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1. Abb 4 22 Mikroskopische Aufnahmen von mit Hilfe der Lithographiemaske zur Strukturierung von Lamellen prozessierten Mikrokan len verschiedenen Abstands a b 30 um c d e 20 um In den Abbildungen links wurde jeweils auf die untere Kante fokussiert in den Abbildungen rechts auf die Oberkante 75 4 2 3 Zellkulturkammern UY baig 5 j ry ME ren i gg gt 3 mep u Fi a 4 ae Bi le al l Abb 4 23 Fertigung der Zellkulturkammern a angefertigte Gussformen b Fl ssiger Silikonkautschuk mit Luftbl schen in der Vakuumkammer c geh rtete Zellkulturkammer d Anpressen der Zellkulturkammer auf dem Biochip e fertiger Biochip Um mit Hilfe der prozessierten MEAs neuronale Aktivit t ableiten zu k nnen ist es notwendig eine Zellkulturkammer auf dem MEA aufzubringen die das N hrmedium aufnehmen kann Erst so wird eine Zellkultivierung auf dem Biochip zu m glich F r die Produktion der Zellkulturkammern musste zuerst eine Gussform siehe Abb 4 23 a angefertigt werden In diese Gu form wurde der Silikonkautschuk nach Zusammenmischen der beiden Komponenten und anschlie ender Entfernung der dabei entstandenen Luftbl schen in der Vakuumkammer siehe Abb 4 23 b gef llt Dabei scheiterte ein erstes Modell daran dass als Bodenplatte eine Polyacrylplatte verwendet wurde Polyacryl hat einen anderen Ausdehnungskoeffizienten als Al
2. transportiert Um diese zu ber cksichtigen wird E gt das Standardelektrodenpotential Eu Das amp Elektrodenpotential unter Standardbedingungen eingef hrt wobei das Standardelektrodenpotential 8 P i der Normal Wasserstoffelektrode als 5 O Bezugspotential Eo 0 gew hlt wird F r die o Berechnung des Elektrodenpotentials E wird Negativer Positiver Orientierter Hydrath lle wiederum die Nernst Gleichung siehe Gl 7 Ladungstr ger Ladungstr ger o Wasserdipol verwendet Abb 2 13 Schematische Darstellung der an Elektroden auftretenden Doppelschichten gem Literatur 10 E E In J yi X GI 7 rd An der Grenzfl che Elektrode Elektrolyt bildet sich eine starre Helmholtz Doppelschicht aus adsorbierten angelagerten Teilchen sowie eine darauf folgende diffuse Gouy Chapman Doppelschicht aus gel sten Teilchen aus siehe Abb 2 13 10 Dabei handelt es sich um ein dynamisches System bei dem die Konzentrationen untereinander wechselwirken Das Elektrodenpotential bleibt somit nicht konstant Die Doppelschichten wiederum sind recht komplex In elektrischen Modellen werden sie meist als RC Glieder Kondensatoren parallel zu Widerst nden dargestellt Eine Metallelektrode umh llt von einem schwer l slichen Salz des Metallions stellt eine Elektrode zweiter Art dar Das Elektrodenpotential h ngt von der Konzentration der Kationen im Salz ab welche
3. Ionenpumpen Die Ionenpumpen k nnen unter Spaltung von ATP AdenosinTriPhosphat organischer Energiespeicher ihre Konformation r umliche Anordnung ndern und dadurch in einem Zyklus 3 Natriumionen von innen nach au en und gleichzeitig 2 Kaliumionen von au en nach innen bef rdern siehe Abb 2 4 Den Ionenpumpen entsprechen somit ionenspezifische Strom bzw Spannungsquellen So bleibt der Natrium Kalium Konzentrations Gradient erhalten Aus dem Verh ltnis der Summen der mit ihrer Permeabilit t P gewichteten Konzentrationen innen wie au en ergibt sich die Ruhemembranspannung Membranspannung im Gleichgewichtszustand nach der Goldmangleichung Gl 3 4 RT Pkl K P Na P Cl C Me er Gl 3 F PxlK PyalNa PalCl Die nderung der Membranspannung und das damit einhergehende ffnen der spannungsgesteuerten Ionenkan le jedoch erkl rt erst die Funktionsweise eines Neurons Intrazellularraum Zellmembran 1 Phase 2 Phase 3 Phase Extrazellularraum Abb 2 4 Schematische Darstellung des Zyklus der Konformations nderungen und der Funktionsweise von Ionenpumpen in drei Phasen gem Literatur 3 l1 Spannungs Rezeptorgesteuerte Ionenkan le Die spannungsgesteuerten Ionenkan le ffnen sich sobald die Membranspannung eine gewisse Schwellspannung entspricht der n tigen Aktivierungsenergie zur Konformations nderung unterschreitet Dabei besitzen die spezifischen spann
4. bersicht ber die Ergebnisse mit Kapitelverweis 56 4 1 MEA Prozessierung In dieser Arbeit sollen Neuronen auf selbst gefertigten Mikroelektrodenarrays MEAs anwachsen Dazu muss die Biokompatibilit t der Materialien des Biochips gew hrleistet sein Im folgenden wird die Eignung der zur Verf gung stehenden Materialien ermittelt siehe Kap 4 1 1 und aus den geeignetsten Materialien nach Beseitigung von Problemen im Prozessablauf siehe Kap 4 1 2 und einer anschlie enden Optimierung siehe Kap 4 1 3 MEAs hergestellt siehe Kap 4 1 4 4 1 1 Materialkonzept Um die Biokompatibilit t der Materialien der f r die MEA Produktion zu vergleichen wurden verschiedene Deckgl ser mit einer reinen Oberfl che aus einem zu vergleichenden Material beschichtet Auf diesen Oberfl chen wurden nach dem bereits bekannten Verfahren siehe Kap 3 1 Neuronen aufgebracht und kultiviert Abb 4 3 Mikroskopische Aufnahmen von Maus SCG Zellen auf beschichteten Deckgl sern DIV 2 Beschichtung a Titan b Siliziumnitrid c Siliziumoxid d Silizium e Germanium f Unbeschichtetes Glas a f lebendes Gewebe Durchlichtmikroskopie 51 Da der Adhasionsvermittler besonders gut auf geladenen Oberfl chen haftet und die Oberfl chen der Deckgl ser nach der Beschichtung ungeladen sein sollten wurden die beschichteten Deckgl ser vor der Beschichtung mit den Adh sionsvermittlern mit Phosphors ure behandelt In
5. 78 Verbindung von invertierendem Eingang und Masse siehe Abb 4 25 a Die Ergebnisse geben Anlass zur Vermutung dass der Masseanschluss der Datenkarte AINGND wie auch ein Anschluss des Signalgenerators SG ber den Stromanschluss bereits geerdet sind In Abb 4 24 rechts sind die entsprechenden Schaltpl ne dargestellt Falls die Vermutung zutrifft Kommt es zu Masseschleifen welche das beobachtete Rauschverhalten erkl ren k nnten Diese einfache Annahme und deren Auswirkungen werden in Kap 4 4 1 noch detaillierter analysiert Als Konfiguration mit dem besten Signal Rausch Verh ltnis erweist sich eine gemeinsame Masse die nicht mit dem invertierenden Eingang verbunden ist wobei beide Messmethoden ann hernd des gleiche Ergebnis liefern siehe Abb 4 25 a F r weitere Messungen wurde diese Messkonfiguration siehe Abb 4 24 a eingesetzt Insbesondere die Verst rkerplatinen wurden nach diesem Schema verkabelt 1 l I 1 l 1 I I 1 I 0 100m 200m 300m 400m 500m 600m 700m 800m 900m 999 597m Zeit 5 500m 400m 5 200m o amp os E 0 E m EL 200m 400m 5 1 1 1 1 I I 1 1 I i 0 100m 200m 300m 400m 500m 600m 700m 800m 200m 999 097m Zeit 5 400m I 1 1 1 D 1 0 100m 200m 300m 400m 500m 600m 700m 800m 900m 999 097m Zeit s 500m 400m 200m o E 2 0 E m a v 200m 400m 1 1 1 1 1 I 1 1 1 1 1 0 100m 200m 300m 400m 500m 600m 700m 800m 900m 999 583m Zeit 5 1 1 1 1
6. Anschlie end sollen Vergleiche einzelner Komponenten des Messsystems durchgef hrt werden um dieses zu charakterisieren und in weiteren Arbeiten gezielt optimieren zu k nnen Der zeitliche Ablauf der mit diesem Aufbau durchf hrbaren Messung ist zur besseren bersicht in Abb 1 2 schematisch dargestellt N hrlanda Mehr sanal S a a I TAT L u rA N LOCAL PVN Bu a ER a Fe u gt I Pet g AATAanG S rn rti p fetta Merz WE AC II L IJ O A y ernamrt inn D x Auswertung H a Abb 1 1 Schematischer Aufbau des zu erstellenden Messsystems Der theoretische Teil dieser Arbeit besch ftigt sich mit der Beschaffenheit und Messbarkeit neuronaler Aktivit tsmuster sowie mit den Beschichtungsverfahren die zur Prozessierung der Biochips eingesetzt werden sollen Im methodischen Teil sollen die Zellkultivierung von Neuronen die Biochip Prozessierung sowie der Aufbau des Messsystems mit Kontaktierung und Verst rkerschaltung n her beschrieben werden Im Ergebnisteil sollen die Ergebnisse der Biochip Prozessierung sowie die Methoden zur Kalibrierung und Eigenheiten des Messsystems pr sentiert und durch geeignete Referenzmessungen die zentralen Fragestellungen untersucht werden Die gesamte Arbeit orientiert sich an der Beantwortung folgender Forschungsfragen e Kann ein geeigneter Biochip zum Ableiten neuronaler Aktivit t mit Methoden der Halbleitertechnologie hergestellt werden Im Zuge eine
7. 0 1 co fev Fr T Hl 0 i T rn mn Hui Wi ih dala Hab L iB Ti ud Ma vi al lds lite ed i j Zeit sl Abb 4 40 Aufgezeichnete Spannungsverl ufe bei der massefreien Kontaktierung des mit unterschiedlichen Elektroden sind in verschiedenen Farben dargestellt Kontaktiert physiologischer Kochsalzl sung bef llten Biochips tausendfach verst rkt Die Signale der 90 Den In einem anschlie enden Versuch wurde die Zellkulturkammer gem dem in Abb 4 41 dargestellten Schaltplan w hrend der Messung mit Hilfe der Referenzelektrode Ag AgCl auf ein konstantes Massepotential gelegt Die Ergebnisse der sind in Abb 4 42 zu sehen Es zeigt sich dass die Offsetspannung schon so hoch ist dass alle Kan le zu beiden Seiten aus dem Aufl sungsbereich verschwinden Dies ist auf eine ungleichm ige Potentialverteilung an den Elektroden zur ckzuf hren Dabei sind auch die Phasengrenzeneffekte an den Elektrodenoberfl chen zu ber cksichtigen Da die Kan le zu beiden Seiten aus dem Aufl sungsbereich verschwinden reicht es nicht aus die Offsetspannung am Signalgenerator anzupassen um alle Kan le in den Aufl sungsbereich zu bekommen Diese Abb 4 41 Schematischer Schaltplan mit Messelektroden in Fl ssigkeit mit Masseanschluss Schwierigkeit bei der Messung wird im Weiteren noch behandelt FE TET ou Floatend Mit Masseanschluss Floatend Spannung V 0 2 4
8. 1 27 4x 10e 10p Eigenproduktion Biochipkontakt Kontakthalterung 2xRM 1 27 2x 10f 10f Eigenproduktion Erste Verst rkerstufe Vorverst rker 8x10 RM 1 27 11f 15m Multichannel Systems Kontaktkabel 8x1 SUB D 11f 15m Eigenproduktion Zweite Platine 8x100 SUB D 15w 15w Eigenproduktion Verst rkerstufe Platine 8x1000 SUB D 15w 15w Eigenproduktion Rauschreduktion Hochpassfilter SUB D 15w 15m Eigenproduktion Signalerzeugung Signalgenerator USB Klemmen f 2k Agilent Biosignalsimulator Pads RM 2 54 Ip 4x16p Multichannel Systems Signalerfassung Oszilloskop Klemmen USB Ax2k w Tektronix Datenkarte SUB D USB 15w w National Instruments Datenspeicherung Computer USB m Software Labview Tab 3 18 bersicht ber die f r den Messaufbau ben tigten Module e Elektroden p Pads f Feinrasterstifte k Klemmen w weiblich m m nnlich 3 5 2 Signalgenerierung Mit dem zuvor beschriebenen Verst rkeraufbau sollen Aktionsimpulse gemessen werden Die Entstehung der Al kann entweder durch spontane neuronale Aktivit t oder aber durch externe elektrische Stimulation zustande kommen Zur Stimulation der Neuronen wurde ein Agilent 33220A Signalgenerator siehe Abb 3 34 eingesetzt Der gew hlte Signalgenerator kann kurze Pulse Pulsdauer lt 100 us mit steilen Kanten senden die ber eine entsprechende Programmierung weiter moduliert werden k nnen siehe Abb 3 34 32 So kann ein Aktionsimpuls elektrisch
9. 3 24 Aufbau einer Kontaktleiste mit F hrung Bauteile f r zwei Kontaktleisten mit justierbarer F hrung St ck Bauteil Modell Ma e mm Wichtiges 1 Vorverstarker MPASI 17 x 1 8 x 25 Rasterma 1 27 mm 6 Buchsenleiste 1 x 10 vergoldet 13 x 2 6 x 7 Rasterma 1 27 mm 20 Feinrasterstift F109 01B 034 G 050 0 48 x 15 8 Federweg 2 mm 4 Translationstisch M MT X 20 x 20 x 10 Arbeitsweg 9 5 mm 2 Winkelelement M MT AB2 25 x 20 x 25 Winkel 90 2 Winkelelement L Profil Alu 5 x 20 x 30 F hrung 18 x 2 6 x 5 mm 1 Stiftleiste 1 x 10 vergoldet 13 x2 2x 8 Rasterma 1 27 mm 1 Stecker SUB D 30 x 20 x 10 15 polig Koaxialkabel 20 cm 15 geschirmte Kabel in einem Tab 3 14 Liste der Bauteile f r zwei Kontaktleisten mit F hrung 43 3 3 2 Kontakthalterung Abb 3 25 Aufbau der Halterung f r die Biochips Um die Kontaktleisten auf dem Biochip ausrichten zu k nnen wurde eine Halterung angefertigt Sie wurde aus Aluminiumplatten verschiedener Dicke 0 1 cm 0 3 cm 1 cm sowie Schrauben Durchmesser 0 3 cm angefertigt siehe Abb 3 25 Um sp ter Bilder der gewachsenen Neuronen w hrend der Ableitung auch mit einem Durchlichtmikroskop aufnehmen zu k nnen wurde ein Loch in der Mitte der Bodenplatte gefr st Au erdem sind die vorgesehenen F hrungsschienen f r die Kontaktleisten sorgen f r die f r die Fixierung siehe Abb 3 26 Abb 3 26 Aufbau
10. 4 19 zeigt Fotos von strukturierten SU 8 Lackschichten auf Tr gersubstraten Die Prozessierung eines 300 um breiten Mikrokanals bei etwa gleicher Tiefe f r das erste MEA Abb 4 19 Fotos von Tr gersubstraten die mit biokompatiblem Design siehe Abb 4 19 c war dabei noch Fotolack unterschiedlich strukturiert wurden a Lamellen unkritisch Abb 4 20 zeigt mikroskopische strukturen b Struktur der Leiterbahnen nach Design 2 c Mikrokanal auf MEA nach Design 1 Aufnahmen des strukturierten SU 8 Lackschicht nach MEA Design Die W nde des Mikrokanals und der beiden Vertiefungen im Zellkulturkammerboden fallen dabei ber die gesamte H he der Lackschicht 300 um steil ab und sind an der Oberkante besonders scharf siehe Abb 4 20 c d Mit diesem Prozess lassen sich die Mikrokan le auch ber Elektroden platzieren um den Signaldurchfluss durch den Mikrokanal zu messen Siehe Abb 4 20 a b Dabei soll der Kanal zwei Gebiete des kultivierten neuronalen Netzwerks topologisch trennen Um zu gew hrleisten dass die Zellk rper der Neuronen aufgrund ihrer Gr e den Mikrokanal nicht passieren k nnen und so die Neuriten topologisch von den Zellk rpern zu trennen wird jedoch ein d nnerer Kanal ben tigt Im folgenden wurden zu diesem Zweck die mit diesem Prozess erreichbare Kanalbreite und der Mindestabstand zwischen den Mikrokan len bestimmt 72 Kanten des Mikrokanals Abb 4 20 Mikroskopische
11. Antwort des Messsystems auf einen generierten Spannungspuls Amplitude 40 100 mV Elektrodendurchmesser 100 um a in Bezug zum Abstand der Elektroden b in Bezug zur messenden Elektrode durchnummeriert entsprechend d c in Bezug zur Amplitude des generierten Impulses d Elektrodenbelegung e f Auflichtmikroskopische Aufnahmen einer elektrolytisch gel sten Elektrode mit Leitung 105 4 6 2 Signalantwort vs Elektrodendurchmesser Mit dem gefertigten Messsystem war es auch m glich den Einfluss des Elektrodendurchmessers auf die Amplitude und auf das SNR zu untersuchen Da der prozessierte Biochip Design 2 4 Arrays mit verschiedenen Elektrodendurchmessern besitzt siehe Abb 4 59 konnten diese in einer entsprechenden Messung verglichen werden Der Messaufbau entspricht dem in Kap 4 6 1 nur der Biochip wurde jeweils um 90 verdreht eingesetzt Damit wurden die Signale von Elektroden unterschiedlicher Gr e abgeleitet Das Erregersignal war wiederum ein Spannungsimpuls von 500 us Dauer und unterschiedlicher Amplitude 20 100 uV Abb 4 63 zeigt die aufgezeichneten Signalantworten bei einem Elektrodendurchmesser von 50 um und Abb 4 64 die aufgezeichneten Signalantworten bei einem Elektrodendurchmesser von 30 um Dabei wurden zur besseren bersicht in jeder der Abb 4 63 a g und Abb 4 64 a g die Signalantworten der jeweiligen Elektrode Nr 7 1 bei den f nf Messungen mit unterschiedlichen eingespeisten
12. ber das Loslichkeitsprodukt f r ges ttigte L sungen im Gleichgewicht gilt L Kationen in L sung Anionen in L sung konstant an die Konzentration von Anionen im Elektrolyten gekoppelt ist Ist die L sung wie im Falle von schwerl slichen Salzen schnell ges ttigt dann bleibt die Konzentration der gel sten Anionen konstant wodurch auch das Elektrodenpotential konstant bleibt Dadurch eignen sich Elektroden zweiter Art als Referenzelektroden Sie sind per Definition ebenfalls von einer Doppelschicht umgeben F r die auftretenden Reaktionen sei auf Tabelle 2 2 verwiesen Je nach Anwendungsgebiet werden Elektroden aus unterschiedlichen Materialien ben tigt Als Beispiel sei hier die Ag AgCl Elektrode Silber Silberchlorid Elektrode genannt da diese aufgrund der Stabilit t ihres Elektrodenpotentials in Kochsalzl sungen h ufig f r physiologische Messungen eingesetzt wird Doch auch die Messweise bedingt die Wahl der Materialien aus denen die Elektroden gefertigt werden 19 2 2 3 Methoden der Ableitung Je nach Positionierung und Beschaltung der Elektroden werden verschiedene Messweisen unterschieden die den Einsatzbereich des Messsystems grob definieren e Bei intrazellul rer Ableitung wird eine Elektrode au erhalb der Zellmembran und eine zweite Elektrode innerhalb der Zellmembran angebracht Das Anbringen der Ableitungen erfolgt blicherweise manuell und erfordert deswegen erheblichen Aufwand Au erdem werden
13. hrmedium abdichtend mit dem MEA verbunden werden Diese Verbindung soll in dieser Arbeit im weiteren als Biochip MEA mit Zellkulturkammer bezeichnet werden Die Anordnung der Elektroden auf dem MEA fertigungstechnisch festgelegt Der Einsatzbereich h ngt stark von der Gr e und Verteilung sowie der Anzahl der Elektroden ab Mit dem Durchmesser der Elektrode w chst die potentielle Kontaktfl che zu einem Neuron allerdings auch die Wahrscheinlichkeit dass von der gleichen Elektrode die Aktivit t mehrerer Neuronen gleichzeitig gemessen wird Kleine Elektroden hingegen geben ein rtlich sch rferes Bild ab jedoch sind sie von den Phasengrenzeffekten und dem daraus resultierenden Rauschen st rker betroffen Mit der Gr e der Elektrode steigt also auch die Stabilit t ihres Elektrodenpotentials F r die Qualit t des MEAs ist nun das Signal Rausch Verh ltnis engl Signal noise relation SNR entscheidend wobei keine proportionale Abh ngigkeit vom Durchmesser der Elektroden angenommen werden kann Je nach Anwendungsbereich variieren auch die Abst nde der Elektroden auf den MEAs Grunds tzlich sollten m glichst viele Elektroden m glichst dicht auf dem MEA angeordnet sein um Aussagen ber einzelne Neuronen treffen zu k nnen F r Aussagen bez glich eines ganzen Netzwerks erscheint es jedoch zweckm ig bei festgelegter Elektrodenzahl gr ere Abst nde zu w hlen Die Verteilung der Elektroden wiederum kann sehr spezifisch au
14. slichkeit der mit spezifischer Wellenl nge belichteten Bereiche zu ver ndern um den Fotolack mittels Belichtung durch eine Lithographiemaske Strukturmaske auf Maskentr ger strukturieren zu k nnen siehe Abb 2 16 Einfallendes Licht se TLL ELLs ENDEN uate Strukturmaske AB YYY BAA BLEN BAA Fotolack Abb 2 16 Schematische Darstellung der Belichtung in der Lithographie belichteter dunkel und unbelichteter hell Fotolack Bei einem Positivresist wird die L slichkeit in einem Entwicklerbad durch die Belichtung erh ht bei einem Negativresist wird sie gesenkt Dazu wird nach der gleichm igen Rotationsbeschichtung engl Spin coating eines geeigneten Substrats der Resist vor der Belichtung engl Softbake gebacken Ein neuerliches Backen nach der Belichtung und nach dem entwickeln engl Hardbake erh ht die mechanische Festigkeit der bereits strukturierten Lackschicht Die spezielle Klasse der Image Reversal Lacke stellt eine Kombination von Positiv und Negativresist dar Wird der Fotolack zuerst gebacken und dann belichtet werden in Analogie zum Positivprozess belichtete Bereiche l slicher Anschlie end k nnen jedoch mit einem weiteren sogenannten Umkehrbackschritt engl Image Reversal Bake speziell belichtete Bereiche aush rten was im Ergebnis einem Negativprozess entspricht In einer folgenden Flutbelichtung wird der bisher unbelichtete Bereich l slich Die L slichkeit bezieht sich nat rlich im
15. 1 i 0 100m 200m 300m 400m 500m 600m 700m 800m 900m 999 583m Zeit 5 Abb 4 25 Aufzeichnungen der Funktionstests der Grundschaltung zehnfach verst rkt In rot ist jeweils die Spannung zwischen AINI VOUT und AINO VREF in wei die Spannung zwischen AINI und AINGND dargestellt Die Messkonfigurationen wurden gem den in Abb 3 23 gezeigten Schaltpl nen gew hlt a AINO AINGND DGND b AINO AINGND DGND VIN c AINO PE AINGND DGND d e AINO DGND AINGND PE 79 4 3 2 Signalgenerierung unter Belastung Da jede Stromquelle wie auch der Signalgenerator einen Innenwiderstand Ry besitzt h ngt der tats chliche Spannungsabfall an einem angeschlossenen Verbraucher UL gem U Us R R Ry von der generierten Gesamtspannung Uc sowie vom Lastwiderstand R ab Deshalb kann am Signalgenerator der angeschlossene Lastwiderstand eingestellt werden UL 20 Q unendlich Daraus errechnet der Signalgenerator die f r einen einstellbaren gew nschten Spannungsabfall am Lastwiderstand UL n tige Gesamtspannung Ug Der Innenwiderstand des verwendeten Signalgenerators R betr gt 20 Q Im Grenzfall Re 20 Q gilt deswegen U Us 2 und im Grenzfall R unendlich gilt U Uc Eine Messung an verschiedenen aus einzelnen Widerst nden aufgebauten Spannungsteilern am Signalgenerator gem dem Schaltplan in Abb 4 26 mit als unendlich angenommenem Lastwiderstand zeigt den Verlauf der abfall
16. 20 Dauer Min 12 Nominelle tzrate Siliziumnitrid 30 nm Min Tab 3 11 Angewandte Prozessparameter beim reaktiven Ionen tzen 39 Lithographische Strukturierung des Zellkulturkammerbodens Prozessschritt n Es wurden Zellkulturkammern mit Kanalstrukturen ber Elektroden entwickelt Diese Kanalstrukturen wurden mittels eines Fotolackes der Schichtdicken von bis zu 300 um zul sst hergestellt Dieser Lithographieschritt wurde mit einem SU 8 Fotolack auf Epoxidbasis siehe Abb 3 19 durchgef hrt Der eingesetzte Negativresist ist bekannterma en biokompatibel 25 und im ausgeh rteten Zustand nicht mehr durch herk mmliche L sungsmittel abzul sen Dazu wird der SU 8 Fotolack nach der Entwicklung auf einer Heizplatte siehe Abb 3 20 hart gebacken Er bleibt danach bestehen und wird nicht durch erneuten Lift off entfernt So wird der Zellkulturkammerboden direkt durch das Lackmaterial selbst lithographisch strukturiert Dieser Fotolack ist hochviskos sodass mit angepassten Prozessparametern eine Schichtdicke von ber 300um erreicht werden kann F r die lithographische Strukturierung dieses SU 8 Lacks sind jedoch andere Prozessparameter notwendig sodass ausgehend von Standardparametern 26 Parameter optimiert wurden Weil der Fotolack so hochviskos ist muss er zun chst grob verteilt engl Dispense an anschlie end durch schnellere Rotation Spin auf gew nschte gleichm ige Schichtdicke gebracht werde
17. 4 1 1 nach dem bekannten Verfahren zur Gewinnung und Kultivierung von Maus SCG Zellen siehe Kap 3 1 durchgef hrt F r die Herstellung des Biochips wurden 2 Elektrodendesigns entwickelt Nach einer notwendigen Prozessoptimierung siehe Kap 4 1 2 und Kap 4 1 3 konnte erfolgreich ein Prozessablauf siehe Kap 3 2 2 zur Fertigung eines Biochips mit Hilfe plasmaunterst tzter Beschichtungs und tzverfahren siehe Kap 2 3 2 und lithographischer Strukturierung siehe Kap 2 3 1 ausgearbeitet werden siehe Kap 4 1 4 Dazu wurde Gold als Leitermaterial und Siliziumnitrid als Isolationsmaterial eingesetzt Zur verbesserten Haftung der Elektroden auf dem Glassubstrat wurde eine Haftschicht f r die Elektroden siehe Kap 3 2 3 aus Chrom oder aus Titan eingesetzt Die tzdauer der Isolationsschicht wurde auf 12 Minuten angepasst damit die Elektroden auch wirklich frei liegen Die beiden Elektrodendesigns wurden erfolgreich prozessiert und elektrisch charakterisiert Zur Aufnahme des neurobasalen N hrmediums wurden ma sgefertigte Zellkulturkammern hergestellt Es wurden erfolgreich Gussformen aus Aluminium angefertigt siehe Kap 3 2 4 mit deren Hilfe Zellkulturkammern aus biokompatiblem Silikonkautschuk gegossen wurden Anschlie end wurden die Kulturkammern ber ein weiteres entwickeltes Verfahren siehe Kap 3 2 5 wasserdicht mit dem Mikroelektrodenarray verbunden siehe Kap 4 2 3 Au erdem wurde mit der Entwicklung einer Elektrodenvergii
18. Abb 4 32 c d zeigt dass die einzelnen Kan le auch unabh ngig voneinander funktionieren In den signalfreien Kan len konnten nur ein berh htes Rauschen jedoch keine Spuren vom angelegten Rechtecksignal detektiert werden Ein elektrisches bersprechen konnte so ausgeschlossen werden Au erdem beweisen die Signale dass der Kontakt zum Biochip hergestellt ist Somit ist der Messaufbau gem der Zielsetzung der Ableitung neuronaler Signale komplett siehe Abb 4 33 Die Elektroden auf dem Biochip k nnen auf der Halterung einzeln kontaktiert werden und ihre so elektrisch abgeleiteten Signale auf der Platine verst rkt und von der Datenkarte erfasst werden Dabei sind die Kan le elektrisch voneinander isoliert 85 USB Zum Computer a pring AD U Abb 4 33 bersicht ber den gesamten Messaufbau 4 3 5 SNR im Verst rkungsfaktorvergleich Um den Einfluss des Verst rkungsfaktors auf das gemessene Signal Rausch Verh ltnis engl Signal noise relation SNR zu bestimmen wurden die beiden Verst rkerplatinen x1000 und x100 miteinander verglichen Als Signalquelle wurde in diesem Fall ein Biosignalsimulator von Multichannel Systems siehe Kap 3 5 3 eingesetzt Dieser simuliert ein von einem MEA gemessenes neuronales Signal was mit dem Signalgenerator selbst ber aufwendigste Programmierung nur unter Einsatz eines Spannungsteilers m glich w re und st rende Verzerrungen des Signals bewirken kann A
19. Analysis of Action Potentials International Conference on Computational Intelligence for Measurement Systems and Applications 2004 26 29 9 S Schmitz Der Experimentator Zellkultur Spektrum Akademischer Verlag 2008 130 140 115 10 D A Stenger T M McKenna Enabling Technologies for Cultured Neural Networks Academic Press 1994 125 144 11 G Xiang L Pan L Huang Z Yu X Song J Cheng W Xing Y Zhou Microelectrode array based system for neuropharmacological applications with cortical neurons cultured in vitro Biosensors and Bioelectronics Ausgabe 22 2007 2478 2484 12 R Weis P Fromherz Frequency dependent signal transfer in neuron transistors Physical Review E Ausgabe 55 1997 877 899 13 EcoMEA Glass User Manual by Multi Channel Systems GmbH 14 M Bove M Grattarola S Martinoia G Verreschi Interfacing cultured neurons to planar substrate microelectrodes characterization of the neuron to microelectrode junction Bioelectrochemistry and Bioenergetics Ausgabe 38 1995 255 265 15 B J Dworak B C Wheeler Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture Lab Chip Ausgabe 9 2009 404 410 16 J R Sheats B W Smith Microlithography Science and Technology Marcel Dekker 1998 43 55 17 G Jing Y Yao M Gnerlich S Perry S Tatic Lucic Tow
20. Aufnahmen des aus SU 8 Fotolack hergestellten Zellkulturkammerbodens a b Mikrokanal ber freige tzter Elektrode c d Rand der ringf rmigen Vertiefung im Zellkulturkammerboden In den Abbildungen links wurde jeweils auf die untere Kante fokussiert n den Abbildungen rechts auf die Oberkante Daf r wurden zwei Tr gersubstrate komplett mit SU 8 Lack beschichtet und lithographisch strukturiert siehe Abb 4 19 a b Als Haftschicht f r den Fotolack wurde jeweils Siliziumnitrid eingesetzt da dies auch auf dem MEA den Untergrund f r den Zellkulturkammerboden darstellt Der Fotolack haftete gut auf dieser Oberfl che 45 Lichtmikroskopische Aufnahmen der so hergestellten Kanalstrukturen in zwei Fokusebenen Oberkante Unterkante sollen Aussagen ber die in diesem Prozess erreichte Kantensch rfe die minimale Kanalbreite und den Mindestabstand der Mikrokan le zulassen Dabei ist entscheidend ob die Strukturen auf den Lithographiemasken abbildungsgetreu auf den Fotolack bertragen werden konnten In Abb 4 21 sind prozessierte Mikrokan le dargestellt Es zeigt sich dass die Kanten aller Mikrokan le von 10 100 um Breite ausreichend scharf sind Die W lbung des Lacks siehe Abb 4 21 b spielt dabei eine nebens chliche Rolle da der Abstand der Kan le gro genug gew hlt wurde Abb 4 22 zeigt prozessierte Mikrokan le die n her aneinander liegen Die Prozessierung stie bei einem Abstand der Mikrokan le von unter 30 um
21. Kap 4 5 6 wurde zur Identifizierung der Biosignale auf die massefreie Messung zur ckgegriffen Dabei zeigte sich dass es mit lebenden Zellkulturen auf den Elektroden zu Spannungs nderungen kommt die bei unbewachsenen Elektroden nicht auftreten und die beschriebenen hnlichkeiten mit den erwarteten neuronalen Signalen aufweisen So wurden im Rahmen dieser Arbeit die Grundlagen gelegt um neuronale Signale extrazellul r mit Hilfe von Elektrodenarrays abzuleiten und zur sp teren Auswertung aufzuzeichnen 110 Spannung HV E 60 uV 60 H a 0 25 5 Zeit ms 20 Spannung HV Zeit ms Abb 4 70 Vergr erte Darstellung der aufgezeichneten Signale mit Maus SCG Zellen a im Vergleich zu einem identifizierten ebenfalls extrazellul r abgeleiteten Aktionsimpuls von Spinalganglion Zellen eines H hnerembryos b 14 111 5 Res mee Das Ziel dieser Arbeit war der Aufbau und die Evaluierung eines Biochip basierten Messsystems f r die Erfassung elektrischer Signale von neuronalen Zellkulturen Im ersten Schritt wurde ein geeigneter Herstellungsprozess f r einen problemorientierten Biochip mit Hilfe der Halbleitertechnologie entwickelt Im zweiten Schritt wurde ein geeigneter Messaufbau zur elektrischen Ableitung und Analyse neuronaler Signale vom selbst entwickelten Biochip hergestellt und evaluiert Zuerst wurde eine eingehende berpr fung der einsetzbaren Materialien auf Biokompatibilit t siehe Kap
22. Silikonkautschuk im Ofen gebacken Die Prozessparameter mussten erst bestimmt werden wobei als Orientierungshilfe auf bereits ver ffentlichte Arbeiten zu diesem Thema zur ckgegriffen wurde 23 Tabelle 3 13 zeigt die verwendeten Parameter des Plasmaveraschens Abb 3 21 Plasmaverascher Foto Prozessparameter beim Plasmaveraschen Plasmaverascher TEPLA 300 E Prozessgas gt 99 99 Sauerstoff Prozessdruck 0 7 Torr Leistung 100 W Veraschungsdauer 38 Backen 30 Min bei 100 C Tab 3 13 Angewandte Prozessparameter bei der Hydrophilisierung der Zellkulturkammer im Plasmaverascher zur Haftungssteigerung Mit den beschriebenen Prozessen konnte eine vollst ndige Fertigung der Biochips durchgef hrt werden F r die elektrische Signalableitung mussten die Biochips in eine Kontakthalterung f r die Messelektronik eingesetzt werden 41 3 3 Kontaktierung der Biochips Zur elektrischen Kontaktierung der Messelektronik mit dem Biochip in einer Kontakthalterung siehe Kap 3 3 2 wurde ein Kontaktkonzept siehe Kap 3 3 1 entwickelt das erm glichen soll vom Biochip abgeleitete Signale ohne weitere Leitungswege direkt zu verst rken um den Einfluss von St rsignalen aus der Umgebung zu reduzieren 3 3 1 Kontaktkonzept Um mit den prozessierten Biochips neuronale Aktivit t ableiten zu k nnen muss zun chst H lse der elektrische Kontakt von Biochip zu Messinstrument gew
23. V m Vergleich zum Netzbrumm vernachl ssigbar ist lt 50 Da in den bisher aufgezeichneten Signalen bei beschalteten Eing ngen der Netzbrumm mit 50 Hz nicht identifiziert werden konnte wurde angenommen dass sich eine Schirmung der Leitungen nur unwesentlich auf das Rauschverhalten auswirkt Jedenfalls m ssen noch zus tzliche Rauschquellen vorliegen deren St rsignale sich auf die Messung st rker auswirken als die durch Funk bertragung eingefangenen St rsignale Es liegt zwar auf der Hand dass insbesondere ein Rauschen von 50 Hz mittels Schirmung reduziert werden kann jedoch sollten zun chst andere Methoden der Rauschreduktion untersucht werden da durch die Schirmung allein keine merkliche Verbesserung des Signal Rausch Verh ltnisses zu erwarten ist ia hh KINN it Il INN N NN INN i ih INA N j fl Mit I Il INN IN I Lil iH mii IN z g N Ih E 6 5 ar IM MAA nt INN AMAA INN ETOH HI IN IN I i IN i ii NEAL I Atl 1 N N N I N N N N N NN NM I IM Hit Mh IN N Il N ii AANNANRAA i Hi Wi 2 Mh E 4 a I un 7 F i i i IA i Hi Li 1 i 1 1 I I I 1 i i 1 i I I 1 i 1 I I a 0 50m 100m 150m 200m 250m 300m 350m 400m 450m 500m 550m 600m 650m 700m 750m 800m 850m 900m 950m 1 Zeit 5 N IM ii hy IN II Ni o 5 i HI li il N i N il II IN j N
24. an den kleineren Elektroden mit Erregeramplituden gr er 40 mV nicht zum Vergleich herangezogen werden konnten da sie au erhalb des Aufl sungsbereichs lagen 107 AINS 2 _20 mV Stimulus AINS 2 amp 40 mV Stimulus b AINS 2 A 60 mV Stimulus o in PER vit et ma nik AINS 2 amp 80 mV Stimulus an AINS 2 a 100 mY Stimulus te Abb 4 65 Aufgezeichnete Signalantworten an Eingang AINS5 bei einem Elektrodendurchmesser von 50 um auf einen Spannungsimpuls von 500 us Dauer und unterschiedlichen Spannungsamplituden a 20 mV b 40 mV c 60 mV d 80 mV e 100 mV Der Aufl sungsbereich in der gew hlten Anordnung ist zu klein um Signalantworten sinnvoll ableiten zu k nnen Bei minimaler Stimulation 20 mV ist ein Gro teil der Elektroden bereits zu stark geladen Um kleinere Spannungsunterschiede zu erzeugen lie e sich ein Spannungsteiler einsetzen Aufgrund der bei Elektrodendurchmessern kleiner 100 um aufgetretenen unerw nschte Effekte wurde jedoch darauf verzichtet Es liegt die Vermutung nahe dass diese Effekte durch eine Elektrodenverg tung beseitigt werden k nnen F r aufschlussreichere Analysen ist ein Messaufbau mit wesentlich mehr Elektroden notwendig Als finaler Test wurde mit dem im Rahmen dieser Areit entwickelten Messaufbau ein Versuch an lebenden Neuronen durchgef hrt Dazu wurde aus den beschrieben Gr nden auf Elektroden mit einem Durchmesser
25. aufgebracht und lithographisch strukturiert Schritt j welche im tzprozess Schritt k die nicht zu tzenden Bereiche bedeckt So kann die Isolation gezielt nur an den f r die Kontaktpads und die Elektroden vorgesehenen Bereichen von den Leiterbahnen entfernt werden Die Oberfl chenverg tung an den Elektroden wird wiederum im Lift off Verfahren strukturiert Dabei wird die bereits bestehenden Lackschicht mittels Sputtern mit dem Verg tungsmaterial beschichtet Schritt 1 und anschlie end die Lackschicht entfernt Schritt m So kann die Verg tung gezielt auf die Elektroden aufgebracht werden Der Zellkulturkammerboden wird direkt lithographisch strukturiert Schritt n Er besteht aus einem biokompatiblen und im ausgeh rteten Zustand besonders stabilen Fotolack Die W nde der Zellkulturkammer wurden in einem eigenen Verfahren hergestellt welches noch eingehender beleuchtet werden soll siehe Kap 3 2 4 Das Anhaften der W nde auf der Oberfl che des MEAs Schritt 0 kann durch vorhergehendes Plasmaveraschen zur Hydrophilisierung der beiden Kontaktfl chen erheblich verbessert werden Der Prozessablauf in einzelnen Prozessschritten Prozessschritt Methode Material a Reinigung des Tr gersubstrats Ultraschallbad Aceton Propanol b Beschichtung mit der Haftschicht 1 f r den Fotolack Sputtern PECVD Cr SiN4 S c Beschichtung mit Fotolack und Strukturierung der L
26. dargestellt Mit Hilfe des Signalgenerators Agilent A Mikroskopische Aufnahme des prozessierten 332204 wurden 5 unterschiedliche Impulsamplituden 20 Biochips Design 2 100 mV mit einer Dauer von 500 us ber eine der Elektroden auf dem MEA eingespeist und die Signalantworten die von allen anderen Elektroden abgeleitet wurden nach Durchlaufen des Hochpassfilters sowie der tausendfachen Verst rkerschaltung aufgezeichnet Abb 4 60 Schematischer Schaltplan f r Referenzmessungen 103 Spannung Spannung je je Cc Cc Cc Cc Cc c m m EL cL oo oo T amp Cc Cc 2 Cc Cc Cc Cc m m EL CL on on 150 E10 ma Th Cc 2 z 5 5 EL L on on Abb 4 61 Aufgezeichnete Signalantworten bei einem Elektrodendurchmesser von 100 um auf einen Spannungsimpuls von 500 us Dauer und unterschiedlichen Spannungsamplituden gelb 20 mV blau 40 mV wei 60 mV rot 80 mV griin 100 mV a g an den Elektroden 7 1 h Schematische Darstellung der Erregersignale Abb 4 61 zeigt die erfassten Signale Dabei wurden zur besseren bersicht in jeder der Abb 4 61 a g die Signalantworten der jeweiligen Elektrode Nr 7 1 bei den f nf Messungen mit unterschiedlichen eingespeisten Impulsamplituden zusammengefasst Es ist deutlich zu erkennen dass die gemessene Signalantwort sowohl von der Amplitude des eingespeist
27. der Dauer eines Aktionsimpulses entspricht in 30 Messpunkten abgetastet werden Dies sollte ausreichen um Aktionsimpulse vom Rauschen unterscheiden zu k nnen Zur Veranschaulichung ist in Abb 3 38 ein 5 ms dauernder Aktionsimpuls in 50 Messpunkten aufgel st also mit einer Abtastrate von 10 kS s dargestellt 53 B wea n f 1 TH z N 5 5 Abb 3 36 Datenkarte 34 berblick ber die eingesetzten Datenerfassungsmethoden Abb 3 37 Oszilloskop 35 Datenkarte Modell NI USB 6211 Abtastrate kS s 250 Analoge Eing nge AIN 16 monopolar 8 bipolar Max Eingangsspannung 10 V Fehler lt 4mV Oszilloskop Modell Tektronix TDS 2004B Analoge Eing nge 4 Datenerfassung Software Labview Signal Express 3 0 Tab 3 20 Eigenschaften der Ger te zur Datenerfassung 100 gt E er In D A 5 E D gt 0 500 1500 20 40 aufgel st Aktionsimpuls 2000 2500 3000 3500 4000 Zeit us Abb 3 38 Ein 5 ms dauernder schematischer Aktionsimpuls in 50 Messpunkten 4500 5000 54 4 Ergebnisse Ziel dieser Arbeit war die Konzeption Realisierung und Charakterisierung ein Messsystem zur Ableitung neuronaler Aktivit t Vor der Beschreibung der Resultate soll ein berblick ber den Ablauf der Messung im Hinblick auf die daf r ben tigten Ger te sowie auf die
28. der Zielsetzung Signale von Zellen innerhalb einer von einem strukturierten Zellkulturkammerboden definierten Fl che ableiten zu k nnen Es wurden zwei Designs ausgearbeitet Das erste Design orientierte sich stark nach einer zuverl ssigen technischen Umsetzbarkeit Deshalb sind die Leiterbahnen auf der entsprechenden Lithographiemaske und die tzl cher f r die Elektroden auf der Lithographiemaske zur Strukturierung der Isolationsschicht relativ gro 100 um Durchmesser siehe Abb 3 5 und 3 6 Referenzelektrode Kontaktpads cr Da _Leiterbahnen stim PALA o Maske f r die Isolation EN Alignmentstrukturen ao t rage rsubstra tbegre nzung Y Maske f r den Mikrokanal Abb 3 5 Design der Lithographiemasken nach MEA Design 1 a zur Strukturierung der Leiterbahnen b zur Strukturierung der Isolation c zur Strukturierung des Zellkulturkammerbodens Abbildungen b und c stellen vergr erte Ausschnitte dar welche der blauen Markierung in Abbildung a entsprechen 29 Da gro e Elektroden nur starke Spannungsschwankungen messen k nnen wobei an den gemessenen Spannungsunterschieden auch die Signale von mehreren Neuronen beteiligt sein k nnen ist dieses MEA gut geeignet f r die Ableitung von Bursts Signalausbreitung im gesamten Neuronennetzwerk Zu diesem Zweck sind die Elektroden in einem gro en Abstand 1 mm von Mittelpunkt zu Mittelpunkt angeordnet F r die Kontaktierung der Elektroden sind
29. die Funkion eines Neurons zu verstehen und so den Informationsgehalt eines neuronalen Signals aussch pfen zu k nnen muss etwas genauer auf die neuronale Signalausbreitung eingegangen werden Dazu ist es zweckm ig sich zun chst den stark spezialisierten Aufbau eines Neurons vor Augen zu f hren Aufbau eines Neurons Ein typisches Neuron ist aus Dendriten sich verzweigende Forts tze die die Eing nge des Neurons darstellen dem Soma Zellk rper ohne Forts tze und dem Axon faserartiger Fortsatz der den Ausgang des Neurons darstellt aufgebaut siehe Abb 2 7 An den unz hligen Dornen Forts tze der Dendriten und Axone befinden sich wiederum unz hlige Synapsen Verbindungsstelle zweier Neuronen Das Soma beinhaltet verschiedene Organellen die alle f r die Funktion des Neurons n tigen Stoffe produzieren Der Axonh gel Verdickung am Soma welcher das Axon entspringt bildet den bergang zum Axon Das Axon wiederum kann je nach Zelle beeindruckende L ngen erreichen im R ckenmark ber 1 Meter und ist dazu von einer Isolationsschicht aus Myelinscheiden von H llzellen produziertes Myelin und Ranvierschen Schn rringen Spalt zwischen zwei Myelinscheiden umgeben Generell sind Neuronen im lebenden Organismus in ein Gewebe aus Gliazellen St tzzellen eingebettet Hierzu z hlen auch die oben erw hnten H llzellen 13 Dorn Zellkern Axonh gel Myelinscheide g u u Dendriten Soma Axon 4 Ranv
30. die Kontaktpads Kontaktfl chen zu beiden Seiten Links rechts f r getrennte Messung Stimulation vorgesehen und richten sich in ihrem Abstand nach dem Rasterma des Vorverst rkers Die Tr gersubstratbegrenzung auf den Lithographiemasken erleichtert die Orientierung beim Einlegen der Masken in den Mask Aligner Die Alignmentstrukturen sollen ein pr zises Alignment Positionierung einer Lithographiemaske ber einem bereits strukturierten Substrat erlauben Auf der Lithographiemaske zur Strukturierung des Mikrokanals ist die gew nschte Beschaffenheit des Zellkulturkammerbodens zu sehen zwei runde Vertiefungen die durch einen d nnen Kanal 300 um verbunden werden Als Referenzelektrode sollte eine au erhalb der Vertiefungen aber noch im Elektrolyt gelegene Elektrode eingesetzt werden F r den Fall dass diese Referenzelektrode aufgrund ihres kleinen Durchmessers st renden Spannungsschwankungen unterlegen ist siehe Kap 2 2 2 befindet sich 1 mm daneben eine Stimulationselektrode Atzl cher f r die Kontaktpads ii tzl cher f r die Elektroden N TNS Alignmentstrukturen ao t Tr gersubstratbegrenzung n Abb 3 6 Design der Lithographiemasken nach MEA Design 1 a zur Strukturierung der Isolation b zur Strukturierung der Leiterbahnen c zur Strukturierung des Isolation Abbildungen b und c stellen vergr erte Ausschnitte dar welche der blauen Markierung in Abbildung a entsprechen 30
31. durch die Vierpunktmessung signifikant verbessert wurde So konnte im Vergleich zur Dreipunktmessung das Rauschen auf weniger als zwei drittel reduziert werden w hrend sich die S gnalamplitude vergleichsweise fast verdoppelt F r weitere Messungen wurden deswegen die Anschl sse gem der Vierpunktmessung gew hlt Spannung V Abb 4 48 Zeitverlauf des tausendfach verst rkten Spannungssignals einer Elektrode bei einer Vierpunktmessung mit einer Referenzelektrode Ag AgCl als Signalmasse und einem Rechtecksignal mit einer Amplitude von 20 mV einer Wiederholfrequenz von Hz und einer Offsetspannung von 1 8 V als Erregersignal 0 4 0 6 0 8 1 Zeit s 94 4 5 Rauschreduktion Bei den vom Verst rker aufgezeichneten Signalen wurde das Rauschen als wesentlicher St rfaktor identifiziert Deswegen wurden Rauschursachen und m gliche Filterschaltungen untersucht Im speziellen wurde der Einfluss des Masseanschlusses siehe Kap 4 5 1 und der Schirmung siehe Kap 4 5 2 die Rauschreduktion mit Tiefpassfiltern siehe Kap 4 5 3 und Hochpassfiltern siehe Kap 4 5 4 sowie eine softwarebasierte Signalkonditionierung siehe Kap 4 5 5 analysiert 4 5 1 Stromquellenvergleich Als eine m gliche Ursache des Rauschens wurden die Stromquellen untersucht Da bei der Messung mit Vorverst rker zwei Stromquellen eingesetzt wurden bot sich bei diesen Messungen ein zus tzlicher Stromquellenvergleich an Dazu wurde
32. experimentelle Vorarbeit gegeben werden siehe Abb 4 1 In Folge sollen zuerst die Ergebnisse der MEA Produktion siehe Kap 4 1 und der Biochipproduktion siehe Kap 4 2 in einzelnen Schritten pr sentiert und in Hinsicht auf die Forschungsfragen siehe Kap 1 diskutiert werden Au erdem soll eine Kalibrierung des Messsystems siehe Kap 4 3 mit speziellem Bezug auf die Wahl der Beschaltung siehe Kap 4 4 und auf verschiedene Methoden der Rauschreduktion siehe Kap 4 5 mit einer abschlie enden Referenzmessung Siehe Kap 4 6 durchgef hrt werden Die unterschiedlichen experimentellen Konzepte sollen verglichen und hinsichtlich des Einsatzes f r die Messung neuronaler Signale diskutiert werden Zur genaueren bersicht sind die Ergebnisse in Abb 4 2 in Themenbereiche untergliedert dargestellt Abb 4 1 bersicht ber den zeitlichen Ablauf der Messung und Anforderungen an das Messsystem sowie die daf r ben tigte experimentelle Vorarbeit 55 Biokompatibilit t Fertigung von MEAs Elektrodenverg tung Mikrokanale Zellkulturkammer Biochip Erweiterungen Signalgenerierung Digitale Datenerfassung Verst rkungsfaktor Verzanzenaillng 1 Dstunge Verst rkung Elektroden Masseanschluss beschaltung Dreipunktmessung Vierpunktmessung Messsystem Bearbeitung Referenz Elektrodenabstand messungen Elektrodengr e Abb 4 2
33. gem Literatur 7 rot aktives blau inaktives Neuron So kann das Netzwerk selbst komplexe Probleme l sen Die Effektivit t einer chemischen Synapse w kann zudem ber die Gr e des synaptischen Spalts ver ndert werden kann Daf r sind komplexere Vorg nge im Netzwerk notwendig die unter dem Begriff Lernen zusammengefasst werden Dies geschieht unter anderem ber hormonelle Steuerung Dabei wird davon ausgegangen dass jene Synapsen effektiver werden welche fters zu einem Aktionsimpuls beigetragen haben F r die Simulation der Ver nderung der Effektivit t einer Synapse w wird meist die Hebb sche Lernregel GI 6 f r einen Lernschritt angewendet Neben der Korrelation der Membranspannung an der betreffenden Pr synapse x und der Aktivit t des darauf folgenden Neurons 6 tritt darin die Lernrate amp als normierender Faktor f r die nderung der synaptischen Effektivit t in einem Lernschritt auf OW X 0 E Gl 6 Dabei ist wiederum zu beachten dass bei vernetzten Neuronen die Spannungen an den Pr synapsen den Aktivit ten der Neuronen in der vorhergehenden Schicht entsprechen Jedoch kann jedes Neuron auch durch einen k nstlichen Stimulus aktiviert werden Dies kann entweder direkt elektrisch geschehen oder durch gezielte chemische Eingriffe Au erdem kann neuronale Aktivit t mit einer Elektrode an der Zellmembran gemessen werden 8 17 2 2 Ableitung neuronaler Aktivit t Die Ableitung
34. hrleistet sein Dies soll ber Feinrasterstifte siehe Abb 3 22 27 geschehen die in die Eing nge dreier bereinander Bader gestapelter Buchsenleisten gesteckt werden Damit sp ter der Vorverst rker siehe Abb 3 23 28 direkt angeschlossen werden kann wurde der Durchmesser der Feinrasterstifte und damit auch das Rasterma der Buchsenleisten an das Rasterma des Vorverst rkers angepasst siehe Kap 3 2 1 Siei Die Buchsenleisten wurden anschlie end in eine gefr ste F hrung in einem L Profil geklemmt welches zur Justierm glichkeit an einem Translationstisch 29 befestigt wird siehe Abb 3 24 Spitze Abb 3 22 Schematischer Aufbau eines Feinraster stiftes gem dem Datenblatt 27 Abb 3 23 Vorverst rker mit Anschl ssen 28 Der Vorverst rker soll so direkt auf dem Biochip aufgebracht werden k nnen Des Weiteren wurde eine Halterung vorgesehen auf der die oben beschriebenen Kontaktleisten mit den Translationstischen und der Biochip fixiert werden k nnen F r eine Verst rkerschaltung ohne Vorverst rker wurde au erdem aus einer Stiftleiste einem Koaxialkabel und einem Stecker der dem Vorverst rkerausgang entspricht ein entsprechendes Verbindungskabel von den Buchsenleisten zum Nachverst rker angefertigt Tabelle 3 14 zeigt eine bersicht ber die ben tigten Bauteile f r den Aufbau der Kontaktleisten 42 Translations tische F hrungsgewinde Abb
35. mit St tzkondensatoren die die Bezugsmasse bez glich der Versorgungsspannung stabilisieren Filterkondensatoren f r die integrierten Tiefpassfilter und Buchsensteckern verl tet siehe Abb 3 31 Die Filterfrequenz des Tiefpassfilters wird mit den Filterkondensatoren auf 100 kHz festgelegt auf diesen Wert bezieht sich auch das frequenzabh ngige Rauschen des OPVs siehe Kap 3 4 1 Der Vorverst rker ben tigt eine niedrigere Versorgungsspannung Vcc lt 6 V weshalb eine eigene Stromversorgung f r den Vorverst rker eingeplant wurde Die Komponenten sind in Tab 3 16 dargestellt Bauteile f r die Verst rkerplatinen St ck Komponente Beschreibung Hersteller Modell 16 OPV Instrumentenverst rker Texas Instruments PGA202KPG4 16 OPV Sockel 6 Pol DIL Sockel Flachprofil Winslow W30506TRC 2 Laborkarte Sub D 9 15 polig Roth Elektronik RE224 HP 4 Buchsenstecker Sub D PCB 15 polig Tyco Electronics 11634585 2 32 Filterkondensator A7pF 50V Unbekannt Unbekannt 32 St tzkondensator luF 50V DC Panasonic EEAGAIHIRO 2 Vcc Vorverst rker Netzteil einphasig SV DC 6 5 A Phoenix Contact 2868541 2 Vcc Nachverstarker Bleiakku AGM 12V 2 0Ah Ritar RT 1220 2 Vcc Vergleich Labornetzger t 1 20 V O 5 A Manson NRP 2050 Tab 3 16 Liste der Bauteile f r die beiden Verst rkerplatinen Zu beachten ist dass die invertierenden Signaleing nge VIN sowie die Anschl sse f r den einzustellenden Verst r
36. siehe Abb 4 25 a Besonders wichtig ist in diesem Zusammenhang dass es einen erheblichen Unterschied machte welche Masse wo angeschlossen wurde 71 I g PE Abb 4 24 Schaltpl ne getesteter Grundschaltungen links und Erg nzung der Erdung von Signalgenerator und Datenkarte rechts als Interpretation der Messergebnisse VOUT AIN1 VREF AINO f r alle Schaltungen a AINO AINGND DGND b AINO AINGND DGND VIN c AINO PE AINGND DGND d AINO DGND AINGND PE In Abb 4 25 e ist der Spannungsverlauf am Verst rkerausgang in Bezug zur vom Verst rker isolierten Erdung dargestellt Deutlich zu sehen sind der Einfluss des Netzbrumms 50 Hz Sinus sowie eine konstante Offsetspannung von 4 3 V Dies ist nicht weiter verwunderlich da ja das Bezugspotential des Verst rkers auf eine von der Datenkarte getrennte Masse gelegt wurde Allerdings w re bei umgekehrter Beschaltung der Masse ein hnliches Ergebnis zu erwarten was jedoch nicht der Fall war siehe Abb 4 25 c In einer weiteren Messkonfiguration wurde eine gemeinsame Masse verwendet die ebenfalls mit dem invertierenden Eingang des Verst rkers Vin verbunden wurde siehe Abb 4 24 b Dies ist grunds tzlich bei einem Instrumentenverst rker nicht notwendig aber durchaus gebr uchlich Es zeigt sich jedoch dass die erfassten Signale in dieser Messkonfiguration von einem st rkeren Rauschen begleitet wurden siehe Abb 4 25 b als ohne die
37. siehe Kap 4 6 2 lassen jedoch vermuten dass f r eine ortsgetreue Aufl sung der generierten und mit Hilfe des Biochips 113 abgeleiteten Signale die Isolationsschicht etwas dicker gew hlt werden sollte In folgenden Versuchen sollte die Antennenwirkung der Zuleitung durch symmetrische Stimulation d nnere Zuleitungen sowie gr ere Abst nde der Zuleitungen minimiert werden Eine abschlie ende Messung von Als von lebenden Neuronen mit Hilfe von chemischer Stimulation siehe Kap 4 6 3 liefert erste Hinweise darauf dass erfolgreich neuronale Aktivit t abgeleitet werden konnte Jedenfalls entsprechen die gemessenen Signale in Form und Refrakt rzeit dem erwarteten Bild von Aktionsimpulsen siehe Kap 2 1 1 Die an den verschiedenen Elektroden gemessenen Signale k nnten auch als Aktivit tsmuster interpretiert werden siehe Kap 2 1 2 Durch diese Messung konnte erfolgreich die Funktionsweise des Biochips als auch des gesamten Messaufbaus demonstriert werden Es ist jedoch kritisch anzumerken dass das Ergebnis mit 8 messenden Elektroden noch nicht signifikant genug f r genauere Aussagen ist Um reproduzierbare Messergebnisse zu erhalten und die gemessenen Signale so als Aktionsimpulse identifizieren zu k nnen sollte in weiteren Versuchen eine elektrische Stimulation der neuronalen Kulturen erm glicht werden Auch sollte auf eine andere Dimensionierung der Mikroelektrodenarrays siehe Kap 3 2 1 zur ckgegriffen werden da die gew hl
38. von 100 um zur ckgegriffen 4 6 3 Messung an lebenden Neuronen Um Signale von lebenden Neuronen ableiten zu k nnen wurden gem dem in Kap 3 1 beschriebenen Verfahren Neuronen auf dem selbst prozessierten Biochip Design 1 siehe Abb 4 66 ausges t Anschlie end wurden sie 5 Tage lang kultiviert und in einer speziellen Transportn hrl sung zum Messaufbau transferiert um diesen noch anpassen zu k nnen 108 SS durchmessenden Elektroden Abb 4 66 Lichtmikroskopische Aufnahme eines prozessierten Biochips nach Design 1 mit strukturierter Zellkulturkammer und 100 um Der Messaufbau ist in Abb 4 67 dargestellt Die Zellkulturkammer war massefrei Die lebenden Zellen wurden nicht elektrisch mit dem Signalgenerator stimuliert sondern mit Nikotin L sungen verschiedener Konzentration zur chemischen Stimulation der Synapsen siehe Kap 2 1 2 Abb 4 68 zeigt die Elektrodenbelegung Abb 4 67 Schematischer Schaltplan f r die Messung an lebenden Neuronen mit chemischer Stimulation GNDA Die aufgezeichneten Spannungsverl ufe an den Elektroden siehe Abb 4 69 zeigen ein Rauschen mit einer Amplitude von rund 20 mV was 20 uV an den Elektroden entspricht Des weiteren sind Spannungsspitzen von bis zu 70 mV bzw 70 uV mit einer Dauer von bis zu einer Millisekunde zu sehen Diese Spannungsspitzen wurden in einer N hrl sung mit 20 uM Nikotin siehe Abb 4 69 c wesentlich h uf
39. von Neuronen siehe Kap 3 1 die Biochip Prozessierung siehe Kap 3 2 sowie der Aufbau des Messsystems siehe Kap 3 5 mit Kontaktierung siehe Kap 3 3 und Verst rkerschaltung siehe Kap 3 4 n her beschrieben werden Die Produktion der Biochips umfasst dabei drei Bereiche die im Folgenden unterschieden werden Die Strukturierung von Mikroelektrodenarrays auf einem Tr gersubstrat zur Ableitung elektrischer Signale Die Herstellung eines Mikrokanals auf dem Zellkulturkammerboden zum strukturierten Wachstum der Neuronen bzw zum Isolieren von Axonen Die Herstellung der Zellkulturkammer zur Aufnahme des N hrmediums Abb 3 1 bersicht ber den Ablauf der angestrebten Messung und Anforderungen an das Messsystem 25 3 1 Zellkultivierung von Neuronen Gewinnung von Neuronen aus Gewebe Prim rkultur Da sich Neuronen nur unter gewissen Umst nden und eher selten teilen m ssen f r die Ableitung neuronaler Aktivit t in vitro Zellen aus einem lebenden Organismus entnommen werden Damit die Zellkulturen vergleichbar bleiben sind die Tierart der Stamm Labortiere unterliegen einer ausgereiften Zucht und das Alter des Versuchstiers sowie die urspr ngliche anatomische Herkunft der Neuronen von Bedeutung F r weitere Versuche an lebenden Neuronen wurden mit freundlicher Unterst tzung von Prof Dr Sigismund Huck vom Hirnforschungsinstitut der Universit t Wien Zellen des oberen Halsganglions engl Superior cer
40. 0 mV von innen nach au en was entsprechende Untersuchungen mit Hilfe der Patch Clamp Technik gezeigt haben Motivation Die Herausforderung besteht nun darin neuronale Aktivit tsmuster also den zeitlichen Verlauf der Aktivit ten mehrerer Neuronen in einem Netzwerk mit einem elektrischen Messsystem aufzuzeichnen und in der Folge auswerten zu k nnen In dieser Arbeit wurde das Ziel verfolgt die neuronalen Aktivit ten eines in vitro kultivierten Neuronennetzwerks mit einem Array extrazellul rer Mikroelektroden abzuleiten um ein ortsaufgel stes Bild der neuronalen Aktivit t zu erhalten Der Potentialunterschied ist erwartungsgem bei extrazellul rer Ableitung wesentlich geringer als bei intrazellul rer Ableitung Dieser Nachteil der extrazellul ren Messung ist jedoch nebens chlich solange neuronale Signale identifizierbar detektiert werden k nnen da die Messung der Aktivit t an sich nicht aber die exakte Beschreibung der Form eines Aktionsimpulses im Vordergrund steht Vielmehr ist die Zielsetzung dieser Arbeit ein zeitlich wie rtlich aufgel stes Bild der Aktivit tsmuster aufzunehmen um so die Funktionalit t eines Neuronennetzwerks anschaulich darzustellen zu k nnen Der Informationsgehalt dieser Aktivit tsmuster geht deutlich ber den eines einzelnen aufgezeichneten Aktionsimpulses hinaus Der zu entwickelnde Messaufbau soll in zuk nftigen Messungen auch erlauben w hrend biologischer Eingriffe Aktivit tsmuster ele
41. 00m 150m 200m 250m 300m 350m 400m 450m 500m 550m 600m 650m 700m 750m 800m 850m 900m 950m 1 0 50m 100m 150m 200m 250m 300m 350m 400m 450m 500m 550m 600m 650m 700m 750m 800m 850m 900m 950m 1 LO Zeit s Zeit s d9 200m m b h E 500m E N FA O i ae i 700m 7 i 7 i r 7 7 i r E 5 7 rn n n 700m i r r r A r A r r r r r r k N 0 50m 100m 150m 200m 250m 300m 350m 400m 450m 500m 550m 600m 650m 700m 750m 800m 850m 900m 950m 1 0 50m 100m 150m 200m 250m 300m 350m 400m 450m 500m 550m 600m 650m 700m 750m 800m 850m 900m 950m 1 Zeit s Zeit s v gt a 1 S 2 E 500m C l O 5 E J O 700m 1 1 I 1 1 i i I l l 1 l 1 1 i 1 1 1 i l 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 50m 100m 150m 200m 250m 300m 350m 400m 450m 500m 550m 600m 650m 700m 750m 800m 850m 900m 950m 1 0 50m 100m 150m 200m 250m 300m 350m 400m 450m 500m 550m 600m 650m 700m 750m 800m 850m 900m 950m 1 vv Zeit s Zeit s 2 _ 200m N 700m 1 I 1 1 1 I 1 ij I I 1 1 1 1 1 1 1 1 700m i i I 1 I 1 1 J 1 I I l l l I I I I I O 0 50m 100m 150m 200m 250m 300m 350m 400m 450m 500m 550m 600m 650m 700m 750m 800m 850m 900m 950m 1 50m 100m 150m 200m 250m 300m 350m 400m 450m 500m 550m 600m 650m 700m 750m 800m 850m 900m 950m CO Zeit s Zeit s a K i i Fr O o 50m 100m 150m 200m 250m 300m 350m 400m 450m 500m 550m 600m 650m 700m 750m 800m 850m 300m 950m i is 0 50m 100m 150m 200m 250m 300m 350m 400m 450m 500m 550m 800m 650m 700m 750m 800
42. 06 530 541 119 Danksagung Diese Arbeit entstand im Laufe meiner T tigkeit als wissenschaftlicher Mitarbeiter am Institut f r Festk rperelektronik FKE der technischen Universit t Wien Ich m chte allen herzlich danken die zu ihrem Gelingen beigetragen haben Herrn O Univ Prof Dr Emmerich Bertagnolli danke ich f r die wissenschaftliche Betreuung dieser Arbeit Herrn Ass Prof Dr Heinz Wanzenb ck danke ich f r den wissenschaftlichen Rat und die kritische Durchsicht des Manuskripts Herrn A O Univ Prof Dr Sigismund Huck und Frau Karin Schwarz vom Hirnforschungsinstitut der Universit t Wien danke ich f r die kooperative Bereitstellung der Hirnzellen und der zellbiologischen Verfahren zur Zellkultivierung womit die Grundlage f r diese Arbeit geschaffen wurde Herrn Ing Markus Schinnerl m chte ich f r die fachm nnische Hilfe bei der Herstellung der Lithographiemasken danken Mein besonderer Dank gilt allen Kolleginnen und Kollegen f r ihre Hilfsbereitschaft und das produktive Arbeitsklima In diesem Zusammenhang m chte ich Dipl Phys Dr Christoph Henkel DI Dr Simon Waid DI Dr Gottfried Hochleitner Mag rer nat Maria Hufnagl und Mag rer nat Christian Peter f r die hilfreichen Ratschl ge bez glich des Aufbaus des Messsystems hervorheben Insbesondere m chte ich meinen Eltern Iris und Hugo f r die Unterst tzung und Aufmunterung w hrend der Entstehung dieser Arbeit danken 120 Le
43. 1 1 1 1 I 1 1 1 I I 0 100m 200m 300m 400m 500m 600m 700m 800m 900m 999 083m Zeit s AIN5 f 159 Hz 1 1 J i 1 i 1 I I I 0 100m 200m 300m 400m 500m 600m 700m 800m 900m 999 083m Zeit s Abb 4 56 Aufgezeichnete Spannungsverl ufe bei einer Vierpunktmessung mit generiertem Rechteckimpuls Amplitude 20 mV Frequenz 1 Hz und unterschiedlichen Hochpassfiltern mit Grenzfrequenzen fg von a 113 Hz b 48Hz c 4 8 Hz d 0 5 Hz e 3 3 Hz f 159 Hz In Abb 4 57 sind die Signalantworten an vier Eing ngen zum besseren Vergleich vergr ert dargestellt Dabei wird deutlich dass in Kanal AIN1 siehe Abb 4 57 b das beste Signal Rausch Verh ltnis erzielt wurde Da die Elektrode von der dieses Signal abgeleitet wurde auf dem MEA m Vergleich zu den anderen Elektroden sogar weiter von der Stimulationselektrode entfernt ist wird im Weiteren angenommen dass der zur Aufnahme dieses Signals beitragende Hochpassfilter f r das gute Signal Rausch Verh ltnis verantwortlich ist Daraus folgt dass ein Hochpassfilter mit einem Widerstand von 100 kQ und einem Kondensator mit einer Kapazit t von 33 nF unter den untersuchten Varianten das beste SNR erzielt F r weitere Versuche wurde deswegen ein Hochpassfilter mit dieser Dimensionierung f r alle Kan le angefertigt 100 Es sollte festgehalten werden dass durch den Hochpassfilter die Messung an einem mit Fl ssigkeit gef llten Biochip ohne Offsetsteuerung erm glicht wurde Dies
44. 5 2 und die Komponenten zur Signalerfassung siehe Kap 3 5 3 ausgetauscht werden 3 5 1 Modulkonzept Damit der gesamte Messaufbau stets ausbauf hig bleibt wurde ein Modulkonzept erarbeitet siehe Abb 3 33 Die zentrale Komponente des Aufbaus ist der von Multichannel Systems bezogene Vorverst rker siehe Kap 3 2 1 3 3 1 3 4 2 3 4 3 An diese Komponente sind weitere Module angepasst Abb 3 33 Schaltplan des gesamten modularen Messaufbaus Die blaue Pfeile zeigen den Weg den ein vom Biochip abgeleitetes Signal im Messaufbau durchl uft Die roten Pfeile zeigen den Weg eines generierten elektrischen Stimulus im Messaufbau So haben die Kontaktpads auf den Biochips und die Buchsenleisten das gleiche Rasterma wie die Eing nge des Vorverst rkers Die Anschl sse der Datenkarte der Hochpassfilterplatine sowie der Verst rkerplatinen sind auf die Ausg nge des Vorverst rkers abgestimmt Das Kontaktkabel kann dabei anstatt des Vorverst rkers zur Verbindung von Messsystem und Biochip verwendet werden So lassen sich die Komponenten auch unabh ngig voneinander testen Tabelle 3 18 zeigt einen berblick ber die verschiedenen Module des Messaufbaus Der Messaufbau in Modulen Aufgabe Modul Verbindungstyp Pole In Out Hersteller Elektrischer Kontakt Biochip Design 1 Elektroden 2x 10e 10p Eigenproduktion zum Neuron Biochip Design 2 Pads RM
45. 6 8 10 12 14 16 18 Zeit s Abb 4 42 Zeitlicher Spannungsverlauf an den Elektroden w hrend der Kontaktierung des Masseanschlusses mit der Referenzelektrode in der Zellkulturkammer 4 4 2 Dreipunktmessung Bei der Dreipunktmessung sind die Masse des generierten Signals SG wie auch die Masse der Verst rkerplatine SGN GND ber die gleiche Bezugselektrode Ag AgCl mit der Zellkulturkammer verbunden Ein schematischer Schaltplan ist in Abb 4 43 dargestellt ber die Stimulationselektrode wurde pro Sekunde ein 500us andauernder Spannungspuls mit einer Amplitude von 100 mV in die Zellkulturkammer geleitet Damit die Signalantworten aufgezeichnet werden k nnen wurde zus tzlich eine geringe Offsetspannung angelegt siehe Kap 4 4 1 91 Bei einer Wiederholfrequenz von 1 Hz wurden die dargestellten Signalkurven mit tausendfach verst rkten Pulsamplituden von 23 V erfasst siehe Abb 4 44 Die Messung zeigt dass der generierte Spannungspuls mit einer Amplitude von 100 mV an den Messelektroden einen Spannungsunterschied von rund 23 mV bewirkte Das abgenommene Spannungssignal unterlag dabei einem Drift von 500 uV s Damit die Signale nicht aus dem Aufl sungsbereich rutschen m sste deswegen bei dieser Messschaltung die Offsetspannung st ndig nachjustiert werden Dies gestaltet sich Aufgrund des starken Drifts und der Abb Ad Soeur Sonn Di de verz gerten Reaktion der Elektroden schwierig Aus diesem Dreipunkt
46. Das zweite MEA Design wurde geplant um den Einfluss von Elektrodenoberfl che und Elektrodenabstand zu bestimmen Auf jeder Seite wurde deshalb ein Array von Elektroden mit einem anderen Durchmesser 10 30 50 100 um im verh ltnism ig etwa gleichen Abstand 100 200 350 700 um aufgebracht siehe Abb 3 7 Dabei wurde angenommen dass jede Elektrode sowohl als Mess wie auch als Stimulationselektrode genutzt werden kann Die Referenzelektrode befindet sich hier in der Mitte um m glichst nahe an den Messelektroden zu sein Sie ist um einiges gr er a 2 5 mm damit ein stabiles Elektrodenpotential gew hrleistet ist und auf allen Seiten mit einem Kontaktpad verbunden Des Weiteren wurde zur Schirmung eine Leiterschleife um das ganze MEA vorgesehen die ebenfalls auf allen Seiten mit einem Kontaktpad verbunden ist Die Kontaktfl chen an den Ecken sollen die M glichkeit bieten diese Leiterschleife mit der Referenzelektrode zu verbinden Der Abstand der Kontaktpads richtet sich wiederum nach dem Rasterma der Kontaktstifte des Vorverst rkers Die gefertigten Lithographiemasken werden in einem Ablauf von mehreren Beschichtungsverfahren zur Strukturierung verwendet Referenzelektrode Maske f r die Leiterbahnen d N a s s Ea j Maske fur die Isolation Abb 3 7 Design der Lithographiemasken nach MEA Design 2 a zur Strukturierung der Leiterbahnen b zur Strukturierung der Isolation c zur Struk
47. Dieser vergr erte Sichtbereich erm glicht eine bessere Ausrichtung tzdauer Damit die Kontaktpads vollst ndig freige tzt werden wurde die tzdauer auf 12 Sekunden erh ht Dadurch konnte die Nitridschicht vollst ndig entfernt werden Dies wurde mit Hilfe einer Widerstandsmessung auf den Kontaktpads durch einen geringen elektrischen Widerstand best tigt Daher wurde angenommen dass auch die Elektroden frei waren 66 4 1 4 Herstellung der Mikroelektrodenarrays Nachdem der Prozessablauf optimiert wurde siehe Kap 4 1 3 konnten reproduzierbar fehlerlose Multielektrodenarrays MEAs prozessiert werden Daf r wurden wie in Kap 3 2 1 beschrieben die Strukturen der MEA Designs auf die Lithographiemasken in den Lithographieschritten im Prozessablauf siehe Kap 3 2 2 in den Fotolack und durch Lift off bzw tzen in die Leiter und Isolationsschichten auf dem Tr gersubstrat bertragen Dabei wurden f rs erste MEA Design 3 Lithographiemasken ben tigt welche in Abb 4 13 neben dem produzierten MEA dargestellt sind Die Pfeile deuten dabei an welcher Teil des MEAs mit der jeweiligen Lithographiemaske strukturiert wurde Die Elektroden selbst sind kaum zu erkennen siehe 4 12 b Mitte Die 2 mal 9 Elektroden im ersten Design sind alle gleich gro Durchmesser 100 um und sind ber Leiterbahnen mit den Kontaktpads verbunden Besonders zu beachten ist der Fluidikaufsatz in der Mitte des MEAs siehe Abb 4 12 c welcher aus Fot
48. I N it Mi I N IN l j Mi i N IN N itt tl I I i i il i N nl i I 1 INA IRA IM I MAA 377 i I i 1 1 t I g 1 1 13 I 1 1 I 1 5 1 0 50m 100m 150m 200m 250m 300m 350m 400m 450m 500m 550m 600m 650m 700m 750m 800m 850m 900m 950m 1 Zeit 5 gi I il I N IN i i Il L 5 5 1 Mi Mit INN i Mi il IN N Ail l I RARR IN a o N IN Nh II I IN Ih AA _ tl i I IN Ih g I 1 1 t LI i I 1 i 1 I 1 I Li I I Li I i 0 50m 100m 150m 200m 250m 300m 350m 400m 450m 500m 550m 600m 650m 700m 750m 800m 850m 900m 950m 1 Zeit s E IN NN E il nuh Wal EN Hi a WiN N N IN Il it i i S 1 s 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 I 1 l I I 1 1 1 0 50m 100m 150m 200m 250m 300m 350m 400m 450m 500m 550m 600m 650m 700m 750m 800m 850m 900m 950m 1 Zeit 5 My i ji EANG U INNEN IN MAA it MMi IN NA ii HI iji ANNAN MK IN IN ii AAN Ai 1 1 1 1 1 1 1 i q 1 1 1 1 1 1 1 1 i 1 1 0 50m 100m 150m 200m 250m 300m 350m 400m 450m 500m 550m 600m 650m 700m 750m 800m 850m 900m 950m 1 Zeit 5 na AN i qd III HERNE I I i AAA HI III il IN it i Il ill IN iH i I I i IN j ih i N n A AUAN 4 u J i I I i I I 1 i I I I I 1 1 1 I t I D I 0 50m 100m 150m 200m 250m 300m 350m 400m 450m 500m 550m 600m 650m 700m 750m 800m 850m 900m 950m 1 eit s Abb 4 52 Aufgezeichneter Spannu
49. Impulsamplituden zusammengefasst Im Unterschied zu den Messungen an Elektroden mit einem Durchmesser von 100 um siehe Abb 4 61 zeigen sich bei allen kleineren Elektroden asymmetrische Spannungsverl ufe die von einem wesentlich h heren Rauschen unterlegt sind Interessant ist dass diese Asymmetrie in allen Elektroden in Richtung positiver Spannung geht au er bei derjenigen Elektrode die der Stimulationselektrode am n chsten war Um dieses Ph nomen genauer zu ergr nden sollte ein Array mit mehr Elektroden aufschlussreichere Messungen der Feldverteilung zulassen Spannung Spannung v ya my E i m Te or a a Zo 5 E o or oe ps 150 100 5 2 a Z 50 m m oo a 0 01 02 03 04 05 06 OF 08 of 1 Zeit s Abb 4 63 Aufgezeichnete Signalantworten bei einem Elektrodendurchmesser von 50 um auf einen Spannungsimpuls von 500 us Dauer und unterschiedlichen Spannungsamplituden wei 20 mV rot 40 mV gr n 60 mV blau 80 mV gelb 100 mV a g an den Elektroden 7 1 h Schematische Darstellung der Erregersignale 106 os N Se ae i ee 0 04 02 03 04 05 06 OF D085 o9 1 Zeit e Abb 4 64 Aufgezeichnete Signalantworten bei einem Elektrodendurchmesser von 30 um auf einen Spannungsimpuls von 500 us Dauer und unterschiedlichen Spannungsamplituden wei 20 mV rot 40 mV gr n 60 mV blau 80 mV gelb 100 mV a g an de
50. Kap 4 3 2 sowie die zeitliche Aufl sung der Datenkarte siehe Kap 4 3 3 untersucht Anschlie end wurde die Funktion der Verst rkerplatinen berpr ft siehe Kap 4 3 4 Au erdem wurde ein geeigneter Verst rkungsfaktor bestimmt siehe Kap 4 3 5 und die zweistufige Verst rkerschaltung mit einer einstufigen Verst rkerschaltung verglichen siehe Kap 4 3 6 4 3 1 Funktionstests Grundschaltung Um die OPVs auf den Verst rkerplatinen sachgem zu verl ten wurden Funktionstests an der Grundschaltung durchgef hrt Die Grundschaltung umfasst die Datenkarte den Signalgenerator und nat rlich einen OPV wobei es f r den Verst rker unterschiedliche Anschlusskonfigurationen gibt Es wurden verschiedenste Messkonfigurationen verglichen wobei die korrekte Beschaltung der Masse im Vordergrund lag In Abb 4 24 links sind 4 der getesteten Schaltungen abgebildet Dabei wurden die Anschl sse f r die Versorgungsspannung zur besseren bersicht weggelassen In allen gezeigten Messkonfigurationen wurde ein Eingang der Datenkarte AIN1 fix mit dem Ausgang eines OPVs VOUT verbunden an dessen Eing nge Vin Vin wiederum die Ausg nge des Signalgenerators SG SG angeschlossen sind Ein weiterer Eingang AINO wurde mit dem Anschluss f r das Bezugspotential des Verst rkers VREF verbunden Au erdem wurde dieser Eingang AINO sowie der Masseanschluss der Datenkarte AINGND je nach Konfiguration an eine von zwei getrennten Massen anges
51. NIO ja FILTERA FILTERB N T 68 vost vos2 LP e T vost vos2 7J vin vin PINS VIN VIN gt PGA202KP PGA202KP 1 ao pic com FEN AO DIG COM 2 a vec penis A1 vcc ies 3 vcc vour N12 tks VCC VOUT 4 VREF voutsense HE VREF VOUTSENSE ie SJ FILTERA FILTERB N10 tks FILTERA FILTERB T 6S vost vos2 LP ol T vost vos2 7_ vn vin PINS VIN VIN PGA202KP PGA202KP 1 ao pic com FEIN AO DIG COM 2 a vec PIN13 A1 vcc ies 3 voc vour N12 tks VCC VOUT i 4 VREF voutsense EN VREF VOUTSENSE i L 5 FILTERA FILTERB ENIO ja tks FILTERA FILTERB L 6S vost vos2 P ol T vost vos2 VIN VIN VIN 5V 5V O VIN SUB1 15I SUB1 G O SUB1 8I SUB1 7 SUB1 14 SUB1 6 SUB1 13 SUB1 5 gt SUB1 12 SUB1 4 SUB1 11 SUB1 3 SUB1 10 SUB1 2 SUB1 9 SUB1 1 Abb 3 31 Schaltplan der herzustellenden 8 Kanal Verst rkerplatine Verst rkungsfaktor x 1000 48 3 4 3 Hochpassfilterkonzept Das Elektrodenpotential der Messelektroden ist nicht zeitlich konstant siehe Kap 2 2 2 und die Elektrodenpotentiale der Messelektroden und der Referenzelektrode k nnen sich stark unterscheiden Dies f hrte dazu dass Spannungs nderungen bei einem Verst rkungsfakt
52. OPV PGA 202KP Verst rkungsfaktor x10 x100 x1000 u Verst rkungsfehler lt 1 Offset mV 0 5 2mV Versorgungsspannung V 6 18V Tab 3 15 Spezifikationen des OPVs PGA202KP im Uberblick 31 CH1 2 004 M 250ns CH4 Vertikalposition 1 36 divs Q 72V Abb 3 30 Kantenprofil unverst rkt gelb und verst rkt gr n mit dem Oszilloskop aufgezeichnet Um die Qualit t des OPVs zu best tigen wurden mit Tek 3 IL E lied wi snk dem Oszilloskop die Flanken des Signals vor und nach Auto Bereich pmnan der Verst rkerschaltung miteinander verglichen Es vertikal und zeigt sich dass der OPV wenige Mikrosekunden Horizontal ben tigt um sich auf einen konstanten 4 ar Verst rkungsfaktor einzupendeln siehe Abb 3 30 Der ae Spannungsunterschied am Ausgang des ai Signalgenerators und am Verst rkerausgang erkl rt sich Autom Bereich aus dem dazwischen geschalteten Spannungsteiler r ckg ngig CHI 7 200mV 46 3 4 2 Mehrkanalkonzept Ziel dieser Arbeit ist es an mehreren Elektroden simultan neuronale Signale aufzunehmen Daf r wurde ein Verst rker mit mehreren einzeln verst rkten Eing ngen angefertigt Da der Vorverst rker 8 individuelle Eing nge besitzt waren bei der Planung zwei 8 Kanal Verst rkerplatinen mit OPVs unterschiedlichen Verst rkungsfaktors x100 x1000 vorgesehen Die OPVs sollten austauschbar bleiben Dazu werden Sockel f r die OPVs auf einer Laborkarte zusammen
53. Universitat wien DIPLOMARBEIT Titel der Diplomarbeit Aufbau und Evaluierung eines Messsystems zur ortsaufgelosten Erfassung elektrischer Aktivitatsmuster von in vitro kultivierten Nervenzellen durch mikrostrukturierte extrazellul re Elektroden Arrays auf einem Biochip Verfasser Lukas Schneider angestrebter akademischer Grad Magister der Naturwissenschaften Mag rer nat Wien 2011 Studienkennzahl It Studienblatt A 411 Studienrichtung It Studienblatt Physik Betreuerin Betreuer O Univ Prof Dr Emmerich Bertagnolli Inhaltsverzeichnis Kurzfassung 1 Einleitung 2 Theorie 2 1 Neuronale Aktivit t 2 1 1 Entstehung neuronaler Signale 2 1 2 Neuronale Signalausbreitung 2 2 Ableitung neuronaler Aktivit t 2 2 1 Zelladh sion von Neuronen in vitro 2 2 2 Phasengrenze Elektrode Elektrolyt 2 2 3 Methoden der Ableitung 2 2 4 Einsatzbereich eines Mikroelektrodenarrays 2 3 Mikroelektronische Beschichtungsverfahren 2 3 1 Lithographische Strukturierung 2 3 2 Plasmaunterst tzte Beschichtungsverfahren 3 Messmethode 3 1 Zellkultivierung von Neuronen 3 2 Biochip Prozessierung 3 2 1 MEA Dimensionierung 3 2 2 Schematischer Prozessablauf 3 2 3 Haftung der Materialien 3 2 4 Fertigung der Zellkulturkammern 3 2 5 Ger te und Parameter im Prozessablauf 3 3 Kontaktierung der Biochips 3 3 1 Kontaktkonzept 3 3 2 Kontakthalterung 3 4 Signalverst rkung 3 4 1 Verst rkerspezifikationen 3 4 2 Mehrkanalkonzept 3 4 3 Hochpassfilter
54. ally patterned basolateral cell arrays Institut f r Physik Wien Diplomarbeit 28 37 39 AZ 5214 E Image Reversal Photoresist Product Datasheet by Clariant AG 40 P Goudeau N Tamura G Parry J Colin C Coupeau F Cleymand H Padmore Strain mapping on gold thin film buckling and silicon blistering Materials Research Society Symposia Proceedings Ausgabe c 2005 O10 4 1 41 I W Rangelow H L schner Reactive ion etching for microelectrical mechanical system fabrication Journal of vacuum science and technology B 13 6 1995 2394 2399 42 U Egert B Schlosshauer S Fennrich W Nisch M Fejtl T Knott T M ller H H mmerle A novel organotypic long term culture of rat hippocampus on substrate integrated multielectrode arrays Brain Research Protocols Ausgabe 2 1998 229 242 43 Marcus Pritschow Titannitrid und Titan Schichten Institut f r Mikroelektronik Stuttgart Doktorarbeit 2007 17 42 44 SU 8 2000 Permanent Epoxy Negative Photoresist processing guidelines for SU 8 2100 and SU 8 2150 by Microchem Corporation 45 L Berdondini M Chiappalone P D Van der Wal K Imsfeld N F De Rooij M Koudelka Hep M Tedesco S Martinoia J Van Pelt G Le Masson A Garenne A microelectrode array MEA integrated with clustering structures for investigating in vitro neurodynamics in confined interconnected sub populations of neurons Sensors and Actuators Ausgabe 114 20
55. als die tzl cher siehe Abb 4 9 In diesem Fall w re durch Ausrichtungsfehler die effektive Elektrodenfl che verringert was auf die Messergebnisse Auswirkungen h tte Im Rahmen der Optimierung des Prozessablaufs siehe Kap 4 1 3 konnte das Alignment verbessert werden Des weiteren erwies es sich als wichtig dass nach der Entwicklung gr ndlich mit Wasser nachgesp lt oder Lackreste im Ultraschallbad entfernt werden Verbleibende Lackreste f hrten dazu dass eine ganze Produktionsserie an mangelnder Haftung des Leitermaterials scheiterte Lift off Prozessschritte g m Der Lift off ist ein weitgehend robuster Prozessschritt Durch punktuelles Einspritzen des L sungsmittels kann das Abl sen beschleunigt werden jedoch k nnen bei geringstem Kontakt der Nadelspitze mit der Metallschicht auf dem Tr gersubstrat erhebliche Sch den entstehen siehe Abb 4 10 Deshalb wurde in dieser Arbeit das punktuelle Einspritzen mit Stahlkan len unterlassen Abb 4 10 Mikroskopische Auflichtaufnahme einer beim Lift off zerkratzten Goldbeschichtung PECVD Prozessschritt 1 Eine Schwierigkeit bei der Analyse des oben genannten Problems war dass sich die Haftungsprobleme erst nach der PECVD Beschichtung zeigten Das PECVD Verfahren selbst ist dabei eigentlich unkritisch Aber das Erhitzen des Tr gersubstrats und die thermische Verspannung der abk hlenden Isolationsschicht k nnen zum Abl sen von schlecht haftenden Teilen d
56. amit durchgef hrten Prozesse n her beschrieben Reinigung Prozessschritt a Die Reinigung des Tr gersubstrats im Ultraschallbad siehe Abb 3 11 ist ein wesentlicher Schritt da jedweder Schmutz zu erheblichen Haftungsproblemen f hren kann Nicht umsonst werden die MEAs ausschlie lich im Reinraum gefertigt Wird das Tr gersubstrat w hrend des Prozessablaufs verunreinigt dann wurde auf diesen Schritt zur ckgegriffen Tabelle 3 5 zeigt die verwendeten Parameter f r den Reinigungsprozess 35 Reinigung des Tr gersubstrats Ultraschallreiniger SONOREX Digital 10P Bandelin Tragersubstrat BOROFLOAT 33 Borosilicatglas 1 Reinigung in L sungsmittel Aceton separatem Leistung 100 Watt Becherglas Zeit 3 4 Min 2 Reinigung in L sungsmittel Isopropanol separatem Leistung 100 Watt Abb 3 11 Ultraschallreiniger Foto Becherglas Zeit 3 4 Min Trocknen Stickstoff Tab 3 5 Angewandte Prozessparameter bei der Reinigung des Tr gersubstrats Sputtern Prozessschritte b e f 1 In der Sputteranlage siehe Abb 3 12 wird das Tr gersubstrat mit Haftmaterial Cr Ti Leitermaterial und Oberfl chenverg tung TiN beschichtet Die Werte f r die resultierenden Schichtdicken beziehen sich auf bestehende Tabellen ausgewerteter vorangehender Arbeiten Da die Prozessparameter f r die Oberfl chenverg tung aus Titannitrid erst bestimmt werden mussten wurden diese v
57. an ihre Grenzen Bei kleinerem Abstand der Kan le l sen sich die lamellenartigen Lackstrukturen vom Tr gersubstrat siehe Abb 4 22 e Dies sind vermutlich die Auswirkungen von Unterschneidungen im strukturierten Lack welche durch l ngere Belichtung sowie optimierte Back und Entwicklungsdauer vermindert werden k nnen 73 Bier i e m Abb 4 21 Mikroskopische Aufnahmen von mit Hilfe der Lithographiemaske zur Strukturierung der Leiterbahnen Design 2 prozessierten Mikrokan len verschiedener Breite a b 10 um c d 30 um In den Abbildungen links wurde jeweils auf die untere Kante fokussiert in den Abbildungen rechts auf die Oberkante Das erreichte Aspektverh ltnis von 300 20 ist dennoch bemerkenswert gut In diesem Prozess lie en sich Anordnungen von mehreren 10 um breiten parallelen Mikrokan len im Abstand von 30 um herstellen siehe Abb 4 22 c d Dies m sste ausreichen um Axone der darauf kultivierten Neuronen zu isolieren und mit darunter gelegenen Elektroden gezielt axonale Signale abzuleiten Tabelle 4 3 zeigt die verwendeten Parameter Optimierte Parameter zur Fertigung eines funktionalisierten Zellkulturkammerbodens Dispense Spin Softbake Belichten Hardbake Entwickeln 300 rpm 180 s 3000 rpm 720s 95 C 35 Min Os 95 C 15 Min 25 Min Tab 4 3 Verwendete Parameter zur Prozessierung von Mikrokan len als funktionalisierter Zellkulturkammerboden 74
58. annungspulsmit einer Dauer von 500 u einer Amplitude von 180 mV einer Wiederholfrequenz von 1 Hz und einer Offsetspannung von 8 66 V als Erregersignal 93 4 4 3 Vierpunktmessung Bei der Vierpunktmessung wird die Bezugsmasse des Signalgenerators von den Verst rkereing ngen getrennt Der Masseanschluss des Signalgenerators wurde mit der Referenzelektrode AG AgCl verbunden Die invertierenden Verst rkereing nge wurden mit der metallischen Referenzelektrode auf dem MEA verbunden Ein schematischer Schaltplan ist in Abb 4 47 dargestellt Mit Hilfe des Signalgenerators wurde ber die Stimulationselektrode ein Rechtecksignal mit einer Amplitude von 20 mV und einer Frequenz von 1 Hz in die Zellkulturkammer geleitet Auch hierbei musste eine Offsetspannung 1 8 V eingestellt werden um die Signale in den Aufl sungsbereich des Verst rkers zu verschieben Abb 4 47 Schematische Darstellung der Vierpunkt messung mit Masseanschluss Abb 4 48 zeigt den an zwei Elektroden gemessenen Spannungsverlauf tausendfach verst rkt Die Kr mmung der Kurve im Vergleich zum rechteckigen Erregersignal verdeutlicht die kapazitiven Effekte zwischen den Elektroden Zum Vergleich mit der in Kap 4 4 2 beschriebenen Dreipunktmessung mit einem generierten Spannungsimpuls von 500 us Dauer wurde der Spannungsabfall von 8 V an der scharfen Kante des gemessenen Signals herangezogen Das Ergebnis zeigt dass die Signal bertragung
59. aphischen Strukturierung Lack AZ 5214 1 0 Image Reversal Spin Coater Convac 1001 Fairchild 1001 Dispense 10 s bei 300 rpm Rampe 64 Spin 30 s bei 3000 rpm Heizplatte Pr zitherm PZ 28 2 Prozess Umkehrprozess Positivprozess Softbake 60 s bei 100 C 60 s bei 100 C Mask Aligner Karl SUSS MJB3 Abb 3 14 Mask Aligner Foto Wellenl nge 365 nm Energiedichte 50 mW cm Lithographiemaske Fiir die Leiterbahnen F r die Isolation Haftschicht Transp Reflekt Transp Reflekt Belichtungsdauer 3 558 3 2 S 3 58 328 Flutbelichtungsdauer 13 5 s 13 28 Hardbake 60 s bei 110 C Entwickler AZ 726 MIF Entwicklungsdauer 70s 90 s 70s 90 s Sp len Deionisiertes Wasser flie end Stopper Deionisiertes Wasser im Becherglas Trocknen Stickstoff Nasschemisches tzen von Chrom Prozessschritte d h Tab 3 7 Angewandte Prozessparameter in der Lithographie Wegen der schlechten Haftung des Fotolacks auf dem Tr gersubstrat wurde eine Chromschicht als Haftvermittler aufgetragen Da Chrom elektrisch leitet muss diese Schicht in zwei separaten Prozessschritten wieder entfernt werden einmal vor der Beschichtung mit Leitermaterial einmal nach der Entfernung des Fotolacks Durch Nasschemisches tzen mit einer Chrom tze siehe Abb 3 15 wird unbedecktes Chrom vom Tr gersubstrat gel st Dies geht recht schnell und de
60. ards a multi electrode array MEA system for patterned neural networks Procedia Chemistry Ausgabe 1 2009 329 332 18 Casy Model DT Cell Counter Operator Manual by InnovatisGroup AG 116 19 Product Data Sheet Glass Cover Slides siliconized by Greiner Bio One International AG 20 Thermo Scientific Heraeus BBD6220 CO2 Inkubatoren Product Information by Thermo Fisher Scientific Incorporation 21 P Scholze A Ciuraszkiewicz F Groessl A O Urtreger J M McIntosh S Huck a462 Nicotinic Acetylcholine Receptors in the Early Postnatal Mouse Superior Cervical Ganglion Developmental Neurobiology Ausgabe 71 2011 390 399 22 P V Kola S Daniels D C Cameron M S J Hashmi Magnetron sputtering of tin protective coatings for medical applications Journal of Materials Processing Technology Ausgabe 56 1996 422 430 23 K C Tang E Liao W L Ong J D S Wong A Agarwal R Nagarajan L Yobas Evaluation of bonding between oxygen plasma treated polydimethyl siloxane and passivated silicon Journal of Physics Conference Ausgabe 34 2006 155 161 24 Information about Dow Corning Brand Silicone Encapsulants by Dow Corning Corporation 25 W Schrott M Svoboda Z Slouka M Pribyl D Snita PDMS microfluidic chips prepared by a novel casting and pre polymerization method Microelectronic Engineering Ausgabe 87 2010 1600 1602 26 Adhesi
61. ariiert Tabelle 3 6 zeigt die gefundenen Parameter Prozessparameter beim Sputtern Bg Pe ee Modell Von Ardemne LS 3908 Targetmaterial Cr Ti Au Pt Ni Ge TiN Basisdruck mbar lt 3e Arbeitsdruck mbar ge Var HF Leistung W 100 100 50 100 100 100 50 Sputterdauer s 30 2x50 3x50 60 60 60 Var Vorsputtern s 30 2x50 3x50 60 60 60 10x60 ae De Spieles oi Schichtdicke nm 25 60 240 120 0 A 0 A Var Tab 3 6 Angewandte Prozessparameter beim Sputtern und nominelle Schichtdicken Fotolithographie Prozessschritte c J Durch die Lithographie wird das Tr gersubstrat mit Hilfe eines Spin Coaters siehe Abb 3 13 gleichm ig mit Fotolack beschichtet und diese sch tzende Lackschicht durch Belichtung in einem Mask Aligner siehe Abb 3 14 den Mikrostrukturen auf den verwendeten Lithographiemasken entsprechend strukturiert In einem letzten Schritt Strippen oder Lift off kann der Fotolack wieder gel st werden Die Dauer der Strukturbelichtung bei der Lithographie wurde daran angepasst ob die Haftschicht f r den Fotolack durchsichtig ist oder reflektiert Besondere Sorgfalt wurde beim Absp len des Entwicklers angewandt damit keine Lackreste an der Lackstruktur h ngen bleiben Tabelle 3 7 zeigt die verwendeten Parameter 36 Abb 3 13 Spin Coater Foto Prozessparameter bei der lithogr
62. as den tats chlichen Spannungsabfall am Lastwiderstand misst Ob der Signalgenerator geeignet ist um damit Neuronen zu stimulieren soll in weiteren Versuchen untersucht werden siehe Kap 4 6 3 Aufgrund des relativ hohen Rauschens wurde jedoch f r die Messung des Signal Rausch Verh ltnisses des Messaufbaus ein Biosignalsimulator von Microchannel Systems eingesetzt siehe Kap 3 5 3 welcher im Bereich von 100 uV wesentlich sch rfere Signale generiert 80 ANTON AM Voltage V i 10 100 0 200m 400m 600m 800m 998 5m 0 200m 400m 600m 800m 999 017m Time s Time s Voltage V ALLE LIU 10 1000 I l l I I l 0 200m 400m 600m 800m 998 5m 0 200m 400m 600m 800m 999 017m Time s Time s UM ba 10 10000 I 0 200m 400m 600m 800m 998 5m 0 200m 400m 600m 800m 999 017m Time s Time s OQO O Os O 3 T 7 zu 5 0 h o F 200m 400m ee 600m 800m 998 5m 0 0 25 0 5 Zeit s 0 75 1 Abb 4 27 Tausendfach verst rkte Spannungsverl ufe am Widerstand R2 verschiedener Spannungsteiler a e R2 10 Q RI 100 Q b f R2 10 Q RI 1kQ c g R2 10 Q RI 10kQ d R2 10 Q RI 100kQ an denen mit dem Signalgenerator ein Rechtecksignal mit einer Frequenz von 2 Hz und den Soll Spannungsamplituden von a 20 mV b 200 mV c 2 V d 20 V e 100 mV f 1 V g 10 V eingespeist wurde h Schematische Darstellung
63. ass sich damit auch die chemische Zusammensetzung der abgeschiedenen Titannitridschichten ver ndert 43 Die Messungen der Rauigkeit wurden mit Hilfe eines Rasterkraftmikroskops engl Atomic force microscope AFM vorgenommen und sind in Abb 4 16 n Diagrammform dargestellt Dabei ist zu beachten dass zumindest der Effekt der Haftschicht aus Titan auf die Rauigkeit der Titannitridschicht von der Sputterdauer abh ngt siehe Abb 4 16 b c 69 TIMN Rauigkeit bei 10 min sputterdauer cau A E 4 oF ohne Ti ohne Ti mit Ti mit Ti mit Tibeheizt mit Ti beheizt Ohne Ti fPh x 6 Verfahren E auadratische Rauigket Mittlere Rauigkeit Mittlere Rauiakeit lt Sputterdauer Quadratische Raul gkeit Sputterdauer 35 45 ce i4 E 35 m K 254 al m k To 24 2am OF im 5 e al 15 gt Ss 157 z 4 5 5 10 12 14 16 185 20 22 4 B 5 10 12 414 16 18 20 22 Sputterdauer min Shuftterdauer min ohne Titan rit Titan ohne Titan rnit Titan Abb 4 16 Rauigkeit der gesputterten Leiterschicht aus Titannitrid mit unterschiedlichen Prozessparametern a bersicht ber verschiedene Varianten steht f r durchgehendes Sputtern b Mittlere Rauigkeit bei unterschiedlicher Sputterdauer c Quadratische Rauigkeit bei unterschiedlicher Sputterdauer Eine genauere Betrachtung der abgeschiedenen Oberfl chen zeigt schlie lich dass die gesteigerte Rauigkeit bei Druckerh hung von der scharfka
64. ation von Auf und Durchlichtmikroskopie 61 4 1 2 Probleme im Prozessablauf Die MEA Prozessierung mit Hilfe mikroelektronischer Beschichtungsverfahren weist einige T cken auf die hier diskutiert werden sollen Zu Beginn der MEA Prozessierung wurden Herstellparameter zur Prozessierung eines Mikroelektrodenarrays herangezogen die sich f r die Herstellung eines MEAs f r Bio Impedanzmessungen an Caco 2 Zellen als geeignet herausgestellt haben 38 Dieser Gesamtprozess wurde auf die Problemstellung dieser Arbeit abgestimmt siehe Kap 4 1 3 Im Folgenden wird auf einige prozesstechnische Schwierigkeiten im Detail eingegangen Reinigung Prozessschritt a Eine mangelhafte Reinigung des Tr gersubstrats kann die Struktur der darauf aufgetragenen Leiter oder Isolationsschicht ma geblich ver ndern Dies gilt insbesondere f r die zur Zellkultivierung eingesetzten Deckgl ser Die Strukturuntersuchung mit Hilfe eines Rasterkraftmikroskops engl Atomic force microscope AFM eines vorm T Siasi unbehandelten Deckglases siehe Abb 4 6 a zeigt j a auf der ansonsten glatten Oberfl che vereinzelte Erhebungen von bis zu 21 nm H he Dabei wachsen diese Erhebungen bei der Beschichtung siehe Abb 4 6 b Es konnte zwar nicht gekl rt werden ob es sich dabei wie vermutet um eine Vorbeschichtung handelt aber mit einer eingehenden Reinigung der Deckgl ser im Ultraschallbad wurden die Erhebungen f r die a O Biokompa
65. b 4 30 b zeigen die getesteten Verst rkerplatinen Die Messergebnisse sind in Abb 4 30 c zu sehen Die einzelnen Kan le werden darauf in verschiedenen Farben dargestellt Dabei ist zu beachten dass der Offset der einzelnen Kan le 1m Messaufbau begr ndet sein muss Es zeigt sich dass alle Kan le unabh ngig vom angelegten Signal gleich verst rken und das gleiche Rauschverhalten aufweisen Da der Offset jedes Kanales individuell unterschiedlich ist wurde angenommen dass dieser individuelle Offset durch die verschiedenen Verst rker bedingt wird Aufgrund des hohen Verst rkungsfaktors k nnen n mlich schon minimale Unterschiede in den Widerstanden im Innenaufbau des Verst rkers zu einem Offset dieses Ausma es f hren siehe Kap 3 4 1 Nun k nnte es sein dass es zwischen den Kan len auf der Verst rkerplatine beispielsweise durch nebeneinander liegende ungeschirmte Signalleitungen zum elektrischen bersprechen kommt Au erdem wurde der elektrische Kontakt zum Biochip bisher nicht untersucht Deswegen wurden in einem weiteren Test gem dem Schaltplan in Abb 4 31 mit der angefertigten Kontakthalterung siehe Abb 3 32 a Biochips kontaktiert siehe Abb 3 32 b und die Kan le nacheinander einzeln getestet w hrend die brigen Kan le offen blieben In der experimentellen Umsetzung sieht das so aus dass mit einem Kabel an dem der Signalgenerator angeschlossen ist nacheinander die Kontaktpads des Biochips abgetastet werden Dabei war
66. benslauf Pers nliche Angaben Name Lukas Schneider Geburtsdatum 25 Februar 1984 Geburtsort Bregenz Familienstand ledig Schulausbildung 1990 1992 Volksschule Graf Starhemberg Gasse Wien 1992 1994 Volksschule L wengasse Wien 1994 1996 Realgymnasium Stubenbastei Wien 1996 2002 Bundesgymnasium Gallusstra e Bregenz Abschluss Allgemeine Hochschulreife Studium 2002 2011 Studium Physik an der Universitat Wien 2005 2008 Studium Bildhauerei Plastik und Multimedia an der Universitat fiir angewandte Kunst Wien Beruflicher Werdegang 2006 2008 Lehrkraft im Unterst tzungskomitee zur Integration von MigrantInnen Wien 11 2009 06 2010 Wissenschaftlicher Mitarbeiter am Institut f r Festk rperelektronik an der TU Wien 121
67. beschichtet siehe Abb 2 17a Bei der PECVD werden inerte Arbeitsgase und Reaktionsgase gemischt Durch die Ionisierung der Reaktionsgase sowie die Beheizung des Substrats wird die Abscheidung einer festen Phase am Substrat beg nstigt siehe Abb 2 17b F r die st chiometrische Zusammensetzung der abgeschiedenen Isolationsschicht sind die Anteile der Reaktionsgase ma gebend Der RIE Prozess kombiniert physikalisches und chemisches tzen Richtung Substrat beschleunigte Plasmaionen f hren zum Aufl sen bestehender Bindungen an der Oberfl che Die Oberfl chenatome k nnen so leichter Molek lverbindungen mit dem Reaktionsgas eingehen und als Gas abgef hrt werden siehe Abb 2 17c Dabei sollten die chemischen Eigenschaften der Reaktionsgase auf die chemischen Eigenschaften der zu tzenden Leiter oder Isolationsschicht abgestimmt sein sodass materialspezifisch ge tzt werden kann Ein spezieller RIE Prozess ist das Plasmaveraschen bei dem ein Sauerstoffplasma gez ndet wird Dieses Verfahren wurde in dieser Arbeit sowohl zur Reinigung besonders bez glich organischer R ckst nde als auch der Hydrophilisierung von Oberfl chen eingesetzt 24 3 Messmethode In dieser Arbeit soll ein Messsystem zur Ableitung elektrischer Aktivit t neuronaler Zellkulturen erstellt werden Dazu wird noch einmal der Ablauf der Messung im Hinblick auf die daf r ben tigten Ger te festgehalten siehe Abb 3 1 Des Weiteren sollen die Zellkultivierung
68. chichtet und mit Neuronen best ckt Die berpr fung der Vitalit t der Neuronen erfolgte mit dem Lichtmikroskop Da in der Neurologie jedoch fast ausschlie lich Durchlichtmikroskope zum Einsatz kommen mussten die Neuronen auf den durch die Beschichtung nicht mehr durchsichtigen Deckgl sern zum Transport fixiert werden Dazu wird erst das Medium abgezogen das Deckglas mit phosphatgepufferter Salzl sung engl phosphate buffered saline PBS zweimal 5 Minuten gewaschen und zur Fixierung der Neuronen 20 Minuten mit 2 iger Paraformaldehyd L sung bedeckt Anschlie end wird ein Deckglas dreimal 5 Minuten mit PBS und 10 Minuten mit Milli Q H O gewaschen und mit 108562 Aquatex zwischen zwei Deckgl sern luftdicht 21 verklebt Durch das Fixiermittel erhalten die Proben eine r tliche F rbung und Lufteinschl sse 1m Fixiermittel werden in mikroskopischen Aufnahmen als Artefakte wahrgenommen siehe Abb 3 4 Aus den geeignetsten Materialien sollen anschlie end die MEAs prozessiert werden Abb 3 4 Am vierzehnten Tag in vitro fixiertes neuronales Zellgewebe a gesundes Gewebe b Lufteinschluss im Fixiermittel In der Zellkultivierung eingesetzte L sungen und Dosierung Ausgangsstoff Stamml sung Gebrauchsl sung Dosierung Phosphatgepufferte Salzl sung PBS Standardl sung Standardl sung vernachl ssigbar Trypsin Reinstoff 0 25 in PBS 30 ul cm Neurobasales Medium NBM Gibco 108880 22 Unv
69. chlossen Zum Vergleich wurde der Massepunkt zwischen den zwei in Serie geschalteten Stromquellen engl ground DGND GNDA und die Erdung der Stromquellen engl protective earth PE verwendet Im weiteren wurden bei jeder Messkonfiguration zwei Methoden der Datenerfassung verglichen Dabei bezieht sich die von der Datenkarte gemessene Spannung an den analogen Eing ngen entweder auf eine einzige fixe Bezugsmasse AINGND oder aber auf andere Eing nge wie z B AINO F r jede getestete Messkonfiguration konnte so das verst rkte Signal des Signalgenerators am Ausgang des Verst rkers gleichzeitig in Bezug zu zwei unterschiedlichen Massen DGND oder PE gemessen werden wobei zu beachten ist welche davon als Bezugspotential f r den Verst rker VREF AINO eingesetzt wird F r den Vergleich der Schaltungen wurde ein Rechteckssignal mit einer Amplitude von 50 mV und einer Frequenz von 2 Hz generiert und zehnfach verst rkt Die Messergebnisse sind in Abb 4 25 zu sehen Dabei zeigt sich dass das von der Datenkarte erfasste Signal in allen Konfigurationen sch rfer ist wenn es in Bezug zu AINO rot dargestellt gemessen wurde F r Konfigurationen mit zwei getrennten Massen siehe Abb 4 23 c d ergibt sich dies aus der Funktionsweise des Verst rkers da ja AINO stets mit dem Bezugspotential des Verst rkers VREF verbunden war Allerdings war dieser Effekt auch in Messkonfigurationen zu sehen in denen eine gemeinsame Masse angeschlossen wurde
70. cklung Haftschicht 1 f Leiterbahnen f Leiter g Lift off h tzen von i Isolation j Strukturierung der tzl cher bahnen Haftschicht 1 Spin Belichtung Entwicklung k Elektroden I Elektroden m Lift off n Strukturierung des Zellkulturkammerbodens o Zellkultur Frei tzen Verg tung Spin Belichtung Entwicklung kammer Abb 3 8 Schematische Darstellung des Prozessablaufs der Biochip Prozessierung e Die Leiterbahnen werden im Lift off Verfahren strukturiert Dazu wird das Tr gersubstrat nach der Reinigung Schritt a eine Fotolackschicht aufgebracht und lithographisch strukturiert Schritt c welche nach gleichm igem Beschichten mit Leitermaterial mittels Sputtern Schritt f wieder entfernt wird Schritt g Dabei wird das ber dem strukturierten Fotolack liegende Leitermaterial ebenfalls entfernt Das bestehende Leitermaterial bildet die Leiterbahnen Um die Haftung des Fotolacks wie des Leitermaterials auf dem Tr gersubstrat zu verbessern kann das Tr gersubstrat zus tzlich mit einem Haftvermittler beschichtet werden welche eventuell auch wieder entfernt werden Entsprechende Prozessschritte Schritte b d e h sind somit als optional aber durchaus hilfreich anzusehen und werden im folgenden Kapitel eingehender erl utert 32 Die Isolation wird durch reaktives Ionen tzen strukturiert Dazu wird nach der Beschichtung mit dem Isolationsmaterial mittels PECVD Schritt 1 eine Fotolackschicht
71. den kann Aufgrund einer mechanischen Eigenheit des Mask Aligners die Belichtungsquelle wird nicht immer exakt positioniert kann es schlie lich am Rand des Tr gersubstrats zu Effekten mangelnder Belichtung kommen siehe Abb 4 8 Dies gilt insbesondere deshalb da das Tr gersubstrat schon beinahe die komplette beleuchtete Fl che bedeckt Dieser Prozessfehler trat nur sporadisch auf und konnte deswegen nicht weiter analysiert werden Abb 4 9 Mikroskopische Auflichtaufnahmen der Elektroden mit strukturierter Isolationsschicht zur Alignmentbewertung bei unterschiedlichem Elektrodendurchmesser a 100 um b 50 um c 30 um d 10 um 63 Ein besonderes Problem bei der Lithographie stellt das Alignment dar Die Strukturen f r die tzl cher sollen direkt ber den Elektroden aufgebracht werden wozu die Alignmentstrukturen auf den Lithographiemasken herangezogen werden k nnen W rden die tzl cher mit einem Positivprozess beschichtet werden dann w rde sich das Alignment recht aufwendig gestalten da w hrend der Positionierung der Lithographiemaske die Elektroden nur durch die ffnungen f r die tzl cher betrachtet werden k nnen Das Ergebnis dieser Ausrichtung ist unbefriedigend Ab einem Elektrodendurchmesser von 30 um kann wegen der schwierigen Ausrichtung nicht gew hrleistet werden dass sich unter der gesamten freige tzten Fl che Leitermaterial befindet obwohl die Elektroden etwas gr er gew hlt wurden
72. der Kontakthalterung aus der Halterung mit Fixierung und zwei Kontaktleisten mit Translationstischen und eingezeichneter Justierbarkeit 44 3 4 Signalverst rkung Weil die an den extrazellul ren Elektroden auf den Biochips zu messenden Spannungsdifferenzen weit unter einem Millivolt betragen k nnen siehe Kap 2 2 3 mussten die elektrischen Signale vor der Datenerfassung verst rkt werden Dazu wurden Verst rkerplatinen siehe Kap 3 4 2 angefertigt auf denen acht Eingangssignale von jeweils einem eigenen Analogverst rker siehe Kap 3 4 1 verst rkt werden Zus tzlich wurde ein Hochpassfilter mit acht getrennten Kan len siehe Kap 3 4 3 hergestellt 3 4 1 Verst rkerspezifikationen F r die Dimensionierung des Verst rkers ist auf ein sinnvolles Signal Rausch Verh ltnis engl Signal noise relation SNR zu achten Dazu ist es von Vorteil die Dauer und die erwartete Amplitude des zu messenden Signals abzusch tzen Bei einer Dauer des zu erfassenden Aktionsimpulses AI von 1 ms und einer Aufl sung von 100 Messpunkten ergibt bezieht sich das SNR auf einen Frequenzbereich von 100 kHz F r die Bestimmung der erwarteten Signalamplitude lie e sich nun das Punkt Kontakt Modell siehe Kap 2 2 3 mit der bekannten Amplitude eines AI heranziehen Diese Methode scheint jedoch recht aufwendig daher beziehen sich weitere berlegungen auf experimentell ermittelte Signalamplituden von 0 1 1 mV 30 Als verst rkendes El
73. des generierten Soll Signals 4 3 3 Zeitliche Aufl sung der Datenerfassung Die Aktionsimpulse der neuronalen Aktivit t sollten in diskreten Messpunkten erfasst werden siehe Kap 3 5 3 Dazu wurde die Eignung der Datenkarte NI USB 6211 bestimmt wobei als entscheidendes Kriterium das zeitliche Aufl sungsverm gen herangezogen wurde Dabei muss nach dem f r praktische Anwendungen modifizierten Nyquist Theorem 36 die Abtastrate mindestens 2 2 Mal h her sein als die maximale aufzul sende Frequenz Bei einer Mehrkanaldatenerfassung h ngt die Abtastrate von der Anzahl der simultan gemessenen Kan le ab Bei 8 Kan len und einer Gesamtabtastrate von 250 kS s entspricht dies einer Abtastrate von 30 kS s pro Kanal womit bis zu 70 us breite Pulse aufgel st werden k nnen sollten Dieses Theorem wurde durch die Messung best tigt Dazu wurde aus dem Signalgenerator der Datenkarte einem Spannungsteiler 10 Q 1 KQ und ein Verst rker Faktor x1000 der in Abb 4 26 zu sehende Schaltplan nachgestellt Anschlie end wurden mit dem Signalgenerator scharfe Pulse von 40 500 us Dauer erzeugt die bereits geteilt und verst rkt mit der Datenkarte zum Vergleich mit zwei unterschiedlichen Sampleraten 15 kS s 30 kS s digitalisiert wurden Entscheidend ist nun ob nach der Datenerfassung noch alle Pulse vom Rauschen unterschieden werden konnten Dazu wurden die Signale ber eine Dauer von einer Sekunde aufgezeichnet Die Ergebnisse di
74. die Neuronen beim Eindringen der Elektrode zerst rt Als besonderes Beispiel sei hier die Patch Clamp Technik genannt mit deren Hilfe das elektrische Verhalten einzelner Ionenkan le untersucht werden kann e Bei der extrazellul ren Ableitung werden beide Elektroden au erhalb der Zellmembran angebracht Auch hier entsteht mit einem AI durch Ladungstr gerverschiebung ein Spannungsunterschied wobei der weitaus gr ere Teil an der Zellmembran abf llt Deshalb m ssen die Signale bei dieser Variante mehr verst rkt werden Deswegen ist die extrazellul re Ableitung auch von vornherein ungenauer was allerdings f r die Visualisierung von Aktivit tsmustern belanglos sein sollte 11 Die komplexen Verh ltnisse werden im Punkt Kontakt Modell nach Weis 12 deutlich siehe Abb 2 14 Dabei werden das Kabelmodell siehe Kap 2 1 2 die elektrochemischen Doppelschichten siehe Kap 2 2 2 sowie ein elektrischer Widerstand des Elektrolyten ber cksichtigt Meist ist es von Interesse mehrere extrazellul re Elektroden einzusetzen Je nach Art der Verschaltung wird zwischen monopolarer Ableitung alle Elektroden messen die Spannung zu ein und derselben Referenzelektrode stabiles Potential und bipolarer Ableitung jede Elektrode misst die Spannung zur vorangehenden Elektrode unterschieden Bei bipolarer Ableitung sind dabei wegen der herausragenden Gleichtaktunterdr ckung haupts chlich Differenzenverst rker bzw Instrumenten
75. einen besonderen Zweck erf llen k nnte wurde jedoch nicht n her untersucht Tabelle 4 1 zeigt einen berblick ber die Ergebnisse der Biokompatibilit tsstudie Um die Biokompatibilit t der herzustellenden MEAs zu gew hrleisten empfehlen sich demnach als Leitermaterial Gold bzw Platin als Haftschicht Titan bzw Chrom und als Isolationsschicht Siliziumnitrid Diese Materialien finden auch in industriell prozessierten MEAs Anwendung weswegen der exemplarische Biokompatibilit tstest als hinreichend angenommen wird Da schon bei der ersten Beschichtung der Deckgl ser mit Gold Haftungsprobleme auftraten soll im weiteren kurz auf die bei der MEA Prozessierung aufgetretenen Probleme eingegangen werden 58 of X 100 00 fim Ni Abb 4 4 Mikroskopische Aufnahmen von Maus SCG Zellen auf beschichteten Deckgl sern DIV 5 Beschichtung a Titan b Siliziumnitrid c Siliziumoxid d Germanium e Silizium f Chrom g Plat n h Nickel a e lebendes Gewebe Durchlichtmikroskopie f h zwischen zwei Deckgl sern fixiertes Gewebe Kombination von Auf und Durchlichtmikroskopie 59 100 um Ti Au 100 um TP Abb 4 5 Mikroskopische Aufnahmen von Maus SCG Zellen auf beschichteten Deckgl sern DIV 5 Beschichtung a Gold b Gold mit Haftschicht aus Titan c Unbeschichtet d Platin mit Haftschicht aus Titan a b d zwischen zwei Deckgl sern fixiertes Gewebe Kombination von Auf
76. ement wurde wegen seiner Pr zision ein Operationsverst rker OPV verwendet Um auch bipolare Ableitungen zu erm glichen wurde ein Instrumentenverst rker Typ PGA202KP gew hlt Abb 3 27 zeigt den prinzipiellen Aufbau des gew hlten OPVs PGA202KP 31 Abb 3 27 Innerer Aufbau des Verst rkers gem dem Datenblatt 31 Front end and logic circuits nur schematisch PGA202KP Abb 3 28 Anschl sse des Verst rkers gem dem Datenblatt 31 Er hat neben dem invertierenden und dem nicht invertierenden Eingang VIN VIN einen Ausgang VOUT zwei Anschl ssen f r die Versorgungsspannung VCC VCC sowie einem Anschluss f r die Bezugsmasse VREF eine Eingangs Offsetsteuerung VOSI VOS2 Anschl sse f r einen integrierten Output Tiefpassfilter FILTERA FILTERB sowie einen F hler um die Ausgangsspannung dem Ausgangswiderstand anpassen zu k nnen VOUTSENSE ber die restlichen Anschliisse AO Al DIG COM l sst sich der Verst rkungsfaktor einstellen Die Anschl sse des OPVs sind in Abb 3 28 schematisch dargestellt Tabelle 3 15 zeigt eine bersicht ber die relevanten Spezifikationen des OPVs PGA202KP siehe Abb 3 29 Spezifikationen des Verst rkers OPV PGA202KPG4 Typus Instrumentenverst rker g Fan ur Rauschen uV Input Output Bi I TY yf Frequenzunabh ngig 1 7uV 32uV Zus tzliches Rauschen bei 100kHz 3 6uV 360uV Abb 3 29
77. en Gewebes siehe u a Abb 4 3 entsprechen der Farbe des Materials mit dem das Deckglas beschichtet wurde Alle undurchsichtig beschichteten Deckgl ser siehe u a Abb 4 4 f h wurden mit dem Auflichtmikroskop betrachtet Dabei zeigen die Bilder in Fixiermittel konserviertes Neuronales Gewebe Das Fixiermittel erzeugt dabei einen r tlichen Farbstich sowie Lufteinschl sse Die betroffenen Gebiete in der Zellkultur werden nicht konserviert was zu einem Absterben der Zellen f hrt siehe u a Abb 4 4 f Es wurden zwei Messreihen durchgef hrt wobei in der ersten Messreihe die Haftung von Gold vollkommen abgel st und Platin teilweise abgel st unzureichend war Au erdem wurde in der ersten Messreihe auf eine Behandlung des mit Silizium beschichteten Deckglases mit Phosphors ure verzichtet was zu einem schnellen Abl sen der Neuronen f hrte Die Ergebnisse sind also nicht statistischer sondern vielmehr exemplarischer Natur Dabei sollte beachtet werden dass die Zellkultivierung immer einer gewissen zuf lligen Streuung unterliegt und keinesfalls 100 ig reproduzierbar ist Eine Kontamination beispielsweise macht die Ergebnisse vollkommen unbrauchbar Als ein besonderes Ergebnis dieser Materialstudie soll noch erw hnt werden dass die Neuronen auf Chrom nach 14 Tagen eine bevorzugte Orientierungsrichtung aufweisen siehe Abb 4 6 f was mit der Kristallstruktur von Chrom zusammenh ngen k nnte Ob das ein Nachteil ist oder sogar
78. en Spannungsimpulses als auch von der gew hlten Messelektrode abh ngt Das bedeutet dass die Signalantwort von der Lage der Elektrode abh ngt Die Messergebnisse wurden in Abb 4 62 a c zusammengefasst Dabei ist die Belegung der Elektroden zu beachten siehe Abb 4 61 d Die Messungen zeigen dass der Zusammenhang zwischen tats chlichem Abstand der Elektroden im Array und der Signalantwort bei weitem weniger signifikant aufscheint als dies urspr nglich erwartet wurde siehe Abb 4 62 a Dabei zeigt sich berraschenderweise dass ein exponentieller Zusammenhang zwischen Signalantwort und der Elektrodennummer also dem Abstand der nach Abb 4 62 d belegten Kontaktpads und Leitungen auf dem Biochip gefunden werden kann siehe Abb 4 62 b Die Abh ngigkeit von der Amplitude des Erregersignals ist dabei f r alle Elektroden weitgehend linear siehe Abb 4 62 c Dieses Verhalten ist vermutlich durch die L nge und den Durchmesser der Zuleitungen f r die Elektroden die wie ein d nnes Kabel wirken bedingt Um Feld bertragungseffekte im restlichen Messaufbau ausschlie en zu k nnen wurde auf einer Seite des Biochips die Stimulationselektrode durch Anlegen einer Gleichspannung von ber 2 V elektrolytisch entfernt siehe Abb 4 62 d e Nach der Entfernung zeigen sich keinerlei Spannungsspitzen im 104 relevanten Bereich Die Elektroden messen ein konstantes Potential Deswegen k nnen Feld bertragungseffekte in anderen Teilen des M
79. en auf e Die erste Form die Verschiebung des Elektrodenpotentials wurde in Kap 4 4 1 erl utert Diese St rsignale k nnen auch nicht durch eine Nachbearbeitung eliminiert werden Deswegen wurde zur Elimination dieser St rsignale ein Hochpassfilter eingesetzt siehe Kap 4 5 4 e Die zweite Form von St rsignalen ist der Netzbrumm Dieser sollte nach Fourierentwicklung theoretisch leicht entfernt werden k nnen In unseren Experimenten konnte eine Verdreifachung des SNR erreicht werden Die Nachbearbeitung mit der Software Signal Express zeigt jedoch dass sich dadurch die Signalform komplett ver ndert 101 e Die dritte Form von St rsignalen bilden schlie lich hochfrequente Spitzen einzelner Messpunkte Diese konnten bis rund 70 gegl ttet werden ohne das gemessene Signal zu verzerren da sich dieses ja ber mehrere Messpunkte erstreckt siehe Kap 4 3 3 Zur Verdeutlichung der Ver nderung der Signalform bei einer softwarebasierten Nachbearbeitung zur Elimination des Netzbrumms wurden in Analogie zu Kap 4 5 4 Signale aufgezeichnet und mit einem softwarebasierten Chebichev Bandstopfilter 50 Hz Filterfrequenz zweiter Ordnung nachbearbeitet Das Erregersignal war diesmal jedoch ein Spannungspuls mit einer Dauer von 500 us und einer Amplitude von 20mV In Abb 4 58 a ist das aufgezeichnete Signal an AIN3 sowie eine mit dem softwarebasierten Bandstopfilter nachbearbeitete Version desselben Signals dargestellt Abb 4 58 b zeig
80. enden Spannung in Abh ngigkeit vom Gesamtwiderstand und vom Teilungs Verst rkungs Verh ltnis siehe Abb 4 27 Da der Signalgenerator nicht auf den Saenminasteiler Lastwiderstand angepasst wurde kommt es zu einer Abweichung der aus reiner Multiplikation des Teilungs Verst rkungs Verh ltnisses mit dem Abb 4 26 Schematischer Schaltplan mit Grundschaltung und am Signalgenerator eingestellten Soll Spannung am Lastwiderstand siehe Abb 4 27 a b Diese Spannungsteiler Abweichung wird bei Lastwiderst nden gr er als 1 KQO unter Annahme eines unendlich gro en Widerstands kleiner als ein Prozent siehe Abb 4 27 f g Des weiteren ist zu sehen dass die Amplitude des aufgezeichneten Rauschens abh ngig von der Konfiguration der Spannungsteiler sowie von der generierten Signalh he 200 300 mV betrug Dabei ist zu beachten dass es sich bei den gezeigten Signalen um tausendfach verst rkte Spannungsunterschiede handelt womit auch St rsignale an den Verst rkereing ngen tausendmal verst rkt werden Dem aufgezeichneten Rauschen entspricht also ein Rauschen an den Verst rkereing ngen von rund 300 uV Der starke Einfluss der Unsch rfe des vom Signalgenerator erzeugten Signals wurde im Vergleich mit einer anderen Signalquelle besonders deutlich siehe Kap 4 3 5 und 4 3 6 Die Versuche zeigen dass nur bei kleinen Lastwiderst nden lt 1 KQO ein zus tzliches Spannungsmessger t eingesetzt werden muss d
81. er Leiterbahnen f hren siehe Abb 4 11 Diese Produktionsfehler konnten durch eine eingehende Sp lung nach der Entwicklung siehe weiter oben vermieden werden 64 amp 50 um 100 um Abb 4 11 Mikroskopische Auflichtaufnahme von nach der PECVD aufgetretenen Haftungsproblemen a Bl schen als m gliche Ursachen f r das Abbr ckeln der Isolationsschicht b Abgebr ckelte Isolationsschicht c keimartige Abl sung der Leiterschicht Gold d gro fl chiges Abl sen der Leiterschicht Buckling 40 RIE Prozessschritt k Beim Frei tzen der Elektroden durch das RIE Verfahren sollte das Reaktionsgas die Schichtdicke der Isolationsschicht durch tzen In einem ersten Vorversuch mit 10 Min tzdauer konnte die 360 nm dicke Siliziumnitridschicht nicht ge tzt werden Die Vollst ndige Entfernung der Nitridschicht konnte leicht mit einem Widerstandsmessger t an den Kontaktpads berpr ft werden Dabei sollte angemerkt werden dass freige tzte Kontaktpads mit einer Fl che im Bereich von 50 mm noch nicht mit freige tzten Mikroelektroden mit einer Fl che im Bereich von 300 um gleichzusetzen sind da kleine Fl chen bei gleicher tzdauer weniger tief ge tzt werden 41 Im Rahmen der Optimierung des Prozessablaufs siehe Kap 4 1 3 konnte dieses Problem behoben werden 65 4 1 3 Optimierung des Prozessablaufs Wie in Kap 4 1 2 dargestellt waren zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit Optimierungen in einze
82. er eingesetzten Materialien best tigt Ein weiterer Schwerpunkt war der Aufbau und die Evaluierung des elektronischen Messsystems Es wurde ein Messaufbau entwickelt der es erlaubt die einzelnen Elektroden auf dem Biochip elektrisch zu kontaktieren und Spannungsunterschiede kleiner 100 uV vom Biochip abzuleiten und tausendfach verst rkt vom Rauschen unterscheidbar digital aufzuzeichnen Im Folgenden wurde dieser Messaufbau eingesetzt um den hergestellten Biochip elektrisch zu charakterisieren Ein abschlie ender Versuch an auf dem Biochip ausges ten lebenden Zellen konnte die Funktion des Gesamtsystems best tigen Es wurden wesentliche Zusammenh nge aufgezeigt und grundlegende Erkenntnisse f r die Herstellung eines problemorientierten Messsystems gewonnen So bietet diese Arbeit das Potential f r zuk nftige Entwicklungen 1 Einleitung Hintergrund Die Reizweiterleitung in Nervenzellen spielt eine wesentliche Rolle in einer Vielzahl von biologischen Prozessen Die Funktionsweise des Schmerzempfindens oder auch das Ged chtnis sowie eine breite Palette von neurologischen Erkrankungen k nnen durch Ableitungen neuronaler Aktivit t entsprechender Nervenzellen genauer beschrieben werden Die neuronale Reizweiterleitung bedient sich elektrischer Mechanismen weswegen sie mit Elektroden abgeleitet werden kann Dabei entspricht ein neuronaler Aktionsimpuls einem etwa eine Millisekunde andauernden Potentialunterschied an der Zellmembran von rund 7
83. erdiinnt Zusatzstoffe 500 ul cm Fetales K lberserum FCS Aus K lberf ten 10 in NBM 100 ul cm PDL hydrobromide Sigma P 1458 100 mg in 10 ml Wasser 0 25 in Wasser 100 ul cem Laminin Cultrex mouse Cat 3400 010 01 1 mg in 9 ml NBM 11 in NBM 50 ul cem Tyrode L sung Standardl sung Ohne CaCl vernachl ssigbar Tab 3 2 Zur Zellkultivierung von Neuronen eingesetzte L sungen und korrekte Dosierung 21 28 3 2 Biochipprozessierung Die Herstellung der Mikroelektrodenarrays MEAs beginnt bei der Produktion der Lithographiemasken Die gew nschten Lithographiemasken wurden mit Autocad 2008 entworfen siehe Kap 3 2 1 Anschlie end wurde mit einem Heidelberg Laserschreiber in einem Fotolack auf einer Multischicht aus verschiedensten Metallen auf dem Maskentr ger die Struktur der entworfenen Lithographiemaske belichtet und entwickelt Die hergestellten Lithographiemasken wurden im weiteren in einem Ablauf unterschiedlicher Beschichtungverfahren siehe Kap 3 2 2 zur Strukturierung von MEAs eingesetzt Dazu soll auf die Haftung der einzelnen Materialschichten eingegangen werden siehe Kap 3 2 3 Damit sp ter Zellen in einem N hrmedium auf dem MEA kultiviert werden k nnen wurde au erdem eine Zellkulturkammer hergestellt siehe Kap 3 2 4 und auf dem MEA aufgebracht Die eingesetzten Ger te und Prozessparameter sind in Kap 3 2 5 zusammengefasst 3 2 1 MEA Dimensionierung Das Design der MEAs orientierte sich an
84. es Ergebnis allein zeigt den besonderen Vorteil eines Hochpassfilters bei der Messung Allerdings ist zu beachten dass ein derartiger Hochpassfilter niederfrequente Signalanteile extrem verzerrt Da die aufzuzeichnenden neuronalen Signale mit Signaldauern von wenigen Millisekunden weit ber der Grenzfrequenz liegen sollte dies jedoch keine Schwierigkeiten verursachen Die Signalverzerrung durch den Hochpassfilter wird im Zuge der software basierten Signalkonditionierung der dargestellten Signalantworten siehe Kap 4 5 5 noch eingehender behandelt Spannung _ Spannung Y a ano Zeit s Zeit s 100m Spannung Y Spannung V GS AIN2 200m 500m 600 00m 200 900 228 6 0 100 200 300m 400 500m Zeit s Zeit s AINA Abb 4 57 Aufgezeichnete Spannungsverl ufe bei einer Vierpunktmessung mit generiertem Rechteckimpuls Amplitude 20 mV Frequenz 1 Hz und unterschiedlichen Hochpassfiltern mit Grenzfrequenzen fo von a 113 Hz b 48 Hz c 4 8 Hz d 3 3 Hz 4 5 5 Software basierte Signalkonditionierung Die gefilterten Messsignale wurden von der Datenkarte erfasst und zur Verarbeitung mit der Software Labview gespeichert Durch die softwarebasierte Nachbearbeitung k nnen St rsignale auch nach der Messung noch eliminiert werden Bedingung hierf r ist dass sie sich hinreichend von dem zu messenden Signal unterscheiden Bei der Messung treten nun insgesamt drei Hauptformen von St rsignal
85. es unvermeidlich dass zeitweise auch zwei Kontaktpads gleichzeitig kontaktiert wurden Der Verst rkungsfaktor war wiederum f r alle Kan le auf einer Platine der selbe 83 Spannung Abb 4 30 Angefertigte Verst rkerplatinen und Funktionstest a Platine A 8x1000 fache Verst rkerschaltung b Platine B 8x 100 fache Verst rkerschaltung c Schaltplan f r die Funktionstests d Aufgezeichneter Spannungsverlauf des Funktionstests mit Platine A und Spannunssteiler R2 10 Q R1 1 kQ bei angelegtem Rechtecksignal mit einer Amplitude von 20 mV und einer Frequenz von 2 Hz Computer ERRERFE N ini COCA Verstarker Datenkarte Vorverstarker MEA Design 1 Abb 4 31 Schaltplan f r die Messung des Kontakts zum Biochip bei einzeln angesteuerten Kan len 84 Spannung Spannung Y Abb 4 32 Angefertigte Kontakthalterung und Kontaktierung des Vorverst rkers auf dem Biochip a Kontakthalterung b Kontaktierung mit Feinrasterstiften c d Aufgezeichneter Spannungsverlauf bei Kontakt mit dem Biochip und einzeln mit einem Rechtecksignal 1V 2 Hz angesteuerten Kontaktpads c mit Platine B hundertfach verst rkt d mit Platine A tausendfach verst rkt Die in den einzelnen Kan len gemessenen Signale sind in verschiedenen Farben dargestellt Die Messung an beiden Verst rkerplatinen siehe
86. eser Messung sind in Abb 4 28 dargestellt Dabei zeigt sich dass sich die erfassten 81 Spannungspulse bei einer Pulsdauer von 300 us oder gr er siehe Abb 4 28 a b g h noch deutlich vom Rauschen abheben Bei einer Samplerate von 15 kHz konnten bereits bei einer Pulsdauer von 100 us nicht mehr alle Pulse einwandfrei identifiziert werden siehe Abb 4 28 j Dasselbe gilt f r die verwendete Samplerate von 30 kHz bei einer Pulsdauer von 50 us siehe Abb 3 26 e Noch k rzere Pulsdauern k nnen nur sehr unzuverl ssig erfasst werden da auf den einzelnen Impulsen nur noch wenige bis gar keine Messpunkte liegen siehe Abb 4 28 f k 1 Die Versuche zeigen dass die Erfassung eines Signals mit einer Pulsdauer von einer Millisekunde oder l nger mit der NI USB 6211 ohne weiteres m glich ist solange sich die Amplitude des Signals stark genug vom Rauschen unterscheidet Das S gnal Rausch Verh ltnis wird in weiteren Messungen noch n her behandelt siehe Kap 4 3 5 und 4 3 6 Erw hnt sei an dieser Stelle noch dass ein Vergleich zwischen Oszillator analoge Messung und Datenkarte digitalisierte Messung vernachl ssigbare Unterschiede aufweist solange die Frequenz unter der Aufl sungsgrenze von 14 kHz liegt V 200m _ 200m eo O E 500m a j H 500m g O 7 700m I I 1 4 1 1 1 1 j i 1 j I 1 1 t 1 t 1 700m 1 L 1 1 1 i I 1 1 1 i I I I 1 0 50m 1
87. essaufbaus als Fehlerquelle ausgeschlossen werden Im Weiteren wurde davon ausgegangen dass diese Effekte aufgrund des geringen Abstandes der Leiterbahnen f r das Erregersignal und die von den Messelektroden abgeleiteten Signale auf dem Biochip entstehen und sich deswegen bei Messungen von neuronalen Signalen nur w hrend der Stimulation auswirken Es sollte festgehalten werden dass der Messaufbau bef higt kurz lt 1 ms andauernde Spannungsimpulse mit Amplituden lt 1 mV also auch Aktionsimpulse von einem Elektrolyt abzuleiten und vom Rauschen unterscheidbar aufzuzeichnen Die Signalantworten skalieren dabei linear mit der Amplitude des Erregersignals Es wurde au erdem ein funktioneller Zusammenhang zwischen der Amplitude der aufgezeichneten Signalantworten und dem Abstand zwischen den Leiterbahnen f r die Messelektroden und die Stimulationselektrode festgestellt Ein direkter funktioneller Zusammenhang zwischen dem Abstand der jeweiligen Elektroden und der Signalantwort konnte jedoch nicht best tigt werden Elektradenantyert 100 um Elektrodenantwort 100 um 16 16 14 14 12 4 ego 12 1 10 MRO In 10 IN 50 my Aimy Impulsantwort w oo Impulsantwort w oo E 6 N 4 50 100 150 200 250 300 350 Oo 1 2 3 4 5 Ei n 5 Abstand zur Signalelektrode um Elektrode Mr Elektradenantwart 100 um Impulsantwort Mw Oo 30 40 So 60 r a0 a 100 110 Stimulus mW Abb 4 62
88. f die Problemstellung und die Verteilung der Neuronen abgestimmt sein Die Verteilung der Neuronen schlie lich kann ber eine zus tzliche Strukturierung des Zellkulturkammerbodens beeinflusst werden So bietet eine raue Oberfl che mehr Halt f r ein Neuron tiefe Grabenstrukturen mit d nnen Verbindungskan len auf der Oberfl che des Tr gersubstrats k nnen aber auch ganze Gebiete im Netzwerk trennen 15 wobei auch In vitro Zusammenh nge zwischen der rtlichen Lage eines Neurons und seiner Position als Knoten im Neuronennetzwerk hergestellt bzw bekr ftigt werden k nnen um aufschlussreichere Aktivit tsmuster zu erhalten 21 2 3 Mikroelektronische Beschichtungsverfahren Da in dieser Arbeit MEAs zur Ableitung neuronaler Aktivit t prozessiert wurden soll im Weiteren auf die relevanten Verfahren der Mikrostrukturherstellung eingegangen werden Besonderes Interesse gilt hierbei der Lithographischen Strukturierung siehe Kap 2 3 1 sowie plasmaunterst tzten Beschichtungs und tzverfahren siehe Kap 2 3 2 2 3 1 Lithographische Strukturierung Zur lithographischen Strukturierung einer Oberfl che wird zun chst ein spezieller Fotolack ben tigt Die wichtigsten Bestandteile von Fotolack sind Polymere oder Harze L sungsmittel sowie eine lichtempfindliche Komponente Der L sungsmittelanteil verfl chtigt sich bei h heren Temperaturen woraufhin der Fotolack aush rten kann Die lichtempfindliche Komponente hat die Aufgabe die L
89. figen Verst rkerschaltung ber eine weitere Strecke unverst rkt geleitet wird w re in diesem Fall ein h heres Rauschen zu erwarten Die Gr nde f r dieses etwas berraschende Ergebnis k nnten mit einer fehlerhaften Wahl der Masseanschl sse f r den Vorverst rker zusammenh ngen was n Kap 4 5 1 noch eingehender erl utert wird Ein Vorverst rker ist jedenfalls nicht notwendig und wurde im Weiteren nicht eingesetzt 88 Zweistufig verst rkt Einstufig verst rkt 900m 800m Voltage V D a oO Q O oO 33 200m 100m a oom ir 1 AANA IHN ai aba AMENN u IE A 200m oe ht inary EN au jr a LAUNE JAN en So Ww 200m gt 400m 500m 20m 40m 60m 69 9799m 0 20m 40m 60m 69 9799r Tine s Tine s MM hy Thy YA ly Nt HAA HAH Fly 40m Tine s om ME Time s 8m Tine s Voltage V Voltage V 40m Tine s m Aviva hypo i 100m Tirre s l 9 997 Time s Abb 4 38 Aufgezeichneter Spannungsverlauf simulierter Biosignale bei a d zweistufiger Verst rkerschaltung x10x100 e h einstufiger Verst rkerschaltung x1000 Die simulierte Signale waren a e EPSP b f Population Spikes c d g h Axonale Signale Al 89 4 4 Elektrodenbelegung Wie in den vorigen Kapiteln dargelegt ist die Belegung der Masseanschl sse von gro er Bedeutung f r die Rauschfre
90. g Ende Das Grundger st der Zellmembran stellt eine doppelte H lle aus Lipiden eine t Lipophiles Ende Doppellipidschicht dar die den Intrazellul rraum Zellinnenraum vom Extrazellul rraum Zellau enraum umgebendes Medium trennt siehe Abb Abb 2 1 Schematische Darstellung 2 1 und 2 2 Die Zellmembran kann so die Ionen im Zellinneren von den Ionen eines Membranlipids gem Literatur 1 au erhalb der Zelle trennen Diese Ionen sind als Ladungstr ger auch die Grundlage jeder chemischen Aktivit t der Zelle Die Konzentrationen der intrazellul r und extrazellul r gel sten Ladungstr ger sind dabei sehr unterschiedlich siehe Tab 2 1 was einem Konzentrationsgradienten r umlicher Konzentrationsanstieg normal zur Zellmembran entspricht Die Doppellipidschicht wirkt dabei in ihrem elektrischen Verhalten wie ein Kondensator Ladungstr ger stauen sich hier innen wie au en an die dadurch entstehende Spannung an der Zellmembran wird Membranspannung Potentialunterschied zwischen Intra und Extrazellul rraum genannt Gro e Bedeutung kommt nun den in der Zellmembran eingelagerten spezifisch wirkenden Transportproteinen zu die Ladungstr ger durch die Zellmembran bef rdern k nnen Im weiteren werden vier f r diese Arbeit relevante Typen von Transportproteinen unterschieden Passive Ionenkan le Ionenpumpen spannungsgesteuerte Ionenkan le und rezeptorgesteuerte Ionenkan le Intrazellul rrau
91. g RIE als Atzverfahren Bei diesen Verfahren wird das Substrat in eine Vakuumkammer eingeschleust und bis zum erreichen des Basisdrucks Gas abgepumpt um eine hohe Reinheit im Gasprozess zu erzielen AnschlieBend wird die Kammer bis zum Erreichen des Arbeitsdrucks mit Prozessgasen gef llt Diese Atmosph re wird mit Hilfe eines hochenergetischen elektromagnetischen Feldes z B erzeugt durch ein Magnetron ionisiert Die Prozessgase werden dabei zum Plasma Gas aus freien Ladungstr gern wobei die Plasmaionen nun beschleunigt werden k nnen Als Prozessgase werden je nach Verfahren inerte Arbeitsgase und oder Reaktionsgase eingesetzt siehe Abb 2 17 17 ee Absaug Magnetron it d se Arbeits Target sasdusan Magnetron Reaktions Pumpe Plasma Getcister eaktions Schutz Tisch blech Gel ste Target atome Substrat Schutz Blech Arbeits M t gasd se ae Reaktions Rotations gasd sen Tisch Be S S o amp Plasma Pumpe j Substrat Abb 2 17 Schematische Darstellung der relevanten plasmaunterstiitzten Verfahren a Sputtern b PECVD c RIE 23 Beim Sputtern werden inerte Plasmaionen auf ein Target aus abzuscheidendem Material beschleunigt Durch die Impuls bertragung werden aus dem Target Atome herausgel st die schlie lich auf das Substrat treffen und zum Teil haften bleiben So wird das Substrat mit Targetmaterial
92. gewissen zeitlichen Abst nden wurde anschlie end der Entwicklungsstand des Neuronennetzwerks mit Hilfe eines Mikroskops fotografisch festgehalten siehe Abb 4 3 4 6 und tabellarisch festgehalten siehe Tab 4 1 Dabei wurde f r die Beurteilung der Biokompatibilit t der Oberfl che neben der Zelldichte eine qualitative Beschreibung der Vernetzung dieser Zellen herangezogen Anhand dieser Beurteilung wurden im weiteren die Materialien f r die MEAs gew hlt Die undurchsichtig beschichteten Deckgl ser mussten daf r zum Transport fixiert werden Mit der Fixierung ist die Entwicklung des Neuronennetzwerks abgeschlossen Deswegen wurde der Zeitpunkt des Fixierens immer gleich gew hlt In unserem Fall wurde die Fixierung am f nften bzw am vierzehnten Tag in vitro engl Day in vitro DIV durchgef hrt Der f nfte Tag n vitro ist ein beliebter Zeitpunkt f r die Ableitung neuronaler Aktivit t da sich das Netzwerk bereits erholt hat also wieder verwachsen ist und die Neuronen noch sehr lernfahig sind 37 Auf den Abb 4 3 4 6 sind zwei Zelltypen zu sehen Gliazellen und Neuronen siehe Abb 4 3 a Dabei ist das berleben beider Zelltypen von Interesse da die Neuronen ohne das St tzgewebe nicht lange berlebensf hig sind Diese Annahme wird beispielsweise durch die Entwicklung des Gewebes auf den mit Germanium beschichteten Deckgl sern best tigt siehe Abb 4 3 e 4 4 d 4 6 d Die Hintergrundfarben in den Aufnahmen des lebend
93. gsten Auch wenn die EPSPs und IPSPs hier ged mpft eintreffen stellt der Axonh gel den Entstehungsort f r Aktionsimpulse dar Dabei wird ein Aktionsimpuls genau dann ausgel st wenn ann hernd gleichzeitig eintreffende PSPs in Summe die Schwellspannung berschreiten Die Forderung nach ann hernder Gleichzeitigkeit ist hierbei entscheidend denn das Neuron stellt ja mit der Zeit seine Ruhemembranspannung wieder ein Ein Neuron kann somit als Koinzidenzdetektor misst gleichzeitiges Auftreten verschiedener Umst nde in diesem Fall neuronaler Aktivit t verstanden werden Mit der Vereinfachung dass die Aktivit t der Synapsen in gewissen Zeitschritten abgetastet werden l sst sich ein Neuron auch relativ einfach simulieren siehe Abb 2 10 7 x Eingabe Membranspannung an der Pr synapse w Gewichtung Synaptische Effektivit t net x w Spannung am Axonhiigel 0j Schwellwert Schwellspannung 6 net 0j Ausgabe Aktivit t x Ausgabefunktion Alles oder nichts Prinzip f r x lt 0 x 0 f r x gt 0 x AD Abb 2 10 Schematische Darstellung der Informationsverarbeitung innerhalb eines Neurons gem Literatur 7 Um das Axon eines Neurons im peripheren Nervensystem befinden sich durch Ranviersche Schn rringe getrennte Myelinscheiden siehe Abb 2 8 Einmal ausgel st pflanzt sich ein Aktionsimpuls entlang des Axons unter Ausl sung immer neuer Aktionsimpulse sp
94. gt noch die einzelnen spezifischen Ionenkan le Diese werden vereinfacht im Widerstand eines Fl chensegments bei der elektrischen Leitung durch die Zellmembran R zusammengefasst Entlang der Zellmembran besitzt ein Fl chensegment einen anderen Widerstand R welcher sich wie gezeigt wird aus dem spezifischen Widerstand des intrazellul ren Mediums ergibt a p p Abb 2 9 Schaltplan der Zellmembran im Kabelmodell gem Literatur 6 R cm Ri Q cm Cu Fem Eine lokale nderung der Membranspannung Uo im ersten Segment bewirkt demnach eine nderung der Membranspannung Um in allen weiteren Segmenten wobei der Betrag gem Gl 4 vom Abstand x der Segmente abh ngt 6 x 5U 6U e oe Das Resultat zeigt eine mit dem Abstand exponentiell abfallende Impulsweiterleitung Die charakteristische Gr e A weist die Dimension einer L nge auf und h ngt gem Gl 5 vom Verh ltnis der richtungsabh ngigen Widerst nde eines Segments der Zellmembran ab Unter der Annahme eines von der Zellmembran umgebenen zylindrischen Leiters mit Radius r und spezifischem Widerstand p r nR sowie einem Membranwiderstand Rm 2rnR l sst sich das Kabelmodell anschaulich auf die passiven elektrischen Eigenschaften eines Axons anwenden p Be E G1 5 15 Am Axonh gel ist durch die Beschaffenheit der Zellmembran die zur Ausl sung eines Aktionsimpulses notwendige Schwellspannung am gerin
95. he Darstellung eines Aktionsimpulses gem Literatur 3 3500 4000 4500 5000 12 Dabei werden drei Phasen unterschieden die die neuronale Zellmembran w hrend eines Aktionsimpulses durchl uft Die Depolarisation die Repolarisation und die Hyperpolarisation Bei der Depolarisation kommt es zur Nivellierung der Ruhemembranspannung Wird die Schwellspannung unterschritten ffnen sich zun chst vorwiegend Natriumkan le Da durch die ffnung von Natriumkan len die Zellmembran weiter depolarisiert wird wird damit auch die ffnung weiterer Kan le beg nstigt es kommt zu einer Kettenreaktion So kann sich die Membranspannung in kurzer Zeit stark ndern Die Repolarisation ergibt sich dadurch dass einige Natriumkan le bereits im inaktivierten Zustand vorliegen w hrend die Zahl offener Kal umkan le weiter zunimmt Die Membranspannung n hert sich wieder der Ruhemembranspannung Wenn schlie lich vorwiegend Kal umkan le ge ffnet sind kommt es zur Hyperpolarisation einer zus tzlichen Polarisation ber die Ruhemembranspannung hinaus F r die Funktionsweise rezeptorgesteuerter Ionenkan le gilt hnliches jedoch wird hier die Konformations nderung ber Rezeptoren f r spezifische Neurotransmitter gesteuert Diese sind vor allem im Bereich der Synapse Verbindungsstelle zweier Neuronen von Bedeutung die im Hinblick auf die neuronale Signalausbreitung noch genauer beleuchtet wird 2 1 2 Neuronale Signalausbreitung Um
96. ie Fertigung der Zellkulturkammer ist eine erstmalige Aufgabe dieser Arbeit Die Herstellungsparameter f r die Schritte der Oberfl chenverg tung Schritt 1 der Beschichtung und Strukturierung eines Fotolacks als Zellkulturkammerboden Schritt n und das Anhaften der Zellkulturkammerw nde auf dem MEA o mussten zuerst gefunden werden Die Herstellung der Zellkulturkammerw nde wird im folgenden Kapitel n her beschrieben 3 2 4 Fertigung der Zellkulturkammern Auf den fertigen MEAs Zellkulturkammern befestigt um darin das neurobasale N hrmedium aufnehmen zu k nnen Die Zellkulturkammern mussten jedoch zuerst gefertigt werden Wegen seiner guten Haftung auf Glas wurde hierf r als Werkstoff ein biokompatibler Silikonkautschuk gew hlt Dieser liegt zun chst im fl ssigen Zustand vor sodass er durch Gussformen strukturiert werden kann Durch S gen Fr sen Bohren Verschrauben und Verkleben wurden zwei verschiedene Gussformen aus Aluminium angefertigt Damit sich die Gussformen von den Zellkulturkammern l sen lassen sind sie aus jeweils zwei Teilen zusammengesetzt aus der Bodenplatte und den W nden der Gussform siehe Abb 3 9 Mit jeder Gussform l sst sich eine oben und unten offene Zellkulturkammer oder nach Wenden der Bodenplatte ein passender Deckel fertigen Die Bodenplatten wurden zu diesem Zweck glatt geschliffen da die Zellkulturkammern sp ter wasserdicht auf dem ebenfalls glatten Substrat haften sollen 34 Zwe
97. ierscher Synapse Neurit eines Schn rring anderen Neurons Abb 2 7 Schematischer Aufbau eines Neurons gem Literatur 5 Die Synapse An der Synapse wird die Pr synapse Endk pfchen an einem Dorn des Axons eines Neurons mit der Postsynapse Endk pfchen an einem Dorn eines Dendriten eines anderen Neurons verbunden Die 2 ee Funktion der Synapse ist in Abb 2 8 skizziert q aufnahme Gelangt ein Aktionsimpuls zur Pr synapse ffnen sich gt die dort befindlichen spannungsgesteuerten Calciumkan le 1 Das Einstr men der Calciumionen El bewirkt eine Entleerung der in Vesikeln gelagerten 5 Transmitter in den synaptischen Spalt 2 und 3 Diese 2 Transmitter wiederum aktivieren in der Postsynapse vorhandene rezeptorgesteuerte Ionenkan le wodurch die postsynaptische Zellmembran je nach Art der aktivierten Ionenkan le de bzw hyperpolarisiert wird 4 und 5 B Die Neurotransmitter werden anschlie end ber E Wiederaufnahmepumpen zur ck in die Pr synapse E bef rdert 6 5 ET eee SERIEN Aus der Aktivierung der rezeptorgesteuerten Ionenkan le Literatur 5 resultiert ein exzitatorischer anregender bzw inhibitorischer hemmender postsynaptischer Potentialunterschied kurz EPSP bzw IPSP Dieser reicht nur in wenigen F llen aus um einen Aktionsimpuls auszul sen Allerdings besitzt ein Neuron etliche Synapsen ja sogar etliche synaptische Verbindungen zu ein und demselben Nachbarneuron wobei
98. iger aufgezeichnet als mit 10 siehe Abb 4 69 b oder 5 uM Nikotin Abb 4 68 Schematische Darstellung der Belegung der Messelektroden auf dem MEA nach Design 1 109 i Aw 7 1 i in Wi Vb fu i UD od un li j Ah 7 Al i h N In ayn 1 N N um N a hr H Y EDEN TUN N I 4 as Ih I ii N ba A T PE af ide 5 ul i IM fr HN Mn a i 14 N N h I a My Sada af lt 10m p Ik yi y Mr ar Vy Ar ji a ae wet VN Wir IM Y ve Y Maen r M W ri aw wv AJ rt yn YY AN N Wy f u iy m N y r 1 20m wm om 50m i i i i i 0 0 0025 0 005 0 0075 0 01 0 0125 0 015 0 0175 0 02 0 0225 0 025 0 0275 0 03 0 0325 0 035 0 0375 0 038 100m 80m Amplitude N aay oy ven o 0 0025 0 005 0 0075 0 01 0 0125 0 015 0 0175 0 02 0 0225 0 025 0 0275 0 03 0 0325 0 035 0 0975 0 03 u Aio 10m h I m iM if N AIN1 o 4 Sein Y y Im RAN Fe TR N Diath NE Ht hy N 4 Y ir dy ku 14 MAAS Wi ih i y W aN N AIN2 on MPS une i a wey W ny my AW AIN3 gt m aa on ey LAS un EN NG Anan A MN ih ee wi Ae a He KAM AA AINS u N beam a hal Ahi Y ne seit AING 50m ae ii AIN7 70m c gt 70 mV 80m E 0 0025 0 005 0 0075 0 01 0 0125 0 015 0 0175 0 02 0 0225 0 025 0 0275 0 03 0 0325 0 035 0 0975 0 03 Abb 4 69 Tausendfach verst rkter Spannungsverlauf an den Elektroden bei der Messung mit kultivierten Neuronen chemisch stim
99. iheit eines Signals Deshalb wurde ein Vergleich verschiedener Messweisen durchgef hrt unterschiedlichen Varianten des Masseanschlusses der Zellkulturkammer wurde dabei besondere Aufmerksamkeit gewidmet Im weiteren werden zun chst die Auswirkungen des Masseanschlusses der Zellkulturkammer ohne weitere elektrische Signale behandelt siehe Kap 4 4 1 Anschlie end werden die Dreipunktmessung siehe Kap 4 4 2 und die Vierpunktmessung siehe Kap 4 4 3 qualitativ verglichen 4 4 1 Auf Masse legen der Zellkulturkammer Um den Einfluss des Masseanschlusses der Zellkulturkammer zu bestimmen wurde zun chst ein Biochip mit physiologischer Kochsalzl sung gef llt und gem dem in Abb 4 39 dargestellten Schaltplan w hrend der Messung massefrei floatend kontaktiert Dabei wurde kein Erregersignal generiert Die aufgezeichneten Signale sind in Abb 4 40 zu sehen Es zeigt sich dass die Kontaktierung zu einer Verschiebung des Offsets f hrt Dies ist sehr wahrscheinlich ein Anzeichen f r chemische Reaktionen an den Phasengrenzen siehe Kap 2 2 2 Die w hrend des Abb 4 39 Schematischer Schaltplan bei floatendem Kontaktvorgang auftretenden Spannungsspitzen k nnten Kontakt mit den Messelektroden in Fl ssigkeit darauf hinweisen dass w hrend der Kontaktierung Ladungsverschiebungen an den Elektrodenoberfl chen auftreten 0 6 0 5 Nicht kontaktiert _Kontakiv fgang 0 4 Spannung V
100. im RIE Verfahren selektiv wieder zu entfernen wird zun chst eine Fotolackschicht auf dem Isolationsmaterial aufgetragen und lithographisch strukturiert In einer speziellen Anlage siehe Abb 3 18 wird die gesamte Oberfl che ge tzt wobei der Fotolack nicht mit dem Reaktionsgas reagiert und so auch darunter liegendes Isolationsmaterial sch tzt Somit werden nur die nicht mit Fotolack bedeckten Fl chen der der Isolation selektiv entfernt Tabelle 3 11 zeigt die verwendeten Parameter f r das Frei tzen der Elektroden und Kontaktpads Die tzrate bezieht sich auf Prozessparameter bei der PECVD Modell Oxford Plasmalab 80 Plus Abgeschiedenes Material Siliziumnitrid Siliziumoxid Basisdruck Torr 0 06 0 06 Arbeitsdruck Torr 1 1 Tr gersubstrat Temperatur C 300 300 HF Leistung W 10 10 Einstr mgeschwindigkeiten 2 iges SiH sccm 700 425 NH sccm 18 BO N20 sccm 710 Dauer 10 30 Min 12 Min Nominelle Schichtdicke nm 120 360 nm 480 Tab 3 10 Angewandte Prozessparameter bei der PECVD RIE Prozessschritt k bestehende Tabellen ausgewerteter vorangehender Arbeiten Abb 3 18 RIE Anlage Foto Prozessparameter beim reaktiven Ionen tzen Modell Oxford Plasmalab 80 Plus Basisdruck mbar 5x10 Arbeitsdruck mTorr 50 Leistung W 50 Einstr mgeschwindigkeiten Arbeitsgas Ar sccm 10 Reaktionsgas SF sccm
101. inem Inkubator siehe Abb 3 3 20 gelagert der durch konstante Temperatur und CO Konzentration sowie den sterilen Innenraum ein lebensfreundliches Umfeld f r die Zellen schafft Aus diesem Umfeld sollten sie auch f r die Messung der Ableitungen h chstens f r 20 Minuten entnommen werden ansonsten muss auf eine spezielle Au enl sung als N hrmedium zur ckgegriffen werden Das Medium sollte au erdem alle zwei bis drei Tage im Verh ltnis 5 7 altes neues N hrmedium gewechselt werden Tabelle 3 1 zeigt einen berblick ber das Verfahren zur Kultivierung der Neuronen 21 Zellkultivierung von Neuronen in vitro Thermo Neuronen aSwt M use P5 SCG Zellen Sterilisation Dest Wasser 100 C Adh sionsvermittler PDL und Laminin Ausges te Zelldichte 40 000 cm in NBM 5 7 wechseln X Deckglas Glass Cover Slides siliconized d Inkubator Thermo Scientific Heraeus Series 6000 Temperatur CO 36 C 5 00 Abb 3 3 Inkubator 20 Tab 3 1 Parameter zur Zellkultivierung von Neuronen in vitro Pr paration f r den Transport Um die Biokompatibilit t der in der Mikroelektronik gebr uchlichen Materialien zu testen wurden die in der Zellkultivierung etablierten Deckgl ser gereinigt und mit den auf Biokompatibilit t zu untersuchenden Materialien beschichtet siehe Prozessparameter zur MEA Prozessierung Anschlie end wurden die Deckgl ser nach dem oben genannten Schema sterilisiert bes
102. iteilige Gussform c e Fix verschraubt 2 Teile fixiert Fix verklebt 2 Teile gel st Abb 3 9 Skizze des Aufbaus der Gussform f r die Fertigung der Zellkulturkammern Der eingesetzte Silikonkautschuk siehe Abb 3 10 24 besteht aus zwei Komponenten Elastomer und Katalysator welche vor dem Gie en vermengt werden Dabei entstehen jedoch etliche kleiner Luftblasen welche in einer Vakuumkammer zum Anwachsen Aufsteigen und Zerplatzen gebracht werden k nnen Danach wird der Silikonkautschuk vorsichtig in die Form gegossen und im Ofen bei 110 C hart gebacken Werden nach anschlie ender Abk hlung Bodenplatte und W nde der Gussform getrennt l sst sich die Zellkulturkammer leicht herausl sen Tabelle 3 4 zeigt die verwendeten Herstellparameter f r das Vergie en des Silikonkautschuks 24 Fertigung einer Zellkulturkammer aus Silikonkautschuk Silikonkautschuk Sylgard DC 184 silicone elastomer Mischen 1 zu 10 Katalysator Elastomer langsam Vakuumpumpe Pfeiffer vacuum duo 5 Luftblasen entfernen 4 mal bis 100 mbar und wieder beliiften GieBen Langsam und gleichm ig an gleicher Stelle Abb 3 10 Silikonkautschuk Backen 45 Min bei 110 C 24 Tab 3 4 Angewandte Prozessparameter bei der Fertigung der Zellkulturkammer 3 2 5 Ger te und Parameter im Prozessablauf Im folgenden Kapitel werden die im Prozessablauf zur Herstellung der Biochips verwendeten Ger te und d
103. iter angenommen dass der Gro teil des gemessenen Rauschens nach der Verst rkerschaltung entsteht 4 3 6 SNR bei stufenweiser Verst rkerschaltung Eine zentrale Frage in dieser Arbeit ist ob neuronale Signale direkt vorverst rkt werden m ssen um vom Hauptverst rker und der DAQ verarbeitet werden zu k nnen So wurde wiederum der Biosignalsimulator als Signalquelle beim Vergleich einer zweistufigen Verst rkerschaltung 1 Stufe x10 2 Stufe x100 zu einer einstufigen Verst rkerschaltung nur 2 Stufe x1000 bei gleichem Gesamt Verst rkungsfaktor eingesetzt F r die zweistufige Verst rkerschaltung wurde als Vorverst rker der MPASI von Microchannel Systems siehe Kap 3 3 1 verwendet Die einstufige Verst rkerschaltung entspricht dabei dem in Abb 4 34 gezeigten Schaltplan die zweistufige Verst rkerschaltung dem in Abb 4 37 we oO _ Ei RND Ei 70 _ gt N m s ap a a 2 gt Abb 4 37 Schematischer Schaltplan bei kontaktiertem Biosignalsimulator und zweistufiger Verst rkung Die experimentellen Daten siehe Abb 4 38 zeigen bei der zweistufigen Verst rkerschaltung siehe Abb 4 38 a d in dieser Konfiguration ein schlechteres SNR als bei der einstufigen Verst rkerschaltung siehe Abb 4 38 e h Zur Verdeutlichung wurde dazu jeweils der Verlauf eines aufgezeichneten simulierten Aktionsimpulses vergr ert dargestellt siehe Abb 4 38 d h Da das Signal in einer einstu
104. ithographie Fotolack E Leiterbahnen PEN de 7 d Entfernung der Haftschicht 1 an freien Stellen Nass chemisches Atzen Cr Atze e Beschichtung mit Haftschicht 2 fiir das Leitermaterial Sputtern Ti Cr f Beschichtung mit Leitermaterial Sputtern Au Pt g Entfernung des Fotolacks und Material dar ber Lift off Aceton h Entfernung der restlichen Haftschicht 1 Nass chemisches tzen Cr tze 1 Beschichtung mit der Isolationsschicht PECVD S13N4 E j Beschichtung mit Fotolack und Strukturierung der Lithographie Fotolack lt tzl cher u k Frei tzen der Elektroden und Kontaktpads RIE SFe E 1 Beschichtung mit der Elektrodenverg tung Sputtern TiN 5 m Entfernung des Fotolacks und Material dar ber Lift off Aceton 2 n Beschichtung mit Fotolack und Strukturierung des Lithographie SU 8 Fotolack 5 funktionalisierten Zellkulturkammerbodens o Anhaften der Zellkulturkammer Plasmaveraschen O Plasma Tab 3 3 bersicht ber die Prozessschritte zur Biochip Prozessierung und die ben tigten Prozesse 33 3 2 3 Haftung der Materialien Der Fotolack haftet haften zwar nicht ausreichend auf dem verwendeten Tr gersubstrat jedoch gut auf Chrom wie auch auf Siliziumnitrid Da beide Materialien auch gut auf dem Tr gersubstrat haften bieten sie sich als Haftschicht zwischen Lack und Tr gersubstrat an Schritt b an Wird mit Siliziumnitrid als Haftschicht gearbeitet muss diese nicht mehr entfernt werden da sie transparent ist und nicht ele
105. jede Synapse eine andere Effektivit t hat 14 Wichtig st nun dass die chemische Signalausbreitung durch den synaptischen Spalt 20 nm wesentlich l nger dauert als die elektrische Signalausbreitung innerhalb ein und desselben Neurons ganz unabh ngig von der zur ckgelegten Wegl nge bis zu 1 m Dies ist besonders deswegen interessant weil es auch elektrische Synapsen gibt wo ber sogenannte Gap junctions Zell Zell Membrankan le der Kontakt zum n chsten anliegenden Neuron hergestellt wird Eine chemische Synapse kann jedoch erstens hormonell gesteuert werden zweitens kann auch die zeitliche Verz gerung ber die Gr e des synaptischen Spalts recht gut abgestimmt werden Diese zeitliche Verz gerung ist von fundamentaler Bedeutung f r die Funktion eines Neurons denn so hat das Neuron ein zeitliches Fenster in dem es einen Aktionsimpuls senden kann oder nicht Alles oder nichts Prinzip Dies soll anhand der Impulsweiterleitung entlang des Neurons im Detail erl utert werden Impulsweiterleitung entlang der Zellmembran Die Impulsweiterleitung entlang der Zellmembran l sst sich mit Hilfe von Ionenstr men erkl ren Zur Simulation der Leiteigenschaften der Zellmembran wird meist das Kabelmodell siehe Abb 2 9 mit seinen elektrisch passiven Eigenschaften angewendet Darin wird die Zellmembran als eine sich in gleichartigen Flachensegmenten wiederholende Struktur aufgefasst In diesem Modell werden weder Ionenpumpen ber cksichti
106. klar unterscheidbar aufnehmen zu k nnen siehe Kap 4 3 5 Die zeitliche Aufl sungsgrenze der Signalerfassung mit der Datenkarte siehe Kap 3 5 3 liegt bei etwa 100 ms siehe 4 3 3 was f r die Ableitung neuronaler Aktivit t ausreichend ist Durch eine h here Abtastrate in diesem Bereich k nnte noch eine erhebliche des SNRs erzielt werden Das Oszilloskop kam f r die Messungen nur bedingt als Vergleichsinstrument in Frage da es ein zus tzliches Massepotential zum Massepunkt hinzufiigt was das Signal Rausch Verh ltnis signifikant verschlechtert Dabei traten Effekte hnlich den sprunghaften St rsignalen bei der zweistufigen Verst rkerschaltung mit zwei Spannungsquellen auf siehe Kap 4 5 1 Es wurden auch Rauschquellen und M glichkeiten zur Rauschreduktion untersucht Eine wesentliche Verbesserung wurde mit einem Tiefpassfilter am Verst rkerausgang siehe Kap 4 5 3 sowie einem Hochpassfilter siehe Kap 3 4 3 am Verst rkereingang siehe Kap 4 5 4 erzielt Bei der Dimensionierung ist jedoch darauf zu achten dass ein berdimensionierter Hochpassfilter vor der Verst rkerschaltung das gemessene Signal grob verzerrt Eine softwarebasierte Signalkonditionierung verzerrt das Signal zus tzlich siehe Kap 4 5 5 weshalb darauf im weiteren Verzichtet wurde Auf eine Schirmung des Messaufbaus siehe Kap 4 5 2 konnte im gesamten Ablauf verzichtet werden da keine signifikante Verbesserung des SNRs erwartet wurde Ein Vergleich von Dreip
107. konzept 3 5 Der Messaufbau 3 5 1 Modulkonzept 3 5 2 Signalgenerierung 3 5 3 Datenerfassung on oo a A 18 18 19 20 21 22 22 23 25 26 29 29 32 34 34 35 43 43 44 45 45 47 49 51 51 52 53 4 Ergebnisse 4 1 MEA Prozessierung 4 1 1 Materialkonzept 4 1 2 Probleme im Prozessablauf 4 1 3 Optimierung des Prozessablaufs 4 1 4 Herstellung der Mikroelektrodenarrays 4 2 Biochip Prozessierung 4 2 1 Oberfl chenverg tung 4 2 2 funktionalisierter Zellkulturkammerboden 4 2 3 Zellkulturkammern 4 3 Kalibrierung des Messsystems 4 3 1 Funktionstests Grundschaltung 4 3 2 Signalgenerierung unter Belastung 4 3 3 Zeitliche Aufl sung der Datenerfassung 4 3 4 Mehrkanalverst rkerschaltung 4 3 5 SNR im Verst rkungsfaktorvergleich 4 3 6 SNR bei stufenweiser Verst rkerschaltung 4 4 Elektrodenbelegung 4 4 1 Auf Masse legen der Zellkulturkammer 4 4 2 Dreipunktmessung 4 4 3 Vierpunktmessung 4 5 Rauschreduktion 4 5 1 Stromquellenvergleich 4 5 2 Funk bertragung und Schirmung 4 5 3 Tiefpassfiltervergleich 4 5 4 Hochpassfiltervergleich 4 5 5 Softwarebasierte Signalkonditionierung 4 6 Referenzmessungen 4 6 1 Signalantwort vs Abstand der Elektroden 4 6 2 Signalantwort vs Elektrodendurchmesser 4 6 3 Messung an lebenden Neuronen 5 Res mee Quellenverzeichnis Danksagung Leblenslauf 55 57 57 62 65 67 69 69 12 76 71 71 80 81 83 86 88 90 90 91 94 95 95 96 98 98 101 103 103 106 108 112 115 120 121 Kur
108. ktrisch abzuleiten um Erkenntnisse ber die Auswirkungen ausgew hlter pharmazeutischer Substanzen auf die Funktionalit t des Nervensystems gewinnen zu k nnen Damit die Ergebnisse vergleichbar bleiben sollte die Messung reproduzierbar sein weswegen der Schwerpunkt dieser Arbeit auf der Ableitung neuronaler Aktivit tsmuster in Zellkulturen in vitro liegt Zielsetzung Als Ziel dieser Arbeit soll ein modulares Messsystem siehe Kap 3 5 1 zur Aufzeichnung von Aktivit tsmustern neuronaler Zellkulturen mit Hilfe von Arrays aus Mikroelektroden MEA auf einem Biochip MEA mit Zellkulturkammer mit passender Verst rkerschaltung aufgebaut werden siehe Abb 1 1 Damit soll eine eingehende Analyse der Eignung der Komponenten im gesamten Messsystem durchgef hrt werden Dazu soll zun chst ein geeignetes MEA dimensioniert siehe Kap 3 2 1 und mit Hilfe lithographischer Strukturierung aus biokompatiblen Materialien siehe Kap 4 2 1 in mehreren Prozessschritten siehe Kap 3 2 2 hergestellt werden Au erdem soll ein Verfahren zur Fertigung einer Zellkulturkammer entwickelt werden um f r die Ableitung neuronaler Aktivit t lebende Zellen in vitro direkt auf dem MEA kultivieren zu k nnen Dabei soll unter anderem die M glichkeit gegeben sein Signale vom Biochip in mehreren Kan len siehe Kap 3 4 2 mit einem Vorverst rker direkt zu verst rken siehe Kap 3 3 1 oder aber die Signale bevor sie verst rkt werden zu filtern siehe Kap 3 4 3
109. ktrisch leitet Dadurch entfallen die Schritte d und h Das Nass chemische Atzen ist nur f r Chromoberfl chen anzuwenden Reine Edelmetalle wie Gold oder Platin als Leiterbahnen Schritt f haften nicht ausreichend gut auf Glassubstraten Als zus tzliche Haftschicht muss deshalb zwischen Glas und Edelmetall eine d nne Schicht Chrom oder Titan aufgebracht werden Wird als Haftschicht f r den Fotlack und als Haftschicht f r die Leiterbahnen das gleiche Material Chrom eingesetzt entf llt der erste Chrom tzschritt Schritt d sowie das sputtern der Haftschicht f r die Leiterbahenen Schritt e Beim Beschichten mit einem Metall das selbst auf dem Tr gersubstrat haftet entf llt die Notwendigkeit f r eine zus tzliche Haftschicht Schritt e Die Oberfl chenverg tung der Elektroden und Kontaktpads Schritt 1 durch eine zus tzliche Schicht von Titannitrid zur Verbesserung der Zelladh sion ist optional und wurde nicht auf alle MEAs angewendet Es muss jedoch vorausgesetzt werden dass die Oberfl chenverg tung auf dem Leitermaterial haftet 22 Die Beschichtung mit SU8 Lack zur Funktionalisierung des Zellkulturkammerbodens Schritt n wurde nur am ersten MEA Design angewandt Die ausreichende Haftung des Lacks wurde in Vorversuchen best tigt Die Zellkulturkammer besteht aus einem Silikonkautschuk Das permanente Anhaften auf dem MEA kann durch vorhergehende Hydrophilisierung der beiden Kontaktfl chen erreicht werden 23 D
110. kungsfaktor AO Al DIG COM Versorgungsspannung VCC VCC und Bezugsmasse VREF aller OPVs auf einer Verst rkerplatine verbunden werden Damit sind die Verst rkerplatinen ausschlie lich f r monopolare Ableitung zu gebrauchen siehe Kap 2 2 5 Die invertierenden Eing nge messen also die Signalmasse einer Referenzelektrode und werden unter unter einem Eingang zusammengefasst im Folgenden Signal Ground SGN GND genannt Die Offsetsteuerung wird vorerst nicht verschaltet In der Arbeit wurde jedoch untersucht ob es n tig ist die eingehenden Signale zus tzlich zu filtern 47 10V DGND A PGA202KP PGA202KP 11 ao pDie com HElgl4 gt AO DIG COM 2 a vec PINI3 A1 vcc ies 3 vcc vour N12 VCC VOUT hai 4 VREF voutsense EN VREF VOUTSENSE L 5 FILTERA FILTERB ENIO 1 FILTERA FILTERB wa E 6S vost vos2 FP ol T vost vos2 7J vin vin PINS VIN VIN A PGA202KP PGA202KP 1 ao pie com P4 gt AO DIG COM 2 a vec PIN13 A1 vcc ies 3 voc vour N12 VCC VOUT a 4 VREF voutsense HE VREF VOUTSENSE i SJ FILTERA FILTERB E
111. lbst entwickelten Hauptverst rker mit variablem Verst rkungsfaktor zus tzlich verst rkt mit einer Datenkarte digitalisiert und mit dem Computer erfasst Zum Testen wurde ein mikroelektronischer Biosignalgenerator eingesetzt der hnlich zu realen Probe mit 1 mV maximaler Amplitude neuronale Signale wie z B EPSPs ausgibt Ein direkter Vergleich zwischen Messungen mit einer zweistufigen x10x100 und einer 112 einstufigen x1000 Verst rkerschaltung eines von einem Biosignalsimulator generierten Signals zeigte jedoch dass der Vorverst rker gar nicht notwendig ist siehe Kap 4 3 6 Auf Basis dieser Erkenntnis ist es in Zukunft m glich eine optimierte Version des Messsystems mit breiteren Abst nden der Kontaktstifte und einer weitaus weniger komplexen Kontakthalterung zu verwenden um die Kontaktierung der Biochips zu erleichtern Dieses Messsystem wurde ausf hrlich evaluiert und Ma nahmen zur Rauschreduktion implementiert Die einzelnen Komponenten des Messsystems wurden in einem modularen Aufbau siehe Kap 3 5 1 getestet Es zeigt sich dass der gew hlte Verst rker siehe Kap 3 4 1 nach eingehenden Funktionstests siehe Kap 4 3 1 und sachgem er Verschaltung auf einer Platine mit acht Kan len siehe Kap 3 4 2 erfolgreich zur Identifizierung des vom Biosignalsimulator generierten Aktionsimpulses eingesetzt werden konnte Dabei empfiehlt sich ein Verst rkungsfaktor von tausend um Signale mit Amplituden lt 1 mV vom Rauschen
112. lnen Prozessschritten n tig Diese sind im folgenden beschrieben Beseitigung von Haftungsproblemen der Leiterbahnen Auf der Suche nach den Ursachen der Haftungsprobleme der Metallstrukturen auf Glas siehe Kap 4 1 2 wurde ein zus tzlicher Schritt nach der Entwicklung eingef hrt bei dem das Tr gersubstrat intensiv gesp lt oder im Ultraschallbad von Lackresten befreit wird So treten diese Probleme nur noch vereinzelt auf Metallische Haftschicht Auf der Suche nach Fehlerquellen f r das in Kap 4 1 2 beschriebene Haftungsproblem von Metall auf Glas wurde unter anderem Chrom als Haftmaterial f r die Leiterbahnen getestet siehe Abb 4 12 Da dadurch die Haftung der Elektroden wesentlich besser gelang und sich die Biokompatibilit t von Chrom und die von Titan im exemplarischen Vergleich nicht wesentlich unterschieden siehe Kap 4 1 1 wurde im weiteren Chrom als Haftmaterial eingesetzt Diese Vorgangsweise bew hrte sich in weiteren Abb 4 12 Mikroskopische Auflichtaufnahme der Versuchen strukturierten Chrom Haftschicht Verbesserung der Ausrichtungsprozedur Zur Optimierung des Alignments wurde f r das Strukturieren der Isolationsschicht anstatt des Positivprozesses der Negativprozess angewandt Damit k nnen die tzl cher genauer positioniert werden da nun rund um die dunklen tzl cher auf der Lithographiemaske zur Strukturierung der Isolation zur Positionierung hindurchgesehen werden kann
113. m Cc re D N E je Les 53 D N x LU Abb 2 2 Schematische Darstellung der Zellmembran und Konzentrationsgradienten gem Literatur 1 Ladungstr ger Extrazellul r Intrazellul r Na 120 mmol l 15 mmol l K 2 5 mmol l 150 mmol l Cl 12 mmol l 9 mmol l Ca 1 mmol l 0 mmol l Tab 2 1 Ladungstr ger und Konzentrationen 1 Passive Ionenkan le Passive Ionenkan le erlauben die Diffusion von Ionen das hei t die thermische Eigenbewegung die zum Ausgleich des Konzentrationsgradienten f hrt durch die Zellmembran in beide Richtungen Dabei gibt es f r jede Ionensorte einen anderen Kanaltyp siehe Abb 2 3 Den passiven Ionenkan len entsprechen hinsichtlich ihres elektrischen Verhaltens somit ionenspezifische Widerst nde parallel zur Kapazit t der Zellmembran So k nnen sich die Konzentrationsgradienten ausgleichen allerdings verschieben sich dabei Ladungen wodurch eine nderung der Membranspannung entsteht Diese wirkt dem Konzentrationsausgleich entgegen Im Gleichgewicht bez glich des Transports einer einzigen Ionensorte entspricht die Membranspannung der Nernst Spannung Ux siehe Tab 2 2 Allgemein F r Chlorionen VA en Ve X pOVAX a Vpg F Na lt Na Gl 1 intrazellul r extrazellul r X An der Reaktion beteiligter Stoff v St chiometrischer Koeffizient z Betrag der Ladung in Elementarladunge
114. m 850m 300m 950m i LO Zeit s Zeit 5 200m a 2 eienenn Ben PH aaa id a ia i ia il a O a 600m Le a _ Al SEE eer cee epee its Bd Saba ba ba ac al P i lB lt T 0 som 100m 150m 200m 250m 300m 350m 400m 450m 500m 550m 600m 650m 700m 750m 800m 850m 300m 950m 1 0 som 100m 150m 200m 250m 300m 350m 400m 450m 500m 550m 600m 650m 700m 750m 800m 850m 300m 950m 1 Zeit s Zeit s Abb 4 28 Zeitliche Erfassung eines 20 mV hohen im Verh ltnis 1 100 geteilten Spannungspulses bei einer Wiederholfrequenz von 20 Hz variierter Pulsdauern und zwei unterschiedlichen Sampleraten a f 30 kHz g 1 15 kHz tausendfach verst rkt Die untersuchten Pulsdauern waren a g 500 us b h 300 us c J 100 us d J 80 us e k 50 us f 1 40 us In rot wurde der erwartete Spannungsverlauf schematisch eingezeichnet 82 4 3 4 Mehrkanalverst rkerschaltung Um die Funktion der angefertigten Verst rkerplatinen zu berpr fen wurden alle Kan le gem dem Schaltplan in Abb 4 29 zusammengeschaltet und ber einen Spannungsteiler 10 Q 1 KQ dasselbe Rechtecksignal Amplitude 20 mV Frequenz 2 Hz gleichzeitig an allen Verst rkern angelegt Nun sollte bestimmt werden ob alle Kan le gleicherma en verst rkt werden Daf r soll der Verst rkungsfaktor und das erzielte Signal Rausch Verh ltnis untersucht werden Abb 4 29 Schematischer Schaltplan der Grundschaltung in mehreren Kan len Abb 4 30 a und Ab
115. mer auf die als Entwickler eingesetzte w ssrige L sung mit basischem pH Wert Bei der Entwicklung werden leichter l sliche Bereiche schneller entfernt Daraus ergibt sich jedoch dass aufgrund von unvermeidbaren Absorptions und Streueffekten die Kantenneigung der entwickelten Lackstrukturen in beiden F llen unterschiedlich ist 22 Zu beachten ist dass f r eine anschlie ende Entfernung der strukturierten Lackschicht auch der ausgeh rtete Fotolack f r spezifische L sungsmittel sogenannte Remover l slich bleiben muss Beim Lift off Prozess l st sich mit der Entfernung der Lackschicht auch der auf dem Fotolack liegende Teil der nach der Lithographie aufgebrachten Schicht So wird auch diese Schicht nach dem negativen Abbild der Lackschicht strukturiert Die Lithographie wird meist nur als strukturgebendes Verfahren mit anderen Bechichtungsverfahren oder tzverfahren kombiniert um die im organischen Lack erhaltenen Strukturen in eine anorganische Materialschicht zu bertragen 16 2 3 2 Plasmaunterst tzte Beschichtungs und tzverfahren In dieser Arbeit wurden Biochips mit Hilfe von plasmaunterst tzten Beschichtungs und tzverfahren prozessiert Die relevanten Verfahren f r diese Arbeit sind die Kathodenzerst ubung auch Sputtern sowie die plasmaunterst tzte chemische Gasphasenabscheidung engl Plasma enhanced chemical vapour deposition PECVD als Abscheideverfahren und das reaktive Ionen tzen engl Reactive ion etchin
116. messung mit Masseanschluss Grund wurde ein Nachregeln der Offsetspannung ob nun am Signalgenerator und somit f r alle Kan le oder an jedem Kanal extra an der daf r vorgesehenen Offsetsteuerung auf i iR i 0 10 20 30 Zeit s dem Verst rker als nicht zielf hrend eingestuft i s T5 On Spannung V I N a oo I a S7 10 _ Abb 4 44 Zeitverlauf des tausendfach verst rkten Spannungssignals von drei Elektroden in verschiedenen Farben dargestellt bei einer Dreipunktmessung mit einer Referenzelektrode Ag AgCl als Massepotential und einem Spannungspulsmit einer Dauer von 500 us einer Amplitude von 100 mV einer Wiederholfrequenz von 1 Hz und einer Offsetspannung von 1 9 V als Erregersignal 92 Eine im Lauf der Arbeit entwickelte Alternative um dieses Problem zu umgehen sieht eine Signalgenerierung Stimulation ohne Masseanschluss des Elektrolyts vor Ein schematischer Schaltplan ist in Abb 4 45 dargestellt Dazu wird der Verst rker in den negativen Bereich bersteuert Offsetspannung 9 V das hei t das Potential des Elektrolyts in der Zellkulturkammer wird sich diesen 9 V Offsetspannung entsprechend einstellen Somit werden zwar nur noch positive Unterschiede der Elektrodenpotentiale gemessen was um Als zu detektieren ausreichen k nnte andererseits k nnten aufgrund des inneren Aufbaus des Instrumentenverst rkers die Potentialunterschiede somit zwar ged
117. mpft jedoch sch rfer gemessen werden der Verst rker stellt hierbei eine Art Hochpassfilter dar Abb 4 45 Schematischer Schaltplan bei der massefreien Dreipunktmessung Aufgrund der massefreien Zellkulturkammer ist diese Methode nicht empfehlenswert obwohl entsprechende Messschaltungen sinnvoll erscheinende Ergebnisse zeigen siehe Abb 4 46 So sind die Spannungen an allen Elektroden in etwa gleich hoch und es wird eine Aufl sung beinahe aller Eing nge in einer Messung erreicht Durch den Offset geht jedoch die H lfte des Aufl sungsbereichs verloren Festgehalten werden sollte noch dass der an der generierte Spannungsimpuls mit einer Amplitude von 180 mV an den Messelektroden einen Spannungsunterschied von 2 mV bewirkte Bei einem Verst rkungsfaktor von Tausend und einer Wiederholfrequenz von 1 Hz ergaben sich damit die dargestellten erfassten Signalkurven mit Pulsamplituden von 2 V Die Amplitude betr gt damit rund zwanzig mal weniger als gem vorigen Versuch zu erwarten w re wenn das Potential der Zellkulturkammer auf Masse gelegen w re Da die Dreipunktmessung aufgrund der beschriebenen Probleme wenig geeignet ist wurden weitere Messmethoden untersucht 10 Spannung V NO 0 10 Zeit s 20 30 Abb 4 46 Zeitverlauf des tausendfach verst rkten Spannungssignals von f nf Elektroden in verschiedenen Farben dargestellt bei einer massefreien Dreipunktmessung und einem Sp
118. mulationselektrode ein Rechtecksignal mit einer Amplitude von 20 mV und einer Frequenz von Hz in die Zellkulturkammer geleitet 98 Abb 4 54 Schematischer Schaltplan f r den Vergleich des Hochpassfilters Die Spannungen an den Elektroden wurden gem der in Abb 4 55 dargestellten Elektrodenbelegung nach der Vierpunktmessung siehe Kap 4 4 3 abgeleitet Die abgeleiteten Signale wurden anschlie end einzeln mit Hochpassfiltern unterschiedlicher Dimensionierung gefiltert bevor sie tausendfach verst rkt mit der Datenkarte erfasst wurden Die Filterdimensionierungen sind Tab 44 zu entnehmen Abb 4 55 Schematische Darstellung der Elektrodenbelegung auf dem MEA nach Design 2 und der Referenzelektrode R nach der Vierpunktmessung Bauteile f r den Hochpassfilter Kanal Widerstand Kapazit t Grenzfrequenz AINO RI 47 KQ Cl 33 nF Fl 113 Hz AINI R2 100 KQ C2 33 nF F2 48 Hz AIN2 R3 1 MQ C3 33 nF F3 4 8 Hz AIN3 R4 10 MQ C4 33 nF F4 0 5 Hz AIN4 R5 47 KQ C5 1 uF F5 3 3 Hz AIN5 R6 10 MQ C6 100 pF F6 159 Hz AIN6 R7 1 MQ C7 100 pF F7 1590 Hz Tab 4 4 Wahl der Widerst nde und Kondensatoren f r den Hochpassfilter sowie resultierende Grenzfrequenz f r 7 Kan le 99 Abb 4 56 zeigt die dabei mit der Datenkarte aufgezeichneten Signale Die Abb 4 56 a f zeigen komplett verschiedene Spannungsve
119. n RT v i U ll y X i Uy RT yp NAcc F IN a ee Gl 2 R Molare Gaskonstante F Faraday Konstante T Temperatur y Aktivit tskoeffizient X Konzentration von X Z VpZp VaZa Aquivalentzahl Anzahl der pro Formelumsatz bertragenen Elektronen Tab 2 2 F r die Ionendiffusion durch die Zellmembran relevante Reaktionsgleichung oben und Nernst Spannung unten _ Intrazellularraum _ Zellmembran Extrazellularraum Abb 2 3 Schematische Darstellung der passiven Ionenkan le und der bevorzugten Diffusionsrichtung gem Literatur 3 Chlorionen diffundieren so lange durch die Kan le bis die aus der Ionenverschiebung resultierende Spannung den Konzentrationsgradienten ausgleicht Dies gilt jedoch nur weil die im Zellinneren angeh uften meist negativ geladenen Proteine nicht durch die Ionenkan le passen also ihren Konzentrationsgradienten nicht ausgleichen k nnen Die Zellmembran wirkt also als semipermeable Membran 2 Die aus dem Ausgleich der Konzentrationsgradienten von Natrium und Kaliumionen resultierenden Spannungen wirken jedoch entgegengesetzt zueinander Auch wenn die Kalium gegen ber der Natriumionenbewegung durch die Anzahl und Beschaffenheit der Kan le beg nstigt wird w rden sich die intra und extrazellul ren Konzentrationen und die daraus resultierenden Spannungen mit der Zeit vollkommen ausgleichen g be es nicht aktive Transportkan le die Ionenpumpen 10
120. n Tabelle 3 12 zeigt die verwendeten Parameter f r die Lithographie von SU 8 Fotolack Abb 3 19 Fotolack SU 8 2150 Foto Strukturierung des Zellkulturkammerbodens Lack SU 8 2150 1 0 Spin Coater Convac 1001 Fairchild 1001 Dispense 100 200 s bei 500 rpm Spin 100 1000 s bei 3000 rpm Heizplatte Pr zitherm PZ 28 2 Softbake 30 Min bei 95 C Mask Aligner Karl SUSS MJB3 Lithographiemaske Zur Strukturierung des Kammerbodens Abb 3 20 Heizplatte Foto Belichtungsdauer 8 95 Hardbake 15 Min bei 95 C Entwickler mr Dev 600 Entwicklungsdauer 20 Min Stopper Isopropanol im Becherglas Sp len Deionisiertes Wasser flie end Trocknen Stickstoff Tab 3 12 Angewandte Prozessparameter bei der lithographischen Strukturierung 40 Befestigung der Zellkulturkammer Prozessschritt 0 Um eine wie in Kapitel 3 2 4 beschrieben aus Silikonkautschuk hergestellte Zellkulturkammer auf dem Tr gersubstrat zu befestigen wird sie zusammen mit diesem mit den gew nschten Kontaktflachen nach oben in den Plasmaverascher Siehe Abb 3 21 eingeschleust Mit Hilfe eines Sauerstoffplasmas werden die Oberfl chen hydrophilisiert um so besser aneinander zu haften Anschlie end werden sie in gew nschter Position aufeinander gepresst und unter diesem Anpressdruck zum Aush rten der neuen Verbindungen zwischen Tr gerglas und
121. n Elektroden 7 1 h Schematische Darstellung der Erregersignale In Abb 4 65 werden die aufgezeichneten Spannungsverl ufe in den jeweiligen Messungen mit Erregersignalen unterschiedlicher Amplitude an Elektrode 2 zur besseren bersicht getrennt dargestellt Darauf ist deutlich zu erkennen dass direkt nach der Signalantwort ein gekr mmter Spannungsverlauf aufgezeichnet wurde siehe Abb 4 64 f obwohl kein Signal mehr gesendet wurde Auch dies stellt einen Unterschied zu den Messungen an den gr eren Elektroden dar Letzteres l sst auf kapazitive Entladungsvorg nge an den Phasengrenzen zwischen Elektroden und Elektrolyt schlie en Damit w re die Abh ngigkeit dieser Effekte vom Elektrodendurchmesser erkl rt Eine Elektrodenverg tung aus Titannitrid siehe Kap 4 2 1 kann dazu beitragen diese Effekte zu minimieren F r eine genauere Analyse ist zu beachten dass die Abst nde der Elektroden auf dem Biochip in den vier Arrays mit unterschiedlichen Elektrodendurchmessern im selben Ma stab gew hlt wurden F r einen direkten Vergleich des Durchmessers des gew hlten Elektrodenpaars bei gleichem Abstand bieten sich Abb 4 61 f und Abb 4 63 c an Aus dem Vergleich der Amplituden der Signalantworten auf das gleiche Erregersignal bei gleichem Abstand und halbem Elektrodendurchmesser 100 bzw 50 um ergibt sich dass die gemessene Spannung mit den kleineren Elektroden rund ein achtel h her war Dabei ist zu beachten dass die Messungen
122. n der beiden Massepunkte der Stromversorgung zu diesen Effekten f hrt F r weitere Versuche mit einer zweistufigen Verst rkerschaltung siehe Kap 4 3 6 und Kap 4 5 3 wurde deshalb auf eine gemeinsame Stromversorgung zur ckgegriffen Die Versorgungsspannung wurde hierzu mit 5 V gew hlt um beide Verst rker versorgen zu k nnen 95 tad Os Are ite AN a Tean RT aas Voltage v3 I N BR N nn 4 PN Hr BR ua TN h i wees hy Li ji va klar gt I aaa ne PAARE ij vr vl H ren Pr i A re ny Seay at MAN A N ff ur Py ne Tider A arty a AR lea pny I ow raa A Poe net Apatite ss I I 40m Som 55m 60m 65m 70m 75m 79 98m Tine 5 30m 35m 45m 4 MAA it rag iA rpa PR WS In EAN ee a ah aan ah aan a Bla BU EN aaa ee Tir BR an ed its Ay jiita ee rues A prone G Wek Fa 37 y p w 3 ru S 3 Voltage v3 100m J 30 0466 rr 75m 40m Som 55m 60m 65m 70m Tire 5 5m Abb 4 50 Aufgezeichneter Spannungsverlauf eines simulierten EPSP bei zweistufiger Verst rkerschaltung x10x100 a mit zwei Stromquellen auf gemeinsamer Masse als Stromversorgung f r die beiden Verst rkerstufen b mit einer gemeinsamen Stromversorgung f r die beiden Verst rkerstufen 4 5 2 Funk bertragung und Schirmung Auch von au en eintreffende St rsignale z B Funksignale kommen als Rauschquellen in Betracht Da darauf verzichtet wurde den Verst rker
123. nden Laborkarte gem Abb 3 32 mit passenden Steckern siehe Kap 3 5 1 verl tet Aus dem Vergleich des in den einzelnen Kan len erzielten Signal Rausch Verh ltnisses siehe Kap 4 5 4 ergibt sich eine optimierte Dimensionierung des Filters mit einem Widerstand von 100 kQ und einem Kondensator mit der Kapazit t von 33 nF womit die Grenzfrequenz bei 48 Hz liegt F r alle folgenden Versuche wurde ein weiterer Hochpassfilter gem dem Schaltplan in Abb 3 32 angefertigt Bei diesem optimierten Hochpassfilter wurden jedoch ausschlie lich Widerst nde von 100 kQ und Kondensatoren mit Kapazit ten von 33 nF verbaut 49 Bauteile f r den Hochpassfilter Widerstand Kapazit t Grenzfrequenz RI 47 KQ C1 33 nF Fl 113 Hz R2 100 kQ C2 33 nF F2 48 Hz R3 1 MQ C3 33 nF F3 4 8 Hz R4 10 MQ C4 33 nF F4 0 5 Hz R5 47 KQ C5 1 uF F5 3 3 Hz R6 10 MQ C6 100 pF F6 159 Hz R7 1 MQ C7 100 pF F7 1590 Hz Tab 3 17 Wahl der Widerst nde und Kondensatoren f r den Hochpassfilter sowie resultierende Grenzfrequenz f r 7 Kan le 50 3 5 Der Messaufbau Im Gesamtsystem ist das Zusammenwirken von unterschiedlichen Komponenten zu koordinieren Dabei ist jede Komponente an die jeweilige Messaufgabe anzupassen Um diese schrittweisen Anpassungen w hrend der Entwicklung zu erm glichen wurde ein Modulkonzept siehe Kap 3 5 1 ausgearbeitet So k nnen die Signalquellen siehe Kap 3
124. neuronaler Aktivit t gelingt mit Hilfe von Elektroden die in Kontakt mit der Zellmembran stehen Deswegen soll die Zelladh sion Haftung einer Zelle auf den Elektroden behandelt werden siehe Kap 2 2 1 Da beim Einsatz von Elektroden Phasengrenzeneffekte zu ber cksichtigen sind werden diese im weiteren kurz erl utert siehe Kap 2 2 2 Au erdem sollen die Priorit ten bei der Wahl der Elektrodenkonfiguration siehe Kap 2 2 3 sowie die Vor und Nachteile eines Mikroelektrodenarrays f r die Messung neuronaler Aktivit t siehe Kap 2 2 4 gekl rt werden 2 2 1 Zelladh sion von Neuronen in vitro F r reproduzierbare Messergebnisse ist es von Vorteil Neuronen in vitro au erhalb des Organismus zu kultivieren Dazu ist es notwendig auf dem Substrat dem zu beschichtenden Untergrund eine Matrix aufzubringen an welcher die Neuronen haften k nnen Diese Matrix simuliert die nat rliche Umgebung St tzgewebe welche f r die Funktionalit t der Neuronen von gro er Bedeutung ist Au erdem wird dadurch die Position der Neuronen in einer Ebene fixiert was besonders die reproduzierbare Auswertung von Langzeitstudien erleichtert bzw erst erm glicht F r die Zelladh sion sind die Integrine eine Gruppe von Transmembranproteinen verantwortlich Diese k nnen beispielsweise an die RGD Sequenzen Arginin Glycin Asparagins ure des im organischen Gewebe vorhandenen Fibronektins binden In vitro werden dabei meist polare Adh sion
125. ngsverlauf an drei Eing ngen wei AIN3 rot AIN4 gr n AIN5 bei der tausendfach verst rkten Funk bertragung eines generierten Spannungspulses mit einer Dauer von ms einer Wiederholfrequenz von 10 Hz und unterschiedlicher Signalamplitude a 100 mV b 200 mV c 300 mV d 500 mV e 1 V 2 V 97 4 5 3 Tiefpassfiltervergleich Zur Entfernung von hochfrequenten St rsignalen wurden Tiefpassfilter untersucht Da auf der 100x Verst rkerplatine vier Verst rker ohne Filterkondensatoren verl tet wurden war es m glich beim Vorverst rkervergleich ebenfalls den Einfluss des Tiefpassfilters mit einer Grenzfrequenz von 100kHz auf das Rauschverhalten zu messen Der Messaufbau entsprach dabei in Analogie zu Kap 4 3 6 und Kap 4 5 1 dem in Abb 4 49 dargestellten Schaltplan Als Signal wurde wiederum ein EPSP simuliert In Abb 4 53 a wird der Spannungsverlauf eines ungefiltert verst rkten simulierten Biosignalssignals gezeigt in Abb 4 53 b der Spannungsverlauf eines gefilterten Signals Das Rauschen von 100 mV im ungefilterten Fall konnte durch den Tiefpassfilter auf ein Viertel 25 mV reduziert werden Obgleich der Tiefpassfiter die Ausgangsspannung des Verst rkers filtert kann er also merklich zur Rauschreduktion beitragen Deswegen sollten in weiteren Experimenten Tiefpassfilter eingesetzt werden Zu diesem Zweck wurden wie in Kap 3 4 3 beschrieben in allen Kan len auf den Verst rkerplatinen Filterkondensatoren verl
126. ntigen Beschaffenheit der Titannitridschicht herr hrt siehe Abb 4 17 Ein Vergleich mit einer Aufnahme die mit einem Raster Elektronen Mikroskop engl Scanning electron microscope SEM einer reaktiv gesputterten Titannitridschicht die gew nschte Anforderungen erf llt siehe Abb 4 18 zeigt dass die Oberfl che nicht scharfkantig sondern vielmehr h gelig sein sollte Von allen variierten Parametern wurde der in Tabelle 4 2 gezeigte Parametersatz als der Geeignetste bestimmt Der Wert f r die resultierende Schichtdicke bezieht sich auf bestehende Tabellen ausgewerteter vorangehender Arbeiten Diese Parameter wurden bei weiteren Versuchen verwendet 70 x 1 00 jum y 1 00 jum 55 nm Abb 4 17 AFM Aufnahmen der gesputterten Leiterschicht aus Titannitrid nach Abscheidung bei a 8x10 mbar b 5x10 mbar Arbeitsdruck Abb 4 18 SEM Aufnahme einer reaktiv gesputterten Leiterschicht aus Titannitrid die gew nschte Forderung nach hoher Oberfl chenrauigkeit erf llt 42 Optimierte Parameter zu Verg tung der Elektroden Arbeitsdruck Sputterdauer Leistung Haftschicht Beheizung Schichtdicke 8x10 mbar 20 x 60s 50 W Ja Ti nein 100 nm Tab 4 2 Optimierte Prozessparameter f r die Oberfl chenverg tung der Elektroden mit Titannitrid 71 4 2 2 Funktionalisierter Zellkulturkammerboden Auf dem Kammerboden der Zellkulturkammer sollten Strukturen herge
127. olack besteht und mit der daf r vorgesehenen Lithographiemaske siehe Abb 4 13 d strukturiert wurde Dieser Fluidikaufsatz mit Mikrokanal Breite 300 um bildet den Boden der Zellkulturkammer und soll sp ter zwei Gebiete im neuronalen Netzwerk rtlich voneinander trennen F r Details bez glich der Herstellung dieses Kanals sei auf Kap 4 2 2 verwiesen Abb 4 13 Fotos der Lithographiemasken nach MEA Design 1 a Lithographiemaske zur Strukturierung der Isolation b Lithographiemaske zur Strukturierung der Isolation c MEA d Lithographiemaske zur Strukturierung des Kammerbodens 67 Im zweiten Design ist kein Fluidikaufsatz vorgesehen Jedoch wurde wie in Kapitel 4 1 3 beschrieben aufgrund schwierigen Alignments mit einem Positivprozess eine zus tzliche negative Lithographiemaske zur Strukturierung der Isolation siehe Abb 4 14 d gefertigt Dies st insbesondere deswegen vorteilhaft weil in diesem Design Elektrodendurchmesser von 10 um vorkommen Die verwendeten Lithographiemasken und das resultierende MEA nach Design 2 sind in Abb 4 14 dargestellt Auf den vier Seiten des MEAs siehe Abb 4 13 c sind jeweils acht Elektroden gleicher Gr e in einem rechteckigen Feld 2 x 4 Elektroden in gleichem Abstand angeordnet Die Gr en und Abst nde der Elektroden auf den vier Seiten sind dabei unterschiedlich sodass durch Drehen des Biochips in der Halterung vier Arrays mit unterschiedlichen Elektrodendurchmessern angesteue
128. on Results Shear Analysis by MicroChem Corporation 27 Feinraster und Doppelhubstifte zur Pr ung von Feinraster Komponenten F109 by Feinmetall GmbH 117 28 8 Channel Miniature Preamplifier Manual MPASI by Microchannel Systems GmbH 29 MT Series Compact Dovetail Linear Stages by Newport Corporation 30 C H Chen D J Yao S H Tseng S W Lu C C Chiao S R Yeh Micro multi probe electrode array to measure neural signals Biosensors and Bioelectronics Ausgabe 24 2009 1911 1917 31 Digitally Controlled Programmable Gain Instrumentation Amplifier PGA202 203 by Burr Brown Corporation 32 Agilent 33220A 20 MHz Function Arbitrary Waveform Generator by Agilent Technologies Incorporation 33 MEA SG MEA Signal Generator by Multi Channel Systems MCS GmbH 34 NI USB 621x Specifications by National Instruments Corporation 35 Digital Storage OscilloscopesTDS1000B Series TDS 2000B Series by Tektronix Incorporation 36 C E Shannon Communication in the Presence of Noise Proceedings of the IEEE Ausgabe 86 1998 447 457 37 A van Bergen T Papanikolaou A Schuker A M ller B Schlosshauer Long term stimulation of mouse hippocampal slice culture on microelectrode array Brain Research Protocols Ausgabe 11 2003 123 133 118 38 M Hufnagl Time resolved transepithelial impedance spectroscopy of caco 2 monolyers relying on lithagraphic
129. or von Tausend nicht mehr erfasst werden konnten da die Spannung au erhalb des Aufl sungsbereichs lag siehe Kap 4 4 1 Au erdem besteht aufgrund ungeschirmter Leitungen die Gefahr des kapazitiven bersprechens durch niederfrequente Signale meist lt 100 Hz aus der Umgebung Um diese niederfrequente Signale und damit auch die Differenz der Elektrodenpotentiale herauszufiltern wurde ein Hochpassfilter zwischen Vorverst rker und Hauptverst rker geschaltet Ein Hochpassfilter ist ein RC Glied welches vom eingehenden Signal U nur den h herfrequenten Teil passieren l sst w hrend niederfrequente Signalanteile abgeschw cht werden U Die Grenzfrequenz ist definiert als die Frequenz bei der gilt U UN Diese Grenzfrequenz bestimmt sich zu f 1 2rRC Dabei sollte darauf geachtet werden dass der Ausgangswiderstand kleiner ist als der Eingangswiderstand des folgenden Verst rkers 10 GQ aber gr er als der Eingangswiderstand an den Elektroden Au erdem sollten die Kondensatoren unempfindlich gegen ber Polarisierungs nderungen sein weshalb Folienkondensatoren gew hlt wurden Abb 3 32 Schaltplan des hergestellten Hochpassfilters Um eine geeignete Dimensionierung des Hochpassfilters zu finden wurde zun chst ein Hochpassfilter mit verschiedenen Filtern f r jeden Kanal angefertigt Tabelle 3 17 zeigt einen berblick ber die ben tigten Bauteile f r diesen Hochpassfilter Alle Teile werden auf einer passe
130. pulation Spikes Spikes Frequenz Hz Einige Milliherz Amplitude V 100 uV 1V Relevante Anschliisse 1 Masseanschluss 32 Ausg nge mit Signalform A 32 Ausg nge mit Signalform B Abb 3 35 Biosimulationschip MEA SG 33 Tab 3 19 Eigenschaften der elektronischen Signalquellen Signalgenerator und Biosignalsimulator 3 5 3 Datenerfassung Damit die neuronalen Signale mit dem Computer aufgezeichnet und ausgewertet werden k nnen werden sie zun chst mit einer Datenkarte siehe Abb 3 36 34 digitalisiert Dabei ist bei der Wahl der Datenkarte auf die Anzahl der Kan le die damit zur Verf gung stehende Abtastrate Messpunkte Zeiteinheit pro Kanal die maximale Eingangsspannung und den maximalen Fehler zu achten Als analoges Referenzmessger t wird ein Oszilloskop herangezogen siehe Abb 3 37 35 Die Datenerfassung und Nachbearbeitung schlie lich ben tigt eine mit der Datenkarte und dem Oszilloskop kompatible Software Tabelle 3 19 zeigt einen berblick ber relevante Spezifikationen der eingesetzten Datenerfassungsmethoden F r die Abtastrate gilt dabei nach dem Nyquist Theorem 36 dass diese mindestens doppelt so hoch sein muss wie die maximal zu messende Frequenz um sie aufzeichnen zu k nnen Mit der gew hlten Datenkarte entspricht die Abtastrate pro Kanal bei acht Kan len 30 Kilosamples pro Sekunde kS s Ein Signal kann also ber die Dauer von einer Millisekunde was
131. r tzfortschritt kann leicht optisch wahrgenommen werden Deshalb wurde die Zeit im L sungsbad nur gesch tzt Tabelle 3 8 zeigt die verwendeten Parameter oe Es Abb 3 15 Chrom tze Foto Prozessparameter beim Nasschemischen Atzen L sungsmittel Microposit Chrome Etch 18 L sungsdauer 25 35 Stopper Sp len in flie endem Wasser deionisiertes Wasser im Becherglas Trocknen Stickstoff Tab 3 8 Angewandte Prozessparameter beim nasschemischen tzen von Chrom 37 Lift off Prozessschritte g m Im Lift off Verfahren werden metallische Mikrostrukturen hergestellt Dazu wird eine Lackschicht mit Fotolithographie strukturiert und dar ber eine Metallschicht abgeschieden Anschlie end wird die strukturierte Lackschicht mit dem darauf abgeschiedenen Metall gel st Wesentlich ist dass das L sungsmittel auch horizontal durch die Lackschicht diffundiert also mit der Zeit der komplette Fotolack gel st wird Dabei werden nat rlich alle den Fotolack bedeckenden Fl chen der dar ber liegenden Leiterschicht ebenfalls vom Tr gersubstrat gel st Die Zeit die der Lift off ben tigt h ngt stark von der gr ten geschlossenen Fl che ab die der Fotolack bedeckt Der Fortschritt des L sungsmittels wurde optisch mitverfolgt und durch punktuelles Einspritzen des L sungsmittels unterst tzt Die mit L sungsmittel gef llten Bechergl ser wurden w hrend der Entfernung des Fotolacks meh
132. rl ufe an den jeweiligen Eing ngen AINO AINS Dabei treten die Signalantworten auf das Erregersignal als Peaks auf welche den Kanten des Rechteckssignals entsprechen Um die Eignung der unterschiedlichen Hochpassfilterschaltungen zu vergleichen m ssen mehrere Faktoren ber cksichtigt werden Einerseits zeigen AINO siehe Abb 4 56 a und AINI siehe Abb 4 56 b wesentlich h here Signalantworten als die brigen Kan le andererseits werden die Signale auch von einem h heren Rauschen begleitet als in anderen Kan len siehe Abb 4 56 e f Au erdem sollte der Abstand der Stimulationselektrode zu der Elektrode an der das gemessene Signal abgeleitet wurde beachtet werden Die grobe bersicht zeigt jedenfalls dass die Filterschaltung die zum Filtern des Signals in Kanal AIN3 verwendet wurde keine sinnvollen Ergebnisse liefert siehe Abb 4 56 d l 1 1 1 1 1 I 1 1 0 100m 200m 300m 400m 500m 600m 700m 800m 900m 999 083m Zeit s li 1 1 L 1 I I I 1 I 0 100m 200m 300m 400m 500m 600m 700m 800m 900m 999 083m Zeit s i I 1 1 1 1 1 1 1 I 1 0 100m 200m 300m 400m 500m 600m 700m 800m 900m 999 083m Zeit s 2 z m 1 z Pata Mica gs ar yi Ri uU a E ag a a a a tg RE a N EACH HZ f 0 5 Hz 1 7 1 1 1 1 1 1 i 1 1 0 100m 200m 300m 400m 500m 600m 700m 800m 900m 999 083m Zeit s 1 foe een hiiaran heijan Ti Akina NOn hg es h AEA eg ana aai aul mana E E J pa AIN4 f 3 3 Hz n G 2 1
133. rmals gewechselt siehe Abb 3 16 da bereits im L sungsmittel gel ste Metallreste die Mikrostrukturen auf dem Tr gersubstrat besch digen k nnen Tabelle 3 9 zeigt die verwendeten Parameter Prozessparameter beim Lift off Metall Lift off L sungsmittel Aceton in separatem Dauer 10 Min Becherglas Sp len Aceton Ultraschallreiniger SONOREX Digital 10P Bandelin 1 Reinigungsschritt in L sungsmittel Aceton separatem Becherglas Leistung 100 Watt Dauer 2 3 Min Sp len Isopropanol 2 Reinigungsschritt in L sungsmittel Isopropanol Abb 3 16 Zum Liftoff n tige separatem Becherglas Leistung 100 Watt Bechergl ser Foto mau nn Trocknen Stickstoff Tab 3 9 Angewandte Prozessparameter im Lift off Prozess PECVD Prozessschritt 1 Gem des Prozessplanes siehe Abb 3 8 werden Leiterbahnen mit Isolationsmaterial bedeckt damit sie sp ter vom neurobasalen N hrmedium getrennt sind Im PECVD Verfahren wird das Tr gersubstrat in einer speziellen Anlage siehe Abb 3 17 mit Isolationsmaterial beschichtet Die Werte f r die resultierenden Schichtdicken beziehen sich auf bestehende Tabellen ausgewerteter vorangehender Arbeiten Tabelle 3 10 zeigt die verwendeten Parameter f r den PECVD Prozess 38 Abb 3 17 PECVD Anlage Foto Um das auf den Leiterbahnen aufgetragene Isolationsmaterial an den Mikroelektroden und auf den Kontaktpads
134. rt werden k nnen Abb 4 14 Fotos der Lithographiemasken nach MEA Design 2 a Lithographiemaske zur Strukturierung der Leiterbahnen b Lithographiemaske zur Strukturierung der Isolation im Positivprozess c MEA d Lithographiemaske zur Strukturierung der Isolation im Negativprozess 68 4 2 Biochipprozessierung Aus den prozessierten MEAs sollten im weiteren Prozessverlauf Biochips zur Ableitung neuronaler Aktivit t gefertigt werden Dazu wird nicht nur eine Zellkulturkammer siehe Kap 4 2 3 teils mit funktionalisiertem Boden siehe Kap 4 2 2 auf dem MEA sondern auch eine spezielle Oberfl chenverg tung zur Verbesserung der Zelladh sion auf den Elektroden siehe Kap 4 2 1 ben tigt Die folgenden Prozesse und dazugeh rige Prozessschritte siehe Kapitel 3 2 2 und 3 2 5 mussten erst entwickelt werden weshalb im Weiteren die variierten Prozessparameter und deren Auswirkungen auf den Biochip diskutiert werden 4 2 1 Oberfl chenverg tung Ziel der Oberfl chenverg tung ist die Verbesserung der Zelladh sion auf den Elektroden Dies wird in der Praxis in der Regel mit einer Elektrodenbeschichtung mit Titannitrid erreicht Dabei scheint die besondere Eignung von Titannitrid neben guter Biokompatibilit t an der Rauigkeit genauer an der Kornstruktur des Materials zu liegen 42 Da sich praktisch alle Parameter zur Prozessierung einer solchen Oberfl chenverg tung auf reaktives Sputtern beziehen 43 was bei der ve
135. runghaft von einem Schn rring zum n chsten fort So kann ein Aktionsimpuls in myelinisierten Nervenfasern energiesparend auch tiber weite Distanzen ungehindert zum Ziel gelangen Aufgrund der dabei auftretenden Refrakt rzeit ist au erdem gew hrleistet dass sich ein Aktionsimpuls nur in eine Richtung fortpflanzt Nun geschieht die neuronale Informationsverarbeitung nicht in einem einzelnen Neuron sondern in einem Neuronennetzwerk Verbund mehrerer Neuronen Neuronennetzwerke Das zeitliche Zusammenwirken mehrerer Neuronen ist in Neuronennetzwerken beschreibbar Die gesendete Information eines Neurons steckt in seiner Aktivit t siehe Abb 2 10 welche formal bin r Alles oder nichts Prinzip und zeitlich diskret Verarbeitung in Zeitschritten ist und zusammen mit den Aktivit ten anderer Neuronen ein Aktivit tsmuster bildet Ein Neuronennetzwerk Verbund mehrerer Neuronen arbeitet meist in Verarbeitungsschichten So stellt das Aktivit tsmuster der ersten Verarbeitungsschicht den Eingang f r die zweite Verarbeitungsschicht dar das Aktivit tsmuster der zweiten Verarbeitungsschicht den Eingang f r die dritte Verarbeitungsschicht usw siehe Abb 2 11 16 Zeitschritt 1 Zeitschritt 2 Zeitschritt 3 1 Schicht 2 Schicht 3 Schicht 1 Schicht 2 Schicht 3 Schicht 1 Schicht 2 Schicht 3 Schicht Abb 2 11 Schematische Darstellung der schrittweisen Informationsverarbeitung in einem geschichteten Neuronennetzwerk
136. rwendeten Sputteranlage siehe Kap 3 2 5 nicht m glich ist wurden die Prozessparameter f r reines Magnetronsputtern zun chst grob bestimmt Die Struktur der gesputterten Titannitridschicht h ngt von der durchgehenden Sputterdauer ab Das Substrat wurde nach einer Minute Sputterdauer eine Minute lang abgek hlt da das durchgehende Sputtern das Substrat erhitzt und somit eine ver nderte Beschaffenheit der Oberfl che beg nstigt Die Auswirkungen eines durchgehenden Sputterprozesses sowie einer zus tzlichen Heizung des Substrats auf die Rauigkeit der abgeschiedenen Titannitridschicht wurden ebenfalls ermittelt i _ bat Pa Durch zus tzlich heizen lie sich die Re gt 4 Abb 4 15 Lichtmikroskopische Auflichtaufnahme von Rissen in der abgeschiedene Schichtdicke maximieren er on denn aufgrund der Por sit t des Leiterschicht aus Titannitrid bei zu hoher Schichtdicke Die Einblendung rechts unten zeigt ein Foto des beschichtete Deckglases a ge ender sce Sn bei geringen Schichtdicken tiefe Risse siehe Abb 4 15 die zu einem leichten Abl sen der gesamten Leiterschicht in Form von feinem Staub f hren Unter anderem deswegen erschien es zweckm ig die Auswirkungen einer Haftschicht aus Titan zu testen Als besonders rauigkeitssteigernde Parameterver nderung wurde eine Erh hung des Arbeitsdrucks durchgef hrt An der Farbe der abgeschiedenen Leiterschicht bei 6x h herem Arbeitsdruck ist erkennbar d
137. s Materialkonzepts soll gekl rt werden ob biokompatible Materialien zur Prozessierung des Biochips gefunden werden k nnen siehe Kap 4 1 Au erdem soll ein Verfahren zur Fertigung einer Zellkulturkammer und deren Haftung auf dem Biochip sowie Methoden zur weiteren problemspezifischen Anpassung des Biochips erarbeitet werden siehe Kap 4 2 e Kann ein geeignetes Messsystem entwickelt werden um neuronale Aktivit ten von diesem Biochip abzuleiten Bei dieser Aufgabenstellung soll gekl rt werden welchen Anforderungen dabei die Verst rkerschaltung gen gen muss siehe Kap 4 3 Es soll untersucht werden ob es notwendig ist die abgeleiteten Signale direkt zu verst rken ob ein simultanes Verst rken mehrerer Kan le m glich ist und welcher Verst rkungsfaktor am besten geeignet ist Au erdem ist zu kl ren welche Anforderungen an das Datenerfassungssystem hinsichtlich zeitlicher Aufl sung Empfindlichkeit und M glichkeiten zur Nachbearbeitung gestellt werden Des Weiteren sollen sich anbietende Messweisen siehe Kap 4 4 und Methoden zur Rauschreduktion siehe Kap 4 5 verglichen werden Anschlie end sollen Experimente durchgef hrt werden die zeigen ob bzw wie Neuronen mit dem Biochip elektrisch stimuliert werden k nnen siehe Kap 4 6 In einem abschlie enden Res mee sollen die Ergebnisse mit Bezug auf die gestellten Forschungsfragen in einem berblick zusammengefasst sowie Optimierungsoptionen f r weitere Arbeiten zu die
138. sem Thema gesammelt werden Abb 1 2 Zeitlicher Ablauf der Messung 2 Theorie Um einen Messaufbau f r neuronale Aktivit tsmuster zu konstruieren sollte zun chst der Ablauf der Messung schematisch dargestellt werden damit die einzelnen Schritte theoretisch fundiert werden k nnen siehe Abb 1 2 Des Weiteren soll auf die Bedeutung neuronaler Aktivit tsmuster siehe Kap 2 1 auf die Ableitung neuronaler Aktivit t siehe Kap 2 2 sowie auf Beschichtungsverfahrene f r ein geeignetes Messsystem siehe Kap 2 3 eingegangen werden 2 1 Neuronale Aktivit t F r die Ableitung neuronaler Aktivit t sollten die Eigenschaften eines solchen Signals bekannt sein Dazu ist es zun chst notwendig die Mechanismen f r die Entstehung neuronaler Aktivit t zu beleuchten Dabei wird zwischen chemischer und elektrischer neuronaler Aktivit t unterschieden Im folgenden wird zun chst die Entstehung der elektrischen Aktivit t beleuchtet siehe Kap 2 1 1 Da die chemische Aktivit t der Neuronen besonders bei der Weiterleitung eines elektrischen Signals von eine Neuron zum n chsten auftritt wird sie im Zuge der Beschreibung der Signalausbreitung siehe Kap 2 1 2 eingehender erl utert 2 1 1 Entstehung neuronaler Signale F r die elektrischen Eigenschaften eines Neurons Nervenzelle und speziell f r die Entstehung neuronaler Aktivit tsmuster ist seine Zellmembran Zellwand Hydrophiles von herausragender Bedeutun
139. simuliert werden Allerdings ist dies recht aufwendig Die niedrigste m gliche Amplitude ist 20 mV weshalb f r die Kalibrierung des Messaufbaus ein Biosignalsimulator anstatt des vorher beschriebenen Signalgenerators herangezogen wurde Der Biosignalsimulator MEA SG besitzt ein gr beres Rasterma siehe Abb 3 35 33 Das st rt jedoch nicht weiter da f r die Kalibrierung zwei Kan le zum Vergleich ausreichen Tabelle 3 19 zeigt einen berblick ber relevante Spezifikationen der gew hlten Signalgeneratoren Wichtig ist dass der Signalgenerator die ausgegebenen Spannungswerte f r einen angelegten bekannten Lastwiderstand errechnet Dieser ist bei Werkseinstellung auf 20 Q angesetzt f r die Messungen werden jedoch meist hohe Widerst nde eingesetzt Bei unbekanntem Gesamtwiderstand kann dieser Umstand bei der Signalgenerierung mit der Option High Z ber cksichtigt werden was einem angenommenen unendlich hohen Lastwiderstand entspricht 52 Eingesetzte Signalgeneratoren und Spezifikationen FE Agilent PARTRA lorn Generator Beate Homsco Ore Abb 3 34 Signalgenerator Agilent 33220 32 Signalgenerator Modell Agilent 33220 A LXI Benutzte Signalformen Rechteck Sinus Puls 0 04 1 ms Frequenz Hz 2 100 Amplitude V 0 02 20 Relevante Anschliisse SG SG Biosignalsimulator Modell MEA SG Relevante Signalformen EPSP Po
140. stellt werden die ein gerichtetes Wachstum der Neuronen durch einen Kanal erm glichen Wie in Kap 3 2 4 beschrieben wird der Zellkulturkammerboden getrennt von der Zellkulturkammer durch lithographische Strukturierung prozessiert Zu Beginn der Optimierung der Mikrostrukturierung des Zellkulturkammerbodens orientierten sich die Prozessparameter am Benutzerhandbuch des Herstellers 44 und wurden im Verlauf der Arbeit weiter verfeinert Um eine hohe Schichtdicke zu erreichen wurde der Fotolack nicht verd nnt weswegen er l nger auf dem Tr gersubstrat verteilt werden musste Nach der Beschichtung mussten die R nder und die Unterseite des Tr gersubstrats gereinigt werden damit dieses nicht beim anschlie enden Softbake auf der Heizplatte kleben bleibt Besonders kritisch ist nun das Anpressen der Lithographiemaske bei der Belichtung Ein hoher Anpressdruck wurde vermieden Damit also die Lithographiemaske l Ti direkt auf dem Fotolack auflag und somit ein gutes Aspektverh ltnis erreicht wurde war es bei dicken Lackschichten umso entscheidender dass die a b Oberfl che ausreichend eben ist Dies konnte selbst La _ s nach einer halbst ndigen Rotationsbeschichtung nur bedingt erreicht werden Die Genauigkeit der Strukturierung hing somit auch von der gesamten Ausbreitung der Lackschicht ab Beim Hardbake und der Entwicklung war wiederum darauf zu achten dass die Lackreste vollst ndig entfernt wurden Abb
141. svermittler auf den Deckgl sern aufgetragen Die Haftung des Adh sionsvermittlers kann wiederum durch vorangehende Ladung des Substrats beg nstigt werden siehe Abb 2 12 Au erdem wird die Zelladh sion durch eine aufgeraute Oberfl che beg nstigt da sich so mehr m gliche Bindungsstellen bieten Dies gilt insbesondere f r jene Elektroden mit denen die neuronale Aktivit t abgeleitet werden soll 9 gt Integrin COO N i Cc G O N ee a a 5 RGD Sequenz D Bindungsstelle Adh sionsmolek l x LL age Positiv geladenes Ende Negativ geladener Objekttrager Abb 2 12 Grob vereinfachte Darstellung der Zelladh sion an einer extrazellul ren Matrix gem Literatur 9 18 2 2 2 Phasengrenze Elektrode Elektrolyt Da ein Neuronennetzwerk um zu funktionieren stets von einem Elektrolyten ionenh ltige elektrisch leitf hige Fl ssigkeit das N hrmedium umgeben ist muss neuronale Aktivit t mit Hilfe von Elektroden elektrische Leiter in Kontakt mit einem Elektrolyten abgeleitet werden Eine Metallelektrode des Metalls M im Elektrolyten stellt eine Elektrode erster Art dar In Analogie zur Wirkung der pass ven Ionenkan le diffundieren Metallionen durch die Phasengrenze bis die daraus resultierende Spannung den Konzentrationsgradienten ausgleicht Nun wird Ladung bei gleichzeitiger Strukturver nderung Z
142. t einen Ausschnitt von 15 ms Es ist leicht zu erkennen dass der 50 Hz Netzbrumm durch die Nachbearbeitung erfolgreich eliminiert wurde Dies bewirkt eine Verdreifachung des SNR Die vergr erte Abbildung zeigt die auftretenden Signalverzerrungen Darauf ist zu erkennen dass Spannungsspitzen des gemessenen und des nachbearbeiteten Spannungsverlaufs ann hernd die gleiche Amplitude besitzen Allerdings wird das erfasste Signal das schon wegen des Hochpassfilters verzerrt erfasst wird durch die Nachbearbeitung zus tzlich verzerrt F r die reine Detektion von neuronalen Signalen insbesondere von Aktionsimpulsen erweist sich die softwarebasierte Nachbearbeitung als besonders n tzlich um Spannungsspitzen vom Netzbrumm isoliert darstellen zu k nnen und so 1m verkleinerten Ma stab nicht vom Rauschen verursachte Spannungsspitzen zu identifizieren UT i i Nalaka dank Spannung W i 1 100m 200m 300m 400m 500m 600m 700m 800m 300m 998 917m Zeit s Spannung Y Im 10m Lim 12m 13m 14m 15 0224m im 2m 3m dm Em 6m 70 s Abb 4 58 Softwarebasierte Nachbearbeitung mit einem Bandstopfilter wei einer vorgefilterten tausendfach verst rkten Signalantwort rot auf einen Spannungspuls mit einer Dauer von 500 us und einer Amplitude von 20mV orange 30 fach vergr ert a Rauschminimierung durch Elimination des 50 Hz Rauschens b Vergr erter Ausschnitt 15 ms resultierende Signalverzerr
143. te MEA Dimensionierung ja nur f r Referenzmessungen entworfen wurde In dieser konnte Arbeit erfolgreich ein komplettes System zur Ableitung und Aufzeichnung neuronaler Signale entwickelt werden Dabei wurden wesentliche Zusammenh nge aufgezeigt und grundlegende Erkenntnisse f r die Herstellung eines problemorientierten Messsystems gewonnen So bietet diese Arbeit das Potential f r zuk nftige Entwicklungen 114 6 Quellenverzeichnis 1 H Pf tzner Angewandte Biophysik Springer Verlag 2003 4 17 2 T Akkermann Physikalische Biochemie Springer Lehrbuch 1992 90 99 3 F van den Berg Angewandte Physiologie Organsysteme verstehen und beeinflussen Georg Thieme Verlag 2005 13 25 4 D E Goldman Potential impedance and rectification in membranes Journal of General Physiology 27 1943 37 60 5 P Karlson D Doenecke J Koolman Kurzes Lehrbuch der Biochemie f r Mediziner und Naturwissenschaftler Georg Thieme Verlag 1960 441 458 6 A L Hodgkin A F Huxley A Quantitative Description of Membrane Current and its Application to Conduction and Excitation in Nerve Journal of Physiology Ausgabe 117 1952 500 544 7 F Rosenblatt The perceptron a probabilistic model for information storage and organization in the brain Psychological Reviews Ausgabe 65 1958 386 408 8 R Schrott A Keue J Taube D Schmuck H Beikirch W Baumann E Schreiber Real time Data
144. tet i wit inode A ie ht AM N Hy wat a f 4 Ahead ul AR RABEN f W i pF 4 a A Hu ah 7 pHa dg ray Voltage v E seat wattle ya Paha ther ht iq we ob abe ani al a A anh all A age fy Mad 1 ta A j drat i ve Neato tall ai Arising A Ay Aaa afd A rrp ets Vanagu yay Phra N y e Voltage w 0 Sm 10 m 15m 20m 25m 30m 35m 40m 4m 50m 55m 60m 65m 70m 75m 80 0466 Tire 5 Abb 4 53 Aufgezeichneter Spannungsverlauf eines simulierten EPSP bei zweistufiger Verst rkerschaltung x10x100 a ohne Tiefpassfilter b mit Tiefpassfilter 4 5 4 Hochpassfiltervergleich Zur Entfernung niederfrequenter St rsignale wurden Hochpassfilter eingesetzt Damit die Phasengrenzeneffekte die Elektrodenpotentiale nicht in den Aussteuerbereich alle Spannungen ber 10 V bei einem Verst rkungsfaktor von 1000 alle Eingangsspannungen gr er als 10 mV der Eing nge des Verst rkers dr ngen sollte ein Hochpassfilter zwischen der Kontakthalterung und der Verst rkerschaltung eingesetzt werden Um diesen zu dimensionieren wurde ein 8 Kanal Hochpassfilter aus verschiedenen Widerst nden und Kondensatoren aufgebaut und die Grenzfrequenzen berechnet siehe Kap 3 5 4 Dieser Hochpassfilter wurde gem dem in Abb 4 54 dargestellten Schaltplan in den Messaufbau integriert Dazu wurde ein nach Design 2 hergestellter Biochip mit physiologischer Kochsalzl sung bef llt und mit dem Messaufbau kontaktiert Anschlie end wurde ber die Sti
145. tibilit tstests siehe Kap 4 1 1 und f r en RAR UM die Rauigkeitsmessungen abgeschiedener Abb 4 7 AFM Aufnahmen eines Deckglases a unbehandelt Titannitridschichten siehe Kap 4 2 1 erfolgreich l l o b nach 5 Minuten Beschichtung mit Titan entfernt Sputtern Prozessschritte b e f 1 Auch beim Sputterprozess kam es zu besonderen Herausforderungen Das Sputtern der meisten Materialien ist von den Prozessparametern her gut bestimmt und verl uft weitgehend problemlos Beim Sputtern der Oberfl chenverg tung aus Titannitrid allerdings war das Ziel eine hohe Oberfl chenrauigkeit Zur Erh hung der Rauigkeit wurden mehrere Prozessparameter variiert siehe Kap 4 2 1 Auf den f r diese Untersuchungen als Substrat eingesetzten Deckgl sern befindliche Erhebungen wurden zuvor im Ultraschallbad entfernt 62 Lithographie Prozessschritte c J Der wahrscheinlich problematischste Prozessschritt ist die Lithographie Schon beim Auftragen des Lacks auf dem Substrat ist genau darauf zu achten dass keine Luftblasen im Fotolack entstehen 39 damit die Rotationsbeschichtung problemlos verl uft Vor allem die Belichtungszeit sollte sehr genau eingehalten werden da Abb 4 8 Mikroskopische Auflichtaufnahme eines Belichtungs fehlers aufgrund mangelnder Belichtung der gesamten Fl che Gold die endg ltige L slichkeit des Lacks stark davon abh ngt wodurch auch der Lift off erheblich erleichtert wer
146. tung ber Nacht mit Laminin bedeckt und vor der Aussaat zweimal mit Tyrode L sung gewaschen Vor der Beschichtung mit Laminin k nnen die Deckgl ser bei 4 C ber mehrere Tage gelagert werden Abb 3 2 In vitro kultivierte Neuronen a am zweiten Tag in vitro b am f nften Tag in vitro 26 Ist die Beschichtung mit Laminin abgeschlossen werden in einem Glasring der auf das Deckglas gestellt wird eine bestimmte Menge an Neuronen ausges t Dazu werden die in der Neurologie gebr uchlichen Deckgl ser 19 in eine sterile Petrischale gelegt die nach der Aussaat mit Neurobasalem Medium NBM gef llt wird Mit dem Glasring wird die zu bewachsenden Fl che r umlich beschr nkt Im Verlauf dieser Arbeit wurden Neuronen auch auf dem Mikroelektrodenarray der Biochips ausges t Die Biochips besitzen hierf r eine integrierte Zellkulturkammer welche nicht nur die Funktion der Petrischale sondern auch des Glasringes ersetzen soll Nach der Beschichtung des Biochips mit dem Adh sionsvermittler k nnen die Neuronen somit direkt in der Zellkulturkammer ausges t werden In der Wachstumsphase sollen sich die vereinzelten Neuronen wieder zu einem funktionierenden Neuronengewebe vernetzen siehe Abb 3 2 In der nat rlichen Umgebung sind Neuronen in einem St tzgewebe aus sogenannten Gliazellen durch zahlreiche Neuriten verbunden In vitro soll ein hnlicher Zustand hergestellt werden W hrend der Wachstumsphase werden sie in e
147. tung und eines funktionalisierten Zellkulturkammerbodens der Grundstein f r die Prozessierung problemspezifischer Biochips gelegt Zur Herstellung einer Elektrodenverg tung aus Titannitrid hat sich ein 20 Min Sputterprozess mit 50 W Leistung als geeignet erwiesen siehe Kap 4 2 1 Damit die Elektroden direkt in Ausbreitungsrichtung des Aktionsimpulses liegen wurden Mikrokan le zwischen zwei gr eren Kulturkammern hergestellt Es wurden erfolgreich Mikrokan le lithographisch auf den Elektrodenarrays strukturiert siehe Kap 4 2 2 welche den Anforderungen gen gen um axonale Aktivit ten separiert abzuleiten Das Wachstum von Zellen auf dem strukturierten Zellkulturkammerboden konnte best tigt werden sodass dieses neue Konzept f r folgende Forschungsarbeiten zur Verf gung steht Eine weitere Aufgabenstellung war der Aufbau eines kompletten Messsystems mit automatisierter Datenerfassung Dabei sollten die schwachen neuronalen Signale auch verst rkt werden Zun chst wurde ein Konzept f r die Kontaktierung des Biochips erarbeitet siehe Kap 3 3 1 und eine Halterung mit Kontaktstiften angefertigt siehe Kap 3 3 2 In ersten Versuchen wurde ein unmittelbar an die Kontaktierung anschlie ender Vorverst rker mit einem Verst rkungsfaktor von zehn eingesetzt der direkt mit dem Biochip verbunden wurde damit sofort nach der Ableitung m glichst rauschfrei Signale verst rkt werden k nnen siehe Kap 4 3 4 Danach wurde das Signal mit einem se
148. turierung des Zellkulturkammerbodens Abbildungen b und c stellen vergr erte Ausschnitte dar welche der blauen Markierung in Abbildung a entsprechen 31 3 2 2 Schematischer Prozessablauf Die Prozessierung der Biochips l uft in 15 Prozessschritten ab in denen das Tr gersubstrat beschichtet oder eine bestehende Schicht wieder vom Tr gersubstrat entfernt wird Nach s mtlichen Bearbeitungsschritten bleiben die Leiterbahnen mit eventuell n tiger Haftschicht Schritte a h die Isolation mit freigelegten Elektroden und Kontaktpads Schritte 1 k die Oberfl chenverg tung an den Elektroden Schritte 1 m und die Zellkulturkammer Schritte n o auf dem Tr gersubstrat bestehen siehe Abb 3 8 Das neurobasale N hrmedium das sp ter in die Zellkulturkammer eingef llt werden soll wird durch die Isolation elektrisch von den Leiterbahnen getrennt sodass diese Signale von den Elektroden zu den Kontaktpads ableiten Die Oberfl chenverg tung an den Elektroden soll dabei den Kontakt zum Neuron verbessern Dazu bedarf es der in Kap 2 3 1 beschriebenen lithographischen Strukturierung in Kombination mit in Kap 2 3 2 beschriebenen plasmaunterst tzten Beschichtungsverfahren und tzprozessen Zur genaueren bersicht ist der gesamte Fertigungsablauf in Tabelle 3 3 dargestellt a Reinigung b Haftschicht 1 c Strukturierung der Leiterbahnen d tzen von e Haftschicht 2 f r Fotolack Spin Belichtung Entwi
149. u erdem wird angenommen dass der Signalgenerator geerdet ist wodurch das Ergebnis zus tzlich verf lscht werden k nnte siehe Kap 4 3 1 Abb 4 34 Schaltplan mit kontaktiertem Biosignalsimulator 86 Ein schematischer Schaltplan des Messaufbau ist in Abb 4 34 dargestellt Es wurden drei unterschiedliche Signalformen generiert siehe Abb 4 35 a c Diese simulieren von einem Biochip abgeleitete Exzitatorische Postsynaptische Potential nderungen EPSP Abb 4 35 a Potentialverschiebungen im Elektrolyten aufgrund anhaltender Aktivit t vieler beteiligter Neuronen engl Population spikes Abb 4 35 b oder Aktionsimpulse spikes Abb 4 35 c Die Messungen dieser simulierten Signale mit einem Verst rkungsfaktor von tausend siehe Abb 4 36 a b c zeigen im Unterschied zu allen bisherigen Messungen dass das Rauschen unter 50 mV lag Das bedeutet dass sich bei Messungen mit diesem Messaufbau Spannungsunterschiede von bis zu 100 uV vom Rauschen unterscheiden lassen Die Messungen mit einem Verst rkungsfaktor von hundert siehe Abb 4 36 d e f zeigen ein gleich hohes Rauschen bei zehn mal kleinerer Signalamplitude Die simulierten Aktionsimpulse gingen bei einem Verst rkungsfaktor von Hundert vollkommen im Rauschen unter siehe Abb 4 36 f Bu Abb 4 35 Vom Biosignal simulator erzeugte Signale a EPSP b Pop Spikes c Spikes 33 Tausendfach verstarkt H
150. uliert mit a 1 uM Nikotin b 5 uM Nikotin c 20 uM Nikotin Da ohne lebende Zellen bei gleicher Messkonfiguration keine derartigen Spannungsspitzen aufgezeichnet wurden siehe Kap 4 4 1 wurde angenommen dass diese elektrischen Signale von der biologischen Substanz erzeugt wurden Die Dauer von bis zu einer Millisekunde Pulsbreite die Signalform die auftretenden Pausen siehe Refrakt rzeit und die Verk rzung dieser Pausen bei erh hter Reizung w ren charakteristisch f r Aktionsimpulse In Abb 4 70 sind zum Vergleich die als Aktionsimpulse in Frage kommenden Signale einem identifizierten neuronalen Signal von Spinalganglion Zellen eines H hnerembryos die mit einer vergleichbaren Messmethode aufgenommen wurden 33 gegen bergestellt Dabei sind die genannten hnlichkeiten zu erkennen Die Unterschiede in den Amplituden und Pulsdauern sind auf die unterschiedlichen Zelltypen zur ckzuf hren Das durchschnittliche Signal Rausch Verh ltnis von 1 3 w re typisch f r diese Messung F r systematische Vergleiche empfiehlt sich eine elektrische Stimulation So w ren in einem aufgezeichneten Spannungsverlauf jeweils nach einem Stimulationsimpuls die Aktivit ten der Neuronen an den Elektroden zu sehen Erste Versuche zeigten dass f r eine elektrische Stimulation der Neuronen ohne Hochpassfilter der Masseanschluss der Zellkulturkammer weiter optimiert werden muss siehe Kap 4 4 Da ein Hochpassfilter die Signalform verzerrt siehe
151. uminium was beim H rten bei 120 C durch Verspannungen zum Ausflie en des sich verfestigenden Silikonkautschuks f hrt Mit einer geschliffenen Bodenplatte aus Aluminium lie sich der Silikonkautschuk jedenfalls einwandfrei so formen dass er sp ter auch auf dem Biochip haftete siehe Abb 4 23 e Die fertige Zellkulturkammer ist in Abb 4 23 c zur genaueren Betrachtung mit der glatten Kontaktfl che welche durch Plasmaveraschen hydrophilisiert wurde um die Haftung am Biochip zu verbessern nach oben gerichtet Der Anpressdruck beim Backen wurde ber mit Gewindestangen verbundenen Polyacrylplatten erreicht siehe Abb 4 23 d Die Haftung auf der Isolationsschicht war sehr gut und die Zellkulturkammer war auch nach Wochen noch absolut wasserdicht Die Herstellung der Zellkulturkammer siehe Kap 3 2 4 sowie das Anhaften der Zellkulturkammer auf dem Chip nach den in Kap 3 2 5 beschriebenen Parametern war somit erfolgreich Die Pfeile in Abb 4 23 sollen den zeitlichen Ablauf der Herstellung der Zellkulturkammer verdeutlichen 76 4 3 Kalibrierung des Messsystems Es wurde ein modulares Messsystem zur Ableitung und Aufzeichnung von elektrischen Signalen vom hergestellten Biochip aufgebaut Anschlie end wurde eine Eignung der unterschiedlichen Komponenten f r die Messung untersucht Zun chst wurde eine geeignete Beschaltung des Verst rkers ermittelt siehe Kap 4 3 1 und das Verhalten des Signalgenerators unter Belastung siehe
152. und Durchlichtmikroskopie c lebendes Gewebe Durchlichtmikroskopie Fortschritt der Zelladh sion von Maus SCG Zellen auf unterschiedlichen Beschichtungen Beschichtung DIV 2 DIV 5 6 DIV 14 Eignung Silizium Abl sen d Zellen Zellen abgel st verzweigt unsicher Siliziumoxid kaum verzweigt verzweigt verklumpt gut Siliziumnitrid kaum verzweigt fein verzweigt fein verzweigt optimal Unbeschichtet kaum verzweigt verzweigt stark dissoziiert Germanium Abl sen d Zellen Zellen abgel st aufgel st t dlich Titan kaum verzweigt fein verzweigt fein verzweigt optimal Nickel fast aufgel st Stark dissoziiert schlecht Chrom fein verzweigt orientiert sehr gut Platin Zellen abgel st stark dissoziiert unsicher Gold verzweigt gut Titan Gold fein verzweigt sehr gut Titan Platin fein verzweigt sehr gut Tab 4 1 Fortschritt der Zelladh sion von Maus SCG Zellen auf unterschiedlichen Beschichtungen DIV 2 5 und 14 60 100 men a 100 um Si ta u Se Zr 100 um Si Ny b 100 um Cr i 5 Q 100 um Pt g x M00 um Ge 100 1m Ni Ch Abb 4 6 Mikroskopische Aufnahmen von Maus SCG Zellen auf beschichteten Deckgl sern DIV 14 Beschichtung a Titan b Siliziumnitrid c Siliziumoxid d Germanium e Silizium f Chrom g Platin h Nickel a h zwischen zwei Deckgl sern fixiertes Gewebe Kombin
153. und die Signalkabel zu schirmen der Stimulus aber im gleichen Kabel wie die Eing nge des Verst rkers gef hrt wird erschien es sinnvoll den Einfluss der Funk bertragung zu messen Dazu wurde die Kontakthalterung zwar angeschlossen und und mit dem Biochip kontaktiert aber die Zellkulturkammer nicht mit Fl ssigkeit gef llt sodass das gemessene Grundsignal dem Netzbrumm bei 50 Hz in Mitteleuropa entspricht Mit Hilfe des Signalgenerators wurden anschlie end im Intervall von 100 ms Pulse mit einer Dauer von 1 ms und variierter Amplitude 100 mV 2 V erzeugt Abb 4 51 zeigt einen dem Messaufbau entsprechenden schematischen Schaltplan Vorverst rker Abb 4 51 Schematischer Schaltplan mit kontaktiertem Biochip ohne Fl ssigkeit 96 Die Messergebnisse mit variierter Signalamplitude sind in Abb 4 52 a f zu sehen In allen Abbildungen sind zwei Formen von St rsignalen zu erkennen Zum einen der 50 Hz Netzbrumm mit einer bei sich ndernden Signalamplitude gleich bleibenden Amplitude von 1 2 V je nach Kanal zum anderen ein sich zeitlich wiederholendes sprunghaftes St rsignal dessen Amplitude mit der generierten Pulsamplitude steigt Dabei ist zu beachten dass die eingefangenen St rsignale nur aufgrund der offenen Eing nge solche Ausma e erreichen Es zeigt sich dass die Auswirkungen der Funk bertragung bei der relevanten Amplitude des Stimulus lt 1
154. undertfach verstarkt rt u Ht z Per tg Spannung V Spannung V Spannung V Nth u FUN ENN en M Le a e A VNI UNC isha Ny Ne Spannung V Spannung V Meo lye th N ye egy itn ant Plan Mb I l 175m 200m 0 25m 50m 75m 100m 125m 150m Zeit s 0 25m 50m 75m Abb 4 36 Aufgezeichneter Spannungsverlauf simulierter Biosignale bei unterschiedlichen Verst rkungsfaktoren a c tausendfach d f hundertfach Die simulierten Biosignale waren a d EPSP b e Population Spikes c f Axonale Signale Als je 40m 60m 69 9966n 40m 60m 70 029 Zeit s 100m Zeit s M 200m 87 Aus diesen Ergebnissen lassen sich zwei wesentliche Schl sse ziehen Erstens wurde deutlich dass f r die Messung von Aktionsimpulsen ein Verst rkungsfaktor von Tausend notwendig ist Zweitens lassen sich mit dem Messaufbau Messgenauigkeiten von unter 100 uV erreichen Da die einzige nderung bei dieser Messung in Vergleich zu anderen Messungen mit schlechterem SNR in der Wahl der Signalquelle bestand wurde angenommen dass der Signalgenerator der Ursprung des zus tzlichen Rauschens war Die Ergebnisse der Funktionstests der Grundschaltung siehe Kap 4 3 2 legen dabei den Schluss nahe dass die Erdung des Signalgenerators damit zusammenh ngt Da sich die Amplitude des Rauschens nicht merklich mit dem Verst rkungsfaktor nderte wurde we
155. ung 102 4 6 Referenzmessungen Mit der Signalauswertung ist der Messaufbau methodisch abgeschlossen Zum berpr fen des gesamten Messaufbaus wurden mit einem extern eingespeisten Signal Referenzmessungen durchgef hrt Dabei wurde vor allem auch der hergestellte Biochip unter realit tsnahen Bedingungen evaluiert Im Folgenden wurde zun chst der Einfluss des Elektrodenabstands siehe Kap 4 6 1 und des Elektrodendurchmessers siehe Kap 4 6 2 auf die Signalantwort ermittelt und anschlie end eine Messung an lebenden Neuronen durchgef hrt siehe Kap 4 6 3 4 6 1 Signalantwort vs Abstand der Elektroden Um die Amplituden der an den einzelnen Elektroden abgeleiteten Signale vergleichen zu k nnen wurde der Einfluss des Elektrodenabstands f r ein gew hltes Elektrodenpaars auf die gemessene Spannungsamplitude De ermittelt u N x 7 rN t u o Zr a t Pin od x os r x NN ESAN a N P ho t Harg x ae 3 i In lt a A pe O ALES mS RR J gt v y AEAN PAD ne 4 E Dazu wurde wiederum der selbst prozessierte Biochip Ge bd 7 Be pa w E siehe Abb 4 59 mit physiologischer Kochsalzl sung bef llt und mit dem Messaufbau nach der NEL STERBEN q i EN Vierpunktmessung kontaktiert Dabei wurde nur das oe R Array mit den gr ten Elektroden Durchmesser 100 um kontaktiert Der schematische Messaufbau ist in Abb 4 60 a a rite ay
156. ungsgesteuerten Ionenkan le f r Natrium Kalium und Calciumionen andere ffnungsdauern sowie Reaktionszeiten Zeit zwischen dem Erreichen der Schwellspannung und dem ffnen der Kan le siehe Abb 2 5 Die spannungsgesteuerten Natriumkan le reagieren schneller werden jedoch auch schneller wieder geschlossen als die Kaliumkan le Die Schwellspannung ist dabei f r beide Kanalsorten etwa gleich hoch Aktivierbar Inaktiviert geschlossen geschlossen Refrakt rzeit Abb 2 5 Konformations nderungen spannungs gesteuerter Ionenkan le gem Literatur 3 Das erkl rt die Entstehung und die typische Form eines Aktionsimpulses gesendetes Signal eines Neurons siehe Abb 2 6 Aber auch das Ph nomen der Refrakt rzeit Zeit zwischen zwei m glichen Als ist somit erkl rbar Dabei ist zu beachten dass neben der absoluten Refrakt rzeit Zeit die eine Konformations nderung vom inaktivierten geschlossenen Zustand in den aktivierbaren Zustand ben tigt von rund 0 5 ms noch eine relative Refrakt rzeit Zeit die eine Konformations nderung aller Kan le ben tigt in der die Schwellspannung gr er ist von rund 3 5 ms hinzukommt 3 Aktionsimpuls 100 Resultierende Membranspannung mV 0 500 1500 2000 2500 3000 20 40 Zeit us Natriumkan le Kaliumkan le Spannungs nderung Aktionsimpuls Ruhemembranspannung Schwellspannung Abb 2 6 Schematisc
157. unktmessung siehe Kap 4 4 2 und Vierpunktmessung siehe Kap 4 4 3 zeigte au erdem dass Letztere ein besseres Signal Rausch Verh ltnis liefert Um die Offsetspannung an den Verst rkereing ngen minimal zu halten empfehlen sich bipolare Ableitungen Allerdings kann dies nur vermutet werden da die Verschaltung der Verst rkerplatinen eine bipolare Ableitung nicht gestattet Die fertigen Messsysteme mit selbst gefertigten Biochips wurden mit Referenzmessungen evaluiert und schlie lich f r die Messung an lebenden Neuronen eingesetzt Wenn die Zellkulturkammer auf Masse gelegt wurde kam es zu einem Drift des Messsignals siehe Kap 4 4 1 welcher ber die Phasengrenzeneffekte erkl rt werden kann siehe Kap 2 2 2 Es muss angenommen werden dass der verwendete Signalgenerator siehe Kap 3 5 2 bers Netz geerdet ist siehe Kap 4 3 1 und die Masse des Signalgenerators erst entkoppelt werden m sste Au erdem mussten mit dem Signalgenerator erzeugte Spannungen geteilt werden um bei einem Verst rkungsfaktor von Tausend mit dem gew hlten Messaufbau noch aufgel st werden zu k nnen siehe Kap 4 3 2 Die tats chlich am Verbraucher anliegende Spannung variiert mit dem Widerstand des Verbrauchers was insbesondere f r Referenzmessungen am Biochip ung nstig ist da die Absolutamplituden der Signalantworten wenig Aussagekraft besitzen Die ersten Ergebnisse aus den Messungen bez glich Abstand sie Kap 4 6 1 und Gr e der Elektroden
158. verst rker geeignet bei Elektrolyt Zellmembran monopolarer Ableitung gen gen einfachere Intrazellul re Ableitung Verst rkerschaltungen F r extrazellul re Ableitung von Aktivit tsmustern ganzer Populationen empfiehlt sich ein Mikroelektrodenarray Allerdings ist sein Verst rker Doppelschicht Einsatzbereich begrenzt weil die Elektrodenanordnung im Vorhinein festgelegt Bosse Ahfelluns een wird Abb 2 14 Schematische Darstellung des Punkt Kontakt Modells gem Literatur 12 20 2 2 4 Einsatzbereich eines Mikroelektrodenarrays Ein Mikroelektrodenarray MEA ist eine blicherweise symmetrische fixe Anordnung vieler kleiner Mikro Elektroden auf einem nicht leitenden Tr gersubstrat siehe Abb 2 15 13 Auch Neuronale Aktivit t kann mit einem MEA abgleitet werden um Aktivit tsmuster des kultivierten Neuronennetzwerks aufzuzeichnen Im Besonderen sind die Aktivit tsmuster bei reproduzierbarem Stimulus unter Einfluss pharmazeutischer Substanzen welche die Aktivit t der Synapsen ver ndern von Interesse Durch gezielte und regelm ige Stimulation l sst sich schlie lich auch das Wachstum der Neuronen beeinflussen Abb 2 16 Kommerzieller Biochip 13 siehe Kap 2 1 2 F r In vitro Messungen haben sich flache runde Elektroden etabliert 14 Damit die Neuronen direkt auf dem MEA kultiviert werden k nnen muss eine Zellkulturkammer Gef f r das N
159. vical ganglion SCG von M usen in einem fr hen Entwicklungsstadium eingesetzt Das SCG befindet sich in der oberen Halsregion und kann nach abtrennen des Kopfes mit einem Mikrogewebeschneider gro z gig herausgeschnitten werden Gewebereste werden anschlie end im Wasserbad mit Pinzetten entfernt und die Neuronen des Ganglions durch Trypsinierung in einem Reagenzglas vereinzelt Trypsin l st Proteine die auch die Neuronen miteinander verbinden allerdings werden auch die Zellw nde langsam aufgel st Um diesen Prozess zu stoppen wird die Trypsinl sung rechtzeitig nach 1 Minute vorsichtig abgezogen und durch eine L sung mit fetalem K lberserum engl Fetal calb serum FCS ersetzt Das restliche Trypsin soll dabei durch FCS neutralisiert werden Nach dieser Behandlung noch bestehende Verbindungen zwischen den Neuronen werden mittels Sch tteln des Reagenzglases gel st Anschlie end k nnen die einzelnen Neuronen mit Hilfe eines optisch elektronischen Systems zur Zellzahlbestimmung Durchlaufz hlung nach dem Widerstandsmessprinzip 18 in gew nschter Menge abgef llt werden Neuronenaussaat Zu Beginn der Neuronenaussaat auf ein Deckglas wird dieses zur besseren Zelladh sion mit einem Adh sionsvermittler beschichtet siehe Kap 2 2 1 Die Deckgl ser werden sterilisiert und zur Beschichtung zwei Stunden mit Poly DL Lysin PDL bedeckt zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen ber Nacht getrocknet und anschlie end zur Beschich
160. wie in Kapitel 4 3 6 gem dem Schaltplan in Abb 4 49 eine zweistufige Verst rkerschaltung eingesetzt wobei die beiden Verst rker entweder mit einer gemeinsamen Stromversorgung oder mit jeweils anderen Stromquellen betrieben wurden Um zwei unterschiedliche Versorgungsspannungen zu erzeugen wurden zwei Serienschaltungen aus jeweils gleichartigen Stromquellen auf eine gemeinsame Masse gelegt Der Massepunkt war dabei in beiden Serienschaltungen der Verbindungspunkt der beiden Stromquellen Als Signalquelle wurde wiederum der Biosimulationschip verwendet Lo oO _ xX RNDz CS ej D 4 F N LEBE rb 2 gt Abb 4 49 Schaltplan mit kontaktiertem Biosignalsimulator Die bei einem simulierten EPSP aufgezeichneten Signalantworten sind in Abb 4 50 dargestellt Abb 4 50 a zeigt den gemessenen Spannungsverlauf unter Verwendung zweier getrennter Versorgungsspannungen Abb 4 50 b zeigt den aufgezeichneten Spannungsverlauf unter Verwendung einer gemeinsamen Versorgungsspannung Beim Einsatz zweier getrennter Stromquellen mit gemeinsamer Masse kam es zu sprunghaften St rsignalen Diese St rsignale traten im Versuch mit einer gemeinsamen Stromquelle nicht auf Dabei wurden keine wesentlichen Unterschiede festgestellt wenn als Stromquellen anstatt der Netzger te Batterien eingesetzt wurden Der Ursprung der St rsignale konnte nicht genauer gekl rt werden jedoch liegt der Schluss nahe dass das Zusammenlege
161. zfassung In der Neurologie hat sich die Analyse der Reizreaktionen von Nervenzellen bew hrt um die an der neuronalen Reizverarbeitung beteiligten Mechanismen zu ergr nden So k nnen beispielsweise Nervenerkrankungen und die Einfl sse entsprechender Medikamente spezifisch untersucht werden Dabei kommen je nach Aufgabenstellung verschiedenste Methoden der Reizung und Aufzeichnung der neuronalen Reizreaktionen zum Einsatz Da die neuronale Reizverarbeitung mit Spannungs nderungen an der Zellmambran einhergeht findet die Ableitung der neuronalen Aktivit t mit Hilfe von Elektroden an der Zellmembran ein breites Anwendungsgebiet In dieser Arbeit wurde ein komplettes elektrisches Messsystem mit einem Array extrazellul rer Elektroden zur ortsaufgel sten Aufzeichnung neuronaler Signale von Zellkulturen in vitro entwickelt und systematisch untersucht Ein besonderer Schwerpunkt war dabei die Herstellung und Evaluierung eines problemorienten biokompatiblen Mikroelektrodenarrays mit integrierter Zellkulturkammer mit Hilfe halbleitertechnolgischer Verfahren Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Prozessablauf zur Produktion eines Biochips mit 10 um durchmessenden Goldelektroden entwickelt der eine Elektrodenverg tung mit Titannitrid zur Verbesserung der Zelladh sion die Strukturierung des Zellkulturkammerbodens zum geordneten Wachstum der Zellkulturen sowie die Herstellung und Anhaftung der Zellkulturkammer erlaubt Dabei wurde die Biokompatibilit t all

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