Pneumocystis - Myconostica
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1. Resultado n 3 La prueba fracas inhibidores u otra sustancia desconocida presentes Cuanto menor sea el valor de Ct mayor ser la probabilidad de enfermedad Los valores de Ct pr ximos al valor de corte de 39 0 tienen mayor probabilidad de representar una colonizaci n que una infecci n pero algunos pacientes pueden padecer la enfermedad con presencia de una cantidad muy peque a de P jirovecii lo que indica una muestra de mala calidad tratamiento previo o la naturaleza de la carga f ngica en ese paciente concreto Limitaciones del procedimiento La principal limitaci n de este procedimiento es la calidad de la muestra primaria Si la muestra es muy peque a o no se obtuvo de la zona afectada del pulm n la prueba ser menos sensible y puede dar un resultado falsamente negativo Las muestras obtenidas mediante lavado broncoalveolar deben centrifugarse antes de la extracci n del DNA del sedimento Los datos tambi n demostraron que una reducci n del volumen de sobrenadante usado en el proceso de extracci n que se obtiene en el paso de centrifugaci n reduce la proporci n de inhibidores que entran en el sistema Aunque el procedimiento de extracci n de DNA f ngico MycXtra se ha dise ado para eliminar los inhibidores de la PCR no se han evaluado todos los f rmacos ni todas las poblaciones de pacientes Para uso diagn stico in vitro MycAssay Pneumocystis Muestras Respiratorias para Roche LightCycler2. 2 0 Contin e en la Secci n 2 inmediatamente Las reacciones del ensayo MycAssay Pneumocystis son estables en el banco durante un m ximo de 60 minutos Despu s de la preparaci n de la PCR aseg rese de que se limpie meticulosamente el rea de trabajo usando reactivos descontaminantes de DNA Procesamiento de la serie anal tica Inserte el CD ROM MycAssay Pneumocystis Myconostica Protocol Vaya a Import a trav s del directorio File y seleccione Object ixo files Importe el archivo Macro MAP v1 2 ixo del CD en su base de datos Spanish 5 030 170 Versi n 1 3 24FEB12 MycAssay Pneumocystis Para el uso diagn stico in vitro para Roche LightCycler 2 0 Muestras Respiratorias 2 3 2 4 2 5 2 6 2 1 2 8 2 9 2 10 File Edit View Tools Window Help PA Mew Ctrl M ME Enalysis Ed Open Ctro Glose g Save CES El ave SS En Er Logout Export COF Std Curve Files Batch import Object ixo Files Batch export Bd Report Chrl FR Print window Exit Vaya a Save a trav s del directorio File y guarde el macro en la ubicaci n deseada de su base de datos Seleccione la opci n Run Macro de la barra de herramientas iA New He Run 3 Analysis El Oper a Report UE Template Ea Aun Macro Seleccione el archivo de plantilla Macro MAP v1 2 y pulse Open Siga las instrucciones del asistente Seleccione la casilla Perform Self Test si se trata de la primera serie anal tica del
3. 2 0 El procedimiento no se ha evaluado de forma exhaustiva con esputos ni se ha evaluado con muestras salinas inducidas ni en muestras procedentes de ni os Pueden obtenerse resultados positivos falsos por contaminaci n externa de la muestra original o de la prueba Esta contaminaci n podr a provenir de aire contaminado con P jirovecii de una t cnica experimental deficiente con respecto al control positivo o de contaminaci n externa especialmente de la pipeta con DNA de P jirovecii Dado que se puede obtener un resultado positivo verdadero en muestras de pacientes con una colonizaci n transitoria o persistente por P jirovecii se requiere aplicar el criterio cl nico para interpretar el resultado de la prueba AUTORIZACI N DE COMERCIALIZACI N TopTaq Hot Start es suministrado por QIAGEN QIAGEN es una marca registrada de Qiagen GmbH Hilden Alemania SmartCycler es una marca registrada de Cepheid 904 Caribbean Drive Sunnyvale CA 94089 Estados Unidos Este producto se vende bajo autorizaci n del Public Health Research Institute Newark New Jersey Estados Unidos y puede usarse bajo los derechos de la patente del PHRI exclusivamente para diagn stico in vitro en seres humanos LightCycler es una marca registrada de Roche Diagnostics GmbH Lab21 184 Cambridge Science Park el Cambridge CB4 OGA United Kingdom Telephone 44 0 1638 552 882 Facsimile 44 0 1638 552 375 Email productsupportWlab21 c
4. 9 y 33 6 Fallo del IAC ACCI N Repetir la muestra Si se produce el mismo resultado presencia de un inhibidor sospechoso en la muestra PNE 530 Cp IAC 560 Cp Interpretaci n Acci n que debe mem mea A gamae Control negativo 239 0 o Sin Cp Entre 29 9 33 6 Control negativo Los resultados del IN IN E A Control negativo 239 0 o Sin Cp lt 29 9 O gt 33 6 Fallo en el control Repetir toda la serie A A A a Control negativo lt 39 0 Entre 29 9 33 6 Contaminaci n Repetir toda la serie anal tica Control positivo Entre 20 0 25 0 ND Control positivo Los resultados del Seramo Il ND ESO PS Control positivo lt 20 0 o gt 25 0 ND Fallo en el control Repetir toda la serie A A A Muestra de paciente 239 0 o Sin Cp Entre 29 9 33 6 Negativo para Comunicar resultado Muestra de paciente lt 39 0 ND Positivo para Comunicar resultado Pneumocystis Resultado n 2 Muestra de paciente 239 0 o Sin Cp lt 29 9 o gt 33 6 Fallo del IAC en la Repetir la muestra Ii di ISA O imma lr Consulte Generaci n de informes cl nicos Resultados n 1 n 2 o n 3 Spanish 9 030 170 Versi n 1 3 24FEB12 MycAssay Pneumocystis Para el uso diagn stico in vitro para Roche LightCycler 2 0 Muestras Respiratorias 4 4 1 4 2 4 3 Resoluci n de problemas El control negativo ha generado una se al positiva en el canal 530 gt Se produjo contaminaci n durante la preparaci n No pueden considerarse precisos los resultados de toda la serie
5. Versi n 1 3 24FEB12 Spanish 2 Para uso diagn stico in vitro MycAssay Pneumocystis Muestras Respiratorias para Roche LightCycler 2 0 CD ROM MycAssay Pneumocystis Myconostica Protocol Protocolo del ensayo MycAssay Pneumocystis de Myconostica Instrucciones de uso Certificado de an lisis Conservaci n El kit se debe guardar congelado entre 15 C y 25 C hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta de la caja del kit momento en el cual se debe desechar de acuerdo con la normativa local Una vez abierta una bolsa su contenido se debe usar inmediatamente no se puede volver a congelar ni tampoco usar otra vez Equipo materiales requeridos y no incluidos Sistema de PCR en tiempo real Roche LightCycler 2 0 incluyendo el manual de usuario ordenador asociado y software LightCycler v4 1 Centrifugadora de carrusel LC 2 0 opcionalmente adaptadores para tubos capilares para minicentrifugadora Carrusel de muestras para tubos capilares de 20 uL Tubos capilares LC 2 0 de 20 uL con tapones Gradilla de soporte para tubos capilares Liberador de tubos capilares Herramienta de taponamiento Microcentrifugadora Agitadora vorticial v rtex Micropipetas vol menes requeridos 7 5 20 uL Puntas con filtro de baja retenci n est riles Guantes desechables sin polvo Soluci n comercial descontaminante de DNA Kit de aislamiento de DNA v ase m s adelante KitMycAssay
6. antes de continuar Mezcle en la agitadora vorticial el contenido de los tubos y las muestras de paciente y a continuaci n centrif guelos en una microcentrifugadora mediante un ciclo corto para asegurarse de que todo el contenido se acumule en el fondo de los tubos antes de usarlos Coloque el n mero requerido de tubos capilares de 20 uL en una gradilla de soporte para tubos capilares Tenga cuidado de no dejar ninguna marca en el vidrio Siempre debe prepararse primero el control negativo seguido de las muestras de an lisis El control positivo debe prepararse siempre en ltimo lugar En la siguiente tabla se muestran los vol menes de reactivo y de DNA 030 170 Versi n 1 3 24FEB12 Spanish 4 Para uso diagn stico in vitro MycAssay Pneumocystis Muestras Respiratorias para Roche LightCycler 2 0 2 1 2 2 Reacci n Reactivo A ada los reactivos en el orden mostrado en la tabla anterior Tubo 1 y luego el Tubo 2 seguidos de la plantilla control negativo muestra de paciente o control positivo Tenga cuidado al tomar muestras parciales del Tubo 1 ya que el l quido es ligeramente viscoso y puede adherirse al borde interno del tubo Si sucediese esto vuelva a centrifugar para acumular el contenido final en la base del tubo antes de intentar extraer las muestras parciales finales Use una nueva punta de pipeta para cada transferencia de l quido Vuelva a cerrar los tubos de reactivos despu s de usarlos y des chelos inmed
7. d a xj ES Welcome to the Experiment Kit Wizard Select the instrument you want to run the experiment on If the A instrument is not in the list click Search The Experiment Kit Wizard helps you run a new experiment using the provided kit The first step is to create the new experiment Lc 1 6937 LC 1 305 on COM1 LC_16937 To start the wizard and create a new experiment click Next Search Y Perform self test If you don t want to create a new experiment at this time click AS j Cancel lt Back Next gt Cancel Asigne un nombre al archivo de la serie anal tica y gu rdelo en la ubicaci n deseada Vaya a la secci n de muestras haciendo clic en la ficha situada a la izquierda de la pantalla Edite el n mero de la muestra en la casilla Samples Count y los nombres en la ficha Capillary view Asigne a las muestras el nombre indicado en el plan del experimento correspondiente a la posici n en el carrusel Sample data Analysis Type 7 Selected Channels 1530 560 610 640 670 705 Print Samples LC Carousel ID MPLC Batch ID Assay Cat No Assay Lot No Color Comp ID ATT Repl Of Sample Note b 1 Negative Corto 2 Repl of Negative Control 1 3 Repl of Negative Control 1 4 Asp 10e3 copies 5 Repl of Asp 10e3 copies 4 i 6 Repl of Asp 10e3 copies 4 ASP 530 7 Asp 10e4 copies 8 Repl of sp 10e4 copies 7 a 9 Repl of Asp 10e4 copies 7 i 10 Asp 10e5 copies IAC 560 11
8. dedicada que se limpie regularmente con agentes descontaminantes de DNA No obstante evite el uso de reactivos descontaminantes de DNA durante la preparaci n del sistema de PCR en tiempo real ya que pueden inhibir el ensayo Utilice micropipetas para transferir l quidos Deben utilizarse micropipetas de uso exclusivo para la preparaci n de estas reacciones estas micropipetas deben descontaminarse con regularidad Se recomienda utilizar puntas con filtro de baja retenci n para asegurarse de que no se pierda DNA durante el procedimiento de preparaci n Deben tomarse precauciones al manipular el Tubo 4 Este tubo contiene el material de DNA plantilla y su contaminaci n podr a generar resultados positivos falsos de la prueba Por ejemplo v ase Mifflin T E 2003 Setting up a PCR Laboratory In PCR Primer 2nd Ed eds Dieftenbach and Dveksler Cold Spring Harbour Laboratory Press Cold Spring Harbour NY USA Spanish 3 030 170 Versi n 1 3 24FEB12 MycAssay Pneumocystis Para el uso diagn stico in vitro para Roche LightCycler 2 0 Muestras Respiratorias Use guantes en todo momento Todos los tubos capilares se deben cerrar despu s del uso y antes de desecharlos Anote con exactitud las posiciones de los tubos capilares que contienen muestras relevantes en el carrusel de 32 posiciones en el plan del experimento El an lisis preciso de los datos requiere la aplicaci n de un archivo de compensaci
9. gen mico humano no presenta un resultado positivo con este ensayo Evaluaci n del rendimiento Se estableci el valor de corte a un Ct de 39 0 despu s del an lisis de un conjunto de muestras cl nicas procedentes de diferentes poblaciones de pacientes Se utilizaron muestras cl nicas de lavado broncoalveolar BAL obtenidas en dos hospitales extra das con el kit MycXtra y almacenadas para evaluar el rendimiento del kit MycAssay Pneumocystis Se realiz una comparaci n de los resultados de la PCR con los de la microscopia de inmunofluorescencia Diagn stico mediante PCR frente a diagn stico mediante microscopia PA Positivo con microscopia Negativo con microscopia Positivo con 45 0 85 PPV PCR Negativo con 2 33 0 94 NPV 0 96 0 80 Sensibilidad Especificidad Tabla 1 Especificidad y sensibilidad diagn sticas del kit MycAssay Pneumocystis en comparaci n con la microscopia de inmunofluorescencia La tabla 1 representa datos obtenidos de pacientes con diagn stico de infecci n por el VIH pacientes sin infecci n por el VIH y pacientes con estado de VIH indeterminado Los pacientes con neumon a por Pneumocystis tienen cantidades muy variables de microorganismos detectables cuanto menor es el valor de Ct mayor es la probabilidad de enfermedad Los pacientes con infecci n por el VIH y neumon a por Pneumocystis tienden a tener cifras m s altas de microorganismos detectables que los pacientes que no est n infectados po
10. n del color generado mediante el kit Myconostica MycAssay CC Procedimiento de uso 1 Preparaci n del sistema de PCR en tiempo real 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 Para comenzar encienda el sistema de PCR en tiempo real LightCycler 2 0 el instrumento el ordenador asociado y la centrifugadora e inicie el software correspondiente Introduzca el nombre de usuario y la contrase a requeridos y seleccione la base de datos diagn stica Si se trata de la primera serie anal tica del d a realice primero una autocomprobaci n del instrumento antes de preparar una serie anal tica Recuerde se debe realizar una serie anal tica de compensaci n de color antes de analizar los resultados de MycAssay Pneumocystis en el LightCycler 2 0 No obstante no es necesario realizar la serie anal tica antes de utilizar este producto y podr realizarla y aplicarla retrospectivamente a los archivos de las series anal ticas Aseg rese de que se haya limpiado el rea de trabajo con reactivos descontaminantes de DNA y de que se haya dejado secar completamente evite usar estos productos durante la preparaci n del ensayo ya que un exceso de soluci n limpiadora puede inhibir las reacciones de PCR Una bolsa contiene un tubo de cada tipo Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 y Tubo 4 Hay suficientes reactivos en una bolsa para realizar 8 reacciones Deben realizarse al menos una reacci n de control positivo y una reacci n de control negativo en c
11. CC v ase m s adelante Muestra La muestra para el ensayo MycAssay Pneumocystis es DNA total extra do de muestras cl nicas de BAL Se recomienda con este fin y se utiliz durante la validaci n el siguiente equipo y kit de aislamiento de DNA suministrado por Myconostica Ltd Kit de extracci n de DNA f ngico MycXtra REF 080 005 disponible en Myconostica Vortex Genie 2 Scientific Industries Inc Nueva York EE UU Plato adaptador para agitadora vorticial REF 080 015 disponible en Myconostica Kit MycAssay Colour Compensation CC El an lisis preciso de los datos producidos con el ensayo MycAssay Pneumocystis requiere la aplicaci n de un archivo de compensaci n del color generado mediante el kit Myconostica MycAssay CC ref 080 080 Cuando se haya creado el archivo se puede aplicar a m ltiples series anal ticas en el mismo aparato Para m s detalles p ngase en contacto con su distribuidor local Notas del procedimiento Lea el protocolo completo antes de empezar El proceso completo del ensayo MycAssay Pneumocystis excluida la extracci n de DNA dura aproximadamente 2 horas seg n el n mero de muestras analizadas La preparaci n de la prueba debe realizarse en una zona de trabajo espec fica para PCR o en un laboratorio de procedimientos previos a la PCR Si no se dispone de una zona de trabajo espec fica para PCR la prueba se debe realizar en una zona del laboratorio
12. Repl of Asp 10e5 copies 10m 12 Repl of Asp 1085 copies 0 13 Asp 10e6 copies 14 Repl of 4sp 10e6 copies 13 E 15 Repl of sp 1086 copies 1 g 16 Positive Control Introduzca el carrusel de centrifugado en el instrumento LC 2 0 Aseg rese de que la ranura debajo de la posici n 1 de la muestra en el carrusel encaje en la clavija de la c mara t rmica Aseg rese de que el carrusel est firmemente insertado en la c mara y cierre la tapa Cuando haya terminado pulse el bot n Start Aseg rese de que el instrumento haya detectado todos los tubos capilares en el carrusel y que se haya iniciado el programa 030 170 Versi n 1 3 24FEB12 Spanish 6 Para uso diagn stico in vitro MycAssay Pneumocystis Muestras Respiratorias para Roche LightCycler 2 0 xi The experiment is ready to run Before starting edit the sample information and run protocol as necessary i Cancel Spanish 7 030 170 Versi n 1 3 24FEB12 MycAssay Pneumocystis Para el uso diagn stico in vitro para Roche LightCycler 2 0 Muestras Respiratorias 3 An lisis e interpretaci n de los datos 3 1 Recuerde se debe aplicar un objeto de compensaci n de color antes de analizar los resultados de MycAssay Pneumocystis en el LightCycler 2 0 Si todav a no ha creado un objeto de compensaci n h galo ahora antes de continuar con el an lisis y la interpretaci n de los datos 3 2 Cuando haya finalizado la serie anal tica compruebe el
13. Uso diagn stico in vitro MycAssay Pneumocystis Roche LightCycler 2 0 myconosjica Muestras Respiratorias MycAssay Pneumocystis Roche LightCycler 2 0 Muestras Respiratorias REF 080 035 Uso previsto MycAssay Pneumocystis est indicado para su uso por profesionales de laboratorio cualificados para la detecci n cualitativa del DNA gen mico de Pneumocystis jirovecii en muestras respiratorias de las v as respiratorias inferiores p ej muestras bronquiales como ayuda para el diagn stico de pacientes adultos que se sospecha que padecen una neumon a por P jirovecii MycAssay Pneumocystis ha sido validada para usarse con el Roche LightCycler 2 0 Resumen y explicaci n La neumon a por Pneumocystis jirovecii previamente carinii PCP es una neumon a oportunista frecuente en pacientes inmunodeprimidos especialmente en aqu llos con infecci n por el VIH avanzada y SIDA Generalmente se adquiere en la comunidad se presenta en forma subaguda y lleva a una insuficiencia respiratoria progresiva y a la muerte si no se trata Como profilaxis se administra trimetoprima sulfametoxazol Bactrim o Septrin de forma sistem tica a muchos pacientes de riesgo una pr ctica que ha reducido sustancialmente la incidencia de PCP pero a n as se producen casos de neumon a y personas que no saben que son VIH positivas pueden ser diagnosticadas de SIDA tras presentar una PCP La PCP tambi n se desarrolla en otros tipos de pacientes i
14. a Pneumocystis el resultado IAC no es necesario para decidir acerca del resultado para el paciente 4 9 No se obtienen resultados para ning n canal con ninguna muestra ni control Las condiciones de conservaci n del kit no cumpl an las instrucciones presentadas en el apartado Conservaci n de estas instrucciones de uso o el kit ha caducado gt Compruebe que se hayan seguido las condiciones de conservaci n correctas del kit Compruebe la fecha de caducidad de los reactivos en la etiqueta de la bolsa caja del kit y repita el proceso con un kit que no haya caducado en caso necesario El equipo usado no tiene un funcionamiento ptimo gt Compruebe que el instrumento de PCR en tiempo real tiene el historial de mantenimiento actualizado y que ha sido totalmente calibrado seg n se describe en su Gu a de instalaci n y mantenimiento Se ha utilizado un protocolo incorrecto durante la preparaci n del software gt Consulte la Secci n 2 y elija el archivo del protocolo correcto seg n se especifica para cada tipo versi n del software del CD ROM Myconostica Protocol S lo puede cargarse el archivo apropiado para el software Repita la serie anal tica usando el archivo del protocolo correcto Si tiene m s preguntas o experimenta cualquier problema p ngase en contacto con el servicio de atenci n al cliente productsupportOlab21 com Caracter sticas de rendimiento y limitaciones Datos de rendimiento anal tico del sis
15. aci n con amplicones de Pneumocystis o IAC no abra los tubos de la reacci n despu s de la amplificaci n No coma beba ni fume en reas donde se manipulen las muestras o los reactivos del kit Las concentraciones bajas de DNA pueden ser inestables si no se conservan correctamente Se recomienda almacenar las extracciones de DNA a una temperatura de 80 C para preservar su integridad Siempre que sea posible debe evitarse tambi n realizar varias secuencias de descongelaci n y congelaci n Contenido del kit Descripci n El kit consta de cinco bolsas selladas de aluminio con 3 compartimentos cada una que se pueden usar por separado Cada bolsa contiene reactivos suficientes para 8 reacciones Volumen Tubo 1 dNTPs 66 uL tap n naranja MgCl Soluci n amortiguadora del complejo de la DNA polimerasa Tubo 2 lt 0 01 de cebadores 66 uL tap n azul lt 0 01 de balizas moleculares lt 0 0001 de control de amplificaci n interno IAC El IAC es un pl smido de DNA recombinante que contiene una secuencia no infecciosa no relacionada con ninguna de las secuencias diana Pneumocystis Amortiguador Tris HCI Tubo 3 Control negativo 25 uL tap n Agua transparente Tubo 4 Control positivo 25 uL tap n negro lt 0 0001 de DNA de control positivo La mol cula de control positivo es un pl smido recombinante que contiene las secuencias diana de Pneumocystis Amortiguador Tris HCI El kit tambi n contiene 030 170
16. ada serie anal tica en la que los reactivos sean del mismo lote del kit Por lo tanto con una bolsa se pueden analizar 6 muestras de paciente Si es necesario analizar m s de 6 muestras de paciente se puede usar m s de una bolsa si las bolsas usadas proceden del mismo lote del kit No obstante en una serie anal tica el LightCycler 2 0 s lo puede contener un m ximo de 32 muestras Por consiguiente se pueden procesar un m ximo de 30 muestras de paciente en una serie anal tica 4 bolsas Calcule el n mero de reacciones necesarias para ello consulte la tabla siguiente N mero de N mero m ximo de muestras bolsas de O Ela Saque el n mero apropiado de bolsas del congelador No use ninguna bolsa que ya no est sellada Si se congelaron las muestras de an lisis despu s de la extracci n s quelas tambi n del congelador Rasgue el n mero de bolsas necesarias para abrirlas y saque los tubos Si se va a usar m s de una bolsa pero solamente se va a procesar un conjunto de controles positivo y negativo s lo es necesario extraer los Tubos 3 y 4 de una bolsa Deben tomarse precauciones al manipular el Tubo 4 Este tubo contiene material de DNA de control positivo y la contaminaci n podr a dar lugar a resultados positivos falsos en la prueba Deje que se descongele el contenido de los tubos coloc ndolos en el banco de laboratorio durante 5 10 minutos asegur ndose de que se haya descongelado totalmente el contenido de todos los tubos
17. anal tica Repita toda la serie anal tica teniendo gran cuidado al a adir las plantillas en particular el control positivo Tubo 4 para asegurarse de que no se produzca una contaminaci n cruzada Aseg rese de que el rea de trabajo y los instrumentos sean debidamente descontaminados antes y despu s de su uso Se ha colocado incorrectamente el control negativo en el instrumento Anote correctamente los tubos capilares en el software El valor de Cp del IAC del control negativo se encuentra fuera del intervalo aceptable gt Se ha inhibido la PCR Aseg rese de que el rea de trabajo y los instrumentos est n completamente secos despu s de usar agentes descontaminantes antes de proceder a la preparaci n para la PCR Las condiciones de conservaci n del kit no cumpl an las instrucciones presentadas en el apartado Conservaci n de estas instrucciones de uso o el kit ha caducado Compruebe que se hayan seguido las condiciones de conservaci n correctas del kit Compruebe la fecha de caducidad de los reactivos en la etiqueta de la bolsa caja del kit y repita el proceso con un kit que no haya caducado en caso necesario No se ha a adido el reactivo de los Tubos 1 2 a la reacci n de PCR o se ha a adido una cantidad dos veces mayor del Tubo 2 Repita la serie anal tica teniendo cuidado en la fase de preparaci n Estos errores pueden detectarse si se observan niveles m s altos o m s bajos de l quido en un tubo capilar d
18. clusivamente por profesionales de laboratorio Es preciso poner en pr ctica procedimientos para la manipulaci n de muestras que no generen aerosoles Deben seguirse las precauciones habituales y las directrices del centro para la manipulaci n de todas las muestras Myconostica Ltd tiene a su disposici n una Hoja de datos sobre la seguridad de los materiales Esta prueba se debe utilizar exclusivamente con el Roche LightCycler 2 0 No use los reactivos ni los controles si las bolsas protectoras llegan abiertas o rotas Los reactivos y los controles no son intercambiables entre kits con n meros de lote diferentes Nunca mezcle reactivos ni controles de tubos diferentes aunque sean del mismo lote Nunca use los reactivos ni los controles despu s de su fecha de caducidad No se deben volver a congelar ni volver a usar los reactivos ni los controles despu s de abiertos Use ropa protectora y guantes desechables cuando manipule los reactivos del kit Evite la contaminaci n microbiana y con desoxirribonucleasa DNAasa de los reactivos cuando tome muestras parciales de los tubos Se recomienda usar puntas de pipeta de desplazamiento positivo o con filtro desechables de baja retenci n libres de DNAasa y est riles Use una nueva punta para cada muestra o reactivo Deseche los reactivos no usados y el material de desecho de acuerdo con las normativas nacionales federales estatales y locales Para evitar la contamin
19. contenido del informe visualizado e impr malo si lo desea 3 3 Los resultados de Pneumocystis se pueden visualizar en la secci n de an lisis PNE 530 y los resultados IAC en la secci n de an lisis IAC 560 3 4 En las dos secciones PNE 530 e IAC 560 seleccione el archivo correcto de compensaci n del color MycAssay CC file que se debe aplicar al experimento 3 5 Channel 530 7 Color Compensation On Select Color Compensation o Include Color Pos 3 6 Analice cada muestra comenzando con los controles como se muestra en la gr fica de flujo a continuaci n tambi n encontrar detalles en la tabla que aparece bajo la gr fica de flujo 030 170 Versi n 1 3 24FEB12 Spanish 8 Para uso diagn stico in vitro MycAssay Pneumocystis Muestras Respiratorias para Roche LightCycler 2 0 Comprobar el control negativo Es el PNE Ct 39 0 o se ha registrado como Sin Ct La serie anal tica est contaminada Comprobar el control negativo NO ACCION Repetir la serie anal tica ME Est el IAC Cp entre 29 9 y 33 6 Fallo de la serie anal tica ACCI N Repetir la serie anal tica Fallo de la serie anal tica Comprobar el control positivo ACCI N Repetir la serie anal tica Est el PNE Cp entre 20 0 y 25 0 Positivo para DNA de Pneumocystis Comprobar la muestra de paciente Es el PNE Cp lt 39 0 Comprobar la muestra de paciente Negativo para DNA de Pneumocystis Est el IAC Cp entre 29
20. e reacci n en comparaci n con los otros No se ha aplicado el archivo CC correcto a los datos Cree un archivo CC mediante el kit Myconostica MycAssay CC apl quelo a los resultados y vuelva a realizar el an lisis Para informaci n detallada sobre el kit consulte a su distribuidor local El control positivo es negativo gt Las condiciones de conservaci n del kit no cumpl an las instrucciones presentadas en el apartado Conservaci n de estas instrucciones de uso o el kit ha caducado Compruebe que se hayan seguido las condiciones de conservaci n correctas del kit Compruebe la fecha de caducidad de los reactivos en la etiqueta de la bolsa caja del kit y repita el proceso con un kit que no haya caducado en caso necesario Se produjo un error durante la preparaci n y la plantilla de control positivo Tubo 4 se coloc en el tubo de reacci n err neo Repita la serie anal tica teniendo extremo cuidado durante la fase de preparaci n Estos errores pueden detectarse si se observa un nivel m s alto de l quido en un tubo de reacci n y un nivel m s bajo en otro en comparaci n con el nivel normal No se ha a adido el reactivo de los Tubos 1 2 a la reacci n Repita la serie anal tica teniendo cuidado en la fase de preparaci n Estos errores pueden detectarse si se observan niveles m s bajos de l quido en este tubo capilar de reacci n que en los otros Se ha colocado incorrectamente el control positivo en el instru
21. iatamente as como el contenido restante en un recipiente de cierre herm tico para residuos cl nicos Los reactivos no usados no pueden guardarse para un uso posterior Tome precauciones especiales al pipetear el Tubo 4 DNA de control positivo para asegurarse de que no contamine ninguna otra reacci n Cierre los tapones de los otros tubos capilares antes de abrir el Tubo 4 para reducir el riesgo de contaminaci n cruzada Utilice la herramienta de taponamiento para cerrar cuidadosamente los tubos capilares con los tapones suministrados en la caja de tubos capilares Aseg rese de que los tubos capilares est n firmemente cerrados Si se desea los tubos capilares se pueden cerrar cuando se haya a adido la plantilla a la reacci n para reducir la posibilidad de una contaminaci n cruzada ambiental Si no dispone de una centrifugadora de carrusel centrifugue las muestras con los adaptadores suministrados en una gradilla de soporte mediante una minicentrifugadora En caso contrario contin e con el paso 1 17 Transfiera con sumo cuidado todos los tubos capilares al carrusel en exactamente el mismo orden que se encuentran en la gradilla de soporte comenzando por el primer tubo capilar en la posici n 1 y contin e en orden ascendente sin dejar huecos Presione cada tubo capilar hacia abajo hasta que est firmemente insertado Si todav a no ha centrifugado las muestras en la Secci n 1 16 centrif guelas mediante la centrifugadora de carrusel LC
22. la amplificaci n del DNA mediante un proceso de termociclado El ensayo tambi n contiene una secuencia de control de amplificaci n interno IAC internal amplification control que es un fragmento de DNA que no est presente en el genoma de Pneumocystis ni en otros genomas f ngicos ni tampoco en genomas bacterianos ni humanos y cuya finalidad es detectar sustancias inhibidoras de la PCR y confirmar la funcionalidad de los reactivos del ensayo Las dianas de DNA amplificadas son detectadas con balizas moleculares sondas de hibridaci n compuestas de un oligonucle tido monocatenario que forma una estructura de horquilla La porci n curva de la horquilla contiene una secuencia sonda que es complementaria de una secuencia diana y la porci n recta de la horquilla est formada por hibridaci n de secuencias de brazo complementarias que se encuentran a cada lado de la secuencia sonda Un extremo del brazo est unido de forma covalente a un fluor foro que emite fluorescencia cuando es excitado por una luz de la longitud de onda apropiada mientras que el otro extremo del brazo est unido de forma covalente a un extintor de fluorescencia que suprime la fluorescencia del fluor foro cuando se encuentra en estrecha proximidad f sica Las balizas moleculares no emiten fluorescencia cuando est n libres en soluci n Sin embargo cuando se hibridan con una cadena de cido nucleico que contiene una secuencia diana experimentan un cambio conformacional q
23. mento Anote correctamente los tubos capilares en el software 4 4 La s muestra s de paciente son negativas y el IAC est fuera de rango Resultado n 3 gt Es probable que la s muestra s de paciente contengan inhibidores de la PCR Recomendamos extraer DNA de las muestras usando el kit de extracci n de DNA f ngico MycXtra 030 170 Versi n 1 3 24FEB12 Spanish 10 Para uso diagn stico in vitro MycAssay Pneumocystis Muestras Respiratorias para Roche LightCycler 2 0 4 5 La muestra de paciente es negativa en la secci n PNE 530 y la gr fica IAC 560 se aleja de forma significativa de la l nea base normal como se muestra en la imagen de ejemplo inferior las flechas indican gr ficas an malas Amplification Curves 1234567809 101112131415161718192021222324 252627 28293031 323334 35353738 3940 Cycles Se ha inhibido la reacci n de PCR gt Aseg rese de que el rea de trabajo y los instrumentos est n completamente secos despu s de usar agentes descontaminantes antes de proceder a la preparaci n para la PCR gt Analice de nuevo la muestra de paciente Si el problema reaparece el inhibidor de la PCR est presente en la muestra Identifique la muestra como Indeterminada 4 6 Los resultados en la secci n IAC 560 coinciden casi exactamente con los resultados en la secci n PNE 530 No se ha aplicado ning n archivo de compensaci n de color o se ha aplicado uno incorrecto a los re
24. nmunodeprimidos como los receptores de trasplantes de un rgano s lido los sujetos con hipogammaglobulinemia y los sujetos con leucemia cr nica Actualmente el diagn stico de PCP se basa en m todos de microscopia dado que P jirovecii no se puede cultivar en laboratorios de microbiolog a est ndar El lavado broncoalveolar BAL bronchoalveolar lavage es el m todo preferido para la obtenci n de muestras Los m todos de diagn stico habituales son la inmunofluorescencia o la fluorescencia directa FD y la tinci n histol gica de las muestras MycAssay Pneumocystis es un kit de diagn stico molecular para la detecci n de P jirovecii basado en la tecnolog a de la reacci n en cadena de la polimerasa PCR polymerase chain reaction con baliza molecular El procedimiento completo de la prueba incluida la extracci n de DNA de la muestra cl nica puede realizarse en 4 horas o en s lo 2 horas si ya se dispone del DNA extra do Este ensayo ofrece el beneficio directo de una mayor eficacia en el laboratorio combinada con una prueba r pida que conlleva probables beneficios cl nicos La exactitud diagn stica de la prueba depende en gran medida de la calidad de la muestra Principios del ensayo Despu s de mezclar los reactivos del kit MycAssay Pneumocystis con una muestra que contenga la secuencia diana de DNA de Pneumocystis una secci n de la subunidad mayor de los ribosomas mitocondriales de Pneumocystis se producir
25. om Spanish 15 030 170 Versi n 1 3 24FEB12
26. r este virus pero existe una superposici n considerable La gr fica de dispersi n de la figura 1 demuestra esta superposici n Para dar informaci n m s completa dado que el conjunto de datos de la tabla 1 inclu a a pacientes cuyo estado de VIH era desconocido en la figura 1 se incluye la gr fica de dispersi n para este grupo columna 3 Spanish 13 030 170 Versi n 1 3 24FEB12 MycAssay Pneumocystis Para el uso diagn stico in vitro para Roche LightCycler 2 0 Muestras Respiratorias 39 A RS 37 35 33 Ct Value 48509 Pe oeoo e o oo O o o 0 N a 00000 o 1 20 0 1 2 3 4 Categor a 1 HIV Microscop a 2 HIV Microscop a 3 HIV Desconocido Microscop a 4 Todos microscop a Figura 1 Gr fica de dispersi n de los valores de Ct obtenidos del DNA extra do de muestras respiratorias de pacientes Se describen cuatro grupos Generaci n de informes cl nicos El kit MycAssay Pneumocystis se ha dise ado para ser usado como ayuda en el diagn stico de la neumon a por Pneumocystis Los resultados deben considerarse en el contexto del estado cl nico del paciente y de los resultados de otras pruebas diagn sticas Los siguientes son informes recomendados que dependen de la interpretaci n del resultado del ensayo Resultado n 1 Pneumocystis jirovecii no detectado Resultado n 2 Pneumocystis jirovecii detectado Resultado positivo Indicar el valor de Ct
27. sentaron un resultado positivo Alternaria alternata Aspergillus flavus A fumigatus A niger A terreus Blastomyces capitatus Candida albicans C glabrata C parapsilosis C tropicalis g nero Cladosporium Cryptococcus neoformans Doratomyces microsporus Fusarium solani Rhizomucor pusillus Rhodotonila rubra Saccharomyces cerevisiae Scedosporium apiospermum prolificans Sporothrix schenkii Trichosporon capitatum Las siguientes especies bacterianas no presentaron un resultado positivo Bordetella pertussis Corynebacterium diphtheriae Escherichia coli Haemophilus influenzae Lactobacillus plantarum Legionella pneumophila Moraxella catarrhalis Mycoplasma pneumoniae Neisseria meningitidis Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae S pyogenes salivarius Se establecieron las siguientes afirmaciones sobre el rendimiento utilizando el sistema Cepheid SmartCycler Sustancias que producen interferencia contraindicaciones de uso Los siguientes compuestos fueron analizados a concentraciones cl nicamente relevantes y se comprob que no inhiben el ensayo acetilciste na anfotericina dipropionato de beclometasona budesonida colistimetato s dico propionato de fluticasona fumarato de formoterol dihidrato bromuro de ipratropio lidoca na manitol sulfato de salbutamol salmeterol Septrin trimetoprima sulfametoxazo cloruro s dico cromoglicato s dico terbutalina y tobramicina El DNA
28. sultados del experimento gt Compruebe en las dos secciones de an lisis si la compensaci n de color est activada y si se ha aplicado el mismo archivo MycAssay CC en los dos canales 4 7 La l nea base para determinadas muestras coincide con el control negativo indicando que no se ha producido ninguna amplificaci n No obstante el software ha presentado un valor Cp positivo como muestra la figura inferior La emisi n de un valor Cp positivo para una gr fica de amplificaci n negativa s lo se ha producido dos veces en 154 reacciones negativas realizadas durante los estudios de validaci n gt Si esto ocurre repita el an lisis de la s muestra s para confirmar el resultado Negativo Amplilication Curves 1 37 1 2 no Cp reported a113 33 2 Fivorescence 530 o o opoopooop o 1920 21 2 23M 253 2 Cyales Sarpin E Meg Spanish 11 030 170 Versi n 1 3 24FEB12 MycAssay Pneumocystis Para el uso diagn stico in vitro para Roche LightCycler 2 0 Muestras Respiratorias 4 8 Al aplicar el objeto CC algunos valores en el canal 560 IAC se reducen y aparecen valores Cp que se encuentran fuera del rango aceptable Amplification Curves Esto es totalmente normal para las reacciones que contienen concentraciones elevadas de DNA diana y no interferir en la interpretaci n de los resultados del paciente gt Siga el procedimiento de an lisis normal ver que para las muestras positivas par
29. tema LightCycler 2 0 El kit se valid inicialmente utilizando el sistema Cepheid SmartCycler Ciertas afirmaciones sobre el rendimiento del ensayo se volvieron a validar con la plataforma LightCycler 2 0 de Roche utilizando tubos capilares de vidrio de 20 uL Roche n de cat logo 04929292001 11909339001 y se describen a continuaci n En los casos en los que no se esperaba que las diferencias entre las plataformas afectaran al rendimiento del ensayo y por consiguiente a la afirmaci n relativa al rendimiento el estudio no se repiti Estos resultados obtenidos utilizando la plataforma SmartCycler se consideran transferibles a la plataforma LightCycler 2 0 Sensibilidad anal tica Con el protocolo anteriormente descrito y una mol cula de DNA recombinante de Pneumocystis generada en Myconostica se determin un l mite de detecci n LoD limit of detection para Pneumocystis de lt 30 copias Este valor se determin usando un pl smido de DNA recombinante que conten a la secuencia diana Dado que la secuencia diana de Pneumocystis es mitocondrial existir n numerosas copias por c lula pero se desconoce el n mero 030 170 Versi n 1 3 24FEB12 Spanish 12 Para uso diagn stico in vitro MycAssay Pneumocystis Muestras Respiratorias para Roche LightCycler 2 0 Selectividad anal tica La selectividad anal tica se analiz usando DNA extra do de diversas especies f ngicas y no f ngicas Las siguientes especies no pre
30. ue les permite emitir 1 Morris A Lundgren JD Masur H Walzer PD Hanson DL Frederick T Huang L Beard CB Kaplan JE 2004 Current epidemiology of Pneumocystis pneumonia Emerg Infect Dis 10 1713 20 Miller RF Allen E Copas A Singer M Edwards SG Improved survival for HIV infected patients with severe Pneumocystis jirovecii pneumonia is independent of highly active antiretroviral therapy Thorax 2006 61 716 21 3 Kovacs JA Gill VJ Meshnick S Masur H 2001 New insights into transmission diagnosis and drug treatment of Pneumocystis carinii pneumonia JAMA 286 2450 60 Huang L Morris A Limper AH Beck JM ATS Pneumocystis Workshop Participants An Official ATS Workshop Summary Recent advances and future directions in pneumocystis pneumonia PCP Proc Am Thorac Soc 2006 3 655 64 Tyagi S Kramer FR 1996 Molecular beacons Probes that fluoresce upon hybridization Nature Biotechnology 14 303 308 Spanish 1 030 170 Versi n 1 3 24FEB12 MycAssay Pneumocystis Para el uso diagn stico in vitro para Roche LightCycler 2 0 Muestras Respiratorias fluorescencia La cantidad de fluorescencia en cualquier ciclo dado o despu s del ciclo depende de la cantidad de amplicones espec ficos que est n presentes en ese momento El sistema Roche LightCycler 2 0 mide simult neamente la fluorescencia emitida por cada baliza Precauciones El kit sirve para el diagn stico in vitro El kit est dise ado para ser usado ex
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