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Elucigene® Male Factor Infertility

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1. ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 15 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Allgemeine Interpretation der Ergebnisse PCR Produkte werden als mit 5 Farbstoffen markiertes System mit dem Filterset G5 beobachtet Filterset G5 weist die mit 6 FAM blau VIC gr n NED gelb und PET rot markierten Fragmente sowie den mit LIZ orange markierten Gr enstandard auf einem Elektropherogramm und im GeneMapper bzw GeneMarker Programm nach http www elucigene com product category reproductive health Wichtiger Hinweis Verschiedene Kombinationen von Ger t Polymer und Gr enstandard k nnen leicht unterschiedliche Gr enauszeichnungen verursachen W hrend der Validierung des Kits sollte der Anwender pr fen dass die Standard Bin Einstellungen zu einer korrekten Peakauszeichnung f hren und ggf Korrekturen vornehmen Bei etwaigen Schwierigkeiten kann der technische Kundendienst techsupport elucigene com weiterhelfen ANXYAZFDE 001 Juni 2015 seite 16 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Allgemeine Analyserichtlinien f r alle Male Factor Infertility Kits 1 Die Negativkontrolle sollte im Lesebereich von 100 bis 550 bp keine scharfen Peaks aufweisen 2 Die Positivkontrolle muss die erwarteten Ergebnisse zeigen wobei alle Peaks die nachstehend aufgef hrten Kriterien erf llen m ssen 3 Bei der Analyse von Aneuploidien in DNA Proben muss f r jeden geteste
2. Dye Set 65 Instrument Protocol Properties Run Module Fragment nalysis50_POPT Protocol Name WIFI Description Owen Temperature C 60 Run Voltage kVolts 19 5 PreRun Voltage kVoltsl 15 Injection Voltage kWolts 3 Run Time sec 1200 PreRun Time sec 150 Injection T me sec 12 Data Delay sec L Advanced Options Close F r einen Durchlauf mit den Proben durch Klicken auf Create Plate from Template Platte nach Vorlage erstellen unter Dashboard eine Probenplatte erstellen und darauf achten dass das richtige Instrumentenprotokoll f r MFI ausgew hlt wird siehe oben ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 14 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Einrichtung des Probenblattes f r GeneMarker Mit der GeneMarker Software ist ein direkter Vergleich zwischen den A und B Daten derselben Person m glich Daf r ist es wichtig dass die Bezeichnung der Rohdaten Ausgabedatei fsa Datei f r alle Proben und Gemische einheitlich ist Das Probenblatt sollte den eindeutigen Probennamen f r jede zu testende Probe mit dem Suffix _A bzw _B enthalten je nachdem welches Gemisch getestet wird Soll der fsa Name die Platten ID enthalten sollte immer dasselbe Format verwendet werden z B MFI TTMMJJJJ Auf dem 3130 sollten die Parameter f r Results Destination Ergebnisziel so eingestellt sein dass die Probenbezeichnung im fsa Dateinamen enthalten ist z B MFI TTMM
3. Symbol der Report Table Berichtstabelle zu finden Gelb ausgef llte Symbole stehen f r die Datenpunkte der aktuellen Probe Symbole mit roter Umrandung stehen f r Trisomie Auszeichnungen Hinweis Das korrigierte Verh ltnisdiagramm erscheint auf einer zweiten Seite f r jede Probe jedoch nur wenn Ratio Plot Verh ltnisdiagramm im Feld Trisomy Print Report Settings Trisomiebericht Druckeinstellungen ausgew hlt wurde ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 38 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung ANHANG 1 Beschriftung der Farbstoffe Die Marker sind wie folge markiert Male Factor Infertility NED sY127 ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 39 von 45 MFI Yplus Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung ANHANG 2 Tabelle mit Markerlage beobachteter Heterozygotie Allel Gr enbereich Male Factor Infertility XHPRT Xg26 2 0 7 J J 2 DXYS218 Xp22 32 Yp11 3 0 74 367 5 402 5 gr n SY84 Yq11 1 221 BEE N E E BR Baoa EL EEE BE BELA BE 20 BEE Zu BE U A Bu EEE BE DE DE BEE Aa De SY254 Yq11 23 223 n zutr 375 386 SY255 Yq11 23 223 118 128 ZFX Y Xp22 11 Yp11 2 485 495 MFI Yplus SY83 Yq11 21 270 280 blau SY105 291 305 blau SY121 Yq11 222 180 200 blau SY143 Yq11 223 305 5 315 blau SY153 Yq11 223 Yg11 23 134 144 blau SY160 Yq12 231 241 blau SY1182 Yq11 221 242 252 SY1191 Yq11 223 375 395 SY1291 Yq
4. File Edit Bins View J ihuga BBBHBEE ANXYAZFDE 001 ajma L LMS HD5 V2 5 Panels SNPlex_48plex_3130_Bins LMS MD10 V2 5 Panels _ SNPlex_48plex_3130_Panels LOH Getting Started Guide Panel L SNPlex_48plex_3730_Bins MEISTE NE Tee el SNPlex_48plex_3730_Panels Male Factor Infertility_Panels Male Infertility_bins Male _Infertility_Panels L MF Y plus_MFI Y plus_bins L MF Y plus_Panels Microsatellite Getting Started Guide Panel E QSTR MI_Panels L QSTR MI_QSTRFL_bins L QSTR MFI_Male Infertility Panel_bins QSTR MFI_Panels L NaPshot Getting Started Guide Panel Male Factor Infertility_Male Factor Infertiity_bins txt Network Files of type Al Files Juni 2015 Seite 22 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung ndern der Analyseparameter Datei M glicherweise m ssen die voreingestellten Analysis Ranges Analysebereiche in den QST R Analyseeinstellungen auf die jeweiligen Testbedingungen angepasst werden Der minimale Analysebereich h ngt vom w hrend der Datenerfassung verwendeten Kapillarmodul und Polymer ab Anzeige der aktuellen Analyseeinstellungen 1 Den GeneMapper Manager durch Klicken auf das Symbol ffnen 2 Die Registerkarte Analysis Methods Analysemethoden ausw hlen Die importierte Male Factor Infertility Produkt Datei wird im Falle von Male Factor Infertility als Male Factor In
5. Peak Ratid Check Observation _ Afto dry 5218 oO 8 m S Pz Allele Allele Name Peak Area Marker Alele Peak Area Peak Ratid 106 111 5898 6732 Joss f Z 100 150 200 250 300 350 400 450 500 Dxys218 2 3s2398 18335 16328 Mh J sry fa fas Jearz S S So jo 3 000 EST ZU fa Jaa Ja o DEE EEE syisa fji fas Jas o J 2500 u fji Jaa Joass Soo So ST S oo sy fa fiza f s Soo So Soo syss ji Jes Jan S S S S awo syss Ja Jas fosis ooo o o Taro Sa 17 122 1s0226553 Ta 10 6782 Oo o So ST O 24038 Ooo o do o doo j 0 387393 s f2bs sips sY2b4 zRNAFY 100 150 200 250 300 350 4c0 450 500 2 000 1 500 1 000 500 Der GeneMarker Bericht enth lt die folgenden Elemente e Bericht berschrift Enth lt Informationen zu Analyse Projekt Probe und Parameter e Signaturfeld Platz f r Datum und Initialen von Berichtpr fern e Elektropherogramm hnlich wie beim Fenster Trisomy Analysis Trisomie Analyse werden alle Farbstofffarben der Probenspur angezeigt e Berichttabelle Zeigt ausgew hlte Peak und Markerwerte f r die aktuelle Probe an Trisomie Auszeichnungen sind grau hervorgehoben Eine zus tzliche Pr fspalte ist f r die Initialen des Pr fers vorgesehen e Korrigiertes Verh ltnisdiagramm Enth lt die Diagrammpunkte des gesamten Datensatzes f r alle Marker des jeweiligen Farbstoffs Die Symbolformen stehen f r verschiedene Marker die zugeh rige Legende ist in der Zeile
6. berein Deletion B2 b4 oder terminal sY160 Unterschiedlicher Sperma Wahrscheinlichkeit f r TESE Wahrscheinlichkeit f r TESE ca 50 b2 b4 Deletion oder testikul rer Ph notyp beinahe null Bericht einschlie lich Bericht einschlie lich Bericht einschlie lich Empfehlung zur genetischen Empfehlung zur genetischen Empfehlung zur genetischen Beratung Screening bei Beratung Beratung Karyotyp m glich 45 X Mosaik Screening bei m nnlichen Verwandten m nnlichen Verwandten Abbildung 2 Ablaufdiagramm ber die klinischen Konsequenzen des Nachweises des jeweiligen Typs h ufiger Y chromosomaler Mikrodeletionen Krausz et al 2014 ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 5 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Warnhinweise und Vorsichtsma nahmen T Die in den Kits gelieferte normale DNA Kontrolle wurde unabh ngig getestet und f r negativ f r Hepatitis B Virus HBV Hepatitis C Virus HCV und humanes Immundefizienz Virus HIV 1 und 2 befunden Bei der Arbeit mit Humanmaterial vorsichtig vorgehen Alle Proben sind als potenziell infekti s zu betrachten Keine Testmethode kann das Vorhandensein von HBV HCV HIV oder anderen infekti sen Erregern mit absoluter Sicherheit ausschlie en Die Handhabung der Proben und Testkomponenten sowie deren Gebrauch Lagerung und Entsorgung muss gem der durch nationale Richtlinien und Verordnungen definierten Verfahren f r biologisch
7. enth lt MFI 3130 Durchlaufmodul Hinweis Es muss ein Durchlaufmodul das Einzelheiten zu den Instrumenteneinstellungen enth lt erstellt und anschlie end einem Durchlaufprotokoll zugewiesen werden in dem das Farbstoffset G5 ausgew hlt wurde Weitere Informationen zur Erstellung von Durchlaufmodulen sind dem Bedienerhandbuch des jeweiligen Ger tes zu entnehmen ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 12 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung DURCHLAUFMODUL 3130 F R POP7 POLYMER 36 cm Kapillarmodul MFI Das MFI Durchlaufmodul im Module Manager Modulverwaltung der 3130 Datenerfassungssoftware erstellen Darauf achten dass Folgendes ausgew hlt wird e Type Regular Typ Normal Template Vorlage FragmentAnalysis36_POP7 e Die in der nachstehenden Tabelle beschriebenen Einstellungen eingeben Nr 4 2 3 4 5 6 T 8 Parameterbezeichnung Bereich Oven Temperature int 18 65 Deg C Poly_fill_Vol 6500 38000 steps Current Stability int 0 2000 uAmps PreRun_ Voltage 0 15 kvolts Pre Run Time 1 1000 sec Injection_Voltage 1 15 kKvolts 1 600 sec Voltage_Number_of_Steps 1 100 nk Voltage_Step_Interval 1 60 sec Data_Delay_Time 1 3600 sec Run_Voltage 0 15 kvolts Run _Time 300 14000 sec Hinweis Der erforderliche Wert f r Run Time Durchlaufzeit kann je nach Umgebungstemperatur am Aufstellort des Gen Analysators variieren Weiter
8. Analyse die Option BPG ausgew hlt ist und die folgenden Einstellungen angezeigt werden e Peak Height Peakh he von 50 Mindesth he von 50 f r die Auszeichnung von Peaks 150 bei Verwendung von 3500 Daten e Height Ratio H henverh ltnis von 30 Maximalh he des zweiten Peaks im Verh ltnis zum Hauptpeak in Prozent damit zwei Allele identifiziert werden Quantification by Peak Area Quantifizierung nach Peakfl che Shorter Length Longer Length K rzer L nger ausgew hlt Die Verh ltnis Schwellwerte f r Trisomie sind 0 80 bis 1 40 Apply Linear Correction Lineare Korrektur anwenden nicht ausgew hlt Auf OK klicken Fenster Trisomy Analysis Trisomie Analyse Im Fenster Trisomy Analysis Trisomie Analyse Abbildung 21 kann sich der Anwender Aneuploidie Probendaten und das Peak Verh ltnis f r jeden Marker anzeigen lassen sowie auf den GeneMarker Bericht zugreifen Eine Reihe von Anzeigen unterst tzen den Anwender bei der Datenanalyse Diese sind e Probenliste e Elektropherogramm e Verh ltnisdiagramm e Berichttabelle Bitte beachten dass eine Trisomie Analyse bei Daten zu Mikrodeletionen des Y Chromosoms nicht notwendig ist ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 35 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Abbildung 21 Fenster Trisomy Analysis Trisomie Analyse Sn BB SA B AabkE E M
9. DNA Probe verd nnen und erneut amplifizieren e Injektionszeit senken siehe Abschnitt Kapillarelektrophorese e Einen h heren Peak Amplituden Schwellenwert w hlen siehe Elucigene CF EU2v1 Leitfaden zur Analysesoftware Bei einem niedrigen DNA Einsatz ist die Wahrscheinlichkeit h her dass die diagnostischen Peaks schwach sind und nicht von der Analysesoftware markiert werden Die folgenden Ma nahmen k nnen ergriffen werden um ein st rkeres Signal zu erhalten e Injektionszeit erh hen siehe Abschnitt Kapillarelektrophorese e Probe erneut extrahieren und in weniger Wasser 50 ul eluieren ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 10 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Testdurchf hrung Amplifikationsverfahren Hinweis Um die Gefahr einer Kontamination so gering wie m glich zu halten m ssen die Schritte 3 5 in einem DNA freien Bereich durchgef hrt werden Au erdem sind Ma nahmen zur Vermeidung einer Kontamination mit PCR Produkten zu ergreifen 1 Den Thermocycler auf einen 20 min tigen aus einem Schritt bei 94 C bestehenden Zyklus zur Aktivierung der DNA Polymerase in Verbindung mit einem Amplifikationszyklus Programm 30 Zyklen von 1 Minute bei 94 C Denaturierung 2 Minuten bei 58 C Annealing und 1 Minute bei 72 C Extension programmieren Zus tzlich muss eine 20 min tige Verl ngerung der Extension bei 72 C im letzten Zyklus eingegeben werden Enzymakt
10. GENEMARKER ist eine Marke der Softgenetics Corporation GENEMAPPER GENESCAN NED VIC PET POP 7 LIZ und HI DI sind Marken der Life Technologies Corporation Hinweise an den K ufer Begrenzte Lizenz Dieses Produkt wird im Rahmen eines Vertrags mit der Life Technologies Corporation vertrieben Im Kaufpreis dieses Produkts sind nicht bertragbare Rechte enthalten die die Anwendung nur des betroffenen Teils des Produkts und seiner Komponenten und ausschlie lich zum Zweck der In vitro Diagnostik und der in der beiliegenden Gebrauchsanweisung beschriebenen klinischen Indikationen gestatten Dar ber hinaus werden keine weiteren Rechte gew hrt Weitere Informationen zum Erwerb von Lizenzen zur Anwendung dieses Produkts und seiner Komponenten erhalten Sie unter outlicensing lifetech com Copyright 2015 Delta Diagnostics UK Ltd ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 45 von 45
11. der DNA bei 20 C gelagert werden Wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden DNA Isolierung aus Vollblutproben EDTA Reproduzierbare und auswertbare Ergebnisse lassen sich erzielen wenn die DNA mithilfe des QlAamp 96 DNA Blood Kit oder des QlAamp DNA Mini Kit mit Proteinase K entsprechend dem im QlAamp Handbuch beschriebenen Protokoll beginnend mit 200ul fl ssigem Vollblut und Verd nnung in 200 ul hochreinem Wasser extrahiert wird DNA Konzentration Unter den empfohlenen PCR Bedingungen und unter Verwendung der empfohlenen Einstellungen f r die Probeninjektion die in dem Kapillars ulen Durchlaufmodul aufgef hrt sind siehe Hinweis im Abschnitt Kapillarelektrophorese werden mit einem DNA Einsatz von 15 ng durchg ngig akzeptable Ergebnisse erzielt Interpretierbare Ergebnisse werden allerdings mit einem DNA Einsatz in einem Bereich zwischen 5 ng und 30 ng erzielt Die Quantifizierung der DNA ist sehr wichtig Daher sollte die Konzentration aller zu testenden DNA Proben gemessen werden um optimale Ergebnisse zu gew hrleisten Akzeptable Methoden sind z B PicoGreen Fluoreszenz oder UV Absorbanz Wegen der Unterschiede zwischen den Methoden zur DNA Quantifizierung sollte der Anwender folgende Hinweise beachten Bei einem sehr hohen DNA Einsatz ist die Wahrscheinlichkeit h her dass die Analysesoftware Hintergrund Peaks markiert Die folgenden Ma nahmen k nnen ergriffen werden um diese Wahrscheinlichkeit zu senken e
12. die wiederum f r ein weiteres Chromosom stehen kann ii Nachweis von Mikrodeletionen des Y Chromosoms Im Jahr 2004 haben die Europ ische Akademie f r Andrologie EAA und das europ ische Netzwerk f r Qualit t in der Molekulargenetik Molecular Genetics Quality Network EMQN eine Reihe von Richtlinien zur guten Praxis f r Tests auf Mikrodeletionen des Y Chromosoms vorgeschlagen bei der f r jede Deletionsregion 2 STS Marker sequence tagged site mittels PCR untersucht werden AZFa sY84 und sY86 AZFb sY127 und sY134 und AZFc sY254 und Y255 8 Im Jahr 2014 wurde diese Richtlinien erg nzt und beinhaltet nun eine erweiterte Analyse die eine weitergehende Charakterisierung und Gr enbestimmung der nachgewiesenen Mikrodeletionen in der AZF Region mittels eines separaten definierten Markersets erm glicht AZFa sY82 sY1182 sY83 und s Y88 AZFb sY105 sY121 sY143 und sY153 AZFc GR GR Subtyp sY1191 und sY1291 2 Die weiterf hrende Charakterisierung Gr enbestimmung von Mikrodeletionen in der AZF Region ist hilfreich da sie die Wahrscheinlichkeit erh ht funktionsf hige Spermien von Patienten mit partiellen Mikrodeletionen zu gewinnen gegen ber Patienten mit einer kompletten Deletion in einer oder mehreren dieser Regionen Beispielsweise geht die GR GR Mikrodeletion bei der es sich um eine AZFc Subdeletion handelt in der Regel mit einem milderen Ph notyp einher als dem bei kompletten Deletionen beobachteten Ph notyp In d
13. enbereich auf 98 bp Start und 600 bp Ende eingestellt ist Abbildung 22 Fenster Trisomy Print Settings Trisomie Druckeinstellungen Samples All Samples C Selected Samples Markers Ratio Plot All Markers Show Population Selected Markers Show Sample Only Report Table Iv Show Allele Name v Show Peak Height Area V Show Peak Ratio Show Trisomy Scores Electropherogram Size Range C Show Current Size Range C Show AllMarkers Size Range Show Custom Size Range Start bp 38 End bp 510 Scale data to highest peaks within size range amp Ok X Cancel ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 37 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Vorschau des GeneMarker Berichts Die Schaltfl che Preview Vorschau anklicken um sich den GeneMarker Bericht anzeigen zu lassen Abbildung 23 Von diesem Fenster aus kann der Anwender die Peakdaten f r jede Probe ber alle Marker hinweg betrachten und drucken sodass ein einfacher ein bis zweiseitiger Probenbericht entsteht Abbildung 23 GeneMarker Bericht Sample AD1_Run_AB3130A_2014 10 15_15 19_0285_2014 10 16 fsa Analysis Type Trisomy Comments Software GeneMarker V2 6 3 Project Untitled Panel GeneMarker MFI Report Time 10 21 2014 12 09 42 Report Type Peak Area Ratio TJ Exp Time 10 16 2014 16 20 24 gt 10 16 2014 16 57 40 Plot Raw Peak Area Ratio All Samples are Displayed Authorization 1 S
14. lang bei 2 8 C gelagert werden bevor die Kapillarelektrophorese durchgef hrt wird ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 11 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Kapillarelektrophorese Jedem Anwender wird empfohlen die gew hlte Ausr stung entsprechend der Gebrauchsanweisung des jeweiligen Herstellers zu bedienen und sich davon zu berzeugen dass sie mit diesem Test kompatibel ist In diesem Zusammenhang sind insbesondere das Polymer und das Kapillararray wichtig Optimale Ergebnisse lassen sich mit den folgenden Bedingungen f r die Kapillarelektrophorese auf einem Gen Analysator ABI3130 oder ABI3500 erzielen 1 6 8 ul Gr enstandard und 250 ul Hi Di Formamid kombinieren und gr ndlich vermischen Gemisch ausreichend f r 16 Vertiefungen Je 15 ul des Gemischs in die der erforderliche Anzahl an Vertiefungen auf der optischen Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen dispensieren 2 3 ul PCR Produkt der Testprobe dem Gr enstandardgemisch aus Schritt 1 zugeben das bereits in die Mikrotiterplatte gef llt wurde und mit der Pipette vermischen Die Platte mit der Abdeckung versehen 3 Das in die optische Mikrotiterplatte gef llte PCR Produkt auf einem Thermocycler mit folgenden Parametern denaturieren 3 Minuten bei 94 C in Verbindung mit 30 Sekunden bei 4 C 4 Die Mikrotiterplatte 10 Sekunden lang bei 1000 g zentrifugieren damit Bl schen aus den Vertiefungen entfernt werden Dann die Mikrotiter
15. ml PCR R hrchen oder vom Hersteller des Thermocycler empfohlene Mikrotiter Platten Pipettenspitzen Laborausstattung Pr zisionspipetten 2 S tze je 1 f r Pr und Postamplifikationsbereich vorzugsweise Verdr ngungspipetten Schutzkleidung Vortex Mischer Mikrozentrifuge Zentrifuge f r Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen PCR Amplifikation Thermocycler f r Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen oder 0 2 ml R hrchen mit einer Temperaturgenauigkeit von 1 C im Bereich von 33 C bis 100 C und einer statischen Gleichf rmigkeit der Temperatur von 1 Die spezifikationsgerechte Leistung von Male Factor Infertility und MFI Yplus wurde an den folgenden Thermocycler Plattformen validiert Life Technologies GeneAmp 9700 Life Technologies Veriti Dx Betrieb im Standardmodus Life Technologies Veriti Dx Betrieb im 9700 Simulationsmodus Life Technologies Proflex Betrieb im Standardmodus Life Technologies Proflex Betrieb im 9700 Simulationsmodus Kapillarelektrophorese Kapillarelektrophorese POP 7 Polymer ABl Best Nr 4352759 10x Puffer f r den Gen Analysator ABl Best Nr 402824 und Hi Di Formamid ABl Best Nr 4311320 GeneScan 600v2 LIZ Gr enstandard ABl Best Nr 4408399 und DS 33 Farbstoffset G5 Matrixstandard ABI Best Nr 4345833 Gen Analysatoren ABI 3130 und 3500 von Applied Biosystems mit der aktuellen GeneMapper Software 36 cm Kapillararray 50 cm Kapillararray f r den Gen Analysator 3
16. polymerase chain reaction and small tandem repeat polymorphisms Human Molecular Genetics 1993 2 1 43 50 4 Mann K Fox SP Abbs SJ Yau SC Scriven PN Docherty Z Mackie Ogilvie C Development and implementation of a new rapid aneuploidy diagnostic service within the UK National Health Service and implications for the future of prenatal diagnosis The Lancet 2001 358 9287 1057 1061 5 Mann K Donaghue C Fox SP Docherty Z Mackie Ogilvie C Strategies for the rapid prenatal diagnosis of chromosome aneuploidy European Journal of Human Genetics 2004 12 907 915 6 Mackie Ogilvie C Donaghue C Fox SP Docherty Z Mann K Rapid prenatal diagnosis of an aneuploidy using Quantitative Fluorescence PCR QF PCR Journal of Histochemistry and Cytochemistry 2005 53 3 285 288 7 Deutsch S Choudhury U Merla G Howald C Sylvan A Antonarakis SE Detection of aneuploidies by paralogous sequence quantification Journal of Medical Genetics 2004 41 908 915 8 Simoni M Bakker E Krausz C EAA EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of y chromosomal microdeletions State of the art 2004 International Journal of Andrology 2004 27 240 9 9 Satsangi J et al Effect of heparin on polymerase chain reaction Lancet 343 1509 1510 1994 10 PCR Primer A Laboratory Manual 2 Ausgabe ColdSpring Harbour Laboratory Press Abschnitt 1 ELUCIGENE ist eine Marke von Delta Diagnostics UK Ltd QIAAMP ist eine Marke von Qiagen Gmbh
17. 11 223 517 537 Die beobachteten Heterozygotien beruhen auf der mit dem Validierungspanel von Elucigene Diagnostics beobachteten Anzahl von Allelen Diese Zahlen k nnen daher von ver ffentlichten Daten abweichen und auch je nach der getesteten Population schwanken ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 40 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Lokation der in den Male Factor Infertility Kits verwendeten STS Marker f r Mikrodeletionen des Y Chromosoms Region STS Marker Beginn STS Ende STS AZFa SY82 AZFa SY84 AZFa SY86 AZFa SY1182 AZFa SY88 AZFb SY105 AZFb SY121 AZFb SY127 AZFb SY134 AZFb SY143 AZFc GR GR SY1191 AZFb SY153 AZFc SY254 AZFc SY254 AZFc SY254 AZFc SY254 AZFb SY153 AZFc SY254 AZFc SY254 AZFc SY254 Die Genomkoordinaten wurden der Datenbank MSY Breakpoint Mapper breakpointmapper wi mit edu basierend auf NCBI Build 38 entnommen ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 41 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Anhang 3 GeneMapper Profil Normales m nnliches GeneMappe Profil aus dem die relative Lage der mittels Male Factor Infertility nachgewiesenen Marker hervorgeht Erw Sc Y arami EEH DESTA EE I i iep i a 5 iR i 5 u l a f l 5 IE i A i _ 5 i hg i pP n AE F ER l E h I l i m Si jawis l _ A a H r er IT ar Sasse A ne 122 42m
18. 2 Aami Tara rrrrr ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 42 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Normales m nnliches GeneMappe Profil aus dem die relative Lage der mittels MFI Yplus nachgewiesenen Marker hervorgeht I oo ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 43 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Leistungsmerkmale Interne Validierung 24 DNA Proben aus Vollblut extrahiert wurden mittels des Elucigene Male Factor Infertility Kits verblindet untersucht Bei 1 Probe kam es zum Versagen der Amplifikation was mit einer geringen DNA Konzentration und Qualit t korrelierte Von den Proben die interpretierbare Ergebnisse lieferten waren 9 normal wiesen 2 eine Mikrodeletion in der AZFa Region und 6 Mikrodeletionen in der AZFc Region auf und zeigten 6 gr ere Deletionen die sowohl AZFb als auch AZFc AZFbc betrafen Alle analysierbaren Ergebnisse wiesen eine Spezifizit t und Sensitivit t von 100 im Vergleich zu den zuvor mit einer etablierten Alternativmethode erzielten Ergebnissen auf Die erweiterte Analyse mittels des Elucigene MFI Yplus Kits best tige das Vorliegen dieser Y Mikrodeletionen und ergab dar ber hinaus den Nachweis einer Reihe von Subdeletionen n mlich GR GR Deletionen partiell in AZFc in 2 Wildtypproben eine partielle AZFa Deletion in einer AZFbc Probe sowie den Verlust des terminalen SY160 Markers in 5 AZFbc Proben was auf eine
19. 500 optische Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen Abdeckungen f r 96 Vertiefungen Cassetten f r 96 Vertiefungen Datenanalyse Eines der beiden folgenden Softwarepakete f r die Datenanalyse ist erforderlich GeneMapper 3 7 Applied Biosystems Inc oder h her oder GeneMarker 1 65 SoftGenetics LLC oder h her Zus tzliche Dokumentation zum Elucigene Male Factor Infertility Produkt Diese Gebrauchsanweisung enth lt einen Abschnitt mit grundlegenden Informationen ber die Auswertung der erzielten Ergebnisse Ein zus tzlicher Leitfaden zur Interpretation f r Elucigene Male Factor Infertility Produkte mit Beispielen und einem Glossar sowie ein Leitfaden zur Analysesoftware k nnen von der Elucigene Website heruntergeladen werden http www elucigene com product category reproductive health ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 9 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Entnahme und Lagerung der Proben Auswertungen haben ergeben dass Vollblutproben EDTA mit diesem Test kompatibel sind Wie gelegentlich beobachtet k nnen sich Probenentnahmehilfen nachteilig auf die Unversehrtheit bestimmter Analyte auswirken und einige Verfahrenstechnologien beeintr chtigen 9 Jedem Anwender wird empfohlen das gew hlte Instrument gem Anweisungen des Herstellers zu verwenden und darauf zu achten dass die Probenentnahmenhilfen mit diesem Test kompatibel sind Blutproben sollten vor der Aufbereitung
20. A 2014 04 15 09 00 0039 D02_Run_AB3130A_2014 03 19_15 10_0020_2014 03 19 fsa H I Run_AB3130A_2014 04 15_15 50_0043 E02_Run_AB3130A_2014 03 19_15 10_0020_2014 03 19 fsa H LU Run AB3130A 2014 04 17 08 58 0048 F02_Run_AB3130A_2014 03 19_15 10_0020_2014 03 19 fsa I Run AB3130A 2014 04 17 08 58 0049 G02_Run_AB3130A_2014 03 19_15 10_0020_2014 03 19 fsa a i Run_AB3130A_2014 04 17_08 58_0050 H02_Run_AB3130A_2014 03 19_15 10_0020_2014 03 19 fsa Run_AB3130A_2014 04 17_08 58_0051 Run_AB3130A_2014 04 17_08 58_0052 Run_AB3130A_2014 04 17_16 13_0057 Run_AB3130A_2014 04 17_16 13_0058 Run_AB3130A_2014 04 17_16 13_0059 Jd Run_AB3130A_2014 04 17_16 13_0060 Run_AB3130A_2014 04 23_10 46_0067 Run_AB3130A_2014 06 10_15 50_0100 t J Run_AB3130A_2014 06 13_15 16_0102 I J Run_AB3130A_2014 06 16_12 46_0103 Run_AB3130A_2014 06 17_10 38_0105 Run_AB3130A_2014 06 17_16 06_0106 H i Run_AB3130A_2014 06 18_09 12_0107 Run_AB3130A_2014 06 19_17 33_0110 Run_AB3130A_2014 06 20_12 27_0111 J Run_AB3130A_2014 06 20_15 57_0112 Ji Run_AB3130A_2014 06 20_15 57_0113 Iaj Run_AB3130A_2014 06 20_15 57_0114 Run_AB3130A_2014 06 23_12 09_0115 Run_AB3130A_2014 06 23_14 33_0116 Run_AB3130A_2014 06 23_16 28_0117 Run_AB3130A_2014 06 24_14 53_0118 Run_AB3130A_2014 06 24_14 53_0119 Run_AB3130A_2014 06 25_13 54_0120 Run_AB3130A_2014 06 25_13 54_0121 v Add Add amp Anaiyze Cancel ANXYAZF
21. DE 001 Juni 2015 Seite 19 von 45 to Add Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Importieren der Male Factor Infertility GeneMapper Analyseeinstellungen in den GeneMapper Manager Die Male Factor Infertility Einstellungen f r GeneMapper m ssen importiert werden Dieser Prozess wird ber die Benutzeroberfl che GeneMapper Manager gesteuert Die Male Factor Infertility GeneMapper Einstellungen sind auf der Elucigene Webseite verf gbar http www elucigene com product category reproductive health 1 Den GeneMapper Manager durch Klicken auf das Symbol ffnen 2 Die Registerkarte Analysis Methods Analysemethoden ausw hlen und dann auf die Schaltfl che Import Importieren dr cken 3 Zu der den ben tigten Datei en f r die Male Factor Infertility Produkt Analyseeinstellungen navigieren und sie importieren Male Factor Infertility oder MFI Yplus 3130 oder 3500 4 Auf die gleiche Art und Weise die entsprechende Registerkarte f r folgende Einstellungen ausw hlen und die entsprechenden Dateien importieren e Table Setttings Tabelleneinstellungen e Plot Settings Grafikeinstellungen e Size Standards Gr enstandards Hinweis F r Cluster Plot Settings Clustergrafikeinstellungen Matrices Matrizen SNP Sets SNP S tze und Report Settings Berichteinstellungen m ssen keine Dateien importiert werden Hinweis Wenn die Male Fa
22. Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Elucigene Diagnostics Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung _ Podukt Gr e Bestellnummer Elucigene Male Factor Infertilit 25 Tests AZFXYB1I Elucigene MFI Yplus 10 Tests AZFPLBX F r die In vitro Diagnostik Mc Elucigene Diagnostics Citylabs Nelson Street Manchester M13 9NQ Kontakt f r den Vertrieb Kundendienst und Technischen Support T 44 0 161 669 8122 F 44 0 161 669 8129 E enquiries elucigene com E techsupport elucigene com Elucigene Diagnostics ist der Handelsname von Delta Diagnostics UK Limited einem in England und Wales unter der Handelsregisternummer 8696299 eingetragenem Unternehmen ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 1 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Elucigene Male Factor Infertility Bei der Male Factor Infertility Produktreihe von Elucigene handelt es sich um DNA basierte Multiplex Assays f r die schnelle Bestimmung des Aneuploidie Status der Geschlechtschromosomen sowie f r den Nachweis und die Charakterisierung der drei h ufigsten Klassen der mit m nnlicher Infertilit t assoziierten Mikrodeletionen des Y Chromosoms Die Elucigene Male Factor Infertility Kits sind in den unten aufgef hrten Formaten erh ltlich Weitere Informationen ber die Kits aus der Male Factor Infertility Produktreihe finden Sie unter http www elucigene com p
23. JJJJ_1234 5_A_AO1 Sample File Name Format Example 123456789_Sample3_A12 lt ext gt Filename is greater than 13 characters Prefix Name Delimiter_ E Format Plate ID Sample Name E well Position none Suffix File Extension None gt Run Folder Name Format Example PiDiagnostics DevelopmentiDiag Dev 3100 ProjectsiCF HTICF UKN31 30 runsislnstr Prefix Name Delimiter _ m lt none gt Auf dem 3500 sollten Dateinamenkonventionen so eingestellt sein dass die Probenbezeichnung im fsa Dateinamen enthalten ist z B MFI TTMMJJJJ_1234 5_A_AO1 eo test Create New File Name Convention Setup a File Name Convention Name is a required field Provide a unique value Name Color Select File Name Attributes Preview of File Name lt Sample Name gt Available Attributes Selected Attributes Amplicon Name a Add Sample Name Analysis Protocol Name z Assay Name Capillary Number Custom Textl Custom Text2 Move Up Custom Text3 M tD Iaa m v Delimiters Select a delimiter Underscore _ 2 F Add between attributes Add gt gt Add a custom value to available attributes optional Custom Text L Custom Text 2 Custom Text 3 Select File Location Default File Location D Applied Biosystems 3500 Data Custom File Location Browse Apply to Plate Save to Library Analyse und Interpretation der Ergebnisse
24. TR_MFI sves 28 54 829 0 01 _01_A01 tsa QSTR_MFI sves 1544 07200 014_01_A01 tsa QSTR_MFI 5Y127 7030 150450 0 01_01_A01 ti QSTR_MFI Ssv2s4 50 35 14532 04_01_A01 tza QSTR_MFI Ar 02_04_E01 tsa QSTR_MFI AME 04 0 309302 0 02 04 601 ti OSTR_MFI 15 31628 J2_04_001 tss OSTR_MFI 24404 02_04_E01 63 QSTR_MFI 270 30022 0 02 04 60 Q OSTR DXxY218 31 43 05 0 RD Manuelle Bearbeitung von Profilen ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 26 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung WARNUNG GeneMapper beschriftet nur bis zu 2 Peaks pro Marker Daher kann eine manuelle Bearbeitung von Profilen erforderlich sein z B um den 3 Peak sofern vorhanden zu beschriften oder die Beschriftung von einem Stotter Peak zu entfernen Um einen Peak zu beschriften den unbeschrifteten Peak mit der linken Maustaste anklicken Es erscheint die Option Add Allele Comment Allel Beschriftung hinzuf gen Auf OK klicken Daraufhin wird der Peak mit seiner Gr e in Basenpaaren und der Peakfl che beschriftet Der neu beschriftete Peak wird automatisch in die Tabelle aufgenommen Um eine Beschriftung von einem Peak zu entfernen die Beschriftung des Peaks mit der linken Maustaste anklicken Es erscheint die Option Delete Allele Comment Allel Beschriftung l schen Auf OK klicken Die Beschriftung des Peaks wird nun entfernt Die gel schten Peakdaten werden automatisch aus der Tabelle entfernt Kopieren von Tabel
25. We Stutter Peak Filter 2 Plus amp Filter Left 164 Right 132 3 Size Call Local Southen Cubic Splnef Large Size Load Default Save Default lt lt Back Cancel Hinweis F r 3500 Daten Min Intensity Mindestintensit t auf 150 erh hen ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 32 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Run Wizard Durchlauf Assistent Additional Settings Weitere Einstellungen Es sind keine weiteren Einstellungen erforderlich Abbildung 17 1 Zum Fortfahren auf OK klicken Abbildung 17 Run Wizard Durchlauf Assistent Additional Settings Weitere Einstellungen Run Wizard Additional Settings Fragment Animal Analysis Set additional options related to the different analysis type Allelic Ladder NONE Allele Evaluation Peak Score Reject lt 11 00 Check 7 00 lt Pass lt lt Back Feld Data Processing Datenverarbeitung Nach Klicken auf OK im Feld Additional Settings Weitere Einstellungen des Durchlauf Assistenten ffnet sich das Feld Data Processing Datenverarbeitung Abbildung 18 Die Rohdaten werden verarbeitet und vermessen woraufhin die Filterparameter und das ausgew hlte Panel angewendet werden 1 Nach Abschluss der Analyse im Feld Data Processing Datenverarbeitung auf OK klicken Abbildung 18 Feld Data Processing Datenvera
26. a D Save XC Delete Use last template ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 31 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Run Wizard Durchlauf Assistent Data Process Datenverarbeitung Im Fenster Data Process Datenverarbeitung des Durchlauf Assistenten kann der Anwender die Peakfilterparameter ausw hlen 1 Wie in der nachstehenden Abbildung dargestellt im Fenster Data Process Datenverarbeitung die geeigneten Analyseeinstellungen ausw hlen Abbildung 16 2 Zum Fortfahren auf Next Weiter klicken Hinweis Die Einstellung des Analysebereichs im Feld Raw Data Analysis Rohdatenanalyse h ngt davon ab welches Polymer w hrend der Datenerhebung verwendet wird Der Anwender sollte einen Wert f r den Start Datenpunkt ausw hlen der den Standardpeak der Gr e 60 bp mit einschlie t Abbildung 16 Fenster Run Wizard Durchlauf Assistent Data Process Datenverarbeitung nun m ee Data Process Fragment Animal Analysis Set data process options Raw Data Analysis Allele Call W Auto Aange frame tal M Auto Range bps 0 10000 Start 36 End 575 j W Smooth Enhanced Smooth Feak Detection Threshold W Peak Saturation e Bazelne Subtraction Min Intensity 50 Max Intensity 20000 i R h Enh d Baseline Subtracti a Deck Percentage gt l Global Max W Pul up Corecton Spike Removal Local Region amp gt 3 3 Local Max
27. ake EEE gt oe Ki ei 2 Report 2 1 A01_Run_AB3130A_2014 A01_Run_AB31304_2014 10 16_16 19_0285_2014 10 16 f x 2 BOlI_Aun_AB31304_2014 C 712 3 C01_Run_AB3130A_2014 365 370 375 380 35 390 395 400 405 1 i D D C ns em z aor mnada fs gt h O i fm a E w nn 3 mes 5 se x Ooo e HE k aa z 3 co Run apz sdam 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 SRY 1 7 Distance Size Einzelheiten zu den Funktionen der Trisomie Analyse und ihrer Anwendung finden sich im Handbuch f r GeneMarker ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 36 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung GeneMarker Bericht GeneMarker enth lt eine Berichtsvorlage die mit dem Elucigene Male Factor Infertility Kit kompatibel ist diese Funktion wird bei der Analyse von Daten auf dem MFI Yplus Kit nicht ben tigt Um zum Bericht zu gelangen das Symbol Print Drucken in der Symbolleiste oben links im Fenster Trisomy Analysis Trisomie Analyse anklicken BIS A Daraufhin ffnet sich das Fenster Trisomy Print Settings Trisomie Druckeinstellungen Abbildung 22 Fenster Trisomy Print Settings Trisomie Druckeinstellungen Die Trisomie Druckeinstellungen legen die einzelnen Optionen fest nach denen Daten im GeneMarker Bericht aufgef hrt und dargestellt werden Die in Abbildung 22 gezeigten Optionen ausw hlen Sicherstellen dass Custom Size Range Individueller Gr
28. ctor Infertility oder MFI Yplus Kits in Verbindung mit dem Elucigene CFEU2 Kit zystische Fibrose angewandt werden k nnen stattdessen die CFEU2 Standardgr eneinstellungen verwendet werden ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 20 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Importieren von Male Factor Infertility Produkt Einstellungen in den Panel Manager Die Male Factor Infertility und MFI Y plus Panel und Bin Einstellungen f r GeneMapper m ssen importiert werden Dieser Prozess wird durch die Benutzeroberfl che Panel Manager gesteuert Male Factor Infertility Panel und Bin Einstellungen f r GeneMapper sind auf der Elucigene Webseite verf gbar http www elucigene com product category reproductive health 1 Das Programm Panel Manager durch Klicken auf das Symbol ffnen 2 Im linken Navigationsfenster auf Panel Manager klicken Panel Manager ist nun blau markiert 3 Filelmport Panels Datei Panels importieren ausw hlen Zur GeneMapper Paneldatei Male Factor Infertility_Panels txt navigieren und sie importieren Abbildung 4 F r MFI Yplus alternativ MFI Y plus_Panels txt ausw hlen 4 Die Paneldatei wird nun im linken Navigationsfenster angezeigt Die Paneldatei anklicken sodass sie blau markiert ist 5 Filellmport Bin Set Datei Binsatz importieren ausw hlen Zur GeneMapper Bindatei Male Factor Infertility_Male Factor Infertility_ bins txt navigieren u
29. die Proben werden in GeneMarker hochgeladen Die Software ffnet dann automatisch das Fenster Raw Data Analysis Rohdatenanalyse Abbildung 12 ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 28 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Abbildung 12 Raw Data Analysis Window Rohdatenanalysefenster un FM FM Em CIN aa aaa COo Zum ZU ZU LAN gt Aubakur HE artO dtt SIE ALTO Sal Se St Salt 520 500 Sn 50 1 00 120 10 ran N BEE EU EA Ar Aan NT MAIR 1619 TE T AIR en Importieren von Male Factor Infertility Produkt Paneleinstellungen in GeneMarker Die Male Factor Infertility Produkt Einstellungen f r GeneMarker m ssen importiert werden Dieser Prozess wird durch die Benutzeroberfl che Panel Editor gesteuert Die Male Factor Infertility Produkt Einstellungen f r GeneMarker sind auf der Elucigene Webseite verf gbar www elucigene com product category reproductive health 1 Den Panel Editor im Dropdownmen Tools Werkzeuge ffnen Abbildung 13 Abbildung 13 Panel Editor ausw hlen UL Gerahtarer innte Fie Ve Project Gppikatiors Toos Hep E Zu a wu z A Sire Tengine Faro ii me 100 1200 1400 Ieo VER 2000 220 240 2200 Zus Burn 1 40 400 SO SIO Sao SEE SEHR GON AO dato arte aroo Tin 233 74an TaD 7 a 23 50 2 Die Option Import Panels Panels importieren im Dropdownmen File Datei ausw hlen Abbildung 14 ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Se
30. e Informationen zur Erstellung von Durchlaufmodulen gehen aus dem Benutzerhandbuch f r den Gen Analysator 3130 von Applied Biosystems hervor Das MFI Protokoll im Protocol Manager Protokollverwaltung erstellen Darauf achten dass Folgendes ausgew hlt wird Type Regular Typ Normal Run Module Durchlaufmodul MFI siehe Durchlaufmodul oben Dye Set Farbstoffset G5 F r einen Durchlauf mit den Proben mit dem Plate Manager Plattenverwaltung ein Probenblatt erstellen und darauf achten dass im Instrumentenprotokoll das richtige Protokoll ausgew hlt wird siehe oben Hinweis Weitere Informationen zu Einrichtung Betrieb und Fehlersuche f r das Instrument gehen aus dem Benutzerhandbuch f r den Gen Analysator 3130 von Applied Biosystems hervor ANXYAZFDE 001 Juni 2015 seite 13 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung GEN ANALYSATOR ABI3500 Es muss ein MFI Instrumentenprotokoll erstellt werden das dann f r jeden Durchlauf des Male Factor Infertility Produkts verwendet werden kann Das MFI Instrumentenprotokoll ber die Instrumentenprotokoll Bibliothek des 3500 erstellen Darauf achten dass Folgendes ausgew hlt wird e Durchlaufmodul FragmentAnalysis50_POP7 e Die in der nachstehenden Abbildung beschriebenen Einstellungen eingeben e Edit Instrument Protocol CFEU2 Setup an Instrument Protocol Q Application Type Fragment Capillary Length 50 cm Polymer POPI
31. er Tat variiert die klinische Signifikanz dieser Subdeletion in Abh ngigkeit vom genetischen Hintergrund und man geht davon aus dass sie in einigen Populationen einen Subfertilit tsph notyp verursacht dagegen jedoch in einigen in der japanischen Population h ufig vorkommenden Y Chromosom Haplotypen sogar als fixiert gilt ohne einen Effekt auf die Spermienzahl auszu ben Mit fluoreszenten Farbstoffen markierte Primer die spezifisch f r flankierende Sequenzen dieser Marker sind amplifizieren die Wildtyp Sequenz und der Verlust des diagnostischen Peaks f r den Wildtyp weist auf eine Mikrodeletion dieses STS Markers hin Amplifizierte Produkte der QF PCR Technik werden auf einem nach dem Prinzip der Kapillar Elektrophorese arbeitenden Gen Analysator quantitativ analysiert um sowohl die Kopienzahl der analysierten STR Marker als auch den Deletionsstatus der Y chromosomalen STR Marker zu bestimmen ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 4 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Deletion von Deletion von Deletion von sY84 sY86 sY127 sY134 sY254 sY255 Erweiterte Analyse Erweiterte Analyse Proximale Grenze Proximale Grenze Pr fen auf sY82 sY83 sY1064 sY105 sY121 sY1224 Heterochromatinmarker Distale Grenze Distale Grenze sY160 sY1065 sY118 sY88 sY143 sY1192 sY153 Marker stimmt nicht mit einer Komplette AZFa oder AZFb Komplette AZFc Deletion kompletten Deletion
32. ese Schritte in einem einfachen Werkzeug namens Run Wizard Durchlauf Assistent Abbildung 15 Der Durchlauf Assistent wird einfach durch Klicken auf das Symbol Run Project Projekt ausf hren in der Hauptsymbolleiste aufgerufen Durchlauf Assistent Eine Durchlaufvorlage erstellen Bei der ersten Verwendung dieser Software zur Analyse von Male Factor Infertility Produkt Daten muss eine Durchlaufvorlage erstellt werden Dazu dient der Durchlauf Assistent 1 Der Durchlauf Assistent wird einfach durch Klicken auf das Symbol Run Project Projekt ausf hren in der Hauptsymbolleiste aufgerufen 2 Eine Bezeichnung f r die Vorlage bestimmen z B QSTR 3 Wie in der nachstehenden Abbildung 15 dargestellt Panel Size Standard Gr enstandard Standard Colour Standardfarbe und Analysis Type Analyseart ausw hlen 4 Auf Save Speichern klicken um die Vorlage f r k nftige Analysen zu speichern 5 Zum Fortfahren auf Next Weiter klicken Abbildung 15 Run Wizard Durchlauf Assistent Fenster Template Selection Vorlagenauswahl Run Wizard Template Selection Set the template of the project Select an existing template or create one u MLFA Template Name JaSTF MmPCR E MSI Fanel GeneMarker MFI Ug 4 MS MLPA Size Standard G5600 U A QSTR A GSTR 2 Standard Color Drange o o 4 SNaPshot Analysis Type Fragment Anima A TrisomY 4
33. eten Chromosome kann eventuell nicht nachgewiesen werden Hinweis Die Heterozygotien der verwendeten Marker entstammen randomisierten Proben aus einer berwiegend nordeurop ischen wei en Population die zu Routineanalysen eingeschickt wurden Etwaige Berechnungen anhand dieser Heterozygotien gelten streng genommen nur f r die Population in der die Proben entnommen wurden Eventuell sollte im Rahmen einer Validierungsstudie eine kleine Studie anhand lokal beschaffter Proben durchgef hrt werden um die Heterozygotien in der zu testenden Population zu ermitteln Es wird davon ausgegangen dass die auf der Population beruhende Variation keine signifikanten Auswirkungen auf den Gesamtinformationsgehalt des Assays hat Weitere Einzelheiten zu den Elucigene Produkten stehen unter der folgenden Adresse zur Verf gung http www elucigene com ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 44 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Literaturangaben 1 Poongothai J Gopenath TS Manonayaki S Genetics of human male infertility Singapore Medical Journal 2009 Apr 50 4 336 47 2 Krausz C Hoefsloot L Simoni M Tuttelmann F European Academy of Andrology European Molecular Genetics Quality Network EAA EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of Y chromosomal microdeletions state of the art 2013 Andrology 2014 Jan 2 1 5 19 3 Mansfield E S Diagnosis of Down syndrome and other aneuploidies using quantitative
34. fertility Analysis Settings Analyseeinstellungen oder bei MFI Yplus als Male Factor Infertility Y plus aufgef hrt 3 F r Male Factor Infertility auf Male Factor Infertility Panel bzw f r MFI Yplus auf Male Factor Infertility Y plus klicken Die Zeile ist nun markiert 4 Auf die Schaltfl che Open ffnen klicken und die Registerkarte Peak Detector Peakdetektor ausw hlen Abbildung 6 Abbildung 6 Analysebereiche General Allele Peak Detector Peak Quality Quality Flags Peak Detection Algorithm Advanced ji Ranges Peak Detection Analysis Sizing Peak Amplitude Thresholds Partial Range 6AlSizes B 50 R 50 Start Pt 1500 Start Size 0 Stop Pt 18000 Stop Size 000 G P Y O 20 Min Peak Half Width 2 pts Polynomial Degree 3 Feak Window Size 15 pts Slope Threshold Peak Start Peak End 3nd Order Least Squares 6 3rd Order Least Squares Cubic Spline Interpolation Local Southern Method 6 Global Southern Method Note For 35XX series data collection normalization only Factory Defaults ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 23 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Bestimmen des korrekten Analysebereichs f r das jeweilige Labor 1 Im GeneMapper Hauptfenster auf den importierten Durchlaufordner doppelklicken um die darin enthaltene Liste mit fsa Da
35. gef hrliches Material erfolgen Im Einklang mit der aktuellen guten Laborpraxis sollten Labore eigene interne Qualit tskontrollproben bekannten Genotyps in jedem Assay mitf hren damit die Validit t des Verfahrens beurteilt werden kann Bei Sch den an der Kitverpackung kann auch der Inhalt besch digt sein Das Kit nicht verwenden und den Kundendienst verst ndigen ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 6 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Symbole auf den Etiketten Die Symbole die auf allen Etiketten und Verpackungen verwendet werden entsprechen dem harmonisierten Standard ISO 15223 Hersteller Anzahl der Tests Bu 3 Gebrauchsanweisung beachten Unterhalb der angegebenen Temperatur lagern Nicht mehr nach dem angegebenen Datum verwenden Bestellnummer J ea gt LOT Los oder Chargennummer In vitro Diagnostikum 5 g ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 7 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Im Lieferumfang enthaltene Materialien Elucigene Male Factor Infertility Kit Jedes Kit enth lt Elucigene Male Factor Infertility TA Teilenummer 450208 1 Gef x 250 ul 25 Tests Reaktionsgemisch mit Primern zur Amplifizierung von X und Y spezifischen STR Short Tandem Repeat und Nicht STR Markern sowie Marker f r Mikrodeletionen des Y Chromosoms Siehe Anhang 2 f r Details zu den Markern in jedem Kit Das Reaktionsgemisch enth lt ferner DNA Po
36. gr ere terminale Yq Deletion hinweist Externe Validierung 25 Proben wurden mittels des Elucigene Male Factor Infertility Kits an einer externen Pr fstelle untersucht Bei 20 dieser Proben ergaben die Tests dass es sich um m nnliche Proben handelte Von diesen wurden 12 als Wildtyp f r Mikrodeletionen des Y Chromosoms getestet 2 Proben wurden positiv f r AZFa Mikrodeletionen 1 f r AZFb 1 f r AZFc 3 f r AZFbc und 1 f r eine AZFabc Mikrodeletion getestet Alle Ergebnisse wiesen eine Spezifizit t und Sensitivit t von 100 im Vergleich zu den zuvor mit einer etablierten Alternativmethode erzielten Ergebnissen auf Bei einer Probe schien ein Verlust des SY86 Peaks Marker f r die AZFa Region vorzuliegen daf r wurden 2 Peaks des SY134 Marker Marker f r die AZFb Region nachgewiesen Dieses Ergebnis ist wahrscheinlich Folge einer kleinen Deletion ca 19 bp des SY86 Amplikons was zu einer Migration dieses PCR Produkts in die benachbarten SY134 Marker bei der Kapillarelektrophorese f hrt ein Beispiel ist im entsprechenden Leitfaden zur Interpretation zu finden Grenzen des Verfahrens Dieser Test ist darauf ausgelegt wie in der Gebrauchsanweisung im Einzelnen dargelegt bestimmte Geschlechtschromosom Aneuploidien sowie spezielle Deletionen des Y Chromosoms nachzuweisen Er kann Neuordnungen der getesteten Chromosome u U nicht nachweisen und weist in keinem Fall Anomalien in anderen Chromosomen nach Ein Mosaik der getest
37. ility Yplus MFI Yplus Zusatzkit das weitere Y Chromosomen Marker enth lt die in Verbindung mit Male Factor Infertility f r die routinem ige In vitro Charakterisierung der drei h ufigsten mit m nnlicher Infertilit t assoziierten Mikrodeletionen des Y Chromosoms zu verwenden sind Das Kit kann f r die erweiterte Analyse und Charakterisierung von Mikrodeletionen des Y Chromosoms verwendet werden die mittels des Male Factor Infertility Kits nachgewiesen wurden Die im Elucigene MFI Yplus Kit verwendete Methode ist die QF PCR quantitative Fluoreszenz Polymerase Kettenreaktion Die Tests sind zur Verwendung mit aus Vollblut EDTA extrahierter DNA bestimmt und nicht f r die Verwendung mit anderen Probenmaterialien vorgesehen Die vorgesehene Zielpopulation sind m nnliche Patienten mit Verdacht auf Infertilit t bei denen ein Test auf Mikrodeletionen des Y Chromosoms positiv ausgefallen ist Der Test ist f r die Verwendung in Verbindung mit anderen Diagnoseverfahren zur Untermauerung oder Widerlegung der vorgeschlagenen klinischen Diagnose vorgesehen Der Test ist nur zum Gebrauch durch Fachkr fte in einem Molekular oder Zytogenetiklabor bestimmt ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 2 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Zusammenfassung und Erl uterung Statistisch treten bei 10 15 aller Paare Empf ngnisschwierigkeiten auf Annahmen zufolge sind in 50 der F lle von den M nnern ausgehende Faktoren
38. ite 29 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Abbildung 14 Panels importieren Panel Edito 0 x File Tools Help gt New BR v LN v es T 2 Help elete Current Panel Marker AFLPPanel EH Save Changes Cues g Save Changes with Signal Info 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 Save As New Panel P J Import Panels Import Pre defined Panels Import ABI Panels Import MRC Holland Panels Export Panel Exit microsat_panel Mouse X Y 5 I gi B aon Run_AB31304_2014 No Dye Maker Left Range Right Range Allele Name Control Distance kb Chromosome Position Recombination Frequenc B E01 Run aBs 30a 2014 1 Bhe 58 04 04 m 5 Re B C01_Run_AB31304_2014 ss 41 6 43 2 45 2 47 0 52 1 54 5 55 4 59 9 63 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Panel Name AFLPPanel Ploidy 2 3 Zum Panel GeneMarker MFI xml oder GeneMarker Y plus navigieren und importieren 4 Den Vorgang nach Bedarf f r andere relevante Paneldateien wiederholen ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 30 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Verarbeitung von Daten Sobald die Rohdatendateien in den GeneMarker hochgeladen sind k nnen sie verarbeitet werden Zu den Verarbeitungsschritten geh ren die Anwendung eines Gr enstandards die Filterung von Rauschpeaks und bei Bedarf der Vergleich mit einem bekannten Allel Panel GeneMarker kombiniert all di
39. ivierung Zyklen Abschlie ende Extension Umgebungs temperatur 30 Zyklen Bei jedem PCR Durchlauf muss eine Negativkontrolle Wasser mitlaufen Es kann auch angemessen erscheinen weitere Kontrollen mitzuf hren z B eine positive m nnliche Normalkontrolle DNA Kontrolle wird mitgeliefert und eine normale weibliche Kontrolle DNA wird nicht mitgeliefert Eine f r die Anzahl der zu analysierenden Proben und Kontrollen ausreichende Anzahl von zuvor aliquotierten R hrchen mit dem Reaktionsgemisch aus dem Male Factor Infertility Produkt Male Factor Infertility oder MFI Yplus auftauen siehe Hinweis unter Im Lieferumfang enthaltene Materialien und die R hrchen 10 Sekunden lang bei 12 000 g zentrifugieren Mit separaten Pipettenspitzen 2 5 ul Test DNA in ein Probenr hrchen mit 10 ul Reaktionsgemisch geben und durch Aufziehen und Aussto en mit der Pipette vermischen F r alle zu testenden Proben ebenso verfahren Keine DNA in das PCR R hrchen f r die Negativkontrolle geben sondern stattdessen 2 5 ul steriles entionisiertes Wasser verwenden Die PCR R hrchen kurz zentrifugieren damit sich der Inhalt am Boden der R hrchen sammelt Alle R hrchen fest im Block des Thermocyclers platzieren Das Aktivierungsprogramm bei 94 C und anschlie end das Amplifikationsprogramm einleiten siehe Schritt 1 Nach Abschluss des Amplifikationsprogramms k nnen die Proben entweder bei Raumtemperatur ber Nacht oder bis zu 7 Tage
40. lendaten 1 Alle Zeilen in der Tabelle unten im Grafikfenster markieren 2 Die ausgew hlten Zeilen mit der Tastenkombination Ctrl C kopieren ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 27 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Analyseleitfaden f r GeneMarker Hinzuf gen von Probendateien zu GeneMarker Die GeneMarker Programmdatei ffnen und nach Aufforderung Open Data Daten ffnen ausw hlen Das Feld Open Data Files Datendateien ffnen ffnet sich Auf die Schaltfl che Add Hinzuf gen klicken Das Dialogfeld Open ffnen ffnet sich Zum Verzeichnis mit den Rohdatendateien navigieren 1 Mit STRG A alle Dateien oder mit der STRG Taste und oder der Umschalttaste einzelne Proben ausw hlen 2 Im Dialogfeld Open ffnen auf die Schaltfl che Open ffnen klicken Die ausgew hlten Dateien erscheinen im Feld Data File List Datendateienliste Abbildung 11 Abbildung 11 Der Data File List Datendateiliste hinzugef gte Proben Open Data Files Data File List E 01 _Run_3631304 amp _2014 10 16_16 193_0255_20714 10 16 fsa E E01_Fun_A831305_2014 10 16_16 19_0285_2014 10 16 fsa E CO Run AB31304_2014 10 16_16 19_02865_2014 10 16 fs Remove Remove Al Add Folder Default A Channels Suto Elewate IR Cancel 3 Im Feld Open Data Files Datendateien ffnen auf die Schaltfl che OK klicken
41. letionsregion klar abtrennbar ist gibt es eine signifikante berlappung zwischen den Mikrodeletionen in AZFb und AZFc Abbildung Langer Arm Kurzer Arm lt lt lt lt lt lt i lt lt gA r i ri e z a m y u _ Le um a gt x s gt 2 AZFc AZFb AZFa Abbildung 1 Lokalisation der AZFa AZFb und AZFc Mikrodeletionsregionen auf dem Y Chromosom Poongothai et al 2009 Die Identifizierung der genetischen Ursachen von m nnlicher Unfruchtbarkeit kann zu einem effektiveren klinischen Management der Patienten f hren Zum Beispiel weisen Patienten bei denen eine Mikrodeletion in der AZFc Region die h ufigste Variante vorliegt unterschiedliche Ph notpyen auf h ufig in Abh ngigkeit vom genetischen Hintergrund Doch in der Regel liegt bei diesen Patienten eine Restspermatogenese vor und die Wahrscheinlichkeit dass Spermatozoen mittels TESE Hodenbiopsie zur Spermiengewinnung gewonnen werden liegt in diesen F llen bei 50 Von AZFc Mikrodeletionen betroffene Paare k nnen m glicherweise mithilfe von assistierten Fertilit tstechniken wie z B ICSI intrazytolasmatische Spermieninjektion in die Lage versetzt werden ein Kind zu empfangen Dies ist anders bei Patienten mit kompletten Mikrodeletionen in der AZFa AZFb und AZFc Region In diesen F llen ist das Gewinnen von funktionsf higen Spermien unwahrscheinlich 2 obwohl die Wahrscheinlichkeit zunimmt wenn keine vollst ndige Deletion vorliegt
42. llungen f r die Trisomie Analyse Abbildung 20 Abbildung 19 Hauptanalysefenster Y Genauer TEST2 30 EErEE x Filz Wow Pujal Auplitiim Tuch Hdp aa B SabE A AER Ae sehe gt as gt F Bm Am des SU an Abbildung 20 Feld Trisomy Analysis Settings Einstellungen f r die Trisomie Analyse r Trisomy Analysis Settings Zeonssnssnsngsnennganens Analysis by Classic BPG C Aneuploidy Peak Height gt 50 Height Ratio gt 30 00 Max Quantification by C Peak Height Peak Area Trisomy Ratio MV Shorter Length Longer Length Apply Linear Correction Trisomy lt 10 80 or gt 1 40 vV Inconclusive Range gt 0 65 to lt 0 80 or gt 1 40 to lt 1 80 Save Parameters when Save Report Hinweis F r 3500 Daten Minimum Intensity Mindestintensit t auf 150 erh hen ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 34 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Einstellungen f r die Trisomie Analyse Im Feld Trisomy Analysis Settings Einstellungen f r die Trisomie Analyse stehen zwei Registerkarten zur Verf gung 1 Registerkarte Analysis Analyse 2 Registerkarte Statistics Plot Statistikdiagramm Registerkarte Analysis Analyse In der Registerkarte Analysis Analyse k nnen Schwellwertoptionen f r die Trisomie Analyse gew hlt werden Sicherstellen dass im Feld Analysis
43. lymerase und Desoxynukleosidtriphosphate in Puffer DNA Kontrolle DK Teilenummer 404489 1 Gef x 50 ul DNA Kontrolle normal sowohl in Bezug auf Marker f r den Nachweis einer Aneuploidie der Geschlechtschromosomen als auch auf Marker f r Y Chromosom Deletionen im Elucigene Male Factor Infertility Kit Elucigene MFI Yplus Kit Jedes Kit enth lt Elucigene MFI Yplus TA Teilnummer 450211 1 Gef x 100 ul 10 Tests Reaktionsgemisch mit Primern zur Amplifikation von Y Chromosom Markern Siehe Anhang 2 f r Details zu den Markern in jedem Kit Das Reaktionsgemisch enth lt ferner DNA Polymerase und Desoxynukleosidtriphosphate in Puffer DNA Kontrolle DK Teilenummer 404489 1 Gef x 50 ul DNA Kontrolle normal in Bezug auf die Marker von Y Chromosom Deletionen im Elucigene MFI Yplus Kit Vorbereitung und Lagerung des Kits Nach dem ffnen des Kits wird empfohlen das Reaktionsgemisch zu je 10 ul in die mitgelieferten 0 2 mI PCR R hrchen oder gleichwertige zu dispensieren und bei 20 C gefroren zu lagern Darauf achten dass der R hrcheninhalt vor dem Dispensieren gr ndlich aufgetaut und vermischt wird Die Kontroll DNA ist bei 20 C gefroren zu lagern ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 8 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Erforderliche Materialien nicht im Kit enthalten Allgemeines Labor Verbrauchsmaterial Handschuhe Mikrozentrifugenr hrchen mit Schraubverschluss 0 2
44. m X 104 bp und Y 110 bp Chromosom und kann dazu verwendet werden das Vorhandensein bzw Fehlen des Y Chromosoms zu bestimmen Er steht f r die relative Menge der X gegen ber der Y Sequenz Bitte beachten dass in seltenen F llen ein Versagen der Amplifikation aufgrund einer Mutation der AMEL Y Sequenz berichtet worden ist TAF9L ist ein invarianter paraloger Marker mit Sequenzen auf den Chromosomen 3 und X Der f r Chromosom 3 spezifische Peak 116 bp steht f r 2 Kopien von Chromosom 3 kann daher als Referenzpeak zur leichteren Bestimmung der Anzahl der vorhandenen X Chromosome Peak bei 121 bp dienen Bei einer Analyse in Verbindung mit Amelogenin und den anderen Geschlechtschromosom Markern ist er besonders n tzlich f r die Diagnose einer Aneuploidie der Geschlechtschromosomen Bei normalen M dchen liegen die Marker in einem Verh ltnisfenster von 0 8 bis 1 4 Bei normalen Jungen ergeben die Marker ein Verh ltnis von 2 1 8 Weitere Einzelheiten zur Interpretation des TAF9L Markers sind im Leitfaden zur Interpretation f r die Elucigene Male Factor Infertility Produkte enthalten Der polymorphe STR Marker DXYS218 liegt sowohl auf dem X als auch auf dem Y Chromosom vor und steht f r die Gesamtzahl der Geschlechtschromosomen F r informative Ergebnisse bei Jungen ist eine Bestimmung welches Allel f r das X bzw Y Chromosom steht nicht m glich Der informative X spezifische Marker XHPRT steht f r die Anzahl an X Chr
45. n Verh ltnis von 1 1 angegeben Falls die Verh ltnisbalance au erhalb dieses Fensters liegt kann dies auf einer Reihe von Faktoren beruhen z B e Trisomie des gesamten Chromosoms Geschlechtschromosom e Trisomie eines Teils des Chromosoms einschlie lich submikroskopische Duplikationen e Mosaik e Kontamination durch einen zweiten Genotyp e Durch Stotter Peaks verursachte Verzerrung e Durch pr ferenzielle Amplifikation eines Allels verursachte Verzerrung e Primerstellen Polymorphismen e Somatische Mikrosatelliten Mutationen Im Leitfaden zur Interpretation f r Elucigene Male Factor Infertility Produkte der auf der Elucigene Website verf gbar ist sind Beispiele von typischen Profilen f r viele dieser F lle enthalten Homozygote Marker sind nicht informativ da sich kein Verh ltnis bestimmen l sst ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 17 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Analyse der Geschlechtschromosom Marker AMEL TAF9 XHPRT DXYS218 und SRY Male Factor Infertility Kit Um die Interpretation eines Ergebnisses f r diese Marker als abnorm zu st tzen m ssen mindestens zwei f r einen Drei Allel Genotyp sprechende informative Marker vorhanden sein und alle anderen Marker nicht informativ sein Ein Ergebnis nur aufgrund der Informationen von einem einzigen Marker als abnorm zu beurteilen wird nicht empfohlen T Der AMEL Marker amplifiziert nicht polymorphe Sequenzen auf de
46. n auf das Durchlaufordner Symbol in diesem Fenster werden die einzelnen zu importierenden fsa Dateien angezeigt Die Proben werden dann durch Klicken auf die Schaltfl che Hinzuf gen am unteren Bildschirmrand hinzugef gt Nun werden die Dateien File Edit Analysis View Tools Help sou HF BRERUL Mi gt Table Setting QSTR Table Settings v02 EPE 50 Project Samples Status Sample File Sample Name sample ID Comments Sample Type SFN Analysis Method Panel Size Standard Matrix SNP Set Run Name C I l I m Add Samples to Project z Edit View Files GM Database Samples To Add Li ERUN _AB3130A_2014 03 19_15 10_0020 S i Run_AB3130A_2014 03 19_15 10_0020 d Run _AB3130A_ 2014 04 10 09 20 0032 A01 _Run_AB3130A_2014 03 19_15 10_0020_2014 03 19 fsa Run AB3130A 2014 04 14 14 24 0033 A02_Run_AB3130A_2014 03 19_15 10_0020_2014 03 19 fsa Run _AB3130A 2014 04 14 14 24 0034 amp B01_Run_AB3130A_2014 03 19_15 10_0020_2014 03 19 fsa Run AB3130A 2014 04 14 14 24 0035 B02_Run_AB3130A_2014 03 19_15 10_0020_2014 03 19 fsa Run AB3130A 2014 04 14 14 24 0036 CO1_Run_AB3130A_2014 03 19_15 10_0020_2014 03 19 fsa Run _AB3130A_2014 04 14_14 24 0037 C02_Run_AB3130A_2014 03 19_15 10_0020_2014 03 19 fsa Run _AB3130A_2014 04 14_14 24 0038 DO1_Run_AB3130A_2014 03 19_15 10_0020_2014 03 19 fsa Run AB3130
47. n ausf llen indem Ctrl D Strg D gedr ckt wird Diesen Vorgang wiederholen indem Male Factor Infertility oder MFI Y plus unter der Spalten berschrift Panel und Male Factor Infertility Size Standard unter der Spalten berschrift Size Standard Gr enstandard gew hlt wird Jedes Mal darauf achten alle Spalten durch Dr cken von Ctrl D Strg D auszuf llen um sicherzustellen dass jede Einstellung auf die komplette Probenliste angewandt wird 3 Zum Starten der Probenanalyse auf gt klicken Bei entsprechender Aufforderung einen Projektnamen zuweisen Pr fen der Male Factor Infertility Produkt Daten 1 Die zu analysierende Probe ausw hlen Zeile der Probe markieren 2 Zur Grafikanzeige Display Plots Grafiken anzeigen klicken 3 Je nachdem welches Kit analysiert wird entweder Male Factor Infertility Plot Settings Grafikeinstellungen Abbildung 9 oder MFI Y plus ausw hlen Abbildung 9 Dropdownmen der Male Factor Infertility Grafikeinstellungen WE Samples Plot File Edit View Tools Alleles Help Plot Setting Male Factor Infertility Plot Settings BEA ME u h M a a a 4 Das Plot Window Grafikfenster zeigt das Probenprofil mit den Tabellendaten an Abbildung 10 GeneMapper beschriftet automatisch bis zu zwei Peaks f r jeden Marker Falls f r einen Marker drei Allele vorhanden sind sollte der dritte nicht markierte Peak manuell be
48. nd sie importieren Abbildung 5 F r MFI Yplus alternativ MFI Y plus_ MFI Y plus_bins txt ausw hlen 6 Auf Apply Anwenden und dann auf OK klicken ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 21 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Abbildung 4 Importieren der Male Factor Infertility Kit Paneldatei Panel Manager File Edit Bins View Kit Name QC CFEU2ZV1 CF Iberian Panel MFI reflex CF UK QSTR MI CF4vz CFEU2Z QSTR QSTRPL TRP F MFI Y plus Devyser CFTR Core 0 Male Factor Infertility CFEUZWI OSTR MFI CF Iberian CF Ivacaftor Panel Devyser CFTR Core C Male Factor Infertility 1 2 3 4 5 6 2 8 9 10 11 12 13 14 15 16 5 asma L LMS HD5 V2 5 Panels SNPlex_48plex_3130_Bins LMS MD10 V2 5 Panels SNPlex_48plex_3130_Panels LOH Getting Started Guide Panel L SNPlex_48plex_3730_Bins Male Factor Infertility_Male Factor Infertility_bins _ SNPlex_48plex_3730_Panels iMale Factor Infertility_Panels Male Infertility_bins Male _Infertility_Panels MFI Y plus_MFI Y plus_bins MFI Y plus_Panels Microsatellite Getting Started Guide Panel QSTR ML Panels QSTR MI_QSTRFL_bins QSTR MFI_Male Infertility Panel_bins QSTR MFI_Panels 5NaPshot Getting Started Guide Panel Male Factor Infertlity_Panels txt Abbildung 5 Importieren der Male Factor Infertility Kit Bindatei Panel Manager
49. omosomen Der Y spezifische Marker SRY ergibt bei normalen Jungen einen Einzelpeak und amplifiziert bei normalen M dchen nicht Analyse von Markern f r Y chromosomale Mikrodeletionen Male Factor Infertility und MFI Yplus Alle Mikrodeletionen des Y Chromosoms werden mit einem Einzelpeak dargestellt Der Verlust eines Peaks entspricht einer Mikrodeletion in dieser Region Der ZFX ZFY Marker steht f r Sequenzen auf sowohl dem X als auch dem Y Chromosom Da sich das aus den beiden Sequenzen erzeugte Amplikon nicht anhand der Gr e unterscheiden l sst gibt dieser Marker unabh ngig vom Probengeschlecht einen Einzelpeak aus Dieser Marker ist nicht f r die diagnostische Anwendung vorgesehen sondern dient als Amplifikationskontrolle ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 18 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Analyseleitfaden f r GeneMapper Import und Analyse von Male Factor Infertility Produkt Dateien 1 2 Auf klicken um einem neuen Projekt Dateien hinzuzuf gen Zum Speicherort der Rohdateien fsa navigieren die entsprechenden Dateien markieren und Die Programmdatei GeneMapper ffnen auf die Schaltfl che Add to List gt gt Zur Liste hinzuf gen klicken Der Durchlaufordner im GeneMapper Hauptfenster angezeigt Abbildung 2 Abbildung 2 Proben die dem Projekt hinzugef gt werden k nnen erscheint nun im Fenster Samples Hinzuzuf gende Proben Durch Doppelklicke
50. platte in den Gen Analysator laden Hinweis Es ist unbedingt notwendig unbenutzte Vertiefungen d h Vertiefungen in die keine DNA Probe geladen wurde trotzdem mit Hi Di Formamid zu bef llen damit die Kapillaren nicht austrocknen Die Einstellungen f r die Probeninjektion k nnen dabei je nach der in der PCR Reaktion erzeugten Amplikonmenge die von der eingesetzten Genom DNA abh ngt ge ndert werden Durch Reduktion der Injektionszeit bzw spannung kann der S ule weniger Amplikon zur Analyse zugef hrt werden Umgekehrt bedeutet eine l ngere Injektionszeit bzw spannung eine gr ere der S ule zugef hrte Amplikonmenge Zuvor amplifizierte Proben k nnen zur erneuten Analyse mehrfach erneut injiziert werden Datenanalyse nach der PCR GEN ANALYSATOR ABI3130 Die Produktreihe Male Factor Infertility ist mit dem Elucigene CFEU2Vv1 Produkt kompatibel Daher k nnen die Male Factor Infertility Produkte mithilfe der bestehenden CFEU2Vv1 Durchlaufmodule und einstellungen angewandt werden Alternativ kann der Anwender ein separates Male Factor Infertility MFI Durchlaufmodul erstellen Dazu ist wie folgt vorzugehen Mit der Datenerfassungssoftware des 3130 ein Probenblatt mit den nachstehenden Einstellungen erstellen e Probenbezeichnung Hier muss die gleiche probenspezifische Bezeichnung bzw Nummer angegeben werden e Eigent mer des Durchlaufs Den Standardeigent mer f r das Labor ausw hlen e Durchlaufprotokoll MFI
51. rbeitung Events Checking options Frocessing Samples AUL_Run_AB3130A_2014 10 16 16 19 _ 0285 2014 10 16 fsa Completed BEOl_ Kun AB3130A_2014 10 16_16 19_ 0285 2014 10 16 fsa Completed CO1l_Run_ AB3130A_2014 10 16_16 19_ 0285 2014 10 16 fsa Completed Checking Calibration 3 samples processed Analys s Time 0 4 s ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 33 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Hauptanalysefenster Das Hauptanalysefenster Abbildung 19 von GeneMarker hat ein anwenderfreundliches Layout Dieses Layout umfasst Die Liste der Probendateien links im Fenster angezeigt Das synthetische Gelbild oben im Fenster angezeigt Datenelektropherogramme unter dem Gelbild Eine Berichttabelle rechts im Fenster angezeigt In diesem Fenster muss unbedingt gepr ft werden ob alle Peaks in den einzelnen Profilen jeweils die korrekte Beschriftung tragen 1 Nacheinander auf jede Probe in der Probendateistruktur links auf dem Bildschirm doppelklicken Mit der rechten Maustaste auf alle fraglichen Peaks klicken und aus den Optionen im Dialogfeld nach Bedarf z B Allel bearbeiten oder l schen best tigen oder Best tigung aufheben ausw hlen 2 Im Hauptanalysefenster das Dropdownmen Applications Anwendungen oben auf dem Bildschirm ausw hlen Trisomy Analysis Trisomie Analyse ausw hlen Daraufhin ffnet sich das Feld Trisomy Analysis Settings Einste
52. roduct category reproductive health Verwendungszweck Male Factor Infertility F r die routinem ige quantitative In vitro Diagnose der sechs h ufigsten in der Regel mit dem m nnlichen Infertilit tsfaktor assoziierten Geschlechtschromosom Aneuploidien z B Klinefelter Syndrom und Mikrodeletionen des Y Chromosoms AZFa AZFb und AZFc Das Kit enth lt die STR Geschlechtschromosom Marker XHPRT und DXYS218 die Nicht STR Marker AMEL TAF9L sowie SRY Marker zur Bestimmung des Aneuploidie Status der Geschlechtschromosomen Dar ber hinaus umfast das Kit die Y chromosomspezifischen Marker sY84 sY86 sY127 sY134 sY254 und sY255 zum Nachweis von Mikrodeletionen des Y Chromosoms in den Loci AZFa AZFb und AZFc Die im Elucigene Male Factor Infertility Kit verwendete Methode ist die QF PCR quantitative Fluoreszenz Polymerase Kettenreaktion Die Tests sind zur Verwendung mit aus Vollblut EDTA extrahierter DNA bestimmt und nicht f r die Verwendung mit anderen Probematerialien vorgesehen Die vorgesehene Zielpopulation sind m nnliche Patienten mit Verdacht auf Infertilit t bei denen m glicherweise assoziierte Merkmale wie z B verminderte Spermienzahl vorliegen Der Test ist f r die Verwendung in Verbindung mit anderen Diagnoseverfahren zur Untermauerung oder Widerlegung der vorgeschlagenen klinischen Diagnose vorgesehen Der Test ist nur zum Gebrauch durch Fachkr fte in einem Molekular oder Zytogenetiklabor bestimmt Male Factor Infert
53. schriftet werden siehe Manuelle Bearbeitung von Profilen weiter unten Hinweis Die Allel Gr enbereiche f r jeden Marker beruhen auf fr her beobachteten Daten Seltene Allele k nnen au erhalb des angegebenen Marker Gr enbereichs fallen sodass es erforderlich sein kann den Binsatz entsprechend zu modifizieren ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 25 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung 5 Es wird empfohlen f r das Plot Window Grafikfenster Single click editing Einzelklick Bearbeitung zu aktivieren Dazu Alleles set click editing Allele Klickbearbeitung einstellen ausw hlen und darauf achten dass diese Option markiert ist Abbildung 10 Beispiele f r ein Grafikfenster mit beschrifteten Spurdaten und der zugeh rigen Genotyp Tabelle 11 Samples Pi O n S Fie Edit View Tools Alleles Help Plot Setting Male Factor Infert ty Plot Settings w Panes 2 na num era wa 3 Mus uns h l a saspie File Sampie Marne Pana sai os so 01_01_AD11s 01 GSTR_MFI af 5 f Sample File mple Name Panel Maher Sre e Ar z 2 a 01_01_A01 t52 0 QSTR_MFI AMEL t0403 402800 10073 235500 01 AD tes OSTR_MFI Tao 15 81 557270 2 0 01 M01 tsa QSTR_MFI SRY 4399 4809070 01 01 A01 tsa QSTR_MFI HPRT 7001 277020 01 AON tus OSTR _MFI OXY 61 29 1817750 3 98427 01_01_A01 tsa QSTR_MFI sv255 22 37 95 0 01_01_A01 tsa QSTR_MFI 5Y134 01 81 580 0 01_01_AD1 tus QS
54. siehe Abbildung 2 ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 3 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Testprinzip Die bei der Elucigene Male Factor Infertility Produktreihe verwendete Methode zur Herstellung eines Multiplex Assays das eine Aneuploidie des X und Y Chromosoms Male Factor Infertility sowie Mikrodeletionen des Y Chromosoms Male Factor Infertility und MFI Yplus nachweist ist die QF PCR quantitative Fluoreszenz Polymerase Kettenreaktion 3 7 i Nachweis einer Aneuploidie der Geschlechtschromosomen Mithilfe der PCR Amplifikation werden chromosomale Aneuploidien nachgewiesen wenn mit fluoreszenten Farbstoffen markierte Primer auf hochgradig polymorphe Regionen der DNA Sequenz die als Short Tandem Repeats STRs bezeichnet werden und auf den interessierenden Chromosomen liegen abzielen Jeder Ziel STR Marker ist spezifisch f r das Chromosom auf dem er liegt die Kopienzahl des STR Markers kann daher zur Diagnose der Kopienzahl des Chromosoms dienen Es wurden informative STR Marker ausgew hlt die ein hohes Ma an Heterogenit t aufweisen sodass sich die Kopienzahl leicht bestimmen l sst wobei zwei Allele eines chromosomspezifischen STR mit der QF PCR Technik als zwei Peaks im Verh ltnis 1 1 bestimmt werden Wird ein weiteres STR Allel beobachtet entweder als drei Peaks im Verh ltnis 1 1 1 oder zwei Peaks im Verh ltnis 2 1 oder 1 2 weist dies das Vorliegen einer weiteren Sequenz nach
55. teien anzuzeigen Eine fsa Datei ausw hlen Durch Klicken auf die Registerkarte Raw data Rohdaten wird das Elektropherogramm der Rohdaten angezeigt Mit dem ersten Peak des Gr enstandards z B 60 bp von GS600LIZv2 als Anhaltspunkt einen ungef hr 100 Datenpunkte gr eren Datenpunkt ausw hlen Abbildung 7 Damit wird der niedrigste Punkt im analysierbaren Bereich festgelegt Sicherstellen dass der maximale Analysebereich den gr ten Peak des Gr enstandards umfasst z B 600 bp von GS600LIZV2 Die neuen Werte in die Analysedatei eingeben der Zugriff darauf erfolgt wie oben beschrieben Abbildung 7 Bestimmen des minimalen Bereichs anhand von Probenrohdaten Info Raw Data EPT Data frag_007_D09 fsa 0 10000 8000 6000 2000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 60 80 100 ANXYAZFDE 001 Juni 2015 Seite 24 von 45 Elucigene Male Factor Infertility Produkte Gebrauchsanweisung Analyse von importierten Male Factor Infertility Produkt Paneldateien 1 Im GeneMapper Hauptfenster Male Factor Infertility Table Settings Tabelleneinstellungen ausw hlen Abbildung 8 Abbildung 8 Einstellen der Tabelleneinstellungen gt a Table Setting Male Factor Infertility Table Settings 2 Unter Analysis Method Analysemethode Male Factor Infertility Analysis Settings Analyseeinstellungen bzw f r MFI Yplus Male Factor Infertility Y plus ausw hlen Alle Spalte
56. ten Marker mindestens 1 Peak beobachtet werden Der akzeptable Bereich f r auf dem Gen Analysator 3130 analysierte Marker Peaks liegt sowohl f r die Aneuploidie als auch die Mikrodeletionsanalyse zwischen 50 und 6000 relativen Fluoreszenzeinheiten RFU Bei den Gen Analysatoren 3500 liegt er zwischen 175 und 32 000 RFU Peakh hen au erhalb dieses Bereichs d rfen nicht analysiert werden 4 Elektropherogramme von schlechter Qualit t aufgrund von berm igem Durchschlagen zwischen Farbstofffarben auch als Pull Up bezeichnet oder Elektrophorese Spikes scharfe Peaks in mehr als einem Farbstoff sollten nicht interpretiert werden Die PCR Produkte sollten erneut injiziert und analysiert werden 5 Die Aneuploidie Analyse erfolgt durch Beurteilung der Peak Verh ltnisse A1 A2 wobei A1 die Peakfl che des k rzeren Fragments und A2 die Peakfl che des l ngeren Fragments bezeichnet Das resultierende Verh ltnis ist f r die Kopienzahl am betreffenden Locus diagnostisch Bei disomen Chromosomen sollten heterozygote Marker zwei Peaks von hnlicher H he zeigen Eine vollst ndige Analyse des Kopienzahl Status eines Chromosoms erfolgt durch Vergleich der Peakfl chen Verh ltnisse 6 Heterozygote Zwei Allel Marker sollten in einem Verh ltnisfenster von 0 8 bis 1 4 liegen F r mehr als 24 bp auseinander liegende Allele ist jedoch ein Gr enverh ltnis von bis zu 1 5 annehmbar Werte die in diesen Bereich fallen werden als ei
57. wie z B niedrige Spermienzahl die zugrundliegende Ursache Auch wenn in der Mehrheit der F lle die Ursachen f r die m nnliche Infertilit t unbekannt sind wurde in Studien nachgewiesen dass eine Aneuploidie der Geschlechtschromosomen und Mikrodeletionen in speziellen Regionen des Y Chromosoms eine Rolle spielen k nnen 1 Das Klinefelter Syndrom ist die h ufigste mit m nnlicher Infertilit t assoziierte Aneuploidie der Geschlechtschromosomen Die Inzidenz dieses Syndroms unter m nnlichen Lebendgeburten betr gt zwischen 1 500 und 1 650 und die h ufigste Ursache ist eine zus tzliche Kopie des X Chromosoms Karyotyp 47 XXY Bei dieser Ver nderung handelt es sich um den in Verbindung mit m nnlicher Infertilit t am h ufigsten beobachten Gendefekt Mikrodeletionen des Y Chromosoms sind die zweith ufigste genetische Ursache f r m nnliche Infertilit t 2 bei der Mikrodeletionen in drei Regionen AZFa AZFb AZFc auftreten Diese werden in bis zu 7 der Oligozoospermie F lle niedrige Spermienzahl und 13 der F lle von nicht obstruktiver Azoospermie vollst ndiges Fehlen von Spermien nachgewiesen 1 Diese Mikrodeletionen treten aufgrund einer homologen Rekombination der repetitiven Sequenzen in diesen Regionen auf und die diesen Ver nderungen zugrundliegenden exakten molekularen Mechanismen und Rekombinationsereignisse wurden aufgekl rt Diese Regionen sind in Yq11 des Y Chromosoms lokalisiert und w hrend die AZFa Mikrode

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