SimplexaTM Dengue - Focus Diagnostics
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1. i Wenn die Molekularkontrolle f r DV2 oder DV3 einen Wert von Ct 0 ergibt so gilt das Assaysegment als ung ltig und unzuverl ssig Alle Patientenproben m ssen erneut getestet werden ii Wenn die Ot Werte f r DV2 und DV3 lt 40 aber 0 sind und die Leerwertkontrolle g ltig ist wird das Assaysegment als g ltig und zuverl ssig angesehen 2 berpr fung von Patientenprobenergebnissen Die Ergebnisse der klinischen Proben sollten erst ausgewertet werden nachdem die Molekular und die Leerwert Kontrollen berpr ft und f r g ltig und zuverl ssig befunden worden sind F r jedes Segment m ssen f r jede Patientenprobe die Ergebnisse f r DV1 DV4 und RNA IC sowie DV2 DV3 und RNA IC berpr ft werden a Die Amplifikationskurven aller Ergebnisse sind zu berpr fen insbesondere wenn eine Data Quality Meldung Datenqualit t vorliegt Eine g ltige Amplifikationskurve zeigt einen stufenlosen exponentiellen Anstieg Empfohlene Ma nahmen dazu finden Sie im Benutzerhandbuch Focus Simplexa Dengue Seite 7 Bu a 220000 a004 aooo 20000 a004 Fa A a Ka zum a a ni en AS zum i i Gal n a EnS Ver En e E S E A G ltige Amplifikationskurve G ltige Amplifikationskurve Ung ltige Amplifikationskurve b Wenn die Amplifikationskurve f r das Target g ltig ist muss f r die interne RNA Kontrolle kein positives Ergebnis angezeigt we2. LoD Konzentration PFU m WHO WEST PAC 74 WHO S16803 WHO CH53489 TVP 360 ANALYTISCHE REAKTIVIT T Zus tzlich zu den f r die Bestimmung der Nachweisgrenze getesteten St mmen wurde ein weiterer Dengue Virus Serotyp auf die ordnungsgem e Reaktivit t im Assay untersucht Negatives Humanserum wurde mit quantifiziertem Virusmaterial in einer bestimmten Konzentration beimpft siehe nachfolgende Tabelle und in dreifacher Ausf hrung getestet Alle St mme wurden ordnungsgem mit dem richtigen Reaktionsgemisch nachgewiesen Tabelle 8 Zusammenfassung Analytische Reaktivit t Anzahl detektiert Gesamtanzahl Reaktionsgemisch 1 amp 4 Reaktionsgemisch 2 amp 3 Virusstamm Getestete Konzentration DV1 DV4 DV2 DV3 Dengue 1 Hawaii nicht verf gbar 3 3 0 3 0 3 0 3 Dengue 2 New Guinea C 1 00 x 10 TCID5o ml 0 3 0 3 3 3 0 3 Dengue 3 H87 1 00 x 10 TCIDso ml 0 3 0 3 0 3 3 3 Dengue 4 H241 Sm14 1 00 x 10 TCIDso ml 0 3 3 3 0 3 0 3 KREUZREAKTIVIT T Die analytische Spezifit t des SimplexaT Assays wurde beurteilt indem getestet wurde ob ausschlie lich Dengue Viren nachgewiesen werden ohne dass es zu Kreuzreaktionen mit eng verwandten Erregern oder mit Erregern die hnliche klinische Symptome verursachen oder mit Erregern die normaler Bestandteil der Flora in den zu untersuchenden Probetypen sind kommt Negatives Humanserum wurde jeweils mit je einem von achtundzwanzig 28 potenziell kreuzre
3. Negative Percent Agreement G Simplexa Dengue Seite 9 Focus Tabelle 4 Dengue Virus 4 Vergleich mit fr heren Ergebnissen Fr heres CDC Ergebnis Simplexa Dengue DV4 3 N Detektiert N a T a le Deteklieri 23 ar 1 95 Laot bis das Nicht detektiert 141 ge 133 a se e a PPA Positive Prozentuale bereinstimmung Positive Percent Agreement NPA Negative Prozentuale bereinstimmung Negative Percent Agreement Die Ergebnisse waren nach wiederholter Testung unver ndert Bei der Wiederholung des Tests wurden 2 von 8 Proben mit dem Simplexa Dengue Assay und mit einem auf CDC Ver ffentlichungen basierenden internen Assay als DV4 nachgewiesen Eine Probe wurde als DV1 nachgewiesen und eine weitere Probe wurde mit beiden Assays als DV2 nachgewiesen Die verbleibenden zwei Proben wurden nach Wiederholung des Tests in keinem der beiden Assays detektiert REPRODUZIERBARKEIT Die Reproduzierbarkeit des Simplexa Dengue Assays wurde an drei verschiedenen Ger ten untersucht Ein Probenpanel und die Molekularkontrolle wurden an jedem Ger t in dreifacher Ausf hrung zwei Mal pro Tag f r insgesamt f nf Tage getestet Die Negativkontrolle wurde in jedem Lauf ein Mal getestet Jedes Ger t wurde von einem Anwender getestet der zwei Tests des gesamten Probenpanels am Tag durchf hrte d h pro Tag wurden zwei Datens tze erhalten Die Reproduzierbarkeit der qualitativen Ger tereaktion und eine Bewertung der ver
4. le noch die interne Kontrolle detektiert werden ist der Assay ung ltig KONTAMINATION DURCH VERSCHLEPPUNG Die Amplifikation von Verschleppungen wurde mit anderen Assays f r das Ger t und die Universal Disc ermittelt Die Untersuchungen zielten darauf ab Kontaminationen in hoch negativen Proben festzustellen Jede Studie bestand daraus eine stark positive und eine stark negative Probe abwechselnd auf jeder Disc zu platzieren Der Verschleppungseffekt wurde durch Vergleich der beobachteten Negativrate f r die stark negative Probe mit der erwarteten Rate unter normalen Bedingungen der Testwiederholung bestimmt In den bisherigen Untersuchungen wurde keine signifikante Kontamination durch Verschleppung festgestellt QUALIT TSKONTROLLE Jedes Labor sollte ausgehend von den vor Ort geltenden Gesetzen Bestimmungen und der blichen guten Laborpraxis eigene Qualit tskontrollbereiche wie auch die H ufigkeit der Qualit tskontrollen ermitteln LITERATUR 1 Halstead SB 1980 Immunological parameters of togavirus disease syndromes p 107 173 In RW Schlesinger ed The Toga Viruses Academic Press Inc New York 2 WHO Dengue Guidelines for Diagnosis Treatment Prevention WHO HTM NTD DEN 2009 1 and Control New edition 2009 E Simplexa Dengue Seite 12 FOCUS 3 CDC http www cdc gov dengue epidemiology index html 4 Gubler DJ 1989 Aedes aegypti and Aedes aegypti borne disease control in the 1990 s top down or bottom
5. 10 IU mI 0 3 0 3 0 3 0 3 Hepatitis B Virus Kontrolle 1 00 x 10 IU ml 0 3 0 3 0 3 0 3 Hepatitis D Virus unbekannt 0 3 0 3 0 3 0 3 HIV 1 1 00 x 10 Kopien ml 0 3 0 3 0 3 0 3 HIV 2 unbekannt 0 3 0 3 0 3 0 3 HSV 1 1 00 x 10 TCIDso ml 0 3 0 3 0 3 0 3 HSV 2 1 00 x 10 TCIDso ml 0 3 0 3 0 3 0 3 HTLV 1 unbekannt 0 3 0 3 0 3 0 3 Humanes Herpes Virus 6 1 00 x 10 TCIDso mi 0 3 0 3 0 3 0 3 Humanes Herpes Virus 7 1 00 x 10 TCIDso mi 0 3 0 3 0 3 0 3 Humanes Herpes Virus 8 1 00 x 10 TCIDso ml 0 3 0 3 0 3 0 3 Mycobacterium tuberculosis DNA 1 67 x 10 ug ml 0 3 0 3 0 3 0 3 Parechovirus 1 00 x 10 TCIDso mi 0 3 0 3 0 3 0 3 Parvovirus B19 Kontrolle 1 00 x 107 IU mI 0 3 0 3 0 3 0 3 Rubellavirus 1 00 x 10 TCIDso mi 0 3 0 3 0 3 0 3 St Louis Encephalitis Virus 1 00 x 10 TCIDso ml 0 3 0 3 0 3 0 3 Toxoplasma gondii 1 00 x 10 Tachyzoiten ml 0 3 0 3 0 3 0 3 Varizella Zoster Virus 1 00 x 10 Kopien ml 0 3 0 3 0 3 0 3 West Nil Virus unbekannt 0 3 0 3 0 3 0 3 Gelbfiebervirus 1 00 x 10 TCIDso ml 0 3 0 3 0 3 0 3 INTERFERENZEN Die Leistungsf higkeit dieses Assays bez glich m glicherweise interferierender Substanzen wurde nicht ermittelt Durch die automatisierte Nukleins ureextraktion werden Verunreinigungen effektiv aus den Proben entfernt da die Nukleins ure w hrend der Extraktion isoliert und gereinigt wird Internen Kontrollen machen den Endnutzer auf eine m gliche Hemmung der PCR aufmerksam wenn weder eines der Zielmolek
6. einem speziellen der Vorbereitung der Universal Disc mit 96 Vertiefungen f r den Dengue Assay vorbehaltenen Arbeitsbereich arbeiten F r die Vorbereitung der Disc den Universal Disc Ladeblock verwenden Bei der Durchf hrung folgender Vorbereitungsschritte das beispielhafte Disc Layout in Abschnitt C beachten In jede Vertiefung 5 0 uL des entsprechenden Reaktionsgemischs geben 5 0 uL der extrahierten Molekularkontrolle in jede Vertiefung MC auf der Platte geben 5 0 uL der extrahierten Untersuchungsprobe in die entsprechende Vertiefung S auf der Platte geben 5 0 uL der extrahierten Leerwertkontrolle in jede Vertiefung NTC auf der Platte geben Die Platte mit Folie Universal Disc Cover Tape abdecken Den Deckel des Integrated Cycler ffnen Die verschlossene Universal Disc auf die Platte legen Den Deckel vorsichtig schlie en Auf Run Lauf klicken Auf Start klicken 2 O 0 N gi e 0 N a G Simplexa Dengue Seite 6 FOCUS F DATENANALYSE 1 Einzelheiten zur Durchf hrung der Datenanalyse und zum Exportieren der Analysen sofern dies erforderlich ist sind der Bedienungsanleitung des Integrated Cycler zu entnehmen RICHTLINIEN F R DIE AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE Die Erstellung von Ergebnisberichten erfolgt in drei Stufen 1 berpr fung der Validit t des Segments anhand der Kontrollen Die Interpretation der Patientenergebnisse ist in der Integrated Cycler Studio Software unterdr ckt falls eine der al
7. up Am J Trop Med Hyg 40 571 578 5 WHO http www who int csr disease dengue en 6 Halstead SB 1989 Antibody Macrophages Dengue Virus Infection Shock and Hemorrhage A Pathogenic Cascade Rev of Inf Dis 11 5S830 S839 7 MMWR May 21 2010 59 19 577 581 8 Laue T Emmerich P Schmitz H Detection of dengue virus RNA in patients after primary or secondary dengue infection by using the TaqMan automated amplification system J Clin Microbiol 1999 Aug 37 8 2543 7 9 Chang GJ Trent DW Vorndam AV Vergne E Kinney RM Mitchell CJ An integrated target sequence and signal amplification assay reverse transcriptase PCR enzyme linked immunosorbent assay to detect and characterize flaviviruses J Clin Microbiol 1994 Feb 32 2 477 83 10 Munoz Jord n J L Collins CS Vergne E et al Highly sensitive detection of dengue virus nucleic acid in samples from clinically ill patients J Clin Microbiol 2009 47 927 931 11 CLSI H18 A4 Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens Approved Guideline 4 Auflage 2010 Die Anwendung von Scorpions Sonden f r Zwecke im Zusammenhang mit der In vitro Diagnostik beim Menschen ist durch eine Lizenz gesch tzt die Focus Diagnostics Inc von DxS Ltd erworben hat Die Farbstoffe Black Hole Quencher CAL Fluor und Quasar sind Handelsmarken von Biosearch Technologies Inc BTI Die Black Hole Quencher CAL Fluor und Quasar Farbstofftechnologie ist im Rahme
8. 10 100 ul und 100 1000 ul Roche MagNA Pure LC System und zugeh riges Verbrauchsmaterial Roche MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit Roche Kat Nr 3038505001 Universal Disc Ladeblock Gefrierschrank 10 C bis 30 C mit manueller Abtaufunktion f r die Lagerung der gefrorenen Kit Komponenten 0 Gefrierschrank 10 C bis 30 C mit manueller Abtaufunktion f r die Lagerung der gefrorenen Proben bei Bedarf gr N En serPNn 11 12 13 14 15 16 17 18 Simplexa Dengue Seite 3 lagsas K hlschrank 2 C bis 8 C f r aufgetaute Kit Komponenten Biologische Sicherheitswerkbank Laminarflow Haube f r die Durchf hrung der Extraktionen Mikrozentrifuge Vortex Mischer Sterile RNase DNase freie Einmalpipettenspitzen mit Aerosolbarriere 1 5 mi Polypropylen Mikrozentrifugenr hrchen und St nder RNase DNase freie R hrchen werden empfohlen sind aber nicht vorgeschrieben Einweg Schutzhandschuhe ungepudert K hlst nder f r 1 5 ml Mikrozentrifugenr hrchen HALTBARKEIT UND HANDHABUNG 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Reagenzien bei 10 bis 30 C aufbewahren keine Gefrierger te mit Abtauautomatik verwenden Kits und Reagenzien nach Ablauf des Verfalldatums nicht mehr verwenden Primer Mixe HS Master Mix Molekularkontrolle und interne RNA Kontrolle vor Gebrauch bei Raumtemperatur auftauen lassen Temperaturbereich ca 18 C bis 25 C Die Reaktionsgemische nach Zugab
9. 8 011 03 0 49 1 5 0 86 2 86 DV3 Dengue 3 90 382 0 51 1 3 0 22 06 0 62 1 6 0 87 2 3 121 32 Schwach positiv Dengue 3 89 33 0 0 58 1 7 0 63 19 o00 o0 0 26 0 8 0 89 27 M ig Positiv G Simplexa Dengue Seite 10 FOCUS Varianzkomponente S Intra Assay z Mittlerer Inter Inter Inter Ziel Probe N Wiederhol Gesamt Ct Instrument Untersucher Tag Lauf genauigkeit SD CV SD CV SD CV SD CV SD CV Molekularkontrolle 90 33 4 0 54 1 6 0 42 1 3 0 00 0 0 0 29 0 9 0 75 2 2 Dengue 90 36 4 0 00 0 0 0 24 0 7 0 00 0 0 0 79 2 2 0 82 2 3 Schwach positiv RU 89 32 0 0 27 0 8 0 10 0 3 o 00 0 0 0 17 0 5 0 33 1 0 M ig Positiv Molekularkontrolle 90 34 4 0 37 1 1 0 29 0 8 0 00 0 0 0 38 151 0 60 1 7 Den als Nicht detektiert klassifizierten Ergebnissen wird ein Ct Wert von 40 1 zum Zwecke der Analyse der Reproduzierbarkeit zugeordnet ANALYSEEMPFINDLICHKEIT NACHWEISGRENZE Die Nachweisgrenze Limit of Detection LoD des SimplexaTM Dengue Assays wurde mit quantifizierten Best nden von Dengue Virus St mmen von denen serielle Verd nnungsreihen in Humanserum hergestellt wurden bestimmt Als Nachweisgrenze f r jeden Assay wurde die niedrigste Konzentration mit einer Erkennung von 2 95 mindestens 19 aus 20 Replikaten festgelegt Tabelle 7 Zusammenfassung Nachweisgrenze Dengue Serotyp Nachweisgrenze
10. G DER REAGENZIEN Ein f r die Vorbereitung des Reaktionsgemischs f r den Dengue Assay reservierter Bereich 1 Primer Mixe und HS Master Mix bei Raumtemperatur etwa 18 C bis 25 C auftauen Vor jedem Gebrauch die Kit Komponenten f r Primer Mixe HS Master Mix und RT Mix durch sechs bis achtmaliges Pipettieren durchmischen und dann kurz anzentrifugieren um den Inhalt auf dem Boden des R hrchens zu sammeln Das ben tigte Volumen jeder Komponente in ein Polypropylen Mikrozentriftugenr hrchen entsprechender Gr e Pipettieren um das erforderliche Volumen des Reaktionsgemischs zuzubereiten N Reaktionsgemisch Volumen Dengue 1 amp 4 Reaktionsgemisch Reaktionsgemisch Reaktionsgemisch Volumen 1 Reaktion Volumen 10 Reaktionen Reagens Reaktionsgemisch Volumen Dengue 2 amp 3 Reaktionsgemisch Reaktionsgemisch Reaktionsgemisch Volumen 1 Reaktion Volumen 10 Reaktionen Reagens Jedes Reaktionsgemisch durch 8 bis 10 maliges Pipettieren vorsichtig mischen Kurz bei geringer Drehzahl anzentrifugieren um den Inhalt auf dem Boden des R hrchens zu sammeln Anschlie end PCR vorbereiten Die Reaktionsgemische innerhalb einer Stunde nach Zubereitung verwenden Falls die PCR nicht sofort nach Herstellung des Reaktionsgemischs vorbereitet wird k nnen die Reaktionsgemische bis zur PCR maximal 1 Stunde bei 2 C 8 C gelagert werden D Ol Zi 2 E BEREICH F R DIE REAL TIME PCR AMPLIFIKATION In
11. Simplexa Dengue REF MOL3100 Rev C Ein Real Time Polymerase Kettenreaktion PCR Assay f r den Nachweis und die Typisierung der Dengue Virus Serotypen 1 2 3 und 4 in vitro OCUS Diagnostics In vitro Diagnostikum VERWENDUNGSZWECK Der Simplexa Dengue Real Time Polymerase Kettenreaktion RT PCR Assay von Focus Diagnostics ist f r die Anwendung auf dem 3M Integrated Cycler f r den in vitro Nachweis und die Typisierung der Serotypen 1 2 3 und 4 des Dengue Virus in Humanserum bestimmt ZUSAMMENFASSUNG UND ERL UTERUNG Dengue Fieber DF ist eine akute sich selbst begrenzende virale Erkrankung die durch Fieber Kopfschmerzen Schmerzen im gesamten K rper Hautausschl ge Lymphadenopathie und Ersch pfung gekennzeichnet ist Bei Vorliegen der schwersten Form einer Dengue Fieber Infektion dem H morrhagischen Dengue Fieber DHF jeidet der Patient unter hohem Fieber und Nierenversagen was zum h ufig t dlichen Dengue Schock Syndrom DSS f hrt Sch tzungen zufolge sind weltweit etwa zwei Milliarden Menschen dem Risiko einer Infektion mit DF ausgesetzt und pro Jahr werden bis zu 100 Millionen Menschen infiziert Zusammen mit den hunderttausenden von F llen an DSS stellen diese Zahlen den Grund daf r dar dass Dengue weltweit als die wichtigste durch Arboviren hervorgerufene Krankheit gilt Auf DHF wurde man erstmalig in den 1950er Jahren w hrend der Dengue Epidemien auf den Philippinen und in Thaila
12. agierenden Erreger in klinisch relevanten Konzentrationen beimpft Unbeimpftes Serum wurde ebenfalls getestet um Ausgangswerte zu erhalten Die Proben wurden in dreifacher Ausf hrung getestet um eine m gliche Kreuzreaktivit t zu berpr fen Falls in einem der Detektionskan le DV1 DV2 DV3 DV4 in einem der drei Replikate ein Signal detektiert wurde wurden weitere 5 Replikate zur Best tigung getestet Es wurde keine Kreuzreaktivit t festgestellt Tabelle 9 Zusammenfassung Kreuzreaktivit t Anzahl detektiert Gesamtanzahl Kreuzreagierender Erreger Getestete Konzentration Reaktionsgemisch 1 amp 4 Reaktionsgemisch 2 amp 3 l DV1 DV4 DV2 DV3 5 Adenovirus Kulturfl ssigkeit Typ 1 1 00 x 10 TCIDso ml 0 3 0 3 0 3 0 3 Adenovirus Kulturfl ssigkeit Typ 7A 1 00 x 10 TCIDso ml 0 3 0 3 0 3 0 3 Aspergillus unbekannt 0 3 0 3 0 3 0 3 Focus Anzahl detektiert Gesamtanzahl Simplexa Dengue Seite 11 Kreuzreagierender Erreger Getestete Konzentration Reaktionsgemisch 1 amp 4 Reaktionsgemisch 2 amp 3 DV1 DV4 DV2 DV3 BK Virus 1 00 x 10 Kopien ml 0 3 0 3 0 3 0 3 Chikungunya Virus 1 00 x 10 TCIDso mi 0 3 0 3 0 3 0 3 Zytomegalievirus CMV 1 00 x 10 TCIDso ml 0 3 0 3 0 3 0 3 Enterovirus 71 1 00 x 10 TCIDso ml 0 3 0 3 0 3 0 3 Epstein Barr Virus EBV 1 00 x 10 Kopien ml 0 3 0 3 0 3 0 3 Hepatitis B Virus Kontrolle 5 00 x
13. bnis Simplexa Dengue DV1 n Detektiert Nicht bereinstimmung beobachtet erwartet detektiert 95 CI PPA 100 0 32 32 Br 3 E 95 CI 89 3 bis 100 0 i a NPA 92 5 136 147 Nicht detektiert 147 11 136 95 CI 87 1 bis 95 8 PPA Positive Prozentuale bereinstimmung Positive Percent Agreement NPA Negative Prozentuale bereinstimmung Negative Percent Agreement Bei der Wiederholung des Tests wurden 5 von 11 Proben mit dem Simplexa Dengue Assay und mit einem auf CDC Ver ffentlichungen basierenden internen Assay nachgewiesen Die verbleibenden 6 Proben wurden in dem auf CDC Ver ffentlichungen basierenden Assay nicht detektiert Tabelle 2 Dengue Virus 2 Vergleich mit fr heren Ergebnissen Fr heres CDC Ergebnis Simplexa Dengue DV2 F N Detektiert an z a en Denen 50 5 95 Te er Nicht detektiert 149 1 148 a ee gt ve PPA Positive Prozentuale bereinstimmung Positive Percent Agreement NPA Negative Prozentuale bereinstimmung Negative Percent Agreement P Die Ergebnisse waren nach wiederholter Testung unver ndert Tabelle 3 Dengue Virus 3 Vergleich mit fr heren Ergebnissen Fr heres CDC Ergebnis Simplexa Dengue DV3 _ N Detektiert N R a nenn e le Rene 9 95 Ga 100 0 Nicht detektiert 150 0 150 95 as N PPA Positive Prozentuale bereinstimmung Positive Percent Agreement NPA Negative Prozentuale bereinstimmung
14. d 3 in einer anderen Reaktion Probenvertiefung unterscheidet Der Test besteht im Wesentlichen aus zwei Schritten 1 RNA Extraktion aus den Proben und 2 Amplifikation der extrahierten RNA mit Hilfe bifunktioneller fluoreszenzmarkierter Primersonden und reverser Primer Der Assay amplifiziert vier serotyp spezifische Regionen Dengue 1 NS5 Gen Dengue 2 NS3 Gen Dengue 3 NS5 Gen und Dengue 4 Kapsid Gen Zur Uberpr fung der Extraktion und zur Erkennung einer RT PCR Hemmung wird eine interne RNA Kontrolle mitgef hrt Gi Simplexa Dengue Seite 2 FOCUS MITGELIEFERTES MATERIAL Das Simplexa Dengue Kit enth lt ausreichend Reagenzien f r die Serotypisierung von 100 Proben Beschreibung des Kits Bezeichnung der Komponente EG SYMBOL Kurz Deckel Anzahl Reaktionen Volumen AUF ETIKETT bezeichnung farbe Gef e pro pro Gef Gef Kit Simplexa Dengue 1 amp 4 Primer Mix MOL3101 REAG A PM Braun 2 50 100 30 pl Simplexa Dengue 2 amp 3 Primer Mix MOL3102 REAG B PM Lia 2 50 100 30 ul HS Master Mix MOL9060 REAG C MM Gr n 4 50 200 200 ul RT Mix MOL9103 REAG D RT Gelb 2 100 200 50 ul Simplexa RNA Internal Control MOL2004 CONTROL Blau 2 50 100 250 ul Simplexa Dengue Molecular Control MOL3103 CONTROL Rot 2 4 8 800 ul Beschreibung der Komponente Kit Komponente Beschreibung Mit fluoreszierendem Farbstoff markierte Primer die De
15. e des RT Mix innerhalb einer Stunde verwenden Falls das PCR Setup nicht sofort nach Herstellung der Reaktionsmischungen durchgef hrt wird k nnen die Reaktionsmischungen bei 2 C bis 8 C gelagert werden bis das PCR Setup innerhalb einer Stunde durchgef hrt werden kann Den RT Mix nach jedem Gebrauch bis zum Verfalldatum einfrieren 10 C bis 30 C Primer Mixe HS Master Mix Molekularkontrolle und die interne RNA Kontrolle aufgetaut nicht l nger als 30 Tage bei 2 bis 8 C aufbewahren Primer Mix HS Master Mix interne RNA Kontrolle oder Molekularkontrolle nicht wieder einfrieren Keine Reagenzien aus verschiedenen Kit Chargen kombinieren WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN 1 2 3 oy 10 11 12 13 14 15 Befolgen Sie die allgemein anerkannten Vorsichtsma ahmen S mtliche Untersuchungsproben und molekulare Kontrollen sind als potenziell infekti s zu betrachten und dementsprechend zu handhaben Beim Umgang mit den Kit Reagenzien pers nliche Schutzausr stung wie unter anderem Handschuhe und Laborkittel tragen H nde nach der Durchf hrung des Tests gr ndlich waschen Nicht mit dem Mund pipettieren In Bereichen in denen Kit Reagenzien oder Humanproben gehandhabt werden darf nicht geraucht getrunken und gegessen werden In diesen Bereichen ist auch das Einsetzen Herausnehmen von Kontaktlinsen oder das Auftragen von Make up nicht erlaubt Nicht verwendete Kit Reagenzien bzw Untersuch
16. en Amerikas vor und ist im S den der USA heimisch In Asien stellt A albopictus den haupts chlichen bertr ger von Dengue dar In j ngster Zeit wurden lokal erworbene Dengue Infektionen in Florida Key West und Miami Dade County beschrieben In der Vergangenheit wurden Verdachtsf lle von DF mit serologischen Methoden diagnostiziert Sowohl virusspezifische Immunglobulin G IgG als auch IgM Antik rper sind in der Regel im Serum von Patienten mit akuten Prim rinfektionen vorhanden w hrend die IgM Antwort bei sekund ren Dengue Fieber Infektionen abgeschw cht sein bzw sogar fehlen kann Dar ber hinaus gibt es innerhalb der Flavivirus Familie eine starke Kreuzreaktivit t Die Interpretation der Antik rper Antwort in Bezug auf akutes Dengue Fieber kann daher schwierig sein wenn andere Flavivirus Infektionen mit klinischen laboratorischen oder epidemiologischen Mitteln nicht ausgeschlossen werden k nnen In j ngster Zeit wurden Real Time RT PCR Methoden entwickelt um Dengue Viren in Patientenblut nachzuweisen Der Nachweis von Dengue Virus RNA durch Reverse Transkriptase PCR RT PCR in Humanseren ist ein starker Hinweis auf akutes Dengue Fieber Dengue Viren k nnen im Blut Serum von Patienten f r etwa 5 Tage nach Beginn der Symptome nachgewiesen werden GRUNDLAGEN DES VERFAHRENS Der Assay ist eine Real Time RT PCR die zwischen den Serotypen 1 und 4 in einer Reaktion Probenvertiefung engl well und den Serotypen 2 un
17. iten Die Reagenzien vorsichtig pipettieren und handhaben um eine Kontamination mit Material aus benachbarten Vertiefungen zu verhindern Geeignete Pipettiertechniken anwenden und f r die Dauer des Tests das gleiche Pipettierschema einhalten um optimale und reproduzierbare Werte zu erhalten Die Reagenzien nicht gegen Reagenzien anderer Kit Chargen oder anderer Hersteller austauschen oder mit diesen mischen Die Verschlusskappen der Reagenzr hrchen nicht vertauschen Dies kann zur Kontamination f hren und die Testergebnisse beeintr chtigen Bei Nichteinhaltung dieses Protokolls oder der angegebenen Zeiten oder Temperaturen kann es zu fehlerhaften Testergebnissen kommen Der Testansatz sollte bei Raumtemperatur Temperaturbereich ca 18 C bis 25 C erfolgen Die Enzyme beim Mischen der Reagenzien in einem K hlblock gek hlt halten Universal Discs die bereits in Kontakt mit Untersuchungsproben oder Reagenzien gekommen sind nicht wieder verwenden Gebrauchte Discs ohne Abl sen oder Entfernen der Abdeckfolie entsorgen G Simplexa Dengue Seite 4 FOCUS 16 Wenn verschiedene Simplexa Kits oder Chargen auf der gleichen Disc angesetzt werden sollten die Molekularkontrollen aus jedem verwendeten Kit getestet werden 17 HS Master Mix und RT Mix enthalten gt 1 Glycerin welches nach Inhalation oder Hautkontakt zu Reizungen f hren kann Nach Einatmen oder Ber hrung sollten Erste Hilfe Ma nahmen eingeleitet werden 18 Ei
18. n eines Vertrags mit BTI einlizenziert und diese Produkte werden ausschlie lich f r klinische diagnostische oder Forschungs und Entwicklungszwecke verkauft AUTORISIERTE VERTRETUNG mdi Europa GmbH Langenhagener Str 71 30855 Langenhagen Hannover Deutschland C BESTELLINFORMATIONEN PI MOL3100 0US Telefon 800 838 4548 nur USA 562 240 6500 International Rev C Fax 562 240 6510 Erstellungsdatum 26 April 2012 TECHNISCHE HILFE Telefon 800 838 4548 nur USA 562 240 6500 International FOCUS Fax 562 240 6526 Diagnostics Besuchen Sie unsere Webseite www focusdx com Cypress Kalifornien 90630 USA
19. nd aufmerksam Bis 1970 gab es in neun L nder DHF Epidemien und mittlerweile hat sich diese Zahl mehr als vervierfacht und steigt weiterhin an Heutzutage sind neu auftretende DHF F lle f r eine Zunahme von Dengue Epidemien in Nord Mittel und S damerika verantwortlich In Asien wo alle vier Dengue Virus Subtypen endemisch sind ist DHF in mehreren L ndern eine f hrende Ursache f r Einweisungen ins Krankenhaus und f r Todesf lle bei Kindern Das Dengue Virus DV ist ein Einzelstrang RNA Virus der Flavivirus Familie und eng verwandt mit dem Gelbfiebervirus dem Japanischen Enzephalitis Virus und anderen Arboviren der Gruppe B Es gibt 4 Dengue Virus St mme die sich alle serologisch unterscheiden Eine Infektion mit einem bestimmten Stamm sch tzt den Wirt nicht vor einer Infektion mit anderen St mmen Vielmehr deutet ein Bericht darauf hin dass DHF und DSS besonders h ufig in Personen auftreten die zuvor durch einen anderen Stamm infiziert worden sind Das Vorhandensein zirkulierender nicht neutralisierender kreuzreaktiver DV Antik rper kann die Infektion immunologisch sogar verst rken Nicht neutralisierende kreuzreaktive Antik rper gegen andere nicht DV Flaviviren bewirken jedoch keine immunologische Verst rkung der Infektion Das Dengue Virus kann berall da bertragen werden wo die Mosquitovektoren Aedes aegypti und Aedes albopictus vorkommen A aegypti kommt haupts chlich in den tropischen und subtropischen Gebiet
20. nd die Extraktion starten 14 Nach Abschluss der Nukleins ureextraktion kann die Kartusche mit den extrahierten Kontrollen und Patientenproben aus dem MagNA Pure Extraktor herausgenommen und verschlossen werden Die extrahierte RNA vor der Verwendung bei 2 C bis 8 C aufbewahren Die Langzeitaufbewahrung extrahierter Proben bei dieser Temperatur wird nicht empfohlen Extrahierte RNA Proben beim Laden der Disc auf einem K hlblock aufbewahren EINSTELLUNG DES GER TS F R DIE REAL TIME PCR 1 Im Bedienungshandbuch f r den Integrated Cycler wird detailliert beschrieben wie die Integrated Cycler Studio Software im einzelnen zu konfigurieren ist um Assays auf dem Integrated Cycler zu definieren sowie L ufe einzurichten und zu analysieren Hinweis Es gibt zwei verschiedene Assay Barcodes Ein Barcode enth lt die Assay Definition f r die Dengue Serotypen 1 und 4 der zweite Barcode enth lt die Assay Definition f r die Dengue Serotypen 2 und 3 Zwei Laufsegmente sind notwendig um Ergebnisse f r alle vier Serotypen zu erhalten Simplexa Dengue Seite 5 Focus Empfohlenes Platten Layout 2 Segmente sind f r diesen Assay notwendig Speiche Speiche Speiche Speiche Speiche Speiche Speiche Speiche Speiche Speiche Speiche Speiche 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 IIO T m O0 w gt Legende Dengue 1 amp 4 Reaktionsgemisch Dengue 2 amp 3 Reaktionsgemisch D BEREICH F R DIE ZUBEREITUN
21. ne l ngere Aufbewahrung extrahierter Proben bei 2 C bis 8 C wird nicht empfohlen Die Leistungsf higkeit des Tests unter diesen Bedingungen wurde nicht gepr ft GEBRAUCHSANWEISUNG A C PROBENGEWINNUNG Geeignete Probentypen sind Seren Blutproben sind aseptisch unter Anwendung standardisierter Blutabnahme Techniken und durch qualifiziertes Personal zu entnehmen Blutproben bei Zimmertemperatur koagulieren lassen und das Serum anschlie end durch Zentrifugieren abtrennen Das Serum zur Aufbewahrung aseptisch in einen fest verschlie baren sterilen Beh lter berf hren Abgetrenntes Serum sollte h chstens 8 Stunden bei Raumtemperatur gelagert werden Falls der Test nicht innerhalb von 8 Stunden abgeschlossen werden kann ist die Probe bei 2 C bis 8 C zu k hlen Kann der Test nicht innerhalb von 48 Stunden abgeschlossen werden oder werden die Proben verschickt sollten die Proben bei mindestens 20 C eingefroren werden Das wiederholte Einfrieren Auftauen von Proben ist zu vermeiden Proben vor dem Gebrauch auftauen und gut mischen PROBENEXTRAKTION Extraktion mit dem Roche MagNA Pure LC Extraktionsverfahren 1 Die Extraktion von Nukleins uren aus Patientenproben und Assaykontrollen erfolgt mit dem Roche MagNA Pure Total Nucleic Acid Kit und dem Roche MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor Ger t Bei der Nukleins ureextraktion mit diesem Kit sind die Gebrauchsanweisungen des Herstellers zu beachten 2 Im D
22. ngue Serotyp 1 RNA Dengue Serotyp 4 RNA und die interne Kontrolle IC spezifisch erkennen Sonden Ziel Fluorophor Anregung Emission Zielgen Farbstoff Dengue 1 Simplexa Dengue 1 amp 4 Primer Mix DVI FAM 495 nm 520 nm NS5 Gen PM Dengue 4 CFR610 590 nm 610 nm Kapsid Gen DV4 PEAN Q670 644 nm 670 nm n Z Mit fluoreszierendem Farbstoff markierte Primer die Dengue Serotyp 2 RNA Dengue Serotyp 3 RNA und die interne Kontrolle spezifisch erkennen Sonden Ziel Fluorophor Anregung Emission Zielgen Farbstoff Dengue 3 FAM 495 nm 520 nm NS5 Gen Simplexa Dengue 2 amp 3 Primer Mix DV3 PM Dengue 2 j DV2 CFR610 590 nm 610 nm NS3 Gen Interne Kontrolle RNA IC Q670 644 nm 670 nm n Z HS Master Mix MM DNA Polymerase Puffer und dNTPs Simplexa RNA Internal Control Verkapselte RNA Matrize RNA IC interne RNA Kontrolle Simplexa Dengue Molecular nt Wies Control MC Molekularkontrolle Inaktivierte Dengue Virus Serotypen 1 2 3 und 4 RT Mix RT Reverse Transkriptase Enzym Puffer ERFORDERLICHES JEDOCH NICHT MITGELIEFERTES MATERIAL Integrated Cycler von 3M mit Integrated Cycler Studio Software Version 4 2 oder h her Universal Discs zur Verwendung auf dem Integrated Cycler Universal Disc Abdeckfolie Nukleasefreies Wasser empfohlen zur Verwendung als Leerwert Kontrolle No Template Control NTC Ein Mehrkanalmikropipette n und oder Repetiermikropipette n mit einem Genauigkeitsbereich von 1 10 ul
23. rden 3 Interpretation der Ergebnisse Interpretation der Ergebnisse Beispiel DV1 Ct Wert Segment f r Dengue 1 amp 4 Ct Wert der Internen RNA Kontr Segment f r Dengue 2 amp 3 Ct Wert der Internen RNA Kontr Interpretation Ct Zyklus Schwellenwert Detektiert entspricht einem Ct lt 40 0 0 Nicht detektiert entspricht einem Ct 0 Zur Angabe eines positiven Ergebnisses Nachweis ist der Nachweis der Simplexa internen RNA Kontrolle RNA IC nicht erforderlich EINSCHR NKUNGEN 1 In vitro Diagnostikum 2 Nur f r den Export bestimmt 3 Dieser Assay ist zur Verwendung mit Serumproben vorgesehen Er wurde nicht mit anderen Probetypen evaluiert 4 Die Detektion der viralen Nukleins uren h ngt von der ordnungsgem en Gewinnung Handhabung Aufbewahrung und dem Transport der Proben sowie von der Probenvorbereitung einschlie lich der Extraktion ab Mangelnde Beachtung der ordnungsgem en Vorgehensweise bei einem dieser Schritte kann zu fehlerhaften Ergebnissen f hren 5 Die Personen die die Analyse durchf hren sollten sich vor Durchf hrung des Assays eingehend mit den Testverfahren und der Ergebnisinterpretation vertraut gemacht haben 6 Alle Ergebnisse aus diesen und anderen Tests m ssen im Zusammenhang mit der klinischen Anamnese den epidemiologischen Daten und allen anderen Daten die dem zust ndigen Arzt vorliegen betrachtet werden 7 Die Pr valenz der Infektion beeinfluss
24. ropdownmen Protocol des MagNA Pure LC Systems die Optionen Total NA und anschlie end Total NA Variable_elution_volume bIk w hlen Damit werden die passenden Einstellungen f r den Lauf geladen 3 Verwenden Sie das Probenprotokoll Total NA Variable_elution_volume 4 Als Probenvolumen sollte 200 uL und als Elutionsvolumen 50 uL eingestellt sein 5 Das Verd nnungsvolumen sollte f r alle Proben auf Null eingestellt sein 6 Das Post Elution Protocol muss auf None eingestellt sein 7 Achten Sie darauf dass sich die Proben und Kontrollen auf der Probenkartusche in den richtigen Positionen befinden 8 Jede Probe und die Molekularkontrolle 2 4 Sekunden vortexen und kurz anzentrifugieren um den Inhalt auf dem Boden des R hrchens zu sammeln 9 200 ul von jeder Probe Molekular MC oder Leerwert Kontrolle in die entsprechende Position in der Probenkartusche pipettieren 10 Den F llpegel der Proben und Kontrollen in der Probenkartusche einer Sichtpr fung unterziehen um sicherzustellen dass Probe n zugegeben wurde n 11 Die Interne RNA Kontrolle 2 Mal kurz vortexen und kurz anzentrifugieren um den Inhalt auf dem Boden des R hrchens zu sammeln 12 In jede Proben und alle Kontroll Vertiefungen 5 ul Interne RNA Kontrolle pipettieren Zwischen den Proben die Pipettenspitzen wechseln 13 Die Probenkartusche mit den Proben in das MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extraktionsger t berf hren u
25. s Kontrollen programmierten Proben ung ltig ist 2 berpr fung der Validit t von Patientenprobenergebnissen 3 Interpretation der Patientenergebnisse Wenn die Kontrollen ung ltig sind k nnen die Patientenergebnisse nicht ausgewertet werden 1 Durch berpr fung der Dengue Molekularkontrolle der Leerwert Kontrolle und der Internen RNA Kontrolle RNA IC die Validit t des Laufs ermitteln Kriterien f r eine g ltige Kontrolle vereinfacht Segment f r Dengue 1 amp 4 Segment f r Dengue 2 amp 3 RNA IC Ct RNA IC Ct a een Kontrolle Molekularkontrollel er Siehe vollst ndige Beschreibung in den nachstehenden Anmerkungen a Leerwertkontrolle NTC Segment f r Dengue 1 amp 4 i Wenn Ct 0 f r DV1 und DV4 und Ct lt 40 f r die interne Kontrolle dann ist diese Kontrolle g ltig b Leerwertkontrolle NTC Segment f r Dengue 2 amp 3 i Wenn Ct 0 f r DV2 und DV3 und Ct lt 40 f r die interne Kontrolle dann ist diese Kontrolle g ltig c Molekularkontrolle MC Segment f r Dengue 1 amp 4 i Wenn die Molekularkontrolle f r DV1 oder DV4 einen Wert von Ct 0 ergibt so gilt das Assaysegment als ung ltig und unzuverl ssig Alle Patientenproben m ssen erneut getestet werden ii Wenn die Ct Werte f r DV1 und DV4 lt 40 aber 0 sind und die Leerwertkontrolle g ltig ist wird das Assaysegment als g ltig und zuverl ssig angesehen d Molekularkontrolle MC Segment f r Dengue 2 amp 3
26. schiedenen Variabilit tskomponenten der Ct Werte sind in den folgenden Tabellen aufgef hrt Tabelle 5 Reproduzierbarkeit der qualitativen Aussage a Nicht Es Nicht ka a 7 Bidets Nicht Nicht bezeichnung detektiert Detektiert detektiert Detektiert ezeichnung detektiert Detektiert detektiert Detektiert Dengue 1 Dengue 2 Schwach 0 90 90 Schwach 0 88 88 positiv positiv Dengue 1 90 89 Dengue 2 M ig positiv M ig positiv Dengue 4 Dengue 3 Schwach Schwach 11 positiv positiv Dengue 4 0 Dengue 3 M ig positiv M ig positiv Negativ 0 0 Negativ Negative 0 0 Negative Kontrolle Kontrolle Molekular Molekular kontrolle kontrolle 88 88 Tabelle 6 Reproduzierbarkeit der Ger tereaktion Ct Werte Varianzkomponente a Intra Assay Mittlerer Inter Inter Inter a Ziel Probe N Wiederhol Gesamt Ct Instrument Untersucher Tag Lauf genauigkeit SD CV SD cvV sp cv sp CV SD CV Derue ik go 35 2 0 44 1 3 016 0 4 010 0 3 0 46 1 3 066 1 9 Schwach positiv on Dengue 1 90 335 0 54 1 6 022 07 000 00 0 29 0 9 0 65 1 9 M ig Positiv Molekularkontrolle 90 34 3 0 49 1 4 026 08 1000 00 0 38 1 1 0 67 20 Dengue 2 88 33 5 0 33 1 0 0 19 0 6 0 19 0 6 0 37 1 1 0 57 1 7 Schwach positiv Se Dengue 88 31 9 0 45 1 4 048 15 000 00 0 23 0 7 0 70 22 M ig Positiv Molekularkontrolle 90 33 2 0 37 1 1 059 1
27. t den Vorhersagewert des Assays G Simplexa Dengue Seite 8 Focus 8 Wie bei anderen Tests auch schlie t ein negatives Ergebnis eine Dengue Virus Infektion nicht aus 9 Falls der die Infektion verursachende Erreger Genmutationen Insertionen Deletionen oder Rearrangements aufweist oder wenn die Testung im Fr hstadium der Erkrankung erfolgt kann es zu falschnegativen Ergebnissen kommen 10 Falschnegative Ergebnisse k nnen auftreten wenn die Probe aufgrund von Fehlern bei Entnahme Transport oder Handhabung eine unzureichende Anzahl von Erregern enth lt 11 Wie bei anderen Testverfahren kann es zu falschpositiven Ergebnissen kommen Eine Wiederholung des Tests oder die Durchf hrung des Tests mit einem anderen Ger t kann in manchen F llen angezeigt sein 12 Bei dem Assay handelt es sich um ein qualitatives Testverfahren das keine Aussage ber die Gesamtmenge der detektierten Erreger erlaubt 13 Dieser Assay kann keine Erkrankung ausschlie en die durch andere bakterielle oder virale Erreger verursacht wird SPEZIFISCHE LEISTUNGSDATEN METHODENVERGLEICH Ein Probenpanel mit 179 bereits charakterisierten Dengue PCR Ergebnissen wurde vom US Center of Disease Control and Prevention CDC zur Verf gung gestellt Die Proben wurden mit dem Simplexa Dengue Assay getestet und mit den fr heren vom CDC gemeldeten Ergebnissen verglichen Tabelle 1 Dengue Virus 1 Vergleich mit fr heren Ergebnissen Fr heres CDC Erge
28. ungsproben gem den rtlichen und nationalen Bestimmungen entsorgen Der Arbeitsablauf im Labor sollte stets in einer Richtung erfolgen ausgehend von den Probenvorbereitungsbereichen in Richtung Ameplifikations Detektionsbereich Im folgenden Abschnitt wird der Ablauf der Arbeitsschritte von der Probenextraktion bis zur Amplifikation mittels Real Time PCR beschrieben e Am Anfang steht die Probenextraktion gefolgt von der Einstellung des Ger ts zur Durchf hrung der Real Time PCR der Zubereitung der Reagenzien und schlie lich der Amplifikation mittels Real Time PCR e Die Verbrauchsmaterialien und Instrumente d rfen nicht bereichs bergreifend au erhalb der speziellen Probenextraktions und Probenvorbereitungsbereiche verwendet werden Sie sollten auch nicht zwischen den verschiedenen Bereichen ausgetauscht werden e Verbrauchsmaterialien und technische Ausstattung f r die Probenvorbereitung d rfen nicht f r die Reagenzienzubereitung oder zur Verarbeitung amplifizierter DNA oder anderer Quellen der Zielnukleins ure verwendet werden e S mtliche Verbrauchsmaterialien und Ger te f r die Amplifikation m ssen stets im Bereich des Real Time PCR Ger ts verbleiben e Auch die pers nliche Schutzausr stung wie z B Laborkittel und Einmalhandschuhe sollten bereichsspezifisch gehandhabt werden Die Kontamination von Reagenzien bzw Patientenproben kann zu einer Verf lschung der Testergebnisse f hren Unter aseptischen Bedingungen arbe
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