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PowerPlex® ESX 17 System Technical Manual TMD024

1. 67 A Vorteile der Verwendung der Loci im PowerPlex ESX 17 System 67 B Methoden zur DNA Extraktion und Quantifizierung 70 C Der CC5 Internal Lane Standard 500 71 D Vorbereiten des PowerPlex ESX 17 System PCR Amplification Mix 72 E Zusammensetzung von Puffern und L sungen 72 F Verwandte Produkte 73 1 Beschreibung STR Short Tandem Repeat Loci bestehen aus kurzen repetitiven Sequenzelementen mit L ngen von 3 7 Basenpaaren 1 4 Diese Repeats sind berall im menschlichen Genom verteilt und hochgradig polymorphe Marker die mithilfe der Polymerase Kettenreaktion 5 9 nachgewiesen werden k nnen Allele von STR Loci werden anhand der Kopienanzahl der Repeatsequenz differenziert die in der amplifizierten Region enthalten sind und nach einer elektrophoretischen Trennung mittels Fluoreszenzdetektion voneinander unterschieden Das PowerPlex ESX 17 System a h erm glicht die Co Amplifikation und vierfarbige Fluoreszenzdetektion von siebzehn Loci sechzehn STR Loci und Amelogenin einschlie lich D18S51 D21S11 TH01 D3S1358 Amelogenin D16S539 D
2. command because no dye lanes are selected Allelleiter Peaks werden Off Ladder gekennzeichnet Symptome Ursachen und Anmerkungen Die Basenpaarl ngen von Allelen in der Allelleiter liegen au erhalb des definierten Kategoriebereichs Achten Sie darauf dass den internen L ngenstandardfragmenten die richtige L nge zugeordnet ist Definieren Sie die internen L ngenstandardfragmente neu und analysieren Sie die Probe erneut mit der GeneScan Software Vergleichen Sie die L nge des kleinsten Allels in der Allelleiter mit der L nge und dem Bereich der Basenpaare die in den Kategorien f r die gleichen Allele aufgef hrt sind Erh hen Sie falls n tig den Startbereich der Kategorie im Fenster Category und speichern Sie das Macro unter einem anderen Namen Die Allelleiter Peaks waren zu hoch und verursachten dass Stutter Peaks als Allel Peaks gedeutet wurden Verwenden Sie eine k rzere Injektionszeit verkleinern Sie die Menge verwendeter Allelleiter oder analysieren Sie die Allelleiterprobe erneut mit erh hten Grenzwerten f r die Peak Amplitude Thresholds in Parametern der GeneScan Analyse Die Allelleiter Daten waren mit dem verwendeten PowerTyper_ESX_17 Macro nicht kompatibel Best tigen Sie dass die PowerTyper_ESX_17 Macro Datei mit der verwendeten Allelleiter bereinstimmt Die Macros wurden nicht in der richtigen Reihenfolge ausgef hrt Verwenden Sie die Option POWER oder POWER 20 Filter Macro Es wurd
3. f r die neuste Version der Panel und Bin Datein steht Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 36 Erste Schritte 1 Die Panel und Bin Dateien f r das PowerPlex ESX 17 System k nnen hier heruntergeladen werden www promega com geneticidtools panels_bins 2 Geben Sie Ihre Kontaktdaten ein und w hlen Sie GeneMapper ID version 3 2 W hlen Sie Submit 3 Speichern Sie die Dateien PowerPlex_ESX_Panels_vX x txt und PowerPlex_ESX_Bins_vX x txt in einem Ordner auf Ihrem Computer ab Importieren der Panel und Bin Dateien Die folgenden Anweisungen entsprechen gr tenteils dem Tutorial f r die Applied Biosystems GeneMapper ID Software Seiten 1 4 1 ffnen Sie die GeneMapper ID Software Version 3 2 2 W hlen Sie Tools und dann Panel Manager 3 Markieren Sie das Symbol f r den Panel Manager im Abschnitt oben links Navigationsbereich 4 W hlen Sie File und dann Import Panels 5 Navigieren Sie zu der gespeicherten Panel Datei W hlen Sie die Datei und dann Import 6 Markieren Sie im Navigationsbereich das PowerPlex ESX Panel das Sie soeben importiert haben 7 W hlen Sie File und dann Import Bin Set 8 Navigieren Sie zu der gespei
4. oder Negative Control Zur fehlerfreien Genotypisierung muss jeder Ordner des Projekts mindestens eine Injektion der Allelleiter enthalten die in der Spalte Sample Type als Ladder bezeichnet ist 5 W hlen Sie in der Spalte Analysis Method die oben erstellte Analyse methode 6 W hlen Sie in der Spalte Panel das Panel Set das in Abschnitt 6 F importiert wurde 7 W hlen Sie in der Spalte Size Standard den L ngenstandard der in Abschnitt 6 G erstellt oder in Abschnitt 6 H importiert wurde 8 Wenn Daten von einem ABI PRISM 310 Genetic Analyzer analysiert werden achten Sie darauf dass in der Spalte Matrix die richtige Matrixdatei ausgew hlt ist 9 W hlen Sie Analyze gr ne Pfeilschaltfl che um die Datenanalyse zu beginnen 6 J Erstellen einer Methode zur Datenbank oder Vaterschaftstest Analyse mit GeneMapper ID Software Version 3 2 1 W hlen Sie Tools und dann GeneMapper Manager 2 W hlen Sie die Registerkarte Analysis Methods 3 W hlen Sie New Ein neues Dialogfeld Analysis Method wird ge ffnet 4 W hlen Sie HID und dann OK Hinweis Wenn Sie die Option HID nicht sehen k nnen haben Sie die GeneMapper ID Software nicht Wenden Sie sich bitte an Applied Biosystems 5 Geben Sie einen aussagekr ftigen Namen f r die Analysenmethode ein z B PowerPlexESX 17_20 filter 6 W hl
5. Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 52 Abbildung 23 PowerPlex ESX 17 System Eine Template DNA 0 5 ng wurde mit dem PowerPlex ESX 17 10X Primer Pair Mix amplifiziert Die Amplifikationsprodukte wurden mit dem CC5 Internal Lane Standard 500 gemischt und mit einem Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer mit einer Injektion von 3 kV und 5 Sekunden aufgetrennt Die Daten wurden mit der GeneMapper ID Software Version 3 2 analysiert Panel A Das Elektropherogramm zeigt die Peaks der mit Fluorescein markierten Loci Amelogenin D3S1358 TH01 D21S11 und D18S51 Panel B Das Elektropherogramm zeigt die Peaks der mit JOE markierten Loci D10S1248 D1S1656 D2S1338 und D16S539 Panel C Das Elektropherogramm zeigt die Peaks der mit TMR ET markierten Loci D22S1045 vWA D8S1179 und FGA Panel D Das Elektropherogramm zeigt die Peaks der mit CXR ET markierten Loci D2S441 D12S391 D19S433 und SE33 Panel E Das Elektropherogramm zeigt die 60 bp bis 500 bp Fragmente des CC5 Internal Lane Standard 500 8247TA A B C D E Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 53 8468TA A B A
6. vs Basic or Advanced Achten Sie darauf dass beide Dateien auf den gleichen Modus eingestellt sind entweder den Modus Classic oder Basic or Advanced Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 62 Der L ngenstandard wird nicht richtig erkannt Die Peaks im L ngenstandard fehlen Fehlermeldung Either panel size standard or analysis method is invalid Off Ladder Allele Symptome Ursachen und Anmerkungen F r die Probe wurde kein Panel ausgew hlt W hlen Sie in der Spalte Panel das zutreffende Panel Set f r das verwendete STR System Es wurde kein L ngenstandard ausgew hlt Achten Sie darauf dass Sie in der Spalte Size Standard den zutreffenden L ngenstandard w hlen Der L ngenstandard wurde nicht richtig definiert oder L ngenstandard Peaks fehlten Definieren Sie den L ngenstandard neu indem nur Peaks benannt werden die in Ihrer Probe vorhanden sind Das vorzeitige Beenden der Analyse oder kurze Laufzeiten bewirken dass l ngere Allelleiter Peaks fehlen Dadurch wird die Qualit t Ihrer L ngenzuordnung rot markiert und es werden keine Allell ngen erkannt Das der Analysemethode zugeordnete Bin Set wurde gel scht W hlen Sie im GeneMapper Manager die Registerkarte Analys
7. 20 SE33 CXR ET 267 417 4 2 6 3 8 20 20 2 21 21 2 22 22 2 23 2 24 2 25 2 26 2 27 2 28 2 29 2 30 2 31 2 32 2 33 2 34 2 35 37 39 42 D19S433 CXR ET 193 245 5 2 6 2 8 12 12 2 13 13 2 14 14 2 15 15 2 16 16 2 17 17 2 18 18 2 D12S391 CXR ET 130 182 14 17 17 3 18 18 3 19 27 D2S441 CXR ET 88 124 8 11 11 3 12 17 1 Die L nge jedes Allels in der Allelleiter wurde durch Sequenzanalysen best tigt 2 Wenn ein interner L ngenstandard wie der CC5 Internal Lane Standard 500 verwendet wird k nnen sich die berechneten L ngen der Allelleiter Komponenten von den hier aufgef hrten unterscheiden Verschiedene Sequenzen in der Allelleiter und den ILS Fragmenten k nnen Unterschiede im Wanderungsverhalten bewirken Die Fluoreszenzmarkierung wirkt sich ebenfalls auf das Wanderungsverhalten der Allele aus 3 Eine aktuelle Liste der Mikrovarianten ist im Variant Allele Report ver ffentlicht am U S National Institute of Standards and Technology NIST zu finden Website www cstl nist gov div831 strbase 4 Amelogenin ist kein STR weist jedoch eine 87 bp X spezifische Bande und eine 93 bp Y spezifische Bande auf 9947A DNA weiblich weist nur die 87 bp X spezifische Bande auf 9 B Methoden zur DNA Extraktion und Quantifizierung Das DNA IQ System Bestellnummer DC6700 ist ein System zur DNA Isolierung und Quantifizierung das speziell f r Spurenmaterial und Vater
8. 9 3 D3S1358 14 15 15 17 17 18 Amelogenin X X X Y X Y D16S539 11 12 11 11 9 13 D2S1338 19 23 23 23 22 25 D1S1656 18 3 18 3 14 17 12 13 D10S1248 13 15 12 15 13 15 FGA 23 24 24 26 20 23 D8S1179 13 13 12 13 14 15 vWA 17 18 17 17 16 19 D22S1045 11 14 16 18 16 16 SE33 19 29 2 23 2 26 2 15 16 D19S433 14 15 13 14 13 14 D12S391 18 20 18 24 18 23 D2S441 10 14 11 12 10 14 1 Informationen ber Strain 9947A und 9948 k nnen online aufgerufen werden http ccr coriell org Sections Collections NIGMS SsId 8 Information ber die Verwendung von 9947A und 9948 DNA als Standard DNA Template k nnen in Literaturangabe 24 gefunden werden F r Anwendungen die menschenspezifische DNA Quantifizierung erfordern wurde das Plexor HY System Bestellnummer DC1000 entwickelt 26 Siehe Kapitel 9 F f r Bestellinformationen Das DNA IQ System wurde auf der Beckman Coulter Biomek 2000 Laboratory Automation Workstation 27 Biomek 3000 Laboratory Automation Workstation 28 und dem Tecan Freedom EVO Liquid Handler 29 vollst ndig automatisiert Zus tzlich sind das DNA IQ Reference Sample Kit f r Maxwell 16 Bestellnummer AS1040 und DNA IQ Casework Pro Kit f r Maxwell 16 Bestellnummer AS1240 erh ltlich 30 31 Wenden Sie sich f r Informationen ber die Automatisierung von Laborverfahren auf automatisierten Workstations an
9. 9948 Kontroll DNAs vorkommen Die terminale Addition von Nukleotiden 16 17 findet statt wenn die Taq DNA Polymerase ein Nukleotid im Allgemeinen Adenin an die 3 Enden amplifizierter DNA Fragmente anf gt Dies ist vom Template unabh ngig Die Effizienz mit der die Addition auftritt ndert sich mit verschiedenen Primer Sequenzen Daher kann manchmal eine Artefaktbande gesehen werden die eine Base k rzer ist als erwartet d h eine terminale Base fehlt Wir haben die Primer Sequenzen modifiziert und zu den Amplifikationsprotokollen einen finalen 45 min tigen Verl ngerungsschritt bei 60 C 18 hinzugef gt So sollte die terminale Addition von Nukleotiden m glichst vollst ndig sein wenn die empfohlenen Mengen an Template DNA verwendet werden Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 67 Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 68 Tabelle 2 Das PowerPlex ESX 17 System Locus spezifische Informationen STR Locus Kennzeichnung Chromosomen Position1 Repeat Sequenz2 5 3 D18S51 Fluorescein 18q21 33 59
10. PowerPlex ESX 16 System 100 Reaktionen DC6721 400 Reaktionen DC6710 PowerPlex ESI 16 System 100 Reaktionen DC6771 400 Reaktionen DC6770 PowerPlex ESI 17 System 100 Reaktionen DC6781 400 Reaktionen DC6780 PowerPlex 16 Monoplex System Penta E Fluorescein 100 Reaktionen DC6591 PowerPlex 16 Monoplex System Penta D JOE 100 Reaktionen DC6651 PowerPlex ES Monoplex System SE33 JOE 100 Reaktionen DC6751 PowerPlex 18D System 200 Reaktionen DC1802 800 Reaktionen DC1808 PowerPlex 16 HS System 100 Reaktionen DC2101 400 Reaktionen DC2100 PowerPlex 16 System 100 Reaktionen DC6531 400 Reaktionen DC6530 PowerPlex S5 System 100 Reaktionen DC6951 400 Reaktionen DC6950 PowerPlex ES System 100 Reaktionen DC6731 400 Reaktionen DC6730 PowerPlex CS7 System Custom 100 Reaktionen X6613 PowerPlex Y23 System 50 Reaktionen DC2305 200 Reaktionen DC2320 Nicht f r die medizinische Diagnostik Zubeh rkomponenten Bestell Produkt Gr e nummer PowerPlex 5 Dye Matrix Standards 310 50 l jeder Farbstoff DG4600 PowerPlex 5 Dye Matrix Standards 3100 3130 25 l jeder Farbstoff DG4700 PowerPlex Direct Amp Reagent Custom 2 1 ml X7221X 8 ml X7271X CC5 Internal Lane Standard 500 300 l DG1521 Wasser Amplifikationsg te 6 250 l 5 1 250 l DW0991 Nicht f r die medizinische Diagnostik Promega GmbH S
11. angezeigt werden d h D18S51 D21S11 TH01 D3S1358 und Amelogenin Alternativ k nnen Sie zur Datenbank oder f r Vaterschaftsanalyse auf das POWER 20 Filter Macro doppelklicken Der Filter POWER 20 darf nicht verwendet werden wenn eventuell DNA Mischspuren vorliegen Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 49 6 M Probenanalyse mit der Genotyper Software und PowerTyper ESX 17 Macro Fortsetzung 6 Doppelklicken Sie auf das Macro Allelic Ladders Ein Plot Fenster wird ge ffnet und zeigt die Fluorescein Allelleitern d h D18S51 D21S11 TH01 D3S1358 und Amelogenin die JOE Allelleitern d h D16S539 D2S1338 D1S1656 und D10S1248 die TMR ET Allelleitern d h FGA D8S1179 vWA und D22S1045 und die CXR ET Allelleitern d h SE33 D19S433 D12S391 und D2S441 an Best tigen Sie dass den Allelleitern die richtigen Allelbenennungen zugeordnet wurden Abbildung 24 in Abschnitt 6 O und Tabelle 3 in Abschnitt 9 A Die Software verwendet eine Leiterprobe um Allell ngen zu bestimmen Das Macro verwendet die erste Leiterprobe die f r Allelbenennungen importiert wurde Wenn das POWER Macro ein zweites Mal durchgef hrt wird verwendet die Software die zweite Leiter wenn das POWER Macro ein drittes Mal du
12. soweit vorhanden Es kann zu stochastischen Effekten kommen wenn geringe Mengen Templates amplifiziert werden Verschiedene Balance Probleme Tauen Sie das 10X Primer Pair Mix und 5X Master Mix vor dem Gebrauch vollst ndig auf und vortexen Sie es 15 Sekunden lang Zentrifugieren Sie das 10X Primer Pair Mix nach dem Mischen nicht Kalibrieren Sie die Thermocycler und Pipetten regelm ig Das in Abschnitt 4 A vorbereitete PCR Amplifikationsgemisch wurde nicht ausreichend gemischt Vortexen Sie das PCR Amplifikationsgemisch 5 10 Sekunden lang bevor es in die Reaktionsr hrchen oder platte gegeben wird Verunreinigte Template DNA In Spurenmaterial vorhandene Inhibitoren k nnen zu Allel Dropout oder Imbalance f hren 7 B GeneMapper ID X Software Symptome Ursachen und Anmerkungen Die Stotter Dateien wurden nicht in den Panel Manager importiert als die Panel und Bin Dateien importiert wurden Die Stutter Distance wurde in der Registerkarte Allele in der Analysis Methode nicht definiert Das Fenster Analysis Requirement Summary war nicht aktiv und eine Analysebedingung wurde nicht eingehalten Aktivieren Sie unter Options das Analysis Requirement Summary und korrigieren Sie die notwendigen Analysebedingungen um mit der Analyse fortzufahren Um nderungen an einem Projekt sehen zu k nnen muss das Projekt erst gespeichert werden Schlie en Sie das Fenster Plot View gehen Sie zur ck zur Hauptseit
13. 310 und Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer n 13 65 71 Basen Das Artefakt wandert schneller als Amelogenin nur ABI PRISM 310 Genetic Analyzer 72 73 Basen m nnliche und weibliche Proben 4 77 78 Basen nur m nnliche Proben 4 nur Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer 76 Basen m nnliche und weibliche Proben 4 85 Basen nur m nnliche Proben 4 D10S1248 ABI PRISM 310 und Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer 60 64 Basen Das Artefakt wandert schneller als D10S12485 1 Die hier aufgef hrten Artefakte sind DNA abh ngig 2 Jeweils zwei Basen k rzer und l nger als das tats chliche Allel 3 Das n 1 Artefakt ist mit hohen Eingabemengen von Template und gro en Peak H hen der Allele besser erkennbar 4 Diese Peaks mit variabler H he auf dem ABI PRISM 310 und Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer k nnen doppelstr ngige DNA sein die vom Amelogenin Amplicon stammt doppel str ngige DNA wandert in Kapillarelektrophorese Instrumenten bekannterma en schneller als einzelstr ngige DNA Dieses Artefakt wird nur bei hohen Maxima f r die X und Y Allel festgestellt 5 Schwaches von DNA abh ngiges Artefakt ist nur mit hohen Eingabemengen von Template und gro en Peak H hen der Allele erkennbar Das Artefakt tritt ungef hr 13 17 Basen vor dem kleinsten Allel Allel 8 in D10S1248 auf Dieser Peak kann abh ngig von der Sensitivit t des Instruments ber oder unterhalb dem Grenz
14. 36 G Erstellen eines L ngenstandards mit GeneMapper ID Software Version 3 2 37 H Importieren des CC5 ILS 500 L ngenstandards in die GeneMapper ID Software Version 3 2 39 I Erstellen einer Methode zur Spurenanalyse mit GeneMapper ID Software Version 3 2 39 J Erstellen einer Methode zur Datenbank oder Vaterschaftstest Analyse mit GeneMapper ID Software Version 3 2 42 K Probenanalyse mit GeneScan Software und Windows Betriebssystemen 44 L Probenanalyse mit GeneScan Software und Macintosh Betriebssystemen 47 M Probenanalyse mit Genotyper Software und PowerTyper ESX 17 Macro 48 Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 1 PowerPlex ESX 17 System Unsere gesamte technische Fachliteratur ist im Internet unter www promega com tbs zu finden Um zu gew hrleisten dass Sie die aktuelle Version dieses Technischen Handbuchs verwenden besuchen Sie bitte unsere Website Bitte wenden Sie sich a
15. 6 N Kontrollen 1 Pr fen Sie die Ergebnisse f r die Negativkontrolle Wenn die in diesem Handbuch beschriebenen Protokolle verwendet wurden sollte die Negativkontrolle frei von Amplifikationsprodukten sein 2 Pr fen Sie die Ergebnisse f r die 9947A DNA Positivkontrolle Vergleichen Sie die Repeatl ngen der Allele der 9947A DNA mit der Locus spezifischen Allelleiter Die erwarteten Allelbenennungen der 9947A DNA f r jeden Locus sind in Tabelle 4 Abschnitt 9 A aufgef hrt Die Zelllinien DNA 9947A weist allelische Imbalance und Imbalance zwischen STR Loci auf Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 51 Sample Info Sample Comment Category Peak 1 Peak 2 Peak 3 Peak 4 Over flow Low Signal Satura tion Edited Label Edited Row Sample Info Category Allele 1 Category Allele 2 Category Allele 1 Category Allele 2 Category Allele 1 Category Allele 2 Category Allele 1 Category Allele 2 Sample Info Category Peak 1 Peak 2 6 O Ergebnisse Ein repr sentatives Ergebnis des PowerPlex ESX 17 Systems wird in Abbildung 23 gezeigt Die PowerPlex ESX 17 Allelleiter wird in Abbildung 24 gezeigt Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland
16. Allele zeigt nicht alle Daten an Das Macro Check ILS zeigt ein leeres Plot Fenster an Off Ladder Peaks Fehlermeldung Could not complete the Run Macro command because the labeled peak could not be found Fortseztung 8 Literaturangaben 1 Edwards A et al 1991 DNA typing with trimeric and tetrameric tandem repeats Polymorphic loci detection systems and population genetics In The Second International Symposium on Human Identification 1991 Promega Corporation 31 52 2 Edwards A et al 1991 DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats Am J Hum Genet 49 746 56 3 Edwards A et al 1992 Genetic variation at five trimeric and tetrameric tandem repeat loci in four human population groups Genomics 12 241 53 4 Warne D et al 1991 Tetranucleotide repeat polymorphism at the human actin related pseudogene 2 actbp2 detected using the polymerase chain reaction Nucleic Acids Res 19 6980 5 Ausubel F M et al 1996 Unit 15 The polymerase chain reaction In Current Protocols in Molecular Biology Vol 2 John Wiley and Sons NY 6 Sambrook J Fritsch E F and Maniatis T 1989 Chapter 14 In vitro amplification of DNA by the polymerase chain reaction In Molecular Cloning A Laboratory Manual Second Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York 7 PCR Technology Principles and Applications for D
17. Group als Security Group aus Dadurch wird allen Benutzern der Software Zugriff gew hrt Sie k nnen auch andere Security Groups verwenden 5 Geben Sie einen aussagekr ftigen Namen f r die Analysenmethode wie PowerPlexESX 17 20 Filter ein 6 W hlen Sie die Registerkarte Allele Abbildung 16 7 W hlen Sie das Bin Set das Sie in Abschnitt 6 A importiert haben Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 33 6 E Erstellen einer Methode zur Datenbank oder Vaterschaftsanalyse mit GeneMapper ID X Software Version 1 2 Fortsetzung 8 Geben Sie die Werte aus Abbildung 16 ein um ein korrektes Filtern der Stutter Peaks bei Verwendung des PowerPlex ESX 17 Systems zu gew hrleisten Eventuell m ssen Sie diese Einstellungen optimieren Interne Validierungen sollten durchgef hrt werden 9 W hlen Sie die Registerkarte Peak Detector Abbildung 14 zeigt ein Beispiel f r die Einstellungen die bei Promega genutzt werden Hinweise 1 W hlen Sie als Analysebereich Full Range oder Partial Range Wenn Sie Partial Range verwenden m ssen Sie einen auf Ihre Daten abgestimmten Analysebereich w hlen W hlen Sie einen Startpunkt hinter dem Primer Peak und direkt vor dem erste
18. Ihre zust ndige Promega Niederlassung oder Vertriebsstelle Kontaktinformationen sind erh ltlich unter www promega com worldwide oder E Mail an genetic promega com 9 C Der CC5 Internal Lane Standard 500 Der CC5 Internal Lane Standard 500 enth lt 21 DNA Fragmente von 60 65 80 100 120 140 160 180 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 und 500 Basen L nge Abbildung 25 Jedes Fragment ist mit CC5 Farbstoff markiert und kann zusammen mit PowerPlex ESX 17 PCR Produkten aufgetrennt als f nfte Farbe werden Der CC5 ILS 500 wurde f r die Verwendung in jeder CE Injektion konzipiert um die Pr zision der PowerPlex ESX 17 System Analyse zu erh hen Protokolle zu Vorbereitung und Gebrauch dieses internen L ngenstandards sind in Abschnitt 5 zu finden Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 71 Abbildung 25 CC5 Internal Lane Standard 500 Das Elektropherogramm zeigt die Fragmente des CC5 Internal Lane Standard 500 8248TA 9 D Vorbereitung des PowerPlex ESX 17 System Amplification Mix Ein Arbeitsblatt zur Berechnung der erforderlichen Menge jeder Komponente des PCR Amplifikationsgemisches wird in Tabelle 5 zur Verf gung gestellt Multiplizieren Sie das Volumen l pro Reaktion mit der Gesamtza
19. K stchen Use marker specific stutter ratio if available angekreuzt ist Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 29 6 D Erstellen einer Methode zur Spurenanalyse mit GeneMapper ID X Software Version 1 2 Fortsetzung 9 Geben Sie die Werte aus Abbildung 13 ein um ein korrektes Filtern der Stutter Peaks bei Verwendung des PowerPlex ESX 17 Systems zu gew hrleisten Eventuell m ssen Sie diese Einstellungen optimieren Interne Validierungen sollten durchgef hrt werden 10 W hlen Sie die Registerkarte Peak Detector Abbildung 14 zeigt ein Beispiel f r Einstellungen die bei Promega eingesetzt werden F hren Sie In House Validierungen durch Hinweise 1 W hlen Sie als Analysebereich Full Range oder Partial Range Wenn Sie Partial Range verwenden m ssen Sie einen auf Ihre Daten abgestimmten Analysebereich w hlen W hlen Sie einen Startpunkt hinter dem Primer Peak und direkt vor dem ersten definierten Peak des internen L ngenstandards um die richtige L ngenzuordnung des internen L ngenstandards zu gew hrleisten 2 Die Peak Amplitude Thresholds definieren die kleinsten Peak H hen die die Software als Peak benennt Die Werte f r Peak Amplitude Thresholds liegen im Allge
20. Registerkarte Size Standard 3 W hlen Sie Import 4 Navigieren Sie zum Speicherort der Datei CC5_ILS_500_IDX xml auf Ihrem Computer 5 Markieren Sie die Datei und w hlen Sie Import 6 W hlen Sie Done um die nderungen zu speichern und den GeneMapper ID X Manager zu schlie en 6 D Erstellen einer Methode zur Spurenanalyse mit GeneMapper ID X Software Version 1 2 Diese Anleitung ist als erste Starthilfe zum Analysieren von Daten mit der GeneMapper ID X Software gedacht Sie kann jedoch nicht eine Schulung f r den Gebrauch der GeneMapper ID X Software ersetzen Wir empfehlen Benutzern sich bez glich Schulungen zu dieser Systemsoftware an Applied Biosystems zu wenden 1 W hlen Sie Tools und dann GeneMapper ID X Manager 2 W hlen Sie die Registerkarte Analysis Methods 3 W hlen Sie New Ein neues Dialogfeld Analysis Method wird ge ffnet 4 W hlen Sie im Analysis Method Editor Fenster GeneMapper ID X Security Group als Security Group aus Dadurch wird allen Benutzern der Software Zugriff gew hrt Sie k nnen auch andere Security Groups verwenden 5 Geben Sie f r die Analysemethode einen aussagekr ftigen Namen wie PowerPlexESX 17 ein 6 W hlen Sie die Registerkarte Allele Abbildung 13 7 W hlen Sie den Bin File den Sie im Schritt 6 A importiert haben 8 Stellen Sie sicher dass das
21. den empfohlenen Zeitraum durch Erhitzen und k hlen Sie sie sofort auf Eis oder im Eiswasserbad ab K hlen Sie die Proben nicht in einem Thermocycler der auf 4 C eingestellt ist da dies aufgrund von Re Annealings zu Artefakten f hren kann Es wurde Formamid von schlechter Qualit t verwendet Verwenden Sie zum Analysieren der Proben nur Hi Di Formamid Kontamination mit einer anderen Template DNA oder zuvor amplifizierter DNA Kreuzkontamination kann ein Problem sein Verwenden Sie gegen Aerosol gesch tzte Pipettenspitzen und wechseln Sie die Handschuhe h ufig Die Proben wurden nicht vollst ndig denaturiert Denaturieren Sie die Proben direkt vor dem Beladen f r den empfohlenen Zeitraum durch Erhitzen und k hlen Sie sie sofort danach auf Eis oder im Eiswasserbad ab Doppelstr ngige DNA wandert w hrend der Kapillar elektrophorese schneller als einzelstr ngige DNA Schatten Peaks die vor den Hauptpeaks auftreten k nnen durch doppelstr ngige DNA aufgrund unvollst ndigen Denaturierens oder Re Annealings nach der Injektion verursacht sein Dies trifft insbesondere dann zu wenn die Schatten Peaks in einem heterozygoten Profil mit der gleichen Entfernung voneinander getrennt vorliegen wie die beiden Hauptpeaks Artefakte der STR Amplifikation Die Amplifikation von gt 0 5 ng Template kann zu einer h heren Anzahl von Artefakt Peaks f hren Verwenden Sie weniger DNA Siehe Abschnitt 6 O f r weitere Informationen ber
22. die Parameter von propriet ren Produkten oder Services der GE Healthcare Bio Sciences Corp zur ckzuentwickeln Gew hrleistungsausschluss GE Healthcare Bio sciences Corp bietet dem Endverbraucher keine Gew hrleistungen gesetzlich oder konkludent einschlie lich ohne Einschr nkung bez glich der Qualit t des Zustands der Beschreibung der Marktg ngigkeit oder der Eignung des Produkts zu einem bestimmten Zweck und alle derartigen Gew hrleistungen werden hiermit ausdr cklich ausgeschlossen GE Healthcare Bio Sciences Corp schlie t hiermit ausdr cklich jede Gew hrleistung bez glich der Ergebnisse aus die durch den Gebrauch der Produkte erzielt werden einschlie lich ohne Einschr nkung alle Forderungen aufgrund inakkurater ung ltiger oder unvollst ndiger Ergebnisse Haftungsausschluss GE Healthcare Bio Sciences Corp und seine Tochtergesellschaften bernehmen keine Haftung gegen ber dem Endverbraucher einschlie lich ohne Einschr nkung f r Gebrauchs oder Profitverlust Gesch ftsunterbrechung oder beliebige Folgesch den Nebensch den oder besondere Sch den oder sonstige mittelbare Sch den beliebiger Art gleichg ltig wie verursacht und gleichg ltig ob eine Vertragshandlung eine unerlaubte Handlung Kausalhaftung oder eine andere Rechtsgrundlage vorliegt 2009 2011 2012 Promega Corporation Alle Rechte vorbehalten Maxwell Plexor und PowerPlex sind eingetragene Warenzeichen der Promega Corporation Dif
23. hrchen oder MicroAmp Optical 96 Well Reaktionsplatte Applied Biosystems 1 5 ml Mikrozentrifugenr hrchen Gegen Aerosol gesch tzte Pipettenspitzen siehe Abschnitt 9 F Wir amplifizieren routinem ig 0 5 ng Template DNA in einem Reaktionsvolumen von 25 l wobei die unten ausgef hrten Protokolle befolgt werden Das PowerPlex ESX 17 System ist f r den GeneAmp PCR System 9700 Thermocycler optimiert Ein Amplifikationsprotokoll f r den GeneAmp PCR Systems 2720 Thermocycler ist in diesem Handbuch enthalten Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 6 4 A Amplifikation Setup Um Kreuzkontamination zu vermeiden wird die Verwendung von Hand schuhen und gegen Aerosol gesch tzte Pipettenspitzen dringend empfohlen Lagern Sie alle Reagenzien f r die Pr Amplifikation und die Post Amplifika tion in separaten R umen Bereiten Sie die Amplifikationsreaktionen in einem Raum vor der speziell f r die Reaktionsvorbereitung vorgesehen ist Verwenden Sie Ger te und Verbrauchsmaterialien die nur der Amplifikations vorbereitung dienen Die Konzentration der 9947A DNA wurde durch Absorptions Messungen bei 260 nm ermittelt Die Quantifizierung mit anderen Methoden wie qPCR kann zu abweichenden Ergebnissen f hren Stelle
24. im Ordner Size Standards Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 47 Analysebereich Start Definiert in Schritt 2 Stopp 10 000 Verarbeiten der Daten Basislinie Markiert Multi Komponenten Markiert Gl ttung Leicht1 Maximum Erkennung Schwellenwert der Maximum Amplitude2 B 50 Y 50 G 50 R 50 O 50 Halbe Breite kleinstes Maximum 2 pts Bereich Gr enaufruf Min 60 Max 500 Methode des Gr enaufrufs Local Southern Method Korrektur Doppelmaximum Keine 1 Smooth Options m ssen von den Labors individuell bestimmt werden 2 Die Grenzwerte der Peak Amplitude Thresholds sind die kleinsten Peak H hen die die Software als Peak deutet Die Grenzwerte der Peak Amplitude Thresholds liegen gew hnlich bei 50 150 RFU und m ssen von Labors individuell bestimmt werden Verwenden Sie 50 RFU als Grenzwert der Peak Amplitude f r CC5 6 L Probenanalyse mit der GeneScan Software und Macintosh Betriebssystemen Fortsetzung 7 Wenden Sie den definierten Size Standard auf die Proben an und analysieren Sie dann die Proben In Abschnitt 6 M finden Sie zus tzliche Informationen ber den Gebrauch der PowerTyper ESX 17 Macro und Genotyper Software Weitere Informationen ber die GeneScan An
25. in den Analyseparametern Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 44 3 Die empfohlenen Analyseparameter sind in Abbildung 22 abgebildet Die Peak Amplitude Thresholds definieren die kleinsten Peak H hen die die Software als Peak benennt Die Grenzwerte der Peak Amplitude Thresholds liegen gew hnlich bei 50 150 RFU und m ssen individuell vom Labor ermittelt werden Verwenden Sie 50 RFU als Grenzwert der Peak Amplitude f r den CC5 Filter nicht dargestellt 4 Die Analyseparameter k nnen im Ordner Params gespeichert werden der sich bei den meisten Installationen hier befindet C AppliedBio Shared Analysis Sizecaller Params 5 Verwenden Sie die gespeicherte Analyseparameterdatei f r die Proben Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 45 8200TA Abbildung 22 Das Fenster Analysis Parameters Der Startpunkt des Analysebereichs kann variieren Er wird in Abschnitt 6 K Schritt 2 definiert 6 K Probenanalyse mit der GeneScan Software und Windows Betriebsystemen Fortsetzung 6 Definieren Sie ei
26. kein STR weist jedoch eine 87 bp X spezifische Bande und eine 93 bp Y spezifische Bande auf 9947A DNA weiblich weist nur die 87 bp X spezifische Bande auf Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 69 Tabelle 3 PowerPlex ESX 17 System Informationen zur Allelleiter STR Locus Kenn zeichnung L ngenbereich von Allelleiter Komponenten1 2 Basen Repeat Zahlen von Allelleiter Komponenten3 D18S51 Fluorescein 286 366 7 10 10 2 11 13 13 2 14 27 D21S11 Fluorescein 203 259 24 24 2 25 25 2 26 28 28 2 29 29 2 30 30 2 31 31 2 32 32 2 33 33 2 34 34 2 35 35 2 36 38 TH01 Fluorescein 152 195 3 9 9 3 10 11 13 3 D3S1358 Fluorescein 103 147 9 20 Amelogenin4 Fluorescein 87 93 X Y D16S539 JOE 273 321 4 16 D2S1338 JOE 197 269 10 12 14 28 D1S1656 JOE 137 184 9 14 14 3 15 15 3 16 16 3 17 17 3 18 18 3 19 19 3 20 3 D10S1248 JOE 83 127 8 19 FGA TMR ET 264 410 14 18 18 2 19 19 2 20 20 2 21 21 2 22 22 2 23 23 2 24 24 2 25 25 2 26 30 31 2 32 2 33 2 42 2 43 2 44 2 45 2 46 2 48 2 50 2 D8S1179 TMR ET 203 251 7 19 vWA TMR ET 124 180 10 24 D22S1045 TMR ET 79 118 7
27. nicht erfasst Nicht alle definierten L ngenstandard CC5 ILS 500 Fragmente wurden w hrend des Laufs festgestellt Erstellen Sie einen neuen L ngenstandard mit den internen L ngenstandardfragmente die in der Probe vorhanden sind Trennen Sie die Proben mit einer l ngeren Laufzeit erneut auf Eine Allelleiter mit geringer Qualit t wurde f r die Analyse verwendet Stellen Sie sicher dass nur hochwertige Allelleiter f r die Analyse eingesetzt werden Eine Allelleiter wurde verwendet die nicht zu dem Lauf der der Proben geh rt Analysieren Sie die Proben mit einer Allelleiter vom gleichen Lauf erneut Die GeneMapper ID Software erfordert dass die Allelleiter aus dem gleichen Ordner wie die Probe importiert wird Stellen Sie sicher dass sich die Allelleiter im selben Ordner wie die Probe befindet Die f r die Analyse gew hlte Panel Datei war f r das verwendete STR System nicht geeignet Ordnen Sie die richtige Panel Datei f r das STR System zu das f r die Amplifikation verwendet wurde Die Allelleiter wurde in der Spalte Sample Type nicht als Allelleiter gekennzeichnet In der Probe wurde der interne L ngenstandard nicht richtig erkannt Definieren Sie manuell die L ngen der L ngenstandardfragmente Eine Allelleiter mit geringer Qualit t wurde f r die Analyse verwendet Stellen Sie sicher dass nurhochwertige Allelleiter f r die Analyse eingesetzt werden Der Startdatenpunkt f r den in Abschnitt 6 E gew hlte
28. oder wenn eine schlechte oder falsche Matrix auf die Proben angewendet wird Erstellen Sie auf dem ABI PRISM 310 Genetic Analyzer eine neue Matrix und wenden Sie sie auf die Proben an F hren Sie auf den ABI PRISM 3100 und 3100 Avant Genetic Analyzers und Applied Biosystems 3130 3130xl 3500 und 3500xL Genetic Analyzers eine neue Spektralkalibrierung durch und wenden Sie diese auf die Proben an Verschiedene Instrumente k nnen unterschiedliche Empfindlichkeiten haben Optimieren Sie die Injektionsbedingungen Siehe Abschnitt 5 CE bedingte Artefakte Verunreinigungen Verunreinigungen im Wasser das mit dem Instrument oder zum Verd nnen der 10X Genetic Analyzer Puffer verwendet wird k nnen Peaks im Fluorescein und JOE Kanal erzeugen Verwenden Sie autoklaviertes Wasser wechseln Sie die Fl schchen und waschen Sie das Pufferreservoir Wiederholen Sie die Probenvorbereitung mit frischem Formamid Langfristige Lagerung amplifizierter Proben in Formamid kann diese zersetzen Das Verfallsdatum f r das CE Polymer war abgelaufen oder das Polymer wurde l nger als eine Woche bei Raum temperatur gelagert Die Instrumente nach Empfehlung des Herstellers t glich oder w chentlich warten Die Allelleiter und das Primerpaargemisch waren nicht kompatibel Achten Sie darauf dass die Allelleiter von dem gleichen Kit ist wie das Primerpaargemisch Formamid schlechter Qualit t Verwenden Sie zum Analysieren der Proben nur Hi Di Form
29. 1 Mb AGAA 19 D21S11 Fluorescein 21q21 1 19 476 Mb TCTA Komplex 19 TH01 Fluorescein 11p15 5 2 149 Mb AATG 19 D3S1358 Fluorescein 3p21 31 45 557 Mb TCTA Komplex Amelogenin3 Fluorescein Xp22 1 22 3 und Y NA D16S539 JOE 16q24 1 84 944 Mb GATA D2S1338 JOE 2q35 218 705Mb TGCC TTCC D1S1656 JOE 1q42 228 972 Mb TAGA Komplex D10S1248 JOE 10q26 3 130 567Mb GGAA FGA TMR ET 4q28 155 866Mb TTTC Komplex 19 D8S1179 TMR ET 8q24 13 125 976Mb TCTA Komplex 19 vWA TMR ET 12p13 31 5 963Mb TCTA Komplex 19 D22S1045 TMR ET 22q12 3 35 779Mb ATT SE33 CXR ET 6q14 89 043 Mb AAAG Komplex D19S433 CXR ET 19q12 35 109 Mb AAGG Komplex D12S391 CXR ET 12p12 12 341 Mb AGAT AGAC Komplex D2S441 CXR ET 2p14 68 214Mb TCTA 1 Informationen ber die Chromosomenposition dieser Loci k nnen in Referenz 20 und 21 und unter www cstl nist gov biotech strbase chrom htm gefunden werden 2 Im Bericht vom August 1997 22 23 der DNA Commission of the International Society for Forensic Haemogenetics ISFH wird erw hnt 1 for STR loci within coding genes the coding strand shall be used and the repeat sequence motif defined using the first possible 5 nucleotide of a repeat motif and 2 for STR loci not associated with a coding gene the first database entry or original literature description shall be used 3 Amelogenin ist
30. 17 System GeneMapper ID Software Version 3 2 Applied Biosystems 3500 oder 3500xL Genetic Analyzer Abschnitt 5 A Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 4 2 Produktkomponenten und Lagerbedingungen Fortsetzung Produkt Gr e Bestellnummer PowerPlex ESX 17 System 400 Reaktionen DC6720 Nicht f r die medizinische Diagnostik Die in diesem System enthaltenen Reagenzien reichen f r 400 Reaktionen von je 25 l aus Lieferumfang Box mit Komponenten f r die Pr Amplifikation blaues Etikett 4 500 l PowerPlex ESX 5X Master Mix 4 250 l PowerPlex ESX 17 10X Primer Pair 250 ng 9947A DNA 10 ng l 10 1 250 l Wasser Amplifikationsg te Box mit Komponenten f r die Post Amplifikation beiges Etikett 4 50 l PowerPlex ESX 17 Allelic Ladder Mix 4 300 l CC5 Internal Lane Standard 500 Der PowerPlex ESX 17 Allelic Ladder Mix wird in einem separaten dicht verschlossenen Beutel geliefert Geben Sie diese Komponente nach dem ffnen in die Box f r die Post Amplifikation Das Wasser Amplifikationsg te wird in einem separaten dicht verschlossenen Beutel geliefert Geben Sie diese Komponente nach dem ffnen in die Box f r die Pr Amplifikation Lagerungsbedingungen B
31. 2S1338 D1S1656 D10S1248 FGA D8S1179 vWA D22S1045 SE33 D19S433 D12S391 und D2S441 Das PowerPlex ESX 17 System ist mit den ABI PRISM 310 3100 und 3100 Avant Genetic Analyzers und Applied Biosystems 3130 3130xl 3500 und 3500xL Genetic Analyzers kompatibel Die Instrumente zur Amplifikation und Detektion k nnen variieren Unter Umst nden m ssen die Protokolle einschlie lich der Anzahl der Zyklen und Injektionszeit f r jedes Laborinstrument optimiert werden F hren Sie eine laborinterne Validierung durch Das PowerPlex ESX 17 System stellt alle Materialien bereit die zur Amplifikation von STR Regionen gereinigter genomischer DNA erforderlich sind einschlie lich Hot Start Taq DNA Polymerase Diese ist im PowerPlex ESX 5X Master Mix enthalten Dieses Handbuch enth lt separate Protokolle f r den Einsatz des PowerPlex ESX 17 Systems mit den GeneAmp PCR System 9700 und 2720 Thermocyclern und zus tzlich Protokolle f r das Auftrennen amplifizierter Produkte und deren Detektion Abbildung 1 Protokolle f r den Betrieb des Fluoreszenzdetektionsinstruments k nnen vom Hersteller des Instruments angefordert werden Informationen ber andere STR Fluoreszenz Systeme von Promega sind auf Anfrage bei Promega unter www promega com erh ltlich 2 Produktkomponenten und Lagerbedingungen Produkt Gr e Bestellnummer PowerPlex ESX 17 System 100 Reaktionen DC6721 Nicht f r die medizinische Diagnostik Die in dies
32. DNA 4 3 16 26 Krenke B E et al 2005 Development of a novel fluorescent two primer approach to quantitative PCR Profiles in DNA 8 1 3 5 27 Greenspoon S and Ban J 2002 Robotic extraction of sexual assault samples using the Biomek 2000 and the DNA IQ System Profiles in DNA 5 1 3 5 28 McLaren B Bjerke M and Tereba A 2006 Automating the DNA IQ System on the Biomek 3000 Laboratory Automation Workstation Profiles in DNA 9 1 11 13 29 Cowan C 2006 The DNA IQ System on the Tecan Freedom EVO 100 Profiles in DNA 9 1 8 10 30 Bjerke M et al 2006 Forensic application of the Maxwell 16 Instrument Profiles in DNA 9 1 3 5 31 Mandrekar P et al 2010 Improved performance of the Maxwell 16 low elution volume system for forensic casework Profiles in DNA 13 2 This can be viewed online at www promega com profiles 1302 1302_05 html Weitere Literatur zu STR kann auf www promega com geneticidentity gefunden werden 9 Anhang 9 A Vorteile bei der Verwendung der Loci im PowerPlex ESX 17 System Die Loci im PowerPlex ESX 17 System Tabelle 2 und 3 wurden gew hlt weil sie den Empfehlungen des European Network of Forensic Science Institutes ENFSI entsprechen Das PowerPlex ESX 17 System amplifiziert alle von ENFSI empfohlenen Loci und SE33 in nur einer Reaktion In Tabelle 4 sind die Allele vom PowerPlex ESX 17 System aufgef hrt wie Sie in den 9947A und
33. Datei die Sie im Abschnitt Vorbereitung gespeichert haben W hlen Sie die Datei und Import 6 Markieren Sie im Navigationsbereich den Ordner den Sie soeben importiert haben 7 W hlen Sie File und dann Import Bin Set 8 Navigieren Sie zu der Bin Datei die Sie im Abschnitt Vorbereitung importiert haben Markieren Sie die Datei und w hlen Sie Import 9 Markieren Sie im Navigationsbereich das PowerPlex ESX Panel das Sie in Schritt 5 importiert haben 10 W hlen Sie File und dann Import Marker Stutter Ein Warnfenster wird ge ffnet in dem gefragt wird ob Sie die aktuellen Werte ber schreiben m chten W hlen Sie Yes 11 Navigieren Sie zu der gespeicherten Stutter Datei W hlen Sie die Datei aus und w hlen Sie Import 12 W hlen Sie im Fenster Panel Manager unten OK Daraufhin werden die importierten txt Dateien gespeichert und das Fenster Panel Manager wird geschlossen 6 B Erstellen eines L ngenstandards mit GeneMapper ID X Software Version 1 2 F r das Erstellen von L ngenstandards stehen zwei Optionen zur Verf gung Verwenden Sie dieses Protokoll oder das alternative Protokoll in Abschnitt 6 C 1 W hlen Sie Tools und dann GeneMapper ID X Manager 2 W hlen Sie die Registerkarte Size Standard 3 W hlen Sie New 4 W hlen Sie im Size Standard Editor Fenster Abbildung 12 GeneMapper ID X
34. Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 18 Abbildung 8 Das Fenster New Result Group 9253TA 9 Vergeben Sie einen eing ngigen Plattennamen W hlen Sie dann den Plattentyp HID aus der Drop Down Liste aus Abbildung 9 10 W hlen Sie Assign Plate Contents Abbildung 10 11 Vergeben Sie Probennamen f r die Wells 12 Im unteren linken Bereich des Bildschirms unter Assays w hlen Sie mit der Add from Library Option den Assay den Sie im Schritt 5 erstellt haben oder w hlen Sie einen bereits bestehenden Assay aus Klicken Sie auf den Add to Plate Button und schlie en Sie das Fenster Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 19 Abbildung 9 Die Auswahl der Platten Eigenschaften 9254TA Abbildung 10 Namenvergabe auf der Platte 9255TA 5 A Detektion amplifizierter Fragmente mit dem Applied Biosystems 3500 und 3500xL Genetic Analyzer Fortsetzung 13 Unter File Name Convention w hlen Sie mit der Add from Library Option die File Name Convention aus den Sie im Schritt 6 erstellt habenoder w hlen einen bereits b
35. F r die Analysemethode wurde der falsche Analysetyp gew hlt Achten Sie darauf dass der Analysetyp HID verwendet wird In der Probe wurde der interne L ngenstandard nicht richtig erkannt Definieren Sie manuell die L ngen der L ngen standardfragmente Der Startdatenpunkt f r den in Abschnitt 6 K gew hlten Teilbereich war nicht korrekt ndern Sie den Startdatenpunkt in der Analysemethode Alternativ dazu k nnen Sie den vollen Bereich f r die Analyse verwenden Zus tzliche Peaks im L ngenstandard advanced mode ffnen Sie den Size Match Editor Markieren Sie den zus tzlichen Peak w hlen Sie Edit und w hlen Sie delete size label W hlen Sie auto adjust sizes Der Lauf war zu kurz und l ngere Fragmente im ILS wurden nicht erfasst Nicht alle im L ngenstandard definierte CC5 ILS 500 Peaks wurden w hrend des Laufs festgestellt Erstellen Sie einen neuen L ngenstandard mit den internen L ngenstandardfragmente die in der Probe vorhanden sind Lassen Sie die Proben mit einer l ngeren Laufzeit erneut laufen Wenn Peaks unter der eingestellten Peak Amplitude Threshold liegen setzen Sie den Grenzwert in der Analysemethode f r den orangen Kanal herunter um die Peaks einzuschlie en Wenn Peaks von schlechter Qualit t sind definieren Sie den L ngenstandard f r die Probe neu um diese Peaks zu berspringen Der L ngenstandard und die Analysemethode waren nicht im gleichen Modus Classic
36. M 310 Data Collection Software 2 Bereiten Sie gem der Beschreibung im Benutzerhandbuch f r den ABI PRISM 310 Genetic Analyzer ein GeneScan Sample Sheet vor Geben Sie die zutreffenden Probeninformationen in die Spalte Sample Info ein Geben Sie in Zeilen die PowerPlex ESX 17 Allelic Ladder Mix enthalten das Wort ladder in die Spalte Sample Info f r die Farben Fluorescein JOE TMR ET CXR ET und CC5 ein Diese Informationen m ssen eingegeben werden um Ihre Daten mit dem PowerTyper ESX 17 Macro erfolgreich analysieren zu k nnen 3 Erstellen Sie eine neue GeneScan Injektionsliste W hlen Sie mithilfe des Pulldown Men s das entsprechende Probenblatt 4 W hlen Sie mithilfe des Pulldown Men s das Modul GS STR POP4 1ml G5 ndern Sie die Injektionszeit in 3 Sekunden und die Laufzeit in 28 Minuten Behalten Sie die Einstellungen f r brigen Parameter wie unten gezeigt bei Inj Sek 3 Inj kV 15 0 Run kV 15 0 Run C 60 Run Time 28 Eventuell muss die Injektionszeit f r einzelne Instrumente optimiert werden F r Proben die 0 5 ng Template DNA enthalten werden Injektionszeiten von 2 5 Sekunden empfohlen Hinweis Die Migration der Fragmente kann w hrend des Verlaufs eines langen ABI PRISM 310 Genetic Analyzer Laufs leicht variieren Die Ursache daf r k nnen Temperatur oder Spannungs nderungen sein Wenn viele Proben analysiert werden sind mehrere und zu v
37. NA Amplification 1989 Erlich H A ed Stockton Press New York NY 8 PCR Protocols A Guide to Methods and Applications 1990 Innis M A et al eds Academic Press San Diego CA 9 Butler J M 2005 Forensic DNA Typing 2nd ed Elsevier Academic Press London 10 Presley L A et al 1992 The implementation of the polymerase chain reaction PCR HLA DQ alpha typing by the FBI laboratory In The Third International Symposium on Human Identification 1992 Promega Corporation 245 69 11 Hartmann J M et al 1991 Guidelines for a quality assurance program for DNA analysis Crime Laboratory Digest 18 44 75 12 Internal Validation of STR Systems Reference Manual GE053 Promega Corporation 13 Kline M C et al 2005 Results from the NIST 2004 DNA quantitation study J Forensic Sci 50 571 8 14 Levinson G and Gutman G A 1987 Slipped strand mispairing A major mechanism for DNA sequence evolution Mol Biol Evol 4 203 21 15 Schlotterer C and Tautz D 1992 Slippage synthesis of simple sequence DNA Nucleic Acids Res 20 211 5 16 Smith J R et al 1995 Approach to genotyping errors caused by nontemplated nucleotide addition by Taq DNA polymerase Genome Res 5 312 7 17 Magnuson V L et al 1996 Substrate nucleotide determined non templated addition of adenine by Taq DNA polymerase Implications for PCR based genotyping BioTechniques 21 700 9 18 Walsh P S Fild
38. PRISM 3100 und 3100 Avant Genetic Analyzer und Applied Biosystems 3130 3130xl 3500 und 3500xL Genetic Analyzer sind schlecht kalibriert F hren Sie die Spektralkalibrierung erneut durch und lassen Sie die Proben noch mal laufen Schlechte Matrix f r den ABI PRISM 310 Genetic Analyzer Lassen Sie die Matrix erneut laufen und optimieren Sie diese Stellen Sie sicher dass die 5 Dye Matrix auf dem Ger t erstellt wird Das falsche G5 Spektral war aktiv Lassen Sie die Proben erneut laufen und stellen Sie sicher dass das PowerPlex 5 dye G5 Spektral auf G5 eingestellt ist Die Anleitung dazu finden Sie in Abschnitt 5 Instrumenten Setup 7 C GeneMapper ID Analysis Software Symptome Ursachen und Anmerkungen Um Proben mit der GeneMapper ID Software zu analysieren muss sowohl f r die Analyseparameter als auch f r den L ngenstandard der Analysetyp Basic or Advanced ausgew hlt sein Sollten sie verschieden sein wird ein Fehler hervorgerufen Um Proben mit den GeneMapper ID Software zu analysieren muss wenigstens ein Allelic Ladder definiert sein Die Anzahl der definierten CC5 ILS 500 Fragmente ist unzureichend Achten Sie darauf dass Sie mindestens ein CC5 ILS 500 Fragment bestimmen das kleiner ist als der kleinste Proben Peak und mindestens ein CC5 ILS 500 Fragment das gr er ist als der gr te Probenpeak Der Lauf war zu kurz und l ngere Fragmente im ILS wurden nicht erfasst Nicht alle definierten L ngen
39. Registerkarte Analysis Methods 3 W hlen Sie New Ein neues Dialogfeld Analysis Method wird ge ffnet 4 W hlen Sie HID und dann OK Hinweis Wenn Sie die Option HID nicht sehen k nnen haben Sie die GeneMapper ID Software nicht Wenden Sie sich an Applied Biosystems 5 Geben Sie f r die Analysemethode einen aussagekr ftigen Namen wie PowerPlexESX 17 ein 6 W hlen Sie die Registerkarte Allele Abbildung 19 7 W hlen Sie das Bin Set das Sie in Abschnitt 6 F importiert haben 8 Stellen Sie sicher dass das K stchen Use marker specific stutter ratio if available angekreuzt ist Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 39 6 I Erstellen einer Methode zur Spurenanalyse mit GeneMapper ID Software Version 3 2 Fortsetzung 9 Geben Sie die Werte aus Abbildung 19 ein um ein korrektes Filtern der Stutter Peaks bei Verwendung des PowerPlex ESX 17 Systems zu gew hrleisten Erkl rungen zum richtigen Einsatz und den Auswirkungen dieser Einstellungen finden Sie im Benutzer Datenblatt mit dem Titel Installation Procedures and New Features for GeneMapper ID Software 3 2 Hinweis Einige Einstellungen wurden optimiert und unterscheiden sich von den Einst
40. Security Group als Security Group aus Dadurch wird allen Benutzern der Software Zugriff gew hrt Sie k nnen auch andere Security Groups verwenden 5 Geben Sie einen aussagekr ftigen Namen wie CC5_ILS_500_IDX ein 6 W hlen Sie Orange als L ngenstandardfilter 7 Geben Sie die Fragmentl ngen des internen L ngenstandards ein 60 65 80 100 120 140 160 180 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 und 500 Basen 8 W hlen Sie OK Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 27 8257TA Abbildung 12 Der GeneMapper ID X L ngenstandard Editor Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 28 6 C Importieren des CC5 ILS 500_IDX L ngenstandard in die GeneMapper ID X Software Version 1 2 Die Datei CC5_ILS_500_IDX xml kann hier heruntergeladen werden www promega com geneticidtools panels_bins Speichern Sie die Datei CC5_ILS_500_IDX xml in einem Ordner auf Ihrem Computer ab 1 W hlen Sie Tools und dann GeneMapper ID X Manager 2 W hlen Sie die
41. Stutter und Artefakte Artefakte der STR Amplifikation Unvollst ndige Adenylierung kann zu Artefakten w hrend der PCR Amplifikation von STR Systemen f hren Diese erscheinen als Peaks die eine Base k rzer als die Allele sind Achten Sie darauf dass der 45 min tige Extension Schritt nach dem Thermocycling bei 60 C durchgef hrt wird Abschnitt 4 B CE bedingte Artefakte Spikes Geringe Spannungs nderungen oder Ureakristalle die das Laserfenster passieren k nnen Spikes oder unerwartete Peaks verursachen Spikes erscheinen manchmal nur in einer Farbe k nnen jedoch oft leicht daran erkannt werden dass sie in allen Farben auftreten Injizieren Sie die Proben erneut Die falsche G5 Matrix war aktiviert Trennen Sie die Probe erneut auf und vergewissern Sie sich dass die PowerPlex 5 Dye G5 Matrix aktiviert ist Siehe Anweisungen zur Vorbereitung des Instruments in Abschnitt 5 Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 57 In einem oder allen Farbkan len sind zus tzliche Peaks sichtbar Schwache oder fehlende Allel Peaks Fortsetzung 7 A Amplifikation und Fragmentdetektion Fortsetzung Symptome Ursachen und Anmerkungen Pull Up oder berstrahlung Pull Up kann auftreten wenn Peaks zu hoch sind
42. T e c h n i c a l M a n u a l PowerPlex ESX 17 System GEBRAUCHSANLEITUNG F R DIE PRODUKTE DC6720 UND DC6721 Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 1 Beschreibung 2 2 Produktkomponenten und Lagerbedingungen 3 3 Bevor Sie beginnen 5 A Warnhinweise 5 B Matrixerstellung oder Spektralkalibrierung 6 4 Protokolle f r die DNA Amplifikation mit dem PowerPlex ESX 17 System 6 A Amplifikation Setup 7 B Amplifikation Thermocycling 9 5 Instrumenten Setup und Probenvorbereitung 10 A Detektion amplifizierter Fragmente mit dem Applied Biosystems 3500 und 3500xL Genetic Analyzer 10 B Detektion amplifizierter Fragmente mit dem ABI PRISM 3100 oder 3100 Avan
43. alysis Software finden Sie im Benutzerhandbuch f r die GeneScan Analysis Software Hinweise 1 Peak H hen au erhalb des linearen Bereichs des Instruments k nnen Artefakt Peaks aufgrund von Instrumentens ttigung d h berladen der Probe sein Es kann zur berstrahlung Pull Ups von einer Farbe durch eine andere kommen Ges ttigte Signale k nnen auch als Doppel Peak Split Peak auftreten 2 Wenn sich die Peak H hen nicht im linearen Detektionsbereich des Instru ments befinden nimmt das Verh ltnis von Stutter Peaks zu tats chlichen Allel Peaks zu und die Interpretation von Profilen wird schwierig 3 Verschiedenen Instrumente k nnen f r die gleiche Probe unterschiedliche relative Fluoreszenzeinheiten messen Au erdem unterscheiden sich unterschiedliche Instrumente in der relativen Effizienz der Farbdetektion die sich auf die Balance zwischen den Farben auswirkt 6 M Probenanalyse mit der Genotyper Software und dem PowerTyper ESX 17 Macro Zur leichteren Analyse der mit dem PowerPlex ESX 17 System generierten Daten haben wir eine Datei erstellt die die automatische Zuweisung von Genotypen mit der Genotyper Software erm glicht Nach der Amplifikation der Proben der Detektion mit dem ABI PRISM 310 oder 3100 Genetic Analyzer und der Analyse mit der GeneScan Analysis Software k nnen Probedateien in das Genotyper Programm importiert und anhand des PowerTyper ESX 17 Macros analysiert werden Di
44. amid Achten Sie darauf dass die Allelleiter und die Proben aus dem gleichen Instrumentenlauf stammen Die Migration der Proben hat sich w hrend eines CE Laufs mit vielen Proben leicht ge ndert Dies kann auf Temperatur nderungen oder Ver nderungen der Kapillare im Verlauf der Zeit zur ckzuf hren sein Verwenden Sie eine andere Injektion der Allelleiter um die Allell ngen zu bestimmen Schlechte Injektion der Allelleiter Verwenden Sie mehrere Leitern pro Instrumentenlauf Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 58 In einem oder allen Farbkan len sind zus tzliche Peaks sichtbar Fortsetzung Die Allelleiter l uft nicht so wie die Proben Symptome Ursachen und Anmerkungen Zu hohe DNA Menge Die Amplifikation von mehr als 0 5 ng Template kann zu einem Ungleichgewicht f hren wobei k rzere Loci h here Peaks aufweisen als l ngere Loci Verwenden Sie weniger Template Verwendung von FTA Papier Die Ergebnisse k nnen denen hneln die mit zu hohen Mengen DNA erzielten wurden Verwenden Sie weniger Zyklen Degradierte DNA Probe DNA Template war degradiert und gr ere Loci zeigten eine geringere Ausbeute Template DNA erneut aufreinigen Template DNA reicht nicht aus Verwenden Sie die empfohlene Menge an Template DNA
45. arkierungen in den Kopfzeilen in der Plot Ansicht pr fen und mit Ihnen nach Standardlaborprozeduren umgehen Navigieren Sie zur Genotyp oder Sample Reiterkarte Um die berpr fung von Proben mit geringer Qualit t zu erleichtern benutzen Sie den Standard Data Interpretation Plot und pr fen Sie die Quality Value Details Tabelle In den Analysis Method Peak Quality und den SQ amp GQ Settings Reitern sind Standardwerte angegeben Diese wirken sich auf die Qualit tswerte in den Plot Einstellungen aus Wir empfehlen die Werte in den Reitern an die Datenanalyseprotokolle anzupassen 6 F PowerPlex ESX Panel und Bin Sets mit GeneMapper ID Software Version 3 2 Zur leichteren Analyse der mit dem PowerPlex ESX 17 System generierten Daten gibt es Panel und Bin Dateien die die automatische Zuweisung von Genotypen mit der GeneMapper ID Software Version 3 2 erm glichen Wir empfehlen Benutzern der GeneMapper ID Software Version 3 2 die Anleitung Applied Biosystems GeneMapper ID Software Human Identification Analysis vollst ndig zu lesen um sich mit dem ordnungsgem en Betrieb der Software vertraut zu machen Benutzern der GeneMapper ID Software Version 3 1 wird empfohlen auf Version 3 2 zu aktualisieren F r eine Analyse mit der GeneMapper ID Software Version 3 2 ben tigen Sie die entsprechenden Panel und Bin Dateien PowerPlex_ESX_Panels_vX x txt und PowerPlex_ESX_Bins_vX x txt wobei X x
46. ass die Consumables Information und die Maintenance Notifications richtig eingestellt sind Stellen Sie die Ofen Temperatur auf 60 C w hlen Sie dann Start Pre Heat mindestens 30 Minuten bevor Sie die erste Injektion machen um den Ofen aufzuheizen Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 12 Abbildung 2 Der Dashboard Screen 9247TA 2 Um ein neues Protokoll anzulegen w hlen Sie aus der Library das Instrument Protocol und w hlen dann Create Alternativ k nnen Sie ein bereits angelegtes Protokoll nutzen Abbildung 3 zeigt die Einstellungen die Promega beim Applied Biosystems 3500xL f r Applikationstyp Dye Set Kapillarl nge Polymer Run Module und entsprechende Protokollinformationen einsetzt Die einzige Einstellung die vom Standard abweicht ist das Dye Set Wenn Sie ein neues Instrument Protocol anlegen stellen Sie sicher dass dasselbe Dye Set f r die Kalibration der Promega 5 Dye Matrix benutzt wurde Wir empfehlen eine Laufzeit von 1 210 Sekunden und die Standardeinstellungen f r die Injektion Optimieren und validieren Sie Laufzeit und andere Ger teeinstellungen in Ihrem Labor Geben Sie dem Protokoll einen eing ngigen Namen Hinweis N here Informationen finden Sie im Handb
47. atent Nr 2231475 japanisches Patent Nr 3066984 und andere eingereichte oder Nicht US Patentantr ge Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 76 h Allgemeine Gesch ftsbedingungen f r den Endverbraucher Zustimmung Diese allgemeinen Gesch ftsbedingungen sind f r den Kauf Gebrauch und die Akzeptanz der Produkte ma geblich die im Bestellformular dem Angebot oder der Rechnung aufgef hrt sind wobei diese Produkte von Promega an den K ufer bernehmer Endverbraucher solcher Produkte verkauft und vertrieben werden Die bergabe der Verkauf von Produkten an den Endverbraucher h ngt ausdr cklich von der Zustimmung des Endverbrauchers zu diesen allgemeinen Gesch ftsbedingungen ab Einschr nkung des Gebrauchs Endverbraucher sind ausdr cklich nicht dazu berechtigt und es ist ihnen untersagt derartige Produkte weiter zu verkaufen zu bergeben oder zu vertreiben weder als Einzelprodukt noch als Komponente eines anderen Produkts Das Recht diese Produkte zu verwenden umfasst oder beinhaltet an und f r sich kein Recht des Endverbrauchers auf die Technologie oder das geistige Eigentum von GE Healthcare Bio Sciences Corp wenn hierin nicht ausdr cklich vorgesehen Der Endverbraucher darf keine Sequenz en dazu verwenden um
48. atibel mit 96 well Platten gegen Aerosol gesch tzte Pipettenspitzen 3100 oder 3130 Kapillar Array 36 cm Performance Optimized Polymer 4 POP 4 f r den 3100 oder 3130 10X genetic analyzer buffer with EDTA MicroAmp Optical 96 Well Plate und Septen Hi Di Formamid Applied Biosystems Bestellnummer 4311320 PowerPlex 5 Dye Matrix Standards 3100 3130 Bestellnummer DG4700 Die Qualit t des Formamids ist von wesentlicher Bedeutung Hi Di Formamid verwenden Aliquotieren Sie das Formamid bevor Sie es bei 20 C einfrieren Mehrfaches Einfrieren und Auftauen oder l ngerfristige Lagerung bei 4 C kann den Zerfall des Formamids bewirken Formamid von schlechter Qualit t kann Ionen enthalten die w hrend der Injektion mit der DNA konkurrieren und somit zu geringeren Peak H hen und reduzierter Sensitivit t f hren Eine l ngere Injektionszeit verst rkt das Signal nicht unbedingt Formamid ist ein Reizmittel und ein Teratogen Vermeiden Sie das Einatmen und Kontakt mit der Haut Lesen Sie vor dem Handhaben dieser Substanz das Warnetikett durch und treffen Sie entsprechende Vorsichts ma nahmen Tragen Sie beim Handhaben von Formamid immer Handschuhe und eine Schutzbrille Vorbereitung der Proben 1 Der zu ladende Cocktail wird vorbereitet indem CC5 Internal Lane Standard 500 und Hi Di Formamid folgenderma en kombiniert und gemischt werden 1 0 l CC5 ILS 500 Anzahl der Injektion
49. bbildung 24 PowerPlex ESX 17 Allelic Ladder Mix Das PowerPlex ESX 17 Allelic Ladder Mix wurde mit einem Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer mit einer Injektion von 3 kV und 5 Sekunden aufgetrennt Die Proben wurden mit der GeneMapper ID Software Version 3 2 und PowerPlex ESX Panel und Bin Dateien analysiert Panel A Die mit Fluorescein markierten Allelleiterkomponenten und deren Allelbenennungen Panel B Die mit JOE markierten Allelleiterkomponenten und deren Allelbenennungen Hinweis Panel C und D werden auf den n chsten Seite gezeigt Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 54 8468TB C D Abbildung 24 PowerPlex ESX 17 Allelic Ladder Mix Fortsetzung Das PowerPlex ESX 17 Allelic Ladder Mix wurde mit einem Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer mit einer Injektion von 3 kV und 5 Sekunden aufgetrennt Die Proben wurden mit der GeneMapper ID Software Version 3 2 und PowerPlex ESX Panel und Bin Dateien analysiert Panel C Die mit TMR ET markierten Allelleiterkomponenten und deren Allelbenennungen Panel D Die mit CXR ET markierten Allelleiterkomponenten und deren Allelbenennungen Hinweis Panel A und B werden auf der vorhergehenden Seite gezeigt 6 O Ergebnisse Fortsetzung Artefakte und Stutter Stutt
50. ch und treffen Sie entsprechende Vorsichtsma nahmen Tragen Sie beim Einsatz von Formamid immer Handschuhe und eine Schutzbrille Vorbereitung der Proben 1 Der Ladecocktail wird vorbereitet indem CC5 Internal Lane Standard 500 und Hi Di Formamid folgenderma en gemischt werden 1 0 l CC5 ILS 500 Anzahl der Injektionen 10 0 l Hi Di Formamid Anzahl der Injektionen Hinweis Das Volumen des internen L ngenstandards im Ladecocktail kann verdoppelt werden um die Intensit t der Standard Peaks anzupassen Belassen Sie das Volumen des Formamids bei 10 0 l und passen Sie das Volumen das in Schritt 3 in die Wells gegeben wird entsprechend an Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 10 2 Vortexen Sie 10 15 Sekunden lang 3 Pipettieren Sie 11 l des Gemisches von Formamid und internem L ngenstandard in jedes Well 4 Geben Sie 1 l der amplifizierten Probe oder 1 l PowerPlex ESX 17 Allelic Ladder Mix zu Decken Sie die Wells mit den geeigneten Septen ab Hinweis Die Detektionsgrenzen verschiedener Instrumente sind unterschiedlich daher m ssen die Injektionszeit Injektionsspannung oder die Menge des PCR Produkts eventuell angepasst werden Die Injektionszeit und die Injektion
51. chen Algorithmen wie die GeneMapper ID Software und kann Unterschiede in der L ngenzuordnung nicht anhand der Allelleiter korrigieren Promega empfiehlt die Verwendung der GeneMapper ID Software zur Analyse von PowerPlex Reaktionen Wenn sie die GeneMapper ID Software Version 3 2 verwenden m ssen Sie darauf achten dass die gew hlte Analysemethode eine HID Methode ist Dies k nnen Sie berpr fen indem die Analysemethode mithilfe des GeneMapper Managers ge ffnet und die Registerkarte General gew hlt wird Der Analysetyp kann nicht ge ndert werden Wenn die Methode nicht HID ist muss sie gel scht und eine neue Analyse methode erstellt werden 7 D PowerTyper ESX 17 Macro Symptome Ursachen und Anmerkungen Genotyper Software ist nicht installiert Stellen Sie sicher dass die Genotyper Software Version 2 5 Macintosh oder Version 3 6 oder h her Windows NT installiert ist Falsche Version der Genotyper Software Das PowerTyper ESX 17 Macro kann nicht mit Genotyper Software Versionen ausgef hrt werden die lter als Version 2 5 Macintosh oder 3 6 Windows NT sind Es wurde keine Allelleiter gefunden Achten Sie darauf dass die Spalte Sample Info oder Color Info f r jede Spur die PowerPlex ESX 17 Allelic Ladder Mix enth lt das Wort ladder enthalten muss Das Macro verwendet das Wort ladder um Allelleitern zu erkennen Es wurden nicht alle f nf Farbstoffe im
52. cherten Bin Datei die Sie im Abschnitt Vorbereitung heruntergeladen haben Markieren Sie die PowerPlex ESX_Bins_v X x und dann Import 9 W hlen Sie im Fenster Panel Manager unten OK Das Fenster Panel Manager schlie t sich automatisch 6 G Erstellen eines L ngenstandards mit GeneMapper ID Software Version 3 2 F r das Erstellen von L ngenstandards stehen zwei Optionen zur Verf gung Sie k nnen dieses Protokoll oder das Alternativprotokoll in Abschnitt 6 H verwenden 1 W hlen Sie Tools und dann GeneMapper Manager 2 W hlen Sie die Registerkarte Size Standard 3 W hlen Sie New Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 37 6 G Erstellen eines L ngenstandards mit GeneMapper ID Software Version 3 2 Fortsetzung 4 W hlen Sie Basic or Advanced Abbildung 17 Die ausgew hlte Analysemethode muss mit der angelegten Analysemethode bereinstimmen W hlen Sie OK 5 Geben Sie einen aussagekr ftigen Namen wie CC5 ILS 500 advanced in den Size Standard Editor ein Abbildung 18 6 W hlen Sie als Farbe f r den L ngenstandardfilter Orange Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschla
53. childkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 73 9 F Verwandte Produkte Fortsetzung System f r die Probenvorbereitung Bestell Produkt Gr e nummer DNA IQ System 100 Reaktionen DC6701 400 Reaktionen DC6700 Differex System 50 Proben DC6801 200 Proben DC6800 Tissue and Hair Extraction Kit mit dem DNA IQ zu verwenden 100 Reaktionen DC6740 Maxwell 16 Forensic Instrument jede AS3060 DNA IQ Reference Sample Kit f r Maxwell 16 48 Pr p AS1040 DNA IQ Casework Pro Kit f r Maxwell 16 48 Pr p AS1240 Plexor HY System 800 Reaktionen DC1000 200 Reaktionen DC1001 Slicprep 96 Device 10er Pack V1391 Nicht f r die medizinische Diagnostik Nur f r den Laborgebrauch Nicht f r den diagnostische Einsatz ART Gegen Aerosol gesch tzte Pipettenspitzen Gr e Bestell Produkt Volumen Spitzen Packung nummer ART 10 Ultramicro Pipet Tip 0 5 10 l 960 DY1051 ART 20E Ultramicro Pipet Tip 0 5 10 l 960 DY1061 ART 20P Pipet Tip 20 l 960 DY1071 ART GEL Gel Loading Pipet Tip 100 l 960 DY1081 ART 100 Pipet Tip 100 l 960 DY1101 ART 100E Pipet Tip 100 l 960 DY1111 ART 200 Pipet Tip 200 l 960 DY1121 ART 1000E Pip
54. ds liegen im Allgemeinen bei 50 150 RFU und m ssen individuell vom Labor ermittelt werden Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 43 8188TA Abbildung 21 Registerkarte Allele des GeneMapper ID mit Einstellungen f r den Gebrauch eines 20 Peak Filters W hlen Sie das Bin Set das in Abschnitt 6 F importiert wurde 6 J Erstellen einer Methode zur Datenbank oder Vaterschaftstest Analyse mit GeneMapper ID Software Version 3 2 Fortsetzung 11 W hlen Sie die Registerkarte Peak Quality Sie k nnen die Einstellungen f r die Peak Qualit t ndern Hinweis Weitere Informationen ber Schritt 11 und 12 sind im Benutzerhandbuch f r den GeneMapper ID enthalten 12 W hlen Sie die Registerkarte Quality Flags Sie k nnen diese Einstellungen ndern 13 W hlen Sie OK um Ihre Einstellungen zu speichern Bearbeiten von Daten von Proben zur Datenbank oder Vaterschaftsanalyse 1 W hlen Sie File dann New Project 2 W hlen Sie Edit dann Add Samples to Project 3 Navigieren Sie zu den Runfiles W hlen Sie die gew nschten aus w hlen Sie dann Add to list und dann Add 4 Verwenden Sie das Dropdown Men in der Spalte Sample Type um
55. ds 3100 3130 Bestellnummer DG4700 erh ltlich 3 Bevor Sie beginnen 3 A Warnhinweise Bei der Typisierungen auf PCR Basis f r die Spurenanalyse oder Vaterschafts tests m ssen Validierungsstudien und Qualit tskontrollma nahmen durchgef hrt werden die in diesem Handbuch nicht enthalten sind 10 11 Richtlinien f r den Validierungsprozess sind im Internal Validation of STR Systems Reference Manual 12 ver ffentlicht Die Qualit t der aufgereinigten DNA sowie geringe Ver nderungen der Puffer der Ionenkonzentrationen der Primerkonzentrationen der Wahl des Thermo cyclers und den Bedingungen w hrend des Thermocyclings k nnen den Erfolg der PCR beeinflussen Wir legen nahe die empfohlenen Verfahren zur Amplifikation und Fluoreszenzdetektion genau zu befolgen Sollten an den empfohlenen Protokollen nderungen vorgenommen werden sind zus tzliche Recherchen und Validierungen erforderlich Bei der STR Analyse auf PCR Basis kann Kontamination durch geringste Mengen menschlicher DNA auftreten Es muss u erst sorgf ltig gearbeitet werden um Kreuzkontamination bei der Vorbereitung der Proben DNA der Handhabung von Primerpaaren dem Zusammenstellen von Amplifikations reaktionen und der Analyse der Amplifikationsprodukte zu vermeiden Reagenzien und Materialien die vor der Amplifikation verwendet werden PowerPlex ESX 5X Master Mix PowerPlex ESX 17 10X Primer Pair Mix 9947A DNA und Wasser Amplifikationg te werd
56. dule Manager in der Data Collection Software ndern siehe unten Vorbereitung des Instruments 5 Zentrifugieren Sie die Platte kurz an damit eventuelle Luftblasen aus den Wells entfernt werden 6 Denaturieren Sie die Proben bei 95 C 3 Minuten lang und k hlen Sie sie dann sofort danach auf zersto enem Eis oder in einem Eiswasserbad 3 Minuten lang ab Die Proben m ssen direkt vor dem Laden des Instruments denaturiert werden Vorbereitung des Instruments Anweisungen zur Reinigung und Installation des Kapillararrays dem Durch f hren einer Spatial Kalibrierung und zum Einf llen von Polymer sind dem Benutzerhandbuch f r das Instrument zu entnehmen Analysieren Sie die Proben gem der Beschreibung im Benutzerhandbuch f r den ABI PRISM 3100 oder 3100 Avant Genetic Analyzer mit Data Collection Software Version 2 0 und dem Applied Biosystem 3130 oder 3130xl Genetic Analyzer mit Data Collection Software Version 3 0 Dabei gelten die folgenden Ausnahmen 1 W hlen Sie im Module Manager New W hlen Sie Regular von der Dropdown Liste Type und HIDFragmentAnalysis36_POP4 von der Dropdown Liste Template Best tigen Sie die Injektionszeit von 5 Sekunden die Spannung von 3 kV und Laufzeit von 1 500 Sekunden Geben Sie dem Run Module einen aussagekr ftigen Namen und w hlen Sie OK Hinweis Die Empfindlichkeit verschiedener Instrumente kann unterschiedlich sein Injektionszeiten und Spannun
57. e PowerTyper ESX Macros k nnen hier heruntergeladen werden www promega com geneticidtools powertyper Das PowerTyper ESX 17 Macro wird zusammen mit der Macintosh Genotyper Software Version 2 5 und der Windows NT Genotyper Software Version 3 6 oder sp ter verwendet Die Genotyper Software muss auf Ihrem Computer installiert sein bevor das PowerTyper ESX 17 Macro verwendet werden kann Bei der Allelleiter muss in der Spalte Sample Info Macintosh Computer oder Color Info Windows NT Betriebssysteme das Wort ladder eingegeben werden Das Macro ben tigt das Wort ladder um Allelleitern zu erkennen Informationen ber die Proben k nnen nach dem Import in das PowerTyper ESX 17 Macro hinzugef gt oder ge ndert werden Markieren Sie die Probe und w hlen Sie dann show dye lanes window im Men Views Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 48 1 Speichern Sie das PowerTyper_ESX_17 Macro auf der Festplatte Ihres Computers ab 2 ffnen Sie die Genotyper Software und dann das PowerTyper_ESX_17 Macro Fragen zur Genotyper Software werden im Benutzerhandbuch f r die Genotyper Analysis Software beantwortet 3 W hlen Sie im Men File die Option Import
58. e Sie in Abschnitt 6 A importiert haben 7 W hlen Sie in der Spalte Size Standard den L ngenstandard der in Abschnitt 6 B erstellt oder in Abschnitt 6 C importiert wurde 8 Wenn Daten von einem ABI PRISM 310 Genetic Analyzer analysiert werden achten Sie darauf dass in der Spalte Matrix die richtige Matrixdatei ausgew hlt ist 9 W hlen Sie Analyze gr ne Pfeilschaltfl che um die Datenanalyse zu beginnen Hinweis Als Voreinstellung zeigt die Software nach der Qualit tspr fung die folgenden bersichten Analysis Requirement Summary Allelic Ladder Analysis Summary und Analysis Summary Stellen Sie sicher dass alle Anforderungen erf llt sind wenn die jeweiligen Fenster erscheinen Sollte das Fenster Analysis Requirement Summary nicht aktiviert sein kann es n tig sein eine manuelle Fehlerbehebung durchzuf hren 10 Wenn die Analyse Anforderungen erf llt sind ffnet sich ein Save Project Fenster Abbildung 15 Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 32 9430TA Figure 15 Das Save Project Fenster 11 Geben Sie den Projektnamen ein 12 W hlen Sie die entsprechende Security Group aus dem Drop Down Men aus und w hlen Sie OK Nac
59. e des GeneMapper ID X und speichern Sie das Projekt Lassen Sie sich das Fenster Plot View erneut anzeigen um die Tabelle Label Edit zu sehen Wenn nderungen an einem Locus vorgenommen werden werden Quality Flags und Marker Kopfzeilen automatisch grau eingef rbt Um die GQ und Marker Kopfzeilen f r einen Locus auf gr n zu ndern berschreiben Sie die GQ im Plot Fenster Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 59 Stotter Peaks werden nicht gefiltert Proben des Projektes werden nicht analysiert nderungen in der Label Edit Ansicht sind nicht sichtbar Die Marker Kopfzeilen mancher Loci sind grau Unbalancierte Peakh hen 7 B GeneMapper ID X Software Fortsetzung Symptome Ursachen und Anmerkungen Um Proben mit der GeneMapper ID Software zu analysieren muss mindestens eine Allelleiter definiert sein Die Anzahl der definierten CC5 ILS 500 Fragmente ist unzureichend Achten Sie darauf dass Sie mindestens ein CC5 ILS 500 Fragment bestimmen das kleiner ist als der kleinste Proben Peak und mindestens ein CC5 ILS 500 Fragment das gr er ist als der gr te Probenpeak In diesem Fall h tte die Allelleiter den Qualit tscheck nicht bestanden Der Lauf war zu kurz und l ngere Fragmente im ILS wurden
60. e eine Matrix aus und f hren Sie die Analyse erneut durch Es trat ein Konflikt zwischen verschiedenen Sets von Panel und Bin Dateien auf Pr fen Sie ob die Bins richtig installiert sind Wenn nicht l schen Sie alle Panel und Bin Sets und importieren Sie diese erneut Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 63 Es werden keine Allelen erkannt es wird jedoch keine Fehlermeldung angezeigt Fehlermeldung Both the Bin Set used in the Analysis Method and the Panel must belong to the same Chemistry Kit Signifikant erh hte Basislinie W hrend der Analyse der Proben erscheint ein roter Balken und die folgende Fehlermeldung erscheint wenn Daten angezeigt werden Some selected sample s do not contain analysis data Those sample s will not be shown Fehlermeldung nach dem Versuch Panel und Bin Dateien zu importieren Unable to save panel data java SQLEException ORA 00001 unique constraint IFA CKP_NNN violated 7 C GeneMapper ID Analysis Software Fortsetzung Symptome Ursachen und Anmerkungen Die GeneMapper ID Software wurde nicht verwendet oder es wurden Microsatellite Analyseeinstellungen anstelle der HID Analyseeinstellungen verwendet Die GeneMapper Software verwendet nicht die glei
61. e h here EDTA Konzentration enth lt darf das DNA Volumen 20 des Gesamtreaktionsvolumens nicht berschreiten bertrag von K Na Mg2 oder EDTA von der DNA Probe kann die PCR negativ beeinflussen Ein ver nderter pH Wert kann ebenfalls die PCR beeinflussen Lagern Sie die DNA in TE 4 Puffer 10 mM Tris HCl pH 8 0 0 1 mM EDTA oder nuklease freiem Wasser Probleme mit dem Thermocycler der Platte oder den R hrchen Ziehen Sie die Protokolle f r das Thermocycling in Abschnitt 4 B zu Hilfe Andere Reaktionsr hrchen Platten oder Thermocycler wurden von uns nicht getestet Kalibrieren Sie den Heizblock des Thermocyclers falls notwendig Die Primerkonzentration war zu niedrig Verwenden Sie die empfohlene Primerkonzentration Vortexen Sie die PowerPlex ESX 17 10X Primerpaare vor dem Gebrauch 15 Sekunden lang Schlechte Injektion bei der Kapillarelektrophorese CC5 ILS 500 Peaks sind auch betroffen Injizieren Sie die Probe erneut Pr fen Sie ob die Spritze undicht ist Pr fen Sie die Leistung des Lasers Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 56 Schwache oder fehlende Allel Peaks Symptome Ursachen und Anmerkungen Die Proben wurden nicht vollst ndig denaturiert Denaturieren Sie die Proben direkt vor dem Laden f r
62. echende R hrchen mit dem PCR Amplifikationsgemisch 7 Verd nnen Sie f r die positive Amplifikationskontrolle die 9947A DNA auf 1 0 ng im gew nschten Template DNA Volumen Geben Sie 1 0 ng der verd nnten DNA in ein Reaktionsr hrchen mit PCR Amplifikations gemisch Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 8 Tabelle 1 PCR Amplifikationsgemisch f r das PowerPlex ESX 17 System Komponente des PCR Amplifikationsgemisch1 Volumen pro Reaktion Wasser Amplifikationsg te bis zu einem endg ltigen Volumen von 25 0 l PowerPlex ESX 5X Master Mix 5 0 l PowerPlex ESX 17 10X Primer Pair Mix 2 5 l Template DNA 0 5 ng 2 3 bis zu 17 5 l Gesamtreaktionsvolumen 25 l 1 Zuerst Wasser Amplifikationsg te in das R hrchen f llen dann PowerPlex ESX 5X Master Mix und PowerPlex ESX 17 10X Primer Pair Mix hinzuf gen Die Template DNA wird in Schritt 6 hinzugef gt 2 DNA Template in nukleasefreiem Wasser oder TE 4 Puffer lagern 10 mM Tris HCl pH 8 0 0 1 mM EDTA Wenn das DNA Template in TE Puffer gelagert wird der nicht den pH Wert 8 0 hat oder eine h here EDTA Konzentration enth lt darf das hinzugef gte DNA Volumen 20 des endg ltigen Reaktions volumens nicht berschreiten Die Effizienz und Q
63. eim CCS ILS 500 sind die Peak H hen generell niedriger als f r andere Farbstoffe Daher kann der Grenzwert des Orangen Farbstoffs geringer sein als f r andere Farbstoffe 11 W hlen Sie die Registerkarte Peak Quality Sie k nnen die Einstellungen f r die Peak Qualit t ndern Hinweis Weitere Informationen ber Schritt 11 und 12 sind im Benutzer handbuch f r den GeneMapper ID enthalten 12 W hlen Sie die Registerkarte Quality Flags Sie k nnen diese Einstellungen ndern 13 W hlen Sie OK um Ihre Einstellungen zu speichern 8187TA Abbildung 20 Registerkarte Peak Detector im GeneMapper ID Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 42 6 I Erstellen einer Methode zur Spurenanalyse mit GeneMapper ID Software Version 3 2 Fortsetzung Bearbeiten von Daten von Spurenmaterial 1 W hlen Sie File dann New Project 2 W hlen Sie Edit dann Add Samples to Project 3 Navigieren Sie zu den Runfiles W hlen Sie die gew nschten aus w hlen Sie dann Add to list und dann Add 4 Verwenden Sie das Dropdown Men in der Spalte Sample Type um jeder Probe die richtige Bezeichnung zuzuordnen Ladder Sample Positive Control
64. ellungen die im Benutzer Datenblatt empfohlen werden 10 W hlen Sie die Registerkarte Peak Detector Wir empfehlen die in Abbildung 20 gezeigten Einstellungen Hinweise 1 W hlen Sie als Analysebereich Full Range oder Partial Range Wenn Sie die Einstellung Partial Range verwenden m ssen Sie einen auf Ihre Daten abgestimmten Analysebereich w hlen W hlen Sie einen Startpunkt hinter dem Primer Peak und direkt vor dem ersten definierten Peak des internen L ngenstandards um die richtige L ngenzuordnung des internen L ngenstandards zu gew hrleisten Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 40 8123TA Abbildung 19 Registerkarte Allele W hlen Sie die Datei die Sie in Abschnitt 6 F importiert haben Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 41 2 Die Peak Amplitude Thresholds definieren die kleinsten Peak H hen die die Software als Peak benennt Die Werte f r Peak Amplitude Thresholds liegen im Allgemeinen bei 50 150 RFU und m ssen individuell vom Labor ermittelt werden B
65. em System enthaltenen Reagenzien reichen f r 100 Reaktionen von je 25 l aus Lieferumfang Box mit Komponenten f r die Pr Amplifikation blaues Etikett 500 l PowerPlex ESX 5X Master Mix 250 l PowerPlex ESX 17 10X Primer Pair 250 ng 9947A DNA 10 ng l 5 1 250 l Wasser Amplifikationsg te Box mit Komponenten f r die Post Amplifikation beiges Etikett 50 l PowerPlex ESX 17 Allelic Ladder Mix 300 l CC5 Internal Lane Standard 500 Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 3 Vorbereitung der Amplifikation Thermocycling Einrichten der Instrumente und Probenvorbereitung Analyse der Daten Abschnitt 4 B Abschnitt 5 Abschnitt 6 Abschnitt 4 A GeneAmp PCR System 9700 GeneAmp PCR System 2720 Applied Biosystems 3130 oder 3130xl Genetic Analyzer mit Data Collection Software Version 3 0 Abschnitt 5 B GeneMapper ID X Software Version 1 2 GeneScan Software und Windows Betriebssysteme GeneScan Software und Macintosh Betriebssysteme ABI PRISM 3100 oder 3100 Avant Genetic Analyzer mit Data Collection Software Version 2 0 Abschnitt 5 B ABI PRISM 310 Genetic Analyzer Abschnitt 5 C Abbildung 1 bersicht ber das Protokoll f r das PowerPlex ESX
66. en 10 0 l Hi Di Formamid Anzahl der Injektionen Hinweis Das Volumen des internen L ngenstandards im Ladecocktail kann verdoppelt werden um die Intensit t der Standard Peaks anzupassen Belassen Sie das Volumen des Formamids bei 10 0 l und passen Sie das Volumen das in Schritt 3 in die Wells gegeben wird entsprechend an 2 Vortexen Sie 10 15 Sekunden lang 3 Pipettieren Sie 11 l des Gemisches von Formamid und internem L ngenstandard in jedes Well Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 21 5 B Detektion amplifizierter Fragmente mit dem ABI PRISM 3100 oder 3100 Avant Genetic Analyzer mit Data Collection Software Version 2 0 und dem Applied Biosystems 3130 oder 3130xl Genetic Analyzer mit Data Collection Software Version 3 0 Fortsetzung 4 1 l der amplifizierter Probe oder 1 l PowerPlex ESX 17 Allelic Ladder Mix hinzuf gen Decken Sie die Wells mit den geeigneten Septen ab Hinweis Die Detektionsgrenzen verschiedener Instrumente sind unterschiedlich daher m ssen die Injektionszeit Injektionsspannung oder die Menge des Produkts die mit dem zu ladenden Cocktail verwendet werden eventuell angepasst werden Die Injektionszeit und die Spannung k nnen Sie im Run Module des Mo
67. en Sie die Registerkarte Allele Abbildung 21 7 W hlen Sie das zum PowerPlex ESX 17 System geh rende Bin Set das in Abschnitt 6 F importiert wurde 8 Stellen Sie sicher dass das K stchen Use marker specific stutter ratio if available angekreuzt ist 9 Geben Sie die Werte aus Abbildung 21 ein damit beim Einsatz des PowerPlex ESX 17 Systems die Peaks korrekt gefiltert werden Erkl rungen zum richtigen Einsatz und den Auswirkungen dieser Einstellungen finden Sie im Benutzer Datenblatt mit dem Titel Installation Procedures and New Features for GeneMapper ID Software 3 2 10 W hlen Sie die Registerkarte Peak Detector Wir empfehlen die in Abbildung 20 gezeigten Einstellungen Hinweise 1 W hlen Sie als Analysebereich Full Range oder Partial Range Wenn Sie Partial Range verwenden m ssen Sie einen auf Ihre Daten abgestimmten Analysebereich w hlen W hlen Sie einen Startpunkt hinter dem Primer Peak und direkt vor dem ersten definierten Peak des internen L ngenstandards um die richtige L ngenzuordnung des internen L ngenstandards zu gew hrleisten Beim CCS ILS 500 sind die Peak H hen generell niedriger als f r andere Farbstoffe Daher kann der Grenzwert des Orangen Farbstoffs geringer sein als f r andere Farbstoffe 2 Die Peak Amplitude Thresholds definieren die kleinsten Peak H hen die die Software als Peak benennt Die Werte f r Peak Amplitude Threshol
68. en bereits erstelltes QC Protokoll nutzen Geben Sie dem Protokoll einen eing ngigen Namen W hlen Sie den L ngenstandard aus Schritt 3 aus Die Einstellungen sollten auf Ihren internen Validierungsdaten f r das PowerPlex ESX 17 System auf dem Applied Biosystems 3500 oder 3500xL basieren Abbildung 5 zeigt eine m gliche Einstellung Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 15 Abbildung 5 Das Fenster Create New QC Protocol 9228TA 5 A Detektion amplifizierter Fragmente mit dem Applied Biosystems 3500 und 3500xL Genetic Analyzer Fortsetzung 5 Um einen neuen Assay zu erstellen navigieren Sie in die Library W hlen Sie Assays dann Create Alternativ k nnen Sie einen bereits angelegten Assay nutzen Im Create New Assay Fenster Abbildung 6 w hlen Sie das Ger teprotokoll aus Schritt 2 und das QC Protokoll das in Schritt 4 erstellt wurde aus Vergeben Sie einen eing ngigen Namen W hlen als Application Type HID Ein Assay ist notwendig f r alle benannten Proben auf einer Platte Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestel
69. en in einer getrennten Box bereitgestellt und sind getrennt von den Materialien zu lagern die nach der Amplifkation eingesetzt werden PowerPlex ESX 17 Allelic Ladder Mix und CC5 Internal Lane Standard 500 Zur Feststellung einer eventuellen Kontamination der Reagenzien muss immer eine Negativkontrollreaktion d h ohne Zugabe von DNA durchgef hrt werden Wir empfehlen dringlich Handschuhe und gegen Aerosol gesch tzte Pipettenspitzen z B ART tips Abschnitt 9 F zu verwenden Manche der in der Analyse von STR Produkten verwendeten Reagenzien sind potenziell gef hrlich und m ssen entsprechend gehandhabt werden Formamid ist ein Reizmittel und ein Teratogen Vermeiden Sie das Einatmen und Kontakt mit der Haut Lesen Sie vor dem Handhaben dieser Substanz das Warnetikett durch und treffen Sie entsprechende Vorsichtsma nahmen Tragen Sie beim Handhaben von Formamid immer Handschuhe und eine Schutzbrille Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 5 3 B Matrixerstellung oder Spektralkalibrierung Um mit den ABI PRISM 310 3100 und 3100 Avant Genetic Analyzers und Applied Biosystems 3130 3130xl 3500 und 3500xL Genetic Analyzers mehrfarbige Systeme auswerten zu k nnen ist das korrekte Erstellen einer Matrixdatei erforderlich F r
70. en nicht alle f nf Farbstoffe importiert Stellen Sie f r die Genotyper Software Versionen 2 5 und 3 6 oder h her Preferences im Men Edit so ein dass Fluorescein JOE TMR ET CXR ET und CC5 Daten importiert werden Es wurden nicht alle f nf Farbstoffe importiert Stellen Sie f r die Genotyper Software Versionen 2 5 und 3 6 oder h her Preferences im Men Edit so ein dass Fluorescein JOE TMR ET CXR ET und CC5 Daten importiert werden Das Laufverhalten der Proben hat sich w hrend eines CE Laufs mit vielen Proben leicht ge ndert Dies kann auf Temperatur nderungen oder Ver nderungen der Kapillare im Lauf der Zeit zur ckzuf hren sein Verwenden Sie eine andere Allelleiter Injektion Verwenden Sie nie die erste Injektion eines Laufes f r die Auftrennung der Allelleiter Die Basenpaarl nge von Allelen war inkorrekt weil dem internen L ngenstandard falsche Fragmentl ngen zugeordnet wurden Best tigen Sie dass die Fragmentl ngen des internen L ngenstandards richtig zugeordnet werden Analysieren Sie die Probe erneut mit der GeneScan Software und definieren Sie die internen L ngenstandardfragmente erneut Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 65 Die Tabelle Plots Window oder
71. er Banden sind ein h ufiges Amplifikations Artefakt im Zusammenhang mit STR Analysen 14 15 Stutter Produkte sind meist um eine Repeat Einheit k rzer als das tats chliche Allel Gelegentlich sind sie aber auch zwei Repeat Einheiten k rzer oder eine Repeat Einheit l nger als das tats chliche Allel Oft zeigen Allele mit vielen Repeat Einheiten einen h heren Stutter Anteil Das Muster und die Intensit t von Stuttern kann f r die gleichen Loci bei unter schiedlichen Primer Sets leicht unterschiedlich sein Erh hter Stutter steht oft mit D22S1045 in Zusammenhang da es sich um einen Trinukleotid Repeatmarker handelt In den PowerPlex ESX Panel Dateien zu Locus spezifischem Filtern in der GeneMapper ID Software Version 3 2 GeneMapper ID X Software und dem PowerTyper ESX 17 Macro f r die Genotyper Software wird der jeweils h chste beobachtete Stutter jedes Locus verwendet Zus tzlich zu den Stutter Peaks k nnen mit den PowerPlex ESX 17 System Loci die folgenden schwachen Artefakt Peaks beobachtet werden Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 55 Loci Instrument Artefaktgr en1 D21S11 D2S441 D1S1656 und SE33 ABI PRISM 310 und Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer n 2 n 22 Amelogenin ABI PRISM
72. erliegt U S Patenten Nr 5 364 759 dem australischen Patent Nr 670231 und andere beantragte Patente die dem Baylor College of Medicine Houston Texas zugewiesen wurden d Lizenziert unter U S Patent Nr 5 338 671 und 5 587 287 und entsprechenden Patenten in anderen L ndern Nur f r den Laborgebrauch Nicht f r den diagnostische Einsatz e Allelsequenzen f r eines oder mehrere der Loci vWA FGA D8S1179 D21S11 und D18S51 in Allelleitergemischen unterliegen U S Patenten Nr 7 087 380 dem australischen Patent Nr 2003200444 und entsprechenden Patentantr gen au erhalb der USA f Die Filter TMR ET CXR ET und CC5 sind propriet r h Dieses Produkt oder Teile davon wird unter der Lizenz der GE Healthcare unter den folgenden Patenten hergestellt und vertrieben sterreichisches Patent Nr E236994 australisches Patent Nr 692230 belgisches Patent Nr 0743987 Schweizer Patent Nr 0743987 und 0851867 deutsches Patent Nr 19581489 69530286 8 und 0851867 EP Patent Nr 0743987 und 0851867 spanisches Patent Nr 2197193 und 2173310 franz sisches Patent Nr 0743987 und 0851867 britisches Patent Nr 0743987 und 0851867 italienisches Patent Nr 0743987 und 0851867 Liechtenstein Patent Nr 0743987 und 0851867 niederl ndisches Patent Nr 0743987 und 0851867 schwedisches Patent Nr 0743987 und 0851867 U S Patent Nr 5 654 419 5 688 648 5 869 255 6 177 247 5 707 804 6 028 190 6 544 744 7 015 000 und 5 728 528 kanadisches P
73. erschiedenen Zeitpunkten des Laufs injizierte Allelleitern empfehlenswert um die akkurate Genotypisierung aller Proben zu gew hrleisten Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 25 5 C Detektion amplifizierter Fragmente mit dem ABI PRISM 310 Genetic Analyzer Fortsetzung 5 W hlen Sie die entsprechende Matrix aus 6 W hlen Sie zur automatischen Datenanalyse das Kontrollk stchen Auto Analyze und die geeigneten Analysenparameter und L ngenstandards aus Genaue Informationen ber diese Optionen finden Sie im Benutzer handbuch f r den ABI PRISM 310 Genetic Analyzer 7 Stellen Sie die Proben in das Ger t und schlie en Sie die T ren Danach klicken Sie auf Run um den Lauf zu starten 8 berwachen Sie die Elektrophorese indem Sie die Rohdaten und die Status Fenster beobachten Jede Probe ben tigt ca 35 Minuten f r den Austausch des Polymers die Injektion der Proben und die Elektrophorese der Probe 6 Analysieren der Daten 6 A PowerPlex ESX Panel Bin und Stutter Sets mit GeneMapper ID X Software Version 1 2 Zur leichteren Analyse der mit dem PowerPlex ESX 17 System generierten Daten gibt es Panel und Bin Dateien die die automatische Zuweisung von Genotypen mit der GeneMapper ID Soft
74. es N J and Reynolds R 1996 Sequence analysis and characterization of stutter products at the tetranucleotide repeat locus vWA Nucleic Acids Res 24 2807 12 19 Griffiths R et al 1998 New reference allelic ladders to improve allelic designation in a multiplex STR system Int J Legal Med 111 267 72 20 Butler J M 2006 Genetics and genomics of core STR loci used in human identity testing J Forensic Sci 51 253 65 21 Hill C R et al 2008 Characterization of 26 miniSTR loci for improved analysis of degraded DNA samples J Forensic Sci 53 73 80 22 B r W et al 1997 DNA recommendations Further report of the DNA Commission of the ISFH regarding the use of short tandem repeat systems Int J Legal Med 110 175 6 Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 66 23 Gill P et al 1997 Considerations from the European DNA Profiling Group EDNAP concerning STR nomenclature Forensic Sci Int 87 185 92 24 Fr geau C J et al 1995 Characterization of human lymphoid cell lines GM9947 and GM9948 as intra and interlaboratory reference standards for DNA typing Genomics 28 184 97 25 Mandrekar P V Krenke B E and Tereba A 2001 DNA IQ The intelligent way to purify DNA Profiles in
75. estehendenden File Name Convention aus Klicken Sie auf den Add to Plate Button und schlie en Sie das Fenster 14 Unter Result Groups w hlen Sie mit der Add from Library Option die Result Group aus den Sie im Schritt 7 erstellt haben oder w hlen eine bereits bestehende Results Group aus Klicken Sie auf den Add to Plate Button und schlie en Sie das Fenster 15 Markieren Sie die Proben Wells und w hlen dann die zugeh rigen Assays File Name Conventions und Result Groups aus 16 W hlen Sie Link Plate for Run 17 Das Load Plate Fenster erscheint W hlen Sie Yes 18 Vergeben Sie im Run Information Window einen Namen f r den Lauf W hlen Sie Start Run nicht gezeigt Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 20 Abbildung 11 Vergabe des Laufnamens 9256TA 5 B Detektion amplifizierter Fragmente mit dem ABI PRISM 3100 oder 3100 Avant Genetic Analyzer mit Data Collection Software Version 2 0 und dem Applied Biosystems 3130 oder 3130xl Genetic Analyzer mit Data Collection Software Version 3 0 Vom Anwender bereitzustellende Materialien 95 C trockener Heizblock Wasserbad oder Thermocycler zersto enes Eis oder Eiswasserbad Zentrifuge komp
76. et Tip 1 000 l 800 DY1131 Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 74 Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 75 a U S Patent Nr 6 242 235 das australische Patent Nr 761757 das kanadische Patent Nr 2 335 153 das chinesische Patent Nr ZL99808861 7 das Hong Kong Patent Nr HK 1040262 das japanische Patent Nr 3673175 das europ ische Patent Nr 1088060 und andere Patente wurden eingereicht b U S Patent Nr 5 843 660 6 479 235 6 221 598 und 7 008 771 das australische Patent Nr 724531 das kanadische Patent Nr 2 118 048 das europ ische Patent Nr 0960207 das chinesische Patent Nr ZL99813729 4 und ZL9719 das koreanische Patent Nr 290332 das Singapur Patent Nr 57050 das japanische Patent Nr 3602142 und 4034293 und andere Patente wurden eingereicht c STR Loci unterliegen U S Patenten Nr RE 37 984 des deutschen Patents Nr DE 38 34 636 C2 und anderer Patente die der Max Planck Gesellschaft zur F rderung der Wissenschaften e V Deutschland erteilt wurden Die Entwicklung und Verwendung von STR Loci unt
77. ewahren Sie alle Komponenten bei 20 C in einem nicht entfrostenden Gefrierschrank auf Die 9947A DNA und Wasser Amplifikationsg te k nnen langfristig bei 4 C gelagert werden Der PowerPlex ESX 17 10X Primer Pair Mix der PowerPlex ESX 17 Allelic Ladder Mix und der CC5 Internal Lane Standard 500 CC5 ILS 500 sind lichtempfindlich und m ssen lichtgesch tzt gelagert werden Wir empfehlen dringend die Reagenzien f r die Pr Amplifikation und die Reagenzien f r die Post Amplifikation separat zu lagern und getrennt mit verschiedenen Pipetten R hrchenhalter usw zu verwenden F r den t glichen Gebrauch k nnen der PowerPlex ESX 17 10X Primer Pair Mix und der PowerPlex ESX 5X Master Mix ohne Aktivit tsverlust bis zu einem Monat bei 4 C aufbewahrt werden Separat erh ltlich Die korrekten Panel und Bin Dateien f r die GeneMapper ID und ID X Software k nnen hier heruntergeladen werden www promega com geneticidtools panels_bins Die PowerTyper ESX Macros k nnen hier heruntergeladen werden www promega com geneticidtools powertyper F r die Erstellung der Farbseperationsmatrix sind Matrix Standards erforderlich Die Matrix Standards sind separat und sowohl f r ABI PRISM 310 Genetic Analyzer PowerPlex 5 Dye Matrix Standards 310 Bestellnummer DG4600 und ABI PRISM 3100 und 3100 Avant Genetic Analyzers sowie Applied Biosystems 3130 3130xl 3500 und 3500xL Genetic Analyzers PowerPlex 5 Dye Matrix Standar
78. ferex DNA IQ PowerTyper und Slicprep sind Warenzeichen der Promega Corporation ABI PRISM GeneMapper GeneScan Genotyper und MicroAmp sind eingetragene Warenzeichen der Applera Corporation ART ist ein eingetragenes Warenzeichen von Molecular Bio Products Inc Biomek ist ein eingetragenes Warenzeichen der Beckman Coulter Inc Freedom EVO ist ein eingetragenes Warenzeichen der Tecan AG Corporation FTA ist ein eingetragenes Warenzeichen von Flinders Technologies Pty Ltd und ist an Whatman lizenziert GeneAmp ist ein eingetragenes Warenzeichen von Roche Molecular Systems Inc Hi Di and POP 4 sind eingetragene Warenzeichen der Applera Corporation Macintosh ist ein eingetragenes Warenzeichen der Apple Computer Inc Microsoft Windows und Windows NT sind eingetragene Warenzeichen der Microsoft Corporation Produkte k nnen unter beantragte oder bereits erteilte Patente fallen oder bestimmten Auflagen unterliegen N here Informationen entnehmen Sie bitte unserer Website Alle Preise und Spezifikationen k nnen ohne vorherige Ank ndigung ge ndert werden nderung von Produktanspr chen vorbehalten Bitte wenden Sie sich an den Technischen Kundendienst von Promega oder greifen Sie auf den Promega Onlinekatalog zu um die neuesten Informationen ber Promega Produkte zu erhalten Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 USA Phone 608 274 4330
79. g k nnen im Module Manager eingestellt werden Der empfohlene Bereich f r die Injektionszeit ist 3 22 Sekunden und f r die Injektionsspannung 1 3 kV 2 W hlen Sie im Protocol Manager New Geben Sie einen Namen f r das Protokoll ein W hlen Sie Regular von der Dropdown Liste Type und w hlen Sie das Run Module das Sie im vorhergehenden Schritt in der Dropdown Liste Run Module erstellt haben W hlen Sie zum Schluss G5 von der Dropdown Liste Dye Set W hlen Sie OK Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 22 3 Erstellen Sie im Plate Manager einen neuen Plate Record wie im Benutzerhandbuch f r das Instrument beschrieben Es wird ein Dialogfeld angezeigt W hlen Sie GeneMapper Generic von der Dropdown Liste Application und dann den zutreffenden Plattentyp 96 well Nehmen Sie Eingaben in den Fenstern Owner und Operator vor und w hlen Sie OK Hinweis Wenn eine Autoanalyse der Probendaten erw nscht ist entnehmen Sie die Anleitungen dazu bitte dem Benutzerhandbuch des Instruments 4 Geben Sie in den Plate Record der GeneMapper Software die Namen der Proben in die entsprechenden Zellen ein Scrollen Sie nach rechts W hlen Sie in der Spalte Result
80. gezeigt Die Option PowerTable erm glicht die Auflistung von bis zu vier Allelen pro Probe Es werden auch zus tzliche Informationen wie Low Peak Signal oder High Peak Signal angezeigt Die Tabellentypen Allele Table und CODIS Table umfassen nur zwei Allele pro Locus Wenn mehr als zwei Allele an einem Locus vorhanden sind werden die kleinsten festgestellten Allele ber cksichtigt Das Format Allele Table zeigt die Kategorien Loci in Spalten an w hrend die Kategorien im Format CODIS Table in Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 50 Zeilen angezeigt werden Diese Tabellen k nnen nach Bedarf angepasst werden Um Daten in Tabellen zu speichern gehen Sie zum Dropdown Men Table markieren Sie Export to File und speichern Sie die Datei am gew nschten Ort mit dem gew nschten Namen Die gespeicherte Datei kann in Microsoft Excel angezeigt und analysiert werden 12 Speichern Sie die analysierten Daten Gehen Sie zum Men File und w hlen Sie Save as Das PowerTyper ESX 17 Macro ist eine Genotyper Datei und kann berschrieben werden wenn Sie Save anstelle von Save as verwenden Format PowerTable Format Allel Tabelle Format CODIS Tabelle
81. h Ende der Analyse erscheint der Analysis Summary Bildschirm Wir empfehlen dass Sie alle gelben und roten Markierungen in den Kopfzeilen in der Plot Ansicht pr fen und mit Ihnen nach Standardlaborprozeduren umgehen Navigieren Sie zur Genotyp oder Sample Reiterkarte Um die berpr fung von Proben mit geringer Qualit t zu erleichtern benutzen Sie den Standard Data Interpretation Plot und pr fen Sie die Quality Value Details Tabelle In den Analysis Method Peak Quality und den SQ amp GQ Settings Reitern sind Standardwerte angegeben Diese wirken sich auf die Qualit tswerte in den Plot Einstellungen aus Wir empfehlen die Werte an die Datenanalyseprotokolle anzupassen 6 E Erstellen einer Methode zur Datenbank oder Vaterschaftsanalyse mit GeneMapper ID X Software Version 1 2 Diese Anleitung ist als erste Starthilfe zum Analysieren von Daten mit der GeneMapper ID X Software gedacht Sie kann jedoch keine Schulung f r den Gebrauch der GeneMapper ID X Software ersetzen Wir empfehlen Benutzern sich bez glich Schulungen zum ausf hrlichen Gebrauch dieser Systemsoftware an Applied Biosystems zu wenden 1 W hlen Sie Tools und dann GeneMapper ID X Manager 2 W hlen Sie die Registerkarte Analysis Methods 3 W hlen Sie New Ein neues Dialogfeld Analysis Method wird ge ffnet 4 W hlen Sie im Analysis Method Editor Fenster GeneMapper ID X Security
82. hl der Reaktionen um das endg ltige Master Mix Volumen l zu bestimmen 9 E Zusammensetzung der Puffer und L sungen Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 72 Tabelle 5 PCR Amplifikationsgemisch f r das PowerPlex ESX 17 System Komponente des PCR Amplifikationsgemisches Volumen pro Reaktion x Anzahl der Reaktionen Endvolumen l Wasser Amplifikationsg te1 l x PowerPlex ESX 5X Master Mix 5 0 l x PowerPlex ESX 17 10X Primer Pair Mix 2 5 l x Pro R hrchen Template DNA Volumen1 0 25 0 5 ng bis zu 17 5 l x Gesamt Reaktionsvolumen 25 l x 1 Das Master Mix Volumen and Template DNA Volumen m ssen insgesamt 25 l ergeben Ber cksichtigen Sie das Volumen der Template DNA und f gen Sie Wasser in Amplifikationsg te hinzu bis das endg ltige Reaktionsvolumen von 25 l erreicht ist TE 4 Puffer 10 mM Tris HCl 0 1 mM EDTA pH 8 0 1 21 g Tris base 0 037 g EDTA Na2EDTA 2H2O Tris Base und EDTA in 900 ml entionisiertem Wasser l sen Stellen Sie mittels HCl den pH Wert auf 8 0 ein Bringen Sie das Gesamtvolumen mit entionisiertem Wasser auf 1 Liter 9 F Verwandte Produkte STR Fluoreszenz Systeme Bestell Produkt Gr e nummer
83. is Methods und ffnen Sie die gew nschte Analysenmethode W hlen Sie die Registerkarte Allele und dann das entsprechende Bin Set In der Analysemethoden Registerkarte Allele wurde das falsche Bin Set gew hlt Achten Sie darauf dass das richtige Bin Set gew hlt wird siehe Abbildung 19 Schlechte Spektralkalibrierung f r die ABI PRISM 3100 und 3100 Avant Genetic Analyzers und Applied Biosystems 3130 3130xl 3500 und 3500xL Genetic Analyzers Nehmen Sie eine neue Spektralkalibrierung vor und trennen Sie die Proben erneut auf Schlechte Matrix f r den ABI PRISM 310 Genetic Analyzer Erstellen Sie eine neue Matrix Stellen Sie sicher dass die verwendete Matrix auf dem selben Ger t erstellt wurde Analysemethode im Classic Modus verwendet Das Anwenden des Modus Classic kann zu Basislinien mit h herem Rauschen f hren verglichen mit Analysen die im Modus Basic or Advanced durchgef hrt werden Empfohlen werden Analysenmethoden und L ngenstandards mit Verwendung des Advanced Modus Das falsche G5 Spectral war aktiviert Trennen Sie die Probe erneut auf und best tigen Sie dass der PowerPlex 5 Dye G5 Spectral auf G5 eingestellt ist Siehe Anweisungen zur Vorbereitung des Instruments in Abschnitt 5 Wenn beim Lauf mit dem ABI PRISM 310 Genetic Analyzer auf keine der Proben eine Matrix angewendet wurde werden keine Daten angezeigt W hlen Sie f r die Analyse der GeneMapper ID Softwar
84. jeder Probe die richtige Bezeichnung zuzuordnen Ladder Sample Positive Control oder Negative Control Zur fehlerfreien Genotypisierung muss jeder Ordner des Projekts mindestens eine Injektion der Allelleiter enthalten die in der Spalte Sample Type als Ladder bezeichnet ist 5 W hlen Sie in der Spalte Analysis Method die oben erstellte Analysemethode 6 W hlen Sie in der Spalte Panel das Panel Set das in Abschnitt 6 F importiert wurde 7 W hlen Sie in der Spalte Size Standard den L ngenstandard der in Abschnitt 6 G erstellt oder in Abschnitt 6 H importiert wurde 8 Wenn Daten von einem ABI PRISM 310 Genetic Analyzer analysiert werden achten Sie darauf dass in der Spalte Matrix die richtige Matrixdatei ausgew hlt ist 9 W hlen Sie Analyze gr ne Pfeilschaltfl che um die Datenanalyse zu beginnen 6 K Probenanalyse mit der GeneScan Software und Windows Betriebsystemen 1 Analysieren von Daten mit der GeneScan Analysis Software 2 Pr fen Sie die Rohdaten f r einen oder mehrere Probenl ufe Markieren Sie den Namen der Probe und w hlen Sie dann Raw Data im Men Sample Ziehen Sie den Cursor so dass sich das Fadenkreuz auf der Basislinie rechts des gro en Primer Peaks befindet vor dem ersten Peak des internen L ngenstandards orange Verwenden Sie den X Wert der unten links im Fenster angezeigt wird als Startposition
85. jedes einzelne Instrument muss eine Matrix erstellt werden F r die Matrixerstellung auf dem ABI PRISM 310 Genetic Analyzer werden die PowerPlex 5 Dye Matrix Standards 310 Bestellnummer DG4600 ben tigt Die PowerPlex 5 Dye Matrix Standards 3100 3130 Bestellnummer DG4700 k nnen nicht dazu verwendet werden eine Matrix auf dem ABI PRISM 310 Genetic Analyzer zu erstellen F r die Spektralkalibrierung auf den ABI PRISM 3100 und 3100 Avant Genetic Analyzers und Applied Biosystems 3130 3130xl 3500 und 3500xL Genetic Analyzers werden die PowerPlex 5 Dye Matrix Standards 3100 3130 ben tigt Die PowerPlex 5 Dye Matrix Standards 310 k nnen nicht dazu verwendet werden eine Matrix auf diesen Instrumenten zu erstellen Protokolle und zus tzliche Informationen ber die Matrixerstellung k nnen Sie dem technischen Datenblatt PowerPlex 5 Dye Matrix Standards 310 Bestellnummer TBD023 entnehmen Protokolle und zus tzliche Informationen ber die Matrixerstellung k nnen Sie dem technischen Datenblatt PowerPlex 5 Dye Matrix Standards 3100 3130 Bestellnummer TBD024 entnehmen Diese Handb cher sind auf Anfrage bei Promega oder im Internet unter www promega com tbs verf gbar 4 Protokolle f r die DNA Amplifikation mit dem PowerPlex ESX 17 System Vom Anwender bereitzustellende Materialien GeneAmp PCR System 9700 oder 2720 Thermocycler Applied Biosystems Mikrozentrifuge 0 2 ml MicroAmp Reaktionsr
86. llen Sie die R hrchen oder MicroAmp Platte in den Thermocycler 2 W hlen Sie das empfohlene Protokoll aus und starten Sie es Das bevorzugte Protokoll f r die GeneAmp PCR System 9700 und 2720 Thermocycler ist unten aufgef hrt 3 Bewahren Sie nach Beendigung des Thermocycling Protokolls die Proben bei 20 C in einem lichtgesch tzten Beh lter auf Hinweis Wenn amplifizierte Proben langfristig bei 4 C oder dar ber gelagert werden k nnen Zerfallsprodukte entstehen Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 9 Protokoll zum Thermocycling1 96 C f r 2 Minuten dann 94 C f r 30 Sekunden 59 C f r 2 Minuten 72 C f r 90 Sekunden f r 30 Zyklen dann 60 C f r 45 Minuten bei 4 C einweichen 1 Wenn der GeneAmp PCR System 9700 Thermocycler verwendet wird muss das Programm mit 9600 als Ramp Speed betrieben werden Die Ramp Speed wird eingestellt nachdem der Lauf des Thermocyclers begonnen hat Der Bildschirm Select Method Options wird angezeigt W hlen Sie 9600 als Ramp Speed und geben Sie das Reaktionsvolumen ein 5 Instrumenten Setup und Probenvorbereitung 5 A Detektion amplifizierter Fragmente mit dem Applied Biosystems 3500 und 3500xL Genetic Analyzer Vom Anwender bereitzu
87. lnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 16 Abbildung 6 Das Fenster Create New Assay 9229TA 6 Um eine neue File Name Convention anzulegen Abbildung 7 navigieren Sie in die Library W hlen Sie File Name Convention und dann Create Alternativ k nnen Sie eine bereits bestehende File Name Convention nutzen W hlen Sie die File Name Convention nach Ihren Laborgepflogenheiten und speichern Sie diese unter einem eing ngigen Namen Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 17 Abbildung 7 Das Fenster New File Name Convention 9252TA 5 A Detektion amplifizierter Fragmente mit dem Applied Biosystems 3500 und 3500xL Genetic Analyzer Fortsetzung 7 Um eine neue Result Group anzulegen Abbildung 8 navigieren Sie in die Library W hlen Sie Result Group und dann Create Alternativ k nnen Sie eine bereits bestehende Result Group nutzen W hlen Sie die Result Group nach Ihren Laborgepflogenheiten aus und speichern Sie diese unter einem eing ngigen Namen 8 Um eine neue Platte anzulegen navigieren Sie in die Library und w hlen Sie Plates aus dem Manage Men W hlen Sie dann Create Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim
88. meinen bei 50 150 RFU und m ssen individuell vom Labor ermittelt werden f r die ABI PRISM Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 30 8258TA Abbildung 13 Registerkarte GeneMapper ID X Allele W hlen Sie die Bin Datei die in Abschnitt 6 A importiert wurde 310 3100 und 3100 Avant Genetic Analyzers und Applied Biosystems 3130 und 3130xl Genetic Analyzers F r die Applied Biosystems 3500 und 3500xL Genetic Analyzers empfiehlt Life Technologies einen Threshold von 175 RFU bei Standard Injektionsbedingungen Jedoch sollten die Werte individuell durch interne Validierungen bestimmt werden Beim CCS ILS 500 sind die Peak H hen generell niedriger als f r andere Farbstoffe Daher kann der Grenzwert des Orangen Farbstoffs geringer sein als f r andere Farbstoffe 3 Der Haken im Normalisierungsk stchen kann gesetzt werden unabh ngig davon ob die Daten w hrend der Datensammlung normalisiert wurden 11 W hlen Sie die Registerkarte Peak Quality Sie k nnen die Einstellungen f r die Peak Qualit t ndern Hinweis Weitere Informationen ber Schritt 11 und 12 sind im Benutzerhandbuch f r den GeneMapper ID X enthalten 12 W hlen Sie die Registerkarte SQ amp GC Settings Sie k nnen diese Einstellu
89. n Teilbereich war nicht korrekt ndern Sie den Startdatenpunkt in der Analysemethode Alternativ dazu k nnen Sie den vollen Bereich f r die Analyse verwenden Zus tzliche Peaks im L ngenstandard ffnen Sie den Size Match Editor Markieren Sie den zus tzlichen Peak w hlen Sie Edit und w hlen Sie delete size label W hlen Sie auto adjust sizes Der Lauf war zu kurz und l ngere Fragmente im ILS wurden nicht erfasst Nicht alle im L ngenstandard definierte CC5 ILS 500 Peaks wurden w hrend des Laufs festgestellt Erstellen Sie einen neuen L ngenstandard mit den internen L ngenstandardfragmente die in der Probe vorhanden sind Lassen Sie die Proben mit einer l ngeren Laufzeit erneut laufen Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 60 Allele werden nicht erkannt Der L ngenstandard wird nicht richtig erkannt Off Ladder Allele Symptome Ursachen und Anmerkungen Wenn Peaks unter der eingestellten Peak Amplitude Threshold liegen setzen Sie den Grenzwert in der Analysemethode f r den orangen Kanal herunter um die Peaks einzuschlie en Wenn Peaks von schlechter Qualit t sind definieren Sie den L ngenstandard f r die Probe neu um diese Peaks zu berspringen Die Spektren der ABI
90. n definierten Peak des internen L ngenstandards um die richtige L ngenzuordnung des internen L ngenstandards zu gew hrleisten 2 Die Peak Amplitude Thresholds definieren die kleinsten Peak H hen die die Software als Peak benennt Die Grenzwerte der Peak Amplitude Thresholds liegen gew hnlich bei 50 150 RFU f r den ABI PRISM 310 3100 und 3100 Avant Genetic Analyzers und Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 34 8260TA Abbildung 16 Registerkarte GeneMapper ID X Allele W hlen Sie das Bin Set das Sie in Abschnitt 6 A importiert haben Applied Biosystems 3130 und 3130xl Genetic Analyzers F r den Applied Biosystems 3500 und 3500xl Genetic Analyzers empfiehlt Life Technologies einen Analysebereich von 175 RFU bei den Injektionskonditionnen Standardeinstellungen Dennoch sollten die Werte durch interne Validierungen bestimmen Beim CCS ILS 500 sind die Peak H hen generell niedriger als f r andere Farbstoffe Daher kann der Grenzwert des Orangen Farbstoffs geringer sein als f r andere Farbstoffe 3 Der Haken im Normalisierungsk stchen kann gesetzt werden unabh ngig davon ob die Daten w hrend der Datensammlung normalisiert wurden 10 W hlen Sie die Registerkarte Peak Quality Sie k nne
91. n Sie f r jedes Amplifikations Set eine frische DNA Verd nnung her Bewahren Sie diese verd nnte DNA nicht auf Die Zelllinien DNA 9947A zeigt allelische Imbalance und Imbalance zwischen STR Loci an F r Sensitivit tstests darf keine Zelllinien DNA verwendet werden DNA die f r Sensitivit tsstudien verwendet wird ist vor dem Gebrauch bei 4 C ber Nacht zu lagern Bewahren Sie keine verd nnte DNA z B 0 25 ng l oder darunter auf F r jeden neuen Amplifikationsansatz muss eine frische DNA Verd nnung hergestellt werden Damit die Amplifikation erfolgreich ist muss mit u erster Sorgfalt gearbeitet werden Richtlinien zur Probleml sung bei der Amplifikation sind in Abschnitt 7 A enthalten 1 Tauen Sie den PowerPlex ESX 5X Master Mix PowerPlex ESX 17 10X Primer Pair Mix die 9947A DNA und Wasser Amplifikationsg te vollst ndig auf Hinweis Zentrifugieren Sie die R hrchen kurz damit sich der Inhalt am Boden sammelt Vortexen Sie dann die Reagenzien vor jedem Gebrauch 15 Sekunden lang Der 10X Primer Pair Mix darf nach dem Vortexen kein weiteres Mal zentrifugiert werden da dies dazu f hren kann dass sich die Primer am Boden des R hrchens konzentrieren 2 Bestimmen Sie die Anzahl der Reaktionen die angesetzt werden sollen Dabei m ssen sowohl die Positiv als auch die Negativkontrollen ber cksichtigt werden Zu dieser Anzahl werden 1 oder 2 Reaktionen hinzugef gt um Pipettierfehler zu kompensieren Diese
92. n den Technischen Kundendienst von Promega wenn Sie Fragen bez glich der Verwendung dieses Systems haben E Mail genetic promega com Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 2 N Kontrollen 51 O Ergebnisse 52 7 Fehlerbehebung 56 A Amplifikation und Fragmentdetektion 56 B Gene Mapper ID X Analyse Software 59 C GeneMapper ID Analyse Software 61 D PowerTyper ESX 17 Macro 64 8 Literaturangaben 66 9 Anhang
93. n die Einstellungen f r die Peak Qualit t ndern Hinweis Weitere Informationen ber Schritt 11 und 12 sind im Benutzerhandbuch f r den GeneMapper ID X enthalten 11 W hlen Sie die Registerkarte SQ amp GQ Settings Sie k nnen diese Einstellungen ndern 12 W hlen Sie Save um Ihre Einstellungen zu speichern 13 W hlen Sie Done um den GeneMapper ID X Manager zu beenden Bearbeiten von Daten von Proben zur Datenbank oder Vaterschaftsanalyse 1 W hlen Sie File und dann New Project 2 W hlen Sie Edit und dann Add Samples to Project 3 Gehen Sie zum Speicherort der Dateien f r den Lauf Markieren Sie die gew nschten Dateien und w hlen Sie Add to list und dann Add 4 Verwenden Sie das Dropdown Men in der Spalte Sample Type um jeder Probe die richtige Bezeichnung zuzuordnen Allelic Ladder Sample Positive Control oder Negative Control Zur fehlerfreien Genotypisierung muss jeder Ordner des Projekts mindestens eine Injektion der Allelleiter enthalten die in der Spalte Sample Type als Allelic Ladder bezeichnet ist W hlen Sie in der Spalte Analysis Method die oben erstellte Analysemethode 5 W hlen Sie in der Spalte Panel das Panel das Sie in Abschnitt 6 A importiert haben 6 W hlen Sie in der Spalte Size Standard den L ngenstandard der in Abschnitt 6 B erstellt oder in Absch
94. nd und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 38 8199TA Abbildung 18 Der L ngenstandard Editor 5725TA Abbildung 17 Das Fenster Select Dye and Analysis Method 7 Geben Sie die Fragmentl ngen des internen L ngenstandards ein 60 65 80 100 120 140 160 180 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 und 500 Basen 8 W hlen Sie OK 6 H Importieren des CC5 ILS 500 Size Standard in die GeneMapper ID Software Version 3 2 Die Datei CC5_ILS_500 xml kann hier heruntergeladen werden www promega com geneticidtools panels_bins Speichern Sie die Datei CC5_ILS_500 xml in einem Ordner auf Ihrem Computer ab 1 W hlen Sie Tools und dann GeneMapper Manager 2 W hlen Sie die Registerkarte Size Standard 3 W hlen Sie Import 4 Gehen Sie zum Speicherort der Datei CC5_ILS_500 xml 5 Markieren Sie die Datei und w hlen Sie Import 6 W hlen Sie Done um die nderungen zu speichern und schlie en Sie den GeneMapper Manager 6 I Erstellen einer Methode zur Spurenanalyse mit GeneMapper ID Software Version 3 2 Die folgenden Anweisungen entsprechen gr tenteils dem Tutorial f r die Applied Biosystems GeneMapper ID Software Seiten 5 11 1 W hlen Sie Tools und dann GeneMapper Manager 2 W hlen Sie die
95. nen neuen L ngenstandard W hlen Sie einen Probenlauf aus und markieren Sie den Pfeil neben dem L ngenstandard W hlen Sie define new Beschriften Sie die L ngenstandard Peaks mit 60 65 80 100 120 140 160 180 200 225 250 275 300 325 375 400 425 450 475 und 500 Basen Speichern Sie den L ngenstandard im Ordner Size Standards unter C AppliedBio Shared Analysis Sizecaller SizeStandards 7 Wenden Sie den definierten Size Standard auf die Proben an und analysieren Sie dann die Proben In Abschnitt 6 M sind zus tzliche Informationen ber den Gebrauch des PowerTyper ESX 17 Macros und der Genotyper Software zu finden Hinweise 1 Peak H hen au erhalb des linearen Bereichs des Instruments k nnen Artefakt Peaks aufgrund von Instrumentens ttigung d h berladen der Probe sein Es kann zur berstrahlung Pull Ups von einer Farbe durch eine andere kommen Ges ttigte Signale k nnen auch als Doppel Peak Split Peak auftreten 2 Wenn sich die Peak H hen nicht im linearen Detektionsbereich des Instruments befinden nimmt das Verh ltnis von Stutter Peaks zu tats chlichen Allel Peaks zu und die Interpretation von Profilen wird schwierig Auch die Peak H hen k nnen uneinheitlicher erscheinen 3 Verschiedenen Instrumente k nnen f r die gleiche Probe unterschiedliche relative Fluoreszenzeinheiten messen Au erdem unterscheiden sich unterschiedliche Instrumente in der relativen Effizien
96. ngen ndern 13 W hlen Sie Save um die neue Analysemethode zu speichern 14 W hlen Sie Done um den GeneMapper ID X Manager zu beenden Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 31 8259TA Abbildung 14 Registerkarte GeneMapper ID X Peak Detector 6 D Erstellen einer Methode zur Spurenanalyse mit GeneMapper ID X Software Version 1 2 Fortsetzung Bearbeiten von Daten von Spurenmaterial 1 W hlen Sie File und dann New Project 2 W hlen Sie Edit und dann Add Samples to Project 3 Gehen Sie zum Speicherort der Dateien f r den Lauf Markieren Sie die gew nschten Dateien und w hlen Sie Add to list und dann Add 4 Verwenden Sie das Dropdown Men in der Spalte Sample Type um jeder Probe die richtige Bezeichnung zuzuordnen Allelic Ladder Sample Positive Control oder Negative Control Zur fehlerfreien Genotypisierung muss jeder Ordner des Projekts mindestens eine Injektion der Allelleiter enthalten die in der Spalte Sample Type als Allelic Ladder bezeichnet ist 5 W hlen Sie in der Spalte Analysis Method die oben erstellte Analysemethode 6 W hlen Sie in der Spalte Panel die Panel Datei di
97. nitt 6 C importiert wurde 7 Wenn Daten von einem ABI PRISM 310 Genetic Analyzer analysiert werden achten Sie darauf dass in der Spalte Matrix die richtige Matrixdatei ausgew hlt ist Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 35 6 E Erstellen einer Methode zur Datenbank oder Vaterschaftsanalyse mit GeneMapper ID X Software Fortsetzung 8 W hlen Sie Analyze gr ne Pfeilschaltfl che um die Datenanalyse zu beginnen Hinweis Als Voreinstellung zeigt die Software nach der Qualit tspr fung die folgenden bersichten Analysis Requirement Summary Allelic Ladder Analysis Summary und Analysis Summary Stellen Sie sicher dass alle Anforderungen erf llt sind wenn die jeweiligen Fenster erscheinen Sollte das Fenster Analysis Requirement Summary nicht aktiviert sein kann es n tig sein eine manuelle Fehlerbehebung durchzuf hren 9 Wenn die Analyse Anforderungen erf llt sind ffnet sich ein Save Project Fenster 10 Geben Sie den Projektnamen ein 11 W hlen Sie die entsprechende Security Group aus dem Drop Down Men aus und w hlen Sie OK Nach Ende der Analyse erscheint der Analysis Summary Bildschirm Wir empfehlen dass Sie alle gelben und roten M
98. nweis Die Detektionsgrenzen verschiedener Ger te sind unterschiedlich daher m ssen die Injektionszeit Injektionsspannung oder die Menge des Produkts die mit dem zu ladenden Cocktail verwendet werden eventuell erh ht oder verringert werden Die Injektionszeit und die Spannung k nnen im Run Module des Module Manager in der Data Collection Software ge ndert werden siehe unten Vorbereitung des Instruments Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 24 4 Zentrifugieren Sie die R hrchen kurz an damit falls n tig Luftblasen aus den Wells entfernt werden 5 Denaturieren Sie die Proben und die Leiter durch Erhitzen auf 95 C f r 3 Minuten und k hlen Sie sie dann sofort auf zersto enem Eis oder in einem Eiswasserbad 3 Minuten lang ab Die Proben m ssen direkt vor dem Laden denaturiert werden 6 Stellen Sie die R hrchen in einen geeigneten Autosampler Einsatz 7 Setzen Sie den Autosampler Einsatz in das Instrument ein und schlie en Sie die T ren des Instruments Vorbereitung des Instruments Anleitungen zum Reinigen des Pumpenblocks Installieren der Kapillaren Kalibrieren des Autosamplers und Einf llen von Polymer in die Spritze sind im Handbuch f r das Instrument zu finden 1 ffnen Sie die ABI PRIS
99. otieren Sie das Formamid bevor Sie es bei 20 C einfrieren Mehrfaches Einfrieren und Auftauen oder l ngerfristige Lagerung bei 4 C kann den Zerfall des Formamids bewirken Formamid von schlechter Qualit t kann Ionen enthalten die w hrend der Injektion mit der DNA konkurrieren und somit zu geringeren Peak H hen und reduzierter Sensitivit t f hren Eine l ngere Injektionszeit verst rkt das Signal nicht unbedingt Formamid ist ein Reizmittel und ein Teratogen Vermeiden Sie das Einatmen und Kontakt mit der Haut Lesen Sie vor dem Handhaben dieser Substanz das Warnetikett durch und treffen Sie entsprechende Vorsichts ma nahmen Beim Handhaben von Formamid immer Handschuhe und eine Schutzbrille tragen Vorbereitung der Proben 1 Bereiten Sie den zu ladende Cocktail vor indem Sie CC5 Internal Lane Standard 500 und Hi Di Formamid folgenderma en kombinieren 1 0 l CC5 ILS 500 Anzahl der Injektionen 24 0 l Hi Di Formamid Anzahl der Injektionen Hinweis Das Volumen des internen L ngenstandards im Ladecocktail kann verdoppelt werden um die Intensit t der Standard Peaks anzupassen Belassen Sie das Volumen des Formamids bei 10 0 l und passen Sie das Volumen das in Schritt 3 in die Wells gegeben wird entsprechend an 2 Vortexen Sie 10 15 Sekunden lang 3 Mischen Sie 25 0 l des vorbereiteten Cocktails und 1 0 l amplifizierte Probe oder 1 l PowerPlex ESX 17 Allelic Ladder Mix Hi
100. portiert Stellen Sie f r die Genotyper Software Versionen 2 5 und 3 6 oder h her Preferences im Men Edit so ein dass Fluorescein JOE TMR ET CXR ET und CC5 Daten importiert werden In der Allelleiter Probendatei waren Maximum Amplituden f r eine oder mehrere Allele unter 150 RFU Die Allelleiter kategorien sind so definiert dass sie eine minimale Peakh he von 150 RFU aufweisen m ssen Wenn die Peak H hen von Leiterallelen unter 150 RFU liegen kann die Software die Allele nicht erkennen Trennen Sie die Allelleiter noch einmal mit mehr Probenvolumen oder einer l ngeren Injektionszeit lauf um Peak H hen von ber 150 RFU zu gew hrleisten CE Spikes in der Allelleiter Probe wurden vom Macro als Allele erkannt Verwenden Sie eine andere Injektion der Allelleiter Die Allelleiter Daten waren mit der verwendeten PowerTyper Datei nicht kompatibel berpr fen Sie dass die PowerTyper_ESX_17 Macro Datei mit der verwendeten Allelleiter bereinstimmt Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 64 Fehlermeldung Could not complete the Run Macro command because the labeled peak could not be found Die Datei wird auf Ihrem Computer nicht ge ffnet Fehlermeldung Could not complete the Run Macro
101. pricht die Ihre amplifizierten Proben enth lt 9 Wenn der Plate Record mit der Platte verkn pft ist wechselt die Farbe der Grafik von gelb auf gr n und der gr ne Pfeil Run Instrument wird aktiviert 10 Klicken Sie auf den gr nen Pfeil Run Instrument auf der Symbolleiste um den Probenlauf zu starten 11 berwachen Sie die Elektrophorese indem Sie die Fenster Run View Array oder Capillaries Viewer in der Data Collection Software beobachten Jede Injektion nimmt ca 40 Minuten in Anspruch Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 23 5 C Detektion amplifizierter Fragmente mit dem ABI PRISM 310 Genetic Analyzer Vom Benutzer bereitzustellende Materialien 95 C trockener Heizblock Wasserbad oder Thermocycler 310 Kapillaren 47 cm 50 m Performance Optimized Polymer 4 POP 4 10X genetic analyzer buffer with EDTA Probenr hrchen und Septen gegen Aerosol gesch tzte Pipettenspitzen Hi Di Formamid Applied Biosystems Bestellnummer 4311320 PowerPlex 5 Dye Matrix Standards 310 Bestellnummer DG4600 zersto enes Eis oder Eiswasserbad Die Qualit t des Formamids ist von wesentlicher Bedeutung Verwenden Sie Hi Di Formamid Aliqu
102. rchgef hrt wird verwendet die Software die dritte Leiter usw bis alle Leitern im Projekt verwendet wurden Wenn eine Allelleiter nicht analysiert wird oder wenn viele Off Ladder Allele in der Probe festgestellt werden m ssen die Proben anhand einer anderen Leiter aus dem Projekt erneut analysiert werden Hinweis Die FGA Allele 50 2 und 48 2 weisen hohe Stutter Werte auf Das PowerTyper ESX 17 Macro kennzeichnet diese Stutter Peaks als Allele 49 2 und 47 2 7 Doppelklicken Sie auf das Macro Display Blue Data um die Fluorescein Daten f r alle Probeninjektionen anzuzeigen Scrollen Sie nach unten um die Daten anzusehen oder bei Bedarf zu bearbeiten 8 Doppelklicken Sie auf das Macro Display Green Data um die JOE Daten f r alle Probeninjektionen anzuzeigen Scrollen Sie nach unten um die Daten anzusehen oder bei Bedarf zu bearbeiten 9 Doppelklicken Sie auf das Macro Display Yellow Data um die TMR ET Daten f r alle Probeninjektionen anzuzeigen Scrollen Sie nach unten um die Daten anzusehen oder bei Bedarf zu bearbeiten 10 Doppelklicken Sie auf das Macro Display Red Data um die CXR ET Daten f r alle Probeninjektionen anzuzeigen Scrollen Sie nach unten um die Daten anzusehen oder bei Bedarf zu bearbeiten 11 Erstellen Sie die entsprechende Tabelle indem Sie den PowerTable den Make Allele Table oder den Make CODIS Table Makro ausw hlen Die drei verf gbaren Tabellenformate werden unten
103. s Group 1 die gew nschte Ergebnisgruppe W hlen Sie in der Spalte Instrument Protocol 1 das Protokoll das Sie in Schritt 2 erstellt haben Achten Sie darauf dass diese Information f r jede Zeile vorhanden sein muss die einen Probennamen enth lt W hlen Sie OK Hinweis Um eine neue Ergebnisgruppe zu erstellen w hlen Sie New von der Dropdown Liste in der Spalte Result Group W hlen Sie die Registerkarte General und geben Sie einen Namen ein W hlen Sie die Registerkarte Analysis und dann GeneMapper Generic von der Dropdown Liste Analysis type 5 Setzen Sie die Proben in das Instrument ein und schlie en Sie die T ren 6 W hlen Sie im Spectral Viewer das Filterset G5 und best tigen Sie dass das aktive Filterset die Datei ist die f r die PowerPlex 5 Dye Chemistry generiert wurde Es ist u erst wichtig den richtigen G5 Spektralkalibrierungslauf f r die PowerPlex 5 Dye Chemistry zu w hlen Wenn das aktive Filterset nicht PowerPlex 5 Dye Chemistry ist w hlen Sie PowerPlex 5 Dye Spectral von der List of Calibrations for Dye Set G5 und klicken dann auf Set 7 Suchen Sie im Run Scheduler den Plate Record den Sie in Schritt 3 und 4 erstellt haben und klicken Sie einmal auf den Namen um ihn zu markieren 8 Wenn der Plate Record markiert ist klicken Sie auf die grafische Platten darstellung die der Platte auf dem Autosampler ents
104. s Verfahren verbraucht nur eine kleine Menge jedes Reagenz und gew hrleistet aber daf r dass genug PCR Amplifikationsgemisch f r alle Proben zur Verf gung steht Es stellt zudem sicher dass jede Reaktion das gleiche PCR Amplifikationsgemisch enth lt 3 Stellen Sie f r jede Reaktion ein sauberes 0 2 ml Reaktionsr hrchen in einen Halter und versehen Sie es mit einer geeigneten Beschriftung Alternativ dazu kann eine MicroAmp Platte verwendet und auf geeignete Weise beschriftet werden Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 7 4 A Amplifikation Setup Fortsetzung 4 Geben Sie das endg ltige Volumen von jedem in Tabelle 1 aufgelisteten Reagenz in ein steriles 1 5 ml R hrchen Tabelle 1 zeigt das Volumen jeder Komponente pro Reaktion an Ein Arbeitsblatt zur Berechnung der erforderlichen Menge jeder Komponente des PCR Amplifikationsgemisches befindet sich in Abschnitt 9 D Tabelle 5 5 Vortexen Sie das PCR Amplifikationsgemisch 5 10 Sekunden lang bevor Sie es in die einzelnen Reaktionsr hrchen pipettieren Ein unzureichendes Vortexen des PCR Amplifikationsgemisches kann zu schlechter Amplifikation oder Imbalance von Locus zu Locus f hren 6 Geben Sie die Template DNA 0 5 ng f r jede Probe in das entspr
105. schaftsproben konzipiert ist 25 Dieses System verwendet paramagnetische Partikel f r die einfache und effiziente Aufreinigung von DNA Proben f r die STR Analyse Es kann dazu verwendet werden DNA aus Spuren oder fl ssigen Proben wie Blut zu extrahieren Das DNA IQ Resin eliminiert PCR Inhibitoren und Verunreinigungen die h ufig in Spurenmaterial zu finden sind Mit DNA reichen Proben liefert das DNA IQ System eine konstante Menge an Gesamt DNA Das System wird dazu verwendet DNA aus Routine Proben einschlie lich Mundh hlenabstrich FTA Papier oder fl ssigem Blut zu isolieren und zu quantifizieren Zus tzlich kann man damit auch DNA aus Spurenmaterial Gewebeproben differentiell getrennten Proben von sexuellen bergriffen und Spuren auf Tr germaterialien isolieren Das DNA IQ System wurde mit den PowerPlex Systemen getestet um ein optimiertes Verfahren zu gew hrleisten Siehe Kapitel 9 F f r Bestellinformationen Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 70 Tabelle 4 PowerPlex ESX 17 System Allelbenennungen in allgemein erh ltlichen Standard DNA Templates STR Locus Standard DNA Templates1 9947A 9948 2800M D18S51 15 19 15 18 16 18 D21S11 30 30 29 30 29 31 2 TH01 8 9 3 6 9 3 6
106. sspannung k nnen Sie im Run Module des Module Manager in der Data Collection Software ndern siehe unten Vorbereitung des Instruments Sind die Peakh hen zu hoch setzen Sie weniger DNA Template in den Amplifikationsreaktionen ein oder reduzieren Sie die Anzahl der Zyklen um 2 bis 4 Zyklen im Amplifikationsprogramm 5 Zentrifugieren Sie die Platte kurz an damit eventuelle Luftblasen aus den Wells entfernt werden 6 Denaturieren Sie die Proben bei 95 C 3 Minuten lang und k hlen Sie sie dann sofort danach auf zersto enem Eis oder in einem Eiswasserbad 3 Minuten lang ab Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 11 5 A Detektion amplifizierter Fragmente mit dem Applied Biosystems 3500 und 3500xL Genetic Analyzer Fortsetzung Vorbereiten des Instruments Anleitungen zum Reinigen des Pumpenblocks Installieren der Kapillaren Kalibrieren des Autosamplers und Einf llen von Polymer in die Spritze sind im Handbuch f r den Applied Biosystems 3500 3500xL Genetic Analzyer zu finden Analysieren Sie die Proben gem der Beschreibung im Benutzerhandbuch f r den Applied Biosystems 3500 3500xL Genetic Analzyer 1 ffnen Sie die 3500 Data Collection Software Der Dashboard Screen ffnet sich Abbildung 2 Stellen Sie sicher d
107. standard CC5 ILS 500 Fragmente wurden w hrend des Laufs festgestellt Erstellen Sie einen neuen L ngenstandard mit den internen L ngenstandardfragmente die in der Probe vorhanden sind Trennen Sie die Proben mit einer l ngeren Laufzeit erneut auf Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 61 Signifikant erh hte Grundlinie Die Peaks im L ngenstandard fehlen Allele werden nicht erkannt 7 C GeneMapper ID Analysis Software Fortsetzung Symptome Ursachen und Anmerkungen Eine Allelleiter wurde verwendet die nicht zu dem Lauf der der Proben geh rt Analysieren Sie die Proben mit einer Allelleiter vom gleichen Lauf erneut Die GeneMapper ID Software erfordert dass die Allelleiter aus dem gleichen Ordner wie die Probe importiert wird Stellen Sie sicher dass sich die Allelleiter im selben Ordner wie die Probe befindet Erstellen Sie ein neues Projekt und analysieren Sie gem der Beschreibung in Abschnitt 6 I oder 6 J erneut Die f r die Analyse gew hlte Panel Datei war f r das verwendete STR System nicht geeignet Ordnen Sie die richtige Panel Datei f r das STR System zu das f r die Amplifikation verwendet wurde Die Allelleiter wurde in der Spalte Sample Type nicht als Allelleiter gekennzeichnet
108. stellende Materialien 95 C Heizblock Wasserbad oder Thermocycler zersto enes Eis oder Eiswasserbad Zentrifuge kompatibel mit 96 well Platten gegen Aerosol gesch tzte Pipettenspitzen 3500 oder 3500xL Kapillaren Array 36 cm 96 well Retainer und Base Set Standard Applied Biosystems Cat 4410228 POP 4 Polymer f r den Applied Biosystems 3500 und 3500xL Genetic Analyzer Beh lter f r den Anoden Puffer Beh lter f r den Kathoden Puffer Conditioning Reagent f r den Applied Biosystems 3500 und 3500xL Genetic Analyzer MicroAmp Optical 96 Well Plate und Septen Hi Di Formamid Applied Biosystems Bestellnummer 4311320 PowerPlex 5 Dye Matrix Standards 3100 3130 Bestellnummer DG4700 Die Qualit t des Formamids ist von wesentlicher Bedeutung Verwenden Sie Hi Di Formamid und aliquotieren Sie das Formamid bevor Sie es bei 20 C einfrieren Mehrfaches Einfrieren und Auftauen oder l ngerfristige Lagerung bei 4 C kann den Zerfall des Formamids bewirken Formamid von schlechter Qualit t kann Ionen enthalten die w hrend der Injektion mit der DNA konkurrieren und somit zu geringeren Peak H hen und reduzierter Sensitivit t f hren Eine l ngere Injektionszeit verst rkt das Signal dann nicht unbedingt Formamid ist ein Reizmittel und ein Teratogen Vermeiden Sie das Einatmen und Kontakt mit der Haut Lesen Sie vor dem Einsatz dieser Substanz das Warnetikett dur
109. t Genetic Analyzer mit Data Collection Software Version 2 0 und dem Applied Biosystems 3130 oder 3130xl Genetic Analyzer mit Data Collection Software Version 3 0 21 C Detektion amplifizierter Fragmente mit dem ABI PRISM 310 Genetic Analyzer 24 6 Datenanalyse 26 A PowerPlex ESX Panel Bin und Stutter Sets mit GeneMapper ID X Software Version 1 2 26 B Erstellen eines L ngenstandards mit GeneMapper ID X Software Version 1 2 27 C Importieren des CC5 ILS 500 IDX L ngenstandards in die GeneMapper ID X Software Version 1 2 29 D Erstellen einer Methode zur Spurenanalyse mit GeneMapper ID X Software Version 1 2 29 E Erstellen einer Methode zur Datenbank oder Vaterschaftstest Analyse mit GeneMapper ID X Software Version 1 2 33 F PowerPlex ESX Panels und Bin Sets mit GeneMapper ID Software Version 3 2
110. ualit t der PCR Amplifikation kann durch eine Ver nderung des pH Werts aufgrund von hinzugef gtem Tris HCl der Magnesiumkonzentration aufgrund von Chelatbildung durch EDTA oder der Anwesenheit von PCR Inhibitoren stark beeinflusst werden PCR Inhibitoren k nnen abh ngig vom DNA Ausgangmaterial und dem verwendeten Extraktionsverfahren in geringen Konzentrationen vorhanden sein 3 DNA Konzentrationen k nnen je nach verwendetem DNA Quantifizierungs verfahren variieren 13 Die hier empfohlene Menge an DNA Template basiert auf Messungen der DNA Konzentration bei einer Absorption von 260 nm Wir empfehlen dringlich eigene Versuche durchzuf hren um die optimale DNA Menge f r die verwendete DNA Quantifizierungsmethode zu bestimmen 8 F r die negative Amplifikationskontrolle wird Wasser Amplifikationsg te anstelle der Template DNA in ein Reaktionsr hrchen mit PCR Amplifikationsgemisch pipettiert 4 B Amplifikation Thermocycling Dieses Handbuch enth lt Protokolle f r den Gebrauch des PowerPlex ESX 17 System mit den GeneAmp PCR System 9700 und 2720 Thermocyclern Die Instrumente zur Amplifikation und Detektion k nnen variieren Unter Umst nden m ssen die Protokolle einschlie lich der Anzahl der Zyklen und Injektionszeit f r jedes Laborinstrument optimiert werden Von der Promega Corporation durchgef hrte Tests haben gezeigt dass f r 0 5 ng DNA Template 30 Zyklen zu guten Erfolgen f hren 1 Ste
111. uch des Applied Biosystems 3500 3500xL Genetic Analyzers Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Aktualisiert 7 12 Bestellnummer TMD024 Seite 13 Abbildung 3 Das Fenster Create New Instrument Protocol 9393TA 5 A Detektion amplifizierter Fragmente mit dem Applied Biosystems 3500 und 3500xL Genetic Analyzer Fortsetzung 3 Erstellen Sie in der Library einen neuen Gr enstandard f r das QC Protokoll W hlen Sie Size Standard dann Create Alternativ k nnen Sie einen vorher erstellten L ngenstandard nutzen Geben Sie dem Gr enstandard den Namen PPlex_ILS500 oder einen anderen geeigneten Namen W hlen Sie Orange als Dye Color Die Fragmente im L ngenstandard sind 60 65 80 100 120 140 160 180 200 225 250 275 300 325 350 375 400 450 475 und 500 Basen Siehe Abbildung 4 Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 14 Abbildung 4 Das Fenster Create New Size Standard 9227TA 4 Um ein neues QC Protokoll anzulegen w hlen Sie QC Protocols in der Library und dann Create Alternativ k nnen Sie ein
112. und importieren Sie das GeneScan Projekt oder die Probenl ufe die analysiert werden sollen Importieren Sie Fluorescein JOE TMR ET CXR ET und CC5 Hinweis Um die Farben zu w hlen die importiert werden sollen w hlen Sie Set Preferences im Men Edit 4 Doppelklicken Sie auf das Macro Check ILS Die Macros werden in der Ecke unten links im aktiven Fenster aufgef hrt Ein Plots Fenster wird angezeigt und zeigt den internen L ngenstandard d h CC5 ILS 500 im Kanal CC5 orange Scrollen Sie nach unten um die Fragmentl ngen des internen L ngenstandards zu pr fen und zu best tigen Analysieren Sie die Proben erneut mit der GeneScan Software falls notwendig und definieren Sie die Fragmente des internen L ngenstandards erneut Hinweise 1 Die Software verwendet eine Allelleiter um Allell ngen zu bestimmen Das Macro verwendet die erste Allelleiter die f r Allelbenennungen importiert wurde 2 Die Macintosh Version der Genotyper Software zeigt die Fragmentl ngen f r den internen L ngenstandard an Sie zeigt jedoch die Rohdaten f r das Elektropherogramm anstelle der analysierten Daten 5 Doppelklicken Sie f r Spurenanalysen auf das Macro POWER Das Macro POWER zieht Allele in der Allelleiter heran um Offsets f r alle Loci zu berechnen Dieser Prozess kann einige Minuten in Anspruch nehmen Nach Beendigung wird ein Plots Fenster ge ffnet in dem die Allelleitern
113. ware Version 3 2 erm glichen Wir empfehlen Benutzern an einer Schulung von Applied Biosystems zur GeneMapper ID X Software teilzunehmen um sich mit der ordnungsgem en Anwendung dieser Systemsoftware vertraut zu machen Hinweis Die erw hnten Panel uns Bins Sets sind mit fr heren Versionen der GeneMapper ID X Software kompatibel Vorbereitung 1 Die Panel Bin und Stutter Dateien f r das PowerPlex ESX 17 System k nnen hier heruntergeladen werden www promega com geneticidtools panels_bins 2 Geben Sie Ihre Kontaktinformationen ein und w hlen Sie GeneMapper ID X dann Submit 3 Speichern Sie die Dateien PowerPlex_ESX_Panels_IDX_vX x txt PowerPlex_ESX_Bins_IDX_vX x txt und PowerPlex_ESX_Stutter_IDX_vX x txt in einem Ordner auf Ihrem Computer ab X x steht f r die neuste Version der Panel und Bin Dateien Importieren von Panel Bin and Stutter Dateien 1 ffnen Sie die GeneMapper ID X Software 2 W hlen Sie Tools und dann Panel Manager Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 26 3 Markieren Sie das Symbol f r den Panel Manager im Abschnitt oben links linker Navigationsbereich 4 W hlen Sie File und dann Import Panels 5 Navigieren Sie zum der
114. wert der Analyse liegen 7 Fehlerbehebung Wenn Sie Fragen haben die hier nicht beantwortet werden wenden Sie sich bitte an Ihre zust ndige Promega Niederlassung oder Vertriebsstelle Kontaktinformationen erhalten sie unter www promega com E Mail genetic promega com 7 A Amplifikation und Fragmentdetektion Symptome Ursachen und Anmerkungen Verunreinigte Template DNA Da nur geringe Mengen Template verwendet werden ist dies nur selten ein Problem Abh ngig von dem verwendeten DNA Extraktionsverfahren und der Probenquelle k nnen in der DNA Probe Inhibitoren vorhanden sein Unzureichende Template Menge Verwenden Sie die empfohlene Menge an Template DNA soweit vorhanden Unzureichende Template Menge Low Copy Number LCN Analyse unter Verwendung von Kapillarelektrophorese kann davon profitieren dass konkurrierende geladene Partikeln w hrend der Injektion reduziert werden Dies kann durch Reinigung des PCR Produktes oder Entsalzen Formamid mit geringerer Leitf higkeit oder reduzierten Mengen von CC5 ILS 500 erfolgen F r alle diese Methoden sollte eine laborinterne Validierung durchgef hrt werden Das PowerPlex ESX 5X Master Mix war vor dem Gebrauch nicht gut gevortext Vortexen Sie das 5X Master Mix 5 10 Sekunden lang bevor es in das PCR Amplifikationsgemisch gegeben wird Hohe Salzkonzentrationen oder ver nderter pH Wert Wenn das DNA Template im TE Puffer gelagert wird der einen h heren pH Wert als 8 0 hat oder ein
115. z der Farbdetektion die sich auf die Balance zwischen den Farben auswirkt Promega GmbH Schildkr tstr 15 68199 Mannheim Deutschland Geb hrenfrei in Deutschland und sterreich 00800 77 66 34 28 Tel 49 621 8501 116 Fax 00800 77 66 34 23 www promega com Bestellnummer TMD024 Aktualisiert 7 12 Seite 46 6 L Probenanalyse mit der GeneScan Software und Macintosh Betriebssystemen 1 Analysieren von Daten mit der GeneScan Analysis Software 2 Pr fen Sie die Rohdaten f r einen oder mehrere Probenl ufe Markieren Sie den Namen der Probe und w hlen Sie dann Raw Data im Men Sample Ziehen Sie den Cursor so dass sich das Fadenkreuz auf der Basislinie rechts des gro en Primer Peaks befindet vor dem ersten Peak des internen L ngenstandards orange Verwenden Sie den X Wert der unten links im Fenster angezeigt wird als Startposition in den Analyseparametern 3 Die empfohlenen Analyseparameter sind 4 Die Analyseparameter k nnen im Ordner Params gespeichert werden 5 Wenden Sie die gespeicherte Analyseparameterdatei auf die Proben an 6 Definieren Sie einen neuen L ngenstandard W hlen Sie einen Probenlauf aus markieren Sie den Pfeil neben dem L ngenstandard und w hlen Sie define new Beschriften Sie die L ngenstandard Peaks mit 60 65 80 100 120 140 160 180 200 225 250 275 300 325 375 400 425 450 475 und 500 Basen Speichern Sie den L ngen standard

PowerPlex® ESX 17 System Technical Manual TMD024

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