Intrazellul¨are Ableitungen von Neuronen des Blutegels F
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1. Aus diesem l sst sich dann auf die Membranleitf higkeit und somit auf die Aktivit t von lonenkandalen zur ckschlie en Da die Kontrolle des Membranpotentials ber Strominjektion erfolgt wird die Spannungsklemme traditionell mit zwei Elektroden in der selben Zelle ausgef hrt eine zur Messung und eine zur Strominjektion Wenn nur eine Elektrode verwendet wird kann diese abwechselnd zur Strominjektion und zur Mes sung verwendet werden Eine Weiterentwicklung der Spannungsklemme ist die Patch Clamp Technik die Sie im Praktikumsteil von Andreas Feigenspan kennenlernen segmental Interganglionic i ayes antarior brala ganglia connectives posterior brein posano D ar Abbildung 3 Das zentrale Nervensystem des Blutegels Aus dem englischen Praktikumsskript Abbildung 4 Ganglion des Blutegels mit fur das Praktikum besonders geeingeten Zellen Aus dem engli schen Praktikumsskript 2 Das Nervensystem des Blutegels Der medizinische Blutegel Hirudo medicinalis geh rt zu den Anneliden Im Gegensatz zum na he verwandten Regenwurm haben Blutegel immer 32 Segmente von denen die ersten vier zum Kopf und die letzten sieben zum Schwanz verschmolzen sind wo sie unter anderem jeweils einen Saugnapf bilden Sein Nervensystem besteht entsprechend aus 21 K rper Ganglien und verschmolzenen Ganglien am Vorder und Hinterende des Tieres die durch einen Kon nektiv genannten doppelten Nervenstrang miteinander verbunden sin2. gebrochen und muss ersetzt werden Wenn Sie mit der Elektrode aus der Zelle rutschen oder das Experiment beenden no tieren Sie bitte ob das Rauschen gr er geworden ist und den Potentialwert den der Verst rker als Ruhewert anzeigt Nur dadurch k nnen Sie im Nachhinein auf die Qualit t Ihrer Ableitungen zur ckschliessen Tauschen Sie den Ringer in der Petrischale aus wenn die Spitze einer Mikropipete abbricht weil sonst die KAc L sung der Pipette die Salz Konzentration des Ringers ver ndert Achten Sie darauf dass Ihnen keine Daten verlorengehen speichern Sie alle Messdaten ab 6 Aufr umen Bitte R umen Sie nach Abschluss eines Praktikumstages das Labor auf 1 das Pr parationsbesteck muss mit VE Wasser abgesp lt und trockengetupft sicher ver staut werden Machen sie alle Ger te und das Licht am Binokular aus Bitte zuerst alle elektrischen Ger te ausschalten bevor Sie den Computer herunterfahren Stellen Sie bitte auch sicher dass Waage pH Meter Puller etc ausgeschaltet sind Gebrauchte und ungebrauchte aber gef llte Mikropipetten kommen in den Glasabfall Die indifferente Elektrode muss mit VE Wasser abgesp lt und so geparkt werden dass sie kein Aluminium ber hrt Ziehen sie die feinen Nadeln aus dem Pr parat und stecken sie wieder in den Sylgard des selben Sch lchens sie k nnen sp ter weiterverwendet werden Das Ganglion und der Ringer werden mit VE Wasser in de
3. Datenanalyse Wenn man in ephys auf den Button Analysis klickt be kommt man ein neues Fenster Dieses ist folgenderma en aufgebaut e Im oberen Teil erwartet das Programm Angaben dar ber welche Daten wie ausgewertet werden sollen Alle Analysen beziehen sich auf die Daten die gerade aktuell in ephys vorhanden sind also entweder gerade aufgenommen oder eingeladen wurden F r al le Auswertungen muss angegeben werden cellnumber bei Einzelableitungen immer 1 bei Doppelableitung die zu betrachtende Zelle first trial das erste zu analysierende tri al ast trial das letzte zu analysierende trial starttime die Anfangszeit der Analyse innerhalb jedes dieser trials in Sekunden z B der Beginn eines bestimmten Reizes endtime Zeitpunkt bei dem die Analyse beendet werden soll Die anderen drei Anga ben threshold binduration und maximal duration for a spike werden nur in einigen der Analysemethoden verwendet und entsprechend unten beschrieben Im mittleren Bereich sind die Buttons angeordnet die die verschiedenen unten beschrie benen Analysen starten Unten gibt es zwei Ausgabefenster Das linke Ausgabefenster zeigt jeweils die aktuellen Ergebnisse der Auswertung Bei einer neuen Auswertung werden diese berschrieben 23 Um die Ergebnisse aufzuheben muss man den Button accept dr cken dann wird der Inhalt des linken Fensters an denjenigen des rechten angeh ngt Das rechte Fenster kann mit save abgespeichert werden dabei wi
4. Kompensieren Sie mit dem Drehrad CAPACITY COMPENSATION 30 die Eingangskapazitat bis die ge messenen Pulse m glichst hnlich wie Rechteckpulse aussehen Abbildung 7 hilft Ihnen dabei Notieren Sie den Wert des Drehrads Wenn mittels einer Elektrode Strom in eine Zelle injeziert wird f hrt der Elektrodenwi derstand zu einem Abfall der gemessenen Spannung Da man in einem elektrophysio logischen Experiment ausschlie lich die Spannung der Zellmembran messen will ist in Intrazellul rverst rker eine sogenannte BRIDGE BALLANCE Funktion eingebaut um das Artefakt durch die Elektrode zu kompensieren Abbildung 8 hilft Ihnen die richtige Einstellung f r den BRIDGE BALLANCE Regler 27 zu finden Notieren Sie den Wert Drehen Sie anschliessend den Regler f r die Experimente mit der Modellzelle wieder auf 0 aber nicht wenn Sie von echten Zellen ableiten Modellzellen Experiment 1 Diese bung ist Pflicht muss aber nicht ins Protokoll Endlich fertig jetzt geht es los Start startet das Experiment W hrend des Experiments soll ten Sie auf dem Oszilloskop sehen was der Messkopf aufzeichnet Wenn die Datenaufnahme abgeschlossen ist erscheinen die Messdaten auf dem Computerbildschirm Sie k nnen das Experiment so oft starten wie sie m chten es wird jeweils unter einer neuen trial number gespeichert und sie k nnen sich mit next trial und last trial die verschiedenen Messungen ansehen Wenn
5. Protokolle vor der eigentlichen Ableitung vor Dop pelableitungen sind mindestens doppelt so schwierig zu bekommen und meistens wesentlich instabiler als Einzelableitungen Das macht die Messzeit zu kostbar um sie mit Reizprogram mierung zu verk rzen F r die Ableitung fahren Sie zun chst beide Mikropipetten ganz nah an die beiden gew nschten Zellen heran so dass Sie bei beiden nur noch durch Antippen oder buzzen die Membran durchbrechen m ssen Sehr h ufig passiert es dass durch die Ersch tterung des Ganglions beim Durchbrechen der Kapsel um das Ganglion mit der zweiten Mikropipet te die erste aus der Zelle rutscht St rke Bewegungen wie der Austausch einer der Pipetten f hren ebenfalls sehr oft zum Ende der ersten Ableitung 10 3 Charakterisierung von Synapsen Wenn Sie im Rahmen des Praktikums eine elektrische Verbindung charakterisieren wollen bietet es sich am meisten an die beiden Retziuszellen gleichzeitig abzuleiten Sie sind stark 30 gekoppelt Andere M glichkeiten sind von den beiden AE oder den beiden Lydig Neuronen abzuleiten Falls Sie lieber eine chemische Synapse studieren wollen probieren Sie am besten eine Doppelableitung von P und AP P und Retzius P und T oder P und Nut 1 Entwickeln Sie eine Stimulation mit der Sie die Abh ngigkeit der postsynaptischen Ant wort vom pr synaptischen Membranpotential und den pr synaptischen Aktionspotentia len bestimmen k nnen Daf r muss die Stimulation aus
6. Sie eine besonders sch ne Messung haben die Sie gerne als Abbildung ins Praktikumsprotokoll bernehmen m chten speichern Sie die Matlab Abbildung ab Fragen 1 2 Wie sieht das gemessene Signal aus Warum hat es nicht die identische Form wie der Stimulus Welcher Spannungswert wurde vor w hrend und nach der Stromstufe vom Computer aufgezeichnet Welche Werte lesen Sie vom Oszilloskop ab Wie kommen die gemessenen Werte zustande Voraussichtlich sind die Werte nicht ganz konstant Vergr ern Sie die Abbildung der Messdaten soweit dass Sie die Schwankungen der Werte erkennen k nnen Wie stark schwanken sie Gibt es Unterschiede zwischen den Schwankungen vor w hrend und nach der Stromstufe Ver ndern Sie die Zeitachse der Abbildung K nnen Sie dann eine zeitliche Struktur des Rauschens erkennen 13 7 Was erwarten Sie wenn Sie den Schalter der Modellzelle auf 20 MQ 500 pF umstellen so dass ein gro es Neuron simuliert wird wird das gemessene Signal gr er oder kleiner berpr fen Sie Ihre Pr diktion experimentell 8 Warum sollten Sie die BRIDGE BALLANCE f r die Versuche mit der Modellzelle auf 0 zur ckdrehen Was passiert wenn diese verstellt ist 4 4 Modellzellen Experiment 2 Diese bung ist Pflicht muss aber nicht ins Protokoll Um den Umgang mit dem Stimulationsprogramm zu ben sollten Sie ein wenig mit der Mo delzelle spielen Sie k nnen dabei gerne ausprob
7. Stroms 15 jetzt nicht mehr 000 ist notieren Sie bitte den entspre chenden Wert Falls er gr sser als 002 oder kleiner als 002 sein sollte sagen Sie mir bitte Bescheid 11 undercompensated potential mV c 10 20 30 40 59 time ms overcompensated potential mvp RO KO 8 a 10 20 EJ 40 5c time ms compensated 250 a 10 20 30 ag 5 time ms potentat Figure 8 Tuning of the capacitance compensation using a 100 MQ resistor Abbildung 7 Einstellung der Kapazit tskompensation Aus dem Verst rker Handbuch undersompensated potential mV o so 0 6150 x0 250 aw e time ms overcompensated time ms compensated time ms pwertia Figure 9 Tuning of the BRIDGE BALANCE using 100 MQ resistor Abbildung 8 Einstellung der Br cke bei Verwendung der Modellzelle Aus dem Verst rker Handbuch 12 4 Dr cken Sie den Schalter ELECTRODE RESISTANCE 10 Damit erzeugen Sie recht 4 3 eckige Strompulse die an die Modellzelle bertragen werden Sie sollten jetzt auf dem Oszilloskop die gemessenen Antworten der Modellzelle sehen Notieren Sie bitte den vom Verst rker bei 14 angezeigten Widerstand berpr fen Sie ob Sie am Osziloskop den gleichen Wert ablesen Wie lang sind die einzelnen Pulse Unter anderem durch die Kapazit t des Pipettenglases kommt es zu ungewollten Effek ten im Messsignal bei schnellen nderungen des injezierten Stroms
8. feinen Schere unter dem Ganglion durch die Blutgef e aufschneiden Nochmal Blut absaugen wenn das Ganglion locker wird ist das zu riskant es zu verlie ren Die Seitennerven durchschneiden etwa die Breite eines Ganglions stehenlassen Das Konnektiv auf beiden Seiten ungef hr auf halbem Weg zum n chsten Ganglion durchschneiden um genug Platz zum Feststecken zu lassen Mit der Pinzette am Ende des Konnektivs das Ganglion festhalten und in die bereitge stellte Petrischale berf hren Mit der feinen Pinzette das Konnektiv am Rand festhalten und mit der groben Pinzette eine feine Drahtnadel durch den Nerven stechen und im Sylgard feststecken Ganglion am anderen Hauptnerven etwas in die L nge ziehen und dort ebenfalls fest stecken Achten Sie darauf dass die ventrale Seite des Ganglions oben ist so dass man die beiden Retzius Zellen sieht Wenn das Ganglion anders aussieht als auf Abb 4 liegt es wahrscheinlich mit der dorsalen Seite nach oben und muss umgedreht werden Tipp die Hauptnerven kr mmen sich meistens zur dorsalen Seite hin bevor sie befestigt wer den Seitlich entweder an den Blutgef e oder den Seitennerven mit ein oder zwei Nadeln pro Seite feststecken Ganglion waschen indem jeweils ein Teil des Ringers mit einer Pipette rausgesaugt und durch frischen Ringer Raumtemperatur ersetzt wird Pr parationsbesteck gut mit VE Wasser absp len mit weichem Tuch trockentupfen und sicher verstauen Zum
9. genug Ringer vorhanden ist mindestens 0 5 gek hlter Ringer und 100 ml bei Zimmertemperatur Wenn nicht bereiten Sie Ringer zu 14 Substanz g 21 entspricht mM H0 2 NaCl 13 429 115 mM KCI 0 6g 4 mM CaCl x2H20 0 54g 1 8 mM MgCl x 6H20 0 6g 1 5 mM Glucose 3 6g 10 mM TrisMaleat 2 29 4 6 mM TrisBase 1 39 5 4 mM Der pH Wert wird mit NaOH auf 7 4 eingestellt indem Sie mit einer Pipette 1 M NaOH zugeben Tasten Sie sich mit einzelnen Tropfen an den Wert heran Falls doch eine Korrektur nach unten n tig ist wird daf r 1 M HCI verwendet 5 2 Aa WO ND Vorbereitung eines Blutegels Besorgen Sie eine Sch ssel Eisw rfel F llen Sie ein Becherglas mit Eisw rfeln und VE Wasser Kran Stellen Sie eine Flasche Ringer aus dem K hlschrank in das restliche Eis Fangen Sie einen Blutegel mit einem Netz aus dem Aquarium und legen ihn f r ca 5 Minuten in das Eiswasser um ihn zu bet uben Achtung auch leicht gek hlte Blutegel k nnen erstaunlich mobil sein Bitte stellen Sie sicher dass das Aquarium wieder fest geschlossen ist Sp len Sie das Netz gut aus und h ngen es zum Trocknen auf Holen Sie eine Pr parationsschale aus dem Gefrierfach und f llen das Wachsbett zu ca 2 3 mit Ringer aus dem K hlschrank berpr fen Sie ob mindestens 10 Stecknadeln und 2 gro e Nadeln im Wachsbett stecken Legen Sie den Blutegel in den Ringer im Wachsbett Stellen Sie eine kleine Petrischale mit Sylgardboden min
10. herausgestellt parallel zu arbeiten zwei Leute werten aus w hrend die anderen beiden ableiten Ich m chte Ihnen dringend raten dass jedeR Teilnehmerin des Praktikums sowohl die Pr paration als auch das Ableiten einmal ausprobiert und sich auch an der Auswertung beteiligt Bitte verstehen Sie dieses Skript nicht als Kochrezept an dass Sie sich sklavisch halten m ssen Wenn Sie eine Idee haben was sie lieber ausprobieren wollen als die von mir vorgeschlagenen Experimente Nur zu Eigene Ideen sind mir lieber als ein perfekt abgearbeiteter Fragenkatalog Ich bin f r jede Anregung und jeden nderungsvorschlag zum Praktikum dankbar 1 Einleitung Intrazellul re Ableitungen Neben extrazellul ren Ableitungen sind Intrazellul rableitungen die klassische Form der Elek trophysiologie Bei dieser Technik nimmt man das Membranpotential einer Zelle relativ zum 4 A Micropipette Electrode with Resistance R MEASURING CIRCUIT Membrane Resistance Bath Electrode EQUIVALENT CIRCUIT Resting Potential Em Figure 1 8 Representative Voltmeter with Infinite Resistance Instruments used to measure potentials must have a very high input resistance Rin Abbildung 1 Aufbau einer Intrazellularableitung und entsprechendes Erstatzschaltbild Aus Axon Guide Aussenmedium auf indem man eine feine Glaskapillare mit einem Elektrolyt durch die Mem bran in die Zelle einf hrt In gewisser Weise nehmen Intrazell
11. nnen Wenn Sie sich nicht sicher sind z gern Sie bitte nicht zu fragen Wechseln Sie dann wieder zur ck auf niedrige Vergr erung F hren Sie vorsichtig den Silberdraht des Elektrodenhalters in eine Mikropipette ein und schrauben die Pipette am Elektrodenhalter fest Achtung Die Ag AgCI Beschichtung des Drahtes darf nicht verkratzen Wenn der Draht silbrig schimmert muss er zuerst neu chloridiert werden Schieben Sie den Elektrodenhalter in den BNC Verbinder des Messkopfes Befestigen Sie die indifferente Elektrode mit Knetgummi so am Petrischalentisch dass sie in den Ringer eintaucht Senken Sie die Spitze der Mikropipette in der N he des Ganglions vorsichtig in den Rin ger Schalten Sie das Oszilloskop und den Computer an berpr fen Sie die im Abschnitt 4 2 aufgelisteten Einstellungen der Kippschalter Stellen Sie mit dem OFFSET Regler 29 den vom Verst rker angezeigten Spannungs wert auf 000 Dr cken Sie den ELECTRODE RESISTANCE Schalter 10 Notieren Sie den ange zeigten Elektrodenwiderstand 14 Wenn dieser weit von den sonst blichen Werten ab weicht oder wenn sich auf dem Oszilloskop ungew hnlich gro es Ableitrauschen zeigt verwerfen Sie die wahrscheinlich schadhafte Mikropipette und nehmen eine neue Kompensieren Sie die Kapazit t mit CAPACITY COMPENSATION 30 siehe oben Abb 7 Stellen Sie die BRIDGE BALANCE 27 ein s o Abb 8 17 overcompensated
12. oder Aus reisser gibt und was daf r der Grund sein k nnte 9 Bestimmung der Spikeschwelle F r das Protokoll erwarte ich dass Sie entweder eine Zelle genauer charakterisieren wobei auch andere Projekte als das hier vorgestellte m glich sind oder die synaptische bertragung eines Zellpaares untersuchen Aufgaben 10 Ziel dieses Experimentes ist es den Membranpotentialwert zu bestimmen bei dem eine Zelle Ihrer Wahl ein Aktionspotential ausl st Dieses Projekt kann ebenfalls nebenbei erledigt werden indem Sie es mit der Charakterisie rung eines Neurons zu verbinden wenn Sie rechtzeitig die n tigen Vorkehrungen treffen 27 9 1 Bereiten Sie ein Protokoll Treppe vor bei dem der injezierte Strom von 3 nA bis 3 nA in jeweils 200 ms langen Stufen in 0 25 nA Schritten ansteigt Erzeugen Sie ausserdem zwei weitere Protokolle kurzeRampe bei dem eine Rampe im gleichen Zeitraum wie bei Treppe von 3 nA auf 3 nA ansteigt und langeRampe die in der dreifachen Zeit den gleichen Strombereich abdeckt Erzeugen Sie ein Protokoll Spruenge bei dem ausgehend von einer konstanten Hy perpolarisation um 3 nA jeweils nach 200 ms einen 10 ms Rechteckpuls gibt wobei die Amplitude der Rechteckpulse von 2 75 nA also 0 25 nA Depolarisation gegen ber dem Haltewert von 3 nA bis 3 nA in Schritten von 0 25 nA ansteigt Leiten Sie von einer Zelle Ihrer Wahl ab Pr sentieren Sie d
13. pr synaptischer De und Hy perpolarisation verschiedener St rke bestehen Je nach dem von Ihnen vorgesehenen Zellpaar bieten sich verschiedene Stimuli an bitte besprechen Sie Ihre Planung mit mir um sich Entt uschungen zu ersparen 2 bertragen Sie das entsprechende Stimulationsprogramm auch auf die zweite Zelle ent weder als separates Stimulusprotokoll oder im selben Protokoll um zu testen ob die beiden Zellen sich reziprok beeinflussen 3 Leiten Sie von den beiden Zellen mit dem gleichen Protokoll mehrfach ab 4 Handelt es sich um eine reziproke Verbindung 5 Handelt es sich um eine chemische oder eine elektrische Synapse 6 Wenn Sie eine chemische Synapse ableiten ndern Sie as Membranpotential der post syaptischen Zelle indem Sie am entsprechenden Verst rker einen HOLDING CUR RENT einstellen F hren Sie das gleiche Protokoll mit verschiedenen HOLDING CUR RENTS aus um das Umkehrpotential der Synapse zu finden 10 4 Auswertung Postsynaptischer Effekt Tragen Sie Mittelwert und Standardabweichung der postsynaptische Antwort gegen die pr synaptische Stimulationsst rke auf falls sinnvoll sowohl f r die beobachteten Membranpotentialwerte als auch f r die resultierenden Spikeraten hierf r empfiehlt sich mean response bzw count spikes im Analysefenster Kopplungsst rke Berechnen Sie f r jeden trial und jede der verschiedenen Stimulusst rken die Kopplungsst rke als postsynaptischer Effekt pr s
14. w hrend eines Experiments stark ndern Die am h ufigsten zu beobachtende nderung ist eine auf synaptische Erm dung zur ckzuf hrende Abnahme der Synap senst rke nach starker oder lang andauernder pr synaptischer Stimulation In manchen F llen ist auch Fazilitation zu beobachten Synaptische Latenz Ein Hinweis ob es sich um eine chemische oder eine elektrische Synapse handelt ist die Zeit zwischen pr synaptischem Aktionspotential und postsyn aptischen Potential Elektrische Synapsen sind sehr viel schneller als chemische die 29 f r die Prozesse der Transmitterfreisetzung und aufnahme mindestens 1 ms brau chen Allerdings h ngt die gemessene Zeit auch von der Position der Synapse relativ zu den beiden Ableitorten ab Umkehrpotential Der Effekt von chemischen Synapsen beruht auf dem Fluss bestimmter lonen deshalb kann man f r chemischen Synapsen ein Umkehrpotential bestimmen Dazu wird f r exzitatorische Synapsen das postsynaptische Membranpotential so weit depolarisiert bis eine pr synaptischen Reizung nicht mehr zu einem postsynaptischen Effekt f hrt Depolarisiert man die postsynaptische Zelle ber diesen Wert hinaus wirkt die Synapse hyperpolarisierend F r inhibitorische Synapsen wird das postsynaptische Membranpotential entsprechend bis zum Umkehrpunkt hyperpolarisiert Pharmakologie Ein schlagender aber im Rahmen des Praktikums nicht zu erbringender Nachweis f r den vorliegenden Synapsentyp ist mit welchen
15. Ausschalten der Absaugpumpe zuerst den Schalter am Handst ck feststellen Vorbereitung der Instrumente Der Verst rker sollte sich vor der Benutzung mindestens 20 Minuten aufw rmen schalten Sie ihn deshalb schon w hrend der Pr paration ein 16 10 11 12 13 14 15 16 17 18 F llen Sie mehrere der bereitgestellten Mikropipetten etwa zur H lfte mit 3 M KAc L sung und lassen Sie sie mit der Spitze schr g nach unten f r mindestens 5 Minuten ruhen Ach tung Die Spitzen der Mikropipetten sind extrem empfindlich Wenn sie ber hrt werden brechen sie sofort ab und sind unbrauchbar Falls unten eine Luftblase bleibt ist das nicht tragisch ein feines Filament stellt sicher dass die L sung bis zur Spitze gelangt berpr fen Sie ob alle Achsen des Mikromanipulators sich ungef hr in mittlerer Stellung befinden Stellen Sie die Petrischale mit dem Pr parat in den Petrischalentisch Fokussieren Sie mit niedriger Vergr erung auf das Ganglion Platzieren Sie den Petrischalentisch so dass das Ganglion genau in der Mitte Ihres Sicht feldes sieht berpr fen Sie das durch Umschalten auf hohe Vergr erung Stellen Sie das Dunkelfeld so ein dass das Ganglion dunkel und von einem hellen Ring umgeben ist Schauen Sie mit gr erer Vergr erung nach ob wirklich die ventrale Seite des Gangli ons nach oben zeigt Vergleich mit Abb 4 und ob Sie einzelne Zellen erkennen k
16. Chemikalien sich die je weiligen Synapsen blocken bzw in ihrer Funktion ver ndern lassen z B eine hohe Mg Konzentration im Ringer reduziert die Transmitteraussch ttung Anatomie Ein ebenfalls sehr zuverl ssiger aber f r das Praktikum zu weitreichender Nach weis elektrischer Koppelung ist das F llen einer Zelle mit einem Farbstoff der durch gap junctions in die elektrisch mit ihr verbundenen Zellen diffundiert Auch k nnen viele f r gap junctions spezifische Proteine angef rbt werden 10 2 Vorbereitung und Durchf hrung von Doppelableitung Prinzipiell funktionieren Doppelableitungen genauso wie Einzelableitungen Deshalb gehen Sie zur Vorbereitung der Doppelableitung genauso vor wie oben beschrieben Sie brauchen einen zweiten Mikromanipulator der auf die andere Seite des Pr parats ge stellt wird und einen zweiten Verst rker mit Messkopf Verbinden Sie den Verst rker genau wie oben beschrieben jeweils mit dem zweiten Kanal des Oszilloskops und des A D Wand lers Geerdet wird dar Messplatz nach wie vor durch den ersten Verst rker und die indifferente Elektrode bleibt auch nur mit dem ersten Messkopf verbunden In der Software w hlen Sie im Protocol Creator die M glichkeit zwei Zellen zu messen und zwei Stimuli zu geben Sie k nnen dann jeweils anw hlen welchen der beiden Stimuli Sie gera de ver ndern Sowohl in der Vorschau als auch bei der Messung werden dann beide Kan le in einer Abbildung angezeigt Bereiten Sie Ihre
17. Intrazellul re Ableitungen von Neuronen des Blutegels F Praktikum Neurophysiologie WS 2006 2007 Jutta Kretzberg email jutta kretzberg uni oldenburg de Tel 0441 798 3314 B ro W4 0 058 Labor W4 0 043 Vorbemerkung Bitte erschrecken Sie nicht ber die L nge dieses Skriptes Es enth lt einiges an Hintergrund information und mehrere alternative Projekte f r das Praktikum zwischen denen Sie w hlen k nnen Ich erwarte von Ihnen dass Sie Am ersten Tag das Experiment mit der Modellzelle Abschitt 4 durchf hren und gewisse Vorarbeiten f r das weitere Praktikum erledigen Am zweiten Tag das Experiment zur Charakterisierung von Neuronen Abschnitt 7 be ginnen das sie voraussichtlich an mindestens einem weiteren Tag fortsetzen werden Ca am dritten Tag das Experiment zur Kodierung Abschnitt 8 durchf hren dieses kann in Kombination mit der Charakterisierung von Neuronen durchgef hrt werden Voraussichtlich am vierten oder f nften Tag sollten Sie zumindest wenn es keine schwer wiegenden technischen Probleme gibt entweder das Experiment zur genaueren Charak terisierung der Spikeschwelle Abschnitten 9 oder das zur synaptischen bertragung 10 durchf hren oder ein kleines von Ihnen selber entwickeltes Projekt angehen Reservieren Sie bitte mindestens einen ganzen Tag der aber z B auch durchaus auf mehrere Nachmittage verteilt sein kann f r die Auswertung Bei Gruppen mit vier Leu ten hat es sich als sinnvoll
18. Matlab ein Es ffnet sich eine graphische Benutzeroberfl che zur Messung und Stimulation Das Programm spiegelt den blichen Ablauf eines elektrophysiologischen Experi ments wieder Mit einem der Fragestellung des Experiments entsprechenden Reiz protokoll werden normalerweise mehrere Messungen trials durchgef hrt zwi schen denen der Zelle etwas Erholungszeit gegeben wird die intern auch zur Dar stellung der Daten und zur Datenspeicherung benutzt wird Normalerweise ist der erste Schritt dass Sie ein sogenanntes protocol erstellen in dem z B festgelegt wird wie lange Daten aufgenommen werden sollen und wie die elektrische Stimulation aussehen soll Sie erreichen eine weitere graphische Be nutzeroberflache den sogenannten protocol creator indem Sie hinter protocol auf change klicken Zur Benutzung des Protocol Creators werden wir Ihnen m ndlich noch einiges sa gen sehr wichtig zu behalten ist dass man den Reiz st ckweise ndert und jeweils mit Accept die nderung akzeptiert bevor man das Protokoll abspeichern und den Creator verlassen kann Zur Messung und Stimulation klicken Sie auf Start Wenn die Messung abge schlossen ist werden Stimulus und Messdaten auf dem Bildschirm dargestellt Die Datenauswertung werden Sie ebenfalls in Matlab vornehmen Da dies nun zu weit f hren w rde bekommen Sie dazu sp ter im Praktikum eine gesonderte Be schreibung Vergessen Sie nicht Ihre Daten un
19. S LATERAL SINUS SEGMENTAL POSTERIOR ROOT GANGLION ANTERIOR ROOT 4 Diagram to show the position of the nerve cord within the ventral blood sinus and its relation to other body structures and the musculature Reprinted with permission from Nicholls and Van Essen 1974 Abbildung 2 Querschnitt durch einen Blutegel Aus Neurobiology of the leech Grunds tzlich gibt es zwei M glichkeiten f r intrazellul re Ableitungen Stromklemme Current Clamp Die Stromklemme dient der Messung der als Membranpo tential bezeichneten Spannung zwischen der intrazellul ren und der indifferenten Elek trode wobei der Strom kontroliert wird Da der Membranwiderstand der Zelle und der Widerst nd der Elektrode in Reihe liegen ist es sehr schwierig bei variabler Strom injektion den Effekt der Elektrode auf die gemessene Spannung von der Zellantwort zu trennen Dies wird in modernen Intrazellul rverst rkern erm glicht durch eine als Br ckenmessung Bridge Balance bezeichnete Technik Diese gleicht die von der Elektrode herr hrende rapide Spannungs nderung bei nderung des injezierten Stroms aus so dass nur der langsamere Effekt der Zellmembran brig bleibt Alle Intrazel lul rableitungen dieses Praktikums werden als Br ckenmessungen durchgef hrt Spannungsklemme Voltage Clamp Umgekehrt wird bei der Spannungsklemme das Po tential zwischen den beiden Elektroden kontrolliert und der durch die Membran flie ende Strom gemessen
20. Standardabweichungen ber die Pr sentationen Tragen Sie Mittelwerte und Standardabweichungen des Membranpotentials gegen die Reizst rke auf Spikeanzahlen in Abh ngigkeit von der Reizst rke Berechnen Sie f r jede Reizst rke und f r den Ruhezustand die im Mittel ber alle Pr sentationen generierte Spikeanzahl und ihre Standardabweichung Tragen Sie diese gegen die Reizst rke auf Antwortlatenz in Abh ngigkeit von der Reizst rke Berechnen Sie f r die verschiedenen Reizst rken den mittleren zeitlichen Abstand zwischen Reizbeginn und erstem Spike und seine Standardabweichung Tragen Sie Mittelwert und Standardabweichung der Latenz gegen die Reizst rke auf Antwortwahrscheinlichkeit in Abh ngigkeit von der Reizst rke Berechnen Sie f r jede Reizst rke und Ruhe den Prozentsatz der Pr sentationen in denen mindestens ein Spike generiert wurde und tragen diesen gegen die Reizst rke auf Diese Angaben sind sehr wichtig um die Graphen zur Spikeanzahl und zur Antwortlatenz richtig interpretieren zu k nnen Stabilit t der Ableitung Um zu sehen ob es langfristige nderungen der gemessenen Zel leigenschaften gibt berechnen Sie f r jede Reizpr sentation einzeln das Ruhepotential den Eingangswiderstand die Anzahl APs in Antwort auf einen von Ihnen ausgew hlten Strompuls und die Antwortlatenz bei einem ausgew hlten Strompuls Tragen Sie die Wer te jeweils gegen die Nummer des trials auf Interpretieren Sie ob es drifts
21. apitel 7 beschrieben 3 Leiten Sie von einer Zelle Ihrer Wahl ab und versuchen Sie m glichst viele Durchl ufe mit dem gleichen Protokoll aufzunehmen mindestens 10 wobei Sie jeweils zwischen den Druchl ufen mindestens 10 s warten sollten 8 3 Auswertung Rasterplot Wandeln Sie die gemessenen Signale in AP Folgen um Sehr kritisch sind die von Ihnen gew hlten Parameter threshold und maximal duration of a spike zur Bestimmung 26 der APs berpr fen Sie ob die vom Programm gefundenen APs mit Ihrem Augenma bereinstimmen wo sich APs befinden Erstellen Sie einen Rasterplot s mtlicher Ant worten Zeigen Sie im Protokoll ausser diesem Rasterplot auch ein Einzelbeispiel f r eine Antwortspur Mittlere Antwort und PSTHs Erstellen Sie die ber alle Pr sentationen ausser solchen bei denen das Membranpotential sehr stark driftet weil die Elektrode au der Zelle gerutscht ist gemittelte Antwort wobei Sie das Zeitfenster variieren z B 1 ms 5 ms 10 ms 50 ms 100 ms Wie unterscheiden sich die mit verschiedenen Zeitfenstern generierte mittlere Antworten Warum bernehmen Sie ins Protokoll eine mittlere Antwort mit einem sinn vollen Zeitfenster Membranpotentialantwort in Abh ngigkeit von der Reizst rke Berechnen Sie das mittlere Membranpotential im Ruhezustand und in Antwort auf die verschiedenen Pulse gemit telt ber den jeweiligen Zeitraum und alle Pr sentationen Berechnen Sie auch die zu geh rigen
22. ators schlie en F r Fragen bez glich der verschiedenen Kn pfe ist auf den Oberfl chen jeweils eine Hilfe vorhanden Speziell f r diese Experiment ist es n tig die Modellzelle mit der Ableitaparatur zu ver binden Bitte verbinden Sie vorsichtig die den Ausgang Re 100MQ der Modellzelle mit dem BNC Eingang des Messkopfes und stecken das Kabel GND Ground Messerde in die Buchse auf der R ckseite des Messkopfes Achtung Der Messkopf ist extrem empfindlich Er darf weder stark ersch ttert werden noch starken elektromagnetischen Feldern ausgesetzt werden Deshalb empfiehlt es sich ein St ck geerdetes Metall z B den Farradayschen K fig anzufassen wenn man den Messkopf ber hrt Bevor Sie die eigentlichen Messungen beginnen sollten Sie jetzt mit Hilfe des Oszilloskops einige Einstellungen am Verst rker vornehmen die ebenfalls vor jedem Experiment n tig sind 1 Stellen Sie den vom Verst rker angezeigten Stromwert 15 auf 000 indem Sie den Dreh knopf BIAS verwenden und schreiben sich den Wert des Reglers auf Dieser Wert kann f r alle weiteren Messungen so bleiben Sie k nnen deshalb den Regler feststellen Stellen Sie den OFFSET am Drehregler so ein dass der am Verst rker angezeigte Span nungswert 14 genau 000 ist Notieren Sie den eingestellten Wert des Drehknopfes Der Offset wird sp ter auch bei jeder Verwendung einer neuen Elektrode jedesmal neu ein gestellt Falls die Anzeige der
23. ausser dem Computer auch das Oszilloskop zu verwenden Benutzen Sie daf r ein T St ck so dass zwei BNC Kabel an den Ausgang Potential mV Output 12 des 9 Verst rkers angeschlossen werden k nnen Eins der Kabel f hrt weiterhin zum A D Wandler das andere zum Eingang CH1 des Oszilloskops 4 2 Vorbereitung eines Experiments Die Verkabelung ist jetzt fertig Um sicherzustellen dass die Apparatur betriebsbereit ist und keinen Schaden nimmt m ssen aber noch folgende Einstellungen vorgenommen werden Die se sollten auch sp ter vor jedem Experiment kontrolliert bzw neu eingestellt werden 1 Stellen Sie den Schalter der Modellzelle auf 100 M 100 p Jetzt modelliert die Mo dellzelle eine kleine Nervenzelle mit einem Membranwiderstand von 100 MQ und einer Kapazit t von 100 pF 2 Der Messkopf steht auf 1x und sollte bitte von Ihnen auch nie auf 10x umgestellt wer den 3 Stellen Sie am Intrazellul rverst rker den Offset 29 und BIAS 28 auf 5 also jeweils in die Mitte des m glichen Bereichs 4 Alle anderen Drehkn pfe des Verst rkers Holding Current 22 Bridge Ballance 27 und Capacity Compensation 30 sollten auf 0 gedreht werden und auch bei sp teren Experimenten immer wieder zumindest auf Werte lt 1 zur ckgesetzt werden 5 Die Kippschalter am Intrazellul rverst rker sind folgendermassen eingestellt e OSCILLATION SHUT OFF 4 steht auf disabled
24. benfalls f r jede Pr sentation Membranpotential und Stromwert bei Ausl sung des ersten Aktionspotenti als Latenz macht hier keinen Sinn und ermitteln Mittelwert und Standardabweichung Vergleichen Sie die Ergebnisse der verschiedenen Reizprotokolle Ermitteln Sie die gleiche Schwelle Wenn nein woran k nnte das liegen 28 Die mit der Treppe erzeugten Messdaten eignen sich auch zu einer genaueren Bestimmung des Eingangswiderstandes der Zelle Berechnen Sie f r jede Pr senstation und jede Sti mulusst rke den Eingangswiderstand mit dem Ohmschen Gesetz Achtung nur steady state verwenden Berechnen Sie f r jede Stimulusst rke den mittleren Widerstand und seine Standardabweichung ber die Pr sentationen Tragen Sie Mittelwert und Standard abweichung gegen die Stimulusst rke auf H ngt der Eingangswiderstand von der Stimu lusst rke ab Ist der Zusammenhang linear 10 Synaptische bertragung F r das Protokoll erwarte ich dass Sie entweder eine Zelle genauer charakterisieren Aufgabe 9 oder Vergleichbares oder die synaptische bertragung eines Zellpaares untersuchen wenn Sie sich kein eigenes Projekt ausdenken Im Nervensystem des Blutegels k nnen sowohl elektrische als auch chemische inhibitori sche und excitatorische Synapsen relativ leicht abgeleitet werden Ihr Effekt wird untersucht indem man Intrazellul rableitungen von zwei Neuronen gleichzeitig durchf hrt und dabei je weils eins der Neuron
25. d Seitlich ziehen von jedem K rper Ganglion Nervenstr nge zum Muskelschlauch bzw der Haut des Blutegels Die K rper Ganglien sind alle sehr hnlich zueinander aufgebaut sie beinhalten zumindest in er ster N herung jeweils die gleichen Neurone die an der gleichen Stelle im Ganglion Abb 4 liegen Eine Ausnahme bilden die K rpersegmente 5 und 6 die speziell der Reproduktion die nen Die Zellk rper der insgesamt etwa 400 Neurone eines Ganglions liegen jeweils an der Oberfl che der ventralen und der dorsalen Seite des Ganglions Das Ganglion ist nahezu spie gelsymmetrisch aufgebaut fast alle Zellen kommen genau zweimal in jedem Ganglion vor Eine Schicht aus Gliazellen umschlie t das Ganglion Diese muss bei Intrazellul rableitungen von der Mikropipette durchbrochen werden Da das Nervensystem des Blutegels so einfach und stereotyp ist sind viele Neurone gut charakterisiert und in ihrer Funktion bekannt Im Rahmen des Praktikums werden Ihnen einige der folgende Zelltypen begegnen Retzius Zellen RZ und Leydig Zellen Ly Die beiden Retzius Zellen als gr ten Neurone im Blutegelganglion sind durch Aussch ttung von Neuromodulatoren an verschiedenen Verhaltensweisen beteiligt unter anderem der Steuerung des Schwimmens und der Ab sonderung von Schleim Die Leydig Zellen sind ihnen insofern hnlich als auch sie durch Neurosekretion potentiell auf viele andere Neurone wirken k nnen T P und N Zellen Diese Zellen sind Sensoren
26. d interessante Abbildungen abzuspeichern 4 bung zur Benutzung der Instrumente Ableitung von einer Mo dellzelle Am ersten Praktikumstag wird es vorwiegend darum gehen den Umgang mit den Mess instrumenten einzu ben Bitte schauen Sie sich zun chst die Benutzungshinweise f r den Intrazellul rverst rker das Oszilloskop den A D Wandler und die Software an Die Handb cher f r die einzelnen Komponenten liegen im Labor f r Sie bereit im Zweifelsfall lohnt es sich dort hineinzugucken 4 1 Einmalige Vorbereitung Die einzelnen Komponenten sind noch nicht miteinander verbunden damit Sie beim Aufbau en ein Gef hl daf r bekommen wie sie zusammenspielen Bitte lassen Sie zun chst alle Ger te auch den Computer ausgeschaltet So wird aus der Sammlung von Einzelteilen ein Elektrophysiologie Messplatz 1 Verbinden Sie den Messkopf mit dem Intrazellularverstarker indem Sie das Kabel in die Buchse Headstage 31 in Abb 5 stecken 2 Jetzt verbinden Sie die Buchse Potential mV Output 12 des Intrazellul rverst rkers mit Hilfe eines BNC Kabels mit Channel 0 des A D Wandlers Der A D Wandler ist bereits mit dem Computer verbunden Der Verst rkungsfaktor des Verst rkerausgangs sollte auf x20 eingestellt sein Jetzt ist die Apparatur prinzipiell schon einsatzf hig um Signale mit dem Messkopf aufzuzeichnen mit dem Verst rker 20 fach zu verst rken und mit dem A D Wandler an den Computer zu bertragen 3 Da
27. destens 12 feinen Drahtnadeln und Ringer bei Raumtemperatur bereit Pr paration Mit einer grossen Nadel das Hinterende feststecken Mit der zweiten grossen Nadel das Vorderende langziehen und feststecken Die gr n gemusterte dorsale Seite muss oben liegen Mit einem Skalpell oder einer gro en Schere genau in der Mitte des R ckens einen Schitt ziehen Den Muskelschlauch auseinanderziehen und seitlich mit Stecknadeln feststecken Blut absaugen das wird w hrend der Pr paration immer wieder n tig und bei Bedarf kalten Ringer nachf llen das Gewebe darf nie trockenfallen Binokkular den eigenen Augen entsprechend anpassen und auf das gew nschte Gangli on fokussieren 15 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 5 4 Muskel und Fettgewebe ber dem ausgew hlten Ganglion und seinen Konnektiv und Seitennerven mit Pinzette und feiner Schere entfernen Achtung Die feinen Scheren sind empfindlich und teuer Bitte lassen Sie sie nicht fallen und benutzen Sie sie ausschlies slich f r feine Schneidarbeiten nicht f r die Haut grobe Muskeln etc Feines Blutgef geflecht ber dem Ganglion mit einer feinen Pinzette und der feinen Schere der L nge nach aufschneiden dabei oben und unten jeweils den Schnitt um etwa die Breite des Ganglions fortsetzen Das Ganglion von den Blutgef en freischneiden aber genug zum sp teren Fixieren briglassen Mit der
28. die auf mechanische Stimulation der Haut reagieren T Zellen touch reagieren auf leichte Ber hrung z B Luftblasen im Was ser P Zellen pressure auf festere z B Antippen mit einem Finger N Zellen noxious auf sehr starke z B Nadelstich Taktile Information ist f r das Verhalten des Blutegels von entscheidender Bedeutung Die Sensorzellen haben ihre Zellk rper in den K rper Ganglien und senden Dendriten in die Haut wo diese sich fein verzweigen und so Infor mation ber Stimulation der gesamten Haut an das zentrale Nervensystem leiten CV AE AP HE Diese Zellen sind Motorneurone Die Axone von CV AE und AP ziehen zum Muskelschlauch um dort die Muskelspannung zu kontrollieren CV ist die Abk rzung f r Ventrolateral Circular excitor denn Aktionspotentiale dieses Neurons bewirken dass die zirkul ren Muskeln sich zusammenziehen AE steht f r Annulus Erector Aktivie rung dieses Neurons f hrt dazu dass die Haut des Segments sich in kleinen Wellen aufstellt AP hei t Anterior Pagoda benannt nach der regelm igen Form der spontan auftretenden Aktionspotentiale Obwohl dieses Neuron einfach abzuleiten ist ist seine Funktion unbekannt bis auf die Tatsache dass es sich um ein Motorneuron handelt HE bedeutet Heart Excitor und bewirkt das zusammenziehen des Herzmuskels HN S Nut Bei diesen Zellen handelt es sich vermutlich um Interneurone HN ist ein inhi bitorisches Interneuron Heart Neu
29. e EL CLEAR 5 steht in der Mitte e BUZZ 8 steht auf OFF e ELECTRODE RESISTANCE 10 ist nicht gedr ckt e Potential mV 11 steht auf 20 damit Computerprogramm und Verst rker optimal aufeinander eingestellt sind Allerdings muss dieser Verst rkungsfaktor beim Able sen auf dem Oszilloskop bedacht werden e STEP SIZE 17 steht auf 0 e CURRENT INPUT 0 1 NA V 19 steht auf OFF e CURRENT INPUT 1 NA V 24 steht auf ON e BRIDGE BALANCE RANGE 26 steht auf 100 MQ 6 Am Oszilloskop stellen Sie zun chst die X Achse SEC DIV auf 50 ms und die Y Achse VOLTS DIF auf 5 V Diese Einstellungen werden Sie haufig Ihren Erfordernissen an passen m ssen Beachten Sie dabei die 20x Verst rkung durch den Verst rker Jetzt k nnen Sie den Verst rker das Oszilloskop und den Computer anschalten W hrend der Verst rker sich auf seine Betriebstemperatur aufw rmt bereiten Sie bitte Ihr Experiment am Computer vor Auch diese Prozedur werden Sie nicht nur f r die Messung mit der Modellzelle sondern vor jedem Experiment durchf hren m ssen 1 Starten Sie Matlab 7 0 2 Tippen Sie ephys in das Matlabfenster ein und dr cken Return Es ffnet sich eine graphische Benutzeroberfl che zur Steuerung eines Elektrophysiologie Experiments 10 10 Geben Sie dem geplanten Experiment einen aussagekr ftigen Namen z B Modellzelle Generieren Sie das f r den ersten Schri
30. e mit Strompulsen reizt und den beim anderen Neuron dadurch aus gel sten Effekt betrachtet 10 1 Kriterien zur Unterscheidung elektrischer und chemischer Synapsen Postsynaptische Potentiale Zun chst muss der Nachweis erbracht werden ob die beiden Zellen berhaupt miteinander gekoppelt sind Dazu wird in eines der Neurone depolarisie render Strom injeziert Wenn sich beim anderen eine De oder Hyperpolarisation einstellt die bei spontan aktiven Neuronen normalerweise mit einer Erohung bzw Erniedrigung der Spikerate einhergeht sind die beiden Neurone elektrisch gekoppelt Effekt pr synaptischer Hyperpolarisation Wenn sowohl Depolarisation als auch Hyperpo larisation des pr synaptischen Neurons mit gleichem Vorzeichen an die postsynaptische Zelle weitergegeben werden handelt es sich um eine elektrische Synapse Reziproker Einfluss Elektrische Synapsen funktionieren normalerweise in beide Richtun gen w hrend chemische Synapsen grunds tzlich gerichtet arbeiten Allerdings kann es bei chemischen Synapsen R ckkopplung geben und rektifizierende elektrische Synapsen lassen depolarisierenden Strom nur in einer Richtung passieren und hyperpolarisieren den in die andere Dynamische nderung der Synapsenst rke Die synaptische St rke ist definiert als post synaptischer Effekt pr synaptischer Effekt Elektrische Synapsen haben normalerweise eine relativ starre synaptische St rke Dagegen kann sich die St rke chemischer Syn apsen
31. en Stimulus Treppe 10 mal Pr sentieren Sie anschliessend entweder die beiden Rampen jeweils 10 mal oder die Spruenge Nat rlich k nnen Sie gerne auch beide Stimulationsarten ausprobieren wenn die Ableitung noch stabil ist Wenn die Ableitung noch stabil ist f hren Sie mehr Pr sentationen der verschiedenen Stimuli durch Hier gilt wie bei den Experimenten zu Kodierung und Zuverl ssigkeit je mehr desto besser Wenn Sie es ganz genau wissen wollen Untersuchen Sie den Membranpotentialbereich der sich als relevant f r die Spikeschwelle herausgestellt hat nochmal genauer mit einer Stromtreppe mit Stufen von kleinerer Amplitude Diese Aufgabe klingt einfach ist aber relativ schwierig wenn das Membranpotential driftet Sagen Sie bitte bescheid wenn Sie Hilfe brauchen Auswertung Bestimmen Sie f r jede Pr sentation der Treppe den Wert des injezierten Stroms und den dadurch bedingten Membranpotentialwert bei dem das erste Aktionspotential ausgel st wird Bestimmen Sie Mittelwert des Membranpotentialwerts bei dem das erste AP ausgel st wird Bestimmen Sie Latenz und zeitliche Pr zision des Auftretens des ersten Spikes nach Beginn der entsprechenden Stromstufe Wenn Sie die Spr nge als weitere Stimulation verwendet haben werten Sie diese Daten in gleicher Weise aus wie die Ergebnisse des Protokolls Treppe Wenn Sie die beiden Rampen verwendet haben bestimmen Sie e
32. erzeich net sind 20 Ruhepotential Das Ruhepotential das sich w hrend der Intrazellul rbleitung einstellt wenn nicht stimuliert wird h ngt vom Zelltyp ab Spontanaktivit t Manche Zellen die nicht elektrisch stimuliert werden und deren Mem branpotential somit beim Ruhepotential liegt produzieren fortw hrend Aktionspotentiale w hrend andere Neurone still sind Allerdings h ngt dieses Kriterium stark von der Ab leitqualit t und vom Zustand des Pr parates ab durch die Verletzung der Membran beim Einstich werden auch in stillen Neuronen APs ausgel st Eingangswiderstand Wenn man in eine Zelle einen Strompuls injeziert kann man mittels des Ohmschen Gesetzes den Widerstand der Zelle als R U I ausrechnen in Einhei ten lmQ 1mV 1nA Es bietet sich an einen hyperpolarisierenden Puls zu nehmen damit durch ihn keine aktiven Prozesse ausgel st werden Je gr er ein Neuron ist desto geringer ist sein Eingangswiderstand Achtung Wenn die Bridge Balance nicht korrekt eingestellt ist misst man Artefakte der Elektrode mit Gr e und Form der Aktionspotentiale Ge bte Elektrophysiologen erkennen die verschie denen Neuronen des Blutegels alleine am Aussehen der Aktionspotentiale Man sollte auf die H he der APs z B Motorneurone haben APs von 5 mV w hrend P Zellen 50 mV depoalrisieren k nnen ihre Breite h ufig gemessen als Dauer des APs bei halber Ma ximalh he und Form z B Steigung der beiden Flan
33. ials allerdings werden ausschliesslich die Zeitpunk te der detektierten Aktionspotentiale in die Auswertung einbezogen In ephys erzeugt der 25 button PSTHeine grafische Ausgabe des Zeitverlaufs der Spikeh ufigkeiten Auch hier ist die Angabe des Zeitfensters binduration entscheidend verschiedene Zeitfenster k nnen zu unterschiedlichen Interpretationen der Daten f hren Antwortlatenz und zeitliche Pr zision In vielen sensorischen Systemen wird das erste Ak tionspotiential der Antwort umso fr her generiert je st rker der Reiz ist Es gibt Hinweise darauf dass die als Latenz bezeichnete Zeitspanne zwischen Beginn des Reizes und Beginn der Antwort genutzt werden kann um schnell von der neuronalen Antwort auf den Reiz zur ckzuschliessen Allerdings tritt das erste AP nach Reizbeginn nicht immer exakt zum selben Zeitpunkt auf weshalb neben der mittleren Antwortlatenz auch die Streuung um diesen Mittelwert betrachtet wird Diese ist ein Ma f r die zeitliche Pr zision der Ant wort Der Button atency schreibt Mittelwert und Standardabweichung des jeweils ersten Aktionspotentials zwischen starttime und endtime in den betrachteten trials in das Aus gabefenster F r diese Funktion ist die Wahl der beiden Parameter zur Spikedetektion threshold und maximal duration besonders entscheidend Wahrscheinlichkeit des Auftretens von Antworten Bei schwachen Reizen z B kurzen Strompulsen mit niedriger Amplitude wird nicht unbedingt jedes
34. ich l ngeren Zeit raum erfolgt oder mehrere trials benutzt werden siehe 8 Es kann zu langsamen Schwankungen des Membranpotentials kommen auch das wird unten diskutiert des halb sollten Sie das Ruhepotential mindestens am Anfang oder am Ende einer langen Messreihe bestimmen und miteinander vergleichen Spontanaktivit t Qualitativ ist wichtig ob die Zelle in Abwesenheit eines Reizes nie vereinzelt oder st ndig Aktionspotentiale generiert Bei stark spontanaktiven Zellen rechnen Sie bitte auch die Spikerate aus siehe 8 Auch diese kann sich erheblich im Laufe eines Experiments ndern Eingangswiderstand Berechnen Sie den Eingangswiderstand der Zelle anhand ihrer Reaktion auf einen hyperpolarisierenden Strompuls Da der Eingangswiderstand ein g ngiges Ma f r die Ableitqualit t ist berpr fen Sie bitte ob er sich zwischen Anfang und Ende Ihrer Messreihe ndert Gr e und Form von Aktionspotentialen Die H he und Dauer eines Aktionspotentials ist nicht ganz einfach zu messen da man streng genommen Bezugspunkte festlegen muss auf die sich die Messung bezieht Auch h ngt die H he eines Aktionspotentials davon ab von welchem Membranpotential aus es startet W hlen Sie sich am besten einen Sti mulus aus der bei allen von Ihnen abgeleiteten Zellen mindestens ein Aktionspotential ausgel st hat und vermessen die H he des APs vom Ausgangspotential bis zur Spitze die Breite des APs vom Start bis zum Einsetzen der Nachhyperpo
35. icht 2 Leiten Sie im Laufe des Praktikums von mindestens drei verschieden Zelltypen des Blut egels ab und charakterisieren sie auf der Grundlage dieser Kriterien Besonders geeignet sind daf r die in Abbildung 4 mit einem K rzel versehenen Zellen Der am einfachsten Ab zuleitende und zu charakterisierende Zelltyp ist die Retziuszelle RZ die Sie als erstes Untersuchungsziel anpeilen sollten 21 3 Warum ist eine hohe Samplerate erforderlich um zuverl ssig Zellen elektrophysiologisch zu charakterisieren 4 Warum ist es wichtig die Bridge Ballance w hrend des Experiments regelm ig zu berpr fen 5 Hinweis Wenn Sie eine gute Ableitung haben k nnen Sie die Zelle gleich f r das Ex periment zu Kodierung und Zuverl ssigkeit verwenden Erstellen Sie deshalb am besten fr hzeitig ein Stimulusprotokoll f r diesen Fragenkomplex und speichern es ab so dass Sie es laden und benutzen k nnen sobald sich die Gelegenheit ergibt 7 2 Auswertung F r die Charakterisierung von Neuronen reicht mir eine qualitative Auswertung die auf kleinen Stichproben beruht Wichtig ist allerdings dass Sie diese als solche kennzeichnen z B Mitte lung ber welchen Zeitraum wieviele trials wurden benutzt ggf auch wieviele Zellen Listen Sie f r die verschiedenen Zelltypen auf Ruhepotential Gemittelt ber mindestens 100 ms neuronaler Antwort wenn keine Reizung stattfindet Besser ist nat rlich wenn die Mittelung ber einen wesentl
36. ieren was Sie m chten allerdings sollten niemals mehr als 5 nA injeziert werden Beispeilsweise k nnten Sie ausprobieren e Ein 10 s langer Sinus Stimulus mit einer Amplitude von 2 nA e Ein 60 s langer Stimulus mit 5 jeweils 10 s langen Pulsen von 3 nA e Eine 30 s lange Treppe bei der von 0 nA anfangend jeweils nach 5 s der Strom um 0 5 nA zunimmt e Ein 60 s langer Stimulus der nach 10 s von 0 nA als Rampe in 40 s auf 3 nA abf llt e Ein 10 s langer Stimulus der jeweils nach 1 s f r 10 ms von 0 nA auf 2 nA springt e Probieren Sie auch aus den gleichen Stimulus mehrfach zu pr sentieren und zwischen durch jeweils f r 10 s zu warten Indem Sie bei repetitions auf change klicken k nnen Sie die Anzahl der Wiederholungen des aktuellen Reizes einstellen und wenn Sie bei pause auf change klicken stellen Sie die Pause zwischen diesen Wiederholungen ein Fragen 1 Was passiert wenn eine sehr kurze Stromstufe injeziert wird 2 berlegen Sie sich eine Versuchsreihe um mit der Modellzelle ein gro es mit einem kleinen Neuron bez glich ihre zeitlichen Antworteigenschaften zu vergleichen 5 Vorbereitung eines elektrophysiologischen Experiments Die meiste Zeit des Praktikums werden Sie damit verbringen einzelne Intrazellul rableitungen von Neuronen des Blutegels durchzuf hren F r jedes dieser Experimente sind folgende Vorbereitungen zu treffen 5 1 Ringer berpr fen Sie ob
37. innen berpr fen Sie bei jedem Experiment bei dem Sie eine Stromstufe injezieren ob Bridge Balance 27 und Kapazit tskompensation 30 noch in Ordnung sind Es ist blich in 18 10 11 einem Stimulusprotokol vor der eigentlich interessierenden Stimulation extra zu diesem Zweck und zur berpr fung ob der Eingangswiderstand der Zelle konstant bleibt einen schwachen Rechteckpuls zu geben z B 500 ms 0 5 nA Versuchen Sie sich beim Ab gleich an Abbildung 9 zu orientieren tats chlich ist dies eine sehr schwierige Aufgabe die sehr viel mehr Erfahrung erfordert als Sie sie im Rahmen des Praktikums erlangen k nnen Falls das Membranpotential gegen 0 driftet rutscht wahrscheinlich gerade die Mikropi pette aus der Zelle Versuchen Sie diese durch eine minimale Bewegung mit dem Mikro manipulator tiefer in die Zelle zu bef rdern Wenn Sie eine Zellmembran durchbrochen haben und die Pipette wieder aus der Zel le gerutscht ist fahren Sie die Elektrodenspitze ein St ck weit von den Zellen weg berpr fen Sie ob der Offset 29 der Elektrode nachreguliert werden muss ob die Elek trode noch den selben Widerstand 10 14 hat Abweidungen bis 20 sind ok und ob BRIDGE BALLANCE 27 noch richtig eingestellt ist Kommt es zu gro en nderungen k nnen Sie versuchen die Pipette mit ELECTRODE CLEAR 5 zu reinigen Wenn das nicht funktioniert ist sie entweder zu sehr mit einem St ck Membran verstopft oder ab
38. its in den fr hen Anf ngen der Elektrophysiologie vor 75 Jahren ist festgestellt worden dass ein sensorisches Neuron umso mehr Aktionspotentiale generiert je st rker ein Reiz ist Inzwischen hat sich f r viele neuronale Systeme jedoch herausgestellt dass dieses als Ratencode bezeichnete Prinzip nicht zur Kodierung der sensorischen In formation ausreicht sondern dass auch die genauere zeitliche Struktur der neuronalen Ant worten eine Rolle spielt Die Dekodierung neuronaler Signale wird dadurch erschwert dass eine Nervenzelle nicht in immer gleicher Weise auf einen wiederholten gleichen Stimulus rea giert Tats chlich kann die Variabilit t der Antworten ganz erheblich sein teilweise gr er als die mittlere Antwort Es ist eine der gro en Fragen der Neurowissenschaften wie Nervensy steme trotz ihrer unzuverl ssigen Bauelemente zuverl ssige Verhaltensantworten generieren k nnen Diese Unzuverl ssigkeit der neuronalen Antworten zeigt sich nicht nur bei nat rlicher Stimulation also z B der Reaktion auf eine Lichtreiz oder einen Druck auf die Haut sondern auch bei der wesentlich besser kontrollierbaren elektrischen Stimulation einzelner Nervenzel len wenn auch in geringerem Ma e 8 1 Methoden zur Untersuchung der Kodierung und Zuverl ssigkeit neuronaler Antworten und Auswertung mit dem Programm ephys Das f r die Stimulation und Datenaufnahme verwendete Programm ephys beinhaltet auch ei nige M glichkeiten der
39. karte im Computer eingebaut ist Die bermittlung der Signale vom Verst rker zum Computer Messwerte und umgekehrt elektrische Rei zung erfolgt ber eine spezielle in die Aparatur eingebaute Anschlussbox f r BNC Kabel die mit dem Verst rker verbunden wird Software Die zur Datenaufnahme und Stimulation verwendete Software wurde in meinem Labor von drei studentischen Hilfskr ften entwickelt Sie ist brandneu an manchen Stel len noch etwas unfertig und hat sicher noch den einen oder anderen bug Bitte z gern Sie deshalb nicht mir bescheidzusagen wenn die Software etwas anderes tut als Sie erwarten Wir werden die Software am Computer besprechen deshalb hier nur ein paar Stichworte e Die komplette Software ist in der Programmiersprache Matlab geschrieben Deshalb m ssen Sie zun chst Matlab starten wenn Sie den Computer benutzen wollen 6 O O OO OY OY 9 YO GCOOA O A O 7 Abbildung 5 Im Praktikum benutzter Intrazellul rverst rker Aus dem Verst rker Handbuch ONH 1 Tektronix TDS1002 Ly a Aa TT aL sitan Em SECIDIV amp EXT TRIG a 2 Kanal Modelle Abbildung 6 Im Praktikum benutztes Oszilloskop das zur schnellen Orientierung dient Die eigentlichen Messungen werden per Computer aufgezeichnet Aus dem Oszilloskop Handbuch Um das Programm zur Datenaufnahme und Stimulation zu starten tippen Sie ephys in
40. ken Lange und Amplitude der Nach hyperpolarisation achten Einige Beispiele sind in Abb 10 gezeigt Reaktion auf langanhaltende depolarisierende Strompulse Eine generelle Unterschei dung wird nicht nur bei Blutegeln zwischen tonischen und phasischen Zellantworten auf langanhaltende Depolarisation getroffen Eine tonische Aktionspotential Antwort dauert so lange wie der Stimulus w hrend eine phasiche Antwort nur transient am Anfang des Pulses auftritt Diese Unterscheidung ist allerdings weniger eindeutig als sie klingt da es sehr verschiedene Auspr gungen von phasischen Antworten gibt so dass sie im Endef fekt ein Kontinuum hin zur tonischen Antwort bilden Reaktion auf langanhaltende hyperpolarisierende Strompulse Insbesondere bei spon tanaktiven Zellen ist es interessant zu untersuchen wie diese auf langanhaltende nega tive Strompulse reagieren Auch manche nicht oder wenig spontanaktive Zellen zeigen nach Ende der Hyperpolarisation sogenannte Rebound Spikes wenn sie zu ihrem Ru hepotential zur ckkehren Morphologie Die letzte Gewissheit um welche Zelle es sich handelt bekommt man durch eine Anf rbung Diese werden wir im Rahmen des Praktikums aber nicht durchf hren 7 1 Aufgaben und Fragen 1 Entwickeln Sie ein Protokoll das die Charakterisierung von Zellen anhand der oben ge nannten Kriterien Position Ruhepotential Spontanaktivit t Eingangswiderstand Form der APs und Reaktion auf lange Strompulse erm gl
41. larisation die H he der Nachhyperpolarisation und die L nge der Nachhyperpolarisation bis das Ausgangspo tential wieder erreicht ist Zeigen Sie f r die verschiedenen Zellen jeweils mindestens ein Aktionspotential in hoher Vergr erung in einer Abbildung Phasisch Tonisch Zeigen Sie f r jede abgeleitete Zelle eine Beispielantwort auf einen lan ganhaltenden mind 100 ms Strompuls bzw die Antworten auf Ihr gesamtes Stimu lusprotokoll Klassifizieren und begr nden Sie ob es sich um eine phasische oder ei ne tonische Antwort handelt Wenn Sie mit Reizen verschiedener St rke gearbeitet ha ben nehmen Sie auch Stellung dazu ob das phasische bzw tonische Verhalten von der Reizst rke abh ngt 22 Rebound Spikes Notieren Sie im Protokoll ob Sie im Anschluss an eine Hyperpolarisation Rebound Spikes beobachten F r diesen Praktikumsteil bietet es sich an die Ergebnisse f r die verschiedenen Zellen gegeneinanderzustellen beispielsweise als Tabelle F r die Diskussion sollten Sie die Zelltypen vergleichen und zu versuchen einen Bezug zu ihrer Funktion herzustellen 8 Kodierung und Zuverl ssigkeit neuronaler Antworten F r das Protokoll erwarte ich dass Sie die Antworteigenschaften einer Zelle anhand von min destens 10 besser mehr Antworten auf wiederholte gleiche Stimulation quantitativ auswerten Das klassische Bild der Aufgabe von Nervenzellen ist dass sie Informationen ber die sensori sche Umwelt bertragen Bere
42. magnetische Fel der Wichtig zu wissen ist dass der Verst rker das gemessene Signal um den Faktor 10 20 oder 50 verst rkt Schalter 11 Das Messprogramm des Computers ist darauf ausgelegt dass Sie Verst rkungsfaktor 20 verwenden Dann entspricht 1 mV auf dem Bildschirm tats chlich 1 mV in der Zelle Oszilloskop Auch das Oszilloskop Abb 6 kann prinzipiell mehr leisten als im Rahmen des Praktikums erforderlich ist Es kann die Signale von zwei Eing ngen gleichzeitig darstel len Wir benutzen es nur zur schnellen Kontrolle der aktuellen Messwerte die eigent lichen Messdaten werden von dem Computer aufgezeichnet Die drei interessantesten Kn pfe sind beim ersten Eingangskanal CH1 Volts DIV Skala der Y Achse und Po sition Position der Darstellung auf dem Display und SEC DIV Skala der X Achse in den Horizontal Einstellungen Diese m ssen jeweils den aktuellen Erfordernissen der Experimente angepasst werden die eingestellten Werte sind jeweils unten auf dem Dis play dargestellt Bitte beachten Sie dass das Messsignal den Verst rker 20x vergr ert verl sst Entsprechend m ssen Sie die Angaben auf dem Bildschirm des Oszilloskops durch 20 teilen um den tats chlichen Spannungswert zu ermitteln A D Wandler Damit die Messwerte von einem Computer verarbeitet werden k nnen m ssen sie zun chst von Analogsignalen in Digitalsignale bersetzt werden Das wird von einem A D Wandler geleistet der als Steck
43. mal eine Antwort aus gel st Deshalb ist es interessant die Wahrscheinlichkeit f r das Auftreten einer Antwort auf verschiedene Stimulusbedingungen zu vergleichen Auch ist es f r die Interpretation von Messdaten wichtig zu wissen in wieviel Prozent der F lle berhaupt eine Antwort erfolgt Dies gilt insbesondere f r die Pr zision der Latenz weshalb ephys bei atency die Anzahl von trials mit angibt in denen keine Aktionspotentiale im betrachteten Zeit bereich generiert wurden Ansonsten l sst sich diese Anzahl nat rlich auch aus den von der Funktion count spikes zur ckgelieferten Nullen bestimmen 8 2 Aufgaben F r den Bereich der neuronalen Kodierung spielt die Datenauswertung meist eine gr ere Rolle als die experimentelle Messung Entsprechend werden auch Sie voraussichtlich einige Zeit f r die Auswertung ben tigen bitte planen Sie daf r einige Stunden bei Ihrer Zeitplanung ein Die notwendigen Methoden werde ich im Detail mit Ihnen besprechen wenn Sie die Da ten erhoben haben Die Messung f r diesen Fragenkomplex l sst sich gut mit den Versuchen zur Charakterisierung von Neuronen kombinieren wenn Sie rechtzeitig das Stimulusprotokoll vorbereiten 1 Erstellen Sie ein Protokoll das aus mehreren l ngeren Pulsen verschiedener Amplitude aber gleicher L nge z B 500 ms mit Ruhepausen dazwischen besteht Verwenden Sie sowohl De als auch Hyperpolarisation 2 Bereiten Sie das Experiment in gleicher Weise vor wie in K
44. n Abfluss gesp lt Die Petrischale gut mit VE Wasser durchsp len und zum Trocknen hinstellen 19 Abbildung 10 Beispiel f r die AP Formen von drei verschiedenen Zelltypen des Blutegels Aus Neuro biology of the leech 7 Der Blutegel kommt in das Gefas mit Alkohol er stirbt darin innerhalb von k rzester Zeit 8 Die Praparationsschale wird gut ausgesp lt der Rand wird wieder mit Wasser gef llt das Wachsbett wird mit Papier trockengetupft und die Schale kommt ins Gefrierfach 9 Sp len Sie alle noch herumstehenden Bechergl ser etc mit VE Wasser und lassen sie trocknen 7 Charakterisierung von Neuronen des Blutegels F r das Protokoll erwarte ich dass Sie mindestens drei verschiedene Zellen qualitativ charak terisieren Bei diesem Praktikumsteil geht es darum mehrere einzelne Neurone des Blutegels abzu leiten und elektrophysiologisch zu charakterisieren Sobald Sie ein wenig bung im Ableiten haben bietet es sich an die Charakterisierung eines Neurons mit einem der Experimente aus Abschnitt 8 zu kombinieren Wichtige Parameter zur Bestimmung des Zelltyps sind Position des Zellk rpers Die meisten Neuronen des Blutegels lassen sich alleine auf Grund der Position ihres Zellk rpers relativ zu den anderen Zellen im Ganglion bestimmen Des halb sucht man die Zelle von der man ableiten m chte durch den optischen Vergleich mit dem in Abb 4 gezeigten Stadtplan auf dem eine Reihe gut ableitbarer Zellen v
45. ntworten neuronaler Systeme auf sensorische oder elektrische Reize variabel sind ist es in den Neurowissenschaften blich den gleichen Reiz mehrfach zu pr sentieren und dann ber die aufgenommenen Antworten zu mitteln H ufig wird zus tzlich eine zeitliche Mittelung der Signale vorge nommen wie sie im letzten Punkt beschrieben wurde Ziel des Verfahrens ist es einen Verlauf der Antwort zu erkennen der die typische Reaktion auf den Stimulus wider spiegelt Dazu wird ein Zeitfenster fester L nge ber die Antwortspur geschoben und in diesem Fenster jeweils der mittlere Membranpotentialwert aller betrachteter trials be stimmet So kann man auch f r komplexe Reizfolgen der Zeitverlauf der im Durchschnitt erzielten Antwort ermitteln In ephys wird dieser Zeitverlauf berechnet und grafisch dar gestellt wenn man auf den Button mean response klickt Das verwendete Zeitfenster wird oben im Fenster als binduration angegeben Die Wahl dieses Zeitfensters ist ein kritischer Parameter denn w hlt man das Fenster zu gro sind schnelle nderungen der Antwor ten unsichtbar ist es zu klein verliert man den berblick ber die grobe Antwortstruktur Auf jeden Fall sollte das Zeitfenster maximal so gross sein wie die k rzeste L nge der verwendeten Reize Bestimmung von AP Zeitpunkten Ausgehend von der Annahme dass APs stereotyp sind und es somit nur darauf ankommt ob ein AP generiert wird Alles oder nichts Prinzip werden elektrophy
46. rd jeweils eine matlab und eine excel Datei erzeugt die sp ter f r das Protokoll verwendet werden k nnen Der Button clear l scht den Inhalt der Ergebnisfenster Im Rahmen des Praktikums sollen Sie folgende Standard Methoden der Auswertung elek trophysiologischer Daten durchf hren die sich teilweise auf das gesamte Membranpotential teilweise nur auf die Aktionspotentiale beziehen Mittleres Membranpotential in einem bestimmten Zeitraum H ufig m chte man das miitt lere Membranpotential einer Zelle unter einer bestimmten Reizbedingung ermitteln Bei der Analyse mit ephys geschieht dies durch Dr cken des Buttons mean Ephys berechnet dann f r jedes trial zwischen first trial und last trial den Mittelwert des Membranpotenti als in dem durch starttime und endtime bestimmten Zeitintervall und gibt diese Werte im Ergebnisfenster aus Zus tzlich wird auch der Mittelwert dieser Werte angegeben Da es sich in erster Linie um eine Mittelung ber die Zeit handelt kann dieses statistische Verfahren selbst auf einen einzigen trial angewandt werden Damit diese Werte Aussa gekraft besitzen muss man darauf achten dass der jeweils untersuchte Bereich sich auf eine konstante Reizbedingung bezieht Besonders wichtig ist diese Auswertung f r die Ermittlung des Ruhepotentials wof r das Membranpotential in Zeitbereichen gemittelt wird w hrend denen die Zelle nicht elektrisch stimuliert wurde Zeitverlauf des mittleren Membranpotentials Da die A
47. ron das an der Mustergeneration des Herzschlags beteiligt ist Die S Zelle ist ebenfalls ein Interneuron Es ist an vielen Verhaltensweisen wie z B Schwimmen und Shortening beteiligt wobei es unter anderem zur Koordination der K rpersegmente dient da die S Zellen aller Segmente elektrisch miteinander gekop pelt sind In jedem Ganglion kommt nur eine S Zelle vor Sie ist sehr klein und schwierig 5 abzuleiten Die Funktion der Nut Zelle ist nicht bekannt doch vermutlich ist es ein Inter neuron Es ist aufgrund ihrer Form Nut getauft worden Im Praktikum k nnte Ihnen diese Zelle begegnen einerseits weil sie aufgrund von Position und Gr e mit AE verwechselt werden kann andererseits weil sie synaptisch mit P gekoppelt ist 3 Im Praktikum verwendete Instrumente Intrazellul rverst rker Der in Abbildung 5 gezeigte Intrazellul rverst rker BA1 S ist ein Br ckenverst rker der w hrend Strominjektion in eine Zelle das durch den Widerstand der Elektrode herr hrende Spannungsartefakt ausgleichen kann Da es sich um ein vielseitiges Messger t f r elektrophysiologische Forschung handelt k nnen die vielen Kn pfe durchaus verwirrend sein Die Einstellung der einzelnen Regler werden Sie am er sten Praktikumstag mit einer Modellzelle erlernen Zum Verst rker geh rt ein Messkopf an den die Elektrode mit einem Elektrodenhalter angesteckt wird Dieser Messkopf ist sehr empfindlich sowohl gegen Ersch tterung als auch gegen elektro
48. s muss ein Zeitfenster festgelegt wer den um AP Raten zu bestimmen Die Wahl dieses Zeitfensters ist mindestens so kritisch wie bei der Ermittlung des Zeitverlaufs des mittleren Membranpotentials Da es sich bei der Bestimmung der AP Rate um eine zeitliche Mittelung handelt kann sie selbst dann angewendet werden wenn ein Stimulus nur einmal pr sentiert wurde Der Button count spikes z hlt f r den oben angegebenen Zeitbereich von start time bis end time in jedem trial die Aktionspotentiale und schreibt diese Gesamtzahlen in das Auswertungsfenster So kann man entsprechend der Funktion mean St ck f r St ck die Antworten auf ver schiedene Reize ausrechnen Standardabweichung der Antworten auf wiederholte Pr sentationen Ausser dem Mittel wert der Spikerate in Reaktion auf einen Reiz kann auch die Standardabweichung also die Streuung der Einzelantworten um den Mittelwert f r verschiedene Bedingungen be rechnet werden Z B ist es interessant zu vergleichen ob die Antworten w hrend der Stimuluation mehr streuen als beim Ruhezustand der Zelle Der Button standard deviati on erzeugt die Standardabweichung zu dem mit count spikes bestimmten Mittelwert Peri Stimulus Time Histogram Im PSTH Peri Stimulus Time Histogram werden die H ufigkeiten aufgetragen wieviele Spikes in bestimmten Zeitfenstern relativ zum Stimu lus generiert wurden Insofern entspricht die Methode PSTH der Berechnung des mittle ren Zeitverlaufs des Membranpotent
49. siologische Me daten h ufig insofern vereinfacht als nur die Zeitpunk te des Ausl sens von Aktionspotentialen betrachtet werden Dieses Verfahren eliminiert jegliche Information ber die APs selber Amplitude Form Dauer als auch ber den Verlauf des Membranpotentials zwischen den APs Die einfachste Methode zur Gene rierung solcher AP Folgen ist ein Schwellwert bei dessen berschreiten der Wert als 1 definiert wird und sonst als 0 egal ob die Zelle am Ruhepotential oder um viele mV depolarisiert ist Da bei der Benutzung verschieden starker Reize schon die passive Antwort auf starke Reize h her sein kann als das Spikemaximum bei niedrigen Reizen 24 verwenden wir ein etwas aufw ndigeres Verfahren Der Button Detect Spikes f hrt die Spikedetektion f r die oben angegebene Zelle trials und Zeitraum durch Hierzu werden die beiden Parameter threshold und maximal duration for a spike ben tigt Die Spikede tektion erfolgt indem getestet wird wann innerhalb eines durch den Wert von maximal duration for a spike festgelegten Zeitintervals das Membranpotential mindestens um den durch threshold gegebenen Wert ansteigt und wieder um die H lfte des Wertes abf llt Dies ist eine stark vereinfachte Ann herung der Spikeform Detect Spikes zeigt jeweils die ersten trials des benutzten Bereichs und markiert die gefundenen Spikes mit einem Kreis Die Parameter der Spikedetektion sind sehr kritisch f r die weiteren Auswertungen Bi
50. treme eu my yo wer gompensatec f amp fe undercompensated m i E ra 5 mi Yin m ei rg 20 ma I 1A 20 ns Figure 11 Adjustment of the bridge balance after penetrating a cell Abbildung 9 Einstellung der Br cke w hrend einer Intrazellul rableitung Aus dem Verst rker Handbuch 19 20 5 5 Fahren Sie die Spitze der Mikropipette mit dem Mikromanipulator nah an das Ganglion heran ohne es zu ber hren W hlen Sie eine hohe Vergr erung so dass fast nur noch das Ganglion zu sehen ist Versuchsdurchf hrung Fahren Sie bei gro er Vergr erung die Spitze der Mikropipette ganz nah an die gew nschte Zelle heran Zielen sie auf die Mitte des als Kreis sichtbaren Zellk rpers Setzen Sie die Pipettenspitze vorsichtig mit dem Feintrieb auf die Zellmembran auf Um die Zellmembran zu durchsto en gibt es zwei Methoden Entweder sie tippen leicht mit dem Finger an den Mikromanipulator Oder Sie dr cken kurz den BUZZ Schalter 8 was zu einer starken Oszillation des Elektrodenpotentials f hrt Wenn sie auf dem Oszilloskop einen pl tzlichen Abfall des Potentials um 10 oder mehr mV beobachten ist die Elektrodenspitze in der Zelle Wahrscheinlich k nnen sie dann auch spontane Aktionspotentiale sehen und falls Sie einen Lautsprecher angeschlossen haben auch h ren Warten Sie dann ein Paar Minuten bis sich das Membranpotential stabilisiert hat bevor Sie die eigentlichen Messungen beg
51. tt des Experiments n tige Protokoll indem Sie bei protocol auf change klicken Es ffnet sich ein Dialogfenster ndern Sie zun chst den Namen des Protokolls so dass Sie sich sp ter wieder daran erinnern zu welchem Zweck Sie dieses Protokoll erstellt haben z B modellzelle aufg1 6 3o berlegen Sie ob die Standardeinstellungen Anzahl Zellen Samplerate Dauer den Anforderungen f r das Experiment gen gen F r diesen ersten Versuch nutzen Sie eine Zelle und einen Stimulus eine Dauer von 10 s und Samplerates von 1 000 Hz f r die Stimulation und 10 000 Hz f r die Datenaufnahme Generieren Sie nun den eigentlichen Reiz F r dieses erste Experiment verwenden Sie bitte einen 10 s langen Stimulus der 5 s lang bei 0 nA gehalten wird dann f r 2 5 s auf 1 nA springt und zum Schluss wieder auf 0 nA abf llt Denken Sie daran bei jeder st ckweisen Anderung auf accept zu klicken damit sie bernommen wird Kommentieren Sie das gerade erstellt Protokoll damit Sie sp ter noch wissen wof r es gut war Um das Dialogfenster schlie en zu k nnen m ssen Sie es zuerst speichern Es ist darauf zu achten dass Sie einen neuen Name f r das Protokoll gew hlt haben da es sonst nicht in das Experiment bernommen wird Klicken Sie also auf save um das Protokoll zu speichern und kehren danach zur Software zur Experimentsteuerung zur ck indem Sie das Fenster des Protocol Cre
52. tte geben Sie sich deshalb viel M he damit diese vern nftig einzustellen Sehen Sie sich bei einer Ableitung mit vielen trials mit identischer Stimulation mindestens die er sten drei die letzten drei und drei trials aus der Mitte an um festzustellen ob f r sie alle die gleichen Parameter verwendet werden k nnen Falls Sie die Zeitpunkte der APs f r Auswertungen ausserhalb der von ephys zur Verf gung gestellten Routinen verwenden wollen k nnen Sie diese mit save vector of spikes als Matlab und Excel files speichern Rasterplot Wenn man die Antworten einer Nervenzelle auf mehrere Prasentationen des gleichen Reizes darstellen m chte verwendet man h ufig Rasterplots bei denen Pr sentationen gegen Zeit aufgetragen werden Jede Pr sentation wird als eine Zeile dargestellt in der die Zeitpunkte des Auftretens von APs mit einem kleinen senkrech ten Strich oder auch nur einem Punkt markiert sind Da alle Antworten untereinander dargestellt werden kann man sehen ob die Antworten im Verlauf des Experiments ihre Eigenschaften ge ndert haben und ob es eine starke Streuung zwischen den einzelnen Antworten gibt Der Button Rasterplot erzeugt eine entsprechende Grafik der mit detect spikes gefundenen Aktionspotentiale Bestimmung der AP Rate AP Raten sind die g ngigste Auswertungsart neuronaler Aktivit t Eine AP Rate ist die mittlere Anzahl APs die in einer bestimmten Zeitspanne generiert werden Die daf r verwendete Einheit ist APs sek E
53. ularableitungen eine Zwischen stellung zwischen Extrazellul rableigungen und Patch Clamp ein Im Gegensatz zum extrazel lularen Ableiten k nnen auch nderungen des Membranpotentials unterhalb der Spikeschwelle detektiert werden Im Gegensatz zu Patch Clamp ist die r umliche Aufl sung aber nicht so fein dass man Effekte einzelner Kan le intrazellul r messen k nnte Um eine Zelle intrazellul r abzuleiten muss man eine sehr feine Glaskapillare Spitze lt 1 um durch die Zellmembran in die Zelle einf hren Das Glasr hrchen ist mit einem Elektro lyt gef llt und verbindet so das Zellplasma mit dem normalerweise aus Ag AgCl bestehendem Elektrodendraht Als Referenzpunkt f r die Messung dient eine ebenfalls aus Ag AgCl beste hende indifferente Elektrode im Aussenmedium Der Nachteil dieses Verfahrens ist dass die Zelle durch das Einf hren der Nadel verletzt wird Mit etwas bung und Gl ck schlie t sich das Loch in der Membran wieder rund um die Pipettenspitze Wenn es aber zu gro ist so dass das Zytoplasma aus der Zelle austritt stirbt die Zelle Der Vorteil von Intrazellul rableitungen ist dass sie die M glichkeit bieten Strom in die Zelle zu injezieren und so das elektrische Verhalten der Zelle zu beeinflussen EPIDERMIS CUTICLE DERMIS z CIRCULAR MUSCLE OBLIQUE MUSCLE LONGITUDINAL MUSCLE od N A DORSAL BRANCH POSTERIOR ROOT gt N sa ae INTESTINE G CONNECTIVES VENTRAL SINU
54. wir nicht nur die spontane Aktivit t von Nervenzellen messen wollen sondern diese auch elektrisch stimulieren brauchen wir auch eine umgekehrte bertragung vom Com puter ber A D Wandler und Verst rker zum Messkopf Da Computer und A D Wand ler sowie Verst rker und Messkopf schon verbunden sind diese Leitungen funktionieren in beide Richtungen brauchen wir nur noch eine Verbindung vom A D Wandler zum Verst rker diese Leitung bertr gt nur in eine Richtung Signale Dazu wird die Buch se Output 0 am A D Wandler per BNC Kabel mit CURRENT INPUT 1 nA V 23 am Verst rker verbunden und der dazugeh rige Schalter 24 am Verst rker auf ON gestellt 4 Um den Einfluss von elektrischem Rauschen zu minimieren lassen Sie bitte den Stecker auf den Eingang 8 des A D Wandlers stecken Dadurch wird ein Referenzsignal erzeugt auf das sich die Messung an Eingang 0 bezieht und dadurch eine gute differenzielle Messung erm glicht 5 Ausserdem muss zur Minimierung des Rauschens der gesamte Messplatz an einem Punkt geerdet sein Bitte lassen Sie das in GND 25 am Verst rker steckende Kabel und alle damit verbundenen Kabel zun chst an ihrem Platz Es kann aber sein dass das Finden und Eliminieren des Rauschens im Praktikum eine gro e Rolle spielen wird 6 Damit man w hrend der Messung oder auch zwischen den Messungen einen guten berblick ber die von der Messelektrode aufgezeichnete Spannung beh lt bietet es sich an
55. ynaptischer Effekt Bei reziproken Synapsen ist das nat rlich in beiden Richtungen notwendig Tragen Sie Mittelwert und Standardabweichung der Synapsenst rke gegen die Reizst rke auf Zeigen Sie ausser dem f r eine exemplarische Stimulusst rke ob sich die Synapsenst rke im Laufe des Experiments ndert indem sie Kopplungsst rke gegen die Trialnummer auftragen Stel len Sie synaptische Erm dung oder Fazilitation fest Synaptische Latenz Bestimmen Sie die synaptische Latenz der Synapse H ngt diese von der St rke der pr synaptischen Reizung ab Chemisch oder elektrisch Begr nden Sie warum es sich bei der von Ihnen betrachteten Synapse um eine chemische bzw eine elektrische Verbindung handelt 31 Literatur liegt beim Praktikum bereit Verst rker Handbuch Operating Instruction and System Description for the BA 1S Intracel lular Bridge Mode Amplifier NPI electronic version 4 1 2004 Oszilloskop Handbuch Benutzerhandbuch Digitalspeicher Oszilloskop der Serie TDS1000 und TDS2000 Tectronix Axon Guide The Axon Guide for Electrophysiology amp Biophysics Laboratory Techniques Axon Instruments 1993 Neurobiology of the Leech Muller Nicholls amp Stent Eds Neurobiology of the Leech Cold Spring Harbor Laboratory 1981 Englisches Praktikumsskript Kristan amp French Boot Camp 2004 Division of Biological Sciences Laboratory Manual 2004 32
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