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Dokument_35.

1. cone in in Gen Name m gliche Funktion COG 5 427 1 000 CMM_1675 hypothetical secreted protein V 2 1 307 11 299 CMM_0338 en secreted protein putative v2 1 039 3 484 CMM_0976 ABC transporter SBP IV 1 910 CMM _1557 hypothetical secreted protein V 2 873 365 CMM_1872 TN ee oten v 2 612 263 CMM_0866 alpha glucoside ABC transporter SBP IV 1 431 1 052 CMM_2536 sbtC ee we a IV 6 353 1 004 CMM_0840 NPL P60 family secreted protein IV 6 326 CMM_0915 pbpC penicillin binding protein 1 2 326 519 CMM_0919 pbpD penicillin binding protein 11 2 324 CMM_0795 extracellular nuclease phosphatase IV 6 302 350 CMM_1865 fts peptidoglycan glycosyltransferase PBP 11 2 264 241 CMM_0839 membrane bound metalloprotease IV 7 205 672 CMM_0042 ppaBT extracellular serine protease IV 6 205 672 CMM_0050 ppaB2 extracellular serine protease IV 6 199 CMM_1250 hypothetical secreted protein V 2 181 365 CMM_1842 ctaC cytochrome c oxidase subunit 2 1 1 180 CMM_2688 acetyl xylan esterase 1 1 166 438 CMM_2185 peptide ABC transporter SBP IV 1 165 241 CMM_2467 hydrolase V 1 138 756 CMM_2283 metal ABC transporter SBP IV 1 108 CMM_2568 groES 10 kDa chaperonin protein Cpn10 IV 4 ws omesse uee Ike orraco see Ne 103 59 CMM_2566 livk 2 0 BE IV 94 679 CMM_0144 conserved secreted protein V 2 92 CMM_0511 conserved secreted pro
2. 70 na J Temperatur C Relative Fluore Abbildung 8 qPCR Experiment mit der 18S rRNA Kontrolle und hsr203J Zielgen A Standardgerade zur Bestimmung der PCR Effizienz von hsr203J In Duplikaten wurden in einer Verd nnungsreihe 100 10 1 0 1 und 0 01 ng RNA eingesetzt Die C Werte repr sentieren den PCR Zyklus bei dem die Fluoreszenz das erste Mal ber den Hintergrundwert steigt B und C Uberpr fung der PCR Reaktion mittels Schmelzkurve und Gelelektrophorese Spuren 1 5 und 8 12 RNA Mengen von 100 0 01 ng Spur 6 Wasserprobe D E PCR Amplifikationsdiagramme 0 24 und 48 h nach der Infektion In Triplikaten wurden je 10 ng RNA aus den 10 mM MgCl Cmm100 und Cmm382 behandelten Bl ttern eingesetzt Die PCR von Cmm100_24 h Pfeile wurde wiederholt und zeigte dort mit 7 Zyklen einen zu Cmm382_24 h vergleichbaren C Wert der 18 S rRNA Daten nicht gezeigt Der C Wert von hsr203J war bei der Wiederholung ebenfalls vergleichbar mit Cmm382_24 h wobei ebenso Unterschiede in den C Werten der 18 S rRNA und von hsr203J der MgClo behandelten Bl tter zu e
3. CMM_1687 tatA CMM_2621 fusA CMM_2519 galk CMM_2724 CMM_1996 argG CMM_1258 CMM_0662 adhA CMM_1396 CMM_0589 CMM_2592 CMM_2369 CMM_2915 CMM_1160 CMM 1737 zwfA2 CMM _2456 CMM_2544 purH CMM_0876 araB CMM_0630 rocD CMM_0709 CMM_2048 rpsO CMM _0179 CMM _0653 cysk CMM_1457 pepN CMM _1514 CMM_1656 dutA CMM_1716 rpmE2 CMM _0991 accA CMM _1995 argH CMM_1093 ilvD CMM _0878 araA CMM_2482 CMM 1180 CMM_2171 gItA2 CMM _0685 CMM _1431 treY CMM_1386 frr CMM_1168 atpG CMM_1371 mapA1 CMM_2974 CMM_2963 rpsF CMM_2580 rp M CMM_1430 treZ CMM_1490 rpmA CMM_0485 cpdA CMM_1256 CMM_0417 CMM_2597 adkA CMM_2608 rpsQ CMM_2796 CMM_0777 CMM_1879 CMM_0385 ItaE transcriptional regulator with FHA domain cytosol aminopeptidase leucine aminopeptidase involved in mycothiol biosynthesis putative phospholipase alpha beta hydrolase family sugar alcoho dehydrogenase 30S ribosomal protein S19 glutamine synthetase Il Sec independent twin arginine protein translocase protein elongation factor G EF G galactokinase anti sigma factor antagonist argininosuccinate synthase citrulline aspartate ligase conserved hypothetical protein NADP dependent alcohol dehydrogenase thioredoxin conserved hypothetical protein phosphoenolpyruvate protein phosphotransferase PTS enzyme DNase Zn dependent dehydrogenase conserved hypothetical protein gl
4. 22444444444Bnn nn nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn anna 71 4 42 ProteOManalySen eresi aAA ENE E NTE A E ASS 74 4 4 2 1 Analyse der Oberfl chenproteine sssessssssrsesrrssrrssrrssrnssrrssrnssrnsstnssrnssrnssrnssrnnt 74 4 4 2 2 Analyse extrazellul rer und zytoplasmatischer Proteine uu sen 78 4 4 3 Transkniptomanahys oMa A R AAS 85 4 4 3 1 Vergleich synthetisches Medium XMM und Minimalmedium M9 86 4 4 3 2 Vergleich synthetisches Medium XMM und Vollmedium TBY 90 4 4 3 3 Vergleich synthetisches Medium XMM mit und ohne Acetosyringon 92 4 5 Charakterisierung und Analyse von Transkriptionsregulatoren ersnsesrseennnnnnnnnnnennnnnnnnnen 94 4 5 1 Charakterisierung von Regulatoren f r pat 1 und celA 0usnneersnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn 94 4 5 2 Insertionsmutagenese von drei putativen Regulatoren uu 444sennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn 96 4 5 3 Analyse der Mutation von CMM_2408 und CMM_2766 cccceessceeeesteeeeeeseeeeesaaes 101 4 6 PromotorstUGle Mm IPPEREPEFEECHERFUCPEFPRFTFEEFELFUFPEFLPELFERSEFRUFERTERFTRELFELFELETERPFESETFEFUFERFEETTEFNELELFELFFPEFTENFEIRTEESTERRTE 103 4 6 1 Analyse der Promotorregion VON gInAT nnnnesessssenennnnnnnnnnnnnnnnennnnnnnennnnnnnnnnn nn nnn nenn 104 4 6 2 Promotoranalyse des 5 Transkriptoms mittels RNA Sequenzierung een 106 97 DISKUSSION sr A ETRA EAE A 112 5 1 I
5. Literaturverzeichnis 129 6 Literaturverzeichnis Abramovitch R B Anderson J C and Martin G B 2006 Bacterial elicitation and evasion of plant innate immunity Nat Rev Mol Cell Biol 7 8 601 611 Alarcon C Castro J Munoz F Arce Johnson P and Delgado J 1998 Protein s from the Gram positive bacterium Clavibacter michiganensis subsp michiganensis induces a hypersensitive response in plants Phytopathology 88 4 306 310 Alfano J R and Collmer A 1997 The type Ill Hrp secretion pathway of plant pathogenic bacteria trafficking harpins Avr proteins and death J Bacteriol 179 18 5655 5662 Amon J Brau T Grimrath A HanBler E Hasselt K Holler M JeBberger N Ott L Szokol J Titgemeyer F and Burkovski A 2008 Nitrogen control in Mycobacterium smegmatis nitrogen dependent expression of ammonium transport and assimilation proteins depends on the OmpR type regulator GInR J Bacteriol 190 21 7108 7116 Arlat M Gough C L Zischek C Barberis P A Trigalet A and Boucher C 1992 Transcriptional organization and expression of the large hrp gene cluster of Pseudomonas solanacearum Mol Plant Microbe Interact 5 187 193 Baker C J Mock N M Whitaker B D Roberts D P Rice C P Deahl K L and Aver yanov A A 2005 Involvement of acetosyringone in plant pathogen recognition Biochem Biophys Res Commun 328 1 130 136 Balaji V Mayros
6. CMM _0486 CMM_2610 rpIP CMM_2233 fumC CMM_1526 CMM_0709 CMM_1473 pckA CMM_1411 CMM_1730 extracellular serine protease family S1A Chymotrypsin pyruvate dehydrogenase E1 component cellulase 50S ribosomal protein L27 oligopeptide ABC transporter SBP conserved membrane protein pyruvate kinase 30S ribosomal protein S17 50S ribosomal protein L2 triosephosphate isomerase 50S ribosomal protein L22 50S ribosomal protein L9 conserved secreted protein sugar ABC transporter ATPase aminopeptidase N 30S ribosomal protein S9 aminodeoxychorismate lyase cytosol aminopeptidase 6 phosphogluconate dehydrogenase conserved hypothetical protein putative translation factor oxidoreductase expansin 50S ribosomal protein L11 30S ribosomal protein S6 50S ribosomal protein L24 30S ribosomal protein S18 hypothetical protein metallopeptidase family M13 conserved secreted protein putative carboxypeptidase or PBP 6 phosphogluconate dehydrogenase decarboxylating Fe3 siderophore ABC transporter SBP conserved secreted protein subtilisin like extracellular serine protease peptidase family S8A 50S ribosomal protein L4 50S ribosomal protein L30 50S ribosomal protein L15 2 oxoglutarate dehydrogenase E1 component sugar ABC transporter substrate binding protein transcription antitermination protein ferrochelatase conserved secreted protein branched chain amino acid aminotransferase 50S ribosomal pro
7. CMM_1948 ppal CMM_0090 tomA und CMM_0043 pelAT in XMM Medium h her als in TBY Medium Der Unterschied der Transkriptmengen betrug jedoch lediglich zwischen 1 4 und 1 6 Daten nicht gezeigt Ohne die Durchf hrung der Benjamini Hochberg Korrektur Benjamini amp Hochberg 1995 wurden zus tzlich die Gene CMM_1942 ppaG CMM_1947 ppaH und CMM_1480 expA identifiziert deren Transkriptmengen in XMM Medium 14 16 Mal h her waren als in TBY Medium Daten nicht gezeigt Das Microarray Experiment XMM gegen M9 Medium wurde mit dem Microarray Experiment II XMM gegen TBY Medium vergleichen um zu berpr fen ob und wie viele Gene in beiden Vergleichen auftauchten und eine hnliche nderung der Transkriptmenge zeigten TBY XMM 426 Gene 490 Gene Abbildung 22 Vergleich der Microarray Experimente mit der isolierten RNA aus einer Cmm382 Kultur in TBY und XMM Medium sowie in M9 und XMM Medium Die Transkriptmengen von 155 Genen waren in beiden Vergleichen ver ndert Davon war das mRNA Level von 97 Genen in XMM h her als in TBY Medium und das von 53 Genen niedriger Die Transkriptmengen von f nf Genen waren in beiden Vergleichen unterschiedlich 355 Gene wurden nur im Vergleich TBY XMM identifiziert 271 nur im Vergleich M9 XMM M erh ht V erniedrigt 155 Gene zeigten in beiden Experimenten ver nderte Transkriptmengen Abbildung 22 Die Transkriptmengen von 150 Genen waren dabei in beiden Experimenten in XMM
8. Neben der in silico Analyse von pCM2_0056 wurde die gesamte Sequenz von pCM2 mit der des Chromosoms verglichen und es wurde eine 24 ige Identit t festgestellt Tabelle 16 Ergebnisse Tabelle 16 Sequenzhomologien zwischen 100 pCM2 und dem Chromosom Sequenzhomologien zwischen pCM2 und Abschnitten des Chromosoms betrugen 82 und 98 http www ncbi nlm nih gov sutils genom_tree cgi Die Gene der entsprechenden Regionen sind mit aufgef hrt hp hypothetisches Protein Identit t Lokalisation auf pCM2 Lokalisation auf dem Chromosom 98 60 436 62 634 76 528 78 724 pCM2_0055 61 455 60 511 hp CMM_0054 77 545 76 541 hp pCM2_0056 62 452 61 448 Regulator CMM_0055 78 542 77 538 hp 95 65 752 68 502 83 803 86 549 pCM2_0061 66 023 66 310 hp CMM_0060 85 126 85 584 hp pCM2_0062 66 549 66 364 hp CMM_0061 85 938 86 894 pCM2_0063 66 933 66 598 hp filamentation protein pCM2_0064 67 041 67 535 hp pCM2_0065 67 655 67 864 hp 93 62 846 63 702 78 724 79 586 pCM2_0057 63 216 63 833 hp CMM_0056 79 094 70756 hp 93 1 1 644 87 336 88 990 pCM2_0001 1 1539 hp CMM_PS_09 parB2 87 336 88 883 92 69 618 69 989 86 995 87 335 pCM2_0069 69 586 69 903 hp 92 64 620 64 836 82 207 82 421 91 68 574 68 902 86 623 86 949 pCM2_0066 67 890 68 732 hp pCM2_0067 69 233 68 844
9. AAGAATTCAGTAGCGCCCGGAACAGG 3 amplifiziert mit den Restriktionsenzymen Scal und EcoRI geschnitten und in den geschnittenen Vektor pDM302gfp ligiert pDM302Pg nA1gfp Fur die Analyse der Promotorstarke des g nA1 Promotors mittels GFP Fluoreszenzmessung wurde eine 200 bp umfassende Promotorregion von ginA7 mit den Oligonukleotiden prom 1636 fw 5 GGAGTACTTTCGTGGGAGTCGCG 3 und prom 1636 rev 5 TCGAATTC GTCTCTGAACATGTGGTG 3 amplifiziert mit den Restriktionsenzymen Scal und EcoRI geschnitten und in den geschnittenen Vektor pDM302gfp ligiert pDM302PpfkAgfp F r die Analyse der Promotorst rke des pfkA Promotors mittels GFP Fluoreszenzmessung wurde eine 200 bp umfassende Promotorregion von pfkA mit den Oligonukleotiden pfkA Scal fw 5 CGAGTACTCGCGCGAGG 3 und pfkA EcoRl rev 5 TCGAATTCGCACAC GTCC 3 amplifiziert mit den Restriktionsenzymen Scal und EcoRI geschnitten und in den geschnittenen Vektor pPDM302gfp ligiert Anhang 143 pDrivecat Zur Verbesserung der Klonierungs Bedingungen wurde das Chloramphenicol Resistenzgen cat mit den Oligonukleotiden cmx_Kpnl_fw 5 CCGGTACCACTGCAGGACAT GGTCAAAG 3 und cmx_SexAl_rev 5 AACCTGGTTCGGATGGGTCATCAATTGG 3 amplifiziert und in den linearen Vektor pDrive Qiagen Hilden ligiert pUC18cat F r die nachfolgende Durchf hrung von Insertionsmutagenese Studien wurde das Suizid Plasmid pUC18cat konstruiert Daf r wurde das Chloramphenicol Resistenzgen cat mit den
10. Die Ernteertr ge werden unter anderem durch abiotischen Stress Ver nderung von Bodenbeschaffenheit Klima und Temperatur und biotischen Stress Sch digung durch lebende Organismen vermindert Rietz amp Parker 2007 Viren Viroide Pilze Oomyceten und Bakterien z hlen zu den Ausl sern des biotischen Stresses 2 1 1 Infektionsverlauf Um sich vor dem Eindringen von sch dlichen Organismen zu sch tzen besitzen Pflanzenzellen nat rliche Barrieren wie zum Beispiel die Epidermis mit der robusten Kutikula und die Zellwand Rietz amp Parker 2007 Bakterien k nnen diese Barrieren nicht einfach durchdringen sondern gelangen ber Wunden oder nat rliche ffnungen in die Wirtspflanze Stomata und die Stomata hnlichen Hydathoden stellen solche nat rlichen ffnungen dar Hydathoden sind Dr sen an der Blattspitze die permanent offen sind Bei hoher Luftfeuchtigkeit werden dar ber Wassertropfen abgesondert die bei niedriger Luftfeuchtigkeit wieder in das Innere der Pflanze gelangen Mit diesen Tropfen k nnen Bakterien leicht in die Pflanze eindringen Ryan et al 2011 Gu et al 2013 Ein Eindringen der Bakterien in den Pflanzensamen ber den Pollenschlauch Verletzungen der Samenh lle oder ber die Micropyle ist ebenfalls m glich Mundt amp Hinkle 1976 Morohashi 2002 Die Micropyle ist ein Bereich des Samens durch den die ersten Wurzeln die sch tzende Samenh lle bei der Keimung verlassen Morohashi 2002 Eine weitere
11. Experimente mit Hilfe des 5 3 RACE Kits 2nd Generation Roche Mannheim durchgef hrt Die Durchf hrung erfolgte nach Angaben des Herstellers Die Gesamt RNA wurde aus einer Cmm382 Kultur in M9 und XMM Medium isoliert siehe Abschnitt 3 3 2 1 und es wurden davon etwa 2 8 ug gemeinsam mit dem Primer ginA SP1 rev Abschnitt 3 1 Tabelle 4 eingesetzt Zur Reinigung der DNA Fragmente wurde das High Pure PCR Product Purification Kit Roche Mannheim verwendet Die PCR 1 nach dem poly tailing der cDNA wurde mit einer Annealing Temperatur von 65 C und dem Primer gInA SP2 rev Abschnitt 3 1 Tabelle 4 im MyiQ Single Color Real Time PCR Detection System Biorad M nchen durchgef hrt F r die Kontroll PCR wurde eine Annealing Temperatur von 55 C verwendet Die PCR Fragmente der Kontroll PCR wurden mit Hilfe des Primers ginA SP2 rev Abschnitt 3 1 Tabelle 4 sequenziert siehe Abschnitt 3 3 1 7 3 3 2 9 RNA Sequenzierung Fur die Analyse von Transkriptionsstartpunkten der Gesamt RNA von C michiganensis subsp michiganensis wurden die 5 NTRs nicht translatierte Region und 5 Enden sequen ziert Daf r wurde der Wildtypstamm wie in Abschnitt 3 2 3 beschrieben kultiviert und die RNA aus einer M9 und TBY Kultur isoliert siehe Abschnitt 3 3 2 1 Aus 10 ug RNA wurde anschlie end eine Prim r Transkript Bibliothek am Center for Biotechnology CeBiTec in Bielefeld erstellt Dabei wurde die mRNA von rRNAs gereinigt fragmentiert und mit Epicen
12. Survival of Clavibacter michiganensis ssp michiganensis in infected tomato stems under natural field conditions in California Ohio and Morocc Plant Pathol 51 149 154 Fatmi M Schaad N W and Bolkan H A 1991 Seed treatments for eradicating Clavibacter michiganensis subsp michiganensis from naturally infected tomato seeds Plant Dis 75 383 385 Filiatrault M J Wagner V E Bushnell D Haidaris C G Iglewski B H and Passador L 2005 Effect of anaerobiosis and nitrate on gene expression in Pseudomonas aeruginosa Infect Immun 73 6 3764 3772 Filippone M P Diaz Ricci J C Castagnaro A P and Farias R N 2001 Effect of fragarin on the cytoplasmic membrane of the phytopathogen Clavibacter michiganensis Mol Plant Microbe Interact 14 7 925 928 Fl gel M 2010 Transkriptomanalysen zur Interaktion von Clavibacter michiganensis subsp michiganensis mit seiner Wirtspflanze Dissertation Universit t Bielefeld Fl gel M Becker A Gartemann K H and Eichenlaub R 2012 Analysis of the interaction of Clavibacter michiganensis subsp michiganensis with its host plant tomato by genome wide expression profiling J Biotechnol 160 1 2 42 54 Francis l Holsters M and Vereecke D 2010 The Gram positive side of plant microbe interactions Environ Microbiol 12 1 1 12 Fuqua W C Winans S C and Greenberg E P 1994 Quorum sensing in bacteria the LuxR Luxl family of
13. Valle J Solano C and Gingeras T R 2011 Genome wide antisense transcription drives mRNA processing in bacteria Proc Natl Acad Sci U S A 108 50 20172 20177 Lee l M Bartoszyk I M Gundersen Rindal D E and Davis R E 1997 Phylogeny and classification of bacteria in the genera Clavibacter and Rathayibacter on the basis of 16S rRNA gene sequence analyses Appl Environ Microbiol 63 7 2631 2636 Lewis R A Laing E Allenby N Bucca G Brenner V Harrison M Kierzek A M and Smith C P 2010 Metabolic and evolutionary insights into the closely related species Streptomyces coelicolor and Streptomyces lividans deduced from high resolution comparative genomic hybridization BMC Genomics 11 682 Lochner A Giannone R J Keller M Antranikian G Graham D E and Hettich R L 2011 Label free quantitative proteomics for the extremely thermophilic bacterium Caldicellulosiruptor obsidiansis reveal distinct abundance patterns upon growth on cellobiose crystalline cellulose and switchgrass J Proteome Res 10 12 5302 5314 L pez Mill n A F Morales F Abad a A and Abad a J 2000 Effects of iron deficiency on the composition of the leaf apoplastic fluid and xylem sap in sugar beet Implications for iron and carbon transport Plant Physiol 124 2 873 884 Loria R Bignell D R Moll S Huguet Tapia J C Joshi M V Johnson E G Seipke R F and Gibson D M 200
14. cmr jcvi org Gartemann et al 2008 verwendet da Phagengen Promotoren effizient sind und eine hohe Stringenz aufweisen Tabor amp Richardson 1985 Des Weiteren wurde die Promotorregion von gInAT auf ihre Expressionsst rke hin getestet ginA7 kodiert f r eine Glutaminsynthetase und wurde gew hlt da in unabh ngigen Experimenten eine erh hte Expression beobachtet wurde Daten nicht gezeigt Die Promotorregionen wurden stromaufw rts von gfp in den E coli Clavibacter Shuttle Vektor pDM302 eingef gt und kompetente C michiganensis subsp michiganensis St mme damit transformiert Die Bakterienst mme die pDM302 mit der Promotorregion von gInAT Abbildung 30 A und dem Phagengen CMM_PS_21 Daten nicht gezeigt enthielten zeigten das st rkste Fluoreszenzsignal Beide Promotorregionen wurden an Hand zweier Methoden analysiert Zum einen wurden sie auf 150 bp verk rzt bzw auf 250 bp verl ngert um einen Verlust oder eine Steigerung der Fluoreszenz zu berpr fen Zum anderen wurde eine 5 RACE durchgef hrt um die Transkriptionsstartpunkte zu identifizieren Beide Methoden waren nur f r die Promotorregion von gInAT erfolgreich Die Fluoreszenzanalysen wurden in Minimalmedium mit und ohne Ammonium durchgef hrt da gInAT f r eine Glutaminsynthetase kodiert und diese eine wichtige Rolle bei der Ammoniumassimilation in stickstoffarmen Bedingungen spielen Nolden et al 2001 Abbildung 30 B Ergebnisse 105 Fluoreszenz in TBY
15. oder 1 ul RNA L sung 0 5 ul Vorw rts Primer 10 pmol ul 0 5 ul R ckw rts Primer 10 pmol ul 1 ul 10 mM dNTP Mix peglab Biotechnologie GmbH Erlangen 0 2 ul Tag DNA Polymerase 3 8 ul H2Opicest 12 8 ul H2Opidest 50 ul PCR Ansatz Phusion Polymerase 10 ul 5 x Phusion DNA Polymerase Puffer GC NEB Schwalbach 12 ul 10 iges v v DMSO 10 ul Bakteriensuspension in H2Opiges vorher 10 min 95 C oder 1 5 ug Plasmid DNA 1 ul Vorw rts Primer 10 pmol ul 1 ul R ckw rts Primer 10 pmol ul 1 ul 10 mM dNTP Mix peglab Biotechnologie GmbH Erlangen 0 5 ul Phusion DNA Polymerase 14 5 ul H2Opidest X HI H2Opidest Material und Methoden 32 Nach der initialen Denaturierung f r 10 min bei 95 C Tag oder 98 C Phusion wurde das DNA Fragment in 30 35 Zyklen amplifiziert die sich aus Denaturierung 30 sek Primer Anlagerung Annealing 30 sek spezifische Temperatur und Elongation vollstandige Synthese eines DNA Doppelstranges bei 68 C Taq 1 kbp min oder 72 C Phusion 1 kbp 30 sek zusammensetzten Die DNA Synthese wurde durch eine terminale Elongation 7 min 68 C 72 C beendet Zur Gr enbestimmung sowie zur Reinigung der amplifizierten Fragmente wurden die PCR Ans tze mittels Agarose Gelelektrophorese analysiert siehe Abschnitt 3 3 1 5 und falls n tig mit dem NucleoSpin Extract II Kit Macherey Nagel D ren nach Angaben des Herstellers gereinigt 3 3 1 4 Restriktion von DNA Um verschied
16. ori PAA PAGE PAMP PAP PBS PCR PR PVDF RNA rpm sek SDS SS Ta TAE TCA TE te TEMED Tris viv w v Wt 211 Megabasen Minute n Nitro Blue Tetrazolium National Collection of Plant Pathogenic Bacteria Nukleotid e nicht translatierte Region Ohm optische Dichte bei 580 nm origin of replication Promotor Polyacrylamid Polyacrylamid Gelelektrophorese pathogen associated molecular pattern Probenauftragspuffer phosphate buffered saline Polymerasekettenreaktion pathogen related polyvinylidene fluoride Ribonukleins ure ribonucleic acid rounds per minute Sekunde n Sodiumdodecylsulfat Sekretionssystem Annealing T emperatur Tris Acetat EDTA Trichloressigsaure Tris EDTA Elongationszeit N N N N Tetramethyl ethylendiamin Tris hydroxymethyl aminomethan Volt volume per volume weight per volume Wildtyp
17. 1 5 111 3 111 3 11 1 V 2 IV 7 1 2 IV 3 1 3 1 3 1 4 V 2 11 2 111 2 V 2 111 3 V 1 11 1 IV 3 V 2 V 2 111 1 V 1 IV 1 111 3 1 3 IV 4 V 2 V 2 1 5 IV 3 1 1 IV 3 1 5 V 2 1 5 1 1 IV 3 V 2 111 3 IV 3 IV 5 nn nn ey ys see eS eS eS Es EEE Es a EEE ee Sa Eu Eu Ei Eu Eu DDDDDOHDHDDDDDODIDO DD DD DO DO DODOO PP PP PrPPEPPLELPPLELPPPPLEPPEPP PEPPPPEPLEPEPICTO TOT ON GG AAO CMM_1861 murD CMM_1911 CMM 2910 CMM_2965 CMM_ 2448 CMM_2969 CMM_1930 CMM_2756 CMM_1013 rmIA CMM_1179 CMM_0215 CMM_0670 CMM_1003 purk CMM_0574 CMM_0588 hemY CMM_2880 CMM_2230 xseB CMM_2768 CMM_1690 CMM_0080 CMM_0984 CMM_1881 CMM_0624 npsC CMM_1997 argF CMM_2274 prsA CMM_2296 CMM_0990 IpdA CMM_1098 CMM_1864 murE CMM_2972 parA CMM_0347 manx CMM_0728 purL CMM_2219 CMM_1607 wcmM CMM_0877 araD CMM_0946 CMM_2496 CMM_2034 CMM_0854 ysS CMM_0529 CMM_2015 hisH pCM2_0013 traA CMM_1835 gcrC CMM_1566 pCM2_0058 CMM_2973 CMM_2326 CMM_2470 CMM_2735 glpX CMM_1571 eraA CMM_2940 CMM_1452 CMM_2393 CMM_0712 CMM_1858 murC CMM_PS_11 CMM_2369 CMM 1442 CMM _0214 CMM_1362 ftsY CMM_1354 recG CMM 1201 UDP N acetylmuramoylalanine D glutamate ligase dehydrogenase DNA glycosylase conserved secreted protein conserved hypothetical protein putative regulatory protein transcriptional regulator containing an aminotransferase domain conserved hypothetical
18. 2000 hydrolytische Enzyme 1 2 TR Rezeptor Kinase Avirulenzprotein Effektor a 3 1 gt Ea 0000000 R Protein a E D Genexpression l R A Genexpression DIS TAN systemisch a tokat Phytohormone CIE Abbildung 1 Wechselseitige evolution re Anpassung von Pflanze und Bakterium 1 Die Pflanzenzelle erkennt mittels spezifischer Rezeptoren Pathogen assoziierte molekulare Muster PAMPs wie bakterielle Oberflachenstrukturen oder sekretierte Proteine Die Erkennung f hrt zu einer basalen Abwehr die sowohl lokal als auch systemisch abl uft 2 ber Sekretionssysteme SS oder noch unbekannte Mechanismen gelangen bakterielle Proteine Effektoren in das pflanzliche Zytoplasma Dort greifen sie an unterschiedlichen Stellen in die pflanzliche Erkennungs und Abwehrmechanismen ein 3 Resistente Pflanzen erkennen ber Rezeptor Proteine R spezifisch bakterielle Effektoren Avirulenzproteine Dadurch wird erneut eine Abwehrreaktion hervorgerufen Das Wachstum des Pathogens wird durch seine Hydrolyse oder einen lokalen Pflanzenzelltod inhibiert T3SS Typ3 SS MAPK Mitogen assoziierte Proteinkinase Modifiziert nach Rietz amp Parker 2007 Savidor et al 2012 Jones amp Dangl 2006 B ttner amp Bonas 2010 Vera et al 2011 Einleitung 8 Einen weiteren Schutz der Pflanze vor Pathogenen bieten Immunrezeptoren R Proteine im Zytoplasma die spezifisch bakterielle Effektormolek le Avirulenzproteine er
19. 45 v v Methanol 10 v v Essigs ure 0 1 w v Coomassie Brilliant Blue G 250 3 4 8 Zymographie Um die Protease Cellulase und Pektinaseaktivit t zu berpr fen wurden die Bakterien von einer bernacht Kultur in 100 mi Minimalmedium berf hrt und 24 h oder 48h Proteaseaktivit t bzw sechs Tage Cellulase und Pektinaseaktivit t kultiviert siehe Abschnitt 3 2 3 nach Jahr et al 2000 Die Kultur wurde anschlie end zentrifugiert 8 000 x g 20 min 4 C und der Medien berstand filtriert Minisart Filter Porengr e 20 um Sartorius AG G ttingen Die Proteine wurden f r die Analyse der Proteaseaktivit t mittels Amicon Filter Porengr e 0 22 um Ausschluss lt 10 kDa Merck Millipore Massachusetts ankonzentriert f r die Analyse der Cellulase und Pektinaseaktivitat wurde eine Ammoniumsulfatf llung durchgef hrt Jahr et al 2000 Die nach Dixon berechnete Menge an Ammoniumsulfat wurde nach und nach zu 50 ml Medium berstand gegeben um eine Endkonzentration von 40 w v Ammoniumsulfat zu erhalten Dixon 1952 Nach einer Zentrifugation 8 000 x g 20 min 4 C wurde das Pellet in 0 25 1 ml 50 mM Tris HCl pH 8 5 resuspendiert und die Proteinl sung f r die folgende Zymographie eingesetzt Noch gel ste Proteine des berstands nach der Zentrifugation wurden erneut mit so viel Ammoniumsulfat versetzt dass eine Endkonzentration von 60 w v Ammoniumsulfat erreicht wurde Nach einer erneuten Zentrifugation
20. Baysal et al 2011 Aufgrund der hohen Bakteriendichte k nnten die in der Pflanze nach der Erkennung hervorgerufenen Antwortreaktionen nicht ausreichen um das bakterielle Wachstum vollst ndig zu inhibieren Da C michiganensis subsp michiganensis nachweislich l ngere Zeit auf Pflanzenablagerungen berleben kann Fatmi amp Schaad 2002 w re eine weitere Erkl rung dass die Bakterien in dem nekrotischen Gewebe weiter wachsen k nnen Antwortreaktionen wie zum Beispiel eine Ver nderung der Zellwand in benachbarten und noch nicht infizierten Pflanzenzellen k nnten jedoch die Ausbreitung der Bakterien verhindern Dadurch w rde es vermutlich erst zu einem sp teren Zeitpunkt zu einer Wachstumsinhibierung durch ein begrenztes N hrstoffangebot kommen C michiganensis subsp michiganensis k nnte au erdem in die hypersensitive Antwort der Pflanze eingreifen sodass zwar nekrotisches Gewebe gebildet wird andere Abwehrreaktionen wie zum Beispiel die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies aber eingeschr nkt werden Morel amp Dangl 1997 Eine weitere Erkl rung w re das auch schon in fr heren Publikationen beobachtete inkonsistente Auftreten einer hypersensitiven Antwort in Tabakbl ttern nach der Infektion mit C michiganensis subsp michiganensis welche Temperatur abh ngig variierte Gitaitis 1990 Diskussion 114 Die in dieser Arbeit beobachtete Zunahme des Wachstums von C michiganensis subsp michiganensis sollte in weiterf hr
21. CMM_1342 leuD CMM_1345 gpsA CMM_1356 CMM_1367 rpsP CMM _1373 rpIS CMM_1383 rpsB CMM_1384 tsf CMM_1385 pyrH CMM _1386 frr CMM_1408 gatA CMM_1409 gatB CMM_1410 CMM_1463 tig 50S ribosomal protein L10 alpha glucoside ABC transporter substrate binding protein alpha glucoside ABC transporter permease component conserved hypothetical protein cystathionine beta synthase L ribulose 5 phosphate 4 epimerase L arabinose isomerase sugar ABC transporter substrate binding protein sugar ABC transporter ATPase aspartokinase malate quinone oxidoreductase penicillin binding protein DNA topoisomerase exonuclease III succinate dehydrogenase flavoprotein subunit ABC transporter substrate binding protein adenosine deaminase acetyl propionyl CoA carboxylase subunit acetyl propionyl CoA carboxylase beta chain adenosylhomocysteinase protein translocase subunit SecA alkyl hydroperoxide reductase acetolactate synthase acetolactate synthase small regulatory subunit ketol acid reductoisomerase D 3 phosphoglycerate dehydrogenase siderophore interacting protein homoserine dehydrogenase transcription termination factor peptide chain release factor 1 RF 1 ATP synthase A chain ATP synthase C chain ATP synthase subunit b F type ATPase subunit b ATP synthase delta chain ATP synthase subunit aloha F ATPase subunit alpha ATP synthase gamma chain F ATPase gamma subunit ATP synthase subunit b
22. CMM_2606 rpIX CMM_2252 CMM_0589 CMM_0560 sugar ABC transporter substrate binding protein peptidyl prolyl isomerase cell surface protein DNA binding protein branched chain amino acid ABC transporter permease protein extracellular serine protease extracellular serine protease conserved secreted protein putative glycosyl hydrolase containing sensor domain membrane metalloendopeptidase subfamily M23B cellulase extracellular serine protease family S1A secreted protein conserved secreted protein hemagglutinin hemolysin related protein possible cell surface protein endo 1 4 beta xylanase A hypothetical secreted protein D alanyl D alanine carboxypeptidase 50S ribosomal protein L29 anion ABC transporter substrate binding protein conserved secreted protein chorismate mutase ubiquinol cytochrome c reductase cytochrome c subunit extracellular serine protease aminodeoxychorismate lyase conserved secreted protein beta N acetylglucosaminidase 30S ribosomal protein S10 enolase conserved secreted protein serine protease family S1C conserved secreted protein glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase peptide ABC transporter substrate binding protein conserved secreted protein pectate lyase pectate lyase 50S ribosomal protein L3 30S ribosomal protein S8 cell division initiation protein putative general stress protein glucose 6 phosphate isomerase cell wall associated protein transaldolase hypotheti
23. Cmm100 C Cmm382 und D Cmm102pDM302Ppat 1gfp inkubiert Eine Chlorose der Bl tter war bei B C und D sichtbar Welke und Stangellasion bei C und D Alle Keimlinge die aus den bakteriell infizierten Samen hervorgingen zeigten eine Gelbf rbung Chlorose der Bl tter Abbildung 14 B D Die Pflanzen die aus den Cmm382 und Cmm102pDM302Ppat 1gfp infizierten Samen hervorgingen zeigten Welkesymptome und St ngell sion Abbildung 14 C und D Durch eine Infektion von Tomatenpflanzen mit dem plasmidfreien Stamm Cmm100 werden normalerweise keine Krankheitssymptome ausgel st Die Chlorose der Bl tter in den Keimlingen die aus Cmm100 infizierten Samen hervorgingen trat deshalb wahrscheinlich unabh ngig von der Infektion auf da auch bei MgCl behandelten Pflanzen eine leichte Chlorose zu erkennen war Abbildung 14 A Warum die Keimlinge der Cmm3832 infizierten Samen Welke und St ngell sion zeigten die Bakterien aber nicht in den Suspensionen nachgewiesen werden konnten die Bestandteile des Pflanzenembryos enthielten ist unklar Ob die Bakterien schon w hrend der Samenruhe in den Embryo gelangen konnten oder erst wenn die Keimwurzeln die Samenh lle durchbrochen hatte konnte nicht gekl rt werden Ein Eindringen des plasmidfreien Stammes Cmm100 von der Samenh lle in den Embryo konnte nicht gezeigt werden 4 4 Analyse von Virulenzfaktoren Bis jetzt wurden nur wenige Virulenzfaktoren in C michiganensis subsp michiganensis charakterisi
24. Die Isolierung extrazellul rer und zytoplasmatischer Proteine erfolgte durch eine Trichloressigs ure F llung Teilmenge In allen drei Replikaten identifizierte Proteine Medium Protein Art en in Teilmenge M9 extrazellul r 302 40 XMM extrazellular 204 49 M9 zytoplasmatisch 354 82 XMM zytoplasmatisch 578 91 Etwa 13 24 der isolierten Proteine wurden in allen Replikaten identifiziert Spalte Teilmenge Die extrazellularen Proteine die in allen drei Replikaten auftraten sind in Tabelle 10 aufgelistet Die identifizierten Proteine wurden in COG Gruppen clusters of orthologous groups COG eingeteilt Diese wurden das erste Mal von Tatusov und Kollegen eingef hrt um die Proteine in unterschiedlichsten Genomen phylogenetisch zu klassifizieren Tatusov et al 2000 Die Einteilung der Gene von Cmm382 in die entsprechenden COG Gruppen und deren Annotation wurde in dieser Arbeit von Fl gel und Kollegen bernommen Fl gel et al 2012 Ergebnisse 81 Tabelle 10 Mittels MALDI Tof MS identifizierte extrazellulare Proteine aus Cmm382 in M9 und XMM Medium Dargestellt ist eine Liste der extrazellul ren Proteine die in allen drei Replikaten identifiziert wurden Die entsprechenden Gene wurden in die COG Gruppen eingeteilt 29 Proteine wurden im Medien berstand von M9 und XMM Medium identifiziert 11 nur in M9 und 20 nur in XMM Medium PBS Penicillin Bindeprotein SBP Substrat Bindeprotein
25. Effektoren im pflanzlichen Zytoplasma in die Abwehrreaktion der Pflanze eingreifen Rietz amp Parker 2007 In dieser Arbeit wurde das Oberfl chenproteom des Wildtypstammes Cmm382 und des plasmidfreien Stammes Cmmi00 mittels 2D Polyacrylamid Gelelektrophorese untersucht Au erdem wurde das zytoplasmatische und das extrazellul re Proteom von Cmm382 analysiert wobei Minimalmedium M9 und Xylemsaft imitierendes Medium XMM als Wachstumsmedien verwendet wurden 4 4 2 1 Analyse der Oberfl chenproteine F r die Isolierung der Oberfl chenproteine aus Cmm382 und Cmm100 wurden die Bakterien wie in Abschnitt 3 2 3 beschrieben kultiviert Als Wachstumsmedium wurden 450 ml M9 Medium verwendet Die Isolierung der Oberfl chenproteine erfolgte mittels Phenolextraktion und Methanolf llung Watt et al 2005 F r die anschlie ende isoelektrische Fokussierung wurden je 30 ug Proteine eingesetzt die daraufhin gelelektrophoretisch aufgetrennt wurden Die isoelektrische Fokussierung erfolgte in einem pH Bereich zwischen 3 und 10 Das Experiment wurde drei Mal reproduziert wobei Abbildung 16 die Gele mit der besten Aufl sung der Proteine zeigt Ergebnisse 75 Abbildung 16 2D Gelelektrophorese des Oberfl chenproteoms von C michiganensis subsp michiganensis Die mittels Phenolextraktion und Methanolf llung isolierten Proteine des Wildtypstammes Cmm382 und des plasmidfreien Stammes Cmm100 wurden in einem pH Bereich zwischen 3 und 10 fokussiert
26. HIT family D 3 phosphoglycerate dehydrogenase oxidoreductase phosphoribosylformylglycinamidine cyclo ligase hypothetical protein ferrochelatase serine protease family S1B dihydroxyacetone kinase dihydrodipicolinate synthase glucose 6 P dehydrogenase effector peptidyl prolyl cis trans isomerase methionyl tRNA synthetase adenylosuccinate synthetase aspartate ammonia lyase putative translation factor nucleoside diphosphate sugar epimerase conserved hypothetical protein sugar ABC transporter substrate binding protein glutamyl tRNA Gin amidotransferase subunit A 30S ribosomal protein S12 1 2 111 3 V 2 1 2 IV 4 1 1 IV 7 1 2 IV 3 1 1 111 1 111 3 V 2 1 1 111 3 11 2 V 2 IV 4 111 3 1 1 V 2 IV 1 1 1 1 5 111 3 1 1 111 3 IV 1 1 1 1 6 111 3 V 1 1 1 111 3 V 1 1 2 1 2 1 1 V 2 1 4 111 3 1 5 V 1 V 1 1 1 V 1 1 2 V 1 1 3 V 2 1 5 IV 7 1 1 1 2 1 1 IV 4 111 3 1 3 1 2 111 3 1 1 V 2 IV 1 111 3 111 3 157 ODPDPPD OPDP PDOQOOPDPDPRODPPDRDP OOORrODODDODPDDPROLPrP PP DPLPDBD DD PPOODDORrPDP PR OOP AO Anhang Fortsetzung Tabelle 22 zytoplasmatisches Proteom von Cmm382 in XMM Medium 36 36 35 35 35 34 33 33 33 33 32 32 32 31 31 31 30 30 30 29 29 29 29 29 29 28 28 28 28 28 28 28 28 27 27 27 26 26 26 26 26 25 25 25 25 25 24 24 24 23 22 22 22 22 22 22 21 21 21 21 21 CMM_2605 rp E CMM_
27. IV 1 VA IV 1 IV 1 V 1 11 1 1 4 IV 1 1 1 IV 6 IV 1 IV 1 V 2 V 2 IV 3 IV 1 V 2 IV 1 IV 1 IV 1 V 2 V 1 V 2 IV 1 V 2 V 2 IV 1 V 2 IV 1 1 2 V 1 V 2 V 1 IV 5 V 2 IV 1 V 1 V 2 V 2 IV 5 1 1 VA IV 1 1 2 IV 1 V 2 1 4 IV 4 V 2 VA IV 5 1 5 IV 1 V 2 IV 1 Anhang 171 Fortsetzung Tabelle 25 H here Transkriptmengen in XMM Medium als in TBY Medium 2 4 2 4 2 4 2 4 2 3 2 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 0 2 0 2 0 2 0 Fe SSeS eS eS eS ST eS eS eS eS Eu S a A FE ml OOOOOOOOOONNNNNSNINNSNINNS0009000 0 0o O OW OOO CMM_1632 CMM_0246 CMM_0105 ramA CMM _0033 CMM_1425 CMM_1953 pCM2_0067 CMM_2533 CMM_0976 CMM_2547 sucD CMM_2081 CMM_0344 CMM_1828 CMM_2063 CMM_1791 CMM_2211 CMM_1612A CMM_0883 bglJ CMM_0522 CMM_1954 CMM_0897 pCM2_0040 CMM_2643 CMM_2924 CMM_1753 CMM_0132 CMM_2590 mtIF CMM_1601 wcmH CMM_2316 CMM 1533 CMM_2591 mtlA CMM_0872 cysB CMM_0342 CMM _0288 CMM_2521 folD CMM_0409 CMM_1320 rsrA CMM_1032 CMM_1430 treZ CMM_1236 CMM_1426 CMM_2005 gluC CMM_2020 CMM_0284 CMM_1313 CMM_0240 CMM_1562 CMM_ 2432 CMM_1468 dcpA CMM_1907 CMM_0741 CMM_2140 CMM_1398 CMM_1948 ppal CMM_0216 CMM_0043 pelAT CMM_2205 CMM_1268 CMM_1479 CMM_2212 CMM_0513 pgmA CMM_2057 CMM_1469 CMM_ 2324 conserved hypothetical protein hypothetical protein alpha rhamnosidase conserved
28. Phytopathology 102 1 23 31 Chan W C Coyle B J and Williams P 2004 Virulence regulation and quorum sensing in staphylococcal infections competitive AgrC antagonists as quorum sensing inhibitors Journal of medicinal chemistry 47 19 4633 4641 Literaturverzeichnis 131 Chan W L Yuo C Y Yang W K Hung S Y Chang Y S Chiu C C Yeh K T Huang H D and Chang J G 2013 Transcribed pseudogene wPPM1K generates endogenous siRNA to suppress oncogenic cell growth in hepatocellular carcinoma Nucleic Acids Res 41 6 3734 3747 Chang J Oikawa S Ichihara G Nanpei Y Hotta Y Yamada Y Tada Oikawa S Iwahashi H Kitagawa E Takeuchi I Yuda M and Ichihara S 2012 Altered gene and protein expression in liver of the obese spontaneously hypertensive NDmcr cp rat Nutr Metab Lond 9 1 87 Chang R J Ries S M and Pataky J K 1992 Effects of temperature plant age inoculum concentration and cultivar on the incubation period and severity of bacterial canker of tomato Plant Dis 76 1 1150 1155 Cohen S A and Michaud D P 1993 Synthesis of a fluorescent derivatizing reagent 6 aminoquinolyl N hydroxysuccinimidyl carbamate and its application for the analysis of hydrolysate amino acids via high performance liquid chromatography Anal Biochem 211 2 279 287 Czernic P Huang H C and Marco Y 1996 Characterization of hsr201 and hsr515 two tobacco
29. V 1 IV 5 1 5 V 2 IV 7 1 1 IV 1 1 1 VA IV 1 1 1 11 1 IV 1 IV 1 V 2 1 1 V 2 IV 7 1 5 IV 3 V 2 1 2 11 2 1 5 1 1 V 1 1 1 Anhang 196 Fortsetzung Tabelle 30 Transkriptmenge in XMM Medium AS niedriger als in XMM Medium 1 4 pCM2_PSEUDO_0004 pCM2_PSEUDO_0004 V 2 1 4 CMM_1107 lipoprotein putative V 2 1 3 CMM_1359 fpgA formamidopyrimidine DNA glycosylase 111 1 1 3 CMM_0465 hypothetical protein V 2 1 3 CMM_1462 membrane protein V 2 1 3 CMM_0702 acetyltransferase V1 1 3 CMM_0507 p A lipoate protein ligase A 1 5 1 3 CMM_2754 kdpD two component system sensor kinase IV 3 1 3 CMM_2955 glycosyl transferase 1 2 proline glycine betaine choline ABC transporter permease 1 3 CMM_1531 proZ component IV 1 1 3 CMM_1264 conserved hypothetical protein V 2 1 3 CMM_0046 hypothetical protein putative phage protein V 2 1 3 CMM_0865 transcriptional regulator Lac family IV 3 1 3 CMM_2866 conserved hypothetical protein putative hydrolase V 2 1 3 CMM_2590 milF PTS system mannitol specific IIA component IV 1 1 3 CMM _1288 sugar nucleotidyltransferase 11 2 1 3 CMM_0452 acetyltransferase V 1 1 3 CMM_0546 trkG potassium uptake protein Trk family IV 1 1 3 CMM_0288 oxidoreductase V 1 1 3 CMM_2084 pitB low affinity inorganic phosphate permease IV 1 1 3 CMM_0761 amino acid permease APC family IV 1 1 3 CMM_1174 transcriptional regulatory protein AsnC family IV 3 1 3 CMM_0904 mgoA malate quinone oxidoreductase 1 1 1 2 CM
30. hrmedien f r E coli und C michiganensis subsp michiganensis nnenenn 25 3 2 2 Kultivierungsbedingungen f r E coli useersnseensssnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn nenn 26 3 2 3 Kultivierungsbedingungen f r C michiganensis subsp michiganensis u 27 3 2 4 Infektion von Tomatenpflanzen sssrsnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn anna 27 3 2 4 1 Wurzelinfektion u 4444444nnnnnannnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnsnnnnnnnsnnennnnannnn 27 3 2 4 2 POtlOlUSINfEKtION szzs ciiebecceavecd sent ET bic ETA ATTS 28 B 2 4 3 Sameninfekti n 4 23 28 ai a Aaa 28 3 2 5 Infektion von Tabakpflanzen 444suernnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn 29 3 2 6 Isolierung des Xylemsaftes aus Tomatenpflanzen uu 2444sssrsnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn 29 3 3 Molekularbiologische Techniken 44444444400nnnnnnnnnennnennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnennn nn nnnn nenn 29 3 3 1 DNATTechnIKen 22 gg gr aa deat ln 29 3 3 1 1 Isolierung von Plasmid DNA aus E coli uuessnsesensnnnnnennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnennnnnenn 30 3 3 1 2 Isolierung chromosomaler DNA aus C michiganensis subsp michiganensis 30 3 3 1 3 Polymerase Kettenreaktion ieii iinan aanren Ea Eai 30 3 3 1 4 Restriktion von DNA Sereia aa A R a AT ES 32 3 3 1 5 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA ssssss
31. immobilized pH gradients Proteomics 2 2 127 134 Huang H C He S Y Bauer D W and Collmer A 1992 The Pseudomonas syringae pv syringae 61 hrpH product an envelope protein required for elicitation of the hypersensitive response in plants J Bacteriol 174 6878 6885 Innes R W Bent A F Kunkel B N Bisgrove S R and Staskawicz B J 1993 Molecular analysis of avirulence gene avrRpt2 and identification of a putative regulatory sequence common to all known Pseudomonas syringae avirulence genes J Bacteriol 175 15 4859 4869 Jacobs J M Babujee L Meng F Milling A and Allen C 2012 The in planta transcriptome of Ralstonia solanacearum conserved physiological and virulence strategies during bacterial wilt of tomato Am Soc Microbiol 3 4 e00114 12 Jahns T Zobel A Kleiner D and Kaltwasser H 1988 Evidence for carrier mediated energy dependent uptake of urea in some bacteria Arch Microbiol 149 5 377 383 Literaturverzeichnis 135 Jahr H Bahro R Burger A Ahlemeyer J and Eichenlaub R 1999 Interactions between Clavibacter michiganensis and its host plants Environ Microbiol 1 2 113 118 Jahr H Dreier J Meletzus D Bahro R and Eichenlaub R 2000 The endo beta 1 4 glucanase CelA of Clavibacter michiganensis subsp michiganensis is a pathogenicity determinant required for induction of bacterial wilt of tomato Mol Plant Microbe Interact 13 7 703 7
32. oder St ngelbereich oder ber kontaminiertes Saatgut in die Wirtspflanze Die Bakterien verbreiten sich anschlie end ber das Xylem sodass die Infektion systemisch ist und somit die gesamte Pflanze betrifft Eichenlaub amp Gartemann 2011 AN Abbildung 2 Wirtsspezifit t der C michiganensis Unterarten A C michiganensis subsp insidiosus verursacht Unterentwicklung in der Luzerne http www eppo in QUARANTINE listA2 htm B subsp nebraskensiss Braunfaule in Mais http www nafis go ke agriculture maize disease control C subsp tesselarius Pigmentflecken auf Weizenblattern http www agric wa gov au PC_93587 html D subsp sepedonicus Ringf ule in der Kartoffelknolle http www eppo int QUARANTINE listA2 htm und E subsp michiganensis Welke und Verletzungen des St ngelgewebes in Tomatenpflanzen diese Arbeit Einleitung 13 Neben der Welke verursacht die Unterart insidiosus Unterentwicklung in der Luzerne Medicago sativa McCulloch 1925 nebraskensis Braunf ule im Mais Zea mays Vidaver 1974 tesselarius Pigmentflecken auf Weizenbl ttern Triticum aestivum Carlson amp Vidaver 1982 sepedonicus l st Ringf ule in Kartoffelknollen Solanum tuberosum aus Manzer amp Genereux 1981 und die Unterart michiganensis verursacht Verletzungen des St ngelgewebes in Tomatenpflanzen Solanum Iycopersicum Strider 1969 Abbildung 2 A E Um landwirtschaftliche Sch den und eine gro fl chig
33. permease component IV 1 9 7 CMM_0273 trehalose utilization related protein 1 1 9 4 CMM_0790 sugar ABC transporter ATPase IV 1 9 2 CMM_2664 conserved hypothetical protein V 2 8 9 CMM_1262 sugar ABC transporter substrate binding protein IV 1 8 8 CMM_2108 sugar ABC transporter permease component IV 1 8 4 CMM_2107 sugar ABC transporter permease component IV 1 8 4 CMM _2908 gntP gluconate permease GntP family IV 1 7 2 CMM_0317 agaA alpha galactosidas 1 1 6 8 CMM_0616 conserved secreted protein V 2 6 8 CMM_0968 ptsA phosphoenolpyruvate protein phosphatase IV 1 6 8 CMM _0725 esterase VA 6 7 CMM_0879 sugar ABC transporter substrate binding protein IV 1 6 6 CMM_0112 dehydrogenase oxidoreductase V4 6 6 CMM_0035 dehydrogenase oxidoreductase V 1 6 5 CMM_0947 beta glycosidase 1 1 6 1 CMM_0553 sugar MFS permease IV 1 6 0 CMM _1314 iron ABC transporter substrate binding protein IV 1 6 0 CMM_0617 Ba secreted protein putative copper resistance V5 5 9 CMM_1587 oligopeptide ABC transporter substrate binding protein IV 1 5 9 CMM_1598 wcmG membrane bound acyltranferase 11 2 5 9 CMM_2782 sugar ABC transporter permease component IV 1 5 9 CMM _1081 hypothetical secreted protein V 2 5 8 CMM_2234 hypothetical protein V 2 5 7 CMM_0777 possibly involved in inositol metabolism 1 1 5 7 CMM 2204 conserved secreted protein putative glycosyl hydrolase v2 containing sensor domain 5 4 CMM_2184 peptide ABC transporter permease component IV 1 5 2 CMM_06
34. wurden in dieser Arbeit ver nderte Transkriptmengen ermittelt Eine Erkl rung hierf r w re dass schon Minimalmedium ausreicht um die Expression von Virulenzgenen zu ver ndern wie es auch schon von anderen Arbeitsgruppen beobachtet wurde Innes et al 1993 Fl gel et al 2012 Da jedoch in dieser Arbeit die Transkriptmengen von Virulenzgenen in M9 Medium nicht h her waren als in Vollmedium trifft diese Beobachtung f r C michiganensis subsp michiganensis wahrscheinlich eher nicht zu Die Ergebnisse aus den Transkriptom Analysen in dieser Arbeit deuten eher darauf hin dass in XMM Medium Bedingungen vorliegen wie sie in einem fr hen Stadium der Infektion im Xylemsaft vorkommen In diesem fr hen Stadium m ssen sich die Bakterien auf die n hrstoffarme Umgebung des Xylemsaftes einstellen um ein Wachstum und die Ausbreitung in der Pflanze zu erm glichen Dies wird durch eine erh hte Konzentration von Transportern gew hrleistet durch die Substanzen aus der Umgebung zur Verf gung stehen deren Konzentration sehr gering ist H n ler amp Burkovski 2008 Die Transkriptmengen einiger Regulatoren waren in dieser Arbeit in XMM Medium niedriger als in M9 Medium Die Regulatoren k nnten dabei als Repressoren oder Aktivatoren die Genexpression von Genen die in einem fr hen Stadium der Infektion wichtig sind ver ndern Eine verringerte Konzentration an Repressoren erm glicht die erh hte Expression von Genen weniger verf gbare Aktiv
35. 1 IV 5 IV 1 111 1 111 3 IV 1 111 1 IV 4 IV 1 IV 1 1 5 V 2 IV 4 VA V 1 1 4 IV 5 1 5 111 3 IV 1 V 2 IV 1 V 1 V 2 111 3 1 4 1 5 IV 1 111 1 IV 3 V 2 111 3 V 1 111 3 IV 1 V 2 V 2 V3 111 3 v 2 111 3 IV 3 111 1 V 2 V 2 IV 3 Vi Anhang 174 Fortsetzung Tabelle 26 Niedrigere Transkriptmengen in XMM Medium als in TBY Medium 2 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 fr sy rss ss Eu Be l Eu Eu OOOOSOO O O O O O O O SOO O0 CMM_2906 CMM_0580 CMM_1095 ilvH CMM_1565 dnaJ2 CMM_2865 CMM_1693 CMM_1792 nusB CMM_2174 CMM_2833 CMM_0871 CMM_2244 greA CMM_1376 CMM_1409 gatB CMM_1408 gatA CMM_2976 CMM_2003 pheS CMM_1005 CMM_1750 uvrB CMM_2123 CMM_1771 hisE CMM_2142 CMM_0003 gndAT CMM_1109 trxB2 CMM_2087 CMM_2935 rpsN CMM_2551 uvrD7 CMM_2958 CMM_2078 CMM_2419 CMM_2542 CMM_1816 ruvC CMM_2956 CMM_1692 CMM_2480 CMM_1017 wcqG CMM_2223 CMM_1851 CMM_0383 ppcA CMM_2936 romG CMM_1374 lepB CMM_1307 CMM_1384 tsfA CMM_1506A CMM_1762 trpA CMM_2524 CMM_1097 CMM_0870 CMM_1161 rfeA CMM_2373 CMM_2328 CMM_2867 CMM_0869 CMM_2229 xseA CMM_0535 CMM_1019 wcq CMM_2933 CMM_0002 dnaN CMM_2866 CMM _2471 cspB CMM_0552 CMM_0087 CMM 1767 trpE1 transcriptional regul
36. 1025 1033 Kir ly Z El Zahaby H M and Klement Z 1997 Role of extracellular polysaccharide EPS slime of plant pathogenic bacteria in protecting cells to reactive oxygen species J Phytopathol 145 59 68 Kirchner O Gartemann K H Zellermann E M Eichenlaub R and Burger A 2001 A highly efficient transposon mutagenesis system for the tomato pathogen Clavibacter michiganensis subsp michiganensis Mol Plant Microbe Interact 14 11 1312 1318 Knoppov M Phensaijai M Vesel M Zemanov M Ne vera J and P tek M 2007 Plasmid vectors for testing in vivo promoter activities in Corynebacterium glutamicum and Rhodococcus erythropolis Curr Microbiol 55 3 234 239 K hler B Wegner L H Osipov V and Raschke K 2002 Loading of nitrate into the xylem apoplastic nitrate controls the voltage dependence of X QUAC the main anion conductance in xylem parenchyma cells of barley roots Plant J 30 2 133 142 Krasikov V Dekker H L Rep M and Takken F L 2011 The tomato xylem sap protein XSP10 is required for full susceptibility to Fusarium wilt disease J Exp Bot 62 3 963 973 Literaturverzeichnis 136 Laemmli U K 1970 Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature 227 5259 680 685 Lasa l Toledo Arana A Dobin A Villanueva M de los Mozos R Vergara Irigaray M Segura V Fagegaltier D Penad s J R
37. 11 2 IV 6 1 1 IV 3 V 2 148 _ eee m fe _ Tabelle 20 Mittels MALDI ToF MS identifizierte extrazellul re Proteine aus Cmm332 in dem synthetischen Medium XMM Dargestellt sind alle 160 Proteine die in einem oder mehreren der Replikate 1 2 oder 3 bei der Analyse des extrazellul ren Proteoms identifiziert wurden Die entsprechenden Gene wurden nach dem absteigenden Score Wert geordnet SBP substrat binding protein PBP penicillin binding protein Score 5 427 1 307 1 039 910 873 612 474 431 422 385 385 385 385 353 326 326 324 318 302 264 256 205 205 199 181 180 172 166 165 149 138 134 125 123 108 107 105 103 101 101 99 93 92 Gen Name CMM 11675 CMM_0338 CMM _0976 CMM 1557 CMM 1872 CMM_0866 CMM _1126 CMM_2536 sbtC CMM_0764 ppaF pCM2_0053 phpA pCM1_ 0023 ppav CMM_1948 ppal CMM_1947 ppah CMM_0840 CMM_0919 pbpD CMM_0915 pbpC CMM_0795 CMM_1921 CMM_1865 fts CMM_0839 CMM_2478 groEL CMM_0050 ppaB2 CMM_0042 ppaB71 CMM_1250 CMM _1842 ctaC CMM _2688 pCM2_0042 CMM_2185 CMM_2467 CMM_1611 cspAT CMM_2283 pCM2_0054 pat 1 CMM_1641 pknD CMM_ 2537 icdA CMM_2568 groES pCM2_0047 CMM_2535 sbtB CMM_2566 livk CMM_0245 CMM_2787 rpIK CMM_2006 gluB CMM_0144 CMM_0511 m gliche Funktion hypothetical secreted protein conserved secreted protein putative PBP ABC transporter substrate binding protein hypothet
38. 2 11 1 1 2 111 3 V 2 111 3 111 3 IV 6 IV 4 111 3 11 2 111 3 1 1 1 5 VA 1 1 1 3 IV 1 IV 1 111 3 1 3 1 3 111 3 1 1 1 1 V 2 V 2 1 2 IV 1 IV 7 1 2 1 2 111 3 V 2 111 3 1 5 111 3 1 1 V 2 IV 1 IV 3 1 3 111 3 1 1 1 3 V 2 1 1 IV 1 IV 5 1 1 1 2 1 1 1 2 158 A POVD ODOODD QOoQOPprpD RA MY WNHNMANAONNA ANH HWNHNAKRNWWHHHWOHWHWENWHHANAWO O _ Anhang Fortsetzung Tabelle 22 zytoplasmatisches Proteom von Cmm382 in XMM Medium 11 21 21 20 20 20 20 20 19 19 19 19 19 18 18 18 18 18 18 18 17 17 17 17 17 17 17 16 16 16 16 16 16 16 15 15 15 15 14 14 14 14 14 14 13 13 13 13 13 13 13 12 12 12 12 12 12 11 CMM_0962 CMM_1443 CMM_2152 CMM_2196 CMM_1764 CMM_1028 CMM_1617 CMM_2602 CMM_0289 CMM_1654 CMM_1459 rpiA CMM_1829 CMM_1998 argD CMM_1409 gatB CMM_1466 CMM_1356 CMM_2769 CMM_0983 addA CMM_1004 purE CMM_ 1096 ilvC CMM_2057 CMM_2870 CMM_2615 rplW CMM_ 1473 pckA CMM_2535 sbtB ribC nadE proS gcvh trpC galE71 acpP rpIR _ 2a ao _ CMM_1876 g kA CMM_1621 aceE CMM_1082 CMM_0727 CMM_1094 ilvB CMM_2009 rp T CMM_2606 rpIX CMM_0969 sdhB CMM_1783 carA CMM_1593 CMM_2900 CMM_2614 CMM_2000 argu CMM_2163 gabT CMM_1933 CMM_1336 metY CMM_0859 CMM 1250 CMM_0366 CMM_0882 xyIA CMM_1667 sseA CMM_19
39. 2013 RNA Seq revelation of the messengers Trends Plant Sci 18 4 175 179 Vera J Castro J Gonzalez A and Moenne A 2011 Seaweed polysaccharides and derived oligosaccharides stimulate defense responses and protection against pathogens in plants Mar Drugs 9 12 2514 2525 Vidaver A K 1974 Corynebacterium nebraskense a new orange pigmented phytopathogenic species Int J Syst Bacteriol 24 482 485 Wallis F M 1977 Ultrastructural histopathology of tomato plants infected with Corynebacterium michiganense Physiol Plant Pathol 11 333 342 Walter M 2002 Die parallele B Helix der Pektat Lyase aus Bacillus subtilis Stabilit t Faltungsmechanismus und Faltungsmutanten Dissertation Universit t Potsdam Walton J D 1994 Deconstructing the cell wall Plant Physiol 104 4 1113 1118 Watt S A Wilke A Patschkowski T and Niehaus K 2005 Comprehensive analysis of the extracellular proteins from Xanthomonas campestris pv campestris B100 Proteomics 5 1 153 167 Wei C F Hsu S T Deng W L Wen Y D and Huang H C 2012 Plant innate immunity induced by flagellin suppresses the hypersensitive response in non host plants elicited by Pseudomonas syringae pv averrhoi PLoS One 7 7 e41056 Wei K Tang D J He Y Q Feng J X Jiang B L Lu G T Chen B and Tang J L 2007 hpaR a putative marR family transcriptional regulator is positively controlled by H
40. 3 111 3 111 3 111 3 111 3 111 3 111 3 111 3 111 3 111 3 111 3 111 3 111 3 111 3 111 3 111 3 111 3 111 3 111 3 111 3 111 3 111 3 111 3 111 3 II 2 II 2 111 1 1 1 V 2 11 1 V 2 V 2 V 2 V 2 V 2 V 2 V 2 111 3 111 3 111 2 IV 2 1 5 11 1 11 1 V 2 V 2 111 3 111 3 111 3 1 3 111 1 111 3 IV 5 V 2 V 2 11 2 111 3 V 2 Anhang 210 Abkurzungsverzeichnis A APS BCIP BSA cfu COG CSPD Da DIG DMSO DNA dNTP dpi DTT EDTA EPS et al GFP HO gest H2Opiaest HR kbp kDa Ix MALDI ToF MS Adenin Ammoniumperoxodisulfat 5 Brom 4 Chlor 3 Indolylphosphat bovines Serumalbumin Cytosin Grad Celsius colony forming units cluster of orthologous groups Disodium 3 4 methoxyspiro 1 2 dioxetane 3 2 5 chloro tricyclo 3 3 1 1 Jdecan 4 yl phenyl phosphate Dalton Digoxigenin Dimethylsulfoxid Desoxyribonukleinsaure deoxyribonucleic acid Desoxynukleosidtriphosphat Tage days days post infection Dithiothreitol Ethylendiamintetraacetat extrazellul re Polysaccharide et alii Guanin Gramm Gr n fluoreszierendes Protein Stunde n destilliertes Wasser zweifach destilliertes Wasser hypersensitive Antwort hypersensitive response Kilobasenpaare Kilo Dalton Liter Lux Beleuchtungsst rke Matrix unterst tzte Laser Desorption lonisation Massenspektrometrie mit Flugzeitanalysator time of flight Anhang Mb NBT NCPPB NT NTR oDsgo0
41. 3 IV 2 V 2 V 2 V 2 1 2 V 2 1 2 IV 1 V 2 1 3 IV 3 111 3 IV 1 V 2 11 1 IV 1 1 2 V 2 IV 2 IV 1 11 2 1 3 1 4 V 2 1 5 rns Eu Eu Eu see eS Eu Eu Eu Eu eS Eu Eu eS eS u mu u Eu ee Ei Eu Eu Eu eS Eu Ure Ue PPPLPPLEPPLEPPLEPPLPPPLPPPPLPPLPPLPPEPPEPFPOITTOCTCTCTIAGTO A OAaa nannanananananqanian anAa DA D gt CMM_2798 CMM_2929 fecD2 CMM_0388 CMM_0097 bg D CMM_0328 CMM_0870 CMM_0324 CMM_1923 ggtA CMM_2371 gltAT CMM_2779 CMM_2708 CMM_2080 CMM_2389 CMM_1618 fabH CMM_2768 CMM_2296 CMM _1699 dnaJ3 CMM 1676 CMM _1686 tatC CMM 1314 CMM _2757 CMM 0065 CMM_0301 CMM 11553 thrA CMM _0646 CMM_0991 accA CMM 1168 atpG CMM 1301 CMM _0109 CMM 1830 g pF CMM _0638 CMM_1105 ilvE CMM_0127 sigX CMM_2106 CMM_2800 CMM_2088 CMM_0035 CMM_0363 CMM_ 2854 CMM_2788 nusG CMM_2930 fecC2 CMM_0220 CMM_0793 CMM_ 2422 CMM _1026 gcdH CMM_0077 CMM_2971 parB7 CMM _0700 CMM _1482 ileS CMM _0400 CMM _0658 CMM_2107 CMM_2780 CMM _1485 ndkA CMM_0154 hspR CMM 0637 CMM _1295 rphA CMM _1169 atpD CMM_1926 CMM 0633 CMM_2867 CMM 0355 bgaA CMM_2364 CMM_0244 membrane bound metalloendopeptidase family M23 iron siderophore ABC transporter permease component alkaline shock protein beta glucosidase glycosy hydrolase family 3 oxidoreductase methylase conserved hypothetical protein ABC transporter fused permease
42. 4 CMM _1733 ctaB protoheme IX farnesyltransferase heme O synthase 1 5 1 4 CMM_0206 3 hydroxyacyl Coenzyme A dehydrogenase 1 5 1 4 CMM_2388 conserved membrane protein V 2 1 4 CMM_1298 conserved membrane protein V 2 1 4 CMM 1549 Er membrane protein putatively involved in DNA V4 ABC transporter ATPase involved in cytochrome bd 1 4 CMM_1543 cydD biosynthesis IV 1 1 4 CMM_0669 hypothetical secreted protein V 2 1 4 CMM_0291 conserved membrane protein putative anti sigma factor IV 3 1 4 CMM_0825 wcoG cell surface protein 11 2 1 4 CMM_ 1963 clvG conserved membrane protein putative ABC transporter V4 permease component 1 4 CMM_1440 ornA oligoribonuclease 111 2 1 4 CMM_2933 conserved membrane protein putative copper export protein IV 1 1 4 CMM_0326 methyltransferase V 1 1 4 CMM_1476 oligopeptide ABC transporter permease component IV 1 1 4 CMM_0767 hypothetical secreted protein V 2 1 4 CMM_2754 kdpD two component system sensor kinase IV 3 1 4 CMM_0258 conserved secreted protein V 2 1 3 CMM_2095B hypothetical protein V 2 1 3 CMM_1962 clvE conserved membrane protein putative ABC transporter V4 permease component 1 3 CMM_1305 conserved hypothetical protein IV 2 1 3 CMM_0222 multidrug resistance membrane protein IV 1 1 3 CMM _1809 relA GTP pyrophosphokinase IV 3 1 3 CMM_1754 phosphotransferase system fructose specific IIA component IV 1 1 3 CMM _1329 conserved hypothetical protein V 2 1 3 CMM_2767 hypothetical membrane protein V 2 1
43. 50S ribosomal protein L7 L12 cationic amino acid permease APC family conserved membrane protein peptide ABC transporter substrate binding protein hydrolase conserved membrane protein glutamyl tRNA GIn amidotransferase subunit C glycerophosphory diester phosphodiesterase pantothenate kinase small conductance mechanosensitive channel DNA or RNA helicase phosphate transport system regulator hypothetical protein 50S ribosomal protein L10 duplicated acetyltransferase leucyl tRNA synthetase ABC transporter ATPase putative recombinase nuclease hypothetical membrane protein conserved hypothetical protein putative F420 dependent NADP reductase topoisomerase II subunit A UDP N acetylmuramyl tripeptide synthase ribonuclease H pyruvate kinase heat inducible transcriptional repressor beta glycosidase tmRNA SsrA binding protein UDP N acetylmuramate dehydrogenase glutamate synthase NADPH beta subunit UDP glucose 4 epimerase leucine responsive regulatory protein AsnC family phosphoglycerate mutase two component system sensor kinase tRNA pseudouridine synthase B conserved secreted protein putative carboxypeptidase or PBP RNA nucleotidyltransferase two component system sensor kinase ATP dependent DNA helicase conserved hypothetical protein putative hydrolase HAD family two component system response regulator alpha glucosidase glycosyl hydrolase family 13 ABC transporter fused permease and ATPase 1 2 IV
44. Boch amp Bonas 2001 ber T3SS und vermutlich noch andere Sekretionssysteme werden Effektoren transportiert Die Besonderheit dieser Sekretionssysteme besteht darin dass sie nicht nur die bakterielle Zellwand berbr cken sondern auch die pflanzliche Zellwand und Plasmamembran sodass die Effektoren direkt in das Zytoplasma der Pflanzenzelle gelangen B ttner amp Bonas 2010 Effektoren k nnen dabei zum Beispiel Phytohormone sein die in der Pflanze als Signalgeber fungieren Ihre Rolle in der Pathogenit t ist jedoch unklar Boch amp Bonas 2001 F r einige Avirulenzgene avr zum Beispiel in Xanthomonas Unterarten ist bekannt dass sie Krankheitssymptome in suszeptiblen Pflanzen ausl sen Boch amp Bonas 2001 hro Gene hypersensitive response hrp kodieren f r Proteine die bei der Ausbildung einer HR und bei der Pathogenit t des Bakteriums von Bedeutung sind Alfano amp Collmer 1997 Bonas et al 2000 B ttner amp Bonas 2010 Dabei werden hrp Gene nicht nur in vivo sondern auch in vitro in Minimalmedium mit Congo Rot oder in einem Apoplasten Medium XVM2 f r Xanthomonas verst rkt exprimiert Wengelnik et al 1996 Gu neron et al 2000 2 2 2 Virulenzfaktoren in Gram positiven Bakterien Als erstes Genom eines Gram positiven Phytopathogens wurde 2004 das Genom von Leifsonia xyli subsp xyli vollst ndig sequenziert Monteiro Vitorello et al 2004 Bis 2010 Einleitung 10 folgte die Vervollstandigu
45. CMM 1619 fabD CMM 2870 CMM_1318 aroA CMM_1621 aceE CMM_1997 argF CMM_2469 serC CMM_2244 greA CMM_2242 CMM_1946 CMM_1831 g pk CMM_2272 gndA2 CMM_0758 purM CMM_1933 CMM_2094 alcA CMM_0989 punA CMM_1670 CMM_0859 CMM_1884 CMM_2521 foID CMM_2790 aspC CMM_1396 CMM_2010 rpml CMM_1553 CMM_1443 nadE stress induced protein putative organic hydroper oxide resistance protein conserved hypothetical protein cell division protein 50S ribosomal protein L31 type B cystathionine beta synthase aldehyde dehydrogenase triosephosphate isomerase 2 keto acid dehydrogenase E1 beta component L alanine dehydrogenase GTP binding protein obg family putative NADPH dependent FMN reductase uroporphyrinogen decarboxylase 30S ribosomal protein S18 uridylate kinase nucleoside diphosphate sugar epimerase glutamine synthetase Il 30S ribosomal protein S4 50S ribosomal protein L19 UDP glucose 4 epimerase conserved hypothetical protein metallopeptidase family M20A adenylosuccinate synthetase inosine 5 monophosphate dehydrogenase 50S ribosomal protein L13 sugar phosphate isomerase epimerase putative acyl dehydratase thiosulfate sulfurtransferase ferrochelatase ATP synthase F ATPase gamma subunit putative Zn ribbon protein cold shock protein DNA polymerase III beta chain conserved hypothetical protein dTDP 4 dehydrorhamnose 3 5 epimerase dihydrolipoamide dehydrogenase GDP L fucose syntha
46. D Insgesamt traten somit Krankheitssymptome nach einer Infektion mit C michiganensis subsp michiganensis sehr inkonsistent auf was die Analyse der Wirt Pathogen Interaktion erschwert 4 3 2 Analyse der Samenbesiedelung in infizierten Tomatenpflanzen Zur Analyse der Fr chte und Samen infizierter Pflanzen wurde eine Petiolusinfektion durchgef hrt Vier Wochen alte Pflanzen wurden mit einer Cmm382 Suspension ODsgo 4 infiziert Nach 25 Tagen zeigten die Pflanzen erste Welkesymptome nach zwei Monaten waren die ersten Fr chte sichtbar Die f r eine Infektion mit C michiganensis subsp michiganensis typischen birds eyes waren jedoch nicht erkennbar Der St ngel der infizierten Pflanze verholzte im Laufe der Zeit Daten nicht gezeigt Aus den Fr chten wurden die Samen geerntet wobei ein Teil davon neu ausges t wurde um zu untersuchen ob Krankheitssymptome im Keimling auftraten 80 der Samen keimten die entstehenden Pflanzen zeigten jedoch keine Krankheitssymptome wie Welke St ngell sion oder ein verringertes Wachstum Ein anderer Teil der Samen wurde f r 2 h in 10 mM K PO Puffer bei 26 C inkubiert um Bakterien von der Samenoberfl che zu isolieren Anschlie end wurde die Suspension auf TBY Agar ausplattiert und mehrere Tage inkubiert Durch die unsterilen Samen waren die Platten jedoch kontaminiert und ein m gliches Bakterienwachstum konnte somit nicht ermittelt werden Um das Problem der Kontamination von isolierten Samen zu
47. DeoR family Antwortregulator PadR Familie Terminator Transkriptionsregulator Transkriptionsregulator Antiterminator Cro Cl Familie Globaler Repressor MerR Familie Antwortregulator Transkriptionsregulator TetR Familie Transkriptionsregulator RpiR Familie GntR Familie Antwortregulator Transkriptionsregulator Lacl Familie ArsR Familie TetR Familie TetR Familie IcIR Familie Antwortregulator Antwortregulator OmpR Familie LysR Familie TetR Familie TetR Familie MarR Familie Cro Cl Familie Antwortregulator Antwortregulator Transkriptionsregulator MarR Familie Lacl Familie MarR Familie Antwortregulator TetR Familie GntR Familie Aminotransferase Dom ne Transkriptionsregulator Lacl Familie Antwortregulator TetR Familie MarR Familie Lacl Familie MerR Familie Rok Familie TetR Familie DeoR family Lacl Familie GntR Familie p c p c p p p c p c p c p c p p p p c pe p c p p c p c p c X M amp x XXXDXXIXKZxX N xnxx 2 x N gt gt lt 9675 m x X gt lt de x 9 Z X 2 M x N xx ZD xx xxx xxx x ZX lt x 198 Anhang 199 7 6 RNA Sequenzierung des gesamten 5 Transkriptoms von Cmm382 in M9 und TBY Medium Nach der Kultivierung von Cmm382 in Minimalmedium wurde die RNA isoliert und eine Sequenzierung der 5 Enden im CeBiTec der Universit t Bielefeld durchgef hrt Durch die Analyse der stromaufw rts liegenden Regionen von 48 G
48. Fritsch E F and Maniatis T 1989 Molecular cloning a laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor N Y Literaturverzeichnis 139 Savidor A Teper D Gartemann K H Eichenlaub R Chalupowicz L Manulis Sasson S Barash I Tews H Mayer K Giannone R J Hettich R L and Sessa G 2012 The Clavibacter michiganensis subsp michiganensis tomato interactome reveals the perception of pathogen by the host and suggests mechanisms of infection J Proteom Res 11 2 736 750 Sch gger H and von Jagow G 1987 Tricine sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa Anal Biochem 166 368 379 Schjoerring J K Husted S M ck G and Mattsson M 2002 The regulation of ammonium translocation in plants J Exp Bot 53 370 883 890 Schmidtke C Findei S Sharma C M Kuhfu J Hoffmann S Vogel J Stadler P F and Bonas U 2012 Genome wide transcriptome analysis of the plant pathogen Xanthomonas identifies sRNAs with putative virulence functions Nucleic Acids Res 40 5 2020 2031 Schneider T Gerrits B Gassmann R Schmid E Gessner M O Richter A Battin T Eberl L and Riedel K 2010 Proteome analysis of fungal and bacterial involvement in leaf litter decomposition Proteomics 10 9 1819 1830 Schulte R and Bonas U 1992 A Xanthomonas pathogenicity loc
49. M CMM_1219 23 kDa TetR Familie p X CMM_1228 22 kDa Cro Cl Familie p X Anhang Fortsetzung Tabelle 31 putative Transkriptionsregulatoren von pat 1 und celA CMM_1242 CMM_1263 CMM_1271 CMM_1284 CMM_1331 CMM_1338 CMM_1449 CMM_1474 CMM_1479 CMM_1502 CMM_1573 CMM_1614 CMM_1620 CMM_1689 CMM_1746 whiA CMM_1757 CMM_1822 CMM_1847 nrdR CMM_1883 CMM_1887 dctR CMM_2018 lexA CMM_2132 CMM_2151 nusA CMM_2189 CMM_2199 CMM_2335 CMM_2345 CMM_2355 CMM_2357 CMM_2375 CMM_2385 CMM_2408 CMM_2475 CMM_2492 CMM_2501 ginR CMM_2525 CMM_2645 CMM_2677 CMM_2680 CMM_2747 CMM_2755 kdpE CMM_2766 CMM_2811 CMM_2829 CMM_2841 CMM_2867 CMM_2876 CMM_2894 CMM_2906 CMM_2969 pCM2_0056 CMM_0036 CMM_0091 regB CMM_0118 CMM_0140 CMM_0161 CMM_0257 CMM_0275 CMM_0301 CMM_0349 CMM_0358 CMM_0381 phnF 32 kDa 44 kDa 25 kDa 12 kDa 24 kDa 24 kDa 21 kDa 52 kDa 20 kDa 27 kDa 25 kDa 21 kDa 46 kDa 37 kDa 35 kDa 22 kDa 34 kDa 17 kDa 25 kDa 25 kDa 24 kDa 31 kDa 36 kDa 30 kDa 13 kDa 31 kDa 17 kDa 36 kDa 11 kDa 21 kDa 22 kDa 28 kDa 26 kDa 25 kDa 25 kDa 31 kDa 23 kDa 22 kDa 17 kDa 10 kDa 26 kDa 28 kDa 19 kDa 19 kDa 38 kDa 17 kDa 24 kDa 21 kDa 27 kDa 48 kDa 36 kDa 38 kDa 23 kDa 27 kDa 17 kDa 35 kDa 23 kDa 45 kDa 26 kDa 26 kDa 37 kDa 26 kDa Antwortregulator Rok Familie Antwortregulator Cro Cl Familie Antwortregulator TetR Familie MarR Familie Cro Cl Familie TetR Familie
50. M glichkeit um in die Pflanze zu gelangen ist die bertragung durch einen tierischen Vektor zum Beispiel ein Insekt Hogenhout amp Loria 2008 Eine Anpassung an die zum Teil limitierten Bedingungen in der Pflanze wurde im Laufe der Evolution beispielsweise durch eine Genomreduktion oder einen horizontalen Gentransfer erm glicht Hogenhout amp Loria 2008 Dadurch war es den Bakterien m glich im Blatt Palisaden und Schwammgewebe St ngel kortikales Parenchym und Xylem und Wurzelgewebe kortikales Parenchym Xylem und Phloem zu berleben Setubal et al 2005 Francis et al 2010 Die dortige Versorgung des Bakteriums mit N hrstoffen kann auf unterschiedliche Weise erfolgen Einige Bakterien wie zum Beispiel die Gattung Bacillus gehen mit der Wirts Pflanze eine Symbiose ein Francis et al 2010 Andere Bakterien sekretieren hydrolytische Enzyme die eine Lyse der Pflanzenzelle Einleitung 6 hervorrufen und dadurch f r ein besseres N hrstoffangebot sorgen Das Bakterium wird dabei als pathogen bezeichnet da es Sch den in der Pflanze hervorruft Kommt es bei dieser Wirt Pathogen Interaktion zur Ausbildung von Krankheitssymptomen ist die Pflanze anf llig suszeptibel und die Wirt Pathogen Interaktion kompatibel Pontier et al 1998 Wird eine pathogene Infektion verhindert ist die Pflanze resistent und die Wirt Pathogen Interaktion inkompatibel Pontier et al 1998 Wenn der Befall im pflanzlichen Wirt Krankheitssymp
51. Medium Die Transkriptmengen von 270 Genen waren in XMM Medium AS h her die von 198 Genen niedriger als in XMM Medium Dargestellt sind die COG Hauptgruppen sowie die COG Gruppe IV Ergebnisse 93 Die Gene die in XMM Medium AS im Vergleich mit XMM Medium die gr te nderung der Transkriptmenge zeigten sind in Tabelle 15 aufgef hrt Eine Liste aller Gene mit einer ver nderten Transkriptmenge befindet sich im Anhang 7 4 Tabelle 29 und Tabelle 30 Tabelle 15 Eine Auswahl der mittels Microarray identifizierten Cmm382 Gene deren Transkriptmengen in XMM Medium Acetosyringon AS h her oder niedriger waren als in XMM Medium Angegeben sind die COG Gruppen der Gene und die absolute nderung der Transkriptmenge fold change absolute FCA die f r niedrigere Transkriptmengen als negativer Wert angegeben ist a Gen Name FCA M gliche Funktion 1 1 CMM_1542 cydB 11 7 cytochrome bd type menaquinol oxidase subunit Il 1 1 CMM_0883 bglJ 18 3 cytochrome bd type menaquinol oxidase subunit I 1 2 CMM_2898 aldA 14 7 L alanine dehydrogenase IV 1 CMM_2771 13 3 multidrug ABC transporter permease component IV 1 CMM_0732 14 8 MFS permease IV 1 CMM_2772 19 0 multidrug ABC transporter ATPase IV 1 CMM_2878 25 6 citrate transporter CitMHS family V 2 CMM_1138 10 0 conserved hypothetical protein V 2 CMM_0235 10 7 conserved secreted protein putative bacteriocin V 2 CMM_1249 11 0 hypotheti
52. Medium entweder h her oder niedriger als im Vergleichsmedium F nf Gene deren Transkript mengen im Experiment zum Beispiel in XMM Medium h her waren als in M9 Medium waren im Experiment Il in XMM Medium niedriger als in TBY Medium 355 Gene wurden nur im Experiment identifiziert 271 Gene nur im Experiment II Abbildung 22 In Minimalmedium werden somit zum Teil andere Gene exprimiert als in Vollmedium Im direkten Vergleich des mRNA Levels in Minimal und Vollmedium wurden jedoch nur wenige putative Virulenzgene identifiziert deren Transkriptmengen in Minimalmedium um das Ergebnisse 92 h chstens 6 fache h her waren als in TBY Medium Daten nicht gezeigt Dazu geh rten zum Beispiel die Gene ppaC und chpF die f r Serinproteasen kodieren sowie die Gene pelA1 und pelA2 die f r Pektat Lyasen kodieren In dieser Arbeit wurde somit nicht beobachtet dass Minimalmedium ausreicht um eine deutliche Ver nderung der Transkript mengen wichtiger Virulenzgene in C michiganensis subsp michiganensis hervorzurufen 4 4 3 3 Vergleich synthetisches Medium XMM mit und ohne Acetosyringon In vorherigen Experimenten wurden nur f r wenige Virulenzfaktoren von C michiganensis subsp michiganensis ver nderte Transkriptmengen in XMM Medium festgestellt Eine Erkl rung hierf r k nnte sein dass die Zusammensetzung des XMM Mediums nicht ausreichte um einer ver nderte Genexpression auszul sen Der Zusatz bestimmter Substanzen zu dem Medi
53. Membran in 990 ul Detektionspuffer mit 10 ul CSPD Reagenz Roche Diagnostics Mannheim f r 15 min bei 37 C im Dunkeln inkubiert Die Lichtemission wurde daraufhin mittels Chemidoc XRS molekularer Imager Biorad M nchen f r 2 h detektiert Material und Methoden 35 1 x Blockierungsl sung 10 x Blockierungsl sung Roche Diagnostics Mannheim wurde kurz vor dem Gebrauch mit 1 x Maleins urepuffer auf 1 x Blockierungsl sung verd nnt 1 x Maleins urepuffer 0 1 M Maleins ure 0 15 M NaCl pH 7 5 Sterilisation durch Autoklavieren 1 x Waschpuffer 1 x Maleins urepuffer 0 3 v v Tween20 steril Detektionspuffer 0 1 M Tris 0 1 M NaCl pH 9 0 Sterilisation durch Autoklavieren TE Puffer 10 mM Tris 1 mM EDTA pH HCI 8 0 Sterilisation durch Autoklavieren 3 3 1 9 DNA Hybridisierung Southern Blot Zum Nachweis von Insertionsmutanten von C michiganensis subsp michiganensis wurden DNA Hybridisierungsexperimente durchgef hrt Dazu wurde das DIG High Prime DNA Labelling and Detection Starter Kit Roche Diagnostics Mannheim verwendet Zur spezifischen Detektion der DNA Fragmente wurde zun chst eine DNA Sonde hergestellt und diese auf ihre Effizienz hin getestet siehe Abschnitt 3 3 1 8 F r die Southern Blot Analyse wurden 4 ug chromosomale DNA von Cmm382 sowie m glicher Insertionsmutanten mit Hilfe von geeigneten Restriktionsenzymen NEB Schwalbach ber Nacht in einem Gesamtvolumen von 20 30 ul bei 37 C g
54. Puffer mit steigenden NaCl Konzentrationen von 100 900 mM in 100 mM Schritten hergestellt wurden Material und Methoden 48 3 4 5 SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese SDS PAGE Fur die gelelektrophoretische Auftrennung der Proteine wurden SDS Polyacrylamid Gele verwendet nach Laemmli 1970 Schagger amp von Jagow 1987 10 iges Trenngel mit Glycerin Schagger amp von Jagow 1987 Sammelgel 3 3 ml Acrylamid Bisacrylamid L sung 37 5 1 0 8 ml 4 5 ml Gelpuffer 2 6 ml 1 1 ml 50 iges v v Glycerin 4 2 ml H2O boest 4 2 ml 135 ul 10 iges w v APS 160 ul 15 ul TEMED 15 ul 12 5 iges Trenngel Laemmli 1970 Sammelgel 4 15 ml Acrylamid Bisacrylamid L sung 37 5 1 0 835 ml 2 6 ml Trenngelpuffer Sammelgelpuffer 1 25 ml 3 21 ml H2O biaest 2 87 ml 30 ul 10 iges w v APS 30 ul 15 ul TEMED 15 ul Die Proteinproben wurden mit 5 x Probenauftragspuffer versetzt bevor sie zur Denaturierung f r 5 min bei 95 C 10 ige Gele inkubiert wurden Folgte eine Analyse mittels MALDI ToF MS wurden l sliche Proteine f r 15 min bei 60 C und 900 rpm TS 100 Thermoshaker peqlab Biotechnologie GmbH Erlangen inkubiert und Oberfl chenproteine f r 30 min bei Raumtemperatur und 1 000 rpm TS 100 Thermoshaker peqlab Biotechnologie GmbH Erlangen Anschlie end erfolgte eine Gelelektrophorese Diese wurde in einem BlueVertical 101 Ger t Serva Electrophoresis GmbH Heidelberg bei einer anf nglichen Spannung von 50 V durchgef hrt Die
55. RNA polymerase promoter system for controlled exclusive expression of specific genes Proc Natl Acad Sci US A 82 4 1074 1078 Literaturverzeichnis 140 Tatusov R L Galperin M Y Natale D A and Koonin E V 2000 The COG database a tool for genome scale analysis of protein functions and evolution Nucleic Acids Res 28 1 33 36 Tews H 2012 Das Exoproteom von Clavibacter michiganensis subsp michiganensis und Untersuchung von Mutanten im Sec und Tat Sekretionssystem Dissertation Universitat Bielefeld Tischner R 2000 Nitrate uptake and reduction in higher and lower plants Plant Cell Environ 23 1005 1024 Tiwari A K Vishwakarma S K Kumar P Pandey N and Lal M 2012 Ratoon stunting disease Leifsonia xyli of sugarcane Plant Knowledge Journal 1 1 20 24 Tsiantos J 1987 Transmission of bacterium Corynebacterium michiganense pv michiganense by seeds J Phytopathol 119 142 146 Turk S C Melchers L S den Dulk Ras H Regensburg Tuink A J and Hooykaas P J 1991 Environmental conditions differentially affect vir gene induction in different Agrobacterium strains Role of the VirA sensor protein Plant Mol Biol 16 6 1051 1059 Turpin W Humblot C Noordine M L Thomas M and Guyot J P 2012 Lactobacillaceae and cell adhesion genomic and functional screening PLoS One 7 5 e38034 Van Verk M C Hickman R Pieterse C M J and Van Wees S C M
56. S2 DNA directed RNA polymerase subunit alpha DNA RNA binding protein polyribonucleotide nucleotidyltransferase UDP galactopyranose mutase aspartyl tRNA synthetase ATP synthase delta chain 50S ribosomal protein L5 glucose 6 P dehydrogenase effector conserved hypothetical protein 50S ribosomal protein L16 putatively involved in pyridoxine biosynthesis 3 isopropylmalate dehydrogenase F420 dependent NADP reductase conserved hypothetical protein cystathionine gamma synthase 50S ribosomal protein L23 aspartate semialdehyde dehydrogenase pyruvate 2 oxoglutarate dehydrogenase complex dihydrolipoamide acyltransferase E2 component serine protease family S1B 50S ribosomal protein L30 putative translation factor oxidoreductase endoribonuclease translation initiation inhibitor aspartyl glutamyl tRNA Asn Gin amidotransferase subunit B peptidyl prolyl cis trans isomerase oxidoreductase 1 1 11 1 111 3 IV 1 111 3 111 3 1 3 1 4 1 2 111 3 1 1 1 4 111 3 111 2 1 3 IV 5 1 2 1 6 1 2 111 3 1 1 111 3 1 4 111 3 IV 1 IV 4 V 2 1 1 V 2 111 3 IV 5 111 3 111 3 111 3 111 3 111 3 111 3 111 2 V 1 111 3 11 2 111 3 IV 1 111 3 1 1 V 2 111 3 1 5 1 2 V 1 V 2 1 2 111 3 1 2 1 1 IV 7 111 3 111 3 V 1 111 3 111 3 IV 4 V 1 Da Mon o D ana award 2202 20 00 Aa aa ad aa Da ADD AA Aa DD DI ADD DAAD an 152 Anhang Fortsetzung Tabelle 21 zytoplasmatisches Proteom von Cmm382 in M9 Mediu
57. SBP IV 1 be 93 CMM_1744 gapa W ne ee I Jar omeen umeherteehemperedietnse i si 45 CMM_1673 xysA endo 1 4 B xylanase A IV 6 u 23 CMM_0039 chpE serine protease family V6 21 CMM_1557 hypothetical secreted protein V 2 11 CMM_0608 conserved secreted protein V 2 30 Proteine wurden sowohl im Medien berstand einer M9 Kultur als auch in dem einer XMM Kultur identifiziert Tabelle 10 Davon konnten acht Proteine der COG Gruppe IV 6 extrazellul re Enzyme zugeordnet werden Au erdem wurden Substrat Bindeproteine und weitere sekretierte Proteine identifiziert Den h chsten Score Wert in XMM Medium erreichte mit etwa 5 400 Einheiten ein hypothetisches sekretiertes Protein CMM_1675 f r das in M9 Medium nur ein Score Wert von 1 000 gemessen wurde Es folgten mit etwa 1 000 Score Ergebnisse 83 Einheiten ein weiteres sekretiertes Protein CMM_0338 und das Substrat Binde Protein eines ABC Transporters CMM_0976 die beide in M9 Medium mit 11 300 und 3 500 wesentlich h here Werte erreichten als in XMM Medium Die Score Werte von Serin proteasen lagen in M9 Medium um mindestens das doppelte h her als in XMM Medium Zehn Proteine wurden nur im Medien berstand von M9 Medium und nicht in dem von XMM Medium identifiziert Dazu geh rten zum Beispiel PpaF und ChpE zwei Serinproteasen sowie XysA eine Xylanase 19 Proteine wurden nur im Medien berstand der XMM Kultur identifiziert darunter zwei Serinpro
58. Spannung wurde auf 120 V erh ht sobald die Proteine das Trenngel erreicht hatten Als Laufpuffer f r 10 ige Gele dienten Kathoden und Anodenpuffer f r 12 ige Gele wurde 1 x SDS Laufpuffer verwendet Zur Gr enbestimmung wurde ein Proteinmarker peqGOLD Protein Marker Il oder V peqlab Biotechnologie GmbH Erlangen mit auf das Gel aufgetragen Anschlie end wurden die Gele mit Coomassie Brilliant Blue gef rbt vgl Abschnitt 3 4 7 Gelpuffer 3 M Tris 1 M HCI 0 3 w v SDS Sterilisation durch Autoklavieren Material und Methoden 49 Trenngelpuffer 1 5 M Tris pH HCI 8 8 0 4 w v SDS Sterilisation durch Autoklavieren Sammelgelpuffer 0 5 M Tris pH HCI 6 8 0 4 w v SDS Sterilisation durch Autoklavieren 5 x Probenauftragspuffer 250 mM Tris 20 w v SDS 60 v v Glycerin 10 v v B Mercaptoethanol 0 01 w v Servablau G 250 pH HCl 6 8 Kathodenpuffer 0 2 M Tris 0 1 M Tricine 0 1 w v SDS Sterilisation durch Autoklavieren Anodenpuffer 0 2 M Tris pH HCl 8 9 Sterilisation durch Autoklavieren 1 x SDS Laufpuffer 50 mM Tris pH HCI 8 5 1 92 M Glycin 1 w v SDS 3 4 6 2D Polyacrylamid Gelelektrophorese 2D PAGE In der zweidimensionalen SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese werden die Proteine zuerst nach ihrem isoelektrischen Punkt aufgetrennt isoelektrische Fokussierung sodass sich die Proteine entlang eines pH Gradienten sammeln Nach einer Aquilibrierung bei der die Disu
59. Tabelle 18 Gene von C michiganensis subsp michiganensis deren Genprodukte in die Umgebung sekretiert werden identifiziert nicht beschrieben Diese Arbeit Savidor et al 2012 Tews 2012 Xylemsaft infizierter Gen Familie ini l Minimalmedium Pflanzen M9 Medium XMM Medium celA v v v v Serinproteasen Gene pat 1 ppaJ phpA phpB ppaA ppaB1 2 ppaC ppaD ppaE G ppaH ppal ew SN BLN HENNY we KIK NSN NTN NE RENN RLS NINES KT NE SI SIR SS NY HEN NESS KPNI NIE SI SI SI S SI SI NESS chpC Diskussion 121 GenFamiie 00 Tews 2012 Oylemsart itizierter Medium XMM Medium Pflanzen chpE v v v v chpF G x x x y Gene f r weitere extrazellul re Enzyme sbtA v x x v sbtB v v v x sbtC v v v v pelA1 2 v v x v expA v x v v xysA v v v v xysB x v x x pgaA v x v v CMM_0795 v v v CMM_0840 y v v Bei einem Vergleich der extrazellularen Proteine die in dieser Arbeit im Medientberstand einer XMM Kultur bzw von Savidor und Kollegen im Xylemsaft infizierter Pflanzen identifiziert wurden gab es einige Unterschiede Savidor et al 2012 Tabelle 18 Der Xylemsaft wurde acht Tage nach der Infektion aus Pflanzen isoliert wobei die Bakteriendichte etwa 10 cfu g betrug und keine oder lediglich leichte Krankheitssymptome an der Pflanze zu erkennen waren Savid
60. Zu Beginn dieser Arbeit wurde das Wachstumsverhalten von C michiganensis subsp michiganensis in vitro unter den gegebenen Laborbedingungen getestet Als Wildtypstamm wurde der Stamm NCPPB382 verwendet der im weiteren Verlauf mit Cmm382 abgek rzt wird Das Wachstum von Cmm382 wurde im Sch ttelkolben ber einen Zeitraum von 53 h analysiert Daf r wurden 50 mi Vollmedium TBY bzw Minimalmedium M9 mit einer Cmm382 bernacht Kultur auf eine optische Dichte von 0 1 bei 580 nm oDsg0 angeimpft Die oDsgo wurde alle 2 4 h gemessen Abbildung 6 In TBY Medium wurde nach 28 h mit 3 95 die End oD erreicht in M9 Medium nach 53 h oD580 1 33 Die Generationszeiten betrugen in TBY Medium 2 9 h 0 2 h und in M9 Medium 12 28 h 0 6 h Eine oDs5so von 0 1 entspricht etwa einer Bakteriendichte von 10 cfu ml colony forming units cfu Engemann 2006 In TBY Medium wurde dementsprechend eine Dichte von 3 95 x 10 cfu ml erreicht in M9 Medium eine von 1 33 x 10 cfu ml Die h chste Bakteriendichte die in der Pflanze neun Tage nach der Infektion mit C michiganensis subsp michiganensis erreicht wird betr gt 1 x 10 cfu ml Meletzus et al 1993 Ergebnisse 58 Wachstum in vitro 10 Abbildung 6 Wachstum von Cmm38 in Voll TBY und Minimalmedium M9 In TBY Medium schwarze Dreiecke wurde nach 28 h mit 3 95 die End oD s erreicht Die Generationszeit betrug 2 9h 0 2 h Die End oDsgo in M9 Medium graue Rauten betrug 1 33 und
61. alle Nukleotide au er Thymin und gro e Buchstaben f r h her konservierte Nukleotide Die beiden konservierten Guanine die in dieser Arbeit in 73 der Promotorregionen identifiziert worden waren wurden ebenfalls in den Promotorregionen von pat 1 Dreier et al 1997 celA Jahr et al 2000 und ginA1 nachgewiesen Die Konsensussequenz der 10 Region entspricht nach der Analyse der 48 Promotorregionen der Sequenz TAnnnT Diese Sequenz stimmt mit der 10 Region von pat 1 Dreier et al 1997 und g InAT berein Au erdem entspricht sie der f r G C reiche Organismen ermittelten 10 Region TAnnnT die im Gegensatz zur typischen 10 Region von A T reichen Organismen wie E coli nicht nur aus Adenin und Thymin bestehen muss Zheng et al 2011 Der in dieser Arbeit ermittelte Prozentsatz an leaderless Transkripten liegt mit etwa 8 5 weit unter dem f r Actinobacteria Genome errechneten Durchschnitt von 19 2 Zheng et al 2011 Die Anzahl der leaderless Transkripte wurde in dieser Arbeit jedoch lediglich manuell bestimmt Dadurch wurden vermutlich zum einen eaderless Transkripte bersehen zum anderen wurden f r einige Gene mittels RNA Sequenzierung keine Transkripte identifiziert Diese Gene wurden vermutlich unter den gegebenen Bedingungen nicht exprimiert Des Weiteren wurden bei der Analyse der eaderless Transkripte die Gene nicht ber cksichtigt die einen Anstieg der Transkriptmenge im offenen Leserahmen zeigten In X campe
62. aroA CMM_2898 aldA CMM_1458 CMM_0629 CMM_1616 fabF CMM_1167 atpA CMM_2599 rp O CMM_0010 ppiA CMM_2611 rpsC CMM_1848 hisD CMM_1489 rplU CMM_ 2312 moaB CMM_0151 dnak CMM_2604 rpsh CMM_0860 rplJ CMM_1112 CMM_0034 CMM_2583 rp Q CMM_0989 punA CMM_1819 CMM_1465 clpP2 CMM_0841 ipyA CMM_2006 gluB CMM_1135 CMM_1745 sodA CMM_0921 CMM_1461 dpsA CMM_ 2584 rpoA CMM_0731 CMM_0521 CMM _0003 gndA71 CMM_1642 IpdB CMM_2446 galU CMM_2233 fumC CMM_2001 argC CMM_ 2617 rp C elongation factor Tu EF Tu succinyl CoA ligase ADP forming subunit alpha GDP mannose 4 6 dehydratase putative phosphomutase lyase glycerol kinase serine hydroxymethyltransferase sugar ABC transporter substrate binding protein fructose bisphosphate aldolase 2 3 bisphosphoglycerate dependent phosphoglycerate mutase phosphoglyceromutase cell division initiation protein pyruvate 2 oxoglutarate dehydrogenase complex dihydrolipoamide acyltransferase E2 component aspartate semialdehyde dehydrogenase response regulator involved in antitermination alpha glucoside ABC transporter SBP Catalase phosphoglycerate kinase metallopeptidase family M20A glutamine synthetase succinyl CoA ligase ADP forming subunit beta oxidoreductase ATP synthase delta chain thioredoxin reductase ATP synthase subunit beta F ATPase subunit beta 50S ribosomal protein L7 L12 malonyl CoA acyl carrier protein transacyl
63. bei 68 C in 0 2 x SSC 0 1 w v SDS Alle weiteren Schritte wurden bei Raumtemperatur auf der Wippe GFL mbH Burgwedel durchgef hrt Einem dreimin tigen Waschschritt folgte die Blockierung f r eine Stunde in 1 x Blockierungsl sung Die weitere Durchf hrung erfolgte analog zum Sondentest siehe Abschnitt 3 3 1 8 Depurinierungsl sung 0 25 M HCI Sterilisation durch Autoklavieren Denaturierungsl sung 1 5 M NaCl 0 5 M NaOH Sterilisation durch Autoklavieren Neutralisierungsl sung 1 5 M NaCl 0 5 M Tris pH HCI 7 5 Sterilisation durch Autoklavieren 20 x SSC 3 M NaCl 0 3 M Tri Natriumcitrat pH 7 Sterilisation durch Autoklavieren 2 x SSC 0 1 w v SDS 20 x SSC mit H2Opidest 1 10 verd nnt Sterilisation durch Autoklavieren 0 1 w v SDS 0 2 x SSC 0 1 w v SDS 20 x SSC mit H2Opidest 1 100 verd nnt Sterilisation durch Autoklavieren 0 1 w v SDS 1 x Blockierungsl sung 10 x Blockierungsl sung Roche Diagnostics Mannheim wurde kurz vor dem Gebrauch mit 1 x Maleins urepuffer auf 1 x Blockierungsl sung verd nnt 1 x Maleins urepuffer 0 1 M Maleins ure 0 15 M NaCl pH NaOH 7 5 Sterilisation durch Autoklavieren Material und Methoden 37 3 3 2 RNA Techniken 3 3 2 1 RNA Isolierung aus C michiganensis subsp michiganensis Zur Isolierung von Gesamt RNA wurden C michiganensis subsp michiganensis wie beschrieben kultiviert siehe Abschnitt 3 2 3 Die gesamte Kultur wurde zentrifugi
64. berstand der Cmm382 Kultur konnten nach der F llung mit 40 w v Ammoniumsulfat zwei Fragmente detektiert werden die Cellulaseaktivit t zeigten Abbildung 19 A Spur 2 nach der F llung mit 60 w v Ammoniumsulfat war ein Cellulase Fragment sichtbar Trotz der eingesetzten hohen Menge an Proteinen war die detektierbare Cellulaseaktivit t sehr schwach Aufgrund des kaum erkennbaren Proteinmarkers konnte die Gr e der Cellulase nicht ermittelt werden Ergebnisse 79 Abbildung 19 Zymographie der extrazellularen Proteine von Cmm382 und Cmm100 zur Analyse der Cellulase und Proteaseaktivitat Die Proteine wurden aus den Medien berst nden einer Cmm100 Kultur mit 40 w v Spur 1 und 60 w v Ammoniumsulfat Spur 3 isoliert sowie aus einer Cmm382 Kultur mit 40 w v Spur 2 und 60 w v Ammoniumsulfat Spur 4 A Nach der SDS Gelelektrophorese wurden die Gele mit einer 0 5 ige w v Congorot L sung gef rbt und mittels Coomassie Brilliant Blue gegengef rbt woraufhin die Cellulaseaktivit t als helle Bande gegen einen blauen Hintergrund zu erkennen war B Nach der SDS Gelelektrophorese wurden die Gele mit 1 M NaOH gef rbt Die Proteaseaktivit t war als helle Bande gegen einen gelbfarbenen Hintergrund zu erkennen Die Pfeile markieren die schwach sichtbaren Cellulase und Proteaseaktivit ten Das Experiment wurde drei Mal wiederholt wobei entweder der Proteinmarker oder die Cellulaseaktivit t nur sehr schwach oder gar nic
65. com Roots and Stems B L ngsschnitt eines spiralen Xylemgef es nach der Infektion mit C michiganensis subsp michiganensis Rasterelektronenmikroskop Bild Jahr et al 1999 Im sp teren Verlauf der Infektion werden pflanzliche Zellen zerst rt sodass die Lokalisation der Bakterien nicht mehr ausschlie lich auf das n hrstoffarme Xylem beschr nkt ist und somit die N hrstoffverf gbarkeit zunimmt Wallis 1977 Erste Krankheitssymptome nach einer Infektion mit C michiganensis subsp michiganensis sind eine einseitige Blattwelke und leichte L sionen des St ngels Abbildung 5 A und B Im weiteren Verlauf der Infektion zeigen fast alle Bl tter der Pflanze Welkesymptome Abbildung 5 C und die L sionen des St ngels werden gro fl chiger und brechen auf Abbildung 5 E Abbildung 5 Krankheitssymptome von Cmm382 infizierten Tomatenpflanzen Fr hzeitige Symptome nach einer Infektion mit Cmm382 sind die einseitige Blattwelke A und leichte St ngell sionen B Im sp teren Stadium der Infektion kommt es zu einer kompletten Blattwelke C Dazu im Vergleich eine gesunde Pflanze ohne Welkesymptome D Neben der Welke kommt es zu gro fl chigen Verletzungen des St ngelgewebes E Einleitung 17 Erfolgt die Infektion in einem fr hen Stadium des Pflanzenwachstums so ist die Infektion meist letal f r die Pflanze Wird die Pflanze in einem sp ten Wachstumsstadium infiziert oder die Krankheitssymptome treten aufgrund der
66. dehydrogenase decarboxylating methylenetetrahydrofolate dehydrogenase methenyltetrahydrofolate cyclohydrolase oxidoreductase nucleoside diphosphate sugar epimerase uracil phosphoribosyltransferase sugar ABC transporter ATPase sugar ABC transporter substrate binding protein 50S ribosomal protein L9 uridylate kinase inosine monophosphate dehydrogenase 50S ribosomal protein L22 aldose 1 epimerase citrate synthase conserved hypothetical protein putative phospholipid binding protein cystathionine beta synthase phosphoenolpyruvate protein phosphatase metallopeptidase family M20A aspartate aminotransferase ornithine carbamoyltransferase 30S ribosomal protein S13 putative amidohydrolase 30S ribosomal protein S4 S adenosylmethionine synthetase glutamyl tRNA GIn amidotransferase subunit C glycosidase conserved hypothetical protein PTS system mannitol specific IIA component putative Zn ribbon protein GMP synthase 50S ribosomal protein L4 beta glucosidase ribose phosphate pyrophosphokinase conserved hypothetical protein 2 keto acid dehydrogenase E1 beta component oligopeptide ABC transporter SBP DNA binding ferritin like protein succinate semialdehyde dehydrogenase aminotransferase polyphosphate glucokinase ROK family phosphoribosylformimino 5 aminoimidazole carboxamide riboucleotide isomerase chorismate synthase 5 enolpyruvylshikimate 3 phosphate phospholyase 111 3 11 2 1 6 111 3 V 2 111 3 1 1 11
67. die Bakterien aus den Bl ttern zu isolieren Je 100 ul einer 1 1 000 Verd nnung wurden auf M9 Medium Platten ausgestrichen und f r zwei bis vier Tage bei 28 C inkubiert Aus der Kolonienzahl wurde die cfu mg Blattmaterial bestimmt Abbildung 10 A Der Bakterientiter in Tabakbl ttern lag 0 24 und 72 h nach der Infektion jeweils bei etwa 1x 10 cfu mg bzw 2 x 10 cfu mg Blattmaterial Aufgrund der hohen Standardabweichung kann keine Aussage ber einen statistisch signifikanten Anstieg der Bakterienzahl getroffen werden Die hohen Standardabweichungen waren vor allem darauf zur ckzuf hren dass die Bakteriendichte kurz nach der Infektion 0 h in den drei Replikaten zum Teil um den Faktor 20 schwankte Daten nicht gezeigt Aus diesem Grund wurde eine weitere Auswertung der Daten durchgef hrt in dem die absolute Bakterienzahl kurz nach der Infektion 0 h auf 100 gesetzt wurde und alle anderen Werte auf diesen Wert bezogen wurden Abbildung Ergebnisse 64 10 B Es traten immer noch groBe Schwankungen auf tendenziell war jedoch ein Anstieg der Bakteriendichte bis 72 h nach der Infektion zu erkennen Aussagen ber einen statistisch signifikanten Anstieg konnten aber ebenfalls nicht getroffen werden A x 109 absolute Werte B in relative Werte 10 _ 4000 E 3500 4 ae 2 3000 E6 5 2500 T o 3 i g 2000 5 1500 4 E E 1000 Mi ye a E S 0 r T T 1 u Oh 24h 48h 72h Oh 24
68. diketo D gluconic acid reductase molybdate ABC transporter substrate binding protein mannose 1 phosphate guanylyltransferase hydrolase alpha beta hydrolase fold family sugar ABC transporter ATPase CMM_PS_22 enoyl CoA hydratase glycosyltransferase hypothetical protein conserved secreted protein conserved hypothetical protein putative sugar kinase sugar ABC transporter substrate binding protein transcriptional regulator involved in molybdate uptake acetyltransferase phosphoglucomutase sugar ABC transporter substrate binding protein membrane protein acetolacetate synthase conserved membrane protein conserved hypothetical protein putative phosphotransferase hypothetical secreted protein 164 V 2 V 1 V 2 V 2 IV 5 V 2 IV 1 V 1 V 1 V 2 1 1 1 1 V 1 IV 4 1 5 V 2 V 2 1 1 IV 1 V 2 IV 1 V 2 V 2 V 2 1 1 1 1 IV 1 V 2 IV 7 IV 3 IV 1 IV 4 IV 2 V 2 IV 5 11 2 1 1 1 2 V 2 1 2 IV 1 IV 3 IV 1 1 1 V 1 IV 1 V 2 1 4 11 2 V 2 V 2 1 1 IV 1 IV 3 V 1 1 1 IV 1 V 2 1 2 V 2 V 2 V 2 Anhang 165 Fortsetzung Tabelle 23 H here Transkriptmengen in XMM Medium als in M9 Medium 1 6 CMM_1180 conserved hypothetical protein V 2 1 6 CMM_0962 ribC riboflavin synthase alpha chain 1 5 1 6 CMM_1048 conserved membrane protein V 2 1 6 CMM_1434 ABC transporter permease component IV 1 1 6 CMM_0792 sugar ABC transporter substrate binding protein IV 1 1 5 CMM_0987 transcriptional regulator
69. einer Wahrscheinlichkeit von etwa 30 60 Ergebnisse 111 vertreten An der 6 Position waren alle vier Basen ungefahr gleich wahrscheinlich In der 10 Region war das T an der sechsten Position zu fast 100 konserviert T und A an der ersten und zweiten Position waren zu 80 90 konserviert An den Positionen 3 5 kamen die vier Basen etwa gleich wahrscheinlich vor Die 35 Region aus Abbildung 33 ist um ein Nukleotid l nger als die 35 Region von E coli Die Base Thymin an Position 7 scheint jedoch in C michiganensis subsp michiganensis mit etwa 50 iger Wahrscheinlichkeit dort vorzukommen weshalb sie in Abbildung 33 mit aufgef hrt wurde Die Base Guanin an Position 3 scheint ebenfalls zu etwa 50 konserviert zu sein Die Wahrscheinlichkeit f r die Base Adenin war an den Positionen 4 und 6 wesentlich h her als an den anderen Positionen An Position 2 und 4 6 sind jeweils drei der vier Basen etwa gleich wahrscheinlich Die Shine Dalgarno Sequenz in C michiganensis subsp michiganensis ist somit an den ersten vier Positionen konserviert bis hochkonserviert Die Basen an Position 1 2 und 6 der 10 Region sind ebenfalls zu 80 100 konserviert F r die 35 Region konnte kein konserviertes Motiv ermittelt werden Lediglich die 7 Position wurde in 50 der F lle mit der Base Thymin besetzt Zusammenfassend l sst sich sagen dass das Motiv der 35 Region in C michiganensis subsp michiganensis in den 48 analysierten Prom
70. eingef gt Nach der Elektroporation von Cmm382 mit pUC18cat der das Ergebnisse 97 entsprechende Zielfragment enthielt konnten Bakterien die den Vektor in das Genom integriert hatten auf TBY Platten mit Chloramphenicol selektiert werden Die korrekte Insertion der entsprechenden Plasmide in den Zielgen Leserahmen wurde mittels DNA Hybridisierung analysiert Eine graphische Darstellung der Lokalisation der Gene CMM_ 2408 CMM_2766 und pCM2_0056 im Genom des Wildtypstammes und der Mutantenstamme ist in Abbildung 25 dargestellt F r die Durchf hrung der DNA Hybridisierungsexperimente wurde eine 370 450 bp lange Sonde hergestellt welche an das 5 Ende der Zielgene und an einen Teil der 5 Region bindet Ein Sondentest bestatigte die Markierung der Sonden mittels Digoxigenin im Vergleich mit einer Digoxigenin markierten Kontroll DNA Abbildung 25 Die DNA Hybridisierung wurde mit der DNA des Wildtypstammes und der von f nf bis sechs m glichen Mutantenstammen durchgef hrt die auf TBY Platten eine Chloramphenicol Resistenz aufwiesen In Abbildung 25 ist das Wildtyp und das mutierte Gen dargestellt sowie die erwarteten DNA Fragmente in DNA Hybridisierungsexperimenten Die Mutantenst mme wurden EH2408 EH2766 und EH0056 bezeichnet F r die berpr fung der Insertion in CMM_2408 wurden Wildtyp und EH2408 DNA mit den Enzymen Bgill und Notl geschnitten Nach der Hybridisierung der spezifischen CMM_2408 Sonde schwarzer Balken Abbildung 2
71. einiger Gene Eine deutliche Regulation bekannter Virulenzgene fand jedoch nicht statt Die Transkriptmengen einiger Gene die f r Transkriptionsregulatoren kodieren waren jedoch in XMM Medium AS ver ndert Diese k nnten f r die Expressions Regulation putativer Virulenzgene wichtig sein 4 5 Charakterisierung und Analyse von Transkriptionsregulatoren Die Abh ngigkeit der Expression m glicher Virulenzgene von dem verwendeten Wachstumsmedium wurde in Transkriptomanalysen in dieser Arbeit gezeigt Bei der Interaktion des Bakteriums mit der Tomatenpflanze sind Transkriptionsregulatoren wichtig um auf ein Signal hin das Level der Genexpression zu ver ndern Das regulatorische Netzwerk das n tig ist um die Genexpression auf die Bedingungen im Xylemsaft umzustellen scheint sehr komplex zu sein Fl gel et al 2012 Fl gel und Kollegen konnten 108 Gene identifizieren die f r Regulatoren kodieren und bei Kontakt mit der Pflanze ein h heres oder niedrigeres Transkript Level zeigten als in dem Wachstum in vitro Fl gel et al 2012 Savidor und Kollegen best tigten mittels Proteomanalysen die wichtige Rolle von Transkriptionsregulatoren in der Wirt Pathogen Interaktion Savidor et al 2012 Die beiden am besten charakterisierten Virulenzfaktoren sind die Cellulase CelA Jahr et al 2000 und die Serinprotease Pat 1 Dreier et al 1997 Die Transkriptionsregulatoren f r pat 1 und celA wurden jedoch bis jetzt nicht untersucht In dieser A
72. genes preferentially expressed during the hypersensitive reaction provoked by phytopathogenic bacteria Plant Mol Biol 31 2 255 265 Davis M J Gillaspie A G Vidaver A K and Harris R W 1984 Clavibacter a new genus containing some phytopathogenic coryneform bacteria including Clavibacter xyli subsp xyli sp nov subsp nov and Clavibacter xyli subsp cynodontis subsp nov pathogens that cause ratoon stunting disease of sugarcane and Bermudagrass stunting disease Int J Syst Bacteriol 34 2 107 117 de Jong W Wosten H A Dijkhuizen L and Claessen D 2009 Attachment of Streptomyces coelicolor is mediated by amyloidal fimbriae that are anchored to the cell surface via cellulose Mol Microbiol 73 6 1128 1140 de Leon L Siverio F and Rodriguez A 2006 Detection of Clavibacter michiganensis subsp michiganensis in tomato seeds using immunomagnetic separation J Microbiol Meth 67 1 141 149 Devillard E Goodheart D B Karnati S K R Bayer E A Lamed R Miron J Nelson K E and Morrison M 2004 Ruminococcus albus 8 mutants defective in cellulose degradation are deficient in two processive endocellulases Cel48A and Cel9B both of which possess a novel modular architecture J Bacteriol 186 1 136 145 Dixon M 1952 A nomogram for ammonium sulphate solutions Biochem J 54 3 457 458 Dreier J Meletzus D and Eichenlaub R 1997 Characterization of the plasmid encode
73. iron sulfur subunit glycerol kinase ribonuclease 50S ribosomal protein L1 30S ribosomal protein S2 50S ribosomal protein L17 oxidoreductase ATP synthase subunit beta GDP L fucose synthase 50S ribosomal protein L5 dehydrogenase oxidoreductase dehydrogenase oxidoreductase Fe3 hydroxamate ABC transporter SBP 30S ribosomal protein S10 conserved hypothetical protein conserved hypothetical protein endoglucanase conserved secreted protein serine protease ATP dependent protein containing a PDZ domain family S16 50S ribosomal protein L6 proline glycine betaine choline ABC transporter SBP hypothetical secreted protein chaperone protein dnaK heat shock protein 70 peptide ABC transporter substrate binding protein oxidoreductase hypothetical secreted protein 30S ribosomal protein S3 ATP dependent protease ATPase subunit extracellular serine protease family S1A Chymotrypsin conserved membrane protein penicillin binding protein 50S ribosomal protein L3 carbamoyl phosphate synthase large chain trigger factor TF prolyl isomerase chaperone hypothetical secreted protein 50S ribosomal protein L14 50S ribosomal protein L29 50S ribosomal protein L31 type B glycine betaine ABC transporter SBP indole 3 glycerol phosphate synthase peptidyl prolyl isomerase transcriptional regulator LytR family phosphohexomutase 3 0xoacyl acyl carrier protein synthase serine threonine protein kinase eukaryotic type p
74. muss dem Medium jedoch neben Nicotins ure die Aminos ure Methionin zugegeben werden da keine Gene f r die Reduktion von Sulfat zur Verf gung stehen Gartemann et al 2008 Das Genom von C michiganensis subsp michiganensis enth lt acht Gene f r putative Bakteriocine F r drei der Genprodukte darunter Michiganin A konnte gezeigt werden dass sie wirkungsvoll das Wachstum des nahen Verwandten C michiganensis subsp sepedonicus inhibieren Holtsmark et al 2008 Eichenlaub amp Gartemann 2011 pCM1 pCM2 NCPPB382 Cmm382 Cmm100 Abbildung 3 Durch Plasmid Verlust entstehende C michiganensis subsp michiganensis St mme Durch Erh hung der Wachstumstemperatur von 25 28 C auf gt 30 C oder durch eine Elektroporation kann es zum einfachen Verlust Cmm101 und Cmmi02 oder zum doppelten Verlust Cmm100 der Plasmide kommen Cmm101 und Cmm102 verursachen verglichen mit dem Wildtypstamm Cmm882 geringere Krankheitssymptome in der Wirtspflanze Cmm100 kann die Pflanze nur noch kolonisieren l st jedoch keine Krankheitssymptome mehr aus Die Wachstumstemperatur f r C michiganensis subsp michiganensis liegt zwischen 25 C und 28 Durch Stressbedingungen wie zum Beispiel eine erh hte Wachstumstemperatur oder das Einbringen von Fremd DNA mittels Elektroporation kann es zum Verlust von pCM1 Einleitung 15 und oder pCM2 kommen Daraus resultieren die St mme Cmm101 und Cmm102 die entweder pCM1 oder pCM2 besitzen oder der
75. nach jedem der 45 Zyklen durch die Zunahme der Fluoreszenz bestimmt Der Farbstoff SYBR Green bindet nur an doppelstr ngige DNA und ist nur durch diese Bindung aktiv Der ermittelte C Wert beschreibt den PCR Zyklus bei dem die Fluoreszenz der Probe den Grenzwert der Hintergrundfluoreszenz erreicht Liegt der C Wert einer Probe drei Zyklen h her als bei einer anderen so war die Transkriptmenge um das 2 8 fache h her Neben einem Amplifikationsdiagramm wurde eine Schmelzkurve erstellt um die Reinheit und Spezifit t des PCR Produkts zu analysieren Zur Qualit tskontrolle wurde jeweils ein 25 ul Ansatz ohne RNA mitgef hrt Eine zus tzliche Analyse der RNA erfolgte mittels 4 iger w v Agarose Gelelektrophorese siehe Abschnitt 3 3 1 5 Dabei sollte nur in den Ans tzen mit RNA das PCR Produkt zu erkennen sein War die PCR nicht erfolgreich waren nur die Primer Dimere erkennbar Um die richtige RNA Menge einsetzen zu k nnen wurden zuerst Verd nnungsreihen mit absteigenden RNA Mengen von 100 0 01 ng in Zehnerschritten Material und Methoden 42 getestet F r jede Verd nnungsreihe wurde mit Hilfe der C Werte eine Standardkurve erstellt Aus der Steigung wurde anschlieBend die Effizienz der PCR ermittelt Bei einer Effizienz zwischen 96 und 108 5 standardmaBig 90 105 Real Time PCR Application Guide Biorad M nchen wurden die Primer f r weiterf hrende Experimente verwendet Mit jeder Probe wurden zwei Replikate durchgef hrt
76. of a tomatine by Botrytis cinerea Physiol Mol Plant Pathol 52 151 165 Ramdas L Coombes K R Baggerly K Abruzzo L Highsmith W E Krogmann T Hamilton S R and Zhang W 2001 Sources of nonlinearity in cDNA microarray expression measurements Genome Biol 2 11 research0047 1 research0047 7 Rehm H 2006 Der Experimentator Proteinbiochemie Proteomics pp 222 225 Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg Rellan Alvarez R Lopez Gomollon S Abadia J and Alvarez Fernandez A 2011 Development of a new high performance liquid chromatography electrospray ionization time of flight mass spectrometry method for the determination of low molecular mass organic acids in plant tissue extracts J Agr Food Chem 59 13 6864 6870 Rho H S Jeon J and Lee Y H 2009 Phospholipase C mediated calcium signalling is required for fungal development and pathogenicity in Magnaporthe oryzae Mol Plant Pathol 10 3 337 346 Rietz S and Parker J E 2007 Plant disease and defence Encyclopedia of Life Sciences John Wiley amp Sons Romano A H and Nickerson W J 1958 Utilization of amino acids as carbon sources by Streptomyces fradiae J Bacteriol 75 2 161 166 Ryan R P Vorh lter F J Potnis N Jones J B Van Sluys M A Bogdanove A J and Dow J M 2011 Pathogenomics of Xanthomonas understanding bacterium plant interactions Nat Rev Microbiol 9 5 344 355 Sambrook J
77. phoU CMM_0449 CMM_2699 CMM_0804 pipA CMM_0725 CMM_1626 CMM_0683 coaBC CMM_1624 CMM_0799 bldKB CMM_1486 CMM_0685 CMM_2081 CMM_1831 gIpK CMM_0058 CMM_1164 atpE CMM_1217 CMM_0147 CMM_1919 CMM_1413 CMM_0558 CMM_0619 putA CMM 2553 CMM_1152 IysA CMM_0165 fhuC CMM_2012 CMM_2135 CMM_2452 CMM_ 2621 fusA CMM_1166 atpH CMM_1527 CMM_2846 CMM_2892 CMM_0682 ilvG CMM_2453 CMM_0924 CMM_1504 fruA CMM_0830 CMM_0730 purS CMM_0034 CMM_0246 CMM_1633 panB metal ABC transporter substrate binding protein hydrolase transcriptional regulator conserved membrane protein putative pilus assembly protein shikimate 5 dehydrogenase sugar ABC transporter ATPase conserved hypothetical protein serine threonine protein kinase putative sugar phosphate isomerase epimerase phosphotransferase system phosphocarrier protein HPr extracellular 5 nucleotidase conserved membrane protein putative ribonuclease conserved hypothetical protein conserved hypothetical protein dehydrogenase 3 0xoacyl acyl carrier protein synthase dihydrolipoamide dehydrogenase E3 component hypothetical protein hypothetical protein dehydrogenase phosphate transport system regulator hypothetical protein sugar ABC transporter substrate binding protein prolyl aminopeptidase esterase metal ABC transporter ATPase pantothenate metabolism flavoprotein transcriptional regulator TetR family oligopeptide ABC tra
78. protein transcriptional regulator TetR family Xaa Pro aminopeptidase acetyltransferase glycoprotease fusion protein conserved hypothetical protein anthranilate synthase component 4 diphosphocytidyl 2 C methyl D erythritol kinase heme oxygenase decyclizing conserved hypothetical protein putative regulatory protein alanine racemase hypothetical membrane protein inositol 1 monophosphatase conserved hypothetical protein peptide chain release factor 1 RF 1 signal recognition particle component elongation factor G EF G tryptophan associated transmembrane protein hypothetical protein conserved hypothetical protein putative nuclease 50S ribosomal protein L1 conserved hypothetical protein rRNA methylase 167 Fortsetzung Tabelle 24 Niedrigere Transkriptmengen in XMM Medium als in M9 Medium 111 3 IV 5 V 1 11 2 V 2 IV 3 1 2 V 2 1 3 IV 1 11 2 IV 3 V 2 V 2 1 6 IV 3 1 2 IV 1 11 1 111 3 IV 3 IV 2 1 6 1 3 V 2 111 1 1 5 IV 3 11 1 111 3 V 2 111 3 11 1 1 2 V 1 V 2 IV 1 IV 3 11 2 IV 6 V 2 V 2 IV 3 1 2 V 1 IV 3 1 2 1 4 1 5 V 2 11 2 V 2 1 1 V 2 111 3 IV 2 111 3 1 2 V 2 V 2 111 3 V 2 111 3 Anhang 168 Fortsetzung Tabelle 24 Niedrigere Transkriptmengen in XMM Medium als in M9 Medium 1 4 CMM_0857 clpC ATP dependent protease ATPase subunit IV 4 1 4 CMM_1162 putative Atp subunit of ATP synthase IV 1 1 4 CMM_2143 membrane protein V 2 1 4 CMM_2646 conserved hypot
79. purine nucleoside phosphorylase dihydrolipoamide dehydrogenase acetyl propionyl CoA carboxylase subunit hypothetical membrane protein conserved hypothetical protein putative sugar translocase dTDP 4 dehydrorhamnose 3 5 epimerase conserved hypothetical protein transcriptional regulator TetR family conserved membrane protein two component system sensor kinase hypothetical protein L asparagine permease APC family glucose 6 phosphate 1 dehydrogenase sugar phosphate isomerase epimerase dihydroxy acid dehydratase conserved membrane protein V 2 V 2 1 4 V 2 1 5 V 1 1 1 1 2 111 3 V 1 1 2 V 2 111 3 111 1 1 1 111 1 1 5 1 5 1 1 111 1 1 1 V 2 IV 3 V 2 1 3 V 2 V 1 V 2 IV 5 IV 3 IV 1 1 3 IV 1 1 1 V 2 1 2 1 2 11 2 V 2 1 1 1 1 1 1 111 1 V 2 11 2 11 2 V 2 1 1 1 3 1 1 1 4 V 2 11 2 11 2 V 2 IV 3 V 2 IV 3 V 2 IV 1 1 1 1 1 1 2 V 2 202 Anhang Fortsetzung Tabelle 33 leaderless Transkripte der Gene im Genom von Cmm382 CMM_1106 CMM_1112 CMM_1113 CMM_1114 CMM_1118 CMM_1121 CMM_1127 CMM_1129 CMM_1135 CMM_1140 CMM_1150 argS CMM_1174 CMM_1178 dapE CMM_1182 tatB CMM_1187 CMM_1188 CMM_1191 CMM_1209 lipB CMM_1219 CMM_1220 CMM_1223 CMM_1225 CMM_1236 CMM_1239 CMM_1256 CMM_1283 CMM_1291 CMM_1294 mur CMM_1297 czcD CMM _1323 guaB CMM_1337 CMM_1371 mapA1 CMM_1376 CMM_1402 csdA CMM_1403 trmU CMM_1411 CMM_1433 CMM_1440 ornA CMM_1443 nadE CMM_1444 CM
80. re Proteine kodieren und eine ver nderte Transkriptmenge zeigten Daten nicht gezeigt Neben den drei Genen sbtB und xysB und CMM_0795 wurden keine weiteren Gene identifiziert deren Transkriptmengen in XMM Medium h her waren als in M9 Medium Es wurden jedoch vier Gene identifiziert deren mRNA Level in XMM Medium niedriger war als in M9 Medium Diese waren CMM_0053 chpC CMM_0070 sbtA CMM_0918 und CMM_ 2871 pgaA wobei die Transkriptmengen 3 6 3 1 1 5 und 5 2 fach niedriger waren Daten nicht gezeigt chpC und sbtA kodieren f r Serinproteasen CMM_0918 f r eine Phosphohydrolase und pgaA f r eine Polygalacturonase Ergebnisse 90 Die Transkriptmengen der meisten Gene die f r extrazellul re Proteine kodieren waren in XMM Medium im Vergleich zu M9 Medium nicht ver ndert Die Transkriptmengen einiger Avirulenzgene in P syringae waren in Minimalmedium mit einer Kohlenstoffquelle h her als in Vollmedium Innes et al 1993 Minimalmedium war in diesem Fall ausreichend um die Expression bestimmter Virulenzgene zu ver ndern In weiteren Microarray Experimenten wurden deshalb die Transkriptmengen in XMM Medium und in Vollmedium TBY verglichen um die Annahme zu berpr fen dass schon Minimalmedium ausreicht um Virulenzgene zu exprimieren 4 4 3 2 Vergleich synthetisches Medium XMM und Vollmedium TBY Bei einem Vergleich des mRNA Levels von Cmm382 Genen in XMM und TBY Medium waren die Transkriptmengen von 239 Genen
81. transcriptional termination antitermination factor hydrolase metallo beta lactamase superfamily sugar ABC transporter permease component C P carbon phosphorus lyase component rRNA methyltransferase ferredoxin glycerophosphory diester phosphodiesterase hydrolase riboflavin synthase alpha chain conserved hypothetical protein putative anti sigma factor acetyltransferase DNA gyrase subunit B kinase long chain fatty acid CoA ligase endoribonuclease translation initiation inhibitor transcriptional regulator GntR family conserved membrane protein ornithine carbamoyltransferase sugar ABC transporter substrate binding protein Fortsetzung Tabelle 28 Niedrigere Transkriptmengen in M9 Medium als in TBY Medium V 2 111 3 V 2 IV 3 111 1 11 2 V 2 V 2 V 2 V 1 1 1 V 2 1 2 V 2 V 2 111 3 V 1 11 2 V 2 V 2 1 1 V 2 IV 1 111 3 IV 1 IV 1 111 1 V 2 IV 3 111 3 V 2 1 6 IV 3 IV 1 1 2 V 2 V 2 111 1 V 2 V 2 V 2 V 2 V 2 V 1 11 2 IV 5 IV 1 1 6 111 3 1 1 1 4 V 1 1 5 IV 3 V 1 111 1 1 5 1 4 111 3 IV 3 V 2 1 2 IV 1 mh uch uch uch uch mh ch u u a ae W WHWWWWWWWWWWWWWWWWADAS Pp BPRPDRRRRRRRRARARRRDR REDD mh uch h ch mh ee _ uch uch kkk keh kh ONNONNMNNYMNNNNYONAAWWWAAWWWH DW WHOWWAWWAWHWWHWWHWHAAHNWAOaOWAhABL Anhang CMM_2731 CMM_0323 CMM_2800 CMM_1452 CMM_1103 CMM_2965 CMM_1327 CMM_1138 CMM_1178 dapE CMM_0775 CMM_1306 CMM_1671 CMM_2666 CMM_2194 CMM_1652 CMM_
82. transporter permease component conserved hypothetical protein sugar ABC transporter ATPase antimicrobial peptide ABC transporter permease component antimicrobial peptide ABC transporter ATPase putative two component system response regulator carboxylesterase type B conserved hypothetical protein glutamate ABC transporter substrate binding protein conserved hypothetical protein hypothetical protein branched chain amino acid ABC transporter permease protein hypothetical protein efflux MFS permease glycine dehydrogenase decarboxylating monooxygenase flavin dependent hypothetical protein oxidoreductase monooxygenase glyoxylase family protein hypothetical secreted protein phosphoenolpyruvate protein phosphotransferase PTS enzyme short chain oxidoreductase conserved hypothetical protein conserved hypothetical protein putative perforin thioredoxin beta glucosidase glycosyl hydrolase family 3 short chain dehydrogenase oxidoreductase sugar ABC transporter substrate binding protein cystathionine gamma synthase sugar ABC transporter substrate binding protein conserved membrane protein 3 0xoacyl acyl carrier protein synthase putative alkaline stress protein regulatory protein zinc finger hydrolase alpha beta hydrolase fold family lyase pantothenate metabolism flavoprotein glycerol kinase hypothetical secreted protein metal ABC transporter permease component IV 1 11 2 IV 3 1 4 V 2 IV 4
83. um anschlie end die relative Transkriptmenge des Zielgens im Verh ltnis zu einem Kontrollgen bestimmen zu k nnen wobei sich die Expression des Kontrollgens unter den gegebenen Testbedingungen nicht unterscheiden sollte Die Datenauswertung erfolgte mittels MyiQ Optical Software Biorad M nchen Die Analyse der Standardkurven erfolgte mit Hilfe der Anwendungen Gene Expression und Melt Curves die der Transkriptmengen mit Gene Expression Analysis Die relative Expressionsrate wurde gem Pfaffl bestimmt Pfaffl 2001 3 3 2 7 cDNA Microarrays F r die Analyse des gesamten Transkriptoms von C michiganensis subsp michiganensis wurden Microarray Chips Agilent Santa Clara verwendet F r jedes der 3 107 annotierten Gene von C michiganensis subsp michiganensis http cmr jcvi org wurden zwei spezifische Sonden 45 60 bp L nge mit der Software eArray hergestellt https earray chem agilent com wobei sowohl Gene des Chromosoms und der beiden nat rlichen Plasmide als auch Pseudogene ber cksichtigt wurden Ein Chip enthielt die Oligonukleotide der 3 107 Gene in achtfacher Ausf hrung F r jeden Vergleich wurde die Gesamt RNA siehe Abschnitt 3 3 2 1 aus zwei bis drei biologischen Replikaten und aus unterschiedlichen Medien verwendet Mittels Agilent RNA 6000 Nano Chip wurde auf einem Agilent 2100 BioAnalyzer nach Angaben des Herstellers Agilent RNA 6000 Nano Assay Protocol2 getestet ob die RNA intakt war Daraufhin
84. und Aufgeschlossenheit und die Bereitstellung deines Gartens Ein weiterer gro er Dank gilt meinen Freunden au erhalb der Arbeit die mich w hrend des Schreibens ertragen haben und f r Ablenkung gesorgt haben Hier ein besonderer Dank an Kristin Jule und Judith f r eine der besten Zeiten meines Lebens in der Villa Danke Manu f r den tollsten Bruder auf der Welt und Mama und Papa f r eure umfassende Unterst tzung Ohne so tolle Menschen wie euch w re das alles nicht m glich gewesen Ein riesengro es Dankesch n geht nat rlich an meinen Freund Frank F r die geduldige Korrektur dieser Arbeit das gemeinsame Erleben von Hoch und Tief Zeiten und f r viele beruhigende Worte Ich bin froh dass es dich gibt Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung 2 ca Ba 1 1ER SUNTAN ANY odie Sos ceca cca case esc esses ec eee cad cc sede edd E E steecotuadscahazgaceeedeed auace see 3 2 3EINICHUN GG 2 occas ee ae ace ee ran an ceas s su natany suackeussemsneerevaceatets 5 2 1 Pflanzen Bakterien Interaktion u 444ennnnnennnnnnnnnennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnennnnnnnnnnnnnnennnnnnnnn 5 2 1 1 Infektionsverlaufsn n ae rinnen 5 2 1 2 Evolutionsbedingte Anpassung von Pflanze und Bakterium 44444s 444 6 2 2 Virulenzfaktoren phytopathogener Bakterien 4uusrnnnnnennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnenn 8 2 2 1 Virulenzfaktoren in Gram negativen Bakterien urs00u
85. und anschlie end gelelektrophoretisch aufgetrennt Die Proteine sammelten sich in einem pH Bereich zwischen etwa 7 und 10 Die Oberflachenproteine von Cmm100 und Cmm382 sammelten sich in einem pH Bereich zwischen etwa 7 und 10 Das Proteinmuster war auf beiden Gelen vergleichbar Abbildung 16 Die Protein Spots waren auf dem Gel mit den Proteinen von Cmmi00 st rker ausgepr gt als auf dem Gel mit den Proteinen von Cmm382 Die Proteine aus einer Cmm100 Kultur lagen somit in einer h heren Konzentration vor weshalb zum Teil Protein Spots sichtbar waren die auf dem Gel mit den Proteinen aus einer Cmm382 Kultur nicht zu erkennen waren Aufgrund der h heren Proteinkonzentration kann daraus jedoch nicht geschlossen werden dass diese Proteine in Cmm100 aber nicht in Cmm882 auf der Oberfl che vorlagen Um eine bessere Auftrennung der einzelnen Proteine zu erhalten und m gliche Unterschiede zwischen dem Oberflachenproteom von Cmm382 und Cmm100 erkennen zu k nnen wurden erneut 2D Gelelektrophorese Experimente durchgef hrt Die Proteine wurden dieses Mal jedoch in einem pH Bereich zwischen 6 und 11 fokussiert In Abbildung 17 ist das Gel des Oberflachen Proteoms von Cmm382 dargestellt Ergebnisse 76 Abbildung 17 2D Gelelektrophorese des Oberflachenproteoms von Cmm382 Die mittels Phenolextraktion und Methanolfallung isolierten Proteine wurden in einem pH Bereich zwischen 6 und 11 fokussiert und anschlieBend gelelektrophoretisch aufgetrennt Di
86. waren W hrend der anschlie enden Inkubationszeit von 5 2 min wurde die L sung gesch ttelt und danach abgesaugt Die Samen wurden im Folgenden so lange mit HzObpidess gewaschen bis kein Sch umen mehr beobachtet wurde Das Trocknen der Samen erfolgte in einer Petrischale Greiner Bio One GmbH Frickenhausen auf sterilem Filterpapier Schleicher amp Schuell Dassel die Lagerung bei 4 C F r die Infektion wurden C michiganensis subsp michiganensis St mme wie in Abschnitt 3 2 3 beschrieben kultiviert zentrifugiert 5 400 x g 10 min 4 C und in 10 mM MgCl aufgenommen wobei eine oDsgq von 8 eingestellt wurde Die sterilen Samen wurden f r 15 min in der jeweiligen Bakteriensuspension inkubiert und anschlie end mit einem Abstand von etwa einem Zentimeter in ein Weckglas Weck GmbH und Co KG Wehr mit je 200 ml MS Agar MS Murashige Skooge Pflanzenn hrmedium Murashige amp Skoog 1962 ausgelegt Die Inkubation erfolgte im Lichtschrank Hell Dunkel Rhythmus 16 h 8 h 150yEinstein Lichtintensit t 21 C 19 C Nach sieben Tagen bzw vier Wochen wurden f nf Samen bzw zwei Keimlinge pro Stamm in Samenh lle Wurzel Hypocotyl und Blattknospe bzw Samen Wurzel St ngel Keimblatt und Blatt aufgeteilt und diese jeweils in 500 ul 10 mM K3PQ Puffer wenn n tig mit entsprechendem Antibiotikum Material und Methoden 29 uber Nacht bei 26 C und 500 rpm inkubiert 7S 100 Thermoshaker peqlab Biotechnologie GmbH Erlangen damit d
87. wurde Eine vollstandige Liste der identifizierten zytoplasmatischen Proteine mit dem entsprechenden Score Wert und der COG Gruppe befindet sich im Anhang siehe Abschnitt 0 Tabelle 21 und Tabelle 22 Tabelle 12 Mittels MALDI Tof MS identifizierte zytoplasmatische Proteine aus Cmm382 in M9 und XMM Medium Dargestellt sind die zytoplasmatischen Proteine die in allen drei Replikaten identifiziert wurden und deren Zuordnung zu den COG Gruppen COG Gruppen Kategorie M9 XMM I Metabolismus 25 40 1 1 Energie und Kohlenstoffwechsel 17 28 1 2 Aminosaurestoffwechsel 4 6 1 3 Nukleotidstoffwechsel 1 0 1 4 Lipidstoffwechsel 1 2 1 5 Stoffwechsel von Coenzymen und Vitaminen 1 3 1 6 Sekund rstoffwechsel 1 1 Il Zellulare Prozesse 3 3 11 1 Zellzyklus 0 1 11 2 Zellwand 3 2 II Informationsspeicherung und prozessierung 37 20 11 1 Replikation und Reparatur 1 0 111 2 Transkription 0 0 111 3 Translation 36 20 IV Potentiell relevant in der phytopathogenen 12 20 Interaktion IV 1 Transporter 2 9 IV 2 Proteintransport 0 0 IV 3 Regulatoren 0 0 IV 4 Stress 7 5 IV 5 Resistenz 2 3 Ergebnisse 85 COG Gruppen Kategorie M9 XMM IV 6 Extrazellul re Enzyme 0 0 IV 7 Intrazellulare Proteasen 1 3 V Unzureichend charakterisiert 5 8 V 1 Allgemeine Funktion vorhersagbar 3 5 V 2 Unbekannte Funktion 2 3 Summe 82 91 Die meisten der identifizierten Proteine sind am Energie und Kohlenstoffmetabolismus
88. 0 CMM_0097 bg D CMM_1180 CMM_0729 purQ CMM_0757 purF CMM_2747 CMM_2492 CMM_1003 purk CMM_0413 CMM_2780 CMM_2515 CMM_2506 pstC CMM_1070 CMM_1054 secA CMM_0853 panC CMM_0795 CMM_PS_22 CMM _2494 phoU CMM_0946 CMM_0545 trkA CMM_2865 CMM_1693 CMM_0532 panD CMM_1015 wcgE CMM_2380 prpD CMM_1979 CMM_1720 serB2 CMM_1704 CMM_1203 CMM_0393 CMM_2520 CMM_1676 CMM_1387 cdsA CMM_2381 CMM_1838 CMM_2899 CMM_2791 murB CMM_1330 pCM2_0033 parA CMM_1550 holA CMM_1844 CMM_0026 CMM_2677 CMM_1014 wcgD CMM_0965 trpS CMM_1560 CMM 2003 pheS CMM _2413 CMM _1097 CMM _2591 mtlA CMM 2015 hisH CMM _0803 bldKE acetyltransferase threonine dehydratase dTDP 4 dehydrorhamnose 3 5 epimerase peptidyl tRNA hydrolase alanyl tRNA synthetase ABC transporter substrate binding protein RNA methyltransferase transcriptional regulator GntR family aminopeptidase M18 family adenylosuccinate lyase aconitate hydratase sugar ABC transporter substrate binding protein thiosulfate sulfurtransferase conserved hypothetical protein beta glucosidase glycosyl hydrolase family 3 conserved hypothetical protein phosphoribosylformylglycinamidine synthase amidophosphoribosyltransferase transcriptional regulator Cro Cl family two component system response regulator phosphoribosylaminoimidazole carboxylase ATPase subunit hypothetical protein sugar hydrolase hypothetical protein phosphate ABC tra
89. 0587 hemE CMM _0788 dakA CMM_0654 cysE CMM _0592 CMM_2180 CMM_1719 glgC CMM_0585 CMM_0004 recF CMM_1567 CMM_1820 CMM_2829 CMM_0730 purS succinate dehydrogenase iron sulfur protein sugar ABC transporter permease component aldo keto reductase oxidoreductase adenylosuccinate synthetase galactokinase glutamyl tRNA GIn amidotransferase subunit C conserved hypothetical protein SGNH_hydrolase subfamily MFS permease conserved membrane protein putatively involved in polysaccharide biosynthesis conserved membrane protein putative transporter SSS family sugar epimerase dehydrogenase beta galactosidase conserved membrane protein conserved membrane protein conserved hypothetical protein putative arsenate reductase GTP binding protein obg family uridylate kinase ribonuclease P protein component transcriptional regulator TetR family oxidoreductase transcriptional regulator MarR family oligopeptide ABC transporter ATPase phosphatase HAD hydrolase family glycosyltransferase dipeptidase DNA gyrase subunit A transcriptional regulator delta 1 pyrroline 5 carboxylate dehydrogenase proline oxidase galactose 1 phosphate uridylyltransferase succinyl CoA ligase ADP forming subunit beta sugar ABC transporter permease component mannose 6 phosphate isomerase ribonuclease DNA polymerase III beta chain phospho 2 dehydro 3 deoxyheptonate aldolase alpha glucosidase L ribulose 5 phosphate 4 ep
90. 062 hypothetical protein putative single strand binding protein V 2 4 6 CMM _1599 fc A fucose synthase 11 2 4 5 CMM_0911 hypothetical protein 11 2 4 5 pCM2_0028 conserved secreted protein V 2 4 2 CMM_1956 monooxygenase V1 4 1 CMM_2714 conserved hypothetical protein V 2 4 0 CMM_2279 conserved membrane protein LysE transporter family IV 1 3 7 pCM2_0066 conserved hypothetical protein V 2 3 6 CMM_0061 cell filamentation protein 11 1 3 6 CMM _2716 conserved membrane protein V 2 Anhang 194 Fortsetzung Tabelle 30 Transkriptmenge in XMM Medium AS niedriger als in XMM Medium 3 6 3 4 3 4 3 4 3 4 3 4 3 3 3 2 3 0 3 0 3 0 3 0 2 9 2 9 2 8 2 8 2 8 2 8 2 8 2 8 2 7 2 7 2 7 2 6 2 6 2 6 2 5 2 5 2 5 2 4 2 4 2 4 2 4 2 4 2 3 2 3 2 2 2 2 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 u gg fee fe iR nn OOO O0000 CMM_1600 gmdA pCM1_0005 traG CMM_1928 pCM1_0016 CMM_0074 CMM_1252 CMM_2688 CMM_2720 CMM _0185 metC CMM _2401 CMM_2400 CMM_2033 pCM2_0067 pCM1_0011 pCM1_ 0023 ppav pCM2_0065 CMM_2032 CMM_1185 CMM_2116 thiED CMM_0184 metE7 CMM_1955 CMM_1067 ansP CMM_1973 CMM_0183 CMM_1466 CMM_2717 CMM_1336 metY CMM_1572 CMM_2060 CMM_0644 CMM_0694 CMM_1602 wcem CMM_1573 pCM1_0015 CMM_1230 CMM_2283 CMM_2097 CMM_2282 CMM_0737 katA CMM _1605 wzy7 CMM_0430 CMM_0560 CMM_1435 CMM_2059 CMM_1265 CMM_2098 CMM_1601 wcmH pCM2_0055 CMM_193
91. 0728 purL phosphoribosylformylglycinamidine synthase II 1 3 CMM_0736 furA transcriptional regulator Fur family IV 3 CMM_0753 purC phosphoribosylaminoimidazole succinocarboxamide synthase 1 3 CMM_0757 purF amidophosphoribosyltransferase 1 3 CMM_0792 sugar ABC transporter substrate binding protein IV 1 CMM_0828 hypothetical protein 1 2 CMM_0839 membrane bound metalloprotease IV 7 CMM_0840 NPL P60 family secreted protein IV 6 CMM_0841 ipyA inorganic pyrophosphatase 1 6 CMN_0844 ftsH cell division protein membrane bound ATP dependent protease 11 1 CMM_0857 cIpC ATP dependent protease ATPase subunit IV 4 Anhang 206 Fortsetzung Tabelle 34 Transkripte der Gene im Genom von Cmm382 mit internen reads CMM_0860 rplJ CMM_0866 CMM_0867 CMM_0871 CMM_0872 cysB CMM_0877 araD CMM_0878 araA CMM_0879 CMM_0880 CMM_0902 lysC CMM_0904 mgo CMM_0919 pbpD CMM_0927 topA CMM_0966 xthA CMM_0970 sdhA CMM_0976 CMM_0983 addA CMM_0991 accA CMM_0999 accD CMM_1038 ahcY CMM_1054 secA CMM_1062 bcp CMM_1094 ilvB CMM_1095 ilvH CMM_1096 ilvC CMM _1100 serA CMM_1129 CMM _1153 thrA CMM_1156 rhoA CMM_1157 prfA CMM_1163 atpB CMM_1164 atpE CMM_1165 atpF CMM_1166 atpH CMM_1167 atpA CMM_1168 atpG CMM_1169 atpD CMM_1170 atpC CMM_1204 CMM_1207 CMM_1208 lipA CMM_1225 CMM_1255 CMM_1278 CMM_1282 CMM_1286 CMM_1287 CMM_1288 CMM_1295 rphA CMM_1308 prfB CMM_1322 sucA
92. 09 wemN CMM_0868 CMM 2155 CMM_2923 CMM_ 1102 CMM_1946 CMM_ 2628 CMM_0532 panD CMM_1237 CMM_1570 CMM_1324 CMM_1670 CMM_1403 trmU CMM_1622 ahpE CMM_0879 CMM_2901 CMM_2235 CMM_1678 CMM_2185 CMM_2816 menA pCM2_0061 pCM2_0018 pCM2_PSEUDO_0005 CMM_2053 CMM_2711 CMM_2856 CMM_0610 CMM_2577 coaA CMM_1612A CMM_1679 CMM_1398 CMM_1434 CMM_1659 acnA CMM_0240 CMM_1436 CMM_1642 IpdB CMM_ 2460 CMM_2184 CMM_1310 ftsX CMM_2210 CMM_1823 gipD pCM2_0062 CMM_1569 CMM_0592 CMM _1242 CMM_0892 CMM _1720 serB2 CMM_0720 wenC CMM_0594 CMM_0858 galE2 CMM _2445 CMM 1737 zwfA2 secreted protein conserved hypothetical protein carboxylesterase type B transcriptional regulator Fur family L ribulose 5 phosphate 4 epimerase membrane protein involved in the export of EPS conserved membrane protein hydrolase serine acetyltransferase undecaprenyl phosphate glycosyl 1 phosphate transferase alpha glucoside ABC transport system permease component 3 0xoacyl acyl carrier protein synthase hypothetical membrane protein efflux MFS permease oxidoreductase monooxygenase polar amino acid ABC transporter substrate binding protein aspartate 1 decarboxylase precursor Aspartate alpha decarboxylase NDP sugar phosphate epimerase conserved membrane protein conserved membrane protein oxidoreductase tRNA methyltransferase thiol specific antioxidant protein sugar ABC transporter substr
93. 1 4 9 CMM _PS_16 CMM_PS_16 V 2 4 8 CMM_0629 amidinotransferase 1 2 4 8 CMM_2526 MFS permease IV 1 4 0 CMM_2773 conserved hypothetical protein putative nitroreductase V 2 3 9 CMM_2566 livK branched chain amino acid ABC transporter SBP IV 1 3 8 CMM_1627 metal ABC transporter permease component IV 1 3 8 CMM_1920 conserved hypothetical protein V 2 3 8 CMM_1267 DNA alkylation repair enzyme 111 1 3 7 CMM_1129 siderophore interacting protein 1 6 3 7 CMM_0234 hypothetical membrane protein V 2 3 6 CMM_2467 hydrolase V 1 3 4 CMM_1998 argD acetylornithine aminotransferase 1 2 3 2 CMM_2072 DNA glycosylase 111 1 3 0 CMM_2897 hypothetical membrane protein V 2 2 7 CMM_0300 nucleoside diphosphate sugar epimerase 1 1 2 7 CMM _0167 fhuB Fe3 siderophore ABC transporter permease component IV 1 multisubunit Na H antiporter NADH quinone 2 7 CMM _1089 mnhD EA IV 1 Anhang 190 Fortsetzung Tabelle 29 H here Transkriptmengen in XMM Medium AS als in XMM Medium 2 5 2 5 2 4 2 4 2 3 2 3 2 3 2 3 2 2 2 2 2 2 2 1 2 0 2 0 2 0 Fy eer ES Bu u SS aS eS eS Bu eS SS Eu u SS u BE nn O DVD9OOO DOOODOODOONN NSNNINNSNINS0 OO 0 WOO OO OCODO OO OO OO m U QOO0OO0OOO CMM 2941 CMM_1713 CMM 2199 CMM_1247 sipX CMM_1799 aroE CMM_1244 CMM_0731 CMM_0678 pknC CMM_2770 CMM _1505 fruB CMM_1126 CMM_0967 CMM_1160 CMM_ 1426 CMM_1911 CMM_0681 fabB CMM_2372 CMM_0620 CMM_0557 CMM_1416 CMM_ 2494
94. 1 3 1 1 111 3 IV 3 V 1 V 2 1 3 111 3 V 1 1 1 V 1 1 2 160 oO oo oo PD OD HY WWHFNWHHHNNNHWNDYM O NNMH AWANNNM 0O8OPFPrPPD PH HAWN NW NM WPDY Anhang 161 Fortsetzung Tabelle 22 zytoplasmatisches Proteom von Cmm382 in XMM Medium 4 CMM_2010 50S ribosomal protein L35 111 3 3 4 CMM _1633 panB 3 methyl 2 oxobutanoate hydroxymethyltransferase 1 5 1 4 CMM _0757 purF amidophosphoribosyltransferase 1 3 1 4 CMM_0757 purF amidophosphoribosyltransferase 1 3 2 3 CMM_1680 short chain dehydrogenase oxidoreduxtase V 1 1 3 CMM_0942 ribokinase 1 1 1 3 CMM_1106 putative fumarylacetoacetate hydrolase V 2 3 3 CMM_2936 romG 50S ribosomal protein L33 111 3 2 3 CMM_2076 hypothetical protein V 2 3 2 CMM_1629 conserved hypothetical protein V 2 1 2 CMM_1319 sigH RNA polymerase sigma factor IV 3 1 2 CMM_1698 nucleoside diphosphate sugar epimerase 1 1 1 2 CMM_2576 gimS glucosamine fructose 6 phosphate aminotransferase 1 1 1 2 CMM _1195 conserved hypothetical protein V 2 1 2 CMM_2197 gcvT aminomethyltransferase 1 2 1 2 CMM_2920 aminopeptidase M18 family IV 7 1 7 4 Microarray Daten des Transkriptoms von Cmm382 Die Transkriptmengen der Gene von Cmm382 wurden in unterschiedlichen Medien bestimmt und verglichen um m gliche Unterschiede im mRNA Level feststellen zu k nnen Verglichen wurden dabei die Transkriptmengen in Minimalmedium M9 und dem synthetischen Medium XMM Tabelle 23 und Tabelle 24 Die Transkriptmenge von 247 Gene
95. 10 Tage alter Pflanzen wurden von Erde befreit leicht verletzt um das Eindringen der Bakterien zu erm glichen und 15 min in Bakteriensuspension inkubiert Die Pflanzen wurden anschlie end einzeln eingetopft Alle zwei Tage wurden sich entwickelnde Material und Methoden 28 Krankheitssymptome protokolliert Das Pflanzenwachstum erfolgte bei 17 h Lichteinwirkung 50 klx und 7 h Dunkelheit einer Luftfeuchtigkeit von 40 und einer Temperatur von 26 5 C 3 2 4 2 Petiolusinfektion Fur die Petiolusinfektion Engemann 2006 vier Wochen alter Tomatenpflanzen wurden die Bakterien wie in Abschnitt 3 2 4 1 beschrieben behandelt Anstelle von 10 mM MgCl wurde jedoch PS Puffer verwendet Mit einem sterilen Skalpel das zuvor in die Bakteriensuspension getaucht wurde wurde eines der Cotyledonen abgeschnitten und die Schnittstelle mit der Suspension bedeckt Alle zwei Tage wurden sich entwickelnde Krankheitssymptome protokolliert PS Puffer 11 7 g Na HPO 3 g KH2PO 5 g NaCl pH 7 Sterilisation durch Autoklavieren 3 2 4 3 Sameninfektion Die Samen aus S lycopersicum cv Moneymaker wurden sterilisiert bevor sie f r Infektionsversuche verwendet wurden Die Sterilisation wurde am Lehrstuhl f r Biochemie Universit t Erlangen N rnberg durchgef hrt Dabei wurden etwa 100 Samen f r drei Minuten in 70 igem v v Ethanol inkubiert Nach dem Entfernen des Ethanols wurde so viel 1 iges v v Natriumhypochlorit zugegeben bis die Samen bedeckt
96. 135 105 115 27 55 40 73 49 99 67 60 88 30 75 48 23 42 94 65 90 22 26 categecegeegecggecgcacctegeggggagacgagacggagcacgcatg Anhang 201 Fortsetzung Tabelle 32 Analyse der stromaufw rts liegenden Regionen von 48 Genen cgagcticcgggcaicacgaagtccagctggtaggitccaagcGgccgtacggcc ana A gaacggaccgctgatggcctcticggctcgcacggtccgctgacgtagacagaccc ee catccaccacacggccgctcgcgaagaacggcaccaggiccgaggaggacacc 122 catg cgcgacccgcggcctggtgcgactcctccccatccggiagictigcgaggttgtccgc CMM_2963 30S ribosomal proteinS6 ccggcaacgggactcccctgccccgcgcggacagatgcacataccctcctgtcge 107 agatcgtctgcgaccgttcaagtccgaaggaggtgggittagtg TREE gecgatgggggceegtggatecttecctacggttetgeccAtcegectegacgacgtga a iko exiecduler ctccgcgactccggccggtgccgtcctgcgcacctcegggctecgceggatccacgag 106 p ccggccgcggicggcgataggagggaacagccatg gcccgaccigiggacggcggccgacgcgcgcicggccgcecccgcgagacicctc er conserved SBEIBISG agGtactigaaagttcatagaacgggtgggacgcagcgcccgcccgcatcgcacg 66 p gaggagcagcgccatg ecgcggccigtacggccgcggggcgicggcgtaccatcggcacgTccgggcgac CMM_1447 hypothetical protein gaggeccggcgagaagaggcgacgacgatg 37 CMM_1925 ccgcccgaticgcgggaatgccgaccccgcccctacagitgacccGaatgcatac 39 monooxygenase oxidoreductase gticgcatggatcaaggaagcagggcagcatg ggcggccicggcggggcgcggggccgctagiagggicgagggAtcctcatgcca CMM_2077 aspartate ammonia lyase cgagegacgagacgatggagccigcacegtg 37 CMM_2185 peptide ABC transporter ccagtttttgcaaagactcccagccgtacctagggicattcttAtctgc
97. 14 Jones J D and Dangl J L 2006 The plant immune system Nature 444 7117 323 329 Joshi M Rong X Moll S Kers J Franco C and Loria R 2007 Streptomyces turgidiscabies secretes a novel virulence protein Nec1 which facilitates infection Mol Plant Microbe Interact 20 6 599 608 Jung M Y Park I S Kim W Kim H L Paek W K and Chang Y H 2010 Clostridium arbusti sp nov an anaerobic bacterium isolated from pear orchard soil Int J Syst Evol Microbiol 60 Pt 9 2231 2235 Kabelka E Franchino B and Francis D M 2002 Two loci from Lycopersicon hirsutum LA407 confer resistance to strains of Clavibacter michiganensis subsp michiganensis Phytopathology 92 5 504 510 Karki H S Barphagha I K and Ham J H 2012 A conserved two component regulatory system PidS PidR globally regulates pigmentation and virulence related phenotypes of Burkholderia glumae Mol Plant Pathol 13 7 785 794 Kaup O Grafen l Zellermann E M Eichenlaub R and Gartemann K H 2005 Identification of a tomatinase in the tomato pathogenic actinomycete Clavibacter michiganensis subsp michiganensis NCPPB382 Mol Plant Microbe Interact 18 10 1090 1098 Kers J A Cameron K D Joshi M V Bukhalid R A Morello J E Wach M J Gibson D M and Loria R 2005 A large mobile pathogenicity island confers plant pathogenicity on Streptomyces species Mol Microbiol 55 4
98. 1857 ftsQ CMM_0449 CMM_1827 CMM_0810 dapX CMM_0081 CMM_1859 murG CMM_0760 CMM_0139 CMM_2355 CMM_0016 pknA CMM_2395 ag B CMM_1833 troD CMM_2147 mutY CMM_1148 CMM_2537 icdA CMM_0989 punA CMM_1777 metk CMM_0312 CMM_2144 truB CMM_0665 fdxA CMM_1313 CMM_1660 dxsA CMM_2756 CMM_1133 echA CMM_1534 chsA CMM_0268 CMM_2969 CMM_0226 CMM_2230 xseB CMM_1695 bacA CMM_0133 CMM_0313 CMM_1421 CMM_2773 CMM_0580 CMM_0684 CMM _0432 CMM_0355 bgaA CMM_0677 sbcD CMM_1828 CMM_0651 CMM _2576 gImS CMM_0203 CMM_0080 CMM_1026 gcdH CMM 1767 trpE1 CMM _0440 sugar ABC transporter permease component acetyltransferase GNAT family conserved membrane protein thioesterase hypothetical membrane protein conserved secreted protein conserved hypothetical protein putative carbohydrate kinase conserved hypothetical protein succinyl diaminopimelate desuccinylase conserved hypothetical protein putative aldolase secreted protein transcriptional regulator MarR family multidrug ABC transporter fused permease and ATPase hydrolase phosphatase conserved hypothetical protein putative phosphodiesterase cell division protein hypothetical protein PTS system hybrid protein dihydrodipicolinate synthase short chain dehydrogenase reductase UDP N acetylglucosamine N acetylmuramyl pentapeptide pyrophosphoryl undecaprenol N acetylglucosamine transferase FAD dependent oxidoreductase conserv
99. 1881 CMM_1898 CMM_1902 CMM_1905 CMM_1906 CMM_1907 CMM_1929 CMM_1932 CMM_1983 pyrG CMM_2007 gluA CMM_2016 hisB CMM_2019 hfIX CMM_2020 CMM_2035 dapA CMM_2040 dapB CMM_2042 pepR CMM_2057 CMM_2071 CMM_2075 CMM_2075A CMM_2076 CMM_2078 CMM_2086 CMM_2095A CMM_2114 ptrB CMM_2121 CMM_2135 CMM_2139 cynX CMM_2140 CMM_2144 truB CMM_2147 mutY CMM_2152 proS CMM_2156 ispG CMM_2157 CMM_2198 CMM_2200 CMM_2218 CMM_2219 CMM_2223 CMM_2248 CMM_2266 CMM_2276 CMM_2285 CMM_2296 CMM_2316 CMM_2341 CMM_2367 ispE CMM_2369 CMM_2373 CMM_2398 CMM_2400 CMM_2405 sdaA CMM_2430 CMM_2432 CMM_2440 CMM_2446 galU CMM_2447 CMM_2452 peptidyl prolyl cis trans isomerase 3 dehydroquinate dehydratase peroxidase cytochrome c oxidase subunit III histidinol dehydrogenase conserved hypothetical protein putative DNA binding protein phospho 2 dehydro 3 deoxyheptonate aldolase ATPase hypothetical protein conserved secreted protein putative amine oxidase hypothetical protein hypothetical protein hypothetical protein quinone oxidoreductase acyl CoA synthetase CTP synthase glutamate ABC transporter ATPase imidazoleglycerol phosphate dehydratase GTP binding protein obg family rRNA methylase dihydrodipicolinate synthase dihydrodipicolinate reductase metallopeptidase M16 family 2 5 diketo D gluconic acid reductase FAD FMN containing dehydrogenase hydrolase hypothetical protein hypothetical pr
100. 1991 Meletzus et al 1993 zum anderen ein angepasstes Protokoll f r die Elektroporation Kirchner et al 2001 Der Nachteil des Vektors pDM302 ist dass er nicht kompatibel ist mit dem nat rlichen Plasmid pCM1 Durch die Selektion mit einem auf pDM302 abgestimmten Antibiotikum geht pCM1 verloren sodass nachfolgende Analysen nur im Stamm Cmm102 m glich sind Hindernisse bei der Arbeit mit C michiganensis subsp michiganensis sind der schnelle Verlust der nat rlichen Plasmide durch Stressbedingungen wie zu hohe Temperatur oder eine Elektroporation sowie die geringe Verf gbarkeit von Promotorsequenzen Ein Vergleich der bekannten Promotorsequenzen f r pat 1 und celA mit bekannten Promotorsequenzen anderer Gram positiver Bakterien lieferte keine homologen Sequenzen Dreier et al 1997 Jahr et al 2000 Die Definition einer spezifischen Konsensussequenz f r Promotorstrukturen wie die 10 die 35 Region und die Shine Dalgarno Sequenz erfordert die Analyse weiterer Promotorregionen 2 5 Zielsetzung der Arbeit F r ein besseres Verst ndnis der Wirt Pathogen Interaktion zwischen dem Gram positiven Bakterium C michiganensis subsp michiganensis und seiner Wirts Pflanze S lycopersicum Tomate in der eine bakterielle Besiedelung der Xylemgef e stattfindet zur Eindammung der Infektion ist die Identifizierung und Charakterisierung von Virulenzfaktoren wichtig Eine in planta Analyse der Infektion ist technisch schwierig Nach der Analyse
101. 2 1 2 V 2 1 2 1 4 IV 1 111 3 IV 4 111 3 1 2 111 3 1 5 IV 4 111 3 111 3 IV 1 1 1 111 3 1 3 1 5 IV 4 1 6 IV 1 V 1 IV 5 111 3 IV 5 11 2 V 2 V 1 1 1 an gt 156 WONMAFRA BMH ANAHRWNAWAWAHANWOH ANMNAHAANAHAH UOR ARAR NORARARARARARON A A A HPHAHRAHA Anhang Fortsetzung Tabelle 22 zytoplasmatisches Proteom von Cmm382 in XMM Medium 81 81 80 79 78 77 76 74 73 71 71 67 67 67 66 66 66 65 65 65 64 63 62 62 61 60 60 60 59 59 56 54 53 53 53 52 52 52 51 50 50 49 49 49 48 47 46 46 46 45 45 44 44 44 44 44 41 40 38 38 37 37 36 36 36 CMM 1104 leuB CMM_2579 rpsi CMM_2665 CMM_1154 thrC CMM_1611 cspA7 CMM_1758 pykA CMM_2060 CMM 1105 ilvE CMM 2468 dixR CMM_0513 pgmA CMM 2962 ssb CMM_2601 rpsE CMM_2775 CMM_1951 CMM_2607 rpIN CMM_1020 g fA CMM_2773 CMM_1463 tig CMM_2223 CMM_2379 prpB CMM_1988 CMM_2185 CMM_1034 CMM_0932 CMM_2603 CMM_1742 CMM_2622 CMM_2566 CMM_0858 CMM_2232 CMM_1384 CMM_0812 CMM_2943 CMM_1367 rpsP CMM_0480 CMM_1335 metx CMM_0873 metB CMM_0990 IpdA CMM_1136 CMM_0640 CMM_2600 rpmD CMM_0594 CMM_1526 CMM_2502 CMM_1659 acnA CMM_1567 CMM_1100 serA CMM_1670 CMM_0758 purM CMM_1806 CMM_0595 hem CMM_1278 CMM_1828 CMM_2035 dapA CMM_1738 opcA CMM_1772 CMM_2370 metS CMM_0689 purA CMM_2077 aspA CMM_2461 CMM_2831 CMM_2470 CMM_2783 CMM _1408 gatA CMM_26
102. 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 CMM_2133 CMM _1320 rsrA CMM_0239 CMM_1954 CMM_2209 CMM_1335 metx CMM_2281 CMM_1526 CMM_0098 CMM_0402 CMM_2655 CMM_0581 CMM_0043 pelAT CMM_0241 CMM_1125 CMM_0469 CMM_1479 CMM_1235 CMM_2330 pCM1_0025 pin CMM_0145 CMM_0328 CMM_2844 CMM_PS_16 CMM_0896 ackA CMM_0345 CMM_2061 CMM_1525 CMM_0796 trxC CMM_1132 CMM_0895 ptaA CMM_2643 CMM_0621 CMM_1602 wemh CMM_2074 CMM_1601 wcmH CMM_1297 czcD pCM1_0007 CMM_2315 CMM_0647 CMM_1723 CMM_0911 CMM_0559 CMM_1236 CMM_0706 pbpB CMM_0746 prkA CMM_0695 CMM_1324 CMM_1246 pCM2_0063 CMM_0640 CMM_1251 CMM_0533 CMM_1500 CMM_2129 CMM_1182 tatB CMM_1791 CMM_2211 CMM_1380 xerC CMM_1747 CMM_1129 CMM_2215 CMM_1266 CMM_0292 CMM_0429 lipase esterase anti sigma factor hypothetical secreted protein conserved hypothetical protein transcriptional regulator MarR family homoserine O acetyltransferase metal ABC transporter permease component oxidoreductase transcriptional regulator Lacl family hypothetical protein transcriptional regulator putative general stress response protein pectate lyase membrane protein transcriptional regulator LuxR family oxidoreductase transcriptional regulator TetR family conserved hypothetical protein conserved secreted protein DNA invertase conserved secreted protein oxidoreductase methylase sugar ABC transporter ATPase CMM_PS_16 acetat
103. 20 hypothetical protein V 2 5 1 CMM_2650 cationic amino acid permease APC family IV 1 5 0 CMM _0778 acetolactate synthase 1 2 5 0 CMM_0977 sugar ABC transporter ATPase IV Anhang Fortsetzung Tabelle 28 Niedrigere Transkriptmengen in M9 Medium als in TBY Medium 5 0 5 0 5 0 4 9 4 8 4 8 4 7 4 7 4 6 4 6 4 5 4 5 4 4 4 4 4 4 4 3 4 3 4 2 4 1 4 1 4 1 4 0 3 9 3 9 3 8 3 8 3 8 3 8 3 7 3 7 3 7 3 7 3 7 3 7 3 7 3 6 3 6 3 4 3 4 3 4 3 4 3 4 3 3 3 3 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 1 3 1 3 1 3 0 3 0 3 0 3 0 2 9 2 9 2 9 2 9 2 9 CMM_1078 CMM_1877 CMM_2077 aspA CMM_1885 dctA CMM_2697 CMM_2779 CMM_0034 CMM_2485 CMM_2214 CMM_0793 CMM_1259 CMM_1010 rmiB CMM_2798 CMM_0451 CMM_0978 CMM_0882 xy A CMM_0945 CMM_0271 CMM_0554 CMM_2820 CMM_1260 CMM_1009 rmI D CMM_2233 fumC CMM_2541 CMM_0791 CMM_0884 CMM_0878 araA CMM_0865 CMM_2916 CMM_1831 g pk CMM_2897 CMM_2531 CMM_1245 CMM_0922 acsA1 CMM_0247 CMM_2505 pstS CMM_0100 bgIF CMM_2770 CMM_2781 CMM_0981 deoA CMM_0671 CMM _0776 CMM_0976 CMM_0101 bgIG CMM _1457 pepN CMM _0272 CMM_0980 cddA CMM_2802 CMM_1792 nusB CMM_1588 CMM_0881 CMM_0880 CMM_0450 CMM_1080 CMM_0086 CMM_0201 CMM_0971 sdhD CMM_0883 bglJ CMM_1651 CMM_0690 CMM_1816 ruvC CMM_2171 gItA2 CMM_0970 CMM_2527 CMM_1244 transcriptional regulator TetR family long chain fatty acid CoA ligase aspartate ammonia ly
104. 207 transcriptional regulator PadR family IV 3 5 4 CMM_2761 hypothetical protein V 2 5 3 CMM_1929 quinone oxidoreductase 1 1 5 0 CMM _1433 conserved hypothetical protein V 2 5 0 CMM_2096 hypothetical protein V 2 4 9 CMM _1849 flavin dependent reductase monooxygenase V 1 4 8 CMM_0319 conserved hypothetical protein V 2 4 7 CMM _1208 lipA lipoyl synthase 5 4 7 CMM_1239 multidrug ABC transporter ATPase IV 1 4 5 CMM_2282 metal ABC transporter ATPase IV 1 4 4 CMM_1899 Zn dependent dehydrogenase V1 4 3 CMM_0185 metC O acetylhomoserine thiol lyase 1 2 4 3 CMM_1788 acsA2 acetyl coenzyme A synthetase 1 4 4 1 CMM _0593 conserved hypothetical protein 1 5 3 9 CMM_0600 DNA RNA endonuclease 111 2 3 9 CMM _0053 chpF extracellular serine protease family S1A Chymotrypsin IV 6 3 9 CMM_1524 nicotinamide mononucleotide transporter PnuC family IV 1 3 8 CMM _1123 sgah hexulose 6 phosphate synthase 1 1 3 6 CMM_1237 NDP sugar phosphate epimerase 1 1 3 6 CMM _1958 peptide ABC transporter permease component IV 1 3 5 CMM _1953 conserved hypothetical protein V 2 3 4 CMM_1611 cspA7 cold shock protein IV 4 Anhang Fortsetzung Tabelle 27 H here Transkriptmengen in M9 Medium als in TBY Medium 3 4 3 4 3 4 3 4 3 4 3 3 3 3 3 2 3 2 3 2 3 1 3 1 3 0 3 0 3 0 3 0 2 9 2 9 2 8 2 8 2 8 2 8 2 8 2 7 2 7 2 6 2 6 2 6 2 6 2 5 2 5 2 5 2 5 2 5 2 4 2 4 2 4 2 4 2 4 2 4 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
105. 2275 gimU CMM_1210 CMM_2047 pnp CMM_0009 CMM_2610 rp P CMM_0484 nagD CMM_1006 wegB CMM_1856 ftsZ CMM_2469 serC CMM_2609 romC CMM_2664 CMM_0561 aspS CMM_1383 rpsB CMM_0795 CMM_0486 CMM_ 2787 rplK CMM_1718 CMM_ 2270 rplY CMM_2272 gndA2 CMM_2521 foID CMM_2088 CMM_0894 CMM_0538 upp CMM_2485 CMM_0196 CMM_2960 rpll CMM_1385 pyrH CMM_1323 guaB CMM_2612 rplV CMM_0609 CMM_2371 gltA1 CMM_1753 CMM_2045 CMM_0872 cysB CMM_0968 ptsA CMM_1696 CMM_2790 aspC CMM_1997 argF CMM_2586 rpsM CMM_1553 CMM_1804 rpsD CMM_1777 metk CMM_1407 gatC CMM_2523 CMM_1657 CMM_2590 mtlF CMM_1630 CMM_ 2554 guaA CMM_2616 rp D CMM_0883 bglJ CMM_2274 prsA CMM_2895 CMM_2944 CMM_1587 CMM_2062 dpsB CMM_0933 gabD CMM_2873 CMM_1631 ppgK1 CMM_2014 hisA CMM_1798 aroC 50S ribosomal protein L5 UDP N acetylglucosamine pyrophosphorylase siderophore interacting protein polyribonucleotide nucleotidyltransferase hypothetical protein 50S ribosomal protein L16 N acetylglucosamine 6 phosphate deacetylase glycosyltransferase mannosyltransferase cell division protein phosphoserine aminotransferase 50S ribosomal protein L29 conserved hypothetical protein aspartyl tRNA synthetase 30S ribosomal protein S2 extracellular nuclease phosphatase putative general stress protein 50S ribosomal protein L11 glycosyltransferase 50S ribosomal protein L25 6 phosphogluconate
106. 23 ggtA dca rplB aS M CMM_2479 cspA2 CMM_1752 rpsA CMM_2137 CMM_1010 rmIB CMM_1012 rmIC CMM_2538 CMM_0753 purC CMM_2735 gipX CMM_2475 CMM_2770 CMM _2919 deoC riboflavin synthase alpha chain NH 3 dependent NAD synthetase prolyl tRNA synthetase glycine cleavage system H protein indole 3 glycerol phosphate synthase UDP glucose 4 epimerase acyl carrier protein 50S ribosomal protein L18 conserved secreted protein conserved hypothetical protein ribose 5 phosphate isomerase dihydroxyacetone kinase acetylornithine aminotransferase aspartyl glutamyl tRNA Asn GIn amidotransferase subunit B monooxygenase conserved hypothetical protein conserved hypothetical protein adenosine deaminase phosphoribosylaminoimidazole carboxylase catalytic subunit ketol acid reductoisomerase 2 5 diketo D gluconic acid reductase hypothetical protein 50S ribosomal protein L23 phosphoenolpyruvate carboxykinase subtilisin like extracellular serine protease peptidase family S8A glucokinase ROK family putative catabolite repressor pyruvate dehydrogenase E1 component putative monooxygenase involved in AB biosynthesis hydrolase acetolactate synthase 50S ribosomal protein L20 50S ribosomal protein L24 succinate dehydrogenase iron sulfur protein carbamoyl phosphate synthase small subunit conserved hypothetical protein deoxycytidine triphosphate deaminase 50S ribosomal protein L2 glutama
107. 23 rpsL pncA rplF tpiA rpsG livk galE2 cynT tsf a a oe BE __ 3 isopropylmalate dehydrogenase 30S ribosomal protein S9 putative sugar phosphate isomerase epimerase threonine synthase cold shock protein pyruvate kinase cysteine peptidase family C56 branched chain amino acid aminotransferase iron dependent repressor Dix family phosphoglucomutase single stranded DNA binding protein 30S ribosomal protein S5 conserved hypothetical protein glycine betaine aldehyde dehydrogenase 50S ribosomal protein L14 UDP galactopyranose mutase putative nitroreductase trigger factor TF prolyl isomerase chaperone GTP binding protein obg family methylisocitrate Iyase phosphonomutase putative hydrolase HAD family peptide ABC transporter substrate binding protein phosphohexomutase pyrazinamidase nicotinamidase 50S ribosomal protein L6 triosephosphate isomerase 30S ribosomal protein S7 branched chain amino acid ABC transporter SBP UDP glucose 4 epimerase carbonic anhydrase elongation factor Ts EF Ts aldehyde dehydrogenase 2 keto acid dehydrogenase E1 beta component 30S ribosomal protein S16 beta hydroxyacid dehydrogenase homoserine O acetyltransferase cystathionine gamma synthase dihydrolipoamide dehydrogenase conserved hypothetical protein conserved hypothetical protein 50S ribosomal protein L30 putative heme peroxidase oxidoreductase acetyltransferase aconitate hydratase hydrolase
108. 28 28 27 27 27 27 25 25 24 24 24 24 23 23 23 22 22 22 21 21 20 20 18 18 17 17 17 17 16 16 16 16 15 CMM_0911 CMM_0861 rpIL CMM_2522 gIyA CMM_1022 wcgK CMM_1642 IpdB CMM_0466 CMM_0109 CMM_1636 gInAT CMM_0051 pelA2 CMM_0043 pelAT CMM_0010 ppiA CMM_1384 tsf CMM_0034 CMM_1278 CMM_1836 gcrA CMM_1831 glpK CMM_1487 CMM_ 2786 rplA CMM_1383 rpsB CMM_2583 rp Q CMM_2088 CMM_1169 atpD CMM_1599 fclA CMM_ 2605 rp E CMM_0112 CMM_0035 CMM_0363 CMM_ 2618 rpsu CMM_0640 CMM_1514 CMM_2692 CMM_0511 CMM_1203 CMM_ 2603 rp F CMM_1532 prox CMM_1248 CMM_0151 dnaK CMM_0956 CMM_0643 CMM_2902 CMM_2611 rpsC CMM_0857 cipC CMM_0039 chpE CMM_ 2327 CMM_0915 pbpC CMM_ 2617 rpIC CMM_1782 carB CMM_1463 tig CMM_1557 CMM_ 2607 rplN CMM_2609 rpmC CMM_1716 romE2 CMM_1703 CMM_1764 trpC CMM_2161 CMM_0517 CMM_1034 CMM_1616 fabF CMM_1873 pknE CMM_2469 serC CMM_0991 accA CMM_0132 hypothetical protein sortase sorted 50S ribosomal protein L7 L12 serine hydroxymethyltransferase secreted protein dihydrolipoyl dehydrogenase conserved secreted protein sugar ABC transporter substrate binding protein glutamine synthetase I pectate lyase pectate lyase peptidyl prolyl cis trans isomerase elongation factor Ts EF Ts sugar phosphate isomerase epimerase serine protease family S1B menaquinol cytochrome C reductase
109. 3 Recent progress in unterstanding and controlling bacterial canker of tomato in eastern North America Plant Dis 1069 1076 Grant S G Jessee J Bloom F R and Hanahan D 1990 Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methylation restriction mutants Proc Natl Acad Sci U S A 87 12 4645 4649 Groisman E A and Ochman H 1996 Pathogenicity islands bacterial evolution in quantum leaps Cell 87 5 791 794 Gu G Cevallos Cevallos J M and van Bruggen A H 2013 Ingress of Salmonella enterica Typhimurium into tomato leaves through hydathodes PLoS One 8 1 e53470 Gueneron M Timmers A C Boucher C and Arlat M 2000 Two novel proteins PopB which has functional nuclear localization signals and PopC which has a large leucine rich repeat domain are secreted through the hrp secretion apparatus of Ralstonia solanacearum Mol Microbiol 36 2 261 277 Gunton J E Gilmour M W Alonso G and Taylor D E 2005 Subcellular localization and functional domains of the coupling protein TraG from IncHl1 plasmid R27 Microbiology 151 Pt 11 3549 3561 Haghjoo E and Galan J E 2007 Identification of a transcriptional regulator that controls intracellular gene expression in Salmonella Typhi Mol Microbiol 64 6 1549 1561 Hansmeier N Chao T C Kalinowski J Puhler A and Tauch A 2006b Mapping and comprehensive analysis of the extracellular a
110. 3 CMM_2687 CMM_1954 CMM_2281 CMM_2031 CMM_1945 CMM_2121 CMM_1382 CMM_1282 CMM_0132 CMM_ 2221 CMM_1101 CMM 1819 pCM2_0063 CMM_1259 GDP mannose 4 6 dehydratase membrane protein membrane protein lipoprotein putative conserved hypothetical protein choline glycine betaine transporter BCCT family unnamed protein product putative acetyl xylan esterase membrane protein o acetylhomoserine thiol lyase conserved hypothetical protein o acetylhomoserine thiol lyase conserved hypothetical protein hypothetical protein hypothetical secreted protein extracellular serine protease hypothetical protein ABC transporter ATPase component ATPase thiamine phosphate synthase phosphomethylpyrimidine kinase methionine synthase II conserved hypothetical protein L asparagine permease APC family acyl CoA dehydrogenase aminotransferase monooxygenase conserved hypothetical protein o acetylhomoserine thiol lyase two component system sensor kinase cysteine peptidase family C56 two component system response regulator ATP GTP binding protein acetyltransferase involved in polysaccharide biosynthesis two component system response regulator secreted protein hypothetical protein metal ABC transporter substrate binding protein hypothetical protein metal ABC transporter ATPase catalase exopolysaccharide polymerase hypothetical secreted protein putative cell surface protein transcriptional regulator AB
111. 3 CMM_2205 acetyltransferase GNAT family V 1 1 3 CMM_1570 conserved membrane protein V 2 1 3 pCM2_0067 hypothetical protein V 2 1 3 CMM_1904 conserved hypothetical protein V 2 1 3 CMM_2316 putative phosphomutase lyase V 2 1 3 CMM_0529 hypothetical protein V 2 1 3 CMM_1187 Mg2 transporter MgtE family IV 1 1 3 CMM_2825 conserved hypothetical protein putative nicotinamidase V 2 1 3 CMM_1664 conserved hypothetical protein V 2 1 3 CMM_2924 hypothetical membrane protein V 2 1 3 CMM_2605 rplE 50S ribosomal protein L5 111 3 1 3 CMM_0114 conserved hypothetical protein V 2 1 3 CMM_0772 acetyltransferase V1 1 3 CMM_2681 conserved hypothetical protein putative hydrolase V 2 1 2 CMM_1353 membrane bound protease IV 7 1 2 CMM_2352 conserved hypothetical protein V 2 1 2 CMM_1269 conserved hypothetical protein V 2 1 2 CMM_1819 putatively involved in pyridoxine biosynthesis 1 5 1 2 CMM_0418 epoxide hydrolase V 1 1 2 CMM_1586 dnaG DNA primase 11 1 1 2 CMM_2350 fecC7 Fe3 siderophore ABC transporter permease component IV 1 1 2 CMM_0246 hypothetical protein V 2 1 2 CMM_0119 transcriptional regulator TetR family IV 3 1 2 CMM_0851 conserved membrane protein V 2 Anhang 182 Fortsetzung Tabelle 27 H here Transkriptmengen in M9 Medium als in TBY Medium 1 2 CMM_1506A hypothetical protein V 2 1 2 CMM_1804 rpsD 30S ribosomal protein S4 111 3 1 2 CMM_0422 sugar ABC transporter ATPase IV 1 1 2 CMM_2394 hypothetical membrane protein V 2 1 2 CMM_2661 hypo
112. 3 und 10 Abbildung 16 wurde jedoch nicht erreicht Die Oberfl chen proteine von Cmm100 und Cmm882 Kulturen in M9 Medium wurden zus tzlich mittels MALDI ToF Massenspektrometrie analysiert F r Cmm382 wurde au erdem das Oberflachen Proteom in XMM Medium untersucht In M9 Medium wurden f r Cmm100 450 Proteine identifiziert f r Cmm382 340 Proteine Daten nicht gezeigt In XMM Medium wurden f r Cmm382 405 Proteine identifiziert Daten nicht gezeigt Die Anzahl der identifizierten Proteine entsprach etwa 10 13 aller f r Proteine kodierenden Sequenzen in C michiganensis subsp michiganensis Dabei waren nur ein geringer Teil der Proteine putative Oberfl chenproteine wie Substrat Bindedom nen von ABC Transportern oder Membranproteine Daneben wurden extrazellul re Proteine wie Serinproteasen identifiziert Ergebnisse 78 und zytoplasmatische Proteine wie Transkriptionsregulatoren und ribosomale Proteine Es wurden demnach nicht nur Oberflachenproteine isoliert sondern auch zytoplasmatische und extrazellul re Proteine Aussagen Uber das Oberflachen Proteom in Cmm100 und Cmm382 konnten somit in dieser Arbeit nicht getroffen werden 4 4 2 2 Analyse extrazellularer und zytoplasmatischer Proteine Das extrazellulare Proteom wurde in zwei verschiedenen Experimenten analysiert Zum einen wurde untersucht ob im Medien berstand einer Cmm382 bzw Cmm100 Kultur in M9 Medium Proteine enthalten waren die eine Cellulase Protease bzw Pektina
113. 5 2 5 2 5 2 5 2 5 2 5 2 4 2 4 2 4 2 4 2 4 2 4 CMM_2436 CMM_2187 CMM_1447 CMM_2844 CMM_1674 xysB CMM_0629 CMM_1102 CMM_2562 livH CMM_0490 CMM_0972 sdhC CMM_1827 CMM_0858 galE2 CMM_0859 CMM_1823 gipD CMM_2195 gcvP CMM_0971 sdhD CMM_2106 CMM_1830 glpF CMM_2923 CMM_0360 CMM_0684 CMM_0685 CMM_0272 CMM_2534 CMM_2060 CMM_0074 CMM_2425 CMM_0109 CMM_1312 CMM_0813 CMM_0970 CMM_0403 gipT CMM_2592 CMM_1075 CMM_0450 CMM_2006 g uB CMM_0201 CMM_1719 gigC CMM_1872 CMM_2235 CMM_0680 CMM_0469 CMM_2007 gluA CMM_1828 CMM_0417 CMM_2547 sucD CMM_0362 CMM_1933 CMM_2535 sbtB CMM_0884 CMM_1659 acnA CMM_0681 fabB CMM_1101 CMM_0627 CMM_0945 CMM_1435 CMM_0683 coaBC CMM_0040 CMM_2418 fadD CMM_2780 CMM_0661 CMM_0105 ramA CMM 2533 L arabinose ABC transporter permease component conserved membrane protein hypothetical protein sugar ABC transporter ATPase endo 1 4 beta xylanase B amidinotransferase efflux MFS permease branched chain amino acid ABC transporter permease protein membrane protein succinate dehydrogenase cytochrome b subunit PTS system hybrid protein UDP glucose 4 epimerase oxidoreductase glycerol 3 phosphate dehydrogenase glycine dehydrogenase decarboxylating succinate dehydrogenase hydrophobic membrane subunit sugar ABC transporter substrate binding protein glycerol uptake facilitator protein MIP family hypothetical membrane protein
114. 5 links an die geschnittene DNA und der Detektion der Digoxigenin Markierung der Sonde war jeweils ein DNA Fragment auf der Membran zu erkennen Abbildung 25 A rechts Das DNA Fragment war im Wildtypstamm 2 500 2 600 bp gro im Stamm EH2408 zwischen 7 400 und 8 500 bp Die Gr en stimmten mit den theoretisch ermittelten Gr en 2 494 bp und 7 458 bp berein F r die berpr fung der Insertion in CMM_2766 wurden Wildtyp und EH2766 DNA mit dem Enzym Pmil geschnitten Abbildung 25 B Die detektierten DNA Fragmente nach Hybridisierung der CMM_2766 Sonde betrugen im Wildtypstamm etwa 3 400 bp im Stamm EH2766 etwa 4 000 bp Die Gr en stimmten mit den theoretisch ermittelten Werten 3 412 bp und 3 980 bp berein In beiden St mmen wurde zus tzlich ein etwa 2 800 bp gro es Fragment detektiert Mittels in silico Analyse wurde untersucht ob die Sonde CMM_2766 an einer anderen Stelle an die Sequenz des Genoms von C michiganensis subsp michiganensis bindet Es wurde jedoch lediglich eine Bindung an die CMM_2766 Region festgestellt Eine Erkl rung f r das zweite detektierte Fragment wurde nicht gefunden Ergebnisse 98 Wildtyp Wt Bglll Not Sondentest 420 bp Boma K CMM_2408 791 bp 2 494 bp EH2408 Im Bglll 420 bp 650 bp Wildtyp Wt bp DM Wt Im a b Pmll Sondentest r u nr ww a a 200 0 m 3 412 bp EH2766 Im dasa Pmil 450 bp Pmil 590 bp 3 980 bp Wildtyp Wt bp DM Wt Im Notl 8 576 me
115. 5 kinase conserved hypothetical protein prephenate dehydratase hypothetical membrane protein phosphoribosyl ATP pyrophosphatase MFS permease methyltransferase IV 4 IV 1 V 2 1 6 IV 4 V 2 V 2 IV 4 V 2 V 2 IV 1 IV 1 1 2 1 5 IV 3 V 2 1 1 V 1 IV 1 1 5 IV 5 11 2 111 1 IV 3 V 2 V 2 111 1 V 2 111 3 IV 3 V 1 1 5 IV 1 V 2 V 2 1 2 V 2 1 1 111 3 111 1 V 2 V 2 111 3 111 3 1 1 111 1 IV 3 V 2 IV 3 V 2 1 6 1 3 111 1 V 2 IV 3 V 2 1 2 V 2 1 2 IV 1 V 1 h h h h h ee ee h ee ee ee ee re b d ee eee ee ee d d ee d h d d b d b d d d eee ee h Gee d d b d ee d d Oe a Oe h d h k PPLPPPPELPLPLLF PL LIITCTTCTTCTCTCTITAAAMTAAMN AAN AA GIG A AUD AHAAWAIDAIAAAAWAAAADAADADAADAADADANNNANN N NNN CMM _1551 rpsT CMM _1729 CMM_0452 CMM_1161 rfeA CMM_2013 CMM_1564 hrcA CMM_1770 hisG CMM_PS_03 CMM_1656 dutA CMM_2180 CMM_2630 rpoC CMM_0503 CMM_2341 CMM_1221 CMM _0379 phnH CMM_0806 CMM_1833 troD CMM_2567 CMM_0607 CMM_2606 rpIX CMM_1847 CMM_1813 CMM_1870 CMM_2429 nrdA CMM_2026 CMM_1586 dnaG CMM _1495 nadD CMM _1624 CMM _1704 CMM _1150 argS CMM _1637 CMM 2144 truB CMM _0842 CMM _1017 wcqG CMM _1391 CMM _1725 CMM_1310 ftsX CMM_2853 CMM_2574 alrA1 CMM_0918 CMM_1693 CMM_2142 CMM_0119 CMM_0805 pepP CMM_2571 CMM_1746 whiA CMM_1767 trpE1 CMM_2367 ispE CMM_0601 hemO CMM_2448 CMM_ 2573 alrA2 CMM_1972 CMM_279
116. 513 pgmA CMM_2410 CMM_0986 CMM_0682 ilvG CMM_0899 CMM_2112 CMM_0226 hypothetical protein short chain alcohol dehydrogenase hypothetical protein hypothetical protein ferredoxin reductase hypothetical protein iron ABC transporter ATPase sugar alcohol dehydrogenase carboxylesterase type B hypothetical protein succinate dehydrogenase iron sulfur protein methylisocitrate lyase ohosphonomutase oxidoreductase conserved hypothetical protein universal stress protein thiamine phosphate synthase phosphomethylpyrimidine kinase hypothetical protein conserved membrane protein succinyl CoA ligase ADP forming subunit beta sugar ABC transporter permease component membrane protein proline glycine betaine choline ABC transporter SBP hypothetical protein conserved hypothetical protein hypothetical secreted protein fructose bisphosphate aldolase citrate synthase phosphoenolpyruvate dependent fructose phosphotransferase system EIIA EIIB EIIC hypothetical secreted protein Zn metalloprotease anti sigma factor antagonist Mn2 Fe2 transport protein NRAMP family conserved hypothetical protein putative general stress protein secreted protein conserved secreted protein superoxide dismutase glutaryl CoA dehydrogenase isocitrate dehydrogenase cysteine synthase hypothetical protein phosphoserine phosphatase sugar ABC transporter permease component anti sigma regulatory factor Ser Thr protein kinase 2 5
117. 6 in M9 Medium 6 6 h Cmm382 9 9 h EH2408 und 17 1 h EH2766 und in XMM Medium 10 9 h Cmm882 12 8 h EH2408 und 11 0 h EH2766 Schwarze Dreiecke Cmm882 dunkelgraue Quadrate EH2408 hellgraue Rauten EH2766 Die Generationszeit war im Vergleich zum Wildtyp in TBY Medium um etwa 54 geringer in M9 Medium um 50 EH2408 bzw 160 EH2766 geringer und in XMM Medium um 17 5 EH2408 bzw 1 6 EH2766 geringer Die Mutation von CMM_2408 oder CMM_2766 hatte somit einen leichten Einfluss auf das Wachstumsverhalten der Stamme in TBY und XMM Medium Die Mutante EH2766 war in M9 Medium stark in ihrem Wachstum einge schrankt verglichen mit dem Wildtypstamm bei der Mutante EH2408 war hingegen lediglich eine leichte Beeinflussung des Wachstums zu erkennen Ergebnisse 103 Zur Analyse der Virulenz der St mme EH2408 und EH2766 wurden Pflanzenin fektionsversuche durchgef hrt wobei je sieben Pflanzen verwendet wurden Die Infektion mit dem Wildtypstamm Cmm382 diente als Kontrolle Erste Krankheitssymptome traten nach acht Tagen Cmm382 EH2408 bzw nach elf Tagen EH2766 auf 19 dpi wurden die Krankheitssymptome der infizierten Pflanzen erneut dokumentiert Abbildung 29 Krankheitssymptome 19 dpi Babgestorben Welke und L sion OWelke OLasion 8 e 7 S c 6 G A 5 G4 3 2 lt 1 0 Oikeine Symptome EH2408 EH2766 Abbildung 29 Krankheitssymptome 19 Tage nach der Infektion von Tomatenp
118. 788 nusG CMM_1851 CMM_0840 CMM_1377 CMM_0982 iunh CMM_0815 CMM_0321 CMM_1171 CMM_2542 CMM_0972 sdhC CMM_2181 CMM_1793 efpA CMM_0353 CMM_1565 dnaJ2 CMM_2823 CMM_2793 CMM_1008 wzm CMM_1472 vals CMM_1817 CMM_0197 CMM_1473 pckA CMM_0383 ppcA CMM_2148 rbfA CMM_2578 CMM_1818 CMM_0367 phnD CMM_2371 gItA7 CMM_2792 CMM_2484 CMM_2976 CMM_2291 CMM_0296 pCM2_0059 CMM_1448 CMM_1620 CMM_1668 CMM_2244 greA CMM_0520 CMM_0839 CMM_2575 acpS CMM_2452 CMM_1815 ruvA CMM_2972 parA CMM_2777 CMM_0220 CMM_1689 CMM_1111 CMM_0964 CMM_0227 CMM_2453 CMM_0792 CMM_2758 CMM_2925 CMM_1506 CMM_1282 CMM_1156 CMM_0521 CMM_0361 CMM_2109 lacZ CMM _2268 mfdA CMM_2665 acyl CoA thioesterase II glycine betaine carnitin ABC transporter ATPase methylisocitrate Iyase phosphonomutase transcription antitermination protein pseudouridine synthase NPL P60 family secreted protein conserved hypothetical protein putative endonuclease inosine uridine preferring nucleoside hydrolase transcriptional regulator CopG family oxidoreductase conserved hypothetical protein ABC transporter fused permease and ATPase succinate dehydrogenase cytochrome b subunit peptide ABC transporter ATPase elongation factor P EF P sugar ABC transporter permease component chaperone conserved membrane protein conserved hypothetical protein putative acyl dehydratase polysaccharide ABC transporter permease component val
119. 8 Thaxtomin biosynthesis the path to plant pathogenicity in the genus Streptomyces Antonie Van Leeuwenhoek 94 1 3 10 Madhaiyan M Poonguzhali S Kwon S W and Sa T M 2010 Bacillus methylotrophicus sp nov a methanol utilizing plant growth promoting bacterium isolated from rice rhizosphere soil Int J Syst Evol Microbiol 60 Pt 10 2490 2495 Manzer F and Genereux H 1981 Ring root pp 31 32 In W J Hocker Compendium of potato diseases Am Phytopathol Soc St Paul MN USA Marschner P 1986 Mineral nutrients of higher plants pp 77 82 Academic Press London McCulloch L 1925 Aplanobacter insidiosum n sp the cause of an alfalfa disease Phytopathol 15 496 497 Meletzus D Bermpohl A Dreier J and Eichenlaub R 1993 Evidence for plasmid encoded virulence factors in the phytopathogenic bacterium Clavibacter michiganensis subsp michiganensis NCPPB382 J Bacteriol 175 7 2131 2136 Meletzus D and Eichenlaub R 1991 Transformation of the phytopathogenic bacterium Clavibacter michiganense subsp michiganense by electroporation and development of a cloning vector J Bacteriol 173 1 184 190 Molino Henares A J Krell T Guazzaroni M E Segura A and Ramos J L 2006 Members of the IcIR family o fbacterial transcriptional regulators function as activators and or repressors FEMS Microbiol Rev 30 157 186 Literaturverzeichnis 137 Monteiro Vitorello C B Cama
120. 8 sucC CMM _1489 rp U CMM 0435 fepB CMM _1734 tktA CMM_1673 xysA CMM _1167 atpA CMM 1844 CMM_0841 ipyA CMM 2921 CMM 2871 pgaA transaldolase hypothetical protein subtilisin like extracellular serine protease peptidase family S8A glutamate ABC transporter substrate binding protein sugar ABC transporter substrate binding protein succinyl CoA ligase ADP forming subunit alpha extracellular serine protease Fe3 siderophore ABC transporter SBP conserved secreted protein anion ABC transporter substrate binding protein peptide ABC transporter substrate binding protein hypothetical secreted protein extracellular serine protease conserved secreted protein cold shock protein peptide ABC transporter substrate binding protein conserved secreted protein hemagglutinin hemolysin related protein possible cell surface protein hypothetical protein polar amino acid ABC transporter SBP glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase 30S ribosomal protein S8 proteinase aconitate hydratase DNA directed RNA polymerase subunit alpha 30S ribosomal protein S1 cell division initiation protein cell surface protein conserved secreted protein putative bacteriocin ketol acid reductoisomerase phosphoglycerate kinase conserved hypothetical protein DNA binding protein serine threonine protein kinase putative Fe dependent peroxidase pyruvate 2 oxoglutarate dehydrogenase complex dihydrolipoamide acyltransferase E2 c
121. 9 suhB CMM_0005 CMM_1157 prfA CMM_1362 ftsY CMM_2621 fusA CMM_1766 CMM_0237 CMM_2078 CMM_2786 rpIA CMM_1629 CMM_1709 30S ribosomal protein S20 2Fe 2S ferredoxin acetyltransferase undecaprenyl phosphate alpha N acetylglucosaminyl transferase conserved hypothetical protein heat inducible transcriptional repressor ATP phosphoribosyltransferase CMM_PS_03 deoxyuridine 5 triphosphate pyrophosphatase peptide ABC transporter substrate binding protein DNA directed RNA polymerase subunit beta transcriptional regulator TetR family hypothetical membrane protein hypothetical membrane protein C P carbon phosphorus lyase component transcriptional regulator GntR family anthranilate phosphoribosyltransferase permease DMT family DNA repair protein 50S ribosomal protein L24 transcriptional repressor preprotein translocase subunit geranylgeranyl pyrophosphate synthase ribonucleoside diphosphate reductase conserved hypothetical protein DNA primase nicotinate nucleotide adenylyltransferase transcriptional regulator TetR family DNA or RNA helicase arginyl tRNA synthetase conserved membrane protein tRNA pseudouridine synthase B cell cycle protein membrane protein ATP GTP binding protein conserved membrane protein ABC transporter permease component involved in cell division transcriptional regulator MarR family alanine racemase secreted phosphohydrolase conserved hypothetical protein membrane
122. 9 CMM_0196 sugar ABC transporter substrate binding protein IV 1 23 2 pCM1_0006 hypothetical protein IV 2 Anhang 169 Fortsetzung Tabelle 25 H here Transkriptmengen in XMM Medium als in TBY Medium 22 8 19 1 14 9 14 2 14 0 12 7 12 5 11 7 10 9 9 8 9 4 9 4 9 3 9 3 9 0 8 7 8 4 7 8 7 8 7 5 7 5 7 3 7 0 6 8 6 6 6 3 6 3 6 0 5 9 5 9 5 8 5 4 5 3 5 2 5 2 5 2 5 1 5 0 4 8 4 8 4 8 4 8 4 6 4 5 4 5 4 5 4 3 4 2 4 1 4 1 4 1 4 0 4 0 4 0 3 9 3 8 3 7 3 7 3 7 3 7 3 5 3 5 CMM_2054 metE2 CMM_0197 CMM 2188 CMM 2252 CMM_0198 CMM_1789 CMM_0183 CMM_2733 CMM_1960 CMM_2842 CMM_0345 CMM_2843 pCM1_0007 CMM_1245 CMM_1957 CMM_1208 IipA CMM_1956 CMM_1243 CMM_1478 CMM_1448 CMM_2400 CMM_0428 CMM_0445 CMM_0521 CMM_1849 CMM_0186 CMM_0265 CMM_0145 CMM_2330 CMM_2527 CMM_2731 CMM_2730 CMM_0366 CMM_2844 CMM_2060 CMM_1829 CMM_2235 CMM_0430 CMM_1265 CMM_0866 CMM_2845 CMM 1662 fadA CMM_0813 CMM_0678 pknC CMM_0185 metC CMM_2857 CMM_1949 CMM_2563 livM CMM_1075 CMM_0104 CMM_2196 gcvH CMM_0184 metET CMM _2665 CMM_2197 gcvT CMM_0581 CMM_1266 CMM_0661 CMM_2107 CMM_1827 CMM_0367 phnD CMM_0630 rocD CMM_0641 5 methyltetrahydropteroyltriglutamate homocysteine methyltransferase sugar ABC transporter permease component conserved membrane protein putative transporter conserved secreted protein sugar ABC transporter permeas
123. 993 CMM _0025 romJ2 CMM _0397 CMM _1377 CMM 0153 dnaJ7 CMM _1726 CMM_0396 CMM _1818 CMM _0394 CMM_2484 CMM_0643 CMM_1506 CMM_2575 acpS CMM_2214 CMM_0587 hemE CMM_0861 rpIL CMM_2650 CMM_1486 CMM_2180 CMM_0964 CMM_2441 CMM_1407 gatC CMM 2552 glpQ1 CMM_2577 coaA CMM 1076 CMM _1704 CMM 2494 phoU CMM _0413 CMM _0860 rplJ CMM_2381 CMM_1547 leuS CMM_1410 CMM_2777 CMM_2951 CMM_1356 CMM_2745 CMM_1651 CMM_1647 murX CMM_0874 rnhA CMM_1758 pykA CMM_1564 hrcA CMM_0947 CMM_1311 smpB CMM_2791 murB CMM_1759 gitD CMM_1909 cpsY CMM_2899 CMM_0568 CMM_2476 CMM_2144 truB CMM_0337 CMM_2964 pcnA CMM_0024 CMM_1200 uvrD3 CMM_2013 CMM_2530 CMM_2475 CMM_2797 agIC CMM_2541 dimethylarginine dimethylaminohydrolase drug exporter RND family stress induced protein putative organic hydroperoxide resistance protein glycine betaine carnitin ABC transporter ATPase 3 methyladenine DNA glycosylase 50S ribosomal protein L36 2 ABC transporter ATPase conserved hypothetical protein putative endonuclease chaperone curved DNA binding protein ABC transporter ATPase Na efflux ABC transporter permease component glutamine amidotransferase subunit pdxT conserved hypothetical protein putative protein disulfide isomerase oxidoreductase short chain dehydrogenase oxidoreductase holo acyl carrier protein synthase thiol disulfide oxidoreductase uroporphyrinogen decarboxylase
124. ATPase gamma glutamyltranspeptidase citrate synthase carboxylesterase hypothetical protein putative excisionase membrane protein permease DMT family 3 oxoacyl acyl carrier protein synthase Ill conserved membrane protein TerC family hypothetical protein curved DNA binding protein putative pseudogene homologous to C terminus of XysB Sec independent twin arginine protein translocase protein iron ABC transporter substrate binding protein hypothetical membrane protein conserved hypothetical protein putative phosphotransferase transcriptional regulator TetR family homoserine dehydrogenase membrane protein acetyl propionyl CoA carboxylase subunit ATP synthase gamma chain F ATPase gamma subunit conserved membrane protein putative pilus assembly protein sugar ABC transporter substrate binding protein glycerol uptake facilitator protein MIP family membrane metalloendopeptidase subfamily M23B branched chain amino acid aminotransferase RNA polymerase sigma factor ECF subfamily sugar ABC transporter substrate binding protein conserved membrane protein oxidoreductase dehydrogenase oxidoreductase Fe3 hydroxamate ABC transporter SBP ATPase involved in chromosome partitioning transcription antitermination protein iron siderophore ABC transporter permease component conserved hypothetical protein myo inositol dehydrogenase peptide ABC transporter permease component glutaryl CoA dehydrogenase conserved hypot
125. Ambion Austin USA Anschlie end wurde die RNA erneut mit dem RNeasy Plant Mini Kit Qiagen Hilden behandelt Die Konzentration der RNA wurde am Nanodrop ND1000 Spectrophotometer peqlab Biotechnologie GmbH Erlangen bei einer Wellenl nge von 260 nm bestimmt Die Reinheit sollte dabei f r Azgo Azgo zwischen 2 0 und 2 2 liegen 3 3 2 3 Gelelektrophoretische Auftrennung von RNA Die Qualit t der RNA Proben siehe Abschnitt 3 3 2 1 und 3 3 2 2 wurde mittels Gelelektrophorese untersucht 3 ul Probe wurden dazu mit 5 ul RNA Ladepuffer versetzt und in einem Agarose Gel aufgetrennt siehe Abschnitt 3 3 1 5 Der Erfolg der RNA Isolierung wurde durch die 16 S und die 23 S rRNA Banden angezeigt 10 x MOPS Puffer 200 mM MOPS 50 mM Natriumacetat 10 mM EDTA pH NaOH 7 0 RNA Ladepuffer 2 x MOPS Puffer 0 2 w v Bromphenolblau 0 2 w v Xylencyanol FF 65 v v Formamid 12 v v Formaldehyd 2 w v Saccharose Lagerung bei 20 C 3 3 2 4 Herstellung von RNA Sonden mittels in vitro Transkription Die f r RNA Hybridisierungen mit spezifischen mRNAs ben tigten antisense RNA Sonden wurden ber in vitro Transkription hergestellt Dabei wurde zuerst ein etwa 500 bp gro es DNA Fragment des zu untersuchenden Gens ber PCR siehe Abschnitt 3 3 1 3 amplifiziert Der verwendete R ckw rts Primer enthielt am 5 Ende die Sequenz des T7 Promotors Uber den die Synthese der Sonde durch eine T7 RNA Polymerase gew hrleistet wurde Da
126. C transporter ATPase hypothetical protein unnamed protein product conserved secreted protein short chain dehydrogenase oxidoreductase glycosyltransferase hypothetical protein arylesterase short chain dehydrogenase oxidoreductase conserved hypothetical protein metal ABC transporter permease component ABC transporter permease component acyl CoA dehydrogenase glutathione S transferase sugar MFS permease CDP glycerol poly glycerophosphate glyceropho sphotransferase hypothetical protein hypothetical protein transcriptional regulator TetR family conserved protein putatively involved in pyridoxine biosynthesis hypothetical protein alpha mannosidase 11 2 IV 2 V 2 IV 2 V 2 IV 1 1 1 V 2 1 2 V 2 1 2 IV 1 V 2 IV 2 IV 6 V 2 IV 1 V 1 1 5 1 2 V 2 IV 1 V 1 1 2 V 1 V 2 1 2 IV 3 IV 7 IV 3 V 1 11 2 IV 3 IV 2 V 2 IV 1 V 2 IV 1 IV 5 11 2 11 2 IV 3 IV 1 V 2 V 2 V 1 11 2 V 2 V 1 1 2 V 2 IV 1 IV 1 V 1 IV 5 IV 1 11 2 V 2 V 2 IV 3 1 5 V 2 1 1 h h h h h h d h ee eee _ h l h mh h h h h h h h d h d h l h h l ee eee eee _ h mh h h l _ h mh h ee h h d h M ARRA RARARARARRARARARA A BH A PP PP PL LPLOIITITAU TAI AI AI AI AI AI AI AI AO DDDDOO 9 OON NN N NSSNSISN IS S00 00 pCM1_0018 CMM_0661 CMM_0663 CMM_0736 furA CMM_0877 araD CMM_1608 wzx7 CMM_1575 CMM_0113 CMM_1607 wcmM CMM_16
127. CA die f r niedrigere Mengen in XMM Medium als negativer Wert angegeben ist COG Gen Name FCA M gliche Funktion 1 1 CMM_0362 2 7 a glucosidase 1 1 CMM _0883 bglJ 4 5 B glucosidase 1 1 CMM_0105 ramA 2 4 a rhamnosidase 1 1 CMM_1473 pckA 34 4 phosphoenolpyruvate carboxykinase 11 2 CMM_0245 5 8 hypothetical secreted protein sortase sorted V4 CMM 0685 34 antimicrobial peptide ABC transporter permease component IV 1 CMM_0684 3 4 antimicrobial peptide ABC transporter ATPase IV 1 CMM_1314 10 9 iron ABC transporter substrate binding protein IV 1 CMM_0197 23 8 sugar ABC transporter permease component IV 1 CMM_0196 30 9 sugar ABC transporter substrat binding protein IV CMM_2931 fecB2 6 84 e R ABC transporter substrate binding IV 2 CMM_1306 1 94 putative secreted protein IV 3 CMM_0865 7 2 transcriptional regulator Lacl family IV 5 CMM_0096 cytC 2 3 ferredoxin reductase IV 5 CMM_0094 cytA 4 7 cytochrom P450 IV 5 CMM_0095 cytB 4 9 3Fe 4S ferredoxin V6 CMM_2535 sbtB 26 ieee extracellular serine protease peptidase IV 6 CMM_1674 xysB 3 9 endo 1 4 B xylanase B IV 6 CMM_0795 5 53 extracellular nuclease phosphatase IV 6 CMM_0918 1 53 secreted phosphohydrolase V 1 CMM_2780 2 4 sugar hydrolase V 2 pCM2_0059 16 14 conserved hypothetical protein Von den 247 Genen deren Transkriptmengen in XMM Medium h her waren als in M9
128. CMM 2475 CMM_2724 CMM_0485 und CMM_1319 und in M9 Medium CMM_ 2462 CMM _1063 und pCM2_0036 Die Score Werte lagen dabei im Mittel bei 40 Zusammengefasst war somit in einer Cmm382 Kultur in XMM Medium im Vergleich zu M9 Medium keine erh hte Konzentration an Regulatoren zu erkennen die zum Beispiel die Anpassung der Genexpression von Virulenzgenen an die ver nderten Bedingungen hervor rufen k nnten 4 4 3 Transkriptomanalysen Um die ermittelten Proteomdaten auf RNA Ebene zu best tigen und weitere Gene zu identifizieren die bei der Virulenz des Bakteriums eine Rolle spielen wurden Microarray Experimente in drei bis f nf biologischen Replikaten durchgef hrt Dabei wurden die Transkriptmengen der Gene von Cmm382 nach der Kultivierung in zwei Medien verglichen Ergebnisse 86 Aus beiden Kulturen wurde die RNA isoliert diese in CDNA umgeschrieben und mit je einem Farbstoff markiert Dadurch konnten nach der Hybridisierung an die 3 107 Oligonukleotide auf dem Microarray Chip Unterschiede in der Transkriptmenge ermittelt werden Die Durchf hrung und Auswertung der Microarray Experimente erfolge am Lehrstuhl f r Biochemie Universit t Erlangen N rnberg gemeinsam mit Stephen Reid und Dr Sophia Sonnewald Die Gene wurden gem Fl gel und Kollegen in die entsprechenden COG Gruppen eingeteilt Fl gel et al 2012 4 4 3 1 Vergleich synthetisches Medium XMM und Minimalmedium M9 Um eine m gliche nderung der Genregulation i
129. CMM_ 2485 B Transkriptionsstartpunkt auf dem Strang der DNA identisch mit dem Startcodon von CMM _ 2510 Es handelt sich um ein leaderless Transkript ohne Ribosomen Bindestelle k 1 000 reads Etwa 90 Nukleotide stromaufw rts von CMM_2485 war eine Erh hung der read Zahl auf 50 000 zu erkennen Abbildung 32 A und Tabelle 17 was auf einen Transkriptionsstartpunkt hinweist Mit dem Erreichen des Startcodons von CMM_2510 stieg die read Zahl auf 80 000 87 000 an Abbildung 32 B und Tabelle 17 CMM_2510 liegt auf dem Strang der DNA was in VAMP 1 7 5 durch eine Darstellung unterhalb der Lokalisationsachse zu erkennen ist Da eine hohe Anzahl an 5 Transkripten mit dem Startcodon von CMM_2510 zusammen Ergebnisse 108 fielen handelt es sich hierbei um ein eaderless Transkript dessen Sequenz keine Ribosomen Bindestelle enth lt Die Startpunkte f r die Transkription und Translation sind identisch Tabelle 17 H chste identifizierte read Zahlen der 5 Transkripte von C michiganensis subsp michiganensis mittels VAMP 1 7 5 M M9 Medium T TBY Medium Nt Nukleotide stromaufwarts stromabw rts im Gen read Zahl N Gen Funktion 104 600 T 150 Nt CMM_2270 rplY 50S ribosomal protein L25 a E leaderless CMM_2510 sigK Ee Me S Ola lacion EC 62 000 T 150 Nt CMM_2580 rplM 50S ribosomal prot
130. CMM_ 2565 livF CMM_2007 gluA CMM_0429 CMM_2112 CMM_1101 CMM_1312 CMM_0417 CMM_1244 CMM_0685 CMM_0684 CMM_2210 CMM_0663 CMM_2064 CMM 2006 gluB CMM_1955 CMM_0195 CMM_ 2562 livH CMM_2901 CMM_1102 CMM_2195 gcvP CMM_2278 CMM_1071 CMM_1946 CMM_0610 CMM_2059 CMM_2592 CMM_0303 CMM_1664 CMM_ 2382 CMM _0786 trxC CMM_1041 bgIK CMM _2098 CMM_2106 CMM _0873 metB CMM _0296 CMM 0392 CMM _0681 fabB CMM_0479 CMM_2277 CMM_0407 CMM_1364 CMM_0683 coaBC CMM_1831 glpK CMM_2036 CMM_2281 proline glycine betaine choline ABC transporter permease component hypothetical protein sortase sorted transcriptional regulator PadR family enoyl CoA hydratase 3 hydroxyacyl CoA dehydrogenase hypothetical protein conserved hypothetical protein universal stress protein sugar ABC transporter permease component oxidoreductase ABC transporter permease component proline glycine betaine choline ABC transporter ATPase acyl CoA dehydrogenase conserved hypothetical protein putative DNA ligase conserved hypothetical protein branched chain amino acid ABC transporter ATPase pyridine nucleotide disulphide oxidoreductase subtilisin like extracellular serine protease peptidase family S8A branched chain amino acid ABC transporter ATPase glutamate ABC transporter ATPase conserved secreted protein conserved hypothetical protein putative phosphotransferase transcriptional regulator TetR family iron ABC
131. CMM_2620 tuf elongation factor Tu EF Tu 111 3 2 306 CMM_1736 pgiA glucose 6 phosphate isomerase 1 1 2 290 CMM_1600 gmdA GDP mannose 4 6 dehydratase 11 2 1 276 CMM_2568 groES 10 kDa chaperonin protein Cpn10 GroES protein IV 4 2 263 CMM_0866 alpha glucoside ABC transporter SBP IV 1 3 241 CMM_2467 hydrolase V 1 3 241 CMM_0839 membrane bound metalloprotease IV 7 3 Anhang Fortsetzung Tabelle 19 extrazellul res Proteom von Cmm382 in M9 Medium 239 231 202 197 192 178 164 150 148 145 144 140 130 126 125 117 113 97 96 93 93 92 92 91 90 89 87 86 86 84 83 83 82 79 79 73 72 72 66 64 63 63 61 59 57 54 54 53 52 51 51 51 48 46 46 45 44 43 43 42 41 CMM_1735 talA pCM2_0042 CMM_2535 sbtB CMM_2006 gluB CMM_0879 CMM_2547 sucD pCM1_ 0023 ppav CMM_0166 fhuD CMM_0178 CMM_1790 CMM_2420 CMM_1081 CMM_0044 ppaC CMM_1389 CMM_1611 cspA7 CMM_1960 CMM_2491 CMM_0431 pCM2_0047 CMM_2628 CMM_1744 gapA CMM_2604 rpsH CMM_0930 CMM_1659 acnA CMM_2584 rpoA CMM_1752 rpsA CMM_1852 CMM_0819 wcoA CMM_0235 CMM_1096 ilvC CMM_1743 pgk CMM_1458 CMM_2934 hupB CMM_0015 pknB CMM_2177 CMM_1641 aceF CMM_0638 CMM_1126 CMM_0128 CMM_0795 CMM_1104 euB CMM_1948 ppal CMM_0931 pbpE CMM_2566 livk CMM_0737 katA CMM_2621 fusA CMM_1461 dpsA CMM_0441 CMM_1745 sodA CMM_1835 gcrC CMM_0049 nagA CMM_254
132. COG Gruppe 1 1 und an der Translation COG Gruppe III 3 beteiligt Tabelle 12 In einer Cmm382 Kultur in XMM Medium waren 20 Proteine vorhanden denen eine m gliche Funktion bei der Wirt Pathogen Interaktion zugeordnet wurde in M9 Medium waren es nur 12 Proteintransporter oder Regulatoren wurden keine identifiziert Die Proteine die den h chsten Score Wert in einer Cmm382 Kultur in XMM Medium aufwiesen waren dabei die Chaperonin Proteine GroES CMM_2568 2 155 und GroEL CMM_2478 1 412 sowie eine Enolase CMM_2263 1 614 siehe Abschnitt 7 2 Tabelle 21 In einer Cmm382 Kultur in M9 Medium wiesen das Chaperonin Protein GroEL CMM_2478 1 742 und ein DNA Bindeprotein CMM_2934 807 die h chsten Score Werte auf siehe Abschnitt 7 2 Tabelle 21 Wie auch schon f r die extrazellul ren Proteine wurden einige zytoplasmatische Proteine lediglich in einem oder zwei der Replikate identifiziert Die Liste der somit insgesamt detek tierten zytoplasmatischen Proteine in M9 Medium 276 und XMM Medium 335 befindet sich im Anhang siehe Abschnitt 0 Tabelle 21 und Tabelle 22 In dieser Liste sind 39 zus tzliche Proteine der COG Gruppe IV die nur in einem oder zwei der Replikate in einer M9 Kultur identifiziert wurden und 44 zus tzliche Proteine in einer XMM Kultur Dabei waren jedoch lediglich sechs bzw sieben Proteine Regulatoren In beiden Medien wurden die Regulator Gene CMM 1757 CMM_2468 und CMM_1884 exprimiert in XMM Medium zus tzlich
133. Cmm382 mit internen reads CMM_2586 rpsM CMM_2587 rpmJ1 CMM_2588 infA CMM_2596 mapA2 CMM_2597 adkA CMM_2598 secY CMM_2599 rplO CMM_2600 rpmD CMM_2601 rpsE CMM_2602 rp R CMM_2603 rpIF CMM_2604 rpsH CMM_2605 rp E CMM_2606 rpI X CMM_2607 rpIN CMM_2608 rpsQ CMM_2609 rpmC CMM_2610 rp P CMM_2611 rpsC CMM_2612 rpIV CMM_2613 rpsS CMM_2614 rp B CMM_2615 rpIW CMM_2616 rpID CMM_2617 rpIC CMM_2618 rpsJ CMM_2620 tuf CMM_2621 fusA CMM_2622 rpsG CMM_2623 rpsL CMM_2630 rpoC CMM_2631 rpoB CMM_2644 CMM_2688 CMM_2689 CMM_2706 CMM_2707 CMM_2713 CMM_2714 CMM_2744 CMM_2773 CMM_2774 CMM_2775 CMM_2786 rpIA CMM_2787 rpIK CMM_2788 nusG CMM_2789 secE CMM_2808 menH CMM_2846 CMM_2847 CMM_2895 CMM_2901 CMM_2935 rpsN CMM_2936 rpmG CMM_2937 rpmB CMM_2950 purB CMM_2962 ssb CMM_2963 rpsF CMM_2968 trxA CMM_2975 CMM_2976 CMM_2977 rnpA CMM_2978 rpmhH CMM_PS_20 30S ribosomal protein S13 50S ribosomal protein L36 translation initiation factor IF 1 methionine aminopeptidase adenylate kinase preprotein translocase subunit secY 50S ribosomal protein L15 50S ribosomal protein L30 30S ribosomal protein S5 50S ribosomal protein L18 50S ribosomal protein L6 30S ribosomal protein S8 50S ribosomal protein L5 50S ribosomal protein L24 50S ribosomal protein L14 30S ribosomal protein S17 50S ribosomal protein L29 50S ribosomal protei
134. Die Ammoniumkonzentration wurde durch den Vergleich mit einer Standardkurve ermittelt bei der die Absorption unterschiedlicher NH CI Konzentrationen gemessen wurde L sung 4 72 v v Phenol 0 025 w v Natriumnitroprussid L sung Il 2 5 w v Natriumhydroxid 5 245 v v Natriumhypochlorit 3 4 2 Analyse der Nitratkonzentration F r die Bestimmung der Nitratkonzentration wurde das Nitrate determination Kit Roche Mannheim verwendet Die Durchf hrung erfolgte nach Angaben des Herstellers wobei jeweils nur die H lfte der vorgegebenen Volumina eingesetzt wurde Die Absorption wurde bei 340 nm gemessen 3 4 3 Analyse der Zucker und Aminos urenkonzentration Um die Konzentration von Zuckern Glucose Fructose und Saccharose und Aminos uren zu bestimmen wurden dem Probenvolumen von 100 ul 500 ul 100 iges v v Ethanol zugef gt Der Inkubation f r 60 min bei 80 C und einer anschlie enden langsamen Abk hlung f r 15 min auf Raumtemperatur folgte ein Zentrifugationsschritt 13 000 x g 5 min Der berstand wurde f r 60 90 min in einer Savant DNA SpeedVac Thermo Scientific Langenselbold vakuumgetrocknet und daraufhin in 250 ul H2Opides resuspendiert Extrakt Die weitere Durchf hrung erfolgte durch J Hofmann Lehrstuhl f r Biochemie Universit t Erlangen N rnberg F r die Bestimmung der Aminosauren Konzentration wurden daf r 10 ul des Extrakts mit Hilfe des Fluorophors 6 aminoquinolyl N hydroxysuccimidyl ca
135. Fluoreszenz unter Pg nA1 600000 300000 500000 250000 2 400000 Q 200000 300000 150000 200000 100000 100000 50000 0 0 RFU oDs o 150 bp 200 bp 250 bp Abbildung 30 GFP Fluoreszenzmessung A Ermittelte Fluoreszenz der St mme Cmm102pDM302PpfkAgfp 1 Ppat Tgfp 2 und Pg nA1gfp 3 nach Wachstum in TBY Medium B Ermittelte Fluoreszenz des Stammes Cmm102pDM302Pg nA1gfp mit der Promotorgr e von 150 bp 200 bp und 250 bp nach Wachstum in Minimalmedium dunkelgr n und Minimalmedium ohne Ammonium hellgr n Sowohl in Minimalmedium dunkelgr n als auch in Minimalmedium ohne Ammonium hellgr n war eine leicht gesteigerte Fluoreszenz zu erkennen wenn die Promotorregion von ginA1 200 bp umfasste im Gegensatz zu der um 50 bp k rzeren oder 50 bp l ngeren Region Abbildung 30 B Ein vollst ndiger Verlust der GFP Expression war jedoch unter keiner der Promotorregionen zu erkennen In den 150 Nukleotiden stromaufw rts des g nA1 Startco dons sind somit anscheinend alle f r eine Transkription wichtigen Sequenzen enthalten Die 5 Region von gInAT CMM_1636 umfasst 193 bp bis zum Startcodon des folgenden Gens CMM_1637 das im Gegensatz zu gInAT auf dem Vorwartsstrang liegt Abbildung 31 A Um den exakten Transkriptionsstartpunkt zu identifizieren wurden 5 RACE Experimente durchgef hrt Dazu wurde die Gesamt mRNA aus einer Cmm382 Kultur in M9 und XMM Medium verwendet In beiden Medien lag der Transkriptions
136. IC 50S ribosomal protein L3 111 3 1 3 CMM_2339 hypothetical membrane protein V 2 1 3 CMM_1116 conserved membrane protein TerC family IV 1 1 3 CMM_1331 two component system response regulator IV 3 1 2 CMM_0399 conserved hypothetical protein V 2 1 2 CMM_2790 aspC aspartate aminotransferase 1 2 1 2 CMM_2397 hypothetical protein V 2 1 2 CMM_1990 tyrS tyrosyl tRNA synthetase 111 3 conserved membrane protein putative ABC transporter 1 2 CMM 1963 cIvG permease component IV 1 1 2 CMM _0989 punA purine nucleoside phosphorylase 1 3 1 1 CMM_2055 aptA adenine phosphoribosyltransferase 1 3 conserved membrane protein putative multidrug exporter 1 1 CMM_2855 MOP MATE family IV 1 1 1 CMM _0741 conserved membrane protein IV 1 1 1 CMM_2301 hypothetical protein V 2 Tabelle 24 Mittels Microarray Experiment ermittelte C michiganensis subsp michiganensis Gene deren mRNA Level in XMM Medium niedriger war als in M9 Medium 179 Gene wurden identifiziert von denen 31 eine 2 oder mehrfach h here Transkriptmenge zeigten Die Gene wurden nach dem absteigenden FCA Wert geordnet FCA fold change absolute FCA Gen Name M gliche Funktion COG 6 8 CMM_2931 fecB2 iron siderophore ABC transporter substrate binding protein IV 1 4 2 CMM_2729 conserved hypothetical protein sortase sorted 11 2 3 9 CMM _1129 siderophore interacting protein 1 6 3 5 CMM _1759 gitD glutamate synthase NADPH beta subunit 1 2 2 Anhang 166 Fortsetzung Tabell
137. III malonyl CoA acyl carrier protein transacylase pyruvate dehydrogenase E1 component conserved hypothetical protein putative Zn ribbon protein glutamine synthetase I dihydrolipoyl dehydrogenase conserved hypothetical protein putative transcriptional regulator hypothetical secreted protein giycerophosphoryl diester phosphodiesterase conserved hypothetical protein trehalose synthase 50S ribosomal protein L31 type B ABC transporter ATPase 2Fe 2S ferredoxin putative Fe S cluster assembly protein ABC transporter putative Fe S cluster assembly protein ABC transporter transketolase glucose 6 phosphate 1 dehydrogenase conserved hypothetical protein protein export membrane protein glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase superoxide dismutase 30S ribosomal protein S1 glutamate synthase NADPH beta subunit tryptophan synthase beta chain indole 3 glycerol phosphate synthase membrane protein guanylate kinase GMP kinase integration host factor IHF fusion protein elongation factor P EF P 30S ribosomal protein S4 conserved hypothetical protein putative ATPase conserved hypothetical protein GTP pyrophosphokinase conserved protein putatively involved in pyridoxine biosynthesis conserved hypothetical protein HIT family hydrolase threonyl tRNA synthetase glycerol uptake facilitator protein MIP family glycerol kinase cytochrome c oxidase subunit Ill ubiquinol cytochrome c reductase cytochrome c subunit
138. Latenzzeit erst sp t auf kann die Pflanze berleben Die entstehenden Fr chte k nnen schwarze Flecke bilden sogenannte birds eyes Gartemann et al 2003 C michiganensis subsp michiganensis kann ber eine Infektion der Tomatenfr chte in die Samen gelangen sodass auch die n chste Generation infiziert ist Auch in dieser kann das Bakterium so lange latent leben bis die Bedingungen optimal sind und es zur Ausl sung von Krankheitssymptomen kommt Tsiantos 1987 Eine Sameninfektion kann ebenfalls ber eine Kontamination des Saatguts stattfinden Hogenhout amp Loria 2008 Von der Samenoberfl che gelangt C michiganensis subsp michiganensis in die Pflanze und besiedelt dort zu Beginn vor allem die ersten sichtbaren Bl tter Cotyledonen und den St ngel Hypocotyl der keimenden Pflanze Xu et al 2010 Dabei ist nicht bekannt wie das Bakterium in die Pflanze gelangt Auf kontaminiertem oberirdischem Material k nnen die Bakterien 24 Monate berleben unterirdisch nur sieben Monate Gleason et al 1991 Eine schnelle Zerst rung der Bakterien ber Kompostierung oder Pasteurisierung ist nicht m glich Francis et al 2010 Ausbreitung und Wachstum der Bakterien k nnen jedoch durch chemische Anwendungen mit Kupferverbindungen Hausbeck et al 2000 oder durch die Verwendung des Antibiotikums Fragarin aus Erdbeerbl ttern einged mmt werden Filippone et al 2001 Au erdem zeigte ein Streptomyces Stamm eine antimikrobielle Aktiv
139. M2_0052 phpB CMM_1136 CMM _1367 rpsP CMM_1642 ipdB CMM_2462 CMM_1490 rpmA CMM_0737 katA CMM_2614 rp B CMM_0517 CMM_0911 CMM_2600 rpmD CMM_2783 CMM_2584 rpoA CMM_2622 rpsG CMM_1383 rpsB CMM_1831 gipK CMM_1587 CMM _1373 rp S CMM _0441 CMM_2616 rpID CMM 2431 CMM _1180 CMM _1357 romF CMM_2599 rplO CMM _0429 CMM_2936 romG CMM_1480 expA CMM_2960 rpll CMM_2226 fbaA CMM_1521 CMM_1485 ndkA CMM_2491 CMM_2583 rp Q CMM_1463 tig CMM_1636 gInAT CMM_0151 dnak CMM_1819 CMM_1752 rpsA CMM_2602 rp R CMM_2775 CMM_1384 tsf CMM_2177 CMM_1734 tktA proline glycine betaine choline ABC transporter SBP elongation factor Tu EF Tu 30S ribosomal protein S17 30S ribosomal protein S9 hypothetical secreted protein pyruvate kinase 50S ribosomal protein L31 type B aspartyl glutamyl tRNA Asn GIn amidotransferase subunit B 30S ribosomal protein S15 50S ribosomal protein L16 serine protease family S1B 30S ribosomal protein S6 rhs related protein beta lactamase superoxide dismutase extracellular serine protease family S1A conserved hypothetical protein 30S ribosomal protein S16 dihydrolipoyl dehydrogenase transcriptional regulator histone like protein 50S ribosomal protein L27 catalase 50S ribosomal protein L2 transcriptional regulator LytR family hypothetical protein sortase sorted 50S ribosomal protein L30 sugar ABC transporter substrate binding pro
140. MALDI ToF MS Daten des zytoplasmatischen Proteoms von Cmm382 Zur Analyse des zytoplasmatischen Proteoms von Cmm882 in Minimalmedium M9 und in dem synthetischen Xylemsaft imitierenden Medium XMM wurden die Bakterienzellen aus 450 ml Kultur aufgeschlossen und die Proteine nach der Fallung mit 10 w v Trichloressig s ure mittels MALDI ToF Massenspektrometrie analysiert Die Analyse erfolgte in biologischen Triplikaten Dabei wurden 276 Proteine in der M9 Kultur identifiziert Tabelle 19 und 335 in der XMM Kultur Tabelle 20 Die Einteilung der Gene von Cmm382 in die entsprechenden COG Gruppen wurde aus Fl gel et al 2012 bernommen Tabelle 21 Mittels MALDI ToF MS identifizierte zytoplasmatische Proteine aus Cmm382 in Minimalmedium M9 Dargestellt sind alle 276 Proteine die in einem oder mehreren Replikaten 1 2 oder 3 bei der Analyse des zytoplasmatischen Proteoms identifiziert wurden Die entsprechenden Gene wurden nach dem absteigenden Score Wert geordnet SBP substrat binding protein PBP penicillin binding protein Score Gen Name m gliche Funktion COG Pee 1 742 CMM _ 2478 groEL 60 kDa chaperonin protein Cpn60 GroEL protein IV 4 3 807 CMM_2934 hupB DNA binding protein IV 3 3 661 CMM_2263 eno enolase 2 phosphoglycerate dehydratase 1 1 3 660 CMM_2620 tuf elongation factor Tu EF Tu 111 3 3 601 CMM_0861 rpIL 50S ribosomal protein L7 L12 111 3 3 525 CMM_1600 gmdA GDP mannose 4 6 dehydratase 11 2 3 497 CMM_2547
141. MM_2501 Transkriptionsregulator NV pat 1 pCM2_0054 extrazellulare Serinprotease SP TMD pelA1 CMM_0043 Pektat Lyase TMD pelA2 CMM_0051 Pektat Lyase SP TMD pfkA CMM_0604 6 Phosphofructokinase NV pgaA CMM_2871 Polygalacturonase SP phpA pCM2_0053 extrazellul re Serinprotease SP TMD phpB pCM2_0052 extrazellul re Serinprotease SP TMD ppaA CMM_0041 extrazellul re Serinprotease NV ppaB1 CMM_0042 extrazellulare Serinprotease SP TMD ppaB2 CMM_0050 extrazellul re Serinprotease SP TMD ppaC CMM_0044 extrazellulare Serinprotease TMD ppaD CMM_0075 extrazellulare Serinprotease SP ppaE CMM_0071 extrazellulare Serinprotease TMD ppaF CMM_0764 extrazellulare Serinprotease TMD ppaG CMM_1942 extrazellulare Serinprotease SP TMD ppaH CMM_1947 extrazellulare Serinprotease SP TMD Gentabelle Name Lokus M gliche Funktion SP oder TMD ppal CMM_1948 extrazellulare Serinprotease SP TMD ppaJ pCM1_0023 extrazellulare Serinprotease SP sbtA CMM_0070 Subtilisin ahnliche extrazellul re Serinprotease TMD sbtB CMM_2535 Subtilisin ahnliche extrazellulare Serinprotease TMD sbtC CMM_2536 Subtilisin ahnliche extrazellulare Serinprotease SP tomA CMM_0090 Endo 1 4 Glycosidase Tomatinase SP TMD xylA CMM_0882 Xylose Isomerase NV xysA CMM_1673 Endo 1 4 Xylanase A TMD xysB CMM_1674 Endo 1 4 Xylanase B NV CMM_0504 Phospholipase C NV one CMM_ 2382 Perforin NV T CMM_2408 Transkriptionsregula
142. MM_2563 livM CMM_2566 livK CMM_2568 groES CMM_2579 rpsi CMM_2580 rp M CMM_2583 rp Q CMM_2584 rpoA CMM_2585 rpsK two component system sensor kinase hydrolase or DNA binding competence protein cytidylate kinase argininosuccinate synthase citrulline aspartate ligase 50S ribosomal protein L20 50S ribosomal protein L35 translation initiation factor IF 3 polyribonucleotide nucleotidyltransferase conserved hypothetical protein conserved hypothetical protein Ku homolog siderophore biosynthesis protein hypothetical protein hypothetical protein sugar ABC transporter permease component beta galactosidase translation initiation factor IF 2 nucleic acid binding protein 3 oxoacyl acyl carrier protein synthase 4 hydroxy 3 methylbut 2 en 1 y diphosphate synthase 4 aminobutyrate aminotransferase conserved secreted lipoprotein putative Fe dependent peroxidase GTP binding protein typA bipA homolog peptide ABC transporter ATPase conserved membrane protein peptide ABC transporter permease component peptide ABC transporter permease component peptide ABC transporter substrate binding protein cysteine desulfurase hypothetical secreted protein peptidoglycan binding hypothetical secreted protein putative pilin conserved hypothetical protein conserved hypothetical protein conserved hypothetical protein transcription elongation factor NADH dehydrogenase enolase 2 phosphoglycerate dehydratase 50S riboso
143. M_0349 transcriptional regulator DeoR family IV 3 conserved membrane protein putative multidrug exporter 1 2 CMM_2855 MOP MATE family IV 1 1 2 CMM _0251 transcriptional regulator Lacl family IV 3 1 2 CMM_2737 peptide ABC transporter ATP binding protein IV 1 1 2 CMM _1448 hypothetical protein V 2 1 2 CMM_2065 two component system sensor kinase IV 3 1 2 CMM_1283 conserved membrane protein V 2 1 2 CMM_2587 rpmd 50S ribosomal protein L36 Ul 1 1 2 CMM_2352 conserved hypothetical protein V 2 1 2 CMM_0199 hypothetical protein V 2 1 2 CMM_0516 hydrolase HAD superfamily V 1 1 2 CMM_2537 icdA isocitrate dehydrogenase 1 1 1 2 CMM 1574 membrane bound esterase VA 1 2 CMM_1940 transposase 18481 family 111 1 1 2 CMM_2099 hypothetical protein V 2 1 2 CMM_1850 dnaE2 DNA polymerase III alpha subunit U4 1 2 CMM_2588 infA translation initiation factor IF 1 111 3 1 2 CMM_1427 dinB DNA polymerase IV 11 1 1 2 CMM_2480 hypothetical protein V 2 1 2 CMM_2691 endoglucanase IV 6 1 2 CMM _1341 leuC 3 isopropylmalate dehydratase large subunit 1 2 1 2 CMM_1197 uvrD2 ATP dependent DNA helicase 111 1 1 2 CMM _1120 ungA uracil DNA glycosylase 111 1 1 2 CMM_1861 murD UDP N acetylmuramoylalanine D glutamate ligase 11 2 1 1 CMM_2576 gImS glucosamine fructose 6 phosphate aminotransferase 1 1 1 1 CMM _1492 proB glutamate 5 kinase Gamma glutamyl kinase 1 2 1 1 CMM 1417 short chain dehydrogenase V1 1 1 CMM_1729 2Fe 2S ferredoxin IV 5 1 1 CMM_0321 oxidoreduc
144. M_1390 Na H antiporter CPA1 family IV 1 1 5 CMM _1299 xylulose kinase 1 1 1 5 CMM_1134 arginase 1 2 1 5 CMM_0132 conserved secreted protein V 2 1 5 CMM _1085 otsA trehalose phosphate synthase 1 1 1 5 CMM _1247 sipX signal peptidase I IV 2 1 5 CMM_1944 hypothetical membrane protein V 2 1 5 CMM_2836 permease DMT family IV 1 1 5 CMM_2213 conserved hypothetical protein universal stress protein IV 4 1 4 CMM _1046 conserved secreted protein V 2 1 4 CMM_0526 hypothetical protein V 2 1 4 CMM_2208 hypothetical protein V 2 1 4 CMM_1623 membrane protein V 2 1 4 CMM_PS_09 CMM_PS_09 V 2 conserved membrane protein putative polysaccharide 1 4 CMM_1025 wzy4 polymerase 11 2 1 4 CMM_2059 hypothetical secreted protein V 2 1 4 CMM_1032 conserved hypothetical protein V 2 1 4 CMM_0524 conserved membrane protein V 2 Anhang 181 Fortsetzung Tabelle 27 H here Transkriptmengen in M9 Medium als in TBY Medium 1 4 CMM_0907 tdkA thymidine kinase 1 3 1 4 CMM_0403 gipT glycerol 3 phosphate MFS permease IV 1 1 4 CMM_0391 hypothetical secreted protein V 2 1 4 CMM _1467 clpX ATP dependent Clp protease ATP binding subunit clpX IV 4 1 4 CMM_1364 lyase IV 5 1 4 CMM _1538 acetyltransferase V 1 1 4 CMM_0739 acetyltransferase V 1 1 4 CMM_0447 conserved hypothetical protein V 2 1 4 CMM_1188 conserved membrane protein V 2 1 4 CMM_0307 sulfurtransferase 1 2 1 4 CMM_0624 npsC non ribosomal peptide synthase 1 6 1 4 CMM_2305 multidrug efflux MFS permease IV 1 1
145. M_1423 sulfite oxidase 1 2 1 5 CMM_2352 conserved hypothetical protein V 2 1 4 CMM_1431 treY maltooligosyltrehalose synthase 1 1 1 4 CMM_0090 tomA tomatinase endo 1 4 beta glycosidase IV 6 1 4 CMM_2896 hypothetical membrane protein V 2 1 4 CMM_1140 pyridoxamine phosphate oxidase 1 5 1 4 CMM_0645 two component system sensor kinase IV 3 1 4 CMM_2742 hydrolase V 1 1 4 CMM_2548 sucC succinyl CoA ligase ADP forming subunit beta 1 1 1 4 CMM_1513 Zn dependent oxidoreductase V 1 1 4 CMM_2394 hypothetical membrane protein V 2 1 4 CMM_1687 tatA Sec independent twin arginine protein translocase protein IV 2 1 4 pCM2_0001 conserved hypothetical protein V 2 1 4 CMM_0942 ribokinase 1 1 1 4 CMM_0739 acetyltransferase V 1 1 4 CMM_0962 ribC riboflavin synthase alpha chain 1 5 1 4 CMM_1698 nucleoside diphosphate sugar epimerase 1 1 1 4 CMM_0350 carbohydrate kinase 1 1 1 4 CMM _1718 glycosyltransferase 11 2 1 4 CMM_0593 conserved hypothetical protein 1 5 1 3 CMM_1238 conserved membrane protein V 2 1 3 CMM_0604 pfkA 6 phosphofructokinase 1 1 1 3 CMM_2805 conserved hypothetical protein putative signal peptidase IV 2 1 3 CMM_PS_05 chpA extracellular serine protease IV 6 1 3 CMM_0391 hypothetical secreted protein V 2 1 2 CMM_1382 sugar MFS permease IV 1 1 2 CMM _1742 tpiA triosephosphate isomerase 1 1 1 2 CMM_0526 hypothetical protein V 2 1 2 CMM_1743 pgkA phosphoglycerate kinase 1 1 1 2 CMM_2389 permease DMT family IV 1 1 2 CMM_1036 copP co
146. M_1451 CMM_1458 CMM_1469 CMM_1507 CMM_1519 zwfA1 CMM_1559 CMM_1567 CMM_1572 CMM_1586 dnaG CMM_1596 wcmE CMM_1601 wcmH CMM _1619 fabD CMM_1624 CMM_1631 ppgK7 CMM_1632 CMM_1639 CMM_1644 CMM_1656 dutA CMM_1664 CMM_1713 CMM_1718 CMM _1719 glgC CMM_1755 polA1 CMM_1757 CMM_1771 hisE putative fumarylacetoacetate hydrolase potassium channel protein beta subunit potassium channel protein alpha subunit transcriptional regulator TetR family Zn dependent hydrolase acetyltransferase Asp Glu tRNA amidotransferase siderophore interacting protein F420 dependent NADP reductase pyridoxamine phosphate oxidase arginyl tRNA synthetase transcriptional regulator AsnC family succinyl diaminopimelate desuccinylase Sec independent twin arginine protein translocase protein Mg2 transporter MgtE family conserved membrane protein conserved hypothetical protein putative phosphoesterase octanoyltransferase lipoate protein ligase B transcriptional regulator TetR family carboxylesterase acetyltransferase ATP dependent RNA helicase hypothetical protein multidrug ABC transporter ATPase Zn dependent alcohol dehydrogenase conserved membrane protein conserved hypothetical protein glutamate racemase cobalt zinc cadmium efflux permease CDF family inosine monophosphate dehydrogenase oxidoreductase methionine aminopeptidase conserved hypothetical protein cysteine desulfurase tRNA specific 2 thiouridylase cons
147. Medium wurden 24 den COG Gruppen Metabolismus zellul re Prozesse und Informationsspeicherung und prozessierung zugeordnet Tabelle 13 und Abbildung 20 Der Hauptanteil der Gene kodiert f r Proteine des Energie und Kohlenstoffwechsels COG Gruppe I 1 sowie f r Proteine des Aminos urestoffwechsels COG Gruppe 1 2 Dazu geh ren zum Beispiel die zwei Gene CMM_0362 und CMM_0883 bglJ die f r Glucosidasen kodieren sowie CMM_0105 welches f r eine Rhamnosidase kodiert Ebenfalls Ergebnisse 89 zur COG Gruppe 1 1 geh rt das Gen CMM_1473 das f r eine Phosphoenolpyruvat Carboxykinase kodiert Die Transkriptmenge von CMM_1473 war in XMM Medium im Vergleich zu M9 Medium um den Faktor 34 4 h her Tabelle 14 sodass es bei diesem Gen den gr ten Unterschied in der Transkriptmenge zwischen M9 und XMM Medium gab 37 der Gene deren mRNA Level in XMM Medium h her war als in M9 Medium wurden der COG Gruppe IV zugeordnet deren Mitglieder vermutlich wichtig f r die Wirt Pathogen Interaktion sind 68 dieser Gene kodieren f r Transporter Tabelle 13 darunter auch die Gene CMM_0684 und CMM_0685 deren Genprodukte antimikrobielle Peptidtransporter sind Tabelle 14 28 Gene deren Transkriptmengen in XMM Medium h her waren als in M9 Medium kodieren f r Zuckertransporter wobei die Gene CMM _0196 und CMM_0197 die st rkste nderung der Transkriptmengen zeigten Tabelle 14 11 der Gene in der COG Gruppe IV kodieren
148. MerR family IV 3 1 5 CMM_2316 conserved hypothetical protein putative phosphomutase lyase V 2 1 5 CMM_1421 conserved hypothetical protein putative phosphoesterase V 2 1 5 CMM_0938 multidrug export ABC transporter ATPase IV 1 1 5 CMM_2216 hypothetical protein V 2 1 5 CMM_0950 conserved hypothetical protein V 2 1 5 CMM_0939 multidrug export ABC transporter permease component IV 1 1 5 CMM_2924 hypothetical membrane protein V 2 1 5 CMM_2183 peptide ABC transporter permease component IV 1 1 5 CMM_2212 amino acid permease APC family IV 1 1 4 CMM_0288 oxidoreductase V 1 1 4 CMM_1425 conserved hypothetical protein V 2 1 4 CMM_2323 hypothetical membrane protein V 2 1 4 CMM_1444 hypothetical protein V 2 1 4 CMM_0305 acetyltransferase V 1 1 4 CMM_1718 glycosyltransferase 11 2 1 4 CMM_0547 transcriptional regulator ArsR family IV 3 1 4 CMM_1258 conserved hypothetical protein V 2 1 4 CMM_1866 conserved hypothetical protein V 2 1 4 CMM_0677 sbcD dsDNA exonuclease subunit 11 1 1 4 CMM_0850 conserved membrane protein V 2 1 4 CMM_0254 conserved hypothetical protein V 2 1 4 CMM_2469 serC phosphoserine aminotransferase 1 2 1 4 CMM_0591 hypothetical protein 1 5 1 4 CMM_0946 sugar ABC transporter permease component IV 1 1 4 CMM 2111 glutaredoxin IV 5 1 4 CMM_2661 hypothetical membrane protein V 2 1 4 CMM_0666 flavin dependent reductase 1 1 1 3 CMM_1562 conserved hypothetical protein V 2 1 3 CMM_0426 manganese containing catalase IV 5 1 3 CMM_2617 rp
149. Molekularbiologische und biochemische Charakterisierung von Clavibacter michiganensis subsp michiganensis Der Naturwissenschaftlichen Fakultat der Friedrich Alexander Universit t Erlangen N rnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr rer nat vorgelegt von Eva Maria Hiery aus N rnberg Als Dissertation genehmigt von der Naturwissen schaftlichen Fakultat der Friedrich Alexander Universitat Erlangen N rnberg Tag der m ndlichen Pr fung 26 07 2013 Vorsitzender des Promotionsorgans Prof Dr Johannes Barth Gutachter Prof Dr Andreas Burkovski PD Dr Frederik B rnke Danksagung Danksagung Ein gro er Dank gilt Prof Dr Andreas Burkovski f r die Bereitstellung eines sehr interessanten und vielseitigen Themas die guten Tipps und Vorschl ge die immer offene T r und das immer offene Ohr f r die Geduld beim Korrekturlesen der Arbeit und f r die Begutachtung dieser Ein weiterer Dank geht an PD Dr Frederik B rnke f r die bernahme des Zweitgutachtens dieser Arbeit Ein weiterer Dank geht an Prof Dr R Eichenlaub f r die Bereitstellung des Wildtypstammes Cmm382 des plasmidfreien Stammes Cmm100 und des Plasmids pDM302 Ich m chte mich ganz herzlich bei dem Lehrstuhl f r Biochemie bedanken f r die Herzlichkeit und die gro e Hilfsbereitschaft und f r die Bereitstellung der Tomaten und Tabakpflanzen sowie die Nutzung des Gew chshauses Ein besonderer Dank gilt dabei Christine Stephen Nurcan An
150. NWDWDDADADNDNNH HOO OO O CMM_2919 deoC CMM_1643 pepA CMM_1680 CMM_2544 purH CMM_1225 CMM_0965 trpS CMM_1828 CMM_2062 dpsB CMM_0388 CMM_1953 CMM_2796 CMM_0604 pfkA CMM_2936 romG CMM_0581 CMM_0538 upp CMM_0640 CMM_2011 infC CMM_2485 CMM_1551 rpsT CMM_1063 CMM_0734 CMM_1753 CMM_2935 rpsN CMM_13683 ffhA CMM_1356 CMM_0878 araA CMM_1656 dutA CMM_1770 hisG CMM_0153 dnaJ7 CMM _1783 carA CMM_2597 adkA CMM 2369 CMM 2155 CMM 0486 CMM 1195 CMM 1459 rpiA CMM_2890 CMM_2060 CMM_0857 cipC CMM_1250 CMM_2931 fecB2 CMM_2566 livk CMM_2090 CMM_2037 thyX CMM_0974 manC CMM_1157 prfA deoxyribose phosphate aldolase cytosol aminopeptidase leucine aminopeptidase short chain dehydrogenase oxidoreduxtase AICAR transformylase IMP synthetase ATP dependent RNA helicase tryptophanyl tRNA synthetase dihydroxyacetone kinase DNA binding ferritin like protein alkaline shock protein conserved hypothetical protein oxidoreductase 6 phosphofructokinase 50S ribosomal protein L33 putative general stress response protein uracil phosphoribosyltransferase conserved hypothetical protein translation initiation factor IF 3 sugar ABC transporter ATPase 30S ribosomal protein S20 transcriptional regulator CarD family amidohydrolase CN hydrolase conserved hypothetical protein 30S ribosomal protein S14 signal recognition particle protein conserved hypothetical protein L arabinose
151. Pflanze Nicotiana Nicotiana Arten Tabak und M jalapa Wunderblume sind resistent gegen ber einer Infektion mit C michiganensis subsp michiganensis Nach der Infektion wird das bakterielle Wachstum durch einen lokalen Pflanzenzelltod Nekrose inhibiert sodass die Ausbreitung der Bakterien in der Pflanze verhindert wird Gitaitis 1990 Alarc n et al 1998 Mysore amp Ryu 2004 Balaji et al 2011 Nekrotisches Gewebe wird dabei durch eine hypersensitive Antwort hervorgerufen an der zum Beispiel auch die pflanzlichen Proteine Hsr201 und Hsr203J beteiligt sind Gitaitis 1990 Pontier et al 1994 Czernic et al 1996 Alarc n et al 1998 In dieser Arbeit wurde untersucht wann und wie stark nach der Infektion von Tabakbl ttern mit C michiganensis subsp michiganensis nekrotisches Gewebe gebildet wurde und ob dadurch das bakterielle Wachstum eingeschr nkt war siehe Abschnitte 4 2 1 und 4 2 2 Au erdem wurden die Transkriptmengen von hsr203J in bakteriell und MgOl behandelten Bl ttern verglichen um zu berpr fen ob die Bildung von nekrotischem Gewebe auf eine hypersensitive Antwort zur ckzuf hren war siehe Abschnitt 4 2 2 In allen Analysen wurde Diskussion 113 dabei der Wildtypstamm Cmm382 mit dem plasmidfreien Stamm Cmm100 verglichen 48 h nach der bakteriellen Infektion war in Tabakblattern eine Gelbf rbung des Gewebes Chlorose und vereinzelt auch schon eine lokale Nekrose zu erkennen die sich bis zu acht Ta
152. Restriktionsenzymen Accl und Sphl aus dem Plasmid pDrivecat geschnitten und in den geschnittenen Vektor pUC18 Yanisch Perron et al 1985 ligiert pUC18fCMM_2408cat F r die nachfolgende Durchf hrung von Insertionsmutagenese Studien wurde ein 480 bp gro es Fragment von CMM_2408 mit den Oligonukleotiden 2408_Xbal_fw 5 GGCCTCTAG AACGATGGCGGCGAGCGGCTG 3 und 2408 Xbal_rev 5 GGCCTCTAGATAGCCCACG CTCACCGCAAC 3 amplifiziert mit dem Restriktionsenzym Xbal geschnitten und in den geschnittenen Vektor pUC18cat ligiert pUC18fCMM_2766cat F r die nachfolgende Durchf hrung von Insertionsmutagenese Studien wurde ein 430 bp gro es Fragment von CMM_2766 mit den Oligonukleotiden 2766_Xbal_fw 5 GGCCTCTAG ACTACGAGGGCTGGCAGATCC 3 und 2766_Xbal_rev 5 GGCCTCTAGACGCATGAGGT AGCGCAGCAG 3 amplifiziert mit dem Restriktionsenzym Xbal geschnitten und in den geschnittenen Vektor pUC18cat ligiert pUC18fpCM2_0056cat F r die nachfolgende Durchf hrung von Insertionsmutagenese Studien wurde ein 630 bp gro es Fragment von pCM2_0056 mit den Oligonukleotiden 0056_Xbal_fw 5 GGCCTCTA GAACGGCAGAGGAACGCATCAC 3 und 0056_Xbal_rev 5 GGCCTCTAGAACCGACTC GCTGACGATCTC 3 amplifiziert mit dem Restriktionsenzym Xbal geschnitten und in den geschnittenen Vektor pUC18cat ligiert pUC18npill Fur die Herstellung einer pCM1_0056 CMM_0055 Doppelmutante wurde das Plasmid pUC18nptll konstruiert Das Neomycin Resistenzgen wurde dabei mit den Oligonukl
153. Tage nach der Wurzelin fektion mit Cmm382 A F nf mit 10 mM MgCl behandelte Pflanzen Kontrolle B F nf mit Cmm382 infizierte Pflanzen Welkesymptome waren in unterschiedlichen Wachstumsstadien zu erkennen C D Weitere beobachtete Krankheitssymptome nach der Infektion mit Cmm382 waren St ngell sionen und ein verringertes Wachstum Als Krankheitssymptome traten Blattwelke St ngell sion und verringertes Wachstum auf War eine Blattwelke dabei sehr fr h zu erkennen 3 dpi trat diese zusammen mit einem verringerten Wachstum auf und die Pflanzen starben nach etwa 14 Tagen ab Abbildung 11 Ergebnisse 66 B rechts War die Blattwelke sehr spat sichtbar 10 dpi wenn an der Pflanze schon etwa 15 20 Blatter zu erkennen waren Abbildung 11 B links trat davor meist eine Stangellasion auf und es dauerte langer bis die Pflanzen abstarben Stangellasionen traten allgemein in der Regel zusammen mit einer Blattwelke auf Bei sehr kleinen Pflanzen war eine Stangellasion schwer oder gar nicht zu erkennen da die St ngel sehr d nn blieben Eine St ngell sion wurde zum Teil auch als erstes Krankheitssymptom der Pflanze beobachtet wenn noch keine Welke zu erkennen war Abbildung 11 C Infizierte Pflanzen zeigten in seltenen F llen auch 2 3 Wochen nach der Infektion keine sichtbaren Krankheitssymptome wie Welke oder St ngell sion Sie waren jedoch im Vergleich zu gesunden Pflanzen erheblich in ihrem Wachstum eingeschr nkt Abbildung 11
154. ToF MS analysiert Die Ergebnisse 96 Gr e von Transkriptionsregulatoren variiert zwischen 15 und 40 kDa Henikoff et al 1988 Seoane amp Levy 1995 Amon et al 2008 F r die Analyse wurden deshalb nur Proteine zwischen 10 kDa und 50 kDa ausgew hlt Jede analysierte Proteinbande lieferte 3 78 verschiedene Proteine Aus diesen wurden die Proteine ausgew hlt deren m gliche Funktion die Regulation der Transkription ist vgl Abbildung 24 Insgesamt wurden in den drei Medien M9 XMM und XVM2 76 solcher Proteine in Bindungsexperimenten mit der Promotorregion von pat 1 identifiziert und 58 f r die Promotorregion von ce A wobei 70 der Proteine an beide Promotorregionen gebunden hatten siehe Abschnitt 7 5 Tabelle 31 Drei dieser Regulatoren wurden f r weiterf hrende Studien ausgew hlt Abbildung 24 CMM_2408 kodiert f r einen Transkriptionsregulator der IcIR Familie Regulatoren dieser Familie binden als ein Dimer oder zwei Dimere an die 5 Region von Genen die unter anderem an der Pathogenit t von Phytopathogenen beteiligt sind Molino Henares et al 2006 Das Genprodukt von CMM_2408 wurde nach der Bindung der Proteinextrakte in allen drei Medien von der Promotorregion von pat 7 eluiert und in zwei der Medien auch von der Promotorregion von celA pCM2_0056 wurde aufgrund der Lokalisation in der N he von pat 1 pCM2_0054 ausgew hlt Das entsprechende Genprodukt konnte von den Promotor regionen von pat T und ce A eluiert werde
155. V 2 V 2 111 3 V 2 1 6 IV 3 IV 1 V 2 V 2 V 2 1 4 111 1 V 1 1 4 1 2 1 2 IV 1 V 1 V 2 1 1 1 5 IV 3 204 Anhang Fortsetzung Tabelle 33 leaderless Transkripte der Gene im Genom von Cmm382 CMM_2469 serC CMM_2472 CMM_ 2475 CMM_2493 CMM_2495 pgmA CMM_2496 CMM_2511 CMM_2515 CMM_2516 CMM_2518 gaIT CMM_2534 CMM_2555 CMM_2559 guaB1 CMM_2572 CMM_2625 CMM_2633 CMM_2645 CMM_2646 CMM_2745 CMM_2757 CMM_2790 aspC CMM_2795 CMM_2797 agIC CMM_2808 menH CMM_2810 menF CMM_2813 CMM_2814 CMM_2858 CMM_2865 CMM_2870 CMM_2874 CMM_2880 CMM_2913 CMM_2918 CMM_2926 CMM_2930 fecC2 CMM_2944 CMM_2945 hisC2 CMM_2946 CMM_2955 CMM_2957 prfC CMM_2964 pcnA CMM_2965 CMM_PS_19 phosphoserine aminotransferase hypothetical membrane protein two component system response regulator two component system sensor kinase 2 3 bisphosphoglycerate dependent phosphoglycerate mutase methylase conserved hypothetical protein hypothetical protein aldose 1 epimerase galactose 1 phosphate uridylyltransferase ABC transporter ATPase conserved membrane protein inosine 5 monophosphate dehydrogenase conserved hypothetical protein putative metalloprotease hypothetical membrane protein conserved hypothetical protein putative polyamine synthase transcriptional regulator TetR family conserved hypothetical protein putative F420 dependent NADP reductase hypothetical membrane pr
156. V 5 1 1 1 1 V 2 V 2 11 2 11 1 1 2 IV 1 IV 2 V 2 IV 3 V 2 1 2 V 2 V 2 11 2 1 1 V 2 V 2 V 2 V 2 1 4 IV 3 11 2 V 2 V 2 IV 2 IV 1 V 2 Ul 1 V 2 1 6 V 2 IV 7 V 2 V 2 178 Anhang Fortsetzung Tabelle 27 H here Transkriptmengen in M9 Medium als in TBY Medium 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 es ed es oe m much Fre much ed ed ee ed oes ed much meh much lee ed le he Fur much le ee OOOOOCOONNNNNNNNNNNNNOO 0 0 0 0 DO 0 0 O O O O O O O O00 OO HOO OW O CMM_1446 msrA CMM_2689 CMM_1325 CMM_0661 CMM_2112 CMM_2060 CMM_0641 CMM_1461 dpsA CMM_0506 CMM_1131 CMM_2042 pepR CMM_0604 pfkA CMM_1532 prox CMM_2967 trxB7 CMM_2027 CMM_1624 CMM_2210 CMM_2339 CMM_0872 cysB CMM_1632 pCM2_0031 CMM_1897 CMM_1634 gInA2 CMM_0405 CMM_1186 CMM_2178 CMM_1612A pCM2_0057 CMM_2848 CMM_2734 CMM_1372 CMM _0484 nagD CMM 1731 CMM _0668 CMM _1475 CMM_2376 CMM_2735 glpX CMM_0663 CMM_0745 CMM_0018 ftsW7 CMM_1724 CMM_1140 CMM_1609 wemN CMM_1425 CMM_0014 pabA CMM_0741 CMM_2101 CMM_1520 CMM_2895 CMM_1468 dcpA pCM2_0058 CMM_0237 CMM_0210 CMM_2737 CMM_1442 CMM_2119 CMM_1151 CMM_1275 pCM2_0037 CMM_1238 CMM_0013 CMM_1024 wcqM CMM_0873 metB CMM_0284 peptide methionine sulfoxide reductase hypothetical protein conserved membrane protein conserved hypothetical protein putative NTPase conserved hypothetical protein putative phosph
157. XVM2 Medium ein Xylemsaft imitierendes in vitro Medium XMM etabliert Ein Vergleich des Proteoms und Transkriptoms von C michiganensis subsp michiganensis in diesem synthetischen Medium XMM und einem Minimalmedium zeigte keine erh hte Konzentration von Virulenzfaktoren im XMM Medium daf r jedoch eine erh hte Transkriptmenge von Genen die f r Transporter kodieren Diese Ergebnisse weisen darauf hin dass das XMM Medium die Bedingungen im n hrstoffarmen Xylemsaft in einem fr hen Stadium der bakteriellen Infektion imitiert in dem vermutlich das Hauptziel der Bakterien die N hrstoffaufnahme das Wachstum und die Ausbreitung ist F r C michiganensis subsp michiganensis wurde eine Analyse der Regulation und der Promotorregionen von Virulenzgenen noch nicht oder nur in ersten Ans tzen durchgef hrt Dreier et al 1997 Jahr et al 2000 Aus diesem Grund waren die Identifizierung putativer Regulatoren f r die beiden am besten charakterisierten Virulenzgene pat 1 und ce A und die Analyse von Promotorregionen mittels RNA Sequenzierung weitere Ziele dieser Arbeit Die Analyse putativer Regulatoren wurde dabei durch homologe Sequenzen zwischen dem bakteriellen Chromosom und den beiden nat rlichen Plasmiden erschwert Die Genprodukte von CMM_2408 und CMM_2766 wurden als Regulatoren von pat 1 welches f r eine Serinprotease kodiert identifiziert und greifen vermutlich als Repressoren in die Regulation der pat 1 Genexpression ein Des Weiteren
158. _1020 g fA CMM_0561 aspS CMM_1166 atpH CMM_2605 rp E CMM_1738 opcA CMM_1136 CMM_2610 rp P CMM_1819 CMM_1104 euB CMM_1135 CMM_1657 CMM_0873 metB CMM_2615 rplW CMM_0903 asdA CMM_1641 aceF CMM_1278 CMM_2600 rpmD CMM_2461 CMM_0643 CMM_0921 CMM_1409 gatB CMM 1772 CMM 1526 succinyl CoA ligase ADP forming subunit beta cell division initiation protein 30S ribosomal protein S17 potassium channel protein beta subunit 30S ribosomal protein S16 50S ribosomal protein L3 nucleoside diphosphate kinase 6 phosphogluconate dehydrogenase indole 3 glycerol phosphate synthase 50S ribosomal protein L9 pyruvate kinase 3 oxoacyl acyl carrier protein synthase 30S ribosomal protein S5 DNA directed RNA polymerase subunit omega GMP synthase peroxiredoxin threonine synthase inorganic pyrophosphatase ketol acid reductoisomerase 50S ribosomal protein L24 dihydrolipoyl dehydrogenase 30S ribosomal protein S7 acetyl propionyl CoA carboxylase subunit tRNA rRNA methyltransferase ATP synthase subunit beta F ATPase subunit beta ATP dependent Clp protease proteolytic subunit conserved hypothetical protein transketolase conserved secreted protein putative PBP elongation factor Ts EF Ts putative monooxygenase involved in AB biosynthesis 50S ribosomal protein L11 30S ribosomal protein S1 30S ribosomal protein S19 50S ribosomal protein L29 50S ribosomal protein L4 30S ribosomal protein
159. _2264 hisS CMM_1006 wegB CMM_0511 CMM_2637 CMM_1578 recO CMM_1308 prfB CMM_2363 moeB CMM 1581 glyS CMM_1386 frrA CMM_0842 CMM_2458 CMM_2819 CMM_1096 ilvC CMM_0313 CMM_0757 purF CMM_1656 dutA CMM_1875 CMM_2875 CMM_2574 alrA1 CMM_2977 rnpA CMM_0920 CMM_2002 pheT CMM_1668 CMM 1857 ftsQ CMM_2829 CMM_1002 CMM_1972 CMM_0475 xthB CMM_2126 CMM_0944 CMM_1977 rluA CMM_1585 dgtA CMM_0010 ppiA CMM_2026 CMM_2800 CMM_2145 apbA CMM_1873 pknE CMM_0896 ackA CMM_2853 CMM_1777 metk CMM_2874 CMM_0532 panD CMM_2576 gImS CMM_0733 CMM_2307 CMM_1150 argS CMM_1689 CMM_ 2968 trxA ATP dependent Clp protease proteolytic subunit glutamine amidotransferase conserved membrane protein O methyltransferase aspartyl tRNA synthetase conserved hypothetical protein tryptophanyl tRNA synthetase elongation factor P EF P conserved hypothetical protein hypothetical secreted protein 50S ribosomal protein L28 DNA repair protein ABC transporter permease component involved in cell division ferric uptake regulator Fur family oxidoreductase ATP dependent Clp protease proteolytic subunit histidyl tRNA synthetase glycosyltransferase mannosyltransferase conserved secreted protein conserved hypothetical protein Zn ribbon domain DNA repair protein recombination protein peptide chain release factor RF 2 molybdenum cofactor biosynthesis protein glycyl tRNA synthetase ribosome rec
160. al ABC transporter substrate binding protein IV 1 2 1 507 CMM 2176 conserved secreted lipoprotein IV 1 3 1 369 CMM_1921 hypothetical secreted protein V 2 2 1 177 CMM _1250 hypothetical secreted protein V 2 2 1 066 CMM _ 2478 groEL 60 kDa chaperonin protein Cpn60 GroEL protein IV 4 2 1 052 CMM _ 2536 sbtC subtilisin like extracellular serine protease IV 6 3 1 004 CMM_0840 NPL P60 family secreted protein IV 6 3 1 000 CMM _1675 hypothetical secreted protein V 2 3 781 CMM_0071 ppaE extracellular serine protease IV 6 3 762 CMM_1942 ppaG extracellular serine protease IV 6 3 756 CMM_2283 metal ABC transporter substrate binding protein IV 1 3 679 CMM_0144 conserved secreted protein V 2 3 672 CMM_0050 ppaB2 extracellular serine protease IV 6 3 672 CMM_0042 ppaBT extracellular serine protease IV 6 3 635 CMM_0278 chorismate mutase 1 2 3 633 CMM_0764 ppaF extracellular serine protease IV 6 3 519 CMM_0919 pbpD penicillin binding protein 11 2 3 482 CMM_2434 serine protease family S1C IV 7 2 443 CMM_2931 fecB2 iron siderophore ABC transporter SBP IV 1 2 438 CMM_2185 peptide ABC transporter substrate binding protein IV 1 3 370 CMM_2688 acetyl xylan esterase 1 1 2 365 CMM_1872 conserved secreted protein peptidoglycan binding V 2 3 365 CMM_1842 ctaC cytochrome c oxidase subunit 2 1 1 3 350 CMM_1865 fts peptidoglycan glycosyltransferase PBP 11 2 3 332 CMM_2263 eno enolase 1 1 2 330 CMM_ 2537 icdA isocitrate dehydrogenase 1 1 2 309
161. ansporter permease component hypothetical protein sugar permease MFS superfamily glycine cleavage system H protein methionine synthase II putative sugar phosphate isomerase epimerase aminomethyltransferase putative general stress response protein Zn metalloprotease conserved hypothetical protein putative NTPase sugar ABC transporter permease component PTS system hybrid protein phosphonate ABC transporter substrate binding protein ornithine aminotransferase hypothetical protein 1 2 IV 1 IV 1 V 2 IV 1 IV 1 1 2 IV 1 IV 1 IV 1 V 2 IV 1 IV 2 IV 1 IV 1 1 5 V 1 IV 1 IV 1 V 2 1 2 1 1 V 2 VA V 1 V 1 V 2 V 2 V 2 VA IV 1 IV 1 1 1 IV 1 IV 7 1 1 V 1 11 2 V 2 IV 1 V 2 1 4 1 4 IV 3 1 2 V 2 IV 1 IV 1 V 2 IV 1 1 2 1 2 V 2 1 2 IV 4 IV 7 V 2 IV 1 IV 1 IV 1 1 2 V 2 Anhang 170 Fortsetzung Tabelle 25 H here Transkriptmengen in XMM Medium als in TBY Medium 3 5 3 5 3 4 3 4 3 4 3 4 3 3 3 3 3 2 3 2 3 2 3 2 3 1 3 1 3 1 3 1 3 1 3 1 3 1 3 0 3 0 3 0 2 9 2 9 2 9 2 9 2 9 2 9 2 9 2 9 2 9 2 9 2 9 2 9 2 8 2 8 2 8 2 8 2 8 2 8 2 7 2 7 2 7 2 7 2 7 2 6 2 6 2 6 2 6 2 6 2 6 2 5 2 5 2 5 2 5 2 5 2 5 2 4 2 4 2 4 2 4 CMM_1530 proW CMM_0911 CMM_1207 CMM_1661 fadB pCM2_0038 CMM_2213 CMM_2108 CMM_0859 CMM_ 2031 CMM_1529 proV CMM_1945 CMM_2074 CMM_0640 CMM_2564 livG CMM_1132 CMM_2535 sbtB
162. ase conserved hypothetical protein N utilization substance protein B homolog oligopeptide ABC transporter permease component sugar ABC transporter permease component sugar ABC transporter ATPase oxidoreductase conserved membrane protein sugar ABC transporter substrate binding protein glycosyl hydrolase family 2 succinate dehydrogenase hydrophobic membrane subunit beta glucosidase topoisomerase II subunit A hypothetical protein crossover junction endodeoxyribonuclease citrate synthase succinate dehydrogenase flavoprotein subunit oxidoreductase sugar ABC transporter ATPase IV 3 1 4 1 2 IV 1 IV 1 V 1 1 1 IV 1 IV 5 1 1 1 1 11 2 IV 7 V 2 IV 1 1 1 IV 1 IV 1 V 1 IV 3 IV 1 11 2 1 1 IV 1 IV 1 V 1 1 1 IV 3 V 2 IV 1 V 2 IV 1 IV 1 1 4 V 1 IV 1 1 1 1 1 IV 1 1 3 V 2 V 1 IV 1 1 1 1 2 IV 1 1 3 V 2 11 2 IV 1 IV 1 IV 1 V 1 IV 1 IV 1 1 1 1 1 1 1 111 1 V 2 111 1 1 1 1 1 V 1 IV 1 183 Anhang Fortsetzung Tabelle 28 Niedrigere Transkriptmengen in M9 Medium als in TBY Medium 2 9 2 9 2 9 2 9 2 9 2 9 2 8 2 8 2 8 2 8 2 8 2 8 2 8 2 7 2 7 2 7 2 7 2 7 2 7 2 7 2 7 2 6 2 6 2 6 2 6 2 6 2 6 2 6 2 6 2 5 2 5 2 5 2 5 2 5 2 5 2 5 2 5 2 5 2 4 2 4 2 4 2 4 2 4 2 4 2 4 2 4 2 4 2 4 2 4 2 4 2 4 2 4 2 4 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 CMM_1453 tesB CMM_1701 CMM_2379 prpB CMM_2
163. ase Na H dicarboxylate symporter DAACS family sugar ABC transporter permease component carboxylesterase sugar phosphate isomerase epimerase sugar ABC transporter ATPase thiol disulfide oxidoreductase myo inositol dehydrogenase alpha mannosidase dTDP glucose 4 6 dehydratase membrane bound metalloendopeptidase family M23 conserved hypothetical protein sugar ABC transporter permease component xylose isomerase sugar ABC transporter permease component sugar ABC transporter permease component hydrolase transcriptional regulator Cro Cl family sugar ABC transporter permease component dTDP 4 dehydrorhamnose reductase fumarate hydratase ABC transporter fused permease and ATPase sugar ABC transporter permease component acetyltransferase L arabinose isomerase transcriptional regulator Lac family hypothetical protein glycerol kinase hypothetical membrane protein sugar MFS permease sugar ABC transporter permease component acetyl coenzyme A synthetase oxidoreductase dehydrogenase phosphate ABC transporter substrate binding protein beta glucosidase glycosyl hydrolase family 3 putative sugar phosphate isomerase epimerase sugar ABC transporter permease component thymidine phosphorylase conserved membrane protein NAD dependent aldehyde dehydrogenase ABC transporter substrate binding protein beta glucosidase glycosyl hydrolase family 1 aminopeptidase N sugar ABC transporter permease component cytidine deamin
164. ase dehydrogenase oxidoreductase nucleoside diphosphate kinase 3 phosphoshikimate 1 carboxyvinyltransferase L alanine dehydrogenase conserved hypothetical protein amidinotransferase 3 oxoacyl acyl carrier protein synthase ATP Synthase F ATPase subunit alpha 50S ribosomal protein L15 peptidyl prolyl cis trans isomerase 30S ribosomal protein S3 histidinol dehydrogenase 50S ribosomal protein L21 molybdenum cofactor biosynthesis protein chaperone protein dnaK heat shock protein 70 30S ribosomal protein S8 50S ribosomal protein L10 potassium channel protein beta subunit sugar phosphate isomerase epimerase 50S ribosomal protein L17 purine nucleoside phosphorylase putatively involved in pyridoxine biosynthesis ATP dependent Clp protease proteolytic subunit inorganic pyrophosphatase glutamate ABC transporter substrate binding protein F420 dependent NADP reductase superoxide dismutase endoribonuclease translation initiation inhibitor stress induced DNA binding protein DNA directed RNA polymerase subunit alpha conserved hypothetical protein oxidoreductase dehydrogenase 6 phosphogluconate dehydrogenase dihydrolipoyl dehydrogenase UTP glucose 1 phosphate uridylyltransferase fumarate hydratase N acetyl gamma glutamy phosphate reductase 50S ribosomal protein L3 111 3 1 1 11 2 V 2 IV 1 1 2 IV 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 2 IV 3 IV 1 IV 5 1 1 IV 7 1 2 1 1 VA IV 1 IV 5 IV 1 111 3 1 4 V 1 1 3 1
165. asegen ce B im Genom von C michiganensis subsp michiganensis annotiert CelB stellt jedoch ein Pseudogen dar da ihm die f r die Virulenz vermutlich essentielle C terminale Dom ne von CelA fehlt Jahr et al 2000 Gartemann et al 2008 Ob CelA in vivo ebenfalls Cellulose in der pflanzlichen Zellwand angreift konnte bis jetzt jedoch nicht gezeigt werden Die in dieser Arbeit beobachtete proteolytische Aktivit t im Medien berstand einer Cmm382 Kultur konnte bis jetzt in fr heren Publikationen nicht nachgewiesen werden Burger et al 2005 Eichenlaub amp Gartemann 2011 Diese kann aufgrund der fehlenden Aktivitat im Medien berstand einer Cmm100 Kultur auf eine oder mehrere der vier Serinprotease Gene auf pCM1 und pCM2 zur ckgef hrt werden Das Molekulargewicht der Genprodukte von pCM1_0023 ppaJ pCM2_0052 phpB pCM2_0053 phpA und pCM2_0054 pat 7 liegt zwischen 30 und 34 kDa was dem ermittelten Molekulargewicht in den Aktivit ts Experimenten in etwa entspricht Von diesen vier Serinproteasen wurden lediglich Pat 1 und PpaJ mittels Massenspektrometrie im Medien berstand einer Cmm382 Kultur in Minimal medium identifiziert sodass die ermittelte Proteaseaktivit t vermutlich durch Pat 1 und oder PpaJ hervorgerufen wurde Eine Pektinaseaktivit t konnte in dieser Arbeit nicht beobachtet werden Pektin kann jedoch direkt nur von Pektin Lyasen gespalten werden Walter 2002 f r die im Genom von Cmm382 bis jetzt keine Gene annot
166. ate binding protein hypothetical protein ATPase mutT like protein peptide ABC transporter substrate binding protein 1 4 dihydroxy 2 naphthoate octaprenyltransferase hypothetical protein conserved hypothetical protein putative ATPase pCM2_PSEUDO_0005 membrane protein hypothetical protein aldo keto reductase glyoxylase family protein pantothenate kinase hypothetical protein conserved hypothetical protein glycosidase ABC type transporter permease component aconitate hydratase short chain alcohol dehydrogenase ABC transporter permease component pyruvate 2 oxoglutarate dehydrogenase complex dihydrolipoamide dehydrogenase E3 component ATPase peptide ABC transporter permease component ABC transporter permease component involved in cell division two component response regulator glycerol 3 phosphate dehydrogenase hypothetical protein metal dependent hydrolase conserved membrane protein two component system response regulator hypothetical protein phosphoserine phosphatase undecaprenyl phosphate sugar phosphotransferase conserved hypothetical protein UDP glucose 4 epimerase acetyltransferase glucose 6 phosphate 1 dehydrogenase 195 Fortsetzung Tabelle 30 Transkriptmenge in XMM Medium AS niedriger als in XMM Medium IV 2 V 2 V 1 IV 3 1 1 11 2 V 2 V 1 11 2 11 2 IV 1 1 4 V 2 IV 1 V 1 IV 1 1 5 1 1 V 2 V 2 V 1 111 3 IV 5 IV 1 V 2 V 1 111 1 IV 1 1 5 V 2 IV 2 IV 3 V 2 V 2
167. ator GntR family conserved hypothetical protein putative ester cyclase acetolactate synthase small regulatory subunit chaperone conserved hypothetical protein putative nuclease conserved hypothetical protein N utilization substance protein B homolog possibly involved in mycothiol synthesis MFS permease conserved hypothetical protein transcription elongation factor conserved hypothetical protein aspartyl glutamyl tRNA Asn Gin amidotransferase subunit B glutamyl tRNA Gin amidotransferase subunit A conserved hypothetical protein phenylalanyl tRNA synthetase alpha subunit transcriptional regulator excinuclease ABC subunit B hypothetical membrane protein phosphoribosyl ATP pyrophosphatase membrane protein 6 phosphogluconate dehydrogenase thioredoxin reductase conserved membrane protein putative RNAse involved in tRNA maturation 30S ribosomal protein S14 ATP dependent DNA helicase conserved hypothetical protein Zn binding conserved hypothetical protein putative nuclease ATP dependent helicase ABC transporter fused permease and ATPase crossover junction endodeoxyribonuclease holliday junction resolvase transcriptional regulator phosphatase HAD hydrolase family conserved hypothetical protein membrane protein GTP binding protein obg family pseudouridine synthase phosphoenolpyruvate carboxylase 50S ribosomal protein L33 signal peptidase MFS permease elongation factor Ts EF Ts hypothetical
168. atoren f hren zu einer erniedrigten Genexpression Extrazellul re Enzyme die in die Wirt Pathogen Interaktion eingreifen spielen ausgehend von den Ergebnissen in dieser Arbeit zu diesem Zeitpunkt der Infektion noch keine gro e Rolle Bei der Expression von Virulenzgenen die beispielsweise f r extrazellulare Enzyme kodieren k nnte die Bakteriendichte von Bedeutung sein Die Transkriptomanalysen in dieser Arbeit wurden bei einer Bakteriendichte von 4 x 10 cfu ml durchgef hrt was lediglich 40 der maximal erreichten Bakteriendichte in planta entspricht Meletzus et al 1993 Erst wenn die Bakteriendichte in der Pflanze hoch genug ist k nnte die Expression von Virulenzgenen angeschaltet oder erh ht werden wie es auch schon f r R solanacearum beobachtet werden konnte Abramovitch et al 2006 Hikichi et al 2007 Zu einem sp teren Zeitpunkt der Infektion wenn N hrstoffe aus den zerst rten Pflanzenzellen zur Verf gung stehen werden Virulenzgene wie extrazellul re Enzyme vermutlich gr tenteils nicht mehr ben tigt und ihre Transkriptmenge nimmt wieder ab Fl gel et al 2012 Die Etablierung eines synthetischen Mediums das den Xylemsaft zu jedem Zeitpunkt der Infektion imitiert ist nicht m glich da die Zusammensetzung des Xylemsaftes von vielen Diskussion 123 Faktoren abhangig ist und sich somit standig verandert Marschner 1986 Im Zuge der basalen Abwehrreaktion werden nach der bakteriellen Infektion beispielswei
169. ausen im Photometer Ultraspec 2100 pro Amersham Biosciences USA ermittelt Eine oDgo0 von 1 entspricht einer Kulturdichte von etwa 10 Zellen pro ml F r die Herstellung chemisch kompetenter E coli DH5aMCR siehe Abschnitt 3 5 1 wurden die Bakterien in 25 ml LB Medium ber Nacht vorkultiviert Zur Isolierung von Plasmid DNA siehe Abschnitt 3 3 1 1 aus E coli DH5aMCR wurden die Bakterien ber Nacht in 4 ml oder 100 ml LB Medium mit dem entsprechenden Antibiotikum Tabelle 6 in Reagenzgl sern oder Erlenmeyerkolben mit Schikane ber Nacht Material und Methoden 27 bei 37 C und 190 rpm Gio Gyrotory Shaker New Brunswick Scientific New Jersey USA bzw 125 rpm SM30 Edmund B hler GmbH T bingen vorkultiviert 3 2 3 Kultivierungsbedingungen f r C michiganensis subsp michiganensis Standardm ig wurden C michiganensis subsp michiganensis St mme in 25 ml TBY Medium mit entsprechendem Antibiotikum bei 26 C und 125 rpm ber Nacht in einem Luftsch ttler SM30 Edmund B hler GmbH T bingen in Erlenmeyerkolben mit Schikane kultiviert Die optische Dichte wurde wie in Abschnitt 3 2 2 beschrieben bei 580 nm oDs 0 bestimmt Zur Isolierung von Gesamt RNA aus einer TBY Kultur wurden 50 ml TBY Medium mit der bernacht Kultur auf eine oDsg9 von 0 12 angeimpft und die Bakterien wurden bis zu einer ODsgo von 0 5 0 6 kultiviert Zur RNA Isolierung aus einer M9 oder XMM Kultur wurden 50 ml des entsprechenden Mediums abends mit ei
170. be von Material und Methoden 52 0 05 iger w v Rutheniumrot L sung einer 10 min tigen Inkubation und dem anschlieBen den Entfarben in 1 M NaCl als ungefarbte Banden gegen einen violetten Hintergrund ermittelt 5 x Probenauftragspuffer 250 mM Tris 20 w v SDS 60 v v Glycerin 10 v v B Mercaptoethanol 0 01 w v Servablau G 250 pH HCI 6 8 3 4 9 Vorbereitung der Proteine zur Analyse mittels MALDI ToF MS Zur Analyse von Oberflachenproteinen sowie extrazellularen und zytoplasmatischen Proteinen mittels MALDI ToF Massenspektrometrie wurden 30 ug Proteine bzw 30 ul Proteinl sung siehe Abschnitt 3 4 4 1 und 3 4 4 2 auf ein SDS Gel siehe Abschnitt 3 4 5 aufgetragen Kurz nach Eintritt der Proteine in das Trenngel wurde die Elektrophorese abgebrochen und das Gel wurde ge und entf rbt siehe Abschnitt 3 4 7 Die noch kaum aufgetrennten Proteine wurden als Gelblock ausgeschnitten in Rektionsgef e berf hrt und mittels MALDI ToF MS analysiert Ruhr Universit t Bochum Zur Analyse von Regulatoren wurden die Elutionsfraktionen der Bindungsexperimente Abschnitt 3 4 4 3 auf ein SDS Gel siehe Abschnitt 3 4 5 aufgetragen Die zu analysierenden Proteinbanden wurden markiert und das gesamte SDS Gel nach Greifswald gesendet Ernst Moritz Arndt Universit t Greifswald Die Analyse erfolgte dort ebenfalls mittels MALDI ToF MS 3 4 10 Protein Hybridisierung Western Blot F r den Nachweis von GFP im Proteinextrakt
171. cagcacgacgacgagaacgagagcgacccatgatcaacccattccg acgaagcaccagacgagaaggagcagcacccatg acgetettcegagetgetegtegeegteetgcaggectacatettegeCetectcaccg ccgtctacatccagatggccgtggcggaggagcactaagcgatctcgtcgaccaa cgagatcacccaaccggaaggaaaccccagtg ggeggaggcggcceategggegeccegeccgctaaactegecegtGgtecctcaac ggaagggecccategegeccgcagagaagcagtecgggegtggaccegcaccg ctagacagggcacaacgtg cccggggcaggcgcicccagggtcgtccggtaiccitcgatGtcgtcgtccgecge cggteegectgeagcacggeggagegtegegagagcaccegtgetegteggecg ccgcggtcgtcatccgatcgctgctcatgcggccgecgeccgcegacgacacgaga ggagacacccgtg ecegeggectgattteceggeegegacctggtategtegectGttggettgegtgtgg tcctccccgatcacgcggtatcgecgcaggcgcecctctctcgctgagcggcaactc atacgacgacaactcgaacggaagacataacacgtg atcecccgciggcgcggtttcacecgciagggttggtcaCaagtcgtcaggtcctca cgatccgceccggtccgccggaggggtcacgaggggcaggegacccgcggiccc gggicccgggatcgatgcatctctitttgaaggaaaittcgtcatg gtcctcccctgagccccaccgcecccataagcigttccgGtcatcacgaaccacga ggagatacacatg gecgcececgccgcatgegeccgeaccatgtcccccactatagtgaacgecGttca ggtgaacatcgttcaggtccatgatcgtcgcatcacgcaggaggaagcccatg aggacggttigctatccggatgcgattcatgcaaacigtgceccGccgattccgttcg gcggttattcgagaagiggacaggaatg gacgggcggcacggigtcggecccggcgiacggigggaggCagcggtaggge gegcacctcggcegecgcecgceaccccgtgaccatcgagacgaagaagacgaga gcacatg tgccgcacagggigicctgacgggtcgcgacggtagactcgccgtGgatcccgac aacgactgtccggcccccgacctgaaggaacgtgaaccacatg egeggegeggttgteceegectecegeggecgggtetaagategactGtegcacttet gcgacgacccatccgtccgecgctcgaccggtacccgcegcgggtccgegecage ggccttat
172. cal membrane protein putative cell surface protein conserved secreted lipoprotein 3 isopropylmalate dehydrogenase putative peptidoglycan lytic enzyme L arabinose ABC transporter SBP endo 1 4 beta xylanase B 50S ribosomal protein L7 L12 50S ribosomal protein L14 conserved secreted protein putative carboxypeptidase or PBP conserved secreted protein 30S ribosomal protein S11 50S ribosomal protein L24 conserved secreted protein conserved hypothetical protein transcriptional regulator IV 1 IV 4 11 2 IV 3 IV 1 IV 6 IV 6 V 2 IV 7 IV 6 IV 6 11 2 V 2 IV 4 IV 6 V 2 11 2 111 3 IV 1 V 2 1 2 1 4 IV 6 1 5 V 2 1 4 111 3 1 1 V 2 IV 7 V 2 1 4 IV 1 IV 1 IV 6 IV 6 111 3 111 3 11 1 IV 4 1 1 11 2 1 1 V 2 IV 1 1 2 IV 2 IV 1 IV 6 111 3 111 3 V 2 V 2 111 3 111 3 V 2 1 5 IV 3 oO O PDP YONH HH HW NY HWNHH HNNNNNNMNNWANNMN WANWAWH D WNHWH WHONM WOW WWH H H0HO DD WW OW wn ww 149 Anhang Fortsetzung Tabelle 20 extrazellul res Proteom von Cmm382 in XMM Medium 20 20 20 20 18 18 17 17 16 16 16 15 15 15 15 14 13 13 12 12 11 11 11 10 10 10 10 DDDORBOVDOPPPPPWTTTTUOOONNNANNORCO0S N CMM_1532 prox CMM_2620 tuf CMM_ 2608 rpsQ CMM_2579 rpsi CMM_1248 CMM_1758 pykA CMM_1716 rpmE2 CMM _1409 gatB CMM_ 2048 rpsO CMM_2610 rp P CMM_1278 CMM_2963 rpsF pCM2_0035 rhsA CMM_2676 blaC CMM_1745 sodA pC
173. cal secreted protein V 2 CMM_2774 27 9 conserved hypothetical protein V 2 CMM_2775 29 9 conserved hypothetical protein V 2 CMM_1921 29 5 hypothetical secreted protein V 2 CMM_2776 39 5 hypothetical protein V 2 pCM2_0036 11 9 similar to LSR2 protein Die Transkriptmengen von 270 Genen waren in XMM Medium AS im Vergleich zu XMM Medium ohne Zusatz h her die von 198 Genen waren niedriger Abbildung 23 Die Funktion von jeweils 36 der Genprodukte ist unzureichend charakterisiert Sie scheinen jedoch in der Acetosyringon vermittelten Genexpression eine Rolle zu spielen In der COG Gruppe IV waren die Transkriptmengen von ungef hr ebenso vielen Transporter und Regulatorgenen h her wie niedriger Die Regulatorgene kodieren dabei zum Beispiel f r Transkriptions regulatoren der Familien TetR Cro Cl MarR DeoR und ArsR F r einige Regulatoren dieser Familien ist bekannt dass sie in der Pathogenit t involviert sind Bonas et al 2000 Haghjoo amp Galan 2007 Wei et al 2007 Au erdem waren die Transkriptmengen von Genen h her die f r Kinasen und Antwort Regulatoren von Zwei Komponenten Systemen kodieren siehe Abschnitt 7 4 Tabelle 31 Die Transkriptmengen dieser Gene waren jedoch in XMM Medium AS nur h chstens um den Faktor 2 4 h her als in XMM Medium ohne Zusatz Die Zugabe von 20 uM Acetosyringon zu dem Xylemsaft imitierenden Medium f hrte insgesamt zu einer Ergebnisse 94 Ver nderung der Transkriptmengen
174. ccgcccacgaaggagatgetcgctgatg 33 CMM_ 1027 mannose 6 phosphate cgagcctaggicggcgiccgggcggcggccccatcggtiggtacttiggtcgcGtc cggacaggacgcgcgcccacgggcgttgtaggtagecgccaagcccgacagg 62 isomerase atcccgacgtg 200 Anhang Fortsetzung Tabelle 32 Analyse der stromaufw rts liegenden Regionen von 48 Genen CMM_1136 conserved hypothetical protein CMM_1164 ATP synthase C chain CMM_1192 ATP dependent RNA helicase CMM_1395 conserved membrane protein CMM_1551 30S ribosomal protein S20 CMM_1611 cold shock protein CMM_1617 acyl carrier protein CMM_1625 conserved membrane protein CMM_1654 conserved hypothetical protein CMM_1670 oxidoreductase CMM_1687 Sec independent twin arginine protein translocase protein CMM_1752 30S ribosomal protein S1 CMM_1813 preprotein translocase subunit CMM_1830 glycerol uptake facilitator protein CMM_2048 30S ribosomal protein S15 CMM_2151 transcriptional termination antitermination factor CMM_2179 GTP binding protein typA bipA homolog CMM_2244 transcription elongation factor CMM_2272 6 phosphogluconate dehydrogenase decarboxylating CMM_2462 transcriptional regulator histone like protein CMM_2485 sugar ABC transporter ATPase CMM_2491 conserved secreted protein CMM_2644 ATP dependent helicase CMM_2761 hypothetical protein CMM_2776 hypothetical protein ggcggcticggcggaggcggceggeggceggcticagcggeggcegacCttctage gacgac
175. ce genes is constitutively expressed in the absence of the Ti plasmid in Agrobacterium tumefaciens J Bacteriol 169 11 5336 5338 Literaturverzeichnis 138 Pfaffl M W 2001 A new mathematical model for relative quantification in real time RT PCR Nucleic Acids Res 29 9 e45 Pontier D Balagu C and Roby D 1998 The hypersensitive response A programmed cell death associated with plant resistance C R Acad Sci Ill 321 9 721 734 Pontier D Gan S Amasino R M Roby D and Lam E 1999 Markers for hypersensitive response and senescence show distinct patterns of expression Plant Mol Biol 39 6 1243 1255 Pontier D Godiard L Marco Y and Roby D 1994 hsr203J a tobacco gene whose activation is rapid highly localized and specific for incompatible plant pathogen interactions Plant J 5 4 507 521 Porter F E McAlpine V W and Kaerwer H E 1960 Seed impregnation including bacterial and vacuum treatment C P Office Canada Patent number 608485 Puente M E and Bashan Y 1993 Effect of inoculation with Azospirillum brasilense strains on the germination and seedlings growth of the giant columnar cardon cactus Pachycereus pringlei Symbiosis 15 49 60 Puente M E Li C Y and Bashan Y 2009 Endophytic bacteria in cacti seeds can improve the development of cactus seedlings Plant Biology 6 643 650 Quidde T Osbourn A E and Tudzynski P 1998 Detoxification
176. cell density responsive transcriptional regulators J Bacteriol 176 2 269 275 Gartemann K H Abt B Bekel T Burger A Engemann J Fl gel M Gaigalat L Goesmann A Gr fen l Kalinowski J Kaup O Kirchner O Krause L Linke B McHardy A Meyer F Pohle S R ckert C Schneiker S Zellermann E M Puhler A Eichenlaub R Kaiser O and Bartels D 2008 The genome sequence of the tomato pathogenic actinomycete Clavibacter michiganensis subsp michiganensis NCPPB382 reveals a large island involved in pathogenicity J Bacteriol 190 6 2138 2149 Literaturverzeichnis 133 Gartemann K H Kirchner O Engemann J Grafen I Eichenlaub R and Burger A 2003 Clavibacter michiganensis subsp michiganensis first steps in the understanding of virulence of a Gram positive phytopathogenic bacterium J Biotechnol 106 2 3 179 191 Giannona S 2003 6 Alanin und Pantothenattransport in Zusammenhang mit der Pantothenatproduktion in Corynebacterium glutamicum Dissertation Universitat zu K ln Gitaitis R D 1990 Induction of a hypersensitivelike reaction in four o clock by Clavibacter michiganensis subsp michiganensis Plant Dis 74 1 58 60 Gleason M L Carlton W M and Peterson R H 1991 Survival and dissemination of Clavibacter michiganensis subsp michiganensis in tomatoes Phytopathology 81 12 1519 1523 Gleason M L Gitaitis R D and Ricker M D 199
177. cup zugegeben Benutzerhandbuch 3 Ergebnisse 77 Die ersten nderungen betrafen die in Abschnitt 3 4 6 angegebene L sung zur Rehydratisierung der Gelstreifen f r die isoelektrische Fokussierung Der L sung wurden zuerst 0 6 w v DTT zugegeben Die Auftrennung der Proteine nach der 2D Gelelektrophorese war jedoch vergleichbar mit der Auftrennung in Abbildung 17 Daten nicht gezeigt Daraufhin wurden der L sung 1 M mehr Harnstoff zugef gt eine erh hte DTT Konzentration sowie Isopropanol und Glycerin Die Gelstreifen wurden in dieser neuen Rehydratisierungsl sung inkubiert Die Zugabe der Proteinl sung erfolgte dabei nicht bei der Inkubation sondern bei der nachfolgenden isoelektrischen Fokussierung ber eine direkte Probenbeladung cup loading Dadurch wird eine identische Startposition f r alle Proteine gew hrleistet Die Gele der nachfolgenden SDS Gelelektrophorese sind in Abbildung 18 dargestellt 11 11 Cmm382 Cmm100 Abbildung 18 2D Gelelektrophorese des Oberfl chenproteoms von Cmm382 und Cmm100 in einem pH Bereich zwischen 6 und 11 Im Vergleich zur Abbildung 17 wurde eine ver nderte Rehydratisierungsl sung verwendet und die Proteine wurden direkt bei der isoelektrischen Fokussierung zugegeben cup loading Die Auftrennung der Proteine wurde verglichen mit der Auftrennung in Abbildung 17 verbessert Eine entsprechend gute Auftrennung wie bei der 2D Gelelektrophorese in dem pH Bereich zwischen
178. d virulence region pat 1 of phytopathogenic Clavibacter michiganensis subsp michiganensis Mol Plant Microbe Interact 10 2 195 206 Eichenlaub R and Gartemann K H 2011 The Clavibacter michiganensis subspecies molecular investigation of gram positive bacterial plant pathogens Annu Rev Phytopathol 49 445 464 Literaturverzeichnis 132 Eikmanns B J Thum Schmitz N Eggeling L Ludtke K U and Sahm H 1994 Nucleotide sequence expression and transcriptional analysis of the Corynebacterium glutamicum gItA gene encoding citrate synthase Microbiology 140 Pt 8 1817 1828 Engemann J 2006 Charakterisierung des Peroxiredoxins Bcp von Clavibacter michiganensis subsp michiganensis Dissertation Universitat Bielefeld Engstrom P Zambryski P Van Montagu M and Stachel S 1987 Characterization of Agrobacterium tumefaciens virulence proteins induced by the plant factor acetosyringone J Mol Biol 197 4 635 645 Evtushenko L l Dorofeeva L V Subbotin S A Cole J R and Tiedje J M 2000 Leifsonia poae gen nov sp nov isolated from nematode galls on Poa annua and reclassification of Corynebacterium aquaticum Leifson 1962 as Leifsonia aquatica ex Leifson 1962 gen nov nom rev comb nov and Clavibacter xyli Davis et al 1984 with two subspecies as Leifsonia xyli Davis et al 1984 gen nov comb nov Int J Syst Evol Microbiol 50 1 371 380 Fatmi M and Schaad N W 2002
179. de Aminosauren Konzentrationen im uM Bereich wobei Glutamin und Asparagin am starksten vertreten waren 33 3 mM Nitrat und 1 9 mM Ammonium Eine in fr heren Verdffentlichungen gemessene geringe Konzentration an Zuckern im Xylemsaft Fl gel et al 2012 war vermutlich auf eine Kontamination mit dem Phloemexudat zur ckzuf hren die in dieser Arbeit durch eine f nfmin tige Wartezeit vor der Entnahme des Xylemsaftes vermieden wurde Ausgehend von den gemessenen Komponenten des Xylemsaftes wurde das XVM2 Medium an die Bedingungen im Xylem angepasst Anstelle der Zucker Fructose und Saccharose wurde eine erh hte Konzentration an Aminos uren verwendet die dem Bakterium als Kohlenstoffquelle dienen Statt Ammonium wurde Nitrat zur Verf gung gestellt welches ausgehend von den Messungen in dieser Arbeit im Xylemsaft die vorherrschende Stickstoffquelle darstellte Nitrat kann jedoch von C michiganensis subsp michiganensis nicht verstoffwechselt werden da keine Gene f r eine Nitrat und Nitrit Reduktase im Genom des Bakteriums annotiert sind Deshalb dienen vermutlich die Aminos uren vor allem Glutamin und Asparagin als Stickstoffquelle die auch in Pflanzen als Stickstoffspeicher genutzt werden Tischner 2000 Da jedoch auch eine hohe Nitrat Konzentration im Xylemsaft und im XMM Medium gemessen wurde k nnte Nitrat obwohl es vom Bakterium nicht verwertet werden kann trotzdem eine wichtige Komponente darstellen F r P aeruginosa konnte beisp
180. dentifiziert von denen 57 eine 2 oder mehrfach erh hte Transkriptmenge zeigten Die Gene wurden nach dem absteigenden FCA Wert geordnet FCA fold change absolute SBP substrate binding protein FCA Gen Name M gliche Funktion COG 39 5 CMM_2776 hypothetical protein V 2 29 5 CMM 1921 hypothetical secreted protein V 2 29 0 CMM _2775 conserved hypothetical protein V 2 27 9 CMM 2774 conserved hypothetical protein V 2 25 6 CMM 2878 citrate transporter CitMHS family IV 1 19 0 CMM 2772 multidrug ABC transporter ATPase IV 1 18 3 CMM_1541 cydA cytochrome bd type menaquinol oxidase subunit 1 1 14 8 CMM_0732 MFS permease IV 1 14 7 CMM_2898 aldA L alanine dehydrogenase 1 2 13 3 CMM 2771 multidrug ABC transporter permease component IV 1 11 7 CMM _1542 cydB cytochrome bd type menaquinol oxidase subunit Il 1 1 11 0 CMM 1249 hypothetical secreted protein V 2 10 7 CMM_0235 conserved secreted protein putative bacteriocin V 2 10 0 CMM 1138 conserved hypothetical protein V 2 9 2 CMM_0897 cell surface protein putative adhesin 11 2 8 7 CMM_0898 hypothetical protein V 2 7 6 CMM_0630 rocD ornithine aminotransferase 1 2 6 8 CMM_0166 fhuD Fe3 siderophore ABC transporter substrate binding protein IV 1 5 9 CMM_0928 tmkA thymidylate kinase 1 3 5 8 CMM_0451 conserved hypothetical protein V 2 5 7 CMM_2931 fecB2 iron siderophore ABC transporter substrate binding protein IV 1 5 2 CMM_0899 conserved membrane protein V 2 5 1 CMM_0450 oxidoreductase V
181. deoR A lacZYA argF U169 80A lacZ AM15mcrA A mmr hsdRMS mcrBC Grant et al 1990 C michiganensis subsp michiganensis NCPPB382 Cmm382 Wildtyp pCM1 pCM2 virulent Gartemann et al 2008 Cmm100 Cmm382 ohne pCM1 und pCM2 nicht Meletzus amp virulent Eichenlaub 1991 Cmm102pDM302 Cmm382 Derivat PDM302 pCM2 diese Arbeit Cmm102pDM302Ppat Tgfp Cmm382 Derivat DDM302P pat 1gfp diese Arbeit pCM2 Cmm102pDM302PgiInA1gfp Cmm382 Derivat PDM302PgInATgfp diese Arbeit pCM2 Cmm102pDM302P pfkAgfp Cmm882 Derivat PDM302P pfkAgfp diese Arbeit pCM2 EH2408 Cmm382 pUC18 fCMM_2408 car diese Arbeit Cmm382 pUC18 FCMM_2408caf chromosomal integriert EH2766 Cmm382 pUC18fCMM_2766cat diese Arbeit Cmm382 pUC18 FCMM_2766caf chromosomal integriert Tabelle 3 Plasmide Plasmide Eigenschaften Referenz pDM302 nptll cat pCM1 Derivat Meletzus et al 1993 pEPR1P45gfp gfpuv nptll rep per T1 T troE T troA T2 T rrnB Knoppova et al T leuB 2007 pDM302gfp pDM302 gfpuv aus pEPR1P45gfp diese Arbeit pDM302Ppat Tgfp pDM302gfp mit einer 200 bp upstream Region von diese Arbeit pat 1 Material und Methoden 23 Plasmide Eigenschaften Referenz pDM302PgInAT1gfp pDM302gfp mit einer 200 bp upstream Region von diese Arbeit gInA1 pDM302PpfkAgfp pDM302gfp mit einer 200 bp upstream Region von
182. der bakteriellen Infektion der Wirts Pflanze und der Nicht Wirts Pflanze N tabacum Tabak war Einleitung 21 deshalb die Etablierung eines synthetischen Xylemsaft imitierenden Mediums das Haupiziel dieser Arbeit In diesem sollte die Genexpression auf Transkriptom und Proteomebene mit der Expression in Minimalmedium verglichen werden um medienbedingte Unterschiede feststellen zu k nnen F r C michiganensis subsp michiganensis wurden bis jetzt kaum Regulator und Promotorstudien durchgef hrt Dreier et al 1997 Jahr et al 2000 Aus diesem Grund waren zwei weitere Ziele dieser Arbeit die Identifizierung von Regulatoren f r die beiden am besten charakterisierten Virulenzgene pat 1 und ce A sowie die Charakterisierung von Clavibacter typischen Konsensussequenzen in Promotorstrukturen wie der 10 der 35 Region und der Shine Dalgarno Sequenz Shine amp Dalgarno 1974 Material und Methoden 3 Material und Methoden 3 1 Bakterienstamme Plasmide und Oligonukleotide 22 Die in dieser Arbeit verwendeten Bakterienstamme sind in Tabelle 2 aufgelistet In Tabelle 3 sind die verwendeten Plasmide wiedergegeben in Tabelle 4 die Oligonukleotide Sie wurden von Eurofins MWG Operon Ebersberg bezogen und in HzOpiges auf eine Konzentration von 100 pmol ul eingestellt Tabelle 2 Bakterienst mme Stamm Genotyp Ph notyp Referenz Escherichia coli DH5aMCR endAT supE44 thi 1 recA1 gyrA96 relA1
183. der Gene im Genom von Cmm382 mit internen reads CMM_1464 cIpP1 CMM_1465 cIpP2 CMM_1466 CMM_1467 cIpX CMM_1489 rp U CMM_1494 CMM_1495 nadD CMM_1497 CMM_1498 CMM_1555 lepA CMM_1568 CMM_1576 leuA CMM_1611 cspA7 CMM _1617 acpP CMM_1618 fabH CMM_1619 fabD CMM_1621 aceE CMM_1630 CMM_1636 gInAT CMM_1642 IpdB CMM_1649 CMM_1653 CMM_1675 CMM_1682 gipQ2 CMM_1683 CMM_1714 CMM_1716 rpmE2 CMM_1728 CMM_1729 CMM_1730 CMM_1731 CMM_1734 tktA CMM_1737 zwfA2 CMM_1740 CMM_1741 secG CMM_1744 gapA CMM_1745 sodA CMM _1752 rpsA CMM_1759 gitD CMM_1763 trpB CMM_1764 trpC CMM_1765 CMM_1780 gmkA CMM_1793 efp CMN_ 1804 rpsD CMM_1807 CMM_1808 CMM _1809 relA CMM_1819 CMM_1820 CMM_1821 thrS CMM_1830 gIpF CMM_1831 gipK CMM_1834 ciaE CMM_1835 qerC CMM_1836 qcrA CMM_1839 CMM_1840 CMM_1841 ctaD CMM_1842 ctaC CMM_1863 murF CMM_1909 cpsY CMM_1941 CMM_1952 betT ATP dependent Clp protease proteolytic subunit ATP dependent Clp protease proteolytic subunit monooxygenase ATP dependent Clp protease ATP binding subunit cloX 50S ribosomal protein L21 hypothetical membrane protein nicotinate nucleotide adenylyltransferase conserved hypothetical protein conserved hypothetical protein GTP binding protein phosphate starvation induced ATPase 2 isopropylmalate synthase cold shock protein acyl carrier protein 3 oxoacyl acyl carrier protein synthase
184. der Infektion mit Cmm100pDM302Ppat 1gfp ohne Krankheitssymptome B Tomatenpflanze zehn Wochen nach der Infektion mit Cmm102pDM302Ppat Tgfp mit starker Blattwelke St ngell sion und ersten Tomatenfr chten Von den infizierten Pflanzen wurden je zwei Pflanzen pro Stamm f r die Ernte der Fr chte weiter angezogen um das Eindringen der Bakterien in die Samen zu berpr fen Nur bei einer der mit Cmm102pDM302Ppat Tgfp infizierten Pflanzen wurden Fr chte ausgebildet die 15 Wochen nach der Infektion f r weitere Analysen verwendet wurden Aus den zwei Fr chten wurden die Samen isoliert die entweder intakt verwendet oder ge ffnet wurden um den Pflanzenembryo Abbildung 13 daraus zu isolieren Ergebnisse 68 Samenhille Keimwurzel Embryo Hypocotyl Ds Cotyledonen 7 N hrgewebe N Abbildung 13 Aufbau eines Tomatensamens Der Embryo bestehend aus Keimwurzel Hypocotyl und den zwei Cotyledonen wird von einem N hrgewebe umgeben und von einer festen Samenh lle gesch tzt Bei der Keimung wird die Samenh lle mit den Keimwurzeln durchsto en modifiziert nach http www accessscience com search aspx rootID 802561 Die intakten Samen sowie der Embryo wurden f r 2 h in 10 mM K PO Puffer bei 26 C inkubiert um die Bakterien zu isolieren Die Suspensionen wurden daraufhin auf TBY Agarplatten mit 50 pg ml Neomycin f r drei bis f nf Tage bei 28 C inkubiert Cmm102pDM302Ppat 1gfp konnte im Gegensatz zum Cmm100 Stamm in der Sam
185. der oDsg der Lichtemission bei 508 nm und dem Trockengewicht der Bakterien bestimmt Giannona 2003 1 x PBS Puffer 11 8 g NaCl 2 g KCI 2 4 g KH2POQ 36 9 g NasHPO x 12 H2O pH 7 4 Sterilisation durch Autoklavieren Ergebnisse 57 4 Ergebnisse In dieser Arbeit wurde die Interaktion zwischen dem Gram positiven pflanzenpathogenen Bakterium C michiganensis subsp michiganensis und der Wirtspflanze S Iycopersicum Tomate untersucht Dabei erfolgte eine phanotypische Analyse der Krankheitssymptome in der Pflanze nach einer bakteriellen Infektion der Wurzeln des Stangels oder der Samen Die Analyse wurde ebenfalls auf molekularer Ebene durchgef hrt wobei zum einen das Proteom und zum anderen das Transkriptom untersucht wurde Dabei wurde die Analyse in einem in dieser Arbeit etablierten synthetischen Medium durchgef hrt welches die Bedingungen des Xylemsaftes dem nat rlichen Lebensraum der Bakterien imitiert Mit Hilfe von MALDI ToF Massenspektrometrie und Microarray Experimenten wurden dabei m gliche Virulenzfaktoren identifiziert Auf DNA Ebene wurden Promotorstudien durchgef hrt um ein Clavibacter typische Konsensus Motiv der 10 der 35 Region sowie der Shine Dalgarno Sequenz zu etablieren Neben der Wirt Pathogen Interaktion wurde au erdem die Interaktion von C michiganensis subsp michiganensis mit der Nicht Wirts Pflanze Nicotiana Tabak analysiert 4 1 Wachstumsverhalten von C michiganensis subsp michiganensis
186. des zytoplasmatischen Proteoms von Cmm382 eennneen 151 7 4 Microarray Daten des Transkriptoms VON CMM382 uessnsenssennnnnnnnnnennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn nn 161 7 5 MALDI ToF Daten der Analyse von Transkriptionsregulatoren von CMM382 neen 197 7 6 RNA Sequenzierung des gesamten 5 Transkriptoms von Cmm382 in M9 und TBY Medium 199 Gentabelle Gentabelle Tabelle 1 Putative Virulenzgene sowie weitere in dieser Arbeit verwendeten Gene und deren Annotation in Clavibacter michiganensis subsp michiganensis Quelle Fl gel et al 2012 SMART EMBL Heidelberg SP Signalpeptid TMD Transmembrandom ne NV nicht vorhanden nicht analysiert Name Lokus M gliche Funktion SP oder TMD celA pCM1_0020 Cellulase TMD celB CMM_2443 Cellulase putatives Pseudogen SP chpA CMM_PSEUDO_08 extrazellulare Serinprotease Pseudogen Has CMM_PSEUDO_09 CMM_PSEUDO_10 chpB CMM_PSEUDO_17 extrazellul re Serinprotease Pseudogen CMM_PSEUDO_18 chpC CMM_0052 extrazellulare Serinprotease NV chpD CMM_PSEUDO_05 extrazellulare Serinprotease Pseudogen CMM_PSEUDO_06 CMM_PSEUDO_07 chpE CMM_0039 extrazellulare Serinprotease SP chpF CMM_0053 extrazellulare Serinprotease TMD chpG CMM_0059 extrazellulare Serinprotease SP TMD gapA CMM_1744 Glycerinaldehyd 3 phosphat Dehydrogenase NV ginA1 CMM_1636 Glutaminsynthetase NV ginR C
187. die Generationszeit 12 28h 0 6 h In der Pflanze wird neun Tage nach der Infektion eine Bakteriendichte von 1 x 10 cfu g erreicht Meletzus et al 1993 Mit dem Erreichen der h chsten oDss in vitro lag die Bakteriendichte in TBY Medium bei 3 95 x 10 cfu ml und in M9 Medium bei 1 33 x 10 cfu ml 4 2 Infektion von Tabakpflanzen Nicotiana Arten Tabak und M jalapa Wunderblume sind resistent gegen ber einer Infektion mit C michiganensis subsp michiganensis Als Abwehrreaktion der Pflanze kommt es nach der bakteriellen Infektion zu einem lokalen Pflanzenzelltod am Ort der Infektion Der zugrunde liegende Mechanismus wird als hypersensitive Antwort hypersensitive response HR bezeichnet Gitaitis 1990 Alarc n et al 1998 Die inkompatible nicht erfolgreiche Interaktion zwischen Nicotiana Arten und C michiganensis subsp michiganensis wurde in dieser Arbeit ph notypisch und auf molekularer Ebene analysiert 4 2 1 Ph notypische Analyse der Nicotiana Infektion Die Bl tter der zwei Tabakarten N benthamiana und N tabacum cv Samsun NN wurden entweder komplett oder teilweise mit den Bakteriensuspensionen oDsg 4 des Wildtypstammes Cmm382 und des plasmidfreien Stammes Cmm100 sowie zur Kontrolle mit 10 mM MgCl behandelt Zwei Tage nach der Infektion days post infection dpi mit Bakterien zeigte sich eine Farbver nderung des Blattgewebes von N tabacum Abbildung 7 A Neben chlorotischem Gewebe war zum Teil lokaler Zell
188. die ben tigten Antibiotika Konzentrationen sind in Tabelle 6 aufgef hrt Zur Herstellung von LB und TBY Agarplatten wurden dem Medium 15 g l Bacto Agar zugesetzt F r die Anfertigung von Agarplatten mit einem Antibiotikum wurde dieses nach dem Autoklavieren und Abk hlen des Mediums in entsprechender Menge zugegeben Tabelle 6 F r die Antibiotika wurden Stamml sungen in 1 000 fach h herer Konzentration in H2Opiaes bzw 70 igem v v Ethanol hergestellt Die Stamml sungen wurden sterilfiltriert Minisart Filter Porengr e 20 um Sartorius AG G ttingen und bis zum Gebrauch bei 20 C bzw 4 C gelagert Material und Methoden 26 Tabelle 5 Zusammensetzung der verwendeten Nahrmedien Medium Zusammensetzung pro LB 10 g NaCl 10 g Trypton 5 g Hefeextrakt Sterilisation durch Autoklavieren 20 min 121 C TBY 10 g NaCl 5 g Trypton 5 g Hefeextrakt pH 7 5 Sterilisation durch Autoklavieren SB L sung 1 5 g NaCl 10 g Trypton 4 g Hefeextrakt pH 7 5 700 ml Sterilisation durch Autoklavieren L sung 2 91 1 g Sorbitol 20 ml 1 M MgCl 200 ml 0 1 M CaCl 300 ml Sterilisation durch Filtration 20 um L sung 1 und 2 mischen Lagerung bei 4 C M9 L sung 1 1 g Glucose in 200 ml H2Opidess Sterilisation durch Autoklavieren L sung 2 15 g Na HPO x 12 H2O 3 g KH PO 0 5 g NaCl 1 g NH CI 298 4 mg Methionin 2 mM pH 7 4 Sterilisation durch Autoklavieren L sung 1 und 2 mischen Zusatz von 100 ul 10
189. diese Arbeit ptkA pUC18 bla lacZa rep pMB1 Yanisch Perron et al 1985 pDrivecat bla nptll cat lacZ Plac f1 origin T7 Promotor diese Arbeit pUC18cat pUC18 cat aus pDrivecat diese Arbeit pUC18fCMM_2408cat pUC18cat 480 bp aus CMM_2408 diese Arbeit pUC18fCMM_2766cat pUC18cat 430 bp aus CMM_2766 diese Arbeit pUC18fpCM2_0056cat pUC18cat 630 bp aus pCM2_0056 diese Arbeit pUC18npil pUC18 nptll aus pDM302 diese Arbeit Tabelle 4 Oligonukleotide Restriktionsschnittstellen unterstrichen Name T C Sequenz pat 1 fw 54 AACCAAAGTCCCGGCTGATC pat 1 rev 54 TCAGGAGGTCGCTAATATGT celA fw 58 TCCACAACGAACCGCACGGT celA rev 58 GTCCCAAATACCCGGCAAGT gfp EcoRI fw 57 CGGAATTCATGATTGAACAAGAGGTA gfp Hindlll rev 57 CCAAGCTTTTATTTGTAGAGCTCATCC pat1_prom Scal fw 60 AGAGTACTAGATCTCGGTTCGTTCGTAGGAG pat1_prom EcoRl rev 60 AAGAATTCAGTAGCGCCCGGAACAGG pDM302 seq fw CTGGCCGTGGTGACAAGAAGAA pDM302 seq fw1 TCAGACAGGTCAGGGGTTGTCG prom 1636 fw Scal g nA71 57 GGAGTACTTTCGTGGGAGTCGCG prom 1636 rev EcoRI g nA7 57 TCGAATTCGTCTCTGAACATGTGGTG gac fw GCAAACCGCCTCTCCCCGC ALPHA II seq fw TGTGCTGCAAGGCGATTAAG 18 S fw 1 3 60 CCCGTTGCTGCGATGATTC 18 S rev 1 3 60 ATTCTCCGTCACCCGTCAC HSR203J fw 1 3 60 GGCTCAACGATTACGCAGAT HSR203J rev 1 3 60 CGGGGTTTGCTCTTGTTCTA pfkA Scal fw 57 CGAGTACTCGCGCGAGG pfkA EcoR
190. dium wurde ein f r X campestris pv vesicatoria entwickeltes Apoplasten Medium XVM2 verwendet Wengelnik et al 1996 XVM2 erm glichte erstmals die Induktion von hypersensitive response hrp Genen in einem synthetischen Medium Es enth lt 20 mM NaCl 10 mM NH SO 5 mM MgSQ 1 mM CaCl 0 16 mM KH PO 0 32 mM K HPO 0 01 mM FeSO 10 mM Fructose 10 mM Saccharose und 0 03 w v casamino acids eine Mischung aller 20 Aminos uren Der pH Wert lag bei 6 7 Um das Medium den Bedingungen im Xylem anzupassen wurden sukzessiv einzelne Komponenten ver ndert Da Nitrat die vorwiegende Stickstoffquelle im Xylemsaft ist Tischner 2000 K hler et al 2002 wurde anstelle von Ammoniumsulfat f r das Clavibacter Medium KNO 20 mM verwendet Nitrat kann von C michiganensis subsp michiganensis nicht reduziert werden da keine Gene vorhanden sind die f r eine Nitrat oder Ergebnisse 73 Nitritreduktase kodieren Gartemann et al 2008 Zur berpr fung ob Stickstoff in Form von Ammonium oder Nitrat fur das Wachstum von Cmm382 notwendig ist wurden die Bakterien in XVM2 Medium ohne NH 4 2SO 4 oder KNO getestet Das Wachstum in diesem Medium war vergleichbar mit dem Wachstum im unver nderten XVM2 Medium Daten nicht gezeigt Trotz der Beobachtung dass Nitrat anscheinend nicht notwendig f r das Wachstum der Bakterien ist wurde f r das synthetische Medium Nitrat verwendet da dieses auch im Xylemsaft gemessen wurde Zucker werden
191. e M Sherf O Jacob Hirsch J Eichenlaub R Iraki N Manulis Sasson S Rechavi G Barash I and Sessa G 2008 Tomato transcriptional changes in response to Clavibacter michiganensis subsp michiganensis reveal a role for ethylene in disease development Plant Physiol 146 4 1797 1809 Balaji V and Sessa G 2008 Activation and manipulation of host responses by a Gram positive bacterium Plant Signal Behav 3 10 839 841 Balaji V Sessa G and Smart C D 2011 Silencing of host basal defense response related gene expression increases susceptibility of Nicotiana benthamiana to Clavibacter michiganensis subsp michiganensis Phytopathology 101 3 349 357 Balaji V and Smart C D 2012 Over expression of snakin 2 and extensin like protein genes restricts pathogen invasiveness and enhances tolerance to Clavibacter michiganensis subsp michiganensis in transgenic tomato Solanum lycopersicum Transgenic Res 21 1 23 37 Baysal O Mercati F ikten H Yildiz R C Carimi F Aysan Y and da Silva J A T 2011 Clavibacter michiganensis subsp michiganensis Tracking strains using their genetic differentiations by ISSR markers in Southern Turkey Physiol Mol Plant Pathol 75 113 119 Ben Daniel B H Bar Zvi D and Tsror Lahkim L 2012 Pectate lyase affects pathogenicity in natural isolates of Colletotrichum coccodes and in pelA gene disrupted and gene overexpressing mutant lines Mol P
192. e Proteine sammelten sich in einem pH Bereich zwischen etwa 8 und 11 Die Auftrennung des Oberflachenproteoms von Cmm100 war vergleichbar Daten nicht gezeigt In beiden Gelen waren keine voneinander unterscheidbaren Proteinpunkte zu erkennen Die Proteine sammelten sich vor allem in einem pH Bereich zwischen 8 und 11 und zeigten horizontales shifting Diese Ph nomen tritt bei einer Auftrennung in einem engen pH Bereich auf Hoving et al 2002 Um das horizontale shifting zu vermeiden wurden nacheinander einige nderungen an dem Protokoll f r die isoelektrische Fokussierung vorgenommen Tabelle 8 Tabelle 8 Vorgenommene nderungen zur verbesserten Proteinauftrennung bei der 2D Gelelektrophorese Ver ndert wurden die L sung zur Rehydratisierung der Gelstreifen vor der isoelektrischen Fokussierung sowie die Probenbeladung nderung Quelle Rehydratisierungsl sung 0 6 w v DTT Rehm 2006 Rehydratisierungsl sung Abschnitt 3 4 6 6 M Harnstoff 2 M Thioharnstoff 4 w v CHAPS 0 5 w v Pharmalyte 0 4 w v DTT Bromphenolblau Rehydratisierungsl6sung neu 7 M Harnstoff 2 M gt en Thioharnstoff 4 w v CHAPs 2 5 w v DTT 10 v v Isopropanol 5 v v Glycerin Bromphenolblau Cup loading Die Proteinl sung wird nach Probenbeladung Amersham der Rehydratisierung wahrend der N Bioscience 2 D y g ENTE isoelektrischen Fokussierung direkt ber YAY electrophoresis einen sample
193. e 24 Niedrigere Transkriptmengen in XMM Medium als in M9 Medium 3 2 3 1 3 1 2 9 2 8 2 5 2 4 2 4 2 3 2 3 ry nse eT ss ey eS eye SS SS SS las Ue NSANNNNNSOO 0 0 o 0 0 0 OO 0 O O O O O OO OO OO O OOO CMM_1699 dnaJ3 CMM_1726 CMM _0144 CMM_0328 CMM_0152 grpE CMM_2364 CMM_2304 CMM_0153 dnaJ1 CMM_1348 CMM_1486 CMM_2933 CMM_0433 fepG CMM_1178 dapE CMM_0014 pabA CMM_0154 hspR CMM_2951 CMM_1758 pykA CMM_1713 CMM_1297 czcD CMM_2577 coaA CMM_2174 CMM_0874 rnhA CMM_1507 CMM_2027 CMM_1954 CMM_2530 CMM_1200 uvrD3 CMM_1953 CMM_2270 rplY CMM_2938 furB CMM_2381 CMM_0587 hemE CMM_1309 ftsE CMM_2734 CMM_1356 CMM_0710 tyrA CMM_1594 CMM_0665 fdxA CMM_1555 lepA CMM_2561 guaB2 CMM_2551 uvrD1 CMM_1955 CMM_1723 CMM_2605 rplE CMM_2604 prsH CMM_2160 dxrA CMM_0004 recF CMM_0251 CMM_1500 CMM_0087 CMM_0209 CMM_0332 CMM_2428 nrdB CMM _2052 spA CMM _1900 CMM _2645 CMM _1492 proB CMM_1724 CMM_0514 pheA CMM_2123 CMM_1771 hisE CMM_1307 CMM 2391 curved DNA binding protein ABC transporter ATPase conserved secreted protein oxidoreductase methylase heat shock chaperone conserved membrane protein hypothetical protein chaperone curved DNA binding protein conserved secreted protein conserved membrane protein conserved membrane protein putative copper export protein iron siderophore ABC transporter permease component succinyl diaminopim
194. e 32 ige bereinstimmung der beiden Sequenzen Abbildung 31 C Spezifische bereinstimmende Promotormotive konnten nicht identifiziert werden A CMM_1637 3021 bp 1425 bp uJ 193 bp B GGGCACCCTGCGATCCTAGGCGCGCGTCACGCGGATCCCCTGGTCGGAC CGACCGGGAGCAGTCGCCGACTCGCCCGGGACAGCCCGCGTAACAT CGC GGAAACACGGCGGTTATGGCGAGGTAACCCCTT CCCCCTAGGGTCGGAGA GGCTGAAACCGTCAGTCTCATCCGCTCCGGCCCCCTTTTGGAGACACCAC ATG Cc C michiganensis subsp michiganensis CMM_1636 GGCTGAAACCGTCAGTCTCATCCGCTCCGGCCCCCTTTTGGAGACACCAC TG AACAAAGC TACAAATAA ACCGTTCCGCCCATGTCAATGAGGAGTCACC C glutamicum cg2429 Abbildung 31 Analyse der g nA1 Promotorregion A Graphische Lokalisation des Gens CMM_1636 gInAT mit der 193 bp umfassenden 5 Region B Identifizierung des Transkrip tionsstartpunktes mittels 5 RACE 50 bp stromaufw rts des Startcodons ATG rot unterstrichen Sich wiederholende Sequenzen blau die putativen 10 und 35 Regionen unterstrichen sowie die m gliche Ribosomenbindestelle rot fett sind hervorgehoben C Ein Vergleich der 5 Region des ginA1 Gens von C michiganensis subsp michiganensis und C glutamicum lieferte nur wenige Ubereinstimmungen senkrechte Striche 4 6 2 Promotoranalyse des 5 Transkriptoms mittels RNA Sequenzierung Die Analyse weiterer Promotoren wurde mittels RNA Sequenzierung durchgef hrt Die Gesamt RNA wurde dabei aus Cmm382 Kulturen welche in TBY und M9 Medium kultiviert wurden isoliert Je 10 ug RNA w
195. e Ausbreitung der Bakterien gering zu halten werden einige Bakterien von der europ ischen Pflanzenschutz Organisation european plant protection organization EPPO als Quarant neorganismen eingestuft C michiganensis subsp michiganensis subsp sepedonicus und subsp insidiosus z hlen zu diesen Quarantaneorganismen _ http www eppo in QUARANTINEI liStA2 htm deren Verbreitung meldepflichtig ist und einged mmt werden muss Die Genome der Unterarten michiganensis sepedonicus und nebraskensis sind vollst ndig sequenziert und f r die Unterarten michiganensis und sepedonicus auch annotiert Bentley et al 2008 Gartemann et al 2008 Eichenlaub amp Gartemann 2011 Alle Unterarten au er C michiganensis subsp sepedonicus zeigen aufgrund der Carotinoid Produktion eine gelb oder orangefarbene Pigmentierung Durch die Bildung von Extrapolysacchariden kann die Koloniemorphologie mukoid sein Die lange Latenzzeit macht die C michiganensis Unterarten zu landwirtschaftlich bedeutenden Pflanzenpathogenen W hrend dieser Latenzzeit kolonisieren die Bakterien die Pflanze l sen jedoch keine Krankheitssymptome aus Anschlie end kommt es zum pl tzlichen Ausbrechen der Infektion Eichenlaub amp Gartemann 2011 2 4 C michiganensis subsp michiganensis Das Genom des C michiganensis subsp michiganensis Stammes NCPPB382 wurde 2008 vollst ndig sequenziert Gartemann et al 2008 33 4 der annotierten Gene konnte noch keine Funktion zug
196. e Dalgarno Sequenz wurde dabei ausgehend von der putativen Anti Diskussion 127 Shine Dalgarno Sequenz am 3 Ende der 16S rRNA ermittelt und entsprach mit AGGAGGT exakt der Ideal Sequenz f r E coli Shine amp Dalgarno 1974 Eine leicht bis stark abgewandelte Sequenz wurde in den meisten Promotorregionen 4 14 Nukleotide stromaufwarts des Startcodons identifiziert Die 10 und 35 Regionen wurden in dieser Arbeit ebenfalls ausgehend von den Idealsequenzen f r E coli ermittelt Shine amp Dalgarno 1974 Im Gegensatz zur 35 Region die keine konservierten Nukleotide aufwies konnten sowohl in der 10 Region als auch in der Shine Dalgarno Sequenz zu etwa 50 konservierte Nukleotide ermittelt werden Der Abstand des Transkriptionsstartpunktes zum Startcodon lag im Durchschnitt zwischen 20 und 80 Nukleotiden zum Teil wurden jedoch auch 150 Nukleotide und mehr beobachtet Bei einer umfangreicheren manuellen Analyse wurden f r etwa 8 5 der Gene im Genom von C michiganensis subsp michiganensis leaderless Transkripte beobachtet bei denen der Transkriptions und der Translationspunkt identisch sind F r weitere 8 5 der Gene wurden hohe Transkriptmenge innerhalb der offenen Leserahmen identifiziert obwohl in dieser Arbeit lediglich das 5 Ende der mRNA sequenziert worden war Basierend auf den Ergebnissen in dieser Arbeit entspricht die Shine Dalgarno Sequenz aGGAgVn wobei n f r alle Nukleotide steht V f r
197. e component anion ABC transporter permease component aminotransferase sugar ABC transporter substrate binding protein peptide ABC transporter substrate binding protein sugar ABC transporter substrate binding protein conserved secreted protein sugar ABC transporter permease component hypothetical protein sugar ABC transporter permease component peptide ABC transporter ATPase lipoyl synthase monooxygenase sugar ABC transporter substrate binding protein oligopeptide ABC transporter substrate binding protein hypothetical protein O acetylhomoserine thiol lyase phosphoketolase conserved hypothetical protein oxidoreductase dehydrogenase flavin dependent reductase monooxygenase oxidoreductase monooxygenase conserved hypothetical protein conserved secreted protein conserved secreted protein oxidoreductase sugar ABC transporter permease component sugar ABC transporter permease component nucleoside diphosphate sugar epimerase sugar ABC transporter ATPase cysteine peptidase family C56 dihydroxyacetone kinase ATPase ribonuclease hypothetical secreted protein putative cell surface protein conserved secreted protein alpha glucoside ABC transporter substrate binding protein conserved hypothetical protein putative monooxygenase 3 oxoacyl CoA thiolase acyl CoA oxidase serine threonine protein kinase O acetylhomoserine thiol lyase hypothetical secreted protein MFS permease branched chain amino acid ABC tr
198. e in Abschnitt 3 2 2 aufgef hrt Mit der bernacht Kultur wurden 100 ml LB Medium auf eine 0D von 0 1 eingestellt Bei einer ODgoo von 0 4 0 6 wurden die Bakterien zentrifugiert 4 000 x g 10 min 4 C in 40 ml kaltem 50 mM CaCl resuspendiert und 30 min auf Eis inkubiert Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt 4 000 x g 10 min 4 C wurde das Pellet in 5 ml kaltem 50 mM CaCl resuspendiert und die Suspension wurde f r 10 min auf Eis inkubiert Nach der Zugabe von 1 3 ml kaltem 87 igem v v Glycerin wurden die kompetenten Bakterien in 100 ul Portionen in fl ssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur weiteren Verwendung bei 80 C gelagert 3 5 2 Transformation kompetenter E coli DH5aMCR Zur Transformation wurden 100 ul kompetente E coli DH5aMCR siehe Abschnitt 3 5 1 auf Eis aufgetaut und entweder mit dem kompletten Ligationsansatz siehe Abschnitt 3 3 1 6 oder mit 1 2 ul Plasmid DNA siehe Abschnitt 3 3 1 1 versetzt Die Bakterien wurden f r 30 min auf Eis inkubiert Die Aufnahme der Plasmid DNA erfolgte w hrend eines Hitzeschocks f r 1 min bei 42 C woraufhin die Bakterien sofort f r 5 min auf Eis inkubiert wurden Nach der Zugabe von 1 ml LB Medium wurde der Ansatz f r eine Stunde bei 37 C und 600 rpm im TS 100 Thermoshaker peqlab Biotechnologie GmbH Erlangen gesch ttelt Die Bakterien wurden f r 3 min bei 5 000 x g und Raumtemperatur pelletiert im R cklauf resuspendiert und auf LB Platten mit dem entsprechenden An
199. e kinase conserved secreted protein conserved hypothetical protein conserved hypothetical protein thioredoxin pyridine nucleotide disulphide oxidoreductase phosphate acetyltransferase conserved hypothetical protein hypothetical membrane protein acetyltransferase involved in polysaccharide biosynthesis conserved hypothetical protein putative DNA ligase glycosyltransferase cobalt zinc cadmium efflux permease CDF family hypothetical protein hypothetical protein transcriptional regulator TetR family conserved hypothetical protein hypothetical protein sortase sorted hypothetical protein hypothetical protein beta lactamase penicillin binding protein phosphoribulokinase conserved hypothetical protein conserved membrane protein hypothetical protein hypothetical protein conserved hypothetical protein two component system sensor kinase tRNA processing ribonuclease BN hypothetical secreted protein conserved hypothetical protein Sec independent twin arginine protein translocase protein anion ABC transporter ATPase hypothetical protein integrase recombinase conserved hypothetical protein putative kinase siderophore interacting protein hypothetical secreted protein peptidoglycan binding Zn metalloprotease conserved hypothetical protein conserved secreted protein V 1 IV 3 V 2 V 2 IV 3 1 2 IV 1 V 1 IV 3 V 2 IV 3 IV 4 IV 6 V 2 IV 3 V 1 IV 3 V 2 V 2 111 1 V 2 1 6 IV 1 V 2 1 1 V 2 V 2 V 2 I
200. ed hypothetical protein putative NUDIX hydrolase transcriptional regulator Lacl family serine threonine protein kinase alpha glycosidase anthranilate phosphoribosyltransferase A G specific adenine glycosylase conserved hypothetical protein putative cysteine protease isocitrate dehydrogenase purine nucleoside phosphorylase S adenosylmethionine synthetase acetyltransferase GNAT family tRNA pseudouridine synthase B ferredoxin iron ABC transporter ATPase 1 deoxyxylulose 5 phosphate synthase esterase lipase enoyl CoA hydratase chalcone synthase polyketide synthase III hydroxyacid dehydrogenase transcriptional regulator containing an aminotransferase domain hypothetical secreted protein exonuclease VII small subunit undecaprenyl diphosphatase bacitracin resistance protein pyrrolidone carboxylate peptidase pyrase transcriptional regulator histone like protein conserved hypothetical protein putative phosphoesterase conserved hypothetical protein putative nitroreductase conserved hypothetical protein putative ester cyclase antimicrobial peptide ABC transporter ATPase conserved hypothetical protein beta galactosidase dsDNA exonuclease subunit dihydroxyacetone kinase monooxygenase glucosamine fructose 6 phosphate aminotransferase drug exporter RND family conserved hypothetical protein glutaryl CoA dehydrogenase anthranilate synthase component I transcriptional regulator Fortsetzung Tabelle 28 Nied
201. ehandelten Bl ttern zu erkennen Abbildung 8 D und F 24 h nach der Infektion lag der C Wert von Cmm382_hsr203J etwa vier Zyklen niedriger als der von MgCl _ hsr203J Der C Wert von Cmmi00_hsr203J lag in diesem Experiment vier Zyklen h her als die Kontrolle Bei wiederholter Durchf hrung war der C Wert jedoch vergleichbar mit Cmm382_hsr203J Daten nicht gezeigt Aus den Effizienzen und den C Werten von Kontrollgen 18S rRNA Gen und Zielgen hsr203J der Kontrolle MgCI gt behandelte Bl tter und der Probe bakteriell infizierte Blatter wurde das Verh ltnis der relativen Genexpression von hsr203J zum 18S rRNA Gen ermittelt Abbildung 9 Pfaffl 2001 Die berechnete Ausgangsmenge in 10 mM MgCl behandelten Bl ttern wurde auf den Wert 1 gesetzt alle weiteren Werte bezogen sich darauf Direkt nach der Infektion 0 h war die Transkriptmenge von hsr203J in Cmm382 infizierten Bl ttern sechs Mal h her 24 h nach der Infektion 25 Mal h her als in den Kontrollpflanzen Die hsr203J Transkriptmenge in Cmm100 infizierten Bl ttern war elf Mal h her als in Kontrollpflanzen Abbildung 9 A Die Transkriptmenge des HR spezifischen Gens hsr203J nahm somit direkt nach der Infektion mit Cmm382 bis etwa 24 h nach der Infektion stark zu 48 h nach der Infektion wurde etwa das mRNA Level zum Zeitpunkt der Infektion erreicht Die Transkriptmenge von hsr203J nach der Infektion mit Cmm100 stieg ebenfalls bis 24 h nach der Infektion an Es wurde jedoch nur et
202. eiden Plasmiden sind die homologen Sequenzen weiter gestreut Etwa 0 5 des Chromosoms 27 von pCM2 und 7 von pCM1 weisen Sequenzhomologien auf Nt Nukleotide Diskussion 126 Dabei wurden wesentlich mehr Sequenzen auf dem Chromosom identifiziert deren homologe Sequenzen auf pCM2 lokalisiert waren als solche die homologe Sequenzen zu denen auf pCM1 aufwiesen Interessanterweise beschrankten sich die homologen Sequenzen im Chromosom auf einen Bereich von 73 000 Nukleotiden was 2 des gesamten Chromosoms entspricht Dieser Bereich liegt genau in der chp Region die im Bereich der Nukleotide 38 100 117 150 lokalisiert ist 44 Gene enth lt und als m gliche Pathogenit tsinsel beschrieben wurde Gartemann ef al 2008 Homologe Bereiche k nnten Uber eine Phageninfektion als fremde DNA in das bakterielle Genom integriert worden sein oder durch andere Mechanismen des horizontalen Gentransfers entstanden sein Groisman amp Ochman 1996 Homologe Sequenzen k nnten auch in zuk nftigen Mutagenese Studien Probleme bereiten 5 8 Analyse der 5 Transkripte mittels RNA Sequenzierung Um zuk nftige Regulator Bindestellen und somit Gene eines Regulons identifizieren zu k nnen deren Expression bei der Wirt Pathogen Interaktion gemeinsam reguliert wird sind Promotoranalysen notwendig Durch zur Verf gung stehende Konsensus Sequenzen f r Promotorstrukturen wie die 10 und 35 Region sowie die Shine Dalgarno Sequenz wird die Analyse noch
203. ein glycine cleavage system H protein extracellular nuclease phosphatase sugar ABC transporter substrate binding protein Na H dicarboxylate symporter DAACS family hypothetical protein ornithine aminotransferase L arabinose ABC transporter permease component oxidoreductase dehydrogenase enoyl CoA hydratase 3 hydroxyacyl CoA dehydrogenase conserved hypothetical protein alpha mannosidase dihydroxyacetone kinase sugar ABC transporter ATPase 3Fe 4S ferredoxin aminomethyltransferase transcriptional regulator Cro Cl family cytochrome P450 conserved membrane protein LysE transporter family beta glucosidase ABC transporter substrate binding protein hypothetical protein hypothetical secreted protein alpha L arabinofuranosidase 162 IV 1 IV 1 IV 1 IV 1 V 1 V 1 IV 1 IV 1 1 4 V 2 IV 1 IV 1 V 1 V 1 V 2 IV 1 V 2 V 2 V 2 V 2 V 2 IV 1 1 1 1 4 IV 3 V 2 1 2 V 2 V 2 IV 3 IV 1 1 4 IV 1 IV 1 V 2 11 2 1 2 V 1 IV 1 V 2 V 2 1 2 IV 6 IV 1 IV 1 V 2 1 2 IV 1 V 1 1 4 V 2 1 1 1 1 IV 1 IV 5 1 2 IV 3 IV 5 IV 1 1 1 IV 1 V 2 V 2 1 1 Anhang Fortsetzung Tabelle 23 H here Transkriptmengen in XMM Medium als in M9 Medium 4 0 4 0 4 0 3 9 3 9 3 9 3 8 3 8 3 8 3 8 3 7 3 6 3 6 3 6 3 6 3 5 3 5 3 5 3 4 3 4 3 4 3 4 3 3 3 3 3 2 3 2 3 2 3 1 3 1 3 1 3 0 2 9 2 9 2 9 2 9 2 9 2 8 2 8 2 8 2 8 2 8 2 8 2 8 2 7 2 7 2 7 2 7 2 7 2 6 2 6 2 6 2
204. ein L13 50 000 T 80 Nt CMM_2485 sugar ABC transporter ATPase 47 000 T 105 Nt CMM_1551 rpsT 30S ribosomal protein S20 47 000 T leaderless CMM_0010 ppiA peptidyl prolyl cis trans isomerase Se fi 90 Nt CMM_2644 ATP dependent helicase 20 500 M 22 Nt CMM_2761 hypothetical protein 20 000 M 55 Nt CMM_1625 conserved membrane protein 20 000 T 400 Nt CMM_1550 holA DNA polymerase III 6 subunit 18 000 T 120 Nt CMM_1611 cspAT cold shock protein TAPOUT IN SOME REN ee factor 15 400 T 48 Nt CMM_2244 greA transcription elongation factor 11 7000 T 122 Nt CMM_2934 hupB DNA binding protein 13 000 T 100 Nt CMM_1752 rpsA 30S ribosomal protein S1 10 000 T 27 Nt CMM_1617 acpP acyl carrier protein 9 600 T 73 Nt CMM_1670 oxidoreductase 5 091 T 44 Nt pCM2_0036 transcriptional regulator 4 300 M 8 Nt CMM_1184 hypothetical protein 4 200 M 26 Nt CMM_2776 hypothetical protein 2 300 M leaderless CMM_0688 hypothetical protein 773 T 9 Nt nach ATG pCM2_0012 hypothetical protein 580 T 44 Nt vor TAG pCM2_0060 hypothetical protein 222 M T 100 Nt pCM1_0028 repA putative replication protein 207 T 27 Nt pCM2_0042 hypothetical protein 178 M T 56 Nt pCM1_0009 hypothetical protein 123 M T 45 Nt pCM1_0023 ppaJ extracellular serine protease Ergebnisse 109 Insgesamt wurden in TBY Medium 12 634 480 reads identifiziert
205. einer Bakterienkultur wurde eine Western Blot Analyse durchgef hrt Nach der Auftrennung der Proteine mittels SDS PAGE siehe Abschnitt 3 4 5 wurden diese auf eine PVDF Membran Millipore Immobilon P Roth Karlsruhe transferiert Dazu wurde die Membran kurz in 60 igem v v Methanol und in Transferpuffer inkubiert und auf in Transferpuffer getr nkte Filterpapiere Schleicher amp Schuell Dassel in eine semi dry Blot Apparatur Amersham Biosciences USA gelegt Darauf wurden das Proteingel und weitere getr nkte Filterpapiere gelegt Der Proteintransfer auf die Membran erfolgte f r 1 h bei 0 8 mA cm Anschlie end wurde die Membran f r 5 min in 1 x PBS T Puffer und danach f r eine Stunde in Blockierungsl sung auf der Wippe GFL mbH Burgwedel inkubiert Nach der Zugabe des GFP spezifischen Antik rpers anti GFP Roche Mannheim in der Maus generiert in einer Konzentration von 1 10 000 wurde die Membran ber Nacht auf der Wippe inkubiert Darauf folgten drei f nfmin tige Waschschritte in 1x PBS T Puffer und eine Inkubation f r 1 h in Blockierungsl sung mit einem sekund ren Antik rper an den eine alkalische Phosphatase gekoppelt war 1 10 000 Anti Maus Sigma Material und Methoden 53 Aldrich Steinheim Die Membran wurde anschlie end wiederum drei Mal f r 5 min in 1x PBS T Puffer gewaschen F r die Detektion des Signals wurden BCIP und NPT Roth Karlsruhe verwendet welche als Substrate f r die alkalische Phosphatase dient
206. elate desuccinylase para aminobenzoate synthetase component Il heat shock regulator transcriptional regulator MerR family hypothetical membrane protein pyruvate kinase hydrolase cobalt zinc cadmium efflux permease CDF family pantothenate kinase possibly involved in mycothiol synthesis ribonuclease H ATP dependent helicase transcriptional regulator Cro Cl family conserved hypothetical protein putative hydrolase HAD family ATP dependent DNA helicase conserved hypothetical protein 50S ribosomal protein L25 ferric uptake regulator Fur family duplicated acetyltransferase uroporphyrinogen decarboxylase ABC transporter ATPase involved in cell division conserved secreted protein putative esterase lipase alpha beta hydrolase family conserved hypothetical protein chorismate mutase hypothetical protein ferredoxin GTP binding protein inosine 5 monophosphate dehydrogenase ATP dependent DNA helicase conserved hypothetical protein conserved hypothetical protein 50S ribosomal protein L5 30S ribosomal protein S8 1 deoxy D xylulose 5 phosphate reductoisomerase DNA replication and repair protein transcriptional regulator Lac family hypothetical secreted protein transcriptional regulator TetR family hypothetical membrane protein organic acid CoA ligase ribonucleoside diphosphate reductase beta subunit ATP dependent DNA helicase conserved membrane protein transcriptional regulator TetR family glutamate
207. ellul re bakterielle Proteine beteiligt sind Alarc n et al Einleitung 18 1998 Somit zahlen spezifische extrazellulare Proteine von C michiganensis subsp michiganensis zu den bakteriellen PAMPs die von pflanzlichen Rezeptoren erkannt werden und Abwehrreaktionen ausl sen siehe Abschnitt 2 1 Weitere m gliche PAMPs k nnten extrazellul re Polysaccharide EPS andere Zellwandkomponenten wie Peptidoglycan Lipoteichons uren sowie Lipopeptide sein aber auch hydrolytische Enzyme oder deren Produkte aus der pflanzlichen Zellwand Balaji amp Sessa 2008 Als Reaktion auf die bakterielle Infektion kommt es zu einer basalen Pflanzenantwort bei der unter anderem PR und Rezeptorgene hochreguliert freie Sauerstoffspezies produziert werden und die Hormonbiosynthese zum Beispiel von Ethylen erh ht wird Balaji et al 2008 Balaji amp Sessa 2008 2 4 2 Virulenzfaktoren in C michiganensis subsp michiganensis In C michiganensis subsp michiganensis sind erst wenige Virulenzfaktoren charakterisiert Zum einen sind das die Serinproteasen Pat 1 Dreier et al 1997 ChpC und ChpG Stork et al 2008 sowie PpaA und PpaC Eichenlaub amp Gartemann 2011 zum anderen ist das die Endo 1 4 Glucanase CelA Jahr et al 2000 Das Genom von C michiganensis subsp michiganensis enth lt 46 Gene die f r m gliche Serinproteasen kodieren wovon 21 extrazellul r aktiv und acht putative Pseudogene sind Fl gel et al 2012 Die extra
208. en Daf r wurden je 65 ul einer BCIP und NBT Stamml sung in 10 ml Inkubationspuffer verd nnt und auf die Membran gegeben Die Membran wurde bis zur gew nschten Signalst rke im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert Die Reaktion wurde durch die Zugabe von Stoppl sung beendet Anschlie end wurde die Membran zwischen Filterpapieren Schleicher amp Schuell Dassel getrocknet Transferpuffer 25 mM Tris 0 2 M Glycin 20 v v Methanol pH HCI 8 5 1x PBS Puffer 11 8 g NaCl 2 g KCI 2 4 g KH2POQ 36 9 g NasHPO x 12 H2O pH 7 4 Sterilisation durch Autoklavieren 1 x PBS T Puffer 1 x PBS Puffer mit 0 1 v v Tween 20 steril Blockierungsl sung 5 w v Magermilchpulver in 1 x PBS BCIP Stamml sung 0 5 g 5 Brom 4 Chlor 3 indolylphosphat Toluidin Salz BCIP wurden in 20 ml 100 igem v v Dimethylformamid gel st und bei 20 C gelagert NBT Stamml sung 0 5 g Nitroblau Tetrazoliumchlorid NBT wurden in 10 ml 70 igem v v Dimethylformamid gel st und bei 20 C gelagert Inkubationspuffer 100 mM Tris pH HCl 9 5 100 mM NaCl 5 mM MgCl Stoppl sung 0 5 M EDTA in 1 x PBS Sterilisation durch Autoklavieren Material und Methoden 54 3 5 Techniken zur Manipulation von Bakterien 3 5 1 Herstellung kompetenter E coli DH5aMCR Chemisch kompetente E coli DH5aMCR wurden nach der Methode von Sambrook und Kollegen durch Behandlung mit CaCl hergestellt Sambrook et al 1989 Die Kultivierung erfolgte wi
209. enden Experimenten analysiert werden wobei jedoch der Beobachtungszeitraum verl ngert werden sollte Des Weiteren k nnte eine detailliertere Analyse der hypersensitiven Antwort durch die Bestimmung der Transkriptmengen weiterer Gene wie beispielsweise hsr515 und hini Czernic et al 1996 Pontier et al 1999 erfolgen 5 1 2 Interaktion mit der Wirts Pflanze S lycopersicum C michiganensis subsp michiganensis dringt ber nat rliche ffnungen oder ber Verwun dungen in seine Wirtspflanze S lycopersicum ein Strider 1969 Carlton et al 1998 Dabei findet die Infektion entweder schon im Keimlingsstadium ber kontaminiertes Saatgut statt oder erst in einem sp teren Wachstumsstadium der Tomatenpflanze Wie die Bakterien dabei vom Infektionsort an ihren Besiedelungsort die Xylemgef e gelangen und sich von dort ausbreiten ist nur ansatzweise untersucht Carlton et al 1998 Xu et al 2010 Nach der Infektion mit dem Wildtypstamm Cmm382 treten Krankheitssymptome wie Blattwelke St ngell sion und birds eyes auf den Tomatenfr chten auf und die Pflanze stirbt in den meisten F llen ab Erfolgt die bakterielle Infektion in einem sp ten Wachstumsstadium der Pflanze kann diese berleben Die Samen entstehender Tomatenfr chte k nnen jedoch infiziert werden sodass die Infektion auf die n chste Generation bergeht Fatmi et al 1991 In dieser Arbeit wurden Tomatensamen in vitro mit C michiganensis subsp michiganensis infiz
210. endent 148 CMM_2495 gpmA phosphoglycerate mutase phosphoglyceromutase A 145 CMM_2621 fusA elongation factor G EF G 111 3 1 143 CMM_ 2226 fbaA fructose bisphosphate aldolase 1 1 3 142 CMM_2462 transcriptional regulator histone like protein IV 3 1 140 CMM_2579 rpsi 30S ribosomal protein S9 111 3 3 138 CMM_0151 dnaK chaperone protein dnaK heat shock protein 70 IV 4 3 137 CMM _1743 pgk phosphoglycerate kinase 1 1 3 135 CMM_1844 metallopeptidase family M20A IV 7 3 Anhang Fortsetzung Tabelle 21 zytoplasmatisches Proteom von Cmm382 in M9 Medium 135 132 126 124 121 118 117 115 115 111 110 103 101 100 98 97 97 97 95 94 93 93 93 92 90 86 86 83 81 81 77 76 75 75 74 74 74 73 72 71 65 64 64 63 62 61 60 58 58 58 56 56 54 54 54 53 53 53 53 52 51 49 48 CMM_2548 sucC CMM _1852 CMM_ 2608 rpsQ CMM_1112 CMM _1367 rpsP CMM 2617 rpIC CMM _1485 ndkA CMM _0003 gndA1 CMM _1764 trpC CMM_2960 rpll CMM _1758 pykA CMM 1616 fabF CMM_2601 rpsE CMM _1779 rpoZ CMM_ 2554 guaA CMM_1205 CMM_1154 thrC CMM_0841 ipyA CMM_1096 ilvC CMM_2606 rpIX CMM_1642 IpdB CMM_2622 rpsG CMM _0991 accA CMM_2487 CMM_1169 atpD CMM_1465 cipP2 CMM_2774 CMM_1734 tktA CMM_0338 CMM_1384 tsf CMM_1082 CMM_2787 rp k CMM_1752 rpsA CMM_2613 rpsS CMM_2609 romC CMM_2616 rplD CMM_1383 rpsB CMM_2584 rpoA CMM_2974 CMM_2047 pnp CMM
211. endet die Kultivierung erfolgte dabei lediglich in Minimalmedium Von den 46 annotierten extrazellul ren Proteinen im Genom von Cmm382 wurden elf Proteine im M9 Medien bstand identifiziert und zehn Proteine im XMM Medium berstand wobei diese Proteine jeweils in allen drei Replikaten in das Medium sekretiert worden waren Die Anzahl konnte auf je 23 bzw 22 Proteine erh ht werden wenn auch Proteine betrachtet wurden die lediglich in einem oder zwei der Replikate identifiziert wurden Dabei fiel auf dass Proteine die durch Gene auf den zwei nat rlichen Plasmiden pCM1 und pCM2 exprimiert werden in beiden Medien jeweils nur in einem der Replikate identifiziert wurden Dies k nnte entweder durch einen Plasmidverlust bei der Kultivierung der Bakterien erkl rt werden oder dadurch dass die Genprodukte plasmidkodierter Gene extrazellul r lediglich in einer sehr niedrigen Konzentration vorlagen Die Analyse der Pektinaseaktivit t war in dieser Arbeit nicht erfolgreich Eine Cellulase und Proteaseaktivit t wurde in dieser Arbeit lediglich im Medien berstand des Wildtypstammes Cmm382 und nicht in dem des plasmidfreien Stammes Cmm100 nachgewiesen was darauf hinweist dass die Aktivit t durch plasmidkodierte Enzyme hervorgerufen wurde Diskussion 119 Die in dieser Arbeit beobachtete cellulolytische Aktivit t im Medien berstand einer Cmm382 Kultur kann vermutlich der Cellulase CelA zugeordnet werden Neben celA ist nur noch ein weiteres Cellul
212. endiert und auf TBY Platten mit entsprechendem Antibiotikum ausplattiert wurden Die Platten wurden f r zwei bis drei Tage bei 28 C inkubiert Entstandene Kolonien wurden nochmals auf TBY Antibiotikaplatten ausgestrichen und weitere ein bis zwei Tage bei 28 C inkubiert Je acht St mmen pro Elektroporation wurden mittels Kolonie PCR auf das Vorhandensein von pCM1 und pCM2 gepr ft siehe Abschnitt 3 3 1 3 3 5 5 Insertionsmutagenese in C michiganensis subsp michiganensis F r die Herstellung von Insertionsmutanten wurden kompetente C michiganensis subsp michiganensis St mme siehe Abschnitt 3 5 3 mit dem Plasmid pUC18cat welches homologe Sequenzen des Zielgens beinhaltete Tabelle 3 transformiert siehe Abschnitt 3 5 4 Die transformierten St mme wurden auf TBY Platten mit 10 ug ml Chloramphenicol ausplattiert Aus den St mmen die sowohl pCM1 als auch pCM2 besa en und auf den Platten mit Chloramphenicol wachsen konnten wurde die chromosomale DNA isoliert und diese in DNA Hybridisierungsexperimenten siehe Abschnitt 3 3 1 9 analysiert Die Insertion erfolgte nach homologer Rekombination wobei das gesamte Plasmid das in der Bakterienzelle nicht repliziert werden kann in den offenen Leserahmen des Zielgens eingef gt wurde Die spezifische DNA Sonde und die Restriktionsenzyme f r den Southern Blot wurden so gew hlt dass nach Vergleich mit der DNA des Wildtyps auf eine Insertion im Zielgen geschlossen werden konnte 3 5 6 Fluoresz
213. ene DNA Fragmente ligieren zu k nnen ben tigt es kompatible Schnittstellen Deshalb wurden Vektor und Insert mit einem oder zwei Restriktionsenzym en nach Angaben des Herstellers NEB Schwalbach in 30 ul Gesamtvolumen geschnitten Eine Restriktion wurde au erdem zur Kontrolle klonierter und isolierter Plasmide durchgef hrt Dabei wurde ein 10 ul Ansatz gew hlt 30 ul 10 ul Restriktions Ansatz 1 5 ug Plasmid DNA 0 5 ug oder 20 ul Insert DNA nach Reinigung 3 ul 10 x NEB Puffer 7 ul 3 ul 10 x BSA optional 7 ul 1 ul Restriktionsenzym 0 5 ul 1 ul Restriktionsenzym II optional 0 5 u X Ul H2Obaest F r die Restriktion mit Plasmid DNA wurden zus tzlich 0 5 ul CIP calf intestine phosphatase Roche Mannheim zugegeben um eine Dephosphorylierung der 5 DNA Enden zu gew hrleisten und damit eine Religation des Plasmids zu verhindern Die Inkubation erfolgte f r 1 h bei 37 C Bei einem folgenden Southern Blot siehe Abschnitt 3 3 1 9 wurde die Inkubation ber Nacht durchgef hrt Wenn n tig wurden die Enzyme anschlie end bei 65 C oder 80 C f r 20 min inaktiviert Der Erfolg der Restriktion wurde anschlie end mittels Agarose Gelelektrophorese untersucht siehe Abschnitt 3 3 1 5 F r Klonierungen wurden entsprechende DNA Fragmente aus dem Gel ausgeschnitten und die DNA wurde daraus extrahiert siehe Abschnitt 3 3 1 5 Material und Methoden 33 3 3 1 5 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA Zur Gr e
214. enen konnten Aussagen ber vorhandene Promotorstrukturen 10 und 35 Region sowie Shine Dalgarno Sequenz bei Translationsstartpunkt identisch sind getroffen werden In Tabelle 32 sind die stromaufw rts Transkriptionsstartpunkte und leaderless Transkripte denen Transkriptions und liegenden Regionen der 48 Gene aufgelistet sowie wenn vorhanden Promotorstrukturen und Transkriptionsstartpunkte In Tabelle 33 sind die Gene und die zugeh rigen COG Gruppen aufgelistet deren Transkripte mittels manueller Analyse als eaderless Transkripte identifiziert wurden Bei diesen Transkripten sind Transkriptions und Translationsstartpunkt identisch In Tabelle 34 sind die Gene aufgelistet bei denen mittels manueller Analyse interne reads im offenen Leserahmen beobachtet wurden Tabelle 32 Analyse der stromaufw rtsliegenden Regionen von 48 Genen im Genom von Cmm382 nach der RNA Sequenzierung des 5 Transkriptoms von Cmm382 Aufgelistet ist das n chstgelegene Gen dessen m gliche Funktion die Sequenz stromaufw rts des Gens mit der 10 und 35 Region rot dem Transkriptionsstartpunkt gro fett unterstrichen der Shine Dalgarno Sequenz gr n und dem Startcodon des Gens fett Au erdem ist die Anzahl der Basenpaare vom Transkriptionsstartpunkt bis zum Startcodon aufgelistet bp Abstand des Transkriptionsstartpunktes zum Startcodon in bp Gen m gliche Funktion Sequenz bp pCM1_0009 conserved hypothetical acctgggattgccgatgtcg
215. ensus pension nachgewiesen werden Daten nicht gezeigt Beide St mme wurden nicht in der Embryo Suspension identifiziert Je f nf Samen aus den Fr chten der mit Cmm102pDM302 Ppat 1gfo und Cmm100pDM302Ppat Tgfp infizierten Pflanzen wurden ausgesat Die Pflanzen die daraus hervorgingen zeigten auch noch 50 dpi keine Krankheitssymptome Daten nicht gezeigt Der Stamm Cmmi02pDM302Ppat 1gfo konnte somit in die Tomaten und auf die Samenoberfl che gelangen ein Eindringen in den Samen wurde jedoch nicht nachgewiesen Eine Detektion der Bakterien in St ngelquer und St ngell ngsschnitten mittels Fluoreszenz mikroskopie war in dieser Arbeit nicht erfolgreich 4 3 3 Analyse der Samenbesiedelung nach einer in vitro Infektion Um die in vitro Infektion steriler Samen mit C michiganensis subsp michiganensis zu analysieren wurden die Samen gesunder Tomatenpflanzen sterilisiert und f r 15 min in einer Bakteriensuspension 0Dsg 8 inkubiert Als Bakterienstamme wurde der Wildtypstamm Cmm382 der plasmidfreie Stamm Cmmi00 und der GFP exprimierende Stamm Cmm102pDM302Ppat 1gfp verwendet Je 20 Samen wurden in den Bakteriensuspensionen oder in 10 mM MgCl als Kontrolle inkubiert Die weitere Inkubation der Samen erfolgte auf MS Agar Pflanzenn hrmedium im Lichtschrank 7 dpi wurden die noch in der Samenh lle liegenden Embryos auf eine m gliche bakterielle Infektion hin untersucht Dazu wurden je f nf Samen ge ffnet und Samenh lle Keimwurzel Hyp
216. enzmessung F r die Herstellung von GFP Reportergen St mmen wurde das promotorlose Gen gfpuv aus pEPR1P45gfp in den E coli Clavibacter Shuttle Vektor pDM302 kloniert wobei das Gen cat welches f r eine Chloramphenicol Resistenz verantwortlich ist ersetzt wurde Tabelle 3 und Tabelle 4 Verschiedene putative Promotorregionen aus C michiganensis subsp michiganensis wurden ebenfalls eingef gt Kompetente C michiganensis subsp michiganensis St mme siehe Abschnitt 3 5 3 wurden mit den entsprechenden Plasmiden mittels Elektroporation transformiert siehe Abschnitt 3 5 4 Die entstandenen C michiganensis subsp michiganensis St mme Tabelle 2 welche durch die Material und Methoden 56 Elektroporation das nat rliche Plasmid pCM1 verloren hatten wurden wie in Abschnitt 3 2 3 beschrieben kultiviert Nach einem Zentrifugationsschritt 5 400 x g 10 min 4 C wurden die Bakterien entweder in fl ssigem Stickstoff schockgefroren und bei 20 C gelagert oder direkt in 1 x PBS gewaschen 5 400 x g 10 min 4 C 10 ml 1 x PBS wurden daraufhin mit der in wenig 1 x PBS aufgenommenen Bakteriensuspension auf eine 0Ds von 0 5 eingestellt Es wurden jeweils zwei Mal 2 ml Probe vermessen Nachdem die Probe mit Licht der Wellenl nge 395 nm angeregt wurde wurde die Licht Emission zwischen 500 und 515 nm mittels Fluorimeter Fluorolog 3 Double Spectrometer Spex Edison USA detektiert Die relativen Fluoreszenz Einheiten RFU wurden abhangig von
217. eordnet FCA fold change absolute SBP substrate binding protein FCA Gen Name M gliche Funktion COG 24 2 CMM _1790 anion ABC transporter substrate binding protein IV 1 19 7 CMM_1973 acyl CoA dehydrogenase V1 17 8 CMM_1956 monooxygenase V 1 14 4 CMM 1957 peptide ABC transporter ATPase IV 1 14 2 CMM _1789 anion ABC transporter permease component IV 1 13 4 CMM _ 2871 gpaA polygalacturonase IV 6 11 9 CMM _ 1499 hypothetical protein V 2 11 7 CMM _0186 oxidoreductase monooxygenase V1 10 7 CMM 2526 MFS permease IV 1 9 1 CMM_1035 conserved hypothetical protein V 2 8 4 CMM_0346 conserved membrane protein V 2 8 4 CMM_1466 monooxygenase V 1 8 0 CMM_1523 acetyltransferase V 1 7 7 CMM_0428 phosphoketolase 1 1 7 6 CMM_2277 regulatory protein zinc finger V 2 7 5 CMM_0049 nagA beta N acetylglucosaminidase 1 1 7 5 pCM1_0006 hypothetical protein IV 2 7 3 CMM_0430 hypothetical secreted protein putative cell surface protein 11 2 7 1 CMM_0445 conserved hypothetical protein V 2 6 8 CMM_2400 O acetylhomoserine thiol lyase 1 2 6 6 CMM_2729 conserved hypothetical protein sortase sorted 11 2 6 5 CMM_0044 ppaC extracellular serine protease IV 6 6 3 CMM_1478 oligopeptide ABC transporter substrate binding protein IV 1 6 3 CMM_PS_10 chpB pseudogene extracellular serine protease family STA IV 6 6 1 CMM_2401 conserved hypothetical protein CoA binding V 2 6 1 CMM_0051 pelA2 pectate lyase IV 6 5 7 CMM _1955 conserved hypothetical protein V 2 5 6 CMM_1
218. eordnet werden Das Genom besteht aus dem Chromosom 3 298 Mb und den beiden nat rlichen Plasmiden pCM1 27 4 kbp und pCM2 70 kbp Abbildung 3 Das Chromosom hat einen G C Gehalt von 72 6 und enth lt 2 984 f r Proteine kodierende Sequenzen wovon 2 029 eine Funktion zugewiesen werden konnte pCM1 hat einen G C Gehalt von 66 5 und 28 kodierende Bereiche von denen nur f r sieben die Funktion bekannt ist pCM2 hat einen G C Gehalt von 67 6 Von den 68 kodierenden Sequenzen ist nur f r 14 die Funktion bekannt Das Genom von C michiganensis subsp michiganensis enth lt 26 Pseudogene also nicht funktionelle Kopien Protein kodierender Gene Chan et al 2013 Es sind keine Insertionselemente oder Transposons vorhanden wie sie bei anderen phytopathogenen Bakterien nachgewiesen werden konnten Gartemann Einleitung 14 et al 2008 Abschnitt 2 2 Die Anzahl der Gene im Genom von C michiganensis subsp michiganensis die f r Transporter und Regulatoren kodieren entspricht der von Bodenbakterien wobei vor allem Gene vorhanden sind die f r putative Carbons ure und Zuckertransporter kodieren Gartemann et al 2008 Die ausschlie lich aerobe Lebensweise schlie t Energiegewinnung durch G rung oder anaerobe Atmung eher aus weshalb keine Gene f r die Sulfat Nitrat und Nitritreduktion vorhanden sind Die meisten Gene f r die Synthese von Aminos uren sind verf gbar Gartemann et al 2008 F r ein Wachstum in Minimalmedium
219. eotiden npt_Accl_fw 5 GGCCGTCGACCGATGGGAACCACGGAGAAG 3 und npt_ Xbal_rev 5 Anhang 144 CCGGTCTAGAGCTCAGAAGAACTCGTCAAG 3 mit den Restriktionsenzymen Accl und Xbal geschnitten und in den geschnittenen Vektor pUC18 Yanisch Perron et al 1985 ligiert 7 2 MALDI ToF MS Daten des extrazellul ren Proteoms von Cmm382 Zur Analyse des extrazellul ren Proteoms von Cmm382 in Minimalmedium M9 und in dem synthetischen Xylemsaft imitierenden Medium XMM wurde der Medien berstand aus 450 ml Kultur biologischen Triplikaten Dabei wurden 227 Proteine im Medien berstand einer M9 Kultur identifiziert Tabelle 19 und 160 im Medien berstand einer XMM Kultur Tabelle 20 Die Einteilung der Gene von Cmm382 in die entsprechenden COG Gruppen wurde aus Fl gel et mittels MALDI ToF Massenspektrometrie analysiert Die Analyse erfolgte in al 2012 bernommen Tabelle 19 Mittels MALDI ToF MS identifizierte extrazellul re Proteine aus Cmm332 in Minimalmedium M9 Dargestellt sind alle 227 Proteine die in einem oder mehreren der Replikate 1 2 oder 3 bei der Analyse des extrazellul ren Proteoms identifiziert wurden Die entsprechenden Gene wurden nach dem absteigenden Score Wert geordnet SBP substrat binding protein PBP penicillin binding protein Score Gen Name m gliche Funktion COG ee ea 11 300 CMM_0338 conserved secreted protein putative PBP V 2 3 3 485 CMM_0976 ABC transporter substrate binding protein IV 1 3 1 623 CMM 2941 met
220. er Medien berstand einer Bakterienkultur auf extrazellulare Proteine hin analysiert Die Genprodukte von 46 Genen im Genom von C michiganensis subsp michiganensis sind als extrazellul r annotiert Fl gel et a 2012 F r die Cellulase CelA und die Serinproteasen Pat 1 ChpC ChpG PpaA und PpaC wurde gezeigt dass sie wichtig f r die Ausbildung der Virulenz sind Dreier et al 1997 Jahr et al 2000 Stork et al 2008 Eichenlaub amp Gartemann 2011 Neben Cellulasen und Serinproteasen sind weitere Gene im Genom von C michiganensis subsp michiganensis vorhanden deren Genprodukte eine Rolle bei der phytopathogenen Interaktion spielen k nnten Dazu z hlen Pektatlyasen PelA1 und PelA2 f r die bekannt ist dass sie f r die Pathogenitat von Bakterien wichtig sind Ben Daniel et al 2012 Xylanasen XysA und XysB Endoglucanasen zum Beispiel CMM_0795 ein Expansin ExpA und Polygalacturonasen PgaA In dieser Arbeit wurden die Proteine des Medien berstands einer C michiganensis subsp michiganensis Kultur zum einen in drei Replikaten mittels MALDI ToF Massenspektrometrie identifiziert und zum anderen auf ihre m gliche Cellulase Protease und Pektinaseaktivit t hin analysiert siehe Abschnitt 4 4 2 2 F r die Identifizierung der Proteine wurde der Wildtypstamm Cmm382 in Minimalmedium und in dem Xylemsaft imitierenden Medium XMM kultiviert F r die Aktivit tsanalyse wurde zus tzlich der plasmidfreie Stamm Cmm100 verw
221. ert 5 400 x g 10 min 4 C die Zellpellets wurden in fl ssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Aufbereitung bei 80 C gelagert Die Isolierung der RNA erfolgte mit Hilfe des NucleoSpin RNA II Kits Macherey Nagel D ren Dazu wurde das Zellpellet nach dem Auftauen auf Eis in 350 ul RA1 Puffer mit 1 v v Mercaptoethanol resuspendiert und die Suspension daraufhin in 2 ml Cryor hrchen mit 300 mg Glasperlen Durchmesser 0 2 0 3 mm transferiert Der Zellaufschluss erfolgte durch zweimaliges hochfrequentes Sch tteln im Precellys 24 Homogenisator peqlab Biotechnologie GmbH Erlangen f r 30 s bei 6 5 m s Zwischen den Intervallen wurde die Suspension f r 3 min auf Eis gek hlt Glasperlen und Zelltr mmer wurden durch Zentrifugation 13 000 x g 3 min 4 C sedimentiert die berst nde mit 350 ul 70 igem v v Ethanol gemischt und die L sungen auf S ulchen mit blauem Ring gegeben Die weitere Isolierung wurde nach Angaben des Herstellers durchgef hrt wobei die RNA f r 15 min mit rDNase Macherey Nagel D ren inkubiert wurde Der RNA Isolierung folgte eine Behandlung mit der TURBO DNase Ambion Austin USA um noch vorhandene DNA abzubauen Anschlie end wurde die RNA erneut mit dem NucleoSpin RNA Il Kit Macherey Nagel D ren gereinigt Die Konzentration der RNA wurde am Nanodrop ND1000 Spectrophotometer peglab Biotechnologie GmbH Erlangen bei einer Wellenl nge von 260 nm bestimmt Die Reinheit sollte dabei f r Azg
222. ert Die Analyse dieser Virulenzfaktoren wurde vor allem gezielt mittels Mutagenese Studien durchgef hrt Die Identifizierung unbekannter und die Verifizierung putativer Virulenzfaktoren wurden von Fl gel und Kollegen mittels Microarray Studien durchgef hrt Fl gel et al 2012 Die zu analysierende RNA wurde dabei aus Bakterien isoliert die sich entweder in der Pflanze vermehrten oder in Minimalmedium mit 5 w v Pflanzenhomogenat kultiviert wurden Zur Analyse und Charakterisierung von Virulenz faktoren wurden in dieser Arbeit mehrere Methoden verwendet Eine direkte Isolierung der Ergebnisse 71 Bakterien aus dem Xylemsaft infizierter Pflanzen war nicht m glich Wurde der Xylemsaft infizierter Pflanzen isoliert und auf Agar Platten drei bis f nf Tage bei 28 C inkubiert konnten keine Bakterien nachgewiesen werden Eine Vermutung war dass die Bakterien sich an die Pflanzenzellen angeheftet oder Aggregate gebildet hatten sodass sie nicht mit dem Xylemsaft zusammen isoliert werden konnten Deshalb wurde ein synthetisches Xylemsaft imitierendes Medium hergestellt um Virulenzfaktoren auf Proteom und Transkriptionsebene zu analysieren Auf Proteomebene wurden Oberflachenproteine zytoplasmatische und extrazellul re Proteine isoliert und analysiert Dabei wurden die Proteine aus einer Bakterienkultur in Minimalmedium und Xylemsaft imitierendem Medium verglichen 4 4 1 Xylemsaft imitierendes in vitro Medium XMM Die Induktion der Expre
223. erved secreted protein conserved hypothetical protein oligoribonuclease NH 3 dependent NAD synthetase hypothetical protein ABC transporter ATPase conserved hypothetical protein methylase ATP dependent helicase glucose 6 phosphate 1 dehydrogenase conserved hypothetical protein hydrolase HIT family two component system sensor kinase DNA primase conserved membrane protein putative transporter DMT family glycosyltransferase malonyl CoA acyl carrier protein transacylase transcriptional regulator TetR family polyphosphate glucokinase ROK family conserved hypothetical protein conserved membrane protein conserved hypothetical protein deoxyuridine 5 triphosphate pyrophosphatase conserved hypothetical protein hydrolase glycosyltransferase glucose 1 phosphate adenylyltransferase DNA polymerase response regulator involved in antitermination phosphoribosyl ATP pyrophosphatase V 2 IV 1 IV 1 IV 3 V 1 V 1 111 3 1 6 V 1 1 5 111 3 IV 3 1 2 IV 2 IV 1 V 2 V 2 1 5 IV 3 V 1 V 1 111 1 V 2 IV 1 V 1 V 2 V 2 11 2 IV 1 1 3 V 1 111 3 V 2 1 5 111 3 V 2 V 2 11 2 1 5 V 2 IV 1 V 2 V 1 111 1 1 1 V 2 V 1 IV 3 111 1 IV 1 11 2 1 4 IV 3 1 1 V 2 V 2 V 2 1 3 V 2 Val 11 2 1 1 111 1 IV 3 1 2 203 Anhang Fortsetzung Tabelle 33 leaderless Transkripte der Gene im Genom von Cmm382 CMM_1772 CMM_1794 aroQ CMM_1824 CMM_1834 ctaE CMM_1848 hisD CMM_1871 CMM_1874 aroG CMM_
224. es aus Tomatenpflanzen Die Isolierung des Xylemsaftes aus vier Wochen alten Tomatenpflanzen erfolgte in Anlehnung an das Protokoll von Rell n lvarez und Kollegen Rellan Alvarez et al 2011 Die St ngel wurden etwa 10 cm ber den Keimbl ttern abgeschnitten Um eine Kontami nation mit dem Phloemsaft zu vermeiden wurde der Xylemsaft erst nach 5 min gesammelt Nach der Sterilisation durch Filtration wurde der Xylemsaft bei 20 C gelagert 3 3 Molekularbiologische Techniken 3 3 1 DNA Techniken Material und Methoden 30 3 3 1 1 Isolierung von Plasmid DNA aus E coli F r die Plasmidisolierung wurden E coli wie in Abschnitt 3 2 2 beschrieben kultiviert F r die Isolierung von kleinen Plasmidmengen wurde das NucleoSpin Plasmid Kit Macherey Nagel D ren verwendet Um gr ere DNA Mengen zu isolieren wurde das NucleoBond Xtra Midi Kit Macherey Nagel D ren eingesetzt Die Isolierung erfolge nach Angaben des Herstellers Die Konzentrationsbestimmung wurde mittels Nanodrop ND1000 Spectrophotometer peqlab Biotechnologie GmbH Erlangen durchgef hrt 3 3 1 2 Isolierung chromosomaler DNA aus C michiganensis subsp michiganensis Zur Isolierung von chromosomaler DNA aus C michiganensis subsp michiganensis wurden die Bakterien wie in Abschnitt 3 2 3 erl utert kultiviert und in Anlehnung an das Protokoll f r Corynebacterium glutamicum weiter behandelt Eikmanns et al 1994 Nach einem Zentrifugationsschritt 4 000 x g 10 m
225. eschnitten siehe Abschnitt 3 3 1 4 Die DNA wurde anschlie end gelelektrophoretisch aufgetrennt siehe Abschnitt 3 3 1 5 Als Kontrolle wurde ein mit Digoxigenin markierter DNA Marker DNA Molecular Weight Marker VII Roche Diagnostics Mannheim mit auf das Gel aufgetragen Das Gel wurde nach dem Lauf von etwa 1 112 h 15 min in Depurinierungsl sung 2 x 15 min in Denaturierungsl sung und 2 x 10 min in Neutralisierungsl sung auf der Wippe GFL mbH Burgwedel inkubiert Es folgte eine bertragung der DNA auf eine positiv geladene Nylonmembran Roche Diagnostics Mannheim mittels Kapillarblot VacuGene Vakuum Pumpe GE Healthcare Freiburg f r 2 h bei 50 mbar wobei eine st ndige Beschichtung des Gels mit 20 x SSC gew hrleistet wurde Die Fixierung der DNA an die Membran wurde durch UV Strahlung 2 x Autocrosslink UV Stratalinker 1800 Stratagene Heidelberg gew hrleistet Die Membran wurde anschlie end in 10 ml DIG Easy Hyb Roche Diagnostics Material und Methoden 36 Mannheim f r 30 min bei 42 C im Hybridisierungsofen HYBAID Biometra G ttingen inkubiert Nach der Zugabe von 3 5 ul Sonden DNA siehe Abschnitt 3 3 1 8 die zuvor fur 5 min bei 95 C denaturiert wurde erfolgte eine Inkubation Uber Nacht bei 50 C im Hybridisierungsofen HYBAID Biometra G ttingen Es folgten vier Waschschritte wobei die ersten zwei f r 5 min bei Raumtemperatur in 2 x SSC 0 1 w v SDS erfolgten und die folgenden zwei f r 15 min
226. eta F ATPase subunit beta ATP synthase epsilon chain conserved membrane protein transcriptional regulator PadR family lipoyl synthase ATP dependent RNA helicase fatty acid desaturase serine protease family S1B CDP glycerol poly Glycerophosphate glycerophosphotransferase polysaccharide polyol phosphate ABC transporter ATPase polysaccharide polyol phosphate ABC transporter permease component sugar nucleotidyltransferase ribonuclease PH TRNA nucleotidyltransferase peptide chain release factor RF 2 2 oxoglutarate dehydrogenase E1 component 3 isopropylmalate dehydratase small subunit glycerol 3 phosphate dehydrogenase conserved hypothetical protein 30S ribosomal protein S16 50S ribosomal protein L19 30S ribosomal protein S2 elongation factor Ts EF Ts uridylate kinase ribosome recycling factor ribosome releasing factor glutamyl tRNA Gin amidotransferase subunit A aspartyl glutamyl tRNA Asn Gin amidotransferase subunit B ABC transporter ATPase trigger factor prolyl isomerase chaperone 111 3 IV 1 IV 1 V 2 1 2 1 1 1 1 IV 1 IV 1 1 2 1 1 11 2 111 1 111 1 1 1 IV 1 1 3 1 4 1 4 1 5 IV 2 IV 5 1 2 1 2 1 2 1 2 1 6 1 2 111 2 111 3 IV 1 IV 1 IV 1 IV 1 IV 1 IV 1 IV 1 IV 1 V 2 IV 3 1 5 11 1 1 4 IV 7 11 2 IV 1 IV 1 11 2 II 2 111 3 1 1 1 2 1 1 V 2 111 3 111 3 111 3 111 3 1 3 111 3 111 3 111 3 IV 1 IV 4 Anhang 207 Fortsetzung Tabelle 34 Transkripte
227. etr nktes Filterpapier Schleicher amp Schuell Dassel gelegt wurde F r die bertragung wurde die Minifold I Dot Blot Apparatur Schleicher amp Schuell Dassel und eine Vakuumpumpe GE Healthcare Freiburg bei 20 mbar verwendet Nach vollst ndiger bertragung der Proben wurde die Membran f r 5 min bei 100 mbar getrocknet Anschlie end wurde die RNA durch UV Bestrahlung im Crosslinker 2 x Autocrosslink UV Stratalinker 1800 Stratagene Heidelberg auf der Membran fixiert Die Membran wurde daraufhin im Hybridisierungsofen HYBAID Biometra G ttingen f r 1h bei 50 C in 12 5 ml Pr hybridisierungsl sung blockiert Nach der Zugabe von 3 5 ul spezifischer DIG markierter RNA Sonde siehe Abschnitt 3 3 2 4 erfolgte die Hybridisierung ber Nacht bei 68 C Es folgten zwei 15 min tige Waschschritte der Membran mit 2 x SSC 0 1 w v SDS bei Raumtemperatur und zwei 25 min tige Waschschritte mit 0 2 x SSC 0 1 w v SDS bei 68 C Anschlie end wurde die Membran kurz in 1 x Waschpuffer und danach in 1 x Blockierungsl sung f r 30 min bei Raumtemperatur auf der Wippe GFL mbH Burgwedel inkubiert Nach der Zugabe von Anti DIG AP konjugiertem Fab Fragment Roche Diagnostics Mannheim in einer Verd nnung von 1 10 000 wurde die Membran f r 30 min bei Raumtemperatur inkubiert Zum Entfernen von nicht gebundenem Antik rper wurde die Membran drei Mal 15 min in 1 x Waschpuffer gewaschen Zum Nachweis der Hybridisierung Material
228. etzung Tabelle 29 H here Transkriptmengen in XMM Medium AS als in XMM Medium 1 2 CMM_0503 transcriptional regulator TetR family IV 3 1 2 CMM _16387 tatA Sec independent twin arginine protein translocase protein IV 2 1 2 CMM 1727 putative Fe S cluster assembly protein IV 5 1 2 CMM_2158 pknF serine threonine protein kinase IV 3 1 2 CMM_0900 DNA polymerase Ill gamma and tau subunit 111 1 1 2 CMM _1493 proA gamma glutamyl phosphate reductase 1 2 1 2 CMM_1559 conserved hypothetical protein V 2 1 2 CMM_2476 two component system sensor kinase IV 3 1 2 CMM_2698 sugar ABC transporter permease component IV 1 1 2 CMM_2169 surface protein putative RTX toxin 11 2 1 2 CMM_0159 conserved hypothetical protein V 2 1 2 CMM_0672 conserved hypothetical protein putative ATPase V 2 1 2 CMM_1477 oligopeptide ABC transporter permease component IV 1 1 2 CMM_1555 epA GTP binding protein 111 3 1 2 CMM _1396 thioredoxin IV 5 1 2 CMM_1199 NTP pyrophosphohydrolase 111 1 1 2 CMM_1829 dihydroxyacetone kinase 1 1 1 2 CMM_1421 conserved hypothetical protein putative phosphoesterase V 2 1 2 CMM_1309 ftsE ABC transporter ATPase involved in cell division IV 1 1 2 CMM_0107 sugar ABC transporter permease compound IV 1 1 2 CMM_2561 guaB2 inosine 5 monophosphate dehydrogenase 1 3 1 2 CMM_1887 dctR two component system response regulator IV 3 1 2 CMM_1360 acetyltransferase V1 1 1 CMM_2647 putative phospholipase carboxylesterase V 2 1 1 CMM_1913 amin
229. f hrbar Der Mutantenstamm EH2408 zeigte ein im Gegensatz zu Cmm382 leicht eingeschr nktes Wachstum in Vollmedium TBY und in XMM Medium Der Mutantenstamm EH2766 zeigte ein im Gegensatz zu Cmm382 leicht eingeschr nktes Wachstum in Vollmedium TBY und ein deutlich eingeschr nktes Wachstum in XMM Medium Im Gegensatz zu celA dessen Transkriptmenge in keinem der drei Medien erh ht war wurde f r pat 7 eine deutlich erh hte Transkriptmenge in M9 Medium und eine leicht erh hte Transkriptmenge in XMM Medium nachgewiesen In Infektionsexperimenten von Tomatenpflanzen wurde f r beide Mutanten st mme verglichen mit dem Wildtypstamm zum Teil eine fr here Entstehung von Krankheitssymptomen beobachtet sowie das Absterben einer gr eren Zahl infizierter Pflanzen Da das Experiment jedoch nur einmal erfolgreich durchgef hrt werden konnte k nnen keine Aussagen getroffen werden ob die Mutation von CMM_2408 und CMM_2766 einen Einfluss auf die Virulenz des Bakteriums hatte Aus den Ergebnissen in dieser Arbeit geht hervor dass die Genprodukte von CMM_2408 und CMM 2766 an der Regulation der Genexpression des Serinproteasegens pat 1 als Diskussion 125 Repressoren beteiligt sind Die unterschiedlich starke pat 1 Expression in den drei Medien weist darauf hin dass neben den Repressoren weitere regulatorische Elemente notwendig sind Ein Regulator der die Genexpression auf ein Signal hin aktiviert ware vorstellbar ebenso wie die Regulation mit Hil
230. f r Regulatoren 7 f r Resistenzproteine und 3 f r extrazellul re Proteine Abbildung 20 Zu den Resistenzgenen z hlen zum Beispiel die Gene des Operons CMM_0094 CMM_0096 deren Genprodukte am Energiemetabolismus beteiligt sind CMM _0094 cytA kodiert f r Cytochrom P450 das zum Beispiel in R fasciens eine Rolle bei der Virulenz des Bakteriums spielt Healy ef al 2002 Die Transkriptmengen der Gene CMM_2535 sbtB CMM_1674 xysB und CMM_0795 die f r extrazellul re Proteine kodieren waren in XMM Medium um das 2 6 bis 3 9 fache h her als in M9 Medium 37 der Gene deren mRNA Level in XMM Medium h her war als in M9 Medium wurden der COG Gruppe unzureichend charakterisiert zugeteilt Bei Wachstum in XMM Medium wird somit vor allem das mRNA Level von Genen erh ht die f r Transporter vor allem Zuckertransporter kodieren Nur f r wenige Gene die f r extrazellul re Proteine kodieren wurde in XMM Medium eine zu M9 Medium ver nderte Transkriptmenge beobachtet Von denen f r C michiganensis subsp michiganensis annotierten 46 Genen f r extrazellul re Proteine wurden in den Microarray Experimenten lediglich vier Gene identifiziert wovon drei der Gene in XMM Medium im Vergleich mit M9 Medium eine h here Transkriptmenge zeigten Tabelle 14 Wurde die Microarray Auswertung ohne die Benjamini Hochberg Korrektur Benjamini amp Hochberg 1995 durchgef hrt konnten sieben Gene identifiziert werden die f r extrazellul
231. fe eines Sigma Faktors oder durch mRNA Abbau In weiteren Experimenten k nnte getestet werden welchen Einfluss eine CMM_2408 CMM _2766 Doppelmutante auf die Transkriptmenge von pat 7 hat Au erdem k nnte die Promotorregion von pat 1 auf Repressor und Aktivator Bindestellen hin analysiert werden Sechs der in dieser Arbeit identifizierten Regulatoren wurden auch schon in fr heren Ver ffentlichungen nachgewiesen Savidor et al 2012 Die Analyse dieser sechs Regulatoren w re ein weiterer denkbarer Schritt 5 7 Homologe Sequenzen innerhalb des Genoms von Cmm382 Wie schon erw hnt wurde bei der Insertionsmutagenese des Regulatorgens pCM2_0056 eine zu pCM2_0056 100 identische Sequenz auf dem Chromosom CMM _0055 identifiziert siehe Abschnitt 4 5 2 Zur berpr fung weiterer homologer Sequenzen wurde die Sequenz des Chromosoms mit den Sequenzen von pCM1 und pCM2 verglichen Etwa 0 5 des Chromosoms 27 von pCM2 und 7 von pCM1 wiesen dabei Sequenz homologien auf wobei homologe Bereiche eine 82 98 ige Identit t zueinander zeigten Abbildung 34 Chromosom Ni 3 297 891 40 000 113 000 _ pCM2 Nt _ pCM1 Nt on 1 27 357 Abbildung 34 Sequenzvergleich des Chromosoms und der Plasmide pCM1 und pCM2 Ein Bereich ber 73 000 Nukleotide im Chromosom schwarz zeigt in den homologen Sequenzen eine 88 92 ige Ubereinstimmung mit der Sequenz von pCM2 blau oder pCM1 rot In b
232. flanzen Insgesamt wurden je sieben Pflanzen ber die Wurzeln mit dem Wildtypstamm Cmm382 Wt und den Insertionsmutanten EH2408 und EH2766 infiziert Diese zeigten 19 dpi unter schiedliche Krankheitssymptome wie Blattwelke und St ngell sion Ein Gro teil der infizierten Pflanzen war zu diesem Zeitpunkt abgestorben Eine Infektion mit dem Stamm EH2408 war dabei f r 86 der Pflanzen letal eine Infektion mit dem Stamm EH2766 f r 71 der Pflanzen und eine mit dem Stamm Cmm382 f r 57 der Pflanzen Keine Krankheitssymptome zeigten zwei Pflanzen die mit dem Stamm EH2766 infiziert worden waren und eine Cmm3832 infizierte Pflanze Das Experiment wurde jedoch aus Zeitgr nden nur zwei Mal durchgef hrt wobei die Infektion beim ersten Experiment gr tenteils nicht erfolgreich war Daten nicht gezeigt Aus diesem Grund konnten keine Aussagen getroffen werden ob die Mutation der Regulator Gene eine Auswirkung auf die Virulenz des Bakteriums hatte 4 6 Promotorstudien Um zuk nftige Regulator Bindestellen oder Gene eines Regulons identifizieren zu k nnen deren Expression bei der Wirt Pathogen Interaktion reguliert wird sind Promotoranalysen notwendig Durch zur Verf gung stehende Konsensus Sequenzen f r Promotorstrukturen wie die 10 und 35 Region sowie die Shine Dalgarno Sequenz wird die Analyse noch nicht charakterisierter Promotoren vereinfacht Promotorstudien wurden bis jetzt nur f r die Virulenzgene pat 1 Dreier et al 1997 u
233. flanzen Savidor et al 2012 Die Analyse annotierter putativer Virulenzfaktoren Einleitung 20 erfolgte durch Mutagenesestudien Dabei wurden die Zielgene entweder im Wildtypstamm deletiert Chalupowicz et al 2010 oder ber einen Vektor in den Stamm Cmm100 eingebracht Meletzus et al 1993 Dreier et al 1997 Jahr et al 2000 Wenn das Zielprotein ein Virulenzfaktor ist l st der transformierte Cmm100 Stamm in infizierten Pflanzen Krankheitssymptome aus Eine weitere Analyse von Virulenzfaktoren erfolgte f r C michiganensis subsp michiganensis durch Insertionsmutagenese Bei der Transformation des Wildtypstammes mit dem Insertionsplasmid kam es dabei meistens zu dem Verlust des nat rlichen Plasmids pCM2 Jahr et al 2000 Stork et al 2008 Nachfolgende Analysen konnten demnach nicht im Wildtypstamm sondern nur im Stamm Cmm101 durchgef hrt werden Allgemein wird durch die Mutation eines einzelnen Gens die Virulenz von C michiganensis subsp michiganensis vermutlich nicht oder nur teilweise eingeschrankt da die Pathogenitat des Bakteriums auf einem Zusammenspiel von Virulenzfaktoren basieren k nnte Walton 1994 Tews 2012 Weitere Analysen von Virulenzfaktoren erfolgten mit Hilfe von qPCR Chalupowicz et al 2010 und Microarray Experimenten Fl gel et al 2012 Die Analysen wurden unter anderem dadurch erm glicht dass zum einen der E coli Clavibacter Shuttle Vektor pDM302 zur Verf gung stand Meletzus amp Eichenlaub
234. ganensis ist allerdings eine Kontamination der Samen de Le n et al 2006 Diese kann in der Landwirtschaft nicht nur durch unsauberes Arbeiten stattfinden sondern auch durch das Eindringen der Bakterien in die entstehenden Tomatenfr chte infizierter Pflanzen Dabei ist bis jetzt unklar wie C michiganensis subsp michiganensis vom Samen in den Keimling gelangt Xu und Kollegen konnten eine Anh ufung von biolumineszenten C michiganensis subsp michiganensis St mmen in den Cotyledonen die ersten zwei Bl tter des Keimlings und im Hypocotyl St ngelabschnitt bis zu den Cotyledonen nachweisen Xu et al 2010 Zur Analyse der Samenbesiedelung aus infizierten Tomatenfr chten war in dieser Arbeit die Ergebnisse 65 Petiolusinfektion die bevorzugte Methode da eine Wurzelinfektion mit dem Wildtypstamm Cmm382 vor der Ausbildung von Fr chten f r die Pflanze letal ist Zus tzlich wurde die in vitro Infektion von sterilisierten Samen mit C michiganensis subsp michiganensis untersucht 4 3 1 Analyse von Krankheitssymptomen Zur Analyse von Krankheitssymptomen wurden zehn Tage alte Pflanzen im Zwei Blatt Stadium mit einer Cmm382 Suspension oDsgo 4 Uber die Wurzeln infiziert Etwa eine Woche nach der Infektion traten die ersten Krankheitssymptome auf die sich in den folgenden Tagen verst rkten sodass nach etwa zwei bis vier Wochen die Pflanzen abstarben Abbildung 11 B Abbildung 11 Krankheitssymptome von Tomatenpflanzen 15
235. ganensis subsp michiganensis in the presence of cadmium Ecotoxicology 18 4 447 454 Zgurskaya H l Evtushenko L l Akimov V N and Kalakoutskii L V 1993 Rathayibacter gen nov including the species Rathayibacter rathayi comb nov Rathayibacter tritici comb nov Rathayibacter iranicus comb nov and six strains from annual grasses Int J Syst Bacteriol 43 1 143 149 Zheng X Hu G Q She Z S and Zhu H 2011 Leaderless genes in bacteria clue to the evolution of translation initiation mechanisms in prokaryotes BMC Genomics 12 361 Anhang 142 7 Anhang 7 1 Plasmidkonstruktion Die Konstruktion der Plasmide die im Abschnitt 3 1 in Tabelle 3 aufgelistet sind wird im Folgenden beschrieben Schnittstellen f r Restriktionsenzyme sind fett markiert pDM302gfp F r nachfolgende Fluoreszenzmessungen wurde gfp aus dem Plasmid pEPR1P45gfp Knoppova et al 2007 mit den Oligonukleotiden gfp EcoRl fw CGGAATTCATG ATTGAACAAGAGGTA 3 und gfp Hindlll rev 5 CCAAGCTTT TATTTGTAGAGCTCATCC 3 amplifiziert mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Hindlll geschnitten und in das geschnittene Plasmid pDM302 Meletzus et al 1993 ligiert pDM302Ppat 1gfp Fur die Analyse der Promotorst rke des pat 1 Promotors mittels GFP Fluoreszenzmessung wurde eine 200 bp umfassende Promotorregion von pat T mit den Oligonukleotiden pat _prom Scal fw S AGAGTACTAGATCTCGGTTCGTTCGTAGGAG 3 und pat1_prom EcoRl rev 5
236. gcggtcgacc 50 SBP gcacgcacggtgggtccgcgccattcccatgcacaggaggaaccttg CMM_2568 10 kDa chaperonin actcgcgtigcgcgagtgcaagcegcggceccgtagaaictcacctGgcactctcctcg 63 GroES protein ggagattgccaatcagicttgtcccttagtcacgaaggaagaggtcaaccgtg CMM_ 2898 L alanine dehydrogenase ctacggagtitcacgcgttcgaagcgcacgatggccaccatgggtctcGccctcccg 57 Tabelle 33 Mittels manueller Analyse identifizierte eaderless Transkripte von 8 5 der Gene im Genom von Cmm382 Aufgelistet sind die Gene bei denen mittels RNA Sequenzierung mit Erreichen des Startcodons hohe read Zahlen ermittelt wurden Die entsprechende COG Gruppen Zuordnung ist ebenfalls aufgelistet Gen M gliche Funktion COG CMM_0010 ppiA peptidyl prolyl cis trans isomerase IV 4 CMM_0012 conserved membrane protein V 2 CMM_0013 sortase 11 2 CMM_0022 conserved membrane protein V 2 CMM_0029 g sA glutaminase 1 2 CMM_0078 NADH oxidase 1 1 CMM_0087 transcriptional regulator TetR family IV 3 CMM_0089 catR transcriptional regulator Lacl family IV 3 CMM_0118 transcriptional regulator TetR family IV 3 CMM_0131 N terminal region of FOF1 ATP synthase subunit B V 2 CMM_0144 conserved secreted protein V 2 CMM_0165 fhuC Fe3 siderophore ABC transporter ATPase IV 1 CMM_0183 aminotransferase 1 2 CMM_0210 putative protein chain release factor B 111 3 CMM_0213 conserved hypothetical protein V 2 CMM_0238 bicyclomycin efflux MFS permease IV 1 CMM_0241 membrane protein V 2 CMM_0246 hypothetical protein V 2 CMM_0262 NTP pyro
237. ge SDS Gele aufgelegt Die Gelelektrophorese erfolgte in 1 x SDS Puffer bei einer konstanten Stromst rke von 15 20 mA Gel f r etwa 14 18h Ettan Dalt Il Amersham Biosciences Freiburg Anschlie end wurden die Gele mit Coomassie Brilliant Blue gef rbt vgl Abschnitt 3 4 7 12 5 iges Trenngel mit Glycerin f r 12 Gele Sammelgel 163 2 ml Bisacrylamid 2 ig v v 4 5 ml 291 84 ml Acrylamid 40 ig v v 9 ml 240 ml 1 M Tris pH HCl 8 8 ane 1 M Tris pH HCI 6 8 25 ml 9 6 ml 10 iges v v SDS 1 ml 155 36 ml HeObidest 60 ml 2 4 ml 10 iges w v APS 380 ml 480 ul TEMED 64 ul Rehydratisierungsl sung 6M Harnstoff 2M Thioharnstoff 4 w v CHAPS 0 5 w v Pharmalyte pH 3 10 GE Healthcare Freiburg 0 4 w v DTT etwas Bromphenolblau Aquilibrierungsl sung 50 mM Tris 6 M Harnstoff 30 v v Glycerin 2 w v SDS pH HCl 6 8 10 x SDS Laufpuffer 0 25 M Tris 1 w v SDS 2 M Glycin 3 4 7 Farbung mit Coomassie Brilliant Blue Mittels SDS siehe Abschnitt 3 4 5 oder 2D PAGE siehe Abschnitt 3 4 6 aufgetrennte Proteine wurden nach der Gelelektrophorese mit Coomassie Brilliant Blue sichtbar gemacht nach Sambrook ef al 1989 Dazu wurden die Gele f r 10 15 min bzw 1 h in einer F rbel sung inkubiert Die Entf rbung erfolgte f r 2 4 h oder ber Nacht in 10 iger v v Essigs ure Zur Lagerung wurden die Gele in Folie eingeschwei t und bei 4 C aufbewahrt Material und Methoden 51 F rbel sung
238. ge nach der Infektion ausbreitete und verst rkte Die Transkriptmenge von hsr203J stieg 24h nach der Infektion in Cmm100 inifizierten Bl ttern auf das 11 fache an nach der Infektion mit Cmm382 war die Transkriptmenge 25 fach erh ht 48 h nach der Infektion wurde jedoch wieder etwa das Ausgangsniveau zum Zeitpunkt der Infektion erreicht Eine Einschr nkung des bakteriellen Wachstums war ber den beobachteten Zeitraum von 72 Stunden nach der Infektion nicht zu erkennen Sowohl f r den Wildtypstamm als auch f r den plasmidfreien Stamm nahm die Bakteriendichte ber diesen Zeitraum sogar leicht zu Aus den Ergebnissen in dieser Arbeit geht hervor dass eindringende Bakterien von der Pflanze erkannt wurden und dadurch innerhalb von 24 Stunden eine hypersensitive Antwort hervorgerufen wurde Eine Folge davon war ein lokaler Pflanzenzelltod der etwa 48 Stunden nach der Infektion eintrat und sich daraufhin verst rkte und ausbreitete Die dadurch zum Beispiel f r P syringae pv averrhoi beobachtete Inhibierung des bakteriellen Wachstums Wei et al 2012 war weder f r den Wildtypstamm Cmm382 noch f r den plasmidfreien Stamm Cmm100 zu erkennen Im Gegensatz zur Infektion der Pflanze mit P syringae pv averrhoi wurde jedoch f r die Infektion mit C michiganensis subsp michiganensis ein 1 000 fach h heres Inokulum verwendet da dieses f r C michiganensis n tig ist um berhaupt die Bildung nekrotischen Gewebes hervorzurufen Nissinen et al 2009
239. gtggagtgcigtacacctgatcccGtggtgctcgcat 57 protein ggggagcgcctaaatgigcagcacgatcaaggggagggtgcaacatg pCM1_ 0023 extracellular serine ggacacagticcacgccggaggagcatgtgagtatcgtccgcgcAtgactttcact 45 protease ggacgccacccicgtacccigiccgcttigatcgtg En tcatgaccgicaaaigtgcactgggcagaccaaggcatgtatcgigggattCagc pCM2_0036 transcriptional regulator gcatcgttaccgcgctgaatccgtatggagaggaaattagatg 44 gtgtggataagcgcgicagtcggaactgcttcctatctatatttgtcaaTicattcgag pCM2_0042 hypothetical protein aggggagctccatcaccatg 27 CMM_0009 hypothetical protein nn 18 CMM _0053 extracellular serine cagagactcggagcacacgcegccgaaggcagatagcttgtecgatGacgaatc 38 protease gtctatcgaacaaactttgaggaggccgccgtg ggacgtgcgggacgagccgggtgcccggcccgiciccttgacGtgccggtcatc CMM_0388 alkaline shock protein cagccggcaccgcgatccccgacgggagcgcgccccatccaccacaggagca 68 ccacatg CMM_0486 putative general stress ctgtcaggigttcaggagccgtccgtcctacagtccagtcGtgggccgcacccggt 37 protein ggectcagtgaggaggagatcatg cgggggactccggtatccccgcaccicccgcgtcgggiagcgiggacagGcgc en cgtccggccgaccggcatcctcggiccggcgacggcgcggcgaiggaaagtg CMM_0662 NADP dependent alcohol cgccggttcgaggatccgcccccgcaggcgtaccgicgagggGtaccgcatcc gaagagggcgcggccggatcgacccgatcccicccctcccccaccggtcagca 75 dehydrogenase caaggagaacccatg 3 acaggggcaigcacicctcgaacccgicgtiactcictacatatCggcgccggccc CMM_0857 ATP dependent protease cetgececgatgcecagggagatacagatg 39 i eF gtcctccaitgcggctgtcgcctccccgggctgcgggccaggatgggatgcGggc CMM_0858 UDP glucose 4 epimerase ggaa
240. h bedeutendste Wirtspflanze S Iycopersicum Tomate einem Vertreter der Solanaceae Strider 1969 Carlton et al 1998 Nach dem Eindringen ber Hydathoden siedeln sich die Bakterien zuerst im dahinter liegenden intrazellul ren Raum an und sind erst sieben Tage nach dem Eindringen in den Xylemgef en detektierbar Carlton et al 1998 Sie verbreiten sich daraufhin ber die Xylemgef e in der gesamten Pflanze sodass die Infektion systemisch ist Dabei kann eine Dichte von 10 Bakterien pro g Pflanzenmaterial erreicht werden Meletzus et al 1993 In den Xylemgef en werden Wasser und gel ste N hrstoffe akropetal von der Wurzel in die gesamte Pflanze transportiert Abbildung 4 A Im Gegensatz dazu wird das zuckerreiche Phloemexudat in den Phloemgef en zur Zuckerspeicherung basipetal in die Wurzeln transportiert Chalupowicz und Kollegen konnten mittels GFP markierter C michiganensis subsp michiganensis St mme zeigen dass sich diese an spiralf rmige sekund re Zellwandverdickungen des Protoxylems anhefteten Chalupowicz et al 2012 Abbildung 4 B Einleitung 16 Kambium Abbildung 4 Aufbau der Leitgewebe in Tomatenpflanzen und deren Besiedelung durch C michiganensis subsp michiganensis A Wasser und gel ste N hrstoffe werden in den XylemgefaBen akropetal von den Wurzeln in die gesamte Pflanze transportiert Zucker werden im Phloemexudat basipetal transportiert modifiziert nach _ http mrb science wikispaces
241. h 48h 72h Abbildung 10 Bakterientiter Bestimmung in Tabakblattern 0 24 48 und 72 h nach der Infektion A Bakterientiter in absoluten Zahlen B Bakterientiter in relativen Zahlen wobei der Wert zum Zeitpunkt der Infektion 0 h gleich 100 gesetzt wurde Schwarze Balken Infektion mit Cmm382 graue Balken Infektion mit Cmm100 4 3 Infektion von Tomatenpflanzen Tomatenpflanzen sind suszeptibel gegen ber einer Infektion mit Cmm382 sodass es zur Ausbildung von Krankheitssymptomen in der Pflanze kommt Die Bakterien dringen dabei ber eine Verwundung des St ngels oder der Wurzeln sowie ber nat rliche ffnungen in die Pflanze ein Bisherige Infektionsversuche von Tomatenpflanzen mit Bakterien wurden vor allem ber eine Verwundung des St ngels Petiolusinfektion durchgef hrt Bermphol et al 1996 Balaji et al 2008 Chalupowicz et al 2010 Chalupowicz et al 2012 Fl gel et al 2012 In dieser Arbeit wurde die Infektion von Tomatenpflanzen gr tenteils ber Wurzelinfektionen durchgef hrt Der Vorteil einer Wurzelinfektion gegen ber der Petiolusinfektion ist dass schon zehn Tage alte Pflanzen infiziert werden k nnen anschlie end innerhalb von zwei bis vier Wochen Krankheitssymptome auftreten und die Pflanzen schnell absterben Vom Zeitpunkt der Infektion bis zum Absterben der Pflanze vergehen somit nur etwa vier bis f nf Wochen Die Hauptursache f r eine Infektion von Tomatenpflanzen mit C michiganensis subsp michi
242. hetical protein chromosome partitioning protein two component system response regulator isoleucyl tRNA synthetase short chain dehydrogenase endoribonuclease L PSP sugar ABC transporter permease component sugar hydrolase nucleoside diphosphate kinase heat shock regulator transcriptional regulator MerR family benzoate transport protein BenE family ribonuclease PH TRNA nucleotidyltransferase ATP synthase subunit beta esterase permease DMT family transcriptional regulator MarR family beta galactosidase conserved membrane protein two component system response regulator 191 Fortsetzung Tabelle 29 H here Transkriptmengen in XMM Medium AS als in XMM Medium IV 7 IV 1 IV 4 1 1 1 6 V 2 IV 1 IV 1 IV 2 IV 1 IV 1 IV 7 1 2 IV 3 IV 1 V 2 V 1 V 1 IV 1 11 1 111 2 IV 1 V 2 1 1 IV 1 11 2 V 2 11 1 IV 3 111 3 V 1 111 3 IV 1 V 1 1 3 IV 3 IV 1 111 2 IV 1 V 1 IV 1 IV 3 1 1 V 2 IV 3 h h h ee ee h d h d d ee ee b d ee ee ee h ee ee b h d h eee Ce h d h d h b h See d h ee ee ee d h d d d h ee ee Cee ar Oe ar Cee a cad NNDNNDNOOOUOUUUUUOUUUUUUUOUUUUUUUUUUUUUUUVUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUOUOURRRARRARARARARARARARRA CMM_2108 CMM_0350 CMM_0226 CMM_2105 CMM_0381 phnF CMM_2638 CMM_0783 CMM_2172 CMM_2370 metS CMM 2173 fdxB CMM _0146 CMM 1061 CMM_2431 CMM_0083 bg C CMM_1977 rluA CMM_1546 trpE2 CMM_2360 CMM_1291 CMM_1143 CMM_0724 wenA CMM_2646 CMM_2071 CMM_0312 CMM_0354
243. hetical protein V 2 1 4 CMM_0372 phnN involved in phosphonate metabolism 1 6 1 4 CMM_0855 hypothetical protein V 2 1 4 CMM_1795 short chain dehydrogenase reductase 1 2 1 4 CMM_0816 esterase lysophospholipase V 1 1 4 CMM_1728 ABC transporter ATPase IV 1 1 4 CMM_1427 dinB DNA polymerase IV U4 1 4 CMM_2058 lipoprotein signal peptidase IV 2 1 4 CMM_2576 gImS glucosamine fructose 6 phosphate aminotransferase 1 1 acetylglutamate kinase N acetyl L glutamate 5 a CMM_1999 argB phosphotransferase le 1 4 CMM_1160 conserved hypothetical protein V 2 1 4 CMM_0659 addB adenosine deaminase 1 3 1 4 CMM_1998 argD acetylornithine aminotransferase 1 2 1 3 CMM_2090 short chain dehydrogenase oxidoreductase V 1 1 3 CMM_0214 conserved hypothetical protein V 2 1 3 CMM_2151 nusA transcriptional termination antitermination factor 111 2 1 3 CMM_2414 5 dehydro 4 deoxyglucarate dehydratase 1 1 1 3 CMM _1298 conserved membrane protein V 2 1 3 CMM_2363 moeB molybdenum cofactor biosynthesis protein 1 5 1 3 CMM_0588 hemY protoporphyrinogen oxidase 1 5 1 3 CMM_0856 conserved hypothetical protein V 2 1 3 CMM_1815 ruvA holliday junction ATP dependent DNA helicase 111 1 1 3 CMM_0391 hypothetical secreted protein V 2 1 3 CMM_1197 uvrD2 ATP dependent DNA helicase 111 1 1 3 CMM_2146 hypothetical protein V 2 1 3 CMM_1772 peptidyl prolyl cis trans isomerase IV 4 1 3 CMM_2080 membrane protein V 2 1 3 CMM_1170 atpC ATP synthase epsilon chain IV 1 1 3 CMM_1640 p
244. hosphoserine aminotransferase acetyl propionyl CoA carboxylase subunit conserved secreted protein 11 2 111 3 1 2 11 2 1 2 V 2 IV 1 1 2 IV 6 IV 6 IV 4 111 3 IV 7 111 3 IV 1 V 2 IV 4 IV 1 V 1 V 2 111 3 IV 4 IV 6 V 2 1 2 111 3 1 3 IV 4 V 2 111 3 111 3 111 3 IV 1 1 2 IV 4 IV 3 1 1 1 4 IV 3 1 2 1 4 V 2 D P D 2 PD OD PDDB oO a Aa PMH NM YAH ANMANMDNDH HAHAHA Baap PY YA NMA DM a a A WNW HPP 146 Anhang Fortsetzung Tabelle 19 extrazellul res Proteom von Cmm382 in M9 Medium 15 15 14 14 14 14 13 12 12 12 11 11 11 11 11 10 10 10 10 _ o 006000005 oOo oh A ARAA A PP rPPFPFPEOITTCTOOTTOONNN N 0900 pCM2_0054 pat 7 CMM_1621 aceE pCM1_0020 celA CMM_1490 rpmA CMM_1587 CMM_0671 CMM_1758 pykA CMM_ 2608 rpsQ CMM_ 2614 rp B CMM_1742 tpiA CMM_2612 rplV CMM _2960 rpll CMM_0608 CMM_2485 CMM_1457 pepN CMM_2579 rpsi CMM_1800 CMM_1643 pepA CMM_0003 gndA71 CMM_2461 CMM_1670 CMM_1480 expA CMM_2787 rplK CMM_2963 rpsF CMM_2606 rpIX CMM_2961 rpsR CMM_0829 wcok CMM_2819 CMM_0337 CMM_2272 gndA2 CMM_2349 fecB1 CMM_2033 CMM_0070 sbi CMM_2616 rpID CMM_2600 rpmD CMM_2599 rp O CMM_1322 sucA CMM_2733 CMM_2788 nusG CMM_0595 hemh CMM_2693 CMM_1105 ilvE CMM_2937 rpmB CMM_1884 CMM_0989 punA CMM_2479 cspA2 CMM_2615 rp W CMM_1551 rpsT CMM 1996 argG
245. hp 91 3 278 4 910 90 318 91 963 pCM2_ 0003 2 421 3 329 hp CMM_0062 91 403 91 792 hp pCM2_0004 3 847 3 966 hp 90 63 046 63 692 47 719 48 361 pCM2_0057 63 216 63 833 hp CMM_0038 47 879 48 292 hp 90 65 010 65 479 112 142 112 613 pCM2_0059 64 866 65 033 hp CMM_0074 112 168 112 389 hp pCM2_0060 65 036 65 257 hp 88 46 413 48 829 55 703 58 103 pCM2_0044 46 277 46 672 hp CMM_0045 57 396 57 043 hp pCM2_0045 46 761 46 916 hp pCM2_0046 46 969 47 142 hp pCM2_0047 48 534 47 770 hp 88 2 244 2 402 87 162 87 318 87 54 757 56 568 58 308 60 109 pCM2_0054 pat 1 55 371 56 213 CMM_PS_05 chpA 58 928 59 730 87 53 524 54 031 58 987 59 495 pCM2_0053 phpA 53 465 54 298 CMM_PS_05 chpA 58 928 59 730 84 56 720 57 860 60 140 61 283 82 63 332 63 579 49 906 50 149 pCM2_0057 63 216 63 833 hp CMM_0040 49 775 50 104 hp 82 5 105 6 055 91 974 92 897 pCM2_0006 4 742 5 263 hp CMM_0063 92 168 92 875 hp pCM2_0007 5 260 6 033 hp Ergebnisse 101 Die Sequenzhomologien umfassen eine Lange zwischen 200 und 2 400 bp und sind zwischen 82 und 98 identisch Die Regionen auf dem nat rlichen Plasmid pCM2 und auf dem Chromosom die homolog zueinander sind sind in Tabelle 16 aufgef hrt sowie wenn vorhanden die entsprechenden Gene Wenn in den homologen Regionen Gene lokalisiert sind kodieren diese in den meisten F lle
246. hsr nach der Infektion mit P solanacearum im Zuge der HR induziert Pontier et al 1994 Czernic et al 1996 Die bei einer HR ablaufenden Reaktionen f hren dazu dass das bakterielle Wachstum und die Ausbreitung der Bakterien inhibiert wird Pontier et al 1998 Eine Analyse der bei einer Interaktion von C michiganensis subsp michiganensis mit Tabakpflanzen beteiligten pflanzlichen hsr Gene wurde bis jetzt nicht durchgef hrt In dieser Arbeit wurden Tabakbl tter mit dem Wildtypstamm Cmm382 und dem plasmidfreien Stamm Cmm100 infiltriert Anschlie end wurde zum einen das Expressionsniveau der beiden HR Gene hsr201 und hsr203J in bakteriell und MgCl behandelten Tabakbl ttern mittels quantitativer real time PCR qPCR ermittelt Zum anderen wurde die Bakteriendichte in den Bl ttern zu unterschiedlichen Zeitpunkten bestimmt um zu berpr fen ob das bakterielle Wachstum inhibiert wurde F r die Durchf hrung von gPCR Experimenten zur quantitativen berpr fung der Transkript menge von hsr201 und hsr203J wurden Tabakbl tter mit Cmm382 und Cmm100 infiltriert O 24 und 48 h nach der Infektion wurde die RNA aus je etwa 150 mg infiziertem Blattmaterial isoliert Nach der Bestimmung von Reinheit und Qualit t der RNA mittels Konzentrations messung und Gelelektrophorese wurden qPCR Experimente durchgef hrt Dabei wurde die mRNA in cDNA umgeschrieben und anschlie end das Zielgen in einer PCR Reaktion amplifiziert Der im Reaktionsansatz en
247. ht zu erkennen waren Daten nicht gezeigt Es wurde dabei zum Teil nur das Fragment detektiert welches in Abbildung 19 A Spur 2 die st rkste Cellulaseaktivit t zeigte Die Gr e dieses Fragments konnte dabei auf 50 60 kDa eingegrenzt werden Die einzige annotierte und funktionsf hige Cellulase CelA ist mit 78 kDa etwas gr er als das in dieser Arbeit detektierte 50 60 kDa Proteinfragment Eichenlaub amp Gartemann 2011 Jahr und Kollegen konnten jedoch ebenfalls kleinere Banden 54 und 43 kDa nachweisen die auf eine Spaltung des nativen Proteins zur ck zu f hren waren Jahr et al 2000 Dadurch lag ein Fragment vor das entweder nur aus der katalytischen Dom ne der Cellulase bestand 43 kDa oder zus tzlich aus der Cellulose Binde Dom ne ohne C Terminus 54 kDa Da das am besten erkennbare Proteinfragment in Spur 2 Abbildung 19 A etwa 50 kDa gro war k nnten die anderen beiden Fragmente die Cellulaseaktivit t zeigten den von Jahr und Kollegen detektierten Fragmenten mit der Molekulargr e von 78 und 43 kDa entsprechen F r die Analyse der Proteaseaktivitat wurden Cmm100 und Cmm382 Kulturen nach 24 und 48 h Wachstum in M9 Medium zentrifugiert und die Proteine mittels Filtration konzentriert 18 ug Proteine wurden anschlie end in der nachfolgenden Zymographie eingesetzt Abbildung 19 B Im Medien berstand der Cmm100 Kultur war keine Proteaseaktivit t zu erkennen Spuren 1 und 3 Im Gegensatz dazu war im Medien bersta
248. hylenebutenolidase conserved hypothetical protein peptidyl dipeptidase hypothetical protein hypothetical protein putative protein chain release factor B peptide ABC transporter ATPase thioredoxin hypothetical membrane protein conserved secreted protein aminotransferase conserved hypothetical protein conserved membrane protein sortase conserved membrane protein cystathionine gamma synthase hypothetical secreted protein IV 5 V 2 V 2 V 2 V 2 IV 7 V 2 IV 5 V 2 V 2 IV 7 1 1 IV 1 IV 5 IV 3 IV 3 V 2 V 2 1 2 111 3 IV 1 IV 5 V 2 V 2 1 2 V 2 V 2 11 2 11 2 1 2 V 2 179 Anhang 180 Fortsetzung Tabelle 27 H here Transkriptmengen in M9 Medium als in TBY Medium 1 6 CMM_ 2834 aldo keto reductase V 1 1 6 CMM_0652 qorA Zn dependent quinone oxidoreductase 1 1 1 6 CMM_0502 serine protease family S53 IV 7 1 6 CMM_0332 organic acid CoA ligase 1 6 1 6 CMM_1423 sulfite oxidase 1 2 1 6 CMM_2922 putative dienelactone hydrolase V 2 1 6 CMM_1398 glycosidase 1 1 1 6 CMM_1512 efflux MFS permease IV 1 bifunctional glycerophosphory diester De lien phosphodiesterase inositol monophosphatase H 1 6 CMM_0187 transcriptional regulator TetR family IV 3 1 6 CMM_2472 hypothetical membrane protein V 2 1 6 CMM_1254 ATPase VA 1 6 CMM_1881 ATPase 11 1 1 6 CMM_1729 2Fe 2S ferredoxin IV 5 1 6 CMM_2029 pgsA phosphatidylglycerophosphate synthas 1 4 1 6 pCM2_PSEUDO_0002 pCM2_PSEUDO_0002 V 2 1 6 CMM_1615 conserved hypothe
249. hypothetical protein conserved hypothetical protein conserved hypothetical protein hypothetical protein ABC transporter permease component ABC transporter substrate binding protein succinyl CoA ligase ADP forming subunit alpha Mn2 Fe2 transport protein NRAMP family transcriptional regulator AraC family dihydroxyacetone kinase short chain dehydrogenase oxidoreductase anion ABC transporter ATPase hypothetical protein hypotheticl protein beta glucosidase hypothetical protein conserved hypothetical protein cell surface protein putative adhesin hypothetical protein conserved hypothetical protein hypothetical membrane protein conserved hypothetical protein conserved secreted protein PTS system mannitol specific IIA component glycosyltransferase putative phosphomutase lyase hypothetical protein PTS system mannitol specific IIBC component cystathionine beta synthase hypothetical protein oxidoreductase methylenetetrahydrofolate dehydrogenase methenyltetrahydrofolate cyclohydrolase oxidoreductase anti sigma factor conserved hypothetical protein maltooligosyl trehalose trehalohydrolase hypothetical protein conserved hypothetical protein glutamate ABC transpoter permease component rRNA methylase hypothetical secreted protein iron ABC transporter ATPase short chain alcohol dehydrogenase conserved hypothetical protein aldo keto reductase peptidy dipeptidase hypothetical protein conserved membrane
250. i Y Yoshimochi T Tsujimoto S Shinohara R Nakaho K Kanda A Kiba A and Ohnishi K 2007 Global regulation of pathogenicity mechanism of Ralstonia solanacearum Plant Biotechnol 24 149 154 Hofmann J Bornke F Schmiedl A Kleine T and Sonnewald U 2011 Detecting functional groups of Arabidopsis mutants by metabolic profiling and evaluation of pleiotropic responses Front Plant Sci 2 82 Hogenhout S A and Loria R 2008 Virulence mechanisms of Gram positive plant pathogenic bacteria Curr Opin Plant Biol 11 4 449 456 Holtsmark l Mantzilas D Eijsink V G H and Brurberg M B 2006 Purification characterization and gene sequence of Michiganin A an actagardine like lantibiotic produced by the tomato pathogen Clavibacter michiganensis subsp michiganensis Appl Environ Microbiol 72 9 5814 5821 Holtsmark l Takle G W and Brurberg M B 2008 Expression of putative virulence factors in the potato pathogen Clavibacter michiganensis subsp sepedonicus during infection Arch Microbiol 189 2 131 139 Hou J Xie Z Xue P Cui Z Chen X Li J Cai T Wu P and Yang F 2010 Enhanced MALDI TOF MS analysis of phosphopeptides using an optimized DHAP DAHC matrix J Biomed Biotechnol 2010 759690 Hoving S Gerrits B Voshol H M ller D Roberts R C and van Oostrum J 2002 Preparative two dimensional gel electrophoresis at alkaline pH using narrow range
251. ical secreted protein conserved secreted protein peptidoglycan binding alpha glucoside ABC transporter SBP extracellular 5 nucleotidase subtilisin like extracellular serine protease peptidase family S8A extracellular serine protease extracellular serine protease family S1A extracellular serine protease extracellular serine protease extracellular serine protease NPL P60 family secreted protein penicillin binding protein penicillin binding protein extracellular nuclease phosphatase hypothetical secreted protein peptidoglycan glycosyltransferase PBP membrane bound metalloprotease 60 kDa chaperonin protein Cpn60 GroEL protein extracellular serine protease extracellular serine protease hypothetical secreted protein cytochrome c oxidase subunit 2 acetyl xylan esterase hypothetical protein peptide ABC transporter substrate binding protein hydrolase cold shock protein metal ABC transporter substrate binding protein extracellular serine protease family S1A pyruvate 2 oxoglutarate dehydrogenase complex dihydrolipoamide acyltransferase E2 component isocitrate dehydrogenase 10 kDa chaperonin protein Cpn10 GroES protein hypothetical protein subtilisin like extracellular serine protease peptidase family S8A branched chain amino acid ABC transporter SBP hypothetical secreted protein sortase sorted 50S ribosomal protein L11 glutamate ABC transporter substrate binding protein conserved secreted protei
252. icillin binding protein Score 2 155 1 614 1 412 694 660 648 603 492 487 Gen Name CMM_2568 groES CMM_2263 eno CMM_2478 groEL CMM_1675 CMM_2537 icdA CMM_1744 gapA CMM_2934 hupB CMM_1736 pgiA CMM_1735 talA m gliche Funktion 10 kDa chaperonin protein Cpn10 GroES protein enolase 2 phosphoglycerate dehydratase 60 kDa chaperonin protein Cpn60 GroEL protein hypothetical secreted protein isocitrate dehydrogenase glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase DNA binding protein glucose 6 phosphate isomerase transaldolase COG IV 4 1 1 IV 4 V 2 1 1 1 1 IV 3 1 1 1 1 Replikat Nr PrOrPPDPLRLPR Anhang Fortsetzung Tabelle 22 zytoplasmatisches Proteom von Cmm382 in XMM Medium 430 419 416 362 334 330 321 278 272 245 234 229 223 218 212 199 194 189 181 181 179 167 167 166 146 142 136 134 133 133 132 130 129 128 126 126 125 123 123 122 121 120 119 115 106 105 104 103 101 96 95 95 92 90 89 88 87 86 85 85 85 84 82 CMM_2620 tuf CMM_2547 sucD CMM 1600 gmdA CMM 2316 CMM _1831 glpK CMM 2522 gIyA CMM_0879 CMM 2226 fbaA CMM_2495 gpmA CMM_1852 CMM_1641 aceF CMM_0903 asdA CMM_1757 CMM_0866 CMM_0737 katA CMM_1743 pgk CMM_1844 CMM_1636 gInAT CMM_2548 sucC CMM_2527 CMM_1166 atpH CMM_2968 trxA CMM_1169 atpD CMM_0861 rpiL CMM_1619 fabD CMM_0035 CMM_1485 ndkA CMM_1318
253. ie Bakterien aus dem Pflanzenmaterial in den Puffer gelangen konnten Der Puffer wurde anschlieBend auf TBY Platten mit Antibiotikum ausplattiert und die Platten wurden fur zwei bis drei Tage bei 28 C inkubiert MS Medium 11 4 4 g MS 0 1 g MES 8 g Phytoagar pH NaOH 6 1 Sterilisation durch Autoklavieren Zugabe von 100 ml 30 w v Saccharose sterilfiltriert 3 2 5 Infektion von Tabakpflanzen Die Infektion vier Wochen alter Tabakpflanzen N tabacum cv Samsun NN und N benthamiana erfolgte durch Blattinfiltration N Kocal Universit t Erlangen N rnberg m ndliche Mitteilung 2010 Dazu wurden die C michiganensis subsp michiganensis St mme wie in Abschnitt 3 2 3 beschrieben in 25 oder 50 ml TBY Medium ber Nacht kultiviert und weiter wie in Abschnitt 3 2 4 beschrieben behandelt Die End oDsg9 wurde auf 4 eingestellt Jeweils eine Pflanze wurde an ein bis zwei Bl ttern mit einem Bakterienstamm durch Infiltration der Suspension in das untere Blattgewebe infiziert Alle zwei Tage wurden sich entwickelnde Krankheitssymptome protokolliert F r eine anschlie ende RNA Isolierung wurden 0 24 und 48 h nach der Infiltration pro Stamm ein Drittel eines infizierten Blattes in Alufolie verpackt in fl ssigem Stickstoff schockgefroren und bei 80 C gelagert Das Pflanzenwachstum erfolgte bei 17 h Lichteinwirkung 50 klx und 7 h Dunkelheit einer Luftfeuchtigkeit von 40 und einer Temperatur von 25 9 C 3 2 6 Isolierung des Xylemsaft
254. ielsweise gezeigt werden dass Nitrat als Signal f r eine nderung der Genexpression fungiert Filiatrault et al 2005 Das angepasste Medium wurde xylem mimicking medium XMM bezeichnet und setzte sich wie folgt zusammen 0 mM Saccharose Fructose und Glucose und schwankende Aminos uren Konzentrationen im uM Bereich wobei die Konzentrationen insgesamt etwa zehn Mal h her waren als im Xylemsaft und Glutamat und Prolin am st rksten vertreten waren Au erdem wurden 23 4 mM Nitrat und 1 6 mM Ammonium gemessen Die Zusammensetzung des XMM Mediums entspricht somit weitestgehend dem Xylemsaft Dass ein synthetisches Medium erfolgreich zur Analyse von Virulenzfaktoren verwendet werden kann wurde schon mehrfach gezeigt Arlat et al 1992 Huang et al 1992 Wei et al 1992 Wengelnik et al 1996 Auch f r C michiganensis subsp michiganensis wurden dazu schon Experimente durchgef hrt und verschiedene in vitro Bedingungen getestet Fl gel et al 2012 Savidor et al 2012 Ideale Bedingungen wurden dabei jedoch nicht erreicht Mit dem in dieser Arbeit etablierten synthetischen Medium XMM wurden deshalb Analysen des Proteoms und Transkriptoms von Cmm382 durchgef hrt um das XMM Medium als Xylemsaft imitierendes Medium zu testen Diskussion 118 5 3 Das extrazellulare Proteom von Cmm382 in M9 und XMM Medium Um die Expression von Virulenzfaktoren von C michiganensis subsp michiganensis in XMM Medium auf Proteomebene zu testen wurde d
255. iert um eine m gliche Besiedelung der keimenden Pflanze mit den Bakterien zu beobachten siehe Abschnitt 4 3 3 Des Weiteren wurde eine Wurzelinfektion von Tomatenpflanzen in einem fr hen Wachstumsstadium zehn Tage durchgef hrt und es wurden sich entwickelnde Krankheitssymptome dokumentiert siehe Abschnitt 4 3 1 Durch eine Infektion von Tomatenpflanzen in einem sp ten Wachstumsstadium vier Wochen wurde in dieser Arbeit au erdem analysiert ob es dabei zu einer Infektion der Samen in sich bildenden Tomatenfr chten kommen kann siehe Abschnitt 4 3 2 F nf Wochen nach der Inkubation von Tomatensamen in einer Bakterien Suspension waren C michiganensis subsp michiganensis in ruhenden Samen auf der Samenoberfl che lokalisiert Im Gegensatz dazu konnten die Bakterien in keimenden Samen in absteigender Zahl in den Wurzeln dem Hypocotyl und den Cotyledonen des Keimlings nachgewiesen werden Cmm382 infizierte Keimlinge zeigten dabei typische Krankheitssymptome bei Cmm100 infizierten Keimlingen war lediglich eine leichte Chlorose zu erkennen Nach der Wurzelinfektion von Tomatenpflanzen in einem fr hen Wachstumsstadium wurde in dieser Diskussion 115 Arbeit oft eine uneinheitliche Bildung von Krankheitssymptomen beobachtet Dabei traten diese zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infektion auf sie waren unterschiedlich stark ausgepr gt und traten in verschiedenen Kombinationen auf Neben den typischen Symptomen wurde dabei auch ein ve
256. iert wurden http cmr jcvi org PelA1 und PelA2 sind die einzigen Pektat Lyasen im Genom und k nnen Pektin nur spalten wenn es zuvor von Pektin methylesterasen demethyliert wurde Walter 2002 Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen dass das Genom von Cmm382 somit vermutlich keine Gene f r Pektin Lyasen enth lt In weiterf hrenden Experimenten k nnten deshalb bei der Bestimmung der Pektinaseaktivit t Pektinmethylesterasen zugef gt werden um eine Aktivit t der Pektat Lyasen zu erkennen Bei einem Vergleich der extrazellul ren Proteine die in dieser Arbeit in der M9 und der XMM Kultur von Cmm382 identifiziert worden waren war eine etwa 80 ige Uberein stimmung zu erkennen darunter auch die Cellulase CelA und einige Serinproteasen wie zum Beispiel Pat 1 Tabelle 18 Von den identifizierten extrazellul ren Proteinen einer Cmm382 Kultur in M9 Medium wurden die meisten sowohl in dieser Arbeit identifiziert als auch in Minimalmedium in der Arbeit von Tews Tews 2012 Tabelle 18 Es gab jedoch auch einige Unterschiede f r die es drei m gliche Erkl rungen gibt Proteine die in dieser Arbeit in M9 Medium identifiziert wurden bei Tews in Minimalmedium jedoch nicht auftauchen zeigten in dieser Arbeit einen sehr geringen Score Wert In der Arbeit von Tews wurden jedoch lediglich Proteine aufgelistet und analysiert deren Score Werte h her als 47 waren Proteine die in Diskussion 120 dieser Arbeit einen geringen Score Wert zeigten w
257. im Phloem transportiert Windt et al 2009 und wurden in dieser Arbeit im Xylemsaft nicht identifiziert Tabelle 7 Fructose und Saccharose die in XVM2 enthalten sind wurden deshalb im Clavibacter Medium nicht verwendet Ein Wachstum von C michiganensis subsp michiganensis war nicht m glich wenn keine Zucker vorhanden waren und die Aminos uren Konzentration zu gering war Daten nicht gezeigt Die fehlende Kohlenstoffquelle wurde deshalb durch die Erh hung der Aminos uren Konzentration von 0 03 w v auf 0 2 w v ersetzt da f r einige Aminos uren zum Beispiel Glutamat und Alanin bekannt ist dass sie als Kohlenstoffquelle dienen k nnen Romano amp Nickerson 1958 Das auf diese Weise adaptierte Medium wurde XMM xylem mimicking medium bezeichnet und setzt sich aus folgenden Komponenten zusammen je 20 mM NaCl und KNO 5 mM MgSO 1 mM CaCl 0 16 mM KH PO 0 32 mM K gt HPO 0 01 mM FeSO und 0 2 w v casamino acids pH 6 7 Die Generationszeit von Cmm382 in XMM Medium betrug 10 7 h 0 97 h Abbildung 15 Wachstum in XMM Abbildung 15 Wachstum von Cmm382 in XMM Medium im Vergleich zu TBY und M9 Medium Die in XMM Medium hellgraue Quadrate maximal erreichte oDsg9 von Cmm382 betrug 0 744 die Generationszeit 10 7 h 0 97 h XMM Medium enth lt KNO und 0 2 w v casamino acids als Kohlenstoff und Stickstoffquelle Die Zusammensetzung des XMM Mediums ist wie folgt je 20 mM NaCl und KNO 5 mM MgSO 1 mM CaC
258. imerase CMM_PS_20 peptide chain release factor 1 RF 1 hypothetical protein beta glucosidase 3 4 dihydroxy 2 butanone 4 phosphate synthase GTP cyclohydrolase II alpha glucosidase glycosyl hydrolase family 13 conserved hypothetical protein partitioning protein conserved secreted protein putative carboxypeptidase or PBP uroporphyrinogen decarboxylase dihydroxyacetone kinase serine O acetyltransferase conserved membrane protein peptide ABC transporter substrate binding protein glucose 1 phosphate adenylyltransferase acetyltransferase DNA replication and repair protein hydrolase HIT family conserved hypothetical protein HIT family hydrolase transcriptional regulator phosphoribosylformylglycinamidine FGAM synthase 1 1 IV 1 V 1 V 1 1 3 1 1 111 3 V 2 IV 1 V 2 IV 1 1 1 V 1 1 1 V 2 V 2 IV 5 111 3 1 3 11 2 IV 3 V 1 IV 3 IV 1 V 1 11 2 1 2 111 1 IV 3 1 2 1 1 IV 1 11 2 11 2 111 1 1 2 1 1 1 1 V 2 111 3 V 2 1 1 1 5 1 1 V 2 11 1 V 2 1 5 1 1 1 2 1 5 IV 1 V 1 111 1 V 1 V 2 IV 3 1 3 185 h h h kkk kkk kkk kkk kkk kkk u u u eh u eh kek ak kh DADADDADAADAODN NNN NNN NN NNN OWN NNN NN NN NNN NAN ONN NO 00 m m 0 m m 0 0 m 00 00 0 m m 0 00 OO Oo Anhang CMM_2427 CMM_2245 ilvA CMM_1012 rmIC CMM_2269 pthA CMM _1802 alaS CMM _0975 CMM_0655 CMM_2906 CMM_2920 CMM_2950 purB CMM_1659 acnA CMM_0423 CMM_2426 sseB CMM_244
259. in 4 C wurde das Zellpellet in 4 ml TE Puffer gewaschen und anschlie end in 1 ml TE Puffer resuspendiert Nach Zugabe einer Spatelspitze Lysozym und mehrmaligem Invertieren wurde die Zellsuspension f r 3 h bei 37 C inkubiert 400 rpm HeizThermoMixer MHR20 23 HLC BioTech Bovenden Anschlie end wurden 3 mi TE Puffer 110 ul 20 iges w v SDS und 150 ul 10 mg ml Proteinase K L sung zugegeben die Suspension wurde mehrfach invertiert und ber Nacht bei 55 C inkubiert Es folgte die Zugabe von 6 M NaCl in 100 ul Portionen bis ein feiner wei er k rniger Niederschlag sichtbar wurde der durch Zentrifugation 4 000 x g mindestens 30 min Raumtemperatur sedimentiert wurde Zum Uberstand wurde 1 Vol kalter 100 iger v v Ethanol gegeben und es wurde mehrmals invertiert Die so pr zipitierte DNA wurde in ein frisches Reaktionsgef transferiert und mit 70 igem v v Ethanol 13 000 x g 10 min Raumtemperatur gewaschen Im Anschluss daran wurde die DNA bei Raumtemperatur getrocknet und in TE Puffer aufgenommen Der L sevorgang erfolgte mindestens ber Nacht bei Raumtemperatur TE Puffer 10 mM Tris 1 mM EDTA pH HCI 8 0 Sterilisation durch Autoklavieren 3 3 1 3 Polymerase Kettenreaktion F r die in vitro Vervielf ltigung spezifischer DNA Sequenzen wurde die Polymeraseketten reaktion PCR eingesetzt Mullis et al 1986 Dazu wurden je zwei Oligonukleotide Primer vorw rts und r ckw rts verwendet die den zu amplifiziere
260. in XMM Medium h her als in TBY Medium und die von 251 Genen niedriger Die prozentuale Verteilung dieser Gene zu den COG Gruppen ist in Abbildung 21 dargestellt H hereTranskriptmenge NiedrigereTranskriptmenge 239 251 16 E Metabolismus E Il Zellul re Prozesse 2 E li Informationsspeicherung und 1 prozessierung E IV Potentiell relevant in der phytopathogenen Interaktion EV Unzureichend charakterisiert 22 26 9 0 2 COG Gruppe IV 12 E Transporter E Proteintransport E Regulatoren Stress Resistenz Extrazellulare Enzyme Intrazellulare Proteasen Abbildung 21 Prozentuale Zuordnung der Cmm382 Gene aus DNA Microarray Experimenten deren Transkriptmengen in XMM Medium hoher bzw niedriger waren als in TBY Medium Das mRNA Level von 239 Genen war in XMM Medium h her das von 251 Genen niedriger als in TBY Medium Dargestellt sind die COG Hauptgruppen sowie die COG Gruppe IV 34 der Gene deren Transkriptmengen in XMM Medium h her als in TBY Medium waren wurden der COG Gruppe IV zugeteilt 65 dieser Gene kodieren f r Transporter 12 f r Regulatoren 5 f r Resistenzproteine und 7 f r extrazellul re Enzyme Der Faktor lag bei diesen sechs Genen die f r extrazellulare Enzyme kodieren zwischen 1 4 und 3 9 Daten nicht gezeigt Neben den Genen sbtB xysB und CMM_0795 die auch schon im Vergleich XMM mit M9 Medium identifiziert worden waren waren die Transkriptmengen der Gene Ergebnisse 91
261. isomerase deoxyuridine 5 triphosphate pyrophosphatase ATP phosphoribosyltransferase chaperone curved DNA binding protein carbamoyl phosphate synthase small subunit adenylate kinase DNase 3 oxoacyl acyl carrier protein synthase putative general stress protein conserved hypothetical protein ribose 5 phosphate isomerase putative phospholipase alpha beta hydrolase family cysteine peptidase family C56 ATP dependent protease ATPase subunit hypothetical secreted protein iron siderophore ABC transporter SBP branched chain amino acid ABC transporter SBP short chain dehydrogenase oxidoreductase alternative thymidylate synthase mannose 1 phosphate guanylyltransferase peptide chain release factor 1 RF 1 1 3 1 2 V 1 1 3 111 1 111 3 1 1 IV 5 IV 4 V 2 V 1 1 1 111 3 IV 4 1 3 1 4 111 3 IV 1 111 3 IV 3 V 1 V 2 111 3 IV 2 V 2 1 1 1 3 1 2 IV 4 1 3 1 3 11 2 1 4 IV 4 V 2 1 1 V 2 IV 7 IV 4 V 2 IV 1 IV 1 V 1 1 3 1 1 111 3 155 BE ee n ee Ee o l Be 2B Be Be In Tabelle 22 Mittels MALDI ToF MS identifizierte zytoplasmatische Proteine aus Cmm382 in dem synthetischen Medium XMM Dargestellt sind alle 335 Proteine die in einem oder mehreren der Replikate 1 2 3 oder 4 bei der Analyse des zytoplasmatischen Proteoms identifiziert wurden Die entsprechenden Gene wurden nach dem absteigenden Score Wert geordnet SBP substrat binding protein PBP pen
262. it t gegen ber C michiganensis subsp michiganensis Yuan et al 2009 Resistente Tomatenpflanzen wurden bis heute nicht identifiziert Der sogenannte quantitative trait locus QTL auf dem Genom wilder Tomatenpflanzen tr gt jedoch zur Resistenz der Pflanze bei Kabelka et al 2002 Au erdem wurden zwei pflanzliche Proteine identifiziert die bei einer berexpression antimikrobielle Aktivit t zeigten Balaji amp Smart 2012 War die mRNA Konzentration von Snakin 2 oder dem Extensin ahnlichen Protein ELP in der Pflanze hoch traten die Krankheitssymptome in infizierten Pflanzen in abgeschw chter Form auf Balaji amp Smart 2012 Neben der Tomatenpflanze als suszeptibler Wirtspflanze l st C michiganensis subsp michiganensis auch in Paprikapflanzen und anderen Vertretern der Familie Solanaceae typische Krankheitssymptome aus Die landwirtschaftlich wichtigste Pflanze ist jedoch die Tomatenpflanze Gleason et al 1993 F r Tabakpflanzen Nicotiana und die Wunderblume Mirabilis jalapa wurde eine Resistenz gegen ber dem Bakterium nachgewiesen Gitaitis 1990 Alarc n et al 1998 Nach der bakteriellen Infektion kommt es zu Abwehrreaktionen wie einem lokalen pflanzlichen Zelltod der im Zuge einer HR ausgel st wird In der Wunderblume wurde ein lokaler Zelltod ebenfalls ausgel st wenn ausschlie lich der Medien berstand einer Bakterienkultur verwendet wurde Daraus l sst sich schlie en dass an der Ausl sung der Reaktion extraz
263. ja Christiane und nat rlich Dr Sophia Sonnewald die mir als meine Mentorin immer mit Rat und Tat zur Seite stand und mich durch den Wirrwarr der Microarray Auswertungen gef hrt hat Ein gro es Dankesch n geht an den Lehrstuhl f r Mikrobiologie f r eine gute Zusammenarbeit sowie aufmunternde und nette Gespr che auf den G ngen Besonders m chte ich mich bei Susanne Morbach bedanken f r die Hilfe und gute Organisation au erdem bei Frau Wehr Manu Markus Gerald Toni und Corny f r ihre Hilfe bei verschiedensten Problemen Danke Kati Julia und Alex f r die Geduld bei etlichen Klonierungen Kultivierungen und Pflanzeninfektionen w hrend eurer Zulassungsarbeit Danke Susanne f r den Flei und die Geduld bei den unz hligen Wachstumsexperimenten bei der Anpassung des XVM2 Mediums an das Xylem Danke Maira f r deine Hilfe bei den Experimenten f r die Charakterisierung eines Transkriptionsregulators sowie f r deine Hilfsbereitschaft und Liebensw rdigkeit Der gr te Dank geht aber an das Burkovski Labor Danke Kristin Nadine und Nadja f r zahlreiche Tipps und f r die Aufwertung des Arbeitsalltags Ihr seid alle drei einfach tolle Menschen die ich in den letzten Monaten Jahren sehr vermisst habe Danke Elena und Lisa f r die super Zusammenarbeit im Labor und f r die geduldige Korrektur meiner Arbeit Danke Elena f r Cr pes Himbeer Tiramisu und deine Hilfsbereitschaft Danke Lisa f r deine kreative Ader deine gro e Offenheit
264. jaes eingestellt Nach einer 10 min tigen Inkubation bei 95 C wurden 4 ul DIG High Prime Roche Diagnostics Mannheim zugef gt Nach einer weiteren Inkubation f r 20 h bei 37 C wurde die Reaktion durch die Zugabe von 0 2 ul 0 2 M EDTA und einer weiteren Inkubation f r 10 min bei 65 C gestoppt Die so hergestellte DNA Sonde wurde anschlie end auf ihre Effizienz hin getestet Dabei wurde 1 ul Sondenl sung unverd nnt sowie 1 10 und 1 100 in H2Obiaest verd nnt auf eine positiv geladene Nylonmembran Roche Diagnostics Mannheim getropft Die Fixierung an die Membran wurde durch UV Strahlung 2 x Autocrosslink UV Stratalinker 1800 Stratagene Heidelberg gew hrleistet Die Blockierung der Membran erfolgte durch Inkubation f r 30 min in 1 x Blockierungsl sung Roche Diagnostics Mannheim auf der Wippe GFL mbH Burgwedel Anti DIG alkalische Phosphatase alkaline phosphatase AP konjugiertes Fab Fragment Roche Diagnostics Mannheim wurde in einer 1 10 000 Verd nnung zugef gt und es wurde wiederum f r 30 min inkubiert Es folgten zwei Waschschritte f r je 15 min in Waschpuffer und eine quilibrierung der Membran f r einige Minuten in Detektionspuffer Anschlie end wurde die Membran f r Hybridisierungsexperimente mit DNA in 10 ml Detektionspuffer mit 200 ul NBT BCIP Roche Diagnostics Mannheim im Dunkeln inkubiert Durch die Zugabe von TE Puffer wurde die Farbentwicklung gestoppt F r Hybridisierungsexperimente mit RNA wurde die
265. kennen Die Erkennung l uft entweder direkt ab oder erfolgt indirekt ber Reaktionsprodukte der Avirulenzproteine Findet keine spezifische Erkennung statt kann die Pflanze die Infektion nicht verhindern Ist die Erkennung spezifisch werden erneut pflanzliche Abwehrreaktionen aktiviert Die Bakterien werden entweder durch antimikrobielle Proteine hydrolysiert oder das bakterielle Wachstum wird durch einen lokalen Pflanzenzelltod inhibiert Abbildung 1 Rietz amp Parker 2007 Der Vorgang der zum Pflanzenzelltod f hrt wird als hypersensitive Antwort hypersensitive response HR bezeichnet Pontier et al 1998 Der lokale Zelltod kann aber auch ein Krankheitssymptom in suszeptiblen Pflanzen sein Es ist jedoch nicht bekannt ob es sich dabei um die gleichen Mechanismen handelt wie bei der HR in resistenten Pflanzen Pontier et al 1998 Kommt es zu genetischen Ver nderungen in den Avirulenzgenen k nnen die Avirulenzproteine nicht mehr von den entsprechenden R Proteinen der Pflanze erkannt werden es findet somit keine spezifische Interaktion statt Durch nat rliche Selektion k nnen die R Proteine so ver ndert werden dass sie die Avirulenzproteine wieder erkennen Jones amp Dangl 2006 Die Interaktion von Gram negativen Bakterien mit Pflanzen ist wesentlich besser untersucht als bei Gram positiven Bakterien Zu den Gram negativen Proteobakterien z hlen Agrobacterium Erwinia Xanthomonas Ralstonia sowie Pseudomonas Arten und Pse
266. knD serine threonine protein kinase IV 3 1 3 CMM_2276 transcriptional regulator MarR family IV 3 1 3 CMM_0016 pknA serine threonine protein kinase IV 3 1 3 CMM_2336 glycosyltransferase 11 2 1 3 CMM _1796 aroB 3 dehydroquinate synthase 1 2 1 3 CMM_2243 conserved hypothetical protein V 2 1 3 CMM_0488 recQ2 ATP dependent DNA helicase II1 1 1 3 CMM_0688 conserved hypothetical protein V 2 1 2 CMM_0158 membrane protein V 2 1 2 CMM_2241 conserved membrane protein V 2 1 2 CMM_0756 conserved membrane protein V 2 1 2 CMM_1769 hisF imidazole glycerol phosphate synthase subunit hisF 1 2 1 2 CMM_1654 conserved hypothetical protein V 2 1 2 CMM_2677 transcriptional regulator TetR family IV 3 1 2 CMM_0561 aspS aspartyl tRNA synthetase 111 3 1 2 CMM_2008 rRNA methyltransferase 111 3 1 2 CMM _1797 aroK shikimate kinase 1 2 1 1 CMM_2756 esterase lipase V 1 Tabelle 25 Mittels Microarray Experiment ermittelte C michiganensis subsp michiganensis Gene deren Transkriptmengen in XMM Medium im Vergleich mit TBY Medium erh ht waren 237 Gene wurden identifiziert von denen 157 eine 2 oder mehrfach erh hte Transkriptmenge zeigten Die Gene wurden nach dem absteigenden FCA Wert geordnet FCA fold change absolute SBP substrate binding protein FCA Gen Name M gliche Funktion COG 42 7 CMM_1473 pckA phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 1 34 0 CMM _1973 acyl CoA dehydrogenase V 1 30 7 CMM_1790 anion ABC transporter substrate binding protein IV 1 24
267. l 0 16 mM KH PO 0 32 mM K HPO 0 01 mM FeSO 0 2 w v casamino acids pH 6 7 TBY Medium schwarze Dreiecke M9 Medium dunkelgraue Rauten Ergebnisse 74 Das Wachstum in XMM Medium war in der exponentiellen Phase in etwa vergleichbar mit dem Wachstum in Minimalmedium in dem die Generationszeit 12 28 h 0 6 h betrug Um zu berpr fen ob die Inhaltsstoffe in XMM Medium mit denen des Xylemsaftes bereinstimmten wurden die Konzentrationen von Nitrat Ammonium Glucose Fructose Saccharose und der Aminos uren ermittelt Tabelle 7 Das XMM Medium enth lt etwa 23 mM Nitrat 1 6 mM Ammonium und keine der analysierten Zucker Die Konzentrationen der Aminos uren waren in den beiden durchgef hrten Messungen nicht konsistent wie es auch schon f r den Xylemsaft beobachtet wurde Die Aminos uren Prolin Leucin und Glutamat lagen in der h chsten Konzentration vor Asparagin konnte nicht identifiziert werden Das XMM Medium wurde in Proteom und Transkriptomanalysen als in vitro Medium zur Analyse und Charakterisierung von Virulenzfaktoren getestet 4 4 2 Proteomanalysen F r die Virulenz von Bakterien spielen Oberfl chenproteine und extrazellul re Proteine bei der Interaktion mit der Wirtszelle eine Rolle Oberfl chenproteine k nnen beim Kontakt mit der Wirtszell Oberfl che zum Beispiel bei der Anheftung wichtig sein Extrazellul re Proteine k nnen als hydrolytische Enzyme Bestandteile der pflanzlichen Zellwand angreifen oder als
268. l rev 57 TCGAATTCGCACACGTCC Material und Methoden Name T4 C 24 Sequenz ginA SP1 rev 55 GGGGGTTGTAGATGTCGAA ginA SP2 rev 65 CGACGGTGGATGCGGGGATGTTGA cmx_Kpnl_fw 64 CCGGTACCACTGCAGGACATGGTCAAAG cmx_SexAl_rev 64 AACCTGGTTCGGATGGGTCATCAATT GG tomA_RNA_c_fw 55 GCGCCACCGACGTCGAG tomA_RNA_c_rev 55 GCGGATGTCAGTGTTCTCAT gyrA_RNA_c_fw 53 ATGAGTAGTGTCGCCGAG gyrA_RNA_c_rev 53 CCACGGAGAAGAGGAACG cmx_Sphl_rev 64 GCATGCTCGGATGGGTCATCAATTGG BMcelA s 5 BIO 45 CGATGCCGTCGAGCTT BMpat 1 s 5 BIO 45 ATGAGGCGGGCCCAC BMcelA as 45 AGGACGAGCCGAAGCA BMpat 1 as 45 TATGCGCGACATGAACTG ALPHA_I_seq_rev CTTCCGGCTCGTATGTTGTG pDM302_rev GCTTCCTTTAGCAGCCCTTG pDM302_fw GCCTTGAAGGCATGTTAGAG pDM302_seq_rev2 TTGTCCAGATAGCCCAGTAG 2408_Xbal_fw 70 3 GGCCICTAGAACGATGGCGGCGAGCGGCTG 2408_Xbal_rev 70 3 GGCCTICTAGATAGCCCACGCTCACCGCAAC 2766_Xbal_fw 62 GGCCICTAGACTACGAGGGCTGGCAGATCC 2766_Xbal_rev 62 GGCCTCTAGACGCATGAGGTAGCGCAGCAG 0056_Xbal_fw 62 GGCCTICTAGAACGGCAGAGGAACGCATCAG 0056_Xbal_rev 62 GGCCICTAGAACCGACTCGCTGACGATCTC CMM_2408probefw 68 CGCCGCTCGCTCTCCACCTG CMM_2408proberev 68 TCGAGCGCGGGTAGCCGGAC CMM_2766probefw 66 GCGCCCTGCTCGTGTGGGTG CMM_2766proberev 66 CGACGACGAGCACCCGGATG pCM20056probefw 62 GGTCGAAGCCGAACAGGAAG pCM20056proberev 62 GGTACACGCCGTGTGCCATC pat 1_s
269. lant Pathol 13 2 187 197 Literaturverzeichnis 130 Benjamini Y and Hochberg Y 1995 Controlling the false discovery rate a practical and powerful approach to multiple testing J R Statist Soc B 57 1 289 300 Bentley S D Corton C Brown S E Barron A Clark L Doggett J Harris B Ormond D Quail M A May G Francis D Knudson D Parkhill J and Ishimaru C A 2008 Genome of the actinomycete plant pathogen Clavibacter michiganensis subsp sepedonicus suggests recent niche adaptation J Bacteriol 190 6 2150 2160 Bermphol A Dreier J Bahro R and Eichenlaub R 1996 Exopolysaccharides in the pathogenic interaction of Clavibacter michiganensis subsp michiganensis with tomato plants Microbiol Res 151 391 399 Boch J and Bonas U 2001 Gram negative plant pathogenic bacteria Contrib Microbiol 8 186 196 Bonas U Van den Ackerveken G B ttner D Hahn K Marois E Nennstiel D Noel L Rossier O and Szurek B 2000 How the bacterial plant pathogen Xanthomonas campestris pv vesicatoria conquers the host Mol Plant Pathol 1 1 73 76 Buhtz A Kolasa A Arlt K Walz C and Kehr J 2004 Xylem sap protein composition is conserved among different plant species Planta 219 4 610 618 Burger A Grafen l Engemann J Niermann E Pieper M Kirchner O Gartemann K H and Eichenlaub R 2005 Identification of homologues to the pathogenicit
270. lfidbr cken entfernt werden folgt die Auftrennung nach ihrem Molekulargewicht mittels SDS PAGE siehe Abschnitt 3 4 5 300 ug Proteine wurden in 450 ul Rehydrati sierungsl sung aufgenommen Die Probenfl ssigkeit wurde in der Rehydratisierungswanne GE Healthcare Freiburg verteilt und der Gelstreifen Immobiline Dry Strip pH 3 10 bzw 6 11 18 cm GE Healthcare Freiburg luftblasenfrei mit der Gelseite nach unten aufgelegt Die Rehydratisierung des Gels erfolgte f r 22 24 h bei Raumtemperatur Anschlie end folgte die isoelektrische Fokussierung der Proteine f r 22 h bei 20 C in einem PGphor Isoelectric Focussing System Amersham Biosciences Freiburg Die Gelstreifen wurden mit zwei in H2Opiaesr getr nkten Filterstreifen und ber Elektrodenbr cken mit den Elektroden des Systems verbunden und mit PlusOne Dry Strip Cover Fluid Amersham Biosciences Freiburg berschichtet Es wurde eine Spannung von 30 V f r 12 h angelegt 60 V f r 2 h sowie 500 und 1 000 V f r jeweils eine Stunde Es folgte ein 12 st ndiger Gradient bei 8 000 V Nach der isoelektrischen Fokussierung wurden die Gelstreifen entweder sofort f r die Material und Methoden 50 zweite Dimension verwendet oder bei 20 C eingefroren Es folgten zwei Inkubationsschritte f r 15 min bei Raumtemperatur in quilibrierungsl sung mit 1 w v DTT und mit 4 w v lodacetamid und einigen K rnern Bromphenolblau Nach dem Sp len mit H2Opiaes wurden die Streifen auf 12 5 i
271. ltriert und behandelt Die folgende RNA Isolierung wurde wie in Abschnitt 3 3 2 2 beschrieben durchgef hrt Die qPCR beruht auf der Quantifizierung spezifischer mRNAs wobei einer reversen Transkription in CDNA eine PCR folgt bei der das Ziel Fragment amplifiziert wird Als template wurde Gesamt RNA verwendet die Oligo nukleotide wurden von MWG Ebersberg bezogen und in einer Menge von 0 6 0 8 uM in H2Opiaese verd nnt eingesetzt Die Gr e der amplifizierten PCR Fragmente betrug 100 200 bp Die Durchf hrung erfolgte mittels iScript One Step RT PCR Kit Biorad M nchen Material und Methoden 41 wobei die reverse Transkription und die Amplifikation in einem Schritt erfolgten Fur die Analyse unterschiedlicher Transkriptmengen wurden 10 ng Gesamt RNA von N tabacum cv Samsun NN Bl ttern verwendet die mit 10 mM MgCl dem Wildtypstamm Cmm382 oder dem plasmidfreien Stamm Cmm100 behandelt wurden 25 ul Ansatz 12 5 ul SYBR Green Mix 0 5 ul Vorw rts Primer 0 5 ul R ckw rts Primer 0 5 ul reverse Transkriptase 1 ul H O pidest 10 ul Gesamt RNA PCR Programm 10 min 55 C reverse Transkription 10 min 95 C Denaturierung des DNA RNA Hybrids 30 sek 95 C PCR 45 Zyklen 30 sek 60 C 30 sek 72 C 1 min 95 C Denaturierung 30 sek 55 C Annealing 81 Zyklen 30 sek 55 95 C Schmelzkurve F r alle qPCR Reaktionen wurde das MyiQ Single Color Real Time PCR Detection System Biorad M nchen verwendet Die Menge des PCR Produkts wurde
272. m 48 47 47 47 46 46 46 44 44 43 43 43 42 42 42 42 41 40 40 40 40 40 40 40 39 39 39 39 38 38 38 38 37 35 35 35 35 34 34 33 32 31 31 30 30 30 28 28 28 28 27 26 26 25 25 25 24 24 24 23 23 23 23 CMM_0594 CMM_1408 gatA CMM_2612 rp V CMM_2603 rp F CMM_1386 frr CMM_1357 romF CMM_1461 dpsA CMM_2586 rpsM CMM_1463 tig CMM_2786 rplA CMM_2088 CMM 2522 glyA CMM _0179 CMM 1951 CMM_2446 galU CMM _1167 aipA CMM _1466 CMM_2614 rp B CMM_0879 pCM2_0036 CMM _1996 argG CMM _1034 CMM_0932 pncA CMM _1806 CMM_ 2048 rpsO CMM_2788 nusG CMM_1817 CMM_2370 metS CMM_2607 rpIN CMM_0513 pgmA CMM_2623 rpsL CMM_2618 rpsJ CMM _1105 ilvE CMM _1745 sodA CMM _0866 CMM_1514 CMM_0877 araD CMM_2963 rpsF CMM_2602 rp R CMM_1407 gatC CMM_2962 ssb CMM_2232 cynT CMM_2468 dixR CMM_1010 rmiB CMM_2631 rpoB CMM_1062 bcp CMM_2045 CMM_1777 metk CMM_2009 rp T CMM_0896 ackA CMM_ 2270 rplY CMM_0894 CMM_1150 argS CMM_2035 dapA CMM _1618 fabH CMM 2943 CMM _1617 acpP CMM_0796 trxC CMM_2880 CMM_2185 CMM_1863 murF CMM_2163 gab7 CMM_0152 grpE putative heme peroxidase glutamyl tRNA GIn amidotransferase subunit A 50S ribosomal protein L22 50S ribosomal protein L6 ribosome recycling factor ribosome releasing factor 50S ribosomal protein L32 stress induced DNA binding protein 30S rib
273. m synthetischen Medium XMM gegen ber Minimalmedium M9 zu berpr fen wurde das Level der mRNA in einer Cmm382 Kultur in XMM Medium mit dem in M9 Medium mittels Microarray Experimenten verglichen Von den 3 107 in Cmm382 analysierten Genen war die Transkriptmenge von 247 Genen in XMM Medium h her als in M9 Medium und die von 179 Genen war niedriger Tabelle 13 Tabelle 13 Eine Liste der Cmm382 Gene aus DNA Microarray Experimenten deren Transkriptmengen in XMM Medium h her bzw niedriger waren als in M9 Medium Gene die eine statistisch relevante Anderung der Transkriptmenge zeigten p value lt 0 05 Benjamini Hochberg Korrektur Benjamini amp Hochberg 1995 wurden in die entsprechenden COG Gruppen eingeteilt A H here Transkriptmenge und niedrigere Transkriptmenge in XMM Medium verglichen mit M9 Medium COG A u Gruppe Kategorie 247 179 I Metabolismus 55 42 1 1 Energie und Kohlenstoffwechsel 29 6 1 2 Aminos urestoffwechsel 12 17 1 3 Nukleotidstoffwechsel 2 5 1 4 Lipidstoffwechsel 8 1 1 5 Stoffwechsel von Coenzymen und Vitaminen 4 7 1 6 Sekundarstoffwechsel 0 6 ll Zellulare Prozesse 5 7 11 1 Zellzyklus 0 1 Il 2 Zellwand 5 6 Hl Informationsspeicherung und prozessierung 3 29 111 1 Replikation und Reparatur 1 12 11 2 Transkription 0 3 11 3 Translation 2 14 IV Potentiell relevant in der phytopathogenen Interaktion 92 42 IV 1 Transporter 68 13 IV 2 Proteintransport 1 3 IV 3 Regulato
274. mal protein L25 UDP N acetylglucosamine pyrophosphorylase metal ABC transporter substrate binding protein hypothetical protein methionyl tRNA synthetase 2 methylcitrate dehydratase conserved hypothetical protein CoA binding ribonucleoside diphosphate reductase beta subunit ribonucleoside diphosphate reductase cold shock protein 60 kDa chaperonin protein Cpn60 GroEL protein transcriptional regulator CarD family polyphosphate kinase RNA polymerase sigma factor ECF subfamily formyltetrahydrofolate deformylase isocitrate dehydrogenase succinyl CoA ligase ADP forming subunit alpha GMP synthase conserved membrane protein branched chain amino acid ABC transporter permease protein branched chain amino acid ABC transporter permease component branched chain amino acid ABC transporter SBP 10 kDa chaperonin protein Cpn10 GroES protein 30S ribosomal protein S9 50S ribosomal protein L13 50S ribosomal protein L17 DNA directed RNA polymerase subunit alpha 30S ribosomal protein S11 IV 3 V 2 1 3 1 2 111 3 111 3 111 3 111 3 V 2 111 1 1 6 V 2 V 2 IV 1 1 1 111 3 V 1 1 4 1 4 1 2 IV 1 IV 1 111 3 IV 1 V 2 IV 1 IV 1 IV 1 1 5 V 2 V 2 V 2 V 2 V 2 111 2 1 1 1 1 111 3 11 2 IV 1 V 2 111 3 1 1 V 2 1 3 1 3 IV 4 IV 4 IV 3 IV 3 1 3 1 1 1 1 1 3 V 2 IV 1 IV 1 IV 1 IV 4 111 3 111 3 111 3 111 2 111 3 Anhang 209 Fortsetzung Tabelle 34 Transkripte der Gene im Genom von
275. menaquinol cytochrome C reductase iron sulfur subunit acetyltransferase conserved membrane protein cytochrome c oxidase subunit I cytochrome c oxidase subunit 2 UDP N acetylmuramoy tripeptide D alanyl D alanine ligase UDP glucose 4 epimerase conserved membrane protein high affinity choline glycine betaine transport protein BCCT family IV 4 IV 4 V 1 IV 4 111 3 V 2 1 5 V 2 V 2 111 3 V 1 1 2 IV 4 1 4 1 4 1 4 1 1 IV 3 1 2 1 1 V 2 IV 3 V 2 1 4 V 2 1 1 111 3 IV 1 IV 5 IV 5 IV 5 1 1 1 1 V 2 IV 2 1 1 IV 5 111 3 1 2 1 2 1 2 1 2 1 3 111 3 111 3 Anhang 208 Fortsetzung Tabelle 34 Transkripte der Gene im Genom von Cmm382 mit internen reads CMM_1966 c vk CMM_1971 CMM_1975 cmkA CMM_1996 argG CMM_2009 rpIT CMM_2010 rpmi CMM_2011 infC CMM_2047 pnp CMM_2069 CMM_2073 CMM_2093 alcBC CMM_2096 CMM_2097 CMM_2107 CMM_2109 lacZ CMM_2149 infB CMM_2150 CMM_2155 CMM_2156 ilpG CMM_2163 gabT CMM_2176 CMM_2177 CMM_2179 bipA CMM_2181 CMM_2182 CMM_2183 CMM_2184 CMM_2185 CMM_2201 CMM_2215 CMM_2221 CMM_2222 CMM_2231 CMM_2243 CMM_2244 greA CMM_2259 CMM_2263 eno CMM_2270 rpIY CMM_2275 gimU CMM_2283 CMM_2292 CMM_2370 metS CMM_2380 prpD CMM_2401 CMM_2428 nrdB CMM_2429 nrdA CMM_2471 cspB CMM_2478 groEL CMM_2490 CMM_2503 ppkA CMM_2510 sigK CMM_2532 purU CMM_2537 icdA CMM_2547 sucD CMM_2554 guaA CMM_2555 CMM_2562 livH C
276. metrie Daten mit den Microarray Daten wird zus tzlich erschwert durch die unterschiedlichen Analyse Methoden Bei einer Analyse des Transkriptoms mittels Microarray verursachen der hohe G C Gehalt von C michiganensis subsp michiganensis und das Quenching des Fluoreszenzsignals technische Probleme Ramdas et al 2001 Lewis et al 2010 C R ckert CeBiTec Universitat Bielefeld m ndliche Mitteilung 2013 Des Weiteren stimmen zum Teil die in Microarray Experimenten ermittelten Transkriptmengen nicht mit der Konzentration berein wie sie in vivo vorliegt C R ckert CeBiTec Universit t Bielefeld m ndliche Mitteilung 2013 Eine Analyse des Proteoms mittels Massenspektrometrie ist sehr sensitiv sodass sogar Proteine im Femtomol Bereich detektiert werden k nnen Hou et al 2010 Au erdem gibt die Analyse des Proteoms im Gegensatz zur Analyse des Transkriptoms mittels Microarray nicht nur Auskunft ber eine ver nderte Expression sondern auch ber eine konstitutive Expression Da die Regulation der Genexpression bei der Wirt Pathogen Interaktion ebenfalls eine Rolle spielt und diese f r C michiganensis subsp michiganensis weitestgehend unbekannt ist wurden in dieser Arbeit Experimente zur Identifizierung putativer Regulatoren durchgef hrt Diskussion 124 5 6 Putative Transkriptionsregulatoren von pat 1 und celA Regulatoren spielen eine groBe Rolle bei der Pathogenitat von Bakterien da sie die Expression von Virulenzgenen i
277. n conserved secreted protein COG V 2 V 2 IV 1 V 2 V 2 IV 1 11 2 IV 6 IV 6 IV 6 IV 6 IV 6 IV 6 IV 6 11 2 11 2 IV 6 V 2 11 2 IV 7 IV 4 IV 6 IV 6 V 2 1 1 1 1 V 2 IV 1 VA IV 4 IV 1 IV 6 1 1 1 1 IV 4 IV 6 IV 1 11 2 111 3 IV 1 V 2 V 2 Replikat Nr WWNMNH HHHW HO 0 WNHWWH WWWWWNWWNWWWAWH NM HW NWWWWWW Anhang Fortsetzung Tabelle 20 extrazellul res Proteom von Cmm382 in XMM Medium 84 73 71 71 67 67 66 61 61 57 57 56 56 56 52 52 51 51 51 49 47 45 44 43 43 42 41 41 41 39 38 35 35 33 33 33 32 29 28 28 28 28 27 27 26 26 25 25 25 24 24 24 24 23 23 22 22 21 CMM_0879 CMM_2161 CMM_0819 wcoA CMM_2934 hupB CMM_ 2562 livH CMM_0044 ppaC CMM_0071 ppaE CMM_2204 CMM_0638 pCM1_0020 celA CMM_0039 chpE CMM_1022 wcqk CMM_0466 CMM_0431 CMM_1673 xysA CMM_2540 CMM_0931 pbpE CMM_2609 romC CMM_1790 CMM_0608 CMM_0278 CMM_1835 qerC CMM_1942 ppaG CMM_1800 aroE CMM_1389 CMM_0049 nagA CMM_ 2618 rpsJ CMM_2263 eno CMM_0128 CMM_2434 CMM_0132 CMM_1744 gapA CMM_1960 CMM_2033 CMM_0051 pelA2 CMM_0043 pe A7 CMM_2617 rpIC CMM_2604 rps CMM_1852 CMM_0486 CMM_1736 pgiA CMM_0627 CMM_1735 talA CMM_2250 CMM_2176 CMM_1104 euB pCM2_0016 CMM_2438 CMM_1674 xysB CMM_0861 rplL CMM_2607 rpIN CMM_0337 CMM_1405 CMM_2585 rpsk
278. n Faktoren wie Temperatur Pflanzengr e und bakterielles Inokulum oder beispielsweise auf einen Verlust der nat rlichen Plasmide von C michiganensis subsp michiganensis zur ckzuf hren die vermutlich zwischen den Bakterien ausgetauscht werden k nnen Chang et al 1992 Eichenlaub amp Gartemann 2011 Die in dieser Arbeit gemachte Beobachtung dass aus den Samen infizierter Pflanzen ph notypisch gesunde Pflanzen hervorgingen k nnte ebenfalls mit einer Latenzzeit der Bakterien erkl rt werden Des Weiteren k nnte in dieser Arbeit keine Infektion der Tomatenfr chte und damit der Samen stattgefunden haben Die wahrscheinlichste Erkl rung ist jedoch dass die Samen zwar als Tr ger f r die C michiganensis subsp michiganensis dienten die Bakterien jedoch nicht in den Keimling gelangen konnten Findet bei der Keimung der Pflanze keine Verletzung statt kann das Eindringen der Bakterien dadurch verhindert werden Zusammengefasst wird durch das nicht einheitliche Auftreten oder das Ausbleiben von Krankheitssymptomen in C michiganensis subsp michiganensis infizierten Tomatenpflanzen die Analyse der Wirt Pathogen Interaktion erschwert und somit ebenfalls die Identifizierung von Virulenzfaktoren die f r die Pathogenit t des Bakteriums verantwortlich sind B ttner amp Bonas 2010 Eine Analyse von Virulenzfaktoren in vivo ist somit schwierig und wird au erdem durch technische Limitierungen eingegrenzt Eine in vitro Analyse erleich
279. n wenn der Proteinextrakt aus einer XMM Kultur verwendet wurde CMM_2766 kodiert f r den Antwortregulator eines Zwei Komponen tensystems und ist mit CMM_2765 das f r eine Sensor Histidin Kinase kodiert in einem Operon lokalisiert http cmr jcvi org Proteine eines Zwei Komponenten Systems sind ebenfalls an der Regulation von Virulenzgenen beteiligt Karki et al 2012 Das Genprodukt von CMM 2766 wurde von den Promotorregionen von pat T und celA eluiert wenn der Proteinextrakt aus einer XMM bzw XVM2 Kultur verwendet wurde 4 5 2 Insertionsmutagenese von drei putativen Regulatoren Die drei Gene CMM 2408 CMM_2766 und pCM2_0056 sollten in dieser Arbeit mittels Insertionsmutagenese ausgeschaltet werden um zu berpr fen ob deren Genprodukte einen Einfluss auf die Expression von pat T und ce A haben Jahr und Kollegen sowie Stork und Kollegen f hrten die Mutation von celA chpC und chpG durch die Insertion einer Resistenzkassette durch Jahr et al 2000 Stork et al 2008 Die Insertion erfolgte durch doppelt homologe Rekombination In dieser Arbeit war jedoch die Herstellung von Insertionsmutanten durch doppelt homologe Rekombination nicht erfolgreich Die Insertions mutagenese wurde deshalb durch einfach homologe Rekombination durchgef hrt Der Vektor pUC18 kann in C michiganensis subsp michiganensis nicht repliziert werden sodass er in das Genom integriert werden muss In pUC18cat wurden je 300 500 bp gro e Fragmente der Zielgene
280. n L16 30S ribosomal protein S3 50S ribosomal protein L22 30S ribosomal protein S19 50S ribosomal protein L2 50S ribosomal protein L23 50S ribosomal protein L4 50S ribosomal protein L3 30S ribosomal protein S10 elongation factor Tu EF Tu elongation factor G EF G 30S ribosomal protein S7 30S ribosomal protein S12 DNA directed RNA polymerase subunit beta DNA directed RNA polymerase subunit beta ATP dependent helicase acetyl xylan esterase hypothetical protein conserved hypothetical protein putative toxin of kil kor system hypothetical protein hypothetical membrane protein conserved secreted protein conserved hypothetical protein conserved hypothetical protein putative nitroreductase conserved hypothetical protein conserved hypothetical protein 50S ribosomal protein L1 50S ribosomal protein L11 transcription antitermination protein preprotein translocase subunit menaquinone biosynthesis methyltransferase plasmid maintenance system antidote protein plasmid maintemance system killer protein conserved hypothetical protein hypothetical protein 30S ribosomal protein S14 50S ribosomal protein L33 50S ribosomal protein L28 adenylosuccinate lyase sSingle stranded DNA binding protein 30S ribosomal protein S6 thioredoxin reductase conserved membrane protein conserved hypothetical protein ribonuclease P protein component 50S ribosomal protein L34 CMM_PS_20 111 3 111 3 111 3 111 3 1 3 IV 2 111
281. n XMM Medium eine h here Transkriptmenge aufwiesen als in M9 Medium und 17 der Gene die eine niedrigere Transkriptmenge aufwiesen zeigten eine zwei oder mehrfach ver nderte Expression Von den 179 Genen deren Transkriptmengen in XMM Medium niedriger waren als in M9 Medium wurden 44 den COG Gruppen Metabolismus Zellul re Prozesse und Informationsspeicherung und prozessierung zugeordnet Tabelle 13 und Abbildung 20 Dabei waren vor allem die Transkriptmengen von Genen ver ndert deren Genprodukte am Aminos urestoffwechsel COG Gruppe 1 2 an der Translation COG Gruppe III 3 sowie an der Replikation und Reparatur COG Gruppe III 1 beteiligt sind 23 der Gene deren mRNA Level in XMM Medium niedriger war als in M9 Medium wurden in die COG Gruppe IV eingeordnet Von diesen Genen kodieren 18 Gene f r Regulatoren und 13 f r Transporter Tabelle 13 Die Transkriptmenge des Gens CMM _2931 das f r einen Eisentransporter kodiert war in XMM Medium 6 84 Mal niedriger Ergebnisse 88 als in M9 Medium Tabelle 14 33 der Gene deren mRNA Level in XMM Medium niedriger war als in M9 Medium geh rten der COG Gruppe unzureichend charakterisiert an Tabelle 14 Eine Auswahl der mittels Microarray identifizierten Cmm382 Gene deren Transkriptmengen in XMM Medium h her bzw niedriger waren als in M9 Medium Aufgelistet sind die COG Gruppen der Gene und die absolute Anderung der Transkriptmenge fold change absolute F
282. n einer Wirt Pathogen Interaktion ver ndern k nnen Bonas et al 2000 Haghjoo amp Gal n 2007 Wei et al 2007 Mittels Proteomanalysen wurden auch f r C michiganensis subsp michiganensis einige Regulatoren identifiziert die vermutlich in der Wirt Pathogen Interaktion involviert sind Savidor et al 2012 Spezifische Regulatoren wurden bis jetzt jedoch nicht identifiziert Fl gel 2010 Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit nach m glichen Regulatoren f r die zwei am besten charakterisierten Virulenzgene pat 1 und celA gesucht In dieser Arbeit wurden mit Hilfe von Bindungsexperimenten und nachfolgender MALDI ToF Massenspektrometrie 92 Regulatoren identifiziert welche an die Promotorregionen von pat 1 oder und ce A gebunden hatten siehe Abschnitt 4 5 1 Die drei Regulatorgene CMM_2408 CMM 2766 und pCM2_0056 wurden mittels Insertionsmutagenese mutiert und die entsprechenden C michiganensis subsp michiganensis St mme wurden in Pflanzen infektionsversuchen in RNA Hybridisierungsexperimenten und in Wachstumsexperimenten mit dem Wildtypstamm Cmm382 verglichen siehe Abschnitt 4 5 2 und 4 5 2 Dabei wurde als Wachstumsmedium das Vollmedium TBY das Minimalmedium M9 und das Xylemsaft imitierenden Medium XMM verwendet Die beiden Regulator Gene CMM_2408 und CMM_2766 wurden in dieser Arbeit erfolgreich mittels Insertionsmutagenese mutiert die Mutation von pCM2_0056 war aufgrund einer 100 igen Sequenzhomologie zu CMM_0055 nicht durch
283. n f r hypothetische Proteine Es wurden jedoch auch Sequenzhomologien zwischen den Genen der Serinproteasen pat 1 und chpA sowie phpA und chpA identifiziert 4 5 3 Analyse der Mutation von CMM_2408 und CMM_2766 Um eine m gliche nderung der Transkriptmengen der beiden Virulenzgene celA Cellulase und pat 1 Serinprotease bei Abwesenheit eines der beiden Transkriptionsregulator Gene CMM_2408 bzw CMM_2766 zu berpr fen wurden RNA Hybridisierungsexperimente durchgef hrt Die verwendete RNA wurde aus den St mmen Cmm382 EH2408 und EH2766 isoliert wobei die St mme in Vollmedium TBY Minimalmedium M9 und Xylemsaft imitierendem Medium XMM kultiviert wurden Mit Hilfe spezifischer RNA Sonden wurde die RNA der Gene gapA pat 1 und celA detektiert Abbildung 27 gapA pat 1 celA Sondentest gt a m Wt 2408 2766 Wt 2408 2766 Wt 2408 2766 TBY o s Er E o XMM 23 pat 1 Abbildung 27 RNA Hybridisierungs Experiment Die Gesamt mRNA wurde aus den St mmen Cmm382 Wt EH2408 2408 und EH2766 2766 isoliert Die Kultivierung der St mme wurde in TBY M9 und XMM Medium durchgef hrt Die Detektion erfolgte mit Hilfe spezifischer Sonden gegen die Gene gapA pat 1 und celA die zuvor mittels Sondentest auf ihre Digoxigenin Markierung getestet wurden Nach 30 min wurde das detektierte Signal aufgenommen Das Gen gapA kodiert f r eine Glycerinaldehyd 3 Phosphat Dehydrogenase die bei der Glycolyse eine Rolle spielt gapA is
284. n vitro the polymerase chain reaction J Biotechnol 24 17 27 Mundt J O and Hinkle N F 1976 Bacteria within ovules and seeds Appl Environ Microbiol 32 5 694 648 Murashige T and Skoog F 1962 A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures Physiol Plantarum 15 473 497 Mysore K S and Ryu C M 2004 Nonhost resistance how much do we know Trends Plant Sci 9 2 97 104 Nie L Wu G and Zhang W 2006 Correlation of mRNA expression and protein abundance affected by multiple sequence features related to translational efficiency in Desulfovibrio vulgaris a quantitative analysis Genetics 174 4 2229 2243 Nissinen R Xia Y J Mattinen L Ishimaru C A Knudson D L Knudson S E Metzler M and Pirhonen M 2009 The putative secreted serine protease Chp 7 is required for full virulence and induction of a nonhost hypersensitive response by Clavibacter michiganensis subsp sepedonicus Mol Plant Microbe Interact 22 7 809 819 Nolden L Farwick M Kr mer R and Burkovski A 2001 Glutamine synthetases of Corynebacterium glutamicum transcriptional control and regulation of activity FEMS Microbiol Lett 201 1 91 98 Oshlack A Robinson M D and Young M D 2010 From RNA seq reads to differential expression results Genome Biol 11 220 Parke D Ornston L N and Nester E W 1987 Chemotaxis to plant phenolic inducers of virulen
285. n war in XMM Medium h her als in M9 Medium die von 179 war niedriger wobei kaum Virulenzgene identifiziert wurden Au erdem waren die Transkriptmengen von 237 Genen in XMM Medium h her als in Vollmedium TBY und die von 167 niedriger Tabelle 25 und Tabelle 26 Das mRNA Level von 151 Genen war in M9 Medium h her als in TBY Medium und das von 432 war niedriger Tabelle 27 und Tabelle 28 Des Weiteren wurde die Transkriptmenge in XMM Medium mit der in XMM Medium 20 uM der Wundsubstanz Acetosyringon verglichen Tabelle 29 und Tabelle 30 um die Wirkung von Acetosyringon auf die Genexpression zu testen Dabei war die Transkriptmenge von 270 Genen in XMM Medium 20 uM Acetosyringon h her als in XMM Medium und die von 198 niedriger Die Gene im Genom von Cmm382 wurden gem Fl gel und Kollegen in COG Gruppen eingeteilt Fl gel et al 2012 Tabelle 23 Mittels Microarray Experiment ermittelte Gene deren Transkriptmengen in XMM Medium h her waren als in M9 Medium 247 Gene wurden identifiziert von denen 164 eine 2 oder mehrfach erh hte Transkriptmenge zeigten Die Gene wurden nach dem absteigenden FCA Wert geordnet FCA fold change absolute SBP substrate binding protein FCA Gen Name M gliche Funktion COG 34 4 CMM_1473 pckA phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 1 30 9 CMM_0196 sugar ABC transporter substrate binding protein IV 1 23 8 CMM_0197 sugar ABC transporter permease component IV 1 20 0 CMM_2783 sugar ABC transporter substra
286. nagB CMM_0422 CMM_1170 atpC CMM_2541 CMM_0679 CMM_1419 CMM_0032 CMM_1688 CMM_0106 ag A CMM_1154 thrC CMM_PS_01 CMM _1538 CMM 2153 CMM _1639 CMM 0272 CMM 2319 CMM 2794 CMM_2491 CMM_2475 CMM_1471 CMM_0777 CMM_0584 CMM_2126 CMM_2405 sdaA CMM_1312 CMM_2353 CMM_0827 wcol CMM_0776 CMM_1610 CMM_1707 CMM_1898 CMM_2761 CMM_0883 bglJ CMM_1400 CMM_2375 CMM_ 2047 pnpA CMM_1996 argG CMM_1628 CMM_0293 CMM_1095 i vH CMM_2847 CMM_0884 sugar ABC transporter permease component carbohydrate kinase hypothetical secreted protein conserved hypothetical protein transcriptional regulator GntR family conserved hypothetical protein transcriptional regulator Cro Cl family aminotransferase DNA glycosylase ferredoxin putative secreted metallopeptidase hypothetical membrane protein hypothetical secreted protein beta glucosidase beta xylosidase pseudouridine synthase anthranilate synthase component conserved membrane protein conserved hypothetical protein short chain alcohol dehydrogenase membrane bound acyltransferase conserved hypothetical protein FAD FMN containing dehydrogenase acetyltransferase GNAT family glucosamine 6 phosphate isomerase sugar ABC transporter ATPase ATP synthase epsilon chain ABC transporter fused permease and ATPase acetyltransferase short chain dehydrogenase oxidoreductase membrane protein transcriptional regulator DeoR family alpha glucosidase glycosyl hydr
287. nauftrennung und Qualitatsbestimmung von Nukleins uren wurden 1 4 ige w v Agarose Gele in 1 x TAE Puffer Sambrook et al 1989 eingesetzt Die zu analysierenden Proben wurden mit 6 x Ladepuffer Sambrook et al 1989 versetzt und auf das Gel aufgetragen Als Referenz wurde ein DNA Marker mitgef hrt pegGOLD DNA Leiter 100 10 000 bp peqlab Biotechnologie GmbH Erlangen Die Proben wurden mit einer Spannung von etwa 10 V cm Gell nge aufgetrennt wobei als Laufpuffer 1 x TAE Puffer diente Die DNA wurde durch eine etwa 10 min tige Inkubation in einem Ethidiumbromidbad gef rbt und anschlie end durch eine Geldokumentationsanlage Doc Print 1000 Gel documentation peqlab Biotechnologie GmbH Erlangen sichtbar gemacht Ethidiumbromid interkaliert in die DNA die Detektion der DNA Banden erfolgt durch Fluoreszenzanregung von Ethidiumbromid mit UV Licht A 366 nm Zur Isolierung wurde die DNA aus dem Gel ausgeschnitten und mittels NucleoSpin Extract II Kit Macherey Nagel D ren nach Angaben des Herstellers isoliert Die Konzentrationsbestimmung wurde bei 260 nm im Nanodrop ND1000 Spectrophotometer peqlab Biotechnologie GmbH Erlangen bestimmt Die Reinheit wurde ber den Quotienten von Azgo Azgo analysiert der bei reiner DNA zwischen 1 8 und 2 0 liegt 1x TAE Puffer 40 mM Tris 1 14 ml Essigs ure 1 mM EDTA pH 8 5 6 x Ladepuffer 0 25 w v Bromphenolblau 0 25 w v Xylencyanol FF 40 w v Saccharose 3 3 1 6 Ligation v
288. nd ce A Jahr et al 2000 durchgef hrt Eine f r Ergebnisse 104 Clavibacter typische Konsensussequenz wurde bis jetzt jedoch nicht identifiziert Eine gr ere Verf gbarkeit von Promotorregionen w rde zum einen den Einsatz starker Promotoren f r molekulare Analysen erm glichen zum anderen die Identifizierung von Genen deren Expression durch den gleichen Transkriptionsregulator gesteuert wird Aus diesen Gr nden wurde in dieser Arbeit zum einen nach starken Promotoren im Genom von C michiganensis subsp michiganensis gesucht zum anderen wurden Promotorregionen nach der Durchf hrung einer RNA Sequenzierung des 5 Transkriptoms analysiert 4 6 1 Analyse der Promotorregion von gInA1 In dieser Arbeit wurden GFP Fluoreszenzanalysen mit den Promotorregionen einiger Gene durchgef hrt um starke Promotoren im Genom von C michiganensis subsp michiganensis zu identifizieren Als Kontrolle wurde die Promotorregion von pat 1 und dem housekeeping Gen pfkA Gunton et al 2005 verwendet Wurde der Promotor P45 der als starker Promotor in C glutamicum gilt Knoppov et al 2007 in GFP Messungen eingesetzt war in den entsprechenden Clavibacter St mmen keine Fluoreszenz detektierbar Daten nicht gezeigt Der Promotor konnte somit von C michiganensis subsp michiganensis nicht abgelesen werden Zur Analyse starker Promotoren wurden deshalb die Promotorregionen von zehn Phagengenen im Genom von C michiganensis subsp michiganensis http
289. nd cell surface proteome of the human pathogen Corynebacterium diphtheriae Proteomics 6 8 2465 2476 Hansmeier N Chao T C P hler A Tauch A and Kalinowski J 2006a The cytosolic cell surface and extracellular proteomes of the biotechnologically important soil bacterium Corynebacterium efficiens YS 314 in comparison to those of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Proteomics 6 1 233 250 HanBler E and Burkovski A 2008 Molecular mechanisms of nitrogen control in Corynebacteria pp 183 201 In A Burkovski Corynebacteria Genomics and molecular biology Caister Academic Press Wymondham UK Harley C B and Reynolds R P 1987 Analysis of E coli promoter sequences Nucleic Acids Res 15 5 2343 2361 Literaturverzeichnis 134 Hausbeck M K Bell J Medina Mora C Podolsky R and Fulbright D W 2000 Effect of bactericides on population sizes and spread of Clavibacter michiganensis subsp michiganensis on tomatoes in the greenhouse and on disease development and crop yield in the field Phytopathology 90 1 38 44 Healy F G Krasnoff S B Wach M Gibson D M and Loria R 2002 Involvement of a cytochrome P450 monooxygenase in thaxtomin A biosynthesis by Streptomyces acidiscabies J Bacteriol 184 7 2019 2029 Henikoff S Haughn G W Calvo J M and Wallace J C 1988 A large family of bacterial activator proteins Proc Natl Acad Sci U S A 85 18 6602 6606 Hikich
290. nd der Cmm382 Kultur sowohl nach 24 als auch nach 48 h Proteaseaktivit t sichtbar Spuren 2 und 4 Das detektierte Fragment hatte eine Molekulargr e von etwa 40 kDa Die Serinproteasen in Ergebnisse 80 C michiganensis subsp michiganensis sind zwischen 30 und 38 kDa gro Dreier et al 1997 Gartemann et al 2008 Aufgrund der fehlenden Proteaseaktivit t im plasmidfreien Stamm Cmmi100 kann die detektierte Proteaseaktivit t von Cmm382 auf Gene zur ckgef hrt werden die auf den nat rlichen Plasmiden lokalisiert sind Eine Pektinaseaktivit t wurde weder im Medien berstand einer Cmm382 noch in dem einer Cmm100 Kultur detektiert Daten nicht gezeigt Identifizierung der Proteine mittels Massenspektrometrie F r die Analyse extrazellul rer und zytoplasmatischer Proteine aus C michiganensis subsp michiganensis mittels MALDI ToF MS wurde der Wildtypstamm Cmm382 in je 450 ml M9 oder XMM Medium kultiviert Die Proteinf llung erfolgte mittels 10 w v Trichloressigs ure Die isolierten extrazellul ren und zytoplasmatischen Proteine wurden anschlie end f r etwa f nf Minuten in einem SDS Gel aufgetrennt Daraufhin wurden sie aus dem Gel ausgeschnitten und mittels MALDI ToF MS analysiert Das Experiment wurde jeweils drei Mal durchgef hrt Die Gesamtzahl aller identifizierten Proteine in den drei Replikaten ist in Tabelle 9 dargestellt Tabelle 9 Mittels MALDI ToF MS identifizierte Proteine aus Cmm332 in M9 und XMM Medium
291. nden DNA Bereich flankierten Ein wiederholter Zyklus aus DNA Denaturierung Primer Anlagerung Annealing und Primer Verl ngerung Elongation ber eine hitzestabile DNA Polymerase erm glichte die Synthese Material und Methoden 31 des gew nschten DNA Fragments Die spezifische Annealing Temperatur der Oligo nukleotide wurde so gew hlt dass sie etwa 3 5 C unter der jeweiligen Schmelztemperatur lag Die Schmelztemperatur berechnet sich aus der Summe von GC und AT Basenpaaren wobei 4 C f r die Trennung von Wasserstoffbr cken pro GC und 2 C pro AT Basenpaar ben tigt werden DNA Sequenzen f r nachfolgende Klonierungs Experimente wurden mit der Phusion DNA Polymerase NEB Schwalbach die eine zus tzliche proofreading Aktivit t besitzt amplifiziert Folgte der Amplifikation keine Klonierung wurde die Taq DNA Polymerase NEB Schwalbach gew hlt Die eingesetzten Oligonukleotide k nnen der Tabelle 4 entnommen werden Als template diente Plasmid DNA siehe Abschnitt 3 3 1 1 direkt von der Agar Platte abgenommenes und in H gt O ides resuspendiertes Zellmaterial Kolonie PCR oder RNA f r die berpr fung einer Kontamination durch DNA Die Reaktion wurde in Primus 96 Cyclern peqlab Biotechnologie GmbH Erlangen oder im MyiQ i Cycler Biorad M nchen durchgef hrt 20 ul PCR Ansatz Tag Polymerase 2 ul 10 x PCR Puffer f r Tag Polymerase 2 ul 25 mM MgCl 10 ul Bakteriensuspension in H2Opides vorher 10 min 95 C
292. nem Wasserstau f hren und somit eine Blattwelke hervorrufen Wallis 1977 Jahr et al 1999 Ob extrazellul re Polysaccharide EPS in der Virulenz des Bakteriums zum Beispiel in der Verursachung eines Wasserstaus involviert sind bleibt unklar Mutanten die nur 10 der normalen EPS besa en zeigten keine Ver nderung in der Ausbildung von Krankheitssymptomen Bermphol et al 1996 Jahr et al 1999 EPS sind aber dennoch wichtig f r das Bakterium da sie einen Schutz vor Austrocknung bieten N hrstoffe und Mineralien wegen der enthaltenen S ure akkumulieren toxische Verbindungen unsch dlich machen und eine Erkennung durch die Pflanze erschweren Kir ly et al 1997 Jahr et al 1999 2 4 3 Molekularbiologische Methoden Die Charakterisierung und Analyse von Virulenzfaktoren f r C michiganensis subsp michiganensis ist aufgrund mangelnder molekularer und biochemischer Methoden bis heute nicht weit fortgeschritten Eine Charakterisierung von Virulenzfaktoren wurde auf mehrere Arten durchgef hrt zum Beispiel durch in silico Analysen Gartemann et al 2008 Stork et al 2008 Klonierungs und Pflanzentests Meletzus et al 1993 Transposonmutagenese Kirchner et al 2001 Kaup et al 2005 DNA Hybridisierungs Burger ef al 2005 und Microarray Studien Fl gel et al 2012 sowie mit Hilfe von Massenspektrometrie Analysen des Medium berstandes einer Bakterienkultur Holtsmark et al 2006 und des Xylemsaftes infizierter P
293. ner 25 ml Kultur in TBY Medium auf eine oDs go von 0 12 angeimpft Die Kultivierung erfolgte bis zu einer ODsg von 0 4 0 5 F r die Proteinisolierung wurden 100 ml TBY Medium mit der bernacht Kultur auf eine oDss von 0 2 angeimpft und etwa 6 8 h kultiviert Anschlie end wurden 450 ml M9 bzw XMM Medium mit dieser Kultur auf eine ODsgq von 0 15 gebracht Die Kultur wurde ber Nacht bis zu einer oD 3u von 0 5 0 8 kultiviert Zur Herstellung von kompetenten C michiganensis subsp michiganensis Stammen wurden 100 ml TBY Medium mit einer 25 ml bertag Kultur auf eine ODsgo von 0 2 angeimpft und ber Nacht kultiviert Um Fluoreszenzmessungen aus den Medien M9 und XMM durchzuf hren wurden 25 ml der entsprechenden Medien mit einer 25 ml TBY Vorkultur auf eine oDsgo von 0 1 angeimpft und ber Nacht bis zu einer oDsgo von 0 4 0 5 kultiviert 3 2 4 Infektion von Tomatenpflanzen 3 2 4 1 Wurzelinfektion F r die Infektion zehn Tage alter Tomatenpflanzen S Iycopersicum cv Moneymaker wurde eine Wurzelinfektion durchgef hrt Engemann 2006 Dabei wurden C michiganensis subsp michiganensis St mme wie in Abschnitt 3 2 3 beschrieben in 25 oder 50 ml TBY Medium ber Nacht kultiviert Nach einem Zentrifugationsschritt 5400 x g 10 20 min 4 C wurde das Pellet in 10 mM MgCl resuspendiert die oDsg der Suspension bestimmt und ein weiteres Mal zentrifugiert Die oDsg9 wurde anschlie end im entsprechenden Volumen auf 4 eingestellt Die Wurzeln
294. ng 1 Die Rezeptor PAMP Interaktion aktiviert Signalkaskaden MAPK Signalkaskaden wodurch die pflanzliche Genexpression ver ndert wird Dadurch werden Proteine gebildet die eine Rolle bei basalen Abwehrreaktionen spielen Diese Abwehrreaktionen sind vergleichbar mit denen des angeborenen Immunsystems bei Tieren Rietz amp Parker 2007 Pathogen betreffende pathogen related PR Proteine Verteidigungsenzyme und Phytohormone sind dabei entscheidend Durch sie wird gew hrleistet dass lokal aber auch systemisch Abwehrreaktionen aktiviert werden um Nachbarzellen vor Angriffen durch Pathogene zu warnen Vera et al 2011 Die Verteidigungsenzyme Phenylalanin Ammoniak Lyase PAL und Lypoxygenase LOX akkumulieren Phenylpropanoid Verbindungen und Oxylipine die eine antibakterielle Aktivit t besitzen Vera et al 2011 Um die pflanzlichen Abwehrreaktionen zu unterbinden sekretieren Bakterien Proteine die in das Zytoplasma der Einleitung 7 Pflanzenzelle geschleust werden und dort als Effektoren wirken Abbildung 1 Rietz amp Parker 2007 Der Transport von Effektoren in das Zytoplasma der Pflanze erfolgt in Gram negativen Bakterien ber Sekretionssysteme In Gram positiven Bakterien ist der Mechanismus des Transports noch unklar Hogenhout amp Loria 2008 Effektoren interagieren im Zytoplasma mit dem Erkennungs und Abwehrmechanismus der Pflanze wodurch eine erfolgreiche Infektion gew hrleistet ist Pontier et al 1998 Bonas et al
295. ng medium XMM nicht gemessen Inhaltsstoff Xylemsaft In vitro Medium XMM pH 5 6 pH 6 7 Nitrat 33 3 1 4 mM 23 4 5 1 mM Ammonium 1 9 0 2 mM 1 6 0 3 mM Zucker mM mM Glucose 0 0 Fructose 0 0 Saccharose 0 0 Ergebnisse 72 Inhaltsstoff Xylemsaft In vitro Medium XMM pH 5 6 pH 6 7 Aminosauren uM uM Glutamin 40 557 33 79 Asparagin 20 131 0 Alanin 2 2 61 88 220 Prolin 3 3 44 174 448 Histidin 5 3 42 22 56 Leucin 5 5 36 126 294 Valin 7 6 35 93 224 Threonin 5 9 33 38 114 Glutamat 8 30 176 414 Arginin 7 27 66 164 Lysin 7 8 26 66 163 Serin 7 8 26 90 219 Isoleucin 6 24 66 141 Aspartat 6 4 22 71 172 Glycin 2 7 11 46 118 Phenylalanin 1 5 11 52 134 Tyrosin 1 6 9 10 26 Methionin 0 3 0 4 16 40 Cystein Tryptophan ean Die Konzentrationsbestimmung erfolge in Duplikaten oder Triplikaten Die Nitrat Ammonium und Zuckerkonzentrationen wurden ber einen optischen Test bestimmt die Konzentrationen der Aminos uren ber eine Reversed Phase Chromatographie Der Xylemsaft enthielt etwa 33 mM Nitrat 1 9 mM Ammonium und keine der analysierten Zucker Tabelle 7 Die Konzentrationen der Aminos uren waren bei den zwei durchgef hrten Messungen sehr unterschiedlich Tabelle 7 Glutamin und Asparagin lagen dabei jeweils in der h chsten Konzentration vor Der pH Wert des Xylemsaftes lag zwischen 5 und 6 Als Grundlage f r das in vitro Xylemsaft imitierende Me
296. ng sieben weiterer Sequenzen weitere Genome werden derzeit sequenziert Francis et al 2010 Erst mit der verf gbaren Genomsequenz konnten Virulenzgene effektiver und schneller analysiert und charakterisiert werden Um Effektoren in die Wirtszelle zu transportieren m ssen sich Bakterien an die Wirtszell Oberfl che anheften ber diese Adh sion Gram positiver Bakterien an die Wirtszelle ist wenig bekannt Streptomyces coelicolor adh riert ber Fimbrien an Zelloberfl chen de Jong et al 2009 Die Genome von Clavibacter michiganensis subsp michiganensis und subsp sepedonicus L xyliund Streptomyces avermitilis enthalten Gene deren Genprodukte an der Synthese von Pili beteiligt sein k nnten die bei der Adh sion eine Rolle spielen http cmr jcvi org Da in Gram positiven Bakterien kein T3SS vorhanden ist um Effektoren ins pflanzliche Zytoplasma zu transportieren m ssen Effektoren auf andere Weise an ihren Zielort gelangen Streptomyces Arten exprimieren beispielsweise eine Salpeters ure Synthase die an der Thaxtomin Produktion beteiligt ist Thaxtomin inhibiert die Cellulose Synthese in der pflanzlichen Zellwand sodass vermutlich das Eindringen von Effektoren in die Pflanzenzelle erleichtert wird Loria et al 2008 Francis et al 2010 Virulenzgene sind in Gram positiven Bakterien vorwiegend innerhalb sogenannter Pathogenit tsinseln lokalisiert die wahrscheinlich ber horizontalen Gentransfer in das bakterielle Genom eingebau
297. nicht charakterisierter Promotoren vereinfacht Promotorstudien wurden bis jetzt nur f r die Virulenzgene pat 1 Dreier et al 1997 und ce A Jahr et al 2000 durchgef hrt Der Transkriptionsstartpunkt von pat 7 liegt 97 Nukleotide stromaufw rts des Startcodons der von ce A 85 Nukleotide stromaufwarts Die 10 und 35 Regionen bestehen f r pat 1 aus den Sequenzen TATCAT und TTGGAG und f r celA aus den Sequenzen TTTTGGG und GCCTCGGGG Die 10 35 Region zeigte bei pat 1 Homologien zu den Sigma Promotoren von Bacillus und E coli Dreier et al 1997 Jahr et al 2000 Um m gliche Konsensus Sequenzen in Promotorstrukturen der Gene im Genom von C michiganensis subsp michiganensis zu identifizieren wurde in dieser Arbeit zum einen die Promotorregion von gInA1 analysiert zum anderen wurde eine RNA Sequenzierung des 5 Transkriptoms durchgef hrt wobei als Wachstumsmedium Minimal bzw Vollmedium verwendet wurde In M9 Medium wurden insgesamt 15 479 792 reads identifiziert und in TBY Medium 12 634 480 reads C R ckert CeBiTec Universit t Bielefeld m ndliche Mitteilung 2013 Die Gesamt Read Zahlen liegen damit im Bereich der f r Salmonella enterica 7 9 Millionen reads Staphylococcus aureus 9 1 Millionen reads Listeria monocytogenes 14 5 Millionen reads und Enterococcus faecalis 15 3 Millionen reads identifizierten Zahlen Lasa et al 2011 48 Promotorregionen wurden anschlie end analysiert Die Shin
298. nnnnnnnnennnnnnn 54 3 5 2 Transformation kompetenter E coli DH5aMCR 24u2220unnnennnnnennnnnnnnnnnnnnnnnnnennnnannn 54 3 5 3 Herstellung kompetenter C michiganensis subsp michiganensis 54 3 5 4 Transformation kompetenter C michiganensis subsp michiganensis nnnen 55 3 5 5 Insertionsmutagenese in C michiganensis subsp michiganensis eennnn 55 3 5 6 FIUOrESZENZMESSUNG arein aAA ANETE AE ANE AE EEEN ENAN aa 55 4 a E E E E E 57 4 1 Wachstumsverhalten von C michiganensis subsp michiganensis 57 4 2 Infektion von TabakpflanZen enini E EE E EO 58 4 2 1 Ph notypische Analyse der Nicotiana Infektion cccccececeeeeeeeeeeeseeeeeeseeeeeeeeeeeeeeeeeeeaees 58 4 2 2 Molekulare Analyse der Nicotiana Infektion 444444444HBnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn nn 60 4 3 Infektion von Tomatenpflanzen 244444ennnnnnennnnennnnnnnennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnennennnnnnnnnnnnannnnnenn 64 4 3 1 Analyse von Krankheitssymptomen uuus s444ssnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnan nn 65 4 3 2 Analyse der Samenbesiedelung in infizierten Tomatenpflanzen enn 66 4 3 3 Analyse der Samenbesiedelung nach einer in vitro Infektion 0unnnnnennn 68 4 4 Analyse von Virulenzfaktoren 444sr444nnnnnnnnnnnnnnnnnnennennnnennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnennnnnnnennnnnnnennn nenn 70 4 4 1 Xylemsaft imitierendes in vitro Medium XMM
299. nnnnnnnnnnnn anna 44 Inhaltsverzeichnis 3 4 2 Analyse der Nitratkonzentration usu444ennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn ann 44 3 4 3 Analyse der Zucker und Aminos urenkonzentration 444440s0nsnnnnennnnnnnnennnnnnn nn 44 3 4 4 Proteinisolierung aus C michiganensis subsp michiganensis nennen 45 3 4 4 1 Isolierung der Oberfl chenproteine 244s424044nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnennnnnnnnnnnnn 45 3 4 4 2 Isolierung extrazellul rer und zytoplasmatischer Proteine 46 3 4 4 3 Isolierung spezifischer Proteine mittels magnetic beads nn 46 3 4 5 SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese SDS PAGE snnersnnennsnnnnnnnnnnnnennnnnnn 48 3 4 6 2D Polyacrylamid Gelelektrophorese 2D PAGE 240unnennnnnnnnnnnnnnnnnnnnennnnnnn 49 3 4 7 F rbung mit Coomassie Brilliant Blue 0unnnnnnneennnennnnnnnnnnennnnnnnnnnnnnnnannennnnannn 50 348 Zymo graphie u e e nein 51 3 4 9 Vorbereitung der Proteine zur Analyse mittels MALDI TOF MS nennen 52 3 4 10 Protein Hybridisierung Western Blot 4 4444snnnnnennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn anna 52 3 5 Techniken zur Manipulation von Bakterien 2444r444nnnnnennnnennennnnennnnnnnnnennnnennnnnnnennn nenn 54 3 5 1 Herstellung kompetenter E coli DHSQMCR 20usnssnsnennsnennnnnnnnnnnnnnnnn
300. nsetzung und der Resistenz der Rathayibacter Arten gegen Bakteriocine Zgurskaya et al 1993 Bakteriocine werden von Clavibacter Unterarten abgegeben um andere Unterarten oder nah verwandte Arten in ihrem Wachstum zu hemmen Holtsmark et al 2006 Im Jahr 2000 wurde C xyli der neuen Gattung Leifsonia zugeteilt Lee et al 1997 Evtushenko et al 2000 was dazu f hrte dass es nur noch eine Clavibacter Art gab C michiganensis 2 3 2 Clavibacter michiganensis C michiganensis bildet keine Endosporen ist durch fehlende Flagellen unbeweglich obligatorisch aerob und nicht s urebest ndig Die Zellwand Typ B2y beinhaltet den Zucker Rhamnose keine Arabinose und die Peptidoglycanschicht enth lt Diaminobutters ure Mycols uren die in einigen anderen Mitgliedern der Ordnung Actinomycetales vertreten sind fehlen in C michiganensis Der G C Gehalt der DNA liegt zwischen 65 und 75 und ist somit hoch wie bei allen pflanzenpathogenen Vertretern der Aktinobakterien Davis et al 1984 Francis et al 2010 Im Vergleich dazu liegt der G C Gehalt der DNA bei den Firmicutes zwischen 30 und 40 Jung et al 2010 Madhaiyan et al 2010 Die f nf Unterarten von C michiganensis haben eine hohe Wirtsspezifit t sodass sie nur in einer der landwirtschaftlich bedeutenden Pflanzen wie zum Beispiel Weizen oder Mais Krankheitssymptome ausl sen Sie gelangen ber nat rlich vorkommende ffnungen wie Hydathoden ber Verwundungen im Wurzel
301. nsporter permease component transcriptional regulator MarR family protein translocase subunit SecA pantoate beta alanine ligase EC 6 3 2 1 extracellular nuclease phosphatase CMM_PS_22 phosphate transport system regulator sugar ABC transporter permease component potassium uptake system NAD binding protein conserved hypothetical protein putative nuclease conserved hypothetical protein aspartate 1 decarboxylase glycosyltransferase 2 methylcitrate dehydratase conserved hypothetical protein DNA binding phosphoserine phosphatase DNA or RNA helicase serine protease ATP dependent family S16 conserved hypothetical protein acetyltransferase siderophore binding protein putative pseudogene homologous to C terminus of XysB phosphatidate cytidylyltransferase duplicated acetyltransferase rRNA methylase involved in antibiotic resistance leucine responsive regulatory protein AsnC family UDP N acetylmuramate dehydrogenase MFS permease ATPase partitioning protein DNA polymerase III delta subunit metallopeptidase family M20A conserved hypothetical protein putative GTPase transcriptional regulator TetR family NDP sugar epimerase tryptophanyl tRNA synthetase phosphatase HAD hydrolase family phenylalanyl tRNA synthetase alpha subunit glucarate dehydratase membrane protein PTS system mannitol specific IIBC component imidazole glycerol phosphate synthase subunit peptide ABC transporter ATPase Fortsetzung Tabelle 28 Nied
302. nsporter substrate binding lipoprotein conserved membrane protein antimicrobial peptide ABC transporter permease component Mn2 Fe2 transport protein NRAMP family glycerol kinase hypothetical protein ATP synthase C chain transcriptional regulator ArsR family putative signal peptidase I serine peptidase family S26 hypothetical membrane protein conserved hypothetical protein hypothetical protein delta 1 pyrroline 5 carboxylate dehydrogenase proline oxidase conserved membrane protein diaminopimelate decarboxylase Fe3 siderophore ABC transporter ATPase conserved hypothetical protein putative nucleoside diphosphate sugar epimerase transcriptional regulator Cro CI family nucleotidyltransferase elongation factor G EF G ATP synthase delta chain conserved hypothetical protein plasmid maintenance system antidote protein transporter RND family acetolactate synthase conserved hypothetical protein conserved membrane protein putative pilus assembly protein phosphoenolpyruvate dependent fructose phosphotrans ferase system EIIA EIIB EIIC glycosyltransferase phosphoribosylformylglycinamidine FGAM synthase sugar phosphate isomerase epimerase hypothetical protein 3 methyl 2 oxobutanoate hydroxymethyltransferase IV 1 V 1 IV 3 IV 2 1 2 IV 1 V 2 IV 3 1 1 IV 1 11 2 111 2 V 2 V 2 V 1 1 4 1 1 V 2 V 2 V 1 IV 3 V 2 IV 1 1 2 VA IV 1 1 5 IV 3 IV 1 V 2 IV 1 IV 1 IV 1 V 2 IV 1 IV
303. nteraktion von Nicht Wirts und Wirts Pflanze mit C michiganensis subsp michiganensis 112 5 1 1 Interaktion mit der Nicht Wirts Pflanze Nicotiana eeeeeeeeeeeeeeeerrserrrssrerrssrennnns 112 5 1 2 Interaktion mit der Wirts Pflanze S lycopersicum 2 20044n40nnnnennnnnnnnennnnnennnnnn nn 114 5 2 Das synthetische Xylemsaft imitierende Medium XMM 240222440042snnnnnennnnennnnnnnennnn nn 116 5 3 Das extrazellul re Proteom von Cmm382 in M9 und XMM Medium sermerseerseersennennn nen 118 5 4 Das Transkriptom von Cmm382 in unterschiedlichen Medien 4 4400 nennen 121 5 5 Proteom und Transkriptomdaten Ein Vergleich ur 24444nnennnnnnennnnnnnnnnnnnnn nen nnnnnnnenn 123 5 6 Putative Transkriptionsregulatoren von pat 1 und CelA u nuuunsennensnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnennnnnn 124 5 7 Homologe Sequenzen innerhalb des Genoms von Cmm382 uussssnsnnnsssnnnnnnennnennennnnnnennnnann 125 5 8 Analyse der 5 Transkripte mittels RNA Sequenzierung 2 2004440nnnnennnnnnnnnennnnnnnnnnnnn ran 126 6 Literat rverzeichnis na a nw tect amet Acdece 129 Inhaltsverzeichnis He PAIN ooo os Seaweeds See cerca once ve tense ee inns ts Sau cee E ed eens A cies EE E E E 142 FAL Plas mdkoOnstruk thon sce naeh ee nee nenn anime 142 7 2 MALDI ToF MS Daten des extrazellul ren Proteoms VON CMM382 eneennnnennnnnennnnnnn 144 7 3 MALDI ToF MS Daten
304. nthetase dihydrodipicolinate synthase 3 oxoacyl acyl carrier protein synthase III 2 keto acid dehydrogenase E1 beta component acyl carrier protein thioredoxin conserved hypothetical protein peptide ABC transporter substrate binding protein UDP N acetylmuramoyl tripeptide D alanyl D alanine ligase 4 aminobutyrate aminotransferase heat shock chaperone 1 5 111 3 111 3 111 3 111 3 111 3 IV 5 111 3 IV 4 111 3 V 1 1 2 V 1 1 4 1 1 IV 1 V 1 111 3 IV 1 IV 3 0 ao aaa aa a ad aD DD WA a Ba av aa aa aD aaa aa a ad ad DD DD DD DD AD ADD an 153 Anhang Fortsetzung Tabelle 21 zytoplasmatisches Proteom von Cmm382 in M9 Medium 22 22 22 22 21 21 21 21 21 21 20 20 19 19 19 19 19 18 18 18 18 17 17 17 16 16 16 15 15 15 15 15 15 13 13 13 13 13 13 12 12 12 11 11 11 11 11 11 11 10 10 10 10 10 10 10 10 oooog CMM_0709 CMM_0589 CMM_1856 ftsZ CMM_1716 rpmE2 CMM_0872 cysB CMM_0812 CMM_1742 tpiA CMM_2944 CMM_2898 aldA CMM_2223 CMM_2914 CMM_0587 hemE CMM_2961 rpsR CMM_1385 pyrH CMM_2831 CMM_1634 gInA2 CMM _1804 rpsD CMM 1373 rp S CMM_0858 galE2 CMM 1654 CMM _1696 CMM _0689 purA CMM 2561 guaB2 CMM_2580 rp M CMM_0034 CMM_2793 CMM_1667 sseA CMM_0595 hemH CMM_1168 atpG CMM_1630 CMM_2479 cspA2 CMM_0002 dnaN CMM_1160 CMM 1012 rmIC CMM_0990 IpdA CMM 1599 fc A CMM _1180 CMM 2171 gItA2
305. o en Fragment auch das Wildtyp Fragment detektiert wurde k nnte mit einer Integration des Plasmids an einer anderen Stelle im Genom erkl rt werden Bei einer in silico Analyse wurde CMM_0055 als ein zu pCM2_0056 homologes Gen auf dem Chromosom identifiziert wobei die Sequenzen zu 100 identisch waren http www ncbi nim nih gov sutils genom_tree cgi Insgesamt gab es eine 98 ige berein stimmung einer 2 198 bp umfassenden homologen Region die auf pCM2 die Gene pCM2_0055 und pCM2_0056 enth lt und auf dem Chromosom die Gene CMM_0054 und CMM_0055 Abbildung 26 377 bp z meo GA pe BCM 98 identisch 232 bp GE lt mo Qo ERREGT Chromosom Abbildung 26 Graphische Darstellung der homologen Sequenzen von pCM2_0056 und CMM_0055 Eine 2198 bp umfassende Region auf dem Chromosom ist zu 98 identisch mit einer Region auf pCM2 darunter die Gene pCM2_0055 und pCM2_0056 Die Sequenzen von pCM2_0056 und CMM_0055 stimmen zu 100 berein Die pCM2_0056 Sonde bindet zu 62 an CMM_0055 und die entsprechende 5 Region Die pCM2_0056 Sonde bindet zu 62 an CMM_0055 und die entsprechende 5 Region wodurch die berpr fung der richtigen Insertion des Plasmids in den offenen Leserahmen von pCM2_0056 erschwert wird In weiteren Experimenten wurde versucht eine pCM2_0056 CMM_0055 Doppelmutante herzustellen was jedoch nicht erfolgreich war Es konnte somit in dieser Arbeit keine pCM2_0056 Insertionsmutante hergestellt werden
306. o Azgo zwischen 2 0 und 2 2 liegen 3 3 2 2 RNA Isolierung aus N tabacum cv Samsun NN Die Isolierung der RNA aus Tabakpflanzen wurde mit Hilfe des RNeasy Plant Mini Kits Qiagen Hilden durchgef hrt 150 mg Blattproben von bakteriell und MgCl behandelten Tabakpflanzen die in fl ssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur weiteren Verwendung bei 80 C gelagert worden waren wurden mittels M rser und Pistill Haldenwanger Waldkraiburg homogenisiert Dabei wurde das Blattmaterial unter Zugabe von fl ssigem Stickstoff so lange bearbeitet bis ein feines Pulver entstanden war Es wurden sofort 450 ul RLT Puffer mit 1 v v B Mercaptoethanol zugegeben und es wurde so lange gem rsert bis eine homogene Fl ssigkeit entstanden war Nach berf hrung der Blatt Suspension in ein 1 5 ml Reaktionsgef und dem Mischen durch Vortexen wurde die Suspension auf eine QlAshredder S ule lila bertragen und es wurde bei 13 000 x g f r 2 min zentrifugiert Anschlie end wurde der berstand des Durchflusses in ein neues Reaktionsgef berf hrt Material und Methoden 38 und bei 80 C bis zur weiteren Verwendung eingefroren Das Lysat wurde daraufhin vorsichtig bei 37 C aufgetaut und es wurden etwa 225 ul 96 iges v v Ethanol zugegeben Die weitere Durchf hrung erfolgte nach Angaben des Herstellers wobei die RNA in 92 ul RNase freiem Wasser eluiert wurde Es folgte ein weiterer Schritt zum Abbau noch vorhandener DNA mittels TURBO DNase
307. o acid permease APC family IV 1 1 1 CMM_0404 two component system response regulator IV 3 1 1 CMM_2218 phosphatase V 2 1 1 CMM_2402 conserved hypothetical protein V 2 1 1 CMM_2806 ferredoxin ferredoxin NADP reductase 1 5 1 1 CMM_2316 putative phosphomutase lyase V 2 1 1 CMM_1411 conserved secreted protein V 2 1 1 CMM_1767 trpET anthranilate synthase component 1 2 1 1 CMM_1852 cell division initiation protein 11 1 1 1 CMM_0890 membrane protein V 2 1 1 CMM _1763 trpB tryptophan synthase beta chain 1 2 1 1 CMM_1308 prfB peptide chain release factor RF 2 111 3 1 1 CMM_2260 serine peptidase family S8 IV 7 1 1 CMM_1278 serine protease family S1B IV 7 1 1 CMM_2380 prpD 2 methylcitrate dehydratase 1 1 1 0 CMM_0128 conserved secreted protein V 2 Tabelle 30 Mittels Microarray Experiment ermittelte C michiganensis subsp michiganensis Gene deren Transkriptmengen in XMM 20 uM Acetosyringon AS im Vergleich mit XMM erniedrigt waren 198 Gene wurden identifiziert von denen 63 eine 2 oder mehrfach ver nderte Transkriptmenge zeigten Die Gene wurden nach dem absteigenden FCA Wert geordnet FCA fold change absolute FCA Gen Name M gliche Funktion COG 11 9 pCM2_0036 conserved hypothetical protein similar to LSR2 protein V 2 9 7 pCM1_0013 hypothetical protein IV 2 7 9 pCM1_0004 parB hypothetical protein putative partitioning protein 11 1 7 4 pCM2_0064 hypothetical protein V 2 6 4 pCM2_0006 hypothetical protein V 2 4 6 CMM_0
308. obachtet wurde Die Analyse erfolgte mit Hilfe des Programms Improbizer lieferte jedoch keine konservierten Motive Deshalb wurden Ergebnisse 110 soweit m glich ausgehend von den E coli Sequenzen der Ribosomen Bindestelle und der 10 35 Region Shine amp Dalgarno 1974 Harley amp Reynolds 1987 diese Motive in den Promotorregionen der 48 analysierten Gene siehe Abschnitt 7 6 Tabelle 32 identifiziert und mit Hilfe des Programms Weblogo dargestellt Abbildung 33 Abbildung 33 Mit Hilfe des Programms Weblogo http weblogo berkeley edu ermittelte grafische H ufigkeit der vier Nukleotide in der Sequenz der Ribosomenbindestelle RBS und der 10 35 Region von 48 analysierten Genen Die Idealsequenz der RBS ist AGGAGGT Shine Dalgarno Sequenz Shine amp Dalgarno 1974 da die Anti Shine Dalgarno Sequenz am 3 Ende der 16S rRNA Sequenz von C michiganensis subsp michiganensis ACCTCCT betr gt Die E coli Sequenzen der 10 35 Region sind TATAAT und TTGAGA Harley amp Reynolds 1987 Je gr er ein Nukleotid dargestellt ist desto h ufiger kam es in den 48 Genregionen vor Die Idealsequenz der Ribosomen Bindestelle ist AGGAGGT ausgehend von der Anti Shine Dalgarno Sequenz der 16S rRNA von C michiganensis subsp michiganensis Die ersten vier Nukleotide der Idealsequenz waren in den 48 Genen zu etwa 70 95 konserviert An der 5 und 6 Position war die Base Guanin nur noch mit
309. ocotyl und Cotyledonen ber Nacht in 500 ul 10 mM K PO Puffer bei 26 C inkubiert Bei den mit Cmm102pDM302Ppat 1gfo Ergebnisse 69 infizierten Samen wurden der Suspension jeweils 50 ug ml Neomycin zugef gt Um eine m gliche Fremd Kontamination zu vermeiden wurden die Suspensionen auf f r C michiganensis subsp michiganensis spezifisches Minimalmedium oder auf TBY Agarplatten mit 50 ug ml Neomycin ausplattiert und drei bis f nf Tage bei 28 C inkubiert Bei den bakteriell infizierten Samen wurden die meisten Bakterien auf der Samenhille identifiziert aber auch im Pflanzenembryo wurden welche nachgewiesen Beim ffnen der Samenh lle k nnte es jedoch zu einer Kontamination des Embryos mit den Bakterien der Samenh lle gekommen sein Ein selbstst ndiges Eindringen der Bakterien in den Samen wurde somit in dieser Arbeit nicht nachgewiesen In weiteren Experimenten wurden die infizierten Samen die noch nicht gekeimt waren drei Wochen nach der Infektion mit 1 iger v v Natriumhypochlorit L sung sterilisiert Bakterien auf der Samenoberfl che werden damit abget tet sodass bei der Isolation des Embryos eine Kontamination mit den Bakterien der Samenh lle vermieden wird Dazu wurden je sechs der infizierten Samen pro Stamm verwendet Jeweils drei Samen wurden anschlie end intakt in 10 mM K PO Puffer inkubiert von drei weiteren wurde lediglich der Pflanzenembryo verwendet Die Suspensionen wurden wie oben beschrieben ausplattiert und die Pla
310. olase family 31 threonine synthase CMM_PS_01 acetyltransferase NAD P H steroid dehydrogenase isomerase conserved membrane protein sugar ABC transporter permease component hypothetical secreted protein ribonucleotide diphosphate reductase beta subunit conserved secreted protein two component system response regulator acetyltransferase GNAT family possibly involved in inositol metabolism acetyltransferase Zn dependent alcohol dehydrogenase L serine dehydratase iron ABC transporter permease component membrane protein capsular polysaccharide synthesis enzyme NAD dependent aldehyde dehydrogenase conserved secreted protein esterase hypothetical protein hypothetical protein beta glucosidase hypothetical secreted protein transcriptional regulator TetR family polyribonucleotide nucleotidyltransferase argininosuccinate synthase hypothetical protein MFS permease acetolactate synthase small regulatory subunit plasmid maintemance system killer protein acetyltransferase 192 Fortsetzung Tabelle 29 H here Transkriptmengen in XMM Medium AS als in XMM Medium IV 1 1 1 V 2 V 2 IV 3 V 2 IV 3 1 2 111 3 1 1 IV 6 V 2 V 2 1 1 111 3 1 2 V 2 V 2 V 1 11 2 V 2 VA V 1 1 4 IV 1 IV 1 IV 1 V 1 V 1 V 2 IV 3 1 1 1 2 V 2 V 1 1 4 V 2 IV 1 V 2 1 3 V 2 IV 3 V 1 1 1 V 1 VA 1 2 IV 1 V 2 11 2 V 1 V 2 V 1 V 2 V 2 1 1 V 2 IV 3 111 3 1 2 V 2 IV 1 1 2 11 1 V 1 Anhang 193 Forts
311. omponent membrane metalloendopeptidase subfamily M23B extracellular 5 nucleotidase conserved secreted protein extracellular nuclease phosphatase 3 isopropylmalate dehydrogenase extracellular serine protease D alanyl D alanine carboxypeptidase branched chain amino acid ABC transporter SBP Catalase elongation factor G EF G stress induced DNA binding protein hypothetical secreted protein superoxide dismutase ubiquinol cytochrome c reductase cytochrome c subunit beta N acetylglucosaminidase succinyl CoA ligase ADP forming subunit beta 50S ribosomal protein L21 iron siderophore ABC transporter SBP transketolase endo 1 4 beta xylanase A ATP synthase subunit alpha metallopeptidase family M20A inorganic pyrophosphatase conserved secreted protein polygalacturonase 1 1 V 2 IV 6 IV 1 IV 1 1 1 IV 6 IV 1 V 2 IV 1 IV 1 V 2 IV 6 V 2 IV 4 IV 1 V 2 IV 4 V 2 IV 1 1 1 111 3 IV 7 1 1 11 2 111 3 11 1 11 2 V 2 1 2 1 1 V 2 IV 3 IV 3 IV 1 IV 7 1 2 V 2 IV 6 1 2 IV 6 11 2 IV 1 IV 5 111 3 IV 5 V 2 IV 5 1 1 1 1 1 1 111 3 IV 1 1 1 IV 6 IV 1 IV 7 1 6 V 2 IV 6 N n OnE Noa NHHNH WAWAH NNMNNM NYO VYNNNANAH HH L a La oa a gt NY NWWHWHWON NNMNH HOW YH P 145 Anhang Fortsetzung Tabelle 19 extrazellul res Proteom von Cmm382 in M9 Medium 41 40 40 40 39 39 37 36 36 36 34 34 34 33 33 33 32 32 32 32 32 31 31 31 30 30 30 29 28
312. on DNA Ligationen von geschnittener Plasmid DNA und geschnittenem DNA Fragment 3 3 1 3 3 3 1 5 wurden unter Verwendung der T4 DNA Ligase NEB Schwalbach durchgef hrt 10 ul Ligations Ansatz x ul Plasmid DNA 50 100 ng x ul DNA Fragment 3 5 facher berschuss 1 ul T4 DNA Ligase Puffer NEB Schwalbach 0 5 ul T4 DNA Ligase NEB Schwalbach X Ul HeOpicest Die Menge an einzusetzendem DNA Fragment wurde aus dem Produkt der Uberschussmenge der Plasmidmenge und der Fragmentgr e in bp dividiert durch die Material und Methoden 34 Plasmidgr e in bp berechnet Die Inkubation erfolgte f r 1 h bei Raumtemperatur oder ber Nacht bei 16 C Es folgte die Transformation von kompetenten E coli DH5aMCR siehe Abschnitt 3 5 2 3 3 1 7 DNA Sequenzierung Sequenzierungsreaktionen wurden durch GATC Biotech Konstanz vorgenommen Dazu wurden 20 30 ul Plasmidl sung 30 100 ng ul sowie 20 ul Primer L sung 10 uM verschickt Alle Ergebnisse wurden mittels Clone Manager Software Sci Ed North Carolina USA ausgewertet 3 3 1 8 DNA Sondenherstellung und test Zur spezifischen Detektion von DNA Fragmenten in DNA Hybridisierungsexperimenten wurde zun chst eine DNA Sonde hergestellt Dazu wurde ein spezifisches 300 500 bp DNA Fragment mittels PCR amplifiziert siehe Abschnitt 3 3 1 3 gelelektrophoretisch aufgetrennt und aus dem Gel isoliert siehe Abschnitt 3 3 1 5 Die Menge des DNA Fragments wurde auf 1 ug in 16 ul H gt Op
313. onde_fw 58 ATCTTCAGCGACAGTCAAGG pat 1_sonde_rev 58 GGGCCCTAATACGACTCACTATAGGGCGCTACGACTTGG TGACTTC celA_sonde_fw 62 5 GCGCCGATCTTGCACCCGTC Material und Methoden Name T4 C 25 Sequenz celA_sonde_rev 62 5 GGGCCCTAATACGACTCACTATAGGGTGCAGGGACAGCC GGCATGGAGC CMM_2408_sonde_fw 61 GGATCGAGATGCTGCAGGAC CMM_2408_sonde_rev 61 GGGCCCTAATACGACTCACTATAGGGCGGCATGGAGCAG CTGATCG CMM_2766_sonde_fw 61 TCACCGACCTGCTCCAGATG CMM_2766_sonde_rev 61 GGGCCCTAATACGACTCACTATAGGGCACACCCGGTCGA GGATCTG pCM2_0056_Kpnl_fw 64 GGCCGGTACCTCCCGCCTGCAGCTGTCACG pCM2_0056_Kpnl_rev 64 GGCCGGTACCGGATGCCGCGGATCTCGTTG npt_Accl_fw 57 GGCCGTCGACCGATGGGAACCACGGAGAAG npt_Xbal_rev 57 CCGGICTAGAGCTCAGAAGAACTCGTCAAG gapA sonde fw 64 GCCGCTTCACGAAGGCGGAG gapA sonde rev 64 GGGCCCTAATACGACTCACTATAGGGGCGTTCGCCGAGG TCTCGATG 3 2 Nahrmedien Kultivierungs und Infektionsbedingungen 3 2 1 Nahrmedien fur E coli und C michiganensis subsp michiganensis Alle E coli St mme wurden standardm ig in LB Medium kultiviert alle C michiganensis subsp michiganensis Stamme in TBY Medium F r Letztere wurden au erdem folgende weitere Medien verwendet SB Medium Engemann 2006 Minimalmedium M9 Engemann 2006 XVM2 Wengelnik et al 1996 und Xylemsaft imitierendes Medium XMM Die Zusammensetzung der Medien ist in Tabelle 5 aufgelistet
314. oppcodons zu erkennen Bei einer hohen 5 Transkript Konzentration nahe des putativen Startcodons im offenen Leserahmen eines Gens bei der Sequenz ATG oder GTG k nnte es sich um ein weiteres oder das richtige Startcodon handeln Das Transkript w re demnach ein leaderless Transkript Eine hohe 5 Transkript Konzentration im offenen Leserahmen eines Gens k nnte auf einen zweiten Transkriptionsstart im Gen hinweisen Wird eine hohe 5 Transkript Konzentration festgestellt ohne dass in der n heren Umgebung der Sequenz lt 150 200 Nukleotide ein Gen lokalisiert ist k nnte es sich um ein nicht annotiertes Gen handeln zum Beispiel f r die 400 Nukleotide stromaufw rts von CMM_1550 Tabelle 17 Neben den in Tabelle 17 aufgelisteten 27 Genen wurden weitere 58 Gene analysiert Mit Hilfe einer manuellen Analyse wurden f r 8 5 der Gene im Genom von Cmm382 ein Anstieg der read Zahlen mit dem Erreichen des Startcodons festgestellt und f r 8 5 der Gene ein Anstieg der read Zahlen im offenen Leserahmen eines Gens siehe Abschnitt 7 6 Tabelle 33 und Tabelle 34 Im Durchschnitt lagen die Transkriptionsstartpunkte der 85 analysierten Gene von pCM1 pCM2 und des Chromosoms zwischen 20 und 80 Nukleotide stromaufwarts des nachfolgenden Gens Um m gliche konservierte Sequenzen in der 5 Region der Gene zu identifizieren wurden jeweils 53 Nukleotide stromaufw rts der Gene analysiert in deren N he in VAMP 1 7 5 eine hohe read Zahl be
315. or et al 2012 Die Bakteriendichte in XMM Medium war mit 4 5 x 10 cfu ml etwa halb so gro Die Ergebnisse lassen vermuten dass die Bedingungen in XMM Medium nicht v llig identisch mit den Bedingungen im Xylemsaft acht Tage nach der Infektion waren Das XMM Medium k nnte somit ein anderes vermutlich fr heres Stadium der Infektion repr sentieren in dem andere und noch nicht so viele extrazellul re Proteine eine Rolle spielen Diese Vermutung wurde in den nachfolgenden Analysen des Transkriptoms untersucht 5 4 Das Transkriptom von Cmm382 in unterschiedlichen Medien Neben der Analyse des Proteoms wurde in dieser Arbeit auch eine Analyse des Transkriptoms von Cmm382 durchgef hrt um Unterschiede in der Transkriptmenge in verschiedenen Medien feststellen zu k nnen siehe Abschnitt 4 4 3 Dabei wurde die Genexpression von 3 107 Genen in XMM Medium und M9 Medium verglichen Von den 426 Genen die in XMM Medium eine ver nderte Transkriptmenge zeigten waren 31 potentiell relevant in der phytopathogenen Interaktion COG Gruppe IV Fl gel et al 2012 Zu dieser Diskussion 122 Gruppe z hlen beispielsweise Gene die f r Transporter Regulatoren und extrazellulare Enzyme kodieren In XMM Medium waren vor allem die Transkriptmengen von Transportern h her als in M9 Medium die von Regulatoren niedriger Lediglich f r vier der 46 Gene im Genom von C michiganensis subsp michiganensis die f r extrazellul re Proteine kodieren
316. osomal protein S13 trigger factor TF prolyl isomerase chaperone 50S ribosomal protein L1 oxidoreductase serine hydroxymethyltransferase NAD dependent aldehyde dehydrogenase glycine betaine aldehyde dehydrogenase UTP glucose 1 phosphate uridylyltransferase ATP synthase F ATPase subunit alpha monooxygenase 50S ribosomal protein L2 sugar ABC transporter substrate binding protein transcriptional regulator histone like protein argininosuccinate synthase citrulline aspartate ligase phosphohexomutase pyrazinamidase nicotinamidase hypothetical protein 30S ribosomal protein S15 transcription antitermination protein conserved hypothetical protein methionyl tRNA synthetase 50S ribosomal protein L14 phosphoglucomutase 30S ribosomal protein S12 30S ribosomal protein S10 branched chain amino acid aminotransferase superoxide dismutase alpha glucoside ABC transporter SBP conserved hypothetical protein L ribulose 5 phosphate 4 epimerase 30S ribosomal protein S6 50S ribosomal protein L18 glutamyl tRNA GIn amidotransferase subunit C single stranded DNA binding protein carbonic anhydrase iron dependent repressor Dtx family dTDP glucose 4 6 dehydratase DNA directed RNA polymerase subunit beta alkyl hydroperoxide reductase putative phospholipid binding protein S adenosylmethionine synthetase 50S ribosomal protein L20 acetate kinase 50S ribosomal protein L25 nucleoside diphosphate sugar epimerase arginyl tRNA sy
317. otein aspartate aminotransferase hypothetical protein alpha glucosidase glycosyl hydrolase family 13 menaquinone biosynthesis methyltransferase isochorismate synthase hypothetical membrane protein conserved membrane protein conserved membrane protein putative protein S isoprenylcysteine methyltransferase conserved hypothetical protein putative nuclease hypothetical protein conserved hypothetical protein putative RNA binding regulator conserved hypothetical protein oxidoreductase hypothetical protein conserved secreted protein iron siderophore ABC transporter permease component 2 keto acid dehydrogenase E1 beta component histidinol phosphate aminotransferase 2 conserved membrane protein glycosyltransferase peptide chain release factor 3 RNA nucleotidyltransferase conserved secreted protein hypothetical protein 1 2 V 2 IV 3 IV 3 1 1 V 1 V 2 V 2 1 1 1 1 IV 1 V 2 1 3 V 2 V 2 V 2 IV 3 V 2 V 2 V 2 1 2 V 2 1 1 1 5 1 5 V 2 V 2 V 2 V 2 V 2 V 2 V 2 V 1 V 2 V 2 IV 1 1 1 1 2 V 2 1 2 111 3 111 3 V 2 V 2 205 Tabelle 34 Mittels manueller Analyse identifizierte Transkripte die hohe interne reads im offenen Leserahmen der Gene im Genom von Cmm332 zeigten Aufgelistet sind die Gene bei denen mittels RNA Sequenzierung hohe read Zahlen im offenen Leserahmen identifiziert wurden Die entsprechende COG Gruppen Zuordnung ist ebenfalls aufgelistet Gen Mogliche Funktion COG CMM_
318. otein conserved hypothetical protein putative nuclease conserved hypothetical protein hypothetical protein protease II oligopeptidase B glutathione S transferase putative nucleoside diphosphate sugar epimerase MFS permease CynX family conserved hypothetical protein tRNA pseudouridine synthase B A G specific adenine glycosylase prolyl tRNA synthetase 4 hydroxy 3 methylbut 2 en 1 yl diphosphate synthase Zn metalloprotease family M50 conserved hypothetical protein copper resistance protein phosphatase conserved hypothetical protein GTP binding protein obg family conserved membrane protein pyrophosphatase transcriptional regulator MarR family ABC transporter duplicated ATPase hypothetical protein conserved hypothetical protein putative phosphomutase lyase hypothetical membrane protein 4 diphosphocytidyl 2 C methyl D erythritol kinase DNase NAD P H oxidoreductase dolichyl phosphate mannose protein mannosyltransferase O acetylhomoserine thiol lyase L serine dehydratase MFS permease aldo keto reductase conserved hypothetical protein UTP glucose 1 phosphate uridylyltransferase 5 formyltetrahydrofolate cyclo ligase transcriptional regulator Cro Cl family nucleotidyltransferase IV 4 1 2 IV 5 1 1 1 2 V 2 1 2 11 1 V 2 V 2 V 2 V 2 V 2 1 1 1 4 1 3 IV 1 1 2 111 3 111 3 1 2 1 2 IV 7 1 1 V 1 V 1 V 2 V 2 V 2 V 2 V 2 IV 7 IV 5 1 3 IV 1 V 2 111 3 111 1 111 3 1 4 IV 7 V 2 IV 5
319. otorregionen nicht konserviert war Im Gegensatz dazu waren etwa 50 der 10 Region und der Shine Dalgarno Sequenz konserviert Diskussion 112 5 Diskussion Das Gram positive Bakterium C michiganensis subsp michiganensis l st in seiner Wirts pflanze S lycopersicum Tomate Krankheitssymptome aus und richtet damit gro e landwirt schaftliche Sch den an Ein besseres Verst ndnis ber den Ablauf der Infektion und ber bakterielle Virulenzfaktoren die an der Wirt Pathogen Interaktion beteiligt sind w re von generellem Interesse und w rde dar ber hinaus helfen die Ausbreitung des Bakteriums einzuschr nken In dieser Arbeit wurde deshalb eine molekularbiologische und biochemische Analyse des Bakteriums durchgef hrt Dabei wurde zum einen die Interaktion des Bakteriums mit Tomatenpflanzen und der Nicht Wirts Pflanze Nicotiana Tabak analysiert Zum anderen wurde ein synthetisches Xylemsaft imitierendes Medium etabliert Darin wurde die Transkription und Translation von Virulenzfaktoren die bei der Interaktion eine Rolle spielen k nnten analysiert Zus tzlich wurde die zugrunde liegende Regulation n her betrachtet Ein weiterer wichtiger Teil dieser Arbeit besch ftigte sich mit der Analyse von Promotorregionen ber die in C michiganensis subsp michiganensis bis jetzt nur sehr wenig bekannt ist 5 1 Interaktion von Nicht Wirts und Wirts Pflanze mit C michiganensis subsp michiganensis 5 1 1 Interaktion mit der Nicht Wirts
320. otransferase cysteine peptidase family C56 hypothetical protein stress induced DNA binding protein membrane protein conserved hypothetical protein metallopeptidase M16 family 6 phosphofructokinase proline glycine betaine choline ABC transporter SBP thioredoxin reductase transcriptional regulator Cro Cl family transcriptional regulator TetR family putative two component system response regulator hypothetical membrane protein cystathionine beta synthase conserved hypothetical protein hypothetical protein NTP pyrophosphohydrolase glutamine synthetase Il two component system sensor kinase membrane protein hypothetical secreted protein hypothetical protein hypothetical protein short chain dehydrogenase oxidoreductase conserved secreted protein putative esterase lipase alpha beta hydrolase family hypothetical membrane protein N acetylglucosamine 6 phosphate deacetylase putative Fe S cluster assembly protein ABC transporter conserved hypothetical protein putative phosphohydrolase oligopeptide ABC transporter ATPase membrane protein fructose 1 6 bisphosphatase carboxylesterase type B hypothetical membrane protein cell division membrane protein conserved hypothetical protein pyridoxamine phosphate oxidase undecaprenyl phosphate glycosyl 1 phosphate transferase conserved hypothetical protein para aminobenzoate synthetase component Il conserved membrane protein hypothetical membrane protein carboxymet
321. phosphohydrolase 11 1 CMM_0286 transcriptional regulator TetR family IV 3 CMM_0321 oxidoreductase V1 CMM_0381 phnF transcriptional regulator GntR family IV 3 CMM_0384 transcriptional regulator Cro Cl family IV 3 CMM_0405 two component system sensor kinase IV 3 CMM_0413 hypothetical protein V 2 CMM_0414 transcriptional regulator MarR family IV 3 CMM_0435 fepB iron siderophore ABC transporter substrate binding protein IV 1 CMM_0439 padA phenolic acid decarboxylase IV 5 CMM_0468 membrane protein V 2 CMM_0475 xthB exonuclease III 11 1 CMM_0485 cpdA 3 5 cyclic nucleotide phosphodiesterase IV 3 Anhang Fortsetzung Tabelle 33 leaderless Transkripte der Gene im Genom von Cmm382 CMM_0487 CMM_0491 CMM_0499 CMM_0506 CMM_0507 p A CMM_0508 CMM_0513 pgmA CMM_0514 pheA CMM_0515 serS CMM_0530 CMM_0544 proC CMM_0551 CMM_0561 aspS CMM_0566 CMM_0568 CMM_0574 CMM_0586 hemA CMM_0601 hemO CMM_0604 pfkA CMM_0607 CMM_0609 CMM_0646 CMM_0647 CMM_0656 CMM_0659 addB CMM_0688 CMM_0694 CMM_0701 CMM_0709 CMM_0736 furA CMM_0741 CMM_0758 purM CMM_0761 CMM_0765 CMM_0767 CMM_0811 CMM_0817 pipB CMM_0828 CMM_0856 CMM_0894 CMM_0895 ptaA CMM_0904 mgo CMM_0905 CMM_0913 CMM_0915 pbpC CMM_0919 pbpD CMM_0950 CMM_0974 manC CMM_0989 punA CMM_0990 IpdA CMM_0991 accA CMM_1001 CMM_1011 wcgC CMM_1012 rmIC CMM_1032 CMM_1043 CMM_1048 CMM_1059 CMM_1064 CMM_1067 ansP CMM_1074
322. plasmidfreie Stamm Cmm100 Abbildung 3 Cmm100 kann das Xylem kolonisieren l st jedoch keine Krankheitssymptome aus Cmm101 und Cmm102 verursachen geringere Krankheitssymptome als der Wildtypstamm Cmm382 Meletzus et al 1993 Gartemann et al 2003 Die Gene auf dem Chromosom sind offensichtlich entscheidend f r die Kolonisierung des Wirts die Gene auf den Plasmiden sind in der Virulenzausbildung des Bakteriums involviert Meletzus et al 1993 Dabei ist jedoch ebenfalls das Zusammenspiel von Genen auf dem Chromosom und den Plasmiden wichtig Eichenlaub amp Gartemann 2011 Auf dem Chromosom liegen 20 Regionen mit einem niedrigeren G C Gehalt die zum Teil Virulenzgene enthalten Gartemann et al 2008 46 Gene sind als extrazellul re Proteine annotiert Fl gel et al 2012 von denen die meisten f r putative Serinproteasen kodieren Sekretionssysteme wie sie in Gram negativen Bakterien vorkommen gibt es in Gram positiven Bakterien nicht Transportproteine k nnten jedoch eine hnliche Funktion bernehmen Daf r spricht dass im Genom von C michiganensis subsp michiganensis Gene vorhanden sind deren Genprodukte an der Erkennung von Signalsequenzen extrazellul rer Proteine beteiligt sein k nnten Gartemann et al 2008 2 4 1 Infektion von Tomatenpflanzen C michiganensis subsp michiganensis gelangt ber Wunden in den Wurzeln oder im St ngel oder ber nat rliche ffnungen wie Hydathoden in seine landwirtschaftlic
323. pper binding protein IV 5 Tabelle 26 Mittels Microarray Experiment ermittelte C michiganensis subsp michiganensis Gene deren Transkriptmengen in XMM Medium im Vergleich mit TBY Medium erniedrigt waren 267 Gene wurden identifiziert von denen 115 eine 2 oder mehrfach ver nderte Transkriptmenge zeigten Die Gene wurden nach dem absteigenden FCA Wert geordnet FCA fold change absolute SBP substrate binding protein FCA Gen Name M gliche Funktion COG 19 4 CMM _0616 conserved secreted protein V 2 15 0 CMM _0022 conserved membrane protein V 2 14 9 CMM 2878 citrate transporter CitMHS family IV 1 10 6 CMM_0617 putative copper resistance protein IV 5 9 5 CMM _1081 hypothetical secreted protein V 2 9 2 CMM_0023 two component system response regulator IV 3 8 0 CMM_2898 aldA L alanine dehydrogenase 1 2 7 3 CMM_0671 conserved membrane protein V 2 6 6 CMM_2699 sugar ABC transporter substrate binding protein IV 1 6 5 CMM_1078 transcriptional regulator TetR family IV 3 Anhang 173 Fortsetzung Tabelle 26 Niedrigere Transkriptmengen in XMM Medium als in TBY Medium 5 6 5 5 5 0 4 9 4 5 4 3 4 1 4 0 4 0 3 8 3 6 3 6 3 5 3 5 3 5 3 4 3 2 3 1 3 1 3 1 3 0 3 0 2 9 2 9 2 9 2 9 2 8 2 8 2 8 2 8 2 7 2 7 2 7 2 7 2 7 2 6 2 6 2 6 2 6 2 5 2 5 2 5 2 5 2 5 2 4 2 4 2 4 2 4 2 4 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 CMM_2543 ddah CMM_1079 CMM_0709 CMM _1701 CMM 1
324. protein conserved hypothetical protein glycosidase extracellular serine protease Zn dependent oxidoreductase pectate lyase acetyltransferase GNAT family NAD dependent epimerase transcriptional regulator TetR family amino acid permease APC family phosphoglucomutase 2 5 diketo D gluconic acid reductase methylase hypothetical secreted protein V 2 V 2 1 4 V 2 V 2 V 2 V 2 IV 1 IV 1 1 1 IV 1 IV 3 1 4 V 1 IV 1 V 2 V 2 1 1 V 2 V 2 11 2 V 2 V 2 V 2 V 2 V 2 IV 1 11 2 V 2 V 2 IV 1 1 2 V 2 V 1 1 5 V 1 IV 3 V 2 1 1 V 2 V 2 IV 1 111 3 V 2 IV 1 V 1 V 2 V 1 1 2 V 2 IV 1 V 2 1 1 IV 6 VA IV 6 VA 1 1 IV 3 IV 1 1 1 1 1 V 1 V 2 Anhang 172 Fortsetzung Tabelle 25 H here Transkriptmengen in XMM Medium als in TBY Medium 1 5 CMM_1944 hypothetical membrane protein V 2 1 5 CMM_1239 multidrug ABC transporter ATPase IV 1 1 5 CMM_2681 conserved hypothetical protein putative hydrolase v 2 1 5 CMM_2405 sdaA L serine dehydratase 1 2 1 5 CMM_1134 arginase 1 2 1 5 CMM_0114 conserved hypothetical protein V 2 1 5 CMM _1837 gerB menaquinol cytochrome C reductase cytochrome B subunit 1 1 1 5 CMM_0679 acetyltransferase V1 1 5 CMM_2848 short chain dehydrogenase oxidoreductase V1 1 5 CMM_1222 hydrolase V 1 1 5 CMM_0693 hypothetical secreted protein v 2 1 5 CMM_0783 transcriptional regulator Cro CI family IV 3 1 5 CMM_0899 conserved membrane protein v 2 1 5 CMM_2095B hypothetical protein V 2 1 5 CM
325. protein tryptophan synthase alpha chain hypothetical protein membrane protein conserved hypothetical protein undecaprenyl phosphate alpha N acetylglucosa minyltransferase NAD P H oxidoreductase hypothetical secreted protein transcriptional regulator MarR family ABC transporter fused permease and ATPase domains exodeoxyribonuclease VII large subunit glycosyltransferase glycosyltransferase conserved membrane protein putative copper export protein DNA polymerase III beta chain putative hydrolase HAD family cold shock protein transcriptional regulator Lacl family transcriptional regulator TetR family anthranilate synthase component IV 3 V 2 1 2 IV 4 V 2 V 2 111 2 IV 5 IV 1 V 2 111 2 V 2 111 3 111 3 V 2 111 3 IV 3 111 1 V 2 1 2 V 2 1 1 IV 5 V 2 111 3 111 1 V 2 V 2 U4 IV 1 111 1 IV 3 V 1 V 2 11 2 111 3 111 3 1 4 111 3 IV 2 IV 1 111 3 V 2 1 2 V 2 V 2 V 2 11 2 V 1 V 2 IV 3 IV 1 111 1 11 2 11 2 IV 1 I 1 V 2 IV 4 IV 3 IV 3 1 2 rn nny ey ss eye Eu Eu Eu aT aS eS wee eS SS SSS EB i Bi Eu Eu Eu Eu Eu CIDAVAIAIAIADAIAIAIADI9AIAIAIAIAIADIDAIADAWAAADAAA AD NN NN NNNNNNNNNNNNNNNNN GOOO MOO 0 00 OO amp 00 0 CMM_1465 clpP2 CMM_1648 CMM_1900 CMM_1181 CMM_0561 aspS CMM_2243 CMM_ 0965 trpS CMM_1793 efpA CMM_2440 CMM_2319 CMM_2937 rpmB CMM_0607 CMM_1310 ftsX CMM_2938 furB CMM_0782 CMM_1464 cipP7 CMM
326. protein putative hydrolase esterase lipase glucose 1 phosphate thymidylyltransferase conserved membrane protein transcriptional regulator TetR family hypothetical protein phosphoribosylaminoimidazole carboxylase ATPase subunit cytosine specific DNA methylase protoporphyrinogen oxidase conserved hypothetical protein exonuclease VII small subunit conserved membrane protein TerC family peptidyl prolyl cis trans isomerase conserved hypothetical protein phosphotransferase system mannitol fructose specific IIA domain ATPase non ribosomal peptide synthase ornithine carbamoyltransferase ribose phosphate pyrophosphokinase hypothetical protein dihydrolipoamide dehydrogenase membrane protein UDP N acetylmuramoylalany D glutamate 2 6 diaminopimelate ligase chromosome partitioning protein alpha mannosidase phosphoribosylformylglycinamidine synthase II conserved hypothetical protein serine acetyltransferase L ribulose 5 phosphate 4 epimerase sugar ABC transporter permease component methylase hydrolase metallo beta lactamase superfamily lysyl tRNA synthetase hypothetical protein imidazole glycerol phosphate synthase subunit conjugal transfer protein Dtr system ubiquinol cytochrome c reductase cytochrome c subunit rRNA methyltransferase hypothetical protein 16S rRNA 7 methylguanosine methyltransferase permease conserved hypothetical protein fructose 1 6 bisphosphatase GTP binding protein era family metal ABC
327. r RRF ribosome releasing factor conserved hypothetical protein putative AAA ATPase serine threonine protein kinase eukaryotic type ATP dependent DNA helicase UDP N acetyImuramoylalanyl D glutamate 2 6 diamino pimelate ligase conserved hypothetical protein conserved hypothetical protein hypothetical protein sugar alcohol dehydrogenase phosphomannomutase conserved secreted protein phosphoribosylformimino 5 aminoimidazole carboxamide riboucleotide isomerase hypothetical protein conserved hypothetical protein putative ATPase RNA nucleotidyltransferase acetyltransferase glycosyltransferase conserved hypothetical protein conserved hypothetical protein UDP glucose 4 epimerase hypothetical membrane protein Na H antiporter aspartyl tRNA synthetase ABC transporter fused permease and ATPase domains xanthine uracil family permease NCS2 family DNA glycosylase putative RNA binding regulator RNA polymerase sigma factor histidyl tRNA synthetase conserved hypothetical protein putative nuclease geranylgeranyl pyrophosphate synthase transcriptional regulator RpiR family conserved membrane protein TerC family 3 dehydroquinate synthase hypothetical secreted protein conserved hypothetical protein NTP pyrophosphohydrolase conserved secreted protein hypothetical protein hypothetical secreted protein conserved hypothetical protein putative helicase conserved membrane protein SAM dependent methyltransferase
328. r die Isolierung putativer Regulatorproteine aus dem Zellextrakt von C michiganensis subsp michiganensis wurden Strep Tactin gekoppelte magnetic beads MagStrep type2 beads IBA GmbH G ttingen verwendet Die Durchf hrung erfolgte in Anlehnung an das Protokoll von Amon und Kollegen Amon et al 2008 Die beads aus 2 x 70 ul magnetic beads L sung wurden am Magneten Invitrogen GmbH Karlsruhe gesammelt und je zwei Mal in 500 ul 1 x PBS 0 1 w v BSA und 2 x DNA Bindepuffer gewaschen 7 ug gereinigtes PCR Produkt siehe Abschnitt 3 3 1 3 und 3 3 1 5 welches zuvor mittels biotinylierter Oligonukleotide Tabelle 4 markiert wurde wurde zugef gt und die Suspension wurde f r 30 min bei Raumtemperatur und 300 rpm TS 100 Thermoshaker peqlab Biotechnologie GmbH Erlangen inkubiert Zur Bindung des Proteinextrakts wurden die Bakterien wie in Abschnitt 3 2 3 beschrieben kultiviert und anschlie end zentrifugiert 5 500 xg 20 min 4 C Nachdem das Pellet in 4 ml Lyse Puffer resuspendiert wurde Material und Methoden 47 folgen zwei Zellaufschlussschritte mittels Homogenisator Precellys 24 peqlab Biotechnologie GmbH Erlangen f r je 30 Sekunden bei 6 5 m s Nach einem Zentrifugationsschritt 13 000 x g 5 10 min 4 C wurde der berstand in 1 5 ml Portionen zu den magnetic beads gegeben Es folgte eine Inkubation f r je 45 min bei 4 C und 300 rpm TS 100 Thermoshaker peglab Biotechnologie GmbH Erlangen Um unspezifische Proteine
329. ranscription repair coupling factor putative sugar phosphate isomerase epimerase 1 4 IV 1 1 1 11 2 111 3 IV 6 111 1 1 3 IV 3 V 1 V 2 IV 1 1 1 IV 1 111 3 IV 1 IV 4 V 2 V 2 IV 1 111 3 V 2 IV 1 1 1 1 1 111 3 1 1 1 5 IV 1 1 1 V 2 IV 4 V 2 111 1 IV 1 V 2 V 2 IV 3 V 1 111 2 V 2 IV 7 1 4 IV 3 111 1 11 1 V 2 V 2 IV 3 V 2 V 1 IV 5 V 2 IV 1 V 2 V 2 V 1 11 2 11 2 V 1 IV 1 1 1 11 2 V 2 184 Anhang Fortsetzung Tabelle 28 Niedrigere Transkriptmengen in M9 Medium als in TBY Medium 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 _ anna xo to to to to to 0000 CMM_0969 sdhB CMM_0420 CMM_2417 CMM_2356 CMM_0689 purA CMM_2519 galk CMM_1407 gatC CMM_0555 CMM_2833 CMM_2308 CMM_2188 CMM_0794 CMM_1911 CMM_0102 bg H CMM_2441 CMM_0248 CMM_1218 CMM_2223 CMM_1385 pyrH CMM_2977 rnpA CMM_0457 CMM_2663 CMM_2867 CMM_1590 CMM_1692 CMM_2310 CMM_0322 CMM_0007 gyrA CMM_2956 CMM_0619 putA CMM_2518 galT CMM_2548 sucC CMM_2698 CMM_1027 manA CMM_1487 CMM_0002 dnaN CMM_1874 aroG CMM_0362 CMM_0877 araD CMM_PS_20 CMM_1157 prfA CMM _0040 CMM _0088 bg A CMM_0961 ribAB CMM 2797 agIC CMM _1654 CMM_0066 parX CMM_0337 CMM_
330. rbamate AQC Cohen amp Michaud 1993 derivatisiert Anschlie end wurden davon 10 ul mittels Reversed Phase Chromatographie Dionex Summit P680 HPLC Idstein analysiert wobei Material und Methoden 45 der Fluoreszenz Detektor RF2000 Dionex Idstein wie von Hofmann und Kollegen beschrieben verwendet wurde Hofmann et al 2011 Die Konzentrationen von Glucose Fructose und Saccharose wurden aus dem ethanolischen Extrakt enzymatisch mittels gekoppeltem optischen Test bei 340 nm ermittelt nach Stitt et al 1989 Dabei wurde die Messung von 200ul Gesamtvolumen im Mikrotiterplatten Reader BioTek http www biotek com durchgef hrt 3 4 4 Proteinisolierung aus C michiganensis subsp michiganensis F r die Isolierung von Oberfl chenproteinen sowie extrazellul ren und zytoplasmatischen Proteinen aus C michiganensis subsp michiganensis wurden die Protokolle von Hansmeier und Kollegen sowie Watt und Kollegen in leicht abgewandelter Form verwendet Watt et al 2005 Hansmeier et al 2006a Hansmeier et al 2006b Die F llung mit Trichloressigs ure trichloroacetic acid TCA wurde nach Savidor und Kollegen Lochner und Kollegen sowie A K hn Georg August Universit t G ttingen m ndliche Mitteilung 2012 durchgef hrt Lochner et al 2011 Savidor et al 2012 3 4 4 1 Isolierung der Oberfl chenproteine F r die Isolierung von Oberflachenproteinen wurden die Bakterien wie in Abschnitt 3 2 3 beschrieben kultiviert und an
331. rbeit wurden mit Hilfe von Bindungsexperimenten m gliche Transkriptionsfaktoren dieser beiden Gene identifiziert und drei ausgew hlte Kandidaten analysiert 4 5 1 Charakterisierung von Regulatoren f r pat 7 und celA F r die Identifizierung m glicher Transkriptionsfaktoren von ce A und pat T wurden Bindungsexperimente durchgef hrt Dabei wurden 500 bp Fragmente der 5 Regionen beider Gene mit Biotin markiert und ber die Strep Tactin Biotin Interaktion an magnetic beads gekoppelt Der Proteinextrakt aus einer Cmm382 Kultur wurde anschlie end zu den magnetic beads gegeben und die spezifisch an die Promotorregionen gebundenen Proteine wurden mittels NaCl Gradienten eluiert Die Bakterien wurden in M9 XMM und XVM2 Medium Wengelnik et al 1996 kultiviert um auch Transkriptionsregulatoren zu erhalten die nur medienabh ngig aktiv sind Die Proteine der neun Elutionsfraktionen wurden mittels SDS PAGE aufgetrennt In Abbildung 24 wurden jeweils die neun Elutionsfraktionen der Proteine auf SDS Gelen aufgetrennt die an die Promotorregion von pat 1 gebunden hatten Das Bandenmuster nach der Bindung an die Promotorregion von ce A war vergleichbar Daten nicht gezeigt Auf den SDS Gelen wurden zahlreiche Proteinfragmente eluiert die spezifisch Ergebnisse 95 an die Promotorregionen gebunden hatten Bei AmtR Bindungsexperimenten mit dem Proteinextrakt aus C glutamicum waren im Gegensatz dazu jeweils nur etwa drei Proteinbanden auf den Gelen
332. ren 10 18 IV 4 Stress 2 5 IV 5 Resistenz 6 2 IV 6 Extrazellulare Enzyme 3 1 IV 7 Intrazellul re Proteasen 2 0 V Unzureichend charakterisiert 92 59 Ergebnisse 87 COG A Gruppe Kategorie 247 179 V 1 Allgemeine Funktion vorhersagbar 22 9 V 2 Unbekannte Funktion 70 50 Die prozentuale Zuordnung der Transkripte zu den COG Gruppen ist in Abbildung 20 graphisch dargestellt Eine Auswahl dieser Gene ist in Tabelle 14 aufgelistet Eine Liste aller Gene die eine veranderte Transkriptmenge zeigten befindet sich im Anhang Tabelle 23 und Tabelle 24 H hereTranskriptmenge NiedrigereTranskriptmenge 247 179 E Metabolismus 24 E i Zellul re Prozesse E Ill Informationsspeicherung und prozessierung 4 E IV Potentiell relevant in der phytopathogenen Interaktion 16 E V Unzureichend charakterisiert 23 37 2 1 37 23 7 3 2 5 2 0 COG Gruppe IV z 12 E Transporter E Proteintransport E Regulatoren E Stress Resistenz Extrazellulare Enzyme Intrazellulare Proteasen 11 1 7 74 43 Abbildung 20 Prozentuale Zuordnung der Gene aus Tabelle 13 zu den COG Gruppen Verglichen wurden die Transkriptmengen der Gene von Cmm382 in XMM und M9 Medium Die Transkriptmengen von 247 Genen waren in XMM Medium h her als in M9 Medium die von 179 Genen war niedriger Dargestellt sind die COG Hauptgruppen sowie die COG Gruppe IV 66 der Gene die i
333. rgo L E A Van Sluys M A Kitajima J P Truffi D do Amaral A M Harakava R de Oliveira J C F Wood D de Oliveira M C Miyaki C Takita M A da Silva A C R Furlan L R Carraro D M Camarotte G Almeida N F Carrer H Coutinho L L El Dorry H A Ferro M I T Gagliardi P R Giglioti E Goldman M H S Goldman G H Kimura E T Ferro E S Kuramae E E Lemos E G M Lemos M V F Mauro S M Z Machado M A Marino C L Menck C F Nunes L R Oliveira R C Pereira G G Siqueira W de Souza A A Tsai S M Zanca A S Simpson A J G Brumbley S M and Set bal J C 2004 The genome sequence of the gram positive sugarcane pathogen Leifsonia xyli subsp xyli Mol Plant Microbe Interact 17 8 827 836 Morel J B and Dangl J L 1997 The hypersensitive response and the induction of cell death in plants Cell Death Differ 4 8 671 683 Moreno Paz M and Parro V 2006 Amplification of low quantity bacterial RNA for microarray studies time course analysis of Leptospirillum ferrooxidans under nitrogen fixing conditions Environ Microbiol 8 6 1064 1073 Morohashi Y 2002 Peroxidase activity develops in the micropylar endosperm of tomato seeds prior to radicle protrusion J Exp Bot 53 374 1643 1650 Mullis K Faloona F Scharf S Saiki R Horn G and Erlich H 1986 Specific enzymatic amplification of DNA i
334. rigere Transkriptmengen in M9 Medium als in TBY Medium IV 1 V 1 V 2 1 4 V 2 V 2 V 2 V 2 1 2 1 1 IV 2 IV 3 IV 1 V 1 V 2 11 1 V 2 IV 1 1 2 V 1 11 2 V 1 111 1 IV 3 IV 3 1 1 1 2 111 1 IV 7 1 1 1 3 1 5 V 1 111 3 IV 1 1 1 V 1 1 4 1 6 V 1 IV 3 V 2 111 1 11 2 IV 7 IV 3 V 2 V 2 V 2 IV 1 V 2 1 1 111 1 1 1 V 1 1 1 IV 1 V 2 1 2 1 2 IV 3 Anhang 189 Fortsetzung Tabelle 28 Niedrigere Transkriptmengen in M9 Medium als in TBY Medium 1 2 CMM_1640 pknD serine threonine protein kinase IV 3 1 2 CMM_1361 smcA chromosome segregation ATPase 11 1 1 2 CMM_0515 serS seryl tRNA synthetase 111 3 1 2 CMM_2272 gndA2 6 phosphogluconate dehydrogenase decarboxylating 1 1 1 2 CMM_0079 conserved hypothetical protein putative sulfurtransferase V 2 1 1 CMM_0920 conserved hypothetical protein V 2 1 1 CMM_1578 recO DNA repair protein recombination protein U4 1 1 CMM_2799 suhB inositol 1 monophosphatase 1 1 1 1 CMM_ 2226 fbaA fructose bisphosphate aldolase 1 1 1 1 CMM_0290 sigL RNA polymerase sigma factor ECF subfamily IV 3 1 1 CMM_0260 crcB2 membrane protein involved in chromosome condensation 11 1 1 1 CMM 1751 coaE dephospho CoA kinase 1 5 1 1 CMM_1098 membrane protein V 2 Tabelle 29 Mittels Microarray Experiment ermittelte C michiganensis subsp michiganensis Gene deren Transkriptmengen in XMM Medium 20 uM Acetosyringon AS im Vergleich mit XMM Medium erhoht waren 270 Gene wurden i
335. rigere Transkriptmengen in M9 Medium als in TBY Medium V 1 1 2 11 2 111 3 111 3 IV 1 111 3 IV 3 IV 7 1 3 1 1 IV 1 1 2 V 2 1 1 V 2 1 3 1 3 IV 3 IV 3 1 3 V 2 V 1 V 2 IV 1 IV 3 IV 2 1 5 IV 6 V 2 IV 3 IV 1 IV 1 V 2 V 2 1 5 11 2 1 1 V 2 1 2 Ul 1 IV 7 V 2 V 1 V 2 1 3 V 1 111 3 IV 3 11 2 IV 1 11 1 111 1 IV 7 V 2 IV 3 11 2 111 3 V 1 111 3 1 1 V 2 IV 1 1 2 IV 1 Se ed ed ee eS ed ed od ed much ed ed ed oe ed ed ed ed much Fun much oe ed es oe ees ee lee es le PHRHBHRHRHEHPHHHPHLHSOTOATAHAAGHAaAananannanannagnananaanan nan inaanganD 9 ADADADAAD DD AAAGD od Anhang CMM_0180 CMM_1386 frrA CMM_0308 CMM_1873 pknE CMM_2052 CMM_1864 murE CMM_1496 CMM_2203 CMM_0472 CMM_2110 CMM_0988 manB CMM_2491 CMM_2014 hisA CMM_2821 CMM_0672 CMM_2964 pcnA CMM_0305 CMM_1030 wcqgR CMM_2635 CMM_2013 CMM_1909 cpsY CMM_1992 CMM_0069 nhaA7 CMM_0561 aspS CMM_0869 CMM_2822 CMM_1460 mutM CMM_2874 CMM_1646 sigA CMM_2264 hisS CMM_2078 CMM_2888 crtE CMM_2189 CMM_2768 CMM_1796 aroB CMM_1803 CMM_2329 CMM_1199 CMM_0511 CMM_2883 CMM_0909 CMM_2451 CMM_1213 CMM_2338 CMM_2151 nusA CMM_2034 CMM_0198 CMM_0380 phnG CMM_1566 CMM_2173 fdxB CMM_1682 gIpQ2 CMM_2075 CMM_0962 ribC CMM_0126 CMM_0261 CMM_0006 gyrB CMM_0605 CMM_2418 fadD CMM_0921 CMM_0789 CMM_0602 CMM_1997 argF CMM_2106 hypothetical protein ribosome recycling facto
336. rkennen waren Ergebnisse 62 Die Qualitat der PCR Produkte wurde zum einen Uber eine Schmelzkurve untersucht Abbildung 8 B Zum anderen mittels Gelelektrophorese Abbildung 8 C Nach der PCR mit 0 01 ng RNA und in der Wasserkontrolle wurde kein amplifiziertes PCR Produkt auf dem Gel nachgewiesen Abbildung 8 C Spuren 5 und 6 Um die RNA Menge von hsr203J in MgCl und bakteriell behandelten Bl ttern zu vergleichen wurde erneut eine qPCR durchgef hrt Dazu wurde Blattmaterial 0 24 und 48 h nach der Infiltration mit 10 mM MgCl Cmm100 und Cmm382 verwendet F r die qPCR Reaktion wurden je 10 ng RNA in Triplikaten eingesetzt In den Amplifikationsdiagrammen Abbildung 8 D F wurde die relative Fluoreszenzeinheit RFU gegen den entsprechenden PCR Zyklus aufgetragen Die jeweils linken Kurven repr sentierten dabei die Amplifikation des 18S rRNA Gens Der C Wert lag bei allen Bedingungen im sechsten oder siebten Zyklus Eine Ausnahme bildete die RNA aus den Bl ttern 24 h nach der Infektion mit Cmm100 Abbildung 8 E gestrichelter Pfeil Bei einer Wiederholung der qPCR lag der C Wert jedoch ebenfalls im siebten Zyklus Daten nicht gezeigt Die rechten Kurven der Amplifikationsdiagramme repr sentierten die PCR mit hsr203J Der C Wert lag dabei etwa 20 PCR Zyklen h her als f r das 18S rRNA Gen 0 und 48 h nach der Infektion war nur ein geringer oder kein Unterschied zwischen der Menge an hsr203J RNA in den 10 mM MgClo und bakteriell b
337. rlichen Bedingungen widergespiegelt sodass die Besiedelung des Keimlings durch die Bakterien in der Natur vermutlich eher den Ergebnissen in dieser Arbeit entspricht Das in dieser Arbeit beobachtete uneinheitliche Auftreten von Krankheitssymptomen nach der fr hen Infektion von Tomatenpflanzen mit C michiganensis subsp michiganensis wurde bereits in einer fr heren Publikation beschrieben Chang et al 1992 Der von Chang und Kollegen erw hnte Einfluss der Temperatur der Gr e der zu infizierenden Tomatenpflanzen und des bakteriellen Inokulums auf die Ausbildung von Krankheitssymptomen k nnte auch in dieser Arbeit als Erkl rung f r das unterschiedliche Auftreten von Blattwelke St ngell sion und verringertem Wachstum dienen F r das in dieser Arbeit beobachtete Ausbleiben jeglicher Krankheitssymptome k nnten zwei Ursachen verantwortlich sein Die Bakteriendichte in der Pflanze nach der Infektion war m glicherweise zu gering um Krankheitssymptome auszul sen Chang et al 1992 In einigen Bakterien werden beispielsweise erst Virulenzfaktoren exprimiert wenn die Bakteriendichte hoch genug ist Fuqua et al 1994 Chan et al 2004 Des Weiteren w re eine Latenzzeit der Bakterien eine weitere m gliche Erkl rung bei der die Bakterien sich Diskussion 116 zwar in der Pflanze ausbreiten jedoch keine Krankheitssymptome ausl sen Tsiantos 1987 Baysal et al 2011 Dabei ist eine Latenzzeit entweder abh ngig von den oben genannte
338. rpG and HrpX and involved in the pathogenesis hypersensitive response and extracellular protease production of Xanthomonas campestris pathovar campestris J Bacteriol 189 5 2055 2062 Literaturverzeichnis 141 Wei Z M Laby R J Zumoff C H Bauer D W He S Y Collmer A and Beer S V 1992 Harpin elicitor of the hypersensitive response produced by the plant pathogen Erwinia amylovora Science 257 85 88 Wengelnik K Marie C Russel M and Bonas U 1996 Expression and localization of HrpA1 a protein of Xanthomonas campestris pv vesicatoria essential for pathogenicity and induction ofthe hypersensitive reaction J Bacteriol 178 4 1061 1069 Windt C W Gerkema E and Van As H 2009 Most water in the tomato truss is imported through the xylem not the phloem a nuclear magnetic resonance flow imaging study Plant Physiol 151 2 830 842 Xu X L Miller S A Baysal Gurel F Gartemann K H Eichenlaub R and Rajashekara G 2010 Bioluminescence imaging of Clavibacter michiganensis subsp michiganensis infection of tomato seeds and plants Appl Environ Microbiol 76 12 3978 3988 Yanisch Perron C Vieira J and Messing J 1985 Improved M13 phage cloning vectors and host strains nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors Gene 33 1 103 119 Yuan H P Min H Lv Z M and Li Z M 2009 Antimicrobial activity of isolate HL 12 against Clavibacter michi
339. rringertes Pflanzenwachstum beobachtet Einige der infizierten Pflanzen zeigten auch noch nach vier Wochen keine Krankheitssymptome Ein Eindringen von C michiganensis subsp michiganensis in die Samen infizierter Tomaten pflanzen konnte in dieser Arbeit nicht gezeigt werden Eine Besiedelung des Keimlings nach der Inkubation von Tomatensamen in einer C michiganensis subsp michiganensis Suspension konnte auch schon von Xu und Kollegen gezeigt werden Xu et al 2010 Die Lokalisation der Bakterien im Hypocotyl und den Cotyledonen konnte dabei ebenfalls beobachtet werden Im Gegensatz zu Xu und Kollegen wurden jedoch in dieser Arbeit keine Bakterien mehr auf der Samenoberfl che keimender Samen nachgewiesen Das k nnte zum einen auf die Verwendung unterschiedlicher Bakterienst mme zur ckgef hrt werden zum anderen auf die Unterschiede in der Durchf hrung der Infektion Im Gegensatz zu Xu und Kollegen die bei der f nfmin tigen Inkubation der Samen in der Bakterienl sung 10 cfu ml ein Vakuum angelegt hatten erfolgte die Inkubation in dieser Arbeit f r 15 min bei einer Bakteriendichte von 8 x 10 cfu ml ohne das Anlegen eines Vakuums Eine Vakuum basierende Sameninfektion erlaubt den Bakterien die Besiedelung von Hohlr umen im Samen die zuvor mit Luft gef llt waren und so das Eindringen unter die Samenh lle oder direkt in den Samen Porter et al 1960 Puente amp Bashan 1993 Puente et al 2009 Dadurch werden jedoch keine nat
340. rukturen an die Wirtszelle adh rieren B ttner amp Bonas 2010 Neben der Plasmamembran besitzen sie eine zweite u ere Membran welche den Export von Proteinen erschwert Daher werden Proteine ber Sekretionssysteme SS aus der Zelle transportiert ber das Typ4 SS T4SS wird zum Beispiel T DNA aus A tumefaciens in die Wirtszelle transportiert und dort ber einen nat rlichen Gentransfer in die Wirts DNA eingebaut Engstr m et al 1987 B ttner amp Bonas 2010 Die am Transport und Einbau beteiligten Gene werden erst mit Hilfe eines Signals exprimiert das ber die Phosphokinase VirA und den Regulator VirG bertragen wird Solche Signale k nnen phenolische Substanzen wie Acetosyringon sein das von der Pflanze bei Verwundung ausgeschieden wird Acetosyringon fungiert daneben ebenfalls als Lockstoff f r Bakterien da durch eine Verwundung das Eindringen in die Pflanze erleichtert wird Engstr m et al 1987 Parke et al 1987 Auch bei Pseudomonas Arten spielt Acetosyringon eine Rolle in der Wirt Pathogen Interaktion Baker et al 2005 ber die Sekretionssysteme T1SS und T2SS werden extrazellul re Proteine wie Phytotoxine oder hydrolytische Enzyme wie Cellulasen Xylanasen Pektat Lyasen und Proteasen aus der Bakterienzelle transportiert Boch amp Bonas 2001 B ttner amp Bonas 2010 Ryan et al 2011 Die Expression der verantwortlichen Gene wird zum Beispiel durch niedrige Temperatur oder phenolische Substanzen aktiviert
341. s amplifizierte PCR Produkt wurde ber Agarose Gelelektrophorese und anschlie ender Extraktion siehe Abschnitt 3 3 1 5 gereinigt Daraufhin wurde das Fragment als template in der in vitro Transkription eingesetzt Die Markierung der RNA Sonden erfolgte mit Digoxigenin 11 dUTPs Material und Methoden 39 20 ul in vitro Transkriptions Ansatz 14 ul gereinigtes PCR Produkt 10 50 ng ul 2 ul 10 x DIG RNA Labelling Mix Roche Diagnostics Mannheim 2 ul 10 x T7 RNA Polymerase Puffer NEB Schwalbach 2 ul T7 RNA Polymerase NEB Schwalbach Der Reaktionsansatz wurde f r 2 h bei 37 C inkubiert Das als template dienende DNA Fragment wurde anschlie end durch Zugabe von 1 ul RNase freier DNase peqlab Biotechnologie GmbH Erlangen und 25 min tiger Inkubation bei 37 C abgebaut Zur berpr fung der Sondenqualitat wurde ein Sondentest durchgef hrt vgl Abschnitt 3 3 1 8 Die markierte RNA Sonde wurde bis zur weiteren Verwendung bei 80 C gelagert 3 3 2 5 RNA Hybridisierung Dot Blot Um die Transkription spezifischer Gene zu analysieren wurden RNA Hybridisierungsexperimente durchgef hrt Dabei wurden zu 100 ul 10 x SSC mit wenig Bromphenolblau versetzt 4 ug Gesamt RNA aus C michiganensis subsp michiganensis gegeben Die RNA L sungen wurden auf eine positiv geladene Nylonmembran Roche Diagnostics Mannheim aufgetragen welche zuvor in RNase freiem H2Obidest und anschlie end in 10 x SSC quilibriert und auf ein mit 10 x SSC g
342. s dem berstand wurden die extrazellul ren Proteine isoliert Die Isolierung zytoplasmatischer Proteine erfolgte wie von Hansmeier und Kollegen beschrieben wobei zu Beginn zwei Zentrifugationsschritte 5 500 x g 25 min 4 C durchgef hrt wurden Hansmeier et al 2006a Der Zellaufschluss erfolgte mit Hilfe des Homogenisators Precellys 24 peqlab Biotechnologie GmbH Erlangen 2 ul Benzonase Nuclease Novagen Darmstadt wurden zum Entfernen von DNA und RNA eingesetzt Anstelle von Aceton wurden 10 w v TCA f r die F llung der Proteine verwendet Vor der Aufnahme der Proteine in 30 ul Rehydratisierungspuffer wurden diese ein Mal in 80 igem v v und ein Mal in 100 igem v v kaltem Aceton gewaschen 13 000 x g 30 min 4 C und luftgetrocknet F r die Isolierung extrazellul rer Proteine wurde der berstand nochmals zentrifugiert 7 500 x g 60 min 4 C in ein neues Gef berf hrt und es wurden drei Proteinase Inhibitor COMPLETE Tabletten Roche Mannheim und 10 w v TCA zugegeben bevor die Suspension ber Nacht bei 4 C inkubiert wurde Einem Zentrifugationsschritt 5 500 x g 30 min 4 C folgten zwei Waschschritte mit 80 igem v v bzw 100 igem v v Aceton bevor die Proteine luftgetrocknet und in 30 ul Rehydratisie rungspuffer aufgenommen wurden Die Lagerung erfolgte bei 20 C Rehydratisierungspuffer 8 M Harnstoff 20 mM DTT 2 w v CHAPS 3 4 4 3 Isolierung spezifischer Proteine mittels magnetic beads F
343. schlie end pelletiert 5 000 x g 20 min 4 C Die weitere Durchf hrung erfolgte mit einigen Abwandlungen wie von Hansmeier und Kollegen sowie Watt und Kollegen beschrieben Watt et al 2005 Hansmeier et al 2006a Nach der Zugabe von 2 w v Chaps Serva Heidelberg wurde die Suspension ber Nacht auf Eis bei 4 C inkubiert Nach dem anschlie enden Zentrifugationsschritt wurde das Lysat filtriert 0 45 um Filter Sartorius G ttingen Es folgten die Zugabe von 10 ml wassergesattigtem Phenol eine zweist ndige Inkubation bei 4 C auf der Wippe GFL mbH Burgwedel und ein Zentrifugationsschritt 3 500 x g 30 min 4 C Die Zugabe von Methanol erfolgte gleichzeitig mit der Zugabe von 1 M DTT und 8 M NH Acetat Nach 12 st ndiger Inkubation wurden die Proteine pelletiert 3 500 x g 30 min 4 C das Pellet wurde zwei Mal in 5 mi kaltem 70 igem v v Ethanol und ein Mal in kaltem Aceton gewaschen 3 500 x g 15 min 4 C luftgetrocknet und anschlie end in 100 ul Rehydratisierungspuffer gel st Die Lagerung erfolgte bei 20 C Rehydratisierungspuffer 8 M Harnstoff 20 mM DTT 2 w v CHAPS Material und Methoden 46 3 4 4 2 Isolierung extrazellul rer und zytoplasmatischer Proteine F r die Isolierung extrazellul rer Proteine wurden die Bakterien wie in Abschnitt 3 2 3 beschrieben kultiviert und anschlie end pelletiert 5 000 x g 25 min 4 C Das Pellet wurde f r die Isolierung zytoplasmatischer Proteine verwendet und au
344. se conserved hypothetical protein citrate synthase malonyl CoA acyl carrier protein transacylase hypothetical protein 3 phosphoshikimate 1 carboxyvinyltransferase pyruvate dehydrogenase E1 component ornithine carbamoyltransferase phosphoserine aminotransferase transcription elongation factor involved in mycothiol biosynthesis oxidoreductase monooxygenase glycerol kinase 6 phosphogluconate dehydrogenase decarboxylating phosphoribosylformylglycinamidine cyclo ligase arylesterase siderophore biosynthesis enzyme monooxygenase purine nucleoside phosphorylase oxidoreductase oxidoreductase transcriptional regulator with FHA domain methylenetetrahydrofolate dehydrogenase methenyltetrahydrofolate cyclohydrolase aspartate aminotransferase thioredoxin 50S ribosomal protein L35 putative amidohydrolase NH 3 dependent NAD synthetase IV 5 1 5 11 1 111 3 1 2 V 1 1 1 1 1 1 2 111 3 V 2 1 5 111 3 1 3 1 1 1 2 111 3 111 3 1 1 V 2 IV 7 1 3 1 3 111 3 1 1 V 2 1 2 1 5 IV 1 IV 3 IV 4 111 1 V 2 11 2 1 1 11 2 V 2 1 1 1 4 V 2 1 2 1 1 1 2 1 2 11 2 IV 5 V 1 IV 1 1 1 1 3 V 1 1 6 1 3 VA V 1 IV 3 1 5 1 2 IV 5 111 3 V 2 1 5 154 4244 o M o 0 432 4 pop ana Mh H Wo aaa a aan a a DD aa sno nan Doan nnn DD oO Anhang Fortsetzung Tabelle 21 zytoplasmatisches Proteom von Cmm382 in M9 Medium NONNNWAAOAWAWAWAAWAWHHRKBKRHRHAAAAUIAADADAIAAIAINNNN
345. se pflanzliche Proteine sekretiert die als Signal fur die Expression bakterieller Virulenzgene dienen Buhtz et al 2004 Krasikov et al 2011 Jacobs et al 2012 Solche Proteine waren zum Beispiel das Lektin hnliche Protein XSP30 Snakin 2 das Extensin hnliche Protein ELP Peroxidasen Serinproteasen und Chitinasen Buhtz et al 2004 Balaji et al 2008 Balaji amp Smart 2012 Das in dieser Arbeit etablierte Xylemsaft imitierende Medium repr sentiert die Bedingungen im Xylem wie sie in einem fr hen Stadium der Infektion vorliegen Durch die Zugabe spezifischer Substanzen zu diesem Medium k nnte die Expression von Virulenzgenen hervorgerufen werden die zu einem anderen Zeitpunkt der Infektion wichtig sind Eine spezifische pflanzliche Substanz w re dabei zum Beispiel die Wundsubstanz Acetosyringon Turk et al 1991 die in dieser Arbeit eine ver nderte Genexpression in C michiganensis subsp michiganensis hervorgerufen hatte 5 5 Proteom und Transkriptomdaten Ein Vergleich Bei einem Vergleich der Daten der Proteom und Transkriptomanalyse wurden in dieser Arbeit nur wenige bereinstimmungen gefunden Diese Beobachtung wurde jedoch auch schon von anderen Arbeitsgruppen gemacht Nie et al 2006 Chang et al 2012 Nie und Kollegen erkl rten diese Abweichungen zum einen mit experimentellen Fehlern zum anderen mit der komplexen Regulation der Transkription und Translation Nie et al 2006 Der Vergleich der Massenspektro
346. seaktivitat zeigten Zum anderen wurden extrazellul re Proteine aus einer Cmm382 Kultur in M9 bzw XMM Medium isoliert und mittels MALDI ToF MS analysiert Analyse der Proteinaktivit t mittels Zymographie Die Analyse der Proteinaktivit t wurde mittels Zymographie durchgef hrt Dabei wurde das f r die Enzyme spezifische Substrat dem Trenngel eines SDS Polyacrylamidgels zugef gt Als Substrat f r Cellulasen wurde Carboxymethylcellulose verwendet f r Proteasen Azocasein und f r Pektinasen Pektin Nach dem Gellauf wurden die Proteine renaturiert und das Gel wurde anschlie end spezifisch behandelt um das Substrat sichtbar zu machen Meletzus und Kollegen konnten Cellulaseaktivit t auf M9 Medium Agarplatten im Wildtypstamm Cmm382 und im Stamm Cmm101 nachweisen jedoch nicht in Cmm100 und Cmm102 Meletzus et al 1993 Die Cellulaseaktivit t korrelierte somit mit der Anwesenheit des nat rlichen Plasmids pCM1 auf dem das Cellulasegen celA lokalisiert ist Das sollte in dieser Arbeit mittels Zymographie best tigt werden Die Proteine des Medien berstandes einer Cmm382 bzw Cmm100 Kultur in M9 Medium wurden mittels Ammoniumsulfat gef llt Nach der F llung mit 40 w v und 60 w v Ammoniumsulfat wurden 18 ug Proteine f r die Zymographie eingesetzt Im Medien berstand der Cmm100 Kultur wurde nach der F llung mit 40 w v und 60 w v Ammoniumsulfat keine Cellulaseaktivit t identifiziert Abbildung 19 A Spuren 1 und 3 Im Medien
347. snnennnnnnennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnen 9 2 2 2 Virulenzfaktoren in Gram positiven Bakterien ssrsnsunnnennnnnnennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnen 9 2 2 3 Methoden zur Charakterisierung und Analyse von Virulenzfaktoren sses 11 2 3 DiE Gattung Clavib ctef nun ri iii 11 2 3 1 Von der Gattung Corynebacterium zur Gattung Clavibacter nnsseneenennennnenenen 11 2 3 2 Clavibacter michiganensis uu uuunssennnnennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnannnnnnnannnn 12 2 4 C michiganensis subsp michiganensis u 240u4240onnnnnennnnennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn nenn 13 2 4 1 Infektion von Tomatenpflanzen ussersnnennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn 15 2 4 2 Virulenzfaktoren in C michiganensis subsp michiganensis uuenennnennnnnnn 18 2 4 3 Molekularbiologische Methoden 44444444444BHnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn 19 2 5 Zielsetzung der Arbeit errare 2 eg Seaesdacebe hata bedeaaa ahecusigncezsdacetadiuia A A a 20 3 Material und Methoden ccseeccceseeeeeeeseeeseeeeeeeseeeeeeeseseenensesenneeseseeeeeseseeneesesesnenseseeneesaseseeeeneeeenens 22 3 1 Bakterienst mme Plasmide und Oligonukleotide uneeeeeeeeeneeseenennnnnsnennnennnnnennnnnnnsnnnnnennnnnnnenn 22 3 2 Nahrmedien Kultivierungs und Infektionsbedingungen 24444224400nnsnnnnnnennnnennnnnnn nennen 25 3 2 1 N
348. sp michiganensis For this reason the establishment of a synthetic xylem mimicking medium to analyse virulence factors of C michiganensis subsp michiganensis in vitro was a central issue in this work To reflect the natural plant environment of C michiganensis subsp michiganensis in vitro the apoplast medium XVM2 in which virulence factors of Xanthomonas showed an increased expression Wengelnik et al 1996 was adapted to the xylem At first the composition of the xylem sap was analysed and the establishment of a xylem mimicking medium XMM based on the XMV2 medium followed A comparison of the proteome and transcriptome of C michiganensis subsp michiganensis in this XMM medium and a minimal medium showed no increased amount of virulence factors in XMM medium but an increased transcript amount of genes coding for transporter These results suggest that the XMM medium mimics the conditions in the nutrient poor xylem at an early stage of infection Here the main aims of the bacteria are nutrient uptake growth and spreading in the plant For C michiganensis subsp michiganensis the analysis of the regulation and of promoter regions of virulence genes was not carried out until now or only in first experiments Dreier et al 1997 Jahr et al 2000 Therefore the identification of proteins which are involved in the regulation of virulence gene expression as well as the characterization of a consensus sequence for specific promoter struc
349. sporter permease component sugar ABC transporter permease component ABC transporter substrate binding protein alpha glucoside ABC transporter substrate binding protein oxidoreductase oxidoreductase dehydrogenase iron ABC transporter substrate binding protein sugar ABC transporter substrate binding protein long chain fatty acid CoA ligase hypothetical protein sugar ABC transporter permease component sugar ABC transporter substrate binding protein dehydrogenase oxidoreductase dehydrogenase oxidoreductase conserved hypothetical protein sugar ABC transporter permease component conserved hypothetical protein conserved hypothetical protein hypothetical protein hypothetical protein hypothetical secreted protein sugar ABC transporter permease component sugar phosphate isomerase epimerase 3 oxoacyl CoA thiolase transcriptional regulator Lacl family conserved hypothetical protein delta 1 pyrroline 5 carboxylate dehydrogenase proline oxidase putative sugar phosphate isomerase epimerase conserved hypothetical protein putative monooxygenase serine threonine protein kinase oligopeptide ABC transporter substrate binding protein acetyl coenzyme A synthetase sugar ABC transporter permease component glycerol kinase conserved hypothetical protein hypothetical secreted protein sortase sorted aspartate ammonia lyase carboxylesterase sugar ABC transporter permease component conserved secreted protein hypothetical prot
350. ss pa oe 377 bp Nhel Sondentest 7 427 K pCM2_0056 _ 1 000 bp 2 A 3 639 So exh wiis A 2 799 3 134 bp EH0056 Im ee Notl 377 bp 630 bp Abbildung 25 DNA Hybridisierungsexperimente zur berpr fung der Insertion von pUC18cat mit dem entsprechenden Zielgenfragment in CMM_2408 CMM_2766 und pCM2_0056 Schematische Darstellung des Wildtyp Gens und des mutierten Gens Insertionsmutante Im Die entsprechenden Sonden wurden mittels Sondentest analysiert K DIG markiertes DNA Fragment als Kontrolle Die DNA Hybridisierung wurde mit dem DNA Marker VII DM Roche Mannheim der Wildtyp DNA Wt und der Insertionsmutanten DNA Im durchgef hrt Ergebnisse 99 F r die berpr fung der Insertion in pCM2_0056 wurden Wildtyp und EH0056 DNA mit den Enzymen Notl und Nhel geschnitten Abbildung 25 C Mit Hilfe einer Kontroll PCR wurde best tigt dass nach der Isolierung der chromosomalen DNA neben dieser auch die nat rlichen Plasmide pCM1 und pCM2 isoliert wurden Daten nicht gezeigt Nach der Hybridisierung der pCM2_0056 Sonde war im Wildtypstamm ein etwa 3 100 bp gro es Fragment auf der Membran zu erkennen Im Stamm EH0056 wurde neben einem 8 000 8 500 bp gro en Fragment auch das Wildtyp Fragment detektiert Die theoretisch ermittelten Gr en lagen f r das Wildtyp Fragment bei 3 134 bp und f r das EH0056 Fragment bei 8 293 bp Die Gr en stimmten mit den detektierten Fragmentgr en berein Dass neben dem etwa 8 000 bp gr
351. ssion von Virulenzgenen in synthetischen Medien wurde f r Pseudomonas Spezies f r E amylovora und f r X campestris pv vesicatoria gezeigt Arlat et al 1992 Huang et al 1992 Wei et al 1992 Wengelnik et al 1996 Das in vitro Medium soll dabei die Bedingungen in vivo imitieren um die Expression von Virulenzfaktoren zu erm glichen C michiganensis subsp michiganensis ist in der Tomatenpflanze im Xylem lokalisiert Um ein Bakterien spezifisches in vitro Medium herzustellen wurden deshalb in dieser Arbeit zuerst die Bestandteile des Xylemsaftes analysiert um anschlie end ein synthetisches Medium herzustellen das die Bedingungen im Xylem repr sentiert Der Xylemsaft enth lt neben Mineralstoffen aus dem Wasser Aminos uren und organische Anionen wie Malat Citrat und Succinat L6pez Millan et al 2000 Buhtz et al 2004 Glucose und Fructose sowie geringe Saccharose Konzentrationen wurden im Xylemsaft der Zuckerr be identifiziert L6pez Millan et al 2000 Nitrat ist das vorherrschende Anion im Xylemsaft der Transport von Ammonium ist umstritten K hler et al 2002 Schjoerring et al 2002 Der Xylemsaft wurde in dieser Arbeit aus vier Wochen alten Tomatenpflanzen isoliert und die Konzentrationen von Nitrat Ammonium der Zucker Glucose Fructose und Saccharose sowie der Aminos uren wurden ermittelt Tabelle 7 Tabelle 7 Konzentrationsbestimmung der Inhaltsstoffe im Xylemsaft und im in vitro Medium XMM xylem mimicki
352. sssssrssrresrrssrrssrrssrrssrrssrrssre 33 39 O Ligation yvon DNA cera 2a A E R A A ATS 33 3 3 1 7 DNA Se QUuenZierunng cecccceseeceeececeeceeeeseeeeaeeeeeneesnaneeeaaeesenaeseeeeenaeeseaaeseeeaeennees 34 3 3 1 8 DNA Sondenherstellung und t St ceccceceseeeeceeeeeeeeceaeeeeaaeeeeneeseaeeesaeeeeaeeeeees 34 3 3 1 9 DNA Hybridisierung Southern BlOt sseeeeeeeeeeeeeenesnesressrrssrrssrssrrssrrssrrssrn 35 82392 RNA TOCHINIKG Msi aar E E cheesy A T S ads 37 3 3 2 1 RNA Isolierung aus C michiganensis subsp michiganensis 37 3 3 2 2 RNA Isolierung aus N tabacum cv Samsun NN usssnssennnneennnnennnnnnnn 37 3 3 2 3 Gelelektrophoretische Auftrennung von RNA ssssssssssssesssreserssrresrissriesresrresnees 38 3 3 2 4 Herstellung von RNA Sonden mittels in vitro Transkription enn 38 3 3 2 5 RNA Hybridisierung Dot Blob aesseeesseeeesrneessrreserneernrnesnnnnesnnnnnsrnnnesnnnnnsnnnnnennnnne 39 3 3 2 6 Quantitative real time reverse Transkriptase PCR qPCR 40 3 3 2 7 CDNA Micro aff ys een en 42 9 2 8 5 RACE nn en ee nn einen 43 3 3 2 9 RNA Sequenzierung nrrns0urnnsnnnnnnnnnnnnannnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnannnnnnnannnnannnn 43 3 4 Biochemische Techniken 424444Hnnennnnnennnennennnnennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnennnnnnnennn nenn 44 3 4 1 Analyse der Ammoniumkonzentration su444444nnnnnnnennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn
353. startpunkt von gInAT 50 bp stromaufw rts des Startcodons ATG Abbildung 31 rote Sequenz 1 unterstrichen Die Gene CMM_RNA_0001a und CMM_RNA_0002a welche f r die 16S rRNA kodieren beinhalten am 3 Ende die Sequenz 5 ATCACCTCCTTTCTAAGGA 3 Das 3 Ende der Sequenz f r die 16S rRNA in E coli besteht aus den Basen 5 ACCTCCTTA 3 und wird als Anti Shine Dalgarno Sequenz bezeichnet Shine amp Dalgarno 1974 Die fett markierten Basen der Sequenz in C michiganensis subsp michiganensis sind identisch mit denen der Sequenz in E coli liegen jedoch etwas weiter stromaufw rts Die komplement re Idealsequenz die 4 14 Nukleotide stromaufw rts des Startcodons lokalisiert ist w re somit AGGAGGT 12 Basen stromaufw rts des Startcodons f r gInAT liegt die Sequenz TGGAGAC Abbildung 31 B rot und fett markiert wobei nur vier Nukleotide identisch zur Idealsequenz sind Die putative 10 35 Region Abbildung 31 B unterstrichen wurde mit Ergebnisse 106 Hilfe von E coli Promotorsequenzen 10 TATAAT 35 TTGAGA Harley amp Reynolds 1987 ermittelt Au erdem wurden in der 5 Region von gInAT entsprechend der 5 Regionen von pat 1 Dreier et al 1997 und ce A Jahr et al 2000 direkte Wiederholungssequenzen identifiziert Abbildung 31 B blau Ein Vergleich der 50 Nukleotide stromaufw rts der Startcodons von ginA1 in C michiganensis subsp michiganensis und in C glutamicum lieferte ein
354. stellt MW Molekulargewicht molecular weight MW Gen Name MW Funktion Familie Promotorregion Medium CMM _0036 38 kDa Lacl Familie p c X CMM_0091 regB 23 kDa Antwortregulator p X CMM_0118 27 kDa TetR Familie p X M CMM_0140 17 kDa MarR Familie p M CMM_0161 35 kDa Lacl Familie c X CMM_0257 23 kDa MerR Familie p c X CMM_0275 45 kDa Rok Familie p x CMM_0301 26 kDa TetR Familie p c X M CMM_0349 26 kDa DeoR family p x CMM_0358 37 kDa Lacl Familie p x CMM_0381 phnF 26 kDa GntR Familie p c X M CMM_0404 26 kDa Antwortregulator p c X M CMM_0425 37 kDa Lacl Familie p c X CMM_0440 18 kDa MarR Familie p M CMM_0473 30 kDa Antwortregulator p c x CMM_0519 38 kDa Transkriptionsregulator p x CMM_0536 16 kDa MarR Familie c X 2 CMM_0537 28 kDa PhoB hnlich p c X M CMM_0618 34 kDa Cro Cl Familie c X CMM_0625 13 kDa GntR Familie c 2 M CMM_0673 24 kDa TetR Familie p c X CMM_0691 16 kDa MarR Familie c X CMM_0733 25 kDa GntR Familie p c X M CMM_0763 51 kDa HTH Dom ne c X CMM_0783 31 kDa Cro Cl Familie p c X M CMM_0785 25 kDa GntR Familie p c X M CMM_0789 28 kDa GntR Familie p c X M CMM_0806 25 kDa GntR Familie p x CMM _0863 17 kDa MarR Familie c X CMM_0865 36 kDa Lacl Familie p c X CMM_0948 40 kDa Lacl Familie p c X CMM_0995 25 kDa Antwortregulator p X CMM_1063 18 kDa Transkriptionsregulator p X CMM_1070 15 kDa MarR Familie c X 2 CMM_1147 37 kDa Lacl Familie p c X CMM_1174 17 kDa AsnC Familie p c X 2 M CMM_1183 32 kDa LysR Familie p c X
355. stris pv vesicatoria wurde jedoch ebenfalls mit 14 eine deutlich abweichende Zahl an leaderless Transkripten identifiziert Schmidtke et al 2012 als der f r y Diskussion 128 Proteobakterien berechnete Durchschnitt von 4 5 Zheng et al 2011 Eine Abweichung vom Durchschnitts Wert k nnte somit auch f r C michiganensis subsp michiganensis gelten Wird ein Anstieg der Transkriptmenge im offenen Leserahmen nahe des Startcodons identifiziert k nnte dies auf einen alternativen Transkriptionsstart hindeuten wie es auch schon f r einige Gene im Genom von X campestris pv vesicatoria festgestellt wurde Schmidtke et al 2012 Eine Erkl rung f r die identifizierten Transkripte im gesamten offenen Leserahmen k nnte eine unvollst ndige Fragmentierung der mRNA bei der Vorbereitung der Proben f r die RNA Sequenzierung sein sodass noch sehr lange cDNA Fragmente vorlagen die weiter in den offenen Leserahmen reichten Eine weitere Erkl rung w re das Auftreten von sogenannten multireads Oshlack et al 2010 Van Verk et al 2013 Multireads sind sequenzierte CDNA Fragmente die zu mehr als einer Sequenz im Genom eines Organismus homolog sind Da wie in dieser Arbeit gezeigt das Genom von C michiganensis subsp michiganensis einige homologe Bereiche aufweist k nnten diese multireads nicht nur das entsprechende 5 Ende der mRNA repr sentieren sondern auch einen dazu homologen Bereich im offenen Leserahmen eines anderen Gens
356. sucD succinyl CoA ligase ADP forming subunit alpha 1 1 3 488 CMM_1744 gapA glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase 1 1 3 393 CMM_2568 groES 10 kDa chaperonin protein Cpn10 GroES protein IV 4 3 374 CMM _1735 talA transaldolase 1 1 3 366 CMM _1611 cspAT cold shock protein IV 4 3 366 CMM_1489 rplU 50S ribosomal protein L21 111 3 3 338 CMM _2604 rpsH 30S ribosomal protein S8 111 3 3 301 CMM_2583 rp Q 50S ribosomal protein L17 111 3 3 288 CMM _0737 katA Catalase IV 5 3 278 CMM_ 2537 icdA isocitrate dehydrogenase 1 1 3 269 CMM _0166 fhuD Fe3 siderophore ABC transporter SBP IV 1 1 250 CMM_2775 conserved hypothetical protein V 2 1 210 CMM_2599 rplO 50S ribosomal protein L15 111 3 3 203 CMM_0860 rplJ 50S ribosomal protein L10 111 3 1 193 CMM_2773 putative nitroreductase V 2 1 191 CMM_2611 rpsC 30S ribosomal protein S3 111 3 1 188 CMM_0009 hypothetical protein V 2 1 183 CMM_1094 ilvB acetolactate synthase 1 2 1 182 CMM _1757 response regulator involved in antitermination IV 3 1 179 CMM_1736 pgiA glucose 6 phosphate isomerase 1 1 3 175 CMM_2968 trxA thioredoxin reductase IV 5 1 171 CMM_2316 putative phosphomutase lyase V 2 3 170 CMM_1100 serA D 3 phosphoglycerate dehydrogenase 1 2 1 166 CMM_1458 conserved hypothetical protein V 2 2 158 CMM_0010 ppiA peptidyl prolyl cis trans isomerase IV 4 3 157 CMM_1636 gInAT glutamine synthetase 1 2 3 148 CMM_2233 fumC fumarate hydratase 1 1 1 2 3 bisphosphoglycerate dep
357. sugar ABC transporter permease component antimicrobial peptide ABC transporter ATPase antimicrobial peptide ABC transporter permease component sugar ABC transporter permease component ABC transporter ATPase cysteine peptidase family C56 conserved hypothetical protein conserved membrane protein sugar ABC transporter substrate binding protein iron ABC transporter permease component acyl CoA oxidase succinate dehydrogenase flavoprotein subunit glycerol 3 phosphate MFS permease phosphoenolpyruvate protein phosphotransferase PTS enzyme hypothetical protein oxidoreductase glutamate ABC transporter substrate binding protein glycosyl hydrolase family 2 glucose 1 phosphate adenylyltransferase conserved secreted protein peptidoglycan binding ATPase ribonuclease acyl CoA ligase aldehyde dehydrogenase oxidoreductase glutamate ABC transporter ATPase dihydroxyacetone kinase conserved hypothetical protein succinyl CoA ligase ADP forming subunit alpha alpha glucosidase arylesterase subtilisin like extracellular serine protease peptidase family S8A acetyltransferase aconitate hydratase 3 oxoacyl acyl carrier protein synthase transcriptional regulator TetR family putative cell wall associated protein sugar ABC transporter permease component ABC transporter ATPase pantothenate metabolism flavoprotein hypothetical protein long chain fatty acid CoA ligase sugar hydrolase conserved hypothetical protein pu
358. t ein housekeeping Gen das konstitutiv exprimiert wird Butte et al 2001 Turpin et al 2012 Im Stamm EH2408 war jedoch in TBY und XMM Medium im Gegensatz zu M9 Medium eine erh hte gapA Transkriptmenge zu erkennen Ergebnisse 102 Abbildung 27 Der Wildtypstamm und der Stamm EH2766 zeigten in allen drei Medien eine vergleichbare gapA Transkriptmenge In den Mutantenstammen EH2408 und EH2766 war die Transkriptmenge von pat 1 in M9 Medium deutlich h her als in TBY Medium Eine leicht erh hte Transkriptmenge war au erdem in XMM Medium zu erkennen Das mRNA Level von celA war in allen drei St mmen und Medien sehr schwach Die Transkriptmenge des Virulenzgens pat 7 war somit nach der Mutation von CMM_2408 oder CMM_2766 in XMM Medium leicht und in M9 Medium stark erh ht sodass auf einen Einfluss der Expression von pat 1 durch die Mutation von CMM_2408 oder CMM_2766 geschlossen werden kann Neben RNA Hybridisierungsexperimenten wurden Wachstumsexperimente in TBY M9 und XMM Medium durchgef hrt um zu berpr fen ob die Mutantenst mme ein im Gegensatz zum Wildtypstamm ver ndertes Wachstum zeigten Die St mme EH2408 und EH2766 erreichten in allen Medien geringere Zellzahlen als Cmm882 Abbildung 28 TBY Medium M9 Medium XMM Medium 40 60 h Abbildung 28 Wachstum der St mme Cmm332 EH2408 und EH2766 in den Medien TBY M9 und XMM Die Generationszeiten der St mme betrugen in TBY Medium 3 7 h Cmm382 und 5 7 h EH2408 EH276
359. t wurden Pathogenit tsinseln weisen im Vergleich zum restlichen Genom einen niedrigeren G C Gehalt auf Francis et al 2010 Neben dem Chromosom kommen oft nat rliche Plasmide in linearer oder zirkul rer Form vor auf denen ebenfalls Virulenzgene lokalisiert sind Das Gen tomA kodiert f r eine Tomatinase die das pflanzliche Alkaloid a Tomatin welches das bakterielle Wachstum hemmt unsch dlich macht Quidde et al 1998 Kaup et al 2005 tomA Homologe liegen in den meisten F llen innerhalb einer Pathogenit tsinsel und konnten in einigen phytopathogenen Bakterien identifiziert werden zum Beispiel in Streptomyces Unterarten Kers et al 2005 C michiganensis subsp michiganensis und subsp sepedonicus Bentley et al 2008 sowie in einem pathogenen Pilz Kers et al 2005 Ein weiterer Virulenzfaktor ist Neci der Nekrose hervorruft und von Streptomyces Arten sekretiert wird um Abwehrreaktionen der Pflanze zu unterdr cken Joshi et al 2007 Spiroplasma Arten exportieren SAP11 das ber eine Kernlokalisationssequenz in den Wirtskern gelangt und dort die Genexpression ver ndert Hogenhout amp Loria 2008 Ebenso wie Gram negative Bakterien besitzen Gram positive Bakterien Gene die f r Phytohormone kodieren Rhodococcus fasciens exprimiert zum Beispiel Cytokinin ber das fas Operon Hogenhout amp Loria 2008 und L xylisubsp xyli Abscisins ure Monteiro Vitorello et al 2004 Ein weiterer Virulenzfaktor ist die P450 Monoox
360. tase V 1 2 keto acid dehydrogenase dihydrolipoamide acetyltrans 1 1 CMM _2942 ferase E2 component l 1 1 CMM_2174 conserved hypothetical protein IV 5 1 1 CMM_1702 glycine betaine choline ABC transporter permease IV 1 1 1 CMM_0598 hemB porphobilinogen synthase 1 5 1 1 CMM _1816 ruvC crossover junction endodeoxyribonuclease 111 1 1 1 CMM _0595 hemH ferrochelatase 1 5 1 1 CMM_2755 kdpE two component system response regulator IV 3 Anhang 197 7 5 MALDI ToF Daten der Analyse von Transkriptionsregulatoren von Cmm332 Um m gliche Transkriptionsregulatoren f r pat T und ce A zu identifizieren wurde der Proteinextrakt einer Cmm382 Kultur in Minimalmedium M9 Apoplasten Medium XVM2 und in Xylemsaft imitierendem Medium XMM zu den 500 bp umfassenden Promotorregionen gegeben und spezifisch gebundene Proteine mittels NaCl Gradient eluiert Die Proteine in den Elutionsfraktionen wurden anschlie end mit Hilfe der MALDI ToF Massenspektrometrie identifiziert In Tabelle 31 sind die Proteine aufgelistet deren Genprodukte Regulatoren darstellen Tabelle 31 Mit Hilfe von MALDI ToF MS ermittelte putative Transkriptionsregulatoren von pat 1 und celA 42 Regulatoren hatten an die Promotorregionen von pat 7 p und celA c gebunden 33 nur an die pat 1 Promotorregion und 15 nur an die celA Promotorregion Die entsprechenden Proteinextrakte wurden aus einer Cmm882 Kultur in Minimalmedium M XVM2 Medium 2 und Xylemsaft imitierendem Medium XMM X herge
361. tative NTPase alpha rhamnosidase ABC transporter permease component 163 IV 1 V 2 V 2 IV 1 IV 6 1 2 IV 1 IV 1 V 2 1 1 IV 1 1 1 V 1 1 1 1 2 1 1 IV 1 IV 1 V 2 IV 1 IV 1 IV 1 IV 1 IV 1 IV 7 V 2 V 2 IV 1 IV 1 1 4 1 1 IV 1 IV 1 V 2 V 1 IV 1 1 1 1 1 V 2 V 1 V 1 V 1 IV 1 1 1 V 2 1 1 1 1 V 1 IV 6 V 1 1 1 1 4 IV 3 11 2 IV 1 IV 1 1 5 V 2 1 4 V 1 V 2 1 1 IV 1 Anhang Fortsetzung Tabelle 23 H here Transkriptmengen in XMM Medium als in M9 Medium 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 ee eS eS eS eS eS SS eS SU E G Lh hme OU aS OOOOOONNNNSNINNISSNING0O OO CO OOOOOO OO OO OO O OO CMM 1071 CMM _0240 CMM_0195 CMM 2901 CMM_0096 cytC CMM_0522 CMM_1313 CMM_2110 CMM_0663 pCM2_0067 CMM_0969 sdhB CMM_2379 prpB CMM_0321 CMM_2213 CMM_2116 thiED CMM_2689 CMM_2668 CMM_2548 sucC CMM_0297 CMM_0951 CMM_1532 prox CMM_0246 CMM_1753 CMM_2036 CMM_2226 fbaA CMM_2171 gItA2 CMM_1504 fruA CMM_2059 CMM_1266 CMM_2255 CMM_2081 CMM_0486 CMM_1306 CMM_0132 CMM_1745 sodA CMM_1026 gcdH CMM_2537 icdA CMM _0653 cysk CMM_1533 CMM_1720 serB2 CMM_0421 CMM_2254 CMM_2057 CMM_2344 modA CMM_0974 manC CMM_0407 CMM_0422 CMM_PS_22 CMM _1133 echA CMM_2955 CMM _0476 CMM_0910 CMM _1084 CMM_0359 CMM_2345 CMM_0679 CMM_0
362. tcatgcccatcciggagcactaactacatg tgtcgecggggcccicttcggcgatgaactatgattcaagctGgcctcccgcggaa cgtcgccggttcgtcgtgtccgtcacctcccagcatctgaaaggcccgicccgcatg ccgegacagggaggigegecctaccggcactagattggageCacegegatgatg cggaagaggtegeeccegegectegacgaacgatcggagcaccacgcagtg teegeceggteccgggggtgtegeccccectggtatgetegtGeggttgecgtetgaa cggccgcggatcaagagagctcgcacatcctgtgacgggcgccgcegcaacgaa cacgagaggggatcatcacatg ccgcegeccccacccgaggctgeccgaccccteccggicgggiagectcgaGtgtt tccaaccgaatagaggagicgcaccgtg acgctccctgacccggtttgcateggcacggtaggctggtggtcGctgggaatage agacggcggctcttcgccctcctccctigatgacaaggccggcaccctctccactga aggacagcactatg tgaccgggtigatccacagctgctggeccgcciagagtggggAttcgcctcgacgg ttecgtcggggcgtccgtgcgagtgcaaggagiccaacgtg acgccccgctgacggtcgggggeccgggcgtagcctgatggcGactgtcgacaa ggaggcatcagatg ctcatggtgicggatttcccegggggagaacaggtatcgtggctctcGccgcatcatc tgatgcaccatctgcaatgagaggaacagacgtg cgtgccgggcticccgaccacagacccgcgtgcaatactcatcggGtggtcgtcgt cgcccacagcgatgagccatgagcatcacatccatcaccacggatcgtcgggca cgtacctgcccgtgaaggagaacaccgaaatg gegeccgegggcggicgggcegccacccgatcccgiaggcigagcGggtcagct gatccagcgcggacgcctccggacgcccecggcgecggeccgegcegacaaccg gaggateccgtg ccccgicggcgagatgggcttctecccggcctgacctgctaaggtggcatcActtg cgagcacatcaccgtgctccctgcgtcgagagaacgcgttccctcctcgecccgat cagatcgccgcacaggecgacggggccgagtg ccaattggatgcatccattgcaatccatgcatgcgtcigicatcctggtgeTccaccg actgaaggacgcatcatg acaggtgatgcgcatatgaccagggcacggaagatcgtgctagaaaggcgtcGt cccacccacccagaggaaggaacggcaatg 94 98 78
363. te N acetyltransferase ornithine acetyltransferase 4 aminobutyrate aminotransferase arylesterase O acetylhomoserine thiol lyase oxidoreductase hypothetical secreted protein nucleoside diphosphate sugar epimerase xylose isomerase thiosulfate sulfurtransferase gamma glutamyltranspeptidase cold shock protein 30S ribosomal protein S1 sugarkinase ROK family dTDP glucose 4 6 dehydratase dTDP 4 dehydrorhamnose 3 5 epimerase acetyltransferase phosphoribosylaminoimidazole succinocarboxamide synthase fructose 1 6 bisphosphatase two component system response regulator putative sugar phosphate isomerase epimerase deoxyribose phosphate aldolase 1 5 1 5 111 3 1 2 1 2 11 2 1 4 111 3 V 2 V 2 1 1 1 1 1 2 111 3 V 1 V 2 V 2 1 3 1 3 1 2 1 1 V 2 111 3 1 1 IV 6 1 1 1 1 IV 5 V 1 1 2 111 3 111 3 1 1 1 3 V 2 1 3 111 3 1 2 1 2 V 1 1 2 V 1 V 2 1 1 1 1 1 2 IV 5 IV 4 111 3 1 1 1 2 11 2 V 1 1 3 1 1 IV 3 1 1 1 3 159 O OPD r N WO _ oO _ D Pr oODPRPD OW e N 000ODPPOODPDPODPDFrO PD CDDPRrODDB N A N Anhang Fortsetzung Tabelle 22 zytoplasmatisches Proteom von Cmm382 in XMM Medium 11 11 11 11 11 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 9 0 O O O O O O oO OOODNNSNNNSN NS 0 00 OO 00 00 PL PFOICTCTCTCTCTITODIODO OD DDO OD gt CMM 1884 CMM_1643 pepA CMM_2242 CMM_2890 CMM 2110 CMM _2613 rpsS CMM_1634 gInA2
364. te binding protein IV 1 19 8 CMM_2188 conserved membrane protein putative transporter SSS family IV 1 17 9 CMM_2438 L arabinose ABC transporter substrate binding protein IV 1 17 0 CMM_2108 sugar ABC transporter permease component IV 1 16 4 pCM2_0059 conserved hypothetical protein V 2 Anhang Fortsetzung Tabelle 23 H here Transkriptmengen in XMM Medium als in M9 Medium 14 6 14 3 13 3 13 3 13 0 11 2 10 9 10 9 10 6 10 5 9 6 8 8 8 8 8 7 8 6 8 5 8 4 8 3 8 3 8 0 8 0 7 8 7 5 7 3 7 2 7 0 6 6 6 6 6 3 6 2 6 1 6 1 6 0 5 9 5 8 5 8 5 7 5 7 5 7 5 6 5 6 5 5 5 5 5 4 5 4 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 1 5 0 5 0 4 9 4 9 4 8 4 8 4 7 4 7 4 5 4 3 4 3 4 1 4 0 CMM_2107 CMM_0198 CMM_0975 CMM_0866 CMM_2527 CMM_0521 CMM_1314 CMM_0086 CMM_1877 CMM_1448 CMM_2782 CMM_2733 CMM_0035 CMM_0112 CMM_0520 CMM_2843 pCM2_0060 CMM_2758 pCM1_0001 CMM_0620 CMM_0441 CMM_2731 CMM_0034 CMM_1662 fadA CMM_0865 CMM 2664 CMM _0619 putA CMM_2665 CMM_2845 CMM_0678 pknC CMM_1587 CMM_0922 acsA1 CMM_2730 CMM_1831 glpK CMM_0451 CMM_0245 CMM_2077 aspA CMM_2779 CMM_2781 CMM_0345 CMM_0442 CMM_2196 gcvH CMM_0795 CMM_0296 CMM_1885 dctA CMM_0058 CMM_0630 rocD CMM_2437 CMM_0247 CMM_1661 fadB CMM_0265 CMM_1259 CMM_1829 CMM_2485 CMM_0095 cytB CMM_2197 gcvT CMM_1474 CMM_0094 cytA CMM_2279 CMM_0883 bglJ CMM_0976 CMM_2424 CMM_1557 CMM_ 2435 abfA2 sugar ABC tran
365. teasen Von den 46 Genen im Genom von C michiganensis subsp michiganensis die f r extrazellul re Proteine kodieren COG Gruppe IV 6 Fl gel et al 2012 wurden somit in dieser Arbeit mittels MALDI ToF MS insgesamt 13 Proteine im Medien berstand einer Cmm882 Kultur in M9 oder XMM Medium identifiziert Tabelle 10 Au erdem wurden 13 Proteine identifiziert die als m gliche sekretierte Proteine annotiert worden waren Zum Teil wurden jedoch im Medien berstand auch nicht extrazellul re Proteine identifiziert wie zum Beispiel das Chaperon GroES und ein Transkriptionsregulator Die Analyse mittels MALDI ToF MS ist sehr sensitiv und kann auch noch Protein im Femtomol Bereich detektieren Hou et al 2010 Bei einer leichte Verunreinigungen des Medien berstandes mit zytoplasmatischen Proteinen werden diese ebenfalls identifiziert Eine Liste aller 506 identifizierter extrazellul rer Proteine befindet sich im Anhang Tabelle 19 und Tabelle 20 Bei der Analyse dieser Liste fiel auf dass nur in einem der Triplikate Proteine identifiziert wurden die plasmidkodiert pCM1 oder pCM2 waren Des Weiteren wurden in den einzelnen Replikaten weitere Serinproteasen und hydrolytische Enzyme identifiziert sowie sekretierte Proteine der COG Gruppe V 2 Tabelle 11 Im Medien berstand einer Cmm382 Kultur in M9 Medium wurden mit Ber cksichtigung der Proteine die nur in einem oder zwei der Replikate identifiziert worden waren 23 extrazellul re Proteine de
366. tein DNA directed RNA polymerase subunit alpha 30S ribosomal protein S7 30S ribosomal protein S2 glycerol kinase oligopeptide ABC transporter SBP 50S ribosomal protein L19 hypothetical secreted protein 50S ribosomal protein L4 hypothetical secreted protein conserved hypothetical protein 50S ribosomal protein L32 50S ribosomal protein L15 conserved secreted protein 50S ribosomal protein L33 expansin 50S ribosomal protein L9 fructose bisphosphate aldolase transcriptional regulator LytR family nucleoside diphosphate kinase conserved secreted protein 50S ribosomal protein L17 trigger factor TF prolyl isomerase chaperone glutamine synthetase chaperone protein dnaK heat shock protein 70 putatively involved in pyridoxine biosynthesis 30S ribosomal protein S1 50S ribosomal protein L18 conserved hypothetical protein elongation factor Ts EF Ts putative Fe dependent peroxidase transketolase IV 1 111 3 111 3 111 3 V 2 1 1 111 3 111 3 111 3 111 3 IV 7 111 3 11 2 IV 5 IV 5 IV 6 V 2 111 3 1 1 IV 3 111 3 IV 5 111 3 IV 3 11 2 111 3 IV 1 111 2 111 3 111 3 IV 1 IV 1 111 3 V 2 111 3 V 2 V 2 111 3 111 3 V 2 111 3 IV 6 111 3 1 1 IV 3 1 3 V 2 111 3 IV 4 1 2 IV 4 1 5 111 3 111 3 V 2 111 3 IV 1 1 1 E u e o n n a a H WH HA a a a apo O HAH AB AaB pO Hh HB Ba ph n se eS 0a amp SH OP 150 pCM2_0007 conserved hypothetical protein V 2 Anhang 151 7 3
367. tein L28 transcriptional regulator with FHA domain purine nucleoside phosphorylase cold shock protein 50S ribosomal protein L23 30S ribosomal protein S20 argininosuccinate synthase conserved hypothetical protein putative general stress protein 50S ribosomal protein L16 fumarate hydratase oxidoreductase stress induced protein putative organic hydroperoxide resistance protein phosphoenolpyruvate carboxykinase conserved secreted protein putative Fe S cluster assembly protein ABC transporter IV 6 1 1 IV 6 111 3 IV 1 V 2 1 1 111 3 111 3 1 1 111 3 111 3 V 2 IV 1 1 2 111 3 1 5 1 2 1 1 111 3 V 1 IV 6 111 3 111 3 111 3 111 3 1 2 IV 7 V 2 1 1 IV 1 IV 1 IV 6 11 2 111 3 111 3 1 1 IV 1 11 2 1 5 V 2 1 2 111 3 IV 3 1 3 IV 4 111 3 111 3 1 2 IV 4 111 3 1 1 V 1 IV 5 1 1 V 2 IV 5 32 noom BA aap wWA e n H a a 022 app Bean nn O O Do pp a 147 Anhang Fortsetzung Tabelle 19 extrazellul res Proteom von Cmm382 in M9 Medium NONNNMNNN CMM_0903 asdA CMM_0872 cysB CMM_1521 CMM_2169 CMM_2709 CMM_0969 sdhB CMM_0560 CMM 2252 aspartate semialdehyde dehydrogenase cystathionine beta synthase transcriptional regulator LytR family surface protein putative RTX toxin secreted metallopeptidase family M23 succinate dehydrogenase iron sulfur protein transcriptional regulator conserved secreted protein 1 2 1 2 IV 3
368. tein V 2 84 192 CMM_0879 sugar ABC transporter SBP IV 1 73 CMM_2161 peptidyl prolyl isomerase IV 4 71 CMM_0819 wcoA cell surface protein 11 2 e jemnaseemm Hantiedchai amoan AO wa 67 129 CMM_0044 ppaC extracellular serine protease IV 6 Ergebnisse 82 cag m ae in Gen Name m gliche Funktion COG 66 782 CMM_0071 ppaE extracellular serine protease IV 6 61 _ CMM_0638 eee v7 56 40 CMM_1022 wcgK secreted protein 1 2 56 38 CMM_0466 conserved secreted protein V 2 56 CMM_0431 A TTA 51 61 CMM_0931 pbpE D alanyl D alanine carboxypeptidase 11 2 51 CMM_1790 anion ABC transporter SBP IV 1 47 635 CMM_0278 chorismate mutase 1 2 44 762 CMM_1942 ppaG extracellular serine protease IV 6 43 CMM_1800 aroE aminodeoxychorismate lyase 1 5 42 51 CMM_0049 nagA beta N acetylglucosaminidase 1 1 39 CMM_2434 serine protease family S1C IV 7 28 CMM_0627 cell wall associated protein 11 2 26 1 507 CMM_2176 conserved secreted lipoprotein IV 1 jo ln 21 CMM_0560 transcriptional regulator IV 3 10 CMM_0911 hypothetical protein sortase sorted 11 2 6 9 CMM_1480 expA expansin IV 6 633 CMM_0764 ppaF extracellular serine protease IV 6 197 CMM_2006 g uB glutamate ABC transporter SBP IV 1 126 CMM_1389 conserved secreted protein V 2 125 CMM_1611 cspA7 cold shock protein IV 4 117 CMM_1960 peptide ABC transporter
369. tektiert in XMM Medium waren es 22 Proteine Tabelle 11 Mittels MALDI ToF MS identifizierte extrazellul re oder sekretierte Proteine die nur in einem oder zwei der Triplikate vorkamen M M9 Medium X XMM Medium Funktion Medium Gen Name Serinprotease CMM _0039 chpE CMM_0764 chpF CMM_1947 ppaH pCM2_0052 phpB pCM2_0053 phpA M CMM_0070 sbtA CMM_2535 sbtB CMM _1948 ppal pCM1_0023 ppaJ pCM2_0054 x XM pat n Pektat Lyase X M CMM_0043 pelA1 CMM_0051 pelA2 Nukl ease M CMM_0795 Phosphatase Xylanase X CMM_1673 xysA CMM_1674 xysB Ergebnisse 84 Funktion Medium Gen Name Endoglucanase M CMM_ 2692 Cellulase X M pCM1_0020 celA Polygalacturonase M CMM_2871 Metallopeptidase M CMM_2709 konservierte X CMM _0429 CMM _0608 CMM_1389 CMM_1405 sekretierte Proteine CMM_2204 M CMM_0178 CMM_0235 CMM_0337 CMM_0511 CMM_1411 CMM_2693 CMM_2921 X M CMM_0128 CMM_0132 CMM_2252 CMM_2491 hypothetische x CMM_ 2431 CMM_2549 SENSE M CMM_1081 CMM_1250 CMM_2902 X M CMM_0441 CMM_1248 CMM_1921 Neben den extrazellularen Proteinen wurden in dieser Arbeit auch die zytoplasmatischen Proteine von C michiganensis subsp michiganensis analysiert Die zytoplasmatischen Proteine die in allen drei Replikaten auftraten sind in Tabelle 12 aufgelistet wobei lediglich eine Einteilung in die jeweiligen COG Gruppen vorgenommen
370. tert die Analyse von Virulenzfaktoren es m ssen jedoch experimentell Bedingungen vorliegen bei denen eine Expression von Virulenzgenen m glich ist Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit das synthetische Medium XMM hergestellt das die Bedingungen im Xylem imitiert siehe Abschnitt 4 4 1 5 2 Das synthetische Xylemsaft imitierende Medium XMM F r die Etablierung eines Xylemsaft imitierenden Mediums f r C michiganensis subsp michiganensis wurde das Xanthomonas Apoplasten Medium XVM2 Wengelnik et al 1996 als Basismedium verwendet In XVM2 Medium konnte die Induktion von Virulenzfaktoren von Xanthomonas campestris pv vesicatoria gezeigt werden Wengelnik et al 1996 Es enth lt die Zucker Fructose und Saccharose die von Xanthomonas als Kohlenstoffquelle verwendet werden und Ammonium welches als Stickstoffquelle dient Zus tzlich werden Aminos uren zur Verf gung gestellt die f r die Expression von Virulenzgenen wichtig sind Schulte amp Bonas 1992 Der nat rliche Lebensraum von C michiganensis subsp michiganensis in der Pflanze ist das n hrstoffarme Xylem und nicht der Apoplast Aus diesem Grund wurde das Diskussion 117 Xanthomonas Apoplasten Medium an die Bedingungen im Xylem angeglichen Daf r wurde in dieser Arbeit zunachst die Zusammensetzung des Xylemsaftes bestimmt Der Xylemsaft wurde dabei aus vier Wochen alten Pflanzen isoliert und setzte sich wie folgt zusammen 0 mM Saccharose Fructose und Glucose schwanken
371. thaltene Farbstoff SYBR Green bindet nur an doppelstr ngige Nukleins uren deren Menge mit steigenden Amplifikationszyklen zunimmt Die Fluoreszenz steigt somit mit zunehmender Zyklenzahl Ab dem berschreiten der Hintergrundfluoreszenz C Wert k nnen Aussagen ber die Quantit t der RNA getroffen werden Je schneller die Hintergrundfluoreszenz berschritten wird desto gr er war die mRNA Ausgangsmenge Pfaffl 2001 Als Zielgene wurden in dieser Arbeit das Gen f r die 18S rRNA als Kontrolle sowie hsr203J und hsr201 verwendet Um die Effizienz der PCR zu berpr fen und die einzusetzende RNA Menge zu bestimmen wurde die qPCR zuerst mit einer RNA Verd nnungsreihe durchgef hrt Von der RNA aus 10 mM MgCl behandelten Bl ttern wurden 100 10 1 0 1 und 0 01 ng in Duplikaten eingesetzt Nach dem Umschreiben der mRNA in cDNA erfolgte eine PCR Reaktion mit den Primern f r das 18S rRNA Gen sowie f r die Gene hsr201 und hsr203J Die Effizienz der PCR mit den hsr201 Primern lag auch bei mehrmaliger Durchf hrung des Experiments deutlich au erhalb des vorgegebenen Bereichs zwischen 90 und 105 Real Time PCR Applications Guide Biorad M nchen Daten nicht gezeigt Ergebnisse 61 hsr201 wurde deshalb nicht weiter verwendet Die Effizienz der PCR mit den 18S rRNA Primern lag bei 96 6 Daten nicht gezeigt f r hsr203J betrug sie 108 8 Abbildung 8 A PCR Effizienz 108 8 Steigung 3 127 Schmelzkurve g
372. thetical membrane protein V 2 1 2 CMM_1427 dinB DNA polymerase IV 111 1 1 2 CMM_2436 L arabinose ABC transporter permease component IV 1 1 2 CMM_1354 recG ATP dependent DNA helicase 11 1 1 2 CMM_0017 pbpA penicillin binding protein 1 2 1 1 CMM _1403 trmU tRNA specific 2 thiouridylase 111 3 1 1 CMM_0029 g sA glutaminase 1 2 1 1 CMM _1739 pg A 6 phosphogluconolactonase 1 1 1 1 CMM _1181 O methyltransferase V 1 Tabelle 28 Mittels Microarray Experiment ermittelte C michiganensis subsp michiganensis Gene deren Transkriptmengen in M9 Medium im Vergleich mit TBY Medium erniedrigt waren 432 Gene wurden identifiziert von denen 216 eine 2 oder mehrfach ver nderte Transkriptmenge zeigten Die Gene wurden nach dem absteigenden FCA Wert geordnet FCA fold change absolute SBP substrate binding protein FCA Gen Name M gliche Funktion COG 25 6 CMM_2898 aldA L alanine dehydrogenase 1 2 18 0 CMM 2699 sugar ABC transporter substrate binding protein IV 1 15 4 CMM _0866 alpha glucoside ABC transporter SBP IV 1 14 0 CMM _0867 alpha glucoside ABC transporter permease component IV 1 13 7 CMM 2783 sugar ABC transporter substrate binding protein IV 1 13 0 CMM 2878 citrate transporter CitMHS family IV 1 11 4 CMM_0868 alpha glucoside ABC transporter permease component IV 1 10 7 CMM_0270 sugar ABC transporter substrate binding protein IV 1 10 4 CMM_0944 sugar ABC transporter substrate binding protein IV 1 10 3 CMM 1261 sugar ABC transporter
373. tibiotikum ausplattiert Die Platten wurden f r 24 h bei 37 C inkubiert 3 5 3 Herstellung kompetenter C michiganensis subsp michiganensis Die Herstellung kompetenter C michiganensis subsp michiganensis erfolgte in Anlehnung an das Protokoll von Kirchner und Kollegen Kirchner et al 2001 Die Bakterien wurden wie in Abschnitt 3 2 3 beschrieben kultiviert Anschlie end wurden 218 ml TBY Medium mit der Ubernacht Kultur auf eine oDsso von 0 2 angeimpft und bei 26 C inkubiert bis eine ODsgo von 0 6 erreicht wurde Alle weiteren Schritte wurden wie von Kirchner und Kollegen beschrieben durchgef hrt Kirchner et al 2001 Nach der Zugabe von 1 ml 15 igem v v Glycerin wurden die kompetenten Bakterien in 100 ul Aliquots in fl ssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur weiteren Verwendung bei 80 C gelagert Material und Methoden 55 3 5 4 Transformation kompetenter C michiganensis subsp michiganensis Die Transformation kompetenter C michiganensis subsp michiganensis erfolgte gem Kirchner und Kollegen Kirchner et al 2001 Die Bakterien wurden auf Eis aufgetaut Anschlie end wurden 2 5 ug DNA zugef gt und die Transformation erfolgte mittels Elektroporation durch einen Gene Pulser Biorad M nchen bei 2 5 kV 600 Q und 25 uF Die dreist ndige Inkubation erfolgte bei 26 C und 600 rpm im TS 100 Thermoshaker peqlab Biotechnologie GmbH Erlangen woraufhin die Bakterien zentrifugiert 5 000 x g 3 min im R cklauf resusp
374. tical protein V 2 1 6 CMM_2561 guaB2 inosine 5 monophosphate dehydrogenase 1 3 1 6 CMM_2090 short chain dehydrogenase oxidoreductase V1 1 6 CMM_1022 wcgk secreted protein 11 2 1 5 CMM_1677 conserved hypothetical protein V 2 1 5 CMM_1622 ahpE thiol specific antioxidant protein IV 5 1 5 CMM_0084 sugar ABC transporter permease component IV 1 1 5 CMM_1389 conserved secreted protein V 2 1 5 CMM_1185 ATP binding protein V1 1 5 CMM_2517 transcriptional regulator DeoR family IV 3 1 5 CMM_0908 tyrosine protein kinase IV 3 1 5 CMM_ 2349 fecB1 Fe3 siderophore ABC transporter substrate binding protein IV 1 1 5 CMM_0320 hypothetical protein V 2 1 5 CMM_1737 zwfA2 glucose 6 phosphate 1 dehydrogenase 1 1 1 5 pCM2_0018 conserved hypothetical protein ATPase IV 2 1 5 CMM_0463 acetyltransferase V 1 1 5 CMM_2968 trxA thioredoxin reductase IV 5 1 5 CMM_1513 Zn dependent oxidoreductase V 1 1 5 CMM_2827 transcriptional regulator GntR family IV 3 1 5 CMM_1059 two component system sensor kinase IV 3 1 5 CMM_0536 transcriptional regulator MarR family IV 3 1 5 CMM_2138 conserved secreted protein V 2 1 5 CMM_0399 conserved hypothetical protein V 2 1 5 CMM_0914 flavin dependent oxidoreductase monooxygenase V 1 1 5 CMM_0093 transport protein RND family IV 1 1 5 CMM_1730 putative Fe S cluster assembly protein ABC transporter IV 5 1 5 CMM_0285 permease DMT family IV 1 1 5 CMM_2879 conserved membrane protein V 2 1 5 CMM_0510 hypothetical protein V 2 1 5 CM
375. tod in Form einer Nekrose zu erkennen In N benthamiana Bl ttern war 2 dpi kein Unterschied zur Kontrolle sichtbar Daten nicht gezeigt 8 dpi zeigten die mit Cmm100 und Cmm382 infiltrierten N tabacum Bl tter eine Ergebnisse 59 deutliche Nekrose Abbildung 7 B Mitte und rechts N benthamiana Blatter zeigten nach der Infektion mit Cmm100 lediglich chlorotisches Gewebe nach der Infektion mit Cmm382 war eine deutliche Nekrose zu erkennen Abbildung 7 C Abbildung 7 Nicotiana Bl tter nach der Infiltration von C michiganensis subsp michiganensis Von links nach rechts 10 mM MgCl Cmm100 und Cmm382 N tabacum Bl tter A 2 dpi und B 8 dpi Nekrotisches Gewebe war nach der bakteriellen Infektion zu erkennen zum Teil auch schon nach zwei Tagen C N benthamiana Bl tter die acht Tage nach der Infektion mit Cmm100 Chlorose Mitte und mit Cmm382 Nekrose rechts zeigten Da der Zelltod in N tabacum Bl ttern schneller zu erkennen war wurde f r nachfolgende Experimente diese Tabakart gew hlt Ob die Ausbildung nekrotischen Gewebes durch eine HR hervorgerufen wurde wurde auf molekularer Ebene analysiert Ergebnisse 60 4 2 2 Molekulare Analyse der Nicotiana Infektion F r die Ausbildung einer Resistenz gegen ber Pathogenen wurden einige pflanzliche Proteine identifiziert die bei der Entstehung einer HR eine Rolle spielen In Tabakpflanzen wird die Expression der beiden Gene hsr201 und hsr203J hypersensitivity related
376. tome ausl st werden die Bakterien als phytopathogen oder virulent bezeichnet Rietz amp Parker 2007 Ein Beispiel f r Krankheitssymptome ist die Chlorose bei der es zu einer Gelbf rbung der Bl tter kommt Hervorgerufen wird dies durch eine anormale Akkumulation von Glucose im Phloem zum Beispiel aufgrund bakterieller Toxine Hogenhout amp Loria 2008 Ein weiteres Symptom ist die Blattwelke die durch eine Verstopfung vaskul rer Gef e aufgrund einer bakteriellen Aggregation hervorgerufen werden kann Des Weiteren kann es zu einer Zerst rung des St ngelgewebes durch bakterielle hydrolytische Enzyme kommen Diese greifen die Bestandteile der pflanzlichen Zellwand Cellulose Hemicellulose Pektin sowie Lignin an was zu L sionen und offenen Wunden im St ngel f hrt Rietz amp Parker 2007 Als weiteres Beispiel f r Krankheitssymptome kommt es bei einer Infektion mit Agrobacterium tumefaciens zu einer St rung der Phytohormon Balance und dadurch zu einer unkontrollierten Pflanzenzellteilung Tumorbildung Rietz amp Parker 2007 2 1 2 Evolutionsbedingte Anpassung von Pflanze und Bakterium Eindringende pathogene Bakterien werden von der Pflanze ber spezifische Rezeptoren erkannt die an bakterielle Pathogen assoziierte molekulare Muster pathogen associated molecular pattern PAMPs binden PAMPs sind Proteine die auf der bakteriellen Oberfl che lokalisiert sind oder vom Bakterium in die Umgebung abgegeben werden Abbildu
377. tor IcIR Familie CMM_2691 Endoglucanase SP TMD CMM_2692 Endoglucanase TMD oa CMM_2766 2 Komponenten System Antwort Regulator pCM2_0056 Transkriptionsregulator Zusammenfassung 1 1 Zusammenfassung Clavibacter michiganensis subsp michiganensis dringt ber nat rliche ffnungen und Verwundungen in seine Wirts Pflanze Solanum Iycopersicum Tomate ein verbreitet sich dort systemisch ber die Xylemgef e und verursacht Krankheitssymptome wie Blattwelke und St ngell sion Die in vivo Analyse von Virulenzfaktoren die an der Wirt Pathogen Interaktion beteiligt sind w re ideal ist jedoch technisch u erst schwierig Au erdem wird die Analyse einer Infektion mit C michiganensis subsp michiganensis zum einen durch eine m gliche Latenzzeit der Bakterien erschwert zum anderen durch uneinheitlich auftretende Krankheitssymptome Aus diesem Grund war ein zentrales Thema dieser Arbeit die Etablierung eines synthetischen Xylemsaft imitierenden Mediums zur in vitro Analyse von Virulenzfaktoren von C michiganensis subsp michiganensis Um die nat rliche pflanzliche Umgebung in vitro widerzuspiegeln wurde das Apoplasten Medium XVM2 in dem Virulenzfaktoren von Xanthomonas eine erh hte Expression zeigten Wengelnik et al 1996 an den Lebensraum von C michiganensis subsp michiganensis angepasst Dazu wurde zun chst die Zusammensetzung des Xylemsaftes analysiert und anschlie end basierend auf dem
378. torello et al 2004 2 2 3 Methoden zur Charakterisierung und Analyse von Virulenzfaktoren Die Charakterisierung und Analyse von Virulenzfaktoren wird auf DNA Ebene mit Hilfe von in silico Analysen oder Mutagenesestudien durchgef hrt Eine Mutation des Zielgens erfolgt dabei durch Insertions Deletions oder Transposonmutagenese Auf RNA Ebene k nnen Microarray Experimente oder RNA Sequenzierungen durchgef hrt werden Informationen auf Proteinebene werden ber Massenspektrometrie Yeast 2 Hybrid Systeme oder die Aufkl rung der Proteinstruktur sowie durch in silico Analysen erhalten Setubal et al 2005 Watt et al 2005 Ryan et al 2011 2 3 Die Gattung Clavibacter 2 3 1 Von der Gattung Corynebacterium zur Gattung Clavibacter Die Gattung Clavibacter wurde 1984 erstmalig von Davis und Kollegen als Ausl ser der ratoon stunting Krankheit in der Zuckerr be und dem Bermudagras beschrieben Davis et al 1984 Bei der ratoon stunting Krankheit zeigen Pflanzen keine sichtbaren Krankheitssymptome die Vitalit t und das Wachstum sind jedoch stark eingeschr nkt Tiwari et al 2012 Davor wurden alle Arten der Gattung Clavibacter aufgrund der St bchenform und der Vervielf ltigung durch Schnappteilung zur Gattung Corynebacterium gez hlt Die 1984 beschriebenen f nf Clavibacter Arten wurden 1993 in die beiden Gattungen Clavibacter und Rathayibacter aufgeteilt vor allem aufgrund der unterschiedlichen Zellwand Einleitung 12 Zusamme
379. transporter ATPase thioesterase conserved membrane protein conserved hypothetical protein putative nuclease UDP N acetylmuramate L alanine ligase CMM_PS_11 DNase thioredoxin conserved hypothetical protein signal recognition particle component ATP dependent DNA helicase conserved hypothetical protein 176 Fortsetzung Tabelle 26 Niedrigere Transkriptmengen in XMM Medium als in TBY Medium 11 2 VA U4 V 2 V 2 IV 3 V 2 V 1 11 2 V 2 IV 3 V 2 1 3 111 1 1 5 V 2 U4 IV 1 IV 4 V 2 IV 1 11 1 1 6 1 2 1 3 V 2 1 1 V 2 11 2 11 1 1 1 1 3 V 2 11 2 1 1 IV 1 V 1 IV 5 111 3 V 2 1 2 IV 2 1 1 111 3 V 2 111 3 IV 1 V 2 1 1 111 3 IV 1 1 4 V 2 V 2 11 2 V 2 U4 IV 5 V 2 IV 2 111 1 V 2 Anhang 177 Fortsetzung Tabelle 26 Niedrigere Transkriptmengen in XMM Medium als in TBY Medium 1 2 CMM_0092 regA two component system sensor kinase IV 3 1 1 CMM_2266 pyrophosphatase 1 6 1 1 CMM_1202 conserved hypothetical protein V 2 1 1 CMM_0456 hypothetical protein V 2 1 1 CMM_1001 hypothetical membrane protein V 2 1 1 CMM_1722 3 oxoacyl acyl carrier protein reductase 1 4 Tabelle 27 Mittels Microarray Experiment ermittelte C michiganensis subsp michiganensis Gene deren Transkriptmengen in M9 Medium im Vergleich mit TBY Medium erh ht waren 315 Gene wurden identifiziert von denen 127 eine 2 oder mehrfach erh hte Transkriptmenge zeigten Die Gene wurden nach dem absteigenden FCA Wert g
380. tre Exonuclease Biozym Oldendorf behandelt Nach dem Entfernen der Tri und Diphosphate Epicentre RNA 5 Polyphosphatase Biozym Oldendorf wurde eine 5 Adapter Ligation durchgef hrt wobei ein RNA Adapter 5 CCCUACACGACGCUCUUCCGAUCGAG 3 an das 5 Ende der mRNA geh ngt wurde Die reverse Transkription Transkriptase Invitrogen GmbH Karlsruhe erfolgte mittels Loop DNA Adapter AGATCGGAAGAGAGACGTGTG CTCTTCCGATCTNNNNNNN 3 Die Adapter Oligonukleotide wurden ber Metabion Martinsried bezogen Es folgten eine cDNA Amplifizierung mit der Phusion Polymerase NEB Schwalbach ein oder mehrere Aufreinigungsschritt e mittels AMPure beads Beckmann Coulter Krefeld und st ndige Analysen mit Hilfe des DNA High Sensitivity Assays Agilent Technologies B blingen um die Qualit t er cDNA zu berpr fen Anschlie end wurde die cCDNA Bibliothek sequenziert Illumina San Diego USA Material und Methoden 44 3 4 Biochemische Techniken 3 4 1 Analyse der Ammoniumkonzentration F r die Bestimmung der Ammoniumkonzentration wurde ein abgewandelter Indophenoltest nach Jahns und Kollegen durchgef hrt Jahns et al 1988 Ein spezifisches Probenvolumen wurde mit 50 mM KH PO Puffer pH 7 auf 1 mi aufgef llt Nach einer zehnmin tigen Inkubation bei 37 C wurden nacheinander je 1 ml L sung und II zugegeben und die Probe wurde f r 15 min bei 50 C inkubiert Die Absorption wurde bei einer Wellenl nge von 546 nm bestimmt
381. tten einige Tage bei 28 C inkubiert Auf allen Platten wurden keine Bakterien nachgewiesen Entweder wurden Bakterien die in den Samen eindringen konnten durch das Natriumhypochlorit abget tet oder es war den Bakterien nicht m glich in den Samen zu gelangen Drei Wochen nach der Sameninfektion mit Cmm382 Cmm100 und Cmm102pDM302Ppat 1gfp waren jeweils zwei der infizierten Samen gekeimt Der Keimling wurde in Samenh lle Wurzel Hypocotyl und Cotyledonen aufgeteilt Die einzelnen Bestandteile wurden anschlie end in 10 mM K PO Puffer inkubiert die Suspensionen ausplattiert und die Platten einige Tage bei 28 C gelagert Die St mme Cmm382 und Cmm100 konnten in den Suspensionen nicht nachgewiesen werden Cmm102pDM302Ppat 1gfp konnte im Keimling jedoch nicht mehr auf der Samenh lle detektiert werden Daten nicht gezeigt Die Bakterien waren vor allem in der Keimwurzel lokalisiert konnten aber auch in abnehmender Kolonienzahl im Hypocotyl und den Cotyledonen nachgewiesen werden Ein Eindringen des Stammes Cmm102pDM302Ppat 1gfo von der Samenh lle in den Keimling wurde somit nachgewiesen Um das Eindringen der Bakterien ph notypisch zu analysieren wurden die Keimlinge die aus den infizierten Samen hervorgingen f nf Wochen nach der Infektion auf Krankheitssymptome untersucht Abbildung 14 Ergebnisse 70 Abbildung 14 Krankheitssymptome von Tomatenkeimlingen funf Wochen nach der Infektion Die Samen wurden in vitro in A 10 mM MgClo B
382. tures was another main goal of this work Homologue sequences between the chromosome and the two natural plasmids made the analyses difficult The two gene products of CMM_2408 and CMM_2766 were found to be involved in the regulation of pat T gene expression as repressor proteins In addition the analysis of 48 promoter regions led to conserved nucleotides in the 10 region and the Shine Dalgarno sequence but not in the 35 region Beside the host pathogen interaction the analysis of the non host interaction between C michiga nensis subsp michiganensis and Nicotiana tabacum tobacco was also part of this work This incompatible interaction was shown phenotypical and in first experiments on a molecular level The observed necrotic leaf tissue and the increased transcript amount of hsr203J after the Summary 4 bacterial infection indicate a hypersensitive response of the plant as an answer to the infection Usually the inhibition of the bacterial growth is also part of the hypersensitive response In this work the growth of C michiganensis subsp michiganensis up to 72 hours after infection was not affected Einleitung 5 2 Einleitung 2 1 Pflanzen Bakterien Interaktion Im Jahr 2012 wurden weltweit insgesamt 20 Millionen Tonnen der Nutzpflanzen Reis Mais und Weizen produziert Quelle Food and Agriculture Organization FAO Trotzdem gelten noch 12 der Weltbev lkerung vor allem in Entwicklungsl ndern als unterern hrt Quelle FAO
383. ubsp michiganensis gezeigt werden in der Einleitung 19 Virulenz des Bakteriums spielt TomA jedoch wahrscheinlich keine gro e Rolle Kaup et al 2005 Eine Mutation der gesamten chp tomA Region f hrte verglichen mit dem Wildtyp zu einer geringeren Kolonisierungsdichte in der Pflanze und zu einer reduzierten Virulenz Chalupowicz et al 2010 Cellulasen tragen als hydrolytische Enzyme ebenfalls zur Virulenz des Bakteriums bei Neben ce A existiert im Genom von C michiganensis subsp michiganensis ein weiteres Gen f r eine Cellulase ce B welches jedoch ein putatives Pseudogen ist Gartemann et al 2008 Neben den Cellulasegenen sind zus tzliche Gene vorhanden die f r hydrolytische Enzyme kodieren Dazu geh ren Endoglucanasen CMM_2691 und CMM_2692 eine Xyloseisomerase xylA Pektat Lyasen pe A7 und pelA2 Xylanasen xysA und xysB eine Polygalacturonase pgaA Perforin CMM_2382 eine Phospholipase C CMM_0504 und 16 Glycosylhydrolasen http cmr jcvi org Gartemann et al 2008 Savidor et al 2012 Ein Signalpeptid f r den Export oder eine Transmembrandom ne ist in den meisten F llen vorhanden Tabelle 1 Die Phospholipase C spielt zum Beispiel bei der Pathogenit t des Pilzes Magnaporthe oryzae in Reispflanzen eine Rolle Rho et al 2009 Extrazellul re Enzyme attackieren die pflanzliche Zellwand um die N hrstoffversorgung des Bakteriums zu erh hen Werden die W nde von Xylemgef e attackiert kann dies zu ei
384. ucose 6 phosphate 1 dehydrogenase hydantoinase AICAR transformylase IMP synthetase ribulokinase ornithine aminotransferase stress induced protein putative organic hydroperoxide resistance protein 30S ribosomal protein S15 NAD dependent aldehyde dehydrogenase cysteine synthase aminopeptidase N conserved hypothetical protein deoxyuridine 5 triphosphate pyrophosphatase 50S ribosomal protein L31 type B acetyl propionyl CoA carboxylase subunit argininosuccinate lyase dihydroxy acid dehydratase L arabinose isomerase methionine R sulfoxide reductase conserved hypothetical protein citrate synthase antimicrobial peptide ABC transporter permease component maltooligosyltrehalose synthase ribosome recycling factor ribosome releasing factor ATP synthase F ATPase gamma subunit methionine aminopeptidase DNA RNA binding protein 30S ribosomal protein S6 50S ribosomal protein L13 maltooligosyl trehalose trehalohydrolase 50S ribosomal protein L27 3 5 cyclic nucleotide phosphodiesterase Zn dependent alcohol dehydrogenase conserved hypothetical protein adenylate kinase 30S ribosomal protein S17 oxidoreductase possibly involved in inositol metabolism oxidoreductase similar to E3 component of 2 oxoglutarate dehydrogenase complex L threonine aldolase IV 3 1 2 IV 5 V 2 V 1 111 3 1 2 IV 2 111 3 1 1 IV 3 1 2 V 2 V 1 IV 5 1 5 IV 1 111 3 IV 5 IV 1 1 1 111 3 IV 1 111 3 V 1 111 3 11
385. udomonas Unterarten Boch amp Bonas 2001 Zu den Gram positiven Bakterien geh ren zum Beispiel die Aktinobakterien Gattungen Clavibacter Leifsonia Rhodococcus und Streptomyces und die Firmicute Gattung Spiroplasma Hogenhout amp Loria 2008 Das Wirtsspektrum kann dabei sehr gro sein wie es zum Beispiel bei Erwinia Rhodococcus und Streptomyces der Fall ist Es reicht von landwirtschaftlich wichtigen Pflanzen wie Kartoffeln bis zu Modellorganismen wie Arabidopsis Die Arten und Unterarten von Pseudomonas Clavibacter und Leifsonia sind im Gegensatz dazu wirtsspezifisch Hogenhout amp Loria 2008 Wichtig f r die Wirtserkennung und besiedelung sind bakterielle Virulenzfaktoren 2 2 Virulenzfaktoren phytopathogener Bakterien Zu den bekanntesten bakteriellen Virulenzfaktoren geh ren Oberfl chenstrukturen wie extrazellul re Polysaccharide Adh sine Pili Flagellen und Fimbrien sowie Proteine in Sekretionssystemen und sekretierte Enzyme B ttner amp Bonas 2010 Die Expression von Virulenzgenen kann durch spezifische Proteine reguliert werden die durch einen bestimmten Reiz die Genexpression bei einer Infektion aktivieren F r einige Transkriptionsregulatoren der Familien OmpR Bonas et al 2000 PidR Karki et al 2012 und MarR Wei et al 2007 ist eine Beteiligung an der bakteriellen Virulenz bekannt Einleitung 9 2 2 1 Virulenzfaktoren in Gram negativen Bakterien Gram negative Bakterien k nnen ber Oberfl chenst
386. um k nnte jedoch eine Expressions nderung Substanz spezifischer Gene zur Folge haben In A tumefaciens dient die phenolische Substanz Acetosyringon als Signal f r die Expression von Virulenzgenen und wird bei einer Verwundung der Pflanze nach au en abgegeben Engstr m et al 1987 Baker et al 2005 Um die m gliche Rolle von Acetosyringon in der Virulenzgenregulation von Cmm382 zu berpr fen wurden in dieser Arbeit erneut Microarray Experimente durchgef hrt Dem Xylemsaft imitierenden Medium XMM wurden dabei 20 uM Acetosyringon AS M Thran Universit t Erlangen N rnberg m ndliche Mitteilung 2012 zugef gt Anschlie end wurden die Transkriptmengen in den Medien XMM und XMM AS verglichen Abbildung 23 zeigt die prozentuale Zuordnung der Gene die eine ver nderte Transkriptmenge zeigten zu den einzelnen COG Gruppen H hereTranskriptmenge NiedrigereTranskriptmenge 270 198 16 E Metabolismus 20 36 E i Zellul re Prozesse fo E Ill Informationsspeicherung und prozessierung E IV Potentiell relevant in der phytopathogenen Interaktion E V Unzureichend charakterisiert 33 5 4 COG Gruppe IV 9 er E Transporter E Proteintransport E Regulatoren nash Stress Resistenz Extrazellul re Enzyme Intrazellul re Proteasen 6 Abbildung 23 Prozentuale Zuordnung der Cmm382 Gene aus DNA Microarray Experimenten deren mRNA Level in XMM Medium Acetosyringon AS h her bzw niedriger war als in XMM
387. umgehen und die Bakterien au erdem mittels GFP Fluoreszenzmikroskopie in vivo zu detektieren wurde der Wildtypstamm Cmm382 mit dem Vektor pDM302Ppat Tgfp transformiert der das Gen f r eine Neomycin Resistenz tr gt Das nat rliche Plasmid pCM1 und der Vektor pDM302 k nnen aufgrund der Inkompatibilit t nicht gleichzeitig in der Bakterienzelle vorkommen Nach der Elektroporation der Bakterien mit pDM302Ppat 1gfp ging pCM1 verloren sodass der Stamm Cmm102pDM302Ppat Tgfp resultierte der nur noch pCM2 als nat rliches Plasmid besa Dieser konnte auf TBY Platten mit Neomycin selektiert werden Cmm102 l st Ergebnisse 67 in der Wirtspflanze nur noch abgeschwachte Krankheitssymptome aus und die Pflanze bildet trotz fr her Infektion Fr chte Aus diesem Grund wurde in diesem Experiment die Wurzelinfektion an Stelle der Petiolusinfektion durchgef hrt Neben dem Cmm102 Stamm wurde der Stamm Cmm1i00pDM302Ppat Tgfp verwendet Cmm100 enth lt weder pCM1 noch pCM2 wodurch die Pflanze zwar besiedelt werden kann aber keine Krankheitssymptome ausgel st werden 42 dpi zeigten Pflanzen die mit dem Cmm102 Stamm infiziert worden waren erste Welkesymptome die sich im Laufe der Zeit auf die gesamte Pflanze erstreckten Abbildung 12 B Im Gegensatz dazu zeigten Cmm100 infizierte Pflanzen keine Krankheitssymptome Abbildung 12 A Abbildung 12 Krankheitssymptome nach der Wurzelinfektion mit Cmm102pDM302Ppat 1gfp A Tomatenpflanze acht Wochen nach
388. und Methoden 40 wurde die Membran f r 5 min in Detektionspuffer quilibriert mit CSPD L sung 1 100 in Detektionspuffer benetzt und in Klarsichtfolie gelegt Nachdem die Membran im Dunkeln f r 15 min bei 37 C inkubiert worden war erfolgte die Detektion der Lichtemission mittels Chemidoc XRS molekularem Imager Biorad M nchen f r maximal 2 h 20 x SSC 3 M NaCl 0 3 M Tri Natriumcitrat pH HCI 7 0 Sterilisation durch Autoklavieren Pr hybridisierungsl sung 100 ml 50 ml Formamid 20 ml 10 x Blockierungs L sung 25 ml 20 x SSC 1 ml 10 iges w v N Lauroylsarkosinat 100 ul 20 iges w v SDS 3 9 ml RNase freies H2Opigest 1 x Blockierungsl sung 10 x Blockierungsl sung Roche Diagnostics Mannheim wurde kurz vor dem Gebrauch mit 1 x Maleinsaurepuffer auf 1 x Blockierungsl sung verd nnt 1 x Maleins urepuffer 0 1 M Maleinsaure 0 15 M NaCl pH NaOH 7 5 Sterilisation durch Autoklavieren 1 x Waschpuffer 1 x Maleinsaurepuffer mit 0 3 v v Tween 20 steril Detektionspuffer 0 1 mM Tris 0 1 M NaCl pH HCI 9 5 Sterilisation durch Autoklavieren 3 3 2 6 Quantitative real time reverse Transkriptase PCR qPCR Um Unterschiede in der Transkriptmenge spezifischer mRNAs erkennen zu k nnen wurde die quantitative real time reverse Transkriptase RT PCR qPCR durchgef hrt Dazu wurden Tabakbl tter von N tabacum cv Samsun NN mit C michiganensis subsp michiganensis wie in Abschnitt 3 2 5 beschrieben infi
389. und in M9 Medium 15 479 792 reads C Ruckert CeBiTec Universitat Bielefeld m ndliche Mitteilung 2013 Die mittels VAMP 1 7 5 identifizierten 5 Transkripte mit der h chsten read Zahl in pCM1 pCM2 und auf dem Chromosom sowie deren Abstand zum n chstgelegenen Gen sind in Tabelle 17 aufgelistet In pCM1 war das read Muster der RNA aus einer Cmm882 Kultur in M9 und TBY Medium vergleichbar In pCM1 und auf dem Chromosom war dieses Muster an einigen Stellen medienbedingt verschieden Daten nicht gezeigt Die read Zahlen der 5 Transkripte des Chromosoms waren deutlich h her als die von pCM1 und pCM2 Tabelle 17 Die h chste 5 Transkript Konzentration wurde 150 Nukleotide stromaufw rts von CMM_2270 identifiziert CMM_2270 kodiert f r das ribosomale Protein L25 der 50S Untereinheit Hohe read Zahlen waren ebenfalls 100 150 Nukleotide stromaufw rts von drei weiteren Genen zu erkennen die f r ribosomale Proteine kodieren Eine hohe 5 Transkript Konzentration wurde au erdem stromaufw rts von Genen identifiziert die f r Proteine der Replikations und Transkriptionsmaschinerie kodieren sowie f r Gene deren Funktion nicht bekannt ist Der Abstand von Sequenzen mit hohen read Zahlen zum n chstgelegenen Gen betrug zwischen acht und 400 Nukleotide Daneben wurden drei eaderless Transkripte identifiziert F r die Gene pCM2_0012 und pCM2_0060 war eine hohe 5 Transkript Konzentration stromabw rts des Startcodons sowie stromaufwarts des St
390. urden deshalb in der Arbeit von Tews vermutlich nicht ber cksichtigt Differenzen zwischen beiden Arbeiten k nnten au erdem mit Unterschieden bei der Kultivierung der Bakterien und der Vorbereitung der Proteine zur Analyse erkl rt werden Das Minimalmedium dass in der Arbeit von Tews f r die Kultivierung verwendet wurde unterschied sich von dem in dieser Arbeit verwendeten M9 Medium vor allem durch eine vierfach erh hte Glucosekonzentration und das Fehlen der Aminos ure Methionin die von C michiganensis subsp michiganensis f r das Wachstum ben tigt wird Die extrazellul ren Proteine wurden nach der Isolierung in der Arbeit von Tews mittels 2D Gelelektrophorese nach ihrem isoelektrischen Punkt und ihrem Molekulargewicht aufgetrennt die einzelnen Spots ausgeschnitten und mittels MALDI ToF MS analysiert Im Gegensatz dazu wurden die Proteine in dieser Arbeit in einer SDS Gelelektrophorese f r 5 min lediglich nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt bevor sie aus dem Gel ausgeschnitten und mittels MALDI ToF MS analysiert wurden Nach einem Vergleich mit den Proteinen die im Medien berstand einer XMM Kultur identifiziert wurden scheint aber die in dieser Arbeit verwendete Methode besser geeignet zu sein da etwas mehr Unterschiede zwischen dem extrazellul ren Proteom in M9 und XMM Medium beobachtet wurden Tabelle 18 Diese Unterschiede k nnten auf eine Rolle dieser extrazellul ren Proteine bei der Wirt Pathogen Interaktion hindeuten
391. urden eingesetzt um die Proben f r die Sequenzierung der cDNA Bibliotheken vorzubereiten Die Analyse der durch die Sequenzierung identifizierten 5 Transkripte erfolgte mit Hilfe des Computerprogrammes VAMP 1 7 5 unter der Anleitung von Dr J rn Kalinowski und Armin Neshat CeBiTec Universit t Bielefeld Weitere Analysen Ergebnisse 107 wurden mit Hilfe der Programme Weblogo http weblogo berkeley edu und mprobizer http Users soe ucsc edu kent improbizer improbizer html durchgef hrt Sequenzierte cDNA Fragmente der gleichen Sequenz wurden dabei in VAMP 1 7 5 als gr n markierte reads dargestellt Abbildung 32 Eine Anh ufung dieser cDNA Fragmente l sst auf eine hohe mRNA Konzentration schlie en Eine sprunghafte Erh hung der 5 Transkript Konzentration die in der N he eines Gens stattfindet deutet auf einen Transkriptions startpunkt hin a CMM _2485 2799580 2798600 2789620 2799640 2799660 2799680 2799700 2825780 2825800 2825820 2625840 CMM_2510 Abbildung 32 Analyse von Transkriptionsstartpunkten mittels VAMP 1 7 5 Eine hohe Konzentration von CDNA Fragmenten und somit der entsprechenden 5 Transkripte wurde als Anh ufung von reads gr n dargestellt untere H lfte des Fensters Ein sprunghafter Anstieg der reads deutet auf einen Transkriptionsstartpunkt hin A Transkriptionsstartpunkt auf dem Strang der DNA etwa 90 Basen stromaufw rts des Startcodons von
392. us is induced by sucrose and sulfur containing amino acids The Plant cell 4 1 79 86 Seoane A S and Levy S B 1995 Characterization of MarR the repressor of the multiple antibiotic resistance mar operon in Escherichia coli J Bacteriol 177 12 3414 3419 Setubal J C Moreira L M and da Silva A C 2005 Bacterial phytopathogens and genome science Curr Opin Microbiol 8 5 595 600 Shine J and Dalgarno L 1974 The 3 terminal sequence of Escherichia coli 16S ribosomal RNA complementarity to nonsense triplets and ribosome binding sites Proc Natl Acad Sci US A 71 4 1342 1346 Siewers V Smedsgaard J and Tudzynski P 2004 The P450 monooxygenase BcABA1 is essential for abscisic acid biosynthesis in Botrytis cinerea Appl Environ Microbiol 70 7 3868 3876 Stitt M Lilley R M Gerhardt R and Heldt H W 1989 Metabolite levels in specific cells and subcellular compartments of plant leaves Method Enzymol 174 518 552 Stork l Gartemann K H Burger A and Eichenlaub R 2008 A family of serine proteases of Clavibacter michiganensis subsp michiganensis chpC plays a role in colonization of the host plant tomato Mol Plant Pathol 9 5 599 608 Strider D L 1969 Bacterial canker of tomato caused by Corynebacterium michiganense A literature review and bibliography vol 193 Agric Exp Sta Tech Bull North Carolina Tabor S and Richardson C C 1985 A bacteriophage T7
393. von den magnetic beads zu trennen wurden diese drei Mal f r 10 min ber Nacht und nochmals zwei Mal f r 30 min in Protein Bindepuffer inkubiert Die Trennung vom Proteinextrakt und vom Puffer erfolge am Magneten Invitrogen GmbH Karlsruhe Spezifische Proteine wurden durch die Zugabe von Elutionspuffer mit steigenden NaCl Konzentrationen von 200 900 mM in 100 mM Schritten in einem Volumen von 100 ul eluiert F r eine Erh hung der Konzentration wurde die Proteinl sung in einer Savant DNA SpeedVac Thermo Scientific Langenselbold vakuumgetrocknet Die Analyse der Proteine erfolgte mittels SDS PAGE siehe Abschnitt 3 4 5 und MALDI ToF Massenspektrometrie siehe Abschnitt 3 4 9 Lyse Puffer 50 mM Tris pH HCI 8 70 mM KCI 1 mM EDTA 1 mM DTT 10 v v Glycerin Sterilisation durch Autoklavieren 400 ul einer in 1 ml H2Opides gel sten Proteinase Inhibitor COMPLETE Tablette Roche Mannheim 1 x PBS Puffer 11 8 g NaCl 2 g KCI 2 4 g KH PO 36 9 g NasHPO x 12 H2O pH 7 4 Sterilisation durch Autoklavieren 2 x DNA Bindepuffer 10 mM Tris pH HCI 7 5 1 mM EDTA 2 M NaCl Sterilisation durch Autoklavieren Protein Bindepuffer 20 mM Tris pH HCI 8 100 mM NaCl 1 mM EDTA 1 mM DTT 10 v v Glycerin Sterilisation durch Autoklavieren 400 ul einer in 1 ml H2Opiges gel sten Proteinase Inhibitor COMPLETE Tablette Roche Mannheim 0 005 v v Triton X 100 Elutionspuffer Wie Protein Bindepuffer wobei neun
394. wa die H lfte des maximalen Niveaus der Cmm382 infizierten Bl tter erreicht Ergebnisse 63 hsr203J c 2 BS L Lo o V i Ga x 25 cc j Te lt O t gt Abbildung 9 Quantitative Analyse der Tabakinfektion A Verh ltnis der relativen Genexpression von hsr203J in bakteriell und 10 mM MgClo behandelten Bl ttern 0 24 und 48 h nach der Infektion 24 h nach der bakteriellen Infektion lag die Transkriptmenge von hsr203J in Cmm100 infizierten Bl ttern elf Mal h her als zu Beginn der Infektion in Cmm382 infizierten Bl ttern lag die Transkriptmenge 25 Mal h her Schwarze Balken mit Cmm100 infizierte Bl tter graue Balken mit Cmm382 infizierte Blatter Die Infektion von Tabakbl ttern mit dem Wildtypstamm Cmm382 oder dem plasmidfreien Stamm Cmm100 l ste somit eine Steigerung der Transkriptmenge des HR spezifischen Gens hsr203J aus Das deutet darauf hin dass durch die Infektion mit C michiganensis subsp michiganensis eine hypersensitive Antwort ausgel st wurde Eine Abwehrreaktion der Pflanze gegen ber einer Infektion ist die Inhibierung des bakteriellen Wachstums Um die Bakteriendichte von Cmm100 und Cmm382 in Tabakblattern nach der Infektion zu bestimmen wurden Tabakbl tter mit den Bakteriensuspensionen ODsgo 0 1 infiltriert 0 24 48 und 72 h nach der Infektion wurden in Triplikaten 150 mg Blattmaterial in fl ssigem Stickstoff gefroren homogenisiert und in 10 mM K HPO Puffer aufgenommen um
395. wurde das Pellet in 50 mM Tris HCl pH 8 5 resuspendiert und die Proteinl sung f r die folgende Zymographie eingesetzt F r die Durchf hrung der SDS PAGE wurden dem 10 igen Trenngel siehe Abschnitt 3 4 5 0 2 w v Azocasein 0 1 w v Carboxymethylcellulose oder 0 1 w v Pektin f r die Bestimmung der Protease Cellulase oder Pektinaseaktivit t zugef gt Die Durchf hrung erfolgte in Anlehnung an das Protokoll von Schneider und Kollegen Schneider et al 2010 18 ug Proteine wurden mit 5 x Probenauftragspuffer versetzt anschlie end jedoch nicht f r 5 min bei 95 C inkubiert Nach der Gelelektrophorese wurde das Gel zwei Mal f r 15 min in 50 mM Tris pH HCI 7 2 25 v v Isopropanol und anschlie end zwei Mal f r 15 min in 50 mM Tris pH HCI 7 2 auf der Wippe GFL mbH Burgwedel inkubiert Es folgte eine Inkubation f r 3 h bei 40 C F r die Bestimmung der Proteaseaktivitat wurde das Gel so lange in 1 M NaOH inkubiert bis ungef rbte Banden auf dem orange gef rbten Gelhin tergrund zu erkennen waren Wenn n tig wurde mit Coomassie Brilliant Blue gegengef rbt siehe Abschnitt 3 4 7 F r die Bestimmung der Cellulaseaktivit t wurde das Gel f r 5 min in 0 5 iger w v Congo Rot L sung gef rbt und in 1 M NaCl entf rbt bis ungef rbte Banden gegen einen roten Hintergrund zu erkennen waren Wenn n tig wurde mit Coomassie Brilliant Blue gegengef rbt siehe Abschnitt 3 4 7 Die Pektinaseaktivit t wurde durch die Zuga
396. wurden 300 ng RNA mit Hilfe eines zuf lligen T7N9 Primers Moreno Paz amp Parro 2006 in cDNA umgeschrieben Die Markierung der Proben und die Hybridisierung an die Oligonukleotide wurden im Wesentlichen nach Angaben des Herstellers gem des two color RNA spike in Kits v5 7 2008 Agilent Technologies Santa Clara durchgef hrt Der Farbstoff Cy5 wurde dabei immer f r die Kontroll Probe verwendet Cy3 f r die zu analysierende Probe Die Chips wurden mit dem Agilent Microarray Scanner analysiert XDR extended dynamic range Aufl sung 5 um Die Datenextraktion wurde mittels Feature Extractions Software Einheit v9 5 3 1 Agilent Technologies nach einem Standard Protokoll vorgenommen Das Umschreiben der RNA in cDNA die Markierung und nachfolgende Hybridisierung der Proben wurden von S Reid Lehrstuhl f r Biochemie Universit t Erlangen N rnberg durchgef hrt die Auswertung der Daten erfolgte unter Anleitung von Dr S Sonnewald Lehrstuhl f r Biochemie Universit t Erlangen N rnberg Die Software GeneSpring XI Agilent Technologies wurde unter Material und Methoden 43 Standardeinstellungen fiir die Datenanalyse gewahlt Statistisch signifikant regulierte Gene p value lt 0 05 wurden mit Hilfe der Anwendung t test against zero und der Benjamini Hochberg Korrektur Benjamini amp Hochberg 1995 identifiziert 3 3 2 8 5 RACE F r die Analyse des Transkriptionsstartpunktes von CMM_1636 gInAT wurden 5 RACE
397. wurden bei der Analyse von 48 Promotorregionen konservierte Bereiche in der 10 Region und der Shine Dalgarno Sequenz identifiziert jedoch nicht in der 35 Region Zusammenfassung 2 Neben der Wirt Pathogen Interaktion wurde in dieser Arbeit auBerdem die Interaktion mit der Nicht Wirts Pflanze Nicotiana tabacum Tabak analysiert Diese inkompatible nicht erfolgreiche Interaktion konnte phanotypisch und in ersten Ansatzen auch auf molekularer Ebene gezeigt werden Das beobachtete nekrotische Blattgewebe und die erh hte Transkriptmenge des Gens hsr203J nach der bakteriellen Infektion weisen auf eine hypersensitive Antwort der Pflanze hin Die dadurch normalerweise hervorgerufene Inhibierung des bakteriellen Wachstums war in dieser Arbeit jedoch bis zu 72 Stunden nach der Infektion nicht erkennbar Summary 3 1 Summary Clavibacter michiganensis subsp michiganensis is a Gram positive bacterium which penetrates its host plant Solanum lycopersicum tomato through natural openings or wounds It spreads out through the xylem vessels and triggers disease symptoms like wilting of the leaves and canker of the stem Virulence factors play an important role during the host pathogen interaction The analysis of these virulence factors in vivo would be ideal but is technically difficult Furthermore the putative latency of the bacteria as well as the inconsistent appearance of disease symptoms impede the analysis of the infection with C michiganensis sub
398. x Spurenelementen 2 5 ul Thiamin 200 mg ml 27 6 ul Nicotins ure 18 mg ml 1 ml 0 1 M CaCl 2 ml 1 M MgSO 10 x Spurenelemente 100ml 200 mg FeCl x 6 H2O 10 mg CuCl x 2 H2O 10 mg Na B40 x 10 H20 10 mg MnCl x 2 H2O 10 mg NH gMo7 x 4 H20 40 mg ZnCl pH HCl 1 Sterilisation durch Filtration XVM2 1 168 g NaCl 1 32 g NH zSO 1 233 g MgSO 0 147 g CaClo 0 022 g KH PO 0 056 g K HPO pH 6 7 Sterilisation durch Autoklavieren 0 01 mM FeSO je 10 mM Fruktose und Saccharose 0 03 w v casamino acids XMM 1 168 g NaCl 2 02 g KNO3 1 233 g MgSO 0 147 g CaCl 0 022 g KH PO 0 056 g K HPO pH 6 7 Sterilisation durch Autoklavieren 0 01 mM FeSO 0 2 w v casamino acids Tabelle 6 Antibiotika Konzentrationen fur LB und TBY Medium Antibiotikum Endkonzentration fur Endkonzentration fur C michiganensis subsp E coli michiganensis Ampicillin 100 ug ml Chloramphenicol 25 ug ml 10 ug ml 8 ug ml M9 und XMM Medium Kanamycin 50 ug ml Neomycin 50 ug ml 8 ug ml M9 und XMM Medium 3 2 2 Kultivierungsbedingungen f r E coli E coli Stamme wurden bei 37 C und 125 rpm in einem Luftsch ttler SM30 Edmund B hler GmbH T bingen als Fl ssigkulturen in Erlenmeyerkolben mit Schikane kultiviert Das Bakterienwachstum wurde durch das Messen der optischen Dichte bei 600 nm oDsoo in Plastikk vetten halb mikro Greiner Bio One GmbH Frickenh
399. y factor Pat 1 a putative serine protease of Clavibacter michiganensis subsp michiganensis Microbiol Res 160 4 417 427 Butte A J Dzau V J and Glueck S B 2001 Further defining housekeeping or maintenance genes Focus on A compendium of gene expression in normal human tissues Physiol Genomics 7 2 95 96 Buttner D and Bonas U 2010 Regulation and secretion of Xanthomonas virulence factors FEMS Microbiol Rev 34 2 107 133 Carlson R R and Vidaver A K 1982 Taxonomy of Corynebacterium plant pathogens including a new pathogen of wheat based on polyacrylamide gel electrophoresis of cellular proteins nt J Syst Bacteriol 32 3 315 326 Carlton W M Braun E J and Gleason M L 1998 Ingress of Clavibacter michiganensis subsp michiganensis into tomato leaves through hydathodes Phytopathology 88 6 525 529 Chalupowicz L Cohen Kandli M Dror O Eichenlaub R Gartemann K H Sessa G Barash I and Manulis Sasson S 2010 Sequential expression of bacterial virulence and plant defense genes during infection of tomato with Clavibacter michiganensis subsp michiganensis Phytopathology 100 3 252 261 Chalupowicz L Zellermann E M Fluegel M Dror O Eichenlaub R Gartemann K H Savidor A Sessa G Iraki N Barash I and Manulis Sasson S 2012 Colonization and movement of GFP labeled Clavibacter michiganensis subsp michiganensis during tomato infection
400. ycling factor RRF ribosome releasing factor cell cycle protein conserved hypothetical protein metallopeptidase family M13 ketol acid reductoisomerase transcriptional regulator histone like protein amidophosphoribosyltransferase deoxyuridine 5 triphosphate pyrophosphatase acyltransferase conserved hypothetical protein alanine racemase ribonuclease P protein component conserved hypothetical protein phenylalanyl tRNA synthetase beta subunit ATPase cell division protein transcriptional regulator membrane protein hypothetical membrane protein exonuclease Ill Zn dependent alcohol dehydrogenase sugar ABC transporter substrate binding protein pseudouridine synthase dGTP triphosphohydrolase peptidyl prolyl cis trans isomerase conserved hypothetical protein conserved membrane protein 2 dehydropantoate 2 reductase serine threonine protein kinase eukaryotic type acetate kinase transcriptional regulator MarR family S adenosylmethionine synthetase putative RNA binding regulator aspartate 1 decarboxylase glucosamine fructose 6 phosphate aminotransferase transcriptional regulator GntR family conserved membrane protein arginyl tRNA synthetase transcriptional regulator thioredoxin reductase 175 Fortsetzung Tabelle 26 Niedrigere Transkriptmengen in XMM Medium als in TBY Medium IV 4 1 5 V 2 V 1 111 3 V 2 111 3 111 3 V 2 V 2 111 3 11 1 IV 1 IV 3 V 1 IV 4 111 3 11 2 V 2 V 2 11 1 111 3
401. ygenase die beispielsweise f r die Virulenz in R fasciens wichtig ist Die P450 Monooxygenase ist au erdem an der Thaxtomin Synthese in S acidiscabies beteiligt sowie an der Biosynthese von Abscisins ure in einem phytopathogenen Pilz Healy et al 2002 Einleitung 11 Siewers et al 2004 Cellulasen sind wichtige hydrolytische Enzyme f r phytopathogene Bakterien da sie die Cellulose in der pflanzlichen Zellwand abbauen Dabei werden 1 4 glucosidische Bindungen gespalten weshalb sie auch 1 4 Glucanasen bezeichnet werden Cellulase Gene kommen im Genom der C michiganensis Unterarten michiganensis und sepedonicus und im Genom von L xyli subsp xyli vor wobei sie in C michiganensis plasmidkodiert sind Monteiro Vitorello et al 2004 Die Cellulasen von Ruminococcus albus besitzen cellulolytische Eigenschaften um die Cellulose im Pansen pflanzenfressender Tiere zu verwerten Dabei wirken die Cellulasen nicht als freie extrazellul re Enzyme sondern sind an der bakteriellen Zellwand verankert Devillard et al 2004 Genauso wie f r Gram negative Bakterien konnte auch f r Gram positive Bakterien gezeigt werden dass Proteasen hier vor allem Serinproteasen eine Rolle bei der Virulenz des Bakteriums spielen In L xyli subsp xyli und den C michiganensis Unterarten michiganensis und sepedonicus wurde unter anderem gezeigt dass die Serinprotease Pat 1 wichtig f r die Virulenz der Bakterien ist Dreier et al 1997 Monteiro Vi
402. yl tRNA synthetase conserved hypothetical protein sugar ABC transporter permease component phosphoenolpyruvate carboxykinase phosphoenolpyruvate carboxylase ribosome binding factor A phosphoglucosamine mutase glutamine amidotransferase subunit pdxT phosphonate ABC transporter SBP citrate synthase conserved hypothetical protein putative acyl dehydratase putative protein disulfide isomerase conserved hypothetical protein endonuclease sugar ABC transporter substrate binding protein conserved hypothetical protein hypothetical protein transcriptional regulator CdaR family ATPase transcription elongation factor conserved hypothetical protein membrane bound metalloprotease holo acyl carrier protein synthase transcriptional regulator Cro CI family nucleotidyltransferase holliday junction ATP dependent DNA helicase chromosome partitioning protein putative recombinase nuclease conserved hypothetical protein transcriptional regulator conserved hypothetical protein hydrolase acetyl xylan esterase putative antibiotic deacetylase conserved hypothetical protein sugar ABC transporter substrate binding protein conserved hypothetical protein conserved hypothetical protein putative helicase short chain dehydrogenase oxidoreductase CDP glycerol poly Glycerophosphate glycerophosphotransferase transcription termination factor oxidoreductase dehydrogenase sugar ABC transporter permease component beta galactosidase t
403. zellul ren Serinproteasen werden der Chp S1A der chymotrypsin verwandten Ppa und der Subtilase Familie zugeordnet Gartemann et al 2008 Serinproteasen k nnen wie es auch f r Cysteinproteasen in Proteobakterien bekannt ist in pflanzliche Signalwege eingreifen und somit als Effektoren im Zytoplasma wirken Abramovitch et al 2006 Hogenhout amp Loria 2008 Neben pat 1 sind auf den nat rlichen Plasmiden pCM1 und pCM2 drei weitere Serinproteasegene phpA phpB und ppd lokalisiert Die Pat 1 Homologen PhpA und PhpB haben jedoch vermutlich keinen gro en Einfluss auf die Virulenz des Bakteriums Burger et al 2005 Alle weiteren 17 Serinproteasegene sind auf dem Chromosom lokalisiert wobei 14 Gene in der 100 kbp umfassenden chp Unterregion der chp tomA Region nahe des origins liegen Gartemann et al 2008 Die 129 kpb umfassende chp tomA Region hat einen niedrigeren G C Gehalt als der Rest des Genoms und enth lt unter anderem Gene deren Genprodukte am Zuckermetabolismus beteiligt sind Gartemann et al 2008 Die Gene der chp tomA Region sind unter anderem wichtig f r die Ausbreitung des Bakteriums im Xylemsaft Chalupowicz et al 2012 Neben den Genen f r Serinproteasen beinhaltet die chp tomA Region das Gen tomA das f r eine Tomatinase kodiert Kaup et al 2005 Tomatinasen zerst ren das pflanzliche Alkaloid a Tomatin welches das bakterielle Wachstum hemmt Eine Tomatinase Aktivit t konnte f r TomA in C michiganensis s
404. zu erkennen Amon et al 2008 Zum einen wurden somit in dieser Arbeit vermutlich einige unspezifisch gebundene Proteine eluiert zum anderen wurde f r 19 Gene des Genoms von C michiganensis subsp michiganensis eine Funktion als DNA Bindeprotein vorhergesagt http cmr jcvi org Diese 19 Proteine hatten vermutlich ebenfalls an die Promotorregionen von pat 1 und celA gebunden obwohl sie keine Regulatorfunktion besitzen 2 3 4 5 6 7 8 9 XMM identifizierte nn a celA Ausgew hlte Transkriptionsregulatoren Gencname Proteinrate Abbildung 24 Analyse und Identifizierung putativer Transkriptionsregulatoren von celA und pat 1 Mit den spezifisch an die Promotorregionen von ce A und pat T gebundenen und eluierten Proteinen wurde eine SDS PAGE durchgef hrt PM Proteinmarker Il Spuren 1 9 Elutionsfraktionen 1 9 steigende NaCl Konzentration Exemplarisch sind nur die Gele mit den eluierten Proteinen f r pat 1 gezeigt Die Gele von ce A waren vergleichbar Ausgew hlte Proteinfragmente zwischen 10 und 50 kDa wurden mittels MALDI ToF MS analysiert und drei ausgew hlte Transkriptionsregulatoren weiter verwendet Aufgrund der unterschiedlich starken Konzentration der Proteinfragmente auf den SDS Gelen der drei Medien M9 XMM und XVM2 war es nicht m glich Unterschiede im Bandenmuster zu erkennen Aus diesem Grund wurden spezifische Proteinbanden aus den Gelen ausgeschnitten und die darin enthaltenen Proteine mittels MALDI
405. zwfB CMM_1083 CMM_1093 ilvD CMM_1099 membrane protein membrane protein Iysophospholipase membrane protein lipoate protein ligase A acetyltransferase phosphoglucomutase prephenate dehydratase seryl tRNA synthetase oxidoreductase pyrroline 5 carboxylate reductase conserved hypothetical protein aspartyl tRNA synthetase excinuclease ABC subunit A phosphoglycerate mutase cytosine specific DNA methylase glutamyl tRNA reductase heme oxygenase decyclizing 6 phosphofructokinase DNA repair protein aldose 1 epimerase membrane protein transcriptional regulator TetR family conserved hypothetical protein adenosine deaminase conserved hypothetical protein ATP GTP binding protein hypothetical secreted protein stress induced protein putative organic hydroperoxide resistance protein transcriptional regulator Fur family conserved membrane protein phosphoribosylformylglycinamidine cyclo ligase amino acid permease APC family glycogen debranching enzyme hypothetical secreted protein proline racemase proline iminopeptidase hypothetical protein conserved hypothetical protein nucleoside diphosphate sugar epimerase phosphate acetyltransferase malate quinone oxidoreductase conserved hypothetical protein putative DNA repair photolyase conserved membrane protein putative resistance protein penicillin binding protein penicillin binding protein conserved hypothetical protein mannose 1 phosphate guanylyltransferase

Dokument_35.

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