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Entwicklung von Medikamenten gegen Prionkrankheiten

1. lt EBOBS MOO substance id 0293_G02 9 5 Tage Verl ngerung der berlebenszeit 6 M use 14 Tage i p 100 Tage nach Infektion i c tp1 wird schnell abgebaut PK in Blutplasma und Hirn tp1 und Boehringer Abbildung 3 12 Bildschirmschnappschuss der Software ChemFinder F r den gezeigten Schnappschuss wurde die Datenbank mit allen 20 000 Substanzen aus DIVERSet 1 und 2 ge laden F r eine ausgew hlte DIVERSet 1 Substanz 10293_G02 sind die Molek lstruktur physikochemische Eigenschaften und Wirksamkeiten aus den verschiedenen experimentellen Untersuchungen angezeigt Mit ChemFinder wurden sowohl die DIVERSet Bibliotheken als auch einige fokussierte Bibliotheken verwaltet diese Weise eine Datenbank erzeugen in welcher f r jede Substanz die Molek lstruktur und die weiteren Daten wie die physikochemischen Eigenschaften abgelegt sind Um die Wirksamkeitsdaten aus den verschiedenen experimentellen Untersuchungen als zus tzli 72 3 7 Alternative Datenverwaltung mit ChemFinder che Felder der Datenbank hinzuzuf gen bietet ChemFinder die M glichkeit solche Daten aus geeignet formatierten Textdateien zu importieren wobei direkt die zum Bef llen der TSE DB eingesetzten Textdateien verwendet werden konnten Es waren dazu lediglich die durch das Format 3 11 definierten Substanznamen aus den sdf Daten zu generieren da diese Name
2. A01 A02 A03 A04 A05 A06 A07 A08 A09 A10 A11 A12 30163 1 in 00 Q G IA U file C scratch thomas visual DIVERSet2 INPfindex html x o Go ict _ SIFT Messungen DIVERSet1 _ SIFT Messungen DIYERSet2 _ 2D Strukturen G SIFT Messungen DIVERSet2 30163 gt 0000 i Al N N A j i N 8000 A TIN A N i N N l Ik N A Wil A f IM N IV Al MN N H N PN YN NN y ia r y P IN MII IN N I N f Ths a he na PY fi a ETE TETA Teer PEET EPEA IT rer 8901 ee Deere 1 ee Te esse Te f iit ni titt Heti irtiit 4 aan tt Fertig Abbildung 3 4 Bildschirmschnappschuss von SIFT Viewer I Das Visualisierungswerk zeug SIFT Viewer I erm glicht dem Benutzer einen schnellen Zugriff auf alle Substanzen der DIVERSet Bibliotheken auf deren Molek lstrukturen diverse SIFT Messdaten und daraus berechnete Wirksamkeiten Genauere Erl uterungen finden sich im Text 54 tung angegeben ist die waagrechte Achse zeilenweise die T pfchen der zugrunde liegenden Platte Al A2 B1 B2 H11 e Im darunter liegenden Plot sind in analoger Weise die gem 3 9 berechneten kon trollenbezogenen SIFT Wirksamkeiten als Kreuze angezeigt F r die gezeigte Platte werden vier T pfchen die Wirksamkeiten a 1 zugeordnet Es handelt sich dabei ausschlie lich um Kontrollmessungen Eine der Messungen E11 zeigt eine recht
3. 1 25 v 0 75 v Cl mi BSc3160 Cl seat 91 0 50 rn oo oA Nx P mA e 0 00 i OL n c CI BSc3193 BSc3202 ni A 1 0 i 2 S AS 10 20 30 100 concentration uM m Negative DOSPA m Bsc3160 Bsc3191 4 Bsc3193 Bsc3202 BSc3205 Magir Bsc3205 v Bsc3217 F3C Abbildung 5 14 SIFT Dosis Wirkungs Analysen f r neue NBB Derivate Gezeigt sind die Dosis Wirkungs Kurven die f r sechs NBB Derivate bei Konzentrationen zwischen 0 1 uM und 100 uM im SIFT Assay bestimmt wurden Wie in der Legende angegeben ist sind hier die Werte f r negative und positive Kontrollen durch rote Quadrate bzw blaue Kreise und die Werte der Testsubstanzen durch weitere Symbole repr sentiert Daneben sind die Strukturen der getesteten Substanzen dargestellt In dieser Versuchsreihe zeigte die Substanz BSc3217 er h hte Wirksamkeitswerte graue Dreiecke Die Struktur dieser Substanz ist daher eingerahmt activity lt Abbildung 5 14 zeigt exemplarisch die Resultate von solchen Verdiinnungsreihenmessun gen fiir sechs NBB Derivate Hier sind die mithilfe von SIFT Viewer II erzeugten Dosis Wirkungs Kurven zusammen mit den Strukturen der getesteten Substanzen dargestellt Wie der Legende des Dosis Wirkungs Plots entnommen werden kann sind die Wirksam keiten der Negativ Kontrollen bei 0 uM durch rote Quadrate symbolisiert und liegen um den Wert 0 verteilt Die positiven DOSPA Kontrollen blaue Kreise bei 17 uM wei
4. M J S Dewar und W Thiel Ground States of Molecules 38 The MNDO Method Appro ximations and Parameters J Am Chem Soc 99 4899 4907 1977 93 W Humphrey A Dalke und K Schulten VMD Visual Molecular Dynamics J Mol Graph 14 33 38 1996 94 153 Literaturverzeichnis 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 sy 176 154 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH amp Co KG Ingelheim am Rhein Germany http www boehringer ingelheim de 113 S W Davies M Turmaine B A Cozens M DiFiglia A H Sharp C A Ross E Scher zinger E E Wanker L Mangiarini und G P Bates Formation of neuronal intranuclear inclusions underlies the neurological dysfunction in mice transgenic for the HD mutation Cell 90 537 548 1997 115 E Scherzinger R Lurz M Turmaine L Mangiarini B Hollenbach R Hasenbank G P Bates S W Davies H Lehrach und E E Wanker Huntingtin encoded polyglutamine expansions form amyloid like protein aggregates in vitro and in vivo Cell 90 549 558 1997 115 M DiFiglia E Sapp K O Chase S W Davies G P Bates J P Vonsattel und N Aronin Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain Science 277 1990 1993 1997 115 W E Klunk J W Pettegrew und D J Abraham Quantitative Evaluation of Congo Red Binding to Amyloid like Prote
5. M usen Ob Prionen wie nach Prusiners Definition tats chlich keine Erbsubstanz in Form von Nukleins uren enthalten wurde in der Gruppe von Detlev Riesner mit sehr empfindli chen physikalisch chemischen Messungen untersucht 19 20 Anhand der Messungen konnte ausgeschlossen werden dass infekti se Einheiten von PrP mehr als ein Nukle ins ure Molek l von maximal 100 oder sogar nur 25 Nukleotiden enthalten Die in dem Erregermaterial enthaltenen Nukleins ure Molek le sind in jedem Fall zu klein als dass darin das Prion Protein verschl sselt sein k nnte Poly Nukleotide die gr er als 25 Ba sen sind kommen sehr selten vor und k nnen deshalb nicht notwendig f r die Infektiosit t von Prionen sein 20 Gegen ber den herk mmlichen Krankheiten deren Erreger Bakterien Pilze oder Viren sind die sich ber Nukleins uren identisch replizieren zeichnen sich die Prionkrankheiten also dadurch aus dass die Erreger aus fehlgefalteten Proteinen zusammengesetzt sind die sich selbst ndig vermehren Es erhebt sich nun die Frage wie Prionen sich selbst replizieren K nnen 1 3 Mechanismen der Prion Vermehrung 1 3 Mechanismen der Prion Vermehrung Mehrere Mechanismen der Selbstreplikation wurden vorgeschlagen Cohen et al 21 schlugen vor dass sich f r die Umwandlung ein einzelnes PrPSC Molek l an ein PrP an lagert und sich die beiden Molek le zu einem Hetero Dimer vereinigen in dem die struk turelle Umwandlung v
6. U Bertsch K F Winklhofer T Hirschberger J Bieschke P Weber F U Hartl P Tavan J Tatzelt H A Kretzschmar und A Giese Systematic Identification of Antiprion Drugs by High Throughput Screening Based on Scanning for Intensely Fluorescent Targets J Virol 79 7785 7791 2005 18 25 26 29 30 31 32 36 95 96 97 99 100 102 U Bertsch K F Winklhofer T Hirschberger J Bieschke P Weber F U Hartl P Tavan J Tatzelt H A Kretzschmar und A Giese Single Molecule Analysis of Protein Aggregation and Prions by SIFT FEBS J 272 338 339 2005 18 95 H A Kretzschmar U Bertsch K F Winklhofer T Hirschberger J Bieschke P Weber F U Hartl P Tavan J Tatzelt und A Giese Single Molecule Analysis of Protein Aggrega tion and Prions by SIFT J Neuropath Exp Neur 64 441 441 2005 18 95 U Bertsch A Giese H Kretzschmar P Tavan T Hirschberger J Bieschke P Weber K F Winklhofer J Tatzelt F U Hartl et al Systematic Identification of New Anti Prion Drugs by High Throughput Screening Based on Scanning for Intensely Fluorescent Targets SIFT PCT EP2005 005614 WO 2005 116640 A2 18 95 103 110 112 114 ChemBridge Corporation San Diego CA USA http chembridge com 19 44 O F Giiner Herausgeber Pharmacophore Perception Development and Use in Drug Design International University Line La Jolla California 2000 19 P Ehrlich Uber den jetzigen Stand der C
7. e den SIFT Viewer I der einen schnellen Webbrowser gest tzten Zugriff auf 2D SIFT Spektren daraus gewonnene Wirksamkeitsma e chemische Strukturen etc erlaubt e den in Java geschriebenen SIFT Viewer II der die Funktionalit ten des SIFT View er I im Hinblick auf den Einsatz mustererkennender Verfahren auf die Variabilit t von Mikrotiterplatten Layouts auf eine Datenbankanbindung etc erweitert e die Oracle basierte Datenbank TSE DB zur Haltung m glichst aller im Verbund gewonnener Daten und insbesondere der vollst ndigen SIFT Messdaten e die dateibasierte Haltung der TSE DB Daten mithilfe der Chemie Software Chem Finder welche chemische Strukturen von potenziellen Wirkstoffen mit experimen tell in den diversen Assays gewonnenen Wirksamkeitsma en kombiniert Aus der obigen Auflistung ist zu erkennen dass die Zuordnung von experimentell be stimmten Wirksamkeiten zu vorgegebenen durch ihre chemische Struktur definierten Sub stanzen ein wesentlicher Aspekt der Datenhaltung und analyse ist W hrend bei Zellkul turversuchen Wirksamkeiten direkt als Messergebnisse vorliegen muss bei SIFT Mes 37 3 Methoden zur Haltung Auswertung und Visualisierung von Daten sungen ein geeignetes Wirksamkeitsma erst noch aus den 2D SIFT Spektren dekodiert werden Da das Hochdurchsatz Screening mit der SIFT Technik den Ausgangspunkt der Medika mentensuche bildete musste also zun chst ein einfach zu handhabendes Wirksamkeits
8. outlier activity sc classification gui dbbrowser infopane substancetree S ST Et event plate selectors views ee pictures tools Abbildung B 1 Paketstruktur der Java Bibliothek t sedb Die Bibliothek tsedb stellt grundlegende Datenstrukturen und Funktionalit ten wie Datenbankanbindung Dateisystem Ein und Ausgabe verschiedene Analyseverfahren sowie Komponenten der grafischen Benut zerschnittstelle zur Verf gung Aus diesen Bausteinen sind die ebenfalls in der tsedb Bi bliothek enthaltenen Anwendungen TSE DB Browser Abschnitt 3 5 3 und SIFT Viewer II Abschnitt 3 6 zusammengesetzt welche zudem in einer hierarchischen Struktur angeordnet sind Anhand der in Abbil dung B 1 gezeigten Paketstruktur der tsedb Bibliothek sollen nun die in den Paketen umgesetzten Funktionalit ten erl utert werden In den Paketentsedb generated db tsedb dataundtsedb data sift wer den Datenstrukturen definiert die ausschlie lich zur Haltung von Daten dienen Dem Gedanken der Objektorientierung folgend wurden dabei die realen Objekte der Medika mentensuche wie Substanzen Platten Bibliotheken Messdaten Messergebnisse etc auf virtuelle Objekte in Gestalt von Java Klassen abgebildet Diese Abbildung geschah indi rekt anhand der in Abschnitt 3 5 1 beschriebenen Tabellen der TSE DB deren Eintr ge die Objekte der realen Welt repr sentieren Aus den Definitionen der Datenbanktabellen wurden dabei die
9. Aggregate bei niedrigen mikromolaren Konzentrationen induziert wurde diese Verbindung als Referenz Substanz f r die SIFT Screening Kampagne eingesetzt 91 Im Verbundprojekt wurde das ScN2a Modell zur in vivo Validierung von Substanzen ein gesetzt die im in vitro SIFT Screening als wirksam gefunden worden waren Die infi zierten Zellen wurden dazu zwei Tage mit einer gegebenen Testsubstanz behandelt An schlie end wurden die Zellen mit einem Puffer gewaschen von der Schale gekratzt und zentrifugiert und der entstandene Niederschlag wurde in einem weiteren Puffer gel st Das dadurch erzeugte Lysat wurde erneut zentrifugiert und dabei in zwei Fraktionen den l slichen berstand S Supernatant und den unl slichen Niederschlag P Pellet aufge spalten Dadurch wurden die enthaltenen PrP Molek le nach ihrer Isoform sortiert wobei das l sliche PrP haupts chlich in der S Fraktion vorliegt und das unl sliche PrPS haupt s chlich in der P Fraktion gefunden wird Anschlie end wurden Western Blots f r die beiden Fraktionen erstellt wobei die jeweils enthaltenen Molek le elektrophoretisch nach 31 2 Der Forschungsverbund TSE Therapie der Gr e aufgespalten mittels Electroblotting auf Membranen bertragen und PrP und PrP jeweils ber ein anti PrP Antiserum sichtbar gemacht wurden F r quantitative Bestimmungen des von den Zellen gebildeten PrP wurde in manchen Experimenten das Lysat vor der Western
10. Die SIFT Technik kann auch dazu eingesetzt werden die Wirksamkeit von Testsubstan zen gegen die Aggregation eines weiteren wichtigen Proteins des amp Synukleins S zu untersuchen Die Aggregation von gS tritt bei den sogenannten Synukleinopathien wie der Parkinsonschen Krankheit auf fiir einen Ubersichtsartikel siehe Goedert 106 Wie in Kapitel 1 angesprochen wurde bilden sich auch hier ahnlich wie bei den Prionkrank heiten Aggregate die haupts chlich aus Proteinen bestehen und denen zelltoxische Ei genschaften zugeschrieben werden Im Gegensatz zu PrP ist wS in w ssriger L sung unstrukturiert nimmt jedoch w helikale Strukturen an wenn es an apolare Oberfl chen wie etwa an biologische Membranen oder Mizellen angelagert ist 107 Jn vitro kann die von der Umgebung abh ngige Faltung von aS durch organische L sungsmittel z B einfache Alkohole wie Ethanol oder fluorierte Alkohole wie Trifluoroethanol TFE gesteuert werden 108 Dabei zeigt sich dass hohe Konzentrationen von fluorierten Alkoholen die Faltung von S in a helikale Strukturen beg nstigen w hrend niedrige Konzentrationen von einfachen oder fluorierten Alkoholen die Faltung von S in faltblattreiche Intermediate bewirken die als Ausgangspunkte f r die Bildung von Fibrillen fungieren Am ZNP wurde ein in vitro Modellsystem etabliert in welchem anstelle von Alkoholen das L sungsmittel DMSO bei niedrigen Konzentrationen 0 3 dazu eingesetzt wird d
11. www treemenu org 84 Leadscope Inc Columbus OH USA http www leadscope com 88 R Clark OptiSim An Extended Dissimilarity Selection Method for Finding Diverse Repre sentative Subsets J Chem Inf Comput Sci 37 1181 1188 1997 88 90 91 R D Brown und Y C Martin Use of structure Activity data to compare structure based clustering methods and descriptors for use in compound selection J Chem Inf Comput Sci 36 572 584 1996 88 89 R D Brown und Y C Martin The information content of 2D and 3D structural descriptors relevant to ligand receptor binding J Chem Inf Comput Sci 37 1 9 1997 88 Daylight Theory Manual 2006 http www daylight com dayhtml doc theory index pdf 89 90 T T Tanimoto JBM Internal Report Technischer Bericht IBM Technical Report Series November 17 1957 91 Tripos SARNavigator User s Guide Version 1 5 2004 91 N W Schiffer S A Broadley T Hirschberger P Tavan H A Kretzschmar A Giese C Haass F U Hartl und B Schmid Identification of Anti prion Compounds as Efficient Inhibitors of Polyglutamine Protein Aggregation in a Zebrafish Model J Biol Chem 282 9195 9203 2007 93 115 116 118 G M Morris D S Goodsell R S Halliday R Huey W E Hart R K Belew und A J Olson Automated docking using a Lamarckian genetic algorithm and an empirical binding free energy function J Comp Chem 19 1639 1662 1998 93 117
12. A Kretz schmar Cell free formation of misfolded prion protein with authentic prion infectivity Proc Natl Acad Sci USA 103 15818 15823 2006 8 G C Telling M Scott J Mastrianni R Gabizon M Torchia F E Cohen S J DeAr mond und S B Prusiner Prion Propagation in Mice Expressing Human and Chimeric PrP Transgenes Implicates the Interaction of Cellular PrP with Another Protein Cell 83 79 90 1995 8 F Wopfner G Weidenhofer R Schneider A von Brunn S Gilch T F Schwarz T Werner und M Schatzl Analysis of 27 Mammalian and 9 Avian PrPs Reveals High Conservation of Flexible Regions of the Prion Protein J Mol Biol 289 1163 1178 1999 9 J Herms T Tings S Gall A Madlung A Giese H Siebert P Schurmann O Windl N Brose und H Kretzschmar Evidence of Presynaptic Location and Function ofthe Prion Protein J Neurosci 19 8866 8875 1999 9 N Vassallo und J Herms Cellular prion protein function in copper homeostasis and redox signalling at the synapse J Neurochem 86 538 544 2003 9 13 D R Brown K F Qin J W Herms A Madlung J Manson R Strome P E Fraser T Kruck A vonBohlen W SchulzSchaeffer et al The cellular prion protein binds copper in vivo Nature 390 684 687 1997 9 10 M Mentler A Weiss K Grantner P del Pino D Deluca S Fiori C Renner W M Klaucke L Moroder U Bertsch et al A new method to determine the structure of the metal
13. Biophys J 90 3908 3918 2006 vi Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abk rzungsverzeichnis 1 Einleitung 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 Prionkrankheiten aoaaa e Die Prranbypothese nesae anaa seima RER ER ERS Mechanismen der Prion Vermehrung Versuche zur Validierung der Prionhypothese Die Strukturen des Prion Proteins Der Lebenszyklus und die Funktion vonPrP 2 22 2 2000 Bekannte anti Prion Substanzen 2 22 Cm nn Neue Strategien 2 2 5 oc eat 2422 2 2 24 2 nad nina Bes 2 Der Forschungsverbund TSE Therapie 2 1 22 2 3 2 4 2 5 2 6 Die DIVERSet Bibliotheken Ha 2 2 2a fee Se I ar a Der anti Prion 2D SIFT Assay TPl 2 2 1 Derin vitro Aggregations Assay 2 Cm nenn 2 2 2 Die 2D SIET Messtechnik 2 4 a4 ete ee Be 2 2 3 2D SIFT Daten f r den Prion Aggregations Assay 2 2 4 Verschiedene Einsatzformen des SIFT Assays Ein Zellkulturmodell f r Prionkrankheiten TP4 HTS f hige Zellkulturen und ein weiteres Modellsystem TP3 Therapeutische Behandlung von Scrapie infizierten M usen TP1 Medizinal und kombinatorische Chemie TP6 3 Methoden zur Haltung Auswertung und Visualisierung von Daten 3 1 32 3 3 Erkennung von Ausreibern zu zu var za 2a 8 ra Bu 3 1 1 Eine Median basierte Erkennung 3 1 2 Ei
14. D Raymond M Horiuchi und B Caughey Inhibition of protease resistant prion protein formation by porphyrins and phthalocyanines Proc Natl Acad Sci USA 95 12117 12122 1998 15 S Priola B Caughey und W Caughey Novel therapeutic uses for porphyrins and phtha locyanines in the transmissible spongiform encephalopathies Curr Opin Microbiol 2 563 566 1999 15 147 Literaturverzeichnis 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 amt 84 85 86 148 S A Priola A Raines und W S Caughey Porphyrin and phthalocyanine antiscrapie com pounds Science 287 1503 6 2000 15 V Perrier A C Wallace K Kaneko J Safar S B Prusiner und F E Cohen Mimicking dominant negative inhibition ofprion replication through structure based drug design Proc Natl Acad Sci USA 97 6073 6078 2000 15 K Winklhofer und J Tatzelt Cationic Lipopolyamines Induce Degradation of PrPSc in Scrapie Infected Mouse Neuroblastoma Cells Biol Chem 381 463 469 2000 15 30 31 J Tatzelt S Prusiner und W Welch Chemical chaperones interfere with the formation of scrapie prion protein EMBO J 15 6363 6373 1996 15 S Gilch K F Winklhofer M H Groschup M Nunziante R Lucassen C Spielhaup ter W Muranyi D Riesner J Tatzelt und H M Sch tzl Intracellular re routing of prion protein prevents propagation of PrP Sc and delays onset of prion d
15. Median bezo genen Wirksamkeitsma eingef rbt wobei gr ne Farbt ne f r h here und rote Farbt ne f r niedrigere Wirksamkeiten stehen Wie beispielsweise in Quadrant A zu erkennen ist zeigen die meisten der in den Zeilen C bis F getesteten Substanzen berdurchschnittlich hohe Wirksamkeiten w hrend die Substanzen aus den Zeilen G und H weniger wirksam waren In hnlicher Weise sind in den Spalten 2 3 6 und 11 viele Substanzen st rker und in Spalte 12 viele Substanzen schw cher wirksam Dieses Muster der gef rbten T pf chen aus Quadrant A wiederholt sich in hnlicher Weise in den Quadranten B und C f r die dort bei den beiden anderen Konzentrationen gemessenen Substanzen Um dieses Muster hervorzuheben wurden in der gezeigten Plattenrepr sentation solche T pfchen ausgew hlt deren Substanzen in mehreren Quadranten erh hte Wirksamkeiten zeigen Die zugeh rigen Kn pfe erscheinen daher als gedr ckt Auf diese Weise konnten die bei drei Substanzkonzentrationen durchgef hrten Messungen zumindest qualitativ ausgewer tet werden Um die Qualit t der SIFT Daten in zuk nftigen Screening Runden zu sichern wurde das Layout der 384er Platten modifiziert sodass nun wieder in ausreichendem Ma Be Kontrollmessungen mitgef hrt werden Zur Analyse von Struktur Wirkungs Beziehungen f r die neu synthetisierten NBB Sub stanzen wurden den qualitativen SIFT Auswertungen wie den oben diskutierten die Struk turen der zugrunde liegenden Hydr
16. Mit csbr k nnen gro e Mengen von Substan zen aus sdf Dateien am Bildschirm dargestellt werden wobei zudem die in der sdf Datei enthaltenen Substanzeigenschaften angezeigt werden k nnen Auf diese Weise wurden mithilfe von csbr die Strukturen der DIVERSet Substanzen zusammen mit den Platten nummern und den T pfchenkoordinaten dargestellt und einzeln in eps Dateien Encapsu lated PostScript abgespeichert Die unter generischen Namen etwa struct_1 eps bis struct_10000 eps abgespeicherten Dateien wurden dann mithilfe eines von mir geschriebenen Skripts name_structs sh im Modul screening umformatiert und umbenannt Das Skript extrahiert dabei aus der eps Datei f r eine gegebene Substanz die darin verborgene Plattennummer und die T pfchenkoordinaten konvertiert die Da tei ins jpeg Format benennt die resultierende jpeg Datei nach den T pfchenkoordinaten und legt sie in einem nach der Plattennummer benannten Verzeichnis innerhalb der im folgenden Abschnitt beschriebenen Verzeichnishierarchie ab Dadurch werden auch diese Grafikdateien der Visualisierung mit SIFT Viewer I zug nglich gemacht 3 4 4 Die SIFT Viewer zugrunde liegende Verzeichnishierarchie Der Webbrowser basierten Visualisierung der SIFT Ergebnisse einer gescreenten Sub stanzbibliothek mit SIFT Viewer I liegt intern eine Hierarchie von Dateien und Verzeich nissen zugrunde auf die in den letzten Abschnitten wiederholt verwiesen wurde In dieser Hierarchie
17. T Nguyen H Inouye M A Baldwin R J Fletterick F E Cohen S B Prusiner und D A Kirschner X ray Diffraction of Scrapie Prion Rods and PrP Peptides J Mol Biol 252 412 422 1995 11 H Wille M D Michelitsch V Guenebaut S Supattapone A Serban F E Cohen D A Agard und S B Prusiner Structural studies of the scrapie prion protein by electron crystal lography Proc Natl Acad Sci USA 99 3563 3568 2002 11 13 C Govaerts H Wille S B Prusiner und F E Cohen Evidence for assembly of prions with left handed beta helices into trimers Proc Natl Acad Sci USA 101 8342 8347 2004 11 13 119 C R Raetz und S L Roderick A left handed parallel beta helix in the structure of UDP N acetylglucosamine acyltransferase Science 270 997 1000 1995 11 S B Prusiner Herausgeber Prion Biology and Diseases Cold Spring Harbor Laboratory Press 2004 13 I Jones Prions show their metal http www chemsoc org chembytes ezine 2002 jones_apr02 htm 14 X Roucou und A C LeBlanc Cellular prion protein neuroprotective function implications in prion diseases J Mol Med 83 3 11 2005 13 B Caughey und R E Race Potent inhibition of scrapie associated PrP accumulation by Congo red J Neurochem 59 768 771 1992 15 L Ingrosso A Ladogana und M Pocchiari Congo red prolongs the incubation period in scrapie infected hamsters J Virol 69 506 508 1995 15 W S Caughey L
18. TSE Therapy Libraries 4 SFT Ecso Test conversion 15 senzace 10251 DJ DIVERSett Substance SIFTPRIMT Sit EC 50 T Bayes TP2 scn2a TP4 Conversion Cell Cuture Secondary Smiles pa 10252 Q lal B 10253 10251_D04 0 0555917 1 24095E 5 oo 2 H 10254 Q 8g 10255 sy 10256 T 10257 4 1 110258 Z 10259 2310260 3 ax 0 10261 0251 _pos 0 107434 lolx 2 10262 EH 10263 21 10264 09 10265 E substance Lists SIFT EC50 Test Conversion 15 Sen2a 8 09 10266 pH Ec 50 65 Substance SIFT PRIM T SittECS Bayes TP 2 SCN2A TP4 Conversion Cell Culture Secondary Smiles i 210267 Conversion 15 a 3 21 10268 40251_D06 ozs P 4 9 10269 10250_A08 2 H 10270 10260_D05 4 210271 10233_602 f10309_F02 30 0 L 10 00 00 L F EH 10272 10297 F03 ax 10273 10305_E04 NH 92410274 10309_F02 ip me cars waa ict eco C NN C N N ect OC e C H 10276 f10251_D07 0 0107597 10369_D05 210277 EHI Sitt Primary 2 10278 HD Bayes 42 10313_B02 0 570222 85 21348767 10 0 0 S 10279 9 24 Cell Culture 475 10280 T Cell Culture Act 2 43 y 10281 J Secondary Cell Culture 54 11028 iP id 10268 10251 _p08 0 244539 2 10284 g Da 40369_D0S 4 04028 04 272006E 5 10 40 ne Sy 10288 z H j r g Libraries Tree Substance Lists Substance Table j A Hw zN p 10293_602 os a19 03 12724564 1 0 00 00 s amp H 10260_A08 oraz 33637464 11 0 00
19. ct c c c c c 1 36 10302_605 0 284 el o 0 e ei0 1 Br c1 c 0 0 0 0 1 31 10298_C04 0 22 et ieseCeieie t pet ecieicie t 6 10307_607 0 38 eefgjecet ehecci 1 10306_A11 0 394 eeeteiet C gt et ecieicn 27 10309 _602 2 0 c c ee c 1 N ct c e c c c 1 45 10309_B06 2 0 10307_c08 1 008 N N C ctie e e c 6 1 0 c1 eCe e 0 0 1 C 6 30234_E06 2 0 N C c1 c c c c c 1 0 c1 c e e c 1 N 2 10304_H110 349 el e 0 eC0 0 1 O c1 e c e 00 1 0 14 10258_D11 0 285 E CEO JEN N C c1 c c c 1 0 1 c c c c 1 Br 2 10259 B02 0 168 z Abbildung 4 6 Bildschirmschnappschuss von hMoSS II Wie das in Abbildung 4 4 darge stellte HTML basierte statische Werkzeug hMoSS dient auch diese Java basierte dynamische Variante der Visualisierung von mit MoSS gebildeten Strukturklassen Im Gegensatz zur stati schen Variante werden hier die Strukturklassen dynamisch infolge von Benutzerinteraktion zur Laufzeit gebildet Als zus tzliche Beschreibung der gebildeten Strukturklassen ist im rechten mittleren Bereich ein Box and Whisker Plot der klassenlokalen Wirksamkeitsverteilung darge stellt Die Knoten der Hierarchie links tragen als Namen die SMILES Strings der Kernmotive der repr sentierten Klassen Wirksamkeiten unten sowie die Struktur einer ausgew hlten Substanz oben rechts dar gestellt Zus tzlich enth lt die Visualisierung mit hMoSS II im mittleren rechten Bereich einen Box and Whisker Plot der klassenlokalen
20. hohe Aktivit t Aus Gr nden des Patentschutzes k nnen zur chemischen Struktur dieser Substanz keine Informationen gegeben werden e Im linken unteren Bereich findet sich die Tabellenrepr sentation der Messplatte in welcher jedes T pfchen durch einen aus den T pfchenkoordinaten zusammenge setzten Namen symbolisiert ist Im dargestellten Schnappschuss wurde durch Kli 3 5 Die Screening Datenbank TSE DB cken auf den T pfchennamen F09 das in Zeile F und Spalte 09 befindliche T pfchen ausgew hlt e Daraufhin wird in dem Plot rechts daneben der die 2D SIFT Spektren aller T pf chen der ausgew hlten Platte 30163 zeigt das zu F09 geh rige Spektrum gelb her vorgehoben und rechts neben dem Spektren Plot die Molek lstruktur der ausge w hlten Testsubstanz 30163_F09 angezeigt Wie dem gelb eingef rbten Spektrum und dem Wert der f r FO9 berechneten SIFT Aktivit t zu entnehmen ist handelt es sich hierbei um eine kaum aggregationshemmende Substanz Durch das Zurverf gungstellen der Software SIFT Viewer I konnten wir unseren Pro jektpartnern erm glichen die Ergebnisse des SIFT Screenings von DIVERSet 1 und 2 rasch visuell zu inspizieren Obschon SIFT Viewer I erfolgreich eingesetzt wurde zeig te sich eine Reihe von Schwachpunkten dieses Werkzeugs Dazu z hlt zum einen die in Abschnitt 3 4 1 angesprochene Beschr nkung auf das beim prim ren Screening der DIVERSet Bibliotheken verwendete Layout der Messplatten
21. llt 500 Um die dennoch un bersicht liche Vielzahl von Subklassen einer zu validierenden konkreten Ausgangsstrukturklasse in leichter berschaubarer Form darzustellen entwickelte ich ein Verfahren welches die Klassen in einer Hierarchie anordnet 4 1 5 Bildung von Strukturhierarchien Weil bei der oben beschriebenen Bildung von Strukturklassen jeweils ein allgemeineres Kernmotiv K zu einem konkretisierten Motiv K gt Kj erweitert wurde gilt f r die zu geh rigen Strukturklassen S und S dass Sk C Sj eine Teilmenge von S ist Die gebil deten Strukturklassen sind also ineinander verschachtelt und es sollte daher m glich sein sie in einer Hierarchie anzuordnen an deren Spitze die zum Ausgangskernmotiv geh rige Strukturklasse steht In immer tiefer liegenden Ebenen der Hierarchie sollen jeweils immer konkretere Strukturklassen angeordnet sein hnlich wie bei der in Abbildung 4 1 dargestellten Hierarchie die bei der Bildung der Klassenliste 4 3 zu einem gegebenen Ausgangskernmotiv durchlaufen wird Zur Konstruktion einer Hierarchie in welcher die von MoSS gebildeten Klassen und zugeh rigen Kernmotive angeordnet werden sollen ist es notwendig zu wissen welche Konkretisierungen eines jeden gegebenen Kernmotivs in der Menge aller Kernmotive ent halten sind Diese Information kann aus der Menge der Kernmotive extrahiert werden indem MoSS ein zweites Mal eingesetzt und dabei auf die Menge der Kernstrukturmoti ve K angewende
22. ma entworfen werden Noch vor der Schilderung der oben genannten Software Tools werde ich dieses und ein weiteres Wirksamkeitsma zur Bestimmung der anti Prion Wirksamkeit im SIFT Assay erl utern das von mir in Kooperation mit Jan Bieschke Uwe Bertsch und Armin Giese vom ZNP entworfen wurde Damit das zu entwickelnde Ma den Testsubstanzen aus den SIFT Messdaten zuverl s sig Wirksamkeitswerte zuordnen kann muss zun chst die Validit t der Messdaten ber pr ft werden Es muss verhindert werden dass fehlerhafte Messungen die nachfolgenden Schritte der Auswertung negativ beeinflussen K nnten Daher m ssen fragw rdige Mes sungen anhand der Daten erkannt markiert und aussortiert werden Vor der Beschreibung der Wirksamkeitsma e sollen daher Algorithmen zur Erkennung von Ausrei ern vorge stellt werden die von mir entwickelt und in den Werkzeugen SIFT Viewer I und II einge setzt wurden 3 1 Erkennung von Ausrei ern F r die Erkennung von fehlerhaften SIFT Messungen werden die 2D SIFT Spektren und die zugeh rigen Gesamtintensit ten kot r und kor s herangezogen Hier kann es aufgrund von bertragungsfehlern bei der Messung in seltenen F llen vorkommen dass einzelne 2D SIFT Spektren exakt verschwinden Solche Spektren k nnen von einem entsprechen den Filter leicht erkannt und aussortiert werden Wie in Abschnitt 2 2 3 bereits angesprochen wurde kann es aber auch vorkommen dass eine Testsubstanz Autofluoreszenz zeigt u
23. sen Werte nahe bei 1 auf W hrend f nf der sechs getesteten Substanzen nur moderate Wirksamkeiten in einem breiten Bereich bei etwa 0 5 zeigen die mit steigenden Konzen trationen leicht abnehmen zeigte die Substanz BSc3217 deutlich h here Wirksamkeiten von bis zu 0 9 Diese Substanz deren Struktur eingerahmt ist war bereits bei den oben geschilderten SIFT Messungen der NBB Substanzen aus der ersten Synthese Runde auf gefallen vgl Abbildung 5 12 denn ihre Struktur kombiniert das Hydrazid Hz und das Aldehyd A gt welche dort beide mit hohen Wirksamkeiten assoziiert waren Mithilfe von derartigen Dosis Wirkungs Analysen konnten eine Reihe neuer NBB Substanzen mit star ken anti aggregatorischen F higkeiten im SIFT Assay identifiziert werden 109 5 Ergebnisse und Diskussion 5 1 4 Therapeutische Behandlung von Scrapie infizierten M usen Um das therapeutische Potenzial einzelner Substanzen die in vorangegangenen Testreihen hohe Wirksamkeiten gezeigt hatten am lebenden Organismus zu berpr fen wurden von meinen Kollegen am ZNP Versuche mit M usen durchgef hrt deren Ablauf in Abschnitt 2 5 skizziert wurde Wie dort beschrieben ist waren die M use intrazerebral mit Scrapie infiziert worden und wurden erst mehr als 100 Tage nach der Infektion in einem sp ten Stadium der Inkubationszeit mit den Testsubstanzen behandelt um die Anwendbarkeit der Substanzen in einem f r die Prionkrankheiten realistischen Szenario zu berpr f
24. use deren Prn p heterozygot nur in einem der Al 1 Einleitung 1 2 4 3 n 49 5 Mn PrPC PrPSc 32 5 275 W _ e 18 5 PrP 27 30 PrpC Abbildung 1 2 Isoformen von PrP im Western Blot Western oder Immuno Blots von Hirn Homogenaten von Syrischen Hamstern die nicht Reihen 1 und 2 oder mit Prionen Reihen 3 und 4 infiziert worden waren Nach einer Polyacrylamid Gel Elektrophorese wurde der Blot mit einem bestimmten anti PrP Antiserum behandelt um die enthaltenen Prion Proteine ein zuf rben Zuvor jedoch wurden die Proben der Reihen 2 und 4 mit Proteinase K verdaut Dabei wurde das PrP Bande bei 27 5 32 5 kDa in Reihe 1 in diesen Reihen vollst ndig hydro lysiert w hrend von PrP lediglich ungef hr 67 Aminos uren vom N Terminus abgespalten wurden sodass das ca 27 bis 30 kDa gro e Fragment PrP 27 30 brig blieb Reihe 4 ber nommen aus 5 und zus tzlich beschriftet lele ausgeschaltet ist einen verz gerten Krankheitsverlauf Ma stab ist dabei der Krank heitsverlauf bei unver nderten Prn p M usen die PrP in vollem Umfang produzie ren Diese Ergebnisse zeigen klar dass PrP f r die Entwicklung der Krankheit notwendig ist und dass der Verlauf der Krankheit von der Menge an verf gbarem PrP abh ngt In teressanterweise entwickelten und verhielten sich die untersuchten PrP knockout M use u erlich v llig normal d h sie zeigten keine Auff lligkeiten gegen ber unver nderten Prn p
25. utert werden Strukturelle Schl ssel Der strukturelle Schl ssel einer gegebenen Substanz s ist ein Bit String bs bsi sa bsD 4 8 der L nge D dessen bin re Eintr ge bs 0 1 die Anwesenheit 1 oder Abwesenheit 0 bestimmter vordefinierter struktureller Fragmente in der Struktur der Substanz s kodie ren F r die Erzeugung von strukturellen Schl sseln f r die Substanzen einer Sammlung m ssen daher zun chst strukturelle Fragmente wie einzelne Atome Atomgruppen oder Ringsysteme die von Interesse sind ausgew hlt und in einem sogenannten Fragmentver zeichnis predefined fragment dictionary abgelegt werden Dabei kann die Auswahl der Fragmente h ndisch oder automatisiert mithilfe von Substruktursuchen in der Substanz sammlung anhand der darin vorkommenden Motive getroffen werden Ist das Fragment verzeichnis festgelegt so werden den darin enthaltenen Fragmenten einzelne Bits in den zu bildenden strukturellen Schl sseln zugeordnet Zur Erzeugung des Schl ssels b f r eine gegebene Substanz s wird berpr ft welche der Fragmente des Verzeichnisses in der Struktur der Substanz s enthalten sind und deren An oder Abwesenheit wie oben gesagt ber die Werte 1 bzw 0 der zugeh rigen Bits vermerkt Zus tzlich k nnen f r die F lle dass Fragmente mehrmals in der Substanzstruktur vorkommen Bits reserviert sein wel che die H ufigkeiten des Vorkommens kodieren Da strukturelle Schl ssel inh rent auf das zugrunde g
26. welche die Gr en und Zusammensetzungen der w hrend der Mes sung registrierten fluoreszierenden Partikel kodiert Diese Messdaten sollen nun genauer diskutiert werden 2 2 3 2D SIFT Daten f r den Prion Aggregations Assay Die Abbildungen 2 5C und D zeigen 2D FID Intensit tsverteilungen die mit der SIFT Methode gewonnen wurden Dabei unterscheidet sich das Ergebnis aus Abbildung 2 5D von jenem aus Abbildung 2 5C dadurch dass dem zu 2 5D geh renden Modellsystem zus tzlich eine Substanz zugegeben wurde welche die Anlagerung von PrP Molekiilen an PrP Aggregate hemmt Um eine Interpretation der beiden 2D FIDs zu erm glichen betrachten wir zun chst die Abbildungen 2 5A und B Dort sind Prion Aggregate sche matisch dargestellt die f r die beiden F lle typisch sind und sich im Laserfokus wei er Kreis der SIFT Apparatur befinden sollen Das in Abbildung A dargestellte Aggregat besteht aus rot markierten PrP Molek len an die gr n markierte PrPC Molek le ange lagert sind Dem in Abbildung B dargestellten Aggregat hingegen fehlen weitgehend die angelagerten gr nen PrP Molekiile weil zugef gte Wirkstoffmolek le blaue Kugeln an die PrPC Monomere gebunden sind und so die Anlagerung verhindern Die in den Abbildungen 2 5C und D gezeigten 2D FID Intensit tsverteilungen die f r Assay Mischungen ohne bzw mit Wirkstoffmolek len aufgenommenen worden sind re Insight Reader kann so eingestellt werden dass jedes T pf
27. Abbildung 5 4 bzw Abbildung 5 19 die in verschiedenen Testreihen SIFT Assay Zellkulturmodell TP4 anti Prion Wirksam keiten gezeigt hatten Als weitere Testsubstanzen wurde der amyloid bindende Farbstoff Congo red siehe beispielsweise 167 eingesetzt dessen Struktur in Abbildung 5 19 ge zeigt ist sowie drei Substanzen die als m gliche Wirkstoffe gegen die Huntingtonsche Krankheit bekannt sind aber hier nicht weiter diskutiert werden sollen Die beiden NBB Substanzen 293G02 und 306H03 zeigten in den Zebrafischen hnlich starke Wirksamkeiten gegen die polyQ Aggregation wie Congo red Hingegen konnte f r die Substanz 313B02 keine aggregationshemmende Wirkung festgestellt werden Neben dem Zebrafischmodell wurden im Rahmen dieses Projekts zus tzlich ein in vitro Assay und ein Zellkulturmodell zur Untersuchung der polyQ Aggregation eingesetzt Auch diese beiden Assays konnten dazu eingesetzt werden die aggregationshemmende Wirkung von zugegebenen Substanzen zu testen Dabei zeigten sich alle drei DIVERSet Substanzen in beiden Assays als wirksam gegen die Aggregation von polyQ Proteinen Um Einblicke in die molekularen Mechanismen zu erhalten durch welche die gefundenen Wirkstoffsub 116 5 1 Entdeckung und Entwicklung einer ersten neuen Wirkstoffklasse stanzen ihre anti aggregatorische Wirksamkeit vermitteln f hrte ich die oben angespro chenen Docking Simulationen durch Docking von NBB Substanzen an polyQ Protofibrillen Be
28. Bend musste f r die daraufhin von seiner Gruppe erstellten fokussierten Bibliotheken ein virtuelles Abbild geschaffen werden um die dazu gewonnenen Messergebnisse rechner gest tzt auswerten zu k nnen siehe Kapitel 4 und 5 36 3 Methoden zur Haltung Auswertung und Visualisierung von Daten Die im vorangegangenen Kapitel skizzierten experimentellen Verfahren zum in vitro und in vivo Hochdurchsatz Screening der DIVERSet Substanzbibliotheken zum Validieren von potenziellen Wirkstoffen und zu ihrer Optimierung durch Methoden der kombina torischen Chemie stellten mich vor die Aufgabe ein zur Realit t der experimentellen Untersuchungen ad quates virtuelles Abbild zu erzeugen das eine schnelle und sichere Auswertung der experimentell gewonnenen Daten erlaubt Ich habe dazu eine Reihe von Werkzeugen programmiert deren Struktur und Funktionsweise im Folgenden erl utert werden sollen Der heute erreichte Stand ergab sich in einem evolution ren Entwicklungsprozess in des sen Verlauf erste Ans tze berarbeitet zum Teil verworfen und durch Neuentwicklungen ersetzt wurden Es w rde zu weit f hren jede Zwischenstufe im Einzelnen zu erkl ren und w re auch f r sp tere Nutzer der von mir programmierten Software Tools nicht be sonders n tzlich Deshalb sollen hier nur jene Werkzeuge genauer beschrieben werden die auch k nftig nutzbringende Einsatzm glichkeiten haben werden Bei den von mir erzeugten Software Tools handelt es sich um
29. Bits gesetzt sind Dazu werden in der Summe ber den ersten Term oe bmi die in bm gesetzten Bits und in analoger Weise ber den zweiten Term DI bni die in b gesetzten Bits gez hlt Davon wird schlie lich die Anzahl der in beiden Bit Strings gemeinsam gesetz ten Bits abgezogen Der Tanimoto Koeffizient Tmn gibt also den Anteil der in beiden Bit Strings gemeinsam gesetzten Bits an Demzufolge ist der Wertebereich von Tmn das In tervall 0 1 wobei Paaren von Substanzen umso gr ere Werte zugewiesen werden je hnlicher ihre Strukturen sind Unter Einsatz des hnlichkeitsma es 4 9 wird die gegebene Sammlung von Substanzen von OptiSim 153 durch ein zweistufiges Verfahren in Cluster eingeteilt Im ersten Schritt w hlt der Algorithmus aus der Sammlung iterativ einzelne Substanzen aus die sich ge m 4 9 paarweise stark un hnlich sind und daher als Repr sentanten der zu bildenden Cluster definiert werden Im zweiten Schritt werden die restlichen Substanzen einzeln dem jeweils hnlichsten Repr sentanten zugeordnet und auf diese Weise die Cluster bef llt Details der Anwendung auf gro e Substanzmengen Soll das beschriebene Clusteringverfahren auf eine gro e Substanzsammlung angewendet werden so empfiehlt das Benutzerhandbuch von SARNavigator 158 dass die Substanz sammlung zuvor in die Menge der wirksamen und die Menge der unwirksamen Substan zen aufgeteilt und das Clustering nur f r die wirksamen Substanz
30. Blot Analyse zus tzlich mit Proteinase K verdaut pp er 7 E P Abbildung 2 9 Inhibierung der PrP Bildung in ScN2a Zellen ScN2a Zellen wurden zwei Tage mit verschiedenen DIVERSet Substanzen behandelt und anschlie end biochemisch analysiert Die resultierenden Western Blots zeigen das PrP in der l slichen S Fraktion und das PrP in der unl slichen P Fraktion Unbehandelte Zellen control weisen sowohl l sliches PrP als auch unl sliches PrP auf Die Behandlung der Zellen mit dem bekannten Wirkstoff DOSPA diente als Positiv Kontrolle und f hrt zum Abbau von PrP in den behandelten Zellen bernommen aus 91 Fig 3A Abbildung 2 9 zeigt Western Blots der S und P Fraktionen von Lysaten der ScN2a Zell kulturen die mit einer Reihe von DIVERSet Substanzen und zur Kontrolle mit DOSPA behandelt wurden Unbehandelte ScN2a Zellen control produzieren sowohl l sliches PrP S Fraktion als auch unl sliches PrP P Fraktion Die Behandlung mit dem Kon trollwirkstoff DOSPA befreit die Zellen von PrP P Fraktion Die schwarzen Banden in den S Fraktionen zeigen dass keine der getesteten Substanzen die Produktion von PrPC beeinflusst Die Testsubstanzen 297F03 und 293G02 inhibieren die Bildung von PrP Mit dem ScN2a Modell konnte so gezeigt werden dass eine Reihe jener Substanzen die in vitro durch ihre anti aggregatorischen Eigenschaften aufgefallen waren in leben den Zellen die Vermehrung von PrP inhibieren k
31. Dieser Dank geb hrt auch allen weiteren An geh rigen des BMO Im einzelnen gilt mein Dank e Verena Schultheis und Dr Matthias Schmitz mit denen ich das Zimmer teil t e f r die angenehme Atmosph re f r viele hilfreiche Gespr che und Diskussionen sowie f r die netten Ablenkungen zwischendurch e Martina Stork und Andreas Weiss f r ihre Hilfe bei meinem Einstieg in das Ge biet der Prionkrankheiten und f r die fruchtbare Zusammenarbeit bei verschiedenen Projekten auf diesem Gebiet e Simon Youssef f r seine Unterst tzung als studentische Hilfskraft bei diversen um fangreichen Programmieraufgaben e Bernhard Schropp Martina Stork und Paul Tavan f r ihre Beitr ge zu unserem ge meinsamen Paper 157 e Robert Denschlag und Martin Lingenheil daf r dass sie mich an ihren teils hitzigen stets interessanten Diskussionen teilnehmen lie en e Galina Babizki f r die Wartung und den Betrieb der Drucker e Benjamin Rieff und Sebastian Bauer f r ihren geistreichen Humor und f r die Leich tigkeit des Seins die sie neben ihren wissenschaftlichen Leistungen unserer Arbeits gruppe zu Teil werden lassen e Rudolf Reichold Dr Arne Sieg und Dr Karl Heinz Mantel f r die gute Zusammen arbeit bei der Systemverwaltung e den Sekret rinnen Frau Michaelis Frau Widmann Diermeier und Frau Podolski f r ihre unkomplizierte Hilfsbereitschaft bei den vielen organisatorischen Kleinigkeiten des Alltags e der Werkstatt um Rudi Sc
32. Gruppe von M usen mit einer gegebenen Test substanz und zur Kontrolle eine weitere Gruppe mit der DMSO Tr gerl sung behandelt Ab dem achtzigsten Tag nach der Infektion werden die Tiere t glich hinsichtlich Anzei chen der Krankheit beobachtet M use die das Endstadium der Krankheit erreichen wel ches durch das Auftreten von bestimmten klinischen Symptomen festgestellt wird werden 35 2 Der Forschungsverbund TSE Therapie get tet Den get teten Tieren k nnen verschiedene Gewebeproben entnommen werden die f r biochemische und immunohistologische Analysen aufbewahrt werden So k nnen beispielsweise Gewebeschnitte aus der Milz pr pariert und die darin enthaltenen PrP Ablagerungen ber Antik rper eingef rbt werden 2 6 Medizinal und kombinatorische Chemie TP6 F r die seit 2005 laufende zweite F rderperiode des Verbundprojektes konnte der Me dizinalchemiker Prof Boris Schmidt als Partner gewonnen werden Schmidt ist derzeit im Bereich Organische Chemie der TU Darmstadt t tig Er bringt seine mehrj hrige Er fahrung aus der industriellen Forschung ber das Zentrale Nervensystem und die Alz heimersche Krankheit bei der Novartis Pharma AG mit Schmidt wurde gegen Ende der ersten F rderperiode des Verbundes zum Projekt hinzugezogen als von uns bereits eine gewisse Substanzklasse von anti Prion Wirkstoffen in vitro TP1 und in Zellkultur TP4 bestimmt worden war 91 und aus den Ergebnissen des SIFT TP1 u
33. Hydrazide und Aldehyde NBB Derivate des Aldehyds A26 und der Hydrazide Ho und Ho zeigten im SIFT Assay erh hte Wirksamkeiten dieser Hydrazide enthalten waren vgl Abbildung 5 9 Dar ber hinaus zeigten Deriva te des Aldehyds A26 dessen Struktur in Abbildung 5 13 gezeigt ist vermehrt erh hte Wirksamkeit Auf den Platten IV und V waren Derivate der Hydrazide Ho und Hjo siehe Abbildung 5 13 enthalten welche jeweils zwei Hydroxyl Gruppen am Phenyl Ring der Hydrazid Gruppe aufweisen und jenen Klassen angeh ren die bereits beim Screening der DIVERSet Bibliotheken durch hohe Wirksamkeiten aufgefallen waren vgl Abbil dung 5 6 Auch zahlreiche neu synthetisierte Substanzen dieser beiden Klassen zeigten erh hte Wirksamkeiten im SIFT Assay 108 5 1 Entdeckung und Entwicklung einer ersten neuen Wirkstoffklasse Weitere Synthese Runden NBB Substanzen der ersten Runde die sich wie oben dargestellt als wirksam herausge stellt hatten wurden in einer zweiten Runde erneut synthetisiert um Verd nnungsreihen messungen im SIFT Assay zu erm glichen Dabei wurden die Substanzen hnlich wie bei den Validierungsmessungen der DIVERSet Prim rtreffer jeweils zweifach bei sieben Konzentrationen zwischen 0 1 uM und 100 uM im SIFT Assay vermessen Da bei diesen Messungen wieder Kontrollen in ausreichendem Umfang mitgef hrt wurden konnte f r die Berechnung der Wirksamkeiten hier wieder das kontrollenbezogene Ma 3 9 einge setzt werden
34. NMR structures of elk and of mouse elk hybrids Proc Natl Acad Sci USA 102 646 650 2005 10 D C Bolton R K Meyer und S B Prusiner Scrapie PrP 27 30 Is a Sialoglycoprotein J Virol 53 596 606 1985 10 E Stimson J Hope A Chong und A L Burlingame Site Specific Characterization of the N Linked Glycans of Murine Prion Protein by High Performance Liquid Chromato graphy Electrospray Mass Spectrometry and Exoglycosidase Digestions Biochemistry 38 4885 4895 1999 10 Literaturverzeichnis 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 N Stahl D R Borchelt K Hsiao und S B Prusiner Scrapie Prion Protein Contains a Phosphatidylinositol Glycolipid Cell 51 229 240 1987 10 S Hornemann C Schorn und K W thrich NMR structure of the bovine prion protein isolated from healthy calf brains EMBO Rep 5 1159 1164 2004 10 B W Caughey A Dong K S Bhat D Ernst S F Hayes und W S Caughey Secon dary Structure Analysis of the Scrapie Associated Protein PrP 27 30 in Water by Infrared Spectroscopy Biochemistry 30 7672 7680 1991 11 K M Pan M Baldwin J Nguyen M Gasset A Serban D Groth I Mehlhorn Z W Huang R J Fletterick F E Cohen et al Conversion of alpha helices into beta sheets features in the formation of the scrapie prion proteins Proc Natl Acad Sci USA 90 10962 10966 1993 11 J
35. Publikation Bertsch et al 91 Anschlie end werden in den Abschnitten 5 1 3 bis 5 1 7 die bisherigen Ergebnisse zur Weiterentwicklung der NBB Wirkstoffe pr sentiert 95 5 Ergebnisse und Diskussion 5 1 1 Das mehrstufige Screening der DIVERSet 1 Bibliothek Kurz nachdem die in Abschnitt 2 1 beschriebene Substanzbibliothek DIVERSet 1 vom Verbund beschafft worden war konnte in TP1 damit begonnen werden diese Substanz sammlung unter Einsatz des SIFT Assays vgl Abschnitt 2 2 systematisch nach anti ag gregatorischen Verbindungen durchzumustern Parallel dazu konnten von mir SIFT View er I und die zugeh rigen Werkzeuge vgl Abschnitt 3 4 rasch entwickelt und eingesetzt werden Das prim re Screening im SIFT Assay Wie in Abschnitt 2 2 erl utert wurde wurden im Zuge des prim ren Screenings der Biblio thek DIVERSet 1 alle Substanzen bei einer einzigen Konzentration ca 10 M in hohem Durchsatz durchgemustert Die Messdaten des prim ren SIFT Screenings konnten mithil fe der SIFT Viewer I Werkzeuge automatisiert aufbereitet und ausgewertet werden Dabei stellten sich einige der Plattenmessungen als qualitativ schlecht heraus und mussten daher wiederholt werden Nach dem in Bertsch et al 91 ver ffentlichten Stand des Screenings mussten noch 18 von 125 Platten komplett von der weiteren Auswertung ausgeschlos sen werden Die restlichen 107 Platten mit validen Messdaten wurden der t pfchenweisen Median basierten Ausrei ererken
36. Spektren verschiedener Messplatten zu illustrieren zeigen die Abbildungen 2 7A und B exemplarisch die Spektren f r zwei weitere DIVERSet Platten Nummern 10273 und 10275 Wie in Abbildung 2 6 sind die Spektren gem der Bele gung der Platte eingef rbt F r einen vom Einfluss der Testsubstanzen unabh ngigen Ver gleich betrachten wir die Spektren f r die Negativ gr n und Positiv Kontrollmischungen rot der drei Platten Die in Abbildung B dargestellten Kontrollspektren zeigen hnliche Formen wie diejenigen in Abbildung 2 6 Die gr nen Negativ Kontrollspektren weisen den charakteristischen Peak im Sektorenbereich 1 5 auf und die roten Positiv Kontroll spektren zeigen erh hte Signale im Sektorenbereich 11 18 Davon unterscheiden sich die Spektren der beiden Kontrollgruppen in Abbildung A deutlich W hrend der Peak der gr nen Kontrollspektren im unteren Sektorenbereich verst rkt ist ist die Erh hung der roten Kontrollspektren im oberen Sektorenbereich zu den mittleren Sektoren 6 10 verscho ben Derartige Unterschiede in den Spektren sind haupts chlich auf die unterschiedlichen 28 2 2 Der anti Prion 2D SIFT Assay TP1 Gr enverteilungen der PrP Aggregate zur ckzuf hren die in den Assay Mischungen verwendet wurden Es sei aber angemerkt dass die Formen der Spektren zudem durch die Wahl des weiter oben besprochenen kleine Partikel Cutoffs beeinflusst werden der bei der Extraktion der Spektren aus den 2D FID Ve
37. Tavan f r die engagierte Be treuung meiner Arbeit Ich danke ihm f r das Vertrauen das er mir schenkte als er mir dieses reiz und anspruchsvolle Projekt anbot f r die Freiheiten die er mir bei der Ge staltung meiner Arbeit lie und f r die gro e Unterst tzung die er mir wo immer n tig gab Sein hoher Anspruch an die Qualit t wissenschaftlichen Arbeitens und Schreibens ist mir zum Leitbild geworden F r seinen pers nlichen Einsatz und f r die gro z gige Finanzierung meiner Doktorarbeit im Rahmen des BMBF Projektes 01 KO 0501 danke ich ihm sehr Meinen Partnern aus den Teilprojekten des Verbundes Dr Uwe Bertsch Dr Armin Gie se und Prof Hans Kretzschmar TP1 Dr Martin Eiden Dr Markus Geissen und Prof Martin Groschup TP3 Dr Konstanze Winklhofer und Prof J rg Tatzelt TP4 und Prof Boris Schmidt TP6 danke ich herzlich f r die Aufnahme in die Prion Community f r die intensive Zusammenarbeit und f r viele interessante Gespr che und Diskussionen die wir allt glich bei den regelm igen Treffen des Verbundes oder auf gemeinsam besuchten Konferenzen f hrten Frau Dr Rosi Lederer ZNP gilt mein Dank f r die Organisation der Treffen und vieler weiterer Angelegenheiten des Verbundes Meinen Kollegen in der Arbeitsgruppe Tavan danke ich f r die kollegiale Arbeitsatmo sph re die von gro em Interesse an der Arbeit des Anderen von Hilfsbereitschaft und von gegenseitiger Unterst tzung gepr gt ist
38. View er II verwendet dabei die frei verf gbare Java Bibliothek iText 139 vgl Anhang B Abschlie end sei an dieser Stelle noch auf die in SIFT Viewer II umgesetzten Verfah ren zur selbstorganisierten Klassifikation von SIFT Messdaten verwiesen welche in An hang C beschrieben sind Nachdem damit die wichtigsten F higkeiten von SIFT Viewer II aufgez hlt wurden sollen nun weitere Einblicke in dessen Bedienung gegeben werden 3 6 2 Einblicke in die Bedienung von SIFT Viewer Il Abbildung 3 11 zeigt einen Bildschirmschnappschuss von SIFT Viewer I in welchem die SIFT Screening Ergebnisse f r eine Bibliotheksplatte aus DIVERSet 1 angezeigt sind Im linken Bereich der Darstellung ist eine Baumstruktur zu erkennen aus welcher einzelne SIFT Plattenmessungen f r die Darstellung im rechten Bereich gew hlt werden k nnen In der Baumstruktur sind zum einen die vom Benutzer aus SIFT Dateien geladenen Plat tenmessungen unterhalb des Knotens from files und zum anderen die in der TSE DB verf gbaren Plattenmessungen from database zugreifbar Uber diesen Baum wurde die Platte 10264 aus DIVERSet 1 ausgew hlt wurden darauf hin die zugeh rigen Messdaten aus der TSE DB eingelesen und im rechten Bereich in nerhalb einer neu angelegten Karteikarte angezeigt Im oberen Bereich dieser Karteikarte sind die Summenobservablen dargestellt weil dieser Plot ber den darunter befindlichen Reiter Sums angew hlt wurde Hinter dieser Kart
39. Wirksamkeitsverteilung hMoSS II unterscheidet sich von hMoSS in erster Linie dadurch dass die Strukturklassen dynamisch zur Laufzeit infolge von Benutzerinteraktion gebildet werden Beim Starten der Anwendung existiert lediglich die zum Ausgangskernmotiv geh rige Klasse die alle Substanzen mit diesem Motiv umfasst und von hMoSS II als Wurzelknoten der Baum struktur dargestellt wird ffnet der Benutzer durch einen Mausklick den Wurzelknoten so werden von hMoSS II dynamisch die Strukturklassen der n chst tiefer liegenden Hier archieebene gebildet wobei das Wurzelmotiv um ein zus tzliches Atom erweitert wird In analoger Weise werden dynamisch alle weiteren Knoten erweitert sobald sie vom Benut zer ge ffnet werden Dabei wird jeweils MoSS dazu eingesetzt die Subklassen der ausge w hlten Klasse zu bilden MoSS erh lt dabei als Eingabe das Kernmotiv der ausgew hlten Klasse die darin enthaltenen Substanzen sowie die Vorgabe nur solche Subklassen zu bil den die das Kernmotiv um ein Atom erweitern 87 4 Methoden zur Untersuchung von Struktur Wirkungs Beziehungen Die beschriebene Integration von MoSS in hMoSS II wurde dadurch erleichtert dass MOSS in Java geschrieben ist Es sei angemerkt dass hMoSS II zur Darstellung von Mole k lstrukturen eine weitere Java Bibliothek einsetzt die ebenso wie MoSS in der Gruppe von Christian Borgelt an der Universit t Magdeburg entwickelt wurde und die er mir dan kenswerterweise zur Verf
40. anschlie end im ER und im Golgi Apparat posttranslational mit komplexen Zuckerseitenketten und einem GPI Anker versehen ber den GPI Anker wird PrP au en in die Plasmamembran eingeh ngt 2 Dort kann es beispielsweise Liganden wie Kupfer binden 3 Durch Endozytose werden PrP Molek le in Vesikeln zu den Lysosomen transportiert wo sie abgebaut werden 4 Die Umwandlung von PrP in PrP findet vermut lich an der Zelloberfl che oder in den Vesikeln statt Im Gegensatz zu PrP kann PrP aber nicht abgebaut werden und bildet Ablagerungen 5 Abbildung bernommen von 67 mit freundlicher Genehmigung von Prof Ian Jones Hinsichtlich der Entwicklung von anti Prion Therapeutika liefert die Betrachtung des Le benszyklus von PrP zus tzliche Hinweise Geht man davon aus dass die Prion Aggre gation teilweise au en an der Zellmembran stattfindet so k nnten m gliche aggregations hindernde Wirkstoffe sobald sie an der Zelloberfl che sind ungehindert diesen Wirkort erreichen und m ssten die Zellmembran nicht berwinden Infolgedessen stellen soge nannte Zellkulturmodelle in denen Zellen frei zug nglich in einem N hrmedium kultiviert werden ein vielversprechendes Testsystem auch f r schlecht membrang ngige Wirkstoff kandidaten dar Derartige Modellsysteme f r Prionkrankheiten werden von zwei unserer Partnerprojekte im BMBF Forschungsverbund zur Suche nach Medikamenten eingesetzt und werden in Kapitel 2 eingehend vorgest
41. betraf dabei die automatisierte Auswertung der mit dem SIFT Verfahren generierten Messdaten Die Auswertung umfasste die Entwicklung eines Ak tivit tsma es welches jeder gemessenen Substanz eine Zahl zuordnet die kodiert wie wirksam die gegebene Substanz die Prion Aggregation in dem mit der SIFT Technik un tersuchten in vitro Assay hindern kann Dar ber hinaus richtete ich eine Datenbank ein in der die rohen SIFT Daten abgelegt werden Die Datenbank enth lt des weiteren so wohl die berechneten SIFT Aktivit ten als auch die in den weiteren Modellsystemen des Verbundes ermittelten Wirksamkeiten der getesteten Substanzen Die zur automatisier ten Auswertung entwickelten Verfahren und die Haltung der Daten werden in Kapitel 3 17 2 Der Forschungsverbund TSE Therapie TP1 Medizin TP4 Biochemie Prof H Kretzschmar Prof J Tatzelt Dr A Giese Dr U Bertsch Dr K Winklhofer SIFT Assay Zellkultur Modell Hochdurchsatz Screening Validierung TP2 Physik Prof P Tavan T Hirschberger Modellierung Mustererkennung Unterst tzung der Experimente TP3 Tiermedizin TP6 Chemie Prof M Groschup Prof B Schmidt Dr M Geissen Dr M Eiden R Narlawar A Taghavi Zellkultur Modell Medizinalchemische Erfahrung Hochdurchsatz Screening Synthese Optimierung Abbildung 2 1 Teilprojekte des Forschungsverbundes TSE Therapie Die am Screening beteiligten Teilprojekte des BMBF Verbundes die zur Verf gung stehenden
42. c e c c c 1 CI 8 I CE0 EN N C 01 e 0 0 0 1 1 e e 0 0 0 1 Br 8 C ct c c c e c 1 c1 e e c c c 1 1 13 C eteieieieiert etieicteicie C 9 E CEO JEN N C 1 c c cc 1 c1 c efe c c 1 N 11 C c1 c e c e 6 1 c1 e efe c c 1 0 21 C ct c c c c c 1 c1 c cfe c c 1 F 54 C et eieieieiert ieieteicie Ci 46 C c1 c c c c 1 c1 c ef c c c 1 Br 27 0 C c1 c e c e 6 1 c1 e efe c 1 1 11 FI CEO JEN N 0 1 c c c 1 1 c c cCc 1 C 27 C et eieieieiet eieieieeicit N 24 C c1 c c e c 6 1 c1 c e eCe c 1 0 61 C et eieieieiet Niecieeie F 17 C c1 e c e c 6 1 c1 e c c e c 1 8 2 c1 c c c e c 1 ct c e cfc c 1 CI 15 c e e c 1 c1 e e cCc c 1 Br 23 C c1 c c c e 6 1 c1 c e e e c c 1 10 Opctic c e cie t pet e c c c 01 65 eteieieieiert etieiciceien 2 ofice C 1 eCe c c 1 C c1 c e c 1 20 C ch eGe e e e 1 N ct c e e 0101 1398 E C c1 efe c c c 1 0 c1 e e c e c 1 109 f30150_ 07 2 0 u LN C cl c e c e e 1 F c1 c c 0 0 0 1 26 10312_F04 0 103 O etieteiciciei1 Oh et eicieicici 64 10313_po9 2 0 Cet o ere cre 1 B ct c e e e 0 1 8 10309_A06 2 0 EO EN N C c1 c e e c c 1 C c c c c c c 1 18 110309_002 2 0 C ct c eQe c 6 1 N c1 c c c c 6 1 14 10307_A02 0 662 o t eicteieic1 O gt cMeeciciet 48 10299_F02 0 284 ieic eicien P icieieiciet 2 10257_D05 0 064 ce e e e 1 CI
43. definiert jedes dieser Strukturmotive eine Klasse von Substanzen aus der DIVERSet 1 Bibliothek deren Strukturen das jeweilige Motiv beinhalten Neben den Strukturmotiven sind die klassenlokalen Verteilungen der SIFT Wirksamkeiten gezeigt wobei die Verteilungen von stark besetzten Klassen zudem durch Box and Whisker Plots vgl Abschnitt 4 1 charakterisiert sind Die Klasse aller 413 NBB Substanzen erste Zeile enth lt viele unwirksame Substan zen aber dennoch ist die Wirksamkeitsverteilung auch hier schon leicht in Richtung po sitiver anti Prion Wirksamkeiten verschoben Im Bezug auf Substitutionen am Benzyl Ring der Benzohydrazid Gruppe vgl Abbildung 5 5 analysierten wir den Einfluss von Hydroxyl Substituenten an unterschiedlichen Positionen Das Hinzuf gen einer Hydro xyl Gruppe in ortho Position zweite Zeile f hrt zu einer Subklasse mit nur geringf gig besserer mittlerer Wirksamkeit Hingegen zeigen die Subklassen mit Hydroxyl Gruppen in meta oder para Position Zeile 3 und 4 erh hte Wirksamkeiten Insbesondere wei sen diejenigen vier Substanzen aus DIVERSet 1 die eine Kombination von Hydroxyl Gruppen in der meta und der para Position Zeile 6 besitzen hohe SIFT Wirksamkei ten auf Zudem waren zwei dieser Substanzen 293G02 und 305E04 auch in Zellkultur wirksam vgl Abbildung 5 6 Was die N Seite des NBB Kerns anbelangt fanden wir 101 5 Ergebnisse und Diskussion Structural motif SIFT activity ot oy LEO
44. den ebenfalls am BMBF Verbund beteiligten Gruppen von Prof Tatzelt und Prof Groschup Zellkulturmodelle f r die Medikamentenentwicklung einge setzt Das Zellkulturmodell der Gruppe Groschup ist sogar so weit entwickelt dass da mit wie mit dem in vitro SIFT Assay Substanzbibliotheken systematisch nach neuen Wirkstoffen durchsucht werden k nnen Sowohl das SIFT Verfahren die Zellkulturmodelle und weitere im Verbund eingesetzte experimentelle Modellsysteme f r Prionkrankheiten als auch die mit diesen Verfahren gewonnenen Daten die von mir in einer Datenbank gesammelt wurden werden im fol genden Kapitel vorgestellt 16 2 Der Forschungsverbund TSE Therapie Wie ich in der Einleitung herausgestellt habe laufen seit Anfang 2002 die Arbeiten des vom BMBF gef rderten Forschungsverbundes Systematische Entwicklung neuer Wirk stoffe f r die kausale Therapie von Prionkrankheiten 4 an dem ich seit Juli 2002 mitge arbeitet habe Dieser interdisziplin re Verbund gliedert sich in insgesamt sieben Teilpro jekte TP aus den Bereichen Humanmedizin Tiermedizin Virologie Biochemie Chemie und Theoretische Physik F nf der sieben Teilprojekte TP1 2 3 4 und 6 verfolgen in en ger Zusammenarbeit einen gemeinsamen Ansatz zur Entwicklung von Medikamenten der eine systematische Suche nach neuen Wirkstoffen in einer gro en Sammlung von Testsub stanzen nach dem Prinzip des HTS sowie die anschlie ende Optimierung der dabei
45. die M glichkeit gegeben Eigenschaften der Cluster wie die Clustergr e oder clusterlokale Anteile von wirksamen Substanzen auszuw hlen an hand derer die repr sentierenden Symbole dargestellt werden sollen So kann die Form die Gr e und die Farbe der Symbole dazu genutzt werden charakteristische Eigenschaf ten der Cluster zu kodieren Als charakteristische Eigenschaft eines Clusters S bietet sich neben seiner Gr e S d h der Anzahl der darin enthaltenen Substanzen beispielsweise der clusterlokale Anteil C e S C ist wirksam in Assay A PassayA S S 4 10 jener im Cluster S enthaltenen Substanzen C an die in einer gew hlten Testreihe Assay A wirksam waren Eine auf diese Weise individuell gestaltete SAR Karte kann vom Be nutzer interaktiv hinsichtlich der in den Clustern enthaltenen Substanzen inspiziert und so nach neuen Leitstrukturen durchsucht werden Das von DataMiner bereitgestellte Clus teringverfahren und die dem Benutzer gegebenen M glichkeiten die Clusteringresultate flexibel nach seinen W nschen grafisch darzustellen erweisen sich als brauchbare Hilfs mittel f r die Identifikation von neuen Leitstrukturen aus einer Vielzahl von durch Scree ning Messungen charakterisierten Substanzen 4 3 Simulationen des Dockings von Wirkstoffen an polyQ Protofibrillen Einzelne im Verbund identifizierte anti Prion Wirkstoffe wurden in den Gruppen von Prof F Ulrich Hartl Department f r zellul re Biochemie MP
46. die Teil menge N der Negativ Kontrollen und die Teilmenge S der T pfchen mit Testsubstanzen unterteilt Diese Unterteilung erm glicht es als erste Vergleichsgr e den arithmetischen Mittelwert 1 P 2 Sw 3 7 PI weP der Summen S w f r die Menge P der Positiv Kontrollen zu definieren Analog dazu wird als zweite Vergleichsgr e der Mittelwert der Summen S 1 w Zul Sag n 2m 3 8 f r die Menge N der Negativ Kontrollen gebildet Es sei angemerkt dass in den weiter unten geschilderten Anwendungen in SIFT Viewer I und II zum Teil anstelle der arithme tischen Mittelwerte 3 7 und 3 8 f r p und n die gem 3 1 definierten Mediane der Summen S 7 innerhalb der beiden Kontrollgruppen verwendet wurden 42 3 2 SIFT Wirksamkeitsma e Nun kann allgemein f r die T pfchen w einer gegebenen Platte und insbesondere f r die T pfchen w S mit Testsubstanzen das Aktivit tsma n S w n p definiert werden welches einem gegebenen T pfchen w eine reelle Zahl a w zuordnet Dabei wird die Differenz zwischen dem Mittelwert n der Negativ Kontrollen und dem S gt Wert f r T pfchen w gebildet und mit der Differenz n p der beiden Kontroll Mittelwerte ins Verh ltnis gesetzt F r den Fall w S d h dass in T pfchen w eine Testsubstanz gemessen wurde gibt die zugeordnete Zahl a w die anti aggregatorische Wirksamkeit der Substanz an a W R wra w 3 9 Aus der Definition 3 9 des Aktivit ts
47. ein Name f r die Klasse das zur Klasse geh rige Strukturmotiv in Form eines SMILES Strings sowie u a die Anzahlen von wirk samen und unwirksamen Substanzen eingetragen sind In der Datei ids sind f r die Substrukturklassen deren Namen und die darin enthaltenen Substanzen aufgelistet Die se Dateien werden von dem Skript miner_tree sh unter Verwendung des Werkzeugs Gawk 123 abgearbeitet um die Teilmengenbeziehungen auszuwerten und daraus die Hierarchie von Strukturklassen zu bilden Neben der Hierarchiebildung dient das Skript miner_tree sh auch der Generierung einer zugeh rigen Webbrowser basierten grafi schen Benutzerschnittstelle 4 1 6 Visualisierungen von Strukturhierarchien Die Webbrowser basierte Visualisierung von Hierarchien von Strukturklassen hnelt jener von linearen Listen von Klassen die mithilfe des Werkzeugs xminer sh bewerkstelligt wurde vgl Abschnitt 4 1 4 Hier wurde lediglich die tabellarische Darstellung der Klas senliste durch eine JavaScript basierte Darstellung der Klassenhierarchie ersetzt wobei das frei verf gbare Paket Morten s JavaScript Tree Menu 151 eingesetzt wurde Abbildung 4 4 zeigt einen Bildschirmschnappschuss der resultierenden Visualisierung ei ner Substrukturhierarchie die mithilfe von hMoSS f r das Kernmotiv einer potenziellen Leitstruktur NBB siehe Kapitel 5 und die im SIFT Screening vermessene Bibliothek DIVERSet 1 gewonnen wurde Im linken Bereich befindet sich die Ja
48. environment in metalloproteins investigation of the prion protein octapeptide repeat Cu 2 complex Eur Biophys J 34 97 112 2005 9 10 R Riek S Hornemann G Wider M Billeter R Glockshuber und K Wuthrich NMR structure of the mouse prion protein domain PrP 121 231 Nature 382 180 182 1996 9 R Zahn A Z Liu T Luhrs R Riek C von Schroetter F L Garcia M Billeter L Cal zolai G Wider und K Wuthrich NMR solution structure of the human prion protein Proc Natl Acad Sci USA 97 145 150 2000 10 145 Literaturverzeichnis 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 146 T L James H Liu N B Ulyanov S Farr Jones H Zhang D G Donne K Kaneko D Groth I Mehlhorn S B Prusiner et al Solution structure of a 142 residue recombinant prion protein corresponding to the infectious fragment of the scrapie isoform Proc Natl Acad Sci USA 94 10086 10091 1997 10 R Glockshuber S Hornemann R Riek G Wider M Billeter und K Wuthrich Three dimensional NMR structure of a self folding domain of the prion protein PrP 121 231 Trends Biochem Sci 22 241 242 1997 10 R Riek S Hornemann G Wider R Glockshuber und K Wuthrich NMR characterization of the full length recombinant murine prion protein mPrP 23 231 FEBS Lett 413 282 288 1997 10 D G Donne J H Viles D Groth I Mehlhorn T L James
49. f r die zu heilende Krankheit wesentlichen Proteine als Target Molek le f r die zu findenden Wirkstoffe bekannt sein und zum anderen muss ein in vitro Modellsystem existieren das diese Target Molek le enth lt und in dem die wesentlichen molekularen Prozesse der Krankheit ablaufen Im Falle der Prionkrankheiten ist die Prion Vermehrung wohl der wesentliche Prozess Damit sind die Isoformen PrP und PrP als Target Mo lek le f r potenzielle Wirkstoffe identifiziert Was nun zus tzlich ben tigt wird ist zum einen ein in vitro Assay f r die Prion Vermehrung in dem die Aggregation stabil und reproduzierbar abl uft und zum anderen ein Messverfahren mit dem die Gr en der ge bildeten Aggregate rasch bestimmt werden k nnen Ein derartiges Verfahren das zum Screening von gro en Substanzbibliotheken eingesetzt werden kann wurde im Rahmen des BMBF Forschungsverbundes von einem unserer Pro jektpartner der Gruppe von Prof Kretzschmar Zentrum f r Neuropathologie und Prion forschung LMU entwickelt Mit dieser auf Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie ba sierenden Methode des Scanning for Intensely Fluorescent Targets SIFT wurde ein in vi tro Aggregations Assay etabliert Im Rahmen des von Prof Tavan initiierten Teilprojekts zum Forschungsverbund bestand einer meiner Hauptbeitr ge in der Entwicklung automa tisierter Verfahren zur zuverl ssigen Auswertung der mit dem SIFT Verfahren erzeugten Daten Dar ber hinaus wurden in
50. gung gestellt hat Abschlie end sei noch angemerkt dass auf der Suche nach einem brauchbaren Werkzeug f r systematische SAR Untersuchungen eine kostenlose Testversion des kommerziellen Softwarepakets Leadscope 152 installiert und probeweise eingesetzt wurde Leadscope unterst tzt die Unterteilung einer gegebenen Substanzsammlung in Strukturklassen und deren Charakterisierung durch grafische Darstellungen von klassenlokalen Wirksamkeits verteilungen Jedoch waren von der damaligen Version von Leadscope die Kernmotive der Strukturklassen unabh ngig von der betrachteten Bibliothek fest vorgegeben und konnten nicht frei gew hlt oder etwa anhand der in der Bibliothek enthaltenen Strukturen generiert werden So war es damals notwendig die oben geschilderten Werkzeuge f r systemati sche SAR Untersuchungen selbst zu entwickeln Inzwischen bietet Leadscope laut Pro duktbeschreibung eine systematische Suchfunktion in Form einer sogenannten Restgrup pen Analyse R group analysis Dieses Werkzeug wurde jedoch nicht mehr im Projekt beschafft und eingesetzt Nachdem ich nun die von mir entwickelten Werkzeuge zur systematischen Untersuchung von SARs f r ausgew hlte Leitstrukturklassen und zu deren Validierung vorgestellt habe m chte ich anschlie end noch ein kommerzielles Softwarepaket vorstellen das ich f r die Suche nach neuen Leitstrukturen eingesetzt habe 4 2 Strukturelle Clusteranalysen zur Suche nach neuen Leitstrukturen Das kommerzi
51. l 10251 20030514 10251 2 2DSift 10252 20030513 10252 2 2DSift 10253 20030513 10253 2 2Dsift 10254 20030513 10254 2 2Dsift 10255 20030513 10255 2 2DSift 10256 20030513 10256 2 2DSift 10257 20030509 10257 3 2DSift 10258 20040503 10258n 2_SIFT 20030512 10258 2 2DSift 10259 20040503 10259n 2 SIFT 20030512 10259 2 2DSift uf 20030515 10259 3 2DSift 10260 20030509 10260 2 2Dsift 10261 20030509 10261 2 2Dsift 10262 20030508 10262 5 2Dsift 10263 s 20030508 10263new SIFT 20030508 10263 2 2DSift 10264 20030507 10264 2 2DSift Abbildung 3 2 Zuordnung von SIFT Plattenmessungen zu DIVERSet Bibliotheksplat ten Auszugsweise ist eine von mir gepflegte Datei gezeigt in der den Plattennummern der DIVERSet 1 Bibliothek die Namen derjenigen SIFT Dateien zugeordnet sind in denen die SIFT Ergebnisse der jeweiligen teilweise mehrfach gemessenen Bibliotheksplatte abgelegt sind Zus tzlich sind in der Liste aufgetretene Messfehler vermerkt Diese Datei wurde auto matisiert prozessiert wobei f r jede Platte jeweils die beste erstgenannte SIFT Datei mit den beschriebenen Werkzeugen behandelt wurde Eine SIFT Datei enth lt zeilenweise die Ergebnisse von einzelnen T pfchenmessungen Dabei sind in einer gegebenen Zeile die Koordinaten des gemessen T pfchens auf der Plat te und neben weiteren Messparametern die sektorenweise gez hlten rot gr n Ereignisse sowie die Gesamtintensit ten Jtot r und kor g angegeben Ein Detail der Messun
52. lstruktur und anti Prion Wirksamkeit bestehen 100 5 1 Entdeckung und Entwicklung einer ersten neuen Wirkstoffklasse Benzyliden Benzohydrazid Abbildung 5 5 NBB Struktur Die Struktur NBB setzt sich aus einer Benzyliden und einer Benzohydrazid Gruppe zusammen die ber ein N Atom verbunden sind 5 1 2 Struktur Wirkungs Beziehungen von NBB Substanzen Um die Frage nach Struktur Wirkungs Beziehungen von NBB Substanzen anhand der im prim ren Screening gesammelten SIFT Wirksamkeiten zu beantworten habe ich mithilfe der in Abschnitt 4 1 beschriebenen Softwarewerkzeuge MoSS hMoSS etc systematisch NBB Substrukturklassen gebildet und auf diese Weise die Einfl sse von verschiedenen Substituenten der NBB Kernstruktur auf die SIFT Aktivit ten untersucht Die Vielzahl der von dem Werkzeug MoSS gebildeten NBB Substrukturklassen konnte mithilfe des Werkzeugs hMoSS bersichtlich in hierarchischer Form dargestellt werden wie es schon in Abbildung 4 4 exemplarisch gezeigt wurde Diese Form der Darstellung erm glichte die Auswahl einer Reihe von NBB Substrukturklassen mit hnlichen Wirksamkeitsprofilen und damit die Identifikation von Struktur Wirkungs Beziehungen Abbildung 5 6 zeigt eine Gruppe von NBB Substanzklassen die auf diese Weise ausge w hlt wurden Das in der ersten Zeile gezeigte allgemeine NBB Kernmotiv wird von den brigen Strukturmotiven um spezifische Substituenten erweitert Gem den Erl uterun gen in Abschnitt 4 1
53. modifizierter Substanzen Die Entwicklung solcher modifizierter NBB Substanzen ist Gegenstand der derzeitigen Forschungsbem hungen Aktuell durchgef hrte Tierversuche zeigen vielversprechende Ergebnisse f r einzelne neu synthetisierte NBB Substanzen mit verbesserten pharmako kinetischen Eigenschaften 5 1 6 Unterdr ckung der Aggregation von Synuklein Au er f r die Suche nach anti Prion Substanzen wurde die SIFT Technik am ZNP auch dazu eingesetzt f r einige NBB Substanzen herauszufinden ob sie auch die Aggregation des Proteins amp Synuklein S hemmen k nnen die mit der Parkinsonschen Krankheit assoziiert ist vgl Abschnitt 2 2 4 Dabei wurde ein am ZNP entwickelter in vitro Aggre gations Assay eingesetzt in welchem mit rot und gr n fluoreszierenden Farbstoffen mar kierte amp S Monomere bei niedrigen Konzentrationen 0 3 des L sungsmittels DMSO zur Aggregation gebracht werden k nnen Auch die im Folgenden aufgef hrten Resultate wurden in unserem gemeinsamen Patent 94 ver ffentlicht 250 07 225 07 200 0 175 0 150 05 125 05 100 05 75 07 50 07 1 25 07 E a Vex ma n amao OS a oo Mai 1 1 1 1 1 1 1 T 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 50 0 100 0 150 0 200 0 250 0 0 50 0 100 0 150 0 200 0 250 0 A 50 0 100 0 150 0 200 0 250 0 0 DMSO 1 DMSO 1 DMSO 10 uM 293602 Abbildung 5 18 Unterdr ckung der S Aggregation durch die Substanz 293G02 Ge zeigt sind mit der SIFT Technik gemessene 2D Fluoreszenz Inten
54. nnen Diese Informationen waren f r meine Analyse der Strukturmotive von anti Prion Wirkstoffen von gro er Bedeutung und wurden bei meinen rechnergest tzten Analysen dementsprechend ber cksichtigt vgl Ab schnitt 5 1 Es sei angemerkt dass das N2a Zellkulturmodell von Konstanze Winklhofer und weiteren Mitarbeitern der Gruppe Tatzelt auch dazu eingesetzt wurde den Einfluss von diversen Mutationen des Prion Protein Gens Prn p auf die Faltung und Maturierung von PrP zu untersuchen 112 Dabei wurden die kultivierten Zellen transient mit ver nderten Prn p Genen transfiziert sodass sie vor bergehend mutierte Prion Proteine exprimierten Im Ge gensatz zu nicht mutiertem wildtypischen PrP wtPrP das posttranslational mit komple 32 2 4 HTS f hige Zellkulturen und ein weiteres Modellsystem TP3 xen Zuckerseitenketten und einem GPI Membrananker versehen wird vgl Abschnitt 1 6 wurden einige der untersuchten PrP Mutanten fehlerhaft prozessiert Die Fehler bei der Maturierung deuteten auf strukturelle Ver nderungen der betroffenen PrP Mutanten ge gen ber wtPrP hin Ich habe daraufhin ein Projekt initiiert in dem zwei der Mutanten und wtPrP mit Moleku lardynamik Simulationen untersucht wurden Die Simulationen best tigten den Verdacht dass die Mutanten eine gegen ber wtPrP ver nderte Struktur aufweisen und ergaben zu dem Hinweise darauf dass die Stabilit t von Helix 1 durch die Dielektrizit tskonstante der Umgebung geste
55. r die Messplatte aus Abbildung 3 8 anhand derjenigen T pfchen generiert wurde die in der Plattenrepr sentation aus Teil B ausgew hlt sind In diesem Chart sind die von SIFT Viewer II berechneten Wirksamkeitswerte f r die ausgew hlten T pfchen gegen die Konzentration aufgetragen Dabei sind zum einen die Wirksamkeitswerte der negativen und positiven DOSPA Kontrollmessungen als rote bzw blaue Symbole bei den Konzen trationen 0 bzw 17 uM eingezeichnet Zum anderen sind die Werte f r die beiden ausge w hlten Substanzen Bsc3119 und Bsc3629 bei den verschiedenen Konzentrationen durch gr ne bzw gelbe Symbole repr sentiert Da auf der gew hlten Platte die Substanzen bei jeder Konzentration zweifach gemessen wurden werden von SIFT Viewer II jeweils die Mittelwerte der Wirksamkeiten gebildet und durch Linien verbunden dargestellt Anhand solcher Dosis Wirkungs Kurven k nnen vom Benutzer Konzentrationsabh ngigkeiten der Wirksamkeiten analysiert und EC50 Werte abgelesen werden In Abbildung 3 9 B ist ein weiterer Chart gezeigt in welchem in analoger Weise die Ge samtintensit ten tot r 1m roten Spektralbereich Channel 2 der ausgew hlten T pfchen gegen die Konzentration aufgetragen sind ber das Drop Down Men im unteren Be reich dieses Charts k nnen alternativ die gr nen Gesamtintensit ten Jot f r die Darstel lung ausgew hlt werden Die dargestellten Dosis Gesamtintensit ts Kurven dienen dazu Fluoreszenzartefakte die et
56. rchtungen vor einer vCJD Epidemie aus Bis November 2006 starben im Vereinigten K nigreich zwar 158 Menschen an vCJD 3 aber die be f rchtete Epidemie blieb gl cklicherweise aus Als Ende des Jahres 2000 die ersten deutschen BSE F lle bekannt wurden f rchtete man auch hierzulande eine bertragung dieser Krankheit auf den Menschen Das Bundesmi nisterium f r Bildung und Forschung BMBF reagierte darauf mit der Errichtung eines F rderschwerpunktes zur Erforschung von Therapiem glichkeiten f r diese Erkrankun gen 4 In diesem Rahmen begann wenig sp ter der Forschungsverbund Systematische Entwicklung neuer Wirkstoffe f r die kausale Therapie von Prionkrankheiten seine Ar beit an dem ich seit Juli 2002 mitgearbeitet habe Gegenstand der vorliegenden Disserta tion ist mein seitdem geleisteter wissenschaftlicher Beitrag zum Forschungsverbund In den Teilprojekten dieses interdisziplin ren Verbundes wurden eine Reihe von Mo dellsystemen f r Prionkrankheiten zur systematischen Suche nach Wirkstoffen in gro en Mengen von Testsubstanzen eingesetzt Mein Beitrag zum Verbund umfasste die Verwal tung Aufbereitung und Analyse der dabei gewonnenen Daten mit dem Ziel Wirkstoffklas sen zu bestimmen Zum Verst ndnis der unserem Forschungsverbund gestellten Aufgabe m chte ich zun chst die grundlegenden Mechanismen von Prionkrankheiten erl utern so weit diese gegenw rtig bekannt sind 1 1 Prionkrankheiten Die Transmissiblen S
57. tsplots die Plattenrepr sentationen die 2D SIFT Spektren und die Molek lstrukturen zu den vom Benutzer ausgew hlten Platten und T pfchen enthalten 3 4 5 Webbrowser basierte Visualisierung mit SIFT Viewer Um dem Leser einen Eindruck der Visualisierung mit SIFT Viewer I zu geben zeigt Ab bildung 3 4 einen Bildschirmschnappschuss dieses Werkzeugs In diesem Schnappschuss sind die SIFT Ergebnisse f r eine Platte der Bibliothek DIVERSet 2 dargestellt Die dar gestellte Platte Nummer 30163 wurde vom Benutzer ber das Drop Down Men im rechten oberen Bereich aus allen 125 DIVERSet 2 Platten ausgew hlt Daraufhin werden die zu dieser Platte geh rigen Darstellungen in den brigen Bereichen des Browserfensters angezeigt e Die Grafik im oberen zentralen Bereich zeigt in verschiedenen Farben Plots der Summenobservablen S 7 orange s7 lila S blau und S 18 cyan sowie der Ge samtfluoreszenzen I skot r rot und Jtot gr n welche mit den Werkzeugen aus Ab schnitt 3 4 2 erzeugt wurden In dieser Darstellung durchl uft wie in der Beschrif Der Verzeichnisname INP wurde gew hlt um meinen Kollegen vom ZNP das zur Zeit der Erstellung von SIFT Viewer Inoch INP Institut f r Neuropathologie hie den Einstiegspunkt zu kennzeichnen 53 3 Methoden zur Haltung Auswertung und Visualisierung von Daten Datei Bearbeiten Ansicht Sehe Lesezeichen Extras Hilfe SIFT Messunger n DIVERSet2 2 Moz zilla Firefox
58. und Paul Tavan hinsichtlich einiger Details verbessert wurde 27 Dieses Modell geht davon aus dass bei der Umwandlung von PrP in PrP die beiden Helizes 2 und 3 erhalten bleiben und dass derjenige Abschnitt der in PrP Helix 1 bildet in PrP zu einer dreieckigen linksh ndigen Helix beitr gt vgl Abbildung 1 6 Das B helikale Sekund rstrukturmotiv ist aus nat rlich vorkommenden Proteinen wie dem En zym UDP N Acetylglucosamine Acyltransferase bekannt 65 Die von Stork et al 27 vorgeschlagene Detailverbesserung betrifft die Platzierung von polaren oder geladenen Residuen in eine sogenannte Loop Struktur welche die regul re 6 Helix unterbricht Auf diese Weise zeigen keine polaren oder geladenen Residuen ins apolare Helix Innere son dern liegen so dass sie im umgebenden Medium solvatisiert werden k nnen Eine derar tige Anordnung ist bei triangul ren parallelen 6 Helizes aus Stabilit tsgr nden zwingend zu fordern 27 Abbildung 1 8 zeigt zum einen wie jeweils drei B helikale PrP Molek le ein Trimer bilden und wie auf diese Weise die aus den EM Messungen erhaltenen Randbedingungen erf llt werden k nnen links Zum anderen sind dort mehrere derartige Trimer Scheiben zu einer kurzen Protofibrille gestapelt rechts Nach diesem Modell k nnten sich mehrere solcher Protofibrillen zu l ngeren Prion St bchen zusammensetzen Auf diese Weise ver sucht das Modell dem in Abschnitt 1 3 diskutierten Fibrillenwachst
59. und SIFT Viewer II nach wie vor von TP1 und mir f r die Analyse von SIFT Messdaten genutzt werden 3 7 Alternative Datenverwaltung mit ChemFinder Die Software ChemFinder der Firma CambridgeSoft 133 dient der Verwaltung von Sub stanzbibliotheken und wurde in der Vollversion bei mir und in einer kostenlosen auf le senden Zugriff begrenzten Version bei unseren Verbundpartnern installiert Gegen ber der Datenverwaltung mit der TSE DB bietet ChemFinder den Vorteil dass die damit verwal teten Bibliotheken in Form von Dateien gehalten werden sodass ich die Bibliotheken regelm ig aktualisieren und an unsere Verbundpartner verteilen konnte Zu den von mir mithilfe von ChemFinder verwalteten Substanzbibliotheken z hlen die DIVERSet Samm lungen und einige fokussierte Bibliotheken die im Labor von Prof Boris Schmidt TP6 oder im Rahmen einer externen Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof Christian Griesinger MPI f r biophysikalische Chemie G ttingen synthetisiert wurden Im Falle der DIVERSet Bibliotheken konnte ich zur Installation eines virtuellen Abbil des dieser Substanzsammlungen die vom Hersteller mitgelieferten sdf Dateien mit den Substanzbeschreibungen vgl Abschnitt 3 3 direkt in ChemFinder importieren und auf 71 3 Methoden zur Haltung Auswertung und Visualisierung von Daten Chemfinder I File Edit View Text Search Record Scripts Online Window Help lE PELER ECEL LERNE NORIETA DS1_and_DS2 CFW
60. und Wirksam keitsplots Des weiteren existiert f r jedes T pfchen eine nach den T pfchenkoordinaten benannte HTML Datei wie beispielsweise AD1 html welche die Grafikdateien der zu geh rigen 2D SIFT Spektren und Molek lstrukturen aus sifts bzw structs_2d einbettet Hinter den T pfchenrepr sentationen in platte_b html liegen Hyperlinks welche auf die zu den T pfchen geh rigen HTML Dateien z B ADl html verwei sen Auf diese Art ist die plattenweise Verschaltungslogik von SIFT Viewer I realisiert Zur Generierung der beschriebenen HTML Dokumente steht das Skript gen_html_ plates sh aus dem CVS Modul screening zur Verf gung Von diesem Skript wird auch die Datei index html im Verzeichnis INP generiert wel che den Einstiegspunkt f r den Benutzer darstellt und mit einem Webbrowser ge ffnet werden muss um die Darstellung von SIFT Viewer I zu starten In dieser Datei wird der vom Browser dargestellte Bereich in Unterbereiche aufgeteilt die Frames genannt werden und deren Inhalt entweder statisch ist oder zur Laufzeit infolge von Benutzerinteraktion dynamisch ver ndert wird In einem statischen Frame von index html findet sich ein sogenanntes Drop Down Men zur Auswahl von Platten das unter Verwendung der Pro grammiersprache JavaScript 127 implementiert wurde sowie eine Reihe von variablen Bereichen in denen die im letzten Abschnitt geschilderten HTML Dokumente dargestellt werden welche die Summen und Aktivit
61. und so die Struk turen und Wirksamkeiten der darin enthaltenen Substanzen inspiziert Auf diese Weise konnte eine Gruppe von f nf benachbarten Clustern identifiziert werden deren Symbo le infolge der Auswahl per Mausklick fett umrandet dargestellt sind und die als XXX_1 bis XXX_5 bezeichnet wurden Da die Symbole benachbart liegen enthalten die Cluster XXX_1 bis XXX_5 allesamt Substanzen die einander strukturell hnlich sind Die Sub stanzen insgesamt 33 dieser Cluster bilden eine gemeinsame chemische Strukturklasse die mit XXX bezeichnet werden soll W hrend die Substanzen der Cluster XXX_1 und XXX_2 lediglich im Zellkultur Assay berwiegend wirksam waren rote K stchen wa ren jene der Cluster XXX_3 XXX_4 und XXX_5 in beiden Assays berwiegend wirksam rote Sternchen Die in den DIVERSet Bibliotheken enthaltenen Substanzen der Klasse XXX sind also insgesamt stark Zellkultur und moderat SIFT aktiv Derartige Clusteranalysen die ich bereits ab dem Sp tsommer 2005 anhand von damals aktuellen St nden der Screening Ergebnisse durchgef hrt hatte lie en schon damals die 121 5 Ergebnisse und Diskussion s S x e 7 e gt 5 d 4 a a s e ad i o A u a s v A m o z r a o n Ld a o a a u e 0 b es m u a 4 u r a o n m s 5 o A P o 4 a 3 e o F e 3 e 4 D e i LJ a gt v e h 4 a a XXX_1 XXX_2 XXX_3 XXX_4 XXX_5 Gr e Par lt 50 Po lt 50 Cl
62. wurden dabei in Quadrant D mitgef hrt Die auf diese Weise bef llten 384 T pfchen Platten wurden mit der SIFT Technik vermessen und die Messdaten mithilfe von SIFT Viewer II ausgewertet 2 a 45 6 3 9 1011 172113 14 15 16 17 1819 2071 22 2324 Kontrollen D Abbildung 5 11 SIFT Ergebnisse f r eine 384 T pfchen Plattenmessung einer 96 T pf chen Platte mit neuen NBB Substanzen Gezeigt ist die von SIFT Viewer II generierte Re pr sentation einer 384 T pfchen Platte auf der in den Quadranten A B und C in drei un terschiedlichen Konzentrationen jeweils die NBB Substanzen einer 96 T pfchen Platte Platte ID im SIFT Assay gemessen wurden In der ersten Zeile von Quadrant D wurden Positiv und Negativ Kontrollmessungen mitgef hrt Die T pfchenrepr sentationen sind gem den qua drantenlokal Median basierten Wirksamkeiten vgl Abschnitt 3 2 3 eingef rbt wobei gr ne Farbt ne hohe und rote Farbt ne niedrige Wirksamkeiten kennzeichnen Mithilfe von SIFT Viewer II wurden die T pfchen von Substanzen ausgew hlt die in mehreren Quadranten er h hte Wirksamkeiten zeigen die zugeh rigen Kn pfe erscheinen daher als gedr ckt Im wei berdeckten Bereich wurden um die Plattenkapazit t zu nutzen weitere Substanzen getestet deren Resultate hier nicht relevant sind Abbildung 5 11 zeigt die von SIFT Viewer II erzeugte Repr sentation der Resultate einer solchen Messung der NBB Platte II und soll zun chst dazu dienen Pro
63. 00 L we u Libraries Tree Substance Lists w lz Abbildung 3 6 Zugriff auf die TSE DB mit dem TSE DB Browser Der TSE DB Browser bietet den Mitarbeitern des Verbundes Zugriff auf die in den verschiedenen Assays gewonnenen Messergebnisse Dabei k nnen die Messdaten ber die Bibliotheksplatten A oder ber Listen von ausgew hlten Substanzen B erreicht werden Der in Schnappschuss A durch Wahl des Reiters Libraries Tree ausgew hlte Auswahl baum repr sentiert die DIVERSet Bibliotheken wobei die Knoten des Baums einzelne Bibliotheksplatten darstellen Durch Klicken auf solche Knoten w hlt der Benutzer eine Platte aus woraufhin im rechten Bereich des Fensters eine neue Karteikarte ge ffnet wird in der eine Tabelle mit den Substanzen der ausgew hlten Platte dargestellt wird Der in Schnappschuss B gezeigte Auswahlbaum Reiter Substance Lists dient dem Zugriff auf die in den verschiedenen experimentellen Untersuchungen als wirksam gefun denen Substanzen Dazu zeigt dieser Auswahlbaum f r jede Untersuchung einen Knoten ber den die zugeh rige Menge der wirksamen Substanzen f r die Tabellendarstellung ausgew hlt werden kann Die Tabellen aus A und B werden dynamisch durch Zugriffe auf die TSE DB mit Substanzinformationen bef llt wobei Molek lstrukturdefinitionen aus der Tabelle SUBSTANCE und Wirksamkeitsdaten aus den in Abbildung 3 5 wei hin terlegten Tabellen der TSE DB ausgelesen werden Ei
64. 1 1 v y a 2 10262 1 fy 10263 1 ot i E 10264 1 aot 801 cot D01 E01 F01 Got SS wells 2 10265 1 EZ 10266 1 10267 1 Total Intensities Sums Activities Structures SubstancesTable fy 10268 1 fy 10269 1 m D 10270 1 fy 10271 1 w 10272 1 m 10273 1 2 10274 1 m 10275 1 2 10276 3 fy 10277 1 E29 10278 1 29 10279 1 10280 1 a D 10281 1 amp 2 10282 1 210283 1 a 10284 1 Sum 1 18 Sum 4 9 Sum1 7 Sum 1 5 234567 8 9 101112 oe Ls Corre oo a if zanmonor 0 7218731 76 6 False Substance 10 1 0 al 33 514 65 8134 Layout Activity Asso star Spectra Dose Observable Ewa amp contrast amp itot with Grubb OD update Bins 1 to 5 Activity Calculator update Abbildung 3 11 Bildschirmschnappschuss von SIFT Viewer II Wie sein Vorg nger dient SIFT Viewer II der Analyse von SIFT Daten Im linken Bereich sind einzelne Plattenmessun gen aufgelistet die aus dem Dateisystem oder aus der TSE DB eingelesen werden k nnen Im rechten Bereich sind die Daten der ge ffneten Messplatte Nr 10264 aus DIVERSet 1 dargestellt Dort ist im unteren linken Teil die Platte in Form von einer Matrix aus Kn pfen repr sentiert Die Kn pfe zeigen durch Farbkodierung die anti Prion Aktivit t der zugeh ri gen Substanzen an gr n aktiv rot inaktiv hnlich wie bei SIFT Viewer I sind im oberen Bereich Summenobservablen und im unteren rechte
65. 46 Daylight Chemical Information Systems Inc Aliso Viejo CA USA http www daylight com 46 89 A Leo C Hansch und D Elkins Partition coefficients and their uses Chem Rev 71 525 616 1971 46 Free Software Foundation Inc CVS Concurrent Versions System http www nongnu org cvs 47 Free Software Foundation Inc Gawk http www gnu org software gawk gawk html1 49 84 CREASO GmbH Gilching Germany http www creaso de 50 W D Ihlenfeldt The CACTVS System Home Page http www2 chemie uni erlangen de software cactvs 51 80 World Wide Web Consortium W3C HyperText Markup Language HTML Home Page http www w3 org MarkUp 51 Ecma International Standard ECMA 262 ECMAScript Language Specification http www ecma international org publications standards Ecma 262 htm 53 Leibniz Rechenzentrum M nchen Oracle9i Datenbankmanagementsystem http www lrz muenchen de services datenhaltung datenbanken oracle9 55 Quest Software Toad Data Modeler http www quest com Toad_Data_Modeler 56 57 P P S Chen The Entity Relationship Model Toward a Unified View of Data ACM Trans Database Syst 1 9 36 1976 56 151 Literaturverzeichnis 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 152 Daylight Chemical Information Systems Inc SMILES http w
66. 7 i So S1 32 33 31 35 36 27 Ss S3 S4 S4 S5 Abbildung 4 3 Bildung einer Hierarchie von Substrukturklassen Links unten ist eine bei spielhafte Liste von neun Strukturklassen S dargestellt die zus tzlich die nach 4 7 jeweils enthaltenen Subklassen S auff hrt Zur Veranschaulichung der zugrunde liegenden Mengen beziehungen sind die Klassen im oberen Bereich als Ellipsen oder fette Punkte dargestellt Die Liste liegt der rechts unten dargestellten Hierarchie zugrunde Erl uterungen finden sich im Text als indirekte Subklassen der bergeordneten Klasse So aufgefasst und aus der Liste ihrer Subklassen gestrichen vgl die zu S geh rige Liste Damit enth lt diese Liste nur noch Subklassen S und Sg die selbst nicht Subklassen anderer Klassen aus der urspr ng lichen Liste sind Auf diese Weise wird die rechts unten dargestellte Hierarchie direkter Subklassen definiert Dort besitzt jeder Knoten S als Kinder ausschlie lich direkte Sub klassen Ausgangspunkt beim Aufbau der Hierarchie sind also die gem 4 7 gebildeten und in Abbildung 4 3 links unten exemplarisch gezeigten Listen von Teilmengen Unter Verwen dung des Skripts miner_tree sh werden aus diesen Listen alle indirekten Teilmengen gestrichen Da durch die Vorgabe eines bergeordneten Kernmotivs die bergeordnete Klasse von vornherein feststeht kann ausgehend von der Liste ihrer direkten Subklassen die Hierarchie unmittelbar aufgebaut werden Im gezeigten Beis
67. 8 aufgefasst Der Index o zeigt dabei an dass die Lage der Prototypen y und ihre Anzahl N von der gew hlten Gau breite o des Dichtemodells abh ngen F r gen gend gro e Werte von o besitzt das Dichtemodell ein einziges Maximum und es wird ein Prototyp gebildet F r abnehmende Werte von o steigt die Zahl No der Prototypen monoton an bis schlie lich f r o 0 jeder der M Codebuchvektoren c einen Prototypen yi definiert Das Gradientenaufstiegsverfahren gestattet die Zuordnung gt yl C 9 von beliebigen Merkmalsvektoren X R zu den Prototypen yi Es kann also dazu eingesetzt werden die Merkmalsvektoren x der T pfchen w auf verschiedenen Skalen o den Prototypen y4 zuzuordnen Diese Zuordnungen definieren scharfe Klassen Ki iw E Bike gt yi c f r j l No C 10 und zerlegen den Datensatz in No disjunkte Teilmengen Wie die Prototypen yi h ngen auch die Klassen K X von der gew hlten Skala o ab Die Implementierung dieses Klassifikationsalgorithmus in SIFT Viewer II gestattet es dass im Quellcode ein gew nschter Bereich N min Nmax vorgegeben werden kann in nerhalb dessen die Zahl No der Prototypen liegen soll Es wird dann ein dazu passendes Intervall Omin Omax f r den Skalenparameter o gefunden Identifikation einer Trefferklasse Falls auf einer gew hlten Aufl sungsstufe o eine Klasse Kl amp existiert welcher die Merkmalsvektoren X aller T pfchen w P mit Positiv Kon
68. 8 1994 3 N Meyer V Rosenbaum B Schmidt K Gilles C Mirenda D Groth S B Prusiner und D Riesner Search for a putative scrapie genome in purified prion fractions reveals a paucity of nucleic acids J Gen Virol 72 37 49 1991 4 J G Safar K Kellings A Serban D Groth J E Cleaver S B Prusiner und D Riesner Search for a Prion Specific Nucleic Acid J Virol 79 10796 10806 2005 4 F E Cohen K M Pan Z Huang M Baldwin R J Fletterick und S B Prusiner Structural clues to prion replication Science 264 530 531 1994 5 J T Jarrett und P T Lansbury Seeding one dimensional crystallization of amyloid a pathogenic mechanism in Alzheimer s disease and scrapie Cell 73 1055 1058 1993 5 P T Lansbury Mechanism of scrapie replication Science 265 1510 1994 5 M Eigen Prionics or The kinetic basis of prion diseases Biophys Chem 63 A1 A18 1996 5 M Eigen BSE und das Prionen Problem Spektrum der Wissenschaft 4 2001 40 49 2001 5 6 7 P Tavan Vorlesung Theoretische Grundlagen der molekularen Biophysik WS 2005 2006 Ludwig Maximilians Universit t M nchen 5 6 M Stork A Giese H A Kretzschmar und P Tavan Molecular Dynamics Simulations In dicate a Possible Role of Parallel beta Helices in Seeded Aggregation of Poly Gln Biophys J 88 2442 2451 2005 5 11 12 93 117 118 119 J Masel V A Jansen und M A Nowak Quantifying the kinet
69. Abbildung 3 3 Verzeichnishierarchie zu SIFT Viewer I Die zur Visualisierung des SIFT Screenings von DIVERSet 2 generierte Verzeichnishierarchie enth lt eine Vielzahl von HTML Dokumenten und Grafikdateien die hier nur auszugsweise dargestellt sind Weggelassene Teile sind durch ersetzt Die Abbildung wurde mithilfe des Linux Kommandos t ree erzeugt dass diejenigen Daten die sich infolge neu hinzugekommener SIFT Messergebnisse h u fig ndern k nnen Spektren Summen Wirksamkeiten auf diese Weise leicht gel scht und neu erzeugt werden k nnen w hrend der statische Bereiche der Molek lstrukturen davon unber hrt bleibt Ein weiterer statischer Bereich der in Abbildung 3 3 dargestellten Verzeichnishierarchie ist derjenige der die eingangs erw hnte Repr sentation der Substanzbibliothek enth lt und sich unterhalb des Verzeichnisses 1 NP befindet Im Unterverzeichnis 1 INP platten existieren dazu f r jede Platte ein nach der Plattennummer benanntes Unterverzeichnis und in jedem dieser Unterverzeichnisse eine Reihe von HTML Dateien 52 3 4 Das Visualisierungspaket SIFT Viewer I Die Dateiplatte_b html enth lt eine Repr sentation der gegebenen Platte in Form ei ner Tabelle in der f r jedes T pfchen der realen Bibliotheksplatte ein nach den T pfchen koordinaten benannter Eintrag steht Die Datei platte_a html dient als Platzhalter f r die in sums bzw inhibs abgelegten Grafikdateien der Summen
70. Abbildung 4 2 zeigt einen Bildschirmschnappschuss der von xminer sh generierten Webbrowser basierten Visualisierung des beschriebenen Beispiels ber die beiden Ein tr ge im linken oberen Bereich Klassenlisten kann der Benutzer sowohl die vollst ndi ge Klassenliste als auch die Auswahl der gro en berwiegend in Zellkultur wirksamen Strukturklassen f r die Darstellung selektieren Hier wurde die Auswahlliste selektiert woraufhin im darunter liegenden Bereich eine Tabelle angezeigt wird in welcher die Klassen nach generischen Namen s556 s2101 etc benannt und nach absteigen der mittlerer Zellkultur Wirksamkeit sortiert aufgelistet sind Die Tabelle zeigt f r jede Klasse ihre Gr e Anzahl Substanzen die Gr e des Kernmotivs Anzahl Atome sowie die klassenlokalen Mittelwerte der Zellkultur und SIFT Wirksamkeiten Eine die ser Klassen die Klasse s4355 die hohe mittlere Zellkultur Aktivit t 0 8 aber keine erh hte SIFT Aktivit t 0 21 zeigt wurde durch Klicken auf den Klassennamen f r die 80 4 1 Identifikation und Validierung von Leitstrukturen home mol thomas scratch screening cell_culture_TP3 DS1_20070306_b miner_run Mozilla Firefox E ioj xj Datei Bearbeiten Ansicht Chronik Lesezeichen Extras Hilfe Klassenlisten s43 5 alle Strukturklassen A03 m ausgew hlte Klassen 5193890 10278 gt Anzahl Anzahl Mittlere Mittlere Klasse Substa At Aktiv
71. Abschnitt einige von SIFT Viewer II ignorierte Kommentarzei len in welchen die verwendbaren T pfchentypen beschrieben sind Es folgt der Eintrag ntp_code welcher nach der Messung von der SIFT Software ausgegeben wird und ein Identifikationsmerkmal f r die SIFT Datei darstellt ber diesen Code kann berpr ft werden ob SIFT Datei und Layout Datei zusammengeh ren In der n chsten nicht lee ren Zeile ist die Plattengr e auf 96 Wells festgelegt 384 Well Platten werden ebenfalls unterst tzt Der n chste Abschnitt substanceids dient der Eingabe von Substanz namen Wie zu erkennen ist belegen die hier gemessenen sechs Substanzen jeweils zwei Spalten 1 und 2 3 und 4 etc in den Zeilen B bis H In der Zeile A wurden Kontrollmes sungen mitgef hrt Die Typen der Kontrollmessungen gehen zwar bereits aus den Sub stanznamen hervor werden aber tats chlich ber die Eintr ge des n chsten Abschnitts welltypes festgelegt Dort sind f r alle T pfchen deren Typen ber die im Kom mentarabschnitt beschriebenen Zahlen kodiert Im letzten Abschnitt di lutions sind wiederum t pfchenweise die Substanzkonzentrationen angegeben welche in den Zeilen B bis H jeweils von 100 uM auf 0 1 uM abfallen Eine solche Layout Datei kann vom Benutzer beispielsweise unter Verwendung des Ta bellenkalkulationsprogramms Microsoft Excel editiert werden und muss dann als Text datei deren Eintr ge durch Tabulatorzeichen getrenn
72. Absorption Distribution Metabolismus Exkretion und Toxikologie zusammengefasst sind Ob die in DIVERSet enthaltenen Verbindungen in diesem Sinne tats chlich medikamentartig sind und g nstige pharmakologische Eigenschaften besitzen kann nur durch aufw ndige Tier versuche getestet werden bei denen einzelne Verbindungen verabreicht und deren Vertei lung im Organismus untersucht wird Derartige Messungen k nnen daher nur f r einige wenige Substanzen durchgef hrt werden die bereits in verschiedenen Assays als wirksam befunden wurden Daher basiert die von ChemBridge getroffene rationale Auswahl auf sogenannten 3D Pharmakophor Analysen 96 welche die Eigenschaften von bekannten Medikamenten ber cksichtigen Unter dem Pharmakophor eines Medikamentes versteht man dabei die r umliche Anordnung der wesentlichen chemischen Eigenschaften die f r die biologi sche Aktivit t des Medikamentes verantwortlich sind ein Konzept das auf Arbeiten von Paul Ehrlich 97 zur ckgeht Die DIVERSet Bibliothek wurde von ChemBridge auf eine Weise die nicht offengelegt ist so zusammengestellt dass von den enthaltenen Substan zen ein gro es Gebiet des Raumes aller m glichen Pharmakophore abgedeckt wird Dabei versucht ChemBridge zu gew hrleisten dass eine m glichst hohe Vielfalt an strukturell unterschiedlichen Substanzen in der Sammlung enthalten ist und dass diese Substanzen hinsichtlich ihrer biologischen Aktivit t vielversprechend sind In
73. Aggregation von poly Glutamin Q Proteinen vgl Abschnitt 1 3 in einem Zebrafischmodell untersucht Mein Beitrag zu diesem Projekt waren Docking Simulatio nen von Modellen der experimentell untersuchten Substanzen an ein Modell f r polyQ Protofibrillen Die Ergebnisse dieses Projekts wurden in einer gemeinsamen Publikation 159 ver ffentlicht und sollen hier kurz skizziert werden In der Gruppe von Prof Haass werden Zebrafische seit einiger Zeit als Modelltiere zum Studium der Alzheimerschen und der Parkinsonschen Krankheit eingesetzt Niclas Schif fer ein Doktorand von Prof Hartl setzte die Zebrafische zum Studium der mit der Hun tingtonschen Krankheit verbundenen Aggregation des Proteins Huntingtin htt ein Das Protein htt weist im N terminalen Bereich einen Abschnitt aufeinander folgender Q Resi duen auf dessen L nge bereits in gesunden Organismen infolge von zahlreichen Polymor phismen im htt Gen variabel ist und zwischen sechs und 35 liegt berschreitet die L nge dieses polyQ Abschnitts einen kritischen Wert von etwa 36 Residuen so bilden sich in Organismen fibrill re Aggregate des htt Proteins 164 166 deren zentrale Bestandteile 115 5 Ergebnisse und Diskussion die polyQ Abschnitte in 6 faltblattartigen Strukturen sind Um die Aggregation von htt in den Zebrafischen zu untersuchen wird den Embryonen geeignete Boten Ribonuklein s ure messenger ribonucleic acid mRNA injiziert sodass sie htt Proteine mit verl
74. E 1 1 1 1 1 1 au 1 1 1 1 1 F 1 t dy 1 dl T 1 1 al 1 1 1 G 1 1 lt 18 1 T 1 1 1 1 1 al H al 1 dt 1 T 1 al 1 di 1 1 1 dilutions 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 0 17 0 17 0 17 0 17 0 0 0 0 B 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Cc 31 6 31 6 31 6 31 6 31 6 31 6 31 6 31 6 31 6 31 6 31 6 31 6 D 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 E 3 16 3 16 3 16 3 16 3 16 3 16 3 16 3 16 3 16 3 16 3 16 3 16 F 1 t 1 T alt 1 al 1 1 al G 0 316 0 316 0 316 0 316 0 316 0 316 0 316 0 316 0 316 0 316 0 316 0 316 H 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 Abbildung 3 7 Exemplarische Layout Datei f r eine Messplatte SIFT Viewer II erm g licht dem Benutzer das Layout einer gegebenen Plattenmessung ber eine Layout Datei zu definieren wobei Substanznamen T pfchentypen und Verd nnungen festgelegt werden N here Erl uterungen des Formats finden sich im Text W hlbare Methoden zur Ausrei ererkennung Wie sein Vorg nger unterst tzt auch SIFT Viewer II die Erkennung von Ausrei ern Hier ist dem Benutzer jedoch die M glichkeit gegeben zur Laufzeit des Programms aus meh reren Methoden zur Ausrei ererkennung per Mausklick eine gew nschte auszuw hlen Dabei stehen die in Abschnitt 3 1 beschriebenen Erkennungsmethoden und einige weite re darauf basierende Verfahren zur Auswahl wobei die Methode nach Grubbs aus Ab schnitt 3 1 2 von SIFT Viewer II vorausgew hlt ist SIFT Viewer II erkennt Ausrei er ge m der ausgew hl
75. ELLE EEE mei ery meme E substance nun Mi Posve EEEFEFFEFFe Negative mmm bute Abbildung C 1 Layout der f r die Klassifikation verwendeten Plattenmessung Gezeigt ist die von SIFT Viewer II generierte Repr sentation der verwendeten Messplatte des DIVERSet Screenings Wie der Legende entnommen werden kann sind die Kn pfe nach den Typen der repr sentierten T pfchen gef rbt vgl Abbildung 3 8A Beim prim ren DIVERSet Screening wurden in Spalte 1 in den Zeilen A C und E Negativ in den Zeilen B D und F Positiv und in den Zeilen G und H Puffer Kontrollen gemessen In den T pfchen der Spalten 2 bis 11 befanden sich Testsubstanzen Spalte 12 blieb leer vgl das Plattenlayout in Abbildung 2 6 Zanmonop Die Daten der 88 bef llten T pfchen wurden der Ausrei ererkennung unterzogen wobei f nf T pfchen aussortiert wurden Die rohen 18 dimensionalen 2D SIFT Spektren x der 83 verbliebenen T pfchen wurden dem Vorverarbeitungsprozess aus Abschnitt C 1 1 un terzogen und dabei in Vektoren C 3 der reduzierten Dimension D 5 transformiert die gem C 4 mit den Grauwerten C 1 und Kontrasten C 2 zu Merkmalsvektoren X der Dimension Dm 5 2 zusammengesetzt wurden F r den resultierenden Merkmals datensatz C 5 wurde unter Einsatz des univar Algorithmus ein Dichtemodell C 6 aus M 9 univariaten Gau funktionen gebildet Mithilfe des Gradientenaufstiegsverfahrens wurden auf verschiedenen Skalen o gem C 8 P
76. Entwicklung einer ersten neuen Wirkstoffklasse OH g ne N OH I Abbildung 5 7 Substanz 293G02 Diese Substanz zeigte die st rkste Wirksamkeit im Zellkul turtest Ihre Struktur vereint die beiden mit hoher SIFT Aktivit t assoziierten Motive n mlich die Naphthalen 2 ylmethylen Gruppe am N Atom und die Hydroxyl Gruppen in meta und para Position am Benzyl Ring der Benzohydrazid Gruppe vgl Abbildung 5 5 2 ylmethylen Gruppe und die Hydroxyl Gruppen in meta und para Position in Kombi nation auftreten Auf die gleiche Weise wurden eine Reihe von weiteren NBB Substrukturklassen hinsicht lich ihrer Wirksamkeiten im SIFT Assay untersucht Dabei konnte beispielsweise gezeigt werden dass Substitutionen von bestimmten Halogenen Fluor Chlor Brom oder Jod an verschiedenen Positionen des Benzyl Rings der Benzyliden Gruppe vgl Abbildung 5 5 die SIFT Aktivit t des NBB Motivs erh hen k nnen Diese Ergebnisse wurden in unse rem Patent ver ffentlicht 94 Die Korrelationen zwischen SIFT und Zellkultur Wirksamkeiten f r die diskutierten struk turellen Motive zeigen dass es m glich ist die Daten aus dem prim ren Hochdurchsatz Screening im SIFT Assay f r die Evaluierung von Struktur Wirkungs Beziehungen ein zusetzen Des weiteren weisen diese Korrelationen darauf hin dass die in Zellkultur ge fundene anti Prion Wirksamkeit tats chlich auf eine Inhibierung der Koaggregation von PrP an PrPS zur ckzuf hren ist Die syste
77. Entwicklung von Medikamenten gegen Prionkrankheiten Thomas Hirschberger M nchen 2007 Entwicklung von Medikamenten gegen Prionkrankheiten Thomas Hirschberger Dissertation an der Fakult t f r Physik der Ludwig Maximilians Universit t M nchen vorgelegt von Thomas Hirschberger aus M nchen M nchen den 24 05 2007 Erstgutachter Prof Paul Tavan Zweitgutachter Prof Erwin Frey Tag der m ndlichen Pr fung 11 07 2007 Zusammenfassung Die Prionkrankheiten oder Transmissiblen Spongiformen Enzephalopathien TSE sind eine Gruppe von bertragbaren t dlich verlaufenden Erkrankungen des Gehirns die bis lang nicht heilbar sind Zu diesen Krankheiten z hlen die Creutzfeldt Jakob Krankheit beim Menschen Scrapie beim Schaf und die Bovine Spongiforme Enzephalopathie BSE beim Rind Auf molekularer Ebene sind Prionkrankheiten gekennzeichnet durch eine Um faltung des zellul ren Prion Proteins PrP in die pathologische Scrapie Isoform PrP und durch die Bildung von zelltoxischen PrP Aggregaten welche die bertr ger dieser Krankheiten sind und Prionen genannt werden Im Jahre 2002 wurde vom Bundesministerium f r Bildung und Forschung ein interdiszi plin rer Forschungsverbund eingerichtet der sich zur Aufgabe gestellt hatte Wirkstoffe zur kausalen Therapie von Prionkrankheiten zu entwickeln und an dem ich zusammen mit Prof Paul Tavan als Verbundpartner mitgearbeitet habe In den Laboren unserer experi mente
78. Eu oy oy j pug eae i 1 0 5 0 0 5 1 Abbildung 5 6 Struktur Wirkungs Beziehungen f r Klassen von NBB Derivaten F r acht NBB Substanzklassen sind die jeweils enthaltenen Substrukturmotive und die Verteilun gen der prim ren SIFT Wirksamkeiten gezeigt Die K sten und langen vertikalen Balken in nerhalb der stark besetzten Wirksamkeitsverteilungen markieren den Median und die Quartile Diese Statistik wurde f r Klassen die nur wenige Substanzen enthalten weggelassen Die bei den vertikalen grauen Balken markieren das Zentrum des unwirksamen Bereichs bei 0 und die Grenze zum wirksamen Bereich bei 0 5 Ubernommen aus Bertsch et al 91 einen eindrucksvollen Effekt von Naphthalenylmethylen Substitutionen Alle Verbindun gen die diesen Rest in Form eines Naphthalen 2 ylmethylen Isomers vorletzte Zeile ent halten zeigen erh hte SIFT Aktivit ten w hrend die mittlere Aktivit t der Verbindungen mit dem Naphthalen 1 ylmethylen Isomer letzte Zeile nahe bei Null liegt Eine signifi kante Struktur Wirkungs Beziehung wird dadurch nahe gelegt dass zwei Verbindungen 293G02 und 297F03 mit Naphthalen 2 ylmethylen Gruppen sich unter den Zellkultur Wirksamen finden Interessanterweise ist diejenige Verbindung 293G02 mit der st rks ten Zellkultur Wirksamkeit dadurch charakterisiert dass in ihrer Struktur siehe Abbil dung 5 7 die beiden mit hoher SIFT Aktivit t assoziierten Motive d h die Naphthalen 102 5 1 Entdeckung und
79. F E Cohen S B Prusiner P E Wright und H J Dyson Structure of the recombinant full length hamster prion protein PrP 29 231 The N terminus is highly flexible Proc Natl Acad Sci USA 94 13452 13457 1997 10 R Riek G Wider M Billeter S Hornemann R Glockshuber und K Wuthrich Prion protein NMR structure and familial human spongiform encephalopathies Proc Natl Acad Sci USA 95 11667 11672 1998 10 H Liu S Farr Jones N B Ulyanov M Llinas S Marqusee D Groth F E Cohen S B Prusiner und T L James Solution structure of Syrian hamster prion protein rPrP 90 231 Biochemistry 38 5362 5377 1999 10 F L Garcia R Zahn R Riek und K Wuthrich NMR structure of the bovine prion protein Proc Natl Acad Sci USA 97 8334 8339 2000 10 D R Perez und K Wuthrich NMR assignment of the Xenopus laevis prion protein fragment xlPrP 98 226 J Biomol NMR 31 260 260 2005 10 D A Lysek C Schorn L G Nivon V Esteve Moya B Christen L Calzolai C von Schroetter F Fiorito T Herrmann P Guntert et al Prion protein NMR structures of cats dogs pigs and sheep Proc Natl Acad Sci USA 102 640 645 2005 10 L Calzolai D A Lysek D R P rez P G ntert und K W thrich Prion protein NMR structures of chickens turtles and frogs Proc Natl Acad Sci USA 102 651 655 2005 10 A D Gossert S Bonjour D A Lysek F Fiorito und K W thrich Prion protein
80. FT Scree ning hervorgeht gliedern sich die T pfchen nach der Zusammensetzung der Assay Mi schung in die vier Gruppen Positiv Kontrollen Negativ Kontrollen Kontrollen ohne PrPSc und Testsubstanzen Nach dem hier vorgestellten verbesserten Verfahren wird jede dieser T pfchengruppen getrennt hinsichtlich Ausrei ern untersucht Als Ausrei er Kriterium soll dabei ein gegen ber dem heuristischen Kriterium 3 2 verbessertes Kri terium eingesetzt werden das urspr nglich von Grubbs 116 vorgeschlagen wurde Das Kriterium von Grubbs basiert auf der Annahme dass die Menge der Jot Werte f r ei ne gegebene T pfchengruppe durch eine Normalverteilung beschrieben werden kann die durch den Mittelwert N N Lf N 2 fens und die Stichproben Standardabweichung 1 N S AT 2 ho sw we w der Werte Ito w f r die N T pfchen charakterisiert ist Um zu entscheiden ob ein fragw rdiger Wert Jot f w dieser Normalverteilung angeh rt wird das Testkriterium en Ttot f w ugl T 3 3 Sf verwendet wobei berpr ft wird ob der Wert T gem T gt T N 3 4 gr er als ein kritischer Wert 7 N a ist der vom Umfang N der Stichprobe und einem w hlbaren Signifikanzniveau a abh ngt In 116 findet sich eine Tabelle Table 1 mit kri tischen Werten Te N f r verschiedene Stichprobenumf nge N und Signifikanzniveaus a welcher der kritische Wert 7T N f r den gegebenen Stic
81. Form zusammenstellt Die durch das SIFT Screening die automatisierte Datenauswertung und die anschlie ende Validierung in einem Zellkultur Assay realisierte systematische Wirkstoffsuche f hrte zur Entdeckung einer neuen Klasse von anti Prion Wirkstoffen den N Benzyliden Benzo hydraziden NBB Solche NBB Substanzen zeigten auch in Tierversuchen Wirksamkeit gegen Prionkrankheiten Dar ber hinaus wurde in einem SIFT Assay Wirksamkeit gegen die mit den TSE verwandte Parkinsonsche Krankheit gefunden Sowohl die Screening Methode als auch die NBB Wirkstoffklasse wurden durch ein Patent gesch tzt 1 ver f fentlicht 2 und auf Fachkonferenzen pr sentiert 3 4 Substanzen der NBB Klasse wurden anschlie end im Rahmen einer externen Kooperati on zus tzlich als Inhibitoren der mit der Huntingtonschen Krankheit einhergehenden Ag gregation von poly Glutamin Q Proteinen gefunden Simulationen des Dockings dieser Substanzen an ein Modell f r polyQ Protofibrillen gaben Hinweise auf m gliche Mecha nismen der generellen anti aggregatorischen Wirksamkeit dieser Substanzen 5 Neben der SIFT Technik wurde im Verbund auch ein Zellkulturmodell f r Prionkrank heiten zum HTS der Bibliotheken nach anti Prion Wirkstoffen eingesetzt Die Ergebnisse dieses zweiten Screenings habe ich in Verbindung mit jenen des SIFT Screenings dazu genutzt die verwendeten Substanzbibliotheken im Hinblick auf Struktur Wirkungs Be ziehungen einer Clusteranalys
82. Griffith Self replication and scrapie Nature 215 1043 1044 1967 3 D C Bolton M P McKinley und S B Prusiner Identification of a protein that purifies with the scrapie prion Science 218 1309 1311 1982 3 S B Prusiner Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie Science 216 136 144 1982 3 S B Prusiner D C Bolton D F Groth K A Bowman S P Cochran und M P McKinley Further Purification and Characterization of Scrapie Prions Biochemistry 21 6942 6950 1982 3 143 Literaturverzeichnis 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 144 A Giese und H A Kretzschmar Prion induced neuronal damage the mechanisms of neuronal destruction in the subacute spongiform encephalopathies Curr Top Microbiol Immunol 253 203 217 2001 3 H B eler A Aguzzi A Sailer R A Greiner P Autenried M Aguet und C Weissmann Mice Devoid of PrP Are Resistant to Scrapie Cell 73 1339 1347 1993 3 S B Prusiner D Groth A Serban R Koehler D Foster M Torchia D Burton S L Yang und S J DeArmond Ablation of the prion protein PrP gene in mice prevents scrapie and facilitates production of anti PrP antibodies Proc Natl Acad Sci USA 90 10608 10612 1993 3 A Sailer H B eler M Fischer A Aguzzi und C Weissmann No Propagation of Prions in Mice Devoid of PrP Cell 77 967 96
83. H 2 2 2 2 2 108 Mit Wirksamkeit assoziierte Hydrazide und Aldehyde 108 SIFT Dosis Wirkungs Analysen f r neue NBB Derivate 109 Mediane der Sterbealter 4 22 22a BOL Ed BPE OS 111 PrP Ablagerungen in der Milz 2 222 222 112 Konzentrationen der Substanzen 309F02 und 293G02 im Blutplasma von M usen E a aha ter al eat state ae el at Baia ugh Gas 113 Unterdr ckung der S Aggregation durch die Substanz 293G02 114 Strukturen der Substanzen 306H03 und Congo red 116 Docking von anti aggregatorischen Substanzen an ein Modell f r eine po Dy 0 Protohbnlle e sai iare ae Ale vate e wake ee Ben Gi say Aol 118 SAR Karte f r die DIVERSet Bibliotheken 22 22 2200 122 Paketstruktur der Java Bibliothek tsedb 22 2 0 130 Layout der f r die Klassifikation verwendeten Plattenmessung 139 Klassen und Merkmalsvektoren 2 2 2 2 onen 140 Wirksamkeitsma e im Vergleich 2 2 2 2 Comm nenn 140 Umgebungsabh ngige Faltung von Helix 1 in PrP M205R 141 Abk rzungsverzeichnis as ADMET ADT BMBF BMO BSE CD CDK CJD cLogP CVS DDL DMSO DOSPA EM ER ER FCS FK a Synuklein Mit der Parkinsonschen Krankheit assoziiertes Protein Seite 30 Absorption Distribution Metabolismus Exkretion und Toxikologie Seite 19 AutoDockTools Werkzeuge fiir Docking Simulationen Seite 93 Bundesministerium f r Bildung und Forschung Seite 1 Lehrstuhl f r BioMole
84. Helizes Gut definierte Docking Positionen werden f r die beiden NBB Verbindungen 293G02 und 306H03 vorhergesagt welche beide eine Amid Gruppe besitzen die hervorragend f r ei ne durch Wasserstoffbr ckenbindungen vermittelte Anlagerung an das polyQ Peptidr ck grat geeignet ist Die Docking Positionen von Congo red und 313B02 zeigen eine weni ger starke Ordnung Dass die NBB Substanzen spezifisch an die Enden der polyQ Helizes binden welche die Ansatzpunkte f r weitere Aggregation von polyQ Segmenten darstel len legt einen Mechanismus der Aggregationshemmung nahe der ein weiteres Fibrillen wachstum verhindern k nnte Es sei angemerkt dass auch andere strukturelle Modelle f r polyQ Protofibrillen existieren 168 Jedoch sind alle diese Modelle hnlich wie unser B helikales Modell durch freie Anlagerungsstellen f r Wasserstoffbr ckenbindungen an die C O und NH Gruppen des Proteinr ckgrats charakterisiert welche die unges ttigten Enden der Faltblatt Fibrillen ausmachen Allgemeine Bedeutung der Ergebnisse Insgesamt best tigen die angef hrten Ergebnisse unsere Ausgangshypothese dass die mit bestimmten neurodegenerativen Krankheiten assoziierten Proteine PrP und mutiertes 117 5 Ergebnisse und Diskussion Congo red 313B02 AG 7 2 kcal mol AG 6 7 kcal mol 293G02 306H03 AG 6 4 kcal mol AG 6 2 kcal mol Abbildung 5 20 Docking von anti aggregatorischen Substanzen an ein Modell f r eine po
85. I f r Biochemie Martinsried und Prof Christian Haass Lehrstuhl f r Stoffwechselbiochemie Adolf Butenandt Insti tut LMU hinsichtlich ihrer Wirkung gegen die mit der Huntingtonschen Krankheit asso ziierte Aggregation von poly Glutamin Q Peptiden in einem Tiermodell getestet und als 92 4 3 Simulationen des Dockings von Wirkstoffen an polyQ Protofibrillen wirksam gefunden Im Rahmen dieser externen Kooperation f hrte ich Docking Simula tionen von Modellen dieser Wirkstoffe an ein spezielles Modell f r eine polyQ Protofi brille durch Unsere Ergebnisse wurden in Schiffer et al 159 ver ffentlicht und werden weiter unten in Abschnitt 5 1 7 beschrieben Um zu erkennen an welchen Stellen eines Rezeptorproteins ein gegebener Wirkstoff bin den und dadurch m glicherweise seine Wirksamkeit vermitteln kann werden blicher weise experimentelle Methoden der Strukturaufkl rung wie NMR oder R ntgenspektro skopie eingesetzt Die im Falle der Huntingtonschen Krankheit auftretenden polyQ Ag gregate sind jedoch wie die PrP Aggregate der Prionkrankheiten vgl Abschnitt 1 5 aufgrund ihrer schlechten L slichkeit bzw Kristallisierbarkeit f r diese experimentellen Methoden unzug nglich Um trotz der experimentellen Unzug nglichkeit solcher polyQ Aggregate zu verstehen an welchen Stellen dieser Aggregate die untersuchten anti aggre gatorischen Wirkstoffe binden k nnen habe ich die angesprochenen Docking Simulatio nen durchg
86. Infolge dieser Beschr n kung konnten Messplatten mit abweichendem Layout wie sie beispielsweise bei den an schlie enden SIFT Validierungsexperimenten in Form von Verd nnungsreihen vgl Ab schnitt 2 2 4 eingesetzt wurden mit SIFT Viewer I nicht ausgewertet werden Zum ande ren gibt es einen grundlegenden Schwachpunkt von SIFT Viewer I der in der eingesetz ten Prozedur der Datenaufbereitung begr ndet liegt Denn dabei werden wie oben be schrieben die im Labor von TP1 erzeugten SIFT Messdaten zun chst zu mir geschickt von mir ausgewertet grafisch aufbereitet und in der statischen Verzeichnishierarchie ab gelegt welche dann an die Experimentatoren zur ckgeschickt wird damit diese endlich die Auswertung betrachten k nnen Mit SIFT Viewer I k nnen also die Messergebnisse nicht unmittelbar nach der Messung inspiziert werden Um diese und weitere Nachteile der dateibasierten Auswertung mit SIFT Viewer I zu beheben wurde von mir zum einen eine Datenbank zur Haltung der Mess und Substanzdaten f r den Verbund eingerichtet und zum anderen eine zweite Version des Auswertungswerkzeugs SIFT Viewer II entwi ckelt mit der auf diese Datenbank zugegriffen werden kann Daher m chte ich zuerst die Datenbank und weiter unten in Abschnitt 3 6 das Werkzeug SIFT Viewer II vorstellen 3 5 Die Screening Datenbank TSE DB Zur Haltung der f r die DIVERSet Bibliotheken vgl Abschnitt 3 3 und f r einige fokus sierte Bibliotheken im Verbund
87. Java Klassen des Pakets t sedb generated db generiert wozu die von Herrn Youssef zur Verf gung gestellte Bibliothek de simon eingesetzt wurde die von ihm bereits vor seiner T tigkeit am BMO f r derartige objektrelationale Abbildungen entwickelt worden war In den Paketen tsedb data und tsedb data sift sind handgeschriebene Klassen enthalten welche die aus den Datenbanktabellen generierten Klassen zu komplexeren Objekten zusammensetzen Als Beispiel eines auf diese Weise zusammengesetzten komplexen Objektes sei hier eine Klasse genannt welche eine mit 130 der SIFT Technik gemessene Platte repr sentiert und dazu die auf der Platte enthaltenen Substanzen sowie die zugeh rigen SIFT Messdaten zusammenf gt Das angesprochene Paket de simon das zur statischen objektrelationalen Abbildung von Datenbanktabellen auf Java Klassen verwendet wurde bildet ebenfalls die Grundlage der dynamischen Datenbankfunktionalit ten der tsedb Bibliothek Mithilfe dieses Pa kets k nnen Verbindungen zur TSE DB aufgebaut und verwaltet SQL Anfragen an die Datenbank gestellt und die dabei erhaltenen Ergebnisse in Java Klassen bersetzt wer den Zu diesen Zwecken verwendet das Paket de simon die Schnittstelle Java Data base Connectivity JDBC die eine einheitliche Behandlung verschiedener relationaler Datenbanksysteme erm glicht F r den Zugriff auf den vom LRZ betriebenen Oracle9i Datenbankserver auf dem die TSE DB eingerichtet ist wurde
88. L N Abbildung 2 3 SIFT Assay Mischung Schematische Darstellung der Zusammensetzung des SIFT Assays Ein menschliches PrP Aggregat ist als Kette von magenta farbenen W rfeln gezeichnet Antik rper gegen menschliches PrP sind als rote Y dargestellt rPrP der Maus ist durch gr ne W rfel symbolisiert Abbildung zur Verf gung gestellt von A Giese SIFT Technik dient nun dazu einzelne gro e rot oder rot gr n fluoreszierende Partikel in der Mischung zu detektieren 2 2 2 Die 2D SIFT Messtechnik Mit FCS werden blicherweise zeitliche Zusammenh nge der gemessenen Fluoreszenz intensit ten F t untersucht wobei die Fluktuationen F t F t F t um den zeitlichen Mittelwert F r herangezogen werden um daraus die normierte Autokorre lationsfunktion G t SF t 6F t t F t f r alle Verz gerungszeiten t zu be rechnen Aus dem Verlauf von G t kann die mittlere Diffusionszeit der beobachteten fluoreszierenden Teilchen bestimmt werden Bei der konfokalen FCS auf der die SIFT Methode basiert wird der anregende Laserstrahl auf ein kleines Volumenelement 1 fl innerhalb der Probe fokussiert und nur die in diesem Volumen erzeugte Fluoreszenz wird gemessen Auf diese Weise k nnen einzelne durch Fluoreszenzfarbstoffe markierte Partikel detektiert werden wenn diese sich durch den Laserfokus bewegen 102 F r die SIFT Analyse die auf diesem Prinzip basiert werden die oben skizzierten zeitlichen Korrelationen
89. LY en aaa aaa mE AnA EE EE TY ER AJA on 44H 225 H Jee 0 50 fi PC 1 PC2 PC3 PC 4 PC5 gray value contrast coarser mer extracted Features Abbildung C 2 Klassen und Merkmalsvektoren Gezeigt sind Bildschirmschnappsch sse von SIFT Viewer II welche f r die exemplarische Messplatte die Ergebnisse der Klassifikati on auf einer Aul sungsstufe o mit zwei Klassen K und K darstellen A In der Plattenrepr sentation sind die Kn pfe gem der Zuordnung der T pfchen zu den beiden Klassen K rot und X gr n Trefferklasse eingef rbt B Die gem C 4 gebildeten Merkmalsvektoren sind nach der selben Farbkodierung gef rbt Die Kn pfe coarser und finer in A erm glichen das Umschalten auf die n chstgr bere bzw n chstfeinere Aul sungsstufe o L2 a45 67 8 9101112 2 a An 64 835921011112 A 7 A 7 ol LV re LL CHENEEEEEEEE 6 lt S DHEHEHEEEHEEEE 6 Oe EMEHHEEEEHEEEE EE LLL eo F LLL a7 LLL ro LL HEC A Ae B Abbildung C 3 Wirksamkeitsma e im Vergleich Die Kn pfe der gezeigten Plattenrepr sentationen sind in A gem dem Bayesschen Wirksamkeitsma C 13 und zum Vergleich in B gem dem kontrollenbezogenen Ma 3 9 eingef rbt Abbildung C 3 zeigt zwei von SIFT Viewer II generierte Repr sentationen in welchen die Kn pfe nach den Wirksamkeiten eingef rbt sind die in A gem dem Bayesschen Ma C 13 und in B gem dem kontrollenbezogenen Ma 3 9 berech
90. MILES Format umgewandelt Bef llung der TSE DB Die Bef llung der Tabellen der TSE DB wurde teilweise von Hand und teilweise au tomatisiert vorgenommen Im Fall der kleineren Tabellen LIBRARY PLATE_TYPE und WELL_TYPE wurden die Daten h ndisch mithilfe des Werkzeugs Datenbank Pilot der kommerziellen Entwicklungsumgebung JBuilder von der Firma Borland 134 in die TSE DB eingetragen Zur Bef llung der restlichen Tabellen mit den gro en Mengen an Sub stanz SIFT Mess und Wirksamkeitsdaten wurden all diese Daten mithilfe von dazu von mir entwickelten Shell Skripten zun chst auf Textdateien verteilt deren Format durch die in Abschnitt 3 5 1 beschriebenen Tabellendefinitionen vorgegeben ist Nach den vorgege benen Definitionen wurde zu jeder Tabelle eine Textdatei generiert deren Spalten durch die Felder der gegebenen Tabelle festgelegt sind In der ersten Zeile einer solchen Textda tei stehen dabei die Namen der Felder und in den weiteren Zeilen die zu importierenden Datens tze wobei die Eintr ge jeweils durch Tabulatorzeichen getrennt werden Die in dieser Form erzeugten Textdateien wurden schlie lich mithilfe von Standarddatenbank funktionen in die TSE DB importiert Bei der sogenannten Urladung dem erstmaligen Bef llen der TSE DB wurden die Daten zu den Substanzbibliotheken und die bis zum damaligen Zeitpunkt vorliegenden Mess ergebnisse und Wirksamkeiten in die TSE DB bertragen Sp tere Aktualisierungen der Daten
91. Medikaments notwen dig sein kann in jahrelangen Forschungsbem hungen viele verschiedenartige Experimen te einzusetzen ohne dass dabei gew hrleistet ist dass am Ende ein taugliches Medikament zur Verf gung steht Das entscheidende Problem das am Beispiel der Entwicklung von QA auch deutlich wird ist dass man sich mit QA initial auf eine oder wenige Verbindun gen einer strukturellen Klasse festgelegt hatte und erst nachtr glich zus tzliche analoge Wirkstoffsubstanzen gesucht hat 15 1 Einleitung 1 8 Neue Strategien Einen alternativen Ansatz mit dem blicherweise in der industriellen Pharmaforschung die Entwicklung von neuen Wirkstoffen gegen eine Krankheit begonnen wird bietet die systematische Suche nach neuen Wirkstoffen aus riesigen Sammlungen von Wirkstoffkan didaten nach dem Prinzip des Hochdurchsatz Screenings HTS Die dabei identifizier ten Leitmolek le k nnen dann hinsichtlich ihrer therapeutischen Wirksamkeit und ihrer pharmakologischen Eigenschaften optimiert werden Infolge der Gr en der durchsuch ten Substanzsammlungen werden blicherweise eine Reihe von Leitmolek len gefunden welche dann parallel weiterverfolgt werden Auf diese Weise soll verhindert werden dass man sich in einer fr hen Entwicklungsphase auf nur eine oder wenige Substanzklassen festlegt die sich sp ter als untauglich herausstellen k nnten Als Voraussetzung f r die Durchf hrung einer derartigen HTS Kampagne m ssen zum einen die
92. Molek l sehr wenige der vielf ltigen vorgegebenen Fragmente besitzt sind Fingerabdr cke vergleichs weise dicht besetzt ohne dabei Spezifit t einzub en 156 Daher stellen Fingerabdr cke Repr sentationen der zugrunde liegenden Substanzstrukturen dar welche f r die Messung struktureller hnlichkeiten zwischen Substanzen und daher f r das strukturelle Clustering geeignet sind 4 2 2 Strukturelles Clustering Der von DataMiner eingesetzte Algorithmus OptiSim 153 bildet Cluster anhand von strukturellen hnlichkeiten zwischen den Substanzen wobei strukturell hnliche Substan 90 4 2 Strukturelle Clusteranalysen zur Suche nach neuen Leitstrukturen zen gemeinsamen Clustern und strukturell un hnliche Substanzen unterschiedlichen Clus tern zugeordnet werden Um die hnlichkeit zwischen zwei Substanzen m und n die durch die Fingerabdr cke bm bzw b repr sentiert sind zu quantifizieren wird als Ma der Tanimoto Koeffizient 157 D X bmibni Ti 4 9 D gt mi bni B bmibni i 1 verwendet Dabei werden die beiden Bit Strings bm und b verglichen indem einzelne Bits gez hlt werden die auf den Wert 1 gesetzt sind Im Z hler von 4 9 steht die Anzahl derjenigen Bit Paare bmibni aus den beiden Bit Strings deren Bits bmi und bni gemein sam auf 1 gesetzt sind ber den Ausdruck im Nenner hingegen wird die Anzahl solcher Bit Paare bestimmt in welchen das eine oder das andere Bit oder beide
93. Prion Wirkstoffen eingesetzt werden Dadurch ist es uns gelungen zwei neue Wirkstoffklassen zu identifizieren Die Entdeckung der ersten dieser beiden neuen Wirkstoffklassen ist das Ergebnis eines mehrstufigen Screenings der Substanzbibliothek DIVERSet 1 unter Einsatz des SIFT Assays aus TP1 des Zellkultur Assays aus TP4 und der von mir entwickelten Software werkzeuge zur automatisierten Messdatenauswertung Gemeinsam mit meinen Kollegen aus TP1 und TP4 haben wir die Screening Methode und die gefundene Wirkstoffklasse durch ein Patent gesch tzt 94 und sp ter im Journal of Virology ver ffentlicht Bertsch et al 91 sowie auf Fachkonferenzen pr sentiert 92 93 Im folgenden Abschnitt wer de ich von der Entdeckung und Weiterentwicklung dieser ersten neuen Wirkstoffklasse berichten Die zweite neue Wirkstoffklasse ist ein Resultat des Screenings der DIVERSet Biblio theken 1 und 2 im SIFT Assay und im Zellkultur Assay von TP3 und wurde von mir bei Leitstruktursuchen in den Daten der beiden Screening Kampagnen entdeckt ber die Entdeckung dieser zweiten Wirkstoffklasse deren Name aus patentrechtlichen Gr nden nicht genannt werden kann werde ich weiter unten in Abschnitt 5 2 in anonymisierter Form berichten 5 1 Entdeckung und Entwicklung einer ersten neuen Wirkstoffklasse Die folgende Darstellung der Entdeckung der ersten neuen Wirkstoffklasse der sogenann ten NBB Klasse NBB N Benzyliden Benzohydrazid orientiert sich an der
94. R die r umliche Struktur von rekombinant hergestelltem PrP aufzukl ren 43 soweit dieses Protein berhaupt eine geordnete Struktur annimmt Danach besitzt PrP wie in Abbildung 1 5 schematisch dar gestellt ist einen flexiblen ungeordneten N terminalen Abschnitt und einen globul ren strukturierten C terminalen Teil die jeweils ungef hr eine H lfte des Proteins ausmachen 1 Einleitung Man vermutet dass die N terminale H lfte durch Binden von Kupfer Ionen 41 teilwei se Struktur annehmen kann 42 Aus experimentellen Gr nden waren jedoch an das mit NMR untersuchte PrP Material durch Wahl eines niedrigen pH Wertes keine Cu Ionen gebunden Bei diesen Bedingungen kann Kupfer nicht binden weil die Cu bindenden Histidin Residuen im N terminalen Teil von PrP protoniert sind Abbildung 1 6 NMR Struktur von PrP NMR Struktur des strukturierten C terminalen Abschnitts Residuen 125 bis 228 von rekombinant hergestelltem menschlichen PrP 44 in einer vereinfachten Darstellung Die Struktur umfasst drei w Helizes als rote und gelbe Schlan gen symbolisiert und ein anti paralleles 6 Faltblatt hellblaue Pfeile Eine Disulfidbr cke nicht dargestellt verbindet Helix 2 und Helix 3 vgl Abbildung 1 5 Die Struktur der C terminalen globul ren H lfte von menschlichem PrP ist in Abbil dung 1 6 dargestellt und durch drei Helizes sowie ein kurzes anti paralleles 6 Faltblatt ausgezeichnet 44 Aus zahlreichen weite
95. Tools und Auswerteverfahren In mehrfacher Hinsicht sind die Darstellungen der 2D SIFT Spektren in den Abbildun gen 2 6 und 2 7 Vorgriffe auf die von mir geleistete automatisierte Prozessierung der SIFT Daten Zum einen basieren die dargestellten Spektren wie oben erw hnt jeweils auf mehreren Einzelmessungen deren Ergebnisse von der automatisierten Prozessierung zusammengefasst wurden Zum anderen ist das automatische Einf rben der Spektren ge m dem Layout der Messplatte ein weiteres Resultat der Prozessierung Die zugrunde liegende Zuordnung der SIFT Spektren zu den gemessenen Testsubstanzen und Kontrol len ist ein wesentlicher Bestandteil der von mir entwickelten Software 2 2 4 Verschiedene Einsatzformen des SIFT Assays Das durch die automatisierte Auswertung erm glichte prim re Screening der DIVERSet Bibliotheken im SIFT Assay stellte den Ausgangspunkt f r die Entwicklung von anti Pri on Medikamenten im Verbund dar Die im prim ren Screening als wirksam gefundenen Substanzen mussten anschlie end ebenfalls im SIFT Assay in Verd nnungsreihen genau er charakterisiert werden Solche Verd nnungsreihenmessungen liefern sogenannte EC50 Werte die angeben bei welcher Konzentration eine gegebene Substanz 50 ihrer ma 29 2 Der Forschungsverbund TSE Therapie ximalen Wirksamkeit erreicht F r Medikamente werden blicherweise EC50 Werte im nanomolaren Bereich gefordert SIFT Messung der Aggregation von Synuklein
96. Transformationsmatrix T k nnen die D dimensionalen Spektren x in w einen Unterraum der reduzierten Dimension D lt D projiziert werden Dazu wird die Teilmatrix Minn Im meil D netl D m der Transformationsmatrix T definiert mit welcher die Vektoren x durch in dimensionsreduzierte Vektoren multipliziert und da xl M x R C 3 berf hrt werden Diese Transformation dient der Rauschunterdr ckung Konstruktion von Merkmalsvektoren Um die Varianz der Merkmale C 1 und C 2 auf eine hnliche Gr e zu bringen wie jene der Komponenten von C 3 wird der Mittelwert 1 D DIE Ai der D gr ten 135 C Eine Methode zur vorurteilsfreien Klassifikation von SIFT Daten Eigenwerte der Kovarianzmatrix K sowie die Varianzen vary gy und vary cy der Grauwerte gw bzw der Kontraste c herangezogen um geeignete Faktoren Kg y Nat 8w und Ke A Varw Cw zu definieren mit welchen die Grauwerte g und Kontraste c gem Ziy Kg 8w bzw 6 See skaliert werden Schlie lich werden die dimensionsreduzierten Vektoren x R mit den skalierten Grauwerten g und Kontrasten c zu Merkmalsvektoren Ku xwb Udy 8w Cw ER mit Dm Dr 2 C 4 w in dem Merkmalsraum R der Dimension Dm D 2 kombiniert Die Merkmalsvek toren X aller Ny validen T pfchen w der gegebenen Platte werden in dem Merkmalsda tensatz X ulw 1 Ny C RP C 5 zusamm
97. _CELL_CULTURE_TP_3 sowie CONVERSION_TP_3 f r die im Zellkultur bzw im Konversions Assay in TP3 Abschnitt 2 4 ermittelten Wirksamkeiten angelegt Die Wirksamkeitsma e f r die Kodierungen der Messergebnisse aus den letztgenannten Mo dellsystemen werden im folgenden Abschnitt 3 5 2 beschrieben Es sei am Rande erw hnt dass die ebenfalls wei hinterlegte Tabelle BAYES_TP_2 f r Ergebnisse von versuchsweise von mir durchgef hrten Bayesschen Klassifikationen der SIFT Screening Daten genutzt wurde vgl die hnlichen Methoden in Anhang C Ferner sei angemerkt dass die grau hinterlegte Tabelle CELL_CULTURE_PLATE die f r rohe Messdaten des in TP3 durchgef hrten Zellkultur Screening der DIVERSet Bibliotheken vorgesehen ist bislang ungenutzt blieb weil entgegen unserer damaligen Erwartung von unseren Projektpartnern keine derartigen Daten produziert wurden Stattdessen wurden wie oben beschrieben ist lediglich die Resultate der Experimente aus TP3 aufgenommen Installation der TSE DB Um die gem dem oben dargestellten ER Modell f r die TSE DB beschriebenen Ta bellen und deren Beziehungen auf den Datenbankserver am LRZ zu bertragen wurde wiederum das Werkzeug Data Modeler eingesetzt Mithilfe dieses Tools wurde aus dem ER Modell Code der Sprache DDL Data Definition Language generiert der zur Erzeu gung der Tabellen auf dem Datenbankserver eingesetzt wurde Die Sprache DDL ist eine 58 3 5 Die Screening Datenbank TSE DB T
98. alt wurde hier nur angedeutet Diese Aspekte sollen im folgenden Abschnitt detaillierter betrachtet werden 1 6 Der Lebenszyklus und die Funktion von PrP Abbildung 1 9 zeigt schematisch Abschnitte aus dem Lebenszyklus von PrP Nach der Synthese wird PrP im endoplasmatischen Retikulum ER und im Golgi Apparat post translational prozessiert und erh lt dabei bis zu zwei komplexe Zucker Seitenketten und den GPI Membrananker Anschlie end wird das reife PrP sekretiert und ber den GPI Anker in Cholesterol reiche Gebiete der Zellmembran eingeh ngt Schritte 1 und 2 in Abbildung 1 9 Dort k nnte PrP seine m gliche Funktion als Kupfer bindendes Protein erf llen 3 Von der Zellmembran wird PrP in Vesikel verpackt und wieder in die Zelle 12 1 6 Der Lebenszyklus und die Funktion von PrP Abbildung 1 8 Fibrillen aus helikalen PrP Molek len Im Hintergrund ist eine EM Karte von PrP 27 30 Kristallen abgebildet auf die ein Trimer aus helikalen Modellen f r PrP nach 63 64 berlagert wurde im Vordergrund links Nach diesem Modell bilden meh rere solche Trimere kurze Fibrillen Abschnitte rechts 8 Str nge sind als gelbe flache Pfeile und a Helizes sind als rote Zylinder dargestellt Ubernommen von 66 zur ckgeholt kann von dort aus abermals an die Zellmembran gebracht werden oder zu Lysosomen in denen es von hydrolysierenden Enzymen zerlegt wird 4 Die zellul re Funktion von PrP ist obschon sie in
99. altung der Ergebnisse aus allen Teilprojekten wurde sp ter zus tzlich ein kommerzielles Softwarepaket eingesetzt wel ches ich weiter unten in Abschnitt 3 7 vorstellen werde 3 6 Das Analysewerkzeug SIFT Viewer Il Mit SIFT Viewer II wurden die F higkeiten des in Abschnitt 3 4 beschriebenen Werk zeugs SIFT Viewer I unter Verwendung der Sprache Java in eine saubere Form gegossen und um einige zus tzliche F higkeiten erweitert SIFT Viewer II ist wie der TSE DB Browser ein Bestandteil der Java Bibliothek tsedb Anhang B und basiert wie oben angesprochen wurde auf darin zur Verf gung gestellten Komponenten Zwar existieren kommerzielle Werkzeuge zur Visualisierung und Analyse von Screening Daten wie beispielsweise diejenigen der Firma Spotfire 135 die m glicherweise f r die Darstellung und Auswertung der SIFT Daten h tten eingesetzt werden k nnen Jedoch h tte die Integration der komplizierten SIFT Daten voraussichtlich einen gro en Aufwand bedeutet Ich bevorzugte die Implementierung von SIFT Viewer II weil es dadurch m g lich wurde einige spezielle Funktionalit ten umzusetzen Im Folgenden sollen die wich tigsten F higkeiten von SIFT Viewer II beschrieben werden wobei die Erweiterungen gegen ber der Vorg ngerversion I im Zentrum der Aufmerksamkeit stehen werden 3 6 1 Die F higkeiten von SIFT Viewer Il Einlesen von SIFT Dateien W hrend beim Vorg ngermodell Ergebnisse von SIFT Messungen die in Form von SIFT Datei
100. annt sind siehe z B die Stoffklasse aus Abbildung 4 2 Andere Klassen wurden jedoch bisher noch nicht be schrieben Ihre eingehende Analyse stellt eine Aufgabe f r eventuelle Nachfolgeprojekte dar Daher repr sentieren die gesammelten Screening Daten eine wertvolle Wissensba sis und daraus identifizierte Leitstrukturen bieten zahlreiche neue Ansatzpunkte f r die Entwicklung anti aggregatorischer Medikamente Aus den genannten Gr nden ist es w nschenswert dass ein Nachfolgeprojekt ins Leben gerufen wird das die Ziele des nun bald auslaufenden Projekts weiterverfolgt und auf die Entwicklung von Medikamenten gegen weitere neurodegenerative Krankheiten erweitert 126 A Publikationen und Patente A 1 Publikationen Uwe Bertsch Konstanze F Winklhofer Thomas Hirschberger Jan Biesch ke Petra Weber F Ulrich Hartl Paul Tavan J rg Tatzelt Hans A Kretz schmar and Armin Giese Systematic Identification of Antiprion Drugs by High Throughput Screening Based on Scanning for Intensely Fluorescent Targets J Virol 79 7785 7791 2005 Hans A Kretzschmar Uwe Bertsch Konstanze F Winklhofer Thomas Hirsch berger Jan Bieschke Petra Weber F Ulrich Hartl Paul Tavan J rg Tatzelt and Armin Giese Single Molecule Analysis of Protein Aggregation and Pri ons by SIFT J Neuropathol Exp Neurol 64 441 2005 Uwe Bertsch Konstanze F Winklhofer Thomas Hirschberger Jan Bieschke Petra Weber F Ulrich Hartl Paul T
101. appschuss der Visualisierung mit hMoSS Die von hMoSS gebildete Hierarchie aus Strukturklassen von NBB Verbindungen der DIVERSet 1 Bibliothek ist im lin ken Bereich als Baumstruktur dargestellt deren Knoten Strukturklassen repr sentieren Durch Mausklicks auf die Knoten k nnen einzelne Klassen f r die Darstellung im rechten Bereich ausgew hlt werden Dort ist f r die ausgew hlte Klasse s486 oben links die Kernstruktur ge zeigt und darunter sind die in der Klasse enthaltenen Substanzen aufgelistet wobei Substanz namen SIFT Wirksamkeiten und die klassenlokal gemittelte Wirksamkeit angegeben sind Durch Klicken des Namens 10305_E04 wird rechts die Struktur dieser Substanz gezeigt Darstellung ausw hlen Wie bei xminer sh wird die ausgew hlte Klasse im mittleren Bereich angezeigt wobei wiederum oben das Kernmotiv und darunter in tabellarischer Form die darin enthaltenen Substanzen deren Wirksamkeiten und die klassenlokal ge mittelte Wirksamkeit angegeben sind Durch Mausklicks auf Substanznamen k nnen die Strukturen der Substanzen im rechten Bereich dargestellt werden Dieses Visualisierungswerkzeug wurde von meinen Verbundpartnern und mir dazu einge setzt systematisch SARs f r Subklassen von potenziellen Leitstrukturen zu untersuchen Dadurch konnte verstanden werden welche Substituenten des Kernmotivs der untersuch ten Leitstruktur die Wirksamkeiten der zugeh rigen Substanzen erh hen oder erniedrigen k nnen sodass damit p
102. ative Analysen zu erm glichen wertet die 2D SIFT Analyse Bertsch et al 91 und 105 eine gegebene 2D FID Verteilung weiter aus indem sie die hochintensiven rot gr n Ereignisse innerhalb der in den Diagrammen eingezeichneten Winkel Sektoren z hlt wobei Bereiche geringer Intensit t d h Ereignisse in der N he des Ursprungs nicht mitgez hlt werden Es wird also ein kleine Partikel Cutoff verwendet Durch das sek torenweise Z hlen intensiver Fluoreszenzereignisse entsteht ein Histogramm das wir 2D SIFT Spektrum nennen 0O000000900009 000000000009 000000000009 Negativ Kontrollen SIFT signal bins Positiv Kontrollen ohne PrPS 123 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Testsubstanzen Sector _ leere T pfchen rPrP L42 Abbildung 2 6 2D SIFT Spektren fiir eine DIVERSet Platte Die fiir eine DIVERSet Plat te aufgenommenen 2D SIFT Spektren sind gem dem Layout der Messplatte farblich ko diert Auf der Messplatte wurden in 80 T pfchen Mischungen des Prion Aggregations Assays gemessen in denen sich jeweils unterschiedliche Substanzen einer DIVERSet Platte befanden Die Symbole f r diese T pfchen sowie die zugeh rigen Spektren sind grau gef rbt Ferner wur den zur Kontrolle in jeweils drei T pfchen Mischungen ohne Testsubstanz gr n bzw mit der Kontrollsubstanz DOSPA rot gemessen Zwei weitere T pfchen cyan enthielten Mischun gen von Antik rpern und monomerem PrP und dienten dazu da
103. avan Jorg Tatzelt Hans A Kretzschmar and Armin Giese Single Molecule Analysis of Protein Aggregation and Pri ons by SIFT FEBS J 272 338 339 Suppl 1 2005 Verena Schultheis Thomas Hirschberger Heiko Carstens and Paul Tavan Extracting Markov Models of Peptide Conformational Dynamics from Simu lation Data J Chem Theory Comput 1 515 526 2005 Thomas Hirschberger Martina Stork Bernhard Schropp Konstanze F Winkl hofer J rg Tatzelt and Paul Tavan Structural Instability of the Prion Prote in upon M205S R Mutations Revealed by Molecular Dynamics Simulations Biophys J 90 3908 3918 2006 Niclas W Schiffer Sarah A Broadley Thomas Hirschberger Paul Tavan Hans A Kretzschmar Armin Giese Christian Haass F Ulrich Hartl and Bet tina Schmid dentification of Anti prion Compounds as Efficient Inhibitors of Polyglutamine Protein Aggregation in a Zebrafish Model J Biol Chem 282 9195 9203 2007 Thomas Hirschberger Rudolf Reichold Heiko Carstens Martina Stork and Paul Tavan Se f organization of hierarchical classification Combining densi ty estimation by normal mixtures with scale space filtering in preparation 127 A Publikationen und Patente A 2 Patente Als wir die Klasse der NBB Substanzen als neue anti Prion Wirkstoffe identifiziert und durch statistische SAR Untersuchungen ihre Wirksamkeit untermauert hatten vgl Ab schnitte 5 1 1 und 5 1 2 reichten wir
104. azide und Aldehyde zugeordnet Abbildung 5 12 zeigt dazu exemplarisch f r die Messplatte aus Abbildung 5 11 die T pfchenrepr sentationen des Quadranten A auf welcher die gedr ckten Kn pfe die zugeh rigen T pfchen von Substanzen hervorheben die bei mehreren Konzentrationen wirksam waren Denjenigen Zeilen und Spalten die berwiegend als wirksam identifizierte Substanzen enthalten sind die Strukturen der zugrunde liegenden Hydrazide H2 H3 H4 und Hs sowie der Aldehyde A12 A13 A16 und Az zugeordnet Dabei erscheinen solche Substanzen die aus diesen Hydraziden und Aldehyden kombiniert sind als besonders vielversprechend Dazu z hlt beispielsweise die Substanz aus T pfchen C2 die aus dem Hydrazid H2 und dem Aldehyd A12 zusammengesetzt ist In der gleichen Weise wurden die SIFT Messungen der brigen NBB Platten ausgewertet und die Ergebnisse mit den Strukturen der Synthesebausteine zusammengestellt Daten nicht gezeigt Dabei wurden die Wirksamkeiten von NBB Derivaten der Hydrazide H bis H5 durch die Resultate f r die Platten I und III best tigt auf welchen weitere Derivate 107 5 Ergebnisse und Diskussion Aya Ay NH2 Aig Cl A gt OMe Abbildung 5 12 SAR Analyse f r die NBB Derivate von Platte II Die T pfchenrepr sen tationen von Quadrant A f r die NBB Platte II zusammen mit den Strukturen der Hydrazide H gt H3 H4 und Hs sowie der Aldehyde A12 A13 A16 und Ap HO Abbildung 5 13 Mit Wirksamkeit assoziierte
105. azu motivieren ihn genau durchzuarbeiten Die detail getreue Darstellung dient jedoch dem Zweck einem potenziellen Nachfolger in einem hoffentlich bald initiierten Folgeprojekt den Einstieg zu erleichtern und die Verwendung der von mir erarbeiteten L sungen ohne gro en Aufwand zu erm glichen Im Rahmen des noch bis Ende 2007 laufenden Projekts konnte der Einsatz dieser Werk zeuge schon bisher wichtige Beitr ge dazu leisten dass wir dem angestrebten Ziel der Entwicklung von Medikamenten einen entscheidenden Schritt n her gekommen sind Es ist uns gelungen zwei neue Klassen von Wirkstoffen gegen Prionkrankheiten anhand der eingesetzten in vitro und Zellkulturmodelle zu identifizieren weiter zu entwickeln und in zus tzlichen Tiermodellen ihre Tauglichkeit als potenzielle Medikamente aufzuzeigen vgl Abschnitte 5 1 und 5 2 Damit ist die angestrebte Entwicklung einer kausalen Therapie gegen Prionkrankheiten aber noch keineswegs abgeschlossen Vielmehr m ssen weitergehende Fragen der Sta bilit t im Metabolismus der Hirng ngigkeit der Toxizit t zu Nebenwirkungen etc erst noch untersucht und die Wirkstoffe entsprechend optimiert werden Falls diese Fragen an hand von Tierversuchen befriedigend beantwortet werden k nnen so st nde im Falle der Creutzfeldt Jakob Krankheit der klinische Einsatz unmittelbar auf der Tagesordnung weil bei derart seltenen rasch t dlich verlaufenden Krankheiten umfangreiche klinische Studi en nicht zwin
106. bank wurden teils mit den eben genannten Mitteln vollzogen teils mit Werkzeugen der in Anhang B beschriebenen Java Bibliothek tsedb Diese Java Bibliothek enth lt eine Vielzahl von Komponenten zur Auswertung und grafischen Darstellung der in der TSE DB gespeicherten Daten Insbesondere enth lt sie mit dem im folgenden Abschnitt beschriebenen TSE DB Browser ein Werkzeug das unseren Verbundpartnern ber eine grafische Oberfl che den Zugriff auf alle in der TSE DB abgelegten Daten erm glicht 3 5 3 Zugriff mit TSE DB Browser Um einen Einblick in die F higkeiten des TSE DB Browsers zu geben sind in Abbil dung 3 6 zwei Bildschirmschnappsch sse dieses Datenbankclients gezeigt Wie aus den beiden Schnappsch ssen zu erkennen ist bietet die Oberfl che des TSE DB Browsers im linken Bereich Baumstrukturen zur Auswahl von Substanzmengen und im rechten Be reich Tabellen in welchen die in den ausgew hlten Mengen enthaltenen Substanzen auf gelistet sind Diese Tabellendarstellungen zeigen die Substanznamen die Wirksamkeiten in den verschiedenen experimentellen Tests und die Molek lstrukturen der ausgew hlten Substanzen ber die beiden Karteikartenreiter im linken unteren Teil kann der Benutzer zwischen zwei verschiedenen Baumstrukturen zur Auswahl von Substanzmengen w hlen 60 3 5 Die Screening Datenbank TSE DB lalx Fie Help
107. bleme zu erl utern die durch das bei den Messungen eingesetzte Plattenlayout verursacht wurden Das oben beschriebene quadrantenweise Bef llen der Messplatten f hrte dazu dass die Mischun gen der unterschiedlichen Quadranten vor der Messung unterschiedlich lange angesetzt waren Daher war die Wirkdauer der zu testenden Substanzen quadrantenweise unter schiedlich Ferner bildeten sich in unterschiedlichem Ma e beispielsweise Ablagerungen an den W nden der T pfe Dies f hrte bei der Auswertung dazu dass die Wirksamkeiten der Substanzen aus den Quadranten A B und C nicht auf die Kontrollmessungen bezogen 106 5 1 Entdeckung und Entwicklung einer ersten neuen Wirkstoffklasse werden konnten die wie erw hnt nur in Quadrant D mitgef hrt wurden Demzufolge konnte das kontrollenbezogene Wirksamkeitsma 3 9 zur Auswertung der Messdaten nicht eingesetzt werden Um dennoch eine Auswertung zu erm glichen wurde das in Abschnitt 3 2 3 beschriebe ne Median basierte Wirksamkeitsma 3 10 quadrantenweise eingesetzt wobei jeweils quadrantenlokale Mediane der Summenobservablen S gt f r die Testsubstanzen gebildet wurden Die resultierenden Wirksamkeitswerte geben an ob und in welchem Ma e eine gegebene Testsubstanz in einem gegebenen Quadranten st rker oder schw cher anti ag gregatorisch wirkt als die zum Median geh rige n Substanz en In Abbildung 5 11 sind die T pfchenrepr sentationen gem diesem quadrantenlokal gebildeten
108. c ture activity relationships 140 141 abzuleiten Solchen SAR Untersuchungen liegt die Vorstellung zugrunde dass Substanzen die hnliche chemische Grundstrukturen besitzen auch hnliche biologische Wirksamkeiten zeigen Daher zielen SAR Auswertungen von HTS Daten auf die Identifikation sogenannter chemischer Leitstrukturmotive welche Klassen von wirksamen Substanzen charakterisieren Sobald eine Leitstruktur identifiziert ist kann durch systematische Variation von Substituenten versucht werden die biologi sche Wirksamkeit und die pharmakologischen Eigenschaften zu optimieren Der soeben skizzierte Ansatz liegt h ufig den Forschungsanstrengungen zugrunde die heutzutage von Pharmakonzernen unternommen werden um neuartige Medikamente zu entwickeln Entsprechend stellte sich unserem Verbund die Aufgabe die in Pharmakon zernen blichen SAR Analysen von HTS Daten f r unsere Zwecke d h f r die Entwick lung von neuen anti Prion Wirkstoffen nachzubilden Dazu konnte aber nicht auf die in den Pharmakonzernen wie Roche oder Bayer entwickelten und eingesetzten Verfahren zur rechnergest tzten SAR Analyse zur ckgegriffen werden da diese Verfahren gesch tztes Eigentum der jeweiligen Firmen sind Vielmehr mussten wir uns am keineswegs vollst n digen Stand der Literatur und an kommerziell bzw im Netz verf gbaren Programmpake ten orientieren um so eine eigenst ndige L sung zur SAR Auswertung der im Verbund gewonnenen HTS Daten z
109. cataway NJ USA 2002 Maebashi Japan 2002 77 78 H Hofer C Borgelt und M R Berthold Large Scale Mining of Molecular Fragments with Wildcards in Proc 5th Int Symposium on Intelligent Data Analysis IDA2003 Berlin Germany 376 385 Springer Verlag Heidelberg Germany 2003 77 H Hofer C Borgelt und M R Berthold Large Scale Mining of Molecular Fragments with Wildcards Intell Data Anal 8 495 504 2004 77 Literaturverzeichnis 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 C Borgelt T Meinl und M R Berthold MoSS A Program for Molecular Substructure Mining in Workshop Open Software for Data Mining OSDM 05 Chicago IL 6 15 ACM Press New York NY USA 2005 77 C Borgelt M R Berthold und D E Patterson Molecular Fragment Mining for Drug Dis covery in Proc 8th European Conf on Symbolic and Quantitative Approaches to Reasoning and Uncertainty ECSQARU 05 Barcelona Spain 1002 1013 Springer Verlag Heidel berg Germany 2005 77 V Heiser S Engernann W Brocker I Dunkel A Boeddrich S Waelter E Nordhoff R Lurz N Schugardt S Rautenberg et al Identification of benzothiazoles as potential polyglutamine aggregation inhibitors of Huntington s disease by using an automated filter retardation assay Proc Natl Acad Sci USA 99 16400 16406 2002 81 Morten s JavaScript Tree Menu http
110. ch die TSE DB in vier Gruppen von Tabellen deren Inhalte substanzbezogene Daten gelb SIFT Daten t rkis Zellkulturdaten grau oder Wirksamkeitsdaten wei sind In den K sten sind jeweils der Tabellenname und die Namen der Felder oder Attribute angege ben wobei die sogenannten Schl sselattribute zudem farblich hervorgehoben und durch die K rzel PK f r Prim rschl ssel bzw FK f r Fremdschl ssel gekennzeichnet sind ber diese ausgezeichneten Attribute k nnen Tabellen miteinander verkn pft werden Betrachten wir zun chst die gelb hinterlegten Tabellen SUBSTANCE LIBRARY_PLATE und LIBRARY die angelegt wurden um die Organisation der realen Testsubstanzen die auf Platten verteilt und in Bibliotheken zusammengefasst sind zu modellieren Zum einen enthalten diese Tabellen Felder die rein zur Haltung von Daten eingerichtet wurden da zu z hlen im Fall der SUBSTANCE Tabelle beispielsweise die Felder C_LOG_P T_PSA etc f r die Haltung der in Abschnitt 3 3 beschriebenen physikochemischen Eigenschaf ten Zum anderen enthalten die Tabellen aber auch Schl sselattribute wie sie oben ange sprochen wurden F r die SUBSTANCE Tabelle wurde das Feld SUBSTANCE_ID ber welches Substanzen eindeutig benannt werden als Prim rschl ssel PK festgelegt Ein Fremdschl ssel FK der SUBSTANCE Tabelle ist das Feld LIBRARY_PLATE_ID wel ches zudem der Prim rschl ssel der Tabelle LIBRARY_PLATE ist Dadurch wird model liert das
111. chen mehrfach gemessen wird wobei dann die Scanning Einheit mehrmals M ander f rmig ber die Messplatte bewegt wird Dadurch soll erreicht werden dass Ver nderungen der Assay Mischung die w hrend der Messung stattfinden k nnen einen weniger ungleichm igen Einfluss auf die Messergebnisse haben Beim Screening der DIVERSet Bi bliotheken wurden zumeist f nf Durchl ufe gew hlt 24 2 2 Der anti Prion 2D SIFT Assay TP1 _ 250 0 225 0 q 200 0 17 50 150 0 125 0 100 0 750 50 0 25 0 ee et T o 0 0 i Li I I iy 1 0 0 50 0 100 0 150 0 200 0 250 0 Abbildung 2 5 Assay Mischungen und 2D FID Verteilungen Die schematischen Darstel lungen der Mischungen ohne A bzw mit zugegebenem Wirkstoff B verwenden die Symbole aus Abbildung 2 3 In B sind Wirkstoffmolek le durch blaue Kugeln symbolisiert Die 2D FID Verteilungen wurden f r Mischungen ohne C bzw mit der Wirkstoffsubstanz DOSPA D aufgenommen zu DOSPA siehe Abschnitt 2 3 In den 2D FIDs ist gr ne Fluoreszenzintensi t t nach rechts und rote Fluoreszenzintensit t nach oben aufgetragen wobei die Einheit jeweils Photonen Bin ist Die H ufigkeiten der Ereignisse mit identischen roten und gr nen Intensit ten sind zus tzlich farblich kodiert wobei die Skala f r zunehmende Ereigniszahlen von gelb f r einzelne Ereignisse ber blau und gr n bis wei reicht bernommen aus 91 sultieren aus der in Abschnitt 2 2 2 beschriebene
112. chroitischen Spiegel nach der Farbe sortiert und von zwei getrennten Einzel Photon Detektoren aufgefangen Die aufgenommenen Intensit tszeitreihen werden von einer zugeh rigen Software analysiert Neben SIFT Daten k nnen mit diesem Ger t auch weitere Messdaten erzeugt werden die auf FCS Analyse Verfahren oder der verbreiteten FIDA Me thode beruhen Grafik bernommen von A Giese und modifiziert in Abschnitt 2 2 1 beschriebenen PrP PrP A ggregations Assays wurde die zweifarbige Variante die 2D SIFT Methode weiterentwickelt und eingesetzt Abbildung 2 4 zeigt schematisch den Aufbau des Messger tes Insight Reader 105 mit dem die zwei Farben 2D SIFT Messungen der anti Prion HTS Kampagne in TP1 durchgef hrt wurden Der Insight Reader prozessiert automatisiert Mikrotiterplatten mit 96 oder 384 einzelnen T pfchen in denen sich jeweils kleine Portionen 20 ul der in Abschnitt 2 2 1 charakterisierten Assay Mischung eventuell kombiniert mit zus tzlichen Substanzen befinden Ein Laser der rotes Licht der Wellenl nge 633 nm ausstrahlt und ein gr ner Laser 488 nm sind gemeinsam auf ein kleines Volumenelement 0 5 fl innerhalb der Probe fokussiert Von den rot und gr n fluoreszierenden Farbstoffen die sich durch dieses kleine Volumenelement bewegen werden rote und gr ne Lichtquanten emittiert deren Wellenl ngen gegen ber denjenigen der Anregungslaser vergr ert also rotverschoben sind Dadurch ist es m glich das emit
113. chuss der Software ChemFinder 12 Systematische Erweiterung von Strukturmotiven 78 Schnappschuss der Visualisierung eines xminer getriebenen MoSS Laufs 81 Bildung einer Hierarchie von Substrukturklassen 83 xi Abbildungsverzeichnis xii 4 4 4 5 4 6 5 1 5 2 5 3 5 4 5 5 5 6 5 7 5 8 5 9 5 10 5 11 5 12 5 13 5 14 5 15 5 16 5 17 5 18 5 19 5 20 5 21 B 1 Cl C2 CS D 1 Schnappschuss der Visualisierung mithMoSS 85 Box and Whisker Plot f r eine Wirksamkeitsverteilung 86 Bildschirmschnappschuss vonhMoSSII 87 Verteilung der prim ren SIFT Wirksamkeiten f r DIVERSet1 97 Dosis Wirkungs Analyse im Zellkulturmodell 2 2 2 2 99 Statistik des Screenings von DIVERSet 1 2 2222 99 Substanzen mit Zellkulturwirksamkeit 2 2 2222 100 NBB Struktur aS Zee a ar ee ate Goat eet es 101 Struktur Wirkungs Beziehungen f r Klassen von NBB Derivaten 102 Substanz 293002 2 2 Oo eS Be Oe CORES EDA RES Oe 103 Synthese von NBB Substanzen 2 2 Emmen 104 Belegungsschema der f nf Platten I bis V mit neu synthetisierten NBB SUHSTANZEN Acta ee Bch a ae ee ene HOR 105 Bef llung einer 384 T pfchen Messplatte 2 22 222 220 105 SIFT Ergebnisse f r eine 384 T pfchen Plattenmessung einer 96 T pf chen Platte mit neuen NBB Substanzen 2 2 22 106 SAR Analyse f r die NBB Derivate von Platte
114. ction to the diagnosis of prion diseases Arch Virol Suppl 16 161 171 2000 22 105 Evotec Technologies GmbH Hamburg Germany http www evotec technologies com 23 26 29 30 76 106 M Goedert Alpha synuclein and neurodegenerative diseases Nat Rev Neurosci 2 492 501 2001 30 107 T S Ulmer A Bax N B Cole und R L Nussbaum Structure and Dynamics of Micelle bound Human alpha Synuclein J Biol Chem 280 9595 9603 2005 30 108 L A Munishkina C Phelan V N Uversky und A L Fink Conformational Behavior and Aggregation of alpha Synuclein in Organic Solvents Modeling the Effects of Membranes Biochemistry 42 2720 2730 2003 30 109 D Butler M Scott J Bockman D Borchelt A Taraboulos K Hsiao D Kingsbury und S Prusiner Scrapie infected murine neuroblastoma cells produce protease resistant prion proteins J Virol 62 1558 1564 1988 31 110 D R Borchelt A Taraboulos und S B Prusiner Evidence for synthesis of scrapie prion proteins in the endocytic pathway J Biol Chem 267 16188 16199 1992 31 111 B Caughey und G J Raymond The scrapie associated form of PrP is made from a cell surface precursor that is both protease and phospholipase sensitive J Biol Chem 266 18217 18223 1991 31 112 K F Winklhofer J Heske U Heller A Reintjes W Muranyi I Moarefi und J Tatzelt Determinants of the in vivo folding of the prion protein A bipartite f
115. de der 1950er Jahre zu den Vermutungen dass diese Krankheiten verwandt sind und dass Kuru und CJD hnlich wie Scrapie bertragbar sind 6 7 Etwa zehn Jahre sp ter wurde die bertrag barkeit der menschlichen TSE Krankheiten Kuru und CJD auf Schimpansen experimentell best tigt 8 9 1 2 Die Prionhypothese Obwohl man lange vorherrschend davon ausging dass die TSE Krankheiten durch lang same Viren bertragen werden wurde bereits Ende der 1960er Jahre aufgrund des ge ringen Molekulargewichts der aus erkrankten Gehirnen extrahierten Scrapie Erreger ge mutma t dass diese aus Proteinen bestehen k nnten 10 11 Erst Anfang der 1980er Jahre gelang es dem amerikanischen Mediziner Stanley Prusiner und seinen Mitarbeitern das Erregermaterial besser aufzureinigen und damit die protein only Hypothese experi mentell zu untermauern 12 14 Amyloide Ablagerungen wie die in Abbildung 1 1 f r CJD gezeigten sind danach die bertr ger der TSE Krankheiten Prusiner nannte diese proteinartigen infekti sen Partikel die kein Erbgut in Form von Nukleins uren enthal ten Prionen 13 F r die Entdeckung dieses neuartigen Prinzips der Infektion wurde er 1997 mit dem Nobelpreis f r Medizin geehrt Prionen bestehen haupts chlich aus fehlgefalteten Exemplaren eines wirtseigenen Prote ins das Prion Protein PrP genannt wurde 13 Die Prionhypothese besagt dass das zen trale Ereignis in der Pathogenese der Prionkrankheite
116. den 45 kommerziell verf gbare Bibliothe ken hinsichtlich der strukturellen Vielfalt und der Leitstrukturartigkeit leadlikeness 100 der enthaltenen Substanzen systematisch untersucht Dabei wurden zum einen die enthaltenen Substanzen nach ihrer Molek lstruktur klassifiziert und die Anzahl sowie die Gr en der resultierenden Klassen als Kriterien f r die strukturelle Vielfalt herangezogen Zum anderen wurde getestet wie viele Verbindungen statistisch abgeleitete Faustregeln wie Lipinskis rule of five erf llen und demnach leitstrukturartig sind Diese Studie best tigt den von ChemBridge angebotenen Sammlungen eine hohe Vielfalt und Leitstruktur artigkeit Abbildung 2 2 Eine 96 Well Mikrotiterplatte Die chemischen Verbindungen der DIVER Set Bibliotheken sind in DMSO gel st und auf 96 Well Mikrotiterplatten verteilt Eine solche Mikrotiterplatte umfasst 96 T pfchen die Wells genannt werden und in 8 Zeilen und 12 Spal ten angeordnet sind blicherweise werden die Zeilen mit den Buchstaben A bis H bezeichnet und die Spalten von 1 bis 12 nummeriert Auf den Platten der DIVERSet Bibliotheken sind die erste und die zw lfte Spalte freigelassen und bieten Platz f r Kontrollmessungen Die Substanzen der DIVERSet Bibliotheken wurden vom Hersteller in dem organischen L sungsmittel Dimethylsulfoxid DMSO gel st und auf 96 Well Mikrotiterplatten ver 20 2 2 Der anti Prion 2D SIFT Assay TP1 teilt geliefert DMSO is
117. der von Oracle speziell f r diesen Servertyp angebotene JDBC Treiber 173 classes12 zip verwendet Das Paket t sedb sql erweitert die allgemeinen Funktionalit ten des Pakets de simon hinsichtlich der speziellen TSE DB bezogenen Datenstrukturen Damit k nnen aus den Ergebnissen von SQL Anfragen an die TSE DB entsprechende Instanzen von Java Klas sen erzeugt werden Dazu sind die meisten der intsedb sql enthaltenen Klassen nach dem sogenannten Factory Entwurfsmuster implementiert siehe Gamma et al 174 f r eine Sammlung von Entwurfsmustern f r objektorientiertes Softwaredesign Durch den Einsatz des Factory Musters wird eine Trennung der Definition und der Erzeugung von Datenstrukturen vollzogen die das Framework flexibel hinsichtlich m glicher zuk nfti ger nderungen der Datenstrukturen macht Die Pakete tsedb io importsundtsedb io imports sift stellen zum einen Methoden f r den Import von Daten in die TSE DB und zum anderen Methoden zum Ein lesen von SIFT Dateien vgl Abschnitt 3 4 1 bereit Das Einlesen von SIFT Layout Dateien vgl Abbildung 3 7 ist in der Klasse PlateLayout destsedb data sift implementiert Im Paket tsedb io export finden sich Exporttools wie beispiels weise ein Werkzeug zum Schreiben von pdf Reports der mit SIFT Viewer II betrachteten Messdaten Die Reportgenerierung setzt dazu die freie Java Bibliothek iText 139 ein Auch einige weitere Teile der Bibliothek wie das Paket tsedb algorit
118. dung 3 2 und aus den Koordinaten des T pfchens der Name der Testsubstanz in dem gem 3 11 vereinbarten Format lt Plattennr gt _ lt T pfchenkoord gt rekonstru iert werden Den T pfchen mit Kontrollmessungen werden dabei Substanznamen der Form lt Plattenr gt _X01 zugeordnet wobei X01 die Zeile X in Spalte 01 bezeichnet Weil beim Screening der DIVERSet Bibliotheksplatten die Kontrollen immer an fest definier ten Zeilenpositionen in der Spalte 01 gemessen wurden kann daraus der Typ der Kontrolle dekodiert werden Es sei angemerkt dass die hier und im Folgenden beschriebene Aus wertung mit SIFT Viewer I nur solche Platten unterst tzt die nach dem in Abbildung 2 6 dargestellten Layout belegt sind welches beim Screening der DIVERSet Bibliotheken verwendet wurde Die mithilfe der Skripten extract_data sh und extract_itot sh extrahierten Daten k nnen in Textdateien abgelegt werden die zeilenweise Substanznamen und zu sammengefasste Messwerte enthalten Ein weiteres Werkzeug filter c dient der plattenweisen Ausrei ererkennung nach den in Abschnitt 3 1 1 definierten Kriterien Plattenweise Prozessierung Da beim Screening der beiden DIVERSet Bibliotheken in TPI nach und nach weitere der jeweils 125 Platten durchgemessen und mir kurz darauf die f r die neu gemessenen Platten erzeugten SIFT Dateien zugeschickt wurden ergab sich f r mich die Aufgabe diese Dateien zu sammeln vgl Abbildung 3 2 und den Bestand der mithilf
119. e 18 Tabellen der TSE DB sind durch Kasten repr sentiert in denen jeweils der Tabellenname die Prim r PK und Fremdschliissel FK sowie die weiteren Felder angegeben sind Zur Gruppierung nach inhaltlichen Zusammenge h rigkeiten sind die Tabellen farblich hinterlegt wobei nach Substanzdaten gelb SIFT Daten t rkis Zellkulturdaten grau und Wirksamkeitsdaten wei unterschieden wird Aus Gr n den der bersichtlichkeit wurden einige Felder der Tabelle SIFT_WELL_TP_1 nicht darge stellt Die Abbildung wurde mithilfe von Toad Data Modeler 129 erstellt Erl uterun gen siehe Text Unter Ber cksichtigung derartiger Modellierungsgesichtspunkte wurden auch die t rkis hinterlegten Tabellen entworfen welche SIFT Messdaten SIFT Messplatten und deren Layout repr sentieren Dabei ist die Tabelle SIFT_WELL_TP_1 f r die Haltung der t pf chenweise gewonnenen SIFT Daten vorgesehen zu denen die 2D SIFT Spektren die Ge samtintensit ten und weitere Messparameter z hlen vgl die Abschnitte 2 2 3 und 3 4 1 Die Tabelle SIFT_PLATE dient der Zuordnung von SIFT Plattenmessungen zu den dabei gemessenen Bibliotheksplatten und ist f r die Haltung der im prim ren Screening vollst n 57 3 Methoden zur Haltung Auswertung und Visualisierung von Daten dig gemessenen Bibliotheksplatten vorgesehen Diese Tabelle korrespondiert zu der von SIFT Viewer I realisierten dateibasierten Zuordnung anhand der in Abbildung 3 2 darge s
120. e H ufigkeiten S S_ ee 4 4 15 B_ der wirksamen bzw der unwirksamen Substanzen bestimmt und gem PS PM und Poa pes 4 5 berpr ft ob der Anteil P einen Minimalwert Ben berschreitet und der Anteil P_ einen Maximalwert P unterschreitet Dabei k nnen die Schranken Pi und P vom Benutzer festgelegt werden Kritik am verwendeten Wirksamkeitsfilter Das Stellen der Bedingung PL gt Bam in 4 5 f hrt dazu dass nur solche Klassen S gebildet werden die eine gewisse Gr e berschreiten und hat daher den Nachteil dass kleine Substanzklassen bersehen werden Dies liegt darin begr ndet dass der Anteil P der wirksamen Substanzen in einer betrachteten kleinen Klasse S gem 4 4 auf die Gesamtzahl 6 der wirksamen Substanzen bezogen wird und nicht auf die Gr e S der Klasse Da aber in vielf ltigen Bibliotheken wie DIVERSet zahlreiche kleine Klassen enthalten sind die dennoch potenzielle Leitstrukturen darstellen k nnen ist das Fordern dieser Bedingung nachteilig 4 1 3 Ein verbesserter Wirksamkeitsfilter Aus diesem Grund habe ich die von MoSS gebotene M glichkeit bei der Bildung der Strukturklassen auch Wirksamkeiten zu ber cksichtigen nicht genutzt was durch die Wahl Rei 0 und P erreicht werden kann Da die Liste 4 3 der Struktur klassen mithin unabh ngig von Wirksamkeiten gebildet wird umfasst sie auch eine Viel zahl unwirksamer Klassen Nun ist es aber
121. e Identifikation einer neuen Leitstruktur 2 2 2 5 2 3 Weiterentwicklung der neu identifizierten Substanzklasse 75 77 77 78 79 80 82 84 88 88 90 92 Inhaltsverzeichnis Ausblick A Publikationen und Patente A l Publikationen 2 mo or Ar2 Patente a Ba hee SE Er EO ae DO a D B Die Java Bibliothek t sedb C Eine Methode zur vorurteilsfreien Klassifikation von SIFT Daten C 1 DasKlassifikationsverfahren 2 0 0 0 nn CLL NVorverarbeilungs ru ar re ee at we aly ts See CE ee C 1 2 Bildung von Klassen 2 wtf Fer eee Ree Beh C 1 3 Konstruktion eines neuen Wirksamkeitsma es C 2 Eine exemplar sche Anwendung 2 25 pas eevee 2a Dre 2 8 D Molekulardynamik Simulationen von PrP Literaturverzeichnis Danksagung 125 127 127 128 129 133 133 134 136 138 138 141 143 157 1X Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 1 22 2 3 2 4 2 5 2 6 2 7 2 8 2 9 2 10 3 1 3 2 3 3 3 4 3 5 3 6 3 7 3 8 3 9 3 10 3 11 3 12 4 1 4 2 4 3 Histopathologie der CJD und Struktur von Prion Ablagerungen 2 Isoformen von PrP im Western Blot 2 2 2 nme 4 Qualitative Diskussion der Energetik der Prion Aggregation 6 Modell zur Vermehrung von infekti sen Prionen 7 Strukturelle Merkmale von PrP 2 22 2 9 NMR Struktur von Pre 20 ae ra 10 Dreieckiges B helikales M
122. e Substituenten der verwendeten Aldehyde und Hydrazide sollten die anti Prion Wirk samkeit erh hen und zugleich die pharmakologischen Eigenschaften der NBB Substanzen verbessern Abbildung 5 9 zeigt schematisch wie die 330 neu synthetisierten NBB Substanzen auf fiinf 96 Topfchen Mikrotiterplatten Platte I bis Platte V angeordnet wurden Wie in der Bildunterschrift beschrieben ist wurden dabei auf den Platten I II und III die sieben Hy drazide H bis H7 und jeweils elf Aldehyde A A 1 A 2 A22 und A23 A33 sowie deren 77 NBB Kombinationen und auf den Platten IV und V die verbliebenen Hydrazide Hg bis H o und die jeweiligen Aldehyde und deren Kombinationen angeordnet Die auf diese Weise bef llten Platten Ibis V wurden zur Vermessung im SIFT Assay ans ZNP geschickt 104 5 1 Entdeckung und Entwicklung einer ersten neuen Wirkstoffklasse Platte Platte II Platte III A1 wee A11 A12 wee A22 A23 sae A33 H1 H1 H1 H7 H7 H7 Platte IV Platte V A1 wee A11 A23 u A33 H8 H8 H10 H10 A12 A22 H8 H10 Abbildung 5 9 Belegungsschema der f nf Platten I bis V mit neu synthetisierten NBB Substanzen Die Hydrazide H bis Hio und die Aldehyde A bis A33 sowie die daraus kombi nierten NBB Derivate wurden auf f nf Mikrotiterplatten I bis V mit je 96 T pfchen verteilt Dabei waren jeweils zeilenweise unterschiedliche Hydrazide und spaltenweise unterschiedli che Aldehyde angeordnet Auf Platte I sind in der ersten S
123. e der oben beschriebenen Werkzeuge extrahierten und bereinigten SIFT Daten zu aktualisieren Zu diesem Zweck wurde ein weiteres Skript prepre sh programmiert welches die in Abbildung 3 2 auszugsweise gezeigte Liste von SIFT Dateien zu den jeweiligen Platten nummern abarbeitet und dabei die jeweils beste SIFT Datei der Datenextraktion und Aus Der ungew hnliche Name prepre sh dieses Skriptes erkl rt sich durch seine Rolle als Vorverarbei tungsschritt pre der in Anhang C beschriebenen Klassifikation welche mit einem weiteren Schritt der Vorverarbeitung pre beginnt 49 3 Methoden zur Haltung Auswertung und Visualisierung von Daten rei ererkennung mit den Skripten extract_data shundextract_itot sh bzw filter c zuf hrt Als Ergebnis dieser Prozessierung liegen die extrahierten nach Aus rei ern gefilterten und mit Substanznamen versehenen 2D SIFT Spektren und Gesamtin tensit ten Jtot r und kot g in Form von f nf Dateien teilweise bin ren Formats vor und stehen somit der weiteren Auswertung zur Verf gung 3 4 2 Grafische Aufbereitung von SIFT Daten Zur automatisierten Erzeugung von Grafikdateien welche die 2D SIFT Spektren die Sum menobservablen Se w und die Wirksamkeiten darstellen wurde von mir ein Software paket f r die Auswertungsumgebung IDL Interactive Data Language 124 entwickelt Die Werkzeuge dieses Pakets sind ebenfalls ber das CVS Modul screening verf g bar Das Paket umfa
124. e von Booleschen Variablen erfasst werden Um jedoch die Beschreibung von etwa als schwach wirksam eingestuften Substanzen zu erm glichen entschloss ich mich dazu die Ergebnisse auf Gleitkommazah len abzubilden wobei 0 0 f r unwirksam und 1 0 f r wirksam steht sodass schwach wirksamen Substanzen dazwischenliegende Werte zugeordnet werden k nnen Es sei an gemerkt das f r die Ergebnisse der Zellkulturexperimente aus TP4 und des Konversions Assays aus TP3 ausschlie lich Werte von 0 0 und 1 0 eingesetzt wurden w hrend bei den Zellkulturergebnissen aus TP3 auch Zwischenwerte verwendet wurden Die Benennung der DIVERSet Substanzen in der TSE DB erfolgte nach der Konventi on 3 11 Zur Beschreibung der Molek lstrukturen wurde das verbreitete SMILES For mat Simplified Molecular Input Line Entry System 131 verwendet welches die kom pakte Darstellung einer Molek lstruktur in Form einer Zeichenkette erlaubt Beispielswei se kann die in Abbildung 3 1 dargestellte Struktur der DIVERSet Substanz 10252_A07 durch den SMILES String O C1C C Br C C CC C2 C201 beschrieben werden Mithilfe des frei verf gbaren Konvertierungswerkzeugs babel 132 und der kommer ziellen Chemie Software ChemFinder der Firma CambridgeSoft 133 wurden die mit 39 3 Methoden zur Haltung Auswertung und Visualisierung von Daten den DIVERSet Bibliotheken mitgelieferten Molek lstrukturen im sdf Format vgl Ab schnitt 3 3 in das S
125. e zu unterziehen Dabei wurde eine weitere neue Wirkstoff klasse entdeckt die derzeit patentiert wird In einem kleinen Nebenprojekt konnte ich durch Molekulardynamik Simulationen von bestimmten Mutanten des Prion Proteins einen Beitrag zur Erforschung der Grundlagen der Prionkrankheiten leisten 6 Die Simulationen erm glichten ein Verst ndnis von Zell kultur Ergebnissen ber die Maturierung des Prion Proteins und gaben Hinweise auf die Funktion des mutierten Residuums f r die korrekte Faltung von PrP 1 U Bertsch A Giese H Kretzschmar P Tavan T Hirschberger J Biesch ke P Weber K F Winklhofer J Tatzelt F U Hartl G W nsch T J H gen PCT EP2005 005614 WO 2005 116640 A2 2 U Bertsch K F Winklhofer T Hirschberger J Bieschke P Weber F U Hartl P Tavan J Tatzelt H A Kretzschmar A Giese J Virol 79 7785 7791 2005 3 H A Kretzschmar U Bertsch K F Winklhofer T Hirschberger J Bieschke P Weber F U Hartl P Tavan J Tatzelt A Giese J Neuropath Exp Neur 64 441 441 2005 4 U Bertsch K F Winklhofer T Hirschberger J Bieschke P Weber F U Hartl P Tavan J Tatzelt H A Kretzschmar A Giese FEBS J 272 338 339 2005 5 N W Schiffer S A Broadley T Hirschberger P Tavan H A Kretzschmar A Giese C Haass F U Hartl B Schmid J Biol Chem 282 9195 9203 2007 6 T Hirschberger M Stork B Schropp K F Winklhofer J Tatzelt P Tavan
126. ef hrt Dabei habe ich als Modell f r eine polyQ Protofibrille eine Struktur verwendet die von meiner Kollegin Martina Stork gemeinsam mit Paul Tavan 27 entwickelt worden war vgl Abschnitt 1 3 Die Struktur ist ein Dimer aus zwei linksh ndigen triangul ren Helizes die jeweils 36 Glutamin Residuen umfassen F nf strukturelle Schnappsch sse des in Wasser gel sten Dimers wurden in einem zeitlichen Abstand von 50 ps aus einer Molekulardynamik Trajektorie entnommen die in der zitierten Arbeit 27 zur Equilibrie rung der modellierten Dimerstruktur mit seiner w ssrigen Umgebung bei Zimmertem peratur und Normaldruck gedient hatte Die Schnappsch sse des polyQ Dimers wurden f r die Docking Simulationen die ich mithilfe des Programmpakets AutoDock 3 0 160 durchf hrte unter Verwendung der zugeh rigen AutoDockTools ADT pr pariert wobei den Atomen der Rezeptorpeptide Partialladungen und bestimmte L sungsmittelparameter zugeordnet wurden Strukturmodelle f r die Ligandmolek le wurden mithilfe des Quan tenchemie Programms MNDO 161 erzeugt und mit Partialladungen versehen Drehbare Bindungen der Liganden wurden durch ADT definiert AutoDock 3 0 modelliert die polyQ Rezeptorpeptide als starr und die Ligandmolek le als flexibel und versucht vermittels eines Lamarckschen Genetischen Algorithmus 160 Stel len an der Oberfl che der polyQ Peptide zu bestimmen an welchen die Ligandmolek le binden k nnen Zur Berechnung der Energ
127. eichtert 3 3 3 Physikochemische Eigenschaften Neben den soeben beschriebenen Eintr gen ber welche die virtuellen Repr sentationen den realen Substanzen zugeordnet werden k nnen enthalten die Substanzbeschreibungen auch eine Reihe von physikochemischen Eigenschaften Dazu z hlen das Lipophilie Ma cLogP calculated LogP 118 die Anzahl der drehbaren Bindungen RB rotatable bonds die sogenannte gesamte polare Oberfl che des Molek ls t PSA total polar sur face area 119 sowie die Anzahlen derjenigen Atome die als Akzeptoren Hacc bzw Donoren Hdon von Wasserstoffbr ckenbindungen fungieren k nnen Die aufgez hl ten Gr en sind aus der Molek lstruktur z hl oder sch tzbar und wurden vom Herstel ler unter Einsatz entsprechender Softwarewerkzeuge wie denjenigen der Firma Daylight 120 generiert Die Gr e tPSA gibt dabei an wie gro derjenige Anteil einer das Mole k l umgebenden Fl che ist welcher die polaren Atome umgibt wobei zumeist Sauerstoff Stickstoff und eventuell weitere Atomarten als polar betrachtet werden Wie in Abschnitt 2 1 hervorgehoben wurde besitzen die DIVERSet Substanzen aufgrund der vom Hersteller getroffenen Auswahl vielversprechende pharmakologische Eigenschaf ten die gem Lipinskis rule of five auf physikochemische Eigenschaften zur ckgef hrt werden k nnen 98 Da die Bedeutung des in Lipinskis Faustregel enthaltenen Lipophilie Ma es c LogP bislang nur a
128. eikarte liegen die Plots der Gesamtin tensit ten und der Wirksamkeiten sowie Darstellungen der Molek lstrukturen vgl Ab bildung 3 10 und einer Substanztabelle verborgen und k nnen durch Anklicken der bri gen Reiter in den Vordergrund gebracht werden Im linken unteren Bereich befinden sich die verschiedenen bereits in Abbildung 3 8 erl uterten Plattenrepr sentationen zwischen denen wiederum ber Reiter gewechselt werden kann Im Schnappschuss ist jene Platten repr sentation im Vordergrund deren Kn pfe nach Wirksamkeiten eingef rbt sind Durch Dr cken der Kn pfe k nnen die zugeh rigen T pfchen ausgew hlt werden Die Kn p fe der positiven und negativen Kontrollt pfchen Al C1 und El bzw Bl D1 und Fl werden von SIFT Viewer II beim ffnen der Platte bereits voreingestellt gedr ckt Weil der Mauszeiger ber dem vom Benutzer gedr ckten T pfchenknopf C03 steht wird der zugeh rige Tooltip mit den t pfchenspezifischen Informationen angezeigt 69 3 Methoden zur Haltung Auswertung und Visualisierung von Daten Je Fe File view Help B loelela SIFT plates 20060518_Verd_2_tog ntp 20030507_10264 2 ntp 2 from files 20060518_Verd_2_tog ntp 900 2 from database 2 DIVERSet1 2 10251 1 zon D 10252 1 f 29 10253 1 600 10254 1 2 10255 1 SR m 10256 1 yy 10257 1 A 29 10258 2 on A rin 10259 3 I Y e 2 10260 1 200 Ta a ee 3 Z 1026
129. eil der Kontrollwirkstoff DOSPA dies verhindern konnte Die meisten der grau dargestellten Spektren f r Mischungen mit Testsubstanzen weisen hnliche Formen auf wie diejenigen der gr nen Negativ Kontrollen ohne Sub stanz Die zugeh rigen Testsubstanzen konnten die Aggregation nicht oder nur schwach hemmen oder haben die Aggregation sogar leicht gef rdert Jedoch findet sich eine getes tete Substanz deren Spektrum deutlich reduzierte Werte in den Sektoren 1 5 zeigt Diese Substanz hemmt also die Prion Aggregation in unserem in vitro System und kann damit als potenzieller anti Prion Wirkstoff identifiziert werden Neben den Spektren werden bei einer 2D SIFT Messung als zus tzliche Observablen die w hrend der gesamten Messzeit aufgenommenen roten und gr nen Fluoreszenzintensit ten Jtot r bzw Ikor g ausgegeben diese Gr en werden in kHz gemessen Im Gegensatz zu den Spektren enthalten diese beiden Gr en auch die h ufigen Fluoreszenzereignisse niedriger Intensit ten und k nnen Hinweise auf von Testsubstanzen verursachte Fluores zenzartefakte geben Testsubstanzen die Autofluoreszenz zeigen oder Testsubstanzen die sogenanntes Quenching d h eine Reduktion der Fluoreszenzeffizienz der markierenden Farbstoffe zeigen zeichnen sich durch Werte der Gr en Jot oder Ikor g aus die stark von denjenigen der Negativ Kontrollmessungen oder der unkritischen Testsubstanzen ab weichen Weil die Spektren solcher Testsubstanzen aufgrund der Ar
130. eilmenge von SQL Structured Query Language und f r diesen Zweck bestimmt Auf diese Weise wurde eine leere Datenbankstruktur erzeugt die noch bef llt werden musste 3 5 2 Datenformate und Bef llung der TSE DB Bevor beschrieben wird wie die leere TSE DB mit Substanz Mess und Wirksamkeits daten bef llt wurde sollen zun chst einige Informationen zu den dabei verwendeten Da tenformaten gegeben werden Wirksamkeitsma e und weitere Formate Insbesondere muss noch das Format f r die Wirksamkeitsdaten festgelegt werden die in den daf r vorgesehenen in Abbildung 3 5 wei hinterlegten Tabellen abgelegt wer den sollen Wie im letzten Abschnitt bereits angesprochen wurde k nnen die SIFT Wirk samkeiten f r deren Haltung Tabelle SIFT_PRIMARY_TP_1 vorgesehen ist mit den in Abschnitt 3 2 definierten Ma en aus den SIFT Messdaten berechnet werden F r den Fall des prim ren Screenings der DIVERSet Bibliotheken geschah dies unter Verwen dung des kontrollenbezogenen Wirksamkeitsma es gem Gleichung 3 9 mithilfe von SIFT Viewer II W hrend SIFT Wirksamkeiten berechnet werden m ssen liegen die Ergebnisse der Ex perimente mit den brigen Modellsystemen Zellkultur Assays TP3 und TP4 und Kon versions Assay TP3 bereits von den Experimentatoren ausgewertet in einfach zu hand habender Form vor Dabei wird schlicht angegeben ob eine getestete Substanz wirksam oder unwirksam ist Infolgedessen k nnten die Testergebniss
131. eine Erfindungsmeldung beim Patentb ro der LMU ein Die LMU nahm unsere Erfindung unbeschr nkt in Anspruch Recherchen in Patent datenbanken wie dem DEPATIS System des Deutschen Patent und Markenamtes 169 ergaben dass die Klasse der NBB Substanzen zwar bereits beispielsweise als Apoptose Aktivatoren gesch tzt ist 170 jedoch zur Anwendung gegen neurodegenerative Krank heiten noch gesch tzt werden konnte Mit Unterst tzung einer Patentanwaltskanzlei mel deten wir das Patent Uwe Bertsch Armin Giese Hans Kretzschmar Paul Tavan Thomas Hirsch berger Jan Bieschke Petra Weber Konstanze F Winklhofer J rg Tatzelt F Ulrich Hartl Gerda W nsch and Tobias J H gen Systematic Identifi cation of New Anti Prion Drugs by High Throughput Screening Based on Scanning for Intensely Fluorescent Targets SIFT PCT EP2005 005614 WO 2005 1 16640 A2 an welches sowohl die Screening Methode als auch die Substanzen der NBB Klasse als Medikamente gegen Prionkrankheiten und weitere neurodegenerative Krankheiten schiitzt Auch im Falle der zweiten neuen Wirkstoffklasse XXX vgl Abschnitt 5 2 reichten wir eine Erfindungsmeldung an die LMU ein die von der LMU unbeschr nkt in Anspruch ge nommen wird Wiederum wurden umfangreiche Recherchen in Publikations und Patent datenbanken durchgef hrt wodurch die Patentierbarkeit dieser Substanzklasse festgestellt wurde Eine zugeh rige Patentmeldung wird derzeit verfasst 128 B Die Java Bibl
132. elegte Fragmentverzeichnis bezogen sind ist ihre Bedeutung nicht allgemein Dieser Nachteil wird von Fingerabdr cken vermieden Fingerabdr cke Wie strukturelle Schl ssel sind auch Fingerabdr cke Substanzrepr sentationen in Form von Bit Strings 4 8 Zur Erzeugung des Fingerabdrucks f r eine Substanz s wird hier aber nicht das Vorkommen fest definierter Fragmente berpr ft sondern es werden die in der Molek lstruktur vorkommenden Pfade der Gestalt Atom Bindung Atom der L ngen n 0 1 2 extrahiert wobei das von DataMiner eingesetzte UNITY System Pfadl ngen n lt 7 ber cksichtigt 154 Ein Beispiel das aus dem Theory Manual von Daylight 156 bernommen ist zeigt die in dem Molek l OC CN enthaltenen Pfade der verschiedenen L ngen n 89 4 Methoden zur Untersuchung von Struktur Wirkungs Beziehungen en 0 O C N e n 1 OC C C CN e n 2 OC C C CN e n 3 OC CN Um nun das Vorkommen der gefundenen Pfade durch Eintr ge im Bit String b zu ver merken sind im UNITY System die Bit Strings in Abschnitte aufgeteilt die f r die Pfade der verschiedenen L ngen vorgesehen sind Dann werden die Pfade einer gegebenen L n ge auf Bitmuster abgebildet und diese in den daf r vorgesehenen Bereich des entstehen den Bit Strings bertragen Da die Zahl der Pfade die in Substanzstrukturen vorkommen k nnen insbesondere f r gro e Pfadl ngen n riesig ist kann dabei nicht f r jeden m g lichen Pfad ein eigenes Bitmus
133. elle Softwarepaket Benchware HTS DataMiner der Firma Tripos 143 dient der Suche nach neuen Leitstrukturen und bietet dazu die M glichkeit die Substan zen einer gegebenen Sammlung in Cluster strukturell hnlicher Substanzen zu unterteilen Anders als von den im letzten Abschnitt beschriebenen Werkzeugen wird dabei strukturel le hnlichkeit nicht direkt anhand der Molek lstrukturen bestimmt sondern anhand von daraus abgeleiteten abstrakteren Beschreibungen der Substanzen in Form von sogenann ten strukturellen Fingerabdr cken 4 2 1 Repr sentation von Substanzstrukturen Zur Repr sentation von Substanzstrukturen wird von DataMiner das Fingerabdrucksystem UNITY der Firma Tripos eingesetzt welches im Detail nicht offengelegt ist In der Lite ratur finden sich lediglich Umschreibungen des UNITY Systems 153 155 aus denen 88 4 2 Strukturelle Clusteranalysen zur Suche nach neuen Leitstrukturen hervorgeht dass es dem Fingerabdrucksystem der Firma Daylight 120 hnelt welches im hilfreichen Daylight Theory Manual 156 dargestellt ist An dieser Darstellung ori entiert sich daher die Darstellung in diesem Abschnitt Fingerabdrucksysteme sind zentrale Bestandteile von chemischen Softwarepaketen wie denjenigen der Firmen Tripos oder Daylight da sie eine effiziente Umsetzung von Sub struktursuchen erm glichen Weil Fingerabdr cke Weiterentwicklungen von sogenannten strukturellen Schl sseln sind sollen letztere zuerst erl
134. ellt Von einem Medikament muss aber ver langt werden dass es oral oder zumindest parenteral d h direkt in die Blutbahn verab reicht werden kann Um in das Zentrale Nervensystem zu gelangen muss der verabreichte Wirkstoff dazu f hig sein die Blut Hirn Schranke zu berwinden In Zellkulturmodellen identifizierte Wirkstoffe m ssen deshalb hinsichtlich der Hirng ngigkeit getestet und ge gebenenfalls optimiert werden 14 1 7 Bekannte anti Prion Substanzen 1 7 Bekannte anti Prion Substanzen Vor dem Beginn der Arbeiten des BMBF Forschungsverbundes waren bereits eine Reihe von chemischen Verbindungen bekannt die wirksam in die Vermehrung von PrP ein greifen k nnen Dazu z hlen Congo red 69 70 Porphyrine Phthalocyanine 71 73 Cp 60 74 polykationische Lipide wie etwa DOSPA 2 3 Dioleoyloxy N 2 sperminecar boxamido ethyl N N dimethyl 1 propanaminium trifluoroacetate 75 chemische Cha perone 76 Suramin 77 und Akridin Derivate 78 80 Die meisten dieser Verbindun gen wurden durch empirische und manchmal gl ckliche Beobachtungen identifiziert oder waren als Medikamente gegen andere Krankheiten bereits bekannt und wurden deshalb auch auf ihre Wirkung gegen die Prion Aggregation getestet Leider konnte aber aus die sen Substanzen bislang kein wirksames Medikament entwickelt werden Einer der vielversprechendsten Kandidaten ist das seit rund 70 Jahren bekannte Malaria Medikament Quinacrine QA und weitere Akrid
135. en F r die Behandlung wurden die Substanzen 293G02 309F02 und 313B02 ausgew hlt die beim Screening von DIVERSet 1 gefundenen worden waren und im Zellkultur Assay hohe Wirksamkeiten gezeigt hatten vgl Abbildung 5 4 Die Substanzen wurden an 14 aufeinander folgenden Tagen t glich in Form von intraperitonealer Injektion von 50 ul der Substanzen in einer DMSO Tr gerl sung verabreicht Dabei wurden die Substanzen 293G02 und 309F02 bei Konzentrationen von 10 mM bzw 5 mM w hrend des gesam ten Zeitabschnitts eingesetzt Die Dosis der Substanz 313B02 betrug zun chst ebenfalls 5 mM wurde aber nach dem Auftreten von toxischen Anzeichen ab dem vierten Tag auf 2 5 mM reduziert Die Tiere wurden get tet sobald sie das Endstadium der Krankheit erreicht hatten Die im Folgenden geschilderten Ergebnisse wurden in unserem gemeinsamen Pa tent 94 publiziert Verl ngerung der Inkubationszeit Abbildung 5 15 zeigt die Mediane der berlebenszeiten f r die Gruppen von M usen die mit der DMSO Tr gerl sung oder den verschiedenen Testsubstanzen behandelt worden waren Wie dort zu erkennen ist starben die n 8 Tiere der mit DMSO behandelten Gruppe knapp 150 Tage nach der Infektion W hrend f r die Behandlung mit der Sub stanz 313B02 keine Verl ngerung der medianen berlebenszeit gegen ber derjenigen der DMSO Kontrollgruppe beobachtet werden konnte f hrte die Behandlung mit den NBB Substanzen 309F02 und 293G02 zu Verl ngerungen der berlebe
136. en Untersuchungen zur sogenannten Pharmakokinetik durchgef hrt 111 5 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 5 16 PrP Ablagerungen in der Milz Immunohistochemisch prozessierte Schnitte durch Milzgewebe von einer mit DMSO Kontroll L sung behandelten Maus A und B und einer mit Substanz 293G02 behandelten Maus C Die Milz der mit DMSO behandel ten Maus weist r tlich eingef rbte Ablagerungen von PrP auf die in B vergr ert dargestellt sind Hingegen ist in der Milz der mit 293G02 behandelten Maus kein PrP detektierbar ber nommen aus unserem Patent Bertsch et al 94 5 1 5 Studien zur Pharmakokinetik Studien zur Pharmakokinetik PK eines untersuchten Wirkstoffs widmen sich den Fra gen auf welche Weise sich der Wirkstoff nach der Verabreichung im Organismus verteilt wie rasch er ins Blutplasma und in verschiedene K rpergewebe gelangt und wo und in welcher Form er abgebaut oder wieder ausgeschieden wird Dabei geht es insbesondere um die Frage ob der untersuchte Wirkstoff tats chlich in ausreichender Konzentration den Wirkort d h im Falle von anti Prion Wirkstoffen in erster Linie das Gehirn erreicht Bei PK Studien werden die zu untersuchenden Substanzen an Versuchstiere verabreicht zu verschiedenen Zeitpunkten danach jeweils einzelne Tiere get tet und das Vorkommen der Substanzen in verschiedenen Gewebeproben analysiert Im Rahmen des Verbundprojektes wurden derartige Studien zur PK der beiden NBB Substanze
137. en durchgef hrt wird Die dadurch gebildeten Cluster enthalten dann zun chst ausschlie lich wirksame Sub stanzen Anschlie end k nnen mithilfe von DataMiner die restlichen unwirksamen Sub stanzen nachtr glich in die Cluster einsortiert werden Diese empfohlene Vorgehensweise Das Quadrieren der Eintr ge bm bzw bni in der Definition des Tanimoto Koeffizienten 4 9 ist nicht notwendig falls es sich bei den zu vergleichenden Vektoren wie hier um Bit Strings handelt da dann stets bmi bmi gilt DDas hier beschriebene Werkzeug DataMiner hie fr her SARNavigator 91 4 Methoden zur Untersuchung von Struktur Wirkungs Beziehungen habe ich f r die Durchf hrung der in Abschnitt 5 2 2 beschriebenen Leitstruktursuche ge w hlt Grafische Darstellung der Cluster in Form einer SAR Karte Das Ergebnis eines Clusterings wird von DataMiner in Form einer sogenannten SAR Karte auf dem Bildschirm dargestellt in welcher die gebildeten Cluster durch Symbole repr sentiert sind Die Symbole werden dabei anhand der hnlichkeiten gem 4 9 zwi schen den Repr sentanten der Cluster so in der Ebene verteilt dass hnliche Cluster durch nahe beieinander liegende Symbole dargestellt werden und die Symbole f r un hnliche Cluster weit entfernt voneinander liegen Weiter unten ist in Abbildung 5 21 eine solche SAR Karte dargestellt und die darin erhaltenen Ergebnisse werden dort diskutiert Dem Benutzer von DataMiner ist
138. en gu und go welche die unteren bzw oberen Grenzwerte definieren noch zu bestimmen sind Ist eine der Bedin gungen in 3 2 erf llt so wird das entsprechende T pfchen als Ausrei er gekennzeichnet F r die in Abschnitt 3 4 beschriebene automatisierte Auswertung des DIVERSet Scree nings mit SIFT Viewer I wurde dieses Verfahren eingesetzt Dabei wurden f r die Fakto ren die Werte gy 0 1 und gy 5 0 heuristisch gew hlt und lieferten im Allgemeinen zuverl ssige Resultate Bei einigen Platten konnte es jedoch vorkommen dass durch diese einfache Ausrei er erkennung T pfchen mit Kontrollmischungen als Ausrei er gekennzeichnet wurden weil die zugeh rigen Werte Jot f gem 3 2 zu stark vom jeweiligen Median M f abwichen 39 3 Methoden zur Haltung Auswertung und Visualisierung von Daten Dies liegt darin begr ndet dass die Mediane M durch die Werte der Testsubstanzen de finiert sind die im gr ten Teil der T pfchen gemessen wurden Offensichtlich konnte es also vorkommen dass sich unterscheidende Assay Zusammensetzungen f r Kontrol len und Testsubstanzen zu deutlich unterschiedlichen Jot s Werten f hren Daher war es n tig die Erkennung dahingehend zu verbessern dass vor einer statistischen Analyse die Menge der T pfchen nach den Arten der darin gemessenen Mischungen gruppiert wird 3 1 2 Eine nach dem T pfchentyp getrennte Erkennung Wie aus dem in Abbildung 2 6 dargestellten Layout der Messplatten beim SI
139. en meiner Auswertung zus tzlich zu den oben geschilderten Ausrei erdetektoren als weitere Pr fgr e die gem Gleichung 3 6 ge bildete Summe S 13 herangezogen wurde die weiter unten eingef hrt werden wird Diese aus den 2D SIFT Spektren gebildete Gr e kann wie die Gesamtintensit ten Jot Hin weise auf von Testsubstanzen verursachte Fluoreszenzartefakte geben 3 2 SIFT Wirksamkeitsma e Wie in Abschnitt 2 2 3 erl utert wurde liefern die SIFT Messungen f r Mikrotiterplat ten mit Testsubstanzen als Ergebnis 2D SIFT Spektren welche die anti aggregatorischen Wirksamkeiten der getesteten Substanzen kodieren Um daraus ein Wirksamkeitsma zu entwickeln schreiben wir zun chst das f r ein T pfchen w erhaltene 2D SIFT Spektrum als D 18 dimensionalen Vektor Xw Xwl gt Xwp NP 3 5 dessen Eintr ge xwi gt 0 nat rliche Zahlen sind Gem der in Abschnitt 2 2 3 erl uter ten Bedeutung der 2D SIFT Spektren ist ein solcher Vektor x ein Histogramm dessen D Eintr ge xwi durch die Anzahlen von hochintensiven rot gr nen Fluoreszenzereignis sen gegeben sind die von Prion Aggregaten bestimmter PrP PrP Zusammensetzungen hervorgerufen wurden Wie dort erkl rt wurde kommt dabei den Eintr gen im Sektoren bereich von etwa i 1 5 eine besondere Bedeutung zu Die zugeh rigen Eintr ge Xi stammen von solchen Aggregaten die in gro en Mengen neu hinzuaggregiertes gr n 41 3 Methoden zur Haltung Aus
140. en vorliegen erst noch ber diverse Shell Skripten aufgearbeitet werden mussten 62 3 6 Das Analysewerkzeug SIFT Viewer II vgl Abschnitt 3 4 1 k nnen SIFT Messungen mit SIFT Viewer II direkt verarbeitet werden Dabei k nnen die Messdaten entweder aus einer lokalen SIFT Datei oder aus der TSE DB eingelesen werden in der TSE DB sind u a alle SIFT Plattenmessungen des prim ren DIVERSet Screenings zusammen mit ihrem Layout abgelegt Werden die Messdaten aus einer SIFT Datei eingelesen so muss der Benutzer dabei das Layout der gemessenen Platte festlegen damit SIFT Viewer II etwa die Typen der T pfchen kennt und Wirksamkeiten f r Testsubstanzen berechnen kann Freie Wahl von SIFT Plattenlayouts Beim Einlesen einer SIFT Plattenmessung kann der Benutzer entweder eines der in der TSE DB definierten Standard Layouts vgl Abschnitt 3 5 1 ausw hlen oder das Lay out ber eine Textdatei frei festlegen In beiden F llen wird von SIFT Viewer II f r je des T pfchen der Name der darin getesteten Substanz der Typ des T pfchens Sub stanz Negativ Positiv Kontrolle etc und die Substanzkonzentration in der Assay Mischung verwaltet Als Beispiel eines frei gew hlten Plattenlayouts zeigt Abbildung 3 7 eine vom Benut zer festgelegte Layout Datei f r eine SIFT Plattenmessung bei der sechs Testsubstanzen und diverse Kontrollen in verschiedenen Konzentrationen gemessen wurden Die gezeigte Datei enth lt im ersten
141. engefasst der den Ausgangspunkt fiir die Bildung von Klassen darstellt C 1 2 Bildung von Klassen Bildung eines Codebuchs und eines Dichtemodells Zun chst wird der univar Algorithmus von Kloppenburg und Tavan 177 dazu eingesetzt eine reduzierte Repr sentation des Merkmalsdatensatzes A in Form eines sogenannten Codebuchs C e r 1 M c RP zu bilden welches aus M lt N Codebuchvektoren c besteht Mit dem Codebuch ist ein Modell f r die Dichte des Datensatzes X in Gestalt einer Mischung M ae lan PRIC 0 2 PR er 0 C 6 r 1 aus M gleich gewichteten univariaten Gau funktionen Zur oY 2m 20 i verbunden dessen Parameter die Zentren c und die Breite o vom univar Algorithmus optimiert werden indem die sogenannte Likelihood dieser Parameter maximiert wird Als Ergebnis liegen die Zentren c an lokalen Mittelwerten des Merkmalsdatensatzes X und die Breite o ist im Sinne der Maximierung der Likelihood optimal 177 PRla C 7 136 C 1 Das Klassifikationsverfahren Prototypische Merkmalsvektoren und scharfe Klassen Gem dem Klassifikationsverfahren aus meiner Diplomarbeit 176 wird nun die Gau breite o des Dichtemodells p x C o variiert um eine Schar von Dichtemodellen auf verschiedenen r umlichen Skalen o zu erzeugen Mithilfe eines Gradientenaufstiegsver fahrens werden die Maxima der Dichtemodelle p x C o gefunden und als prototypische Merkmalsvektoren yl f r j 1 N C
142. er Prion Vermehrung aus Ab bildung 1 4 werden dabei winzige Mengen von authentischem aus Gehirnen extrahiertem PrP mit gro en Mengen von PrP die in Form von Hirnhomogenat zur Verf gung ge stellt werden in einem zyklischen Prozess inkubiert der aus abwechselnden Schritten der Inkubation und der Ultraschallbehandlung besteht Man nimmt dabei an dass w hrend der Inkubation PrP bzw PrP s Aggregate wachsen und dass die anschlie ende Ultra schallbehandlung die PrP Aggregate in kleinere Einheiten zerbricht welche zus tzliche Keime f r weiteres Aggregat Wachstum bieten K rzlich ist es mit der PMCA Technik gelungen Aggregate herzustellen die ebenso infekti s sind wie nat rliches PrP 36 Obwohl diese in vitro Studien den Eindruck vermitteln dass an der Prion Vermehrung le diglich PrP beteiligt ist gibt es experimentelle Hinweise aus Studien mit M usen dass im lebenden Organismus bei der Bildung von PrP ein nicht n her bestimmtes Makromole k l teilnehmen k nnte das Protein X genannt wurde 37 Wie dem auch sei das Fehlen einer detaillierten Kenntnis der an der in vivo Aggregation von Prionen m glicherwei se teilnehmenden Kofaktoren ndert nichts an den grundlegenden Resultaten dass dabei wirtseigene Prion Proteine infekti se und toxische Aggregate bilden Das geschilderte Wissen ber die molekularen Vorg nge der Prion Vermehrung legt nun einen m glichen Wirkmechanismus f r potenzielle anti Prio
143. eweils komponentenweise der Grauwert g subtrahiert wird Anschlie Bend wird t pfchenweise der sogenannte Kontrast D y 2 CAN C 2 i 1 der grauwertbereinigten Spektren x als weiteres Merkmal gespeichert Die Vektoren x werden schlie lich in die kontrastnormierten Spektren x 1 cw Xi berf hrt indem sie jeweils mit dem Kehrwert des Kontrastes c skaliert werden Die resultierenden grauwertbereinigten und kontrastnormierten Spektren x werden in dem Datensatz A x w 1 Ny zusammengefasst Der Grauwert gwu eines Spektrums Xy stimmt mit der Summenobservable S 18 w berein 134 C 1 Das Klassifikationsverfahren Dimensionsreduktion durch Hauptkomponentenanalyse Der Datensatz X wird einer sogenannten Hauptkomponentenanalyse principal compo nent analysis PCA unterzogen 181 Dabei wird zum einen der Mittelvektor w x des Datensatzes X gebildet sodass die Spektren x gem HR Zr Mn Xo Xp in das Schwerpunktsystem transformiert werden k nnen Zum anderen wird die Kovari anzmatrix Ny x x f r m ne l1 D wm wn Kee mit Kman Vv w 1 des Datensatzes X berechnet Die Kovarianzmatrix K wird durch Diagonalisierung in die Transformationsmatrix Ter gt berf hrt deren Zeilen durch die Eigenvektoren von K gebildet werden die normiert und nach der Gr e der zugeh rigen Eigenwerte A i 1 D sortiert sind Unter Verwendung der
144. experimentellen Techniken und deren Einsatzzwecke f r die systematische Suche nach neuen Wirkstoffen So wohl der in TP1 eingesetzte SIFT Assay als auch das Zellkulturmodell aus TP3 sind HTS f hig und konnten daher zum Testen von gro en Anzahlen von Wirkstoffkandidaten eingesetzt werden Das Zellkulturmodell aus TP4 diente zur Validierung von gefundenen Wirkstoffen In TP6 wurden Wirkstoffe hinsichtlich ihrer strukturellen Merkmale optimiert und zus tzliche Substanzen synthetisiert welche dann wiederum mit den Verfahren der anderen Teilprojekte hinsichtlich ihrer Wirksamkeit gegen Prionkrankheiten getestet werden konnten Unser Teil projekt TP2 bernahm die Sammlung Auswertung und Aufbereitung der gewonnenen experi mentellen Daten sowie die Kommunikation der aufbereiteten Daten innerhalb des Verbundes skizziert Auf Basis der f r die Substanzen gesammelten Wirksamkeiten sowie der f r al le Testsubstanzen zugreifbaren Molek lstrukturen f hrte ich strukturelle Analysen durch Die f r diesen Zweck von mir entwickelten und eingesetzten Verfahren werden in Kapi tel 4 vorgestellt Automatisierte Auswertung zentrale Datenhaltung und strukturelle Analysen dienten der Identifikation von neuen Wirkstoffklassen So wurde die Klasse der N Benzyliden Ben zohydrazide NBB Derivate als potenzielle anti Prion Therapeutika identifiziert 91 93 und durch ein Patent gesch tzt 94 Dar ber hinaus konnten wir eine weitere Wirkstoff klasse finde
145. f die abgebildete Dot Blot Membran bertragen mit PK verdaut und die darin enthaltenen PrP Molek le wurden ber Antik rper angef rbt Proben die PrP enthalten erscheinen als dunkle Dots sodass wirksame Testsubstanzen durch helle Dots Quadrate charakterisiert sind Mit freundlicher Genehmigung von M Eiden Abbildung 2 10 zeigt exemplarisch das mit diesem Assay f r eine DIVERSet Platte erziel te Ergebnis Negative Kontrollmessungen mit der DMSO Tr gerl sung sind durch dunkle Dots charakterisiert erste Spalte wohingegen mit dem Wirkstoff Suramin 77 behandel te Zellen helle Dots hervorrufen letzte Spalte Einzelne helle Dots im mittleren Bereich der Platte markieren Testsubstanzen welche wie Suramin die Anreicherung von PrP in den Zellkulturen wirksam hemmen k nnen Mit diesem Zellkultur Assay wurde ein Gro teil der DIVERSet Bibliotheken nach Inhibi toren durchgemustert Die Wirksamkeit der dabei gefundenen Substanzen wurde anschlie Bend anhand von Verd nnungsreihen berpr ft und genauer charakterisiert Zur computer gest tzten Auswertung mussten auch die Ergebnisse des prim ren Zellkultur Screenings und der Verd nnungsreihen genau wie die Ergebnisse aus den brigen Teilprojekten in ei ne zentrale Datenbasis aufgenommen werden um mir eine Suche nach chemischen Kern motiven potenzieller Wirkstoffe zu erm glichen siehe Kapitel 4 Ein zellfreier PrPC PrP Konversions Assay Neben dem im zentrale
146. folge der von ChemBridge getroffenen Auswahl erf llen die meisten der DIVERSet Substanzen die Kriterien von Lipinski s rule of five 98 einer statistisch begr nde ten Faustregel welche die pharmakologischen Eigenschaften einer Substanz aus physiko chemischen Eigenschaften der Substanz vorherzusagen sucht Hierzu hatten Lipinski et al 98 eine Auswahl von gut 2000 verschiedenartigen Wirkstoffen untersucht die es in 19 2 Der Forschungsverbund TSE Therapie die klinische Versuchsphase II geschafft hatten und daher durch g nstige pharmakologi sche Eigenschaften ausgezeichnet sind Statistische Analysen der pharmakologischen und physikochemischen Eigenschaften ergaben die unscharf formulierte Vorhersage dass die Absorption oder die Permeation einer gegebenen Substanz wahrscheinlich schlecht sind wenn diese Substanz mehr als 5 H Br cken Donatoren mehr als 10 H Br cken Akzepto ren ein Molekulargewicht gr er als 500 oder eine Lipophilie LogP gr er als 5 aufweist 98 Dabei ist das Lipophilie Ma LogP eine aus der Molek lstruktur empirisch bere chenbare Gr e Weil die vier Kriterien als Grenzen Vielfache von 5 enthalten wird diese Regel rule of five genannt Auf diese physikochemischen und auf weitere Eigenschaften der DIVERSet Substanzen werde ich in Abschnitt 3 3 im Zusammenhang mit der von mir vorgenommenen Datenhaltung der Bibliotheken n her eingehen In einer k rzlich erschienenen Studie 99 wur
147. ften angegeben werden k nnen vgl Abbildung 3 1 ab M END Zum anderen unterst tzt das sdf Format dass derartige Substanzdefinitionen aneinander geh ngt werden K nnen 44 3 3 Elektronische Daten zu den DIVERSet Bibliotheken ISIS 09300311332D 1213 0 0 0 0 0 0 0 0999 V2000 0 2458 1 1708 0 0000 C o 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7833 1 4708 0 0000 C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2458 0 5333 0 0000 C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7833 0 2333 0 0000 O 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 3208 1 1708 0 0000 C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 3208 0 5333 0 0000 C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3167 0 2125 0 0000 O 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7833 2 1125 0 0000 Br 0 0 0 0 00 00 0 0 0 0 1 8625 1 4708 0 0000 C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 8625 0 2333 0 0000 C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 4000 1 1708 0 0000 C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 4000 0 5333 0 0000 C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 3 2 0 01 0 Q 3 lt a 0 0 0 0 4 3 0 0 0 0 5 2 0 0 0 0 6 4 0 0 0 0 7 3 2 0 0 0 0 8 2 0 0 0 0 9 3 o 0 0 0 Br 10 6 0000 11 9 2 0 0 0 0 1210 2 0 0 0 0 Nu 629090 0 11 12 0 0 0 0 M END gt lt ID gt 5100026 Q 9 5100026 gt lt Plate gt 5100026 10252_A07 10252 gt lt Col gt 5100026 07 gt lt Row gt 5100026 A gt lt Supplier gt 5100026 ChemBridge gt lt Coordinates gt 5100026 A07 gt lt clogP gt 5100026 2 270000000000000e 000 gt lt RB gt 5100026 0 gt lt tPSA gt 5100026 3 021000000000000e 001 gt lt Hacc gt 5100026 2
148. g das in Abschnitt 2 2 2 nur am Rande erw hnt wurde ist dass jedes T pfchen einer Platte mehr fach gemessen wurde Demzufolge enth lt eine SIFT Datei f r jedes T pfchen mehrere Zeilen mit den Ergebnissen solcher Einzelmessungen Daraus ergab sich f r die von mir entwickelte automatisierte Extraktion der Messdaten die Anforderung diese Einzelergeb 48 3 4 Das Visualisierungspaket SIFT Viewer I nisse t pfchenweise zusammenzufassen Zu diesem Zweck programmierte ich ein Shell Skript extract_data sh im CVS Modul screening welches unter Verwendung des Linux Werkzeuges Gawk 123 zeilenweise eine SIFT Datei prozessiert Dabei wer den anhand der in den Zeilen enthaltenen T pfchenkoordinaten die zu einem T pfchen geh rigen sektorenweisen rot gr n Ereignisse der Einzelmessungen aufsummiert und er geben auf diese Weise 2D SIFT Spektren In der gleichen Weise k nnen mit einem zwei ten Skript extract_itot sh die Gesamtintensit ten Jtot r und Jtot g von Einzelmes sungen zusammengefasst werden Die beiden Skripten bewerkstelligen zudem die Zuordnung der t pfchenweise extrahier ten Messergebnisse zu den getesteten Substanzen Diese Zuordnung wird dadurch erm g licht dass die meisten der im DIVERSet Screening gemessenen Platten nach dem in Ab bildung 2 6 dargestellten Layout Eins zu Eins belegt waren Dadurch kann f r jedes T pfchen in dem eine Testsubstanz gemessen wurde aus dem Namen der SIFT Datei vgl Abbil
149. geh rigen Molek le oder einzelner Atomgruppen zur ckgef hrt werden wie etwa die m glichen Schwierigkeiten die Blut Hirn Schranke zu berwinden welche polaren Substanzen zu geschrieben werden 141 Beispielsweise gab Prof Schmidt zu bedenken dass es bei der Substanz 293G02 vgl Abbildung 5 7 aufgrund der beiden polaren Hydroxyl Gruppen m glicherweise Probleme mit der Bioverf gbarkeit dieser Substanz im lebenden Organis mus geben k nnte Derartige medizinalchemische berlegungen flossen in die Auswahl der Bausteine f r die Synthese von neuen NBB Substanzen ein Synthese einer ersten Runde von neuen NBB Substanzen Hydrazid Aldehyd Abbildung 5 8 Synthese von NBB Substanzen Aus coed und Benzaldehyd kann unter Abspaltung von Wasser NBB synthetisiert werden Wie in Abbildung 5 8 gezeigt ist k nnen neue NBB Substanzen aus Hydraziden und Al dehyden unter W rmezufuhr einfach hergestellt werden Durch den Einsatz der kombina torischen Chemie bei der spezifische Substituenten am Hydrazid mit spezifischen Sub stituenten am Aldehyd kombiniert werden konnte deshalb im Labor von Prof Schmidt innerhalb von kurzer Zeit eine umfangreiche fokussierte Bibliothek neuer NBB Deriva te synthetisiert werden Insgesamt wurden dabei auf Mikrotiterplatten zeilenweise zehn unterschiedliche Hydrazide die mit den K rzeln H bis H o bezeichnet seien mit spal tenweise 33 unterschiedlichen Aldehyden A A33 zu 330 NBB Derivaten kombiniert Di
150. gend erforderlich sind Anders gestaltet sich die Lage bei h ufigen Krankhei ten wie Alzheimer oder Parkinson Hier sind in jedem Fall umfangreiche klinische Studien 125 6 Ausblick der sogenannten Phasen Ibis III notwendig um Wirkstoffe als Medikamente zu etablieren Solche Studien erfordern einen Partner aus der Industrie Die Tatsache dass Substanzen der identifizierten Wirkstoffklassen NBB und XXX Wirk samkeiten nicht nur gegen Prionkrankheiten sondern auch gegen weitere Proteinaggrega tionskrankheiten wie Parkinson und Huntington zeigen vgl Abschnitte 5 1 6 und 5 1 7 l sst es als m glich erscheinen dass Wirkstoffe aus diesen Klassen auch die Aggregations prozesse des t Proteins und der A Peptide inhibieren k nnen welche der Pathogenese der Alzheimerschen Krankheit zugrunde liegen Mithin tragen aus gegenw rtiger Sicht die identifizierten Wirkstoffklassen das Potenzial Medikamente auch gegen so weit ver breitete Gei eln der Menschheit wie die Parkinsonsche oder die Alzheimersche Krankheit zu liefern Die damit verbundene Hoffnung steigert den wirtschaftlichen Wert der bisher identifizierten Wirkstoffklassen und die Chance dass Lizenzinteressenten gefunden wer den k nnen Es sei an dieser Stelle betont dass unsere Leitstruktursuchen neben den ausf hrlich dis kutierten Klassen NBB und XXX Hinweise auf weitere anti aggregatorische Wirkstoff klassen geliefert haben von denen einige bereits aus der Literatur bek
151. gewonnenen Messdaten und ergebnisse richtete ich auf einem vom Leibniz Rechenzentrum LRZ in M nchen zur Verf gung gestellten Daten bankserver 128 eine Datenbank ein die ich TSE DB genannt habe Herr Simon Youssef unterst tzte mich als studentische Hilfskraft sowohl beim Entwurf und bei der Einrichtung der TSE DB als auch bei der Entwicklung der zugeh rigen Java Bibliothek tsedb und der darauf basierenden Datenbank Clientprogramme TSE DB Browser und SIFT View 55 3 Methoden zur Haltung Auswertung und Visualisierung von Daten er II die dem Zugriff auf die in der TSE DB abgelegten Daten dienen und weiter unten beschrieben werden 3 5 1 Modellierung und Installation der TSE DB F r den Entwurf und die Installation der TSE DB wurde das Modellierungswerkzeug Toad Data Modeler der Firma Quest Software 129 eingesetzt Mit Toad Data Mo deler wurde zun chst ein sogenanntes Entity Relationship ER Modell 130 f r die zu erstellende TSE DB entworfen ER Modelle dienen der Beschreibung wie Objekte der Realit t Entit ten und deren Beziehungen Relationen auf Datenstrukturen abgebildet werden k nnen und werden daher h ufig zur Modellierung von Datenbanken eingesetzt Abbildung 3 5 zeigt das f r die TSE DB entworfene ER Modell als Diagramm in dem die 18 Tabellen der TSE DB als K sten dargestellt sind Die K sten sind farblich hinter legt um inhaltlich eng zusammenh ngende Tabellen zu gruppieren Danach gliedert si
152. gt lt Hdon gt 5100026 Abbildung 3 1 Auszug aus der sdf Datei zu DIVERSet 1 Der gezeigte Abschnitt aus der sdf Datei zu DIVERSet 1 zeigt die Beschreibung einer exemplarisch ausgew hlten Substanz Im ersten Teil der Beschreibung ist die zweidimensionale Molek lstruktur definiert welche zu dem rechts grafisch dargestellt ist Im zweiten Teil nach der Zeile M END sind zus tzliche Eigenschaften der Substanz abgelegt N here Erl uterungen finden sich im Text 45 3 Methoden zur Haltung Auswertung und Visualisierung von Daten 3 3 2 Eindeutige Namen f r die DIVERSet Substanzen Wie aus Abbildung 3 1 zu erkennen ist umfassen die in den sdf Dateien enthaltenen Sub stanzinformationen die Nummer Eintrag Plate der Mikrotiterplatte auf der die Sub stanz geliefert wurde und die Koordinaten Coordinates bzw Row und Col des T pfchens auf dieser Platte Obschon jede Substanz vom Hersteller ber eine Identifi kationsnummer ID bereits eindeutig bezeichnet ist entschlossen wir uns dazu jeder DIVERSet Substanz einen weniger abstrakten Namen zu geben Nach der von uns dazu vereinbarten Konvention wird jede Substanz im Format Substanzname lt Plattennummer gt _ lt T pfchenkoordinaten gt 3 11 eindeutig benannt Dementsprechend tr gt die in Abbildung 3 1 dargestellte Substanz den Namen 10252_A07 Durch diese Namensgebung wird die Zuordnung von Messergeb nissen zu Substanzen erl
153. h Klicken der rechten Maustaste ber ei nem gew hlten T pfchenknopf aufrufen Kann Aus einem solchen Men k nnen dann verschiedene vordefinierte T pfchenmengen per Mausklick ausgew hlt oder bereits aus gew hlte wieder abgew hlt werden Im Falle der gezeigten Platte mit Verd nnungsreihen sind beispielsweise diejenigen T pfchen ausw hlbar in welchen eine gegebene Substanz in verschiedenen Konzentrationen gemessen wurde In B wurden auf diese Weise die 65 3 Methoden zur Haltung Auswertung und Visualisierung von Daten 1273737 5262 20 82 95 1414617 12203742 Se Geos Olde A mi B B L Cc Cc f D D E E F F G G toggle outlier S TITITTTKrTT H select this welltype Substance X ey Positive deselect this welltype Negative substance id 10353_F11 select positives CID_Rods_only isOutlier false deselect positives Mix_only Substance select negatives 0 1 34 65 32 1 well type dilution deselect negatives itot 1 itot 2 select all deselect all Abbildung 3 8 T pfchenweise Repr sentationen von SIFT Messplatten Dargestellt sind zwei von SIFT Viewer II verwendete grafische Komponenten zur Repr sentation von SIFT Messplatten wobei jeweils die T pfchen durch anklickbare Kn pfe symbolisiert sind In A sind die Kn pfe nach dem T pfchentyp eingef rbt in B nach der SIFT Wirksamkeit Hier bei sind wirksame Substanzen durch gr ne und unwirksame Substanze
154. hemotherapie Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschaft 42 17 47 1909 19 C A Lipinski F Lombardo B W Dominy und P J Feeney Experimental and computatio nal approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings Adv Drug Deliv Rev 46 3 26 2001 19 20 46 H J Verheij Leadlikeness and structural diversity of synthetic screening libraries Mol Div 10 377 388 2006 20 149 Literaturverzeichnis 100 G M Rishton Nonleadlikeness and leadlikeness in biochemical screening Drug Discov Today 8 86 96 2003 20 101 I Vorberg A Buschmann S Harmeyer A Saalmuller E Pfaff und M H Groschup A novel epitope for the specific detection of exogenous prion proteins in transgenic mice and transfected murine cell lines Virology 255 26 31 1999 21 102 P Schwille J Bieschke und F Oehlenschlager Kinetic Investigations by Fluorescence Cor relation Spectroscopy The Analytical and Diagnostic Potential of Diffusion Studies Bio phys Chem 66 211 228 1997 22 103 J Bieschke A Giese W Schulz Schaeffer I Zerr S Poser M Eigen und H Kretzschmar Ultrasensitive detection of pathological prion protein aggregates by dual color scanning for intensely fluorescent targets Proc Natl Acad Sci USA 97 5468 5473 2000 22 104 A Giese J Bieschke M Eigen und H A Kretzschmar Putting prions into focus applica tion of single molecule dete
155. hm und dessen Unterpakete sind f r die Verwendung von SIFT Viewer II vorgesehen Im Paket tsedb algorithm outlier sind die verschiedenen in Abschnitt 3 1 beschriebenen Algo rithmen zur Erkennung von Ausrei ern implementiert das Pakettsedb algorithn activity dient zur Berechnung von Wirksamkeitsma en nach den in Abschnitt 3 2 de finierten Methoden und im Paket tsedb algorithm classification ist die in Anhang C beschriebene Klassifikation von 2D SIFT Spektren umgesetzt Im Paket t sedb gui und seinen Unterpaketen werden Komponenten der grafischen Be nutzerschnittstelle GUI graphical user interface definiert welche von den Anwendungen TSE DB Browser und SIFT Viewer II verwendet werden Zu diesen GUI Komponenten z hlen beispielsweise ein Passwort Dialog der zur Herstellung einer Verbindung mit der TSE DB erscheint sowie eine Komponente zur Darstellung von Molek lstrukturen wel 131 B Die Java Bibliothek tsedb che auf der frei verf gbaren Java Bibliothek CDK Chemistry Development Kit 137 basiert Des weiteren z hlen zu den von beiden Anwendungen genutzten GUI Komponen ten eine Tabellendarstellung von Substanznamen Molek lstrukturen und Wirksamkeiten sowie die im Paketverzeichnis tsedb gui pictures abgelegten Symboldateien f r die Verzierung von Kn pfen Die Komponenten aus dem Paket tsedb gui dbbrowser und dessen Unterpaketen werden hingegen nur vom TSE DB Browser genutzt Dazu z hlen ein navigierbarer Baum z
156. hnitt 2 3 Dabei wurde vor der Western Blot Analyse die unl sliche Fraktion mit der Pro teinase K behandelt um das in den Zelllysaten enthaltene PrP quantifizieren zu k nnen Im Gegensatz zu unbehandelte Zellen control zeigen vor allem die mit den Testsubstan zen 293G02 und 313B02 behandelten Zellen konzentrationsabh ngige Reduktionen der PrP Banden bernommen aus Bertsch et al 91 In SIFT Verdonnungsreinen valdione Treffer TP so In Zeikutur valcerte Trier td Je Abbildung 5 3 Statistik des Screenings von DIVERSet 1 Aufgelistet sind die Zahlen der Substanzen die in den verschiedenen Schritten des Screenings untersucht bzw als wirksam gefunden wurden Ausgehend von den 10 000 Substanzen aus DIVERSet 1 wurde die Menge der wirksamen Substanzen unter Einsatz der Assay Systeme schrittweise eingeschr nkt bis schlie lich sechs Substanzen mit validierter SIFT und Zellkulturwirksamkeit identifiziert wa ren geschr nkt wurde bis schlie lich nurmehr sechs Substanzen brig geblieben waren die in den verwendeten Tests starke anti Prion Wirksamkeiten zeigten Die Entdeckung der Wirkstoffklasse NBB Abbildung 5 4 zeigt die Molek lstrukturen der aus dem SIFT Screening TP1 und den Zellkulturvalidierungen TP3 resultierenden sechs Substanzen zusammen mit ihren Wirk samkeiten im prim ren SIFT Screening erste Spalte in den SIFT Verd nnungsreihen zweite Spalte und im Zellkultursystem letzte Spalte Vier die
157. hnittstelle Seite 131 Hierarchische Erweiterung des Werkzeugs MoSS Seite 84 High Throughput Screening Hochdurchsatz Screening Seite 16 Interactive Data Language Software Paket f r Datenanalysen Seite 50 Java Database Connectivity Eine Datenbank Schnittstelle Seite 131 Ma f r die Lipophilie einer Substanz Seite 46 Leibniz Rechenzentrum der Bayerischen Akademie der Wissenschaften Sei te 55 Molekulardynamik Seite 5 Molecular Substructure Miner Werkzeug f r systematische Suchen nach che mischen Substrukturen Seite 77 Max Planck Institut Seite 30 Messenger Ribonucleic Acid Boten Ribonukleins ure Seite 116 Eine Zelllinie Seite 31 N Benzyliden Benzohydrazide Im Verbund entdeckte und entwickelte Klas se von Wirkstoffen gegen Proteinaggregationskrankheiten Seite 18 Nuclear Magnetic Resonance Kernspinresonanz Seite 9 Pharmakokinetik Seite 112 Primary Key Prim rschl ssel Attribut einer Datenbanktabelle Seite 56 Proteinase K Ein Enzym das Peptidbindungen in Proteinen spaltet Seite 3 Protein Misfolding Cyclic Amplification Ein in vitro Modellsystem zur Ver mehrung von Prionen Seite 8 Das f r das Prion Protein kodierende Gen Seite 3 Das Prion Protein Seite 3 Zellul re Isoform des Prion Proteins Seite 3 Abk rzungsverzeichnis Prpres Prps QA rPrP SAR ScN2a SIFT SMB SQL TFE TP tPSA TSE vCJD wtPrP ZNP 2D FID Protease resistente Isoform des Prion Proteins Seite 8 Kran
158. hprobenumfang N und das 40 3 2 SIFT Wirksamkeitsma e gew hlte Signifikanzniveau entnommen werden kann Ist T gr er als 7 N a also die Ungleichung 3 4 erf llt so geh rt Jot f w mit der Wahrscheinlichkeit 1 nicht der zugrunde gelegten Normalverteilung an und wird daher als Ausrei er angesehen Bei dieser Ausrei ererkennung wird zun chst f r die anf nglich N Werte der Mittelwert uyr gebildet Dann wird der von u am weitesten entfernt liegende Wert Jot p w als fragw rdiger Wert ausgew hlt das Testkriterium 3 3 ausgewertet und der fragliche Wert als Ausrei er aus der Menge entfernt falls er gem 3 4 mit der Wahrscheinlichkeit 1 a nicht der Normalverteilung angeh rt Diese Prozedur wird f r die verbleibenden Werte solange iteriert bis kein Ausrei er mehr gefunden wird Das skizzierte Verfahren wurde in SIFT Viewer II implementiert wobei die kritischen Werte T N fiir 0 05 und 0 01 und f r bestimmte N lt 100 aus der Tabelle in 116 bernommen und fehlende Werte geeignet inter N lt 100 bzw extrapoliert N gt 100 wurden F r die Gruppe der Testsubstanzen wurde das Signifikanzniveau 0 01 und f r die kleineren Gruppen von Kontrollmessungen jeweils der gro z gigere Wert a 0 05 gew hlt Falls eine T pfchengruppe jedoch weniger als N 3 T pfchen umfasst Kann keine Ausrei ererkennung anhand dieses Tests vorgenommen werden Abschlie end sei angemerkt dass in Teil
159. hrer geistigen F higkeiten der abh ngig von der Variante innerhalb von wenigen Monaten oder h chstens etwa zwei Jahren zum Tode f hrt Dem geistigen Abbau liegt ein massives Absterben von Zel len des zentralen Nervensystems zugrunde dessen Folgen in Abbildung 1 1A zu erkennen sind Die Abbildung zeigt eine mikroskopische Aufnahme eines eingef rbten Schnittes durch das Gehirn eines CJD Patienten und macht die histopathologischen Merkmale der CJD deutlich Dazu z hlen die wei lich erscheinenden Vakuolen welche eine schwam martige Struktur des Gehirns hervorrufen sowie violett eingef rbte sogenannte Amyloid artige Ablagerungen Amyloide entstehen durch Aggregation von abnorm ver nderten Proteinen finden sich zumeist au erhalb der Zellen sind unl slich und liegen in Form von kleinen Fasern vor Abbildung 1 1B zeigt f r den Fall der Prionen eine elektronenmikroskopische Aufnahme solcher amyloiden Ablagerungen die aufgereinigt wurden und dann fibrill re Strukturen aufweisen Derartige Amyloide werden in hnlicher Form auch bei anderen neurodege nerativen Krankheiten wie der Alzheimerschen der Huntingtonschen oder der Parkinson schen Krankheit beobachtet Die hnlichkeiten von lichtmikroskopischen pathologischen Merkmalen in Gehirnschnit ten die bei der bertragbaren Schafkrankheit Scrapie und den menschlichen Krankheiten 1 2 Die Prionhypothese Kuru und CJD beobachtet wurden veranlassten Neuropathologen bereits En
160. hwarz sowie Martina Stork f r ihre Hilfe beim Anfertigen von Modellen des Prion Proteins die bei ffentlichen Veranstaltungen ausgestellt wurden e sowie Sebastian Bauer und Verena Schultheis f r das sorgf ltige Korrekturlesen meiner Dissertation Ausdr cklich gilt mein Dank f r das angenehme Arbeitsumfeld auch den ehemaligen Mit gliedern unserer Arbeitsgruppe Drs Heiko Carstens Bernhard Egwolf Gerald Mathias Paul Strodel und Prof Marco Nonella Meinen Freunden au erhalb des BMO bin ich dankbar f r die Erinnerung an das Leben da drau en Meinen Eltern meinem Bruder und meiner n heren Familie danke ich von Herzen f r ihren Glauben an mich sowie f r die F rsorge und Unterst tzung die sie mir geben seit ich sie kenne Die st rkste pers nliche Unterst tzung w hrend meiner Promo tion gab mir meine Freundin Natalie Oliphant mit ihrer Liebe und Geduld Sie nahm an meiner Arbeit Anteil gab mir in schwierigen Momenten Kraft und schenkte mir erholsa me Wochenenden Daf r dass sie immer f r mich da ist danke ich ihr von Herzen 158
161. i en Joint Photographic Experts Group umgewandelt und f r die Verwendung mit SIFT Viewer I nach Platten sortiert an ber set up definierten Positionen im Dateisystem ab gelegt vgl die Beschreibung der Verzeichnishierarchie in Abschnitt 3 4 4 weiter unten Es sei angemerkt dass die in Abschnitt 2 2 3 dargestellten 2D SIFT Spektren mit einer leicht modifizierten Version dieser Prozedur erstellt wurden In hnlicher Weise werden mit der Prozedur print_sums platten und t pfchenwei se einzelne 2D SIFT Spektren eingelesen und daraus die gem 3 6 definierten Sum menobservablen S w f r die Sektorenbereiche v b 1 5 1 7 4 9 und 1 18 berechnet Diese Prozedur plottet sowohl die f r die T pfchen einer Platte berechneten Summenobservablen als auch die Gesamtfluoreszenzen Jtot r und Jtot g und legt den Plot als jpeg Grafikdatei an einer definierten Stelle ab vgl Abschnitt 3 4 4 Analog dazu werden 50 3 4 Das Visualisierungspaket SIFT Viewer I mit der Prozedur print_inhibs die gem 3 9 definierten Wirksamkeiten berechnet geplottet und in weiteren jpeg Dateien gespeichert 3 4 3 Darstellung von Molek lstrukturen Die im Lieferumfang der DIVERSet Bibliotheken in Form von sdf Dateien enthaltenen Molek lstrukturen vgl Abschnitt 3 3 wurden einer visuellen Repr sentation zug nglich gemacht indem mit dem Werkzeug csbr des Softwarepakets CACTVS 125 f r jede Substanz eine Grafikdatei generiert wurde
162. i Recherchen nach einem brauchbaren Softwarewerkzeug zur Identifikation und Va lidierung von Leitstrukturen anhand von HTS Daten stie ich im Internet auf das Pro grammpaket Molecular Substructure Miner MoSS 144 welches von Informatikern der Universit t Magdeburg in Kooperation mit der Firma Tripos 143 f r das Auffinden von charakteristischen chemischen Strukturmotiven in Substanzmengen entwickelt wurde 145 149 4 1 1 Die Bildung von Strukturklassen mit MoSS Der Ausgangspunkt f r die Bildung von Strukturklassen mithilfe von MoSS ist eine Bi bliothek B C li 1 N 4 1 in welcher die N Molek lstrukturen C der Substanzen compounds einer zugeh ri gen realen Sammlung zusammengefasst sind Optional k nnen die Substanzen zus tzlich durch biologische Wirksamkeiten beschrieben sein Eine solche Bibliothek B und ein vom Benutzer gew hltes strukturelles Kernmotiv K bilden die Eingabe f r MoSS Abbildung 4 1 zeigt schematisch f r ein exemplarisches Ausgangskernmotiv K oben wie MoSS schrittweise das Kernmotiv erweitert um strukturelle Klassen zu bilden Im ersten Schritt versucht MoSS dazu das Kernmotiv K in die Substanzstrukturen C B einzubetten Falls diese Einbettung m glich ist sind als Resultat in der Strukturklasse S K Cice B C gt K CB 4 2 die eine Teilmenge der Bibliothek B ist diejenigen Substanzstrukturen C zusammenge fasst in die das Motiv K eingebettet werden kann Diese Einbettu
163. i den Docking Simulationen setzte ich wie ich in Abschnitt 4 3 beschrieben habe als Modell f r eine polyQ Protofibrille eine triangul re 6 helikale Struktur ein die von mei ner Kollegin Martina Stork zusammen mit Paul Tavan entwickelt worden war 27 Das Modell ist ein Dimer aus zwei polyQ Peptiden mit jeweils 36 Residuen die linksh n dig gewunden und dadurch zu triangul ren 6 Helizes angeordnet sind F nf verschiedene Schnappsch sse dieser Struktur wurden als Rezeptoren eingesetzt Modelle f r die Wirk stoffsubstanzen 293G02 306H03 313B02 und Congo red wurden wie in Abschnitt 4 3 beschrieben berechnet Mithilfe des Softwarepakets AutoDock 160 wurden f r jeden polyQ Schnappschuss und f r jedes Ligandmolek l 100 einzelne Docking Simulationen durchgef hrt Abbildung 5 20 zeigt f r die vier Wirkstoffsubstanzen jeweils die polyQ Protofibrillen zusammen mit den Strukturen von gedockten Molek len Dabei sind die f nf verschie denen polyQ Schnappsch sse und die zugeh rigen Dockings farblich kodiert F r jeden Wirkstoff und jeden Schnappschuss sind die 20 Dockings mit den niedrigsten freien Bin dungsenergien dargestellt und zus tzlich die jeweiligen Mittelwerte dieser freien Energien angegeben Die Simulationen sagen f r alle untersuchten Verbindungen relativ gro e Bin dungsenergien zwischen 6 2 und 7 2 kcal mol vorher was auf thermisch stabile Dockings hinweist Alle Substanzen binden bevorzugt an die beiden Enden der polyQ
164. ialog zur Herstellung der Verbin dung mit der TSE DB Symbolknopf DB Des weiteren k nnen die Reportgenerierung Knopf R oder der Export von Aktivit tswerten Knopf A aufgerufen werden SIFT Viewer II wurde von meinen Kollegen aus TP1 dazu eingesetzt die SIFT Daten zu analysieren die beim Screening und der Validierung der DIVERSet Bibliotheken und einiger fokussierter Bibliotheken gewonnen wurden Wie zum Ende von Abschnitt 3 5 be reits angesprochen wurde war in der ersten Projektphase des Screenings auch das zuge h rige Werkzeug TSE DB Browser entstanden mit welchem unsere M nchner Verbund partner aus TP1 die Ergebnisse der brigen Teilprojekte d h die in der TSE DB abge legten Wirksamkeitsdaten inspizieren k nnen Weil jedoch der Zugriff auf den vom LRZ betriebenen Datenbankserver auf welchem die TSE DB installiert ist auf Angeh rige des M nchner Hochschulnetzes beschr nkt ist K nnen unsere ausw rtigen Verbundpartner nicht auf die TSE DB zugreifen Um dennoch allen Verbundpartnern Zugriff auf die im Verbund erzielten Resultate zu geben habe ich die Verwaltung der Substanz und Wirk samkeitsdaten auf die kommerzielle Software ChemFinder umgestellt Dankenswerter weise hat mich Prof Schmidt TP6 zu Beginn der zweiten F rderperiode Jahresmitte 2005 auf dieses n tzliche Softwarepaket aufmerksam gemacht dessen Einsatz ich im Folgenden vorstellen m chte Es sei jedoch noch angemerkt dass die TSE DB
165. ic parameters of prion repli cation Biophys Chem 77 139 152 1999 6 J Masel und V A Jansen The measured level of prion infectivity varies in a predictable way according to the aggregation state of the infectious agent Biochim Biophys Acta 1535 164 173 2001 6 L Manuelidis Transmissible Encephalopathies Speculations and Realities Viral Immu nol 16 123 139 2003 7 Literaturverzeichnis 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 M Eiden A Buschmann L Kupfer und M H Groschup Synthetic Prions J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health 53 251 256 2006 8 D A Kocisko J H Come S A Priola B Chesebro G J Raymond P T Lansbury und B Caughey Cell free formation of protease resistant prion protein Nature 370 471 474 1994 8 21 G Legname I V Baskakov H O B Nguyen D Riesner F E Cohen S J DeArmond und S B Prusiner Synthetic Mammalian Prions Science 305 673 676 2004 8 G P Saborio B Permanne und C Soto Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding Nature 411 810 813 2001 8 J Bieschke P Weber N Sarafoff M Beekes A Giese und H Kretzschmar Autocatalytic self propagation of misfolded prion protein Proc Natl Acad Sci USA 101 12207 12211 2004 8 P Weber A Giese N Piening G Mitteregger A Thomzig M Beekes und H
166. iden tifizierten Wirkstoffe hinsichtlich ihrer pharmakologischen Eigenschaften umfasst Zwei weitere Teilprojekte befassten sich mit dem Einfluss von Kupfer auf die Entwicklung der Prionkrankheiten bzw mit der Entwicklung einer Immunprophylaxe und spielen Neben rollen in dem zentralen Screening Ansatz von dem hier berichtet wird Das bersichtsdiagramm in Abbildung 2 1 zeigt die f nf am Screening teilnehmenden Teilprojekte des Verbundes sowie deren Mitarbeiter die eingesetzten Techniken und die Einsatzzwecke der Techniken f r den Screening Ansatz Sowohl Teilprojekt TP1 um Prof Kretzschmar und Dr Giese als auch TP3 um Prof Groschup brachten mit dem SIFT Assay bzw einem Zellkultur Assay zwei Modellsysteme f r Prionkrankheiten mit in den Ver bund die es erlaubten gro e Mengen von Substanzen in hohem Durchsatz nach Wirkstof fen durchzumustern Demgegen ber diente das von Prof Tatzelt eingesetzte Zellkultur modell zur Validierung von mit dem SIFT Assay gefundenen Wirkstoffen Prof Schmidt konnte seine medizinalchemische Erfahrung einbringen und gezielt zus tzliche Substan zen aus identifizierten und vielversprechenden Wirkstoffklassen synthetisieren und wei teren Tests zur Verf gung stellen Das von mir zusammen mit Prof Tavan bearbeitete Teilprojekt TP2 nahm im Verbund die zentrale Rolle der Sammlung Auswertung Aufbe reitung und Verteilung der in den Testsystemen des Verbundes aufgenommen Daten ein Einer meiner Hauptbeitr ge
167. ie Ausbildung faltblattreicher S Intermediate und deren Aggregation zu induzieren hnlich wie im anti Prion SIFT Assay werden dabei amp S Monomere mit Farbstoffen mar kiert Dabei wird die H lfte der aS Monomere mit gr nen und die andere H lfte mit roten Farbstoffen markiert Die markierten S Monomere werden gemischt und durch Zugabe von DMSO zur Bildung von amp S Multimeren angeregt Die in solchen Mischungen gebil deten rot gr n fluoreszierenden wS Multimere k nnen wiederum unter Einsatz der 2D SIFT Technik gemessen und die Messdaten mithilfe der 2D SIFT Software 105 ausge wertet werden Durch Zugabe von Testsubstanzen zur Mischung kann deren Wirksamkeit gegen die Aggregation von aS gemessen werden 2 3 Ein Zellkulturmodell f r Prionkrankheiten TP4 Die Arbeitsgruppe um Prof J rg Tatzelt und Dr Konstanze Winklhofer die zu Beginn der Arbeit des Verbundes am Max Planck Institut MPI f r Biochemie in Martinsried t tig war und inzwischen ins Adolf Butenandt Institut der LMU umgezogen ist brachte ein etabliertes Zellkulturmodell 75 91 f r Prionkrankheiten mit in den Verbund Dieses 30 2 3 Ein Zellkulturmodell f r Prionkrankheiten TP4 Zellkulturmodell setzt Neuroblastomzellen der Linie N2a ein die in einem N hrmedium in Petrischalen kultiviert werden und stabil mit Scrapie der Maus infiziert werden k nnen ScN2a 109 111 Die infizierten ScN2a Zellen produzieren PrP das sowohl infekti s als auch
168. ie Zahl der offenen Kettenenden expo nentiell zunimmt Der damit identifizierte physikalisch chemische Mechanismus erkl rt wie sich Krankheitskeime die nur aus Proteinen bestehen vermehren k nnen Er zeigt ferner dass im Prinzip schon ein einziges amyloides PrP Aggregat welches in die N he nativer PrP Molekiile gelangt die Krankheit ausl sen kann Die Frage nach der infekti sen Einheit also danach welche Menge von PrP infekti s ist versucht man mit Tierversuchen zu beantworten Dabei werden eine Reihe von unter schiedlich stark verd nnten Prion Pr parationen Gruppen von Versuchstieren verabreicht Die maximale Verd nnung bei der noch die H lfte der Tiere einer Gruppe sterben wird als infekti se Dosis ID5 bezeichnet Anhand von solchen Versuchen sch tzten verschie dene Experimentatoren die Zahl der PrP Molek le pro IDso Einheit und kamen auf stark unterschiedliche Werte von 10 bis 10 oder sogar dar ber vgl die Diskussion von Masel et al 28 Masel und Jansen 29 konnten anhand von mathematischen Modellen hn lich den oben beschriebenen erkl ren dass die Infektiosit t nicht allein durch die Zahl der PrP Molek le charakterisiert werden kann sondern stark von der Gr enverteilung der Prion Aggregate abh ngt Danach sind viele k rzere Aggregate st rker infekti s als we nige lange Damit k nnen die vorgestellten mathematischen Modelle f r die Kinetik der Prion Vermehrung auch den ungew h
169. ie eines Liganden in der N he des Rezeptors wendet AutoDock ein Interpolationsschema mit sogenannten Gitterkarten an die vorab im Bereich des Rezeptors f r die in den Liganden vorkommenden Atomarten berechnet werden Zur Berechnung der Gitterkarten mit 127x127x127 Punkten im Abstand von 0 375 die um die polyQ Dimere zentriert waren habe ich das Werkzeug AutoGrid des Pakets ADT verwendet F r jeden der f nf polyQ Dimer Schnappsch sse simulierte ich das Docking der ausge w hlten Substanzen Dabei wurden f r jedes Rezeptor Ligand Paar 100 separate Docking L ufe durchgef hrt und die so gefundenen Dockings nach aufsteigender freier Energie 93 4 Methoden zur Untersuchung von Struktur Wirkungs Beziehungen sortiert Die jeweils 20 gedockten Strukturen mit der niedrigsten freien Energie wurden mithilfe des Softwarepakets VMD 162 visualisiert Nachdem nun in den beiden vorangegangenen Kapiteln Methoden zur Datenhaltung und auswertung sowie f r SAR Analysen vorgestellt wurden kann im n chsten Kapitel ber die damit erzielten Resultate berichtet werden 94 5 Ergebnisse und Diskussion Die in den vorangegangen Kapiteln skizzierten experimentellen Methoden meiner Ver bundpartner und die von mir entwickelten Werkzeuge zur Haltung und Auswertung der da mit gewonnenen experimentellen Daten sowie zur Untersuchung von Struktur Wirkungs Beziehungen konnten im Verbund wohlkoordiniert f r die systematische Suche nach neu en anti
170. in Derivate f r die man herausgefunden hat dass sie die Anreicherung von Protease resistentem PrP in kultivierten mit Scrapie infizierten Zellen hemmen 78 80 Versuche mit Scrapie infizierten M usen denen QA verabreicht wurde zeigten jedoch keine signifikante Verl ngerung der Inkubationszeit 81 82 Dennoch deuteten vorl ufige klinische Versuche bei denen CJD Patienten mit QA behandelt wurden auf eine vor bergehende Verbesserung der Symptome hin 83 84 Zur Zeit wird QA in klinischen Studien in London und San Francisco an CJD Patienten getestet 85 87 Um herauszufinden weshalb QA zwar in vitro aber nicht oder nur schwach in vivo wirk sam ist wurde die Pharmakokinetik von QA untersucht 88 89 wobei mehreren Ver suchstieren QA in therapeutischen Dosen verabreicht wurde und anschlie end gemessen wurde in welchen Konzentrationen der Wirkstoff in verschiedenen Bereichen des Gehirns vorlag Diese Studien lieferten als m gliche Erkl rungen f r die mangelnde Wirksamkeit dass QA in zu geringen Konzentrationen am Wirkort vorliegt Daher wird derzeit anhand von QA Analoga getestet wie sich nderungen der Molek lstruktur auf die Metabolisie rungseigenschaften und die biologische Aktivit t der resultierenden Verbindungen gegen die Anreicherung von Prion Material auswirken 90 Es wird also versucht die pharma kokinetischen Eigenschaften von QA zu verbessern Das Beispiel QA zeigt dass es f r die Entwicklung eines anti Prion
171. in Verd nnungsreihen gemes sen und anhand der dadurch umgesetzten Dosis Wirkungs Analysen validiert rund 150 Substanzen wobei sich SIFT Viewer II als hilfreiches Werkzeug erwies 5 2 1 Das Zellkultur Screening der DIVERSet Bibliotheken Zus tzlich zum SIFT Assay aus TP1 wurde ab Ende 2004 der Zellkultur Assay von TP3 vgl Abschnitt 2 4 zum Screening der DIVERSet Bibliotheken eingesetzt Dabei wur den die anti Prion Wirksamkeiten der DIVERSet Substanzen zun chst bei einer einzigen Konzentration 20 uM getestet vgl Abbildung 2 10 Die dabei als wirksam gefundenen Substanzen die Prim rtreffer wurden anhand von Verd nnungsreihen validiert wodurch insbesondere nach solchen Substanzen gesucht wurde die auch noch bei geringeren Kon zentrationen wirksam sind Abgesehen von dieser grundlegenden Vorgehensweise unter 119 5 Ergebnisse und Diskussion schieden sich die Screening Kampagnen von DIVERSet 1 und DIVERSet 2 hinsichtlich einiger Details Das prim re Screening von DIVERSet 1 wurde auf SMB Zellen durchgef hrt und die Pri m rtreffer wurden in Verd nnungsreihen bei vier Konzentrationen 1 uM 4 uM 10 uM und 40 uM auf SMB Zellen berpr ft Die Substanzen mit den h chsten Wirksamkeiten wurden zus tzlich auf ScN2a Zellen getestet Hingegen werden beim noch laufenden Prim rscreening von DIVERSet 2 alle Substanzen sowohl auf SMB als auch auf ScN2a Zellen getestet und nur jene Testsubstanzen die bei beiden Zelllinie
172. ins with a Beta pleated Sheet Conformation J Histochem Cytochem 37 1273 1281 1989 116 R Nelson und D Eisenberg Recent atomic models of amyloid fibril structure Curr Opin Struct Biol 16 260 265 2006 117 Deutsches Patent und Markenamt DEPATISnet http depatisnet dpma de 128 X Cai Sui S Kasibhatla J Drewe S Reddy P und H Z Zhang Substituted N Arylcarbonyl Benzhydrazides N Arylcarbonyl Benzylidene Hydrazides and Analogs as Activators of Caspases and Inducers of Apoptosis and the Use thereof WO 2002 089745 128 Sun Microsystems Inc Java Technology http java sun com 129 Eclipse an open development platform http www eclipse org 129 Oracle Technology Network http www oracle com technology 131 E Gamma R Helm R Johnson und V John Design Patterns Elements of Reusable Object Oriented Software Addison Wesley 1995 131 Apache Software Foundation Log4j project http logging apache org log4j 132 T Hirschberger Hierarchische Klassifikation durch selbstorganisierende neuronale Algo rithmen Diplomarbeit Lehrstuhl f r BioMolekulare Optik Fakult t f r Physik LMU M n chen 2002 133 137 Literaturverzeichnis 177 178 179 180 181 182 183 M Kloppenburg und P Tavan Deterministic Annealing for Density Estimation by Multiva riate Normal Mixtures Phys Rev E 55 2089 2092 1997 133 136 S Albrech
173. iothek t sedb Unter Verwendung der Programmiersprache Java 171 wurde von meiner studentischen Hilfskraft Herrn Simon Youssef und mir die Bibliothek t sedb implementiert Diese Bi bliothek umfasst eine Schnittstelle zur TSE DB diverse Ein und Ausgaberoutinen ins Dateisystem Verfahren zur Ausrei ererkennung und zur Wirksamkeitsberechnung vgl Abschnitte 3 1 bzw 3 2 zahlreiche Komponenten f r grafische Benutzerschnittstellen und einige weitere Funktionalit ten und stellt damit ein Software Framework zur Ver f gung auf dem sowohl die in Abschnitt 3 5 3 beschriebene Datenbank Client Software TSE DB Browser als auch das Analysewerkzeug SIFT Viewer II aus Abschnitt 3 6 ba sieren Bevor nun einzelne Bestandteile der Bibliothek ausf hrlicher geschildert werden sollen einige Werkzeuge und Methoden beschrieben werden die bei der Entwicklung der Bibliothek von Herrn Youssef und mir eingesetzt wurden F r die Programmierung der tsedb Bibliothek und der darauf aufsetzenden Anwen dungen wurden zum einen die kommerzielle integrierte Entwicklungsumgebung JBuilder der Firma Borland 134 und zum anderen das frei verf gbare Werkzeug Eclipse 172 welches dem selben Zweck dient eingesetzt Zur Verwaltung des damit programmier ten Quellcodes der tsedb Bibliothek wurde der am Lehrstuhl f r BioMolekulare Optik BMO eingerichtete CVS Server verwendet der bereits in Abschnitt 3 4 im Zusammen hang mit SIFT Viewer I angesprochen wurde Der t sedb Q
174. isease EMBO J 20 3957 3966 2001 15 34 K Doh Ura T Iwaki und B Caughey Lysosomotropic Agents and Cysteine Protease In hibitors Inhibit Scrapie Associated Prion Protein Accumulation J Virol 74 4894 4897 2000 15 C Korth B C May F E Cohen und S B Prusiner Acridine and phenothiazine derivatives as pharmacotherapeutics for prion disease Proc Natl Acad Sci USA 98 9836 9841 2001 15 75 B C H May A T Fafarman S B Hong M Rogers L W Deady S B Prusiner und F E Cohen Potent inhibition of scrapie prion replication in cultured cells by bis acridines Proc Natl Acad Sci USA 100 3416 3421 2003 15 S J Collins V Lewis M Brazier A F Hill A Fletcher und C L Masters Quinacrine Does Not Prolong Survival in a Murine Creutzfeldt Jakob Disease Model Ann Neurol 52 503 506 2002 15 K Doh ura K Ishikawa I Murakami Kubo K Sasaki S Mohri R Race und T Iwaki Treatment of Transmissible Spongiform Encephalopathy by Intraventricular Drug Infusion in Animal Models J Virol 78 4999 5006 2004 15 Y Kobayashi K Hirata H Tanaka und T Yamada Quinacrine administration to a pati ent with Creutzfeldt Jakob disease who received a cadaveric dura mater graft an EEG evaluation Rincho Shinkeigaku 43 403 408 2003 15 M Nakajima T Yamada T Kusuhara H Furukawa M Takahashi A Yamauchi und Y Kataoka Results of quinacrine administration to patients with Creut
175. itat Aktivitat bstanzen Atome 7 kultur SIFT 19 1 000000 0 478533 i 14 0 833333 1 654090 s N 9 0 833333 0 003136 Cr rt gt LX gt N 25 0 300000 0 211594 N X g SOR S 21 0 800000 0 030170 17 0 750000 0 385037 9 0 750000 0 231215 2 0 750000 0 081555 19 0 750000 1 654090 116 0 750000 0 451246 16 10 750000 10 082552 4 2 0 750000 0 762915 Compound Zellkultur Aktivit t SIFT Aktivitat 5 a 63 Lo 0 194553 24 0 666667 0 216269 T Ds 18 esor De 110 236089 10274 Co4 1 0 0 685185 11 0 625000 0 822422 a T PERE 2 0 625000 0 803946 ESR TS ae 15 0 600000 0 234204 z file C Dokumente und Einstellungen thomas Desktop D51_20070306_b miner_run vis structs s4355 html Abbildung 4 2 Schnappschuss der Visualisierung eines xminer getriebenen MoSS Laufs Die von MoSS gebildete Liste von Strukturklassen ist im linken Bereich in tabella rischer Form dargestellt Durch Mausklicks auf Listeneintr ge k nnen einzelne Klassen f r die Darstellung im mittleren Bereich ausgew hlt werden Dort ist f r die ausgew hlte Klasse s4355 oben das Kernmotiv gezeigt und darunter sind die in der Klasse enthaltenen Substanzen auf gelistet wobei Substanznamen Zellkultur und SIFT Wirksamkeiten sowie klassenlokal ge bildete Mittelwerte der Wirksamkeiten angegeben sind Durch Anklicken des Substanznamens 10278_A03 wird rechts die Struktur dieser Substanz gezeigt Da
176. kheitsassoziierte Scrapie Isoform des Prion Proteins Seite 3 Quinacrine Malaria Medikament mit anti Prion Wirksamkeit Seite 15 Rekombinant hergestelltes Prion Protein Seite 21 Structure Activity Relationships Struktur Wirkungs Beziehungen Seite 75 Mit Scrapie infizierte N2a Zellen Seite 31 Scanning for Intensely Fluorescent Targets Seite 16 Scrapie Mouse Brain Eine Zelllinie Seite 33 Structured Query Language Seite 59 Trifluoroethanol Ein organisches L sungsmittel Seite 30 Teilprojekte des Forschungsverbundes TSE Therapie Seite 17 Total Polar Surface Area Ma f r die Polarit t einer Substanz Seite 46 Transmissible Spongiforme Enzephalopathien Seite 1 Neue Variante der CJD Seite 1 Wildtypisches Prion Protein Seite 32 Zentrum f r Neuropathologie und Prionforschung der LMU Seite 21 Two Dimensional Fluorescence Intensity Distribution Zweidimensionale Flu oreszenz Intensit ts Verteilung Seite 24 XV Abk rzungsverzeichnis xvi 1 Einleitung In den fr hen 1990er Jahren erkrankten im Vereinigten K nigreich j hrlich rund 35 000 Rinder an der Bovinen Spongiformen Enzephalopathie BSE Wenige Jahre sp ter wur de die Krankheit vCJD eine neue Variante der Creutzfeldt Jakob Krankheit CJD ent deckt 1 Experimentelle Hinweise 2 dass vCJD wahrscheinlich durch neuartige Krank heitserreger von BSE infizierten Rindern ber die Nahrungskette auf den Menschen ber tragen worden war l sten Bef
177. ksamkeiten zu analysieren wurden Verd nnungsreihen mit sieben verschiedenen Konzentrationen zwischen 0 1 uM und 100 uM im SIFT Assay vermessen Die Messergebnisse wurden in Form von Dosis Wirkungs Kurven hnlich den in Abbildung 3 9 A gezeigten ausgewertet Dabei konnten f r 80 Substanzen konzen trationsabh ngige anti aggregatorische Wirksamkeiten best tigt werden Vielen der un tersuchten Substanzen konnten aus den Dosis Wirkungs Kurven zus tzlich EC50 Werte vgl Abschnitt 2 2 4 zugeordnet werden die im Bereich zwischen 0 3 uM und 60 uM lagen Die von SIFT Viewer II gebotene F higkeit Dosis Wirkungs Kurven zu generieren stand w hrend der Validierung von DIVERSet 1 noch nicht zur Verf gung und wurde erst beim Screening von DIVERSet 2 genutzt Die genannten Substanzanzahlen beziehen sich auf den in Bertsch et al 91 ver ffentlichten Stand In zwischen konnte die Wirksamkeit von insgesamt 130 Prim rtreffern aus DIVERSet 1 best tigt werden und f r 116 der best tigten Substanzen konnten EC50 Werte bestimmt werden 97 5 Ergebnisse und Diskussion Vergleich von SIFT und Konversions Assay Neben der zentralen SIFT Screening Kampagne wurde zus tzlich eine Menge von 70 SIFT wirksamen Substanzen von unseren Verbundpartnern aus TP3 mithilfe des in vitro PrPC PrP Konversions Assays berpr ft vgl Abschnitt 2 4 Im Konversions Assay zeigten sich 15 der 70 getesteten Substanzen als aktiv Eine Analyse diese
178. kulare Optik Seite 129 Bovine Spongiforme Enzephalopathie Seite 1 Circular Dichroism Zirkul rer Dichroismus Seite 10 Chemistry Development Kit Eine Java Bibliothek Seite 132 Creutzfeldt Jakob Krankheit Seite 1 Calculated LogP Berechnete Sch tzung f r LogP Seite 46 Concurrent Versions System Werkzeug zur Quellcode Verwaltung Seite 47 Data Definition Language Seite 58 Dimethylsulfoxid Ein organisches L sungsmittel Seite 20 2 3 Dioleoyloxy N 2 sperminecarboxamido ethyl N N dimethyl 1 propan aminium trifluoroacetate Ein kationisches Lipid das im SIFT Screening als Positiv Kontrollsubstanz eingesetzt wurde Seite 15 Elektronenmikroskopie Seite 11 Endoplasmatisches Retikulum Organell in welchem Proteine posttranslatio nal modifiziert werden Seite 12 Entity Relationship ER Modelle sind Schemata zur Beschreibung von Ob jekten und deren Beziehungen die h ufig zum Entwurf von Datenbanken eingesetzt werden Seite 56 Fluorescence Correlation Spectroscopy Seite 21 Foreign Key Fremdschl ssel Attribut einer Datenbanktabelle Seite 56 xiii Abk rzungsverzeichnis GFP GPI GUI hMoSS HTS IDL JDBC LogP LRZ MD MoSS MPI mRNA N2a NBB NMR PK PK PK PMCA Prn p PrP Prp XIV Das griin fluoreszierende Protein Seite 116 Glycosylphosphatidylinositol Molek l ber welches Proteine in Membra nen verankert werden Seite 10 Graphical User Interface Grafische Benutzersc
179. ll Lysate Die Kulturen von Scrapie infizierten Zellen der hier eingesetzten Lini en SMB scrapie mouse brain und ScN2a werden nicht in Petrischalen sondern in den T pfchen von Mikrotiterplatten gehalten Wegen dieser kompakten Form der Kultivierung k nnen alle Testsubstanzen einer Bibliotheksplatte eins zu eins auf eine Zellkulturplatte bertragen und so den einzelnen Zellkulturen zugef hrt werden Nach einer dreit gigen Behandlung der infizierten Zellen werden Lysate der einzelnen T pfchen in vereinfachter Weise hinsichtlich des von den Zellen produzierten PrP analysiert Im Gegensatz zum herk mmlichen Western Blot Verfahren werden hier die Lysate nicht elektrophoretisch aufgespalten sondern vollst ndig als sogenannte Dots von einer gegebenen Zellkultur platte auf eine Membran bertragen Auf der Membran wird das produzierte PrPS ber spezifische Antik rper sichtbar gemacht und kann optisch quantifiziert werden 33 Ej 2 Der Forschungsverbund TSE Therapie PPT eee ye IH Abbildung 2 10 Ergebnisse des Zellkultur Assays f r eine DIVERSet Platte Analysiert wurden acht negative Kontrollen mit der DMSO Tr gerl sung erste Spalte und acht positive Kontrollen mit dem Wirkstoff Suramin 77 letzte Spalte sowie 80 Testsubstanzen mittlere Spalten Jeder Dot stammt von einem T pfchen mit kultivierten Zellen die f r drei Tage mit DMSO Suramin oder einer Testsubstanz behandelt wurden Die Zell Lysate wurden au
180. llen Partner aus den Bereichen Humanmedizin Tiermedizin und Biochemie wurden eine Reihe von Testsystemen erarbeitet und eingesetzt mit denen umfangreiche Sammlun gen von medikamentartigen Substanzen sogenannte Substanzbibliotheken systematisch nach neuen Wirkstoffen durchsucht wurden Meine Aufgabe im Verbund bestand in der Sicherung Qualit tskontrolle und Analyse der experimentell gewonnenen Daten mit dem Ziel Wirkstoffsubstanzen zu bestimmen Dazu habe ich eine zentrale Datenbank eingerich tet und diverse Softwarewerkzeuge entwickelt welche eine klar strukturierte Verbindung von gewonnenen Messdaten mit Informationen ber die getesteten Substanzen erm glich ten und so die Voraussetzung zur Identifikation von Wirkstoffklassen schufen Eine der experimentellen Methoden das Scanning for Intensely Fluorescent Targets SIFT wurde zur Messung der Koaggregation von PrP an PrP in einem molekula ren Assay entwickelt und zum Hochdurchsatz Screening HTS der Bibliotheken sowie zur Validierung von dabei gefundenen prim ren Treffern anhand von Verd nnungsreihen messungen eingesetzt Zur automatisierten Auswertung und Aufbereitung der rohen SIFT Messdaten habe ich das Softwarewerkzeug SIFT Viewer entwickelt welches die Mess daten von Ausrei ern befreit den gemessenen Substanzen anhand der validen Messdaten anti aggregatorische Wirksamkeitswerte zuordnet sowie Messdaten Analyseresultate und Molekiilstrukturen der Testsubstanzen in grafischer
181. ly Hypothese w re voll 1 Einleitung bracht wenn es gelingen w rde infekti se Prionen in vitro zu synthetisieren eine aktuelle bersicht zu k nstlichen Prionen geben Eiden et al 31 Die strukturelle Umwandlung und Aggregation von PrP in fehlgefaltetes Protease re sistentes PrP konnte in vitro modelliert werden 32 aber die geringe Ausbeute an produziertem PrP erlaubte keinen direkten Nachweis der Infektiosit t K rzlich ist es Legname et al 33 jedoch gelungen k nstliche Prionen aus verk rzten Prion Proteinen herzustellen und damit M use zu infizieren Kritiker bem ngeln aber mehrere Punkte an der Studie von Legname et al Zum einen waren die verwendeten M use genetisch so ver ndert dass sie die verk rzten Prion Proteine in stark erh hter Anzahl bildeten Damit k nnte sich die TSE Krankheit in einem solchen Milieu auch spontan bilden Zum an deren erkrankten die mit den k nstlichen Prionen infizierten M use erst sehr viel sp ter als M use denen nat rliche Scrapie Erreger verabreicht worden waren und starben kaum fr her als nicht infizierte Kontrolltiere Dies deutet darauf hin dass die Infektiosit t der in dieser Studie erzeugten k nstlichen Prionen sehr gering ist Die zyklische Verst rkung der Fehlfaltung von Proteinen PMCA protein misfolding cy clic amplification ist ein in vitro Modellsystem das es erm glicht gro e Mengen von PrP in PrP S umzuwandeln 34 35 Nach dem Prinzip d
182. lyQ Protofibrille Das Modell f r eine polyQ Protofibrille umfasst einen Dimer aus 36Q Peptiden die in einer triangul ren 6 helikalen Struktur angeordnet sind 27 Nach dem Modell w rde die Protofibrille durch Anlagerung weiterer Windungen am oberen und unteren Ende der B Helix wachsen Die Peptidr ckgrate der polyQ Dimere sind als R hren und die gedockten Substanzen in Form von Linien Repr sentationen dargestellt Die f nf verschiedenen polyQ Schnappsch sse und die zugeh rigen Dockings werden durch Farbkodierung unterschieden F r jeden der vier Liganden Congo red 313B02 293G02 und 306H03 und jeden Schnapp schuss sind die 20 Dockings mit den niedrigsten freien Energien gezeigt Zus tzlich sind die Mittelwerte dieser freien Energien f r die vier ausgew hlten Substanzen angegeben bernom men aus Schiffer et al 159 118 5 2 Eine weitere neue Wirkstoffklasse htt strukturell hnliche fibrill re Aggregate bilden wobei die hnlichkeit in einer gemein samen helikalen Kernstruktur bestehen k nnte 27 64 Deshalb hatten wir vermutet dass Inhibitoren der PrP Aggregation auch die Aggregation von polyQ Proteinen hem men sollten Unsere Beobachtung dass anti Prion Substanzen tats chlich auch wirksame Inhibitoren der polyQ Aggregation sind stellt die oben angef hrte Best tigung unserer Arbeitshypothese dar Diese Ergebnisse bekr ftigen also die Sichtweise dass der Patho genese verschiedener neurodegenerativer K
183. m glich Wirksamkeiten im Nachhinein zu ber cksichtigen um aus einer umfangreichen Klassenliste die wirksamen heraus zu fil tern Dabei verwende ich anstelle des im Kriterium 4 5 eingesetzten globalen Anteils P der die Zahl der wirksamen Substanzen auf alle in der Bibliothek enthaltenen wirksa men Substanzen bezieht den klassenlokalen Anteil p S pen 4 6 S gt Fy 4 6 der wirksamen Substanzen innerhalb der fraglichen Klasse S und berpr fe ob P einen w hlbaren Mindestanteil peu bersteigt Die Verwendung dieses modifizierten Wirksam keitsfilters f hrt dazu dass nun auch kleine Klassen mit hohen Anteilen wirksamer Sub stanzen gefunden werden 79 4 Methoden zur Untersuchung von Struktur Wirkungs Beziehungen Die nachtr gliche Ber cksichtigung von Wirksamkeiten bei der Auswahl von Klassen bietet den weiteren Vorteil dass die vollst ndige Klassenliste 4 3 nur einmal gebildet werden muss und sp ter durch Variation des Grenzwertes pmi beliebig gefiltert werden kann Ferner k nnen auch weitere Filter angewendet werden So kann beispielsweise eine Mindestgr e der Klassen gefordert werden Schlie lich k nnen experimentell bestimmte Wirksamkeiten aus mehreren Testreihen z B SIFT TP1 und Zellkultur TP3 nach einander eingesetzt werden um die Klassenliste nachtr glich zu filtern oder um einzelne Klassen zu charakterisieren 4 1 4 Aufbereitung und Visualisierung von Strukturklassen Zur Umsetzung des s
184. ma es ist leicht zu erkennen dass den T pfchen mit Testsubstanzen Werte a w 0 zugeordnet werden wenn die Summe S w in der N he des Negativ Mittelwerts n liegt S i w n und daher die Substanz keine oder eine schwache anti oder pro aggregatorische Wirkung besitzt Hingegen werden T pfchen mit S x w p deren Substanzen die Aggregation hnlich gut hemmen wie die Kontrollwirk stoffe auf Aktivit tswerte a w 1 abgebildet Durch die in 3 9 vollzogene Normierung auf den Abstand n p der Kontrollenmit telwerte der von den zugeh rigen Spektren abh ngt und daher von Platte zu Platte va riieren kann wird also erreicht dass unabh ngig von dieser Variabilit t f r alle Platten unwirksamen Substanzen Aktivit tswerte a 0 und wirksamen Substanzen Werte a 1 zugeordnet werden Dieses auf die plattenlokalen Kontrollmessungen bezogene SIFT Ak tivit tsma wurde in SIFT Viewer I und II implementiert und f r die Auswertung des Screenings der DIVERSet Bibliotheken eingesetzt 3 2 3 Ein auf die Testsubstanzen bezogenes WirksamkeitsmaB Fiir den Fall dass auf einer gegebenen Messplatte keine oder nicht auswertbare Kontroll messungen mitgef hrt wurden wurde ein zweites Wirksamkeitsma entwickelt welches die Wirksamkeit einer gegebenen Testsubstanz relativ zu denjenigen der anderen Testsub stanzen beschreibt Wie dem kontrollenbezogenen Ma 3 9 werden auch diesem Ma die Summenobserva blen 5 zugrunde gelegt Aufg
185. matischen Substruktursuchen deckten ferner Substituentenkombinationen auf die mit erh hter Wirksamkeit verbunden sind Die Viel zahl der so gefundenen NBB Subklassen validierte das NBB Motiv als Leitstruktur die sich somit zur weiteren Optimierung in Nachfolgeuntersuchungen anbot 5 1 3 Fokussierte NBB Bibliotheken Nachdem die NBBs als neue anti Prion Wirkstoffe entdeckt und ihr Charakter als Leit struktur durch statistische SAR Analysen belegt worden war traten wir TPl und TP2 gegen Ende der ersten F rderperiode unseres Verbundprojektes in Kontakt mit dem Medi zinalchemiker Prof Boris Schmidt TU Darmstadt der schlie lich f r die zweite F rder periode als Verbundpartner gewonnen werden konnte vgl Abschnitt 2 6 Meine Kollegen Dr Bertsch und Dr Giese vom ZNP und ich trafen uns mit Prof Schmidt und pr sentierten ihm die SIFT Ergebnisse f r die NBB Substanzklasse deren zahlreiche Subklassen mit hilfe des Werkzeugs hMoSS hierarchisch angeordnet worden waren vgl z B Abbildung 4 4 Dadurch konnte sich Prof Schmidt rasch einen berblick dar ber verschaffen wel che Subklassen von NBB Substanzen bereits getestet worden waren und welche Substitu enten rund um das NBB Kernmotiv die aggregationshemmende Wirkung positiv oder ne gativ beeinflussen k nnen Dar ber hinaus wurden pharmakologische Eigenschaften ein 103 5 Ergebnisse und Diskussion zelner Substanzen diskutiert die auf physikochemische Eigenschaften der zu
186. n Gem dem hier vorgestellten Verfahren werden die SIFT Messdaten plattenweise pro zessiert Dazu werden die f r eine Messplatte mit N T pfchen w gewonnenen 2D SIFT Spektren x die gem Gleichung 3 5 D 18 dimensionale Vektoren sind in einem Datensatz X x w 1 N C R 133 C Eine Methode zur vorurteilsfreien Klassifikation von SIFT Daten zusammengefasst Zun chst wird der Datensatz X einer Ausrei erbereinigung mithilfe der nach dem T pfchentyp trennenden Erkennungsmethode vgl Abschnitt 3 1 2 unterzogen wobei als Pr fgr en neben den Gesamtintensit ten Jtot r und tor r zus tzlich die gem Gleichung 3 6 gebildeten Summenobservablen S 8 eingesetzt werden C 1 1 Vorverarbeitung Extraktion von Merkmalen Die verbleibenden N lt N validen Spektren x werden einem mehrstufigen Transfor mationsprozess der sogenannten Vorverarbeitung unterzogen Dieser Prozess der Vor verarbeitung wurde urspr nglich in der Gruppe von Paul Tavan zur Aufbereitung von Sprachsignalen in einem Spracherkennungssystem entwickelt 179 180 dort verwen dete Bezeichnungen werden hier bernommen Neben der Transformation der Spektren dient die Vorverarbeitung der Extraktion von Merkmalen Zuerst wird hierbei f r jedes Spektrum x der sogenannte Grauwert D EN el C 1 i l als erstes Merkmal extrahiert Zudem werden die Spektren x in die grauwertbereinigten Spektren t X Xw gul berf hrt indem j
187. n die derzeit gesch tzt werden soll und deshalb in dieser Arbeit nicht offen gelegt werden kann Nichtsdestoweniger berichte ich in Kapitel 4 ber die Methoden die zur Entdeckung dieser und weiterer Wirkstoffklassen gef hrt haben 18 2 1 Die DIVERSet Bibliotheken Damit ich unsere Beitr ge zum Verbund in den Kapiteln 3 und 4 darstellen kann ist es notwendig zun chst die experimentellen Verfahren unserer Projektpartner vorzustellen Dazu sollen vorab die angesprochenen Sammlungen von Substanzen die in den diversen Assays des Verbundes getestet wurden kurz charakterisiert werden 2 1 Die DIVERSet Bibliotheken F r die systematische Suche nach neuen Wirkstoffen wurden vom Verbund zwei soge nannte Substanzbibliotheken d h Sammlungen von potenziellen Wirkstoff Substanzen beschafft Wir entschieden uns f r die von der Firma ChemBridge 95 angebotene Bi bliothek DIVERSet die insgesamt rund 50 000 Substanzen beinhaltet und kauften davon zwei jeweils 10 000 Substanzen umfassende Teilbibliotheken die wir DIVERSet 1 und DIVERSet 2 genannt haben DIVERSet wird von ChemBridge 95 als eine vielf ltige Sammlung von medikamentartigen kleinen Molek len beschrieben die rational so ausge w hlt wurden dass sie vielversprechende pharmakologische Eigenschaften besitzen Damit eine chemische Verbindung ein Medikament sein Kann muss sie pharmakologische Eigenschaften besitzen welche in dem h ufig verwendeten K rzel ADMET
188. n wie oben erkl rt wurde die zu den Substanzen geh rigen Versuchsergeb nisse in den Textdateien markieren Die grafische Oberfl che von ChemFinder zeigt dann wie Abbildung 3 12 ausweist im linken Bereich die sdf Daten sowie im Feld substance_id den Substanznamen und im rechten Bereich die aus den Textdateien importierten Versuchsergebnisse Beispielsweise ist dort im Feld tp1_sift die aus dem prim ren Screening abgeleitete Wirksamkeit 3 9 der abgebildeten Substanz aufgef hrt ChemFinder bietet dar ber hinaus die M glich keit weitere Textdaten zu Substanzen abzulegen und anzuzeigen Dies war speziell f r die Speicherung der Ergebnisse von Tierversuchen von Vorteil die im sp teren Verlauf des Projekts f r einige wenige ausgesuchte Substanzen durchgef hrt wurden In Abbil dung 3 12 zeigt das Feld tierversuche ein entsprechendes Versuchsergebnis an das h n disch eingegeben wurde Im Falle der fokussierten Bibliotheken mit neu synthetisierten Substanzen mussten die Molek lstrukturen erst noch eingegeben werden Diese Aufgabe wurde teilweise von den Chemikern und teilweise von mir bernommen F r die Eingabe der Molek lstrukturen verwendete ich das Programm ChemDraw welches wie ChemFinder zum ChemOffice Paket 133 geh rt Mit den geschilderten Mitteln wurden von mir regelm ig die neu hinzugekommenen Messergebnisse in die ChemFinder Datenbanken aufgenommen und diese an unsere Partnergruppen verteilt ChemFi
189. n 309F02 und 293G02 durchgef hrt die in den oben geschilderten Therapie Experimenten vielversprechende Ergebnisse gezeigt hatten F r die PK Studien wurden am ZNP die beiden Substanzen einzeln zum Zeitpunkt t 0 jeweils einer Gruppe von zw lf M usen intraperitoneal verabreicht wobei die eingesetzten Dosen von 10 umol kg 112 5 1 Entdeckung und Entwicklung einer ersten neuen Wirkstoffklasse 309F02 bzw 20 umol kg 293G02 jenen der Therapie Experimente entsprachen Zu den Zeitpunkten t 0 5 1 2 4 8 und 24 h nach der Verabreichung wurden jeweils zwei M use get tet und Proben von Blutplasma und Hirn entnommen Das Vorkommen der Testsubstanzen in den entnommenen Proben wurde von der Firma Boehringer Ingelheim 163 massenspektrometrisch analysiert Substanzen im Blutplasma 3500 _ 3000 309F02 2500 293G02 5 2000 E 1500 x 1000 lt 500 0 T T T T 0 5 10 15 20 25 Zeit h Abbildung 5 17 Konzentrationen der Substanzen 309F02 und 293G02 im Blutplasma von M usen Die mithilfe von Massenspektrometrie ermittelten Konzentrationen der beiden Substanzen im Blutplasma von M usen sind gegen die Zeit nach der Verabreichung aufgetra gen Gezeigt sind jeweils die Mittelwerte der Konzentrationen von zwei untersuchten M usen Die Messungen wurden von der Firma Boehringer Ingelheim durchgef hrt Abbildung 5 17 zeigt die zeitlichen Verl ufe der massenspektrometrisch ermittel
190. n Abbildung 3 11 gezeigten Bildschirmschnappschuss von SIFT Viewer II zeigt Abbildung 3 8 zwei Bestandteile der graphischen Benutzer schnittstelle n mlich die beiden angesprochenen Repr sentationen einer SIFT Messplat te Die gezeigten Repr sentationen wurden von SIFT Viewer II anhand der in Abbil dung 3 7 dargestellten Layout Datei und der zugeh rigen SIFT Datei gebildet Die 96 T pfchen der Messplatte sind hier durch quadratische per Mausklick eindr ckbare bzw r ckstellbare Kn pfe repr sentiert Dabei sind die Kn pfe der Layout Repr sentation in A gem den auf der Platte vorhandenen T pfchentypen eingef rbt Die Repr sentation in B hingegen zeigt zum einen die Ergebnisse der Ausrei ererkennung wobei diejenigen Kn pfe deren zugrunde liegende T pfchen als Ausrei er erkannt wurden durch einen wei en Querbalken als durchgestrichen markiert sind Zum anderen sind in B die Er gebnisse der Wirksamkeitsberechnung durch die Farben der Kn pfe kodiert Anhand der hierbei verwendeten Farbskala wurden die T pfchenrepr sentationen von unwirksamen Substanzen in roten und diejenigen von wirksamen Substanzen in gr nen T nen einge f rbt Beide Repr sentationen A und B dienen als Bestandteile von SIFT Viewer II der Aus wahl von einzelnen T pfchen oder von bestimmten Mengen von T pfchen per Mausklick F r die Auswahl von T pfchenmengen existieren t pfchenabh ngige Kontextmen s wie das in B gezeigte welche der Benutzer durc
191. n Bereich 2D SIFT Spektren dargestellt EEE BOW Te A ae Ie EEE sectors SIFT Plates Im rechten unteren Bereich sind die 2D SIFT Spektren fiir die ausgew hlten T pfchen geplottet wobei negative Kontrollspektren rot positive Kontrollspektren gr n und Sub stanzspektren grau eingef rbt sind Dabei verwendet SIFT Viewer II dieselbe Farbkodie rung wie in der Layout orientierten Plattenrepr sentation die hier verborgen ist aber in Abbildung 3 8A eingesehen werden kann ber die Karteikartenreiter unterhalb des Spek trenplots k nnen Dosis Wirkungs Kurven oder Dosis Gesamtintensit ts Kurven Reiter Dose Observable wie jene aus Abbildung 3 9 angezeigt werden Weil bei der gezeig ten Prim rscreeningmessung jede Substanz nur bei einer Konzentration gemessen wurde bieten diese Darstellungen hier nur eingeschr nkten Nutzen Unterhalb der beschriebenen Darstellungen befinden sich Drop Down Men s aus wel chen wie oben beschrieben wurde die Methoden zur Ausrei ererkennung und zur Wirk 70 3 7 Alternative Datenverwaltung mit ChemFinder samkeitsberechnung ausgew hlt werden k nnen ber die zugeh rigen update Kn pfe wird die gew hlte Prozessierung angesto en Die Eintr ge des Men s und die Symbolkn pfe links oben stellen dem Benutzer zus tz liche Bedienm glichkeiten zur Verf gung Dazu geh ren ein Dialog zur Auswahl einer SIFT und der zugeh rigen Layout Datei sowie ein D
192. n Medikamente nahe Die zu findenden Wirkstoffe k nnten die Prion Vermehrung stoppen indem sie die Anlagerung von PrP an PrP oder die anlagerungsinduzierte Umwandlung von PrP in PrPS hem men oder vollst ndig blockieren Das davor bereits gebildete Prion Material k nnte dann vom heilenden Organismus langsam abgebaut werden sodass auf diese Weise die Krank heit gestoppt und eventuell vollst ndig geheilt wird F r die Suche nach derartigen Wirk stoffen die dazu an PrP oder PrP binden m ssen bieten sich in vitro Systeme wie das PMCA Modell an 1 5 Die Strukturen des Prion Proteins Gegenw rtig ist die Suche nach Wirkstoffen welche an PrP und PrP binden und das Wachstum von PrP verhindern k nnen leider noch ausschlie lich auf rein empirische Suchmethoden beschr nkt Ein Grund daf r ist dass zur molekularen Struktur von PrP nur sehr ungenaue Informationen vorhanden sind Dennoch m chte ich im Folgenden das vorhandene Wissen zu den Molek lstrukturen von PrP und PrP kurz skizzieren 1 5 Die Strukturen des Prion Proteins PrP ist ein Protein das gut 200 Aminos uren umfasst und weitgehend homolog in vielen verschiedenen Spezies vorkommt 38 Es findet sich in gro en Mengen an den synap tischen Endkn pfchen von Nervenzellen 39 Welche Funktion es dort aus bt ist noch weitgehend unbekannt wenn auch begr ndete Vermutungen ge u ert wurden dass es an der Hom ostase von Cu II Ionen beteiligt i
193. n Wirksamkeit zei gen werden als Prim rtreffer erachtet Die Prim rtreffer werden in Verd nnungsreihen mit nurmehr drei Konzentrationen 0 2 uM 2 uM und 20 uM unter Einsatz beider Zell linien berpr ft wobei die Experimente mit den ScN2a Zellen lediglich zur Kontrolle mitgef hrt werden So wurde DIVERSet 1 vollst ndig durchgemustert wobei 575 Prim rtreffer gefunden wurden SMB Die Validierungsmessungen der Prim rtreffer ergaben 70 Substanzen die noch bei einer Konzentration von 1 uM wirksam waren SMB Bei der anschlie enden berpr fung dieser 70 hochwirksamen Substanzen auf ScN2a Zellen zeigten sich 52 Sub stanzen als wirksam Aus DIVERSet 2 wurden bislang Stand 11 06 rund die H lfte der Substanzen im prim ren Screening getestet wobei 262 Prim rtreffer gefunden wurden SMB und ScN2a Bei den Verd nnungsreihenmessungen waren 40 Substanzen auch bei der geringen Konzentration von 0 2 uM noch wirksam SMB 5 2 2 Die Identifikation einer neuen Leitstruktur Nachdem also ein Gro teil der beiden DIVERSet Bibliotheken im SIFT und im Zell kultur Assay von TP3 durchgemustert worden war unterzog ich die Bibliotheken einer strukturellen Clusteranalyse mithilfe des kommerziellen Softwarewerkzeugs Benchware HTS DataMiner vgl Abschnitt 4 2 Diese Analyse unterteilt die Substanzen der gege benen Sammlung in Cluster von strukturell hnlichen Substanzen und kann daher dazu genutzt werden neue potenzielle Leitstrukturen aufzu
194. n Zellkultur Screening eingesetzten Modellsystem wurde in TP3 ein weiterer Assay eingerichtet Dieser von Dr Martin Eiden entwickelte zellfreie Kon versions Assay 114 ist dem mit der SIFT Technik untersuchten Assay aus TP1 grund s tzlich hnlich Auch der Konversions Assay ist ein in vitro Modell in dem PrPS und 34 2 5 Therapeutische Behandlung von Scrapie infizierten M usen TP1 rekombinantes PrP zusammen gegeben werden Das PrP induziert eine Umwandlung von PrP in eine teilweise PK resistente Isoform PrP Neu gebildetes PrP kann ber spezifische Antik rper die nur an PrP binden detektiert und quantifiziert werden Auch diesem Assay k nnen Testsubstanzen zugegeben werden um deren Einfluss auf die Um wandlung von PrP in PrP zu messen Mit dem Konversions Assay wurde eine Auswahl von DIVERSet Substanzen die im SIFT Screening Wirksamkeit gezeigt hatten getestet F r unser Teilprojekt ergab sich daraus die Aufgabe anhand der experimentellen Ergebnisse aus dem SIFT Screening und dem Konversions Assay zu berpr fen inwiefern die Ergebnisse der beiden Assays einander bedingen d h ob Korrelationen zwischen den Ergebnissen vorliegen In Ab schnitt 5 1 1 wird von diesen Untersuchungen berichtet 2 5 Therapeutische Behandlung von Scrapie infizierten M usen TP1 Zur berpr fung der therapeutischen Wirksamkeit einzelner ausgew hlter Substanzen die in den vorangegangenen Untersuchungen hohe Wirk
195. n dabei schrittweise um Bindungen und Atome erweitert Es sei angemerkt dass Wasserstoffatome wie beispielsweise diejenigen der OH Gruppen aufgrund der von MoSS eingesetzten Repr sentation von Molek lstrukturen nicht als eigenst ndige Atome betrachtet werden aller Ns gebildeten Strukturklassen Die Klassen S sind gem 4 2 diejenigen Teilmen gen der Bibliothek B deren Substanzen die jeweiligen Strukturmotive K gemein haben Die Klassen werden dabei ausschlie lich anhand der Strukturen der Bibliothekssubstan zen gebildet Wirksamkeiten der Substanzen werden zun chst nicht ber cksichtigt 4 1 2 Ber cksichtigung von Wirksamkeiten in MoSS MOSS bietet nun die M glichkeit beim Bilden der Strukturklassen auch Wirksamkeiten zu ber cksichtigen wodurch erreicht werden soll dass diskriminierende Strukturmotive gefunden werden die h ufig in den wirksamen und selten in den unwirksamen Substanz strukturen vorkommen 145 Bereits vor der Bildung der Klassen unterteilt MoSS dazu die zu durchsuchende Bibliothek B anhand der gegebenen Wirksamkeiten und eines vom Benutzer festgelegten Grenzwertes in die Menge 6 der wirksamen und die Menge B_ der unwirksamen Substanzen In analoger Weise wird bei der Bildung einer Strukturklas 78 4 1 Identifikation und Validierung von Leitstrukturen se S diese Klasse in die Menge S der wirksamen und die Menge S_ der unwirksamen Substanzen aufgeteilt Anhand der Gr en dieser Mengen werden di
196. n die Umwandlung von zellul rem Prion Protein PrP in die krankheitsassoziierte Scrapie Isoform PrP ist 13 Au er dem vermutet man dass PrP zum einen als Schablone f r diese Umwandlung wirkt und zum anderen als toxisches Agens das die Fehlfunktion und den Tod von Nervenzellen verursacht 5 15 Abbildung 1 2 zeigt sogenannte Western Blots von Hirn Homogenaten gesunder und mit Prionen infizierter Hamster in denen Prion Proteine ber Antik rper sichtbar gemacht wurden Wie anhand der Blots zu erkennen ist besitzt PrPS einen Abschnitt der resistent gegen ber Verdauung mit der Proteinase K PK ist schwarze Bande in Reihe 4 Die PK ist ein in der Biochemie h ufig eingesetztes proteolytisches Enzym welches Proteine oder Peptide spalten kann indem es die Hydrolyse von Peptidbindungen katalysiert Die Anwesenheit des PK resistenten PrP Fragmentes das zwischen 27 und 30 kDa 1 Da 1 u schwer ist und deshalb PrP 27 30 genannt wird ist ein molekulares Kennzeichen der Prionkrankheiten 12 14 Bemerkenswerterweise beh lt PrP 27 30 Infektiosit t Die protein only Hypothese wird eindrucksvoll von Experimenten mit sogenannten PrP knockout M usen untermauert deren f r das Prion Protein kodierendes Gen Prn p durch eingebrachte Ver nderungen ausgeschaltet wurde 16 18 Prn p0 0 M use deren Prn p homozygot in beiden Allelen ausgeschaltet ist sind immun gegen eine Infektion mit Scra pie Prionen Ferner zeigen Prn p0 M
197. n durch rote Farbt ne gekennzeichnet Zudem sind Ausrei er mit einem wei en Balken als durchgestrichen gekenn zeichnet Dar ber hinaus bieten beide Plattenrepr sentationen t pfchenweise Tooltips A zur Anzeige von t pfchenspezifischen Informationen und Kontextmen s B zur Auswahl von Sub stanzmengen zu zwei Substanzen geh rigen T pfchen in den Spalten 5 und 6 bzw 7 und 8 ausge w hlt ber die Kontextmen s hinaus enthalten die T pfchenrepr sentationen sogenannte Tooltips wie den in A gezeigten welche dem Benutzer diverse t pfchenspezifische Infor mationen anzeigen sobald der Mauszeiger eine Weile auf ein T pfchen deutet Darstellung von Grafiken hnlich wie der Vorg nger stellt auch SIFT Viewer II Graphen der Summenobservablen der Gesamtintensit ten und der Wirksamkeiten sowie der 2D SIFT Spektren dar vgl den Schnappschuss von SIFT Viewer I in Abbildung 3 4 Anstelle von statischen Grafikdatei en werden hier jedoch dynamische Charts der frei verf gbaren Java Bibliothek JFreeChart 136 zur Darstellung eingesetzt vgl Anhang B Zudem werden im Falle der Spektren von dem entsprechenden dynamischen Chart nur diejenigen Spektren angezeigt die zu den vom Benutzer ber die Plattenrepr sentationen ausgew hlten T pfchen geh ren Dar ber hinaus bieten die Charts dem Benutzer zus tzliche Funktionen wie beispielsweise per Maus Bereiche eines gegebenen Plots auszuw hlen und vergr ert darzustellen 66 3 6 Da
198. n zeitlichen Diskretisierung der gemesse nen Fluoreszenzintensit ten Die in den Diagrammen aufgetragenen Punkte repr sentie ren rot gr n Ereignisse die von Prion Aggregaten von einzelnen Antik rpern oder von PrP Monomeren hervorgerufen wurden als diese den Laserfokus passierten Einzelne Farbstoffe erzeugen dabei rot gr n Ereignisse niedriger Intensit t die in den 2D FIDs als Punkte in den dichten Punktwolken in der N he des Ursprungs erscheinen Hingegen wer den durch gro e Aggregate hervorgerufene rot gr n Ereignisse hoher Intensit t auf vom Ursprung weiter entfernt liegende Punkte in den 2D FIDs abgebildet die insgesamt selte ner sind Genau in diesen Teilen der Verteilungen unterscheidet sich nun die f r eine Mischung ohne Wirkstoffsubstanz erhaltene 2D FID aus Abbildung 2 5C von derjenigen f r eine Mischung mit einem aggregationshemmenden Wirkstoff 2 5D Die Anwesenheit des 25 2 Der Forschungsverbund TSE Therapie Aggregationshemmers verschiebt die Ereignisse hoher Intensit t weg von den gr nen Sektoren unten rechts hin zu den roten Sektoren oben links da in diesem Fall weniger gr n markiertes PrP an die rot markierten PrP Aggregate gebunden ist Diese visuelle Analyse der 2D FID Verteilungen zeigt bereits dass es mit der 2D SIFT Technik grund s tzlich m glich ist die aggregationshemmende Wirkung zugesetzter Substanzen anhand der erhaltenen 2D FID Verteilungen zu messen Um quantit
199. n zu denjenigen Klas sen r aufsummiert deren Codebuchvektoren c dem Prototypen y4 zugeordnet werden Eine der unscharfen Klassen j geh rt zu der in C 11 definierten Trefferklasse 7 ihr Index sei j t Die Zuordnungswahrscheinlichkeit des gegebenen Merkmalsvektors X zu dieser Klasse t wird als neues Wirksamkeitsma W gt 0 1 w awlC o P t Xy C o C 13 definiert welches T pfchen w der Menge W Werte aus dem Intervall 0 1 zuordnet Je wahrscheinlicher der Merkmalsvektor x eines gegebenen T pfchens w zu der unscharfen Trefferklasse geh rt desto n her liegt seine Wirksamkeit a w C o bei 1 C 2 Eine exemplarische Anwendung Um die F higkeiten des skizzierten Klassifikationsverfahrens zu demonstrieren habe ich es exemplarisch auf die Screening Messung einer DIVERSet Platte angewendet Abbil dung C 1 zeigt die von SIFT Viewer II generierte Repr sentation der verwendeten Mess platte in welcher die Kn pfe nach den Typen der repr sentierten T pfchen eingef rbt sind Wie es beim prim ren Screening im SIFT Assay blich war wurden in den T pfchen der Zeilen A bis H und der Spalten 2 bis 11 die 80 Substanzen der ausgew hlten DIVERSet Platte in der ersten Spalte in den Zeilen A C und E Negativ in den Zeilen B D und F Positiv und in den Zeilen G und H Puffer Kontrollen gemessen vgl das Plattenlayout in Abbildung 2 6 138 C 2 Eine exemplarische Anwendung oe Sh GS tap den re deh ed anya ale
200. nander getrennt und eng um die Werte 0 bzw 1 verteilt Durch Ausgehend von der Originalbibliothek in der die Substanzen bei Konzentrationen von 10 mM vorlagen wurden ber mehrere sequentielle Schritte Verd nnungen von 1 1000 erzeugt 91 96 5 1 Entdeckung und Entwicklung einer ersten neuen Wirkstoffklasse Compounds inactives actives SIFT activity Abbildung 5 1 Verteilung der prim ren SIFT Wirksamkeiten f r DIVERSet 1 Die Ver teilungen der prim ren SIFT Wirksamkeiten f r die DIVERSet 1 Substanzen durchgezogene Linie die Negativ Kontrollen gepunktet und die Positiv Kontrollen DOSPA gestrichelt Die Wirksamkeiten der negativen und positiven Kontrollen liegen eng um die Werte 0 bzw 1 verteilt und sind deutlich voneinander getrennt Der Grenzwert zur Definition von wirksamen Substanzen wurde auf 0 5 gesetzt bernommen aus Bertsch et al 91 die Festlegung eines Grenzwertes von 0 5 wurde die Menge der getesteten Substanzen in die unwirksamen lt 0 5 und die wirksamen oder prim ren Treffer gt 0 5 unterteilt Gem der Definition des Wirksamkeitsma es weisen prim re Treffer daher mindestens 50 des anti aggregatorischen Effektes von DOSPA auf Aus dieser ersten Runde des SIFT Screenings erhielten wir 256 prim re Treffer Validierung der Prim rtreffer im SIFT Assay Um die Wirksamkeiten der 256 Prim rtreffer zu berpr fen und um Einfl sse der Sub stanzkonzentrationen auf die Wir
201. nd dadurch die Fluoreszenzsignale der einge setzten Farbstoffe berlagert werden Des weiteren kann eine getestete Substanz durch sogenanntes Quenching die Fluoreszenz der eingesetzten Farbstoffe reduzieren Derartige unerw nschte Einfl sse schlagen sich in den zugeh rigen 2D SIFT Spektren nieder und beeintr chtigen deren Interpretation Die nderungen der Messdaten zeigen sich insbe sondere bei den Werten der roten und gr nen Gesamtintensit ten tot r und tot g Fluores zierende oder quenchende Testsubstanzen erh hen bzw erniedrigen die Werte von Jtot r oder Jot gegen ber denjenigen von unkritischen Substanzen Weil sich die Jtot Werte von verf lschenden Substanzen zumeist deutlich abheben sind diese Messgr en zur Er kennung von Ausrei ern geeignet F r die Erkennung von Ausrei ern anhand der Gesamtintensit ten wurden von mir zwei Verfahren entwickelt Beiden Verfahren ist gemein dass damit die Messdaten plattenweise prozessiert werden und dass Verteilungen der beiden Gr en kot r und kor g f r die T pf chen einer gegebenen Messplatte analysiert werden Zur Vereinfachung der Notation seien 38 3 1 Erkennung von Ausrei ern die beiden Gesamtintensit ten durch Jot f symbolisiert wobei f r g als Platzhalter f r rot oder gr n steht 3 1 1 Eine Median basierte Erkennung Das erste Verfahren legt die beiden Verteilungen der f r alle T pfchen einer Platte erhal tenen Gesamtintensit ten Jtot f zug
202. nd des Zellkultur Screenings TP3 weitere potenzielle Leitstrukturen identifiziert worden waren Seine medizinalchemische Erfahrung erlaubt es Schmidt eine gegebene Leitstruktur mit den Mitteln der kombinatorischen Chemie hinsichtlich der pharmakologischen Eigen schaften zu variieren Dabei werden diverse Substituenten an verschiedene Stellen eines Kernmotivs Leitstruktur angebracht und beliebig kombiniert Die Auswahl der Substitu enten erfolgt dabei anhand einer Analyse der Substituentenmuster von Substanzen einer Klasse die in einem vorangegangenen HTS als wirksam identifiziert wurde Zus tzlich werden Substituenten in Betracht gezogen welche erfahrungsgem Eigenschaften wie L slichkeit metabolische Stabilit t oder Membrang ngigkeit steuern k nnen Auf diese Weise k nnen erfahrene pharmazeutische Chemiker aufbauend auf einer schon durchge f hrten HTS Kampagne gro e Mengen neuer potenzieller Wirkstoffe erzeugen welche in einer fokussierten Bibliothek zusammengefasst werden Derartige fokussierte Biblio theken k nnen dann in den unterschiedlichen Modellsystemen des Verbundes hinsichtlich der jeweiligen Wirksamkeiten getestet werden Die Ergebnisse flie en anschlie end in die Entwicklung einer n chsten Generation von weiter optimierten Verbindungen ein Die Einbindung von Prof Schmidt in unseren Verbund stellte mich zun chst vor die Auf gabe ihm die bisher gewonnenen Analyseergebnisse zur Verf gung zu stellen Anschlie
203. nder bietet einige hilfreiche F higkeiten wie die M glichkeit Suchen nach chemi schen Strukturmotiven durchzuf hren oder Listen von Substanzen auszudrucken Chem Finder l ste daher die Verwaltung der Wirksamkeitsdaten mit der TSE DB ab F r die Verwaltung und Analyse von SIFT Messdaten mithilfe von SIFT Viewer II wurde aber die TSE DB weiterhin genutzt Nachdem nun die von mir zur Verwaltung und Auswertung von Substanz Mess und Wirksamkeitsdaten entwickelten oder eingesetzten Softwarewerkzeuge vorgestellt wur den sollen im n chsten Kapitel einige weitere Werkzeuge vorgestellt werden die zur Un tersuchung von Beziehungen zwischen chemischen Strukturen und Wirksamkeiten die nen Die Namen der Felder sind gegen ber denjenigen der entsprechenden TSE DB Tabellen leicht abgewan delt 73 3 Methoden zur Haltung Auswertung und Visualisierung von Daten 74 4 Methoden Zur Untersuchung von Struktur Wirkungs Beziehungen Das vorangegangene Kapitel hat die Anstrengungen erl utert die von mir w hrend der Laufzeit des Verbundprojektes unternommen wurden um die von meinen Partnern erho benen Daten zentral zu sammeln ihre Qualit t zu sichern und einen schnellen visuellen Zugriff darauf zu erm glichen Da diese Daten Informationen ber die anti Prion Wirk samkeit einer Vielzahl chemischer Substanzen unterschiedlichen Aufbaus enthalten k n nen sie genutzt werden um allgemeine Struktur Wirkungs Beziehungen SAR stru
204. ndung an Helix 3 betreffen weil das mutierte Residuum M205 sich an der Bindestelle zwischen diesen beiden Helizes befindet vgl Abbildung 1 6 Dar ber hinaus implizieren aktuelle Modelle f r die Struk tur von PrP wie das in Abbildung 1 7 gezeigte dass bei der Umfaltung von PrP nach PrP Helix 1 ihre Struktur verliert Im Rahmen eines daraufhin von mir initiierten Pro jekts wurden wildtypisches PrP sowie die beiden Mutanten PrP M205S und PrP M205R mithilfe von Molekulardynamik MD Simulationen untersucht Mein Kollege Bernhard Schropp f hrte damals als studentische Hilfskraft diese Simulationen durch Die Ergeb nisse dieses Beitrags zur Grundlagenforschung der Prionkrankheiten habe ich gemeinsam mit M Stork B Schropp und P Tavan im Biophysical Journal publiziert 113 t 0 t 10 ns Abbildung D 1 Umgebungsabh ngige Faltung von Helix 1 in PrP M205R Gezeigt sind zwei strukturelle Schnappsch sse der Mutante PrP M205R zu Beginn t 0 der MD Tra jektorie und nach 10 ns Das Proteinriickgrat ist jeweils als Band das mutierte Residuum R205 in einer sogenannten Licorice Lakritze Repr sentation dargestellt 141 D Molekulardynamik Simulationen von PrP Die MD Simulationen der PrP Molek le in w ssriger L sung zeigten dass die native Struktur von PrP innerhalb weniger Nanosekunden stark deformiert wird sobald die Punktmutationen M205S und M205R durchgef hrt wurden Im Fall von M205R ist die Deformation durch ei
205. ne Bewegung von Helix 1 weg vom hydrophoben Kern des Prote ins in die w ssrige Umgebung und durch einen anschlie enden strukturellen Zerfall cha rakterisiert Abbildung D 1 veranschaulicht diesen Zerfall von Helix 1 anhand von zwei Schnappsch ssen von PrP M205R zum Beginn t 0 und zum Ende der Simulation nach t 10 ns Der Zerfall legt nahe dass die hydrophobe Anbindung von Helix 1 an Helix 3 bei dem Residuum M205 f r die korrekte Faltung von Helix 1 in ihre stabile native Struktur not wendig ist Das Residuum M205 erf llt dadurch die Funktion einer intramolekularen Cha perone f r die Faltung von Helix 1 Zusammen mit CD und NMR spektroskopischen Untersuchungen von Helix 1 Modellpeptiden in verschiedenen L sungsmitteln 182 183 legt der in der Simulation von PrP M205R beobachtete Zerfall von Helix 1 nahe dass die Stabilit t von Helix 1 durch die Dielektrizit tskonstante der Umgebung gesteuert wird Solange Helix 1 an den hydrophoben Kern des Proteins angelagert ist Kann sie wegen der dort erniedrigten Dielektrizit tskonstante in eine stabile helikale Struktur falten In w ssriger Umgebung ist die Helix jedoch instabil Der Zerfall von Helix 1 in hydrophiler Umgebung unterst tzt jene Strukturmodelle f r PrP die eine Umfaltung von Helix 1 postulieren 142 Literaturverzeichnis 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 R G Will J W Ironside M Zeidler S N C
206. ne Leitstruktur definierte Substanzklasse Teilklassen enth lt die zu bestimmten Derivaten der Leitstruk tur geh ren und durch signifikant gro e Wirksamkeiten ausgezeichnet sind Findet man n mlich solche Teilklassen so ist dadurch gezeigt dass die urspr nglich gefundene Leit struktur den Kern eines potenziellen Pharmazeutikums bildet Man sagt dann dass durch diesen Prozess der SAR Analyse von Subklassen die urspr nglich gefundene Leitstruk tur erst als solche validiert wird Die von mir zur Beantwortung der hier aufgeworfenen Fragen eingesetzten bzw entwickelten Werkzeuge werde ich in Abschnitt 4 1 beschreiben ber die oben angesprochenen Fragen hinaus stellt sich hier die allgemeinere Frage ob das Auffinden neuer potenzieller Leitstrukturen wie in unserem Fall zun chst geschehen auf Zuf lle und gl ckliche Umst nde angewiesen ist oder ob es nicht doch vielmehr m g lich ist solche Leitstrukturen systematisch aus gesammelten HTS Daten zu identifizieren Liest man die Werbeprospekte von kommerziell verf gbaren Softwarepaketen zur phar makologischen Datenanalyse so kann man meinen dass dazu eine Vielzahl von L sungen einkaufbar sind Allerdings stellte sich heraus dass ein erstes f r diese Zwecke einge kauftes Paket Catalyst Firma Accelrys 142 die erhoffte L sung nicht brachte Erst drei Jahre nach Beginn des Projekts erhielt ich durch Kontakte zur Firma Evotec Technolo gies 105 die Pharmaforschung im Auftrag
207. ne hilfreiche Zusatzfunktion der Ta bellendarstellungen bietet sich dem Benutzer beim Klicken auf die Spalten berschriften wodurch die Substanzen nach den in der angeklickten Spalte enthaltenen Wirksamkeits werten sortiert werden 61 3 Methoden zur Haltung Auswertung und Visualisierung von Daten Der TSE DB Browser ist also ein n tzliches Werkzeug f r den Zugriff auf die in der TSE DB abgelegten Daten An dieser Stelle sei angemerkt dass die TSE DB in der Anfangs phase des Verbundprojektes als in TP1 das SIFT Screening der DIVERSet Bibliotheken durchgef hrt wurde f r die Haltung der komplizierten SIFT Messdaten konzipiert wur de Der urspr ngliche Zweck der TSE DB war die rohen SIFT Messdaten an einer f r TP1 und unser Teilprojekt zentralen Stelle zu halten damit wir gemeinsam die Verfah ren zur automatisierten Auswertung und Aufbereitung entwickeln und einsetzen konnten die von dem im folgenden Abschnitt beschriebenen Werkzeug SIFT Viewer II zur Verf gung gestellt werden Erst sp ter als nach und nach auch weitere Assays in den brigen Teilprojekten eingesetzt wurden wurde die TSE DB auf die Haltung dieser zus tzlichen Wirksamkeitsdaten ausgeweitet und der TSE DB Browser programmiert Die TSE DB und die beiden zugeh rigen Werkzeuge dienten daher vorrangig unseren M nchner Part nern aus TP1 f r die Auswertung der komplizierten SIFT Messdaten und die Inspektion der Ergebnisse aus den brigen Teilprojekten F r die H
208. ne nach dem T pfchentyp getrennte Erkennung SIFT WirksamkeitsmaBe 2 2 2 Con 3 2 1 Observablen aus den 2D SIFT Spektren 3 2 2 Ein auf die Kontrollen bezogenes Wirksamkeitsma 3 2 3 Ein auf die Testsubstanzen bezogenes Wirksamkeitsma Elektronische Daten zu den DIVERSet Bibliotheken 3 3 1 Molek lstrukturen 22 2 u 05 zu 24 aan sans aa 3 3 2 Eindeutige Namen f r die DIVERSet Substanzen xi xiii NULU 15 16 17 19 21 21 22 24 29 30 33 35 36 37 38 39 40 4 42 42 43 44 44 46 vii Inhaltsverzeichnis Vili 3 3 3 Physikochemische Eigenschaften 3 4 Das Visualisierungspaket SIFT ViewerI 3 4 1 SIFT Dateien und die Extraktion von Messdaten 3 4 2 Grafische Aufbereitung von SIFT Daten 3 4 3 Darstellung von Molek lstrukturen 3 4 4 Die SIFT Viewer I zugrunde liegende Verzeichnishierarchie 3 4 5 Webbrowser basierte Visualisierung mit SIFT ViewerI 3 5 Die Screening Datenbank TSE DB 3 5 1 Modellierung und Installation der TSE DB 3 5 2 Datenformate und Bef llung der TSE DB 3 5 3 Zugriff mit TSE DB Browser 4 3 6 Das Analysewerkzeug SIFT Viewerl 2 2 22 222m 3 6 1 Die F higkeiten von SIFT Viewerl 3 6 2 Einblicke in die Bedienung von SIFT Viewer 1 3 7 Al
209. net wurden Die Wirk samkeiten aus A welche die Zuordnungswahrscheinlichkeiten der T pfchen zur Treffer klasse 7 angeben liegen f r die T pfchen B1 D1 und Fl nahe bei 1 0 f r das T pfchen C3 bei 0 88 und f r die brigen T pfchen bei Werten nahe 0 0 T pfchen C3 stellt daher einen Prim rtreffer im Sinne dieses Ma es dar Die kontrollenbezogene Wirksamkeit B f r T pfchen C3 liegt bei 0 72 sodass die Substanz auch von diesem Ma als Treffer ein gestuft wird Auch den Testsubstanzen aus weiteren T pfchen beispielsweise C4 0 31 und C11 0 34 werden moderate Wirksamkeiten zugeordnet Das Verfahren stellt also eine alternative Methode zur Treffererkennung dar und wurde in geringem Umfang beim Screening der DIVERSet Bibliotheken eingesetzt 140 D Molekulardynamik Simulationen von PrP Von Konstanze Winklhofer und weiteren Mitarbeitern aus der Gruppe von J rg Tatzelt TP4 war das N2a Zellkulturmodell vgl Abschnitt 2 3 dazu eingesetzt worden den Ein fluss von Mutationen des Prion Protein Gens auf die Faltung und Maturierung von PrP zu untersuchen 112 Die Untersuchungen hatten gezeigt dass die Punktmutationen M205S und M205R d h die Ersetzung des hydrophoben Residuums M205 durch hydrophile Re siduen die Faltung und Maturierung von PrP st ren 112 Die St rungen wurden als Konsequenzen von mutationsinduzierten strukturellen nderungen von PrP interpretiert von denen angenommen wurde dass sie Helix 1 und ihre Anbi
210. ng aller Substanzstrukturen der betrachteten Messplatte dar Im hier exemplarisch gezeigten Fall sind dort 80 Strukturen in Zeilen a drei Strukturen angeordnet Wie im rechten Bereich von Abbildung 3 10 schematisch dargestellt ist verteilt SIFT Viewer II die Bilder der Molek lstrukturen auf ein Raster mit jeweils drei Bildern pro Zei le Da die Zahl der Substanzen auf einer Platte gro sein kann im Falle des DIVERSet Screenings wurden jeweils 80 Substanzen auf einer 96 Well Platte gemessen und der Darstellungsbereich begrenzt ist kann nur ein kleiner Ausschnitt des Rasters angezeigt werden vgl Abbildung 3 10 links W hlt der Benutzer ber die oben beschriebenen T pfchenrepr sentationen eine Substanz aus so wird dieser Ausschnitt so verschoben dass sich das Bild der zugeh rigen Struktur im Ausschnitt befindet Zudem wird dieses Bild fett umrandet dargestellt 68 3 6 Das Analysewerkzeug SIFT Viewer II Generierung von Reports Um die von SIFT Viewer II erzeugten Visualisierungen f r die sp tere Betrachtung und Diskussion aufzubewahren bietet SIFT Viewer II die M glichkeit einen Report der be trachteten Plattenmessung in Form einer pdf Datei Portable Document Format 138 abzuspeichern Bei der Generierung eines solchen Reports werden von SIFT Viewer II Schnappschiisse der diversen oben beschriebenen grafischen Komponenten erzeugt und gemeinsam mit weiteren Informationen in einer pdf Datei zusammengestellt SIFT
211. ngedeutet wurde soll diese Gr e hier kurz erl utert werden 121 Experimentell wird LogP bestimmt indem die gegebene Substanz in ein zweiphasiges System aus apolarem Oktanol und polarem Wasser gebracht wird und anschlie end die Konzentrationen Ko und Kw der Substanz in Oktanol bzw Wasser gemessen werden Die Gr e LogP ist dann definiert als Logarithmus des Verteilungskoeffizienten P Ko Kw 46 3 4 Das Visualisierungspaket SIFT Viewer I wobei gro e Werte lipophile Substanzen markieren Anstelle von durch aufw ndige Mes sungen bestimmten LogP Werten sind in DIVERSet berechnete Sch tzungen cLogP an gegeben siehe 118 f r eine bersicht ber Methoden zur cLogP Berechnung Das Kri terium LogP lt 5 aus Lipinskis rule of five setzt der Lipophilie eine obere Grenze Weil aber keine untere Grenze gesetzt wird sind nach diesem Kriterium beliebig stark polare Substanzen erlaubt Von bekannten Medikamenten wei man aber dass die Polarit t nicht beliebig gro sein darf Um die Polarit t zu begrenzen sind daher in DIVERSet die Werte der gesamten polaren Oberfl che tPSA angegeben und wurden wohl bei der Substanz auswahl von ChemBridge ber cksichtigt denn die in DIVERSet enthaltenen Substanzen besitzen tPSA Werte die kleiner als 100 sind Da die Molek lstrukturen und die physikochemischen Eigenschaften der DIVERSet Sub stanzen in verschiedenen Phasen der Medikamentenentwicklung herangezogen werden war es no
212. ngen werden durch die Schreibweise C gt K symbolisiert die besagen soll dass die Strukturen C das Motiv K konkretisieren In m glicherweise zahlreichen weiteren Schritten die in Abbildung 4 1 nur angedeutet sind erweitert MoSS das Kernmotiv K systematisch zu konkretisierten Kernmotiven K gt K indem zus tzliche Bindungen und Atome hinzugef gt werden Die Auswahl der Erweiterungen geschieht dabei in sinnvoller Weise anhand der in der Klasse S K enthaltenen Strukturen MoSS versucht die erweiterten Kernmotive K in die verbliebenen Substanzstrukturen einzubetten wobei die erfolgreichen Einbettungen konkretisierte Substrukturklassen S K definieren Die Kernmotive werden wiederum erweitert und eingebettet bis die resultierenden Klassen nurmehr einzelne Substanzstruk turen enthalten und daher nicht weiter konkretisiert werden k nnen Als Ergebnis dieser systematischen Substruktursuchen liefert MoSS die Liste 6 S K lj 1 Ns 4 3 11 4 Methoden zur Untersuchung von Struktur Wirkungs Beziehungen OH Abbildung 4 1 Systematische Erweiterung von Strukturmotiven Wie hier schematisch dargestellt ist erweitert MoSS ein strukturelles Kernmotiv oben sukzessive um m gliche Substituenten zu konkretisierten Kernmotiven F r diese Kernmotive bildet MoSS strukturelle Klassen in welchen diejenigen Substanzstrukturen zusammengefasst sind die das jeweilige Kernmotiv als Substruktur enthalten Die Motive werde
213. nger ten polyQ Abschnitten exprimieren welche Aggregate bilden die biochemisch detektiert werden k nnen Es sei angemerkt dass die den Embryonen injizierten mRNA Molek le einen zus tzlichen Abschnitt enthalten der f r das gr n fluoreszierende Protein GFP kodiert Weil die Zebrafische transparent sind k nnen die von ihnen produzierten und mit GFP markierten htt Proteine sowie deren Aggregation unter dem Mikroskop beobachtet werden daraus resultierende Bilder und Filme finden sich in 159 und im zugeh rigen Begleitmaterial Das Zebrafischmodell reproduziert also ein wesentliches Merkmal der Pathologie der Huntingtonschen Krankheit Verabreicht man den Fischen Testsubstanzen so kann deren Einfluss auf die polyQ Aggregation analysiert werden ee R 5 H N ace A O sth Koh O N N N O So ne S O HN 306H03 Congo red 2 Abbildung 5 19 Strukturen der Substanzen 306H03 und Congo red Diese Substanzen wurden wie die Substanzen 293G02 und 313B02 in den experimentellen Testreihen und an hand von Docking Simulationen untersucht Die Substanz 306H03 die der Substanz 293G02 strukturell hnlich ist vgl Abbildung 5 7 hatte zuvor im SIFT Assay und in den Zellkul turmodellen von TP3 und TP4 anti Prion Wirksamkeit gezeigt Congo red ist als amyloid bindender Farbstoff bekannt F r die Untersuchung in dem Zebrafischmodell w hlten wir die Substanz 313B02 und die beiden NBB Substanzen 293G02 und 306H03 vgl
214. nlichen Verlauf der Prionkrankheiten erkl ren 25 1 4 Versuche zur Validierung der Prionhypothese Eis SE a amp Abbildung 1 4 Modell zur Vermehrung von infekti sen Prionen Dieses vereinfachte Mo dell zeigt schematisch wie innerhalb eines Zyklus Ketten von aneinander gereihten PrP Molek len durch Anlagerung von PrP Molekiilen an den Kettenenden wachsen Durch den Bruch von Ketten deren L nge einen kritischen Wert berschreitet verdoppelt sich die Zahl der freien Kettenenden von Zyklus zu Zyklus bernommen aus 25 der durch eine lange Inkubationszeit und ein rasches Fortschreiten im klinischen Stadium gekennzeichnet ist Die Modelle zur Prion Vermehrung zeigen exemplarisch dass die Theorie wichtige Bei tr ge zur Prion Forschung leisten kann indem sie der weitgehend experimentell arbei tenden biologischen und medizinischen Forschergemeinschaft Hinweise auf neue Frage stellungen und experimentelle Ans tze gibt Insbesondere basieren die im folgenden Ab schnitt diskutierten Verfahren zur in vitro Vermehrung von Prionen auf diesen Modellen 1 4 Versuche zur Validierung der Prionhypothese Obwohl die Prionhypothese gemeinhin als richtig angenommen wird weil sie mittlerwei le von sehr vielen experimentellen Ergebnissen untermauert wurde gibt es nach wie vor Skeptiker die nicht ausschlie en wollen dass Prionkrankheiten durch Viren bertragen werden k nnten 30 Der direkteste Beweis f r die protein on
215. nserem Forschungsverbund f r die Medikamentensu che beschafften Substanzbibliotheken DIVERSet 1 und 2 hinsichtlich ihrer pharmakologi schen Eigenschaften beschrieben Dort wurde au erdem erkl rt dass die in den Bibliothe ken enthaltenen Substanzen in DMSO gel st und auf Mikrotiterplatten verteilt vom Her steller ChemBridge 95 geliefert wurden Neben den realen Substanzen war im Lieferum fang der beiden Bibliotheken jeweils eine Datenbank enthalten in der zu jeder Substanz die zweidimensionale Molek lstruktur definiert ist sowie eine Reihe von Eigenschaften abgelegt sind Diese Informationen zu den DIVERSet Bibliotheken wurden von Chem Bridge in Form von zwei gro en Dateien im sdf Format structure data file MDL 117 mitgeliefert Abbildung 3 1 zeigt exemplarisch einen Auszug der zu DIVERSet 1 geh ri gen sdf Datei in welchem eine Substanz dieser Bibliothek beschrieben ist 3 3 1 Molek lstrukturen Im ersten Teilabschnitt der Substanzbeschreibung ist die Molek lstruktur in dem verbrei teten mol Format 117 definiert Dazu sind die in dem ausgew hlten Molek l enthalte nen Atome deren Typen und hier zweidimensionale Koordinaten angegeben Die Bin dungen zwischen den Atomen sind durch eine Konnektionstabelle definiert Das sdf For mat erweitert das mol Format welches lediglich zur Definition der Struktur eines einzel nen Molek ls vorgesehen ist zum einen dadurch dass im sdf Format neben der Struktur zus tzliche Eigenscha
216. nszeiten um 11 5 bzw 9 5 Tage Die beobachteten Verl ngerungen der berlebenszeiten stimmen in etwa mit der Behand lungsdauer von 14 Tagen berein was bedeuten k nnte dass die Behandlung mit diesen Substanzen den Krankheitsfortschritt anhalten konnte solange die Medikamente verab reicht wurden Obwohl die Krankheit durch die Behandlung nicht geheilt werden konnte weisen die Resultate darauf hin dass bei TSE Patienten der Krankheitsverlauf durch eine Therapie mit diesen Substanzen abgeschw cht werden k nnte In diesem Fall w rde die Behandlung mit diesen Medikamenten zu einer Lebensverl ngerung und zu einer Stabili sierung des Gesundheitszustandes f hren 110 5 1 Entdeckung und Entwicklung einer ersten neuen Wirkstoffklasse 165 crn 2 100 BE 155 cc mn ge 28 150 o S 145 140 N N N 2 S a 8 mM 2 oO a gt 3 2 Abbildung 5 15 Mediane der Sterbealter F r Gruppen von M usen die mit den Substanzen 313B02 293G02 309F02 oder zur Kontrolle mit DMSO behandelt wurden sind die Mediane der berlebenszeiten in Tagen nach der Infektion dargestellt Der Median der berlebenszeit der n 8 mit DMSO behandelten Tiere lag bei knapp 150 Tagen W hrend die Behandlung mit der Substanz 313B02 die berlebenszeit nicht verl ngern konnte f hrten die Substanzen 309F02 und 293G02 zu deutlichen Verl ngerungen der medianen berlebenszeiten von 11 5 bzw 9 5 Tagen Clearance von PrP in der Milz Um das Vo
217. nten Auch bei dieser reduzierten Konzentration erwiesen sich noch vier dieser sechs Substan zen als wirksam Diese vier Substanzen wurden anschlie end im Zellkulturtest einer Dosis Wirkungs Ana lyse unterzogen Abbildung 5 2 zeigt die resultierenden Western Blots der aus den Zell lysaten pr parierten unl slichen Fraktionen vgl Abschnitt 2 3 welche das von den Zel len produzierte PrP enthalten Die schwachen Banden f r die Substanzen 293G02 und 313B02 zeigen an dass diese Substanzen die Zellen besonders wirksam von PrPSC befrei en k nnen Quantitative Analysen der Western Blots f r diese beiden Substanzen ergaben EC50 Werte von ungef hr 2 uM bzw 6 uM Als Zusammenfassung der Ergebnisse des mehrstufigen Screenings im SIFT und im Zell kultur Assay zeigt die Tabelle in Abbildung 5 3 wie ausgehend von den 10 000 Substan zen der DIVERSet 1 Bibliothek die Menge der wirksamen Substanzen schrittweise ein Hier wurden Kurzformen der gem 3 11 festgelegten Substanznamen gew hlt 98 5 1 Entdeckung und Entwicklung einer ersten neuen Wirkstoffklasse N xO 293G02 313B02 309F02 305E04 GE a ea S uM 1 3 6 4 8 14 2 4 8 4 8 14 2282 De c _ Abbildung 5 2 Dosis Wirkungs Analyse im Zellkulturmodell ScN2a Zellen wurden f r zwei Tage mit den ausgew hlten Substanzen 293G02 313B02 309F02 und 305E04 in ver schiedenen Konzentrationen von einigen uM behandelt und biochemisch analysiert vgl Ab sc
218. nung vgl Abschnitt 3 1 1 unterzogen wobei sich nur etwa 7 der T pfchenmessungen als unbrauchbar erwiesen Zahlreiche stichprobenartige berpr fungen der automatisierten Ausrei ererkennung ergaben dass zumeist Fluores zenzartefakte wie Autofluoreszenz oder Quenching vgl Abschnitt 3 1 die Ursache der starken Variationen dieser Daten waren SIFT Viewer I erwies sich mithin als brauchbares Werkzeug f r die automatisierte Aufbereitung und Auswertung der SIFT Daten sowie f r deren Inspektion durch meine Kollegen am ZNP und durch mich Also konnte mithilfe dieses Werkzeugs die Qualit t der SIFT Daten gesichert werden Es sei angemerkt dass die SIFT Daten zum DIVERSet 1 Screening sp ter in die damals noch nicht existente TSE DB vgl Abschnitt 3 5 bertragen wurden Anhand der g ltigen T pfchenmessungen 93 konnten den zugeh rigen DIVER Set 1 Substanzen Prim rwirksamkeiten 3 9 zugeordnet werden welche unter Einsatz der SIFT Viewer I Werkzeuge berechnet wurden und welche die anti aggregatorischen Wirksamkeiten der Testsubstanzen kodieren vgl Abschnitt 3 2 Als Resultat der Wirksamkeitsberechnungen zeigt Abbildung 5 1 die Verteilungen der prim ren SIFT Wirksamkeiten f r die Mengen der DIVERSet 1 Testsubstanzen durch gezogene Linie der Negativ Kontrollen gepunktet und der Positiv Kontrollen DOSPA gestrichelt Wie deutlich zu erkennen ist liegen die Verteilungen der negativen und posi tiven Kontrollen klar vonei
219. odell f r PP 2222 12 Fibrillen aus helikalen PrP Molek len 2222 22 13 Lebenszyklus von PrP und Entstehung von PrPP 2 2 2 14 Teilprojekte des Forschungsverbundes TSE Therapie 18 Eine 96 Well Mikrotiterplatte 00 20 SIFT Assay Mischung 2 he ee Oe ee anna 22 SIFT Messaufbau 2 an au Fre a Bas ae 23 Assay Mischungen und 2D FID Verteilungen 25 2D SIFT Spektren f r eine DIVERSet Platte 02 26 Plattenvariabilit t von 2D SIFT Spektren 2 22 2200 28 Der anti PrP Wirkstoff DOSPA 222222222 31 Inhibierung der PrP Bildung in ScN2a Zellen 2 2 2 32 Ergebnisse des Zellkultur Assays f r eine DIVERSet Platte 34 Auszug aus der sdf Datei zuDIVERSet 1 45 Zuordnung von SIFT Plattenmessungen zu DIVERSet Bibliotheksplatten 48 Verzeichnishierarchie zu SIFT Viewer I 52 Bildschirmschnappschuss von SIFT Viewerl 54 ER Diagramm der TSE DB 2 2 Enno 57 Zugriff auf die TSE DB mit dem TSE DB Browser 61 Exemplarische Layout Datei f r eine Messplatte 2 2 2 2 64 T pfchenweise Repr sentationen von SIFT Messplatten 66 Dosis Wirkungs und Dosis Gesamtintensit ts Kurven 67 Von SIFT Viewer II dargestellte Molek lstruktur 68 Bildschirmschnappschuss von SIFT Viewer 70 Bildschirmschnapps
220. oeben beschriebenen modifizierten Einsatzes von MoSS habe ich das Shell Skript xminer sh programmiert welches als Bestandteil des CVS Moduls screening zur Verf gung steht Das Skript xminer sh l sst die Klassenbildung mithil fe von MoSS wirksamkeitsunabh ngig ablaufen f gt den Substanzbeschreibungen Wirk samkeiten aus verschiedenen Testreihen hinzu bildet gefilterte Klassenlisten und bereitet die Ergebnisse f r eine Webbrowser basierte Darstellung grafisch auf Bei der grafischen Aufbereitung werden hnlich wie bei SIFT Viewer I eine Vielzahl von Grafikdateien der Strukturmotive wiederum unter Verwendung des Pakets CACTVS 125 erzeugt und einbettende HTML Dateien angelegt Die generierte Darstellung bietet einen schnellen Zugriff auf die gebildeten Klassen und die darin enthaltenen Substanzen Um den Einsatz von xminer sh zu demonstrieren soll exemplarisch das Ergebnis einer Klassenbildung f r die Substanzen der DIVERSet 1 Bibliothek gezeigt werden F r die Bildung der Klassen wurde als Ausgangsmotiv ein einzelnes Kohlenstoffatom gew hlt und als Randbedingung gefordert dass die Kernmotive der zu bildenden Klassen jeweils mindestens 10 Atome enthalten sollen MoSS erzeugte daraufhin eine Liste mit insgesamt 5476 Klassen aus welcher von xminer sh diejenigen 29 Klassen ausgew hlt wurden die mehr als drei Substanzen enthalten S gt 3 von denen mehr als 50 in Zellkultur wirksam sind Py gt 0 5 gem Gleichung 4 6
221. on PrP in PrP autokatalytisch abl uft Dagegen postulierte Peter Lansbury 22 23 ein Modell eines im Wesentlichen eindimensionalen Kristallwachstums nach dem eine Kette aus aneinander gereihten PrP Molek len w chst indem sich ein zelne PrP Molekiile an den Enden anlagern und in die PrP Form umgewandelt werden Bedingung f r das Wachstum einer Kette ist die Bildung eines Kristallisationskeimes Ei ne solche Protofibrille muss erst eine kritische L nge erreicht haben bevor sich schneller neue Molek le anlagern als alte wieder abgespalten werden Das skizzierte Kettenmodell f gt sich zwanglos in den experimentellen Befund ein dass PrP Partikel aus amyloiden Fasern bestehen Manfred Eigen 24 untersuchte die chemische Kinetik der von Cohen et al und von Lansbury postulierten Mechanismen und fand dass das Hetero Dimer Modell nicht plau sibel ist wenn realistische Werte f r die kinetischen Konstanten angenommen werden Eigens Untersuchungen ergaben dass nach dem Hetero Dimer Modell die Konzentrati on von PrP entweder stetig abnehmen oder ansteigen m sste und dass demzufolge die Prionkrankheiten stets von selbst heilen oder viel h ufiger spontan auftreten m ssten als dies bei den sporadischen Varianten der Fall ist 25 Eigen l ste dieses Problem indem er eine kooperative Wechselwirkung zwischen mehr als zwei PrP Einheiten postulierte die f r die autokatalytische Strukturumwandlung n tig sein soll Diese Ko
222. operativit t war von dem Prinzip der sogenannten allosterischen Enzyme motiviert die erst durch Anlage rung eines Effektor Molek ls in eine wirksame Form umgewandelt werden Ferner konnte Eigen auch die Keimbildungsphase aus Lansburys Kettenmodell als eine Art kooperative Wechselwirkung interpretieren 25 Damit wird also die spontane Bildung stabiler Krank heitskeime als sogenannte seeded aggregation aufgefasst Abbildung 1 3 zeigt ein Schema der Energetik eines solchen Prozesses welches von Paul Tavan im Rahmen seiner Vorlesung Theoretische Grundlagen der molekularen Biophy sik 26 im Wintersemester 05 06 vorgestellt wurde Er postulierte dabei den gezeigten qualitativen Verlauf der freien Energie als Funktion der L nge der Prion Aggregate Da nach muss f r die Bildung eines stabilen Aggregationskeimes erst eine energetische H rde berwunden werden bevor sich weitere Molek le energetisch g nstig anlagern K nnen Dieselbe Fragestellung untersuchte meine Kollegin Martina Stork anhand von Moleku lardynamik MD Simulationen von poly Glutamin Q Peptiden 27 die bei der Hun tingtonschen Krankheit und bei weiteren neurodegenerativen Krankheiten als Bausteine von pathologischen Aggregaten vorkommen F r die untersuchten 36 Residuen umfassen den poly Q Peptide von denen angenommen wird dass sie in den amyloiden Aggregaten eine spezielle zweifach gewundene helikale Struktur aufweisen konnte gezeigt wer den dass die
223. otenzielle Leitstrukturen validiert werden konnten siehe Kapi tel 5 85 4 Methoden zur Untersuchung von Struktur Wirkungs Beziehungen unteres oberes Quartil Quartil Minimalwert Median Maximalwert Abbildung 4 5 Box and Whisker Plot f r eine Wirksamkeitsverteilung Die exemplari sche Verteilung von Wirksamkeitswerten kurze senkrechte Striche wird mithilfe eines Box and Whisker Plots durch Minimal und Maximalwert Median lange senkrechte Striche und Quartile charakterisiert Dabei definieren die Quartile eine Box und Minimal und Maximal wert die Whisker Grafische Darstellungen von Wirksamkeitsverteilungen Damit klassenlokale Wirksamkeitsverteilungen einzelner Substrukturklassen besser beur teilt werden k nnen wurden zus tzlich zu einfachen Mittelwerten sogenannte Box and Whisker Plots eingesetzt Abbildung 4 5 zeigt einen solchen Box and Whisker Plot f r ei ne exemplarische Verteilung von Wirksamkeitswerten Diese aus der deskriptiven Statistik stammenden Diagramme repr sentieren eine gegebene Verteilung von Werten durch f nf charakteristische Werte n mlich durch den Minimal und den Maximalwert den Median sowie die beiden sogenannten Quartile Analog zum Median der gem Gleichung 3 1 die Mitte der in der Verteilung enthaltenen Werte angibt geben das untere und das obere Quartil diejenigen Werte an unterhalb bzw oberhalb derer jeweils ein Viertel der Werte der Verteilung liegen Zur Darstellung solcher B
224. ousens K Estibeiro A Alperovitch S Poser M Pocchiari A Hofman und P G Smith A new variant of Creutzfeldt Jakob disease in the UK Lancet 347 921 925 1996 1 M E Bruce R G Will J W Ironside I McConnell D Drummond A Suttie L McCard le A Chree J Hope C Birkett et al Transmissions to mice indicate that new variant CJD is caused by the BSE agent Nature 389 498 501 1997 1 The National Creutzfeldt Jakob Disease Surveillance Unit CJD Statistics 2006 http www cjd ed ac uk fiqgures htm 1 Bundesministerium f r Bildung und Forschung F rderschwerpunkt zur Erforschung von Therapiem glichkeiten f r menschliche TSE Erkrankungen http www gesundheitsforschung bmbf de de 396 php 1 17 S B Prusiner Prions Proc Natl Acad Sci USA 95 13363 13383 1998 1 2 3 4 W Hadlow Scrapie and kuru Lancet ii 289 290 1959 3 I Klatzo D C Gajdusek und V Zigas Pathology of Kuru Lab Invest 8 799 847 1959 3 D C Gajdusek C J Gibbs und M Alpers Experimental transmission of a Kuru like syn drome to chimpanzees Nature 209 794 796 1966 3 C J Gibbs D C Gajdusek D M Asher M P Alpers E Beck P M Daniel und W B Matthews Creutzfeldt Jakob disease spongiform encephalopathy transmission to the chimpanzee Science 161 388 389 1968 3 I Pattison und K Jones The possible nature of the transmissible agent of scrapie Vet Rec 80 2 9 1967 3 J S
225. ox and Whisker Plots die auch Candlestick Repr sentationen genannt werden dient die von mir geschriebene Prozedur candle_inhib des IDL Mo duls screening_inhibition pro welches ebenfalls von dem CVS Modul scree ning bereitgestellt wird Box and Whisker Plots wurden nicht in die Webbrowser basier te Darstellung von hMoSS integriert sondern mussten f r ausgew hlte Substrukturklassen mithilfe des IDL Skripts h ndisch erzeugt werden Dynamische Java basierte Bildung von Strukturklassen hnlich wie das Webbrowser basierte Werkzeug SIFT Viewer I durch die Java basier te Variante SIFT Viewer II ersetzt wurde so habe ich auch f r das statische Werkzeug hMoSS eine dynamische Java basierte Variante hMoSS II entwickelt und implementiert Die zu diesem Werkzeug geh rigen Java Klassen werden von dem CVS Modul hmoss bereitgestellt Zur Erl uterung der zus tzlichen F higkeiten von hMoSS II zeigt Abbildung 4 6 einen Schnappschuss dieses Werkzeugs Wie bei hMoSS ist im linken Bereich der Darstellung eine Hierarchie von Strukturklassen und im rechten Bereich eine ausgew hlte Klasse zu sammen mit dem Kernmotiv oben links der Liste der enthaltenen Substanzen und deren 86 4 1 Identifikation und Validierung von Leitstrukturen 5 x CEONN Cc1cecec1 c3cccec3 502 I CEOJEN N C e1 ciicieie1 ieteicice1 C 13 c eeicicic 1 lieleicieieit N 11 C etieeieieiet etieteieicieit O 96 E CEO JEN N C 1 c c c c 1 c1
226. palte ab der zweiten Zeile die Hydrazide H bis H7 in der ersten Zeile ab der zweiten Spalte die Aldehyde A bis Ay und in den restlichen T pfchen au er in dem leeren T pfchen in der ersten Zeile und ersten Spalte deren Kombinationen angeordnet Den Substanzen der Platten II und III liegen zeilenweise die selben Hydrazide H H7 aber spaltenweise andere Aldehyde A12 A22 bzw A23 A33 zugrun de Die verbliebenen Hydrazide Hg bis Hig wurden auf den Platten IV und V mit den jeweiligen Aldehyden kombiniert I gt A B gt C D 96 T pfchen NBB Platte 384 T pfchen Messplatte Abbildung 5 10 Bef llung einer 384 T pfchen Messplatte Die NBB Substanzen einer 96 T pfchen Platte wurden bei drei verschiedenen Konzentrationen auf die drei Quadranten A B und C einer 384 T pfchen Messplatte bertragen und mit der SIFT Technik gemessen Kon trollen wurden nur in Quadrant D mitgef hrt Dadurch sollte eine Dosis Wirkungs Analyse erm glicht werden 105 5 Ergebnisse und Diskussion SIFT Messung und auswertung Um die neu synthetisierten NBB Substanzen einer Dosis Wirkungs Analyse im SIFT Assay zu unterziehen wurden wie in Abbildung 5 10 skizziert ist die Substanzen ei ner 96 T pfchen Platte jeweils bei drei verschiedenen Konzentrationen 10 uM 1 uM 0 1 uM auf die drei Quadranten A B und C einer 384 T pfchen Messplatte bertragen T pfchen mit positiven und negativen Kontrollmischungen
227. piel wird also die Klasse Sg als Wurzel des Baums definiert und ausgehend von So in einem sogenannten Tiefen durchlauf sukzessive die Hierarchie aufgebaut Dabei wird die erste So Teilmenge Sj als Kindknoten von Sg angelegt welcher elementar ist und daher ein Blatt im entstehenden Baum ergibt Die n chste Konkretisierung der Wurzel So ist die Klasse Sg welche ih rerseits durch S2 S und S7 konkretisiert wird etc Wie an der Klasse S4 zu erkennen 83 4 Methoden zur Untersuchung von Struktur Wirkungs Beziehungen ist k nnen Klassen an mehreren Stellen der Hierarchie auftauchen In dieser Hinsicht un terscheidet sich die auf diese Weise gebildete Hierarchie von derjenigen die von MoSS urspr nglich bei der Bildung der Kernmotive durchlaufen wurde denn in jener Hierarchie kommen Kernmotive in der Regel nicht mehrfach vor um redundante Suchen zu vermei den Details der Implementierung Der hier vorgestellte Algorithmus zur Hierarchiebildung wurde von mir in Form des Shell Skripts miner_tree sh implementiert welches Bestandteil des Softwarepakets hMoSS hierarchischer MoSS ist und im gleichnamigen Verzeichnis des CVS Mo duls screening abgelegt ist Zum Verst ndnis der Funktionsweise des Skripts miner_ tree sh sei angemerkt dass von MoSS die Liste der gebildeten Strukturklassen in Form von zwei Textdateien ausgegeben wird Die Datei sub enth lt zeilenweise Angaben zu den gebildeten Substrukturklassen wobei jeweils
228. pongiformen Enzephalopathien TSE oder Prionkrankheiten 5 sind eine Gruppe von t dlichen neurodegenerativen Erkrankungen die bedauerlicherwei se noch immer unheilbar sind Zu den verbreitetsten Prionkrankheiten z hlen die BSE beim Rind die Traberkrankheit Scrapie beim Schaf und die CJD beim Menschen Selte ner auftretende menschliche Prionkrankheiten sind das Gerstmann Str ussler Scheinker Syndrom die t dliche famili re Insomnie und die durch Kannibalismus bertragene und inzwischen nahezu ausgerottete Krankheit Kuru TSE k nnen sporadisch auftreten ber 1 Einleitung Abbildung 1 1 Hi kroskopische Aufnahme eines eingef rbten Schnittes durch das Gehirn eines CJD Patienten Als Merkmale der CJD zeigen sich wei lich erscheinende Vakuolen und violett eingef rb te Ablagerungen die Prionen genannt werden Als Gr enma stab k nnen die als bl uliche Kringel erscheinenden Nervenzellen dienen die einen Durchmesser von etwa 50 um besitzen B Das elektronenmikroskopische Bild von aufgereinigten Prion Ablagerungen l sst deren fi brill re Strukturen erkennen Mit freundlicher Genehmigung von A Giese A bzw M zel und H Diringer B Gene ererbt oder durch Erreger bertragen werden Die h ufigste menschliche Prionkrank heit die CJD tritt in allen drei Varianten auf 5 Patienten der CJD erleiden nach langer symptomloser Inkubationszeit ab dem ersten Auf treten von Symptomen einen rasch fortschreitenden Abbau i
229. r Daten ergab dass vom Konversions Assay tendenziell solche Substanzen als aktiv erkannt wurden die durch sehr hohe SIFT Aktivit ten charakterisiert sind was durch die SIFT EC50 Werte belegt wird die f r 48 der getesteten 70 Substanzen vorlagen W hrend die elf im Kon versions Assay aktiven Substanzen einen mittleren SIFT EC50 Wert von 3 1 uM auf weisen liegt jener der verbleibenden 37 dort inaktiven Substanzen deutlich h her bei 14 6 uM Die bereinstimmung der mit den beiden Methoden erzielten Ergebnisse ist auf die hnlichkeit der Assays zur ckzuf hren denn in beiden Verfahren wird die anti aggregatorische Wirksamkeit gemessen Zellkulturtest der validierten SIFT Treffer Die oben genannten 80 validierten Treffer Substanzen des in vitro SIFT Assays wurden im ScN2a Zellkulturmodell von TP4 vgl Abschnitt 2 3 hinsichtlich ihrer anti Prion Wirk samkeiten untersucht Dabei wurden in einer ersten Runde alle 80 Substanzen bei einer Konzentration von etwa 15 uM getestet Die Western Blots aus Abbildung 2 9 stammen aus dieser ersten Runde und zeigen exemplarisch dass einige der getesteten Substanzen die Zellkulturen von PrP befreien k nnen indem sie die Bildung von PrP hemmen oder den Abbau von PrP anregen In diesem Zellkulturtest wurden acht Substanzen als wirksam gefunden Sechs dieser acht Substanzen waren in ausreichender Menge vorhan den sodass sie zus tzlich bei einer Konzentration von 10 uM evaluiert werden kon
230. r Struktur der krankheitsassoziierten Isoform PrP ist dagegen viel weniger bekannt Die mangelnde Kenntnis liegt darin begr ndet dass PrP bedauernswerterweise f r hoch aufl sende Techniken der strukturellen Analyse unzug nglich ist Konventionelle Fl ssig NMR Techniken scheitern weil die PrP Fibrillen zu gro und unl slich sind und R nt genbeugung kann nur bedingt eingesetzt werden weil es kaum m glich zu sein scheint dreidimensionale Kristalle dieser Fibrillen zu z chten Damit kann R ntgenbeugung le diglich an der eindimensional geordneten Kristallstruktur der Fibrillen ansetzen Aus der CD und Infrarot Spektroskopie ist aber bekannt dass PrP im Vergleich zu PrP einen stark erh hten Anteil an 6 Faltblattstrukturen und einen leicht verringerten Anteil an a helikalen Strukturen aufweist 60 61 Experimente zur R ntgenbeugung an PrP 27 30 St bchen gaben Hinweise darauf dass die enthaltenen 6 Faltblatter parallel zur Fibril lenachse ausgerichtet sind 62 Aufgrund der unscharfen experimentellen Daten existieren f r die Struktur von PrP nur spekulative Modelle Abbildung 1 7 zeigt ein 6 helikales Modell das urspr nglich basie rend auf niedrig aufl senden elektronenmikroskopischen EM Daten zu zweidimensio nalen Kristallen von PrP Protofibrillen vorgeschlagen 63 64 und von meiner Kollegin Martina Stork in Zusammenarbeit mit Armin Giese Zentrum f r Neuropathologie und Prionforschung LMU
231. rankheiten gemeinsame Mechanismen unter liegen und legen nahe dass gemeinsame therapeutische Targets existieren K nnten 5 2 Eine weitere neue Wirkstoffklasse Die umfangreichen oben geschilderten Arbeiten die zur Entwicklung der NBB Wirkstoff klasse f hrten sowie eine Reihe von zus tzlichen Untersuchungen haben schlie lich zur Entdeckung einer weiteren Klasse von neuen Wirkstoffen gegen Prion und verwandte Krankheiten gef hrt Da die neue Wirkstoffklasse durch ein Patent gesch tzt werden soll kann wie zu Beginn des Kapitels angesprochen wurde die chemische Grundstruktur die ser Klasse hier nicht offengelegt werden Jedoch m chte ich von den Arbeiten die zur Entdeckung dieser Klasse gef hrt haben berichten Gegen Ende des Jahres 2003 wurde die zweite Substanzbibliothek DIVERSet 2 beschafft Wie die erste Bibliothek wurde auch DIVERSet 2 im SIFT Assay prim r durchgemustert wobei wiederum SIFT Viewer I zur Datenauswertung eingesetzt wurde Da dieses Werk zeug welches w hrend des Screenings von DIVERSet 1 entwickelt worden war nun in ausgereifter Form zur Verf gung stand konnten die neuen Messdaten rascher ausgewertet werden Dar ber hinaus wurden die Messdaten und Ergebnisse in die neu eingerichtete TSE DB bertragen und konnten daher zus tzlich mithilfe des neu entwickelten Nach folgemodells SIFT Viewer II analysiert bzw visuell inspiziert werden Die beim Prim r screening gefundenen Treffer gut 200 Substanzen wurden
232. ren NMR Messungen von rekombinant herge stellten Prion Proteinen vieler unterschiedlicher Spezies 45 55 wei man dass die Pri on Proteine aller untersuchten Spezies sehr hnliche Strukturen wie das gezeigte mensch liche PrP aufweisen Weil PrP aus nat rlichen Quellen in den f r NMR Messungen notwendigen gro en Men gen nur schwer zug nglich ist wurde in den zitierten Studien stattdessen rekombinant von Escherichia coli Bakterien hergestelltes PrP verwendet Den rekombinanten PrP Kon strukten fehlen jedoch die beiden posttranslationalen Modifikationen die natives PrP kennzeichnen vgl Abbildung 1 5 Diese Modifikationen der Aminos urekette sind zwei angeh ngte Zuckerseitenketten 56 57 sowie ein C terminaler Glycosylphosphatidylino sitol GPI Anker 58 ber den PrP von au en in die Zellmembran eingeh ngt wird K rzlich konnten NMR spektroskopische und Zirkulardichroismus CD Messungen an bovinem PrP durchgef hrt werden welches aus gesunden K lberhirnen behutsam auf gereinigt worden war sodass die angeh ngten Zucker Molek le und ein Teil des GPI Ankers erhalten blieben 59 Nach dieser Studie haben diese Modifikationen keinen Ein 10 1 5 Die Strukturen des Prion Proteins fluss auf die C terminale Struktur von PrP Insgesamt ist damit PrP ein zum Teil nativ gefaltetes posttranslational stark prozessiertes und membranverankertes Protein welches jedoch auch nativ ungefaltete Abschnitte aufweist Zu
233. rkommen von PrP Ablagerungen in der Milz zu untersuchen wurden wie in Abschnitt 2 5 erl utert wurde aus den Milzen der get teten M use Gewebeschnitte pr pariert und die darin enthaltenen PrP Ablagerungen ber Antik rper eingef rbt Abbildung 5 16 zeigt mikroskopische Aufnahmen von solchen Gewebeschnitten durch die Milzen von zwei M usen Der Schnitt in A zeigt das Milzgewebe einer mit DMSO behan delten Maus und l sst r tlich eingef rbte PrP Ablagerungen erkennen die in B weiter vergr ert dargestellt sind In C ist das Milzgewebe einer Maus die mit der Substanz 293G02 behandelt worden war gezeigt Hier wie auch f r die anderen mit der Substanz 293G02 behandelten M use konnten keine Zeichen von PrP detektiert werden was zeigt dass diese in die Bauchh hle gespritzte Substanz eine sogenannte Clearance von PrP in der Milz bewirkt Dieses Ergebnis zeigt dass die Substanz 293G02 im gew hlten Versuchsszenario eine ausgepr gte anti Prion Wirksamkeit in der Milz vermittelt Da die Substanz intraperitone al verabreicht wurde ist es wahrscheinlich dass sie dieses Organ leichter erreichen konnte als das Gehirn Die Therapie mit der Substanz 293G02 konnte die PrP Ablagerung und den Krankheitsfortschritt im Gehirn aber wohl deshalb nicht verhindern weil sie entweder die Blut Hirn Schranke nicht effizient berwand oder zu rasch im Organismus abgebaut wurde Um solche Fragen der Bioverf gbarkeit zu kl ren wurd
234. rototypen und gem C 10 zugeh rige scharfe Klassen ki gebildet deren Anzahlen zwischen Nmin 1 und Nmax 9 lagen Abbildung C 2 zeigt die Ergebnisse der Klassifikation auf einer Skala o mit N 2 Klas sen K l und K2 In A ist eine von SIFT Viewer II generierte Repr sentation der Messplatte gezeigt in welcher die Kn pfe nach der Zugeh rigkeit der Merkmalsvektoren x zu den beiden Klassen eingef rbt sind KC rot K2 gr n Wei durchgestrichene und schwarz hinterlegte Kn pfe markieren die Ausrei ert pfchen denen auch die beiden Puffer Kon trollen T pfchen G1 und Hl angeh ren Die meisten T pfchen wurden der roten Klasse Kl zugeordnet Die gr ne Klasse K umfasst alle drei Positiv Kontrollen T pfchen B1 D1 und F1 und stellt daher gem C 11 die Trefferklasse 7 dar Dieser Klasse geh rt auch das T pfchen C3 an die darin gemessene Testsubstanz wird als Treffer angesehen In B sind die Merkmalsvektoren x f r die validen T pfchen dargestellt und gem der selben Farbkodierung eingef rbt Die gr n gef rbten Merkmalsvektoren die der Treffer klasse 7 K2 zugeordnet wurden unterscheiden sich von jenen der Klasse K beson ders deutlich durch die ersten beiden Komponenten der dimensionreduzierenden Trans formation PC1 und PC2 sowie durch die skalierten Grauwerte und Kontraste 139 C Eine Methode zur vorurteilsfreien Klassifikation von SIFT Daten 2 00 A 1 75 1 50 FERIITERE TE Fe A LI
235. rstellung im mittleren Bereich ausgew hlt Dort ist oben das Kernmotiv der Klasse und darunter eine Tabelle der darin enthaltenen Substanzen angezeigt Wie aus der Tabelle entnommen werden kann waren vier der Substanzen wirksam 1 0 im Zellkultur Scree ning wohingegen im SIFT Screening lediglich die Substanz 10278_A03 eine leicht anti aggregatorische Aktivit t zeigt Durch Klicken auf den Substanznamen wurde diese Sub stanz f r die Darstellung im rechten Bereich ausgew hlt Die gezeigte Klasse geh rt der Superklasse der Benzothiazole an die als Wirkstoffe gegen die mit der Huntingtonschen Krankheit assoziierte Proteinaggregation bekannt sind 150 Das beschriebene Werkzeug xminer sh wurde erst j ngst von mir entwickelt und kann wie das geschilderte Beispiel demonstriert auch zur Identifikation von potenziellen Leit strukturen eingesetzt werden Infolge des dabei allgemein zu w hlenden Ausgangskern motivs etwa eines C Atoms ist jedoch der Speicherbedarf f r die Bildung der umfangrei chen Klassenliste betr chtlich und der Einsatz dieses Werkzeugs daher nicht ohne einen ausreichend dimensionierten Rechner zu bewerkstelligen Aufgrund von damit verbun 81 4 Methoden zur Untersuchung von Struktur Wirkungs Beziehungen denen Schwierigkeiten wurde MoSS von mir zun chst nur zur Validierung von bereits auf andere Weise gefundenen potenziellen Leitstrukturen eingesetzt wobei die Zahl der Klassen typischerweise deutlich geringer ausf
236. rteilungen festgelegt wird Der Cutoff wird f r jede Platte einmal und anhand der enthaltenen Kontrollmessungen festgelegt 91 was zun chst ma nuell und sp ter automatisiert von der 2D SIFT Software vorgenommen wurde 91 105 ber die Wahl des Cutoffs versucht man zum einen die Plattenvariabilit t auszugleichen was wie gezeigt nur in begrenztem Umfang gelingt Zum anderen versucht man daf r zu sorgen dass sich die positiven und negativen Kontrollspektren insbesondere im Sek torenbereich 1 5 deutlich unterscheiden in dem die neu gewachsenen rot gr nen PrP PrP Aggregate beschrieben sind Aus den obigen Erl uterungen ist klar dass die 2D SIFT Spektren die anti aggregatori schen Eigenschaften jener DIVERSet Substanzen kodieren welche den PrPC PrP Mi schungen zugesetzt wurden F r mich ergab sich daraus die Aufgabe ein verl ssliches quantitatives Ma zur Auswertung der Spektren im Hinblick auf die anti aggregatorischen Eigenschaften der DIVERSet Substanzen zu entwickeln Das zu entwickelnde Wirksam keitsma muss der beschriebenen Variabilit t der Spektren von unterschiedlichen Platten Rechnung tragen Angesichts der gro en Zahl der DIVERSet Substanzen und der dazu ge nerierten Spektren musste die Extraktion des Wirksamkeitsma es automatisiert erfolgen und dazu mussten die gemessenen Spektren einer computergest tzten Analyse zug nglich gemacht werden Kapitel 3 beschreibt die dazu von mir entwickelten Software
237. rund des Fehlens von Kontrollmessungen wird als Ver gleichsgr e der gem 3 1 gebildete Median der Werte S w f r die T pfchen w e S mit Testsubstanzen herangezogen Damit kann nun das auf die Testsubstanzen bezogene Wirksamkeitsma 5 R S w a S gt R wralw 1 5 3 10 Die Bezeichnung Abstand ist gerechtfertigt weil f r valide SIFT Messungen die Differenz n p positiv ist 43 3 Methoden zur Haltung Auswertung und Visualisierung von Daten definiert werden welches wie das kontrollenbezogene Ma a jedem gemessenen T pf chen w S eine reelle Zahl a w zuordnet Die Interpretation der f r die Testsubstanzen einer Platte resultierenden Aktivit tswerte a ndert sich jedoch gegen ber derjenigen des Ma es a Werte a lt 0 beschreiben nun solche Substanzen deren anti aggregatorische Wirksamkeit geringer ist als die Wirksamkeit der zum Median geh rigen Substanz en Der anderen H lfte der Substanzen werden Aktivit tswerte a gt 0 zugeordnet Das Wirksamkeitsma 3 10 wurde in den SIFT Viewer II implementiert Beide Werk zeuge SIFT Viewer I und II wurden f r die Auswertung der f r die DIVERSet Biblio theken gewonnenen Messdaten eingesetzt Zur Erl uterung ihrer Funktionsweise sollen zun chst die f r die DIVERSet Bibliotheken vom Hersteller mitgelieferten elektronischen Daten beschrieben werden 3 3 Elektronische Daten zu den DIVERSet Bibliotheken In Abschnitt 2 1 wurden die in u
238. runde und geht von der Annahme aus dass die meisten Lot f Werte eng um zentrale Werte verteilt liegen sodass Ausrei er durch gro e Abst n de zu diesen zentralen Werten charakterisiert sind Als zentraler Wert der Jot Verteilung wird dabei der sogenannte Median verwendet ein dem arithmetischen Mittel hnliches Lagema das in der deskriptiven Statistik h ufig eingesetzt wird 115 Zur Bildung des Medians der Aot Verteilung f r g werden die N Werte die hier kurz J genannt seien der Gr e nach sortiert sodass die geordnete Menge J1 Ia In vorliegt Der Median ist dann gem j rn N ungerade 3 1 3Unj2 Iny2 N gerade als der in der Mitte d h an der Stelle N 1 2 liegende Wert y 1 2 definiert falls die L nge N der Stichprobe ungerade ist und andernfalls als Mittelwert der beiden der Mitte am n chsten liegenden Werte Im Gegensatz zum arithmetischen Mittelwert ist der Median robust gegen ber Ausrei ern d h sein Wert ver ndert sich kaum oder nicht wenn weit vom Zentrum entfernt liegende Werte zur Verteilung hinzukommen Die gem 3 1 f r die beiden Verteilungen Ito f r g gebildeten Mediane M und Mg werden nun herangezogen um f r jedes T pfchen Well w zu berpr fen ob die Werte der Gesamtintensit ten gem Ikot r w lt Qu Mr oder Liot w gt 8o Mr oder Lot w lt gu Mg oder Ttot g W gt 8o Mg 3 2 weit entfernt vom jeweiligen Median liegen wobei die Faktor
239. s Analysewerkzeug SIFT Viewer II 2 A m Total Intensity in Channel 2 100 09 4 x 90 0 8 gt 07 i a s0 Ta BB art 70 4 os a t 2 60 gu i w 04 50 4 a 0 3 ut am 3 aA a u Ss a o2 I art 3 DE i gt 20 gt 00 5 10 0 1 y 02 5 0 1 2345 10 20 30 100 0 1 2345 10 20 30 100 concentration uM A concentration WM B Negative e DOSPA Bsc3119 Bsc3629 Negative DOSPA a Bsc3119 Bsc3629 Total Intensity in Channel 2 Abbildung 3 9 Dosis Wirkungs und Dosis Gesamtintensit ts Kurven Gezeigt sind zwei Charts mit Dosis Wirkungs Kurven A und Dosis Gesamtintensit ts Kurven B die von SIFT Viewer II f r die vom Benutzer ausgew hlten T pfchen generiert wurden Der Chart in A zeigt zum einen die Wirksamkeitswerte der T pfchen mit negativen und positiven DOSPA Kontrollmessungen die als rote bzw blaue Symbole bei den Konzentrationen 0 bzw 17 uM eingezeichnet sind und zum anderen die Wirksamkeiten der beiden Substanzen Bsc3119 und Bsc3629 bei den diversen gemessenen Konzentrationen gr ne bzw gelbe Symbole und Lini en In B sind in analoger Weise die Werte der Gesamtintensit t Jot in der Einheit kHz im roten Spektralbereich Channel 2 gegen die Konzentration aufgetragen Im Falle von Verd nnungsreihenmessungen wird von SIFT Viewer II ein zus tzlicher Chart mit Dosis Wirkungs Kurven generiert Abbildung 3 9 A zeigt einen solchen Chart der f
240. s Ausbleiben der Aggregation dieser Assay Bestandteile zu kontrollieren Zwei der Spektren hellgrau wurden von der wei ter unten Kapitel 3 beschriebenen automatisierten Auswertung als Ausrei er erkannt Nach Fig 2A aus Bertsch et al 91 Abbildung 2 6 zeigt 2D SIFT Spektren die bei der Messung einer DIVERSet Platte erhal ten wurden Wie dem rechts abgebildeten Layout der Messplatte zu entnehmen ist wurden dabei 80 Testsubstanzen im Aggregations Assay sowie verschiedene Kontrollmischungen gemessen F r jedes T pfchen wurde dabei eine 2D FID Verteilung aufgenommen und mit der 2D SIFT Analyse ausgewertet Die drei gr n gef rbten Spektren die f r Assay 26 2 2 Der anti Prion 2D SIFT Assay TP1 Mischungen erhalten wurden denen keine Substanz zugegeben wurde weisen einen deut lichen Peak im Bereich der Sektoren 1 5 auf Dies zeigt dass in diesen Mischungen viele Aggregate vorhanden sind an die sich gr n markiertes PrP in gro en Mengen angelagert hat Die drei rot gef rbten Spektren f r Mischungen mit der zugegebenen anti aggregato rischen Kontrollsubstanz DOSPA vgl Einleitung und Abschnitt 2 3 unterscheiden sich davon deutlich in ihrer Form Der Peak f r rot gr ne Aggregate in den Sektoren 1 5 fehlt Hinzugekommen sind erh hte Werte in den Sektoren 11 18 die anzeigen dass in der Mi schung viele ausschlie lich rot markierte PrP Aggregate enthalten sind an die wenig gr n markiertes PrP gebunden ist w
241. s mehrere Substanzen auf einer Bibliotheksplatte liegen k nnen und dass jede Substanz auf genau einer Bibliotheksplatte liegt Zur Darstellung dieser Beziehung im ER Diagramm sind die beiden Tabellen durch eine Linie verbunden deren Enden mit den Symbolen gt und 4 versehen sind Diese Symbole kennzeichnen den Grad der Bezie hung wobei gt f r mehrere und f r eines steht Die auf diese Weise realisierte Modellierung der substanzbezogenen Daten in Form von drei separaten miteinander ver kn pften Tabellen soll daf r sorgen dass Redundanzen verringert und die Integrit t der Daten gew hrleistet wird Toad Data Modeler hie damals CASE Studio 2 und wurde von der Firma CHARONWARE angeboten 56 3 5 Die Screening Datenbank TSE DB CELL_CULTURE_PLATE lt CELL_CULTURE PLATE ID PK PLATE_TYPE_ID Fi LIBRARY_PLATE_ID FK A A SIFT_PRIMARY_TP_1 BAYEs_TP_2 SUBSTANCE_ID FK SUBSTANCE ID FK ACTIVITY ACTIVITY CONVERSION_TP_3 CELL_CULTURE_TP_3 SUBSTANCE_ID FK SUBSTANCE_ID FK ACTIVITY ACTIVITY PICTURE_LINK PICTURE_LINK CELL_CULTURE_PLATE_ID FK SIFT_EC 50 TP_1 SCN_2A_TP_4 SECONDARY_CELL_CULTURE_TP_3 SUBSTANCE_ID FK SUBSTANCE_ID FK SUBSTANCE _ID FK ACTIVITY ACTIVITY ACTIVITY PICTURE_LINK Abbildung 3 5 ER Diagramm der TSE DB Di
242. samkeiten zeigten bietet sich das Mausmodell an Am ZNP werden dabei M use zun chst mit Scrapie infiziert indem ihnen intrazerebral Erreger injiziert werden und sp ter mit einzelnen potenziellen Wirk stoffsubstanzen behandelt Prionkrankheiten f hren blicherweise erst lange nach der Infektion eines Organismus mit dem Erreger zu klinischen Symptomen und werden daher erst zu diesem Zeitpunkt diagnostiziert Um die Anwendbarkeit der zu testenden Substanzen in einem f r Prion krankheiten realistischen Szenario zu berpr fen werden die infizierten M use in einem der gew hlten Versuchsabl ufe erst mehr als 100 Tage nach der Infektion also in einem sehr sp ten Stadium der Inkubationszeit mit Testsubstanzen behandelt Dieser Zeitpunkt wird gew hlt weil die M use bei dem gew hlten Erregerstamm erst dann subklinische Symptome zeigen Daher entspricht dies dem fr hesten Zeitpunkt zu dem ein an TSE erkrankter Mensch realistischerweise behandelt werden k nnte Die zu applizierenden Testsubstanzen sind in DMSO gel st und werden innerhalb eines festgelegten Zeitraums bei vorab gew hlten Konzentrationen verabreicht H ufig werden die Wirkstoffe intraperitoneal d h in die Bauchh hle injiziert da diese Form der Verab reichung die Tiere schont Intraperitoneal verabreichte Stoffe werden blicherweise gut resorbiert also aus der Bauchh hle in die Blutbahn aufgenommen Um aussagekr ftige Ergebnisse zu erzielen wird jeweils eine
243. se helikale Struktur in Monomeren instabil ist und erst durch Dimerisierung 1 Einleitung AG Stabiler PrPS Aggregationskeim u Instabile PrPS Aggregate Zahl der aggregierten PrPS Monomere Abbildung 1 3 Qualitative Diskussion der Energetik der Prion Aggregation Qualitati ve Abh ngigkeit der freien Energie als Funktion der L nge der Prion Aggregate Ausgehend von einem PrP Molekiil steigt die freie Energie mit der Zahl der gebildeten und aggregierten PrP Molek le zun chst bis zu einem Maximalwert an berschreitet die L nge der Aggre gate einen kritischen Wert so f llt die freie Energie der Aggregation wieder sodass sich ein stabiler Aggregationskeim ausbilden kann bernommen aus 26 stabilisiert wird Damit konnten also MD Simulationen die mit der Gr e der Aggregate zunehmende Stabilit t belegen welche dem Aggregationskeimkonzept zugrunde liegt Die Vermehrung der Keime die f r den infekti sen Krankheitsprozess n tig ist und im Falle von Bakterien oder Viren in Form der identischen Replikation auftritt konnte von dem oben skizzierten Modell von Eigen nicht erkl rt werden Hierzu nahmen Masel et al 28 den Gedanken des Kettenbruchs in ein verfeinertes mathematisches Modell auf dessen Parameter aus experimentellen Daten gesch tzt wurden Abbildung 1 4 zeigt sche matisch wie die Verl ngerung von Ketten aus PrP Molek len und der Bruch von Ketten einer gewissen L nge so zusammenwirken dass d
244. ser Substanzen 293G02 309F02 305E04 und 297F03 besitzen das gemeinsame Kernstrukturmotiv NBB das in Abbildung 5 5 gezeigt ist Wie eine daraufhin von mir durchgef hrte Substruktursuche in 99 5 Ergebnisse und Diskussion SIFT SIFT ScN2a prim EC50 EC50 Compound Structure activ uM uM 293G02 F Se Sti 0 51 0 3 2 fe 313B02 SN ANH AY In 057 35 6 N 0 ci 309F02 Br SN F n d 30 mee o OH eae tn 073 o cl 297F03 z cot 0 43 30 0 OH O 2008 oyan kE 0 39 n d n d not determined inhibition confirmed by dilution series confirmation pending o Abbildung 5 4 Substanzen mit Zellkulturwirksamkeit Gezeigt sind die Molek lstrukturen dieser sechs Substanzen und ihre Wirksamkeiten in den drei Schritten des Screenings Die erste Spalte zeigt die Wirksamkeiten im prim ren SIFT Screening SIFT prim activ Diese Substanzen wurden in SIFT Verd nnungsreihen validiert und falls m glich wurden EC50 Werte bestimmt mittlere Spalte Die letzte Spalte kombiniert die Ergebnisse mehrerer Schritte im Zellkultursystem Vier dieser Substanzen besitzen das gemeinsame Strukturmotiv NBB bernommen aus Bertsch et al 91 der DIVERSet 1 Bibliothek ergab enthalten 413 der 10 000 Substanzen das NBB Struk turmotiv Die auff llige H ufung des NBB Motivs in der Menge der Zellkultur Treffer legte die Vermutung nahe dass f r die Substanzen der NBB Klasse relevante Beziehun gen zwischen Molek
245. setzt der die wirksamen von den unwirksamen Testsubstanzen trennte vgl Abbildung 5 1 Ob wohl diese Vorgehensweise erfolgreich zur Treffererkennung eingesetzt wurde hat sie den Nachteil dass ihr einige sicherlich gut begr ndete Vorurteile zugrunde liegen wie bei spielsweise die Annahme dass die Summenobservable S F die anti aggregatorische Wirk samkeit kodiert Um diesen Nachteil zu vermeiden habe ich ein alternatives Verfahren zur Trefferaus wahl entwickelt welches die Testsubstanzen anhand der 2D SIFT Spektren vorurteilsfrei in Klassen von hnlicher spektraler Charakteristik unterteilt Das Verfahren basiert dazu auf einem selbstorganisierenden Klassifikationsalgorithmus den ich im Rahmen meiner Diplomarbeit 176 in der Arbeitsgruppe von Prof Paul Tavan entwickelt und in das dort existierende Softwarepaket multivar 177 178 integriert hatte Das Verfahren wurde zu n chst in das Shell Skript basierte Paket SIFT Viewer I und sp ter in das Java Werkzeug SIFT Viewer II integriert Dazu war es notwendig das Paket multivar in die Sprache Java zu portieren Die resultierende Java Bibliothek jGRBF generalisierte radiale Basisfunk tionen steht als gleichnamiges Modul im CVS zur Verf gung Bei den jJGRBF und SIFT Viewer II bezogenen Programmieraufgaben unterst tzte mich wiederum Simon Youssef als studentische Hilfskraft Das Verfahren umfasst mehrere Stufen die im Folgenden be schrieben werden C 1 Das Klassifikationsverfahre
246. sind zum einen die oben beschriebenen Grafikdateien f r diverse SIFT Daten und Substanzstrukturen und zum anderen eine Repr sentation der Substanzbibliothek in Form von HTML Dokumenten Hypertext Markup Language 126 abgelegt welche als Platzhalter f r die Grafikdateien dienen und nachfolgend beschrieben werden Abbildung 3 3 zeigt auszugsweise die Verzeichnishierarchie die der Visualisierung des SIFT Screenings von DIVERSet 2 zugrunde liegt Die Grafikdateien der 2D SIFT Spek tren sind unterhalb des Verzeichnisses sifts abgelegt in welchem f r jede Platte ein nach der Plattennummer benanntes Unterverzeichnis existiert In analoger Weise liegen die Grafikdateien der Summenplots der Wirksamkeiten und der Molek lstrukturen je weils unterhalb der Verzeichnisse sums inhibs bzw structs_2d Diese Haltung der Daten in getrennten Unterverzeichnishierarchien identischer Struktur erf llt den Zweck 51 3 Methoden zur Haltung Auswertung und Visualisierung von Daten DIVERSet2 INP Lees sums sifts 30126 index html plate drop down html platten 30126 A01 html base H12 html platte_a html platte _b html 30250 A0l jpeg el H11 jpeg 30250 30126 sums jpeg a 2 30250 inhibs 30126 inhibs jpeg 30250 structs 2d 30126 AO2 html A02 jpeg tad H11 jpeg 30250
247. sit ts Verteilungen vgl Ab schnitt 2 2 2 verschiedener Mischungen des a Synuklein Aggregations Assays Ohne DMSO findet im Assay keine nachweisbare Aggregation statt links Bei einer DMSO Konzentration von 1 bilden sich gro e rot gr n fluoreszierende Aggregate die in Form von hochintensiven Fluoreszenzereignissen detektiert werden Mitte Die Zugabe der Substanz 293G02 verhindert die Bildung solcher Aggregate rechts 250 07 225 07 200 07 175 07 150 07 125 07 100 07 om Abbildung 5 18 zeigt die zweidimensionalen Fluoreszenz Intensit ts Verteilungen vgl Abschnitt 2 2 3 f r verschiedene Mischungen des aS Aggregations Assays Wie in dem linken Diagramm zu erkennen ist findet ohne DMSO keine nachweisbare Aggregation statt was durch das Fehlen von Fluoreszenzereignissen hoher Intensit t gekennzeichnet ist Bei einer DMSO Konzentration von 1 bilden sich gro e rot gr n fluoreszierende 114 5 1 Entdeckung und Entwicklung einer ersten neuen Wirkstoffklasse aS Aggregate die durch hochintensive Fluoreszenzereignisse charakterisiert sind Mitte Durch Zugabe der Substanz 293G02 bei einer finalen Konzentration von 10 uM wird die Bildung solcher Aggregate wirksam verhindert rechts Dies ist ein klarer Hinweis darauf dass die Substanz 293G02 nicht nur als anti Prion Substanz wirkt sondern auch das Potenzial besitzt ein Therapeutikum f r Synukleinopa thien wie die Parkin
248. sonsche Krankheit zu sein Dass die Substanz 293G02 sowohl gegen die Aggregation von Prion Proteinen als auch gegen die amp S Aggregation wirkt weist auf eine allgemeine anti aggregatorische Wirksamkeit dieser Substanz bei Protein Aggregati ons Krankheiten hin Wie bereits mehrfach betont wurde ist diesen Krankheiten gemein dass die dabei beteiligten Proteine in 6 Faltblatt Konformationen fehlfalten und zu amy loiden Fibrillen aggregieren Deshalb K nnte es sein dass die Substanz 293G02 und m g licherweise weitere Substanzen der NBB Klasse das Potenzial besitzen als Therapeutika f r die kausale Behandlung einer ganzen Palette von neurodegenerativen Protein Aggre gations Krankheiten eingesetzt werden zu k nnen Zu diesen Krankheiten z hlen neben den Prionkrankheiten und der Parkinsonschen Krankheit auch die Huntingtonsche und die Alzheimersche Krankheit 5 1 7 Inhibierung der Aggregation von poly Glutamin Proteinen Um die Vermutung der generellen anti aggregatorischen Wirksamkeit der NBB Substan zen zu berpr fen wurden k rzlich wie es in Abschnitt 4 3 angesprochen wurde im Rahmen eines gemeinsamen Projekts mit TP1 sowie mit den Gruppen von Prof F Ulrich Hartl MPI f r Biochemie Martinsried und Prof Christian Haass Adolf Butenandt Insti tut LMU einige Substanzen die im Verbund als anti Prion Wirkstoffe identifiziert wor den waren hinsichtlich ihrer Wirksamkeit gegen die mit der Huntingtonschen Krankheit assoziierte
249. sp ren Da wie ich in Abschnitt 4 2 2 erl utert habe die Menge aller 20 000 Substanzen der beiden DIVERSet Bibliotheken als Ausgangsmenge f r die Clusterbildung mit DataMi ner zu umfangreich gewesen w re schr nkte ich die Ausgangsmenge auf die Menge der Prim rtreffer 837 Substanzen Stand 11 06 des Zellkultur Screenings von DIVERSet 1 und 2 ein und lie so die Cluster ausschlie lich anhand der wirksamen Substanzen bilden Anschlie end wurden die restlichen unwirksamen Substanzen zus tzlich in die gebilde ten Cluster einsortiert Das Resultat der Clusterbildung wird von DataMiner wie in Ab Clusteranalysen wie die im Folgenden geschilderte waren von mir bereits mehrfach zu verschiedenen fr heren Zeitpunkten unter Verwendung des jeweils aktuellen Stands der Screening Ergebnisse durch gef hrt worden Die hier geschilderte Clusteranalyse basiert auf dem oben zusammengefassten Stand aus 11 06 des DIVERSet Screenings 120 5 2 Eine weitere neue Wirkstoffklasse schnitt 4 2 2 beschrieben ist in Form einer sogenannten SAR Karte grafisch dargestellt in welcher die Substanzcluster S durch in der Ebene angeordnete Symbole repr sentiert sind Dabei werden von DataMiner die Symbole so angeordnet dass sie nahe beieinander liegen wenn die repr sentierten Cluster strukturell hnlich sind Die Gr en die Formen und die Farben der Symbole werden anhand von clusterlokalen Eigenschaften bestimmt die vom Benutzer ausgew hl
250. sst das IDL Modul screening_common pro dessen Prozedur setup zur lnitialisierung von allgemeinen Informationen ber die Nummern der ge messenen Platten und die Lage der oben beschriebenen extrahierten Daten im Dateisys tem dient Die vermittels set up eingelesenen Informationen werden von den im Modul screening_visual pro befindlichen Prozeduren verwendet welche der eigentli chen Erzeugung von Grafikdateien dienen Die Funktionsweisen dieser Prozeduren sollen nun im einzelnen skizziert werden Die Prozedur print _raw zur plattenweisen Darstellung von 2D SIFT Spektren arbeitet die eingelesene Plattenliste ab und w hlt dabei anhand der T pfchennamen nach Konven tion 3 11 alle zu dieser Platte geh rigen Spektren aus der Menge aller Spektren aus Die auf diese Weise ausgew hlten Spektren einer Platte werden gem dem f r das Screening vereinbarten Plattenlayout und wiederum anhand der T pfchennamen nach T pfchenty pen gruppiert vgl Abschnitt 3 2 2 wobei die zus tzliche Gruppe der T pfchen mit Aus rei erspektren gebildet wird Die gruppierten Spektren werden dann in unterschiedlichen Farben geplottet vgl die in Abbildung 2 6 verwendete Farbkodierung F r die sp tere Visualisierung mit SIFT Viewer I wird dabei f r jedes T pfchen ein Plot aller Spektren auf der Platte erzeugt in dem das gegebene T pfchen hervorgehoben dargestellt ist Die se Plots werden zun chst in ps Dateien PostScript geschrieben sogleich in jpeg Date
251. st 39 40 CHO CHO GPI 230 PHGGGWGQ S S flexibel ungeordnet globul r strukturiert Abbildung 1 5 Strukturelle Merkmale von PrP Das 208 Aminos uren 23 230 lange menschliche PrP besitzt einen flexiblen ungeordneten N terminalen Teil 23 124 und einen globul ren strukturierten C Terminalen Teil 125 228 Der flexible N terminale Abschnitt weist eine Dom ne auf in der sich das Oktapeptid PHGGGWGQ viermal und in leicht mo difizierter Form ein f nftes Mal wiederholt 51 91 Diese Region kann ber Histidin H Residuen Cu Kupfer Ionen binden 41 und dadurch Struktur annehmen 42 In der C ter minalen H lfte von PrP befinden sich die drei w Helizes H1 144 154 H2 173 194 und H3 200 228 sowie zwei kurze Str nge 128 131 und 161 164 die zusammen ein anti paral leles Faltblatt bilden H2 und H3 sind ber eine Disulfidbr cke zwischen den Cystein Residu en Cys179 und Cys214 kovalent verbunden Posttranslational werden an die Aminos urekette zwei komplexe Zuckerseitenketten CHO an den Asparagin Residuen Asn181 und Asn197 und der C terminalen GPI Anker an das Serin Residuum Ser230 angeh ngt Die f r diese Pro zessierung ben tigten terminalen Signalsequenzen 1 22 und 231 255 als Punkte dargestellt werden danach abgespalten und sind im reifen PrP nicht mehr vorhanden Kurt W thrich und seinen Mitarbeitern ist es vor rund zehn Jahren erstmals gelungen mit hilfe von Messungen der kernmagnetischen Resonanz NM
252. t J Busch M Kloppenburg F Metze und P Tavan Generalized Radial Basis Function Networks for Classification and Novelty Detection Self Organization of Optimal Bayesian Decision Neural Networks 13 1075 1093 2000 133 F Metze Integration neuronaler Methoden zur Phonemerkennung aus flie end gesproche ner Sprache Diplomarbeit Institut f r Medizinische Optik Fakult t f r Physik LMU M n chen 1998 134 A W rl Geh rorientierte Vorverarbeitung von Sprachsignalen f r spracherkennende Sys teme Diplomarbeit Institut f r Medizinische Optik Fakult t f r Physik LMU M nchen 2000 134 K Pearson On Lines and Planes of Closest Fit to Systems of Points in Space Phil Mag 2 559 572 1901 135 S A Kozin G Bertho A K Mazur H Rabesona J P Girault T Haertle M Takahashi P Debey und G H B Hoa Sheep prion protein synthetic peptide spanning helix I and beta strand 2 residues 142 166 shows beta hairpin structure in solution J Biol Chem 276 4636446370 2001 142 S Megy G Bertho S A Kozin P Debey G H B Hoa und J P Girault Possible role of region 152 156 in the structural duality of a peptide fragment from sheep prion protein Protein Sci 13 3151 3160 2004 142 155 Literaturverzeichnis 156 Danksagung Allen die zum Gelingen meiner Doktorarbeit beigetragen haben m chte ich an dieser Stelle herzlich danken Ganz besonders danke ich meinem Doktorvater Prof Paul
253. t als L sungsmittel weit verbreitet weil darin viele Substanzen gut l sbar sind und weil DMSO sich gut mit Wasser oder anderen L sungsmitteln mischen l sst Abbildung 2 2 zeigt eine solche 96 Well Mikrotiterplatte Auf jeder DIVERSet Plat te sind 80 Substanzen so auf die 96 T pfchen Wells verteilt dass die erste und die letzte T pfchenspalte 1 und 12 frei bleiben Dieses Format erm glicht es dass alle Substanzen einer 96 Well Bibliotheksplatte verd nnt auf eine 96 Well Messplatte bertragen und die beiden frei gebliebenen Spalten mit Kontrollproben bef llt werden k nnen Die Plat ten der Bibliotheken DIVERSet 1 und 2 werden von Projektpartner TP1 gek hlt gelagert Von dort aus werden Verd nnungen der Substanzen f r die Messungen in den verschiede nen Assays an die Verbundpartner verteilt 2 2 Der anti Prion 2D SIFT Assay TP1 Am von Prof Hans Kretzschmar geleiteten Zentrum f r Neuropathologie und Prionfor schung ZNP der LMU in Gro hadern wurde im Rahmen des Forschungsverbundes ein high throughput screening HTS nach Inhibitoren der Prion Aggregation durchgef hrt F r das Screening wurde die auf fluorescence correlation spectroscopy FCS basierende SIFT Technik eingesetzt mit der ber fluoreszierende Farbstoffe markierte Prion Aggre gate und deren Wachstum detektiert werden k nnen 2 2 1 Der in vitro Aggregations Assay Der mit der SIFT Methode beobachtete Assay basiert auf einem zellfreien in vitro Modell sys
254. t ge zeigt werden Insgesamt zeigt die im Verbund geleistete Entdeckung und Entwicklung von zwei neuen Wirkstoffklassen dass auch eine kleine Gruppe von eng zusammenarbeitenden Wissen schaftlern Resultate erzielen kann die sonst nur in Pharmakonzernen erzielt werden 123 5 Ergebnisse und Diskussion 124 6 Ausblick Als unser Forschungsverbund Mitte des Jahres 2002 seine Arbeit zur Entwicklung von Medikamenten gegen Prionkrankheiten aufnahm war mir in mancherlei Hinsicht unklar auf welches Abenteuer ich mich mit meinem Vorsatz eingelassen hatte diese Arbeit im Teilprojekt von Paul Tavan durch Einsatz und wo n tig Entwicklung rechnergest tzter Methoden zu unterst tzen Die Unklarheiten betrafen insbesondere die Fragen mit wel chen Algorithmen und Softwaremodellen die absehbare Flut an Screening Daten bew l tigt werden kann und wie darauf aufbauend Struktur Wirkungs Beziehungen systematisch untersucht und schlie lich neue Leitstrukturen gefunden werden k nnen Wie die vorlie gende Arbeit zeigt ist es mir im Laufe der Zeit zunehmend besser gelungen so weit wie n tig geeignete Verfahren und Werkzeuge selbst zu entwickeln und wo immer m glich vorgefertigte L sungen zu finden und einzusetzen Diese Entwicklungsprozesse und die eingesetzten Werkzeuge sind in den Kapiteln 3 und 4 ausf hrlich dokumentiert Der detailgetreue und daher weitgehend trockene Charakter dieses Teils der vorliegenden Arbeit mag nicht jeden Leser d
255. t sind abgespeichert werden 63 3 Methoden zur Haltung Auswertung und Visualisierung von Daten REMARK Das ist ein Kommentar REMARK welltype name REMARK 0 Empty well REMARK 1 Substance REMARK 2 Dospa REMARK 3 Negative Buffer CJD Rods PrP REMARK 4 Buffer REMARK 5 10293 G02 REMARK 6 nur CJD rods REMARK bi nur Mix keine rods keine Substanz REMARK 8 Pipettierfehler ntp_code 20060518 ntp platesize 96 substanceids 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2 L A Negative DOSPA Negative DOSPA Negative DOSPA Negative DOSPA Rods Rods Mix Mix B Bsc2161 Bsc2161 Bsc2889 Bsc2889 Bsc3119 Bsc3119 Bsc3629 Bsc3629 10353 _F11 10353_F11 10339 C04 10339 C04 Cc Bsc2161 Bsc2161 Bsc2889 Bsc2889 Bsc3119 Bsc3119 Bsc3629 Bsc3629 10353_F11 10353_F11 10339 C04 10339 C04 D Bsc2161 Bsc2161 Bsc2889 Bsc2889 Bsc3119 Bsc3119 Bsc3629 Bsc3629 10353_F11 10353_F11 10339 C04 10339 C04 E Bsc2161 Bsc2161 Bsc2889 Bsc2889 Bsc3119 Bsc3119 Bsc3629 Bsc3629 10353_F11 10353 _F11 10339 C04 10339 C04 F Bsc2161 Bsc2161 Bsc2889 Bsc2889 Bsc3119 Bsc3119 Bsc3629 Bsc3629 10353 _F11 10353 _F11 10339 C04 10339 C04 G Bsc2161 Bsc2161 Bsc2889 Bsc2889 Bsc3119 Bsc3119 Bsc3629 Bsc3629 10353 _F11 10353_F11 10339 _C04 10339 _C04 H Bsc2161 Bsc2161 Bsc2889 Bsc2889 Bsc3119 Bsc3119 Bsc3629 Bsc3629 10353 _F11 10353_F11 10339 _C04 10339 C04 welltypes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 3 2 3 2 3 2 3 2 6 6 7 7 B 1 1 di al dt E 1 1 1 1 1 al Cc di 1 1 1 T 1 al 1 di 1 1 1 D 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
256. t werden k nnen So legte ich fest dass die Gr en der dargestellten Symbole proportional zu den Clus tergr en S d h zu den Anzahlen der jeweils enthaltenen Substanzen C sein soll Die Formen der Symbole wurden anhand der gem 4 10 definierten Anteile HC S a C amin Ps rt iS 5 1 jener in den jeweiligen Clustern S enthaltenen Substanzen C festgelegt deren prim re Wirksamkeiten a C aus dem SIFT Screening oberhalb einer gew hlten Grenze amin 0 25 lagen Anhand dessen werden Cluster deren Anteil Ps rt S mehr als 50 betr gt als Sternchen und die restlichen berwiegend unwirksamen Cluster als K stchen darge stellt In analoger Weise kodiert die Farbe der Symbole die clusterlokalen Anteile HC e S C ist Prim rtreffer Pzx S S 5 2 der Prim rtreffer des Zellkultur Screenings wobei die Symbole von Clustern mit mehr als 50 wirksamen Substanzen rot und jene der restlichen Cluster grau gefarbt sind Abbildung 5 21 zeigt die aus der beschriebenen Clusteranalyse und der von mir festge legten Form der Symboldarstellung resultierende SAR Karte Dem gew hlten Schema entsprechend werden gro e Cluster die zudem hohe Anteile an SIFT und Zellkultur wirksamen Substanzen enthalten durch gro e rote Sternchen symbolisiert Solche Clus ter stellen m glicherweise potenzielle Leitstrukturklassen dar Mithilfe von DataMiner wurden einzelne solcher interessanter Cluster per Mausklick ausgew hlt
257. t wird Als Ergebnis liefert MoSS gem 4 3 eine Liste der Klassen von Kernmotiven also f r jedes Kernmotiv K diejenigen Kernmotive Kg welche das jeweilige Kernmotiv K konkretisieren Die Konkretisierungsbeziehungen zwischen den Kernmotiven bertragen sich als Hierarchiebeziehungen auf die Strukturklassen S K sodass jeder Klasse Sj gt SKE S CS f r j l Ns 4 7 die Menge derjenigen Klassen S zugeordnet wird welche Teilmengen von S sind Um die skizzierte hierarchische Beziehung zwischen den Strukturklassen zu veranschau lichen ist in Abbildung 4 3 links unten eine beispielhafte Liste mit neun Strukturklassen S j 1 9 gezeigt Die Liste der Strukturklassen S f hrt zus tzlich die nach 4 7 in den Sj jeweils enthaltenen Subklassen S auf Im oberen Bereich von Abbildung 4 3 werden die zugrunde liegenden Mengenbeziehungen durch Ellipsen und fette Punkte ver anschaulicht Dort bezeichnet eine Ellipse eine Strukturklasse S welche andere Struk turklassen S als echte Teilmengen enth lt So umfasst beispielsweise die gro e Ellipse Sg alle anderen Klassen S bis Sg Klassen die keine anderen Subklassen enthalten sind als fette Punkte dargestellt S1 bis S5 Enth lt eine Subklasse z B Sg einer bergeord neten Klasse z B So weitere Subklassen z B S2 S7 so werden diese Subklassen 82 4 1 Identifikation und Validierung von Leitstrukturen S4 So S Sg S7 S6 Sg S2 33 24 25 Se S
258. tefakte nicht oder nur schlecht interpretiert werden k nnen m ssen derartige Messungen als Ausrei er erkannt und markiert werden Als Vorgriff auf die Resultate der von mir entwickelten automa tisierten berpr fung der Messdaten sind in Abbildung 2 6 zwei der Spektren hellgrau gef rbt weil die gemessenen Testsubstanzen Fluoreszenzartefakte zeigten und als Ausrei Ber erkannt wurden Plattenvariabilit t der 2D SIFT Spektren Die mit der SIFT Technik vermessenen Assay Mischungen werden plattenweise pr pa riert Dabei werden im Allgemeinen f r verschiedene Platten unterschiedliche Hirnhomo genate verwendet sodass sich die Gr enverteilungen der darin enthaltenen PrP Ag gregate unterscheiden Zudem unterliegt das Mischungsverh ltnis der Farbstoffe und der Antik rper leichten Schwankungen von Platte zu Platte Daher variieren die Formen der resultierenden Spektren f r unterschiedliche Platten 21 2 Der Forschungsverbund TSE Therapie Platte 10273 1400 1200 1000 SIFT signal bins oo Q oO 123 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Sector Platte 10275 1400 1200 N amp 2 1000 H 800 D N 600 L n 123 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Sector Abbildung 2 7 Plattenvariabilit t von 2D SIFT Spektren Die 2D SIFT Spektren der bei den gemessenen DIVERSet Platten unterscheiden sich deutlich Die Spektren sind wie in Ab bildung 2 6 eingef rbt Um diese Variabilit t der
259. tellten Liste ber die Tabellen PLATE_TYPE WELL_TYPE und PLATE_STRUCTURE_ DILUTION sind verschiedene fest vereinbarte Standard Layouts definiert welche beim Prim rscreening der DIVERSet Bibliotheken und den anschlie enden Validierungsmes sungen eingesetzt wurden Alternativ zu diesen Standard Layouts k nnen vermittels der Tabelle SIFT_LAYOUT frei w hlbare Layouts realisiert werden Hierzu bietet das weiter unten in Abschnitt 3 6 beschriebene Werkzeug SIFT Viewer II dem Benutzer die M g lichkeit Messplattenlayouts festzulegen Die urspr nglich zur Markierung von Ausrei ern vorgesehene Tabelle SIFT_WELL_VALIDITY blieb ungenutzt weil Ausrei er stattdessen mit SIFT Viewer II zur Laufzeit erkannt werden Die wei hinterlegten Tabellen dienen der Haltung der Substanzwirksamkeiten aus allen im Verbund eingesetzten Modellsystemen Dazu besitzen diese Tabellen jeweils das Feld SUBSTANCE_ID der SUBSTANCE Tabelle als Fremdschl ssel und zur Haltung der Wirk samkeiten die Felder ACTIVITY vom Typ Gleitkommazahl Die Tabelle SIFT_PRIMARY_ TP_1 ist f r SIFT Wirksamkeitsma e die gem den in Abschnitt 3 2 definierten Me thoden f r das prim re Screening gebildet werden k nnen vorgesehen und die Tabelle SIFT_EC_50_TP_1 f r die in Abschnitt 2 2 4 angesprochenen SIFT EC50 Werte Des weiteren wurden die Tabelle SCN_2A_TP_4 f r die Wirksamkeiten aus den Zellkulturex perimenten von TP4 Abschnitt 2 3 und die Tabellen CELL_CULTURE_TP_3 SECON DARY
260. tem f r die Bildung von Prion Aggregaten 32 Aufgereinigtes PrP wird dabei mit monomeren PrP Molekiilen gemischt welche sich an die PrP Partikel anlagern sich dort strukturell umwandeln und so zum Wachstum der PrP Aggregate beitragen k nnen Abbildung 2 3 zeigt schematisch die Bestandteile des eingesetzten Modellsystems Zum einen sind dies PrP Aggregate die aus Gehirnen von CJD Patienten extrahiert wurden in der Abbildung ist ein solches Aggregat durch eine Kette aus magenta farbenen W r feln symbolisiert Zum anderen beinhaltet die Mischung rekombinant hergestellte Prion Proteine rPrP der Maus gr ne W rfel welche PrP Monomere modellieren und ber Farbstoffe Alexa 488 markiert sind die im gr nen Spektralbereich fluoreszieren Des weiteren befinden sich in der Mischung Exemplare rote Y eines speziellen Antik r pers 101 der ausschlie lich an die PrP Aggregate bindet Die Antik rper sind mit rot fluoreszierenden Farbstoffen Alexa 647 versehen und markieren daher die PrP Aggregate Nach dem Ansetzen der Mischung binden viele rot markierte Antik rper an die PrP Ag gregate und bilden dadurch intensiv rot fluoreszierende Partikel Lagern sich anschlie end viele gr n markierte PrP Molekiile an die PrP Aggregate an so entstehen gro e Ag gregate die starke rote und gr ne Fluoreszenzsignale emittieren k nnen Die FCS basierte 21 2 Der Forschungsverbund TSE Therapie
261. ten Kon zentrationen der beiden Substanzen im Blutplasma der untersuchten M use Gezeigt sind jeweils die Mittelwerte der Werte von zwei M usen Die Konzentration der Substanz 309F02 lag 0 5 h nach der Verabreichung bei etwa 3000 nmol l und nahm einem ex ponentiellen Verlauf folgend innerhalb der ersten vier Stunden rasch auf Werte unterhalb von 500 nmol l ab Die Substanz 293G02 war bereits nach 0 5 h und 1 h nur in Konzen trationen von wenigen hundert nmol l vorhanden und konnte in den Proben der sp teren Zeitpunkte nicht mehr detektiert werden Aus den Proben der Gehirne konnten lediglich f r die Substanz 309F02 und die ersten beiden Zeitpunkte Werte von einigen hundert nmol kg ermittelt werden Ansonsten lagen beide Substanzen unterhalb der Nachweisgrenze Diese Ergebnisse zeigen dass beide Substanzen im Organismus d h h chstwahrschein lich in dem daf r zust ndigen Organ der Leber rasch abgebaut werden Daher konnten bei den Therapieversuchen mit M usen nur sehr geringe Wirkstoffdosen in die Gehirne ge langen Die Tatsache dass dennoch therapeutische Effekte nachweisbar waren zeigt dass dazu schon geringste Konzentrationen dieser Substanzen ausreichen Man kann daher ver 113 5 Ergebnisse und Diskussion muten dass NBB Substanzen mit hnlichen Wirkprofilen aber besserer Bioverf gbarkeit hochpotente anti Prion Therapeutika darstellen Der entscheidende n chste Schritt besteht also in der Identifikation entsprechend
262. ten Methode und markiert die betroffenen T pfchen ber die weiter unten beschriebene grafische Benutzerschnittstelle ist dem Benutzer zudem die M glich keit gegeben h ndisch weitere T pfchen als Ausrei er zu markieren oder die Markierung von bereits markierten T pfchen zu entfernen 64 3 6 Das Analysewerkzeug SIFT Viewer II Berechnung von Wirksamkeiten Wie bei der Ausrei ererkennung stehen dem Benutzer in SIFT Viewer II verschiedene Methoden zur Berechnung von Wirksamkeiten vgl Abschnitt 3 2 zur Auswahl Nach der vorausgew hlten oder vom Benutzer per Mausklick ausgew hlten Methode werden die Wirksamkeiten von SIFT Viewer I zur Laufzeit berechnet Zusammen mit den im letzten Abschnitt angesprochenen M glichkeiten kann der Benutzer beispielsweise fragw rdige Kontrollmessungen h ndisch als Ausrei er markieren und daraufhin die Neuberechnung der Wirksamkeiten ansto en falls diese von den Kontrolldaten abh ngen T pfchenweise Repr sentationen von Messplatten Von SIFT Viewer I wurden Messplatten durch eine Tabelle repr sentiert deren Eintr ge ber die T pfchennamen benannt sind und dem Benutzer Zugriff auf die t pfchenweisen Messdaten bieten vgl Abbildung 3 4 In SIFT Viewer II wurde diese einfache Repr sentation von Messplatten durch zwei weiterentwickelte Repr sentationen ersetzt welche dem Benutzer einige zus tzliche Visualisierungen und Auswahlm glichkeiten bieten Als Vorgriff auf den weiter unten i
263. tenbanken ergaben dass die Klasse XXX eine bis dahin unbekann te Klasse von anti Prion Wirkstoffen ist Die neu entdeckte Substanzklasse erwies sich daher als eine neue Leitstrukturklasse deren Substanzen seither im Verbund in zahlrei chen Nachfolgeexperimenten weiterentwickelt werden 5 2 3 Weiterentwicklung der neu identifizierten Substanzklasse Im Rahmen einer kurz nach der Entdeckung dieser neuen Leitstruktur initiierten Koope ration mit der Gruppe von Prof Christian Griesinger MPI f r biophysikalische Chemie G ttingen wurde dort eine Vielzahl von weiteren Substanzen knapp 100 dieser und ver wandter Klassen synthetisiert Die Substanzen dieser fokussierten Bibliothek werden der zeit sowohl im SIFT Assay gegen die Prion Aggregation und gegen jene von amp Synuklein als auch im Zellkultur Assay von TP3 getestet Von mir wurden virtuelle Repr sentatio nen der Substanzen erzeugt und zusammen mit den Messergebnissen in die ChemFinder basierte Datenhaltung vgl Abschnitt 3 7 aufgenommen Bei den SIFT Experimenten konnten neue XXX Derivate identifiziert werden die deutlich st rkere in vitro Wirksam keiten zeigen als jene XXX Substanzen aus den DIVERSet Bibliotheken F r einige der vielversprechendsten Substanzen dieser Klasse laufen bereits Tierversuche All diese Ex perimente sind Gegenstand der laufenden Forschung im Verbund und die dabei bereits erzielten Ergebnisse k nnen aus den genannten patentrechtlichen Gr nden hier nich
264. ter reserviert werden Stattdessen wird der gegebene Pfad ber einen Pseudo Zufallszahlengenerator dem der Pfad als Keim seed gegeben wird eindeutig auf ein Bitmuster einen sogenannten Hash abgebildet Dieses Bitmuster wird durch eine logische Oder Verkn pfung in dem daf r vorgesehenen Bereich dem dortigen Bitmuster hinzugef gt in welchem bereits die Bitmuster anderer Pfade der gegebenen L nge kodiert sein k nnen Die vom Zufallsgenerator vorgenommene Hash Abbildung ist in umgekehrter Richtung nicht eindeutig d h es kann vorkommen dass ein Bitmuster mehrere Pfade kodiert So wohl diese Mehrdeutigkeit als auch die Oder Verkn pfung der Bitmuster verschiedener Pfade bewirken dass anhand eines Bitmusters f r eine gegebene Substanz nicht mit Si cherheit entschieden werden kann ob ein fraglicher Pfad in der Struktur der Substanz enthalten ist Umgekehrt ist es sehr h ufig m glich das Vorkommen eines Pfades in der Substanzstruktur mit Sicherheit auszuschlie en Es sei angemerkt dass Fingerabdr cke h ufig f r die Durchf hrung von Substruktursuchen eingesetzt werden und dabei vermit tels dieser Ausschlussm glichkeit aufw ndigere Einbettungsversuche hinf llig machen k nnen Trotz der angesprochenen Mehrdeutigkeiten kodieren Fingerabdr cke Substanzstruktu ren in einer gegen ber strukturellen Schl sseln effizienteren Weise W hrend strukturelle Schl ssel blicherweise sp rlich mit Einsen besetzt sind weil ein typisches
265. ternative Datenverwaltung mit ChemFinder Methoden zur Untersuchung von Struktur Wirkungs Beziehungen 4 1 Identifikation und Validierung von Leitstrukturen 4 1 1 Die Bildung von Strukturklassen mit MoSS 4 1 2 Ber cksichtigung von Wirksamkeiten inMoSS 4 1 3 Ein verbesserter Wirksamkeitsfilter 22 222 220 4 1 4 Aufbereitung und Visualisierung von Strukturklassen 4 1 5 Bildung von Strukturhierarchien 4 1 6 Visualisierungen von Strukturhierarchien 4 2 Strukturelle Clusteranalysen zur Suche nach neuen Leitstrukturen 4 2 1 Repr sentation von Substanzstrukturen 42 2 Strukturelles Clustering 46 44 664 804 04 4 8 200 84 4 3 Simulationen des Dockings von Wirkstoffen an polyQ Protofibrillen Ergebnisse und Diskussion 5 1 Entdeckung und Entwicklung einer ersten neuen Wirkstoffklasse 5 1 1 Das mehrstufige Screening der DIVERSet 1 Bibliothek 5 1 2 Struktur Wirkungs Beziehungen von NBB Substanzen 5 1 3 Fokussierte NBB Bibliotheken 2 2222020 5 1 4 Therapeutische Behandlung von Scrapie infizierten M usen 5 1 5 Studien zur Pharmakokinetik oaaae 5 1 6 Unterdr ckung der Aggregation von a Synuklein 5 1 7 Inhibierung der Aggregation von poly Glutamin Proteinen 5 2 Eine weitere neue Wirkstoffklasse sce eae ate er 5 2 1 Das Zellkultur Screening der DIVERSet Bibliotheken 5 2 2 Di
266. tierte Licht aus der Scanning unit 23 2 Der Forschungsverbund TSE Therapie ber eine Anordnung dichroitischer Spiegel die das anregende Licht reflektieren und das emittierte Licht durchlassen sowie ber eine weitere optische Anordnung zu zwei ge trennten Einzel Photon Detektoren zu leiten Diese optische Anordnung umfasst weitere dichroitische Spiegel welche die gr nen und roten Fluoreszenzphotonen nach der Farbe getrennt in die Detektoren leiten Die von den beiden Einzel Photon Detektoren w hrend der gesamten Messzeit aufge fangenen Fluoreszenzphotonen werden innerhalb kurzer zeitlicher Abschnitte sogenann ter Bins gez hlt Beim DIVERSet Screening wurde eine Gesamtmesszeit von f nfmal 15 s also 75 s f r jedes T pfchen gew hlt und die L nge der Bins betrug 40 us Auf grund dieser kurzen Zeitskala ist es nach der Poisson Statistik sehr unwahrscheinlich dass Fluoreszenzsignale von mehr als einem Partikel erzeugt werden Jedes der resultierenden 1 875 x 10 zeitlichen Bins definiert ein rot gr n Ereignis d h einen zweidimensiona len Vektor dessen Eintr ge durch die Anzahlen der roten bzw gr nen Photonen gegeben sind die innerhalb des zeitlichen Bins registriert wurden Jedes rot gr n Ereignis definiert also einen Punkt im positiven Quadranten einer Ebene Tr gt man diese rot gr n Ereig nisse in ein Diagramm ein so ergibt sich eine zweidimensionale Fluoreszenz Intensit ts Verteilung 2D FID
267. trollen zugeordnet werden so wird diese Klasse als Trefferklasse Ty K C 11 definiert Enth lt die Klasse 7 auf der gew hlten Skala o neben den Merkmalsvekto ren der Positiv Kontrollen auch solche von Testsubstanzen so werden diese als Treffer angesehen ber diese scharfe Klassifikation hinaus soll eine unscharfe Zuordnung der Merkmalsvektoren X von Testsubstanzen zur Trefferklasse 7 auf der gew hlten Aufl sungsstufe o getroffen und anhand dieser ein neues Wirksamkeitsma konstruiert werden 137 C Eine Methode zur vorurteilsfreien Klassifikation von SIFT Daten C 1 3 Konstruktion eines neuen Wirksamkeitsma es Nach dem Bayesschen Satz definieren die Komponenten C 7 des Dichtemodells C 6 M unscharfe Klassen r die durch die Zuordnungswahrscheinlichkeiten l Aaya yPxler 7 P r x C o PRIC o f r r 1 M C 12 charakterisiert sind Dabei wird ein gegebener Merkmalsvektor gem den Wahrschein lichkeiten P r C o 0 1 den M Klassen r zugeordnet Die zu den unscharfen Klassen r geh rigen Codebuchvektoren c werden gem C 9 den Prototypen y zugeordnet c y welche die scharfen Klassen K definieren Dadurch werden die M unscharfen Klassen r zu N lt M unscharfen Klassen j vereinigt die durch die Zuordnungswahrscheinlichkeiten PYIRCo XO PeI amp C o f r j 1 No re r e ys charakterisiert sind Hier werden die Zuordnungswahrscheinlichkeite
268. twendig unseren Projektpartnern einen einfachen Zugriff auf diese Daten zu erm glichen Das im Folgenden beschriebene Paket SIFT Viewer I ist eines der Werkzeu ge die von mir zu diesem Zweck und zur Auswertung der SIFT Messdaten entwickelt wurden 3 4 Das Visualisierungspaket SIFT Viewer Zu Beginn des Screenings der DIVERSet Bibliotheken als von meinen Partnern in TP1 die ersten Platten mit Testsubstanzen mit der SIFT Technik gemessen worden waren wur de rasch klar dass die generierten Messdaten automatisiert ausgewertet und in einer leicht zugreifbaren Form aufbereitet werden m ssen Die bis dahin in TP1 vorgenommene Aus wertung unter Verwendung des Tabellenkalkulationsprogramms Microsoft Excel ist nur f r kleinere Datenmengen geeignet weil daf r einige Handarbeit n tig ist Daher wur de von mir zur automatisierten Auswertung Aufbereitung und Visualisierung der SIFT Daten das Softwarepaket SIFT Viewer I entwickelt Das Paket SIFT Viewer I umfasst eine Reihe von Softwarewerkzeugen die in dem Mo dul screening f r das Versionskontrollsystem CVS Concurrent Versions System 122 abgelegt und f r die Mitarbeiter der Arbeitsgruppe Tavan ber den dortigen CVS Ser ver zug nglich sind Es sei darauf hingewiesen dass das Modul screening neben SIFT Viewer Inoch Werkzeuge zur Durchf hrung von Substruktursuchen und zur Klassifikation von SIFT Daten vgl Abschnitt 4 1 weiter unten bzw Anhang C enth lt Die wichtigsten
269. tzt wurde vgl Abschnitt 3 5 2 Als Hinweis f r an der Java Technik Interessierte sei angemerkt dass der Einsatz von Ja va erm glichte frei verf gbare Programmbibliotheken bei der Entwicklung der tsedb Bibliothek zu verwenden Dazu z hlen neben den oben genannten Bibliotheken auch das Framework log4j 175 welches f r die Ausgabe von Meldungen zur Information des Benutzers oder bei auftretenden Fehlern eingesetzt wurde Anstatt solche Meldungen auf die Standardausgabe auszugeben werden die Meldungen dem Loggingsystem von log4j bergeben Beim Erstellen des Programms legt der Programmierer lediglich den Typ der bergebenen Meldung fest wobei zwischen Informations Warn und Fehlermeldungen unterschieden wird Zur Laufzeit des Programms k nnen dann Ziel und Umfang der Aus gabe konfiguriert werden Auf diese Weise kann etwa f r die Benutzer eine Programmver sion eingestellt werden die nur wichtige Informationen ausgibt w hrend die Entwickler beispielsweise zur Suche nach Programmfehlern eine wortreichere Konfiguration w hlen k nnen 132 C Eine Methode zur vorurteilsfreien Klassifikation von SIFT Daten Bei den Screening Kampagnen der DIVERSet Bibliotheken im SIFT Assay vgl Kapi tel 5 wurden f r die Auswahl von Treffersubstanzen anhand der gemessenen 2D SIFT Spektren das auf den Summenobservablen S gt basierende kontrollenbezogene Wirksam keitsma vgl Abschnitt 3 2 sowie ein heuristisch festgelegter Grenzwert einge
270. u entwickeln In publizierten SAR Untersuchungen siehe beispielsweise 79 f r eine SAR Studie von Akridin Derivaten als anti Prion Therapeutika werden in der Regel relativ kleine An zahlen 10 von Substanzen aus einer gegebenen strukturellen Klasse analysiert die wie oben dargestellt wurde durch eine gemeinsame chemische Leitstruktur charakterisiert ist Dabei werden die Einfl sse von strukturellen Variationen auf die biologischen Wirk samkeiten der betrachteten Substanzen diskutiert wobei die Wirksamkeiten blicherwei se durch aufw ndige Experimente wie beispielsweise Verd nnungsreihen in Zellkulturen oder Tierversuche relativ genau bestimmt sind Nachdem es uns im Verbund gelungen war durch visuellen Vergleich der SIFT und Zellkulturergebnisse aus TP1 und TP4 eine erste 75 4 Methoden zur Untersuchung von Struktur Wirkungs Beziehungen Hypothese f r eine Leitstruktur einer anti Prion Wirkstoffklasse aufzustellen siehe Kapi tel 5 und sich gezeigt hatte dass in den DIVERSet Bibliotheken einige hundert Vertreter dieser potenziellen Wirkstoffklasse vorhanden sind stellte sich zun chst die Frage ob es m glich sein w rde SAR Untersuchungen von solch gro en Anzahlen 500 struktu rell hnlicher Substanzen durchzuf hren die durch vergleichsweise ungenau bestimmte SIFT Wirksamkeiten aus dem prim ren Screening beschrieben sind Dabei ging es insbe sondere um die Frage ob die durch die mehr oder weniger zuf llig gefunde
271. uellcode ist im CVS Modul ISE_DB abgelegt und dar ber f r die Mitarbeiter des BMO zug nglich JBuilder und Eclipse unterst tzen den Zugriff auf Versionskontrollsysteme wie CVS und erleichtern damit erheblich die Softwareentwicklung in einer Gruppe mit mehreren Entwicklern F r eine detaillierte Beschreibung der tsedb Bibliothek sei auf die im Quellcode ent haltenen Kommentare und auf das Java Werkzeug javadoc verwiesen mit dessen Hilfe aus dem Quellcode der Bibliothek und den darin enthaltenen Kommentaren eine HTML basierte Dokumentation generiert werden kann Werkzeuge wie JBuilder oder Eclipse un terst tzen die Dokumentationsgenerierung mit javadoc und vereinfachen diesen Vor gang erheblich An dieser Stelle soll lediglich ein berblick ber die wichtigsten in der tsedb Bibliothek umgesetzten Funktionalit ten gegeben werden Zur Umsetzung der angesprochenen Funktionalit ten besteht die tsedb Bibliothek aus einer umfangreichen Sammlung von etwa 140 Java Klassen das sind Objekte der Spra che Java die der Datenhaltung und dem Zurverf gungstellen von Methoden dienen Die Klassen sind nach inhaltlicher Zusammengeh rigkeit in sogenannten Paketen gruppiert JBuilder ist auf dem Windows Laptop lisa und Eclipse auf dem Linux Rechner celeritas installiert 129 B Die Java Bibliothek tsedb tsedb generated db data sift sql io imports em SPE exports algorithm
272. uert wird 113 In w ssriger Umgebung ist Helix 1 instabil Sobald sich diese Helix jedoch an den hydrophoben Kern des Proteins anlagert kann sie wegen der dort erniedrigten Dielektrizit tskonstante in eine stabile helikale Struktur falten 113 Anhang D berichtet von diesem Beitrag zu der Grundlagenforschung auf dem Gebiet der Prionkrankheiten den ich zusammen mit Martina Stork Bernhard Schropp und Paul Ta van abseits des zentralen Screening Projektes leisten konnte 2 4 HTS f hige Zellkulturen und ein weiteres Modellsystem TP3 Prof Martin Groschup und das auf der Ostseeinsel Riems gelegene Bundesforschungs institut f r Tiergesundheit an dem Groschup t tig ist sind einer breiteren ffentlichkeit durch die BSE Pathogenesestudien an Rindern bekannt die dort durchgef hrt werden Im von Groschup geleiteten Institut f r Neue und Neuartige Tierseuchenerreger ist au er dem eine Reihe von Modellsystemen f r Prionkrankheiten verf gbar die im Verbund f r die Suche nach Wirkstoffen eingesetzt wurden Das f r die Wirkstoffsuche bedeutendste auf der Insel Riems eingesetzte System ist ein Zellkulturmodell mit welchem Testsubstanzen aus den DIVERSet Bibliotheken in ho hem Durchsatz plattenweise prozessiert und nach Wirkstoffen durchsucht werden k n nen Dieses HTS f hige Zellkulturmodell unterscheidet sich von jenem aus der Gruppe Tatzelt vor allem hinsichtlich der Kultivierung der Zellen und der anschlie enden Analyse der Ze
273. um eine strukturelle Basis zu verleihen Die Zuckerseitenketten und der Membrananker wurden bei der Mo dellbildung mit ber cksichtigt und sind lediglich aus Gr nden der bersichtlichkeit hier nicht mit abgebildet 11 1 Einleitung Helix 3 Abbildung 1 7 Dreieckiges helikales Modell fiir PrP Nach diesem Modell bleiben bei der Umwandlung von PrP in PrP Helix 3 vollst ndig und Helix 2 bis zur Disulfidbriicke erhalten vgl Abbildungen 1 5 und 1 6 w hrend der N terminale Rest der Sequenz beginnend bei Residuum 106 in eine 6 helikale Struktur eingebunden ist Der hier abgebildete Teil des Modells umfasst die Sequenz der Aminos uren 106 bis 228 und reicht damit N terminal ber den in PrP globular strukturierten Teil hinaus Abschnitte die in PrP unstrukturiert sind oder Helix 1 bilden tragen in PrP zu einer linksh ndigen 6 Helix bei Die mittlere Windung der regul ren dreifach gewundenen 6 Helix ist von einer Loop Region 134 153 unterbrochen in der geladene und polare Residuen platziert sind Dies gew hrleistet dass nur apolare Residu en ins Innere der Helix zeigen was f r die Stabilit t solcher Strukturen notwendig ist nach Model 2 aus Stork et al 27 Die weiter oben ausgef hrten strukturellen Betrachtungen von PrP haben offen gelassen auf welche Weise die posttranslationalen Modifikationen in den Zellen vorgenommen wer den Auch die m gliche Funktion von PrP im zellul ren Kupferhaush
274. unction of helix 1 in folding and aggregation J Biol Chem 278 14961 14970 2003 32 141 113 T Hirschberger M Stork B Schropp K F Winklhofer J Tatzelt und P Tavan Structural instability of the prion protein upon M205S R mutations revealed by molecular dynamics simulations Biophys J 90 3908 3918 2006 33 141 150 Literaturverzeichnis 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 M Eiden G J Palm W Hinrichs U Matthey R Zahn und M H Groschup Synergistic and strain specific effects of bovine spongiform encephalopathy and scrapie prions in the cell free conversion of recombinant prion protein J Gen Virol 87 3753 3761 2006 34 I N Bronstein K A Semendjajev G Musiol und H M hlig Taschenbuch der Mathematik Deutsch Thun und Frankfurt am Main 1995 39 F E Grubbs Procedures for Detecting Outlying Observations in Samples Technometrics 11 1 21 1969 40 41 Elsevier MDL San Ramon CA USA CTfile Formats http www mdli com downloads public ctfile ctfile jsp 44 A J Leo Calculating log Poct from structures Chem Rev 93 1281 1306 1993 46 47 P Ertl B Rohde und P Selzer Fast Calculation of Molecular Polar Surface Area as a Sum of Fragment Based Contributions and Its Application to the Prediction of Drug Transport Properties J Med Chem 43 3714 3717 2000
275. und Diffusionszeiten nicht ben tigt Stattdessen st tzt sich die Auswertung auf die seltenen hochintensiven Signale die von einzelnen intensiv fluoreszierenden Partikeln im Laserfokus stammen Um bei Messun gen von geringen Konzentrationen gro er langsam diffundierender Partikel die Zahl der detektierten Partikel zu erh hen wird bei der SIFT Technik der Laserfokus durch die Pro be bewegt Auf diese Weise scannt man nach intensiv fluoreszierenden Targets Ein und zweifarbige Varianten der SIFT Technik wurden am Institut von Prof Kretzschmar schon fr her auf dem Gebiet der Diagnose von Prionkrankheiten erfolgreich f r die ul trasensitive Detektion von PrP Aggregaten eingesetzt 103 104 Zur Untersuchung des 22 2 2 Der anti Prion 2D SIFT Assay TP1 www Single Photon Detectors Dichroic Analyseverfahren FCS FIDA SIFT Pinhole Abbildung 2 4 SIFT Messaufbau Mit dem abgebildeten Ger t Insight Reader 105 wur den Mikrotiterplatten in deren T pfchen sich Assay Mischungen mit jeweils unterschiedlichen Testsubstanzen befanden mit der SIFT Technik in hohem Durchsatz vermessen Das Ger t be wegt dazu die einzelnen T pfchen durch den gemeinsamen Fokus von zwei bei unterschiedli chen Wellenl ngen gr n 488 nm und rot 633 nm anregenden Lasern Die von Fluoreszenz markierten Prion Aggregaten im Laserfokus abgestrahlten gr nen und roten Photonen wer den von einem di
276. unl slich und resistent gegen ber der Verdauung mit Proteinase K ist Daher gibt das Modellsystem der ScN2a Zellen zuverl ssig die in vivo Kennzeichen der Prion krankheiten wieder die bereits in Zusammenhang mit dem in Abbildung 1 2 dargestellten Western Blot diskutiert wurden LPDPP PSP AA o CH3 IN Au u a nN CH3 NH2 4x CF3 COOy NH3 Abbildung 2 8 Der anti PrP Wirkstoff DOSPA Das polykationische Lipid DOSPA ver hindert zuverl ssig die Anreicherung von PrP in ScN2a Zellen 75 DOSPA wurde des halb f r die Zellkulturtests von DIVERSet Substanzen als Positiv Kontrolle mitgemessen Weil DOSPA im molekularen SIFT Assay die Aggregation von PrP und PrP verl sslich hemmt vgl Abbildung 2 5 wurde das Lipid auch im SIFT Screening als Kontrollsubstanz mitge f hrt bernommen aus 75 Bereits vor Beginn des Verbundprojektes konnten Winklhofer und Tatzelt durch den Ein satz des ScN2a Modells eine neue Klasse von anti Prion Substanzen die polykationi schen Lipopolyamine identifizieren 75 Diese Substanzen beeinflussen die Neubildung von PrP und induzieren den Abbau von PrP Aggregaten in ScN2a Zellen Die effek tivste der untersuchten Verbindungen aus dieser Klasse ist das Lipid DOSPA dessen che mische Struktur in Abbildung 2 8 dargestellt ist DOSPA erwies sich auch im SIFT anti Prion Assay als wirksam vgl Abbildung 2 5D Weil DOSPA eine starke und verl ss liche Abnahme der Bindung von PrP an PrP
277. ur Auswahl von Bibliotheksplatten und Substanzen sowie einige unsichtbare Komponen ten die zur Verarbeitung von durch Benutzerinteraktionen ausgel sten Ereignissen dienen In analoger Weise sind die im Paket tsedb gui sift und unterhalb davon befindli chen GUI Komponenten f r die Anwendung SIFT Viewer II vorgesehen Zu diesen Kom ponenten z hlen die verschiedenen grafischen T pfchenrepr sentationen von Messplat ten aus dem Paket tsedb gui sift selectors die zur Auswahl von T pfchen dienen Dynamische Chart Komponenten wie Plots von SIFT Spektren Summenobserva blen und Aktivit ten Dosis Wirkungs Kurven und weitere grafische Darstellungen ba sieren auf der frei verf gbaren Java Bibliothek JFreeChart 136 und finden sich im Paket tsedb gui sift views Intsedb gui sift plate werden mehrere der ge nannten Komponenten zur Repr sentation einer Messplatte zusammengestellt Das Paket tsedb gui sift event dient der Verarbeitung von Ereignissen die zur Laufzeit infolge von Benutzerinteraktionen auftreten Es sei angemerkt dass die Funktionalit ten dieser Komponenten auch in Abschnitt 3 6 im Zusammenhang mit den F higkeiten von SIFT Viewer II erl utert werden Das Paket tsedb tools enth lt einige kleinere Werkzeuge ohne grafische Benutzero berfl che beispielsweise eines das aus den SIFT Messdaten f r alle DIVERSet Biblio theken die Wirksamkeiten berechnet und von mir bei der Bef llung der TSE DB Tabelle SIFT_PRIMARY_TP_1 eingese
278. uster Mitglieder sc Ppt gt 50 6 Pi gt 50 Abbildung 5 21 SAR Karte f r die DIVERSet Bibliotheken Die von DataMiner gebilde ten Substanzcluster sind durch Symbole repr sentiert die so in der Ebene verteilt sind dass jene von strukturell hnlichen Clustern nahe beieinander liegen Die Gr en der Symbole spie geln die Zahlen der in den Clustern enthaltenen Substanzen wieder Die Formen der Symbole sind durch die gem Gleichung 5 1 definierten clusterlokalen Anteile Ps rr jener Substan zen C festgelegt deren Prim rwirksamkeit a C gt 0 25 im SIFT Screening den gew hlten Mindestwert berschritt Dabei werden Cluster die mehr als 50 wirksame Substanzen ent halten Ps rr gt 0 5 durch Sternchen und die brigen Cluster durch K stchen repr sentiert Die Symbole sind rot gef rbt falls der gem 5 2 definierte Anteil Pzx gt 0 5 der Prim r treffer aus dem Zellkultur Screening gr er als 50 liegt andernfalls sind die Symbole grau gef rbt Daraus ergibt sich dass gro e rote Sternchen solche Cluster repr sentieren die viele in beiden Assays wirksame Substanzen enthalten Ausgew hlt sind f nf dadurch hervorste chende Cluster XXX_1 bis XXX_5 deren Substanzen der gemeinsamen auf diese Weise entdeckten neuen Wirkstoffklasse XXX angeh ren 122 5 2 Eine weitere neue Wirkstoffklasse Wirksamkeit der Substanzklasse XXX erkennen Daraufhin durchgef hrte Recherchen in Literatur und Patentda
279. vaScript basierte Baumdarstellung der Strukturhierarchie Die Knoten des Baumes sind nach den generi schen Klassennamen benannt und zeigen zudem die klassenlokalen Mittelwerte der SIFT Wirksamkeiten um das Auffinden von hochwirksamen Klassen zu unterst tzen Durch Klicken in der Baumdarstellung kann der Benutzer hnlich wie beim Explorer von Mi crosoft Windows durch die Hierarchie navigieren und einzelne Strukturklassen f r die 84 4 1 Identifikation und Validierung von Leitstrukturen 2D Strukturen Mozilla Firefox amp GG Gi tesizic scratchithomas queries DIVERSet1 NBB_dss2 miner_runjminer_js_treejindex html Be Gir Hierarchie von 2D Strukturmotiven Site contents E menu 5 3687 0 04 E Struktur s687 15486 E04 gO s686 0 33 s685 0 11 9 684 0 20 BE Struktur s684 a 9658 0 19 H O s644 0 20 H O s6360 34 a s600 0 32 5 s5150 37 A Struktur s515 4 5140 32 5 s486 0 43 Di Struktur 486 C 84850 55 s228 0 73 s40 0 01 HO s457 0 32 42 s47 0 28 s421 0 00 E 3640 14 c 4 cr 3313106 cl 10308 E04 SA s3150 02 01 s151 0 28 s27 0 17 2 s683 0 50 O 682 0 09 4 3681 0 02 E s677 0 07 E s670 0 07 0 s667 0 03 HHMI RREN NAY Compound SIFT activity 10307 D11 0 552381 10305 E04 0 728636 10305 B08 0 0149925 Mean 3 0 432003 a Fertig Abbildung 4 4 Schn
280. von Firmen wie Roche betreibt Hinweise auf das neu auf dem Markt erschienene Softwarepaket Benchware HTS DataMiner der Firma Tripos 143 welches sich tats chlich als wirksames Instrument zur Identifikation von potenziellen Leitstrukturen aus HTS Daten erwies In Abschnitt 4 2 werde ich dieses Werkzeug vorstellen In j ngster Vergangenheit konnte ich dar ber hinaus zeigen dass eines der in Abschnitt 4 1 beschriebenen Werkzeuge zur Validierung von Leitstrukturen zus tzlich zur Identifikation von neuen Leitstrukturen eingesetzt werden kann Hat man schlie lich wirksame Substanzklassen identifiziert so kann man sich die An schlussfrage stellen welche molekularen Mechanismen die Wirksamkeit der Substanzen einer gegebenen Klasse vermitteln Im Falle von anti aggregatorischen Wirkstoffen ist man dabei allerdings mit dem Problem konfrontiert dass der Angriffspunkt der Substan zen experimentell bislang nicht bestimmt werden kann Solche Substanzen k nnen entwe der an die PrPC Monomere andocken und so deren Koaggregation an die PrP Fibrillen verhindern oder sie k nnen direkt und mit demselben Resultat an die Fibrillen binden Trotz dieser Unsicherheit stellte sich mir im Verlauf des Projekts die Aufgabe in silico Docking Experimente durchzuf hren Die dazu verwendeten Methoden werden in Ab schnitt 4 3 skizziert 76 4 1 Identifikation und Validierung von Leitstrukturen 4 1 Identifikation und Validierung von Leitstrukturen Be
281. wa durch Autofluoreszenz oder Quenching der Testsubstanzen 67 3 Methoden zur Haltung Auswertung und Visualisierung von Daten verursacht werden k nnen zu inspizieren Im gezeigten Beispiel zeigen beide Kurven er h hte Werte der roten Gesamtintensit ten f r hohe Konzentrationen und weisen dadurch auf Autofluoreszenzen der beiden Testsubstanzen hin Es sei angemerkt dass diese stark erh hten Intensit tswerte bereits von der automatischen Detektion als Ausrei er erkannt wurden und demzufolge die zugeh rigen T pfchenrepr sentationen in Abbildung 3 8 B als durchgestrichen markiert sind Darstellung von Molek lstrukturen Auch die Darstellung von Molek lstrukturen geschieht mit SIFT Viewer II dynamisch Falls eine Verbindung zur TSE DB besteht holt SIFT Viewer II aus der Tabelle SUB STANCE anhand der Substanznamen der auf der betrachteten Platte enthaltenen Substan zen die zugeh rigen SMILES Strings und erzeugt daraus Bilder der Molek lstrukturen Dabei werden Funktionalit ten der frei verf gbaren Java Bibliothek CDK 137 einge setzt vgl Anhang B 10293_603 Abbildung 3 10 Von SIFT Viewer II dargestellte Molek lstruktur Die Molek lstruktur der vom Benutzer zuletzt ausgew hlten Substanz wird von SIFT Viewer II in den sichtbaren Bereich geholt und fett umrandet Das Raster im rechten Bereich stellt schematisch die Anord nu
282. wertung und Visualisierung von Daten markiertes PrP enthalten Weil daher kleine Eintr ge in diesem Bereich die anti aggre gatorische Wirksamkeit der Testsubstanzen kodieren soll das zu entwickelnde Wirksam keitsma auf diesen Eintr gen basieren 3 2 1 Observablen aus den 2D SIFT Spektren Aus den oben angef hrten Gr nden scheint es also zweckm ig zu sein die Eintr ge Xwi verschiedener Sektorenbereiche wie beispielsweise demjenigen f r i 1 5 zusammenzufassen Es wird dazu f r ein gegebenes T pfchen w die Summe b Syw I Ku 3 6 der Eintr ge xw in dem von Sektor v bis Sektor b reichenden Bereich gebildet Diese De finition erfolgt allgemein f r Sektorenbereiche von v bis b weil neben der Summe S z w weitere solche bereichsweisen Vergr berungen der Spektren x f r verschiedene Aus wertungen verwendet werden wie beispielsweise S ie f r die Ausrei ererkennung vgl Abschnitt 3 1 Nach den oben gegebenen Erl uterungen kodieren insbesondere gro e Werte der Summe S w diejenigen in der Mischung im T pfchen w enthaltenen Ag gregate die durch Anlagerung von PrP Molekiilen gewachsen sind 3 2 2 Ein auf die Kontrollen bezogenes Wirksamkeitsma Zur Ableitung eines auf die Kontrollt pfchen bezogenen Wirksamkeitsma es wird zu n chst hnlich wie f r die Ausrei ererkennung aus Abschnitt 3 1 2 die Menge W aller T pfchen einer gegebenen Platte in die Teilmenge P der Positiv Kontrollen
283. ww daylight com smiles 59 Open Babel The Open Source Chemistry Toolbox http openbabel sourceforge net 59 CambridgeSoft Corp Cambridge MA USA http www cambridgesoft com 59 71 73 Borland Software Corporation Cupertino CA USA http www borland com 60 129 Spotfire Inc Somerville MA USA http www spotfire com 62 JFree org JFreeChart http www jfree org jfreechart 66 132 The Chemistry Development Kit http almost cubic uni koeln de cdk 68 132 Adobe Systems Incorporated PDF Reference http partners adobe com public developer pdf index_ reference html 69 iText a Free Java PDF Library http www lowagie com iText 69 131 G Thomas Medicinal Chemistry An Introduction John Wiley amp Sons Ltd 2000 75 H Bohm G Klebe und H Kubinyi Wirkstoffdesign Der Weg zum Arzneimittel Spektrum Akademischer Verlag 2002 75 104 Accelrys Inc San Diego CA USA http www accelrys com 76 Tripos Inc St Louis MO USA http www tripos com 76 77 88 C Borgelt Neuro Fuzzy Systeme Institut fiir Wissens und Sprachverarbeitung Otto von Guericke Universit t Magdeburg MoSS Molecular Substructure Miner http fuzzy cs uni magdeburg de borgelt moss html 77 C Borgelt und M Berthold Mining Molecular Fragments Finding Relevant Substructures of Molecules in IEEE International Conference on Data Mining ICDM 51 58 IEEE Press Pis
284. zahlreichen Studien untersucht wurde weitgehend unklar einen aktuellen berblick zur Funktion von PrP bieten Roucou und LeBlanc 68 Es gibt aber Hinweise darauf dass PrP Neuronen vor oxidativem Stress schiitzen und vor der Apoptose dem programmierten Zelltod bewahren kann 68 Weil PrP Kupfer Ionen binden kann vermutet man au erdem eine Rolle in der Kupfer Ho m ostase d h in der Selbstregulierung des Kupferhaushalts der Zellen 40 Weil PrP von den meisten K rperzellen exprimiert wird wenn auch in besonders gro en Mengen nur von Nervenzellen schlie t man auf eine allgemeine Bedeutung von PrP wenn auch andererseits die in Abschnitt 1 2 angesprochenen Experimente mit PrP knockout M usen andeuteten dass PrP f r das normale Funktionieren von Zellen nicht sonderlich essentiell zu sein scheint Im kranken Organismus wird PrP an der Zellmembran oder in den Vesikeln in die patho logische Konformation PrP umgefaltet aus der es nicht oder in beschr nktem Umfang abgebaut werden kann Schritt 5 in Abbildung 1 9 Infolgedessen sammelt sich PrP dort an verursacht ber bislang unbekannte Signalwege neuronale Fehlfunktion und den Zelltod und lagert sich schlie lich ab 13 1 Einleitung normal pathway t abnormal pathway ligand p conversion compartment Zn memory Pre PrPs Abbildung 1 9 Lebenszyklus von PrP und Entstehung von PrP PrP wird in den Ri bosomen hergestellt 1 und
285. zfeldt Jakob disease Dement Geriatr Cogn Disord 17 158 163 2004 15 R Love Old drugs to treat new variant Creutzfeldt Jakob disease Lancet 358 563 563 2001 15 Medical Research Council Clinical Trials Unit PRION 1 Randomised trial of quinacrine in human prion disease http www ctu mrc ac uk studies cjd asp 15 Literaturverzeichnis 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 National Institutes of Health ClinicalTrials gov CJD Creutzfeldt Jakob Disease Quinacrine Study http www clinicaltrials gov show NCT00183092 15 V Gayrard N Picard Hagen C Vigui V Laroute O Andr oletti und P L Toutain A possible pharmacological explanation for quinacrine failure to treat prion diseases phar macokinetic investigations in a ovine model of scrapie Br J Pharmacol 144 386 393 2005 15 Y Huang H Okochi B C H May G Legname S B Prusiner L Z Benet B J Guglielmo und E T Lin Quinacrine is mainly metabolized to mono desethyl quinacrine by CYP3A4 5 and its brain accumulation is limited by P glycoprotein Drug Metab Dis pos 34 1136 1144 2006 15 B C H May J Witkop J Sherrill M O Anderson P B Madrid J A Zorn S B Prusiner F E Cohen und R K Guy Structure activity relationship study of 9 aminoacridine com pounds in scrapie infected neuroblastoma cells Bioorg Med Chem Lett 16 4913 4916 2006 15
286. zu SIFT Viewer I geh rigen Werkzeuge werde ich im Folgenden detailliert vorstellen 3 4 1 SIFT Dateien und die Extraktion von Messdaten Wie in Abschnitt 2 2 2 erl utert wurde werden von meinen Kollegen vom ZNP mit hilfe von Insight Reader Mikrotiterplatten t pfchenweise vermessen und die dabei er 47 3 Methoden zur Haltung Auswertung und Visualisierung von Daten zeugten Messdaten mithilfe der zugeh rigen SIFT Software hinsichtlich des Z hlens von rot gr nen Fluoreszenzereignissen ausgewertet Mit der SIFT Software k nnen die Ergeb nisse einer Plattenmessung in Form einer Textdatei exportiert werden die wir SIFT Datei nennen Auf diese Weise wurde eine Vielzahl von SIFT Dateien erzeugt und mir zur auto matisierten Auswertung zugeschickt Abbildung 3 2 zeigt einen Auszug aus der Liste der von mir gesammelten SIFT Dateien f r die Platten der DIVERSet 1 Bibliothek Um die Zuordnung von SIFT Dateien zu Bibliotheksplatten zu erleichtern wurde beim Screening der DIVERSet Bibliotheken jeweils die Nummer der getesteten Platte nach einer verein barten Konvention in den Namen der daf r erhaltenen SIFT Datei aufgenommen Zuordnung von Messplatten zu Bibliotheksplatten vom vereinbarten Format abweichende Messungen sind durch die folgenden vorangestellten Buchstaben gekennzeichnet unvollstaendige Messungen nicht 5 mal pro Topf Verteilung auf Platte falsch ntp code in falschem Format schlechte Platte nicht da n Dh

Entwicklung von Medikamenten gegen Prionkrankheiten

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