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1. Heparin Abbildung 4 46 Interaktion von LPC behandelten und unbehandelten AsPC 1 Pankreastumorzellen mit Thrombozyten Eine LPC Inkubation vermochte die Bindung zwischen Thrombozyten und Tumorzellen zu mindern was teilweise durch eine Inhibition des thrombozyt ren P Selektin geschah Ein potentiell vorhandener Synergismus zwischen Heparin und LPC Behandlung konnte hier nicht nachgewiesen werden Die bei den jeweiligen Teilversuchen eingesetzten Reagenzien sind unter den Balken durch gekennzeichnet Neben der Untersuchung der LPC vermittelten Wirkung auf Zellen solider Tumore sollte auch die Wirkung auf Tumore Iymphozyt ren Ursprungs untersucht werden Dazu wurde die aus einem Non Hodgkin Lymphom abgeleitete Suspensionszelllinie U937 verwandt 4 Ergebnisse und Diskussion o o gt Ft A U937 m U937 LPC Q gt Adh sion A o N o Zeit s Abbildung 4 47 Einfluss der LPC Inkubation 450 uM f r 24 Std auf die Wechselwirkung von U937 Zellen mit rekombinantem P Selektin Durch die Inkubation kam es zu einer geringen Abnahme der Adh sion der U937 Zellen an P Selektin Da U937 Zellen bekannterma en PSGL 1 auf ihrer Membran exprimieren wurde die Interaktion dieser Zellen mit immobilisiertem P Selektin unter physiologischen Flussbedingungen untersucht Durch Inkubation der Zellen f r 24 Std mit 450 uM LPC konnte eine geringe Reduktion der
2. 58 time space plot des SACED Assays n 2unnsonnssosnnonsennnnsonneoennonnennnnen 60 R ntgenfilm von zwei ausgewerteten Membranen u 2222s0 nennen 67 Durchflusszytometrischer Nachweis der VLA 4 P und L Selektin Ligand Expression auf MV3 Melanomzellen rzu220rn nennen 70 Interaktion von MV3 Melanomzellen mit Thrombozyten 71 Interaktion von MV3 Melanomzellen mit P Selektin ee 71 Durchflusszytometrische Bestimmung der VLA 4 Expression 72 Std nach SIRNA Zugabe een a Dei Die inne 73 Einfluss von Mn Stimulation und siRNA Behandlung auf die Zelladh sion an VCAM 1 uanasceeseeeeeennnnsnsnsssssenennnnnnennnsnnnnennnnnnnnnnennnnennnnnn 73 Interaktion zwischen MV3 Melanomzellen und HUVEC Endothelzellen unter physiologischen Flussbedingungen 22222400220er nennen 74 Inhibition der VLA 4 VCAM 1 Wechselwirkung durch fraktionierte und unfraktionierte Heparine und den Antik rper Natalizumab 76 Einfluss der Kettenl nge auf die VLA 4 VCAM 1 Wechselwirkung 77 Einfluss von N aceyliertem und RO Heparin auf die Adh sion von MV3 Melanomzellen Einfluss der Desulfatierung in Position 6 des Heparingrundgeriistes auf die Adh sion von MV3 Melanomzellen unter Flussbedingungen 78 Einfluss der Desulfatierung in Position 2 des Heparingrundgeriistes auf die Adh sion von MV3 Melanomzellen
3. B16F10 LPC 7 Tage Inkubation stim g a0 ra 4 B16F10 LPC 13 Tage Inkubation stim B16F10 unstimuliert 8 Zeit s Abbildung 4 21 Einfluss der Inkubationszeit auf das Adh sionsverhalten der B16F10 Zellen Nach 7 Tagen Inkubation mit 450 uM LPC wurde ein Maximum der Adh sionsinhibition erreicht Durch fortdauernde Inkubation wurde die Adh sion nicht weiter minimiert Schon nach 24st ndiger Inkubation war ein Abnahme der Adh sion zu verzeichnen die nach sieben Tagen ihr Maximum erreichte und sich auch durch Verl ngern des Inkubationszeitraumes auf 13 Tage nur geringf gig steigern lie Bei diesen Untersuchungen wurde das Kulturmedium alle 48 Std inklusive des LPC gewechselt Parallel durchgef hrte Untersuchungen mit LPC Konzentrationen von 300 uM f r verschiedene Inkubationszeit r ume zeigten keinen Einfluss auf die Adh sion der MV3 Zellen Um zu berpr fen ob es sich bei den beobachteten Effekten um reversible oder irreversible Prozesse handelt wurde den LPC inkubierten Zellen das Medium entzogen und durch LPC 91 4 Ergebnisse und Diskussion freies Medium ausgetauscht Im Anschluss wurden nach verschiedenen Zeitr umen des LPC Entzuges erneut Adh sionsuntersuchungen durchgef hrt s Abbildung 4 22 Vier Std nach Entzug zeigte sich ein Anstieg der Adh sion der mit der Dauer des Entzuges korrelierte Nach 18stiindigem Entzug waren keine Unterschiede mehr zwischen unbehandelten und vo
4. 0 24 48 72 Std Abbildung 4 17 Ver nderung der Membranzusammensetzung von B16F10 Melanomzellen Nach LPC Inkubation lie sich ein steigender Anteil an Margarins ure in der Zellmembran detektieren Die Menge anderer Fetts uren ging sukzessive zur ck Gleichzeitig kam es zur Reduktion der Anteile anderer Fetts uren in der Zellmembran So sank die Konzentration an Palmitins ure von 30 innerhalb von 48 Std auf 15 ab Auch verringerte sich die Konzentration anderer unges ttigter Fetts uren wie z B der ls ure Nach 48 Std LPC Inkubation war eine Abs ttigung der Zellmembran mit ca 55 Margarins ure zu detektieren 4 2 2 Untersuchung von apoptoserelevanten Proteinen nach LPC Inkubation Trotz dieser dramatischen nderung der Zellmembranzusammensetzung konnten keine Einfl sse auf die Viabilit t der B16F10 festgestellt werden Dies wurde durch mehrere Methoden bewiesen Dr Jantscheff konnte den Einbau von Bromdesoxyuridin BrdU in die DNA der B16F10 Zellen verdeutlichen was ein Kennzeichen proliferierender Zellen darstellt 4 Ergebnisse und Diskussion Parallel dazu wurde das Proteom von MV3 Melanomzellen nach apoptoserelevanten Proteinen oder deren Spaltprodukte nach achtt giger LPC Behandlung untersucht MV3 als Melanomzellen humanen Ursprungs zeigten ein hnliches Bild in der Aufnahme von LPC wie die murinen BI16F10 Melanomzellen Daher sind auch die LPC vermittelten Auswirkungen auf potentiell apoptotisc
5. 3 2 3 Zellzahlbestimmung Die Bestimmung der Zellzahl wurde mithilfe des CASY I Modell TT nach dem Coulter Counter Prinzip durchgef hrt Beim Coulter Counter Verfahren wird zwischen zwei Platinelektroden die in eine Kapillare eingearbeitet sind eine Spannung angelegt Da sich die Kapillare in einer Elekrolytl sung befindet Kommt es zu einem Konstanten Stromfluss mit definiertem Widerstand Bei einem Messvorgang werden Partikel oder Zellen mit hoher Geschwindigkeit zwischen den beiden Elektroden hindurchgesaugt Hierdurch kommt es zu einer Unterbrechung des Stromflusses und einem der Gr e der Zelle bzw Partikel proportionalen Anstieg des Widerstandes So sind einerseits Aussagen ber die Zellzahl und andererseits ber die Zellgr e m glich Praktisch wurden 20 uL der zu quantifizierenden Zellsuspension in 10 mL Casy ton Fl ssigkeit berf hrt Verd nnung 1 zu 500 In zwei Messzyklen mit je 400 uL Messvolumen wurden Zellgr enverteilung und Zellanzahl bestimmt 3 Material und Methoden 3 3 Zelllinien 3 3 1 MV3 Melanomzellen Die Melanomzelllinie MV3 wurde 1991 von van Muijen und Mitarbeitern aus einem 76 j hrigen Krebspatienten isoliert Die Zelllinie zeichnet sich durch eine Expression des Integrins VLA 4 aus Au erdem exprimiert sie zahlreiche Proteoglykane und EGF Rezeptoren Durch mehrfache Injektion in Nacktm use wurde das metastatische Potential gesteigert Kultiviert wurde die Zelllinie in RPMI 1
6. 65 66 67 68 69 70 Laubli H amp Borsig L Selectins promote tumor metastasis Semin Cancer Biol 2010 doi 10 1016 j semcancer 2010 04 005 Schindler U amp Baichwal V R Three NF kappa B binding sites in the human E selectin gene required for maximal tumor necrosis factor alpha induced expression Mol Cell Biol 14 5820 5831 1994 Morigi M et al Fluid shear stress modulates surface expression of adhesion molecules by endothelial cells Blood 85 1696 1703 1995 Sipkins D A et al In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment Nature 435 969 973 2005 Antoine M Tag C G Gressner A M Hellerbrand C amp Kiefer P Expression of E selectin ligand 1 CFR ESL 1 on hepatic stellate cells implications for leukocyte extravasation and liver metastasis Oncol Rep 21 357 362 2009 Antoine M et al Secreted cysteine rich FGF receptor derives from posttranslational processing by furin like prohormone convertases Biochem Biophys Res Commun 382 359 364 2009 Lenter M Levinovitz A Isenmann S amp Vestweber D Monospecific and common glycoprotein ligands for E and P selectin on myeloid cells J Cell Biol 125 471 481 1994 Levinovitz A M hlhoff J Isenmann S amp Vestweber D Identification of a glycoprotein ligand for E selectin on mouse myeloid cells J Cell Biol 121 449 459 1993 Steegmaier M Borges E Berger
7. 3 12 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchung der Interaktion von Thrombozyten mit Tumorzellen 3 12 1 Durchf hrung und Auswertung Zur Bestimmung der Interaktion von B16F10 bzw MV3 Melanomzellen mit Thrombozyten wurden 25 000 B16F10 respektive 50 000 MV3 Zellen in 1 mL Zellkulturmedium in 24 Well Platten ausges t Es folgte eine Inkubationszeit von 48 Std im Brutschrank in der die Zellen den Boden der 24 Well Platte konfluent bewachsen haben 63 3 Material und Methoden 64 Am Versuchstag wurden die Thrombozyten wie in Kapitel 3 4 beschrieben isoliert quantifiziert markiert und z T aktiviert Den Zellen wurde das Medium entzogen und sie wurden einmal mit 1 mL PBS gewaschen Danach wurden 200 000 Thrombozyten und die entsprechenden Inhibitoren in jeweils 1 mL PBS zu den Zellen hinzugegeben Eingesetzt wurden 2 5 ug P Selektin Antik rper anti human CD62P sowie die entsprechende Menge Kontrollantik rper Auch wurde der Einfluss einer LPC Inkubation der Tumorzellen sowie verschiedene Heparinmengen getestet Anschlie end wurden die Platten f r 15 min auf einen Sch ttler gestellt W hrend dieser Zeit fand eine Interaktion der adh renten Tumorzellen mit den Thrombozyten statt In einem letzen Schritt wurde zweimal mit 1 mL PBS gewaschen Mit dem Mikroskop Axiovert 200 LD Objektiv 10fache Vergr erung und der Kamera AxioCam MRc wurden unter Einsatz des FITC Filters Bilder von jedem Well aufgenommen mithilfe derer die Thr
8. Adh sion manuell durch Markieren erfasst werden s Abbildung 3 3 Hierbei wurde jeweils 55 56 3 Material und Methoden nach 25 Bildern bzw nach jeder Sekunde eine neue Z hlung vorgenommen Parallel zur Zellzahl wurde auch die Geschwindigkeit jeder markierten Zelle erfasst ebenso wie die Durchschnittsgeschwindigkeit Auch kann durch Festsetzen einer Geschwindigkeits untergrenze zwischen adh renten und sich fortbewegenden Zellen diskriminiert werden Durch das Parzellieren jeder Sequenz in f nf Teilsequenzen wird der Fehler der durch das Verlieren von einzelnen Zellen durch das Programm auftreten w rde minimiert Durch Bildung des Quotienten aus der Zellzahl vor Beginn des Durchflusses und jeweils im Sekundenabstand danach l sst sich eine Aussage ber die Zelladh sion treffen woman MUE TITRACK AVI 2 we Ds Exit Gperate Jode indo tidp gt 2 Pathe an und Teer EEE nn dr isdat 6 pic ma ie Pcnwerisoce SES wei GHETTO Urt Cordenc ME 3 Begining Fame nbFrereesin Avi fle Average Sosedwath Line nsec Speed Asray Fa fiso 11 364 Gem gt 8 Boor we Abbildung 3 3 Auswertung mittels Imagoquant MultiTrack A VI 2 N Pictures sec um pix Limit um sec Average Speed um sec Number of cells Anzahl der Bilder die in die Auswertung eingehen Aufnahmegeschwindigkeit der Videokamera Verh ltnis zwischen Pixeln und Distan
9. 92 98 2007 Taichman D B et al Tumor cell surface alpha 4 beta 1 integrin mediates adhesion to vascular endothelium demonstration of an interaction with the N terminal domains of INCAM 110 VCAM 1 Cell Regul 2 347 355 1991 Martin Padura I et al Heterogeneity in human melanoma cell adhesion to cytokine activated endothelial cells correlates with VLA 4 expression Cancer Res 51 2239 2241 1991 Mattila P Majuri M L amp Renkonen R VLA 4 integrin on sarcoma cell lines recognizes endothelial VCAM 1 Differential regulation of the VLA 4 avidity on various sarcoma cell lines Int J Cancer 52 918 923 1992 Klemke M Weschenfelder T Konstandin M H amp Samstag Y High affinity interaction of integrin alpha4betal VLA 4 and vascular cell adhesion molecule 1 VCAM 1 enhances migration of human melanoma cells across activated endothelial cell layers J Cell Physiol 212 368 374 2007 Garofalo A et al Involvement of the very late antigen 4 integrin on melanoma in interleukin 1 augmented experimental metastases Cancer Res 55 414 419 1995 6 Literaturverzeichnis 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 Higashiyama A Watanabe H Okumura K amp Yagita H Involvement of tumor necrosis factor alpha and very late activation antigen 4 vascular cell adhesion molecule 1 interaction in surgical stress enhanced experimental metastasis Cancer Im
10. Die Subkultivierung erfolgte analog Kapitel 3 3 1 3 3 6 HUVEC HUVEC Zellen Human Umbilical Vein Endothel Cells sind humane prim re Endothelzellen isoliert aus Nabelschn ren Nach Stimulation mit TNFo oder Interleukin 1 exprimieren sie vermehrt VCAM 1 und P Selektin Sie wurden k uflich von der Firma PromoCell GmbH erworben Kultiviert wurden sie in Endothelial Cell Growth Medium der Firma PromoCell dieses war mit IGF und VEGF versetzt Zur Abl sung der Zellen vom Boden der Kulturflaschen wurde das DetachKit ebenfalls von der PromoCell GmbH verwendet das neben Trypsin auch EDTA enthielt Durchgefiihrt wurde die Subkultivierung gem den Angaben des Herstellers 3 3 7 AsPC 1 Pankreasadenokarzinomzellen AsPC 1 Zellen sind Pankreasadenokarzinomzellen die aus einer 62 j hrigen Patientin isoliert werden konnten Nach drei Passagen in Nacktm usen wurden sie in Zellkulturflaschen berf hrt Sie exprimieren zahlreiche Mucine Sie wurde von Prof Dr Massing vom Institut f r Tumorbiologie der Universit t Freiburg zur Verf gung gestellt Kultiviert wurden 3 Material und Methoden sie in D MEM GlutaMAX Medium unter Zusatz von 10 V V FKS inaktiviert und 1 V V Penicillin Streptomycin L sung Die Subkultivierung erfolgte analog Kapitel 3 3 1 3 3 8 MIA PaCa 2 Pankreasadenokarzinomzellen Bei MIA PaCa 2 Zellen handelt es sich ebenfalls wie bei AsPC 1 Zellen um Pankreaskarzinomzellen Isoliert wu
11. J Schwarz H amp Vestweber D The E selectin ligand ESL 1 is located in the Golgi as well as on microvilli on the cell surface J Cell Sci 110 Pt 6 687 694 1997 Fuhlbrigge R C King S L Sackstein R amp Kupper T S CD43 is a ligand for E selectin on CLA human T cells Blood 107 1421 1426 2006 Kotovuori P et al The vascular E selectin binds to the leukocyte integrins CD11 CD18 Glycobiology 3 131 136 1993 Dimitroff C J Lee J Y Rafii S Fuhlbrigge R C amp Sackstein R CD44 is a major E selectin ligand on human hematopoietic progenitor cells J Cell Biol 153 1277 1286 2001 Brodt P et al Liver endothelial E selectin mediates carcinoma cell adhesion and promotes liver metastasis Int J Cancer 71 612 619 1997 137 6 Literaturverzeichnis 138 71 72 73 74 75 76 TR 78 79 80 81 82 83 Khatib A M et al Rapid induction of cytokine and E selectin expression in the liver in response to metastatic tumor cells Cancer Res 59 1356 1361 1999 Laferriere J Houle F amp Huot J Regulation of the metastatic process by E selectin and stress activated protein kinase 2 p38 Ann N Y Acad Sci 973 562 572 2002 Laferri re J Houle F amp Huot J Adhesion of HT 29 colon carcinoma cells to endothelial cells requires sequential events involving E selectin and integrin beta4 Clin Exp Metastasis 21 257 264 2004 Witz I
12. Proteingrundger st an das O glykosidisch Kohlenhydratketten gebunden sind die bis zu 75 des gesamten Molek ls ausmachen k nnen Das minimale Bindungsmotiv f r alle Selektine besteht aus der sialinisierten Blutgruppendeterminante sialyl Lewis sLe und ace ihrem Isomer sialyl Lewis sLe Durch Akkumulation vieler sLe Epitope auf einem Proteingrundger st wird eine Affinit tserh hung gegen ber den Selektinen erreicht Den am meisten erforschten Selektin Liganden stellt das P Selectin glycoprotein ligand 1 PSGL 1 dar Durch seine exponierte Lokalisation auf den Spitzen der Mikrovilli des Endothels kann PSGL 1 zum einen das Leukozytenrollen entlang des Endothels vermitteln andererseits die homotypischen Leukozyt Leukozyt Interaktionen beg nstigen da auch L Selektin PSGL 1 mit hoher Affinit t bindet F r die Bindung an P Selektin ist eine Sulfatierung an bestimmten Tyrosinresten des Proteingrundger sts essentiell Neben der reinen Bindungsfunktion ist auch die PSGL 1 vermittelte Signaltransduktion Gegenstand aktueller Untersuchungen Es konnte gezeigt werden dass ber den zytoplasmatischen Rest eine Aktivierung von Proteinkinasen Scr bei Bindung an P Selektin erfolgt und dies zur Aktivierung der MAP Kinase Kaskade f hren kann Neben PSGL 1 wurden bereits CD24 GPIba und die Gruppe der Sulfatide sulfatierte Galactocerebroside als P Selektin Liganden identifiziert Der Beitrag des thro
13. Y J Borsig L Varki N M amp Varki A P selectin deficiency attenuates tumor growth and metastasis Proc Natl Acad Sci U S A 95 9325 9330 1998 Ludwig R J et al Endothelial P selectin as a target of heparin action in experimental melanoma lung metastasis Cancer Res 64 2743 2750 2004 135 6 Literaturverzeichnis 136 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 Bruehl R E Springer T A amp Bainton D F Quantitation of L selectin distribution on human leukocyte microvilli by immunogold labeling and electron microscopy J Histochem Cytochem 44 835 844 1996 Hafezi Moghadam A Thomas K L Prorock A J Huo Y amp Ley K L selectin shedding regulates leukocyte recruitment J Exp Med 193 863 872 2001 Ley K Laudanna C Cybulsky M I amp Nourshargh S Getting to the site of inflammation the leukocyte adhesion cascade updated Nat Rev Immunol 7 678 689 2007 Brustein M Kraal G Mebius R E amp Watson S R Identification of a soluble form of a ligand for the lymphocyte homing receptor J Exp Med 176 1415 1419 1992 Mebius R E et al Expression of GlyCAM 1 an endothelial ligand for L selectin is affected by afferent lymphatic flow J Immunol 151 6769 6776 1993 Berg E L Mullowney A T Andrew D P Goldberg J E amp Butcher E C Complexity and differential expression of carbohydrate epitopes associated w
14. Zellen wurden zur Revitalisierung in einem 37 C warmen Wasserbad aufgetaut und unverz glich in ein Zentrifugenr hrchen mit 8mL 37 C warmem Zellkulturmedium 43 3 Material und Methoden 44 berf hrt Eine Sch digung der Zellen durch das im Gefriermedium enthaltene DMSO wurde so vermieden Nach Durchf hrung der Zentrifugation bei 1640 rpm und 4 C f r 4 min wurde das erhaltene Pellet in 1 mL Zellkulturmedium aufgenommen und in eine mit Medium be f llte Zellkulturflasche berf hrt Generell wurde ein Medienwechsel bei Farbumschlag des im Medium enthaltenen Farbstoffs Phenolrot durchgef hrt Bei ca 90 iger Konfluenz der Zellen wurden sie wie in Kapitel 3 3 1 beschrieben gesplittet 3 2 2 Kryokonservierung von Zellen Zur Konservierung der Zellen wurde folgenderma en vorgegangen Die konfluent gewachsenen Zellen wurden durch Behandlung mit Trypsin oder EDTA L sung f r 5 min bei 37 C vom Boden der Zellkulturflaschen abgel st mithilfe des CASY Coulter Counters gez hlt und durch Zentrifugation f r 4 min bei 1300 rpm zu einem Pellet verdichtet Danach wurden sie mit Einfriermedium das aus 90 FKS inaktiviert bei 56 C 30 min und 10 DMSO bestand auf eine Konzentration von 1x10 Zellen eingestellt und in Kryor hrchen berf hrt Die Kryor hrchen wurden in den Cryo 1 C Freezing Container berf hrt und bei 80 C f r mindestens 12 Stunde gelagert und anschlie end in fl ssigem Stickstoff deponiert
15. der gegen den Fc Teil des ersten Antik rpers bzw Liganden gerichtet ist Es schloss sich eine Inkubationszeit von 30 min auf 3 Material und Methoden Eis im Dunkeln an Nach Zugabe von 100 uL Waschpuffer wurde erneut in der Platten Zentrifuge zentrifugiert Anschlie end wurden zwei Waschschritte mit je 100 uL Waschpuffer vorgenommen bevor nach abschlie ender Resuspendierung die durchflusszytometrische Analyse durchgef hrt wurde F r die Arbeiten in 2 ml Reagiergef en wurde wie folgt verfahren Zu den 1 Mio Zellen pro Gef wurden 5 ug Prim rantik rper bzw Ligand zugegeben Nach 30 min tiger Inkubation auf Eis wurde zentrifugiert 2900 rpm 4 min 4 C der berstand verworfen und in 100 uL Waschpuffer resuspendiert Nach Zugabe des zweiten fluoreszenzgelabelten Antik rpers wurde erneut 30 min auf Eis und unter Lichtausschluss inkubiert Nach dem anschlie enden Zentrifugationsschritt folgte ein Waschschritt mit 2 mL Waschpuffer Das Pellet wurde abschlie end in 1 mL Waschpuffer aufgenommen und durchflusszytometrisch untersucht 3 6 3 Bestimmung der Interaktion von Tumorzellen mit Thrombozyten Zur Bestimmung der Interaktion von Thrombozyten mit Tumorzellen B16F10 AsPC 1 MIA PaCa 2 wurden jeweils 200 000 Tumorzellen Vorbereitung s Kapitel 3 6 1 in Reagiergef e berf hrt Dazu wurden je nach Ansatz verschiedene Inhibitoren hinzupipettiert Ein gegen P Selektin gerichteter Antik rper 2 5 ug anti human CD62P
16. mittel Einlass q eae Abbildung 3 2 Aufbau der Durchflussapparatur Aufgrund des hydrostatischen Drucks wird das Flie mittel aus dem Vorratsgef ber einen Dreiwegehahn und eine Blasenfalle in die Durchflusskammer wo Bindungsereignisse stattfinden transportiert Von dort gelangt es ber einen weiteren Dreiwegehahn in das Abfallbeh ltnis Links befindet sich eine schematische Darstellung der Durchflusskammer im Querschnitt modifiziert nach J Fritzsche 54 3 Material und Methoden 3 7 7 Durchf hrung von Zelladh sionsexperimenten und Testung potentieller Inhibitoren Zur Durchf hrung eines Experiments wurde ein beschichteter Glastr ger in die Durchflusskammer eingepasst und fixiert Die nun verschlossene Kammer wurde auf dem inversen Mikroskop Axiovert 200 installiert An der Seite des Mikroskops wurde eine Videokamera befestigt Das Flie mittelvorratsgef wurde mit PBS Puffer PBS bei Versuchen mit Selektinen der vorher auf 20 C temperiert wurde bef llt und in erh hter Lage positioniert Aufgrund des nun vorherrschenden hydrostatischen Drucks wurde in der Durchflusskammer eine Scherrate G von 200 s erreicht so wie sie auch in postkapillaren Venolen vorliegt Die Kammer wurde dabei mit einem Volumen von 40 uL Puffer pro Sekunde durchstr mt Bei Untersuchungen am Integrin VLA 4 wurden 1x10 Zellen in FKS freiem Medium mit MnCl c 1 mM und den evtl zu testenden Agenzien zu einem Gesamtvolumen von 1
17. modifizierte Tlepar ndenivaler une ee 17 4 1 2 5 Charakterisierung der Heparin Bindungsstelle am V LA cc ceeceseeeeees 79 4 1 3 Untersuchung der Relevanz der VLA 4 VCAM 1 Interaktion in einem Mausmodell mit modifizierten Heparinderivaten 81 II 4 2 Untersuchung des Einflusses von Lysophosphatidylcholin auf das IV Metastasierungsverhalten verschiedene Krebszelllinien 4 2 1 LPC Metabolismus von B16F10 Melanomzellen 4 2 2 Untersuchung von apoptoserelevanten Proteinen nach LPC Inkubation 4 2 3 Einfluss des LPC auf die Adh sions und Migrationseigenschaften der B16F10 Melanomzellen 4 2 3 1 Bestimmung der Expression von Adh sionsrezeptoren nach Inkubation mit verschiedenen LPC Konzentrationen 4 2 3 2 Beeinflussung des VLA 4 VCAM 1 Bindungsweges durch verschiedene LPC Konzentrationen 4 2 3 3 Beeinflussung des VLA 4 VCAM 1 Bindungsweges durch verschiedene LPC Inkubationszeitr ume 4 2 3 4 LPC vermittelte Beeinflussung der Interaktion von Thrombozyten mit B16F10 Melanomzellen 4 2 3 5 Einfluss des LPC auf die Zellgr e und den Zelldurchmesser 4 2 3 6 Einfluss des LPC auf die Migrationseigenschaften von B16F10 Melanomzellen95 4 2 4 Mikroskopische Untersuchungen verschiedener Membraneigenschaften nach LPC Inkubation 4 2 4 1 Bestimmung der Integrinverteilung auf B16F10 Melanomzellen nach LPC Inkubation 4 2 4 2 Rasterelektronenmikroskopische Betrachtung der Zellmorphologie nach EPCInkubalion na ca ee 4 2 4 3 Quantifizi
18. rker Abbildung 3 4 Schematischer Aufbau eines Rasterelektronenmikroskops 3 9 2 Vorbereitung der Zellen Die mit verschiedenen LPC Konzentrationen versetzten B16F10 oder MV3 jeweils 50 000 Melanomzellen wurden in 6 Well Platten auf 15 mm Deckgl sern ausges t Nach 24 Std wurde das Medium entfernt und es wurde einmal mit 3 mL PBS f r 5 min gewaschen Zur Fixierung erfolgte eine Zugabe von 1 mL PFA 4 pro Well f r 30 min bei RT Danach wurde dreimal f r jeweils 5 min mit 3 mL PBS pro Well gewaschen 3 Material und Methoden Anschlie end wurden die Deckgl ser in einer Metallhalterung fixiert und in einer Reihe aufsteigender Ethanolkonzentrationen getrocknet Folgende Ethanolkonzentrationen und Inkubationszeiten wurden verwandt e Jeweils 5 min mit 10 30 50 70 und 90 Ethanol e 2 mal f r 10 min in 100 Ethanol e 2 mal f r 10 min in 100 Ethanol der ber Molekularsieb entw ssert wurde 3 9 3 Kritisch Punkt Trocknung der Zellen und Sputtern der Probe Zur weiteren Entfernung von Wasser und Ethanol aus der Probe wurde eine Trocknung mit fl ssigem CO durchgef hrt Dazu wurden die Deckgl ser achtmal nacheinander mit fl ssigem CO bei ca 80 bar und 10 C versetzt Bei anschlie endem Erhitzen auf ber 40 C wurde der Kritische Punkt erreicht Nachfolgend wurden die Deckgl ser vorsichtig auf Aluminium Probenteller geklebt und am Rand mit Leitsilber bestrichen wodurch ein besserer Elektronenabfluss erm g
19. und Migrationseigenschaften der B16F10 Melanomzellen 4 2 3 1 Bestimmung der Expression von Adh sionsrezeptoren nach Inkubation mit verschiedenen LPC Konzentrationen Um zu berpr fen ob die LPC Behandlung der B16F10 Melanomzellen einen Einfluss auf die Genexpression von Adh sionsrezeptoren oder deren Liganden aus bt wurde die Expression des Integrins VLA 4 und die von P Selektin Liganden nach Inkubation der B16F10 Zellen mit 300 uM bzw 450 uM LPC f r 13 Tage bestimmt Durch den Einsatz eines prim ren Antik rpers gegen VLA 4 und eines sekund ren FITC gelabelten Antik rpers gegen den Fc Teil des prim ren Antik rpers wurde die Integrin Expression ermittelt Im Anschluss an diese Markierung wurde die Expression durchflusszytometrisch bestimmt Auch die Funktionalit t des VLA 4 wurde durch die Verwendung von l slichen VCAM I Fc Chimeren berpr ft die ebenfalls an VLA 4 binden Mit l slichen P Selektin Fc Chimeren 4 Ergebnisse und Diskussion wurde die P Selektin Ligand Expression bestimmt Sowohl VCAM I als auch P Selektin wurden mit FITC gelabelten sekund ren Antik rpern markiert Wie in Abbildung 4 19 zu erkennen bten sowohl die Inkubation mit 300 uM LPC als auch die Inkubation mit 450 uM keinen Einfluss auf die Expression des Integrins VLA 4 aus s Teilabbildungen A und D 300 uM LPC Kontrolle B Kontrolle C N Kontrolle i A V4 f 4 7 f u BI6F10 B16F10 LPC VCAM 1 fe VCAM 1 Events Ev
20. usen gezeigt werden Hier war eine Verminderung der Metastasierung zu beobachten Allerdings kann bei P Selektin defizienten M usen nicht zwischen thrombozyt rem und endothelialem P Selektin unterschieden werden Um den Beitrag von endothelial exprimiertem P Selektin zur Metastasierung zu untersuchen wurde C57BL 6J M usen das Knochenmark von P Selektin Knockout P M usen implantiert Diese Tiere sind Tr ger endothelialen aber nicht thrombozyt ren P Selektins In den anschlie end durchgef hrten Metastasierungsuntersuchungen stellte sich heraus dass die Zahl der Metastasen im Lungengewebe der Knochenmark transplantierten M use gegen ber den Wildtyp M usen verringert war allerdings nicht verglichen mit dem Ausma von P Selektin Knockout P M usen Die metastasierungssteigernde Rolle des endothelialen P Selektins konnte so herausgearbeitet werden 2 2 3 Rolle des L Selektin bei der h matogenen Metastasierung L Selektin CD62L LECAM 1 gp90MEL 14 wird permanent von vielen Leukozytenpopulationen exprimiert Es ist auf den Spitzen der Mikrovilli lokalisiert und dadurch trotz seiner nur zwei SCR Einheiten Liganden gut zug nglich W hrend der initialen Kontaktaufnahme zwischen Lymphozyten und Endothel der postkapillaren Venolen kommt es zu einer Aktivierung der Lymphozyten und einer nachgeschalteten proteolytischen Abspaltung des L Selektins shedding Daraus resultiert eine Rollbewegung des 2 Theoretischer Te
21. 20t giger Inkubation mit der gleichen Konzentration hatte sich diese noch weiter erh ht und die urspr ngliche Zelloberfl che war kaum noch zu erkennen Eine Inkubation mit 300 uM LPC sowohl f r drei als auch f r 20 Tage f hrte hingegen nur zu einer geringen Zunahme der Anzahl an Filopodien Diese Resultate korrelieren mit den Befunden zur Adh sion und Migration der B16F10 Zellen unter LPC Einfluss So konnten bei LPC Konzentrationen von 300 uM keine Einfl sse auf die Adh sion festgestellt werden Hingegen bei Konzentrationen 99 4 Ergebnisse und Diskussion von 450 uM konnten mit zunehmender Inkubationszeit Abnahmen der Adh sion beobachtet werden Die verst rkte Bildung von Filopodien ist m glicherweise urs chlich f r die Abnahme der Adh sion Entgegen der vorherrschenden Lehrmeinung nach der mit einer verst rkten Filopodienbildung auch eine verst rkte Adh sion und Migration einhergehen k nnte eine unphysiologisch hohe Zahl an Filopodien die Adh sion sterisch behindern und sogar inhibieren Diese Theorie wird auch durch rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen von B16F10 Zellen denen das LPC haltige Medium entzogen wurde untermauert So nahm die Zahl der Filopodien mit fortdauernder Zeit des LPC Entzuges ab und die Adh sion der B16F10 Melanomzellen an VCAM 1 wieder zu s Kapitel 4 2 3 3 In Abbildung 4 30 ist dies f r Entzugszeitr ume von 2 4 8 24 und 96 Std gezeigt Es wurde eine R ckbildung der Filopodien e
22. 4 2 7 Beeinflussung des VLA 4 VCAM 1 Bindungsweges von MV3 Melanomzellen durch LPC unter physiologischen Flussbedingungen Wie bereits dargelegt hat eine LPC Inkubation von 450 uM einen starken Einfluss auf die Adh sion der murinen Melanomzelllinie BI6F10 Um zu bestimmen ob die detektierten Effekte nur zelllinienspezifischer Natur waren oder sich dar ber hinaus auch auf Melanomzellen unterschiedlicher Spezies bertragen lassen wurden in einem n chsten Schritt VLA 4 positive MV3 Melanomzellen humanen Ursprungs untersucht Bei rasterelektronenmikroskopischen Untersuchungen konnte wie schon in Kapitel 4 2 4 2 dargestellt auch bei diesen Zellen nach LPC Inkubation mit 450 uM eine verst rkte Filopodien Bildung beobachtet werden Infolgedessen wurden MV3 Zellen mit 450 uM LPC f r verschiedene Zeitr ume inkubiert und anschlie end Adh sionsuntersuchungen unter physiologischen Flussbedingungen unterzogen Wie in Abbildung 4 39 ersichtlich ist hatte 110 4 Ergebnisse und Diskussion eine LPC Inkubation von 24 Std eine Reduktion der Adh sion an VCAM 1 zur Folge Mit fortdauernder Inkubationszeit konnte dieser Effekt noch auf das Niveau unstimulierter MV3 Zellen gesteigert werden 100 o 60 A MV3 stimuliert mit Mn as 4 MV3 LPC 24 Std Inkubation stim G 4 Fr v MV3 LPC 4 Tage Inkubation stim zz o MV3 unstimuliert 340 lt 20 0 0 1 2 3 4 Zeit s Abbildung 4 39 Einfluss der I
23. 4 markiert war Es waren keine Unterschiede der Integrin Verteilung bei den unbehandelten Zellen links und den LPC behandelten Zellen rechts zu detektieren Die Ma stabsbalken symbolisieren jeweils eine L nge von 20 um 4 2 4 2 Rasterelektronenmikroskopische Betrachtung der Zellmorphologie nach LPC Inkubation Nachdem keine Unterschiede der Integrinverteilung nach LPC Inkubation in der Zelloberfl che der BI6F10 Zellen mittels LSM detektiert werden konnten wurden die Zellen elektronenmikroskopisch betrachtet um eventuell vorhandene LPC vermittelte morphologische Unterschiede zu erfassen Nach der anf nglich detektierten Zunahme von Filopodien auf der Zelloberfl che von BIOFIO Zellen wurden verschiedene LPC Konzentrationen und Inkubationszeitr ume in die Untersuchungen mit einbezogen s Abbildung 4 29 4 Ergebnisse und Diskussion in LPC A A Abbildung 4 29 Rasterelektronenmikroskopische Untersuchung von B16F10 Melanomzellen Mit zunehmender LPC Inkubationsdauer und LPC Konzentrationen von 450 uM war eine starke Zunahme an Filopodien zu verzeichnen LPC Konzentrationen von 300 uM zeigten nur eine geringe Steigerung der Filopodienbildung Die Ma stabsbalken in der linken Spalte repr sentieren eine L nge von 20 um und in der rechten von 2 um Wie in Abbildung 4 29 zu erkennen ist kam es durch eine Inkubation mit 450 uM LPC f r drei Tage zu einer starken Zunahme der Anzahl an Filopodien auf der Zelloberfl che Nach
24. 4 mediated melanoma cell adhesion in the course of metastasis Minisymposium des GRK 677 in Bonn 2009 Poster Schlesinger M Fritzsche J Jantscheff P Kirfel G F rst D Massing U Bendas G Lysophosphatidylcholine inhibits VLA 4 mediated melanoma cell adhesion in the course of metastasis Symposium on Phospholipids in Pharmaceutical Research Heidelberg 2009 Poster Schlesinger M Naggi A Torri G Fritzsche J Simonis D Schmitz P Casu B Bendas G Heparin inhibits the VLA 4 mediated melanoma cell binding Evaluation of structural requirements 6th International Conference on Proteoglycan Aix les Bains Frankreich 2009 Poster Schlesinger M Naggi A Torri G Fritzsche J Simonis D Schmitz P Casu B Bendas G Heparin inhibits the VLA 4 mediated melanoma cell binding Evaluation of structural requirements Internationales Symposium des GRK 677 in Bonn 2009 Poster Schlesinger M Naggi A Torri G Zeisig R Fritzsche J Simonis D Alexander M Schmitz P Casu B Bendas G Heparin inhibits VLA 4 mediated melanoma cell binding Evaluation of structural requirements CESAR Jahrestagung Heidelberg 2009 Poster Schlesinger M Naggi A Torri G Zeisig R Fitchner I Fritzsche J Simonis D Schmitz P Casu B Bendas G VLA 4 as a target for heparin in inhibiting melanoma cell metastasis Evaluation of structural requirements of heparin 4 Mildred Scheel Cancer Conference in Bonn 2010 Poster 8 Publikationslist
25. 50 3 6 3 Bestimmung der Interaktion von Tumorzellen mit Thro m boZ yte eee 51 3 7 Mikroskopische Zelladh sionsbestimmungen unter physiologischen Fluss Bedingungen sn ea aaa ace aca aaah 51 32 2 Prinzip d r Meihade Wu nen een tee m ee Ore ce en ee 51 3 7 2 Vorbereitung der Proben unanennsnenesneunsesseunnesnennnunnennnunnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn 52 3 7 3 Reinigung der Glaspl ttchen nnnanenesnenseseunsesneunnenneunnennnunnennennnennnnnnennnnnnennnnnnennnenn 52 3 7 4 Beschichtung der Glasplattchen mit Rezeptorproteinen uan 52 3 7 5 Pr paration der Glaspl ttchen mit Endothelzellen 53 3 7 6 Aufbau der D rchilussapparatir Aus ur ann u en ee en a 54 3 7 7 Durchf hrung von Zelladh sionsexperimenten und Testung potentieller Inhibitoren 55 3 7 8 Auswertung mithilfe der Imagoquant MultiTrack AVI 2 Software 55 3 8 Konfokale Laserscanning Mikroskople cscssssssssssssssesssssssssssessessssesssesssesseesseesseesess 56 3 8 1 Prinzip der Methoden en PO en una a heine TREY area aaa 56 39 2V OLDE RC HUIS Cr Proben cie sata aan nia nt ae sata tele ae aaa 57 3 9 Rasterelektronenmikroskople cscsssssssssssessesessssessessessessessessessossaesatsosseceeeeseessesstsaeess 57 3 9 1 Prinzip der Methode ra Ar ar ann a a CNT UMP ETED ET Mets heteMere Fetter 57 ae CS dy COUT Toe 111 Se PnP uam del ran PP 58 3 9 3 Kritisch Punkt Trocknung der Zellen und Sputtern der Probe 59 3 10 SACED Mo
26. Adh sion detektiert werden s Abbildung 4 47 Die Rollgeschwindigkeiten der behandelten und unbehandelten Zellen auf P Selektin waren durch die LPC Inkubation nicht beeinflusst Diese nur schwach ausgepr gten Effekte deuten darauf hin dass entweder das r umlich ausgedehnte PSGL 1 durch zu erwartende LPC Membraneffekte Filopodien wenig beeinflusst wird weiterhin sind Selektin Ligand Bindungen nicht von komplexen Signalwegen wie im Falle der Integrine gesteuert Es l sst sich verallgemeinern dass die an Melanomzellen erhobenen Effekte des LPC offensichtlich auch bei Zellen anderer Tumorentit ten zum Tragen kommen Eine genaue Analyse bedarf der Kenntnisse der vorherrschenden Adh sionsmaschinerie der Zellen Weitere Untersuchungen hinsichtlich verschiedener LPC Konzentrationen und Inkubations zeiten sowie morphologische Untersuchungen sollten folgen Ebenso sollte die Relevanz der LPC Wirkung in in vivo Metastasierungsmodellen kritisch berpr ft werden 121 4 Ergebnisse und Diskussion 122 4 3 Untersuchung des Einflusses von Histon Deacetylase Inhibitoren auf die Adh sions wirkung verschiedener Krebszelllinien als potentiell antimetastatischer Therapie ansatz 4 3 1 Beeinflussung des VLA 4 VCAM 1 Bindungsweges von MV3 Zellen durch ver schiedene Inkubationszeiten und verschiedene Konzentrationen an TSA ST71 und HDACi x Das Integrin VLA 4 spielt wie in vorangegangenen Kapiteln umfassend erl utert eine Schl sselroll
27. Die Familie der Selektine l sst sich in drei Klassen einteilen E Selektin das auf den Endothelzellen der Blutgef e zu finden ist L Selektin das auf Leukozyten exprimiert wird und P Selektin das auf Blutpl ttchen und ebenso wie E Selektin auf dem Gef endothel lokalisiert ist Selektine sind in der Lage bestimmte Kohlenhydratmuster z B auf Zelloberfl chen zu erkennen und spezifisch zu binden Vermittelt wird diese Calciumionen abh ngige Bindung durch die N terminal angeordnete Lektin Dom ne die unter den drei Selektinen eine hohe Sequenzhomologie von 60 65 aufweist Auch im weiteren Aufbau sind sich alle Selektine sehr hnlich An die Lektindom ne schlie t sich eine wegen ihrer hnlichkeit nach dem epidermal growth factor EGF benannte Region an Sie bt einen allosterischen Effekt auf die Lektinbindungsdom ne aus Auch wird eine direkte Beteiligung an der Ligandbindung beschrieben An die EGF Dom ne gebunden sind die short consensus repeats SCRs die neben der Lokalisation eine weitere Unterscheidung der Selektine zulassen L Selektin weist zwei P Selektin neun und E Selektin sechs SCRs auf Sie verleihen der Lektin und der EGF Dom ne ihre exponierte Lage Zudem sind sie an der Rezeptorstabilisierung und an der Signaltransduktion beteiligt Auch wird eine Rolle bei der Liganderkennung und der Aktivit t 1718 Verankert in der Zellmembran sind die Selektine durch der Lektindom ne postuliert ei
28. Enoxaparininjektion bzw sogar darunter schlie t man die Maus mit 27 pulmonalen Metastasen aus der Betrachtung aus Natalizumab scheint effektiv die VLA 4 vermittelte Anhaftung der MV3 Zellen respektive der Mikrothromben am Gef endothel zu unterbinden Der Unterschied in der Zahl der Metastasen im Vergleich der sp ten Enoxaparin und Natalizumabinjektion liegt wahrscheinlich in der h heren Affinit t des Natalizumabs zu VLA 4 begr ndet Das kurzkettige Heparin vermittelte eine sehr heterogene Verteilung der Anzahl der Metastasen denn vier Tiere zeigten nur eine oder gar keine Metastasen wohingegen zwei Tiere ber 20 Metastasen aufwiesen Der Mittelwert lag bei 7 8 Metastasen pro Tier und damit knapp ber dem Niveau der fr hen Enoxaparin Injektion Dieses Derivat wirkte ausschlie lich ber die Blockade von thrombozyt rem P Selektin Zahl der pulmonalen Metastasen Abbildung 4 14 Anzahl der pulmonalen Metastasen nach Applikation von Enoxaparin Enoxa Natalizumab Nata und Heparinderivaten bestehend aus 12 Saccharideinheiten Eine Reduktion der Zahl der Metastasen ist durch fr he Heparinapplikation oder durch sp te Natalizumab Injektion zu erreichen Zusammenfassend l sst sich feststellen dass das Integrin VLA 4 einen entscheidenden Adh sionsrezeptor f r die h matogene Metastasierung der humanen Melanomzellinie MV3 darstellt F r die Inhibition durch Heparin konnten in vitro eindeutige Struktur Wirkungs Beziehungen e
29. Farbstoff Amido Schwarz versetzt und UV photometrisch vermessen Parallel wird eine BSA Kalibrierreihe vermessen die die Berechnung des Proteingehalts in der Probe erm glicht Die Proben wurden so verd nnt dass in den Ans tzen ungef hr 10 ug Protein enthalten waren Mit Aqua dem wurden sowohl die Proben 10 uL als auch die Verd nnungen der Kalibrierreihe auf 225 uL aufgef llt Nach Zugabe von 30 uL 1 M Tris HCl pH 7 5 mit 2 SDS und kurzem Durchmischen wurden die Ans tze mit 50 uL eisgek hlter TCA L sung 100 versetzt und kurz bei RT inkubiert Parallel wurde eine PVDF Membran zuerst kurz in Methanol und anschlie end f r 2 min in Aqua dem getaucht Ein gleich gro es Filterpapier wurde ebenfalls mit Aqua dem benetzt Die Membran wurde b ndig auf das Filterpapier gelegt und beide wurden in einen Vakuumblock eingebaut an den durch eine Vakuumpumpe Unterdruck angelegt wurde Alle Ans tze wurden in die Vertiefungen des Vakuumblocks pipettiert Das L sungsmittel passierte die Membran und das Filterpapier die Proteine hingegen wurden durch die Membran retiniert Zus tzlich wurden alle Probengef e mit 180 uL TCA 6 gesp lt und auch diese L sungen wurden in die entsprechenden Vertiefungen pipettiert Nach Zugabe von weiteren 180 uL TCA 6 wurde die Membran f r 20 min in eine Amido Schwarz L sung 61 3 Material und Methoden gelegt Danach wurde die Membran 1 min in Aqua dem gesp lt und dreimal in 25 mL Entf r
30. MV3 stimuliert mit Mn 4 MV3 mTOR PI3K Inhibitor 2 Std Inkubation stim v MV3 mTOR PI3K Inhibitor 16 Std Inkubation stim 40 MV3 mTOR PI3K Inhibitor 72 Std Inkubation stim O MV3 unstimuliert Adh sion Zeit s Abbildung 4 54 Einfluss der Inkubationszeit des kombinierten PI3K mTOR Inhibitors auf die Adh sion der MV3 Melanomzellen an VCAM 1 unter physiologischen Flussbedingungen Nach keiner der angegebenen Inkubationszeiten war eine Reduktion der Adh sion detektierbar Dies kann ebenfalls sowohl f r den mTOR als auch f r den HSP90 Inhibitor angenommen werden So hatten nur Pan HDACi einen Einfluss auf den VLA 4 VCAM 1 Bindungsweg Erste orientierende Untersuchungen zur Beeinflussung der VLA 4 Aktivit t auf intrazellul rer Signalebene mit HDACi ergaben somit erfolgversprechende Ans tze die auch auf eine alternative Melanomzelllinie bertragen werden konnten Zur Aufkl rung der in MV3 Melanomzellen aktivierten Signalwege k nnten in zuk nftigen Untersuchungen weitere 129 4 Ergebnisse und Diskussion niedermolekulare selektive Inhibitoren zum Einsatz kommen Best tigungen hierf r sowie als alternativer Ansatz kann in der siRNA Technologie mit der bestimmte Enzyme transient herabreguliert werden k nnen gefunden werden 130 5 Zusammenfassung 5 Zusammenfassung Zellul ren Adh sionsrezeptoren wird im Prozess der h matogenen Metastasierung eine entscheidende
31. P The involvement of selectins and their ligands in tumor progression Immunol Lett 104 89 93 2006 Gout S Tremblay P amp Huot J Selectins and selectin ligands in extravasation of cancer cells and organ selectivity of metastasis Clin Exp Metastasis 25 335 344 2008 Burdick M M McCaffery J M Kim Y S Bochner B S amp Konstantopoulos K Colon carcinoma cell glycolipids integrins and other glycoproteins mediate adhesion to HUVECs under flow Am J Physiol Cell Physiol 284 C977 987 2003 Fukuda M N et al A peptide mimic of E selectin ligand inhibits sialyl Lewis X dependent lung colonization of tumor cells Cancer Res 60 450 456 2000 Mannori G et al Inhibition of colon carcinoma cell lung colony formation by a soluble form of E selectin Am J Pathol 151 233 243 1997 Lauri D Needham L Martin Padura I amp Dejana E Tumor cell adhesion to endothelial cells endothelial leukocyte adhesion molecule 1 as an inducible adhesive receptor specific for colon carcinoma cells J Natl Cancer Inst 83 1321 1324 1991 Dimitroff C J Lechpammer M Long Woodward D amp Kutok J L Rolling of human bone metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E selectin Cancer Res 64 5261 5269 2004 Gout S Morin C Houle F amp Huot J Death receptor 3 a new E Selectin counter receptor that confers migration and survival advantages to colon
32. Prozess der Transkription einleiten Wird der Acetylrest von Lysinresten der Histonproteine allerdings durch Histon Deacetylasen HDAC abgespalten so wird der Lysinrest protoniert liegt positiv geladen vor und kann in Folge dessen mit der negativ geladenen DNA interagieren Dadurch hat die Chromatinstruktur eine hohe Packungsdichte und ist Enzymen wie der RNA Polymerase schwer zug nglich Nicht nur nukle re Proteine sind Substrate von HDAC und HAT sondern auch Nichthistonproteine Phylogenetisch betrachtet stellten Nichthistonproteine zuerst das Substrat von HDAC dar Mittlerweile wurden weit mehr als 50 verschiedene Proteine als HDAC Substrate identifiziert Die posttranslationale Acetylierung von zytosolisch lokalisierten Proteinen ist sehr wichtig f r deren Funktion So kann sowohl eine beracetylierung als auch eine verminderte Acetylierung einen Funktionsverlust des 2 Theoretischer Teil entsprechenden Proteins bedeuten Zytosolisch lokalisierte Substrate von HDAC k nnen beispielsweise Transkriptionsfaktoren DNA Reparatur Enzyme Chaperon oder Struktur proteine sein Bis dato sind bereits 18 verschiedene HDACs identifiziert die in vier Klassen unterteilt werden HDAC der Klasse I sind ausschlie lich im Kern lokalisiert HDAC der Klassen II und IV hingegen sind sowohl im Kern als auch im Zytosol zu finden Die Klasse III der HDAC die Sirtuine silent mating type information regulation two sind nukle r mi
33. R amp Lefer A M Lysophosphatidylcholine promotes P selectin expression in platelets and endothelial cells Possible involvement of protein kinase C activation and its inhibition by nitric oxide donors Circ Res 78 780 789 1996 6 Literaturverzeichnis 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 Huang Y H Sch fer Elinder L Wu R Claesson H E amp Frostegard J Lysophosphatidylcholine LPC induces proinflammatory cytokines by a platelet activating factor PAF receptor dependent mechanism Clin Exp Immunol 116 326 331 1999 Kabarowski J H Zhu K Le L Q Witte O N amp Xu Y Lysophosphatidylcholine as a ligand for the immunoregulatory receptor G2A Science 293 702 705 2001 Zhu K et al Sphingosylphosphorylcholine and lysophosphatidylcholine are ligands for the G protein coupled receptor GPR4 J Biol Chem 276 41325 41335 2001 Xu Y Sphingosylphosphorylcholine and lysophosphatidylcholine G protein coupled receptors and receptor mediated signal transduction Biochim Biophys Acta 1582 81 88 2002 Zohn I E et al G2A is an oncogenic G protein coupled receptor Oncogene 19 3866 3877 2000 Weng Z et al A DNA damage and stress inducible G protein coupled receptor blocks cells in G2 M Proc Natl Acad Sci U S A 95 12334 12339 1998 Lin P amp Ye R D The Lysophospholipid Receptor G2A Activates a Specific Combination of G Pro
34. Rolle zuteil So besteht vermittelt durch P Selektin die M glichkeit einer Ummantelung der Tumorzellen mit Thrombozyten die neben einem Schutz vor Zellen des Immunsystems eine Voraussetzung f r eine gr enabh ngige Restriktion der entstandenen Mikrothromben in den Kapillaren des Blutgef systems darstellt Auch bietet die Interaktion des Integrins VLA 4 auf Tumorzellen mit endothelialem VCAM 1 eine M glichkeit zur Adh sion von Tumorzellen an das Gef endothel mit anschlie ender Extravasation Adh sionsrezeptoren erweisen sich somit als aussichtsreiche Targets f r eine therapeutische Intervention des M etastasierungsprozesses Der Fokus dieser Arbeit liegt auf der VLA 4 VCAM I Wechselwirkung die exemplarisch an verschiedenen Melanomzellen untersucht wurde und den M glichkeiten zu deren Inhibition Durch Tierexperimente zur experimentellen Metastasierung konnte die pathophysiologisch bedeutende Rolle dieser Interaktion f r den Metastasierungsprozess von Melanomzellen verdeutlicht werden In dieser Arbeit wurden verschiedene Ans tze zur Inhibition verfolgt So wurde zun chst eine Blockade mit strukturell modifizierten nicht antikoagulativ wirkenden Heparinderivaten untersucht Dabei konnten klare Struktur Wirkungs Beziehungen ermittelt werden Neben der Molek lgr e spielt auch der Sulfatierungsgrad eine entscheidende Rolle zur optimalen Inhibition Damit sind nicht nur v llig neuartige Erkenntnisse zur Heparinwirkung entstanden so
35. XP260 die Auswertung der Lamellen und Ruffledynamik durchgef hrt werden Durch Kennzeichnung der Lamellen und Protrusionsbewegungen mit Linien erlaubt die Software einen R ckschluss auf Parameter wie Protrusions oder Retraktionsgeschwindigkeiten 60 3 Material und Methoden 3 10 4 Bestimmung der Zellgr e bzw Oberfl chenausdehnung als Parameter f r die Zelladh sion Neben der Aufzeichnung von Videos und Bildern kann mit der NIS Elements AR 2 30 Software auch die Oberfl chenausdehnung von Zellen in Aufsicht ermittelt werden Ist zus tzlich auch der Durchmesser der entsprechenden Zellen bekannt so lassen diese beiden Parameter indirekt einen Schluss auf die Zelladh sion zu Zellen die nicht an einer Oberfl che wie z B ECM adh rieren k nnen runden sich ab und haben in der Aufsicht eine kleinere Oberfl che als Zellen die stark mit dem Untergrund wechselwirken 3 11 Bestimmung Apoptose relevanter Proteine mittels Proteome Profiler Human Apoptosis Array Kit 3 11 1 Gesamtproteinbestimmung von Zelllysaten mittels Amido Black Protein Assay Bevor die Expression apoptoserelevanter Proteine untersucht werden konnte mussten die Proteinmengen in den zu untersuchenden Zelllysaten mithilfe des Amido Black Protein Assays bestimmt werden Der Amido Black Protein Assay erm glicht in Gegenwart von Detergenzien mit gro er Genauigkeit kleinste Mengen Protein zu quantifizieren Dazu wird die Probe mit dem
36. Zytoskeletts beteiligt Aktinfilamente verleihen einer Zelle nicht nur mechanische Stabilit t sondern bef higen sie auch durch Ausbildung von Protrusionen zur Migration Durch extrazellul re motogene Mediatoren wie z B Zytokine kommt es innerhalb der Zelle zur Polymerisation von monomerem G Aktin zu F Aktinfilamenten die ein schnell wachsendes Plus und ein langsam wachsendes Minus Ende aufweisen Das schnell wachsende Plus Ende ist in Richtung der Zellmembran orientiert und treibt diese durch Ausbildung von Protrusionen voran Dabei kann zwischen der Formation von Lamellipodien und Filopodien unterschieden werden Die Ausbildung von Lamellipodien kann durch das Dendritic Nucleation Model beschrieben werden Danach lagert sich der Arp2 3 Komplex Actin related Protein 2 3 an die Spitzen oder Seiten nahe der Spitzen bereits bestehender Aktinfilamente an und vermittelt dort eine Nucleation neuer Aktinmonomere in einem Winkel von 70 zum Ausgangsfilament Beendet wird die Anf gung neuer Aktinmonomere durch Capping Proteine die an die Spitze der entstandenen Filamente binden Eine ausreichende Menge an Aktinmonomeren zur Nucleation wird durch Abspaltung am hinteren Ende des Lamellipodiums durch Proteine der Cofili ADF Familie erreicht So entsteht ein f r Lamellipodien charakteristisches stabiles Netzwerk das in der Lage ist die Plasmamembran voranzuschieben Filopodien werden nach dem Convergent Elongati
37. acetyltransferase and class II histone deacetylases are required for repression Proc Natl Acad Sci U S A 104 4571 4576 2007 Chang S et al Histone deacetylases 5 and 9 govern responsiveness of the heart to a subset of stress signals and play redundant roles in heart development Mol Cell Biol 24 8467 8476 2004 Ha C H et al PKA phosphorylates histone deacetylase 5 and prevents its nuclear export leading to the inhibition of gene transcription and cardiomyocyte hypertrophy Proc Natl Acad Sci U S A 107 15467 15472 2010 Marks P A amp Xu W Histone deacetylase inhibitors Potential in cancer therapy J Cell Biochem 107 600 608 2009 Rivera Del Valle N et al PCI 24781 a Novel Hydroxamic Acid HDAC Inhibitor Exerts Cytotoxicity and Histone Alterations via Caspase 8 and FADD in Leukemia Cells Int J Cell Biol 2010 207420 2010 Gui C Ngo L Xu W S Richon V M amp Marks P A Histone deacetylase HDAC inhibitor activation of p21WAF1 involves changes in promoter associated proteins including HDACI Proc Natl Acad Sci U S A 101 1241 1246 2004 Qian D Z et al Class II histone deacetylases are associated with VHL independent regulation of hypoxia inducible factor alpha Cancer Res 66 8814 8821 2006 Kim S O et al Anti invasive activity of histone deacetylase inhibitors via the induction of Egr 1 and the modulation of tight junction related proteins in human hepatocarcinoma cells BMB
38. amp Krug H F On the mechanism of alkylphosphocholine APC induced apoptosis in tumour cells Biol Chem 386 237 245 2005 Aepfelbacher M ADP ribosylation of Rho enhances adhesion of U937 cells to fibronectin via the alpha 5 beta 1 integrin receptor FEBS Lett 363 78 80 1995 Hotchin N A amp Hall A Regulation of the actin cytoskeleton integrins and cell growth by the Rho family of small GTPases Cancer Surv 27 311 322 1996 Hotchin N A amp Hall A The assembly of integrin adhesion complexes requires both extracellular matrix and intracellular rho rac GTPases J Cell Biol 131 1857 1865 1995 Laudanna C Campbell J J amp Butcher E C Role of Rho in chemoattractant activated leukocyte adhesion through integrins Science 271 981 983 1996 Ramos C L et al Functional characterization of L selectin ligands on human neutrophils and leukemia cell lines evidence for mucinlike ligand activity distinct from P selectin glycoprotein ligand 1 Blood 91 1067 1075 1998 Chen L et al Chemical ablation of androgen receptor in prostate cancer cells by the histone deacetylase inhibitor LAQ824 Mol Cancer Ther 4 1311 1319 2005 Beckwith M Fenton R G Katona I M amp Longo D L Phosphatidylinositol 3 kinase activity is required for the anti ig mediated growth inhibition of a human B lymphoma cell line Blood 87 202 210 1996 Hosoi H et al Studies on the mechanism of resistance to rapamycin in human cancer
39. anderen Pan HDACi herbeif hren Eine selektive Inhibition von HDAC 6 hingegen hat keinen Einfluss auf die Adh sion 4 3 2 Einfluss von TSA ST71 und HDACi x auf die Expression des Integrins VLA 4 Um zu berpr fen ob die verminderte Adh sion durch die beiden Pan HDACi TSA und HDACi x auf einer erniedrigten Expression des VLA 4 der MV3 Zellen beruht wurde eine durchflusszytometrische Quantifizierung durchgef hrt Dazu wurden MV3 Zellen mit oben genannten Konzentrationen der jeweiligen HDACi versetzt und f r 72 Std inkubiert Da die Testung des HDACi x zu einem sp teren Zeitpunkt mit einer neuen Charge fluoreszenz markiertem Antik rper durchgef hrt wurde war ein direkter Vergleich mit der Untersuchung der Expression des VLA 4 unter TSA und ST71 Einfluss nicht zul ssig Daher sind in Abbildung 4 51 zwei Balkendiagramme aufgef hrt Wie erwartet hatte ST71 keinen Einfluss auf die Expression da es seine Wirkung vornehmlich im Zytosol aus ben sollte Eine TSA Inkubation hingegen verursachte eine signifikant verst rkte Expression von VLA 4 Dieses Resultat l sst sich mit einer TSA vermittelten vermehrten Acetylierung der Histone erkl ren Die Packungsdichte des Chromatin ist durch einen erh hten Acetylierungsgrad erniedrigt wodurch Polymerasen leichter binden und die Translation forcieren k nnen Allerdings sollte eine vermehrte VLA 4 Expression auch mit einer verst rkten Adh sion an VCAM 1 korrelieren Da dies nicht der Fall war m
40. cells Mol Pharmacol 54 815 824 1998 Jego G Hazoum A Seigneuric R amp Garrido C Targeting heat shock proteins in cancer Cancer Lett 2010 do1 10 1016 j canlet 2010 10 014 7 Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen 7 Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen Abbildung 2 1 Abbildung 2 2 Abbildung 2 3 Abbildung 2 4 Abbildung 3 1 Abbildung 3 2 Abbildung 3 3 Abbildung 3 4 Abbildung 3 5 Abbildung 3 6 Abbildung 4 1 Abbildung 4 2 Abbildung 4 3 Abbildung 4 4 Abbildung 4 5 Abbildung 4 6 Abbildung 4 7 Abbildung 4 8 Abbildung 4 9 Abbildung 4 10 Abbildung 4 11 Abbildung 4 12 Abbildung 4 13 Abbildung 4 14 Abbildung 4 15 Abbildung 4 16 Abbildung 4 17 Abbildung 4 18 Abbildung 4 19 berblick ber Assoziationsm glichkeiten von Integrinuntereinheiten 9 Affinit ts und Avidit tserh hung von Integrinen 0 0 0 ee eeeeeeeeeeeeeeeeee 11 Thrombozyt Tumorzell Interaktion 00 ce ceeceeeeeeseecseceseeeeeeeeseesnaeeneensees 15 Schematische Darstellung der LPC vermittelten Migration von Glioblastomzellen in die Blutbahn ne ce eeeesseceseceseeeeaeecsseceeesseeesneees 24 Kovalente Fixierung von Proteinen an Glasoberfl chen 53 Aufbau der Durchflussapparatur 0020000020000ssnnoesnneesnnnnsennnnnnnneen 54 Auswertung mittels Imagoquant MultiTrack AV TI 56 Schematischer Aufbau eines Rasterelektronenmikroskops
41. compared with adjusted dose intravenous unfractionated heparin in patients with proximal deep venous thrombosis Thromb Haemost 90 252 259 2003 Akl E A et al Extended perioperative thromboprophylaxis in patients with cancer A systematic review Thromb Haemost 100 1176 1180 2008 Akl E A et al Low molecular weight heparins are superior to vitamin K antagonists for the long term treatment of venous thromboembolism in patients with cancer a cochrane systematic review J Exp Clin Cancer Res 27 21 2008 AGOSTINO D amp CLIFFTON E E Decrease in pulmonary metastases potentiation of nitrogen mustard effect by heparin and fibrinolysin Ann Surg 157 400 408 1963 Halkin H Goldberg J Modan M amp Modan B Reduction of mortality in general medical in patients by low dose heparin prophylaxis Ann Intern Med 96 561 565 1982 Kingston R D Fielding J W amp Palmer M K Peri operative heparin a possible adjuvant to surgery in colo rectal cancer Int J Colorectal Dis 8 111 115 1993 Torngren S amp Rieger A The influence of heparin and curable resection on the survival of colorectal cancer Acta Chir Scand 149 427 429 1983 143 6 Literaturverzeichnis 144 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 Siragusa S Cosmi B Piovella F Hirsh J amp Ginsberg J S Low molecular weight heparins and unfractionated heparin in the treatmen
42. ein Isotyp Antik rper der kein Epitop auf den Zellen oder Pl ttchen erkennt 2 5 ug und unfraktioniertes Heparin 100 ug Anschlie end wurden die mit TRAP 14 aktivierten oder nicht aktivierten markierten Thrombozyten 20 Mio hinzugef gt s Kapitel 3 4 Im Anschluss wurde das Probenvolumen mit PBS auf 1000 uL aufgef llt Nachfolgend wurden die Ans tze f r 5 min auf einen Sch ttler gestellt damit die Tumorzellen mit den Thrombozyten in Wechselwirkung treten konnten Abschlie end wurden die Ans tze durchflusszytometrisch untersucht 3 7 Mikroskopische Zelladh sionsbestimmungen unter physiologischen Fluss bedingungen 3 7 1 Prinzip der Methode Unter Flussbedingungen wurde die Adh sion von Zellen an immobilisierten Rezeptorproteinen oder Endothelzellschichten untersucht Dadurch wird die physiologische Situation in einer postkapillaren Venole m glichst vergleichbar simuliert Die Proteine bzw Zellen werden dazu auf Glaspl ttchen immobilisiert die in eine Durchflusskammer eingebaut 3 Material und Methoden 52 werden Unter konstantem Pufferfluss kann die Zelladh sion in Kombination mit Inhibitoren oder Stimulanzien mikroskopisch untersucht werden Es wurden Videos des Geschehens in der Durchflusskammer aufgenommen und halbautomatisch ausgewertet Es lassen sich wichtige Charakteristika des Adh sionsgeschehens wie z B die Anzahl adh rierter Zellen oder Rollgeschwindigkeiten determinieren 3 7 2 Vorbereit
43. eine verst rkte Expression von HDAC 5 und 10 nachgewiesen werden Neben einer ver nderten Expression konnte auch eine ver nderte HDAC Lokalisation gezeigt werden beispielsweise zu Transkriptionsfaktoren f r Onkogene Der Einsatz von HDAC Inhibitoren HDACi ist daher ein vielversprechender Ansatz Derzeit befinden sich 15 Kandidaten in verschiedenen Phasen der klinischen Pr fung Sie alle inhibieren ein unterschiedliches Isoformen Muster an HDAC mit verschiedenen Affinit ten Das Hydroxams urederivat Vorinostat wurde als bisher einziges Molek l von der FDA in den USA zur Behandlung des kutanen T Zelllymphoms zugelassen Die vielf ltigen Mechanismen denen die antineoplastischen Wirkungen von HDACi zugrunde liegen sollen 27 2 Theoretischer Teil 28 hier nur ansatzweise erl utert werden Beispielsweise werden in Zellen der akuten Leuk mie Fas Todesrezeptoren verst rkt exprimiert was mit einer erh hten Apoptoserate einhergeht Auch werden Proteine die den Zellzyklus stoppen in ARP 1 Zellen vermehrt exprimiert so z B das zu einem Arrest der Krebszellen in der G1 Phase f hrende p21 Eine HDACi vermittelte Degradierung des Transkriptionsfaktors HIF la kann auch zu einer verminderten Angiogenese beitragen Neben den antiproliferativen HDACi vermittelten Effekten sind die antimetastatischen Effekte wenig erforscht Bereits gezeigt werden konnte durch Kim und Mitarbeiter dass es durch Trichostatin in der Leberkre
44. en 129 Tabelle 3 1 Ger te u neu 20a leere alla 31 Tabelle 3 2 Verwendete Chemikalien 4 aan 34 Tabelle 33 Antik rper essen esse 38 Tabelle 3 4 Verwendete Testsubstanzen rn ee actu cossatenecastacseepnizns 38 Tabelle 3 5 Sonstige verwendete Ar kel uud innte in Bess 39 Tabelle 3 6 Ans tze die mittles Genexpressionsanalyse untersucht wurden 65 Tabelle 4 1 Untersuchte potentiell apoptoserelevante Proteine 2uu0222002200s ner see ennennnnen en 88 159 8 Publikationsliste 8 Publikationsliste Wissenschaftliche Orginalarbeiten Schlesinger M Simonis D Schmitz P Fritzsche J Bendas G Binding between heparin and the integrin VLA 4 Thromb Haemost 2009 Nov 102 5 816 22 Simonis D Schlesinger M Seelandt C Borsig L Bendas G Analysis of SM4 sulfatide as a P selectin ligand using model membranes Biophys Chem 2010 Aug 150 1 3 98 104 Jantscheff P Schlesinger M Fritzsche J Taylor L Graeser R Kirfel G Fiirst D Massing U Bendas G Lysophosphatidylcholine pretreatment reduces VLA 4 and P selectin mediated B16 F10 melanoma cell adhesion in vitro and inhibits metastasis like lung invasion in vivo Mol Cancer Ther 2010 im Druck Schlesinger M Schmitz P Zeisig R Naggi A Torri G Casu B Bendas G Impact of the integrin VLA 4 in MV3 melanoma metastasis and its inhibition by different heparin derivatives Thromb Haemost 2011 eingereicht Abstracta Kongressbeitrage Schles
45. ssen den beobachteten Effekten andere bislang unbekannte Mechanismen zu Grunde liegen Diese k nnten sich auf Expressionsebene aber auch posttranslational im Zytosol abspielen Beispielsweise k nnte die Funktion von Signalmolek len durch ein ver ndertes Acetylierungsmuster eingeschr nkt sein wodurch nur noch eine verminderte VLA 4 Aktivierung m glich ist 125 4 Ergebnisse und Diskussion 126 Fluoreszenz a o Fluoreszenz o88888 88 8 amp amp Mya MV3x Mva MVA TSA Mva ST71 Abbildung 4 51 Durchflusszytometrische Bestimmung des Einflusses von TSA ST71 und HDACi x auf die Expression von VLA 4 Durch TSA und HDACi x Inkubation war eine verst rkte VLA 4 Expression zu detektieren ST71 hingegen hatte keinen Auswirkungen auf die Expression Auch f r die Inkubation mit HDACi x war eine signifikant verst rkte VLA 4 Expression zu detektieren Es kommen wahrscheinlich auch hier die oben beschriebenen gleichen Mechanismen zum Tragen Die erw hnten Erkl rungsans tze bed rfen weiterer Untersuchungen wie z B Gen expressionsanalysen um den HDACi vermittelten Einfluss auf die Translation zu spezifizieren Auch sind Analysen einzelner ausgesuchter Signalmolek le auf acetylierungsbedingte Ver nderungen der Proteinstruktur mittels SDS Page denkbar 4 3 3 Beeinflussung des VLA 4 VCAM 1 Bindungsweges von G361 Melanomzellen durch TSA und HDACi x Zur berpr fung der bertragbarkeit der in Kapitel 4 3 1 beschrie
46. ver ndert wurden Sie exprimieren Adh sionsrezeptoren wie VCAM 1 oder P Selektin nach Zytokin Stimulation Die Kultivierung erfolgte in D MEM high glucose unter Zusatz von 10 V V FKS inaktiviert 1 V V Penicillin Streptomycin L sung und 2 mM L Glutamin Die Subkultivierung geschah wie in Kapitel 3 3 1 beschrieben 45 3 Material und Methoden 46 3 3 4 U937 Die Zelllinie U937 leitet sich von einem Non Hodgkin Lymphom ab und wurde aus einem 37 j hrigen Patienten isoliert Sie exprimiert den P Selektin Liganden PSGL 1 konstitutiv Es handelt sich um eine Suspensionszelllinie die mit RPMI 1640 Medium mit 10 V V FKS inaktiviert und 1 V V Penicillin Streptomycin L sung kultiviert wurde Dazu wurde bei Gelbf rbung des Mediums die H lfte der Zellsuspension entfernt und durch frisches Medium ersetzt Einmal w chentlich wurde ein Teil der suspendierten Zellen in ein Zentrifugenr hrchen berf hrt und bei 1640 rpm bei 4 C f r 4 min zentrifugiert Das Pellet wurde resuspendiert und in 20 mL neues Kulturmedium berf hrt 3 3 5 G361 Melanomzellen Die Zelllinie G361 ist eine humane Melanomzelllinie und wurde von Dr Hinke Multhaupt vom Department of Biomedical Sciences der Universit t Kopenhagen zur Verf gung gestellt Neben den Integrinen u und of exprimiert diese Zelllinie zahlreiche 284 Proteoglykane Kultiviert wurden die Zellen in McCoy s 5A Medium angereichert mit 10 FKS
47. zu geringe Anzahl an PSGL 1 basierten Liganden f r das ausbleibende Zellrollen urs chlich sein 4 1 1 4 Bestimmung der VLA 4 VCAM 1 vermittelten Zelladh sion unter physio logischen Flussbedingungen und deren siRNA vermittelte Herabregulation Zur Bestimmung der VLA 4 VCAM I Interaktion unter physiologischen Flussbedingungen wurde rekombinantes VCAM 1 auf Glaspl ttchen immobilisiert Nach Zugabe der Zellen und kurzer Sedimentationsphase wurde die Adh sion nach Starten des Flusses gemessen Ziel war es die Adh sionsf higkeit von unstimulierten und mit Mn in ihrer Integrinfunktion stimulierten MV3 Zellen gegen berzustellen Durch den Einsatz von siRNA sollte weiterhin die Expression von VLA 4 unterdr ckt bzw vermindert werden Infolgedessen sollte gezeigt werden dass die Bindung der MV3 Melanomzellen VLA 4 vermittelt ist und nicht durch andere VCAM 1 erkennende Integrine wie z B a487 apB2 und amp resultiert In durchflusszytometrischen Voruntersuchungen wurden mittels FITC gelabelter siRNA die optimale Zellzahl die optimale Konzentration des Transfektionsreagenz und der siRNA ermittelt Sowohl mit siRNA die gegen die mRNA von VLA 4 gerichtet ist als auch mit Kontroll siRNA wurde die Abh ngigkeit der VLA 4 Expression von der Inkubationsdauer bestimmt Als optimal erwies sich eine Inkubationszeit von 72 Std exemplarisch ist das Ergebnis der VLA 4 Expression nach diesem Zeitpunkt in Abbildung 4 4 dargestellt Eine deutlich v
48. 0 0 0 eee eeeceeeeeseeceseeeeeeeeneees 79 Adh sionsuntersuchungen von MV3 Melanomzellen an Antik rpern gegen die a und B Untereinheit anti CD29 und Natalizumab unter physiologischen Flussbedingungen zur n heren Charakterisierung der Heparinbindunssstelle u an a eu 80 Median der Score Werte der Lungenmetastasen ccccceeseceeeseeeeteeeeneees 81 Anzahl der pulmonalen Metastasen nach Applikation von Enoxaparin Enoxa Natalizumab Nata und Heparinderivaten bestehend aus 12 Saccharideinheien a ne een ade 83 LPC Konsumierung von B16F10 Melanomzellen ser ers 85 LPC Metabolismus aus dem Kulturmedium essensenneennenn 85 Ver nderung der Membranzusammensetzung von BIL6FT0 Melanomzellen maisen ioeie e ea een Queeie 86 Vergleich der Expression von apoptoserelevanten Proteinen in LPC behandelten und unbehandelten MV3 Melanomzellen e 87 Expression von Adh sionsrezeptoren nach LPC Inkubation f r 13 Tage mit 300 uM A C und 450 uM LPC D F ou eee 89 157 7 Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen 158 Abbildung 4 20 Abbildung 4 21 Abbildung 4 22 Abbildung 4 23 Abbildung 4 24 Abbildung 4 25 Abbildung 4 26 Abbildung 4 27 Abbildung 4 28 Abbildung 4 29 Abbildung 4 30 Abbildung 4 31 Abbildung 4 32 Abbildung 4 33 Abbildung 4 34 Abbildung 4 35 Abbildung 4 36 Abbildung 4 37 Abbildung 4 38 Abbildung 4 39 Abbildung 4 40 Abbildung 4 41 A
49. 0 uM bis 375 uM LPC und stimuliert mit Mn zeigten ein Adh sionsverhalten wie unbehandelte stimulierte Zellen Teilweise war sogar eine leichte Steigerung der Adh sion zu erkennen Erst Konzentrationen von 425 uM LPC konnten die Adh sion der B16F10 Zellen vermindern Bei einer LPC Konzentration von 450 uM war die Adh sion auf das Ma unstimulierter Zellen reduziert Eine leichte Erh hung des LPC Spiegels ber die physiologische Konzentration hinaus bt also bereits einen starken Effekt auf die Funktionalit t des Integrins 90 4 Ergebnisse und Diskussion VLA 4 aus dies ist insbesondere hinsichtlich der unver nderten Expressionslevel bemerkenswert Eine LPC Konzentration von 425 uM scheint einen Schwellenwert f r diese weiter zu kl renden Effekte darzustellen 4 2 3 3 Beeinflussung des VLA 4 VCAM 1 Bindungsweges durch verschiedene LPC Inkubationszeitr ume Nach der Bestimmung der Konzentrationsabh ngigkeit der Inhibition des VLA 4 wurde der Einfluss der Inkubationszeit auf die VLA 4 vermittelte Adh sion untersucht B16F10 Melanomzellen die mit einer Konzentration von 450 uM f r verschiedene Inkubations zeitr ume versetzt wurden zeigten eine zunehmende Abnahme der Adh sionsf higkeit mit l ngerer Inkubationsdauer s Abbildung 4 21 100 m el I A BI6F10 stimuliert mit Mn Lo Z d gt A B16F10 LPC 24 Std Inkubation stim 5 vy B16F10 LPC 3 Tage Inkubation stim kkk
50. 00 uL versetzt und f r 5 min bei 37 C und leichtem Schwenken inkubiert Als Kontrollexperiment dienten 1x10 Zellen ohne MnCl Stimulation Zellen die auf ihre Selektin Bindungsf higkeit untersucht wurden erhielten keine MnC Behandlung Anschlie end wurden die 1x10 Zellen und die evtl zu testenden Agenzien in die Blasenfalle injiziert Nach kurzem ffnen der Dreiwegeh hne wurden die Zellen mit der entsprechenden Substanz in die Durchflusskammer gesp lt Dies wurde durch die Kamera optisch erfasst Durch Schlie en der Dreiwegeh hne konnten die Zellen f r f nf respektive zwei min in der Kammer sedimentieren und mit den immobilisierten Rezeptorproteinen oder Zellen interagieren Mit dem Beginn der Aufnahme einer Videosequenz von 15 s wurde der Fluss wieder gestartet und die Interaktion der Zellen mit den Rezeptorproteinen konnte optisch erfasst werden 3 7 8 Auswertung mithilfe der Imagoquant MultiTrack AVI 2 Software Die Videos wurden unter Einsatz eines long distance LD Objektives mit 10facher bzw 20facher Vergr erung mit dem Kameramodell CSC 795 aufgenommen Dabei betrug die Dauer eines Videos 15 s und es wurden 25 Bilder pro Sekunde aufgezeichnet Die Kamera wurde mit der Software Virtual Dub gesteuert Mit dieser Software wurden ebenfalls die zu analysierenden Sequenzen aus den Videos herausgeschnitten und gespeichert Mit der Imagoquant MultiTrack AVI 2 Software Konnte nun die Zellzahl als Parameter der
51. 03 Laserscanningmikroskopische Untersuchung von BI16F W Melanomzellen 22 222 a ee Bes 104 Strukturen von LPC oben und Hexadecylphosphocholin im Verpleiche nee ie 106 Einfluss von Hexadecylphosphocholin HePC auf die Zelladh sion von B16F10 Melanomzellen an VCAM 1 unter Flussbedingungen 107 Einfluss von Glycerophosphocholin auf die Zelladh sion von B16F10 Melanomzellen an VCAM 1 unter Flussbedingungen 108 Untersuchung der Wirkung von LPC Inkubation und unfraktioniertem Heparin auf die VLA 4 VCAM I Interaktion uu222esnseenneessnerseennnen 109 Untersuchung der Wirkung von LPC Inkubation und unfraktioniertem Heparin auf die VLA 4 VCAM I Interaktion 22202nseenneensner seen 110 Einfluss der Inkubationszeit auf das Adh sionsverhalten det MV3 Zelle naeh leeres tele 111 Einfluss des LPC Entzuges auf die Adh sion von MV3 Zellen 112 Heatmap Analyse der Genexpression von Rho A und B nach Inkubation der MV3 Melanomzellen mit LPC ossee 114 Heatmap Analyse der Genexpression der a4 ITGA4 und Untereinheiten ITGB1 des Integrins VLA 4 oo nennen 115 Quantifizierung der pulmonalen Metastasen der Versuchstiere 117 Quantifizierung der pulmonalen Metastasen der Versuchstiere 118 Interaktion von LPC behandelten und unbehandelten MIA PaCa 2 Pankreastumorzellen mit Thrombozyten cceeecccceeceeeeeeeeeseeeeeeteeeeeaes 119 Interaktion von LPC
52. 1 25 g Amido Schwarz 10B 0 25 m V 50 ml Eisessig 10 V V 25 ml Methanol 45 V V ad 500 ml Aqua dem 41 3 Material und Methoden Boratpuffer pH 8 8 Calcein AM L sung Ca Mg L sung 500 mM KCI L sung 3 M MgClo L sung 1 M MnCl L sung 100 mM MnCl L sung 2 mM NaCl Lo sung 1 54 M 10x Konzentrat NaCl L sung 154 mM isotonische L sung NaOH IM PBS 20x Konzentrat PBS gebrauchsfertige L sung PBS gebrauchsfertige L sung Pl ttchenpuffer 10x Konzentrat 42 618 mg Bors ure ad 100 0 ml Aqua dem pH Einstellung auf 8 8 mit 1 M NaOH 50 ug Calcein AM ad 100 uL DMSO 7 35 g CaCl 2H gt 0 10 16 g MsCh 6 H0O ad 100 0 ml Aqua dem 22 37 g KCl ad 100 ml Aqua dem 20 33 g MgClo 6H20 ad 100 ml Aqua dem 1 62 g MnCl 2H O ad 100 0 ml Aqua dem 1 0 ml MnClz L sung 100 mM ad 50 0 ml Aqua dem 90 0 g NaCl ad 1000 0 ml Aqua dem 100 0 ml NaCl L sung 10x Konzentrat ad 1000 0 ml Aqua dem 4 0 g NaOH ad 100 0 ml Aqua dem 2 0 g KCI 80 0 g NaCl 2 0 g KH gt PO 11 5 g N HPO ad 500 0 ml Aqua dem 25 0 ml PBS 20x Konzentrat ad 500 0 ml Aqua dem ggf pH Einstellung auf 7 4 1 0 ml Ca Mg L sung 500 mM 25 0 ml PBS 20x Konzentrat ad 500 0 ml Aqua dem gef pH Einstellung auf 7 4 42 4 g NaCl 11 9 g HEPES 0 35 g Na2HPO 8 3 ml 3 M KClI L sung 3 Material und Methoden Plattchenpuffer gebrauchsfertige L sung TC
53. 279 BP lt 0 001 AK 4 000 000 4 3 000 000 4 pe a 3 2 000 000 4 u A 1 000 000 e 4 is a 0 T T T n 14 n 10 n 14 100 127 9 51 7 unbehandelt 300 uM 450 uM Er ERD g ta Abbildung 4 43 Quantifizierung der pulmonalen Metastasen der Versuchstiere Im oberen Teil ist die Luciferase Aktivit t der Lungen Homogenate der Versuchstiere zu erkennen dargestellt als Dotplot Eine stark verminderte Luciferase Aktivit t war f r die Gruppe zu erkennen der 450 uM LPC behandelte Zellen injiziert worden waren Diese Ergebnisse wurden optisch anhand der pr parierten Lungen best tigt unterer Teil der Abbildung n Zahl der Tiere pro Gruppe Durch die Behandlung der B16F10 Zellen mit 300 uM LPC f r zwei Tage kam es nicht zu einer Verringerung der Zahl pulmonaler Metastasen Im Vergleich zur Kontrollgruppe konnte sogar eine Zunahme der Luciferase Aktivit t um 28 detektiert werden Diese Unterschiede waren allerdings nicht signifikant Durch die Langzeitbehandlung der B16F10 Zellen mit 450 uM LPC f r zehn Tage war hingegen eine Abnahme um 50 der Zahl der Metastasen im Vergleich zur Kontrollgruppe zu verzeichnen Eindrucksvoll ist dieses Resultat in Abbildung 4 43 anhand der drei exemplarisch aufgef hrten Lungensektionen zu erkennen Eine stark verminderte Zahl an Metastasen weisen die Lungen der Tiere auf die mit 450 uM LPC inkubierte Zellen erhalten hatten Diesen visuellen Eindruck be
54. 4 9 Einfluss von N aceyliertem und RO Heparin auf die Adh sion von MV3 Melanomzellen RO Heparin konnte die Adh sion minimieren was N acetylierte Derivate nicht vermochten F r die Untersuchungen wurden jeweils 500 ug der jeweiligen Derivate verwendet Neben den hier beschriebenen Variationen am Heparingrundger st wurden auch desulfatierte Derivate untersucht Dabei kamen Verbindungen zum Einsatz die in Position Ce des Saccharidgrundger stes zu verschiedenen Graden desulfatiert waren s Abbildung 4 10 Eine 50 ige Desulfatierung zeigte die gleiche inhibitorische Kapazit t wie unfraktioniertes Heparin A MV3 stimuliert mit Mn 60 MV3 stim 6 O des H 85 5 pb MV3 stim 6 O des H 70 8 lt MV3 stim 6 O des H 56 5 40 MV3 stim 6 O des H 50 lt o MV3 unstimuliert 20 Zeit s Abbildung 4 10 Einfluss der Desulfatierung in Position 6 des Heparingrundger stes auf die Adh sion von MV3 Melanomzellen unter Flussbedingungen Mit steigender Desulfatierung in Position 6 nahm die inhibitorische Kapazit t ab Eingesetzt wurden jeweils 500 ug des entsprechenden Heparins Hingegen nahm mit steigendem Grad der Desulfatierung die Inhibitionsf higkeit ab Molek le die zu 56 desulfatiert waren reduzierten die Adh sion auf das Niveau unstimulierter Zellen wohingegen 85 desulfatiertes Heparin keinen inhibitorischen Effekt mehr aus bte Somit ist ein bestimmt
55. 4 Aktivierung kommen Um einen ersten Anhaltspunkt f r die zugrundeliegenden Mechanismen zu bekommen wurde ein selektiver HDAC 6 Inhibitor synthetisiert im Arbeitskreis von Prof Jung aus Freiburg untersucht HDAC 6 findet sich ausschlie lich im Zytosol und ist an der Deacetylierung des Chaperon Proteins HSP90 beteiligt HSP90 wiederum ist u a an der Formgebung der Proteinkinase B beteiligt einem Enzym das die Aktivierung von Integrinen vermitteln kann So k nnten genomische von zytosolischen HDAC vermittelten Wirkungen getrennt betrachtet werden Eine Inkubation der MV3 Zellen nach durchgef hrtem Zytotoxizit tstest mit 10 M ST71 f r 72 Std und anschlie enden Adh sionsuntersuchungen zeigten allerdings keinen signifikant hemmenden Effekt s Abbildung 4 49 Somit scheint eine TSA vermittelte HDAC 6 Inhibition als m gliche Ursache f r die beobachtete Reduktion der Adh sion auszuscheiden 123 4 Ergebnisse und Diskussion 100 80 A NE a un 4 M383 stimuliert mit Mn l MV3 ST71 72 Std Inkubation stim O MV3 unstimuliert 40 Adh sion 20 Zeit s Abbildung 4 49 Einfluss des HDAC 6 selektiven Inhibitors ST71 auf das Adh sionsverhalten der MV3 Zellen an VCAM 1 Eine geringe nicht signifikante Reduktion der Adh sion war erkennbar Zur Verifizierung der mit TSA beobachteten Effekte wurde ein sich in der klinischen Erprobung befindlicher Pan HDACi im Folgend
56. 640 Medium das mit 10 V V nicht desaktiviertem FKS versetzt war Nach Farb nderung des mit Phenolrot versetzten Mediums bzw bei 80 90 iger Konfluenz der Zellen in den Zellkulturflaschen wurde das Medium von den Zellen entfernt Anschlie end wurden die Zellen mit 2 mL 0 2 iger EDTA L sung versetzt Es folgte eine Inkubationszeit von 4 min bei 37 C und 5 CO Gehalt der Umgebungsluft Durch Klopfen an den Rand der Zellkulturflasche und Sp len mit Medium wurden die Zellen vom Boden der Zellkulturflasche gel st und in ein Zentrifugenr hrchen berf hrt Nach Zentrifugation f r 4 min bei 1640 rpm und 4 C wurde das entstandene Pellet in 1 mL Medium resuspendiert wovon je nach Bedarf bestimmte Volumina in neue Zellkulturflaschen berf hrt wurden 3 3 2 B16F10 Melanomzellen Die murine Melanomzelllinie B16 wurde durch wiederholte intraven se Applikation und Isolation in Nacktm usen zur Filialgeneration B16F10 herangezogen Wie bei den humanen MV3 Melanomzellen konnte das Metastasierungspotential dadurch erh ht werden Als Kulturmedium fand D MEM high glucose Medium unter Zusatz von 10 V V FKS inaktiviert 1 V V Penicillin Streptomycin L sung und 2 mM L Glutamin Verwendung Gehandhabt wurden die Zellen wie in Kapitel 3 3 1 beschrieben 3 3 3 bEnd3 Endothelzellen Die bEnd3 Zellen sind prim re Hirnendothelzellen der Maus die durch Infektion mit einem onkogentragenden Retrovirus zu h mangiom hnlichen Zellen
57. 9 1988 Boukerche H et al Platelet melanoma cell interaction is mediated by the glycoprotein IIb IHa complex Blood 74 658 663 1989 6 Literaturverzeichnis 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 Nierodzik M L Klepfish A amp Karpatkin S Role of platelets thrombin integrin IIb Illa fibronectin and von Willebrand factor on tumor adhesion in vitro and metastasis in vivo Thromb Haemost 74 282 290 1995 Rimpler Horst Biogene Arzneistoffe Deutscher Apotheker Verlag Stuttgart 1999 Akl E A et al Anticoagulation for the initial treatment of venous thromboembolism in patients with cancer a systematic review Cancer 113 1685 1694 2008 B ller H R et al Fondaparinux or enoxaparin for the initial treatment of symptomatic deep venous thrombosis a randomized trial Ann Intern Med 140 867 873 2004 van Dongen C J J van den Belt A G M Prins M H amp Lensing A W A Fixed dose subcutaneous low molecular weight heparins versus adjusted dose unfractionated heparin for venous thromboembolism Cochrane Database Syst Rev CDO01100 2004 do1 10 1002 14651858 CD001100 pub2 van Doormaal F F et al Treatment of venous thromboembolism in patients with cancer subgroup analysis of the Matisse clinical trials Thromb Haemost 101 762 769 2009 Riess H et al Fixed dose body weight independent subcutaneous low molecular weight heparin Certoparin
58. A MV3 stimuliert mit Mn E 60 A MVS stimuliert mit Mn 5 yg Nata 5 MV3 stimuliert mit Mn 500 pg Tinzaparin g wer lt MV3 stimuliert mit Mn 500 ug Enoxaparin 5 40 o MV3 unstimuliert a MV3 stimuliert mit Mn 500 pg UFH v Rig a Pi a re kkk kkk Zeit s Abbildung 4 7 Inhibition der VLA 4 VCAM 1 Wechselwirkung durch fraktionierte und unfraktionierte Heparine und den Antik rper Natalizumab Unfraktioniertes Heparin hat vergleichsweise eine h here inhibitorische Potenz als fraktioniertes Heparin Die Signifikanzangaben beziehen sich auf den Vergleich mit stimulierten MV3 Melanomzellen 4 1 2 3 Beeinflussung des VLA 4 VCAM 1 Bindungsweges durch Heparinderivate definierter Gr e Die Befunde dass unfraktioniertes Heparin eine st rkere Inhibition des VLA 4 VCAM 1 Bindungsweges als fraktioniertes Heparin verursachte deuten einen Einfluss der Heparingr e auf diese Aktivit t an Deshalb wurden nun Heparinderivate mit definierten Kettenl ngen verwendet Diese sowie auch die anderen hier verwendeten nicht antikoagulativ wirksamen Derivate des Heparins wurden von Frau Dr Naggi aus dem Institut G Ronzoni in Mailand zur Verf gung gestellt Die Derivate mit verschiedenen Kettenl ngen wurden aus Tinzaparin isoliert Wie in Abbildung 4 8 zu erkennen hatten Derivate mit Kettenl ngen von 8 bis 12 Saccharideinheiten kein inhibitorisches Potential auf die VLA 4 v
59. A L sung 100 TCA L sung 6 TRAP 14 L sung 2 5 mM Tris SDS L sung pH 7 5 bei RT Waschpuffer 3 1 7 Statistik 10 0 ml 1 M MsCl L sung ad 500 0 ml Aqua dem 50 0 ml Pl ttchenpuffer 10x Konzentrat 0 9 g D Glucose Monohydrat 1 5 g BSA ad 500 0 ml Aqua dem 100 g Trichloressigs ure TCA 100 m V ad 100 ml Aqua dem 6 ml TCA L sung 100 V V ad 100 ml Aqua dem 5 0 mg TRAP 14 ad 1500 uL Pl ttchenpuffer 12 1 g Tris 1 00 mol l 2 0 g Natriumdodecylsulfat SDS 2 0 m V ad 100 ml Aqua dem 0 25 g BSA ad 50 ml PBS Die in dieser Arbeit angegebenen Werte repr sentieren Mittelwerte aus mindestens drei identischen Experimenten Standartabweichung wenn nicht anders angegeben Mithilfe des ungepaarten Student schen t Tests wurden signifikante Unterschiede ermittelt Die Signifikanzniveaus sind den jeweiligen Darstellungen zu entnehmen dabei gilt p lt 0 05 p lt 0 01 p lt 0 001 3 2 Zellkultur 3 2 1 Revitalisierung und Inkulturnahme der Zellen Um Kontaminationen der Zellen mit Bakterien oder Pilzen zu vermeiden wurden alle Arbeiten unter aseptischen Bedingungen unter einer Laminar Air Flow Werkbank durchgef hrt Alle verwendeten Gegenst nde wurden vor Gebrauch autoklaviert oder mit einem Desinfektionsmittel abgespr ht Die Kultivierung geschah in einem Inkubator bei 37 C und 5 CO Luftgehalt Die in einem Kryogef in fl ssigem Stickstoff gehaltenen
60. B16F10 Ruffle B16F10 LPC Ruffle Abbildung 4 26 Einfluss der LPC Inkubation auf die Lamellen und Ruffle Dynamik Durch LPC Inkubation war eine signifikant verminderte Ruffle Geschwindigkeit zu detektieren Durch die LPC Inkubation kam es zu einer Verlangsamung der Lamellenprotrusion und Retraktion sowie zu einer signifikant verminderten Ruffle Geschwindigkeit s Abbildung 4 26 Bei Betrachtung der Bewegungsfrequenz von LPC behandelten und unbehandelten Zellen zeigte sich eine signifikant verminderte Lamellenprotrusion und Retraktion wobei die Ruffle Dynamik unbeeinflusst blieb s Abbildung 4 27 2 5 2 0 S 1 5 N c S 51 1 0 da i 0 5 0 0 c E Ss S GNG e oi Ge S A 23 2 5 E f amp De I ne ws byt g 505 sE SoS sg S96 sg SPS 725 FES oa Di oc nic oc mc Abbildung 4 27 Einfluss der LPC Inkubation auf die Lamellen und Ruffle Frequenz LPC vermittelt kam es zu einer Abnahme der Lamellenfrequenz 4 Ergebnisse und Diskussion Eine Erkl rung f r die beobachteten Effekte der verminderten Bewegungsfrequenz als auch der verringerten Bewegungsgeschwindigkeit k nnte in der Anreicherung von ges ttigten Phospholipiden in den Zellmembranen der LPC behandelten Zellen begr ndet liegen Durch den starken Einbau der an das LPC gebundenen Fetts ure Kommt es zu einer Steigerung der Rigidit t der Zellemembran dies u ert sich in einer verminderten Beweglichkeit der Zelle 4 2 4 Mikroskopische Untersuchungen v
61. Cell Biol 18 516 523 2006 139 6 Literaturverzeichnis 140 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 Desgrosellier J S amp Cheresh D A Integrins in cancer biological implications and therapeutic opportunities Nat Rev Cancer 10 9 22 2010 Hieken T J Ronan S G Farolan M Shilkaitis A L amp Das Gupta T K Molecular prognostic markers in intermediate thickness cutaneous malignant melanoma Cancer 85 375 382 1999 Nip J Shibata H Loskutoff D J Cheresh D A amp Brodt P Human melanoma cells derived from lymphatic metastases use integrin alpha v beta 3 to adhere to lymph node vitronectin J Clin Invest 90 1406 1413 1992 Gutheil J C et al Targeted antiangiogenic therapy for cancer using Vitaxin a humanized monoclonal antibody to the integrin alphavbeta3 Clin Cancer Res 6 3056 3061 2000 McNeel D G et al Phase I trial of a monoclonal antibody specific for alphavbeta3 integrin MEDI 522 in patients with advanced malignancies including an assessment of effect on tumor perfusion Clin Cancer Res 11 7851 7860 2005 Tamaskar I et al Antitumor effects of sunitinib or sorafenib in patients with metastatic renal cell carcinoma who received prior antiangiogenic therapy J Urol 179 81 86 discussion 86 2008 Kuwada S K Drug evaluation Volociximab an angiogenesis inhibiting chimeric monoclonal antibody Curr Opin Mol Ther 9
62. D44 CD43 Integrine und L Selektin 8 In einigen in vivo Untersuchungen konnte der Beitrag des E Selektins zur h matogenen Metastasierung gezeigt werden Dabei interagieren die Tumorzellen E Selektin vermittelt mit dem Endothel und k nnen nach erfolgter Adh sion ins Gewebe transmigrieren und eine Metastase etablieren Auch zeigte sich dass die Expression von E Selektin Liganden auf Tumorzellen mit der Adh sion der Zellen an aktiviertem Endothel korreliert Durch Inhibition des E Selektins entweder durch Zugabe von l slichem E Selektin oder von Ligandmimetika lie sich die Metastasierung signifikant reduzieren Als Anfang der 90er Jahre die Involvierung von Selektinen im Prozess der h matogenen Metastasierung entdeckt wurde nahm man zun chst an dass nur Kolonkarzinomzellen E Selektin vermittelt metastasieren Sp ter wurde jedoch auch die E Selektin Bindung f r andere Tumorentit ten nachgewiesen Neben mucinartigen Liganden wurde 2006 auch der death receptor 3 als E Selektin Ligand identifiziert Die E Selektin vermittelte Adh sion induziert in den Kolonkarzinomzellen allerdings keine Apoptose sondern aktiviert die mitogen activated protein kinase MAPK dies tr gt zu einer verst rkten Migration der Zellen bei Auch andere Arbeitsgruppen konnten Ver nderungen in der Genexpression von Tumorzellen nach E Selektin Bindung 2 Theoretischer Teil 283 Dass E Selektin keinen
63. DISKUSSION ooo ccccssssssssssssssssssssesssesssesssesssessseessessseessessseessessseessess 69 4 1 Bestimmung der Interaktion zwischen Heparinderivaten und VLA 4 nn 69 4 1 1 Charakterisierung der Melanomzelllinie MV3 hinsichtlich metastasierungsrelevanter Adh sionsrezeptoren und deren Liganden 69 4 1 1 1 Durchflusszytometrische Bestimmung des Integrins VLA 4 und der P und L Selektin Liganden auf MV3 Melanomzellen nnnnn 69 4 1 1 2 Bestimmung der Interaktion von Thrombozyten mit MV3 Melanomzellen 70 4 1 1 3 Untersuchung der Zelladh sion an P Selektin unter physiologischen Fluss BEBNEUNGEN vl a ae hin 71 4 1 1 4 Bestimmung der VLA 4 VCAM 1 vermittelten Zelladh sion unter physio logischen Flussbedingungen und deren siRNA vermittelte Herabregulation 72 4 1 2 Die Inhibitionswirkung von strukturell modifizierten Heparinderivaten auf die VLA 4 vermittelte Zelladh sion von MV3 Zellen unter physiologischen Fl ssbeding ngen s een on aar ea eaaa 14 4 1 2 1 Charakterisierung des Adh sionsverhaltens von MV3 Melanomzellen an HUVEC unter physiologischen Flussbedingungen unmmemeeennneeene 74 4 1 2 2 Beeinflussung des VLA 4 VCAM 1 Bindungsweges durch unfraktioniertes und fraktioniertes Heparin und Antik rper nennen 15 4 1 2 3 Beeinflussung des VLA 4 VCAM 1 Bindungsweges durch Heparinderivate GEIIDIEHEE OTOBE se u ses ass en een u 76 4 1 2 4 Beeinflussung des VLA 4 VCAM 1 Bindungsweges durch strukturell
64. EDTA L sung 0 25 T4049 Trypsin EDTA L sung 1x T3924 VCAM I Fc Chim re rekombinant murin VCAM I Fc Chim re rekombinant human Wasserstoffperoxid 30 x treme GENE Transfection Reagent Zitronens ure wasserfrei Hersteller Sigma Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen Deutschland Fluka Neu Ulm Deutschland Sigma Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen Deutschland DpharmaconRNAi ThermoScientific Bonn Deutschland R amp D Systems GmbH Wiesbaden Nordenstadt Deutschland Bachem Distribution Services GmbH Weil am Rhein Deutschland Sigma Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen Deutschland Sigma Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen Deutschland R amp D Systems GmbH Wiesbaden Nordenstadt Deutschland R amp D Systems GmbH Wiesbaden Nordenstadt Deutschland Fluka Neu Ulm Deutschland Roche Grenzach Wyhlen Deutschland AppliChem GmbH Darmstadt Deutschland 37 3 Material und Methoden 3 1 3 Antik rper Tabelle 3 3 Antik rper Antik rper anti Human IgG FITC Konjugiert anti Maus CD49d Integrin a4 Kette anti Human CD62P P Selektin anti Human CD29 Integrin B1 Kette anti Maus IgG FITC konjugiert Maus IgGy Isotypkontrolle Natalizumab anti Human CD49d Integrin a4 Kette 3 1 4 Testsubstanzen Tabelle 3 4 Verwendete Testsubstanzen Testsubstanz Enoxaparin Natrium Clexane 20 mg 0 2 ml Glycerophosphocholin Heparin Natrium 5000 ratiopharm 5000 1 E 0 2 ml Hexadecy
65. Eli M Emerging roles of PAR 1 and PAFR in melanoma metastasis Cancer Microenviron 1 103 111 2008 Kahn M L Nakanishi Matsui M Shapiro M J Ishihara H amp Coughlin S R Protease activated receptors 1 and 4 mediate activation of human platelets by thrombin J Clin Invest 103 879 887 1999 Dennis J W amp Laferte S Tumor cell surface carbohydrate and the metastatic phenotype Cancer Metastasis Rev 5 185 204 1987 Stone J P amp Wagner D D P selectin mediates adhesion of platelets to neuroblastoma and small cell lung cancer J Clin Invest 92 804 813 1993 Borsig L et al Heparin and cancer revisited mechanistic connections involving platelets P selectin carcinoma mucins and tumor metastasis Proc Natl Acad Sci U S A 98 3352 3357 2001 Dardik R Savion N Kaufmann Y amp Varon D Thrombin promotes platelet mediated melanoma cell adhesion to endothelial cells under flow conditions role of platelet glycoproteins P selectin and GPIIb IIIA Br J Cancer 77 2069 2075 1998 Yu Y et al Platelets promote the adhesion of human hepatoma cells with a highly metastatic potential to extracellular matrix protein involvement of platelet P selectin and GP IIb Illa J Cancer Res Clin Oncol 128 283 287 2002 Karpatkin S Pearlstein E Ambrogio C amp Coller B S Role of adhesive proteins in platelet tumor interaction in vitro and metastasis formation in vivo J Clin Invest 81 1012 101
66. II und richten 102 103 und as Volociximab Volociximab wird auch 104 105 sich gegen die Integrine a B3 Vitaxin eine antiangiogenetische Wirkung zugeschrieben Neben den signaltransduktorischen Eigenschaften k nnen auf Tumorzellen exprimierte Integrine auch die feste Adh sion der Tumorzellen an vaskul res Endothel vermitteln und damit eine Metastasierung beg nstigen Hier soll besonders das Integrin o48 VLA 4 im Fokus stehen dessen Expression auf Osteosarkom Rhabdomyosarkom und Melanomzellen 106 108 nachgewiesen wurde Durch die Interaktion von VLA 4 mit dem endothelst ndigen VCAM I wird neben der Adh sion auch die Transmigration verst rkt was durch in vitro Versuche nachgewiesen werden konnte Auch in vivo konnte schon zu Beginn der 90er Jahre die prometastatische Rolle der VLA 4 VCAM I Interaktion gezeigt werden Durch IL 1 oder TNF a Behandlung wurde eine verst rkte VCAM I Expression in murinen Blutgef en der Lunge erreicht was mit einer verst rkten Metastasierung einherging Auch klinische Untersuchungen verschiedener an Hautkrebs erkrankter Patientenpopulation en zeigten eine Korrelation zwischen VLA 4 bzw Integrin Expression der Tumorzellen und der Metastasierungsrate in den Lymphknoten u Weitere Arbeitsgruppen berichteten hingegen dass eine verst rkte VLA 4 Expression in Tumorzellen mit einer verminderten Metastasierungsrate einhergeht Begr ndet wird dies durch homotypische Wech
67. M et al High levels of cathepsin B predict poor outcome in patients with breast cancer Int J Biol Markers 13 139 144 1998 Niedergethmann M et al Prognostic impact of cysteine proteases cathepsin B and cathepsin L in pancreatic adenocarcinoma Pancreas 29 204 211 2004 Duffy M J Proteases as prognostic markers in cancer Clin Cancer Res 2 613 618 1996 Lauffenburger D A amp Horwitz A F Cell migration a physically integrated molecular process Cell 84 359 369 1996 Jay P Y Pham P A Wong S A amp Elson E L A mechanical function of myosin II in cell motility J Cell Sci 108 Pt 1 387 393 1995 Palecek S P Huttenlocher A Horwitz A F amp Lauffenburger D A Physical and biochemical regulation of integrin release during rear detachment of migrating cells J Cell Sci 111 Pt 7 929 940 1998 Gallatin W M Weissman I L amp Butcher E C A cell surface molecule involved in organ specific homing of lymphocytes 1983 J Immunol 177 5 9 2006 Johnston G I Cook R G amp McEver R P Cloning of GMP 140 a granule membrane protein of platelets and endothelium sequence similarity to proteins involved in cell adhesion and inflammation Cell 56 1033 1044 1989 Crockett Torabi E Selectins and mechanisms of signal transduction J Leukoc Biol 63 1 14 1998 Kansas G S Selectins and their ligands current concepts and controversies Blood 88 3259 3287 1996 133 6 Li
68. M I Wechselwirkung wurden auch andere strukturell modifizierte Heparinderivate untersucht Dabei stellte sich heraus dass unfraktioniertes Heparin das an der Aminogruppe des Glucosamins acetyliert ist Kein inhibitorisches Potential entfaltet Dies zeigte sich sowohl f r 50 acetylierte als auch f r 100 acetylierte Derivate s Abbildung 4 9 Diese Befunde stehen in einem interessanten Gegensatz zu bisherigen Erkenntnissen an Selektinen da das zu 50 acetylierte Derivat eine h here inhibitorische Kapazit t an P Selektin als natives Heparin zeigte Das zu 100 acetylierte Heparin hingegen verliert seine Wirkung sowohl an P als auch an L Selektin Auch wurde ein RO Heparin Derivat reduced oxyheparin das zwischen der C C3 Kohlenstoffbindung im Saccharidgrundger st oxidativ gespalten ist getestet Durch diese offenkettige Form ist die Saccharidkette flexibler was sich bei der Inhibition von P Selektin in einem gesteigerten inhibitorischen Potential niederschl gt Die VLA 4 VCAM I Wechselwirkung wurde zwar auch inhibiert f hrte allerdings nicht zu demselben Ausma des unfraktionierten Heparins 71 4 Ergebnisse und Diskussion EN rag Berne yy A MV3 stimuliert mit Mn co 60 m MV3 stimuliert mit Mn NA H 100 u v MV3 stimuliert mit Mn NA H 50 g 4 MV3 stimuliert mit Mn RO H 3 40 c MV3 unstimuli lt unstimuliert Zeit s Abbildung
69. Melanomzellmigration durch LPC Neben dem Einsatz einer unphysiologisch geringen Konzentration an LPC wird von einer Aktivierung des Proteins G43 ausgegangen Dies muss kritisch in Betracht gezogen werden da die Funktionsweise von LPC Rezeptoren momentan noch v llig unklar ist Als bewiesen angenommen werden kann hingegen dass aus LPC entstandene LPA f r die 247 Migration und Invasivit t von Tumorzellen verantwortlich ist Dies konnte f r mehrere Tumorzellentit ten gezeigt werden Dabei kommt dem Autotaxin eine entscheidende Rolle als 3247 Der Mechanismus der Autotaxin vermittelten LPA produzierendes Enzym zu Metastasierung ist in Abbildung 2 4 zum besseren Verst ndnis schematisch f r Glioblastomzellen dargestellt Durch Gef rupturen gelangt LPC aus dem Blut in die extrazellul re Matrix und wird dort von Autotaxin zu LPA katalysiert Diesem LPA Gradienten folgen die Glioblastomzellen LPA Rezeptor vermittelt und erreichen so den Blutfluss 23 2 Theoretischer Teil 24 Blutgef Endoth zellen Glioblastom 4 zellen Abbildung 2 4 Schematische Darstellung der LPC vermittelten Migration von Glioblastom zellen in die Blutbahn entnommen aus Kishi et al Zirkulieren die Tumorzellen im Blut k nnen sie ber Adh sionsrezeptoren wie ICAM 1 oder VCAM 1 die durch LPC verst rkt auf dem Gef endothel exprimiert werden binden Auch kann eine Ummantelung der Tumorzellen mit Thrombozyte
70. R Rezeptoragonisten zur verst rken P Selektin Exprimierung stimuliert Nach Zugabe von Heparin in verschiedenen Mengen P Selektin Antik rper bzw Isotyp Antik rper ohne spezifisches Target auf den Zellen wurde die Zahl der Thrombozyten in repr sentativen Bildausschnitten nach kurzem Sch tteln und Abwaschen der nicht adh renten Thrombozyten bestimmt Dabei zeigte sich eine Adh sion die durch Zugabe von PAR Rezeptoragonisten gesteigert und durch Antik rper gegen P Selektin verringert werden konnte Der Isotyp Antik rper hatte keinen Effekt Unfraktioniertes Heparin konnte die Interaktion bereits bei der kleinsten Menge 50 ug signifikant verringern s Abbildung 4 2 4 Ergebnisse und Diskussion T aT aT anti P Sel Ak al iso Ak aT 50 pg UFH aT 250 ug UFH aT 500 pg UFH a 50 100 150 200 250 300 350 400 Thrombozyten pro Bildausschnift Abbildung 4 2 Interaktion von MV3 Melanomzellen mit Thrombozyten PAR Rezeptoragonisten verst rken die Bindung durch Aktivierung der Thrombozyten aT wohingegen P Selektin Antik rper anti P Sel Ak die Bindung verringern ebenso wie bestimmte Mengen an unfraktioniertem Heparin UFH Ein Isotyp Antik rper Iso Ak hat keinen Einfluss auf die Bindung 4 1 1 3 Untersuchung der Zelladh sion an P Selektin unter physiologischen Fluss bedingungen Die Interaktion der MV3 Zellen mit immobilisiertem P Selektin wurde unter physiologischen Flussbedingunge
71. Rep 42 655 660 2009 Zhang X et al HDAC6 modulates cell motility by altering the acetylation level of cortactin Mol Cell 27 197 213 2007 153 6 Literaturverzeichnis 154 273 274 275 276 271 278 279 280 281 282 283 284 285 Inoue K et al Histone deacetylase inhibitor reduces monocyte adhesion to endothelium through the suppression of vascular cell adhesion molecule 1 expression Arterioscler Thromb Vasc Biol 26 2652 2659 2006 Hellebrekers D M E I et al Epigenetic regulation of tumor endothelial cell anergy silencing of intercellular adhesion molecule 1 by histone modifications Cancer Res 66 10770 10777 2006 Kuzelov K et al Suberoylanilide hydroxamic acid SAHA at subtoxic concentrations increases the adhesivity of human leukemic cells to fibronectin J Cell Biochem 109 184 195 2010 Mahlknecht U amp Sch nbein C Histone deacetylase inhibitor treatment downregulates VLA 4 adhesion in hematopoietic stem cells and acute myeloid leukemia blast cells Haematologica 93 443 446 2008 Juengel E et al Effects of combined valproic acid and the epidermal growth factor vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor AEE788 on renal cell carcinoma cell lines in vitro BJU Int 105 549 557 2010 Juengel E et al Alterations of the gene expression profile in renal cell carcinoma after treatment with the histone deacetylase inh
72. Rolle des Integrins VLA 4 bei der h matogenen Metastasierung nn 9 2 2 6 Rolle der Thrombozyten bei der h matogenen Metastasierung nn 12 2 3 Antimetastatische Wirkung von Heparin ccssssssssessssessssesssessssesssessssessseesssessseessess 15 2 3 1 Klinische Erkenntnisse 1 n 2 Jana ee nee e iii 15 2 3 2 Molekulare Mechanismen a ae 16 2 4 Lysophosphatidylcholin 2 een 18 2 4 1 Vorkommen und physiologische Funktionen von Lysophosphatidylcholin 18 2 4 2 Lysophosphatidylcholinrezeptoren und deren Funktionen 20 2 4 3 Lysophosphatidylcholin und Krebs unanssesnsssesesneennenneunnennnunnennnunnennnunnennnunnennnenne 21 2 4 4 Lysophosphatidylcholin und Metastasierung nennen 23 2 5 Das Aktinzytoskelett und seine Bedeutung bei der Metastasierung nn 25 2 6 Histon Deacetylase Inhibitoren unennnneeennennsennnennnennnennnennnennnennnennnennnennne 26 2 6 1 Funktionsweise von Histon Deacetylasen nn 26 2 6 2 Histon Deacetylase Inhibitoren und Krebs bzw Metastasierung eenean 27 2 7 Ziel ERSTEN Rae at da nn nd a an Eh en ER an EA sn ae 29 3 MATERIAL UND IVER BHO DEIN eisen 31 3 1 Verwendete Materialien nee 31 3E Ger te are een a 31 2 eZ Chemikalien ee ee ee ee ea 34 ASS DES ee EL EN A I ee ees ate een atc eee och tee atch eee nee 38 Dill ATS SUSU SAIL een 38 EASO I E A a A a a a a a a a ch 39 3 1 6 Puffer und Losungen estate Al 3 1 7 Statistik 43 3 2 Zellkultur 43 3 2 1 Revitalisierung und In
73. ST71 und HDACi x auf die Expression des Integrins VER ana a 4 3 3 Beeinflussung des VLA 4 VCAM 1 Bindungsweges von G361 Melanomzellen durch TSA und HDACi Xx unnenenssmennmeensssennnneenn 4 3 4 Inhibition von krebsrelevanten Schl sselenzymen zur Beeinflussung des VLA 4 VCAM 1 Bindungsweges 5 ZUSAMMENFASSUNG 7 VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN UND TABELLEN 8 BUBEIK HG J ba em ee a ee ee ee 122 125 126 127 131 133 157 161 165 167 Abkiirzungsverzeichnis ADP Aqua dem ATP bEnd3 bFGF bzw ca Calcein AM CD cDNA CO2 D MEM DMSO ECM EDTA EGF FACS FITC FKS ggf HRP HUVEC IGF IU Adenosindiphosphat Aqua demineralisata Adenosintriphosphat brain endothelioma cells basic fibroblast growth factor beziehungsweise circa Calcein Acetoxymethylester cluster of differentiation complementary deoxyribonucleic acid Kohlenstoffdioxid Dulbecco s modified eagle s medium Dimethylsulfoxid extracellular matrix Ethylenediaminetetraacetic acid epidermal growth factor fluorescence activated cell sorting Fluorescein Isothiocyanat fetales K lberserum gegebenenfalls Horseradish peroxidase human umbilical vein endothelial cell Insulin like growth factor international unit VII kD Kp LPC LPA min Mio mL NADPH ng PBS PFA pN PVDF rpm RPMI s Std TCA TNF a TRAP 14 V VEGF vWF Vill Intraven s Kilodalton Gleichgewichtsdissoziationskonstante Lysophosph
74. Sch rfe System GmbH Reutlingen Deutschland NUAIRE Fernwald Deutschland Nalge Nunc International Hereford Gro britannien Nikon D sseldorf Deutschland BD Biosciences Heidelberg Deutschland ThermoQuest Analytische Systeme GmbH Egelsbach Deutschland ThermoScientific Braunschweig Deutschland 31 3 Material und Methoden Ger t Ilumina HumanHT 12 Expression BeadChip Illumina iScan Illumina TotalPep 96 RNA Amplification Kits Kamera COOL 13001 LSM 710 Magnetriihrer MR 3001 Minishaker MS1 Multiscan Ex NanoDrop ND 1000 UV Vis Photometer Nunc Kammer pH Meter 720 Rasterelektronenmikroskop XL 30 S FEG RNA 6000 Nano Chip RNeasy MicroElute spin column Schiittler KS 15 B Sputter Coater 208 HR 32 i Hersteller Applied Biosystems Darmstadt Deutschland Applied Biosystems Darmstadt Deutschland Applied Biosystems Darmstadt Deutschland VDS Vossk hler GmbH Osnabr ck Deutschland Carl Zeiss AG Oberkochen Deutschland Heidolph Elektro GmbH amp Co KG Kelheim Deutschland IKA Works da Brasil Ltda Taquara Brasilien Thermo Electron Corporation Langenselbold Deutschland Thermo Scientific Wimington USA Nunc GmbH amp Co KG Langenselbold Deutschland Beckman Instruments Inc Palo Alto CA USA Phillips Hamburg Deutschland Agilent Technologies Palo Alto CA USA Qiagen Hilden Deutschland Johanna Otto GmbH Hechingen Deutschland Cress
75. Selektin auch als CD62E oder ELAM 1 bezeichnet wird nach Kontakt des Gef endothels mit Entz ndungsmediatoren wie TNFa oder IL 1 per Genexpression nach zwei bis sechs Stunden auf der Zelloberfl che pr sentiert Hierbei wird die Expression ber den Transkriptionsfaktor NFKB gesteuert Auch kann ein verlangsamter Blutfluss zur E Selektin Expression fiihren In Venolen des Hautgewebes als auch in spezialisierten Gebieten des Knochenmarks ist eine konstitutive E Selektin Expression zu verzeichnen Der prominenteste und best charakterisierte E Selektin Ligand ist ESL 1 E selectin ligand 1 Dieser ist ein 150 kD schweres Glykoprotein das N glykosidisch an Kohlenhydrat ketten gebunden ist Damit er als E Selektin Ligand an der Zelloberfl che von Myeloiden dienen kann ist eine Fucosylierung durch die Enzyme a 1 3 fucosyltransferases IV oder VII FucT4 and FucT7 von N ten Andernfalls ist er im Golgi Apparat lokalisiert In der Vergangenheit Konnte von Antoine et al gezeigt werden dass auch eine endoproteolytische Prozessierung durch die furin like proprotein convertase im Golgi Komplex unabdingbar f r eine Sekretion an die Zelloberfl che ist Zu P und L Selektin weist ESL 1 keine Affinit t auf Auf der Zelloberfl che ist er in Randbereichen von Mikrovilli zu finden wodurch er f r E Selektin erschwert zug nglich istf Weitere E Selektin Liganden sind P Selectin glycoprotein ligand 1 PSGL 1 C
76. Vorstellung neuartiger therapeutischer Strategien zur Hemmung des metastasierungsrelevanten Integrins VLA 4 an M elanomzellen Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Naturwissenschaften Dr rer nat an der Mathematisch Naturwissenschaftlichen Fakultat der Rheinischen Friedrich Wilhelms Universitat Bonn vorgelegt von Martin Schlesinger aus Koln Bonn Dezember 2010 Angefertigt mit Genehmigung der Mathematisch Naturwissenschaftlichen Fakult t der Rheinischen Friedrich Wilhelms Universit t Bonn 1 Referent Prof Dr G Bendas 2 Referentin Prof Dr G K nig Tag der m ndlichen Pr fung 06 04 2011 Erscheinungsjahr 2011 Meiner Familie und meiner Frau My Loan gewidmet Inhaltsverzeichnis ABKURZUNGSVERZEICHNIS ooo ssssssssssssssssssssssssessssssssccccccessseseneeeeessstssunnansssssseseeeeees Vo EEINERLTUNG nee 1 ZI HEORETISCHERTEIE een 3 2 1 Prinzip der h matogenen Metastasierung ssscsssssssessssessseesssessseessseesseessseersseessses 3 2 2 Beteiligung von Adh sionsrezeptoren bei der h matogenen Metastasierun 4 2 2 1 Aufbau der Selektine nsnsessesssessessenssennennsunnenenennnnnnunnenenunnnnnnennenenennnnnennnnenennnnenennnnnenn 4 2 2 2 Rolle des P Selektin bei der h matogenen Metastasierung nn 5 2 2 3 Rolle des L Selektin bei der h matogenen Metastasierung nn 6 2 2 4 Rolle des E Selektin bei der h matogenen Metastasierung nn 8 2 2 5
77. Weder eine Blockade von mTor und PI3K noch von HSP90 hatte einen inhibierenden Einfluss auf die VLA 4 vermittelte Interaktion 128 4 Ergebnisse und Diskussion Die inhibierten Enzyme scheinen keine Auswirkungen auf die VLA 4 vermittelte Adh sion von MV3 Melanomzellen an VCAM 1 zu haben F r das Ausbleiben der Inhibition k nnten nat rlich eine falsch gew hlte Inkubationszeit oder eine zu niedrige Konzentration der Inhibitoren urs chlich sein die in dieser Arbeit nicht allumfassend gekl rt werden konnten Das Ausbleiben der Effekte k nnte aber auch durch eine dynamische Anpassung der MV3 Zellen hinsichtlich ihrer signal pathways verursacht sein So k nnten die MV3 Zellen auf eine Inhibition der PI3K f r 72 Std mit einer Kompensation der verlorenen Enzymaktivit t reagieren Eine Umgehung des PI3K Signalweges ber andere nicht inhibierte Kaskaden k nnte eine Aktivierung des VLA 4 trotz PI3K Inhibition erm glichen Es wurden MV3 Zellen f r k rzere Zeitr ume mit dem PI3K Inhibitor versetzt um Kompensationseffekten der Zellen vorzubeugen Eine evtl vorhandene inhibitorische Auswirkung auf die Zelladh sion sollte so detektierbar sein Inkubationszeitr ume von 2 und 16 Std zeigten allerdings auch keine Effekte auf die Adh sion s Abbildung 4 54 Nach diesen prelimin ren Versuchen kann der PI3K Signalweg als m gliches Target zur Inhibition der VLA 4 vermittelten Adh sion vorerst ausgeschlossen werden 100 60 A
78. a Ortiz I S nchez Luque F J amp Teixid J Activated G alpha l3 impairs cell invasiveness through pl90RhoGAP mediated inhibition of RhoA activity Cancer Res 68 8221 8230 2008 Gaetano C G et al Inhibition of autotaxin production or activity blocks lysophosphatidylcholine induced migration of human breast cancer and melanoma cells Mol Carcinog 48 801 809 2009 Graeser R et al Antimetastatic effects of liposomal gemcitabine and empty liposomes in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer Pancreas 38 330 337 2009 Millard T H Sharp S J amp Machesky L M Signalling to actin assembly via the WASP Wiskott Aldrich syndrome protein family proteins and the Arp2 3 complex Biochem J 380 1 17 2004 Mullins R D Heuser J A amp Pollard T D The interaction of Arp2 3 complex with actin nucleation high affinity pointed end capping and formation of branching networks of filaments Proc Natl Acad Sci U S A 95 6181 6186 1998 Svitkina T M amp Borisy G G Arp2 3 complex and actin depolymerizing factor cofilin in dendritic organization and treadmilling of actin filament array in lamellipodia J Cell Biol 145 1009 1026 1999 Pollard T D amp Borisy G G Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments Cell 112 453 465 2003 Maciver S K amp Hussey P J The ADF cofilin family actin remodeling proteins Genome Biol 3 reviews3007 2002 Svitkina T M et al Mec
79. al Modified heparins inhibit integrin alpha IIb beta 3 mediated adhesion of melanoma cells to platelets in vitro and in vivo Int J Cancer 125 2058 2065 2009 Bitar K N amp Yamada H Modulation of smooth muscle contraction by sphingosylphosphorylcholine Am J Physiol 269 G370 377 1995 Xu Y Fang X J Casey G amp Mills G B Lysophospholipids activate ovarian and breast cancer cells Biochem J 309 Pt 3 933 940 1995 Gauster M et al Endothelial lipase releases saturated and unsaturated fatty acids of high density lipoprotein phosphatidylcholine J Lipid Res 46 1517 1525 2005 Cathcart M K McNally A K amp Chisolm G M Lipoxygenase mediated transformation of human low density lipoprotein to an oxidized and cytotoxic complex J Lipid Res 32 63 70 1991 Hessler J R Morel D W Lewis L J amp Chisolm G M Lipoprotein oxidation and lipoprotein induced cytotoxicity Arteriosclerosis 3 215 222 1983 Kuliszkiewicz Janus M Janus W amp Baczynski S Application of 31P NMR spectroscopy in clinical analysis of changes of serum phospholipids in leukemia lymphoma and some other non haematological cancers Anticancer Res 16 1587 1594 1996 6 Literaturverzeichnis 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 Kuliszkiewicz Janus M Tuz M A amp Baczy ski S Application of 31P MRS to the analysis of phospholipid changes in plasma of patients wit
80. al regulated kinase ERK 820 LPC vermittelt eine verminderte Expression von Thromboplastin auf humanen Monozyten Allerdings konnte durch LPC Gabe auch eine verst rkte Expression des Plasminogen activator inhibitor 1 in glatten Muskelzellen der Aorten von Ratten in vivo detektiert 3 werden Daneben konnte eine Hochregulation der Expression von Urokinase und Urokinase Rezeptoren auf Makrophagen gezeigt werden Die hier beschriebenen Mechanismen geben kein eindeutiges Bild der Funktion des LPC da die beobachteten Effekte teilweise entgegengesetzte Wirkungen auf die Koagulation ausiiben Hier bedarf es weiterf hrender Untersuchungen LPC kann einen Einfluss auf die Funktionalit t von Ionenkan len entfalten und zu deren beschleunigter Dimerisierung f hren Durch die Beobachtung dass monozyt re Schaumzellen im Rahmen einer beginnenden Artheriosklerose am Gef endothel der Arterien adh rieren und dass erh hte Level an oxidiertem LDL enth lt hohe Konzentration an LPC diesen Prozess beschleunigen wurde Anfang der 90er Jahre der Einfluss von LPC auf Endothelzellen des arteriellen Schenkels 19 2 Theoretischer Teil 20 untersucht Dabei stellte sich heraus dass LPC eine verst rkte Expression von ICAM 1 und VCAM 1 auf dem Gef endothel vermittelt E Selektin hingegen wurde nicht verst rkt exprimiert Dies konnte sowohl f r humane als auch f r Arterien aus Kaninchen gezeigt werden Bere
81. altransduktionswege als in MV3 Zellen zur Aktivierung des VLA 4 vorhanden sind und diese nicht durch das TSA wohl aber durch HDACi x inhibiert werden Vergleichende Genexpressionsanalysen zwischen MV3 und G361 Zellen K nnten hier Aufschluss bringen 4 3 4 Inhibition von krebsrelevanten Schl sselenzymen zur Beeinflussung des VLA 4 VCAM 1 Bindungsweges Neben der Untersuchung des Einflusses von HDACi auf den VLA 4 VCAM 1 Bindungsweg wurden weitere potentielle Schl sselmolek le im Kontext der VLA 4 Aktivierung analysiert Dazu wurden niedermolekulare sich in der klinischen Erprobung befindliche Inhibitoren eingesetzt Auch hier k nnen aus rechtlichen Gr nde Namen und Strukturen nicht aufgezeigt werden Daraus sollte einerseits eine Identifizierung weiterer Targets erfolgen mit deren gezielter Beeinflussung eine Herabregulation der VLA 4 Integrinfunktion erreicht werden kann Andererseits sollte eine weitere Charakterisierung der MV3 Melanomzelllinie auf 127 4 Ergebnisse und Diskussion funktioneller Ebene erfolgen Eine Analyse des gesamten Transkriptoms der Zelllinie wie in Kapitel 4 2 8 dargestellt gibt zwar einen Aufschluss ber den Expressionsstatus der Zellen erm glicht jedoch keine Aussagen ber genutzte Signaltransduktionswege Gerade vor dem Hintergrund der geringen Differenzierung von entarteten Zellen sind diese Informationen interessant Folgende Substanzen gegen folgende Targets wurden eingesetzt Ein I
82. amit ist die kombinierte inhibitorische Wirkung von LPC Inkubation und Heparin auch st rker als die Aktivit t der beiden einzelnen Agenzien die somit offensichtlich synergistisch auf die VLA 4 VCAM I Interaktion einwirken 100 A B16F10 stimuliert mit Mn e B16F10 stim LPC 450 pM 13 T Inkubation B16F10 stim 500 ug UFH O B16F10 unstimuliert B16F10 stim LPC 450 pM 13 T Inkubation 500 ug UFH Adhasion Zeit s Abbildung 4 37 Untersuchung der Wirkung von LPC Inkubation und unfraktioniertem Heparin auf die VLA 4 VCAM 1 Interaktion Die Kombination aus Heparin 500 ug und LPC 450 uM fiir 13 Tage tibertraf die inhibitorische Wirkung der einzelnen Komponenten Auch die Adh sion unstimulierter B16F10 Melanomzellen wurde durch die Kombination noch unterboten Um die Art der aufgetretenen synergistischen Wirkung weiter zu determinieren wurde eine LPC Konzentration zur Kombination mit Heparin gew hlt die keine bzw nur eine geringe inhibitorische Wirkung aus bt B16F10 Zellen die sechs Tage mit 300 uM LPC inkubiert wurden fanden hier Verwendung Auch B16F10 Zellen die 50 ug unfraktioniertes Heparin und die Kombination aus LPC Behandlung und Heparin erhalten hatten wurden Adh sionsuntersuchungen unterzogen Dabei zeigten die LPC inkubierten B16F10 Zellen nur eine geringe inhibitorische Wirkung die nicht signifikant verschieden von unbehandelten stimulierten Zellen war Ein h
83. anti P Sel Ak 500 ug Fondaparinux m MV3 stimuliert anti P Sel Ak 500 ug UFH gt MV3 stimuliert anti P sel Ak 500 ug Tinzaparin v MV3 stimuliert anti P Sel Ak Natalizumab O MV3 unstimuliert Adh sion Zeit s Abbildung 4 6 Interaktion zwischen MV3 Melanomzellen und HUVEC Endothelzellen unter physiologischen Flussbedingungen Durch den Einsatz von Antik rpern und Heparin l sst sich die Adh sion vermindern Fondaparinux zeigte keinen Effekt Die Interaktion zwischen Mn stimulieren MV3 Melanomzellen und HUVEC Endothelzellen ist nur teilweise P Selektin vermittelt was sich durch den Einsatz von 10 ug Antik rper gegen P Selektin zeigen lie s Abbildung 4 6 Eine Kombination aus 10 ug P Selektin Antik rper und 5 ng Natalizumab blockierender Antik rper gegen die Q4 Untereinheit des Integrins VLA 4 reduzierte die Adh sion auf das Niveau unstimulierter MV3 Zellen Dies verdeutlicht die Involvierung des Integrins VLA 4 f r die MV3 HUVEC Interaktion Eine Kombination des P Selektin Antik rpers 10 ug mit 500 ug 74 4 Ergebnisse und Diskussion unfraktioniertem bzw fraktioniertem Heparin Tinzaparin f hrte ebenfalls zu einer Reduktion der Adh sion auf das Niveau unstimulierter MV3 Zellen Diese Reduktion der Adh sion war signifikant verschieden von der Adh sion Mn stimulierter MV3 Melanomzellen und l sst den Schluss zu dass Heparin und Natalizumab mit VLA 4 die gleiche Zie
84. antimetastatischer Therapien er ffnen An der Adh sion von Tumorzellen an das Gef endothel sind nachweislich Adh sionsrezeptoren aus den Familien der Selektine und Integrine beteiligt Diese eigentlich von Zellen des Immunsystems genutzten Molek le stellen daher interessante Ziele im metastatischen Geschehen dar So konnte f r das zur Antikoagulation verwendete Polysaccharid Heparin eine Adh sionsrezeptor blockierende Wirkung nachgewiesen werden In der klinischen Praxis verl ngert sich durch Heparinapplikation das berleben von Krebspatienten Im Rahmen dieser Arbeit soll der Prozess der Adh sion von Tumorzellen an Molek le des Gef endothels durch verschiedene Strategien inhibiert werden Dabei stehen die Wechselwirkung zwischen dem Integrin VLA 4 very late activation antigen 4 und dem endothelialen VCAM I vascular cell adhesion molecule 1 im Fokus der Untersuchungen Einerseits werden neue pharmakologische Optionen evaluiert andererseits soll ein besseres Verst ndnis der Rolle des VLA 4 beim metastatischen Geschehen gewonnen werden In der Arbeit werden grunds tzlich drei Strategien zur Beeinflussung der Funktionalit t des VLA 4 verfolgt Zum einen werden die initialen Erkenntnisse dass Heparin auch eine Bindungsf higkeit an VLA 4 besitzt ausgenutzt um das Prinzip der kompetitiven Inhibition des VLA 4 durch verschiedene Heparinderivate zu realisieren Durch den Einsatz neuartiger Heparinderivate werden ausf hrliche Struktu
85. atidylcholin Lysophosphatidic acid Minute Million Milliliter Millimeter Nicotinamidadenindinukleotidphosphat Nanogramm phosphate buffered saline Paraformaldehyd Piconewton Polyvinylidenfluorid rounds per minute Roswell Park Memorial Institute siehe Stunde Trichloroacetic acid tumor necrosis factor alpha thrombin receptor agonist peptide 14 Volumen vascular endothelial growth factor von Willebrand Faktor 1 Einleitung 1 Einleitung Die Diagnose Krebs ereilt in Deutschland laut der deutschen Krebshilfe e V jedes Jahr mehr als 450 000 Menschen 216 000 versterben an den Folgen der Erkrankung Oft ist ein Prim rtumor chirurgisch entfernbar oder durch Chemo oder Radiotherapie behandelbar Urs chlich f r das Fortschreiten der Krankheit und letztendlich f r das Sterben der Patienten ist die Bildung von Metastasen die vom Prim rtumor entfernte Organe infiltrieren und zerst ren Tumorzellen des Prim rtumors verlassen beim Prozess der h matogenen Metastasierung ihren Zellverband migrieren zu Blutgef en penetrieren diese und werden mit dem Blutfluss fortgetragen Diese adh rieren dann am Gef endothel in entfernten Organen beispielsweise im Gehirn oder in der Lunge transmigrieren in das umgebende Gewebe und etablieren eine Metastase Ein besseres Verst ndnis dieses bisher nur ansatzweise aufgekl rten Prozesses k nnte daher die M glichkeit pharmakologischer Interventionen bieten und ein potentielles Feld
86. auf wohl aber eine L Selektin Ligand Expression Dadurch besteht die M glichkeit der Wechselwirkung mit Leukozyten Dies kann einerseits eine Bindung der Tumorzelle an zytotoxische T Lymphozyten bedingen was eine Abt tung der Tumorzelle zur Folge haben kann Andererseits kann eine starke Leukozytenbindung auch prometastatisch wirken Dies h ngt von den Leukozytensubtypen und den Tumorentit ten ab Das Wechselspiel von Leukozyten mit Tumorzellen und der daraus resultierende klinische Outcome sind Gegenstand aktueller Forschung Erst 6 bis 12 Stunden nachdem die Tumorzellen die Blutbahn erreicht haben oder in einem Experiment injiziert wurden ist L Selektin an der h matogenen Metastasierung beteiligt Dies konnte durch den Einsatz von L Selektin defizienten M usen und Fucosyltransferase 7 FucT7 defizienten M usen bewiesen werden Durch die ausbleibende Expression des Enzyms FucT7 k nnen endogene potentielle L Selektin Liganden nicht mehr posttranslational modifiziert werden und interagieren aus diesem Grund nicht mehr mit L Selektin Auch kann die Bindung von Leukozyten an Mikrothromben bestehend aus Tumorzellen und Thrombozyten eine Aktivierung des Endothels und eine damit einhergehende Expression von Adh sionsrezeptoren z B durch CCL5 bedingen Dadurch kommt es nachfolgend zur Rekrutierung von Monozyten zum metastatischen Mikromilieu 2 Theoretischer Teil 2 2 4 Rolle des E Selektin bei der hamatogenen Metastasierung E
87. bbildung 4 42 Abbildung 4 43 Abbildung 4 44 Abbildung 4 45 Abbildung 4 46 Abbildung 4 47 VLA 4 vermitteltes Adh sionsverhalten von B16F10 Zellen inkubiert mit verschiedenen LPC Konzentrationen f r 13 Tage 90 Einfluss der Inkubationszeit auf das Adh sionsverhalten der B16F 10 Zellen een ee eh 91 Einfluss des LPC Entzuges auf die Adh sion von B16F10 Zellen 92 Einfluss der erneuten LPC Zugabe auf das Adh sionsverhalten der TBR GRIN Zee es 93 Bestimmung der Interaktion zwischen B16F10 Melanomzellen und Ihrambozyten es coh nenne 94 Bestimmung des Zelldurchmessers und der Oberfl chenausdehnung von LPC behandelten und unbehandelten B16F10 Melanomzellen 95 Einfluss der LPC Inkubation auf die Lamellen und Ruffle Dynamik 96 Einfluss der LPC Inkubation auf die Lamellen und Ruffle Frequenz 96 Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme mittels Laserscanning Mikroskop von B16F10 Melanomzellen auf deren Oberfl che das Integrin VLA 4 markiert war ccceeccecsseceeesececseececseeeesseeeeseeeenaeeees 98 Rasterelektronenmikroskopische Untersuchung von BIGFIO Melanomvellen trnac ceased e se ai 99 Rasterelektronenmikroskopische Untersuchung von BILGE TO Melanamzellei see 101 Rasterelektronenmikroskopische Untersuchung von WIVS3 Melanomzellen essential 102 Quantifizierung von Filopodien auf LPC behandelten und unbehandelten Zellmembranen 2 uu 2u0se alas 1
88. behandelten und unbehandelten AsPC 1 Pankreastumorzellen mit Thrombozyten u0220002sssnnensensnnennnnn 120 Einfluss der LPC Inkubation 450 uM f r 24 Std auf die Wechselwirkung von U937 Zellen mit rekombinantem P Selektin 121 7 Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen Abbildung 4 48 Abbildung 4 49 Abbildung 4 50 Abbildung 4 51 Abbildung 4 52 Abbildung 4 53 Einfluss der Inkubationszeit auf das Adh sionsverhalten der MV3 Zellen unter TSA Inkubation an VCAM 1 n 123 Einfluss des HDAC 6 selektiven Inhibitors ST71 auf das Adh sionsverhalten der MV3 Zellen an VCAM 1 e een 124 Einfluss des HDACi x x auf das Adh sionsverhalten der MV3 Zellen an VEAMA san ke 124 Durchflusszytometrische Bestimmung des Einflusses von TSA ST71 und HDACi x auf die Expression von VLA 4 eee 126 Einfluss der TSA und HDACi x x Inkubation auf die Adh sion der humanen G361 Zellen an VCAM 1 unter physiologischen Fluss bedinzineen eis zn nee 127 Einfluss verschiedener Inhibitoren auf die Adh sion der MV3 Melanomzellen an VCAM 1 unter physiologischen Flussbedingungen nach einer Inkubationszeit von 72 Std uerseessnnesnnnessnersnnesnnennnennnnennnen non 128 Abbildung 4 54 Einfluss der Inkubationszeit des kombinierten PI3K mTOR Inhibitors auf die Adh sion der MV3 Melanomzellen an VCAM 1 unter physiologischen Flussbedingungen uursuurssesnnersnnessnersnnesnnennne
89. bel sung f r jeweils 3 min gelegt Anschlie end wurde sie abermals fiir 3 min in Aqua dem getaucht Die Proteinflecken wurden ausgestanzt und in jeweils 1 mL Elutionsl sung in Glasr hrchen f r 15 min gegeben Dabei ging der Farbstoff in die Elutionsl sung ber und konnte UV photometrisch bei einer Wellenl nge von 630 nm erfasst werden Anhand der Kalibriergraden konnte auf die Proteinmenge in den Proben geschlossen werden 3 11 2 Prinzip der Methode Das zentrale Element des Human Apoptosis Array Kit ist eine mit Antik rpern beschichtete Nitrocellulose Membran Die Antik rper sind auf 35 verschiedenen Positionen der Membran jeweils in Duplikaten fixiert und binden hochspezifisch und hochaffin Proteine die bei der Apoptose einer Zelle exprimiert werden s Abbildung 3 6 Dabei ist es den Herstellern gelungen jede Membran mit der gleichen Menge Antik rper pro Spot zu beschichten So ist ein Vergleich der detektierten Proteinmengen zwischen zwei Membranen m glich und l sst quantitative Aussagen zu Nach Inkubation der Membran mit Zelllysaten die potentiell apoptoserelevante Proteine enthalten wird die Membran mit einem Antik rpercocktail inkubiert Dieser Cocktail besteht aus Antik rpern die auch an apoptoserelevante Proteine binden Sollten durch die an die Membran gebundenen Antik rper nun apoptoserelevante Proteine fixiert sein so bindet der zweite Antik rper r ckseitig an das entsprechende Protein Da der zweite Antik
90. benen HDACi vermittelten Effekte auf die VLA 4 abh ngige Adh sion der MV3 Melanomzellen an VCAM 1 wurde eine weitere humane Melanomzelllinie verwandt Wie in durchflusszytometrischen Analysen best tigt werden konnte exprimieren auch Melanomzellen der Linie G361 VLA 4 Daher wurden die Zellen nach Zytotoxizit tsbestimmungen sowohl mit TSA als auch mit HDACi x fiir 72 Std mit Konzentrationen von 10 M inkubiert 4 Ergebnisse und Diskussion 100 80 60 A 6361 stimuliert mit Mn A G361 TSA 72 Std Inkubation stim w G361 x 72 Std Inkubation stim 40 O G361 unstimuliert Adhasion 20 Zeit s Abbildung 4 52 Einfluss der TSA und HDACi x x Inkubation auf die Adh sion der humanen G361 Zellen an VCAM 1 unter physiologischen Flussbedingungen HDACi x war in der Lage die Adh sion zu vermindern wohingegen TSA keinen Einfluss aus bte Bei den anschlie end durchgef hrten Adh sionsuntersuchungen unter Flussbedingungen zeigte sich eine signifikante Reduktion der Adh sion nur f r die HDACi x inkubierten Zellen s Abbildung 4 52 Die TSA Behandlung hat hingegen keinen Einfluss auf die VLA 4 vermittelte Adh sion Die Ursache k nnte durch eine zu niedrig gew hlte TSA Konzentration bedingt sein wobei durch den Einsatz h herer Konzentrationen die Gefahr besteht in einen f r die Zellen toxischen Bereich zu gelangen Auch ist denkbar dass in den G361 Zellen andere intrazellul re Sign
91. bszelllinie HepG2 zu einer verst rkten Expression des Proteins Claudin 3 kommt womit eine verminderte Migration und Invasion korrelierten Zhang et al zeigten dass es durch den Einsatz von Trichostatin in Hela Zellen zu einer HDAC 6 Inhibition und dadurch vermittelt zu einer verst rkten Acetylierung des Proteins Cortactin kommt was sich in einer verminderten Migration und einer damit einhergehenden verringerten Metastasierung u ert Der Einfluss von HDAC bzw HDACi auf Adh sionsrezeptoren die ma geblich an der Metastasierung beteiligt sind wurde in der Vergangenheit von mehreren Arbeitsgruppen untersucht wobei der Fokus dabei eher auf entz ndlichem Geschehen ruhte Inoue et al verwiesen auf eine verminderte Expression des Immunglobulins VCAM 1 auf HUVEC Zellen Human umbilical vein endothel cells nach 273 TNFa Stimulation unter Wirkung des Trichostatin Expression von ICAM 1 VCAM 1 und E Selektin auf Tumorendothelzellen durch die Gabe Hellebrekers et al gelang es die von HDACi und DNA Methyltransferase Inhibitoren signifikant zu steigern dies u erte sich in einer verst rkten Zelladh sion von Leukozyten Diese kontr ren Ergebnisse lassen die Annahme zu dass die beobachteten Effekte zelllinienspezifischer Natur und daher tendenziell nicht zu verallgemeinern sind Vorinostat bewirkte in verschiedenen Leuk miezelllinien eine verst rkte Expression von Integrinen und eine damit einhergehende Adh sionsver
92. carcinoma cells by triggering p38 and ERK MAPK activation Cancer Res 66 9117 9124 2006 Aychek T et al E selectin regulates gene expression in metastatic colorectal carcinoma cells and enhances HMGBI release Int J Cancer 123 1741 1750 2008 Laferriere J Houle F Taher M M Valerie K amp Huot J Transendothelial migration of colon carcinoma cells requires expression of E selectin by endothelial cells and activation of stress activated protein kinase 2 SAPK2 p38 in the tumor cells J Biol Chem 276 33762 33772 2001 6 Literaturverzeichnis 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 Laubli H amp Borsig L Selectins as Mediators of Lung Metastasis Cancer Microenvironment 2010 doi 10 1007 s12307 010 0043 6 Hemler M E VLA proteins in the integrin family structures functions and their role on leukocytes Annu Rev Immunol 8 365 400 1990 Kinashi T Intracellular signalling controlling integrin activation in lymphocytes Nat Rev Immunol 5 546 559 2005 Hynes R O Integrins versatility modulation and signaling in cell adhesion Cell 69 11 25 1992 Springer T A Traffic signals on endothelium for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration Annu Rev Physiol 57 827 872 1995 Bridges L C Sheppard D amp Bowditch R D ADAM disintegrin like domain recognition by the lymphocyte integrins alpha4betal and alpha4beta7 Bi
93. chstumsfaktoren durch Heparin gebunden 175 und inaktiviert z B VEGF vascular endothelial growth factor Ferner ist beschrieben 17 2 Theoretischer Teil 18 dass UFH eine Doxorubicinresistenz bei MDA 231 Zellen aufheben konnte Hier scheint Heparin eine chemosensitivierende Wirkung auf Krebszellen auszu ben 6 Au erdem inhibiert Heparin Nucleasen im nanomolaren Bereich Dies konnte sowohl f r 177 178 r Die Endonucleasen als auch f r extrazellul re Nucleasen demonstriert werden physiologische Relevanz dieser Interaktion im Rahmen der Metastasierung ist noch nicht gekl rt und bedarf weiterer Untersuchungen In unserem Arbeitskreis konnte erstmals die Interaktion zwischen Heparin und dem Integrin VLA 4 beschrieben werden Das Integrin VLA 4 wird von verschiedenen Melanomzellen exprimiert und ist an der Metastasierung ma geblich beteiligt was von mehreren 110112 Die in vitro Inhibition zwischen VLA 4 und Arbeitsgruppen gezeigt werden konnte endothelst ndigem VCAM I scheint also ein neues und vielversprechendes Target der Heparinwirkung bei der Unterdriickung der Metastasierung zu sein 2009 konnte die chinesische Arbeitsgruppe um Xian Lu Zeng das thrombozyt re Integrin O13 als weiteres Heparin Target aufzeigen Durch verschiedene Heparinderivate wurde die Interaktion zwischen Thrombozyten und Melanomzellen vermindert dies dr ckte sich in einer reduzierten Metastasierung aus Heparin nimmt also
94. cinoma MIA PaCa 2 in continuous culture sensitivity to asparaginase Int J Cancer 19 128 135 1977 Barthel S R Johansson M W Annis D S amp Mosher D F Cleavage of human 7 domain VCAM 1 CD106 by thrombin Thromb Haemost 95 873 880 2006 Garner E amp Raj K Protective mechanisms of p53 p21 pRb proteins against DNA damage induced cell death Cell Cycle 7 277 282 2008 Toyoshima H amp Hunter T p27 a novel inhibitor of G1 cyclin Cdk protein kinase activity is related to p21 Cell 78 67 74 1994 Mollinedo F et al In vitro and In vivo selective antitumor activity of Edelfosine against mantle cell lymphoma and chronic lymphocytic leukemia involving lipid rafts Clin Cancer Res 16 2046 2054 2010 Mollinedo F et al Lipid raft targeted therapy in multiple myeloma Oncogene 29 3748 3757 2010 Zaremberg V Gajate C Cacharro L M Mollinedo F amp McMaster C R Cytotoxicity of an anti cancer lysophospholipid through selective modification of lipid raft composition J Biol Chem 280 38047 38058 2005 Jim nez L pez J M R os Marco P Marco C Segovia J L amp Carrasco M P Alterations in the homeostasis of phospholipids and cholesterol by antitumor alkylphospholipids Lipids Health Dis 9 33 2010 Holleran B J Barbar E Payet M D amp Dupuis G Differential recruitment of alpha2betal and alpha4betal integrins to lipid rafts in Jurkat T lymphocytes exposed to collagen ty
95. d erneute Inkubation stim 3 40 m 2 0 B16F10 unstimuliert 20 kkk SSS te kk Krk 0 0 1 2 3 4 Zeit s Abbildung 4 23 Einfluss der erneuten LPC Zugabe auf das Adh sionsverhalten der B16F10 Zellen Eine abermalige LPC Gabe verminderte die Adh sion unter das Level der erstmaligen 4 2 3 4 LPC vermittelte Beeinflussung der Interaktion von Thrombozyten mit B16F10 Melanomzellen Wie in Kapitel 2 2 6 beschrieben spielt die Ummantelung der Tumorzellen mit Thrombozyten in der Blutbahn eine essentielle Rolle im Prozess der h matogenen Metastasierung Daher wurde der Einfluss der LPC Inkubation auf die Thrombozyten Adh sion an B16F10 Zellen quantifiziert Die B16F10 Zellen wurden im Vorfeld der Untersuchungen f r drei Tage mit 450 uM LPC inkubiert Die genaue Versuchsdurchf hrung und das Verfahren der Thrombozytenisolierung sind in Kapitel 3 12 und 3 4 beschrieben Wie in Abbildung 4 24 ersichtlich ist die Anzahl der unstimulierten Thrombozyten die an LPC behandelte und unbehandelte B16F10 binden nahezu identisch Durch Aktivierung der Thrombozyten mittels TRAP 14 einem Peptidagonisten an PAR Rezeptoren kommt es zu einer verst rkten Interaktion zwischen Thrombozyten und B16F10 Melanomzellen Dabei ist die Interaktion mit LPC inkubierten B16F10 Zellen signifikant vermindert und auf dem Niveau unstimulierter Thrombozyten Die Interaktion zwischen Thrombozyten und B16F10 Melanomzellen ist P Selektin vermittelt dies konnte durch den Einsa
96. d Diskussion 4 1 Bestimmung der Interaktion zwischen Heparinderivaten und VLA 4 4 1 1 Charakterisierung der Melanomzelllinie MV3 hinsichtlich metastasierungs relevanter Adh sionsrezeptoren und deren Liganden 4 1 1 1 Durchflusszytometrische Bestimmung des Integrins VLA 4 und der P und L Selektin Liganden auf MV3 Melanomzellen Wie in den vorangegangenen Kapiteln beschrieben spielen Adh sionsrezeptoren im Prozess der h matogenen Metastasierung eine entscheidende Rolle Es Konnte bereits in Vorarbeiten gezeigt werden dass Heparin an das metastasierungsrelevante Integrin VLA 4 auf murinen B16F10 Melanomzellen bindet und es funktionell inhibiert Um weitere Einblicke in diese erstmals beschriebene Wechselwirkung von Heparin und VLA 4 zu erlangen und dies auch auf das humane VLA 4 zu bertragen sollen Struktur Wirkungs Beziehungen mittels verschiedener Heparinderivate unter Verwendung der humanen Melanomzelllinie MV3 hergeleitet werden Prim r ist daf r die genaue Kenntnis der von MV3 Melanomzellen exprimierten Adh sionsrezeptoren wichtig Die Charakterisierung der MV3 Zellen wurde durchflusszytometrisch mit Antik rpern und rekombinanten Adh sionsrezeptoren auf Proteinebene durchgef hrt wie in Abbildung 4 1 detailliert erl utert Es wurde die Expression des Integrins VLA 4 und die Existenz von P und L Selektin Liganden nachgewiesen Dies ist anhand der Rechtsverschiebungen der Kurven zu h heren Fluoreszenzintensit ten im Vergleich
97. d als inside out signalling bezeichnet und kann z B durch Chemokine oder Bindung eines T Zell Rezeptors an einen MHC Komplex hervorgerufen werden Die Aktivierung ist innerhalb einer Sekunde m glich kann jedoch auch bis zu einer Minute dauern Bei genauerer Betrachtung wurde festgestellt dass eine Forcierung der Ligandbindung durch Regulation der Affinit t und auch der Avidit t m glich ist Die Avidit t kann durch r umliche Ann herung einzelner Molek le ber sogenannte Mikrocluster zu Clustern erh ht werden Dies wird durch zytoskeletale Bestandteile erreicht s Abbildung 22 Zur Erl uterung der Affinit tserh hung soll kurz der Aufbau eines Integrins beschrieben werden Die a Untereinheit des Integrins besteht aus einem apikalen B Propeller an den sich eine Stelzenregion anschlie t gefolgt von transmembran rer und zytoplasmatischer Dom ne In den Propeller ist bei den a Untereinheiten 1 2 10 11 D E L M und X eine I Dom ne inseriert Die I Dom ne ist Tr ger der Ligandbindungsstelle und der MIDAS metal ion dependent adhesion site einer Bindungsstelle f r zweiwertige Kationen die eine Rolle bei der Aktivierung des Integrins und der Ligandbindung spielt Ist keine I Dom ne in der a Untereinheit enthalten so bernimmt der Propeller z T die Ligandbindung Die B Untereinheit besteht apikal aus einer I like Dom ne die der I Dom ne der a Untereinheit auf Grund hoher Sequenzhomologie recht hnlic
98. d inhibit acute inflammation Blood 82 3253 3258 1993 Borsig L Wong R Hynes R O Varki N M amp Varki A Synergistic effects of L and P selectin in facilitating tumor metastasis can involve non mucin ligands and implicate leukocytes as enhancers of metastasis Proc Natl Acad Sci U S A 99 2193 2198 2002 L ubli H Stevenson J L Varki A Varki N M amp Borsig L L selectin facilitation of metastasis involves temporal induction of Fut7 dependent ligands at sites of tumor cell arrest Cancer Res 66 1536 1542 2006 Wang L Brown J R Varki A amp Esko J D Heparin s anti inflammatory effects require glucosamine 6 O sulfation and are mediated by blockade of L and P selectins J Clin Invest 110 127 136 2002 Wei M et al Modified heparin inhibits P selectin mediated cell adhesion of human colon carcinoma cells to immobilized platelets under dynamic flow conditions J Biol Chem 279 29202 29210 2004 Vlodavsky I et al Mammalian heparanase Gene cloning expression and function in tumor progression and metastasis Nat Med 5 793 802 1999 Mousa S A amp Mohamed S Inhibition of endothelial cell tube formation by the low molecular weight heparin tinzaparin is mediated by tissue factor pathway inhibitor Thromb Haemost 92 627 633 2004 Aviezer D et al Differential structural requirements of heparin and heparan sulfate proteoglycans that promote binding of basic fibroblast growth fac
99. das VLA 4 Nach Applikation der Zellen starben nur in der Kontrollgruppe innerhalb von 24 Std zahlreiche Tiere Auch bei Wiederholung des Versuches tauchte dieses Ph nomen auf Durch mikroskopische Beobachtungen konnte in vitro festgestellt werden dass die MV3 Zellen stark zur Aggregation neigen was wahrscheinlich urs chlich f r die starke Erh hung der Mortalit t ist Auf Grund des hohen Verlustes an M usen konnte die Kontrollgruppe statistisch nicht in die Auswertung des Versuches mit einbezogen werden Auch ist ein Vergleich mit der Kontrollgruppe des ersten Experiments aus statistischen Gr nden nicht zul ssig Daher musste die Auswertung durch Vergleich der einzelnen Gruppen untereinander erfolgen Die Applikation von Enoxaparin 30 min vor Tumorzellgabe zeigte eine Reduktion der Metastasierung im Vergleich zur Applikation 14 Std nach Tumorzellinokulation um ca 50 s Abbildung 4 14 Allerdings waren in der Gruppe der sp ten Heparininjektion nur vier Tiere auswertbar und die Zahl der pulmonalen Metastasen schwankte von 4 bis 21 Die Reduktion der Metastasierung scheint vornehmlich durch die Inhibition von thrombozyt rem P Selektin in der fr hen Phase der Tumorzelldissemination bedingt zu sein Die sp te Heparininjektion 14 Std nach Tumorzellapplikation hat hierauf keinen Einfluss 4 Ergebnisse und Diskussion Die Injektion von Natalizumab 14 Std nach Tumorzellgabe reduzierte die Zahl der Metastasen auf das Ma der fr hen
100. derived transforming growth factor beta down regulates NKG2D thereby inhibiting natural killer cell antitumor reactivity Cancer Res 69 7775 7783 2009 Rickles F R amp Falanga A Molecular basis for the relationship between thrombosis and cancer Thromb Res 102 V215 224 2001 Estrov Z et al Elevated plasma thrombopoietic activity in patients with metastatic cancer related thrombocytosis Am J Med 98 551 558 1995 Trousseau Phlegmasia alba dolens Clinique Medicale de Hotel Dieu de Paris 2nd ed 2nd Edition ed 654 712 1865 Tranum B L amp Haut A Thrombocytosis platelet kinetics in neoplasia J Lab Clin Med 84 615 619 1974 141 6 Literaturverzeichnis 142 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 Baron J A Gridley G Weiderpass E Nyr n O amp Linet M Venous thromboembolism and cancer Lancet 351 1077 1080 1998 S rensen H T Mellemkjaer L Steffensen F H Olsen J H amp Nielsen G L The risk of a diagnosis of cancer after primary deep venous thrombosis or pulmonary embolism N Engl J Med 338 1169 1173 1998 Erpenbeck L amp Sch n M P Deadly allies the fatal interplay between platelets and metastasizing cancer cells Blood 115 3427 3436 2010 Gately S The contributions of cyclooxygenase 2 to tumor angiogenesis Cancer Metastasis Rev 19 19 27 2000 Melnikova V O Villares G J amp Bar
101. detektieren die eine anti apoptotische Wirkung aufweisen Einfluss auf die Metastasierung in der Lunge hat konnte in einem in vivo Metastasierungsversuch 2009 gezeigt werden Durch diese kontroversen Resultate wird deutlich dass die Rolle des E Selektins noch nicht abschlie end gekl rt ist und es weiterer Untersuchungen bedarf 2 2 5 Rolle des Integrins VLA 4 bei der h matogenen Metastasierung Integrine sind Zelloberfl chenrezeptoren die die Adh sion zwischen Zellen der extrazellul ren Matrix ECM und Bestandteilen des Plasmas vermitteln Alle Integrine bestehen aus einer a und einer B Untereinheit die nicht kovalent miteinander verbunden sind Insgesamt wurden bisher 24 verschiedene Integrine in Vertebraten identifiziert Die unterschiedlich m glichen Kombinationen sind in Abbildung 2 1 dargestellt Oz 40 Clb By ay 1 Ba Ps Bo Hy k Be o D Qg B7p 4 By On 0 Abbildung 2 1 berblick ber Assoziationsm glichkeiten von Integrinuntereinheiten In rot dargestellt sind die leukozyt ren Integrine entnommen aus Kinashi Durch die vermittelte Adh sion sind Integrine essentiell f r die strukturelle Entwicklung und Homeostase von Organismen Im Immunsystem spielen sie bei vielen Prozessen eine Rolle die hier jedoch nur ansatzweise erw hnt werden Sie vermitteln die feste Adh sion von Leukozyten an Endothelzellen und antigenpr sentierende Zellen Hierdurch kann es nachfolgend zur Extravasation vo
102. e Schlesinger M Jantscheff P Kirfel G Massing U Bendas G Lysophosphatidylcholine pretreatment reduces VLA 4 and P selectin mediated B16 F10 melanoma cell adhesion in vitro and inhibits metastasis like lung invasion in vivo CESAR Jahrestagung St Gallen Schweiz 2010 Poster 163 9 Verfassererkl rung 9 Verfassererkl rung Hiermit erkl re ich dass ich die vorliegende Arbeit selbst ndig verfasst und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt und die den verwendeten Werken w rtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche kenntlich gemacht habe Bonn Martin Schlesinger 165
103. e inwieweit die eingeschr nkte Adh sionwirkung auch in einer verminderten Matrixbindung und migration der LPC behandelten Melanomzellen manifestiert war Daf r wurde die Integrin vermittelte Adh sion an Fibronektin untersucht indem der Durchmesser der B16F10 Zellen mit der Fl chenausdehnung der B16F10 Zellen in Aufsicht korreliert wurde Bei intakter Integrinfunktion ist den Zellen eine Adh sion mit daraus resultierendem Spreiten auf der Fibronektinschicht m glich Ist die Integrinfunktion inhibiert 94 4 Ergebnisse und Diskussion oder negativ beeinflusst so kommt es zu einer verminderten Adh sion und einer abgerundeten Zelle die in der Aufsicht eine verringerte Fl che einnimmt Dazu wurden der Durchmesser und die Fl chenausdehnung in Aufsicht von LPC behandelten und LPC unbehandelten B16F10 Zellen bestimmt Die LPC behandelten Zellen wurden f r drei Tage mit 450 uM LPC versetzt Der Durchmesser der Zellen wurde mit einem CASY 1 Modell TT nach dem Coulter Counter Prinzip bestimmt s Kapitel 3 2 3 und die Fl chenausdehnung auf Fibronektin wurde mit dem Programm NIS Elements AR 2 30 erfasst p N 3000 E18 46 2500 5 z E N 49 2000 5 a 40 1500 7 D a 8 7 D N E 6 1000 z 5 gt 500 A a 0 m 0 amp so amp Sp D oO a m m Abbildung 4 25 Bestimmung des Zelldurchmessers und der Oberfl chenausdehnung von LPC behandelten und unbehandelten B16F10 Melanomzellen LPC vermittelt zei
104. e Prof Dr Jung Universit t Freiburg Deutschland LEO Pharma GmbH Neu Isenburg Deutschland Sigma Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen Deutschland Hersteller B Braun Petzold GmbH Melsungen Deutschland Sch rfe System GmbH Reutlingen Deutschland Greiner Bio One GmbH Frickenhausen Deutschland Greiner Bio One GmbH Frickenhausen Deutschland Greiner Bio One GmbH Frickenhausen Deutschland Greiner Bio One GmbH Frickenhausen Deutschland Greiner Bio One GmbH Frickenhausen Deutschland 39 3 Material und Methoden Artikel Deckgl ser rund Durchmesser 18 mm St rke 3 0 28 0 32 mm Einmalspritzen Injekt 10 ml Human Apoptosis Array Kit Immersions l 518 F Kryor hrchen PP mit Schraubverschluss steril Mullkompressen steril 5x 5 cm 8fach Pipette 10 uL Pipette 100 uL Pipette 1000 uL Pipette 1 5 ml Finnpipette Pipettenspitzen 1 200 uL gelb Pipettenspitzen 101 1000 uL natur Pipettenspitzen 5 ml Plastibrand Reagiergef 1 5 ml Reagiergef 2 0 ml 40 Hersteller Labor und Medizintechnik Dr J Rost Leipzig Deutschland B Braun Melsungen AG Melsungen Deutschland R amp D Systems GmbH Wiesbaden Nordenstadt Deutschland Carl Zeiss AG Oberkochen Deutschland Greiner Bio One GmbH Frickenhausen Deutschland Maimed GmbH amp Co KG Neuenkirchen Deutschland Eppendorf AG Hamburg Deutschland Eppendorf AG Hamburg Deutschland Eppendorf AG Hamburg De
105. e allerdings auch durch eine Kombination beider Mechanismen verursacht werden 4 2 5 Einfluss verschiedener Lipidderivate bzw Lipidmetabolite auf die Zelladh sion von B16F10 Melanomzellen 4 2 5 1 Beeinflussung des VLA 4 VCAM 1 Bindungsweges durch Hexadecylphospho cholin unter physiologischen Flussbedingungen Bei Betrachtung der Struktur von LPC f llt die hnlichkeit zu Hexadecylphosphocholin HePC auf einem Arzneistoff aus der Klasse der Alkylphosphocholine der zur Therapie der Leishmaniose und zur Behandlung von b sartigen Hautver nderungen bei Brustkrebs dermal eingesetzt wird s Abbildung 4 34 Abbildung 4 34 Strukturen von LPC oben und Hexadecylphosphocholin im Vergleich F r HePC ist ein rapider Uptake aus dem Kulturmedium mit anschlie ender Inkorporation in die Zellmembran von Tumorzellen beschrieben Neben der Vermittlung der Apoptose durch zahlreiche Mechanismen beispielsweise der Aktivierung von Caspasen konnte eine 301 HePC scheint also einen Clusterung und Aktivierung von Todesrezeptoren gezeigt werden Einfluss auf Membraneigenschaften auszu ben Um indirekt weitere Erkenntnisse ber die Effekte des LPC zu gewinnen wurde auch der Einfluss des HePC auf die Funktionalit t des Integrins VLA 4 unter Flussbedingungen untersucht Zun chst wurde die Toxizit t mittels MTT Assay bestimmt und ein ICso Wert von 100 uM ermittelt F r die anschlie end durchgef hrten Adh sionsuntersuchungen wurden Konzentrat
106. e anschlie end mit 400 mL _ isotonischer Kochsalzl sung 154 mM NaCl gesp lt um alle Blutbestandteile quantitativ zu entfernen Danach wurde die Sepharose 4B in Ethanol 20 V V f r den n chsten Versuch resuspendiert Die isolierten Thrombozyten wurden bei 4 C und unter Lichtausschluss gelagert Quantifiziert wurden die Thrombozyten mithilfe der Neubauer improved Z hlkammer mit 47 3 Material und Methoden 48 der neben gro en Blutbestandteilen wie Leukozyten auch kleine wie Thrombozyten gez hlt werden k nnen Es wurden f nf diagonal angeordnete Quadrate die jeweils wieder aus 16 Untereinheiten bestehen ausgez hlt Durch bekanntes Volumen der Z hlkammer konnte nach Bildung des Mittelwertes auf die Konzentration der Thrombozyten im Eluat geschlossen werden Durch Zentrifugation des Eluates und Resuspension des Pellets konnte die Konzentration der Thrombozyten eingestellt werden 3 4 2 Markierung von Thrombozyten F r fluoreszenzmikroskopische oder durchflusszytometrische Untersuchungen wurden die Thrombozyten mit dem Fluoreszenzfarbstoff Calcein Acetoxymethylester Calcein AM markiert Dazu wurden 5 mL Thrombozytensuspension mit einer Konzentration von 100 Mio Thrombozyten 100 uL mit 10 uL Calcein AM c 1 mM versetzt Nach Passieren der Zellmembran wird die Esterstruktur im Zytosol durch unspezifische Esterasen gespalten und kann so die Zellmembran nicht mehr durchdringen Durch Komplexbildung mit Calciumi
107. e bei der Metastasierung der Melanomzelllinien MV3 und BI6F10 Eine Inhibition der extrazellul ren Dom ne des VLA 4 durch verschiedene Heparin Derivate sowie auf membran rer Ebene durch LPC konnte in den vorherigen Kapiteln dargelegt werden Eine weitere M glichkeit zur Inhibition der Integrinwirkung k nnte auf intrazellul rer Ebene erfolgen Dabei sollen verschiedene Schl sselenzyme die in Zusammenhang mit einer Integrinaktivierung beschrieben sind im Mittelpunkt stehen Dadurch k nnen einerseits weitere therapeutische Ans tze gefunden werden andererseits soll eine Charakterisierung der MV3 Melanomzelllinie hinsichtlich intrazellul rer Signalkaskaden und deren Inhibition erfolgen Histon Deacetylase Inhibitoren HDACi werden seit einigen Jahren intensiv als potentielle Wirkstoffe in der Tumortherapie untersucht Da das Gebiet der HDACs und deren antimetastatisches Potential auf Adh sionsrezeptorebene bisher kaum erforscht ist wurde zun chst der Pan HDACi Trichostatin A TSA auf seine Wirkung zur Hemmung der VLA 4 vermittelten Zelladh sion untersucht In Voruntersuchungen wurde mittels MTT Assay die mittlere inhibitorische Konzentration ICs59 des TSA auf die MV3 Zellen bestimmt wobei ein log ICso Wert von 6 5 ermittelt wurde Die Zellen wurden infolgedessen mit einer subtoxischen Konzentration von 107 M TSA versetzt und Adh sionsuntersuchungen unter physiologischen Flussbedingungen unterzogen Dabei wurde der TSA vermittelte Einfl
108. ein coupled receptor antagonized by lysophosphatidylcholine J Biol Chem 279 42484 42491 2004 Seuwen K Ludwig M amp Wolf R M Receptors for protons or lipid messengers or both J Recept Signal Transduct Res 26 599 610 2006 Tokumura A et al Identification of human plasma lysophospholipase D a lysophosphatidic acid producing enzyme as autotaxin a multifunctional phosphodiesterase J Biol Chem 277 39436 39442 2002 Umezu Goto M et al Autotaxin has lysophospholipase D activity leading to tumor cell growth and motility by lysophosphatidic acid production J Cell Biol 158 227 233 2002 Tanaka M et al Autotaxin stabilizes blood vessels and is required for embryonic vasculature by producing lysophosphatidic acid J Biol Chem 281 25822 25830 2006 van Meeteren L A et al Autotaxin a secreted lysophospholipase D is essential for blood vessel formation during development Mol Cell Biol 26 5015 5022 2006 van Leeuwen F N Giepmans B N G van Meeteren L A amp Moolenaar W H Lysophosphatidic acid mitogen and motility factor Biochem Soc Trans 31 1209 1212 2003 Mills G B amp Moolenaar W H The emerging role of lysophosphatidic acid in cancer Nat Rev Cancer 3 582 591 2003 Ren J et al Lysophosphatidic acid is constitutively produced by human peritoneal mesothelial cells and enhances adhesion migration and invasion of ovarian cancer cells Cancer Res 66 3006 3014 2006 Ba
109. einer verst rkten Bindung an die Tumorzellen Hier war die Bindung an LPC behandelte MIA PaCa 2 Zellen signifikant verringert Durch den Einsatz eines Antik rpers gegen P Selektin konnte die Bindung der unbehandelten MIA PaCa 2 Zellen ebenfalls vermindert werden die der LPC inkubierten Zellen allerdings nicht Somit kann angenommen werden dass die Interaktion zwischen Tumorzellen und Thrombozyten zu einem gewissen Teil P Selektin vermittelt ist Der Einsatz eines Kontroll Antik rpers der kein Epitop auf Tumorzellen oder Thrombozyten erkennt hatte keinen Einfluss auf die Interaktion Der Einsatz von 100 ug unfraktioniertem Heparin indes konnte die Interaktion von Thrombozyten sowohl mit LPC behandelten als auch unbehandelten Zellen deutlich reduzieren Auch bei den hier untersuchten Effekten scheinen LPC und Heparin synergistisch zu wirken Heparin entfaltet einen Teil seiner Wirkung ber eine Blockade von P Selektin kk 1800 IO 1600 1400 1200 N E 4 1000 800 oo 400 200 0 TRAP 14 t t LPG P Selektin Ak Kontroll Ak Heparin D a a Abbildung 4 45 Interaktion von LPC behandelten und unbehandelten MIA PaCa 2 Pankreastumorzellen mit Thrombozyten Eine LPC Inkubation vermochte die Bindung zwischen Thrombozyten und Tumorzellen signifikant zu verringern dies geschah teilweise durch eine Inhibition des thrombozyt ren P Selektin Auch 100 ug unfraktio
110. em Wasser wurden diese im Trockenschrank bei 80 C getrocknet 3 7 4 Beschichtung der Glaspl ttchen mit Rezeptorproteinen Zur kovalenten Fixierung von Rezeptorproteinen auf der Oberfl che der Glaspl ttchen wurde Cyanurchlorid verwendet Cyanurchlorid dient als Linker zwischen den Rezeptorproteinen und den Silanolgruppen der gereinigten Glaspl ttchen Zur kovalenten Bindung des 3 Material und Methoden Cyanurchlorids an die Silanolgruppen wurde eine Spatelspitze des Cyanurchlorids in 50 mL wasserfreiem Chloroform gel st Nach Zugabe der Glaspl ttchen wurde f r 30 min im Ultraschallbad auf 80 C erhitzt Danach wurde f r 20 min mit wasserfreiem Chloroform im Ultraschallbad gesp lt Abschlie end wurden die Glaspl ttchen bei 80 C getrocknet Die Glaspl ttchen konnten nun direkt verwendet oder unter wasserfreien Bedingungen f r maximal zwei Monate gelagert werden Zur kovalenten Immobilisierung von Rezeptorproteinen wie Selektinen oder VCAM 1 wurden die Konzentrationen der jeweiligen L sung auf 0 02 ug uL eingestellt F r die Beschichtung eines Glaspl ttchens wurden 10 uL verwendet und mit 10 uL BSA L sung 4 m V und 60 uL Boratpuffer pH 8 8 gemischt Dieses Gemisch wurde auf die Glasoberfl che aufgebracht Unter diesen Bedingungen reagiert das an die Glasoberfl che gebundene Cyanurchlorid mit freien Aminogruppen des Rezeptorproteins unter Ausbildung einer kovalenten Bindung s Abbildung 3 1 Nach einer Inkubationszeit
111. ems GmbH Wiesbaden Nordenstadt Deutschland 35 3 Material und Methoden Chemikalie L Selektin Fc Chim ren rekombinant murin Magnesiumchlorid Hexahydrat Mangan II chlorid Dihydrat Methanol Mowiol Natriumazid Natriumchlorid tri Natriumcitrat Dihydrat di Natriumhydrogenphosphat Natriumhydroxid Penicillin Streptomycin L sung P0781 Pepstatin Phalloidin Fluorescein Isothiocyanate Labeled P Selektin Fc Chim ren rekombinant human P Selektin Fc Chim ren rekombinant murin RLT Puffer 36 Hersteller R amp D Systems GmbH Wiesbaden Nordenstadt Deutschland Merck KGaA Darmstadt Deutschland Merck KGaA Darmstadt Deutschland Merck KGaA Darmstadt Deutschland Sigma Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen Deutschland Janssen Chimica Beerse Belgien Merck KGaA Darmstadt Deutschland KMF Laborchemie Handels GmbH Lohmar Deutschland Merck KGaA Darmstadt Deutschland ACROS Organics Geel Belgien Sigma Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen Deutschland Sigma Aldrich Taufkirchen Deutschland Sigma Aldrich Taufkirchen Deutschland R amp D Systems GmbH Wiesbaden Nordenstadt Deutschland R amp D Systems GmbH Wiesbaden Nordenstadt Deutschland Qiagen Hilden Deutschland 3 Material und Methoden Chemikalie RPMI 1640 Medium R8758 Schwefels ure 95 97 Sepharose 4B siGLO Green Transfection Indicator TNF a TRAP 14 Trifluoracetat Trypsin
112. en antikoagulatorische Eigenschaften auf haben aber trotzdem eine Selektin Bindungsf higkeit und reduzieren die Metastasierung in vivo Neben der Inhibition von P und L Selektin kommt es durch die Gabe von Heparin auch zur Inhibition von tumorzellexprimierenden Enzymen wie beispielsweise der Heparanase Durch die Sezernierung von Heparanase ist es Tumorzellen m glich die ECM zu degradieren und so verst rkt zu migrieren Heparin inhibiert die Bildung von Thrombin wodurch eine verminderte Generierung von Fibrin und damit einhergehend eine verringerte Entstehung von an der Metastasierung beteiligten Mikrothromben erfolgt Desweiteren wird die Thrombin vermittelte Aktivierung von Thrombozyten ber PAR Rezeptoren reduziert s Kapitel 2 6 6 Anhand des LMWH Tinzaparin wurde ein weiterer Mechanismus der antimetastatischen Aktivit t postuliert Durch Freisetzung von Tissue Factor pathway inhibitor TFPI aus Endothelzellen und der damit verbundenen Hemmung des Komplexes aus TFP und Faktor VIIa inhibiert Tinzaparin den Angiogeneseprozess Nachgeschaltet hat dies auch eine Reduktion der Thrombinaktivierung zur Folge Als weiterer Effekt wird die Bindung von Heparin an bFGF basic fibroblast growth factor beschrieben bFGF vermittelt ber die Bindung und Agonisierung des bFGF Rezeptors proliferative und migratorische Stimuli in Krebszellen die somit durch Heparinbindung inhibiert werden Auch werden weitere Wa
113. en als HDACi x bezeichnet in die Untersuchungen mit einbezogen Nach durchgef hrten MTT Assays wurde eine subtoxische Konzentration von 10 nM eingesetzt und es wurden Inkubationszeiten von 72 bzw 96 Std gew hlt Auch wurde zur Testung der Konzentrationsabh ngigkeit eine Konzentration von 1 nM verwendet 100 80 A MV3 stimuliert mit Mn v MV3 x 1 nM 96 Std Inkubation stim A MV3 x 10 nM 72 Std stim MV3 x 10 nM 96 Std stim O MV3 unstimuliert on o 40 Adh sion 20 Zeit s Abbildung 4 50 Einfluss des HDACi x x auf das Adh sionsverhalten der MV3 Zellen an VCAM 1 Unterschiedlich lange Inkubationszeitr ume zeigten keine Unterschiede in der vermittelten Inhibition Konzentrationen von 1 nM wiesen keinen inhibitorischen Effekt mehr auf 124 4 Ergebnisse und Diskussion Wie in Abbildung 4 50 ersichtlich kam es durch den Einsatz der 10 nM Konzentration sowohl nach 72 als auch nach 96 Std zu einer signifikanten Verminderung der Adh sion der MV3 Zellen an immobilisiertem VCAM 1 Die Inkubationsdauer vermittelte hier keine Unterschiede Eine Inkubation mit einer Konzentration von 1 nM hingegen hatte keinen Einfluss auf die Bindung der MV3 Zellen Der Schwellenwert f r eine effektive Inhibition scheint also im niedrigen nanomolaren Bereich zwischen Konzentrationen von 1 und 10 nM zu liegen Der f r TSA konstatierte Effekt auf die Adh sion l sst sich somit auch mit
114. enfache anstieg 103 4 Ergebnisse und Diskussion 104 4 2 4 4 Betrachtung des Aktinzytoskeletts nach LPC Inkubation Die vermehrte Bildung von Filopodien auf der Zellmembran infolge einer LPC Inkubation erweist sich zwar als ein hochinteressantes morphologisches Ph nomen welches auch f r eine reduzierte Zelladh sion partiell verantwortlich sein k nnte jedoch ergeben die elektronenmikroskopischen Untersuchungen keinerlei Hinweise f r deren Ursachen Es ist davon auszugehen dass die Filopodien durch das Vorantreiben zytoskelettaler Bestandteile in die Zellmembran gebildet wurden Um dies zu beweisen wurde das Aktinzytoskelett mit Phalloidin FITC markiert und die Zellproben mit einem Laserscanning Mikroskop untersucht Abbildung 4 33 Laserscanningmikroskopische Untersuchung von B16F10 Melanomzellen Durch eine LPC Inkubation von sechs Tagen kam es zur vermehrten Bildung von Aktinfilamenten an der Zellmembran rechte Bildh lfte Die erhaltenen Aufnahmen sind in Abbildung 4 33 dargestellt wobei links die unbehandelten und rechts die LPC inkubierten B16F10 Zellen abgebildet sind Eine vermehrte Lokalisation von Aktinfilamenten an der Zellmembran nach sechst giger Inkubation mit 450 uM LPC 4 Ergebnisse und Diskussion konnte sehr deutlich anhand einer verst rkten Fluoreszenz an der Zelloberfl che gezeigt werden LPC scheint also eine Aktin Nucleation an der Zellmembran durch einen bislang unbekannten Mechanismus zu
115. ents j L B16F10 LPC LA B16F10 B16F10 P CA P Selekti AS ne id FL1 H FL1 H Kontrolle 4 Kontrolle A FE oe Kontrolle Wa B16F10 a ne N B16F10 VLA 4 1 B16F 10 LPC E f P Sekin gt n VCAM BI6F10 Zi 5 A z AN v au a Dih B16F10 LAC P N B16F10 LPC f J P Selektin A y f vas f d 4 IX Fi J 1 HA A j N Pi d Q _ b 20 _ FL1 H FL1 H FL1 H Abbildung 4 19 Expression von Adh sionsrezeptoren nach LPC Inkubation f r 13 Tage mit 300 uM A C und 450 uM LPC D F Die Expression von VLA 4 war nicht beeinflusst durch Inkubation mit 300 uM A und 450 uM D LPC Die Bindung von VCAM 1 an VLA 4 zeigte sich durch die LPC Inkubation leicht eingeschr nkt B und D Die Bindung von rekombinantem l slichem P Selektin war durch die LPC Behandlung nicht betroffen C und F Es waren keine Verschiebungen der Histogrammkurven im Vergleich zu unbehandelten B16F10 Zellen zu erkennen Bei Verwendung des nat rlichen Liganden VCAM 1 war eine geringe Linksverschiebung der LPC behandelten B16F10 Zellen zu verzeichnen sowohl bei einer 300 uM als auch einer 450 uM Konzentration s Teilabbildungen B und E Diese nicht signifikanten Unterschiede lassen sich wahrscheinlich durch eine verminderte Zug nglichkeit des VLA 4 auf der Oberfl che der B16F10 Melanomzellen erkl ren Die P Selektin Ligand Expression schien bei beiden Konzentrationen unbeeinflusst zu sein die durchflusszyt
116. er Grad an Desulfatierung in Position 6 also tolerabel 78 4 Ergebnisse und Diskussion was mit der Inhibition von P Selektin kongruent ist Eine Desulfatierung auf 42 in Position 6 verbessert die P Selektin Inhibitionsfahigkeit sogar geringfiigig wohingegen die L Selektin Inhibition verringert ist Komplett desulfatiertes Heparin vermag weder P noch L Selektin zu inhibieren Heparinderivate die in Position 2 zu verschiedenen Ausma en desulfatiert waren konnten die VLA 4 VCAM 1 Wechselwirkung kaum inhibieren s Abbildung 4 11 Hier hatte der Grad der Desulfatierung keinen oder nur einen u erst geringen Einfluss auf das Inhibitionspotential Auch sind diese Derivate nicht in der Lage eine P und L Selektin Inhibition zu vermitteln 100 80 y 4 MV3 stimuliert with Mn 60 MV3 stim 2 O des H 83 y MV3 stim 2 O des H 68 A MV3 stim 2 O des H 53 O MV3 unstimuliert Adhasion Zeit s Abbildung 4 11 Einfluss der Desulfatierung in Position 2 des Heparingrundgeriistes auf die Adh sion von MV3 Melanomzellen Schon ein zu 50 desulfatiertes Derivat vermag die VLA 4 VCAM 1 Wechselwirkung nur noch bedingt zu inhibieren 4 1 2 5 Charakterisierung der Heparin Bindungsstelle am VLA 4 Die Bindung von Heparin an murines VLA 4 und wie hier best tigt auch humanes VLA 4 wurde erstmals von unserer Arbeitsgruppe beschrieben weitergehende Info
117. erimentelle Pharmakologie und Onkologie in Berlin durch Nacktm usen wurden 1 x 10 MV3 Melanomzellen in 0 4 mL PBS Puffer in die Schwanzvene injiziert Neben der Kontrollgruppe wurde einer Mausgruppe 30 min vor Tumorzellapplikation 10 mg kg K rpergewicht Natalizumab injiziert Die dritte Gruppe erhielt mit 5 ug Natalizumab pr inkubierte MV3 Zellen Nach 31 Tagen wurden die M use get tet und die Zahl und Gr e der Lungenmetastasen wurde ausgewertet Dabei konnte f r beide Verumgruppen eine signifikante Reduktion der Metastasierung im Vergleich zur Kontrollgruppe verzeichnet werden wobei die M use die mit Natalizumab pr inkubierte MV3 Zellen injiziert wurden die geringste Zahl an pulmonalen Metastasen aufwiesen Dargestellt in Abbildung 4 13 ist der Median der Score Werte der einzelnen Gruppen berechnet aus Gr e und Anzahl der pulmonalen Metastasen Median der Lungenmetastasen Kontrollgruppe Natalizumab 30 min MV3 pr inkubiert vor MV3 Applikation mit Natalizumab Abbildung 4 13 Median der Score Werte der Lungenmetastasen MV3 Zellen die mit Natalizumab pr inkubiert wurden wiesen die geringste Zahl an Metastasen in der Lunge auf Dieser Versuch zeigte deutlich die Involvierung des VLA 4 im Prozess der h matogenen Metastasierung der MV3 Melanomzellen und rechtfertigte die weiteren in vivo 81 4 Ergebnisse und Diskussion 82 Untersuchungen zur Evaluierung der inhibitorischen Wirkung von Heparin Da das fra
118. erminderte Fluoreszenzintensit t die f r eine geringere VLA 4 Expression spricht war bei den siRNA gegen VLA 4 behandelten MV3 Zellen zu verzeichnen Die Kontroll siRNA hatte nur einen marginalen Einfluss auf die Expression die Fluoreszenzintensit ten waren h her als f r unbehandelte MV3 Zellen 4 Ergebnisse und Diskussion 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 Fluoreszenzintensitat 1000 500 MV3 MV3 Kontroll MV3 siRNA siRNA gegen VLA 4 Abbildung 4 4 Durchflusszytometrische Bestimmung der VLA 4 Expression 72 Std nach siRNA Zugabe Eine verminderte Expression ist detektierbar Bei den anschlie end durchgef hrten Adh sionsuntersuchungen zeigte sich dass durch den Einsatz von Mn Ionen eine Verst rkung der Adh sion durch Affinit ts als auch durch Avidit tserh hung des VLA 4 zu verzeichnen war s Abbildung 4 5 Der Einsatz von siRNA gerichtet gegen VLA 4 mRNA hatte eine starke Verminderung der Adh sion der MV3 Zellen unter das Niveau der nicht aktivierten Zellen zur Folge was eindrucksvoll die Dominanz des VLA 4 f r die Bindungsf higkeit der MV3 Zellen in diesem Assay unter Beweis stellt Die mit Kontroll siRNA behandelten MV3 Zellen zeigten zwar auch eine geringf gig verminderte Adh sionsf higkeit die sich jedoch nicht signifikant von den unbehandelten Mn stimulierten MV3 Melanomzellen unterschied 80 A MV3 stimuliert mit Mn MV3 Kontroll siRNA stimuli
119. ermittelte Bindung der MV3 Melanomzellen Auch das Pentasaccharid Fondaparinux vermochte die Bindung der MV3 Zellen nicht zu inhibieren Hier best tigten und erkl rten sich die in Kapitel 4 1 2 1 erhaltenen Ergebnisse Erst Derivate mit Kettenl ngen von 14 bis 18 Saccharideinheiten zeigten ein geringes inhibitorisches Potential Diese Kettenl ngen scheinen also einen Schwellenwert f r eine effektive Inhibition darzustellen F r die Inhibition von P und L Selektin gen gen hingegen bereits Heparinderivate mit einer Kettenl nge von mindestens vier Monosaccharideinheiten 4 Ergebnisse und Diskussion A MV3 stimuliert mit Mn 4 MV3 stimuliert 500 ug Fondaparinux gt MV3 stimuliert 500 ug Heparin bestehend aus 8 Saccharideinheiten lt MV3 stimuliert 500 ug Heparin bestehend aus 10 Saccharideinheiten MV3 stimuliert 500 ug Heparin bestehend aus 12 Saccharideinheiten v MV3 stimuliert 500 ug Heparin bestehend aus 14 16 18 S O MV3 unstimuliert Adh sion 2 Zeit s Abbildung 4 8 Einfluss der Kettenl nge auf die VLA 4 VCAM 1 Wechselwirkung Erst Derivate mit einer Kettenlange von 14 18 Saccharideinheiten vermochten die Adh sion der MV3 Melanomzellen zu minimieren 4 1 2 4 Beeinflussung des VLA 4 VCAM 1 Bindungsweges durch strukturell modifizierte Heparinderivate Neben der Charakterisierung des Einflusses der Molek lgr e des Heparins auf die VLA 4 VCA
120. erschiedener Membraneigenschaften nach LPC Inkubation 4 2 4 1 Bestimmung der Integrinverteilung auf B16F10 Melanomzellen nach LPC Inkubation Mit der Annahme dass es durch den vermehrten LPC vermittelten Einbau von ges ttigten Phospholipiden zu einer Rigidit tsver nderung der Zellmembran kommt k nnten auch die Befunde der verminderten Adh sionsf higkeit von LPC inkubierten B16F10 Melanomzellen erkl rt werden s Kapitel 4 2 3 So kann beispielsweise die freie Beweglichkeit von VLA 4 Molek len in der Zellmembran gest rt sein was sich in einer verringerten Funktionalit t u ert Eine vermehrte oder abgeschw chte VLA 4 Clusterbildung durch die ver nderte Membranzusammensetzung ist ebenfalls denkbar Dies wurde nach Markierung der membranst ndigen VLA 4 Molek le mittels FITC gelabelter Antik rper und anschlie ender fluoreszenzmikroskopischer Betrachtung untersucht LPC behandelte und unbehandelte B16F10 Zellen 450 uM f r f nf Tage wurden mit einem prim ren Antik rper gegen VLA 4 und einem sekund ren Antik rper gegen den Fc Teil des prim ren gelabelt und anschlie end durch ein Konfokales Laserscanning Mikroskop betrachtet s Abbildung 4 28 Es konnten allerdings keine Unterscheide in der Verteilung des VLA 4 gefunden werden 97 4 Ergebnisse und Diskussion 98 Abbildung 4 28 Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme mittels Laserscanning Mikroskop von B16F10 Melanomzellen auf deren Oberfl che das Integrin VLA
121. erseits sollten auch verschiedene Inkubationszeit r ume untersucht werden Daher wurden MV3 Zellen f r drei bzw sieben Tage mit jeweils 300 uM bzw 450 uM LPC inkubiert Da sich auch w hrend des normalen Zellwachstums eine Ver nderung der Genexpression ergeben kann z B bei zunehmender Konfluenz durch vermehrte Bildung von Zell Zell Kontakten wurden f r die genannten Zeitr ume zus tzlich unbehandelte MV3 Zellen analysiert Zur besseren bersicht sind die Versuchsans tze in Kapitel 3 14 tabellarisch dargestellt Analysiert wurden jeweils Triplikate der einzelnen Ans tze wobei jeweils behandelte und unbehandelte Zellen miteinander verglichen wurden so dass insgesamt vier Vergleiche resultierten Durch die Software detektiert wurden jeweils die Gene die um den Faktor 1 5 im Vergleich zu den unbehandelten Zellen dereguliert waren Im Ergebnis ergaben sich 32 Gene die jeweils in allen vier Vergleichen dereguliert waren Dabei konnte f r 18 Gene eine verst rkte Expression und f r 14 Gene eine verminderte Expression ermittelt werden Im Rahmen dieser Arbeit soll nur auf die Gene eingegangen werden die in unmittelbarem Zusammenhang mit Integrinen stehen oder solche die einen Einfluss auf die Formation des Zytoskeletts vermitteln In Abbildung 4 41 exemplarisch dargestellt ist die Expression der Proteine Rho A und B als Vertreter der kleinen GTPasen Die Proteine der Rho Familie sind ma geblich an der Organisation und Formation des Aktinzy
122. ert Als Grund f r verringerte LPC Konzentrationen wird einerseits ein verst rkter Lipidkonsum von Tumorzellen im Vergleich zu nicht entarteten Zellen vorgeschlagen So konnte f r transfizierte HeLa Zellen eine verst rkte LPC Metabolisierung aus dem Kulturmedium beobachtet werden Eine mit dem Onkogen Ras transfizierte Keratinozytenzelllinie zeigte eine Aktivit tssteigerung des f r die Phospholipidbiosynthese verantwortlichen Enzyms Phosphocholin Cytidyltransferase hnliche Ergebnisse konnten bei einer Ras transfizierten murinen Fibroblastenzelllinie erhalten werden Hier waren die Cholin Kinase und die Phospholipid degradierende Phospholipase A in ihren Aktivit ten hochreguliert 2 Theoretischer Teil Eine direkte Reacylierung von LPC zu PC und einer damit verbunden Gr enzunahme der Zellen Konnte anhand der Kolorektalkarzinom Zelllinie SW480 gezeigt werden Andererseits ist eine berexpression von Autotaxin bzw der Lysophospholipase D f r viele Tumorzellen beschrieben so dass ein enzymatischer Abbau des LPC zu LPA durch diese Enzyme f r die Konzentrationsabnahme des LPC angenommen wird Auch hier bedarf es weiterf hrender Untersuchungen 2 4 4 Lysophosphatidylcholin und Metastasierung Wie in Kapitel 2 4 3 beschrieben kann LPC die Migration von T Zellen intensivieren Eine Beeinflussung der Tumorzellmigration von LPC wird kritisch diskutiert eine Studie zeigt eine Verminderung der
123. ert mit Mn oO MV3 unstimuliert e MV3 siRNA stimuliert mit Mn a oO Adh sion N oo Zeit s Abbildung 4 5 Einfluss von Mn Stimulation und siRNA Behandlung auf die Zelladh sion an VCAM 1 Mn Stimulation erh hte die Zahl adh rierender Zellen w hrend siRNA sie signifikant verminderte 23 4 Ergebnisse und Diskussion 4 1 2 Die Inhibitionswirkung von strukturell modifizierten Heparinderivaten auf die VLA 4 vermittelte Zelladh sion von MV3 Zellen unter physiologischen Flussbedingungen 4 1 2 1 Charakterisierung des Adh sionsverhaltens von MV3 Melanomzellen an HUVEC unter physiologischen Flussbedingungen Um den Beitrag der VLA 4 VCAM 1 Wechselwirkung an der Melanomzelladh sion am vaskul ren Endothel zu charakterisieren und damit die Relevanz einer VLA 4 Inhibition f r antimetastatische Prinzipien zu untersuchen wurden MV3 Bindungsexperimente an HUVEC Endothelzellen durchgef hrt Dabei wurde die HUVEC 4 Std vor Versuchsbeginn mit TNF a 10 ug ml stimuliert Dadurch wurde eine Expression von Adh sionsrezeptoren bzw deren Liganden auf der Endotheloberfl che forciert Zur Inhibierung der Adh sion kamen Antik rper gegen P Selektin und VLA 4 fraktioniertes und unfraktioniertes Heparin sowie das synthetisch hergestellte Pentasaccharid Fondaparinux zum Einsatz 100 95 A MV3 stimuliert mit Mn A MV3 stimuliert anti P Sel Ak lt MV3 stimuliert
124. erung der Filopodien auf B16F10 Melanomzellen 4 2 4 4 Betrachtung des Aktinzytoskeletts nach LPC Inkubation 4 2 5 Einfluss verschiedener Lipidderivate bzw Lipidmetabolite auf die Zelladh sion von B16F10 Melanomzellen nnnsneeeeneeenn 4 2 5 1 Beeinflussung des VLA 4 VCAM 1 Bindungsweges durch Hexa decylphosphocholin unter physiologischen Flussbedingungen 4 2 5 2 Beeinflussung des VLA 4 VCAM 1 Bindungsweges durch Glycerophosphocholin unter physiologischen Flussbedingungen 4 2 6 Beeinflussung des VLA 4 VCAM 1 Bindungsweges von B16F10 Melanomzellen durch Kombinationen aus LPC und Heparin 4 2 7 Beeinflussung des VLA 4 VCAM I Bindungsweges von MV3 Melanomzellen durch LPC unter physiologischen Flussbedingungen n 4 2 8 Untersuchung des Transkriptoms von MV3 Melanomzellen nach LPC Inkubation mittels Genexpressionsanalyse 4 2 9 In vivo Untersuchung des LPC Effektes auf B16F10 Melanomzellen in einem Mausmodell 4 2 10 Verallgemeinerung des LPC Effektes auf verschiedene Tumorentit ten 106 107 108 110 112 116 118 4 3 Untersuchung des Einflusses von Histon Deacetylase Inhibitoren auf die Adh sions wirkung verschiedener Krebszelllinien als potentiell antimetastatischer Therapieansatz 122 4 3 1 Beeinflussung des VLA 4 VCAM 1 Bindungsweges von MV3 Zellen durch verschiedene Inkubationszeiten und verschiedene Konzentrationen an TSA ST71 und HDACi x nennnssnnenseenseensneennsnnnnsnnnnnnnnn 4 3 2 Einfluss von TSA
125. es Europe BV Leiden Niederlande Merck KGaA Darmstadt Deutschland Sch rfe System GmbH Reutlingen Deutschland Pierce ThermoScientific Bonn Deutschland Riedel de Ha n Seelze Deutschland Applied Biosystems Darmstadt Deutschland ACROS Organics Geel Belgien Avanti Polar Lipids Inc Alabaster AL USA 3 Material und Methoden Chemikalie D MEM Media GlutaMAX D MEM low glucose D5546 Dimethylsulfoxid EDTA L sung 0 02 E8008 Ethanol 96 V V technisch FACS Clean FACS Flow FACS Rinse Fetales K lberserum Flexi Tube siRNA Fibronectin from bovine plasma D Glucose Monohydrat L Glutamin 200 mM G7513 Kaliumdihydrogenphosphat Leupeptin L Selektin Fc Chim ren rekombinant human Hersteller Invitrogen GmbH Karlsruhe Deutschland Sigma Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen Deutschland ACROS Organics Geel Belgien Sigma Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen Deutschland Hofmann Chemie Import Export GmbH Hamburg Deutschland BD Biosciences Heidelberg Deutschland BD Biosciences Heidelberg Deutschland BD Biosciences Heidelberg Deutschland Sigma Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen Deutschland Qiagen Hilden Deutschland Sigma Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen Deutschland Merck KGaA Darmstadt Deutschland Sigma Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen Deutschland Merck KGaA Darmstadt Deutschland Sigma Aldrich Taufkirchen Deutschland R amp D Syst
126. eweiligen Gens geschlossen werden Durch anschlie enden Abgleich von LPC behandelten mit unbehandelten Ans tzen kann eine Deregulierung quantifiziert werden Nur eine LPC Inkubation mit 450 uM LPC f r sechs Tage zeigte eine verminderte mRNA Menge sowohl f r die o4 als auch f r die B Untereinheiten Auf mRNA Ebene zeigten sich auch nur geringe Unterschiede in der Transkriptmenge von a4 ITGA4 und B Untereinheiten ITGB1 s Abbildung 4 42 Bei LPC Inkubationszeiten von drei Tagen waren so gut wie keine Unterschiede detektierbar Bei Inkubationszeitr umen von sechs Tagen indes waren Unterschiede nur f r LPC Konzentrationen von 450 uM 115 4 Ergebnisse und Diskussion 116 konstatierbar Hier kam es zu einer Herabregulation der Expression um maximal 20 30 sowohl f r die a4 als auch fiir die B Untereinheiten Da auf Proteinebene auch nur u erst geringe Unterschiede in der VLA 4 Expression festgestellt werden konnten und eine Bindung des l slichen physiologischen Liganden VCAM 1 auch kaum eingeschr nkt war k nnen die stark ausgepr gten Einfl sse der LPC Inkubation auf die Adh sion der MV3 Zellen an VCAM 1 unter Flussbedingungen nicht mit einer verminderten Expression der VLA 4 Untereinheiten erkl rt werden M glicherweise tr gt die leichte Reduktion der Expression marginal zu den beobachteten Effekten bei Die Hauptursache der verminderten Adh sion d rfte in anderen Mechanismen begr ndet liegen 4 2 9 In vi
127. g receptor zugeschrieben Durch Sequenzvergleiche von OGRI mit anderen GPCRs wurden die Rezeptoren G2A und GPR4 als hochaffine Rezeptoren f r LPC im Jahr 2001 deorphanisiert Sie sind an Gg Gi bzw Gj23 Proteine gekoppelt und aktivieren bei Stimulation die Phospholipase C die durch Inositoltriphosphat IP3 die Freisetzung von Ca aus intrazellul ren Speichern mediiert G2A wird u a in der Milz im 213 214 p mente Thymus auf T und B Lymphozyten Monozyten und Makrophagen exprimiert ie Expression von G2A kann durch den Einsatz von DNA sch digenden Agenzien forciert 214 Lin et al konnten eine werden Ein G2A Agonismus f hrt dann zum Zellzyklusarrest G2A vermittelte Einleitung der Apoptose in HeLa Zellen bereits bei Konzentrationen von 0 01 bis 0 5 uM LPC zeigen Kabarowski et al konnten eine G2A vermittelte Aktivierung der GTPase RhoA in transfizierten Fibroblasten mit einhergehender Bildung von Stressfibern demonstrieren Auch wird RhoA vermittelt eine Aktivierung des Serum Response Faktor 2 Theoretischer Teil beobachtet der einen Einfluss auf die Genexpression aus bt In G2A berexprimierenden DO11 10 Zellen konnte LPC die Transmigration im Vergleich zu wildtyp Zellen stimulieren Der Rezeptor GPR4 wird in vielen Geweben z B in der Leber Lunge Lymphknoten Aorta Plazenta Milz und Prostata exprimiert um nur einige Beispiele zu nennen Eine Aktivierung du
128. gte sich eine geringere Oberfl chenausdehnung bei gr erem Durchmesser Wie in Abbildung 4 25 zu erkennen waren die LPC inkubierten B16F10 Zellen durchschnittlich ca 2 uM gr er als unbehandelte Zellen Bei Betrachtung der Fl chenausdehnung stellte sich ein kontr res Bild dar Die unbehandelten Zellen waren geringf gig gr er als LPC inkubierte Zellen Daraus l sst sich schlussfolgern dass die Adh sion an Fibronektin durch die LPC Inkubation vermindert war Dies spricht f r ein Abkugeln der Zellen und schlie lich f r eine gest rte VLA 4 Rezeptorfunktion 4 2 3 6 Einfluss des LPC auf die Migrationseigenschaften von B16F10 Melanomzellen Mithilfe des SACED Assays wurde ebenfalls der LPC vermittelte Einfluss auf die Migration von B16F10 Melanomzellen untersucht Zu diesem Zweck wurden B16F10 Melanomzellen f r drei Tage mit 450 uM LPC inkubiert und auf eine Fibronektin Matrix berf hrt auf der anschlie end die migrationsbeschreibenden Parameter ermittelt wurden Einerseits wurde die 95 4 Ergebnisse und Diskussion Dynamik der Zelllamelle hinsichtlich ihrer Protrusions und Retraktionsbewegung untersucht und quantifiziert andererseits wurde die Ruffledynamik betrachtet Ruffles sind lamellenartige Zellausst lpungen die sich vertikal und nicht horizontal erstrecken xx P 1 5 Geschwindigkeit um min 5 oO a oO B16F10 Protrusion B16F10 LPC Protrusion B16F10 Retraktion Retraktion
129. h acute leukemia Biochim Biophys Acta 1737 11 15 2005 Raffelt K et al Systemic alterations in phospholipid concentrations of blood plasma in patients with thyroid carcinoma an in vitro 31 P high resolution NMR study NMR Biomed 13 8 13 2000 Takatera A et al Quantification of lysophosphatidylcholines and phosphatidylcholines using liquid chromatography tandem mass spectrometry in neonatal serum J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 838 31 36 2006 Takatera A et al Blood lysophosphatidylcholine LPC levels and characteristic molecular species in neonates prolonged low blood LPC levels in very low birth weight infants Pediatr Res 62 477 482 2007 Cunningham T J Yao L amp Lucena A Product inhibition of secreted phospholipase A2 may explain lysophosphatidylcholines unexpected therapeutic properties J Inflamm Lond 5 17 2008 Thi s F Delachambre M C Bentejac M Lagarde M amp Lecerf J Unsaturated fatty acids esterified in 2 acyl l lysophosphatidylcholine bound to albumin are more efficiently taken up by the young rat brain than the unesterified form J Neurochem 59 1110 1116 1992 Scott G A Arioka M amp Jacobs S E Lysophosphatidylcholine mediates melanocyte dendricity through PKCzeta activation J Invest Dermatol 127 668 675 2007 Scott G A Jacobs S E amp Pentland A P sPLA2 X stimulates cutaneous melanocyte dendricity and pigmentation through a lysophosp
130. h ist und auch eine MIDAS aufweist Bei einer a Integrinuntereinheit die keine I Dom ne aufweist ist die I like Dom ne zusammen mit dem Propeller an der Ligandbindung beteiligt Ist jedoch eine I Dom ne vorhanden so bernimmt die I like Dom ne einen regulatorischen Einfluss auf die Ligandbindung Der I like Dom ne schlie t sich proximal eine cysteinreiche Stelzenregion an die durch transmembran re und zytoplasmatische Dom nen in der Zellmembran verankert ist Eine Erh hung der Affinit t eines Integrins wird einerseits durch eine Spreizung und einer damit verbundenen Aufrichtung der Integrin Untereinheiten bewerkstelligt andererseits durch 2 Theoretischer Teil Zugbewegungen innerhalb der Untereinheiten wodurch die Ligandbindungsstelle freigelegt wird Bildlich dargestellt in Abbildung 2 2 sind sowohl die Affinit ts als auch die Avidit tserh hung Das inside out signalling kann wie bereits erw hnt durch Chemokine erfolgen jedoch auch artifiziell durch Mn Ionen herbeigef hrt werden Eine Assoziation von intrazellul ren Proteinen wie Talin oder Kindlin an den zytoplasmatischen C Terminus der Integrin B Untereinheit bewirkt eine Erh hung der Affinit t se ion der Affinit t ali inaktiver intermedi rer aktivierter Zustand Zustand Zustand Clusterbildung BI AIG Abbildung 2 2 Affinit ts und Avidit tserh hung von Integrinen a Regulierung der Affinit t durch Aufrichtung b Reg
131. hanism of filopodia initiation by reorganization of a dendritic network J Cell Biol 160 409 421 2003 Krugmann S et al Cdc42 induces filopodia by promoting the formation of an IRSp53 Mena complex Curr Biol 11 1645 1655 2001 Jaffe A B amp Hall A Rho GTPases biochemistry and biology Annu Rev Cell Dev Biol 21 247 269 2005 Olofsson B Rho guanine dissociation inhibitors pivotal molecules in cellular signalling Cell Signal 11 545 554 1999 Ridley A J Rho family proteins coordinating cell responses Trends Cell Biol 11 471 477 2001 Wennerberg K amp Der C J Rho family GTPases it s not only Rac and Rho and I like it J Cell Sci 117 1301 1312 2004 6 Literaturverzeichnis 260 261 262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 272 Roberts P J et al Rho Family GTPase modification and dependence on CAAX motif signaled posttranslational modification J Biol Chem 283 25150 25163 2008 Marks P A amp Dokmanovic M Histone deacetylase inhibitors discovery and development as anticancer agents Expert Opin Investig Drugs 14 1497 1511 2005 Xu W S Parmigiani R B amp Marks P A Histone deacetylase inhibitors molecular mechanisms of action Oncogene 26 5541 5552 2007 Chen B amp Cepko C L HDAC4 regulates neuronal survival in normal and diseased retinas Science 323 256 259 2009 Li B et al FOXP3 interactions with histone
132. hatidylcholine dependent mechanism J Invest Dermatol 126 855 861 2006 Sakai M et al Lysophosphatidylcholine plays an essential role in the mitogenic effect of oxidized low density lipoprotein on murine macrophages J Biol Chem 269 31430 31435 1994 Sakai M et al Lysophosphatidylcholine potentiates the mitogenic activity of modified LDL for human monocyte derived macrophages Arterioscler Thromb Vasc Biol 16 600 605 1996 Ngwenya B Z amp Yamamoto N Effects of inflammation products on immune systems Lysophosphatidylcholine stimulates macrophages Cancer Immunol Immunother 21 174 182 1986 147 6 Literaturverzeichnis 148 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 Quinn M T Parthasarathy S amp Steinberg D Lysophosphatidylcholine a chemotactic factor for human monocytes and its potential role in atherogenesis Proc Natl Acad Sci U S A 85 2805 2809 1988 McMurray H F Parthasarathy S amp Steinberg D Oxidatively modified low density lipoprotein is a chemoattractant for human T lymphocytes J Clin Invest 92 1004 1008 1993 Ohara Y Peterson T E Zheng B Kuo J F amp Harrison D G Lysophosphatidylcholine increases vascular superoxide anion production via protein kinase C activation Arterioscler Thromb 14 1007 1013 1994 Rong J X Berman J W Taubman M B amp Fisher E A Lysophosphatidylcholine stimulates monocy
133. hatidylcholine lysoPC in ovarian cancer patients Int J Cancer 71 31 34 1997 Geilen C C Wieder T Boremski S Wieprecht M amp Orfanos C E c Ha ras oncogene expression increases choline uptake CTP phosphocholine cytidylyltransferase activity and phosphatidylcholine biosynthesis in the immortalized human keratinocyte cell line HaCaT Biochim Biophys Acta 1299 299 305 1996 Teegarden D Taparowsky E J amp Kent C Altered phosphatidylcholine metabolism in C3H10T1 2 cells transfected with the Harvey ras oncogene J Biol Chem 265 6042 6047 1990 Mansilla F et al Lysophosphatidylcholine acyltransferase 1 LPCAT1 overexpression in human colorectal cancer J Mol Med 87 85 97 2009 Kishi Y et al Autotaxin is overexpressed in glioblastoma multiforme and contributes to cell motility of glioblastoma by converting lysophosphatidylcholine to lysophosphatidic acid J Biol Chem 281 17492 17500 2006 Yang Y Mou L Liu N amp Tsao M S Autotaxin expression in non small cell lung cancer Am J Respir Cell Mol Biol 21 216 222 1999 Quifiones L G amp Garcia Castro I Characterization of human melanoma cell lines according to their migratory properties in vitro In Vitro Cell Dev Biol Anim 40 35 42 2004 151 6 Literaturverzeichnis 152 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 Bartolom R A Wright N Molin
134. hes Verhalten als hnlich zu erachten Durchgef hrt wurden die Untersuchungen mit einem Apoptose Array mittels einer antik rperbeschichteten Membran die hochaffin und quantitativ apoptoserelevante Proteine im Zelllysat bindet und immobilisiert s Kap 3 11 2 Durch Biotin gelabelte sekund re Antik rper und Streptavidin gebundene Meerrettichperoxidase war schlie lich eine Quantifizierung der gebundenen Proteine sowohl f r LPC behandelte als auch f r LPC unbehandelte Zellen m glich Nach Auswertung war kein signifikanter Unterschied in der Menge apoptoserelevanter Proteine oder deren Spaltprodukte detektierbar Tendenziell l sst sich eine leicht erh hte Proteinmenge bei LPC behandelten Zellen nachweisen was jedoch nicht auf alle Proteine zutrifft An drei Beispielen soll dies exemplarisch gezeigt werden s Abbildung 4 18 S N a oO N o oa optische Dichte mm 2 gt oO a 0 00 MV3 MV3 LPC MV3 MV3 LPC MV3 MV3 LPC p21 p27 p53 Abbildung 4 18 Vergleich der Expression von apoptoserelevanten Proteinen in LPC behandelten und unbehandelten MV3 Melanomzellen Es waren keine signifikanten Unterschiede detektierbar Das Protein p53 wird konstitutiv von Zellen exprimiert aber auch permanent ubiquitinyliert und durch Proteasomen degradiert wodurch seine Funktion als Transkriptionsfaktor fiir zellzyklusinhibierende Proteine letztlich gehemmt wird Ist die Zelle allerdings oxidativem Stress ausgesetz
135. ibitor valproic acid and interferon alpha World J Urol 2010 doi 10 1007 s00345 010 0582 y Oertl A et al Altered expression of betal integrins in renal carcinoma cell lines exposed to the differentiation inducer valproic acid Int J Mol Med 18 347 354 2006 van Muijen G N et al Establishment and characterization of a human melanoma cell line MV3 which is highly metastatic in nude mice Int J Cancer 48 85 91 1991 Poste G Doll J Hart I R amp Fidler I J In vitro selection of murine B16 melanoma variants with enhanced tissue invasive properties Cancer Res 40 1636 1644 1980 Montesano R et al Increased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behavior of endothelial cells expressing the middle T oncogene Cell 62 435 445 1990 J ger E et al Identification of a naturally processed NY ESO 1 peptide recognized by CD8 T cells in the context of HLA B51 Cancer Immun 2 12 2002 Lydolph M C et al Alpha9betal integrin in melanoma cells can signal different adhesion states for migration and anchorage Exp Cell Res 315 3312 3324 2009 Chen W H et al Human pancreatic adenocarcinoma in vitro and in vivo morphology of a new tumor line established from ascites In Vitro 18 24 34 1982 6 Literaturverzeichnis 286 287 288 289 290 291 292 293 294 295 296 297 298 Yunis A A Arimura G K amp Russin D J Human pancreatic car
136. ical human melanoma models is based on inhibition of migration and microvascular arrest Clin Exp Metastasis 22 69 76 2005 Stevenson J L Choi S H amp Varki A Differential metastasis inhibition by clinically relevant levels of heparins correlation with selectin inhibition not antithrombotic activity Clin Cancer Res 11 7003 7011 2005 Miao H Q et al Inhibition of heparanase activity and tumor metastasis by laminarin sulfate and synthetic phosphorothioate oligodeoxynucleotides Int J Cancer 83 424 431 1999 Hostettler N et al P selectin and heparanase dependent antimetastatic activity of non anticoagulant heparins FASEB J 21 3562 3572 2007 6 Literaturverzeichnis 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 Lee A E Rogers L A Longcroft J M amp Jeffery R E Reduction of metastasis in a murine mammary tumour model by heparin and polyinosinic polycytidylic acid Clin Exp Metastasis 8 165 171 1990 Amirkhosravi A Mousa S A Amaya M amp Francis J L Antimetastatic effect of tinzaparin a low molecular weight heparin J Thromb Haemost 1 1972 1976 2003 Ludwig R J et al The ability of different forms of heparins to suppress P selectin function in vitro correlates to their inhibitory capacity on bloodborne metastasis in vivo Thromb Haemost 95 535 540 2006 Nelson R M et al Heparin oligosaccharides bind L and P selectin an
137. ich verschiedenen Stellen der Untereinheit binden und nicht um eine Bindungsstelle konkurrieren Hier bedarf es weiterf hrender Untersuchungen die aber durch das Fehlen von R ntgenstrukturanalysen oder der Nichtzug nglichkeit des VLA 4 f r strukturaufkl rende NMR Untersuchungen schwierig erscheinen m MV3 auf anti CD29 500 ug UFH 100 MV3 auf Natalizumab 500 pg UFH 80 Q relative Adh sion A o N 2 Zeit s Abbildung 4 12 Adh sionsuntersuchungen von MV3 Melanomzellen an Antik rpern gegen die a und Untereinheit anti CD29 und Natalizumab unter physiologischen Flussbedingungen zur n heren Charakterisierung der Heparinbindungsstelle Heparin bindet anscheinend eher an die a Untereinheit da die Adh sion st rker reduziert war als bei Versuchen mit Antik rpern gegen die B Untereinheit 4 Ergebnisse und Diskussion 4 1 3 Untersuchung der Relevanz der VLA 4 VCAM 1 Interaktion in einem Mausmodell mit modifizierten Heparinderivaten Die Rolle von Adh sionsrezeptoren im metastatischen Geschehen gilt als gesichert und konnte f r die Klasse der Selektine in vielen in vivo Modellen nachgewiesen werden Das Integrin VLA 4 hingegen wurde bisher nur unzureichend unter diesem Aspekt untersucht Daher wurde in einem ersten Mausversuch die Rolle des VLA 4 auf MV3 Melanomzellen im Prozess der h matogenen Metastasierung evaluiert Diese Experimente f hrte Dr Zeisig am Institut f r Exp
138. ie das schwach gelbe MTT in ein blau violettes wasserunl sliches Formazan berf hren Nach Zerst rung der Zellen und Freisetzung des Formazans k nnen das Vorhandensein und die Menge colorimetrisch an einem Plattenreader ausgewertet werden So kann der Konzentrationsbereich von Substanzen ermittelt werden in dem diese nicht toxisch auf Zellen wirken 3 5 2 Praktische Durchf hrung und Auswertung von MTT Assays Im Rahmen dieser Arbeit wurden MTT Assays nach folgendem Schema durchgef hrt Die zu untersuchenden Zellen wurden mit EDTA oder Trypsin von der Zellkulturflasche abgel st s Kapitel 3 2 1 und im CASY Zellz hlger t s Kapitel 3 2 3 quantifiziert Anschlie end fand eine Einstellung der Zellkonzentration auf 5 000 Zellen pro 90 uL N hrmedium statt 90 uL dieser Suspension wurden pro Well in 96 Well Mikrotiterplatten mit flachen B den pipettiert Der u ere Rand der Platte wurde mit PBS Puffer bef llt um Verdunstungseffekte zu vermeiden Die Platten wurden f r 24 Stunden im Inkubator bei einer Temperatur von 37 C und einem CO2 Gehalt von 5 mit dem Ziel belassen den Zellen eine Sedimentation auf und Adh sion am Boden der Mikrotiterplatte zu erm glichen Parallel fand die Herstellung der Verd nnungsreihen der zu untersuchenden Substanzen statt Nach 24 Stunden wurde das Medium aus der Platte entfernt durch 90 uL neues Medium ersetzt und 10 uL der Verd nnungen pro Well zugegeben Eine Reihe der Platte wurde als Kontrolle
139. il Lymphozyten entlang der Endothelzelloberfl che an die sich eine Integrin vermittelte feste Adh sion anschlie t Diesem Prozess folgt die Diapedese der Leukozyten ins lymphatische Gewebe wo u a die Antigenpr sentation stattfindet Zu den L Selektin Liganden z hlen das glycosylation depent cell adhesion molecule 1 GlyCAM 1 CD34 und Podocalyxin GlyCAM I1 ist entgegen anderer L Selektin Liganden nicht membranst ndig sondern wird im lymphatischen Gewebe sezerniert Daher ist die genaue Rolle bei der Leukozytenrekrutierung nicht abschlie end gekl rt CD34 das vor allem als Stammzellmarker bekannt ist wird wie Podocalyxin auch auf vaskul rem Endothel exprimiert Weitere L Selektin Liganden sind Nucleolin Endomucin und mucosal addressin cell adhesion molecule 1 MadCAM 1 das ebenfalls in der Lage ist mit Integrinen zu interferieren ouB7 253 Neben P Selektin bindet auch L Selektin an PSGL 1 Der Weg des L Selektin vermittelten Rollens von Leukozyten auf HEVs und anschlie enden homings in Lymphknoten kann ebenfalls von L Selektin exprimierenden malignen Lymphomen beschritten werden Hierbei kommt es zu einer verst rkten Metastasierung in den Lymphknoten die sich durch Gabe von Antik rpern gerichtete gegen L Selektin vermindern l sst L Selektin wird vor allem von Zellen leukozyt ren Ursprungs exprimiert Krebszelllinien nicht Iymphozyt ren Ursprungs weisen keine L Selektin Expression
140. indungsweges durch Glycerophosphocholin unter physiologischen Flussbedingungen Durch den rapiden Abbau von LPC und die Inkorporation der Fetts uren in die Zellmembran ist die M glichkeit einer extrazellul ren Anreicherung von Metaboliten wie beispielsweise Glycerophosphocholin im Kulturmedium gegeben Dieses k nnte zweiwertige Kationen wie Mn chelatieren Chelatiertes Mn ist dann nicht mehr in der Lage Integrine zu aktivieren Dies k nnte eine verminderte Adh sion von B16F10 Zellen in in vitro Untersuchungen 107 4 Ergebnisse und Diskussion erkl ren Daher wurden B16F10 Zellen vor Mn Stimulation mit Konzentrationen von 450 uM und 900 uM Glycerophosphocholin versetzt 80 Z i i 4 B16F10 stim Glycerophosphocholin 450 pM x 60 I m B16F10 stim Glycerophosphocholin 900 uM S A B16F10 stimuliert mit Mn 3 O B16F10 unstimuliert 3 40 Zeit s Abbildung 4 36 Einfluss von Glycerophosphocholin auf die Zelladh sion von B16F10 Melanomzellen an VCAM 1 unter Flussbedingungen Konzentrationen von 450 uM und 900 uM hatten keinen Einfluss auf die Adh sion Wie in Abbildung 4 36 zu erkennen ist hatte Glycerophosphocholin keinen Einfluss auf die Adh sion der B16F10 Melanomzellen an VCAM 1 unter Flussbedingungen Die Adh sion war sogar geringf gig st rker als von B16F10 Zellen ohne Glycerophosphocholin Eine Beeinflussung der Aktivierung der B16F10 Zellen und damit des Adh
141. iner Redistribution von Cholesterol in der Zellmembran f hrt So k nnte es durch LPC Administration zu einer Rigidit tssteigerung der Zellmembran und damit einhergehend zu einer verl ngerten Membranst ndigkeit von Rho GTPasen kommen was eine Aktin Nucleation und Filopodienbildung nach sich ziehen w rde Neben Proteinen die an der Organisation des Zytoskeletts beteiligt sind k nnte eine Ver nderung der Lipid Rafts auch einen Einfluss auf Proteine wie Integrine und Proteine die an der Integrin Aktivierung beteiligt sind nach sich ziehen Mehrere Gruppen haben die Lokalisation des Integrins VLA 4 in der Zellmembran untersucht Einige Studien konnten eindeutig die laterale Bewegung von VLA 4 in Lipid Rafts nach Aktivierung von T Lymphozyten zeigen Eine Zerst rung der Raft Strukturen hatte eine Abnahme der Integrin vermittelten Adh sion von T Lymphozyten zur Folge Eine Clusterung von Lipid Rafts mit darin enthaltenen VLA 4 Molek len f hrte wiederum zu einer verst rkten Adh sion Andere Gruppen hingegen konnten die Lokalisation von VLA 4 in Lipid Rafts in Lymphozyten im peripheren Blut nicht best tigen wohl aber die Notwendigkeit des Vorhandenseins von Rafts f r die VLA 4 Aktivierung So scheint der LPC vermittelte 105 4 Ergebnisse und Diskussion 106 Einfluss auf die Lipid Rafts urs chlich f r die Bildung von Filopodien als auch fiir die gest rte Integrin Funktion zu sein Der LPC Effekt auf die Adh sion k nnt
142. inger M Naggi A Torri G Zeisig R Alexander M Schmitz P Casu B Bendas G Blocking of integrin mediated human MV3 melanoma cell binding by commercial and modified heparins Int J Clin Pharmacol Ther 2010 Jul 48 7 448 50 Alexander M Schlesinger M Jantscheff P Massing U Bendas G Reduction in human melanoma cell adhesion receptor activity by lysophosphatidylcholine LPC treatment functional characterization and signal pathway analyses Int J Clin Pharmacol Ther 2010 Jul 48 7 478 80 Alexander M Schlesinger M Jantscheff P Massing U Bendas G Lysophosphatidylcholine LPC as a pharmacological molecule for the reduction of tumor cell adhesion and metastasis Pharmacol Ther 2010 im Druck Patente Europ isches Patent mit der Nummer 10156776 6 und dem Titel Combined use of phospholipids and sufate groups carrying polysaccharides for inhibiting metastatic spread 161 8 Publikationsliste 162 Preise Best Abstract Preis f r junge Wissenschaftler anl sslich der CESAR Jahrestagung Neue therapeutische Konzepte f r onkologische und h matologische Patienten 01 03 Juli 2010 St Gallen Schweiz Poster Simonis D Schlesinger M Alban S Rothe U Bendas G The detection of kinetic binding constants confirms the potency of heparin as selectin inhibitor DPhG Jahrestagung in Erlangen 2007 Poster Schlesinger M Fritzsche J Jantscheff P Massing U Bendas G Lysophosphatidylcholine inhibits VLA
143. ington Scientific Instruments Ltd Watford Gro britannien 3 Material und Methoden Ger t Trockenschrank T 5042 Ultraschallbad Bandelin Sonorex RK 102 H Universal 320R Zentrifuge Vacubrand BVC 21 Pumpe Videokamera CSC 795 PAL VX 95 Systec Wasserbad TW 12 Zentrifuge 5417C Zentrifuge Avanti J 25 Zentrifuge mini Spin Zentrifuge Universal 320 R Hersteller Heraeus Hanau Deutschland Bandelin electronic Berlin Deutschland Hettich AG Bach Schweiz Vacubrand GmbH Wertheim Deutschland Pacific Corporation Tokio Japan Systec GmbH Wettenberg Deutschland Julabo Labortechnik GmbH Seelbach Deutschland Eppendorf AG Hamburg Deutschland Beckman Instruments Inc Palo Alto CA USA Eppendorf AG Hamburg Deutschland Hettich Zentrifugen Tuttlingen Deutschland 33 3 Material und Methoden 3 1 2 Chemikalien Tabelle 3 2 Verwendete Chemikalien Chemikalie Aprotinin Bacillol AF B Mercaptoethanol Bors ure Bovines Serumalbumin Fraktion V gt 96 Calcein AM Calciumchlorid Dihydrat CASY ton L sung Chemiluminescence detection substrate Chloroform Cy3 Cyanurchlorid 1 2 Distearyl sn Glycero 3 Phosphocholin 34 Hersteller Sigma Aldrich Taufkirchen Deutschland Bode Chemie Hamburg Deutschland Sigma Aldrich Deisenhofen Deutschland Merck KGaA Darmstadt Deutschland Sigma Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen Deutschland Molecular Prob
144. inhergehend mit einer Gl ttung der Zellmembran mit zunehmender LPC Entzugszeit detektiert 100 4 Ergebnisse und Diskussion 2 Std Entzug Abbildung 4 30 Rasterelektronenmikroskopische Untersuchung von B16F10 Melanomzellen Mit zunehmender Dauer des LPC Entzuges war eine Riickbildung der Filopodien zu verzeichnen Die Ma stabsbalken in der linken Spalte repr sentieren eine L nge von 20 um und in der rechten von 2 um Neben den oben beschriebenen Untersuchungen an murinen B16F10 Melanomzellen wurden auch humane MV3 Melanomzellen mit LPC versetzt und rasterelektronenmikroskopischen Betrachtungen unterzogen Wie in Abbildung 4 31 zu erkennen ist hat eine Inkubation mit 450 uM LPC f r sieben Tage auch bei den MV3 Melanomzellen eine verst rkte Bildung von Filopodien zur Folge Weiterhin pr sentieren unbehandelte MV3 Zellen im Vergleich zu B16F10 Melanomzellen vermehrt Filopodien auf ihrer Zellmembran 101 4 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 4 31 Rasterelektronenmikroskopische Untersuchung von MV3 Melanomzellen Durch eine Inkubation von sieben Tagen mit 450 uM LPC war eine starke Zunahme an Filopodien auf der Zellmembran zu verzeichnen Die Ma stabsbalken in der linken Spalte repr sentieren eine L nge von 20 um und in der rechten von 2 um Das Ph nomen der vermehrten Bildung von Filopodien nach LPC Inkubation scheint also nicht zelllinienspezifischh sondern zumindest auch auf andere Melanomzelllinien unte
145. ionen von 10 uM 20 uM und 75 uM gew hlt Um eine vollst ndige Aufnahme des HePC zu gew hrleisten wurden die 4 Ergebnisse und Diskussion B16F10 Zellen 24 Std vor Versuchsbeginn mit entsprechenden Substanzmengen versetzt Wie in Abbildung 4 35 zu erkennen ist reduzierten Konzentrationen von 10 uM und 20 uM HePC die Adh sion an VCAM 1 um ca 20 unter Flussbedingungen wohingegen 75 uM HePC die Adh sion auf ca 30 reduzierte _ So T A B16F10 stimuliert mit Mn 60 A B16F10 stim 10 UM HePC 3 B16F10 stim 20 uM HePC S m B16F10 stim 75 uM HePC g 40 o B16F10 unstimuliert N Zeit s Abbildung 4 35 Einfluss von Hexadecylphosphocholin HePC auf die Zelladh sion von B16F10 Melanomzellen an VCAM 1 unter Flussbedingungen Konzentrationen von 10 uM und 20 uM HePC reduzierten die Adh sion um ca 20 HePC scheint also durch seine ges ttigte Struktur einen Einfluss auf die Membranfunktion auszu ben und die Adh sionsrezeptorfunktion zu inhibieren Auch ist eine Beeinflussung intrazellul rer Signalwege denkbar die sich in einer eingeschr nkten Rezeptorfunktion niederschl gt Auf Grund der oben dargelegten Befunde ist eine Differenzierung zwischen den beiden Mechanismen nicht m glich sie liefern nur weitere Indizien die die LPC vermittelten Effekte durch Membranumstrukturierungen erkl rbar machen 4 2 5 2 Beeinflussung des VLA 4 VCAM 1 B
146. isher unbekannt Es werden unfraktioniertes Heparin UFH mit einer Molekularmasse von ungef hr 5 bis 25 kDa und fraktioniertes Heparin LMWH low molecular weight heparin mit einer Molekularmasse von 4 bis 6 kDa unterschieden Fraktioniertes Heparin wird durch Abbau von h hermolekularem Heparin mit salpetriger S ure oder durch Heparinasen gewonnen Auf die pharmakologischen Mechanismen der Heparinwirkung wird in Kapitel 2 3 2 n her eingegangen 15 2 Theoretischer Teil 16 Wie bereits in Kapitel 2 2 6 erl utert haben Tumorpatienten ein erh htes Risiko eine Venenthrombose zu erleiden Bei auftretenden thromboembolischen Ereignissen empfehlen die aktuellen Leitlinien der Arbeitsgemeinschaft der Wissenschaftlichen Medizinischen Fachgesellschaften e V eine initiale Behandlung mit UFH LMWH oder Fondaparinux Dabei gelten LMWH und Fondaparinux als sicherer und genauso wirksam wie UFH F r die prolongierte Behandlung sollten laut Leitlinien ber einen Zeitraum von drei bis sechs Monaten auch UFH LMWH oder Fondaparinux eingesetzt werden Durch Metaanalysen klinischer Daten konnte gezeigt werden dass LMWH unfraktioniertem Heparin berlegen ist 345 Schon 1964 konnte in Versuchen mit Ratten gezeigt werden dass eine Heparinapplikation nach Tumorzellinjektion neben einer verminderten Koagulation auch zu einer verminderten 146 hnliche Befunde konnten sp ter Metastasierung und zu einem l ngeren berleben f hrt a
147. iskussion GTPase Aktivit tsmessung LPC behandelter Zellen k nnte teilweise Aufschluss ber die hier postulierten Mechanismen bringen Neben der Bestimmung der Rho Expressionslevel wurde auch die Expression der LPC Rezeptoren G2A und GPR4 determiniert Es zeigte sich dass beide Rezeptoren nur marginal exprimiert werden und daher als Targets respektive Ursache der hier beschriebenen Effekte ausscheiden Routinem ig fand auch eine Analyse der erhobenen Daten zur Expression des VLA 4 statt Eine Bestimmung auf Proteinebene mittels Durchflusszytometrie zeigte keine oder nur sehr geringe Unterschiede in der Expression LPC behandelter bzw unbehandelter B16F10 Zellen s Kapitel 4 2 3 1 00 280 0 260 0 2400 2200 3d wo 3d 300 3d 450 6d wo 6d 300 d 450 100 Abbildung 4 42 Heatmap Analyse der Genexpression der a4 ITGA4 und Untereinheiten ITGB1 des Integrins VLA 4 Die Untersuchungen wurden an MV3 Zellen durchgef hrt die drei 3d bzw sechs 6d Tage mit 300 uM 300 bzw 450 uM 450 LPC inkubiert wurden Durch Vergleich mit unbehandelten Zellen wo without kann auf die Expression geschlossen werden In rot dargestellte Felder zeigen allgemein eine verst rkte Transkription des entsprechenden Gens an w hrend gr ne Felder f r eine verringerte Transkription sprechen Durch Vergleich der Farbe des jeweiligen Feldes mit den im rechten Bildteil dargestellten Farbskalen kann auf die Transkriptionsintensit t des j
148. ith L selectin recognition of high endothelial venules Am J Pathol 152 469 477 1998 Suzawa K et al Preferential Induction of Peripheral Lymph Node Addressin on High Endothelial Venule Like Vessels in the Active Phase of Ulcerative Colitis Am J Gastroenterol 102 1499 1509 2007 Taura D et al Induction and isolation of vascular cells from human induced pluripotent stem cells brief report Arterioscler Thromb Vasc Biol 29 1100 1103 2009 Rosen S D Ligands for L selectin homing inflammation and beyond Annu Rev Immunol 22 129 156 2004 Berlin C et al alpha 4 integrins mediate lymphocyte attachment and rolling under physiologic flow Cell 80 413 422 1995 Qian F Hanahan D amp Weissman I L L selectin can facilitate metastasis to lymph nodes in a transgenic mouse model of carcinogenesis Proc Natl Acad Sci U S A 98 3976 3981 2001 Mannori G et al Differential colon cancer cell adhesion to E P and L selectin role of mucin type glycoproteins Cancer Res 55 4425 4431 1995 Talmadge J E Donkor M amp Scholar E Inflammatory cell infiltration of tumors Jekyll or Hyde Cancer Metastasis Rev 26 373 400 2007 L ubli H Spanaus K amp Borsig L Selectin mediated activation of endothelial cells induces expression of CCL5 and promotes metastasis through recruitment of monocytes Blood 114 4583 4591 2009 6 Literaturverzeichnis 58 59 60 61 62 63 64
149. its 1993 wurde dieser Effekt durch eine verst rkte Aktivit t der Proteinkinase C in Schweinearterien mechanistisch untermauert Eine verst rkte Pr sentation von P Selektin wurde 1996 sowohl auf Blutpl ttchen als auch auf dem Gef endothel von Katzen nach LPC Kontakt beschrieben Dies f hrte zu einer verst rkten Adh sion von polymorphkernigen Leukozyten an das Endothel Bei allen hier beschriebenen Studien wurden LPC Konzentrationen von 5 bis maximal 100 uM verwendet Im Blut liegen dagegen h here LPC Konzentrationen vor Die Ergebnisse der Untersuchungen bei diesen Konzentrationen bleiben die Autoren jedoch schuldig Die Mechanismen die den hier beschriebenen Effekten zugrunde liegen sind weitestgehend unbekannt Jedoch wurden zwei G Protein gekoppelte Rezeptoren f r LPC identifiziert Diese sind m glicherweise an der Vermittlung der Effekte beteiligt 2 4 2 Lysophosphatidylcholinrezeptoren und deren Funktionen Mit der Absicht Rezeptoren f r Lysophospholipide zu identifizieren wurde 1996 von zwei Arbeitsgruppen parallel der G Protein gekoppelte Rezeptor GPCR OGRI auf Ovarialkarzinomzellen identifiziert Dabei kamen PCR polymerase chain reaction basierte Klonierungsstrategien mit degenerierten Primern zum Einsatz Allerdings wies dieser Rezeptor nur eine Affinit t f r Sphingosylphosphorylcholin SPC auf nicht jedoch f r LPC Eine rezeptorvermittelte Wirkung von LPC wurde zu diesem Zeitpunkt dem platelet activatin
150. ker D L et al Plasma lysophosphatidic acid concentration and ovarian cancer JAMA 287 3081 3082 2002 Sengupta S Wang Z Tipps R amp Xu Y Biology of LPA in health and disease Semin Cell Dev Biol 15 503 512 2004 Xu Y et al Lysophosphatidic acid as a potential biomarker for ovarian and other gynecologic cancers JAMA 280 719 723 1998 6 Literaturverzeichnis 234 235 236 231 238 239 240 241 242 243 244 245 Sedl kova I Vavrova J Tosner J amp Hanousek L Lysophosphatidic acid in ovarian cancer patients Ceska Gynekol 71 312 317 2006 Taylor L A Arends J Hodina A K Unger C amp Massing U Plasma lyso phosphatidylcholine concentration is decreased in cancer patients with weight loss and activated inflammatory status Lipids Health Dis 6 17 2007 Zhao Z et al Plasma lysophosphatidylcholine levels potential biomarkers for colorectal cancer J Clin Oncol 25 2696 2701 2007 S llentrop F et al 31P NMR spectroscopy of blood plasma determination and quantification of phospholipid classes in patients with renal cell carcinoma NMR Biomed 15 60 68 2002 Sasagawa T Okita M Murakami J Kato T amp Watanabe A Abnormal serum lysophospholipids in multiple myeloma patients Lipids 34 17 21 1999 Okita M Gaudette D C Mills G B amp Holub B J Elevated levels and altered fatty acid composition of plasma lysophosp
151. ktionierte Heparin Enoxaparin einen starken inhibitorischen Einfluss auf die VLA 4 VCAM I Interaktion in den in vitro Versuchen aus bte wurde es einer Mausgruppe 30 min vor Tumorzellinokulation 100 IU i v verabreicht Wie L ubli et al zeigen konnte entfaltet Heparin in der Anfangsphase der Tumorzelldissemination seine antimetastatischen F higkeiten vornehmlich ber die Inhibition der Tumorzell Thrombozyten Assoziation Erst nach einer Zeit von ca 12 Std ist die antimetastatische Wirkung des Heparins auf eine Inhibition von L Selektin zur ckzuf hren Die Beteiligung des VLA 4 am metastatischen Geschehen wird wahrscheinlich zu einem hnlich sp ten Zeitpunkt wie beim L Selektin stattfinden da VLA 4 vornehmlich eine feste Bindung der Tumorzelle bzw der Mikroembolie an das Gef endothel vermitteln wird Aus diesem Grund wurde einer Mausgruppe u a Enoxaparin 100 IU erst 14 Std nach Tumorzellinokulation injiziert Zur Best tigung der sp ten VLA 4 vermittelten Heparinwirkung wurde auch einer weiteren Gruppe Natalizumab 10mg kg K rpergewicht 14 Std nach Tumorzellinokulation appliziert Um den Selektin vermittelten anti metastatischen Effekt von dem VLA 4 vermittelten zu trennen wurde einer weiteren Mausgruppe ein Heparinderivat 150 ug mit einer definierten Kettenl nge bestehend aus 12 Monosaccharideinheiten 30 min vor Tumorzellinokulation appliziert Dieses Derivat inhibiert nur Selektine in ihrer Funktion und nicht
152. ktorproteine m glich F r die kontrollierte Aus bung der Aktivierungsfunktion ist eine genau festgelegte Lokalisation der Rho GTPasen von N ten So halten sich Rho GTPasen vorzugweise an Plasma oder intrazellul ren Membranen auf Erreicht wird dies durch posttranslationale Modifikationen So werden Mitglieder der Rho Familie am C terminalen Ende enzymatisch je nach Subtyp an Geranyl Farnesyl oder Palmitoyl Reste gebunden Auch sind mehrfache Modifikationen m glich Mit diesen hydrophoben Modifikationen ist eine feste Adh sion an Lipidbilayer m glich die durch zus tzliche Wechselwirkungen geclusterter polybasischer Aminos uren mit Membranen verst rkt wird Eine Inhibition der an der posttranslationalen Modifikation beteiligten Enzyme zeigt einen Einfluss auf die Lokalisation und Funktionalit t verschiedener Rho Proteine 2 6 Histon Deacetylase Inhibitoren 2 6 1 Funktionsweise von Histon Deacetylasen Der Acetylierung bzw Deacetylierung von Histonproteinen kommt eine entscheidende Rolle bei der Regulation der Transkription in eukaryotischen Zellen zu Vorgenommen wird die bertragung eines Acetylrestes auf die Lysinreste von Histonproteinen durch Histon Acetyltransferasen HAT Liegen die Lysinreste von Histonen acetyliert vor sind sie ungeladen und k nnen nicht mit den negativ geladenen Phosphatanionen der DNA interagieren Dadurch ist die Chromatinstruktur geweitet und f r RNA Polymerasen gut zug nglich die den
153. kulturnahme der Zellen 43 3 2 2 Kryokonservierung von ZEN 5 5 5 nc a lt cssacslasesutiuarassssesssscssattsaccwtugarntiesanstueeastomacel 44 3 2 3 Ze 1 Zanlbe Suinmlune een 44 SS PRINIEN 2 a on 45 323 1 MY3 Melanomzellen ve etek al eel etl et ee ek el el eh etl ot 45 3 3 2 B16F10 ME ATOM een een 45 3 3 3 bEnd3 Endothelzellen sus mens en nee sen en ea SMe EP 45 SEE US EL Eee ee nenn ERRRRERERERDERRDRERBRRRETE 46 3 3 5 G361 Melanomzellen nennen 46 2O HUVEC T em ee ee ee ee 46 3 3 7 AsPC 1 Pankreasadenokarzinomzellen nennen 46 3 3 8 MIA PaCa 2 Pankreasadenokarzinomzellen unanaseseesessesseesesseensennnennennnennennnene 47 3 4 Isolierung von THOM OZ y COI us ne 47 3 4 1 Isolierung und Quantifizierung von Thrombozyten a seesssstessseeeseesesteeesnteeensees 47 3 4 2 Markierung von Thrombozyten nuunansnssesessssesseusssensssensesunnsennsnensnnunnnennene 48 3 4 3 Aktivierung von Ebromhazyien Zee nennen 48 3 5 Zytotoxizit tsbestimmungen mittels MTT Assay ucusausssnsnnsnenesnennennennennnnnenn 48 3 5 1 Prinzip des MTT AssayS nennen 48 3 5 2 Praktische Durchf hrung und Auswertung von MTT Assays ooo oc ccccccececeeeeeeceeee 49 3 6 Durchflusszytometrie oooo cccsssssessssescstecssteessssessseecsueessseeesnteesseessueeesseessateesneeesaeeesnaees 50 3 6 1 Pr paration der Zellen f r die Durchflusszytometrie oo ecssscssseesssecsssessseesstecsssee 50 3 6 2 Bestimmung verschiedener CD Antigene auf Zelloberfl chen mittels Antik rper
154. legt der im oberen Teil der Abbildung aufgef hrte Dotplot Der Synergismus zwischen Heparin und LPC wurde in einem zweiten Versuchsteil analysiert In Abbildung 4 44 als Balkendiagramm dargestellt kam es durch Administration von 50 IU unfraktioniertem Heparin vor Tumorzellinokulation zu einer Abnahme der Luciferase Aktivit t von 56 im Vergleich zur Kontrollgruppe Die Kombination aus LPC Inkubation 450 uM LPC f r 10 Tage der B16F10 Zellen und einer Heparin Injektion 30 min vor 117 4 Ergebnisse und Diskussion 118 4 000 000 3 000 000 2 000 000 1 000 000 unbehandelt 450 pM Heparin Heparin LPC Abbildung 4 44 Quantifizierung der pulmonalen Metastasen der Versuchstiere Durch eine Kombination aus LPC Inkubation 450 uM f r 10 Tage und einer Heparin Applikation 30 min vor Tumorzellinokulation konnte eine Reduktion der Metastasen um 80 erreicht werden Beide Substanzen wirken synergistisch Tumorzellinokulation hatte eine weitere deutliche Reduktion der Bildung von Metastasen um 80 zur Folge Die erhaltenen Werte unterschieden sich signifikant von denen die bei den Untersuchungen der Einzelkomponenten erzielt wurden Neben dem eindrucksvollen Beweis der antimetastatischen LPC Wirkung in vivo reflektiert sich auch der in vitro nachgewiesene Synergismus zwischen beiden Agenzien F r den Beweis eines additiven Synergismus m ssten jedoch weitere Experimente erfolgen 4 2 10 Verallgemeinerung des LPC Effektes auf
155. licht wurde Abschlie end wurden die Proben im Sputter Coater mit 2 2 2 nm Platin Palladium gesputtert Die Proben waren nun einer Betrachtung mit dem Rasterelektronenmikroskop zug nglich 3 10 SACED Motilita tsassay 3 10 1 Prinzip des SACED Motilitatsassays stroboscopic analysis of cell dynamic Zur Bestimmung des Migrationsverhaltens und der Motilit t von Zellen kann deren Lamellen und Ruffledynamik mithilfe des SACED Assays ermittelt werden Dazu wurden die zu untersuchenden Zellen auf Bestandteile der ECM z B Fibronektin gegeben und mittels Mikroskop ber einen bestimmten Zeitraum hochaufl send gefilmt Nach Bearbeitung der aufgenommenen Bilder lassen sich in die Lamellen der einzelnen Zellen ein Pixel dicke Linien legen F r diesen Bereich ermittelt ein Programm die verschiedenen Graustufen f r alle Bilder der aufgenommenen Serie Diese Graustufen werden anschlie end in einem time space plot durch das Programm SACED XP260 hintereinander gelegt s Abbildung 3 5 In den time space plots l sst sich die Lamellenprotrusion und retraktion sowie die Ruffledynamik erkennen Durch Einzeichnen von Linien die die Lamellendynamik beschreiben ist die Ermittlung von motilit tsbeschreibenden Parametern wie z B der Lamellengeschwindigkeit Bewegungsstrecke und Bewegungsfrequenz m glich 59 3 Material und Methoden yy y yy Hoyt y Het 58 10 2 5 5 7 5 10 125 Abbild
156. lphosphocholin HSP90 Inhibitor L a Lysophosphatidylcholin Hersteller Sigma Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen Deutschland R amp D Systems GmbH Wiesbaden Nordenstadt Deutschland R amp D Systems GmbH Wiesbaden Nordenstadt Deutschland R amp D Systems GmbH Wiesbaden Nordenstadt Deutschland R amp D Systems GmbH Wiesbaden Nordenstadt Deutschland BD Biosciences Pharmingen Heidelberg Deutschland Biogen Idec GmbH Ismaning Deutschland Hersteller Sanofi Aventis GmbH Frankfurt M Deutschland Synthese Arbeitsgruppe Prof Dr Massing Universit t Freiburg Deutschland Ratiopharm GmbH Ulm Deutschland Synthese Arbeitsgruppe Prof Dr Massing Universit t Freiburg Deutschland Avanti Polar Lipids Alabaster Alabama USA 3 Material und Methoden Testsubstanz Modifizierte Heparin Derivate mTOR Inhibitor mTOR und PI3K Inhibitor Pan HDAC Inhibitor ST71 Tinzaparin Trichostatin A 3 1 5 Sonstiges Tabelle 3 5 Sonstige verwendete Artikel Artikel Alkoholtupfer CASY cups Cellstar Kulturflasche 25 75 175 cm mit Filter Cellstar TC Platte 6 Well steril Cellstar TC Platte 24 Well steril Cellstar Zentrifugenr hrchen PP R hrchen 15 ml Cellstar Zentrifugenrohrchen PP R hrchen 50 ml Hersteller Synthese Arbeitsgruppe Prof Dr B Casu G Ronzoni Institut f r Chemische und Biochemische Forschung Mailand Italien Synthese Arbeitsgrupp
157. lstruktur inhibieren Interessanterweise zeigt Fondaparinux keinerlei inhibitorische Wirksamkeit Zur Bestimmung des Einflusses verschiedener anderer Heparinderivate auf die VLA 4 VCAM I Interaktion wurden in den folgenden Untersuchungen statt HUVEC wiederum VCAM I Fc Chimeren auf Glaspl ttchen immobilisiert um eine isolierte Betrachtung der Wechselwirkung zu erm glichen 4 1 2 2 Beeinflussung des VLA 4 VCAM 1 Bindungsweges durch unfraktioniertes und fraktioniertes Heparin und Antik rper Da in der klinischen Praxis zur Thrombosepr vention bei Krebserkrankungen vor allem fraktioniertes Heparin eingesetzt wird wurden zuerst die fraktionierten Heparine Tinazaparin und Enoxaparin auf ihre inhibitorischen Kapazit ten der VLA 4 VCAM 1 Wechselwirkungen hin untersucht und mit unfraktioniertem Heparin verglichen Zu Kontrollzwecken wurde auch der Antik rper Natalizumab in die Untersuchung mit einbezogen Wie in Abbildung 4 7 ersichtlich reduzierten sowohl 500 ug Enoxaparin als auch Tinzaparin die Adh sion der stimulierten MV3 Zellen an VCAM I auf das Ma unstimulierter Zellen Das gleiche Bild ergab sich f r 5 ug Natalizumab Das unfraktionierte Heparin verminderte die Adh sion der MV3 Zellen sogar noch unter das Niveau von unstimulierten Zellen und hat daher offenbar eine st rkere inhibitorische Potenz die sich u U auch auf die Restaktivit t der nicht stimulierten Zellen richtet 75 76 4 Ergebnisse und Diskussion Nu 1
158. m 20 120 Std Abbildung 4 15 LPC Konsumierung von B16F10 Melanomzellen Nach 48 Std war das LPC quantitativ metabolisiert und aus dem Kulturmedium entfernt Auch zeigte sich der Effekt der kompletten Metabolisierung des LPC nach wiederholter LPC Gabe erneut s Abbildung 4 16 Innerhalb von 48 Std wurde das LPC quantitativ aus dem Zellkulturmedium verstoffwechselt Gaal ae 100 7 80 60 4 40 4 LPC Konzentration im Medium 20 4 T T 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 Std Abbildung 4 16 LPC Metabolismus aus dem Kulturmedium Auch nach wiederholter LPC Gabe konnte eine komplette Metabolisierung des LPC beobachtet werden 85 4 Ergebnisse und Diskussion 86 4 2 1 2 Ver nderung der Fetts urekomposition von B16F10 Melanomzellen Um zu berpr fen ob die massive zellul re Aufnahme von LPC zu einer Ver nderung der Zellmembranzusammensetzung f hrt wurden gaschromatographische Analysen der Zellmembranen von B16F10 Melanomzellen nach LPC Inkubation durchgef hrt Diese zeigten eine rapide Ver nderung der Zusammensetzung der Membranlipide Dabei wurde eine deutliche Anreicherung der Fetts ureart beobachtet die an das Glycerocholingrundger st des LPC gebunden war Wie in Abbildung 4 17 dargestellt war eine Zunahme von Margarins ure von ca 5 zum Zeitpunkt der LPC Zugabe auf ca 45 innerhalb von 24 Std zu beobachten N 2 Zusammensetzung der Zellmembran 3 3 2 F
159. mbozyt ren P Selektins zur h matogenen Metastasierung Konnte in in vitro als auch in in vivo Untersuchungen herausgearbeitet werden s Kapitel 2 2 6 Die 2 Theoretischer Teil Expression von endothelialem P Selektin erm glicht in physiologischer Weise das Rollen und Abbremsen von Leukozyten wodurch erst eine Integrin vermittelte feste Adh sion an das Gef endothel m glich wird Auch Tumorzellen treten ber ihre P Selektin Liganden mit dem Gef endothel in Wechselwirkung Allerdings entspricht das vermittelte Zellrollen nicht dem von Leukozyten denn die Tumorzellen exprimieren zwar mucine P Selektin Liganden aber zumeist kein PSGL 1 Der P Selektin Ligand CD44v auf Kolonkarzinomzellen LS174T beispielsweise vermittelt eine Adh sion der Zelle an P Selektin die einer Kraft von 125 pN standh lt Ein Polymorphkerniger Leukozyt hingegen l sst sich erst bei einer Kraftaufwendung von 175 pN von rekombinatem P Selektin entfernen Als weiterer P Selektin Ligand auf Tumorzellen konnte das sulfatierte Galactocerebrosid SM4 identifiziert werden das zur Metastasierung von MC 38 Kolonkarzinomzellen ma geblich beitr gt Auch der Stammzellmarker CD24 wurde auf BI6F10 und K1735 Melanomzellen als P Selektin Ligand identifiziert und dient als Tumormarker bzw Prognosemarker bei nicht kleinzelligem Bronchialkarzinom Die Rolle von P Selektin bei der h matogenen Metastasierung Konnte durch den Einsatz von Knockout P M
160. missionskathode die aus einer feinen erhitzbaren Wolframkristallspitze besteht erzeugt Durch Anlegen einer 57 3 Material und Methoden 58 Spannung emittiert diese Spitze Elektronen Die zu vermessenden Proben werden in ein Vakuum eingebracht da nur unter diesen Bedingungen Elektronen existieren k nnen Der geb ndelte scharfe Elektronenstrahl rastert in einem bestimmten Muster die Probe ab Dabei wird der Elektronenstrahl gradlinig entlang der Probenoberfl che und zum Ausgangspunkt zur ckgef hrt bis die komplette Oberfl che abgerastert ist Wechselwirkungen zwischen Probe und Elektronen f hren zu einer Abbildung der Probenoberfl che F r die zu untersuchenden Proben wird mit einem an das Rasterelektronenmikroskop angeschlossenen Sekund relektronendetektor gearbeitet s Abbildung 3 4 Die Beschleu nigungsspannung betr gt f r alle Proben 8 keV Um die Leitf higkeit der Proben sicherzustellen werden diese mit einer Platin Palladium Mischung in einer Argonatmosph re gesputtert Zus tzlich wird der Rand des Objekttr gers mit einem Silberlack bestrichen um Aufladungseffekte der Probe zu minimieren Die computergest tzte Auswertung wird mithilfe des Programms Mctrl durchgef hrt Kathode Anode Kondensor 1 Kondensor 2 Raster Generator rasterspulen A Video Endlinse 5 z Einheit Polschuh mit Endblende Probenteller Sekund relek Signal tronen Detektor Verst
161. munol Immunother 42 231 236 1996 Okahara H Yagita H Miyake K amp Okumura K Involvement of very late activation antigen 4 VLA 4 and vascular cell adhesion molecule 1 VCAM 1 in tumor necrosis factor alpha enhancement of experimental metastasis Cancer Res 54 3233 3236 1994 Schadendorf D Heidel J Gawlik C Suter L amp Czarnetzki B M Association with clinical outcome of expression of VLA 4 in primary cutaneous malignant melanoma as well as P selectin and E selectin on intratumoral vessels J Natl Cancer Inst 87 366 371 1995 Hieken T J et al Beta 1 integrin expression in malignant melanoma predicts occult lymph node metastases Surgery 118 669 673 discussion 673 675 1995 Hieken T J Ronan S G Farolan M Shilkaitis A L amp Das Gupta T K Beta 1 integrin expression a marker of lymphatic metastases in cutaneous malignant melanoma Anticancer Res 16 2321 2324 1996 Qian F Vaux D L amp Weissman I L Expression of the integrin alpha 4 beta 1 on melanoma cells can inhibit the invasive stage of metastasis formation Cell 77 335 347 1994 Mullen J T Vartanian T K amp Atkins M B Melanoma complicating treatment with natalizumab for multiple sclerosis N Engl J Med 358 647 648 2008 Panzara M A Bozic C amp Sandrock A W More on melanoma with transdifferentiation N Engl J Med 359 99 author reply 99 100 2008 Kopp H Placke T amp Salih H R Platelet
162. n mit PBS Puffer und Abl sen mit 0 02 iger EDTA L sung wurden die Zellen mit dem CASY 1 Modell TT Zellz hlger t quantifiziert Auf Trypsin zum Abl sen der Zellen wurde verzichtet um eine Besch digung der Oberfl chenproteine zu vermeiden Nach durchgef hrter Subkultivierung wurden die Zellen erneut zentrifugiert Das Pellet wurde in 2mL PBS Puffer in einem ersten Waschschritt aufgenommen Nach wiederholter Zentrifugation wurden die Zellen in 5 mL PBS Puffer resuspendiert und nochmals zentrifugiert Abschlie end wurde die Konzentration auf 1 Mio Zellen pro 100 uL PBS Puffer eingestellt Sofern die anschlie ende durchflusszytometrische Untersuchung in einer 96 Well Platte durchgef hrt wurde wurden 100 000 Zellen in die entsprechenden Wells pipettiert Bei einer Versuchsdurchf hrung in FACS R hrchen wurden 1 Mio Zellen in 2 mL Reagiergef e berf hrt 3 6 2 Bestimmung verschiedener CD Antigene auf Zelloberfl chen mittels Antik rper F r die Arbeiten in 96 Well Platten wurden folgende Arbeitsschritte durchgef hrt Es wurden 2 5 ug Prim rantik rper bzw Ligand pro Well zugegeben die an das zu untersuchende Antigen binden Nach 30 min Inkubationszeit auf Eis wurden 100 uL Waschpuffer hinzuf gt In einer Platten Zentrifuge wurde bei 2900 rpm und 4 C f r 4 min zentrifugiert und die Platte anschlie end ausgeschlagen Nach Resuspendierung in 100 uL Waschpuffer wurde der sekund re fluoreszenzgelabelte Antik rper hinzupipettiert
163. n Leukozyten in entz ndetes Gewebe kommen Vor allem die Integrine LFA 1 lymphocyte function associated antigen 1 aL gt amP 2 au und o4B7 sind essentiell f r eine intakte Immunantwort Die a gt Integrine binden an die endothelial exprimierten Immunglobuline ICAM 1 intercellular adhesion molecule 1 ICAM 2 und ICAM 3 Die Liganden der a Integrine sind VCAM 1 vascular cell adhesion molecule 1 MADCAM 1 mucosal vascular addressin cell adhesion molecule 1 und Fibronektin als Komponente der ECM au und a4 interagieren zudem noch mit ADAM7 und ADAM28 2 Theoretischer Teil 10 a disintegrin and metalloprotease Diese sind auf Lymphozyten lokalisierte Metalloproteasen die neben ihren enzymatischen Eigenschaften zus tzlich eine Integrinbindungsdom ne aufweisen Die feste Adh sion von Lymphozyten in peripheren Lymphknoten und an antigenpr sentierende Zellen wird durch die LFA 1 ICAM Interaktion vermittelt Die a4 Integrine hingegen spielen vornehmlich eine Rolle bei der Adh sion von Lymphozyten an mukosale Lymphknoten Peyer Plaques und in inflammatorischen Arealen Der festen Adh sion vorausgehend findet ein Selektin vermitteltes Rollen der Lymphozyten ber die Endotheloberfl chen statt Integrine binden ihre Liganden allerdings nicht konstitutiv sondern liegen in einem niedrig affinen Zustand vor Erst durch eine Aktivierung der Zelle kommt es zu einer Erh hung der Bindungsf higkeit Dies wir
164. n sind Inhibitoren die gezielt die Interaktion von Thrombozyten mit Tumorzellen blockieren unabdingbar 2 Theoretischer Teil Tumorzelle gare Thromboplastin Aktivierung v ptoren Thrombin _ PAR Rezeptor SLe auf PSGL 1 P Selektin a2B Integrin KollagenTyp I Il 4 a6 Integrin Hl IV und XI gt Fibrinogen ________ wps Integrin gt Fibronektin lt _ GPlib illa mp3 Integrin GPIlb llla Kollagen _r WWF P Selektin __ Thrombin Mac 1 auf Integrin Thrombospondin 1 gt high molecular weight kininogen Faktoren XI und XII Abbildung 2 3 Thrombozyt Tumorzell Interaktion Dargestellt sind die an der Thrombozyten Aktivierung beteiligten Molek le und die verschiedenen Adh sionsrezeptoren modifiziert nach Erpenbeck et al 2 3 Antimetastatische Wirkung von Heparin 2 3 1 Klinische Erkenntnisse Heparin ist ein Polysaccharid das aus bis zu zehn verschiedenen Monosaccharid Einheiten aufgebaut sein kann Der gr te Teil des Molek ls besteht aus periodischen Abschnitten die aus 1 4 verkn pften a D Glucosamin N 6 disulfat und amp L Idurons ure 2 sulfat Einheiten aufgebaut sind Im Organismus kommt es als Proteoglykan in basophilen Granulozyten und Mastzellen vor und wird durch Endoglykosidasen freigesetzt Die physiologische Funktion von endogen freigesetztem Heparin ist allerdings b
165. n stattfinden da LPC eine Pr sentation von P Selektin auf der Thrombozytenoberfl che vermittelt s Kapitel 2 4 1 und 2 2 6 Bei diesem Schritt der metastatischen Kaskade ist LPC also direkt beteiligt Neben diesen prometastatischen Effekten k nnen LPC bzw Phospholipide auch eine antimetastatische Wirkung aus ben Viele Krebszelllinien haben einen erh hten Lipidstoffwechsel s Kapitel 2 4 3 In einem Versuch an tumortragenden M usen bei dem die Wirkung von liposomal verpacktem Gemcitabin mit dem freien Wirkstoff verglichen wurde zeigten auch die M use mit applizierten leeren Liposomen eine signifikant verringerte Zahl an Metastasen Folgender Erkl rungsansatz kann f r diese Befunde herangezogen werden Durch den Enhanced Permeability and Retention EPR Effekt reichern sich die Liposomen vornehmlich im Tumorgewebe an Die liposomalen Phospholipide werden enzymatisch zu LPC umgesetzt Entstandenes LPC wird von den Tumorzellen Konsumiert und in die Zellmembran inkorporiert Dadurch kommt es je nach verwendeten Phospholipiden zu einer ver nderten Membranzusammensetzung die sich auch auf die Membran eigenschaften auswirkt So ist beispielsweise eine Ver nderung der Adh sionsrezeptor funktionen oder auch eine ver nderte Verweildauer von membrangebundenen Proteinen denkbar 2 Theoretischer Teil 2 5 Das Aktinzytoskelett und seine Bedeutung bei der Metastasierung Neben Mikrotubuli sind Aktinfilamente an der Ausbildung des
166. n untersucht um eine m gliche Bindung der MV3 Melanomzellen mit endothelialem P Selektin als m glichen Schritt der Metastasierungskaskade zu simulieren Zu diesem Zweck wurden die rekombinanten P Selektin Fc Chimeren mit Cyanurchlorid auf Glaspl ttchen fixiert und die in PBS Puffer suspendierten Zellen auf die Glaspl ttchen gegeben Nach einer kurzen Sedimentations und Interaktionsphase zwischen P Selektin und MV3 Zellen wurde der Fluss gestartet und die adh rierenden Zellen mithilfe eines Programms quantifiziert m MV3 auf h P Selektin a o gt o Oo Adh sion 20 Zeit s Abbildung 4 3 Interaktion von MV3 Melanomzellen mit P Selektin 90 der Zellen werden schon nach 1 s nach Starten des Flusses abgerissen 71 4 Ergebnisse und Diskussion 12 In der ersten Sekunde nach Beginn des Durchflusses wurden bereits 90 der MV3 Melanomzellen von der immobilisierten P Selektin Schicht abgerissen s Abbildung 4 3 Auch war kein typisches P Selektin vermitteltes Rollen zu verzeichnen Es ist daher anzunehmen dass endotheliales P Selektin keinen Einfluss auf das Metastasierungsverhalten der MV3 Melanomzellen aus bt Daraus kann weiterhin geschlussfolgert werden dass die vorhandenen P Selektin Liganden offensichtlich von geringerer Bindungsaffinit t gegen ber dem Standardliganden PSGL 1 gepr gt sind oder sterisch beeinflusst die Bindungskinetik f r ein Zellrollen nicht erf llen Auch k nnte eine
167. ndern zuk nftig ist bei Kenntnis der Adh sionsrezeptorausstattung der Tumorzellen eine l ngerfristige Applikation mit einem selektiv Adh sionsrezeptor blockierenden nicht antikoagulativ wirkendem Heparin als therapeutische Option besser kalkulierbar Aufbauend auf ersten Erkenntnissen von antimetastatischen Wirkungen ges ttigter Phospholipide wurde eine Inhibition des VLA 4 VCAM 1 Bindungsweges auf membran rer Ebene durch Applikation von Lysophosphatidylcholin erreicht Dabei kamen sowohl der LPC Inkubationsdauer als auch der Konzentration eine entscheidende Bedeutung zu Einhergehend mit Ver nderungen der Membrankomposition kam es zu einer starken morphologischen Verwandlung der Zellen mit Formation zahlreicher Filopodien bedingt durch Reorganisationen des Zytoskeletts Die festgestellte deutliche Reduktion der Zelladh sion ber VLA 4 konnte durch in vivo Versuche mit Nachweis einer signifikanten Abnahme der Metastasierungsf higkeit der verwendeten Melanomzellen nach LPC Behandlung eindrucksvoll best tigt werden Erste Einblicke in die molekularen Mechanismen durch Gene Array Analysen ergaben Hinweise auf die Involvierung von GTPasen die sowohl f r 131 5 Zusammenfassung die Ver nderung der Integrinfunktionalit t als auch f r die beobachteten Membraneffekte verantwortlich gemacht werden k nnten Damit wird erstmalig ein Erkl rungsansatz geliefert der noch weitreichende M glichkeiten f r eine pharmakologische Interve
168. nen transmembran ren Bereich an den sich ein kurzer zytoplasmatischer Rest von 17 Aminos uren anschlie t F r L Selektin sind drei Interaktionspartner beschrieben die an der Signaltransduktion ber den zytoplasmatischen Rest beteiligt sind Auch wird ber die zytoplasmatische Dom ne die proteolytische Abspaltung Shedding des L Selektin von der Leukozytenoberfl che gesteuert Sowohl P als auch E Selektin k nnen ber ihre 2 Theoretischer Teil zytoplasmatischen Reste die Tyrosinkinasen spleen tyrosine kinase Syk und Src family tyrosine kinases SFKs aktivieren 2 2 2 Rolle des P Selektin bei der h matogenen Metastasierung P Selektin CD62P PADGEM GMP 140 wird in den a Granula von Thrombozyten und in den Weibel Palade K rperchen von Endothelzellen dauerhaft vorr tig gehalten Nach Stimulation der Zellen mit z B Thrombin Proteinen des Komplementsystems oder ADP fusionieren die Vesikel mit der Zellmembran so dass P Selektin auf der Zelloberfl che pr sentiert werden kann Ca 30 bis 60 min nach Stimulusentzug findet eine Endocytose des pr sentierten P Selektins statt veranlasst durch bestimmte Aminos uren im zytoplasmatischen Teil des P Selektins Auch kann durch TNFa oder LPS Stimulation eine Transkription von P Selektin in Endothelzellen hervorgerufen werden die nach vier Stunden ihr Maximum erreicht Selektine erkennen und binden mucin hnliche Glykoproteine Mucine bestehen aus einem
169. ner Streptavidin gelabelten Cy3 Farbstoffl sung inkubiert Hier fand die Markierung der an den Chip hybridisierten cRNA statt Nach weiteren Waschschritten wurden die Mikrochips mit dem Ilumina iScan Scanner ausgelesen Mit der BeadStudio GenomeStudio Software wurde die Qualit t der entwickelten Chips anhand von vier Kriterien gem dem Benutzerhandbuch berpr ft Nach abschlie ender Normalisierung der Daten konnte die Expression des gesamten Transkriptoms von LPC behandelten und unbehandelten MV3 Zellen verglichen werden Zur Veranschaulichung der durchgef hrten Schritte siehe Abbildung 3 7 3 Material und Methoden fe ee AAAA 3 total RNA TITT 77 a TITT 1T7 T7 Oligo dT Primer t er j Synthese der cDNA gi AAAA T7 3 ne PTT 17 5 cDNA j Aufreinigung der dsDNA TTTT T7 3 3 _ 5A Tit 17 5 aufgereinigte dsDNA j Synthese der cRNA 7 os W UVUU 5 3 E j Aufreinigung der cRNA Nn JUUU 5 3 K ase OO 3 r JUUU 3 7 ui j Abbildung 3 7 Prinzip der Genexpressionsanalyse schematisch dargestellt modifiziert nach M Alexander 3 15 Tierexperimentelle Simulation der h matogenen Metastasierung 3 15 1 Durchf hrung der Experimente und Auswertung Im Rahmen dieser Arbeit wurden die antimetastatischen Wirkungen von Heparin bzw Heparinderivaten und von LPC in Mausmodellen untersucht Alle Tierversuche wurden entsprechend dem deutschen Tierschutzgesetz und nach Zus
170. nfluenz der Glaspl ttchen zu verzeichnen Sechs Stunden vor Versuchsbeginn wurden die Zellen mit rekombinantem humanen bzw murinen TNF a versetzt so dass in jedem Well eine Konzentration von 50 ng mL vorlag Hierdurch wurde eine verst rkte Expression von membranst ndigem VCAM 1 erreicht Vor Einbau in die Durchflusskammer wurde das den Zellen anhaftende Medium vorsichtig mit einem Papiertuch am Rand der Pl ttchen abgetupft 3 7 6 Aufbau der Durchflussapparatur Die Durchflussapparatur besteht aus einem transparenten Polyacrylblock in den eine Kammer mit den Ma en 11 mm x 6 mm x 0 45 mm gefr st wurde s Abbildung 3 2 Die Kammer ist an einer Seite ge ffnet und kann mit einem Glaspl ttchen das mit immobilisierten Rezeptorproteinen oder Zellen beschichtet ist verschlossen werden Um dem Austritt von Fl ssigkeit vorzubeugen wird das Glaspl ttchen mit Schrauben und Dichtungsring am Polyacrylblock fixiert An der Vorder und Hinterseite befinden sich jeweils Bohrungen die als Ein und Auslass ffnungen f r das Flie medium dienen Die Ecken innerhalb der Kammer sind abgerundet wodurch ein laminares Flie en erm glicht wird Der Durchflusskammer vorgeschaltet sind eine Blasenfalle die zum Injizieren von Zellen und Substanzen verwendet wird ein Dreiwegehahn und ein Vorratsgef i mit Puffer Nach Passieren der Durchflusskammer gelangt das Flie mittel ber einen weiteren Dreiwegehahn in ein Abfallbeh ltnis Durchfluss Flie
171. nhibitor der sowohl die Klasse der Phosphoinositol 3 Kinasen PI3K als auch mTOR mammalian Target of Rapamycin bindet und inhibiert F r beide Enzyme konnte eine Beteiligung beim malignen Geschehen einer Krebserkrankung in zahlreichen Studien nachgewiesen werden Ein Inhibitor der nur mTOR inhibiert Ein Inhibitor der das Chaperon Molek l HSP90 inhibiert HSP90 ist ubiquit r in Zellen vorhanden und u a an der Ausformung von Steroidrezeptoren und Transkriptionsfaktoren beteiligt In vielen Krebszellen konnte eine Uberexpression von HSP90 detektiert werden Eine Inhibition f hrt zur Akkumulation falsch gefalteter funktionsloser Proteine die eine Apoptose der Zellen nach sich ziehen 7 10 k nnen Nach erfolgten Zytotoxizit tsbestimmungen der Substanzen wurden die Zellen f r 72 Std mit den jeweiligen Inhibitoren inkubiert Wie in Abbildung 4 53 ersichtlich hatte keiner der Inhibitoren einen Einfluss auf die VLA 4 vermittelte Adh sion Adh sion o o o A MV3 stimuliert mit Mn v MV3 mTOR Inhibitor 72 Std Inkubation stim MV3 mTOR PISK Inhibitor 72 Std Inkubation stim lt MV3 HSP90 Inhibitor 72 Std Inkubation stim O MV3 unstimuliert oa A o N o Zeit s Abbildung 4 53 Einfluss verschiedener Inhibitoren auf die Adh sion der MV3 Melanomzellen an VCAM 1 unter physiologischen Flussbedingungen nach einer Inkubationszeit von 72 Std
172. niertes Heparin konnte die Thrombozyt Tumorzell Interaktion vermindern Die bei den jeweiligen Teilversuchen eingesetzten Reagenzien sind unter den Balken durch gekennzeichnet In weiteren Analysen wurde der LPC Einfluss auf die Wechselwirkung von Thrombozyten mit AsPC 1 Zellen analysiert Die AsPC 1 Pankreastumorzellen hatten zuvor eine zweit gige 119 4 Ergebnisse und Diskussion 120 LPC 450 uM Inkubation erfahren Wie in Abbildung 4 46 ersichtlich ist konnte eine LPC Inkubation die Interaktion mit aktivierten Thrombozyten minimieren allerdings waren die detektierten Unterschiede nicht signifikant Durch den Einsatz eines Antik rpers gegen P Selektin wurde die Interaktion der LPC behandelten als auch der unbehandelten Zellen mit Thrombozyten reduziert Gleichwohl f hrte auch der Einsatz eines Kontroll Antik rpers zu hnlichen Reduzierungen der Bindung Der Einsatz von 100 ug unfraktioniertem Heparin zur berpr fung ob ein synergistischer Effekt zwischen LPC Inkubation und Heparin besteht zeigte keine Wirkung F r eine umfassende Untersuchung potentieller Synergismen zwischen LPC Behandlung und Heparin bei dieser Tumorzelllinie m ssen noch weitergehende Experimente durchgef hrt werden die in diesem Rahmen der Arbeit nicht ber cksichtigt wurden 4000 1 1 3500 3000 2500 5 2000 j 1500 1000 500 0 TRAP 14 LPG P Selektin Ak Kontroll Ak
173. nkubationszeit auf das Adh sionsverhalten der MV3 Zellen Nach 24 Std Inkubation mit 450 uM LPC wurde eine Reduktion der Adh sion ersichtlich Durch fortdauernde Inkubation wurde die Adh sion weiter minimiert Ob diese Effekte wie bei den B16F10 Zellen reversibler Natur sind wurde durch den Entzug des LPC haltigen Mediums und anschlie end durchgef hrte Adh sionsuntersuchungen getestet Auch wurde ebenfalls der Einfluss von Hexadecylphosphocholin HePC auf die VLA 4 vermittelte Adh sion untersucht Wie in Abbildung 4 40 dargestellt kam es durch eine LPC Inkubation von vier Tagen und einen sich daran anschlie enden LPC Entzug von 24 Std zu einer Zunahme der Adh sion bis nahezu auf das Niveau der unbehandelten stimulierten MV3 Zellen 111 4 Ergebnisse und Diskussion A MV3 stimuliert mit Mn v MV3 stim LPC vor 24 Std entzogen 4 MV3 stim 20 uM HePC O MV3 unstimuliert Adhasion 2 Zeit s Abbildung 4 40 Einfluss des LPC Entzuges auf die Adh sion von MV3 Zellen Nach 24 Std der LPC Entziehung war ein Ansteigen der Adh sion auf das Level unbehandelter Zellen zu verzeichnen Eine Behandlung der Zellen mit 20 uM HePC f hrte zu einer Reduzierung der Adh sion Die Behandlung der MV3 Melanomzellen mit HePC in einer Konzentration von 20 uM zeigte eine Abnahme der VLA 4 vermittelten Adh sion allerdings war der Unterschied nur nach einer Sekunde nach Starten des Durchflus
174. nliches Bild ergab sich f r B16F10 Zellen die vor den Adh sionsuntersuchungen mit 50 ug unfraktioniertem Heparin behandelt wurden Allerdings konnte eine geringf gig st rkere Inhibition beobachtet werden als bei den LPC inkubierten B16F10 Zellen 109 4 Ergebnisse und Diskussion 100 80 x 60 A B16F10 stimuliert mit Mn 3 B16F10 stim LPC 300 uM 6 T Inkubation Q 4 B16F10 stim 50 ug UFH 2 40 v B16F10 stim LPC 300 uM 6 T Inkubation 50 ug UFH oO B16F10 unstimuliert 20 Zeit s Abbildung 4 38 Untersuchung der Wirkung von LPC Inkubation und unfraktioniertem Heparin auf die VLA 4 VCAM 1 Interaktion Durch den Einsatz nicht inhibitorisch wirkender Konzentrationen von Heparin 50 ug und LPC 450 uM f r sechs Tage konnte eine additive Wirkung von LPC und Heparin detektiert werden Eine Kombination aus LPC Inkubation und Heparin Behandlung in den bereits genannten Konzentrationen und Zeitr umen zeigte hingegen eine Summierung der beiden Einzeleffekte s Abbildung 4 38 Vier Sekunden nach Starten des Durchflusses war die Adh sion durch Kombination der beiden Agenzien um 50 reduziert verglichen mit den unbehandelten stimulierten Zellen Verglichen mit den Effekten der Einzelkomponenten Heparin Reduktion um ca 30 LPC Inkubation um ca 10 deuten die hier beobachteten Effekte nicht nur auf eine einfache Synergie sondern sogar auf additiv synergistische Effekte hin
175. nnen Auch die Freisetzung von tissue factor durch die Tumorzelle kann ber die Aktivierung von Faktor VII und Faktor X zu einer Aktivierung von Thrombin aus Prothrombin f hren Die Protease Thrombin spaltet einerseits Fibrinogen zu Fibrin andererseits aktiviert sie die auf Thrombozyten befindlichen Thrombinrezeptoren PAR 1 und PAR 4 durch Abspaltung der N terminalen Enden der Rezeptoren und Freilegung der aktivierenden Ligandstrukturen Die Aktivierung der Thrombozyten hat eine Form nderung die Freisetzung von TXA2 und eine verst rkte Pr sentation von P Selektin und von CD40 zur Folge Desweiteren kommt es zur Aktivierung der thrombozyt ren Integrine Om 3 und O28 und zur Sezernierung von Fibronektin und von Willebrand Faktor vWF Diese binden wiederum an Om 3 Auch kann es durch Thrombin zur Aktivierung von tumorzellst ndigen Integrinen kommen Neben den bereits genannten Adh sionsrezeptoren die zu einer Tumorzell Thrombozyt Assoziation f hren k nnen ist noch der Glykoproteinkomplex Iba IX V GPIba IX V zu nennen Dieser Komplex wird auf Thrombozyten exprimiert und bindet u a an vWF P Selektin Thrombin Integrin Ou gt 2 Thrombospondin 1 und die 13 2 Theoretischer Teil 14 Gerinnungsfaktoren XI und XII Auch dadurch wird dem Tumorzell Thrombozyten Agglomerat die Adh sion an das Gef endothel erleichtert Ein weiteres thrombozyt res Glykoprotein ist GPVI Es bindet an die ECM Kompone
176. nte Kollagen und wirkt stark aktivierend auf die thrombozyt ren Integrine Dabei ist es selbst zu einer festen Adh sion eines Thrombozyten nicht bef higt und sollte daher eher in die Reihe der aktivierenden 126 Eine bersicht mit allen bis dato bekannten und Rezeptoren eingegliedert werden beteiligten Rezeptoren ist in Abbildung 2 3 zu finden Der Beitrag von P Selektin zur Adh sion zwischen Thrombozyten und Tumorzellen kann als gesichert angesehen werden da die Agglomeratbildung in P Selektin defizienten M usen statistisch signifikant verringert war Au erdem pr sentieren Tumorzellen im Vergleich mit nicht entarteten Zellen vermehrt Mucine auf ihrer Oberfl che Auch konnte eine P Selektin vermittelte Ummantelung von Neuroblastomzellen und kleinzelligen Bronchialkarzinomzellen mit Thrombozyten gezeigt werden wobei das Integrin Om 3 als Bindungspartner ausgeschlossen werden konnte Andere Studien hingegen zeigen die Beteiligung von Am an der Tumorzellummantelung mit Thrombozyten 7 Die Beteiligung beider Molek le an der Interaktion zwischen Tumorzellen und Thrombozyten kann also angenommen werden wobei es von der eingesetzten Tumorzelllinie abzuh ngen scheint welcher Mechanismus berwiegt Die Inhibition der dargestellten Mechanismen k nnte sich positiv auf den Verlauf der Krebserkrankung auswirken Allerdings muss hierbei die physiologische Rolle der Thrombozyten bei der H mostase bedacht werden Deswege
177. ntensit t des jeweiligen Gens geschlossen werden Durch anschlie enden Abgleich von LPC behandelten mit unbehandelten Ans tzen kann eine Deregulierung quantifiziert werden Eine verminderte Expression sowohl von Rho A und B konnte f r beide Inkubationszeitr ume und Konzentrationen detektiert werden Im Kontext einer verst rkten Aktin Nucleation und der damit einhergehenden vermehrten Bildung von Filopodien scheinen diese Resultate eher widerspr chlich So w re eine verst rkte Expression von Rho A bzw B zu erwarten gewesen Allerdings kann mit der hier beschriebenen Methode der Genexpressionsanalyse nicht auf die Aktivit ten der untersuchten Proteine geschlossen werden So kann eine verminderte Expression durch eine erh hte Aktivit t Kompensiert werden Auch k nnte die verringerte Expression von Rho A und B im Sinne eines negativen Feedback Mechanismus verstanden werden in dem die berh hte Aktivit t durch die verminderte Expression eben dieser Proteine nivelliert wird Allerdings k nnte eine Reduktion von Rho A und B auch urs chlich f r die verringerte Adh sionsf higkeit LPC behandelter Zellen sein denn auch Proteine der Rho Familie sind ma geblich an der Affinit ts und Avidit tsregulation von Integrinen beteiligt So scheinen die Rho Proteine ein funktionelles Begegnungselement darzustellen denn sowohl die Aktin Organisation als auch die Integrin Funktionalit t werden ber sie reguliert Eine 114 4 Ergebnisse und D
178. ntion liefert Auch mithilfe weiterer molekularbiologischer Techniken soll das therapeutische Potential des LPC Einsatzes weiter beleuchtet werden Auf intrazellul rer Ebene konnte der VLA 4 VCAM I Bindungsweg durch die Anwendung von Inhibitoren der Histon Deacetylase effektiv gehemmt werden Diese neue Wirkstoffklasse scheint nicht nur einen zytostatischen Effekt auf Tumore auszu ben sondern auch den Prozess der Metastasierung zu beeinflussen So wurden im Rahmen dieser Arbeit verschiedene neuartige Ansatzpunkte zur Pr vention einer Adh sionsrezeptor vermittelten Metastasierung aufgezeigt in ihren Mechanismen verfolgt und somit f r potentielle therapeutische Ansatzpunkte offengelegt 132 6 Literaturverzeichnis 6 Literaturverzeichnis 1 10 11 12 13 14 Liotta L A Kleinerman J amp Saidel G M Quantitative relationships of intravascular tumor cells tumor vessels and pulmonary metastases following tumor implantation Cancer Res 34 997 1004 1974 Mareel M Berx G Van Roy F amp Bracke M Cadherin catenin complex a target for antiinvasive therapy J Cell Biochem 61 524 530 1996 Swisshelm K Macek R amp Kubbies M Role of claudins in tumorigenesis Adv Drug Deliv Rev 57 919 928 2005 Duffy M J Maguire T M McDermott E W amp O Higgins N Urokinase plasminogen activator a prognostic marker in multiple types of cancer J Surg Oncol 71 130 135 1999 Maguire T
179. nur mit 10 uL PBS beimpft Anschlie end wurden die Platten f r 71 Stunden im Brutschrank unter oben genannten Bedingungen inkubiert Das Medium mit den enthaltenen Substanzen wurde entfernt und 20 uL MTT L sung pro Well zugegeben Abermals wurde eine Stunde bei 37 C und 5 CO inkubiert Nach Entfernen der MTT L sung wurden 150 uL MTT Lyse L sung pro Well zugegeben Die Platten konnten so im K hlschrank f r mehrere Stunden verwahrt werden oder es fand direkt eine Vermessung im Platten Reader Mutiscan Ex bei Wellenl ngen von 570 nm und 690 nm statt Anhand der erhaltenen Daten konnte in einem logarithmisch aufgetragenen Diagramm ein sigmoidaler Kurvenverlauf festgestellt werden an dessen Wendepunkt die jeweils substanzspezifische mittlere inhibitorische Konzentration abzulesen war Zur Auswertung wurde das Programm GraphPad Prism 5 0 verwendet 49 3 Material und Methoden 50 Zusammensetzung der L sungen MTT L sung 5 mg MTT Feststoff gel st in 1 mL PBS MTT Lyse L sung DMSO 3 6 Durchflusszytometrie 3 6 1 Pr paration der Zellen f r die Durchflusszytometrie Da der theoretische Hintergrund der Durchflusszytometrie schon in vielen Arbeiten sehr detailreich beleuchtet wurde wird hier darauf verzichtet und auf einschl gige Literatur verwiesen Die Zellen f r einen durchflusszytometrischen Versuch wurden in Kulturflaschen unter bekannten Bedingungen kultiviert s Kapitel 3 3 1 Nach Entfernen des Mediums Wasche
180. oben beschrieben die Funktionen des LPC im Organismus mannigfaltig und noch nicht restlos aufgekl rt sind sind auch die Funktionen bzw die Beteiligung des LPC an Krebserkrankungen nur ansatzweise erforscht Neben seiner eigenen Funktion als Lokalhormon das die GPCRs G2A und GPR4 bindet dient LPC als Vorstufe f r Lysophosphatids ure LPA Diese wird durch das Enzym Autotaxin Lysophospholipase D eine membranst ndige oder sezernierte Phosphodiesterase aus LPC generiert und vermittelt zahlreiche Funktionen Beispielsweise ist LPA f r die embryonale Entwicklung entscheidend was bereits in Autotaxin defizienten M usen gezeigt werden konnte 7 21 2 Theoretischer Teil 22 So berichten die meisten Studien von LPC als Vorstufe des LPA welches wiederum intensiver in seiner Involvierung im Krebsgeschehen untersucht wurde Als gesichert anzusehen ist dass LPA die Proliferation Adh sion Migration Invasion und Metastasierung von Krebszellen positiv beeinflusst Auch konnten erh hte LPA Level im Blut von Ovarialkarzinompatientinnen detektiert werden Seine Wirkung vermittelt LPA durch bis dato vier identifizierte GPCRs Da Krebserkrankungen oft mit entz ndlichem Geschehen einhergehen und LPC in der Lage ist Zellen des Immunsystems und des Endothels zu aktivieren liegt die Vermutung nahe dass die Plasmalevel an LPC bei Krebspatienten erh ht sind Paradoxerweise ist dies jedoch nicht der Fall Mehrere Autoren be
181. ochem J 387 101 108 2005 Dustin M L amp Springer T A T cell receptor cross linking transiently stimulates adhesiveness through LFA 1 Nature 341 619 624 1989 Carman C V amp Springer T A Integrin avidity regulation are changes in affinity and conformation underemphasized Curr Opin Cell Biol 15 547 556 2003 Bilsland C A Diamond M S amp Springer T A The leukocyte integrin p150 95 CD11c CD18 as a receptor for iC3b Activation by a heterologous beta subunit and localization of a ligand recognition site to the I domain J Immunol 152 4582 4589 1994 Shimaoka M Takagi J amp Springer T A Conformational regulation of integrin structure and function Annu Rev Biophys Biomol Struct 31 485 516 2002 Luo B Carman C V amp Springer T A Structural basis of integrin regulation and signaling Annu Rev Immunol 25 619 647 2007 Moser M Legate K R Zent R amp F ssler R The tail of integrins talin and kindlins Science 324 895 899 2009 Hauck C R Hsia D A Ilic D amp Schlaepfer D D v Src SH3 enhanced interaction with focal adhesion kinase at beta 1 integrin containing invadopodia promotes cell invasion J Biol Chem 277 12487 12490 2002 Guo W amp Giancotti F G Integrin signalling during tumour progression Nat Rev Mol Cell Biol 5 816 826 2004 Mitra S K amp Schlaepfer D D Integrin regulated FAK Src signaling in normal and cancer cells Curr Opin
182. ombozytenzahl bestimmt wurde Da humanes P Selektin dem murinen strukturell sehr hnlich ist und auch an murine P Selektin Liganden bindet ist es vertretbar die Interaktion von murinen BI16F10 Melanomzellen mit humanen Thrombozyten zu untersuchen 3 13 Integrin Knockdown 3 13 1 VLA 4 Knockdown in MV3 Melanomzellen Um die Anzahl an VLA 4 Molek len in der Zellmembran von MV3 Zellen f r Adh sionsexperimente unter physiologischen Flussbedingungen zu minimieren wurde siRNA Flexi Tube siRNA eingesetzt Um den Knockdown des VLA 4 zu optimieren wurden vier verschiedene siRNAs die jeweils gegen andere mRNA Sequenzen des VLA 4 gerichtet waren gemischt und verwendet Um die siRNA in die Zellen einzubringen wurde Transfektionsreagenz x treme GENE Transfection Reagent benutzt das die Zellmembran kurzfristig f r diese durchl ssig macht Zuerst wurde die siRNA unter RNase freien Bedingungen in serumfreies Medium eingebracht Auch das Transfektionsreagenz wurde in serumfreies Medium pipettiert Beide Ans tze wurden innerhalb von 5 min vereint und f r 20 min bei RT inkubiert Danach wurde diese Mischung zu 20 000 am Vortag in 24 Well Platten ausges ten Zellen hinzugegeben Da hier nur das Prinzip des Einsatzes von siRNA vorgestellt werden soll k nnen die genauen Mengen und Konzentrationsangaben und einzelne Arbeitsschritte den Anleitungen der Hersteller entnommen werden Um die optimale Zellzahl und die optimalen nicht toxischen Konzen
183. ometrisch erhaltenen Histogrammkurven sind f r behandelte und unbehandelte Zellen nahezu identisch s Teilabbildungen C und F 89 4 Ergebnisse und Diskussion 4 2 3 2 Beeinflussung des VLA 4 VCAM 1 Bindungsweges durch verschiedene LPC Konzentrationen Nach Feststellung der Adh sionsrezeptor Expression wurde der Einfluss der LPC Inkubation auf den VLA 4 VCAM 1 Bindungsweg unter physiologischen Flussbedingungen untersucht Daf r wurden die B16F10 Zellen f r 13 Tage mit verschiedenen LPC Konzentrationen versetzt beginnend mit 300 uM was einer physiologischen Konzentration entspricht Zur besseren Veranschaulichung ist in Abbildung 4 20 nur die Adh sion der Zellen vier Sekunden nach Starten des Flusses aufgetragen Hier wird deutlich dass LPC Konzentrationen von 300 uM bis 375 uM nicht zu einer Abnahme der Adh sion im Vergleich zu unbehandelten Zellen f hrten sondern sogar geringf gige Anstiege der Adh sion vermittelten Bei Erreichen einer Konzentration von 400 uM LPC war ein Abfall der Adh sion zu detektieren der sich in signifikanten Unterschieden bei LPC Konzentrationen von 425 uM und 450 uM manifestierte kkk kkk 9 100 N To lt O 60 c 2 a Q t Oo po 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Mn 4 4 LPC uM 300 325 350 375 400 425 450 Abbildung 4 20 VLA 4 vermitteltes Adh sionsverhalten von B16F10 Zellen inkubiert mit verschiedenen LPC Konzentrationen f r 13 Tage Zellen inkubiert mit 30
184. on Tumorzellen beteiligt W hrend die Beteiligung und Funktion der Selektine bei der h matogenen Metastasierung in den letzten Jahren intensiv untersucht und aufgekl rt wurde ist die Aktivit t der Integrine im Kontext der Metastasierung weit weniger beforscht Im Rahmen der vorliegenden Arbeit soll die Rolle des Integrins VLA 4 das von verschiedenen Tumorentit ten exprimiert wird im Prozess der Metastasierung n her untersucht werden Es kann postuliert werden dass es durch Bindung an den endothelialen Liganden VCAM 1 Tumorzellen bzw tumorzellenthaltenen Mikrothromben m glich ist an das vaskul re Endothel zu adh rieren als eine Voraussetzung f r die nachfolgende Transmigration und Metastasenbildung In der vorliegenden Arbeit soll ein tieferes Verst ndnis des VLA 4 vermittelten Beitrages zur Metastasierung erlangt werden um das Integrin als pharmakologische Zielstruktur f r neuartige antimetastatische Strategien zu erschlie en Daf r sollen drei verschiedene Strategien zur Inhibition der VLA 4 vermittelten Adh sion evaluiert werden K rzlich wurde die extrazellul re Blockade des VLA 4 durch Heparin beschrieben In dieser Arbeit sollen strukturell modifizierte nicht antikoagulativ wirkende Heparinderivate auf ihre inhibitorischen Potenz untersucht werden um hinsichtlich Struktur Wirkungs Beziehungen die F higkeit von Heparin als Inhibitor im Metastasierungsprozess umfassend zu charakterisieren Durch Ver nderungen der Kompositi
185. on Model gebildet Dabei werden zwei Aktinfilamente des bestehenden Lamellipodiums zu einem Lambda Precursor vereint der dann u a durch Proteine wie Fascin zu einem Filopodium verl ngert wird Dabei ist der Arp2 3 Komplex wichtig f r die initiale Bildung des Filopodiums aus Filamenten des Lamellipodiums wohingegen andere Gruppen den Proteinkomplex aus Mena und IRSp53 als Initiatoren der Filopodienformation vorschlagen Aktiviert werden Arp2 3 bzw Mena durch die Proteine WASP Wiskot Aldrich Syndrom Protein oder IRSp53 Diese wiederum werden in ihrer Aktivit t durch Proteine die zu den Rho GTPasen Ras homologue geh ren reguliert So haben Rho GTPasen einen entscheidenden Einfluss auf die Formation des Zytoskeletts und damit auf die migratorischen Eigenschaften von Zellen Rho GTPasen geh ren zur Familie der kleinen GTPasen der Ras Familie und Cdc42 cell division cycle 42 Rho GTPasen werden durch Guanin Nucleotid Austausch Faktoren GEFs aktiviert und durch GTPase Aktivierungsproteine durch Austausch von GTP Die prominentesten und am genausten untersuchten Rho GTPasen sind Rho Rac gegen GDP desaktiviert GDIs Guanin Nucleotid Dissoziationsinhibitoren vermitteln einen 25 2 Theoretischer Teil 26 Arrest im inaktiven GDP gebundenem Zustand und verhindern eine spontane GTP vermittelte Aktivierung Nur im aktivierten GTP gebundenem Zustand ist eine Interaktion mit und Signalvermittlung an Effe
186. on von Zellmembranen durch Lysophosphatidylcholin soll weiterhin eine Einflussnahme auf die Funktion von Adh sionsrezeptoren evaluiert werden Hierbei wird der Fokus auf den molekularen Mechanismen der LPC vermittelten Wirkung liegen 29 2 Theoretischer Teil Auch soll durch den Einsatz von hochselektiven Inhibitoren eine Ausschaltung verschiedener intrazellul rer Signalwege erfolgen Die dadurch vermittelten Konsequenzen auf die Funktionalit t von Adh sionsrezeptoren sollen Aufschluss ber potentielle intrazellul re Zielstrukturen liefern die zuk nftig eine dringend ben tigte antimetastatische Therapie erm glichen k nnten 30 3 Material und Methoden 3 Material und Methoden 3 1 Verwendete Materialien 3 1 1 Ger te Tabelle 3 1 Ger te Ger t Agilent 2100 BioAnalyzers Allegra 25 R Centrifuge Analysenwaage Sartorius Basic BA210S AxioCam MRc Axiovert 25 Axiovert 200 BioRad Gel DOC 100 CASY 1 Model TT Cell Counter Analyser System CO Air Jacketed Incubator Cryo 1 C Freezing Container Eclipse TE 2000 E FACSCalibur FORMA Universal Wassermantel Inkubator Holten LaminAIR Hersteller Agilent Technologies Waldbronn Deutschland Beckman Coulter GmbH Krefeld Deutschland Sartorius AG G ttingen Deutschland Carl Zeiss AG Oberkochen Deutschland Carl Zeiss AG Oberkochen Deutschland Carl Zeiss AG Oberkochen Deutschland Bio Rad Laboratories Miinchen Deutschland
187. onen ist eine Anregung bei einer Wellenl nge von 485 nm m glich die bei einer Wellenl nge von 520 nm gr nes Licht emittiert 3 4 3 Aktivierung von Thrombozyten Eine Aktivierung der Thrombozyten wurde mit TRAP 14 einem Peptid bestehend aus 14 Aminos uren durchgef hrt Zu 100 uL Thrombozytensuspension 100 Mio Thrombozyten wurden 10 uL einer 2 5 mM TRAP 14 L sung gegeben Anschlie end wurde f r 5 min bei 37 C gelinde gesch ttelt 3 5 Zytotoxizit tsbestimmungen mittels MTT Assay 3 5 1 Prinzip des MTT Assays Mithilfe des MTT Assays 3 4 5 Dimethlythiazol 2 yl 2 5 diphenyltetrazoliumbromid kann die Lebensf higkeit von Zellen bzw die Toxizit t von Substanzen auf bestimmten Zellen untersucht werden Eine Bestimmung der mittleren inhibitorischen toxischen Konzentration ICso ist m glich Die Zellen werden ber einen Zeitraum von 72 Stunden mit der zu untersuchenden Substanz bei 37 C und 5 CO Luftgehalt inkubiert Danach wurde den Zellen sowohl das Medium als auch die darin befindliche Substanz entzogen und es wurde eine schwach gelbe 3 4 5 Dimethylthiazol 2 yl 2 5 diphenyltetrazoliumbromid L sung 3 Material und Methoden MTT L sung hinzu pipettiert Da vitale Zellen mitochondriale Aldehyddehydrogenasen besitzen unabh ngig davon in welchem Stadium des Zellzykluses sie sich zu diesem Zeitpunkt befinden stehen mit NADPH Nicotins ureamid Adenin Dinukleotid Phosphat Reduktions quivalente zur Verf gung d
188. ontains a sorting determinant that mediates rapid degradation in lysosomes J Cell Biol 124 435 448 1994 Setiadi H Disdier M Green S A Canfield W M amp McEver R P Residues throughout the cytoplasmic domain affect the internalization efficiency of P selectin J Biol Chem 270 26818 26826 1995 Gotsch U Jager U Dominis M amp Vestweber D Expression of P selectin on endothelial cells is upregulated by LPS and TNF alpha in vivo Cell Adhes Commun 2 7 14 1994 Bischoff J amp Brasel C Regulation of P selectin by tumor necrosis factor alpha Biochem Biophys Res Commun 210 174 180 1995 Sanders W E Wilson R W Ballantyne C M amp Beaudet A L Molecular cloning and analysis of in vivo expression of murine P selectin Blood 80 795 800 1992 Varki A Selectin ligands will the real ones please stand up J Clin Invest 99 158 162 1997 6 Literaturverzeichnis 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 Moore K L Structure and function of P selectin glycoprotein ligand 1 Leuk Lymphoma 29 1 15 1998 Moore K L et al Identification of a specific glycoprotein ligand for P selectin CD62 on myeloid cells J Cell Biol 118 445 456 1992 Sako D et al A sulfated peptide segment at the amino terminus of PSGL 1 is critical for P selectin binding Cell 83 323 331 1995 Zarbock A et al PSGL 1 engagement by E selectin signal
189. parininjektion 24 Std nach Tumorzellverabreichung detektiert werden Dahingegen scheint der Applikationsweg der Heparinverabreichung keinen Einfluss auf die Tumorzellmetastasierung zu haben In den meisten tierexperimentellen Studien wurden hohe 2 Theoretischer Teil Heparinkonzentrationen eingesetzt welche die therapeutisch verwendeten Mengen bertreffen Allerdings zeigte sich auch in Studien in denen klinisch relevante Mengen Heparin verwendet wurden eine Reduktion der Metastasierung Die folgenden Mechanismen welche die beschriebenen Effekte hervorrufen sind abh ngig von der Tumorzellentitat und treffen jeweils nur teilweise auf bestimmte Zelllinien zu Im Jahr 1993 wurde eine Bindung von Heparin an P und L Selektin beschrieben und in vivo konnte die immunmodulierende Wirkung gezeigt werden Sp ter konnte durch den Einsatz von P bzw L Selektin defizienten M usen Heparin als Inhibitor von P und L Selektin 132 166 bewiesen werden Eine Heparinapplikation zur Zeit der Tumorzell Administration u ert sich vornehmlich in einer Inhibition von thrombozyt rem P Selektin Eine Heparininjektion 6 bis 18 Stunden nach Tumorzellgabe wirkt haupts chlich ber eine Blockade von leukozyt rem L Selektin Durch den Einsatz von modifizierten Heparinderivaten konnten Struktur Wirkungs Beziehungen an P und L Selektin hergeleitet 161 168 16 Diese Derivate weisen teilweise keine oder nur verminderte werd
190. pe IV and fibronectin J Leukoc Biol 73 243 252 2003 Mitchell J S Brown W S Woodside D G Vanderslice P amp McIntyre B W Clustering T cell GM1 lipid rafts increases cellular resistance to shear on fibronectin through changes in integrin affinity and cytoskeletal dynamics Immunol Cell Biol 87 324 336 2009 Leitinger B amp Hogg N The involvement of lipid rafts in the regulation of integrin function J Cell Sci 115 963 972 2002 Shamri R et al Chemokine stimulation of lymphocyte alpha 4 integrin avidity but not of leukocyte function associated antigen 1 avidity to endothelial ligands under shear flow requires cholesterol membrane rafts J Biol Chem 277 40027 40035 2002 Gajate C amp Mollinedo F The antitumor ether lipid ET 18 OCH 3 induces apoptosis through translocation and capping of Fas CD95 into membrane rafts in human leukemic cells Blood 98 3860 3863 2001 155 6 Literaturverzeichnis 156 299 300 301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 Gajate C et al Intracellular triggering of Fas independently of FasL as a new mechanism of antitumor ether lipid induced apoptosis Int J Cancer 85 674 682 2000 Vink S R van Blitterswijk W J Schellens J H M amp Verheij M Rationale and clinical application of alkylphospholipid analogues in combination with radiotherapy Cancer Treat Rev 33 191 202 2007 Oberle C Massing U
191. r Wirkungs Beziehungen der Heparinbindung an VLA 4 vorgestellt 1 Einleitung Desweiteren werden Einblicke zur antimetastatischen Wirksamkeit von ges ttigten Phospholipiden auf die Fragestellung des VLA 4 als metastasierungsrelevanten Adh sionsrezeptor bertragen Es werden hierf r erstmals Erkenntnisse zur Beeinflussung der VLA 4 Funktion durch Lysophosphatidylcholin funktionell und mechanistisch vorgestellt Letztlich wird die M glichkeit analysiert inwieweit Hemmstoffe bekannter signalling pathways ebenfalls einen Einfluss auf die Adh sionsfunktion des VLA 4 entfalten Die Arbeit bietet somit einen breiten Einblick in die potentielle pharmakologische Beeinflussbarkeit von Adh sionsrezeptoren als vielversprechende Optionen f r eine dringend notwendige antimetastatische Therapie 2 Theoretischer Teil 2 Theoretischer Teil 2 1 Prinzip der h matogenen Metastasierung Die h matogene Metastasierung ist ein hochregulierter Komplexer Prozess der noch nicht in allen Einzelheiten verstanden ist Eine Tumorzelle die sich diesem Prozess unterwirft muss alle Teilschritte dieser Kaskade erfolgreich durchlaufen um schlie lich einen Sekund rtumor in einem entfernten Organ etablieren zu k nnen Die erste Eigenschaft die eine Tumorzelle aufweisen muss ist die F higkeit sich vom Prim rtumor zu l sen Dies geschieht beispielsweise durch eine verminderte Expression von E Cadherin das homophile Zell Zell Interaktionen vermittel
192. rch LPC oder SPC f hrt in GPR4 transfizierten HEK293 Zellen zu einer verst rkten Expression SRE abh ngiger Serum Response Element Gene Auch konnte in Swiss 3T3 Zellen eine verst rkte GPR4 vermittelte DNA Synthese festgestellt werden ebenso wie eine Chemotaxis Andererseits war durch eine GPR4 berexpression eine ligand 9 unabh ngige Inhibition der Aktivierung von ERK zu beobachten Durch weitere vielf ltige intrazellul re Mechanismen die GPR4 ausl st wird vermutet dass GPR4 mit 218 verschiedenen G Proteinen interagieren kann Auch mutma en einige Arbeitsgruppen dass LPC kein direkter Ligand von G2A und GPR4 ist sondern vielmehr die Anreicherung der Rezeptoren an der Zelloberfl che vermittelt Neben der Aktivierung durch Lysolipide k nnen sowohl G2A als auch GPR4 durch Protonen aktiviert werden Dabei werden Histidin Reste der Rezeptoren protoniert wodurch Konformations nderungen in den Rezeptoren herbeigef hrt werden Dies kann eine Rezeptoraktivierung nach sich ziehen Welche Histidinreste f r eine Aktivierung notwendig sind ist Gegenstand aktueller Forschung Weiterhin werden Protonen vermittelte allosterische Wirkmechanismen diskutiert Seit 2004 wird auch der Agonismus von LPC an G2A und GPR4 in Frage gestellt und LPC wird von mehreren Arbeitsgruppen als Antagonist beschrieben Protonen werden hingegen als Agonisten erachtet 2 4 3 Lysophosphatidylcholin und Krebs Da wie
193. rden sie 1975 von A Yunis aus einem 65 j hrigen Patienten Sie zeichnen sich durch einen triploiden Chromosomensatz aus Die Zellen wurden von Prof Dr Massing vom Institut f r Tumorbiologie der Universit t Freiburg zur Verf gung gestellt Kultiviert wurden sie in D MEM GlutaM AXTM Medium unter Zusatz von 10 V V FKS inaktiviert und 1 V V Penicillin Streptomycin L sung Die Subkultivierung erfolgte analog Kapitel 3 3 1 3 4 Isolierung von Thrombozyten 3 4 1 Isolierung und Quantifizierung von Thrombozyten Die Thrombozyten wurden aus Vollblut junger gesunder Spender isoliert Nach der Abnahme befand sich das Blut in Kalium EDTA haltigen S Monovetten um einer Koagulation durch Ca Entzug vorzubeugen Nach Umf llen des Blutes in Zentrifugenr hrchen wurde mit einer Beschleunigung von 224 g und 37 C f r 15 min zentrifugiert Dadurch kam es zu einer Auftrennung der Blutbestandteile mit einer Anreicherung von thrombozytenreichem Plasma Das Plasma wurde auf die trockene Oberfl che einer frisch vorbereiteten S ule bestehend aus Sepharose 4B gegeben Die S ule wurde zuvor mit 50 mL Pl ttchenpuffer gesp lt Nachdem durch ffnen des Hahns das Plasma vollst ndig in die S ule eingetreten war wurden weitere 50 mL Pl ttchenpuffer auf die S ule gegeben um den Transport der Probe durch die S ule voranzutreiben Die thrombozytenreiche Fraktion des Eluates lie sich durch eine leichte Tr bung identifizieren Die S ule wurd
194. ren Adh sionsrezeptoren lag hierauf das besondere Augenmerk Die murine Melanomzelllinie B16F10 fand f r diese Untersuchungen Verwendung da sie ein hohes metastatisches Potential aufweist Zun chst wurden die Zellen in Kulturflaschen mit 450 uM LPC versetzt Dies entspricht einer leicht erh hten physiologischen Konzentration Um LPC vermittelte zytotoxische Effekte zu vermeiden wurden 20 mg mL Bovines Serum Albumin zugesetzt dies bindet freies LPC reversibel Neben den B16F10 Zellen wurden auch Luciferase transfizierte B16F10 Zellen in die Untersuchungen eingeschlossen um zu berpr fen ob durch die Transfektion ein ver ndertes Verhalten der Zellen zu beobachten ist Jeweils nach 24 Std wurde die LPC Konzentration im Medium enzymatisch bestimmt dabei lie die Entstehung eines roten Farbstoffs R ckschl sse auf die LPC Konzentration zu Diese Untersuchungen wurden von Dr Jantscheff im Institut f r Tumorbiologie in Freiburg durchgef hrt Wie in Abbildung 4 15 ersichtlich nahm die LPC Konzentration in den Kulturflaschen mit B16F10 Zellen innerhalb 84 4 Ergebnisse und Diskussion von 24 Std auf die Halfte der Ausgangskonzentration ab und nach 48 Std war das LPC quantitativ verbraucht Die Konzentration im zellfreien Medium blieb hingegen konstant 120 100 80 B16F10 ELN mit 450 uM LPC 60 ie B16F10 mit 450 uM LPC 0 40 E Kulturmedium ohne Zellen mit 450 uM LPC LPC Konzentration im Mediu
195. richten von erniedrigten Konzentrationen an LPC die mit dem Voranschreiten der Krankheit und erh hten Entz ndungsparametern einhergehen Ein hnlich paradoxes Bild konnte bei der Sepsis beobachtet werden Durch Massing und Mitarbeiter konnten 2007 gezeigt werden dass eine erniedrigte LPC Konzentration im Blutplasma von Krebspatienten mit einer Erh hung des Entz ndungsmediators C reaktives Protein und 235 Zhao et al berichteten von einer verst rkten Kachexie der Patienten einhergeht erniedrigten LPC Spiegeln im Blutplasma bei einer Kolorektalkarzinom Patientenpopulation und schlagen daraufhin LPC als Biomarker f r die Diagnostik des Kolorektalkarzinoms vor Unges ttigte LPCs mit einer oder zwei Doppelbindungen in der Acylkette scheinen hier die sensitivsten Marker zu sein und dies bereits schon f r fr he Krankheitsstadien Generell konnte bei verschiedenen Tumorentit ten eine Verringerung der LPC Konzentration im Blutplasma detektiert werden beispielsweise bei Leuk mie Lymphomen Tumoren des 186 187 237 Verdauungstraktes und bei Nierenzellkarzinomen Bei Remission der Erkrankung lie sich auch ein Anstieg der LPC Konzentration auf Normalwerte verzeichnen In Untersuchungen Ende der neunziger Jahre in denen ebenfalls die Plasmalevel an LPC von Krebspatienten bestimmt wurden stellte sich teilweise ein kontr res Bild dar So wurde ein erh hter LPC Spiegel bei Ovarialkarzinom und Myelompatienten detekti
196. rmals LPC behandelten Zellen zu erkennen 80 A B16F10 stimuliert mit Mn B16F10 LPC vor 18 Std entzogen stim w B16F10 LPC vor 12 Std entzogen stim A B16F10 LPC vor 8 Std entzogen stim B16F10 LPC vor 4 Std entzogen stim O B16F10 unstimuliert 60 Adh sion Zeit s Abbildung 4 22 Einfluss des LPC Entzuges auf die Adh sion von B16F10 Zellen Nach 4 Std der LPC Entziehung war ein Ansteigen der Adh sion zu verzeichnen Nach 18 Std war die Adh sionsf higkeit vollst ndig wiederhergestellt Die beobachteten Effekte scheinen somit reversibler Natur zu sein Ob sich eine Verminderung der Adh sion durch erneute LPC Inkubation der B16F10 Zellen erreichen l sst wurde durch erneute 24st ndige LPC Inkubation untersucht Es zeigte sich eine Verminderung der Adh sion bei 24st ndiger LPC Inkubation Diese war st rker ausgepr gt als bei erstmaliger Inkubation ber den gleichen Zeitraum s Abbildung 4 23 Die Reduktion der Adh sion von B16F10 Melanomzellen durch LPC Inkubation stellt somit einen reversiblen Effekt dar der sich je nach LPC Konzentration und Inkubationszeit ver ndert Die molekularen Ursachen bleiben an dieser Stelle noch ungekl rt 92 4 Ergebnisse und Diskussion 100 80 om x x 2 z 60 aaa N Ea A B16F10 stimuliert mit Mn Q PESA A B16F10 LPC 24 Std Inkubation stim 2 l ene v B16F10 LPC 24 St
197. rmationen tiber die Bindungsstelle des Heparins am Integrin sind deswegen nicht vorhanden Da Heparinbindungen an anderen Integrinen nur vereinzelt in der Literatur berichtet wurden lassen sich daraus keine verallgemeinernden Schussfolgerungen ziehen Daher sollte die Heparin Bindungsstelle in ersten Versuchen grob charakterisiert werden Dazu wurden Antik rper gegen die a Untereinheit Natalizumab und gegen die B Untereinheit anti CD29 auf Glaspl ttchen immobilisiert die dann zu Zelladh sionsversuchen herangezogen wurden Bei den Versuchen wurden jeweils 500 ug unfraktioniertes Heparin zugegeben Liegt die 79 80 4 Ergebnisse und Diskussion Heparinbindungsstelle auf der a bzw der Untereinheit des Integrins so sollte das gebundene Heparin die Bindung der Zelle an den a bzw den B Antik6rper inhibieren Wie in Abbildung 4 12 ersichtlich bindet Heparin vornehmlich an die a Untereinheit da die Adh sion eine Sekunde nach Starten des Flusses um 80 reduziert ist im Vergleich zu Versuchsans tzen bei denen kein Heparin verwendet wurde Bei Versuchen mit Antik rpern gegen die B Untereinheit wurde die Adh sion im gleichen Zeitraum nur um 25 reduziert Dies sind erste Anhaltspunkte die f r eine dominante Bindung des Heparins an die a Untereinheit sprechen Allerdings sind die genauen Bindungsstellen der Antik rper nicht bekannt So ist beispielsweise denkbar dass der Antik rper gegen die B Untereinheit und Heparin an r uml
198. rmittelt werden Dabei unterscheiden sich die strukturellen Voraussetzungen 83 4 Ergebnisse und Diskussion der Heparinmolek le f r eine VLA 4 Inhibition teilweise deutlich von den Bedingungen f r eine Hemmung der Selektine Weitere in vivo Untersuchungen m ssten durchgef hrt werden um die VLA 4 Inhibition durch Heparin in ihrer physiologischen Relevanz beim Prozess der h matogenen Metastasierung zu untermauern Auch ist zuk nftig bei Kenntnis der molekularen Adh sionsfunktionen verschiedener Tumorentit ten ein gezielter antimetastatischer Einsatz von definierten m glichst nicht antikoagulativ wirksamen Heparinderivaten denkbar 4 2 Untersuchung des Einflusses von Lysophosphatidylcholin auf das Metastasierungs verhalten verschiedene Krebszelllinien 4 2 1 LPC Metabolismus von B16F10 Melanomzellen 4 2 1 1 Aufnahme von LPC durch B16F10 Melanomzellen Wie in Kap 2 4 4 dargelegt konnten Massing und Mitarbeiter eine antimetastatische Wirkung von leeren Liposomen in einem Pankreastumormodell zeigen Als molekulare Hypothese wird eine Anreicherung der Liposomen im Tumor durch den EPR Effekt und eine anschlie ende Spaltung der liposomalen Phospholipide zu LPC angenommen das dann in lokal hohen Konzentrationen die Tumorzellen beeinflusst In dieser Arbeit sollten Beitr ge f r die Erkl rung der molekularen Mechanismen des LPC in seiner antimetastatischen Wirkung erbracht werden Durch die bekannte Schl sselrolle der zellul
199. rper am Fc Teil mit Biotin gelabelt ist kann hieran ein Streptavidin HRP Konjugat binden das im n chsten Schritt zugegeben wird Durch Zugabe von Luminol das durch die Meerrettichperoxidase oxidiert und angeregt wird werden Photonen emittiert die in einer Dunkelkammer durch Auflegen von R ntgenfilmen sichtbar gemacht werden k nnen Diese Filme werden fixiert und an einem Reader mit entsprechender Software hinsichtlich ihrer Pixeldichte quantifiziert 62 3 Material und Methoden Abbildung 3 6 R ntgenfilm von zwei ausgewerteten Membranen Jedes Protein wird in Duplikaten bestimmt Die Pixeldichte wird durch eine spezielle Software erfassbar 3 11 3 Durchf hrung und Auswertung Untersucht wurde mit dem Human Apoptosis Array Kit ob und welche apoptoserelevanten Proteine durch eine LPC Inkubation von MV3 Zellen hochreguliert wurden Durchgef hrt wurde der Kit entsprechend der Anleitung des Herstellers R amp D Systems Zur Lyse der Zellen wurde der im Kit enthaltenen Lyse Puffer unter Zusatz von jeweils 10 ug Aprotinin Leupeptin und Pepstatin pro mL Puffer verwendet Darauf wurde die Membran mit 400 ug Gesamtprotein versetzt Als Chemiluminescence Substrat wurde Super Signal West Dura Extended Duration Substrate der Firma Thermo Scientific verwendet Der entwickelte R ntgenfilm wurde mithilfe des Readers BioRad Gel DOC 100 ausgelesen und mit der Software Quantity One 4 2 3 von BIORAD ausgewertet
200. rschiedlicher Spezies bertragbar zu sein Die funktionelle Charakterisierung von Pankreastumorzellen nach LPC Exposition ist in Kapitel 4 2 11 n her beschrieben 4 2 4 3 Quantifizierung der Filopodien auf B16F10 Melanomzellen Nach Generierung der rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen von _ BI6F10 Melanomzellen inkubiert mit LPC in verschiedenen Konzentrationen f r verschiedene Zeitr ume wurde eine Quantifizierung der Filopodien vorgenommen s Abbildung 4 32 Die bereits in Kapitel 4 2 4 2 dargestellten optischen Eindr cke best tigen sich nun auch statistisch 102 4 Ergebnisse und Diskussion kk 180 160 a O N B O O O O Filopodien Fl che oa oO N fb oOo Oo B16F10 B16F10 300 pM 3T 300 pM 20T B16F10 450 pM 3T 450 pM 20T B16F10 B16F10 Abbildung 4 32 Quantifizierung von Filopodien auf LPC behandelten und unbehandelten Zellmembranen Es konnten statistisch signifikante Unterschiede zwischen 300 uM LPC und 450 uM LPC behandelten B16F10 Zellen ermittelt werden Durch Inkubation der Zellen mit 300 uM LPC kam es in etwa zu einer Verdopplung der Zahl der Filopodien auf der Zellmembran im Vergleich zu unbehandelten Zellen Die Inkubationsdauer hatte hier keinen oder nur einen sehr geringen Einfluss auf die Mengen an Filopodien Eine Inkubation mit 450 uM LPC f r drei Tage f hrte zu einer f nffachen Expression von Filopodien auf der Zellmembran die nach 20 Tagen auf das Sieb
201. s through Src kinase Fgr and ITAM adapters DAP12 and FcR gamma to induce slow leukocyte rolling J Exp Med 205 2339 2347 2008 Aigner S et al CD24 a mucin type glycoprotein is a ligand for P selectin on human tumor cells Blood 89 3385 3395 1997 Aruffo A Kolanus W Walz G Fredman P amp Seed B CD62 P selectin recognition of myeloid and tumor cell sulfatides Cell 67 35 44 1991 Romo G M et al The glycoprotein Ib IX V complex is a platelet counterreceptor for P selectin J Exp Med 190 803 814 1999 Goetz D J et al A human colon carcinoma cell line exhibits adhesive interactions with P selectin under fluid flow via a PSGL 1 independent mechanism Am J Pathol 149 1661 1673 1996 Ma Y Q amp Geng J G Heparan sulfate like proteoglycans mediate adhesion of human malignant melanoma A375 cells to P selectin under flow J Immunol 165 558 565 2000 Hanley W et al Single molecule characterization of P selectin ligand binding J Biol Chem 278 10556 10561 2003 Garcia J Callewaert N amp Borsig L P selectin mediates metastatic progression through binding to sulfatides on tumor cells Glycobiology 17 185 196 2007 Lee H J et al CD24 a novel cancer biomarker predicting disease free survival of non small cell lung carcinomas a retrospective study of prognostic factor analysis from the viewpoint of forthcoming seventh new TNM classification J Thorac Oncol 5 649 657 2010 Kim
202. selwirkungen von VLA 4 Molek len die die Tumorzellen zusammenhalten und so eine Abl sung und Dissemination von bestehenden Tumoren h 116 verhindern Diese Theorie untermauernd wurde 2008 im New England Journal of Medicine von zwei Multiple Sklerose Patientinnen berichtet die mit dem gegen VLA 4 gerichteten Antik rper Natalizumab behandelt wurden Bei beiden Patientinnen wurden Leberflecke identifiziert die sich nach Natalizumab Gabe schnell in metastasierende Melanome ver ndert hatten Eine daraufhin durchgef hrte Metaanalyse von Natalizumab behandelten Patienten best tigte diese Resultate allerdings nicht Die Autoren schlussfolgern dass VLA 4 in einem fr hen Stadium der Tumorentwicklung eher den Zusammenhalt des Tumors f rdert und deshalb nicht antagonisiert werden sollte zu einem sp teren Zeitpunkt hingegen zu einem prometastatischen und invasiven Ph notyp beitr gt 2 2 6 Rolle der Thrombozyten bei der h matogenen Metastasierung Nach Erreichen des Blutflusses kommt es zu einer schnellen Ummantelung der Tumorzelle mit Thrombozyten wodurch sich die Tumorzelle einige berlebensvorteile sichert Sie sch tzt sich einerseits vor nat rlichen Killerzellen NK Zellen und zytotoxischen T Zellen 12 2 Theoretischer Teil und deren zytotoxischen Mediatoren wie TNFa Perforinen oder Granzymen Im Jahre 2009 konnte gezeigt werden dass der von Thrombozyten sezernierte platelet derived transforming grow
203. ses signifikant verschieden von unbehandelten stimulieren Zellen LPC und HePC scheinen also auch bei dieser Zelllinie Adh sionsrezeptoren in ihrer Funktion zu inhibieren Die bei den murinen B16F10 Melanomzellen beobachteten Effekte lassen sich somit auch auf andere Zelllinien bertragen 4 2 8 Untersuchung des Transkriptoms von MV3 Melanomzellen nach LPC Inkubation mittels Genexpressionsanalyse Die beschriebenen Aktivit ten des LPC auf die Integrinfunktion offensichtlich durch membran re Effekte deuten auf eine komplexe Beeinflussung vielf ltiger Signalwege der Zellen hin Eine orientierende Information ber beeinflusste pathways sollte eine Untersuchung der Genexpression von Melanomzellen nach LPC Behandlung liefern Daf r wurde die Mikrochip Technologie der Firma Illumina verwendet So war eine umfassende Analyse des gesamten Transkriptoms von LPC behandelten Zellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen m glich Eine punktuelle Betrachtung einzelner Gene mittels quantitativer Echtzeit PCR konnte so vermieden werden Da nur humane Mikrochips zur Verf gung standen wurde statt der murinen Zelllinie B16F10 auf die humane Melanomzelllinie MV3 zur ckgegriffen MV3 Zellen zeigen eine hnliche Reaktion auf LPC Behandlung wie B16F10 Zellen weshalb dies zul ssig war Durch die 112 4 Ergebnisse und Diskussion Analysen sollten einerseits die Auswirkungen verschiedener LPC Konzentrationen auf die Genexpression analysiert werden ander
204. sionsverhaltens durch Lipidmetabolite scheint somit nicht urs chlich f r die beobachteten Effekte 4 2 6 Beeinflussung des VLA 4 VCAM 1 Bindungsweges von B16F10 Melanomzellen durch Kombinationen aus LPC und Heparin Wie bereits in Kapitel 4 1 2 dargestellt konnte Heparin die Interaktion zwischen VLA 4 und VCAM I in in vitro Untersuchungen unter Flussbedingungen effektiv hemmen Dabei interagierte Heparin mit dem extrazellul ren Teil des VLA 4 Auch LPC vermag wie in Kapitel 4 2 3 beschrieben die VLA 4 VCAM 1 Bindung zu inhibieren Die zugrundeliegenden Effekte scheinen wie in Kapitel 4 2 4 4 beschrieben auf einer Beeinflussung von Lipid Rafts und der Ausbildung von Filopodien zu beruhen Daher stellte sich die Frage ob durch den Einsatz einer Kombination beider Agenzien eine verst rkte Inhibition des VLA 4 VCAM 1 Bindungsweges zu erzielen ist Infolgedessen wurden verschiedene Untersuchungen durchgef hrt um synergistische Effekte zu detektieren bzw zu 108 4 Ergebnisse und Diskussion quantifizieren Zun chst wurden dazu B16F10 Melanomzellen f r 13 Tage mit LPC in einer Konzentration von 450 uM inkubiert und Adh sionsuntersuchungen unter physiologischen Flussbedingungen unterzogen wobei gleichzeitig 500 ug unfraktioniertes Heparin zugegeben wurde Wie in Abbildung 4 37 zu erkennen konnte die Kombination aus LPC Inkubation und 500 ug unfraktioniertem Heparin die Adh sion sogar unter das Niveau unstimulierter Zellen absenken D
205. st rkung Gegenteiliges berichten Mahlknecht et al sie konnten in Zellen der Akuten Myeloischen Leuk mie h matopoetischen Stammzellen und Monozyten eine Downregulation von VLA 4 Molek len sowohl nach Behandlung mit Vorinostat als auch mit dem HDACi Valproins ure detektieren ae eat es pl 3 lad 976 Dies u erte sich in einer verminderten Adh sion J ngel et al zeigten dass es durch eine Kombination aus Valproins ure und dem Tyrosinkinaseinhibitor AEE788 zu einer verminderten Expression der Integrinuntereinheiten a3 P3 P und B4 in Nierenkarzinomzellen kommt was zu einer verminderten Wechselwirkung mit Komponenten der extrazellul ren Matrix f hrt Allerdings konnten auch Unterschiede in der Expression verschiedener 2 Theoretischer Teil Molek le die an der Integrinaktivierung beteiligt sind festgestellt werden So werden auch sie als Ursache f r eine verminderte Adh sion diskutiert Eine R ckf hrung des pathophysiologischen Integrinexpressionsmusters hin zur physiologischen Rezeptor Ausstattung durch Valproins uregabe wird vermutet Die Erforschung der Rolle von HDACi bei der Inhibition von Integrinen im Rahmen der Tumorzellmetastasierung befindet sich gerade erst am Anfang und bedarf weiterer Untersuchungen die sowohl die Integrin Expression als auch die Rolle von Signalmolek len betrachten 2 7 Ziel der Arbeit Adh sionsrezeptoren sind ma geblich am Prozess der h matogenen Metastasierung v
206. t So korreliert die verringerte Expression von E Cadherin mit der Progression von Tumoren F r manche Tumorentit ten kann auch ein Zusammenhang zwischen der Expression von Tight Junction Proteinen wie beispielsweise Claudin 1 und der Tumorproliferation hergestellt werden Nach erfolgter L sung von Zell Zell Kontakten kommt es zur Sezernierung verschiedener Enzyme die die extrazellul re Matrix degradieren Als involvierte Enzyme sind die Matrixmetalloproteinasen die Cathepsine und die Serinproteinasen zu nennen Diese lassen sich anhand ihrer Substratspezifit ten in weitere Subgruppen unterteilen Eine Involvierung dieser Enzyme in die Krebsprogression wurde bereits f r viele unterschiedliche Tumore gezeigt So dient z B der Plasminogenaktivator vom Urokinasetyp als Tumormarker bei Brustkrebs Nach erfolgter Herausl sung aus dem Zellverband und Degradierung der extrazellul ren Matrix erfolgt die Zellmigration Dazu findet eine Polarisierung der Zelle in Vorder und Hinterseite statt die eine gerichtete Migration erst m glich macht Nach Ausbildung von Lamellipodien und Filopodien an der Vorderseite der Zelle und Integrin vermittelter Adh sion an die extrazellul re Matrix kommt es zur Myosin II vermittelten Kontraktion des Zellleibes Parallel dazu findet am hinteren Teil der Zelle eine proteolytische oder durch mechanische Kr fte bedingte Abl sung von der extrazellul ren Matrix statt Hierbei verbleiben Integrinfragmente a
207. t oder erf hrt eine Sch digung der DNA kommt es zur Akkumulation und Konformationsver nderungen von p53 in der Zelle Infolgedessen kann p53 in den Zellkern translozieren und dort die Translation proapoptotischer und zellzyklusinhibierender Proteine 87 4 Ergebnisse und Diskussion f rdern Beispielsweise werden die Proteine p21 und p27 vermehrt translatiert Diese binden und inhibieren u a Proteine die den Zellzyklus vorantreiben wie die Cyclin abh ngigen Kinasen 2 und 4 Diese vermitteln den Arrest in der G Phase des Zellzyklusses und einen Proliferationsstopp Sollten die MV3 Zellen eine Sch digung durch die LPC Inkubation erfahren haben so w re eine deutlich erh hte Menge der oben untersuchten Proteine im Zelllysat im Vergleich zu unbehandelten MV3 Zellen zu detektieren gewesen Die in Tabelle 4 1 aufgef hrten Proteine wurden ebenfalls quantifiziert zeigten jedoch keine signifikant verschiedenen Expressionslevel Tabelle 4 1 Untersuchte potentiell apoptoserelevante Proteine Bad HSP60 HSP70 Bcl 2 HTRA2 Omi Bax Bel x Livin Pro Caspase 3 PON2 Cleaved p2V CIPVCDNKIA Catalase p27 Kipl cIAP 1 Caspase 3 Phospho p53 cIAP 2 Phospho p53 S46 Claspin Phospho p53 S15 S392 Clusterin Phospho Rad17 Cytochrome c SMAC Diablo TRAIL S635 R1I DR4 Survivin TRAIL R2 DR5 TNF RI TNFRSFIA FADD XIAP Fas TNFRSF6 HIF 1 HO 1 HMOX1 HSP32 HO 2 HMOX2 HSP27 4 2 3 Einfluss des LPC auf die Adh sions
208. t of patients with acute venous thromboembolism results of a meta analysis Am J Med 100 269 277 1996 Hettiarachchi R J et al Do heparins do more than just treat thrombosis The influence of heparins on cancer spread Thromb Haemost 82 947 952 1999 Agnelli G et al Nadroparin for the prevention of thromboembolic events in ambulatory patients with metastatic or locally advanced solid cancer receiving chemotherapy a randomised placebo controlled double blind study Lancet Oncol 10 943 949 2009 Altinbas M et al A randomized clinical trial of combination chemotherapy with and without low molecular weight heparin in small cell lung cancer J Thromb Haemost 2 1266 1271 2004 Kakkar A K et al Low molecular weight heparin therapy with dalteparin and survival in advanced cancer the fragmin advanced malignancy outcome study FAMOUS J Clin Oncol 22 1944 1948 2004 Klerk C P W et al The effect of low molecular weight heparin on survival in patients with advanced malignancy J Clin Oncol 23 2130 2135 2005 Lee A Y Y et al Randomized comparison of low molecular weight heparin and coumarin derivatives on the survival of patients with cancer and venous thromboembolism J Clin Oncol 23 2123 2129 2005 Borsig L Antimetastatic activities of heparins and modified heparins Experimental evidence Thromb Res 125 Suppl 2 S66 71 2010 Bereczky B et al Selective antimetastatic effect of heparins in preclin
209. te chemoattractant protein 1 gene expression in rat aortic smooth muscle cells Arterioscler Thromb Vasc Biol 22 1617 1623 2002 Engelmann B et al Tissue factor expression of human monocytes is suppressed by lysophosphatidylcholine Arterioscler Thromb Vasc Biol 19 47 53 1999 Dichtl W et al Oxidized LDL and lysophosphatidylcholine stimulate plasminogen activator inhibitor 1 expression in vascular smooth muscle cells Arterioscler Thromb Vasc Biol 19 3025 3032 1999 Oka H et al Lysophosphatidylcholine induces urokinase type plasminogen activator and its receptor in human macrophages partly through redox sensitive pathway Arterioscler Thromb Vasc Biol 20 244 250 2000 Lundbaek J A amp Andersen O S Lysophospholipids modulate channel function by altering the mechanical properties of lipid bilayers J Gen Physiol 104 645 673 1994 Kume N Cybulsky M I amp Gimbrone M A Lysophosphatidylcholine a component of atherogenic lipoproteins induces mononuclear leukocyte adhesion molecules in cultured human and rabbit arterial endothelial cells J Clin Invest 90 1138 1144 1992 Sugiyama S Kugiyama K Ohgushi M Fujimoto K amp Yasue H Lysophosphatidylcholine in oxidized low density lipoprotein increases endothelial susceptibility to polymorphonuclear leukocyte induced endothelial dysfunction in porcine coronary arteries Role of protein kinase C Circ Res 74 565 575 1994 Murohara T Scalia
210. teins and Promotes Apoptosis Journal of Biological Chemistry 278 14379 14386 2003 Kabarowski J H et al Direct genetic demonstration of G alpha 13 coupling to the orphan G protein coupled receptor G2A leading to RhoA dependent actin rearrangement Proc Natl Acad Sci U S A 97 12109 12114 2000 Radu C G Yang L V Riedinger M Au M amp Witte O N T cell chemotaxis to lysophosphatidylcholine through the G2A receptor Proc Natl Acad Sci U S A 101 245 250 2004 Tomura H Mogi C Sato K amp Okajima F Proton sensing and lysolipid sensitive G protein coupled receptors a novel type of multi functional receptors Cell Signal 17 1466 1476 2005 Bektas M et al The G protein coupled receptor GPR4 suppresses ERK activation in a ligand independent manner Biochemistry 42 12181 12191 2003 Wang L et al Lysophosphatidylcholine induced surface redistribution regulates signaling of the murine G protein coupled receptor G2A Mol Biol Cell 16 2234 2247 2005 149 6 Literaturverzeichnis 150 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 Liu J et al Each one of certain histidine residues in G protein coupled receptor GPR4 is critical for extracellular proton induced stimulation of multiple G protein signaling pathways Pharmacol Res 61 499 505 2010 Murakami N Yokomizo T Okuno T amp Shimizu T G2A is a proton sensing G prot
211. teraturverzeichnis 134 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 21 28 29 Springer T A Structural basis for selectin mechanochemistry Proc Natl Acad Sci U S A 106 91 96 2009 Bevilacqua M P amp Nelson R M Selectins J Clin Invest 91 379 387 1993 Watson S R et al The complement binding like domains of the murine homing receptor facilitate lectin activity J Cell Biol 115 235 243 1991 Bargatze R F et al In vivo and in vitro functional examination of a conserved epitope of L and E selectin crucial for leukocyte endothelial cell interactions J Immunol 152 5814 5825 1994 Ivetic A amp Ridley A J The telling tail of L selectin Biochem Soc Trans 32 1118 1121 2004 Evangelista V et al Src family kinases mediate neutrophil adhesion to adherent platelets Blood 109 2461 2469 2007 Simon S I Hu Y Vestweber D amp Smith C W Neutrophil tethering on E selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM 1 through a mitogen activated protein kinase signal transduction pathway J Immunol 164 4348 4358 2000 Geng J G et al Rapid neutrophil adhesion to activated endothelium mediated by GMP 140 Nature 343 757 760 1990 McEver R P Selectin carbohydrate interactions during inflammation and metastasis Glycoconj J 14 585 591 1997 Green S A Setiadi H McEver R P amp Kelly R B The cytoplasmic domain of P selectin c
212. th factor B die Zahl der NKG2D Rezeptoren auf NK Zellen herunterregulieren kann Die Tumorzellen entziehen sich weiterhin dem im Blutstrom vorherrschenden Scherstress Die Aggregate aus Tumorzellen und Thrombozyten k nnen zus tzlich in kleinen Gef en stecken bleiben was der Tumorzelle die Transmigration in umgebenes Gewebe erm glicht Die Thrombozyten setzten dar ber hinausgehend Wachstumshormone frei die u a die Angiogenese und Proliferation der sich etablierenden Metastasen f rdern Dieses Ph nomen der Ummantelung der Tumorzellen mit Thrombozyten wurde schon 1865 von Trousseau beschrieben An sich selbst und weiteren 182 Patienten beobachtete er eine Thrombophlebitis als Folge einer Krebserkrankung Mikrothromben f hrten zu Entz ndungen des Gef endothels im ven sen und arteriellen Schenkel 1872 wurde durch Reiss schlie lich gezeigt dass Thrombozyten an der Mikrothrombenbildung beteiligt waren Daher ist eine akute ven se Thromboembolie oft der Vorbote f r die Diagnose einer malignen Entartung Die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen dieses Geschehens sind vielf ltiger Art Eine Tumorzelle die den Blutstrom erreicht hat kann ADP sezernieren das an purinerge Rezeptoren P2Y1 und P2Y12 auf Thrombozyten binden und diese aktivieren kann Als weiter proaggregatorische Mediatoren k nnen Thromboxan A2 TXA2 oder PAF genannt werden die ebenfalls an thrombozytenst ndige Rezeptoren PAFR binden k
213. tilit tsassay uunssenssseensesseensensennnensennnennennnennnnnnennnnnnennnnnnennnnnnennnnnnennnnnnennnanne 59 3 10 1 Prinzip des SACED Motilit tsassays stroboscopic analysis of cell dynamic 59 3 10 2 Vorbereitung der POM achat alas a ana u a Fa tlt ara ara a a a Te ae 60 II 3 10 3 Durchfiihrung und Auswertung 60 3 10 4 Bestimmung der Zellgr e bzw Oberfl chenausdehnung als Parameter f r die FEAR SION ee ee ee 61 3 11 Bestimmung Apoptose relevanter Proteine mittels Proteome Profiler Human Apoptosis Array KIEN 2 61 3 11 1 Gesamtproteinbestimmung von Zelllysaten mittels Amido Black Protein Assay 61 3 11 2 Prinzip der Methode een 62 3 11 3 Durchf hrung und Auswertung nme nenn 63 3 12 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchung der Interaktion von Thrombozyten mit Tumorzellen a near 63 3 12 1 Durchf hrung und I UWE UND een een 63 3 13 Integrin Knockdown iy nase 64 3 13 1 VLA 4 Knockdown in MV3 Melanomzellen oo eessssssesssessesssssessesssesssessesssesseesees 64 3 14 Genexpressionsamal yse sccssssssscssssssssessssssssessssessueessuessseessuesssuessscessueesseesueessseesaseesses 65 3 14 1 Prinzip Durchf hrung und Auswertung oa ssssssssssssssssesssesssesssessecssscsssesseesseesseesses 65 3 15 Tierexperimentelle Simulation der h matogenen Metastasierung 67 3 15 1 Durchf hrung der Experimente und Auswertung ccssssssessssessessseessssessseesneessees 67 4 ERGEBNISSE UND
214. timmung der zust ndigen Beh rden durchgef hrt Die Untersuchungen der Heparinderivate wurden von der Epo GmbH im Max Delbr ck Center f r Molekulare Medizin in Berlin durchgef hrt Dazu wurden weiblichen Nacktm usen erworben von Taconic Europe D nemark die unter keimarmen Bedingungen gehalten wurden 1x10 MV3 Melanomzellen in 0 4 mL PBS gel st in die Schwanzvene injiziert Je nach Versuch wurden die MV3 Zellen vorher mit 5 ug Natalizumab Antik rper 67 3 Material und Methoden 68 gegen VLA 4 inkubiert oder der Antik rper wurde nach Tumorzellinjektion gespritzt 10 mg kg K rpergewicht Auch wurden verschiedene Heparinderivate zu verschiedenen Zeitpunkten appliziert Nach 31 Tagen wurde die Metastasenzahl in der Lunge der M use durch Ausz hlen ermittelt Die Untersuchungen der LPC Wirkung auf Tumorzellen wurde an C57BV 6N M usen Charles River Laboratories Sulzfeld im Institut f r Tumorbiologie der Universit t Freiburg durchgef hrt Hier wurden B16F10 Melanomzellen transfiziert mit Luciferase vorinkubiert mit 300 uM LPC f r 2 Tage oder mit 450 uM LPC f r 10 Tage in die Schwanzvenen der M use injiziert Neben der LPC Wirkung wurde zus tzlich die Kombination mit unfraktioniertem Heparin 50 IU untersucht Nach 14 Tagen wurden die M use euthanasiert und die Lungenhomogenate mithilfe eines Luciferase Assays hinsichtlich ihrer Metastasen analysiert 4 Ergebnisse und Diskussion 4 Ergebnisse un
215. tochondrial und zytoplasmatisch positioniert Mit zunehmender Zahl identifizierter Target Proteinen werden auch spezifische Funktionen einzelner HDAC erkannt So konnte beispielsweise mithilfe von Knockout M usen gezeigt werden dass HDAC 4 essentiell f r Knochen Muskel und Retinaentwicklung ist HDAC 7 ist bedeutend f r die Aufrechterhaltung der T Zellfunktion und HDAC 5 und HDAC 9 sind wichtig f r die Herzmuskelentwicklung So werden HDAC auch im Rahmen vieler Erkrankungen als beteiligte Molek le identifiziert Dies f hrt zu der Konsequenz dass aktuell gro e Anstrengungen zur Synthese subtypspezifischer HDAC Inhibitoren unternommen werden 2 6 2 Histon Deacetylase Inhibitoren und Krebs bzw Metastasierung Neben genetischen Ursachen werden heute auch epigenetische Effekte f r die Entstehung von Krebs verantwortlich gemacht So muss die Diagnose der Kombination vieler Onkogene nicht zwangsl ufig zur Entstehung von Krebs f hren wenn diese nicht exprimiert werden An der Epigenese beteiligte Enzyme r cken somit immer st rker in den Fokus potentieller neuartiger Therapieans tze gegen Krebs Beispielsweise wird durch HDAC Inhibition gezielt versucht Krebszellen in ihrem Verhalten zu beeinflussen Es konnte f r Kolonkarzinome ein erh htes Proteinlevel an HDAC 2 und 3 und f r bestimmte Formen des Brustkrebs ein erh htes Level an HDAC 1 und 3 detektiert werden Bei Patienten mit Lungenkrebs mit einer schlechten Prognose konnte
216. tor to its receptor J Biol Chem 269 114 121 1994 Castelli R Porro F amp Tarsia P The heparins and cancer review of clinical trials and biological properties Vasc Med 9 205 213 2004 145 6 Literaturverzeichnis 146 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 Jayson G C amp Gallagher J T Heparin oligosaccharides inhibitors of the biological activity of bFGF on Caco 2 cells Br J Cancer 75 9 16 1997 Ishihara M et al Heparin carrying polystyrene to mediate cellular attachment and growth via interaction with growth factors J Biomed Mater Res 50 144 152 2000 Angelini A et al Inhibition of P glycoprotein mediated multidrug resistance by unfractionated heparin a new potential chemosensitizer for cancer therapy Cancer Biol Ther 4 313 317 2005 Napirei M Ludwig S Mezrhab J Kl ckl T amp Mannherz H G Murine serum nucleases contrasting effects of plasmin and heparin on the activities of DNasel and DNasel like 3 DNase113 FEBS J 276 1059 1073 2009 Widlak P amp Garrard W T The apoptotic endonuclease DFF40 CAD is inhibited by RNA heparin and other polyanions Apoptosis 11 1331 1337 2006 Fritzsche J Simonis D amp Bendas G Melanoma cell adhesion can be blocked by heparin in vitro suggestion of VLA 4 as a novel target for antimetastatic approaches Thromb Haemost 100 1166 1175 2008 Zhang C et
217. toskeletts beteiligt So konnte sowohl f r Rho A als auch f r Rho B nach beiden LPC Inkubationszeitr umen eine verminderte Expression detektiert werden Bei genauerer Betrachtung der in Abbildung 4 41 dargestellten Heatmaps f llt auch eine Konzentrationsabh ngigkeit der Expression auf So waren die Effekte f r MV3 Zellen die mit 450 uM LPC inkubiert wurden st rker ausgepr gt als f r Zellen die eine physiologische LPC Konzentration von 300 uM erhielten 113 4 Ergebnisse und Diskussion 7000 00 oO oO O oO 750 00 g 5 S 0 n D 500 00 i e i ve Ve 9 0 00 mm m 6000 00 5500 00 6250 00 5000 00 4750 00 4500 00 10000 0 o Q gt Q 9500 0 2 5 6 g O D sn D 8000 0 supo p p 8500 0 gt OOOO O 6666 6 7000 0 6500 0 6000 0 500 0 5000 0 Abbildung 4 41 Heatmap Analyse der Genexpression von Rho A und B nach Inkubation der MV3 Melanomzellen mit LPC Die Untersuchungen wurden an MV3 Zellen durchgefiihrt die drei 3d bzw sechs 6d Tage mit 300 uM 300 bzw 450 uM 450 LPC inkubiert wurden Durch Vergleich mit unbehandelten Zellen wo without kann auf die Expression geschlossen werden In rot dargestellte Felder zeigen allgemein eine verst rkte Transkription des entsprechenden Gens an w hrend gr ne Felder eher f r eine verringerte Transkription sprechen Durch Vergleich der Farbe des jeweiligen Feldes mit den im rechten Bildteil dargestellten Farbskalen kann auf die Transkriptionsi
218. trationen an siRNA und Transfektionsreagenz zu ermitteln wurden Vorversuche mit 3 Material und Methoden FITC gelabelter siRNA siGLO Green Transfection Indicator durchgef hrt Im Durchflusszytometer zeigte eine 5 nM Konzentration an siRNA und eine 0 5 V V Transfektionsreagenzkonzentration die gr te Effektivit t Weiterhin wurde durchflusszytometrisch ermittelt dass die st rkste Downregulation der VLA 4 Expression nach 72 Std Inkubationszeit zu verzeichnen ist Aus diesem Grund wurde dieser Zeitrahmen f r die Zellen die Adh sionsuntersuchungen unter Flussbedingungen unterworfen werden sollten gew hlt 3 14 Genexpressionsanalyse 3 14 1 Prinzip Durchf hrung und Auswertung Die Genexpressionsanalysen wurde von Dr Michael Alexander LIFE amp BRAIN Center Department of Genomics Bonn durchgef hrt Es sollten Unterschiede in der Genexpression die auf LPC Behandlung von MV3 Melanomzellen beruhen detektiert werden Folgende Ans tze wurden untersucht s Tabelle 3 6 Tabelle 3 6 Ans tze die mittels Genexpressionsanalyse untersucht wurden 50 000 50 000 50 000 50 000 MV3 MV3 MV3 MV3 wo wo 300 uM 450 uM 3 Tage 3 Tage LPC LPC 3 Tage 3 Tage 20 000 20 000 20 000 20 000 MV3 MV3 MV3 MV3 wo wo 300 uM 450 uM 6 Tage 6 Tage LPC LPC 6 Tage 6 Tage Die angegebenen Zellzahlen wurden in 6 Well Platten ausges t und mit entsprechenden LPC Konzentrationen versetzt Nach drei bzw sechs Tagen Ink
219. tress herbeigef hrt werden 1 Die physiologische Konzentration von LPC im Blut wird mit 200 bis 300 uM angegeben w hrend andere Quellen von 300 bis 400 uM ausgehen Ein Gro teil des LPCs liegt im Blut gebunden an Albumin LDL oder Immunglobuline vor und wird so zu Organen wie ER 191 192 beispielsweise dem Gehirn transportiert die einen vermehrten Bedarf an bestimmten Lipiden aufweisen Somit stellt LPC einerseits einen schnell verf gbaren Speicher an Fetts uren im Blut dar Andererseits hat LPC als Lokalhormon signaltransduktorische Eigenschaften die in einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen eine Rolle spielen Nachfolgend werden hier nur einige ausgesuchte Beispiele genannt Eine durch UV Strahlung hervorgerufene Expression der sekretorischen PLA gt in Keratinozyten der Haut und damit einhergehender Steigerung der LPC Konzentration vermittelt eine verst rkte Melaninexpression und Dendritenformation in Melanozyten LPC ist in der Lage Makrophagen zu aktivieren und zur Proliferation anzuregen Dies u ert sich in einer verst rkten Phagozytose von antik rpermarkierten Antigenen Monozyten und T Zellen folgen einem LPC Gradienten in Richtung des entz ndeten Gewebes und werden zur Sezernierung von aktivierten Sauerstoffspezies und Monocyte chemoattractant protein 1 angeregt was mit einer Gewebssch digung einhergeht Vermittelt wird dies durch die extracellular sign
220. tz von Antik rpern die gegen P Selektin gerichtet sind gezeigt werden Hiervon wurde auch die Interaktion zwischen LPC behandelten und unbehandelten B16F10 beeinflusst 93 4 Ergebnisse und Diskussion 325 300 275 250 225 200 175 150 125 100 75 50 25 0 TRAP 14 Thrombozyten Fl cheneinheit LPC P Selektin Ak z Kontroll Ak 4 Abbildung 4 24 Bestimmung der Interaktion zwischen B16F10 Melanomzellen und Thrombozyten Durch LPC Inkubation war die Wechselwirkung zwischen aktivierten Thrombozyten und B16F10 Melanomzellen signifikant vermindert P Selektin scheint hauptverantwortlich f r die Interaktion zu sein Durch den Einsatz eines Antik rpers der kein Epitop auf B16F10 Zellen oder Thrombozyten erkennt war die Bindung zwischen B16F10 Zellen und Thrombozyten nicht eingeschr nkt Es l sst sich damit schlussfolgern dass die LPC Behandlung der Melanomzellen signifikant die P Selektin vermittelte Wechselwirkung mit aktivierten Thrombozyten reduziert und hieraus eine Erkl rung der antimetastatischen Wirkung resultieren kann 4 2 3 5 Einfluss des LPC auf die Zellgr e und den Zelldurchmesser VLA 4 hat nicht nur eine Funktion zur Vermittlung der Zell Zell Wechselwirkung ber VCAM 1 sondern ebenfalls eine Beteiligung an der Migrationsbewegung der Zellen beispielsweise an Fibronektin Substraten Daher stellte sich die Frag
221. ubationszeit wurde das Medium von den Zellen entfernt und die Zellen mit 300 uL RLT Puffer versetzt mit 1 Mercapto ethanol pro Well lysiert Die Lysate wurden unter RNase freien Bedingungen in Reagiergef e berf hrt und bei 80 C gelagert Die komplette RNA wurde mithilfe des RNeasy MicroElute spin column Kit nach Anleitung des Herstellers isoliert Die RNA 65 3 Material und Methoden 66 Qualit t wurde mithilfe des Agilent 2100 BioAnalyzers unter Benutzung eines RNA 6000 Nano Chips nach Vorgaben des Herstellers kontrolliert Quantifiziert wurde die RNA mit einem NanoDrop ND 1000A UV Vis Photometer unter Verwendung von jeweils 1 5 uL Probenvolumen Unter Einbeziehung von Qualit tsmerkmalen wurden 500 ng RNA in Biotin gelabelte CRNA unter Verwendung des Ilumina TotalPep 96 RNA Amplification Kits nach Angaben des Herstellers umgeschrieben Als Resultat ergab sich zun chst einstr ngige cDNA die anschlie end zu dsDNA erg nzt wurde Nach Aufreinigung erfolgte die Umschreibung in Biotin gelabelte cRNA Nach erneuter Aufreinigung und Quantifizierung wurde die gelabelte cRNA in den Mikrochips Illumina HumanHT 12 Expression BeadChip nach Anweisung des Herstellers f r 16 20 Std inkubiert In dieser Zeit hybridisierte die cRNA an die komplement ren bead fixierten Sonden ber 48 000 Sonden kodieren f r mehr als 25 000 Gene Nach Zugabe von Wasch und Blockierpuffern wurden die Mikrochips in ei
222. uch in retrospektiven klinischen Studien erhoben werden Auch zeigte sich in Metaanalysen bei denen die initiale Behandlung von ven sen Thrombosen bei Krebspatienten mit UFH und LMWH durchgef hrt wurde eine Reduktion der Mortalit t bei LMWH behandelten Patienten Die beobachteten Vorteile beruhten nicht auf einer Reduktion von Pulmonalembolien Die Durchf hrung prospektiver randomisierter klinischer Studien konnte einen positiven Effekt von LMWH best tigen Allerdings bedarf es weiterer Untersuchungen um sowohl den Zeitpunkt der LMWH Applikation als auch Menge und Dauer der Verabreichung zu determinieren 6 2 3 2 Molekulare Mechanismen Wie in zahlreichen Tiermodellen gezeigt werden konnte u ert sich eine Heparinapplikation nicht in einer Inhibition des Wachstums des Prim rtumors sondern in einer Verminderung der Zahl der Metastasen gt gt Das meist verwendete Modell der Metastasierung bei dem den Versuchstieren eine bestimmte Zahl an Tumorzellen in die Schwanzvene injiziert wird kann den physiologischen Prozess der h matogenen Metastasierung nur unzureichend simulieren Allerdings l sst sich mit diesem Modell die Phase der Zirkulation der Tumorzellen im Blut gut nachahmen und auf molekularer Ebene beleuchten So konnte gezeigt werden dass die Heparinapplikation 24 Std vor oder nach der Tumorzellinjektion keinen Einfluss auf die Metastasierung hat Nur in einer einzigen Studie konnten Effekte bei einer He
223. uf der extrazellul ren Matrix so dass eine Migrationsspur entsteht Nach enzymatisch erfolgter Degradation der Endothelzellschicht von Gef en kommt es zur Dissemination der Tumorzellen durch den Blutkreislauf Die hieran beteiligten Mechanismen und Rezeptoren wie z B Proteine aus den Familien der Selektine und Integrine werden in folgenden Kapiteln ausf hrlich erl utert Nach Verlassen des Blutbettes durch Transmigration kommt es durch mitotische Teilung der Zelle zur Etablierung einer Metastase 2 Theoretischer Teil 2 2 Beteiligung von Adh sionsrezeptoren bei der h matogenen Metastasierung 2 2 1 Aufbau der Selektine Der Fokus der vorliegenden Arbeit soll auf der Rolle von Adh sionsrezeptoren im metastatischen Geschehen liegen daher werden diese zun chst n her beleuchtet Erl uterungen zu molekularen Strukturen und Aufbauten unterschiedlicher Adh sionsrezeptorklassen sowie deren physiologische Funktionen sollen zum besseren Verst ndnis der pathophysiologischen Situation beitragen Zuerst soll auf die Familie der Selektine eingegangen und deren Beteiligung an einer Immunantwort skizziert werden Die Entdeckung der Selektine reicht in das Jahr 1983 zur ck als mithilfe eines Antik rpers L Selektin auf der Oberfl che von Leukozyten charakterisiert werden konnte Erst 1989 wurden die Selektine von Johnson und McEver als lectin cell adhesion molecules LECAMSs beschrieben und zu einer Familie zusammengefasst
224. ulierung der Avidit t durch Clusterung c Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme der Aktivierung eines Integrins Die Untereinheiten sind zur Unterscheidung eingef rbt Abbildungsteile a und b modifiziert nach Kinashi Abbildungsteil c entnommen aus Luo Umgekehrt kann eine Ligandbindung ein Signal vermitteln das zur Aktivierung von intrazellul ren Proteinen wie z B der Fokalen Adh sionskinase FAK f hrt Diese wiederum aktiviert zahlreiche weitere Proteine und Signalkaskaden in der Zelle Neben der Aufrechterhaltung der Zellhomeostase k nnen Integrine die auf entarteten Zellen exprimiert werden zu deren Malignit t beitragen Sie vermitteln dann proliferative prometastatische und antiapoptotische Signale ins Zellinnere Auch korreliert eine verst rkte Expression mancher Integrine mit einer schlechten klinischen Prognose Auf Melanomzellen werden beispielsweise die Integrine a 3 und as verst rkt exprimiert 0 Daher haben sich Integrine als interessante und vielversprechende pharmakologische Targets bei vielen bisher nur palliativ behandelbaren Tumorerkrankungen herausgestellt Beispielsweise befindet sich momentan das zyklische Pentapeptid Cilengitide das die Integrine a 3 und a s inhibiert in der klinischen Phase III bei Patienten mit Glioblastom Gegen das maligne Melanom 11 2 Theoretischer Teil befinden sich die Antik rper Vitaxin und Volociximab in der klinischen Phase
225. ung 3 5 time space plot des SACED Assays Hier dargestellt die Lamellendynamik von Keratinozyten unter EGF Einfluss im time space plot ber eine Dauer von 12 5 min Wei e Linien beschreiben die Rufflebewegung dunkle Linien kennzeichnen die Lamellenbewegung Die schwarzen Pfeile bezeichnen die Bildung neuer Lamellipodien aus Hinz et al 1999 3 10 2 Vorbereitung der Proben Zur Beschichtung der Nunc Kammern mit Fibronektin als Komponente der ECM wurden 40 uL der Fibronektin L sung c 2 5 ug uL mit 1610 uL Zellkulturmedium versetzt 200 uL dieser Mischung wurden in eine Kammer gegeben und ber den kompletten Boden verteilt Nach 20 min Sedimentationszeit wurde das Medium vorsichtig abgenommen und durch 1 mL neues Medium ersetzt In dieses wurden nun 5 000 B16F10 Melanomzellen inkubiert mit LPC f r 48 Std gegeben Nach 24 Std Inkubationszeit konnte der Versuch durchgef hrt werden 3 10 3 Durchf hrung und Auswertung Durchgef hrt wurden die Untersuchungen am Mikroskop Nikon Eclipse TE 2000 E in dem eine Temperierung der Proben auf 37 C m glich ist Mithilfe der Software NIS Elements AR 2 30 und einer 60fachen Vergr erung konnten Videosequenzen einzelner B16F10 Zellen aufgezeichnet werden Es wurden jeweils 14 Zellen mit und ohne LPC Inkubation f r jeweils 10 min mit einer eingebauten Kamera COOL 1300D beobachtet Nach Konvertierung der einzelnen Bilder der Videosequenzen konnte mit der Software SACED
226. ung der Proben Die bei Zelladh sionsuntersuchungen eingesetzten Zellen wurden in Zellkulturflaschen bei 37 C und 5 COs versorgt mit dem jeweiligen Medium im Brutschrank gehalten Zu Versuchsbeginn wurde das berst ndige Medium entfernt die konfluent wachsenden Zellen mit PBS Puffer gesp lt und mit einer 0 02 igen EDTA L sung abgel st Auf Trypsin wurde verzichtet um eine Besch digung der extrazellul r gelegenen Proteindom nen zu vermeiden Anschlie end wurden die Zellen mithilfe des CASY 1 Modell TT s Kapitel 3 2 3 gez hlt und bei 2 C und 1400 rpm zentrifugiert Das entstandene Pellet wurde zu einer Konzentration von 1 Mio Zellen pro 50 uL FKS freiem N hrmedium resuspendiert Darauf erfolgte ggf eine Subkultivierung 3 7 3 Reinigung der Glaspl ttchen Zum Fixieren von Rezeptorproteinen oder Zellen f r Adh sionsuntersuchungen unter Flussbedingungen wurden Glaspl ttchen mit einem Durchmesser von 18 mm und einer Dicke von 0 28 0 32 mm verwendet Gereinigt wurden die Glaspl ttchen in einer Mischung aus 15 mL Wasserstoffperoxid 30 und 35 mL Schwefels ure 98 f r 30 min bei 80 C im Ultraschallbad Anschlie end wurde zehnmal mit demineralisiertem Wasser gewaschen In einer Mischung aus 50 mL Wasser 10 mL Wasserstoffperoxid L sung 30 und 10 mL Ammoniakl sung 26 wurde abermals f r 30 min im Ultraschallbad auf 80 C erhitzt Nach abschlie ender zehnmaliger Sp lung der Glaspl ttchen mit demineralisiert
227. ur von 37 C erw rmt Danach wurde das Medium vorsichtig von den Zellen abgenommen und es wurde einmal mit 3 mL PBS Puffer 5 min gewaschen Nach vollst ndiger Entfernung des PBS Puffers wurden die Zellen f r 3 min vorsichtig mit 1 mL PEG GTX pro Well versetzt Anschlie end wurden die Zellen abermals f r 5 min mit 3 mL PBS 37 C gewaschen Durch Zugabe von 1 mL PFA 4 pro Well f r 10 min wurden die Zellen fixiert Danach wurde dreimal f r jeweils 2 min mit 3 mL PBS pro Well gewaschen Parallel wurden auf Objekttr gern die mit Parafilm berspannt waren jeweils 50 uL Tropfen Phalloidin FITC c 0 5 mg mL aufgebracht In diese Tropfen wurden die Glastr ger kopf ber gelegt so dass die Zellen mit dem Phalloidin FITC in Ber hrung kamen Diese Ans tze wurden in eine feuchte abgedunkelte Kammer verbracht um Austrocknungs oder Ausbleichungseffekte zu vermeiden Nach 45 min Inkubation bei RT wurden die Glastr ger dreimal mit jeweils 3 mL PBS f r 2 min gewachsen Abschlie end wurde einmal mit Aqua dem 3 mL gewaschen Eingebettet wurden die Glaspl ttchen in 5 uL Mowiol auf Objekttr gern Die Lagerung fand bei 4 C unter Lichtausschluss statt 3 9 Rasterelektronenmikroskopie 3 9 1 Prinzip der Methode Bei einem REM handelt es sich um eine Weiterentwicklung des Elektronenmikroskops Im Gegensatz zur Lichtmikroskopie werden anstelle von Lichtstrahlen punktf rmige Elektronenstrahlen verwendet Die Elektronen werden durch eine Felde
228. uss auf den VLA 4 VCAM 1 Bindungsweg analysiert Vor Versuchsbeginn wurden die Zellen 72 bzw 96 Std mit TSA inkubiert Da evtl ein supprimierender Einfluss auf die Expression der Adh sionsrezeptoren resultierte wurden diese Inkubationszeiten gew hlt um den Abbau funktionsf higer Molek le und deren verminderte Nachbildung zu gew hrleisten und den resultierenden Effekt zu quantifizieren Es zeigte sich eine Inhibition der Bindung der MV3 Zellen an immobilisiertes VCAM 1 Dieser Effekt war f r eine 72st ndige Inkubationsdauer st rker ausgepr gt als f r eine 96stiindige s Abbildung 4 48 4 Ergebnisse und Diskussion _ oO o _ A MV3 stimuliert mit Mn MV3 TSA 96 Std Inkubation stim A MV3 TSA 72 Std Inkubation stim O MV3 unstimuliert Adhasion A oa oO N o Zeit s Abbildung 4 48 Einfluss der Inkubationszeit auf das Adh sionsverhalten der MV3 Zellen unter TSA Inkubation an VCAM 1 Nach 72 Std Inkubation war eine Reduktion der Adh sion auf das Niveau unstimulierter MV3 Zellen ersichtlich Durch fortdauernde Inkubation 96 Std fand eine Wiederherstellung der Adh sion statt ber die Ursachen des Wiederanstiegs der Adh sionsf higkeit der MV3 Zellen kann nur spekuliert werden Sollte die Expression intrazellul rer VLA 4 aktivierender Signalproteine durch TSA inhibiert worden sein so K nnte es durch verst rkte Expression anderer Molek le zu einer VLA
229. utschland Thermo Fisher Scientific GmbH Langenselbold Deutschland Starlab GmbH Ahrensburg Deutschland Starlab GmbH Ahrensburg Deutschland Brand GmbH amp Co KG Wertheim Deutschland Sarstedt AG amp Co Niimbrecht Deutschland Sarstedt AG amp Co Niimbrecht Deutschland 3 Material und Methoden Artikel S Monovette Software AxioVision 4 6 Software BD CellQuest Pro 5 2 1 Software Imagoquant MultiTrack AVI 2 Software Microscop Control Software WinMDI 2 8 Software ZEN40 Sterilfilter FP 30 0 2 CA S Sterilfilter Millipore Express Plus Venenverweilkan le Vasofix Braun le Z hlkammer Neubauer improved 3 1 6 Puffer und L sungen Amido Black Elutionsl sung Amido Black Entf rbel sung Amido Black F rbel sung Hersteller Sarstedt AG amp Co N mbrecht Deutschland Carl Zeiss AG Oberkochen Deutschland BD Biosciences Heidelberg Deutschland Mediquant GmbH L tzen Deutschland Phillips Hamburg Deutschland The Scripps Research Institute La Jolla CA USA Carl Zeiss AG Oberkochen Deutschland Whatman GmbH Dassel Deutschland Millipore GmbH Schwalbach Deutschland B Braun Melsungen AG Melsungen Deutschland Paul Marienfeld GmbH amp Co KG Lauda K nigshofen Deutschland 125 uL EDTA Na L sung 200 mM pH 8 0 0 5 g Natriumhydroxid 25 mmol l ad 500 ml Ethanol 50 V V 10 ml Eisessig 2 V V 450 ml Methanol 90 V V ad 500 ml Aqua dem
230. vermitteln und damit eine vermehrte Bildung von Filopodien zu forcieren Dabei scheint der Schwellenwert ab dem eine Filopodienbildung detektierbar ist Knapp ber der physiologischen Konzentration zu liegen Die Anreicherung von ges ttigten Fetts uren in der Zellmembran kann somit nicht f r die Bildung von Filopodien verantwortlich sein denn auch B16F10 Zellen die mit 300 uM LPC inkubiert wurden zeigten eine Anreicherung von ges ttigten Fetts uren in der Zellmembran jedoch keine vermehrte Formation von Filopodien Vorstellbar ist auch dass die Tumorzellen das LPC enzymatisch reacylieren beispielsweise durch die lysophosphatidylcholine acyltransferase und in die Membran einbauen was zu einer Rigidit tssteigerung f hrt Ab einer bestimmten Konzentration gelingt es der Zelle allerdings nicht mehr das vorhandene LPC quantitativ zu metabolisieren wodurch es sich in den Zellmembranen anreichert Dies k nnte eine starke Ver nderung von sogenannten Lipid Rafts lateral separierten Membranbereichen mit hoher Rigidit t in der Zellmembran mit darin lokalisierten Proteinen nach sich ziehen So kann die laterale Bewegung oder der Verbleib von membranst ndigen Proteinen in Lipid Rafts ver ndert sein Durch Gabe des Alkylphosphocholins Edelfosin das LPC strukturell hnelt konnte eine solche nderung der biophysikalischen Eigenschaften von Lipid Rafts in Myelomzellen beobachtet werden Edelfosin reichert sich in Lipid Rafts an was zu e
231. verschiedene Tumorentit ten Nachdem auch in einem in vivo Modell best tigt werden konnte dass der LPC vermittelte Einfluss auf die Funktionalit t von Adh sionsrezeptoren und die Morphologie von Melanomzellen zu einer Reduktion der Metastasierung f hrt sollten die beobachteten Effekte nun auch auf andere Tumorentit ten bertragen werden Folglich wurden zwei Pankreastumorzelllinien AsPC 1 und MIA PaCa 2 und eine Lymphomzelllinie U937 in die Untersuchungen einbezogen Mithilfe der Durchflusszytometrie Konnte gezeigt werden dass sowohl AsPC 1 als auch MIA PaCa 2 Zellen kein VLA 4 exprimieren Jedoch konnte eine Expression von P und L Selektin Liganden konstatiert werden Damit sind diese Zelllinien im initialen Schritt der h matogenen Metastasierung bef higt eine Interaktion mit Thrombozyten einzugehen s Kapitel 2 2 6 Daher wurde der Einfluss der LPC Inkubation auf die Thrombozyten Interaktion durchflusszytometrisch untersucht Zuvor wurden die MIA PaCa Tumorzellen f r drei Tage mit 450 uM LPC behandelt In Abbildung 4 45 sind die f r MIA PaCa 2 erhaltenen Daten graphisch dargestellt Ruhende 4 Ergebnisse und Diskussion Thrombozyten zeigten eine fast identische Bindung an LPC behandelte und unbehandelte MIA PaCa 2 Zellen Durch eine Stimulation der Thrombozyten mit TRAP 14 und einer damit verbundenen Pr sentation von P Selektin und Aktivierung weiterer Adh sionsrezeptoren auf der Zelloberfl che der Thrombozyten kam es zu
232. vo Untersuchung des LPC Effektes auf B16F10 Melanomzellen in einem Mausmodell Um die in vitro beobachteten LPC vermittelten Effekte auf ihre physiologische Relevanz in vivo zu berpr fen wurde ein Mausmodell zur Simulation der h matogenen Metastasierung etabliert Die Details der Versuchsdurchf hrung werden in Kapitel 3 15 beschrieben Neben einer Kontrollgruppe der unbehandelte B16F10 Melanomzellen administriert wurden wurden einer Verumgruppe B16F10 Zellen injiziert die zuvor f r zehn Tage mit 450 uM LPC inkubiert worden waren Einer weiteren Mausgruppe wurden B16F10 Zellen gespritzt die vorher zwei Tage einer Konzentration von 300 uM LPC ausgesetzt waren Neben der LPC Wirkung wurde in einem weiteren Versuchsteil zus tzlich die Kombination mit unfraktioniertem Heparin 50 IU untersucht welches den Versuchstieren 30 min vor Tumorzellapplikation 1 v injiziert wurde Die verwendeten B16F10 Zellen hatten zuvor eine Inkubation mit 450 uM LPC f r zehn Tage erhalten Hierbei sollten synergistische Effekte zwischen LPC und Heparin in vivo untersucht werden Zur besseren Vergleichbarkeit wurden einer weiteren Mauskohorte unbehandelte BI6F10 Zellen injiziert 30 min nach Heparininjektion Nach Beendigung des Versuchs und Analyse der Lungen hinsichtlich pulmonaler Metastasen mithilfe eines Luciferase Assays ergab sich das in Abbildung 4 43 illustrierte Resultat 4 Ergebnisse und Diskussion p 0 006 5 000 000 pr ee p 0
233. von 12 Stunden bei 4 C wurden die Pl ttchen mit demineralisiertem Wasser gewaschen und f r Zellrollversuche verwandt s Kapitel 3 7 7 Rezeptorprotein Cl N Cl Cl N Cl Cl N NH SS SS SS HCI HCI Y i na Cl N ji ian ji ne zz Zr ZZ Glasoberfl che Glasoberfl che Abbildung 3 1 Kovalente Fixierung von Proteinen an Glasoberfl chen Cyanurchlorid bindet zuerst unter Abspaltung von Chlorwasserstoff an die freien Silanolgruppen des Glases In einem zweiten Schritt kommt es zur Reaktion von freien Aminogruppen des zu immobilisierenden Proteins mit Cyanurchlorid Hier wird unter wiederholter Abspaltung von Chlorwasserstoff eine kovalente Bindung zwischen Cyanurchlorid und Protein ausgebildet 3 7 5 Pr paration der Glaspl ttchen mit Endothelzellen Zur Untersuchung der Interaktion von HUVEC bzw bEnd3 Endothelzellen mit Tumorzellen unter Flussbedingungen wurden konfluent bewachsene Glastr ger verwandt und in die Durchflussapparatur eingebaut Zun chst wurden die Glaspl ttchen kurz in Ethanol 96 V V getaucht um Fettreste von den Oberfl chen zu entfernen Anschlie end wurden sie autoklaviert und in die Vertiefungen 53 3 Material und Methoden von einer 6 Well Platte gelegt Die Platte wurde mit 3 mL Medium pro Well befiillt in die jeweils 100 000 Zellen pipettiert wurden Durch Schwenken wurden die Zellen gleichm ig verteilt und 48 Stunden im Brutschrank inkubiert Nach diesem Zeitraum war eine vollst ndige Ko
234. z unter Verwendung des LD Objektives mit 20facher Vergr erung Geschwindigkeitslimit Durchschnittsgeschwindigkeit der Zellen pro N Bilder Zellanzahl pro Bild 3 8 Konfokale Laserscanning Mikroskopie 3 8 1 Prinzip der Methode Zur Untersuchung des Zytoskeletts von MV3 Melanomzellen wurde die Konfokale Laserscanning Mikroskopie angewandt Dabei wird nicht die komplette Probe wie bei der Fluoreszenzmikroskopie mit Fluoreszenzlicht bestrahlt stattdessen wird die Probe von einem Laser Punkt f r Punkt abgerastert Durch den Laser werden Fluorophore zur Emission von Licht angeregt die von Photomultipliern detektiert werden Durch den Gebrauch einer Lochblende Pinhole kann genau das Licht gemessen werden das in der Fokusebene durch 3 Material und Methoden Anregung entsteht Streulicht und Licht das nicht aus der Fokusebene kommt k nnen so ausgeschlossen werden Am Computer kann aus den gemessenen Lichtintensit ten ein dreidimensionales Bild zusammengesetzt werden 3 8 2 Vorbereitung der Proben Zur Anf rbung des Aktinzytoskeletts von Lysophosphatidylcholin LPC inkubierten B16F10 Melanomzellen wurde wie folgt vorgegangen Die B16F10 Zellen 20 000 wurden in 6 Well Platten die jeweils mit 15 mm Deckgl sern best ckt waren f r 24 Stunden bei 37 C und 5 CO inkubiert Die Deckgl schen wurden vorher mit Ethanol 96 entfettet und autoklaviert Die im Folgenden verwendeten Agenzien wurden im Wasserbad auf eine Temperat
235. zu den Kontrollans tzen eindeutig erkennbar 69 4 Ergebnisse und Diskussion 70 se Kontrolle g Kontrolle se Kontrolle MV3 FITC Ak T MV3 FITC Ak MV3 FITC Ak MV3 h L Sel FITC Ak Events MV3 h P Sel FITC Ak MV3 Nata FITC Ak N i ht o o os 10 10 10 10 10 10 10 107 10 10 10 10 107 10 10 FLI H FLI H FLI H Abbildung 4 1 Durchflusszytometrischer Nachweis der VLA 4 P und L Selektin Ligand Expression auf MV3 Melanomzellen Durch Verwendung des Antik rpers Natalizumab Nata gegen VLA 4 und rekombinanten P und L Selektin Fc Chimeren und FITC gelabelten sekund ren Antik rpern gegen Fc Teile konnte die Expression der jeweiligen Molek le gezeigt werden Als Kontrolle dienten MV3 Zellen die nur mit FITC gelabeltem Antik rper inkubiert wurden 4 1 1 2 Bestimmung der Interaktion von Thrombozyten mit MV3 Melanomzellen Die Ummantelung von Tumorzellen mit Thrombozyten nach Eintritt einer Tumorzelle in den Blutkreislauf besitzt eine zentrale Rolle im metastatischen Geschehen Da wie im vorherigen Abschnitt gezeigt werden konnte MV3 Melanomzellen P Selektin Liganden exprimieren wurde berpr ft ob auch eine Interaktion mit Thrombozyten erfolgt und welche Adh sionsrezeptoren an diesem Prozess beteiligt sind Dazu wurden FITC markierte Thrombozyten auf konfluente MV3 Zellschichten gegeben und die Thrombozyten in einigen Ans tzen durch Zugabe von PA
236. zus tzlich zur Antikoagulation auf vielf ltige molekulare Weise Einfluss auf das Krebsgeschehen 2 4 Lysophosphatidylcholin 2 4 1 Vorkommen und physiologische Funktionen von Lysophosphatidylcholin Lipide sind in vielf ltiger Weise an Signaltransduktionsprozessen im Organismus beteiligt Dabei kommen ihnen viele physiologische Funktionen zu Sie sind aber auch in eine Vielzahl pathophysiologischer Prozesse involviert Gegenstand aktueller Forschung ist die Beteiligung von Lipidderivaten in der Proliferation und der Migration von Krebszellen Neben Sphingosine l phosphat und Sphingosylphosphorylcholin sind aus der Gruppe der Phosphoglycerolipide die Lysophosphatids ure und das Lysophosphatidylcholin LPC zu nennen die n her beleuchtet werden Phosphatidylcholine PC bestehen aus einer polaren Phosphocholin Kopfgruppe und zwei unpolaren Fetts ureresten die an Glycerol gebunden sind Sie stellen den Hauptanteil an Membranlipiden in S ugetierzellen dar Durch Abspaltung einer Fetts ure entweder auf Grund einer spontanen Hydrolyse oder durch enzymatische Prozesse wird LPC gebildet Die beteiligten Enzyme sind die Phospholipase Az PLA gt und die Lecithin Cholesterol Acyl 2 Theoretischer Teil Transferase LCAT die eine Fetts ure vom Phosphocholin auf Cholesterol bertr gt Auch k nnen endothelst ndige Triglyceridlipasen LPC erzeugen In vitro konnte eine LPC Generierung auch durch Lipoxygenasen oder oxidativen S

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