Simplexa™ BKV Die Quantifizierungsstandards
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1. Beim Umgang mit den Kit Reagenzien pers nliche Schutzausr stung wie jedoch nicht beschr nkt auf Handschuhe und Laborkittel tragen H nde nach der Durchf hrung des Tests gr ndlich waschen Nicht mit dem Mund pipettieren In Bereichen in denen Kit Reagenzien und oder Humanproben gehandhabt werden darf nicht geraucht getrunken und gegessen werden In diesen Bereichen sollten auch keine Kontaktlinsen eingesetzt herausgenommen und kein Make up aufgetragen werden Nicht verwendete Standards in bereinstimmung mit den nationalen und regionalen Vorschriften entsorgen Die Kontamination von Reagenzien bzw Patientenproben kann zu einer Verf lschung der Testergebnisse f hren Unter aseptischen Bedingungen arbeiten Die Standards vorsichtig pipettieren und handhaben um eine Kontamination mit Material aus benachbarten Kavit ten zu verhindern Geeignete Pipettiertechniken anwenden und f r die Dauer des Tests das gleiche Pipettierschema einhalten um optimale und reproduzierbare Werte zu erhalten Die Standards nicht gegen Standards anderer Kit Chargen oder anderer Hersteller austauschen bzw mit diesen mischen Die Verschlusskappen der Reagenzr hrchen nicht vertauschen Dies k nnte zur Kontamination f hren und die Testergebnisse beeintr chtigen Universal Discs die bereits in Kontakt mit Patientenproben oder Reagenzien gekommen sind nicht wieder verwenden Gebrauchte Discs ohne Abnehmen oder Entfernen der Abdeckfolie entsorgen GE2. Den Deckel des Integrated Cycler ffnen Die verschlossene Universal Disc auf die Platte legen Den Deckel vorsichtig schlie en Auf Run Lauf klicken Auf Start klicken Focus E AUSWERTUNG DER STANDARDKURVE KALIBRIERUNGSLAUF Simplexa BKV Seite 5 1 Die Integrated Cycler Studio Software erkennt automatisch ob ein Kalibrierungslauf g ltig ist a G ltige Kalibrierungsl ufe werden automatisch zur weiteren Nutzung gespeichert b Ung ltige Kalibrierungsl ufe werden verworfen und es muss anschlie end ein neuer Kalibrierungslauf erfolgen bevor Patientenproben getestet werden k nnen EINSCHR NKUNGEN 1 Nur f r das Simplexa BKV Kit 2 Die Personen die die Analyse durchf hren sollten sich vor Durchf hrung des Assays eingehend mit den Testverfahren und der Ergebnisinterpretation vertraut gemacht haben 3 Zur Quantifizierung unbekannter Patientenproben speichert die Integrated Cycler Studio Software den letzten g ltigen Kalibrierungslauf ab Die Quantifizierungsstandards und Patientenproben m ssen mit der identischen Methodik extrahiert werden da es ansonsten zu fehlerhaften Testergebnissen kommen kann LITERATUR 1 NCCLS H18 A2 Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens Approved Guideline 2nd Ed 1999 2 CDC NIH Manual 1999 Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 4th ed And National Committee for Clinical Laboratory Standards NCCLS Protection of
3. 2x pulsvortexen und kurz zentrifugieren um die Inhaltsstoffe auf den Boden des R hrchens zu ziehen In jede Standard und Kontroll Kavit t 5 ul interne Kontrolle pipettieren Zwischen den Proben die Pipettenspitze wechseln Nach den Angaben im Benutzerhandbuch das die Probengef e neue Verbrauchsmaterialien f r den Aspirator und die Reagenzien in das easyMAGTM Ger t laden Die Lyse im Ger t starten und die Iysierten Proben 10 Minuten inkubieren bevor das magnetische Silica Gemisch zugegeben wird Das magnetische Silica Gemisch w hrend der Lyse Inkubation vorbereiten Silica mischen und mit nukleasefreiem Wasser verd nnen indem 1 Teil magnetisches Silica zu 3 Teilen nukleasefreiem Wasser gegeben wird z B 270 ul magnetisches Silica 810 ul nukleasefreies Wasser Je Probe mindestens 135 ul magnetisches Silica Gemisch vorbereiten Zum bertragen des Silica Gemisches in die Kavit ten der ELISA Streifen das magnetische Silica Gemisch anmischen und 1 Spitze sowie den Betriebsmodus P2 der Biohit Pipette verwenden Auf Start dr cken um 1050 ul des magnetischen Silica Gemisches anzusaugen und nochmals auf Start dr cken um das erste Volumen zur ck in das R hrchen mit Silica Gemisch auszuwerfen Auf Start dr cken um 125 ul des magnetischen Silica Gemisches in 8 einzelne Kavit ten des ELISA Streifens zu pipettieren Bedarfsweise f r weitere ELISA Streifen wiederholen Nach der 10 min tigen Lyseinkubation 8 Spitzen je ELISA Streifen un
4. K hlst nder f r 1 5 ml Mikrozentrifugenr hrchen Zur Verwendung beim Roche MagNA Pure LC Extraktionsverfahren Zur Verwendung beim bioMerieux easyMAG Extraktionsverfahren HALTBARKEIT UND HANDHABUNG 1 2 3 Die Standards bei 10 C bis 30 C lagern keine Gefrierger te mit Abtauautomatik verwenden Die aufgetauten Standards nach erstmaligem Gebrauch maximal 5 Tage bei 2 C bis 8 C lagern Die Standards d rfen nach Ablauf des Verfallsdatums nicht mehr verwendet werden WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN 1 2 ha m 8 9 10 11 12 13 In vitro Diagnostikum Alle Humanprodukte sollten als potentiell infekti s angesehen werden Das Ursprungsmaterial dieses Produktes ist mit US FDA anerkannten Methoden auf HBs Antigen Hepatitis C Antik rper und HIV 1 2 AIDS Antik rper untersucht und f r negativ befunden worden Dennoch gew hrleistet keine der bekannten Testmethoden absolute Garantie daf r dass Produkte die aus menschlichem Blut gewonnen wurden die genannten oder andere infekti se Krankheiten nicht bertragen k nnen Alle Kontrollen Serumproben und Ger te die in Kontakt mit den Proben kommen sollten daher als potentiell infekti s angesehen und durch entsprechende biologische Sicherheitsma nahmen dekontaminiert oder entsorgt werden Die amerikanischen CDC und National Institutes of Health empfehlen dass potentiell infekti se Materialien mit biologischer Sicherheitsstufe 2 gehandhabt werden
5. 00 ul von jedem Standard und der Leerwert Kontrolle in die entsprechende Position in der Probenkartusche pipettieren 10 Den F llpegel der Standards und Leerwert Kontrolle in der Probenkartusche einer Sichtpr fung unterziehen um sicherzustellen dass Probe n zugegeben wurde n G Simplexa BKV Seite 3 FOCUS 11 Die DNA zur Extraktions und Amplifikationskontrolle zweimal pulsvortexen und kurz zentrifugieren um die Inhaltsstoffe 12 13 14 auf den Boden des R hrchens zu ziehen F r jeden Satz Standards 100 ul der internen Kontrolle in 6 ml Lysepuffer in ein konisches R hrchen pipettieren Kurz auf dem Vortex mischen In das entsprechende Fach des MagNA Pure Extraktionsger tes geben Die Probenkartusche in das MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extraktionsger t berf hren und die Extraktion starten Nach Abschluss der Nukleins ureextraktion kann die Kartusche mit den extrahierten Standards aus dem MagNA Pure herausgenommen und verschlossen werden Die extrahierte DNA vor der Verwendung bei 2 C bis 8 C aufbewahren Die Langzeitlagerung extrahierter Standards bei dieser Temperatur wird nicht empfohlen Extrahierte DNA Proben beim Laden der Disc auf einem K hlblock aufbewahren Extraktion mit dem NucliSENS easyMAGTV Extraktionsverfahren von bioM rieux 1 2 10 11 12 13 14 15 16 Zur Bedienung von Ger t und Software ist das Benutzerhandbuch des NucliSENS easyMAGTM zu beachten In der N
6. BRAUCHSANWEISUNG A BEREICH ZUR EXTRAKTION DER QUANTIFIZIERUNGSSTANDARDS Durchf hrung in einem Bereich der speziell f r die Extraktion bestimmt ist Die Vorbereitung der Quantifizierungsstandards f r die Extraktion wird auf einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgef hrt Extraktion mit dem MagNA Pure LC Extraktionsverfahren von Roche 1 Die Extraktion der Quantifizierungsstandards erfolgt mit dem MagNA Pure Total Nucleic Acid Kit von Roche und dem MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor Ger t von Roche Hinsichtlich der Nukleins ureextraktion mit diesem Kit die Gebrauchsanweisungen des Herstellers beachten 2 Im Dropdownmen Protocol des MagNA Pure LC Systems die Optionen Total NA und anschlie end Total NA Variable_elution_volume blk w hlen Damit werden die passenden Einstellungen f r den Lauf geladen 3 Das Probenprotokoll sollte Total NA Variable_elution_volume sein 4 Als Probenvolumen sollte 200 ul und als Elutionsvolumen 50 ul eingestellt sein 5 Das Verd nnungsvolumen sollte f r alle Proben auf Null eingestellt sein 6 Das Post Elution Protocol muss auf None eingestellt sein 7 Darauf achten dass die Quantifizierungsstandards und die Leerwertkontrolle sich in der Probenkartusche an der richtigen Position befinden 8 Jeden Standard und jede Leerwert Kontrolle 2 4 Sekunden vortexen und kurz zentrifugieren um die Inhaltsstoffe auf den Boden des R hrchens zu ziehen 2
7. Laboratory Workers from Instruments Biohazards and Infectious Disease Transmitted by Blood Body Fluids and Tissue NCCLS M29 A VERTRIEB DURCH mdi Europa GmbH Langenhagener Str 71 30855 Langenhagen Hannover Deutschland BESTELLINFORMATIONEN Telefon 1 800 838 4548 nur USA 1 562 240 6500 international Fax 1 562 240 6510 TECHNISCHE HILFE Telefon 1 800 838 4548 nur USA 1 562 240 6500 international Fax 1 562 240 6526 Besuchen Sie unsere Webseite www focusdx com CE PI MOL2310 Rev B Erstellungsdatum 20 April 2012 Focus Diagnostics Cypress Californien 90630 USA
8. Simplexa BKV Die Quantifizierungsstandards REF MOL2310 Rev B Mit den Simplexa BKV Quantifizierungsstandards wird eine Standardkurve f r den Simplexa BKV Assay auf dem 3M Integrated Cycler erstellt OCUS Diagnostics In vitro Diagnostikum ANWENDUNGSBEREICH Mit den Simplexa BKV Quantifizierungsstandards von Focus Diagnostics wird eine Standardkurve f r den SimplexaTM BKV Assay auf dem 3M Integrated Cycler erstellt MITGELIEFERTES MATERIAL Der Simplexa BKV Quantifizierungsstandard Satz von Focus Diagnostics enth lt ausreichend Reagenzien f r zwei Bestimmungen Beschreibung des Quantifizierungsstandard Kits QS Focus Diagnostics Simplexa BKV Quantifizierungsstandards REF MOL2310 Anzahl der Reaktionen t z Volumen pl f Kit Komponente ker R hrchen pro A Beschreibung der Komponente pro Kit R hrchen Pro Gef p 7 _ Simplexa BKV Quantitation MOL2311 1 2 400 ul BKV Amplicon in humaner Basismatrix Standard 1 QS 1 Simplexa BKV Quantitation BKV Amplicon in humaner Basismatrix Standard 2 QS 2 MOL2312 1 2 400 yl Simplexa BKV Quantitation BKV Amplicon in humaner Basismatrix Standard 3 QS 3 MOL2313 1 2 400 ul Simplexa BKV Quantitation MOL2314 4 2 400 pL BKV Amplicon in humaner Basismatrix Standard 4 QS 4 SimplexaTM BKV Quantitation Standard 5 QS 5 BKV Amplicon in humaner Basismatrix MOL2315 1 2 400 u
9. d den Betriebsmodus P3 der Biohit Pipette verwenden um jeder Probe in dem Probengef 100 ul des magnetischen Silica Gemisches zuzusetzen Die Spitzen in die Kavit ten der ELISA Streifen geben und Start dr cken um das magnetische Silica Gemisch zu mischen und anzusaugen Das magnetische Silica Gemisch in das jeweilige Probengef geben und die Pipettenspitze n in die Proben eintauchen Sie sollten sich unterhalb des Fl ssigkeitsspiegels befinden Auf Start dr cken um das magnetische Silica anzusaugen zu pipettieren und mit den Proben zu mischen 3x Die Pipettenspitzen m ssen unterhalb des Fl ssigkeitsspiegels bleiben damit der Mischvorgang korrekt ausgef hrt wird F r jedes weitere Probengef Schritt 13 und 14 wiederholen Nach Zugabe des magnetischen Silica Gemisches zu allen Probengef en den Extraktionslauf starten Focus 17 Nach Abschluss des Laufs das die Probengef e aus dem Ger t nehmen Simplexa BKV Seite 4 Werden die Proben nicht sofort weiterverarbeitet sind sie in individuelle R hrchen zu berf hren um das Risiko dass magnetisches Silica zur ck in die Probe f llt zu minimieren Die extrahierte DNA bis zum Gebrauch bei 2 C bis 8 C aufbewahren Die Langzeitlagerung extrahierter Proben bei dieser Temperatur wird nicht empfohlen Extrahierte DNA Proben beim Beschicken der Disc auf einem K hlblock aufbewahren B EINSTELLUNG DES GER TS F R DIE REAL TIME PCR Einzelheiten dar ber wie di
10. e Integrated Cycler Studio Software zu konfigurieren ist um eine Assaydefinition hinzuzuf gen eine Standardkurve zu erstellen Kalibrierungslauf und die L ufe auf dem Integrated Cycler zu analysieren sind der Bedienungsanleitung des Integrated Cycler zu entnehmen 1 Hinweis Patientenproben und Positivkontrollen k nnen abgearbeitet werden sobald ein valider Kalibrierungslauf vorliegt Beispiel f r ein Disc Layout Der Kalibrierungslauf darf nur mit den Quantifizierungsstandards und der Leerwert Kontrolle beschickt werden Speiche Speiche Speiche Speiche 1 2 3 4 Speiche 5 Speiche 6 Speiche 7 Speiche 8 Speiche 9 Speiche 10 Speiche 11 Speiche 12 A QS 1 QS 3 QS 5 B QS 1 QS 3 QS 5 C QS 1 QS 3 QS 5 D QS 1 QS 3 QS 5 E QS 2 QS 4 NTC F QS 2 QS 4 G QS 2 QS 4 H QS 2 QS 4 C REAGENZIENZUBEREITUNGSBEREICH Ein f r die Vorbereitung des Reaktionsgemisches f r den Simplexa BKV Assay reservierter Bereich 1 Primer Mix und Master Mix bei Raumtemperatur etwa 18 C bis 25 C auftauen Jedes R hrchen im Kit enth lt eine f r 50 Reaktionen ausreichende Reagenzienmenge Vor jedem Gebrauch die Primer Mix und Master Mix Komponenten durch sechs bis achtmaliges vorsichtiges Umdrehen durchmischen und dann kurz zentrifugieren um die Inhaltsstoffe auf den Boden des R hrchens zu ziehen 2 In ein Polypropylen Mikrozentri
11. fugenr hrchen entsprechender Gr e jede Komponente in dem in der folgenden Tabelle angegebenen Volumen pipettieren um das erforderliche Volumen des Reaktionsgemisches zuzubereiten Reaktionsgemischvolumen Reaktionsgemisch Reaktionsgemisch Reagens Volumen 1 Volumen 24 Reaktion Reaktionen SimplexaTM Master Mix 4 0 ul 96 ul SimplexaTM BKV Primer Mix 1 0 ul 24 ul Gesamtvolumen 5 0 ul 120 yl 3 Das Reaktionsgemisch durch Umdrehen des R hrchens oder durch 8 bis 10 maliges Pipettieren vorsichtig mischen 4 Kurz zentrifugieren um die Inhaltsstoffe auf den Boden des R hrchens zu ziehen 5 Mit der Vorbereitung der PCR fortfahren 6 Das Reaktionsgemisch innerhalb einer Stunde nach Zubereitung verwenden Sofern die PCR Vorbereitung nicht sofort nach dem Ansetzen des Reaktionsgemisches erfolgt sollte dieses bei 2 C bis 8 C gelagert werden D BEREICH F R DIE REAL TIME PCR AMPLIFIKATION In einem speziellen der Vorbereitung der Universal Disc mit 96 Kavit ten f r den Simplexa BKV Assay vorbehaltenen Bereich arbeiten Bei der Durchf hrung folgender Vorbereitungsschritte das beispielhafte Disc Layout in Abschnitt B beachten i O 0o N D a ea In jede Kavit t 5 0 uldes Reaktionsgemischs pipettieren 5 0 ul des extrahierten Quantifizierungsstandards in die entsprechende Kavit t QS pipettieren 5 0 ul der extrahierten Leerwert Kontrolle in die Kavit t NTC pipettieren Die Disc mit dem Universal Disc Cover Tape abdecken
12. l ERFORDERLICHES JEDOCH NICHT MITGELIEFERTES MATERIAL 0 9 09 0 R O Simplexa BKV REF MOL2300 Integrated Cycler von 3M mit Integrated Cycler Studio Software Version 3 0 oder h her Universal Discs zur Verwendung auf dem Integrated Cycler Universal Disc Abdeckfolie Roche MagNA Pure LC und zugeh riges Verbrauchsmaterial Roche MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit Roche Kat Nr 3038505001 P NucliSENS easyMAGT Ger t von bioM rieux und dazugeh rige s Verbrauchsmaterial und Reagenzien P Biohit bioMerieux Mehrkanalpipette P ELISA Streifenplatte Ein Mehrkanalmikropipette n und oder Repetiermikropipette n mit einem Genauigkeitsbereich von 1 10 ul 10 100 ul und 100 1000 ul Gefrierschrank 10 C bis 30 C mit manueller Abtaufunktion f r die Lagerung der gefrorenen Kit Komponenten K hlschrank mit 2 C bis 8 C f r aufgetaute Kit Komponenten und Standards Biologische Sicherheitswerkbank Laminarflow Haube f r die Durchf hrung der Extraktionen Mikrozentrifuge Vortex Mischer Sterile RNase DNase freie Einmalpipettenspitzen mit Aerosolbarriere 1 5 ml Polypropylen Mikrozentrifugenr hrchen und St nder RNase DNase freie R hrchen werden empfohlen sind aber nicht vorgeschrieben Focus 18 19 20 a b SimplexaTM BKV Seite 2 Einweg Schutzhandschuhe ungepudert Nukleasefreies Wasser zur Extraktion und als Leerwert Kontrolle No Template Control NTC
13. ucliSENS easyMAGTM Software die Vorlage Generic Allgemein mit folgenden Einstellungen w hlen Default Request Standardanfrage Generic 2 0 1 oder quivalent Run Name Prefix Anfangskode der Laufbezeichnung beliebig Sample ID prefix Anfangskode der Proben ID beliebig Sample Type Probentyp Primary Prim r Workflow Defaults Standardarbeitsabl ufe On board lysis Incubation Lyse Inkubation im Ger t On board Silica Incubation Inkubation mit Silica im Ger t Sample Addition Guidance Off Hinweise zur Zugabe von Proben Aus Reagent Tracking R ckverfolgung der Reagenzien Lysis Silica Internal Control reagent tracking disabled R ckverfolgung von Lyse Reagenz Silica und interner Kontrolle deaktiviert Die individuellen Probendaten in der Bildschirmmaske Extraction Request Extraktionsanforderung wie folgt eingeben Sample ID Proben ID Probenbezeichnung eingeben Request Anfrage Generic 2 0 1 oder quivalent Volume Volumen mL 0 200 Eluate Eluat pL 50 Type Typ Primary Prim r Priority Priorit t Normal Matrix Other Andere Nach den Angaben im Benutzerhandbuch in der NucliiSENS easyMAGT M Software einen Extraction Run Extraktionslauf erstellen Jeden Standard 2 4 Sekunden vortexen und kurz zentrifugieren um die Inhaltsstoffe auf den Boden des R hrchens zu ziehen 200 ul des Standards und der Leerwert Kontrolle in Probengef e pipettieren Die interne Kontrolle zweimal
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