoff Sonde Sonde Reverse primer TT TTT FAM Farbstoff Quencher o Minor Groove Binder AmpliTaq Gold DNA Polymerase Reverse primer Sonde Sonde ir A lt gt Primer Template AARON 7 f C Erweiterter Primer Ubereinstimmung Bei TaqMan Assays wird die Fluoreszenz von unspezifisch gebundenen Sonden verringert weil Nukleotidfehlpaarungen zwischen einer Sonde und einer Sequenz die Wahrscheinlichkeit verringern dass die Sonde gespalten wird Die k rzeren Sondenl ngen haben zur Folge dass eine Nicht bereinstimmung eines Basenpaares gr ere negative Auswirkungen auf die Bindung hat Die nicht bereinstimmende Sonde bindet nicht fest an das Allel so dass die AmpliTaq Gold DNA Polymerase die nicht passende Sonde abdr ngt ohne den Reporter Farbstoff abzuspalten
128. ler durchf hren m chten deaktivieren Sie die Option Amplification Amplifikation Hinweis Die Pra PCR Messung ist nicht obligatorisch wird jedoch empfohlen Die StepOne Software verwendet die Pr PCR Messung zur Normalisierung der Post PCR Daten Weitere Informationen zum Vervollstandigen des Bildschirms Methoden und Materialien finden Sie in der StepOne Software Help indem Sie auf klicken oder Help gt StepOne Help Hilfe StepOne Hilfe w hlen Definieren der SNP Assays Informationen zur Beispielanalyse Bildschirm SNP Assays vervollst ndigen Hinweise Geben Sie im Bildschirm Set Up SNP Assays Definieren der SNP Assays die Anzahl der f r die Analyse verwendeten SNP Assays ein und legen Sie anschlie end die Eigenschaften fur die jeweiligen SNP Assays fest In der Beispielanalyse werden Proben f r SNP rs8039 ausgewertet Da es sich hierbei um einen TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assay Assay ID C__11711420_30 handelt konnen die Daten zum SNP Assay aus der im Lieferumfang enthaltenen bzw von der Website von Applied Biosystems heruntergeladenen Assay Informationsdatei AIF importiert werden 1 Geben Sie f r die Anzahl der zu untersuchenden SNP Assays eine 1 ein 2 Klicken Sie auf Yes Select SNP Assay from SNP Assay Manager Ja SNP Assay aus SNP Assay Manager wahlen 3 Klicken Sie auf Select SNP Assay s from Library SNP Assays aus Bibliothek w hlen 4 Klicken Sie auf Import AIF AI
129. ls ausw hlen 79 Negativkontrolle 78 Plattenbelegung 78 Positivkontrolle 78 unbekannt 78 Well Tabelle 80 Wells ausnehmen 81 83 Well Tabelle 80 WICHTIG Beschreibung x Y y Achsenabschnitt 131 Z Zielsequenz 131 Zielsequenzbibliothek 131 Zielsequenzfarbe 131 Zyklusphase 131 Zyklus Schwellenwert siehe unter Schwellenwert Zyklus 138 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen www appliedbiosystems com Worldwide Sales and Support Applied Biosystems vast distribution and service network composed of highly trained support and applications personnel reaches 150 countries on six continents For sales office locations and technical support please call our local office or refer to our Web site at www appliedbiosystems com Applied Biosystems is committed to providing the world s leading technology and information for life scientists Headquarters 850 Lincoln Centre Drive Foster City CA 94404 USA Phone 1 650 638 5800 Toll Free In North America 1 800 345 5224 Fax 1 650 638 5884 06 2010 Applied Biosystems Bestell Nr 4377728 Version B
130. lyseparameter Setup f r Richten Sie eine neue und auf Ihrem eigenen Design Seite 102 Fortgeschrittene basierende Analyse ein Diese Funktion bietet erfahrenen Anwendern Flexibilit t beim Design QuickStart F hren Sie eine neue Analyse ohne Informationen ber die Seite 107 Platteneinrichtung durch Template Richten Sie eine neue Analyse mithilfe der Seite 112 Einrichtungsinformationen einer Vorlage Templates ein Export Import Importieren Sie Analysedesigns aus ASCll Textdateien die Seite 113 Informationen ber die Analyseeinrichtung enthalten Informationen zur Beispielanalyse Zur Veranschaulichung wie Genotypisierunganalysen durchgef hrt werden f hrt Sie dieses Handbuch durch die einzelnen Verfahren zur Erstellung Vorbereitung und Auswertung anhand einer Beispielanalyse Die Beispielanalyse stellt eine typische Analyse dar mit deren Hilfe Sie sich schnell mit dem StepOne System vertraut machen k nnen Beschreibung Das Ziel der Genotypisierungs Beispielanalyse ist SNP rs8039 zu untersuchen M gliche Genotypen sind AA AC und CC In dem Beispiel wurden 20 unbekannte genomische DNA gDNA Proben mithilfe des TagMan Drug Metabolism Genotyping Assay ID C__11711420_30 genotypisiert Die Reaktionen wurden so eingerichtet dass die PCR Primer und Sonden die auf beide Allele des SNP rs8039 abzielen in demselben Well vorhanden waren Die PCR wurde mithilfe des TaqMan Universal PCR Master Mix durch
131. me PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Unterstutzte Assays und Verbrauchs materialien Hinweise Kapitel 1 Erste Schritte ails Informationen zum SteoOne System Das StepOne System unterst tzt Genotypisierungsanalysen die Standardreagenzien und Protokolle verwenden entweder mit MicroAmp Fast Optical 48 Well Reaction Plates MicroAmp Fast 8 Tube Strips oder MicroAmp Fast Reaction Tubes with Caps und MicroAmp Fast 48 Well Trays WICHTIG Verwenden Sie mit dem StepOne System ausschlie lich Fast Verbrauchsmaterialien Reaktionsplatte Reaktionsgef streifen und Reaktions gef e auch wenn S e eine Analyse mit Standardreagenzien durchf hren Obwohl TaqMan SNP Genotyping Assays nicht den Fast Mastermix oder Fast Protokolle verwenden m ssen Sie f r die Durchf hrung Ihrer Genotypisierungsanalysen Fast Verbrauchsmaterialien verwenden Verbrauchsmaterial G A MicroAmp Fast Optical 48 Well Reaction Plates B MicroAmp Fast 48 Well Tray MicroAmp 96 well Splash free Support Base D MicroAmp Optical 8 Cap Strips MicroAmp Fast 8 Tube Strips F MicroAmp Fast Reaction Tubes with Caps G MicroAmp Optical 48 Well Adhesive Film Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 3 4 Kapitel 1 Erste Schritte Informationen zu Genotypisierungsanalysen I
132. mplifikationsdarstellung auf Seite 58 zu weiteren Informationen ber die Darstellung C Temperaturdaten f r W hlen Sie bee Temperature Plot Temperaturgraph gen AUTIN Echtzeit Siehe Informationen zum Temperaturgraphen auf Seite 59 nl zu weiteren Informationen ber die Darstellung D Ablauf in der W hlen Sie a Run Method View Laufprofilanzeige a er Siehe Informationen zur Laufprofilanzeige auf Seite 60 9 zu weiteren Informationen ber die Anzeige E Benachrichtigungs Aktivieren oder deaktivieren Sie Enable Notifications einstellungen Benachrichtigungen aktivieren aktivieren deaktivieren 56 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 4 Analysedurchfuhrung A Uberwachen des Laufs F StepOne v1 0 File Edit Instrument Analysis Tools Help Reagents A Estimated Time Remaining 56 min 22 sec Instrument Status g amp Connected B Run Status 1 1 O Enable Notifications C Edit Run Method D 21 Adjust of Cycles C Add Melt Curve Stage to End Enab a u _ Add Holding Stage to End 100 gi P _ 7 n Analysis Fu 180 1 30 Legend Data Collection On Data Collection Off A AutoAOn A Auto A Off MR Home J Genotyping Example eds x l Local Instrument connected Hinweise Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotyp
133. n In der Abbildung unten ist die Well Tabelle f r die Genotypisierungs Beispielanalyse dargestellt 4 View Plate Layout View Well Table 39 Select Wells With Select Item v Select Item v Bp 2 collapse All 2 l u u Well Omit Frag Sample Na SNP Assay AssayID Task Allele 1 Allele 2 Allele 1 Allele 2 Allele1 Rn Allele2Rn Pa 3c Negative Control 4 1 Al C__11711420 Negative Cont A C VIC NFQ M FAM NFQ 2 07 2 841 2 A2 d C__11711420 Negative Cont A C VIC NFQ M FAM NFQ 2 05 2 791 3c Positive Contrpl Allele 1 Allele 2 3 C7 C__11711420 Positive Contr A Cc VIC NFQ M FAM NFO 3 49 3 808 Sc Positive Contral Allel 2 Allele 2 4 c8 C 11711420 Positive Contr A C VIC NFQ M FAM NFQ 2 222 4 82 Unknown 3b I As LI Sample 1 Ben a Ze Unknown A C VIC NFQ M FAM NFQ 3 818 2 63 Spalte Beschreibung Well Die Position des Wells auf der Reaktionsplatte Omit Ein H kchen zeigt an dass der Well aus der Auswertung ausgenommen wurde Flag Ein 4 signalisiert dass der Well die Anzahl cvn Markierungenn ausgel st hat die innerhalb des Symbols aufgelistet ist Sample Name Der Name der Probe SNP Assay Name Der Name des SNP Assays das im Well beurteilt wird Assay ID Die Assay Identifikationsnummer des SNPs der im Well beurteilt wird Task Die dem Well zugewiese
134. n 25 a Kapitel 2 Experimentelles Design L Definieren des Laufprofils 6 Klicken Sie auf Next gt Weiter 2C Set Up Run Method Graphical View Run Method Help T Instructions Review the reaction volume and the default thermal profile for the stages you selected for the instrument run If needed change your selection edit the run method or select a run method from the library Graphical View Tabular View Reaction Volume Per Well 25 yL Add Stage Add Step Delete Selected Undo Set Cycle Count Rea Collect Data Y f Open Run Method Save Run Method BE Include V Pre PCR Read V Amplification Post PCR e PCR Read Holding Stag Holding Stage Cycling Stage st PCR Read Holding Stag Number of Cycles 50 C Enable Auto A Starting Cycle A 100 1 95 0 C T 75 Anan 100 00 30 50 25 0 Legend Data Collection On Data Collection Off A AutoAOn A Auto A Off 100 Step 1 Step 1 Step 1 Step 2 Step 1 lt gt Einrichtungs hinweise Weitere Informationen Hinweise Beachten Sie beim Einrichten Ihres eigenen Analysedesigns Folgendes e Geben Sie ein Reaktionsvolumen Well von 10 bis 30 ul ein Applied Biosystems empfiehlt f r Genotypisierungsanalysen ein Reaktionsvolumen von 25 ul e Pr fen Sie das Standardlaufprofil Falls Sie f r Ihre Analyse andere E
135. n 2 Erstellen Sie das Analysedesign unter Verwendung des Analysedesign Assistenten in der StepOne Software 3 Bereiten Sie die Analyse vor und verwenden Sie daf r die vom Analysedesign Assistenten in Kapitel 2 berechneten Reagenzien und Volumina 4 F hren Sie die Analyse auf einem StepOne System durch 5 Werten Sie die Ergebnisse aus Weitere Informationen finden Sie unter Informationen zur Beispielanalyse auf Seite 9 Hinweise 8 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 1 Erste Schritte 4 Informationen zur Beispielanalyse Anwendung des Nach Abschluss der Tutorial Ubungen in den Kapiteln 2 bis 5 dient dieses Handbuch als Handbuchs f r Anleitung f r den Arbeitsablauf mit dem Analysedesign Assistenten f r Ihre eigenen Ihre eigene Genotypisierungsanalysen Alle Verfahren in den Kapiteln 2 bis 5 enthalten eine Reihe Analysen an Hinweisen mit Informationen ber die Ausf hrung der verschiedenen Aktionen f r Ihre eigenen Analysen Au erdem k nnen Sie einen der anderen von der StepOne Software angebotenen Arbeitsabl ufe zur Ausf hrung Ihrer eigenen Analysen verwenden Die unten stehende Tabelle bietet einen berblick ber alle von der StepOne Software angebotenen Arbeitsabl ufe Arbeitsablauf Beschreibung Siehe Analysedesign A Der Assistent f hrt Sie durch bew hrte Schritte zur Eingabe Kapitel 2 ssistent Ihrer eigenen Ana
136. n Ein mit diesem Symbol D eines Hauptnetzdruckschalters hin par gekennzeichneter Anschluss kann Wechselstrom oder spannung und Gleichstrom oder spannung erhalten oder abgeben Sicherheits Die Applied Biosystems Ger te k nnen mit den folgenden Sicherheitssymbolen versehen symbole sein Die Symbole werden entweder allein angezeigt oder mit einem Text der die jeweilige Gefahr beschreibt siehe Sicherheitshinweise auf Ger ten auf Seite x11 Diese Sicherheitssymbole k nnen auch in Kombination mit den Hinweisen GEFAHR WARNUNG und VORSICHT erscheinen die in diesem und anderen Dokument en verwendet werden Symbol Beschreibung Symbol Beschreibung Weist auf das Vorhandensein beweglicher Teile hin und warnt den Anwender vorsichtig vorzugehen Dieses Symbol fordert zwecks n herer Informationen zum Konsultieren des Handbuchs auf und warnt den Anwender gt vorsichtig vorzugehen Weist auf Stromschlaggefahr hin und warnt den Anwender vorsichtig vorzugehen Weist auf hei e Oberfl chen oder AN andere Gefahren im Zusammenhang mit hohen Temperaturen hin und warnt den Anwender vorsichtig vorzugehen Dieses Symbol weist auf einen Laser im Ger teinnern hin und warnt den Anwender vorsichtig vorzugehen gt gt p Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen xi Vorwort Sicherheitshinweise auf Geraten
137. n der StepOne Software Help Pr fen Sie in der Beispielanalyse die Amplifikationsdarstellung auf Folgendes e korrekte Werte f r Grundlinie und Schwellenwert e Ausrei er 1 W hlen Sie in der Navigationsleiste _ Amplification Plot aus 2 In der Amplifikationsdarstellung a Wahlen Sie aus dem Dropdown Menu Plot Type Darstellungstyp ARn vs Cycle Rn ber dem Zyklus b W hlen Sie aus dem Dropdown Men Color Plot By Darstellungsfarbe entsprechend Well c Klicken Sie auf Show Hide the plot legend Darstellungslegende anzeigen ausblenden 90 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 5 Analyseauswertung ee Ansicht der Amplifikationsdarstellung 3 Sehen Sie sich die Grundlinienwerte an a W hlen Sie aus dem Dropdown Men Graph Type Graphentyp Linear b W hlen Sie Baseline Grundlinie um den Start und Endzyklus anzuzeigen c Pr fen Sie dass die Grundlinie korrekt eingestellt ist 4 Sehen S e sich die Schwellenwerte an a W hlen Sie aus dem Dropdown Men Graph Type Graphentyp Log b W hlen Sie aus dem Dropdown Men Target Zielsequenz C__11711420_30 A c W hlen S e Threshold Schwellenwert um den Schwellenwert anzuzeigen d Pr fen Sie dass der Schwellenwert korrekt eingestellt st In der Beispielanalyse liegt der Schwellenwert in der exponentiellen Phase 5 Stellen Sie eventuelle Ausrei er fest a
138. n von Pipettierfehlern zu reduzieren e PCR Inhibitoren PCR Inhibitoren in der Reaktion k nnen die Amplifikationseffizienz herabsetzen Ein mittels PCR amplifiziertes DNA Segment Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 119 Glossar Analyse Analysedesign Assistent Analysename Analysetyp Assay Assay ID Assay Informationsdatei AIF Assay Mix Bezieht sich auf den gesamten Prozess der Durchf hrung eines Laufs mithilfe des StepOne Systems einschlie lich Einrichtung Lauf und Auswertung Analysetypen die Sie mit dem StepOne System durchf hren k nnen sind e Quantifizierung Standardkurve e Quantifizierung relative Standardkurve e Quantifizierung vergleichender C AAC e Schmelzkurve e Genotypisierung e Positiv Negativ Funktion in der StepOne Software die Ihnen bei der Einrichtung der Analyse entsprechend Ihrem Analysedesign hilft indem Sie durch bew hrte Schritte gef hrt werden Dieser Name wird w hrend der Analyseeinrichtung eingegeben und dient der Identifizierung der Analyse Analysenamen d rfen nicht l nger als 100 Zeichen sein und keine der folgenden Zeichen enthalten Schr gstrich umgekehrter Schr gstrich Gr er als Zeichen gt Kleiner als Zeichen lt Stern Fragezeichen Anf hrungszeichen vertikale Linie Doppelpunkt oder Semikolon Analysetyp den Sie mit dem
139. n werden auch Sicherheitswarnbegriffe verwendet Weitere Informationen finden Sie unter Sicherheitswarnbegriffe auf Seite x Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Vorwort Zugriff auf Informationen Zugriff auf Informationen Dazugeh rige Dokumentation Im Lieferumfang des StepOne Systems ist die folgende Dokumentation enthalten Englisch Deutsche Dokument eBN BN Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Getting 4376786 4377729 Started Guide for Genotyping Experiments Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Getting 4376787 Started Guide for Presence Absence Experiments Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Getting 4377742 Started Guide for Relative Standard Curve and Comparative C 4376785 Experiments Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Getting 4376784 4377736 Started Guide for Standard Curve Experiments Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Installation 4376782 4377798 Networking and Maintenance Guide Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Installation 4376783 4377792 Quick Reference Card Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Site 4376768 4378359 Preparation Guide Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Software Help Die folgende Dokumentation kann von Applied Biosystems k uflich erworben werden
140. n zum Vervollst ndigen des Bildschirms Materials List finden Sie Informationen in der StepOne Software Help indem Sie auf klicken oder Help gt StepOne Help Hilfe gt StepOne Hilfe w hlen Hinweise Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 31 einen Kapitel 2 Experimentelles Design Beenden des Analysedesign Assistenten Beenden des Analysedesign Assistenten W hlen S e im Dialogfeld Review Plate Layout for Experiment Pr fen der Plattenbelegung f r die Analyse eine Option zum Beenden des Analysedesign Assistenten zur Pr fung der Plattenbelegung und zum Starten des Laufs Analysedesign 1 Pr fen Sie die Plattenbelegung Sollte die Plattenbelegung fehlerhaft sein klicken Assistenten Sie auf Return to the Wizard Zur ck zum Assistenten und berpr fen Sie die beenden eingegebenen Werte 2 W hlen Sie Save Experiment Analyse speichern 3 Klicken Sie im Dialogfeld Save Experiment Analyse speichern auf Save Speichern um die Analyse als Genotyping Example eds zu speichern o Review Plate Layout for Experiment Genotyping Example x T Review the plate layout then select what you wantto do next 2 Save Experiment Save and close this experiment Create Another Experiment Start Run for This E iment elle Using the Design Wizard Return to the Wizara Edit Plate Layout Save and close this Continue designing this
141. ne Aufgabe Unbekannt Negativkontrolle oder Positivkontrolle Allele 1 2 Der Name des mit dem SNP assoziierten Allels das im Well beurteilt wird Allele 1 2 Dyes Der Name der Reporter und Quencher Farbstoffe des mit dem SNP assoziierten Allels das im Well beurtelt wird Allele 1 2 R Normalisiertes Signal R des Reporterfarbstoffs des mit dem SNP assoziierten Allels das im Well beurteilt wird Pass Ref Das Signal des passiven Referenzfarbstoffs fur den Well Call Die Allelbestimmung die der Probe zugewiesen wird M gliche Bestimmungen lauten Quality Der f r die Genotypenbestimmung errechnete Qualitatswert e Homozygot 1 1 Homozygot f r Allel 1 e Homozygot 2 2 Homozygot f r Allel 2 e Heterozygot 1 2 Heterozygot e EI Negativkontrolle e X Unbestimmt Method Die f r die Zuweisung der Bestimmung zur Probe verwendete Methode Auto falls von der StepOne Software zugewiesen oder Manual manuell falls die Zuweisung durch einen Benutzer erfolgt Hinweise Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 81 a Kapitel 5 Analyseauswertung Ansicht der Well Tabelle Spalte Beschreibung Comments Kommentare die f r den dazugeh rigen Proben Well eingegeben wurden Allele 1 2 C Schwellenwertzyklus C der Probe f r das mit dem SNP assoziierte Allel das im Well beurteilt wird QC Markierungsspalten
142. nem direkt einsetzbaren Reaktionsgef mit folgendem Inhalt e Zwei sequenzspezifische Primer f r die Amplifikation des zu bestimmenden Polymorphismus e Zwei allelspezifische TaqMan MGB Sonden zur Detektion der Allele des jeweils zu bestimmenden Polymorphismus Hinweise 4 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 1 Erste Schritte Informationen zu Genotypisierungsanalysen Informationen zu Jede allelspezifische TaqMan MGB Sonde verf gt ber die folgenden Eigenschaften TaqMan Einen Reporter Farbstoff an ihrem 5 Ende MGB Sonden Der Farbstoff VIC befindet sich am 5 Ende der Sonde fiir Allel 1 Der Farbstoff FAM befindet sich am 5 Ende der Sonde f r Allel 2 Die mit VIC Farbstoff markierte Sonde f r Allel 1 entspricht dem ersten Nukleotid innerhalb der eckigen Klammern der Kontextsequenz in der Assay Informationsdatei AIF die im Lieferumfang enthalten ist Die mit FAM Farbstoff markierte Sonde f r Allel 2 entspricht dem zweiten Nukleotid innerhalb der eckigen Klammern der Kontextsequenz in der AIF F r die Kontextsequenz ATCGATT G TJATCC bindet die mit VIC Farbstoff markierte Sonde an das Allel 1 das G enth lt und die mit FAM Farbstoff markierte Sonde an das Allel 1 das T enth lt e Einen Minor Groove Binder MGB Erh ht die Schmelztemperatur T f r eine gegebene Sondenl nge und erm glicht die Entwicklung k rze
143. nete Schutzbrille sowie Schutzkleidung und handschuhe e VERLETZUNGSGEFAHR Beim Betrieb des Ger ts k nnen Heizdeckel und Heizblock Temperaturen von ber 100 C erreichen X Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Vorwort Symbole an den Ger ten f N N Nez HR ELEKTRISCHE SPANNUNG F r einen sicheren Ger tebetrieb ist die Aufrechterhaltung der Erdung unerl sslich Betreiben Sie das System nie ohne angeschlossenen Erdleiter Symbole an den Ger ten Elektrische Aufden Applied Biosystems Ger ten k nnen Sie die folgenden elektrischen Symbole finden an den Ger ten Symbol Beschreibung Symbol Beschreibung Weist auf die Ein Position des Dieses Symbol zeigt einen Hauptnetzschalters hin L m glichen Anschluss an die Betriebserde eines anderen Ger ts an Dies ist keine gesch tzte Weist auf die Aus Position des Erdklemme O Hauptnetzschalters hin Dieses Symbol zeigt eine gesch tzte Erdklemme an die Weist auf einen Standby Schalter geerdet werden muss bevor andere l hin mit dem das Ger t auf elektrische Anschl sse zum Ger t Standby Betrieb umgeschaltet hergestellt werden werden kann Wenn der Schalter auf Standby gestellt ist k nnen Ein mit diesem Symbol gef hrliche elektrische Spannungen PREP gekennzeichneter Anschluss kann auftreten Wechselstrom oder spannung erhalten oder abgeben Weist auf die Ein Aus Positio
144. nformationen zu Genotypisierungsanalysen Endpunktanalysen Genotypisierungsanalysen sind Endpunktanalysen Bei Endpunktanalysen werden e die Daten am Ende des PCR Prozesses erfasst e die Reaktionen durch die Menge der am Ende der PCR akkumulierten Zielsequenz charakterisiert Saiki er al 1985 e Ein Datenpunkt entspricht der normalisierten Intensit t des Reporter Farbstoffs oder R Einige Endpunktanalysen enthalten auch Pr PCR Datenpunkte In diesem Fall berechnet das System den Delta R AR Wert anhand der folgenden Formel R post PCR R pre PCR AR Hinweis In diesem Handbuch bezieht sich der Begriff Analyse auf den gesamten Prozess vom Analysedesign bis zur Datenanalyse Einsatz von Echtzeit PCR Daten in Endpunktanalysen Die StepOne Software bietet die M glichkeit zur Erfassung von Echtzeit Daten sowohl f r Positiv Negativ Analysen als auch f r Genotypisierungsanalysen In dem Fall dass eine Analyse fehlschl gt k nnen die Echtzeitdaten zur Bestimmung der Fehlerursache hilfreich sein Informationen Ein Genotypisierungs Assay erkennt Varianten einer einzelnen Nukleins uresequenz ohne zu TaqMan die Zielsequenz zu quantifizieren Durch das Vorhandensein von zwei Sonden in jeder SNP Geno Reaktion k nnen zwei m gliche Varianten eines Single Nucleotide Polymorphismen SNP typisierungs Punktmutation in einer Zielsequenz genotypisiert werden Assays Jeder TagMan SNP Genotyping Assay besteht aus ei
145. nitor so dass Sie eine entspannte K rper und Kopfhaltung einnehmen k nnen Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen xix Vorwort Normen zu Sicherheit und elektromagnetischer Vertraglichkeit EMV Normen zu Sicherheit und elektromagnetischer Vertraglichkeit EMV US amerikanische und kanadische Sicherheits normen c UL us Kanadische EMV Norm Europaische Sicherheits und EMV Normen Ce Australische EMV Normen Das StepOne System wurde auf die Einhaltung der folgenden Normen getestet UL 61010A 1 CAN CSA C22 2 No 1010 1 92 Safety Requirements for Electrical Equipment for Measurement Control and Laboratory Use Part 1 Allgemeine Anforderungen UL 61010A 2 010 CAN CSA 1010 2 010 Particular Requirements for Laboratory Equipment for the Heating of Materials Besondere Anforderungen an Laborgerate f r das Erhitzen von Stoffen Aktuelle FDA Norm Radiation Control for Health and Safety Act of 1968 Performance Standard 21 CFR 1040 10 and 1040 11 Gesetz zur Strahlungskontrolle f r Sicherheit und Gesundheit von 1968 Das Gerat wurde auf Einhaltung der Norm ICES 001 Ausgabe 3 getestet Industrial Scientific and Medical Radio Frequency Generators Radiofrequenzgeneratoren fur Industrie Wissenschaft und Medizin Sicherheit Dieses Ger t h lt die europ ischen Sicherheitsbestimmungen ein Niederspannungsrichtlinie
146. nnungsreihe wird durch serielle Verd nnung von Standards hergestellt Der Standardstamm wird zur Herstellung der ersten Verd nnungsstufe verwendet die erste Verd nnungsstufe wird wiederum zur Herstellung der zweiten verwendet usw Die zur Herstellung einer Standardverd nnungsreihe notwendigen Volumina werden anhand der Anzahl der Verd nnungsstufen der Anzahl der Standardreplikate der Ausgangsmenge des Verd nnungsfaktors und der Standardkonzentration in der Stamml sung definiert siehe auch unter Standardkurve Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 129 Glossar Steigung SYBR Green Reagenzien Systemfarbstoff TaqMan Reagenzien Temperature Plot Temperaturgraph Template Thermoprofil Tm Touchscreen Unbekannt Verdunnungsfaktor Verdunnungsmittel Vergleichende C AACr Methode Regressionskoeffizient berechnet aus der Regressionsgeraden in der Standardkurve Die Steigung gibt die Effizienz der PCR Amplifikation f r einen Assay an Eine Steigung von 3 3 bedeutet eine 100 ige Amplifikationseffizienz siehe auch unter Amplifikationseffizienz EFF PCR Reaktionskomponenten die aus zwei Primern zur Amplifikation der Zielsequenz und SYBR Green Farbstoff zur Detektion doppelstr ngiger DNA bestehen Von Applied Biosystems hergestellte und auf dem StepOne System vorkalibrierte Farbstoffe Systemfarbstoffe e FAM Farbstoff e JOE
147. nstrument verwenden um den Wells bestimmte Inhalte zuzuordnen und Well Zuordnungen sowie um die Ergebnisse anzusehen Die Plattenbelegung wird auf folgenden Bildschirmen angezeigt Darstellungsassistent Erweiterte Einrichtung Lauf und Analyse Die Plattenbelegung kann ausgedruckt in einen Bericht bernommen exportiert und als Folie f r eine Pr sentation gespeichert werden In Genotypisierungsanalysen die Aufgabe f r den SNP Assay in Wells die ein Proben Template mit einem bekannten Genotyp enthalten Teil des Ger telaufs in Genotypisierungs und Positiv Negativ Analysen der nach der Amplifikation stattfindet In Genotypisierungsanalysen werden die w hrend der Post PCR Messung erfassten Fluoreszenzdaten im sog Allelic Discrimination Plot Alleldiskrimierungsdarstellung dargestellt und zur Allelbestimmung verwendet In Positiv Negativ Analysen werden die wahrend der Post PCR Messung erfassten Fluoreszenzdaten im Positiv Negativ Plot dargestellt und zur Detektion verwendet Wird auch als Endpunktmessung bezeichnet Teil des Geratelaufs in Genotypisierungs und Positiv Negativ Analysen der vor der Amplifikation stattfindet Fluoreszenzdaten die bei der Pra PCR Messung erfasst wurden werden zur Normalisierung der Fluoreszenzdaten der Post PCR Messung verwendet PCR Reaktionskomponente die aus Primern zur Amplifikation der Zielsequenz und einer TaqMan Sonde zur Detektion der Amplifikation der Zielsequenz besteht PCR Reaktionskom
148. nt Type Applied Biosystems StepOne v DC Host Name ffis6 116 100 004 2d Save amp Exit Save amp Add Another Cancel Hinweis Weitere Informationen zur Konfiguration des StepOne Systems zur Verwendung im Netzwerk oder zur Fern berfachung finden Sie im Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Handbuch zu Installation Netzwerkeinbindung und Wartung Hinweise Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 63 a Kapitel 4 Analysedurchfuhrung Uberwachen des Laufs 3 Klicken Sie f r Ihr Ger t auf berwachung dieses Ger ts starten Applied Biosystems StepOne v1 0 1 2 Edi enstrument Analysis Tools Help New Experiment 3 Open Save a Close T Send Experiment to Instrument Manage Instruments Add Instrument ze Local Instrument Type Applied Biosystems StepOne Host Name 192 168 0 1 31 waoww a Run Status Estimated Time Remaining Cannot determine Experiment Name Experiment Type Temperature Download Experiment from Instrument BD Instrument Name Local Instrument Status Connected Block Type 48 Well Block Serial Number 100010001 LED PrintReport _ Enable Run Notifications Notification Settings Current Temperatures Sample 25 0 Cover 105 0 Block 25 0 View Temperature Bi Sample I cover BB Blo
149. nt from Instrument 4 Export Print Report lt View Plate Layout View Well Table gt Select Wells With Selectitem v Selectitem Raw Data Plot 69 000 1 68 000 67 000 66 000 65 000 Sample 1 Sample2 Sample3 Sample4 Samples Sample 6 A E c_11 Jet U c11 M c11 W c11 M c11 U c11 FJ c Sample7 Sample8 Sample9 Sample 10 Sample 11 Sample 12 Sample 13 Sample 14 B U c11 U c11 J c11 U c1 M c1 U ci U c1 FJ ca fo QC Summary Pa Multiple Plots View Sample 15 Sample 16 Sample 17 Sample 18 Sample 19 Sample 20 P IR i E cn 3 U c11 M c11 J c11 M ci J ca U ca Amplitude 2 Filter Wells m 20 Unknown 2 Negative Control g 2 Positive Control 24 Empty Analysis Summary Total Wells in Plate 48 Wells SetUp 24 Wells Processed 24 Wells Flagged 0 Wells Omitted from Analysis 0 Samples Used 20 SNP Assays Used 1 M Home E Genotyping Example eds x Disconnected Auswertungs Achten Sie bei der Auswertung Ihrer eigenen Analyse bei jedem Filter auf Folgendes hinweise e charakteristischer Signalanstieg e keine abrupten nderungen oder Einbr che Weitere Weitere Informationen zur Rohdatendarstellung finden Sie in der StepOne Software Informationen Help indem Sie auf klicken oder Help gt StepOne Help Hilfe StepOne Hilfe wahlen Hinweise Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genoty
150. nur mit ausreichender L ftung zum Beispiel Abzugshauben Weitere Sicherheitsrichtlinien enth lt das entsprechende Sicherheitsdatenblatt e Pr fen Sie in regelm igen Abst nden auf Chemikalienlecks oder versch ttungen Bei Lecks oder Versch ttungen die vom Hersteller im entsprechenden Sicherheitsdatenblatt empfohlenen Reinigungsma nahmen durchf hren e Bez glich der Lagerung Handhabung und Entsorgung von Chemikalien sind s mtliche lokalen landesweiten regionalen bzw nationalen Gesetze und Auflagen einzuhalten Die Chemikalienhersteller liefern neuen Kunden zusammen mit den gef hrlichen Chemikalien ein aktuelles Sicherheitsdatenblatt MSDS Au erdem legen s e nach Aktualisierung eines Sicherheitsdatenblatts dem Kunden bei der n chsten Lieferung der gef hrlichen Chemikalie das aktualisierte Sicherheitsdatenblatt bei Sicherheitsdatenblatter enthalten die erforderlichen Sicherheitsangaben f r die sichere Lagerung Handhabung Bef rderung und Entsorgung der betreffenden Chemikalie Jedes Mal wenn Sie ein neues Sicherheitsdatenblatt mit einer gef hrlichen Chemikalie erhalten m ssen Sie das alte Sicherheitsdatenblatt damit ersetzen Die Sicherheitsdatenblatter f r alle von Applied Biosystems gelieferten Chemikalien stehen Ihnen 24 Stunden am Tag zur Verf gung So k nnen Sie Sicherheitsdatenbl tter beziehen 1 Gehen Sie auf https docs appliedbiosystems com msdssearch html 2 Machen Sie im Feld Search Suche auf de
151. nzuzuf gen Hinweis Die Post PCR Messung ist obligatorisch 5 W hlen Sie Next gt Weiter Hinweise 18 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 2 Experimentelles Design 9 Definieren der Methoden und Materialien 1B Define Methods amp Materials Methods amp Materials Help IE Instructions Selectthe reagents selectthe type of DNA template to use selectthe stages for the instrument run then review the instrument ramp speed for this genotyping experiment Which reagents do you want to use for genotyping 1 Other The PCR reactions contain two primers and two TaqMan probes The primers are designed to amplify the sequence containing the SNP Each TaqMan probe is designed to hybridize to one allele sequence and generate fluorescence signal when the allele sequence is amplified What type of template do you want to use in the PCR reactions 2 Dry DNA gDNA or cDNA y g You are adding the purified resuspended DNA to the final reaction mix Use an optimized protocol to extract the DNA Then make sure the A260 280 ratio is greater than 1 7 the DNA does not contain PCR inhibitors agarose gel electrophoresis shows the DNA is intact and the DNA has not been heated above 60 C Use the standard ramp speed in the instrument run for this genotyping experiment 3 Pf i Standard 2 hours to complete a rur For optimal results using the st
152. oOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 17 O Kapitel 2 Experimentelles Design Definieren der Methoden und Materialien Definieren der Methoden und Materialien Auf dem Bildschirm zur Eingabe der Methoden und Materialien legen Sie Folgendes fest e die f r die Genotypisierung von Proben verwendeten Reagenzien e den Zustand der zu genotypisierenden DNA Template fl ssig oder trocken e die f r die PCR Reaktionen geeignete Heiz K hlgeschwindigkeit Ramp Speed e indie Methode aufzunehmede Stufen Informationen zur In der Beispielanalyse werden TaqMan Reagenzien und in den PCR Reaktionen Beispielanalyse fl ssige genomische DNA gDNA Templates verwendet Da in den Reaktionen keine TaqMan Fast Reagenzien enthalten sind f hrt das StepOne System den Lauf in Standardgeschwindigkeit durch Da das StepOne System au erdem die thermische Wechselbelastung f r die PCR ausf hrt besteht das Laufprofil f r die Analyse aus den Stadien Pra PCR Messung Amplifikation und Post PCR Messung Bildschirm 1 W hlen Sie als Reagenzien TaqMan Reagents aus vervollst ndigen 2 W hlen Sie als Template Typ Wet DNA gDNA or cDNA fl ssige DNA gDNA oder cDNA aus 3 W hlen Sie als Heiz K hlgeschwindigkeit Standard 2 hours to complete a run Standard ca 2 Stunden f r einen Lauf aus 4 W hlen S e Pre PCR Read Pr PCR Messung und Amplification Amplifikation um diese Stufen zur Methode hi
153. on einer Referenzprobe und einer endogenen Kontrolle zur Bestimmung der relativen Menge einer Zielsequenz in einer Probe verwendet 130 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Well herauslassen Well verwerfen y Achsenabschnitt Zielsequenz Zielsequenzbibliothek Zielsequenzfarbe Zyklusphase Zyklus Schwellenwert Glossar Ma nahme die Sie nach der Analyse durchf hren um einen oder mehrere Wells aus der Gesamtanalyse auszuschlie en bevor Sie die Daten erneut analysieren Ma nahme die w hrend der Analyse von der Software durchgef hrt wird um einen oder mehrere Wells aus der weiteren Analyse auszuschlie en wenn einem Well eine bestimmte Markierung zugewiesen wird Regressionskoeffizient berechnet aus der Regressionsgeraden in der Standardkurve Der y Achsenabschnitt gibt den erwarteten Schwellenwert Zyklus C f r eine Probe mit einer Menge gleich 1 an z B I ng ul Die Nukleins uresequenz die Sie amplifizieren und bestimmen m chten Sammlung von Zielsequenzen in der StepOne Software Einer Zielsequenz zugeordnete Farbe um diese in den Plattenbelegungs und Analyse Darstellungen zu identifizieren Phase im Thermoprofil die wiederholt wird Wenn die Zyklusphase zur Durchf hrung einer PCR verwendet wird nennt man sie Amplifikationsphase Siehe unter Schwellenwert Zyklus Cy Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrung
154. onen der Software Hilfe der Benutzeroberfl che Sie haben folgende M glichkeiten um auf die Hilfefunktion der zugreifen StepOne Software zuzugreifen e Dr cken Sie auf Fl e Klicken Sie auf in der Symbolleiste e Wahlen Sie Help gt StepOne Help Hilfe gt StepOne Hilfe So k nnen Sie in der Hilfefunktion nach Themen suchen e Sehen Sie im Inhaltsverzeichnis nach e Suchen Sie nach einem bestimmten Thema e Suchen Sie im alphabetischen Index Kunden Feedback Applied Biosystems ist fiir Kommentare und Vorschlage zur Verbesserung der Anwender unterlagen dankbar Sie k nnen Ihre Kommentare an die folgende E Mail Adresse schicken techpubs appliedbiosystems com WICHTIG Bitte schicken Sie an die oben angegebene E Mail Adresse nur Kommentare und Vorschl ge zu unseren Dokumentationen Wenn Sie Unterlagen bestellen oder PDF Dateien herunterladen m chten oder wenn Sie eine technische Frage haben gehen Sie auf www appliedbiosystems com und klicken Sie dort auf den Support Link Siehe Technischer Support unten viii Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Vorwort Technischer Support Technischer Support Die aktuellen Service und Support Informationen fur alle Standorte erhalten Sie durch Klicken auf den Support Link unter www appliedbiosystems com Auf der Support Seite haben Sie die folgenden Moglichkeiten In den haufig gestellten Fragen FAQs
155. otypisierungsanalysen Kapitel 3 Ansetzen der Reaktionen ie Ansetzen der Probenverd nnungen Ansetzen der Probenverd nnungen Verd nnen Sie die Probenstamml sung so dass Sie die Konzentrationen zu den von der StepOne Software siehe berpr fen des Pipettierprotokolls auf Seite 27 berechneten Volumina erhalten Informationen zur Die berechneten Volumina f r die Genotypisierungsanalyse sind unten aufgef hrt Die Beispielanalyse endg ltige Konzentration betr gt 30 0 ng ul Volumen ul f Konzentration Reakt Proben era oc der Proben Proben DNAse Verd nnte l sung ng pl stamm freies Proben l sung ul Wasser ul insgesamt pl 1 Probe 1 100 0 0 66 1 54 2 20 2 Sample 2 100 0 0 66 1 54 2 20 21 Probe 21 100 0 0 66 1 54 2 20 Ben tigte e DNAse freies Wasser zur Probenverd nnung Materialien e Mikrozentrifugen R hrchen e Pipetten und Pipettenspitzen e Probenstamml sung e Vortexer e Zentrifuge Proben 1 Beschriften S e f r jede Probe ein separates Mikrozentrifugen Reaktionsgef vorbereiten Probe 1 Probe 2 bis Probe 20 2 Geben Sie 1 54 ul DNAse freies Wasser in jedes leere Reaktionsgef 3 Geben Sie 0 66 ul der jeweiligen Probenstamml sung zu jedem Reaktionsgef 4 Vortexen Sie jede verd nnte Probe 3 bis 5 Sekunden und zentrifugieren Sie die Reaktionsgef e Vorbereitungs Bei der Vorbereitung von Proben f r Ihre eigenen Analysen
156. own Men unter Task Aufgabe f r den SNP Assay rs8039 und w hlen S e anschlie end Negative Control Negativkontrolle um diese Aufgabe den ausgew hlten Wells hinzuzuf gen 9 Erstellen Sie Proben und weisen Sie diese der Plattenbelegung zu a Klicken Sie wiederholt auf Create New Sample Neue Probe erstellen bis die Probenliste 20 Proben enth lt b W hlen S e in der Plattenbelegung die Reihe A4 c Aktivieren Sie das Kontrollk stchen Assign Zuweisen f r Probe 1 um den Assay der Probe und dem ausgew hlten Well zuzuweisen d Wiederholen Sie die Schritte 9b bis 9c um die Proben wie unten dargestellt zuzuweisen 104 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 6b 6c 8 Anhang A Alternative Analyseablaufe Setup fur Fortgeschrittene Q Instructions Define the SNP assays and samples for this experiment then assign them to wells in the plate For each SNP assay assignment select a task Assign SNP Assay s to the Selected Wells Create New Add Saved SNP Assay ET lt View Plate Layout View Results Table gt Select Wells With Select Item W Select Item Assign 9a 9c Hinweise Sample Color 3 SNP Assay Allele 1Alele 2 Task Reporter pre rs8039 C FAM v A Sample 1 Sample2 Sample3 Sample4 Samples Sample 6 N rs80 i
157. pOne Hilfe wahlen Aktivieren der Benachrichtigungen optional Bei Aktivierung der Benachrichtigungseinstellungen werden Sie von der StepOne Software per E Mail darauf aufmerksam gemacht wenn das StepOne System den Lauf startet und beendet oder beim Lauf ein Fehler auftritt Die Aktivierung der Benachrichtigungseinstellungen ist optional und wirkt sich nicht auf die Leistung des StepOne Systems oder die Dauer des Laufs aus WICHTIG Die Funktion Benachrichtigungseinstellungen ist nur dann verf gbar wenn der von Ihnen verwendete Computer mit dem StepOne System verbunden ist und an ein Ethernet Netzwerk angeschlossen ist Hinweis Das Benachrichtigungssystem ist auch f r Computer verf gbar die ein StepOne System fern berwachen Weitere Informationen ber Fern berwachung finden Sie unter Fern berwachung auf Seite 62 Informationen zur Bei der Beispielanalyse ist die StepOne Software so eingerichtet dass 3 Anwender Beispielanalyse benachrichtigt werden Scientist Wissenschaftler Supervisor Laborleiter und Technician Techniker mycompany com wenn das StepOne System den Lauf beendet oder w hrend des Betriebs Fehler auftreten Der f r das Beispiel verwendete SMTP Server www mycompany com verwendet SSL Verschl sselung Secure Sockets Layer und fordert vom Anwender eine Authentifizierung Benachrichtigung 1 Klicken Sie im Navigationsbereich der StepOne Software auf Run Lauf seinstellungen
158. pisierungsanalysen 87 n Kapitel 5 Analyseauswertung Ansicht der Multikomponentendarstellung Ansicht der Multikomponentendarstellung In der Multikomponentendarstellung wird der vollst ndige spektrale Beitrag eines jeden Farbstoffs in einem ausgew hlten Well ber die Dauer des PCR Laufs angezeigt Informationen zu Pr fen Sie in der Beispielanalyse die Multikomponentendarstellung auf Folgendes den Beispiel e ROX Farbstoff passive Referenz eaten e FAM Farbstoff Reporter e Spitzen Tiefen und oder pl tzliche nderungen e Amplifikation in den Negativkontroll Wells Ansicht der 1 W hlen Sie in der Navigationsleiste Ra Multicomponent Plot aus Multikompo E E nenten 2 W hlen Sie ein Well aus der Plattenbelegung aus Es wird in der darstellung Multikomponentendarstellung angezeigt 3 W hlen Sie aus dem Dropdown Men Plot Color Darstellungsfarbe Dye Farbe 4 Klicken Sie auf Show Hide the plot legend Darstellungslegende anzeigen ausblenden 5 Pr fen Sie die FAM und VIC Farbsignale In der Beispielanalyse steigen die FAM und VIC Farbsignale ber die gesamte PCR hinweg an was auf eine normale Amplifikation hindeutet 6 Priifen Sie das ROX Farbsignal In der Beispielanalyse bleibt das ROX Farbsignal wahrend des gesamten PCR Verfahrens konstant was auf typische Daten hinweist 7 Wahlen Sie die Negativkontoll Wells nacheinander aus und pr fen Sie auf Amplifikation In der Beispielanalyse
159. plate Control NTC siehe Negativkontrolle NC Normalisierte Menge 124 Normalisierter Reporter Rn 124 Normen EMV xx Sicherheit xx Normen zur elektromagnetischen Vertraglichkeit SieheEMV Normen NOSIGNAL 82 O Online Hilfe Siehe Hilfesystem P Passive Referenz 125 Markierung BADROX 82 Phase 125 Plattenbelegung 78 125 Plus Minus Assay Ergebnisbestimmungen 94 Positivkontrolle 125 anwenden 23 24 best tigen 76 80 82 Markierung PCFAIL 82 Post PCR Messung 125 Pr PCR Messung 125 Primer Sonden Mix 125 Primer Mix 125 Probe 125 Probe oder Standard 105 125 Probe SNP Assay Reaktion 125 Probe Zielsequenz Reaktion 126 Probenbibliothek 126 Proben DNA 10X 126 Punkt 126 Q Quantifizierungsmethode 126 Quencher 126 QuickStart Arbeitsablauf 107 126 R R2 Wert 126 Radioaktiver Abfall Handhabung xvii Rampe 126 R umliche Kalibrierung 126 Raw Data Plot Rohdatendarstellung 86 127 Reagenzien 127 Bestellen 29 TaqMan Reagenzien 4 6 Reaktionsmix 127 Ansetzen 38 Bestellen 29 Einrichten 27 Reaktionsplatte Ansetzen 40 Bestellen 29 Einlegen 48 entnehmen 66 kompatibel Reaktionsplatte einlegen 40 Reaktionsplatte entnehmen 66 Referenzprobe 127 refSNP ID 127 Regressionsgerade 127 Regressionsgerade siehe auch unter Regressionskoeffizienten Regressionskoeffizienten 127 Regressionskoeffizienten siehe auch unter Standardkurve Reihe siehe unter Standardverd nnungsreihe 136 Appl
160. platte f r 3 bis 5 Sek und zentrifugieren Sie sie anschlie end kurz 6 Zentrifugieren Sie die Reaktionsplatte kurz WICHTIG Achten Sie darauf dass der Boden der Reaktionsplatte nicht schmutzig wird Fl ssigkeiten und andere Kontaminanten die am Boden der Reaktionsplatte haften bleiben k nnen den Heizblock kontaminieren und ein ungew hnlich hohes Hintergrundsignal verursachen Hinweise Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 41 a Kapitel 3 Ansetzen der Reaktionen Vorbereiten der Reaktionsplatte Richtig Falsch Fl ssigkeit am e nicht kr ftig genug oder Boden des Wells e nicht lange genug zentrifugiert Vorbereitungs Bei der Vorbereitung der Reaktionsplatte f r Ihre eigenen Analysen ist Folgendes zu hinweise beachten e Stellen Sie sicher dass Sie die richtigen Verbrauchsmaterialien verwenden e Stellen Sie sicher dass die Plattenbelegung in der Reaktionsplatte sowie der StepOne Software berein stimmt e Falls Sie weniger als 40 Reaktionen laufen lassen verwenden Sie lieber Reaktionsgef streifen als eine Reaktionsplatte e Laden Sie 3 bis 20 ng gereinigte genomische DNA pro Reaktion e Alle Wells desselben Genotypisierungs Assays m ssen dieselbe Menge an Probe bzw Kontrolle enthalten e Sie k nnen auch mehrere Assays auf einer Reaktionsplatte laufen lassen sie m ssen jedoch separat analysiert werden Hinweise
161. plification Plot Echtzeit anzeigen Amplifikationsdarstellung Siehe Informationen zur Amplifikationsdarstellung auf Seite 58 zu weiteren Informationen ber die Darstellung B Temperaturdaten f r Klicken Sie auf Temperature Plot Temperaturgraph den autin Eehtzeit Siehe Informationen zum Temperaturgraphen auf Seite 59 zu gen weiteren Informationen ber die Darstellung C Ablauf in der Klicken Sie auf Run Method View Lauftypanzeige rn Siehe Informationen zur Laufprofilanzeige auf Seite 60 zu 9 weiteren Informationen ber die Anzeige D Benachrichtigungs Aktivieren oder deaktivieren Sie Enable Notifications einstellungen Benachrichtigungen aktivieren aktivieren deaktivieren Siehe Aktivieren der Benachrichtigungen optional auf Seite 49 zu weiteren Informationen ber die Benachrichtungseinstellungen amp Applied Biosystems StepOne v1 0 File Edit Instrument Analysis Tools Help New Experiment EF Open 5 Close T Send Experiment to Instrument Eg Download Experiment from Instrument PD PrintReport Manage Instruments amp Select an instrument then click Monitor to monitor the instrument Local Instrument Default w u Add Instrument ff S Run Status Idle Instrument Name Local Instrument C Enable Run Notifications D Local Instrument A Estimated Time Remaining Cannot determine Status Connected Experiment Name
162. ponente die den Forward Primer und Reverse Primer zur Amplifikation der Zielsequenz enthalt Das Template das Sie untersuchen Reaktionskomponente die unter dem Reiter Reaction Mix Calculations Berechnung des Reaktionsmix des Bildschirms Reaction Setup Reaktionseinrichtung angezeigt wird Die Software nimmt an dass die zum Reaktionsmix hinzugef gte Probe bzw der Standard in einer 10fachen Konzentration vorliegt Wenn das Reaktionsvolumen zum Beispiel 20 ul betragt belauft sich das berechnete Proben bzw Standardvolumen fur l Reaktion auf 2 ul Kombination von Probe und SNP Assay in einer PCR Reaktion Jede PCR Reaktion kann nur eine Probe und einen SNP Assay enthalten Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 125 Glossar Probe Zielsequenz Reaktion Probenbibliothek Proben DNA 10X Punkt Quantifizierungs methode Quencher QuickStart R2 Wert Rampe Raumliche Kalibrierung Raw Data Plot Rohdatenplot 126 Kombination von Probe und Zielsequenz in einer PCR Reaktion Im Analysedesign Assistenten kann jede PCR Reaktion nur eine Probe und eine Zielsequenz enthalten Sammlung von Proben in der StepOne Software Die Probenbibliothek enth lt die Probenbezeichnung und die Probenfarbe Reaktionskomponente die auf dem Reaktionseinrichtungsbildschirm angezeigt wird Die Software nimmt an dass die zum Reaktionsmix hinzugef gte Proben DNA in e
163. pplied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 4 Analysedurchfuhrung A Starten der Analyse e Fragen Sie Ihren Systemadministrator oder die IT Abteilung nach folgenden Informationen Netzwerkadresse eines SMTP Servers Simple Mail Transfer Protocol Ein Benutzername und ein Passwort f r den Server falls f r den Zugriff erforderlich Die SSL Einstellung Secure Sockets Layer des Servers Ein oder Aus Weitere Weitere Informationen zum Bildschirm Notification Settings finden Sie in der Informationen StepOne Software Help indem Sie auf klicken oder Help gt StepOne Help Hilfe gt StepOne Hilfe w hlen Starten der Analyse Starten Sie den Lauf entsprechend der Konfiguration Ihres StepOne System Wie Sie den Lauf starten h ngt von der Konfiguration Ihres StepOne Systems ab Konfiguration Beschreibung Siehe Computer Das gelbe StepOne Systemkabel verbindet den Computer gesteuerte Computer mit dem StepOne System gesteuerte Konfiguration starten unten Eigenst ndig e Der Computer und das StepOne System sind Eigenst ndige nicht miteinander verbunden oder Konfiguration e Der Computer und das StepOne System sind Starten auf Seite 52 mit demselben Netzwerk verbunden Computer Folgen Sie dieser Anleitung wenn Ihr Computer an das StepOne System durch das gesteuerte StepOne Systemkabel direkt ve
164. r entsprechend den Angaben in der Hilfe der StepOne Software klicken Sie auf in der Symbolleiste oder w hlen Sie Help gt StepOne Help Hilfe StepOne Hilfe Weitere Informationen zum Temperaturgraphen finden Sie in der StepOne Software Help indem S e auf klicken oder Help gt StepOne Help Hilfe StepOne Hilfe w hlen Informationen zur Laufprofilanzeige Nach Start eines Laufs zeigt das StepOne System den Ablauf im Laufprofilbildschirm an Dieser Bildschirm zeigt den Verlauf in Bezug auf das Thermoprofil des Laufprofils an Das unten abgebildete Schaubild zeigt den bei der Beispielanalyse angezeigten Lauftypbildschirm Ziel Aktion A Lauftyp ndern Zyklen 1 Klicken Sie im Navigationsbereich auf AR Run Method Haltephase oder Lauftyp SEINE kurve 2 F hren Sie im Lauftypbildschirm eine der folgenden hinzuf gen Aktionen aus Geben Sie die Anzahl an Zyklen ein die auf die Zyklusphase anzuwenden sind W hlen Sie Add Melt Curve Stage to End Schmelzkurvenphase am Ende zuf gen wenn Sie eine Schmelzkurvenphase am Laufende hinzuf gen m chten W hlen Sie Add Holding Stage to End Haltephase am Ende zuf gen wenn Sie eine Haltephase am Laufende hinzuf gen m chten 3 Klicken Sie auf Send to Instrument An Ger t senden 60 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 4 Kapitel 4 Analysedurchf hrung
165. r Seite MSDS Search Sicherheitsdatenblattsuche die folgenden Angaben a Geben Sie den Namen der Chemikalie die Bestellnummer oder sonstige Informationen ein die Sie in dem jeweiligen Sicherheitsdatenblatt vermutlich erwarten b Wahlen Sie die gew nschte Sprache c Klicken Sie auf Search Suche 3 So k nnen Sie die gew nschten Dokumente ansehen herunterladen oder ausdrucken a Klicken S e mit der rechten Maustaste auf den Dokumententitel b W hlen Sie e ffnen um das Dokument anzuzeigen e Ziel speichern unter um eine PDF Version des Dokuments unter dem von Ihnen gew hlten Zielpfad zu speichern e Ziel drucken um das Dokument zu drucken Applied Biosystems SteopOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen XV Vorwort Sicherer Umgang mit Chemikalienabfallen 4 So k nnen Sie sich auf der Seite Search Results Suchergebnisse die Kopie eines Sicherheitsdatenblattes per Fax oder E Mail schicken lassen a Wahlen Sie unter dem Dokumententitel zwischen den Optionen Fax oder Email E Mail b Klicken Sie auf RETRIEVE DOCUMENTS Dokumente abrufen am unteren Ende der Dokumentenliste c Geben Sie die erforderlichen Informationen ein d Klicken Sie auf View Deliver Selected Documents Now Ausgewahlte Dokumente jetzt ansehen verschicken Hinweis Kontaktieren Sie wegen Sicherheitsdatenblattern f r Chemikalien die nicht von Applied Biosystems geliefert werden den jeweiligen Ch
166. r die PCR Pr PCR PCR Post PCR Messung Messung l Haltephase Haltephase CENG IUA yet Haltephase Phase Schritt Denaturieren Anlagerung Extension Temperatur 60 C 95 C 92 C 60 C 60 C Zeit 00 00 30 00 10 00 00 00 15 00 01 00 00 00 30 hh mm ss Datenerfassung Ja Nein Nein Ja Ja Hinweis Bei der oben dargestellten Methode wird fur den Schritt Anlagerung Extension die Datenerfassung aktiviert sodass das StepOne System w hrend der PCR Daten in Echtzeit erfasst Auch wenn die Echtzeitdaten f r die Genotypisierung nicht erforderlich sind k nnen sie hilfreich bei der Fehlerbehebung fehlgeschlagener PCR L ufe sein 1 Klicken Sie in das Feld Reaction Volume Per Well Reaktionsvolumen pro Well und geben Sie 25 ein 2 Klicken Sie auf das Feld Number of Cycles Anzahl der Zyklen und geben Sie 50 ein 3 Klicken Sie auf die Zeiteinstellung f r den ersten Schritt der Cycling Phase 95 C 00 20 und geben Sie 10 00 ein 4 Passen Sie den ersten Schritt der Cycling Phase an a Klicken Sie auf die Temperatureinstellung fiir den ersten Schritt 95 C und geben Sie dann 92 C ein b Klicken Sie auf die Zeiteinstellung f r den ersten Schritt 92 C und geben Sie 00 15 ein 5 Klicken Sie auf die Zeiteinstellung f r den zweiten Schritt 60 C und geben S e 01 30 e n Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalyse
167. rbunden ist Konfiguration starten 1 Klicken Sie in der StepOne Software auf Temperature Plot Temperaturgraph 2 Klicken Sie auf START RUN LAUF STARTEN Hinweise Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 91 A Kapitel 4 Analysedurchf hrung Starten der Analyse o StepOne v1 0 _ File Edit Instrument Analysis Tools Help New Experiment 29 Open il Save EF Close w Send Experiment to Instrument Eg Download Experiment from Instrument 4 Export Print Report Experiment Menu f Experiment Type Reagents Run Status Sea x Estimated Time Remaining 56 min 22 sec Instrument Status g amp Connected Run Status 171 C Enable Notifications Run Method Edit Run Method Adjust of Cycles e PCR Read Holding Stag Holding Stage Cycling Stage st PCR Read Holding S _ Add Melt Curve Stage to End Enable Auto _ Add Holding Stage to End staring Cycle MNE Sendte strument Legend Data Collection On Data Collection Off A AutoAOn A Auto A Off MR Home Genotyping Example eds x En Eigenst ndige Folgen Sie dieser Anweisung wenn Computer und StepOne System nicht direkt mit Konfiguration dem gelben StepOne Systemkabel verbunden sind starten au 1 Wenn Ihr Computer und das StepOne System an dasselbe Netzwerk angeschlossen sind f hren Sie Schritte la bis If aus Setzen
168. reihe Standardkurven Methode 129 Standardmenge 129 Standardverd nnungsreihe 129 Standardverd nnungsreihe siehe auch unter Standardkurve Steigung 130 Steigung siehe auch unter Amplifikationseffizienz EFF StepOne System Datenerfassung 2 Informationen 2 Konfigurationen 121 122 Reagenzien 4 Verbrauchsmaterialien SYBR Green Reagenzien 130 Symbole Sicherheit xi Systemfarbstoff 130 7 TaqMan MGB Sonden 5 TaqMan SNP Genotypisierungs Assays 4 TaqMan Reagenzien 130 Technischer Support kontaktieren ix Temperaturgraph 59 130 Template 130 Template vorbereiten 37 Textkonventionen v Thermoprofil 130 Tm siehe auch unter Schmelztemperatur 130 Touchscreen 130 U Uberspannungskategorie Nennwert xviii Unbekannte Proben 130 unbekannte Proben 23 78 unspezifische Fluoreszenz 6 V Verbrauchsmaterialien 3 29 37 38 40 Siehe auch Ben tigte Materialien Verd nner 130 Verd nnungsfaktor siehe unter Serienfaktor Vergleichende Cy AAC Methode 130 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 137 Stichwortverzeichnis Verwenden von Vorlagen 112 Verwendung des Handbuchs als Tutorial 8 Voraussetzungen f r die Verwendung dieses Handbuchs v Vorbereitungshinweise 37 39 42 Vorschriften Entsorgung von Chemikalienabfallen xvi VORSICHT Beschreibung x W WARNUNG Beschreibung x Well auslassen 131 Well verwerfen 131 Wel
169. ren k nnen Verwenden Sie alle erforderlichen Komponenten Setzen Sie die Reagenzien entsprechend der Herstelleranweisungen an Sch tzen Sie den Assay Mix bis zu seiner Verwendung im Gefrierger t vor Licht berm ige Lichteinstrahlung kann die Funktion der Fluoreszenzsonden beeintr chtigen F hren Sie vor der Ausf hrung folgende Schritte durch Sch tteln Sie die Flasche um den Master Mix gr ndlich zu mischen Resuspendieren Sie den Assay erneut durch Vortexen und zentrifugieren Sie das Reaktionsgef kurz Legen Sie alle gefrorenen Proben auf Eis um sie aufzutauen Wenn sie aufgetaut sind resuspendieren Sie die Proben erneut durch Vortexen und zentrifugieren Sie die Reaktionsgef e kurz Weitere Weitere Informationen zur Vorbereitung des Reaktionsmixes finden Sie in den Informationen jeweiligen Protokollen der Reagenzien die Sie bei den PCR Reaktionen verwenden siehe Weitere Informationen auf Seite 36 Hinweise Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 39 NQ Kapitel 3 Ansetzen der Reaktionen Vorbereiten der Reaktionsplatte Vorbereiten der Reaktionsplatte Ben tigte Materialien Reaktionsplatte vorbereiten Getrocknete DNA Hinweise F llen Sie die Reaktionsplatte mit dem Reaktionsmix von Seite 38 und den verd nnten Proben von Seite 37 Die Reaktionen werden nach der von der StepOne Software generierten Plattenbelegung zu
170. rer Sonden Alfonina et al 1997 Kutyavin et al 1997 Die Verwendung k rzerer Sonden f hrt zu gr eren Unterschieden in den T Werten zwischen der passenden und der nicht passenden Sonde und somit zu einer stabileren Genotypisierung Einen nicht fluoreszierenden Quencher NFQ an seinem 3 Ende der die Detektion der Fluoreszenz des Reporter Farbstoff mit gr erer Empfindlichkeit als mit einem fluoreszierenden Quencher erm glicht WICHTIG Applied Biosystems empfiehlt nicht die Verwendung von TAMRA Farbstoff als Reporter oder Quencher mit dem StepOne System 5 Nuklease Die Abbildung unten ist eine schematische Darstellung des 5 Nuklease Assays Assay W hrend der PCR geschieht Folgendes e Jede TaqMan MGB Sonde bindet spezifisch an die entsprechende Komplement rsequenz zwischen Forward und Reverse Primer e Solange die Oligonukleotid Sonde intakt ist wird das Reportersignal durch die Nahe des Quenscher Farbstoffs zum Reporter Farbstoff gequenscht e AmpliTaq Gold DNA Polymerase verl ngert die Primer die an das genomische DNA Template gebunden sind e AmpliTaq Gold DNA Polymerase eine 5 Nuklease schneidet die Sonden die stabil an der Zielsequenz hybridisiert sind e Durch die Aufspaltung der an der Zielsequenz hybridisierten Sonden wird der Reporter vom Quencher entfernt und die Fluoreszenz des Reporters steigt an Das durch die PCR Amplifikation generierte Fluoreszenzsignal zeigt an welche Al
171. rmationen 36 Analysedesign einrichten Arbeitsablauf 14 Beenden des Analysedesign Assistenten 32 Bestellen von Materialien 29 Definieren der Analyseeigenschaften 16 Einrichten der SNP Assays 20 Einrichten des Lauftyps 25 Hinweise 17 19 22 24 26 29 31 33 neu anlegen 15 Reaktionen einrichten 27 Analysedesign Assistent 120 Bildschirm Experiment Properties Analyseeigenschaften 16 Bildschirm Materials List Materialliste 29 Bildschirm Reaction Setup Reaktionseinrichtung 27 Bildschirm Run Method Lauftyp 25 Bildschirm SNP Assays 20 fertigstellen 32 Analysename 120 Analysetyp 120 Anwenderbeachtungsbegriffe beschrieben vi Applied Biosystems Abteilung f r Informationsentwicklung viii kontaktieren 1x Kunden Feedback ber Dokumentation viii Technischer Support ix Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System siehe StepOne System Arbeitsablauf Analysedesign Assistent 11 Erweiterte Einrichtung 102 Export Import 113 QuickStart 107 Template 112 Arbeitsablauf der erweiterten Einrichtung 9 102 129 Arbeitsablauf des Analysedesign Assistenten 11 Arbeitsablauf f r den Export Import 113 Assay 120 Assay ID 120 Assay Informationsdatei AIF 20 120 Assay Mix 38 120 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 133 Stichwortverzeichnis Aufgabe 121 Auftragsbezogene Assays 121 Ausgangsmenge 121 AusreiBer 121 Auswahlen von Wells 79 Auswerten der Analyse siehe auch
172. rs8039 f r die Plattenbelegung a Klicken Sie auf Create New SNP Assay Neuen SNP Assay erstellen b Klicken Sie in das Feld SNP Assay Name und geben Sie rs8039 ein c Klicken Sie auf OK Sy New SNP Assay Enter a SNP assay name then select a SNP assay color For each allele enter an allele name or base s then en select the reporter quencher and allele color Click OK to add the SNP assay to the library a SNP Assay Name rs 039 ei Color Assay ID Allele 1 Name or Base s Allele 1 Color Reporter VIC v Quencher NFQ MGB Allele 2 Name or Basels Allele 2 Color i v Reporter FAM v Quencher NFQ MGB Comments Hinweise Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 103 WW Anhang A Alternative Analyseabl ufe Setup f r Fortgeschrittene Hinweise 6 Richten Sie die unbekannten Proben ein a W hlen Sie in der Plattenbelegung die Reihen A und B b Aktivieren Sie in der Liste der SNP Assays das Kontrollk stchen Assign Zuweisen f r den SNP Assay rs8039 um ausgew hlte Wells als solche zu markieren c Klicken Sie auf das Dropdown Men unter Task Aufgabe f r den SNP Assay rs8039 und w hlen Sie anschlie end Unknown Unbekannt um diese Aufgabe den ausgew hlten Wells hinzuzuf gen 7 Wahlen Sie in der Plattenbelegung die Reihen Al und A2 8 Klicken Sie auf das Dropd
173. rt Properties Exporteinstellungen Setup Einrichten W hlen Sie im Dropdown Men One File Eine Datei Wahlen Sie im Dropdown Men File Type Dateiart 7 txt Wahlen Sie Open file s when export is complete Datei en nach Abschluss des Exports ffnen Klicken Sie auf Start Export Export starten und anschlie end bei Aufforderung Close Export Tool Export Tool schlie en Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 113 N Anhang A Alternative Analyseabl ufe Arbeitsablauf f r den Export Import Sy Export Data Q Selectthe type of data to export select whether to export one file or separate files then enter export file properties Optionally click Customize Export to change the export format and to select fields to export Click Start Export to export your data il Export Properties Customize Export 1 Select data to export a Setup 2 Select one file or separate files One File v Select to export all data in one file or in separate files for each data type 2c 3 Enter export file properties 2d Export File Name Example_Genotyping_Experiment_data File Type E txt S Export File Location C Applied Biosystems StepOne System experiments Browse 2e E Bpen file s when export is complete C Save current settings as the default Start Export Cancel 3 Erstellen
174. rten v Analysedesign einrichten Kapitel 2 w Ansetzen der Reaktionen Kapitel 3 1 Setzen Sie die Probenverd nnungen an 2 Setzen Sie den Reaktionsmix an 3 Bereiten Sie die Reaktionsplatte vor w Analyse durchf hren Kapitel 4 v Analyse auswerten Kapitel 5 v Analyse beenden Weitere Weitere Informationen zur Vorbereitung des TaqMan SNP Genotyping Assays siehe Informationen R Custom TaqgMan SNP Genotyping Assays Protocol BN 4334431 Custom TaqgMan Genomic Assays Protocol BN 4367671B TaqgMan SNP Genotyping Assays Protocol BN 4332856C TaqgMan Drug Metabolism Genotyping Assays Protocol BN 4362038A Performing a Custom TaqMan SNP Genotyping Assay for 96 Well Plates Quick Reference Card BN 4371394A Performing a TagMan Drug Metabolism Genotyping Assay for 96 Well Plates Quick Reference Card BN 4367636A Pre Developed TaqgMan Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol BN 4312214C Allelic Discrimination Pre Developed TaqMan Assay Reagents Quick Reference Card BN 4312212C Hinweis Die in diesem Kapitel beschriebenen Verfahren konzentrieren sich auf die Verwendung fl ssiger DNA Proben Wenn Sie mit getrockneter DNA arbeiten richten Sie sich bez glich der Einzelheiten zu Rekonstituierung und Plattenbelegung Ihrer Proben nach dem Reagenzienprotokoll ihres PCR Kits Hinweise 36 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Gen
175. rvisor mycompany com technician mycompany com Separate e mail addresses with commas For example jane_smith mydomain com awong bigmailhost com 6 Outgoing Mail Server SMTP smtp mycompany com For example smtp mycompany com Server requires an encrypted connection Yes No fa Server requires authentication Yes O No Tb Server Authentication User Name ExampleUser Te Server Authentication Password warnen Laufhinweise So richten Sie die automatische Benachrichtigung im StepOne System ein Ihr StepOne System muss f r die Verwendung in einem Netzwerk konfiguriert sein Siehe Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Installationshandbuch e Legen Sie die Ereignisse fest ber die Sie benachrichtigt werden m chten Instrument Error Ger tefehler Veranlasst das StepOne System die angegebenen E Mail Empf nger ber alle vom StepOne System w hrend eines Laufs festgestellten Fehler zu informieren Run Started Lauf wurde gestartet Veranlasst das StepOne System die E Mail Empf nger ber jeden gestarteten Ger telauf zu informieren Run Completed Lauf ist abgeschlossen Veranlasst dasStepOne System die E Mail Empf nger ber jeden abgeschlossenen Ger telauf zu informieren e Erfragen Sie die E Mail Adressen der Personen die benachrichtigt werden sollen WICHTIG Trennen Sie die Adressen durch Kommata voneinander ab Hinweise 50 A
176. s f r jeden n der Plattenbelegung ausgew hlten Well anzeigen zu lassen 4 W hlen Sie in der unteren Darstellung Raw Data Plot Rohdatendarstellung um die Rohdaten f r jeden in der Plattenbelegung ausgew hlten Well anzeigen zu lassen 5 StepOne v1 0 File Edit Instrument Analysis Tools Help i New Experiment EF Open la Save Close amp Send Experiment to Instrument Eg Download Experiment from Instrument EE Export Print Report Experiment Menu f Experiment Type Multiple Plots View gt 32 43 00 Amplification Plot ARn vs Cycle v 2e PARE Amplification Plot ES Allelic Discrimination Plot Sample 1 Sample2 Sample3 Sample4 SampleS Sample6 A E c_11 Jen U c11 U c11 J c11 M c_19 J c_14 J c Amplification Plot x Multicomponent Plot L Cae E Raw Data Plot Sample7 Sample8 Sample9 Sample 10 Sample 11 Sample 12 Sample 13 Sample 14 B U c11 U c11 J c11 U c1 U c1 U ci U ca c m QC Summary Ty _ ER AR DSe MER EEE EEE Sample 15 Sample 16 Sample 17 Sample 18 Sample 19 Sample 20 Cycle WS o CE BEE J c_19 J c_11 O cas Jc Bic Bc 4 aw Data Plot v Raw Data Plot Filter Wells I 20 Unknown J 2 Negative Control B 2 Positive Control 24 Empty X Analysis Summary Total Wells in Plate 48 Wells SetUp 24 Wells Processed 24 Wells Flagged 0 Wells Omitted from An
177. scher Wert der die Sequenz von Mengen in der Standardkurve definiert Der Serienfaktor und die Ausgangsmenge werden zur Berechnung der Standardmenge f r jeden Punkt in der Standardkurve verwendet Wenn die Standardkurve beispielsweise mit einem Serienfaktor von 1 10 oder 10 definiert ist bedeutet das eine 10fache Differenz zwischen zwei beliebigen nebeneinander liegenden Punkten in der Kurve Funktion in der StepOne Software die es Ihnen erlaubt die Analyse entsprechend Ihrem Analysedesign einzurichten 128 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen SNP SNP Assay SNP Assay Bibliothek Sonden Mix Standard Standardkurve Standardkurven Methode Standardmenge Standard verdunnungsreihe Glossar Abk rzung f r Einzelnukleotid Polymorphismus Der SNP kann in einer Basendifferenz oder Indel Insertion Deletion bestehen In Genotypisierungsanalysen eine PCR Reaktion die Primer zur Amplifikation des SNP und zwei Sonden zur Detektion unterschiedlicher Allele enthalt Sammlung von SNP Assays in der StepOne Software PCR Reaktionskomponente die eine TaqMan Sonde zur Detektion der Amplifikation der Zielsequenz enth lt Probe die bekannte Mengen eines Standards enth lt Standardreaktionen werden in Quantifizierungsanalysen verwendet um Standardkurven zu generieren Siehe auch unter Standardkurve und Standardverd nnungsreihe In Standardkurven und relat
178. set up the properties for each SNP assay Set Up SNP Assays Have you ordered and received the assay and the assay information file AIF for each SNP assay 1 How many SNP assays are you studying in this experiment 1 2 7 Yes Select SNP Assay from Library No Set Up SNP Assay Properties Manually NOTE Import the AIF into the SNP assay library before you set up the SNP assay properties Click Select SNP Assay s from Library to open the SNP assay library Ifthe SNP assay is not in the library import the AIF into the library Then 3 selectthe SNP assay s to set up the SNP assay properties SNP Assay 1 Properties C__11711420_30 Select SNP ma from Library Clear SNP Assay Properties SNP Assay 1 Name C__11711420_30 Enter Gene Name Select Marker Color Ill x Allele 1 A SelectReporter VIC v Select Quencher NFO MGB v SelectAllele 1 Color EM v Allele 2 C Select Reporter FAM i Select Quencher NFQ MGB SelectAllele 2 Color he amp SNP Assay Library x IE cae assays edit existing SNP assays delete SNP assays import SNP assays from a text file or an AIF or export SNP assays to a text file Apply a filter to reduce the number of SNP assays Enter a filter query then click Apply Filter To enter multiple filter queries click Advanced Filter Advanced Filter IF SNP Assay v wl Apply Fiter Remove F
179. shandbuch zu Genotypisierungsanalysen 131 Glossar 132 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Nummerische Eintrage 5 Nuklease Assay 5 A Abfallentsorgung Richtlinien xvii Abfallprodukte Beschreibung xvii Abteilung fur Informationsentwicklung kontaktieren viii AIF siehe unter Assay Informationsdatei Allel 119 Allelbestimmung automatisch 98 manuell 99 Allelic Discrimination Plot Alleldiskriminierungsplot 6 119 Bestimmungen manuell zuweisen 99 Ergebnisse beurteilen 74 77 Allgemeine xix Amplification Plot Amplifikationsdarstellung 119 Ansehen nach dem Lauf 90 95 W hrend eines Laufs berwachen 58 Amplifikation 119 Ansehen nach dem Lauf 90 93 Kurve 92 Markierung NOAMP 82 W hrend eines Laufs berwachen 58 Amplifikationseffizienz EFF 119 Amplikon 119 Analyse 120 Analyse anlegen Beispielanalyse 15 Drucken 28 bertragen Siehe Daten bertragen Analyse ausf hren Arbeitsablauf 46 Benachrichtigungseinstellungen aktivieren 49 51 Daten bertragen 66 Starten 51 berwachen 55 Vorbereiten auf 47 Analyse auswerten siehe auch Fehlerbehebung Multikomponentendarstellung ansehen 88 Plattenbelegung ansehen 78 Raw Data Plot Rohdatendarstellung ansehen 86 Well Tabelle ansehen 80 Stichwortverzeichnis Analyse vorbereiten Arbeitsablauf 36 Hinweise 37 39 42 Probenverd nnungen 37 Reaktionsmix 38 Reaktionsplatte 40 Weitere Info
180. sierungsanalysen Kapitel 2 Experimentelles Design 9 Bestellen von Materialien f r die Analyse Einrichtungs Beachten Sie beim Einrichten Ihres eigenen Analysedesigns Folgendes hinweise e Geben Sie ein Reaktionsvolumen Well von 10 bis 30 ul ein Applied Biosystems empfiehlt f r Genotypisierungsanalysen ein Reaktionsvolumen von 25 ul e Geben Sie ein bersch ssiges Reaktionsvolumen von mindestens 10 ein damit Pipettier oder sonstige Analysefehler ber cksichtigt werden e Wenn Sie ein getrocknetes DNA Template verwenden werden die Komponenten und Volumina neu berechnet Weitere Weitere Informationen zum Bildschirm Reaction Setup finden Sie in der StepOne Informationen Software Help indem Sie auf klicken oder Help gt StepOne Help Hilfe StepOne Hilfe w hlen Bestellen von Materialien f r die Analyse Pr fen S e die auf dem Bildschirm Order Materials List zur Vorbereitung der Reaktionsplatte aufgef hrte Materialliste und f gen Sie die Artikel hinzu die Sie bestellen m chten Geben S e anschlie end die Bestellung auf Bildschirm 1 Klicken Sie auf das Feld Gene Name Name des Gens oder RS Number RS Material Nummer geben Sie rs8039 ein und klicken Sie anschlie end auf Find Assay bestellung Assay suchen um den entsprechenden Assay von der Applied Biosystems vervollst ndigen Website zu erhalten a Wahlen Sie im Dialogfeld Find Assay Results Ergebnisse der Assay Suche den Assay C__11711420
181. statigen Sie dass die Positivkontrollen keine Markierungen aufweisen A und dass ihre normalisierte Fluoreszenz des Reporter Farbstoffs R f r den Genotyp geeignet ist zum Beispiel bei der Beurteilung der Positivkontrolle Allel 1 Allel 1 ware ein bedeutender Anstieg des R Werts fur die Allel 1 Sonde zu erwarten und nur ein sehr geringer f r die Allel 2 Sonde c Wiederholen Sie Schritt b f r jede Positivkontrolle e Pr fen Sie die Daten f r die unbekannten Proben Beachten Sie bei allen Zeilen die ein A in der Spalte Flag aufweisen die Daten und die Markierung en f r den zugeh rigen Well e Wahlen Sie die Bereiche der Tabelle oder Wells eines angegebenen Typs aus indem Sie wie folgt vorgehen Klicken Sie mit der linken Maustaste und ziehen Sie die Maus ber den Bereich den Sie als Bereich der Tabelle ausw hlen m chten W hlen Sie den Reiter View Table Tabelle ansehen und anschlie end aus dem Men Select Items Artikel ausw hlen Sample Probe Target Zielsequenz oder Task Aufgabe W hlen Sie nun auf dem zweiten Select Items Men den Proben Zielsequenz oder Aufgabennamen um Wells eines bestimmten Typs mithilfe des Well Auswahl Tools auszuw hlen e Gruppieren Sie die Zeilen der Plattenbelegung durch Auswahl einer Option aus dem Men Group By Gruppieren nach Anschlie end k nnen Sie die Listen ein oder ausblenden indem Sie auf das Symbol neben den einzelnen Listen klicken oder indem Sie
182. ster in der Ecke links unten in der Darstellung auswahlen sollten nur die Negativkontrollen ausgewahlt sein Das Vorhandensein einer Unbekannten unter den Negativkontrollen k nnte darauf hinweisen dass die Amplifikation der Probe fehlgeschlagen ist Hinweise 14 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 5 Analyseauswertung ine Ansicht der Amplifikationsdarstellung c Wiederholen Sie Schritte 3a und 3b f r alle anderen Cluster in der Darstellung Element Beschreibung SNP Assay Bestimmt die Daten des SNP Assays die von der StepOne Dropdown Men Software in der Darstellung angezeigt werden Plot Type Legt den Darstellungstyp Cartesian oder Polar fest den die Dropdown Men StepOne Software f r die Anzeige der Daten verwendet Apply Call Wenn ein Datenpunkt ausgew hlt ist K nnen Sie ber dieses Dropdown Men Men einem Datenpunkt innerhalb des Scatterplots eine Allelbestimmung zuweisen Toolbar Enth lt Werkzeuge zur Bearbeitung des Scatterplots A W hlt Datenpunkte durch Anklicken einzelner Datenpunkte oder durch Klicken und Ziehen eines Felds um eine Datenpunktgruppe aus lt W hlt Datenpunkte durch Einkreisen aus m Positioniert den Scatterplot neu d Vergr ert den Scatterplot mi Zoomt aus dem Scatterplot heraus Legende Erl uterung der Symbole im Scatterplot In d
183. suchen Eine Frage direkt an den technischen Support richten Applied Biosystems Anwenderunterlagen Sicherheitsdatenblatter Analysezertifikate oder sonstige Dokumente bestellen PDF Dokumente herunterladen Informationen ber Kundenschulungen abrufen Softwareaktualisierungen und Patches herunterladen Dar ber hinaus finden Sie auf der Support Seite die weltweiten Telefon und Faxnummern der Kundenservice und Verkaufsstellen von Applied Biosystems WICHTIG Wenn Sie von diesem Handbuch dazu angewiesen werden oder wenn Sie einen Wartungstermin f r Ihr StepOneStepOne Ger t vereinbaren m chten z B anberaumte Jahreswartung oder Temperaturpr fung kal ibrierung kontaktieren Sie das Kundenservicezentrum von Applied Biosystems Unter http www appliedbiosystems com support contact finden Sie die entsprechenden Telefonnummern oder k nnen eine E Mail an das Kundenservicezentrum schicken Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Ix Vorwort In diesem Dokument verwendete Sicherheitskonventionen In diesem Dokument verwendete Sicherheitskonventionen Sicherheits warnbegriffe In den Applied Biosystems Anwenderunterlagen wird unter Verwendung von vier Sicherheitswarnbegriffen auf m gliche Gefahren hingewiesen Jeder Warnbegriff WICHTIG VORSICHT WARNUNG GEFAHR schreibt einen bestimmten Beachtungs oder Handlungsgrad vor wie nachstehend erl utert Definitionen
184. t Report ER StepOne v1 0 File Edit Instrument Analysis Tools Help 1 TE New ei OY Open W Save MF Close w Send Experiment to Instrument Eg Download Experiment from Instrument 4P Run Analyze Design Wizard Analyze Experiment E o Open Lookin O experiments examples 2 a My Recent Documents 3 My Computer a File name Genotyping Example eds My Network Places Files oftype All SDS Files eds edt sds Save current display as the default www appliedbiosystems com Disconnected n TM Weitere Weitere Informationen finden Sie in der StepOne Software Help indem Sie Informationen auf klicken oder Help gt StepOne Help Hilfe gt StepOne Hilfe w hlen Hinweise 73 Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen es Kapitel 5 Analyseauswertung Ansicht der Amplifikationsdarstellung Ansicht der Amplifikationsdarstellung F hren Sie eine erste Pr fung der Analyseergebnisse in der Alleldiskriminierungs Darstellung durch welche die normalisierte Reporter Farbstofffluoreszenz R f r Allel spezifische Sonden des SNP Assay kontrastiert Unter Platten lesen und auswerten auf Seite 6 finden Sie eine ausf hrliche Beschreibung der Darstellung Informationen zu berzeugen Sie sich dass die Alleldiskriminierungs Darstellung f r die Beispielanalyse den Beispiel Folgendes anzeigt daten e Cluster f r die drei m
185. t die unten den Beispiel stehende Abbildung aus einer anderen Analyse mit Wells die die Markierung daten NOREPORTER ausl sten Zusammen 1 W hlen Sie in der Navigationsleiste E QC Summary Zusammenfassung der fassung prufen Qualit tskontrolle aus 2 Pr fen Sie die Zusammenfassung und achten Sie dabei auf die Anzahl der Wells die eine Markierung ausl sten 3 W hlen Sie in der Zusammenfassung Flag Details Markierungsdetails die Markierung NOREPORTER aus 4 Pr fen Sie die detaillierten Informationen die f r NOREPORTER angezeigt werden 5 Klicken Sie auf View NOREPORTER Troubleshooting Information um die Informationen zur Fehlerbehebung f r diese Markierungen darzustellen In der Abbildung unten wird eine Zusammenfassung zur Qualitatskontrolle f r eine Genotypisierungsanalyse mit Markierungen dargestellt Hinweise 84 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 5 Analyseauswertung Ansicht der QC Zusammenfassung 5 StepOne v1 0 File Edit Instrument Analysis Tools Help New Experiment EF Open la Save Close 55 Send Experiment to Instrument Eg Download Experiment from Instrument 4 Export Print Report Experiment Menu amp Experiment QC Summary Flag Summary Total Wells 48 Processed Wells 48 SNP Assays Used 1 Wells Set Up 48 Flagged Wells 7 Samples Used Showin Ta
186. tandig Der Computer und das StepOne System sind Fern berwachung auf vernetzt mit demselben Netzwerk verbunden Seite 62 Eigenst ndig Der Computer und das StepOne System sind _ yEigenstandige Basis nicht miteinander verbunden berwachung auf Seite 65 Hinweise Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 55 A Kapitel 4 Analysedurchf hrung berwachen des Laufs _ Kombinierte Wenn Ihr Computer ber das StepOne Systemekabel direkt mit dem StepOne System Uberwachung verbunden ist k nnen Sie den Ablauf der Analyse entsprechend den folgenden Hinweise Beschreibungen in Echtzeit anzeigen Pr fen Sie den Lauf auf potenzielle Probleme indem Sie in regelm igen Abst nden alle drei verf gbaren Darstellungen der StepOne Software aufrufen Ziel Aktion A Lauf stoppen 1 Klicken Sie in der StepOne Software auf STOP RUN LAUF STOPPEN 2 Klicken Sie im Dialogfeld Stop Run Lauf stoppen auf eine der folgenden Optionen Stop Immediately Sofort stoppen um den Lauf sofort zu stoppen Stop after Current Cycle Hold nach aktuellem Zyklus stoppen anhalten um den Lauf nach dem aktuellen Zyklus zu stoppen oder anzuhalten Cancel Abbrechen um den Lauf fortzusetzen B Amplifikationsdaten in W hlen Sie By Amplification Plot Echtzeit anzeigen Amplifikationsdarstellung Siehe Informationen zur A
187. te enter sample names then enterthe number of negative and positive controls Set Up Samples N View Plate Layout 1 If How many samples do you want to test in the reaction plate 20 Arrange Plate By Rows v Place Controls in Upper Left v 2 How many replicates do you need 1 For each sample in the reaction plate enter a sample name and select a sample color Enter Sample Name Color Sample 1 A Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample 2 Gye Je mc m c m cW c M c M c Sample 3 Sample 4 Sample Sample Sample Sample Sample 2 Sample Sample 3 Sample 4 Sample 5 m c m c mM c M c m c M c W c M c Sample 6 Sample 5 Sample 6 Sample 7 Sample 8 Sample 9 Sample 1 m c m c mM c M c_ M c M swe Bc Be Specific Sample SNP Assay Reactions How many negative controls do you need for each SNP assay 2 How many positive controls do you need for each SNP assay optional 2 Select Positive Control 1 Genotype Allele 1 Allele 2 Heterozygous v Select Positive Control 2 Genotype Allele 2 Homozygous Well Count D 20 Unknown g 2 Positive Control N 2 Negative Control 24 Empty Einrichtungs Beachten Sie beim Einrichten Ihres eigenen Analysedesigns Folgendes hinweise e Verwenden Sie zwischen 1 und 48 Proben Kennzeichnen Sie alle Proben mit eindeutigen Namen und Farben e Applied Biosystems emp
188. te 48 Wells SetUp 24 Wells Processed 24 Wells Flagged 0 Wells Omitted from Analysis 0 Samples Used 20 SNP Assays Used 1 i Genotyping Example eds X Disconnected Auswertungs Beachten Sie bei der Auswertung Ihrer eigenen Analyse Folgendes hinweise e Passive Referenz Das Fluoreszenzniveau der passiven Referenz sollte w hrend des gesamten PCR Verfahrens relativ konstant bleiben Reporter Farbe Das Fluoreszenzniveau der Reporter Farbe sollte einen flachen Bereich f r die Grundlinie gefolgt von einem rapiden Anstieg der Fluoreszenz im Verlauf der Amplifikation aufweisen Unregelm igkeiten im Signal Es sollten keine Spitzen Tiefen und oder pl tzlichen nderungen im Fluoreszenzsignal auftreten e Negativkontroll Wells Es sollten keine Amplifikationen in den Negativkontroll Wells auftreten Weitere Weitere Informationen zur Multikomponentendarstellung finden Sie in der StepOne Informationen Software Help indem Sie auf klicken oder Help gt StepOne Help Hilfe StepOne Hilfe wahlen Hinweise Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 89 es Kapitel 5 Analyseauswertung Ansicht der Amplifikationsdarstellung Ansicht der Amplifikationsdarstellung Informationen zu den Beispiel daten Ergebnisse pr fen Hinweise Falls Sie f r Ihre Analyse Echtzeitdaten erfasst haben pr fen Sie die Amplifikations daten um d
189. te Kriterien erf llt sind zum Beispiel wenn bei einem Well Daten fehlen Weitere Informationen finden Sie in der StepOne Software Help c Klicken Sie zum Schlie en des Dialogfelds f r die Auswertungseinstellungen auf Apply Analysis Settings Auswertungseinstellungen bernehmen 10 Klicken Sie zur Auswertung der Daten anhand der neuen Einstellungen auf Hinweise Reanalyze Neu auswerten 98 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 5 Analyseauswertung ze Ansicht der Auswertungseinstellungen Bestimmungen manuell zuweisen 1 2 9 Wenn Sie Bestimmungen f r mehrere SNPs zuweisen w hlen Sie einen anderen Marker aus dem SNP Assay Dropdown Men und wiederholen Sie Schritt 8 Hinweise Klicken S e in der Analyse auf Analysis Settings Auswertungseinstellungen W hlen Sie den gew nschten SNP Assay aus der Tabelle Select aSNP Assay SNP Assay ausw hlen aus Richten Sie die Marker Auswertungseinstellungen ein a Klicken Sie auf Edit Default SNP Assay Settings Standard SNP Einstellungen bearbeiten b Deaktivieren Sie Autocaller enabled Autocaller aktiviert c Klicken Sie auf Save Changes nderungen speichern um die Einstellungen zu speichern Optional Weisen Sie Markierungen zu a W hlen S e den Reiter Flag Settings Markierungseinstellungen b Weisen Sie die gew nschten Markierungen zu Hinweis Bei der Zuweisun
190. tion et l limination des d chets CAUTION Hot surface DANGER High voltage ATTENTION Surface br lante DANGER Haute tension WARNING To reduce the chance of electrical shock do not remove covers that require tool access No user serviceable parts are inside Refer servicing to Applied Biosystems qualified service personnel AVERTISSEMENT Pour viter les risques d lectrocution ne pas retirer les capots dont l ouverture n cessite l utilisation d outils L instrument ne contient aucune piece r parable par utilisateur Toute intervention doit tre effectu e par le personnel de service qualifi de Applied Biosystems CAUTION Moving parts DANGER Class 3B Ill visible and or invisible LED radiation present when open and interlocks defeated Avoid exposure to beam ATTENTION Parties mobiles DANGER Rayonnement visible ou invisible d un faisceau LED de Classe 3B Ill en cas d ouverture et de neutralisation des dispositifs de s curit Evitez toute exposition au faisceau Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Vorwort Allgemeine Ger tesicherheit Anbringung der Am StepOne System befindet sich an der unten angezeigten Stelle ein Warnhinweis Warnhinweise ung SIC Allgemeine Geratesicherheit M N 0 EAN VERLETZUNGSGEFAHR Die nicht sachgem e Verwendung des Ger ts entsprechend den Vorgaben
191. tte und bertragen der Daten 6 Greifen Sie auf dem Computer Desktop ber den Windows Explorer auf das USB Laufwerk zu 7 Kopieren Sie die Datei Genotyping Example eds auf lt drive Laufwerk gt Applied Biosystems StepOne System experiments wobei lt drive Laufwerk gt das Installationsverzeichnis der StepOne Software ist Hinweise Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 69 we Kapitel 4 Analysedurchfuhrung Entnehmen der Reaktionsplatte und Ubertragen der Daten Hinweise 70 Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 5 Analyseauswertung Dieses Kapitel umfasst die folgenden Themen WE Kapilel bersicht 2 4 44 ven bowie bes yee dew Ren are 72 E ffnen der Analyse zur Auswertung 00 00000 c cece cee eee eee 73 E Ansicht der Alleldiskriminierungs darstellung 222222 74 m Ansicht der Plattenbelegung 0c eens 78 E Ansicht der Well Tabelle 0 0 0 0 eens 80 E Ansicht der Zusammenfassung zur Qualit tskontrolle 84 E Ansicht der Rohdatendarstellung 20 0 0 000 ccc ees 86 E Ansicht der Multikomponentendarstellung 0 000000 c ee eae 88 E Ansicht der Amplifikationsdarstellung 0 0 0 00 00 00 cece eee ees 90 E Ansicht der Auswertungseinstellungen 0 0 0000 e eee ees 95 E V
192. uf berwachen Sie den Lauf 0O A OO N Entladen Sie die Reaktionsplatte und bertragen Sie die Daten ww Analyseauswertung Kapitel 5 Ansicht der Alleldiskriminierungsplot Ansicht der Plattenbelegung Ansicht der Well Tabelle Ansicht der QC Zusammenfassung Ansicht der Rohdatendarstellung Ansicht der Multikomponentendarstellung Ansicht der Amplifikationsdarstellung Ansicht der Auswertungseinstellungen O ON Oo FW NY Daten auswerten v Analyse beenden Hinweise Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 11 um Kapitel 1 Erste Schritte Arbeitsablauf der Beispielanalyse Hinweise 12 Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 2 Experimentelles Design Dieses Kapitel umfasst die folgenden Themen mM Kapitel bersicht 4 404 ven deep bes iee dude hee ren are 14 E Anlegen einer neuen Analyse 0 0 eens 15 E Definieren der Analyseeigenschaften 0 0 ene 16 E Definieren der Methoden und Materialien 0 0 cece 18 E Definieren der SNP Assays 0 0 ccc ee eee nes 20 E Definieren der Proben und Replikate 0 0 0 0 0 0 cece 23 E Definieren des Lautproruls 22400000 bean cad MOae esd Seen edd be bao de 25 E berpr fen des Pipettierprotokolls 000 00 ccc cee cee eee
193. ung verf gen Dieses Handbuch verwendet die folgenden Konventionen e Fett gedruckter Text weist auf Benutzeraktionen hin Zum Beispiel Geben Sie 0 ein und dr cken Sie dann bei allen brigen Feldern auf Enter e Kursiv gedruckter Text weist auf neue und wichtige W rter hin und wird au erdem zur Hervorhebung verwendet Zum Beispiel Erstellen Sie vor einer Analyse immer eine neue Matrix Ein rechtes Pfeilsymbol gt trennt aufeinander folgende Befehle aus einem Dropdown oder Shortcut Men voneinander ab Zum Beispiel W hlen Sie Datei gt ffnen Vorwort Verwendung dieses Handbuchs vi Beachtungs hinweise Sicherheits warnbegriffe In den Applied Biosystems Anwenderunterlagen werden zwei Beachtungshinweise verwendet Jeder Begriff schreibt einen bestimmten Beachtungs oder Handlungsgrad vor wie nachstehend erlautert Hinweis Weist auf interessante oder hilfreiche Informationen hin die f r die Verwendung des Produkts jedoch nicht entscheidend sind WICHTIG Weist auf Informationen hin die f r die sachgem e Verwendung des Ger ts des Chemikalienkits oder die sichere Verwendung einer Chemikalie n tig sind Im Folgenden sind Beispiele f r Beachtungshinweise aufgef hrt Hinweis Sie k nnen auch ber die Steuerkonsole auf die Kalibrierungsfunktion zugreifen WICHTIG Fur die Verifizierung Ihrer Client Verbindung ben tigen Sie einen g ltigen Nutzernamen In den Anwenderunterlage
194. ut View Well Table Select Wells With Select Item v l Select Item v 2 pp showinwens v EElvewteoera Sample Name 2 3 4 5 6 if 8 Task SNP Assay Name Assay ID a Sample 1 Sample 2 Sample 3 Sample 4 Sample 5 Sample 6 a Lal c__1iggazo_30 I c__11711420_30 M c_11711420_30 TJ c__11711420_30 I c__11711420_30 TJ c_11711420_30 I c_11711420_30 ele Allele 2 3 Allele 1 Dyes Allele 2 Dyes Sample 8 Sample 9 Sample 10 Sample 11 Sample 12 Sample 13 Sample 14 SNP Assay Color T c__11711420_30 TJ c__11711420_30 I c__11711420_30 I c__11711420_30 I c__11711420_30 T c__11711420_30 TJ c__11711420_30 Sample Color Task Color Genotype Call Sample 16 Sample 17 Sample 18 Sample 19 Sample 20 e e Flags T c 11711420_30 I c_11711420_30 I c_11711420_30 I c__11711420_30 I c_11711420_30 E c_11711420_30 J c_11711420_20 D E F Wells I 20 Unknown 0 2 Negative Control J 2 Positive Control 24 Empty Analysis Summary Total Wells in Plate 48 Wells SetUp 24 Wells Processed 24 Wells Flagged 0 Wells Omitted from Analysis 0 Samples Used 22 SNP Assays Used 1 Auswertungs Beachten Sie bei der Auswertung Ihrer eigenen Analyse Folgendes hinweise e In der Plattenbelegung werden vom Benutzer ausgelassene Wells oben links mit D8 angezeigt und Wells die durch die QC Markierungseinstellungen ausgelassen wurden werden mit LI in der Ecke angezeigt e Achten Sie darauf an welcher
195. v e Occupational Safety and Health Standards Bloodborne Pathogens OSHA Standards fur blutgebundene Pathogene 29 CFR 1910 1030 www access gpo gov nara cfr waisidx_01 29cfr1910a_01 html e Die Protokolle des Biosicherheitsprogramms Ihres Unternehmens Instituts ber die Arbeit den Umgang mit potenziell infekti sen Materialien Weitere Informationen ber die Vorschriften f r Biogefahrdung finden Sie auf der folgenden Website http www cdc gov Sicherheit am Arbeitsplatz Eine ergonomisch korrekte Einrichtung Ihres Arbeitsplatzes kann Beschwerden wie z B M digkeit Schmerzen und Verspannungen verringern oder verhindern Sie k nnen diese Beschwerden minimieren oder verhindern indem Sie Ihren Arbeitsplatz so einrichten dass eine neutrale oder entspannte Arbeitshaltung gef rdert wird JN jil HT Jo WVO MUSKULOSKELETTAL UND REPETITIVE BEWEGUNGEN WARNHINWEIS Diese Gefahren sind auf potenzielle Risikofaktoren zur ckzuf hren wie unter anderem sich wiederholende Bewegungsabl ufe ung nstige K rperhaltung beranstrengung Verharren in statischen Sitzpositionen Anpressdruck und andere Umweltfaktoren des Arbeitsplatzes So k nnen Sie das Risiko muskuloskelettaler Erkrankungen und repetitiver Bewegungen minimieren e Verwenden Sie nur Ger te die eine neutrale und bequeme Arbeitsposition unterst tzen und Ihnen einen einfachen Zugriff auf Tastatur Monitor und Maus erm glichen e Platzieren Sie Tastatur Maus und Mo
196. w nschten Speicherort und klicken auf OK Hinweise Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 33 9 Kapitel 2 Experimentelles Design L Beenden des Analysedesign Assistenten Hinweise 34 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 3 Ansetzen der Reaktionen Dieses Kapitel umfasst die folgenden Themen E Kapitel bersicht 4 4042 e204 24 se bes hee dude eee ern are 36 E Ansetzen der Probenverd nnungen 0000 eee 31 E Ansetzen des Reaktionsmix 0 0 0 0 0000s 38 E Vorbereiten der Reaktionsplatte 0 0 0 0 00 nes 40 Hinweis Weitere Informationen ber ein Thema dieses Handbuchs finden Sie in der Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Software indem Sie entweder F1 dr cken in der Symbolleiste auf klicken oder Help gt StepOne Help Hilfe StepOne Hilfe w hlen Hinweise Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen 35 Kapitelubersicht Kapitelubersicht Kapitel 3 Ansetzen der Reaktionen Dieses Kapitel erklart wie Sie die PCR Reaktionen fur die Beispiel Genotypisierungsanalyse ansetzen und bietet Hinweise fur das Ansetzen von PCR Reaktionen fur hre eigene Analyse Arbeitsablauf Bereiten Sie die PCR Reaktionen nach dem folgenden Arbeitsablauf vor Analyse sta
197. w do you want to identify this experiment Required Tl ExperimentName Genentech Barcode Optional Example 1 2 3 User Name Optional Example User all Comments Optional Genotyping Getting Started Guide SE What type of experiment do you want to design 5 Presence Absence Design a genotyping experiment to detect single nucleotide polymorphism variants of a target nucleic acid sequence in a sample Hinweise 16 Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Kapitel 2 Experimentelles Design o Definieren der Analyseeigenschaften Einrichtungs Beachten Sie beim Einrichten Ihres eigenen Analysedesigns Folgendes hinweise e Geben Sie einen Analysenamen ein der beschreibenden Charakter hat und sich leicht merken l sst e Optional Geben Sie einen Barcode von bis zu 100 Zeichen ein damit die in der Analyse verwendete Reaktionsplatte eindeutig gekennzeichnet ist e Optional Geben Sie zur Identifizierung des Verantwortlichen f r die Analyse einen Benutzernamen ein e W hlen Sie als Analysetyp Genotyping Genotypisierung aus Weitere Weitere Informationen zum Vervollst ndigen des Bildschirms mit den Informationen Analyseeigenschaften finden Sie in der StepOne Software Help indem Sie auf klicken oder Help gt StepOne Help Hilfe StepOne Hilfe w hlen Hinweise Applied Biosystems Ste
198. y Value 95 0 Save Changes Cancel Revert to Defaults for All Analysis Settings Apply Analysis Settings Cancel 6 2 Wells I 20 Unknown J 2 Negative Control J 2 Positive Control 24 Empty 2 Filter Analysis Summary Total Wells in Plate 48 Wells SetUp 24 Wells Processed 24 Wells Flagged 0 Wells Omitted from Analysis 0 Samples Used 20 SNP Assays Used 1 MR Home J Genotyping Example eds x Disconnected Auswertungs Beachten Sie bei der Auswertung Ihrer eigenen Analyse Folgendes hinweise e Wenn Ihre Analyse aus zwei Clustern besteht aktivieren Sie den Algorithmus f r die 2 Cluster Bestimmung indem Sie aus dem Dialogfeld Edit Default SNP Assay Settings Standard SNP Assay Einstellungen bearbeiten 2 Cluster Calling Enabled 2 Cluster Bestimmung aktiviert w hlen e Die C Einstellungen stehen nur f r Auswertungen zur Verf gung die Amplifikationsdaten enthalten Analysen die nur aus Pr und Post PCR Messungen bestehen verwenden den Schwellenwertzyklus C zur Auswertung nicht e Probendaten k nnen wie folgt bestimmt werden automatisch mithilfe des Autocallers siehe Seite 98 manuell mithilfe der Men leiste und dem Scatterplot siehe Seite 99 Weitere Weitere Informationen zu Auswertungseinstellungen finden Sie in der StepOne Informationen Software Help indem Sie auf klicken oder Help gt StepOne Help Hilfe StepOne Hilfe w hlen
199. ysen mit denselben Einrichtungsdaten erstellen Informationen zu Die StepOne Software bietet die M glichkeit Templates zur Erstellung von Analysen Templates zu erstellen Templates sind vor allem bei Analysen bei denen die Proben nach identischen Plattenbelegungen und unter denselben Analysebedingungen analysiert werden hilfreich und zeitsparend So erstellen Sie 1 eine Analyse Hinweise Erstellen Sie eine Analyse wie in Kapitel 2 Experimentelles Design auf Seite 13 beschrieben Wahlen Sie File gt Save As Template Datei Als Vorlage speichern und klicken Sie anschlieBend im Dialogfeld Save Experiment Analyse speichern auf Save Speichern Speichern Sie die Analyse als Genotyping Example edt Klicken Sie auf 5 Close Schlie en Erstellen S e eine Analyse mithilfe eines Templates a Klicken S e im Bildschirm Home Startseite auf und anschlie end auf S Template Vorlage b W hlen Sie im Dialogfeld Open ffnen die Datei Example Genotyping edt und anschlie end Open ffnen c ndern Sie die Analyse mithilfe der Werkzeuge im Arbeitsablauf Advanced Setup Erweiterte Einrichtung d W hlen Sie aus der Dropdownliste der Dateitypen Experiment Document Template files edt e Klicken Sie auf la Save Speichern geben Sie einen Namen f r die Analysedatei ein und klicken Sie zum Speichern der Analyse auf Save Speichern Bereiten Sie die Reaktionen vor wie in Kapitel 3 Anset
200. zen der Reaktionen auf Seite 35 erl utert Lassen Sie die Analyse wie in Kapitel 4 Analysedurchf hrung auf Seite 45 dargestellt ablaufen Werten Sie die Analyse aus wie in Kapitel 5 Analyseauswertung auf Seite 71 beschrieben Wiederholen Sie die Schritte 4 bis 7 nach Bedarf um weitere Analysen aus der Vorlage zu erstellen 112 Applied Biosystems SteoOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen Arbeitsablauf fur den Export Import Wenn Sie eine Genotypisierungsanalyse mithilfe des Arbeitsablaufs Export Import erstellen k nnen Sie eine neue Analyse mit aus anderen Analysen exportierten Daten Anhang A Alternative Analyseablaufe A Arbeitsablauf f r den Export Import einrichten Informationen Die StepOne Software kann Analysedesigns aus ASCII Textdateien importieren die zum Einrichten Einrichtungsdaten f r Analysen in dem Plattenbelegungsformat der StepOne Software von enthalten Die Importfunktion ist vor allem dann n tzlich wenn mehrfache Analysen Import Export durchgef hrt werden da viele der in Kapitel 2 beschriebenen Schritte automatisiert sind So erstellen Sie 1 Erstellen Sie eine Analyse wie in Kapitel 2 Experimentelles Design auf Seite 13 eine Analyse beschrieben 2 Exportieren Sie die Einrichtungsdaten aus der ge ffneten Analyse wie folgt a b Hinweise Wahlen Sie File Datei gt Export Wahlen Sie in den Reiter Expo
201. zum StepOne SysteM nm anna 2 Informationen zu Genotypisierungsanalysen 2222 en neueren nn 4 Verwendung dieses Handbuchs 00 cee eens 8 Informationen zur Beispielanalyse 0 0 0 cc ee ees 9 Arbeitsablauf der Beispielanalyse 0 000 cee eee eee 11 Kapitel 2 Experimentelles Design 000 cee eee 13 KAPltellDErSICHL 24 262 we oe ebaneus een eet he setae oben eco ee eee oer enn 14 Anlegen einer neuen Analyse 000 ccc ee eee 15 Definieren der Analyseeigenschaften 2 222 cece eee eee ees 16 Definieren der Methoden und Materialien 0 0 ce eee 18 Definieren der SNP AssayS 0000 e eee eee eee eee eee 20 Definieren der Proben und Replikate 0 000 ee eee 23 Definieren des LaufprofilS 0 00 eens 25 berpr fen des Pipettierprotokolls onana naaa aee 27 Bestellen von Materialien f r die Analyse 2 2 anaana aaa 29 Beenden des Analysedesign Assistenten 2 222 c eee eee eee 32 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Einf hrungshandbuch zu Genotypisierungsanalysen iil Kapitel 3 Ansetzen der Reaktionen 000e eee eeee 35 Kapitell belsicht ives cto 2a se ow SR ee ae ee et asien 36 Ansetzen der ProbenverdUnnungen 0c eee eee eee 37 Ansetzen des Reaktionsmix 24 jens 2 a kee a kee 38 Vorbereiten der Reaktionsplatte 0 0 eas 40 Kapitel 4 Analysedurchfuhrung 0 2000 cee eee 45 Ka

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