LM DNA Kit Product Insert
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1. o N o amplifica o Po o Lo E ADN bifilamentar mm Brilhante ADN monofilamentar mma menos brilhante Banda primer P gina 8 de 8 LC1287CEPT 3 02 142. lise por software Para a an lise manual o resultado dos testes Nulo 1 ou 2 identifica a presen a ou aus ncia de alelos nulos espec ficos O resultado dos kits de tipagem LIFECODES SSO de locus espec fico correspondentes pode conter ambiguidades envolvendo estes alelos nulos p ex A 24 02 24 09N B 51 01 51 11N C 04 01 04 09N DRB4 01 03 DRB4 01 03 01 02N ou DRB5 01 02 DRB5 01 08N Se o alelo nulo for identificado com o produto Nulo todas as combina es de alelos que n o incluam o alelo nulo podem ser eliminadas dos resultados obtidos com o kit de tipagem LIFECODES SSO de locus espec fico correspondente Se o alelo nulo estiver ausente com base no resultado do produto Nulo todas as combina es de alelos que incluam o alelo Nulo podem ser eliminadas dos resultados obtidos com o kit de tipagem LIFECODES SSO de locus espec fico correspondente No folheto informativo do produto e no software este processo de combina o dos resultados dos dois produtos referido como fus o dos resultados REAGENTES A Identifica o Consultar a listagem completa dos n meros do cat logo nos quadros na sec o Reagentes por N mero de Cat logo B Avisos e precau es 1 Para utiliza o de diagn stico in vitro 2 Devem ser designadas pipetas separadas para manipula es Pr PCR assim como para manipula es P s PCR P gina 2 de 8 LC1287CEPT 3 02 14 3 Risco biol gico todas as amostras biol gicas e de sangue devem ser trat
3. ximo de 100 popula es diferentes atrav s do Instrumento Luminex uma vez que cada popula o de microesferas pode ser distinguida pela sua assinatura ou cor de fluoresc ncia nica Uma sonda SSO diferente pode estar ligada a cada microesfera de cor Por esse motivo uma mistura de v rias sondas pode ser distinta uma da outra em virtude da sua associa o com microesferas de cores espec ficas O Instrumento Luminex consegue tamb m quantificar as quantidades relativas de produto de PCR marcado que hibridiza com cada Microesfera Luminex Por conseguinte o sinal relativo obtido com as sondas SSO no ensaio LIFECODES bem como com outros m todos SSOP pode ser utilizado para atribui o das sondas que tenham reactividade positiva ou negativa com a amostra de ADN amplificada consultar a sec o Resultados O que por sua vez fornece a informa o necess ria para determinar o fen tipo HLA da amostra HLA C resolvendo a ambiguidade al lica entre A 24 02 24 09N B 51 01 51 11N e C 04 01 04 09N O Nulo 2 utilizado como teste complementar para aumentar a resolu o do teste LIFECODES HLA DRB3 4 5 resolvendo a ambiguidade al lica entre DRB4 01 03 DRB4 01 03 01 02N e DRB5 01 02 DRB5 01 08N A fus o da informa o do teste Nulo 1 ou 2 com os resultados do Kit de Tipagem LIFECODES SSO correspondente espec ficos do locus com o objectivo de gerar uma tipagem sugerida de uma amostra pode ser feita atrav s de uma an lise manual ou de uma an
4. 100 C e uma precis o m nima de 0 5 C As condi es para os cicladores t rmicos poder o ter de ser alteradas de forma a optimizar os perfis Para obter um perfil t rmico contactar o Servi o T cnico atrav s do n mero 203 328 9500 ou 888 329 0255 COLHEITA E PREPARA O DA AMOSTRA A O ADN humano pode ser purificado a partir de Sangue total Buffy coats e Esfrega os bucais utilizando um m todo validado que cumpra os crit rios adiante indicados O ADN extra do de sangue preservado em EDTA e em ACD Acido c trico citrato de s dio e dextrose foi testado tendo demonstrado resultar neste ensaio O ADN extra do de sangue preservado em heparina n o pode ser utilizado neste ensaio N o foram testados outros conservantes O ADN isolado deve estar em 10 mM TRIS pH 8 0 9 0 ou em gua livre de nuclease Caso esteja presente um agente quelatante como EDTA a concentra o final do agente quelatante n o deve exceder 0 5 mM A presen a de lcool detergentes ou sais pode afectar de forma adversa a amplifica o de ADN A concentra o final de ADN dever ser 10 200 ng ul As medi es de absorv ncia da amostra de ADN a 260 e 280 nm dever o apresentar um r cio de 1 65 para 2 0 O ADN pode ser utilizado imediatamente ap s o isolamento ou guardado temperatura de 20 C durante um ano A congela o e descongela o repetida deve ser evitada uma vez que pode resultar na degrada o do ADN PROCEDIMENTO A
5. ESSE LiFECODES Immucor Transplant Diagnostics Inc 550 West Avenue Stamford Connecticut 06902 E U A Tel 1 203 328 9500 ou 888 329 0255 n mero gratuito Fax 1 203 328 9599 WWW IMMUCOR COM Documenta o e Tradu es referentes ao Produto est o dispon veis em www Immucor com FOLHETO INFORMATIVO DO PRODUTO KITS DE TIPAGEM LIFECODES HLA Alelo Nulo para utiliza o com Luminex Para utiliza o em diagn stico in vitro NDICE Defini o dos S mbolos Instru es de Utiliza o Reagentes por N mero de Cat logo A Purifica o do ADN gen mico Utiliza o Prevista B Amplifica o Resumo e Explica o C Hibridiza o Princ pios do Procedimento D An lise a amostra com o Instrumento Luminex 5 Reagentes Resultados A Identifica o Controlo de Qualidade B Avisos e precau es Limita o do Procedimento C Instru es de armazenamento Detec o de Avarias D Purifica o ou tratamento para utiliza o Valores Previstos E Indica es de instabilidade Caracter sticas Espec ficas de Funcionamento 7 Requisitos do Instrumento Refer ncias Colheita e Prepara o da Amostra Licen a Limitada Procedimento Marcas Comerciais Usadas A Materiais fornecidos B Materiais reagentes e equipamento Electroforese em gel necess rios mas n o fornecidos Desempenho do gel DEFINI O DOS SIMBOLOS R tulos do produto e documentos suplementares N mero do LOT N mero do Limita es de Limi
6. Materiais fornecidos Para informa es mais detalhadas consultar quadros na sec o Reagentes por N mero de Cat logo e Mistura padr o adequada MX Solu o de dilui o DS e Mistura misturas da sonda adequada BM e Quadro s dos limiares quadros dos resultados obtidos pela sonda no s tio Web B Materiais reagentes e equipamento necess rios mas n o fornecidos conforme listagem ou equivalente onmo OW e Estreptavidina SA PE conjugada com ficoeritrina PE 1mg ml e Aparelho de ultrasons Fisher Scientific N FS15 ou FS20 Lifecodes N cat 628511 e Microcentrifugadora e Estojo de fluido Luminex 1x Lifecodes N cat 628005 e Ponteiras do filtro de camadas Polimerase Taq Recombinante para kits comprados sem Taq e Kits de calibragem Luminex Kit de Calibragem Luminex 100 200 e Misturador Vortex Kit de Verifica o de Resultados Luminex 100 200 N de cat logo e Agua livre de nuclease Lifecodes N cat 757008 LIFECODES 628018 e 628019 respectivamente 20 ml e Pipetadores pipetadores multicanais e ponteiras 1 20 ul 20 200 ui e Tubos e tampas para PCR AB Gene Faixa t rmica de 0 2 ml 1000 ui N AB0451 G Software de folha de c lculo para visualizar os ficheiros com o valor e Placas de 96 po os do ciclador t rmico PCR Costar separado por v rgula csv N 6509 Bloco t rmico Fisher Scientific Standard Heatblock e Pel cula Microseal Bio Rad Inc N MSA 5001 ou fita adesi
7. armazenamento mais prolongado armazenar a 20 C durante uma semana no m ximo at ser poss vel realizar o ensaio O produto amplificado pode ser congelado e descongelado apenas uma vez A congela o e descongela o repetida resultar na degrada o das amostras amplificadas e fornecer resultados incorrectos se as mesmas forem utilizadas para ensaio Purifica o do ADN gen mico utilizando o m todo escolhido a concentra o final deve ser 10 200 ng pl Ajustar se necess rio com gua livre de nuclease Manter todas as amostras com concentra es semelhantes Amplifica o de ADN PCR Deixar que a mistura padr o MX aque a temperatura ambiente 18 30 C Agitar levemente os reagentes em v rtice durante aproximadamente 10 segundos Isto far com que os sais fiquem dissolvidos Mexer um pouco 5 10 segundos na microcentrifugadora para que o conte do assente no fundo do tubo Utilizando o quadro 1 abaixo preparar os componentes para a amplifica o para n 1 reac es usando a quantidade indicada para cada componente por reac o excepto para ADN Adicionando gua livre de nuclease fazer com que o volume final atinja 50 ul por reac o Agitar levemente em v rtice mexer um pouco o fundo e colocar no gelo Pipetar a quantidade adequada de ADN Gen mico 100 300 ng nos tubos de PCR Distribuir as al quotas da mistura de amplifica o nos tubos de PCR que cont m o ADN gen mico O volume total da
8. cada sonda dos valores da amostra que produzem o conjunto de dados de fundo corrigido Os valores de controlo de fundo encontram se no Quadro dos limiares e s o espec ficos do conjunto Os valores de fundo s o valores MFI Intensidade M dia de Fluoresc ncia pada cara gr nulo para compensa o de ru do de fundo devido varia o de gr nulos 4 Para cada amostra dividir os dados de fundo corrigidos de cada sonda pelo valor de fundo corrigido da sonda Consensus correspondente produzindo o conjunto de dados normalizado MFI Conen MFI C onidloe em raito para e O Para cada sonda registar o valor normalizado na folha de c lculo do Quadro dos limiares 6 Uma vez que tenham sido classificados todos os valores o padr o de resultados obtidos pela sonda isto a combina o de todos os positivos e negativos atribu dos a uma dada amostra pode ser comparado com o quadro de resultados obtidos pelas sondas LC1024 disponibilizado no s tio Web Aten o e Existe um Quadro dos limiares separado para cada loculus e Estes quadros dos limiares s o espec ficos do conjunto certifique se de que o n mero do conjunto nos quadros dos limiares e o n mero do conjunto de um kit de tipagem s o coincidentes P gina 5 de 8 LC1287CEPT 3 02 14 e Se um valor normalizado de uma sonda espec fico for superior ao limiar m ximo de uma classifica o negativa e inferior ao valor m nimo de uma classifica o positiva a amostra deve ser
9. o gel certificar que deixa espa o suficiente para o ADN percorrer uma dist ncia significativa 2 5 a 5 cm UTILIZAR COM PRECAU O o GelStar um carcinog nio potencial NOTA poss vel processar geles com 20 ul de 10 mg ml de brometo de et dio em vez da mancha de cido nuc lico GelStar9 A intensidade da banda do produto ser menor em geles que contenham brometo de et dio do que em geles que contenham GelStar UTILIZAR COM PRECAU O o brometo de et dio um conhecido carcinog nio 3 Manter o gel no escuro e deixar solidificar 4 Carregar uma mistura de 2 5 ul de cada produto PCR e 2 5 ul 2 vezes carregando tamp o com corante vis vel por amostra por amplifica o Deixar o gel percorrer no escuro a aproximadamente 160 volts durante 45 minutos ou at que a amostra tenha percorrido um precurso suficiente que permita ver bandas separadas do produto monofilamentar e bifilamentar a banda azul de bromofenol ou outro marcador vis vel migra 2 5 a 5 cm a partir dos po os 5 Fotografar usando transiluminator UV acompanhado de um filtro fotogr fico amarelo GelStar Cambrex N 50536 ATEN O utilizar equipamento protector quando manusear a mancha de cido nucl ico GelStar ou o brometo de et lio e quando fotografar o gel usando o transiluminador UV 6 An lise do gel Nulo Nulo Classe 1 Classe 2 Bifilamentar es bp o a Monofilamentar bp 150 180 140 180 Funcionamento do gel Amplifica
10. ou das ag ncias de acredita o LIMITA ES DO PROCEDIMENTO As condi es da PCR e as condi es do ensaio descritas exigem condi es controladas com precis o Os desvios destes par metros podem conduzir falha do produto Todos os instrumentos devem ser calibrados em conformidade com as recomenda es do fabricante e dever o funcionar dentro dos par metros recomendados pelo fabricante 1 Os gr nulos devem ser pr aquecidos e postos em boa suspens o antes da utiliza o Este procedimento assegura que os componentes do tamp o de hibridiza o ficam dissolvidos 2 Incuba es a 47 C e a 56 C exigem um elevado grau de precis o 0 5 C Deve se utilizar um ciclador t rmico A temperatura dentro dos po os da placa de 96 po os do ciclador t rmico deve ser verificada utilizando um termo el ctrico por exemplo Modelo VPT 0300 da Bio Rad ou equivalente A temperatura dentro dos po os e entre os po os n o deve variar mais do que 0 5 C 3 O per odo temperatura de 56 C muito importante e n o deve exceder um total de 15 minutos Isto inclui a incuba o de 10 minutos e n o mais de 5 minutos para diluir todas as amostras com a mistura da solu o de dilui o estreptavidina PE 4 Uma vez dilu da a an lise da amostra tem de estar conclu da no prazo de 1 hora proteger da luz 5 N o misturar componentes de outros kits e conjuntos Devido natureza complexa da tipagem HLA a interpreta
11. LIFECODES HLA SSO utilizam oligonucle tidos espec ficos para sequ ncia SSOs para identificar que alelos HLA est o presentes numa amostra amplificada por PCR o conjunto de SSOs empregues n o as metodologias que determina a capacidade de distinguir entre os v rios alelos presentes na amplifica o por PCR Enquanto os m todos dot blot e SSOP reversos empregam marcadores enzim ticos e substratos colorim tricos que requerem desenvolvimento posterior o teste LIFECODES um sistema homog neo multiplex Isto todos os SSOs s o analisados simultaneamente e o teste realizado na totalidade num nico reactor atrav s da incorpora o de um nico reagente PRINC PIOS DO PROCEDIMENTO O procedimento de Tipagem LIFECODES HLA SSO baseado na hibridiza o do produto monofilamentar PCR para sondas SSO A amplifica o de ADN por PCR utiliza normalmente quantidades equimolares de primer forward e reverse para gerar um produto de ADN bifilamentar Contudo se a quantidade de um primer for excessiva em rela o ao outro a reac o ir gerar algum produto de ADN monofilamentar para al m do produto bifilamentar Durante os ciclos iniciais da fase de amplifica o LIFECODES gerado ADN bifilamentar Ap s o primer limitante se ter dissipado o primer restante utiliza o produto bifilamentar como uma matriz para gerar ADN monofilamentar Este m todo gera produtos bifilamentares e monofilamentares que ap s desnatura o ir o ambos part
12. SSO s o concebidas para produzir produtos bifilamentares e monofilamentares que s o os produtos predominantes que hibridizam com os SSO Para garantia de qualidade ou para diagnosticar a exist ncia de problemas com uma experi ncia poder ser necess rio efectuar a electroforese em gel para examinar a reac o PCR presen a de ADN amplificado Materials necess rios os referidos ou equivalentes e Agarose de grau para Ebectroforese Lonza Group Ltd IDNA Mancha de gel com cido nucl ico GelStar Agarose N 50170 Lonza Group Ltd N 50535 Fonte de alimenta o aparelho de electroforese Transilluminator UV ChromatoVUE UVP Inc modelo TM36 Tamp o do gel 1x 40xTAE Promega N V4281 Sistema de imagiologia fotogr fica A migra o relativa do produto mofilamentar depende da concentra o do gel e do sistema tamp o utilizados As migra es aproximadas para cada amplifica o s o referidas em baixo para amostras processadas em gel de Agarose a 2 em tamp o 1X TAE tamp o tris acetato de electroforese Condi es para electroforese 1 Remover a mancha de cido nucl ico GelStar Lonza Group Ltd N 50535 do congelador para descongelar Manter no escuro 2 O gel usado para este procedimento deve estar a 2 isto para uma base de 200 ml de gel utilizar 4 gramas de agarose com 200 ml 1X TAE Diluir de 40X TAE Adicionar 10 ul da mancha de cido nuc lico GelStar agarose fundida Ao deitar
13. adas como potencialmente infecciosas Durante o manuseamento seguir as Precau es gerais 4 A solu o de dilui o as misturas de sonda a Polimerase Tag e a estreptavidina PE cont m compostos perigosos Evitar o contacto com a pele e os olhos e deitar fora os materiais ap s utiliza o de acordo com regulamenta o local Consultar a informa o nas folhas de dados relativa seguran a do material C Instru es de armazenamento 1 Seguir as indica es sobre as temperaturas adequadas para o armazenamento que constam no r tulo da embalagem do componente do kit 2 As misturas a sonda e estreptavidina PE s o sens veis luz CONSERVAR AO ABRIGO DA LUZ N O CONGELAR 3 N o utilizar os componentes ap s a data de validade ter expirado D Purifica o ou tratamento necess rio para utiliza o Consultar Colheita e prepara o da amostra E Indica es de instabilidade 1 Caso tenha ocorrido precipita o dos sais durante o transporte ou armazenamento dissolver novamente na totalidade antes de utilizar agitando em v rtice temperatura ambiente 18 a 30 C 2 N o utilizar Estreptavidina conjugada com R Ficoeritrina que tenha sido congelada durante o transporte ou armazenamento REQUISITOS DO INSTRUMENTO 1 Instrumento Luminex e XY PLATFORM N mero do produto 888300 888310 2 Ciclador T rmico equipado com uma tampa aquecida tempos de activa o ajust veis um intervalo t rmico m nimo de 2 C a
14. as propriedade de F Hoffmann La Roche Ltd e Roche Molecular Systems Inc para a pr tica do processo de Reac o em Cadeia da Polimerase PCR descrito nas referidas patentes Para obter informa es adicionais sobre a necessidade de aquisi o de licen as no seu pa s contactar a F Hoffmann La Roche Ltd ou a Roche Molecular Systems Inc A aquisi o deste produto inclui uma licen a limitada n o transfer vel sob a patente 5 981 180 nos E U A ou respectivas patentes equivalentes estrangeiras propriedade da Luminex Corporation para efectuar an lise multiplexada de amostras cl nicas para tipagem de HLA Fabricante Immucor Transplant Diagnostics Inc 550 West Avenue Stamford Connecticut 06902 E U A Tel 1 203 328 9500 or 888 329 0255 em E U A e no Canad Fax 1 203 328 9599 Representante autorizado Emergo Europe Molenstraat 15 2513 BH Haia Pa ses Baixos Tel 31 0 70 345 8570 Fax 31 0 70 346 7299 Assist ncia t cnica na Europa Telefone 32 3 385 4791 ltima revis o e publica o deste documento Rev 3 2014 02 19 MARCAS COMERCIAIS UTILIZADAS AB Gene AB Gene House IDNA Agarose Lonza Group Ltd Costar Corning Incorporated GelStar Lonza Group Ltd Microseal Bio Rad Laboratories Inc LIFECODES Immucor Inc Luminex Luminex Corporation P gina 7 de 8 LC1287CEPT 3 02 14 Anexo A Electroforese em gel As reac es PCR executadas nos kits de tipagem LIFECODES HLA
15. considerada como indeterminada para esta sonda A amostra deve ser tipada assumindo inicialmente que o valor negativo e em seguida assumindo que positivo e Consultar a sec o VALORES PREVISTOS para mais informa o sobre os valores limiares CONTROLO DE QUALIDADE Recomenda se a execu o de um controlo positivo e de um controlo negativo com cada teste por exemplo um branco com gua e uma amostra previamente tipada respectivamente As sondas de oligonucle tido da sequ ncia espec fica SSO consensuais indicadas no Quadro dos limiares hibridizam com os respectivos alelos espec ficos do locus Os valores obtidos com os SSOs consensuais dos controlos positivos devem exceder o valor limite para os SSO conforme especificado na Folha de Trabalho do Quadro dos Limiares A s Mistura s de sonda LIFECODES cont m cont m uma ou mais sondas SSO identificadas nas folhas de trabalho dos kits de tipagem Estas sondas consensuais hibridizam com todos os alelos e actuam como controlos internos para verificar a amplifica o e para confirmar a ocorr ncia de hibridiza es Se o valor m nimo n o for obtido para estes SSO a amostra poder n o produzir a tipagem correcta e o teste da amostra deve ser repetido O ensaio deve ser executado conforme recomendado na folha de dados devendo igualmente ser executado com quaisquer outros procedimentos de controlo de qualidade que estejam em conformidade com os requisitos locais estaduais federais e
16. dem resultar em erro da tipagem da amostra CARACTER STICAS ESPEC FICAS DE FUNCIONAMENTO Quando s o usados kits de tipagem LIFECODES HLA SSO Alelo Nulo de acordo com o procedimento descrito no folheto informativo do produto o tipo HLA de Classe e Classe Il das amostras de ADN pode ser determinado O teste HLA Alelo Nulo Classe 1 Nulo1 mostra uma concord ncia de 100 97 4 limite inferior do intervalo de confian a de 95 para o locus A uma concord ncia de 100 97 4 limite inferior do intervalo de confian a de 95 para o locus B e uma concord ncia de 100 97 4 limite inferior do intervalo de confian a de 95 para o locus C em 139 amostras avaliadas em compara o com os resultados obtidos com sequencia o bidireccional O teste HLA Alelo Nulo Classe 2 Nulo2 mostra uma concord ncia de 97 1 92 7 limite inferior do intervalo de confian a de 95 para o locus DRB 4 e uma concord ncia de 98 5 94 8 limite inferior do intervalo de confian a de 95 para o locus DRB 5 em 137 amostras avaliadas em compara o com os resultados obtidos com sequencia o bidireccional REFERENCIAS 1 Olerup O et al 1992 Tissue Antigens 39 225 2 Saiki RK et al 1986 Nature 324 163 3 Maeda M et al 1989 Tissue Antigens 34 290 4 Bugawan TL et al 1990 Immunogenetics 32 231 LICEN A LIMITADA Este produto n o fornecido com polimerase Tag nem inclui qualquer licen a no mbito das patentes estrangeir
17. es ficheiros s o denominados OUTPUT CSV e guarados numa pasta cujo Batch Name Nome do lote inclu do no Luminex IS Estes dados ficam ent o dispon veis para se efectuar as classifica es de tipagem conforme se descreve a seguir Consultar o Manual do Utilizador do Luminex IS para conhecer o funcionamento do instrumento incluindo os procedimentos de in cio de funcionamento calibra o manuten o e encerramento di rios RESULTADOS A tipagem de amostras pode ser efectuada da seguinte forma Os ficheiros CSV gerados podem ser abertos e os dados processados com programas comuns de folha de c lculo como por exemplo o Microsoft Excel Lotus 123 Corel Quattro Pro ou software semelhante A an lise constitu da pelos seguintes passos 1 Certificar se de que o Number of Events N mero de eventos de cada SSO em cada amostra pelo menos 60 Esta informa o encontrada na sec o DataType Count Tipo de dados contagem no ficheiro CSV 2 Determinar que os valores das sondas Consensus para cada amostra est o acima da respectiva Intensidade M dia de Fluoresc ncia ou MFI m nima Os limiares m nimos s o espec ficos do conjunto e podem ser encontrados no Quadro dos limiares Aten o e Para se obter resultados fi veis necess rio dispor de dados suficientes recolhidos pelo instrumento Luminex e Recolha pelo menos 60 ocorr ncias para cada SSO 3 Subtrair o valor do Background Control Controlo de fundo de
18. icipar na reac o de hibridiza o Cada uma das diferentes sondas pode ser hom loga a uma sequ ncia dentro do ADN amplificado que nica para um alelo ou grupo de alelos Por outras palavras estas sondas s o concebidas de forma a que cada sonda hibridize preferencialmente com uma regi o complementar que pode ou n o estar presente no ADN amplificado Al m disso o ADN amplificado tamb m hibridizado com uma ou mais sondas Consensus hom logas a sequ ncias presentes em todos os alelos de um locus A tipagem SSO pode ser afectada pelo tipo de material biol gico m todo de purifica o quantidade e integridade do ADN gen mico Por essa raz o o sinal obtido para a s sonda s Consensus pode servir como um indicador do sucesso dos procedimentos de amplifica o e hibridiza o De igual forma o sinal obtido com a sonda Consensus pode ser usado para normalizar o sinal das sondas espec ficas do alelo e corrigir as varia es da quantidade de produto amplificado na reac o de hibridiza o A an lise dos resultados gerados a partir da tipagem SSO pode ser utilizada para determina o da presen a ou aus ncia de sequ ncias espec ficas de ADN em ADN amplificado e para identificar os alelos poss veis na amostra Para o procedimento de Tipagem LIFECODES HLA SSO as Microesferas Luminex concebidas para utiliza o com o Instrumento Luminex t m sondas anexadas Podem ser misturadas e analisadas Microesferas Luminex at ao n mero m
19. mistura padr o e ADN gen mico deve ser igual a 50 ul para cada reac o de amostra Vedar bem os tubos para evitar a evapora o durante o processo de PCR Colocar as amostras no ciclador t rmico e executar o programa consultar o quadro 2 Componente Quantidade por reac o de amostra PCR Mistura padr o LIFECODES 15 ul ADN gen mico 10 200 ng ul Total de 200 ng Polimerase Tag 0 5 ul 2 5 U At ao volume final de Agua livre de nuclease 50 ul C H ro 1 Componentes de reac o para amplifica o Quadro 2 Condi es do ciclador t rmico para amplifica o 95 C durante 5 min N mero de ciclos 1 95 C durante 30 seg 60 C durante 45 seg 12 C durante 45 seg N mero de ciclos 8 95 C durante 30 seg 63 C durante 45 seg 12 C durante 45 seg N mero de ciclos 32 Nota para se certificar da amplifica o da amostra consultar a sec o Electroforese 72 C durante 15 min em gel Anexo A N mero de ciclos 1 ibridiza o Certificar se de que os componentes do tamp o de dilui o para hibridiza o da mistura de sonda LIFECODES est o dissolvidos e que os gr nulos est o completamente em suspens o Ligar o instrumento Luminex e a plataforma XY dando um tempo de aquecimento de 30 minutos Aquecer a mistura da sonda a 55 60 C num bloco t rmico durante pelo menos 5 a 10 minutos para dissolver completamente os componentes na mistura da sonda Submeter a ultrasons du
20. o dos dados e as classifica es de tipagem devem ser verificadas por pessoal qualificado DETEC O DE AVARIAS gr nulos mistura da sonda e repetir o ensaio funcionar em boas do Luminex IS condi es A conduta de passagem da Remover e submeter a agulha a ultrasons Executar fluxo amostra est bloqueada reverso Contactar a Immucor Transplant Diagnostics Inc caso o problema persista 32 3 385 47 91 Falha do limiar CON A amostra n o foi ADN baixo Verificar a concentra o e a pureza do ADN amplificada ou foi insuficientemente Os sais das concentra es de Aquecer a mistura padr o a 37 C durante 5 minutos amplificada mistura padr o n o est o agitar em v rtice ligeiramente e mexer um pouco o fundo dissolvidos Polimerase Taq insuficiente Utilizar apenas Tag recombinante Experimentar o Lifecodes n 167075 As condi es de amplifica o n o est o dentro dos par metros Executar o perfil t rmico no ciclador t rmico para verificar espec ficos se os par metros est o dentro dos par metros especificados Intensidade M dia de Fluoresc ncia MFI baixa Aquecer a solu o de dilui o a 45 C durante 5 minutos antes da utiliza o e agitar em v rtice Guardar temperatura ambiente Substituir a Estreptavidina PE ou amostra n o espec ficos especificados consegue fornecer Amostra de ADN contaminada um resultado de ADN al E Jad Voltar a isolar o ADN da amostra de sangue Evapora o du
21. rante a fase de hibridiza o Caso n o se esteja a utilizar a totalidade da placa deixar uma fila vazia de cada lado das amostras que v o ser ensaiadas de forma a permitir que a placa fique bem vedada Falhas m ltiplas de Amplifica o espec fica do As condi es de amplifica o n o Executar o perfil t rmico no ciclador t rmico para verificar SSO alelo est o dentro dos par metros se os par metros est o dentro dos par metros A amplifica o por PCR pode ser verificada atrav s de electroforese em gel consultar o Anexo A VALORES PREVISTOS Cada Locus tem uma sonda CON e duas sondas SSO Se uma amostra contiver um dos locus a ser testado a sonda de consenso e pelo menos uma das sondas SSO para esse locus devem ser positivas Normalmente os valores das sondas podem ser processados como positivos e negativos Em alguns casos raros um valor pode situar se entre os valores de corte positivos e negativos sendo consequentemente considerado como indeterminado Se uma amostra contiver valores indeterminados para uma sonda SSO espec fica a amostra deve ser tipada com a sonda em primeiro lugar como negativa e em seguida como positiva Caso duas sondas SSO para um locus sejam indeterminadas a amostra n o pode ser tipada e deve ser novamente testada P gina 6 de 8 LC1287CEPT 3 02 14 Conforme mencionado na sec o Limita es do procedimento muito importante seguir o protocolo com precis o Quaisquer desvios po
22. rante pouco tempo 15 seg agitando em seguida a mistura em v rtice durante cerca de 15 segundos para suspender completamente os gr nulos Distribuir al quotas de 5 ul de produto de PCR de loculus espec ficos numa placa de 96 po os do ciclador t rmico Costar N 6509 Distribuir al quotas de 15 ul de mistura de sonda em cada po o Aquando da distribui o de al quotas em mais de 10 po os agitar levemente a mistura de sonda em v rtice depois de cada conjunto de dez Vedar a placa com Pel cula MicrosealO Hibridizar as amostras nas seguintes condi es de incuba o Quadro 3 Condi es do ciclador 97 C durante 5 minutos t rmico para hibridiza o 47 C durante 30 minutos 56 C durante 10 minutos 56 C MANTER HOLD Enquanto as amostras hibridizam preparar uma mistura 1 200 de estreptavidina PE Solu o de Dilui o Combinar 170 ul de solu o de dilui o DS e 0 85 ul de 1mg ml estreptavidina PE SA PE por amostra Recomenda se efectuar a mistura da solu o de dilui o em quantidade suficiente para n 1 amostras tendo em conta as perdas que ocorrem ao fazer a pipetagem Consultar o quadro 4 Manter a mistura da solu o de dilui o estreptavidina PE no escuro a temperatura ambiente a estreptavidina PE sens vel luz A solu o de dilui o pode ser aquecida a 45 C durante 5 minutos e agitada em v rtice ap s a sua chegada para assegurar que todos os componentes ficam dissolvidos A sol
23. sse O Modelo de Lote Batch Template fornecido no s tio Web sendo lhe atribu do neste caso o nome de Nulo1 xxxxxx n de lote Ter em aten o que as vers es dos modelos s o espec ficas aos n meros de lote e correspondem aos n meros de lote das misturas de sonda Seguir as instru es que surgem passo a passo no ecr para a cria o de lotes e Ao atribuir um nome ao lote n o incluir v rgulas no mesmo uma vez que a informa o que se segue a uma v rgula perder se ap s exporta o dos dados Para obter mais instru es sobre a forma de criar lotes simples e m ltiplos consultar o Manual do utilizador do Luminex b Clicar sobre o s mbolo Eject Ejectar para ejectar o suporte da placa Colocar a placa do ciclador t rmico de 96 po os contendo as amostras no bloco t rmico XYP existente no suporte da placa c Clicar o s mbolo Retract Recolher As amostras est o agora prontas a ser analisadas Dever ser efectuado um passo prim rio antes de dar in cio execu o d Ap s as amostras terem sido processadas atrav s do instrumento dever ser efectuada uma ac o de sanitiza o com 70 de Isopropanol ou 20 de lex via de uso dom stico seguida de duas ac es de lavagem Neste momento o instrumento poder ser desligado se n o for utilizado durante o resto do dia 3 Ap s um lote ter sido completado os dados s o exportados como um ficheiro com o valor separado por v rgula csv Est
24. te m ximo lote cat logo temperatura de temperatura Data de Conservar ao V Suficiente Y validade Z abrigo da luz para testes N K Naogcongear Aten o Consultar a a side Fabicanie Representante Instru es de o na Europa in Utiliza o Utiliza o P gina 1 de 8 LC1287CEPT 3 02 14 REAGENTES POR N MERO DE CAT LOGO Kit de Tipagem LIFECODES HLA Alelo Nulo para utiliza o com Luminex Produto n 629100 50 N mero do Volume de 7 Mistura Padr o LIFECODES Alelo 3 Suficient Mistura Padr o LIFECODES Alelo 629002 870 uL Nulo Classe 2 i Solu o de dilui o 628515 19 7mL 18 30 C As Misturas de sonda s o sens veis luz evitar o mais poss vel a exposi o luz ATEN AO n o utilizar os componentes ap s a sua data de validade ter expirado UTILIZA O PREVISTA Tipagem do ADN de Alelos Classe e Classe Il em conjunto com Kits de Tipagem LIFECODES HLA SSO RESUMO E EXPLICA O A tipagem do ADN com base no HLA utilizando ADN amplificado por PCR um procedimento laboratorial comum A amplifica o do ADN por PCR utilizada como um meio de melhorar uma regi o ADN seleccionada Para a tipagem HLA utilizado um teste posterior para determina o das propriedades do ADN amplificado T m sido utilizados na tipagem HLA diversos tipos de testes como o SSP 1 SSOP directo 2 RFLP 3 e SSOP e t cnicas dot blot reversos 4 Tal como os m todos SSOP e dot blot reverso os kits de Tipagem
25. u o de dilui o deve estar temperatura ambiente 18 30 C antes de se efectuar a mistura Preparar antes da utiliza o e eliminar qualquer por o que reste P gina 4 de 8 LC1287CEPT 3 02 14 Quadro 4 Volumes de Solu o de dilui o DS Estreptavidina PE SA PE prepara o da solu o natos de dilui o 850 4 25 1700 pl 3400 mi 8500 Nota N O CANCELAR O PROGRAMA DE HIBRIDIZA O ANTES DE RETIRAR O TABULEIRO DO CICLADOR T RMICO 8 Ao atingir os 56 C manter Hold enquanto o tabuleiro est no ciclador t rmico diluir cada amostra com 170 ul da mistura da solu o de dilui o preparada com estreptavidina PE E fundamental que todas as amostras sejam dilu das no per odo de 5 minutos ap s o passo HOLD a 56 C de 10 minutos 9 Retirar o tabuleiro das amostras do ciclador t rmico e coloc lo no instrumento Luminex D An lise da amostra utilizando o instrumento Luminex Para obter os melhores resultados submeter de imediato as amostras a ensaio usando o instrumento Luminex 1 Ligar o instrumento Luminex entre 30 minutos e 4 horas antes de proceder ao ensaio das amostras 2 aus a analisar as amostras no instrumento Luminex criar um Batch Run Execu o de lote com o qual as amostras ser o analisadas a Seleccionar Create a new batch Criar um novo lote a partir do menu File Ficheiro Por exemplo no caso de se pretender analisar Nulo Classe adicionar Lote para Nulo Cla
26. va N 13259 030 Costar N 6524 e 70 de isopropanol ou 20 de lex via e Ciclador t rmico consultar a sec o Requisitos do Instrumento p gina 3 INSTRU OES PARA UTILIZA AO NOTAS As misturas da sonda e a estreptavidina PE s o sens veis luz conservar ao abrigo da luz e n o congelar Aquecer os gr nulos a uma temperatura entre os 55 e os 60 C durante pelo menos 5 a 10 minutos para dissolver completamente os componentes na mistura da sonda e Submeter a ultrasons durante pouco tempo 15 seg agitando a mistura em v rtice durante cerca de 15 segundos de forma a suspender completamente os gr nulos e Usar do m ximo cuidado no processo de forma o de al quotas utilizando pipetas calibradas Caso contr rio poder resultar em perda de reagente e no insucesso da amostra e Todas as temperaturas devem ser respeitadas com exactid o Flutua es t o pequenas como 0 5 C podem afectar os resultados P gina 3 de 8 LC1287CEPT 3 02 14 N 5 6 7 Quad Na fase de hibridiza o as amostras n o devem permanecer no estado dilu do a 56 C durante mais de 5 minutos consultar a sec o Resultados Recomenda se o ensaio das amostras amplificadas com a maior brevidade poss vel Caso as amostras n o possam ser processadas no instrumento Luminex no mesmo dia o produto amplificado pode ser guardado at ao m ximo de 3 dias entre os 2 e os 8 C antes de ser utilizado Se pretender um
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