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Volltext in PDF - Martin-Luther-Universität Halle

1. 151 Literaturverzeichnis Mehrhof FB F U Muller M W Bergmann P Li Y Wang W Schmitz R Dietz R von Harsdorf 2001 In cardiomyocyte hypoxia insulin like growth factor I induced antiapoptotic signaling requires phosphatidylinositol 3 OH kinase dependent and mitogen activated protein kinase dependent activation of the transcription factor cAMP response element binding protein Circulation v 104 p 2088 2094 Menasche P A A Hagege J T Vilquin M Desnos E Abergel B Pouzet A Bel S Sarateanu M Scorsin K Schwartz P Bruneval M Benbunan J P Marolleau D Duboc 2003 Autologous skeletal myoblast transplantation for severe postinfarction left ventricular dysfunction J Am Coll Cardiol v 41 p 1078 1083 Minami E M A Laflamme J E Saffitz C E Murry 2005a Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart Circulation v 112 p 2951 2958 Mitsiadis TA K Fried C Goridis 1999 Reactivation of Delta Notch signaling after injury complementary expression patterns of ligand and receptor in dental pulp Exp Cell Res v 246 p 312 318 Mitsuda S C Yoshii Y Ikegami M Araki 2005 Tissue interaction between the retinal pigment epithelium and the choroid triggers retinal regeneration of the newt Cynops pyrrhogaster Developmental Biology v 280 p 122 132 Monzen K R Nagai I Komuro 2002 A role for bone morphogenetic protein signaling in cardiomyocyte differentiation
2. den Angaben des Herstellers 45 Material und Methoden 2 2 3 Transformation von E Coli Zellen mit Plasmiden Ligationsans tze wurden in chemisch oder elektrokompetente E coli XLI blue Bakterien transformiert Die gesamten 10 ul der Ligationsans tze wurden zu 200 ul auf Eis aufgetauten chemischkompetenten Bakterien gegeben und f r weitere 30 Minuten auf Eis inkubiert Anschlie end erfolgte ein Hitzeschock bei 42 C f r zwei Minuten bevor die Bakterien f r 30 60 Minuten in 1 ml LB Medium bei 37 C gesch ttelt wurden und in verschiedenen Konzentrationen auf Agarplatten mit entsprechendem Selektionsmedium ausgestrichen wurden Die Bakterien wurden auf den Agarplatten bei 37 C ber Nacht im Brutschrank kultiviert Je nach Art der verwendeten Plasmide und in Abh ngigkeit von der Zusammensetzung der Agarplatten war eine Blau Wei Selektion hinsichtlich solcher Kolonien welche Plasmide mit integriertem Insert aufgenommen haben m glich F r die Transformation der cDNS Bibliothek wurden 4 ul Ligationsansatz zu 40 ul Elektro Ten Blue Electroporation Competent Cells Stratagene auf Eis gegeben und in einer sterilen 1 mm Elektroporationsk vette Peqlab im Electro Square Porator ECM 830 BTX mit folgenden Einstellungen 1700 V 176us Pulsl nge 25 Pulse Intervall von 100 ms transformiert Anschlie end wurde der Transforamtionsansatz mit 960 ul SOC Medium verd nnt und bei 37 C f r 90 min im Sch ttler inkubiert Ansonsten ist wi
3. v 11 p 305 311 Hocht Zeisberg E H Kahnert K Guan G Wulf B Hemmerlein T Schlott G Tenderich R Korfer U Raute Kreinsen G Hasenfuss 2004 Cellular repopulation of myocardial infarction in patients with sex mismatched heart transplantation Eur Heart J v 25 p 749 758 Hodgson DM A Behfar L V Zingman G C Kane C Perez Terzic A E Alekseev M Puceat A Terzic 2004 Stable benefit of embryonic stem cell therapy in myocardial infarction Am J Physiol Heart Circ Physiol v 287 p H471 H479 Iten LE S V Bryant 1973 Forelimb Regeneration from Different Levels of Amputation in the Newt Notophthalmus viridescens Length Rate and Stages Wilhelm Roux Archiv 173 p 263 282 Iten LE S V Bryant 1976 Stages of tail regeneration in the adult newt Notophthalmus viridescens J Exp Zool v 196 p 283 292 Iwanaga K H Takano M Ohtsuka H Hasegawa Y Zou Y Qin K Odaka K Hiroshima H Tadokoro I Komuro 2004 Effects of G CSF on cardiac remodeling after acute myocardial infarction in swine Biochem Biophys Res Commun v 325 p 1353 1359 Kajstura J A Leri N Finato C Di Loreto C A Beltrami P Anversa 1998a Myocyte proliferation in end stage cardiac failure in humans Proc Natl Acad Sci U S A v 95 p 8801 8805 Kingsley DM A E Bland J M Grubber PC Marker L B Russell NG Copeland N A Jenkins 1992 The mouse short ear skeletal morphogenesis locus is associated with defects in a bone morphogenetic member
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6. berstand so i aus Myomen von Prof Eppenberger Thymosin beta 4 Kaninchen Abcam ab 14334 1 100 Blastemmarker Maus Ig M Hybridomabank 1 16 22 18 Phospho Histon Kaninchen NEB 9701 1 300 H3 Tab 2 Prim rantik rper f r Immunfluoreszenzf rbungen 42 Material und Methoden 2 1 10 Sekund rantik rper fiir Immunfluoreszenzf rbungen Western Blots und in situ Hybridisierungen Name Hersteller Bestnr Verdiinnung Anti Digoxigenin AP Fab Fragmente 150 U 200 ul Boehringer 1 2500 Donkey Anti Rabbit Cy3 Chemicon AP182C 1 300 Donkey Anti Mouse Cy2 Conjugated Dianova 715 225 151 1 100 Donkey Anti Mouse Cy3 Conjugated Chemicon AP 192C 1 100 Cy2 Donkey Anti Rabbit Biomeda SJ29002 1 100 Biotinylated Anti Mouse IgM Vector BA 2020 1 100 HRP gekoppelt Anti Maus Pierce 1 3000 HRP gekoppelt Anti Kanichen Pierce 1 3000 Tab 3 Sekund rantik rper 2 1 11 Terti rantik rper und Fluoreszenzfarbstoffe Name Hersteller Bestnr Verd nnung Cy2 Conjugated Streptavidin Rockland S000 1 1 1 100 Dapi Molecular Probes D 3571 1 1000 Phalloidin TRITC labeled Sigma P 1951 1 300 Tab 4 Terti rantik rper und Fluoreszenzfarbstoffe 43 Material und Methoden 2 1 12 Liste der verwendeten Oligonukleotide T an Produkt Bezeichnung Nukleotidsequenz ae ay in in bp Fw 5 TGACAGGAGCAGCCAGGATG 3 TB1 MHC 56 340 Rv S ACATTG
7. sung 50 mg ml in DMF e BrdU Stamml sung 10 mg ml in PBS Proteinase K Stamml sung 20mg ml in DEPC behandeltem HO 10x DNA Ladepuffer 25 ml 5 g Ficoll 400 5 ml 0 5 M EDTA pH 8 0 5 ml 20 SDS 0 0625 g Bromphenolblau 0 0625 g Xylen Cyanol ad 25 ml H2O e 10x PBS 1 5 M NaCl 0 03 M KCI 0 08 M NaHPO x 2H gt 0 pH 7 2 50x TAE Puffer 2 M Tris HCl 57 1 ml konz Essigs ure 0 05M EDTA 39 Material und Methoden 10x TBS T 0 1 M Tris HCI pH 8 0 oder pH 7 4 1 5 M NaCl 5 Tween 20 L sungen f r die Plasmid Pr paration L sung A 50 mM Glukose 25 mM Tris Hcl pH 8 0 10 mM EDTA L sung B 0 2 N NaOH 1 SDS L sung C 30 ml 5 M Kac 5 75 ml Eisessig 14 25 ml H20 L sungen f r In situ Hybridisierungen auf Paraffinschnitten Hybridisierungspuffer 50 Formamid 5x SSC pH 4 5 50 ug ml Hefe tRNA 1 SDS 50 ug ml Heparin Waschl sung I 50 Formamid 5x SSC pH 4 5 1 SDS Waschl sung III 50 Formamid 2x SSC pH 4 5 NTMT 100 mM NaCl 5 mM MgCl 100 mM Tris HCl pH 9 5 0 1 Tween 20 2 mM Levamisol 20x SSC 175 32 g NaCl 88 23 g Natriumcitrat pH Wert auf 4 5 mit Zitronens ure Narkosebad 0 5 g Tricain auf 0 5 1 H20 Desinfektionsbad 5 g Sulfermerazine 1 SOB Medium 20 g Trypton 5 g Hefeextrakt 0 5 g NaCl ad 1 L H20 nach dem autoklavieren 10 ml steriles 1 M MgCl und 10 ml 1 M MgSO SOC Medium zu 100 ml SOB Medium wird 1 ml 2 M Glucose sterilfiltriert gegeben Proteinextraktionspuff
8. urspr nglich epikardialen Zellen exprimiert wurden Die experimentelle Blockade des FGF Signalweges mittels Expression eines dominant negativen FGF Rezeptors verhinderte den epithelialen zu mesenchymalen bergang und somit die koronare Gef neubildung Dies resultierte dann in einem vorzeitigen Arrest der Regeneration Diese Untersuchungen zeigen dass myokardiales und epikardiales Gewebe auf Verletzungen in einer FGF abh ngigen Art und Weise miteinander reagieren und so eine kardiale Regeneration erm glichen Lepilina et al 2006 1 4 Proliferationsf higkeit von Kardiomyozyten verschiedener Spezies und Altersstufen In kardialen Myozyten sind DNS Synthese und Mitose trotz der Pr senz von Myofibrillen m glich W hrend der normalen Kardiomyogenese proliferieren ventrikul re und atrielle Myozyten mit hnlicher Geschwindigkeit w hrend sich spezialisierte Myozyten des konduktiven Systems im Ratten und M useherzen langsamer teilen Zwei bis drei Wochen nach der Geburt sinkt die Proliferationsrate in Kardiomyozyten graduell ab und es findet ein bergang von hyperplatischem zu hypertrophem Wachstum statt Rumyantsev 1991 Im adulten Herzen konnte bisher keine mit den Satellitenzellen des Skelettmuskels vergleichbare gro e und potente Vorl uferzellpopulation identifiziert werden Auch klinisch wurde bisher keine funktionell signifikante myokardiale Regeneration in Folge von Krankheiten oder Verletzungen des Herzens die auf dem Verlus
9. 100 Ethanol und einst ndiger Inkubation bei 80 C pr zipitiert Nach 10 min Zentrifugation bei 4 C und 13 000 rpm wurde die RNA mit 70 Ethanol gewaschen und das Pellet in 100 ul DEPC behandeltem H20 aufgenommen Die vor dem DNase Verdau entnommene Probe und 5 ul der gel sten RNA wurden zur Kontrolle auf einem 1 igen Agarosegel aufgetrennt Der verbliebene Rest wurde bei 20 C gelagert Schnittstelle RNA Polymerase Gr e bp TB8 pSK Sall Xbal antisense sense 800 TB10 pKS Xbal Sall T3 T7 antisense sense 300 TB14 pSK Sall Xbal T3 T7 antisense sense 900 TB19 pSK Sall Xbal T3 T7 antisense sense 900 TB25 pSK Sall Xbal T3 T7 antisense sense 1800 a sm muscle actin k antisense Thymosin 4 k antisense Cytokeratin 18 antisense Tab 6 bersicht ber die in situ Proben Sense und antisense RNS Proben f r in situ Hybridisierungen auf Paraffinschnitten wurden mit Digoxigenin UTP markiert Die als Matrize f r die Transkription dienenden DNS Fragmente befanden sich in einem Plasmidvektor in dem sie von je einem Promotor f r unterschiedliche RNS Polymerasen flankiert wurden Dieser Umstand erm glichte die Generierung von RNS Proben in beiden Transkriptionsrichtungen sense und antisense F r die in vitro Transkription und die dabei erfolgende Markierung wurde jeweils 1 ug 51 Material und Methoden zuvor linearisierte DNS verwendet Die Schnittstellen f r die Linear
10. 137 Wird die Regenerationsf higkeit durch die Dedifferenzierung von Kardiomyozyten oder von Stammzellen erm glicht 139 M gliche Gr nde f r das limitierte regenerative Potenzial der SAUSEBETE na lenken ken 140 AUSDICK near ie 141 ZuUsammenfassins ale 143 Literatur verzeichn8 u 22 22 22 ea 145 Anhans yon 158 Abk rz ngsverzeichms 2 22 na 158 Negativkontrollen f r Immunfluoreszenzf rbungen 160 Lebenslauf nen 161 Publikationen und Tagungsbeitra ge eee ceessecceeneeceeeeeceeeeeenteeeesaes 162 Einleitung 1 Einleitung 1 1 Was versteht man unter Regeneration Regenerationsprozesse finden im weitesten Sinne auf allen biologischen Organisationsebenen statt Alle Organismen besitzen mehr oder weniger ausgepr gte regenerative F higkeiten Im Allgemeinen versteht man unter Regeneration vor allem solche Mechanismen die zum Ersatz oder zur Reparatur von verletzten K rperteilen f hren Dabei ist die Wundheilung fast allen die extensive epimorphe Regeneration hingegen nur wenigen Spezies vorbehalten Unter epimorpher Regeneration versteht man eine komplette funktionelle und morphologische Wiederherstellung des verletzten K rperteils Die F higkeit zur epimorphen Regeneration umfasst haupts chlich jene K rperteile die besonders h ufig Verletzungen ausgesetzt sind z B die Schw nze der Salamander Aber auch weniger verletzungsgef hrdete Organstrukturen wie zum Bei
11. 182 43 CST 9211 1 1000 P p70S6 Kinase Kaninchen Thr 412 Ser 424 70 85 CST 9204 1 1000 P p70S6 Kinase Kaninchen Thr 389 70 85 CST 9234 1 500 P S6 rib Prot Kaninchen Ser 240 244 32 CST 2215 1 2000 P p90 RSK Kaninchen Ser 380 90 CST 9341 1 1000 P PKC pan Kaninchen Thr 410 76 85 CST 2060 1 1000 P SAPK JNK Kaninchen Thr 183 Tyr 185 46 54 CST 4671 1 1000 P TSC2 Kaninchen Tyr 1571 200 CST 3614 1 1000 Ral A Maus 24 BD 610221 1 5000 Troponin T Maus 25 HyTest 4T19 1 1000 Tab 1 Prim rantik rper f r Western Blots 41 Material und Methoden 2 1 9 Prim rantik rper f r Immunfluoreszenzf rbungen Name Klon Spezies Hersteller Bestnr Verd nnung Anit Collagen Rockland 600 401 108 Type VI Kaninchen ae 1 50 Rabbit j Anti Digoxigenin AP Fab Boehringer 1 2500 Fragmente 150 U 200 ul Fibronectin Maus Hybridomabank MT4 1 200 vi Hybridomazell berstand ag aus ME 20 von Prof Braun Monoclonal Anti Actin a Smooth 1A4 Maus Sigma F 3777 1 200 Muscle FITC Monoclonal Anti hHCD Maus Sigma C 4562 1 100 Caldesmon Monoclonal Anti hCP Maus Sigma C 2687 1 100 Calponin Monoclonal Anti AC 15 Maus Sigma A 5441 1 100 B Actin Monoclonal Anti EA53 Maus Sigma A 7811 1 50 a Actinin Monoclonal Anti a Smooth Muscle 1A4 Maus Sigma A 2547 1 100 Actin Monoclonal mo s anti 1F2 Maus Acris 4T19 1 140 troponin T En F Hybridomazell
12. 2005 Eine dritte Gruppe die die Auswirkungen von oberfl chlichen und transmuralen Verletzungen des Myokards in MRL M usen und Kontrollm usen untersucht und verglichen hat Konnte zwar zytoprotektive Mechanismen wie Zellproliferation erh hte Gef bildung und geringere Apoptoseraten und damit bessere berlebensraten in Herzen von MRL M usen beobachten diese reichten aber nicht f r eine komplette myokardiale Regeneration aus Naseem et al 2007 1 6 Embryonale Herzentwicklung Das Herz ist das erste Organ das w hrend der Embryogenese gebildet wird und seine zirkulatorische Funktion ist notwendig f r die Lebensf higkeit von S ugetierembryonen Die Entwicklung des Herzens setzt sich aus einer Vielzahl sehr komplexer morphogenetischer Prozesse die sowohl in ihrer r umlichen als auch zeitlichen Reihenfolge exakt koordiniert werden m ssen zusammen Viele dieser Prozesse basieren auf Interaktionen zwischen Zellen und Geweben Diese Interaktionen werden ber verschiedene Signaltransduktionswege vermittelt Die Herzentwicklung beginnt mit der Induktion von kardiogenen Zellen in bilateralen Feldern des lateralen Mesoderms Die 24 Einleitung bilateralen Herzprimordien konvergieren und fusionieren entlang der Mittellinie und bilden dort einen linearen kontrahierenden Herzschlauch Zaffran and Frasch 2002 Dieser bringt dann anhand von anschlie enden Windungen die rudiment ren Atrien und Ventrikel in die entsprechende Positi
13. 34 B E H Dennoch konnten auch Bereiche detektiert werden die in erster Linie f r a Glattmuskelaktin positiv waren Abb 34 A D G 99 Ergebnisse Anti a Glattmuskelaktin MyHC Doppelf rbung Ani GlatimunkelBktin GaldEaman R A la gt a 4 ee E Abb 34 Doppelfarbungen von oa Glattmuskelaktin mit MyHC und Caldesmon Immunfluoreszenzf rbungen f r a Glattmuskelaktin gr n MyHC bzw Caldesmon rot Dapi Kernf rbung blau Die Ausschnitte A B und C stellen berlagerungsbilder dar Die wei en Pfeile in B und E weisen auf Bereiche hin in denen nur a Glattmuskelaktin exprimiert wird Die Proteinexpression von Thymosin 4 nahm wie die von Caldesmon und a Glattmuskelaktin im Verlauf der Regeneration zu vgl Abb 35 Auch im scheinoperierten Kontrollherzen ist Thymosin 4 bereits schwach detektierbar Abb 35 A Besonders stark erschien die Thymosin 4 Expression innerhalb der ersten beiden Wochen nach der Sch digung des Ventrikels C D Sie nahm nach 21 Tagen bereits wieder ab und erreichte nach 84 Tagen wieder das Expressionsniveau von scheinoperierten Herzen Zur genaueren Lokalisation der Thymosin 4 Expression wurden Doppelf rbungen mit Antik rpern gegen a Glattmuskelaktin und o Aktinin durchgef hrt Diese ergaben eine weitestgehende Kolokalisation von Thymosin B4 sowohl mit a Glattmuskelaktin als auch mit a Aktinin s Abb 36 Thymosin 4 konnte nicht nur im Zytoplasma sondern wie bereits beschr
14. 4 9 1 4 9 2 4 9 3 4 9 4 4 10 4 11 EN 8 1 8 2 8 3 8 4 Analyse der Subtraktionsklone e eee eeeeesecseeeeseeeeaeeceaecnseeseneeenees 130 Dominanz der Expression der zu der glattmuskelspezifischen Myosin regulatorischen leichten Kette homologen cDNS w hrend der Macroarray Hybridisierungen cccceeseceenceeeeceeeceeeeceeeeeeeeeeeeeteeeees 130 Entstehung verschiedener Expressionsmuster bei den in situ Hybridisierungen mit den Subtraktionsklonen TB14 und TB26 130 In situ Hybridisierungen mit dem B Aktin homologen Subtraktionsklon Distinkte Expression des NADH Dehydrogenase Homologs TB8 132 Das regenerationsassoziierte Antigen 22 18 und Zytokeratin 18 werden auch im regenerierenden Herzen exprimiert rseneenseensersnrsnneennen 132 Aktivierung verschiedener Signalkaskaden kurze Zeit nach Sch digung des Venttikels yes 134 Einfluss des MEK1 2 Inhibitors U0126 auf die Proteinexpressionen und Phosphorylierungen verschiedener Enzyme u suersersnnesnnennnnennn 134 St rkere Aktivierung der Akt Kinase nach U0126 Injektion in gesch digte Herzen snnsietansu eh 135 Zunahme der MyHC Expression nach U0126 Behandlung 135 Die transiente oder kontinuierliche Injektionen von U0126 haben keinen signifikanten Einfluss auf nachfolgende Phosphorylierungen oder Proteimexpressionen un zeigen est een 136 In vitro Analyse des Effektes von U0126 auf kardiale Molchzellen
15. F r die Einleitung der Narkose wurden die Molche f r ca 10 min in einem Becherglas mit 0 1 iger Tricain L sung gehalten Zur Desinfektion der Wunden wurden die operierten Tiere ber Nacht in einem geeigneten Beh lter mit 0 5 iger Sulfamerazine L sung gehalten Intraperitoneale Injektionen von Inhibitoren 20 ug pro g Molch wurden in einer 42 igen Methanol A PBS L sung mit einer MEK1 2 Inhibitor U0126 wurde mittels einer sterilen 1ml Plastikspritze und einer 27 G x 3 4 Kan le direkt i p in das narkotisierte Versuchstier gespritzt Zwei Stunden sp ter 58 Material und Methoden erfolgte die mechanische Ventrikelsch digung Je nach Versuchsansatz erfolgten an den drei darauffolgenden Tagen weitere intraperitoneale Injektionen Sch digung des Ventrikels Narkotisierten Tieren wurde zun chst mit einer Microschere ein ca 1 cm langer Schnitt in die Oberhaut gemacht Dieser verlief oberhalb der Vorderbeine sagittal in der Mitte bis zum Anfang des Kopfes Es folgte ein zweiter Schnitt transversal durch die Unterhaut Von hier aus war der kr ftige Truncus arteriosus sichtbar welcher vorsichtig mit einer Pinzette ergriffen wurde und das Herz aus der K rper ffnung gezogen wurde Die Sch digung erfolgte durch f nfzehnmaliges Quetschen des Ventrikels mit einer Pinzette Anschlie end wurde das Herz vorsichtig wieder in den Brustkorb zur ckgeschoben und der Schnitt in der Oberhaut mit Cyanacrylatklebstoff verklebt W h
16. F Aktin berschneiden sich kaum In Abb 31 A kann man die Ausbildung von netzartigen Strukturen sieben Tage nach Sch digung gut erkennen Regenerierende Trabekel die bereits wieder F Aktin positiv waren exprimierten nur noch in Randbereichen Fibronektin s Abb 31 B D F 96 Ergebnisse U 2 21d poston F Aktin Fibronektin Cc x D c e 2 i Abb 31 Auspr gung der Expression von Fibronektin und F Aktin 7d und 14d nach der Herzsch digung Immunfluoreszenzf rbungen mit einem Antik rper gegen Fibronektin gr n sowie Phalloidinf rbung von F Aktinen rot und Dapi Kernf rbung blau Die linke Spalte zeigt die F rbungen 7d die rechte Spalte 21d nach Herzsch digung berlagerungsbilder A B 21d Einzelbilder der Fibronektinf rbungen gr n C D Einzelbilder der F Aktinf rbung E F und der Dapi Kernf rbung G H 97 Ergebnisse 3 5 3 Zunahme der Expression von glattmuskelspezifischen Proteinen und von Thymosin 4 im Verlauf der Herzregeneration a Glattmuskelaktin _ 14d postop RE aF a Abb 32 Zunahme der a Glattmuskelaktinproteinexpression in den ersten drei Wochen der Herzregeneration Immunfluoreszenzf rbung f r o Glattmuskelaktin gr n Dapi Kernf rbung blau im Magen A scheinoperierten Herzen B vier C sieben D 14 E bzw 21 Tage nach Sch digung des Herzens F Immunfluoreszenzf rbungen mit einem Antik rper gegen a Glattmuskelaktin zeigte
17. In fr heren elektronenmikroskopischen Analysen konnten keine mitotischen Myozyten entdeckt werden weil nur sehr kleine Gewebeproben analysiert werden k nnen und die mitotischen Ereignisse in Kardiomyozyten u erst selten sind Neuere Techniken wie die konvokale Laser Scannig Mikroskopie erm glichen jedoch die Analyse gr erer Gewebeareale und ergaben neben der Identifikation von mitotischen interstitiellen Fibroblasten auch eine vergleichbar gro e Anzahl von mitotischen Kardiomyozyten 14x10 37x10 Kajstura et al 1998a Limana et al 2002 Wobei diese Ergebnisse innerhalb der Forschergemeinschaft als umstritten gelten Dar ber hinaus gelang es einigen Gruppen kleine Populationen kardialer Stammzellen zu isolieren Beltrami et al 2003 Laugwitz et al 2005 Martin et al 2004b Oh et al 2003 Manche dieser Vorl uferzellpopulationen konnten in in vivo Versuchen zu Kardiomyozyten Endothelzellen und glatten Muskelzellen differenzieren und gesch digtes Areal ersetzen Beltrami et al 2003 bzw nach Transplantationen exprimierten sie kardiale Marker und fusionierten teilweise mit Kardiomyozyten oder differenzierten zu Kardiomyozyten Oh et al 2003 Auch extrakardiale Vorl uferzellen wie h matopoetische Stammzellen migrierten nach transgender Transplantationen von Herzen oder Knochenmark in das Wirts bzw Spenderherz und siedelten sich dort an Dort differenzierten sie in verschiedene Zelltypen Laflamme et al 2002b Minami et a
18. Infarktes unabh ngig von myokardialer Regeneration zu wirken Laflamme and Murry 2005 In einer weiteren Studie Konnte gezeigt werden dass Kardiomyozyten selbst einen G CSF Rezeptor exprimieren und eine in vitro G CSF Behandlung die Kardiomyozyten vor dem Zelltod ausgel st durch oxidativen Stress sch tzen kann Harada et al 2005 Klinische Studien konnten erste Verbesserungen im Bereich der ventrikul ren Funktion und Reperfusion zeigen 30 Einleitung CSC Differenzierung parakrine Effekte Zufuhr von Wachstumsfaktoren CSC Differenzierung Verbesserung der Uberlebenschancen von Kardiale Kardiomyozyten Stammzellen CSC Isolation Mobilisierung von BMSCs Infarkt Ersatz von gesch digten Differenzierung und oder Kardiomyozyten Fusion Cyclin D Cyclin A parakrine Effekte Uberexpression viraler und Amplifikation Oncoproteine p38 Inhibition EB Bo _ 3 ae Stammzellen Differenzierte BMSCs und MSCs Kardiomyozyten Verbesserung der kontraktilen Ventrikelfuntionen u Myoblasten Satellitenzellen Abb 5 Zellbasierte und molekulare Strategien f r die Reparatur des S ugerherzens Schematische Darstellung von vier m gliche Strategien Stimulation endogener kardialer Stammzellen Transplantation adulter Stammzellen oder autologer Myoblasten und Induktion der Proliferation von endogenen Kardiomyozyten Kardiale Stammzellen und BMSCs k nnen durch Applikation von Wachstumsfaktoren lokal aktiviert
19. Inhibition von MEK1 2 konnte eine st rkere Aktivierung der Akt nicht aber der p 38 MAP Kinase 30 min nach der Sch digung detektiert werden Da Stresssignale und Wachstumsfaktoren verschiedene Signalkaskaden aktivieren k nnen und es teilweise zu berlappungen zwischen einzelnen Signalwegen und Substratproteinen kommen kann k nnte die Akt m glicherweise die Inhibition von MEKI 2 teilweise kompensieren Allerdings zeigten die bisher analysierten Substratproteine des Akt Signalweges und oder des MEK Erk Signalweges keine eindeutige Deregulation im Vergleich zu den mit L sungsmittel behandelten Kontrollherzen Nur das 4EBP 1 eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1 scheint 30 min nach der Herzsch digung in den mit U0126 behandelten Herzen an den Threoninresten 37 46 st rker phosphoryliert worden zu sein Diese Phosphorylierungen beg nstigen nachfolgende weitere Phosphorylierungen die letztlich zum Start der Translation f hren Ob ein fr herer Translationsstart im Herzen eine schnellere Regeneration erm glicht oder eher sch dliche Auswirkungen hat l sst sich aus den bisherigen Ergebnissen nicht ableiten 4 9 2 Zunahme der MyHC Expression nach U0126 Behandlung Die Analyse sp terer Zeitpunkte nach der Herzsch digung ergab einen Anstieg der Myosin Schwere Kette Expression in den mit dem Inhibitor behandelten Herzen Sieben Tage nach der Herzsch digung war dieser Unterschied nicht mehr erkennbar Nach vierzehn Tagen hatte sich
20. Kinase Mitogen activated kinase p38 handelt es sich um ein Enzym innerhalb einer Signalkaskade die f r die Kontrolle der zellul ren Antwort auf Zytokine und Stress zust ndig ist In Abb 36 wird deutlich dass bereits 10 Minuten nach Sch digung beide vom verwendeten P p38 Antik rper detektierten Phosphorylierungsstellen Thr 180 Tyr 182 stark phosphoryliert wurden w hrend in den scheinoperierten oder nicht operierten Kontrollen teilweise keine bzw nur sehr schwache Phosphorylierungen erkennbar waren Die beobachtete Aktivierung mittels Phosphorylierung blieb auch noch 30 min bzw zwei Stunden nach der Sch digung bestehen Auch die JNK SAPK stress activated protein kinase ist ein Enzym das Stress Wachstums und Differenzierungssignale auf Transkriptionsfaktoren wie c Jun ATF 2 u a bertr gt Die SAPK wurde in Folge der Sch digung besonders stark nach zwei Stunden an dem Threoninrest 183 und den Tyrosinrest 185 phosphoryliert Die Aktivierung der Proteinkinase C geh rt zu den ersten Ereignissen in einer Kaskade von Reaktionen die zu einer Vielzahl von zellul ren Antworten wie Sekretion Genexpression Proliferation und Muskelkontraktion f hren Die Isoformen der Proteinkinase C werden in drei Klassen unterteilt und werden entweder in einer Ca 104 Ergebnisse abh ngigen oder unabh ngigen Weise von Phosphatidylserin Diacylglycerol und Phorbolestern aktiviert Eine andere Klasse ben tigt weder die einen noch die
21. N Haase W Rosamond V J Howard J Rumsfeld T Manolio Z J Zheng K Flegal C O Donnell S Kittner D Lloyd Jones D C Goff Jr Y Hong R Adams G Friday K Furie P Gorelick B Kissela J Marler J Meigs V Roger S Sidney P Sorlie J Steinberger S Wasserthiel Smoller M Wilson P Wolf 2006 Heart disease and stroke statistics 2006 update a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee Circulation v 113 p e85 151 Tsonis PA 1983 Effects of carcinogens on regenerating and non regenerating limbs in amphibia review Anticancer Res v 3 p 195 202 Ueda Y H Kondoh N Mizuno 2005 Generation of transgenic newt Cynops pyrrhogaster for regeneration study Genesis v 41 p 87 98 Urbanek K F Quaini G Tasca D Torella C Castaldo B Nadal Ginard A Leri J Kajstura E Quaini P Anversa 2003 Intense myocyte formation from cardiac stem cells in human cardiac hypertrophy Proc Natl Acad Sci U S A v 100 p 10440 10445 Urist MR 1965 Bone formation by autoinduction Science v 150 p 893 899 Wagner M M A Siddiqui 2007 Signal transduction in early heart development I cardiogenic induction and heart tube formation Exp Biol Med Maywood v 232 p 852 865 Walder S F Zhang P Ferretti 2003 Up regulation of neural stem cell markers suggests the occurrence of dedifferentiation in regenerating spinal cord Dev Genes Evol v 213 p 625 630 Wang ZQ DC Wu
22. Nkx2 5 GATA4 und Tbx 2 und 3 induzieren Schultheiss et al 1997 Yamada et al 2000 Weitere Experimente zeigten aber dass BMPs allein nicht ausreichen um eine komplette kardiogene Induktion zu gew hrleisten sondern nur diese nur im Zusammenspiel mit FGFs erreichen k nnen Barron et al 2000 Demnach spielen BMP2 und BMP4 eine wichtige Rolle f r die fr hen Schritte der Kardiogenen Induktion Neben BMP2 und BMP4 werden auch die BMPs 5 6 7 und 10 w hrend der Herzentwicklung zu bestimmten Zeitpunkten und in bestimmten Regionen exprimiert Die funktionellen Inaktivierungen verschiedener BMPs konnten die genauen Rollen dieser Faktoren w hrend der Kardiogenese bisher jedoch nicht 25 Einleitung entschl sseln BMP2 Knock out M use sterben nach Ausbildung des Herzschlauches Zhang and Bradley 1996 und BMP4 Knock out M use schon w hrend der Gastrulation Winnier et al 1995 Im Fall der Inaktivierung von BMP 5 6 und 7 sind die M use lebensf hig und zeigen aber keinen ausgepr gten Herzph notyp Dudley and Robertson 1997 Kingsley et al 1992 Solloway et al 1998 BMP 10 defiziente M use sterben zwischen den embryonalen Tagen E 9 5 bzw 10 5 und zeigen starke kardiale Abnormalit ten Chen et al 2004 Neuhaus et al 1999 Die von BMPs vermittelte Signaltransduktion erfordert eine Komplexbildung durch Bindung an BMP Typ I und Typ II Rezeptoren Daraufhin phosphoryliert der Typ H Rezeptor den TypI Rezeptor und aktiviert des
23. Proteinen Auff llig erscheint die Zunahme der Expression von glattmuskelspezifischen Transkripten wie a Aktin 2 und Transgelin 2 im Falle der Chiphybridisierungen sowie die ansteigende Expression von a Glattmuskelaktin und Caldesmon bei den Immunfluoreszenzf rbungen Au erdem wies die Mehrzahl der Signale bei der Hybridisierung der Koloniefilter mit markierten im regenerierenden Herzen angereicherten Transkripten als CDNS Sonde Homologien zu der Myosin regulatorischen leichten Kette des Glattmuskels auf Auch RT PCRs mit spezifischen Oligonukleotiden gegen die cCDNS von Myosin regulatorischen leichten Kette des Glattmuskels zeigten nur eine Expression im gesch digten Herzen und in der aus Magen generierten cDNS Eine Expression von Glattmuskelproteinen wie dem o Glattmuskelaktin konnte beispielsweise auch im sich entwickelnden M useherzen etwa 9 5 Tage p c beobachtet werden Zu diesem Zeitpunkt waren auch die anderen im S ugetier bekannten Aktinisoformen das a skelettale und a kardiale Aktin im sich entwickelnden Herzen pr sent Die Expression von oa Glattmuskelaktin nahm ab E 17 p c wieder ab und konnte zwei Wochen nach der Geburt nur noch in Glattmuskelzellen der Gef e detektiert werden Clement et al 2007 hnliche Beobachtungen konnten auch im pr natalen Rattenherz gemacht werden Ya et al 1997 Bei der Entwicklung des H hnerherzens wurde die Expression von a Glattmuskelaktin vor der Expression des a skelettalen Aktins dete
24. Streifen zerteilt um gleichzeitig verschiedene prim re Antik rper verwenden zu k nnen Die Membranstreifen wurden dann auf einem Sch ttler 15 min in ddH2O wieder angefeuchtet Danach erfolgte eine Inkubation mit je 5 ml Enhancer Reagent 1 Pierce Biotechnology Inxc IL USA pro Membranstreifen f r 2 min und anschlie endem f nfmaligem Waschen f r je 2 min in ddH gt O Danach wurde in je 5 ml Enhancer Reagent 2 Pierce Biotechnology Inxc IL USA f r 10 min inkubiert und wiederum f nf Mal mit 62 Material und Methoden ddH gt O gewaschen Die unspezifische Antik rperbindung erfolgte mittels Blockierung der in 5 igem Magermilchpulver in TBST f r eine Stunde bei Raumtemperatur auf einem Sch ttler Anschlie end wurden die Membranen f nfmal f nf Minuten mit TBST gewaschen Die prim ren Antik rper wurde in geeigneten Verd nnungen in 3 igem Magermilchpulver in TBST ber Nacht bei 4 C auf einem Sch ttler inkubiert Am folgenden Tag wurden die Membranen f nf mal 10 min in TBST gewaschen und dann die entsprechenden sekund ren mit HRP gekoppelten Antik rper in 3 igem Magermilchpulver f r 1 2 Stunden bei Raumtemperatur auf die Membranen gegeben Nach einem letzten Waschschritt mit TBST f r ca zwei Stunden erfolgte die Detektion nach enzymatischem Umsatz des Super Signal West Femto Maximum Sensitivity Substrates Pierce Biotechnology Inxc IL USA im Versadoc 2 2 16 Isolation prim rer Kardiomyozyten aus ad
25. U S A v 98 p 11569 11574 152 Literaturverzeichnis Nechiporuk A M T Keating 2002 A proliferation gradient between proximal and msxb expressing distal blastema directs zebrafish fin regeneration Development v 129 p 2607 2617 Naseem RH A P Meeson D J Michael M D White J Kallhoff C Humphries S C Goetsch L J De Windt M A Williams M G Garry D J Garry 2007 Reparative myocardial mechanisms in adult C57BL 6 and MRL mice following injury Physiol Genomics v 30 p 44 52 Neuhaus H V Rosen R S Thies 1999 Heart specific expression of mouse BMP 10 a novel member of the TGF beta superfamily Mech Dev v 80 p 181 184 Oberpriller JC Mauro A editor The Development and Regenerative Potential of Cardiac Muscle London Harwood Academic Publishers 1991 p 81 92 OBERPRIL J OBERPRIL JC 1971 Mitosis in Adult Newt Ventricle Journal of Cell Biology v 49 p 560 amp Oberpriller JO J C Oberpriller 1974 Response of the adult newt ventricle to injury J Exp Zool v 187 p 249 253 Oberpriller JO J C Oberpriller AM Arefyeva V I Mitashov B M Carlson 1988 Nuclear characteristics of cardiac myocytes following the proliferative response to mincing of the myocardium in the adult newt Notophthalmus viridescens Cell Tissue Res v 253 p 619 624 Odelberg SJ 2002 Inducing cellular dedifferentiation a potential method for enhancing endogenous regeneration in mammals Semin Cell Dev Biol v 13
26. bzw mobilisiert werden Alternativ k nnen kardiale und andere adulte Stammzellen in vitro amplifiziert werden und f r autologe Transplantationen eingesetzt werden Die transplantierten Zellen erzielen dabei entweder positive Effekte durch die Differenzierung in kardiovaskul re Zelltypen Kardiomyozyten Endothelzellen und Glattmuskelzellen und oder durch die Sekretion von parakrinen Mediatoren Die Proliferation terminal differenzierte Kardiomyozyten l sst sich m glicherweise durch die direkte Beeinflussung verschiedener Zellzyklusmodulatoren initiieren Ver ndert nach Germani et al 2007 1 7 4 Mesenchymale Stammzellen MSC Mesenchymale Stammzellen werden aus dem Stroma des Knochenmarks isoliert und produzieren Zytokine und Wachstumsfaktoren die die H matopoese unterst tzen Dazzi et al 2006 Dar ber hinaus k nnen sie spontan zu Adipozyten und Osteoblasten und nach Induktion auch zu Chondrozyten differenzieren Caplan and Bruder 2001 Diese Entdeckungen machten mesenchymale Stammzellen auch f r die kardiale Reparatur interessant Unter Verwendung von 5 Azazytidin zur Demethylierung der DNS konnten MSCs zur Expression kardialer Marker in vitro stimuliert werden Makino et al 1999 Allerdings ist unklar ob sich auch funktionelle Kardiomyozyten aus MSCs bilden k nnen Der Einsatz von 5 Azazytidin limitiert zudem die klinische Anwendbarkeit solcher 31 Einleitung Strategien Direkte Injektionen von nicht induzierten MS
27. der Suche nach potenziellen Enzymen die zellul re Schutzfunktion gegen eine Reihe von Stressfaktoren bernehmen k nnen sind u a antioxidierende Enzyme wie die Superoxid Dismutase SOD untersucht worden Paradoxerweise f hrte jedoch die MEK Uberexpression fast zu einer Halbierung der SOD Aktivit t in vitro Die Inkubation mit dem Superoxiderzeuger Menadione bei gleichzeitiger MEK berexpression f hrte zu der erwarteten Zunahme des Zelltodes und konnte durch vorherige Inkubation mit dem MEK Inhibitor U0126 gehemmt werden Diese Ergebnisse belegen dass die Aktivierung des MEK Erk Signalweges in Abh ngigkeit von der Art des einwirkenden Stresses ein verbessertes oder vermindertes Zell berleben bewirken kann Badrian et al 2006 Die antiapoptotischen und zellsch tzenden Effekten des Insulin Wachstumsfaktors 1 Mehrhof et al 2001 des Cardiotrophins 1 Sheng et al 1997 des Urocortins Brar et al 2000 und des extrazellul ren Proteins SIOOA Most et al 2003 im Herzen oder in Kardiomyozytenkulturen h ngen unter anderem von der Aktivierung des Erk Signalweges ab In diesen F llen verhinderte die pharmakologische Inhibition der Erk Aktivit t mit den Inhibitoren U0126 oder PD98059 die sch tzende Wirkung der oben genannten Faktoren Des Weiteren resultierte die Hemmung von Erk mit dem Inhibitor PD98059 kurz vor der experimentellen Induktion von Isch mie und anschlie ender Reperfusion im Herzen in einer st rkeren kardialen Verle
28. dieser um einen sehr langsamen Erneuerungsprozess zu handeln Alternativ k nnten die Vorl uferzelleigenschaften jedoch auch bei der in vitro Isolation entstanden sein Nichtsdestotrotz k nnten diese Zellen jedoch trotzdem von theoretischem Nutzen sein Laflamme and Murry 2005 1 7 6 Embryonale Stammzellen ES Zellen Mit Ausnahme der ethischen und politischen Bedenken machen die vielf ltigen Eigenschaften embryonaler Stammzellen diese zu einer attraktiven Quelle f r zellbasierte kardiale Therapien Die aus der inneren Zellmasse w hrend des Pr implantationsstadiums von sS ugetierembryonen gewonnenen ES Zellen habe eine nahezu unbegrenzte Selbsterneuerungsf higkeit Amit et al 2000 und es existieren bereits gut etablierte Protokolle f r deren Isolation Kultivierung und Differenzierung Aus ES Zellen generierte Kardiomyozyten exprimieren die molekularen Elemente die f r die korrekte elektromechanische Kopplungen mit dem Wirtsmyokard notwendig sind Westfall et al 1997 Xu et al 2002 Da murine ES Zellen im Vergleich zu humanen ES Zellen bereits seit ber 20 Jahren untersucht werden konnten mit ihrer Hilfe schon wichtige Erkenntnisse ber die Herzentwicklung und m gliche regenerative Anwendungen gewonnen werden Bereits die spontan gebildeten dreidimensionalen Aggregate die so genannten Embryoid Bodies beinhalten Foci von schlagendem Myokard Doetschman et al 1985 Schon nach kurzer Zeit der in vitro Differenzierung nehm
29. fand man auch in den Myozyten und in den nicht trabekel assoziierten Zellkernen die meisten Mitosen 21 Tage nach Sch digung fiel in allen drei Zelltypen die Mitoserate wieder ab und erreichte nach 43 Tagen fast wieder das Kontrollniveau des scheinoperierten Ventrikels Im Allgemeinen ergab diese Analyse eine eher geringe Mitoserate unter den Myozyten aber viele Mitosen in den trabekel assoziierten Zellen 70 Ergebnisse Zeitverlauf der mitotischen Ereignisse wahrend der kardialen Regeneration oO o oe oO D ol E Myozytenkerne N oO m Trabekel assoziierte Zellkerne D andere Zellkerne Anzahl mitotischer Kerne pro mm Sham Ad 7d 14d 21d 43d postop postop postop postop postop Abb 11 Grafische Darstellung des Zeitverlaufs der Mitoseh ufigkeit w hrend der kardialen Regeneration Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler an 3 3 Herstellung einer cDNS Bibliothek als Hilfsmittel zur Untersuchung der Herzregeneration im Molch Notophthalmus viridescens viridescens auf der transkriptionalen Ebene Die Herstellung einer eigenen cDNS Bibliothek wurde notwendig da das Genom des Molches Notophthalmus viridescens viridescens bisher nicht vollst ndig sequenziert wurde und keine kommerziellen cDNS Bibliotheken oder cDNS Microarrays von diesem Organismus zur Verf gung standen Der Zeitpunkt 14 Tage nach der mechanischen Ventrikelsch digung schien aus vers
30. fer K P Neuhaus J Kruse T Braun 2003 The homeobox gene Lbx1 specifies a subpopulation of cardiac neural crest necessary for normal heart development Circ Res v 92 p 73 80 Kruse Julia Borchardt Thilo Kostin Sawa Braun Thomas 2008 Mitotic activities and massive changes of the cytoskeletal composition are important steps for a successful regeneration of the mechanical damaged newt heart in Vorbereitung 162 Danksagung An erster Stelle m chte ich mich bei Prof Dr Dr Thomas Braun f r die M glichkeit der Bearbeitung dieses interessanten Themas und fir sein st ndiges Interesse seine motivierende Unterst tzung und stetige Diskussionsbereitschaft bedanken Dr Friedemann Laube danke ich f r die Einf hrung in die ersten Schritte des Umgangs mit den Molchen Dr Thilo Borchardt gilt mein besonderer Dank f r seine gro e Begeisterung mit der er in das Molchprojekt miteingestiegen ist und seine wertvollen Ratschl ge Diskussionen und manigfaltigen Unterst tzungen Mario Looso und Patrick Weiss danke ich f r die hervorragende bioinformatische Unterst tzung und Auswertung der Microarraydaten Henning Witt und Patrizia Ruiz danke ich f r die Kooperation zur Herstellung der Molch cDNA Microarrays und die Anleitung f r deren Hybridisierung Dr Thomas Kubin Jutta Wetzel und Kerstin Richter danke ich f r die Unterst tzung und die Weitergabe ihres Know hows bei den Western Blots Bei Jia Shen bedanke ich mich f r die tat
31. fortgesetzt Nach der Zytokinese reassemblieren die Proteinkomponenten der Myofibrillen wieder Ahuja et al 2004 Es herrschen kontroverse Ansichten ber die Gr nde f r die Unf higkeit von adulten S ugerkardiomyozyten in vivo auf Herzsch digungen mittels vollst ndigen Zytokinesen reagieren zu k nnen Ahuja et al konnten einerseits zwar einen Anstieg der Expression von Proteinen die in den Prozess der Zellteilung involviert sind im adulten hypertrophierten M useherzen beobachten Andererseits blieben vollst ndige Zellteilungen jedoch aus obwohl eben diese Proteine auch im embryonalen Herzen besonders zu den Zeitpunkten an denen noch Zytokinese stattfindet stark exprimiert werden Als m gliche Ursachen f r die im adulten Herzen unvollst ndigen Zellteilungen wurde zum einen das Vorkommen von komplexen geordneten und funktionellen Sarkomeren im adulten Myokard und zum anderen ineffizientere Abbaumechanismen als die die in embryonalen differenzierten Kardiomyozyten die Zellteilung mittels Aufl sung der Myofibrillen erleichtern postuliert Ahuja et al 2007 Eine andere Gruppe untersuchte die Lokalisation von Anillin einem bekannten Regulator der Spaltungsfurche in sich vollst ndig teilenden gegen ber binukle ren Rattenkardiomyozyten in Kultur Sie entdeckten dabei dass binukle re Zellen dann entstehen wenn es zu einer fehlerhaften Fokussierung von Anillin in der Zellteilungsebene kommt Engel et al 2006 Im Gegensatz zu d
32. gezeigt werden dass ihre Rolle innerhalb der kardiogenen Induktion synergistische Interaktionen mit BMP Signalwegen erfordert Barron et al 2000 Lough et al 1996 Experimente in H hner und M usembryonen zeigten dass bestimmte FGFs wie FGF 1 2 4 und 8 mit BMP2 kooperieren und mesodermale Zellen kardiogen spezifizieren k nnen Alsan and Schultheiss 2002 Lough et al 1996 Zhu et al 1996 Dementsprechend ben tigen mesodermale Zellen BMPs fiir die Induktion der kardiogenen Vorl uferzellen und FGFs f r den Erhalt der Proliferations und berlebensf higkeit der differenzierten Kardiomyozyten Die Signalweiterleitung der FGFs erfolgt ber die Dimerisierung der FGF Rezeptoren nach Ligandenbindung und anschlie ender Autophosphorylierung der intrazellul ren Tyrosinreste Diese induzieren die Assemblierung und Rekrutierung von nachfolgenden Signalkomplexen Dis FGF Signale k nnen ber drei Hauptsignalwege weitergegeben werden Den Ras MAPK Signalweg den Phospholipase Cy Ca Signalweg und den Phosphatidylinositol 3 PI3 Kinase Akt Signalweg Dabei wird der Ras MAPK Signalweg w hrend der Kardiogenese am h ufigsten aktiviert Wagner and Siddiqui 2007 1 6 2 Positive und negative Signalmolekiile des Mesoderms und des Ektoderms Wnts und Crescent Wnts sind sekretorische Glycoproteine mit verschiedenen Funktionen innerhalb diverser entwicklungsbiologischer Prozesse wie der Schicksalsbestimmung verschiedener Zelltypen der A
33. growth factors 1 and 4 participate in regulation of cardiogenesis Dev Dyn v 207 p 429 438 Zhulidov PA E A Bogdanova A S Shcheglov L L Vagner G L Khaspekov V B Kozhemyako M V Matz E Meleshkevitch L L Moroz S A Lukyanov D A Shagin 2004 Simple cDNA normalization using kamchatka crab duplex specific nuclease Nucleic Acids Res v 32 p e37 Zhang M D Methot V Poppa Y Fujio K Walsh C E Murry 2001 Cardiomyocyte grafting for cardiac repair graft cell death and anti death strategies J Mol Cell Cardiol v 33 p 907 921 Zhang YM C Hartzell M Narlow S C Dudley Jr 2002 Stem cell derived cardiomyocytes demonstrate arrhythmic potential Circulation v 106 p 1294 1299 Zimmermann WH M Didie GH Wasmeier U Nixdorff A Hess I Melnychenko O Boy W L Neuhuber M Weyand T Eschenhagen 2002 Cardiac grafting of engineered heart tissue in syngenic rats Circulation v 106 p 1151 1157 157 Anhang 8 Anhang 8 1 Abkiirzungen und Fachausdriicke Abb BCIP BMP BMSCs bp BrdU BSA C cDNA cDNS Cy2 Cy3 bzw d DAPI DEPC d h ddH gt 0 Dig DNS DNA DNase dNTP DTT E coli EDTA etal EtOH EZM FGF h Abbildung 5 Bromo 4 Chloro 3 indolylphosphat Bone Morphogenetic Protein Stammzellen aus dem Knochenmark bone marrow derived stem cells Basenpaar re Bromodesoxyuridin Rinderserumalbumin Grad Celsius zur mRNS komplement re DNS die durch Reverse Transkription entsteht Carbo
34. ihre Proliferationseigenschaft w re eine geringere Zellzahl f r Transplantationen ausreichend und eine graduelle in situ Vermehrung w rde es der Angiogenese im Empf ngerherz erleichtern den wachsenden metabolischen Anforderungen nachkommen zu k nnen 1 7 7 Tissue engineering Gewebez chtung Beim Tissue engineering werden verschiedene bestehende Techniken und Entwicklungen so miteinander verkn pft dass k nstlich neue Gewebe generiert werden k nnen Einer der am st rksten verfolgten Ans tze auf diesem Gebiet stellt das Auss en von Kardiomyozyten auf por sen Ger sten dar Diese Ger ste bestehen aus biologisch abbaubaren synthetischen oder nat rlichen Polymeren Da aus M usen oder Ratten isolierte Kardiomyozyten an sich teilungsunf hig sind gestaltet sich das Erreichen einer gewebe hnlichen Zelldichte als schwierig Trotzdem konnten diese Konstrukte Aktionspotenziale leiten synchron schlagen und nach elektrischer Stimulation hypertrophieren Papadaki et al 2001 Radisic et al 2004 Die Entdeckung der Proliferationsf higkeit von von humanem ES Zell abgeleiteten Kardiomyozyten ist f r diese Technik sehr verhei ungsvoll Ein weiterer Ansatz besteht darin die prim ren Kardiomyozyten in ein Kollagengel zu geben in dem sie in einer zyklischen 34 Einleitung Streckapparatur mechanisch konditioniert werden In diesen Konstrukten hatten die Kardiomyozyten eine nat rliche st bchenf rmige Morphologie und gut ausgebilde
35. kommerziell vorbehandelte Objekttr ger aufgenommen 30 min an der Luft getrocknet und in 4 PFA f r 10 min bei RT fixiert und bis zur Antik rperf rbung in PBS im K hlschrank aufbewahrt 2 2 14 Antik rperf rbungen auf Gefrierschnitten Fixierte Gewebeschnitte wurden zun chst 2x 3 min in PBS pH 7 4 gewaschen Dann wurde der erste Antik rper in entsprechender Verd nnung in PBS auf die Schnitte pipettiert und ber Nacht bei 4 C in einer feuchten Kammer inkubiert Nach zweimaligem Waschen mit PBS wurde der entsprechende mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelte Zweitantik rper appliziert und f r 2h bei RT inkubiert Nach wiederholtem Waschen erfolgte gegebenenfalls noch eine Kernf rbung mit DAPI 1 1000 f r 15 20 min und oder eine F Aktin F rbung Phalloidin 1 200 f r 30 min bei RT Zuletzt wurden die gef rbten Schnitte mit Mowiol eingedeckt und dunkel bei 4 C gelagert 61 Material und Methoden 2 2 15 Proteinpr parationen und Western Blots Molchherzen wurden in je 120 ul Extraktrionspuffer EP mittels Ultraschall Bandelin Sonoplus 15 Power 1 Zyklus von 20s Lange zerkleinert und fiir 1 min bei 99 C denaturiert Restliche Zelltriimmer wurden mittels Zentrifugation f r 5 min bei 14 000 rpm pr zipitiert Der Uberstand wurde in ein neues Eppendorfgef berf hrt und ein 10 ul Aliquot fiir die Konzentrationsbestimmung der Proteine abgenommen Zu dem restlichen Proteinlysat wurden 4 4 ul 1M DTT gegeben und die Pro
36. p 335 343 Oh H S B Bradfute T D Gallardo T Nakamura V Gaussin Y Mishina J Pocius LH Michael RR Behringer D J Garry M L Entman M D Schneider 2003 Cardiac progenitor cells from adult myocardium homing differentiation and fusion after infarction Proc Natl Acad Sci U S A v 100 p 12313 12318 Orlic D J Kajstura S Chimenti F Limana I Jakoniuk F Quaini B Nadal Ginard D M Bodine A Leri P Anversa 2001 Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart improving function and survival Proc Natl Acad Sci U S A v 98 p 10344 10349 Padhi BK L Joly P Tellis A Smith P Nanjappa M Chevrette M Ekker M A Akimenko 2004 Screen for genes differentially expressed during regeneration of the zebrafish caudal fin Dev Dyn v 231 p 527 541 Pandur P M Lasche L M Eisenberg M Kuhl 2002 Wnt 11 activation of a non canonical Wnt signalling pathway is required for cardiogenesis Nature v 418 p 636 641 Papadaki M N Bursac R Langer J Merok G Vunjak Novakovic L E Freed 2001 Tissue engineering of functional cardiac muscle molecular structural and electrophysiological studies Am J Physiol Heart Circ Physiol v 280 p H168 H178 Patapoutian A B J Wold R A Wagner 1995 Evidence for developmentally programmed transdifferentiation in mouse esophageal muscle Science v 270 p 1818 1821 Poss KD 2006 Getting to the heart of regeneration in zebrafish Semin Cell Dev Biol 153 Literaturverzeichn
37. sondern eher das Erscheinungsbild von Stressfasern vgl Abb 47 D Bei einer Konzentration von 80uM U0126 sind sowohl die a Aktinin positiven als auch die a Aktinin negativen Zellen in ihrer Teilungsf higkeit gehemmt worden Einfluss des Inhibitors U0126 auf prim re Molchherzzellen E a Aktinin pH3 Zellen E a Aktinin pH3 Zellen Anzahl der pH3 Zellen MeOH 10 uM U0126 80 uM U0126 Abb 45 Einfluss des Inhibitors U0126 auf die Mitoserate von prim ren Molchherzzellen 116 Ergebnisse 3 7 2 Verringerung der Anzahl an a Aktinin positiven Zellen nach Behandlung mit dem Inhibitor U0126 Ca 18 der Zellen aus der Passage 5 waren a Aktinin positiv Mit Zunahme der U0126 Konzentration nahm nicht nur die Kernteilungsrate sondern auch die Anzahl a Aktinin exprimierender Zellen ab Sie sank auf ca 7 bei Verwendung von einer Inhibitorkonzentration von 80 uM Einfluss von U0126 auf die Expression von a Aktinin 25 20 15 E MeoH m 10uM U0126 o 80uM U0126 10 Gesamizellzahl 5 Anteil a Aktinin positiver Zellen an der 0 Abb 46 Grafische Darstellung der Abnahme der Anzahl a Aktinin positiver Zellen nach Behandlung mit dem MEK 1 2 Inhibitor U0126 Der Fehlerbalken gibt den Standardfehler an 117 Ergebnisse Abb 47 Immunfluoreszenf rbungen von prim ren Molchherzzellen in der Passage 5 mi
38. sowie dem Zusatz von 12 0 tetradecanoylphorbol 13 acetate TPA Ebenfalls positive Einfl sse bte der Zusatz von saurem und basischem FGF Fibroblast growth factor und konditioniertem Medium von kardialen Nicht Myozyten aus Zu einer Hemmung der Proliferation f hrten hingegen Zus tze wie TGF Transforming Growth Factor konditioniertes Medium von Nicht Myozyten mit Heparin sowie TGF und PDGF Platelet Derived Growth Factor in Kombination Aus diesen Zellkulturexperimenten l sst sich ableiten dass die 15 Einleitung Proliferationsfahigkeit der Myozyten vermutlich sowohl auf autokrine als auch auf parakriner Stimulation beruht Soonpaa et al 1994 Die besondere F higkeit adulter Kardiomyozyten zur Regeneration des Herzens beizutragen wurde au erdem von Experimenten unterstrichen in denen das Potenzial von Kardiomyozyten zur Transdifferenzierung in verschiedene Zelltypen nachgewiesen werden konnte So konnte zum einen eine starke Reduktion von Sarkomerproteinen wie a Myosin Schwere Kette und Troponin T innerhalb des Myokards nach mechanischer Sch digung des Ventrikels beobachtet werden Diese Beobachtung weist auf eine partielle Dedifferenzierung der adulten Kardiomyozyten w hrend der Regeneration hin Zum anderen verloren in regenerierende Extremit tenst mpfe transplantierte Kardiomyozyten ihren kardialen Ph notyp und nahmen stattdessen ein skelettmuskul res oder chondrozytales Schicksal an Dar ber hinaus exp
39. urser seen 56 Haltungsbedingungen der Molche u 22u0e2sersnersnnennnennnnennnen nen 58 Operative Eingriffe am Molch uu u uucuestesnssnensensin 58 Einbettung von Gewebe uuuueu eier 59 Plastikeinbettungen f r die Anfertigungen semid nner 2 um Ultramikt tomschnitie 2 Rasse iborkiu 59 Einbettungen in Paralfin a cst ei lee a a 60 Einbettungen in Gefriermedium uuessserssessnersnnesnnennnnennnernnne essen 61 Antik rperf rbungen auf Gefrierschnitten 2240444 rennen 61 Proteinpr parationen und Western Blots uersersnesnnennneesnnee en 62 Isolation prim rer Kardiomyozyten aus adulten Molchherzen 63 Behandlung der Kardiomyozytenkulturen mit dem Inhibitor U0126 64 Mikroskopie und Fotodokumentation zuersnersnnesnnernnnennnersnnennne nen 64 3 Ergebnisse nase aa aana n a aa ea 65 Die mechanische Sch digung des Ventrikels f hrt zu makroskopisch erkennbaren L sionen ovessa n end e Bean 65 Histologische Untersuchung der Herzregeneration anhand semid nner transversaler Plastikschnitte 66 Analyse der Mitoseh ufigkeit im Verlauf der kardialen Regeneration 69 Herstellung einer cDNS Bibliothek als Hilfsmittel zur Untersuchung der Herzregeneration im Molch auf der transkriptionalen Ebene 71 Herstellung von Macro und MicroarrayS ccsscceeeseceeeseceesteeeenteeeenes 73 Hybridisierung
40. von Zellen darstellt B Aktin wird haupts chlich in Nichtmuskelzellen exprimiert Die Ver nderungen der Aktin Expression begleiten m glicherweise die strukturellen Ver nderungen die in Folge einer Sch digung des Myokards auftreten Die Untersuchung der Lokalisation der ver nderten Aktin Expression im gesch digten Hundemyokard ergab eine innerhalb von 24 Stunden einsetzende und bis zu 90 Tagen anhaltende B Aktin Expression im myokardialen Interstitium Dabei kolokalisiert Aktin mit dem Endothelzellmarker van Willebrand Faktor Tian et al 1999 Die genaue Lokalisation der B Aktin Expression im gesch digten Molchherzen waren im Rahmen der in situ Hybridisierungen nicht m glich Der Anstieg der Expression von Nichtmuskel Proteinen im Molchherzen k nnte auch ein weiteres Indiz f r Dedifferenzierungsprozesse der Kardiomyozyten darstellen Einzelf rbungen mit einem anti B Aktin Antik rper mittels DAB F rbungen 14 Tage nach Herzsch digung ergaben eine positive F rbung in der Peripherie der einzelnen Trabekel Daten nicht gezeigt Somit K nnte es sich auch um endokardiale Trabekel assoziierte Zellen handeln 131 Diskussion 4 6 4 Distinkte Expression des NADH Dehydrogenase Homologs TB8 Da es sich bei der NADH Dehydrogenase um ein wichtiges mitochondriales ubiquit r vorkommendes Enzym der Atmungskette handelt k nnte man in Folge der Herzsch digung einen allgemeinen Anstieg der Genexpression von Komponenten des zellu
41. with the release of cardioactive cytokines Stem Cells v 25 p 236 244 Engel FB M Schebesta M T Duong G Lu S Ren J B Madwed H Jiang Y Wang MT Keating 2005 p38 MAP kinase inhibition enables proliferation of adult mammalian cardiomyocytes Genes Dev v 19 p 1175 1187 Engel FB M Schebesta M T Keating 2006 Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation J Mol Cell Cardiol v 41 p 601 612 Einhorn TA C A Lee 2001 Bone regeneration new findings and potential clinical applications J Am Acad Orthop Surg v 9 p 157 165 Eppenberger Eberhardt M I Flamme V Kurer H M Eppenberger 1990 Reexpression of alpha smooth muscle actin isoform in cultured adult rat cardiomyocytes Dev Biol v 139 p 269 278 Favata MF K Y Horiuchi E J Manos A J Daulerio D A Stradley W S Feeser DE Van Dyk W J Pitts R A Earl F Hobbs R A Copeland R L Magolda P A Scherle J M Trzaskos 1998 Identification of a novel inhibitor of mitogen activated protein kinase kinase J Biol Chem v 273 p 18623 18632 Ferretti P J P Brockes 1988 Culture of newt cells from different tissues and their expression of a regeneration associated antigen J Exp Zool v 247 p 77 91 Ferretti P J P Brockes 1990 The monoclonal antibody 22 18 recognizes a conformational change in an intermediate filament of the newt Notophthalmus viridescens during limb regeneration Cell Tissue Res v 259 p 483 493 Ferretti P S Ghosh 1
42. 2002a Mpsl mRNS konnte mittels in situ Hybridisierung in einigen wenigen Myozyten in der N he der Wunde detektiert werden In mps Mutanten wurde nach Amputation der Herzspitze ein normales Fibringerinnsel gebildet Im weiteren Verlauf der Regeneration blieben die Fibrinablagerungen zur ck und es entstanden gro e Bindegewebsnarben anstelle einer neuen kompakten Ventrikelwand Poss et al 2002b Folglich scheint die proliferative Aktivit t der Kardiomyozyten entscheidend zur epimorphen Regeneration beizutragen Da wie bereits erw hnt Ontogenese und Regeneration gewisse Parallelen aufweisen ist von Raya und Kollegen die Expression von kardialen Differenzierungsmarkern w hrend der Regeneration untersucht worden Der fr heste bekannte Marker der kardialen Abstammung ist Nkx2 5 Schwartz and Olson 1999 Nkx2 5 wird im ungesch digten adulten Zebrafischherz schwach exprimiert Im Verlauf der Regeneration hingegen Konnte kein ver ndertes Expressionslevel beobachtet werden Raya et al 2003 Tbx5 ein weiterer fr her Herzmarker Begemann and Ingham 2000 zeigte ebenfalls keine Ver nderung Diese Ergebnisse weisen darauf hin dass die de novo generierten Kardiomyozyten vermutlich nicht aus undifferenzierten Stammzellen oder dedifferenzierten Blastemzellen gebildet wurden sondern dass vielmehr differenzierte 17 Einleitung Kardiomyozyten in den Zellzyklus zur ckkehren und proliferieren und somit die zellul re Grundlage f r die e
43. 969 Cy3 anti Kanichen su 97 Abb 48 Beispiel f r die unspezifische Hintergrundf rbung bzw Autofluoreszenz des Herzgewebes von Negativkontrollen die nur mit dem Sekund rantik rper inkubiert wurden im Vergleich zur spezifischen Antik rperf rbung mit beiden Antik rpern bei jeweils gleicher Belichtungszeit a Glattmuskelaktin Hinterextremit t Abb 49 Glattmuskelspezifische F rbung des a Glattmuskelaktin Antik rpers auf einem Schnitt durch die Skelettmuskulatur einer Hinterextremit t des Molches Nur Gef w nde zeigen eine positive F rbung 160 Anhang 8 3 Lebenslauf Name Geburtsdatum Geburtsort Familienstand Schulausbildung 1989 1996 10 06 1996 Studium 10 1996 10 2000 01 2001 11 2001 11 2001 Doktorarbeit 01 2002 0 1 2005 02 2005 01 2008 Julia Kruse 21 12 1976 K ln ledig Gymnasium Liebfrauenschule in Oldenburg Erlangung der Allgemeinen Hochschulreife Studium der Biochemie an der Martin Luther Universit t Halle Wittenberg Anfertigung der Diplomarbeit am Institut f r Physiologische Chemie der Martin Luther Universit t Halle Wittenberg mit dem Thema Untersuchungen zur differentiellen Genexpression in den hyperplastischen Herzen Lbx1 defizienter M use Betreuer Prof Dr Dr Thomas Braun Erlangung des akademischen Grades Diplom Biochemikerin durch Urkunde und Zeugnis der Martin Luther Universit t Halle Wittenberg Beginn der Pro
44. 997 Expression of regeneration associated cytoskeletal proteins reveals differences and similarities between regenerating organs Dev Dyn v 210 p 288 304 Fukuda T K Chen X Shi C Wu 2003 PINCH 1 is an obligate partner of integrin linked kinase ILK functioning in cell shape modulation motility and survival J Biol Chem v 278 p 51324 51333 148 Literaturverzeichnis Gaiano N G Fishell 2002 The role of notch in promoting glial and neural stem cell fates Annu Rev Neurosci v 25 p 471 490 Gaussin V J E Tomlinson C Depre S Engelhardt C L Antos G Takagi L Hein J N Topper S B Liggett E N Olson M J Lohse S F Vatner D E Vatner 2003 Common genomic response in different mouse models of beta adrenergic induced cardiomyopathy Circulation v 108 p 2926 2933 Germani A G Di Rocco F Limana F Martelli M C Capogrossi 2007 Molecular mechanisms of cardiomyocyte regeneration and therapeutic outlook Trends Mol Med Glaser R MM Lu N Narula J A Epstein 2002 Smooth muscle cells but not myocytes of host origin in transplanted human hearts Circulation v 106 p 17 19 Harada M Y Qin H Takano T Minamino Y Zou H Toko M Ohtsuka K Matsuura M Sano J Nishi K Iwanaga H Akazawa T Kunieda W Zhu H Hasegawa K Kunisada T Nagai H Nakaya K Yamauchi Takihara I Komuro 2005 G CSF prevents cardiac remodeling after myocardial infarction by activating the Jak Stat pathway in cardiomyocytes Nat Med
45. A Im Verlauf der Regeneration bildeten sich jedoch schlauchf rmige netzartige Strukturen bestehend aus Fibronektin und KollagenVI aus Innerhalb dieser Strukturen nahm die Expression von muskelspezifischen Zytoskelettproteinen wie Myosin Schwere Kette und F Aktin im Verlauf der Regeneration wieder zu Die Zu bzw Abnahme der Fibronektinexpression spiegelt die Umgestaltung des gesch digten Myokards wieder Allerdings konnten auch 84 Tage nach der Sch digung noch kleine Fibronektinr ckst nde in kleinen Regionen im ansonsten normal erscheinenden Myokard detektiert werden Abb 29 B 84d postop 4d postop D x 7dpostop 444 post p G 5 21d postop Abb 29 Die Zu bzw Abnahme der Expression von Fibronektin kennzeichnet den Verlauf der Regeneration Immunfluoreszenzf rbungen mit einem Antik rper gegen Fibronektin gr n sowie Phalloidinf rbung von F Aktinen rot und Dapi Kernf rbung blau im scheinoperierten Herzen A 84d B 4d C 7d D 14d E und 21d G Der wei e Pfeil im vergr erten Ausschnitt von B weist auf Fibronektinr ckst nde hin 95 Ergebnisse 21d postop X Abb 30 Ver nderungen der KollagenVI Expression im Verlauf der Regeneration des Herzens Immunfluoreszenzf rbungen mit einem Antik rpern gegen Kollagen VI gr n sowie MyHC rot und Dapi Kernf rbung blau im scheinoperierten Herzen A 84d B 4d C 7d D 14d E und 21d F Die Expressionen von Fibronektin und
46. CTTTATTTCAGCGTG 3 Fw 5 ACTCCCTGAAACAGACCGGAC 3 TB2 56 240 Rv S CGCTATTGGCTAAATTCCAGTE 3 Fw S TCATTGAGCTCACGGAGAGG 3 TB5 TroponinT 56 445 Rv S GTCACTGACTCGGTTCCTCAG 3 Fw 5 TGTCCTTCGCTTACCTCACG 3 TB8 NADH DH 56 290 Rv 5S CACTCTGGAACCTTGTAGCAGTC 3 Fw S CTGTCATTCCAAATATTGTGTAATGC 3 TB10 Aktin 56 245 Rv S GAGGAGAGATTGTAACTTAACAGG 3 Fw 5S AGGAGTCETGEGETGCTCTACTC 3 MRLC 56 360 Rv S AACATCTTCCGGGTCAGTGC 3 Fw 5 AGGAGTTCAAGGAGGCATTCAG 3 TB13 Xen MRLC 56 245 Rv S GGGTCCAACAACTTGAATGC 3 Fw 5 CTTCTCAAACCCATGAGAAGG 3 TB19 56 300 Rv S CCGTAACTCATTACTTCACAGGG 3 Fw 5 GGATGTCTCAAGCACATCTTACC 3 TB25 Fhll 56 330 Rv S GTAGCAATCCACACAGTAGAACAG 3 Fw 5 GTTCCTCATCACGTTGAGACC 3 TB 46 56 126 Rv SCGCTTGTTTTATTAGTTGCTC 3 Fw 5 ACAGCCHACGATTGCAAGG 3 TB 54 Hb 56 345 Rv 5S AGTTGGAGTGCAGGGTCAGG 3 Fw 5 AGAATTTGGCATAAGGCTACAG 3 TB 59 Xen RNP 56 200 Rv S AGCGAACTGTGGCTATGAGTC 3 sm alpha aktin FW S CGGGCATGAAACAACTTACA 3 55 410 227D_C07 Rv 5 ATTTTGGGATGGAATTGTGG 3 Fw 5 TCACAGGGATCAAGGCTTCT 3 gt Xen ThymosinB4 55 303 248A_D08 Rv S TCCAATCTCCCTTTGCATCT 3 Tab 5 Oligonukleotidsequenzen 44 Material und Methoden 2 2 Methoden Sofern nicht anders erw hnt wurden alle Standardmethoden der Molekularbiologie nach Molecular Cloning Sambrook et al 1989 oder Current Protoco
47. Chen S Woodard L Z Lin C L Cai MM Lu M Reth O Platoshyn J X Yuan S Evans KR Chien 2005 Postnatal isl1 cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages Nature v 433 p 647 653 Laveder P C De Pitta S Toppo G Valle G Lanfranchi 2002 A two step strategy for constructing specifically self subtracted cDNA libraries Nucleic Acids Res v 30 p e38 Leferovich JM K Bedelbaeva S Samulewicz X M Zhang D Zwas E B Lankford E Heber Katz 2001 Heart regeneration in adult MRL mice Proc Natl Acad Sci U S A v 98 p 9830 9835 Leobon B I Garcin P Menasche J T Vilquin E Audinat S Charpak 2003 Myoblasts transplanted into rat infarcted myocardium are functionally isolated from their host Proc Natl Acad Sci U S A v 100 p 7808 7811 Lepilina A A N Coon K Kikuchi J E Holdway R W Roberts C G Burns K D Poss 2006 A Dynamic Epicardial Injury Response Supports Progenitor Cell Activity during Zebrafish Heart Regeneration Cell v 127 p 607 619 Li F X Wang J M Capasso A M Gerdes 1996 Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development J Mol Cell Cardiol v 28 p 1737 1746 Li Z M H Theus L Wei 2006 Role of ERK 1 2 signaling in neuronal differentiation of cultured embryonic stem cells Dev Growth Differ v 48 p 513 523 Lien CL M Schebesta S Makino G J Weber M T Keating 2006 Gene Expression Analysis of Zebrafish Heart Regeneration P
48. Cs in infazierte Herzen konnten deren Herzfunktion verbessern Berry et al 2006 Direkt injizierte markierte MSCs konnten im Myokard detektiert werden aber obwohl sie sich mit verschiedenen Muskelmarkern anf rben lie en glich ihre Morphologie mehr der Morphologie von Fibroblasten als von Kardiomyozyten Shake et al 2002 Au erdem konnten keine elektromechanischen Kopplungen untereinander oder mit Wirtszellen festgestellt werden Dennoch erschien das pathologische ventrikul re Remodeling in transplantierten Herzen dadurch abgeschw cht dass eine dickere Infarktnarbe und eine geringere ventrikul re Dilatation entstanden Shake et al 2002 1 7 5 Myokardiale Vorl uferzellen Bis vor Kurzem geh rte das Herzen noch mit zu einem der letzten Organe in denen keine definierte Vorl uferzellpopulation identifiziert werden konnte Die Arbeiten verschiedener Gruppen weisen darauf hin dass auch das Herz Populationen residenter Vorl uferzellen mit kardiomyogenem Potential besitzt Einer Gruppe gelang die Isolation einer Zellpopulation aus adulten Rattenherzen die f r den Stammzellmarker c kit positiv waren Beltrami et al 2003 Eine zweite Vorl uferzellpopulation wurde aus adulten M useherzen basierend auf ihrer Sca 1 Stammzellantigen 1 Expression isoliert Oh et al 2003 Eine dritte aus adulten M useherzen isolierte Zellpopulation zeichnet sich durch den Ausschluss des Hoechstfarbstoffes aus Martin et al 2004a Eine weitere
49. Experiment getestet Daf r wurde jeweils die entsprechende Menge der in Methanol gel sten 10mM UO126 Stockl sung mit Amphibien PBS A PBS verd nnt und den zuvor narkotisierten Molchen intraperitoneal gespritzt Zwei Stunden sp ter wurden die Tiere erneut narkotisiert und der Ventrikel mittels Quetschung mechanisch gesch digt Die Entnahme der Herzen erfolgte zu verschiedenen Zeitpunkten Der inhibitorische Effekt des U0126 wurde mittels Westernblot unter Verwendung des P MEK1 2 und des P Erk1 2 Antik rpers untersucht Eine Konzentration von 20ug g K rpergewicht zeigte hierbei eine effektive Inhibition Dr Thomas Kubin pers nliche Mitteilung und wurde in allen weiteren Experimenten verwendet Kontrolltiere erhielten anstelle des Inhibitors Injektionen von einem Gemisch aus 42 Methanol 58 A PBS welches der L sungsmittelzusammensetzung mit Inhibitor entsprach 3 6 2 1 Die biochemische Inhibition der MEK1 2 Kinase durch den Inhibitor U0126 ist in den ersten 30 min nach der Herzsch digung detektierbar In diesem Experiment wurden den Versuchsgruppen zwei Stunden vor der Herzsch digung intraperitoneal 20ug g K rpergewicht U0126 bzw das verd nnte L sungsmittel 42 Methanol 58 A PBS injiziert Nach der Herzsch digung bzw nach der Scheinoperation bei der lediglich der Korpus ge ffnet und wieder verschlossen wurde wurden die Herzen 10 min 30 min oder 24 h sp ter entnommen Bereits 10 min nach der Herzsch digung wurde die Ph
50. F llen vgl Abb 9 B wird ein Teil des Trabekels von reiferen Kardiomyozyten erkennbar an der Querstreifung der Sarkomere und der kr ftigeren Blauf rbung besetzt 67 Ergebnisse Abb 9 Vergr erte Ausschnitte aus semid nnen Schnitten von regenerierenden Herzen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der mechanischen Sch digung A 20 fache Vergr erung eines Ventrikelausschnittes 4 Tage nach der Sch digung B 20 fache Vergr erung eines Ventrikelausschnittes 7 Tage nach der Sch digung C 20 fache Vergr erung eines Ventrikelausschnittes 14 Tage nach der Sch digung D 20 fache Vergr erung eines Ventrikelausschnittes 43 Tage nach der Sch digung E 40 fache Vergr erung eines Ventrikelausschnittes 4 Tage nach der Sch digung der schwarze Pfeil markiert Trabekel assoziierte Zellen F 40 fache Vergr erung eines Ventrikelausschnittes 7 Tage nach der 68 Ergebnisse Sch digung der schwarze Pfeil weist auf einen partiell mit Kardiomyozyten gef llten Trabekel hin G 40 fache Vergr erung eines Ventrikelausschnittes aus einem scheinoperierten Herzen e steht f r Epikard H 40 fache Vergr erung eines Ventrikelausschnittes 84 Tage nach der Sch digung e steht f r Epikard D 40 fache Vergr erung eines Ventrikelausschnittes 14 Tage nach der Sch digung der schwarze Pfeil kennzeichnet eine Mitose in Kardiomyozyten J 63 fache Vergr erung einer Karyokinesse innerhalb eines Kardi
51. LoS Biol v 4 150 Literaturverzeichnis Limana F K Urbanek S Chimenti F Quaini A Leri J Kajstura B Nadal Ginard S Izumo P Anversa 2002 bcl 2 overexpression promotes myocyte proliferation Proc Natl Acad Sci U S A v 99 p 6257 6262 Lindner V C Booth I Prudovsky D Small T Maciag L Liaw 2001 Members of the Jagged Notch gene families are expressed in injured arteries and regulate cell phenotype via alterations in cell matrix and cell cell interaction Am J Pathol v 159 p 875 883 Liu L X Zhang B Qian X Min X Gao C Li Y Cheng J Huang 2007 Over expression of heat shock protein 27 attenuates doxorubicin induced cardiac dysfunction in mice Eur J Heart Fail Lough J M Barron M Brogley Y Sugi D L Bolender X Zhu 1996 Combined BMP 2 and FGF 4 but neither factor alone induces cardiogenesis in non precardiac embryonic mesoderm Dev Biol v 178 p 198 202 Maier CE R H Miller 1992 In vitro and in vivo characterization of blastemal cells from regenerating newt limbs J Exp Zool v 262 p 180 192 Makino S K Fukuda S Miyoshi F Konishi H Kodama J Pan M Sano T Takahashi S Hori H Abe J Hata A Umezawa S Ogawa 1999 Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro J Clin Invest v 103 p 697 705 Makino S G G Whitehead C L Lien S Kim P Jhawar A Kono Y Kawata M T Keating 2005 Heat shock protein 60 is required for blastema formation and maintenance during re
52. Rahmen dieser Arbeit erhalten wurde durchgef hrt wurde Dadurch 124 Diskussion gelang es ihnen die Anreicherung von gewebespezifischen stark abundanten Transkripten wie mitochondrialen RNS etc stark zu verringern Laveder et al 2002 Kommerzielle Hersteller verwenden f r die Normalisierung von cDNS Bibliotheken eine hnliche Strategie Hierbei wird basierend auf den unterschiedlichen Hybridisierungskinetiken abundanter und seltener Transkripte eine thermostabile duplexspezifische Nuklease DSN verwendet welche selektiv Hybride aus doppelstr ngiger cCDNS vorwiegend abundanter Transkripte zerschneidet Anschlie end werden nur die einzelstr ngigen Transkripte amplifiziert Zhulidov et al 2004 4 5 1 Die Analyse differentiell exprimierter Gene ergab gro e Ver nderungen innerhalb der Expression von Transkripten die f r Zytoskelettproteine codieren Die verschiedenen Hybridisierungsexperimente mit den Microarrays ergaben deregulierte Expressionen von Komponenten des Zytoskelettes Innerhalb der ersten 21 Tage nach der Sch digung des Ventrikels wurden Transkripte mit Homologien zur Myosin leichte Kette Kinase ventrikul ren alkalischen Myosin Leichten Kette 1 und Telethonin schw cher exprimiert als in den scheinoperierten Kontrollherzen Telethonin ist ein Bestandteil der Z Streifen F r die sequenzierten Klone mit Homologien zu Desmin Troponin C MHC und kardialem Aktin konnte in den ersten zwei Wochen zun chst eine verri
53. Trends Cardiovasc Med v 12 p 263 269 Morrison JI S Loof P He A Simon 2006 Salamander limb regeneration involves the activation of a multipotent skeletal muscle satellite cell population J Cell Biol v 172 p 433 440 Most P M Boerries C Eicher C Schweda P Ehlermann S T Pleger E Loeffler W J Koch H A Katus C A Schoenenberger A Remppis 2003 Extracellular S1OOA1 protein inhibits apoptosis in ventricular cardiomyocytes via activation of the extracellular signal regulated protein kinase 1 2 ERK1 2 J Biol Chem v 278 p 48404 48412 Muller P P Pfeiffer J Koglin H J Schafers U Seeland I Janzen S Urbschat M Bohm 2002 Cardiomyocytes of noncardiac origin in myocardial biopsies of human transplanted hearts Circulation v 106 p 31 35 Muller Ehmsen J P Whittaker R A Kloner JS Dow T Sakoda T I Long P W Laird L Kedes 2002 Survival and development of neonatal rat cardiomyocytes transplanted into adult myocardium J Mol Cell Cardiol v 34 p 107 116 Nace JD R A Tassava 1995 Examination of fibronectin distribution and its sources in the regenerating newt limb by immunocytochemistry and in situ hybridization Dev Dyn v 202 p 153 164 Namura S K Iihara S Takami I Nagata H Kikuchi K Matsushita M A Moskowitz J V Bonventre A Alessandrini 2001 Intravenous administration of MEK inhibitor U0126 affords brain protection against forebrain ischemia and focal cerebral ischemia Proc Natl Acad Sci
54. ach der Amputation konnten im Stumpf auch Zellen detektiert werden die sowohl f r den Antik rper 22 18 als auch f r einen zweiten Antik rper 12 102 der spezifisch f r den adulten Skelettmuskel des Molches ist positiv waren Kintner and Brockes 1984 Das detektierte Antigen ist intrazellul r und filament s Auch in Zellkulturen aus verschiedenen Geweben des Molches wie aus dem Stumpfblastem dem Herzen und der Leber wurde dieses Antigen in verschiedenem Ausma exprimiert Ferretti and Brockes 1988 Ferretti and Brockes 1990 Dar ber 132 Diskussion hinaus resultierte die Transplantation markierter Kardiomyozyten in regenerierende Extremit ten in der Abnahme von Kardiomyozytenmarkern und Zunahme der 22 18 Expression Laube et al 2006 Die Expression des regenerations assoziierten Antigens 22 18 konnte im Rahmen dieser Arbeit vier sieben vierzehn und 21 Tage nach der mechanischen Sch digung innerhalb des Ventrikels detektiert werden Dabei nahm die Expressionsst rke im Verlauf der Regeneration zu Keratine sind Intermedi rfilamentproteine und im herk mmlichen Sinne Marker f r die epitheliale Differenzierung In niedrigeren Organismen findet man diese aber auch in nicht epithelialen Zellen vorwiegend in mesenchymalen WVorl uferzellen w hrend der Regeneration von Organstrukturen Die Expression von Zytokeratin 18 konnte bereits nach drei bis f nf Tagen im Stumpfblastem des Molches nachgewiesen werden Experimente mi
55. adult mammalian heart Circ Res v 83 p 1 14 Anversa P A Leri M Rota C Bearzi K Urbanek J Kajstura R Bolli 2006 Stem Cells Myocardial Regeneration and Methodological Artifacts Stem Cells Ausubel F R and Brent S K 1992 Current Protocols in Molecular Biology Greene Publishing Associated and Wiley Interscience Volume 1 and 2 Bader D J Oberpriller 1979 Autoradiographic and electron microscopic studies of minced cardiac muscle regeneration in the adult newt notophthalmus viridescens J Exp Zool v 208 p 177 193 Badrian B T M Casey M C Lai P E Rakoczy P G Arthur M A Bogoyevitch 2006 Contrasting actions of prolonged mitogen activated protein kinase activation on cell survival Biochem Biophys Res Commun v 345 p 843 850 145 Literaturverzeichnis Barron M M Gao J Lough 2000 Requirement for BMP and FGF signaling during cardiogenic induction in non precardiac mesoderm is specific transient and cooperative Dev Dyn v 218 p 383 393 Begemann G P W Ingham 2000 Developmental regulation of Tbx5 in zebrafish embryogenesis Mech Dev v 90 p 299 304 Beltrami AP L Barlucchi D Torella M Baker F Limana S Chimenti H Kasahara M Rota E Musso K Urbanek A Leri J Kajstura B Nadal Ginard P Anversa 2003 Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration Cell v 114 p 763 776 Beltrami AP K Urbanek J Kajstura S M Yan N Finato R Bussani B Nadal Gina
56. al 2 1 1 Chemikalien und Verbrauchsmaterial Soweit nicht anders erw hnt wurden Chemikalien in Analysequalit t und Biochemikalien der Firmen Merck Darmstadt Sigma Deisenhofen New England Biolabs Invitrogen Leek NL Promega Mannheim Stratagene Heidelberg und Boehringer Mannheim verwendet Radioaktiv gelabelte Nukleotide Braunschweig bezogen wurden von Amersham Buchler BCIP Boehringer Bromdesoxy Uridin BrdU Sigma Deckgl ser 24mm x 60mm Menzel Diaminobenzidin DAB Sigma DIG RNA Labeling Mix 10x konzentriert Sigma Einmalfilter Minisart NML Minisart 0 45um Sartorius G ttingen Entellan Merck Ethyl 3 aminobenzoate methanesulfonic acid salt Sigma Tricain Faltenfilter Schleicher amp Sch ll Hefe tRNA Boehringer LB Medium Lennox Roth LB Agar Lennox Roth NBT Boehringer Objekttr ger Elka Paraffin Merck Parafilm American National Can Plastikgef e Nunc Roskilde DK R ntgenfilme Kodak Frankfurt Sulfamerazine Sigma Trizol Reagent Invitrogen UV K vetten Eppendorf 37 Material und Methoden Vectabond Reagent 2 1 2 Enzyme Expand Reverse Transkriptase Proteinase K Restriktionsendonukleasen RNase A RNase H RNasin RNase Inhibitor Sp6 RNA Polymerase Taq DNA Polymerase T7 RNA Polymerase 2 1 3 Bakterienstimme Vector Laboratories Boehringer Mannheim Boehringer Mannheim New England Biolabs oder Jena Biosciences Boehringer Mannheim Promega Prome
57. altransduktionskaskaden kurze Zeit nach der Sch digung des Ventrikels haben Aufschl sse ber deren Beteiligung w hrend der Herzregeneration gegeben Der Einsatz weiterer f r andere Schl sselenzyme spezifischer Enzyminhibitoren k nnte in Anlehnung an die Untersuchungen mit dem MEK Inhibitor U0126 durchgef hrt werden Diese k nnten weitere Einblicke in die Regulation der Regeneration bringen Die erfolgreiche 141 Ausblick Etablierung einer stabilen Herzmuskelzelllinie wiirde dariiber hinaus in vitro Experimente deutlich erleichtern und fiir eine bessere Reproduzierbarkeit sorgen Eine weitere groBe Herausforderung stellt die in vivo Markierung spezieller Zelltypen sowie die erfolgreiche Uberexpression oder Repression interessanter deregulierter Gene und ihrer entsprechenden Proteinprodukte dar Mit Hilfe solcher Experimente lie en sich funktionelle Studien mit potenziell regenerationsrelevanten Genen durchf hren 142 Zusammenfassung 6 Zusammenfassung Entgegen der fr heren Behauptungen dass die Herzen von Molchen zwar ein gewisses regeneratives Potenzial besitzen aber trotzdem die Wunde letztendlich durch die Ausbildung einer Narbe verschlossen wird McDonnell and Oberpriller 1984 Oberpriller and Oberpriller 1974 resultierte die in dieser Arbeit verwendete Methode der mechanischen Quetschung des Ventrikels in einer nahezu kompletten Wiederherstellung der urspriinglichen Morphologie innerhalb von ca 12 Wochen E
58. anderen Stimuli f r ihre Aktivierung In diesem Experiment schienen die Threonin 404 Reste der detektierten PKCs nach 10 min noch nicht aktiviert zu werden Nach 30 min bzw zwei Stunden war eine leichte Zunahme der Phosphorylierung zu beobachten pap as ae ee we P p38 Thr 180 Tyr 182 gt P SAPK Thr 183 Tyr 185 _ lt ee P PanPKC Thr 404 un m P MEK1 2 Ser 212 221 s Ti EEL ex e aan eee P Erk1 2 Thr 202 Tyr 204 Gesamt Erk1 2 gt a P p90RSK Ser 380 onl gt em lt lt P Akt Ser 473 x Ponceau Rot gef rbte Aktinbanden als Ladungskontrollen Abb 38 Westernblotanalyse der Phosphorylierungszust nde verschiedener Kinasen 10 30 und 120 min nach der Sch digung des Ventrikels im Vergleich mit scheinoperierten Sham Herzen Die MAP Erk Kinase MEK1 und MEK2 sind Bestandteile der Mitogen aktivierten Proteinkaskade die das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung kontrollieren MEK1 und MEK werden ihrerseits von verschiedenen Zytokinen und Wachstumsfaktoren sowie mittels Membrandepolarisationen oder Kalziumeinstr mungen stimuliert Raf hnliche Molek le aktivieren MEK1 2 durch Phosphorylierungen an den Serinresten 212 und 221 Auch die Kinasen MEK1 2 wurden 10 bzw 30 min nach Herzsch digung stark phosphoryliert Die Phosphorylierung wurde nach zwei S
59. ans J N Cohn 1996 Changes in beta actin mRNA expression in remodeling canine myocardium J Mol Cell Cardiol v 28 p 53 63 Chen H S Shi L Acosta W Li J Lu S Bao Z Chen Z Yang M D Schneider KR Chien S J Conway MC Yoder L S Haneline D Franco W Shou 2004 BMP10 is essential for maintaining cardiac growth during murine cardiogenesis Development v 131 p 2219 2231 Chu PH P Ruiz Lozano Q Zhou C Cai J Chen 2000 Expression patterns of FHL SLIM family members suggest important functional roles in skeletal muscle and cardiovascular system Mech Dev v 95 p 259 265 Clement S M Stouffs E Bettiol S Kampf K H Krause C Chaponnier M Jaconi 2007 Expression and function of alpha smooth muscle actin during embryonic stem cell derived cardiomyocyte differentiation J Cell Sci v 120 p 229 238 Conboy IM T A Rando 2002 The regulation of Notch signaling controls satellite cell activation and cell fate determination in postnatal myogenesis Dev Cell v 3 p 397 409 Corcoran JP P Ferretti 1997 Keratin 8 and 18 expression in mesenchymal progenitor cells of regenerating limbs is associated with cell proliferation and differentiation Dev Dyn v 210 p 355 370 Dazzi F R Ramasamy S Glennie S P Jones I Roberts 2006 The role of mesenchymal stem cells in haemopoiesis Blood Rev v 20 p 161 171 Deb A S Wang K A Skelding D Miller D Simper N M Caplice 2003 Bone marrow derived cardiomyocytes ar
60. artige unreife Trabekel entstanden sind die teilweise von Myozyten besetzt wurden Zwischen 14 und 21 Tagen wurde das zerst rte Myokard an vielen Stellen bereits durch neues ersetzt Einige Randregionen zeichnen sich nach wie vor durch ein starkes EZM Aufkommen aus In diesem Zeitraum wird das Myokard allm hlich wieder kompakter aber die Folgen der Sch digung bleiben immer noch gut erkennbar Nach 43 Tagen gibt es nur noch wenige Regionen die noch nicht wieder das geordnete Erscheinungsbild von intaktem Myokard aufweisen 66 Ergebnisse 70 bzw 84 Tage nach der Herzsch digung ist die Regeneration komplett abgeschlossen und kein Unterschied im Vergleich mit den scheinoperierten Kontrollherzen erkennbar 7d postop j 14d postop 4 SAN fy er a 2 3 j p I PL se E Abb 8 Zerst rung und Regeneration des kompakten trabekulierten Myokards nach mechanischer Sch digung des Ventrikels Ausschnitte aus semid nnen toluidinblaugef rbten Transversalschnitten aus A scheionoperierten Herzen B vier C sieben D 14 21 F 43 G 70 und H 84 Tage nach Sch digung Betrachtet man die 40 fachen Vergr erungen in Abb 9 B E so erkennt man die schlauchf rmigen unreifen Trabekel deutlich anhand ihrer nur schwachen Blauf rbung Au erdem befinden sich in ihrem Inneren kaum Zellkerne Daf r befindet sich auf ihren u eren Umrandungen eine Vielzahl von sogenannten Trabekel assoziierten Zellen In manchen
61. ase B Plate0i1_HO01 L lactate Dehydrogenase Plate017 C14 akitivitat Glykolyse Plate020_119 Plate024 A20 Contig 9 Amb mex Ahnlich der Creatine Plate024 P22 Kinase M Kette Plate027_N16 Energie Homeostase Plate030_J17 Entz ndung Stressantwort Regionen Hormonaktivit t von Adipozyten sekretiert Contig 17 Kompl C3 Vorl ufer Komplementaktivierung Contig 77 Thioredoxin interagierendes Protein Abb 15 Grafische Darstellung im Herzen mindestens 2 48 fach runterregulierter cDNS Sequenzen deren Contigsequenzen Ahnlichkeiten zu Komponenten die in metabolische bzw homeostatische Vorg ngen oder in Stressantworten und Entz ndungsreaktionen involviert sind Die je acht Einzelexperimente pro Regenerationszeitpunkt wurden als Combine 7T Combine 14T und Combine 21T zusammengefasst Die linke Spalte zeigt die Plattenkoordinaten der einzelnen Sequenzen Die gr nen Balken zeigen eine verringerte Genexpression gegen ber der Expression in scheinoperierten Kontrollherzen an Die rechte Spalte enth lt die Contignummern sowie eine kurze Beschreibung zu welchen Sequenzen das jeweilige Contig Homologien aufweist und deren biologischen Funktionen Auf der anderen Seite stieg die Expression der Transkripte einiger Zytoskelettproteine besonders ab vierzehn Tagen nach der Herzsch digung wieder stark an Darunter befand sich zum Beispiel auch ein Contig mit Homologie zum dem Glattmuskelprotein Transgelin Andere Transk
62. auf scheinoperiertem Herzen F Vergr erte Aufnahme der TB10 Expression in ungesch digtem Bereich 14d postop 85 Ergebnisse Die in situ Hybridisierungen zur Expressionsanalyse des Subtraktionsklones TB10 Mit einer Homologie zu B Aktin zeigten wie im Falle von TB8 nur positive F rbungen auf den Paraffinschnitten von gesch digten Molcherzen Abb 20 A C E Dabei traten Signale sowohl innerhalb von scheinbar intakten Trabekeln E als auch innerhalb gesch digter regenerierender Areale C auf Die Negativkontrolle sense Probe fiel auch hier positiv aus d h es waren keine Signale detektierbar Abb 20 B Abb 21 Expression des Subtraktionsklons TB14 im gesch digten 14d postop und scheinoperierten Herzen A TB14 as Probe auf gesch digtem Herzen 14d postop B Trichrome gef rbter Nachbarschnitt C TB14 as Probe auf gesch digtem Herzen 14d postop D TB 14 as Probe auf gesch digtem Herzen 14d postop E TB14 s Probe auf gesch digtem Herzen 14d postop F TB14 as Probe auf scheinoperiertem Herzen Die Expression des Subtraktionsklons TB14 mit einer Homologie zur sm MRLC auf Paraffinschnitten von gesch digten Herzen trat sowohl in Form von distinkten Signalen in gesch digten Regionen Abb 21 A C als auch in Form von einer gro fl chigen myokardialen Expression D auf Die Negativkontrolle mit der sense Probe fiel positiv 86 Ergebnisse Abb 21 E aus und im scheinoperierten Herzen konnten keine Expres
63. bei Wirbeltieren 1 3 1 Der Molch Molche sind aquatische urodele Amphibien und geh ren zur Familie der Salamander Drei Molchspezies werden in der experimentellen Biologie bisher untersucht Notophthalmus viridescens der gr nliche Wassermolch aus den USA Pleurodeles walt der iberische Molch und Cynops pyrroghaster der japanische Molch Bei dem ebenfalls h ufig verwendeten Versuchstier Ambystoma mexicanum handelt es sich um einen neotenen larvalen Salamander und nicht um einen Molch W hrend ihres Lebens durchlaufen die Molche drei verschiedene Stadien Als Larven leben sie zun chst im Wasser Nach ihrer vollst ndigen Metamorphose verlieren sie ihre Kiemen und verbringen die n chsten ein bis drei Jahre als so genannte rote Eften im Falle von Notophthalmus virdescens bis zu ihrer Geschlechtsreife an Land Nach dieser zweiten Metamorphose kehren die adulten olivgr nen rotgepunkteten Molche wieder ins Wasser zur ck Brockes and Kumar 2005 Vor der Zeit des Xenopus war der Molch als ein beliebtes Versuchstier f r die Untersuchung der Embryologie von Amphibien Ihre Zellkerne besitzen einen gro en haploiden DNS Gehalt 20 40 pg und verf gen ber gro e Zellen Zellkerne und Chromosomen einschlie lich der bis zu einen Millimeter gro en Lampenb rsten Chromosomen in wachsenden Oocyten Besonders zeichnen sie sich jedoch durch ihr breites regneratives Potential aus Adulte Molche sind in der Lage ihre Extremit ten ihren Schwanz in
64. ben bei 80 C gelagert Die Konzentrationsbestimmung erfolgte mittels des DC Protein Assay kit BioRad Laboratories CA USA nach den Angaben des Herstellers Die fiir jede Messung neu angesetzte BSA Srandardkurve umfasste einen Bereich von 2 20 ug Die colorimetrische Messung erfolgte an einem FLUOstar Galaxy bMG Messger t Die elektrophoretische Auftrennung der Proteine erfolgte unter Verwendung von NuPAGE Novex Bis Tris Gelen 4 12 Invitrogen Germany in dazu passenden Gelelektrophoresekammern in einem 1x MES SDS Running Buffer NuPAGE Invitrogen Pro Tasche wurden 10ug Protein aufgetragen Dazu wurden xul Proteinl sung mit 2ul EP und yul LB DTT Puffer auf ein Volumen von 10ul gebracht Durch den Zusatz von je 0 4 ul Bromphenolblaulsg konnte die Migration der Proben auf der SDS PAGE visualisiert werden Als Gr enstandard wurden 5 ul BenchMark Invitrogen Germany mit aufgetragen Die ersten 15 min wurden die Gele einer Spannung von 75V die restlichen ca 1 5h bei 130V ausgesetzt Anschlie end wurden die aufgetrennten Proteine aus dem Gel in einem XCell II Blot Module Invitrogen Germany elektrisch auf eine Nitrocellulosemembran 0 2 um Porengr e Invitrogen Germany f r drei Stunden bei 30 V geblottet Anschlie end wurden die Membranen fiir 2 5 min in Red Alert Lsg Novagen Germany gefarbt und zwischen Filterpapier bis zum Scannen getrocknet Nach dem Scannen wurden die Membranen anhand der Markerbanden in geeignete
65. brafischen gegen ber S ugetieren Generell stellt die Teilungsf higkeit von Zellen eine wichtige Voraussetzung f r die Erneuerung von gesch digtem Gewebe dar Fr he Arbeiten von Oberpriller et al konnten mittels Autoradiographien nach H3 Thymidininjektionen und elektronenmikroskopischen Analysen bereits zeigen dass infolge der Amputation kleiner Teile des Atriums zehn Tage bzw 20 Tage nach partieller Amputation des Ventrikles in den Randzonen der Wunde eine maximale DNS Syntheserate und Mitoserate innerhalb der Kadiomyozyten beobachtet werden konnte Die DNS Syntheserate betrug f r Kardiomyozyten in der Randzone des gesch digten Atriums 9 8 und die Mitoserate betrug 0 2 F r die ventrikul ren Kardiomyozyten konnten DNS Syntheseraten von ebenfalls 10 und 0 9 mitotisch aktive Myozyten ermittelt werden McDonnell and Oberpriller 1984 Oberpriller and Oberpriller 1974 In einem etwas ver ndertem Experiment in dem das amputierte Gewebe der Ventrikelspitze zur Vergr erung des reaktiven Wundbereichs zun chst zerkleinert und anschlie end auf die Wunde zur ckgegeben wurde konnte sich ein kleiner Teil des Herzmuskeltransplantats in die Wunde integrieren Die st rkste proliferative Aktivit t der retransplantierten Kardiomyozyten konnte mit 24 3 DNS Syntheserate und 2 61 Mitoserate 16 Tage nach der Amputation beobachtet werden Bader and Oberpriller 1979 Ein Fall in dem Zellteilungen von adulten S ugerkardiomyozyten dok
66. btraktionsklonen 75 l sst sich zum einen anhand der starken Redundanz innerhalb der nichtnormalisierten cDNS Bibliothek erkl ren Das es sich bei dem identifizierten Transkript um einen falsch positiven nicht subtrahierten Klon handeln k nnte widerlegen die Ergebnisse der RT PCRs und der in situ Hybridisierungen Hier konnte nur ein Produkt auf cDNS von gesch digten Herzen bzw aus Magengewebe amplifiziert werden Auch die in situ Hybridisierungen ergaben eine eindeutige differentielle Expression Zum anderen k nnten dieser Umstand wie auch die Ergebnisse der Immunfluoreszenzanalysen mit f r andere Glattmuskelproteine spezifischen Antik rpern einen weiteren Hinweis auf die strukturellen Ver nderungen der Molchkardiomyozyten w hrend der Regeneration darstellen Diese Ver nderungen spielen m glicherweise eine entscheidende Rolle f r die besondere Proliferationsf higkeit und De bzw Redifferenzierungsf higkeit der Kardiomyozyten des Molches 4 6 2 Entstehung verschiedener Expressionsmuster bei den in situ Hybridisierungen mit den Subtraktionsklonen TB14 und TB25 Wie bereits erw hnt erfolgte die Herstellung der RNS Proben f r die in situ Hybridisierungen unter Einbeziehung der gesamten cDNS Sequenz und nicht nur der homologen Regionen Daher k nnte die Hybridbildung theoretisch auch die Expression eines anderen Genes widerspiegeln Die gro fl chigen myokardialen Expression der Klone TB 14 und TB 25 scheinen die Expression der Myo
67. chiedenen Gr nden f r die Herstellung einer cDNS Bibliothek geeignet Zum Einen ist bereits von Oberpriller et al unter Verwendung eines anderen Sch digungsmodells gezeigt worden dass in diesem Zeitraum besonders Myozyten im Randbereich des gesch digten Areals eine verst rkte Proliferationsaktivit t aufweisen Bader and Oberpriller 1979 McDonnell and Oberpriller 1984 Oberpriller and Oberpriller 1974 Zum Anderen ergab die lichtmikroskopische Analyse von Toluidinblaugef rbten semid nnen Schnitten von verschiedenen Zeitpunkten nach der ventrikul ren Sch digung auch im vorliegenden Sch digungsmodell ein Maximum an Zellkernteilungen 14 Tage nach der Sch digung Die bereits bekannte F higkeit von Amphibien mittels starker Zellteilung sowohl differenzierter Zelltypen z B Myozyten als auch dedifferenzierter Zelltypen gesch digtes Gewebe vollst ndig und funktionell zu 71 Ergebnisse ersetzen stellt einen wesentlichen Vorteil der Amphibien gegen ber den S ugetieren dar Die Mechanismen die zu diesem Vorteil f hren sollten mit Hilfe der cDNS Bibliothek und der anschlie end hergestellten Macro und Microarrays untersucht werden F r die Herstellung der cDNS Bibliothek wurden 14 Tage nach der mechanischen Sch digung die Ventrikel von 30 Tieren entnommen und aus diesen das ben tigte eine Mikrogramm m RNS isoliert Nach der cDNS Synthese und weiterer Prozessierung der erhaltenen Fragmente enzymatischer Verdau Gr enfrak
68. chtkulturen inokuliert und die entsprechenden Plasmid DNS isoliert Die Plasmide wurden sowohl mit dem Restriktionsenzym Sfil fragmentiert als auch sequenziert Die erhaltenen Sequenzen wurden zun chst mit Eintr gen aus den Datenbanken BLASTn und BLASTx verglichen und entsprechend ihrer Sequenzhomologien untereinander zusammengefasst 80 Ergebnisse Ld A a 3 B I as Abb 17 Beispiel von zwei Koloniefiltern die jeweils mit zwei verschiedenen radioaktiv markierten cDNS Sonden hybridisiert wurden A verwendete Sonde enth lt Transkripte die im regenerierenden Herzen unterrepr sentiert sind B verwendete Sonde basiert auf Transkripten die w hrend der Regeneration angereichert wurden Se e om ca ey u en nn MF de lk be Se a B MZ gt w LLL L L T Baye oe quuun ne ovowpas MA s ca am ie es Gem en am n uuu Gouuw Abb 18 Sfil Restriktionsverdau der Filterklone Hier dargestellt sind die Klone die aus der Hybridisierung mit der cDNS Subtraktions Sonde die mit cDNS aus gesch digten Herzen angereichertwurde A zeigt die verdaute Plasmid DNS der Klone TB1 TB15 B zeigt die verdaute Plasmid DNS der Klone TB16 TB30 C zeigt die verdaute Plasmid DNS der Klone TB31 TB45 D zeigt die verdaute Plasmid DNS der Klone TB46 TB59 M1 A EcoRI HindIII DNS Gr enstandard M2 pUCI18 Sau3A DNS Gr enstandard 81 Ergebnisse Klon Fragmentgr e Ergebn
69. chung weiterer Zielproteine innerhalb des MAPK und Akt Signalweges auf m gliche durch den Inhibitor induzierte Deregulationen 30 und 120 min nach der Herzsch digung 111 Ergebnisse P p70 S6 Kinase Thr 412 Ser 424 P S6 ribosomales Protein Ser 240 244 P GSK 3 Ser 9 Ponceau Rot gefarbte Aktinbanden als ei eer Ladungskontrollen Abb 42b Untersuchung weiterer Zielproteine innerhalb des MAPK und Akt Signalweges auf m gliche durch den Inhibitor induzierte Deregulationen 30 und 120 min nach der Herzsch digung 3 6 2 4 Untersuchung des Einflusses der U0126 Behandlungen auf die Proteinexpression von Zytoskelettproteinen und Mitose bzw S Phasen Markern in gesch digten Herzen Fiir die vier sieben und 14 Tage Versuchsgruppen erhielten die Molche wie bereits beschrieben zun chst zwei Stunden vor der Herzsch digung i p Injektionen des Inhibitors bzw des L sungsmittels An den darauffolgenden Tagen wurden sie jeweils einmal t glich injiziert Den 4 Tage Gruppen wurden die Herzen am Tag nach der 4 Injektion entnommen der 7 Tage Gruppe drei Tage sp ter und der 14 Tage Gruppe zehn Tage sp ter Auff llig war die st rkere Myosin Schwere Kette Expression in den U0126 Proben vier Tage nach Herzsch digung Die MyHC Expression zeigte sieben Tage sp ter keine gro en Unterschiede mehr zu der nur mit L sungsmittel behandelten Gruppe 14 Tage sp ter war die Expression in den Kontrolltieren st rker als i
70. cken gewischt wurden bei maximal 4 Chips pro Objekttr gerhalterung nach folgendem Schema gewaschen Waschschritt Beschreibung SSC pH 7 0 SDS 10 Dauer min 1A 2x SSC 0 03 SDS 200 ml 2x 0 6 ml 10 min 1B 2x SSC 200 ml 2x 10 min 2 1x SSC 200 ml 1x 5 min 3 0 2x SSC 200 ml 0 2x 2 min Tab 7 Zusammensetzung der Waschpuffer und Dauer der Waschschritte nach der Hybridisierung Dabei wurden zun chst die Deckgl schen vorsichtig mit einer Pinzette entfernt und maximal 4 Chips pro K vette nach den Angaben in der Tabelle vorsichtig gesch ttelt Anschlie end wurden die Chips einzeln in einem 50 ml R hrchen bei 600 rpm f r 2 min zentrifugiert um die restliche Fl ssigkeit zu entfernen Die trockenen Chips wurden dann trocken und dunkel bis zum Scannen gelagert 2 2 10 3 In situ Hybridisierung auf Gewebeschnitten Die Technik der in situ Hybridisierung wurde im Labor von David Wilkinson etabliert und stellt eine Methode zur Untersuchung von Expressionsmustern auf Transkriptionsebene RNA dar Dabei wird die auf Komplementarit t der Nukleotide beruhende Hybridausbildung zwischen endogener Ziel RNS sense und in vitro synthetisierter markierter antisense RNS ausgenutzt In dieser Arbeit erfolgte die Markierung der RNS Proben durch Einbau von Digoxigenin 11 UTP Die Hybridausbildung konnte dann mit Hilfe eines Anti Digoxigenin Antik rpers welcher wi
71. cyan Indocarbocyan beziehungsweise Tag e 4 6 Diamidino 2 Phenylindol Diethylpyrocarbonat das hei t zweifach destilliertes H2O Digoxigenin Desoxyribonukleins ure Desoxyribonuklease Desoxynukleosidtriphsophat 1 4 Dithiothreit Escherichia coli Ethylendiamintetraacetat et altera Ethanol Extrazellul re Matrix Fibroblast Growth factor Stunde 158 Anhang hpf HRP in vitro in vivo LB M u MeOH MHC MSCs NBT PCR PDGF postop PFA RNase RNS RNA rpm RT SDS PAGE S Phase Taq TPA Tris TRITC hours past fertilisation Stunden nach der Befruchtung Horseradisch Meerrettich Peroxidase in der Zellkultur au erhalb des Organismus im lebenden Organismus Luria Bertani Kulturmedium molar Mikro 110 Methanol Myosin Heavy Chain Mesenchymale Stammzellen Nitro blau Tetrazoliumchlorid Polymerase Ketten Reaktion Platelet Derived Growth Factor nach der Operation Paraformaldehyde Ribonuklease Ribonukleins ure rounds per minute Umdrehungen pro Minute Raumtemperatur Natrium dodecylsulfate Polyacrylamide Gelelektrophorese Synthese Phase des Zellzyklus Thermus aquaticus 12 0 Tetradecanoylphorbol 13 acetat Tris hydroxymethyl aminomethan Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanat 159 Anhang 8 2 Negativkontrollen fiir Immunfluoreszenzfarbungen Normale Farbung 1 u 2 Ak Negativkontrolle nur 2 AK A B Cy2 anti Maus sw 02 Cy3 anti Maus SW
72. d mit geringer oder ganz ohne Narbenbildung ersetzen Ein besseres Verst ndnis der Mechanismen die der Regeneration zu Grunde liegen stellt eine wichtige Grundlage f r eine erfolgreiche Manipulation oder Aktivierung von regenerativen Prozessen im menschlichen Herzen dar 4 1 Vor und Nachteile der Verwendung des Molches als Modellorganismus f r die Analyse der Herzregeneration Das breite Spektrum von regenerationsf higen Organen bzw Organstrukturen wie den Extremit ten dem Schwanz dem Gehirn und dem R ckenmark den Linsen und der Retina den Haarzellen des sensorischen Epithels im Innenohr den Kiefern und dem Herzen machen den adulten Molch zum Champion der Regenerationsf higkeit Die Entschl sselung der der Regenerationsf higkeit zu Grunde liegenden Mechanismen stellt ein wichtiges und attraktives Forschungsgebiet dar Die komplizierte und uneffektive Z chtung der Molche unter Laborbedingungen behindern oder verhindern bisher sogar den Einsatz von in anderen Modellorganismen etablierten genetischen Analysen wie die einfache Herstellung von transgenen oder knock out Tieren Dar ber hinaus werden die M glichkeiten standardisierte Versuchsbedingungen innerhalb der einzelnen Versuchstiergruppen anzuwenden dadurch erschwert dass die in der freien Wildbahn eingefangenen Tiere unterschiedlich alt sind und h ufig Pathogene etc mit in die Versuchstierhaltung einschleppen Dar ber hinaus sind der Lieferumfang und die Lieferzeiten stark von d
73. dargestellt Die vergr erten Ausschnitte zeigen dass es sich bei den MyHC negativen Bereichen nicht um Artefakte sondern um intaktes von Zellen besiedeltes Gewebe handelt in dem vor bergehend kein MyHC mehr exprimiert wurde Abbildung 28 zeigt die Expression von Myomesin A C und a Aktinin vier und 21 Tage nach Herzsch digung Auch hier spiegeln sich die f r die Expression von MyHC gemachten Beobachtungen wieder Die Abb 28 E F zeigen die f r die Antik rper spezifischen quergestreiften F rbungen der M Banden E und der Z Scheiben F deutlich Myomesin a Aktinin 4d postop Q O a e Q N Abb 28 Transiente Reduktion der Expression von Myomesin und a Aktinin nach mechanischer Sch digung des Ventrikels Immunfluoreszenzen mit Antik rpern gegen Myomesin rot A C a Aktinin gr n B D und Dapi Kernf rbung blau vier Tage bzw 21 Tage nach Herzsch digung Die 40 fachen Vergr erungen zeigen die spezifische Anf rbung der M Banden E durch Myomesin und der Z Scheiben F durch a Aktinin 94 Ergebnisse 3 5 2 Die Neubildung des Myokards nach mechanischer Sch digung des Ventrikels wird von Extrazellul ren Matrix Proteinen wie Fibronektin und KollagenVI unterst tzt Im scheinoperierten ungesch digten Herzen setzt sich die Myozyten umgebende Extrazellul re Matrix haupts chlich aus KollagenVI Proteinen und zu einem geringeren Anteil aus Fibronektin zusammen vgl Abb 29 A Abb 30
74. das Verh ltnis umgekehrt W hrend die Myosin Schwere Kette Expression in den mit dem Inhibitor behandelten Herzen 14 Tage nach Herzsch digung das Expressionsniveau der ungesch digten Kontrollherzen erreicht hatte zeigten die mit L sungsmittel behandelten Herzen eine deutlich st rkere Expression Die ebenfalls untersuchte Expression des Troponin T hat den Expressionsverlauf der Myosin Schwere Kette nicht widergespiegelt Diese Beobachtungen k nnten auf eine beschleunigte Regeneration und Redifferenzierung der Kardiomyozyten hinweisen In Bezug auf die 135 Diskussion Analyse der Expression von Proliferationsmarkern wie dem phosphorylierten Histon 3 und PCNA konnte die bei der Ausz hlung der Mitosen generell ermittelte Tendenz dass die Proliferationsrate im Verlauf der Regeneration zunimmt und vierzehn Tage nach der Herzsch digung am h chsten ist reproduziert werden Zwischen den beiden Versuchsgruppen konnten keine signifikanten Unterschiede ermittelt werden Eine m gliche Erkl rung f r die Detektion der unterschiedlichen Mengen des Proteins Myosin Schwere Kette nach vier und 14 Tagen nach Herzsch digung k nnte ein ver nderter Ablauf der Umbauprozesse des Zytoskelettes die im Rahmen der Regeneration stattfinden darstellen Aus diesem Grund wurde die Expression zweier bekannter Aktin Depolymerisationsfaktoren im Verlauf der Regeneration und der U0126 Behandlung untersucht Ab dem vierten Tag nach der Herzsch digung stieg di
75. der cDNS Microarrays mit verschiedenen GEwebeprobe ii sie ae oss oe carb ee eE e ledges EEE ghey ack 74 Deregulation verschiedener Gene w hrend der ersten drei Wochen deriklerzrescneralion sea eis IB Rs 76 CDNS SUbLLAKUSN uk a AO N TEAR 80 Inhaltsverzeichnis 3 3 3 1 3 3 3 2 3 4 3 4 1 3 4 2 3 5 3 5 1 32 3 5 3 3 5 4 3 6 3 6 1 3 6 2 3 6 2 1 3 6 2 2 3 6 2 3 Hybridisierung der Koloniefilter mit radioaktiv markierten subtrahierten eDNS Sonden nee ann 80 Expressionsanalyse der Filterklone mittels RT PCR auf cDNS aus verschiedenen Geweben des Molches ussessesseenneennesnensnenen 83 In situ Hybridisierungen auf Paraffinschnitten von gesch digten und scheinoperlerlen Herzen zu 202 84 In situ Hybridisierungen mit in situ Proben von verschiedenen Subtraktionsklonen auf Paraffinschnitten u 2u0nner rennen 84 Untersuchung der Expression ausgew hlter Gene in gesch digten Molchherzen mittels in situ Hybridisierungen 89 Immunfluoreszenzf rbungen auf Gefrierschnitten u eeeeee 93 Reduktion der Expression von Sarkomerproteinen w hrend der Herzreseneration im Molch 2 nn 2 93 Die Neubildung des Myokards nach Sch digung des Ventrikels wird von Proteinen der Extrazellul ren Matrix unterst tzt 95 Zunahme der Expression von glattmuskelspezifischen Proteinen und von Thymosin 4 im Verlauf der Herzregeneration e 98 Expressio
76. der nur distinkte Areale wie in Abb 23 C gef rbt oder gro fl chige Bereiche im ungesch digtem oder regenerierenden Myokard siehe Abb 23 A B D Im scheinoperierten Herzen und auf der Negativkontrolle war keine F rbung detektierbar 88 Ergebnisse 3 4 2 Untersuchung der Expression ausgew hlter Gene im gesch digten Molchherzen mittels in situ Hybridisierung Die lokale Genexpression von den Molchhomologen zu Thymosin 4 Zytokeratin 18 und a Glattmuskel Aktin wurde zum einen basierend auf den Ergebnissen der Chiphybridisierungen verst rkte Expression im gesch digten Herzen und zum anderen aufgrund ihrer bereits beschriebenen Relevanz innerhalb von regenerativen Prozessen untersucht Thymosin 4 ist ein Peptid dass an das monomere G Aktin bindet und dadurch dessen Polymerisation zu Mikrofilamenten verhindert Thymosin 4 wird in die Wundfl ssigkeit sekretiert Es unterst tzt die kardiale Zellmigration das berleben und die Reparatur Bock Marquette et al 2004 Au erdem wird Thymosin 4 auch w hrend der Herzregeneration im Zebrafisch im Bereich der Wunde und im umgebenden kompakten Myokard exprimiert Lien et al 2006 Keratine sind im herk mmlichen Sinne Marker f r epitheliale Differenzierung In niedrigeren Organismen findet man diese aber auch in nicht epithelialen Zellen vorwiegend in mesenchymalen Vorl uferzellen w hrend der Regeneration von Organstrukturen Die Expression von Zytokeratin 18 konnte be
77. derte die neuronale Differenzierung bei gleichzeitiger Erh hung der Aktivit t der Caspase 3 Li et al 2006 Neben den bereits erw hnten Differenzierungsprozessen spielt der Erk MAP Kinase Signalweg auch in Transdifferenzierungsprozessen wie sie im Verlauf der Regeneration auftreten k nnen eine wichtige Rolle So k nnen zum Beispiel die pigmentierten Epithelzellen der Retina RPE in alle Zelltypen die die neurale Retina zusammensetzen transdifferenzieren Organkulturen bestehend aus RPE Zellen und mittels einem Membranfilter abgetrennter Aderhaut sind f r die Proliferation und Differenzierung der RPE Zellen in Neuronen ausreichend da diffusible Faktoren aus der Aderhaut f r die Transdifferenzierung der RPE Zellen verantwortlich zu sein scheinen und deshalb direkter Zellkontakt notwendig ist Die Transdifferenzierung Konnte durch Zusatz von U0126 verhindert werden Der Effekt des U0126 war reversibel Mitsuda et al 2005 Die Aktivierung des Erk MAP Kinase Signalweges wird auch mit Zell berlebens und Zellschutzmechanismen in Verbindung gebracht Die chronische Aktivierung dieses 137 Diskussion Signalweges K nnte daher eine sinnvolle therapeutische Strategie darstellen Badrian et al untersuchten die Wirkung einer konstitutiv aktivierten Form von MEK auf neonatale Rattenmyozyten unter Bedingungen des Glukoseentzugs Die berexpression konnte die Anzahl der in Folge des Glukoseentzugs absterbenden Kardiomyozyten halbieren Bei
78. diomyozyten insgesamt Deb et al 2003 Hocht Zeisberg et al 2004 Laflamme et al 2002a Muller et al 2002 Summa summarum zeigen die Daten der klinischen Transplantationsstudien dass endogene zirkulierende Vorl uferzellen in erster Linie die Gef neubildung besonders des Endothels und in geringerem Umfang im Glatten Muskel unterst tzen Der Anteil an chim ren Kardiomyozyten ist hingegen sehr gering Laflamme and Murry 2005 29 Einleitung 1 7 3 Der Einsatz von Zytokinen zur gezielten Mobilisierung von endogenen Vorl uferzellen Die zuvor genannten Beobachtungen der Teilnahme von endogene Vorl uferzellen aus dem Knochenmark an den Reparaturprozessen nach einem Infarkt resultierten in Bestrebungen solche Zellen gezielt mittels Zytokinen wie dem gut untersuchten Granulozyten stimulierenden Faktor G CSF zu mobilisieren Mehrere Gruppen berichteten von verbesserten ventrikul ren Funktionen durch G CSF Behandlungen nach Infarkten in M usen Orlic et al 2001 Ratten Sugano et al 2005 und Schweinen Iwanaga et al 2004 Andererseits gab es auch Berichte in denen solche Behandlungen keinen Nutzen Deten et al 2005 brachten Die Gr nde f r die unterschiedlichen Effekte sind bisher unbekannt Da G CSF keinen Einfluss auf die kontraktile Funktion des Herzens hat und mehr als 99 der mobilisierten Zellen Makrophagen und Granulozyten sind scheinen die zus tzlich aktivierten Leukozyten positiv auf die Reparatur des
79. e Proteinexpression von Cofilin und Destrin in den gesch digten mit L sungsmittel behandelten Kontrollherzen leicht an und verst rkte sich innerhalb der untersuchten 14 Tage Herzproben Die mit dem MEK1 2 Inhibitor behandelten Herzen hatten vier Tage nach Herzsch digung ein hnlich niedriges Expressionsniveau wie die ungesch digten Kontrollherzen In den Inhibitor injizierten Herzen stieg die Expression nach sieben bzw 14 Tagen deutlich an ohne sich jedoch von den gesch digten mit L sungsmittel behandelten Kontrollherzen zu unterscheiden Diese Ergebnisse lassen sich auf Grund der nur sehr moderaten Unterschiede vorsichtig ebenfalls in Richtung einer ver nderten Dynamik der Regeneration interpretieren 4 9 3 Die transienten oder kontinuierlichen Injektionen von U0126 haben keinen signifikanten Einfluss auf nachfolgende Phosphorylierungen oder Proteinexpressionen Die durch den Inhibitor ausgel ste verringerte Phosphorylierung der MEK1 2 und der Erk1 2 Kinase erfolgte nur kurz nach der Herzsch digung und blieb nicht einmal 24 Stunden bestehen Auch die t glichen Injektionen konnten keine detektierbare Hemmung der Zielkinasen ausl sen Die Erk Kinase war 14 Tage nach der Herzsch digung noch etwas st rker aktiviert als in den ungesch digten Kontrollherzen Beim Vergleich der Auswirkungen der transienten 4 t gige Inhibitorinjektion mit der kontinuierlichen 14 tagigen Inhibitorinjektion konnten keine signifikanten Unterschiede der P
80. e Komponenten erg nzt 8 ul 5x Reaktionspuffer 4 ul DTT 0 1 M 4 ul dNTP Mix 10 mM 1 ul RNase Inhibitor Rnasin 40 U gesamt 2 ul SuperScript II Reverse Transkriptase Invitrogen 200 U ul Der vollst ndige Reaktionsansatz wurde f r 60 min bei 42 C im Heizblock inkubiert Abschlie end wurde die Reverse Transkriptase durch eine zehnmin tige Inkubation bei 70 C hitzeinaktiviert Vor dem Einsatz in der PCR wurde der Ansatz gegebenenfalls noch verd nnt 2 2 6 cDNS Subtraktion Das in dem PCR Select cDNA Subtraction Kit Clontech angewendete Verfahren erm glicht die Isolation differentiell exprimierter Sequenzen durch selektive Amplifikation Aus zwei unterschiedlichen Proben wird mRNA isoliert und aus dieser cDNS synthetisiert Abb 5 zeigt ein Schema der cDNS Subtraktion M chte man sowohl 47 Material und Methoden Gene identifizieren welche in einem bestimmten Zustand stark als auch schwach exprimiert werden im Vergleich zu einem Kontrollzustand f hrt man die Subtraktion in zwei Richtungen durch Experiment cDNS Kontroll cDNS Experiment cDNS Adapter 1 im Uberschuss Adapter 2R a E gt CER 1 Hybridisierung a E H m a B o B m B p m n c EEE Cc d EE d a b c d 2 Hybridisierung Zugabe der Primer PCR Amplifikation a d keine Amplifiakation gt b b keine Amplifikation c lineare Amplifikation Abb 6 Schema der cDNS Subtraktion Die Abbildung wurd
81. e bereits beschrieben weiter verfahren worden 2 2 4 DNS Sequenzierung Die DNS Sequenzierung erfolgte nach der Kettenabbruchmethode Sanger et al 1977 Dabei wurde nach Protokollen der Firma ABI Applied Biosystemts durch Dye Terminator Cycle Sequencing in der automatischen Sequenziermaschine 310 Genetic Analyser ABI Pro Reaktion wurden 100 200 ng Plasmid 4 ul Ready Reaction Premix 2 ul 5x Big Dye Sequencing Puffer und 1 ul Oligonukleotid 5 pmol eingesetzt und mit H20 auf 10 ul aufgef llt 46 Material und Methoden 2 2 5 Amplifikation von DNS Fragmenten mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion PCR Mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion l sst sich ein DNS Segment das von bekannten Sequenzen begrenzt wird durch eine sich zyklisch wiederholende Abfolge von Reaktionsschritten amplifizieren Saiki et al 1988 Durch den Einsatz geeigneter genspezifischer Primer und der Taq DNS Polymerase wurden bestimmte Genfragmente amplifiziert und nachgewiesen 2 2 5 1 RT PCR Mittels der RT PCR lassen sich spezifische mRNS Molek le nach vorheriger reverser Transkription nachweisen cDNS Erststrangs ynthese F r die Synthese einzelstr ngiger zur mRNS komplement rer DNS cDNS wurden 1 4 ug Gesamt RNS und 1 ug Oligo dT Oligonukleotide in einem Volumen von 21 ul f r 10 min bei 65 C zusammen inkubiert Nach erfolgter Aufl sung von Sekund rstrukturen wurde der Reaktionsansatz auf Eis abgek hlt und durch folgend
82. e in direkter An 7 eae lehnung an das CLONTECH PCR Select e exponentielle Amplifikation cDNA Subtraction Benutzerhandbuch 3 So 5 erstellt im 5 3 Auf Abweichungen von den Angaben im Benutzerhandbuch wird im Folgenden eingegangen e Fir den Ligationseffizienztest wurden statt der mitgelieferten G3PDH Oligonukleotide die f r murines und humanes Gewebe spezifisch sind vorher getestete Aktin Oligonukleotide verwendet 48 Material und Methoden e Zur Untersuchung der Subtraktionseffizienz wurden sowohl die nicht subtrahierten cDNSs als auch die subtrahierten cDNSs zun chst mittels der verschachtelten PCR amplifiziert elektrophoretisch aufgetrennt auf eine positiv geladene Polyamidmembran transferiert und mit einer radioaktiv markierten Sonde gegen Aktin hybridisiert 2 2 7 Konstruktion einer cDNS Bibliothek F r die Herstellung einer cDNS Bibliothek aus 1 ug mRNS aus 30 Molchherzen ist das Creator Smart cDNA Library Construction Kit Clontech verwendet worden Die im Kit enthaltenen optimierten Oligonukleotide und Enzyme sollen vor allem die Anreicherung vollst ndiger cDNSs w hrend der Erst und Zweitstrangsynthese beg nstigen Im Wesentlichen wurde nach den Angaben des Herstellers verfahren Allerdings wurden f r die Zweitstrangsynthese mittels Oligonukleotid Verl ngerung statt drei Amplifikationsrunden f nfzehn Runden ben tigt F r die Ligation in den Plasmidvektor hat sich der Einsatz von 1
83. e present in adult human heart A study of gender mismatched bone marrow transplantation patients Circulation v 107 p 1247 1249 Dell Era P R Ronca L Coco S Nicoli M Metra M Presta 2003 Fibroblast growth factor receptor 1 is essential for in vitro cardiomyocyte development Circ Res v 93 p 414 420 Deten A HC Volz S Clamors S Leiblein W Briest G Marx H G Zimmer 2005 Hematopoietic stem cells do not repair the infarcted mouse heart Cardiovasc Res v 65 p 52 63 147 Literaturverzeichnis Dinsmore Charles E April 2001 Regeneration Principles In ENCYCLOPEDIA OF life SCIENCES john WILEY amp Sons Ltd Chichester http www els net doi 10 1038 npg els 0001112 Doetschman TC H Eistetter M Katz W Schmidt R Kemler 1985 The in vitro development of blastocyst derived embryonic stem cell lines formation of visceral yolk sac blood islands and myocardium J Embryol Exp Morphol v 87 p 27 45 Dudley AT E J Robertson 1997 Overlapping expression domains of bone morphogenetic protein family members potentially account for limited tissue defects in BMP7 deficient embryos Dev Dyn v 208 p 349 362 Duellmann WE L Trueb 1994 Biology of Amphibians Johns Hopkins University Press USA p 397 400 Ebelt H M Jungblut Y Zhang T Kubin S Kostin A Technau S Oustanina S Niebrugge J Lehmann K Werdan T Braun 2007 Cellular cardiomyoplasty improvement of left ventricular function correlates
84. e von 10 um am Rotationsmikrotom RM 2145 Leica angefertigt und auf mit Vectabond Reagenz beschichteten Objekttr gern platziert Nachdem die Schnitte auf einer Heizplatte bei 45 C mindestens 30 Minuten gestreckt wurden konnte die Lagerung bei 4 C bzw RT erfolgen 60 Material und Methoden 2 2 13 3 Einbettungen in Gefriermedium Frisch pr pariertes Gewebe wurde nach kurzem Waschen in PBS entweder direkt in ein mit fl ssigem Stickstoff vorgek hltes Eppendorfgef oder in eine kleine aus Parafilm gefaltete mit Kryoeinbettungsmedium gef llte Tasche berf hrt und in fl ssigem Stickstoff eingefroren Bis zum Schneiden wurden die Gewebe bei 80 C gelagert Die gefrorenen Gewebest cke wurden vor ihrer Einbettung mit einer in fl ssigem Stickstoff vorgek hlten Pinzette im Kryostaten in gew nschter Orientierung platziert Auf einen Objekthalter wurde etwas Gefriermedium gegeben und so lange gewartet bis sich dieses milchig wei verf rbt und langsam fest wird dann wurde das Gewebe darauf platziert kurz in fl ssigen Stickstoff getaucht und mit einem weiteren Tropfen Gefriermedium bedeckt Der Objekthalter wurde bis zum vollst ndigen gefrieren des Einbettungsmediums in fl ssigen Stickstoff getaucht F r die Anfertigung der 6 um dicken Gefrierschnitte wurde im Kryostaten CM 3050 S Leica eine Kammertemperatur von 25 C und eine Objekthaltertemperatur von 21 C eingestellt Die Schnitte wurden auf mit silikonbeschichtete oder
85. ederum mit dem Enzym alkalische Phosphatase gekoppelt ist in einer Farbreaktion nachgewiesen werden Als Negativkontrolle wurde neben der antisense Probe eine ebenfalls synthetisierte sense Probe mit untersucht Die sense Probe sollte mit der Ziel RNS kein Signal geben da die beiden Sequenzen miteinander bereinstimmen und daher nicht hybridisieren k nnen Alle f r den ersten Tag verwendeten L sungen sind zuvor mit 0 1 Diethylpyrocarbonat DEPC behandelt worden 56 Material und Methoden Tag 1 Hybridisierung Schritt Dauer Zusammensetzung Beh lter Xylol 96 EtOH 70 EtOH 50 EtOH 30 EtOH PBS 2x 7 min 3x 2 min 1x 2 min 1x 2 min 1x 2 min 2x 5 min Kiivette Kiivette Kiivette Kiivette Kiivette Kiivette Proteinase K 1x 5 min 10 ug ml in PBS Kiivette 2 mg ml in PBS 4 PPA O 2 Glutaraldehyd 0 25 in 0 1 M Triethanolamin Glycin 1x 10 min Kiivette PFA Glutaraldehyd 1x 15 min Kiivette Essigs ureanhydrid 1x 10 min K vette PBS 2x 5 min Kiivette Hybridisierungspuffer 1x 20 min feuchte Kammer 65 C RNS Probe 100 200 ul Objekttr ger ca 100 ng 200 ul ber Nacht feuchte Kammer 70 C Tab 8 Inkubationsschritte am ersten Tag 100 ng der RNS Proben wurden zu 200 ul Hybridisierungspuffer gegeben und durch Inkubation bei 80 C f r 10 Minuten denaturiert Anschlie end wurden die Proben auf die Schnitte pipettiert und diese mit Deckgl schen abgedeckt Tag 2 Anti
86. ege angereicherten cDNS dienten im Folgenden als Grundlage f r die Herstellung radioaktiv markierter Sonden f r die Hybridisierung der Koloniefilter 3 3 3 1 Hybridisierung der Koloniefilter mit radioaktiv markierten subtrahierten cDNS Sonden Die zwei aus der cDNS Subtraktion resultierenden Proben wurden radioaktiv markiert und als Sonden f r die Hybridisierungen der Koloniefilter eingesetzt Dabei enthielt die eine Probe cDNS von Transkripten die w hrend der Regeneration nach 14 Tagen stark angereichert wurden und die andere entsprechend cDNS von Transkripten die im regenerierenden Herzen nicht pr sent sind Um die komplette 100 000 Klone umfassende Bibliothek ber cksichtigen zu k nnen mussten die 7 Filtersets mit beiden Proben einzeln hybridisiert werden Die anschlie ende Auswertung der Signale auf den Koloniefiltern ergab 59 positive Signale f r die Hybridisierung mit der Sonde die Transkripte enthalten sollte welche im regenerierenden Herzen h ufig vorkommen Mit der anderen Probe konnten ca 490 positive Signale detektiert werden Im Rahmen dieser Arbeit sind bisher nur die 59 Signale aus der einen Subtraktionsrichtung weiter analysiert worden In Abb 17 sind zwei hybridisierte Filter als Beispiel dargestellt Zun chst wurden entsprechend der zuvor bestimmten Koordinaten der Signale auf den Filtern die Koordinaten der Klone in den 384er Platten ermittelt Anschlie end wurden aus den Glycerolstocks der identifizierten Klone berna
87. egenerieren k nnen Alvarado 2000 Es gibt einige St mme wie die Rotiferen und Nematoden bei denen die Anzahl der mitotischen Zellteilungen bereits w hrend der Embryonalentwicklung festgelegt ist Zellkonstanz und somit kaum eine M glichkeit zur Regeneration oder asexuellen Reproduktion im adulten Organismus besteht Auch innerhalb nahverwandter Spezies wie den Schnurw rmern Lineus ruber und Lineus viridis die sich makroskopisch kaum unterscheiden lassen kann sich nur Lineus ruber bidirektional regenerieren und der andere Schnurwurm scheinbar nicht Brockes et al 2001 Urodele Amphibien k nnen komplette Gliedma en regenerieren w hrend Planarien neue Organismen aus 1 279 ihres K rpers bilden k nnen Alvarado 2000 Die gro e Variabilit t und die evolution ren Distanzen zwischen den Tieren welche regenerative F higkeiten besitzen sind erstaunlich und werfen die Frage auf ob es verschiedene Arten der Regeneration gibt und jeder Stamm wom glich seine eigenen Strategien entwickelt hat oder ob die Mechanismen der Regeneration auf einen gemeinsamen Vorfahren zur ckgehen Um diese Frage zu beantworten muss man einen Blick auf die bereits bekannten Strategien der Regeneration werfen Alvarado 2000 Von T H Morgan 1866 1945 wurde zun chst eine Unterteilung in zwei Gruppen unternommen 1 Regeneration die in Abwesenheit von aktiver Zellproliferation stattfindet Morphallaxis 2 Regeneration die Zellproliferation ben ti
88. eisen auf einen mitotischen Myozyten a trabekel assoziierten b und nicht trabekel assoziierten Zellkern c 69 Ergebnisse Myozytenkerne befanden sich innerhalb von Trabekeln in Regionen starker Toluidinblauf rbung Je nach Schnittrichtung konnten wie in Abb dargestellt die w hrend der Mitose kondensierten Chromosomen in der N he von quergestreiften Sarkomeren lokalisiert werden Als trabekel assoziierte Zellen wurden solche Zellen bezeichnet die einen direkten Kontakt zu der Basalmembran der Trabekel aufweisen Die als andere Zellen bezeichneten Zellen befanden sich meist in einer lockeren Ansammlung von Zellen ohne jedoch direkte Zellkontakte zu den Trabekeln auszubilden Parallel dazu wurden die Ventrikelschnitte mit einer 2 5 fachen Vergr erung aufgenommen und unter Verwendung des Programms Image J die Ventrikelfl chen berechnet Somit lie sich die Anzahl der mitotischen Zellkerne pro mm Fl che berechnen Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Abb 11 grafisch dargestellt Im scheinoperierten Ventrikel konnten gelegentlich Mitosen in Nichtmyozytenkernen und ganz selten innerhalb von Myozytenkernen identifiziert werden Vier Tage nach der Sch digung war schon ein leichter Anstieg der Mitoserate in den Nichtmyozytenkernen zu verzeichnen Dieser wurde aber nach sieben Tagen zun chst wieder geringer Die h chste Mitoserate trat in den trabekel assoziierten Zellkernen 14 Tage nach Herzsch digung auf Zu diesem Zeitpunkt
89. ektive als auch sch digende Effekte haben kann Dies k nnte auch die unterschiedlichen Ergebnisse der in vivo und in vitro Experimente in dieser Arbeit erkl ren 4 10 Wird die Regenerationsf higkeit durch die Dedifferenzierung von Kardiomyozyten oder von Stammzellen erm glicht Die in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse deuten eher in die Richtung dass Dedifferenzierung von Kardiomyozyten einen entscheidenden Bestandteil des Regenerationsprozesses ausmachen Zum einen konnten Mitosen innerhalb von Kardiomyozyten im Verlauf der Regeneration beobachtet werden Zum anderen suggerieren die Analysen der differentiellen Gen und auch Proteinexpressionen gr ere strukturelle Ver nderungen innerhalb der Kardiomyozyten Da w re beispielsweise die deutliche vor bergehende Reduktion der Expression von Sarkomerproteinen sowie die Zunahme von Glattmuskelspezifischen Proteinen und Transkripten zu nennen Au erdem konnte die Expression von regenerations assoziierten Antigenen wie 22 18 und Zytokeratin 18 die w hrend der Extremit tenregeneration im vorwiegend aus dedifferenzierten mesenchymalen Zellen bestehenden Blastem exprimiert werden Corcoran and Ferretti 1997 Kintner and Brockes 1984 auch im Herzen detektiert werden Zudem konnten Transplantationsversuchen mit Kardiomyozyten des Molches in regenerierende Extremit tenst mpfe die F higkeit der transplantierten Kardiomyozyten in skelettale oder chondrozytale Zelltypen zu transdifferenzie
90. elektronisch es dokument ULB Sachsen Anhalt Analyse der Herzregeneration nach mechanischer Sch digung des Ventrikels des adulten Molches Notophthalmus viridescens Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium Dr rer nat vorgelegt der Naturwissenschaftlichen Fakult t Biowissenschaften der Martin Luther Universit t Halle Wittenberg von Julia Kruse geb am 21 12 1976 in K ln Gutachter in 1 Prof Dr Elmar Wahle 2 Prof Dr Dr Thomas Braun 3 Prof Dr Doris Wedlich Halle Saale den 06 06 2008 urn nbn de gbv 3 000014292 http nbn resolving de urn resolver pl urn nbn 3Ade 3 Agbv 3A3 000014292 Erklarung Hiermit erkl re ich Julia Kruse dass ich die vorliegende Arbeit selbst ndig und nur unter Verwendung der angegebenen Literatur und Hilfsmittel angefertigt habe Die den benutzten Werken w rtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen sind als solche gekennzeichnet Diese Arbeit wurde an keiner anderen Hochschule oder Universit t zur Promotion eingereicht Julia Kruse Bad Nauheim den 23 01 08 Inhaltsverzeichnis 1 1 1 2 1 3 1 3 1 1 3 1 1 1 3 1 2 1 3 1 3 1 3 2 1 4 1 5 1 5 1 1 6 1 6 1 1 6 2 1 7 1 7 1 1 7 2 123 1 7 4 1 7 5 1 7 6 1 7 7 1 7 8 Inhaltsverzeichnis 1 Binleifuns 2 22 nee ER 7 Was versteht man unter Regeneration u ursssensnsnssnnenneneennnnnn 7 Phylogenetische Verteilung der Regenerati
91. em Gange und die Proliferation der Kardiomyozyten erreicht ihren H hepunkt Da sich die gesch digten Herzen sowohl aus gesch digten regenerierenden Arealen als auch aus ungesch digtem voll intaktem Gewebe zusammensetzte konnten in der cDNS Bibliothek sowohl f r die Sch digung spezifische Transkripte als auch Transkripte die in ungesch digten Herzen exprimiert werden angereichert werden Als m glichen Hinweis auf verst rkte Proliferationsaktivit t w rde man insbesondere eine Deregulation von Zellzyklusregulatoren und Transkriptionsfaktoren erwarten Die Sequenzierung von ca 10 der Klone der nicht normalisierten cDNS Bibliothek ergab eine Redundanz von 70 Die hohe Redundanz ist ein Indiz f r eine pr ferenzielle Anreicherung von h ufig exprimierten Transkripten im Vergleich zu weniger pr senten mRNS wie denen von Zellzyklusregulatoren und Transkriptionsfaktoren die unter den Sequenzen kaum vertreten waren W rde man eine neue cDNS Bibliothek generieren wollen k nnte man basierend auf den bisher gewonnen Erkenntnissen effektive Methoden zur Anreicherung von seltenen Transkripten bei gleichzeitiger Subtraktion stark abundanter Transkripte anwenden Laveder et al entwickelten beispielsweise eine Strategie zur Herstellung von subtrahierten cDNS Bibliotheken in der in einem ersten Schritt ein Oligo dirigierter RNase H Verdau und in einem zweiten Schritt eine Hybridisierung mit Proben aus einer 3 Enden EST Sammlung wie sie im
92. en Bindegewebe resultiert In einem anderen Experiment wurde das aus der Herzspitze amputierte Gewebe zun chst mechanisch zerkleinert und anschlie end zur Vergr erung des reaktiven Wundbereichs auf die Wunde zur ckgegeben Ein kleiner Teil des Herzmuskeltransplantats konnte sich in die Wunde integrieren Die st rkste proliferative Aktivit t der retransplantierten Kardiomyozyten wurde nach 16 Tagen beobachtet Diese w hrend der DNS Synthese mit 3H Thymidin markierten Zellen wiesen einen Zusammenbruch der Myofibrillenstruktur auf In mitotischen Zellen waren die Myofibrillen zerstreut und Z Banden fehlten Nach 70 Tagen waren die Myofibrillenstrukturen und die interzellul ren Verbindungen der Transplantate komplett wiederhergestellt Bader and Oberpriller 1979 Dieses Experiment zeigte deutlich dass Molchherzen die F higkeit zur effektiven Erneuerung von gesch digtem Myokard besitzen 14 Einleitung 1 3 1 3 In vitro Analyse der proliferativen Eigenschaften von Kardiomyozyten des Molches Bettencourt Dias et al 2003 analysierten die proliferativen Eigenschaften einzelner Kardiomyozyten mittels Time Lapse Mikroskopie in vitro Dabei stellte sich heraus dass 75 der Zellen in die S Phase des Zellzyklus eintraten und wiederum 76 dieser Zellen anschlie end auch die Mitose durchliefen Ein weiterer Anteil von 29 dieser Zellen durchlief eine oder mehrere komplette Zellteilungen inklusive Karyokinese und Zytokinese und produzie
93. en Kardiomyozyten der S ugetiere besteht das Amphibienherz haupts chlich aus diploiden mononukle ren Zellkernen Matz et al 1998 Oberpriller et al 1988 Tate et al 1987 Untersuchungen mittels Time Lapse Mikroskopie von prim ren Kardiomyozytenkulturen des Molches ergaben dass 80 der mitotischen mononukle ren Myozyten auch mononukle re Tochterzellen hervorbrachten Matz et al 1998 Diese Beobachtungen und hnliche Resultate aus weiteren Time Lapse Analysen stellen ein wichtiges Indiz daf r dar dass Kardiomyozyten von Molchen nicht nur die F higkeit zur Karyokinese sondern auch f r eine vollst ndige Zytokinese besitzen F r die in dieser Arbeit eingesetzte Sch digung des Ventrikels mittels mechanischer Quetschung konnte 14 Tage nach Sch digung die h chste Mitoserate innerhalb der Kardiomyozyten ermittelt werden Diese lag bei 6 6 1 05 Mitosen pro mm Gewebe 122 Diskussion Neben den Kardiomyozyten zeigten auch andere Zelltypen deren Identit ten noch einer genauen Bestimmung bed rfen 14 Tage nach der Sch digung die st rkste mitotische Aktivit t Auch wenn Kardiomyozyten nicht die am st rksten proliferierende Zellpopulation darstellen scheinen sie dennoch im Vergleich zu Kardiomyozyten von S ugetieren ein deutlich gr eres Potential f r erfolgreiche Kernteilungen zu besitzen Interessant erscheint das h ufige Auftreten von Mitosen innerhalb der als trabekel assoziierten Zellen bezeichneten Zellen f
94. en besonders stark im Epikard s Abb 25 A C aber auch innerhalb einiger Trabekel vgl Abb 25 B auf Im scheinoperierten Herzen konnten dagegen keine Zytokeratin 18 Transkripte nachgewiesen werden vgl Abb 24 D Die Negativkontrolle s Abb 25 B blieb ungef rbt 91 Ergebnisse Abb 26 In situ Hybrisisierung mit sense und antisense Proben gegen Thymosin 4 auf Paraffinschnitten von gesch digten Herzen 14d postop von scheinoperierten Herzen sowie und Darmgewebe A Thymosin 4 as Probe auf gesch digtem Herzen 14d postop B Thymosin 4 sense Probe auf gesch digtem Herzen 14d postop C Vergr erter Ausschnitt aus A zeigt positive Signale in gesch digten Bereichen D Thymosin 4 as Probe auf scheinoperiertem Herzen E Vergr erter Ausschnitt aus A zeigt positive Signale in Zellen die intakte Trabekel s umen Thymosin 4 Transkripte konnten vorwiegend in einzelnen Zellen die direkt mit dem Trabekel assoziiert zu sein schienen nachgewiesen werden s Abb 26 A E Die Thymosin 4 positiven Zellen s umten nicht nur intakte Trabekel sondern waren auch in gesch digten bzw regenerierenden Regionen vgl Abb 26 C zu finden Auch hier wiesen die Negativkontrolle und der Schnitt vom scheinoperierten Herzen keine positiven Signale auf 92 Ergebnisse 3 5 Immunfluoreszenzfarbungen auf Gefrierschnitten 3 5 1 Reduktion der Expression von Sarkomerproteinen w hrend der Herzregeneration im Molch F
95. en des Molches Die Uberpriifung der differentiellen Expression der Filterklone TB1 2 5 8 10 13 19 25 46 54 59 sowie der m MRLC Klone wurde mittels RT PCR durchgefiihrt Die Auswahl geeigneter Oligonukleotide basierte auf den zuvor ermittelten Sequenzinformationen Zuerst wurde die Spezifit t der Oligonukleotide sowie deren geeigneten Anlagerungstemperatur auf der jeweiligen Plasmid DNS getestet Ergaben die Kontroll PCRs ein Produkt der erwarteten Gr e konnten die Oligonukleotide auf den verschiedenen cDNS getestet werden In Tab 12 sind die Ergebnisse zusammengefasst worden Klon Expression im gesch digten Herzen ia Vergleich ae Kontroll cDN S Mapen CDNS TB1 nicht untersucht nicht untersucht TB2 TB5 schwach TB8 TB10 TB13 m MRLC TB14 TB19 TB25 nicht untersucht nicht untersucht TB46 nicht untersucht nicht untersucht TB54 nicht untersucht nicht untersucht TB59 nicht untersucht nicht untersucht Skelettmuskel Tab 12 berpr fung der differentiellen Genexpression einiger Filterklone mittels RT PCR aus cDNS aus gesch digtem Herzen 14d postop vs ungesch digtem Herzen Magen und Skelettmuskel lt kein Unterschied PCR Produkt amplifiziert t im gesch digten Herzen st rker expremiert kein PCR Produkt F r die Klone TB 2 5 8 10 19 und m MRLC konnte das Ergebnis der Filterhybridisierung mittels semiquantitativer RT PCR reproduziert werde
96. en lokalen Witterungsbedingungen abh ngig Das Geschlecht der Molche kann nur w hrend der Paarungszeit eindeutig unterschieden werden Methoden zur funktionellen genetischen Analyse sind noch wenig etabliert und das Molchgenom nicht sequenziert Erst einer Arbeitsgruppe gelang bisher die erfolgreiche Herstellung eines transgenen Molches der Gattung Cynops pyrrhogaster zur Untersuchung der Regeneration 119 Diskussion der Linse Ueda et al 2005 Des Weiteren gibt es nur wenig Sequenzinformationen und spezielle molchspezifische Antik rper Trotz dieser Hindernisse stellt die Aufkl rung der effektiven Regenerationsmechanismen im Molch eine wichtige Voraussetzung f r die Entwicklung therapeutisch anwendbarer Strategien f r die Regeneration diverser Organe im Menschen dar 4 2 Vor und Nachteile der mechanischen Ventrikelsch digung Da von Molchen bisher keine nat rlich auftretende Herzsch digung beschrieben wurde kann kein solches Krankheitsbild als Vorbild f r eine k nstliche Sch digungsmethode dienen Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Herzsch digung mittels 15 facher Quetschung des Ventrikels mit feinen Pinzetten erzeugt Ein Vorteil dieser Methode liegt in der Vermeidung starker Blutungen wie sie zum Beispiel bei Amputationen der Herzspitze auftreten Dadurch konnte eine bessere berlebensrate als bei den initialen Amputationsversuchen erzielt werden Au erdem blieb bei dieser Methode die u ere Morphologie des Ventrike
97. en und Geraten 0 0 ee eeeeeeeceeceseceeeteeeenneeeenes 45 Extraktion von Nukleins uren aus Geweben uuersnersnnesnnersnnennnen en 45 Isolation von mRNS aus Gesamt RNS 20222urs0nesnnennnennnersnnennne 45 Transformation von E Coli Zellen mit Plasmiden 46 DNS Seq enzierung ur une ee 46 Amplifikation von DNS Fragmenten mit Hilfe der Polymerase Kettenreaklion are se ae ee 47 RI PER ans 47 EDNS Subtraklioh u 1200er 47 Konstruktion einer cCDNS Bibliothek uernsersersnesnnennnnesnnen en 49 Transfer von DNS auf Polyamidmembranen Southern Blotting 49 Markierung von Nukleins uren 220022000sssssenssnsennsnnensnnnennnnnnn 50 Radioaktive Markierung von DNS Fragmenten uursnnesnsernsnerneren 50 In vitro Transkription zur Synthese von RNS Proben 50 Inhaltsverzeichnis 2 2 9 3 2 2 10 2 2 10 1 2 2 10 2 2 2103 2 2 11 2212 2 213 22 131 2 2 13 2 2 2133 2 2 14 2 2 15 2 2 16 2 2 16 1 2 2 17 3 1 3 2 3 2 1 3 3 3 3 1 3 3 2 3 3 2 1 3 3 3 Fluoreszenzmarkierungen von RNS Proben f r die Chiphybridisierunsen ae ei 32 Hybridisierungstechniken u sk 55 Hybridisierung membrangebundener Nukleins uren oder Rolsniehlier E E RB Cees 55 Hybridisierung der CDNS Microarrays nuesseessnersnnesnnennnennnnennnen non 55 In situ Hybridisierung auf Gewebeschnitten
98. en und nach weiteren zehn Tagen ohne erneute Injektionen schlie lich die Herzentnahme Bei der zweiten Versuchgruppe erhielten die Molche insgesamt 14 Injektionen die ebenfalls t glich verabreicht wurden Wie bereits beschrieben hielt die durch den Inhibitor ausgel ste verringerte Phosphorylierung der Erk1 2 Kinase noch nicht einmal 24 Stunden an vgl Abb 40 und wurde auch durch die t glichen Injektionen nicht wieder ausgel st Die Erk Kinase schien sogar im Gegenteil auch 14 Tage nach der Herzsch digung noch st rker aktiviert zu sein als in den ungesch digten Kontrollherzen Auch die 114 Ergebnisse Proteinexpressionen des MyHC und P Histon 3 zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen der transienten oder der kontinuierlichen Inhibitorinjektion mon EEE oe ee TEE ae ZZ MyHC lt P Histon 3 ee ere ee Pe Cd bl Lil Li Ponceau Rot gefarbte Aktinbanden als Ladungskontrollen Abb 44 Vergleich zwischen transienter viermalige Injektion und kontinuierlicher vierzehnmalige Inhibitorgabe auf die Phosphorylierung bzw Expression verschiedener Proteine 14 Tage nach der Herzsch digung 3 7 Untersuchungen des Einflusses des MEK1 2 Inhibitors U0126 auf Prim rkulturen aus ungesch digten Molchherzen Zur weiteren Analyse des in vivo beobachteten Effektes von U0126 auf die Herzregeneration wurden Prim rkulturen aus ungesch digten Herzen generiert Diese Kulturen zei
99. en von ES Zellen abstammende Myozyten verschiedene Ph notypen elektrophysiologisch unterschiedlicher Subtypen wie ventrikul ren atrialen und nodal geschwindigkeitsmachender Kardiomyozyten an Maltsev et al 1993 Zhang et al 2002 Ein gewisses Problem stellt die Ausbildung von Teratomen nach Transplantationen in gesch digte Herzen dar und erfordert deshalb eine 33 Einleitung sehr sorgfaltige Aufreinigung von von ES Zellen abstammenden Myozyten Laflamme and Murry 2005 Transplantationsversuche mit genetisch selektierten von ES Zellen abstammenden Myozyten in ein immunkompatibles Empf ngerherz resultierten in der Entstehung von stabilen intrakardialen Transplantaten Auch die Transplantationen von undifferenzierten ES Zellen f hrten zu funktionell verbesserten Integrationen die morphologisch keine Unterschiede zu von ES Zellen abgeleiteten Myozyten aufwiesen und keine Teratome bildeten Hodgson et al 2004 Diese Beobachtungen sind jedoch umstritten Die positiven Effekte von ES Zelltransplantationen m ssen nicht ausschlie lich auf der Ausbildung von neuem Myokard beruhen sondern k nnen auch auf bereits erw hnten sekund ren Effekten wie den Ver nderungen des Remodelings nach Infarkt oder verst rkter Angiogenese beruhen Ebelt et al 2007 Der gro e Vorteil der von humanen ES Zellen abstammenden Myozyten liegt in ihrer proliferativen Aktivit t in vitro Snir et al 2003 als auch in vivo Laflamme et al 2005 Durch
100. entdeckte Vorl uferzellpopulation besteht aus Zellen die den LIM Homeodom nen Transkriptionsfaktor islet 1 exprimieren Diese Zellen wurden zun chst w hrend der Herzentwicklung entdeckt Cai et al 2003 Anderen Forschern gelang es die Existenz von islet 1 positiven Zellen in neonatalen und in geringerer Menge im adulten Herzen nachzuweisen Laugwitz et al 2005 In in vitro und in vivo Versuche mit den verschiedenen myokardialen Vorl uferzellen konnten zwar gewisse kardiale Eigenschaften anhand kardialer Gen oder Proteinexpressionen sowie verbesserte ventrikul re Funktionen nach Transplantationen in infazierte Herzen beobachtet werden aber es sollte kritisch angemerkt werden dass die Experimente mit kardialen Stammzellen durchaus kritisch diskutiert werden und viele Versuche von anderen Gruppen nicht reproduziert werden k nnen 32 Einleitung Gegenw rtig wird behauptet dass sich alle vier kardialen Vorl uferzellen voneinander unterscheiden d h keine der anderen Marker berlappend exprimiert werden Dabei scheint es paradox das ein Organ das bekannt ist f r seine fehlende regenerative Kapazit t mehrere nicht berlappende Populationen kardialer Vorl uferzellen beherbergen soll Jedenfalls scheinen diese Zellen nicht wie beispielweise Satellitenzellen eine effektive Geweberegeneration unterst tzen zu k nnen Sollten die erw hnten Zellen tats chlich eine Vorl uferzellfunktion in vivo haben dann scheint es sich bei
101. er EP 25mM Tris HCl pH 8 0 10 mM EDTA pH8 0 1x Protease Inhibitor Cocktail Roche 1x Phosphatase Inhibitor Cocktail Set II Calbiochem 2 5 SDS 0 5 Triton X 100 x ul ddH gt O 20x Elektroblotting Puffer 163 2 g Bicine 209 3 g BisTris 12 g EDTA ad 2 L dd H20 1x Elektroblotting Puffer 50 ml 20x Elektroblotting Puffer 200 ml ad 1 L dd H20 40 Material und Methoden 2 1 8 F r Western Blots verwendete Prim rantik rper Bezeichnung Spezies Phosphorylierungs MW Hersteller Bestnr Verdiinnung stelle in kDa Akt Kaninchen 60 CST 1 1000 Cofilin Kaninchen 19 CST 3312 1 1000 Destrin ADF Kaninchen 19 Sigma D8815 1 1000 Erk 1 Maus 44 42 BD 610030 1 5000 Erk 2 Maus 42 BD 610103 1 5000 MEK 1 Maus 45 BD 610121 1 1000 MEK 2 Maus 46 BD 610235 1 1000 MF20 MyHC Maus 200 Prof Braun 1 1500 P 4EBP1 Kaninchen Thr 37 46 15 20 CST 2855 1 1000 P Akt Kaninchen Thr 308 60 CST 9275 1 500 P Akt Kaninchen Ser 473 60 CST 9271 1 500 PCNA Maus 36 BD 610664 1 2000 P CREB Kaninchen Ser 133 43 CST 9191 1 1000 P Elk 1 Kaninchen Ser 383 62 CST 9181 1 1000 P Erk1 2 Kaninchen Thr 202 Tyr 204 42 44 CST 9101 1 1000 P GSK 3 B Kaninchen Ser 9 46 CST 9336 1 1000 P Histon 3 Kaninchen Ser 10 17 CST 9701 1 1000 P MEK1 2 Kaninchen Ser 217 221 45 CST 9121 1 1000 P MSK 1 Kaninchen Ser 376 90 CST 9591 1 500 P p38 Kaninchen Thr 180 Tyr
102. er resuspendiert 53 Material und Methoden 4 Synthese der fluoreszenzmarkierten cDNS Proben Von den amplifizierten RNSs wurden zur Konzentrationsbestimmung 0 5 ul auf einem 1 igen Agarosegel aufgetrennt Aquivalente Mengen Gesamt RNS 50 100 ug wurden mit 4 ul regular anchored RAM Oligonukleotid in einem Gesamtvolumen von 15 4 ul gemischt und f r 10 min auf 65 C erhitzt Nach dem Abk hlen auf Eis wurden folgende Komponenten zugegeben 6ul 5x First Strand Buffer 250 mM Tris HCL pH 8 3 375 mM KCl 15 mM MgCl unmarkierte dNTPs 3 ul 0 1 M DTT dATP 25 mM 0 6 ul unmarkierter dNTP Mix 25 mM dCTP 10 mM 3 ul Cy3 oder Cy5 dCTP 25 nM dGTP 25 mM 2 ul Superscript II Invitrogen dTTP 25 mM Der Reaktionsansatz wurde f r 1 h bei 42 C inkubiert Durch Zugabe von 1 ul Superscript wurde die Reverse Transkription nochmals verstarkt und fiir weitere 30 60 min fortgesetzt Zur Degradation der RNS und zum Stoppen der Erststrangsynthese wurden 15 ul 0 1 N NaOH und 2 mM EDTA zugefiigt und der gesamte Reaktionsansatz fiir 10 min auf 65 C erhitzt Zur Neutralisation wurden 15 ul 0 1 M HCl zugegeben Zur Aufreinigung der Proben wurden 380 ul TE Puffer pH 8 0 in einer Microcon YM 30 S ule Millipore vorgelegt Dann wurden je 60 ul Cy5 Probe zusammen mit der zu vergleichenden Cy3 Probe hinzugef gt und f r 20 min bei 14000 xg zentrifugiert Der Durchfluss wurde entfernt und der Waschschritt mit 450 ul TE Puffer wiederholt Beim dr
103. erieren aber nur die r hrenf rmige H hlen bewohnenden polychaeten W rmer k nnen auch vordere K rpersegmente ersetzen Vermutlich sind die H hlenbewohner anf lliger f r Amputationen und die F higkeit zur Regeneration bringt ihnen somit einen selektiven Vorteil Alternativ postulierte Morgan 1901 dass es sich bei der Regeneration nicht um einen prim ren Mechanismus handeln w rde sondern lediglich um ein Nebenprodukt anderer Mechanismen Einen Hinweis auf diese Theorie geben zum Beispiel die auff lligen hnlichkeiten der Regeneration mit der Ontogenese der asexuellen Reproduktion oder der Metamorphose Die Ontogenese besteht aus der hierarchischen Abfolge von Programmen die gegebenenfalls als Programmodule auch bei der Regeneration genutzt werden und sekund r aktiviert werden Dabei steht die Regeneration in dieser Hypothese nicht unter selektivem Druck sondern ist aus anderen Gr nden wie zum Beispiel durch Mutationen die dem prim ren Mechanismus auf Kosten des Sekund ren einen selektiven Vorteil verschaffen verloren gegangen Eindeutige Beweise fehlen aber bisher f r beide Ansichten Brockes et al 2001 Um die evolution re Beziehung zwischen der Ontogenese und der Regeneration vollst ndig aufzukl ren bedarf es weiterer molekularer Beweise von verschiedenen Organismen wie Hydra Planarien und Salamandern Alvarado 2000 11 Einleitung 1 3 Modellorganismen fiir die Untersuchung der Herzregeneration
104. esch digtem Herzen 14d postop Gesamt bersicht B Vergr erter Ausschnitt aus A C a Glattmuskelaktin as Probe auf einem Darmschnitt D Vergr erter Ausschnitt aus B E o Glattmuskelaktin as Probe auf scheinoperiertem Herzen Pfeile weisen auf schwache Expressionen hin F a Glattmuskelaktin sense Probe gesch digtem Herzen 14d postop In situ Hybridisierungen mit antisense und sense Proben gegen a Glattmuskelaktin zeigten im Bereich der Trabekel teilweise sehr starke Expressionen vgl Abb 24 A B D Auch auf der Positivkontrolle einem Darmschnitt s Abb 24 C konnten Signale detektiert werden Im Myokard von scheinoperierten Herzen konnte eine sehr schwache Expression beobachtet werden s Abb 24 E Die sense Probe diente wiederum als Negativkontrolle und erzeugte keine Signale vgl Abb 24 F 90 Ergebnisse Abb 25 In situ Hybridisierung mit sense und antisense Proben gegen Zytokeratin 18 auf Paraffinschnitten von gesch digten Herzen 14d postop von scheinoperierten Herzen sowie und Darmgewebe A Zytokeratinl8 as Probe auf gesch digtem Herzen 14d postop B Zytokeratin18 sense Probe auf gesch digtem Herzen 14d postop C vergr erter Ausschnitt aus A zeigt positive Signale im Epikard D a Glattmuskelaktin as Probe auf scheinoperiertem Herzen E vergr erter Ausschnitt aus A zeigt positive Signale in Trabekeln Zytokeratin 18 mRNS Konnte nur im regenerierenden Herzen detektiert werden Positive Signale trat
105. ess Cold Spring Harbour New York Schneider VA M Mercola 2001 Wnt antagonism initiates cardiogenesis in Xenopus laevis Genes Dev v 15 p 304 315 Schultheiss TM J B Burch A B Lassar 1997 A role for bone morphogenetic proteins in the induction of cardiac myogenesis Genes Dev v 11 p 451 462 Shake JG P J Gruber W A Baumgartner G Senechal J Meyers J M Redmond M F Pittenger B J Martin 2002 Mesenchymal stem cell implantation in a swine myocardial infarct model engraftment and functional effects Ann Thorac Surg v 73 p 1919 1925 Sheldahl LC D C Slusarski P Pandur J R Miller M Kuhl R T Moon 2003 Dishevelled activates Ca2 flux PKC and CamKII in vertebrate embryos J Cell Biol v 161 p 769 777 Sheng Z K Knowlton J Chen M Hoshijima J H Brown K R Chien 1997 Cardiotrophin 1 CT 1 inhibition of cardiac myocyte apoptosis via a mitogen activated protein kinase dependent pathway Divergence from downstream CT 1 signals for myocardial cell hypertrophy J Biol Chem v 272 p 5783 5791 Shi X D J Garry 2006 Muscle stem cells in development regeneration and disease Genes Dev v 20 p 1692 1708 Smithers L C Haddon Y J Jiang J Lewis 2000 Sequence and embryonic expression of deltaC in the zebrafish Mech Dev v 90 p 119 123 Snir M I Kehat A Gepstein R Coleman J Itskovitz Eldor E Livne L Gepstein 2003 Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human e
106. et Roell et al 2007 1 7 2 Transplantation von multipotenten adulten Stammzellen Transplantationen von kompletten Organen oder von Knochenmarkszellen erm glichten wichtige Einsichten in die F higkeiten zirkulierender Zellen sich in adulten Geweben anzusiedeln So genannte transgender Transplantationen bei denen beispielsweise m nnliche Patienten weibliche Spenderherzen erhalten lassen die Verfolgung des Schicksals zirkulierender extrakardialer Zellen aufgrund des unterschiedlichen Genotyps zu Immunf rbungen mit spezifischen Zellmarkern erm glichen dar ber hinaus die Charakterisierung des angesiedelten Zelltyps Dadurch lie en sich unter anderem zirkulierende endotheliale Vorl uferzellen nachweisen Die hohe endotheliale Chimerbildung konnte sowohl nach Herztransplantationen Hocht Zeisberg et al 2004 als auch nach Knochenmarkstransplantationen Deb et al 2003 in der koronaren Zirkulation beobachtet werden Auch im glatten Muskel von Arterien und Venen Glaser et al 2002 Quaini et al 2002 und in perineuralen Schwannzellen Minami et al 2005a wurden zirkulierende Zellen nach Herztransplantationen wiedergefunden Kontroverse Ansichten herrschen dar ber in welchem Ausma zirkulierende Zellen in das Myokard integrieren Es konnten zwar Y Kardiomyozyten im transplantierten weiblichen Spenderherzen detektiert werden aber die meisten Forscher fanden nur sehr wenige dieser chim ren Kardiomyozyten einer auf 10 10 Kar
107. ew hrleisten und Arrhythmien zu verhindern Reinecke et al 1999 33 Einleitung 1 8 Ziele der Doktorarbeit Der Molch Notophthalmus viridescens ist f r seine au ergew hnliche F higkeit zur Regeneration diverser verletzter Organe bekannt In fr heren Arbeiten von Oberpriller et al ist die Regenerationsf higkeit des Molchherzens nach partieller Amputation des Ventrikels oder Atriums in erster Linie anhand von elektronenmikroskopischen Aufnahmen histologisch untersucht worden Dabei wurde den Herzen von Molchen zwar ein gewisses regeneratives Potenzial zugestanden die Wunde letztendlich aber trotzdem durch Ausbildung einer Narbe verschlossen McDonnell and Oberpriller 1984 Oberpriller and Oberpriller 1974 Im Rahmen dieser Arbeit sollten die Auswirkungen einer mechanischen Sch digung des Ventrikels auf die Regeneration des Herzens morphologisch und molekular untersucht werden Die Herstellung einer cDNS Bibliothek aus gesch digten Molchherzen sollte dabei als Grundlage f r die Herstellung von Macro und Microarrays f r die Analyse im regenerierenden Herzen differentiell exprimierter Gene dienen Deren differentielle Expression sollte anschlie end verifiziert und mittels in situ Hybridisierungen weiter charakterisiert werden Die Proteinexpression potentiell interessanter Gene sollte mittels Immunfluoreszenzf rbungen und Western Blots untersucht werden 36 Material und Methoden 2 Material und Methoden 2 1 Materi
108. f r 1 h inkubiert 52 Material und Methoden 2 Zweitstrangsynthese F r die Zweitstrangsynthese wurden folgende weitere Komponenten zugef gt 45 5 ul RNase freies H2O 15 ul 5x Second Strand Buffer 1 5 ul dNTPs je 2 5 mM 0 5 ul E coli DNS Ligase 10 U ul GibcoBRL 0 5 ul RNase H 2 U ul GibcoBRL 2 ul E coli DNS Polymerase I 10 U ul GibcoBRL Der gesamte Reaktionsansatz von 75 ul wurde bei 16 C fiir 2 h inkubiert Nach Zugabe von 75 ul H2O wurde erst eine Phenol Chloroform Isoamylalkohol 25 24 1 Extraktion und anschlie end noch eine Chloroform Extraktion durchgef hrt F r die Pr zipitation der DNS wurden 1 ul Polyacrylamid 10 ul 7 5 M Ammoniumacetat und 375 ul eiskalter Ethanol 20 C zugegeben Nach Zentrifugation mit 14 000 g f r 20 min bei 4 C wurde das Pr zipitat mit 70 Ethanol gewaschen und in 4 ul RNase freiem Wasser resuspendiert 3 In vitro Transkription F r die in vitro Transkription wurde das T7 Megascribe Kit Ambion verwendet 4 ul pr zipitiertes Produkt der Zweitstrangsynthese lul 10x Transcription buffer je lul 75 mM ATP CTP GTP UTP 1 ul Enzym Mix Dieser Ansatz wurde f r mindestens 6 h bei 37 C inkubiert Nach Zugabe von 130 ul RNase freiem Wasser wurde eine Phenol Chloroform Isoamylalkohol 25 24 1 und Chloroform Extraktion durchgef hrt Wie zuvor beschrieben wurde die RNA gef llt und gewaschen Das Pr zipitat wurde in 10 ul RNase freiem Wass
109. fail to heal the heart in response to ischemia reperfusion injury Wound Repair Regen v 13 p 205 208 Ahuja P E Perriard T Pedrazzini S Satoh J C Perriard E Ehler 2007 Re expression of proteins involved in cytokinesis during cardiac hypertrophy Exp Cell Res v 313 p 1270 1283 Ahuja P E Perriard J C Perriard E Ehler 2004 Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes J Cell Sci v 117 p 3295 3306 Akimenko MA S L Johnson M Westerfield M Ekker 1995 Differential induction of four msx homeobox genes during fin development and regeneration in zebrafish Development v 121 p 347 357 Alessandrini A S Namura M A Moskowitz J V Bonventre 1999 MEK1 protein kinase inhibition protects against damage resulting from focal cerebral ischemia Proc Natl Acad Sci U S A v 96 p 12866 12869 Alsan BH T M Schultheiss 2002 Regulation of avian cardiogenesis by Fgf8 signaling Development v 129 p 1935 1943 Alvarado AS 2000 Regeneration in the metazoans why does it happen Bioessays v 22 p 578 590 Amit M M K Carpenter M S Inokuma C P Chiu C P Harris M A Waknitz J Itskovitz Eldor J A Thomson 2000 Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture Dev Biol v 227 p 271 278 Anversa P J Kajstura 1998 Ventricular myocytes are not terminally differentiated in the
110. faktoren im Verlauf der Regeneration und der U0126 Behandlung untersucht Als Antwort auf entsprechende Stimuli unterst tzt Cofilin unter anderem die Regeneration von Aktinfilamenten durch das Aufl sen bestehender Filamente Auch Destrin geh rt zur Familie der Aktin Depolymerisationsfaktoren und bewirkt ebenfalls die Depolymerisation von Aktinfilamenten und ist in Vorg nge wie Zellmobilit t und Zytokinese involviert Ab dem vierten Tag nach der Herzsch digung stieg die Proteinexpression von Cofilin und Destrin in den gesch digten Kontrollherzen MeOH leicht an und verst rkte sich innerhalb der untersuchten 14 Tage Herzproben Die mit dem MEK1 2 Inhibitor behandelten Herzen hatten vier Tage nach Herzsch digung ein hnliches Expressionsniveau wie die ungesch digten Kontrollherzen In den Inhibitor injizierten Herzen stieg die Expression nach sieben bzw 14 Tagen deutlich an ohne sich jedoch von den gesch digten Kontrollherzen MeOH zu unterscheiden 3 6 2 6 Die transiente oder kontinuierliche Injektion von U0126 hat keinen Einfluss auf die Expression bzw Phosphorylierung von Erk1 2 Histon 3 oder MyHC Die beiden in Abb 44 dargestellten Versuchsgruppen unterscheiden sich lediglich in der Dauer der Gabe des MEK1 2 Inhibitors Dabei wurde in dem einen Fall 14d postop 4 Injekt wie bereits beschrieben die erste Injektion 2 Stunden vor der Herzsch digung durchgef hrt Darauf folgten an den n chsten drei Tagen weitere drei Injektion
111. ga Promega Eppendorf Promega XLiblue Stratagene recAl endAl gyrA96 thi 1 hsdR17 supE44 relAl lac F proAB lacPZAM15 Tn10 Tet Elektro Ten Blue Electroporation Competent Cells Stratagene A mcrA 183 A mcrCB hsdSMR mrr 173 endAl supE44 thi l recAl gyrA96 relAl lac Kan F proAB lac ZAM15 Tn10 Tet 2 1 4 Verwendete Vektoren pGEM T Vektor pGEM T Easy Vektor pBluescript II SK 4 pBluescript II KS 4 pDNR LIB Promega Promega Stratagene Stratagene BD Biosciences 38 Material und Methoden 2 1 5 DNA Gr enstandards DNA EcoRVHindlll verdaut pUC 18 Sau3A verdaut 2 1 6 Verwendete Kits e DNA Cycle Sequencing Kit Abi Weiterstadt e CLONTECH PCR Select cDNA Subtraction Kit Clontech e QUIAEX II Gel Exraction Kit 500 Quiagen VECTASTAIN ABC Kit Vector Vector Laboratories e Creator Smart cDNA Library Construction Kit Clontech e NucleoBond PC 500 Macherey Nagel Oligotex mRNA Mini Kit Quiagen 2 1 7 H ufig verwendete L sungen und Medien Alle in dieser Arbeit verwendeten L sungen und Puffer wurden mit bidestilliertem H2O aus einer Reinstwasseranlage angesetzt und vor Gebrauch autoklaviert oder sterilfiltriert Spezielle L sungen werden bei den einzelnen Protokollen extra angegeben e Ampicillin Stamml sung 100 mg ml in H O Chloramphenicol Stamml sung 30 mg ml in Ethanol absolut e IPTG Stamml sung 24 mg ml in H20 X Gal Stamml
112. generation Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America v 102 p 14599 14604 Maltsev VA J Rohwedel J Hescheler A M Wobus 1993 Embryonic stem cells differentiate in vitro into cardiomyocytes representing sinusnodal atrial and ventricular cell types Mech Dev v 44 p 41 50 Mao L A L Bryantsev M B Chechenova E A Shelden 2005 Cloning characterization and heat stress induced redistribution of a protein homologous to human hsp27 in the zebrafish Danio rerio Exp Cell Res v 306 p 230 241 Martin CM A P Meeson S M Robertson T J Hawke J A Richardson S Bates S C Goetsch T D Gallardo D J Garry 2004 Persistent expression of the ATP binding cassette transporter Abcg2 identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart Dev Biol v 265 p 262 275 Matz DG J O Oberpriller J C Oberpriller 1998 Comparison of mitosis in binucleated and mononucleated newt cardiac myocytes Anat Rec v 251 p 245 255 McDonnell TJ J O Oberpriller 1983 The atrial proliferative response following partial ventricular amputation in the heart of the adult newt A light and electron microscopic autoradiographic study Tissue Cell v 15 p 351 363 McDonnell TJ J O Oberpriller 1984 The response of the atrium to direct mechanical wounding in the adult heart of the newt Notophthalmus viridescens An electron microscopic and autoradiographic study Cell Tissue Res v 235 p 583 592
113. gt Epimorphose Ein prominentes Beispiel f r morphallaktische Regeneration repr sentiert die Hydra Dabei entdeckte Abraham Trembley 1710 1784 dass abgetrennte Teile der Hydra allein durch die Umgestaltung der bereits existierenden Zellen jedoch ohne neue Zellmasse zu bilden regenerieren Die epimorphe Regeneration bei der Zellproliferation notwendig ist wird nochmals in zwei breite Kategorien unterteilt 1 Regeneration ohne Blastembildung 2 Regeneration basierend auf der Ausbildung eines Blastems Einleitung Regeneratives Potenzial Leber Skelettmuskel Gehirn Retina Blut Pankreas Herz R ckenmark Haut Darmepithel Extremit ten Nieren Abb 1 Unter den Vertebraten verf gen die Nicht S uger ber ein h heres regeneratives Spektrum als die S ugetiere Viele Gewebe der S ugetieren wie die Leber das Blut die Haut der Skelettmuskel der Darm und die Bauchspeicheldr se verf gen ber bedeutende regenerative F higkeiten Demgegen ber k nnen Strukturen des Zentralennervensystems wie das Gehirn das R ckenmark und die Retina der S ugetiere nicht regenerieren Gleiches gilt auch f r Niere Herz und Extremit ten Bestimmte Urodelen und oder Teleosten k nnen jedoch auch schwere Sch digungen der zuletzt genannten Organe und Strukturen durch Regeneration beheben Wie und Warum diese unterschiedliche regenerative F higkeit dieser Gewebe nur bei einigen St mmen w hrend der Evolution erhalten blieb ist nach wie vor ungek
114. gten morphologisch unterschiedliche Zelltypen Wurden die Zellen l ngere Zeit kultiviert bildeten sie dreidimensionale Cluster Manche dieser Cluster kontrahierten gelegentlich Da die Zellen in Kultur proliferierten lie en sie sich mehrfach passagieren F r das im Folgenden beschriebene Experiment wurden Zellen aus der f nften Passage verwendet Die Zellen wurden ber einen Zeitraum von sieben Tagen mit reinem Methanol 10uM oder 80 uM UO126 inkubiert Dabei wurde pro Konzentration zwei Kammern behandelt Jeden zweiten Tag also insgesamt 3 Mal wurde das Medium unter Zusatz des L sungsmittels bzw des Inhibitors erneuert Im Hellfeld waren zun chst keine Unterschiede zwischen den einzelnen Testgruppen erkennbar Die Immunfluoreszenzf rbungen gegen das Sarkomer und Stressfaserprotein a Aktinin und den Mitosemarker phosphoryliertes Histon 3 zeigten deutliche Unterschiede 115 Ergebnisse 3 7 1 Blockierung der Mitoserate nach Inkubation von prim ren Molchherzzellen mit U0126 Die kontinuierliche Inkubation mit U0126 f hrte zu einer deutlichen Abnahme von f r den Mitose Marker Phospho Histon 3 positiven Zellen Dabei schienen bei einer geringen U0126 Konzentration 10 uM a Aktinin positive Zellen sensitiver auf den Inhibitor zu reagieren als die a Aktinin negativen Zellen Allerdings zeigte die a Aktinin F rbung in Zellen deren Kerne auch f r das phosphoryliertes Histon 3 positiv waren keine geordnete Anf rbung von Z Scheiben
115. gung C Schnitt durch einen Extremit tenstumpf 12 Tage nach Amputation D Herzschnitt 14 Tage nach der Sch digung E Herzschnitt 21 Tage nach der Sch digung F MyHC Immunfluoreszenzf rbung rot eines Parallelschnittes 103 Ergebnisse 3 6 Analysen der Proteinexpressionen w hrend der Herzregeneration mittels Western Blots 3 6 1 Ver nderungen des Phosphorylierungsstatus verschiedener Enzyme kurze Zeit nach der Sch digung des Herzens Phosphorylierungen von Enzymen z hlen zu den weitverbreiteten Mechanismen die der Aktivierung oder Inaktivierung von Enzymen dienen Die Herstellung spezifischer Antik rper die einzelne Phosphorylierungsstellen erkennen erm glicht die Detektion verschiedener Phosphorylierungszust nde Im Rahmen dieser Arbeit wurden Herzen 10 30 Minuten und zwei Stunden nach der mechanischen Sch digung des Ventrikels entnommen Aus diesen Proben wurden Proteine extrahiert und jeweils 10 ug Proteinextrakt auf einer denaturierenden SDS PAGE aufgetrennt Die auf eine Nitrocellulose Membran transferierten Proteineextrakte wurden anschlie end mit verschiedenen prim ren Antik rpern inkubiert und schlie lich mit entsprechenden sekund ren Antik rpern nachgewiesen Dabei wurden Komponenten verschiedener Signaltransduktionswege die bekannterma en in Stressantworten Differenzierungsprozesse Zellteilungen Zellwachstum etc involviert sind untersucht Bei der in dieser Arbeit untersuchten Aktivierung der MAP
116. hmen dieser Arbeit sollten die Auswirkungen einer mechanischen Sch digung des Herzens auf die Regeneration des Herzens untersucht werden Die Untersuchung sollte sowohl morphologische wie molekulare Ver nderungen des Regenerationsprozesses umfassen und versuchen zu einem kausalen Modell der Regeneration zu kommen 3 1 Die mechanische Sch digung des Ventrikels f hrt zu makroskopisch erkennbaren L sionen Truncus arteriosus RI Ventrikel Abb 7 Verschiedene Ansichten des Molches Notophthalmus viridescens und seines gesch digten bzw ungesch digten Herzens A zwei adulte gr nliche Wassermolche Notophthalmus viridescens B isoliertes Herz 14 Tage nach Herzsch digung t Truncus arteriosus a Atrium v Ventrikel die schwarzen Pfeile markieren die nach der Sch digung sichtbaren L sionen C in situ Aufnahme eines Molchherzen Beschriftungen vgl B D H matoxylin amp Eosin F rbung eines transversalen Kryotomschnittes durch den Ventrikel und den Truncus arteriosus 65 Ergebnisse Im Rahmen dieser Arbeit wurde die F higkeit der adulten Molchspezies Notophthalmus viridescens dargestellt in Abb 7 A ventrikul res Myokard nach mechanischer Sch digung zu regenerieren untersucht Die allgemeine Anatomie des Molchherzens ist bereits im 1 2 1 1 beschrieben worden Auf dem HE gef rbten Transversalschnitt in Abb 7 D kann man die starke Trabekulierung des Myokards und das geringe Ventrikellumen gut erkennen U
117. ich die Knorpelstrukturen verl ngern und weiter ausdifferenzieren Au erdem konnten in dieser Phase Mitosen im Knochenmark detektiert werden Iten and Bryant 1976 Probe Scheinoperierte Herzen Minipool Gesamt RNS Menge in ug Minipool 1 4 Regenerierende Herzen 7d postop Regenerierende Herzen 14d postop Regenerierende Herzen 21d postop Nicht amputierte Hinterextremit ten Regenerat 12d nach Amputation Regenerat 23d nach Amputation Nicht amputierte Schwanzspitzen 1 4 35 24 27 21 Regenerat 12d nach Amputation 1 4 10 8 8 Regenerat 23d nach Amputation 1 4 4 13 Tab 10 bersicht ber die Anzahl der Hybridisierungsproben mit Angaben der jeweiligen Gesamtmengen an isolierter Gesamt RNA 75 Ergebnisse Abb 13 Beispiel fiir zwei komplexe Microarray Hybridisierungen mit erfolgreichem Farbstoffaustausch Dye swap Links im Bild sind zwei komplette Microarrays abgebildet die mit der gleichen Probenkombination aber mit jeweils vertauschten Farbstoffen markiert wurden In den vergr erten Ausschnitten weisen die wei en Pfeile auf deregulierte Spots hin die einmal gr n erscheinen und im Paralleexperiment nach Farbstoffwechsel wie zu erwarten rot leuchten Bei gelben Spots handelt es sich um nicht deregulierte Transkripte 3 3 2 1 Deregulation verschiedener Gene w hrend der ersten drei Wochen der Herzregeneration Im Folgenden wurden Transkripte ausgew hlt die m
118. ichend um eine effektive Herzregeneration wie sie im Zebrafisch und im Molch m glich ist zu bewirken Auch in den beiden zuletzt genannten Organismen ist Thymosin B4 ein Faktor unter vielen verschiedenen der zu einer erfolgreichen Regeneration beitragen kann Dennoch gibt das Auftreten des gleichen Peptids in regenerationskompetenten und inkompetenten Organismen Anhaltspunkte daf r dass Faktoren die w hrend der Regeneration in Amphibien und im Zebrafisch eine Rolle spielen auch im S ugetier vorkommen und es sich scheinbar nicht um Faktoren handelt die im S ugerorganismus berhaupt nicht gebildet werden Nun gilt es die Mechanismen aufzukl ren die daf r verantwortlich sind dass das Potenzial solcher Faktoren nicht f r eine vergleichbar effektive Regeneration im S ugetier ausreicht Durch Thymosin 4 Injektionen konnten wie bereits erw hnt schon positive Effekte erzielt werden Experimente in denen die Thymosin 4 Aktivit t erfolgreich im Molchherzen geblockt werden kann k nnten Aufschluss ber die genaue Funktion und Bedeutung dieses Peptids f r die erfolgreiche Regeneration im Molchherzen geben 129 Diskussion 4 6 Analyse der Subtraktionsklone 4 6 1 Dominanz der Expression der zu der glattmuskelspezifischen Myosin regulatorischen leichten Kette homologen cDNS w hrend der Macroarray Hybridisierungen Die starke Pr senz der Sequenz f r die glattmuskelspezifische Myosin regulatorische leichte Kette unter den Su
119. icia Ruiz Die aufgereinigten PCR Fragmente wurden dann auf zwei Sets von Microarrays mit je 50 000 Fragmenten gespottet und vervielf ltigt AG Claus Hultschig Mit der Sequenzierung von drei ig 384er Mikrotiterplatten also von insgesamt 11 520 cDNS Klonen wurde der DNA Sequenzierservice des Max Planck Instituts f r Molekulare Zellbiologie und Genetik Dresden beauftragt Die erhaltenen Sequenzen wurden dann von den Diplombioinformatikern Mario Looso und Patrick Weiss auf ihre Qualit t berpr ft Aus der Qualit tspr fung der Sequenzen resultierten 9686 Sequenzen von guter Qualit t 257 Sequenzen niedriger Qualit t 105 Klone ohne Sequenzdaten und 260 von sehr geringer L nge 1200 Sequenzen besa en kein Insert Die 9686 Sequenzen hoher Qualit t konnten zu 2894 verschiedenen Contigs zusammengefasst werden Unter Verwendung verschiedener BLAST Algorithmen BLASTn BLASTx tBLASTx wurde nach Homologien zwischen den Contigsequenzen und den Eintr gen in verschiedenen nicht redundanten Proteindatenbanken NCBI NR und EST Datenbanken gesucht Die Ergebnisse wurden anschlei end von den Bioinformatikern Mario Looso und Patrick Weiss in einer eigens programmierten Molch EST Datenbank dargestellt 55 der Contigsequenzen erreichten bei den BLAST Suchen E values 20 bis 100 und damit gro e bereinstimmungen mit bereits bekannten Sequenzen 13 Ergebnisse 3 3 2 Hybridisierung der cDNS Microarrays F r die ersten Genexpressionsana
120. icksalsentscheidung ber Proliferation Differenzierung von einigen residenten Stammzellen wie denen der h matopoetischen Radtke et al 2002 neuralen Gaiano and Fishell 2002 gastrointestinalen Brittan and Wright 2002 und skelettmuskul ren Conboy and Rando 2002 Abstammungen spielt bleibt zu kl ren ob die erhaltenen Resultate einen Hinweis auf die Beteiligung einer Stammzellpopulation w hrend der Herzregeneration im Zebrafisch darstellen Zumindest bei der Extremit tenregeneration des Molches wurde eine Beteiligung von Pax7 Satellitenzellen postuliert Morrison et al 2006 Lepilina und Kollegen konnten durch die Verwendung von transgenen Reporterst mmen zeigen dass sich nach Amputation der Ventrikelspitze ein Blastem aus Vorl uferzellen welche prekardiale Marker exprimierten differenzierten und proliferierten bildete Dar ber hinaus stellten sie fest dass das Epikardium welches die beiden Herzkammern 19 Einleitung umgibt die Expression von Markern der Embryonalentwicklung induziert und schnell expandiert um das durch die Amputation exponierte Myokard zu bedecken Au erdem machte eine Subpopulation der epikardialen Zellen einen epithelialen zu mesenchymalen bergang EMT durch und stellte neue Gef e f r den regenerierenden Muskel bereit W hrend der Regeneration wurde die Expression des Fibroblastenwachstumsfaktors fgfl7b im Myokard induziert w hrend die FGF Rezeptoren fgfr2 und fgfr4 von benachbarten
121. ieben Bock Marquette et al 2004 auch im Kern detektiert werden vgl Abb 35 D 100 Ergebnisse 4d postop Abb 35 Zunahme der Thymosin 4 Proteinexpression in den ersten drei Wochen der Herzregeneration Immunfluoreszenzfarbung rot Dapi Kernfarbung blau im scheinoperierten Herzen A vier B sieben C 14 D bzw 21 Tage E und 84 Tage nach Sch digung des Herzens F Der wei e Pfeil in D weist auf Thymosin F rbung in den Kernen hin 101 Ergebnisse Anti Thymosin 4 a Anti Thymosin 4 a Aktinin Glattmuskelaktin Doppelf rbung Doppelf rbung N s u ie a a i m FB ar Abb 36 Kolokalisation der Proteinexpression von Thymosin 4 mit MyHC und Caldesmon Immunfluoreszenzf rbungen f r Thymosin 4 rot a Glattmuskelaktin bzw a Aktinin gr n Dapi Kernf rbung blau Die Ausschnitte A und B stellen berlagerungsbilder dar 3 5 4 Expression des regenerations assoziierten Antigens 22 18 in regenerierenden Herzen Der monoklonale Antik rper 22 18 Konnte durch Immunisierung einer Maus mit Zellen aus einem mid bud Blastem des Molches isoliert werden Der Antik rper f rbt vor allem Zellen innerhalb des Stumpfblastems beginnend 4 Tage nach Amputation Nach zehn Tage ist ein gro er Teil der Blastemzellen positiv danach nimmt die F rbung sukzessive wieder ab Kintner and Brockes 1984 Das detektierte Antigen ist intrazellul r und filament s Auch in Zellkulturen aus versch
122. iedenen Geweben des Molches wie aus dem Stumpfblastem dem Herzen und der Leber wurde dieses Antigen in verschiedenem Ausma exprimiert Ferretti and Brockes 1988 Ferretti and Brockes 1990 Die Expression des regenerations assoziierten Antigens 22 18 konnte vier sieben vierzehn und 21 Tage nach der Sch digung innerhalb des Ventrikels detektiert werden Dabei nahm die Expressionsst rke im Verlauf der Regeneration zu Vier Tage nach der Sch digung 102 Ergebnisse konnten nur ganz vereinzelt positive Signale detektiert werden Vierzehn Tage nach der Sch digung konnte die st rkste Expression beobachtet werden Sie nahm nach 21 Tagen bereits wieder ab Im scheinoperierten Ventrikel konnte keine Expression beobachtet werden In Abb 36 ist die Expression von 22 18 im scheinoperierten Herzen A bzw sieben B vierzehn D und 21 Tage nach Sch digung dargestellt Die F rbung eines Schnittes von einem Stumpfblastem 12 Tage nach der Amputation diente als Positivkontrolle Der gegen MyHC angef rbte Parallelschnitt F eines hnlichen Ausschnittes wie in D weist daraufhin dass es sich bei den positiven Zellen um MyHC negative undifferenzierte Zellen handeln k nnte 7d postop Abb 37 Expression des regenerationsassoziierten Antigens 22 18 im regenerierenden Molchherzen Die Immunfluoreszenzf rbung f r das 22 18 Antigen ist gr n die Dapi Kernf rbung blau A scheinoperiertes Herz B Herzschnitt 7 Tage nach der Sch di
123. indestens 2 48 fach st rker oder schw cher exprimiert wurden als in den scheinoperierten Kontrollherzen Die Chiphybridisierungen mit den fluoreszenzmarkierten Herzproben ergaben eine 2 48 fache verringerte Expression von einigen Komponenten des Zytoskelettes Dies galt vor allem f r die cDNS Sequenzen die den Contigs 13 19 24 und 52 zugeordnet wurden In Abb 14 sind Beschreibungen zu den homologen Sequenzen der einzelnen Contigs und deren bekannten biologischen Funktionen aufgef hrt Bei den Transkripten der Contigs 1 2 6 10 25 und 38 trat die verringerte Expression nur sieben Tage und 14 Tage nach der Sch digung auf 21 Tage nach der Herzsch digung wurden die entsprechenden Transkripte bereits wieder verst rkt exprimiert Andere schwach exprimierte Contigs wiesen Homologien zu Enzymen der Regulation des Metabolismus bzw Komponenten von Stress und Entz ndungsreaktionen auf vgl Abb 15 76 Ergebnisse Ek fT lt 6 4T CombineHerz21T_ Plate055_J09 Plate06i 601 Contig 13 Myosin light T T Chain kinase Plate063_NO8 Zytokinese Regulation der Plate070_A16 Chemotaxis Kinaseaktivit t Plate070_D19 Plate030 Contig 10 Amb Mex Plate091 5 similar to Desmin Muskelzelldifferenzierung Intermediarfilament Contig 2 Troponin C type1 langsam Aktinbindung Muskelkontraktion Contig 6 Myosin heavy Chain Polypeptide 6 Muskelentwicklung Contig 1 Human Myosin heavy chain ca
124. inzig minimale Fibronektinr ckst nde konnten gelegentlich noch in Herzen 84 Tage nach der Sch digung detektiert werden In den Regenerationsprozess sind mitotische Aktivit ten verschiedener Zelltypen auch von Kardiomyozyten involviert Die h chste Mitoserate wurde 14 Tage nach der Herzsch digung erreicht Die erfolgreiche Herstellung einer cDNS Bibliothek die Transkripte aus Herzen 14 Tage nach der Sch digung des Ventrikels enthielt diente als Grundlage f r die Herstellung von Macro und Microarrays Diese konnten f r erste Analysen der differentiellen Genexpression im regenerierenden Herzen verwendet werden Sowohl bei der Analyse der differentiellen Genexpression mittels Macro und Microarrays als auch bei den Immunfluoreszenzf rbungen konnte eine verringerte Expression von Sarkomerproteinen wie Myosin Schweren Kette a Aktinin Myomesin etc beobachtet werden Gleichzeitig konnte eine Zunahme der Expression von glattmuskelspezifischen Genen und Proteinen detektiert werden Die Ver nderungen in der Zusammensetzung der Komponenten des Zytoskelettes k nnten einen Hinweis auf die Dedifferenzierung von Kardiomyozyten darstellen Au erdem wurde die differentielle Expression des Thymosin B4 Peptids und seiner dazugeh rigen mRNS festgestellt Die beschriebene Funktion des Thymosin 4 besteht in der Verhinderung der Polymerisation von globul rem Aktin Zudem konnte gezeigt werden dass die Injektion von Thymsosin 4 positive Effekte auf die Infa
125. is Poss KD A Nechiporuk AM Hillam S L Johnson M T Keating 2002a Mps1 defines a proximal blastemal proliferative compartment essential for zebrafish fin regeneration Development v 129 p 5141 5149 Poss KD L G Wilson M T Keating 2002b Heart regeneration in zebrafish Science v 298 p 2188 2190 Quaini F E Cigola C Lagrasta G Saccani E Quaini C Rossi G Olivetti P Anversa 1994 End stage cardiac failure in humans is coupled with the induction of proliferating cell nuclear antigen and nuclear mitotic division in ventricular myocytes Circ Res v 75 p 1050 1063 Quaini F K Urbanek A P Beltrami N Finato C A Beltrami B Nadal Ginard J Kajstura A Leri P Anversa 2002 Chimerism of the transplanted heart N Engl J Med v 346 p 5 15 Radisic M H Park H Shing T Consi F J Schoen R Langer L E Freed G Vunjak Novakovic 2004 Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds Proc Natl Acad Sci U S A v 101 p 18129 18134 Radtke F A Wilson B Ernst H R MacDonald 2002 The role of Notch signaling during hematopoietic lineage commitment Immunol Rev v 187 p 65 74 Raya A C M Koth D Buscher Y Kawakami T Itoh R M Raya G Sternik H J Tsai C Rodriguez Esteban J C Izpisua Belmonte 2003 Activation of Notch signaling pathway precedes heart regeneration in zebrafish Proc Natl Acad Sci U S A v 100 Suppl 1 p 11889 11895 Rei
126. isierungen wurden dabei so gew hlt dass sie die Herstellung von Transkripten mit definierter L nge erm glichten Ein typischer Ansatz f r eine Transkription setzte sich folgenderma en zusammen x ul linearisierte DNS 1 ug 4ul 5x Transkriptionspuffer 2 ul 100 mM DTT 2 ul DIG Mix DIG 11 UTP ATP CTP GTP UTP lul RNasin RNase Inhibitor 40 U ul lul RNS Polymerase T3 Sp6 20 U ul oder T7 15 U ul ad 20 ul H2O Der Ansatz wurde zwei Stunden bei 37 C inkubiert Durch Zugabe von 2 ul Dnasel 10 U und Inkubation bei 37 C f r 15 min wurde die Plasmid DNS abgebaut Danach wurde die RNS unter Zugabe von 10 ug t RNA 33 ul 7 5 M Ammoniumacetat 100 ul H20 und 300 ul Ethanol pr zipitiert sedimentiert und in 100 ul RNase freiem H20 resuspendiert Bis zur Verwendung wurden die Proben bei 20 C gelagert 2 2 9 3 Fluoreszenzmarkierungen von RNS Proben f r die Chiphybridisierungen 1 Erststrangsynthese Zun chst wurden jeweils 3 ug Gesamt RNS zusammen mit 0 5 ul OligoT7 dT 2g VN Oligonukleotid 0 25 ug ul f r 10 min auf 70 C erhitzt Anschlie end kurz auf Eis abgek hlt und wieder auf Raumtemperatur erw rmt und folgende Komponenten zugef gt 2 ul 5x First Strand Buffer GibcoBRL 1 ul DTT 100 mM GibcoBRL lul dNTPs je 2 5 mM 0 5 ul RNase Inhibitor 35 U ul Fermentas 0 5 ul Superscript II Reverse Transkriptase 200 U ul GibcoBRL Der 10 ul Ansatz wurde zuerst f r 5 min bei RT und dann bei 42 C
127. isse des Blastn Macaca mulatta Major Histocompatibility Complex BAC MMUO65H09 TB1 0 3 kb complete 118 138 Tetraodon nigroviridis full length cDNA 54 148 TB2 0 3 kb keine Homologie TB3 none nur Vektor TB4 none nur Vektor Danio rerio troponin T2 cardiac tnnt2 mRNA 1 29 460 509 TB5 0 9 kb Danio rerio troponin T3a skeletal fast mRNA 39 140 N viridescens mitochondrial gene for 16S ribosomal RNA 50nt 92 TB7 0 15 kb bp 5 53 des Inserts 152 204 von N viridescencs Bos taurus NADH dehydrogenase ubiquinone 1 beta subcomplex TB8 1 1kb MRNA 85 107 204 226 273 398 85 homolog Trichosurus vulpecula beta actin mRNA TB10 0 35 kb complete cds 7 40 97 Homologie TB13 0 95 kb X laevis mRNA for myosin light chain 266 82 TB19 keine Homologie Sus scrofa four and a half LIM domains 1 protein isoform C TB25 1 5 kb FHL1C 28 Int 79 TB32 0 15 kb keine Sequenz TB46 0 23 kb keine Homologie TB54 0 6 kb Ambystoma mexicanum Hb b mRNA for beta globin chain 83 37 101 TB59 0 500 kb Xenopus laevis ribonucleoprotein mRNA 197nt 91 129 411 div TBs insgesamt 44 TB14 0 5 1 1kb Mouse Myosin regulatory light chain A smooth muscle homolog Tab 11 Zusammenfassung der Subtraktionsklone mit Informationen ber ihre Fragmentgr e und Homologie zu anderen bekannten Sequenzen Die blau markierten Klone sind weiter analysiert worden 82 Ergebnisse 3 3 3 2 Expressionsanalyse der Filterklone mittels RT PCR auf cDNS aus verschiedenen Geweb
128. itten Waschschritt wurde die 450 ul TE Puffer noch durch die Zugabe von 20 ug Cot 1 human DNS 10 mg ml und 20 ug Poly A RNS 10 mg ml erg nzt und wie zuvor beschrieben erneut zentrifugiert Die Membran durfte nicht vollst ndig austrocknen sondern es sollten ca 25 ul des lilafarbenen konzentrierten Probengemisches auf der Membran zur ckbleiben Nun wurde die Microcon S ule umgedreht auf in ein neues Eppendorfgef gesetzt und kurz bei 14000 rpm zentrifugiert Dann wurde die S ule erneut umgedreht und mir 30 ul DEPC H O f r eine Minute inkubiert wiederum umgedreht und in dasselbe Eppendorfgef eluiert Anschlei end wurde das Volumen in einer Vakuumzentrifuge auf ca 5 ul reduziert Zu dem Konzentrat wurden 80 ul DIG Hyb Buffer Roche gegeben Der Ansatz 54 Material und Methoden wurde bei 100 C fiir maximal 2 min denaturiert und fiir 20 min bei 14000 rpm bei RT zentrifugiert 2 2 10 Hybridisierungstechniken 2 2 10 1 Hybridisierung membrangebundener Nukleins uren oder Koloniefilter Die Koloniefilter wurden zun chst mit 5xSSC f r 15 min bei Raumtemperatur angefeuchtet und anschlie end in 0 1xSSC 0 1 SDS f r 30 60 min bei 70 C im Wasserbad inkubiert Die Filter bzw Southern Blot Membranen wurden anschlie end in einem geeigneten Volumen Church amp Gilbert Puffer unter Zusatz von 200 pg ml denaturierter Heringssperma DNS f r 2 h ohne Hybridisierungssonde bei 65 C pr hybridisiert Die eigentliche Hybridisier
129. k rper Inkubation Schritt Dauer Zusammensetzung Beh lter Waschl sung I mehrmals kurz K vette 65 C Waschl sung I 3x 15 min K vette 65 C Waschl sung II 3x 15 min K vette 65 C TBST 3x 10 min Kiivette RT Blockierung 1x 30 min TBST 5 Schafserum feuchte Kammer RT Anti Dig Ak ber Nacht 1 2500 in TBST 1 Schafserum feuchte Kammer 4 C 57 Material und Methoden Tab 9 Waschschritte und Antik rperinkubation Tag 3 F rbung TBST 4x 15 min K vette NTMT 3x 10 min K vette Zuletzt erfolgte die Inkubation in der NBT BCIP F rbel sung im Dunkeln ber eine Dauer von 10 Stunden bis zu drei Tagen 2 2 11 Haltungsbedingungen der Molche Adulte Molche der Gattung Notophthalmus viridescens viridescens wurden in der freien Wildbahn auf dem Gel nde von der Charles D Sullivan amp Co Incorporation eingefangen und verschickt Pro Aquarium HxBxT 35cm x 62 cm x 38 cm konnten zehn bis 15 Tiere untergebracht werden Diese wurden zweimal w chentlich mit lebenden roten M ckenlarven gef ttert Aquarien waren mit einer kleinen Insel sowie einigen k nstlichen Wasserpflanzen ausgestattet Die Wassertemperatur betrug 18 20 C ber ein Pumpen und Filtersystem konnte das Wasser durch die Aquarien zirkulieren und st ndig frisches Wasser zugef hrt werden 2 2 12 Operative Eingriffe am Molch Narkose und Wunddesinfektion Am Tag des operativen Eingriffs erhielten die Versuchstiere kein Futter
130. klusive des R ckenmarks und der sensorischen Ganglien Unter und Oberkiefer die Linse und Retina der Augen den Darm und Teile des Herzens zu regenerieren Brockes and Kumar 2005 Abb 3 Molche wie der gr nliche Wasermolch Notophthalmus viridescens verf gen ber ein breites regeneratives Spektrum Der adulte Molch kann unter anderem die Linse und die Retina 1 das R ckenmark 2 Teile des Herzens 3 die Extremit ten 4 sowie Ober und Unterkiefer regenerieren Ver ndert nach Brockes and Kumar 2005 12 Einleitung 1 3 1 1 Die Anatomie des Herzens von Amphibien Im Gro en und Ganzen ist die Anatomie des Herzens bei allen Amphibien hnlich und variiert haupts chlich in den relativen Proportionen und der inneren Struktur Das Herz setzt sich aus drei Kammern zusammen zwei Atrien und einem Ventrikel Bei den meisten Amphibien ist der linke Ventrikel kleiner als der rechte Die Aortenb gen erf llen verschiedene Aufgaben wobei nur einige adulte Salamander ber die komplette Anzahl der Aortenb gen verf gen Der karotide Bogen dient der Blutversorgung des Kopfes w hrend der systemische Bogen den K rper inklusive Teile des Kopfes au er der Lunge und des Pharynx versorgt Der pulmonale Bogen transportiert Blut in die Lungen und die W nde des Pharynx Das Herz selbst bezieht seine N hrstoffe und Sauerstoff aus dem Blut welches durch das Herz hindurchflie t Im Allgemeinen l uft der Herzkreislauf bei Am
131. kombinationen hybridisiert Die verschiedenen Zeitpunkte sollten dazu dienen Einblicke in den Verlauf der Regeneration auf der transkriptionalen Ebene durch die differentielle Expression von bestimmten Genen zu gewinnen Die Verwendung weiterer Molchgewebe wie der Extremit tenregenerate und der Schwanzregenerate sollten die Unterscheidung von gemeinsam genutzten Regenerationsprogrammen und rein herzspezifischen Genexpressionen erm glichen Der Zeitpunkt zw lf Tage nach Amputation der Extremit ten wird als sogenannte Akkumulationsphase Maier and Miller 1992 oder moderate early bud stage Iten amp Bryant 1973 bezeichnet da diese Phase vorwiegend von Dedifferenzierungen und Proliferation im Blastem gekennzeichnet ist 23 Tage nach Amputation beginnt hingegen die Differenzierungsphase Maier and Miller 1992 bzw das late bud stage Iten amp Bryant 1973 in dieser Phase respezialisieren sich die Blastemzellen wieder das hei t es konnten erste Anzeichen beginnender Chondrogenese und Myogenese beobachtet werden Im Fall der Schwanzregeneration f llt der Zeitpunkt 74 Ergebnisse 12 Tage nach Amputation in die sogenannte Phase III 10 15 Tage w hrend dieser Phase wird die Regeneration axialer Strukturen sichtbar und die Chondrogenese und Myogenese beginnen langsam Iten and Bryant 1976 Der Zeitpunkt 23 Tage nach der Amputation f llt in die so genannte Phase IV 13 32 Tage w hrend der die Myogenese stark zunimmt und s
132. kr ftige Unterst tzung bei den Western Blots und die Testung der umfangreichen Antik rpersammlung Dr Rene Zimmermann danke ich f r die berlassung des Zytokeratin 18 Plasmids und die Weitergabe von interessanter Fachliteratur Dr Sawa Kostin Beate Grohmann und Renate M hren danke ich f r die Einf hrung in die Geheimnisse der Immunfluoreszenzf rbungen und die Unterst tzung bei den semid nnen Ultramikrotomschnitten und der Histologie des Molchgewebes Marion Wiesnet danke ich f r die Hilfe bei der Herstellung der prim ren Molchherzzellen Der gesamten ehemaligen Arbeitsgruppe in Halle danke ich f r die angenehme Arbeitsatmosph re dabei insbesondere Manja Petra und Herbert f r ihre guten Ratschl ge und Hilfestellungen auch ber die r umliche Entfernung hinweg bis nach Bad Nauheim Allen Arbeitsgruppen und Mitarbeitern des Max Planck Institutes f r Herz und Lungenforschung danke ich f r die stetige Hilfsbereitschaft und angenehme Arbeitsatmosph re Bei dem Labor 142 bedanke ich insgesamt f r drei sch ne Jahre und gro e Hilfsbereitschaft in vielerlei Hinsicht Marianne danke ich f r ihr stets offenes Ohr und guten Ratschl ge in diversen Lebenslagen und ihre Gesellschaft w hrend der Mittagspausen Meiner Familie und meinen Freunden in Oldenburg Halle und Frankfurt danke ich f r die moralische Unterst tzung und Geduld w hrend der gesamten Promotionszeit 163
133. ktiert und im weiteren Verlauf gemeinsam mit diesem in sich entwickelnden Sarkomeren exprimiert Im Verlauf der Herzentwicklung beschr nkte sich die Expression des a Glattmuskelaktins dann auf den Ausflusstrakt Sugi and Lough 1992 In vitro Experimente mit Embryonalen Stammzellen zeigten dass eine Intervention oder Suppression der o Glattmuskelaktinexpression die kardiale ES Zelldifferenzierung beeintr chtigt Clement et al 2007 Prim re adulte Rattenkardiomyozyten machen w hrend ihrer Kultivierung gro e morphologische Ver nderungen durch die unter anderem von dem Abbau und der Regeneration des Kontraktionsapparates begleitet 126 Diskussion werden Die adulten Kardiomyozyten exprimieren mit zunehmender Zeit in der sie kultiviert werden in einer zunehmenden Anzahl der Kardiomyozyten a Glattmuskelaktin Dabei ist die Expression haupts chlich in stressfaser hnlichen Strukturen an Stelle von Myofibrillen zu finden Eppenberger Eberhardt et al 1990 Diese Beobachtungen deuten auf eine besondere Rolle von Glattmuskelproteinen w hrend der Entwicklung und Regeneration von Kardiomyozyten hin F r die Regeneration des Molchherzens scheinen sie ebenfalls von Bedeutung zu sein da Glattmuskelproteine und Transkripte der entsprechenden Gene wie bereits erw hnt in verschiedenen Experimenten stark exprimiert wurden Dabei spiegelt die Expression keine Neoangiogenese im regenerierenden Molchherzen wider da der Molch im Herzen keine Blu
134. ktivierung des Wnt Ca und des Wnt Polarit t Signalweges durch Wnt II im pr kardialen Mesoderm Wagner and Siddiqui 2007 1 7 Therapeutische Ans tze zur Unterst tzung der Herzregeneration Es werden derzeit verschiedene Ans tze zur Unterst tzung der kardialen Regeneration verfolgt Eine Auswahl dieser Methoden wird im Folgenden kurz vorgestellt 1 7 1 Transplantation von autologen skelettalen Myoblasten Satellitenzellen Die zellbasierte kardiale Reparatur begann mit der Transplantation von Satellitenzellen denn manche Forscher hofften dass auch Skelettmuskelzellen nach Transplantation in den Herzmuskel zu einer Verbesserung der Kontraktionsleitung f hren Allerdings exprimieren die reifen Skelettmuskelzellen nicht die n tigen Adh sions oder Gap Junction Proteine die f r eine korrekte elektromechanische Kopplung mit dem Myokard des Wirtes notwendig sind Reinecke et al 2000 Daher schlugen die Transplantate asynchron Leobon et al 2003 Rubart et al 2004 Trotzdem konnten in 28 Einleitung Tiermodellen positive Effekte auf die kontraktilen Ventrikelfunktionen nach Infarkt erzielt werden Klinische Phase 1 Studien ergaben eine schlechte Integration der transplantierten Satellitenzellen im Infarktgebiet und ein Teil der Patienten entwickelte ventrikul re Arrhythmien Menasche et al 2003 hnliche negative Effekte wurden auch nach Transplantation von skelettalen Myoblasten in infazierte M useherzen beobacht
135. l 2005b Orlic et al 2001 Uber die H he des Anteils an chim ren Kardiomyozyten herrschen kontr re Meinungen Glaser et al 2002 Laflamme et al 2002b Minami et al 23 Einleitung 2005b Quaini et al 2002 Es sollte jedoch angemerkt werden dass zurzeit keine einheitliche Lehrmeinung zur Rolle kardialer Stammzellen existiert Alle diese Beobachtungen zeigen dass auch das S ugerherz gewisse endogene regenerative Kapazit ten besitzt Diese scheinen aber ohne externe Unterst tzung oder Aktivierung nicht effektiv genug zu sein um gro e gesch digte Areale funktionell zu regenerieren Eine Ausnahme hiervon wurde in einer Publikation von Leferovich et al postuliert Dort wurde die Herzregeneration eines bestimmten Mausstammes der MRL MpJ Maus welche ber besondere F higkeiten der Wundheilung verf gt nach transmuraler Kryosch digung untersucht Dieses besondere Wundheilungsmerkmal ist ber mindestens sieben genetische Loci verteilt Dieser Mausstamm reagierte auf die Sch digung mit deutlich geringerer Narbenbildung und einer erh hten Mitoserate in Kardiomyozyten Leferovich et al 2001 Diese Ergebnisse wurden durch die Arbeiten zweier anderer Gruppen deutlich relativiert Abdullah et al konnten nach Anwendung des Isch mie Reperfusionsmodells keine signifikanten Unterschiede zwischen der Resistenz der MRL M use und der Resistenz der C57 Bl6 Kontrolltiere gegen ber myokardialen Infarkten feststellen Abdullah et al
136. l ren Metabolismus annehmen Eine derart spezifische und regional begrenzte Expression erscheint jedoch eher unwahrscheinlich Aufgrund der Beschaffenheit der in situ Proben ist die Detektion einer anderen unbekannten mRNS die nicht f r die NADH Dehydrogenase codiert durchaus m glich und k nnte das beobachtete Expressionsmuster erkl ren 4 7 Das regenerationsassoziierte Antigen 22 18 und Zytokeratin 18 werden auch im regenerierenden Herzen exprimiert Das regenerationsassoziierte Antigen 22 18 und Zytokeratin 18 sind Marker deren Expressionen bisher vor allem w hrend der Extremit ten und Schwanzregeneration untersucht worden sind Beide Antigene konnten im Rahmen dieser Arbeit auch im regenerierenden Herzen detektiert werden Diese Umst nde weisen auf m gliche Parallelen zwischen der Extremit ten und Schwanzregeneration sowie der Herzregeneration hin Eine solche Parallele k nnte z B die F higkeit von terminal differenzierten Zellen im gesch digten Gewebe zu dedifferenzieren und anschlie end entweder zu transdifferenzieren oder zu redifferenzieren sein Der monoklonale Antik rper 22 18 ist durch Immunisierung einer Maus mit Zellen aus einem mid bud Blastem des Molches isoliert worden Der Antik rper f rbt vor allem Zellen innerhalb des Stumpfblastems beginnend 4 Tage nach Amputation Nach zehn Tagen ist ein gro er Teil der Blastemzellen positiv f r 22 18 Anschlie end nimmt die F rbung sukzessive wieder ab 14 Tage n
137. l rt Ver ndert nach Poss 2006 Die Regeneration ohne Blastembildung erfolgt dann entweder mittels a der Transdifferenzierung des bestehenden Gewebes in die fehlende Gewebestruktur b begrenzte Dedifferenzierung und Proliferation der berlebenden Zellen in dem verletzten oder amputierten Organ c durch Zellteilung und anschlie ender Differenzierung der im gesch digten Gewebe ans ssigen Stammzellen Beispiele f r die stammzellvermittelte Regeneration finden sich zum Beispiel auch beim Menschen im Fall der Knochen Einhorn and Lee 2001 und der Muskelregeneration Shi and Garry 2006 Im Gegensatz dazu beruht die blastemische Regeneration auf der Ausbildung einer spezialisierten Struktur des sogenannten Regenerationsblastems Diese Struktur weist gro e hnlichkeit zu der fr hen embryonalen Extremit tenknospe w hrend der Embryogenese der Wirbeltiere auf Das Blastem l sst sich in zwei klar definierte Bereiche aufteilen Einer u eren Schicht von Zellen epithelialen Ursprungs welche den gesamten Stumpf nach au en begrenzen und der darunter befindlichen Zellmasse mesenchymalen Ursprungs Die Ausbildung des Blastems kann je nach Organismus wenige Stunden bis hin zu einigen Tagen dauern Die fehlenden Strukturen werden letztlich durch Differenzierung des Blastems ersetzt Diese Art der Regeneration findet 9 Einleitung man gew hnlich bei den St mmen Planaria Mollusca Echinodermata Urochordata und bei der Extremit te
138. l ssen im Zuge der Verletzung ausgesetzt wurden Demgegen ber teilen sich Stammzellen sehr langsam und befinden sich in gut gesch tzten Nischen innerhalb des entsprechenden Gewebes Differenzierte Zellen K nnten hingegen bereits Mutationen in der nukle ren und mitochondrialen DNS angesammelt haben oder andere gef hrliche Fracht mit sich tragen Laube et al 2006 Molche scheinen aber auch gegen diese Gefahren einen effektiven Schutzmechanismus zu besitzen denn die meisten Versuche zur chemisch induzierten Kanzerogenese ergaben in Molchen ein seltenes Auftreten von Tumoren Besonders die Applikation von kanzerogenen Chemikalien direkt in Gewebe w hrend der Regeneration konnte nur selten Tumore induzieren Tsonis 1983 140 Ausblick 5 Ausblick Die histologische Analyse der Herzregeneration ergab dass Molche der Spezies Notophthalmus viridescens in der Lage sind ihren Ventrikel nach mechanischer Sch digung ohne Narbenbildung wiederherzustellen Die Regeneration dauert ca 12 Wochen Elektrophysiologische oder echokardiografische Messungen zur berpr fung der uneingeschr nkten Funktionsf higkeit nach erfolgreicher Regeneration sind f r den Molch bisher noch nicht etabliert worden Die nicht invasive in vivo Verfolgung des Regenerationsprozesses mit Hilfe der MRT Technologie wird am Max Planck Institut in Bad Nauheim derzeit etabliert und k nnte die Messung verschiedener ventrikul rer Messparameter erm glichen Die Detektion v
139. le Stammzellen ES Zellen u 22u0022002 nern ennennnnenen 33 Tissue engineering Gewebez chtung uuussssssssnsesssnnesnnnennnnn 34 Probleme verschiedener Methoden und Strategien fiir deren klin schen Einsatz A S AE E en 35 Inhaltsverzeichnis 1 8 2 1 2 1 1 2 1 2 2 1 3 2 1 4 213 2 1 6 2 1 7 2 1 8 2 1 9 2 1 10 2 1 11 2 1 12 2 2 2 2 1 2 2 2 2 2 2 1 2 2 3 2 2 4 22 3 2 2 5 1 2 2 6 2 2 7 2 2 8 2 2 9 2 2 9 1 2 2 9 2 Ziele der Doktorarbeit ar nn 36 2 Material und Methoden Mater une s aeaa a a aaa 37 Chemikalien und Verbrauchsmaterial ceeeeeceeeseceeeseeeeeteeeeneeeeeee 37 Enzyme eine 38 Ba kterienstamme 1 22 2e 0hestasunseiiiesnsenitssmse i 38 Verwendete VektoreM sen 38 DNA Gr benstandardsne suen sn lesen 39 Verwendete Kils uuu aun aaa a 39 L sungen und Medien aus a en 39 Liste der verwendeten Prim rantik rper f r Westernblots 41 Liste der verwendeten Prim rantik rper f r Immunfluoreszenzf rbungen 022200snsnssnsenssnnensnnnennnnnennn nenn 42 Liste der verwendeten Sekund rantik rper f r Immunfluoreszenzf rbungen und Westernblots u 2u0220 en 43 Liste der verwendeten Terti rantik rper u 200sseensneennennennnnnn 43 Liste der verwendeten Oligonukleotide u 00 seen 44 Me thoden oendna an n a a reine 45 Sterilisation von L sung
140. leiben der Hyperphosphorylierung des 4EBP 1 eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1 einem Inhibitor des Translationsstarts Ohne Hyperphosphorylierung bleibt 4E BP1 an eIF4E eukaryotic initiation factor 4E gebunden und inhibiert dadurch die cap abh ngige Translation indem er die Bindung von eIF4E an die cap Struktur der m RNS verhindert 30 min nach der Herzsch digung nahm die Phosphorylierung am Threoninrest 1571 des Tuberins leicht zu Die mit dem MEK1 2 Inhibitor behandelten Herzen zeigten aber keine signifikanten Unterschiede Im Fall des bereits erw hnten 4E BP1 bereiten die Phosphorylierungen an den Threoninresten 37 46 die nachfolgenden Phosphorylierungen an dem Serinrest 65 und Threoninrest 70 vor Sie alleine sind jedoch nicht ausreichend um die Bindung mit eIF4E aufzuheben Auch hier waren die Ergebnisse nicht eindeutig Nach U0126 Behandlung konnte jedoch eine etwas st rkere Phosphorylierung an den hier untersuchten Aminos ureresten des 4E BP1 beobachtet werden Dieser Umstand k nnte auf eine erh hte Translationsaktivit t hinweisen Die mitogenaktivierte p70 S6 Kinase wird f r Zellwachstumsprozesse und den Ablauf der G1 Phase des Zellzyklus ben tigt Die Aktivit t der p70 S6 Kinase wird mittels multipler Phosphorylierungen reguliert Sie stellt sowohl innerhalb des Akt Signalweges ein Zielprotein der mTOR Kinase als auch der Erk1 2 Kinase dar Die p70 S6 Kinase phosphoryliert ihrerseits das S6 Protein der 40S ribo
141. ls erhalten w hrenddessen gro e Teile des innenliegenden Myokards zerst rt wurden Diese Sch digungsmethode wie auch eine partielle Amputation des Ventrikel l sst sich nat rlich nicht 1 1 mit dem bei S ugetieren angewendeten Infarktmodell in dem beispielsweise mittels Ligation bestimmter Koronararterien gezielt ein Infarkt induziert werden kann vergleichen Die K nstliche Ligation kann den nat rlich auftretenden thrombotischen Gef verschluss zum Beispiel gut simulieren Da die Molche keine Koronargef e besitzen schied diese Sch digungsmethode f r die Analyse der Herzregeneration im Molch aus Die mechanische Quetschung des Ventrikels im Molch verursacht mehrere auf den gesamten Ventrikel verteilte gesch digte Areale und nicht einen klar begrenzten Wundbereich wie im Fall der Ligation Kryosch digung oder Amputation Dies macht eine genaue Quantifizierung und Lokalisation der Sch digung auf Gewebeschnitten schwierig Trotzdem lie en sich qualitative Unterschiede im Verlauf der Regeneration gut analysieren Die Ergebnisse der Westernblotanalysen die sich jeweils auf Proteinextrakte aus einzelnen Herzen bezogen haben sich in den meisten F llen sehr homogen verhalten Dies spricht f r eine gute Reproduzierbarkeit dieser Sch digungsmethode zumindest dann wenn der komplette Ventrikel in die Analyse miteinbezogen werden kann 120 Diskussion 4 3 Mitotisch aktive Kardiomyozyten ein entscheidender Vorteil von Molchen und Ze
142. ls in Molecular Biology Ausubel et al 1992 durchgefiihrt Die wichtigsten in dieser Arbeit angewendeten Techniken werden im Folgenden kurz beschrieben 2 2 1 Sterilisation von L sungen und Ger ten Die Sterilisation von L sungen Medien und Labormaterialien z B Glaswaren Pipettenspitzen u erfolgte in Autoklaven der Firma Sauter und Fedegari f r 30 min bei 2 2 bar Druck und 134 C L sungen mit hitzesensitiven Bestandteilen wurden gegebenenfalls durch 0 2 um bzw 0 45 um Cellulose Acetat Sterilfilter Sartorius entkeimt 2 2 2 Extraktion von Nukleins uren aus Geweben Die Pr paration von Gesamt RNS aus diversen Geweben erfolgte mittels Trizol Reagent Invitrogen nach den Empfehlungen des Herstellers Zur Zerkleinerung der Gewebeproben wurde entweder ein elektrischer Gewebezerkleinerer f r Eppendorfgef e oder eine Stahlkugel in einer Schwingm hle Retsch MM 301 mit 20 Schwingungen pro Sekunde f r zwei mal drei Minuten benutzt Zur Isolation von RNS aus 30 Molchherzen f r die Herstellung der cDNS Bibliothek bzw F r die Durchf hrung der cDNS Subtraktion wurde f r jeweils 10 Herzen 1 ml Trizol eingesetzt Nach der Gewebezerkleinerung wurden Gewebereste durch eine zehnmin tige Zentrifugation bei 12 000 x g und 4 C pelletiert Ansonsten wurde nach den Angaben des Herstellers verfahren 2 2 2 1 Isolation von mRNS aus Gesamt RNS Die Isolation von mRNS erfolgte mit Hilfe des Oligotex mRNS Mini Kits Quiagen nach
143. lysen wurde das zweite 50 000 Fragmente umfassende Chipset B verwendet Auf diesem Set befanden sich die 11 520 bereits sequenzierten Klone Dieser Umstand sollte die anschlie ende Bestimmung der Sequenzen von deregulierten cDNS erleichtern F r die Herstellung der Hybridisierungsproben wurde zun chst gesch digtes und ungesch digtes Gewebe von verschiedenen Zeitpunkten nach einer Gewebesch digung gesammelt Die sehr geringen Mengen an Geasmt RNS pro Herz machte die mRNS Isolation aus je drei Herzen pro Zeitpunkt notwendig Diese aus je drei Geweben bestehenden sogenannten Minipools wurden auch bei der Isolation von RNS aus Extremit tenst mpfen und Schwanzproben beibehalten In Ausnahmef llen wurden nur zwei Gewebeproben vereint F r jeden Sch digungszeitpunkt wurden vier solcher Minipools hergestellt In Tab 1 sind die verschiedenen Proben aufgef hrt F r die Chiphybridisierungen wurde beispielsweise RNS aus dem Minipool 1 von regenerierenden Herzen 7d postop mit dem Cy3 Farbstoff markiert und zusammen mit Cy5 markierter RNS aus Minipool 1 der scheinoperierten Herzen auf einem Chip hybridisiert Um Unregelm igkeiten zwischen den Einbauraten der beiden Farbstoffe ausschlie en zu k nnen wurden beide Proben in einem zweiten Ansatz mit dem jeweils anderen Farbstoff markiert und auf einem zweiten Chip hybridisiert Dye swap So konnten je acht Messdaten pro Experiment ermittelt werden Insgesamt wurden 56 Chips mit verschiedenen Proben
144. m die Sch digung m glichst gro fl chig und reproduzierbar zu machen wurden die Ventrikel jeweils 15 mal mit einer feinen Pinzette gequetscht Die hier verwendete Sch digungsmethode resultierte in dem Erhalt der u eren Morphologie des Ventrikels bei gleichzeitiger gro fl chiger Zerst rung der inneren Struktur des Ventrikels Die Abb 7 B und C zeigen die noch 14 Tage nach der Sch digung makroskopisch erkennbaren Sch digungen des Ventrikels Sie sind in Form von roten L sionen erkennbar 3 2 Histologische Untersuchung der Herzregeneration anhand semid nner transversaler Plastikschnitte Zur histologischen Untersuchung des Verlaufs der Herzregeneration sind Molchherzen an verschiedenen Zeitpunkten nach der Sch digung entnommen in Plastik eingebettet semid nn 0 5 lum geschnitten und anschlie end mittels Toluidin Blau F rbung gegengef rbt worden Der scheinoperierte ungesch digte Ventrikel des Molchherzens zeichnet sich durch sein kompaktes stark trabekuliertes Myokard aus Es wird nach au en von einem einschichtigen Epikard begrenzt und innen werden die Trabekel von einem einschichtigen Endokard umgeben In Abb 8 B und Abb 9 A ist das Ausma der Sch digung nach vier Tagen zu erkennen Gro e Areale sind zerst rt und man findet in diesen Bereichen kaum noch intaktes Myokard Das Epikard wird von Extrazellul rer Matrix EZM nach innen verst rkt Sieben Tage sp ter findet man bereits Bereiche in denen neue schlauch
145. mbryonic stem cell derived cardiomyocytes Am J Physiol Heart Circ Physiol v 285 p H2355 H2363 Solloway MJ A T Dudley E K Bikoff K M Lyons B L Hogan E J Robertson 1998 Mice lacking Bmp6 function Dev Genet v 22 p 321 339 Soonpaa MH L J Field 1998 Survey of studies examining mammalian cardiomyocyte DNA synthesis Circ Res v 83 p 15 26 Soonpaa MH J O Oberpriller J C Oberpriller 1994 Factors altering DNA synthesis in the cardiac myocyte of the adult newt Notophthalmus viridescens Cell Tissue Res v 275 p 377 382 Sugano Y T Anzai T Yoshikawa Y Maekawa T Kohno K Mahara K Naito S Ogawa 2005 Granulocyte colony stimulating factor attenuates early ventricular expansion after experimental myocardial infarction Cardiovasc Res v 65 p 446 456 Sugi Y J Lough 1992 Onset of expression and regional deposition of alpha smooth and sarcomeric actin during avian heart development Dev Dyn v 193 p 116 124 Tate JM T J McDonnell J C Oberpriller J O Oberpriller 1987 Isolation of cardiac myocytes from the adult newt Notophthalmus viridescens an electron microscopic and quantitative light microscopic analysis Tissue Cell v 19 p 577 585 155 Literaturverzeichnis Tian B W C Carlyle W G Weigold K M McDonald D L Judd C A Toher D C Homans J N Cohn 1999 Localization of changes in beta actin expression in remodeled canine myocardium J Mol Cell Cardiol v 31 p 751 760 Thom T
146. motion an der Martin Luther Universit t Halle Wittenberg am Institut f r Physiologische Chemie Fortsetzung und Fertigstellung der Promotionsschrift am Max Planck Institut f r Herz und Lungenforschung in Bad Nauheim Thema Analyse der Herzregeneration nach mechanischer Sch digung des Ventrikels des adulten Molches Notophthalmus viridescens 161 Anhang 8 4 Tagungsbeitr ge und Publikationen Teilnahme an der 4 GfE School Novel Approaches to Developmental Biology in G nzburg mit einem Kurzvortrag Analysis of differential gene expression in hearts of Lbx1 deficient mice Oktober 2002 Gene expression profiling of regenerating hearts and limbs in the newt Notophthalmus viridescens Thilo Borchardt Mario Looso Patrick Weiss Julia Kruse Henning Witt Patricia Ruiz Thomas Braun Max Planck Institute for Heart and Lung Research Department of Cardiac Development and Remodelling Parkstrasse 1 D 61231 Bad Nauheim Center for Cardiovascular Research Hessische Stra e 3 4 10115 D Berlin Posterpr sentation auf dem Regeneration Meeting 2006 in Ascona September 2006 Analysis of heart regeneration in the newt Notophthalmus viridescens Julia Kruse Thilo Borchardt Sawa Kostin and Thomas Braun Max Planck Institute for Heart and Lung Research Bad Nauheim Germany Posterpr sentation bei der Spetses International Summer School 2007 Molecular Mechanisms of Regeneration September 2007 Sch
147. n Die brigen Klone zeigten keine differentielle Genexpression Die Oligonukleotide f r die m MRLC Klone sind f r Glattmuskelzellen spezifisch da nur mit der Magen cDNS und nicht mit der Skelettmuskel cDNS ein entsprechendes Produkt detektiert werden konnte 83 Ergebnisse 3 4 In situ Hybridisierungen auf Paraffinschnitten von gesch digten und scheinoperierten Herzen 3 4 1 In situ Hybridisierungen mit in situ Proben von verschiedenen Subtraktionsklonen auf Paraffinschnitten In situ Hybridisierungen bieten neben der M glichkeit zur Untersuchung differentieller Genexpression zus tzlich die M glichkeit der genaueren Lokalisation der m RNS Expression im untersuchten Gewebe oder Organismus Aufgrund der verifizierten differentiellen Genexpression der Klone TB8 TB10 TB14 TB19 mittels RT PCR bzw wegen der Homologie von TB25 zum Fhll Gen und dessen bekannter Beteiligung an der Entwicklung von Herzsch digungen Chu et al 2000 Gaussin et al 2003 wurden von diesen Klonen sense und antisense RNS Proben hergestellt Daf r wurden die entsprechenden Fragmente zun chst mittels Sall Xbal Doppelverdau aus dem pDNRLib Vektor herausgeschnitten und gerichtet in einen gleicherma en vorgeschnittenen pSK bzw pKS Vektor kloniert Im pSK pKS Vektor wurden die klonierten Fragmente von zwei verschiedenen Promotoren f r RNS Polymerasen flankiert Diese erm glichten somit die Herstellung von sense und antisense RNS Proben Abb 19 Ex
148. n und Schwanzregeneration einiger Vertebraten Abb 2 Beispiel f r die Extremit tenregeneration nach Amputation unter Ausbildung eines Blastems Die Fotografien zeigen die Regeneration einer Vorderextremit t des Molches Nototophthalmus viridescens nach a distaler bzw b proximaler Amputation einer im Zeitverlauf von 7d 21d 25d 28d 42d und 70d Die Extremit tenregeneration des Molches stellt ein Klassisches und gut untersuchtes Beispiel f r die Regeneration mit Blastembildung dar Ver ndert nach Brockes 1997 Die bereits 1927 von Korschelt festgestellten gro en strukturellen hnlichkeiten von Regenerationsblastemen zwischen den verschiedenen St mmen und das h ufige Vorkommen von Regnerationsblastemen im Bereich der epimorphen Regeneration lassen eine urspr ngliche Bef higung aller Metazoen zur Regeneration vermuten Allerdings erkl rt diese Theorie nicht warum die F higkeiten zur Regeneration mittels Blastembildung als evolution r konserviertem Merkmal innerhalb desselben Stammes nur einigen Spezies vorbehalten geblieben ist und bei anderen nahverwandten Arten ganz oder teilweise verloren gegangen ist Goss versuchte sp ter diesen scheinbaren Widerspruch von Korschelts Theorie dadurch zu erkl ren dass das Merkmal Regeneration w hrend der Entwicklung der Metazoen m glicherweise negativ selektiert worden sein K nnte Damit lie en sich zum einen die Konservierung von blastemischen Strukturen zwischen weit entfer
149. n 3H Thymidin markiert Bei S ugern berstieg die DNS Syntheserate unabh ngig vom experimentellen Modell einschlie lich neonataler Rattenherzen 1 6 nicht sondern variierte von 0 bis 0 5 in adulten Tieren Nach mehrfachen 3H Thymidin Injektionen konnten in Fr schen bis zu 94 der Myozyten in perinekrotischen Regionen markiert werden Bei den S ugetieren wurden hingegen h chstens 9 markierte Myozyten identifiziert Rumyantsev 1991 In einem bersichtsartikel von Soonpaa amp Field werden die Schwierigkeiten bei der eindeutigen Identifikation von proliferierende Kardiomyozyten kritisch diskutiert und Publikationen in denen in gesch digten bzw ungesch digten Ratten oder M useherzen DNS Synthesen in Kardiomyozyten ermittelt wurden und tabellarisch aufgelistet und verglichen In den meisten Arbeiten wurde nicht untersucht ob die DNS Synthesen auch zu kompletten Zytokinesen gef hrt haben Zusammenfassend zeigen die Daten dass DNS Synthesen im adulten S ugerherz auftreten Dabei existieren allerdings gro e Diskrepanzen zwischen den ermittelten H ufigkeiten der DNS Synthesen die in ungesch digten oder gesch digten Herzen ermittelt wurden Die Genauigkeit solcher Messungen h ngt dabei vor allem von der Genauigkeit der Methode zur Bestimmung der DNS Syntheserate und der Methode zur eindeutigen Identifizierung von Kardiomyozyten ab Generell nimmt die DNS Syntheserate der Kardiomyozyten von embryonalen ber neonatale bis hin zu adul
150. n auf der Positivkontrolle vgl Abb 32 A die gew nschte Spezifit t f r glatte Muskulatur Die F rbungen auf gesch digten Herzen ergaben eine starke Zunahme der im scheinoperierten Herzen sehr schwachen Proteinexpression B von a Glattmuskelaktin Bereits vier Tage nach der Sch digung des Ventrikels konnten Areale die f r a Glattmuskelaktin stark positiv sind detektiert werden C Die Expression dehnte sich innerhalb der ersten 7 Tage weiter aus D und blieb auch zwei Wochen nach der Herzsch digung noch bestehen E Nach 21 Tagen nahm die Expression allm hlich wieder ab Sie blieb jedoch noch st rker als im ungesch digten Herzen Ein vergleichbares 98 Ergebnisse Muster zeigten auch die Immunfluoreszenzf rbungen mit einem anderen glattmuskelspezifischen Antik rper dem Caldesmon in Abb 33 Caldesmon EN 4d postop rer 7d postop gt gt eet 5 u 5 X d eR 4 Abb 33 Zunahme der Caldesmonproteinexpression in den ersten drei Wochen der Herzregeneration Immunfluoreszenzf rbung f r Caldesmon rot Dapi Kernfarbung blau im Magen A scheinoperierten Herzen B vier C sieben D 14 E bzw 21 Tage nach Sch digung des Herzens F Doppelf rbungen mit anti a Glattmuskelaktin und anti Caldesmon Antik rpern ergaben die erwartete Koexpression von Caldesmon und a Glattmuskelaktin vgl Abb 34 B Doppelf rbung mit a Glattmuskelaktin und MyHC resultierten h ufig in doppelt positiven Arealen Abb
151. n den mit U0126 behandelten Tieren Die Expression von Troponin T schien im Gegensatz zu MyHC kaum dereguliert zu sein Die Phosphorylierung des Serinrestes des Histons 3 begann nach sieben Tagen anzusteigen und wurde nach 14 Tagen am st rksten Ein hnliches Ergebnis ergab auch ein Marker der S Phase des Zellzyklus der Antik rper gegen PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen 112 Ergebnisse RUE MeOH MeOH oeoe _ gt ee ll i i _ aaa aa ae gt ess w MyHC Troponin T Destrin Cofilin PCNA P Histon 3 Ponceau Rot gefarbte Aktinbanden als Ladungskontrollen MyHC Troponin T Destrin Cofilin PCNA P Histon 3 Ponceau Rot gefarbte Aktinbanden als Ladungskontrollen Abb 43 Westernblotanalyse zur Proteinexpression verschiedener Zytoskelettkomponenten und Proliferationsmarkern 1 4 7 und 14 Tage nach der Herzsch digung 113 Ergebnisse 3 6 2 5 Verringerte Expression der Aktin Depolymerisationsfaktoren Cofilin und Destrin in U0126 injizierten Herzen vier Tage nach der Herzsch digung Eine Erkl rungsm glichkeit f r die unterschiedlichen Mengen an MyHC nach vier und 14 Tagen nach Herzsch digung k nnte ein ver nderter Ablauf der Umbauprozesse des Zytoskelettes die im Rahmen der Regeneration stattfinden darstellen Aus diesem Grund wurde die Expression zwei bekannter Aktin Depolymerisations
152. n des regenerationsassoziierten Antigen 22 18 in Tegenerierenden Herzen usssnisfnsnskenule ea 102 Analysen der Proteinexpressionen w hrend der Herzregeneration 104 Ver nderungen des Phosphorylierungsstatus verschiedener Enzyme kurze Zeit nach Sch digung des Herzens 2uur204r20ne essen 104 Untersuchung des Einflusse des MEK1 2 Inhibitors U0126 auf die Herzreseneraton see al 106 Die biochemische Inhibition der MEK1 2 Kinase durch den Inhibitor U0126 ist in den ersten 30 min nach Herzsch digung GEIER SLDAr een ee Eee 107 St rkere Aktivierung der Akt Kinase nach Inhibition der MEK1 2 durch den Inhibitor VO 12 6 esta 109 Weitere Substratproteine des MAPK Signalweges und oder Akt Signalweges zeigen keine eindeutige Deregulation nach U0126 In ROG as rise 109 Inhaltsverzeichnis 3 6 2 4 3 6 2 5 3 6 2 6 3 7 3 7 1 3 7 2 4 1 4 2 4 3 4 4 4 5 4 5 1 4 5 2 4 5 3 4 5 4 Untersuchung des Einflusses der U0126 Behandlungen auf die Proteinexpression von Zytoskellettproteinen und Mitose bzw S Phasen Markern in gesch digten Herzen u nen 112 Verringerte Expression der Aktin Depolymerisationsfaktoren Cofilin und Destrin in U0126 injizierten Herzen vier Tage nach der Herzschalieung aussi ie 114 Die transiente oder Kontinuierliche Injektion von U0126 hat keinen Einfluss auf die Expression bzw Phosphorylierung von Erk1 2 Histon 3 oder MYHO testet essen 114 Unters
153. necke H G H MacDonald S D Hauschka C E Murry 2000 Electromechanical coupling between skeletal and cardiac muscle Implications for infarct repair J Cell Biol v 149 p 731 740 Reinecke H M Zhang T Bartosek C E Murry 1999 Survival integration and differentiation of cardiomyocyte grafts a study in normal and injured rat hearts Circulation v 100 p 193 202 Rio Tsonis K C H Washabaugh P A Tsonis 1995 Expression of pax 6 during urodele eye development and lens regeneration Proc Natl Acad Sci U S A v 92 p 5092 5096 Roell W T Lewalter P Sasse Y N Tallini B R Choi M Breitbach R Doran U M Becher SM Hwang T Bostani J von Maltzahn A Hofmann S Reining B Eiberger B Gabris A Pfeifer A Welz K Willecke G Salama J W Schrickel M I Kotlikoff B K Fleischmann 2007 Engraftment of connexin 43 expressing cells prevents post infarct arrhythmia Nature v 450 p 819 824 Rubart M M H Soonpaa H Nakajima L J Field 2004 Spontaneous and evoked intracellular calcium transients in donor derived myocytes following intracardiac myoblast transplantation J Clin Invest v 114 p 775 783 Rumyantsev PP Replicative behaviour of different types of cardiomyocytes in terms of experimental conditions age and systematic position of animals In Oberpriller JO 154 Literaturverzeichnis Sambrook J and Fritsch E F a M T 1989 Molecular cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbour Laboratory Pr
154. nem 1 1 Gemisch aus Propylenoxid und Epoxid Harz Ladd USA inkubiert Zuletzt wurden zwei einst ndige Inkubationen in reinem Epoxid Harz bei 37 C und eine dritte f r 15 min Zuletzt wurden die Herzen in Silikonformen in dem Epoxidharz f r 3 Tage zum Aush rten in einen 50 C Inkubator gestellt Semid nne Schnitte wurden dann am Ultramikrotom Ultracut E Reichert Jung angefertigt und anschlie end mit Toluidin Blau kontrastiert Toluidin Blau Stockl sungen A 1 ige w ssrige filtrierte L sung B 0 5 ige w ssrige L sung pH 11 4 Gebrauchsl sungen 0 5 ige L sung 1 iger L sung 1 6 2 2 13 2 Einbettungen in Paraffin F r Antik rperf rbungen und in situ Hybridisierungen wurden Organe in 4 Paraformaldehyd in PBS f r 2 h bei 4 C fixiert und anschlie end durch halb bis einst ndige Inkubationen in einer aufsteigenden Ethanolreihe 70 90 96 und 2x 100 Ethanol entw ssert Es folgte eine zweimalige Inkubation in reinem Xylol von je einer Stunde Als N chstes wurde mit einer 1 1 Mischung aus Xylol und Paraffin fortgefahren In diesem Gemisch wurde eine Stunde lang bei 60 C inkubiert bevor sich die einzubettenden Objekte zweimal eine Stunde lang mit 60 C warmem Paraffin infiltriert wurden Zuletzt wurden die Embryonen bzw Organe in eine Plastikform gegossen und mit fl ssigem Paraffin bedeckt Nach dem Erh rten bei Raumtemperatur wurden die Paraffinbl cke bei RT gelagert Paraffinschnitte wurden mit einer Dick
155. neration verst rkt exprimiert werden w hrend der Herzentwicklung keine gro e Rolle spielen f hren zu der Frage ob Regeneration und Embryonalentwicklung auf unterschiedlichen genetischen Programmen basieren Zur Beantwortung dieser Frage wurde 50 der Atrien von 24 hpf Embryonen amputiert und die Expression von msxB und msxC nach drei sieben und 24 Stunden mittels in situ Hybridisierung analysiert Msx Transkripte wurden bereits nach 3 Stunden in dem verbleibenden kardialen Schlauch stark exprimiert und blieben auch nach sieben bzw 24 Stunden noch nachweisbar Dieses Ergebnis zeigt dass die Expression von molekularen Regenerationsmarkern nicht nur auf adulte Zellen zutrifft sondern auch embryonale kardiale Zellen in der Lage sind ein genetisches Regenerationsprogramm zu aktivieren Raya et al 2003 Im Rahmen eines gro en Screenings mittels in situ Hybridisierungen zur Identifizierung von Faktoren die in Regenerationsmechanismen involviert sind wiesen Komponenten des Notch Signalweges eine ver nderte Expression auf Diese Faktoren sind bisher nicht mit epimorpher Regeneration sondern vielmehr bei Verletzungen der Z hne Mitsiadis et al 18 Einleitung 1999 und der Arterien d h vorwiegend mit endothelialen Verletzungsreaktionen in Zusammenhang gebracht worden Lindner et al 2001 Bei dem im Screening identifizierten Kandidaten handelt es sich um notchlb einem der beiden Zebrafischorthologen vom Drosophila Notch Die Exp
156. ngerte Expression detektiert werden Diese stieg jedoch nach 21 Tagen bereits wieder auf ein st rkeres Expressionsniveau als in den Kontrollherzen an Diese Beobachtungen lassen sich m glicherweise mit elektronenmikroskopischen Analysen von DNS synthetisierenden proliferierenden Kardiomyozyten vergleichen Diese werden h ufig durch eine geringere Anzahl und kleinere Myofibrillen gekennzeichnet In mitotischen Kardiomyozyten konnten keine Z Scheiben beobachtet werden Bader and Oberpriller 1979 OBERPRIL J and OBERPRIL JC 1971 Oberpriller and Oberpriller 1974 Au erdem spiegeln sie die mittels Immunfluoreszenzf rbungen beobachtete vor bergehende Reduktion von Sarkomerproteinen wie Myosin Schwere Kette a Aktinin und Myomesin wider Andere Transkripte mit Homologien zu Zytoskelettproteinen wurden im Gegensatz dazu bereits nach sieben bzw 14 Tagen wieder st rker exprimiert Zu dieser Gruppe geh rten Sequenzen mit Homologien zu a skelettalem Aktin a Aktin 2 Glattmuskel Aorta und einem Transkript mit hnlichkeit zum Transgelin 2 Diese Proteine geh ren nicht 125 Diskussion unbedingt zu typischen Markern f r reife Kardiomyozyten sondern k nnten unter der Annahme das die Regeneration des Herzens hnlich wie die der Extremit ten unter anderem auf Dedifferenzierung und Redifferenzierung beruht auf neugebildete unreifere oder dedifferenzierte Kardiomyozyten hinweisen 4 5 2 Zunahme der Expression von glattmuskelspezifischen
157. nten St mmen sowie die differentielle Verteilung dieses Merkmals zwischen verschiedenen taxonomischen Gruppen innerhalb eines Stammes erkl ren Warum das Merkmal Regeneration negativ selektiert worden sein k nnte bleibt ungekl rt Vergleiche zwischen der bereits besser erforschten Embryonalentwicklung und der Regeneration bei Wirbeltieren geben deutliche Hinweise auf gemeinsam genutzte regulatorische Prozesse und Gene die beispielsweise eine Rolle f r die Morphogenese bei 10 Einleitung der Extremit ten oder Augenentwicklung und der Extremit ten oder Augenregeneration spielen Alvarado 2000 Pax 6 ist ein solcher Hauptregulator der Augenentwicklung und seine Expression konnte unter anderem w hrend der Augenregeneration des Plathelminthen Dugesia G tigrina Callaerts et al 1999 bei der Augenentwicklung beim Axolotl und der Linsenregeneration des Molches Notophthalmus viridescens Rio Tsonis et al 1995 sowie in in vitro Transdifferenzierungsexperimenten von prim ren pigmentierten Epithelzellen aus der Iris von H hnern zu Linsenzellen nachgewiesen werden Kosaka et al 1998 F r den Verlust der Regenerationsf higkeit zwischen nahverwandten Spezies gibt es zwei verschiedene kontroverse Hypothesen So geht Goss von einer adaptiven Bedeutung der Regeneration aus und f hrt als Beispiel die unterschiedliche Regenerationsf higkeit polychaeter und oligochaeter W rmer an Beide k nnen ihre hinteren K rpersegmente regen
158. of the TGF beta superfamily Cell v 71 p 399 410 Kintner CR J P Brockes 1984 Monoclonal antibodies identify blastemal cells derived from dedifferentiating limb regeneration Nature v 308 p 67 69 149 Literaturverzeichnis Kosaka M R Kodama G Eguchi 1998 In vitro culture system for iris pigmented epithelial cells for molecular analysis of transdifferentiation Exp Cell Res v 245 p 245 251 Koshiba K A Kuroiwa H Yamamoto K Tamura H Ide 1998 Expression of Msx genes in regenerating and developing limbs of axolotl J Exp Zool v 282 p 703 714 Jo SK W Y Cho S A Sung H K Kim N H Won 2005 MEK inhibitor U0126 attenuates cisplatin induced renal injury by decreasing inflammation and apoptosis Kidney Int v 67 p 458 466 Laflamme MA J Gold C Xu M Hassanipour E Rosler S Police V Muskheli C E Murry 2005 Formation of human myocardium in the rat heart from human embryonic stem cells Am J Pathol v 167 p 663 671 Laflamme MA C E Murry 2005 Regenerating the heart Nat Biotechnol v 23 p 845 856 Laflamme MA D Myerson J E Saffitz C E Murry 2002a Evidence for cardiomyocyte repopulation by extracardiac progenitors in transplanted human hearts Circ Res v 90 p 634 640 Laube F M Heister C Scholz T Borchardt T Braun 2006 Re programming of newt cardiomyocytes is induced by tissue regeneration J Cell Sci v 119 p 4719 4729 Laugwitz KL A Moretti J Lam P Gruber Y
159. omyozyten 3 2 1 Analyse der Mitoseh ufigkeit im Verlauf der kardialen Regeneration Im Rahmen einer erfolgreichen Wiederherstellung von zerst rtem Myokard bedarf es wie bereits beschrieben McDonnell and Oberpriller 1984 Oberpriller and Oberpriller 1974 der Teilungsf higkeit verschiedener Zelltypen Zur Bestimmung der H ufigkeit von Zellkernteilungen in mechanisch gesch digtem Myokard wurden semid nne Schnitte 0 5 1 um von je zwei oder drei scheinoperierten Herzen bzw von Herzen 4 7 14 21 oder 43 Tage nach der Sch digung angefertigt Anschlie end wurden diese mit Toluidinblauf rbel sung kontrastiert F r jeden Zeitpunkt wurden je vier transversale Schnitte durch den kompletten Ventrikel unter einem Mikroskop mit 63 facher Vergr erung ausgez hlt Als mitotische Zellkerne wurden solche Kerne definiert in denen die kondensierten Chromosomen deutlich zu erkennen waren Au erdem war die in nicht mitotischen Zellen gut erkennbare Kernmembran in Zellen in der M Phase nicht mehr sichtbar Je nach ihrer Lokalisation im Gewebe wurden die Zellkerne als Myozytenkerne trabekel assoziierte Zellkerne oder als andere zu keiner der beiden vorherigen Gruppen zugeh rigen Zellkerne bezeichnet Beispiele f r die Zuordnung der verschiedenen Zellen sind in Abb 10 zu sehen Abb 10 Beispiel f r Mitosen in verschiedenen Zelltypen 14 Tage nach Sch digung Ausschnitt aus einem semid nnen toluidinblaugef rbten Plastikschnitt Die Pfeile w
160. on Mitosen im gesch digten Myokard erfolgte unter Verwendung von semid nnen Toluidin Blau gef rbten Herzschnitten Eine eindeutige immunhistochemische Charakterisierung und Identifizierung der mitotischen Zellkerne gelang aufgrund des Mangels an molchspezifischen Antik rpern und des Fehlens transgener Molchlinien die ber zelltypspezifische Reportergenexpressionen verf gen noch nicht Das Screening weiterer Antik rper zur Charakterisierung der als Trabekel assoziierten Zellen sowie die Herstellung transgener Molche w ren wichtige Erg nzungen der bisherigen Analysen Die Analysen der differentiellen Genexpression im gesch digten Molchherzen haben erste interessante Ergebnisse in Bezug auf Ver nderungen in der Expression von Zytoskelettproteinen ergeben Sie k nnen sowohl Ausdruck der Dedifferenzierungsprozesse als auch notwendige Voraussetzungen f r die Proliferationsf higkeit von Kardiomyozyten sein Die Generation eines zweiten Chipsatzes mit zuvor normalisierten cDNS und der Vereinigung von Transkripten vieler verschiedener Zeitpunkte nach der Sch digung werden wahrscheinlich die Identifikation von weiteren f r die erfolgreiche Regeneration wichtigen Faktoren erm glichen Erg nzende Analysen der bereits als dereguliert identifizierten Sequenzen mit Homologie zu bekannten Genen sowie der Sequenzen ohne Homologie mittels RACE PCR in situ Hybridisierungen etc sind ebenfalls erforderlich Die Untersuchung der Aktivierung verschiedener Sign
161. onen die f r die weitere Ausbildung des Vier bzw Dreikammerherzens notwendig sind Im Folgenden werden kurz drei Signaltransduktionswege vorgestellt deren Beteiligung besonders in der fr hen Herzentwicklung und dabei insbesondere f r die kardiogene Induktion im Mesoderm eine Rolle spielen Eine Beteiligung dieser Signaltransduktionswege bzw einiger Bestandteile an der Herzregeneration ist denkbar und wurde im Fall der Herzregeneration des Zebrafisches auch schon teilweise untersucht Lepilina et al 2006 1 6 1 Positiv wirkende Signalmolek le des Endoderms BMPs und FGFs BMPs BMPs wurden urspr nglich als Signalmolek le mit der F higkeit zur Induktion der Knochen und Knorpelbildung entdeckt Urist 1965 Sie geh ren zu der TGF B Superfamilie transforming growth factor zu der au erdem TGF Activine Inhibine und die M llerian inhibiting substance geh ren Bis heute konnten 15 BMPs in S ugetieren identifiziert werden Dabei scheinen BMP2 und 4 die einzigen BMP Isoformen zu sein die die Bildung von kardiogenen Zellen aus nicht pr kardialem Mesoderm in vitro induzieren k nnen Schultheiss et al 1997 Endodermale Zellen ventral des anteromedialen Mesoderms produzieren und sekretieren BMPs die an BMP Rezeptoren binden und entsprechende Signaltransduktionswege aktivieren Die ektopische Applikation von rekombinantem reinem BMP2 in nichtkardiogenem Mesoderm konnte die Expression von kardiogenen Transkriptionsfaktoren wie
162. onsanalyse ergab einen kontinuierlichen Anstieg der Expression von sieben bis 21 Tage nach der Herzsch digung Auch in situ Hybridisierungen auf transversalen Herzschnitten 14 Tage nach der Sch digung zeigten eine Anf rbung sowohl in gesch digten Regionen als auch in ungesch digten Bereichen Keine Thymosin B4 mRNS konnte hingegen im scheinoperierten Herzen nachgewiesen werden Auf Proteinebene konnte ebenfalls eine Zunahme der Thymosin 4 Expression im Verlauf der Regeneration beobachtet werden Dabei konnte das Peptid teilweise auch im Zellkern detektiert werden und eine gewisse basale Proteinexpression konnte im scheinoperierten Herzen beobachtet werden Interessant ist die Expression von Thymosin 4 im regenerierenden Molchherzen da Thymosin 4 auch im regenerierenden Zebrafischherzen drei und sieben Tage nach Amputation der Herzspitze in der Wunde und im angrenzenden Myokard detektiert werden konnte Lien et al 2006 In in vitro Versuchen mit murinen embryonalen Herzexplantaten f hrte die Zugabe von Thymosin 4 zur Migration von Muskelaktin positiven schlagenden Zellen aus dem Explantat In Kulturen von neonatalen Rattenkardiomyozyten f hrte Thymosin 4 ebenfalls zu erh hter Migration und zu l ngerem berleben in der Kultur Auch im Fall der Regeneration des Molchherzens w re 128 Diskussion ein Einfluss von Thymosin 4 auf die zellul re Beweglichkeit vorstellbar Die Suche nach weiteren Interaktionspartnern von Thym
163. onsf higkeit 8 Modellorganismen f r die Untersuchung der Herzregeneration bei Wirbellieren essen 12 Det MO eis seitens testen 12 Die Anatomie des Herzens von Amphibien ueennen 13 Herzregeneration im Molch a use een 14 In vitro Analyse der proliferativen Eigenschaften von Kardiomyozyten des MOoIches ccesscccessceceeeeecceeececseeeecseeeesseeeeaees 15 Herzregeneration im Zebrafisch 200220000ssssnssnnnsnnnnsnnnenennn 16 Proliferationsf higkeit von Kardiomyozyten verschiedener Spezies and Altersstuten u Erik 20 Grundprinzipien der myokardialen Infarktreparatur beim SAUSCHER ss a era De N 22 Herzregeneration im Sauseler a 20 a2 a 23 Embryonale Herzentwicklune nte2 n23e lan 24 Positiv wirkende Signalmolek le des Endoderms BMPs und Positive und negative Signalmolek le des Mesoderms und des Ekt des us Er 27 Therapeutische Ans tze zur Unterst tzung der Herzregeneration 28 Transplantation von autologen skelettalen Myoblasten Satellitenzellen z us acsredstenseresiestn nein aa 28 Transplantation von multipotenten adulten Stammzaellen 29 Der Einsatz von Zytokinen zur gezielten Mobilisierung von endogenen Vorlauferzellen ric csccevscsisaecadsassavsavasavsascossnsesvasdevsdeadeonacde snes 30 Mesenchymale Stammzellen MSC 2u2ssssssennsnnesnnnenennnann 31 Myokardiale Vorlauferzellen uote 32 Embryona
164. osin 4 neben seiner bereits bekannten Aktinbindung ergab eine Affinit t zu den Proteinen PINCH und ILK Diese sind ihrerseits Komponenten eines gr eren Komplexes der in Interaktionen zwischen Zellen und Extrazellul rer Matrix involviert ist und unter dem Namen Fokaler Adh sions Komplex bekannt ist Bock Marquette et al 2004 PINCH und ILK unterst tzen die Phosphorylierung der Serin Threonin Kinase Akt und spielen wie Akt eine zentrale Rolle in verschiedenen Signaltransduktionswegen die f r Zellwachstum Zellbeweglichkeit und Zell berleben verantwortlich sind Fukuda et al 2003 Neben den positiven Effekten von Thymosin 4 in vitro f hrte auch die intrakardiale und oder intraperitoneale Injektion von Thymosin 4 in infazierte M useherzen zu einer verringerten Narbenbildung besseren echokardiografischen Messwerten f r die Ejektionsfraktion EF und die systolische Druckmesserverk rzung fractional shortening FS Dar ber hinaus Konnte die Zelltodrate 24 Stunden nach der Ligation erfolgreich gesenkt werden Bock Marquette et al 2004 Thymosin 4 ist ein sowohl im S ugetierherz als auch im Zebrafisch und Molchherzen vorkommendes Peptid welches ber ein gro es Potenzial f r die Unterst tzung der Herzregeneration verf gt Dieses in verschiedenen Organismen nat rlich vorkommende Peptid hat im gesch digten S ugerherzen positive Wirkungen Diese positiven Effekte von Thymosin 4 sind im S ugerherzen scheinbar nicht ausre
165. osphorylierung der MEK1 2 Kinasen sowohl in den scheinoperierten als auch in den gesch digten Herzen nach Inhibitorgabe stark verringert die Gesamtmenge der Kinasen blieb unver ndert 107 Ergebnisse P MEK1 2 om P Erk1 2 Abb 39 Inaktivierung der MEK1 2 und Erk1 2 Kinasen nach i p Injektion des Inhibitors U0126 in ap s Ral A scheinoperierte Herzen und in Herzen 10 min nach Schadigung F r das Zielenzym der MEK1 2 Kinase die Erk1 2 Kinase konnte auch noch nach 30 min keine Phosphorylierung detektiert werden Die 90kDa S6 Kinase die von der aktivierten Erk1 2 Kinase phosphoryliert wird zeigte auch hier eine deutlich schw chere Phosphorylierung Einen Tag nach Herzsch digung und Inhibitorbehandlung waren keine Unterschiede zwischen behandelten und Kontrolltieren in Bezug auf die hier untersuchten Phosphorylierungsstellen mehr detektierbar Der Phosphorylierungsstatus erreichte in den meisten F llen wieder das Niveau der ungesch digten Herzen Die Detektion des GTP bindenden Proteins Ral A einem Mitglied der Ras Superfamilie diente hier und im Folgenden zum quantitativen Vergleich der einzelnen Proben sowie die Ponceau Rot gef rbten Membranauschnitte o P MEK1 2 gt Gite eas Gap Gp ae EEE dite ee Ste ees ee ee Cesa MEK1 2 ws gt ep ee SES dite te He ee Fesamt Erk1 2 u e TS u P p90RSK SD ee ee eee RalA Abb 40 Untersuch
166. phibien folgenderma en ab Das Blut verl sst den Ventrikel und das rechte Atrium auf unterschiedlichen Wegen in Richtung Kopf Haut und Lunge Zuriickkommendes Blut aus dem Kopf dem K rper und der Haut tritt ber den Sinus venosus in das linke Atrium ein Das Blut aus der Lunge kehrt ber die Lungenvene in diesen zur ck Zus tzlich findet in manchen Spezies eine Trennung zwischen deoxygeniertem und oxygeniertem Blut durch ein ventrikul res Septum und einem interatriellen Septum bei manchen Salamandern statt Bei anderen Salamandern findet keine Trennung des Blutes statt so dass sich das oxygenierte Blut der Haut und der Lunge mit dem deoxygenierten Blut des K rpers mischt bevor es das Herz auf dem Weg zu den verschieden K rperteilen wieder verl sst Diese verschiedenen Arten der kardialen Zirkulation h ngen mit den unterschiedlichen Lebensweisen der Salamander zusammen Eine andere Verteilung des Blutes ist beispielsweise besonders f r aquatische Salamander die sauerstoffarme Gew sser bewohnen wichtig Duellmann 1994 Der Ventrikel von Molchen ist stark trabekuliert Die Trabekel setzen sich vorwiegend aus Kardiomyozyten gelegentlich Fibroblasten und anderen Elementen wie Nervenfasern und Mastzellen zusammen Von innen werden die Trabekel von einem einschichtigen Endokard ausgekleidet Oberpriller and Oberpriller 1974 Au erdem findet man im Molchherzen Melanozyten Granulozyten und Monozyten und im Gegensatz zum Menschen kernhal
167. pimorphe Herzregeneration bilden Raya et al 2003 Von einigen Mitgliedern der Msx Familie der Homeodom nen besitzenden Transkriptionsfaktoren ist die F higkeit zur Unterdr ckung von Differenzierungsprozessen w hrend der Entwicklung und Regeneration bekannt Koshiba et al 1998 Nechiporuk and Keating 2002 Odelberg 2002 Au erdem konnte eine verst rkte Expression von msxB und msxC w hrend der Flossenregeneration nachgewiesen werden Akimenko et al 1995 Die Analyse des Einflusses dieser Faktoren auf die Herzregeneration ergab auch hier eine starke bereits nach 3 Tagen einsetzende Expression in der myokardialen Randzone der L sion In der zweiten Woche erreichte die Expression ihr Maximum und nahm anschlie end wieder vollst ndig ab Im ungesch digten adulten Herzen und w hrend der Herzentwicklung konnte dagegen keine Expression von msxB und msxC nachgewiesen werden Diese Ergebnisse weisen unter anderem auf eine Eignung der Mitglieder der Msx Genfamilie als gewebeunabh ngige Marker f r regenerative Prozesse hin Raya et al 2003 Beobachtungen der eigenen Arbeitsgruppe Zimmermann et al weisen jedoch auf eine Expression von Msx Genen auch im ungesch digten Myokard hin was zu gewissen Zweifeln an den publizierten Daten f hrt Die Beobachtungen dass Gene die w hrend der Herzentwicklung eine Rolle spielen keine ver nderte bzw verst rkte Expression w hrend der Herzregeneration zeigen und ebenfalls Gene die w hrend der Rege
168. pression des Subtraktionsklons TB8 im gesch digten 14d postop und scheinoperierten Herzen A TB8 as Probe auf gesch digtem Herzen 14d postop B Trichrome gef rbter Nachbarschnitt C TB8 s Probe auf gesch digtem Herzen 14d postop D TB8 as Probe auf scheinoperiertem Herzen 84 Ergebnisse Die in situ Proben bestanden aus den kompletten Inserts und nicht nur aus den zu bekannten Sequenzen homologen Bereichen Analysiert wurden die Expressionsmuster auf 10um diinnen frontal geschnittenen Paraffinschnitten von Molchherzen 14 Tage nach Sch digung und scheinoperierten Sham Herzen Die in situ Hybridisierungen mit sense s und antisene as RNS Proben gegen den Subtraktionsklon TB8 mit einer Homologie zur NADH Dehydrogenase zeigten wie bei der RT PCR auch auf Paraffinschnitten eine differentielle Expression Im Vergleich mit einem trichromgef rbten Nachbarschnitt vgl Abb 19 B wurde deutlich dass die Expression innerhalb eines gesch digten Areals auftrat vgl Abb 19 A Die sense Probe die als Kontrolle diente zeigte keine Farbung Abb 18 C Im scheinoperierten Herzen fand man ebenfalls keine Expression Abb 19 D Abb 20 Expression des Subtraktionsklons TB10 im gesch digten 14d postop und scheinoperierten Herzen A TB10 as Probe auf gesch digtem Herzen 14d postop B TB10 s Probe auf gesch digtem Herzen 14d postop C Vergr erter Ausschnitt aus Bild A TB10 Expression in einem gesch digtem Areal D TB10 as Probe
169. r alle im Folgenden dargestellten Immunfluoreszenf rbungen wurden wenn nicht anders angegeben 6 um dicke transversale Gefrierschnitte verwendet 4d postop 7d postop be Pa Nk 7 LE _ 21d postop F Abb 27 Transiente Reduktion der MyHC MF20 Expression nach mechanischer Sch digung des Ventrikels Immunfluoreszenzf rbung mit einem Antik rper gegen MyHC rot Dapi Kernf rbung blau auf scheinoperierten Herzen A vier B sieben C 14 D und 21Tage E nach Herzsch digung Die gestrichelten Rechtecke markieren die Region aus der der jeweilige vergr erte Ausschnitt stammt wei e Rechtecke Die Immunfluoreszenzf rbungen unter Verwendung von Antik rpern gegen Sarkomerproteine wie Myosin Schwere Kette MF20 a Aktinin detektiert Stressfasern und Z Scheiben und Myomesin detektiert M Banden zeigten deutlich dass kurz nach 93 Ergebnisse der mechanischen Ventrikelsch digung die Expression von Sarkomerproteinen in gesch digten Bereichen sehr stark abnahm Im Verlauf der ersten drei Wochen nach der Sch digung nahm die Expression allm hlich wieder zu und die Areale ohne Reexpression von Sarkomerproteinen wurden deutlich kleiner Nach 84 Tagen schien die Ventrikelstruktur in Bezug auf die Expression der Sarkomerproteine vollst ndig wiederhergestellt In Abbildung 27 ist die Expression von MyHC zu den Zeitpunkten 4d 7d 14d 21d und 84d nach Herzsch digung im Vergleich zur scheinoperierten Kontrolle Sham
170. r die leider bisher noch kein geeigneter Marker gefunden werden konnte Immunhistochemische F rbungen mit Antik rpern gegen Marker von Endothelzellen wie Tie2 und eNOS blieben bisher erfolglos Die genaue Charakterisierung dieser Zellen stellt einen wichtigen Schritt f r das Verst ndnis des Regenerationsblaufes im Molchherzen dar Bei diesen k nnte es sich zum Einen um normale endokardiale Zellen oder aber um dedifferenzierte Zellen wie z B Kardiomyozyten handeln die zun chst einen schlauchf rmigen unreifen Trabekel bilden 4 4 Histologische Untersuchungen belegen eine erfolgreiche Regeneration des Molchherzens innerhalb von 12 Wochen Entgegen der fr heren Behauptungen dass die Herzen von Molchen zwar ein gewisses regeneratives Potenzial besitzen aber trotzdem die Wunde letztendlich mittels Ausbildung einer Narbe verschlossen wird McDonnell and Oberpriller 1984 Oberpriller and Oberpriller 1974 resultierte die in dieser Arbeit verwendete Methode der mechanischen Quetschung in einer nahezu kompletten Wiederherstellung der urspr nglichen Morphologie des Ventrikels Einzig minimale Fibronektinr ckst nde konnten gelegentlich noch in Herzen 84 Tage nach der Sch digung detektiert werden Es kam auch bei Anwendung dieser Sch digungsmethode im Verlauf des Regenerationsprozesses zu vermehrten Expressionen von Proteinen die die Extrazellul ren Matrix bilden wie Kollagen VI und Fibronektin Die Umgestaltung und Ausdehnung der E
171. r p90 RSK und der Erk Kinase in Bezug auf Ver nderungen ihrer Phosphorylierungstati nach 10 min bzw zwei Stunden im gesch digten im Vergleich mit scheinoperierten Herzen untersucht worden F r den Zeitpunkt 30 min nach der Herzsch digung wurden zus tzlich die Auswirkungen der pr operativen U0126 Injektion untersucht 109 Ergebnisse Dabei zeigte die von Mitogenen und Stressfaktoren aktivierte Kinase MSK1 die sowohl von Erk als auch von der p38 MAPK phosphoryliert wird eine deutliche Zunahme der Phosphorylierung an dem Serinrest 376 30 min und auch noch zwei Stunden nach der Herzsch digung Allerdings schien in diesem Fall die pr operative U0126 Injektion nicht zu einer schw cheren Phosphorylierung wie im Fall der p90 RSK zu f hren Das gleiche Bild zeigte auch ein weiteres Zielgen der MSK das Histon 3 Die Phosphorylierung des Serinrestes 10 des Histons 3 spielt eine wichtige Rolle bei der Chromosomenkondensation w hrend der Mitose Die Untersuchung von weiteren Substratproteinen der Erk bzw der p90 RSK wie der Transkriptionsfaktoren Elk 1 und CREB lieferte f r beide Transkriptionsfaktoren keine eindeutigen Befunde Der Komplex aus Tuberin einem Produkt des Tumorsuppressorgens TSC2 und Hamartin TSC1 wird durch Phosphorylierungen an Threonin 1462 und 1571 des Tuberins von der Akt Kinase reguliert Die Phosphorylierungen f hren zur Hemmung der mTOR FRAP Kinase mammalian target of rapamycin Diese f hrt wiederum zum Ausb
172. rd F Silvestri A Leri C A Beltrami P Anversa 2001 Evidence that human cardiac myocytes divide after myocardial infarction N Engl J Med v 344 p 1750 1757 Benjamin IJ DR McMillan 1998 Stress heat shock proteins molecular chaperones in cardiovascular biology and disease Circ Res v 83 p 117 132 Berry MF A J Engler Y J Woo T J Pirolli L T Bish V Jayasankar K J Morine T J Gardner D E Discher H L Sweeney 2006 Mesenchymal stem cell injection after myocardial infarction improves myocardial compliance Am J Physiol Heart Circ Physiol v 290 p H2196 H2203 Bettencourt Dias M S Mittnacht J P Brockes 2003 Heterogeneous proliferative potential in regenerative adult newt cardiomyocytes J Cell Sci v 116 p 4001 4009 Bock Marquette I A Saxena M D White J M Dimaio D Srivastava 2004 Thymosin beta4 activates integrin linked kinase and promotes cardiac cell migration survival and cardiac repair Nature v 432 p 466 472 Bottcher RT C Niehrs 2005 Fibroblast growth factor signaling during early vertebrate development Endocr Rev v 26 p 63 77 Brar BK A K Jonassen A Stephanou G Santilli J Railson R A Knight DM Yellon DS Latchman 2000 Urocortin protects against ischemic and reperfusion injury via a MAPK dependent pathway J Biol Chem v 275 p 8508 8514 Brittan M N A Wright 2002 Gastrointestinal stem cells J Pathol v 197 p 492 509 Brockes J A Kumar 2005 Newts Curr Biol v
173. rdiac muscle beta isoform Muskelentwicklung Muskelkontraktion Plate052 Hos Contig 24 Ventricular Piate082 Lia Alkali myosin light chain 1 Plate062 L13 1 f Zytoskelettorganisation Plate110_ C15 and Biogenese Calcium Plate123_K10 bindung Contig 52 Telethonin Sarkomer organisation Z Scheibe Contig 19 Myosin Light chain 1 Muskelkontraktion Mikrofilamentmotor aktivit t Contig 25 Keratin 19 Typel zytoskelettal Sarkomerorganisation Plate0g1 Contig 38 Amb Mex Plate034_019 Cardiac actin Regulation der Herzkontraktion Abb 14 Grafische Darstellung im regenerierenden Herzen schwach exprimierter cDNS Sequenzen deren Contigsequenzen hnlichkeiten zu Komponenten des Zytoskelettes aufweisen Die je acht Einzelexperimente pro Regenerationszeitpunkt wurden als Combine 7T Combine 14T und Combine 21T zusammengefasst Die linke Spalte zeigt die Plattenkoordinaten der einzelnen Sequenzen Die gr nen Balken zeigen eine verringerte Genexpression gegen ber der Expression in scheinoperierten Kontrollherzen an die roten Balken weisen auf erh hte Genexpressionen hin Die rechte Spalte enth lt die Contignummern sowie eine kurze Beschreibung zu welchen Sequenzen das jeweilige Contig Homologien aufweist und deren biologischen Funktionen 71 Ergebnisse Metabolismus Homeostase CombineHerz T CombineHerz14T CombineHerz21T Pistebee et Contig 27 Lactate PlateQ09_F 24 Dehydrogen
174. reinstimmung mit dem Keratin 18 verschiedener Spezies am gr ten war Dr Rene Zimmermann pers nliche Mitteilung Die klonierte cDNS diente als Grundlage f r die Herstellung der Proben f r die in situ Hybridisierungen und die Ableitung von Oligonukleotiden f r RT PCRs Zytokeratin 18 mRNS konnte mittels in situ Hybridisierungen nur im regenerierenden Herzen 14 Tage nach der Sch digung 133 Diskussion detektiert werden Positive Signale traten besonders stark im Epikard aber auch innerhalb einiger Trabekel auf Im scheinoperierten Herzen konnten dagegen keine Zytokeratin 18 Transkripte nachgewiesen werden RT PCRs mit spezifischen Oligonukleotiden ergaben nach 35 Zyklen nur ein Produkt auf cDNS aus Herzen 14 Tage nach Sch digung Starke Expression konnten zudem im ungesch digten Skelettmuskel und Magen nachgewiesen werden Daten nicht gezeigt Die genaue Funktion dieser beiden filament sen Regenerationsmarker l sst sich anhand der Expressionsdaten noch nicht bestimmen und bedarf weiterer funktioneller Analysen Die berlappenden Expressionen in verschiedenen regenerationsf higen Organen weisen aber auf die Existenz von zumindest partiell hnlichen Regenerationsmechanismen hin 4 8 Aktivierung verschiedener Signalkaskaden kurze Zeit nach Sch digung des Ventrikels Innerhalb der ersten zwei Stunden nach der Sch digung konnten Ver nderungen des Phosphorylierungsstatus verschiedener Enzymkinasen die Bestandteile wich
175. reits nach drei bis f nf Tagen im Stumpfblastem des Molches nachgewiesen werden Experimente mit antisense Oligonukleotiden gegen Zytokeratin 18 in kultivierten Blastemzellen deuteten darauf hin dass Zytokeratin 18 m glicherweise dem Erhalt des undifferenzierten proliferationsaktiven Status der mesenchymalen Vorl uferzellen dient Corcoran and Ferretti 1997 a Glattmuskelaktin wurde als ein Vertreter der Glattmuskel Gene deren starke Pr senz sowohl innerhalb der aus der cDNS Subtraktion hervorgegangenen Klone als auch bei der Chiphybridisierung auff llig war gew hlt Basierend auf den Blast Ergebnissen der sequenzierten Klone eines Teils der cDNS Bibliothek konnten Oligonukleotide mit gro er Homologie zu den ausgew hlten cDNS Sequenzen abgeleitet werden die zur PCR Amplifikation genspezifischer Fragmente aus cDNS von gesch digten Herzen 14 Tage nach Sch digung verwendet wurden Die Fragmente wurden in einen T Vektor kloniert und mittels in vitro Transkription sense und antisense Proben hergestellt Die Expression wurde auf 10 um d nnen frontal geschnittenen Paraffinschnitten von Herzen 14 Tage nach Sch digung im Vergleich mit Schnitten von scheinoperierten Herzen untersucht 89 Ergebnisse Abb 24 In situ Hybrisisierung mit sense und antisense Proben gegen a Glattmuskelaktin auf Paraffinschnitten von gesch digten Herzen 14d postop von scheinoperierten Herzen sowie und Darmgewebe A o Glattmuskelaktin as Probe auf g
176. ren demonstrieren Laube et al 2006 Demnach scheinen Kardiomyozyten des Molches je nach u erem Stimulus ihren Ph notyp komplett bzw vor bergehend ndern zu k nnen Auch bei der Untersuchung der Herzregeneration im Zebrafisch konnten bisher noch keine kardialen Stammzellen identifiziert werden obwohl die endokardiale Expression von notchlb w hrend der Herzregeneration in diese Richtung weisen k nnte Raya et al 2003 Die Aktivierung von Notch spielt n mlich bei der Schicksalsbestimmung ber Proliferation und Differenzierung von einigen residenten Stammzellen wie beispielsweise 139 Diskussion den Satellitenzellen im Skelettmuskel eine wichtige Rolle Conboy and Rando 2002 In den fr hen Arbeiten von Oberpriller et al konnten im Molchherzen keine kardialen Stammzellen identifiziert werden Um das Schicksal der verschiedenen kardialen Zelltypen w hrend der Regeneration des Herzens genau verfolgen zu k nnen m sste eine stabile Markierungsmethode der verschiedenen Zelltypen etabliert werden 4 11 M gliche Gr nde f r das limitierte regenerative Potenzial der S ugetiere Der Prozess der Dedifferenzierung in einem gesch digten Gewebe resultiert in einer weiteren vor bergehenden Verringerung der Anzahl funktioneller Zellen und k nnte zu einer Verschlechterung der Gewebefunktion und oder Organfunktion f hren Au erdem f hrt Dedifferenzierung zur Mobilisation von solchen Zellen die bereits vielen sch dlichen Einf
177. rend des Aufwachens wurden die Molche in einem Becherglas mit Wasser gehalten und nach dem Desinfektionsbad in ihre Haltungsbecken zur ckgesetzt Amputation der Schwanzspitze oder der Hinterextremit t Narkotisierten Tieren wurde mir einer scharfen Schere entweder ein ca 5 mm langes St ck Schwanz oder der distale Teil einer Hinterextremit t entfernt F r die Gewinnung von Blastemgewebe wurde nach einem geeigneten Zeitraum nach der Amputation das nachwachsende Regenerat m glichst exakt herausgeschnitten 2 2 13 Einbettung von Gewebeproben 2 2 13 1 Plastikeinbettungen f r die Anfertigungen semid nner 2 um Ultramikrotomschnitte Gewebe die nachfolgend elektronenmikroskopisch analysiert werden sollten wurden nach der Entnahme kurz in Amphibien PBS gewaschen und dann bis zur Einbettung in 3 Glutaraldehyd bei 4 C gelagert Es folgte ein Waschschritt in Cacodylatpuffer pH 7 4 mit Saccharose ber Nacht Anschlie end wurden die Proben wie folgt in einem Microscopy Tissue Processor Lynx el Reichert Jung 120 min bei 4 C in 4 iger Osmiumtetroxidl sung Roth Karlsruhe inkubiert Nach dreimaligem Waschen in Cacodylatpuffer pH 7 4 ohne Saccharose Zum Dehydratisieren wurde eine aufsteigende 59 Material und Methoden Ethanolreihe 30 50 70 90 zweimal 100 f r jeweils 30 min bei ebenfalls 4 C durchlaufen Danach wurden die Proben zweimal f r 15 min und 4 C in Propylenoxid Merck und f r 60 min in ei
178. ressionsanalyse von notchlb im adulten Zebrafischherz ergab eine schwache Expression die mit endokardialer Expression deckungsgleich war Einen Tag nach der Amputation der Herzspitze fand man bereits Expressionen im gesamten Endokard und besonders stark in dem die L sion umgebenden Areal Nach einer Woche nahm die Expression ab bis sie nach zwei Wochen das Kontrollniveau wieder erreicht hat Auch der notchIb Ligand deltaC der w hrend der Embryonalentwicklung in arteriellem Endothel exprimiert wird Smithers et al 2000 zeigt r umlich das gleiche jedoch zeitlich ein auf die erste Woche begrenztes Expressionsmuster Beide Faktoren werden interessanterweise nicht w hrend der Herzentwicklung exprimiert Raya et al 2003 Um Hinweise darauf zu erhalten ob es sich bei der entdeckten Beteiligung des Notch Signalweges um eine endotheliale Verletzungsreaktion oder um einen echten Beitrag zur epimorphen Regeneration handelt wurde die Expression dieser beiden Faktoren auch w hrend der kaudalen Flossenregeneration untersucht W hrend die Faktoren in Kontrollflossen nicht exprimiert wurden konnte bereits nach 24 Stunden in dem fr hen Blastem eine Anh ufung der notchlb und deltaC Transkripte in den Bereichen in denen auch msxb und msxc detektiert wurden nachgewiesen werden Raya et al 2003 Demnach scheint der Notch Signalweg in beiden regenerativen Prozessen eine Rolle zu spielen Da die Aktivierung von Notch eine bedeutende Rolle bei der Sch
179. rierenden Fibroblasten und Endothelzellen besteht Mit der Zeit wandelt sich dieses so genannte Granulozytengewebe in eine kompakte Kollagennarbe um Bei den meisten humanen Infarkten dauert dieser Wundheilungsprozess zwei Monate Herzinfarkte f hren zu einer Abnahme der Wanddicke in der verletzten Region und zu einer Dilatation des Lumens des betroffenen Ventrikels Dieser Prozess wird als ventrikul re Umgestaltung Remodeling bezeichnet und f hrt zu erh htem mechanischem Stress auf die Ventrikelwand Der mechanische Stress provoziert das Entstehen von Fehlfunktionen bei der Kontraktion Das Ausma des Herzversagens korreliert mit der Menge an gesch digtem Myokard Laflamme and Murry 2005 22 Einleitung 1 5 1 Herzregeneration im S ugetier Zwischen 1850 1911 wurde allgemein angenommen dass die kardiale Hypertrophie auf hypertrophierenden und hyperplasierenden Myozyten beruht Anversa and Kajstura 1998 Die 1925 publizierte Beobachtung dass im humanen Herzen keine mitotischen Figuren detektiert werden konnten pr gten ein neues Verst ndnis vom S ugerherz als einem terminal differenzierten postmitotischen Organ Anversa et al 2006 In den letzten 10 12 Jahren konnten jedoch in histologischen Gewebeproben von verschiedenen humanen Herzerkrankungen mitotische Figuren innerhalb humaner Kardiomyozyten detektiert werden Beltrami et al 2001 Chimenti et al 2003 Kajstura et al 1998b Quaini et al 1994 Urbanek et al 2003
180. rimierten die transplantierten Kardiomyozyten phosphoryliertes Histon 3 ein weiteres Indiz f r ihre aktive Beteiligung an der Extremit tenregeneration mittels Proliferation Jn vitro Kultivierungen und Kontrolltransplantationen der Kardiomyozyten in ungesch digte Extremit ten belegten die Notwendigkeit des Kontaktes der transplantierten Zellen zu bisher noch unbekannten Faktoren die sich in Folge der Sch digung im Gewebe angesammelt haben um Dedifferenzierungen und Reprogrammierungen zu erm glichen Laube et al 2006 Die Zellteilungsf higkeit adulter Kardiomyozyten des Molches unterscheidet diese von S ugerzellen und die Aufkl rung der zugrunde liegenden Mechanismen ist essentiell f r die Entwicklung neuer Strategien zur Initiation bzw Verbesserung der Herzregeneration beim S ugetier Bettencourt Dias et al 2003 1 3 2 Herzregeneration beim Zebrafisch Au er vom Molch ist bisher nur vom Zebrafisch als weiterem Vertebraten die F higkeit zu epimorpher Regeneration bekannt Aufgrund seiner vergleichsweise einfachen genetischen Manipulierbarkeit und der vielen verf gbaren molekularen und genetischen Werkzeuge stellt der Zebrafisch ein beliebtes Forschungsobjekt dar hnlich wie nach der Amputation der Herzspitze des Molches wird auch beim Zebrafisch allerdings bereits innerhalb einiger Sekunden die Amputationsfl che von einem Blutgerinnsel verschlossen Zwei bis vier Tage sp ter werden die Erythrozyten dann durch Fibrin e
181. ringerten Apoptoseraten und morphologischen Ver nderungen in den Mitochondrien Liu et al 2007 Dar ber hinaus konnten Makino et al in einem chemischen Mutagenese Screening nach Flossenregenerationsmutanten im Zebrafisch eine 127 Diskussion Mutation in einem anderen Hitzeschockprotein dem HSP 60 als den ma geblichen Defekt f r eine fehlerhafte Bildung des Regenerationsblastems identifizieren Die HSP 60 Mutanten wiesen au erdem einen Regenerationsdefekt im Herzen auf Makino et al 2005 Auch das HSP27 des Zebrafisches konnte bereits kloniert werden und entsprechende Transkripte dieses Gens kommen am h ufigsten im adulten Skelettmuskel und im Herzen vor Mao et al 2005 Die bereits bekannten Eigenschaften des HSP 27 k nnten auch bei der Regeneration im Herzen des Molches eine Rolle spielen Warum die vermehrte Expression allerdings erst nach 21d zu beobachten war bleibt noch zu kl ren Denn im Fall des mutierten hsp60 Gens im Zebrafisch scheint eine Beteiligung dieses Hitzeschockproteins in einem sehr fr hen Stadium der Blastembildung essenziell zu sein 4 5 4 Zunahme der Expression von Thymosin 4 im regenerierenden Molchherzen Ein weiterer Faktor dessen mRNS und Proteinexpression im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurde ist das Peptid Thymosin 4 Eine seiner Funktionen besteht darin globul res Aktin G Aktin zu binden und somit dessen Polymerisation zu filament sem Aktin F Aktin zu verhindern Die Genexpressi
182. ripte deren Expression angestiegen sind zeigten Homologien zu den Komponenten der Extrazellul ren Matrix Fibronektin und Kollagen oder zu Faktoren aus dem Bereich des Chromatinumbaus sowie aus den Bereichen der Stressantwort und des Zell berlebens vgl Abb 16 78 Contig 11 hnlich wie Resistin lokalisiert in inflammatorischen Regulation der Zellproliferation Antwort auf oxidativen Stress Ergebnisse Zytoskelettkomponenten __CombineHerz T CombineHerz14T CombineHerz21T _ Plated t Extrazellulare Matrix Chromatinumbau ___CombineHerz T _CombineHerz14T _CombineHerz21T __ Plate124 Plate014_K05 Transkriptionsfaktoren Plate023_K06 Entz ndung Zell berleben Plate0s1_EO Plate041 PlateO41 Plate046 Contig 28 Salamander skelettales alpha Aktin Entwicklung von Skelettmuskelfasern Contig 64 Alpha Aktin 2 Glattmuskel Aorta Zytoskelett Contig 51 hnlich wie Transgelin 2 Reorganisation des Aktinskeletts Muskelentwicklung Contig 29 Salamander Fibronektin Extrazellulare Matrix Zelladh sion Contig 18 Kollagen Alpha 1 Ill Kette Vorl ufer Contig 55 HMG 17 Chromatinentfaltung Genaktivierung Contig 45 Histon H4 Contig 46 MRF2 3 end Modulator Rec Fact 2 Transkriptionale Repressor aktivit t Contig 21 Similar to Monocyte Chemotactic Protein 3 MCP3 Makrophageanlockung Contig 12 Small heat shock protein 27 P
183. rktreparatur in der Maus hat Bock Marquette et al 2004 und auch im regenerierenden Zebrafisch exprimiert wird Lien et al 2006 Ein positiver Einfluss von Thymosin 4 auf die zellul re Migration und Beweglichkeit w re auch bei der Herzregeneration im Molch vorstellbar Regenerierende Herzen exprimierten auch die Antigene 22 18 und Zytokeratin 18 Beide Antigene sind unter anderem bekannte Marker f r das regenerierende Stumpfblastem und K nnten einen unreifen dedifferenzierten Status von regenerierenden Zellen des Molches widerspiegeln Die Western Blot Analysen verschiedener Signaltransduktionskinasen haben unter anderem eine Beteiligung des 143 Zusammenfassung MEK Erk Signalweges w hrend der Regeneration ergeben Die erfolgreiche chemische Inaktivierung der MEK1 2 Kinase hat zu einer verst rkten Aktivierung der Akt Kinase und zu einer tempor ren Erh hung der Expression der Myosin Schweren Kette gef hrt Die Behandlung von prim ren Kardiomyozytenkulturen mit dem auch in vivo verwendeten Inhibitor U0126 hat zu einer dosis und zelltypabh ngigen Verringerung der Mitoserate sowie der Expression des Sarkomerproteins a Aktinin gef hrt Diese initialen Experimente k nnten m glicherweise den Weg f r eine Beschleunigung des Regenerationsprozesses durch Blockierung der MEK1 2 Kinase weisen 144 Literaturverzeichnis 7 Literaturverzeichnis Abdullah I J J Lepore J A Epstein M S Parmacek P J Gruber 2005 MRL mice
184. rmedium 60 MEM GlutaMax Gibco 42360 10 FCS PAA Laboratories GmbH 2 Penicillin Streptomycin Glutamin 28 U 100ml Insulin Sigma I 0516 100x P S G Stockl sung 10 000 U ml Penicillin G sodium Gibco UK 10 000 ug ml Streptomycin sulfate GibcoUK 29 2 mg ml L Glutamine Gibco UK 2 2 16 1 Behandlung der Kardiomyozytenkulturen mit dem Inhibitor U0126 Die Zellen wurden ber einen Zeitraum von sieben Tagen mit reinem Methanol 10uM oder 80 uM U0126 inkubiert Dabei wurde pro Konzentration zwei Kammern behandelt Jeden zweiten Tag also insgesamt 3 Mal wurde das Medium unter Zusatz des L sungsmittels bzw des Inhibitors erneuert 2 2 17 Mikroskopie und Fotodokumentation Die mikroskopische Begutachtung und fotografische Dokumentation von fluoreszenzgef rbten Gewebeschnitten oder Zellkulturen erfolgte am Imager Z1 Zeiss mit integrierter Axiocam Zeiss F r die Hellfeldaufnahmen wurde ein Axiophot 2 Zeiss Mikroskop mit integrierter Axiocam Zeiss verwendet Aufnahmen erfolgten an beiden Mikroskopen mit der Software Axiovision Rel 4 5 Zeiss 64 Ergebnisse 3 Ergebnisse In fr heren Arbeiten von Oberpriller et al ist die Regenerationsf higkeit des Molchherzens nach partieller Amputation des Ventrikels oder Atriums in erster Linie anhand von elektronenmikroskopischen Aufnahmen histologisch untersucht worden Bader and Oberpriller 1979 McDonnell and Oberpriller 1983 McDonnell and Oberpriller 1984 Im Ra
185. roteinbindung antiapoptotisch Zellbeweglichkeit Contig 14 Thymosin Beta4 Kardiomyocytenwanderung berleben und Reparatur Abb 16 Grafische Darstellung im regenerierenden Herzen stark exprimierter cDNS Sequenzen deren Contigsequenzen hnlichkeiten zu Komponenten des Zytoskelettes der Extrazellul ren Matrix dem Chromatinumbau Entz ndungsreaktionen Zell berleben oder zu Transkriptionsfaktoren aufweisen Die je acht Einzelexperimente pro Regenerationszeitpunkt wurden als Combine 7T Combine 14T und Combine 21T zusammengefasst Die linke Spalte zeigt die Plattenkoordinaten der einzelnen Sequenzen Die roten Balken zeigen eine starke Expression der entsprechenden Transkripte gegen ber der Expression in scheinoperierten Kontrollherzen an Die gr nen Balken indizieren eine schwache Genexpression Die rechte Spalte enth lt die Contignummern sowie eine kurze Beschreibung zu welchen Sequenzen das jeweilige Contig Homologien aufweist und deren biologischen Funktionen 79 Ergebnisse 3 3 3 cDNS Subtraktion F r die pr ferenzielle Anreicherung von Transkripten die w hrend der Regeneration differentiell exprimiert werden wurde eine cDNS Subtraktion von mRNS aus ungesch digten und mRNS aus Herzen 14 Tage nach der Sch digung des Ventrikels durchgef hrt Die in cDNS konvertierten Transkripte wurden im Verlauf zweier Hybridisierungsschritte voneinander subtrahiertt und anschlie end exponentiell amplifiziert Die auf diesem W
186. roteinexpressionen des MyHC und P Histon 3 detektiert werden Daraus l sst sich schlie en dass die Aktivierung oder auch Inaktivierung innerhalb eines kurzen 136 Diskussion Zeitfensters nach der Herzsch digung vermutlich ausreichend ist um weitere Zielproteine zu aktivieren bzw nicht zu aktivieren Die Auswirkungen der Aktivierung oder Inaktivierung dieses Signalweges lassen sich teilweise erst zu sp teren Zeitpunkten nachweisen 4 9 4 In vitro Analyse des Effektes von U0126 auf kardiale Molchzellen Die in vitro Versuche mit Herzzellen aus ungesch digten Ventrikeln aus der 5 Passage ergaben eine wie auch in anderen in vitro Experimenten beschriebene Hemmung der Differenzierung bzw Beg nstigung der Dedifferenzierung und Inhibition der Proliferation Bei geringeren Inhibitorkonzentrationen reagierten a Aktinin positive Zellen sensitiver als a Aktinin negative Zellen Dieser Umstand k nnte der weniger sensitiven Zellpopulation die noch einer genaueren Charakterisierung bedarf m glicherweise einen selektivenVorteil verschaffen wenn die Inhibitorkonzentration nicht so hoch ist dass alle Zelltypen gleicherma en gehemmt werden Andere Forscher haben die Rolle von MEK und Erk gezielt w hrend Differenzierungsprozessen untersucht Dabei verhinderte die Hemmung von MEK durch den Inhibitor U0126 in in vitro Differenzierungsassays mit Embryonalen Stammzellen die Differenzierung zu Kardiomyozyten Dell Era et al 2003 oder vermin
187. rsetzt Innerhalb der folgenden neun bis 30 Tage umgeben Kardiomyozyten das 16 Einleitung Gerinnsel wandern dort ein und ersetzen dieses schlie lich Nach 60 Tagen ist kein Fibrin mehr erkennbar und das ventrikul re Gewebe und die Kontraktilit t erscheinen normal Die Herzspitze besteht nun aus neugebildetem kompaktem Myokard Poss et al 2002b Markierungsexperimente mit BrdU zeigten auch in diesem System eine verst rkte proliferative Aktivit t der Kardiomyozyten mit einem Maximum nach 14 Tagen Bei den markierten Myozyten handelte es sich vorwiegend um zirkulierende Zellen in der N he des kompakten Myokards an den lateralen Wundr ndern Mit Hilfe der BrdU Inkorporation konnte festgestellt werden dass nach zun chst disperser Kardiomyozytenproliferation sich ein Gradient von proliferierenden Zellen ausbildet der am h chsten in den epikardialen Myozyten ist welche kontinuierlich nach innen verdr ngt werden um die Amputationsstelle aufzuf llen Poss et al 2002b Um zu testen ob die F higkeit zur Herzregeneration im Zebrafisch im Gegensatz zur bei den Vertebraten viel st rker verbreiteten Vernarbung von der Proliferationsf higkeit der Kardiomyozyten abh ngt wurde die Regenerationsf higkeit eines im mps Gen mutierten Zebrafischs untersucht Mps ist eine mitotische Kontrollpunkt Kinase die in vielen proliferativen Zelltypen stark exprimiert wird und auch w hrend der Flossenregeneration einen Rolle spielt Poss et al
188. rte mononukle re schlagende Tochterzellen Manche aus der Zellteilung hervorgegangene Klone zeigten schw chere und ungeordnete Anti MyHC F rbungen im Vergleich zu sich nicht teilenden Zellen Obwohl die proliferativen F higkeiten zwischen verschiedenen Klonen stark variierten zeigten Tochterzellen interessanterweise gleiche Tendenzen zu weiteren symmetrischen Zellteilungen sowie eine vergleichbare Dauer des Zellzyklus Weitere 31 der urspr nglichen Kardiomyozyten brachten als Folge unvollst ndiger Zellteilungen binukle re Zellen hervor Von diesen durchliefen manche jedoch im weiteren Verlauf eine weitere S Phase und vollzogen danach eine komplette Mitose inklusive Kompletter Zytokinese Diese Ergebnisse zeigen dass Kardiomyozyten ein heterogenes Zellteilungspotential besitzen Nur eine Subpopulation der adulten Kardiomyozyten besitzt die F higkeit zur kompletten Zellteilung Diese Subpopulation ist m glicherweise ma geblich an der Herzregeneration des Molches beteiligt Sie weist jedoch weder morphologisch noch in ihrem Kontraktionsverhalten Unterschiede zu den anderen Myozyten auf Bettencourt Dias et al 2003 und k nnte auch ein in vitro Artefakt sein Soonpaa et al 1994 hatten zuvor die Wirkung verschiedener Substanzen und Wachstumsfaktoren auf die Proliferationsf higkeit von Kardiomyozyten in vitro untersucht Am st rksten erh ht wurde dabei die DNS Synthese durch den Zusatz von konditioniertem Medium von ventrikul ren Myozyten
189. sen Kinaseaktivit t Diese kann zur Aktivierung des TAK 1 MKK3 6 p38 JNK Signalweges oder des Smad Signalweges f hren In beiden F llen f hren weitere Phosphorylierungen und Interaktionen zur Aktivierung von Transkriptionsfaktoren wie ATF 2 und der Transkription entsprechender Zielgene Monzen et al 2002 Typ Il BMP Ril Typ Typ ZGF B RI ALK3 Typ Il TGF B RIl Abb 4 TGFB und BMP Signaltransduktionswege und deren Beteiligung an der kardiogenen Induktion Das TGF oder BMP Signal kann ber den TAKI MEKKI oder den Smad Signalweg weitergeleitet werden und aktiviert verschiedene genetische Programme mittels Interaktionen mit verschiedenen transkriptionalen Effektoren oder Smad Transkriptionsfaktoren wie ATF 2 Ver ndert nach Wagner and Siddiqui 2007 26 Einleitung FGFs FGFs bestehen aus einer groben Familie von Polypeptidwachstumsfaktoren Sie wurden erstmals als wachstumsstimulierende Faktoren identifiziert als gezeigt wurde dass FGF 1 und FGF 2 die Proliferation von Fibroblasten stimulierten Sie sind an vielen verschiedenen zellul ren Prozessen wie Chemotaxis Zellmigration Angiogenese Differenzierung Zell berleben und Apoptose beteiligt Bottcher and Niehrs 2005 Da FGFs bereits in die Induktion und Modellierung des Mesoderms unabh ngig von der kardiogenen Induktion involviert sind ist es schwierig deren prim re Funktion w hrend der kardiogenen Induktion zu entschl sseln Es konnte
190. sin regulatorischen leichten Kette bzw des Fhll Gens widerzuspiegeln wenn man diese beispielsweise mit der Proteinexpression von a Glattmuskelaktin bzw der beschriebenen Expression von Fhll vergleicht Chu et al 2000 Die unterschiedlichen Expressionsmuster lassen sich m glicherweise auch durch unterschiedliche Ausma e der Herzsch digungen bzw des zeitlichen Ablaufs des Regenerationsprozesses erkl ren Die gro fl chige Expression von TB14 k nnte beispielsweise eine Antwort auf die st rkere mechanische Beanspruchung 130 Diskussion des gesch digten Myokards bei gleichzeitiger Erneuerung mittels Proliferation darstellen Um welche Zelltypen es sich genau bei den positiven Signalen in distinkten gesch digten Arealen handelt bedarf der weiteren Aufkl rung 4 6 3 In situ Hybridisierungen mit dem Aktin homologen Subtraktionsklon TB10 Vorausgesetzt die von dem Subtraktionsklon abgeleitete antisense RNS Probe hybridisiert mit dem zu den zellul ren B Aktin Transkripten homologen Bereich k nnte die differentielle Expression in gesch digten und ungesch digten Arealen des Ventrikels 14 Tage nach Sch digung des Herzens dem von anderen ebenfalls in zwei myokardialen Sch digungsmodellen beobachteten Anstieg der B Aktin Expression entsprechen Carlyle et al 1996 B Aktin ist ein Protein des Zytoskelettes das einen potenziellen Mediator f r das Wachstum die Signalweiterleitung und Wanderung sowie Umstrukturierungsprozesse
191. sion von TB14 nachgewiesen werden F gt a D a E AES ict FE en ote u a Abb 22 Expression des Subtraktionsklons TB19 im gesch digten 14d postop und scheinoperierten Herzen A TB19 as Probe auf gesch digtem Herzen 14d postop B Trichrome gef rbter Nachbarschnitt C TB19 Expression im Atrium eines scheinoperierten Herzens 14d postop D TB19 s Probe auf gesch digtem Herzen 14d postop E TB19 as Probe auf scheinoperiertem Herzen Die Expression des Subtraktionsklons TB19 ohne Homologie verhielt sich im gesch digten Herzen wie die von TB8 und TB10 also stark begrenzt auf gesch digte Regionen s Abb 22 A Allerdings lies sich f r TB19 auch eine punktf rmige Expression im Atrium Abb 22 C jedoch nicht im Ventrikel E des scheinoperierten Herzens nachweisen Die Negativkontrolle fiel ebenfalls positiv aus 87 Ergebnisse Abb 23 Expression des Subtraktionsklons TB25 im gesch digten 14d postop und scheinoperierten Herzen A TB25 as Probe auf gesch digtem Herzen 14d postop bersicht ber die Expression im kompletten Ventrikel B Vergr erter Ausschnitt von Bild A C TB25 as Probe auf einem anderen gesch digten Herzen 14d postop D Vergr erter Ausschnitt von Bild B E TB25 as Probe auf scheinoperiertem Herzen F TB25 s Probe auf gesch digtem Herzen 14d postop Die Expression des Subtraktionsklons TB25 mit Homologie zum Fhl 1 zeigte ein hnliches Bild wie die des Klons TB14 Es waren entwe
192. somalen Untereinheit und ist somit in 110 Ergebnisse die Translationskontrolle involviert Die untersuchten Proben zeigten untereinander fiir die drei untersuchten Phosphorylierungsstellen ein sehr heterogenes Muster und im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle eine sehr schwache Zunahme Am st rksten war die Zunahme der Phosphorylierungen der Serinreste 240 244 des S6 ribosomalen Proteins erkennbar Aber auch hier sind die Unterschiede zwischen unbehandelten OP MeOH und behandelten OP U0126 nicht eindeutig Die GSK 3 Glykogensynthase Kinase 3 phosphoryliert und inaktiviert in Abh ngigkeit von der vorherrschenden Insulinkonzentration die Glykogensynthase Des Weiteren ist sie auch noch in die Regulation der Proteinsynthese des Cyclin DI Abbaus etc involviert Zudem ist sie ein Bestandteil des Wnt Signalweges Die von Akt vermittelte Phosphorylierung von GSK3 an dem Serinrest 9 f hrt zu ihrer Inaktivierung Zwei der drei mit Inhibitor behandelten Proben zeigten eine leicht erh hte Phosphorylierung des Serinrestes im Vergleich zu den ungesch digten Kontrollen und zu den nur L sungsmittel behandelten Kontrollen O oma O g0min th OC WW WW EU 2 P MSK1 Ser 376 Piston 3 ww P Eiki Ser 383 P CREB o a Ser 133 P TSC2 Dem Tyr 1571 gg ee P 4EBP1 Thr 37 46 Ponceau Rot gef rbte Aktinbanden als Ladungskontrollen Abb 42a Untersu
193. spiel die Linse des Salamanderauges verf gen ber bemerkenswerte regenerative Kapazit ten W hrenddessen fehlt beispielsweise Insekten und Knorpelfischen die F higkeit zu epimorpher Regeneration v llig Dinsmore 2001 Sowohl Ein und Vielzeller als auch wir Menschen m ssen angemessen auf akute Verletzungen reagieren k nnen u ere Einfl sse wie Verletzungen oder Amputationen l sen die so genannten reparativen Regenerationsprozesse aus Dabei m ssen zun chst gesch digte Gewebe und zellul re Bruchst cke entfernt werden bevor die eigentliche Regeneration stattfinden kann Dinsmore 2001 In der Wissenschaft wird zwischen verschiedenen Formen der Reparatur unterschieden Die Wundheilung entspricht einer minimalen Form der Regeneration Sie geht bei S ugern in der Regel mit Vernarbungen einher falls die Basalmembran durchbrochen wird Geweberegeneration hingegen f hrt bereits zu einem besseren Ersatz von gesch digten Zellen und Geweben Aus der bereits erw hnten epimorphen Regeneration resultiert die vollst ndige Wiederherstellung der zerst rten Struktur und ihrer Funktion Dinsmore 2001 Einleitung 1 2 Phylogenetische Verteilung der Regenerationsf higkeit Die F higkeit zur Regeneration ist bei den Metazoen viel st rker verbreitet als gemeinhin angenommen Fast jeder Stamm besitzt eine oder mehrere Spezies die fehlende K rperteile oder in manchen F llen sogar komplette neue Organismen aus Teilen ihres K rpers r
194. t Antik rpern gegen a Aktinin und phosphoryliertes Histon 3 Immunfluoreszenzen gegen a Aktinin gr n gegen phosphoryliertes Histon 3 rot und Dapi Kernf rbung blau A 10 fache Vergr erung von prim ren Herzzellkulturen die nur mit Methanol behandelt wurden B 20 fache Vergr erung eines P Histon 3 positiven Zellkerns einer o Aktinin negativen Zelle C 10 fache Vergr erung von prim ren Herzzellkulturen die mit 10uM U0126 behandelt wurden D Vergr erter Ausschnitt einer 40 fachen Vergr erung von einem eines P Histon 3 positiven Zellkerns einer a Aktinin positiven Zelle Der wei e Pfeil markiert den positiven Zellkern und die diffuse a Aktinin F rbung E 10 fache Vergr erung von prim ren Herzzellkulturen die mit 80uM U0126 behandelt wurden F Vergr erter Ausschnitt einer 40 fachen Vergr erung von a Aktinin positiven Zellen mit Querstreifung durch Anf rbung des o Aktinins in den Z Scheiben 118 Diskussion 4 Diskussion S ugetiere sind nicht in der Lage gr ere Verletzungen des Herzens zu regenerieren Im Gegensatz dazu besitzen bestimmte Nicht S ugetier Vertebraten wie der Zebrafisch Danio rerio oder der Molch Notophthalmus viridescens die F higkeit ihr Herz ohne funktionelle Einb en zu reparieren Bei den S ugetieren f hrt die Reparatur des gesch digten Gewebes vorwiegend zu Fibrosen und Vernarbung Zebrafische und Molche k nnen hingegen kontraktiles Gewebe durch neugebildetes Myokar
195. t antisense Oligonukleotiden gegen Zytokeratin 18 in kultivierten Blastemzellen deuteten darauf hin dass Zytokeratin 18 m glicherweise dem Erhalt des undifferenzierten proliferationsaktiven Status der mesenchymalen Vorl uferzellen dient Corcoran and Ferretti 1997 Ferretti et al haben unter anderem auch die Expression von Zytokeratin 18 in regenerierenden Ober und Unterkiefern im Molch untersucht und konnten sowohl Zytokeratin 18 Transkripte als auch Zytokeratin 18 Proteine in Blastemzellen detektieren Ferretti and Ghosh 1997 W hrend der Entwicklung des urodelen Nervensystems und w hrend der Regeneration nach Amputation des Schwanzes konnten Expressionen von Zytokeratin 18 in dem regenerierenden ependymalen Schlauch beobachtet werden Walder et al 2003 Nicht nur in verschiedenen Organen des Molches sondern auch im Zebrafisch konnten Zytokeratinexpressionen detektiert werden So tauchten in einem Screening nach Genen die w hrend der Flossenregeneration differentiell exprimiert werden auch diverse Zytokeratine auf n situ Hybridisierungen mit antisense Proben gegen Zytokeratin 18 detektierten sowohl in Embryonen und Larven als auch ein Tag und 4 Tage nach der Flossenamputation Zytokeratin 18 Padhi et al 2004 Unter Verwendung der Methode des Differential Display zur Identifizierung weiterer differentiell exprimierter Transkripte konnte eine Sequenz isoliert werden die Homologien zu den Keratinen 8 18 und 19 aufwies wobei die be
196. t von Kardiomyozyten beruhen dokumentiert Zudem treten bei Erwachsenen sehr selten prim re myokardiale Tumore auf Obwohl diese Beobachtungen nahe legen dass die Proliferationsf higkeit adulter Kardiomyozyten niedrig ist schlie en sie die Existenz einer limitierten F higkeit f r hyperplastisches Wachstum im normalen oder kranken Myokard nicht aus Von verschiedenen Forschergruppen existieren Daten die zeigen dass die Proliferationsf higkeit von adulten Kardiomyozyten nicht irreversibel verlorengegangen ist Allerdings ist diese F higkeit ungleich zwischen verschiedenen 20 Einleitung Zelltypen verteilt und stark vom Alter und der systematischen Position der jeweiligen Spezies abh ngig Rumyantsev 1991 Soonpaa and Field 1998 Ruymyantsev et al haben f r die Untersuchung der Proliferationsf higkeit von Kardiomyozyten sowohl verschiedene Tiermodelle Fr sche Eidechsen Ratten und M use sowie auch verschiedene Sch digungsmodelle mechanische Quetschung des Ventrikels Ligation der linken Koronararterie Koarktation der abdominalen Aorta zur Induktion von kardialer Hypertrophie wie auch Injektionen von Isoproterenol ebenfalls zur Induktion von Hypertrophie verwendet Anschlie end wurden proliferierende Zellen mit Triium markiertem Thymidin markiert und Gewebeschnitte licht bzw elektronenmikroskopisch analysiert 13 14 der perinekrotischen ventrikul ren Myozyten des Frosches wurden bereits nach einmaliger Injektion vo
197. t zwischen Zell berleben und Apoptose Akt wird von Insulin und verschiedenen Wachstums und berlebensfaktoren aktiviert Die Aktivierung von Akt f hrt ihrerseits zur Inhibition der Apoptose durch Phosphorylierungen verschiedener Zielproteine wie Bad c Raf Caspse 9 etc Au erdem hat Akt Einfluss auf die Glycogensynthese und das Zellwachstum Auch im Fall der Proteinkinase Akt f hrte die Sch digung zur verst rkten Phosphorylierung des Serinrestes 473 w hrend aller untersuchten Zeitpunkte Nach 30 min war die Aktivierung am st rksten 3 6 2 Untersuchung des Einflusses des MEK1 2 Inhibitors U0126 auf die Herzregeneration Die Ergebnisse der Westernblot Analysen ergaben eine eindeutige und massive Aktivierung des MAP Kinase Signalweges innerhalb der ersten zwei Stunden nach Herzsch digung Die Aktivierung konnte anhand von Phosphorylierungen dreier miteinander agierender Kinasen gezeigt werden Aus dieser Beobachtung ergab sich die Fragestellung welche Auswirkung die Inhibition eines der stark aktivierten Enzyme auf den Regenerationsverlauf haben w rde Der kommerziell erh ltliche hochselektive 106 Ergebnisse Inhibitor der MEK 1 2 Kinase U0126 1 4 diamino 2 3 dicyano 1 4 bis 2 aminophenylthio butadien erschien fiir die Untersuchung dieser Fragestellung geeignet Favata et al 1998 Zun chst wurden drei Konzentrationen des Inhibitors 5 10 20 ug g K rpergewicht auf ihre Wirksamkeit und Vertr glichkeit im in vivo
198. te elektromechanische Verbindungen Dariiber hinaus ordneten sie sich zu Muskelfasern an und konnten eine gewisse Kraft erzeugen Nach Transplantation in ungesch digte Herzen berlebte ein Teil dieser Konstrukte und hypertrophierte weiter Zimmermann et al 2002 Einen limitierenden Faktor bei der Gewebez chtung und der zellbasierten Herzreparatur stellt die N hrstoffzufuhr dar Laflamme et al 2002b 1 7 8 Probleme verschiedener Methoden und Strategien f r deren klinischen Einsatz Die direkte Injektion von Zellen ins Herz stellt nach wie vor ein gro es Problem dar da ca 90 der injizierten Zellen im Blutkreislauf oder durch Austritte an der Injektionsstelle verloren gehen Muller Ehmsen et al 2002 Daher ist auch die Anzahl der im Myokard zur ckbleibenden Zellen nicht vorhersagbar und variiert stark zwischen den einzelnen Studien Eine weitere Schwierigkeit bereitet die gro e Apoptoserate der transplantierten Zellen unabh ngig vom Zelltyp Auch hier betr gt der Verlust innerhalb der ersten Woche an die 90 Muller Ehmsen et al 2002 Zhang et al 2001 Weitere Herausforderungen stellen die Proliferationskontrolle von transplantierten Zellen und deren Schwierigkeiten sich erfolgreich in vernarbtes Gewebe zu integrieren Das unwirtliche Narbengewebe verhindert die Bildung von elektromechanischen Verbindungen zwischen transplantierten Kardiomyozyten und dem Gastmyokard Diese sind aber notwendig um die synchrone Kontraktion zu g
199. ten Kardiomyozyten stark ab und bewegt sich f r M use und Ratten meistens deutlich unter 1 Soonpaa and Field 1998 21 Einleitung 1 5 Grundprinzipien der myokardialen Infarktreparatur beim S ugetier Isch mische Herzkrankheiten und deren Folgen geh ren zu den weltweit h ufigsten Todesursachen des Menschen Thom et al 2006 In Deutschland stellten sie mit 21 im Jahr 2002 die h ufigste Todesursache dar World Health Statistics 2006 Herzinfarkte entstehen haupts chlich als Folge einer Thrombose innerhalb der Herzkranzgef e Bereits nach 20 min tiger Durchblutungsst rung beginnt das Herz irreversiblen Schaden zu nehmen da der hohe metabolische Umsatz des Myokards unterbrochen wird Es folgt eine Welle des Zelltodes die sich von den inneren Schichten nach au en innerhalb der folgenden drei bis sechs Stunden ausbreitet Obwohl Kardiomyozyten am empfindlichsten reagieren sind auch Gef zellen Fibroblasten und Nervenzellen von der Isch mie betroffen Die myokardiale Nekrose ruft eine starke inflammatorische Antwort hervor Mehrere Millionen aus dem Knochenmark stammende Leukozyten anf nglich vorwiegend Neutrophile und sp ter haupts chlich Makrophagen erreichen das infazierte Areal Die Makrophagen phagozytieren die Zelltriimmer und dirigieren die nun folgende Wundheilungsphase Gleichzeitig mit der Entfernung von totem Gewebe bildet sich ein hydrophiles provisorisches Wundheilungsgewebe aus das vorwiegend aus prolife
200. tgef e besitzt Dr Sawa Kostin pers nliche Mitteilung hnlich wie f r die Herzentwicklung vermutet Sugi and Lough 1992 k nnten die a Glattmuskelaktin Filamente auch w hrend der Herzregeneration im Molch als eine Art Ger st f r die Deposition der skelettalen und kardialen Filamente dienen und oder die Kontraktilit t der Kardiomyozyten regulieren In den Immunfluoreszenzf rbungen konnte die Expression von a Glattmuskelaktin sowohl in Bereichen die auch f r Myosin Schwere Kette und Myomesin Daten nicht gezeigt positiv waren als auch in Regionen die f r diese Muskelmarker negativ waren detektiert werden 4 5 3 Zunahme der Expression von HSP 27 im regenerierenden Molchherzen Des Weiteren wurde das Hitzeschockprotein HSP 27 21 Tage nach der Sch digung stark exprimiert Die Expression von Hitzeschockproteinen werden vor allem durch Stressfaktoren wie oxidativen isch mischen Stress Inflammation u induziert Sie verhindern als molekulare Chaperone fehlerhafte Faltungen und unterst tzen die Reparatur oder den Abbau nicht nativer Proteine F r verschiedene Hitzeschockproteine konnten schon kardioprotektive Effekte in Bezug auf Zell berleben und Zelladaptation beobachtet werden Benjamin and McMillan 1998 Die transgene berexpression von HSP 27 in einem mittels Doxorubicin induzierten Herzsch digungsmodell der Maus f hrte zu verbesserten berlebenschancen verminderten Konzentrationen von reaktiven Sauerstoffspezies ver
201. tige Erythrozyten 13 Einleitung 1 3 1 2 Herzregeneration im Molch Zur Untersuchung der Regenerationsfahigkeit von Molchherzen wurden entweder kleine Stiicke eines der beiden Atrien oder ca ein Achtel des Ventrikels amputiert Dabei wurde die Wunde zun chst durch Bildung eines Blutgerinnsels verschlossen Im weiteren Verlauf traten dann Koagulationsnekrosen auf Makrophagen wurden aktiviert die regenerative Aktivit t der Kardiomyozyten stimuliert und Bindegewebe gebildet Mit Hilfe von lichtmikroskopischen Autoradiographien konnten sowohl in den Randzonen der Wunde im Atrium als auch im Ventrikel DNS Synthesen und Mitosen in Myozyten nachgewiesen werden Im Ventrikel und Atrium begann die Proliferation etwa zehn Tage nach erfolgter Amputation McDonnell and Oberpriller 1984 Oberpriller and Oberpriller 1974 Au er von Myozyten wurde 3H Thymidin auch von Fibroblasten endokardialen Zellen epikardialen Zellen und Blutzellen inkorporiert 20 30 Tage nach der partiellen Ventrikelamputation konnten lichtmikroskopisch in der Randzone und innerhalb der haupts chlich aus Bindegewebe bestehenden Wunde vereinzelte kardiale Fasern beobachtet werden die sich durch weniger und kleinere Myofibrillen auszeichneten Die Autoren zogen aus diesen Beobachtungen den Schluss dass die Regeneration des Molchherzen nicht komplett erfolgt sondern in einem halbfunktionellen Gewebe bestehend aus einem Gemisch von kontrahierenden Myozyten und zur ckbleibend
202. tiger Signalwege sind beobachtet werden So wurden die MAP Kinase p38 die JNK SAPK die Kinase Akt und die MEK1 2 Kinase sowie deren Zielenzyme Erk1 2 und p 90RSK in gesch digten Herzen im Vergleich zu scheinoperierten Kontrollherzen durch verst rkte Phosphorylierungen aktiviert Die Aktivierung eben dieser Kinasen war zu erwarten da sie entweder in zellul re Stress und Zytokinantwort p 38 und JNK SAPK und oder Zellwachstums und Zelldifferenzierungsprozesse MEK Erk p9ORSK bzw in diverse andere Signalwege die unter anderem eine entscheidende Rolle fiir das Gleichgewicht zwischen Apoptose und Zelliiberleben spielen Akt involviert sind 4 9 Einfluss des MEK1 2 Inhibitors U0126 auf die Proteinexpressionen und Phosphorylierungen verschiedener Enzyme Aufgrund der eindeutigen Aktivierung der Kinasen MEK Erk und p90RSK innerhalb der ersten zwei Stunden nach Herzsch digung sollten im Rahmen dieser Arbeit die Auswirkungen der Inhibition dieses Signalweges untersucht werden Dabei stellte sich heraus dass eine Konzentration von 20ug pro g K rpergewicht des chemischen Inhibitors U0126 eine effektive Hemmung der Phosphorylierung von MEK und Erk 10 min nach der 134 Diskussion Herzsch digung hervorruft Diese blieb im Fall der Erk auch noch 30 min nach der Sch digung bestehen und wirkte sich auf die p90 RSK gleicherma en aus 4 9 1 St rkere Aktivierung der Akt Kinase nach U0126 Injektion in gesch digte Herzen In Folge der
203. tionierung etc Konnten diese schlie lich in den Plasmidvektor PDNR Lib kloniert und anschlie end in E coli Bakterien transformiert werden Zur berpr fung des Anteils rekombinanter Kolonien und deren Fragmentgr en wurden von 18 Klonen Plasmid DNS pr pariert diese mit dem Restriktionsenzym Sfil verdaut und anschlie end gelelektrophoretisch aufgetrennt Abb 12 Sfil Restriktionsverdau von 18 Klonen aus der cDNS Bibliothek M1 A EcoRI HindIII DNS Gr enstandard M2 pUC18 Sau3A DNS Gr enstandard Wie in Abb 12 zu sehen ist konnte aus allen 18 Plasmiden ein Fragment herausgeschnitten werden Zweidrittel der Klone verf gten ber Fragmente mit einer Mindestl nge von 500 bp Die transformierten E coli Bakterien wurden mit einem Titer von 2 5x 10 cfu ml in Form von Glycerolstocks eingefroren 72 Ergebnisse 3 3 1 Herstellung von Macro und Microarrays Das Deutsche Ressourcenzentrum fiir Genomforschung GmbH RZPD wurde nach der Fertigstellung der cDNS Bibliothek damit beauftragt 100 000 Kolonien zu isolieren diese auf 384er Platten zu transferieren und Macroarrays in Form von Koloniefiltern herzustellen Die komplette cDNS Bibliothek wurde anschlie end auf sieben Koloniefiltersets mit je ca 15 000 Kolonien abgebildet Zus tzlich erfolgte in Kooperation mit dem Max Planck Institut f r Molekulare Genetik der Abteilung von Prof Dr Hans Lehrach eine Vervielf ltigung der klonierten Fragmente mittels PCR AG Patr
204. tunden bereits wieder schw cher Vergleicht man die Gesamtmenge an MEK1 und MEK sind zwar Unterschiede zwischen 105 Ergebnisse den einzelnen Proben erkennbar diese allein scheinen jedoch nicht fiir die eindeutige Aktivierung nach Herzsch digung verantwortlich gemacht werden zu k nnen Die Aktivierung von MEK1 2 f hrte ihrerseits zur Aktivierung der extracellular signal responsive Kinasen Erkl und Erk2 auch p44 und p42 MAP Kinasen genannt durch Phosphorylierungen an dem Threoninrest 202 und dem Tyrosinrest 204 Bereits 10 min nach Sch digung hatte die Aktivierung der MEK1 2 Kinasen eine Aktivierung der Erk1 2 Kinasen zur Folge die auch noch zwei Stunden nach der Sch digung bestehen blieb Die Gesamtmenge an Erk1 2 hatte leicht zugenommen im Vergleich zu den scheinoperierten Kontrollherzen p90 RSK geh rt zur Familie der weitverbreiteten 90 kDa ribosomalen S6 Serin Threonin Kinasen Die p90 RSK wird von Erk1 2 mittels Phosphorylierung an verschiedenen Phosphorylierungsstellen aktiviert Der hier verwendete Antik rper erkennt die Phosphorylierung an dem Serinrest 380 Die im Zellkern lokalisierte aktivierte Form der p90 RSK phosphoryliert verschiedene Transkriptionsfaktoren wie CREB c Fos und SRF Wie zu erwarten hatte die sch digungsbedingte Aktivierung von MEK1 2 und Erk1 2 auch eine Aktivierung von p90 RSK an allen drei untersuchten Zeitpunkten zur Folge Die Proteinkinase Akt spielt eine kritische Rolle f r das Gleichgewich
205. tzung Yue et al 2000 Die herzspezifische transgene berexpression von MEK1 f hrte zur Bildung einer kompensatorischen physiologischen Herzhypertrophie und verbesserten Herzfunktionen sowie einer partiellen Resistenz gegen ber Apoptosen Bueno et al 2000 Andere Experimente konnten wiederum zeigen dass die Aktivierung des Erk Signalweges nicht immer positive Effekte hervorruft sondern je nach u erem Stimulus kann auch eine gezielte Inaktivierung dieses Signalweges n tzlich sein So f hrte zum Beispiel die Vorbehandlung von M usen mir dem MEK Inhibitor U0126 vor der Verabreichung des Chemotherapeutikums Cisplatin das in Abh ngigkeit von der eingesetzten Dosis nephrotoxisch wirkt zu verminderten Nierensch den durch Verringerung der Inflammation und Apoptose Dabei konnte nach der Inhibitorbehandlung eine verringerte TNFa Genexpression und eine verringerte Caspase 3 Aktivit t beobachtet werden Jo et al 2005 Vorbehandlungen von Versuchstieren mit einem MEK Inhibitor vor der 138 Diskussion Induktion einer fokalen zerebralen Isch mie f hrten zu deutlich verringerten Infarktvolumina Alessandrini et al 1999 Namura et al 2001 Wang et al 2004 Die verschiedenen Experimente mit dem Inhibitor U0126 die im Rahmen dieser Arbeit durchgef hrt wurden als auch die Ergebnisse von anderen Gruppen zeigen deutlich dass sich die Wirkung der Inhibtion des MEK Erk Signalweges nicht pauschal hervorsagen l sst und sowohl prot
206. uchungen des Einflusses des MEK1 2 Inhibitors U0126 auf Prim rkulturen aus ungesch digten Molchherzen 115 Blockierung der Mitoserate nach Inkubation von prim ren Molchherzzellen mit U0R6 2 2 22 116 Verringerung der Anzahl an o Aktinin positiven Zellen nach Behandlung mit dem Inhibitor U0126 urssuessnersnnesnnernnnrsnnennne 117 4 Diskussion ER ha 119 Vor und Nachteile der Verwendung des Molches als Modellorganismus f r die Analyse der Herzregeneration 119 Vor und Nachteile der mechanischen Ventrikelsch digung 120 Mitotisch aktive Kardiomyozyten ein entscheidender Vorteil von Molchen und Zebrafischen gegen ber S ugetieren N 121 Histologische Untersuchungen belegen eine erfolgreiche Regeneration des Molchherzens innerhalb von 12 Wochen 22222202 seen 123 Herstellung einer cCDNS Bibliothek und die Analyse differentiell exprimierter GEBE Renten 124 Die Analyse differentiell exprimierter Gene ergab gro e Ver nderungen innerhalb der Expression von Transkripten die f r Zytoskelettproteine COLE TREE RAR 125 Zunahme der Expression von glattmuskelspezifischen Proteinen 126 Zunahme der Expression von HSP 27 im regenerierenden Mo lchherzen ra 127 Zunahme der Expression von Thymosin 4 im regenerierenden Molchherzen 2 4 212 2l 82a 128 Inhaltsverzeichnis 4 6 4 6 1 4 6 2 4 6 3 4 6 4 4 7 4 8 4 9
207. ul doppelstr ngiger cDNS am besten bew hrt 2 2 8 Transfer von DNS auf Polyamidmembranen Southern Blotting Nach elektrophoretischer Auftrennung der zu transferierenden DNS Fragmente im 1 igen Agarosegel wurden diese zun chst durch zehnminiitige Inkubation in 0 25 M HCl L sung depuriniert Anschlie end wurden die DNS Fragmente mittels 0 4 M NaOH L sung ber Nacht auf eine positiv geladene Polyamidmembran bertragen Die Membran wurde 10 min mit 2x SSC gewaschen getrocknet und die DNA nach 30 min Inkubation bei 80 C auf der Membran immobilisiert 49 Material und Methoden 2 2 9 Markierung von Nukleins uren 2 2 9 1 Radioaktive Markierung von DNS Fragmenten F r die radioaktive Markierung von DNS Fragmenten wurde die Methode des Random Priming Feinberg und Vogelstein 1984 angewendet Hierbei hybridisieren komplement re Hexanukleotide aus einem Gemisch verschiedenster Basensequenzen Random Primer an die zu markierende DNS Dabei wird der komplement re DNS Strang durch den enzymatischen Einbau DNS Polymerase Klenow Fragment von Desoxyribonukleosid 5 triphosphate a 32P markiert synthetisiert Es wurden im Fall der Aktin Sonde 50 ng DNS und 50 uCi a P dCTP Amersham eingesetzt F r die Markierung der subtrahierten cDNSs wurden zu 100 ng 50 uCi a 72P dCTP gegeben Die Inkubation betrug 2h bei 37 C Die Proben wurden anschlie end ber NAP 5 S ulen aufgereinigt 2 2 9 2 In vitro Transkription
208. ulten Molchherzen Vor der Entnahme der Molchherzen wurden die Tiere wie bereits beschrieben narkotisiert und die Bauchseite sorgf ltig desinfiziert Die isolierten Herzen wurden in 70 igem Leibovitz 15 L 15 Medium Gibco mit 2 Penicillin und Streptomycin ber Nacht bei 25 C und 2 CO im Brutschrank inkubiert Am folgenden Tag wurden die Ventrikel zun chst mit einem Skalpel zerkleinert und anschlie end mit einer Enzyml sung verdaut Der Verdau fand bei 27 C und 90 rpm in einem Sch ttelinkubator statt W hrend des ca achtst ndigen enzymatischen Verdaus wurde die Enzyml sung alle zwei Stunden gewechselt Der erste und zweite Verdau wurde mikroskopisch begutachtet und meistens verworfen Bei dem dritten und vierten Enzymwechsel wurde der berstand bei 300 rpm 3 min zentrifugiert und in Kulturmedium resuspendiert Die beiden letzten Fraktionen enthielten erfahrungsgem die meisten Kardiomyozyten Die Fraktionen wurden zun chst ber Nacht auf unbeschichteten Plastikkulturschalen pr plattiert Die am folgenden Tag im berstand befindlichen Kardiomyozyten wurden schlie lich auf mit Laminin 10 uM Sigma L 2020 beschichtete Kammerobjekttr ger LabtekII Chamber Slides RS Glass Slide Nunc plattiert Alle drei Tage wurde das Medium gewechselt Enzyml sung A PBS mit 0 5 Trypsin Sigma T 7409 380 U Collagenase Typ H Gibco 17101 015 0 15 BSA Sigma A 8806 0 3 Glucose Sigma G 6152 63 Material und Methoden Kultu
209. umentiert werden konnten stammt von Engel et al Dieser Gruppe gelang es in adulten Rattenkardiomyozyten mittels chemischer Inhibierung der MAP Kinase p38 und zus tzlicher Stimulation der Zellkultur mit dem Wachstumsfaktor FGF1 sowohl Karyo als auch Zytokinesen zu stimulieren Engel et al 2005 Allerdings bleibt dies bei einer Mitoserate von 0 14 unter diesen speziellen Zellkulturbedingungen ein seltenes Ereignis Das postnatale Rattenherz besteht zw lf Tage nach der Geburt zu ca 90 aus binukle ren Kardiomyozyten Li et al 1996 Auch im gesch digten S ugerherz konnten DNS Synthesen und Kernteilungen detektiert werden Capasso et al 1992 Diese resultieren jedoch meistens in der Entstehung von binukle ren Zellen in denen eine vollst ndige Zytokinese unterblieben ist Demgegen ber sind embryonale Kardiomyozyten in der Lage sich zu teilen und gleichzeitig die Pumpaktivit t des sich entwickelnden Herzens aufrechtzuerhalten Mittels konfokaler Mikroskopie von dreifach gef rbten prim ren embryonalen Kardiomyozyten und whole mount Kulturen von embryonalen M useherzen 121 Diskussion konnte gezeigt werden dass differenzierte embryonale Kardiomyozyten proliferieren k nnen Daf r ist jedoch die Deassemblierung von Myofibrillen den kontraktilen Elementen der Kardiomyozyten notwendig Diese Deassemblierung beginnt bei den Z Scheiben und den diinnen Aktinfilamenten und wird dann bei den M Streifen und dicken Myosinfilamenten
210. ung des Inhibitoreinflusses 30 min und einen Tag nach der Herzschadigung auf die Phosphorylierungen der MEK1 2 Erk1 2 und p90 RSK Kinasen Kontr bzw K kennzeichnet im Folgenden Proteinextrakte aus normalen ungesch digten Herzen 108 Ergebnisse 3 6 2 2 Starkere Aktivierung der Akt Kinase nach Inhibition der MEK1 2 Kinase durch den Inhibitor U0126 Zur Uberpriifung ob sich durch die Inaktivierung des MAPK Signalweges auf der Stufe der MEK1 2 Kinase der Phosphorylierungsstatus anderer Signalwege ver ndert wurden die Phosphorylierungen der Akt Kinase und der p38 MAP Kinase ebenfalls untersucht F r die Phosphorylierungsstellen Serin 473 und insbesondere Threonin 308 der Akt Kinase konnte nach 30 min eine st rkere Phosphorylierung in den Proteinextrakten der mit U0126 behandelten Tieren detektiert werden Im Fall der p38 MAP Kinase konnten hingegen keine eindeutigen Unterschiede zwischen den beiden Versuchsgruppen festgestellt werden Einen Tag sp ter verhielten sich beide Versuchsgruppen wieder gleich A P Akt Thr 308 P Akt Ser 473 ere Gesamt Akt P p38 Thr 180 Tyr 182 Abb 41 St rkere Aktivierung der Akt gegen ber p38 MAP Kinase nach Inhibitorinjektion 3 6 2 3 Weitere Substratproteine des MAPK Signalweges und oder Akt Signalweges zeigen keine eindeutige Deregulation nach U0126 Injektionen Neben den bereits erw hnten Substratproteinen der MEK1 2 Kinase sind weitere Substratproteine de
211. ung erfolgte ebenfalls im Church amp Gilbert Puffer 100 ug ml Heringssperma DNA bei 65 C ber Nacht mit der erfolgreich radioaktivmarkierten Sonde 100000 3 000 000 counts ml Am n chsten Tag wurden die Southern Blots 3 mal f r 15 min mit Waschpuffer 1 bei 65 C gewaschen ein R ntgenfilm aufgelegt und je nach gemessener Aktivit t f r 1 bis 7 Tage bei 80 C exponiert Die Koloniefilter wurden einmal mit 1x SSC 0 1 SDS f r 20 min bei 65 C gewaschen Anschlie end erfolgte ein zweimaliges Waschen mit 0 3 SSC 0 1 SDS f r 15 min und zum Schluss ein letzter Waschschritt mit 0 1 SSC 0 1 SDS f r 30 min 2 2 10 2 Hybridisierung der cDNS Microarrays mit fluoreszenzmarkierten cDNS Proben Die Glaschips wurden in den Hybridisierungskammern w hrend der Vorbereitung der Hybridisierungsproben auf 42 C vortemperiert Zuletzt wurde die Probe auf den Chip pipettiert ohne den gespotteten Bereich zu besch digen Das Ganze wurde vorsichtig unter Vermeidung von Luftblasen mit einem passenden Deckgl schen 22 mm x 60 mm abgedeckt In die vier Vertiefungen in den Ecken der Hybridisierungskammern wurden zum Erhalt der Feuchtigkeit zus tzlich jeweils 20 ul Hybridisierungspuffer gegeben Die fest verschraubten Hybridisierungskammern wurden dann bei 42 C ber Nacht in einem Wasserbad inkubiert 55 Material und Methoden Am darauffolgenden Tag wurden die Chips nach dem die Hybridisierungskammern sorgf ltig von Au en tro
212. usbildung von Zellpolarit ten sowie der Differenzierung Proliferation und Migration verschiedener Zelltypen Patapoutian et al 1995 27 Einleitung Die Wnts bilden eine dritte gro e Gruppe von Signalmolek len welche die kardiogene Induktion des Mesoderms kontrollieren Untersuchungen der Herzentwicklung im Xenopus und im Hiihnchen haben gezeigt dass die Induktion der kardialen mesodermalen Vorl uferzellen auf der Aktivierung des Wnt Ca Sheldahl et al 2003 und des Wnt Polarit t Pandur et al 2002 Signalweges bei gleichzeitiger Inhibition des Wnt catenin Signalweges beruhen Schneider and Mercola 2001 Die Aktivierung des Wnt Ca Signalweges f hrt zur Aktivierung der Proteinkinase C w hrend die Aktivierung des Wnt Polarit t Signalweges die Jun aminoterminalen Kinase JNK aktiviert Beide Signalwege werden von Wnt 11 aktiviert dessen Expression im pr kardialen Mesoderm von Xenopus H hnchen und M useembryonen detektiert wurde Pandur et al 2002 Zwei weitere Wnts Wnt 3a und Wnt Sc werden ebenfalls im kardiogenen Mesoderm exprimiert und aktivieren den Wnt catenin Signalweg welcher die Kardiogenese inhibiert Schneider and Mercola 2001 Daher erfordert die Herzentwicklung im Falle des Wnt Signalweges eine r umlich koordinierte Expression von zwei gegens tzlichen Aktivit ten Zum einen die Inhibition des Wnt B catenin Signalweges durch Sekretion der inhibierenden Molek le DKK und Crescent und die A
213. xtrazellul ren Matrix scheint aber im Molchherzen eher vor bergehenden St tzfunktionen zu dienen und ganz im Gegenteil die Neubildung von funktionsf higem Myokard nicht zu be oder verhindern Die bereits sehr kurz nach der Amputation detektierbare Fibronektinexpression im Stumpfblastem suggeriert eine m gliche Funktion des Fibronektins als einem Substrat f r die Migration und Akkumulation von 123 Diskussion dedifferenzierenden Zellen des Stumpfgewebes Nace and Tassava 1995 Eine solche Funktion des Fibronektins w re auch w hrend der Herzregeneration denkbar 4 5 Herstellung einer cDNS Bibliothek und die Analyse differentiell exprimierter Gene Da die Proliferationsf higkeit von Kardiomyozyten im Molch ein wichtiger Vorteil gegen ber den Kardiomyozyten der S ugetiere darstellt wurde die f r die in dieser Arbeit verwendete Sch digungsmethode ermittelte maximale Mitoserate von 14 Tagen nach der Sch digung als ein geeigneter Zeitpunkt f r die Herzentnahmen zur Herstellung einer cDNS Bibliothek angenommen Auch die Analysen anderer Arbeitsgruppen die eine Sch digung durch partielle Amputation verursachten ergaben wie bereits erw hnt maximale Proliferationsraten innerhalb der ersten 10 20 Tage nach der Sch digung McDonnell and Oberpriller 1984 Oberpriller and Oberpriller 1974 Zudem spielen zu diesem Zeitpunkt Inflammation und Nekrose keine so gro e Rolle mehr Stattdessen ist die strukturelle Neugestaltung in voll
214. zur Synthese von Digoxigenin UTP markierten RNS Proben Sense und antisense RNS Proben f r in situ Hybridisierungen auf Paraffinschnitten wurden mit Digoxigenin UTP markiert Die als Matrize f r die Transkription dienenden DNS Fragmente befanden sich in einem Plasmidvektor in dem sie von je einem Promotor f r unterschiedliche RNS Polymerasen flankiert wurden Dieser Umstand erm glichte die Generierung von RNS Proben in beiden Transkriptionsrichtungen sense und antisense F r die in vitro Transkription und die dabei erfolgende Markierung wurde jeweils 1 ug zuvor linearisierte DNS verwendet Die Schnittstellen f r die Linearisierungen wurden dabei so gew hlt dass sie die Herstellung von Transkripten mit definierter L nge erm glichten Ein typischer Ansatz f r eine Transkription setzte sich folgenderma en zusammen x pl linearisierte DNS 1 pg 4 ul 5x Transkriptionspuffer 2 ul 100 mM DTT 2 ul DIG Mix DIG 11 UTP ATP CTP GTP UTP 50 Material und Methoden 1 ul RNasin RNase Inhibitor 40 U ul 1 ul RNS Polymerase T3 Sp6 20 U ul Joder T7 15 U ul ad 20 ul H20 Der Ansatz wurde zwei Stunden bei 37 C inkubiert Danach wurde 1 ul Probe abgenommen Die im Ansatz enthaltene DNS wurde anschlie end durch Zugabe von 2 ul DNase und Inkubation bei 37 C fiir 15 min abgebaut Danach wurde die RNS durch Zugabe von lul t RNS 10 mg ml 33 ul DEPC behandeltes 7 5 M Ammoniumacetat 100 ul DEPC behandeltes H O 300 ul

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