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Megap Lpd - Ruprecht-Karls

1. au 20521039 Mass 120952 Score 83 KIAA0411 Homo sapiens gi 24307967 Mass 125395 Score 83 SLIT ROBO Rho GTPase activating protein 3 Gi B anaa Mass 122623 Score 83 KIAA0411 protein imported human gi 62648014 Mass 125339 Score 83 PREDICTED simi gi 73985028 Mass 125477 Score 83 PREDICTED simi gi 75677374 Mass 122616 Score 83 SLIT ROBO Rho GTPase activating protein 3 isoform b gi 76655096 Mass 122628 Score 83 PREDICTED similar to SLIT ROBO Rho GTPase gi 76665098 Mass 125507 Score 83 PREDICTED similar to SLIT ROBO Rho GTPase gi 109035846 Mass 125363 Score 83 PREDICTED similar to SLIT ROBO Rho GTPase gi 109035849 Mass 122584 Score 83 PREDICTED similar to SLIT ROBO Rho GTPase EA ale Mass 125311 Score 82 WARP Mus musculus gu 27327088 Mass 111502 Score 82 brain stress early protein Gbi neural variant mena protein 5 gi 1644457 Query Observed 36 556 80 45 572 29 90 532 61 isoform 1 Mass 84067 Score 78 Mus musculus Mr expt Mr calc 1111 58 1111 57 0 02 1142 57 1142 56 0 01 1594 80 1594 78 0 02 Proteins matching the same set of peptides gil16444 99 neural variant mena protein gil67537 54 enabled homolog gil38614 390 Enah protein Mass 84589 Score 78 Mus musculus Mass 86248 Score 78 Mus musculus Mass 59720 Score 78 Mus musculus Search Parameters Type of searc
2. K derprotein Das zweite Plasmid kodiert ein Hybridprotein das sich aus der GAL4 AD und im Anschluss aus einem m glichen Bindepartner f r den bat zusammensetzt prey Beuteprotein Ein Hefestamm wird mit beiden Plasmiden transformiert der kein funktionierendes GAL4 Gen hat und ein oder mehrere Reportergene tr gt denen eine Bindestelle f r den GAL4 Transkriptionsfaktor vorgeschaltet ist Als Reporter dieser Interaktion fungieren Gene die entweder bestimmte Aminos uren bzw Basen herstellen k nnen z B Histidin Uracil oder Adenin oder eine optische Erkennung erm glichen z B einen Farbumschlag katalys ert durch das acZ Gen Wenn es zwischen bait und prey zu einer Interaktion kommt resultiert daraus in der Regel eine funktionelle Rekonstitution des GAL4 Transkriptionsaktivators was eine Expression der Reportergene zur Folge hat Letzteres kann durch Wachstum auf entsprechenden Selektionsmedien nachgewiesen werden Zur Erh hung der Spezifit t wurden in dem benutzten System Invitrogen drei verschiedene Reportergene H S3 URA3 und lacZ mit voneinander unabh ngigen Promotoren eingesetzt Abbildung 12 42 Material und Methoden reconstitution of an active transcription ST CLL inthe yeast genome UA SGAL Hiss gt Growth on plates lacking histidine and containing 3AT UAS GAL gt ne on reel GALI promoter Growth on plates lacking uracil URAS SEH FR No growth on plates
3. Mus musculus Mr expt Mr calc Delta Miss Score Expect Rank Peptide 1185 1229 1291 1436 1447 1478 1833 1857 Proteins matching the same set of peptides gi 18542419 Wavel ra od Scar Mus musculus 419773 WASP family 1 3 gi 16797665 GAP3 Query 39 568 70 702 Mass Mass Mass Mus musculus Mus musculus 64 1185 66 0 02 0 46 0 0045 1 R LSVSVTOLDPK E 64 1229 66 0 02 0 55 0 0006 1 R IENDVATILSR R 67 1291 69 0 02 0 31 0 14 1 R HPSTLPVISDAR S 67 1436 69 0 02 0 22 0 87 1 R SSTIODOOLFDR K 77 1447 79 0 02 1 10 16 1 K RHPSTLPVISDAR S 67 1478 69 0 02 0 13 8 5 1 K EEELSLODITMR K Oxidation M 87 1833 91 0 04 0 11 12 1 K LAQGPELAEDDADLLHK H 91 1857 96 0 05 0 31 0 1 1 K NELECVTNISLANIIR O 61772 Score 220 Queries matched 8 61756 Score 220 Queries matched 8 16663 Score 114 Queries matched 2 Observed Mr expt Mr calc Delta Miss Score Expect Rank Peptide 23 82 1134 1403 E 1134 47 0 02 0 57 0 00038 1 R ASEDWWEGR H 62 1403 64 0 03 0 57 0 00033 1 K ADSEASSGPLLDDK A Proteins matching the same set of peptides 531121311789 Mass 125311 Score 112 Queries matched 2 WARP Mus musculus 41127537098 Mass 111502 Score 112 Queries matched 2 brain stress early protein Gbi isoform 1 Mus musculus 4 gi 14861844 Mass 73494 Score 87 Queries matched 3 PL10 protein Mus musculus Query Observed Mr expt Mr cal
4. 44457 neural variant mena protein Mus musculus Probability Based Mowse Score Ions score is 10 Log P where P is the probability that the observed match is a random event Individual ions scores gt 42 indicate identity or extensive homology p lt 0 05 Protein scores are derived from ions scores as a non probabilistic basis for ranking protein hits Number of Hits WJ aay Sui oly Probsbilitu Based Mowse Score Archive Report of Selected Matches 1 428350183 KIAA1168 protein Mass 150042 Score 730 Queries matched 23 Homo sapiens Query Observed Mr expt Mr calc Delta Miss Score Expect Rank Peptide 8 483 26 11 492 75 964 51 964 50 0 01 0 44 0 035 1 K TDVFOSLR E 983 48 983 46 0 02 0 16 21 1 K MYLTPSEK H Oxidation M 120 aa OD GO S CO aT eT eT 1 ON 1 CY He ee GO Oy OT amp JO 1 Gy Go CO Gy Ws 00 O 0 WI OS an VO ee 510 78 21 78 547 30 568 80 584 35 588 83 605 80 616 33 622 35 629 82 644 34 681 91 474 28 710 92 482 57 723 35 728 38 495 23 742 35 745 40 835 90 Anhang AMAGSVLLDK R NFVGPPHFK T DIIEYAELK T TMLESLIADK S LGTPQQIAIAR E AMAGSVLLDKR F Oxidation M MESVFNOAIR N LADQIFAYYK A TVEVLEPEVTK L EFFLELTMGR R TAIPFTOEPOR D SLLOGTILOYVK T YAPLHLVPLIER L YAPLHLVPLIER L 1019 55 1019 53 0 02 0 29 1 2 1041 55 1041 54 0 01 0 15 26 1092 59 1092 57 0 02 0 10 89 1135 59 1135 58
5. Zum Entfernen von Primern und bersch ssigen Nukleotiden mussten zun chst die PCR Produkte mittels Exo I und CIAP aufgereinigt werden W hrend Exol den Abbau von Nukleotiden einzelstr ngiger DNA von 3 nach 5 katalysiert entfernt die Phosphatase die 5 Phosphatreste der DNA Molekule Die Reaktion erfolgte be 37 C fur 15 mm anschlieBend wurden die Enzyme bei 85 C fur 15 min inaktiviert Ansatz PCR Produkt 2 5 ul Exol 20U ul 0 25ul CIAP 1U ul 0 5ul H20 0 75 ul Sequenzierreaktion Sequenzier PCR PCR Produkt Exo CIAP 2 ul Primer 10 pmol ul 0 5 ul Premix 2 ul H20 0 5 ul 24 Material und Methoden Standard Programm 20 sec 94 C 2 min 60 C 30 Zyklen Falls die verwendeten Primer eine von 60 C abweichende Annealing Temperatur aufwiesen wurde ein zus tzlicher Temperaturschritt n die Sequenzier PCR eingef gt 20 sec 94 C 20 sec Ta 2 min 60 C Nach Beendigung der Sequenzreaktion wurden die Proben mit je 15 ul HO auf ein Endvolumen von 20 ul aufgefullt Die Aufreinigung der Sequenzreaktion erfolgte mit Hilfe von Sephadex G50 in Millipore Multiscreen HV Platten Dabei werden nicht eingebaute Didesoxynukleotide bersch ssige Primer und Polymerase von den eigentlichen Sequenzierprodukten abgetrennt e Befullen einer 96 Well Multiscreen HV Platte mit Sephadex G50 Pulver e Zugabe von je 300 ul H20 bidest pro Well Inkubation bei RT f r mind 3 h um das Sephadex gut quellen
6. 1 Antik rper 1 100 1 600 in 1 BSA 1x PBS T verd nnen Inkubation der Zellen in einer feuchten Kammer mit dem prim ren Antik rper f r 60 min bei RT oder 4 C UN Waschen 3x 5 min mit 1x PBS T Zweiten fluoreszenzmarkierten Antik rper 1 100 1 600 in 1 BSA 1x PBS T verd nnen Phalloidin TRITC 1 700 Inkubation der Zellen in einer dunklen feuchten Kammer mit dem sekund ren Antik rper f r 60 min bei RT Waschen 3x 5 min mit 1x PBS T 51 Material und Methoden e Gegenfarbung der Zellkerne mit DAPI 30 ng ml in 1x PBS f r 3 min e Abspulen der Pr parate mit H2O bidest und Lufttrocknen im Dunkeln e Eindecken der Pr parate mit Vectashield e Bei Immunfluoreszenz in Deckglaskammern Uberschichten der Zellen mit 500 ul H2O nach der DAPI Farbung 2 14 Fluoreszenzmikroskopie und Live Cell Imaging Fixierte und lebende Zellen wurden mit einem Nikon ECLIPSE Ti Mikroskop aufgenommen Hierbei wurde entweder mit einem Nikon 60x PlanApo TIRF NA 1 45 oder mit einem Nikon 100x PlanApo TIRF NA 1 45 Objektiv gearbeitet Die Aufnahmen von EYFP mCherry und dem DIC Kontrast erfolgten mit Hilfe einer Hamamatsu ORCA AG hochaufl senden CCD Kamera unter Anwendung der NIS Elements 3 0 Software Insbesondere f r die Analyse der Dynamik von auswachsenden Lamellipodien wurden lebende Zellen NIH 3T3 Fibroblasten aufgenommen Live Cell Imaging Diese wurden auf Fibronektin beschichtete 5 g cm 4 Well Kammern mit Deckgla
7. EE EE CCtaaatttd EE EE ttcatgcaga cagagctaaa Tase eet aaaagaagtg atgtttgaat EE Eer EE tacagcggag catatttaat geCgccctcgg ctaagcatag CaceaecCltita ECUCtaggaat tggtagalgt gccagcagca tgtaccgage Tearvgecat agigact get gcaaaattaa COLCLOLGAL aacatagaag aaagaagcat aaaaagcatt SGELLESELT Caglcegagtc agcagaaggt gaagctaagg aaagaccercg ctgoetcgggeec cgtcagcgacag tetgagatac ggagcaccta ggcaaggcca GR e Lee e be a acctttat cgatgitacc taccecagtg actgcacata allLCadalcc cetaaaccaaa actaagittg aaaaccagag Caggaggatc LeOLClLaddaa EE E ggcaagacet gactaaagti taaaaactga L Eet Ehe ease aget ee ee adaclCcadaac acacttracaa toeaeceacteca traastteldlt 116 Anhang 5 5 Negativkontrollen f r die RNA in situ Hybridisierung 3 1 3 4 Abbildung 54 RNA in situ Hybridisierung mit sense Sonden fiir Megap a Robol b und Lpd c Embryonalstadium E11 5 p c Sowohl f r Megap als auch f r Robol und Lpd wurde keine unspezifische F rbung detektiert H Hinterhirn M Mittelhirn F Vorderhirn N Neuralrohr Die Ma stabsbalken in a bis c entsprechen 1000 um 5 6 Massenspektrometrie Daten GST Pulldown mit adultem Mausgehirn 3 2 2 1 1 YLP motif containing 1 ZAP3 Mascot Search Results User Uwe Warnken Email U Warnken dkfz de Search title MS data file C Program Files Matrix Science Mascot Daemon data 060803_VE1122 1 pkl Database NCBInr 080606 3841279 sequences 1323634604 res
8. lew Val Pro Ar Le Sarl Pro Glu Pha Pro G Leu Glu Arg Pro Hs aa nae CTG GTT CCG CG GCA TEG ATCC CCG GAA TTC CCG GGT CGA CTC GAG CGG CCG CAT CG GAC TGA Bani Ent ST Sall wei Moi Stop codons pGEX 4T 2 27 4581 01 omir Leu Val Pro Arg Gh SerlPro Gy le Pro Gly m Thr Arg Ala Ala Ala Ser CTG GTT CCG CG SGA TEC CCAG A ATT CCC GG CGA GCC GCA TCG TGA BamH I Ecol Enz KT Not Stop codon pGEX 4T 3 27 4583 01 rombin fisu Val Pro Arg G Sarl Pro Asn Ser Arg Wal Ser Ser G lle Val Thr As CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG AAT TCC CGG GIG GAC TCG AGC GGC CGC ATC GIG ACT GAC TGA Baal Ehlers Sall ect Not Stop codons pS iisBamT Sop pGEX 400 bp Abbildung 42 Vektorkarte pGEX Vektoren nach GE Healthcare Homepage pGEX Vectors Klonname Schnittstellen Schnittstellen Insert Versuch Vektor Insert pGEX 22 26 EcoRI Xhol EcoRI Xhol MEGAP Proteinexpression Bp 2288 2612 GST MEGAP SH3 5 3 4 pcDNA3 1 peDNA3 1 A 5428 5427 bp Comments for pcDNA3 1 5428 nucleotides CMV promoter bases 232 819 T7 promoter pniming site bases 863 882 Multiple cloning site bases 895 1010 pcDNA3 1 BGH reverse priming site bases 1022 1039 BGH polyadenylation sequence bases 1028 1252 fi origin bases 1298 1726 SV40 early promoter and origin bases 1731 2074 Neomycin resistance gene ORF bases 2136 2930 SV40 early polyadenylation signal bases 3104 3224 pUC origin bases 3617 4287 complementary strand Ampicillin res
9. Cgaaggccaa gtgaagggga SCavtcgagcc eagacceccad ccttcaagag aagagcagga aggcegcagc cctcagaaga Gegqgccclac totcetaagert OCLOCCTECS CCLOCE CL Ce gaagatggtc SCCeLacete EECUECTLCCa GCUCALACLEC STICCEAagtg Eecrcaagctr aagtattagg COCCOCactgd Beckiscelge GE e A ee gcgggtcggc CoCcCagCccce gcceccggggcg Ee Lane ei eelere ter cggccaggag GTCOCCCCCE agcacccccr gQaagaagaag aaatcggaag gcagggggag cacccctgag agaggcaggg accagcecage gcaaaaactg LOLCgGCCCaga EE TE ccttacagcet EE EE agtaggtttt CCeaacclug qcacctgggc Caaa accecteca EE EE EtoOtaesatas taaaaccatt cetttaaaaa cgcggagcgg acCeccuccgc GEL Cccaagcd ggcgacgtga aatggccacg gtgaacggaa agccagggtg dad CtCOLCOLL gagggtgggg alegguqccr agccaggaac ccccaggcta Gectgqgagcaga LOCLOLCeCELT aaggaagggg CECUCCCatcc Leceassagtta EE EE EEN gcettaeeeta agtgtceccagc tggggaggac GCCEOCGaar gggggaggtc ELLLLIALTO SLETLOSSCC aaaaaaaaaa gt 21127886591lrefINM_153831 2 Homo sapiens PTK2 protein tyrosine kinase 2 PTK2 transcript variant 1 mRNA 1 61 121 ES 241 gt 04 361 421 481 541 601 661 721 GER 841 301 Jol 1021 E04 1141 1201 1261 t321 1 081 1441 EA 159061 1621 Gaccacrgtg cgceccgteg E ee eeng erte aagaataacg cttcaccttga ctggtatgga aaagcaatag Tteaggggeat JSELCETECE ECCOCAGLOL tgagasasttceg Tgidatttett accaggaaat ggggcaatgc agcgattttt tecaacaaac TLgagatcce caagctggat cggacaaggg arlcaaacag EE EE tagatgggta aagaaggtga tLgeggacaca
10. EE EE GStactoargd GCecltoctatgd gatatgggcg aaatatgaat aagccaactt gatcaagtgg tgggagatgc bag e Lopes agaaaactga CUGeaaeltce EENEG agttacctaa accactcagt gcaggrigeac gctgacctaa agacetcag a aagcaaggca atagatgaag agaatagaac tatatgagte Ecogaecagcd Cereatasttg 114 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 21 61 2221 2281 2341 2401 2461 252l 2581 2641 e 2701 Boe a 2881 2941 3001 JUGI Coral 3lol 3241 S301 S361 3421 3481 3541 3601 3661 Sl 3781 3841 3901 396l 4021 4081 4141 4201 4261 4321 4381 4441 tga aagctgat ttggagagcet LECcLgtacge acagggacat actcttggatt cgeectcattaa acgtatggat aaggagtgaa ctecaaarttg gcaggcggce aggctcagca actcccqgagg IL CCagcoa ECECTOOUCta aggcalolce ggcagcccaa Caacccattt getggetgga ttgacaggga LIOgLaaace atctgggaag rreagccee tgtacgagaa Cagccecacec LalLLggecace agatggcaca SCCcagcagta CUCacgcccl aaacgeicgg ttttgaagat qccagcactrt taagtttaac ttcagaaaaa CELL LISOTEA gecaaggggt tgaagcaaag altatccaga actttacaaa EE aaclagccgt CUCTOCagCa ctgcecattgag aaagattaaa COCOCCOCECO tecaccaccc ataaattatt cgttaccagt tggagtcatce Gagguceaccr SEA ee Les LOCLOCE COD atcccgatart Anhang acagagaatc tcgcaagctaa agtacagcre aatgttetgg atggaagata Sheet he ggct ccagagt caa gtttggtgtg Gaacaatgat CCCTCCL ACC e Leg ang agaagagcgc Qtctgatgdaa aggatttrtat SCeLggLcca tetcggaccaa tgtggaggac gatggaagag aaaagaggaa ggatggaagt agalLccroca CCLUGCCagc
11. F beobachten b b Megap RNA in situ Hybridisierung auf einem Transversalschnitt Embryonalstadium E11 5 p c b und b zeigen AusschnittsvergroBerungen des Auges b und des Neuralrohrs b Expression von Megap konnte in den ventrikularen Zonen VZ im Vorderhirn F den trigeminalen TG und inferialen IG Ganglien im Neuralrohr N inkl der Flurplatte FP den Hinterwurzelganglien DRG sowie im neuronalen Gewebe des Auges neural layer of optic cup OC detektiert werden c d Hybridisierung mit einer Robol anti sense RNA Sonde auf den entsprechenden Folgeschnitten der RNA in situ Hybridisierung f r Megap a gt c b gt d Co Expression von Megap und Robol konnte im Neuroepithel des Neuralrohrs sowie im Mittel und Vorderhirn detektiert werden Im Unterschied zu Megap wird Robo nicht in den ventrikul ren Zonen VZ den Hinterwurzelganglien DRG der Flurplatte FP und im neuronalen Gewebe des Auges exprimiert Die Ma stabsbalken entsprechen in a b c und d 1000 um in b b sowie d und d 500 um 57 Ergebnisse 3 2 Isolierung von MEGAP Interaktionspartnern In fr heren Studien konnte gezeigt werden dass MEGAP mit WAVE I Soderling er al 2002 Robol Wong et al 2001 und c Abl Endris et al 2009 interagiert Diese Proteine sind an der Regulation des Zell Zytoskeletts bzw an der _ Slit Robo S gnaltransduktionskaskade beteiligt Um ein besseres Verst ndnis
12. R D Higgs H N Kaiser D A Blanchoin L May R C Hall M E and Pollard T D 1999 Scar a WASp related protein activates nucleation of actin filaments by the Arp2 3 complex Proc Natl Acad Sci U S A 96 3739 3744 Marin O and Rubenstein J L 2001 A long remarkable journey tangential migration in the telencephalon Nat Rev Neurosci 2 780 790 Marin O and Rubenstein J L 2003 Cell migration in the forebrain Annu Rev Neurosci 26 441 483 Mattila P K and Lappalainen P 2008 Filopodia molecular architecture and cellular functions Nat Rev Mol Cell Biol 9 446 454 Mayer B J 2001 SH3 domains complexity in moderation J Cell Sci 714 1253 1263 Miyata T Kawaguchi A Okano H and Ogawa M 2001 Asymmetric inheritance of radial glial fibers by cortical neurons Neuron 3 727 741 Nadarajah B Brunstrom J E Grutzendler J Wong R O and Pearlman A L 2001 Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex Nat Neurosci 4 143 150 Ozmen M Yilmaz Y Caliskan M Minareci O and Aydinli N 2000 Clinical features of 21 patients with lissencephaly type I agyria pachygyria Turk J Pediatr 42 210 214 Pertz O C Wang Y Yang F Wang W Gay L J Gristenko M A Clauss T R Anderson D J Liu T Auberry K J Camp D G 2nd Smith R D and Klemke R L 2008 Spatial mapping of the neurite and soma proteomes reveals a functiona
13. Reiner O Carrozzo R Shen Y Wehnert M Faustinella F Dobyns W B Caskey C T and Ledbetter D H 1993 Isolation of a Miller Dieker lissencephaly gene containing G protein beta subunit like repeats Nature 364 717 721 Ridley A J Schwartz M A Burridge K Firtel R A Ginsberg M H Borisy G Parsons J T and Horwitz A R 2003 Cell migration integrating signals from front to back Science 302 1704 1709 Rodal A A Sokolova O Robins D B Daugherty K M Hippenmeyer S Riezman H Grigorieff N and Goode B L 2005 Conformational changes in the Arp2 3 complex leading to actin nucleation Nat Struct Mol Biol 2 26 31 Rohatgi R Ma L Miki H Lopez M Kirchhausen T Takenawa T and Kirschner M W 1999 The interaction between N WASP and the Arp2 3 complex links Cdc42 dependent signals to actin assembly Cell 97 221 231 Sabatier C Plump A S Le M Brose K Tamada A Murakami F Lee E Y and Tessier Lavigne M 2004 The divergent Robo family protein rig l1 Robo3 is a negative regulator of slit responsiveness required for midline crossing by commissural axons Cell 717 157 169 Saiki R K Scharf S Faloona F Mullis K B Horn G T Erlich H A and Arnheim N 1985 Enzymatic amplification of beta globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia Science 230 1350 1354 Salazar M A Kwiatkowski A V P
14. Se he erte tgtgacgggc agaggagtat tgtggatgag Gaeqctaltg EGUGetgace ggctgtggat gcagacgaga SELOLELSTE acagctccaa EE Ee ECCaggacce tcatgaagaa gacatettaa aattccagga SLEOOSIETLE gaatataaaa SELL E cetg agaacacaac Chen Ch weg er gagaagtLce gccatgttga caggagagaa atctetgttaa ctcaggaaga aaa tgtatgtggg Glaatcogcc CUCtCacagce gaactLasaag atgaggatgg gcaccgocga Sccagcccac Calggqaatca acagatccat retacagt at EE Eeer KEE agakcttrtega EL LESTTTER QOCeCCaccaa ClCeagcagcc CCCCCLEOCEa ctggtgaaag STEecLalgg ICCALLCCee dacbetgace EE ET gccaaaaact ccacachig eClLeccaccay SIELLEL GIGS e We e Lee Bes aaaatgtggc C aatlLLalgt ttectaaact aacocaagag cgttecgtctag getratatttt E eeng IS sg a tcotcggaage aganccatcc ClLaltetaca tgaagcaaaa ttttgaaaaa atataatgaa EA MR ee Eh ggaaatacag Trgcatatet rgtceteaaa gtacttacta Eeer Ce agacaccgarc gaattgaaaa ttatgacgaa ctcagctcag agtccagaag geccagcag agcacatggt Cagccacgogc ggaatcatag tggacctgeg gacagcaaca a cctgatgt cgattggaaa agaaaccgce evtgctgacag CegeCaa cer ctgtcecatcega tgaaggaagt BCCLacCagc LQOGtGagcr aagagtacaa tactegatgt CCUCCCCUTag cagcgaggaa cgaccatcetg CCCLCECOCEC EE EE EE tcacattaag accttagctg getgagaatt aacaccette gaagacttga tegtgrtggat EEN Se e geg Se ue e Leed GE e geet gccacloggag Caggaatttg alLaLacccce ctgtacagtt aatlcargqgqag tttggatceta agagagcaaa cgactccgtcgta EE ASC9HEELLACE geatggtgtg tggggaaaga atgctgggcc cacaatectg
15. ca 500 600 bp eines Gens ausgew hlt Dieser Bereich wurde mittels PCR Saiki et al 1985 aus Maus cDNA amplifiziert und mit dem Acceptor Vector K t Novagen in den pSTBlue 1 Vektor kloniert Vor der eigentlichen Synthese der Sonde in Antisense oder Sense Richtung musste der Vektor jeweils am 5 bzw am 3 Ende des klonierten cDNA Fragments mit einem geeigneten Restriktionsenzym linearisiert werden Hierzu wurden 5 ug des Vektors in einem 50 ul Ansatz verdaut Die Aufreinigung des linearisierten Vektors erfolgte mit dem QlAquick PCR Purification Kit laut Angaben des Herstellers F r die Sondensynthese wurde 1 ug der aufgereinigten DNA eingesetzt Die aufgef hrten Komponenten wurden f r die in vitro Transkription 20 ul Ansatz n einem 1 5 ml Reaktionsgef auf E s gemischt 35 Material und Methoden Komponente Antisense T7 Sense Sp6 DNA linearisierter Vektor l ug in mind Sul 1 ug in mind Sul Transcription buffer 2 ul 2 ul DIG labeling Mix l ul l ul RNase out Invitrogen 0 5 ul 0 5 ul T7 RNA Polymerase 2 ul Sp6 RNA Polymerase 2 ul H20 ad 20 ul ad 20 ul e Inkubation der Ans tze f r 2 3 h bei 37 C e Zugabe von ul tRNA 50 mg ml Roche Katalog Nr 109495 und 2 ul DNase I Roche Katalog Nr 10776785001 gt Inkubation f r 15 min bei 37 C e Aufreinigung der mit DNase verdauten RNA mit Hilfe von NucAway Spin Columns Ambion Katalog Nr AM10070 nach Angaben des Herstellers e Kont
16. containing SFOA 6 Fluroorotic Acid GEO Toxic GAL4 binding sites URS HI 5PO1 3 promoter Abbildung 12 Der Screen mit drei Reportergenen nach Invitrogen Die Zeichnung veranschaulicht die bei Expression resultierenden Phanotypen der drei Reportergene HIS3 Wachstum auf His Platten lacZ blauer Farbumschlag im X gal Filter Assay und URA3 Wachstum auf Ura Platten Aufgrund einer h heren Transformationseffizienz wurde der Hefestamm MaV203TM f r den Yeast Two Hybrid Screen ausgew hlt siehe Anhang 5 2 Bei diesem Stamm kann die Aktivierung der Reportergene HIS3 lacZ und URA3 beobachtet werden Abbildung 12 2 10 41 Vorbereitung des Yeast Two Hybrid Screens Klonierung C terminaler MEGAP Fragmente in Yeast Two Hybrid Vektoren In Anbetracht der Tatsache dass MEGAP f r ein Protein mit einer Gr e von ca 160 kDa kodiert war die Expression des gesamten Proteins n Hefen nicht m glich Im Rahmen der Analyse der Interaktionen zwischen MEGAP und dem Transmembranrezeptor Robol sowie zwischen MEGAP und WAVE 1 wurde die MEGAP SH3 Dom ne bereits als essentielle Komponente f r Protein Protein Interaktionen isoliert Wong et al 2001 Soderling et al 2002 Daher wurde der C terminale Bereich von MEGAP MEGAP C welcher auch die SH3 Dom ne enth lt f r die Suche nach Interaktionspartnern verwendet Abbildung 13 Zur Durchf hrung eines MEGAP spezifischen Yeast Two Hybrid Screens sollte das kommerziell erh
17. pDEST32_MEGAP C pDEST22 leer pDEST32_MEGAP C pDEST22 ROBOI CC3 Tabelle 11 Auflistung der im Library Swap verwendeten Konstruktkombinationen und der zugeh rigen Galactosidaseaktivit ten L9 Negativkontrolle L10 Positiv kontrolle Die Werte der 8 Gal units zeigten eine starke Autoaktivierung f r pDEST32_CATS53 an welches daher nicht weiter analysiert werden konnte 12 104 CO B Gal units Klon Nr Abbildung 21 Library Swap mit Klon Nr 16 bzw Periphilin und MEGAP C Details bez glich der Klonbezeichnungen sind Tabelle 11 zu entnehmen Die Negativkontrollen f r Periphilin L1 und L3 zeigten eine leichte Autoaktivierung dennoch konnte durch Co Transformation mit MEGAP C die Reporteraktivit t deutlich gesteigert werden 65 Ergebnisse 322 GST Pulldown mit der MEGAP SH3 Dom ne 3 2 2 1 Isolierung putativer Interaktionspartner aus eukaryontischen Zell und Gewebeextrakten Neben dem Yeast Two Hybrid Screen wurden f r die Suche nach bisher unbekannten MEGAP Interaktionspartnern in dieser Arbeit GST Pulldown Experimente durchgef hrt Wie beim Yeast Two Hybrid Screen wurde die MEGAP SH3 Dom ne als bait eingesetzt kloniert als Fusionsprotein mit der Glutathione S Transferase GST Das GST MEGAP SH3 Fusionsprotein wurde mittels Glutathione Affinit tschromatographie aufgereinigt und liegt gekoppelt an Glutathione Sepharose K gelchen vor Zun chst wurde die GST fusionierte MEG
18. r das Auswachsen von Lamellipodien Der zweite Mechanismus wird von den Mitgliedern der Proteinfamilie der Formine gesteuert welche die Aktin Zusammenlagerung in Form von parallelen quervernetzten Bundeln vorantreiben Diese Strukturen liegen der Ausbildung von Filopodien zugrunde Mattila and Lappalainen 2008 Die kleinen GTPasen der Rho Familie mit den Hauptvertretern RhoA Racl und Cdc42 nehmen eine vorherrschende Rolle in den Signaltransduktionskaskaden ein welche die Ausbildung von Zellfortsatzen wahrend der Migration regulieren Charest and Firtel 2007 Wenn die GTPasen an GTP gebunden sind liegen sie in aktiviertem Zustand vor und interagieren mit diversen Effektoren wie zum Beispiel den Aktivatoren des Arp2 3 Komplexes vgl Abschnitt 1 3 1 Die wichtigste Rolle nehmen in diesem Zusammenhang Racl und Cdc42 ein deren Zielproteine aus der WASP WAVE Familie den Arp2 3 Komplex aktivieren der die Polymerisation von verzweigtem Aktin steuert Zusatzlich spielen auch die 8 Einleitung Aktin assoziierten Ena VASP Proteine eine wesentliche Rolle in der Regulation von Aktin Dynamiken Krause et al 2003 Es konnte gezeigt werden dass Ena VASP Proteine die Wachstumsgeschwindigkeit von Lamellipodien erh hen aber auch die Generierung von Aktin Verzweigungen durch den Arp2 3 Komplex hemmen Trichet et al 2008 Die genauen biochemischen Mechanismen mit welchen die Ena VASP Proteine das Aktinzytoskelett beeinflussen sind jedoch
19. verschiedene Mod der Zellbewegung somale Translokation und die kontinuierliche Fortbewegung der ganzen Zelle locomotion Rakic 1972 Nadarajah et al 2001 Bei der somalen Translokation streckt d e Zelle zun chst einen langen Fortsatz mit verzweigtem Ende in Richtung der Migration aus welcher sich an die Oberfl che des Gehirns anheftet Durch Kontraktion dieses Fortsatzes wird der Zellk rper anschlie end nachgezogen Miyata et al 2001 Tamamaki et al 2001 Neuronen welche mit Hilfe der locomotion wandern bilden k rzere unverzweigte Forts tze deren L nge w hrend der Migration relativ konstant bleibt Abbildung 6 Radial migrierende Neuronen orientieren sich anhand der Projektionen radialer Gliazellen Hierbei handelt es sich um neuronale Vorl uferzellen welche einen Zellk rper innerhalb der ventrikul ren Zone sowie einen langen bis zur Oberfl che des Gehirns reichenden Fortsatz besitzen Die tangentiale Migration findet bei GABAergen Interneuronen und einigen Oligodendrozyten statt Tangential migrierende Neuronen werden auch als neurophil bezeichnet da sie sich nicht an den Forts tzen radialer Gliazellen sondern durch Signalaustausch untereinander und durch die Wahrnehmung extrazellul rer Signale orientieren Marin and Rubenstein 2001 Abbildung 6 Mechanismen der radialen Migration somale Translokation A und Locomotion B Modifiziert nach Gupta et al 2002 E n allgemeines Modell der n
20. 0 0 212 Queries matched 1323634604 residues 10 0 088 0 68 15 1 8 00017 le 05 1 9 0 42 0 01 70 10 1 PRPRPRPPPRPRH WD d DNN DDD C Program Files Matrix Science Mascot Daemon data 060803_VE1122_5 pkl NCBInr 080606 3841279 sequences Mus musculus house mouse 7 Aug 2006 at 14 10 03 GMT CW17R Mus musculus WASP family 1 Mus musculus GAP3 Mus musculus PL10 protein Mus musculus DEAD box polypeptide 17 isoform 1 Mus musculus Expect Rank Peptide SITNTTVCTK C WNODTMEOK T Oxidation M ILRPWOSSETR S FORPGDPOSAODK A OGIETPEDONDLR K AYIVOLOIEDLTR K OGIETPEDONDLRK M TVIPGMPTVIPPGLTR E TVIPGMPTVIPPGLTR E Oxidation M HTLITEMVALNPDFKPPADYKPPATR V Oxidation M 123 CW17 Mus muscu gil14318588 sfl protein gi 33286894 sfl protein gi 74151067 unnamed prot gi TAZZZZ63 unnamed prot 2 gil16877274 WASP family 1 Query 49 af 64 76 ii oe 104 DUG Mu Mu tein tein Observed 593 615 646 719 483 740 612 929 83 83 84 34 60 34 30 96 lus Mass S muscu Mass s muscu Mass produc Mass produc Mass Anhang 68547 Score 272 Queries matched 10 lus 59879 Score 272 Queries matched 10 lus 68531 Score 272 Queries matched 10 t Mus musculus 68583 Score 272 Queries matched 10 t Mus musculus 61746 Score 220 Queries matched 8
21. 0 02 0 43 0 047 1166 69 1166 68 0 01 0 61 0 00067 1175 65 1175 63 0 02 1 38 0 14 1209 59 1209 58 0 01 0 38 0 14 1230 64 1230 63 0 01 0 25 2 7 1242 69 1242 67 0 02 0 29 0 97 1257 62 1257 61 0 02 0 11 69 1286 67 1286 66 0 01 0 28 1 2 1361 80 1361 79 0 01 0 75 2 7e 05 1419 82 1419 82 0 00 0 18 12 1419 82 1419 82 0 00 0 18 41 1444 69 1444 68 0 01 0 22 4 4 1444 69 1444 68 0 01 0 70 8 3e 05 1454 76 1454 75 0 01 0 44 0 026 1482 68 1482 66 0 01 0 1 6 2e 02 1482 68 1482 66 0 02 0 34 0 28 1488 78 1488 77 0 01 0 36 0 19 1669 80 1669 78 0 02 0 67 0 00011 Proteins matching the same set of peptides gi 6807649 Mass 147462 Score 730 hypothetical protein Homo sapiens gi 39104558 Mass 147947 Score 730 mKIAA1168 protein Mus musculus gi 74188573 Mass 147448 Score 730 unnamed protein product Mus musculus 4 91 160797665 Mass 16663 Score 84 GAP3 Mus musculus Query Observed Mr expt Mr calc Delta 42 568 26 1134 50 1134 47 0 03 Ta 702 84 1403 66 1403 64 0 02 Proteins matching the same set of peptides Miss Score 0 0 isoform a PRPRPRPPPRPRPPPRP PPP PPP PP PP DRDWDANAKAAKAKRADDAADADBDAAN Queries matched 23 Queries matched 23 Queries matched 23 Queries matched 2 27 2 3 56 0 0017 Expect Rank Peptide 1 R ASEDWWEGR H 1 K ADSEASSGPLLDDK A Queries matched 2 Queries matched 2
22. 0 04 1 19 Lae 1 K QLYTNYQEALKR T 84 775 41 1548 81 1548 79 0 03 0 12 42 1 R SYTSLMPPLSPOTK I 86 778 90 1555 78 1555 75 0 03 0 50 0 0064 1 R SQSTVSSIFSEAWK R 87 783 41 1564 81 1564 78 0 03 0 58 0 0011 1 R SYTSLMPPLSPOTK I Oxidation M 92 802 44 1602 86 1602 84 0 02 0 57 0 0015 1 K SSLSVOPGFLADLNR T 95 875 48 1748 95 1748 91 0 04 0 12 35 1 K SPTPPAMOPLPLASOSK A 96 881 43 1760 85 1760 81 0 04 0 53 0 0033 1 R TESAYDWTSLSSSSIK S 97 883 48 1764 95 1764 91 0 04 0 41 0 044 1 K SPTPPAMOPLPLASOSK A Oxidation M 104 690 07 2067 19 2067 16 0 03 0 2 3 1e 02 1 K LHLSGVNLPGIHQQGIVSAK A 105 707 42 2119 23 2119 20 0 03 0 19 5 8 1 K TVSPVVAQAVPPTPAPPVPPAK K 106 1060 63 2119 25 2119 20 0 04 0 11 39 1 K TVSPVVAQAVPPTPAPPVPPAK RK 109 725 75 2174 24 2174 21 0 03 0 40 0 053 1 K QQSFGVKPPPSPLSPVPSVVK Q 113 747 75 2240 21 2240 18 0 03 0 29 0 52 1 K QIASQFPPPPTPPPVDSQPLK S 120 852 12 2553 33 2553 30 0 03 0 24 1 5 1 R LTQADISEQPAMTTVVPQVPTSPK S Oxidation M 2 41118797665 Mass 16663 Score 124 Queries matched 2 GAP3 Mus musculus Query Observed Mr expt Mr calc Delta Miss Score Expect Rank Peptide 38 568 26 1134 51 1134 47 0 04 0 34 0 45 1 R ASEDWWEGR H 69 702 85 1403 68 1403 64 0 04 0 90 8e 07 1 K ADSEASSGPLLDDK A Proteins matching the same set of peptides gi 20521039 Mass 120952 Score 123 Queries matched 2 KIAA0411 Homo sapiens gi 24307967 Mass 1
23. 10 um Ein Kernpunkt der funktionellen Charakterisierung der Interaktion zwischen MEGAP und Lpd bestand in der Identifikation MEGAP spezifischer Effekte auf Lpd und Lamellipodien Dynamiken Zu diesem Zweck wurden NIH 3T3 Zellen mit EYFP markiertem MEGAP 74 Ergebnisse bzw Lpd transient transfiziert und die lebenden Zellen unter PDGF Stimulierung gefilmt Live Cell Imaging Vor der Behandlung mit PDGF konnten distinkte Unterschiede bez glich der Verteilung von MEGAP und Lpd innerhalb der Zelle beobachtet werden Unter Serum reduzierten Bedingungen wurde MEGAP in Form einer deutlich abgegrenzten Linie entlang der Zellmembran detektiert Lpd hingegen pr sentierte nur eine diffuse zytoplasmatische Lokalisation Nach der Stimulierung mit PDGF l ste sich MEGAP von der Membran ab und hemmte gleichzeitig die Ausbildung von Lamellipodien Abbildung 29 Abbildung 31B Bei Uberexpression von Lpd wurde nach der Stimulierung mit PDGF eine entgegengesetzte Reaktion beobachtet In diesem Fall produzierten die Zellen ausgepragte Lamellipodien an deren Migrationsfront Lpd angereichert wurde Abbildung 30 Abbildung 31B Das aufgezeigte Verhalten von Lpd wurde ebenfalls f r Rat2 Fibroblasten f r WI 38 Humane Lungenfibroblasten sowie f r Bl6 Fl Maus Melanoma Zellen beschrieben Krause et al 2004 Abbildung 29 Zeitrafferaufnahme einer NIH 3T3 Zelle unter Serum Reduktion und PDGF Stimulierung bei Zeitpunkt 0 min Die Zelle wurde mit Wildtyp
24. 2 5 Bedeutung der Interaktion zwischen MEGAP und Lamellipodin auf neuronaler Ebene Die aufgezeigte Interaktion zwischen MEGAP und Lpd sowie die gemeinsame Involvierung in die PDGF vermittelte Signaltransduktion f hrte zu der Frage ob beide Proteine auf neuronaler Ebene in ein und denselben Signaltransduktionsweg integriert sind oder ob sie jeweils verschiedene Funktionen in separaten Signalwegen einnehmen k nnen MEGAP ist ber die Interaktion mit dem Slit Rezeptor Robol an der repulsiven Wegfindung von Wachstumskegeln beteiligt Wong et al 2001 und wurde als Kandidatengen f r schwerwiegende kognitive Defekte isoliert Endris et al 2002 Vor kurzem konnte gezeigt werden dass eine Reduktion der Interaktion zwischen MEGAP und dem WAVE I Komplex die dendritische Morphologie von Neuronen und die Signaltbertragung an den Synapsen beeinflusst Des Weiteren wurde bei den analys erten WAVE 1 Knockout M usen eine Verhaltens nderung beobachtet Soderling er al 2007 Daher vermitteln die Ergebnisse dieser Studie einen Einblick w e der Verlust der MEGAP Funktion zu kognitiven Defekten f hren kann Lpd ist ebenfalls in die Slit Robo Signaltransduktion eingebunden Im Fadenwurm Caenorhabditis Elegans C elegans beg nstigt MIG 10 ein Homolog von Lpd die Weefindung und das Auswachsen von Axonen als Antwort auf die Stimulierung durch die Signalmolekule Slit und Netrin Chang er al 2006 Quinn er al 2006 Die Mutation von MIG 10 ve
25. Abbildung 44 Vektorkarte pcDNA4 TO myc His nach Invitrogen Homepage Vector Maps Klonname Schnittstellen Schnittstellen Insert Versuch Vektor Insert TO MEGAPa EcoRI Notl EcoRI Notl MEGAPa fl IF live cell EYFP fl Dralll NotI Dralll NotI EYFP fl imaging TO MEGAPa EcoRI Notl EcoRI Notl MEGA Pa IF live cell R542I EYFP R5421 fl imaging Dralll NotI Dralll NotI EYFP fl TO Robol BspEI Xbal BspEI Avrll Robol fl GST Pulldown 105 Anhang 53 6 pENTRIA Comments for pENTR 1A 2717 nucleotides rmB T1 transcription termination sequence bases 106 149 rmB T2 transcription termination sequence bases 281 308 attL1 bases 358 457 complementary strand ccdB gene bases 612 917 attL2 bases 946 1045 Kanamycin resistance gene bases 1168 1977 pUC origin bases 2041 2714 Abbildung 45 Vektorkarte pENTRIA nach Invitrogen Homepage Vector Maps Klonname Schnittstellen Schnittstellen Insert Bemerkung Vektor Insert pENTR Lpd Sall EcoRI Sall EcoRI Lamellipodin aus pBSII Lpd Start tga pENTR mCherry Lpd Dral Sall Dral Sall mCherry aus pENTR Lpd 5 3 7 pENTR2B Comments for pENTR 2B 2718 nucleotides rmB T1 transcription termination sequence bases 106 149 rmB T2 transcription termination sequence bases 281 308 attL1 bases 358 457 complementary strand ccdB gene bases 613 918 attL2 bases 947 1046 Kanamycin resistance gene bases 1169 1978 pUC origin bases 2042 2715 Abbildu
26. Ausschluss von RNasen zu gew hrleisten wurde zu den aufgelisteten Puffern jeweils DEPC 1 1000 zugef gt die L sung U N bei RT ger hrt und abschlie end autoklaviert Alternativ wurde f r frisch anzusetzende Puffer DEPC behandeltes H2O verwendet Des Weiteren wurden gebackene Magnetr hrer und Deckgl ser verwendet F r die Hybr d s erung und Detektion der Sonde wurde nach folgendem Protokoll vorgegangen 1 Tag Hybridisierung Objekttr ger OT mit Kryoschnitten in Kunststoffbox 30 min auftauen lassen l ul Sonde mit der entsprechenden Menge 1x TE Puffer verd nnen zum Beispiel 1 10 abh ngig von der Ausgangskonzentration 1 5 ul Sondenverd nnung mit 150 ul vorgew rmten Hybridisierungspuffer in einem 1 5 ml Reaktionsgef mischen und f r 10 min bei 70 C Heizblock inkubieren Boxpuffer f r die Hybridisierung in der feuchten Kammer ansetzen Filterpapierstreifen in Kunststoffbox legen Boxpuffer eingie en Sonde Hybridisierungspuffer auf OT luftblasenfrei auftragen vorsichtig Deckglas auflegen 37 Material und Methoden OT in der Box bei 68 C U N inkubieren 2 Tag Posthybridisierung Waschpuffer frisch ansetzen in drei Glask vetten aufteilen und auf 68 C im Wasserbad oder Heizofen erw rmen Schnitte auf OT bei 68 C 3x mit Waschpuffer waschen 10 min 30 min 30 min Waschpuffer in Formamid Sonderabfall entsorgen MABT Puffer fr sch aus MAB und 0 1 Tween herstellen 200 ml n K vette und 1
27. Bereiche innerhalb des C terminalen MEGAP Fragments mit Periphilin interagiert Auch wenn zwei Proteine sowohl im Hefesystem als auch im Rahmen biochemischer Bindungsstudien eindeutig miteinander interagieren sagt dies noch nichts ber die physiologische Relevanz dieser Interaktion aus Fur die tatsachliche Ausbildung von Proteinkomplexen m ssen die Bindungspartner sowohl im gleichen Zellkompartiment als auch zur gleichen Zeit exprimiert werden Da MEGAP zur Gruppe der zytoplasmatischen Proteine geh rt ware die Interaktion mit einem Kernprotein wie Periphilin zwar nicht auszuschlie en aber nicht unbedingt wahrscheinlich Ein weiterer Grund f r die ausschlie liche Selektion falsch positiver Klone k nnte generell auch die verwendete cDNA Bibliothek sein Die Analyse des Expressionsmusters von Megap zeigte jedoch eine Pr senz der Megap mRNA in weiten Bereichen des sich entwickelnden Nervensystems auf Daher sollten m gliche MEGAP Interaktionspartner auch in einer humanen f talen Gehirn cCDNA Bibliothek enthalten sein 87 Diskussion Zusammenfassend kann gesagt werden dass mit Hilfe des Yeast Two Hybrid Sytems die parallele Analyse einer Vielzahl an putativen Protein Protein Interaktionen realisierbar ist Allerdings mussen gegebenenfalls die Unterschiede der Proteinexpression zwischen Hefen und Menschen ber cksichtigt werden Es ist zu vermuten dass bei dem durchgef hrten Yeast Two Hybrid Screen eines der Hauptprobleme in der p
28. Gehirn cDNA Bibliothek ergab sich eine Anzahl von 1 406 x 10 doppelt transformierten Klonen Hierbei ist anzumerken dass trotz der relativ hohen Konzentration 59 Ergebnisse des Histidinsynthese Inhibitors 3 AT sehr viele Klone gewachsen sind Dies deutete auf eine gr ere Anzahl falsch positiver Klone hin Daher wurden fur die Generierung von Masterplatten 672 der gr ten gewachsenen Klone fur eine weitere Analyse in sieben 96 Well Platten berf hrt Nachtraglich wurden noch zehn weitere gro e Klone von einer f r 96 h bei 30 C inkubierten Platte ausgew hlt 8 1 8 10 bzw Nr 20 29 Diese Klone wurden direkt mit Hilfe des 8 Galactosidase Flussigassays bewertet II 1 Durchf hrung des X Gal Filter Assays Nach einer Inkubation der angeimpften Masterplatten fur 48 h bei 30 C wurden die Klone mit einem 96 Pin Replikator Nalge Nunc zur Durchf hrung eines X Gal Filter Assays Abschnitt 2 10 4 5 auf Hybond NX Nylonmembranen auf Leu Trp Agarplatten uberimpft Nach zwei weiteren Tagen Wachstum wurde ein X Gal Filterassay durchgef hrt Insgesamt zeigten 35 der 672 Hefeklone nach max mal 24 Stunden Inkubationszeit einen Farbumschlag nach blau verf gten also ber eine B Galaktosidase Aktivitat Dieses Enzym wird unter den Bedingungen eines Yeast Two Hybrid Screens nur dann gebildet wenn eine Interaktion zwischen den beiden Proteinen stattfindet oder eine Autoaktivierung erfolgt Parallel zu den untersuchten Klonen w
29. Im Gegensatz zu MEGAP wurde Lpd nicht an Vinculin markierten Fokalen Adhasionen wei er Pfeil sondern in der N he von Membranfortsatzen detektiert roter Pfeil Die Ma stabsbalken in A bis C entsprechen 5 um A serum PDGF PDGF serum PDGF PDGF starved 2 40 5 20 starved 2 40 5 20 MEGAP Y755D Lpd MEGAP wt Lod MEGAP wt Lpd Abbildung 35 Die MEGAP SH3 Mutante Y755D erm glicht die Ausbildung von Lamellipodien Filmaufnahmen TIRF von transient transfizierten NIH 3T3 Zellen unter Serum Reduktion und Stimulierung durch PDGF bei Zeitpunkt 0 min A NIH 3T3 Zellen wurden mit Wildtyp MEGAP EYFP und mCherry Lpd Expressionskonstrukten co transfiziert MEGAP und Lpd zeigten berlappende Proteinlokalisation und konnten an Fokalen Adhasionen detektiert werden wei e Pfeile Aufgrund der starken Inhibierung durch Wildtyp MEGAP erfolgte keine Ausbildung von Lamellipodien nach der Behandlung mit PDGF B NIH 3T3 Zellen wurden mit der EYFP markierten MEGAP SH3 Mutante Y755D und mit mCherry Lpd co transfiziert Vor der Stimulierung durch PDGF zeigten MEGAP Y755D und Lpd weder Co Lokalisation noch konnte die Lokalisation an distinkte zellul ren Strukturen beobachtet werden Im Gegensatz zu A initiierte die Stimulierung mit PDGF das Auswachsen eines kleinen Lamellipodiums gestrichelte Linie an dessen Migrationsfront Lpd angereichert wurde Pfeil Die Ma stabsbalken in A und B entsprechen 5 um 83 Erg
30. Inhaltsverzeichnis 5 ANHANG 5 1 Genotypen der verwendeten E coli Bakterienst mme 5 2 Hefest mme 5 3 Vektorkarten und verwendete Konstrukte 3 3 1 pSTBlue 1 5 3 2 pBluescript II SK 5 33 pGEX4T 5 3 4 pcDNA3 1 5 3 5 peDNA4 TO mycHis C 5 3 6 pENTRIA 5 3 7 pENTR2B 5 3 8 pENTR3C 5 3 9 pDONR221 5 3 10 pcDNA DEST53 5 3 11 pDEST22 5 3 12 pDEST32 5 3 13 pDEST12 2 5 3 14 bestellte Klone 5 4 Sequenzen der cDNA Klone Yeast Two Hybrid Screen 3 2 1 5 5 Negativkontrollen f r die RNA in situ Hybridisierung 3 1 3 4 5 6 Massenspektrometrie Daten GST Pulldown mit adultem Mausgehirn 3 2 2 1 5 7 NCBI Referenzsequenzen 5 8 Internetadressen 6 REFERENZEN 101 101 101 102 102 103 104 104 105 106 106 107 108 108 109 109 110 110 110 117 117 125 125 126 Einleitung 1 Einleitung 1 1 Migrationsprozesse als Motor der Entwicklung und Adaption Eine zentrale Gemeinsamkeit aller biologischen Organ smen besteht n der Anpassungs f higkeit an ihre jeweilige Umwelt Zu Beginn der Evolution besa en bereits einzellige Lebewesen die F higkeit auf spezifische Faktoren in ihrer Umgebung in Form von zielgerichteter oder zielabgewandter Bewegung zu reagieren Dieser Prozess der gesteuerten Zellbewegung Migration nimmt auch in den h her organisierten mehrzelligen Organismen bis hin zum Menschen eine wichtige Rolle in diversen physiologischen und pathologischen Prozessen e n 1 1 1 Die Embryogene
31. Lako M van Herpe I Evans J Saretzki G and Hole N 2004 A role for nucleoprotein Zap3 in the reduction of telomerase activity during embryonic stem cell differentiation Mech Dev 2 1509 1522 Arnaout M A Goodman S L and Xiong J P 2007 Structure and mechanics of integrin based cell adhesion Curr Opin Cell Biol 79 495 507 Ayala R Shu T and Tsai L H 2007 Trekking across the brain the journey of neuronal migration Cell 28 29 43 Bacon C Endris V and Rappold G 2009 Dynamic expression of the Slit Robo GTPase activating protein genes during development of the murine nervous system J Comp Neurol 513 224 236 Bashaw G J Kidd T Murray D Pawson T and Goodman C S 2000 Repulsive axon guidance Abelson and Enabled play opposing roles downstream of the roundabout receptor Cell 701 703 715 Blagg S L and Insall R H 2004 Solving the WAVE function Nat Cell Biol 6 279 281 Brose K Bland K S Wang K H Arnott D Henzel W Goodman C S Tessier Lavigne M and Kidd T 1999 Slit proteins bind Robo receptors and have an evolutionarily conserved role in repulsive axon guidance Cell 96 795 806 Broussard J A Webb D J and Kaverina I 2008 Asymmetric focal adhesion disassembly in motile cells Curr Opin Cell Biol 20 85 90 Chang C Adler C E Krause M Clark S G Gertler F B Tessier Lavigne M and Bargmann C I 2006 MIG 10 lamelli
32. Wachstumskegeln k nnte eine Interaktion zwischen MEGAP und Lpd auch dazu dienen dass entlang der neuronalen Forts tze und an den neuronalen Zellk rpern keine zus tzlichen Lamellipodien gebildet werden 4 3 Die Rolle von MEGAP w hrend der Entwicklung des ZNS Die Entwicklung des zentralen Nervenssystems ZNS stellt einen der ersten Prozesse im Verlauf der Embryogenese dar Eine pr zise Regulation der Migration neuronaler Vorl uferzellen und Neuronen mit anschlie ender Vernetzung der Nervenzellen st wichtig f r die komplexe Funktion des ZNS Diese Prozesse werden durch eine Vielzahl von S gnaltransduktionskaskaden gesteuert welche u a die Organisation des Zytoskeletts kontrollieren Aufgrund der Verkn pfungen zwischen den verschiedenen Signalwegen oder der zentralen Rolle bestimmter Faktoren kann bereits die Fehlfunktion eines einzigen Proteins globale Auswirkungen auf die Entwicklung des ZNS und damit verbundene kognitive Funktionen haben MEGAP wurde im Rahmen genetischer Analysen mental retardierter Patienten als ein Kandidatengen f r geistige Behinderung identifiziert Endris et al 2002 Eine Patientin be welcher MEGAP aufgrund einer balancierten de novo Translokation zwischen den Chromosomen X und 3 zerst rt wurde wies zus tzlich zu der schweren Beeintr chtigung ihrer kognitiven Funktionen auch motorische Defekte Ataxie sowie ein fehlendes Sprachverm gen auf Der bisher am besten verstandene S gnalweg bei welchem M
33. aagatactta ttggacgatg Cagagastcc tgagagagaa AICCCICIIC ECOUCCTCOCCL atettecagt gaagggagaa CCCCaacelg EE EE EqQagccaacc Cattcagaag Cagcecaccrg Jagggagaag ttactccgaca ctatceaacag tgctttgaag actagaaaag tcectaagagt atttagacaa e een ge LN wg een ge ELICAALCEe tgaagacaag gacagtgacg ctgccggetg acgggctttg COCCOLCTCL CaccaLlgecce tattggagaa agettcggeg atttetteaa gtgaggcgtg L ee ee taca attca tatgacagat aatcacacac ggtgcaatgg Seege tere tee atagtggaca cggtcagagg tatgagettcg aaaggattte gtgaagagcg Oe Le Lehr aagectaact ttactggatt tttgccaace tacdagarltg gaactggcaa acacalcttg gacagaaaag gCaccaccce gtgqaatgqgaa CCalCaatlac gtgtcagaaa tcaaccaggg te Lee ee eer gttggcaatta qaagccttaa ggaggaagcg gcgccgagegc STICELTetg deetageate Caaattegag agegagta tt gtattatcag gtcacaa agt Steng e eiser EE taa aaccagtt attatatgtt tagaaatacg atgaagtatt ETLITLCASITTE ttaatagaga ataaggaatg ECOgCCCaga EE EE Qaatgctaca TOaastcattgc CCECOCAQ TC CaaageLgge Cagalgatta attatgagat gagatgtaca aaacatgtaa Caavocgtca COGCTOCLOE gcggtccgag Cagrcreccec tagcaaaata tactaagact aaaggtoettt OCalogagal aaagcatgtg gectcacgtg agaggagtgg cactgaagart agagatagct gqcga atcatac agaaaaagat Caaaacacla agaaagtatt CUttCaagtge agaaggaatc ECaaegrtoqcad actaaaaata ggagaatatg atttatcatce Caacagcgaa EGCLGagace tcaaagagaa TCaaggeatt aaactgtact gtetcgaccart SIECCLIECTE cagaactggg agagetecte BER Oct SooceLgggta
34. acaggccaca accgggttat acaaaccaat EQgGCagcatc acctcaggag agggattggg ggaaatggaa GagacecLtce ccaacatata ECOCCCUGCa ctacaacgag ggaccggtcg Gargtccagt CITELLITCE Cagcacccac CalCaaecaad aaagcaaatg Cartgactaa Jagcacgect Lraaccecegt gttgaaaaat COCCLEELCEC gaatgaaaat ablacgcecta catagtggaa CULTLOUCCta agttgcaata GLEallLecag atgtgaagca Cacagaataa tgtaccagag tttttatata ttaactaacc SELLLOLLEL EE E EE E actLtgacct CtTgtgcacac gcatcotttga agatttgtac aaaltaggqag aaaggaaaat tcagctagtg EE EE ttaccaatge ra gacecec a Jaggaagaga gtgtcctggg cocagtocga cattaccagg LALScaggtc at ageJ3a3lgt Caagrocrgc gQaagatcagc cgaggcagta Laccegqcc g OCLC EE ggtgtcaage aatgataagg aaaatccagc ctgaggacat cgagagattg atgaaactgg EE EE EE gcaagactga tIeraceete EE cage CTLECE Cala aatcatgata tatatgtcaag aagggggatg gaggagagca ecatagaatt E EE EE aadaaaclac ttgggtcggg LIEgecaigLt cacclcecasaa atttatadag CLUCCETOta Ehe e te elei Gene gttgggggat attaaaaagg gt 21110434669 dbjlAK022970 11 Homo sapiens cDNA FLJ12908 fis clone NT2RP2004399 DPH3 KTI11 homolog S cerevisiae Homo sapiens 61 121 eg 241 Sol 3641 421 481 541 gatgccgagc ggggegttac atcgaggact ga actcaacttert gccaacaaag ggaatgagcc tatgarcttcge ggaagcaagt aLtlellaalt ttggttteat ccaggccggt EE recaalLalda Scatcaccaa aattagttaa cagatagaaa Lgccergtaa ccataacatg eet ue ee Sheet Che Leocggcgaag Seeerei ee tass cgaggactcg ggatcagttt aLgetgaa
35. bisher nur ansatzweise verstanden Extracellular stimuli Extracellular stimuli r 5 Growing filaments push membrane forward dr Q d S e 2 WASP Scar activation Ss PH Capping limits H I elongation 3 Arp2 3 complex Q DD activation and Q filament nucleation e y e amp GQ o Os Q 9 ADF cofilin a a 2 yf inhibition O ey R gt X a d 8 ADF cofilin severs S a ma 1 Profilin bound ATP actin e a i are aa d d d aa e Ba LA Re a Ce e Q a o amp Aeemg of Call Sauce D001 114 p Ngre slipad wrt permumse Ze Ameal Renee of Dxegomger and Biren checelas ZE 25 2000 by Renews wwe eegen Abbildung 4 Darstellung der Aktin Tretm hle innerhalb eines auswachsenden Lamellipodiums 1 Ein Pool an Profilin gebundenem ATP Aktin steht f r die Verl ngerung von Aktinfilamenten zur Verf gung 2 Extrazellul re Signale initiieren die Aktivierung der kleinen Rho GTPasen und somit die Aktivierung des WAVE Komplexes 3 Aktives WAVE stimuliert die katalytische Aktivit t des Arp2 3 Komplexes welche die Bildung neuer Verzweigungen im Aktin Netzwerk erm glicht 4 Ausgehend von der neuen Verzweigung findet ein schnelles Wachstum der Aktinfilamente an den barbed Enden statt 5 Die wachsenden Filamente dr cken die Zellmembran vorw rts 6 So genannte Capping Proteine unterbinden weitere Anlagerung von Aktin Monomeren 7 Die Aktinfilamente altern durch Hydroly
36. der GST Pulldown Studien konnte somit die Bindung zwischen der MEGAP SH3 Dom ne und Lpd bzw mDial in vitro belegt werden Dieser Ansatz gibt allerdings keine Auskunft dar ber ob d e jeweiligen Proteine auch unter physiologischen Bedingungen bzw unter Co Expression 1m gleichen Zellkompartiment Komplexe bilden Diese Fragestellung kann mit Hilfe der Co Immunprazipitation Co IP untersucht werden N N Ko O SO og ww S E GST SH3 170 kDa 170 kDa a Abbildung 23 GST Pulldown mit der MEGAP SH3 Dom ne und HEK293 Zelllysaten transfiziert mit Myc Lpd Myc mDial bzw Myc Robol Sowohl bei Myc Lpd als auch Myc mDial konnte eine Interaktion mit der MEGAP SH3 beobachtet werden ww Zelllysate 3 3 MEGAP interagiert mit dem Ena V ASP bindenden Protein Lamellipodin Lpd Fur die Co IP Studien wurden Myc Tag Expressionskonstrukte f r Lpd und mDial zusammen mit MEGAP Expressionskonstrukten zun chst in HEK293 Zellen transient co transfiziert Die Prazipitation der Immunkomplexe mit einem Myc spezifischen Antik rper bestatigte die Bindung von Wildtyp MEGAP und Myc Lpd Abbildung 24A Als 68 Ergebnisse Spezifitatskontrollen wurden in der Co IP die MEGAP Mutanten W781A Soderling et al 2002 und Y755D Endris et al 2009 eingesetzt welche keine funktionelle SH3 Dom ne besitzen Im Gegensatz zu Wildtyp MEGAP zeigten beide SH3 Mutanten keine Interaktion mit Myc Lpd Dies ist ein wichtiger Hinweis auf die Bedeutun
37. der im cDNA Klon enthaltenen Sequenz an Die mit roter Schrift markierten Tripletts zeigen vorzeitig generierte Stoppkodons an welche durch Verschiebung des Leserasters entstanden sind Aufgrund der Tatsache dass 1m Verlauf des Screens alle selektierten Klone als falsch positiv bewertet wurden sind die 3 Enden der in den Klonen enthaltenen cDNA Sequenz nicht ermittelt worden gt 21128411187lemblIA J544537 11 Homo sapiens mRNA for protein phosphatase nuclear targeting subunit CAT53 gene 61 11 181 241 301 361 421 481 541 601 661 Tal Tol 841 301 961 101 1081 1141 1204 1261 el aod 1441 15041 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 AR OR ALOL 2221 2201 2341 ccggggtteg cagaaacaag gaaaacagca CaccCcCcacca taacttcaaa EE gggtgggggg EQaggqccecc aaaattttac tttagaggtt cogcagcaac OCCactagcc SCECcacgetg aataalceaac LEGaacccac gaaatgaata taaataattg CCCCLCCCCC accaccat coot tcogg E e atgaaggaag CoOvTCaCcCag tggctgacgt ectgqcagcatc aagcagctga agcgactgga aagaaacgta gtgaaggcetg CLECOCaCCa ECO ELLI ertagaccea cctgcagaga gtgaagatca OCCCCEOLEC aagccaagcc ecagaaccag CCLOLtGeaag aagccagtgg agtgtgacat actgaacgag SCtgucagacc EE agcaatagcec EE E Ee EE gaacctgggg Ctggccaalc ggcattaatg gaggaactac gagatgggga cacgaaagat aaatattggt attcaaagac Laccocucac gcaagtcaag EGOCTOGLCaL aagatgaagg agacccgggc Caqgcacccag tgcctgtgaa UCCCCC EE agaaatacaa ELCCCOCCaca CaggCc
38. diesem Zweck wurde zus tzlich eine GAP defiziente MEGAP Variante eingesetzt um die durch MEGAP verursachten Ver nderungen der Lamellipodien Dynamik zu studieren Da die GAP Mutante MEGAP RI m Vergleich zu den EYFP transfizierten Kontrollzellen hnliche lamellipodiale Wachstumsgeschwindigkeiten aufgewiesen hat war die Aktivierung von Racl und des WAVE 1 Komplexes vermutlich nicht behindert Dennoch unterdr ckte die Co Expression von MEGAP RI und Lpd die stimulierenden Effekte von Lpd auf lamellipodiale Wachstumsgeschwindigkeiten sowie auf die Umf nge auswachsender Lamellipodien Basierend auf diesen Ergebnissen kann angenommen werden dass die Lpd vermittelten Aktin Dynamiken aufgrund der Interaktion zwischen MEGAP und Lpd gehemmt werden Die Inhibierung von Lpd erfolgt wahrscheinlich ber die Assoziation mit MEGAP und die damit verbundene Umlagerung an Fokale Adhasionen Diese Hypothese wird durch die Tatsache gest tzt dass der Verlust der Interaktion zwischen MEGAP und Lpd trotz der verbleibenden GAP Aktivitat des MEGAP Proteins die Ausbildung kleiner Lamellipodien erm glicht und sich Lamellipodin in den auswachsenden Membranfortsatzen anreichert 93 Diskussion Filopodium Filopodium Polymerisation von verzweigtem Aktin P Lamm lt WAVE 1 Lamm lt lt WAVE Rac GTP MEGAP Rac GTP Abbildung 38 Schematische Darstellung der Inhibierung von Lamellipodien durch MEGAP rechts Mit Hilfe seiner GAP Akti
39. ein Bindeglied zwischen Signalkaskaden an der Zellmembran und Faktoren betrachtet welche die Aktinpolymerisation beg nstigen RPGF Abbildung 36 Ausbildung von Lamellipodien nach Aktivierung des PDGF Rezeptors Durch die Bindung des Wachstumsfaktors PDGF erfolgt die Aktivierung und Dimerisierung des PDGF Rezeptors wodurch die Kinasen PI3K und c Abl aktiviert werden Sowohl c Abl als auch PI3K k nnen ber die Aktivierung von Regulatoren der kleinen GTPasen wie SOS Sini et al 2004 die Bildung von GTP gebundenem Racl initiieren Uber diesen Weg erfolgt die Aktivierung des WAVE 1 Komplexes welcher seinerseits die katalytische Aktivit t des Arp2 3 Komplexes stimuliert und somit die f r die Ausbildung von Lamellipodien erforderliche Aktinpolymerisation beg nstigt Gleichzeitig synthetisiert die aktivierte PDK PIP3 wodurch Lpd und damit assoziierte Faktoren w e zum Beispiel das Ena VASP Protein Mena an die Zellmembran rekrutiert werden Dieser Prozess verst rkt die Rate der Aktinpolymerisation und erh ht somit die Wachstumsgeschwindigkeit von Lamellipodien gt Interaktion Aktivierung 90 Diskussion 4 2 2 Die MEGAP SH3 Dom ne vermittelt die Bindung von MEGAP an Lamellipodin Die ersten Hinweise auf eine Assoziation zwischen MEGAP und Lpd waren die Ergebnisse eines GST Pulldowns mit der MEGAP SH3 Dom ne und HEK293 Zellextrakten Hierbei wurden sowohl Lpd als auch mDial zusammen mit der MEGAP SH3 Dom ne pr zipitiert Dr Vo
40. f r die bernahme der Betreuung dieser Arbeit an der Fakult t f r Biowissenschaften der Universit t Heidelberg und fur die gute Beratung m Verlauf der Arbeit Dr Volker Endris danke ich f r die sehr gute praktische Betreuung f r die st ndige Diskussionsbereitschaft und kritische Betrachtung meiner Arbeit sowie fur die wertvollen Ratschl ge beim Schreiben der Dissertation Dr Claire Bacon danke ich f r ihre Hilfe bei der RNA in situ Hybridisierung sowie f r die Unterst tzung beim berarbeiten englischsprachiger Manuskripte Dr Christine Fischer danke ich fur die Unterst tzung bei der statistischen Auswertung der Daten des Live Cell Imaging Claudia Durand m chte ich f r die hilfreichen Korrekturvorschl ge bei der berarbeitung des Manuskripts danken Allen meinen Kollegen und Freunden die mich w hrend meiner Zeit m Labor begleitet haben danke ich f r ihre Hilfsbereitschaft und Kollegialitat sowie f r die angenehme und freundliche Arbeitsatmosphare Des Weiteren m chte ich mich bei den Kooperationspartnern Dr Elaine Pinheiro und Prof Dr Frank Gertler vom Massachusetts Institute of Technology fur die gute Zusammenarbeit bedanken Abschlie end m chte ich in diesem Rahmen auch ganz herzlich meiner Familie danken die mich immer uneingeschrankt unterstutzt und gefordert hat Abk rzungen AS B ME bp BSA C elegans DAPI DNA DTT EDTA E coli et al S g GAP GEF GDP
41. fiir Megap a b und Lpd c d a b Hybridisierung einer Megap anti sense RNA Sonde auf einem medialen a und lateralen b Sagittalschnitt Ausschnitt Kopf Embryonalstadium E11 5 p c Wie bereits in Abbildung 18 dargestellt konnte eine starke Expression von Megap in weiten Bereichen des sich entwickelnden Gehirns beobachtet werden c d Hybridisierung mit einer Lpd anti sense RNA Sonde auf den entsprechenden Folgeschnitten der RNA in situ Hybridisierung fiir Megap a gt c b gt d Co Expression von Megap und Lpd lie sich in Bereichen des Mittelhirns M der Medulla Oblongata MO der subventrikul ren Zone SVZ des Vorderhirns telencephalic vesicle TV sowie im Ganglion trigeminale TG detektieren Die Ma stabsbalken in a bis di entsprechen 1000 um Negativkontrolle mit den sense Sonden gegen Megap und Lpd siehe Anhang 5 5 Bacon und Haussmann unver ffentlichte Daten 70 Ergebnisse Im Gegensatz zu Megap zeigte Lpd ein deutlich niedrigeres Expressionsniveau im sich entwickelnden ZNS Dennoch konnten im Vergleich zur Hybridisierung mit der anti sense Sonde gegen Megap Regionen berlappender Expressionsmuster identifiziert werden Insbesondere die subventrikulare Zone SVZ des Vorderhirns die Medulla Oblongata sowie das Ganglion tr geminale TG pr sentierten eindeutige Co Expression von Lpd und Megap Des Weiteren wurde berlappende Expression der mRNA n Bereichen des Mittel M und Vorderhirns F detektiert
42. fur die Rolle von MEGAP bez glich neuronaler Entwicklungsprozesse zu erhalten sollte im Rahmen dieser Arbeit nach bisher unbekannten MEGAP Interaktionspartnern gesucht werden Die Suche nach MEGAP bindenden Proteinen erfolgte mit Hilfe des Yeast Two Hybrid Systems und mittels GST Pulldown 3 2 1 Yeast Two Hybrid Screen Mit dem Yeast Two Hybrid System k nnen cDNA Bibliotheken gezielt nach bisher unbekannten Interaktionspartnern durchsucht werden Aufgrund der Tatsache dass die MEGAP SH3 Dom ne eine wichtige Rolle bei der Interaktion zwischen MEGAP und WAVE 1 bzw Robol einnimmt wurden in dieser Arbeit ebenfalls MEGAP SH3 bindende Proteine gesucht Die MEGAP SH3 Dom ne befindet sich 1m C terminalen Bereich von MEGAP Abbildung 9 Da d e Expression des gesamten Proteins aufgrund seiner Gr e von 160 kDa in Hefen nicht m glich war wurde nur ein C terminales Fragment f r den Yeast Two Hybrid Screen ausgew hlt MEGAP C Abbildung 13 und als bait verwendet Die Expression des Fusionsproteins aus der DNA bindenden Dom ne des Transkriptionsfaktors GAL4 GAL4 DB und MEGAP C erfolgte uber den Gateway Expressionsvektor pDEST32 Der Expressionsvektor pDEST22 diente zur Expression von Fusionsproteinen aus der GAL4 Aktivierungsdomane GAL4 AD und bekannten Interaktionspartnern wie der CC3 Dom ne von Robol Die f r den Yeast Two Hybrid Screen verwendete cDNA Bibliothek setzte sich ebenfalls aus Expressionsvektoren zusammen welche die GAL4 A
43. g NaCl 2 g KCl 14 4 g NaHPO pH 7 4 ad H20 11 TBS 10x 60 55 g Tris HCl 0 5 M 87 67 g NaCl 1 5 M pH 7 4 ad H20 11 TE 1x 50 mM Tris HCl pH 8 0 20 mM EDTA 2 2 N hrmedien f r Bakterien SOC Medium 20 g Bacto tryptone 5 g Bacto yeast extract 10 ml NaCl 1 M 2 5 ml KCI 1 M 5 ml MgCl 2 M 10 ml Glucose steril filtriert 2 M pH 7 0 ad H20 11 LB Medium 10 g NaCl 10 g Bacto tryptone 5 g Bacto yeast extract ad HO II fur Agar Platten 15 g Bacto Agar IPTG X Gal Platten pro Platte 20 ul IPTG 100 mM und 50 ul X Gal 2 zugeben Ampicillin 50 mg ml in Ethanol 70 Kanamycin 20 mg ml in H2O Chloramphenicol 25 mg ml in Ethanol 100 Gentamycin 10 mg ml in H20 20 2 3 2 3 1 Antik rper Antik rper Material und Methoden Prim rantik rper MEGAP 19 Vinculin Myc tag Lpd Anti Digoxigenin AP 2 9 2 Klon Kaninchen Maus Maus Kaninchen Monospezifische IgG Fraktion monoklonal IgG1 monoklonal Immunogen CHELRELERQONTVKQ humanes Vinculin aufgereinigt aus Uterus EQKLISEEDL humanes c Myc AS 410 419 polyklonal Lpd GST FP4 2 AS 888 1060 nach Verdau mit PreScission Protease polyklonal Fab fragments Sekund rantik rper Antik rper Anti Maus Anti Maus Anti Maus Anti Maus Anti Maus Anti Kaninchen Anti Kaninchen Anti Kaninchen Anti Kaninchen Anti Kaninchen Konjugat Tier Peroxidase Alexa Fluor 54
44. induction of membrane ruffling Mol Biol Cell 6 4294 4303 Kurosaka S and Kashina A 2008 Cell biology of embryonic migration Birth Defects Res C Embryo Today 84 102 122 Landy A 1989 Dynamic structural and regulatory aspects of lambda site specific recombination Annu Rev Biochem 58 913 949 Lauffenburger D A and Horwitz A F 1996 Cell migration a physically integrated molecular process Cell 84 359 369 Le Clainche C and Carlier M F 2008 Regulation of actin assembly associated with protrusion and adhesion in cell migration Physiol Rev 88 489 513 Lein E S Hawrylycz M J Ao N Ayres M Bensinger A Bernard A Boe A F Boguski M S Brockway K S Byrnes E J Chen L Chen L Chen T M Chin M C Chong J Crook B E Czaplinska A Dang C N Datta S Dee N R Desaki A L Desta T Diep E Dolbeare T A Donelan M J Dong H W Dougherty J G Duncan B J Ebbert A J Eichele G Estin L K Faber C Facer B A Fields R Fischer S R Fliss T P Frensley C Gates S N Glattfelder K J Halverson K R Hart M R Hohmann J G Howell M P Jeung D P Johnson R A Karr P T Kawal R Kidney J M Knapik R H Kuan C L Lake J H Laramee A R Larsen K D Lau C Lemon T A Liang A J Liu Y Luong L T Michaels J Morgan J J Morgan R J Mortrud M T Mosqueda N F Ng L L Ng R Orta G J Overly C C Pak
45. mit 2 ml H2O kurz vor Gebrauch mischen Zugabe von 20 30 ul Enhancer L sung PVDF Membran Hybond P GE Healthcare Chemilumineszenz Detektion Immobilon FL Millipore Proteindetektion und Quantifizierung mit dem LI COR Imager SDS PAGE Proben mit 3 4 ul 5x SDS Sample Buffer mischen aufkochen bei 95 C f r 3 min SDS Page nach Protokoll Sambrook and Maniatis Molecular Cloning herstellen Proben auf SDS Page auftragen Elektrophorese bei 125 150 V f r 1 5 h Coomassie Blue F rbung 30 min bei RT sch tteln danach U N mit Destain L sung entf rben Western Blot PVDF Membran auf das ungef rbte Gel legen beidseits mit Whatman 3M Papier getrankt in 1x Transfer Puffer versehen Gel PVDF Sandwich zwischen Blottingpads legen und in XCell Blottingapparatur legen Blotten mit 125 mA fur 1 5 h Chemilumineszenz Detektion Geblottete Membran fur 1 h in Blocking L sung I blocken Primaren Antik rper in Blocking L sung I verd nnen 1 40 1 5000 je nach Ant k rper U N bei 4 C inkubieren 3 5x waschen mit 1x TBS 0 1 Tween Ant k rper L sung kann mehrfach wieder verwendet werden Inkubation mit HRP gekoppeltem Sekund rantik rper 1 10000 verd nnt in Blocking L sung I f r 1 h bei RT 3 5x waschen mit 1x TBS 0 1 Tween Inkubation f r 1 min bei RT in ECL L sung kurzes Abwaschen mit H20 Sofortige Exposition auf Rontgenfilm 31 Material und Methoden Proteindetektion mit dem LI COR Imag
46. pDEST22 WAVE wurden als Positivkontrollen f r die Interaktion mit MEGAP C eingesetzt 44 Material und Methoden Test auf MEGAP Autoaktivierung und Bestimmung der 3AT Konzentration Titration Ein nh rentes Problem eines Yeast Two Hybrid Screens besteht in der Identifizierung falsch positiver Klone Diese Situation tritt ein wenn das zu testende Protein bait oder der putative Interaktionspartner prey autoaktivierende Eigenschaften besitzen also allem die Transkription eines Reportergens initiieren k nnen Um die Zahl falsch positiver Klone m glichst gering zu halten musste zun chst die potentielle Autoaktivierung durch den bar MEGAP C bzw MEGAP SH3 KID ermittelt und diese durch Zugabe steigender Konzentrationen des kompetetiven Inhibitors 3 Amino 1 2 4 Triazol 3 AT unterdr ckt werden Die Titration wurde auf Leu Trp His Platten durchgef hrt da pDEST32 in diesem Fall pDEST32 MEGAP C bzw pDEST32 MEGAP SH3 KID das Gen zur Synthese der essentiellen Aminos ure Leucin tr gt und pDEST22 parentaler Vektor ohne Insert das zur Synthese der essentiellen Aminos ure Tryptophan Dieses Vorgehen erlaubte daher das spezifische Wachstum doppelt transformierter Hefestamme Als Selektionsmarker fur die Autoaktivierung wurde Histidin verwendet da diese essentielle Aminos ure nur be erfolgter Proteininteraktion oder vorhandener Autoaktivierung vom transformierten Hefestamm gebildet werden kann Zus tzlic
47. verwendet Anschlie end wurden 1 2 ug 29 Material und Methoden Antik rper zugegeben und 1 2 h auf Eis inkubiert Die Antigen Antik rper Komplexe wurden anschlie end durch Zugabe von 8 ul gewaschenen Protein A G Sepharose Beads Ultralink Protein A G Sepharose PIERCE tber Nacht gebunden Die Beads wurden am nachsten Tag mit 3500 rpm fur 5 min abzentrifugiert und insgesamt dreimal mit 800 ul Lysis Puffer gewaschen Analog zum GST Pulldown erfolgte die weitere Analyse durch SDS PAGE und Western Blot 2 7 4 SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese PAGE und Western Blot Verwendete Puffer und Materialien Proteinmarker 5x SDS Sample Buffer Laemmili Puffer 10x Transfer Puffer 10x Gel Blottingapparatur Coomassie Blue Destain Losung Blocking L sung I Blocking L sung IT ECL L sung Luminol PageRuler Prestained Protein Ladder Fermentas 0 225 M Tris HCl pH 6 8 50 Glycerol 5 SDS 0 05 Bromphenolblau 0 25 M DTT 0 25 M Tris 1 92 M Glycin 1 SDS 0 25 M Tris 1 92 M Glycin Novex XCell SureLock Mini Cell 0 25 g Coomassie Brilliant Blue in 100 ml Destain L sung 30 v v Methanol 10 v v Eisessig 3 Milchpuver in 1x TBS 0 1 Tween 50 Odyssey Blocking Buffer LI COR in 1x TBS 200 ml 0 1 M Tris HCl pH 8 6 62 ul H20 50 mg Luminol 30 Material und Methoden Enhancer 11 mg p Hydroxycoumaric acid Sigma C9008 in 10 ml DMSO 8 ml L sung
48. 0 ml in Falcon R hrchen abf llen Schnitte bei RT f r 30 min in K vette waschen anschlie end 30 min mit je 400 ul MABT auf OT in feuchter Kammer Anschlie end je 400 ul Blockl sung auf OT auftragen und 1 h bei RT in feuchter Kammer inkubieren 0 8 1 ul Anti DIG Antik rper Roche Katalog Nr 11093274910 mit 1 5 ml Blockl sung mischen jeweils 150 ul Antikorperverdunnung blasenfrei auf OT auftragen und mit Deckglas abdecken U N in feuchter Kammer bei RT inkubieren 3 Tag Farbreaktion MABT Puffer frisch ansetzen auf K vetten und ein Falcon R hrchen verteilen Schnitte auf OT 4x in MABT waschen in K vetten 10 min 20 min anschlie end auf OT n Box 2x 20 min AP Puffer auftauen bzw frisch ansetzen und filtrieren Rotilabo Spritzenfilter steril 0 22 um Katalog Nr P664 1 Schnitte 2x 10 min mit je 400 ul AP Puffer pro OT aquilibrieren Farbl sung mit 1 5 ml AP Puffer und 15 ul NBT BCIP L sung Roche Katalog Nr 1681451 ansetzen danach abgedunkelt arbeiten Jeweils 150 ul Farbl sung blasenfrei auf OT auftragen und U N in feuchter Kammer mit Aluminiumfolie abdecken bei RT inkubieren alternativ l nger bei 4 C inkubieren 38 Material und Methoden 4 Tag Eindecken e Kaiser s Glyceringelatine Merck Katalog Nr 1092420100 im Wasserbad auf 50 C erwarmen e Farblosung in 1x PBS K vetten auswaschen 5 min 10 min 30 min Inhalt der ersten beiden K vetten in NBT BCIP Sonderabfall en
49. 000 3019 3003 3022 M13 Reverse priming site 3027 3043 3027 3043 Kanamycin resistance gene 3156 3965 EM promoter c 3486 3552 Zeocin resistance gene c 3111 3485 pUC origin 4086 4759 3615 4288 Abbildung 48 Vektorkarte pDONR221 nach Invitrogen Homepage Vector Maps 5 3 10 pcDNA DESTS53 Comments for pcDNA DEST53 7767 nucleotides CMV promoter bases 232 819 T7 promoter bases 863 882 Cycle 3 GFP N terminal bases 905 1621 atf 1 recombination site bases 1643 1767 Chloramphenicol resistance gene bases 1876 2535 ccdB gene bases 2856 3161 atfR2 recombination site bases 3202 3326 BGH polyadenylation region bases 3361 3588 fl origin bases 3634 4062 SV40 early promoter and origin bases 4089 4397 Neomycin resistance ORF bases 4472 5266 SV40 early polyadenylation region bases 5440 5570 pUC origin bases 5953 6626 Ampicillin resistance ORF bla bases 6771 7631 c bla promoter bases 7632 7730 c c complementary strand Abbildung 49 Vektorkarte pcDNA DEST5S3 nach Invitrogen Homepage Vector Maps 108 Anhang 5 3 11 pDEST22 Comments for pDEST22 8930 nucleotides ADH1 promoter bases 272 1726 Nuclear localization signal NLS bases 1734 1754 GAL4 DNA activation domain bases 1761 2105 atiR1 site bases 2121 2245 Chloramphenicol resistance Cm gene bases 2495 3154 ccdB gene bases 3495 3800 atiR2 site bases 3841 3965 ADH1 transcription termination region bases
50. 0A GAL2 ADE2 LYS2 GALI HIS3 met2 GAL7 lacZ Kontrollstamm enthaltene Plasmide cDNA Insert Interaktionsst rke humanes RB pPC97 FB Acc M28419 B Vidal et al 1996 EZ schwach humanes E2F1 pPC86 E2Fl Acc M96577 Aminos uren 342 437 Drosophila DP pPC97 CYH2 dDP Acc X79708 Aminos uren 1 377 o C Du et al 1996 m ig stark pPC86 dE2F Drosophila E2F Acc U10184 Aminos uren 225 433 D Chevray and peeve Ratten cFos k p Fos Acc X06769 star Nathans 1992 Aminos uren 132 211 101 Anhang Maus cJun Acc X12761 Aminos uren 250 325 pPC86 Jun GAL4 Acc K10486 Aminos uren 1 881 Tabelle 12 Hefekontrollstimme A E nach Invitrogen Die Tabelle gibt einen berblick ber die verwendeten Hefekontrollstamme die bei dem Yeast Two Hybrid Screen zur qualitativen Einsch tzung der Interaktionsstarke der isolierten Bindungspartner eingesetzt wurden pCL1 encoding full length GAL4 E Fields and Song 1989 sehr stark 5 3 Vektorkarten und verwendete Konstrukte 5 3 1 pSTBlue 1 T7 startj41 Hinz Hr 14 p5TElne 1 sequence landmarks i fac start codon l j zi ve Gem ec V lacZ o peptide ORF 1 378 N Pst H nn Awr 111130 TT promote 2 4 n Soci T7 transcription start 41 N BamH led Xba itt 4 N EcoR Ka Pml i152 multiple egen region BR EcoR Vion Bstk Win Ajo I Not T 51 178 N EcoR ong lee kisa 3 8 j Sal 112 Apa hisy bp promoter 185 202 oe i Acc i113 Sac 1163 SP
51. 25395 Score 123 Queries matched 2 SLIT ROBO Rho GTPase activating protein 3 isoform a Homo sapiens gai 2332592 Mass 122623 Score 123 Queries matched 2 KIAA0411 protein imported human gi 62648014 Mass 125339 Score 123 Queries matched 2 PREDICTED similar to SLIT ROBO Rho GTPase activating protein 3 srGAP3 srGAP2 WAVE associated gi 73985028 Mass 125477 Score 123 Queries matched 2 PREDICTED similar to SLIT ROBO Rho GTPase activating protein 3 Canis familiaris gi 75677374 Mass 122616 Score 123 Queries matched 2 SLIT ROBO Rho GTPase activating protein 3 isoform b Homo sapiens gi 76665096 Mass 122628 Score 123 Queries matched 2 PREDICTED similar to SLIT ROBO Rho GTPase activating protein 3 isoform 2 Bos taurus gi 76665098 Mass 125507 Score 123 Queries matched 2 119 Anhang PREDICTED similar to SLIT ROBO Rho GTPase activating protein 3 isoform 3 Bos taurus gi 109035846 Mass 125363 Score 123 Queries matched 2 PREDICTED similar to SLIT ROBO Rho GTPase activating protein 3 isoform a isoform 1 Macaca mulatta gi 109035849 Mass 122584 Score 123 Queries matched 2 PREDICTED similar to SLIT ROBO Rho GTPase activating protein 3 isoform b isoform 2 Macaca mulatta gil21311769 WARP Mus musculus 91127597098 Mass 125311 Score 122 Queries matched 2 Mass 111502 Score 122 Queries matched 2
52. 4203 4360 f1 origin bases 4687 5142 TRP1 gene bases 5245 5919 c ARS4 CEN6 origin bases 6455 6972 Ampicillin bla resistance gene bases 7104 7964 pUC origin bases 8109 8782 Abbildung 50 Vektorkarte pDEST22 nach Invitrogen Homepage Vector Maps 5 3 12 pDEST32 GAL4 DBD Frag cm pDEST 32 12266 bp Comments for pDEST 32 12266 nucleotides ADH1 promoter bases 103 1557 GAL4 DNA binding domain bases 1581 2024 attR1 site bases 2037 2161 Chloramphenicol resistance Cm gene bases 2411 3070 ccdB gene bases 3411 3716 attR2 site bases 3757 3881 ADH1 transcription termination region bases 4119 4276 f1 origin bases 4603 5058 Leu2 gene bases 5767 6861 ARS4 CEN6 origin bases 7589 8107 Gentamicin resistance gene bases 8452 8985 c pUC origin bases 9833 10506 Cycloheximide sensitivity CYH2 bases 11445 11894 c c complementary strand Abbildung 51 Vektorkarte pDEST32 nach Invitrogen Homepage Vector Maps 109 Anhang 5 3 13 pDEST12 2 Comments for pDEST 12 2 7278 nucleotides CMV promoter bases 15 608 SP6 promoter bases 687 706 attR1 site bases 730 854 Chloramphenicol resistance gene Cm bases 963 1622 ccdB gene bases 1964 2269 attR2 site bases 2310 2434 T7 promoter bases 2465 2484 C SV40 early polyadenylation signal bases 2784 3050 f1 intergenic region bases 3176 3631 SV40 early promoter and origin bases 3791 4099 Neomycin resistance gene bases 4158
53. 47 50 0 00 0 12 13 2 rai 529 30 1056 59 1056 60 0 00 0 22 1 2 1 53 625 32 1248 62 1248 63 0 01 d ER 0 0013 1 54 630 83 1259 65 1259 65 0 01 0 66 4 4e 05 1 56 633 78 1265 54 1265 54 0 00 0 22 1 1 1 me 634 31 1266 61 1266 61 0 00 0 35 0 053 d 58 639 87 1277 72 1277 72 0 00 0 28 0 27 1 59 649 84 1297 67 1297 67 0 01 0 47 0 0036 1 62 655 84 1309 66 1309 66 0 00 0 16 Bad 1 64 662 80 1323 58 1323 58 0 00 0 28 0 24 1 69 694 87 1387 72 1387 73 0 01 0 41 0 013 I E 741 39 1480 77 1480 77 0 00 0 18 2 7 1 74 504 29 1509 86 1509 87 0 01 0 16 4 1 1 73 755 94 1509 86 1509 87 0 00 0 23 0 82 1 79 760 46 1518 90 1518 90 0 01 1 25 0 53 1 80 766 41 1530 80 1530 81 0 01 0 48 0 0023 1 82 768 39 1534 76 1534 77 0 01 0 78 2 le 06 1 88 538 93 1613 77 1613 78 0 01 0 8 21 1 89 807 89 1613 77 1613 78 0 01 0 19 1 6 1 a0 812 39 1622 76 1622 75 0 01 0 22 0 93 1 St 819 45 1636 89 1636 90 0 01 0 51 0 0011 1 92 820 38 1638 75 1638 75 0 00 0 48 0 0025 d 93 553 97 1658 89 1658 90 0 01 1 23 0 76 4 94 832 44 1662 86 1662 87 0 00 1 20 1 6 1 Kb 854 95 1707 88 1707 89 0 00 0 18 2 5 1 107 712 33 2133 96 2133 99 0 03 0 14 5 1 2 4116797665 Mass 16663 Score 150 Queries matched 2 GAP3 Mus musculus Query Observed Mr expt Mr calc Delta Miss Score Expect Al 568 24 1134 47 1134 47 0 00 0 42 0 013 ANANDAN ANA N DD DVDA DUNAN ANA A DDAN NA N DADWRDD DDN DDD Expect Rank Peptide LYNIK K KFPAVETR N KYGPVMOR Y TISOAVNKK S NLSADOWR N KY
54. 4952 Synthetic polyadenylation signal bases 5016 5064 bla promoter bases 5376 5474 Ampicillin b a resistance gene bases 5475 6335 pUC onigin bases 6480 7153 C complementary strand Abbildung 52 Vektorkarte pDEST12 2 nach Invitrogen Homepage Vector Maps 5 3 14 bestellte Klone Lamellipodin KIAA1681 Kazusa DNA Research Institute mDial mKIAA4062 Kazusa DNA Research Institute 5 4 Sequenzen der cDNA Klone Yeast Two Hybrid Screen 3 2 1 748 GAT GAA GAT ACC CCA CCA AAC CCA AAA AAA GAG GGT GGG TCG AAT CAA ACA AGT TTG sp Glu Asp Thr Pro Pro Asn Pro Lys Lys Glu Gly Gly Ser Asn Gln Thr Ser Leu attB 1 ata ai attB2 l 805 ie AAA an GEN pt ACCCAACTTT CTTGTACAAA GTGGTTTGAT GGCCGCTAAG yr Lys Lys Val 859 TAAGTAAGAC GTCGAGCTCT AAGTAAGTAA CGGCCGCCAC CGCGGTGGAG CTTTGGACTT CTTCGCCAGA Abbildung 53 Sequenzausschnitt der Klonierungsstelle des pEXP AD22 Vektors f r die Generierung der cDNA Bibliothek F r eine korrekte Expression des Fusionsproteins musste der Leserahmen des Vektors mit dem Leserahmen des cDNA Inserts bereinstimmen 110 Anhang Der Expressionsvektor pEXP AD22 wurde f r die Herstellung der humanen fotalen Gehirn cDNA Bibliothek eingesetzt Die in diesem Abschnitt angegebenen Sequenzen der identifizierten Klone stammen aus der Datenbank des NCBI In gr n bzw rot sind Start und Stoppkodon des jeweiligen Transkripts angegeben Die gelb unterlegten Sequenzbereiche geben den Anfang
55. 5 Mus sculus gi 94366360 Mass 278483 Score 50 Queries matched PREDICTED spectrin alpha 2 isoform 17 Mus sculus g1 94366362 Mass 279076 Score 50 Queries matched PREDICTED spectrin alpha 2 isoform 14 Mus sculus g1 94366364 Mass 275189 Score 50 Queries matched PREDICTED spectrin alpha 2 isoform 12 Mus sculus gi 94366366 Mass 235695 Score 50 Queries matched PREDICTED spectrin alpha 2 isoform 11 Mus sculus gi 94366368 Mass 232108 Score 50 Queries matched PREDICTED spectrin alpha 2 isoform 3 Mus musculus gi 94368049 Mass 286640 Score 50 Queries matched PREDICTED similar to Spectrin alpha chain brain Spectrin non ery gi 94368051 Mass 285151 Score 50 Queries matched PREDICTED similar to Spectrin alpha chain brain Search Param Type of search Enzyme Fixed modifications Variable modificat Mass values Protein Mass Peptide Mass Toler Fragment Mass Tole Max Missed Cleavages Instrument type Number of queries 2 Lamellipodin Ras association and pleckstrin homolo eters MS MS Ion Search Trypsin Carbamidomethyl C ions Oxidation M Monoisotopic Unrestricted ance 200 ppm rance 0 1 Da 1 ESI QUAD TOF 83 Mascot Search Results User Email Search title MS data file Database Taxonomy Uwe Warnken U Warnken dkfz de Anhang 31 30 60 24 41 Queries 0 14 0 18 46 0 00018 0 74 0 014 19 m
56. 6 Alexa Fluor 488 IRDye 680 IRDye 800CW Peroxidase Alexa Fluor 555 Alexa Fluor 488 IRDye 680 IRDye 800CW Digoxigenin Firma SIGMA Molecular Probes Molecular Probes LI COR LI COR SIGMA Molecular Probes Molecular Probes LI COR LI COR Hersteller Pineda SIGMA ALDRICH Cell signaling Technology Covance Krause et al 2004 Roche Applied Science Katalog Nr A 4416 A 11003 A 21202 926 32222 926 32212 A 6154 A 31572 A 21206 926 32223 926 32213 21 Material und Methoden 2 4 Primer Bezeichnung Sequenz 5 3 CMV for CGCASATGCGGCGGTAGCGCGTIG BGH rev TAGAAGGCACAGTCGAGG M13 for ACGTTGTAAAACGACGGCCAG M13 rev GGAAACAGCTATGACCATG T7 TAATACGACTCACTATAGGG SP6 GATTTAGGTGACACTATAG pENTRY for sequence ACTTAAGCTCGGGCCCCAAATAA pENTRY rev sequence GAGATTTTGAGACACGGGCCAGA Dest32 for AACCGAAGTGCGCCAAGTGTCTG Dest32 rev AGCCGACAACCTTGATTIGGAGAC pEXP AD22 for TATAACGCGTTTGGAATCACT AD502 for CGGTCCGAACCTCATAACAACTC AD502 rev GTAAATTTCTGGCAAGGTAGACAAGCCGA Tabelle 1 Vektorprimer Bezeichnung Sequenz 5 3 MEGAP2288for EcoRI ATGGGGAATTCCGTTGACCATGACAATGGCACTG MEGAP 2504for EcoRI GATGGGAATTCCCAGGACATGGATGATGCCTTC MEGAP3010rev Xhol CTAGATACTCGAGGTGCTCATGGTCTTCTCGATG RG Exon21rev TCTCAGGGCTCTCGATCCT RG Ex9 for GCCACCATGCAGACATTACA RG Ex14 rev ACTCTGAAGATCCCCTGCTG Tabelle 2 MEGAP spezifische Primer Bezeichnung Sequenz 5 3 hLPD Start Sall for
57. 6 transcription start 184 i Eag Wim _ BspLU11 Was Ae Zn Mot 172 fl origin 373828 Net ol SPB start1ad Mla coding sequence Q60 1817 Jpn 2 l ma Kan coding sequence 1966 2778 RI Fe SS G i z oe Dealer pUC origin 3453 ON wal degt FEN Ngo ege Abu Kam Yo AW ER j 1 pSTBlue 1 r 3851 bp ra N i N N d ff PARM i2660 A 7 fi f Beni 11207 5 d Sea 111266 Er Ge Bou tO 12414 oR smB 2413 Bsa Ii1681 Ahd i1747 i Sof i2397 l a Ecol 12205 Me ee gma 227 1 nn _ T rt Spm li 1578 TT Cla liaws Mru Ina Blunt chaning site R Z0mer primer 769535 3 1 acz slart TF promoter primer SEO A cf T promotar Kpnl Sani Esi ut Snail BamH Ercobl EukW EGR HIAGGGAAAGTICGG k Flaten Fat ai Arg Fert Leia Gin The Fray wr Wal Ser Aap Pre Ghi et The Met lla e Pre Ser Ser dan Tee Ihr Ha Ger Ara Gli Ser Ser Val Fro Ace Aine Il Siy Sal Hing ill Ano Aer il Emil Eeao109 Eag Abha Bsr Apa Sac Mor al ae a Feb ee a a eek Fe Aa ie tah Ba a Fin m Ba Le Ate bk Ga SPE promoter GICGACAAGCl SAUCE Tor ALL irr KKK Wal Asp Leg Leu Leu Glu Pre feele Ale Lei dae His he Oye Gly Gw Fra Ger Ser Ara Pro Leu Iyr Ser ser Pro ya ep Fro dl nigra SP6 promoter primer 59349 3 ACAACG TCO TGAC eu Dr Arg Ara Age Ire Hu Asr U 13mer primer 353515 3 pSTBlue 1 cloning expression region Abbildung 40 Vektorkarte pSTBlue 1 nach Novagen Homepa
58. 79074 Mass 137281 Score 873 Queries matched 34 PREDICTED Ras association RalGDS AF 6 and pleckstrin homology domains 1 isoform 2 Mus musculus Query Observed Mr expt Mr calc Delta Miss Score Expect Rank Peptide 11 489 76 977 50 977 47 0 03 0 22 6 1 R GTQLEESSK A 13 499 28 996 55 996 53 0 03 0 9 94 1 R ASGIYYVPK G 17 523 80 1045 58 1045 56 0 03 0 39 0 13 1 K NPONYLLGK K 22 536 73 1071 44 1071 41 0 03 0 7 2 2e 02 1 K YLCCDDAR T 23 538 29 1074 56 1074 54 0 03 0 35 0 35 1 R QVLDNLMDK S 27 544 32 1086 63 1086 60 0 03 0 19 13 1 K RPSVDSLVSK F 29 546 29 1090 56 1090 53 0 03 0 29 1 1 1 R QVLDNLMDK S Oxidation M 41 574 79 1147 57 1147 54 0 03 0 48 0 015 1 K APTDCCLALK H 45 587 81 1173 60 1173 57 0 04 0 58 0 0016 1 K FAPPAESGSPSK E 51 599 78 1197 54 1197 51 0 03 0 16 19 1 K SGSCAEHPEPK R 61 647 83 1293 65 1293 62 0 03 0 33 0 37 1 K MFGAWLGELDR L 62 655 83 1309 64 1309 61 0 03 0 25 2 3 1 K MFGAWLGELDR L Oxidation M 65 680 82 1359 62 1359 59 0 03 0 37 0 16 1 R QETNMANFSYR F 66 685 86 1369 71 1369 69 0 03 0 31 0 55 1 K QLYTNYQEALK R 67 688 81 1375 61 1375 58 0 03 0 40 0 084 1 R QETNMANFSYR F Oxidation M FL 472 26 1413 75 1413 74 0 02 0 15 25 1 R LQNAAQHSGTLFK S 72 718 91 1435 80 1435 77 0 03 0 70 7 7e 05 1 K SLPASGTPQSPPAVK A 73 720 37 1438 73 1438 69 0 04 1 3 3 4e 02 2 K YKAPTDCCLALK H 74 733 43 1464 84 1464 81 0 03 0 27 1 4 1 K VAVVNPOPOLWSK T 79 509 61 1525 82 1525 79 0 03 1 30 0 57 1 K QLYTNYQEALKR T 80 763 92 1525 83 1525 79
59. A aus Hefen 41 Das Yeast Two Hybrid System 42 Kultivierung von Zelllinien 50 Transfektion von Zelllinien 50 Immunfluoreszenz 51 Fluoreszenzmikroskopie und Live Cell Imaging 52 Kymographie 52 TIRF Mikroskopie 54 ERGEBNISSE 55 Expression von MEGAP im Nervensystem 55 Isolierung von MEGAP Interaktionspartnern 58 Yeast Two Hybrid Screen 58 GST Pulldown mit der MEGAP SH3 Dom ne 66 MEGAP interagiert mit dem Ena V ASP bindenden Protein Lamellipodin Lpd 68 MEGAP und Lamellipodin werden teilweise co exprimiert 70 MEGAP co lokalisiert mit Lamellipodin in NIH 3T3 Zellen 71 MEGAP hemmt die Dynamik von Lamellipodien 73 Die Inhibierung von Lamellipodin erfolgt durch die MEGAP abh ngige Lokalisierung an Fokale Adh sionen 81 DISKUSSION 85 Identifizierung neuer MEGAP Interaktionspartner 85 Isolierung MEGAP bindender Proteine mit Hilfe des Yeast Two Hybrid Systems 85 Putative Interaktionspartner der MEGAP SH3 Dom ne 88 MEGAP interagiert mit dem Ena V ASP bindenden Protein Lamellipodin 89 Lamellipodin ist an der Regulation von Aktin Dynamiken beteiligt 89 Die MEGAP SH3 Dom ne vermittelt die Bindung von MEGAP an Lamellipodin 91 Die MEGAP abh ngige Assoziation von Lamellipodin an Fokale Adh sionen inhibiert die Zellmotilitat 92 Verknupfungen zwischen der Signaltransduktion von MEGAP und Lamellipodin 94 Bedeutung der Interaktion zwischen MEGAP und Lamellipodin auf neuronaler Ebene 96 Die Rolle von MEGAP w hrend der Entwicklung des ZNS 97 Ausblick 99
60. AP SH3 Dom ne mit einem Zellextrakt aus HEK293 Zellen inkubiert Abbildung 22A wobei GST allein und ein Ansatz ohne Zelllysat als Negativkontrollen mitgef hrt wurden Nach dem Pulldown und einer Auftrennung der Pr zipitate mittels SDS PAGE wurden diejenigen Proteinbanden ausgeschnitten welche nur im Ansatz mit der MEGAP SH3 Dom ne detektiert werden konnten Im Anschluss daran wurden die isolierten Proteine einem Trypsinverdau unterzogen und die generierten Peptide mittels Massenspektrometrie analysiert Hierbei konnten Lamellipodin und Diaphanous homolog 1 als interessante Kandidaten identifiziert werden Beide Proteine sind wie MEGAP an der Regulation des Aktinzytoskeletts beteiligt Die Zelllinte HEK293 wurde aus humanen fotalen Nierenzellen etabliert in denen MEGAP endogen nur gering exprimiert wird Daher wurde ein zweites GST Pulldown Experiment mit dem Lysat von adultem Mausgehirn durchgef hrt Abbildung 22B Mit diesem Ansatz sollten MEGAP Interaktionspartner identifiziert werden welche in Gehirn spezifische S gnaltransduktionswege eingebunden sind Interessanterweise wurde Lamellipodin erneut zusammen mit der MEGAP SH3 Dom ne prazipitiert Zus tzlich konnten durch den GST Pulldown mit adultem Mausgehirn Komponenten des WAVE I Komplexes prdazipitiert werden 3 4 und 5 in Abbildung 22B dessen Interaktion mit MEGAP bereits bekannt war Soderling et al 2002 Der putative Interaktionspartner Diaphanous 1 konnte hier nicht erfa
61. C Fragment in den pDEST22 Vektor kloniert Anschlie end wurden die generierten Expressionskonstrukte in den Hefestamm MaV203 transformiert Transformations kombinationen siehe Tabelle 11 und die vorhandene B Galactos daseaktivit t quantifiziert Abbildung 21 Zur Verifizierung der Daten wurden fur jeden doppelt transformierten Hefeklon drei voneinander unabhangige Werte ermittelt Die Mittelwerte sind in Tabelle 11 aufgef hrt wobei das Expressionskonstrukt pDEST32 CAT53 eine sehr starke Autoaktivierung zeigte Aufgrund der gro en Diskrepanz zwischen den Werten aus dem ersten B Gal Fl ssigassay und dem Library Swap wurde CATS3 als falsch positiver Klon eingeordnet Auch bei Periphilin konnte eine leichte Autoaktivierung des Gal Reporters festgestellt werden welche allerdings durch die Co Transformation mit den Expressionskonstrukten f r MEGAP C deutlich gesteigert wurde 64 Ergebnisse Als Endresultat des Yeast Two Hybrid Screens konnte somit genau ein Protein Periphilin als putativer Interaktionspartner fur MEGAP selektiert werden Dies sollte anschlie end mittels GST Pulldown bestatigt werden P Gal units Fl ssigassay Konstruktkombination pEXP AD22 _Periphilin pDEST32 leer pEXP AD22 _Periphilin pPDEST32_MEGAP C pDEST32_Periphilin pDEST22 leer pDEST32_Periphilin pPDEST22_MEGAP C pEXP AD22_CAT53 pDEST32 leer pEXP AD22_CAT53 pDEST32_MEGAP C pDEST32_CAT53 pDEST22 leer pDEST32_CAT53 pDEST22_MEGAP C
62. D und die in der Bibliothek enthaltenen Proteinfragmente exprimierten prey Fur die Isolation physiologisch relevanter Interaktionspartner mm Rahmen des Yeast Two Hybrid Screens wurde eine humane Totale Gehirn cDNA Bibliothek verwendet Der Ablauf eines Yeast Two Hybrid Screens setzt sich aus mehreren Schritten zusammen Abbildung 19 Nach der Co Transformation des bar pDEST32 MEGAP C und der cDNA Bibliothek m ssen die generierten Hefeklone auf Selektionsmedium wachsen Nur 58 Ergebnisse so konnte die Aktivierung von Reportergenen detektiert und die entsprechend positiven Klone selektiert werden In dieser Arbeit wurde Histidin als prim rer Selektionsmarker verwendet und die Hefeklone auf einem Selektionsmedium ohne Histidin inkubiert Aufgrund einer restlichen Histidinsynthese im Hefestamm MaV203 wurde der Inhibitor 3 AT zu dem Selektionsmedium in entsprechend angepasster Konzentration zugef gt Im Anschluss an die erste Selektion ber das Wachstum auf His Platten erfolgte die qualitative Bestimmung der Reporteraktivit ten des URA3 und des lacZ Gens Bei den Klonen welche in diesem Prozess als positiv bewertet wurden fand anschlie end eine quantitative Analyse der lacZ Reporteraktivitat statt Nach der Identifizierung der putativen Interaktionspartner wurden Kontrollexperimente durchgef hrt um die isolierten Kandidaten zu verifizieren I Co Transformation von MEGAP C bait und lll Quantifizierung der Reporte
63. EGAP wichtige Funktionen einnimmt ist die Slit Robo vermittelte repulsive Wegfindung von Axonen bzw Wachstumskegeln ber die Bindung des Slit Liganden an den Robo Rezeptor wird MEGAP mit hoher Wahrscheinlichkeit aktiviert und unterbindet anschlie end die Polymerisation von verzweigtem Aktin 97 Diskussion Sowohl in dieser Arbeit als auch im Rahmen eines Expressionsvergleichs der Gene srGAPI srGAP2 und srGAP3 Megap Bacon et al 2009 wurde eine starke Pr senz des Megap Transkripts in weiten Bereichen des sich entwickelnden ZNS in der Maus aufgezeigt Hierbei konnte beobachtet werden dass die Expression von Megap bereits sehr fr h 1m Verlauf der Embryogenese initiiert wird und insbesondere in stammzellreichen Regionen mit hohem Migrationspotential stattfindet Des Weiteren wurde die Megap mRNA in den Hinterwurzelganglien sowie in den trigeminalen und inferialen Ganglien im Kopfbereich detektiert Somit st anzunehmen dass MEGAP sowohl an der Migration neuronaler Zellk rper als auch an der Wegfindung von Axonen beteiligt ist Interessanterweise grenzt sich die Expression von Megap bzw srGAP3 sowohl r umlich als auch zeitlich deutlich von den Expressionsmustern der anderen srGAP Transkripte ab Bacon et al 2009 Dies l sst vermuten dass die einzelnen srGAPs verschiedene Funktionen im Verlauf der Entwicklung des ZNS einnehmen Im Rahmen der Expressionsstudien n dieser Arbeit wurde auch die Co Expression von Megap und den Tran
64. EGFP N Sequencing EGFP C Sequencing Periphilinl 627 for Periphilinl 827 rev Periphilinl 1031varl 4 for Periphilinl 1372varl_rev Periphilinl 1200var2 4 rev CAT53 1706 for CATS3_ 1884 rev hFAK 2176 rev GAPDH for GAPDH rev Tabelle 6 sonstige Primer Sequenz 5 3 ATATTTAARATCGATATGGTGAGCAAGGGCGAGGA ATAGTCCACCTIGIACAGCTCGICCATGC SC TCGCCG IC CAGCTCEACCAG CATEGTCCTGCICGGAGTITICGIG TCCTCGTGCCTCCTACAAAC TAGCT T TT CAGCAGCCCACT GIGAAACTTTCGGGATGGTG TCCTCTICAGCCTCCIGAGTIE TGCTIGAGTTCTICAACACACE CTAACCAACTGACCCGGAAA CTCAAATGCATGICGGICTG AGGACAATTIGGAGGCATIG ACCACAGTCCATGCCATCAC TCCACCACCE DE rIGe Ter 23 Material und Methoden 2 5 DNA Sequenzierung Im Anschluss an PCR Reaktionen Saiki et al 1985 wurden die Sequenzen der generierten Produkte ber Bedarf mittels DNA Sequenzierung berpr ft Die in der vorliegenden Arbeit durchgef hrten Sequenzierungen basieren auf dem Prinzip der Kettenabbruch Reaktion durch Didesoxynukleotid Zugabe Sanger et al 1977 Kits und Reagenzien zur DNA Sequenzierung DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Premix mit fluoreszenzmarkierten Didesoxy Kit Amersham Biosciences nukleotiden fur die Sequenzierreaktion CIAP Calf Intestine Alkaline Phosphatase 1 U ul MBI Fermentas Exol Exonuklease I MBI Fermentas 20 U ul Sephadex G50 fine GE Healthcare GFX TempliPhi GE Healthcare 2 5 1 Sequenzierung von PCR Produkten Aufreinigung von PCR Produkten mittels Exo CIAP
65. F Aktin Bundeln stabilisiert 3 Anzahl und Gr e der F Aktin B ndel nimmt zu welche durch Aktin bindende Proteine und Adh sionskontakte mit der extrazellul ren Umgebung stabilisiert werden In der Aktin reichen Seite werden MT weiter stabilisiert und verlangert 4 Aktinfasern werden teilweise degradiert oder durch Capping Proteine stabilisiert MT werden durch MT bindende Proteine stabilisiert und zu einem verl ngerten neu orientierten Axonschaft geb ndelt Modifiziert nach Dent and Gertler 2003 14 Einleitung 1 1 4 Mentale Retardierung als Folge neuronaler Migrationsdefekte Mentale Retardierung oder auch Geistige Behinderung tritt mit einer Pr valenz von 2 3 n der westlichen Bev lkerung auf Dieses vielschichtige Krankheitsbild beschreibt im Allgemeinen eine Verz gerung der geistigen Entwicklung welche s ch n einem R ckstand von kognitiven sprachlichen und sozialen F higkeiten u ert Auch wenn bei ber der H lfte der registrierten F lle die Krankheitsursachen bisher unbekannt sind konnten neuronale Migrationsdefekte als Basis fur die Entstehung bestimmter Syndrome identifiziert werden So wurden zum Beispiel im Rahmen genetischer Analysen mental retardierter Patienten mit Gehirnfehlbildungen Mutationen in den Genen LISI und Doublecortin DCX als Ursache f r kortikale Migrationsdefekte analysiert Reiner et al 1993 Gleeson et al 1998 Patienten mit einer als klassische Lissenzephalie bezeichneten Krankh
66. GCAGTCGACATGGAGCAGCTATCAGATGAA hLPD 468 rev AGGCATCCAGATCCACAGTC hLpd 800for EcoRI ATCGAATTCAGGCACAGTGAGTGATGCTG hLpd 1335for EcoRI GCAGAATTCCGAAACAGCTGAGATGGCAGA hLpd 1857rev Sall GTTGTCGACTCACTCTGGGATGCTGGAAGAA hLpd_939for BamHl AGAGGATCCAGGGCAGCCAATTACTGAGG hLpd_946for BamHl GGTGGATCCCCAATTACTGAGGAAGAACA hLpd_1904rev_Sall ACAGTCGACTCAGTCAGAAACTCCGCTATCAG hLpd_1885for_BamHl AGAGGATCCTCTGATAGCGGAGTTTCTGAC hLpd_2607rev_Sall ATAGTCGACTCACACAGTCTTGGTGCTGGTTG hLpd_2587for BamH1 ATAGGATCCCCAACCAGCACCAAGACTGT 22 hLpd 3534rev_Sall hLpd_3515for_BamHl hLpd 4069rev_Sall pBSIULpd_ 60for_SaclI hLpd_3975rev_Nhel ml pd Ex1_267_for ml od Ex2 381 rev mLpd_Ex11_ 1731 for mLpd_Ex12_ 1830 rev ml od 827 rev Material und Methoden ATAGTCGACTCAGACTGCCACTTTIGGAGAGG ATAGGATCCACCTCTCCAAAAGTGGCAGTC ATAGTCGACAGGAGGCTCTGAACACCTGA ATACCGCGGCGCGCGTAATACGACTCAC ATAGCTAGCCCAGTCTCTGGAGAGCTTGG GGACCTGGATAAAATGITIGGG IGTTTCCTGGCGAAGAGGAG GAACAAATACAAAGCACCCACAG TGCATCATCACAGCAAAGGT CGGGAGGAGTTACTGATGGA mLpd_1092_for GCTEGATAACCTGATGGACAA Tabelle 3 Lpd spezifische Primer Bezeichnung mDial 1035 for mDial_ 1505 rev Sequenz 5 3 TCCAGCTGAGGAACTGGACT TIGGCCTCAGATTTTICCAC Tabelle 4 mDial spezifische Primer Bezeichnung mRobo1l 4071for mRobo1l 4555rev Sequenz 5 3 ECCCCACCTOCATACTIACGE GATCATCTGCETACECT LCC Tabelle 5 Robol spezifische Primer Bezeichnung mCherry_ for Dral Clal mCherry_rev_Sall
67. GPVMOR Y Oxidation M SVLOPSOOK L AKPSYLIDK N EKPGVESMR K Oxidation M DEIIWLLR H ISOETDKTTTR N EYLTSHLEIR F MMEEFVPHSK S 2 Oxidation MMNTIIFHTK M 2 Oxidation EFLALASSSLLK I NNNOOLAOLOK E SLSELLGPYGMK F Oxidation SENISPEEEYK I ALFVFMALSFAR D Oxidation LALOSSSCLSLFR D AINQIAAALFTIHK G AINQIAAALFTIHK G LKEFLALASSSLLK I LVVENVDVLTOMR T Oxidation M LGOMIVDYENPLK K Oxidation M TSFDKPDOMAALFK R Oxidation M TSFDKPDOMAALFK R Oxidation M MFOOCLELPSOSR Y ELATVLSDOPGLLGPK A MFOOCLELPSOSR Y Oxidation M KLVVENVDVLTOMR T Oxidation M LGOMIVDYENPLKK M Oxidation M SLSDALISLOMVYPR R Oxidation M AIIGLYNYAHEMTHGASDR E Oxidation M M M M M Rank Peptide 1 R ASEDWWEGR H 122 70 702 82 1403 63 1403 64 0 Anhang 01 0 109 2 3e 09 Proteins matching the same set of peptides gil21311769 WARP 91127597098 brain stress early protein Gbi Mus musculus Mass 125311 Score Mass 111502 Score isoform Search Parameters Type of search Enzyme Fixed modifications Variable modifications Mass values Protein Mass Peptide Mass Tolerance Fragment Mass Tolerance Max Missed Cleavages Instrument type Number of queries Trypsin Carbamidomethyl C Oxidation M Monoisotopic Unrestricted 200 ppm 0 1 Da 1 ESI QUAD TOF 117 MS MS Ion Search 149 149 Mus musculus
68. GTP h min sec His kb l LB Lpd M Mb MEGAP mg ml mM mRNA ug ul MT NCBI ng Deng OT DC PAGE PBS PCR pH PIP3 RNA rpm RT RT PCR SDS Ta TBS TE Tris UN UV WAVE I w v Aminos ure Mercaptoethanol Basenpaare Bovines Serum Albumin Caenorhabditis elegans Fadenwurm 4 6 Diamidino 2 phenylindol Desoxyribonukleinsaure Dithiotreitol Ethylendiaminotetraessigsaure Escherichia coli und andere Grad Celsius Erdbeschleunigung GTPase activating protein Guanine exchange factor Guanosindiphosphat Guanosintriphosphat Stunden Minuten Sekunden Histidin Kilobasen Liter Luria Broth Medium Lamellipodin Molar Megabasen Mental disorder associated GAP protein Milligramm Milliliter Millimolar messenger Ribonukleinsaure Boten RNA Mikrogramm Mikroliter Mikrotubuli National Center for Biotechnology Information Nanogramm Optische Dichte bei 600 nm Objekttr ger post coitum verwendet bei der Datierung von Embryonalstadien Polyacrylamid Gelelektrophorese phosphate buffered saline Phosphat gepufferte Salzlosung polymerase chain reaction Polymerase Kettenreaktion Potential hydrogenii negativer Logarithmus der Protonenkonzentration Phosphatidylinositoltrisphosphat Ribonukleins ure revolutions per minute Umdrehungen pro Minute Raumtemperatur Reverse Transkription PCR Sodiumdodecylsulfat Annealing Temperatur Anlagerungstemperatur der Primer Tris buffered salin
69. Gehirns im Neuralrohr im neuronalen Gewebe des optischen Systems sowie in diversen Ganglien detektiert werden F r die Suche nach MEGAP Interaktionspartnern wurden ein Yeast Two Hybrid Screen sowie GST Pulldown Experimente durchgefthrt Im Rahmen des Yeast Two Hybrid Screens mit einem C terminalen MEGAP Fragment und einer humanen fotalen Gehirn cDNA Bibliothek wurde das nukleare Protein Periphilin als putativer Interaktionspartner isoliert Die Bindung von MEGAP an Periphilin ber die MEGAP SH3 Dom ne konnte jedoch nicht best tigt werden GST Pulldown Experimente mit Proteinextrakten aus HEK293 Zellen sowie adultem Mausgehirn wiesen auf eine Interaktion zwischen der MEGAP SH3 Dom ne und dem Formin mDial sowie dem Ena V ASP bindenden Protein Lamellipodin Lpd hin In dieser Arbeit wurde die Assoziation zwischen MEGAP und Lpd nachgewiesen Anhand von Co IP Studien konnte die Interaktion zwischen MEGAP und Lpd sowohl in vitro als auch f r die endogen exprimierten Proteine in vivo verifiziert werden Hierbei stellt die Funktionalit t der MEGAP SH3 Dom ne einen essentiellen Faktor f r die Bindung von MEGAP an Lpd dar Expressionsstudien zeigten weiterhin eine Co Expression der Megap und Lpd mRNA w hrend der murinen Embryonalentwicklung u a in Bereichen des Hinterhirns sowie in den trigeminalen Ganglien auf In NIH 3T3 Mausfibroblasten co lokalisierten MEGAP und Lpd verst rkt an Fokalen Adh sionen sowie an der Zellmembran Nur unter Co Expre
70. INAUGURAL DISSER TA TION Zur Erlangung der Doktorw rde der Naturwissenschaftlich Mathematischen Gesamtfakult t der Ruprecht Karls Universit t Heidelberg vorgelegt von Diplom Biochemikerin Lydia Hau mann aus Berlin Tag der m ndlichen Pr fung 24 M rz 2009 Identifizierung und Charakterisierung von MEGAP Interaktionspartnern Gutachter Professor Dr Herbert Steinbei er Professor Dr Gudrun Rappold II Im Rahmen dieser Dissertation wurden folgende Publikationen angefertigt Endris V Haussmann L Rappold G 2009 Abl dependent phosphorylation of MEGAP srGAP3 affects its binding to WAVE 1 submitted Haussmann L Endris V Bacon C Pinheiro E Gertler F Rappold G 2009 MEGAP inhibits actin dynamics and affects the localization of the Ena VASP binding protein Lamellipodin in preparation Il Meinem Mann Guido Das Sch nste was wir erleben k nnen ist das Geheimnisvolle Es ist das Grundgef hl das an der Wiege von wahrer Kunst und Wissenschaft steht Wer es nicht kennt und sich nicht wundern nicht mehr staunen kann der ist sozusagen tot und sein Auge erloschen Albert Einstein Einstein sagt IV Danksagungen Frau Prof Dr Gudrun Rappold danke ich fiir die Uberlassung des Themas die Ubernahme des Gutachtens die gute Betreuung wahrend der gesamten Arbeit sowie die konstruktive Kritik beim Schreiben der Dissertation Herrn Prof Dr Herbert Steinbei er danke ich
71. J G Allen K M Fox J W Lamperti E D Berkovic S Scheffer I Cooper E C Dobyns W B Minnerath S R Ross M E and Walsh C A 1998 Doublecortin a brain specific gene mutated in human X linked lissencephaly and double cortex syndrome encodes a putative signaling protein Cell 92 63 72 Grigoriev A 2003 On the number of protein protein interactions n the yeast proteome Nucleic Acids Res 37 4157 4161 Gupta A Tsai L H and Wynshaw Boris A 2002 Life is a journey a genetic look at neocortical development Nat Rev Genet 3 342 355 127 Referenzen Hartley J L Temple G F and Brasch M A 2000 DNA cloning using in vitro site specific recombination Genome Res 0 1788 1795 Haussmann L Endris V Bacon C Pinheiro E Gertler F B and Rappold G 2009 MEGAP inhibits actin dynamics and affects the localization of the Ena V ASP binding protein Lamellipodin n preparation Hedberg K M Bengtsson T Safieyko Mroczka B Bell P B and Lindroth M 1993 PDGF and neomycin induce similar changes in the actin cytoskeleton in human fibroblasts Cell Motil Cytoskeleton 24 139 149 Hengen P N 1997 False positives from the yeast two hybrid system Trends Biochem Sci 22 33 34 Higashi T Ikeda T Shirakawa R Kondo H Kawato M Horiguchi M Okuda T Okawa K Fukai S Nureki O Kita T and Horiuchi H 2008 Biochemical characterization of the Rho GTPa
72. Lpd transfizierten NIH 3T3 Zellen A Ermittlung der Wachstumsgeschwindigkeit von Lamellipodien um min mit Hilfe von Kymograph Bildern wobei das Auswachsen eines Lamellipodiums dx in Korrelation zur nderung der Zeit dt gestellt wird Die Steigung dx dt gibt dann die jeweilige Geschwindigkeit an B Die Umf nge der einzelnen Lamellipodien einer stimulierten Zelle wurden jeweils zum Zeitpunkt der maximalen Gr e vermessen und addiert Abschlie end wurde das Verh ltnis aus der Summe der Lamellipodienumf nge und dem Zellumfang der unstimulierten Zelle serum starved berechnet Die Ma stabsbalken n A und B entsprechen 10 um bzw 2 um Kymograph 53 Material und Methoden 2 16 TIRF Mikroskopie In dieser Arbeit wurde neben der klassischen Epifluoreszenzmikroskopie Abschnitt 2 14 die Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Mikroskopie eingesetzt um gezielt Strukturen an der Adhasionsflache zwischen Zelle und Objekttr ger zu analysieren F r die TIRF Experimente wurden die Zellen analog zum in Abschnitt 2 14 beschriebenen Protokoll vorbereitet Sowohl das Live Cell Imaging als auch die Aufnahme von fixierten Zellen erfolgte in Lab Tek II 4 Well Deckglaskammern wobei fixierte Zellen nach der F rbung mit Wasser berschichtet wurden Die physikalische Grundlage der TIRF Mikroskopie beruht auf der Erzeugung einer evaneszenten Welle welche bei der Totalreflexion eines Lichtstrahls an der Grenzfl che zweier Me
73. MEGAP EYFP transfiziert Nach der Stimulierung mit PDGF l ste sich MEGAP von der Zellmembran und hemmte durch die GAP Aktivit t zus tzlich die Ausbildung von Lamellipodien 75 Ergebnisse Abbildung 30 Zeitrafferaufnahme einer mit EYFP Lpd transfizierten NIH 3T3 Zelle unter Serum Reduktion und PDGF Stimulierung bei Zeitpunkt 0 min Nach der Behandlung mit PDGF erfolgte eine stark ausgepr gte Bildung von Lamellipodien an deren Migrationsfront Lamellipodin angereichert wurde Die Membranlokalisation von Lpd war haupts chlich w hrend des Auswachsens der Lamellipodien zu beobachten Filmausschnitte bei 1 2 und 3 min 76 Ergebnisse MEGAP wt Lpd A serum starved B PDGF 640 Abbildung 31 Gegen berstellung der Umlagerung von MEGAP und Lpd nach Stimulierung durch PDGF Filmaufnahmen Epifluoreszenz von NIH 3T3 Zellen ausgesat auf Fibronektin und stimuliert mit PDGF NIH 3T3 Zellen wurden mit Expressionskonstrukten f r EYFP markiertes MEGAP bzw Lpd transfiziert A Unter Serum reduzierten Bedingungen Zeitpunkt 0 min konnte MEGAP explizit an der Zellmembran detektiert werden Lpd wies nur eine diffuse zytoplasmatische Lokalisation auf wei e Pfeile B Die Stimulierung durch PDGF initiierte sowohl bei MEGAP als auch bei Lpd eine Umlagerung innerhalb der Zelle MEGAP l ste sich fast komplett von der Zellmembran und hemmte gleichzeitig das Auswachsen von Lamellipodien Im Gegensatz dazu reagierten die mit EYFP Lpd tra
74. Mit Hilfe der RNA in situ Hybridisierung wurde somit gezeigt dass Megap und Lpd w hrend der Embryogenese n der Maus n bestimmten Bereichen und zu bestimmten Zeitpunkten co exprimiert werden AA MEGAP co lokalisiert mit Lamellipodin in NIH 3T3 Zellen Im Anschluss an die Analyse der mRNA Expression wurde untersucht ob MEGAP und Lpd an ahnlichen zellularen Strukturen detektiert werden konnen Zu diesem Zweck wurden MEGAP EYFP und mCherry Lpd Fusionsproteine in NIH 3T3 Zellen co exprimiert Mit Hilfe von Epifluoreszenzaufnahmen konnte eine berlappende Proteinlokalisation von MEGAP und Lpd aufgezeigt werden Abgesehen von der Detektion im Zytoplasma wurde eine spezifische Co Lokalisation beider Proteine an der Zellmembran beobachtet Abbildung 26 Aufgrund der Tatsache dass MEGAP exprimierende Zellen eine verringerte Adh s on an die Oberfl che der Zellkulturschalen aufwiesen wurden die NIH 3T3 Zellen jeweils auf Fibronektin beschichtete Deckgl ser ausges t Insbesondere bei dem Wachstum auf einer Fibronektin beschichteten Oberfl che in Kombination mit Serum Reduktion zeigte MEGAFP eine starke Lokalisierung an die Zellmembran Dies k nnte darauf hinweisen dass MEGAP eventuell ber Integrin vermittelte Signalwege an die Membran rekrutiert wird Analog zu den Effekten von MEGAP n SHSY 5Y Neuroblastoma Zellen Yang et al 2006 zeigten MEGAP exprimierende NIH 3T3 Zellen unter Serum Reduktion und anschlie ender Stimulierung durc
75. Nachweis f r die 8 Galactosidaseaktivitat wird mit dem chromogenen Substrat ONPG O nitrophenyl 8 D galactopyranosid durchgef hrt welches in w ssrigen L sungen farblos ist ONPG wird durch Galactosidase zu Galactose und o Nitrophenol hydrolysiert Das Absorptionsmaximum von o Nitrophenol liegt be alkalischem pH bei 420 nm Wenn ONPG im berschuss in der Reaktion vorliegt ist die Menge des gebildeten o Nitrophenols proportional zur Menge der Galactosidase in der Probe und erlaubt so eine Quantifizierung der Interaktionsst rke der beiden Proteine Hierbei wurde nach folgendem Protokoll vorgegangen eine Einzelkolonie in 10 ml Selektivmedium animpfen und U N bei 160 rpm und 30 C inkubieren um eine OD 09 0 4 0 8 zu erhalten 5 min bei 2200 rpm abzentrifugieren und den Uberstand verwerfen Pellet in 1 5 ml Z Puffer resuspendieren und in ein 1 5 ml Reaktionsgef transferieren 2 min bei 13000 rpm abzentrifugieren und den Uberstand verwerfen L sen des Pellets in 200 ul Z Puffer 10 ul der Zellsuspension entnehmen und in 990 ul H2O bidest 1 100 verd nnen Messen der ODgoo Leerwertbestimmung mit H20 bidest Rest der Probe in fl ss gem Stickstoff schockgefrieren zum Aufbrechen der Zellen falls zu diesem Zeitpunkt unterbrochen werden soll Aufbewahrung der Zellen auf 80 C fur B Galactosidase Fl ssigassay Zellen bei RT auftauen lassen 700 ul Z Puffer mit B ME zugeben zum Starten der Reaktion Zugabe von 160
76. P W Danuser G and Theriot J A 2007 Actin myosin network reorganization breaks symmetry at the cell rear to spontaneously initiate polarized cell motility J Cell Biol 778 1207 1221 Yang Y Marcello M Endris V Saffrich R Fischer R Trendelenburg M F Sprengel R and Rappold G 2006 MEGAP impedes cell migration via regulating actin and microtubule dynamics and focal complex formation Exp Cell Res 3 2 2379 2393 Yu J Moon A and Kim H R 2001 Both platelet derived growth factor receptor PDGFR alpha and PDGFR beta promote murine fibroblast cell migration Biochem Biophys Res Commun 282 697 700 Yu J C Gutkind J S Mahadevan D Li W Meyers K A Pierce J H and Heidaran M A 1994 Biological function of PDGF induced PI 3 kinase activity its role in alpha PDGF receptor mediated mitogenic signaling J Cell Biol 127 479 487 133
77. Queries matched Queries matched 1 K ADSEASSGPLLDDK A 5 WAVE 1 WASP family 1 Wiskott Aldrich syndrome protein family member 1 Mascot Search Results User Email Search title MS data file Database Taxonomy Timestamp Significant hits gi 758299 gi 116877274 gi 16797665 gi 14861844 gi 40068493 Uwe Warnken U Warnken dkfz de Probability Based Mowse Score 100484 sequences Ions score is 10 Log P where P is the probability that the observed match is a random event Individual ions scores gt 35 indicate identity or extensive homology p lt 0 05 Protein scores are derived from ions scores as anon probabilistic basis for ranking protein hits Humber of Hits 190 zt aur Probability Based Mowse Score Archive Report of Selected Matches 1 gil758299 Mass 59890 CW17R Mus musculus Query Observed Mr expt 36 562 78 1123 54 51 598 25 1194 49 68 686 86 1371 70 81 491 90 1472 68 84 757 84 1513 67 89 781 41 1560 81 94 548 26 1641 76 95 824 96 1647 91 96 832 96 1663 90 124 735 36 2937 41 Score Mr calc 1123 90 1371 1472 1513 1560 1641 1647 1663 2937 1194 Proteins matching the same set of peptides gi 2143272 Mass 70819 55 73 70 70 85 80 94 93 51 Score 272 Queries matched Delta Miss Score 0 01 0 33 0 01 0 24 0 02 0 11 0 02 0 20 0 03 0 59 0 0 04 0 66 4 0 03 1 19 0 03 0 26 0 03 0 41 0 10
78. T H Parry S E Pathak S D Pearson O C Puchalski R B Riley Z L Rockett H R Rowland S A Royall J J Ruiz M J Sarno N R Schaffnit K Shapovalova N V Sivisay T Slaughterbeck C R Smith S C Smith K A Smith B I Sodt A J Stewart N N Stumpf K R Sunkin S M Sutram M Tam A Teemer C D Thaller C Thompson C L Varnam L R Visel A Whitlock R M Wohnoutka P E Wolkey C K Wong V Y Wood M Yaylaoglu M B Young R C Youngstrom B L Yuan X F Zhang B Zwingman T A and Jones A R 2007 Genome wide atlas of gene expression in the adult mouse brain Nature 445 168 176 129 Referenzen Li S S 2005 Specificity and versatility of SH3 and other proline recognition domains structural basis and implications for cellular signal transduction Biochem J 390 641 653 Locascio A and Nieto M A 2001 Cell movements during vertebrate development integrated tissue behaviour versus individual cell migration Curr Opin Genet Dev 71 464 469 Lock J G Wehrle Haller B and Stromblad S 2008 Cell matrix adhesion complexes master control machinery of cell migration Semin Cancer Biol 78 65 76 Long H Sabatier C Ma L Plump A Yuan W Ornitz D M Tamada A Murakami F Goodman C S and Tessier Lavigne M 2004 Conserved roles for Slit and Robo proteins in midline commissural axon guidance Neuron 42 213 223 Machesky L M Mullins
79. Y Hara T Ikeda W Hirata K and Takai Y 2008 Sequential activation of Rapl and Racl small G proteins by PDGF locally at leading edges of NIH3T3 cells Genes Cells 73 549 569 Tamamaki N Nakamura K Okamoto K and Kaneko T 2001 Radial glia is a progenitor of neocortical neurons in the developing cerebral cortex Neurosci Res 47 51 60 Trichet L Sykes C and Plastino J 2008 Relaxing the actin cytoskeleton for adhesion and movement with Ena VASP J Cell Biol 781 19 25 Ulke Lemee A Trinkle Mulcahy L Chaulk S Bernstein N K Morrice N Glover M Lamond A I and Moorhead G B 2007 The nuclear PP1 interacting protein ZAP3 ZAP is a putative nucleoside kinase that complexes with SAM68 CIA NF110 45 and HNRNP G Biochim Biophys Acta 1774 1339 1350 Van Criekinge W and Beyaert R 1999 Yeast Two Hybrid State of the Art Biol Proced Online 2 1 38 Vidal M Brachmann R K Fattaey A Harlow E and Boeke J D 1996 Reverse two hybrid and one hybrid systems to detect dissociation of protein protein and DNA protein interactions Proc Natl Acad Sci U S A 93 10315 10320 Volkmann N Amann K J Stoilova McPhie S Egile C Winter D C Hazelwood L Heuser J E Li R Pollard T D and Hanein D 2001 Structure of Arp2 3 complex in its activated state and n actin filament branch junctions Science 293 2456 2459 Wallar B J and Alberts A S 2003 The form
80. Zelllysaten Basierend auf den Ergebnissen der prim ren GST Pulldown Experimente und des Yeast Two Hybrid Screens wurden Diaphanous homolog 1 mDial Lamellipodin Lpd und Periphilin als Kandidaten fur weitere Analysen ausgewahlt Aufgrund der Beteiligung an der Regulation von Aktin Dynamiken stellten mDial und Lpd besonders interessante Kandidaten dar Die Proteine SF1 Splicing factor 1 und YLP ZAP3 wurden nicht einbezogen da sowohl ihre Lokalisation als auch ihre Funktionen auf den Zellkern konzentriert sind Kramer 1992 Armstrong er al 2004 Ulke Lemee er al 2007 Zun chst sollte die Interaktion zwischen der MEGAP SH3 Dom ne und den putativen 67 Ergebnisse Interaktionspartnern in vitro best tigt werden Zu diesem Zweck wurden Lpd mDial und Periphilin jeweils in einen Myc Tag Expressionsvektor kloniert Myc Robol wurde als Positivkontrolle verwendet Die generierten Expressionskonstrukte wurden in HEK293 Zellen transfiziert Anschlie end wurden mit den Zelllysaten und GST MEGAP SH3 bzw GST allein erneut Pulldown Experimente durchgefuhrt Abbildung 23 Sowohl Myc Lpd als auch Myc mDial und die Positivkontrolle Myc Robol konnten zusammen mit der MEGAP SH3 Dom ne pr zipitiert werden Mit GST allein erfolgte keine Interaktion Im Gegensatz dazu konnte be1 Myc Periphilin keine Interaktion mit der MEGAP SH3 Dom ne nachgewiesen werden nicht gezeigt Daher wurde Periphilin in weiteren Studien nicht ber cksichtigt Anhand
81. aaagttgcca gactgatgat d atcaaatcat gagaacacat LOGCUTCOCOG aggagttcaa aattagcaag Gagqctgtgat aaataaagag SOETLICCLEL aggectatgte attaggagac te het en gene attacagaaa cgaagtcegac tecttggaaaa Chen ge tech wie e Le Anhang EE EE Le E EE OULCCLOLCECa agagaaaata agtecaaaat agttaggaca ggagcaaagc agtaatattt ccaggtaggg tcgtcgtgtea actrattotg Cagaccegac alaggctacc cattggaaat tttattaatg E EE gttaaaacaa Sc gagacada tgtggcatart aagtaatcca CLOACCCACL Le aen aacagacacc ggtctcacaca aatgctgcaa CCACCOJOCCE caagattgaa etgtaatece gactagcctg gtgtggggcc Cacaccactgq aaagcagagt aLtLagerca Le ee erte es LE ee tens aggaactgaa aaglLecactec tgtttaaagg agtdectasce atgctaaata aaagagattg tatgacatta cagtLLOCaC gegtgtccatt cagtcgaggte gaagtgatga agatgaaaag ataccagtgt SEET e e eeneg et etacracaag aataaatatg EE EE EE ttgaaaatte cagtgatgte gaatgtaaat gtgagtagcc Caaattacca tetggatgtg SCaacrgctce acogcgqgqcat gatactgcca Ae get As eng e tel LCCCagqgada taatgggaat gtcitetaaag LN e Rehn ST agceLactcag ggcaacatag ccgagcaaat cgtcecagec aaaactggac agacaclect cgtaatcettt EE ER attgqcaatta CECCdadacr attetgcata ctttttata aagtcagata e EE Ee SCELLEGELSE accaagccag Letgtastge acaalgCecc aagaatgagg adaddacalcc agtaagtgga GELLLLOLTL daacttecaldg gGtdaagcacc cccatgagag gcagagaaat cgetgcagta cetttatata cgtcaggiig EE EE EE EE aaattataa atgagaaatc gcaaaagcaa Cagerocada acalLgttagc QCUCLOCtaag
82. al to local analyses Curr Opin Biotechnol 9 396 403 Kerrien S Alam Faruque Y Aranda B Bancarz I Bridge A Derow C Dimmer E Feuermann M Friedrichsen A Huntley R Kohler C Khadake J Leroy C Liban A Lieftink C Montecchi Palazz L Orchard S Risse J Robbe K Roechert B 128 Referenzen Thorneycroft D Zhang Y Apweiler R and Hermjakob H 2007 IntAct open source resource for molecular interaction data Nucleic Acids Res 35 D561 565 Kramer A 1992 Purification of splicing factor SF1 a heat stable protein that functions in the assembly of a presplicing complex Mol Cell Biol 72 4545 4552 Krause M Dent E W Bear J E Loureiro J J and Gertler F B 2003 Ena VASP proteins regulators of the actin cytoskeleton and cell migration Annu Rev Cell Dev Biol 19 541 564 Krause M Leslie J D Stewart M Lafuente E M Valderrama F Jagannathan R Strasser G A Rubinson D A Liu H Way M Yaffe M B Boussiotis V A and Gertler F B 2004 Lamellipodin an Ena VASP ligand is implicated in the regulation of lamellipodial dynamics Dev Cell 7 571 583 Krebs A Rothkegel M Klar M and Jockusch B M 2001 Characterization of functional domains of mDial a link between the small GTPase Rho and the actin cytoskeleton J Cell Sci 714 3663 3672 Kurokawa K and Matsuda M 2005 Localized RhoA activation as a requirement for the
83. alcaad cctttgaagg Caccaccttce tocoggaget agagtcctgg ggcctgagga taaatgtgaa Gacatgcaclet gggtgtgccc aggagcgata aggagagtec coctagacga ggtcaggtgg ttatgggaag tccaagagat tgaaacaacc Ee EE EE ALctaagcce Caactacttg EA get e Let eeng EE ale sn teagasactte ccgagtcgge agttttgggt SEET EE e L ee agtcaaaagt ggcgagtega ca adatttatt aaccaacaac EQuagaccacl tgaggatgaa CCOCECTE Cag aaaaagtcga EJaggagsce ECacoccdaay gQaagaatgcc acgtcagagc getaectcade GeeLaLggag aattaagaag gQaaaacgagc cgaggcaatg catggataca agalcctaac aggcaaactg taagatcaag tgagacagcg CEggtetctg LaLccagsct ELCaLcoagcce qgagtgttoc Ae eege Ch catgggcgot EE EE agactattceg cggagaaaga ttgaaaggat EILCLLELIE gaaatctgtg ECCCaaacca LEC Ee Leg EE EEEEERE SCEIGELOISGE ggtgecgacg CCcaaagaac gtggatggga TEE EE gacgttggcg EE Ce ctcaagcaga g gctecgga agcagtacec EE EE ccagagaaga CECCOETCca agcacagtgg aacgtagqctg acaacCaccla ggcctgggct aaaaaaaaag acagaaccaa gacgcagacc SCCLELLLOG Caacltgscctce agagaatatt EE eege ten e CODCGECt Ga GUECTGCCCL gagc gggaga Galccegagc atggatgaga ggggcaggag ggaaagggcc atcatgggta gacaagalca Caggccugce cocgagagag CCCLECCCac qccgaaggac cecaaattca EE taaaagactt TOLELLILEE tcgcaaaaaa cttetcaaggg Cetocaagar EGancalect gctacaaact tecageasat acdacacagc SE en ge teg ae e agcotcgorga Ctgagcgacc agagggagaa etggactaga tggtttetcga erecaggaga acvoCccaccaa cttetggatge EE EE gcacageeaa GOtccaggcac agcca
84. ast Nitrogen Base Sigma nach Herstellerangabe Selektivmedium Nach Einstellen des pH auf 5 9 mit NaOH wurde f r 20 min bei 121 C autoklaviert und dann 20g Glucose zugegeben Platten Den entsprechenden Plattenmedien wurde 2 Bacto Agar BD zugesetzt 3 AT Platten Nach dem Autoklavieren und dem Abk hlen auf 65 C wurde 3 AT n der gew nschten Konzentration zu dem SC Medium gegeben Verwendete Selektivmedien Leu Trp Sigma Leu Trp His BD Leu Trp Ura BD Leu Trp His Ura BD Bei den Selektivmedien handelt es sich um Aminos uregemische die mit Ausnahme der genannten alle essentiellen Aminosauren enthalten 2 10 1 Stammhaltung von Hefen Die MaV Stamme wurden auf YPD oder Selektivplatten ausgestrichen und 2 Tage bei 30 C bebr tet bis Kolonien sichtbar waren Diese Platten wurden mit Paraf lm versiegelt und bis zu 8 Wochen bei 4 C aufbewahrt Dauerkulturen wurden zu gleichen Teilen aus frischen 40 Material und Methoden Ubernachtkulturen und 30 steril filtriertem Glycerin angelegt wobei das Tieffrieren zunachst in einer Mischung aus Ethanol und Trockeneis erfolgte bevor die dauerhafte Lagerung bei 80 C begann Ein erneutes Animpfen erfolgte stets auf YPD Platten Alle Kulturen wurden aus einer Einzelkolonie angeimpft 2 10 2 Transformation von Hefen Zur Transformation von Hefen wurde das Grow n Glow High Efficiency Yeast Transformation Kit der Firma MoBiTec Katalog Nr 2200 1 benutzt D
85. at the beginning of this work mRNA expression patterns of Megap and Robol were investigated at different developmental stages of the murine embryonic development These studies have shown the expression of Megap in many regions of the developing nervous system The expression of the Megap transcript is initiated early during embryonic development before E9 5 p c and was detected especially in the stem cell rich areas of the brain in the neural tube in the neuronal tissue of the optic system as well as in various ganglia In order to search for novel MEGAP interaction partners a Yeast Two Hybrid screen and GST Pulldown experiments were carried out During the Yeast Two Hybrid screen with a C terminal MEGAP fragment and a human fetal brain cDNA library the nuclear protein Periphilin was isolated as a putative interaction partner However the binding of MEGAP to Periphilin via the MEGAP SH3 domain could not be confirmed GST Pulldown experiments with protein extracts of HEK293 cells and adult mouse brain indicated an interaction between the MEGAP SH3 domain and the formin mDial as well as the Ena V ASP binding protein Lamellipodin Lpd In this work the associativity between MEGAP and Lpd was proven By means of Co IP studies the interaction between MEGAP and Lpd was verified both in vitro and for the endogenously expressed proteins in vivo Here it was shown that the binding of MEGAP to Lpd depends on an intact MEGAP SH3 domain Furthermore expr
86. atched 0 0024 0 06 matched matched matched PRPRPRPPPR D D D D 2 ITDESGHLAER A HFDOFWSAAK T MAEHWEVAPR H Oxidation M DKEVEFGGPAPR V VGFOYOGIMOR H AIGFVVGOTDWEK I MPLPAPALGHOPPPVPR V Oxidation M Delta Miss Score Expect Rank Peptide 1 R ASEDWWEGR H 1 K ADSEASSGPLLDDK A 2 2 2 Expect Rank Peptide 1 R IDGITIQAR O 1 K ITALDEFATK L Spectrin non eryt 2 2 throid al throid al C Program Files Matrix Science Mascot Daemon data 060803_VE1122_2 pkl NCBInr 080606 3841279 sequences 454192 sequences Mammalia mammals 1323634604 residues lpha chain pha chain Al Al pha pha domains 1 isoform 2 118 Anhang PREDICTED Ras association RalGDS AF 6 and pleckstrin homology domains 1 isoform 2 Mus Timestamp 7 Aug 2006 at 13 14 29 GMT Significant hits gi 82879074 musculus gi 16797665 GAP3 Mus musculus gi 30794348 casein alpha S1 Bos taurus Probability Based Mowse Score Ions score is 10 Log P where P is the probability that the observed match is a random event Individual ions scores gt 41 indicate identity or extensive homology p lt 0 05 Protein scores are derived from ions scores as a non probabilistic basis for ranking protein hits 45 diy SI Number of Hits A Probability Based Mowe Score Fa Archive Report of Selected Matches 1 gi 828
87. atzen an der Migrationsfront protrusion Bildung neuer Adhasionen adhesion und R ckzug des hinteren Teils der migrierenden Zelle retraction Um sich in eine bestimmte Richtung bewegen zu k nnen muss sich die Zelle zun chst polarisieren d h sich in eine Vorderseite mit Migrationsfront und eine r ckw rtige Seite einteilen Die wichtigsten Regulatoren des Polarisierungsprozesses sind die kleine Rho GTPase Cdc42 die Par Proteine und die atypische Protein Kinase aPKC Ridley et al 2003 Zus tzliche Polarisierungssignale werden zum Beispiel durch einen Gradienten an Phosphatidylinositoltrisphosphat PIP3 vermittelt welcher zum hinteren Teil der Zelle hin abnimmt Als Antwort auf extrazellulare Stimuli wird PIP3 durch die Phosphatidylinositol 3 Kinase PI3K synthetisiert und durch die PIP3 Phosphatase PTEN abgebaut Im hinteren Bereich der Zelle ist die erhohte Aktivitat von PTEN mit der Aktivitat des Aktin abhangigen Motorproteins Myosin II korreliert welches die Kontraktion der Ruckzugsfront in Richtung d Einleitung der Zellbewegung gew hrleistet Aktuelle Studien haben gezeigt dass entgegen fr herer Annahmen Signale fur die Zellpolarisierung in der Nahe des Zellkerns und an der zuk nftigen R ckzugsfront initiert werden Yam et al 2007 Die Ausbildung von Zellfortsatzen ist der eigentliche Beginn des Migrationszyklus einer Zelle Die mechanische Triebkraft f r die Bewegung der Migrationsfront
88. brain stress early protein Gbi isoform 1 Mus musculus 5 gi 30794348 casein alpha S1l Query Observed ao 634 37 68 692 88 Mass 24570 Score 52 Queries matched 2 Bos taurus Mr expt Mr calc Delta Miss Score Expect Rank Peptide 1266 73 1266 70 0 03 0 25 2 6 1 R YLGYLEQLLR L 1383 75 1383 72 0 03 0 27 1 3 1 R FFVAPFPEVFGK E Proteins matching the same set of peptides gi 61658244 alpha S1 casein gi 70905149 alpha Sl casein Mass 24368 Score 52 Queries matched 2 Bubalus bubalis Mass 24440 Score 52 Queries matched 2 Bubalus bubalis Search Parameters Type of search Enzyme Fixed modifications Variable modifications Mass values Protein Mass Peptide Mass Tolerance Fragment Mass Tolerance Max Missed Cleavages Instrument type Number of queries MS MS Ion Search Trypsin Carbamidomethyl C Oxidation M Monoisotopic Unrestricted 200 ppm 0 1 Da H I H ESI QUAD TOF 121 3 CYFIP KIAA1168 Cytoplasmic FMRI interacting protein 1 Mascot Search Results User Uwe Warnken Email U Warnken dkfz de Search title MS data file C Program Files Matrix Science Mascot Daemon data 060803_VE1122_3 pkl Database NCBInr 080606 3841279 sequences 1323634604 residues Taxonomy Mammalia mammals 454192 sequences Timestamp 7 Aug 2006 at 13 15 21 GMT Significant hits gi 63 30183 KIAA1168 protein Homo sapiens gi 16 797665 GAP3 Mus musculus gi 16
89. bundene kognitive Funktionen isoliert werden Endris et al 2002 Die Einbindung von MEGAP in die Slit Robo Signaltransduktion Wong et al 2001 deutet insbesondere auf eine Funktion bei der Wegfindung auswachsender Axone hin Dieser Prozess ist eine wichtige Voraussetzung fur die korrekte Vernetzung und Positionierung neuronaler Vorlauferzellen und Neuronen wahrend der Entwicklung des Nervensystems Daher sollte zunachst die Expression von MEGAP wahrend der murinen Embryonalentwicklung und insbesondere des Nervensystems untersucht werden Aus fr heren Studien war bereits bekannt dass Megap in der Maus sehr stark im adulten Hippokampus inklusive des Gyrus Dentatus exprimiert ist Zusatzlich konnte die Expression von Megap u a in der Amygdala im Piriformen Kortex im Bulbus olfaktorius sowie 1m Zerebellum nachgewiesen werden Endris et al 2002 Lein et al 2007 Waltereit et al 2008a Die in dieser Arbeit durchgef hrten RNA in situ Hybridisierungen zeigten auf dass Megap bereits sehr fruh wahrend der murinen Embryonalentwicklung transkribiert wird Im Embryonalstadium E9 5 p c konnte die Expression von Megap haupts chlich im Neuroepithel des Neuralrohrs in der ventrikul ren Zone des Vorderhirns telencephalic vesicle sowie in Bereichen des Hinterhirns detektiert werden Abbildung 17 Auch in sp teren Entwicklungsstadien E11 5 p c und E12 5 p c wurde die Megap mRNA in gro en Teilen des sich entwickelnden Zentralne
90. c g aaggacgt acacaccetgt ggagatggtc LUCLCCaaag cctgaggctg tttgtttaect Chen g e eeh aaatacaasat Caceccoccca tcagccagag agaggaaaat ggcccatatg ggeagatlat SLELLACGHTE tagcacagc a tgggttagtt ECCagcagcc CladaactCca EE EE ee Ctaccclada Cagalectar attgaggaca Ehe enger he ene acaactctgg gactaagaaa cataagtatt aaaactigag agaga aagtcet EE EE EE EE tetaatttta ttgattaaaa dtaaaatttt ttgtaaagct ctacctggga agccgtaggot tecgagagaa tattgtgcca tLacagre t aagtggtcca tgcaagcagg CtOtCCOCaAT atcacct E aagotactot EILTEILECCE ga aggcctgre ELCLECacca tgcaagcaag EE EE E QUCaaacaca agcaatagca cgggatggtg TIcattgagg SCetgtgagg tcgegcagtcea ggttcgtcgg gctgaagaag LCCagaaaat aaagccagaa actegte dt aggttggtag cttcaggaga agggcgaaca Eatgcccecc ctcacaaatt SIELCEITCE OCCOCECECa LOULCaggac tttggaatat CULCTaECT Ca EOCLCOLOGUCa LE e E he EES aagaatctaa Caqgcogcace EQULEGQ UCaAL ECUCECaCEL gtacataaaa aatgqgqrgqce SEKR tlaltacttat LILLOLLeCe STEEL TEE EA Let eegen aaactaccaa cactaacaga aatlacagcc gttagtgtta ggatggatga agactrcqtcr CacCloLeccTcg ttttgtgaat Laacggqcggc tacagaagag egagcacete aagaaaccac e De e E eege ee E eg er E ege tatgegagag ggecgaaagg ccagaaagga EE CagLeCCCga aaggtgttag tgggetgetg gaggcgggat acacatggga CCadaaacca gtgaaaatgc Cagaartttac aacactgaad GCCecocage acgacacagc acaactcagg ETOELCEeLlg gageggacgg acgaa LG EE Ee cactgctaga gagactatga gagatgaatc acagggacat agcggtct
91. c Delta Miss Score Expect Rank Peptide 32 547 27 1092 53 1092 55 0 01 0 10 22 1 K YLVLDEADR M 38 564 82 1127 62 1127 64 0 03 0 45 0 0057 1 K DLLDLLVEAK O 63 646 35 1290 69 1290 72 0 03 0 31 0 13 1 R SFLLDLLNATGK D Proteins matching the same set of peptides 91118204785 DEAD Mass 73838 Score 87 Queries matched 3 Asp Glu Ala Asp box polypeptide 3 Y linked Mus musculus gi 74181660 Mass gi 94407081 Mass PREDICTED similar to 91 1835122 Mass dead box RNA helicase 6 gi 40068493 Query Observed ae 556 31 26 613 85 ve 708 85 Mass 73795 Score 87 Queries matched 3 unnamed protein product Mus musculus 64423 Score 87 Queries matched 3 DEAD Asp Glu Ala Asp box polypeptide 3 Y linked Mus musculus 73455 Score 86 Queries matched 3 Mus musculus 73166 Score 45 Queries matched 3 DEAD box polypeptide 17 isoform 1 Mus musculus Mr expt Mr calc Delta Miss Score Expect Rank Peptide 1110 60 1110 61 sc DS 0 9 21 1 K IVDOIRPDR O 1225 68 1225 70 0 02 0 7 38 1 K APILIATDVASR G 1415 68 1415 71 0 03 0 29 0 2 1 K GTAYTFFTPGNLK O Proteins matching the same set of peptides gi 63146347 DEAD Mass 72981 Score 45 Queries matched 3 Asp Glu Ala Asp box polypeptide 17 Mus musculus Search Parameters Type of search Enzyme Fixed modifications Variable modifications Mass values Protein Mass Peptide Ma
92. cc attetcecaca OCadatCceca acaaacggca aaacatcaag acaaacccag aaaagctaga dcacagcaca tagaattatt aagagattga tgattgaaaa atgaaataga togatcac da CCELGEATTE EE EE aggctgagag CTatgcrcrc aacaagcagifctgctatg Caacaadacc gagaagctat gaataaagct gtaggtagca ggaadattcatctg Hehe ge te tens tatcaggact tgcaaaatac agactccogca gctaggasta agaaacaaga Cheese he er ttcaaaagtg ttaccaagca etgoggeast gagccaaaat tacttactac gaattetgge attatattaa tcaaaatatg daltlLleclaa Llageccelta LCatatgage COCCLCOCCOOC STLLEIGETCE aggctcagga tgtatttaaa agcatttaaa a atetattt acccagarcgt gtaa aattatce ccatataaag taaaagtgca tgatgcaaaa aaggaaagac gQaaggcagct agggagtgta caaga actget CagucceEtrcg EE EE ctgtgtcaga tgggacttgt gtgqgaatttt tgattgtaac tctaatgagt LUECULLOaaag gtctatggaa Ttaagatgaat atacaattort Ee gehs SE Ee aagaggaagt batrorocca atgagaccac taaaacataa agtgatttta ECUTOCECOCL CULT agtcad QUT OGLCCCaACE tataggtaca ger cgcCECatg DEE ttaccagagt COELIELEL EE EE aL aaataaagca EE EE gtctgaggga EE E Ee cagacctggt cgagggccgce tggttataga gagagatggc ttataaaagg Cagcagarce CLOELECCeL gaatgaagga agatacttca Faogelaacet gaaatcagat SctLoctttaet tgaagatagt acaggtttac agatecercd gteLgcagga COoOCgdacccce EE EE gacaggagcc EE TEE Ee ectgacadaa aacagaaaag gcaattggaa traltlaactta aaggaattta CCCLOCaaag EES ctcggotgca aLaccocccree ccaaaaaaac attttttaaa atgLocatga EE EE aaacaaagcg acaacccctce CCCaCeCact grgttat
93. chiedener Linien jeweils als unabh ngige Einheiten und tragen zur Generierung von Geweben und Zelltypen im gesamten Organismus bei Der Ursprung der mesenchymalen Zellen liegt jedoch auch innerhalb von 4 Einleitung proliferativen epithelialen Zellschichten z B Ektoderm des fr hen Embryos oder die Zellschichten des Neuralrohrs Erst w hrend sich bestimmte Zellen aus der epithelialen Schicht abl sen findet ein bergang von epithelialen zu mesenchymalen Charakteristika statt Locascio and Nieto 2001 Eine der wichtigsten Voraussetzungen f r die Transformation epithelialer Zellen zu einem mesenchymalen Ph notyp ist die nderung der interzellul ren Adhasionseigenschaften Im Verlauf der Histo und Organogenese k nnen distinkte Migrationspfade mesenchymaler Zellen beobachtet werden vgl Abbildung 1 wobei u a die Migrationsstr me der Neuralleistenzellen Sauka Spengler and Bronner Fraser 2008 und der neuronalen Vorl uferzellen siehe Abschnitt 1 1 3 eine sehr wichtige Rolle einnehmen Abbildung 1 Migrationspfade der Neuralleistenzellen a und der Vorl uferzellen des Nerven und BlutgefaBsystems b im Mausembryo Darstellung bei Embryonalstadium E13 5 p c Kurosaka and Kashina 2008 1 1 2 Migration auf zellularer Ebene Regulation des Zytoskeletts Die gerichtete Zellmigration bildet die Basis fur die korrekte Entwicklung und Funktion von sowohl ein als auch mehrzelligen Organismen Trotz der Unterschi
94. d der Slit Robo GAP srGAP Familie MEGAP ist in Signaltransduktionskaskaden an der Zellmembran eingebunden MEGAP inhibiert die Polymerisation von verzweigtem Aktin Signaltransduktion ber den Slit Robo Komplex im Wachstumskegel Zielsetzung dieser Arbeit MATERIAL UND METHODEN Allgemeine Pufferl sungen N hrmedien f r Bakterien Antik rper Prim rantik rper Sekund rantik rper Primer DNA Sequenzierung Sequenzierung von PCR Produkten TempliPhi Amplifikation von Plasmidklonen Das Gateway Klonierungssystem Analyse von Protein Protein Interaktionen Herstellung von Zelllysaten Bestimmung von Proteinkonzentrationen GST Pulldown und Co Immunpr zipitation Co IP SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese PAGE und Western Blot Expression und Aufreinigung von rekombinanten Proteinen in Bakterien Expression Aufreinigung von GST Fusionsproteinen RNA in situ Hybridisierung Allgemeine Grundlagen Embryonenpraparation RNA Sondensynthese Sondenhybridisierung und Detektion Yeast Two Hybrid Methoden Stammhaltung von Hefen Transformation von Hefen 15 16 16 18 19 20 20 20 21 21 21 22 24 24 26 26 28 28 29 29 30 32 32 33 34 34 34 35 36 39 40 41 2 10 3 2 10 4 2 11 2 12 2 13 2 14 2 15 2 16 3 1 3 2 3 2 1 22 3 3 3 4 3 5 3 6 Su 4 4 1 4 1 1 4 1 2 4 2 4 2 1 22 4 2 3 4 2 4 4 2 5 4 3 4 4 Inhaltsverzeichnis Isolation von Plasmid DN
95. d einer 5 CO2 Konzentration in 250 ml Zellkulturflaschen mit Filter Greiner liegend inkubiert Alle 2 3 Tage wurde der Medium berstand entfernt die Zellen mit PBS gewaschen und mit ca 2 ml Trypsin von der Kulturflasche abgel st Die Zellen wurden anschlie end in einem Verh ltnis von 1 10 NIH 3T3 bzw 1 20 HEK293 n frischem Medium neu ausges t 2 12 Transfektion von Zelllinien HEK293 und NIH 3T3 Zellen wurden mit dem LipofectamineTM 2000 Transfection Reagent Invitrogen nach Angaben des Herstellers transfiziert Die Zellen wurden am Tag vor der Transfektion auf 10cm Zellkulturschalen f r Zelllysate bzw 24 Well Zellkulturschalen mit 12 mm Deckgl sern f r Immunfluoreszenz in Antibiotika freiem Medium ausges t HEK293 und NIH 3T3 Zellen wurden bei einer Konfluenz von etwa 30 transfiziert Plattentyp Wachstumsfliche Totalvolumen Medium f r Lipofectamine Medium Verdiinnung 2000 10 cm Platte 60 cm 10 ml 2x 1 5 ml 24 Well 2 cm 0 5 1 ml 2x 50 ul Nach Empfehlung des Herstellers wurde nach folgendem Protokoll vorgegangen e In zwei sterilen 1 5 ml Reaktionsgef en wurde die gleiche Menge Serum freies Medium Opti MEM I with GlutaMAX I Gibco vorgelegt e Zugabe der DNA in das erste Gef kurzes Mischen e Zugabe von Lipofectamine 2000 in das zweite Gef nach vorsichtigem Mischen Inkubation bei RT f r 5 min e Zugabe der verd nnten DNA zum Medium mit Lipofectamine 2000 nach vorsicht
96. dalacce gtcacactac gecagcgtga COCOCCELCE L t e te tech et ggttagagcc acattaataa tgggggCcccc ccarggagge gggaggtgat gggtccagga EE EE EE SCCCsaadtoga cgaaggccct cggtggcatg tggaggacart LCCCCacgad ccccggecgga ggggccacart GeCcagccacct agqgcacgat titcartgatg Caetgqqggcce ELGESTECSLE Cagetgatga ITSACcLgTTg SCOLLOOLIT Egtacecec s erggcgaaca ggatcagctg gatgctgaaa agitocggaa ECUCTCaagc gtregatgat CEIILIGLETE cagtgagacc aclogcaccoce aggaggotte tgggtggatt SELGELELSE aaaatggatt taaacagtgg gt 21178190459 refINM_000978 3 Homo sapiens ribosomal protein L23 RPL23 mRNA 1 61 ioe 181 241 301 a0 421 481 541 ggccacgtga CELL LE ET aacacaggag agactlccccg gagctcagaa aaagatggcg gagatgaaag cggattgecat aaaaaaaact ggagggtggg tettttttcece LeOggatttce ccaaaaacct SLICLISELSE aaaaggtaca EQUETCLELCa OcCECtgCccaL E Ne e e te aa catta cggggcgtta ggcg EE EELER GtatalCatc gggtgacatg LEec3gcageg ttttgaagart tacaggacca cagcattgca aaaagtattt aagttcatat aag atgt cgaagc ccggtaggag tcegtgaadg gtgatggeca OeECacecgjac aatgcaggag gtagcaaagg CLOCOCA gotttgcaaaa CeCagcgLcc gaggacgtgg ctgtaatcaa ggatcaaggg cCagL casagaa aacgaaagtc teatagegaa agtgtgcaga Gtataclcrgec aaaaaaaaaa LLregastcga TIIGLECLET EE gie acggcrqaac aggcaaacca atacegraga cCaatad3aggc CLLEILISGCCE aaaaaataaa aaaa Bei diesem Klon war das sequenzierte Transkript so kurz dass auch das 3 Ende des cDNA Klons e
97. dass MEGAP und Robol n einem gemeinsamen Signaltransduktionsweg eingebunden sind sollte eine berlappung der mRNA Expression nachzuweisen sein Dies konnte sowohl f r E11 5 p c als auch f r E12 5 p c in der Maus gezeigt werden Abbildung 18 Megap und Robol werden u a im Neuroepithel des Neuralrohrs und in Teilen des Vorder und Mittelhirns co exprimiert Im Unterschied zur Expression von Megap konnte die Robol mRNA jedoch nicht in den ventrikul ren Zonen des Vorder Mittel und MHinterhirns E11 5 und E12 5 in der Flurplatte E11 5 den Hinterwurzelganglien E11 5 im neuronalen Gewebe des Auges sowie in den trigeminalen und inferialen Ganglien E11 5 detektiert werden Aufgrund dieser Unterschiede und der sehr fr hen Expression von MEGAP ist dessen Einbindung n einen oder mehrere von Robol unabh ngige Signaltransduktionswege sehr wahrscheinlich Um die Spezifit t der anti sense RNA Sonden f r Megap und Robol zu verifizieren wurden jeweils RNA in situ Hybridisierungen mit den entsprechenden sense Sonden durchgef hrt vgl Anhang 5 5 56 Ergebnisse Abbildung 18 RNA in situ Hybridisierung mit Sonden f r Megap a b und Robol c d a Hybridisierung einer Megap anti sense RNA Sonde auf einem medialen Sagittalschnitt Embryonalstadium E12 5 p c Eine starke Expression von Megap lie sich im Neuroepithel des Neuralrohrs N sowie in weiten Bereichen von Hinterhirn H Mittelhirn M und Vorderhirn
98. den Endprodukte LR Reaktion Die LR Reaktion wurde generell verwendet um cDNA Fragmente von einem Entry Vektor in Gateway Expressionsvektoren pDEST Vektoren zu transferieren Die folgenden Komponenten wurden f r die LR Reaktion 10 ul Ansatz in einem 1 5 ml Reaktionsgef gemischt 27 Material und Methoden Komponente Probe Negativkontrolle Entry Vektor 150 1 l ul pDEST Vektor 150 1 l ul l ul 5x LR Clonase Reaktionspuffer 2 ul 2 ul Ix TE Puffer pH 8 0 ad 9 2 ul 9 2 ul e Zugabe von 0 8 ul LR Clonase zu jedem Reaktionsansatz Inkubation fur 1 h bei 25 C bei sehr gro en Plasmiden auch l nger e Zugabe von ul ProteinaseK zu jedem Reaktionsansatz 10 min Inkubation bei 37 C e Einsatz von je 1 2 ul jedes Reaktionsansatzes f r die Transformation in Bakterien BP Reaktion Neben der LR Reaktion wurde die BP Reaktion eingesetzt um cDNA Fragmente aus pDEST Vektoren n pDONR Vektoren zu transferieren Diese Generierung von ENTRY Vektoren aus Gateway Expressionsvektoren war u a f r den Library Swap Abschnitt 3 2 1 1 erforderlich Hierbei wurde unter Verwendung einer BP Clonase und entsprechendem 5x BP Clonase Reaktionspuffer analog zur LR Reaktion vorgegangen siehe oben 2 7 Analyse von Protein Protein Interaktionen 2 7 1 Herstellung von Zelllysaten Lysis Puffer modifizierter Ripa Puffer Zusammensetzung nach Upstate 50 mM Tris HCl pH 7 4 1 NP 40 Igepal 0 25 Natr um
99. dens Die TIRF Aufnahmen von Wildtyp MEGAP EYFP und mCherry Lpd co transfizierten NIH 3T3 Zellen zeigten eine Co Lokalisation beider Proteine an distinkten Strukturen in der N he der Zellmembran Abbildung 27A Die Co Expression von Lpd und der GAP Mutante MEGAP RI zeigte ebenfalls eine Co Lokalisation der beiden Proteine welche besonders an faserartigen adh sions hnlichen Strukturen innerhalb der Lamella detektiert werden konnte Jedoch co lokalisierte Lpd nicht sehr stark mit MEGAP RI an der Migrationsfront von Zellforts tzen Abbildung 27B Wie in Abschnitt 3 3 beschrieben vermittelt die MEGAP SH3 Dom ne die Interaktion zwischen MEGAP und Lpd Im Rahmen der Co Lokalisationsstudien sollte nun untersucht werden ob die MEGAP SH3 Dom ne auch die Lokalisation von MEGAP und Lpd beeinflusst Hier konnte gezeigt werden dass der Funktionsverlust der SH3 Dom ne in der Mutante Y755D sowohl die Co Lokalisation zwischen MEGAP und Lpd als auch deren Lokalisation an spezifische zellul re Strukturen aufhebt Abbildung 27C 72 Ergebnisse MEGAP Y755D Lpd MEGAP Y755D Abbildung 27 MEGAP co lokalisiert mit Lpd in NIH 3T3 Zellen A C TIRF Aufnahmen von NIH 3T3 Zellen unter Serum Reduktion und Co Expression von MEGAP und Lpd A B NIH 3T3 Zellen wurden mit mCherry Lpd und Wildtyp A bzw GAP defizientem R542I B MEGAP EYFP Expressionskonstrukten co transfiziert Sowohl der Wildtyp als auch die GAP Mutante MEGAP RI co lokalisier
100. deoxycholat 1 mM EDTA 150 mM NaCl 1x Protease Inhibitor Cocktail SERVA 2 mM Na3VOa aktiviert 2 mM NaF direkt vor der Benutzung des Puffers frisch zugeben Die Herstellung von Proteinextrakten aus transient transfizierten Zellen oder aus Geweben erfolgte in Vorbereitung fur GST Pulldown oder Co Immunpr zipitation Co IP Abschnitt 2 7 3 Standardm ig wurden f r die Pulldown und Co IP Studien transfizierte HEK293 Zellen ausgesat auf 10 cm Gewebekulturschalen benutzt Die Zellen wurden zweimal mit eiskaltem 1x PBS gewaschen und anschlie end auf Eis im K hlraum in 2x 350 ul Lysis 28 Material und Methoden Puffer mit einem Zellschaber abgel st Das Zelllysat wurde nach 5 minttiger Inkubation auf Eis fiir 15 min bei 13000 rpm abzentrifugiert und der erhaltene Uberstand in ein frisches 1 5 ml Reaktionsgef berf hrt Anschlie end erfolgte die Bestimmung der Proteinkonzentration n den Lysaten 2 7 2 Bestimmung von Proteinkonzentrationen Die Quantifizierung von Proteinkonzentrationen in Zell oder Gewebeextrakten wurde mit dem BCA Protein Assay Kit PIERCE durchgef hrt Bei der BCA Reaktion BCA Bicinchonins ure reagieren zweiwertige Kupferionen quantitativ mit Protein zu einwertigen Kupferionen Diese geben mit BCA einen violetten Farbstoff dessen Absorption bei einer Wellenlange von 562 nm photometrisch ausgewertet werden kann Das Protokoll wurde laut Angaben des Herstellers durchgef hrt u
101. die Co Expression von MEGAP Y755D und Lpd die Bildung kleiner Lamellipodien Abbildung 35B Des Weiteren konnte gezeigt werden dass sich Lpd unter Co Expression mit der SH3 Mutante innerhalb der auswachsenden Lamellipodien anreicherte Somit deuten die Ergebnisse darauf hin dass die Bindung von MEGAP an Lpd sowie die Umlagerung von Lpd an Fokale Adhasionen die Lpd assoziierten Akt n Dynamiken beeinflussen kann 8 1 Ergebnisse MEGAP wt MEGAP RI Phalloidin MEGAP RI MEGAP wt Vinculin MEGAP wt Vinculin Vinculin 82 Ergebnisse Abbildung 34 MEGAP lokalisiert an die Enden von Aktinfasern und an Vinculin markierte Fokale Adh sionen Dargestellt sind TIRF Aufnahmen von NIH 3T3 Zellen unter Serum reduzierten Bedingungen A NIH 3T3 Zellen wurden mit MEGAP EYFP Expressionskonstrukten Wildtyp und GAP Mutante MEGAP RI transfiziert Nach der Fixierung erfolgte eine F rbung des F Aktins mit TRITC konjugiertem Phalloidin Unabh ngig von der GAP Aktivitat wurden sowohl Wildtyp MEGAP als auch MEGAP RI an den Enden von Aktinfasern detektiert B Analog zu A wurden NIH 3T3 Zellen mit MEGAP EYFP Expressionskonstrukten transfiziert und mit einem Vinculin spezifischen Antik rper gef rbt F r Wildtyp MEGAP und MEGAP RI konnte eine Co Lokalisation mit Vinculin an Fokalen Adh sionen beobachtet werden C NIH 3T3 Zellen wurden mit einem EYFP Lpd Expressionskonstrukt transfiziert und anschlie end gegen Vinculin gef rbt
102. dien no und n entsteht Abbildung 16 F r die spezifische Anregung einzelner Fluoreszenzfarbstoffe werden bei der TIRF Mikroskopie Laser mit definierten Wellenl ngen eingesetzt Damit der Laserstrahl im Objekttr ger optisch dichteres Medium no total reflektiert wird muss dessen Einfallwinkel 8 gr er sein als ein so genannter kritischer Winkel 0 Aufgrund der wellenmechanischen Eigenschaften des Lichts ergeben sich im Medium n exponentiell abfallende Aufenthaltswahrscheinlichkeiten des total reflektierten Lasers Dadurch kann sich im Medium n ein geringer Teil des Laserlichts in Form einer evaneszenten Welle ausbreiten deren Intensitat mit der gleichen Exponentialfunktion abnimmt Somit ist es m glich dass die Fluoreszenz nur im Oberflachenbereich einer Zelle 100 200 nm uber dem Deckglasboden mit dem Laser angeregt wird In der vorliegenden Arbeit wurden mit Hilfe der TIRF Mikroskopie z B Fokale Adhasionsstellen und die Enden von Aktinfasern visualisiert Z Ausbreitungsrichtung I 0 gt 0 Abbildung 16 Schematische Darstellung der totalen Reflexion eines Lichtstrahls im Medium n Die gr n gezeichnete Exponentialkurve zeigt die hierbei entstehende evaneszente Welle an 54 Ergebnisse 3 Ergebnisse 3 1 Expression von MEGAP im Nervensystem Im Rahmen molekulargenetischer Untersuchungen mental retardierter Patienten konnte MEGAP srGAP3 als ein Kandidatengen f r neuronale Entwicklung und damit ver
103. diese Membran wurde auf eine Platte Selektionsmedium aufgebracht eventuelle Luftblasen wurden entfernt und von der Masterplatte die zu testenden Hefeklonen uberimpft Inkubation bei 30 C bis Einzelkolonien auf der Membran sichtbar waren ca 48 h daraufhin wurde die Membran mit einer Pinzette von der Platte abgehoben f r 10 sec in fl ss gem Stickstoff schockgefroren und anschlie end be RT aufgetaut w hrend dieser Zeit wurde Whatman Papier auf eine passende Gr e zurechtgeschnitten in Petrischalen 15 cm Durchmesser berf hrt und mit Z Puffer X gal L sung angefeuchtet die Membran wurde auf das Papier aufgebracht Kolonieseite nach oben Vermeidung von Luftblasen und die einzelnen Kolonien wurden ebenfalls mit Z Puffer X gal L sung betr ufelt anschlie end wurde bei 37 C inkubiert wobei darauf geachtet wurde dass die Petrischale leicht schr g stand so dass bersch ssiger Z Puffer X gal L sung s ch nicht auf der Membran sammelt nach 24 h wurde das Experiment abgebrochen und das Ergebnis ausgewertet 49 Material und Methoden 2 11 Kultivierung von Zelllinien Medium DMEM high Glucose Gibco supplementiert mit 10 Fotalem Kalberserum bzw Neugeborenem Kalberserum PAA und Penicillin Streptomycin Gibco Die Zelllinien HEK293 humane embryonale Nierenzellen CRL 1573 und NIH 3T3 Maus Fibroblasten CRL 1658 wurden von der American Tissue Culture Cooperation ATCC bezogen Die Zellen wurden bei 37 C un
104. e Tris gepufferte Salzl sung Tris EDTA Puffer Tris hydroxymethyl aminomethan units Einheit der Aktivitat von Enzymen uber Nacht ultraviolett Wiskott Aldrich Verprolin homology protein 1 weight per volume Gewicht Volumen Verhaltnis VI Zusammenfassung der Arbeit Identifizierung und Charakterisierung von MEGAP Interaktionspartnern vorgelegt von Diplom Biochemikerin Lydia Hau mann Betreuerin der Arbeit Professor Dr Gudrun A Rappold In der vorliegenden Arbeit wurde nach bisher unbekannten Interaktionspartnern f r das mit geistiger Behinderung assoziierte Protein MEGAP gesucht MEGAP srGAP3 ist ein Mitglied der Slit Robo GAP srGAP Familie und an der Slit Robo vermittelten repulsiven Wegfindung von Axonen und neuronalen Migration beteiligt Durch die Inhibierung der kleinen Rho GTPase Racl und der Interaktion mit WAVE 1 inhibiert MEGAP die Aktinpolymerisation Um die funktionelle Korrelation der Assoziationen zwischen MEGAP dem Slit Rezeptor Robol sowie weiteren MEGAP Interaktionspartnern zu verstehen wurde zu Beginn dieser Arbeit das Expressionsmuster der Megap und Robo mRNA in verschiedenen Entwicklungsstadien der murinen Embryonalentwicklung untersucht Die Expressionsstudien haben gezeigt dass Megap in vielen Bereichen des sich entwickelnden Nervensystems exprimiert wird Die Expression des Megap Transkripts wird bereits sehr fr h vor E9 5 p c initiiert und konnte verst rkt in den stammzellreichen Regionen des
105. e Zelle leicht erh hte Lamellipodien Dynamik nach Stimulierung durch PDGF Jedoch waren durch die Expression von MEGAP RI sowohl die Wachstumsgeschwindigkeiten als auch die Umfange von den gebildeten Zellfortsatzen verringert 79 Ergebnisse Geschwindigkeit um min Lpd MEGAP MEGAP MEGAP RI MEGAP RI Kontrolle Lpd Lpd Verh ltnis Umfang der Lamellipodien Umfang der Zelle Lod MEGAP RI MEGAP RI Kontrolle Lpd Abbildung 33 Inhibierung der Lamellipodien Dynamik aufgrund der Interaktion zwischen MEGAP und Lpd A Box and Whisker Plots zur Darstellung der Wachstumsgeschwindigkeiten primarer Lamellipodien in NIH 3T3 Zellen nach Stimulierung durch PDGF Gegen bergestellt sind Geschwindigkeitswerte f r Einzel bzw Co Expression von fluoreszenzmarkiertem Lpd und MEGAP Wildtyp und GAP Mutante MEGAP RI Als Kontrolle wurden EYFP transfizierte Zellen analys ert In einem Box and Whisker Plot entsprechen der untere bzw obere Rand der Box dem 25 und 75 Quartil die u eren Linien whiskers begrenzen das 10 bzw 90 Perzentil eines Datensatzes Die Punkte markieren die Median und die Linien die Mittelwerte in den einzelnen Boxen Die Berechnung der Wachstumsgeschwindigkeiten erfolgte mittels Kymographie Abschnitt 2 15 wobei alle auswachsenden Lamellipodien einer Zelle einbezogen wurden F r jeden Datensatz wurden mindestens 25 Zellen untersucht Die statistische Auswertung der Ergebnisse zeigte auf das
106. ebnisse Zusammenfassend kann gesagt werden dass in dieser Arbeit die bisher unbekannte Interaktion zwischen MEGAP und dem Ena VASP bindenden Protein Lamellipodin Lpd identifiziert und charakterisiert wurde In diesem Zusammenhang wurde gezeigt dass die MEGAP SH3 Dom ne die Bindung von MEGAP an Lpd vermittelt und MEGAP einen hemmenden Effekt auf Lpd aus bt Die Inhibierung von Lpd erfolgt vermutlich ber die Lokalisierung an Fokale Adhasionen 84 Diskussion 4 Diskussion 4 1 Identifizierung neuer MEGAP Interaktionspartner Makromolekulare Interaktionen wie Protein Protein Interaktionen sind essentiell fur alle biologischen Prozesse von der Ausbildung zellularer Strukturen und enzymatischen Reaktionen bis hin zur Regulation von Signaltransduktionskaskaden Daher fungieren die meisten Proteine als stabile oder transiente Komplexe mit anderen Proteinen wobei eine dynamische Generierung und Degradation der Proteinkomplexe stattfindet Alberts 1998 Grigoriev 2003 Kerrien er al 2007 Die Analyse des so genannten Interaktoms einer Zelle bzw eines Zelltyps ist somit unerl sslich um sowohl die Funktion einzelner Komponenten als auch die Zelle oder den Organismus als Einheit zu verstehen Kelly and Stumpf 2008 4 1 1 Isolierung MEGAP bindender Proteine mit Hilfe des Yeast Two Hybrid Systems F r die gezielte Suche nach bisher unbekannten Protein Protein Interaktionen wurde u a das Yeast Two Hybrid System entwickelt Seit sei
107. echsel zu einem Modellsystem in dem MEGAP und Lpd endogen co exprimiert werden Dies k nnte zum Beispiel uber die Verwendung der Neuroblastoma Zelllinie NIE 115 Pertz et al 2008 erfolgen in welcher mit Hilfe von miRNAs bzw RNA Interferenztechnologien die Expression von MEGAP oder Lpd gezielt unterdr ckt werden konnte Die dadurch verursachten Effekte in Bezug auf die Zellmotilitat und die Ausbildung von Zellfortsatzen k nnten f r MEGAP und Lpd sowohl einzeln als auch kombiniert untersucht werden Des Weiteren bietet sich die Analyse der Megap Neuronen an um die Effekte von MEGAP auf die Lpd vermittelte Lamellipodien Dynamik auf neuronaler Ebene zu untersuchen In diesem Zusammenhang stellt sich u a d e Frage ob die vermehrte Ausbildung von Lamellipodien in hippokampalen Megap Neuronen auf die fehlende Inhibierung von Lpd durch Megap oder auf die Abwesenheit der GAP Aktivitat von Megap zur ckzuf hren ist Hier k nnte ebenfalls die Unterdr ckung der Lpd Expression mit Hilfe von Lpd spezifischen miRNAs aufschlussreich sein Sollte die verst rkte Lamellipodienbildung in den Megap defizienten Neuronen in Abwesenheit von Lpd nicht erfolgen ware dies eine weitere Bestatigung fur die Rolle von MEGAP als Inhibitor von Lpd Insbesondere die ver nderte Morphologie der hippokampalen Neuronen in Megap defizienten Mausen konnte einen Ansatzpunkt fur die Erklarung von Erkrankungen wie geistiger Behinderung oder Autismus darstellen F
108. ede zwischen den diversen Zelltypen und den jeweiligen Migrationsereignissen wird angenommen dass allen Migrationsvarianten ein hnlicher molekularer Mechanismus zugrunde liegt dessen Hauptkomponenten m Verlauf der Evolution ber mehrere Millionen Jahre konserviert wurden Da die Charakteristika mesenchymaler Zellen dem allgemeinen Phanotyp von Fibroblastenzellen sehr hnlich sind wurden viele Aspekte der gerichteten Zellbewegung m Zellkultursystem analysiert Einleitung Die Form einer Zelle wird durch drei verschiedene Polymersysteme bestimmt aus denen s ch das Zytoskelett zusammensetzt den Aktinfasern den Mikrotubuli MT sowie den Intermedi rfilamenten Abbildung 2 Nur aufgrund der Reorganisation dieser Polymersysteme k nnen nderungen der Morphologie einer Zelle und Migrationsprozesse stattfinden welche einen Organismus formen und somit eine der Grundlagen des Lebens darstellen migrierende Zelle Aktinzytoskelett Mikrotubuli Intermedi rfilamente Abbildung 2 Schematische Darstellung des Zytoskeletts einer Zelle m Zellkultursystem In rot blau und gr n sind die drei Hauptkomponenten des Zytoskeletts dargestellt Aktin Mikrotubuli und Intermedi rfilamente Modifiziert nach A Video Tour of Cell Motility Die Migration einer Zelle kann als zyklischer Prozess betrachtet werden Lauffenburger and Horwitz 1996 Dieser beginnt mit der Antwort auf ein extrazellul res Signal welches zur Polarisierung d
109. ein Lamellipodin Lpd gezeigt und nachfolgend charakterisiert Lamellipodin wurde zum ersten Mal im Rahmen einer Suche nach Bindungspartnern f r die EVHI Dom ne Ena VASP homology 1 der Ena VASP Proteinfamilie beschrieben Krause et al 2004 In dieser Arbeit konnten Krause et al den stimulierenden Effekt von 89 Diskussion Lpd auf die Aktin Dynamiken in Lamellipodien aufzeigen Uber die Interaktion zwischen seiner PH Dom ne Pleckstrin homology domain und Phosphatidylinositol 3 4 5 Trisphosphat PIP3 wird Lpd nach der Aktivierung der Phosphoinositid 3 Kinase PI3K an die Zellmembran rekrutiert und lokalisiert daher an die Migrationsfront von Lamellipodien und an die Enden von Filopodien Die Aktivierung der PI3K erfolgt u a durch den Einfluss von Wachstumsfaktoren wie PDGF vgl Abbildung 36 Des Weiteren wurde von Krause et al beobachtet dass eine berexpression von Lpd die Zunahme lamellipodialer Wachstumsgeschwindigkeiten ausl st Die Unterdr ckung der Expression von Lpd mit Hilfe Lpd spezifischer shRNAs Lpd knockdown resultierte in einer drastischen Abnahme der Anzahl auswachsender Lamellipodien sowie in reduzierten Wachstumsgeschwindigkeiten und Lamellipodienumfangen der restlichen Membranfortsatze Beide Effekte wurden auf eine deutliche Verringerung des F Aktingehaltes innerhalb der Zellperipherie zur ckgef hrt Da Lpd die Lokalisierung der Ena VASP Proteine an die Zellmembran bewirken kann wird es als
110. eit besitzen eine glatte Gehirnoberfl che ohne Einfurchungen und weisen u a anstelle von sechs kortikalen Schichten nur vier auf Ozmen et al 2000 Sowohl Lis als auch DCX geh ren zur Gruppe der Mikrotubuli assoziierten Proteine MAPS welche die Strukturen der Mikrotubuli in Abh ngigkeit ihres Phosphorylierungsstatus stabilisieren k nnen Sapir er al 1997 Horesh et al 1999 Die Stabilisierung von Mikrotubuli spielt w hrend der neuronalen Migration sowohl beim Auswachsen des leading neurite als auch bei der Translokation des Zellkerns eine wichtige Rolle Daher k nnen Defekte in den MAPs oder auch in Aktin assoziierten Proteinen die Beweglichkeit migrierender Neuronen erheblich einschr nken und die Entwicklung des Nervensystems st ren In der vorliegenden Arbeit wurde das Protein MEGAP analysiert das vor einigen Jahren bei einer Patientin mit starker mentaler Retardierung als Kandidatengen f r neuronale Entwicklungsdefekte isoliert werden konnte Endris et al 2002 12 MEGAP ist Mitglied der Slit Robo GAP srGAP Familie Aufgrund des Zusammenhangs zwischen der Proteinfunktion von MEGAP und mentaler Retardierung erfolgte die Bezeichnung MEntal disorder associated GAP protein Wie der Name bereits impliziert geh rt MEGAP zur Gruppe der GTPase aktivierenden Proteine GAPs und durch seine Interaktion mit dem Transmembranrezeptor Robol speziell zur Proteinfamilie der Slit Robo GAPs srGAPs Die srGAPs wurden zun c
111. ellegrini L Cestra G Butler M H Rossman K L Serna D M Sondek J Gertler F B and De Camilli P 2003 Tuba a novel protein containing bin amphiphysin Rvs and Dbl homology domains links dynamin to regulation of the actin cytoskeleton J Biol Chem 278 49031 49043 Sanger F Nicklen S and Coulson A R 1977 DNA sequencing with chain terminating inhibitors Proc Natl Acad Sci US A 74 5463 5467 Sapir T Elbaum M and Reiner O 1997 Reduction of microtubule catastrophe events by LIS1 platelet activating factor acetylhydrolase subunit Embo J 16 6977 6984 131 Referenzen Sauka Spengler T and Bronner Fraser M 2008 A gene regulatory network orchestrates neural crest formation Nat Rev Mol Cell Biol 9 557 568 Sini P Cannas A Koleske A J Di Fiore P P and Scita G 2004 Abl dependent tyrosine phosphorylation of Sos 1 mediates growth factor induced Rac activation Nat Cell Biol 6 268 274 Soderling S H Binns K L Wayman G A Davee S M Ong S H Pawson T and Scott J D 2002 The WRP component of the WAVE I complex attenuates Rac mediated signalling Nat Cell Biol 4 970 975 Soderling S H Guire E S Kaech S White J Zhang F Schutz K Langeberg L K Banker G Raber J and Scott J D 2007 A WAVE I and WRP signaling complex regulates spine density synaptic plasticity and memory J Neurosci 27 355 365 Takahashi M Rikitake Y Nagamatsu
112. ellte ein Hefeklon dar welcher neben MEGAP C die Phosphatase CATS53 exprimierte Hier zeigte sich erst nach dem Austausch der Expressionsvektoren Library Swap dass CATS3 auch ohne die Co Expression von MEGAP C die Expression des lacZ Gens in sehr starkem Ausma induzieren konnte Der einzige Kandidat welcher als putativer MEGAP Interaktionspartner aus dem Yeast Two Hybrid Screen hervorging war das nukle re Protein Periphilin Sowohl die Analyse der Reporteraktivitaten als auch die Kontrollexperimente bez glich autoaktivierender Eigenschaften wiesen auf eine Interaktion zwischen MEGAP und Periphilin hin Obwohl das Yeast Two Hybrid System entwickelt wurde um binare direkte Interaktionen zwischen Proteinen zu messen k nnen indirekte Interaktionen nicht ausgeschlossen werden Aus diesem Grund m ssen die isolierten Bindungspartner jeweils mit Hilfe weiterer Methoden verifiziert werden Da die putative Assoziation zwischen der MEGAP SH3 Dom ne und Periphilin mittels GST Pulldown nicht best tigt werden konnte wurde Periphilin ebenfalls als falsch positiver Kandidat aussortiert Allerdings enthielt das im Yeast Two Hybrid Screen verwendete C terminale MEGAP Fragment nicht nur die MEGAP SH3 Dom ne sondern auch die so genannte KID Dom ne Kinase Interacting Domain ber welche die Interaktion zwischen MEGAP und c Abl vermittelt wird Endris et al 2009 Daher besteht die M glichkeit dass MEGAP ber die KID Dom ne oder andere
113. en Zellk rper innerhalb des sich entwickelnden Nervensystems statt Im Anschluss daran setzen nur die Neuriten die Wanderung durch den Organismus fort um ihre spezifischen Ziele zu erreichen und mit den jeweiligen Effektoren Verkn pfungen einzugehen hnlich der Migration mesenchymaler Zellen wird die neuronale Migration durch die Umstrukturierung des Zytoskeletts als Antwort auf extrazellulare Signale und deren bermittlung durch intrazellul re Signalkaskaden erreicht Die epithelialen Schichten der ventrikul ren Zonen s nd die Geburtsorte der neuronalen Vorl uferzellen und Neuronen m sich entwickelnden Nervensystem Durch asymmetrische Zellteilung innerhalb der ventrikul ren Zone beginnt die Differenzierung zu einem neuronalen Ph notyp Nachdem eine neuronale Zelle aus dem Zellzyklus ausgetreten ist muss s e aus der ventrikul ren Zone herauswandern ber diesen Mechanismus werden die Strukturen des Nervensystems gebildet Bei der neuronalen Migration k nnen zwei Arten definiert werden rad ale Migration bei der Zellen aus den ventrikul ren Zonen n Richtung der Oberfl che des Gehirns wandern und die tangentiale Migration bei welcher Zellen senkrecht zur Migrationsrichtung radial migrierender Zellen wandern Marin and Rubenstein 2003 Mit Hilfe der radialen Migration entstehen die laminaren Strukturen des zerebralen und zerebellaren Kortex sowie Striatum Thalamus und R ckenmark Hierbei existieren zwei 11 Einleitung
114. en f r SH3 Dom nen postuliert die sich ber den gesamten C Terminus verteilen Somit besteht die M glichkeit dass MEGAP entweder mit einer oder mehreren der SH3 Bindungsstellen interagiert oder mit Profilin um dessen Bindungsstelle konkurriert Letztere Situation wurde eine Parallele zur putativen Interaktion zwischen MEGAP und mDial herstellen MEGAP o A Ras association Pleckstrin Homology Prolin reiche Regionen EVH1 Bindungsstellen Bindungsstellen f r Profilin Krause et al 2004 Abbildung 37 Lpd Dom nenstruktur und die Interaktion mit MEGAP Die MEGAP SH3 Dom ne ist essentiell f r die Interaktion zwischen MEGAP und Lpd Welche der Prolin reichen Regionen des Lpd Proteins an MEGAP bindet ist derzeit noch nicht bekannt Die dargestellten Proteindom nen entsprechen nicht den genauen Gr enverh ltnissen FCH Fes CIP4 homology domain GAP GTPase activating protein domain SH3 Src homology 3 domain RA Ras association domain PH Pleckstrin homology domain EVH1 Ena VASP homology 1 domain 4 2 3 Die MEGAP abh ngige Assoziation von Lamellipodin an Fokale Adh sionen inhibiert die Zellmotilit t Die Beteiligung von SH3 Dom nen an Protein Protein Interaktionen ist ein weit verbreitetes Motiv innerhalb von S gnaltransduktionskaskaden Li 2005 Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin dass die MEGAP SH3 Dom ne als ein Bindeglied zwischen Signalkomplexen an der Zellmembran dem Aktinzytoskelett sowie Fo
115. enden Wachstumskegeln durch die Bindung des repulsiven Liganden Slit ist zum Beispiel nach dem Uberqueren der Mittellinie des ZNS erforderlich damit die Axone kommissuraler Neuronen die Mittellinie nicht ein zweites Mal kreuzen Uber dieses Migrationsereignis werden die beiden symmetrischen Halften des ZNS miteinander verknupft 18 Einleitung Dickson 2002 Dickson and Gilestro 2006 Allerdings ist die Slit Robo Signaltransduktion nicht auf das Nervensystem beschrankt In Vertebraten spielt sie zusatzlich wichtige Rollen bei der Entwicklung zum Beispiel von Lunge und Niere Des Weiteren sind die Slit Robo Komplexe in pathologische Prozesse wie Krebs involviert Hinck 2004 Chedotal et al 2005 Wie die Bindung von Slit an den Robo Rezeptor intrazellulare Signalkaskaden aktiviert ist bisher noch nicht verstanden Es wird angenommen dass mehrere katalytisch inaktive Adaptorproteine an die zytoplasmatische Dom ne von Robo gebunden sind und dass die Bindung von Slit diese Interaktionen reguliert Hohenester 2008 Die Assoziation der srGAPs mit Robo zeigt auf dass nach der Aktivierung des Rezeptors durch Slit eine Umstrukturierung des Zytoskeletts uber die Regulation der kleinen Rho GTPasen erfolgt Wong et al 2001 Neben den srGAPs sind auch die Tyrosin Kinase c Abl und das Ena VASP Protein Ena mit zytoplasmatischen Bereichen des Robo Rezeptors assoziiert Bashaw et al 2000 Somit ist MEGAP eine Komponente der Signalkaskaden welche
116. entielle Aminos urereste identifiziert Die GAP Aktivit t der srGAPs scheint jeweils spezifisch f r bestimmte Rho GTPasen zu sein So reguliert srGAP1 haupts chlich die Aktivit t von Cdc42 wohingegen MEGAP ma geblich die Aktivit t von Racl inhibiert Endris er al 2002 Soderling er al 2002 Im Gegensatz dazu wurde die Spezifit t von srGAP2 bisher noch nicht ermittelt LA MEGAP ist in Signaltransduktionskaskaden an der Zell membran eingebunden 1 3 1 MEGAP inhibiert die Polymerisation von verzweigtem Aktin Die Proteinfamilie der kleinen Rho GTPasen nimmt eine zentrale Rolle in den S gnaltransduktionskaskaden ein welche die Organisation des Zytoskeletts regulieren Wie 16 Einleitung bereits beschrieben ist die Formation eines stark verzweigten Aktin Netzwerkes essentiell f r das Auswachsen von Lamellipodien Dieser Prozess w rd ber den Arp2 3 Komplex vermittelt dessen Aktivierung durch den WAVE Komplex erfolgt Machesky et al 1999 Rohatgi et al 1999 Der WAVE Komplex wurde zusammen mit WAVE 1 aus Rindergehirn isoliert und setzt sich neben WAVE 1 aus den Proteinen Abi Abl interacting protein Napl Nck associated protein HSPC300 sowie PIR121 Sral zusammen Eden er al 2002 Die Bindung von aktiviertem WAVE induziert eine Konformations nderung im Arp2 3 Komplex so dass dieser als Keim f r die Anlagerung von Aktin Monomeren an ein bereits existierendes Aktinfilament fungieren kann Volkmann et al 2001 R
117. er Galactosidase wurde in 8 Gal units angegeben Abschnitt 2 10 4 4 Hervorgehoben sind die Negativkontrolle rot pDEST32 MEGAP C pDEST22 leer die Positivkontrolle grin pDEST32 MEGAP C pDEST22 ROBOI CC3 sowie die eindeutig positiv getesteten Klone Nr 16 braun 1 20 und 29 gelb Klon Nr 16 zeigte in diesem Assay eine extrem starke Galactosidaseaktivitat 61 Ergebnisse Originalname Klon Nr X Gal Filter Wachstum auf Gal units Assay Leu Trp Ura Fl ssigassay ge a 0 97 0 92 0 93 VI B12 17 1 06 VI A10 VII B11 8 2 8 3 8 5 8 6 8 7 8 8 d d 8 9 28 n d n d 1 13 IBll IV Gl IV G2 VII A9 VU A10 VHI All Negativkontrolle Positivkontrolle Tabelle 9 Gegen berstellung der Ergebnisse aus der qualitativen X Gal Filter Assay Wachstum auf Leu Trp Ura und quantitativen B Galactosidase Fl ssigassay Analyse der Reportergen aktivit t in den Hefeklonen Klone welche durchg ngig negativ getestet wurden sind nicht aufgef hrt Bei der qualitativen Analyse wurde die folgende Bewertung vorgenommen negativ sehr schwach kaum detektierbar bis positiv mit zunehmender Intensit t n d nicht determiniert Der orange markierte Klon Nr 16 zeigte in allen Experimenten herausragende Aktivierung der Reportergenaktivitat Ausgehend von den Werten der Positiv und Negativkontrollen wurden Klon Nr 16 und die gelb markierten Klone f r eine weitere Analyse ausgew hlt Um e
118. er Odyssey Infrared Imaging System Mit Hilfe des LI COR Imagers k nnen an eine Membran gebundene Proteine nicht nur qualitativ analys ert sondern auch quantifiziert werden Die Behandlung der geblotteten Membran Immobilon FL erfolgte analog zur Chemilumineszenz Detektion Allerdings wurde die Membran mit einem von LI COR entwickelten Blocking Buffer siehe Blocking L sung II unter Ausschluss von Tween geblockt Sowohl der prim re als auch sekund re Antik rper wurden in Blocking L sung II 0 1 Tween verd nnt Anstelle des HRP gekoppelten Sekund rantik rpers wurden n diesem Fall Sekund rantik rper verwendet welche mit speziell von LI COR entwickelten Fluoreszenzfarbstoffen konjugiert waren IRDye 680 and 800CW Nach der Inkubation mit dem sekund ren Antik rper 1 15000 1 20000 wurde die Membran mehrfach in 1x TBS 0 1 Tween gewaschen in 1x TBS berf hrt und abschlie end mit dem LI COR Imager eingescannt 2 8 Expression und Aufreinigung von rekombinanten Proteinen in Bakterien 2 8 1 Expression Fur die Expression der GST Fusionsproteine Glutathion S Transferase wurde das pGEX Vektorsystem verwendet Die GST Konstrukte wurden vor der Expression in den E coli Stamm BL21 DE3 transformiert Das pGEX Vektorsystem erlaubt eine kontrollierte Proteinexpression mit Hilfe des Lac Repressor Systems Die Expression wird durch Bindung des Lac Repressor kodiert vom lac Gen an das Lac Operon verhindert Durch Zugabe von Isop
119. er WW Motiven anderer Proteine interagieren Krebs et al 2001 Folglich liegt die Vermutung nahe dass MEGAP mit seiner SH3 Dom ne eine Bindung zur FHl Dom ne von mDial eingehen k nnte Eine Besonderheit der Struktur der so genannten diaphanous related Formine DRFs in S ugetieren einschlie lich mDial besteht in der intramolekularen Interaktion zwischen einer N terminalen GTP bindenden Dom ne GBD und einer C terminalen Diaphanous autoregulator schen Dom ne DAD ber welche die Ruckfaltung der Peptidkette und somit eine Autoinhibierung in Abwesenheit von Rho GTP erfolgt Faix and Grosse 2006 Durch die Bindung von Rho GTP und weiteren Signalfaktoren wird die Interaktion zwischen GBD und DAD aufgehoben und zum Beispiel mDial aktiviert Diese autoregulatorischen Eigenschaften und damit verbundene Anderungen der Proteinkonformation k nnten eventuell auch dafiir verantwortlich sein dass die Interaktion zwischen MEGAP und mDial 1m Rahmen der Co IP Studien nicht eindeutig belegt werden konnte Die Verwendung von konstitutiv aktivem mDial in Form von GBD und DAD Deletionskonstrukten w re in diesem Zusammenhang hilfreich um die Assoziation zwischen MEGAP und mDial genauer zu untersuchen 4 2 MEGAP interagiert mit dem Ena VASP bindenden Protein Lamellipodin 4 2 1 Lamellipodin ist an der Regulation von Aktin Dynamiken beteiligt In dieser Arbeit wurde die bisher unbekannte Interaktion zwischen MEGAP und dem Ena VASP bindenden Prot
120. er Zelle und der Ausbildung einer Migrationsfront leading edge mit dynamisch auswachsenden Zellforts tzen sowie einer R ckzugsfront trailing edge f hrt Pollard and Borisy 2003 Ridley et al 2003 Die Strukturen welche die Aktivit t der Migrationsfront definieren sind die Lamella Lamellipodien und Filopodien Abbildung 3 Die Lamella ist eine breite hoch aktive Zone welche die Flache hinter der eigentlichen Migrationsfront einnimmt In diesem Bereich der Zelle findet ein Gro teil der mechanistischen und regulatorischen Ereignisse statt die f r das Auswachsen von Zellforts tzen und somit f r die Migration der Zelle verantwortlich sind Einleitung Zellbewegung t Richtung der Ir Fi Huclaus Ruckzugsfront Abbildung 3 Darstellung des Aktinzytoskeletts in einer migrierenden Zelle A In auswachsenden Lamellipodien Lp wird ber Arp2 3 WAVE S gnaltransduktionskaskaden ein stark verzweigtes Akt n Netzwerk generiert B Zur Wahrnehmung der unmittelbaren Umgebung bilden die Zellen Filopodien Fp welche aus geb ndelten Aktinfasern bestehen C Fokale Adh sionen FA dienen als Verbindung zwischen extrazellul rer Matrix und Aktin Stressfasern SF D Innerhalb der Lamella Lm sind Myos n II und Tropomyosin mit Aktinfasern verankert Modifiziert nach Le Clainche and Carlier 2008 Der Migrationszyklus einer Zelle kann in vier Schritte untergliedert werden Polarisierung Auswachsen von Zellforts
121. erbaren Hefeklone Die Lokalisation gibt die Positionierung des sequenzierten cDNA Fragments in Bezug auf den Leserahmen an Die Sequenzen der cDNA Klone welche sich innerhalb des offenen Leserahmens ORF des jeweiligen Gens befanden sind im Anhang aufgef hrt Abschnitt 5 4 Bei der Auswahl putativer Interaktionspartner f r weiterf hrende Analysen mussten mehrere Kriterien beachtet werden Die erste wichtige Bedingung war die Aktivierung von Reportergenen m Rahmen des Yeast Two Hybrid Screens Zus tzlich sollten die identifizierten Kandidaten in f r MEGAP relevante S gnaltransduktionswege eingebunden sein In diesem Kontext wurden z B Proteine welche in die Regulation des Zytoskeletts involviert sind als besonders interessant erachtet Da sowohl mitochondriale als auch r bosomale Proteine h ufig als falsch positive Interaktionspartner bei Yeast Two Hybrid Screens identifiziert werden Hengen 1997 Van Criekinge and Beyaert 1999 wurde Klon 14 nicht weiter ber cksichtigt Klone Nr 9 und 10 wurden ebenfalls als negative Ergebnisse aussortiert da sie eine sehr geringe Reporteraktivierung aufwiesen und die Sequenz der enthaltenen cDNA Fragmente au erhalb des Leserahmens f r das Protein INA lokalisiert war 63 Ergebnisse Die Sequenz von Klon Nr 23 konnte mit einer sehr hohen Ubereinstimmung der Focal adhesion Kinasel FAK zugeordnet werden Dieses Protein spielt eine zentrale Rolle bei der Regulation des Zytoskeletts an de
122. ertieres Einschneiden von Bauchfell und Bauchdecke e nach Entnahme der Embryonen Entfernung von Uterus Fruchtblase und Plazenta 34 Material und Methoden e Fixierung der Embryonen mit 4 PFA in 1x PBS U N oder l nger bei lteren Entwicklungsstadien unter leichtem Sch tteln bei 4 C e am n chsten Tag 3x 10 min mit 1x PBS waschen e anschlie end Entw ssern mit 30 Sucrose in 1x PBS U N unter leichtem Sch tteln bei 4 C e nach Abs nken auf den Boden des Gef es Entnahme der Embryonen aus der Sucrose L sung sorgf ltiges Entfernen restlicher Fl ssigkeit e unter K hlung mit Hilfe eines Ethanol Trockeneis Gemisches luftblasenfreie Einbettung der Embryonen n Jung Einbettmedium Leica Microsystems Nussloch Katalog Nr 020108926 Verwendung von Tissue Embedding Molds Polysciences Inc Katalog Nr 18646A e Lagerung der eingebetteten Embryonen bei 80 C e Herstellung von D nnschnitten mit Hilfe eines Kryotoms Aufnahme der Schnitte auf SuperFrost Plus Objekttrager Langenbrinck Katalog Nr 03 0060 e Schnitte mindestens 2 3 h auf einer Heizplatte 37 C trocknen auf Objekttr gern bei 80 C lagern 2 9 3 RNA Sondensynthese Die RNA Sonden f r die n situ Hybridisierung wurden mit dem Sp6 T7 MaxiScript Kit Ambion Katalog Nr 1320 und mit dem DIG RNA labeling Mix Roche Katalog Nr 11277073910 generiert Um eine m glichst hohe Spezifit t der RNA Sonde zu erreichen wurden nicht homologe Sequenzbereiche
123. ession studies revealed the co expression of Megap and Lpd mRNA for instance in some areas of the hindbrain and the trigeminal ganglia during the murine embryonic development In NIH 3T3 mouse fibroblasts MEGAP and Lpd co localized especially at focal adhesions as well as the cell membrane Lpd was only detected at focal adhesion sites under co expression of MEGAP Live cell analyses revealed that MEGAP inhibits Lpd evoked lamellipodial dynamics independently of its GAP activity Furthermore it was demonstrated that loss of the interaction between MEGAP and Lpd using the SH3 mutant Y755D not only prevents the co localization of both proteins at focal adhesions but also facilitates the formation of small lamellipodial protrusions despite the remaining GAP activity Together these results show that MEGAP inhibits lamellipodial dynamics possibly by relocating Lpd to focal adhesion sites VII Inhaltsverzeichnis 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 3 1 1 4 1 2 1 3 1 3 1 13 2 1 4 2 2 1 2 2 2 3 2 3 1 2 32 2 4 2 5 2 31 232 2 6 2 7 2 451 2 2 213 2 7 4 2 8 2 8 1 2 8 2 2 9 29 1 29 2 2 9 3 2 9 4 2 10 2 10 1 2 10 2 EINLEITUNG Migrationsprozesse als Motor der Entwicklung und Adaption Die Embryogenese in Vertebraten Migration auf zellularer Ebene Regulation des Zytoskeletts Neuronale Migration und die Wegfindung von Axonen Mentale Retardierung als Folge neuronaler Migrationsdefekte MEGAP ist Mitglie
124. euronalen Migration beschreibt einen Zyklus aus drei Schritten Zuerst streckt die Zelle zur Orientierung einen Fortsatz aus leading neurite an dessen Ende sich der so genannte Wachstumskegel growth cone befindet Mit Hilfe des Wachstumskegels untersucht das Neuron akt v die direkte Umgebung und bestimmt somit die Migrationsrichtung n Abh ngigkeit von extrazellul ren S gnalen Der n chste Schritt besteht in der Translokation des Zellkerns n Richtung des leading neurite Abschlie end wird das hintere Ende der Zelle nachgezogen 12 Einleitung Analog zu der Migration mesenchymaler Zellen ist bei der neuronalen Migration die Regulation des Zytoskeletts essentiell Hierbei findet ein eng verwobenes Zusammenspiel zwischen Komponenten des Aktin Netzwerkes und der Mikrotubuli statt Dies kann anhand der Wegfindung des leading neurite veranschaulicht werden Das Auswachsen dieses Fortsatzes wird durch die Verl ngerung geb ndelter Mikrotubuli erm glicht welche auch das Zentrum des Wachstumskegels bilden Der u ere Bereich des Wachstumskegels wird haupts chlich durch das Aktinzytoskelett geformt Aufgrund dieser distinkten Zusammensetzung kann der Wachstumskegel in eine periphere Zone mit Aktinfilamenten eine bergangszone sowie in eine zentrale Zone eingeteilt werden Abbildung 7 A Filopodium Lamellipodium f 7 merge F Aktin tyr MTs ace MIs Abbildung 7 A Darstellung hippokampaler Wachstu
125. g der Polymerase des Bakteriophagen 29 Als Ausgangsmaterial dient eine bernachtkultur des Plasmid Klons Die resultierenden DNA Konkatemere k nnen direkt ohne vorherige Aufreinigung in die Sequenzierreaktion eingesetzt werden Durchf hrung e 1 ul Bakterien bernachtkultur wurden mit 2 5 ul Sample Buffer gemischt und 3 min bei 95 C in 0 2 ml PCR Gef en in einem Thermocycler inkubiert anschlie end Abk hlen der Reaktion auf 4 C e 2 5 ul Reaktions Puffer wurden mit 0 2 ul Phi Polymerase gemischt und zu den Zelllysaten gegeben e Die Polymerisationsreaktion wurde fur 16 h bei 30 C im Thermocycler durchgef hrt Anschlie end wurde das Enzym durch eine 10 min tige Inkubation bei 65 C inaktiviert Vom so erhaltenen Reaktionsansatz wurden 0 5 1 5 ul f r eine bliche Sequenzier PCR Abschnitt 2 5 1 eingesetzt 2 6 Das Gateway Klonierungssystem Ende der 90er Jahre wurden Methoden entwickelt die eine Klonierung ohne die Verwendung von Restriktionsenzymen und DNA Ligasen erm glichten wobei sich insbesondere das Gateway Klonierungssystem Invitrogen als zuverl ssig erwiesen hat Hartley et al 2000 Es beruht auf der sequenzspezifischen Rekombinationsfahigkeit des Bakteriophagen Lambda die sowohl fur den Einbau seines Genoms in das Bakteriengenom als auch fur den Wechsel zwischen lysogenem und lytischem Weg verantwortlich ist Landy 1989 Die dafur notwendigen Clonasen wurden zu einem Klonierungssyste
126. g der SH3 Dom ne f r die Interaktion zwischen MEGAP und Lpd Um zu zeigen dass die beiden Proteine nicht nur unter Uberexpression in einer Zelllinie sondern auch unter physiologischen Bedingungen Komplexe bilden wurde eine weitere Co IP mit embryonalen Kortexneuronen der Ratte durchgef hrt Abbildung 24B Mit Hilfe eines Lpd spezifischen Antikorpers konnten hier sowohl endogen exprimiertes Lpd als auch MEGAP pr zipitiert werden Dies ist eine Bestatigung fur die Interaktion zwischen MEGAP und Lpd in vivo N A B Ze o MEGAPA A A df AA d Myc Lpd Es By 160 kDa u B MEGAP IB MEGAP mee 160 KDa 190 kDa wl n E SS ie led Wee 190kDa 160 e ee 15 MEGAP Abbildung 24 In vitro und in vivo Bindung von MEGAP und Lpd A HEK293 Zellen wurden mit Myc Lpd und MEGAP Expressionskonstrukten transient co transfiziert Die Immunprazipitation erfolgte ca 24 h nach der Transfektion mit einem monoklonalen Myc Tag Antik rper Die Prazipitate wurden mittels Immunoblot analysiert obere Reihe MEGAP mittlere Reihe Myc Lpd Die Co IP zeigt dass nur Wildtyp MEGAP wt an Myc Lpd bindet Mit den beiden MEGAP SH3 Mutanten W781A und Y755D konnte keine Interaktion mit Myc Lpd beobachtet werden Die Kontrollansatze ohne Antikorper Ab control und die Einzeltransfektionen zeigten keine unspezifischen Prazipitate auf B Zelllysate von embryonalen kortikalen Neuronen der Ratte Primarkultur wurden f r eine Co IP mit einem Lpd spez
127. ga tatcgaatge qgagtgtggat acacatctgg atttaaaaga ter taaacca Lladacocte accatggcag gagacgtatt gtgtgtggag See e ee ter adagetactg tete ldce Che ei gen gerad agataattte datFacteog ggagctggcc EQULT Carga ECUCaLeCCCLG aaacagtlececc aalclaaatc gerteactaga aactgetcgat tagaacctta aaaacagtgc OtatleCtqaca reggactgerT cgaggtggaa cocatgtgga ageccececrttca ctgaacar tt gacaaccatt al ee ae e SE e e Ce CELCLLECOC acagcatcat 115 601 661 Tal 781 841 301 961 1021 10841 1141 t201 1261 loal lool 1441 1501 1561 1021 1681 1741 1801 1861 1921 1 981 2041 21 01 21 61 N et 2341 2401 2461 Ze 201 2641 201 2 161 2921 2881 2341 3001 E ee e eng agattattaa aaattagttg EE EE JATGLLLEITTE agttagtgaa tatLetgc aet aaattggtga gactttgcca aaggctaatg RRE eg ag aatgagcttg aagecctotat agaaaaagag Caagaastta ctgtgtataa EE EE e acetgcacaca tggetgtgtg tgaaaatgct L Me e Leg ees Cagetgaaca CLgGUCCcCcatg gctgatgagt aacaggaaga agcagteagt tctatttetaa tgaactgtag CCaggecgcag heen ee tere ACCCCOCTCT aggctgtggt catgcctaaa ctgtgtgata EA RE gie cCagetgtaca tttcecaggett taaatcatga gtttaaaata gaaacatttt gccagaataa cattaggatt aaccagecer EA Neng gaatggacat atagtattaa Caagaaagaa actecrtogga cagaatgaga ggtcagagca aaattgcatt Cavatcacag aaaatgagag aacatgcagc atatataaag gaatcattta ataaaaaata attagaaaaa LUCattCoggac Cagccactag Cagtacatta Gacateccag gagcagagta atcatgttga EE SEET
128. gag aaagagaagc SCeTLgtLatg CCO EE E Een Tacatatllt aggagaccca agtattacce toetatcgogga accatceecag CEET EE EE GEET LN ee Lee L ge Lee Reef Ccaacctcggge agcecactce aCCCUGtLCad ISELLLOCCTE LIgaL L9sStt BALL eeh eene agcttaaaaa Anhang aatagccaat CCCTLOGaccL ACgEcttetg CISCcCelacg tagaggccga cgccagagga cacggtcgaga cagtggacat cgaaggcecrt EITLITC ALE tgeeggtggt EE CHE ECRLIOL Cac EIGECCESTE agacatgtca qaacaactgt EQCCEGCCCE gectetcygtga CCacergcet CotCecagtert SEEOIGELLeH ELIAS gELEctg gtreecteacat Claagrcecat gcactgagag SCOCCAgEeTE dacaecctadge eggtgeaagt Lagccagcct EE EE GER Ee ee e CCaccectga ECCCCaAGOLEC gggttttgtg ELLIGELEC aaaaaaaaaa EE Ee gggggaccta OGECCLCcac cggggtggcc ggtggccgag te eet enge ggtggtgggc EE EE ggtggtagca agtggtggca GgeCatlcgce catgaaggec cgaggccatg Cacgggggag aaccgcccrg EE EE acc QcCUCacacaa EE EE EE gggttcctgg ggggaggaga CUTLLUCC Gada agdacctada gctacacagaa Tatlecetcat ggctcaatca gggcreacch GA e tee hee er ELtagcLgge ggagacttga gggcctgaaa ctggaacoctt arececaect COCCCOCECAC Cagggtettg tatattttgt aaaaaaa Cagggggtcc Let e tee E ei eiert caatgcgggg gaggaaacga Jaggaggacc ae COECCEUCa Ste te eege tel tgggtggggg gtggccartcg cccacgaagg Ctqggacacg accatcgagg ggggecaccg ctcetcgecgaca acCCCIgggLge CCCCECL gga EE EE SITILLLLETG Gagaccggad agallcgcce GCCGOttacc CUCctgacaca ggggtgggga gecggarcctg CLOCCAGCOC TEE agaggtgaga Caa
129. ge technical literature 102 Anhang Klonname Insert Versuche pST mMEGAP 25 30 MEGAP a b RNA ISH Bp 2504 3010 pST mRobol Robol RNA ISH Bp 4071 4555 pST mL pd 267 827 Lpd RNA ISH BP 267 827 5 3 2 pBluescript II SK fl origin 21 327 B galactosidase fragment 460 816 multiple cloning site 653 760 lac promoter 817 938 pUC origin 1158 1825 ampicillin resistance bla ORF 1976 2833 ampicillin pBluescript II SK 3 0 kb pUC ori pBluescript II SK Multiple Cloning Site Region sequence shown 598 826 Apa Hinc ll EcoO 109 cc BssH II T7 Promoter kpa e ll Xho Sal Ee M13 20 primer binding site T7 primer binding site KS primer binding site Bspl06 Not Cla Hind Ill EcoRV EcoRI Pal Smal Boni Spel Xba Fag Bal Sacll Sacl GGTAT laity TREE REES aha een enee eieiei KS primer binding site SK primer binding site T3 Promoter BssH II 3 gal frag ment l in a LEE N URL UN nn dl du mil nn ra lan T3 primer binding site 13 Reverse primer binding site Abbildung 41 Vektorkarte pBluescript II SK nach Stratagene Homepage Vector Maps amp Sequences Klonname Schnittstellen Schnittstellen Insert Bemerkung Vektor Insert pBSII Lamellipodin full Bglll SalI BglII Sall Lamellipodin Vektor KIAA1681 length Bp Start 467 Insert PCR aus IRAK p961 N 1864 Q2 Lpd 103 Anhang 5 3 3 pGEX4T pGEX 4T 1 27 4580 01 Thrombin
130. gqgqagc ggaaaggcag L eessen ger aggcggctaa OCCatGatad EE agggaatcct eeLracg3gce ccecgtargt qgqoceocaagtrt Cecaaggccc geccaaacag agcagatget acgaggaaaa gggggaaagg CCACCECLOCC egteaclaca c Ccatocage aaatggagtt Et Ee CELLLCOCCCCC attggataaa cctggacagce EE EE cctgcagacc tettaacaat LCtactgace taaactggtg SITCOLLTLE gQaaagataag tetgacagag OGCCaagecet oc ogagac caagtacaac ELOIOC3ScEcee agagatcaaa LCELaattca Lacggcr gc EE e SE Le tede Lee tee e tee gQaagaggaaa atiggatgaa gcgagagata catggaggag cacccctgga LCaggagcre Calaeccecet Egageactcrg SCELECagtt tggaggagga ee ee ggtgccacart 111 2401 2461 Zoot Bord 2641 2701 2761 2021 2881 2341 30017 3061 3121 alol 3241 S301 3361 3421 3481 3541 3601 3661 cera alol 3841 S901 S961 4021 4081 4141 4201 4261 2321 ai 4441 4501 ggGactectag aagggcartge cctggtgggc CCCTELCEOGTG ccaggtectg EE cgagggggce ggtgggggca ggaagtgggc CoOeECCCCac qgcccoctggog agcatgggtg ggccaccggc Catgagctace ggaggccaca aagggcaact gecocggcece agcacc rece Cagtgqgqgtcc atggcccggg gaccatacca cattccgagg ctggtggggg tgggcaacag abCgccecca aaggcccectgg gaggaatggg gaagtggtgg etcatgatgt gtggccatga gccatggagg gcegetatga ccectgcccsaccatt OCECTLECCa ggagccggce cgcattgatg actgctgaag EE EE CCCCLACCCL Cactlaagda ggggtattgt Cacacalcal te Let eege qgcgaacteg TLIGECSLgGECE SICELCLeSE ELLITIASTE Faggt ctlle Caacaagatg atgaaaacag tgaggat
131. h Enzyme Fixed modifications Variable modifications Mass values MS MS Ion Search Trypsin Carbamidomethyl C Oxidation M Monoisotopic Homo sapiens Queries matched 2 Queries matched lar to SLIT ROBO Rho GTPase activating protein 3 lar to SLIT ROBO Rho GTPase activating protein 3 activating protein 2 Queries matched 2 2 Queries matched Homo sapiens Queries matched 2 3 isoform srGAP3 srGAP2 Canis familiaris Oxidation M Oxidation M Oxidation M Oxidation M SVETDSSTVEHVR C SVETDSSTVEHVR C FINMFAVLDELK N Oxidation M YIETSAHYEENK S YIETSAHYEENK S NYGVIIPYPPSNR Y YSNSEVVTGSGLDSOK S WAVE associated 2 Bos taurus activating protein activating protein Queries matched Queries matched 2 3 isoform 2 3 isoform 3 Bos taurus a isoform 1 activating protein Delta Miss Score 0 0 0 Queries matched 2 3 isoform Queries matched 2 Queries matched 2 Mus musculus Queries matched 3 16 21 61 0 00066 1 5 4e 02 Queries matched Queries matched Queries matched b isoform 2 Expect Rank Peptide 1 R QVYGLNFGSK E 1 K APSTSTPEPTR K 1 R VHIYHHTGNNTFR V Macaca mulatta Macaca mulatta 121 Protein Mass Unrestricted Peptide Mass Tolerance 200 ppm Fragment Mass Tolerance 0 1 Da Max Missed Cleavages z TL Instrument type ESI QUAD TOF Number of q
132. h einen Wachstumsfaktor keine Membranforts tze bzw Lamellipodien Dieser Effekt wird durch die GTPase aktivierende Funktion von MEGAP auf Racl und die daraus resultierende Hemmung der Aktinpolymerisation gefordert Endris et al 2002 Soderling et al 2002 Um die Proteinlokalisation von MEGAP und Lpd an der Migrationsfront und an benachbarten zellularen Strukturen zu untersuchen wurde zus tzlich die GAP defiziente MEGAP Mutante MEGAP RI R5421 verwendet welche keinen storenden Einfluss auf das Aktinzytoskelett ausubt Yang et al 2006 71 Ergebnisse Abbildung 26 Epifluoreszenzaufnahmen von NIH 3T3 Zellen unter Serum reduzierten Bedingungen ausges t auf Fibronektin und transient transfiziert mit mCherry Lpd und MEGAP EYFP Expressions konstrukten MEGAP und m geringeren Ausma auch Lpd zeigten eine deutliche Lokalisation an der Zellmembran Der Ma stabsbalken entspricht 5 um Aus fr heren Studien st bekannt dass Lpd mit den Mitgliedern der Akt n assoziierten Ena V ASP Proteinfamilie interagiert und in die Regulation von Lamellipodien Dynamiken eingebunden ist Krause et al 2004 Um die Lokalisation von MEGAP und Lpd gezielt an den Strukturen von Zellforts tzen und an der Migrationsfront von Lamellipodien zu untersuchen wurde die TIRF Mikroskopie eingesetzt vgl Abschnitt 2 16 Dies erm glichte die hoch aufgel ste Visualisierung von Adh sionsstrukturen und der Zellmembran n unmittelbarer N he des Deckglasbo
133. h wurde den Platten 3 AT ein spezifischer Inhibitor der Histidinsynthese n steigenden Konzentrationen zugegeben um die Autoaktivierung und das damit verbundene Wachstum zu unterdr cken Im Vorversuch wurden je 2ul frischer bernachtkultur der Kontrollst mme A E in 1 10 1 100 und 1 1000 Verd nnungen auf Selektionsplatten mit steigenden 3 AT Konzentrationen 10 mM 25 mM 50 mM 75 mM 100 mM aufgebracht und drei Tage bei 30 C inkubiert Ausgehend von diesen Ergebnissen wurde eine Konzentration von 25 mM 3 AT ausgew hlt welche anschlie end mit einem Kontrollexperiment verifiziert wurde Analog zur Vorselektion der 3 AT Konzentration wurden je 2ul frischer bernachtkultur in 1 10 und 1 100 Verd nnungen auf Leu Trp His Platten mit 25 mM 3 AT aufgebracht Hierbei wurden die Kontrollstamme B C und D sowie mit pDEST32 MEGAP C bzw pDEST32 MEGAP SH3 KID und pDEST22 ROBOI CC3 WAVE 1 und pDEST22 parentaler Vektor doppelt transformierte Hefest mme verwendet Abbildung 14 Das Ergebnis wurde w eder nach drei Tagen Inkubation bei 30 C ausgewertet Wie Abbildung 14 zeigt besitzen beide MEGAP Fragmente in Co Transformation mit pDEST22 III und VI keine autoaktivierenden Eigenschaften bei Zugabe von 25 mM 3 AT Des Weiteren konnte sowohl f r d e Konstrukte pDEST32 MEGAP C und pDEST32 MEGAP SH3 KID die Interaktion zwischen MEGAP und der CC3 Dom ne von Robol im 45 Material und Methoden Hefesystem best tigt werden Im Gegensatz daz
134. hdem die neuronalen Zellk rper ihre Zielposition erreicht haben Dieser Prozess ist essentiell f r den Aufbau einer Vielzahl neuronaler Verkn pfungen bzw Synapsen sowohl im zentralen als auch im peripheren Nervensystem Ein Hauptmechanismus stellt in diesem Zusammenhang die Chemotaxis dar wobei die Wachstumskegel molekulare Gradienten detektieren und diesen folgen Abbildung 8 Die S gnalmolek le k nnen sowohl absto ende als auch attraktive Effekte auf die Migration des Wachstumskegels haben indem sie S gnaltransduktionskaskaden aktivieren die entweder die Degradation von Aktin und Mikrotubuli initiieren oder deren Polymerisation bef rdern Wichtige Vertreter dieser S gnalmolek le geh ren u a zu den Proteinfamilien der Netrine Semaphorine Slits und Ephrine Dickson 2002 Plachez and Richards 2005 D Gradient Area of Interest F actin Microtubule S dynamic end z Stable end Abbildung 8 Orientierung des Wachstumskegels anhand eines attraktiven Gradienten 1 Gleichm ige Verteilung von Filopodien und Lamellipodien Im Axonschaft liegen die MT stark geb ndelt vor deren Struktur sich 1m Wachstumskegel auflockert und ausbreitet 2 Nach der Detektion des Signals findet selektive Aktinpolymerisation in Richtung des Gradienten statt vermehrte Ausbildung von Filopodien und Lamellipodien am anderen Ende Aktinabbau Die MT Enden werden in Aktin reichen Regionen transient gebunden und durch Interaktion mit
135. hrend sich die Zelle vorw rts bewegt l sen sich einige Fokale Adhasionen auf und die Zelle beginnt eine neue Phase des Migrationszyklus Die Zelle bildet neue Forts tze aus die wieder durch Adh s onskontakte an der Migrationsfront stabilisiert werden F r eine 10 Einleitung gerichtete Vorw rtsbewegung m ssen nicht nur Zellforts tze gebildet und stabilisiert sondern ein Teil der generierten Adhasionskontakte wieder aufgel st und das hintere Ende der Zelle von der Matrix gel st werden Der koordinierte Auf und Abbau Fokaler Adhasionen wird u a durch das Mikrotubuli Netzwerk reguliert Insbesondere die Aufl sung Fokaler Adh s onen wird durch die zielgerichtete Lokalisation von Mikrotubuli an die Adhasionen initiiert Dies erfolgt zun chst durch Destabilisierung der Adhasion durch mechanischen Spannungsabbau der Aktin Stressfasern und assoziiertem Myosin Im Anschluss daran l sen sich die Komponenten der Adh s on ber Kontraktion der Aktin Fasern oder Endozytose vom Substrat Broussard et al 2008 1 1 3 Neuronale Migration und die Wegfindung von Axonen Eine auBergewohnliche Art der Zellmigration stellt die Musterbildung innerhalb des sich entwickelnden Nervensystems dar Obwohl wahrend der Proliferation und Migration neuronaler Vorlauferzellen und Neuronen die gleichen Migrationsmechanismen wie bei anderen mesenchymalen Zellen angewendet werden findet nach der Differenzierung eine station re Positionierung der neuronal
136. hst 1m Rahmen der Suche nach Interaktionspartnern f r den Drosophila Roundabout Rezeptor Robo identifiziert Die Proteinfamilie setzt sich aus den Proteinen srGAPI srGAP2 und 15 Einleitung stGAP3 MEGAP zusammen Sie besitzen eine Proteinstruktur mit hoch konservierten Dom nen welche eine N terminale FCH Dom ne Fes CIP4 homology domain eine zentrale RhoGAP Dom ne und eine SH3 Dom ne Src homology 3 domain beinhaltet Wong et al 2001 Abbildung 9 Die Prolin reiche zytoplasmatische CC3 Dom ne der Robo Rezeptoren bindet direkt an die SH3 Dom ne der srGAP Familie Das Motiv der SH3 Dom ne ist weit verbreitet und stellt ein wichtiges Modul f r Protein Protein Interaktionen und damit verbundene Signalkaskaden dar Mayer 2001 Neben der Bindung an die CC3 Dom ne von Robol interagiert MEGAP ber die SH3 Dom ne auch mit dem WAVE 1 Komplex Soderling et al 2002 WAVE 1 Soderling et al 2002 Robo1 Wong et al 2001 cAbl Endris et al 2009 R542 Fact Y755 W781 Yang et al 2006 Endris et al 2009 Soderling et al 2002 Abbildung 9 Dom nenstruktur des MEGAP Proteins Uber die GAP Dom ne inaktiviert MEGAP spezifisch Racl und auch Cdc42 nicht im Schema gezeigt Die MEGAP SH3 Dom ne spielt eine wichtige Rolle bei Protein Protein Interaktionen wie z B der Interaktion zwischen MEGAP und dem WAVE 1 Komplex oder Robol Sowohl f r die GAP als auch die SH3 Dom ne wurden funktionell ess
137. idues Taxonomy Mus musculus house mouse 100484 sequences Timestamp 7 Aug 2006 at 14 10 32 GMT Significant hits gi 31044495 YLP motif containing 1 Mus musculus gi 16797665 GAP3 Mus musculus gi 74189848 unnamed protein product Mus musculus Probability Based Mowse Score Ions score is 10 Log P where P is the probability that the observed match is a random event Individual ions scores gt 35 indicate identity or extensive homology p lt 0 05 Protein scores are derived from ions scores as a non probabilistic basis for ranking protein hits Number of Hits e Za ry om Ga Lo D VD D Oo Low e D I Sy Probability Based Mowse Score Archive Report of Selected Matches 1 gi 31044495 Mass 155091 Score 309 Queries matched 13 YLP motif containing 1 Mus musculus Query Observed Mr expt Mr calc Delta Miss Score Expect Rank Peptide 9 474 25 946 49 946 45 0 04 0 16 5 6 1 R DWEAIASR M E 475 76 949 50 949 46 0 04 1 22 1 4 1 R RTYPEER M 24 526 77 1051 52 1051 48 0 04 0 26 0 54 1 K DOLOEYEK O 25 529 79 1057 56 1057 52 0 04 0 4 le 02 1 K EVEFGGPAPR V 47 602 79 1203 56 1203 53 0 04 0 29 0 24 1 R STFDADHAGOR D 51 612 36 1222 70 1222 67 0 03 0 14 Tes 1 K NVDDILKPPGR E 117 52 614 32 1226 63 1226 59 0 04 53 618 81 1235 61 1235 57 0 04 54 621 31 1240 61 1240 57 0 04 55 651 35 1300 68 1300 64 0 04 57 663 85 1325 69 1325 65 0 04 65 725 39 1448 77 1448 73 0 04 76 597 68 1790 01 1789 97 0 04 gi 16797665 GAP3 Mus mu
138. ie Durchf hrung erfolgte nach den Angaben des Herstellers 2 10 3 Isolation von Plasmid DNA aus Hefen Die Aufreinigung von Plasmid DNA aus Hefen war f r die Identifizierung der putativen Interaktionspartner von MEGAP und f r die Transformation der entsprechenden Plasmide in Bakterien erforderlich Hierzu wurden Plasmide aus fl ssigen Hefekulturen nach folgendem Protokoll isoliert Hoffman and Winston 1987 e aus einer einzelnen Kolonie eine Ubernachtkultur UNK im entsprechenden Selektivmedium an mpfen und mindestens 16 h ber 30 C und 160 rpm inkubieren e 1 5 ml der UNK f r 5 min bei 13000 rpm abzentrifugieren e Uberstand verwerfen und Pellet in 200 ul Yeast Lysis Solution resuspendieren e 200 ul Phenol Chloroform Isoamyl Alkohol 25 24 1 und 0 3 g Glass Beads Partikelgr e 400 600 um Sigma Bestellnr G8772 zugeben und 2 min vortexen e 5 min bei 13000 rpm abzentrifugieren und den berstand in ein neues 1 5 ml Reaktionsgef berf hren e Zugabe von Si 10 Volumen 3M NaAc und 2 5x Volumen Ethanol e 40 min bei 13000 rpm abzentrifugieren Uberstand verwerfen und Pellet in 100 ul Ethanol resuspendieren e 2 min bei 13000 rpm abzentrifugieren Uberstand verwerfen Pellet in 20 ul H O bidest l sen davon 2 ul in die Bakterien Transformation einsetzen 41 Material und Methoden 2 10 4 Das Yeast Two Hybrid System Das Yeast Two Hybrid System ist eine molekulargenetische Methode zur Identifizierung und Charakter
139. ifischen Antik rper eingesetzt Die Analyse der Pr zipitate mit einem MEGAP spezifischen Antik rper weist darauf hin das d e Interaktion zwischen MEGAP und Lpd auch in vivo und in einem neuronalen Kontext stattfindet Haussmann et al 2009 Im Unterschied zur Analyse der Interaktion zwischen MEGAP und Lpd konnten f r mDial keine konsistenten Ergebnisse produziert werden Entweder wurde nur eine sehr schwache oder teilweise auch gar keine Bindung von MEGAP an mDial detektiert nicht gezeigt Dies kann darin begr ndet sein dass mDial in einem bestimmten Aktivitatsstatus vorliegen muss damit die Interaktion zu MEGAP stattfinden kann Da sich die Interaktion zwischen MEGAP und mDial nicht best tigen lie wurde bei der funktionellen Analyse der Protein Protein Interaktionen der Fokus auf die Rolle der Bindung von MEGAP an Lpd gerichtet 69 Ergebnisse 3 4 MEGAP und Lamellipodin werden teilweise co exprimiert Mit Hilfe der Co IP konnte belegt werden dass MEGAP und Lpd in vivo und besonders in Neuronen Komplexe bilden Demnach sollte das Expressionsmuster beider Proteine in distinkten neuronalen Strukturen berlappen Da der in dieser Arbeit verwendete MEGAP Antik rper nur im Western Blot eine ausreichend hohe Spezifit t aufwies wurde die Expression von Lpd im Vergleich zu Megap in Zusammenarbeit mit Dr Claire Bacon mittels RNA in situ Hybridisierung analysiert Abbildung 25 Abbildung 25 RNA in situ Hybridisierung mit Sonden
140. igem Mischen Inkubation bei RT f r 20 min e Zugabe des Lipofectamine 2000 DNA Gemischs zu den Zellen e Mediumwechsel 4 h nach der Transfektion 50 2 13 Material und Methoden Immunfluoreszenz Verwendete Puffer und Materialien Lab Tek II Chambered Coverglass 4 Well Nunc Bovine Plasma Fibronectin Invitrogen Fixierungsl sung 4 PFA Sucrose in 1x PBS Blocklosung 3 Bovines Serum Albumin Fraktion V ICN in Ix PBS 0 1 Tween Phalloidin TRITC SIGMA DAPI 4 6 Diamidino 2 phenyl indole 2 mg ml Serva Vectashield mounting medium Vector Labs Die verwendeten Zellen wurden fur die Immunfluoreszenz Experimente mit einer Dichte von ca 30 auf beschichtete Glasdeckglaser Gi 12 mm oder in 4 Well Kammern mit Deckglasboden ausges t F r HEK293 Zellen gen gt die Beschichtung der Deckgl ser mit Poly D Lysin Bei Versuchen mit NIH 3T3 Zellen wurde eine Beschichtung mit Fibronektin vorgenommen um die Zelladhasion zu verbessern Die adh renten Zellen wurden transfiziert und am n chsten Tag fixiert Anschlie end fand die Immunf rbung mit spezifischen Antik rpern statt Hierbei wurde wie folgt vorgegangen Medium von den transfizierten Zellen entfernen Zellen mit 37 C warmen 1x PBS waschen Zellen mit 4 PFA Sucrose in 1x PBS f r 10 min bei 37 C fixieren Zellen 3x 5 min mit 1x PBS waschen Zellen 1x 10 min mit 1x PBS 0 1 Tween 20 PBS T permeabilisieren Blocking 60 min mit 3 BSA in 1x PBS T
141. ine allgemeine Aussage ber die Qualit t des Yeast Two Hybrid Screens treffen zu k nnen wurden auch einige Klone mit geringer Reporteraktivit t einbezogen IV Identifizierung der ausgew hlten Hefeklone Ausgehend von den Ergebnissen des Galactosidase Fl ssigassays wurde die Identit t von 10 Hefeklonen mittels DNA Sequenzierung und anschlie endem Vergleich mit bekannten 62 Ergebnisse Sequenzen der Datenbank des National Center for Biotechnology Information NCBI bestimmt Tabelle 10 Hierbei muss jedoch angemerkt werden dass nur die Klone 1 16 20 und 29 eine Aktivierung der Reportergene aufzeigten welche sich deutlich von den Werten der Negativkontrolle abheben konnte Klon Nr Identit t Lokalisation Leserahmen 9 Homo sapiens internexin neuronal 3 UTR nd intermediate filament protein alpha INA 10 Homo sapiens internexin neuronal 3 UTR nd intermediate filament protein alpha INA 14 Homo sapiens ribosomal protein L23 ORF 4 RPL23 mRNA Verschiebung um eine Base Generierung eines Stoppkodons Verschiebung um eine Base Generierung eines Stoppkodons Verschiebung um eine Base Generierung eines Stoppkodons Homo sapiens MARCKS like 1 MARCKSL1 mRNA 23 Homo sapiens PTK2 protein tyrosine kinase ORF 2 Focal adhesion kinase 1 29 DPH3 KTI11 homolog S cerevisiae ORF Homo sapiens Tabelle 10 Auflistung der im Rahmen des Yeast Two Hybrid Screens eindeutig identifizi
142. ins active scaffolds that remodel the cytoskeleton Trends Cell Biol 3 435 446 Waltereit R Kautt S and Bartsch D 2008a Expression of MEGAP mRNA during embryonic development Gene Expr Patterns 8 307 310 Waltereit R Leimer U Endris V von Bohlen und Halbach O Panke J Baier V Till S Haderer J Kutscherjawy S Nescholta S Sartorius A Rappold G Bartsch D and Hrab de Angelis M 2008b Characterisation of MEGAP srGAP3 mental retardation mouse model 249 13 In Annual Meeting of the Society for Neuroscience Washington 132 Referenzen Watanabe N and Mitchison T J 2002 Single molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia Science 295 1083 1086 Watanabe T Noritake J and Kaibuchi K 2005 Regulation of microtubules in cell migration Trends Cell Biol 5 76 83 Westphal R S Soderling S H Alto N M Langeberg L K and Scott J D 2000 Scar WAVE 1I a Wiskott Aldrich syndrome protein assembles an actin associated multi kinase scaffold Embo J 19 4589 4600 Wong K Ren X R Huang Y Z Xie Y Liu G Saito H Tang H Wen L Brady Kalnay S M Mei L Wu J Y Xiong W C and Rao Y 2001 Signal transduction in neuronal migration roles of GTPase activating proteins and the small GTPase Cdc42 in the Slit Robo pathway Cell 707 209 221 Yam P T Wilson C A Ji L Hebert B Barnhart E L Dye N A Wiseman
143. isierung von Protein Protein Interaktionen Mit diesem System k nnen cDNA Bibliotheken gezielt nach bisher unbekannten Interaktionspartnern durchsucht werden Des Weiteren besteht die M glichkeit zwei bereits bekannte Proteine auf eine m gliche Interaktion zu testen In dieser Arbeit wurde der erste der beiden Ans tze verwendet um neue Interaktionspartner f r das Protein MEGAP zu suchen Das Yeast Two Hybr d System bas ert auf der Beschaffenheit vieler eukaryontischer Transkriptionsfaktoren die aus zwei voneinander trennbaren funktionell unabh ngigen Dom nen aufgebaut sind In Saccharomyces cerevisiae bedient man sich normalerweise des Transkriptionsfaktors GAL4 Dieser besitzt zwei verschiedene Dom nen eine zum Binden an die DNA Bindedom ne GAL4 DB und eine welche die Transkription aktiviert Aktivierungsdom ne GAL4 AD Obwohl die beiden Dom nen sich normalerweise auf derselben Polypeptidkette befinden sind diese auch dann wirksam wenn sie von zwei unterschiedlichen Proteinen ber n chtkovalente Protein Protein Interaktionen zusammengebracht werden Dazu bedient man sich zweier in Hefe kompatibler Expressionsvektoren Jedes der beiden Plasmide tr gt jeweils ein f r das entsprechende Experiment konstruiertes Fusionsgen Dieses kodiert 1m ersten Fall f r ein Hybridprotein das aus der GAL4 DB besteht und an der sich die Aminos uresequenz anschlie t f r die ein potentieller Bindungspartner gefunden werden soll bait
144. istance gene bla bases 4432 5428 complementary strand ORF bases 4432 5292 complementary strand Ribosome binding site bases 5300 5304 complementary strand bla promoter P3 bases 5227 5333 complementary strand Abbildung 43 Vektorkarte pcDNA3 1 nach Invitrogen Homepage Vector Maps 104 Anhang Klonname Schnittstellen Schnittstellen Insert Versuch Vektor Insert pcDNA3 1 EcoRI Xbal EcoRI Xbal MEGAPa Co IP MEGAPa pcDNA3 1 EcoRI Xbal EcoRI Xbal MEGAPa Co IP MEGAPa W781A W781A 5 35 pcDNA4 TO mycHis C pcDNA4 TO myc His A B C Comments for pcDNA4 TO myc His A 5151 nucleotides CMV promoter bases 232 958 Unique in versions Aand B only TATA box bases 804 810 e Unique in version B only Tetracycline operator 2 2X TetO sequences bases 820 859 Unique in version C only CMV Forward priming site bases 769 789 Multiple cloning site bases 968 1069 c myc epitope bases 1073 1102 Polyhistidine 6xHis tag bases 1118 1135 BGH reverse priming site bases 1158 1175 BGH polyadenylation sequence bases 1164 1388 fi origin bases 1434 1862 SV40 promoter and origin bases 1867 2211 EM 7 promoter bases 2253 2319 Zeocin resistance gene bases 2320 2694 SV40 early polyadenylation sequence bases 2824 2954 pUC origin bases 3337 4010 complementary strand bla promoter bases 5016 5114 complementary strand Ampicillin bla resistance gene bases 4155 5015 complementary strand
145. it Hilfe der Anwendung eines Kymograph Makros f r ImageJ wurde das Bild dieser Linie von jeder Einzelaufnahme des Films kopiert und entlang der x Achse eingef gt Das f r einen Filmausschnitt generierte zusammengesetzte Kymograph Bild stellte die r umliche Bewegung der Zellmembran in Abh ngigkeit von der Zeit dar ber das Vermessen der Steigung von prim ren Wachstumsmaxima der gebildeten Lamellipodien dx dt konnte deren Wachstumsgeschwindigkeit berechnet werden um min Zus tzlich zur Quantifizierung der Wachstumsgeschwindigkeiten primarer Lamellipodien wurden deren max male Umf nge nach PDGF Stimulierung m Verh ltnis zum Umfang der gesamten unstimulierten Zelle serum starved bestimmt Abbildung 15B Die Umf nge einzelner Lamellipodien bzw der ganzen Zelle wurden ebenfalls mit Hilfe der ImageJ Software vermessen Die statistische Analyse der Wachstumsgeschwindigkeiten und Umfangverhaltnisse der gebildeten Lamellipodien wurde mit der SAS V9 1 Software fur Windows unter Anwendung eines generalisierten linearen Modells mit wiederholten Messungen durchgefuhrt Globale Tests und multiple paarweise post hoc Vergleiche mit dem Tukey Test wurden durchgef hrt wobei statistische Signifikanz bei einem p Wert von p lt 0 05 angenommen wurde Kymograph Z Projektion serum starved stimuliert PDGF Abbildung 15 Quantifizierung von Lamellipodien Wachstumsgeschwindigkeiten und Umf ngen Darstellung anhand von EYFP Lamellipodin
146. k nnen Yu et al 1994 Yu et al 2001 Takahashi et al 2008 NIH 3T3 Zellen welche Wildtyp MEGAP berexprimierten bildeten nach der Stimulierung durch PDGF kaum Lamellipodien oder kleinere Zellforts tze aus Abbildung 28A Im Unterschied dazu reagierten Zellen unter berexpression der GAP defizienten Mutante MEGAP RI auf die Behandlung durch PDGF mit ausgepr gter Lamellipodienbildung Abbildung 28B Diese Beobachtung ist mit der Tatsache vereinbar dass MEGAP RI im Unterschied zum Wildtyp die Zellmotilitat nicht einschrankt Yang et al 2006 Durch die Einbeziehung von MEGAP RI konnte hier gezeigt werden dass die Unterdr ckung von PDGF induzierten Lamellipodien haupts chlich durch die GTPase aktivierende Funktion der GAP Dom ne verursacht wird Um GAP unabhangige Effekte von MEGAP auf Lpd zu untersuchen wurde die Mutante MEGAP RI n weiterf hrende Studien einbezogen MEGAP wt PDGF MEGAP RI PDGF Abbildung 28 Inhibierung von PDGF stimulierten Lamellipodien durch Wildtyp MEGAP aber nicht durch die GAP defiziente Mutante MEGAP RI Epifluoreszenzaufnahmen von PDGF stimulierten 4 min 100 ng ml NIH 3T3 Zellen ausgesat auf Fibronektin und transfiziert mit MEGAP EYFP Expressionskonstrukten Im Gegensatz zu Wildtyp MEGAP A konnten Zellen welche mit dem GAP defizienten MEGAP RI transfiziert waren B ausgepragte PDGF induzierte Lamellipodien ausbilden wei e Pfeile Die MaBstabsbalken in A und B entsprechen
147. kalen Adhasionen fungiert Diese Annahme wird durch das Ergebnis gestutzt dass die Mutation des 92 Diskussion Tyrosinrestes Y755 nicht nur die Interaktion zwischen MEGAP und Lpd stort sondern auch die Lokalisierung beider Proteine an Fokale Adh s onen unterbindet Mit hoher Wahrscheinlichkeit vermittelt die MEGAP SH3 Dom ne die Bindung von MEGAP an die Proteine der Fokalen Adh s onen In Abwesenheit von MEGAP wird Lpd in Fibroblasten nicht an Fokalen Adhasionen detektiert Im Gegensatz dazu ist bei den Ena VASP Proteinen bekannt dass sie ber die Interaktion mit FPPPP Motiven in Zyxin und Vinculin gezielt an Fokale Adh sionen geleitet werden Gertler et al 1996 Drees er al 2000 Dennoch wirkt sich die Bindung von Lpd an die Mitglieder der Ena VASP Familie nicht auf dessen zellul re Lokalisation aus Krause er al 2004 In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden dass Lpd durch die Interaktion mit MEGAP von der Migrationsfront entfernt und an Fokale Adh s onen umgelagert wird vgl Abbildung 38 Dies weist auf eine Ver nderung der Funktionalit t des Lpd Proteins h n Um den Einfluss von MEGAP auf Lpd bezogene Aktin Dynamiken zu beurteilen wurden lamellipodiale Wachstumsgeschwindigkeiten n Fibroblasten unter der Expression von MEGAP und Lpd quantifiziert Hierbei musste zwischen den Auswirkungen von MEGAP auf die Racl WAVE I bzw auf die Lpd vermittelte Regulation von Aktin Dynamiken unterschieden werden Zu
148. l Cdc42 Rac regulatory network Proc Natl Acad Sci USA 705 1931 1936 Plachez C and Richards L J 2005 Mechanisms of axon guidance in the developing nervous system Curr Top Dev Biol 69 267 346 Plattner R Kadlec L DeMali K A Kazlauskas A and Pendergast A M 1999 c Abl is activated by growth factors and Src family kinases and has a role in the cellular response to PDGF Genes Dev 1 3 2400 2411 Pollard T D 2007 Regulation of actin filament assembly by Arp2 3 complex and formins Annu Rev Biophys Biomol Struct 36 451 477 130 Referenzen Pollard T D and Borisy G G 2003 Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments Cell 772 453 465 Ponti A Machacek M Gupton S L Waterman Storer C M and Danuser G 2004 Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells Science 305 1782 1786 Quinn C C Pfeil D S Chen E Stovall E L Harden M V Gavin M K Forrester W C Ryder E F Soto M C and Wadsworth W G 2006 UNC 6 netrin and SLT 1 slit guidance cues orient axon outgrowth mediated by MIG 10 RIAM lamellipodin Curr Biol 6 845 853 Quinn C C Pfeil D S and Wadsworth W G 2008 CED 10 Racl mediates axon guidance by regulating the asymmetric distribution of MIG 10 lamellipodin Curr Biol 78 808 813 Rakic P 1972 Mode of cell migration to the superficial layers of fetal monkey neocortex J Comp Neurol 45 61 83
149. lker Endris unver ffentlichte Daten Da MEGAP haupts chlich m zentralen Nervensystem eine wichtige Rolle einnimmt Endris er al 2002 Soderling er al 2007 wurde gezielt nach MEGAP bindenden Proteinen gesucht die in Neuronen exprimiert werden Im Gegensatz zu mDial konnte die Bindung von Lpd an die MEGAP SH3 Dom ne auch auf neuronaler Ebene gezeigt werden Im Anschluss an die GST Pulldown Experimente erfolgte die Verifizierung der Interaktion zwischen MEGAP und Lpd mit Hilfe von Co IP Studien Sowohl unter berexpression von MEGAP und Lpd n HEK293 Zellen als auch mit der Co IP endogen exprimierter Proteine aus embryonalen Kortexneuronen konnte eine Interaktion zwischen MEGAP und Lpd aufgezeigt werden hnlich der Bindung von MEGAP an WAVE 1 Soderling er al 2002 Endris er al 2009 wurde hier dargelegt dass dessen Assoziation mit Lpd von einer intakten MEGAP SH3 Dom ne abh ngt Die direkte Interaktion zwischen MEGAP und WAVE I wird durch die Phosphorylierung eines Tyrosinrestes innerhalb der MEGAP SH3 Dom ne reguliert In fr heren Studien konnte gezeigt werden dass die Protein Tyrosin Kinase c Abl welche in die Signaltransduktion von WAVE I und Robol eingebunden ist Bashaw er al 2000 Westphal et al 2000 direkt mit MEGAP interagiert und den Tyrosinrest Y755 der MEGAP SH3 Dom ne phosphoryliert Der Phosphorylierungsstatus von Y755 beeinflusst nicht nur die Bindung von MEGAP an WAVE I sondern auch dessen raumzeitliche zel
150. ltliche ProQuest Two Hybrid System with Gateway Technology der Firma Invitrogen verwendet werden Dazu wurde die MEGAP C kodierende cDNA zun chst 43 Material und Methoden in den pENTR2B Vektor kloniert und anschlie end ber das Gateway System Abschnitt 2 6 in den pDEST32 Vektor f r die Expression in Hefen transferiert Die Einhaltung des korrekten Leserasters wurde nach der Generierung des pENTRY Vektors berpr ft da m Verlauf der Gateway Klonierung keine Sequenz nderungen erfolgen ATG MEGAP C TGA Fes Cip FCH pDEST 32 12266 bp Abbildung 13 Schematische Darstellung des MEGAP C Konstruktes fiir den Yeast Two Hybrid Screen Das C terminale MEGAP Fragment wurde mittels LR Reaktion aus einem ENTRY Vektor pENTR MEGAP C in den pDEST32 Vektor transferiert welcher auch die DNA bindende Dom ne bzw den bat exprimiert Zusatzlich zu dem in Abbildung 13 dargestellten MEGAP C Expressionskonstrukt wurde ein kleineres MEGAP Fragment in den pDEST32 Vektor kloniert welches hauptsachlich die SH3 und die so genannte KID Dom ne enthielt WEGAP SH3 KID Beide Konstrukte wurden bez glich ihrer Eignung im Rahmen der 3AT Titration getestet Analog zur Klonierung der pDEST32 Expressionskonstrukte f r die DNA bindende Dom ne des Transkriptionsfaktors GAL4 wurden die CC3 Domane von Robol und WAVE I jeweils in pDEST22 kloniert mit welchem die GAL4 Aktivierungsdom ne exprimiert werden kann Sowohl pDEST22 ROBO CC31 als auch
151. lul re Lokalisation Endris er al 2009 Da die Kinase c Abl den AS Rest Y755 der MEGAP SH3 Dom ne phosphorylieren kann ist anzunehmen dass dessen Aktivierung auch die Interaktion zwischen MEGAP und Lpd beeinflusst In Fibroblasten erfolgt die Aktivierung von c Abl zum Beispiel uber die Signaltransduktion des Wachstumsfaktors PDGF Plattner et al 1999 welcher die Ausbildung von Lamellipodien induziert Hedberg er al 1993 Im Rahmen des GST Pulldowns mit adultem Mausgehirn wurde bei Lpd eine Phosphorylierung des Serinrestes 899 detektiert Daher besteht die M glichkeit dass die Modifizierung der Interaktion zwischen MEGAP und Lpd aufgrund von Phosphorylierungen nicht auf MEGAP beschr nkt ist 91 Diskussion Obgleich gezeigt werden konnte dass die Interaktion zwischen MEGAP und Lpd ber die MEGAP SH3 Dom ne erfolgt bleibt immer noch die Frage offen welche Dom ne von Lpd an das MEGAP Protein bindet Das ca 200 kDa gro e Protein Lpd besitzt 1m N terminalen Bereich eine RA Dom ne Ras association domain und die daran anschlie ende PH Dom ne durch dessen Interaktion mit PIP3 Lpd an die Migrationsfront von Lamellipodien rekrutiert wird In der C terminalen H lfte von Lpd befinden s ch mehrere Prolin reiche Regionen welche Bindungsstellen f r Profilin darstellen sowie mit der EVH1 Domane der Ena V ASP Proteine interagieren vgl Abbildung 37 Krause et al 2004 Des Weiteren wurden mehrere putative Bindungsstell
152. m zusammengestellt mit dem 26 Material und Methoden beliebige DNA Fragmente zun chst in Plasmide kloniert Generierung von Entry Vektoren und anschlie end zwischen Plasmiden transferiert werden k nnen Der Vorteil liegt dar n dass die Rekombinase vier verschiedene Erkennungssequenzen attB attP attL attR unterscheidet wobei DNA Fragmente nur von attB nach attP sowie von attL nach attR bertragen werden k nnen Tabelle 7 Reaktion katalysiert durch Lytischer Weg attL x attR attB x attP LR Clonase Int Xis IHF Lysogener Weg attB x attP gt attL x attR BP Clonase Int IHF Tabelle 7 Prinzip des Gateway Klonierungssystems Der lysogene Weg wird durch die BP Clonase katalysiert der lytische Weg durch die LR Clonase Diese gerichtete Umklonierung ist konservativ so dass kein Netto Gewinn oder Verlust an Nukleotiden erfolgt und somit das Leseraster erhalten bleibt Tabelle 8 zeigt welche Ausgangsprodukte fur die Klonierungen eingesetzt wurden Ausgangsprodukte Erkennungssequenz Resistenz PCR Produkte von pEXP attB i AD502 Vektoren pDONR201 attP Kanamycin pDONR221 attP Kanamyc n pENTRIA attL Kanamyc n pENTR2B attL Kanamyc n pENTR3C attL Kanamyc n pDEST22 attR Ampicillin pDEST32 attR Gentamycin pcDNA DEST53 attR Ampicillin Tabelle 8 Ausgangsprodukte des Gateway Klonierungssystems Angegeben sind auch die jeweiligen Erkennungssequenzen der Clonasen und die Resistenzen der resultieren
153. mskegel mit ausgepragter Filopodien bzw Lamellipodienbildung Im Normalfall findet ein reguliertes Zusammenspiel beider Aktinstrukturen statt P periphere Zone T bergangszone C zentrale Region des Wachstumskegels B Komposition eines pausierenden hippokampalen Wachstumskegels aus Aktinfilamenten rot und Mikrotubuli MT griin blau Die Mikrotubuli stellen das Zentrum des Wachstumskegels dar Post translationale Modifizierungen der Tubulin Untereinheiten wie Tyrosinierung tyr oder Acetylierung ace modifizieren deren Funktion Die sich verlangernden Plus Enden von Mikrotubuli tyr MTs assoziieren auch mit Aktinfilamenten in der peripheren Zone Modifiziert nach Dent and Gertler 2003 Der Wachstumskegel stellt eine hoch dynamische Struktur dar welche durch die Generierung und den Abbau von Filopodien und Lamellipodien entsteht Durch die Interaktion zwischen extrazellularen Signalen Liganden und Transmembranrezeptoren werden innerhalb des 13 Einleitung Wachstumskegels Signalkaskaden initiiert welche die Organisation des Zytoskeletts beeinflussen und folglich zu einer Polarisierung des Wachstumskegels f hren Somit w chst der leading neurite in die Richtung aus wo Signale fur die verst rkte Polymerisation von Akt n und Mikrotubuli detektiert werden k nnen Die Wegfindung von Wachstumskegeln spielt nicht nur bei der neuronalen Migration eine wichtige Rolle sondern auch w hrend des Auswachsens von Axonen nac
154. n Endris et al und Soderling et al haben dargelegt dass MEGAP mit seiner GTPase aktivierenden Funktion spezifisch die Aktivitat von Racl und Cdc42 inhibiert Somit ist MEGAP uber die Funktion seiner GAP Domane direkt in die negative Regulation der Aktin Dynamiken eingebunden Eine weitere Verbindung zwischen MEGAP und dem Aktinzytoskelett besteht in der Interaktion zwischen der MEGAP SH3 Dom ne und WAVE 1 Durch die Integration in den WAVE Komplex kann MEGAP gezielt die Aktivit t von Racl hemmen und folglich auch die Aktivierung von WAVE I und Arp2 3 unterbinden Abbildung 11 Filopodium Polymerisation von a as Aktin i GE 2 ag 1 A Ba Rac GTP Abbildung 11 MEGAP und die Regulation des Aktinzytoskeletts Uber die Inhibierung von Racl und die Interaktion mit dem WAVE I Komplex hemmt MEGAP die Polymerisation von verzweigtem Aktin Modifiziert nach A Video Tour of Cell Motility ml ee 1 3 2 Signaltransduktion ber den Slit Robo Komplex im Wachstums kegel Eine wichtige Gemeinsamkeit der srGAPs ist die Interaktion der SH3 Dom ne mit der CC3 Dom ne der Robo Rezeptoren Wong et al 2001 und somit die Einbindung in die Slit Robo vermittelte Signaltransduktion Brose et al 1999 Die Robo Rezeptoren werden u a im Wachstumskegel exprimiert und sind an der repulsiven Wegfindung von neuronalen Vorl uferzellen und auswachsenden Axonen beteiligt Der Prozess der Absto ung von Robol exprimier
155. n gegen ber den Slits unterdr ckt wodurch das Uberqueren der Mittellinie erm glicht wird Sabatier er al 2004 Aufgrund der Tatsache dass MEGAP nicht nur mit Robol sondern auch mit Robo2 und Robo3 interagiert Dr 98 Diskussion Volker Endris unver ffentlichte Daten w re eine Beteiligung von MEGAP und Lpd an den Signalwegen von Robo2 und Robo3 vorstellbar Wie bereits im Zusammenhang mit MEGAP bzw Lpd bezogenen Signalwegen diskutiert wurde stellt MEGAP vermutlich einen Inhibitor fur Lpd dar Die asymmetrische Ausbildung von Lamellipodien im Wachstumskegel ist sowohl fur die Wegfindung von Axonen als auch fur die neuronale Migration erforderlich Demnach konnte das Zusammenspiel von MEGAP und Lpd nicht nur beim Uberqueren der Mittellinie sondern zum Beispiel auch bei der Generierung gerichteter Migrationsstr me von neuronalen Vorl uferzellen und Neuronen eine wichtige Rolle einnehmen Um die Rolle von MEGAP bez glich der Entwicklung des ZNS genauer zu untersuchen wurde m Rahmen einer Kooperation mit der Gruppe von Prof Dr Dusan Bartsch Zentralinstitut f r Seelische Gesundheit Mannheim eine Megap Knockout Maus Megap generiert welche ein Megap Transkr pt mit einem vorzeitigen Stoppkodon nach Exon 3 exprimiert Mit Hilfe der Megap Knockout Maus soll zum Beispiel untersucht werden wie genau Megap die Migration neuronaler Vorl uferzellen und Axonen beeinflusst welche neuronalen Subpopulationen und damit verbunde
156. nach der Aktivierung des Robo Rezeptors die Struktur des Zytoskeletts beeinflussen 1 4 Zielsetzung dieser Arbeit In fr heren Studien konnte gezeigt werden dass MEGAP ber die Interaktion mit dem Transmembranrezeptor Robol in die repulsive Wegfindung von Wachstumskegeln involviert ist Mit seiner GAP Domane inhibiert MEGAP spezifisch die Aktivit t von Racl und Cdc42 und ubt somit einen direkten Einfluss auf das Aktinzytoskelett aus Zusatzlich zu seiner GTPase aktivierenden Funktion kann MEGAP die Polymerisation von Aktin uber die Bindung an den WAVE 1 Komplex hemmen Obwohl die Signaltransduktion innerhalb dieses komplexen Netzwerkes aus Struktur und regulatorischen Proteinen schon teilweise untersucht wurde sind bisher noch wenig Details ber die genaue Funktionsweise und Regulation von MEGAP bekannt Um ein besseres Verst ndnis f r die Rolle von MEGAP mit Hinblick auf die Regulation des Zytoskeletts und die damit assoziierten neuronalen Migrationsprozesse zu erhalten sollten n dieser Arbeit bisher unbekannte Interaktionspartner von MEGAP identifiziert und die funktionelle Bedeutung der Interaktion charakterisiert werden Davon verspricht man sich auch den Gewinn neuer Erkenntnisse wie sich Fehlfunktionen des MEGAP Proteins auf das Migrationsverhalten von Neuronen und Axonen und somit auch auf kognitive Funktionen auswirken k nnen 19 Material und Methoden 2 Material und Methoden 2 1 Allgemeine Pufferlosungen PBS 10x 80
157. nd Neel 1993 Zellpellet auf Eis auftauen Zellen vollst ndig in 1 ml NETN Protease Inhibitor Cocktail resuspendieren Zugabe von 2 ul Lysozym 50 mg ml Inkubation f r 15 min auf Eis Zugabe von 20 ul DTT 0 5 M und 140 ul Sarcosyl 10 Dal Ultraschall Behandlung fur 4x 15 sec auf Eis Die Zellen jeweils 1 min nach jedem Schritt auf Eis abk hlen lassen Zelllysat in 1 5 ml Reaktionsgef e umf llen Zentrifugation bei 13000 rpm fur 15 min ber 4 C Zell berstand in 2 ml Reaktionsgef berf hren Zugabe von 400 ul Triton X 100 10 Mit NETN auf 2 ml auffullen Inkubation fur 30 min bei RT In der Zwischenzeit f r jede Probe 80 100ul Glutathion Sepharose mit NETN Puffer zwei bis dreimal waschen Die Sepharose Beads dabei maximal bei 2000x g abzentrifugieren Zelluberstand mit den gewaschenen Beads mischen und fur mindestens 2 Stunden bei 4 C in einem Uberkopfrotator inkubieren Beads abzentrifugieren und dreimal mit NETN Puffer waschen 33 Material und Methoden e Proteine bei 20 C f r kurzen Zeitraum oder in Aliquots bei 80 C optional mit 10 Glycerol lagern 2 9 RNA in situ Hybridisierung 2 9 1 Allgemeine Grundlagen Die RNA in situ Hybridisierung wird verwendet um mRNA Transkripte in Geweben oder einzelnen Zellen nachzuweisen Die Methode basiert auf der Fahigkeit einzelstrangiger Nukleins uren sich mit komplement rer Basensequenz zu einem doppelstr ngigen Abschnitt zusammenzulagern Einer der beiden St
158. nd an den Ma stab einer 96 Well Platte angepasst 2 7 3 GST Pulldown und Co Immunprazipitation Co IP Die Pulldown und Co IP Studien wurden mit Proteinextrakten Abschnitt 2 7 1 aus Geweben Maus Gehirn oder aus transient transfizierten Zellen HEK293 durchgef hrt Fur die Pulldown Experimente wurden GST Fusionsproteine mit der aufgereinigten MEGAP SH3 Dom ne Abschnitt 2 8 1 und dem entsprechenden Zelllysat Proteinmenge ca 1000 ug gemischt und ber Nacht bei 4 C auf einem berkopfrotator inkubiert Am n chsten Tag wurden die GST MEGAP SH3 Proteinkomplexe f r 5 min bei 3500 rpm abzentrifugiert Ungebundene Proteine wurden durch das wiederholte Waschen mit Lysis Puffer entfernt 3x 500 ul Abschlie end wurde der Puffer berstand bis auf ca 20 ul abgenommen d e Proben mit 5x SDS Sample Buffer versetzt und mittels SDS PAGE und Westernblot analys ert Die Identifizierung von Proteinen welche zusammen mit der GST MEGAP SH3 Dom ne pr zipitiert wurden erfolgte nach einem Trypsinverdau mit Hilfe eines ESI QUAD TOF Massenspektrometers Die so erhaltenen Ionenmassen der generierten Proteinfragmente wurden mit dem Mascot Programm analysiert und mit Proteinsequenzen aus der NCBInr protein database verglichen Zus tzlich zu den GST Pulldown Experimenten wurde die Co IP eingesetzt um Protein Protein Interaktionen in vivo nachzuweisen F r einen Co IP Ansatz wurden 750 1000 ug Protein in einem maximalen Volumen von 1 ml
159. ne Migrationsereignisse besonders von einem intakten Megap Protein abh ngig sind und wie sich die Abwesenheit von Megap auf das Verhalten und kognitive Funktionen auswirkt Erste Daten weisen darauf hin dass die Megap defizienten M use neben einer verringerten berlebensrate w hrend der Embryonalentwicklung reduzierte Aktivit ten am Tag sowie eine erh hte Angstlichkeit aufzeigen Waltereit er al 2008b Des Weiteren konnte in den Prim rkulturen hippokampaler Megap Neuronen sowohl an den neuronalen Zellk rpern als auch entlang der Axone eine verst rkte Ausbildung von Lamellipodien beobachtet werden Dr Volker Endris unver ffentlichte Daten Dies k nnte ein erster Hinweis darauf sein dass MEGAP auch in Neuronen die Funktion von Lpd gezielt inhibiert 4 4 Ausblick Die Charakterisierung der Interaktion zwischen MEGAP und Lpd hat den hemmenden Effekt von MEGAP auf die Lpd bezogene Lamellipodien Dynamik in Mausfibroblasten aufgezeigt Um weitere Einblicke in die damit verbundenen Signalwege zu erhalten w re es hilfreich die Proteindom ne von Lpd zu identifizieren welche mit MEGAP interagiert So k nnten weitere Analysen auch gezielt mit Lpd Mutanten durchgef hrt werden die zum Beispiel nicht mehr 99 Diskussion mit MEGAP interagieren und sich dadurch vielleicht auch der Inhibierung durch MEGAP entziehen Ein weiterer wichtiger Punkt fur die Analyse der funktionellen Korrelation zwischen MEGAP und Lpd ware der W
160. nelten Diese sind haufig mit Fokalen Adhasionen assoziiert Mattila and Lappalainen 2008 Um diese Beobachtungen zu bestatigen wurden MEGAP EYFP exprimierende Zellen gegen F Aktin und den Fokalen Adhasions Marker Vinculin gefarbt Mit Hilfe von TIRF Aufnahmen konnte gezeigt werden dass sowohl Wildtyp MEGAP als auch die GAP Mutante MEGAP RI an die Enden von F Aktin Stressfasern Abbildung 34A und an Vinculin markierte Fokale Adhasionen lokalisieren Abbildung 34B Fur die Isolation MEGAP abhangiger Effekte auf die Lokalisation von Lpd wurden EYFP Lpd exprimierende Zellen ebenfalls gegen Vinculin gefarbt Im Gegensatz zu MEGAP wurde Lpd zwar in direkter Nahe von Membranfortsatzen aber nicht an Vinculin markierten Fokalen Adhasionen detektiert Abbildung 34C Krause et al 2004 Die gleiche Abwesenheit von Lpd an den Strukturen Fokaler Adhasionen konnte unter Co Expression mit der MEGAP SH3 Mutante Y755D welche nicht mit Lpd interagiert vgl Abschnitt 3 3 beobachtet werden Daher stellte sich nun die Frage ob diese MEGAP SH3 abhangige Lokalisation an Fokale Adh s onen auch fur den inhibierenden Effekt von MEGAP auf Lpd und damit verbundene Aktin Dynamiken verantwortlich war Zur Analyse dieser Frage wurden PDGF behandelte Zellen unter Co Expression von Lpd und MEGAP Wildtyp und SH3 Mutante Y755D im TIRF Modus gefilmt Wahrend Lpd und Wildtyp MEGAP co transfizierte Zellen kaum auf die PDGF Stimulierung reagierten Abbildung 35A ermoglichte
161. ner Etablierung Fields and Song 1989 wurden mit dieser Methode Details vieler biologischer Signalwege entdeckt Hierbei stellen die verwendeten Hefen ein Modellsystem f r die biologischen Abl ufe in eukaryontischen Zellen dar Dies bietet einen gro en Vorteil im Vergleich zur Anwendung bakterieller prokaryontischer Systeme In der vorliegenden Arbeit wurde ein Yeast Two Hybrid Screen mit einem C terminalen Fragment von MEGAP MEGAP C und einer humanen fotalen Gehirn cDNA Bibliothek durchgef hrt Vor dem eigentlichen Yeast Two Hybrid Screen wurde die bereits bekannte Interaktion zwischen MEGAP und der CC3 Dom ne des Rezeptors Robol als Positivkontrolle im Hefesystem getestet Aufgrund der Interaktion zwischen MEGAP und Robol sollte der Transkriptionsfaktor GAL4 rekonstituiert und somit die in dem Hefestamm enthaltenen Reportergene exprimiert werden Die Aktivierung des Reportergens lacZ wurde mit Hilfe des 8 Galactosidase Fl ssigassays quantifiziert Hierbei konnte nur eine m ig starke Aktivierung des lacZ Gens beobachtet werden Im Gegensatz dazu wurde in fr heren Studien mittels GST Pulldown und Co IP eine starke Interaktion zwischen der MEGAP SH3 Dom ne und Robo detektiert vgl Abbildung 23 Diese Diskrepanz wies bereits darauf hin dass die post translationale Modifikation des MEGAP Proteins in Hefen und Menschen 85 Diskussion m glicherweise nicht komplett bereinstimmt Da jedoch im Vergleich zur Negativkontrolle die Co E
162. ng 46 Vektorkarte pENTR2B nach Invitrogen Homepage Vector Maps 106 Anhang Klonname Schnittstellen Schnittstellen Insert Vektor Insert pENTR MEGAP C KpnI NotI KpnI Notl MEGAP Bp 2052 tga pENTR MEGAP EcoRI Xhol EcoRI Xhol MEGAP SH3 KID Bp 2288 3010 pENTR Robol CC3 EcoRI Notl EcoRI Notl Robol CC3 Bp 4368 4885 5 3 8 pENTR3C Comments for pENTR 3C 2723 nucleotides rrnB T1 transcription termination sequence bases 106 149 rnB T2 transcription termination sequence bases 251 308 aitL1 bases 358 457 complementary strand ccdB gene bases 618 923 attL2 bases 952 1051 Kanamycin resistance gene bases 1174 1983 pUC origin bases 2047 2720 Abbildung 47 Vektorkarte pPENTR3C nach Invitrogen Homepage Vector Maps Klonname Schnittstellen Schnittstellen Insert Bemerkung Vektor Insert pENTR MEGAPa EcoRI Xhol EcoRI Xhol MEGAPa fl pENTR MEGAPa EcoRI Xhol EcoRI Xhol MEGAPa fl Mutation Y755D Y755D 107 Anhang 53 9 pDONR221 pDONR 221 pDONR Zeo Comments for pDONR 221 pDONR Zeo 4762 nucleotides 4291 nucleotides rmB T2 transcription termination sequence c 268 295 268 295 rrnB Tt transcription termination sequence c 427 470 427 470 M13 Forward 20 priming site 537 552 537 552 attPt 570 801 570 801 ccdB gene c 1197 1502 1197 1502 Chloramphenicol resistance gene c 1847 2506 1847 2506 attP2 c 2754 2985 2754 2985 T7 Promoter priming site c 3
163. nommen und 1 100 verd nnt Je 100 ul dieser Verd nnung wurden auf drei kleinen Platten 10 cm Selektion Trp Leu ausplattiert um daraus die Transformationseffizienz des Screens berechnen zu k nnen Zu diesem Zweck wurde zun chst die Anzahl der Hefeklone auf den drei 10cm Platten bestimmt und der Mittelwert gebildet Die Transformationseffizienz lie sich wie folgt berechnen Anzahl der Klone Mittelwert x 100 ausplattiertes Volumen 100 ul x Anzahl Platten umrechnen auf gro e Platten mit je 400 cm x 10 entnommenes Ausgangsvolumen Insgesamt wurden die transformierten Hefen auf 111 Agar Platten mit Selektivmedium verteilt und f r 72 h bei 30 C inkubiert Die gr ten gewachsenen Klone wurden anschlieBend in mit Selektivmedium Trp Leu gefullten 96 Wellplatten je 190 ul Medium pro Well berf hrt um Masterplatten anzulegen Anschlie end wurde die Aktivierung der Reportergene n den Klonen getestet Wachstum auf Agar Platten ohne Histidin bzw Uracil sowie Nachweis und Quantifizierung der gebildeten Galactosidase Abschnitt 2 10 4 4 und 2 10 4 5 2 10 44 6 Galactosidase Fl ssigassay Das Enzym 8 Galactosidase wird unter den Bedingungen eines Yeast Two Hybrid Screens nur dann gebildet wenn eine Interaktion zwischen den beiden zu testenden Partnern 47 Material und Methoden stattfindet Nur in diesem Fall wird das lacZ Gen eines der drei Reportergene Abschnitt 2 10 4 exprimiert und ist somit aktiv Der
164. nsfizierten Zellen aktiv auf die PDGF Stimulierung und bildeten ausgepragte Lamellipodien Hierbei konnte eine Anreicherung von Lpd an der Migrationsfront von auswachsenden Lamellipodien beobachtet werden Die Ma stabsbalken in A und B entsprechen 10 um Die Einzeltransfektionen von Wildtyp MEGAP und Lpd in den NIH 3T3 Zellen haben das gegensatzliche Verhalten beider Proteine nach der Stimulierung durch PDGF aufgezeigt Mit Hilfe von Zeitrafferfilmen von MEGAP Wildtyp und MEGAP RI und Lpd co transfizierten Zellen sollte nun die funktionelle Verbindung zwischen MEGAP und Lpd untersucht werden In diesem Zusammenhang sollte auch die Frage beantwortet werden ob Lpd dem starken inhibierenden Effekt von MEGAP auf die Racl und WAVE I Signaltransduktion entgegenwirken kann Die MEGAP SH3 Mutante Y755D wurde in diese Experimente nicht einbezogen da sie weder eine Interaktion noch eine Co Lokalisation mit Lpd aufwies Die Aufnahmen von PDGF stimulierten Zellen demonstrierten unter Co Expression von Wildtyp MEGAP und Lpd eine starke Inhibierung der Lamellipodien Dynamik Trotz der Uberexpression von Lpd wurden nach der Behandlung mit PDGF fast keine Lamellipodien gebildet Die restlichen Zellforts tze wiesen drastisch verringerte Umf nge und ein verlangsamtes Wachstumsverhalten auf Abbildung 32A Eine hnliche Situation wurde be der Co Expression von MEGAP RI und Lpd beobachtet Da MEGAP RI aufgrund 71 Ergebnisse seiner GAP Defizie
165. nte gezeigt werden dass MEGAP haupts chlich m Nervensystem exprimiert wird Insbesondere w hrend der Embryogenese wird MEGAP sehr stark in gro en Bereichen des sich entwickelnden Gehirns und im Neuralrohr exprimiert Da MEGAP eine wichtige Rolle bei der Entwicklung kognitiver Funktionen einzunehmen 46 Material und Methoden scheint wurde in dieser Arbeit der Schwerpunkt auf die Identifizierung von Interaktionspartnern gelegt welche f r die Entwicklung des Gehirns physiologisch relevant sind Somit wurde f r den prim ren Yeast Two Hybrid Screen eine Human Fetal Brain cDNA Bibliothek Invitrogen Katalog Nr 11386 026 eingesetzt 2 10 43 Durchf hrung des Yeast Two Hybrid Screens Um eine m glichst hohe Anzahl der in der cDNA Bibliothek vorhandenen Klone nach putativen MEGAP Interaktionspartnern zu durchsuchen wurden fur den Yeast Two Hybrid Screen 38 Einzeltransformationen Abschnitt 2 10 2 mit je 0 77 ug cDNA Bibliothek Human Fetal Brain 29 3 ug gesamt durchgefuhrt Hierzu wurde ein Hefeklon welcher bereits den entsprechenden bait pDEST32 MEGAP C enthielt in einem Liter Selektivmedium bis zum Erreichen einer Zelldichte von ODgoo 0 4 0 6 vermehrt 30 C 160 rpm Nach der Transformation wurden alle Ans tze vereinigt und je 300 ul transformierte Hefezellen auf eine Agar Platte 14 5cm mit Selektivmedium Trp Leu His 25 mM 3 AT ausplattiert Von dem vereinigten Transformationsansatz wurden 10 ul ent
166. nteraktion zwischen MEGAP und mDial werden gegenw rtig von Simone Steinlicht im Labor fortgef hrt Obgleich die Assoziation zwischen MEGAP und mDial in dieser Arbeit also nicht bewiesen werden konnte existiert zwischen den beiden Proteinen die M glichkeit einer funktionellen Verkn pfung aus folgenden Gr nden Das Protein mDial mammalian Diaphanous Homolog 1 geh rt zur gro en Familie der Formine und ist ebenso wie MEGAP an der Regulation von Akt n Dynamiken n der N he der Zellmembran beteiligt Sowohl MEGAP als auch mDial sind in die Signaltransduktion der kleinen Rho GTPasen eingebunden wobei mDial durch die Rho GTPasen RhoA B und C aktiviert wird Higashi er al 2008 und im aktivierten Zustand Racl aktivieren kann Kurokawa and Matsuda 2005 MEGAP hingegen 88 Diskussion bt mit Hilfe seiner GAP Aktivitat einen inhibierenden Effekt insbesondere auf die Rho GTPase Racl aus Endris et al 2002 Soderling et al 2002 Aufgrund der gegensatzlichen Wirkung in Bezug auf Racl k nnte MEGAP die Funktion eines Gegenspielers f r mDial einnehmen Formine sind gro e Multidom nenproteine und zeichnen sich durch eine hoch konservierte FH2 Dom ne formin homology domain 2 im C terminalen Bereich aus der in den meisten F llen eine Prolin reiche FHI Dom ne vorgelagert ist Wallar and Alberts 2003 Higgs 2005 ber die Prolin reiche FH1 Domane k nnen Formine sowohl mit Profilin als auch mit den SH3 Dom nen od
167. nz keinen hemmenden Einfluss auf die Racl Signaltransduktion aus bt zeigte sich hier im Vergleich zu Wildtyp MEGAP eine leicht verst rkte Lamellipodien Dynamik Abbildung 32B Um die Auswirkungen von Wildtyp MEGAP und der GAP Mutante MEGAP RI auf Lpd und die damit verbundene Lamellipodien Dynamik zu quant f z eren wurden die Wachstumsgeschwindigkeiten der Lamellipodien mittels Kymographie berechnet vgl Abschnitt 2 15 Abbildung 15A Zus tzlich wurden die Umf nge der gebildeten Lamellipodien an den jeweiligen Wachstumsmaxima vermessen und m Verh ltnis zum Umfang der gesamten unstimulierten Zelle gesetzt Abbildung 15B Die Wachstumsgeschwindigkeiten von PDGF induzierten Lamellipodien wurden unter Einzel und Co Expression von Lpd und MEGAP Wildtyp und GAP Mutante verglichen Abbildung 33A Des Weiteren wurden EYFP transfizierte Zellen als Kontrolle verwendet Die statistische Auswertung der Unterschiede zwischen den Wachstumsgeschwindigkeiten der primaren Lamellipodien belegte die Beobachtung dass sowohl Wildtyp MEGAP als auch die GAP Mutante MEGAP RI die Dynamik von auswachsenden Lamellipodien hemmen Im Gegensatz dazu erfolgte durch die Uberexpression von Lpd im Vergleich zu den EYFP transfizierten Kontrollzellen eine signifikante Erh hung der lamellipodialen Wachstumsgeschwindigkeiten Krause et al 2004 Durch die Co Expression von MEGAP wurde dieser Effekt aufgehoben und die Wachstumsgeschwindigkeiten der Lamellipodien weit un
168. odal et al 2005 Initiiert wird diese S gnalkaskade ber die kleine Rho GTPase Racl welche m aktivierten Zustand an PIR121 des WAVE Komplexes bindet Es existieren zwei kontroverse Modelle welche die Aktivierung des WAVE Komplexes durch Racl beschreiben Blagg and Insall 2004 Die Aktivierung von Racl erfolgt durch die Bindung von GTP im Rahmen des so genannten Rho Zyklus den alle kleinen Rho GTPasen durchlaufen Abbildung 10 Plasma membrane Rho a S EC e Rho GEF i bw Rho GAP STP Effector N Fer SN Pa EN en I P MEGAP Abbildung 10 Der Rho Zyklus der kleinen GTPasen In ruhendem Zustand existieren die Rho Proteine haupts chlich in ihrer inaktiven GDP gebundenen Form und in Komplexen mit Rho GDIs guanine nucleotide dissociation inhibitors Nach der Stimulierung durch extrazellul re Signale dissoziiert Rho GDP von Rho GDI und lokalisiert an spezifische Positionen der Zellmembran Hier wird mittels aktivierter Rho GEFs guanine nucleotide exchange factors GDP durch GTP ausgetauscht Aktivierte GTP gebundene Rho Proteine interagieren anschlieBend mit ihren Effektoren wie zum Beispiel Racl mit WAVE 1 Die GAP Proteine konnen die niedrige intrinsische GTPase Aktivitat der Rho GTPasen stimulieren so dass vermehrt inaktives Rho GDP gebildet wird Uber diesen Weg erfolgt die Hemmung assoziierter Signalwege durch die Rho GAPs Modifiziert nach Watanabe et al 2005 17 Einleitung Die Arbeiten vo
169. ost translationalen Modifikation von MEGAP C begr ndet war wodurch das Protein nicht korrekt exprimiert wurde und physiologisch relevante Interaktionspartner nicht erfasst werden konnten 4 1 2 Putative Interaktionspartner der MEGAP SH3 Dom ne Neben der Anwendung des Yeast Two Hybrid Systems wurden auch biochemische Methoden eingesetzt um nach bisher unbekannten Interaktionspartnern f r MEGAP zu suchen Im Rahmen von GST Pulldown Experimenten mit der MEGAP SH3 Dom ne und Proteinlysaten aus HEK293 Zellen sowie adultem Mausgehirn wurden die Proteine Diaphanous Homolog 1 mDial Lamellipodin Lpd Komponenten des WAVE I Komplexes sowie zwei nukle re Proteine isoliert Dr Volker Endris unver ffentlichte Daten Letztere wurden f r eine funktionell relevante Interaktion mit der MEGAP SH3 Dom ne aufgrund hrer Lokalisation im Zellkern nicht in Betracht gezogen Die Pr zipitation des WAVE I Komplexes konnte aufgrund der bereits beschriebenen Assoziation zwischen MEGAP und WAVE I Soderling et al 2002 als intrinsische Positivkontrolle f r den GST Pulldown bewertet werden Die Bindung von mDial an die MEGAP SH3 Dom ne wurde n der vorliegenden Arbeit nur in vitro gezeigt In den Co IP Studien mit MEGAP und mDial konnte ich keine konsistenten Ergebnisse produzieren so dass eine Interaktion zwischen den beiden Proteinen zwar nicht ausgeschlossen aber auch nicht eindeutig belegt werden konnte Arbeiten zur Best tigung einer m glichen I
170. pd wird ber die Phosphorylierung des Tyrosinrestes Y755 reguliert Demzufolge ist anzunehmen dass die Aktivierung der Proteinkinase c Abl und dessen Assoziation mit MEGAP zu einer partiellen oder vollst ndigen Dissoziation des MEGAP Proteins von Lpd und WAVE 1 f hrt 94 Diskussion In dieser Konstellation waren beide Proteine von ihrer Inhibierung durch MEGAP befreit und k nnten die Ausbildung von Lamellipodien stimulieren Abbildung 39B Abbildung 39 Einbindung von MEGAP in die PDGF Signaltransduktion A Mit Hilfe seiner Racl spezifischen GAP Aktivitat und den Interaktionen zu WAVE I und Lpd inhibiert MEGAP die Arp2 3 vermittelte Aktinpolymerisation B ber die Bindung von PDGF wird die Proteinkinase c Abl aktiviert welche MEGAP u a an Position Y755 phosphorylieren kann Dies f hrt wahrscheinlich zur Aufhebung der Bindung von MEGAP an Lpd und WAVE 1 und erm glicht somit die Ausbildung von Lamellipodien gt Interaktion Aktivierung Interaktion Inhibierung Interaktion P Phosphorylierung Unter Co Expression von MEGAP Wildtyp und GAP Mutante und Lpd in den NIH 3T3 Zellen wurde auch nach der Stimulierung durch PDGF vorrangig eine Hemmung der Aktin 95 Diskussion Dynamiken beobachtet Dieses Ergebnis wird vermutlich darauf zur ckzuf hren sein dass unter berexpression nur ein sehr geringer Teil von MEGAP durch endogen exprimiertes c Abl oder weitere Proteinkinasen phosphoryliert wurde 4
171. podin and AGE 1 PI3K promote axon guidance and outgrowth n response to slit and netrin Curr Biol 6 854 862 Charest P G and Firtel R A 2007 Big roles for small GTPases in the control of directed cell movement Biochem J 401 377 390 Chedotal A Kerjan G and Moreau Fauvarque C 2005 The brain within the tumor new roles for axon guidance molecules in cancers Cell Death Differ 72 1044 1056 Chevray P M and Nathans D 1992 Protein interaction cloning in yeast identification of mammalian proteins that react with the leucine zipper of Jun Proc Natl Acad Sc US A 89 5789 5793 Dent E W and Gertler F B 2003 Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance Neuron 40 209 227 Dickson B J 2002 Molecular mechanisms of axon guidance Science 298 1959 1964 126 Referenzen Dickson B J and Gilestro G F 2006 Regulation of commissural axon pathfinding by slit and its Robo receptors Annu Rev Cell Dev Biol 22 651 675 Drees B Friederich E Fradelizi J Louvard D Beckerle M C and Golsteyn R M 2000 Character zation of the interaction between zyxin and members of the Ena vasodilator stimulated phosphoprotein family of proteins J Biol Chem 275 22503 22311 Du W Vidal M Xie J E and Dyson N 1996 RBF a novel RB related gene that regulates E2F activity and interacts with cyclin E in Drosophila Genes Dev 0 1206 1218 Eden S Roha
172. r here Studien haben gezeigt dass der Hippokampus ein wichtiges Zentrum f r kognitive Funktionen wie das Lernen und die Erinnerung darstellt Eichenbaum 2004 In dieser Gehirnregion werden bis ins Erwachsenenalter hinein Neuronen geboren welche uber kurze Strecken innerhalb des Hippokampus migrieren Ghashghaei er al 2007 Unter der Annahme dass der Ph notyp der Megap defizienten M use u a durch die fehlende Bindung von MEGAP an Lpd verursacht wird k nnte die Assoziation zwischen beiden Proteinen nicht nur die neuronale Migration und die Wesfindung von Axonen w hrend der Entwicklung des ZNS sondern auch die neuronale Plastizitat im erwachsenen Organ smus beeinflussen 100 Anhang 5 Anhang 5 1 Genotypen der verwendeten E coli Bakterienst mme XL2 Blue endAl gyrA96 nal thi 1 recAl relA1 lac gInV44 PT Tn10 proAB lacl A lacZ M15 Amy Cm hsdR17 rK mx DH So F endAl glnV44 thi 1 recAl relAl gyrA96 deoR nupG 80dlacZAM15 A lacZYA argF U169 hsdR17 rg mg DH10B F endAl recAl galEl5 galK16 nupG rpsL AlacX74 80lacZAM15 araD139 A ara leu 7697 mcrA A mrr hsdRMS merBC X DB3 1 F gyrA462 endA1 glnV44 A srl recA merB mrr hsdS20 rg mg aral4 galK2 lacY1 proA2 rpsL20 Sm xyl5 Aleu md 5 2 Hefest mme MaV203 MATa leu2 3 112 trpl 901 his3 A 200 ade2 101 cyh2R canIR gal4 A gal80 A HIS3UASGAL1 HIS3 LYS2 GAL1 lacZ SPAL10 URA3 PJ696 Mata trpl 901 leu2 3 112 ura3 52 his3 200 gal4A gal8
173. r Zellmembran Allerdings musste bei der Sequenzanalyse nicht nur die Identitat des jeweiligen Klons sondern auch dessen korrekter Leserahmen bestatigt werden Bei Klon Nr 23 wurde eine Verschiebung des Leserasters um eine Base detektiert Daher konnte auch die FAK nicht mehr als putativer Interaktionspartner gewertet werden Eine hnliche Situation lag bei den Klonen Nr 20 und 29 vor Da in diesen Klonen direkt nach der Vektorsequenz ein Stoppkodon folgte war die Expression eines Fusionsproteins mit der GAL4 Aktivierungsdomane und dem putativen Interaktionspartner MARCKS like 1 bzw DPH3 auszuschlieBen Deshalb mussten auch Klon Nr 20 und 29 als falsch positive Kandidaten aussortiert werden Somit konnten letztlich nur die Klone Nr 5 CAT53 und 16 Periphilin f r den Library Swap Abschnitt 3 2 1 1 und daran anschlie ende Untersuchungen ausgew hlt werden 3 2 1 1 Library Swap der putativen Interaktionspartner Um sicherzustellen dass es sich bei den putativen Interaktionspartnern von MEGAP nicht um falsch positive Ergebnisse handelt wurde ein Library Swap durchgef hrt Dieser basiert auf dem Grundsatz dass es bei zwei im Yeast Two Hybrid System interagierenden Proteinen irrelevant ist welches der beiden Proteine als bait oder prey fungiert vgl 2 10 4 Hierzu wurden die f r die putativen Interaktionspartner kodierenden cDNAs aus pEXP AD22 in den pDEST32 Vektor kloniert Dem entsprechend wurde das MEGAP
174. raktivit t der 29 der cDNA Bibliothek prey in den GAL4 selektierten Klone defizienten Hefestamm MaV203 j Galactosidase Fi ssigassay Wachstum auf Selektionsmedium Auswahl von 10 Klonen zur Identifizierung Trp Leu His f r 72 h sehr viele Klone gewachsen Auswahl der 672 gr ten Klone IV Identifizierung putativer Interaktionspartner Anl Masterplatten 96 Well F t I AR EEN DNA Sequenzierung Vergleich mit den Sequenz datenbanken des NCBI ll Screening aller Klone gt Auswahl der Klone 16 Periphilin und 5 C AT53 ll 1 B Galactosidase Filter Assay II 2 Wachstum auf Selektions fur weiterfuhrende Analysen medium Trp Leu Ura Library Swap GS T Pulldown 35 positive Klone 5 positive Klone Auswahl von 29 Klonen Ausschlie lich Selektion falsch positiver Klone Abbildung 19 Ablaufschema des Yeast Two Hybrid Screens mit pDEST32 MEGAP C I Isolierung von Hefeklonen mit putativen MEGAP Interaktionspartnern Um sicher zu stellen dass mit der Transformation der cDNA Bibliothek die Anzahl der enthaltenen Klone abgedeckt wurde erfolgte zun chst die Bestimmung der Transformationseffizienz bzw die Anzahl der doppelt transformierten Hefeklone Nur mit einer gro en Anzahl an doppelt transformierten Klonen bestand die Wahrscheinlichkeit dass auch cDNA Klone mit geringer Kopienzahl erfasst werden konnten F r den durchgef hrten Yeast Two Hybrid Screen mit pDEST32 MEGAP C und der humanen f talen
175. range kommt dabei von einer zuvor hergestellten und markierten Sonde der andere liegt 1m Praparat vor und soll nachgewiesen werden Die Markierung der einzelstrangigen RNA Sonde erfolgt blicherweise mit Haptenen wie Digoxigenin oder auch mit Fluoreszenzfarbstoffen Die Experimente in dieser Arbeit wurden mit Digoxigenin markierten RNA Sonden durchgef hrt Das Digoxigenin kann mit Hilfe eines Antikorpers der beispielsweise mit einem Enzym gekoppelt ist erkannt werden Das Enzym meistens Alkalische Phosphatase oder Peroxidase kann dann durch Zusatz von Reagenzien einen Farbstoff umsetzen der kovalent 1m Gewebe gebunden bleibt und sich daher nicht durch Diffusion verteilt Beim Nachweis von mRNA in Geweben werden nur jene Zellen angef rbt hybridisiert in denen ein zu untersuchendes Gen aktiv ist Nur hier liegt die entsprechende mRNA vor In Vorbereitung auf die Hybridisierung der Sonde wird das zu farbende Gewebe mit Hilfe von formaldehydhaltigen L sungen fixiert und anschlie end entw ssert Es besteht die M glichkeit sowohl ganze Gewebest cke bzw Embryonen mit der Sonde zu hybridisieren oder die mRNA auf Gewebe D nnschnitten nachzuweisen In dieser Arbeit wurden Maus Embryonen verschiedener Entwicklungsstadien nach der Fixierung und Einbettung mit Hilfe eines Kryotoms Cryostat CM3050 S Leica auf eine Schichtdicke von 14 um geschnitten und anschlie end mit der Sonde hybridisiert 2 92 Embryonenpr paration e T ten des Mutt
176. rmittelt werden konnte 112 Anhang gt 21148255928lrefINM_016488 5 Homo sapiens periphilin 1 PPHLN1 transcript variant 1 mRNA 61 121 181 241 J01 era 421 481 541 601 661 Tal 781 841 901 Jol 1021 1081 1141 1201 1261 121 1381 1441 1501 101 1621 1681 1741 1801 1861 1 921 1981 2041 2101 22 01 2221 2281 ro nl 2401 2461 22 ZOOM 2641 2701 AGL 2321 2881 294 3001 S061 atal gral dt 3201 S61 3421 3481 atctcgcgegecg OGIG ECT CCE cgatatgaat ggctacaata gqa gga gct agceecEecec tggacaagag tttagaagaa Gacaalaccer qgttecagtg cagtoetceaac aatcctgaaa coctcaagtg gaaaaggaac gaaagtaact gaccagccag Cagctadeca cgacaagact ttagaaaagt Cagecelogc gQaaaacgaag erge2gcece eCeagacatta cgaacacaga EQCaaC le Cac EAR Me tags te gggtgatgta ggtegggagg ALLeLel lie cetagataag gggggcgaca relscegsat ctaaagctgg CalCCcalcac tetaatcaaa Se Ee eeh tladactatt SELCLIELDE GE ENEE alCCddalca ECCLOGQLCaC tgaggaasact E EE Ee etgatast ae ataattttaa ttaaaagcta LAaAGCLECL GCC aceccacata accttagata eeeLeetl lie gtttaaaaac ceattaaatt TELLLELCLE agcattatle SOLO Ladddq cataatgttce agcrgatgtg aatgtagata agt ccggaagtac ggagggccag atgaaagaat gactagttaa acaatagata atgatcgaag acgatcatcte aaagttteta ttttcagaga tcagtagcag atagaaagtc gagataaaga STtLEeEagtagE LCOCtgaggc tgectgaaat aggaacctga EE EE Ee gtgaaacttt etatatagtt agcagqracc gcgaagagac ggaagaaacg cctgggggat caccattca
177. rolle der Sondenqualit t und Abschatzen der Konzentration mittels Agarose Gelelektrophorese Lagerung der Sonden bei 80 C 2 9 4 Sondenhybridisierung und Detektion Verwendete Puffer und Materialien SSC 20x 3 M NaCl 300 mM Na 3Citrat pH 7 4 10x Salz 100 ml 1 54 g Tris 10 78 g NaCl 0 71 2 NaH gt PO HO 0 89 g Na gt HPO 2 HO 10 ml EDTA 0 5 M pH mit ca 6 ml IN HCl auf 7 5 einstellen 50x Denhardts 1 w v BSA 1 w v Ficoll SIGMA Katalog Nr P 2637 1 w v Polyvinylpyrollidon SIGMA Katalog Nr P 5288 mit H gt 0 DEPC auff llen bei 20 C lagern Hybridisierungspuffer 10 ml der Reihenfolge nach mischen 900 ul ddH gt O 1 ml 10x Salz 100 ul 50x Denhardts l ml yeast RNA 10 mg ml SIGMA Katalog Nr R 6750 2 ml 50 w v Dextransulfat SIGMA Katalog Nr D 8906 5 ml deion Formamid 36 Material und Methoden Waschpuffer Ix SSC 50 Formamid 0 1 Tween SIGMA Katalog Nr P 7949 auff llen mit HxO DEPC und R hren mit gebackenem Magnetr hrer 140 C MABT 100 mM Maleinsaure 150 mM NaCl ergibt pH von ca 1 5 mit ION NaOH oder NaOH Pl tzchen auf pH 7 5 einstellen 0 1 Tween AP Puffer 10 ml 1 ml Tris pH 9 5 1 M 250 ul MgCl 2 M 333 ul NaCl 3 M 10 ul Tween 20 240 ul Levamisol 10 mg ml ad 10 ml mit H O DEPC Boxpuffer 10 ml Formamid 2 ml 20x SSC 8 ml ddH2O Blockl sung 6 ml 4 8 ml MABT 1 2 ml Horse Serum 10 min hitzeinaktiviert Um den
178. ropyl B D thiogalactos d IPTG das den Lac Repressor bindet und ihn inaktiviert wird die Expression gestartet Der Stamm BL21 DE3 tr gt die lacI Mutation und produziert genug Lac Repressor f r einen effizienten Transkriptions Block Die Expressionsklone wurden ber Nacht in 25 ml LB Medium plus entsprechendes Antibiotikum angeimpft und bei 37 C inkubiert Ausgehend von dieser Starterkultur wurden am n chsten Tag ca 200 ml LB Medium Antibiotika mit einer OD6o von 0 1 angeimpft Die Kulturen wurden anschlie end bei 30 37 C und 200 rpm im Sch ttler weiter inkubiert Die Expression der Fusionsproteine wurde durch Zugabe von IPTG mit einer Endkonzentration von 1 mM nach Erreichen einer Optischen Dichte von ODso 0 5 induziert Die Zellen wurden f r ca 4 Stunden bei 37 C weiter inkubiert Danach wurde die Kultur in 50 ml Zentrifugen R hrchen umgef llt und bei 3500x g f r 15 min abzentrifugiert 32 Material und Methoden Der Uberstand wurde anschlieBend verworfen und die Zellpellets die das rekombinante Protein enthalten bis zur Weiterverarbeitung bei 20 C eingefroren 2 8 2 Aufreinigung von GST Fusionsproteinen Verwendete Puffer und Materialien NETN 20 mM Tris HCl 100 mM NaCl 1 mM EDTA 0 5 Nonidet P40 pH 8 0 Glutathione Sepharose 4B Amersham Biosciences Protease Inhibitor Cocktail EDTA Roche Aufreinigung schwer loslicher Fusionsproteine Modifiziert nach Frangioni et al Frangioni a
179. rursacht u a ein fehlerhaftes Auswachsen der Axone von Motorneuronen und mechanosensorischen Neuronen in C elegans Demzufolge spielen sowohl MEGAP als auch Lpd eine wichtige Rolle in der Slit Robo vermittelten neuronalen Migration Dar ber hinaus fungiert MIG 10 zusammen mit dem Racl Homolog CED 10 um die Orientierung auswachsender Axone als Antwort auf die UNC 6 Netrin vermittelte Signaltransduktion zu steuern Quinn et al 2008 In Motorneuronen f hrt asymmetrisch aktiviertes Racl GTP zu einer asymmetrischen Rekrutierung von MIG 10 an die Zellmembran Dies initiiert eine lokal verstarkte Aktinpolymerisation welche fur das gerichtete Auswachsen von Neuriten und fur die Wegfindung von Wachstumskegeln ben tigt wird Somit stellen sowohl MEGAP als auch 96 Diskussion Lpd Komponenten der Racl vermittelten Signaltransduktion dar bei der MEGAP die Rolle eines Inhibitors fur Lpd bernehmen k nnte Zus tzlich zu den Studien welche in C elegans durchgef hrt wurden konnte m der Maus die Lokalisation von Lpd an der Migrationsfront von Wachstumskegeln hippokampaler Neuronen gezeigt werden Krause er al 2004 In Zusammenhang mit den Ergebnissen dieser Arbeit kann die Hypothese aufgestellt werden dass MEGAP wahrend der Slit Robo vermittelten Repulsion von Axonen die Rekrutierung von Lpd an die Migrationsfront und somit auch die verstarkte Ausbildung von Membranfortsatzen unterbindet Neben der Beteiligung an der repulsiven Wegfindung von
180. rvensystems ZNS nachgewiesen Regionen mit ausgepr gter Megap Expression umfassen die ventrikul ren und subventrikul ren Zonen des Vorder Mittel und Hinterhirns das Neuroepithel des Neuralrohrs die Hinterwurzelganglien sowie die trigeminalen und inferialen Ganglien Abbildung 18 Insbesondere in den ventrikul ren Zonen werden die neuronalen Vorl uferzellen geboren Ayala er al 2007 Die starke Expression von Megap n einer Vielzahl neuronaler Vorl uferzellen deutet auf eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des ZNS hin Weitere Daten zur Expression von Megap k nnen ber folgende Internetseiten eingeholt werden www brain map org www ncbi nlm n h gov projects gensat www genepaint org 55 Ergebnisse Abbildung 17 RNA in situ Hybridisierung mit einer Megap Sonde auf Sagittalschnitten eines Mausembryos im Entwicklungsstadium E9 5 p c Die Hybridisierung mit einer Megap anti sense RNA Sonde zeigt eine starke Expression von Megap a im Neuroepithel des Neuralrohrs N und im Hinterhirn H b im Vorderhirn F und im otogenen Vesikel OV Die Ma stabsbalken entsprechen 500 um Im Rahmen der Analyse des Expressionsmusters von Megap wurde zus tzlich die Expression des Slit Rezeptors Robol in den Embryonalstadien E11 5 p c und E12 5 p c untersucht Hierbei wurden benachbarte Schnitte mit den Sonden f r Megap bzw Robo hybridisiert um die jeweiligen Expressionsmuster n Korrelation zu stellen Unter der Annahme
181. s sowohl Wildtyp MEGAP als auch in geringerem Ausma die GAP Mutante MEGAP RI einen hemmenden Effekt auf die Wachstumsgeschwindigkeiten von Lamellipodien aus ben B Quantifizierung der Lamellipodienumf nge nach PDGF Stimulierung m Verh ltnis zum Gesamtumfang der unstimulierten Zelle dargestellt mittels Box and Whisker Plot Aufgrund der starken GAP Aktivit t von Wildtyp MEGAP war nur bei MEGAP RI eine Analyse der Umfangverh ltnisse m glich Hierbei konnte belegt werden dass die Co Expression von MEGAP RI nicht nur die Dynamik von auswachsenden Lamellipodien reduziert sondern auch dem stimulierenden Effekt von Lpd bez glich der Lamellipodienumf nge entgegenwirkt Die Sternsymbole in A und B geben signifikante Abweichungen von p lt 0 05 an 80 Ergebnisse 3 7 Die Inhibierung von Lamellipodin erfolgt durch die MEGAP abhangige Lokalisierung an Fokale Adhasionen Die quantitative Beurteilung der Lamellipodien Dynamik in MEGAP und Lpd co exprimierenden Zellen konnte den hemmenden Effekt von MEGAP auf Lpd zeigen Um weitere Einblicke in den biochemischen Mechanismus ftir diesen Prozess zu erhalten wurde untersucht an welchen zellularen Strukturen MEGAP die Funktion von Lpd beeinflusst Zu diesem Zweck sollten die Regionen mit eindeutiger Co Lokalisation von MEGAP und Lpd charakterisiert werden Insbesondere die Co Expression von MEGAP RI und Lpd zeigte Co Lokalisationsmuster welche sehr den Enden von F Aktin Stressfasern ah
182. sboden ausgesat und mit EYFP bzw mCherry Expressionskonstrukten fir MEGAP und Lamellipodin transfiziert Das Medium wurde 4 h nach der Transfektion gewechselt und durch Serum reduziertes Medium ersetzt Das Live Cell Imaging erfolgte unter Einbindung des Nikon Perfect Focus Systems um Fokusschwankungen zu vermeiden Wahrend der Filmaufnahmen wurden die Zellen in Opti MEM I mit Glutamax supplementiert mit 0 1 Neugeborenem Kalberserum und Penicillin Streptomycin gehalten Mit Hilfe einer Tokai Hit Umweltkammer konnten die Zellen w hrend der Aufnahme bei 37 C und 5 CO inkubiert werden Die Stimulierung von Lamellipodien zu Beginn der Filmaufnahme Zeitpunt 0 min erfolgte durch die Zugabe von PDGF BB 100ng ml Invitrogen zu den Zellen direkt in der Kammer Die Daten wurden mit NIS Elements 3 0 ImageJ und Photoshop bearbeitet 2 15 Kymographie Da eine stimulierte Zelle in einem dynamischen Wechsel mehrfach Lamellipodien ausbildet und gebildete Zellforts tze wieder zuruckzieht wurden f r die Einhaltung konstanter Bedingungen jeweils die pr m ren Lamellipodien direkt nach der Stimulierung der Zellen durch PDGF vermessen Die Filmaufnahmen der stimulierten NIH 3T3 Zellen wurden analys ert indem eine 1 Pixel breite Linie in einem Winkel von 90 ber das Lamellipodium 52 Material und Methoden in Wachstumsrichtung gezeichnet wurde Abbildung 15A Krause et al 2004 In Anlehnung an die SACED Methode Hinz et al 1999 und m
183. sculus Mass 16663 Score 83 Query Observed Mr expt Mr calc 43 568 27 1134 52 1134 47 0 05 0 49 63 702 85 1403 68 1403 64 0 04 0 34 Proteins matching the same set of peptides gi 21311769 Mass 125311 Score 82 Queries WARP Mus musculus gi 27597098 Mass 111502 Score 82 Queries brain stress early protein Gbi isoform 1 Mus musculus gi 74189848 Mass 98017 Score 50 Queries unnamed protein product Mus musculus OO OO OO Query Observed Mr expt Mr calc Delta Miss Score 18 493 81 985 60 985 56 0 04 0 16 5 8 36 554 82 1107 62 1107 58 0 04 0 34 0 068 Proteins matching the same set of peptides gi 74205468 Mass 114278 Score 50 Queries matched unnamed protein product Mus musculus gi 94366348 Mass 286709 Score 50 Queries matched PREDICTED spectrin alpha 2 isoform 20 Mus sculus gi 94366350 Mass 286025 Score 50 Queries matched PREDICTED spectrin alpha 2 isoform 21 Mus sculus qg1 94366352 Mass 283519 Score 50 Queries matched PREDICTED spectrin alpha 2 isoform 23 Mus sculus g1 94366354 Mass 285221 Score 50 Queries matched PREDICTED spectrin alpha 2 isoform 22 Mus sculus gi 94366355 Mass 279415 Score 50 Queries matched PREDICTED spectrin alpha 2 isoform 19 Mus sculus gi 94366358 Mass 278840 Score 50 Queries matched PREDICTED spectrin alpha 2 isoform 1
184. se in Vertebraten Besonders w hrend der fr hen Embryonalentwicklung stellt die koordinierte Zellmigration die Bas s f r die Entstehung von Geweben und Organen dar Im Unterschied zur zweidimensionalen Umgebung eines Zellkultursystems m ssen sich die migrierenden Zellen und Zellverbande innerhalb einer dreidimensionalen extrazellul ren Matrix mit distinkten physikalischen und chemischen Eigenschaften orientieren und korrekt positionieren Im s ch entwickelnden Embryo wird die Zellmigration also durch das Zusammenspiel extra und intrazellul rer Signale welche Zeitpunkt Richtung und den endg ltigen Bestimmungsort der jeweiligen Zellpopulation festlegen pr zise koordiniert Des Weiteren reguliert die Beschaffenheit der extrazellul ren Matrix auch die Geschwindigkeit der wandernden Zellen Im Verlauf der Embryogenese finden zwei grundverschiedene Arten der Zellwanderung statt wobei die beteiligten Zellen sich aufgrund ihrer Morphologie voneinander abgrenzen So wandern epitheliale Zellen ausschlie lich in Form von gro en Zellverb nden und legen nur kurze Strecken innerhalb des Embryos zur ck Ein wichtiges Beispiel f r die Migration epithelialer Zellen ist die konvergente Extension welche besonders in Organ smen wie Fischen und Amphibien eine Rolle spielt deren Gr e m Verlauf der fr hen Embryonalentwicklung keiner drastischen nderung unterliegt Keller er al 2000 Im Gegensatz dazu bewegen sich die mesenchymalen Zellen vers
185. se regulated actin assembly by diaphanous related formins mDial and Daaml in platelets J Biol Chem 283 8746 8755 Higgs H N 2005 Formin proteins a domain based approach Trends Biochem Sci 30 342 353 Hinck L 2004 The versatile roles of axon guidance cues in tissue morphogenesis Dev Cell 7 783 793 Hinz B Alt W Johnen C Herzog V and Kaiser H W 1999 Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED a new computer assisted motion analysis Exp Cell Res 251 234 243 Hoffman C S and Winston F 1987 A ten minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli Gene 57 267 272 Hohenester E 2008 Structural insight into Slit Robo signalling Biochem Soc Trans 36 251 256 Horesh D Sapir T Francis F Wolf S G Caspi M Elbaum M Chelly J and Reiner O 1999 Doublecortin a stabilizer of microtubules Hum Mol Genet 8 1599 1610 Humphries J D Wang P Streuli C Geiger B Humphries M J and Ballestrem C 2007 Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin J Cell Biol 779 1043 1057 Keller R Davidson L Edlund A Elul T Ezin M Shook D and Skoglund P 2000 Mechanisms of convergence and extension by cell intercalation Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 355 897 922 Kelly W and Stumpf M 2008 Protein protein interactions from glob
186. se von ATP welches an jede Untereinheit gebunden ist 8 ADF Cofilin baut ADP Aktinfilamente ab 9 Die Rho GTPasen aktivieren PAK und LIM Kinasen welche ADF Cofilin phosphorylieren und dadurch den Aktinumsatz verlangsamen 10 Profilin katalysiert den Austausch von ADP gegen ATP Dadurch stehen abgebaute Aktin Monomere erneut f r die Verl ngerung von Aktinfilamenten bereit Modifiziert nach Pollard and Borisy 2003 Pollard 2007 Nachdem sich ein Zellfortsatz an der Migrationsfront gebildet hat muss dieser zur Stabilisierung der auswachsenden Zellmembran mit der extrazellul ren Matrix eine Bindung eingehen Die neu gebildeten Adh sionsstellen dienen anschlie end als Ankerpunkte f r die Vorw rtsbewegung der Zelle Eine zentrale Rolle bei der Adh s on an die extrazellul re 9 Einleitung Matrix nehmen die Integrine ein Transmembranproteine welche indirekt an die intrazellul ren Enden von Aktin Stressfasern binden und gleichzeitig mit Proteinen der extrazellul ren Matrix zum Beispiel Fibronektin interagieren Integrine sind Heterodimere und setzen sich aus verschiedenen Kombinationen an a und B Ketten zusammen Diese Variierung der Proteinzusammensetzung ist f r die differenzierte Interaktion mit unterschiedlichen extrazellul ren Matrixproteinen verantwortlich Lock et al 2008 Die Bindung der Integrine an hre Liganden l st eine Konformations nderung aus welche intrazellul re S gnalkaskaden an der Migrationsfron
187. skripten des Slit Rezeptors Robol wie auch von Lpd untersucht Aufgrund der Einbindung in die Slit Robo vermittelte Signaltransduktion und der Interaktion zwischen MEGAP und Robol Wong et al 2001 sowie zwischen MEGAP und Lpd wurde zumindest eine partielle berlappung der Expressionsmuster erwartet Eine Co Expression mit der Megap mRNA konnte sowohl fur Robol als auch f r Lpd gezeigt werden Jedoch wurden auch Bereiche identifiziert welche die Co Expression von Megap und Lpd aber nicht die Expression von Robol aufwiesen Ein interessantes Beispiel stellen hier die trigeminalen Ganglien dar Diese Strukturen beinhalten wahrend der embryonalen Entwicklung sowohl neuronale Zellk rper als auch die Forts tze von Nervenzellen Da Megap und Robol in den trigeminalen Ganglien nicht co exprimiert werden ist hier die Einbindung von MEGAP und Lpd in Robol unabhangige Signalwege sehr wahrscheinlich Im ZNS der S ugetiere werden neben Robol zwei weitere Slit Rezeptoren der Robo Familie exprimiert Robo2 und das auch als Rig 1 bezeichnete Protein Robo3 Dickson and Gilestro 2006 hnlich der Funktion von Robol wird Robo2 verst rkt in Axonen nach dem berqueren der Mittellinie exprimiert so dass diese die Mittellinie nicht ein zweites Mal kreuzen Long et al 2004 Im Gegensatz dazu wurde die Expression von Robo3 in Axonen vor dem Uberqueren der Mittellinie detektiert Es konnte gezeigt werden dass die Expression von Robo3 die Sensitivit t von Axone
188. ss Tolerance MS MS Ion Search Trypsin Carbamidomethyl C Oxidation M Monoisotopic Unrestricted 200 ppm Fragment Mass Tolerance 0 1 Da Max Missed Cleavages 1 Instrument type Number of queries ESI QUAD TOF 126 124 Anhang 5 7 NCBI Referenzsequenzen Gen Protein Spezies Nukleotid Sequenz Peptid Sequenz MEGAPa Mensch AF427144 AANO7095 Megap Maus NM 080448 NP 536696 ROBOI Mensch NM 002941 NP 002932 Robol Maus NM 019413 NP 062286 Lpd Mensch NM 213589 NP _ 998754 Lpd Maus NM 001045513 NP 001038978 mDial Mensch NM 005219 NP 005210 mDial Maus NM _007858 NP 031884 Periphilin Mensch NM 016488 NP 057572 5 8 Internetadressen A Video Tour of Cell Motility http cellix 1mba oeaw ac at Allen Institute for Brain Science http www brain map org Expert Protein Analysis System ExPASy http expasy ch Genepaint www genepaint org Kazusa DNA Research Institute http www kazusa or jp e index html Image Processing and Analysis in Java ImageJ http rsb info nih gov 1j National Center for Biotechnology Information http www ncbi nlm nih gov NIH Gensat Project www ncbi nlm nih gov projects gensat Programm Primer3 http frodo wi mit edu RZPD Ressourcenzentrum fur Genomforschung http www rzpd ia de 125 Referenzen 6 Referenzen Alberts B 1998 The cell as a collection of protein machines preparing the next generation of molecular biologists Cell 92 291 294 Armstrong L
189. ssion von MEGAP wurde Lpd an Fokalen Adhasionen detektiert Mit Hilfe von Live Cell Imaging Analysen wurde gezeigt dass MEGAP unabh ngig von seiner GAP Aktivit t einen inhibierenden Effekt auf Lpd und damit verbundene Lamellipodien Dynamik aus bt Die Verwendung der MEGAP SH3 Mutante Y755D demonstrierte dass ein Verlust der Interaktion zwischen MEGAP und Lpd nicht nur die Co Lokalisation der beiden Proteine an Fokale Adh sionen unterbindet sondern auch die Ausbildung kleiner Lamellipodien trotz verbleibender GAP Aktivit t erm glicht Somit kann angenommen werden dass MEGAP die Dynamik von Lamellipodien durch die Rekrutierung von Lpd an Fokale Adh sionen hemmt Vil Summary of the work Identification and characterization of MEGAP interaction partners presented by Diplom Biochemikerin Lydia Hau bmann Supervisior Professor Dr Gudrun A Rappold This work focused on the search for novel MEGAP interaction partners a protein associated with severe mental retardation MEGAP srGAP3 is a member of the Slit Robo GAP srGAP family and is involved in repulsive axon guidance and neuronal migration via Slit Robo mediated signal transduction Affecting particularly the activity of Racl and binding to the WASP related protein WAVEI MEGAP has previously been shown to inhibit actin polymerisation To understand the functional correlation of the interactions between MEGAP the Slit receptor Robol and further MEGAP interaction partners
190. sst werden 66 Ergebnisse de de Se SOS amp d g d Oo Oo B A ZS N A A x A A oO S O S O O O LC O 1 gt TR 3 gt Sr e gt a f 180 kDa 5 gt i An Te es 130 kDa 180 kDa WW a PR gt 100 kDa ZS 6 130 kDa 70 kDa mm TE gt gt kDa S 100 kDa no eh e Pr di a e z K 45 kDa og 70 kDa rt Wl NM HEK293 Zelllysat ohne Adultes Mausgehirn Lysat Zelllysat 1 YLP motif containing protein 1 YLP motif containing protein 2 HLA B associated transcript 2 2 Lamellipodin Ras association and 3 YLP motif containing protein pleckstrin homology domains 1 isoform 2 4 Lamellipodin Ras association and 2 GYFIP KIAA1168 pleckstrin homology domains 1 isoform 2 4 NCK associated protein 1 5 Diaphanous homolog 1 5 WASP family 1 6 SF1 Splicing factor 1 Abbildung 22 GST Pulldown mit der MEGAP SH3 Dom ne und Zelllysaten von HEK293 Zellen A bzw adultem Mausgehirn B Die rot markierten Proteine wurden als putative MEGAP Interaktionspartner selektiert Die detaillierten Ergebnisse der Massen spektrometrie Analyse des GST Pulldowns mit adultem Mausgehirn sind im Anhang aufgef hrt Abschnitt 5 6 Im Rahmen der Analyse der Proteinbanden mittels Massenspektrometrie konnte f r Lamellipodin eine Phosphorylierung am Aminos urerest S899 detektiert werden 3222 Verifizierung der putativen Interaktionspartner Yeast Two Hybrid Screen und GST Pulldown mit
191. t und innerhalb der Lamella aktiviert Die Aktivierung von Integrinen auf der zytoplasmatischen Seite wird durch die Bindung von Talin vermittelt und involviert auch die Protein Kinase C PKC kleine GTPasen und PI3K S gnaltransduktionswege Arnaout er al 2007 Im Anschluss an die Aktivierung lagern sich Integrinkomplexe zusammen und rekrutieren weitere Struktur und Signalproteine wie zum Beispiel Vinculin um die Adh sionskontakte zu stabilisieren und sp ter ausgereifte Fokale Adh sionen innerhalb der Lamella zu bilden Abbildung 5 Perr ef Tain F actin Inactive Inactive y integrin Vinculin M N Active nn Integrin Ase ay Cellfront m s Protrusion y O A Focal adhesion GE Abbildung 5 Regulation Fokaler Adh sionen durch Vinculin Uber niedrig affine Bindungen wird Vinculin an das Integrin bindende Protein Talin rekrutiert Fokale Komplexe und durch Interaktion zum Beispiel mit Aktin aktiviert Die Aktivierung von Vinculin f hrt zu einer Konformations nderung und einer hoher affinen Bindung an Talin Dies stabilisiert die aktive Konformation der Integrine und f rdert somit Stabilisierung und Wachstum Fokaler Adhasionen FA Die Destabilisierung der FA erfolgt u a ber den Abtransport von Akt n retrograde flow und somit Vinculin Sofern Vinculin im Verlauf der Bildung Fokaler Komplexe nicht aktiviert wird werden diese sehr schnell wieder abgebaut Humphries er al 2007 W
192. tag bacCCUCCCL TEE agcagqtatgc EUCCCOCaaat ES E EE EE gccaagctaa KEE ET teccicggggt gatgteacaa L Se CEA acaaalaaclt EE EE ECELELELUELG gtgtarcttta gcatargecce caacaggtgg accacallt 113 Anhang gt 211210147480lrefINM_023009 5 Homo sapiens MARCKS like 1 MARCKSL1 mRNA 61 11 181 241 gt 01 361 421 481 541 601 661 Jal 781 841 SE 961 1021 1081 1141 1201 1761 Seel 1381 1441 15041 15961 SOCAELCLOIg aggcgqcagct CIICCIIICC SCECCCagcee ecoccoagga tgaaaagcaa cagatgaggc StqeqgCcda LCaagaagcc SI EE gcagcgacga Cecaqggccaad Cagagccatc DEER H gcgaggtceac C CaL cgoro Se tee ege ter ggttagtgat cataaggcag EE SE CTECCCCUCE actgccccgt Sadcetgltgle tgtaatgtga CGcaaacccca EOIGELELLACE aaaaaaagaa cgcggagcgg SIIELECSCSE Gaccccgqccg JacccecaLlc gIgcagcaggc tggagactta Agecggggcc gggggaggtc ttteaaattg LOCCECCECa gggcactgoer gggggcagag EE EE Ee aggtaggggc EGCCLOGacCC er cceagcca ELCLOCLCCE gtgaaatgct LUGETOQGELL CCCULOGagcca tgtttttagt STEFGLELEELE ECUCET CC EE aacaacttct gatL tgtact gtaacatttg aaaaaaaaaa agcggcggcg cggcacccct CacCtalecce Wisscascc GELLCCecetg ECCCCCaagd actggcgarg Ceceoccaagg erte tert egen cecacagagg Caggaaggga gctagtgcag gggecggaga aggtgggtga EE EES COLTCECCECL aaggccagtt OLG tCeCLOCCCaa gaagtggggt STEELOLOSCE ataaatgtcet cttggtaagce COECTCEECEL EE e Se Ge geg gQaaaaggaat aaaa Ggcgcagcta eCcccetcqgg tgeggcgcga agagctcecaa
193. te des MEGAP Proteins basieren im Hefesystem nicht erfasst In diesem Zusammenhang wurde fur MEGAP bereits gezeigt dass uber die Phosphorylierung des C terminalen Tyrosinrestes Y755 die Interaktion zwischen MEGAP und WAVE I reguliert wird Endris et al 2009 Des Weiteren besitzt MEGAP eine Vielzahl an Serin und Threoninresten deren Phosphorylierungsstatus bisher nicht ausreichend analysiert worden ist Zus tzlich kann nicht ausgeschlossen werden dass das verk rzte MEGAP Proteinfragment nach der Translation nicht korrekt gefaltet wurde Dieser Effekt ist m glicherweise durch die Generierung eines Fusionsproteins aus der DNA bindenden Dom ne von GAL4 und MEGAP C verst rkt worden Die ver nderte Terti rstruktur k nnte somit auch die Bindungseigenschaften von MEGAP C zu putativen Interaktionspartnern beeinflusst haben Neben der fehlerhaften Expression einiger humaner Proteine 1m Hefesystem stellen die autoaktivierenden Eigenschaften vieler Fusionsproteine ein weiteres Hindernis fur die Isolierung echter Interaktionspartner dar Sobald einer der putativen Bindungspartner die Expression der analysierten Reportergene allein aktivieren kann existiert keine M glichkeit diesen Kandidaten im Hefesystem zu verifizieren Daher mussten Hefeklone welche ein 86 Diskussion Protein mit autoaktivierenden Eigenschaften exprimierten als negat v bez glich der Interaktion zu MEGAP C bewertet werden Ein extremes Beispiel f r diese Situation st
194. ten mit Lpd an spezifischen zellul ren Strukturen markiert durch we e Pfeile Im Gegensatz zu Lpd wurde MEGAP RI auch an der Migrationsfront eines kleinen Membranfortsatzes detektiert roter Pfeil C Co Transfektion von EYFP markiertem MEGAP Y755D SH3 Mutante welche nicht an Lpd bindet und mCherry Lpd Weder die Co Lokalisation zwischen MEGAP Y755D und Lpd noch an distinkte zellul re Strukturen konnte beobachtet werden Die Ma stabsbalken in A bis C entsprechen 10 um 3 6 MEGAP hemmt die Dynamik von Lamellipodien MEGAP inhibiert die Polymerisation von verzweigtem Aktin indem es die GTPase Aktivit t von Racl erh ht Endris et al 2002 und somit die Aktivierung des WAVE 1 Komplexes unterbindet Soderling et al 2002 Im Gegensatz dazu kann Lpd die Dynam k von Lamellipodien ber die Beeinflussung des F Aktingehaltes in der N he der Migrationsfront steigern Krause et al 2004 Die Co Lokalisation von MEGAP und Lpd an Strukturen in der Nahe der Zellmembran wies auf die Einbindung beider Proteine in 73 Ergebnisse einen gemeinsamen Signaltransduktionsweg fur die Regulation des Aktinzytoskeletts hin Demnach sollten nun Aspekte der Lamellipodienbildung untersucht werden welche in Zusammenhang mit der Interaktion zwischen MEGAP und Lpd stehen Zu diesem Zweck wurde der Wachstumsfaktor PDGF platelet derived growth factor eingesetzt durch dessen Stimulierung in NIH 3T3 Zellen gezielt Lamellipodien induziert werden
195. ter den Wert der Kontrollzellen reduziert Aufgrund der GTPase aktivierenden Funktion von MEGAP war der inhibierende Effekt auf Lpd und die damit verbundene Lamellipodien Dynamik besonders ausgepr gt Die starke Verringerung der Wachstumsgeschwindigkeiten spiegelte die Tatsache wider dass MEGAP die Ausbildung von Zellforts tzen generell hemmte Die Co Expression von MEGAP RI und Lpd f hrte ebenfalls zu einer Reduktion der Wachstumsgeschwindigkeiten Diese waren jedoch aufgrund der GAP Defizienz im Verhaltnis zur Co Expression von Wildtyp MEGAP und Lpd leicht erhoht Dar ber hinaus konnte gezeigt werden dass MEGAP RI unter Co Expression mit Lpd nicht nur die Wachstumsgeschwindigkeiten von Lamellipodien verringerte sondern auch dem stimulierenden Effekt von Lpd auf die Umfange von Zellforts tzen entgegenwirkte Abbildung 33B Somit wurde demonstriert dass MEGAP einen GAP unabh ngigen inhibierenden Effekt auf Lpd und damit verbundene Aktin Dynamiken aus bt 78 Ergebnisse Abbildung 32 Zeitrafferaufnahmen von NIH 3T3 Zellen unter Serum Reduktion und Stimulierung durch PDGF bei Zeitpunkt 0 min A Transfektion der Zelle mit Wildtyp MEGAP EYFP gr n und mCherry Lpd rot Aufgrund des starken inhibierenden Effektes von MEGAP bildete die Zelle trotz berexpression von Lpd kaum Zellforts tze aus B Co Transfektion von EYFP markiertem MEGAP RI gr n und mCherry Lpd Im Vergleich zur Co Expression von Wildtyp MEGAP und Lpd A zeigte di
196. tgi R Podtelejnikov A V Mann M and Kirschner M W 2002 Mechanism of regulation of WAVEI nduced actin nucleation by Racl and Nck Nature 4 8 790 793 Eichenbaum H 2004 Hippocampus cognitive processes and neural representations that underlie declarative memory Neuron 44 109 120 Endris V Haussmann L and Rappold G 2009 Abl dependent Phosphorylation of MEGAP srGAP3 affects its binding to WAVE 1 submitted Endris V Wogatzky B Leimer U Bartsch D Zatyka M Latif F Maher E R Tariverdian G Kirsch S Karch D and Rappold G A 2002 The novel Rho GTPase activating gene MEGAP srGAP3 has a putative role in severe mental retardation Proc Natl Acad Sci U S A 99 11754 11759 Faix J and Grosse R 2006 Staying in shape with formins Dev Cell 70 693 706 Fields S and Song O 1989 A novel genetic system to detect protein protein interactions Nature 340 245 246 Frangioni J V and Neel B G 1993 Solubilization and purification of enzymatically active glutathione S transferase pGEX fusion proteins Anal Biochem 2 0 179 187 Gertler F B Niebuhr K Reinhard M Wehland J and Soriano P 1996 Mena a relative of VASP and Drosophila Enabled is implicated in the control of microfilament dynamics Cell 87 227 239 Ghashghaei H T Lai C and Anton E S 2007 Neuronal migration in the adult brain are we there yet Nat Rev Neurosci 8 141 151 Gleeson
197. tsorgen e nach Waschen in PBS Schnitte mit je 190 ul Glyceringelatine luftblasenfrei eindecken bersch ssige Fl ssigkeit mit Papiert chern abnehmen und OT U N im Abzug ausdampfen lassen 2 10 Yeast Two Hybrid Methoden Verwendete Puffer und Materialien 3 AT Sigma 3 Amino 1 2 4 Triazol B Mercaptoethanol Roth 14 4 M Glass Beads Sigma Partikelgr e 400 600 um Glukose Merck 20 Glukose steril filtriert ONPG O nitrophenyl B D galactopyranosid ONPG L sung 40 mg ONPG in 10 ml Z Puffer Phenol Chloroform gebrauchsfertige L sung Isoamylalkohol 25 24 1 Roth Yeast Lysis Solution 100 mM Tris HCl pH 8 0 1 mM EDTA 1 SDS 2 TritonX 100 X gal Roth 5 bromo 5 chloro 3 indolyl B8 D galactosid X gal Stockl sung X gal mit einer Konzentration von 20 Bi in DMF l sen und lichtgesch tzt ber 20 C aufbewahren Z Puffer Na HPO 7 H O 16 1 NaH gt PO S HO 5 5 Si KCl 0 75 8 MgSO 7 H20 0 246 pH auf 7 0 einstellen autoklavieren 39 Material und Methoden Z Puffer X gal L sung 100 ml Z Puffer 0 27 ml B Mercaptoethanol 1 67 ml X gal Stockl sung Z Puffer mit B 100 ml Z Puffer Mercaptoethanol 270 ul B Mercaptoethanol N hrmedien f r Hefen YPD Vollmedium 10 g Hefeextrakt 10g Pepton 100 mg Adeninsulfat Sigma ad 1000 ml H20 bidest Nach Einstellen des pH auf 6 0 mit HCl wurde f r 25 min bei 121 C autoklaviert und dann 20 g Glucose zugegeben Selektivmedium SC Medium 13 4 g Ye
198. u war kein Hefewachstum bei den mit MEGAP C und WAVE I bzw MEGAP SH3 KID und WAVE I co transformierten Klonen zu beobachten Der Kontrollstamm B welcher schwach interagierende Proteine exprimiert zeigte ebenfalls kein Wachstum Daher konnten m glicherweise sehr schwache Interaktionen im Yeast Two Hybrid Screen nicht repr sentiert werden Da jedoch die Interaktion zwischen MEGAP und WAVE 1 im Hefesystem bisher noch nicht gezeigt wurde kann hier keine Aussage bez glich des fehlenden Wachstums getroffen werden 1 10 1 100 1 10 1 100 Abbildung 14 Kontrollexperiment der 3 AT Titration unter Verwendung von 25 mM 3 AT und 72h Inkubation bei 30 C Neben den Kontrollst mmen B D Anhang 5 2 wurden folgende Hefeklone analysiert I pDEST32 MEGAP C pDEST22 WAVE 1 II pDEST32 MEGAP C pDEST22 ROBOI CC3 LI pDEST32 MEGAP C pDEST22 parentaler Vektor IV pDEST32 MEGAP SH3 KID pDEST22 WAVE 1 V pDEST32 MEGAP SH3 KID pDEST22 ROBOI CC3 VI pDEST32 MEGAP SH3 KID pDEST22 parentaler Vektor Im Rahmen der 3 AT Titration konnten keine Unterschiede zwischen MEGAP C und MEGAP SH3 KID bez glich der Interaktion mit Robol und ihrer autoaktivierenden Eigenschaften festgestellt werden In diesem Fall wurde das gr ere Fragment MEGAP C f r den Yeast Two Hybrid Screen ausgew hlt da sich gr ere Proteine unter Umst nden besser falten 2 10 42 Verwendung einer humanen f talen Gehirn cDNA Bibliothek Im Rahmen der Expressionsanalyse kon
199. ueries 113 4 Napl NCK associated protein 1 Mascot Search Results Uwe Warnken U Warnken dkfz de User Email Search title MS data file Anhang C Program Files Matrix Science Mascot Daemon data 060803_VE1122_4 pkl Database NCBInr 080606 3841279 sequences 1323634604 residues Taxonomy Mus musculus house mouse 100484 sequences Timestamp 7 Aug 2006 at 14 12 13 GMT Significant hits gi 28395023 NCK associated protein 1 Mus musculus gi 16797665 GAP3 Mus musculus Probability Based Mowse Score Ions score is 10 Log P where P is the probability that the observed match is a random event Individual ions scores gt 35 indicate identity or extensive homology p lt 0 05 Protein scores are derived from ions scores as a non probabilistic basis for ranking protein hits Humber of Hits di du Ga zu we zu 13 it 0 25 I 750 Lio Probahilitu Based Mowse Score Archive Report of Selected Matches 1 411283250223 Mass 130012 Score 938 Queries matched 34 NCK associated protein 1 Mus musculus Query Observed Mr expt Mr calc Delta Miss Score E 650 37 649 36 649 38 0 02 0 26 0 71 1 6 474 27 946 52 946 52 0 00 1 55 0 00081 1 ZE 489 77 977 52 977 51 0 01 1 13 9 8 d 14 494 80 987 58 987 57 0 01 1 14 10 1 ie 495 24 988 47 988 47 0 00 0 26 0 54 1 18 497 76 993 51 993 51 0 00 1 8 32 3 20 507 76 1013 51 1013 55 0 04 0 14 Tae 1 pa 517 80 1033 58 1033 58 0 00 0 39 0 028 1 23 524 76 1047 50 10
200. ul ONPG L sung Inkubation unter leichtem Sch tteln be 30 C genaue Zeit stoppen ab Zugabe von ONPG b s zum Farbumschlag nach gelb Abstoppen der Reaktion durch Zugabe von 400 ul IM NazCOs Farbe bleibt stabil 1 min bei 13000 rpm abzentrifugieren und den Uberstand in ein neues 1 5 ml Reaktionsgef berf hren Messen der On in entsprechender Verd nnung so dass OD42 zwischen 0 02 1 0 gelesen werden kann linearer Bereich Leerwertbestimmung mit H20 bidest Berechnung der Gal Aktivit t n units B Gal Units OD429 x 1000 Atmin X ODe00 48 Material und Methoden Es wurde stets eine Negativkontrolle sowie Kontrollstamme Invitrogen bekannter Interaktionsstarke als Positivkontrollen mitgefthrt Tabelle 12 nach maximal 3 h oder bei einem beobachteten Farbumschlag der schw chsten bekannten Interaktion wird das Experiment abgebrochen 2 10 45 X Gal Filter Assay Das Prinzip des X Gal Filter Assays entspricht dem des Galactos dase Fl ssigassays mit ONPG auch hier wird die Aktivit t der B Galactos dase bestimmt Der Unterschied besteht dar n dass in diesem Assay keine quantitative Bestimmung des blauen Farbumschlags m gl ch ist Das Vorgehen war wie folgt modifiziert nach Invitrogen Benutzerhandbuch des ProQuest Two Hybrid Systems eine Hybond NX Nylonmembran Amersham wurde auf eine passende Gr e zurechtgeschnitten und unter UV Bestrahlung Stratalinker von beiden Seiten sterilisiert
201. urden Positivkontrollen Kontrollstamme B und C pDEST32 MEGAP C pDEST22 ROBOI CC3 sowie eine Negativkontrolle pDEST32 MEGAP C pDEST22 leer mitgef hrt Zur Verifizierung der Daten wurde der Filter Assay mit allen Klonen zweimal wiederholt Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 zusammengefasst II 2 Test auf Aktivierung des URA3 Gens Zus tzlich zur qualitativen Analyse der Aktivit t des H S3 Reportergens wurde die Aktivierung des URA3 Gens untersucht Nur bei einer Proteininteraktion wird das URA3 Gen exprimiert welches der Hefezelle die Synthese der essentiellen Aminos ure Uracil Ura und somit das Wachstum auf Ura defizienten Platten erm glicht Diese Selektionsmethode zeigte eine sehr starke Stringenz auf da eindeutiges Wachstum nur bei 5 der 1m Filterassay als positiv getesteten Klone nachgewiesen werden konnte Tabelle 9 60 Ergebnisse III Quantifizierung der Reporteraktivit t mittels Galactosidase Fl ssigassay Ausgehend von den Ergebnissen des X Gal Filterassays sowie des Wachstumstests auf Ura defizienten Platten wurden 29 Klone f r eine Quantifizierung der B Galactos daseaktivit t ausgew hlt Abbildung 20 Tabelle 9 Die n diesem Experiment eindeutig positiv getesteten Klone wurden anschlie end mittels DNA Sequenzierung identifiziert Gal units 1 3 5 7 9 ii 43 45 17 12 om e 5 2 De Klon Nr Abbildung 20 Darstellung der im 6 Galactosidase Fl ssigassay getesteten Klone Die Aktivit t d
202. vitat und ber die Interaktion mit WAVE 1 hemmt MEGAP die Aktivierung des Arp2 3 Komplexes Endris er al 2002 Soderling er al 2002 Zus tzlich bewirkt MEGAP die Umlagerung von Lpd an Fokale Adh sionen und unterbindet somit dessen Stimulierung der Aktinpolymerisation an der Zellmembran FA Fokale Adh sion 4 2 4 Verkn pfungen zwischen der Signaltransduktion von MEGAP und Lamellipodin Die Analyse der Lamellipodien Dynamik in den NIH 3T3 Fibroblasten hat die Einbindung von MEGAP in die PDGF induzierten Signalkaskaden demonstriert Uber die Inhibierung von Racl und WAVE 1 unterbindet MEGAP die Arp2 3 vermittelte Aktinpolymerisation Endris et al 2002 Soderling et al 2002 Die neu entdeckte Interaktion zwischen MEGAP und Lpd stellt m glicherweise auch einen Verkn pfungspunkt zwischen Lpd und WAVE 1 dar Abbildung 39A Die Integration von MEGAP WAVE I und Lpd in einen Multiproteinkomplex w re auch mit den Ergebnissen fr herer Studien vereinbar bei welchen Lpd in Proteinkomplexen identifiziert wurde die sowohl das Ena V ASP Protein Mena als auch WAVE 1 enthielten Salazar et al 2003 In dieser Arbeit konnte gezeigt werden dass der inhibierende Einfluss von MEGAP auf die Aktin Dynamiken an der Zellmembran nicht nur ber die Inhibierung von Racl und WAVE I Endris et al 2002 Soderling et al 2002 sondern auch ber die Interaktion mit Lpd erfolgt Sowohl die Bindung von MEGAP an WAVE I Endris et al 2009 als auch an L
203. wird durch die Polymerisation von Aktinfilamenten bereitgestellt Diese bilden entweder parallele Bundel oder ein stark verzweigtes Netzwerk zur Generierung von Filopodien bzw Lamellipodien Pollard and Borisy 2003 Le Clainche and Carlier 2008 In beiden Fallen wird durch die Anlagerung von Aktin Monomeren an die schnell wachsenden barbed Enden von Aktinfilamenten eine mechanische Kraft generiert welche die Zellmembran in die Richtung der Migration dr ckt Im Verlauf der Zellbewegung werden die Aktinfasern innerhalb der Migrationsfront an ihrem hinteren langsam wachsenden pointed Ende kontinuierlich abgebaut Diese Maschinerie aus Aktinpolymerisation und Depolymerisation wird auch h ufig als Aktin Tretmuhle actin treadmill bezeichnet Abbildung 4 In solch einer Konstellation ist die Kraft der Aktinpolymerisation an der Migrationsfront an den Abbau der Aktinfilamente m hinteren Bereich des Lamellipodiums gekoppelt Dieser Prozess treibt die Zelle voran Watanabe and Mitchison 2002 Ponti et al 2004 Die Zusammenlagerung der zwei verschiedenen Aktinstrukturen wird durch unterschiedliche Initiierungsprozesse erreicht Pollard 2007 Der erste Mechanismus wird ber den Arp2 3 Komplex vermittelt welcher mit der Oberfl che existierender Aktinfilamente interagiert und somit neue Keime f r die Anlagerung von Aktin Monomeren G Aktin bildet Das durch diesen Prozess generierte stark verzweigte Aktin Netzwerk bildet die Basis f
204. xpression von MEGAP C und Robol CC3 eindeutig die Expression der Reportergene lacZ und HIS3 aktivieren konnte wurde der Yeast Two Hybrid Screen mit dem MEGAP C Fragment durchgef hrt Die im Rahmen des Yeast Two Hybrid Screens identifizierten putativen Interaktionspartner waren u a die Protein Phosphatase 1 CATS53 das nukle re Protein Periphilin sowie die Focal Adhesion Kinase 1 FAK Die FAK musste zusammen mit weiteren CDNA Klonen sehr fr h aussortiert werden da diese in Bezug auf die Vektorsequenz eine Verschiebung des Leserasters aufwiesen Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde jedoch die Assoziation zwischen MEGAP und Fokalen Adh s onen entdeckt Obwohl die Isolierung der FAK fur das Ergebnis des Yeast Two Hybrid Screens keine Relevanz besitzt ware es eventuell sinnvoll eine m gliche Interaktion zwischen MEGAP und der FAK mit Hilfe weiterer Methoden zu berpr fen Die Enzymkomplexe welche die Translation Faltung und post translationale Modifikation von Proteinen erm glichen sind nicht in allen Organismen identisch So existieren auch Unterschiede zwischen Hefen und den Zellen der Vertebraten obwohl beide Systeme eukaryontische Eigenschaften besitzen Demnach besteht eine sehr hohe Wahrscheinlichkeit dass die Phosphorylierung oder andere post translationale Modifikationen von MEGAP im Hefesystem nicht realisiert werden konnten Folglich wurden Interaktionen welche zum Beispiel auf der Phosphorylierung einzelner AS Res
205. zu lassen e Abzentrifugieren der Fl ssigkeit bei 910 x g f r 5 min wobei die austretende Flussigkeit von einer herkOmmlichen 96 Well Platte aufgefangen wird e Erneute Zugabe von 150 ul H2O bidest pro Well kurz quellen lassen Abzentrifugieren der Flussigkeit bei 910 x g fur 5 min e Beladen der so vorbehandelten MultiScreen Platte mit der Sequenzreaktion Zentrifugation bei 910 x g f r 5 min wobei das entstehende Eluat aufgereinigte Sequenzierreaktion in einer frischen 96 Well Platte aufgefangen wird Die technische Bedienung des MegaBACE1000 Sequenziergerates erfolgte nach den Herstellerangaben Die Sequenzierungen wurden standardm ig unter folgenden Bedingungen durchgef hrt Injektion der Proben 3 5 kV f r 30s Lauf 9 kV f r 100 150 m n je nach L nge der Fragmente Temperatur 44 C Puffer 1x LPA Puffer Amersham Die erhaltenen Sequenzen wurden mit Hilfe des MegaBACE Sequence Analyzer Programms Amersham Biosciences 2002 ausgewertet 25 Material und Methoden 2 5 2 TempliPhi Amplifikation von Plasmidklonen Plasmidkonstrukte wurden ebenfalls auf dem MegaBACEI000 Sequenzierger t sequenziert allerdings wurden die Plasmide zun chst mit Hilfe der TempliPhi Reaktion Amersham Biosciences amplifiziert bevor die eigentliche Reaktion mit dem DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit Amersham Biosciences durchgefuhrt wurde Die TempliPhi Amplifizierung beruht auf dem Prinzip der Rolling Circle Amplifizierun

Megap Lpd - Ruprecht-Karls

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