MutaCHIP ARTERO - bei Immundiagnostik
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1. ErrorCode 3011 Keep Esc pressed for 3 seconds and plug in the reader in the right manner please refer to the user manual of the PGDx System Poor image quality Clean the bottom side of the MutaCHIP using a cotton swab or a cloth wet with disinfectant Repeat the photograph it can be necessary to repeat this procedure several times Blurred picture Carefully clean the camera with a cotton swab 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 04 12 20122. The MutaCHIP is designed for the use with the MAAT and the software provided by PharmGenomics Perform all steps in a timely manner Keep all stock solutions cooled while working Always open the MutaCHIP with both hands Do not apply pressure to the tube 9 Sample Collection The template for PCR amplification is genomic DNA from EDTA whole blood The DNA concentration should be between 15 and 30 ng uL The minimum DNA purity A260 A280 ratio should be higher than OD 260 280 1 8 For the assay high molecular freshly extracted DNA has to be used 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 04 12 2012 Sample Collection 10 Test Procedure 10 1 PCR Product Generation e Before starting make sure that all working surfaces and utilized devices are decontaminated e Prepare all components of the kit required for the procedure of the PCR e Subsequently perform the PCR according to the protocol listed below e For the amplification of target DNA three PCR reactions per sample are required one for each mastermix Those are pipetted as described in the following tables PCR Mix A PCR Mix A green lid 12 6 uL PCR Buffer incl Polymerase 12 5 uL PCR Mix B PCR Mix C PCR Mix C red lid 11 0 uL PCR Buffer incl Polymerase 12 5 uL The samples are placed in the Thermocycler and the program described in 10 2 is to be applied 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 04 12 2012 10 2 PCR Protocol Th
3. an acute blockage caused by the formation of a thrombus or blood clot which can lead to a myocardial infarction or stroke Risk factors of atherosclerosis are environmental factors like nutrition rich in fat nicotine consumption lack of movement and infection In addition there a several factors with a strong genetic component like increased LDL VLDL low density and very low density 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 lipoproteins decreased HDL high density lipoprotein high blood pressure increased haemostatic factors increased homocysteine diabetes adiposity and gender Genomic epidemiologic studies have identified candidate genes showing a significant or suggestive disease association The following single nucleotide polymorphisms SNP and variations can be associated with the development of atherosclerosis and its resulting complications See Application By genotyping those patients can be identified who have an increased risk to develop atherosclerosis or its resulting complications This will allow an early prevention and intervention In addition the differentiation of the varying forms of the disease is possible which will allow an individualized therapy References Lusis A J Atherosclerosis Nature 407 2000 233 241 Libby P Ridker P M Hansson G K Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis Nature 473 2011 317 325 3 Concept of the Assay To analyse the mut
4. results see following chapter 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 11 Evaluation and Interpretation of Results The evaluation is performed using the MAAT and the ARTERO Genotyping Software The results are compiled with help of the software into a report For the evaluation of the chip follow the short instructions below For further and detailed information please refer to the ARTERO Genotyping Software handbook Step 1 Create a new project Click on the button New experiment Assign an arbitrary name for the experiment and subsequently save it by clicking on the button save o Creste a mem project E Gag A Local Dak C Documents PODx System POM Projects 2 EE Organza e hono foster v fe z c Patent 1 m ae Patent Lami Patest jami wer Poteet Sard Patent 6 mi mo Patwet mi wt A c LI A s File name Patient Seve ni type Extended Motup Language Daten ammi cm Hide Folder Step 2 Start the analysis proces Click on the Start button to initiate data analysis 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 04 12 2012 Evaluation and Interpretation of Results Step 3 Quality check of the chi ee 9 oe 9 e ee ESEG EE e 9 Ld e Please check the quality of the chipimage If there are dust or dirt partic
5. und nach mitgeliefertem Protokoll bearbeitet Die Analyse mittels Pr zipitationsreaktion l sst eine eindeutige Genotypisierung aller auf den MutaCHIP gespotteten Allele der verschiedenen Gene zu Das amplifizierte Produkt wird auf den MutaCHIP gegeben und bindet an den dort immobilisierten Sonden Durch einen Waschschritt werden unspezifisch gebundene Fragmente wieder entfernt Im Anschluss wird das Enzym hinzugegeben welches an den Sonden Fragment Komplex bindet Nach Zugabe des Substrats tritt eine F llungsreaktion an den Stellen an denen noch DNA gebunden ist auf Das farbige Pr zipitat wird mit dem Imagereader detektiert und von der dazugeh rigen Software ausgelesen und bewertet 4 Kitbestandteile Jedes Testkit enth lt die folgenden Reagenzien zur Durchf hrung von 20 MutaCHIP Assays sowie eine Gebrauchsanweisung PCR Mix A gr ner Deckel PCR Mix B gelber Deckel PCR Mix C roter Deckel PCR Buffer inkl Polymerase Hybridisation Buffer Washing Buffer Enzyme Mix DNA Ref 2 mL Schraubgef MutaCHIPs 1 5 mL Gef B Substrate 30 mL Plastikgef braun Gebrauchsanweisung 2012 Immundiagnostik AG Version 1 3 04 12 2012 Erforderliche Materialien 5 5 Erforderliche Materialien Ben tigte Ger te von PharmGenomics erh ltlich e Macroarray Analysing Tool MAAT Notebook ARTERO Genomics Software MutaCHIP Imagereader Thermocycler f r PCR Peglab Primus 25 advanced Thermomixer mit K hlfunktion BIOR M
6. 30 C 550 rpm f r 10 min Den Enzyme Mix vollst ndig entfemen 500 uL Washing Buffer vorsichtig auf den MutaCHIP pipettieren F Zweiter Waschschritt Den Thermoshaker auf 21 C temperieren Achtung W hrend des Herunterk hlens des Thermoshakers muss der MutaCHIP unbedingt aus dem Shaker entnommen werden e Waschen des MutaCHIPs bei 21 C 550 rpm f r 5 min G F rbung Achtung Auf korrekte Einstellung des Volumens achten Der Chip darf w hrend und nach dem F rben nicht gesch ttelt werden e Den Washing Buffer aus Schritt F vollst ndig entfernen e 100 uL Substrate in den MutaCHIP geben und f r 5 min bei 21 C inkubieren Dazu den MutaCHIP in den Thermoshaker berf hren keine Sch ttelfunktion aktivieren e Danach das Substrate wieder vollst ndig entfernen Pipette und umgehend 500 pl Washing Buffer hinzugeben e MutaCHIP in den Imagereader berf hren auf korrekte Platzierung achten Bild erstellen und mit der Analyse Auswertung beginnen siehe folgendes Kapitel 2012 Immundiagnostik AG Version 1 3 06 12 2012 11 Auswertung Die Auswertung erfolgt ber das MAAT und die ARTERO Genomics Software Die Ergebnisse werden mit Hilfe der Software in einem Report zusammengestellt F r die Auswertung des Chips folgen Sie der folgenden kurzen Anleitung F r weitere und detailliertere Informationen sehen Sie bitte im ARTERO Genomics Software Handbuch nach Schritt 1 Ein neues Projekt erstellen LL Klicken Sie auf d
7. ations a PCR is performed which amplifies the relevant genes using freshly extracted genomic DNA as template The amplification product is transferred to the MutaCHIP and is treated following the provided protocol The analysis allows distinct genotyping of all variants of the amplified genes that are spotted onto the MutaCHIP The amplified product binds onto the MutaCHIP to the immobilised probes In a washing step the unspecific fragments are removed from the surface Subsequently the Enzyme Mix is added to the MutaCHIP coupling with the probe target complex After addition of the substrate a precipitate will form This precipitate is then detected by the Image reader and the signals are evaluated by the software 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 04 12 2012 Concept of the Assay 5 4 Components Each test kit contains the following components for 20 MutaCHIP assays and the instruction manual Size of Reaction Tube or Flask PCR Mix A green lid 2 mL Reaction Tube 1 PCR Mix B yellow lid 2 mL Reaction Tube 1 PCR Mix C red lid 2 mL Reaction Tube 1 0 2 5 Materials PCR Buffer incl Polymerase 2 mL Reaction Tube Required materials that can be ordered separately from PharmGenomics e Macroarray Analysing Tools MAAT o Notebook ARTERO Genotyping Software o MutaCHIP image reader o Thermocycler Peglab Primus 25 advanced o Thermoshaker with cooling function BIOR Mixing Block MB 102 Required Materials not
8. e PCR protocol has to be established anew for each laboratory as different thermocyclers have different heating rates This establishment can be omitted when using the recommended thermocycler Peglab Primus 25 advanced The following standard protocol can be used to start the establishing process Primer Hybridisation Elongation 5 Cycles Primer Hybridisation Elongation Final Elongation Elongation 30 Cycles 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 04 12 2012 Test Procedure 9 10 3 MutaCHIP Protocol A Preparation of the Hybridisation Buffer If the Hybridisation Buffer is turbid or a precipitate can be seen it has to be heated in a microwave for several seconds 240 W or in a water bath Gently shake the Hybridisation Buffer until it gets clear to homogenise it again Before usage it has to be cooled to room temperature RT B Preparation of DNA samples e Preheat the thermoshaker to 50 C e Add 7 pL PCR product A 4 uL PCR product B und 4 uL PCR product C in a separate tube and mix by brief vortexing e Denature the mixture for 2 min at 95 C in a thermocycler e After denaturation add 90 pL Hybridization Buffer e Pipette the denatured mixture into the MutaCHIP without touching the bottom of the tube C Hybridisation e Perform the hybridisation at 50 C 550rpm for 45 min D Washing steps after Hybridisation Caution Pay attention to the correct adjustment of volume e Completely remove
9. e gesunde Variante der untersuchten genetischen Variation Der Patient tr gt auf einem Allel die gesunde und auf dem anderen Allel die mutierte genetische Variation Der Patient tr gt auf beiden Allelen die mutierte genetische Variation in homozygoter Form Die Signalwerte der Sonden f r diese genetische Variation sind zu gering um ein valides Ergebnis zu erzeugen Dies k nnte auf Sequenzver nderungen in direkter N he zur untersuchten Variation hindeuten Die anderen Signale werden jedoch durch den Ausfall nicht beeintr chtigt Beide Sonden f r diese genetische Variation erzeugen ein nicht g ltiges Signal Dies k nnte auf eine Verschmutzung auf der Chipoberfl che zur ckzuf hren sein Die anderen Signale werden jedoch durch den Ausfall nicht beeintr chtigt 2012 Immundiagnostik AG Version 1 3 04 12 2012 Auswertung 13 Schritt 5 Diagnostischer Report Um die Daten auszuwerten lassen Sie sich den diagnostischen Report anzeigen Klicken Sie hierf r auf die Schaltflache Report Zusatzlich k nnen Sie auch ein pdf Dokument erstellen oder den Report direkt ausdrucken JI E http localhost PGDx System diag Rep Tamox Rep Ov BGX JD Edit View Favorites Tools Help Bm PGDx System Diagnostic R X m New tab Ctrl T Duplicate tab Ctrl K New window Ctri N New session Open Ctrl O Edit with Notepad Save Save as Ctrl S Close tab Ctrl W Page setup Print Ctrl P P
10. en Sie ein weiches Tuch das mit Desinfektionsmittel angefeuchtet ist Wiederholen Sie das Foto es kann notwendig sein diesen Schritt mehrfach zu wiederholen Unscharfes Bild Reinigen Sie vorsichtig die Kamera mit einem Tuch oder einem Wattstabchen 2012 Immundiagnostik AG Version 1 3 04 12 2012 MutaCHIP ARTERO DNA Macroarray Kit for the Analysis of Genetic Predisposition of Atherosclerotic Cardiovascular Diseases For in vitro diagnostics only C Eee N 4o SN KF390009 on Immundiagnostik AG Stubenwald Allee 8a 64625 Bensheim Germany www immundiagnostik com Tel 49 0 6251 701900 info immundiagnostik com Fax 49 0 6251 849430 E Content b Application Introduction Concept of the Assay Components Materials Storage and Shelf life Working Conditions Considerations and Precautions Sample Collection y O O O Oo a C A Q CO Test Procedure PCR Product Generatlon e etre esci onu tede eee ete oa eaaa aaa Haiei 7 PCR doloe IRAPERERFSBEFFFERPPPFELREERFTFECBELETEEEPETTERSPEETTETBERFLEFEREFFTECFELFERERTREFFELEFERETETLTCEEFERTRERTFETTFEER 8 Muta CHIP Protocol BERRRESHEREFERERRESFFEHREFFERTERHERPEEBEFERFECREEESEEHFEEEEUEEECEREETEFEESFREEUFEEDEPEEFPEFRELEFEEEEFFR 9 on O O O N O A A C N Evaluation and Interpretation of Results 10 N Trouble shooting 14 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 Application 3 1 Applicatio
11. gt Starte Ge pesierung M Analysefortschritt After the complete data analysis the results can be access in the analysis module genotyping module or in the diagnostic report The used icons are explained in the following table Symbole der Software und ihre Bedeutung The patient carries on both alleles the healthy variant of the investigated genetic variants The patient carries on one allele the healthy and on the other allele the mutated genetic variant The patient carries on both alleles the mutated genetic variation in homozygous form The signal values of the probes for this genetic variation are too weak for a valid result This could be caused by other sequence variations in close proximity to the investigated variant The remaining signals of the assay are not influenced Both probes for this genetic variant show an invalid signal This might be caused by impurities or dust particles on the MutaCHIP surface The remaining signals of the assay are not influenced 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 04 12 2012 Evaluation and Interpretation of Results 13 Step 5 Diagnostic report To evaluate the results open the diagnostic Report Main Therefore click on the button Report Additionally a pdf document can be created or the report can be directly printed SE http localhost PGDx System diag Rep Tamox Rep O B C X i PGDx System Diagnostic R X jum DE Edit View Favorite
12. hriften und Grunds tze f r molekularbiologisches Arbeiten m ssen eingehalten werden Der Test ist zur Verwendung mit frisch extrahierter genomischer DNA aus EDTA Vollblut als Ausgangsmaterial geeignet Nur dann k nnen optimale Ergebnisse sichergestellt werden Mischen Sie keine Reagenzien aus unterschiedlichen Lots Die MutaCHIPs sind o nur fur den Einmalgebrauch bestimmt o nur zur in vitro Diagnostik zu verwenden Der MutaCHIP darf w hrend den Arbeitsschritten nicht austrocken Der MutaCHIP ist f r den Gebrauch mit dem MAAT und der dazugeh rigen Software von PharmGenomics ausgelegt Die Arbeitsschritte z gig durchf hren Alle Ausgangsl sungen w hrend des Arbeitens k hlen Das MutaCHIP Gef B mit zwei H nden ffnen Dabei ist darauf zu achten dass kein Druck auf den MutaCHIP ausge bt wird 9 Probengewinnung Als Matrize f r die PCR Amplifikation dient genomische DNA aus EDTA Vollblut Die DNA Konzentration sollte zwischen 15 30ng ul liegen Die Reinheit OD260 280 der DNA sollte h her als 1 8 sein F r den Assay darf nur hochmolekulare frisch extrahierte DNA verwendet werden 2012 Immundiagnostik AG Version 1 3 04 12 2012 Probengewinnung 10 Testdurchf hrung 10 1 PCR Produktherstellung e Vor Beginn der Arbeiten sollte sichergestellt sein dass die Arbeitsfl chen und eingesetzten Ger te dekontaminiert sind e Die Komponenten des Kits die zur Durchf hrung der PCR ben tigt werden bere
13. ie Schaltfl che Neues Experiment Vergeben Sie einen beliebigen Namen f r das Experiment und speichern Sie es anschlie end indem Sie auf die Schaltfl che Speichern klicken EE Ansichten v BE Neuer Ordner Name nderungsdatum Typ Patient 1 xml Patient 2 xml Patient 3 xml Mi Computer E Dokumente IE Bilder Patient 5 xml I Musik j Zuletzt ge ndert Patient 6 xml Patient 7 xml B Suchvorg nge Ji ffentlich Ordner Dateiname Neues Experiment Dateityp Extended Markup Language Daten xml Ordner ausblenden Schritt 2 Analyseprozess starten ais Klicken Sie auf die Schaltfl che Start um die Datenanalyse zu starten 2012 Immundiagnostik AG Version 1 3 04 12 2012 Auswertung Schritt 3 Qualit tspr fung des MutaCHIPs berpr fen Sie die Bildqualit t E E se Bitte berpr fen Sie die Qualit t des Bildes Falls Staubpartikel auf dem Bild zu erkennen sind entfernen sie diese bitte da sonst m glicherweise die Auswertung beeintr chtigt werden k nnte Um Staubpartikel zu entfernen s ubern Sie bitte die Unterseite des Chips mit einem weichen und feuchten Tuch Dr cken Sie anschlie end auf Bild erneut aufnehmen um den Aufnahmevorgang zu wiederholen Klicken Sie auf Analyse fortsetzen wenn Sie ein qualitativ einwandfreies Bild sehen Neues Bid Um ein einwandfreies Analyseergebnis zu erhalten mu
14. itstellen Zur Amplifikation der Ziel DNA werden drei PCR Ans tze pro Probe ben tigt f r jeden Primer Mix einer Diese werden wie in folgenden Tabellen beschrieben pipettiert PCR Mix A Bestandteil Volumen pro 29 1 uL Reaktionsansatz PCR Mix A gr ner Deckel 12 6 uL PCR Buffer inkl Polymerase 12 5 uL PCR Mix B PCR Mix C Bestandteil Volumen pro 27 5 uL Reaktionsansatz PCR Mix C roter Deckel 11 0 uL PCR Buffer inkl Polymerase 12 5 uL Die Proben in den Thermocycler stellen und das in 10 2 beschriebene PCR Protokoll verwenden 2012 Immundiagnostik AG Version 1 3 04 12 2012 10 2 Probenzusammenf hrung und Verd nnung Das PCR Protokoll muss f r jedes Labor erneut etabliert werden da die verschiedenen Thermocycler unterschiedliche Heizraten haben Diese Etablierung entf llt wenn der empfohlene Thermocycler verwendet wird Peqlab Primus 25 advanced F r die Etablierung kann mit dem folgenden Standard Protokoll begonnen werden Primer Hybridisation Elongation 5 Zyklen 30 Zyklen Primer Hybridisation E 5 Zyklen Elongation E oo 2012 Immundiagnostik AG Version 1 3 04 12 2012 Testdurchf hrung 9 10 3 MutaChip Protokoll A Vorbereitung des Hybridisierungspuffers Falls der Hybridisation Buffer tr b oder flockig geworden ist kann dieser f r wenige Sekunden in der Mikrowelle 240 W oder in einem Wasserbad erw rmt und durch Schwenken homogenisiert werden bis er
15. ixing Block MB 102 O O O O Ben tigte Ger te und Verbrauchsmaterialien nicht mitgeliefert e Pipetten o 01 25uL o 0 5 10 uL o 10 200 uL o 100 500 uL e 0 2 ml PCR Gef e steril 6 Lagerung und Haltbarkeit e Alle Komponenten sind bei 2 8 C zu lagern e Das Substrat ist unbedingt vor Lichteinwirkung zu sch tzen m Inneren des Beutels befinden sich 5x MutaCHIPs mit jeweils ge ffnetem Deckel Wenn ein Lichtschutzfolien Beutel ge ffnet wurde m ssen die Deckel der darin verbleibenden MutaCHIPs unbedingt ge ffnet bleiben da das Schutzgas entweicht e Die MutaCHIPs k nnen im wieder lose nicht luftdicht verschlossenen keine Klebestreifen verwenden Lichtschutzfolien Beutel mehrere Wochen bei Raumtemperatur RT gelagert werden Dabei einen dunklen und trockenen vor Feuchtigkeit sch tzen Ort zur Aufbewahrung ausw hlen Um selbst minimale Performanceverluste zu vermeiden empfehlen wir jedoch den Verbrauch eines ge ffneten MutaCHIP Beutels m glichst innerhalb von zwei Wochen e Die MutaCHIPs sind gegen direkte Sonneneinstrahlung und Staub zu sch tzen 7 Arbeitsbedingungen e Die MutaCHIPs d rfen niemals zentrifugiert werden e Die Oberfl che des MutaCHIPs darf nicht mit der Pipettenspitze ber hrt werden Der MutaCHIP darf nur mit den im Protokoll erw hnten Substanzen verwendet werden 2012 Immundiagnostik AG Version 1 3 04 12 2012 pup e 8 Hinweise und Vorsichtsma nahmen Die Vorsc
16. les lon the chip surface clean the the bottom of the reaction tube carefully with a cloth and destilled water and click on the Take a new picture button To ensure a correct analysis result the picture quality of the MutaCHIP has to be checked Particles of dust on the bottom side of the MutaCHIP can affect the analysis These can be removed by cleaning with a soft and wet tissue Follow the instructions given in the screen shown here Press Continue analysis if the quality of the picture is comparable to the figure above 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 04 12 2012 uu Step 4 Genotyping results M BE E HE CR prr Experiment Extras Hilfe Procite Acsywemod4 Repotmod PhamGereme er Sa gt 7 H e en _PharmGenomics Patiert Tami individualised therapies Patient Kam Patert Gomi Patent Smi S CYP2D6 Genotypisierungstest Homozygot Homozygot n Wildlyp ewe Mutation 3 o 4 A 6 o 7 a 3 9 o 10 o 1 o Analyseprotokoll 7 o gt gt Waxommen bem PharmGenomcs D agnosbc Syste 29 o 2011 145933 emodus Rohdatenanalyse 41 9 ONO CYP2DE Bider Charge E 5 Keine Gen Delebon detekbert gt Stan formation E gt gt 207 Spots erfasst N Keine Gen Duplikation detektiert Spots zugeordnet gt gt Erfasse Signalstarke gt gt Genenere Rohdaten gt gt Starie Normalisierung Genolypisierung abgeschlossen schlossen I gt
17. mmun E MutaCHIP ARTERO DNA Makroarray Kit f r die Untersuchung der genetischen Pr disposition von arteriosklerotischen sowie kardiovaskul ren Erkrankungen Nur f r in vitro Diagnostik C Ed Yo SN KF390009 re Immundiagnostik AG Stubenwald Allee 8a 64625 Bensheim Germany www immundiagnostik com Tel 49 0 6251 701900 info immundiagnostik com Fax 49 0 6251 849430 E re Inhaltsverzeichnis Verwendungszweck Einleitung Testprinzip Kitbestandteile Erforderliche Materialien Lagerung und Haltbarkeit Arbeitsbedingungen Hinweise und Vorsichtsma nahmen Probengewinnung N Oo Ci CI Ci RA FP WO CO Testdurchf hrung PCR Produktherstellurg 1 211i iiiceeee eril ee ana alas 7 Probenzusammenf hrung und Verd nnung eeeeeeeeee nennen nennen nnne nnn 8 MutaChip Protokoll 2 12 2 2222222 oce eic ccc ecco cce ce cue cecececic ee zeeooculepeeliclrellcecIeeionnes reci 9 on O O N O OO A W N Auswertung 10 N Troubleshooting 14 2012 Immundiagnostik AG Version 1 3 Verwendungszweck 3 1 Verwendungszweck Der MutaCHIP ARTERO Test ist ein molekularbiologischer Test zur Untersuchung von Mutationen in Genen die zu kardiovaskul ren Erkrankungen f hren k nnen Die untersuchten Genvarianten stehen im Zusammenhang mit Genen die den Blutdruck die Lipid Balance den N hrstoffmetabolismus Ent
18. n The MutacHiP9 ARTERO Test is a biomolecular test for the analysis of mutations in marker genes which can lead to atherosclerotic cardiovascular diseases The analyzed gene variations are associated with genes which regulate blood pressure lipid balance nutrient metabolism and oxidative stress For this purpose genomic DNA is analyzed using MutaCHIP technology Cys112Arg Cys158Arg Cholesterol metabolism and TaqiB regulation CETP Val405lle Asp442Gly SelE Ser128Arg Methylation Homocysteine C677T ApoE GNB3 C825T High blood pressure AGT Met235Thr AGTR1 A1166C Faktor Il G20210A Coagulation Faktor V Leiden Arg506Gin C1565T Coagulation PAI I 4G 5G 2 Introduction Atherosclerosis is a progressive disease characterized by the accumulation of lipids and fibrotic elements in the arteries The early atherosclerotic lesions are made up of subendothelial accumulations of fat containing macrophages so called foam cells These lesions also called fatty streaks can be detected in the aorta and with increasing age also in the coronary and cerebral arteries The fatty streaks are the precursors of advanced lesions which are characterized by the accumulation of lipid rich necrotic debris and smooth muscle cells These plaques can become more complex by calcium inclusion ulcer formation and bleedings Although these accumulation can become large enough to inhibit the blood flow the most important clinical complication is
19. n fettreiche Ern hrung Nikotinkonsum Bewegungsmangel und Infektionen Dar ber hinaus gibt es eine Reihe von Faktoren mit einer starken genetischen Komponente wie erh htes LDL VLDL low density und very low density Lipoprotein verringertes HDL high density Lipoprotein Bluthochdruck erh hte h mostatische Faktoren erh htes Homocystein Diabetes mellitus Adipositas und das Geschlecht Genomisch epidemiologische Studien haben Kanditatengene 2012 Immundiagnostik AG Version 1 3 06 12 2012 identifiziert die eine signifikante oder suggestive Erkrankungsassoziation aufzeigen Folgende Einzelnukleotid Polymorphismen SNP und Variationen konnten mit der Entstehung von Arteriosklerose und deren Folgeerkrankungen assoziiert werden siehe Abschnitt 1 Durch eine Genotypisierung k nnen diejenigen Personen erkannt werden die ein erh htes Risiko haben an Atherosklerose und deren Folgeerscheinungen zu erkranken Dies erm glicht eine fr he Pr vention und Intervention Referenzen Lusis A J Atherosclerosis Nature 407 2000 233 241 Libby P Ridker P M Hansson G K Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis Nature 473 2011 317 325 3 Testprinzip Zur Analyse der Mutationen werden die variablen Bereiche der unterschiedlichen Gene mittels PCR amplifiziert wobei frisch extrahierte genomische DNA des Patienten als Matrize dient Das Amplifikationsprodukt wird anschlieBend auf den MutaCHIP gegeben
20. provided e pipettes o 01 25uL o 05 10yuL o 10 200 uL o 100 500 uL e 0 2 mL PCR tubes sterile 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 04 12 2012 6 Storage and Shelf life All components are stored at 2 8 C The substrate has to be strictly protected against light exposure The bags contain each 5x MutaCHIPs with open lids After unsealing a bag the lids of the remaining MutaCHIPs have to remain open as the protection gas escapes The MutaCHIPs can be stored in the loosely not airtight closed do not use tape light protection bag up to several weeks and room temperature RT For storage choose a dry and dark place To avoid even minimal loss of performance we recommend using up one bag of MutaCHIPs within two weeks The MutaCHIPs have to be protected against direct exposure to sunlight and dust and dust 7 Working Conditions Never centrifuge the MutaCHIPs Do not touch the surface of the MutaCHIPs with a pipette Use only substances that are mentioned in the protocol 8 Considerations and Precautions The guidelines and principles for working in a biomolecular laboratory have to be followed The test is suitable for genomic DNA freshly extracted from whole EDTA blood as starting material Only then optimal results are guaranteed Do not mix reagents from different lots The MutaCHIPs are o for single use only o only for in vitro diagnostics Do not let the MutaCHIP dry out while performing the analysis
21. rint preview Send gt Import and export Properties Work offline Exit rmGenomics GenoChip Ta S Result Sample Type of sample Draw date Processing date Report date 05 07 2011 Results and Interpretation gem Print General Options Select Printer B Add Printer let PDFCreator Status Ready Location Comment ElPinttofle Freerences eDoc Printer Page Range eA Number of copies Selection Current Page Pages 1 Collate Bn Enter either a single page number or a single 12 page range For example 5 12 9m Boot Defective CYP2D6 alleles detected 2012 Immundiagnostik AG Version 1 3 04 12 2012 12 Troubleshooting Software Meldung Warnung Die Pr fen Sie das Enzym und oder Substrat Signale des Biotinreferenzmarkers sind zu Wiederholen Sie den Assay mit neuem niedrig Dies kann ein Zeichen f r einen Enzym Substrat fehlgeschlagenen oder nicht ausgef hrten Konjugationsschritt sein oder das Enzym ist nicht mehr funktional Das System muss gestoppt werden Software Meldung keine Fehlerangabe Der Reader ist nicht richtig angeschlossen ErrorCode 3011 Halten Sie Esc f r 3 Sekunden gedr ckt und schlieBen Sie den Reader in der richtigen Art und Weise an bitte wenden Sie sich an das Benutzerhandbuch des PGDx Systems Schlechte Bildqualitat Reinigen Sie die Bodenunterseite des ArraygefaBes Benutz
22. s Tools Help New tab Ctrl T New window CtrleN New session General Options Open Ctrl 0 Select Printer Edit with Notepad i Add Printer H i PDFCresto J rmGenomics GenoChip Ta EPDE Crestor Save as Ctrl S Close tab Ctrl W reg S Result Se Reody El Pitto tie Location Print Ctrl P Comment eDoc Printer Print preview pem 7 Sample Page Range Al Number of copies 1 Import and export Type of sample Selection Current Page Properties Draw date Pages 1 poss 3 3 Work offline Processing date Enter either 2 angle page number ora single P PF Exit Report date 05 07 2011 CETE Results and Interpretation Defective CYP2D6 alleles detected 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 04 12 2012 12 Trouble shooting en S m Software Message Warning The Check enzyme and or substrate signals of the biotin reference markers Repeat the assay with new enzyme are too low This could be a sign of a substrate failed or missed conjugation step Alternatively the enzyme could be degraded The system will be stopped Software Message Warning The Please read paragraph 11 1 signals of the DNA probes indicate a failed amplification However there might be a homozygous deletion of the CYP2D6 gene Please refer to the handbook under section Detection of 5 homozygous Software Message No error The reader is not plugged in properly description
23. ss zun chst die Bildqualit t des MutaCHIPs berpr ft werden Staubpartikel auf der Unterseite des MutaCHIPs k nnen die Analyse beintr chtigen Diese k nnen durch das s ubern mit einem weichen und feuchten Tuch entfernt werden Klicken Sie auf die Schaltfl che Analyse fortsetzen falls die Bildqualit t der in der oberen Abbildung entspricht 2012 Immundiagnostik AG Version 1 3 04 12 2012 E Schritt 4 Genotypisierungsergebnisse ir PharmGencersci Degnoiti System TR Ep E er et See Experiment Extras Hilfe en Procite Anamo Reportmod Pram nnemen Ir J N Pavert Sani zz 5 E zs Homes PharmGenomics Patert Tl individualised therapies Paket Sam Papert Gam Patent Earl EN S CYP2D6 Genotypisierungstest Homozygot Homozygot e Wildlyp Mutation 3 o 4 A 6 o 7 L3 3 9 9 o 10 o n 9 Analyseprotokoll 7 o men bem PharmGenomics D agnosbc Syste 29 o 11145933 Analysemodus Rohdatenanalyse 4 o ohdaten Q JCONO CYP2D6 B deriCharge 5 Keine Gen Delebon detekbert N Keine Gen Duplikation detektiert Genotypisierung abgeschlossen Analysefortscheitt Nach der vollst ndigen Datenanalyse k nnen Sie die Ergebnisse im Analysemodul Genotypisierungsmodul oder im Diagnosebericht abrufen Die dabei verwendete Symbole werden in der unten stehenden Tabelle erl utert Symbole der Software und ihre Bedeutung Der Patient tr gt auf beiden Allelen di
24. the Hybridisation Buffer from step C e Add carefully 500 uL of Washing Buffer onto the MutaCHIP e Wash the MutaCHIP at 550 rpm and 50 C for 5 min E Enzyme conjugation Set the thermoshaker to 30 C Note During the cooling period the MutaCHIP has to be removed from the termoshaker The Washing Buffer has to remain on the MutaCHIP until the target temperature is reached Caution Pay attention to the correct adjustment of volume e Completely remove the Washing Buffer from step D Add 100 pL of Enzyme Mix to the MutaCHIP Incubate the MutaCHIP at 550 rpm and 30 C for 10 min Completely remove the Enzyme Mix from step Add of 500 uL Washing Buffer to the MutaCHIP F Washing step after Enyzme conjugation Set the thermoshaker to 21 C Note During the cooling period the MutaCHIP has to be removed from the termoshaker e Wash the MutaCHIP at 550 rpm and 21 C for 5 min G Precipitation Caution Pay attention to the correct adjustment of volume Do not shake the MutaCHIP during the precipitation e Completely remove the Washing Buffer from step F e Add 100 uL of Substrate to the MutaCHIP and incubate for 5 min at 21 C To do so put the MutaCHIP into the thermoshaker Do not activate shaking function e Thereafter remove the Substrate completely pipette and immediately add 500 uL of Washing Buffer e Place the MutaCHIP into the image reader pay attention to the correct orientation take a picture and start with the analysis evaluation of the
25. wieder klar ist Vor dem Verwenden muss der Puffer auf Raumtemperatur RT abgek hlt werden B Vorbereitung der DNA Proben e Thermoshaker auf 50 C vorheizen e 5 uL PCR Produkt A 4 uL PCR Produkt B und 4 uL PCR Produkt C in ein frisches PCR Reaktionsgef B berf hren und kurz vortexen e Die so vorbereitete Probe f r 2 min bei 95 C denaturieren e Anschlie end die denaturierte Probe mit 90 uL Hybridisation Buffer auff llen und durch auf und abpipettieren mischen e Das Gemisch vollst ndig in den MutaCHIP berf hren ohne dabei den Boden des MutaCHIPs zu ber hren C Hybridisierung e Hybridisieren der Probe bei 50 C 550rpm f r 45 min D Waschschritte nach der Hybridisierung Den Thermoshaker auf 50 C temperiert lassen Achtung Auf korrekte Einstellung des Volumens achten e Den Hybridisation Buffer aus Schritt C vollst ndig entfernen e 500 uL Washing Buffer vorsichtig auf den MutaCHIP pipettieren e Waschen des MutaCHIPs bei 50 C 550 rpm f r 5 min E Enzymkonjugation Den Thermoshaker auf 30 C temperieren Achtung W hrend des Herunterk hlens des Thermoshakers muss der MutaCHIP unbedingt aus dem Shaker entnommen werden Der Washing Buffer muss auf dem MutaCHIP verbleiben bis die Zieltemperatur erreicht ist Achtung Auf korrekte Einstellung des Volumens achten e Den Washing Buffer aus Schritt D vollst ndig entfernen 100 uL Enzyme Mix vorsichtig auf den MutaCHIP pipettieren Konjugation des MutaCHIPs bei
26. z ndungen und Oxydativen Stress regulieren F r diesen Test wird genomische DNA mittels DNA Makroarray Technologie untersucht Cys112Arg Cholesterin Metabolismus Taq1B und Regulation CETP Val405lle Asp442Gly Ser128Arg Methylierung Homocystein C677T GNB3 C825T Bluthochdruck O Met235Thr Faktor Il G20210A Faktor V Leiden Arg506Gin Gerinnung C1565T PAI I 4G 5G Oxidierung CYBA 8 Cys242Thr 2 Einleitung Arteriosklerose ist eine progressive Krankheit charakterisiert durch die Ansammlung von Lipiden und fibrotischen Elementen in den Arterien Die fr hen arteriosklerotischen L sionen bestehen aus subendothelialen Akkumulationen von fetthaltigen Makrophagen sogenannten Schaumzellen Diese L sionen auch fatty streaks genannt k nnen in der Aorta und mit fortschreitendem Alter auch in den koronaren und den zerebralen Arterien nachgewiesen werden Die fatty streaks sind Vorl ufer von fortgeschrittenen L sionen die durch die Akkumulation von Lipid reichem nekrotischem Debris und glatten Muskelzellen charakterisiert sind Diese Plaques k nnen durch Kalkeinlagerungen Geschw rbildung und Blutungen zunehmend komplexer werden Obwohl diese Ansammlungen ausreichend grof werden k nnen um den Blutfluss zu stoppen ist die wichtigste klinische Komplikation eine akute Verstopfung durch die Bildung eines Embolus der zu einem Herzinfarkt oder Schlaganfall f hren kann Zu den Risikofaktoren von Arteriosklerose z hlen Umweltfaktore
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