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HiSeq 4000 Systemhandbuch - Support

1. A Oberer F hrungsstift B Rechte F hrungsstifte Bewegen Sie den Fliefszellenregler langsam in Position 1 Dadurch wird das Vakuum aktiviert und die Flie zelle wird in Position gehalten Wenn der Fliefzellenregler gr n blinkt ist das Vakuum aktiviert Falls der Regler nicht gr n leuchtet lesen Sie M gliche Probleme bei der Laufkonfiguration auf Seite 59 Abbildung 14 Flie zellenregler in Position 1 0 Warten Sie f nf Sekunden und bewegen Sie dann den Fliefzellenregler langsam in Position 2 ganz rechts Wenn der Fliefzellenregler dauerhaft gr n leuchtet ist ein Vakuum entstanden und die Fliefzelle ist einsatzbereit Abbildung 15 Flie zellenregler in Position 2 i 7 Stellen Sie sicher dass das Kontrollk stchen Vacuum Engaged Vakuum aktiviert auf dem Bildschirm f r das Einsetzen der Primer Flie zelle aktiviert ist und w hlen Sie dann die Option Next Weiter Teile Nr 15066496 Rev ADEU Pr fen des Flusses Bei der berpr fung des Flusses wird auch festgestellt ob die Flie zelle und die Dichtungen ordnungsgem installiert sind und Vakuum entstanden ist 1 W hlen Sie L sung 2 Wasser in Laborqualit t aus der Dropdown Liste a ACHTUNG Verwenden Sie Wasser zur Pr fung des Flusses nur bei einer gebrauchten Flie zelle Verwenden Sie niemals Wasser zur Pr fung des Flusses bei einer Cluster Flie zelle 2 berpr fen Sie die folgenden Standardwerte Volume Volumen 250 Aspirate Rate As
2. 15066496 Rev A DEU T Technischer Support 69 U Unterbrechen eines Laufs 11 V Verbrauchsmaterialien Illumina Sequenzierungskits 16 Vom Benutzer bereitgestellt 6 Vorbereitung 16 Verf gbarer Speicherplatz 43 Vom Soot bereitgestellte Verbrauchsmaterialien 6 Vorf llen Abfallvolumen 27 Optionale Einstellung 20 Vorbereitung 27 W Wartungsprotokolle 43 Wartungswaschlauf 9 38 Wartungswaschlaufl sung Entsorgung 38 Lagern 38 Vorbereiten 38 Waschl ufe Vorbereiten der Wartungswaschlaufl sung 38 Wartungswaschlauf 38 Wasserwaschlauf 41 Wasserwaschlauf 9 Dauer 41 Erwartete Volumina 41 Verbrauchsmaterialien 41 Wiegen der Reagenzien Nach dem Lauf 37 Vor dem Lauf 22 Workflow Echtzeitanalyse 51 Gestaffelte L ufe 63 Sequenzierung 17 Z Zyklen berwachung 33 HiSeq 4000 Systemhandbuch 67 xopul Index 68 Teile Nr 15066496 Rev ADEU Technische Unterst tzung Wenn Sie technische Unterst tzung ben tigen wenden Sie sich bitte an den technischen Support von Illumina Tabelle 3 Allgemeine Kontaktinformationen f r Illumina Website www illumina com E Mail techsupport illumina com Tabelle 4 Telefonnummern des Illumina Kundendiensts Region Telefonnummer Region Telefonnummer Nordamerika 1 800 809 4566 Italien 800 874909 Australien 1 800 775 688 Neuseeland 0800 451 650 Belgien 0800 81102 Niederlande 0800 0223859 D nemark 80882346 Norwegen 800 16836 Deutschland 0800 180 89
3. Powered by Illumina SeqMonitor SureMDA TruGenome TruSeq TruSight Understand Your Genome UYG VeraCode verifi VeriSeq die k rbisorange Farbe und das Streaming Basen Design sind Marken von Illumina Inc und oder ihren Tochtergesellschaften in den USA und oder anderen L ndern Alle anderen Namen Logos und Marken sind Eigentum der jeweiligen Eigent mer Teile Nr 15066496 Rev ADEU Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ii Kapitel 1 berblick L 1 A ee Ee 2 HiSeq 4000 Komponenten 2 3 Sequenzierungs Verbrauchsmaterialien 6 Starten des HiSeq 4000 Systems 7 HiSeq 4000 Software 8 Weitere Ressourcen _ 0 022200000002200nnenneeeooennneeeeeeenneneeenn 13 Kapitel 2 Durchf hren eines SequenzierungslaufS 15 EINIEHUNG ee EE 16 Sequenzierungsworkflow 0222222 17 Eingeben von Laufparametern 2 18 Laden und Vorf llen von Reagenzien 2222222 22 Einsetzen der SequenzierungsflieBzelle 29 berwachen des Laufs 33 Kapitel 3 Verfahren nach einem Laut 35 Einleitung EE 36 Entladen und Wiegen von Reagenzien 37 Durchf hren eines Wartungswaschlaufs 38 Durchf hren eines Wasserwaschlaufs 22 0 41 Schnellformatierung des Ausgabelaufwerks durchf hren 43 Ger t in den Leerlau
4. fung mit einer gebrauchten Flie zelle durchf hren w hlen Sie L sung 2 wobei es sich um Wasser handelt Geben Sie die folgenden Standardwerte ein Volume Volumen 250 Aspirate Rate Aspirationsrate 250 Dispense Rate Zufuhrrate 2000 W hlen Sie Pump Pumpe Wenn Sie die Fluidikpr fung unterbrechen m ssen w hlen Sie Pause Inspizieren Sie die Flie zelle auf Luftblasen die die Lanes passieren sowie auf Undichtigkeiten in der N he der Manifolds Wenn eine erh hte Anzahl an Luftblasen vorliegt berpr fen Sie die Manifold Dichtungen auf Behinderungen senken Sie die Aspirationsrate auf 100 und pumpen Sie weitere 250 ul Wasser in die Flie zelle Teile Nr 15066496 Rev ADEU Anhalten oder Abbrechen eines Laufs Die Optionen zum Unterbrechen bzw Beenden eines Laufs auf dem HiSeq 4000 System unterscheiden sich von den Optionen auf anderen HiSeq Ger ten Beim Beenden eines Laufs gibt es keine Option Daten zu speichern oder den Lauf wieder aufzunehmen Unterbrechen eines Laufs Sie k nnen einen Lauf im Lauf bersichtsbildschirm anhalten Das Unterbrechen eines Laufs ist ggf erforderlich um die Laufkomponenten zu berpr fen oder um einen Lauf auf der benachbarten Flie zelle zu konfigurieren Weitere Informationen finden Sie unter Gestaffelte L ufe auf Flie zelle A und Flie zelle B auf Seite 63 Beim vor bergehenden Unterbrechen eines Laufs kann dieser ohne Datenverlust fortgesetzt werden RTA v2 nimmt die Ve
5. oder Back Zur ck um die Parameter zu ndern HiSeq 4000 Systemhandbuch 2 1 ulajaweledine7 uo uaqeBuly Laden und Vorfullen von Reagenzien Nach der Eingabe der Laufparameter sind die n chsten Schritte f r die Laufkonfiguration das Laden der SBS Indizierungs und Paired End Reagenzien sowie das Vorf llen der Reagenzien durch das Fluidiksystem Die Software f hrt Sie in mehreren Voreinstellungsbildschirmen auf der Registerkarte Pre Run Setup Vorlaufkonfiguration durch diese Schritte Von Illumina bereitgestellte Verbrauchsmaterialien Acht Trichterverschl sse Vom Benutzer bereitzustellende Verbrauchsmaterialien 250 ml Flasche Corning Katalognr 430776 Konische 15 ml R hrchen Corning Katalognr 430052 Wasser in Laborqualit t HINWEIS Laden Sie zum Vorbereiten der Sp lung nach dem Sequenzierungslauf 25 ml PW1 oder Wasser in Laborqualit t in Position 2 Die Sp lung nach dem Lauf ersetzt nicht den Ger tewaschlauf nach dem Lauf Laden von SBS Reagenzien 1 Invertieren Sie jede Flasche mehrmals um sicherzugehen dass die Reagenzien gr ndlich gemischt werden Durchf hren eines Sequenzierungslaufs 2 Nehmen Sie den Verschluss von jeder Reagenzienflasche ab und setzen Sie einen Trichterverschluss auf 3 ACHTUNG y Nach dem Kontakt mit der HCM Flasche m ssen Sie die Handschuhe entsorgen und neue Handschuhe anziehen 3 Halten Sie das Gewicht der einzelnen Reagenzien im Laborkontrollformular fest
6. 14 HPM HT Amplifikations Vormischung 15 HDR HT Denaturierungsmischung enth lt Formamid 16 HP11 Primer Mischung Read 2 HiSeq 4000 Systemhandbuch 2 3 usizuabesy uon ua njioA pun Uape7 Durchf hren eines Sequenzierungslaufs Position Reagenzien Beschreibung 17 HP14 Indizierungsoligomischung 18 Pw1 10 ml PW1 oder Wasser in Laborqualit t 19 Pw1 10 ml PW1 oder Wasser in Laborqualit t HP14 ist nur f r indizierte L ufe erforderlich Falls HP14 nicht verwendet wird laden Sie ein konisches 15 ml R hrchen mit 10 ml PW1 oder Wasser in Laborqualit t 7 Schieben Sie den Reagenzien Rack in die Reagenzienkammer indem Sie ihn an der erh hten F hrung unten in der Kammer ausrichten 8 Senken Sie die Sipper wie folgt in die Paired End Reagenzr hrchen ab a Ziehen Sie den Griff zu sich hin und dr cken Sie ihn dann nach unten b Inspizieren Sie die Sipper um sicherzustellen dass sie beim Eintauchen in die R hrchen nicht verbogen werden c Schieben Sie den Griff in die Aussparung am unteren Ende der Schiene 9 W hlen Sie Next Weiter Vorf llen von Reagenzien 24 Die Schritte zum Vorf llen der Reagenzien umfassen das Reinigen des Flie zellenhalters das Laden der Primer Flie zelle das Verifizieren des ordnungsgem en Flusses und abschlie end das Starten des Vorf llvorgangs Reinigen des Flie zellenhalters 1 ffnen Sie die T r der Flie zellenkammer a ACHTUNG Es d rfen keine Fl ssigkeiten auf der T
7. E CGACGAAAAGAATGA ee TACCATTAAGAGCTACCGTGCAACAGTAACACACTTCT AAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCAT TAAGAGCTACCGTGCAACGACGAAAAGAATG TGATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAG ATTACTTGAT CCAGT GAL CANCG TA CCGTAACGAACGTATCAATTGAGACT Gel GTTAACCTTAAGA TACTTGATOCACIGAFTCAAO e NV A E E EE AACGTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGCTTCTGTTAACCTTAAGATT en TCAATTGAGACTAGCAACGAC GAAAAGAATGAT ARCA IUT GTTAACCTIAAGATTACTTGATCCACT SE ACCGTAAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTAC TGATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTCTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAAC GEN kees EE eeler Eeer WEE CCGTGCAACGA ERS LATS A GAAAAGAATGAT CACAC AACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTAC ACOAT TAAGAGC TACCO GAACAGTAACACAGT CTO AGO A GAT ACT GATOGAGT GA CAAGTACOGIAACGAAGE AI AA CAGACTARATA IRACGTACCAT TAAGAGOTACCOT LAC UACCAMRAGAATEATR TGATAACAGTAACACACTTI SR SW AACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGT re CGTA de CT ARA ACCATTAAGAGCTACCGTCTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAAC CTTGATCCACTGATTCAACGTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGCTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGT DEN ICAATTGAGACT AAA ARC OAS GATAAGA CTGTTAACCTTAAG AAC TOA CCACIOA TOAACOTACCOTAACCAACOTAYOAATIGAGAC Y AAATATTAACG TACCATTAAGAGCTACCGTGCAACGAAAAGAATGATAACAG
8. Laufs nicht zum Ger t zur ckkehren um Reagenzien zu laden Durchf hren eines Sequenzierungslaufs Lagern Sie die verpackte Flie zelle mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur bevor Sie die Folienverpackung entfernen Weitere Informationen finden Sie in den folgenden Handb chern zur Reagenzienvorbereitung Hiseg 3000 4000 Cluster Kit Referenzhandbuch Teile Nr 15066495 Hiseg 3000 4000 SBS Cluster Kit Referenzhandbuch Teile Nr 15066494 Gestaffelte L ufe Sie k nnen einen neuen Lauf auf Flie zelle A bzw Flie zelle B starten w hrend auf der benachbarten Flie zelle gerade ein Lauf ausgef hrt wird Weitere Informationen finden Sie unter Gestaffelte L ufe auf Flie zelle A und Flie zelle B auf Seite 63 1 6 Teile Nr 15066496 Rev ADEU Sequenzierungsworkflow Bereiten Sie die Flie zelle und die Reagenzien f r den Lauf vor Weitere Informationen finden Sie unter Vorbereitung der Flie zelle und der Reagenzien auf Seite 16 Geben Sie die Laufparameter gem den Anweisungen auf der Benutzeroberfl che der Steuerungssoftware ein Wiegen Sie die Reagenzien Laden Sie die SBS Reagenzien f r Read 1 und Read 2 die Indizierungsreagenzien falls anwendbar und die Paired End Reagenzien berpr fen Sie mit einer gebrauchten Flie zelle den ordnungsgem en Fluss F llen Sie die SBS Reagenzien vor und messen Sie den Vorf llabfall Laden Sie eine Hiseq 3000 4000 Cluster Flie zelle und berpr fen Sie den
9. USA 1 800 809 ILMN 4566 1 858 202 4566 au erhalb von Nordamerika techsupport illumina com www illumina com
10. USB Kabel des Barcodescanners und der Maus an die USB Ports auf der Vorderseite des Computers an HiSeq 4000 Systemhandbuch d Uberblick HiSeq 4000 Software Auf dem Ger tecomputer sind drei Software Anwendungen installiert HiSeq 4000 Control Software Die Benutzeroberfl che der HiSeq Control Software HCS f hrt Sie durch die Schritte f r die Einrichtung eines Sequenzierungslaufs W hrend des Laufs steuert die Software die Ger te Hardware und die Fluidik legt Temperaturen fest und liefert eine visuelle Zusammenfassung von Qualit tsstatistikwerten Echtzeitanalyse Software Die in die Steuerungssoftware integrierte Echtzeitanalyse RTA Software f hrt das Base Calling durch und weist jeder Base f r jeden Zyklus einen Qualit ts Score zu Weitere Informationen hierzu finden Sie unter Echtzeitanalyse auf Seite 47 Sequenzierungsanalyse Viewer Software Der Sequenzierungsanalyse Viewer SAV liefert detaillierte Qualit tsstatistikwerte Benutzeroberfl che der HiSeq 4000 Control Software Der Begr ungsbildschirm ist in zwei Bereiche unterteilt einen f r jede Flie zelle Sie k nnen ber die Benutzeroberfl che der Software einen Lauf f r Flie zelle A und einen Lauf f r Flie zelle B parallel einrichten Sie k nnen auch voneinander unabh ngige L ufe ber die Benutzeroberfl che der Software konfigurieren Im Begr ungsbildschirm stehen Befehle zum Starten eines Sequenzierungslaufs Waschen des Ger ts und Durchf hren
11. bereits aufgenommen wurden Fluidikdiagramm Erweitern Sie den Fluidikabschnitt und berwachen Sie die chemischen Schritte Laufkonfiguration berpr fen Sie die Parameter des aktuellen Laufs Analysediagramm berpr fen Sie die Qualit ts Scores pro Zyklus Bilddiagramm berpr fen Sie die Intensit ten pro Zyklus F r jeden gescannten Bildstreifen wird nur ein Miniaturbild dargestellt Die anderen Bilder werden in der Benutzeroberfl che der Software nicht angezeigt Bericht zur ersten Base Wenn Sie w hrend der Einrichtung des Laufs die Option Confirm First Base Erste Base best tigen aktiviert haben wird das Best tigungsdialogfeld f r die erste Base automatisch nach Abschluss des zweiten Zyklus angezeigt Der Lauf wird an diesem Punkt angehalten 1 berpr fen Sie den Bericht zur ersten Base im Best tigungsdialogfeld 2 Wenn die Ergebnisse zufriedenstellend sind w hlen Sie Continue Fortfahren Sequenzierungsanalyse Viewer Die Sequenzierungsanalyse Viewer Software zeigt die Sequenzierungskennzahlen die w hrend des Sequenzierungslaufs generiert werden Die Kennzahlen werden in Form von Schaubildern Diagrammen und Tabellen dargestellt Der Sequenzierungsanalyse Viewer wird automatisch ge ffnet wenn die Laufkennzahlen verf gbar sind W hlen Sie zu einem beliebigen Zeitpunkt w hrend des Laufs Refresh Aktualisieren um aktualisierte Kennzahlen zu erhalten Weitere Informationen finden Sie im Sequenzierungsana
12. einer Systempr fung zur Verf gung Nach Abschluss eines Laufs werden Sie aufgefordert einen Waschlauf f r das Ger t durchzuf hren Nach dem Waschlauf zeigt die Software wieder den Begr ungsbildschirm an Abbildung 5 Begr ungsbildschirm Welcome d Welcome Pense select re apropiate cator lo start Pease rei ise NEO opon 1 s Men schaltfl che des Begr ungsbildschirms Benutzeroberfl chenbereich f r Flie zelle A Benutzeroberfl chenbereich f r Flie zelle B Aktivit tsanzeigen Dom P Befehle des Begr Bungsbildschirms Zu den Befehlen des Begr ungsbildschirms geh ren Sequence Sequenzieren Wash Waschlauf und Check Pr fen 5 Teile Nr 15066496 Rev ADEU Sequence Sequenzieren W hlen Sie Sequence Sequenzieren um einen neuen Sequenzierungslauf einzurichten Abbildung 6 Optionen unter Sequence Sequenzierung Wash Waschlauf W hlen Sie Wash Waschlauf um einen Ger tewaschlauf oder einen Wartungswaschlauf zu starten Abbildung 7 Optionen unter Wash Waschlauf Water Wash Wasserwaschlauf Bei einem Wasserwaschlauf wird das System mit Wasser gesp lt Ein Wasserwaschlauf ist erforderlich wenn das Ger t seit mindestens einem Tag nicht verwendet wurde Er kann optional nach jedem Sequenzierungslauf durchgef hrt werden Weitere Informationen hierzu finden Sie unter Durchf hren eines Wasserwaschlaufs auf Seite 41 Maintenance Wash Wartungswaschlauf Der Wartungswa
13. finden Sie in Read 1 Primer Rehybridisierung auf einer Hiseg 3000 4000 Flie zelle Teile Nr 15058794 Fehlerbehebung 6 A Teile Nr 15066496 Rev ADEU Index PF 52 A Aktivit tsanzeigen 9 Ausgabelaufwerk Schnellformatierung 43 Ausgabeordner Optionaler Speicherort 18 Standardspeicherort 10 Ausschalten des Ger ts 45 B BaseSpace SE 50 Lauf berwachung 18 Probenblatt 11 20 Speicherung und Analyse 18 Begr ungsbildschirm 8 Befehle 9 Men 10 Bericht zur ersten Base 33 Berichte Integration der ersten Base 33 Bilder Miniaturbilder 18 55 Speichern von Bilderproben 18 Ube machun 33 Bildschirm zur Einrichtung der Flie zelle 19 C Chemische Schritte berwachung 33 Cluster nach Filterung 52 Clusterintensit ten 3 D Datenkomprimierung 54 Daten bertragung Netzwerkspezifikationen 50 Dokumentation 13 69 DoNotEject Laufwerk 7 Doppelte Indizierun Auf Paired End Flie zelle 19 Einstellungen im Rezepturbildschirm 19 E Echtzeitanalyse Phasierung 52 Qualit ts Score 53 Echtzeitanalyse Software 8 RTA v2 Unterschiede 48 Echtzeitanalyse Workflow 51 Empirische Phasierung 52 HiSeq 4000 Systemhandbuch xopul Erste Base best tigen 19 Fehler und Warnungen In Ausgabedateien 50 Statussymbole 10 Fehlerbehebung 59 Fluidik 60 Laden von Flie zellen 59 Registrierung 51 Fehlerwahrscheinlichkeit 53 Flie zelle Einsetzen 29 Fehlerbehebung 59 Flie zellen ID 19 Flie zellenhalter 24 Regle
14. folgenden Standardeinstellungen f r die Chemie Diese Felder werden entsprechend dem gew hlten Indextyp automatisch ausgef llt a SBS Hiseq 3000 4000 SBS Kit Hiseq 3000 4000 SBS Kit Gibt die SBS Chemie an die f r Read 1 und Read 2 verwendet wird b Index Hiseq 3000 4000 Sequencing Primer Hiseq 3000 4000 Sequenzierungs Primer oder HiSeq 3000 4000 Dual Index Sequencing Primer HiSeq 3000 4000 Doppel Index Sequenzierungs Primer Gibt die Chemie an die f r Index Reads verwendet wird c PE Turnaround HiSeq 3000 4000 PE oder HiSeq 3000 4000 PE Dual Index HiSeq 3000 4000 PE Doppel Index Gibt die Chemie an die f r die Paired End Resynthese verwendet wird Aktivieren Sie das Kontrollk stchen Existing Recipe Vorhandene Rezeptur wenn Sie eine benutzerdefinierte Rezeptur verwenden m chten Lassen Sie ansonsten zu dass die Software eine Rezeptur auf Basis der Informationen erstellt die Sie in den Einrichtungsbildschirmen des Laufs eingegeben haben Illumina empfiehlt den Rezepturassistenten zu verwenden um die Rezeptur auf Basis der Informationen zu erstellen die Sie im Rezepturbildschirm eingeben Bildschirm Sample Sheet Probenblatt Probenbl tter sind optional es sei denn Sie verwenden BaseSpace um eine Datenanalyse durchzuf hren 1 2 W hlen Sie Browse Durchsuchen um zum Speicherort der Probenbl tter zu navigieren W hlen Sie Next Weiter Bildschirm Reagents Reagenzien Im Bildschi
15. zelle freizugeben Abbildung 18 Flie zellenregler in Position 0 i LE Heben Sie die gebrauchte Flie zelle aus der Halterung Reinigen des Flie zellenhalters 1 2 Ziehen Sie ein neues Paar ungepuderte Latexhandschuhe an Wischen Sie die Oberfl che des Flie zellenhalters vorsichtig mit einem Alkoholtupfer oder einem fusselfreien mit Ethanol oder Isopropanol befeuchteten Tuch ab bis er sauber ist HiSeq 4000 Systemhandbuch 2 9 a ezgeysBbunJaizuanbas Jop uszjesuly a ACHTUNG Es darf kein Alkohol in die Vakuum ffnungen oder auf die Umgebung der Manifolds gelangen Reinigen Sie den Tisch ggf mit einem fusselfreien Tuch Abbildung 19 berpr fen der Vakuum ffnungen 3 Unterziehen Sie den Flie zellenhalter einer Pr fung um sicherzustellen dass sich keine Fussel auf dem Halter befinden und die Vakuum ffnungen nicht blockiert werden Einsetzen der Sequenzierungsflie zelle y HINWEIS f Ersetzen Sie die Manifold Dichtungen nicht 1 Legen Sie die Flie zelle so auf den Flie zellenhalter dass die Einlass und Auslassanschl sse nach unten weisen und der Barcode sich auf der rechten Seite befindet Stellen Sie sicher dass der Pfeil am linken Rand der Flie zelle in Richtung Ger t zeigt Durchf hren eines Sequenzierungslaufs 2 Schieben Sie die Flie zelle vorsichtig bis zum Anschlag in Richtung des oberen und der rechten F hrungsstifte Abbildung 20 Fliefizelle an oberem und rechten F hrungssti
16. 94 sterreich 0800 296575 Finnland 0800 918363 Schweden 020790181 Frankreich 0800 911850 Schweiz 0800 563118 Gro britannien 0800 917 0041 Spanien 900 812168 Irland 1 800 812949 Andere L nder 44 1799 534000 Materialsicherheitsdatenbl tter Sicherheitsdatenbl tter SDS Safety Data Sheets stehen auf der Illumina Website unter support illumina com sds html zur Verf gung Produktdokumentation Die Produktdokumentation steht auf der Illumina Website im PDF Format zum Herunterladen zur Verf gung Gehen Sie zu support illumina com w hlen Sie ein Produkt aus und klicken Sie anschlie end auf Documentation amp Literature HiSeq 4000 Systemhandbuch 6 Q Bunzinisio uN y siuy 2 Ee O A A E EE E GATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTCTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGT SE SRE CE LAS NE RUE E PA NO EE RO RE A RE AAAAGAN AACAGTAACA TTCTGTTAACCTT TTACTTGATCCACTGATTCAACGTACC TTACTTGATCCAC TACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACT AACGTACCATTAAGAGCTACC EE EE ES AC TAC Ae E E EA E TTGAGA ACTRAATATTAACGTAS ACCAT MAA GAGE ACOTO OT ET TANGETI e GATCCACTGATTCAACG EEE ES SE IST E Ee GTTAACCTTAAGAT TACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTA ATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACTTAACCTT TTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTCTTCTGTT AAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAACGACGA EE e A e GATTCAACGTACCGTAACGAA CTA ATCAATTOREN ACY AAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTGCAACGACGAAAAGAATGAT
17. AACAGTAACACA GATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGT TRATT OAA EAN PCR NO a A ANR GES A EAST RAC AT TACTTGATCCACTGATT Ed CAATTGAGACT TTAACGTACCATTAA SEH CCGTGCAACGACGAACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGAT en GAAAATAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACT ee ACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAGCTACCGTGCAACGACGAAAAGAATGAT GAATGATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAGA RTROTT AT CAC GA CAACOTACCOTAMAGATTACTTGAICCACTGATICAACGTAOOO AA SCAATG TAC SE AAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACC SATAACAGTAACACACTICTGTIAACCTIAAGA e d ee ACCGT A EN CT GET E e CGAAAAGAATGATAACAGTAACACA QUE det CCATTAAGAGCTACCGTGCAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTGCAACGACGAAAAGAAT GAT SATAACAGT AACACAC CTO TRAGO AAGAT TAG TGATOCACIGA TOAACOTACOGIAACOAACGIAT CAI GAGACTAATA ENEE STACCGT E SY TOY KE TCAATTGAGA FAMA ET ee EE CCGTGCAACGACGAAAAGAATGA Ee e CACTTCTGTTAACCTT gt TTGATCCACTGATTCAACG TTACTTGATCCACTGATTCAACGTA AACGAACGTATCAATTGAGCTTCTGTTAACCTT TTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTA BEE AAAAGAATI AAC AA E AACCTTAAGATTACTTGAT ATEN TACO TACGOTAAMOA TACTO OCACIGATTOAACGT ACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGT ACCAT TAAGAGCTACG NASEN E NE OR OS as GTACCGTAACGAACGTATCATTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAA O TAAATAT TAACGTACCATTAAGAGCTACCGTGCAACGACGAAAAGAA elle ACTTI AACCTT AAAAGAATGATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTT ASA TACTTGAS CCACT GATTCAACGTACCGTAAAGATT
18. ACTTGA P CACT ERIC AAC GTACCGTAACGAACGTATCAATTGA SA Sr e CCATTAAGAGCTACCGTGCAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAGA ITAS ITGA ECAC ALTO AAC E ACTA CAGE TT CAN CAGACTARATA TRA CG TACCATAAGAGOTACOO TOCAACOACGAMMAGAAT GARA GATAACAGTAACACACTTI pel FUA AACCTTAAGA ANE E ACCGTAACGAA N RAA TAGS CTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTCTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACG gt TTGATCCACTGATTCAA GATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAA GCTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAGCAACGACG AATTOAGACTRAATA TAACOIAOCATIAAGAGT CTG TIMA GOTIAAGATIACTIGATCCACTGAT CAAATAGOGTAACOAAC EE EE RO ER LEE A EE GE AACGAACGTATCAATTGAGACTAAA SE DT ER REIS LE CGAAAAGAATGAT e E CCTT EHE AAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGCTTCTGTTAACC ACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAG ACT GCAACGACO AAT Se E SE EE EE SATAACAGTAACACACTTCT GTTAACCTTAAGA AH A TTAAGAGCTACCGTCTTCTGTTAACCTIAAGATTACTITGATCCACTGATTCAACGTACCGT gt ACTGATTCAACGTACCAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTCTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGA AAAAGAATGATAACAGTAACACACTTCTGTT ACA E EE TACTTGATOCACTCATICAAOSTACOCIAACCAACOTATCAATIGAGACT AAATATTAACGT ACCATIAAGAGCTACO GATAACAGTAACACACTTCT Ree Hee ACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGT ESTATE LIET Se EE TGAGACTAAATATTAACGTTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTTCTGTTAACCTTAAGATT EEE CGTA ATCAATTGAGACT Ae AE GATTACTTGATC
19. ATTAAGAGSTACGGTECAACSACSAAGTIGTSTTAACETTAAGAT V ACTTGA dE RG ITS Te TE e CIP GAAAAG GAAAAGAATGATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAGATT GATCCACTGATTCAACGTACCGTAAAGATTACTTGAT TGATAACAGTAACACACTTCTGTTAA Ass eer GATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTA TACCATTAAGAGCTACCGTGCAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGA TGATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGT Eh e DGTACCGTAACGAACGTATCATTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAA d e Ee GAAAAGAATGATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAAAGATTACTTGATG z ga O NUR F R FORSCHUNGSZWECKE ILLUMINA EIGENTUMSRECHTLICH GESCH TZT Teile Nr 15066496 Rev A DEU Februar 2015 Katalognummer SY 401 9003DOC Anpassen einer kurzen Ende zu Ende Workflow Anleitung mit dem Custom Protocol Selector support illumina com custom protocol selector html Dieses Dokument und dessen Inhalt sind Eigentum von Illumina Inc und verbundenen Unternehmen Illumina und ausschlie lich f r den bestimmungsgem en Gebrauch durch den Kunden in Verbindung mit dem Gebrauch des hier beschriebenen Produkts der hier beschriebenen Produkte und f r keinen anderen Bestimmungszweck ausgelegt Dieses Dokument und dessen Inhalt d rfen ohne schriftliches Einverst ndnis von Illumina nicht verwendet und zu keinem anderen Zweck verteilt bzw anderweitig bermittelt offengelegt oder auf irgendeine Weise reproduziert werden Illumina bertr gt mi
20. Abgegebenes Volumen Abgegebenes S Volumen pro Lane insgesamt Acht SBS Positionen 32 ml 4ml Acht SBS Positionen und zehn Paired End 72 ml 9 ml Positionen 10 Entfernen Sie die Umwicklung von den Abfallschl uchen und setzen Sie die Schl uche wieder in die Abfallflasche ein Teile Nr 15066496 Rev ADEU Schnellformatierung des Ausgabelaufwerks durchf hren Um auf dem Ger tecomputer Speicherplatz f r einen nachfolgenden Lauf freizugeben empfiehlt Illumina eine Schnellformatierung des Ausgabelaufwerks O durchzuf hren nachdem ein Lauf abgeschlossen ist Eine Schnellformatierung l scht das Laufwerk O ohne wichtige System oder Ger tewartungsdateien zu entfernen y Hinweis Ger tewartungsprotokolle werden auf dem Laufwerk C gespeichert Daher kann gefahrlos eine Schnellformatierung von Laufwerk O vorgenommen werden w hrend ein Ger tewaschlauf durchgef hrt wird 1 ffnen Sie in Windows Computer um eine Liste der Computerlaufwerke anzuzeigen 2 Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Laufwerk Ok und w hlen Sie Formatieren 3 Aktivieren Sie im Dialogfeld Formatieren das Kontrollk stchen Schnellformatierung 4 W hlen Sie Start HiSeq 4000 Systemhandbuch A 3 us ynJyolmp sy1amynejeqebsny sap Bun491JeWAOHISUUOS Verfahren nach einem Laut Ger tin den Leerlauf versetzen 44 Gehen Sie wie nachfolgend beschrieben vor wenn das Ger t bis zu zehn Tage im Leerlaufmodus bleiben soll Falls
21. Ar DER Durch das Wiegen der Reagenzien vor und nach einem Sequenzierungslauf kann die tats chliche Reagenzienzugabe ermittelt werden 4 ffnen Sie die T r der Reagenzienkammer 5 Heben Sie die Sipper f r den Sequenzierungsreagenzien Rack wie folgt an a Ziehen Sie den Griff zu sich hin und schieben Sie ihn dann nach oben b Schieben Sie den Sippergriff in die Aussparung am oberen Ende der Schiene Vergewissern Sie sich dass der Sippergriff fest in der Aussparung sitzt 6 Schieben Sie den Reagenzien Rack aus der Reagenzienkammer 7 Platzieren Sie die einzelnen Reagenzienflaschen in die nummerierten Positionen des Racks Stellen Sie sicher dass sich die konische Seite der Flasche in der Aussparung auf dem Boden des Racks befindet 2 pe Teile Nr 15066496 Rev ADEU 10 11 Tabelle 1 SBS Reagenzienpositionen Position Reagenzien Beschreibung 1 HIM HT Inkorporations Mischung 2 PW1 25 ml PW1 oder Wasser in Laborqualit t 3 HSM HT Scan Mischung 4 HB1 HT SBS Puffer 1 5 HB2 HT SBS Puffer 2 6 HB2 HT SBS Puffer 2 7 HCM HT Aufspaltungsmischung 8 HB2 HT SBS Puffer 2 Geben Sie 25 ml PW1 oder Wasser in Laborqualit t in die Flasche in Position 2 Schieben Sie den Reagenzien Rack in die Reagenzienkammer indem Sie ihn an der erh hten F hrung unten in der Kammer ausrichten Senken Sie die Sipper wie folgt in die Sequenzierungs Reagenzienflaschen ab a Ziehen Sie den Griff zu sich hin und dr cken Sie ihn nach unten b Inspiziere
22. Bildstreifen 2 steht f r den zweiten Bildstreifen J HINWEIS Ein Bildstreifen ist eine Plattenreihe innerhalb einer Lane der Flie zelle Die letzten zwei Ziffern stehen f r die Platten 01 bis 28 Die Plattennummerierung beginnt bei 01 am Ausgabeende der Flie zelle bis 28 am Eingabeende Abbildung 28 Plattennummerierung Plattenname Oberfl che lt 1 2 07 Platte 1 oben 01 bis 28 2 unten Bildstreifen 1 Erster 2 Zweiter In diesem Beispiel handelt es sich um eine Platte aus der oberen Oberfl che der Flie zelle den zweiten Bildstreifen und die siebte Platte Teile Nr 15066496 Rev ADEU Fehlerbehebung SE SR de SEa 58 M gliche Probleme bei der Laufkonfiguration 2 59 Durchf hren einer Fluidikpr fung 60 Anhalten oder Abbrechen eines Late 61 Gestaffelte L ufe auf FlieBzelle A und Flie zelleB 63 M gliche Primer Rehybridisierung f r Head 64 mme E A M eg Fun pe d Ness o d rre ra w HiSeq 4000 Systemhandbuch 5 D elle Fehlerbehebung Einleitung Im folgenden Abschnitt wird beschrieben was Sie bei Problemen die w hrend der Durchf hrung eines Sequenzierungslaufs auftreten k nnen tun k nnen Dar ber hinaus enth lt er Anweisungen zur Durchf hrung einer Fluidikpr fung im Begr ungsbildschirm 5 8 Teile Nr 15066496 Rev A DEU Problem Die Software wurde nicht initialisier
23. CACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTCTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAACGACGA SARA NT ASTRO PACA ET RAS GET ARS AT SET TER TE RG GET CAAC TTA C ETAGE NEE CPR TOC o Ee SATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTCTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACG CCATTAAGAGCTACCGTGCAACTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTGCAACGACGAACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGAT Ee e TAC TATORT SET TRETEN ET SARA GARE TA GER CA ET CAC ESA CARACAS N AAAAGAATGATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACC SATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTA SE CGACGAAAAGAATGATAACAGTAACACACTTCTGTI e TT A NE TOT AAC E EE SR a CAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTCTTCTGTTAACCTTAAGA o pue GTACCGTAACGAACGTATCATTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTGCAACGACGAAAAGAATGATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTT TER ELACTENTCHACEN TARGA ACTTGATCCACT GA CAACCTACCGTAACGAACGTATCAALTGARC TETE TAG ET E TAC CS TAG AAC E PNG AAITEA CAC IA RC AAC ER CU AAAAGAATGATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACC Ilumina 5200 Illumina Way San Diego Kalifornien 92122
24. EE 13 me SSL 223 gt gt N e u a at D rege Kg AE m d A ai mt mi _ m aea y pera e ert S gr i amp u ro HiSeq 4000 Systemhandbuch 1 Leyde Uberblick Einleitung Das HiSeq System kombiniert innovative Technik mit bew hrter SBS Technologie und setzt damit neue Standards in puncto Leistung Schlichtheit und Wirtschaftlichkeit Das HiSeq 4000 System umfasst die folgenden Funktionen Bildgebung von zwei Oberfl chen Das HiSeq 4000 System verwendet ein Epifluoreszenzsystem mit zwei Kameras und vier Sensoren das ber eine moderne Scan Technologie zur Darstellung von zwei Oberfl chen ausgestattet ist Strukturierte Flie zelle Das HiSeq 4000 System verwendet eine strukturierte Flie zelle die das Generieren von Sequenzierungs Clustern in einer geordneten Anordnung erm glicht Dies sorgt f r mehr Ausgabe Reads und generierte Daten Zwei Flie zellen Das HiSeq 4000 System ist ein System f r zwei Flie zellen das die Durchf hrung von Sequenzierungen f r eine oder beide Flie zellen gleichzeitig und mit unterschiedlichen Read L ngen erm glicht Reagenzienk hler mit hoher Aufnahmekapazit t Die Reagenzienkammer ist ein hochleistungsf higer K hler der ausreichend Reagenzien f r den gesamten Sequenzierungslauf aufnehmen kann Integrierte Fluidik f r Paired End L ufe Die integrierte Paired End Fluidik liefert Reagenzien aus der Reagenzienkammer f r die Read 2 Resynthese u
25. Flaschen aus dem Reagenzien Rack und dokumentieren Sie das Gewicht auf dem Laborkontrollformular Sie k nnen ein interaktives Laborkontrollformular von der HiSeq 4000 Supportseite der Illumina Website herunterladen a WARNUNG Die Reagenzien enthalten Formamid ein aliphatisches Amid das in Verdacht steht ein fortpflanzungsgef hrdendes Toxin zu sein Es kann daher durch Inhalation orale Aufnahme Kontakt mit der Haut oder Kontakt mit den Augen zu einer Verletzung von Personen kommen Beh lter und nicht verwendeter Inhalt m ssen gem den geltenden Sicherheitsvorschriften Ihrer Region entsorgt werden Weitere Informationen finden Sie im SDS f r dieses Kit unter support illumina com sds html usizuabesy uoan ua alM pun uspejlug HiSeq 4000 Systemhandbuch 3 d Verfahren nach einem Laut Durchf hren eines Wartungswaschlaufs Ein Wartungswaschlauf muss alle zehn Tage und wahlweise nach einem Sequenzierungslauf durchgef hrt werden Illumina empfiehlt einen Wartungswaschlauf nach jedem Sequenzierungslauf Der Bildschirm Load Gasket Dichtung einsetzen ffnet mit einem Wartungswaschlauf alle zehn Tage Ersetzen Sie vor dem Waschlauf die Dichtungen im vorderen und hinteren Manifold Ein Wartungswaschlauf dauert ca 2 5 Stunden Dabei wird das System mit einer vorbereiteten L sung aus Tween 20 und ProClin 300 gesp lt Vom Benutzer bereitzustellende Verbrauchsmaterialien Ethanol Tupfer Acht Flaschen 250 ml Corning Katalog
26. Seite 61 berblick ber das Probenblatt Das Probenblatt ist eine benutzergenerierte Datei im csv Format in der Informationen zum Sequenzierungslauf gespeichert werden Wenn der Lauf beginnt kopiert die Software das Probenblatt in den Laufordner wo es sp ter zu Analysezwecken verwendet wird HiSeq 4000 Systemhandbuch 1 1 SJEMYOS 000r7 BSSIH berblick Probenbl tter sind optional es sei denn Sie verwenden BaseSpace um eine Datenanalyse durchzuf hren Verwenden Sie den Illumina Experiment Manager IEM zum Erstellen eines Probenblatts bevor Sie den Lauf starten Verf gbarer Speicherplatz 12 Am Anfang des Laufs pr ft die Software den freien Speicherplatz auf dem lokalen Laufwerk O Ausgabelaufwerk Um einen Lauf durchzuf hren sind mindestens 2 TB erforderlich Wenn der verf gbare Speicherplatz w hrend des Laufs den sicheren Grenzwert unterschreitet stoppt die Software den Lauf und versetzt die Flie zelle in einen sicheren Status Nachdem Speicherplatz verf gbar gemacht wurde wird der Lauf automatisch fortgesetzt Illumina empfiehlt eine Schnellformatierung des Ausgabelaufwerks O 1 durchzuf hren nachdem ein Lauf abgeschlossen ist um das Laufwerk f r den nachfolgenden Lauf zu l schen Weitere Informationen finden Sie unter Schnellformatierung des Ausgabelaufwerks durchf hren auf Seite 43 Teile Nr 15066496 Rev ADEU Weitere Ressourcen Die folgenden Dokumente stehen auf der Website von Illumi
27. T e A EE E E CTTGATCCACTGATTCAACGTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGCTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAGCAACGAC AAAAGAATGA TAACACTAACACACTICT GTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTAC TGATMGAGTMCACACTGTGTIMACOTTAAGALTACTTGTTGATCCACTGATTCAACBTACCGTATCAAT TGAGACTAAATAT TAAGGTACCAT TAAGAGCTACCGTOTTCTGTIAACCT TAAGATTACTIGATCCACTGATTGAAGGTACC gt CACTGATTCAACGTACCAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTCTTCTGTTAACCTTAAGA LE PARA SH ACCGTAACG GAAAAGAATGATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTT AAA TEO CACTOATICAACO TACCGTAAAGATTACTTGATCCACTGAT TCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCAT TAAGAGCTAC RETTET TR e E e a FO AA T TGAGACTAAATATTAACGTTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTTCTGTTAACCTTAAGATTA EE M r NN Te TILASC TIAA GATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTCTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAACGACG AGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTGCAACGACGAAAAGAATGATAACAGTAACAC a AACACACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTCTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAAC TACCATTAAGAGCTACCGTGCAACTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGT AACGARCOTATCAAT TGAGACTABATATTAASSTACC
28. aschen und r hrchen mit der Waschl sung zu f llen bzw nachzuf llen Teile Nr 15066496 Rev ADEU Tween 20 und ProClin 300 Waschlauf 1 10 11 W hlen Sie im Begr ungsbildschirm die Option Wash Maintenance Waschlauf Wartung Wenn Sie die Wartungswaschlaufl sung eines vorherigen Laufs aufbewahrt haben f llen Sie die aufbewahrte Waschl sung auf und invertieren Sie sie zum Mischen Bereiten Sie andernfalls die Waschlaufkomponenten wie folgt mit frischer Waschl sung vor a F llen Sie acht SBS Flaschen mit 250 ml Wartungswaschlaufl sung F llen Sie zehn PE R hrchen mit 12 ml Wartungswaschlaufl sung c Weisen Sie jeder Flasche und jedem R hrchen eine Position im Reagenzien Rack zu und behalten Sie diese f r die nachfolgenden Waschl ufe bei Anderenfalls k nnte die Waschl sung mit Reagenzien aus den Sippern kontaminiert werden Laden Sie die Flaschen und R hrchen in die zugewiesenen Positionen des Reagenzien Racks im Ger t W hlen Sie Next Weiter Entfernen Sie die Flie zelle vom Flie zellentisch und legen Sie sie beiseite bis Sie dieselbe Flie zelle erneut laden bevor Sie den Waschlauf starten Ziehen Sie ein neues Paar Schutzhandschuhe an und dr cken Sie leicht auf eine Seite der Dichtung bis die andere Seite passt Verwenden Sie eine Pinzette um die Dichtung zu fassen und zu entfernen Entfernen Sie die hintere Dichtung auf dieselbe Weise Abbildung 24 Entfernen der gebrauchten Manifold Dich
29. ase Call Dateien Clusterpositionsdateien Filterdateien InterOp Dateien RTA Konfigurationsdatei Laufinformationsdatei Miniaturbilddateien HiSeq 4000 Systemhandbuch Dateibeschreibung Speicherort und Name Die Analyseergebnisse der einzelnen Platten werden in Base Call Dateien gespeichert Sie enthalten den Base Call und den kodierten Qualit ts Score Data Intensities BaseCalls LO0 X Die Dateien f r jede Platte werden pro Zyklus in den jeweiligen Ordnern gespeichert s_ Lane _ Platte bcl gz wobei Lane der Platzhalter f r die einstellige Nummer der Lane und Platte der Platzhalter f r die vierstellige Plattennummer ist Die Base Call Dateien werden mit dem gzip Tool komprimiert Die Clusterpositionsdateien f r die einzelnen Platten enthalten die X und Y Koordinaten jedes Clusters Clusterpositionsdateien werden bei der Matrizenbildung generiert Data Intensities Eine Datei f r den gesamten Lauf wird im Ordner Intensities gespeichert s locs Die Filterdatei gibt an ob ein Cluster die Filter passiert hat Filterdateien werden bei Zyklus 26 generiert und verwenden 25 Datenzyklen Datal Intensities BaseCalls1 LOO X Die Dateien werden pro Lane und Platte in einem entsprechenden Ordner gespeichert s_ Lane _ Platte filter Bin re Berichtsdateien die im Sequenzierungsanalyse Viewer verwendet werden InterOp Dateien werden w hrend des Laufs aktualisiert InterOp Ordner Die RTA Konfigu
30. chen Sie die Oberfl che des FlieRzellenhalters vorsichtig mit einem Alkoholtupfer oder einem fusselfreien mit Ethanol oder Isopropanol befeuchteten Tuch ab bis er sauber ist Y ACHTUNG Es darf kein Alkohol in die Vakuum ffnungen oder auf die Umgebung der Manifolds gelangen Reinigen Sie den Tisch ggf mit einem fusselfreien Tuch Geben Sie 10 ml Wasser in Laborqualit t in jede Reagenzienposition in den Reagenzien Racks Senken Sie dann die Sipper in das Wasser ab Schalten Sie das Ger t aus Um das Ger t wieder zu starten geben Sie Wasser in alle Reagenzienpositionen schalten Sie das Ger t ein und f hren Sie einen Wasserwaschlauf durch Weitere Informationen finden Sie unter Durchf hren eines Wasserwaschlaufs auf Seite 41 HiSeq 4000 Systemhandbuch 4 5 S 2199 sep uayeyossny 46 Teile Nr 15066496 Rev A DEU Echtzeltanalyse Einleitung 48 berblick ber RTA V2 2 49 Echtzeit analyse Worktl W eebe SEENEN e dE ENEE Seed SE 51 Sequenzierung von Ausgabedateien 55 Plattennummerierung Loc iii eee eee eee eeeeeeececcecee 56 ne u MT e SE Frs Bee EE eh ur en race rar Ka HiSeq 4000 Systemhandbuch A7 Glace Echtzeitanalyse Einleitung 48 Die Echtzeitanalyse Software f hrt w hrend des Sequenzierungslaufs auf dem Ger t eine Bildanalyse und ein Base Calling durch wodurch wertvolle Zeit bei der ansc
31. das Ger t l nger als zehn Tage nicht verwendet werden soll lesen Sie den Abschnitt Ausschalten des Ger ts auf Seite 45 1 F hren Sie einen vollst ndigen Wartungswaschlauf durch um das System gr ndlich zu sp len Weitere Informationen finden Sie unter Durchf hren eines Wartungswaschlaufs auf Seite 38 2 Lassen Sie die Flie zelle auf dem FlieRzellentisch wobei sich der Flie zellenregler in Position 2 befinden muss Die Manifolds bleiben in der angehobenen Position 3 Geben Sie 10 ml Wasser in Laborqualit t in jede Reagenzienposition in den Reagenzien Racks Senken Sie dann die Sipper in das Wasser ab 4 Schalten Sie das Ger t nicht aus 5 Bevor Sie das Ger t erneut verwenden f hren Sie einen Wasserwaschlauf durch Weitere Informationen finden Sie unter Durchf hren eines Wasserwaschlaufs auf Seite 41 Teile Nr 15066496 Rev ADEU Ausschalten des Ger ts Schalten Sie das Ger t nur aus wenn es innerhalb der n chsten zehn Tage oder l nger nicht benutzt werden soll Wenn Sie das Ger t innerhalb der n chsten zehn Tage verwenden m chten lesen Sie den Abschnitt Ger t in den Leerlauf versetzen auf Seite 44 Gehen Sie wie folgt vor um die Fluidik sicher vorzubereiten und das System auszuschalten 1 F hren Sie einen Wartungswaschlauf durch um das System zu sp len Weitere Informationen finden Sie unter Durchf hren eines Wartungswaschlaufs auf Seite 38 2 Entfernen Sie die Flie zelle vom Flie zellentisch 3 Wis
32. die Reinigungsschritte Stellen Sie sicher dass die Dichtungen vorhanden sind und gut sitzen Setzen Sie die Flie zelle wieder ein Falls die vorhergehenden Schritte nicht zum Erfolg f hren ersetzen Sie die Dichtungen und setzen Sie anschlie end die Flie zelle erneut ein Stellen Sie den Flie zellenregler auf Position 2 Positionieren Sie die Flie zelle neu und berpr fen Sie ob die L cher nach unten zeigen Suchen Sie im Bereich der Dichtungen nach wei en Ablagerungen Falls Ablagerungen vorhanden sind tauschen Sie die Dichtungen aus Tauschen Sie die Dichtungen vor jedem Ger tewartungswaschlauf aus berpr fen Sie ob die Sipper Einheiten vollst ndig abgesenkt wurden und jeder Sipper in Kontakt mit den Reagenzien ist 59 uoneinBiuoyneT 1p 19q w qold SU9II5ON 1 2 Fehlerbehebung 60 Durchf hren einer Fluidikpr fung ber die Schaltfl che Check Pr fung im Begr ungsbildschirm k nnen Sie eine Fluidikpr fung durchf hren Verwenden Sie diese Option w hrend der Ger teinstallation und der Behebung von Fluidik Fehlern Setzen Sie eine gebrauchte Flie zelle in das Ger t ein Laden Sie acht SBS Flaschen mit PW1 oder Wasser in Laborqualit t und laden Sie die Flaschen auf den entsprechenden Reagenzien Rack Laden Sie den Rack in das Ger t W hlen Sie im Begr ungsbildschirm die Option Check Pr fung W hlen Sie L sung 5 HB2 aus der Dropdown Liste aus Wenn Sie eine Fluidikpr
33. dschirm HiSeq 4000 Systemhandbuch 2 T usizuabBesy UOA u jN oA pun Uape7 Durchf hren eines Sequenzierungslaufs 28 Messen Sie nach Abschluss des Vorf llvorgangs den gesammelten Abfall und berpr fen Sie ob das Volumen in jedem R hrchen 1 75 ml bzw insgesamt 14 ml betr gt Das Gesamtvolumen wird wie folgt berechnet 250 ul f r jede SBS Position aufer Position 2 250 x 7 1 75 ml 1 75 ml f r jede Lane 1 75 x 8 14 ml Halten Sie die Ergebnisse im Laborkontrollformular fest Bevor Sie fortfahren setzen Sie die Abfallschl uche wieder in den Abfallbeh lter ein W hlen Sie Next Weiter Teile Nr 15066496 Rev ADEU Einsetzen der Sequenzierungsflie zelle Zu den Schritten zum Einsetzen der Cluster Flie zelle geh ren das Entfernen der zum Vorf llen verwendeten Flie zelle das Reinigen des Flie zellenhalters das Reinigen und Einsetzen der Flie zelle in das Ger t sowie das Verifizieren des ordnungsgem en Flusses Vom Benutzer bereitzustellende Verbrauchsmaterialien gt gt gt gt Reinigungst cher f r Objektive 70 iges Ethanol oder Alkoholtupfer Fusselfreie Labort cher Eine Kunststoffzange Entfernen der gebrauchten Flie zelle 1 3 Bewegen Sie den Flie zellenregler langsam in Position 1 um die Manifolds zu l sen Abbildung 17 Flie zellenregler in Position 1 Bewegen Sie den Flie zellenregler langsam in Position 0 um die Vakuumdichtung zu l sen und die Flie
34. e Speicherung W hlen Sie Connect to BaseSpace Mit BaseSpace verbinden um den Lauf mit BaseSpace zu verbinden W hlen Sie eine Einstellung f r BaseSpace aus Storage and Analysis Speicherung und Analyse Sendet zwecks Remote berwachung und Datenanalyse Laufdaten an BaseSpace Zur Verwendung dieser Option ist ein Probenblatt erforderlich Sy HINWEIS Bevor Sie diese Option ausw hlen vergewissern Sie sich dass Sie ber eine ausreichende Netzwerkbandbreite verf gen um die Laufdaten an BaseSpace zu senden Weitere Informationen finden Sie im HiSeq 4000 und HiSeq 3000 Handbuch zur Standortvorbereitung Teile Nr 15066492_DEU Run Monitoring Only Nur Lauf berwachung Sendet nur InterOp Dateien an BaseSpace sodass Sie Ihren Lauf remote berwachen k nnen HINWEIS i Standardm ig werden Base Call Dateien komprimiert und Q Scores gruppiert um den ben tigten Speicherplatz zu reduzieren Das Gruppieren von Q Scores fasst Qualit tsbewertungen ber einen gr eren Bereich von Werten zusammen ohne die Genauigkeit oder die Leistung zu beeintr chtigen Melden Sie sich mit der E Mail Adresse Ihres Mylllumina Kontos und Ihrem Kennwort bei BaseSpace an W hlen Sie Browse Durchsuchen und navigieren Sie zum Speicherort des bevorzugten Ausgabeordners Sie m ssen einen Ausgabeordner angeben auch wenn Sie BaseSpace zur Speicherung und Datenanalyse verwenden Stellen Sie sicher dass die Miniaturbildeinstellung Save A
35. e zelle geladen haben pr fen Sie ob das Vakuum aktiviert ist A HINWEIS Ilumina empfiehlt die Verwendung einer Flie zelle aus dem vorherigen Lauf um die Reagenzien des nachfolgenden Laufs vorzuf llen oder nach dem Lauf einen Ger tewaschlauf durchzuf hren 1 Sp len Sie die gebrauchte Flie zelle mit Wasser in Laborqualit t Trocknen Sie die Flie zelle mit einem f r Objektive geeigneten Reinigungstuch oder einem anderen fusselfreien Tuch ab 2 Reinigen Sie die Flie zelle mit Alkoholtupfern und einem Reinigungstuch f r Objektive A HINWEIS Entfernen bzw ersetzen Sie in diesem Schritt nicht die Flie zellen Dichtungen 3 Legen Sie die gebrauchte Flie zelle so auf den Flie zellenhalter dass die Einlass und Auslassanschl sse nach unten weisen und der Barcode sich auf der rechten Seite befindet Stellen Sie sicher dass der Pfeil am linken Rand der Flie zelle der die Flussrichtung angibt in Richtung Ger t zeigt 4 Schieben Sie die Flie zelle vorsichtig bis zum Anschlag in Richtung des oberen und der rechten F hrungsstifte Ar Hinweis Nehmen Sie die Hand von der Flie zelle bevor Sie den Vakuumschalter bet tigen Dadurch wird verhindert dass im Laufe der Zeit eine Verschiebung der Ausrichtung auftritt HiSeq 4000 Systemhandbuch P 5 usizuabesy uon ua njioA pun Uape7 Durchf hren eines Sequenzierungslaufs 26 Abbildung 13 Fliefszelle an oberem und rechten F hrungsstiften ausgerichtet
36. en bzw aus diesem herausgefahren wird Der Flie zellentisch muss in der vordersten Position positioniert sein um die T r der Flie zellenkammer ffnen zu k nnen und eine Flie zelle einzusetzen oder zu entfernen Teile Nr 15066496 Rev ADEU Die Flie zelle befindet sich auf dem Flie zellenhalter wobei die Einlass und Auslass ffnungen nach unten zeigen und wird durch das Vakuum unter jedem Flie zellenhalter in Position gehalten Der beleuchtete Flie zellenregler der sich vor jedem Flie zellenhalter befindet steuert das Vakuum Wenn der Flie zellenregler gr n leuchtet sitzt die Vakuumdichtung sicher Strukturierte Flie zelle Die auf dem HiSeq 4000 System verwendete Flie zelle ist eine strukturierte Flie zelle mit Milliarden von geordneten Nanowells Die Wells sind in das Glas der Flie zelle eingearbeitet wodurch das Generieren von Sequenzierungs Clustern in einer geordneten Struktur erm glicht wird Die Cluster sind eng aneinander ausgerichtet was die Anzahl der Ausgabe Reads und die Menge der generierten Daten erh ht Die strukturierte Flie zelle enth lt acht Lanes mit zwei Bildstreifen pro Lane und hat die gleichen allgemeinen Ma e wie andere HiSeq Hochleistungs Fliefzellen Die strukturierte Flie zelle ist im Lieferumfang des HiSeq 3000 4000 PE Cluster Kits enthalten Sie wird in trockenem Zustand in einem mit Folie verpackten Paket geliefert Innerhalb des in Folie verpackten Pakets befindet sich die Flie zelle zu
37. enster mit Menioptionen Show Log File Protokolldatei anzeigen In dieser Datei werden alle Fehler festgehalten die in der Steuerungssoftware auftreten Verwenden Sie diese Protokolldatei zu Fehlerbehebungszwecken Scanner Aktiviert den Befehl zum manuellen Initialisieren der Software About Info Bietet Informationen zur Ger te Hardware und den Software Versionen sowie Kontaktinformationen f r technische Unterst tzung Exit Beenden Schlie t die Benutzeroberfl che der Steuerungssoftware Fenster mit Men optionen Das Fenster mit Men optionen stellt Einstellungen bereit mit denen die Lauf ID V orlage die Standardspeicherorte der Ordner ein LIMS Server der Benutzername und das Kennwort festgelegt werden k nnen Au erdem enth lt es die M glichkeit anzugeben ob die Ger testatusinformationen an Illumina bermittelt werden sollen Teile Nr 15066496 Rev ADEU Abbildung 10 Fenster mit Men optionen Run ID Template Lauf ID Vorlage Die Namenskonvention die zum Generieren von Laufordnernamen verwendet wird Default Output Folder Standardausgabeordner Der Standardspeicherort in dem L ufe der Flie zelle A gespeichert werden Default Output Folder2 Standardausgabeordner2 Der Standardspeicherort in dem L ufe der Flie zelle B gespeichert werden I HINWEIS Ilumina empfiehlt einen Speicherort im Netzwerk f r die Ausgabeordner Sie k nnen jedoch auch einen Speicherort auf dem Laufwerk O angeben sofern sich de
38. enzien Rack entsprechen den Anschl ssen auf einem internen Reagenzien Selektor Ventil Rack f r Indizierungs und Paired End Reagenzien Befindet sich in der linken Position Er verf gt ber zwei Reihen mit nummerierten Positionen die konische 15 ml R hrchen mit Paired End Reagenzien und Indizierungsreagenzien enthalten Die linke Reihe enth lt die Reagenzien f r Flie zelle A und die rechte Reihe die Reagenzien f r Flie zelle B HiSeq 4000 Systemhandbuch 3 usjuauodui0y 000y SIH berblick gt Reagenzienk hler Die Reagenzien Racks sind im Reagenzienk hler untergebracht in dem eine Innentemperatur von 2 C bis 8 C herrscht Abbildung 2 Reagenzienkammer Sippergriffe Reagenzien Rack f r Indizierungs und Paired End Reagenzien Reagenzien Rack f r SBS Reagenzien f r Flie zelle A Reagenzien Rack f r SBS Reagenzien f r Flie zelle B A B C D FlieBzellenkammer In der Flie zellenkammer sind der Flie zellentisch die thermischen Stationen das Vakuumsystem und die Fluidikanschl sse f r die einzelnen Flie zellen untergebracht i f Abbildung 3 Fle zellentisch mit zwei Flie zellen Flie zelle A Flie zelle B Flie zellenregler A Flie zellenregler B vou gt Auf der linken Seite ist Flie zelle A und auf der rechten Seite ist Flie zelle B dargestellt Jede Flie zelle befindet sich auf dem Flie zellentisch der von der Steuerungssoftware in das optische Modul hineingefahr
39. enzien wechseln ist das Kontrollk stchen f r den Vorf llvorgang deaktiviert Das Vorf llen der Reagenzien ist nicht erforderlich 5 W hlen Sie Next Weiter um mit dem Laden der Reagenzien fortzufahren HiSeq 4000 Systemhandbuch 61 SINE saule U9U981qq Japo USYEUUY Fehlerbehebung Beenden eines Laufs 62 a ACHTUNG Das Beenden eines Laufs auf dem HiSeq 4000 System ist endg ltig Wenn RTA v2 beendet wird wird die Verarbeitung nicht wieder aufgenommen und die Laufdaten werden nicht gespeichert Daher kann ein Lauf nicht fortgesetzt werden nachdem er gestoppt wurde 1 W hlen Sie zum Beenden des Laufs Abort Abbrechen Best tigen bzw brechen Sie die Ausf hrung des Befehls ab Wenn Sie den Befehl best tigen wird der Begr ungsbildschirm angezeigt 2 Fahren Sie mit dem Verfahren nach einem Lauf fort J HINWEIS A Falls ein Lauf w hrend Read 1 gestoppt wird ist es m glich eine Primer Rehybridisierung auf dem cBot System durchzuf hren Starten Sie nach der Primer Rehybridisierung einen neuen Lauf auf dem HiSeq 4000 System um die Flie zelle zu sequenzieren Teile Nr 15066496 Rev A DEU Gestaffelte L ufe auf Flie zelle A und Flie zelle B Warten Sie bis der Lauf auf der benachbarten Flie zelle einen Chemie Schritt durchf hrt und w hlen Sie anschlie end Pause Das Men Pause wird ge ffnet HINWEIS Unterbrechen Sie den aktuellen Lauf immer w hrend eines Chemie Schrittes und nicht w hrend e
40. erne Komponenten A Optikmodul Enth lt optische Komponenten die die Darstellung zweier Oberfl chen der Flie zelle erm glichen indem A C G und T gleichzeitig mithilfe von Epifluoreszenz aufgenommen werden Der Anregungslaserstrahl tritt durch das Objektiv und die Fluoreszenz wird vom selben Objektiv erfasst D Flie zellenkammer Enth lt den vakuumgesteuerten Flie zellentisch der die Flie zelle w hrend des Sequenzierungslaufs in Position h lt C Fluidikkammer Enth lt Fluidikpumpen die die Reagenzien in die Flie zelle und anschlie end in den Abfallbeh lter leiten D Statusleiste Zeigt den Ger testatus anhand von drei Farben an Blau bedeutet dass das Ger t l uft Orange weist darauf hin dass das Ger t berpr ft werden muss und Gr n zeigt an dass das Ger t f r den n chsten Lauf bereit ist E Reagenzienkammer Enth lt Reagenzien Racks mit Reagenzien f r Sequenzierungsl ufe und die Waschl sung f r Ger tewaschl ufe Reagenzienkammer Bei der Reagenzienkammer handelt es sich um einen Reagenzienk hler mit drei Reagenzien Racks zwei Racks f r SBS Reagenzien und einen Rack f r Indizierungs und Paired End Reagenzien Mithilfe der Sippergriffe werden die Sipper in die Reagenzienflaschen abgesenkt SBS Reagenzien Racks Fassen konische 250 ml Flaschen Der Reagenzien Rack f r Flie zelle A befindet sich in der Mitte und der Rack f r die Flie zelle B liegt ganz rechts Die Nummern der Positionen auf dem Reag
41. es Phred Algorithmus Weitere Informationen finden Sie unter en wikipedia org wiki Phred_quality_score Die Qualit tsbewertung berechnet f r jeden Base Call mehrere Fehlerwahrscheinlichkeiten und ermittelt anhand der Prognosewerte den Q Score aus einer Qualit tstabelle Qualit tstabellen werden erstellt um optimale Qualit tsprognosen f r L ufe zu liefern die auf spezifisch konfigurierten Sequenzierplattformen mit bestimmten Chemie Versionen durchgef hrt werden Nachdem der Q Score ermittelt wurde werden die Ergebnisse in Base Call Dateien bcl gespeichert Weitere Informationen finden Sie unter Sequenzierung von Ausgabedateien auf Seite 55 Q Score Gruppierung RTA v2 gruppiert die Qualit ts Scores in bestimmte Bereiche und weist jedem Bereich einen Wert zu Die Q Score Gruppierung reduziert den Speicherplatzbedarf erheblich ohne die Genauigkeit und Leistung von nachgeschalteten Anwendungen zu beeintr chtigen Die Q Score Gruppierung tr gt zur Effizienz der Analyseverfahren und Daten bertragungsanforderungen bei die mit dem hohen Durchsatz des HiSeq 4000 Systems einhergehen Die resultierende bcl Datei ist kleiner da die Komprimierungsalgorithmen die Datei besser komprimieren k nnen Es werden weniger Daten auf den Ger tecomputer geschrieben und auf einen Speicherort im Netzwerk bertragen wodurch das Kopieren der Dateien schneller erfolgt Teile Nr 15066496 Rev A DEU Sequenzierung von Ausgabedateien Dateityp B
42. f versetzen 44 Ausschalten des Ger ts o ooooooocccccccccccccccccoocccccccnnn nn nncccnnnnnncnncnnns 45 Kapitel 4 Echtzeitanalyse 47 Einleit ng RE See 48 berblick ber RTA v2 cnn cnn cnn 49 Echtzeitanalyse Workflow 22 0 51 Sequenzierung von Ausgabedateien 22220000000 55 Plattennummerierung 2 LL 56 Kapitel 5 Fehlerbehebung 222222200000000unenenennnnn 57 Einleitung osea a a iia 58 M gliche Probleme bei der Laufkonfiguration 59 Durchf hren einer Fluidikpr fung 60 Anhalten oder Abbrechen eines Laufs 61 Gestaffelte L ufe auf Flie zelle A und FlieBzelle B 63 M gliche Primer Rehybridisierung f r Read e 64 UE A AA 65 Technische Unterst tzung 2 enn 69 HiSeq 4000 Systemhandbuch Teile Nr 15066496 Rev ADEU berblick Einleitung 2 HiS eq 4000 Komponenten 2 222222222222 3 Sequenzierungs Verbrauchsmaterialien 2 6 Starten des HiSeq 4000 Systems 2 2 7 HiSeq 4000 Software 2 uunnneennennnnnennnneannnnennnnnennn nenn nenn nenne nenne nennen 8 Weitere Ressourcen
43. ften ausgerichtet A Oberer F hrungsstift B Rechte F hrungsstifte y HINWEIS Nehmen Sie die Hand von der Flie zelle bevor Sie den Vakuumschalter bet tigen Dadurch wird verhindert dass im Laufe der Zeit eine Verschiebung der Ausrichtung auftritt 3 O Teile Nr 15066496 Rev ADEU 3 Bewegen Sie den Flie zellenregler langsam in Position 1 Dadurch wird das Vakuum 5 aktiviert und die Flie zelle wird in Position gehalten Wenn der Fliefzellenregler gr n blinkt ist das Vakuum aktiviert Falls der Regler nicht gr n leuchtet lesen Sie M gliche Probleme bei der Laufkonfiguration auf Seite 59 Abbildung 21 Flie zellenregler in Position 1 Warten Sie f nf Sekunden und bewegen Sie dann den Fliefzellenregler langsam in Position 2 Wenn der Flie zellenregler dauerhaft gr n leuchtet ist ein Vakuum entstanden und die Flie zelle ist einsatzbereit Abbildung 22 Flie zellenregler in Position 2 y i Stellen Sie sicher dass das Kontrollk stchen Vacuum Engaged Vakuum aktiviert auf dem Bildschirm f r das Laden der Sequenzierungsflie zelle aktiviert ist Pr fen des Flusses Bei der berpr fung des Flusses wird auch festgestellt ob die Flie zelle und die Dichtungen ordnungsgem installiert sind und Vakuum entstanden ist 1 2 W hlen Sie L sung 5 aus der Dropdown Liste berpr fen Sie die folgenden Standardwerte Volume Volumen 250 Aspirate Rate Aspirationsrate 250 Dispense Rate Zufu
44. g der L sung f r den Wartungswaschlauf Ger tewartungswaschlauf und Wasserwaschlauf Sammeln und Messen der Abfallvolumina Ger tewartungswaschlauf und Wasserwaschlauf Lagern der Flie zellen Allgemeine Verwendung Reinigen des Flie zellenhalters Reinigen der Flie zelle Aufteilen von Reagenzienvolumina Aufteilen von Reagenzienvolumina Ger tewartungswaschlauf Ger tewartungswaschlauf Entfernen der Flie zellen Dichtungen SBS und PE Reagenzien Racks Positionen mit PW1 Ger tewaschlauf Teile Nr 15066496 Rev ADEU Starten des HiSeq 4000 Systems 1 Starten Sie den Ger testeuerungscomputer 2 Melden Sie sich mit dem Standard Benutzernamen und dem Standard Kennwort beim Betriebssystem an Benutzername sbsuser Kennwort sbs123 Warten Sie ab bis das Betriebssystem geladen wurde Wenn die Anmeldung mit den Standarddaten fehlschl gt erkundigen Sie sich bei Ihrem zust ndigen Administrator nach dem Benutzernamen und dem Kennwort f r Ihren Standort 3 Bringen Sie den Hauptnetzschalter in die EIN Position Wenn Sie vor dem Ger t stehen befindet sich der Netzschalter auf der linken Seite 4 Warten Sie mindestens eine Minute bis das Ger t ordnungsgem konfiguriert und das Ger telaufwerk DoNotEject initialisiert ist W hrend der Initialisierung des Laufwerks wird ein entsprechendes Fenster ge ffnet Schlie en Sie das Fenster Falls sich das Fenster nicht ffnet suchen Sie unter A
45. hlie enden Datenanalyse eingespart werden kann Das HiSeq 4000 System verwendet eine neue Implementierung der Echtzeitanalyse RTA Software namens RTA v2 die die folgenden wichtigen Unterschiede bez glich der Architektur und der Funktionen aufweist Die Konfigurationsdateien das Format der Ausgabedateien und der Verarbeitungs Workflow sind gegen ber Vorg ngerversionen der Software unterschiedlich Die Konfigurationsdatei Einstellungen von Vorg ngerversionen sind nicht mit RTA v2 kompatibel Wenn RTA v2 beendet wird wird die Verarbeitung nicht wieder aufgenommen und die Laufdaten werden nicht gespeichert Die Demultiplexierungsleistung wird nicht berechnet Daher wird die Registerkarte Index im Sequenzierungsanalyse Viewer SAV nicht ausgef llt Teile Nr 15066496 Rev ADEU berblick ber RTA v2 RTA v2 wird auf dem Computer des Ger ts ausgef hrt und extrahiert Intensit ten aus Bildern f hrt das Base Calling durch und weist dem Base Call einen Qualit ts Score zu Im Gegensatz zu fr heren Versionen der Echtzeitanalyse Software kommunizieren RTA v2 und die Steuerungssoftware ber ein HTTP Webinterface und gemeinsame Speicherbereiche Wenn RTA v2 beendet wird nimmt RTA v2 die Verarbeitung nicht wieder auf und die Laufdaten werden nicht gespeichert Daher kann ein Lauf nicht fortgesetzt werden nachdem er gestoppt wurde RTA v2 nimmt die Verarbeitung nur dann automatisch wieder auf wenn der Lauf unterbrochen wurde We
46. hrrate 2000 W hlen Sie Pump Pumpe Inspizieren Sie die Flie zelle auf Luftblasen die die Lanes passieren sowie auf Undichtigkeiten in der N he der Manifolds Wenn berm ig viele Luftblasen vorhanden sind berpr fen Sie die Manifold Dichtungen auf Obstruktionen und wiederholen Sie den Vorgang mit L sung 6 um zu HiSeq 4000 Systemhandbuch EN a ezgeysBunaizuanbas Jop uszjesuly Durchf hren eines Sequenzierungslaufs 32 verhindern dass die L sung an Position 5 aufgebraucht wird Senken Sie die Aspirationsrate auf 100 und pumpen Sie weitere 250 ul in die Flie zelle W hlen Sie Next Weiter Stellen Sie sicher dass der Flie zellenregler gr n leuchtet und schlie en Sie dann die T r der Flie zellenkammer Achten Sie darauf dass die Kontrollk stchen Vacuum Engaged Vakuum aktiviert und Door Closed T r geschlossen aktiviert sind und w hlen Sie Next Weiter W hlen Sie Start um den Sequenzierungslauf zu starten Teile Nr 15066496 Rev ADEU berwachen des Laufs Sie k nnen die Laufkennzahlen die Fluidik und die Bildgebung auf dem Lauf bersichtsbildschirm berwachen Abbildung 23 Lauf bersichtsbildschirm Cycle 1 of 310 Analysis Carat per son LE Fluidics gt Images Bo LI il ABORT PAUSE Statusleiste In der Statusleiste k nnen Sie pr fen wie viele Zyklen bereits abgeschlossen sind Flie zellenbild Im Flie zellenbild sehen Sie welche Lanes
47. ierung Vorphasierung 52 PhredSkala 53 Polyklonale Cluster 52 Probenblatt BaseSpace 20 Uberblick 11 Protokolldatei anzeigen 10 Protokolldateien GlobalLog 50 LaneNLog 50 Pr fen des Flusses Standardwerte 27 31 Q Q Scores 53 Qualit ts Scores 53 Gruppierung 18 54 R Reagenzien bfall Nach dem Lauf 37 Entladen 37 Kit ID aufzeichnen 19 20 Laden von Paired End Reagenzien 23 Reagenzien Bildschirm 19 20 Vorbereitung 16 Vorf llen 27 Reagenzien Bildschirm 19 20 Reagenzienkammer 3 Reagenzienpositionen aired End 23 SBS 22 Registrierung Clusterpositionen 51 Reinheitsfilter 52 P Rezepturbildschirm 19 RTA v2 Daten bertragung 50 Fehlerbehandlung 50 Q Score Gruppierung 54 SAV Registerkarte Index 48 Stoppen eines Laufs keine Fortsetzung 62 Runinfo xml 55 S SBS Reagenzienposition 22 Schnellformatierung Ausgabelaufwerk 43 Sensoranzeigen 9 Sequenzierungs Verbrauchsmaterialien 16 Sequenzierungsanalyse Viewer 8 erblick 33 Sequenzierungsworkflow 17 Software Begr ungsbildschirm 8 Stach se 8 Experiment Manager 11 Fehlerbehebung 5 HiSeq Control is 8 Info Version 10 lnitialisierung 7 Protokolldatei anzeigen 10 a riet 8 Vollbild anzeigen 10 Statusalarmsymbol 10 Statusseite 33 Stoppen eines Laufs 11 Stoppen eines Laufs keine Fortsetzung 62 Strukturierte Fliefszelle 5 Cluster nach Filterung 52 Geordnetes Array 52 r 69 Symbole Fehler und Warnungen 10 Statusalarm 10 Systempr fung 9 Teile Nr
48. illumina Hiseq 4000 Systemhandbuch Ee SS A O O ll y E A A e TGATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTCTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCG CACT SAONE L PAR TOAT OOA IGAT T NATC OTACA ATACANT AGAC TAATAI AACOTACCATIAAGAGO TACCGIOTICTCTAACCTIAAGATIACT E GAAAAGAATGATAACAGTAACACACTTCTGTTAACC GATTACTTGATCCA GER El CCGTAAAGATT FOOD EE CT AL e EAS PARC TAC ACACTICTO AR COTA GALTACTIOAICCAC TGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTCTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAA U YGAGACTAAATA ARC LIAAGGTAAGATIAG I GATOOAGTSATTCMOSTAGESTAROGAACSTATCHAITGAGAGTAAATATTAAOGTAGGATIMGAGCH CTSTAACOHAAGA ACT I GATGCAC GA OAAC AGOGT ATENT e EE EN e e TARTA SEH AACGAACGTCTICTGTTAACCTTAAGAT 1 EE E EE Geck EEN E E CTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACAACCTT TT GATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTGCAACGACGAAAAGAA GTAACAC E TT TRI TAACOT AM ACTI CAT CAR TOATI AACOTACOSTAACGAACOT N AARTATTAREGTACCATTARSAGCTACCHTEHCTETTAROCTTANERTTACT AAC LACS AIT OR AC ARTE A EE ATTACTTGATCCACT BASS AACGAACGTA E e E AA GR ACCA MARGE CCGTGCAACGACGAACTTCTGTT RAT GA Te GCTACCGTGCAACGAAAATAA GATTACTTGATCCACTGATTCAACG AACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAGCTACCGTGCAACGACGAAAAGAA GAAAAGAAT E Nee E AAA GATIACLTSACOAGTEAT TO AASCTAC CET AA SCAACGTATCAATTGAGACTAAMTATTAACOTACCATIDAGAGO TAE EE GTTAACCTT E E ACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGT
49. iner Filterdatei filter gespeichert werden Die Filterdatei gibt an ob Cluster die Filter passiert haben Clusterpositionsdateien Die Clusterpositionsdatei s locs enth lt die X und Y Koordinaten jedes Clusters auf der Flie zelle Die prim ren Ausgabedateien werden f r die anschlie ende Datenanalyse verwendet Mit der Konvertierungssoftware bcl2fastq k nnen Sie die Demultiplexierung und FASTO Konvertierung durchf hren Verwenden Sie bcl2fastq v2 16 oder h her zum Konvertieren von HiSeq 4000 Daten Die aktuelle Softwareversion und Informationen zum Download finden Sie auf der HiSeq 4000 Supportseite der Illumina Website RTA v2 liefert Echtzeitkennzahlen zur Laufqualit t die in InterOp Dateien gespeichert werden InterOp Dateien sind Bin rdateien mit Kennzahlen zu Platten Zyklen und zur Read Ebene Sie werden ben tigt um Kennzahlen im Sequenzierungsanalyse Viewer HiSeq 4000 Systemhandbuch A 9 ch Y 1d JAN 4911q18qf Echtzeitanalyse ansehen zu k nnen Verwenden Sie zur Anzeige der von RTA v2 generierten Kennzahlen SAV v1 8 46 oder h her Weitere Informationen finden Sie unter Sequenzierung von Ausgabedateien auf Seite 55 RTA v2 Fehlerbehandlung RTA v2 generiert Protokolldateien im Ordner RTALogs Wenn ein Fehler auftritt wird dieser in einer separaten CSV Datei protokolliert Nachdem die Verarbeitung abgeschlossen ist werden alle Protokolldateien an das endg ltige Ausgabeziel bertragen Folgende Protokol
50. ines Bildgebungsschrittes W hlen Sie Normal Pause Normale Unterbrechung Warten Sie bis der aktuelle Chemie Schritt abgeschlossen wurde Das System wird automatisch in einen sicheren Zustand versetzt Wenn der benachbarte Lauf angehalten wurde richten Sie den neuen Lauf ein Sobald Sie die neue Flie zelle f r den neuen Lauf geladen haben schlie en Sie die T r der Flie zellenkammer W hlen Sie Start um den Sequenzierungslauf zu starten W hlen Sie Resume Fortsetzen auf der benachbarten Fliefszelle um den unterbrochenen Lauf fortzusetzen Die Software steuert automatisch die Chemie und Bildgebungsverfahren auf beiden Fliefzellen HiSeq 4000 Systemhandbuch 6 3 g a119Zga 4 pun y a 9Zga 4 ne ajng7 0921509 M gliche Primer Rehybridisierung f r Read 1 Wenn die Laufkennzahlen f r Read 1 niedrige Clusterzahlen oder niedrige Intensit ten zeigen oder auf andere Probleme hindeuten k nnen Sie eine Primer Rehybridisierung f r Read 1 durchf hren um die Flie zelle zu retten Die Primer Rehybridisierung f r Read 1 wird auf dem cBot System durchgef hrt und besch digt nicht die Cluster auf der Flie zelle Zur Durchf hrung einer Primerhybridisierung f r Read 1 auf einer strukturierten HiSeq 4000 Flie zelle ben tigen Sie folgende Verbrauchsmaterialien von Illumina Hiseq 3000 4000 cBot Multi Primer Rehybridisierungs Kit Katalognr GD 310 1001 HiSeq cBot Manifold Katalognr SY 401 2015 Weitere Informationen
51. ldateien werden beim Auftreten von Fehlern erstellt GlobalLog tsv enth lt eine Zusammenfassung wichtiger Lauf Ereignisse LaneNLog tsv protokolliert die Verarbeitungsereignisse pro Lane Error tsv protokolliert w hrend des Laufs aufgetretene Fehler Warningl og tsv f hrt w hrend des Laufs aufgetretene Warnungen auf Daten bertragung 50 W hrend des Laufs fordert RTA v2 eine Daten bertragung von RunCopyService an der Software die die bertragung auf den angegebenen Ausgabeordner steuert Wenn BaseSpace verwendet wird sorgt der BaseSpace Broker f r die bertragung von Daten nach BaseSpace Wenn die Netzwerkverbindung unterbrochen wird f hrt RTA v2 mit der Verarbeitung fort und speichert die Daten lokal Die Daten bertragung wird fortgesetzt wenn die Verbindung wiederhergestellt wurde L HINWEIS i Stellen Sie sicher dass Ihre Netzwerkverbindung die Mindestanforderungen zum Senden der Laufdaten an BaseSpace erf llt Weitere Informationen finden Sie im Handbuch zur Laboreinrichtung und Standortvorbereitung f r Ihre HiSeq Konfiguration Weitere Informationen hierzu finden Sie unter Weitere Ressourcen auf Seite 13 Nach Abschluss des Vorgangs erstellt RTA v2 eine Markerdatei namens RTAComplete txt Die Daten bertragung wird abgeschlossen sobald diese Datei generiert wurde Teile Nr 15066496 Rev A DEU Echtzeitanalyse Workflow Der Workflow der Echtzeitanalyse besteht aus den folgenden Schritten Matrizenbild
52. lgt sichergestellt Ggf vorhandene Reagenzien und Probenreste werden aus den Fluidikschl uchen und Sippern gesp lt Eine Ansammlung und Kristallisation von Salz in den Fluidikschl uchen und Sippern wird verhindert Eine Kreuzkontaminierung aus dem vorherigen Lauf wird verhindert Ar Hinweis Am Ende jedes Laufs wird ein Wasserwaschlauf durchgef hrt um das System zu waschen und die Fluidik zu berpr fen Bei der Einrichtung eines Laufs pr ft die Software ob innerhalb der letzten 24 Stunden ein Wasserwaschlauf oder ein Wartungswaschlauf durchgef hrt wurde Ein Wartungswaschlauf ist alle zehn Tage erforderlich Zehn Tage nach dem letzten Wartungswaschlauf werden Sie aufgefordert einen Wartungswaschlauf durchzuf hren Teile Nr 15066496 Rev ADEU Entladen und Wiegen von Reagenzien J HINWEIS A Gehen Sie mit Reagenzien wie mit chemischen Abf llen um Reagenzien missen gem f den Sicherheitsstandards Ihres Landes entsorgt werden 1 ffnen Sie die T r der Reagenzienkammer 2 Heben Sie die Sipper f r den entsprechenden SBS Rack bzw Paired End Rack wie folgt an a Ziehen Sie den Sippergriff ausw rts b Heben Sie den Sippergriff an und ziehen Sie ihn gleichzeitig ausw rts c Schieben Sie den Sippergriff in die Aussparung am oberen Ende der Schiene Vergewissern Sie sich dass der Sippergriff fest in der Aussparung sitzt 3 Schieben Sie den Reagenzien Rack mithilfe des Rack Griffs aus der Reagenzienkammer 4 Nehmen Sie die
53. ll Thumbnails Alle Miniaturbilder speichern lautet Die Software speichert automatisch alle Miniaturbilder Ein Miniaturbild ist eine Auswahl von Bildern aus vielen Platten in jeder Plattenspalte bzw in jedem Bildstreifen die in einem Miniaturbild zusammengefasst werden Teile Nr 15066496 Rev A DEU 6 W hlen Sie Next Weiter Bildschirm Flow Cell Setup Einrichtung der Flie zelle Im Bildschirm Flow Cell Setup Einrichtung der Flie zelle werden Informationen ber die Flie zelle aufgezeichnet die f r Ihren Lauf verwendet wird Alle Felder m ssen ausgef llt werden 1 Scannen Sie den Flie zellenbarcode ein oder geben Sie die Flie zellen ID Barcodenummer der zu sequenzierenden Flie zelle ein Die Flie zellen ID wird verwendet um den FlieRzellentyp und die Reagenzienkompatibilit t festzustellen 2 Vergewissern Sie sich dass der Flie zellentyp Hiseq 3000 4000 PE Flow Cell HiSeq 3000 4000 PE Flie zelle ist Der Flie zellentyp wird automatisch auf Basis der Flie zellen ID ausgew hlt 3 Geben Sie einen Namen f r den Versuch ein Der Name des Versuchs erscheint auf jedem Bildschirm um den gerade durchgef hrten Lauf zu identifizieren 4 Geben Sie den Benutzernamen ein 5 W hlen Sie Next Weiter Bildschirm Advanced Erweitert 1 Optional Aktivieren Sie das Kontrollk stchen Confirm First Base Erste Base best tigen Ein Bericht zur ersten Base wird automatisch f r jeden Lauf nach Z
54. lyse Viewer Benutzerhandbuch Teile Nr 15020619 HiSeq 4000 Systemhandbuch 3 3 sine sap ueusemieqn Durchf hren eines Sequenzierungslaufs Verfahren nach einem Lauf Wenn der Lauf abgeschlossen ist entladen und wiegen Sie die Reagenzien und f hren Sie anschlie end einen Ger tewaschlauf durch Weitere Informationen finden Sie unter Verfahren nach einem Lauf auf Seite 35 3 A Teile Nr 15066496 Rev ADEU Verfahren nach einem Lauf Einleitung 36 Entladen und Wiegen von Reagenzien 2 37 Durchf hren eines Wartungswaschlaufs 38 Durchf hren eines Wasserwaschlaufs 41 Schnellformatierung des Ausgabelaufwerks durchf hren 2 43 Ger t in den Leerlauf versetzen 44 Ausschalten des Ger ts 2 45 Y Eegen ee u er SS HE ee Ne DE 2 em ge R gt e ng Wed Eege f SE W i ag Ae rat Zregchrmgneurgnt HiSeq 4000 Systemhandbuch 3 5 cleyde Verfahren nach einem Laut Einleitung 36 Zu den Verfahren nach einem Lauf geh ren das Entfernen und das Wiegen der Reagenzien sowie ein Ger tewaschlauf Ein Wasserwaschlauf ist nach jedem Lauf erforderlich wobei wahlweise ein Wartungswaschlauf durchgef hrt werden kann Illumina empfiehlt einen Wartungswaschlauf Durch regelm ige Ger tewaschl ufe wird die kontinuierliche Leistungsf higkeit des Ger ts wie fo
55. n Sie die Sipper um sicherzustellen dass sie beim Eintauchen in die Trichterverschl sse nicht verbogen werden c Schieben Sie den Sippergriff in die Aussparung am unteren Ende der Schiene Aktivieren Sie das Kontrollk stchen PW1 25 ml loaded PW1 25 ml geladen Laden von Indizierungs und Paired End Reagenzien 1 Invertieren Sie jede Flasche mehrmals um sicherzugehen dass die Reagenzien gr ndlich gemischt werden Halten Sie das Gewicht der einzelnen Reagenzien im Laborkontrollformular fest Heben Sie die Sipper f r den Paired End Reagenzien Rack wie folgt an a Ziehen Sie den Griff zu sich hin und schieben Sie ihn dann nach oben b Schieben Sie den Griff in die Aussparung am oberen Ende der Schiene Vergewissern Sie sich dass der Griff fest in der Aussparung sitzt Schieben Sie den Reagenzien Rack mithilfe des Rack Griffs aus der Reagenzienkammer Stellen Sie konische 15 ml R hrchen mit 10 ml PW1 oder Wasser in Laborqualit t in die Positionen 12 18 und 19 des Paired End Racks Entfernen Sie die Verschl sse von den einzelnen Reagenzr hrchen und stellen Sie das R hrchen in die entsprechend nummerierte Position bzw in die Position mit der Farbe die der Farbe des Etiketts entspricht Tabelle 2 Positionen der Paired End Reagenzien Position Reagenzien Beschreibung 10 HRM HT Resynthese Mischung 11 HLM2 HT Linearisierungs Mischung 2 12 Pw1 10 ml PW1 oder Wasser in Laborqualit t 13 HAM HT Amplifikations Mischung
56. n werden vollgef llt um sicherzugehen dass die Sipper gesp lt werden Das abgegebene Volumen f r jede Position variiert jedoch sodass nach Abschluss des Waschlaufs die Flaschen und R hrchen unterschiedliche Volumina enthalten Positionen Abgegebenes Volumen Acht SBS Positionen 82 ml 10 Paired End Positionen 76 ml Alle Positionen 19 75 ml pro Lane Entfernen Sie die Umwicklung von den Abfallr hrchen und setzen Sie sie wieder in den Abfallbeh lter ein Teile Nr 15066496 Rev ADEU Durchf hren eines Wasserwaschlaufs Nach jedem Sequenzierungslauf ist ein Wasserwaschlauf erforderlich wobei die Option besteht stattdessen einen Wartungswaschlauf durchzuf hren Illumina empfiehlt nach jedem Lauf einen Wartungswaschlauf durchzuf hren Wenn das Ger t seit mindestens einem Tag nicht verwendet wurde f hren Sie einen Wasserwaschlauf durch bevor Sie einen neuen Sequenzierungslauf starten Von Illumina bereitgestellte Verbrauchsmaterialien Wasser in Laborqualit t Vom Benutzer bereitzustellende Verbrauchsmaterialien Acht Flaschen 250 ml Corning Katalognr 430776 Zehn R hrchen 15 ml Corning Katalognr 430052 Wasser in Laborqualit t Verfahren 1 W hlen Sie im Begr ungsbildschirm die Option Wash Water Waschen Wasser aus 2 W hlen Sie Yes Ja um die Paired End Reagenzienpositionen zu waschen W hlen Sie ansonsten No Nein um nur die SBS Reagenzienpositionen zu waschen W hlen Sie Next Weiter um for
57. na zum Herunterladen zur Verf gung Ressource HiSeg 4000 und HiSeq 3000 Handbuch zur Standortvorbereitung Teile Nr 15066492_DEU HiSeg 4000 und HiSeq 3000 Sicherheits und Compliance Handbuch Teile Nr 15066491 DEU HiSeg 4000 Laborkontrollformular Teile Nr 15058793_DEU Hiseq 3000 4000 Cluster Kit Referenzhandbuch Teile Nr 15066495 Hiseq 3000 4000 SBS Kit Referenzhandbuch Teile Nr 15066494 Beschreibung Enth lt Spezifikationen f r den Laborplatz die elektrischen Anforderungen und die Umgebungsbedingungen Bietet Informationen zu Ger tekennzeichnungen und Compliance Zertifizierungen sowie sicherheitsbezogene Informationen Bietet eine interaktive Dokumentation von Lauftypen Reagenzchargennummern Gewicht der Reagenzien und abgegebenen Volumina f r einen Lauf mit einer oder zwei Flie zellen Enth lt eine Beschreibung des Cluster Kit Inhalts sowie Anweisungen zum Vorbereiten von Verbrauchsmaterialien vor einem Sequenzierungslauf Enth lt eine Beschreibung des SBS Kit Inhalts sowie Anweisungen zum Vorbereiten von Verbrauchsmaterialien vor einem Sequenzierungslauf Auf der HiSeq 4000 Supportseite der Illumina Website k nnen Sie auf Dokumentation Software Downloads Online Schulungen und h ufig gestellte Fragen zugreifen HiSeq 4000 Systemhandbuch 13 U9IINOSSIY 919 I9 A 14 Teile Nr 15066496 Rev ADEU Durchf hren eines Sequenzierungslaufs Einleitung 16 Sequenzierung
58. nd die indizierte Sequenzierung an die Flie zelle Steuerungsoptionen auf der Benutzeroberfl che Die Benutzeroberfl che der Ger tesoftware bietet Optionen zum Einrichten des Laufs und Bedienen des Ger ts ber den Touchscreen Monitor bzw die integrierte Tastatur Base Calling in Echtzeit Die Ger tesoftware extrahiert Intensit ten aus Bildern und f hrt das Base Calling mit Qualit ts Score auf dem Ger tecomputer durch sodass Sie w hrend des Laufs Qualit tskennzahlen berwachen k nnen und bei der anschlie enden Datenanalyse wertvolle Zeit sparen Die nachgeschaltete Analyse von Sequenzierungsdaten kann mit Illumina Analysesoftware oder Software Programmen von Drittanbietern auf einer benutzerdefinierten Infrastruktur durchgef hrt werden BaseSpace Konnektivit t Das HiSeq 4000 System bietet eine Funktion zum Senden von Ger tezustands und Sequenzierungsdaten an die BaseSpace Genomik Cloud L sung in Echtzeit um die Ger tequalit tskontrolle und Analyse zu optimieren 2 Teile Nr 15066496 Rev ADEU HiSeq 4000 Komponenten Das HiSeq 4000 System besteht aus dem Ger t dem Bildschirm dem Ger testeuerungscomputer und Zubeh r wie einer Tastatur einer Maus einem Universal Netzteil und einem Barcodescanner Das Ger t enth lt vier Hauptkammern das Optikmodul die Flie zellenkammer die Fluidikkammer und die Reagenzienkammer Der Betriebsstatus des Ger ts ist auf einer beleuchteten Statusleiste ersichtlich Abbildung 1 Ext
59. nn die Netzwerkverbindung unterbrochen wird f hrt RTA v2 mit der Verarbeitung fort und speichert die Daten lokal Nach Wiederherstellung der Verbindung wird die Daten bertragung automatisch fortgesetzt RTA v2 Eingabe RTA v2 ben tigt die folgenden Eingabedateien Die im lokalen Speicher des Systems gespeicherten Plattenbilder Runlnfo xml die von der Steuerungssoftware zu Beginn des Laufs automatisch generiert wird RTA v2 liest aus dieser Datei den Namen des Laufs die Anzahl der Zyklen und die Angabe ob ein Read indiziert ist sowie die Anzahl der Platten auf der Flie zelle RTA exe config eine Softwarekonfigurationsdatei im XML Format RTA v2 erh lt Befehle von der Steuerungssoftware die ber den Speicherort der Datei RunInfo xml und dar ber informieren ob ein optionaler Ausgabeordner angegeben wurde oder nicht RTA v2 Ausgabe Bilder von jedem Kanal werden gespeichert und als Platten an RTA v2 bergeben RTA v2 generiert von diesen Bildern prim re Ausgabedateien die mehrere hinsichtlich ihrer Qualit t ausgewertete Base Call Dateien und Filterdateien umfassen Andere Dateien unterst tzen die Generierung prim rer Ausgabedateien Base Call Dateien F r jede analysierte Platte wird eine komprimierte Base Call Datei bel pro Zyklus generiert Die Base Call Datei enth lt den Base Call und den entsprechenden Qualit ts Score Filterdateien Jede Platte liefert Filterinformationen die pro Platte ber den gesamten Lauf in e
60. nr 430776 Zehn R hrchen 15 ml Corning Katalognr 430052 Wasser in Laborqualit t ProClin 300 Sigma Aldrich Katalognr 48912 U Tween 20 Sigma Aldrich Katalognr P7949 Vorbereiten der L sung f r den Wartungswaschlauf 38 Bereiten Sie f nf Liter Wartungswaschlaufl sung f r die Verwendung mit einem Ger t vor Die L sung kann bis zu 30 Tage bei Raumtemperatur aufbewahrt und w hrend dieser Zeit bis zu dreimal verwendet werden 1 Bereiten Sie 250 ml von 10 Tween 20 vor indem Sie die folgenden Volumina mischen f gen Sie zuerst das Wasser hinzu Wasser in Laborqualit t 225 ml Tween 20 25 ml 2 Platzieren Sie einen R hrstab in einer leeren Ballonflasche mit einem Fassungsverm gen von mindestens sechs Litern 3 Kombinieren Sie die folgenden Volumina in der Ballonflasche f gen Sie zuerst das Wasser hinzu Wasser in Laborqualit t 750 ml 10 Tween 20 250 ml ProClin 300 1 5 ml Diese Volumina ergeben eine L sung aus ca 2 5 Tween 20 und 0 15 ProClin 300 4 Stellen Sie die Ballonflasche auf eine R hrplatte und r hren Sie so lange bis die Mischung gr ndlich gemischt ist 5 F gen Sie der L sung vier Liter Wasser in Laborqualit t zu Diese Volumina ergeben eine Waschl sung aus ca 0 5 Tween 20 und 0 03 ProClin 300 6 R hren Sie weiter bis die L sung gr ndlich gemischt ist 7 Legen Sie sie bei Raumtemperatur in einem geschlossen Beh lter zur Seite bis Sie bereit sind die Reagenzienfl
61. ordnungsgem en Fluss Starten Sie den Sequenzierungslauf Optional Pr fen Sie nach Zyklus 2 den Bericht zur ersten Base und fahren Sie anschlie end mit Read 1 fort Wenn der Lauf abgeschlossen ist entladen und wiegen Sie die Reagenzien s F hren Sie einen Ger tewaschlauf durch HiSeq 4000 Systemhandbuch 1 E MO 440MSBUNJSIZUSENbaS Durchf hren eines Sequenzierungslaufs 18 Eingeben von Laufparametern W hlen Sie im Begr ungsbildschirm Sequence Sequenzieren Die Benutzeroberfl che der Steuerungssoftware f hrt Sie durch die Schritte der Laufkonfiguration Die Schritte f r die Laufkonfiguration sind in drei Registerkarten unterteilt Run Configuration Laufkonfiguration Pre Run Setup Vorlaufkonfiguration und Initiate Run Lauf initiieren Die Laufkonfigurationsbildschirme enthalten Dropdown Listen Kontrollk stchen oder Textfelder zur Angabe der Laufparameter Scannen Sie die Flie zellen oder Reagenzien Kit ID mit dem tragbaren Barcodescanner ein oder geben Sie die ID ber die Touchscreen Tastatur ein Das Tastatursymbol befindet sich rechts neben den Textfeldern ki W hlen Sie Next Weiter um zum n chsten Bildschirm zu wechseln oder Back Zur ck um zum vorherigen Bildschirm zur ckzukehren Sie k nnen jederzeit w hrend der Laufkonfiguration Cancel Abbrechen w hlen um die Laufkonfiguration zu beenden und zum Begr ungsbildschirm zur ckzukehren Bildschirm Storag
62. pirationsrate 250 Dispense Rate Zufuhrrate 2000 3 W hlen Sie Pump Pumpe 4 Inspizieren Sie die Flie zelle auf Luftblasen die die Lanes passieren sowie auf Undichtigkeiten in der N he der Manifolds Wenn Sie eine erh hte Anzahl an Luftblasen feststellen berpr fen Sie die Dichtungen auf Behinderungen senken Sie die Aspirationsrate auf 100 und pumpen Sie weitere 125 ul Wasser in die Flie zelle Wenn die Probleme weiterhin bestehen entfernen Sie die Flie zelle wiederholen Sie die Reinigungsschritte und setzen Sie die Flie zelle erneut ein Positionieren der Schl uche und Starten des Vorf llvorgangs 1 Entfernen Sie die acht Abfallr hrchen der entsprechenden Flie zelle vom Abfallbeh lter Entfernen Sie nicht die acht R hrchen der gegen berliegenden Flie zelle oder die R hrchen der Kondensationspumpe oder der Paired End V orf llpumpen Abbildung 16 Positionieren der Schl uche oa Abfallr hrchen der Flie zelle f r die Reagenzienpositionen 1 bis 8 Schlauch der Kondensatpumpe nicht entfernen Schl uche der Paired End Vorf llpumpe nicht entfernen ou gt 2 Platzieren Sie jeden Abfallschlauch in einem separaten leeren 15 ml R hrchen Der Vorf llabfall wird gesammelt und nach dem Vorf llvorgang gemessen 3 W hlen Sie Start Prime Vorf llvorgang starten Der Vorf llbildschirm wird ge ffnet und der Vorf llvorgang wird gestartet berwachen Sie den Status des Vorf llvorgangs auf dem Vorf llbil
63. r Speicherort vom Ordner HiSeq Temp unterscheidet Verwenden Sie nicht das Laufwerk S Dieses Laufwerk ist f r den Betrieb des Ger ts reserviert Default Temp Folder1 Standard Temp Ordnerl Der Speicherort in den w hrend eines Laufs tempor re Dateien geschrieben werden Der Ordner HiSeq Temp wird auf das Laufwerk O geschrieben Run Setup Folder Laufeinrichtungsordner Der Speicherort der LIMS Probeformulare LIMS Server LIMS Server Der Name des Servers f r Interaktionen mit dem unterst tzten Illumina LIMS LIMS User name LIMS Benutzername Der Benutzername der f r die Authentifizierung beim Illumina LIMS verwendet wird LIMS Password LIMS Kennwort Das Kennwort das f r die Authentifizierung beim Ilumina LIMS verwendet wird Send instrument health information to Illumina to aid technical support Ger testatusinformationen an den technischen Support von Illumina senden Erlaubt dem Ger t Informationen f r jeden Lauf an BaseSpace zu senden Alle Informationen werden vertraulich behandelt Illumina empfiehlt diese Funktion zu aktivieren HiSeq 4000 Optionen zum Unterbrechen bzw Abbrechen eines Laufs Die Optionen zum Unterbrechen bzw Abbrechen eines Laufs auf dem HiSeq 4000 System unterscheiden sich von den Optionen auf manchen anderen HiSeq Ger ten Beim Beenden eines Laufs gibt es keine Option den Lauf wieder aufzunehmen Weitere Informationen finden Sie unter Anhalten oder Abbrechen eines Laufs auf
64. r 30 Schalter 25 Strukturiert 5 Vorbereitung 16 Flie zellenhalter F hrungsstifte 25 30 Positionen der Vakuum ffnungen 24 Flie zellenkammer 3 4 Flie zellenregler Position 0 24 Position 1 25 30 Position 2 25 30 Fluidik Fehlerbehebung 59 60 Fluidikkammer 3 G Ger t ausschalten 45 Ger t in den Leerlauf versetzen 44 Ger tewaschlauf 38 Ger tezustand 10 Gestaffelte L ufe 63 Gruppierung von Q Scores 18 H Hilfe Dokumentation 13 technisch 69 HiSeq Control Software 8 Indizierungsreagenzien laden 23 Indizierungsschema 20 Integration der ersten Base ericht 19 Best tigung 33 Intensit tsextraktion 51 InterOp Dateien 55 65 Index 66 K Komponenten Flie zellenkammer 3 4 Fluidikkammer 3 Optikmodul 3 Reagenzienkammer 3 L Laden der Reagenzien SBS Position 22 Trichterverschl sse 22 Wiegen 22 Laden von Flie zellen Flie zelle vorf llen 25 Luftblasen Undichtigkeiten 27 31 Sequenzierungsflie zelle 30 Laden von Reagenzien PE Positionen 23 PW1 in Position 2 22 Verbrauchsmaterialien 22 Lane Auswahl 19 Laufkonfiguration Chemie Einstellungen 19 Indizierungseinstellungen 19 Laden von Flie zellen 30 Lane Auswahl 19 Pr fen des Flusses 27 31 Verbleibende Zyklen 20 Vorf llen der Reagenzien 20 Lauf berwachung 3 LIMS Server 10 N Name des Versuchs 19 O Online Schulungen 13 Optikmodul 3 Ordnerspeicherorte Standardeinstellungen 10 P Paired End Reagenzien Laden 23 Phas
65. r der Flie zellenkammer oder dem Flie zellentisch abgestellt werden wenn die T r ge ffnet ist Versch ttete Fl ssigkeiten in diesem Bereich k nnen das Ger t besch digen 2 Stellen Sie sicher dass sich der Flie zellenregler in der AUS Position befindet Abbildung 11 Flie zellenregler in Position 0 3 Ziehen Sie ein neues Paar ungepuderte Latexhandschuhe an 4 Wenn die Flie zelle aus einem vorherigen Lauf vorhanden ist entfernen Sie sie und legen Sie sie in ein R hrchen mit Lagerungspuffer oder Wasser in Laborqualit t damit sie nicht austrocknet Sie k nnen sie zur Pr fung des Flusses vor dem Einsetzen einer Cluster Flie zelle verwenden Teile Nr 15066496 Rev ADEU 5 Wischen Sie die Oberfl che des FlieRzellenhalters vorsichtig mit einem Alkoholtupfer oder einem fusselfreien mit Ethanol oder Isopropanol befeuchteten Tuch ab bis er sauber ist 5 ACHTUNG Es darf kein Alkohol in die Vakuum ffnungen oder auf die Umgebung der Manifolds gelangen Reinigen Sie den Tisch ggf mit einem fusselfreien Tuch 6 Unterziehen Sie den Flie zellenhalter einer Pr fung um sicherzustellen dass sich keine Fussel auf dem Halter befinden und die Vakuum ffnungen nicht blockiert werden Abbildung 12 Positionen der Vakuum ffnungen Laden einer Primer Flie zelle Laden Sie im Bildschirm Load Priming Flow Cell Primer Flie zelle laden eine gebrauchte Flie zelle f r den Vorf llvorgang Wenn Sie die gebrauchte Fli
66. rarbeitung nach der Fortsetzung eines unterbrochenen Laufs automatisch wieder auf Weitere Informationen hierzu finden Sie unter Echtzeitanalyse auf Seite 47 1 W hlen Sie im Lauf bersichtsbildschirm die Option Pause Das Men Pause wird ge ffnet Abbildung 29 Optionen im Men Pause f p ma ause Cl 10e Reagen nange 2 W hlen Sie Normal Pause Normale Unterbrechung 3 W hlen Sie Yes Ja um die Auswahl zu best tigen Die Software beendet den aktuellen Vorgang und versetzt die Flie zelle in einen sicheren Status 4 W hlen Sie Resume Fortsetzen um den Lauf fortzusetzen Wechseln von Reagenzien w hrend des Laufs Wenn Sie den Lauf mit nicht vollst ndig gef llten Reagenzien starten w hlen Sie die Funktion Change Reagents Reagenzien wechseln um den Lauf anzuhalten und die Reagenzien aufzuf llen 1 W hlen Sie im Lauf bersichtsbildschirm die Option Pause Das Men Pause wird ge ffnet 2 W hlen Sie Change Reagents Reagenzien wechseln 3 W hlen Sie Yes Ja um die Auswahl zu best tigen Die Software beendet den aktuellen Chemie oder Bildgebungsvorgang versetzt die Flie zelle in einen sicheren Zustand und ffnet den Reagenzienbildschirm 4 Geben Sie im Reagenzienbildschirm die folgenden Reagenzienparameter ein Die Reagenzien Kit ID f r neue Reagenzien Die Anzahl der Zyklen f r die die Reagenzien ausreichen sollen Ar Hinweis Im Bildschirm Change Reagents Reag
67. rationsdatei wird zu Beginn des Laufs generiert Sie enth lt die Einstellungen f r den Lauf Stammordner RTAConfiguration xml Enth lt den Namen des Laufs die Anzahl der Zyklen in jedem Read die Angabe ob der Read indiziert ist sowie die Anzahl der Bildstreifen und Platten auf der Flie zelle Die Laufinformationsdatei wird am Anfang des Laufs generiert Stammordner Runlnfo xml W hrend der Bildgebung wird bei jedem Zyklus ein Miniaturbild f r jeden Kanal und jede Platte in den einzelnen Bildstreifen erzeugt Thumbnail_Images L00 X C X 1 F r jede Lane wird ein Ordner und f r jeden Zyklus ein entsprechender Unterordner angelegt s_ Lane _ Platte _ Kanal jpg Platte ist der Platzhalter f r die vierstellige Zahl die die Oberfl che die Bildstreifen und die Platte angibt Weitere Informationen hierzu finden Sie unter Plattennummerierung auf Seite 56 99 usisjepagebsny uon Bunisizuenbes Echtzeitanalyse Plattennummerierung 96 Die strukturierte Flie zelle des HiSeq 4000 Systems wird f r jeden Zyklus in 112 Platten auf jeder Lane oben und unten aufgenommen Jede Lane hat zwei Bildstreifen mit je 28 Platten Die Platten werden entsprechend ihrer Position nummeriert Der Plattenname ist eine vierstellige Zahl die die Position der Flie zelle darstellt Die erste Ziffer sieht f r die Oberfl che 1 steht f r oben 2 steht f r unten Die zweite Ziffer steht f r den Bildstreifen 1 steht f r den ersten
68. rbeitsplatz nach dem Ger telaufwerk DoNotEject J HINWEIS f Werfen Sie niemals das Flash Laufwerk DoNotEject aus das sich im Geh use des Ger ts befindet und ndern Sie nicht die darauf gespeicherten Dateien Das Laufwerk enth lt Hardwarekonfigurationsdateien und wird jedesmal initialisiert wenn Sie das Ger t einschalten swe s S 0007 Doc Sep u y e 5 Archivieren Sie die auf dem Ger tecomputer befindlichen Daten aller vorherigen L ufe in einem Netzwerkverzeichnis So wird sichergestellt dass ausreichend freier Speicherplatz vorhanden ist 6 Offnen Sie die HiSeq Control Software HCS mithilfe des Symbols auf dem Computer Desktop Die Initialisierung der Steuerungssoftware nimmt einige Minuten in Anspruch Wenn die Initialisierung der Software abgeschlossen ist wird der Begr ungsbildschirm ge ffnet Links unten im Bildschirm wird das Initialisierungssymbol 2 angezeigt Ger testeuerungscomputer Best Practices Schalten Sie den Computer nicht ein w hrend das Ger t l uft Schalten Sie immer zuerst den Computer ein bevor Sie das Ger t einschalten Schalten Sie das Ger t nicht aus w hrend die Ger testeuerungssoftware l uft Warten Sie nach dem Ausschalten des Ger ts eine Minute bevor Sie es wieder einschalten Schlie en Sie die USB Kabel des Ger ts des Bildschirms und der Tastatur an die USB Ports auf der R ckseite des Computers an bevor Sie den Computer einschalten Schlie en Sie die
69. rde Bei der Registrierung werden die Clusterpositionen in der Matrize an die Positionen auf dem Bild in jedem der vier Farbkan le bertragen Die Intensit tsextraktion ermittelt f r ein bestimmtes Bild einen Intensit tswert f r jeden Cluster in der Matrize Wenn die Registrierung f r ein Bild in einem Zyklus fehlschl gt werden f r diese Platte in diesem Zyklus keine Base Calls erzeugt Sehen Sie sich im Sequenzierungsanalyse Viewer SAV die Miniaturbilder an und berpr fen Sie ob die Registrierung bei einzelnen Bildern fehlgeschlagen ist Weitere Informationen finden Sie unter Sequenzierung von Ausgabedateien auf Seite 55 Farbmatrixkorrektur Nach der Registrierung und Intensit tsextraktion korrigiert RTA v2 den Crosstalk zwischen Kan len Crosstalk tritt z B auf wenn ein Cluster Intensit t in Kanal C und auch etwas Intensit t in Kanal A zeigt RTA v2 korrigiert mithilfe einer 4 x 4 Farbmatrix die Intensit ten sodass sie nur einen geringen oder keinen Crosstalk aufweisen und gleicht Unterschiede in der Gesamtintensit t zwischen den Farbkan len aus HiSeq 4000 Systemhandbuch 5 1 MO IA40M 93S eUe 1971493 Echtzeitanalyse Korrektur der empirischen Phasierung W hrend der Sequenzierungsreaktion erweitert sich jeder DNA Strang in einem Cluster um eine Base pro Zyklus Die Phasierung und Vorphasierung finden statt wenn eine Phasenverschiebung eines Strangs mit dem aktuellen Inkorporationszyklus eintritt Eine Pha
70. ren oder nicht aufgerufen werden k nnen weil sie auferhalb des Bildes sind oder die Bildregistrierung fehlgeschlagen ist werden als No Calls beschriftet No Calls werden mit N dargestellt Cluster nach Filterung W hrend der ersten 25 Zyklen von Read 1 entfernt der Reinheitsfilter Cluster niedriger Qualit t aus den Analysenergebnissen Cluster passieren den Filter wenn nicht mehr als ein Base Call einen Reinheitswert unter 0 6 in den ersten 25 Zyklen aufweist Die Reinheit ist definiert als das Verh ltnis der hellsten Basenintensit t dividiert durch die Summe der hellsten und der zweithellsten Basenintensit t Der Prozentsatz der Cluster die den Filter passieren Cluster nach Filterung wird in den Analyseberichten als PF dargestellt Teile Nr 15066496 Rev ADEU Die strukturierte Flie zelle des HiSeq 4000 Systems generiert verglichen mit anderen HiSeq Modellen einen niedrigeren Prozentsatz an Clustern nach Filterung Der Unterschied beruht auf den Eigenschaften eines geordneten Arrays von Clustern auf einer strukturierten Flie zelle im Vergleich zum zuf lligen Array von Clustern einer nicht strukturierten Flie zelle Zuf llige Cluster in einer nicht strukturierten Flie zelle Die Cluster werden w hrend der Matrizenbildung in einem zuf lligen Array gebildet und platziert Cluster mit niedriger Qualit t werden w hrend der Matrizenbildung aus der Roh Cluster Anzahl entfernt wodurch sich ein relativ hoher Prozentsatz von Cluste
71. rm Reagents Reagenzien werden Informationen ber das Reagenzien Kit aufgezeichnet das f r Ihren Lauf verwendet wird 20 1 Scannen Sie die Reagenzien Kit ID des SBS Kits oder geben Sie sie in das Feld Reagent Kit ID Reagenzien Kit ID ein Scannen Sie die PE Reagenzien Kit ID oder geben Sie sie in das Feld PE Reagent Kit ID PE Reagenzien Kit ID ein W hlen Sie das SBS Reagenzien Kit f r den Lauf aus W hlen Sie 300 Cycles 300 Zyklen f r ein Kit f r 300 Zyklen Die Anzahl der verbleibenden Zyklen ist standardm ig 318 W hlen Sie 150 Cycles 150 Zyklen f r ein Kit f r 150 Zyklen Die Anzahl der verbleibenden Zyklen ist standardm ig 168 W hlen Sie 50 Cycles 50 Zyklen f r ein Kit f r 50 Zyklen Die Anzahl der verbleibenden Zyklen ist standardm ig 67 HINWEIS Das Feld Cycles Remaining Verbleibende Zyklen wird anhand der SBS Kit ID automatisch ausgef llt Die Software z hlt von der eingegebenen Zyklenanzahl abw rts Ist die Zyklenanzahl gering werden Sie aufgefordert frische Reagenzien zu laden Teile Nr 15066496 Rev ADEU 4 W hlen Sie Prime SBS Reagents SBS Reagenzien vorf llen um die Reagenzien vorzuf llen F hren Sie immer einen Vorf llvorgang aus bevor Sie eine Cluster Flie zelle laden 5 W hlen Sie Next Weiter berpr fungsbildschirm 1 berpr fen Sie auf dem berpr fungsbildschirm die Laufparameter 2 W hlen Sie Next Weiter um fortzufahren
72. rn nach Filterung ergibt Geordnetes Array von Clustern auf einer strukturierten Flie zelle Cluster werden in einem vordefinierten Array aus Nanowells gebildet Leere Wells ohne Cluster sowie polyklonale Wells bei denen mehr als eine Sequenz vorhanden ist sind in der Roh Cluster Anzahl enthalten passieren aber nicht den Filter Daher liefert ein geordnetes Array auf einer strukturierten Flie zelle einen relativ niedrigen Prozentsatz von Clustern nach Filterung Abbildung 26 Leere und polyklonale Wells in der Roh Cluster Anzahl enthalten Abbildung 27 Wells mit Clustern die nicht den Filter passieren grau dargestellt Qualit tsbewertung Ein Qualit ts Score oder Q Score ist eine Prognose ber die Wahrscheinlichkeit eines fehlerhaften Base Calls Je h her der Q Score ist desto h her ist die Qualit t des Base Calls und die Wahrscheinlichkeit dass dieser korrekt ist Der Q Score ist eine kompakte M glichkeit kleine Fehlerwahrscheinlichkeiten zu kommunizieren Qualit ts Scores werden als Q X dargestellt wobei X der Score Wert ist Die folgende Tabelle zeigt die Beziehung zwischen dem Qualit ts Score und der Fehlerwahrscheinlichkeit Q Score Q X Fehlerwahrscheinlichkeit Q40 0 0001 1 in 10 000 Q30 0 001 1 in 1 000 Q20 0 01 1 in 100 Q10 0 1 1 in 10 HiSeq 4000 Systemhandbuch 5 3 MOJIA40M 93S eUe 1971493 Echtzeitanalyse 94 J HINWEIS Die Qualit tsbewertung basiert auf einer ge nderten Version d
73. s tzlich in einer aufklappbaren Schachtel aus Kunststoff Abbildung 4 Beispiel Cluster auf einer strukturierten Flie zelle HiSeq 4000 Systemhandbuch 5 usjuauodui0y 000y basIH Uberblick Sequenzierungs Verbrauchsmaterialien Zum Sequenzieren auf dem HiSeq 4000 System sind Reagenzien und andere Verbrauchsmaterialien aus den Illumina Kits erforderlich Verbrauchsmaterial Alkoholtupfer 70 Isopropyl oder Ethanol 70 Ballonflasche Fassungsverm gen mindestens 6 Liter 250 ml Zentrifugenr hrchen Konische 15 ml R hrchen Konische 50 ml R hrchen selbststehend optional Einweg Handschuhe ungepudert Labort cher fusselfrei Linsenpapier 4 x 6 Zoll 10 2 x 15 2 cm Pipettenspitzen 200 ul Pipettenspitzen 1000 ul ProClin 300 50 ml Tween 20 viskose Fl ssigkeit 100 ml Pinzette viereckige Kunststoffspitze Wasser Laborqualit t 18 M Ohm Vom Benutzer bereitzustellende Verbrauchsmaterialien Anbieter VWR Katalognr 95041 714 Allgemeiner Laborlieferant Allgemeiner Laborlieferant Corning Katalognr 430776 Corning Katalognr 430052 Corning Katalognr 430921 Allgemeiner Laborlieferant VWR Katalognr 21905 026 VWR Katalognr 52846 001 Allgemeiner Laborlieferant Allgemeiner Laborlieferant Sigma Aldrich Katalognr 48912 U Sigma Aldrich Katalognr P7949 McMaster Carr Katalognr 7003422 Millipore Zweck Reinigen der Flie zelle und des Flie zellentisches Vorbereitun
74. schlauf sp lt Tween 20 und ProClin 300 durch das System Dieser Waschlauf ist alle zehn Tage erforderlich und wird nach einem Sequenzierungslauf empfohlen Weitere Informationen hierzu finden Sie unter Durchf hren eines Wartungswaschlaufs auf Seite 38 Check Pr fung W hlen Sie die Option Check Pr fung um bei der Ger teinstallation oder der Behebung von Fluidik Fehlern den Bildschirm f r die Fluidikpr fung zu ffnen und den ordnungsgem en Fluss zu berpr fen Aktivit ts und Sensoranzeigen In der unteren rechten Ecke des Begr ungsbildschirms befinden sich mehrere Symbole die mithilfe von Ger tesensoren die Ger teaktivit t und den Status bestimmter Komponenten angeben Abbildung 8 Aktivit tsanzeigen Von links nach rechts befinden sich Aktivit tsanzeigen f r die X Y und Z Motoren die Elektronik Funktionalit t die Kamera das Fluidiksystem und Verarbeitungsfunktionen Abbildung 9 Sensoranzeigen Von links nach rechts stellen Sensoranzeigen die Temperatur der Flie zelle A die Temperatur des Reagenzienk hlers den Cloud Status von BaseSpace und die Temperatur von Flie zelle B dar HiSeq 4000 Systemhandbuch 9 9 8MIOS 000p beSIH Uberblick 10 Statussymbole In der oberen rechten Ecke jedes Bildschirms befinden sich Statussymbole die Sie ber Anderungen der Bedingungen Fehler oder Warnungen w hrend der Laufkonfiguration oder des Laufs informieren Statussymbol Statusname Beschreibung S
75. sierung tritt ein wenn eine Base zur ckf llt Eine Vorphasierung tritt ein wenn eine Base vorauseilt Abbildung 25 Phasierung und Vorphasierung A A Read mit einer phasierenden Base B Read mit einer vorphasierenden Base RTA v2 verwendet den Algorithmus zur Korrektur der empirischen Phasierung um die Auswirkungen der Phasierung und der Vorphasierung zu korrigieren Bei diesem Algorithmus wird w hrend jedes Zyklus des Laufs die Datenqualit t maximiert Die Ergebnisse der Phasierung und Vorphasierung werden in der Datei EmpiricalPhasing_ Lane _ Read _ Platte txt aufgezeichnet die sich im Ordner Data Intensities BaseCalls Phasing befindet Base Calling 92 Nachdem die Roh Intensit ten farbkorrigiert und die Phasierungs und Vorphasierungsdaten korrigiert wurden ist der Farbkanal mit der hellsten Intensit t der Base Call f r diesen Cluster in diesem Zyklus Das Base Calling beginnt auf einem HiSeq 4000 System das RTA v2 verwendet nach Zyklus 3 Beim Base Calling wird eine Base A C G oder T f r jeden Cluster einer bestimmten Platte eines bestimmten Zyklus festgelegt Base Calls werden in Base Call Dateien bcl gespeichert Base Call Dateien sind Bin rdateien mit 1 Byte pro Call und Qualit ts Score Jede Base Call Datei enth lt den Base Call und den entsprechenden Qualit ts Score Um einen Base Call durchzuf hren m ssen die Cluster zun chst den Reinheitsfilter passieren Cluster die den Filter nicht passie
76. sworkflow 17 Eingeben von Laufparametern 22 222222222222 18 Laden und Vorf llen von Reagenzien 2222 22 Einsetzen der Sequenzierungsflie zelle 29 berwachen des Laufs 0c2uccueeeneseesnensennesnennenoesesnnnnnennennenneneeneenn 33 Sarre Rauna Ar ag Ae a rca trt w HiSeq 4000 Systemhandbuch 1 5 cleyde Einleitung Um auf dem HiSeq 4000 System einen Lauf durchzuf hren bereiten Sie alle Reagenzien vor und halten Sie sich an die Eingabeaufforderungen der Software zum Einrichten des Laufs Zu den Schritten f r das Einrichten des Laufs geh ren das Eingeben der Laufparameter das Laden und Vorf llen der Reagenzien das Laden der Flie zelle und das Durchf hren einer Fluidikpr fung Rufen Sie die Spezifikationen f r das HiSeq 4000 auf der Illumina Website auf um Informationen ber die Laufzeit sowie andere Performance Spezifikationen zu erhalten Sequenzierungs Verbrauchsmaterialien HiSeq 4000 Kit Name Katalognummer HiSeq 3000 4000 SBS Kit 300 Zyklen FC 410 1003 HiSeq 3000 4000 SBS Kit 150 Zyklen FC 410 1002 HiSeq 3000 4000 SBS Kit 50 Zyklen FC 410 1001 Vorbereitung der Flie zelle und der Reagenzien Bevor Sie den Lauf einrichten bereiten Sie alle Reagenzien f r den Lauf vor SBS Reagenzien Indizierungsreagenzien und Paired End Reagenzien Wenn Sie von der Software dazu aufgefordert werden laden Sie alle Reagenzien Sie m ssen w hrend des
77. t Der Flie zellenregler ist orange Der Flie zellenregler blinkt orange Der Flie zellenregler blinkt gr n Schlechte Fl ssigkeitsabgabe HiSeq 4000 Systemhandbuch M gliche Ursache Die Software konnte interne Hardwareger te nicht initialisieren Die Flie zelle wurde nicht richtig platziert Das Vakuum ist nicht dicht Die Manifolds wurden nicht angehoben Das Vakuum wirkt zwar aber unzureichend Der Vakuumdruck ist zufriedenstellend M glicherweise Luftblasen im System M gliche Probleme bei der Laufkonfiguration Aktion Schlie en Sie die Fehlermeldung und starten Sie anschlie end die Ger tesoftware neu Falls das Problem weiterhin besteht starten Sie den Ger tecomputer neu Wenn Sie den Computer neu starten m chten schalten Sie das Ger t zuerst aus um sicherzustellen dass das DoNotEject Laufwerk korrekt erkannt wird Falls das Problem nach dem Neustart des Ger tecomputers weiterhin besteht schalten Sie das Ger t aus warten Sie mindestens 60 Sekunden und starten Sie das Ger t anschlie end neu Entfernen Sie die Flie zelle und wiederholen Sie die Reinigungsschritte Stellen Sie sicher dass die Dichtungen vorhanden sind und gut sitzen Setzen Sie die Flie zelle wieder ein Falls die vorhergehenden Schritte nicht zum Erfolg f hren ersetzen Sie die Dichtungen und setzen Sie anschlie end die Flie zelle erneut ein Entfernen Sie die Flie zelle und wiederholen Sie
78. t diesem Dokument keine Lizenzen unter seinem Patent Markenzeichen Urheberrecht oder b rgerlichem Recht bzw hnlichen Rechten an Drittparteien Die Anweisungen in diesem Dokument m ssen genau durch qualifiziertes und entsprechend ausgebildetes Personal ausgef hrt werden damit die in diesem Dokument beschriebene Anwendung der Produkte sicher und ordnungsgem erfolgen kann Vor der Verwendung dieser Produkte muss der Inhalt dieses Dokuments vollst ndig gelesen und verstanden worden sein FALLS NICHT ALLE HIERIN AUFGEF HRTEN ANWEISUNGEN VOLLST NDIG GELESEN UND BEFOLGT WERDEN K NNEN PRODUKTSCH DEN VERLETZUNGEN DER BENUTZER UND ANDERER PERSONEN SOWIE SACHSCH DEN EINTRETEN ILLUMINA BERNIMMT KEINERLEI HAFTUNG F R SCH DEN DIE AUS DER UNSACHGEM SSEN VERWENDUNG DER HIERIN BESCHRIEBENEN PRODUKTE EINSCHLIESSLICH TEILEN HIERVON ODER DER SOFTWARE ENTSTEHEN ODER JEDER ANDEREN ART DER VERWENDUNG DER PRODUKTE AUSSERHALB DES G LTIGKEITSBEREICHS DER AUSDR CKLICHEN SCHRIFTLICHEN LIZENZEN ODER DER DURCH ILLUMINA GENEHMIGTEN ZULASSUNGEN IN VERBINDUNG MIT DEM ERWERB DER PRODUKTE DURCH DEN KUNDEN NUR F R FORSCHUNGSZWECKE 2015 Illumina Inc Alle Rechte vorbehalten Illumina 24sure BaseSpace BeadArray BlueFish BlueFuse BlueGnome cBot CSPro CytoChip DesignStudio Epicentre GAllx Genetic Energy Genome Analyzer GenomeStudio GoldenGate HiScan HiSeq HiSeq X Infinium iScan iSelect MiSeq NeoPrep Nextera NextBio NextSeq
79. tatus OK Keine Anderung Das System funktioniert normal Information Nur zur Information Es ist keine Aktion erforderlich Achtung Informationen die m glicherweise Ihre Aufmerksamkeit erfordern Warnung Warnungen stoppen einen Lauf nicht erfordern jedoch m glicherweise eine Aktion bevor der Lauf fortgesetzt werden kann Fehler Fehler stoppen einen Lauf in der Regel und erfordern im Allgemeinen eine Aktion bevor der Lauf fortgesetzt werden kann Wenn eine Bedingungs nderung auftritt blinkt das entsprechende Symbol um Sie darauf aufmerksam zu machen Zum Beheben des Alarms w hlen Sie das Symbol aus um das Statusfenster zu ffnen Dort finden Sie eine allgemeine Beschreibung der Bedingung W hlen Sie Acknowledge Best tigen um die Meldung zu akzeptieren und Close Schlie en um das Dialogfeld zu schlie en Men des Begr ungsbildschirms Die Men schaltfl che des Begr ungsbildschirms die sich in der oberen linken Ecke des Begr ungsbildschirms befindet bietet folgende Optionen View Ansicht Bietet Optionen zum Anzeigen der Benutzeroberfl che im Vollbildmodus oder in einem Fenster sowie zum Minimieren der Benutzeroberfl che Tools Werkzeuge Bietet Zugriff auf das Fenster Options Optionen und die Option Show Log Protokoll anzeigen Options Optionen Im Fenster Options Optionen k nnen Sie die Standardeinstellungen f r Ihren Lauf festlegen Weitere Informationen hierzu finden Sie im F
80. tungen Setzen Sie je eine neue Dichtung in das vordere und das hintere Manifold ein Setzen Sie die Flie zelle wieder ein Stellen Sie sicher dass das Kontrollk stchen Vacuum Engaged Vakuum aktiviert auf dem Bildschirm f r das Laden der Wasch Flie zelle aktiviert ist W hlen Sie Next Weiter F hren Sie eine Fluidikpr fung durch a W hlen Sie L sung 2 aus der Dropdown Liste Akzeptieren Sie die Standardwerte f r die Pumpe b W hlen Sie Pump Pumpe c Inspizieren Sie die Flie zelle auf Luftblasen die die Lanes passieren sowie auf Undichtigkeiten in der N he der Manifolds Zus tzliche Luftblasen sind bei Tween 20 und ProClin 300 Waschl ufen normal und haben keinen Einfluss auf das abgegebene Volumen HiSeq 4000 Systemhandbuch 3 9 s nejyosems unyeM seule ueJynjyalng Verfahren nach einem Laut 40 12 13 14 15 16 17 Entfernen Sie die acht Abfallr hrchen der entsprechenden Flie zelle vom Abfallbeh lter Entfernen Sie nicht die acht R hrchen der gegen berliegenden Fliefzelle oder die R hrchen der Kondensatpumpe B ndeln Sie die acht Abfallr hrchen mit Parafilm sodass sie nebeneinanderliegen Platzieren Sie die geb ndelten Enden der Abfallr hrchen in einer 250 ml Flasche W hlen Sie Next Weiter um den Wasserwaschlauf zu starten W hlen Sie nach Abschluss des Waschlaufs Return to Start Zur ck zum Anfang Messen Sie das abgegebene Volumen HINWEIS Alle Flaschen und R hrche
81. tzufahren 3 Laden Sie Wasser in Laborqualit t wie folgt in das Ger t a F llen Sie acht SBS Flaschen mit 250 ml Wasser in Laborqualit t b F llen Sie zehn PE R hrchen mit 12 ml Wasser in Laborqualit t 4 Stellen Sie sicher dass eine gebrauchte Flie zelle geladen ist Setzen Sie ggf eine gebrauchte Flie zelle ein W hlen Sie Next Weiter 5 F hren Sie eine Fluidikpr fung durch a W hlen Sie L sung 2 aus der Dropdown Liste Akzeptieren Sie die Standardwerte f r die Pumpe b W hlen Sie Pump Pumpe c Inspizieren Sie die Flie zelle auf Luftblasen die die Lanes passieren sowie auf Undichtigkeiten in der N he der Manifolds 6 Entfernen Sie die Abfallschl uche der entsprechenden Flie zelle vom Abfallbeh lter Entfernen Sie nicht die Abfallschl uche der gegen berliegenden Flie zelle oder die Schl uche der Kondensatpumpe 7 B ndeln Sie die Abfallschl uche mit Parafilm sodass die Enden nebeneinanderliegen Platzieren Sie die geb ndelten Enden der Abfallschl uche in einer 250 ml Flasche 8 W hlen Sie Next Weiter um den Wasserwaschlauf zu starten Positionen Ungef hre Laufzeit Acht SBS Positionen 20 Minuten Acht SBS Positionen und zehn Paired End Positionen 60 Minuten HiSeq 4000 Systemhandbuch 41 SINe y9SEMISSSEM SOUI9 USIYNJYIING Verfahren nach einem Laut 42 9 Messen Sie nach Abschluss des Waschlaufs die abgegebenen Volumina und dokumentieren Sie sie auf dem Laborkontrollformular Positionen
82. ung Definiert die Clusterpositionen Registrierung und Intensit tsextraktion Zeichnet die Position der einzelnen Cluster auf der strukturierten Flie zelle auf und ermittelt einen Intensit tswert f r jeden Cluster Farbmatrixkorrektur Korrigiert Crosstalk zwischen Kan len Korrektur der empirischen Phasierung Korrigiert die Auswirkungen der Phasierung und Vorphasierung Base Calling Legt f r jeden Cluster einen Base Call fest Qualit tsbewertung Weist jedem Base Call einen Qualit ts Score zu Matrizenbildung Der erste Schritt im Workflow ist die Matrizenbildung Hierbei werden die einzelnen Clusterpositionen in einer Platte anhand von X und Y Koordinaten definiert Die Matrize wird bei der Registrierung und Intensit tsextraktion im nachfolgenden Schritt zu Referenzzwecken verwendet Aufgrund des Arrays auf der strukturierten Flie zelle sind die Clusterpositionen entsprechend der Anzahl der Reihen der Anzahl der Spalten und des Abstands zwischen den Nanowells auf der Flie zelle vordefiniert Weitere Informationen hierzu finden Sie unter Strukturierte Flie zelle auf Seite 5 Die Clusterpositionen des gesamten Laufs werden in einer Clusterpositionsdatei s locs gespeichert Weitere Informationen finden Sie unter Sequenzierung von Ausgabedateien auf Seite 55 Registrierung und Intensit tsextraktion Die Registrierung und die Intensit tsextraktion werden durchgef hrt nachdem die Matrize mit den Clusterpositionen erstellt wu
83. yklus 2 generiert und im Stammverzeichnis des Laufordners gespeichert Wenn Sie diese Option w hlen k nnen Sie den Bericht best tigen bevor Sie mit dem Lauf fortfahren Anderenfalls wird der Lauf fortgesetzt ohne dass das Best tigungsdialogfeld angezeigt wird 2 Optional W hlen Sie im Flie zellenbild diejenigen Lanes aus die Sie vom Lauf entfernen m chten Standardm ig werden keine Lanes entfernt I HINWEIS Das PhiX Alignment wird f r alle Lanes automatisch durchgef hrt 3 W hlen Sie Next Weiter Rezeptbildschirm Aus den im Rezepturbildschirm eingegebenen Informationen wird automatisch eine Rezeptur generiert 1 W hlen Sie eine Index Option aus No Index Kein Index F hrt einen nicht indizierten Paired End Lauf durch Single Index Einfacher Index F hrt einen Paired End Lauf mit einem Index Read durch Dual Index Doppelter Index F hrt einen Paired End Lauf mit zwei Index Reads und Paired End Resynthese durch Custom Benutzerdefiniert F hrt einen Paired End Lauf mit einer benutzerdefinierten Anzahl an Zyklen f r die Index Reads durch 2 Geben Sie die Anzahl der Zyklen f r Read 1 und Read 2 ein HiSeq 4000 Systemhandbuch 1 9 ulajaweledjne7 uo uaqeBuly Durchf hren eines Sequenzierungslaufs Wenn Sie die Indizierungsoption Custom Benutzerdefiniert ausgew hlt haben geben Sie die Anzahl der Zyklen f r jeden Index Read ein Read L ngen m ssen nicht identisch sein berpr fen Sie die

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