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ALGORITMI PER L'ANALISI ED IL TROUBLESHOOTING DI

1. Figura 2 6 programma Sequencing Analysis 5 2 per l analisi visiva dei segnali di sequenziamento Il troubleshooting la procedura di analisi del risultato del sequenziamento necessaria per capire se la qualit dello stesso buona In caso contrario bisogna riconoscerne le cause e ripetere o meno la procedura di sequenziamento modificando qualit o quantit del template L osservazione dei dati viene compiuta da personale esperto che analizza visivamente attraverso opportuni programmi d analisi come il Sequencing Analysis 5 2 mostrato in figura 2 6 il risultato e l andamento di ogni segnale che viene fornito dal software dall Applied Biosystems 3730xl decidendo se l elettroferogramma presenta o no problematiche e se il campione deve essere risequenziato Il lavoro di questa tesi ha l obiettivo di automatizzare l analisi e la ricerca di tali problematiche nell elettroferogramma fornendo un software d ausilio alla decisione I dati utilizzati per implementare e testare l algoritmo di ricerca delle problematiche sono stati forniti dalla BMR Genomics un azienda di Padova che offre servizi di analisi del DNA tra cui anche il sequenziamento A seconda dei casi al segnale viene attribuita un classe Le cause degli errori possono esser di pi tipi imputabili allo strumento ad esempio la corsa nei capil
2. Tabella 6 23 VP VN FP FN in percentuale per le sequenze FD 106 6 Risultati risultato VERO FALSO TOTALE realt VERO VP 32 FN 28 60 FALSO FP 0 VN 1140 1140 Tabella 6 24 Numero di VP VN FP FN per le sequenze P A C G T risultato VERO FALSO realta VERO VP 53 33 FN 46 67 FALSO FP 0 VN 100 Tabella 6 25 VP VN FP FN in percentuale per le sequenze Poli A C G T 0 88 9 0 92 0 96 93 097 0 9 0 0 8 74 0 7 0 6 56 7 E ro 03 E ppv 0 2 0 1 0 TD D 87 DD FD poli A C G T Figura 6 18 grafico che rappresenta la probabilit di assegnazione corretta in blu e il valore predittivo positivo in rosso per sequenze TD D DD FD poli A C G T 107 6 Risultati 099 1 1 0 93 0 95 IR 0 9 0 8 076 0 7 0 7 0 6 0 53 0 5 04 0 3 0 2 0 1 ea 7 a Ea E TD D DD FD poli A CIGIT Se Sp Figura 6 19 grafico che rappresenta la sensibilit in azzurro e la specificit in grigio per sequenze TD D DD FD poli A C G T Per concludere in figura 6 20 viene riportato il grafico con la probabilit di assegnazione compiuta dall algoritmo per tutte le problematiche Mediamente la probabilit supera il 93 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 8 7 0 99 097 096 2 99 6 5 0 95 0 96 0 97 1 0 91 99 0 92 7 0 87 0 88 il E Pc 3 l o TS TS x 5 5 4 2 NS NR SA FS SB M SI TD
3. I primi 220 picchi sono multipli TD D successivamente i picchi multipli calano di intensit L algoritmo classifica la sequenza come FD risultato VERO FALSO TOTALE realt VERO VP 87 FN 23 110 FALSO FP 68 VN 1022 1090 Tabella 6 16 Numero di VP VN FP FN per le sequenze TD risultato VERO FALSO realta VERO VP 79 09 FN 20 91 FALSO FP 6 24 VN 93 76 Tabella 6 17 VP VN FP FN in percentuale per le sequenze TD 105 6 Risultati risultato VERO FALSO TOTALE realt VERO VP 97 FN 37 130 FALSO FP 7 VN 1059 1066 Tabella 6 18 Numero di VP VN FP FN per le sequenze D risultato VERO FALSO realt VERO VP 72 39 FN 27 61 FALSO FP 0 66 VN 99 34 Tabella 6 19 VP VN FP FN in percentuale per le sequenze D risultato VERO FALSO TOTALE realta VERO VP 133 FN 41 174 FALSO FP 45 VN 981 1026 Tabella 6 20 Numero di VP VN FP FN per le sequenze DD risultato VERO FALSO realt VERO VP 76 44 FN 23 56 FALSO FP 4 39 VN 95 61 Tabella 6 21 VP VN FP FN in percentuale per le sequenze DD risultato VERO FALSO TOTALE realt VERO VP 281 FN 102 383 FALSO FP 31 VN 786 817 Tabella 6 22 Numero di VP VN FP FN per le sequenze FD risultato VERO FALSO realt VERO VP 73 37 FN 26 63 FALSO FP 3 79 VN 96 21
4. La variazione dell andamento del segnale non viene riconosciuta come significativa e di conseguenza il segnale non viene classificato come M falso negativo risultato VERO FALSO TOTALE realt VERO VP 279 FN 88 367 FALSO FP 52 VN 817 869 Tabella 6 12 Numero di VP VN FP FN per le sequenze M risultato VERO FALSO realt VERO VP 84 29 FN 26 59 FALSO FP 5 98 VN 94 02 Tabella 6 13 VP VN FP FN in percentuale per le sequenze M 99 6 Risultati 1 0 91 1 0 94 0 9 0 9 0 84 0 8 0 8 0 7 0 7 0 6 0 6 0 5 E pe 0 5 O Se 0 4 E ppv 0 4 Sp 0 3 0 3 0 2 0 2 0 1 0 1 0 0 M M Figura 6 10 grafico che rappresenta la Figura 6 11 grafico che rappresenta la probabilit di assegnazione corretta in blu sensibilit in azzurro e la specificit in e il valore predittivo positivo in rosso per grigio per sequenze M sequenze M 6 3 Segnale inarcato Il numero dei FP Tabella 6 14 e 6 15 compiuti in questo step dell algoritmo sono dovuti agli errori compiuti dagli step precedenti E il caso per esempio di sequenze in cui non viene riconosciuto correttamente l istante t Cap 5 paragrafo 5 1 Per diminuire invece il numero dei FN si potrebbe modificare il parametro rapporto bande SI che stato scelto pari a 8 paragrafo 5 3 Cap 5 Bisogna porre attenzione per nel caso di segnali SB che hanno ampiezza bassa e si rischia di selezionare erroneamente molt
5. TD Successivamente all analisi l algoritmo fornisce in output la classificazione delle problematiche attribuite alla sequenza sotto analisi L algoritmo stato addestrato su 167 sequenze e le sue performance sono state testate su 1200 sequenze Per quasi tutte le problematiche ricercate dall algoritmo la probabilit di assegnazione corretta supera il 90 ed il positive predictive value supera l 80 tranne per le sequenze TD e DD per cui la precisione scende a 56 e 74 rispettivamente Questi risultati costituiscono un buon punto di partenza Non esistono in letteratura lavori che hanno affrontato il problema del troubleshooting automatico per segnali di sequenziamento Sanger e pertando questa tesi il primo lavoro che affronta l analisi automatica del segnale per il 110 7 Conclusioni troubleshooting Possibili sviluppi futuri comprendono un raffinamento dell algoritmo per migliorarne la performance e l utilizzo di tecniche di elaborazione del segnale per risolvere le problematiche legate ad artefatti dello stesso 111 Elenco dei simboli Simbolo Significato A adenina AD Analyzed Data BL blob C citosina D doppio DD diventa doppio dNTP deossinucleoside trifosfato ddNTP dideossinucleoside trifosfato DG agglomerati non incorporati DP dimeri di primer emPCR PCR ad emulsione FD fondo doppio FN falso negativo FP falso positivo FS fuori scala G guan
6. percentuale dei punti che la superano inferiore al 20 di tutta le serie Per questo il controllo fallisce e la sequenza non viene classificata come SA File Edit View Insert Tools Window Help DSUS AALS PPD andamento dato grezzo per verifica ampiezza SA FS T T T T r T E Z 8 2 5 5 h 1 f 1 f 8000 10000 12000 14000 16000 tempo andamento dato grezzo per verifica ampiezza SB T T T T scala intensit luminosa massima I fi f fi f 8000 10000 12000 14000 16000 tempo Figura 6 5 plot di output della funzione ampiezza segnale per la sequenza B4 71 ab1l 95 6 Risultati Un possibile miglioramento dell algoritmo si potrebbe avere quindi riducendo questa percentuale Bisogna far attenzione per a non considerare cos solo i picchi dei dimeri di primer Cap 4 paragrafo 4 6 ci farebbe aumentare il numero dei FP che normalmente hanno intensit elevata rispetto l intero segnale Scende invece a 95 92 la probabilit di assegnazione corretta per SB Anche per questo caso la maggior parte dell errore dipende dai FN per questo tipo di sequenze l algoritmo ha difficolt a distinguere una sequenza SB da una sequenza NR figura 6 1 Per migliorare questo step si potrebbe pensare di analizzare non solo il RD ma anche la sequenza di basi Cap 5 figura 5 16 fornita dal file ABIF La maggior parte delle sequenze NR sono caratterizzate ma non sempre da una seque
7. quella posizione della sequenza stato trovato un picco multiplo altrimenti contiene 0 Per ogni picco multiplo associato anche un valore di intensit anch esso contenuto in un array chiamato intensit Ogni elemento di intensit pari ad 1 se il picco multiplo caratterizzato da due picchi di intensit molto simile altrimenti uguale a 0 se il picco multiplo caratterizzato dalla presenza di due picchi di intensit differente In figura 4 17 riportato una sezione dell AD della sequenza contenuta nel file ABIF s_Sf ab1 La sezione contiene i picchi associati alla sequenza di basi che vanno dalla 64 alla 99 L AD presenta dei 82 5 Troubleshooting algoritmi e soluzioni proposte picchi multipli ed in particolar modo i sotto picchi hanno un intensit bassa rispetto la sequenza dominante Il plot di figura 5 17 mostra la stessa porzione dell AD di figura 5 16 elaborata dall algoritmo La linea in nero rappresenta la soglia utilizzata per escludere il rumore di fondo dall analisi mentre gli asterischi rossi rappresentano le posizioni del base_location SS FinchTV n_5f ab1 File Edit View Finch Help eaw Go to Base No Find Sequence 4 4 1 4 1 1 Ac TG AA Reset Scales Horizontal Scale Figura 5 16 una finestra dell Analyzed Data della sequenza s_5fabl Si osserva la presenza di un alto rumore di fondo nel segnale File Edit View Insert Tools Window Help DS H
8. 330 340 Vertical Scale 70 PaO tlt TGCGCTCGGTCGT CGAGCGGTATCAGCT CAC TCAAAGGCGGTAAT ACG GTTATCCACAG AATC AG GGG ATAAC GC AG 350 380 390 400 410 420 430 Anthony Any Jn ull Horizontal Scale O Figura 4 9 Raw Data ed Analyzed Data di una sequenza fuori scala FS Questo un effetto dovuto all incapacit dello strumento di registrare una luminescenza delle molecole cos intensa da superare la scala di intensit luminosa massima del sequenziatore 3730xl per cui il segnale satura Genera picchi multipli nelle singole posizioni dell Analyzed Data In genere il FS pu interessare solo le prime 200 300 basi del campione di DNA 4 2 2 3 Segnale che cala gradualmente Nel caso in cui vi sia un alta concentrazione di DNA i frammenti lunghi prodotti dalla reazione di sequenziamento potrebbero accumularsi all interno dei capillari ostacolando l elettroforesi Durante questo processo anche gli ioni negativi presenti nei sali possono interferire con l aspirazione dei frammenti pi lunghi che quindi giungono in numero minore alla finestra di rilevazione Cos la potenza del segnale diventa sempre pi debole all aumentare della lunghezza del frammento l andamento del segnale cala gradualmente e certe volte giunge a morire Per cui diventa difficile interpretare l elettroferogramma e identificare correttamente la base azotata La pres
9. 4 l algoritmo pu non riconoscere la presenza di picchi multipli alla fine di una sequenza a causa della scarsa risoluzione che possono avere quest ultimi Quindi in funzione ai quality scores associati ad ogni base identificata l algoritmo rianalizza l AD solo fino al picco P della sequenza che ha un quality _score superiore al valor medio di tutti i quality scores N il numero dei quality scores 1 quality _score gt Y quality _ scores i l Questo passo viene compiuto solo per sequenze che risultano inizialmente TD attraverso la funzione analisi qualit Per riportare un esempio di come funziona l algoritmo di fronte a queste 86 5 Troubleshooting algoritmi e soluzioni proposte g ua onla ga S Goto Base No Find Sequence ALSI situazioni in figura 5 19 viene riportata la sequenza 6 no FD 8624 ab1 gi vista in figura 4 19 del Capitolo 4 i cui ultimi 200 picchi dell AD hanno come si osserva una scarsa risoluzione La sequenza FD ma l algoritmo nella prima analisi la classifica TD FD Successivamente l analisi di qualit ignora appunto gli ultimi 200 picchi e la sequenza viene correttamente classificata come FD Figura 5 19 AD della sequenza 6 no FD 8624 ab1 La sequenza che presenza picchi multipli in tutta la sua lunghezza ha dei problemi di risoluzione relativi alle ultime 200 basi circa I picchi non hanno una forma regolare si allargano
10. 4500 5000 5500 6000 6500 7000 7500 5000 8500 S000 9500 10000 10500 11000 11500 12000 12500 13000 13500 140 a E Ej Il marcatore viene rilevato Ci sta ad indicare che la mixture viene Figura 4 5 RawData della sequenza contenuta nel file 2 no NR 9042 ok abl I dati registrano il picco del marcatore intorno ai 1400 1500 valori dell asse x Il resto dell acquisizione non contiene segnale ma solo rumore di fondo La reazione di sequenziamento non ha prodotto frammenti marcati per cui non sono stati caricati nei capillari del sequenziatore Sequenza NR 34 4 Controllo di qualit del segnale caricata nei capillari ma la reazione di sequenziamento non ha prodotto i frammenti marcati con le molecole di fluorescente che non vengono quindi rilevate e il segnale presenta solo rumore di fondo Le cause di una mancata reazione di sequenziamento possono essere di diverso tipo fallimento della fase di primer annealing durante la reazione di sequenziamento bassa concentrazione di DNA presenza di contaminanti che hanno ostacolato l innesco della reazione bassa concentrazione di primer o una sua errata progettazione troppi o pochi reagenti fallimento del ciclo termico della reazione di sequenziamento denaturazione primer annealing fallimento dell estensione dei frammenti prodotti non risospesi 35 4 Controllo di qualit del segnale Figura 4 6 Rappresentazione degli aspetti relativi ai dati
11. 5 Troubleshooting algoritmi e soluzioni proposte AD t Y t Elt AD lt Y lt Elt ADz t Yolt Ezlt AD t Yglt Elt dove Y t e E t sono il risultato della trasformazione di y t ed e t da RD ad AD Anche in quest analisi il segnale subisce una sogliatura per escludere il rumore di fondo Dopo diverse prove empiriche si giunti alla conclusione che la soglia pari a 80 offre le migliori prestazioni per l analisi Il file ABIF fornisce nell array base location le posizioni che occupano le singole basi nell AD Utilizzando quindi questa informazione per ogni segnale l algoritmo procede nella seguente maniera considera un intorno costituito da 11 campioni di ogni punto del base location e all interno di questo controlla la presenza di picchi di AD AD ADc ADs Se vi sono almeno due picchi l algoritmo riconosce la presenza di picchi multipli in quella posizione della sequenza I picchi vengono ordinati in base alla loro intensit e vengono presi in considerazione solo i due picchi pi alti Se il picco pi basso inferiore alla met dell intensit del picco pi alto viene riconosciuto un picco multiplo Viceversa viene riconosciuto un picco multiplo i cui picchi coinvolti hanno stessa intensit L analisi viene ripetuta per tutti 1 punti del base_location Alla fine di questo passo si ottiene un array chiamato presenza che ha le stesse dimensioni di base location e che per ogni posizione contiene 1 se in
12. D DD FD poli 1 Figura 6 20 probabilit di assegnazione corretta dell algoritmo per ogni problematica 108 Capitolo 7 Conclusioni L obiettivo di questa tesi stato quello di realizzare un algoritmo di analisi dei segnali di sequenziamento di DNA per valutare la presenza di problematiche che possono generare errori nella determinazione della sequenza nucleotidica Queste problematiche possono essere causate sia dalla qualit e o dalla quantit del campione da sequenziare che dal processo di sequenziamento Le cause appena elencate vanno ad inficiare la regolarit l ampiezza e l andamento del segnale L analisi per il controllo delle eventuali problematiche viene in genere compiuta da biologi esperti che valutano visivamente l esito di ogni sequenziamento Successivamente a questa analisi il segnale viene assegnato ad opportune classi che ne rappresentano il problema A seconda della gravit della problematica si decide se opportuno o meno sequenziare il campione Il software per l analisi delle problematiche sviluppato nell ambito di questa tesi fornisce quindi un utile ausilio per la procedura di troubleshooting I segnali analizzati sono relativi alla metodologia di sequenziamento Sanger e ottenuti dal sequenziatore Applied Biosystems 3730xl L algoritmo stato implementato in Matlab e per compiere l analisi dei segnali sono state utilizzate tecniche di approssimazione dei dati filtro a media 109 7 Conclusi
13. DNA marcati I contaminanti invece possono degradare il campione di DNA i frammenti prodotti quindi sono in numero scarso per generare un segnale significativo Anche una bassa concentrazione di DNA o primer nella reazione di sequenziamento riduce la potenza del segnale Tutto ci si manifesta come una registrazione di un segnale grezzo debole a volte anche molto rumoroso da rendere impossibile nell Analyzed Data la distinzione dei picchi e di conseguenza la lettura della sequenza nucleotidica questo il caso di sequenze classificate come segnale basso SB uch IY Raw Data Display 3 0 SB 0477 0k BHA FinchTY 3 no SB 0477 ok ab1 Ele gdt yew Anh teb 90 III Geospita eit Golo Baso No 3 AAN NI Ania J WN sa Mii Mi wy i ull a ua SELL YAWN SOLA DEPP RANA Figura 4 7 RawData ed Analyzed Data di una sequenza SB Il segnale grezzo debole e nella trasformazione in Analyzed Data presente rumore di fondo che compromette la pulizia del singolo picco Il software riesce ad identificare le basi ma la qualit dell identificazione non ottima come mostrano le barre grigie dei quality scores associate alla sequenza 37 4 Controllo di qualit del segnale 4 2 2 2 Segnale alto e fuori scala Una quantit elevata di DNA e primer nella reazione di sequenziamento genera un grande numero di frammenti corti per cui il segnale relativo alle prime basi risulta molto alto il caso di seque
14. DNA non vengano caricati nei capillari il Raw Data si presenta come in figura 4 3 33 4 Controllo di qualit del segnale FinchTV Raw Data Display NS_1 ZELL 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 S000 5500 6000 6500 7000 7500 6000 8500 9000 9500 10000 10500 11000 11500 12000 12500 13000 1350 arwi SME MM si VAMPIRA Lh Ny ig bl kta drat hy af gyal Ai 1a Halos saya AHN Neen pile bi i vd m lt gt Figura 4 4 RawData della sequenza contenuta nel file NS_1 abl Il sequenziamento non ha prodotto nessun segnale utile per l identificazione delle basi I dati costituiscono solo rumore di strumentazione Sequenza NS Ci che viene registrato solo rumore di fondo in quanto il rilevatore non ha registrato nessuna emissione di luce L Analyzed Data si presenta molto rumoroso e il software non riesce a riconoscere le basi azotate Il procedimento di basecalling quindi fallisce Questo aspetto dipende dalla strumentazione e non dal processo di reazione di sequenziamento Nel caso in cui venisse usato un marcatore Cap 2 paragrafo 3 1 nemmeno questo sarebbe visibile nel Raw Data Questo tipo di sequenze vengono classificate come NS no signal 4 2 1 2 No reaction I casi come quello mostrato in figura 4 5 invece vengono classificati come NR no reaction TT FinchTV Raw Data Display 2 no NR 9042 ok lt Horizontal Scale 50 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
15. FD Questi problemi ricorrono sia per filamenti di DNA amplificati con la PCR sia per filamenti clonati attraverso plasmidi Durante la reazione a catena della Polimerasi infatti possibile che vengano amplificati filamenti di DNA differenti a causa di un appaiamento aspecifico del primer progettato Generalmente le procedure di cleanup che seguono la PCR rimuovono i nucleotidi non incorporati e primers residui ma non i prodotti secondari della PCR 47 4 Controllo di qualit del segnale Nel caso di clonaggio attraverso plasmidi invece pu accadere inavvertitamente che il DNA venga estratto da pi colonie con contenuto plasmidico diverso anzich da una sola Il DNA non unico ci sono quindi diversi campioni Per entrambe le situazioni il macchinario legge pi di una sequenza contemporaneamente Una ottimale progettazione del primer e il successo della fase di primer annealing della reazione di sequenziamento sono dei processi fondamentali per un giusto esito del sequenziamento Precedentemente si visto come il fallimento del primer annealing pu causare la formazione di pochi frammenti marcati ma anche nel peggiore dei casi il totale fallimento della reazione di sequenziamento Una scorretta progettazione del primer invece porta alla lettura contemporanea di due o pi sequenze Ci accade quando 1 Nella reazione presente oltre al primer ideale anche un primer che di una base pi corto rispetto l altr
16. FP FN VP e VN mentre la seconda li riporta in percentuale I FP e i FN danno una misura degli errori compiuti dall algoritmo i Falsi Positivi rappresentano il numero di sequenze riconosciute come appartenenti alla classe oggetto di studio ma che in realt non vi appartengono mentre i Falsi Negativi rappresentano il numero di sequenze realmente appartenenti alla classe ma non riconosciute dall algoritmo In particolare i VP e VN in percentuale corrispondono rispettivamente alla sensibilit Se e alla specificit Sp Se Sp LE TP FN IN FP Essendo il numero dei Veri Negativi molto alto non si riescono sempre a discriminare efficacemente gli errori commessi dall algoritmo per diverse problematiche per cui viene calcolato anche il valore predittivo positivo PPV definito come DE PPV TP FP Per ogni classificazione viene calcolata anche la probabilit di assegnazione corretta Pc _TN TP ON Pc dove N pari a 1200 Pc che varia tra 0 e 1 permette di quantizzare la correttezza dell algoritmo nel classificare una sequenza Per cui maggiore Pc migliore la performance dell algoritmo possibile calcolare anche la probabilit d errore pari a 1 Pc Pe Pi problematiche posso interessare una sequenze Per cui possibile 91 6 Risultati valutare la bont della classificazione considerando globalmente il numero di sequenze per l algoritmo ha riconosciuto tutte le problematich
17. Figura 5 1 Classificazione degli aspetti relativi ai dati di sequenziamento Raw Data Analyzed Data del sequenziatore 3730xl che possono compromettere l identificazione della sequenza suddivise nelle tre tipologie principali L algoritmo stato realizzato per riconoscere le classi evidenziate in verde Le figura 5 2 e 5 3 riportano i segnali ricavati dal sequenziamento di un campione di DNA contenuti nel file ABIF s_ 5f ab1 La prima mostra il RD mentre la seconda l AD della sequenza Dal RD si osserva come il campione di DNA sia stato preparato attraverso la tecnica della PCR Cap 2 paragrafo 2 1 1 in quanto il segnale non occupa l intero asse dei tempi e presenta un ultimo picco finale di colore verde Adenina Cap 3 paragrafo 3 2 L ampiezza del segnale alta quindi classificato come SA Cap 3 paragrafo 3 2 2 2 ed inarcato S Cap 3 paragrafo 3 2 3 L AD invece caratterizzato da picchi multipli lungo tutto il segnale la sequenza risulta anche FD Cap 3 paragrafo 3 2 3 63 5 Troubleshooting algoritmi e soluzioni proposte inchTV Raw Data Display s_5f Hasan seat Figura 5 2 RD ottenuto dal sequenziamento di un filamento di DNA Il segnale alto SA ed inarcato SI Il campione stato amplificato attraverso la tecnica della PCR e lo si coglie dall ultimo picco verde che rappresenta l adenina e dal fatto che il segnale non occupa l intero asse temporale File Edit View Finch Help 22899
18. del dato grezzo causando per l appunto un calo graduale del segnale nel caso in cui la doppia elica del DNA venga denaturata solo parzialmente sequenza che muore M figura 4 10 oppure ad un segnale basso caso gi presentato precedentemente nel caso in cui molte copie dello stampo di DNA non vengano completamente denaturate figura 4 7 Aspetti relativi alla reazione di sequenziamento per l appunto la difficolt di svolgere particolari sezioni del campione e aspetti che interessano lo strumento e in particolar modo la corsa elettroforetica possono compromettere la corretta acquisizione dei dati generando quindi i segnali appena descritti 40 4 Controllo di qualit del segnale Y FinchTV Raw Data Display Flagwt6 DOR ALS 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 6000 9000 10000 11000 12000 13000 14000 15000 1600 4000 Vertical Scale O Ble Edt View Finch Help 2290 wl a alaja ai Figura 4 10 Raw Data ed Analyzed Data di una sequenza che cala gradualmente L elettroferogramma risulta pi corto e non si riesce a sequenziare l intero filamento di DNA L intensit dei dati grezzi relativi alle prime basi nella norma fino ai 5000 campioni dell asse delle ascisse mentre successivamente il segnale cala In corrispondenza a questo calo aumenta il rapporto segnale disturbo Dalla 560 base in poi il rumore diventa significativo l interpretazione dei dati diven
19. del sequenziatore assegna una N noise in quella posizione del cromatogramma In genere le sequenze SB presentano nell Analyzed Data un alto rumore di fondo lungo tutto la sequenza e ci classifica il segnale anche come FD I picchi nell Analyzed Data sono multipli e i picchi secondari hanno un intensit minore rispetto quelli principali 45 4 Controllo di qualit del segnale E FinchTY 3 no SB 8477 ok ab1 Ble Edt yew Finch Help asse 28290 wt 2 o a e simp Go to Base No Find Sequence oo i v a0 1 LH Il a H bhe ELLA HHHH H AAAAC GAGCTCTTGTTGTAAACATTGATCCAAC 350 360 7 Horizontal Scale Figura 4 17 Analyzed Data e Raw Data di una sequenza SB Si osservano nel primo riquadro picchi multipli anche se evidente la presenza di una sequenza dominante I picchi sono distribuiti lungo l intero Analyzed Data La sequenza SB ed FD La presenza di pi di un template nella reazione di sequenziamento causa la lettura contemporanea di pi sequenze che quindi risultano sovrapposte nell Analyzed Data Il sequenziatore legge contemporaneamente due o pi sequenze e tale effetto che non visibile nel Raw Data si manifesta in maniera evidente nell Analyzed Data I picchi risultano doppi nel caso in cui i campioni di DNA sono due multipli nel caso di pi campioni I picchi possono avere stessa intensit ed il caso di sequenze classificate come D o possono avere intensit differente con la pr
20. di sequenziamento Raw Data Analyzed Data del sequenziatore 3730xl che possono compromettere l identificazione della sequenza suddivise nelle tre tipologie principali L area evidenzia le classi di problematiche che interessano l ampiezza e l andamento del RawData 4 2 2 Problematiche legate all ampiezza e all andamento del Raw Data In questo paragrafo vengono presentate le problematiche legate all ampiezza e all andamento del Raw Data con i relativi effetti nell Analyzed Data tali da rendere nei casi peggiori impossibile il processo di basecalling Un sequenziamento andato a buon fine presenta un Raw Data che ha un andamento regolare costante e che non supera determinati valori nella scala di intensit luminosa Questo tipo di problematiche sono raggruppate nel riquadro evidenziato nel flow chart di figura 4 6 mentre nei successivi paragrafi verranno descritte nel dettaglio le caratteristiche principali di ogni classe con le relative cause 36 4 Controllo di qualit del segnale 4 2 2 1 Segnale basso Dopo la fase di preparazione del campione importante eliminare sali residui proteine detergenti e residui di RNA La presenza di queste molecole inibisce la reazione di sequenziamento o interferisce sul processo dell elettroforesi La presenza di proteine interferisce durante il processo dell elettroforesi perch queste tendono ad attaccarsi alla parete dei capillari ostacolando e rallentando la corsa dei frammenti di
21. ezyre Shoar tho ineortinto smallor fregmonte lt 200 bo ard subclone Ircrease tha denaturation temperature add DMSO to afinal concentration v v of 5 Note Adcing e mixiura of 5 DMSO and 5 glrosrci has also been used successfully for some templates Ircubate the reection at 96 C for 10 min hafora cycling Add bataina to a fina concentration of 1 M Double all raaction components and inci hate a 98 C fer 10 nin kefore cycing Add Sto 10 formamide or 5 70 10 qycerol to he reactions Lnearze the plasmids with a restriction evyre Shear the insertinto smaller tragments lt 200 bo ard subclone Usa an anshored primer Te a saquencing primer that is sclyT containing ar A C or G base at the 3 enc of a polyA region The 3 basa will anchor the primer into place attha and of the homesolymer region DNA tabella riportata nella guida Sequencing Cheministry guide dell Applied Biosystems 3730 3730xl 60 4 Controllo di qualit del segnale Problematiche Simbolo Assenza di segnale NS NR Problematiche legate all ampiezza SB del Raw Data SA FS Problematiche legate all andamento M del Raw Data ST Linea di base inarcata SI D Picchi multipli 2a DD TD DP Picchi anomali a PR DG Tabella 4 2 simbologia associata alle problematiche 61 Capitolo 5 Troubleshooting algoritmi e soluzioni proposte Nel capitolo 4 s
22. nel paragrafo 5 2 1 all interno di una finestra di 200 campioni che scansiona y t dall istante t 200 fino alla fine di y t Questo passo fornisce la serie di picchi pi La scelta di non considerare i primi 200 campioni di y t dipende dal fatto che questi primi dati possono registrare anche la fluorescenza dei dimeri di primer DP Cap 4 paragrafo 4 6 che incrementerebbero di molto il valore del RD proprio in questa regione del segnale Prima di quest operazione come per tutte le 77 5 Troubleshooting algoritmi e soluzioni proposte analisi fatte precedentemente il RD viene sogliato con soglie pari a 50 nel caso di segnali bassi 200 per segnali alti e fuori scala Nel caso in cui il segnale non rientrasse in nessuna di queste categorie la soglia rumore resta pari a 75 L istante T che indica la fine di y t invece corrisponde alla posizione dell ultimo picco del RD altrimenti alla posizione in cui stato riconosciuto il picco A di PCR Tin Una volta trovata la serie di picchi p con i P dove P il numero dei picchi viene effettuata un operazione di media mobile per approssimare questa serie 1 2nH f gt P mi Il risultato di questa operazione una serie di valori f per ogni p si identifica l insieme N dei 2n picchi pi vicini a p N contiene 2n 1 punti perch contiene pure p Il parametro n viene posto uguale a 3 Dopo aver reiterato l operazione di media mobile su f per 3 volte s
23. questo lavoro di tesi Questa tesi stata realizzata durante uno stage universitario iniziato nel mese di Ottobre 2009 presso l azienda BMR Genomics di Padova Quest azienda offre servizi di analisi del DNA tra cui quello del sequenziamento attraverso il metodo Sanger per mezzo del sequenziatore Applied Biosystems 3730xl I dati utilizzati per implementare e testare l algoritmo derivano proprio da questa strumentazione da notare anche l originalit e l unicit di questo progetto il primo in assoluto ad affrontare il problema del troubleshooting automatico di sequenze di DNA 12 Capitolo 1 La biologia del DNA 1 1 La struttura chimica del DNA Il DNA acido desossiribonucleico una molecola presente sia nelle cellule procariotiche che eucariotiche che codifica l informazione ereditaria e la trasferisce da una generazione all altra Gli acidi nucleici tra cui il DNA sono costituiti da monomeri chiamati nucleotidi ognuno dei quali consiste di uno zucchero pentoso un gruppo fosfato e una base azotata i Phosphate H group OH OH Sugar Figura 1 1 rappresentazione della molecola nucleotidica di DNA costituita da un gruppo fosfato un gruppo zuccherino e una base azotata Adenina xe Nel DNA lo zucchero pentoso il desossiribosio Lo scheletro della macromolecola consiste di una catena di zuccheri pentosi alternati a gruppi fosfato 13 1 La biologia del DNA zucchero fosfato zuccher
24. sample a description of recommended template injected too low quantities If possible resuspend the template in a smaller volume Increase injection time Refer to Optimizing Electrokinetic Injection on page 4 5 Excess salt present in the sample Clean up the sample using a spin column ora 70 ethanol wash Bad post reaction clean up Repeat sample preparation High background Dirty template bad primers bad post Refer to the documents listed on page vii of reaction clean up the Preface saction for a description of how to clean up dirty templates Top heavy data Amount of template in the sequencing Refer to Template Quantity on page 2 5 for reaction too high creating an excess of short a description of recommended template fragments that are preferentially injected into quantities the capillary array Concentration of extension products too high Dilute the sample or decrease the injection time Diluted reactions Use more BigDye reagent 57 4 Controllo di qualit del segnale Blank lanes or no signal Failed injection Breakdown of BigDye G nudeotide Abrupt signal loss Poor template quality Inhibition of the sequencing reaction Multiple overlapping sequences in the data PCR templates Blocked capillary array caused by an excess of protein template or other impurities or by dried polymer Formamide degradation caused by exposure to the air Reactions too dilute Poor quan
25. superiore a tal livello 5 2 2 Problematiche legate all andamento del Raw Data La funzione segnale calante di Matlab ha lo scopo di analizzare l andamento del RD Cap 3 paragrafo 3 2 2 Prima di procede con quest analisi l algoritmo testa la lunghezza di y t per riconoscere un campione preparato o attraverso PCR o attraverso DNA ricombinante Presenza pcr la funzione realizzata per la ricerca del picco di PCR L algoritmo trova i picchi del RD dopo un processo di sogliatura per escludere rumore di fondo identico a quello descritto nel paragrafo 5 2 1 Se l ultimo picco verde A e se occupa una posizione inferiore ai 16000 valori delle ascisse il RD ha un asse x che raggiunge al massimo 16200 valori viene riconosciuto un picco di PCR Questa funzione riceve come argomento il parametro soglia rumore descritto nel paragrafo precedente che assume differenti valori a seconda dell ampiezza del RD In figura 5 12 rappresentata una finestra temporale del RD di un segnale fuori scala 79 5 Troubleshooting algoritmi e soluzioni proposte contenuta nel file ABIF PerlRhod1 16S ab1 Si nota l ultimo picco verde rappresentativo della PCR Il RD successivo al picco non contiene il segnale di sequenziamento y t ma rumore di fondo e t Se venisse utilizzata una soglia rumore pari a 75 verrebbero trovati altri picchi nel RD riconosciuti come appartenenti a y t In questo esempio necessario usare una soglia maggiore almeno
26. tecniche di laboratorio le sequenze di DNA oggetto allo studio vengono estratte dai plasmidi ricavando pi copie del campione biologico d interesse Col processo di reazione a catena della polimerasi PCR possibile produrre milioni di copie di una quantit molto ristretta di DNA iniziale dunque una tecnica pi rapida rispetto al DNA ricombinante sebbene necessiti delle sequenze nucleotidiche primer che possano appaiarsi correttamente con le estremit del segmento da amplificare La PCR un processo ciclico in cui una sequenza di processi vengono ripetuti molte volte Frammenti di DNA a doppio filamento vengono denaturati attraverso la somministrazione di calore circa 90 C Alla miscela viene aggiunto un primer sintetizzato chimicamente alla temperatura di 50 60 C per favorire il legame del primer col filamento Vengono aggiunti chimicamente i quattro deossinucleosidi trifosfato ANTPs e la DNA polimerasi che catalizza la produzione di nuovi filamenti complementari a quelli da copiare Un singolo ciclo di reazioni impiega pochi minuti per raddoppiare la quantit di DNA iniziale e il DNA neosintetizzato viene a trovarsi nello stato a doppia elica Ripetendo il ciclo di reazioni denaturazione primer annealing 18 2 Il sequenziamento copia del filamento molte volte si ottiene un aumento esponenziale del numero di copie di DNA iniziale La DNA polimerasi per un enzima che viene in gran parte distrutto dalle a
27. 0 mostrato il plot fornito in seguito alle elaborazioni appena descritte I pallini in blu rappresentano i valori contenuti nel vettore presenza10 Ogni punto riassume la natura di 10 basi della sequenza sotto analisi in questo caso per la sequenza s_ 5f ab1 riportata in molte figure di questo capitolo Si nota come le prime 30 basi vengano escluse dall analisi La sequenza lunga circa 330 basi come mostrato dall asse x del grafico con precisione 328 i punti possono assumere due soli valori 1 quando le 10 basi contenute in quella finestra sono rappresentate da un AD che contiene picchi multipli 0 viceversa Ad esempio il punto indicato dalla freccia rappresenta le 10 basi contenute tra la 190 esima e la 200 esima base Si osserva che la sequenza nel suo complesso presenta picchi multipli L algoritmo classifica la sequenza come FD figura 5 4 88 5 Troubleshooting algoritmi e soluzioni proposte Figure No 5 File Edit View Insert Tools Window Help D WS AAS GED distribuzione di picchi doppi T T i i 2 3 3 6 2 a L f 150 200 n basi ogni punto corrisponde a 10 basi Figura 5 20 plot fornito dalla funzione presenza _picchiDoppi Il grafico riporta in ascissa le basi della sequenza raggruppate in gruppi da 10 mentre in ordinata i valori rappresentati possono occupare solo due livelli 1 se in quella posizione dell asse x dell AD ci sono picchi multipli 0 viceversa Il plot il ri
28. 0 0 x 10 Figura 5 10 I punti in blu rappresentano l inviluppo del RawData elaborato dalla funzione ampiezza segnale A questo punto la serie di valori viene confrontata con tre soglie costanti i cui valori sono stati suggeriti dai biologi della BMR Genomics che si occupano di 73 5 Troubleshooting algoritmi e soluzioni proposte troubleshooting e la prima soglia scelta pari a 500 serve per verificare se il segnale basso Se l 80 dei valori sta al di sotto di questa soglia il segnale viene classificato SB e la seconda soglia pari a 5000 serve per riconoscere un segnale alto Se il 20 dei valori supera questa soglia il segnale viene classificato SA e la terza soglia pari a 27000 la scala di intensit del RD arriva fino a 32000 serve per riconoscere un segnale fuori scala Se il 15 dei valori supera questa soglia il segnale viene classificato FS In particolare la scelta delle diverse percentuali per FS SA e SB ha un motivo come gi spiegato nel capitolo 4 nel paragrafo 4 3 2 segnali alti e fuori scala si presentano a volte con un RD che assume valori elevati soprattutto nei primi istanti di acquisizione e pian piano cala raggiungendo valori regolari Come detto precedentemente la soglia rumore che viene utilizzata per escludere il disturbo dall analisi inizializzata a 75 Il riconoscimento di un segnale basso piuttosto che di un segnale alto o fuori scala fa s che il valore del
29. 130 ether eteive sti ata tebe etree tte tit Te Toso TAGOTACCAS TTATAGCTAATOCEE Teaee the TCGG ARE TASo TOCCATAAAGTCCC 170 200 biro dar til ner tite we lb tec tre tts sew th tet eee are beet TTAGGAC AAG AGC TTTGAG ACCC TTAAGAGCCTTATCACGATTIGAAGGGATGAGGGTAAGATACTAA SATA Vay S YI Aa RATA SAAS Reset Scales Horizontal Scale Figura 4 22 Analyzed Data di un filamento di DNA che presenta una regione con omopolimero Dopo la 77 base presente una successione di nucleotidi contenente la base azotata T Successivamente a tal regione si osservano dei picchi doppi uno dominante l altro secondario che interessano la restante parte della sequenza DD FD 4 2 5 Picchi anomali Questo tipo di problematiche interessano solo alcune regioni dei segnali di sequenziamento sono raggruppate nell area evidenziata del flow chart di figura 4 23 51 4 Controllo di qualit del segnale s gt gt Le Figura 4 23 Rappresentazione degli aspetti relativi ai dati di sequenziamento Raw Data Analyzed Data del sequenziatore 3730xl che possono compromettere l identificazione della sequenza suddivise nelle tre tipologie principali Nel riquadro evidenziato sono messe in risalto le classi relative all analisi dei picchi anomali nell Analyzed Data Durante la fase del primer annealing della reazione di sequenziamento Cap 2 paragrafo2 1 2 i primer si agganciano al filamento di DNA da sequenziare Pu accadere c
30. 7D e in base all intensit dei picchi viene aggiunta la sigla D uguale intensit FD diversa intensit il caso mostrato in figura 421 49 4 Controllo di qualit del segnale FinchTV 9 no 1D FD zoi4pde5a3intF ab1 Eile Edit View Finch Help a a veajan alal Go to Base No Find Sequence RR PR LILHHHHIHH i LH swot LHe444 4a 1 1 1 4 Maot o G AA oT OG AAACCT GAATAT CATAT GAGAAAT GGT CAATGCAT GGTTTGC TO AGAGAGT TCACAC 40 50 60 70 80 90 100 1444 4444 CATCECTO TOTOCAAGOAAGOTATCAGAGOCCACACCOAATC 110 120 130 140 b 444 0 0 04 0 44 4 6 0 1 4 444 444 AAT PELLET cree SOOAGATAREA GIO TE EE TGGAACACCAACCAGG AAAATC TCS ewes enn eee 180 190 210 220 TATED ANGUS CODON inn LH L HHHHHHE HH HELLHEHHLHHH 1 14 H IMETTAGACECATTOTTOTIARGGATTO TOAGGGAACTOTEAGETTCCIETET9A ii GA AA AGAAG 260 AMAA aisha inania aAA as tanhia Annam Horizontal Scale Figura 4 21 picchi doppi nelle prime 150 basi dell Analyzed Data Il picco secondario ha intensit inferiore rispetto a quello principale Si osserva come i quality scores delle prime basi abbiano valori pi bassi rispetto quelli delle basi successive alla 150 La sequenza TD FD Anche la struttura e la composizione del campione di DNA costituiscono x un potenziale problema nella procedura di sequenziamento Si visto come campioni con un alto contenuto in GC siano difficili da sequenziare a causa del
31. BIF 28 Capitolo 4 Controllo di qualit del segnale 30 4 1 Caratteristiche dei dati controllo di qualit e troubleshooting 30 4 2 Problematiche nana licia aa 33 4 2 1 No signal e no reaction nia lilla lan 33 4 2 2 Problematiche legate all ampiezza e all andamento del Raw Data 36 4 2 3 SCIA MAr Lao 43 4 2 4 Picchi multipli nell Analyzed Data ano 44 4 2 5 Picchi anomali 00000000 IRR IU aaa 51 Capitolo 5 Troubleshooting algoritmi e soluzioni proposte 62 d l No signal emo teactioni sicu e e aan aaa 66 5 2 Problematiche legate all ampiezza e all andamento del Raw Data 72 5 2 1 Problematiche legate all ampiezza del Raw Data 72 5 2 2 Problematiche legate all andamento del Raw Data 75 33 Segnale AAC ALO as n ta e a a a a gs e ae 80 5 4 Picchi multipli nell Analyzed Dat siluri 81 Capitolo 6 Risultati urra iaia a 90 6 1 No signal eNoreactioni niin eeann a reini o eia liolalshai 92 6 2 Problematiche legate all ampiezza e all andamento del Raw Data 95 6 2 1 Problematiche legate all ampiezza del Raw Data 95 6 2 2 Problematiche legate all andamento del Raw Data 98 6 3Seonale marcato antenata 100 6 4 Picchi multipli nell Analyzed Data angie 101 Capitolo 7 Conclusioni alien
32. Dc t RDc t Il RDo della sequenza s Sf abl mostrato in figura 5 7 e si pu osservare dallo zoom come il marcatore occupi per questo esempio proprio una finestra di circa 100 campioni intorno ai 1320 1420 valori dell asse temporale con un ampiezza pari a circa 2000 nella scala di intensit luminosa L algoritmo esamina solo il dato grezzo della G Per il riconoscimento del marcatore m t calcola all interno di una finestra mobile di 150 campioni che scansiona il RDg a partire dall inizio la varianza s dei dati La varianza viene calcolata utilizzando la formula 2 1 2 S AD RD on i l dove N il numero dei campioni contenuti nella finestra corrente mentre N LS RD Gi i l RD la media dei campioni di RDe contenuti nella stessa finestra La scelta di esaminare finestra per finestra la varianza del segnale e di non concentrare la ricerca del marcatore esclusivamente nell intervallo 1200 1500 dovuta al fatto che per alcuni sequenziamenti la migrazione dei frammenti di DNA parte in ritardo per cui sia il marcatore m t che il segnale y t di sequenziamento sono traslati in avanti lungo l asse delle ascisse Nelle finestre che non contengono n marcatore m t n il segnale yc t la varianza quella dei dati che rappresentano solo rumore di fondo ec t Una cambiamento significativo della varianza dei dati della finestra corrente rispetto a quelli della precedente e della seguent
33. E SEQUENZIAMENTO partenza regolare SEQUENZIAMENTO CON PCR sequenziamento con per ULTIMA BASE A t PICCHI DOPPI OUTPUT FD RAW DATA INARCATO OUTPUT SI ANDAMENTO DEL SEGNALE Figura 5 4 risultato del troubleshooting automatico per la sequenza s_sf abl Nel flow chart figura 5 5 sono rappresentati gli step su cui articolato l algoritmo e nei paragrafi successivi verranno descritte nel dettaglio le specifiche di ogni step L algoritmo stato implementato in Matlab Matrix Laboratory un software che utilizza un linguaggio ad alto livello molto utilizzato nel settore del calcolo ingegneristico e della simulazione La logica con cui opera una logica prettamente matriciale inoltre essendo un metalinguaggio Matlab consente l utilizzo di molte funzioni predefinite senza che l utente debba preoccuparsi di programmare a basso livello Matlab viene spesso utilizzato per l analisi numerica per la modellazione di sistemi dinamici per lo sviluppo di algoritmi l elaborazione grafica e l analisi del segnale Tutte queste caratteristiche lo rendono facile ed efficiente ed per questo che stato utilizzato per implementare l algoritmo di questa tesi Per questo lavoro sono state realizzate 11 funzioni In un unico script invece sono stati memorizzati i parametri utilizzati nell algoritmo come le soglie decisionali e che possono esser modificati da chi utilizza il 65 5 Troubleshooting a
34. ES KAAL BOD Analyzed Data 2000 7 1800 1600 1400 Figura 5 17 una finestra dell Analyzed Data della sequenza s_5f abl identica a quella di figura 5 16 La figura mostra il primo passo dell algoritmo per il riconoscimento dei picchi multipli In nero rappresentata la soglia per l eliminazione del rumore di fondo presente in ogni Analyzed Data mentre gli asterischi in rosso rappresentano le posizioni delle basi In figura 5 18 viene mostrata invece l analisi compiuta dall algoritmo per la 83 5 Troubleshooting algoritmi e soluzioni proposte sequenza d esempio e il primo vettore costituisce la successione di basi azotate identificate dal sequenziatore per la sezione del segnale considerata e il secondo vettore rappresenta il base location la posizione nell asse x dell AD occupata da ogni base azotata e ilterzo vettore rappresenta la sezione corrispondente dell array presenza e il quarto vettore rappresenta invece la sezione corrispondente dell array intensit l array contiene in tutte le posizioni solo lo 0 in quanto tutti i picchi multipli trovati sono relativi a picchi di diversa intensit Sequence TIG AJAA CIT G A C AIT G T T C A A T G T T T G T T C T G C A C A G T T base_location Ge ere om oer ms om os fr om pe E pea papon oa isor ea na ma so nes ns ne ve ns raa as as vss e a Presenza SS Intensita Figura 5 18 la figura mostra 4 array seq
35. RDc in ogni finestra e ne calcola la media t Tools Window Help dit rt DEUS RAZ PPD 1200 1000 IT AU MI Wi nL INI MNN L 2500 Sato 3500 4000 Figura 5 8 In nero sono PISO i punti massimi calcolati dalla funzione presenza segnale per il riconoscimento dei picchi di sequenziamento nel RD Come evidente nel plot di figura 5 8 i punti di massimo definiti x nella prima porzione del segnale sono bassi mentre intorno ai valori 1800 1900 dell asse temporale in corrispondenza dell acquisizione del segnale di sequenziamento vero e proprio i punti iniziano ad assumere valori elevati Questa netta variazione dei valori viene riconosciuta dall algoritmo attraverso la valutazione della derivata dei punti di massimo trovati In prossimit della variazione la derivata cresce a differenza delle altre porzioni del segnale La derivata viene calcolata tramite approssimazione come differenza finita all indietro xlt l xlt x It t t dove 1 2 M ed M il numero dei punti di massimo x calcolati La variazione significativa del segnale riconosciuta nell istante quando la derivata in supera di 3 2 la media delle derivate iz Lo ae x it Ri Ss yeu 2M 13 Una volta trovato l istante salvato nella variabile inizio_segnale della 70 5 Troubleshooting algoritmi e soluzioni proposte funzione l algoritmo si accerta che l ampiezza del segnale sia tale da rappresentar
36. UNIVERSITA DEGLI STUDI DI PADOVA FACOLTA DI INGEGNERIA CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOINGEGNERIA ALGORITMI PER L ANALISI ED IL TROUBLESHOOTING DI SEGNALI DI SEQUENZIAMENTO SANGER DEL DNA ALGORITHMS FOR ANALYSIS AND TROUBLESHOOTING OF SANGER DNA SEQUENCING DATA Relatore Prof Barbara Di Camillo Correlatore Prof Giovanni Sparacino Correlatore Dott Barbara Simionati Correlatore Ing Fabrizio Levorin Laureanda Jole Costanza ANNO ACCADEMICO 2009 2010 Indice pe ORV A121 g 6 Reece aR VE oS MERRIE COSCE NERS COSIO DORICO PAST IER IRONICI ere Re OI RIO 7 MEAT LEVA 01 tate eects E RR IRE N AS E EE E E 9 Capitolo 1 La biologia del DNA ceccceeseceeeeceeececeeeeeceeeeeceteeecenanaeeees 13 Lil Eastrottura chimica de PN eee lia 13 dea replicaziene del DNA irta ia 15 1 3 L informazione contenuta nel DNA ii 15 Capitolo 2 Il sequenziamento i 17 2 1 Il sequenziamento Sander italia chelolasa lcd 17 2 1 1 La preparazione del campione 17 2 1 2 La reazione di seguenziamento s iaia 19 2 RI Leletto foreS ik arte Liana 20 2 2 Altri tipi di seguenziamento iar aaa lato 22 2 2 1 Sequenziatori di nuova generazione ii 22 2 3 Scope della TES ts civhadecgy sh sass de nu aai Batic iiaausn R 24 Capitolo SLM 27 3 1 Il sequenziatore Applied Biosystems 3730x1 i 27 3 1 1 Raw Data ed Analyzed Data il file A
37. We nuda Ai seoa Goto Base No Find Sequence m cacce Goo EENT bebe ELH rtbb bets COTOGACACTE TE OTAACCAGOCCITAAGOC SIICTICACACITAAGAGTTCIAGOGIO 200 LELLA mm ide AHEHE Ace CTAGCA TOCCACTC I fea tls ashe Hrer entered dts da dee ett 1 4ttete ATO GAGCAACGGACAG AC CAAGTICCAAATICT TAAAGAOTTAGAGAGOGAATOTATOA IN TOOOTOTGACT 260 280 230 300 210 320 Figura 5 3 AD ottenuto dal sequenziamento dello stesso campione di DNA della figura 5 2 Si osservano picchi multipli lungo tutta la sequenza L algoritmo riesce ad individuare tutti e tre gli aspetti che riguardano la sequenza e in figura 5 4 viene mostrato l output dell analisi automatica L algoritmo e riconosce la presenza del marcatore m t nel RD e individua l istante in cui la CCD camera del sequenziatore inizia a rilevare i picchi del segnale di sequenziamento Cap 2 paragrafo 2 1 3 y t e riconosce che il campione stato preparato attraverso la tecnica della PCR e riconosce la presenza di picchi multipli nell AD e individua un RD inarcato 64 5 Troubleshooting algoritmi e soluzioni proposte e riconosce un calo del RD ma non cos drastico da portarlo a morire OR File Edit View Web Window Help De fa Current Directory C Documents and SettingstxpDe w gt gt main3 MARCATORE inizio marcatore 1350 fine marcatore 1500 3t3SEGNALE t inizio segnale 1800 OUTPUT SA PARTENZA SEGNAL
38. a 200 per riconoscere la fine di y t Vi sono casi pi gravi in cui la soglia deve anche superare i 300 o 400 valori Dopo diverse prove empiriche la soglia rumore stata fissata a 500 per segnali FS Le stesse osservazioni valgono per segnali alti la soglia corretta a 300 e per segnali bassi la soglia corretta a 50 Per quest ultimo caso essendo il segnale debole la soglia rumore stata abbassata in modo da non perdere i picchi di sequenziamento La funzione presenza pcr qualora venisse trovato il picco di PCR fornisce in output la posizione dell ultimo picco Tin che rappresenta quindi la lunghezza del filamento sequenziato 76 5 Troubleshooting algoritmi e soluzioni proposte Figure No 7 DER Fl Edk View Insert Took Window Help D W KAAS PPD scala intenst luminosa a ate tae a emote Figura 5 12 finestra temporale del RD di una segnale FS contenuta nel file ABIF PerlRhod1 16S abl L ultimo picco A rappresenta la fine di y t Il resto del segnale costituisce rumore di fondo In segnale calante l informazione sulla presenza del picco di PCR necessaria per riconoscere la fine del segnale y t registrato e limitare l analisi solo nella regione che lo contiene L obiettivo quello di tracciare la curva F t per approssimare l andamento di y t Ci lo si fa attraverso una ricerca del picco massimo del RD stessa strategia di peak detection utilizzata nella funzione ampiezza segnale
39. a sequenza di DNA in cui visibile la presenza di dimeri di primer DP visibili nei primi picchi Si nota come questi abbiano intensit maggiore rispetto al resto del RawData L effetto della presenza di bolle d aria o di cristalli di polimero all interno della soluzione contenente il campione di DNA viene registrato durante l acquisizione dei dati nel processo di elettroforesi capillare Ci che si osserva la presenza di un picco stretto e molto alto spike sia nel RawData che nell Analyzed Data Sotto nelle figure 4 26 e 4 27 sono riportati il RawData e l Analyzed Data di una sequenza che presenta questo artefatto e che viene classificata nella categoria BL blob 53 4 Controllo di qualit del segnale T Pante Mar Loto DA pibos gt 11 91 DARI Figura 4 26 RawData di una sequenza di DNA che contiene uno spike anomalo dovuto alla presenza di bolle d aria o di cristalli di polimero BL e RR vlui amp B Vote fanina Figura 4 27 Analyzed Data della stessa sequenza di DNA di figura 4 26 in cui evidente un picco anomalo Durante la reazione di sequenziamento i nucleotidi marcati non incorporati possono formare agglomerati che migrano durante il processo di elettroforesi e vengono quindi rilevati dallo strumento Questi si presentano come dei picchi spuri che compaiono all interno del segnale visibili sia nel RawData che nell Analyzed Data e che occupano delle posizioni ben precise in quest ultimo tra
40. alta VERO VP 78 05 FN 21 95 FALSO FP 1 25 VN 98 75 Tabella 6 11 VP VN FP FN in percentuale per le sequenze SB 1 090 94 SA 0 9 98 0 95 0 9 FS SB E Pc E ppv Figura 6 6 grafico che rappresenta la probabilit di assegnazione corretta in blu e il valore predittivo positivo in rosso per sequenze SA FS SB 97 6 Risultati Li 0 98 0 99 0 98 0 9 0 8 0 8 0 7 0 6 0 5 E Se 0 3 0 2 0 1 SA FS SB Figura 6 7 grafico che rappresenta la sensibilit in azzurro e la specificit in grigio per sequenze SA FS SB 6 2 2 Problematiche legate all andamento del Raw Data Per questo tipo di analisi la probabilit di assegnazione corretta del 91 33 Su 331 sequenze classificate come M 1 84 di esse viene classificato correttamente figura 6 10 Per poter migliorare il metodo si potrebbe pensare di usare tecniche di filtraggio del segnale ad esempio un filtro passa basso in modo da eliminare la componente di rumore e t che presente nel RD L uso di questi filtri elimina le componenti ad alta frequenza che sono tipiche del rumore ma in parte anche del segnale utile y t Quindi opportuno scegliere una frequenza di taglio adeguata Inoltre c da considerare che l uscita di un filtro passa basso reale non uguale a quella di un filtro passa basso ideale in quanto il segnale viene modificato anche in modulo Per questo l elaborazione del RD attr
41. amma decrescono fino a scomparire e rendendo difficile il basecalling 4 2 3 Segnale inarcato L effetto di un segnale inarcato dovuto alla presenza di contaminanti all interno della soluzione contenente il campione di DNA Ci che avviene un innalzamento della linea di base del segnale registrato durante il passaggio dei frammenti marcati dalla finestra di rilevamento del sequenziatore La presenza di queste molecole incrementa il rumore di fondo durante l acquisizione dei dati per cui viene sempre registrato un segnale creando l effetto cerchiato in figura 4 15 43 4 Controllo di qualit del segnale L effetto visibile nel Raw Data di una sequenza e pu interessare i primi dati di fluorescenza come per l esempio mostrato ma anche una finestra pi ampia del Raw Data se non tutto l asse Be Gui gee Fah bb QI Cui Bee Mz ETAT OAOCTCA TATTIETTOTTO ah DEF aha sl nni it id iy ene ae an iy i i alta er iN x ili I i in Hi Il IO laf il is l aih GINU Al Lit NHL NAN hi I ala i ti We BM ih a Nt cu Ni th Wel an f i hie ih a Hh alli dr il WN Ai sil vil gilda AMM aad Hela I EETEESETEELET Aia ta cacte late Ti Het eta ATTASCACGCG IATC Figura 4 15 RawData ed Analyzed Data di una sequenza SI La presenza di contaminanti nella reazione di sequenziamento causa l effetto visibile nel primo riquadro e interessante i primi picchi acquisiti Nell Analyzed Data
42. are l ampiezza di y t argomento trattato nel paragrafo 4 3 del Cap 4 La funzione Matlab che realizza questa analisi si chiama ampiezza segnale e determina se il segnale basso SB se alto SA o se fuori scala FS Quando l analisi d esito negativo ed il segnale quindi non rientra in nessuna delle tre classi l algoritmo ne riconosce un ampiezza regolare Per valutare solo i picchi del sequenziamento e quindi escludere il rumore di fondo e t l intero RD viene sottoposto ad un processo di sogliatura realizzato dalla funzione sogliatura Per la maggior parte dei segnali e t resta contenuto all interno di una banda di valori 50 50 nella scala delle ordinate prima dell istante t paragrafo 5 1 La scelta stata quella di scegliere una soglia costante soglia rumore pari a 75 e di considerare solo i dati che superano tale valore e di porre uguali a zero quelli che non lo superano Il passo successivo consiste nel ricercare i punti pi alti del RD come rappresentato dai pallini in blu della figura 5 10 per la sequenza s_Sf abl Il segnale y t viene visitato attraverso finestre di 200 campioni dentro ognuna delle quali viene trovato il picco pi alto per ogni RD RD RDc RDo attraverso una strategia di peak detection Il picco finale quello in blu viene scelto tra i quattro picchi trovati in ogni finestra e corrisponde al picco pi alto fra i quattro File Edt view Insert Tools Window Help Oe HS A72 7 9 9
43. averso filtraggio non adatta invece per l analisi della sua ampiezza Gli errori di tipo FP Tabelle 6 12 6 13 sono dovuti nella maggior parte dei casi al mancato riconoscimento del picco di PCR Cap 4 paragrafo 4 1 che rappresenta la fine del segnale y t di sequenziamento Quando il picco della A non viene riconosciuto i picchi di e t vengono attribuiti al segnale per cui assumendo valori bassi la sequenza viene classificata come M figura 6 8 Gli errori di tipo FN invece interessano per lo pi segnali in cui non viene 98 6 Risultati riconosciuta una variazione significativa dell andamento figura 6 9 andamento dato grezzo segnale calante T come il caso mostrato in scala intensit luminosa 2000 L o AAA WU NA VN T 1 DG DG OG 06 picchi massimi H L 10000 assex DG 1 6000 1 I 12000 14000 16000 18000 Figura 6 8 plot fornito dalla funzione segnale calante per la sequenza 577 09 146 Fabl Il picco finale della PCR non viene riconosciuto e il segnale viene classificato come M falso positivo 1000 andamento dato grezzo segnale calante 500 0 scala intensit luminosa 500 picchi massimi i 0 2000 4000 I I 6000 10000 assex DG L 12000 14000 l 16000 18000 Figura 6 9 plot fornito dalla funzione segnale calante per la sequenza NEOR2 ab1
44. avr un patrimonio genetico identico alla cellula di partenza 1 3 L informazione contenuta nel DNA Il DNA una molecola informazionale L informazione contenuta nella macromolecola codificata nella sequenza delle basi che ne costituiscono i filamenti Tale informazione poi usata dal RNA per specificare la sequenza aminoacida che definisce la struttura primaria di una proteina 15 1 La biologia del DNA Le conoscenze relative alla struttura e ai meccanismi di replicazione del DNA hanno permesso lo sviluppo di tecniche capaci di fornire copie multiple di sequenze di DNA e di determinare la sequenza nucleotidica di molecole di DNA la tecnica del sequenziamento 16 Capitolo 2 Il sequenziamento 2 1 Il sequenziamento Sanger Il sequenziamento il metodo fondamentale per caratterizzare una macromolecola sia che si tratti di determinare l ordine degli aminoacidi di una proteina o la sequenza di basi di un acido nucleico Per capire l importanza di questa tecnica e la conseguente informazione che fornisce basti pensare che il sequenziamento di un intero genoma pu permettere di predire la sequenza di tutte le proteine che potenzialmente questo pu produrre Il metodo di sequenziamento del DNA con dideossinucleoterminatori 0 metodo di Sanger consiste di 3 fasi la preparazione del campione la reazione di sequenziamento l elettroforesi 2 1 1 La preparazione del campione Nella prima fase di preparazio
45. b1 che a partire dalla 219 esima base presenta picchi multipli Il software ignora le basi commettendo un Falso Negativo perch non viene classificata come DD D 103 6 Risultati FinchTV SABCASTELITSAR ab1 Ele Edit View Finch Help gt 830 Wale SrH ced Goto Base No eB HHHH IILI Ww J L 1 I H HHHH PLL PELE l I H TAacAC ce T To PAG TTTAARGTTTTCETT SCOCGAATTOS ececece TTESTITCITGAGGECIGAROC TeacecocTtT 160 ladda hu TCATTTOC TECAACACSACAASGAACGGGTCAAATSCAC 86008 A Selected Base G 219 Q13 Figura 6 16 Analyzed Data della sequenza SABCASTELITSIR abl DD D Quando l algoritmo riconosce una sequenza DD riesce approssimativamente a dare una posizione della base in cui si sdoppiano i picchi Cap 5 paragrafo 5 4 e nel caso in cui questo si trovasse lontano della zona poli A T C G l omopolimero non viene individuato FN di 46 67 Tabella 6 25 Inoltre una parte dei FN per i poli A T C G viene compiuta qualora non venisse riconosciuta una sequenza DD in quanto solo questo riconoscimento implica la ricerca dell omopolimero Cap 5 paragrafo 5 4 La specificit e il valore predittivo positivo per questa problematica assumono valore massimo avvero pari ad 1 figura 6 19 Questo dovuto al fatto che l algoritmo stato testato solo per il riconoscimento di questa problematica Specificit e valore predittivo positivo non sono q
46. cazione del DNA La replicazione del DNA ha lo scopo di trasmettere l informazione e quindi il suo patrimonio genetico ad una cellula figlia quando la cellula si riproduce La replicazione si svolge in due tappe la doppia elica viene svolta denaturata ad opera dell enzima DNA elicasi nuovi nucleotidi vengono aggiunti mediante legami fosfodiesterico ad ogni nuovo filamento in via di accrescimento in base ad una sequenza determinata dall appaiamento complementare con le basi presenti sul filamento stampo processo catalizzato dall enzima DNA polimerasi Le DNA polimerasi possono allungare un filamento polinucleotidico legando in modo covalente nuovi nucleotidi ad un filamento preesistente ma non sono in grado di iniziare un filamento dal nulla Per catalizzare la replicazione l enzima necessita di un innesco definito primer Il primer corrisponde ad una breve sequenza di RNA a singolo filamento Successivamente la DNA polimerasi aggiunge nucleotidi in corrispondenza dell estremit 3 del primer fino a quando non completata la replicazione di quella sezione di DNA Un osservazione fondamentale che i nucleotidi sono aggiunti in corrispondenza dell estremit 3 del filamento in accrescimento ovvero l estremit in cui il filamento di DNA possiede un gruppo ossidrilico OH libero legato al carbonio 3 del desossiribosio terminale In questo modo il DNA si replica esattamente uguale a se stesso e la nuova cellula
47. costituiscono picchi di y t Nel caso in cui l andamento avesse raggiunto valori inferiori a 350 parametro dell algoritmo la sequenza sarebbe stata riconosciuta come M La figura 5 14 mostra il plot di output della funzione segnale calante descritta 5 3 Segnale inarcato La funzione Matlab segnale inarcato stata realizzata per riconoscere nel RD l innalzamento della linea di base del segnale Cap 3 paragrafo 3 2 3 Come linea di base viene intesa quel livello medio di valori registrati prima dell acquisizione dei picchi di sequenziamento Questa funzione riceve come argomento di input una variabile fornita dalla funzione presenza segnale paragrafo 5 1 chiamata bandalmax utilizzata per rappresentare la linea di base del segnale L algoritmo proposto confronta la larghezza di banda contenuta tra le due linee rosse mostrate in figura 5 15 chiamata banda segnale e la larghezza tra la linea rossa inferiore e la linea di base del segnale inizializzata come banda segnale lineaBase nella funzione e che qua verr indicata come A Il livello di ciascuna linea viene calcolato attraverso il seguente procedimento a partire dall istante di inizio di y t t paragrafo 5 1 vengono 80 5 Troubleshooting algoritmi e soluzioni proposte calcolati in ogni finestra mobile di 50 campioni che scandisce il segnale il picco e il nadir del RD fino a 4000 campioni rappresentati nel plot con i pallini neri La media dei picchi d il va
48. di base azotata un colore per ogni base Normalmente il sistema del sequenziatore interpreta automaticamente l elettroferogramma e quando l interpretazione non ovvia il sistema inserisce o una N al posto della lettera A T C G che identifica la base azotata mancante questa quando possibile pu essere corretta manualmente dopo aver analizzato visivamente l elettroferogramma oppure inserisce comunque una lettera associata ad un quality score un punteggio legato alla probabilit di errore nella determinazione dell identit della base Il troubleshooting la procedura di controllo di qualit dell elettroferogramma necessaria per l identificazione l analisi e la risoluzione di problemi inerenti alla preparazione del campione di DNA e o alle reazioni che stanno alla base del sequenziamento e o a malfunzionamenti legati alla strumentazione La lettura dell elettroferogramma un passo necessario per valutare la correttezza del sequenziamento ma anche un lavoro che richiede importanti risorse umane personale esperto per una giusta interpretazione dei risultati economiche nonch dispendio di tempo Lo scopo della tesi quello di automatizzare questo processo attraverso la realizzazione di un algoritmo che sia un supporto d analisi efficiente e veloce per il personale dell azienda addetto all analisi visiva dell elettroferogramma Il Capitolo 1 della tesi presenta una panoramica sulla biologia del DNA 10 Introduzion
49. e in cui vengono descritti i suoi costituenti principali i nucleotidi e come sono organizzati struttura composizione e disposizione lungo la doppia elica Viene spiegato il processo di replicazione del DNA e l importanza funzionale che questa macromolecola assume nelle cellule degli organismi viventi in cui contenuta Nel Capitolo 2 vengono illustrate le varie tecniche di sequenziamento del DNA in particolar modo viene descritto nel dettaglio il metodo Sanger con le varie tecniche di preparazione del campione biologico oggetto di studio Sono riportate anche le tecniche di sequenziamento di nuova generazione che si basano sul principio del pirosequenziamento Come accennato precedentemente nel sequenziamento automatico si possono presentare dei problemi che possono originare degli errori nella determinazione della sequenza Scoprire dall analisi dell elettroferogramma Capitolo 3 la causa degli errori permette di risalire all origine del problema risolverlo se possibile e di ottenere quindi un risultato migliore La manifestazione di questi errori nell elettroferogramma e le loro cause sono argomenti trattati nel Capitolo 4 mentre nel Capitolo 5 della tesi descritto l algoritmo proposto per l analisi ed il riconoscimento automatico degli errori direttamente sull elettroferogramma L algoritmo realizzato in Matlab organizzato in vari step sequenziali in alcune fasi dell analisi e paralleli in altre Verte in un analisi del s
50. e FD con una probabilit di assegnazione corretta di circa 89 L algoritmo classifica 312 sequenze come FD e 104 sequenze come D e rispettivamente il 102 6 Risultati 90 06 ed il 93 27 sono correttamente classificate figura 6 18 L algoritmo offre prestazioni meno buone per le classificazioni DD e TD Di 178 sequenze classificate DD il 74 72 sono correttamente classificate e di 155 sequenze classificate TD solo il 56 13 sono correttamente classificate figura 6 18 La sensitivit cala al 76 figura 6 19 sia per TD che per DD Per ottenere risultati migliori una possibile soluzione potrebbe esser quella di considerare blocchi con meno basi ad esempio 50 e non di 100 per individuare i picchi multipli lungo la sequenza e per evitare di approssimare in un unico risultato la natura di 100 basi Cap 5 paragrafo 5 4 Questa approssimazione tra l altro la fonte di errori per il mancato riconoscimento di sequenze DD Quando sono solo le ultime 50 20 basi a presentare picchi multipli l uso della mediana fa si che queste vengono ignorate per cui nel risultato finale che riporta la natura di tutte le 100 basi se non di pi non compaiono Inoltre quando non viene riconosciuto il picco della PCR e i picchi multipli interessano solo le ultime 250 basi il software ignora queste basi Cap 5 paragrafo 5 4 punto 3 2 e l algoritmo compie un FN il caso riportato in figura 6 16 relativo alla sequenza SABCASTELITSIR a
51. e certifica la presenza del marcatore 68 5 Troubleshooting algoritmi e soluzioni proposte L algoritmo riconosce il cambiamento significativo quando la varianza della finestra corrente 8 volte pi grande della varianza di quella precedente e successiva La funzione fornisce in output le variabili e out pari a 1 quando viene riconosciuto il marcatore pari a 0 nel caso contrario e ampiezza che rappresenta l ampiezza del marcatore e inizio marc e fine marc rappresentano gli estremi della finestra contenente il marcatore Fie ER User eet Toor Wedo Hep NEAS AA REA 25 J i nili a INI I kd NI Il i i Figura 5 7 RDg con il picco del marcatore La seconda funzione presenza segnale stata realizzata per riconoscere la successione dei picchi di sequenziamento y t nel RD In un sequenziamento corretto il RD rappresentato da un segnale i cui primi 1800 2000 campioni contengono solo rumore di fondo e t a parte il marcatore per RDc Successivamente il segnale cresce e si osserva la registrazione simultanea dei segnali di sequenziamento i picchi per ogni base azotata Cap 2 paragrafo 2 1 3 L algoritmo analizza solo i primi 4000 campioni del RD Utilizzando come in presenza_marcatore una finestra mobile ma stavolta composta da 69 5 Troubleshooting algoritmi e soluzioni proposte 100 campioni cerca il punto di massimo e minimo di tutti e quattro i RDg RD RD
52. e dei picchi di sequenziamento reali Questo ulteriore controllo scaturisce dall esigenza di riconoscere un segnale di sequenziamento che sia corretto e che non rappresenti un segnale che in effetti non il risultato di una corretta reazione Il RD viene suddiviso in due regioni la prima che precede l istante t e che contiene solo rumore di fondo e t la seconda successiva all istante che contiene anche il segnale di sequenziamento y t Il criterio quello di valutare l intensit del segnale nella seconda regione e l algoritmo lo fa confrontando le due bande A contenute dalle linee continue nere mostrate in figura 5 9 Gli estremi di ciascuna banda y e yz non visibili in figura perch molto vicini per la prima Aj e y e y per la seconda A gt vengono trovati attraverso il calcolo della media dei punti di massimo e di minimo trovati precedentemente e rispettivamente nelle due regioni In particolare y e y2 vengono calcolati considerando solo i primi 5 punti di massimo e minimo in quanto il segnale in prossimit di t non pi stazionario Se A 3 volte pi ampia di Aj allora viene riconosciuto il segnale di sequenziamento ed il risultato viene fornito in output dalla funzione la variabile esito uguale ad 1 qualora y t viene riconosciuto viceversa uguale a 0 La funzione presenza segnale fornisce in output anche la variabile bandalmax ovvero il livello superiore di A quello indicato come y Questo valore c
53. e in questo caso ad un errata costruzione delle bande A e Az la presenza di spikes sporadici DP DG BL Capitolo 4 paragrafo 4 6 rende difficoltosa la procedura di riconoscimento del segnale y t Figure No 2 File Edit View Insert Tools Window Help DSHS RAAS API variabilita del RawData PER LA VERIFICA DELLA PRESENZA DEL SEGNALE T T T T T T intensit asse x raw data Figura 6 2 sequenza riconosciuta dall algoritmo come SB In realt si tratta di una sequenza NR che contiene picchi anomali L algoritmo compie un Falso Negativo 93 6 Risultati risultato VERO FALSO TOTALE realt VERO VP 52 FN 5 57 FALSO FP 7 VN 1136 1143 Tabella 6 2 Numero di VP VN FP FN per le sequenze NS risultato VERO FALSO realt VERO VP 91 23 FN 8 77 FALSO FP 0 61 VN 99 39 Tabella 6 3 VP VN FP FN in percentuale per le sequenze NS risultato VERO FALSO TOTALE realt VERO VP 96 FN 10 106 FALSO FP 19 VN 1075 1094 Tabella 6 4 Numero di VP VN FP FN per le sequenze NR risultato VERO FALSO realta VERO VP 90 57 FN 9 43 FALSO FP 1 74 VN 98 26 Tabella 6 5 VP VN FP FN in percentuale per le sequenze NR 11 099 1 1 0 99 cs l 10 91 0 9 0 9 0 9 0 8 0 8 0 7 0 7 0 6 0 6 0 5 E Pc 0 5 H Se 0 4 MPPV 04 Sp 0 3 0 3 0 2 0 2 0 1 0 1 0 0 NS NR NS NR Figura 6 3 gra
54. e non possibile riconoscere il picco principale 3 2 il vettore Doppio contiene l elemento 1 dopo la prima posizione la sequenza viene classificata nella classe DD perch l algoritmo riconosce picchi multipli solo a partire da un punto intermedio della sequenza Nel caso in cui il filamento di DNA sia stato preparato attraverso la tecnica di DNA ricombinante Cap 2 paragrafo 2 1 1 e se i picchi doppi interessano solo le ultime 250 basi queste vengono ignorate dall algoritmo in quanto i picchi multipli riconosciuti potrebbero esser dovuti alla bassa risoluzione del segnale Una sequenza DD pu nascere dalla presenza di un omopolimero nella regione che precede il doppiaggio paragrafo 4 5 del Cap 4 Vengono prese in considerazioni le 30 basi precedenti e seguenti il punto intermedio Viene analizzata la stringa di caratteri rappresentante le basi e se viene individuata una ripetizione continua di una singola 87 5 Troubleshooting algoritmi e soluzioni proposte base azotata l algoritmo riconosce la presenza di un omopolimero e classifica la sequenza nella classe PA se l omopolimero l adenina PC se l omopolimero la citosina PG se l omopolimero la guanina PT se l omopolimero la timina Se la sequenza costituita da meno di 200 basi invece di compiere l analisi appena vista sul vettore Doppio viene fatta direttamente sul vettore presenza10 output della funzione presenza picchiDoppi In figura 5 2
55. e presenti in essa E in particolare su 1200 sequenze problematiche 716 il numero di sequenze correttamente classificate 59 67 L algoritmo stato testato anche su 150 sequenze che invece non presentano nessuna problematica Solo 5 di queste vengono classificate erroneamente in quanto viene loro attribuita almeno una classe di problematiche tre di queste sequenze vengono classificate come DD un altra M e un altra ancora come DD ed M 6 1 No signal e No reaction L algoritmo offre buone prestazioni per la ricerca di queste problematiche La probabilit di assegnazione corretta molto alta raggiungendo quasi il 98 delle assegnazioni corrette per il riconoscimento di sequenze con mancata reazione NR e addirittura il 99 delle assegnazioni corrette per il riconoscimento di sequenze con assenza di segnale NS L analisi automatica riesce quasi sempre a distinguere nel RD il rumore di fondo e t dall acquisizione dei picchi di sequenziamento y t Cap 5 paragrafo 5 1 Dal valore predittivo positivo si evince che delle 115 sequenze classificate come NR dall algoritmo l 83 di queste sono correttamente classificate Invece per le 59 sequenze classificate come NS l 88 di queste sono classificate correttamente Come stato detto precedentemente la probabilit di assegnazione corretta non in grado di dare una giusta discriminazione per quantizzare l entit dell errore commesso e per le sequenze NS si osserva che anche se pr
56. e sequenze come SI aumentando i FP Sono comunque buone le percentuali trovate sia per la probabilit di assegnazione corretta che per il valore predittivo positivo entrambe del 90 figura 6 12 Minore invece la sensitivit dell algoritmo pari al 75 figura 6 13 risultato VERO FALSO TOTALE realt VERO VP 273 FN 88 381 FALSO FP 28 VN 811 839 Tabella 6 14 Numero di VP VN FP FN per le sequenze SI 100 6 Risultati risultato VERO FALSO realt VERO VP 75 62 FN 24 38 FALSO FP 3 33 VN 96 67 Tabella 6 15 VP VN FP FN in percentuale per le sequenze SI 1 1 0 96 0 9 0 9 0 8 0 8 0 75 0 7 0 7 0 6 0 6 0 5 E Pc 0 5 E Se 0 4 ERN da Sp 0 3 0 3 0 2 0 2 0 1 0 1 0 0 SI SI Figura 6 12 grafico che rappresenta la Figura 6 13 grafico che rappresenta la probabilit di assegnazione corretta in blu e sensibilit in azzurro e la specificit in il valore predittivo positivo in rosso per grigio per sequenze SI sequenze SI 6 4 Picchi multipli nell Analyzed Data Per quanto riguarda l analisi dell AD ed in particolare il riconoscimento dei picchi multipli l algoritmo ha nel complesso buone prestazioni Ci sono casi in cui per un picco viene riconosciuto singolo e non multiplo ed per questo che vengono compiuti i FN per le sequenze FD Tabelle 6 22 e 6 23 e la sensibilit scende al 73 figura 6 19 In questo casi l algo
57. egnale di sequenziamento fornito dal sequenziatore Applied Biosystems 3730xl con lo scopo di compiere una decisione e di attribuire al segnale le classi che ne rappresentano i problemi che generano errori nella determinazione della sequenza L algoritmo elabora i dati forniti dal sequenziatore per approssimare l andamento del segnale il suo inviluppo valutare la sua intensit e per analizzare la forma e la regolarit del singolo picco dell elettroferogramma Per far ci ci si avvale di strategie di peak detection strategie di sogliatura per la valutazione del superamento di un certo valore limite e di tecniche per l approssimazione di dati L algoritmo stato realizzato grazie ad un training set composto da 167 sequenze di cui erano note le problematiche Utilizzando un altro set di dati di 1200 11 Introduzione sequenze con problematiche note stata valutata la performance dell algoritmo ovvero quante classificazioni corrette vengono da esso compiute per ogni problematica risultati riportati nel Capitolo 6 La valutazione della performance stata fatta ricavando i Veri Positivi Veri Negativi Falsi Positivi Falsi Negativi per ogni classificazione del troubleshooting automatico Una ulteriore verifica stata fatta valutando come funziona l algoritmo di fronte ad un sequenziamento andato a buon fine test con 150 sequenze che non presentano problematiche In fine il Capitolo 7 espone le conclusioni che si possono trarre da
58. enza di RNA causa gli stessi effetti in 39 4 Controllo di qualit del segnale quanto entra in competizione con la corsa dei frammenti di DNA durante l aspirazione Lo stesso fenomeno si manifesta nel caso di campioni di DNA che hanno un alta concentrazione di nucleotidi contenenti G o T In questi casi il DNA difficile da sequenziare usando le condizioni standard di reazione Questo probabilmente dovuto alle alte temperature di denaturazione necessarie per consentire lo svolgimento della doppia elica di DNA durante la reazione di sequenziamento Cap 2 paragrafo 2 1 2 Per questi campioni utilizzando temperature di denaturazione inferiori ai 95 C possono verificarsi due casi possibile che il DNA venga denaturato ma non completamente oppure che il DNA mantenga la struttura completa a doppia elica Nel primo caso il primer riesce ad agganciarsi al filamento campione la DNA polimerasi sintetizza i nuovi nucleotidi ma non riesce a proseguire nel momento in cui incontra il filamento non svolto Nel secondo caso invece il primer non riesce completamente ad agganciarsi la fase di primer annealing fallisce e la DNA polimerasi non pu sintetizzare un nuovo filamento marcato fallimento della fase di copia del filamento e di terminazione Per entrambi i casi alla fine della reazione si hanno pochi frammenti marcati e il segnale rilevato dallo strumento debole Queste situazioni influiscono sull ampiezza e anche sull andamento
59. eressante che quasi tutto il genoma circa il 99 9 identico in tutti gli individui di una specie Nonostante questa apparente omogeneit esistono comunque molte differenze tra gli individui I ricercatori hanno mappato oltre 2 milioni di polimorfismi di singoli nucleotidi SNPs ossia di basi che differiscono almeno nell 1 delle persone Per conseguire tutte queste importanti scoperte la genomica si avvalsa delle diverse tecniche di sequenziamento del DNA Il termine sequenziamento in biologia molecolare indica il processo per la determinazione dell esatta struttura primaria di un biopolimero e cio dell ordine delle basi nel caso di un acido Introduzione nucleico o degli amminoacidi nel caso di proteine La metodica per il sequenziamento di DNA principalmente utilizzata finora si basa sul metodo della terminazione della catena sviluppato da Frederick Sanger Questa tecnica si basa sull utilizzo di nucleotidi modificati dideossitrifosfato ddNTPs per interrompere la reazione di sintesi in posizioni specifiche lungo la sequenza Il sequenziamento tramite il cosiddetto metodo Sanger risulta oggigiorno nella capacit di sequenziare frammenti fino a 1000 basi e l automazione ha reso possibile la corsa di 384 reazioni contemporaneamente Il risultato del sequenziamento rappresentato nell e ettroferogramma che mostra una successione di picchi che corrisponde alla sequenza dei nucleotidi il colore del picco corrisponde al tipo
60. esenza di una sequenza dominante ed il caso delle sequenze riconosciute come FD Nelle figure 4 18 e 4 19 sono riportati due casi di picchi multipli per entrambi i casi i picchi multipli interessano l intero RawData ma mentre la prima figura mostra una sequenza D in quanto i picchi hanno uguale intensit la seconda figura riporta una sequenza FD con picchi di intensit differente 46 4 Controllo di qualit del segnale FinchTV 6 si D C9 3_FW ab1 File Edit View Finch Help 2200 we ala aja ar Go to Base No Find Sequence N d A IY Ny IRA IA MAM i Mu MEASLY pat oe Figura 4 18 picchi doppi di uguale intensit lungo l intero Analyzed Data La sequenza D FinchTV 6 no FD 8624 ab1 Ele Edt yew Finch Help 3 2290 wl GEAEOE sE Goto Base No Find Sequence LEEEETITETEET EERTE ETETEN HEHE Hatt HEHEHHE TOGTCATAGCTOTTICCIO TOTGAAATTOTTATCCOC TCACAATTCCACACAACATAC GAG nto bash HHH Hds phe PPATATIN DE 1124031144441 GA eTeccage Tec CTAACTCACATTAAT AACE T STC OC CARCOCGCOGOGAGAGOCOGT 2 270 Ta 290 H h trth rT Hah HH mm H HILL n BHH TT b 1 mm In ieinter NMa r aii I LI H Hu Hate CT CAC TCAAAGGC GGT AATACGGT 400 410 TTCCATAG Pirta TTT 44 Wait H ST HEEL om LL n HEr mm HH Pleated So Seo ACAGAATCAGGGGATAA 430 Horizontal Scale Figura 4 19 picchi doppi di diversa intensit lungo l intero Analyzed Data La sequenza
61. eta i dati di fluorescenza mostrandoli in un elettroferogramma che riporta lo spettro di emissione dei vari fluorescenti in 27 3 I dati funzione del tempo Dato che vengono identificati prima i nucleotidi terminali dei segmenti pi corti l elettroferogramma rappresenta proprio la sequenza ordinata dei nucleotidi letti detta read Durante questa procedura chiamata basecalling viene anche assegnato un punteggio ad ogni base identificata Questi punteggi detti quality score vengono determinati grazie ad un algoritmo simile a Phred e sono legati alla probabilit di errore nella determinazione dell identit delle basi a partire dal tracciato elettroforetico Generalmente durante la fase di risospensione del campione di DNA da caricare sul sequenziatore viene inserito anche un primer di controllo detto marcatore contenente la prima molecola marcata con lo stesso fluorescente usato per marcare i ddGTPs L uso del marcatore lungo circa 20 basi utile per capire se un possibile fallimento del sequenziamento stato causato da una mancata corsa nei capillari o perch la reazione di sequenziamento non stata eseguita 3 1 1 Raw Data ed Analyzed Data il file ABIF L Applied Biosystems 3730xl salva i dati in un file binario con un formato definito ABIF Applied Biosystems Inc Format Questo file contiene il Raw Data l Analyzed Data e altre informazioni relative al sequenziamento Il Raw Data la sequenza di dati grezzi
62. fico che rappresenta la Figura 6 4 grafico che rappresenta la probabilit di assegnazione corretta in blu sensitivit in azzurro e la specificit in e il valore predittivo positivo in rosso per grigio per sequenze NS e NR sequenze NS e NR 94 6 Risultati 6 2 Problematiche legate all ampiezza e all andamento del Raw Data 6 2 1 Problematiche legate all ampiezza del Raw Data La funzione ampiezza segnale Cap 5 paragrafo 5 2 1 stata realizzata per riconoscere segnali alti SA fuori scala FS e bassi SB Nelle tabelle 6 6 6 11 possibile osservare i risultati della riuscita dell algoritmo per quest analisi La probabilit di assegnazione corretta Pc di 96 25 per SA 99 per FS 95 92 per SB figura 6 6 L algoritmo offre ottime prestazioni per il riconoscimento di sequenze FS mentre per sequenze SA probabilit di assegnazione corretta cala al 96 25 Ci pu dipendere dalla percentuale 20 parametro memorizzato nel file di configurazione della serie dei punti di inviluppo presi in considerazione nella fase di sogliatura Cap 5 paragrafo 5 2 1 figura 5 10 La maggior parte degli errori dovuta ad un alto numero di FN circa 9 rispetto 1 1 9 del FP perch non il 20 della serie dei punti di inviluppo ma meno superano la soglia considerata Si osserva dal primo riquadro di figura 6 5 come il segnale RD per la sequenza B4 71 ab1 supera la soglia costante pari a 5000 ma la
63. grafi successivi verranno descritti i diversi problemi che interessano i segnali di sequenziamento con le relative cause Alcuni problemi hanno una gravit differente rispetto ad altri ed assumono una certa priorit durante l analisi Il flow chart di figura 4 3 rappresenta le diverse classificazioni del troubleshooting per segnali di sequenziamento Sanger di DNA attraverso il sequenziatore 3730 xl Il troubleshooting Cap 2 paragrafo 2 3 consiste nell assegnare ad ogni sequenza una o pi classi che identificano la problematica o le problematiche che la caratterizzano Il primo step fondamentale quello di valutare la presenza del segnale di sequenziamento nei dati raccolti durante il passaggio dei frammenti marcati dalla CCD camera del sequenziatore Cap 3 par 3 1 Quest analisi riguarda esclusivamente il Raw Data l assenza di segnale pu esser dovuta all insuccesso della corsa elettroforetica Cap 2 paragrafo 2 1 3 o ad un fallimento della reazione di sequenziamento Cap 2 paragrafo 2 1 2 In questi casi l esito del sequenziamento viene classificato come no signal NS o no reaction NR classificazioni che verranno descritte nel dettaglio nel paragrafo 4 2 di questo capitolo Altre problematiche sono legate all ampiezza e all andamento del Raw Data paragrafo 4 3 a seconda dei casi il segnale potrebbe esser classificato come segnale basso SB segnale alto SA fuori scala FS segnale che mu
64. he invece dell appaiamento del primer col filamento campione di DNA due primer si agganciano tra loro Quindi la DNA polimerasi sintetizza un filamento che sar la copia complementare del primer e non del campione 5 ACTATAGGGCACGCGTGGT LETTI 3 TGGTGCGCACGGGATATCA Figura 4 24 esempio dell appaiamento di due primer identici 52 4 Controllo di qualit del segnale In figura 4 24 riportato l appaiamento di due primer Alla fine della reazione di sequenziamento si avranno dei frammenti di DNA marcati copia sia del primer che del filamento di DNA da sequenziare I frammenti copia del primer sono tutti di lunghezza molto piccola essendo il primer costituito da circa 20 nucleotidi Ci si manifesta con la registrazione di un segnale intenso durante il passaggio dei frammenti pi corti dalla CCD camera e quindi i primi picchi visibili nel Raw Data hanno un intensit maggiore rispetto l intero segnale La figura 4 25 rappresenta il Raw Data di una sequenziamento in cui sono visibili i picchi dei dimeri di primer Questo tipo di problema viene classificato come DP ed dovuto a fenomeni che coinvolgono la sola reazione di sequenziamento Anche nell Analyzed Data possibile riscontrare la presenza di questi picchi Hinchi1y Raw Data Display bho3r i i sl Videos epico nda cules stent ahane ana clack BACATET 7 TTAGHAATT t l il Pugs UN AAR YEE Cae a Figura 4 25 RawData e Analyzed Data di un
65. i 109 Elence de simbolo 112 RIPA RAIL 114 Bibliosfafig ai Alea ri i al n 115 Sommario Una volta effettuato il sequenziamento Sanger di un campione di DNA necessario valutare la correttezza del sequenziamento analizzando i segnali Raw Data ed Analyzed Data forniti dal sequenziatore per poter risalire ai problemi legati alle tecniche di preparazione del campione o alla procedura di sequenziamento che possono generare errori nella determinazione della sequenza Tali analisi detta in gergo troubleshooting attualmente viene effettuata da biologi esperti in quanto non esistono software che realizzano automaticamente questa analisi In questa tesi stato realizzato un algoritmo che compie l analisi automatica dei segnali e classifica le problematiche in opportune categorie al fine di fornire un supporto efficiente e veloce al troubleshooting Per realizzare l algoritmo stato utilizzato un training set di 167 sequenze con problematiche note L algoritmo implementato in Matlab utilizza tecniche di filtro a media mobile di peak detection e altre metodologie tipiche dell analisi del segnale Per validare l algoritmo sono state utilizzate 1200 sequenze con problematiche note Per ogni problematica stata testata la performance dell algoritmo valutando quante classificazioni corrette vengono da esso compiute I risultati ottenuti sono buoni superando per ogni problematica mediamente il 93 dell assegnazione corretta definita come il rappo
66. i dell AD non viene riconosciuta una sequenza multipla Per far ci l algoritmo scandisce il vettore presenza in blocchi di 10 posizioni Quando su 10 basi pi di tre sono costituite da picchi multipli in quel blocco viene riconosciuta l esistenza di picchi multipli Il risultato viene salvato in un altro vettore chiamato presenzal0 questo contiene 1 se in 10 basi dell AD almeno 3 contengono picchi multipli 0 viceversa La funzione fornisce come output il vettore presenza10 e la variabile intensit TOT Per la sequenza s Sf abl presa come esempio in questo capitolo base location un vettore riga che ha dimensioni 1 328 Per quello che stato detto in questo paragrafo presenza sar anch esso un vettore che avr le stesse dimensioni Ignorando le prime 30 basi la dimensione principale del vettore passer da 328 a 298 Raggruppando le basi in gruppi di 10 presenzal0 invece avr dimensioni 1 29 figura 5 21 Il passo successivo ha la finalit di trovare la ragione dell AD che presenta picchi multipli e ipicchi multipli interessano tutto l asse x dell AD FD D e ipicchi multipli interessano solo la parte iniziale dell AD 7D e ipicchi multipli iniziano da un punto intermedio dell AD DD Se la sequenza costituita da almeno 200 basi l algoritmo funziona come segue il vettore presenza10 viene anch esso raggruppato in blocchi da dieci e per ogni blocco viene calcolata la mediana dei valori che contiene il dat
67. i ottiene la curva dell andamento F t Figure No 1 File Edit View Insert Tools Window Help O HSkAAS PHD andamento dato grezzo segnale calante T T T __ picchi massimi g 3 E z H e 4 E 2 n a 4000 assex DG Figura 5 13 RD della sequenza s_5fabl La linea blu rappresenta la curva dell andamento F t di y t calcolata dall algoritmo per l analisi del decremento del segnale Il passo successivo consiste nel valutare l istogramma dell andamento Il criterio il seguente se la variazione di F t significativa l algoritmo 78 5 Troubleshooting algoritmi e soluzioni proposte riconosce un andamento calante del segnale anzich un andamento costante Inoltre se l ultimo valore della curva basso l algoritmo riconosce una morte M del segnale La variazione significativa e il valore basso vengono affrontati dall algoritmo in modi differenti a seconda di un segnale SB SA FS o di uno che non rientri in nessuna delle tre classi Per quest ultimi la variazione significativa corrisponde ad un A di 1000 valori mentre il valore basso un parametro fissato a 200 Quindi quando F t subisce una variazione di 1000 valori nell asse y e quando decresce raggiungendo il valore 200 l algoritmo classifica il segnale come M Nel caso di segnali SB SA FS i parametri cambiano come mostra la tabella 5 1 La scelta di questi valori stata fatta in base a tes
68. ina M segnale che muore NR no reaction NS no signal Pe Probabilita di assegnazione corretta PCR Polimerase chain reaction PPV Valore predittivo positivo poli Omopolimero A T C G A T C G PR problemi di risoluzione RD Raw Data SA segnale alto SB segnale basso Se sensitivit 112 Simbolo Significato SI segnale inarcato Sp specificit ST segnale con struttura T timina TD tratto doppio VN vero negativo VP vero positivo 113 Ringraziamenti Ringrazio vivamente tutto il personale dell azienda BMR Genomics dai biologi agli informatici per avermi fornito tutti i dati indispensabili per la realizzazione della tesi In particolare ringrazio Barbara e Fabrizio che mi hanno seguito costantemente durante i sei mesi di lavoro e risposto alle mie domande in maniera esaustiva e chiara Inoltre ringrazio sentitamente la prof Barbara Di Camillo che stata sempre disponibile a dirimere i miei dubbi durante la stesura di questo lavoro Ringrazio i professori che con la loro precisione e passione hanno contribuito alla mia formazione professionale tra cui il prof Sparacino Ringrazio tutti i miei colleghi studenti in particolare Francesca e Marco Grazie Padova per avermi accolta ospitata e accompagnata fino a questo traguardo che oggi festegger con te Inoltre desidero ringraziare Anna e Roberto per il supporto e il tifo che mi hanno fatto Infine ho desider
69. io di ringraziare i miei genitori e le mie sorelle per il sostegno e il grande aiuto che mi hanno dato 114 Bibliografia Dale Jeremy W c2008 Dai geni ai genomi applicazioni del DNA ricombinante seconda edizione Napoli EdiSES Ewing B Green P 1998 Base calling of automated sequencer traces using phred II Error Probabilities Genome Research Department of Molecular Biotechnology University of Washington Seattle Washington 98195 7730 USA Vol 8 3 pp 186 194 Sanger F Nicklen S and Coulson A R 1977 DNA sequencing with chain terminating inhibitors Biochemistry Proc Natl Acad Sci USA Vol 74 12 pp 5463 5467 Savada D et al 2009 Biologia la cellula terza edizione Bologna Zanichelli Wu SM Blomberg LA Chan WY 1996 Recovery of unlabeled PCR product from polyacrylamide gel for sequencing Biotechniques Dept of Pediatrics Georgetown University Children s Medical Center Washington DC 20007 2196 USA Vol 21 3 Sep pp 358 362 Automated DNA sequencing Chemistry Guide 1998 Applied Biosystems Capitolo 7 pp 1 38 Applied Biosystems 3730 3730xl DNA Analyzers Sequencing Chemistry guide 2002 cap 1 2 4 Appendix A B The qiagen guide to template Purification and DNA Sequencing 1998 2a edizione QIAGEN 115
70. ione inserendo i quattro ddNTPs marcati mediante l incorporazione di un composto fluorescente diverso per ogni base e l elettroforesi avviene lungo dei capillari all interno dei quali sempre ricostruita la rete di gel o in polimero Durante la corsa elettroforetica i frammenti vengono letti in ordine di lunghezza crescente da un fascio laser che eccita i marcatori fluorescenti Quindi l intensit della luce emessa viene misurata e tale informazione cio quale colore di fluorescenza e dunque il tipo di dANTP presente all estremit di ogni filamento di differente lunghezza viene inviata ad un computer L introduzione dell elettroforesi capillare per la separazione dei frammenti marcati ha consentito un notevole aumento della processivit Sono stati inoltre sviluppati modelli di sequenziatori automatici che sono in grado di eseguire corse elettroforetiche multiple su apparecchi multicapillari 21 2 Il sequenziamento A fragmentation I Il IN IWIN In vivo cloning and amplification O Cycle sequencing 3 GACTAGATACGAGCGTGA 5 template 5 CTGAT 2 primer CTGATC CTGATCT ie CTGATCTA A c CTGATCTAT b SE craarcrate 2 CTGATCTATGC Polymerase CTGATCTATGCT TPs CTGATCTATGCTC Labeled ddNTPs CTGATCTATGCTCG Electrophorsesis 1 read capillary d TI I gt i Figura 2 2 a estrazione del filamento di DNA da sequenziare b prepara
71. la 70 esima e l 80 esima base come per il caso riportato in figura 4 28 o tra la 230 esima e la 350 esima base Ci dovuto al fatto che evidentemente questi agglomerati migrano lungo i capillari in funzione del loro volume e giungono al rilevatore in istanti della corsa determinanti quelle posizioni nell Analyzed Data In questi casi le sequenze vengono assegnate alla classe DG 54 4 Controllo di qualit del segnale Hine Raw Data Display 14 51 DG B91N 0k f la Ni fl ft il mie il Fgh vl nhl lt soli Figura 4 28 RawData ed Analyzed Data di una sequenza di DNA che contiene uno spike anomalo dovuto al rilevamento di agglomerati dei nucleotidi marcati non incorporati DG La presenza di picchi spuri rende difficile l identificazione della base azotata e sia nella figura 4 27 che nel secondo riquadro della figura 4 28 si puo osservare un basso quality score delle basi che contengono le anomalie appena descritte In gran parte dei segnali di sequenziamento possibile osservare che sia i primi picchi contenenti le 30 40 basi del cromatogramma che gli ultimi picchi nell Analyzed Data non hanno una forma ben delineata soprattutto per campioni di DNA amplificati tramite DNA ricombinante questi non somigliano pi ad una curva gaussiana e diventano molto irregolari nell ampiezza e nella forma Quando l irregolarit dei picchi interessa gran parte dell ultima porzione del segnale la sequenza vie
72. la am Goto Base No Find Sequence Vertical se PEHEE HE MRAR ASTA ae Figura 3 2 Analyzed Data associato al Raw Data di figura 3 1 E possibile visualizzare la forma dei picchi relativi ad ogni base azotata del DNA Questa assume un colore differenze come mostrato nella legenda Ad ogni lettera della sequenza associata il quality score rappresentato dalla barra grigia in verticale Pi alta la barra migliore la qualit del risultato Il file ABIF fornisce inoltre altre informazioni relative al sequenziamento la sequenza delle basi nucleotidiche il signal strength associato ad ogni segnale il base spacing ovvero l ampiezza media di ogni singolo picco e le informazioni sulle impostazioni del macchinario come il numero del capillare in cui stata fatta la corsa elettroforetica l identificativo del campione la data e il tempo di inizio e di fine della corsa 29 Capitolo 4 Controllo di qualit del segnale 4 1 Caratteristiche dei dati controllo di qualit e troubleshooting Sia il sequenziamento manuale che quello automatico Cap 2 paragrafo 2 1 3 presentano dei problemi che possono originare errori nella determinazione della sequenza Questi tipi di problemi come gi detto precedentemente Cap 2 paragrafo 2 3 possono essere imputabili allo strumento o alla reazione di sequenziamento Analizzare il Raw Data utile per valutare diverse caratteristiche del processo e o del segnale il rapporto segna
73. la soglia cambi Per i successivi step dell algoritmo nel caso di segnali bassi la soglia da 75 corretta a 50 per segnali alti corretta a 300 per segnali fuori scala corretta a 500 Il motivo di questa correzione verr spiegato nel paragrafo 5 2 2 La figura 5 11 mostra l output della funzione ampiezza segnale per la sequenza s_Sf abl 74 5 Troubleshooting algoritmi e soluzioni proposte Figure No 3 Goo Fie Edt View Insert Tools Window Help DEURA PLD x 10 andamento dato grezzo per verifica ampiezza SAFS 35 T T T T T 3 25 2 15 1 05 CN OO N scala intensit luminosa massima o 25 I f fi i 10000 12000 14000 16000 18000 tempo a6 10 andamento dato grezzo per verifica ampiezza SB T T T T T scala intensit luminosa massima eT EESE fi 1 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 Figura 5 11 plot output della funzione ampiezza segnale per il troubleshooting automatico della sequenza s_5f abl Il primo riquadro mostra il RD e in rosso sono tracciate le due soglie per il confronto dell ampiezza del segnale per il riconoscimento di segnali SA e FS I punti in blu tracciano l inviluppo del segnale Il RD supera nettamente la soglia pari a 5000 e l algoritmo classifica il segnale come SA Il secondo riquadro invece rappresenta il confronto del RD con la soglia per il riconoscimento di segnali SB evidente come il RD sia nettamente
74. lari o legati alla reazione di sequenziamento ad esempio la mancata reazione al templato o al primer Gli effetti invece sono legati alla risoluzione all andamento o alla qualit del segnale 26 Capitolo 3 I dati 3 1 Il sequenziatore Applied Biosystems 3730x1 I dati utilizzati per questo lavoro di tesi sono stati forniti dall azienda padovana BMR Genomics e sono relativi a campioni di DNA sequenziati con il metodo Sanger attraverso la tecnologia del sequenziatore Applied Biosystems 3730xl I capillari per elettroforesi sono realizzati in silice fusa o teflon avente diametro interno nel range di 25 75 um e diametro esterno di 300 400 um rivestito da uno strato protettivo di poliammide che lo rende resistente e maneggevole La lunghezza del capillare 25 75 cm non influisce sull efficienza del processo ma gioca un ruolo importante sul tempo di migrazione e quindi sulla durata dell analisi All interno di ogni capillare presente il polimero POP 7 che costruisce la rete attraverso cui si muovono i frammenti Una volta applicata la differenza di potenziale che varia tra 8 5 KV e 13 2 kV a seconda delle impostazioni del sequenziatore inizia la corsa elettroforetica alla temperatura di 60 C Passando dalla finestra di rilevamento le molecole di fluorescente vengono colpite da un fascio laser ed emettono luce Un rilevatore registra lo spettro delle onde elettromagnetiche e il 3730x1 Data Collection software legge e interpr
75. le prime 30 40 basi non sono caratterizzate da un segnale pulito difficile riconoscere i picchi Per queste basi il quality score assume valori scarsi 4 2 4 Picchi multipli nell Analyzed Data Si parla di picchi multipli quando ci sono due o pi picchi nella stessa posizione dell Analyzed Data Le cause possono essere molteplici e interessano sia i processi caratterizzanti la reazione di sequenziamento sia la composizione e la struttura del campione di DNA d interesse L area evidenziata nel flow chart di figura 4 16 contiene le diverse classificazioni dei picchi multipli descritte nei punti successivi di questo paragrafo 44 4 Controllo di qualit del segnale Figura 4 16 Rappresentazione degli aspetti relativi ai dati di sequenziamento Raw Data Analyzed Data del sequenziatore 3730xl che possono compromettere l identificazione della sequenza suddivise nelle tre tipologie principali Nel riquadro evidenziato sono messe in risalto le classi relative all analisi dei picchi multipli nell Analyzed Data Una scarsa qualit del campione interferisce durante la reazione di sequenziamento come si visto per sequenze SB FS SA o M Ci genera un Analyzed Data che presenta un alto rumore di fondo dovuto all accavallamento di pi segnali nella stessa posizione Quando questo accavallamento di segnali talmente importante da impedire l interpretazione del dato la procedura di assegnazione della base fallisce e il software
76. le alte temperature di fusione richieste per la denaturazione della doppia elica del DNA Campioni di questo tipo devono esser perci trattati con temperature adeguate altrimenti il segnale rilevato dallo strumento risulta debole in ampiezza paragrafo 3 6 1 Problematico anche il sequenziamento di campioni che contengono regioni con lo stesso omopolimero figura 4 22 sequenze classificate come PA nel caso di ripetizione di basi A PT nel caso di ripetizione di basi T PG nel caso di ripetizione di basi G PC nel caso di ripetizione di basi C La DNA polimerasi slitta di posizione durante la reazione di sintesi di nuovi nucleotidi Nell Analyzed Data la sequenza successiva all omopolimero presenta picchi multipli Come nel punto 1 il sequenziamento mostra la 50 4 Controllo di qualit del segnale sovrapposizione di due sequenze identiche una shiftata rispetto l altra Il riconoscimento di picchi multipli o doppi a partire da un punto intermedio alla sequenza viene classificato con il suffisso DD e a seconda dell entit dei picchi di uguale intensit o diversa e con la presenza di un picco dominante viene aggiunta al suffisso DD rispettivamente la voce D o FD FinchTV 7 si PT Lo73 ab1 DER File Edit View Finch Help 2090 we a a a o Sr Go to Base No Find Sequence rici eve t te de de Le EA EEE NNN TNGN NITE G GNA TT NTATG G AACAG TGCTAG GGGCTTTAATCTAACACTCT ei bettilerin TITOITTTTETET
77. le rumore l ampiezza e l andamento del segnale la giusta riuscita della reazione di sequenziamento e della corsa nei capillari o anomalie nel segnale spikes Le figure 3 1 e 3 2 mostrate nel Capitolo 3 rappresentano i segnali di un buon sequenziamento Visualizzando l intero asse dei tempi del Raw Data figura 4 1 possibile osservare che l andamento e l ampiezza del segnale rimangono costanti lungo l asse temporale l ampiezza media ha valori che non superano i 5000 nella scala di intensit luminosa il sequenziamento parte intorno ai 2000 nell asse temporale e non ci sono picchi anomali o spikes 30 4 Controllo di qualit del segnale FinchTV Raw Data Display 17 no BUONA 8387 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 12000 13000 14000 15000 M Mi dil th lu MARNA Mi N N ih Ii Horizontal Scale _ Figura 4 1 intero asse temporale del RawData di figura 3 1 L Analyzed Data Figura 3 2 ha anch esso una buona qualit Ogni picco ha una forma che somiglia ad una curva gaussiana e ogni base assegnata associata ad un solo picco I signals strength Cap 3 paragrafo 3 1 1 rientrano nel range dei valori accettabili deve essere superiore a 100 e il numero di basi sequenziate 1001 L esempio mostrato rappresenta il segnale di sequenziamento di un campione di DNA nella cui fase di preparazione del campione stata utilizzata la tecnica del DNA ricombinante Quando viene utiliz
78. lgoritmi e soluzioni proposte software Il software riporta il risultato dell analisi per ogni singola sequenza in una interfaccia figura 5 4 e in diversi plot viene mostrato come il segnale viene elaborato fornendo all operatore uno strumento in pi per la valutazione del risultato Nel cd allegato alla tesi contenuto il codice dell algoritmo e tre file ABIF che rappresentano tre sequenze esempio dati forniti dall azienda BMR Genomics due caratterizzate da problematiche una invece che non ne contiene 1 segnde di Bequenziamento presente si si mo si Segnde debde 3 presenza del picco A ddla per 4 presenza di piechi ingdi neil Analyzed Data si 6 RawData cda e muore Figura 5 5 flow chart rappresentante gli step dell algoritmo che effettua il troubleshooting automatico PA PT PC PG 5 1 No signal e no reaction Ogni qual volta si debba analizzare l esito di un sequenziamento necessario innanzitutto capire se i frammenti marcati vengano caricati nello strumento Cap 2 paragrafo 2 1 3 Il primo passo da compiere quello di verificare la presenza del marcatore Cap 3 paragrafo 3 1 e la successione dei picchi di sequenziamento nel 66 5 Troubleshooting algoritmi e soluzioni proposte dato grezzo Per quest analisi sono state realizzate due funzioni chiamate presenza marcatore e presenza segnale La prima serve come dice il nome stesso a verificare la p
79. lificazione mentre per il sequenziamento delle basi si serve di una tecnica che utilizza l enzima ligasi al posto della DNA polimerasi La piattaforma Solexa invece amplifica i frammenti servendosi di un altra versione della PCR detta bridge PCR Per la fase di sequenziamento viene usata ancora la DNA polimerasi ma in una procedura diversa che prevede l utilizzo anche di particolari 23 2 Il sequenziamento deossinucleotidi modificati Come anticipato in precedenza queste tecnologie di nuova generazione sono caratterizzate da un livello di accuratezza non confrontabile con quello ottenuto con il metodo di Sanger Inoltre le read ottenute risultano lunghe circa settanta basi quindi molto pi corte anche di quelle fornite in output dal GS FLX Nuovamente gli aspetti positivi sono dati dai costi e dalla quantit di dati in output ad ogni corsa dello strumento vengono sequenziate pi di 3000 Mb ad un costo di circa 2 dollari per Mb costi approssimati che comprendono i soli reagenti La metodologia Sanger tuttora la pi utilizzata perch permette di ottenere read lunghe fino a 1000 basi con un accuratezza nella determinazione delle basi pari al 99 999 Gli aspetti negativi pi gravosi sono rappresentati dalla lentezza di questa tecnologia che permette di sequenziare solamente 1 Mb alla volta e dai costi elevati che superano i 500 dollari per Mb costi approssimati che comprendono i soli reagenti 2 3 Scopo de
80. lla reazione si avr un certo numero di frammenti marcati corti di lunghezza inferiore al numero di basi che precedono la zona di appaiamento secondario inferiore a 14 basi nell esempio illustrato ed un numero ridotto di frammenti lunghi marcati sintetizzati da quei filamenti che non si ripiegano In figura 4 13 la sequenza presenta infatti un andamento regolare per le prime basi fino a circa 5500 campioni dell asse dei tempi successivamente si assiste ad un calo repentino del segnale che assume valori molto ridotti rispetto la precedente porzione del RawData 42 4 Controllo di qualit del segnale UU UU SIU iil SAU SHU SUU SUL IN 1 i y di TRO i by f pl yl ip iah i y 4 CAC TE ia I ity ty ahh sargi f e StU SWU SULU BUUU BIU 22020 BUU BUI bol BRU U BU BUI M i lalla AN WY RIO dei iper va pp ann Figura 4 13 RawData di una sequenza ST Il segnale subisce un calo repentino mostrato nel riquadro in rosso L Analyzed Data si presenta come in figura 4 14 Il filamento contiene una struttura secondaria e la sequenza viene riconosciuta come ST struttura secondaria FinchTV 11 no ST MEDEA 2203yerso3 maxi11 06 09 ab1 Ele Edt View Finch Help gt a Y we A wa Ai cosa Find Sequence HHHH CTTCTATAATATTATGGGGTGGAGG 240 250 260 Figura 4 14 Analyzed Data della sequenza di figura 4 13 In corrispondenza della struttura secondaria i picchi dell elettroferogr
81. lla tesi L Applied Biosystems 3730x1 mostrato in figura 2 3 uno strumento per il sequenziamento del DNA che sfrutta il metodo Sanger ed usa un sistema di elettroforesi capillare ognuno dei quali riempito col polimero POP 7 ed uno di rilevamento delle molecole di fluorescente contenute nei frammenti 24 2 Il sequenziamento Figura 2 3 sequenziatore Applied Biosystems Figura 2 4 piastra da 384 pozzetti 3730x1 per il sequenziamento di DNA con il contenenti la soluzione col DNA da metodo Sanger utilizzato nell azieda BMR sequenziare Genomics di Padova Figura 2 5 capillari per elettroforesi Questo sequenziatore riesce a sequenziare pi di 1000 basi utilizzando piastre con 96 o 384 pozzetti permettendo quindi l analisi di 96 o 384 campioni di DNA figura 2 4 La qualit e la quantit del DNA stampo del primer dei reagenti usati per la reazione di sequenziamento Sanger e la procedura di elettroforesi capillare sono fattori importanti che influiscono sulla qualit del segnale rilevato ed elaborato e quindi sull accuratezza nella determinazione delle basi 25 2 Il sequenziamento
82. lore della soglia superiore chiamata soglia alta mentre quella inferiore soglia bassa uguagliata al valore del nadir pi alto Una sequenza viene riconosciuta come S7 quando A grande in confronto alla banda del segnale L algoritmo compie quest operazione testando se il A moltiplicato per 8 maggiore di banda segnale L esito positivo di questo controllo classifica il segnale come inarcato SI mm Il NU III mT ONTO Y M LIA RTP o pa 3 3 e 2 E 2 pi o de 1 L 1 1000 1500 2000 assex DG Figura 5 15 plot output della funzione segnale _inarcato per il troubleshooting automatico della sequenza s_5fabl La figura rappresenta i primi 4000 campioni del RD Le linee in rosso vengono tracciate dall algoritmo e per questa sequenza la linea di base del segnale inarcata e lo si coglie dalla distanza della linea rossa inferiore rispetto la linea di base vicina allo zero 5 4 Picchi multipli nell Analyzed Data Il riconoscimento di picchi multipli nell AD Cap 3 paragrafo 3 2 4 svolto dalla funzione presenza picchiDoppi A differenza dei casi precedenti in questo step il segnale sottoposto ad analisi l AD e non il RD Questo passo dell algoritmo ha lo scopo di verificare picco per picco del segnale la presenza di picchi multipli lungo la sequenza Come per RD AD la sovrapposizione dei quattro segnali associati ad ogni base 81
83. lte temperature necessarie durante la fase di denaturazione Per ovviare a tal problema viene utilizzata la DNA polimerasi del batterio Thermus Aquaticus che vivendo in acque caldissime dispone di un intero meccanismo termoresistente compresa la DNA polimerasi 2 1 2 La reazione di sequenziamento Durante la fase di reazione di sequenziamento il campione biologico viene sottoposto a quattro processi denaturazione primer annealing copia del filamento terminazione Con la denaturazione i singoli filamenti di DNA cos separati sono posti in provetta Il primer annealing la fase in cui viene aggiunto un primer all estremit 3 di uno dei due filamenti Il primer sintetizzato artificialmente e appositamente per la sequenza di DNA da sequenziare Vengono allestite quattro miscele in quattro provette una per ogni base In ogni provetta viene aggiunta la DNA polimerasi fase della copia del filamento i quattro nucleotidi dATP dCTP dGTP dTTP e una piccola quantit di un dideossinucleoside trifosfato ad esempio ddATP Un dideossinucleoside trifosfato ddNTP un nucleotide che non ha il gruppo OH in posizione 3 dello zucchero HO O Figura 2 1 Rappresentazione di un deossinucleoside trifosfato a sinistra e di un dideossinucleoside trifosfato a destra Il dideossinucleoside trifosfato un nucleotide che non ha il gruppo OH in posizione 3 dello zucchero 19 2 Il sequenziamento Questi comunque pot
84. ne del campione il filamento di DNA che si vuole sequenziare viene copiato artificialmente in modo da ottenere diverse copie identiche dello stesso Sono due le tecniche che permettono questo processo di duplicazione il DNA ricombinante e la PCR dall inglese Polymerase Chain Reaction Il DNA ricombinante una sequenza di DNA ottenuta artificialmente dalla 17 2 Il sequenziamento combinazione di materiale genetico di origini differenti Per ottenerlo ci si serve di sistemi biologici come i plasmidi Quest ultimi sono piccoli filamenti circolari di DNA presenti nel citoplasma batterico e distinguibili dal cromosoma batterico per le loro dimensioni ridotte I batteri usano plasmidi come veicolo per trasportare DNA ad un altro batterio possibile usare la capacit dei plasmidi di integrarsi in un batterio ospite ad esempio Escherichia Coli per integrare un gene o una sequenza di DNA di interesse Perch la sequenza di DNA o il gene di interesse possa essere correttamente trasportato occorre anzitutto che sia tagliato e ridotto nei minimi termini possibili In seguito al taglio il gene potr essere integrato cio inserito all interno del vettore L ultima fase consiste nell inserimento di un plasmide all interno del batterio che viene fatto replicare Dopo la replicazione si ottengono cos molti batteri che contengono lo stesso materiale genetico e i plasmidi con la sequenza di DNA di interesse Attraverso opportune
85. ne riconosciuta come PR problemi di risoluzione 55 4 Controllo di qualit del segnale FinchTV 16 no PR 8930 ok ab1 Bile Edt View Finch Help 2290 PE GERE Goto Base No Find Sequence homas Figura 4 29 Analyzed Data di una sequenza di DNA con problemi di risoluzione PR Viene mostrata di seguito la tabella 4 1 riportata nella guida Applied Biosystems 3730 3730xl Sequencing Chemistry Guide che descrive le diverse problematiche relative al sequenziamento del DNA nella prima colonna vengono riportate le problematiche mentre nella seconda e terza colonna della tabella vengono descritte rispettivamente le possibili cause della problematica e le tecniche per correggere il problema In tabella 4 2 vengono riportati i simboli associati ad ogni problematica 56 4 Controllo di qualit del segnale Possible Cause Recommended Action Poor data resolution Clogged capillary array caused by an excess Replace the array of protein template other sample impurities or dried polymer Degradation of samples in formamide Re prepare the samples Degradation dus to formamide exposed to air Overloading of the sample Dilute the sample and adjust the injection parameter Refer to Optimizing Electrokinetic Injection on page 4 5 Weak signal Quantity of template or primers in the Refer to Template Quantity on page 2 5 for sequencing reaction or the quantity of
86. nza costituita da sole e poche N noice al posto delle lettere A C T G che rappresentano le basi azotate ci potrebbe esser una ulteriore strumento per operare la distinzione tra sequenze SB e NR Di seguito sono riportate le tabelle che contengono il numero dei VP FN FP VN in valore assoluto e in percentuale rispettivamente per SA FS SB Le figura 6 6 riporta in valori percentuali la probabilit di assegnazione corretta e il valore predittivo positivo mentre la figura 6 7 riporta la sensitivit e la sensibilit per le tre problematiche trattate risultato VERO FALSO TOTALE realt VERO VP 279 FN 28 307 FALSO FP 17 VN 876 893 Tabella 6 6 Numero di VP VN FP FN per le sequenze SA risultato VERO FALSO realt VERO VP 90 88 FN 9 12 FALSO FP 1 9 VN 98 1 Tabella 6 7 VP VN FP FN in percentuale per le sequenze SA 96 6 Risultati risultato VERO FALSO TOTALE realt VERO VP 56 FN 11 67 FALSO FP 1 VN 1132 1133 Tabella 6 8 Numero di VP VN FP FN per le sequenze FS risultato VERO FALSO realta VERO VP 83 58 FN 16 42 FALSO FP 0 08 VN 99 92 Tabella 6 9 VP VN FP FN in percentuale per le sequenze FS risultato VERO FALSO TOTALE realta VERO VP 128 FN 36 164 FALSO FP 13 VN 1023 1036 Tabella 6 10 Numero di VP VN FP FN per le sequenze SB risultato VERO FALSO re
87. nze classificate come segnali alti SA illustrato in figura 4 8 e in certi casi cos elevato che supera la scala di intensit massima che lo strumento pu rilevare che nel caso del sequenziatore 3730x1 pari a 32000 Quest ultimo il caso delle sequenze classificate come fuori scala FS figura 4 9 Aid wa 3 38 g Go a Bas Na Find Size dpr bb SOADS TOO GATCEAT beds bE EEE ELEIASEE ELE Da db DIDGATATCOG AGAAGCAATCAACALT ac m ww Figura 4 8 Raw Data ed Analyzed Data di una sequenza alta SA Il Raw Data ha un ampiezza che supera i 5000 valori della scala di intensit luminosa ma non satura Questo causa delle anomalie nell Analyzed Data I singoli picchi non hanno una forma delineata soprattutto nelle prime e ultime basi 38 4 Controllo di qualit del segnale Y FinchIV Raw Data Display 4 si FS 1746 0k 4000 200 3000 4000 Sono 6000 7000 8000 s000 10000 11000 12000 13000 14000 15000 16000 17000 18000 FinchTV 4 si FS 1746 0k ab1 File Edit View Finch Help gt aaa vale a BS l cosa Goto Base No Find Sequence ee TAG CINGGGCGTAATCATGG TCATAGCTGT ITICCTGTGTGAAATT GTTATCCGC TCACAATTCCACACAACATACGAGCCOGAA 90 100 110 120 130 140 150 160 BCA TAAAGT G TAAAGC CTGGGGT GCC TAATGAGT GAGC TAACTCACATTAATTOCOTTOCOCTCACTOCCCOCTTTCCAGTCOOGAA 70 180 190 200 210 220 230 240 250 ACCT CCAGCTGCAT TAATGAAT CG GC CAACGCECEGGGAGAGGCEGTTTECGIATTO GCTICCTCGCTCACTGA 261 2 280 230 300 310 0
88. o In questo caso il sequenziamento mostra la sovrapposizione di due sequenze identiche una shiftata rispetto l altra 2 Pi di un primer presente nella reazione di sequenziamento Ci accade quando durante la fase di cleanup successiva alla PCR non vengono rimossi i primer non utilizzati Se nel template vi un sito di ancoraggio per i primer spuri verranno sintetizzati frammenti marcati costituenti sequenze nucleotidiche differenti 3 c una seconda zona di appaiamento col primer nel template A causa delle motivazioni esposte in questi tre punti possibile che da un certo punto in poi dell Analyzed Data si possano presentare dei picchi multipli nella sequenza i picchi possono avere stessa intensit la sequenza viene classificata come DD D o i picchi possono avere intensit differente con la presenza di una sequenza dominante DD FD 48 4 Controllo di qualit del segnale X FinchTV 8 si DD FD BL71_Vk3_6 ab1 Bile Edit view Finch Help eno waana SF Sal cross Go to Base No Find Sequence ere cd o i no GACT HHHHH HH HHHEHHL H PELLELLLLLL EPH AAAAATOCAGC ATOAGeAGTCOCCCTEGOC teccet 80 a 00 210 220 Figura 4 20 Picchi doppi di uguale intensit a partire dalla 221 base dell Analyzed Data DD D Viceversa possibile riscontrare sequenze che hanno picchi multipli solo nelle prime basi In questi casi la sequenza viene classificata utilizzando il prefisso
89. o calcolato viene memorizzato nel vettore chiamato Doppio Cos ogni elemento di quest ultimo riassume la natura di 100 basi della sequenza La logica sempre la 85 5 Troubleshooting algoritmi e soluzioni proposte stessa se la mediana calcolata pari a 1 le 100 basi sotto analisi sono rappresentate da picchi multipli se la mediana calcolata pari a 0 le 100 basi invece sono rappresentate da una sequenza che nel suo complesso non presenta picchi multipli Quando il risultato dell operazione di mediana uguale a 0 5 questa viene corretta a 1 per tutte le volte che viene calcolata nell algoritmo Una volta calcolato il vettore Doppio lo si sottopone a tre test l se il vettore Doppio costituito da elementi pari solo a 0 nella sequenza non viene riconosciuta la presenza di picchi multipli se il vettore Doppio contiene l elemento 1 in tutte le sue posizioni allora nella sequenza viene riconosciuta la presenza di picchi multipli in tutta la sua lunghezza se il vettore Doppio contiene anche degli elementi pari a 0 vuol dire che la distribuzione dei picchi multipli interessa solo alcune porzioni dell AD L analisi viene suddivisa in altri due sotto problemi 3 1 il vettore Doppio contiene l elemento 1 nella sua prima posizione la sequenza viene classificata nella classe TD perch l algoritmo riconosce picchi multipli solo nelle prime basi In pi per i motivi spiegati nel paragrafo 4 5 del Capitolo
90. o fosfato Le basi sono legate agli zuccheri e sporgono dalla catena polinucleotidica I nucleotidi sono uniti da legami fosfodiestere presenti tra lo zucchero di un nucleotide e il fosfato del successivo diestere si riferisce ai legami covalenti formati dai gruppi OH che reagiscono con i gruppi fosfato acidi I gruppi fosfato uniscono il carbonio in 3 di uno zucchero pentoso al carbonio in 5 dello zucchero adiacente Modello a doppia elica e 4 Nucleotide Gruppo Do we Figura 1 3 disposizione dei Baaai NI De nucleotidi nella doppia elica atti a Gup i del DNA fosfato Figura 1 2 modello a doppia elica del DNA In evidenza i legami a ponte idrogeno tra le basi azotate dei due filamenti complementari e i legami fosfodiestere presenti tra lo zucchero di un nucleotide e il fosfato del successivo del singolo filamento Il DNA a doppio filamento e le due catene polinucleotidiche sono tenute assieme da legami a ponte idrogeno tra le basi azotate I due filamenti di DNA hanno direzione opposte e tale orientamento antiparallelo permette ai due filamenti di adattarsi l uno all altro nello spazio tridimensionale Nel DNA si trovano quattro basi azotate e quindi quattro nucleotidi queste basi e le loro abbreviazioni sono adenina A citosina C guanina G timina T Adenina e timina si appaiono sempre tra loro cos come citosina e guanina 14 1 La biologia del DNA 1 2 La repli
91. obabilit di assegnazione corretta alta il valore predittivo positivo pi basso figura 6 3 La sensitivit del 91 per sequenze NS del 90 per sequenze NR Gli errori pi frequenti compiuti da questo step dell algoritmo e che costituiscono quella percentuale di FP Tabella 6 3 interessano il riconoscimento dell istante t di inizio del segnale di sequenziamento y t paragrafo 5 1 Cap 5 In figura 6 1 mostrato il plot fornito dalla funzione presenza segnale 92 6 Risultati descritta nel paragrafo 5 1 si osserva che l istante t non stato individuato correttamente e ci causa un errata costruzione delle bande A e A Cap 5 paragrafo 5 1 che distinguono il rumore dai picchi di sequenziamento Figure No 2 File Edit View Insert Tools Window Help DEHRA PPA variabilita del RawData PER LA VERIFICA DELLA PRESENZA DEL SEGNALE T T T T T T intensit W A fi L 2500 3000 asse x raw data Figura 6 1 esempio di sequenza riconosciuta NR dall algoritmo In realt il Raw Data in questione presenta i picchi del segnale y t e non NR L algoritmo fallisce FalsiPositivi Viceversa possibile che alcune sequenze NR non vengano riconosciute correttamente e questo il caso dei Falsi Negativi Tabelle 6 2 e 6 3 In figura 6 2 si pu osservare un esempio di sequenza NR che viene riconosciuta dell algoritmo come un segnale basso SB La causa di questo errore attribuito anch
92. ome sar spiegato nel paragrafo 5 4 verr utilizzato come argomento di input della funzione segnale inarcato 71 5 Troubleshooting algoritmi e soluzioni proposte De WS AA PPD marcatore 2500 2000 g 1500 Fie Edt View Insert Tools Window Help DES XAA 7 PPX variabilit del RawData PER LA VERIFICA DELLA PRESENZA DEL SEGNALE T T T T intensit il bhi NN Li Figura 5 9 plot forniti dalle funzione presenza_marcatore e presenza_segnale per la sequenza di figura 5 2 L algoritmo riconosce correttamente la presenza e la posizione del marcatore nel RD e riconosce secondo plot la presenza dei picchi del segnale di sequenziamento Il Nl I NILO LULA Se l algoritmo non trova n il marcatore n il segnale di sequenziamento attribuisce alla sequenza la classe NS RD e t Se invece trova il marcatore ma non il segnale di sequenziamento l algoritmo classifica la sequenza come NR RD m t e t Per entrambi i casi l algoritmo non prosegue con i successivi step in quanto i dati costituirebbero solo disturbo e non segnale utile y t da cui poter leggere la sequenza di basi 5 2 Problematiche legate all ampiezza e all andamento del Raw Data 5 2 1 Problematiche legate all ampiezza del Raw Data Quando l algoritmo riconosce il segnale y t prosegue con il secondo step T2 5 Troubleshooting algoritmi e soluzioni proposte dell analisi che verte nel valut
93. oni mobile di calcolo numerico della derivate per valutare le variazioni del segnale di peak detection Il software ha lo scopo di riconoscere dai dati la presenza del segnale di sequenziamento e una volta riconosciuto il segnale viene sottoposto a diversi controlli che riguardano la sua ampiezza il suo andamento e la sua regolarit L esito del sequenziamento viene classificato come no signal NS o no reaction NR quando non presente il segnale di sequenziamento la differenza sta nella causa che ha provocato l assenza del segnale un NS dipende dal fallimento da parte della strumentazione ad esempio la corsa nei capillari un NR dal fallimento della reazione chimica e quindi la sintesi dei frammenti marcati Altre problematiche sono legate all ampiezza e all andamento del Raw Data a seconda dei casi il segnale potrebbe esser classificato come segnale basso SB segnale alto SA fuori scala FS segnale che muore M segnale con struttura S7 problematica che non stata affrontata in questa tesi La classe segnale inarcato SJ a se stante e viene assegnata quando l esito del sequenziamento fornisce un Raw Data con una deriva della linea di base La presenza di picchi multipli nell Analyzed Data rappresenta una terza tipologia di problematiche che portano a classificare il segnale come doppio D fondo doppio FD diventa doppio DD tratto doppio
94. ono state descritte tutte le problematiche che possono generare errori nella determinazione della sequenza delle basi azotate di un campione di DNA sottoposto a sequenziamento Sanger Il troubleshooting la procedura di analisi dei dati di sequenziamento necessaria per capire se bisogna o meno ripetere il procedimento cambiando eventualmente qualit o quantit del template cio del campione biologico da processare L osservazione dei dati viene compiuta da biologi esperti che analizzano visivamente il risultato e l andamento dei segnali forniti dal sequenziatore L analisi consiste nel riconoscere particolari problematiche nei dati che possono compromettere l identificazione delle basi azotate del campione I segnali Analyzed Data e Raw Data che in seguito verranno chiamati AD e RD rispettivamente Cap 3 paragrafo 3 1 1 devono per ci rispettare delle caratteristiche ben precise Lo scopo di questa tesi stato quello di automatizzare l analisi dei dati in modo di fornire un algoritmo che sia un supporto efficiente e veloce al troubleshooting Nel capitolo 4 stato presentato in figura 4 3 il flow chart con le principali 62 5 Troubleshooting algoritmi e soluzioni proposte classificazioni del troubleshooting Viene riportato lo stesso diagramma in figura 5 1 con in evidenza in verde le analisi realizzate dall algoritmo proposto e descritto in questo Capitolo ws lt lt o gt gt xe MWS ss Es 7 JD
95. ore M segnale con struttura ST La classe segnale inarcato SJ a se stante verr descritta nel paragrafo 4 4 La presenza di picchi multipli nell Analyzed Data paragrafo 4 5 rappresenta una terza tipologia di problematiche che classifica il segnale come doppio D fondo doppio FD diventa doppio DD tratto doppio 7D Una quarta tipologia relativa alla presenza di picchi anomali sporadici lungo l Analyzed Data 32 4 Controllo di qualit del segnale paragrafo 4 6 raggruppa le problematiche dimeri di primer DP blob BL problemi di risoluzione PR e agglomerati non incorporati DG Queste classificazioni non sono presenti in letteratura ma sono state introdotte e adottate dai biologi della BMR Genomics per riconoscere l insieme delle problematiche che caratterizzano un sequenziamento e Jey ue Mt EUGIEIEARO Figura 4 3 Rappresentazione degli aspetti relativi ai dati di sequenziamento Raw Data Analyzed Data del sequenziatore 3730xl che possono compromettere l identificazione della sequenza suddivise nelle tre tipologie principali aspetti legati all ampiezza e all andamento del RawData aspetti legati alla presenza di picchi multipli e anomali nell Analyzed Data Solo la classe SI non rientra in nessun gruppo specifico 4 2 Problematiche 4 2 1 No signal e no reaction 4 2 1 1 No signal Nel caso in cui i frammenti di
96. raccolti durante l emissione dei fluorescenti la combinazione dei segnali di fluorescenza associati ad ogni base azotata Il segnale associato ai nucleotidi contenenti Guanina G di colore nero il segnale associato ai nucleotidi contenenti Timina T di colore rosso per la Citosina C blu per l Adenina A verde come mostrato in figura 3 1 Durante la corsa elettroforetica 1 frammenti vengono letti in ordine di lunghezza crescente per cui l asse x del Raw Data rappresenta la lunghezza del filamento di DNA mentre l asse y rappresenta la scala d intensit luminosa rilevata dalla fluorescenza dei marcatori 28 3 I dati FinchTV Raw Data Display 17 no BUONA 8387 AL 1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500 2600 2700 2800 2900 3000 3100 3200 3300 3400 3500 3600 3700 3800 3900 4000 4100 4200 4300 4400 hit Ki AL LAT AULA Vertical cong Scale 4000 3000 a WN My anil AN ih I NI ML Horizontal Scale 3 Figura 3 1 RawData della sequenza 17 no BUONA B387 ab1 8 8 MTV sl J Il software del sequenziatore il cui algoritmo non noto rielabora il Raw Data e normalizza i dati in ampiezza e nel tempo fornendo l Analyzed Data l elettroferogramma vero e proprio da questo segnale che vengono identificate le basi e dalla qualit del singolo picco viene assegnato il quality score FinchTV 17 no BUONA 8387 ab1 Elle Edit View Finch Help 2290 ua vela
97. ranno esser aggiunti dalla DNA polimerasi a un filamento di DNA in corso di sintesi mediante la formazione di un legame fosfodiesterico tra il suo 5 fosfato e il 3 OH del residuo precedente Tuttavia poich i ddNTPs mancano del gruppo OH in posizione 3 il nucleotide successivo non potr esser legato come avviene nella replicazione naturale del DNA Per questo motivo la sintesi si arresta alla posizione in cui un ddNTP stato incorporato all estremit in accrescimento di un filamento di DNA fase di terminazione A differenza di quanto accade nella PCR questa volta viene copiato solo il filamento specifico per il primer utilizzato in direzione 5 3 La replicazione del DNA procede e nella provetta si viene a trovare una miscela di filamenti stampo del DNA insieme ad una variet di filamenti neosintetizzati pi brevi I filamenti nuovi ognuno dei quali termina con un ddATP per l esempio riportato avranno lunghezze differenti Una volta che la DNA polimerasi incontra una base T sul filamento stampo essa potr aggiungere o un dATP o un ddATP Se viene aggiunto un dATP la crescita del filamento continua mentre se viene aggiunto un ddATP la crescita del filamento si arresta Questo processo viene ripetuto in altre provette rispettivamente per il ddGTP ddTTP ddCTP Dopo aver fatto proseguire per un po la replicazione del DNA i filamenti neosintetizzati vengono denaturati e tramite opportune tecniche di laboratorio separa
98. resenza del marcatore nel RD Nel caso in cui si usasse il marcatore come avviene per la maggior parte delle sequenze analizzate dalla BMR Genomics questo si presenta come una forma d onda caratterizzata dalla successione di due picchi che ricoprono una finestra di circa 150 campioni in corrispondenza dei 1200 1500 valori dell asse temporale e assume valori d ampiezza variabili dai 300 ai 3500 nella scala d intensit luminosa Come gi spiegato questo non altro che un breve filamento di DNA avente il primo nucleotide marcato con lo stesso fluorocromo utilizzato per marcare i nucleotidi che contengono la G per cui assume la stessa colorazione di questa base nera come mostrato in figura 5 6 inchTV Raw Data Display s_5f Vertical Scale T H lt Reset Scales Horizontal Scale Figura 5 6 Picco caratteristico del marcatore Questo occupa una finestra temporale di 150 200 campioni circa nell intervallo 1300 1400 del RawData Il RD di ogni nucleotide costituito da due componenti il rumore di fondo e t e la successione dei picchi di sequenziamento y t RD lt ylt e lt RD it yrtit erlt RD t1 yelt eclt Quello associato al nucleotide G RDc 1 pu contenere anche il marcatore m t 67 5 Troubleshooting algoritmi e soluzioni proposte RD If ypglt eglt mit Il segnale RD t y t e t non altro che la sovrapposizione dei quattro segnali RD t RDr t R
99. rez alesho Denaturerd alcohol has Inconsistent quality Ine concentration of the alcohol and purity of the additives can vary sc the ooneertraticn of alecho rsoommimencied in tae painia ion prococuros Use a pracioltatior method appropriata for your sequencing chemistry 59 4 Controllo di qualit del segnale Ditticuity sequencing Ihe DNA Is meting et a hgher temperature GC rich templates due te the righ proportion of GC base pairs rei Note Even a template that has a tairly 9 average base compcsition overall can have a very GC rich region that effects its ability to be sequenced Secondary structure Self aineaing DNA in the template making it difficult to obtain good sequencing data beyond the region ol sacondary structure Slippage in the Long homopolymerT or A regions region cf the homopolymer DNA Use of dUTP in the deoxyruclestide mixture sequencing Tabella 4 1 troubleshooting del sequenziamento di Ircrease tha denaturation temperature Add UMSU to atinal concentration v v ot 5 Note Adcing mixture of 5 DMSO and 5 qlycercl has also been used successfully for some templates Ircubate the reaction at 95 C for 10 mn bafore cycling Add betains to a fina concentration of 1 M t Double all reaction components and incubate a 98 C for 10 min before cycling Add Sto 1096 formamide or 5 u 1076 gycerol to he reactions Lnearze tre plesmics with a restriction
100. rit del segnale solo fino a otto incorporazioni contemporanee la lettura di sequenze contenenti omopolimeri pi lunghi di otto basi pu portare a risultati non corretti Questa tecnica sviluppata dal Genome Sequencer FLX della 454 Life Sciences Corporation centro di eccellenza della Roche Applied Science ed stato il primo sequenziatore di nuova generazione disponibile sul mercato come prodotto commerciale Le read ottenute con il GS FLX sono lunghe 200 300 basi 400 con la nuova versione Titanium molto meno rispetto a quelle ottenuti con il metodo Sanger e sono inoltre caratterizzate da un accuratezza inferiore Tuttavia dato che il volume dei reagenti pu essere ammortizzato sull intero set di sequenze presenti sull array i costi si riducono molto 60 dollari per Mb costi approssimati che comprendono i soli reagenti Inoltre questa nuova tecnica caratterizzata da un maggiore grado di parallelismo ovvero pu trattare milioni di sequenze diverse contemporaneamente sia in fase di amplificazione che in fase di sequenziamento L enorme mole di dati in output permette di aumentare di molto il coverage del genoma originale Oltre al GS FLX sono state proposte altre tecnologie di sequenziamento high throughput Tra queste quelle che godono di maggiore popolarit sono 1 AB SOLID della Applied Biosystems e il Genome Analizer o Solexa della Illumina La tecnologia AB SOLID utilizza l emPCR per la prima fase di amp
101. ritmo non trova i picchi multipli lungo tutta la sequenza ma solo in porzioni di essa per questo viene classificata a volte come TD oppure come DD In figura 6 14 viene mostrato l output della funzione presenza picchiDoppi Cap 5 paragrafo 5 4 un esempio di sequenza FD contenuta nel file pGem 0000009409 ab1 figura 6 15 i cui 101 6 Risultati picchi multipli non vengono correttamente individuati L algoritmo sequenza come TD FD Figure No 7 File Edit View Insert Tools Window Help DaeWSB KAAS PHD distribuzione di picchi doppi dopo il controllo di qualita 2 T T T T 1 picchi doppi 1 1 n 1 n f 200 300 400 500 600 700 n basi ogni punto corrisponde a 10 basi Figura 6 14 plot di output della funzione presenza picchiDoppi per individuare i picchi multipli lungo la sequenza dell AD FinchTV pGem 0000009409 ab1 228 8 OG SES Batok DOD Figura 6 15 Analyzed Data della sequenza pGem 0000009409 ab1 analizzato in figura 6 14 classifica la Per migliorare quest analisi si potrebbe pensare di considerare un intorno del picco Cap 5 paragrafo 5 4 pi ampio Questo pu esser utile per sequenze FD i cui picchi multipli sono dovuti soprattutto al rumore di strumentazione risultando quindi meno delineati e sfasati Nel complesso l algoritmo riesce a riconoscere sequenze D con una probabilit di assegnazione corretta del 96 33 e sequenz
102. rto tra il numero dato dalla somma dei veri positivi e negativi e il numero di sequenze del validation test Introduzione Il sequenziamento del patrimonio genetico principalmente di quello umano ha aperto nuovi scenari di ricerca grazie anche allo sviluppo e ai progressi nei metodi e nelle tecnologie di analisi Molte malattie dipendono da mutazioni localizzate su geni specifici Nel 1986 Renato Dulbecco sugger che determinando la sequenza normale del DNA umano si sarebbero potuti ricavare alcuni vantaggi anche per la ricerca sul cancro Prese cos corpo il Progetto Genoma Umano HGP inaugurato ufficialmente nel 1990 con l obiettivo di mappare il patrimonio genetico umano genoma ovvero di descrivere la struttura la posizione e la funzione dei geni che caratterizzano la specie umana In seguito al sequenziamento del genoma umano sono emersi fatti interessanti ed inattesi Dei 3 2 miliardi di paia di basi meno del 2 fa parte di regioni codificanti e il numero totale di geni ammonta a circa 24000 Prima delle tecniche del sequenziamento si stimava che il numero dei geni del genoma umano variasse da un minimo di 80000 a un massimo di 100000 Un numero di geni tanto inferiore alle aspettative sta a significare che la diversit osservata nelle molecole proteiche deve esser dovuto a modifiche post traduzionali In altre parole un gene eucariotico di medie dimensioni codifica in realt pi di una molecola proteica Un altra scoperta int
103. s Use agarose ga electrophoresis to detect the presence of secondary PCR products Optimize the PCR conditions and or use a Hot Start method Purify the PCR products using a gel before sequencing 4 Controllo di qualit del segnale Multicie overlapping More thar cre sequence cresent In the reaction due to m xed clacves or colonies sequances in ths date cloned DNA templates Ke soate the DNA trom a pra cclory and re seq uence When picking ceclerial cokonies for gowlh and DNA iso ation choose a cclory tnat ie well soaled Wih 1 13 plaques use fesh olates tor plequs cicing Check the DNA purity by running iton an agarose cel Very ctrorg signals arc common wren sequencing shol POR Tegiments because the sequencing reaction Is onton vory efficient You may need lo load less of Ihis type of sampic to compensate or the inorsased signal Multizlo poaks in the same pos tion al Some points put uo peaks or biad through Very strong sigrale saturating the inslrument s celecior causing te signals 10 be truncatod The Saguenciny Analysis soflurare underestimates the amount of signal at these postion there ore uncerestimating the amount of spectral ovorlaz 10 correct Use orly room temoereture acorol Gelo alcohol will also orecicitate unneorcorated dye terminstora Incomplete removal of un ncoroorated rLorescently labeed deMiPs durng acol precipitaticn Dicess dye peaxs Do net use denatu
104. sultato dell analisi della sequenza s_5fab1 e si evince dal grafico come l intera sequenza presenta picchi multipli possibile verificare la riuscita del troubleshooting automatico controllando l AD di figura 5 3 relativo alla sequenza in questione 89 Capitolo 6 Risultati L algoritmo descritto nel Capitolo 5 stato realizzato utilizzando un insieme di 167 sequenze di DNA con problematiche note fornite dalla BMR Genomics Per ogni problematica in tabella 6 1 indicato il numero di sequenze utilizzate per impostare in maniera empirica i diversi parametri dell algoritmo si osserva che la somma delle sequenze utilizzate per la ricerca di ogni problematica non corrisponde a 167 in quanto una sequenza pu presentare una o pi problematiche Classificazione N sequenze per implementazione NR 25 NS 10 SB 29 SA 38 FS 7 M 42 SI 44 Picchi Multipli 80 Totale 167 Tabella 6 1 sequenze utilizzate per la realizzazione dell algoritmo L algoritmo stata testato con altre 1200 sequenze anche queste con 90 6 Risultati problematiche note Per la classificazione di ogni problematica sono stati ricavati i Veri Positivi VP i Veri Negativi VN i Falsi Positivi FP e i Falsi Negativi FN i cui risultati sono riportati nelle successive tabelle di questo capitolo Per ogni classificazione vengono riportate due tabelle la prima che riporta in valore assoluto il numero dei
105. t su segnali che hanno composto il training set per la realizzazione dell algoritmo come sar mostrato nel Capitolo 6 segnale Variazione significativa Valore basso SB 50 100 SA 4000 350 FS 15000 500 Tabella 5 1 tabella con i valori scelti per i parametri variazione significativa e valore_basso usati nella funzione segnale calante per sequenze SB SA o FS 79 5 Troubleshooting algoritmi e soluzioni proposte File Edit View Insert Tools Window Help DEURA PND andamento dato grezzo segnale calante T DG DG 06 DG picchi massimi E Ll L L 8000 10000 16000 1 5 assex DG istogramma ampiezza raw data istogramma Figura 5 14 plot output della funzione segnale calante per il troubleshooting automatico della sequenza s_5fabI Nel primo riquadro tracciata in blu la curva che rappresenta l andamento di y t F t Il secondo riquadro rappresenta il suo istogramma Il segnale inizialmente assume valori piuttosto alti sopra i 20000 e man mano cala fino a raggiungere valori pi bassi 3000 La variazione pari in valore assoluto a 17000 e l algoritmo riconosce un calo del segnale Il segnale per non viene classificato come M in quanto il calo non cos drastico da portare il segnale a morire Nella parte finale del segnale i dati assumono valori alti 3000 nella scala di intensit luminosa e
106. ta difficile ed il basecalling ha un quality scores basso 4 2 2 4 Segnale che cala repentinamente strutture secondarie Nel paragrafo 3 2 2 3 si visto che oltre a valutare l ampiezza del Raw Data necessario analizzare anche il suo andamento se si mantiene costante condizione ottimale o se cala gradualmente come nel caso delle sequenze classificate come M Un altro problema consiste nel calo repentino del RawData Il calo repentino del segnale dovuto generalmente alla presenza di strutture secondarie nel campione La sequenza di nucleotidi complementari lungo lo stesso filamento del DNA pu far si che questo si ripieghi su se stesso 41 4 Controllo di qualit del segnale TTGCATGATGCG TCGAAA TIGCATGATGCGTGGGATCCCTCGAAA Figura 4 11 Esempio di un filamento di DNA che pu generare una struttura secondaria Figura 4 12 Appaiamento di 4 nucleotidi lungo il singolo filamento di DNA Formazione di una struttura secondaria Nell esempio riportato in figura 4 11 il filamento presenta la sequenza GGGATCCC le prime quattro basi azotate sono complementari alle successive quattro Il filamento ripiegandosi su se stesso impedisce alla DNA polimerasi di continuare la sintesi di nuovi nucleotidi durante la fase di copia della reazione di sequenziamento Cap 2 paragrafo 2 1 2 per cui si stacca dopo aver sintetizzato un nuovo frammento che pu non contenere il dideossinucleotide terminale marcato Alla fine de
107. ti dai filamenti stampo A questo punto il preparato pronto per la successiva fase e viene sottoposto ad elettroforesi 2 1 3 L elettroforesi L elettroforesi un processo elettrocinetico nel quale molecole e particelle cariche sotto l influenza di un campo elettrico migrano in direzione del polo che ha carica opposta Grazie alla presenza dei gruppi fosfato le molecole di DNA sono cariche negativamente e quindi migreranno verso il polo positivo anodo se sottoposte a un campo elettrico con velocit che dipende anche dalla loro 20 2 Il sequenziamento lunghezza oltre che dall intensit della corrente Nel sequenziamento manuale le quattro miscele di frammenti di terminazione della catena una per ogni analogo ddNTP marcato radioattivamente vengono sottoposte ad elettroforesi su gel di poliacrilamide o gel di agarosio in differenti corsie Durante la corsa i frammenti pi corti si muoveranno pi agevolmente attraverso il gel rispetto 1 frammenti pi lunghi Se il campo elettrico viene tolto prima che le molecole abbiano raggiunto l elettrodo si ha una separazione dei singoli componenti in base alla loro mobilit elettroforetica La sequenza delle basi del DNA complementare a quella cercata viene letta dall autoradiogramma delle quattro linee Nel sequenziamento automatico invece non necessario separare le quattro reazioni di terminazione in quattro provette differenti ma si pu allestire una singola reaz
108. titation of primer and or template leading to top heavy data Residual salts or organic chemicals carried over from template preparation Incomplete removal of cellular components such as RNA proteins polysaccharides and contaminating chromosomal DNA Degradation of DNA in storage More than one template DNA in the sequencing reaction Various types of contaminates present during template preparation More than one template present in the reaction i e secondary PCR products due tolack of specificity 58 Cycle sequencing reaction failed Repeat the cycle sequencing reaction adjust primer and template concentration Bad post reaction clean up Repeat sample preparation Replace the capillary array Reaction plate not centrifuged prior to Centrifuge the reaction plate injection air bubbles in the sample wells Refer to Problems with Commercial Formamide on page A 2 Use formamide as recommended in Appendix A Cover reaction plates with septa or film Repeat run using more BigDye reagent Adjust concentrations and repeat reactions Precipitate the template with ethanol and resequence Refer to Chapter 3 Purifying the Extension Products Precipitate the template with ethanol and resequenca Refer to Chapter 3 Purifying the Extension Products The majority of cleanup procedures for PCR products are designed to remove unincorporated nucleotides and residual POR primers not secondary PCR product
109. uence rappresenta la sequenza di basi identificata dal sequenziatore relativa alla porzione del segnale di figura 5 16 Il secondo array rappresenta il base location contenente la posizione nell asse x dell AD delle basi gli asterischi in rosso di figura 5 17 Il terzo array presenza calcolato dall algoritmo e contiene I nelle posizioni dove viene riconosciuto un picco multiplo 0 viceversa Sono colorate in giallo le posizioni in cui stato trovato il picco multiplo e per ognuno di esso corrisponde un valore che viene memorizzato nel vettore intensit Viene analizzata la natura del picco multiplo l array intensit contiene 1 se il picco doppio D 0 nel caso contrario FD L algoritmo prosegue calcolando la mediana dei valori contenuti nel vettore intensit e memorizza il risultato nella variabile intensit TOT Attraverso quest operazione viene riconosciuto se la sequenza nel suo complesso FD o D 84 5 Troubleshooting algoritmi e soluzioni proposte Cap 4 paragrafo 4 5 Inoltre l algoritmo ignora le prime 30 basi della sequenza questa scelta si basa sul fatto che i primi dati acquisiti hanno sempre una risoluzione scarsa Quasi tutte le sequenze presentano infatti picchi irregolari e senza forma proprio per queste basi Dopo aver analizzato la natura dei picchi FD D viene analizzata la quantita di picchi multipli nella sequenza Quando i picchi multipli trovati sono pochi rispetto il numero di bas
110. uindi in questo caso utili per valutare la performance La funzione presenza picchiDoppi proposta fornisce un unico risultato intensit TOT Cap 5 paragrafo 5 4 per riassumere la natura dei picchi dell intera sequenza D o FD Nel caso in cui la sequenza presentasse sin dall inizio un alto rumore di fondo tale da riconoscere un FD ma anche un punto a partire dal quale la sequenza si sdoppia divenendo ad esempio DD D 104 6 Risultati necessario fare una distinzione delle due porzioni dell AD riconoscere quindi un FD ma anche un DD D fornendo due risultati distinti per quanto riguarda l intensit dei picchi Vale anche per le sequenze TD E il caso mostrato in figura 6 17 in cui la sequenza presenta picchi multipli D nelle prime 220 basi dopo di queste la sequenza FD L algoritmo classifica la sequenza come FD L unica operazione di mediana Cap 5 paragrafo 5 4 quindi non pi adeguata Di seguito sono riportate le tabelle col numero dei VP VN FP FN per sequenze TD D DD FD poli A T G C mentre in figura 6 18 riportato il grafico con la probabilit di assegnazione corretta e il valore predittivo positivo in figura 6 19 il grafico con la sensitivit e la specificit per le sequenze appena elencate FinchTV APSTHRREV ab1 000 Ele Edt view Foch Help 090 aelclalsla s Go to Base No Find Sequence AAA Val Mv Alla RZ VAAL Reset Scales Figura 6 17 sequenza APSTHRREVabI
111. zata la tecnica della PCR se la dimensione del filamento inferiore al limite di lettura del sequenziatore si ottengono invece segnali come quelli riportati in figura 4 2 Si pu osservare che il Raw Data non occupa l intero asse dei tempi come per i campioni amplificati attraverso plasmidi e l ultimo picco in verde rappresenta l adenina Questo tipo di preparazione del campione infatti pu esser utilizzata per campioni di DNA corti con lunghezza inferiore alle mille basi come invece avviene attraverso le tecniche del DNA ricombinante Cap 2 paragrafo 2 1 1 FinchTV Raw Data Display 103_TED eooo 7000 sooo sooo 10000 11000 12000 13000 14000 15000 16000 li eaoh ui aa IIN Figura 4 2 RawData di un campione di DNA amplificato attraverso la tecnica della PCR La lunghezza del filamento minore alla lunghezza massima leggibile dal sequenziatore 3730xl In genere i campioni preparati con PCR presentano per costruzione un ultimo picco verde rappresentante l adenina Il processo di preparazione del campione il funzionamento dello 31 4 Controllo di qualit del segnale strumento la reazione di sequenziamento e la successiva run elettroforetica sono step del processo di sequenziamento che possono interferire nella riuscita del processo stesso Questi step spesso causano degli errori che impediscono una corretta individuazione delle basi nucleotidiche di cui composto il filamento di DNA sequenziato Nei para
112. zione del campione c reazione di sequenziamento d elettroforesi capillare 2 2 Altri tipi di sequenziamento 2 2 1 Sequenziatori di nuova generazione I sequenziatori di nuova generazione presentano il pregio rispetto al metodo Sanger di servirsi di tecniche di amplificazione in vitro piuttosto che della complicata procedura dei plasmidi ma soprattutto di utilizzare array di diversa natura per sequenziare contemporaneamente milioni di frammenti di DNA Queste migliorie hanno permesso alle nuove piattaforme di ridurre drasticamente i tempi e i costi richiesti Nonostante questi incoraggianti passi in avanti i sequenziatori di nuova generazione a eccezione del Genome Sequencer FLX 454 GS FLX non sono ancora le tecnologie di riferimento per il sequenziamento genomico a causa soprattutto dei pesanti limiti in termini di lunghezza delle read e di accuratezza nella determinazione delle basi Il GS FLX 454 utilizza una tecnica detta pirosequenziamento Questa 22 2 Il sequenziamento tecnica si articola in pi fasi necessaria una prima fase di amplificazione durante la quale viene utilizzata una variante della PCR detta PCR ad emulsione o emPCR tramite la quale si ottengono milioni di copie identiche di ogni frammento di DNA La lettura delle sequenze avviene invece per mezzo della tecnica del pirosequenziamento che utilizza l enzima DNA polimerasi Uno dei limiti di questa tecnica il fatto che essa garantisce la linea

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