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MiSeqDx Diagnose-Assay für zystische Fibrose - Support

1. 94 44 100 100 100 94 44 94 44 April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Summe Alle HGVS Name oder Ergebnisse gesamt bereinstimmende Calls Standarte Varianten Probe Standort wenn kein HGVS Name Pro Alle Standort Standort Standort No Miscalls Standort Standorte 1 2 3 Callse 6 6 0 nn E O CI I E E E n cm Lc O O ET I O E E n emon O CI IC CI E E mn mac LE E TEO n esere ie e e e A A O ET I E EC EC p a O O TO I E EC E 56 Teile Nr 15038344 Rev A DEU bereinstimmung 100 100 100 100 100 100 100 100 April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Summe Alle HGVS Name oder Ergebnisse gesamt bereinstimmende Calls Standarte Varianten Probe Standort wenn kein HGVS Name Pro Alle Standort Standort Standort No Miscalls Standort Standorte 1 2 3 Callse 6 6 0 w ee prama CI TO O E E E w esmen E CI I CI E E E o esere Im e ee TA CI un E FC a ame e O O ET E E E ee om CI ICI CI E E E 2 css a ee eee 57 Teile Nr 15038344 Rev A DEU bereinstimmung 100 100 100 100 100 100 100 100 April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Summe Alle HGVS Name oder Ergebnisse gesamt bereinstimmende Calls Standort Varianten Probe Standort wenn kein HGVS Name Pro Alle Standort Standort Stando
2. ame e 8 e ee e gt 59 Teile Nr 15038344 Rev A DEU Ubereinstimmung 100 100 94 44 100 94 44 100 April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Summe alle Anzahl Ergebnisse bereinstimmende Calls Standorte Panel Probe Genotyp Ri a Pro Alle Standort Standort Standort No Miscalls bereinstimmung Standort Standorte 1 2 3 Calls w omaoma m e 6 6 e au aonan a u m no 0 mamma em mamma m 6 6 e e comme e e di corone e A e gt 60 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Summe alle Anzahl Ergebnisse bereinstimmende Calls Standorte Panel Probe Genotyp Ri a Pro Alle Standort Standort Standort No Miscalls bereinstimmung Standort Standorte 1 Di 3 Calls gt COSCIA E 00 COS ame u m mn 0 aa mamma A m m m 0 0 mu ame e e ejeje B 61 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Summe alle Anzahl Ergebnisse bereinstimmende Calls Standorte Panel Probe Genotyp Ri a Pro Alle Standort Standort Standort No Miscalls bereinstimmung Standort Standorte 1 2 3 Calls a omaoma e e 6 600 e mom m mamma em CA mamma I am e ECC A 0 n awon I m O CI m ame 6 m e e 60 0 w 62 Teile Nr
3. BERNIMMT KEINERLEI HAFTUNG F R SCH DEN DIE AUS DER UNSACHGEM SSEN VERWENDUNG DER HIERIN BESCHRIEBENEN PRODUKTE EINSCHLIESSLICH TEILEN HIERVON ODER DER SOFTWARE ENTSTEHEN ODER JEDER ANDEREN ART DER VERWENDUNG DER PRODUKTE AUSSERHALB DES G LTIGKEITSBEREICHS DER AUSDR CKLICHEN SCHRIFTLICHEN LIZENZEN ODER DER DURCH ILLUMINA GENEHMIGTEN ZULASSUNGEN IN VERBINDUNG MIT DEM ERWERB DER PRODUKTE DURCH DEN KUNDEN F R IN VITRO DIAGNOSTIK 2012 2104 Illumina Inc Alle Rechte vorbehalten Illumina und MiSeqDx sind Marken oder eingetragene Marken von Illumina Inc Alle anderen hierin enthaltenen Marken und Namen sind Eigentum der jeweiligen Eigent mer AMPure Beckman und Beckman Coulter sind Marken oder eingetragene Marken der Beckman Coulter Inc Kontaktinformationen wi Ilumina Emergo Europe San Diego Kalifornien 92122 USA Molenstraat 15 1 800 809 ILMN 4566 2513 BH Den Haag 1 858 202 4566 au erhalb von Nordamerika Niederlande techsupport illumina com www illumina com Produktkennzeichnungen Der mit jedem Kit versendete Symbolschl ssel enth lt eine vollst ndige Referenz der Symbole die auf der Produktverpackung und beschriftung verwendet werden April 2014 Teile Nr 15038344 Rev ADEU 66
4. Inkubieren Sie zwei Minuten lang bei Raumtemperatur Platzieren Sie die CLP Platte mindestens zwei Minuten bzw so lange auf dem Magnetstativ bis der berstand klar ist Stellen Sie eine neue MIDI Platte nachstehend als LNP Platte bezeichnet bereit bertragen Sie 20 ul des berstands von der CLP Platte auf die LNP Platte Optional bertragen Sie die verbleibenden 10 ul berstand von der CLP Platte auf eine neue Platte und beschriften Sie diese Platte mit einem Laufnamen und Datum Lagern Sie diese Platte bis zum Ende des Sequenzierungslaufs und der Datenanalyse bei 25 C bis 15 C Die gereinigten PCR Produkte k nnen im Falle von Probenfehlern zur Fehlerbehebung verwendet werden SICHERER HALTEPUNKT Wenn Sie den Vorgang an diesem Punkt beenden versiegeln Sie die LNP Platte und zentrifugieren Sie sie eine Minute lang bei 1000 x g und 20 C Die Platte ist bis zu drei Stunden lang bei 2 C bis 8 C stabil Bibliotheksnormalisierung Vorbereitung 1 Bereiten Sie frisches 0 1N NaOH vor 2 Bringen Sie den Bibliotheksnormalisierungsverd nner die Bibliothek Beads und den Bibliotheksnormalisierungs Wasch Puffer auf Raumtemperatur 3 Mischen Sie den Bibliotheksnormalisierungsverd nner kr ftig mit dem Vortexer und stellen Sie sicher dass alle Ausf llungen vollst ndig aufgel st wurden 4 Mischen Sie die Bibliothek Beads kr ftig eine Minute lang mit dem Vortexer zeitweilig mit Inversion bis die Beads resuspendiert sind
5. 3 Tischzentrifuge Es wird eine Tischzentrifuge ben tigt die die Temperatur von 20 C halten kann Es wird eine separate Zentrifuge im Voramplifikationsbereich ben tigt Es kann jede Plattenzentrifuge verwendet werden die die vorgesehenen Geschwindigkeiten des Protokolls erreicht 280 bis 2400 x g 4 Hitzeblock Es wird ein Hitzeblock f r R hrchen ben tigt Der Hitzeblock muss den folgenden Leistungsspezifikationen entsprechen Temperaturbereich Umgebung 5 C bis 99 C Temperatursteuerung 0 1 C bei 37 C 0 4 C bei 60 C 5 Magnetstativ Es wird ein Magnetstativ f r eine 96 Well Platte ben tigt Die Leistung ist besser wenn sich die Magnete an der Seite des Stativs und nicht am Boden befinden 6 Pr zisionspipetten Es wird ein Satz Pr zisionspipetten ben tigt Es wird ein separater Satz im Voramplifikationsbereich ben tigt Die Verwendung von Pr zisionspipetten ist notwendig um eine genaue Reagenz und Probenabgabe zu gew hrleisten Es k nnen Einzel oder Mehrkanalpipetten verwendet werden wenn sie regelm ig kalibriert werden und ihre Genauigkeit innerhalb von 5 des angegebenen Volumens liegt 7 Verbrauchsmaterialien Die folgenden Verbrauchsmaterialien werden ben tigt 96 Well PCR Platten mit Rahmen 0 2 ml Polypropylen oder vergleichbar 96 Well Lagerungsplatten 0 8 ml MIDI Platten HINWEIS Stellen Sie sicher dass die 96 Well Platte zum Magnetstativ passt Konische 15 ml R hrchen Eppe
6. Pr zisionspipetten Es wird ein Satz Pr zisionspipetten ben tigt Es wird ein separater Satz im Nachamplifikationsbereich ben tigt Die Verwendung von Pr zisionspipetten ist notwendig um eine genaue Reagenz und Probenabgabe zu gew hrleisten Es k nnen Einzel oder Mehrkanalpipetten verwendet werden wenn sie regelm ig kalibriert werden und ihre Genauigkeit innerhalb von 5 des angegebenen Volumens liegt 5 Verbrauchsmaterialien Die folgenden Verbrauchsmaterialien werden ben tigt 96 Well PCR Platten mit Rahmen 0 2 ml Polypropylen oder vergleichbar HINWEIS Stellen Sie sicher dass die 96 Well Platte zum Magnetstativ passt 96 Well Lagerungsplatten 0 8 ml MIDI Platten L sungsbecken PVC DNase RNase frei Bottich Klebende Aluminiumfolienversiegelung Entsprechende PCR Plattenversiegelung Aerosol resistente Pipettenspitzen Ger te und Materialien f r die Nachamplifikation 1 Thermocycler Es wird ein Thermocycler ben tigt Der Thermocycler muss einen beheizbaren Deckel besitzen und den folgenden Leistungsspezifikationen entsprechen Temperatursteuerungsbereich 4 C bis 99 C Steuerungsgenauigkeit 0 25 C von 35 C bis 99 C 2 Mikroplattensch ttler Es wird ein Mikroplattensch ttler im Nachamplifikationsbereich des Labors ben tigt Der Plattensch ttler muss den folgenden Leistungsspezifikationen entsprechen Maximale Mischgeschwindigkeit 3 000 rpm Mischgeschwindigkeitsbereich 200 bis 3 000 rpm
7. Verfallsdatum bei 2 C bis 8 C gelagert werden Stringenter Wasch Puffer Universeller Wasch Puffer PCR Reinigungs Beads Bibliothek Beads Bibliotheksnormalisierungs Wasch Puffer MiSegDx SBS L sung PR2 Klinischer CF Sequenzierungs Assay MiSegDx Flie zelle Klinischer CF Sequenzierungs Assay 4 Die folgenden Reagenzien werden in Umgebungstemperatur ausgeliefert und sind stabil wenn sie bei Raumtemperatur bis zum angegebenen Verfallsdatum gelagert werden Elutionspuffer Filterplatte Bibliothek Lagerungspuffer April 2014 Teile Nr 15038344 Rev ADEU 9 MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose 5 nderungen an der physischen Struktur der bereitgestellten Reagenzien kann auf eine Sch digung der Materialien hindeuten Verwenden Sie die Reagenzien nicht wenn Anderungen an der physischen Struktur auftreten z B offensichtliche Ver nderungen der Reagenzienfarbe oder Eintr bung mit offenkundiger Keimkontamination 6 Die Reagenzien Hybridisierungspuffer Stringenter Wasch Puffer und Bibliotheksnormalisierungsverd nner k nnen sichtbare Ausf llungen oder Kristalle bilden Mischen Sie vor der Verwendung kr ftig mit dem Vortexer und stellen Sie anschlie end visuell sicher dass keine Ausf llungen vorhanden sind 7 Beachten Sie die folgenden Best Practices beim Umgang mit PCR Reinigungs Beads und Bibliothek Beads Die Beads d rfen niemals eingefroren werden Die Beads sollten Raumtemperatur haben Mischen S
8. April 2014 Teile Nr 15038344 Rev A DEU 21 MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose berpr fen Sie nach dem Laden der Probe ob sich Luftblasen im Beh lter befinden Falls Luftblasen vorhanden sind klopfen Sie die Kartusche vorsichtig auf den Tisch damit die Blasen entweichen 3 Fahren Sie mit den Schritten zum Einrichten des Laufs unter Verwendung der MiSeq Operating Software MOS Benutzeroberfl che fort Interpretation der Ergebnisse Der Illumina MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose ist f r die Sequenzierung aller pro teincodierenden Regionen im CFTR Gen ber die 27 Exone zwischen 5 und 30 Basen flankierender intronischer Sequenz ca 100 nt flankierender Sequenz an den 5 und 3 UTRs und zwei tiefen intronischen Mutationen 1811 1 6k bA gt G 3489 10kbC gt T konzipiert Die genauen sequenzierten Regionen sind in Tabelle 2 aufgef hrt Au erdem liefert der Assay Ergebnisse ber die PolyTG PolyT Variante und zwei gro e Deletionen CFTRdele2 3 CFTRdele22 23 1 Der Assay Bericht listet die Probennamen und den Genotyp f r jede in einer Probe nachgewiesene Variante auf Es werden f r jede Variante die genomische Koordinate der CDNA Name der Human Genome Variation Society HGVS und der Proteinname sofern verf gbar angegeben Beim Varianten Typ handelt es sich um eine einzelne Nukleotidvariante Single Nucleotide Variant SNV eine Deletions Insertionsvariante DIV eine
9. DE I I I I I EEE BEE RE E O I I E I EEE SEE A TG 10 T 7 TG 12 T 5 TG 10 T 9 TG 10 T 9 TG 10 T 9 TG 11 T 7 100 TG 10 T 9 TG 12 T 5 100 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose TG 11 T 7 TG 11 T 9 2 1 TG 11 T 7 TG 12 T 5 2 0 TG 11 T 7 TG 12 T 7 37 3 TG 11 T 9 TG 12 T 7 3 0 TG 12 T 7 TG 12 T 7 2 2 Summe 448 Proben wurden nicht erneut getestet Anzahl der synthetischen Proben 0 0 Anzahl der Miscalls 3 0 Anzahl der No Calls 0 0 Genauigkeit 0 100 100 100 100 98 44 Eines der diskordanten Ergebnisse stammte aus der Reproduzierbarkeitsstudie Das PolyTG PolyT Ergebnis der Probe war bei allen 18 Replikaten konkordant bei der bidirektionalen Sanger Sequenzierung jedoch diskordant Reproduzierbarkeit Die Reproduzierbarkeit des MiSeqDx Systems f r zystische Fibrose wurde anhand einer Blindstudie an drei Teststandorten und mit zwei Bedienern an jedem Standort ermittelt Zwei gut charakterisierte Panels mit jeweils 46 Proben wurden an jedem Standort von beiden Bedienern getestet Daraus ergaben sich 276 Probenergebnisse pro Bediener Die Panels enthielten eine Mischung aus genomischer DNA aus lymphoblastoiden Zelllinien mit bekannten Mutationen im CFTR Gen sowie leukozytenbereinigte Blutproben die mit lymphoblastoiden Zelllinien mit bekannten Mutationen im CFTR Gen versetzt wurden Die B
10. Ergebnissen oder einer wesentlichen Abnahme der Probenqualit t f hren Wenden Sie die routinem igen Vorsichtsma nahmen f r das Labor an Pipettieren Sie nicht mit dem Mund Essen trinken oder rauchen Sie nicht in ausgewiesenen Arbeitsbereichen Tragen Sie bei der Handhabung von Proben und Assay Reagenzien Einweg Handschuhe und einen Laborkittel Waschen Sie sich nach der Handhabung von Proben und Assay Reagenzien gr ndlich die H nde Verwenden Sie Assay Komponenten nicht mehr nach ihrem auf dem Etikett des Assay Kartons angegebenen Verfallsdatum Tauschen Sie Assay Komponenten aus unterschiedlichen Assay Chargen nicht gegeneinander aus Beachten Sie dass die Assay Charge auf dem Etikett des Assay Kartons angegeben ist Lagern Sie die Assay Komponenten bei der angegebenen Temperatur in ausgewiesenen Voramplifikations und Nachamplifikationsbereichen Ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen bis zu sechsmal der Komponenten aus Karton 1 beeintr chtigt die Integrit t des Assays nicht 12 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Um eine Zersetzung der Proben oder Reagenzien zu verhindern stellen Sie sicher dass alle Natriumhypochloritd mpfe vollst ndig abgef hrt wurden bevor Sie das Protokoll starten Ordnungsgem e Laborpraktiken und eine gute Laborhygiene sind unerl sslich um
11. PolyTG PolyT Variante PolyTGPolyT oder eine gro e Deletion DEL Der Genotyp Call heterozygot oder homozygot kann der Referenzbaseninformation entnommen werden die die Referenzsequenz an dieser genomischen Koordinate angibt sowie der Ergebnisbeschreibung die die beiden Allele an der genomischen Position in der Probe bereitstellt Wenn beispielsweise die Referenz G und das Ergebnis A G ist weist dies auf eine G gt A nderung an dieser genomischen Koordinate hin und bedeutet dass der Genotyp des Variantenallels heterozygot ist Wenn die Referenz G und das Ergebnis T T ist weist dies auf eine G gt T nderung an dieser genomischen Koordinate hin und bedeutet dass der Genotyp des Variantenallels homozygot ist Die Sequenzierungstiefe an der Variantenposition wird im Feld Depth Tiefe und die Allelh ufigkeit wird im Abschnitt Frequency H ufigkeit angegeben 2 Der Assay Bericht enth lt Informationen zur Proben Call Rate f r jede Probe Die Call Rate wird berechnet als die Anzahl der Variantenpositionen regionen die einen vordefinierten Konfidenzschwellenwert erreichen geteilt durch die Gesamtzahl der untersuchten Positionen Regionen Die genomische Koordinate einer Position oder Region bei der der Konfidenzwert unter dem Schwellenwert liegt wird separat im Abschnitt Coordinates not called Koordinaten ohne Call aufgef hrt Benutzer sollten die Positionen bei denen kein Call erfolgte anhand
12. bp validiert Die H ufigkeit der von diesem Assay ermittelten Varianten ist je nach Bev lkerungsgruppe unterschiedlich Es ist nicht m glich alle Variantenkombinationen zu validieren die dieser Assay im CFTR Gen nachweisen k nnte Es wird empfohlen neue und seltene Varianten mit einer validierten Referenzmethode zu best tigen Wie bei jedem auf Hybridisierung basierenden Assay k nnen zugrundeliegende Polymorphismen oder Mutationen in Oligonukleotid bindenden Regionen die untersuchten Allele und somit die Anzahl der Calls beeintr chtigen Wenn mehr als zwei Varianten in einer Probe identifiziert werden sollte der Benutzer das Ergebnis verifizieren indem er die Probe unter Verwendung des Ger tesystem mit einem frischen gDNA Extrakt wiederholt um eine Kreuzkontamination der Probe auszuschlie en HINWEIS Es sollte eine Haplotyp Phasierung in Betracht gezogen werden wenn zwei oder mehr Varianten nachgewiesen werden Dieser Assay kann nicht feststellen ob sich Varianten in cis trans Ausrichtung zu anderen Varianten befinden In der MiSeq Reporter Software werden alle Insertionen Deletionen in Homopolymer Regionen linksb ndig ausgewiesen Beispielsweise wird die Variante 444delA als eine GA TC Deletion identifiziert w hrend die Deletion in dbSNP als eine G ATC Deletion angegeben wird Eine Ausnahme hiervon bilden die 135 CF Variationen die in der CFTR2 Datenbank als krankheitsverursachend aufgef hrt sind basierend auf einer Variantenliste v
13. einem Mikrozentrifugenr hrchen DNase RNase freies Wasser 900 ul Stock 1 0 N NaOH 100 pl 2 Invertieren Sie das R hrchen zum Mischen mehrmals Interne PhiX Kontrolle denaturieren und verd nnen 1 Mischen Sie folgende Volumina um die Interne PhiX Kontrolle Bibliothek auf 2 nM zu verd nnen 10 nM Interne PhiX Kontrolle Bibliothek 2 ul 1X TE Puffer 8 ul 2 Mischen Sie folgende Volumina um eine 1 nM Interne PhiX Kontrolle Bibliothek zu erhalten 2 nM Interne PhiX Kontrolle Bibliothek 10 ul 0 1 N NaOH 10 pl 3 Mischen Sie die L sung mit 1 nM Interne PhiX Kontrolle kurz mit dem Vortexer 4 Zentrifugieren Sie die Matrizenl sung eine Minute lang bei 280 x g und 20 C 5 Inkubieren Sie die L sung 4 5 Minuten lang bei Raumtemperatur um die Interne PhiX Kontrolle Bibliothek in Einzelstr nge zu denaturieren 6 Geben Sie das folgende Volumen von vorgek hltem Bibliothek Verd nnungspuffer in das R hrchen mit denaturierter Interne PhiX Kontrolle Bibliothek um eine 20 pM Interne PhiX Kontrolle Bibliothek zu erhalten Denaturierte Interne PhiX Kontrolle Bibliothek 20 ul Vorgek hlter Bibliothek Verd nnungspuffer 980 ul Vorbereiten der Reagenzienkartusche 1 Tauen Sie die MiSeqDx Reagenzienkartusche Klinischer CF Sequenzierungs Assay in einem Wasserbad auf das ausreichend raumtemperiertes deionisiertes Wasser enth lt um die Basis der Reagenzienkartusche bis zur auf der Reagenzienkartusche aufgedruckten Wasserlinie einzutauchen Da
14. r zystische Fibrose 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Versiegeln Sie die CLP Platte und sch tteln Sie sie auf einem Mikroplattensch ttler zwei Minuten lang bei 1800 rpm Inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur ohne zu sch tteln Platzieren Sie die Platte mindestens zwei Minuten bzw so lange auf einem Magnetstativ bis der berstand klar ist Lassen Sie die CLP Platte auf dem Magnetstativ entfernen Sie vorsichtig den berstand und entsorgen Sie ihn Lassen Sie die CLP Platte auf dem Magnetstativ und waschen Sie die Beads wie folgt a F gen Sie jedem Probe Well 200 ul frisch zubereitetes 80 iges Ethanol hinzu b Inkubieren Sie die Platte auf dem Magnetstativ mindestens 30 Sekunden bzw so lange bis der berstand klar ist c Entfernen Sie vorsichtig den berstand und entsorgen Sie ihn Wiederholen Sie den Waschvorgang wie im vorherigen Schritt beschrieben Verwenden Sie eine auf 20 ul eingestellte P20 Mehrkanalpipette um berfl ssiges Ethanol zu entfernen Entfernen Sie die CLP Platte vom Magnetstativ und lassen Sie die Beads 10 Minuten lang an der Luft trocknen F gen Sie 30 ul Elutionspuffer zu jeder Probe hinzu und mischen Sie dies dann kurz mit dem Vortexer Versiegeln Sie die CLP Platte und sch tteln Sie sie auf einem Mikroplattensch ttler zwei Minuten lang bei 1800 rpm berpr fen Sie nach dem Sch tteln ob die Proben resuspendiert sind Wiederholen Sie diesen Schritt wenn dies nicht der Fall ist
15. 00 100 100 100 100 100 April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Summe Alle HGVS Name oder Ergebnisse gesamt bereinstimmende Calls Standarte Varianten Probe Standort wenn kein HGVS Name Pro Alle Standort Standort Standort No Miscalls Standort Standorte 1 2 3 Callse 6 6 0 me a CI I E E TOI w awon o O O TO E E E me n CI I CI E E E o O KO O EL I E E RO 45 Teile Nr 15038344 Rev A DEU bereinstimmung 100 100 100 100 100 100 100 100 April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Summe Alle HGVS Name oder Ergebnisse gesamt bereinstimmende Calls Standarte Varianten Probe Standort wenn kein HGVS Name Pro Alle Standort Standort Standort No Miscalls Standort Standorte 1 2 3 Callse 6 6 0 a emmen rm e e le e e a esere rr e e e n resa EC ee e mem ren e e e ee 46 Teile Nr 15038344 Rev A DEU bereinstimmung 100 100 100 100 100 100 100 100 April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Summe Alle HGVS Name oder Ergebnisse gesamt bereinstimmende Calls Standarte Varianten Probe Standort wenn kein HGVS Name Pro Alle Standort Standort Standort No Miscalls Standort Standorte 1 2 3 Callse 12 12 0 s awon vom e ne eee a e prama EE E IRC amon e C
16. 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose 63 Summe alle Anzahl Ergebnisse bereinstimmende Calls Standorte Panel Probe Genotyp Pro Alle Standort Standort Standort No Miscalls Standort Standorte 1 2 3 Calls aaa s as oe s e 0 B PolyTG PolyT Varianten PA insgesamt 1656 Alle 18 Proben waren miteinander konkordant aber nicht mit der bidirektionalen Sequenzierung nach Sanger IRE E I Ea Teile Nr 15038344 Rev A DEU Ubereinstimmung 100 94 44 100 0 100 100 100 100 97 83 April 2014 MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose DNA Extraktion Drei h ufig verwendete im Handel erh ltliche Extraktionsmethoden die magnetische Bead Extraktion die Alkoholpr zipitation und die Isolation mittels Kieselgels ule wurden unter Verwendung von mit K EDTA antikoaguliertem Vollblut gepr ft Bei der Studie wurden insgesamt 14 Blutproben verwendet Zwei davon waren Wildtypproben die brigen enthielten eindeutige Genotypen die neun verschiedene Varianten darstellten darunter sowohl h ufige als auch seltene Varianten F r die polyTG polyT Variation wurden Proben mit T 5 9 und TG 10 12 ber cksichtigt Die drei DNA Extraktionsmethoden wurden von zwei verschiedenen Bedienern unabh ngig getestet von denen jeder drei L ufe pro Extraktionsmethode durchgef hrt hat Jede Extraktion wurde vom jeweiligen Bediene
17. 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Genotyp CFTR Positive Calls Varianten Allgemeiner cDNA Gen No Positive Name cDNA Name Varel Region Klinische o Synthetische Calls MISGIS bereinstimmung Name Koordinate hg19 0359K c 1075C gt A SNV Exon8 1 100 T360K 1079C gt A gt A 28 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Genotyp CFTR Positive Calls Varianten Allgemeiner cDNA Variantent Gen No Miscalls Positive Name cDNA Name ME Region Klinische Zelllini 6 Synthetische Calls Ubereinstimmung Name Koordinate hg19 Proben eis Proben W401X c 1202G gt A c 1202G gt A SNV Exon9 0 0 1 0 0 100 1341 1G gt A c 1209 1G SNV Intron9 2 100 gt A tt I i gt A 5466X c 1397C gt G SNV Exon11 1 1 100 C gt G 1461ins4 29 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Genotyp Allgemeiner Name cDNA Name Koordinate S489X Q493X 1507del 1677del TA Q525X E528E 1717 1G gt A cDNA Name c 1466C gt A 30 Teile Nr 15038344 Rev A DEU Variantentyp SNV c 1519_1521 DIV Exon11 4 2 delATC c 1545_1546 DIV Exon11 1 delTA gt A CFTR Positive Calls Varianten Gen No Miscalls Positive Region Klinische u Synthetische Calls bereinstimmung hg19 Proben Zelllinienpr
18. Falls die Proben nicht vollst ndig resuspendiert sind pipettieren Sie diese Proben behutsam auf und ab oder klopfen Sie die Platte leicht gegen die Bank um die Beads zu resuspendieren und sch tteln Sie sie f r weitere 5 Minuten Platzieren Sie die LNP Platte mindestens zwei Minuten lang auf dem Magnetstativ bertragen Sie den berstand von der LNP auf die SGP Platte Pipettieren Sie leicht 5 mal auf und ab um zu mischen Verschlie en Sie die SGP Platte und zentrifugieren Sie sie anschlie end eine Minute lang bei 1000 x g und 20 C SICHERER HALTEPUNKT Wenn Sie nicht gleich mit dem Bibliotheks Pooling und der anschlie enden Sequenzierung auf dem MiSeqDx fortfahren bewahren Sie die versiegelte SGP Platte bis zu 3 Tage bei 25 C bis 15 C auf April 2014 Teile Nr 15038344 Rev A DEU 19 MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Bibliotheks Pooling Vorbereitungen f r Bibliotheks Pooling 1 Erhitzen Sie einen f r 1 5 ml Zentrifugenr hrchen passenden Hitzeblock auf 96 C 2 Bereiten Sie in einem Eisk bel ein Eiswasserbad vor K hlen Sie den Bibliothek Verd nnungspuffer im Eiswasserbad 3 Beginnen Sie mit dem Auftauen der MiSeqDx Reagenzienkartusche Vorbereiten einer frischen Verd nnung von NaOH ACHTUNG y Die Verwendung von frisch verd nntem NaOH ist notwendig um die Proben f r die Clusterbildung auf dem MiSeqDx vollst ndig zu denaturieren 1 Mischen Sie die folgenden Volumina in
19. I IC CI IRC d nn CE I E E E NEO a ammon emer e m eee 47 Teile Nr 15038344 Rev A DEU Ubereinstimmung 100 100 100 100 100 100 100 100 April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Summe Alle HGVS Name oder Ergebnisse gesamt bereinstimmende Calls Standarte Varianten Probe Standort wenn kein HGVS Name Pro Alle Standort Standort Standort No Miscalls Standort Standorte 1 2 3 Callse 6 6 0 mc Je Te m eee om Im em ee w amn a eee a moa m e ee e e e O a m m e eee e e O a moa m e A A A e O a amen re eee A AO O 48 Teile Nr 15038344 Rev A DEU Ubereinstimmung 100 100 100 100 100 100 100 100 April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Summe Alle HGVS Name oder Ergebnisse gesamt bereinstimmende Calls Standarte Varianten Probe Standort wenn kein HGVS Name Pro Alle Standort Standort Standort No Miscalls Standort Standorte 1 2 3 Callse 6 6 0 s amoa E E E E BCE EC mar e e ne CI IC CI IE a amwr w O O ET I E E E s esere e e u eee ce se e vira v e ne e viene an e e ee 49 Teile Nr 15038344 Rev A DEU bereinstimmung 100 100 100 100 100 100 100 100 April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Summe Alle HGVS Name oder Ergebnisse gesamt bereinstimmende Calls Stan
20. Versiegeln Sie die AMP Platte und sichern Sie den Verschluss mit einer Gummiwalze 8 Zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 1000 x g und 20 C 9 bertragen Sie die AMP Platte in den Nachamplifikationsbereich 10 F hren Sie mithilfe des folgenden Programms auf einem Thermocycler eine PCR durch 95 C f r 3 Minuten 25 Zyklen von 95 C f r 30 Sekunden 62 C f r 30 Sekunden 72 C f r 60 Sekunden 72 C f r 5 Minuten Halten Sie die Temperatur konstant bei 10 C SICHERER HALTEPUNKT Falls Sie nicht gleich mit der PCR Reinigung fortfahren kann die AMP Platte ber Nacht auf dem l Thermocycler bleiben oder sie kann bei 2 C bis 8 C bis zu 48 Stunden aufbewahrt werden PCR Reinigung Vorbereitung 1 Bringen Sie die PCR Reinigungs Beads auf Raumtemperatur 2 Bereiten Sie frisches 80 iges Ethanol aus reinem Ethanol zu Verfahren 1 Zentrifugieren Sie die AMP Platte eine Minute lang bei 1000 x g und 20 C 2 Stellen Sie eine neue MIDI Platte nachstehend als CLP Platte bezeichnet bereit 3 Invertieren Sie die PCR Reinigungs Beads 10 mal Mischen Sie kr ftig mit dem Vortexer und invertieren Sie erneut 10 mal Inspizieren Sie die L sung visuell um sicherzugehen dass die Beads resuspendiert sind 4 F gen Sie 45 ul PCR Reinigungs Beads zu jedem Well der CLP Platte hinzu 5 bertragen Sie das vollst ndige PCR Produkt von der AMP zur CLP Platte April 2014 Teile Nr 15038344 Rev ADEU 17 MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f
21. ale Diagnostik Pr implantationstests Tr ger Screenings Neugeborenen Screenings oder Bev lkerungs Screenings vorgesehen Zusammenfassung und Erl uterung des Assay Klinische Beschreibung Die Mukoviszidose oder zystische Fibrose ZF ist eine der h ufigsten genetischen Erkrankungen der westlichen Welt und die am h ufigsten auftretende lebensbedrohliche autosomal rezessive Erkrankung in der nicht hispanischen wei en Bev lkerung 3 ZF wirkt sich auf die Viskosit t der Schleimsekrete aus und bef llt die Epithelien der Atemwege die Bauchspeicheldr se den Darm das hepatobili re System den m nnlichen Genitaltrakt und die Schwei dr sen was zu einer komplexen Multiorgan Multisystemerkrankung f hrt 4 wobei die Lunge das prim re Organ bez glich Morbidit t und Mortalit t ist In vielen F llen sind eine Mangelern hrung oder Verdauungsst rungen Vorboten von durch ZF verursachten Lungenerkrankungen Ein Schwerpunkt der aktuellen interventionellen Anstrengungen liegt daher in der Fr herkennung der Erkrankung durch ein Neugeborenen Screening wodurch die fr hzeitige lebenswichtige medizinische Versorung sichergestellt und f r Menschen mit dieser Erkrankung das bestm gliche Ergebnis erzielt werden soll25 Obwohl es bei der Lebenserwartung geschlechtliche Unterschiede gibt die mittlere Lebenserwartung ist bei M nnern h her als bei Frauen liegt die allgemeine Lebenserwartung in den USA bei 38 3 Jahren CFTR Varianten u
22. darte Varianten Probe Standort wenn kein HGVS Name Pro Alle Standort Standort Standort No Miscalls Standort Standorte 1 2 3 Callse 6 6 0 nm l O O ET E E s mon la I E E N RO 50 Teile Nr 15038344 Rev A DEU bereinstimmung 100 100 100 100 100 97 22 100 100 April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Summe Alle HGVS Name oder Ergebnisse gesamt bereinstimmende Calls Standarte Varianten Probe Standort wenn kein HGVS Name Pro Alle Standort Standort Standort No Miscalls Standort Standorte 1 2 3 Callse 12 12 0 a om am I E E O 51 Teile Nr 15038344 Rev A DEU bereinstimmung 100 100 100 100 100 100 100 100 April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Summe Alle HGVS Name oder Ergebnisse gesamt bereinstimmende Calls Standarte Varianten Probe Standort wenn kein HGVS Name Pro Alle Standort Standort Standort No Miscalls Standort Standorte 1 2 3 Callse 6 6 0 me Im O O ET E N EC z ee pma O O ET I E E E me Im O O ET E I E s amoa vm I RT I EC E m A CI I E E IEC me LO I ET I E EC w awon v e O TO E E NO 52 Teile Nr 15038344 Rev A DEU bereinstimmung 100 100 100 100 100 100 100 100 April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Summe Alle HGVS Nam
23. der jeweiligen Varianteninformationen pr fen um m glicherweise nicht entdeckte Varianten zu identifizieren sowie die entsprechenden Bev lkerungsh ufigkeiten um festzustellen ob eine Probe wiederholt werden muss 3 Ein Probenergebnis wird nur dann als g ltig betrachtet wenn die Call Rate mindestens 99 betr gt Wenn die Call Rate unter 99 betr gt wird die Leistung als Fail Fehlgeschlagen angegeben und die Probe muss wiederholt werden 4 Es wird empfohlen alle Varianten die sich au erhalb dessen befinden was in der Genauigkeitsstudie validiert wird siehe Genauigkeit auf Seite 24 mithilfe einer validierten Referenzmethode zu verifizieren bevor ein Bericht ber das erste Patientenergebnis mit diesen Varianten erstellt wird HINWEIS Es sollte eine Haplotyp Phasierung in Betracht gezogen werden wenn zwei oder mehr Varianten nachgewiesen werden 5 Alle Varianteninterpretationen sollten von einem zertifizierten klinischen Molekulargenetiker oder einem quivalenten Spezialisten gem lokalen Verfahren und Richtlinien durchgef hrt werden Zu den potenziellen Interpretationsreferenzen geh ren unter anderem CFTR2 Datenbank 213 Sosnay Papier ACMG Richtlinien von 2004 1 und die Committee Opinion des ACOG von 20118 22 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Informationen zur Berechnung und Darstellung der Ergebnisse bzw zur Beschreibung des Inhalts i
24. dieses Produkts im Labor des Benutzers sollte die Leistung des Assays durch das Testen mehrerer positiver und negativer Kontrollproben mit bekannten Leistungsmerkmalen verifiziert werden Alle Qualit tskontrollen sollten in bereinstimmung mit den lokalen bundes und oder landesweiten Vorschriften oder Zulassungsanforderungen durchgef hrt werden April 2014 Teile Nr 15038344 Rev ADEU 23 MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Leistungsmerkmale Genauigkeit Die Genauigkeit des Illumina MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose ergab sich aus der Auswertung von 500 Proben die eine Vielzahl von CFTR Varianten aus vier verschiedenen Quellen repr sentieren Die prim re Quelle der Genauigkeitsdaten war eine klinische Genauigkeitsstudie die mit einem Panel aus 366 Proben durchgef hrt wurde Die Mehrzahl n 355 der Proben bestand aus archivierten anonymisierten klinischen gDNA Proben die aus mensch lichem Blut isoliert wurden Die restlichen 11 Proben wurden aus im Handel erh ltlichen Zelllinienproben gewonnen Die Daten dieser Studie wurden durch Genauigkeitsdaten von 68 Zelllinienproben die in der Reproduzierbarkeitsstudie untersucht wurden 14 klinischen Proben aus der analytischen Studie zur Auswertung der Extraktionsmethode sowie 52 synthetischen Plasmidproben erg nzt Die synthetischen Plasmide wurden so kon struiert dass sie den genomischen Kontext seltener Varianten enthielten u
25. dige Evaporation sicherzustellen Ethanolreste k nnen den Ablauf nachfolgender Reaktionen beeintr chtigen Mischen Sie den Oligo Pool f r den klinischen CF Sequenzierungs Assay und den Hybridisierungspuffer nicht zum Lagern Wenn diese vermischt werden wird der Oligo Pool f r den klinischen CF Sequenzierungs Assay selbst bei Gefrierlagerung instabil Die Verwendung von Thermocyclern mit aktiver Abk hlung z B Peltier thermoelektrisch gek hlt wird f r den Hybridisierungsschritt nicht empfohlen Der Schritt der passiven Abk hlung ist f r eine ordnungsgem e Hybridisierung ausschlaggebend F gen Sie PCR Polymerase immer erst direkt vor dem Gebrauch zur PCR Master Mischung hinzu Bewahren Sie die kombinierte Gebrauchsl sung niemals auf W hrend des Bibliotheksnormalisierungsschritts ist es u erst wichtig das Bibliothek Bead Pellet vollst ndig zu resuspendieren Dies ist unerl sslich um eine konsistente Clusterdichte auf der MiSegDx Flie zelle zu erzielen Halten Sie beim Bibliotheksnormalisierungsschritt die angegebenen Inkubationszeiten ein Eine unsachgem e Inkubation kann die Bibliotheksdarstellung und die Clusterdichte beeintr chtigen Aufgrund der Anzahl an Platten bertragungen und dem sich daraus ergebenden Kontaminierungspotenzial m ssen Sie u erste Vorsicht walten lassen um sicherzustellen dass der Well Inhalt vollst ndig im Well verbleibt Passen Sie auf dass der Inhalt nicht verspritzt wird Die Empfehlun
26. e oder Ergebnisse gesamt bereinstimmende Calls Standarte Varianten Probe Standort wenn kein HGVS Name Pro Alle Standort Standort Standort No Miscalls Standort Standorte 1 2 3 Callse 6 6 0 a awon v e AC TO ER BEER SE BCE E a won ase O ET O EC E a me n O O ET E E EC m E e I TO I EC E RM n O O TO I E E E ML O TO E E E de css ne ee e e l 53 Teile Nr 15038344 Rev A DEU bereinstimmung 100 100 100 100 100 100 100 100 April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Summe Alle HGVS Name oder Ergebnisse gesamt bereinstimmende Calls Standorte Varianten Probe Standort wenn kein bereinsfimmun HGVS Name Pro Alle Standort Standort Standort No Miscalls 8 Standort Standorte 1 2 3 Callse 6 18 6 6 6 0 0 100 67 c 1408G gt A V470M E oe eee O E 0 CO E O 54 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Summe Alle HGVS Name oder Ergebnisse gesamt bereinstimmende Calls Standarte Varianten Probe Standort wenn kein HGVS Name Pro Alle Standort Standort Standort No Miscalls Standort Standorte 1 2 3 Callse 6 6 0 nn o u TO I I E E a mon ese e O ET I O E E MK e I TO E EC E p amme p CI I TO EC E a awn LC TO O E EC E s o amoa vm e I O TO E E E namen im O TO E E E E 55 Teile Nr 15038344 Rev A DEU bereinstimmung 100 94 44
27. e Calls Ubereinstimmung Name Koordinate hg19 Proben rien Proben 3791delC c 3659delC DIV Exon22 2 0 0 0 0 100 c 3884_3885 DIV Exon24 1 100 insT P1290P 4016insT 37 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Genotyp Allgemeiner Name cDNA Name Koordinate Q1313X G1349D 4209TG TI gt AA CFTR dele22 23 4382delA Y1424Y Q14630 cDNA Name c 3937C gt T c 4046G gt A c 4077_4080 delTGTT insAA c 3964 78_ 4242 577del c 4251delA c 4272C gt T c 4389G gt A Alle Varianten PA insgesamtt Alle WT NA insgesamt Variantentyp SNV SNV DIV DEL DIV SNV SNV Gesamtzahl aller WT und Varianten OA DIV ist ein Akronym f r Deletions Insertions V ariante Proben wurden nicht erneut getestet A Software gibt nicht den cONA Namen f r diese genomische Koordinate an CFTR Gen Region hg19 Exon24 Exon25 Exon25 Intron24 Exon27 Exon27 Exon27 Positive Calls Varianten No Miscalls Positive ee Zelllinienproben Synthetische Calls Ubereinstimmung roben Proben 0 0 1 0 0 100 0 1 0 0 0 100 0 0 1 0 0 100 1 0 1 0 0 100 0 0 il 0 0 100 6 2 0 0 0 100 150 32 0 0 0 100 2072 3 4 99 66 2600928 1 25 gt 99 99 2603000 4 6 gt 99 99 Im Sanger Bericht wurde die P205S Variante f r die klinische Probe als heterozygot aufgef hrt Eine Pr fung der Sanger Daten zeigte jedoch dass die Va
28. eberichtsdatei im MiSeg Reporter Benutzerhandbuch Teile Nr 15038356_DEU Einschr nkungen des Verfahrens 1 Die Assay Sequenzen der folgenden Regionen im CFTR Gen Alle proteincodierenden Regionen im CFTR Gen ber 27 Exone hinweg Zwischen 5 und 10 Basen flankierender intronischer Sequenz Hundert Nukleotide intronischer Sequenz an den 5 und 3 UTRs untranslatierte Regionen Zwei tiefe intronische Mutationen 1811 1 6kbA gt G 3489 10kbC gt T Die PolyTG PolyT Sequenz in Intron 9 Insgesamt 5206 Positionen Regionen von den m glichen 188 702 Basenpaaren im Gen F r In Vitro Diagnostik Die mit dem Illumina MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose erzielten Ergebnisse sollten im Kontext einer vollst ndigen klinischen Bewertung verwendet und interpretiert werden Der Assay ist f r das Sequenzieren der Protein kodierenden Regionen und der Intron Exon berg nge des CFTR Gens konzipiert Er enth lt nicht alle intronischen Regionen und gro en Deletionen Daher ist auch bei einem Wildtyp Gesamtergebnis nicht auszuschlie en dass die analysierten Proben andere Mutationen Varianten des Gens Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator CFTR enthalten Der Assay dient dem Erkennen von zwei spezifischen gro en Deletionen CFTRdele2 3 und CFTRdele22 23 Andere gro e Deletionen werden nicht ermittelt oder protokolliert Dieser Assay ist nur f r Insertionen und Deletionen einer Gr e von maximal 3
29. eine Kontaminierung von Reagenzien Instrumenten und genomischen DNA Proben durch PCR Produkte zu verhindern Eine Kontaminierung durch PCR Produkte kann zu falschen und unzuverl ssigen Ergebnissen f hren Stellen Sie zur Verhinderung einer Kontaminierung sicher dass die Voramplifikations und Nachamplifikationsbereiche ber eigene Ger te z B Pipetten Pipettenspitzen Vortexer und Zentrifuge verf gen Vermeiden Sie eine Kreuzkontaminierung Verwenden Sie nach jeder Probe und nach der Abgabe von Reagenzien jeweils frische Pipettenspitzen Mischen Sie Proben mit einer Pipette und zentrifugieren Sie die Platte wenn dies angegeben ist Mischen Sie die Platten nicht mit dem Vortexer Die Verwendung von Aerosol resistenten Spitzen verringert das Risiko einer Amplikon bertragung und einer Kreuzkontaminierung von Probe zu Probe Die Index Proben Paarung muss genau dem Probenblatt entsprechen Abweichungen zwischen dem Probenblatt und dem Plattenlayout f hren zu einem Verlust der positiven Probenidentifikation und fehlerhaften Ergebnisberichten Bereiten Sie stets frisches 80 iges Ethanol f r die Schritte des Waschlaufs zu Ethanol kann Wasser aus der Luft aufnehmen was die Ergebnisse verf lscht Stellen Sie sicher dass w hrend der Waschschritte das gesamte Ethanol vom Boden der Wells entfernt wird Ethanolreste k nnen die Ergebnisse beeintr chtigen Halten Sie nach dem Magnetstativ Schritt die angegebene Trockenzeit ein um eine vollst n
30. en Genotyp generieren Wenn die positive Kontrollprobe einen anderen als den erwarteten Genotyp generiert ist m glicherweise ein Fehler bei der Probenverfolgung oder eine fehlerhafte Aufzeichnung von Index Primern aufgetreten Der gesamte Assay muss wiederholt werden angefangen mit der Bibliotheksvorbereitung Negative Kontrollprobe Keine Matrize Keine DNA Die Verwendung einer negativen Kontrollprobe keine Matrize keine DNA ist bei jedem Lauf erforderlich um m gliche Kontaminationsvorkommnisse zu entdecken Die Call Rate sollte bei der negativen Kontrollprobe weniger als 10 betragen Wenn eine negative Kontrollprobe eine Call Rate von mehr als 10 generiert ist w hrend der Assay Verarbeitung m glicherweise eine Kontamination aufgetreten Der Assay wird als fehlgeschlagen angesehen und der gesamte Assay muss wiederholt werden angefangen mit der Bibliotheksvorbereitung Wildtyp Kontrollprobe Die Wildtyp DNA Kontrollprobe wird bei jedem Lauf empfohlen Die Wildtyp Kontrollprobe muss eine gut charakterisierte Probe sein die keine CFTR Varianten enth lt Die Wildtyp Kontrollprobe muss den erwarteten Genotyp generieren Wenn die Wildtyp Kontrollprobe einen anderen als den erwarteten Genotyp generiert ist m glicherweise ein Fehler bei der Probenverfolgung oder eine fehlerhafte Aufzeichnung von Index Primern aufgetreten Der gesamte Assay muss wiederholt werden angefangen mit der Bibliotheksvorbereitung Vor der anf nglichen Verwendung
31. en ist der Verkauf oder die Nutzung dieses Ger ts nur ber einen Arzt bzw s im Auftrag eines Arztes oder einer anderen Fachperson mit entsprechender Lizenz zul ssig Einige Komponenten dieses Assays enthalten Formamid ein aliphatisches Amid das in Verdacht steht ein fortpflanzungsgef hrdendes Toxin zu sein Weitere Informationen hierzu finden Sie unter Reagenzien auf Seite 7 Es kann daher durch Inhalation oder orale Aufnahme Kontakt mit der Haut oder den Augen zu einer Verletzung von Personen kommen Beh lter und nicht verwendeter Inhalt m ssen gem den geltenden Sicherheitsvorschriften Ihrer Region entsorgt werden Wenn Sie weitere Informationen ben tigen wenden Sie sich bitte an den technischen Support von Illumina Einige Komponenten dieses Assays enthalten das Reduktionsmittel 2 Mercaptoethanol Weitere Informationen hierzu finden Sie unter Reagenzien auf Seite 7 Es kann daher durch Inhalation oder orale Aufnahme Kontakt mit der Haut oder den Augen zu einer Verletzung von Personen kommen Die Verwendung muss in einem gut bel fteten Bereich stattfinden und alle Beh lter und nicht verwendeten Inhalte m ssen gem den geltenden Sicherheitsvorschriften Ihrer Region entsorgt werden Wenn Sie weitere Informationen ben tigen wenden Sie sich bitte an den technischen Support von Illumina Behandeln Sie alle Proben wie potenzielle Infektionserreger Wenn die beschriebenen Verfahren nicht eingehalten werden kann dies zu fehlerhaften
32. endeten Index Primer m ssen auf Basis des gew nschten endg ltigen Probendurchsatzes ausgew hlt werden damit Diversit t in der Indexsequenz sichergestellt ist MiSeqDx verwendet eine gr ne LED zum Sequenzieren von G T Basen und eine rote LED zum Sequenzieren von A C Basen Um eine ordnungsgem e Registrierung sicherzustellen muss in jedem Zyklus mindestens eines der zwei Nukleotide f r jeden Farbkanal gelesen werden Es ist wichtig die Farbbalance f r jede Base des sequenzierten Index Reads zu halten Anderenfalls kann bei der Sequenzierung des Index Reads ein Registrierungsfehler auftreten Verwenden Sie den folgenden minimalen Satz an Indizes mit Farbbalance f r Sequenzierungsl ufe mit acht Proben Tabelle 11 Index Primer Kombinationen f r 8 Proben Sequenzierungsl ufe Index Primer 1 A701 Index Primer 2 A702 Index Primer 10 A710 Index Primer C A503 Probe 1 Probe 2 Probe 3 Index Primer D A504 Probe 4 Probe 5 Probe 6 Index Primer E A505 Probe 7 Probe 8 Wenn keine sechs eindeutigen Proben ausgenommen die positiven und negativen Kontrollen verf gbar sind ist es akzeptabel den Lauf mit Replikaten von humangenomischen DN A Proben aufzuf llen Gebrauchsanweisung MiSeqDx Probenblattvorbereitung 1 W hlen Sie im Begr ungsbildschirm von Illumina Worklist Manager IWM die Option Create Worklist Arbeitsliste erstellen 2 W hlen Sie im Feld Test Type Testtyp die Option Klinischer CF Sequenzierungs Assa
33. enzierungs Assay f r zystische Fibrose Erforderliche jedoch nicht bereitgestellte Reagenzien Voramplifikationsreagenzien e 10N NaOH aus Tabletten herstellen oder Standardl sung verwenden e TE Puffer e DNase und RNase freies Wasser Nachamplifikationsreagenzien e 10 N NaOH aus Tabletten herstellen oder Standardl sung verwenden e Ethanol absolut f r die Molekularbiologie TE Puffer e DNase und RNase freies Wasser Lagerung und Handhabung 1 Die Raumtemperatur ist mit 15 C bis 30 C definiert 2 Die folgenden Reagenzien werden gefroren ausgeliefert und sind stabil wenn sie bis zum angegebenen Verfallsdatum bei 25 C bis 15 C gelagert werden Oligo Pool f r den klinischen CF Sequenzierungs Assay Hybridisierungspuffer Extension Ligation Mischung Index Primer C A503 D A504 und E A505 Index Primer 1 A701 2 A702 und 10 A710 PCR Polymerase PCR Master Mischung Bibliotheksnormalisierungsverd nner Bibliothek Verd nnungspuffer Interne PhiX Kontrolle MiSegDx Reagenzienkartusche Klinischer CF Sequenzierungs Assay Mit Ausnahme der Reagenzienkartusche sind die Reagenzien f r maximal 6 vor dem angegebenen Verfallsdatum durchgef hrte Gefrier Auftau Zyklen stabil Frieren Sie die Reagenzienkartusche nicht mehr ein nachdem sie aufgetaut wurde Sie kann bei 2 C bis 8 C bis zu sechs Stunden lang gelagert werden 3 Die folgenden Reagenzien werden gek hlt ausgeliefert und sind stabil wenn sie bis zum angegebenen
34. er Tr ger der CFTR Mutation nach Ethnizit t in den USA auf Basis einer Kohorte von 364 890 Personen die zum Tr gertest berwiesen wurden und bez glich Mukoviszidose nicht famili r vorbelastet sind werden in Tabelle 1 angegeben Tabelle 1 Allgemeine Tr gerh ufigkeit von Mukoviszidose Mutationen in den verschiedenen ethnischen Gruppen in den USA Ethnische Gruppe Beobachtete Tr gerh ufigkeit Afroamerikanisch 1 aus 84 Aschkenasi J disch 1 aus 29 Asiatisch 1 aus 242 Wei 1 aus 28 Hispanoamerikanisch 1 aus 59 J disch 1 aus 32 Nah stlich 1 aus 91 Ureinwohner 1 aus 70 Nordamerikas S dasiatisch 1 aus 118 Sonstige ethnische l aus 111 Gruppe gt 1 ethnische Gruppe l aus 34 Teilweise 1 aus 56 afroamerikanisch Teilweise wei 1 aus 32 Teilweise 1 aus 51 hispanoamerikanisch Keine Angabe 1 aus 37 Alle Personen 1 aus 38 Assay Design Alle proteincodierenden Regionen im CFTR Gen einschlie lich 10 nt flankierender intronischer Sequenz werden f r alle au er drei Exons Exon 7 10 und 20 nachgewiesen Bei Exon 7 und Exon 10 werden nur 5 nt flankierende intronische Sequenz am 5 Ende des Exons einbezogen um proximale homopolymere Indels zu vermeiden Bei Exon 20 werden 30 nt flankierender intronischer Sequenz am 5 Ende des Exons einbezogen um den Nachweis der Mutation 3272 26A gt G zu erm glichen Dar ber hinaus weist der Assay ca 100 nt flankierender Sequenz an den 5 und 3 UTRs zwei tiefe intronische Mutationen 1811 1 6kbA
35. erminatoren um einzelne Nukleotidbasen zu erkennen die in wachsende DN A Str nge eingebaut sind W hrend eines Sequenzierungszyklus wird ein einzelnes mit Fluoreszenzfarbstoff markiertes Desoxynukleotid Triphosphat ANTP zur Nukleotid S urekette hinzugef gt Die Nukleotid Kennzeichnung dient als Terminator f r die Polymerisation d h nach jeder ANTP Inkorporation wird der Fluoreszenzfarbstoff bildlich erfasst um die Base zu identifizieren und dann enzymatisch gespalten um die Inkorporation des n chsten Nukleotids zu erm glichen Da alle vier an reversible Terminatoren gebundenen dNTPs A G T C als einzelne separate Molek le vorhanden sind werden Integrationsfehler durch nat rliche Wettbewerbsmechanismen minimiert Base Calls erfolgen bei jedem Sequenzierungszyklus direkt anhand von Signalst rkemessungen Das Endergebnis ist eine Base f r Base erfolgende Sequenzierung Datenanalyse MiSeq Reporter verarbeitet die im Rahmen der Prim ranalyse generierten Base Calls und liefert basierend auf den Angaben im Probenblatt Informationen zu jeder Probe Dieser Schritt wird Sekund ranalyse genannt Die Sekun d ranalyse umfasst die Demultiplexierung die FASTO Dateigenerierung das Alignment das Varianten Calling und das Generieren von VCF Dateien die Informationen zu CFTR Varianten enthalten die an speziellen Positionen im Refe renzgenom gefunden wurden e Demultiplexierung Dies ist der erste Schritt der Sekund ranalyse wenn im Pr
36. ferte w ssrige L sung mit 2 C bis 8 C festphasigen paramagnetischen Beads und Polyethylenglykol Bibliotheksnormalisierungs 2 R hrchen 48ml Gepufferte w ssrige L sung mit 2 C bis8 C o Wasch Puffer Salzen 2 Mercaptoethanol und Formamid Bibliothek Beads 1 R hrchen 2 C bis 8 C festphasigen paramagnetischen Beads MiSeqDx Fliefszelle 6 Beh lter 1 Fliefzelle Glassubstrat mit kovalent 2 C bis 8 C Klinischer CF gebundenen Oligonukleotiden Sequenzierungs Assay MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Karton 4 Tabelle 8 Karton 4 Nachamplifikationsreagenzien Komponente Menge F llmenge Wirkstoffe Lagerung MiSegDx SBS L sung 6Flaschen 353 1 ml Gepufferte w ssrige L sung 2 C bis 8 C PR2 Klinischer CF Sequenzierungs Assay MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Karton 5 Tabelle 9 Karton 5 Voramplifikationsreagenzien Komponente Menge F llmenge Wirkstoffe Lagerung Filterplatte 6 Platten N A Polypropylen Mikrotiterplatte mit einer 15 C bis 30 C modifizierten Polyethersulfonmembran Tabelle 10 Karton 5 Nachamplifikationsreagenzien Komponente Menge F llmenge Wirkstoffe Lagerung Elutionspuffer 1 R hrchen 4 8 ml Gepufferte w ssrige L sung 15 C bis 30 C Bibliothek 1 R hrchen 3 5 ml Gepufferte w ssrige L sung 15 C bis 30 C Lagerungspuffer 8 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSeqDx Klinischer Sequ
37. g zur Zugabe von 250 ng DNA erm glicht die DNA Mengenvariation Die Leistung des Assays wird durch diese Zugabestufe erh ht Verfahrenshinweise 1 Illumina verlangt dass jeder Lauf der als parallel zu verarbeitender Satz an Proben definiert ist eine positive Kontroll DNA Probe und eine negative Kontrollprobe NTC oder No Template Control enth lt Die positive Kontroll DNA Probe muss eine gut charakterisierte Probe mit einer oder mehreren bekannten CFTR Varianten sein Illumina empfiehlt die Verwendung einer Wildtyp Kontrollprobe Die Wildtyp Kontrollprobe sollte als eine Probe ausgef hrt werden und nicht die positive oder negative Kontrollprobe ersetzen Bevor Sie mit dem MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose beginnen extrahieren und quantifizieren Sie die DNA Sie k nnen hierf r ein beliebiges validiertes DNA Extraktionsverfahren verwenden April 2014 Teile Nr 15038344 Rev ADEU 13 MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose 4 Quantifizieren Sie die DNA mit einem Spektralphotometer Vergewissern Sie sich dass das A260 A280 Verh ltnis der DNA Probe gt 1 5 ist Normalisieren Sie die DNA Probe auf 50 ng ul Jede Probe muss 5 ul genomische DNA insgesamt 250 ng enthalten Probendurchsatz und Indexdarstellung Beim Illumina MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose betr gt der Probendurchsatz pro MiSeqDx Lauf 8 Proben Die w hrend der PCR Amplifikation verw
38. gt G 3489 10kbC gt T zwei gro e Deletionen CFTRdele2 3 CFTRdele22 23 und die PolyTG PolyT Region nach Die komplette Abdeckung des Assays wird in den Positionen der genomischen Koordinaten in Tabelle 2 gezeigt 2 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Abdeckung der genomischen Koordinaten hg19 Anfang der hg19 Ende der genomischen Koordinate genomischen Koordinate L nge Basenpaar chr7 chr7 CFTR_Exon 1 117120041 117120211 171 CFTR_Exon 3 129 CFTR_Exon 5 110 CFTR_Exon 20 CFTR_Exon 22 CFTR_Exon 23 April 2014 Teile Nr 15038344 Rev A DEU 3 MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose hg19 Anfang der hg19 Ende der genomischen Koordinate genomischen Koordinate L nge Basenpaar chr7 chr7 CFTR_Exon 24 117292886 117292995 110 CFTR_Exon 25 117304732 117304924 193 CFTR_Exon 26 117305503 117305628 126 CFTR_Exon 27 117306952 117307262 311 Summe Basen 203 Bei Exon 7 und Exon 10 werden nur 5 nt flankierende intronische Sequenz stromaufw rts vom Exon einbezogen Dies dient der Vermeidung homopolymerer Abschnitte in diesen Regionen Im Falle von Exon 10 ist dies die PolyT Poly TG Region in Intron 9 Diese Region wird speziell und separat behandelt Bei den tiefen intronischen Mutationen werden 5 die SNV auf beiden Sei
39. hatten Die DNA Zugaben von 1250 ng 250 ng und 100 ng wurden mit vier repr sentativen DNA Proben und mindestens 20 Replikaten pro DNA Zugabestufe f r jede Probe n 4x20 80 Proben weiter getestet w hrend die Untergrenze von 25 ng mit 14 Proben und 20 Replikaten f r jede Probe n 14x20 280 Proben getestet wurde Die Genauigkeit und die Proben First Pass Rate betrugen bei allen DNA Zugabestufen 100 St rende Substanzen Um die Auswirkungen st render Substanzen auf das Illumina MiSeqDx System f r zystische Fibrose zu untersuchen wurde die Leistung des Assays mit und ohne potenzielle St rsubstanzen berpr ft In dieser Studie wurden sechzehn Vollblutproben mit eindeutigen CF Genotypen getestet Vier k rpereigene st rende Substanzen Bilirubin Cholesterin H moglobin und Triglyceride wurden getestet indem die Blutproben vor der DNA Extraktion mit diesen versetzt wurden Die Konzentrationsgrenzen f r jede Substanz sind in der nachfolgenden Tabelle aufgef hrt Um dar ber hin aus die St rungen aufgrund der Blutentnahme geringe Menge zu untersuchen wurden die Blutproben mit EDTA versetzt und um die St rungen aufgrund der Probenvorbereitung zu untersuchen wurde der endg ltige Wasch Puffer aus einer Kieselgels ulen Isolationsmethode zur bereinigten genomischen DNA zugef gt Der MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose erzielte mit und ohne st rende Substanzen eine Call Rate von 100 bei allen Proben und e
40. ht Castellani C Cuppens H Macek H Jr Cassiman JJ Kerem E et al 2008 Consensus on the use and interpretation of cystic fibrosis mutation analysis in clinical practice J Cystic Fibrosis 7 179 196 Clinical and Functional Translation of CFTR CFTR2 Verf gbar unter www cftr2 org Online August 2013 The Clinical and Functional Translation of CFTR CFTR2 Project Verf gbar unter www nacfconference org art plenaryarchives 2011 Cutting pdf Online Im Namen des CFTR2 Projekts von Garry Cutting bei der 25th Annual North American Cystic Fibrosis Conference NACFC pr sentiert und von der Cystic Fibrosis Foundation gesponsert 04 November 2011 Anaheim CA 65 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose 14 Watson MS Cutting GR Desnick RJ Driscoll DA Klinger K et al 2004 Cystic fibrosis population carrier screening 2004 revision of American College of Medical Genetics mutation panel Genetics in Medicine 665 387 391 15 Pratt VM Caggana M Bridges C Buller AM DiAntonio L et al Mai 2009 Development of Genomic Reference Materials for Cystic Fibrosis Genetic Testing Journal of Molecular Diagnostics 11 3 186 193 16 Amos J Feldman GL Grody WW Monaghan K Palomaki GE et al 2008 Edition Revised 03 2011 American College of Medical Genetics Standards and Guidelines for Clinical Genetic Laboratories 17 Rehm HL Bale SJ Bayrak Toydemir P Berg JS Brow
41. ie die Beads unmittelbar vor der Verwendung mit dem Vortexer bis sie gut suspendiert sind und die Farbe homogen erscheint Mischen Sie die Probe nach dem Hinzuf gen der Beads gr ndlich indem Sie zehnmal auf und abpipettieren Die Proben k nnen auch mit einem Sch ttler sorgf ltig gemischt werden Inkubieren Sie die Bead Probenmixtur bei Raumtemperatur f r die gesamte angegebene Dauer Folgen Sie den Anweisungen wenn Sie das Magnetstativ verwenden Warten Sie bis die L sung klar ist bevor Sie aspirieren Belassen Sie die Platte auf dem Magnetstativ wenn Sie den berstand langsam aspirieren Achten Sie dabei darauf dass die separierten Beads nicht durcheinandergebracht werden 8 Die PCR Amplifikationsplatte kann ber Nacht auf dem Thermocycler bleiben oder bei 2 C bis 8 C bis zu zwei Tage lang gelagert werden Versiegeln Sie vor dem Lagern der Platte bei 2 C bis 8 C den Platten Well 9 Frieren Sie die Bibliothek Beads nicht ein bzw vermischen Sie sie nicht mit dem Bibliotheksnormalisierungsverd nner Reagenz wenn sie nicht sofort verwendet werden 10 Die vollst ndige Bibliotheksnormalisierungsplatte kann bei 25 C bis 15 C bis zu 3 Tage lang gelagert werden 11 Die Pooled Amplicon Library PAL kann bei 25 C bis 15 C bis zu 3 Tage lang gelagert werden 12 Laden Sie den frisch vorbereiteten verd nnten Amplikon Pool sofort in die Reagenzienkartusche Die Lagerung des verd nnten Amplikon Pools kann zu einer signifika
42. illumina MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose FUR IN VITRO DIAGNOSTIK Katalognummer DX 102 1001 6 L ufe bis zu 48 Proben pro Kit Verwendungszweck Illumina MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose ist ein In vitro Diagnostiksystem f r die gezielte Sequenzierung das die proteincodierenden Regionen und Intron Exon Grenzen des CFTR Gens in genomischer DNA die aus in K EDTA gesammelten menschlichen peripheren Blutproben isoliert wurde resequenziert Der Test erkennt einzelne Nukleotidvarianten und kleine Indels innerhalb der sequenzierten Region und meldet zudem zwei tiefe intronische Mutationen und zwei gro e Deletionen Der Test muss auf dem Illumina MiSeqDx Ger t durchgef hrt werden Der Test ist zur Unterst tzung der Diagnose von Personen mit Verdacht auf zystische Fibrose CF vorgesehen Dieser Assay ist am besten geeignet wenn der Patient eine atypische oder nicht klassische Form von CF aufweist oder wenn andere Mutationspanels die beiden verursachenden Mutationen nicht nachweisen konnten Die Ergebnisse des Tests sollten von einem zertifizierten klinischen Molekulargenetiker oder einem gleichwertig qualifizierten Kollegen interpretiert werden und in Verbindung mit anderen verf gbaren Informationen wie z B klinischen Symptomen anderen Diagnostiktests und der Krankheitsgeschichte der Familie verwendet werden Dieser Test ist nicht f r unabh ngige Diagnosezwecke die pr nat
43. ine Reproduzierbarkeit von 100 in Genotyp Calls zwischen Proben Es wurden keine St rungen durch eine der endogenen oder exogenen St rsubstanzen beobachtet April 2014 Teile Nr 15038344 Rev ADEU 64 MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Um die Auswirkungen der Multiplexierung von Index Primer St rungen zu untersuchen wurde eine Kreuzkontaminationsstudie mit zwei Proben von der jede eindeutige homozygote Genotypen an vier unterschiedlichen genomischen Positionen aufwies und zwei entsprechenden Index Primern durchgef hrt Es wurde keine nderung beim Varianten Calling bei Kontaminationsgraden von unter 40 beobachtet Der Probengenotyp wurde heterozygot wenn der Kontaminationsgrad mindestens 40 betrug Testsubstanz Im Blut getestete Im Blut getestete Konzentration Konzentration Call Rate Obergrenze Untergrenze Gesamtzahl der Replikate Bilirubin 16 684 umol L 137 umol L 100 Cholesterin 16 13 mmol L 2 6 mmol L 100 H moglobin 16 2 g L 0 4 g L 100 Triglycerid 16 37 mmol L 7 4 mmol L 100 EDTA 16 7 0 mg ml 2 8 mg ml 100 Quellen 1 10 11 12 13 Bobadilla JL Macek Jr M Fine JP Farrell PM 2002 Cystic Fibrosis A Worldwide Analysis of CFTR Mutations Correlation With Incidence Data and Application to Screening Human Mutation 19 575 606 Moskowitz SM Chmiel JF Sternan DL Cheng E Gibson RL et al 2008 Clinical practice and genetic counseling for cystic fib
44. karte Plate Graphic Plattengrafik und verwenden Sie die Option Copy to Clipboard In Zwischenablage kopieren oder Print Drucken um ein Bild der Probenplatte zu erfassen W hlen Sie Finish Fertig stellen Hybridisierung des Oligonukleotid Pools Vorbereitung 1 Bringen Sie den Oligo Pool f r den klinischen CF Sequenzierungs Assay den Hybridisierungspuffer die genomischen DNA Proben und die positive Kontrollprobe auf Raumtemperatur 2 Mischen Sie den Oligo Pool f r den klinischen CF Sequenzierungs Assay und den Hybridisierungspuffer kr ftig um sicherzustellen dass sich alle Ablagerungen vollst ndig aufgel st haben Zentrifugieren Sie dann kurz die R hrchen um Fl ssigkeit zu sammeln 3 Erhitzen Sie einen 96 Well Hitzeblock auf 95 C 4 Erw rmen Sie einen Inkubator auf 37 C 5 Erstellen Sie die Probenplatte entsprechend der von IWM ausgedruckten Plattengrafik Verfahren 1 Stellen Sie eine neue 96 Well PCR Platte nachstehend als HYB Platte bezeichnet bereit 2 F gen Sie 5 ul Probe oder Kontrolle bei 50 ng ul 250 ng insgesamt zu den entsprechenden Wells in der HYB Platte hinzu Folgen Sie dem generierten Plattenlayout um eine korrekte Well Auswahl vorzunehmen 3 F gen Sie 5 ul Oligo Pool f r den klinischen CF Sequenzierungs Assay zu allen Wells hinzu die genomische DNA enthalten 4 F gen Sie 40 ul Hybridisierungspuffer zu jeder Probe in der HYB Platte hinzu Pipettieren Sie drei bis f nfmal leicht auf u
45. le Standort Standort Standort No Miscalls Standort Standorte 1 2 3 Callse 6 6 1 4 c 1521_1523delCTT F508del 6 18 5 mn m I I RC CI r ne mn e m e ee m re eee ee Ton um e e e ee mama amano a eee een m HC CI CI IC CI EC an m E I I I e 42 Teile Nr 15038344 Rev A DEU Ubereinstimmung 94 44 94 44 94 44 94 44 100 100 100 100 April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Summe Alle HGVS Name oder Ergebnisse gesamt bereinstimmende Calls Standarte Varianten Probe Standort wenn kein HGVS Name Pro Alle Standort Standort Standort No Miscalls Standort Standorte 1 2 3 Callse 6 6 0 en a ACI I IC CI CI RC gt E E CI A IC CI EC I gt moa m ACI ACI IC CI CI RC O amoa O O O I O IT O o O me m O I IC CI O E mn as O ACI E CI O E 43 Teile Nr 15038344 Rev A DEU bereinstimmung 100 100 100 94 44 100 100 100 100 April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Summe Alle HGVS Name oder Ergebnisse gesamt bereinstimmende Calls Standarte Varianten Probe Standort wenn kein HGVS Name Pro Alle Standort Standort Standort No Miscalls Standort Standorte 1 2 3 Callse 12 12 0 o awon om O O ET E O E E e emn e O I ET E BCE EN a a O O e e E E me a O O TO I O EC E 44 Teile Nr 15038344 Rev A DEU bereinstimmung 100 100 1
46. lutproben wurden bereitgestellt um die Inkorporation der Extraktionsschritte zum Vorbereiten der gDNA zu erm glichen die als prim re Zugabe f r den Assay Workflow dient Die Proben First Pass Rate definiert als die Anzahl der Proben die beim ersten Versuch den QC Kennzahlen entsprechen betrug 99 7 Alle Ergebnisse basieren auf anf nglichen Tests Der PA auf Genotypebene betrug f r alle Varianten einschlie lich der PolyTG PolyT Variante 99 22 und ohne die PolyTG PolyT Variante 99 60 Der NA Wert f r alle WT betrug 99 70 und der OA Wert f r alle gemeldeten Positionen betrug ebenfalls 99 70 Der PA Wert f r die PolyTG PolyT Variante betrug 97 83 40 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Reproduzierbarkeit des MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose ohne PolyTG PolyT Varianten P A uo Summe Alle HGVS Name oder Ergebnisse gesamt Ubereinstimmende Calls Standorte m Varianten Probe Standort wenn kein Name N bereinstimmung an o i Miscalls HGVS Pro Alle Standort Standort Standort Standort Standorte 1 2 3 Callse 1 c 1408G gt A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 41 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Summe Alle HGVS Name oder Ergebnisse gesamt bereinstimmende Calls Standarte Varianten Probe Standort wenn kein HGVS Name Pro Al
47. m Vortexter Stellen Sie ein neues Eppendorf Gef nachfolgend als DAL R hrchen bezeichnet bereit Geben Sie 585 ul Bibliothek Verd nnungspuffer in das DAL R hrchen Geben Sie 6 ul von 20 pM Interne PhiX Kontrolle in das DAL R hrchen Pipettieren Sie 3 bis 5 mal auf und ab um die Spitze zu sp len und eine vollst ndige bertragung sicherzustellen bertragen Sie 9 ul PAL in das DAL R hrchen das Bibliothek Verd nnungspuffer enth lt Pipettieren Sie 3 bis 5 mal auf und ab um die Spitze zu sp len und eine vollst ndige bertragung sicherzustellen Mischen Sie das DAL R hrchen mit dem Vortexer bei h chster Geschwindigkeit Zentrifugieren Sie das DAL R hrchen eine Minute lang bei 1000 x g und 20 C Inkubieren Sie das DAL R hrchen bei 96 C zwei Minuten lang auf einem Hitzeblock Invertieren Sie das DAL R hrchen nach der Inkubation ein bis zweimal um es gut zu mischen und legen Sie es dann sofort in das Eiswasserbad Belassen Sie das DAL R hrchen f nf Minuten lang im Eiswasserbad Laden der Probenbibliotheken in eine Kartusche 1 2 Verwenden Sie eine separate saubere und leere 1 ml Pipettenspitze um die Verschlussfolie ber dem mit Load Samples Proben laden bezeichneten Beh lter auf der Reagenzienkartusche zu durchstechen Geben Sie mit der Pipette 600 ul der Probenbibliotheken in den Beh lter Load Samples Proben laden Achten Sie beim Zuf hren der Probe darauf die Verschlussfolie nicht zu ber hren
48. n KK Deignan JL et al 2013 ACMG clinical laboratory standards for next generation sequencing Genetics in Medicine Genetics in Medicine 15 9 733 747 Patente und Marken Dieses Dokument und dessen Inhalt sind Eigentum von Illumina Inc und verbundenen Unternehmen Illumina und ausschlie lich f r den bestimmungsgem en Gebrauch durch den Kunden in Verbindung mit dem Gebrauch des hier beschriebenen Produkts der hier beschriebenen Produkte und f r keinen anderen Bestimmungszweck ausgelegt Dieses Dokument und dessen Inhalt d rfen ohne schriftliches Einverst ndnis von Illumina nicht verwendet und zu keinem anderen Zweck verteilt bzw anderweitig bermittelt offengelegt oder auf irgendeine Weise reproduziert werden Illumina bertr gt mit diesem Dokument keine Lizenzen unter seinem Patent Markenzeichen Urheberrecht oder b rgerlichem Recht bzw hnlichen Rechten an Drittparteien Die Anweisungen in diesem Dokument m ssen von qualifiziertem und entsprechend ausgebildetem Personal genau befolgt werden damit die in diesem Dokument beschriebene Anwendung der Produkte sicher und ordnungsgem erfolgt Vor der Verwendung dieser Produkte muss der Inhalt dieses Dokuments vollst ndig gelesen und verstanden worden sein FALLS NICHT ALLE HIERIN AUFGEF HRTEN ANWEISUNGEN VOLLST NDIG GELESEN UND BEFOLGT WERDEN K NNEN PRODUKTSCH DEN VERLETZUNGEN DER BENUTZER UND ANDERER PERSONEN SOWIE ANDERWEITIGER SACHSCHADEN EINTRETEN ILLUMINA
49. n anhand eines Filters der eine Gr enauswahl vornehmen kann ungebundene Oligonukleotide aus der genomischen DNA B Extension Ligation Im zweiten Schritt der Extension Ligation werden die hybridisierten Upstream und Downstream Oligonukleotide verbunden Eine DNA Polymerase erstreckt sich von den Upstream Oligonukleotiden ber die Zielregion hinaus gefolgt von der Ligation mit dem 5 Ende des Downstream Oligonukleotids mittels DNA Ligase Das Ergebnis besteht in der Bildung von Produkten die die CF spezifischen Oligonukleotide enthalten flankiert von Sequenzen die f r die Amplifikation ben tigt werden C PCR Amplifikation Im dritten Schritt der PCR Amplifikation werden die Extension Ligation Produkte unter Verwendung von Primern die Indexsequenzen f r die Proben Multiplexierung hinzuf gen sowie von g ngigen Adaptern die f r die Clusterbildung auf dem MiSeqDx Ger t erforderlich sind amplifiziert Am Ende dieses Vorgangs reinigt ein PCR Reinigungsverfahren die PCR Produkte die als Bibliothek bezeichnet werden D Bibliotheksnormalisierung Im letzten Schritt der Bibliotheksnormalisierung wird die Quantit t jeder Bibliothek normalisiert um eine einheitlichere Bibliotheksdarstellung in der endg ltigen Pool Bibliothek sicherzustellen Am Ende dieses Vorgangs wird die Pool Bibliothek zur Sequenzierung mit der SBS Chemie auf das MiSeqDx Ger t geladen Sequenzierung Die SBS Chemie verwendet eine Methode mit reversiblen T
50. n einem Bericht im Textdateiformat finden Sie unter MiSeq Reporter Benutzerhandbuch Teile Nr 15038356_DEU Der Genetiker hat die M glichkeit in einem Dropdown Men der MiSeq Reporter Software einen Interpretationswert f r jede Variante einzugeben die f r eine Probe gemeldet wurde Es stehen folgende Interpretationswerte zur Auswahl CF verursachend Mutation von variierender klinischer Konsequenz Mutation von unbekannter Signifikanz oder nicht CF verursachend Der eingegebene Wert wird an die Ergebnisdatei angeh ngt und in der Interpretationsspalte im Bericht des klinischen Sequenzierungs Assays angezeigt Verfahren zur Qualit tskontrolle Die guten Laborpraktiken schreiben vor dass Kontrollproben evaluiert werden m ssen um Unterschiede bei der Blutverarbeitung und bei technischen Verfahren im Labor des Benutzers zu erkennen die zu signifikanten Schwankungen bei den Ergebnissen f hren k nnen 1 Positive Kontrollproben Eine positive DNA Kontrollprobe ist bei jedem Lauf erforderlich Die positive Kontroll DNA Probe muss eine gut charakterisierte Probe mit mindestens einer bekannten CFTR Variante sein 5 Illumina empfiehlt die Verwendung rotierender positiver Kontrollproben die den technischen Standards und Richtlinien des ACMG von 2008 f r CF Mutationstests und den klinischen Laborstandards f r die Sequenzierung der n chsten Generation des ACMG aus dem Jahr 2013 entsprechen Die positive Kontrollprobe muss den erwartet
51. nd Inzidenz Das Gen Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator CFTR wurde 1989 identifiziert Es befindet sich am langen Arm des Chromosoms 7 und enth lt 27 kodierende Exons verteilt ber 230 kb2 Eine 6 5 kb mRNA die von dem normalen Allel produziert wird kodiert CFTR ein 1490 Aminos ure haltiges Membranprotein das als regulierter Chlorid Kanal in den Epithelzellen mehrerer Organe fungiert Derzeit sind ber 1 900 Varianten des CFTR Gens beschrieben wobei die Mehrheit davon Punktmutationen sind Die h ufigste CFTR Variante ist das F508del Allel3 April 2014 Teile Nr 15038344 Rev A DEU 1 MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose das fast 70 aller CFTR Varianten ausmacht Allerdings resultieren die anderen h ufig auftretenden CFTR Varianten oft in einem CF Ph notyp und anderen auf CFTR zur ckzuf hrenden Erkrankungen 3 Die Mukoviszidose hat eine gesch tzte Erkrankungsh ufigkeit von einer in 2 000 bis 4 000 Lebendgeburten und eine Pr valenz von rund 30 000 Personen in der US Bev lkerung Sie tritt in allen ethnischen Gruppierungen mit unterschiedlicher H ufigkeit auf 1 3 000 bei Wei en 1 9 200 bei Hispanoamerikanern 1 10 900 bei amerikanischen Ureinwohnern 1 15 000 bei Afroamerikanern und 1 31 000 bei der asiatisch amerikanischen Bev lkerung 4 Allerdings wird die Zuweisung einer Ethnie auf eine betroffene Person immer schwieriger Aktuelle Sch tzwerte der H ufigkeit d
52. nd ab um zu mischen 5 Verschlie en Sie die HYB Platte und zentrifugieren Sie 1000 x g eine Minute lang bei 20 C 6 Legen Sie die HYB Platte in dem mit 95 C vorgeheizten Block ab und inkubieren Sie sie eine Minute lang 7 Verringern Sie die Temperatur des Hitzeblocks auf 40 C und fahren Sie mit der Inkubation fort bis der Hitzeblock 40 C erreicht etwa 80 Minuten Die allm hliche Abk hlung ist f r eine ordnungsgem e Hybridisierung kritisch Deshalb werden PCR Thermocycler mit aktiver K hlung z B Peltier thermoelektrisch gek hlt f r diesen Vorgang nicht empfohlen SICHERER HALTEPUNKT Nachdem der Hitzeblock 40 C erreicht hat bleibt die HYB Platte zwei Stunden lang bei 40 C stabil Entfernen von ungebundenen Oligonukleotiden Vorbereitung 1 Bringen Sie die Extension Ligation Mischung den stringenten Wasch Puffer und den universellen Wasch Puffer auf Raumtemperatur und mischen Sie diese dann kurz mit dem Vortexer 2 F gen Sie die Filterplatten Assembly Einheit nachfolgend FPU bezeichnet in der entsprechenden Reihenfolge von oben nach unten zusammen Deckel Filterplatte Adapterkranz und MIDI Platte 3 Waschen Sie die Filterplattenmembran vorab wie folgt a F gen Sie 45 pl stringenten Wasch Puffer zu jedem Well hinzu b Verschlie en Sie die Filterplatte mit dem Deckel und zentrifugieren Sie sie f nf Minuten lang bei 2400 x g und 20 C April 2014 Teile Nr 15038344 Rev ADEU 15 MiSeqDx Kli
53. nd umfassten zwischen einer bis zehn Varianten innerhalb desselben Konstrukts Sie wur den linearisiert auf der genomischen DNA mit entsprechenden Kopienzahlen verd nnt und mit menschlichen genomischen DNA Proben des Wildtyp Genotyps bei quivalenten Kopienzahlen gemischt um eine heterozygote Probe zu imitieren Beim MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose wurden insgesamt 5 206 Positionen mit den Referenzmethoden der bidirektionalen Sequen zierung nach Sanger und den PCR Tests verglichen Die Genotypisierungsergebnisse f r SNV und kleine InDel Stellen einschlie lich der PolyTG PolyT Region wurden mit der bidirektionalen Sanger Sequenzanalyse verglichen Zwei validierte PCR basierte Assays wurden als Referenzmethode f r die beiden gro en Deletionen im Panel verwendet Jeder doppelte PCR Assay nutzte zwei Primer S tze um zwischen Wildtyp heterozygoten und homozygoten Genotypen zu unterscheiden Einer der Primer S tze diente dazu die Deletionshaltepunkte zu flankieren w hrend der andere Satz eine in der Deletion befindliche Region amplifizierte Die zwei Produkte wurden anhand von Gr entrennung auf einem Agarosegel nachgewiesen Die PCR Assays wurden anhand eines Panels aus insgesamt 28 Proben 22 Proben f r jede Deletion validiert die aus Zelllinien und aus Blut gewonnenen genomischen DNA Proben sowie synthetischen Plasmiden bestanden die den WT HET und HOM Genotyp f r jede gro e Deletion umfassten Anhand de
54. ndorf Mikrozentrifugenr hrchen Schraubverschluss empfohlen PCR 8 fach R hrchenstreifen L sungsbecken PVC DNase RNase frei Bottich Klebende Aluminiumfolienversiegelungen April 2014 Teile Nr 15038344 Rev A DEU 11 MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Klebende Plattenversiegelungen Aerosol resistente Pipettenspitzen Probenerfassung Transport und Lagerung Warn ANMERKUNG Behandeln Sie alle Proben wie potenzielle Infektionserreger Vollblutproben die in K EDTA R hrchen gesammelt wurden k nnen verwendet werden Vollblutproben k nnen bei Raumtemperatur maximal sieben Tage bis zu 30 Tage bei 2 C bis 8 C oder gefroren bei 25 C bis 15 C bis zu 30 Tage lang gelagert werden Transportieren Sie Vollblut bei Raumtemperatur maximal sieben Tage lang bei 2 C bis 8 C maximal 30 Tage lang oder gefroren bei 25 C bis 15 C maximal 30 Tage lang Beim Transport von Vollblut m ssen die l nderspezifischen Bundes staatlichen und regionalen Vorschriften f r den Transport von Krankheitserregern eingehalten werden Nach dem sechsmaligen Einfrieren und Auftauen von genomischer DNA wurden keine negativen Auswirkungen auf die Assay Leistung beobachtet Bei Vollblutproben mit erh hten Bilirubin Cholesterin H moglobin Triglycerid bzw EDTA Werten wurden keine negativen Auswirkungen auf die Assay Leistung beobachtet und Vorsichtshinweise x ACHTUNG y Gem geltenden Gesetz
55. ng zu jedem Probe Well der Filterplatte hinzu 2 Verschlie en Sie die Filterplatte mit klebbarer Aluminiumfolie und decken Sie sie dann mit dem Deckel zu 3 Inkubieren Sie die FPU im vorab erw rmten Inkubator 45 Minuten lang bei 37 C PCR Amplifikation Vorbereitung 1 Bereiten Sie frisches 0 05 N NaOH vor 2 Ermitteln Sie anhand des Plattengrafikausdrucks von Illumina Worklist Manager die zu verwendenden Index Primer 3 Bringen Sie die PCR Master Mischung und die entsprechenden Index Primer auf Raumtemperatur Mischen Sie mit dem Vortexer alle aufgetauten R hrchen und zentrifugieren Sie sie anschlie end kurz 4 Stellen Sie eine neue 96 Well PCR Platte nachstehend als AMP Platte bezeichnet bereit 5 F gen Sie anhand des Probenblatts Index Primer wie folgt zur AMP Platte hinzu a F gen Sie 4 ul der Index Primer C A503 D A504 und E A505 zu den entsprechenden Wells in einer Spalte der AMP Platte hinzu b Entsorgen Sie die urspr nglichen wei en Verschl sse und bringen Sie neue wei e Verschl sse an c F gen Sie 4 ul der ausgew hlten Index Primer 1 A701 2 A702 and 10 A710 zu den entsprechenden Wells in einer Reihe der AMP Platte hinzu Die Spitzen m ssen nach jeder Reihe ausgetauscht werden um eine Index Kreuzkontaminierung zu vermeiden d Entsorgen Sie die urspr nglichen orangefarbenen Verschl sse und bringen Sie neue orangefarbene Verschl sse an 16 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSeqDx Klini
56. nischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Verfahren 1 Entfernen Sie die HYB Platte aus dem Hitzeblock und zentrifugieren Sie sie eine Minute lang bei 1 000 x g und 20 C 2 bertragen Sie das gesamte Volumen etwa 55 ul jeder Probe in die entsprechenden Wells der Filterplatte 3 Verschlie en Sie die Filterplatte mit dem Deckel und zentrifugieren Sie sie f nf Minuten lang bei 2400 x g und 20 C 4 Waschen Sie die Filterplatte wie folgt a Geben Sie 45 ul stringenten Wasch Puffer in jeden Probe Well b Verschlie en Sie die Filterplatte mit dem Deckel und zentrifugieren Sie sie f nf Minuten lang bei 2400 x g und 20 C 5 Wiederholen Sie den Waschvorgang wie im vorherigen Schritt beschrieben HINWEIS Wenn der Wasch Puffer nicht vollst ndig abl uft zentrifugieren Sie erneut bei 2400 x g und 20 C bis die gesamte Fl ssigkeit durchgelaufen ist weitere f nf bis zehn Minuten 6 Entsorgen Sie den gesamten Durchfluss der Formamid enth lt und setzen Sie dann die FPU wieder zusammen 7 Geben Sie 45 ul universellen Wasch Puffer in jeden Probe Well 8 Verschlie en Sie die Filterplatte mit dem Deckel und zentrifugieren Sie sie zehn Minuten lang bei 2400 x g und 20 C HINWEIS Stellen Sie sicher dass die gesamte Fl ssigkeit nach dem Zentrifugieren abgelaufen ist Wiederholen Sie das Zentrifugieren bei Bedarf Extension Ligation von gebundenen Oligonukleotiden Verfahren 1 F gen Sie 45 ul Extension Ligation Mischu
57. nten Verringerung der Clusterdichte f hren Ger te und Materialien Bereitgestellte separat erh ltliche Ger te und Materialien 1 MiSeqDx Ger t Katalognummer DX 410 1001 2 TruSeq Indexplattenvorrichtungs Kit Katalognummer FC 130 1005 3 TruSeq Indexplattenvorrichtungs und Kranz Kit Katalognummer FC 130 1007 4 Ersatzverschliisse f r Indexadapter Katalognummer DX 502 1003 Erforderliche jedoch nicht bereitgestellte Ger te und Materialien Ger te und Materialien f r die Voramplifikation 1 Hitzeblock Es wird ein Hitzeblock f r eine 96 Well Platte ben tigt Der Hitzeblock muss den folgenden Leistungsspezifikationen entsprechen Hitzebl cke mit beheizten Deckeln sind zur Verwendung akzeptabel Temperaturbereich Umgebung 5 C bis 99 C Temperatursteuerung 0 1 C bei 37 C 0 4 C bei 60 C 2 Probeninkubator Es wird ein Inkubator Hybridisierungsofen ben tigt Der Inkubator muss den folgenden Leistungsspezifikationen entsprechen Temperaturbereich 10 bis 100 C Temperatursteuerung 0 2 C 10 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose 3 Tischzentrifuge Es wird eine Tischzentrifuge ben tigt die die Temperatur von 20 C halten kann Es wird eine separate Zentrifuge im Nachamplifikationsbereich ben tigt Es kann jede Plattenzentrifuge verwendet werden die die vorgesehenen Geschwindigkeiten des Protokolls erreicht 280 bis 2400 x g 4
58. oben Proben Exon11 0 0 2 0 0 100 April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Genotyp CFTR Positive Calls Varianten Allgemeiner cDNA Gen No Positive Variantent Miscall P ut Name cDNA Name CORE Region Klinische da 6 Synthetische Calls I Ubereinstimmung Name Koordinate hg19 Proben Erran PIREA Proben S549R c 1645A gt C SNV Exon12 1 100 c 1645A gt C c 1647T gt G EIC seme m O I c 1680 1G SNV Exon13 2 G gt A gt A 31 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Genotyp CFTR Positive Calls Varianten Allgemeiner cDNA Variantent Gen No Miscalls _ Positive Name cDNA Name yP Region Klinische FERNE M Synthetische Calls bereinstimmung Name Koordinate hg19 Proben ee Proben V5621 c 1684G gt A SNV Exon13 1 0 0 0 0 100 gt A 2183AA gt G c 2051_2052 DIV Exon14 3 1 100 delAAinsG 32 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Genotyp CFTR Positive Calls Varianten Allgemeiner cDNA Gen No Positive Variantent Miscall P ut Name cDNA Name eb Region Klinische PER 9 Synthetische Calls I Ubereinstimmung Name Koordinate hg19 Proben Erranen PTOS ER Proben 2184insA c 2052_2053 DIV Exon14 3 1 100 insA 33 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzie
59. obenblatt mehrere Proben aufgelistet sind und der Lauf ber Index Reads verf gt Die Demultiplexierung trennt Daten aus zusammengefassten Proben auf der Basis der eindeutigen Sequenzindizes die w hrend der PCR Amplifikation hinzugef gt wurden e Generieren von FASTO Dateien Nach der Demultiplexierung generiert MiSeq Reporter tempor re Dateien im FASTO Dateiformat dem Textformat f r die Darstellung von Sequenzen FASTO Dateien enthalten die Reads f r jede Probe sowie die Qualit ts Scores ausgenommen Reads von Clustern die den Filter nicht passiert haben e Alignment Beim Alignment werden Sequenzen mit der Referenz verglichen um eine Beziehung zwischen den Sequenzen zu identifizieren Au erdem wird ein Score basierend auf hnlichkeitsregionen zugewiesen Ausgerichtete Reads werden in Dateien im BAM Format gespeichert MiSeq Reporter verwendet einen banded Smith Waterman Algorithmus der lokale Sequenz Alignments durchf hrt um hnliche Regionen zwischen zwei Sequenzen zu ermitteln April 2014 Teile Nr 15038344 Rev A DEU 5 MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Varianten Calling Bei diesem Schritt werden einzelne Nukleotidvarianten SNVs Insertionen und Deletionen Indels und weitere strukturierte Varianten in einer standardisierten und analysierbaren Textdatei mit dem Namen MiSegDxCFClinicalSequencingAssay txt aufgezeichnet Weitere Informationen hierzu finden Sie im Abschnitt Analys
60. om September 2013 Alle Indels in Homopolymer Regionen innerhalb dieser Gruppe von Variationen stimmen mit den erwarteten Variantennachweisen gem CFTR2 berein Der Assay kann nicht feststellen ob die Ausrichtung der PolyTG PolyT Variante cis trans zu anderen Varianten ist Bei Patienten mit einer R117H Variante sollten weitere Tests durchgef hrt werden um festzustellen ob sich eine PolyTG PolyT Variante die den klinischen Ph notyp z B 12 13 TG oder 5T beeinflussen kann in cis trans Ausrichtung befindet PolyTG PolyT sind Homopolymer Regionen die aufgrund des Verrutschens der DNA Polymerase Slippage bekannterma en schwer zu sequenzieren sind anto 6 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose 9 Dieser Assay wird ausschlie lich in einem 8 Plex Format ausgef hrt Wenn keine sechs klinische Proben verf gbar sind ausgenommen die positive und die negative Kontrollprobe m ssen andere Proben menschlicher genomischer DNA f r den Lauf verwendet werden Produktkomponenten Die Illumina MiSegDx Plattform umfasst folgende Komponenten e MiSegDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Katalog Nr DX 102 1001 e MiSegDx Ger t Katalognummer DX 410 1001 Reagenzien Bereitgestellte Reagenzien Reagenzien f r den Illumina MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Katalognummer DX 102 1001 werden von Illumina bereitges
61. r an unterschiedlichen Tagen durchgef hrt Die DNA Konzentration und das A260 A280 Verh ltnis der extrahierten gDNA Proben wurden mithilfe der Spektralfotometrie ermittelt Die Gesamtzahl der Proben f r jede Extraktionsmethode der Studie ist 168 14 Proben x 2 Bediener Extraktionsmethode x 3 L ufe Bediener x 2 Replikate extrahierte gDN A Probe Anzahl der Proben First Extraktionsmethode getesteten Call Rate Genauigkeit gt Pass Rate Proben Alkoholpr zipitation 168 gt 99 99 gt 99 99 100 Kiesels urefilters ulen Isolation 168 gt 99 99 gt 99 99 100 Extraktion des magnetischen Bead 168 gt 99 99 gt 99 99 100 Prozent der Proben mit einer Call Rate von ber 99 im ersten Lauf DNA Zugabe Der DNA Zugabebereich des Illumina MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose wurde untersucht indem eine Studie zur seriellen Verd nnung mit 14 repr sentativen DNA Proben durchgef hrt wurde die 16 eindeutige CF Varianten enthielt Jede Probe wurde bei 9 DNA Zugabestufen von 1250 ng bis 1 ng 1250 ng 500 ng 250 ng 100 ng 50 ng 25 ng 10 ng 5 ng und 1 ng doppelt getestet Zur Ermittlung der Genauigkeit wurden Genotyp Proben mit bidirektionalen Sequenzierungsdaten nach Sanger und die Deletionen mit einem PCR Assay verglichen 1250 ng und 25 ng wurden als Ober und Untergrenze f r die DNA Zugabe identifiziert da sie eine Proben First Pass Rate von 95 ohne falsche Calls 100 Genauigkeit und Call Rate
62. r Untersuchung der PCR Produkte auf einem Agarosegel wurde best tigt dass die PCR Assays eine 100 ige Spezifit t und Reproduzierbarkeit f r alle getesteten Proben aufwiesen Die Genauigkeit der PCR Assays wurde anhand der Sanger Sequenzierung best tigt und f r 100 aller Proben nachgewiesen F r jeden Genotyp wurde die Genauigkeit anhand von drei statistischen Messgr en ermittelt Die positive bereinstimmung Positive Agreement PA wurde f r jede Genotyp Variante berechnet indem die Anzahl der Proben mit bereinstimmenden Varianten Calls durch die Gesamtzahl der Proben mit dieser Variante wie anhand der Referenzmethoden ermittelt dividiert wurde Die negative bereinstimmung Negative Agreement NA wurde ber alle Wildtyp WT Positionen hinweg berechnet indem die Anzahl der konkordanten WT Positionen durch die Gesamtzahl der WT Positionen wie in den Referenzmethoden ermittelt dividiert wurde Die allgemeine bereinstimmung Overall Agreement OA wurde ber alle berichteten Positionen hinweg berechnet indem die Anzahl der konkordanten WT und Varianten Positionen durch die Gesamtzahl der berichteten Positionen wie in den Referenzmethoden ermittelt dividiert wurde Der MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose hatte einen PA von 99 66 auf Genotypebene einschlie lich PolyTG PolyT Varianten 100 ohne PolyTG PolyT Varianten Der NA Wert f r alle WT Positionen war gt 99 99 und der OA Wert f r alle gemelde
63. riante homozygot war und falsch gemeldet wurde MiSegDx meldete die Variante als homozygot Eines der diskordanten Ergebnisse stammte aus der Reproduzierbarkeitsstudie Das PolyTG PolyT Ergebnis der Probe war bei allen 18 Replikaten konkordant bei der bidirektionalen Sanger Sequenzierung jedoch diskordant Y Bei der urspr nglichen synthetischen heterozygoten Probe wurde festgestellt dass diese nicht korrekt vorbereitet wurde Als sie nach der erneuten Vorbereitung mit demselben Plasmid getestet wurde wurde sie nachgewiesen PA ohne PolyTG PolyT Calls betrug 100 Eine synthetische f r Exon8 heterozygote Probe wurde f r die Variante CFTR dele22 23 als heterozygot gemeldet Weitere Untersuchungen ergaben dass dieses Ergebnis wahrscheinlich von einer geringf gigen Kontamination herr hrte Au erdem konnten bei einer zweiten Probe die Sanger Primer die Variante Q1463Q aufgrund von Indels sowohl stromaufw rts als auch stromabw rts der Variantenstelle nicht vollst ndig nachweisen 38 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose 39 Genauigkeit der PolyTG PolyT Variante f r den MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose PolyTGPolvT Genot Anzahl der klinischen Anzahl der Anzahl der synthetischen Anzahl der Anzahl der No y e SR Proben Zelllinienproben Proben Miscalls Calls Genauigkeit TG 9 T 7 TG 11 T 7 2 0 0 0 1 50 00 EEE TE I I O I I IEC
64. rige L sung mit Salzen 25 C bis 15 C und dNTPs F llmenge Wirkstoffe Lagerung 4 6 ml Gepufferte w ssrige L sung 25 C bis 15 C 4 5 ml 10 ul mit Salzen 2 Mercaptoethanol und Formamid Gepufferte w ssrige L sung 25 C bis 15 C Gepufferte w ssrige L sung 25 C bis 15 C mit genomischer PhiX DNA Teile Nr 15038344 Rev A DEU 7 MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Karton 2 Tabelle 5 Karton 2 Nachamplifikationsreagenzien Komponente Menge Inhalt Lagerung MiSeqDx 6 Kartuschen Einweg Kartusche mit Clusterbildungs und 25 C bis 15 C Reagenzienkartusche Sequenzierungsreagenzien f r die Verwendung mit Klinischer CF dem MiSegDx Ger t einschlie lich Formamid Sequenzierungs Assay 2 Mercaptoethanol und 2 DMSO MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Karton 3 Tabelle 6 Karton 3A Voramplifikationsreagenzien Komponente Menge Fillmenge Wirkstoffe Lagerung Stringenter Wasch Puffer 1 Flasche 24 ml Gepufferte w ssrige L sung mit Salzen 2 C bis 8 C 2 Mercaptoethanol und Formamid Universeller Wasch 1 R hrchen Gepufferte w ssrige L sung mit Salzen 2 C bis 8 C Puffer Tabelle 7 Karton 3B Nachamplifikationsreagenzien Komponente Menge F llmenge Wirkstoffe Lagerung PCR Reinigungs Beads 1 R hrchen 5ml Gepuf
65. rosis and CFTR related disorders Genetics in Medicine 10 12 851 868 Moskowitz SM Chmiel JF Sternen DL Cheng E Cutting GR CFTR related disorders Pagon RA Bird TC Dolan CR Stephens K editors GeneReviews Seattle WA University of Washington 2008 Verf gbar unter www ncbi nlm nih gov books NBK1250 Online Aktualisiert am 19 Februar 2008 Katkin JP 2012 Cystic fibrosis Clinical manifestations and diagnosis Verf gbar unter www uptodate com Online 07 Dezember 2012 Farrell PM Rosenstein BJ White TB Accurso FJ Castellani C et al 2008 Guidelines for diagnosis of cystic fibrosis in newborns through older adults Cystic Fibrosis Foundation consensus report J Pediatr 153 2 54 S14 Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry Annual Data Report 2010 Cystic Fibrosis Mutation Database CFTR1 Verf gbar unter www genet sickkids on ca app Online August 2013 Committee on Genetics April 2011 The American College of Obstetricians and Gynecologists Committee Opinion Update on Carrier Screening for Cystic Fibrosis 486 1 4 Rohlfs EM Zhou Z Heim R Nagan N Rosenblum L et al 2011 Cystic fibrosis carrier testing in an ethnically diverse US population Clinical Chemistry 57 6 841 848 Sosnay PR Siklosi KR Van Goor F Kaniecki K Yu H et al 2013 Defining the disease liability of variants in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene Nat Genet 25 August zuerst elektronisch ver ffentlic
66. rt No Miscalls Standort Standorte 1 2 3 Callse E esi Tee Te Te TTT man I IC CI CC E I A E O mn v CI ICI O O e E TE I I E CIN CO EIC CEC BEE AA E ES ES Alle Varianten PA insgesamt einschlie lich AAA PolyTG PolyT Daten in Tabelle 15 Alle WT NA insgesamt 2871132 8613396 2865930 2855526 2865982 26006 Gesamtzahl aller WT und Varianten OA 2873712 8621136 2868492 2858079 2868497 26043 ENEN Proben wurden nicht neu getestet bereinstimmung 100 100 100 100 100 100 100 100 99 22 99 70 99 70 Je ein Replikat der Proben 5 und 75 hatte eine Call Rate von 0 Weitere Untersuchungen zeigten dass die Proben vor der Bibliotheksvorbereitung wahrscheinlich nicht zur Probenplatte hinzugef gt wurden Untersuchungen zeigten dass die Proben 9 und 10 vor der Bibliotheksvorbereitung wahrscheinlich vom Bediener vertauscht wurden Ohne PolyTG PolyT Varianten betrug der PA 99 60 58 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose PolyTG PolyT Reproduzierbarkeit f r das MiSegDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Summe alle Anzahl Ergebnisse bereinstimmende Calls S tandorte Panel Probe Genotyp Pro Alle Standort Standort Standort No Miscalls Standort Standorte 1 2 3 Calls A TG 12 T 7 TG 12 1 7 6 18 6 6 6 0 0 mm 6 m CI CC n 7 cosmo 6 ss e ee 0 gt mamma I I I e e
67. rtusche auf Eis bzw lagern Sie sie bei 2 C bis 8 C bis zu sechs Stunden bis Sie den Lauf konfigurieren k nnen Die besten Ergebnisse erzielen Sie wenn Sie direkt mit dem Laden der Probe und dem Konfigurieren des Laufs fortfahren Vorbereiten von Proben f r die Sequenzierung 1 I A UO N 11 12 13 14 15 16 Bringen Sie den Bibliothek Verd nnungspuffer auf Raumtemperatur Mischen Sie den Bibliothek Verd nnungspuffer kr ftig mit dem Vortexer und stellen Sie sicher dass alle Ausf llungen vollst ndig aufgel st wurden Wenn die SGP Platte gefroren gelagert wurde tauen Sie die SGP Platte bei Raumtemperatur auf Zentrifugieren Sie die SGP Platte eine Minute lang bei 1000 x g und 20 C Stellen Sie ein neues Eppendorf Gef nachfolgend als PAL R hrchen bezeichnet bereit Wenn die SGP Platte gefroren gelagert wurde mischen Sie jede zu sequenzierende Bibliothek indem Sie 3 bis 5 mal auf und abpipettieren bertragen Sie 5 ul jeder zu sequenzierenden Bibliothek von der SGP Platte auf einen PCR 8 fach R hrchenstreifen Verschlie en Sie die SGP Platte mit einer klebenden Plattenversiegelung und legen Sie sie beiseite i HINWEIS Bewahren Sie die versiegelte SGP Platte bei 25 C bis 15 C auf Die versiegelte SGP Platte kann maximal 3 Tage lang aufbewahrt werden Kombinieren und bertragen Sie den Inhalt des PCR 8 fach R hrchenstreifens in das PAL R hrchen Mischen Sie das PAL R hrchen gr ndlich mit de
68. rungs Assay f r zystische Fibrose 34 Genotyp CFTR Positive Calls Varianten Allgemeiner cDNA Gen No Positive Name cDNA Name Varel Region Klinische o Synthetische Calls MISGIS bereinstimmung Name Koordinate hg19 2789 5G gt A c 2657 5G SNV Intron16 1 100 gt A Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Genotyp CFTR Positive Calls Varianten Allgemeiner cDNA Gen No Positive Variantent Miscall P ut Name cDNA Name CRETE Region Klinische PER 9 Synthetische Calls I Ubereinstimmung Name Koordinate hg19 Proben SERE ROSTA Proben 3121 1G gt A c 2989 1G SNV Exon19 1 100 gt A um mm w E on 35 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Genotyp CFTR Positive Calls Varianten Allgemeiner cDNA Gen No Positive Variantent Miscall P Rio Name cDNA Name CORE Region Klinische da 6 Synthetische Calls er bereinstimmung Name Koordinate hg19 Proben ETTORE ROSI Proben Y1092X c 3276C gt G SNV Exon20 1 100 C gt G W1204X c 3611G gt A SNV Exon22 1 100 c3611G gt A 36 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Genotyp CFTR Positive Calls Varianten Allgemeiner cDNA Variantent Gen No Miscalls _ Positive Name cDNA Name ME Region Klinische Zelllini 6 Synthetisch
69. s Wasser darf die maximale Wasserlinie nicht bersteigen 2 Lassen Sie die Reagenzienkartusche im raumtemperierten Wasserbad etwa eine Stunde oder so lange auftauen bis sie vollst ndig aufgetaut ist 3 Nehmen Sie die Kartusche aus dem Wasserbad und klopfen Sie sie vorsichtig auf dem Tisch ab um das Wasser von der Basis der Kartusche zu entfernen Trocknen Sie die Basis der Kartusche ab Stellen Sie sicher dass kein Wasser auf die Oberseite der Reagenzienkartusche gespritzt ist berpr fen der Reagenzienkartusche 1 Invertieren Sie die Reagenzienkartusche zehnmal um die aufgetauten Reagenzien zu mischen und berpr fen Sie anschlie end visuell ob alle Positionen aufgetaut sind 20 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose 4 HINWEIS Es ist u erst wichtig dass die Reagenzien in der Kartusche vollst ndig aufgetaut und gemischt sind damit eine ordnungsgem e Sequenzierung sichergestellt werden kann berpr fen Sie visuell das Reagenz in Position 1 um sicherzustellen dass es vollst ndig gemischt ist und keine Ausf llungen enth lt Klopfen Sie die Kartusche vorsichtig auf dem Tisch ab um Luftblasen in den Reagenzien zu entfernen I ANMERKUNG Die MiSegDx Sipper R hrchen reichen bis zum Boden der einzelnen Beh lter um die Reagenzien zu aspirieren Deshalb ist es wichtig dass sich keine Luftblasen in den Beh ltern befinden Lagern Sie die Reagenzienka
70. scher Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose 6 Bereiten Sie die PCR Gebrauchsl sung aus PCR Master Mischung PCR Polymerase wie folgt vor a F gen Sie 5 6 ul PCR Polymerase zu 280 ul PCR Master Mischung hinzu b Invertieren Sie die vorbereitete PCR Gebrauchsl sung zum Mischen 20 mal Verfahren 1 Entnehmen Sie die FPU aus dem Inkubator und entfernen Sie die Aluminiumfolieversiegelung 2 Verschlie en Sie die Filterplatte mit dem Deckel und zentrifugieren Sie sie zwei Minuten lang bei 2400 x g und 20 C 3 F gen Sie 25 ul 0 05 N NaOH zu jedem Probe Well der Filterplatte hinzu Pipettieren Sie das NaOH 5 bis 6 mal auf und ab 4 Decken Sie die Filterplatte ab und inkubieren Sie sie f nf Minuten lang bei Raumtemperatur 5 bertragen Sie w hrend der Inkubation der Filterplatte 22 ul der PCR Gebrauchsl sung in jeden Well der AMP Platte mit Index Primern 6 bertragen Sie die vom Filter eluierten Proben wie folgt zur AMP Platte a Pipettieren Sie die Proben in der ersten Spalte der Filterplatte 5 bis 6 mal auf und ab b bertragen Sie 20 pl von der Filterplatte zur entsprechenden Spalte der AMP Platte c Pipettieren Sie leicht 5 bis 6 mal auf und ab um die DNA mit der PCR Gebrauchsl sung gr ndlich zu mischen d bertragen Sie in hnlicher Weise die verbleibenden Spalten von der Filterplatte zur AMP Platte Die Spitzen m ssen nach jeder Spalte ausgetauscht werden um Index und Probenkreuzkontaminierungen zu vermeiden 7
71. tellt Dieses Kit wurde f r sechs L ufe mit maximal acht Probem pro Lauf insgesamt bis zu 48 Proben konfiguriert MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Karton 1 Tabelle 3 Karton 1A Voramplifikationsreagenzien Komponente Menge Oligo Pool f r den 1 R hrchen klinischen CF Sequenzierungs Assay Hybridisierungspuffer 1 R hrchen Extension Ligation 1 R hrchen Mischung Index Primer C A503 D 1 R hrchen A504 und E A505 pro Primer Index Primer 1 A701 2 1 R hrchen A702 und 10 A710 pro Primer PCR Polymerase 1 R hrchen PCR Master Mischung 1 R hrchen F llmenge 600 ul 4 32 ml 4 8 ml 192 ul 128 ul 56 ul 2 8 ml Tabelle 4 Karton 1B Nachamplifikationsreagenzien Komponente Bibliotheksnormalisierungsverd nner Bibliothek Verd nnungspuffer Interne PhiX Kontrolle April 2014 Menge 1 R hrchen 1 R hrchen 1 R hrchen Wirkstoffe Lagerung Gepufferte w ssrige L sung mit 25 C bis 15 C Oligonukleotiden die auf das CFTR Gen abzielen Gepufferte w ssrige L sung mit Salzen 25 C bis 15 C und Formamid Gepufferte w ssrige L sung mit einer 25 C bis 15 C propriet ren Mischung aus DNA Polymerasen DNA Ligasen und dNTPs PCR Primer mit Indexsequenzen und 25 C bis 15 C Sequenzierungsadaptern PCR Primer mit Indexsequenzen und 25 C bis 15 C Sequenzierungsadaptern Propriet re DNA Polymerase 25 C bis 15 C Gepufferte w ss
72. ten Positionen war ebenfalls gt 99 99 24 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Gesamt Genauigkeit des MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Genotyp CFTR Positive Calls Varianten Allgemeiner cDNA Variantent Gen No Miscalls _ Positive Name cDNA Name yP Region Klinische TR 6 Synthetische Calls Ubereinstimmung Name Koordinate hg19 Proben Zeillmienptoben Proben 117120141 c 8G gt C SNV Exon1 25 3 0 0 0 100 EEES EA CS A EZ ei E E E E 25 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Genotyp CFTR Positive Calls Varianten Allgemeiner cDNA Gen No Positive Variantent Miscalls z ER Name cDNA Name STE Region Klinische da b Synthetische Calls Ubereinstimmung Name Koordinate hg19 Proben ie Proben 457TAT gt G c 325_327 DIV Exon4 1 100 delTAT insG 26 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSegDxT Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Genotyp CFTR Positive Calls Varianten Allgemeiner cDNA Gen No Positive Variantent Miscall P ut Name cDNA Name CORE Region Klinische dan 6 Synthetische Calls I Ubereinstimmung Name Koordinate hg19 Proben SPORE ROSA Proben 71145 c 579 5G gt A SNV Intron5 1 100 G gt A 852del22 c 720_741 DIV Exon6 1 100 delAGGG AGAATG ATGATG AAGTAC 27 Teile Nr
73. ten flankierende Nukleotide einbezogen Bei Exon 20 werden 30 nt flankierende intronische Sequenz am 5 Ende des Exons einbezogen um den Nachweis der Mutation 3272 26A gt G zu erm glichen Mit den zwei gro en Deletionen und den PolyTG PolyT Regionen gibt es insgesamt 5206 Positionen Regionen Verfahrensprinzipien Illumina MiSegDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose umfasst zwei Hauptverfahren Das erste Verfahren die Bibliotheksvorbereitung besteht im manuellen Vorbereiten der Proben f r die Sequenzierung Die Bibliotheksvorbereitung besteht aus vier wichtigen Schritten Hybridisierung Extension Ligation PCR Amplifikation und Bibliotheksnormalisierung Das zweite Verfahren ist das Sequenzieren der vorbereiteten Probe mithilfe der SBS Chemie Sequencing by Synthesis auf dem MiSeqDx Ger t Bibliotheksvorbereitung Anw spez Region von Anw spez cucszes s osseo Sonde 1 Interesse Sonde 2 anna Azz Anw spez Anw spez Sonde 2 O PT index index 2 Ps P7 Index 1 Index2 PS 4 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose A Hybridisierung Im ersten Schritt der Hybridisierung wird ein Pool von Upstream und Downstream Oligonukleotiden der spezifisch f r den MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose ist in die genomische DNA Probe hybridisiert Am Ende des Vorgangs entfernt ein Waschlauf in drei Schritte
74. und sich kein Pellet im unteren Bereich des R hrchens befindet wenn das R hrchen invertiert wird Verfahren 1 Mischen Sie den Bibliotheksnormalisierungsverd nner und die Bibliothek Beads in einem frischen 1 5 ml R hrchen wie folgt a F gen Sie 394 ul Bibliotheksnormalisierungsverd nner hinzu b Pipettieren Sie die Bibliothek Beads 10 mal auf und ab um zu resuspendieren 18 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 11 12 13 14 15 16 MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose HINWEIS Es ist u erst wichtig das Bibliothek Bead Pellet im unteren Bereich des R hrchens vollst ndig zu resuspendieren Durch die Verwendung einer P1000 wird sichergestellt dass die Beads homogen resuspendiert werden und sich keine Bead Masse im unteren Bereich des R hrchens befindet Dies ist unerl sslich um eine einheitliche Clusterdichte auf der Flie zelle zu erzielen c Geben Sie mit einer Pipette 72 ul Bibliothek Beads in das R hrchen mit Bibliotheksnormalisierungsverd nner d Mischen Sie die L sung indem Sie das R hrchen 15 bis 20 mal invertieren Geben Sie 45 ul der kombinierten Bibliotheksnormalisierungsverd nner Bibliothek Beads Gebrauchsl sung in jeden Well der LNP Platte mit den Bibliotheken Versiegeln Sie die LNP Platte und sch tteln Sie sie auf einem Mikroplattensch ttler 30 Minuten lang bei 1800 rpm Platzieren Sie die Platte mindestens zwei Minuten bzw so lange auf einem Magnetstati
75. v bis der berstand klar ist Lassen Sie die LNP Platte auf dem Magnetstativ entfernen Sie vorsichtig den berstand und entsorgen Sie ihn Entfernen Sie die LNP Platte vom Magnetstativ und waschen Sie die Beads mit Bibliotheksnormalisierungs Wasch Puffer wie folgt a Geben Sie 45 ul Bibliotheksnormalisierungs Wasch Puffer in jeden Probe Well b Versiegeln Sie die LNP Platte und sch tteln Sie sie auf einem Mikroplattensch ttler f nf Minuten lang bei 1800 rpm c Platzieren Sie die Platte mindestens zwei Minuten bzw so lange auf dem Magnetstativ bis der berstand klar ist d Entfernen Sie vorsichtig den berstand und entsorgen Sie ihn Wiederholen Sie den Bibliotheksnormalisierungs Waschvorgang wie im vorherigen Schritt beschrieben Verwenden Sie eine auf 20 ul eingestellte P20 Mehrkanalpipette um berfl ssigen Bibliotheksnormalisierungs Wasch Puffer zu entfernen Entfernen Sie die LNP Platte vom Magnetstativ und f gen Sie 30 ul 0 1 N NaOH zu jedem Well hinzu Versiegeln Sie die LNP Platte und sch tteln Sie sie auf einem Mikroplattensch ttler f nf Minuten lang bei 1800 rpm Stellen Sie w hrend der f nfmin tigen Elution eine neue 96 Well PCR Platte nachstehend als SGP Platte bezeichnet bereit F gen Sie 30 ul Bibliothek Lagerungspuffer zu jedem Well hinzu der in der SGP Platte verwendet werden soll Stellen Sie nach Beendigung der f nfmin tigen Elution sicher dass alle Proben in der LNP Platte vollst ndig resuspendiert sind
76. y aus 3 Geben Sie im Feld Worklist Name Name der Arbeitsliste einen Namen f r das Probenblatt ein Wenn f r den Namen des Probenblatts die alphanumerische Barcode ID der Reagenzienkartusche verwendet wird findet die MiSeq Operating Software MOS das Probenblatt automatisch Wenn ein anderer Name f r das Probenblatt verwendet wird kann die Schaltfl che Browse Durchsuchen in der MiSeq Operating Software MOS verwendet werden um das entsprechende Probenblatt zu finden 4 Optional Geben Sie eine Beschreibung f r den Lauf ein Stellen Sie sicher dass das Datum mit dem Startdatum des Laufs bereinstimmt 6 W hlen Sie Next Weiter al Eingeben von Probeninformationen 1 Geben Sie auf der Registerkarte Table Tabelle oder Plate Platte f r jeden Probenwell folgende Informationen ein a Sample ID Proben ID Geben Sie eine eindeutige Proben ID ein b Index 1 and Index 2 Index 1 und Index 2 Geben Sie den Indexadapter an der f r jedes Index Read verwendet werden soll 2 Optional Um detailliertere Informationen zu den Proben aufzuzeichnen geben Sie einen Probennamen und eine Beschreibung ein 14 Teile Nr 15038344 Rev A DEU April 2014 5 MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs Assay f r zystische Fibrose Optional W hlen Sie zum Angeben von Kontrollen auf der Platte im Dropdown Men Control Kontrolle Negative Negativ bzw Positive Positiv aus Wechseln Sie zur Register

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