Simplexa™ Influenza A H1N1 (2009)
Contents
1. Chang Y Lemkp G et al Progressive multifocal leukoencephalopathy in persons infected with human immunodeficiency virus San Francisco 1981 1989 Ann Neurol 1991 30 597 11 NCCLS H18 A2 Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens Approved Guideline 2nd Ed 1999 12 CDC NIH Manual 1999 Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 4th ed And National Committee for Clinical Laboratory Standards NCCLS Protection of Laboratory Workers from Instruments Biohazards and Infectious Disease Transmitted by Blood Body Fluids and Tissue NCCLS M29 A Simplexa BKV Seite 13 Focus Die Anwendung von Scorpions Sonden f r Zwecke in Zusammenhang mit der In vitro Diagnostik beim Menschen ist durch eine Lizenz gesch tzt die Focus Diagnostics Inc von DxS Ltd erworben hat Die Farbstoffe Black Hole Quencher CAL Fluor und Quasar sind Marken der Biosearch Technologies Inc BTI Die Black Hole Quencher CAL Fluor und Quasar Farbstofftechnologie ist im Rahmen eines Vertrags mit BTI lizenziert und diese Produkte werden ausschlie lich f r klinische diagnostische oder Forschungs und Entwicklungszwecke verkauft VERTRIEB DURCH mdi Europa GmbH Langenhagener Str 71 30855 Langenhagen Hannover Deutschland PI MOL2300 OUS DE BESTELLINFORMATIONEN Rev E Erstellungsdatum 10 November Telefon 1 800 838 4548 nur USA 1 562 240 6500 international 2014 Fax 1 562 240 6510 TECHN2. 17 Wenn verschiedene Simplexa Kits auf der gleichen Disc angesetzt werden m ssen die Positiv und Leerwert Kontrollen aus jedem verwendeten Kit getestet werden 18 Der Master Mix enth lt gt 1 Glycerin welches bei Einatmen oder Hautkontakt zu Reizungen f hren kann Nach Einatmen oder Ber hrung sollten Erste Hilfe Ma nahmen eingeleitet werden 19 Eine l ngere Aufbewahrung extrahierter Proben bei 2 C bis 8 C wird nicht empfohlen die Leistung wurde unter diesen Bedingungen nicht gepr ft 20 Das Kit bei offensichtlich angebrochener oder besch digter Verpackung bzw angebrochenem oder besch digtem Inhalt nicht verwenden und Focus Diagnostics kontaktieren Kontaktadressen befinden sich auf der letzten Seite dieses Dokuments GEBRAUCHSANWEISUNG A PROBENGEWINNUNG Hierf r geeignet sind Urin und Plasmaproben Bei Plasmaproben keine Probenr hrchen mit Heparin als Antikoagulans verwenden Heparin inhibiert die PCR Focus Simplexa BKV Seite 4 B PROBENEXTRAKTIONSBEREICH In einem speziellen der Extraktion von Proben und Kontrollen vorbehaltenen Bereich arbeiten Die Vorbereitung der Proben f r die Extraktion wird auf einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgef hrt Extraktion mit dem MagNA Pure LC Extraktionsverfahren von Roche 1 N a e E a a 10 11 12 13 14 Die Extraktion von Nukleins uren aus Patientenproben und Assaykontrollen erfolgt mit dem Roche MagNA Pure Total Nucleic Acid
3. Deletionen oder Rearrangements aufweist oder wenn die Testung im Fr hstadium der Erkrankung erfolgt kann es zu falsch negativen Ergebnissen kommen 8 Falsch negative Ergebnisse k nnen auftreten wenn in der Probe aufgrund von Fehlern bei Entnahme Transport oder Verarbeitung zu wenig Erreger vorhanden sind 9 Wie bei anderen Testverfahren kann es auch hier zu falsch positiven Ergebnissen kommen Eine Wiederholung des Tests oder die Durchf hrung des Tests mit einem anderen Ger t k nnte in manchen F llen indiziert sein 10 Dieser Assay kann keine Erkrankung ausschlie en die durch andere bakterielle oder virale Erreger verursacht wird 11 Die Leistung dieses Assays wurde nicht f r das Screening von Urin oder Plasma auf das Vorliegen von BKV bestimmt 12 Dieser Assay ist nicht als Screeningtest oder Diagnostikum zum Nachweis des Vorliegens von BKV in Urin oder Plasma bestimmt 13 Die Leistungsf higkeit dieses Assays bez glich m glicherweise interferierender endogener oder exogener Substanzen wurde nicht ermittelt SPEZIFISCHE LEISTUNGSDATEN METHODENVERGLEICH An der Studie zur klinischen bereinstimmung nahm eine interne Pr fstelle teil Die Referenzwerte wurden mit Hilfe eines im Labor entwickelten Hochleistungstests LDT Laboratory Developed Test erstellt Die Studie zur BKV Detektion und Quantifizierung untersuchte 150 Plasma und 125 Urinproben Die Probenextraktion erfolge mit dem MagNa Pure Extraktionsverfahren Die in
4. Kitund dem Roche MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor Ger t Hinsichtlich der Nukleins ureextraktion mit diesem Kit die Gebrauchsanweisungen des Herstellers beachten Im Dropdownmen Protocol des MagNA Pure LC Systems die Optionen Total NA und anschlie end Total NA Variable_elution_volume bIk w hlen Damit werden die passenden Einstellungen f r den Lauf geladen Das Probenprotokoll sollte Total NA Variable_elution_volume sein Als Probenvolumen sollte 200 ul und als Elutionsvolumen 50 ul eingestellt sein Das Verd nnungsvolumen sollte f r alle Proben auf Null eingestellt sein Das Post Elution Protocol muss auf None eingestellt sein Darauf achten dass Proben und Kontrollen sich auf der Probeneinsatz an der richtigen Position befinden Jede Probe Niedrigpositiv und Hochpositiv Kontrolle 2 4 Sekunden vortexen und kurz zentrifugieren um die Inhaltsstoffe auf den Boden des R hrchens zu ziehen 200 ul von jeder Probe Niedrig und Hochpositiv Kontrolle sowie Leerwert Kontrolle in die entsprechende Position der Probeneinsatz pipettieren Den F llpegel der Proben und Kontrollen in der Probeneinsatz einer Sichtpr fung unterziehen um sicherzustellen dass Probe n zugegeben wurde n Die DNA zur Extraktions und Amplifikationskontrolle zweimal pulsvortexen und kurz zentrifugieren um die Inhaltsstoffe auf den Boden des R hrchens zu ziehen F r je 16 Proben 1 16 Proben 100 ul der IC
5. die interne Kontrolle nicht unbedingt nachgewiesen werden 3 Die Amplifikationskurven aller Ergebnisse sind zu berpr fen insbesondere wenn eine Data Quality Meldung Datenqualit t vorliegt Eine g ltige Amplifikationskurve zeigt einen glatten exponentiellen Anstieg Weitere Einzelheiten dazu finden sich im Benutzerhandbuch EINSCHR NKUNGEN 1 Die Personen die die Analyse durchf hren sollten sich vor Durchf hrung des Assays eingehend mit den Testverfahren und der Ergebnisinterpretation vertraut gemacht haben 2 Zur Quantifizierung unbekannter Patientenproben speichert die 3M Integrated Cycler Studio Software die letzte g ltige Kalibrierungsdatei Die Quantifizierungsstandards und Patientenproben m ssen mit der identischen Methodik extrahiert werden da es ansonsten zu fehlerhaften Testergebnissen kommen kann 3 Bei der berwachung eines Patienten muss das f r die Bestimmung der ersten Probe verwendete Extraktionsverfahren f r alle weiteren Bestimmungen verwendet werden 4 Alle Testergebnisse aus diesen und anderen Tests m ssen im Zusammenhag mit der klinischen Anamnese den epidemiologischen Daten und allen anderen Daten die dem zust ndigen Arzt vorliegen gesehen werden 5 Die Pr valenz der Infektion beeinflusst den pr diktiven Wert des Assays 6 Wie bei anderen Tests auch schlie t ein negatives Ergebnis eine BKV Infektion nicht aus 7 Falls der die Infektion verursachende Organismus Genmutationen Insertionen
6. pipettieren 5 In Bereichen in denen Kit Reagenzien und oder Humanproben gehandhabt werden darf nicht geraucht getrunken und gegessen werden In diesen Bereichen sollten auch keine Kontaktlinsen eingesetzt herausgenommen und kein Make up aufgetragen werden 6 Nicht verwendete Kit Reagenzien bzw Humanproben gem den rtlichen und nationalen Bestimmungen entsorgen 7 Der Arbeitsablauf im Labor sollte nur in einer Richtung erfolgen ausgehend vom von den Pr Amplifikationsbereich en in Richtung Ameplifikations Detektionsbereich Im folgenden Abschnitt wird der Ablauf der Arbeitsschritte von der Probenextraktion bis zur Amplifikation mittels Real Time PCR beschrieben e Am Anfang steht die Probenextraktion gefolgt von der Einstellung des Ger ts zur Durchf hrung der Real Time PCR der Zubereitung der Reagenzien und schlie lich der Amplifikation mittels Echtzeit PCR e Die Verbrauchsmaterialien und Instrumente d rfen nicht bereichs bergreifend zwischen den speziellen Probenextraktions und Probenvorbereitungsbereichen verwendet werden Sie sollten auch nicht zwischen den verschiedenen Bereichen ausgetauscht werden e Verbrauchsmaterial und technische Ausstattung f r die Probenvorbereitung d rfen nicht f r die Reagenzienzubereitung oder zum Bearbeiten amplifizierter DNA oder anderer Quellen der Zielnukleins ure verwendet werden e S mtliches Verbrauchsmaterial und s mtliche technischen Vorrichtungen f r die Amplifikation m ssen imme
7. ten der ELISA Streifen geben und Start dr cken um das magnetische Silica Gemisch zu mischen und anzusaugen Das magnetische Silica Gemisch in das jeweilige Probengef geben und die Pipettenspitze n in die Proben eintauchen Sie sollten sich unterhalb des Fl ssigkeitsspiegels befinden Auf Start dr cken um durch ansaugen und wieder abgeben das magnetische Silica mit den Proben zu mischen 3x Die Pipettenspitzen m ssen unterhalb des Fl ssigkeitsspiegels bleiben damit der Mischvorgang korrekt ausgef hrt wird F r jedes weitere Probengef Schritt 13 und 14 wiederholen Nach Zugabe des magnetischen Silica Gemisches zu allen Probengef en den Extraktionslauf starten Nach Abschluss des Laufs das die Probengef e aus dem Ger t nehmen Werden die Proben nicht sofort weiterverarbeitet sind sie in individuelle R hrchen zu berf hren um das Risiko dass magnetisches Silica zur ck in die Probe f llt zu minimieren Die extrahierte DNA bis zum Gebrauch bei 2 C bis 8 C aufbewahren Die Langzeitlagerung extrahierter Proben bei dieser Temperatur wird nicht empfohlen Extrahierte DNA Proben beim Beschicken der Disc auf einem K hlblock aufbewahren EINSTELLUNG DES GER TS F R DIE REAL TIME PCR 1 Einzelheiten dar ber wie die Integrated Cycler Studio Software zu konfigurieren ist um eine Assaydefinition hinzuzuf gen einen Lauf einzustellen und die L ufe auf dem Integrated Cycler zu analysieren sind der Bedienungsanleitun
8. 0 019 0 037 Mittelstarker Pool 5 00 x 10 4 71 x 10 3 673 80 0 022 0 050 0 025 0 048 0 076 zen 2 00 x 10 1 44 x 10 3 158 80 0 063 0 050 0 000 0 098 0 126 j Nicht Neg Pool 0 Nicht detektiert detektiert 0 n Z Simplexa BKV Seite 10 Focus Simplexa BKV Reproduzierbarkeit Standardabweichung Von Von Von Erwartete Geometrischer Log System Tag Lauf Innerhalb zu zu eines Tag Lauf Laufs Konzentration Mittelwert Mittelwert Anzahl der Kopien m Kopien ml Kopien ml Messergebnisse Gesamt Probenbezeichnung Ba 1 00 x 107 5 75 x 10 6 760 80 0 000 0 104 0 014 0 013 0 105 Mittelstarker Pool 5 00 x 10 2 87 x 10 3 458 80 0 000 0 061 0 022 0 081 0 104 a uen 2 00 x 10 1 12 x 10 3 048 79 0 088 0 049 0 000 0 090 0 135 Nicht Neg Pool 0 Nicht detektiert detektiert 0 n z Anzahl der Ergebnisse innerhalb des linearen Bereiches des Simplexa BKV Assays LINEARIT T Die Bestimmung der Linearit t erfolge unter Verwendung von Proben f r die ein BKV Stamm mit bekannter Bestandskonzentration einer klinisch negativen Urin bzw Plasmamatrix zugesetzt wurde Die Probengruppe umfasste 10 Pools bekannter Kopienzahl verteilt ber den erwarteten linearen Bereich Mindestens 3 Konzentrationen der Pools lagen an der Quantifizierungsuntergrenze LLOQ 2 lagen an der Quantifizierungsobergrenze ULOQ und
9. Graphs Mit Kurven setzen Durch Setzen des H kchens im Markierungsfeld Include Calibration Result Mit Kalibrierungsergebnis wird dem Vorhersagelauf der Kalibrierungsbericht hinzugef gt Die Seiten mithilfe der Pfeiltasten links oben im Fenster Print Preview Druckvorschau durchbl ttern 4 Den Bericht nach Bedarf Print Ausdrucken oder Save Abspeichern 5 Die pr diktiven Werte ggf exportieren QUALIT TSKONTROLLE Jedes Labor sollte ausgehend von den vor Ort geltenden Gesetzen Bestimmungen und der blichen guten Laborpraxis eigene Qualit tskontrollbereiche wie auch die H ufigkeit der Qualit tskontrollen ermitteln ERSTELLUNG VON ERGEBNISBERICHTEN 1 Laufvalidit t Durch berpr fung der BKV und IC Ergebnisse f r die Niedrigpositiv Kontrolle LPC Hochpositiv Kontrolle HPC und Leerwert Kontrolle NTC die Validit t des Laufs ermitteln Damit der Lauf als valide gilt m ssen alle drei Kontrollen die Akzeptanzkriterien erf llen Bei ung ltigem Lauf m ssen alle Patientenproben erneut getestet werden Akzeptanzkriterien BKV DNA f r die Extraktions und Amplifikationskontrolle IC No Template Control NTC Nicht detektiert Detektiert Low Positive Control LPC Innerhalb des Toleranzwertes auf dem s High Positive Control HPC Innerhalb des Toleranzwertes auf dem nicht Suireffend chargenspezifischen Etikett e Der Leerwert NTC entspricht den Akzeptanzkriterien falls kein BKV detektiert und die interne Ko
10. ISCHE HILFE Telefon 1 800 838 4548 nur USA 1 562 240 6500 International FOC U S Fax 1 562 240 6526 Diagnostics Besuchen Sie unsere Webseite www focusdx com Cypress California 90630 USA
11. Primary Prim r Workflow Defaults Standardarbeitsabl ufe On board lysis Incubation Lyse Inkubation im Ger t On board Silica Incubation Inkubation mit Silica im Ger t Sample Addition Guidance Off Hinweise zur Zugabe von Proben Aus Reagent Tracking R ckverfolgung der Reagenzien Lysis Silica Internal Control reagent tracking disabled R ckverfolgung von Lyse Reagenz Silica und interner Kontrolle deaktiviert Die individuellen Probendaten in der Bildschirmmaske Extraction Request Extraktionsanforderung wie folgt eingeben Sample ID Proben ID Probenbezeichnung eingeben Request Anfrage Generic 2 0 1 oder quivalent Volume Volumen mL 0 200 Eluate Eluat uL 50 Type Typ Primary Prim r Priority Priorit t Normal Matrix Other Andere Nach den Angaben im Benutzerhandbuch in der NucliiSENS easyMAG Software einen Extraction Run Extraktionslauf erstellen Jede Probe Niedrigpositiv und Hochpositiv Kontrolle 2 4 Sekunden vortexen und kurz zentrifugieren um die Inhaltsstoffe auf den Boden des R hrchens zu ziehen 200 ul der Probe der Niedrig Hochpositiv und der Leerwert Kontrolle in Probengef e pipettieren Die interne Kontrolle zweimal 2x pulsvortexen und kurz zentrifugieren um die Inhaltsstoffe auf den Boden des R hrchens zu ziehen In jede Proben und Kontroll Kavit t 5 ul interne Kontrolle pipettieren Bei jeder Kavit t die Pipettenspitze wechseln Nach den Angaben im Benutzerhan
12. Simplexa BKV MOL2300 Rev E OCUS Diagnostics Ein Real Time PCR Assay zur quantitativen In vitro Bestimmung des BK Virus BKV In vitro Diagnostikum ANWENDUNGSBEREICH Der Simplexa BKV Assay von Focus Diagnostics dient der quantitativen In vitro Bestimmung der Nukleins uren des BK Virus BKV im Urin und oder Plasma mit dem Integrated Cycler von 3M Dieser Assay ist f r die Verwendung in Verbindung mit dem klinischen Bild sowie anderen Laborparametern des Krankheitsverlaufs als Hilfsmittel zur Behandlung von mit BKV infizierten Patienten bestimmt Der Assay ist nicht zum Screening von Spendern vorgesehen Der Assay darf nur fachgerecht eingesetzt werden ZUSAMMENFASSUNG UND ERL UTERUNG Das BK Virus BKV geh rt zu den humanen Polyomaviren und ist ein unbeh lltes Virus mit einem zirkul ren doppelstr ngigen DNA Genom von 5 300 bp Das BKV wurde erstmalig 1971 im Urin eines nierentransplantierten Patienten isoliert und als Mitglied der Familie Polyomaviridae identifiziert Im Erwachsenenalter betr gt die Seropr valenz weltweit 70 bis 90 Meist kommt es vor dem vierten Lebensjahr zur Serokonversion Die Vir mie bei Prim rinfektion f hrt zur Besiedelung der Nieren wo das Virus eine klinisch latente Infektion hervorrufen kann blicherweise schlummert das Virus doch kann es in bestimmten Patientenpopulationen beispielsweise bei immunsupprimierten Patienten oder Schwangeren immer wieder zur Reakt
13. Verschleppung festgestellt LITERATUR 1 Padgett B L and Walker D L 1973 Prevalence of antibodies in human sera against JC virus an isolate from a case of progressive multifocal leukoencephalopathy J Infect Dis 127 4 467 470 2 Shah KV Daniel RW Warszawski RM High prevalence of antibodies to BK virus an SV40 related papovavirus in residents of Maryland J Infect Dis 1973 128 784 3 Gardner SD Prevalence in England of antibody to human polyomavirus B K BMJ 1973 1 77 4 Mantyjarvi RA Meurman OH Vihma L Berglund B A human papovavirus BK biological properties and seroepidemiology Ann Clin Res 1973 5 283 5 Flaegstad T Ronne K Filipe AR Traavik T Prevalence of anti BK virus antibody in Portugal and Norway Scand J Infect Dis 1989 21 2 145 7 6 Rziha HJ Bornkamm GW zur Hausen H BK virus I Seroepidemiologic studies and serologic response to viral infection Med Microbiol Immunol Berl 1978 Jul 4 165 2 73 81 AU Dei R Marmo F Corte D Sampietro MG Franceschini E Urbano P 7 Age related changes in the prevalence of precipitating antibodies to BK virus in infants and children J Med Microbiol 1982 Aug 15 3 285 91 8 Arthur RR Shah KV Occurrence and significance of papovaviruses BK and JC in the urine Prog Med Virol 1989 36 42 9 Shah KV Polyomaviruses IN Virlogy 3 Ed Fields BN Knope DM Howley PM Eds Lipincott Raven Publishers Philadelphia 1996 p 2027 10 Gillespie SM
14. d dNTPs Simplexa Extraction amp Ein 577 Basenpaare umfassendes DNA Fragment aus dem Gen das die N Methyltransferase der gro en Amplification Control DNA IC DNA Untereinheit der Ribulose 1 5 bisphosphat Carboxylase Oxygenase der Pflanze Arabidopsis thaliana f r die Extraktions und kodiert Amplifikationskontrolle Simplexa EBV Positive Control _ A f LPC Niedrigpositiv Kontrolle BKV Amplicon in humaner Basismatrix Simplexa EBV High Positive Control HPC Hochpositiv BKV Amplicon in humaner Basismatrix Kontrolle Simplexa EBV Barcode Card u Barcode Karte Test spezifische Parameter ERFORDERLICHES JEDOCH NICHT MITGELIEFERTES MATERIAL Simplexa BKV Quantitation Standard Set REF MOL2310 3M Integrated Cycler mit Integrated Cycler Studio Software Version 3 0 oder h her Universal Discs zur Verwendung auf dem Integrated Cycler Universal Disc Abdeckfolie Roche MagNA Pure LC und zugeh riges Verbrauchsmaterial Roche MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit Roche Kat Nr 3038505001 P NucliSENS easyMAG Ger t von bioM rieux und dazugeh rige s Verbrauchsmaterial und Reagenzien P Biohit bioMerieux Mehrkanalpipette P ELISA Streifenplatte 0 Ein Mehrkanalmikropipette n und oder Repetiermikropipette n mit einem Genauigkeitsbereich von 1 10 ul 10 100 ul und 100 1000 ul 11 Gefrierschrank 10 C bis 30 C mit manueller Abtaufunktion f r die Lagerung der gefrorenen Kit Kom
15. dass die Primer BKV spezifisch sind und keine Kreuzreaktion mit anderen Erregern aufweisen u a mit HIV 1 HIV 2 HSV 1 HSV 2 HHV 6 JCV VZV EBV CMV Staphylococcus saprophyticus Enterococcus Candida Enterobacter Citrobacter E coli Klebsiella und Proteus mirabilis Weiterhin ist auch aus den Datenbanken der Nukleins uresequenzen ersichtlich dass die Primer BKV spezifisch sind und keine signifikante Homologie mit anderen Erregern oder menschlicher DNA aufweisen INTERFERENZ Die Leistungsf higkeit dieses Assays bez glich m glicherweise interferierender Substanzen wurde nicht ermittelt Der automatisierte Nukleins ureextraktionsprozess mit dem MagNA Pure System oder dem NucliSENS easyMAG_ entfernt Verunreinigungen effektiv aus den Proben da die Nukleins uren w hrend der Extraktion isoliert und gewaschen werden Die internen Kontrollen machen den Endnutzer auf eine m gliche Hemmung der PCR aufmerksam wenn das Target und die interne Kontrolle nicht detektiert werden ist die Messung ung ltig REPRODUZIERBARKEIT Die Untersuchung zur Reproduzierbarkeit wurde auf zwei Integrated Cycler Systemen durchgef hrt mit einem Bediener je System und zwei L ufen pro Tag ber f nf Tage Die Probengruppe zur Reproduzierbarkeit umfasste Kontrollen NTC HPC und LPC Quantifizierungsstandards QS 1 bis QS 5 negative Pools Plasma und Urinmatrix ohne Zusatz und positive BKV Pools in Plasma und Urinmatrizen mit drei unterschiedlichen Konz
16. dbuch das die Probengef e neue Verbrauchsmaterialien f r den Aspirator und die Reagenzien in das easyMAG Ger t laden G Simplexa BKV Seite 5 FOCUS 10 Die Lyse im Ger t starten und die lysierten Proben 10 Minuten inkubieren bevor das magnetische Silica Gemisch 11 12 13 14 15 16 17 zugegeben wird Das magnetische Silica Gemisch w hrend der Lyse Inkubation vorbereiten Silica durchmischen und mit nukleasefreiem Wasser verd nnen indem 1 Teil magnetisches Silica zu 3 Teilen nukleasefreiem Wasser gegeben wird z B 270 ul magnetisches Silica 810 ul nukleasefreies Wasser Je Probe mindestens 135 ul magnetisches Silica Gemisch vorbereiten Zum bertragen des Silica Gemisches in die Kavit ten der ELISA Streifen das magnetische Silica Gemisch anmischen und 1 Spitze sowie den Betriebsmodus P2 der Biohit Pipette verwenden Auf Start dr cken um 1050 ul des magnetischen Silica Gemisches anzusaugen und nochmals auf Start dr cken um das erste Volumen zur ck in das R hrchen mit Silica Gemisch auszuwerfen Auf Start dr cken um je 125 ul des magnetischen Silica Gemisches in 8 einzelne Kavit ten des ELISA Streifens zu pipettieren Bedarfsweise f r weitere ELISA Streifen wiederholen Nach der 10 min tigen Lyseinkubation 8 Spitzen je ELISA Streifen und den Betriebsmodus P3 der Biohit Pipette verwenden um jeder Probe im Probengef 100 ul des magnetischen Silica Gemisches zuzusetzen Die Spitzen in die Kavit
17. die Auswertung einflie enden Proben Plasma 75 Urin 55 lagen innerhalb des kombinierten Messbereiches des Referenz LDT und des Simplexa BKV Assays Die Passing Bablock Regression ergab f r Plasma eine Steigung von 1 05 sowie einen Achsenabschnitt von 0 83 und f r Urin eine Steigung von 1 05 sowie einen Achsenabschnitt von 0 82 Simplexa BKV Seite 8 PROBEN Matrix Plasma Extraktionsmethode MagNA Pure Regressionsanpassung nach Passing Bablock mit Konfidenzgrenze P BReg Kure 0 83 1 05 X 95 CI f r Achsenschnittpunkt 0 9554 0 7204 195 CI f r Steigung 1 0276 1 0778 In 75 Kotrelationskoeffizient R 1 Simplexa BKV Konz Log10 Kopien ml 5 6 LDT BKV Konz Log10 Kopien ml Simplexa BKV Konz Log10 Kopien ml P B Anpassung Identit tskurve Ref Test PROBEN Matrix Urin Extraktionsmethode MagNA Pure Regressionsanpassung nach Passing Bablock mit Konfidenzgrenze P B Reg Kurve 0 82 1 05 X 95 CI f r Achsenschnittpunkt 1 0538 0 6348 95 CI f r Steigung 1 0104 1 0852 n 55 Korrelationskoeffizient R 0 99 Simplexa BKV Konz Log10 Kopien m O Simplexa BKV Konz Log10 Kopien ml Identit tskurve Ref Test Klinische Proben mit Ergebnissen im linearen Bereich des Simplexa BKV Assays wurden auch mittels easyMAG Extraktion getestet Diese Proben verhielten sich quivalent zu den mit MagNA Pure extrahierten Proben f r Plasma ergab sich eine Steigung
18. die PCR Vorbereitung nicht sofort nach dem Ansetzen des Reaktionsgemisches erfolgt sollte dieses bei 2 C bis 8 C gelagert werden BEREICH F R DIE REAL TIME PCR AMPLIFIKATION In einem speziellen der Vorbereitung der Universal Disc mit 96 Kavit ten f r den Simplexa BKV Assay vorbehaltenen Bereich arbeiten Bei der Durchf hrung folgender Vorbereitungsschritte das beispielhafte Disc Layout in Abschnitt C beachten a wi In jede Kavit t 5 0 ul des Reaktionsgemischs pipettieren 5 0 ul der extrahierten Positivkontrollen in die Kavit t HPC und LPC pipettieren 5 0 ul der extrahierten Patientenprobe in die entsprechende Kavit t S pipettieren 5 0 ul der extrahierten Leerwert Kontrolle in die Kavit t NTC pipettieren Die Disc mit dem Universal Disc Cover Tape abdecken Den Deckel des Integrated Cycler ffnen Simplexa BKV Seite 6 Dlagsasnica 7 Die verschlossene Universal Disc auf die Platte legen 8 Den Deckel vorsichtig schlie en 9 Auf Run Lauf klicken 10 Auf Start klicken F DATENANALYSE 1 Nach Beendigung des Laufs auf Analyze Analysieren klicken 2 Die Farbstoffe einzeln pr fen oder durch Anklicken des Markierungsfeldes neben jedem Farbstoff alle Farbstoffe Kan le ausw hlen 3 Durch Anklicken von Print Preview Druckvorschau rechts unten wird eine Zusammenfassung der pr diktiven Werte ausgegeben Zur Vorschau der Amplifikationskurven das H kchen im Markierungsfeld Include
19. die verbleibenden Pools verteilten sich etwa gleichm ig zwischen der LLOQ und der ULOQ Jede Probe wurde im Zufallsverfahren in mindestens 3 Replikaten getestet Die Linearit t wurde f r jeden Probentyp mit jedem der beiden Extraktionsverfahren ermittelt Die einzelnen Werte f r den Messbereich sind in der folgenden Tabelle aufgef hrt MagNA Pure easyMag MagNA Pure easyMag Kopien mi 250 bis 1 00 x 10 250 bis 1 00 x 10 500 bis 1 00 x 10 250 bis 1 00 x 10 Simplexa BKV Assay Linearit t f r Plasma MagNA Pure 3 x S ap S x x x m z 2 2 I 40 5 0 5 0 Erwartete BKV Konz Log10 Kopien ml Regressionsgleichung Log_Simplexa_BKV 0 085935 0 987908 Log_Erwartete_ BKV ocus Simplexa BKV Seite 11 lagmanticr Simplexa BKV Assay Linearit t f r Urin MagNA Pure Simplexa BK V K onz Log 10 Kopien ml m aaa aaa 3 0 40 5 0 60 70 80 90 10 Erwartete BKV Konz Log10 Kopien mi Regressionsgleichung Log_Simplexa BKV 0 086666 1 084331 Log_Erwartete BKV Simplexa BKV Assay Linearit t f r Plasma easyMAG o o o a a an A Simplexa BKV Konz Log10 Kopien ml N ERE a Dun co 6 0 Erwartete BKV Konz Log10 Kopien ml Regressionsgleichung Log_Simplexa_BKV 0 213131 0 986263 Log_Erwartete_BKV S
20. entrationen d h einen schwach positiven Pool Zusatzkonzentration von etwa der zwei bis vierfachen Nachweisgrenze LoD einen mittelstarken Pool etwa die 8 bis 10 fache LoD und einen schwach positiven Pool oberer Bestimmungsbereich des Assays F r die Studie wurden vier Kopien jeder Panelprobe getestet was f r jedes Panelelement insgesamt 80 Bestimmungen ergab Die Ergebnisse zur Reproduzierbarkeit jeder Panelprobe sind in der nachstehenden Tabelle aufgelistet Simplexa BKV Reproduzierbarkeit Standardabweichung Von Von Von Erwartete Geometrischer Log System Tag Lauf Innerhalb Konzentration Mittelwert Mittelwert Anzahl der zu zu zu eines Probenbezeichnung Kopien m Kopien ml Kopien mi Messergebnisse System Tag Lauf Laufs Gesamt NTC 0 Nicht detektiert Nicht 0 Nicht zutreffend n z detektiert HPC 5 08 x 107 4 81 x 107 7 682 74 0 026 0 012 0 025 0 024 0 045 LPC 6 32 x 10 6 44 x 10 3 809 80 0 014 0 034 0 015 0 045 0 060 QS 1 4 70 x 10 gt 1x10 n z 0 n z QS 2 5 29 x 10 5 35 x 10 6 728 79 0 016 0 021 0 024 0 024 0 043 QS 3 2 74 x 10 5 56 x 10 4 745 80 0 000 0 021 0 014 0 021 0 032 QS 4 5 83 x 10 5 89 x 10 3 770 80 0 005 0 025 0 017 0 047 0 056 QS 5 1 05x 10 1 02x 10 3 007 80 0 008 0 031 0 000 0 083 0 089 Plasma Hochkonzentrierter 7 6 Pool 1 00x 10 9 11x10 6 960 74 0 016 0 009 0 026
21. g des Integrated Cycler zu entnehmen Hinweis Vor Durchf hrung eines Vorhersagelaufes muss eine valide Standardkurve Kalibrierungslauf eingerichtet werden REAGENZIENZUBEREITUNGSBEREICH Ein f r die Vorbereitung des Reaktionsgemisches f r den Simplexa BKV Assay reservierter Bereich 1 Oy Om E Primer Mix und Master Mix bei Raumtemperatur etwa 18 C bis 25 C auftauen Jedes R hrchen im Kit enth lt eine f r 50 Reaktionen ausreichende Reagenzienmenge Vor jedem Gebrauch die Primer Mix und Master Mix Komponenten durch sechs bis achtmaliges vorsichtiges Umdrehen durchmischen und dann kurz zentrifugieren um die Inhaltsstoffe auf den Boden des R hrchens zu ziehen In ein Polypropylen Mikrozentrifugenr hrchen entsprechender Gr e jede Komponente in dem in der folgenden Tabelle angegebenen Volumen pipettieren um das erforderliche Volumen des Reaktionsgemisches zuzubereiten Reaktionsgemischvolumen Reaktionsgemisch Reaktionsgemisch Reagens Volumen 1 Volumen 10 Reaktion Reaktionen Simplexa Master Mix 4 0 ul 40 ul Simplexa BKV Primer Mix 1 0 ul 10 ul Gesamtvolumen 5 0 ul 50 ul Das Reaktionsgemisch durch Umdrehen des R hrchens oder durch 8 bis 10 maliges Pipettieren vorsichtig mischen Kurz zentrifugieren um die Inhaltsstoffe auf den Boden des R hrchens zu ziehen Mit der Vorbereitung der PCR fortfahren Das Reaktionsgemisch innerhalb einer Stunde nach Zubereitung verwenden Sofern
22. implexa BKV Seite 12 Simplexa BKV Assay Linearit t f r D16 Urin easyMAG E z 4 a 2 To Q N S 5 gt f gt A Ea Z E a Nn q ji T T 15 T T T meee e e 0 0 10 20 30 4 0 5 0 60 70 8 0 9 0 10 Erwartete BKV Konz Log10 Kopien ml Regressionsgleichung Log_Simplexa_BKV 0 213131 0 986263 Log_Erwartete_ BKV MESSBEREICH Alle Extraktionsverfahren und Probentypen waren bis zu einer Konzentration von 1 x 10 Kopien mi linear Der Messbereich des Assays wurde ausgehend von der Nachweisgrenze festgelegt da diese h her war als die Untergrenze der Linearit t und lag damit zwischen gt 510 Kopien ml und gt 1 x 10 Kopien ml Proben oberhalb des linearen Bereiches werden als gt 1 x 10 Kopien ml ausgewiesen und Proben unterhalb von 510 als lt 510 Kopien ml KONTAMINATION DURCH VERSCHLEPPUNG Die Amplifikation von Verschleppungen wurde mit anderen Assays f r das Ger t und die Universal Disc ermittelt Die Studien zielten darauf ab Kontaminationen in hoch negativen Proben festzustellen Die Studie bestand daraus eine hoch positive und eine hoch negative Probe abwechselnd auf jeder Disc zu platzieren Der Verschleppungseffekt wurde durch Vergleich der beobachteten Negativrate f r die hoch negative Probe mit der erwarteten Rate unter normalen Bedingungen der Testwiederholung bestimmt In den bisherigen Untersuchungen wurde keine signifikante Kontamination durch
23. in 6 ml Lysepuffer in ein konisches R hrchen pipettieren Kurz auf dem Vortex mischen In das entsprechende Fach des MagNA Pure Extraktionsger tes geben Werden beispielsweise mehr als 16 Proben 17 32 Proben extrahiert m ssen 200 ul der IC in 12 ml Lysepuffer in ein konisches R hrchen pipettiert werden Kurz auf dem Vortex mischen In das entsprechende Fach des MagNA Pure Extraktionsger tes geben Die Probeneinsatz in das MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extraktionsger t berf hren und die Extraktion starten Nach Abschluss der Nukleins ureextraktion kann die Kartusche mit den extrahierten Kontrollen und Patientenproben aus dem MagNA Pure Extraktor herausgenommen und verschlossen werden Die extrahierte DNA vor der Verwendung bei 2 C bis 8 C aufbewahren Die Langzeitauflagerung extrahierter Proben bei dieser Temperatur wird nicht empfohlen Extrahierte DNA Proben beim Laden der Disc auf einem K hlblock aufbewahren Extraktion mit dem NucliSENS easyMAG Extraktionsverfahren von bioM rieux 1 2 Zur Bedienung von Ger t und Software ist das Benutzerhandbuch des NucliSENS easyMAG zu beachten In der NucliSENS easyMAG Software die Vorlage Generic Allgemein mit folgenden Einstellungen w hlen Default Request Standardanfrage Generic 2 0 1 oder quivalent Run Name Prefix Anfangskode der Laufbezeichnung beliebig Sample ID prefix Anfangskode der Proben ID beliebig Sample Type Probentyp
24. ivierung kommen Diese Reaktivierung kann sich vielf ltig manifestieren und reicht von einer subklinischen Vir mie und Virurie bis hin zur Nephropathie und Ureterstenose nach Nierentransplantation Eine offenkundige klinische Erkrankung als Folge einer BKV Infektion ist selten korreliert aber mit dem Grad der Immunsuppression Derzeit stellt die PCR das einzige zuverl ssige Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung des BKV dar Bedingt durch das langsame Wachstum und die Notwendigkeit spezieller Zelllinien liefert die Anz chtung des Virus nur selten zeitnahe hilfreiche Informationen zur Behandlung der Patienten Serumassays sind ebenfalls kaum von Nutzen da ein Gro teil der Bev lkerung seropositiv f r das BKV ist und die Erkrankung aus der Reaktivierung der latenten Infektion resultiert GRUNDLAGEN DES VERFAHRENS Bei dem Test handelt es sich um ein Real Time PCR System zur Amplifikation und Detektion Der DNA Nachweis des BK Virus im Urin und Plasma erfolgt durch eine bifunktionelle fluoreszierende Primersonde Der Test besteht im Wesentlichen aus zwei Schritten 1 Extraktion von DNA aus Patientenproben 2 Amplifizierung eines spezifischen Zielmolek ls in jedem Analyt und der internen Kontrolle mithilfe einer bifunktionellen fluoreszierenden Primersonde und eines R ckw rts Primers Der Assay liefert eine Zahl als Ergebnis die virale DNA in der Probe wird ber eine gut konservierte Zielregion im VP2 Gen des BKV Genoms identifi
25. ntrolle IC nachgewiesen wurde Die Detektion von BKV in der Leerwert Kontrolle zeigt an dass die Proben m glicherweise w hrend der Verarbeitung kontaminiert wurden e Die Niedrigpositiv Kontrolle LPC erf llt die Akzeptanzkriterien falls die in der LPC detektierte BKV Konzentration innerhalb der Toleranzgrenzen wie auf dem chargenspezifischen Etikett angegeben liegt Die IC sollte nachgewiesen werden dies ist aber nicht zwingend erforderlich e Die Hochpositiv Kontrolle HPC erf llt die Akzeptanzkriterien falls die in der HPC detektierte BKV Konzentration innerhalb der Toleranzgrenzen wie auf dem chargenspezifischen Etikett angegeben liegt Die IC sollte nachgewiesen werden dies ist aber nicht zwingend erforderlich 2 Interpretation der Ergebnisse Interpretation der Ergebnisse Beispiel BKV Wert Interpretation Nicht detektiert Detektiert BKV nicht detektiert lt 510 Kopien ml n zZ BKV detektiert unterhalb LLoQ Lower Limit of Quantitation X Kopien ml n zZ BKV Nachweis in der bestimmten Konzentration gt 1x10 Kopien ml n zZ BKV detektiert oberhalb ULoQ Upper Limit of Quantitation Nicht detektiert Nicht detektiert Ung ltig erneut extrahieren und Test wiederholen Simplexa BKV Seite 7 Gocus 3 Validit t der Probenergebnisse Eine Probe ist valide falls entweder 1 kein BV detektiert und die IC nachgewiesen wurde oder 2 BKV detektiert wurde Bei BKV positiven Ergebnissen muss
26. onskontrolle maximal 30 Tage bei 2 8 C aufbewahrt werden a a G Simplexa BKV Seite 3 FOCUS 6 Primer Mix Master Mix Positivkontrollen und DNA f r die Extraktions und Amplifikationskontrolle nicht wieder einfrieren 7 Keine Reagenzien aus verschiedenen Kitchargen kombinieren WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN 1 In vitro Diagnostikum 2 Alle Humanmaterialien sollten als potentiell infekti s behandelt werden Das Ursprungsmaterial dieses Produktes einschlie lich der Kontrollen ist mit US FDA anerkannten Methoden auf HBs Antigen Hepatitis C Antik rper und HIV 1 2 AIDS Antik rper untersucht und f r negativ befunden worden Dennoch gew hrleistet keine der bekannten Testmethoden absolute Garantie daf r dass Produkte die aus menschlichem Blut gewonnen wurden die genannten oder andere infekti se Krankheiten nicht bertragen k nnen Alle Kontrollen Serumproben und Ger te die in Kontakt mit den Proben kommen sollten daher als potentiell infekti s angesehen und durch entsprechende biologische Sicherheitsma nahmen dekontaminiert oder entsorgt werden Die amerikanischen CDC und NIH empfehlen dass m glicherweise infekti se Substanzen entsprechend Biosicherheitsstufe 2 gehandhabt werden 3 Beim Umgang mit den Kit Reagenzien pers nliche Schutzausr stung wie jedoch nicht beschr nkt auf Handschuhe und Laborkittel tragen H nde nach der Durchf hrung des Tests gr ndlich waschen 4 Nicht mit dem Mund
27. ponenten 12 Gefrierschrank 10 C bis 30 C mit manueller Abtaufunktion f r die Lagerung der gefrorenen Proben 13 K hlschrank mit 2 C bis 8 C f r Proben und aufgetaute Kit Komponenten 14 Biologische Sicherheitswerkbank Laminarflow Haube f r die Durchf hrung der Extraktionen 15 Mikrozentrifuge 16 Vortex Mischer 17 Sterile RNase DNase freie Einmalpipettenspitzen mit Aerosolbarriere 18 1 5 ml Polypropylen Mikrozentrifugenr hrchen und St nder RNase DNase freie R hrchen werden empfohlen sind aber nicht vorgeschrieben 19 Einweg Schutzhandschuhe ungepudert 20 Nukleasefreies Wasser zur Extraktion und als Leerwert Kontrolle NTC No Template Control 21 K hlst nder f r 1 5 ml Mikrozentrifugenr hrchen Zur Verwendung beim Roche MagNA Pure LC Extraktionsverfahren Zur Verwendung beim bioMerieux easyMAG Extraktionsverfahren ze Na 1 B N gt HALTBARKEIT UND HANDHABUNG Reagenzien bei 10 bis 30 Caufbewahren keine Gefrierger te mit Abtauautomatik verwenden Reagenzien vor Gebrauch bei Raumtemperatur auftauen lassen Temperaturbereich ca 18 C bis 25 C Kits und Reagenzien nach Ablauf des Verfallsdatums nicht mehr verwenden Das Reaktionsgemisch nach Zugabe des Master Mix innerhalb einer Stunde verwenden Das Reaktionsgemisch bei 2 C bis 8 C lagern bis die PCR angesetzt werden kann 5 Nach dem ersten Auftauen k nnen Primer Mix Master Mix und DNA f r die Extraktions und Amplifikati
28. r im Bereich des Real Time PCR Ger ts verbleiben e Auch die pers nliche Schutzausr stung wie z B Laborkittel und Einmalhandschuhe sollten bereichsspezifisch gehandhabt werden 8 Die Kontamination von Reagenzien bzw Patientenproben kann zu einer Verf lschung der Testergebnisse f hren Unter aseptischen Bedingungen arbeiten 9 Die Reagenzien vorsichtig pipettieren und handhaben um eine Kontamination mit Material aus benachbarten Kavit ten zu verhindern 10 Geeignete Pipettiertechniken anwenden und f r die Dauer des Tests das gleiche Pipettierschema einhalten um optimale und reproduzierbare Werte zu erhalten 11 Die Reagenzien nicht gegen Reagenzien anderer Kit Chargen oder anderer Hersteller austauschen oder mit diesen mischen 12 Die Verschlusskappen der Reagenzr hrchen nicht vertauschen Dies k nnte zur Kontamination f hren und die Testergebnisse beeintr chtigen 13 Nur das in diesem Beipackzettel beschriebene Protokoll verwenden Bei Nichteinhaltung des Protokolls oder der angegebenen Zeiten sowie Temperaturen kann es zu fehlerhaften Testergebnissen kommen 14 Der Testansatz sollte bei Raumtemperatur Temperaturbereich ca 18 C bis 25 C erfolgen Beim Mischen der Reagenzien die Enzyme durch einen K hlblock gek hlt halten 15 Universal Discs die bereits in Kontakt mit Patientenproben oder Reagenzien gekommen sind nicht wieder verwenden 16 Gebrauchte Discs ohne Abnehmen oder Entfernen der Abdeckfolie entsorgen
29. von 0 98 sowie ein Achsenabschnitt von 0 03 und f r Urin eine Steigung von 1 06 sowie ein Achsenabschnitt von 0 4 ANALYSEEMPFINDLICHKEIT NACHWEISGRENZE Die Nachweisgrenze LoD Limit of Detection errechnete sich aus k nstlichen Proben eines BKV Stammes mit bekannter Bestandskonzentration der einer klinisch negativen Plasma bzw Urinmatrix zugesetzt wurde Die Probengruppe umfasste Negativproben Plasma und Urinmatrix ohne Zusatz und seriell verd nnte Proben mit unterschiedlicher Konzentration im Bereich der ungef hren Nachweisgrenze ermittelt im Rahmen einer fr heren Testphase Zu jeder Kombination aus Extraktionssystem easyMAG MagNA Pure und Probentyp Plasma Urin wurden 24 Kopien aus drei 3 unterschiedlichen Extraktionen und PCR L ufen f r jeden Konzentrationsspiegel mittels Probit Analyse ausgewertet um die geringste Konzentration zu ermitteln die sich mit einer Wahrscheinlichkeit von 95 noch genau detektieren lie Die Nachweisgrenze wurde f r jedes der beiden Extraktionsverfahren sowie f r jeden Probentyp ermittelt Die einzelnen Werte f r die Nachweisgrenze sind in der folgenden Tabelle aufgef hrt Basierend auf der h chsten f r alle Extraktionsverfahren und Probentypen ermittelten Nachweisgrenze wurde eine Nachweisgrenze von 510 Kopien ml festgelegt Simplexa BKV Seite 9 Focus Plasma MagNA Pure easyMag MagNA Pure easyMag ANALYTISCHE REAKTIVIT T KREUZREAKTIVIT T Aus Studien ist bekannt
30. ziert Zur berpr fung der Extraktion und zur Erkennung einer Hemmung der PCR wird eine interne Kontrolle mitgef hrt Das aus jeder Probe gewonnene Amplifikationssignal wird mit einer Kalibrierkurve verglichen und quantifiziert MITGELIEFERTES MATERIAL Das Simplexa BKV Kit von Focus Diagnostics enth lt ausreichend Reagenzien f r 100 Bestimmungen Beschreibung des Kits EG SYMBOL Kurzbezei Deckeitar Anzahl Reaktionen Volumen Bezeichnung der Komponente AUF ETIKETT chnung on pro pro Gef Kit Fl schchen Simplexa BKV Primer Mix MOL2301 REAG A pm Baum 2 soro T o Simplexa Master Mix a ne Gr n 2 50 100 20041 Simplexa Extraction amp Amplification Control DNA Forever eono fie e T Ba ff sonst Do Simplexa BKV Low Positive Control MOL2302 CONTROL LPC wei 6 16 200W Simplexa BKV High Positive Control MOL2303 CONTROL HPC Rot 6 1 6 200 ul G Simplexa BKV Seite 2 FOCUS Beschreibung der Komponente Kit Komponente Beschreibung Mit fluoreszierendem Farbstoff markierte Primer zur spezifischen Quantifizierung des BKV und der internen Kontrolle Sonden Target Fluorophor Exzitation Emission Zielgen Simplexa BKV Primer Mix PM Farbstoff Primer Mix BKV FAM 495 nm 520 nm VP2 Gen Interne A thaliana Kontrolle Q670 644 nm 670 nm Gen Simplexa Master Mix MM Master Mix DNA Polymerase Puffer un
Download Pdf Manuals
Related Search