MycAssay™ Aspergillus
Contents
1. MycAssay Aspergillus Para utiliza o diagn stica in vitro LightCycler 2 0 Amostras Respirat rias 3 An lise e interpreta o de dados 3 2 Tome nota Um objecto para compensa o da cor deve ser aplicado antes de se analisar os resultados para o MycAssay Aspergillus no LightCycler 2 0 Se n o for o caso aplique um objecto antes de continuar com a an lise e interpreta o dos dados Uma vez terminada a execu o verifique os conte dos do relat rio exibido e imprima o caso necess rio 3 3 Os resultados de Aspergillus podem ser vistos na sec o de an lise Pathogen 530 e os resultados IAC na sec o de an lise IAC 560 3 4 Nas duas sec es ASP 530 e IAC 560 seleccione o ficheiro de Compensa o da Cor correcto MycAssay CC file a ser aplicado experi ncia 3 5 Analise cada amostra come ando com os controlos conforme mostrado no fluxograma abaixo tamb m podem ser encontrados detalhes na tabela apresentada abaixo do fluxograma 030 152 Vers o 1 3 01MAR12 Portugu s 8 Para utiliza o diagn stica in vitro Amostras Respirat rias MycAssay Aspergillus LightCycler 2 0 A execu o est contaminada AC O Repetir a execu o A execu o falhou z AC O Repetir a execu o Positivo para DNA Aspergillus Negativo para DNA Aspergillus Verifique o controlo negativo O ASP Ct 39 0 ou est registado como Nenhum Cp A execu o falhou2. Infect 4 710 716 Perfect JR Cox GM Lee JY Kauffman CA de Repentigny L Chapman SW Morrison VA Pappas P Hiemenz JW Stevens DA and the Mycoses Study Group 2001 The impact of culture isolation of Aspergillus species A hospital based survey of Aspergillosis Clinical Infectious Diseases 33 1824 33 7 Maertens J Van Eldere J Verhaegen J Verbeken E Verschakelen J Boogaerts M 2002 Use of Circulating Galactomannan Screening for Early Diagnosis of Invasive Aspergillosis in Allogeneic Stem Cell Transplant Recipients The Journal of Infectious Diseases 186 1297 306 8 Tillie Leblond I Tonnel AB 2005 Allergic bronchopulmonary aspergillosis Allergy 60 1004 13 Greene R 2005 The radiological spectrum of pulmonary aspergillosis Med Mycol 43 Suppl 1 8147 54 Portugu s 1 030 152 Vers o 1 3 01MAR12 MycAssay Aspergillus Para utiliza o diagn stica in vitro LightCycler 2 0 Amostras Respirat rias apenas 40 65 dos casos provados por radiologia e serologia Uma vez que o diagn stico diferencial amplo incluindo tuberculose micobacteriose at pica sarcoidose histoplasmose coccidioidomicose pneumoconiose pulm o reumat ide espondilite anquilosante e outras a documenta o da presen a de Aspergillus spp nas amostras respirat rias importante para evitar o atraso no diagn stico da aspergilose pulmonar e o tratamento incorrecto MycAssay Aspergillus um kit de diagn stico molecul
3. LightCycler 2 0 Amostras Respirat rias 1 12 Adicione os reagentes na ordem apresentada na tabela anterior o Tubo 1 em seguida o Tubo 2 seguido pelo padr o controlo negativo amostra do doente ou controlo positivo Tome cuidado ao retirar al quotas do Tubo 1 o l quido ligeiramente viscoso e pode aderir aresta interna do tubo Se isto acontecer volte a centrifugar para acumular o conte do final na base do tubo antes de tentar remover as al quotas finais 1 13 Utilize uma nova ponta de pipeta para cada transfer ncia de l quido Volte a tapar cada tubo de reagente a seguir utiliza o e elimine o imediatamente assim como todo o conte do restante num recipiente de res duos cl nicos que possa ser selado Os reagentes n o utilizados n o podem ser guardados para utiliza o posterior 1 14 Tenha um cuidado adicional ao pipetar o Tubo 4 controlo positivo de DNA para assegurar que n o contamina outra reac o Fechando todos os outros capilares antes de abrir o Tubo 4 pode reduzir o risco de contamina o cruzada 1 15 Feche os tubos capilares cuidadosamente com as tampas fornecidas na caixa dos capilares utilizando uma ferramenta de capsular Assegure se que os tubos capilares est o firmemente fechados Os tubos capilares podem ser fechados depois de se adicionar o padr o reac o quando se pretende reduzir o potencial de contamina o cruzada e ou do ambiente 1 16 Quando n o est dispon vel uma centr f
4. podendo ser realizado e aplicado posteriormente a este ficheiro de execu o Assegure se de que a rea de trabalho foi limpa com reagentes de descontamina o de DNA e deixe secar completamente evite utiliz los durante a prepara o do ensaio uma vez que o excesso de solu o de limpeza pode inibir as reac es de PCR Cada bolsa cont m um tubo de cada Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 e Tubo 4 Em cada bolsa existem reagentes suficientes para executar 8 reac es Devem ser realizadas pelo menos uma reac o com controlo positivo e uma reac o com controlo negativo por execu o em que os reagentes s o de um nico kit Por conseguinte uma bolsa pode analisar 6 amostras de doentes Se for necess rio analisar mais de 6 amostras pode utilizar se mais de uma bolsa se as bolsas utilizadas forem do mesmo lote Todavia o LightCycler 2 0 s pode analisar at 32 numa nica execu o Por isso podem realizar se at 30 amostras de doentes numa nica execu o 4 bolsas Calcule o n mero de reac es necess rias consultando a tabela abaixo N mero N mero m ximo de amostras de doente de bolsas Retire o n mero adequado de bolsas do congelador N o utilize bolsas que j n o estejam seladas Se as amostras de doentes tiverem sido congeladas ap s a extrac o remova as igualmente do congelador Abra o n mero necess rio de bolsas e retire os tubos Se for utilizada mais de uma bolsa mas se for executado apenas um
5. concebido para remover os inibidores da PCR nem todos os f rmacos ou popula es de doentes foram avaliados O procedimento n o foi totalmente avaliado em esputo nem em amostras induzidas com solu o salina ou amostras provenientes de crian as Podem ser obtidos resultados positivos falsos provenientes da contamina o externa da amostra ou da an lise original Essa contamina o pode surgir do ar contaminado com Aspergillus uma t cnica experimental fraca no que se refere ao controlo positivo ou contamina o externa especialmente pipetador com DNA de Aspergillus Uma vez que um resultado positivo verdadeiro pode ser obtido de doentes que estejam transitoriamente ou persistentemente colonizados com Aspergillus spp necess ria a avalia o cl nica na interpreta o dos resultados da an lise no contexto da doen a AUTORIZA O TopTaq Hot Start fornecido por QIAGEN QIAGEN uma marca comercial registada da Qiagen GmbH Hilden Alemanha Este produto comercializado sob a licen a do Public Health Research Institute Newark New Jersey EUA e pode ser utilizado sob os direitos de patente do PHRI apenas para o diagn stico humano in vitro SmartCycler uma marca comercial registada da Cepheid 904 Caribbean Drive Sunnyvale CA 94089 EUA Parte deste produto est coberta por uma licen a exclusiva a um pedido de patente detido pelo Fred Hutchinson Cancer Centre Seattle EUA LightCycler
6. conjunto de controlos positivos e negativos s necess rio retirar os Tubos 3 e 4 de uma das bolsas Proceda com precau o ao manipular o Tubo 4 Este cont m material de controlo positivo de DNA e uma contamina o pode dar origem a resultados de doente positivos falsos Deixe o conte do dos tubos descongelar colocando os sobre a bancada do laborat rio durante 5 10 minutos assegurando se que o conte do de cada tubo descongela antes de prosseguir Agite o conte do dos tubos e as amostras de doentes no v rtice prossiga com uma breve centrifuga o numa microcentr fuga para garantir a acumula o de todo o conte do no fundo dos tubos antes de utilizar Coloque o n mero exigido de capilares de 20 uL num suporte para tubos capilares Tome cuidado para n o deixar marcas no vidro Prepare sempre primeiro o controlo negativo seguido pelas amostras do doente O controlo positivo deve ser sempre preparado em ltimo lugar Os volumes de reagente e de DNA s o apresentados na seguinte tabela Reac o Reagente Controlo Amostras Controlo positivo negativo do doente Tubo 1 tampa cor de laranja 7 5 uL 7 5 uL 7 5 uL Tubo 2 tampa verde Po 75 75W 7 5 uL Tubo 3 tampa transparente Fo MOL Jo a 3 Amostras de doente TA O fr o Tubo 4 tampa preta TR PR 10 pL Volume total 25 uL 25 uL 25 uL Portugu s 5 030 152 Vers o 1 3 01MAR12 MycAssay Aspergillus Para utiliza o diagn stica in vitro
7. reagentes suficientes para 8 reac es Volume Tubo 1 dNTPs 66 uL Tampa MgCl cor de Solu o tamponada com complexo de DNA polimerase laranja Tubo 2 lt 0 01 prim rios 66 uL Tampa lt 0 01 sinais moleculares verde lt 0 0001 Controlo de Amplifica o Interno CAI O Controlo de Amplifica o Interno um plasm deo de DNA recombinante que abriga uma sequ ncia n o infecciosa n o relacionada com a sequ ncia alvo Aspergillus Tamp o Tris HCI Tubo 3 Controlo negativo 25 uL Tampa gua transparent e Tubo 4 Controlo positivo 25 uL Tampa lt 0 0001 DNA de controlo positivo preta A mol cula do controlo positivo um plasm deo recombinante que abriga a sequ ncia alvo Aspergillus Tamp o Tris HCI O kit cont m igualmente CD ROM do Protocolo do MycAssay Aspergillus Myconostica Instru es de utiliza o Certificado de an lise Conserva o O kit deve ser conservado congelado 15 a 25 C at ao prazo de validade indicado no r tulo da caixa do kit momento em que deve ser eliminado em conformidade com as regulamenta es locais Uma vez aberta uma bolsa o conte do deve ser utilizado imediatamente sem voltar a congelar nem reutilizar posteriormente Portugu s 3 030 152 Vers o 1 3 01MAR12 MycAssay Aspergillus Para utiliza o diagn stica in vitro LightCycler 2 0 Amostras Respirat rias Materiais equipamentos necess rios mas n o fornecidos Sistema de PCR e
8. 2 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Aspergillus Amostras Respirat rias LightCycler 2 0 Caracter sticas e limita es do desempenho O kit foi inicialmente validado utilizando o Cepheid SmartCycler Determinadas reivindica es de desempenho do ensaio foram revalidadas na plataforma LightCycler 2 0 utilizando capilares de vidro de 20 uL Roche Cat amp 04929292001 ou 11909339001 e s o apresentadas abaixo Onde n o se esperava que as diferen as entre plataformas afectassem o desempenho do ensaio e por isso a reivindica o o estudo n o foi repetido Estes resultados obtidos utilizando o SmartCycler s o considerados transfer veis para a plataforma LightCycler 2 0 Sensibilidade anal tica Com o protocolo do LightCycler 2 0 descrito anteriormente e os padr es da PCR gerados na Myconostica o LoB do MycAssay M Aspergillus foi determinado como sendo um Cp de 39 0 enquanto o LoD foi determinado como sendo lt 25 c pias de DNA alvo utilizando a estirpe AF293 de A fumigatus Selectividade anal tica O DNA gen mico extra do a partir de Penicillium spp gera resultados positivos Tal deve se ao facto das sequ ncias dos alvos moleculares serem grandemente conservadas entre Aspergillus e Penicillium Por conseguinte deve notar se que um resultado positivo neste ensaio pode ser o resultado de infec o por Penicillium e n o por Aspergillus A selectividade anal tica foi testada com DNA extra
9. AC O Repetir a execu o Verifique o controlo negativo O IAC Cp 30 3 33 9 Verifique o controlo positivo O ASP Cp 15 0 20 0 Verifique a amostra de teste O ASP Cp lt 37 0 Verifique a amostra de teste O IAC Ct Cp 30 3 33 9 O IAC falhou AC O Repetir a amostra Se o resultado for o mesmo suspeita de presen a de inibidor na amostra Amostra Pathogen 530 Cp IAC 560 Cp Interpreta o Medida subsequente Controlo negativo 39 0 ou nenhum Cp Entre 30 3 e 33 9 Controlo negativo aceit vel Os resultados do doente s o v lidos Controlo negativo 39 0 ou nenhum Cp lt 30 3 ou gt 33 9 Falha no controlo Repetir a execu o negativo completa Controlo negativo lt 39 0 Entre 30 3 e 33 9 Contamina o Repetir a execu o completa Controlo positivo Entre 15 0 e 20 0 N D Controlo positivo Os resultados do aceit vel doente s o v lidos Controlo positivo lt 15 0 ou gt 20 0 N D Falha no controlo Repetir a execu o positivo completa Amostra do doente 239 0 ou nenhum Cp Entre 30 3 e 33 9 Negativo para Registar resultado Aspergillus Resultado 1 Amostra do doente lt 37 0 N D Positivo para Registar resultado Aspergillus Resultado 2 Amostra do doente 239 0 ou nenhum Cp lt 30 3 ou gt 33 9 Falha do IAC na Repetir a amostra amostra Resultado 3 CCO cut off cl nico Todos os resultados ao n vel ou abaixo do n v
10. Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Aspergillus Roche LightCycler 2 0 my conosjica Amostras Respirat rias MycAssay Aspergillus Roche LightCycler 2 0 Amostras Respirat rias REF 080 045 Utiliza o prevista MycAssay Aspergillus est indicado para a utiliza o por profissionais de laborat rio qualificados para a detec o qualitativa do DNA gen mico de Aspergillus spp extra do de amostras respirat rias do tracto respirat rio inferior p ex amostras br nquicas como ajuda no diagn stico em doentes adultos com suspeita de infec o ou alergia por Aspergillus O MycAssayT Aspergillus foi validado para utiliza o com o Roche LightCycler 2 0 Resumo e explica o Aspergillus spp s o fungos ub quos e oportunistas que provocam tanto s ndromas al rgicas como invasivas O g nero abrangido por aproximadamente 300 esp cies das quais 41 foram associadas doen a humana A maioria das infec es causada por A fumigatus A flavus A terreus e A niger com menor frequ ncia foram implicados A nidulans e outras esp cies raras tais como A sydowii A versicolor A lentulus e A pseudofischeri 1 A maioria das infec es e alergias causadas por Aspergillus spp afecta o tracto respirat rio As s ndromas al rgicas incluem aspergilose boncopulmonar ABPA e sinusite Aspergillus al rgica e s o habitualmente causadas por A fumigatus A aspergilose pulmonar cr nica inclui aspergil
11. Se o problema persistir o inibidor PCR est presente na amostra Registe a amostra como Indeterminada 4 6 O resultado na sec o IAC 560 corresponde quase exactamente ao resultado na sec o Pathogen 530 N o foi aplicado um ficheiro de Compensa o da Cor ou foi aplicado um ficheiro errado aos resultados da experi ncia gt Verifique nas duas sec es se a compensa o da cor est em ON e que foi aplicado o mesmo ficheiro MycAssay CC nos dois canais 4 7 A base para algumas amostras corresponde ao controlo negativo indicando que n o ocorreu nenhuma amplifica o Todavia o software apresentou um valor Cp positivo conforme mostrado na figura abaixo Uma sa da de Cp positivo para um gr fico de amplifica o negativa s foi observada duas vezes em 154 reac es negativas realizadas durante estudos de valida o gt Quando isso acontece repita a s amostra s para confirmar um resultado Negativo 4 8 Quando aplico o meu objecto CC alguns dados nos ressaltos de canal 560 IAC resultaram em valores Cp que ficam fora do intervalo aceit vel Amplification Curves Fluorescente 564 Este resultado totalmente normal para reac es que contenham elevadas concentra es de DNA alvo pelo que n o interferem com a interpreta o dos resultados do doente gt Siga a an lise normal pode ver que para amostras com resultado positivo para Aspergillus o resultado IAC n o precisa de ser tomado e
12. ar para a detec o do DNA gen mico de Aspergillus spp com base na tecnologia de PCR com sinais moleculares Molecular Beacon Todo o procedimento de an lise incluindo a extrac o de DNA da amostra cl nica pode ser terminado em 4 horas comparativamente cultura f ngica que pode demorar v rios dias a produzir resultados positivos Este ensaio oferece vantagens sobre os m todos de diagn stico actualmente dispon veis para a aspergilose invasiva aguda e a aspergilose pulmonar cr nica Estas vantagens incluem uma detec o mais r pida de Aspergillus spp e o potencial de um aumento da sensibilidade a Aspergillus spp em doentes altamente imunocomprometidos com suspeita de aspergilose pulmonar invasiva Princ pios do procedimento A seguir mistura dos reagentes no kit MycAssay Aspergillus com uma amostra contendo a sequ ncia de DNA alvo de Aspergillus uma por o do gene 18S riboss mico de Aspergillus a termociclagem resulta na ocorr ncia da amplifica o do DNA O ensaio tamb m cont m um Controlo de Amplifica o Interno IAC um fragmento de DNA n o presente em genomas de Aspergillus outros genomas f ngicos bacterianos ou humanos para detectar subst ncias inibit rias da PCR e confirmar a funcionalidade dos reagentes do ensaio Os alvos de DNA amplificados s o detectados com a tecnologia de sinais moleculares Os sinais moleculares s o amostras de hibridiza o de oligonucle tidos de cadeia nica que formam u
13. azelly B Mayaud C Cadranel J 2007 Bronchopulmonary aspergillosis infections in the non immunocompromised patient Rev Pneumol Clin 63 155 166 Tyagi S Kramer FR 1996 Molecular beacons Probes that fluoresce upon hybridization Nature Biotechnology 14 303 308 030 152 Vers o 1 3 01MAR12 Portugu s 2 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Aspergillus Amostras Respirat rias LightCycler 2 0 Elimine os reagentes n o utilizados e os res duos de acordo com os regulamentos nacionais federais estatais e locais Para evitar a contamina o com produtos de amplifica o de Aspergillus ou IAC n o abra os tubos de reac o ap s a amplifica o Podem ser analisados controlos adicionais de acordo com as directrizes ou os regulamentos de organiza o locais estatais provinciais federais ou acreditadas N o coma beba nem fume nas reas em que as amostras e os reagentes dos kits s o manuseados Concentra es baixas de DNA podem ser inst veis se n o forem conservadas correctamente Recomenda se que as extrac es de DNA de amostras cl nicas sejam conservadas a 80 C para preservar a sua integridade M ltiplos ciclos de descongela o e recongela o devem ser igualmente evitados sempre que poss vel Conte do do kit Descri o O kit consiste em cinco bolsas de folha seladas com 3 compartimentos podendo ser cada uma delas removida da caixa e utilizada separadamente Cada bolsa cont m
14. contextualizados na doen a cl nica do doente e noutros resultados de an lises de diagn stico Os seguintes s o relat rios recomendados dependendo cada um da interpreta o do resultado do ensaio Resultado n 1 Aspergillus spp n o detectado Resultado n 2 Aspergillus spp detectado Resultado positivo Este ensaio tamb m detecta Penicillium spp Resultado n 3 An lise falhada presen a de inibidores ou de outra subst ncia desconhecida Limites do procedimento Q limite principal deste procedimento relaciona se com a qualidade da amostra principal Se a amostra for muito pequena ou se n o tiver sido colhida na rea afectada do pulm o a an lise ser menos sens vel e pode ser falsamente negativa As amostras da BAL devem ser centrifugadas antes da extrac o do DNA do sedimento Os dados demonstraram igualmente que a redu o no volume do sobrenadante utilizado no processo de extrac o alcan ada pelo passo de centrifuga o diminui a propor o de inibidores que entram no sistema 030 152 Vers o 1 3 01MAR12 Portugu s 14 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Aspergillus Amostras Respirat rias LightCycler 2 0 Resultados positivos falsos s o poss veis se o agente infectante for Penicillium spp que n o pode ser diferenciado de Aspergillus spp mediante a utiliza o deste kit Embora o procedimento de extrac o de DNA f ngico MycXtraTM tenha sido
15. do de uma variedade de esp cies f ngicas e n o f ngicas diferentes As esp cies seguintes n o apresentaram um resultado positivo Blastomyces capitatus Candida albicans C glabrata C parapsilosis C tropicalis Cladosporium spp Cryptococcus neoformans Doratomyces microsporus Fusarium solani Rhizomucor pusillus Rhodotonila rubra Saccharomyces cerevisiae Scedosporium apiospermum S prolificans Sporothrix schenkii Trichosporon capitatum As esp cies bacterianas seguintes n o apresentaram um resultado positivo Bordetella pertussis Corynebacterium diphtheriae Escherichia coli Haemophilus influenzae Lactobacillus plantarum Legionella pneumophila Moraxella catarrhalis Mycoplasma pneumoniae Neisseria meningitidis Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae S pyogenes S salivarius O DNA humano e as 3 esp cies seguintes Pneumocystis jirovecii Histoplasma capsulatum e Alternaria alternata n o foram testadas no sistema LightCycler 2 0 mas sim no SmartCycler Todos os 4 testes apresentaram resultados negativos com o ensaio Reprodutibilidade e repetibilidade A repetibilidade e a reprodutibilidade foram determinadas por 4 operadores diferentes que analisaram um painel de 7 padr es diferentes em triplicado num total de 168 ensaios As experi ncias foram realizadas utilizando 1 lote de fabrica o diferente do kit MycAssay Aspergillus em 2 equipamentos diferentes situados em 2 locais di
16. e luvas Todos os tubos de reagente devem ser tapados a seguir utiliza o e antes da sua elimina o Aponte com precis o no plano experimental as posi es de todos os tubos capilares que cont m amostras relevantes na posi o 32 do carrossel Uma an lise precisa dos dados exige a aplica o de um ficheiro de compensa o da cor criado com o kit Myconostica MycAssay CC 13 vide por exemplo Mifflin T E 2003 Setting up a PCR Laboratory em PCR Primer 23 Ed eds Dieffenbach and Dveksler Cold Spring Harbour Laboratory Press Cold Spring Harbour NY EUA 030 152 Vers o 1 3 01MAR12 Portugu s 4 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Aspergillus Amostras Respirat rias LightCycler 2 0 Procedimento para a utiliza o 1 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 Prepara o da PCR em tempo real Para come ar ligue o sistema de PCR em Tempo Real LightCycler 2 0 equipamento computador associado e centrifugadora e inicie o software relevante Introduza o nome de utilizador e a palavra passe e escolha a base de dados de diagn stico Se for a primeira execu o do dia execute um auto teste no equipamento antes de iniciar a execu o Tome nota Deve ser realizada uma execu o de compensa o da cor antes de se analisar os resultados para o MycAssay Aspergillus no LightCycler 2 0 No entanto isto n o precisa de ser realizado antes de se utilizar este produto
17. e tipo de erros pode ser detectado ao observar um n vel mais alto de l quido num tubo de reac o e um n vel mais baixo noutro comparativamente ao normal O reagente do Tubo 1 ou 2 n o foi adicionado reac o Repita a execu o tendo cuidado na fase de prepara o Estes erros podem ser detectados ao observarem se n veis mais baixos de l quido neste capilar de reac o comparados com os outros O controlo positivo foi posicionado incorrectamente no equipamento Assegure se que os capilares s o correctamente apontados no software 4 4 A s amostra s de doente s o negativa s e o IAC est fora do intervalo Resultado 3 gt prov vel que a s amostra s de doente contenha m inibidores da PCR Recomenda se que o DNA das amostras seja extra do utilizando o kit de Extrac o de DNA F ngico MycXtra 030 152 Vers o 1 3 01MAR12 Portugu s 10 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Aspergillus Amostras Respirat rias LightCycler 2 0 4 5 A amostra do doente negativa na sec o ASP 530 e o gr fico IAC 560 desvia se significativamente da base regular conforme mostrado na imagem exemplar abaixo as setas indicam gr ficos anormais A reac o PCR foi inibida gt Certifique se de que a rea de trabalho e os instrumentos est o perfeitamente secos ap s a utiliza o de agentes de descontamina o antes da prepara o da PCR gt Execute novamente a amostra do doente
18. el s o considerados clinicamente positivos Outras amostras podem registar valores de Cp gt 37 0 mas estas s o reflectores de n veis normais ou de fundo da carga de Aspergillus na amostra respirat ria Ver Relat rio Cl nico Resultado 1 2 ou 3 Portugu s 9 030 152 Vers o 1 3 01MAR12 MycAssay Aspergillus Para utiliza o diagn stica in vitro LightCycler 2 0 Amostras Respirat rias 4 Resolu o de problemas 4 1 O controlo negativo gerou um sinal positivo no canal 530 gt Ocorreu contamina o durante a prepara o Os resultados de toda a execu o n o s o fi veis como sendo precisos Repita toda a execu o tendo muito cuidado ao adicionar os padr es em particular o controlo positivo Tubo 4 para assegurar que n o ocorre contamina o cruzada Certifique se de que a rea de trabalho e os instrumentos est o adequadamente descontaminados antes e depois de utilizar O controlo negativo foi posicionado incorrectamente no equipamento Assegure se que os capilares s o correctamente apontados no software 4 2 O valor Cp de IAC do controlo negativo n o se situa dentro do intervalo aceit vel gt A PCR foi inibida Certifique se de que a rea de trabalho e os instrumentos est o perfeitamente secos ap s a utiliza o de agentes de descontamina o antes da prepara o da PCR As condi es de conserva o do kit n o cumpriram as instru es na sec o Conserva o destas
19. ferentes no Reino Unido Os resultados foram analisados contra o limite do branco LoB e o cut off cl nico CCO Com uma concentra o de 6 vezes o limite de detec o LoD os resultados de 100 de todas as amostras analisadas estavam em concord ncia positivo com o LoB e 87 5 das amostras estavam em concord ncia no CCO Com concentra es superiores a 6 x LoD os resultados de 100 de todas as amostras estavam em concord ncia tanto com CCO como LoB Transfer ncia do cut off cl nico O cut off cl nico de 36 0 foi estabelecido no SmartCycler Este cut off foi transferido analiticamente para a plataforma do LightCycler 2 0 utilizando um padr o com uma concentra o de Aspergillus que tinha demonstrado render 295 de resultados positivos no CCO do SmartCycler Foi determinado um valor de Cp de 37 0 que foi ent o confirmado utilizando padr es com 3 concentra es diferentes Portugu s 13 030 152 Vers o 1 3 01MAR12 MycAssay Aspergillus Para utiliza o diagn stica in vitro LightCycler 2 0 Amostras Respirat rias As seguintes Reivindica es de Desempenho foram estabelecidas utilizando o Cepheid SmartCycler Subst ncias interferentes contra indica es para a utiliza o Os compostos seguintes foram analisados com concentra es clinicamente relevantes e considerados como n o inibindo o ensaio acetilciste na anfotericina dipropionato de beclometasona budesonida colistimetato de s dio propio
20. instru es de utiliza o ou o kit expirou Verifique se foram seguidas as condi es de conserva o correctas do kit Verifique o prazo de validade dos reagentes ver caixa do kit r tulo da bolsa e repita com um kit dentro do prazo de validade se necess rio O reagente do Tubo 1 ou 2 n o foi adicionado reac o da PCR ou foi adicionada a quantidade a dobrar do Tubo 2 Repita a execu o tendo cuidado na fase de prepara o Este tipo de erros pode ser detectado ao observarem se n veis mais altos ou mais baixos de l quido num capilar de reac o comparados com os outros N o foi aplicado o ficheiro CC correcto aos dados Crie um ficheiro CC com o kit Myconostica MycAssay CC aplique o aos resultados e proceda a uma nova an lise Contacte o seu distribuidor local para obter mais informa es sobre este kit 4 3 O controlo positivo est negativo gt As condi es de conserva o do kit n o cumpriram as instru es na sec o Conserva o destas instru es de utiliza o ou o kit expirou Verifique se foram seguidas as condi es de conserva o correctas do kit Verifique o prazo de validade dos reagentes ver caixa do kit r tulo da bolsa e repita com um kit dentro do prazo de validade se necess rio Ocorreu um erro durante o passo 1 11 1 13 e o padr o do controlo positivo Tubo 4 foi colocado no tubo de reac o errado Repita a execu o tendo muito cuidado na fase de prepara o Est
21. is dica das vias a reas com tamp es de esputo espesso de Aspergillus hyphae IgE total s rica gt 1000 Ul mL e anticorpos IgE e IgG espec ficos de Aspergillus fumigatus detect veis ou um teste de pun o cut nea positivo para Aspergillus s o as caracter sticas da doen a As culturas de esputo podem ser positivas para A fumigatus e podem ser observadas bronquiectasia numa TAC do t rax Os meios actuais de diagn stico da aspergilose pulmonar cr nica s o uma mistura de radiologia que n o espec fica e serologia anticorpos IgG contra Aspergillus ou precipitinas que positiva na maioria das formas de aspergilose e por conseguinte n o espec fica para qualquer manifesta o particular de aspergilose As culturas s o positivas em 1 Base de dados de esp cies em www aspergillus org uk 2 Hope WW Walsh TJ Denning DW 2005 The invasive and saprophytic syndromes due to Aspergillus spp Medical Mycology 43 suppl 1 S207 38 3 Hope WW Walsh TJ Denning DW 2005 Laboratory diagnosis of invasive aspergillosis Lancet Infectious Diseases 9 609 22 Levy H Horak DA Tegtmeier BR Yokota SB Forman SJ 1992 The value of bronchoalveolar lavage and bronchial washings in the diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis Respir Med 86 243 8 5 Greub G and Bille J 1998 Aspergillus species isolated from clinical specimens suggested clinical and microbiological criteria to deteremine significance Clin Microbiol
22. m Tempo Real Roche LightCycler 2 0 incluindo o manual do utilizador o computador em anexo e o software LightCycler vers o v4 1 Centr fuga de carrossel LC 2 0 opcionalmente adaptadores capilares para minicentr fuga Carrossel de amostras para tubos capilares de 20 uL Tubos capilares LC 2 0 de 20 uL com tampas Suporte para tubos capilares Releaser de capilares Ferramenta de capsular Microcentr fuga Agitador v rtice Micropipetas volumes necess rios 7 5 uL 20 uL Pontas de filtro de baixa reten o est reis Luvas descart veis sem p Solu o de descontamina o de DNA patenteada Kit de isolamento de DNA ver em baixo Kit MycAssay CC ver abaixo Amostra A amostra para o ensaio MycAssayT Aspergillus DNA gen mico total extra do de amostras cl nicas de LBA e de outras amostras das vias respirat rias inferiores Para este efeito recomenda se o seguinte kit de isolamento e equipamento que foi utilizado durante a valida o Kit de Extrac o de DNA F ngico MycXtraTM REF 080 005 disponibilizado pela Myconostica Vortex Genie 2 Scientific Industries Inc New York USA Placa de adapta o para v rtice REF 080 015 disponibilizado pela Myconostica Kit de Compensa o da Cor MycAssay CC Uma an lise precisa de dados obtidos atrav s do ensaio MycAssayTM Aspergillus requer a aplica o de um ficheiro de compensa o da cor criado com o kit MycAssa
23. m considera o numa decis o relativa ao resultado para o doente Portugu s 11 030 152 Vers o 1 3 01MAR12 MycAssay Aspergillus Para utiliza o diagn stica in vitro LightCycler 2 0 Amostras Respirat rias 4 9 N o existem resultados para qualquer canal com amostras ou controlos As condi es de conserva o do kit n o cumpriram as instru es na sec o Conserva o destas instru es de utiliza o ou o kit expirou gt Verifique se foram seguidas as condi es de conserva o correctas do kit Verifique o prazo de validade dos reagentes ver caixa do kit r tulo da bolsa e repita com um kit dentro do prazo de validade se necess rio O equipamento utilizado n o funciona correctamente gt Verifique se o seu equipamento de PCR em tempo real tem o hist rico de manuten es actualizado e se foi totalmente calibrado conforme descrito no Guia de Instala o e Manuten o Foi utilizado um ficheiro de protocolo incorrecto durante a configura o do software gt Consulte a Sec o 2 e seleccione o ficheiro de protocolo correcto conforme especificado para cada tipo vers o de software do CD ROM do Protocolo Myconostica S pode ser carregado o ficheiro apropriado para o software Repita a execu o utilizando o ficheiro de protocolo correcto Se tiver mais d vidas ou problemas ou se tiver problemas contacte o Apoio T cnico productsupportDlab21 com 030 152 Vers o 1 3 01MAR12 Portugu s 1
24. ma estrutura de haste e ansa stem and loop A ansa cont m uma sequ ncia de amostras que complementar sequ ncia alvo e a haste formada pela liga o de sequ ncias de bra o complementares que se encontram localizadas de ambos os lados da sequ ncia de amostras Um fluor foro que fluoresce quando excitado por luz com o comprimento de onda apropriado ligado covalentemente extremidade de um bra o e um supressor que suprime a fluoresc ncia do fluor foro quando se encontra em grande proximidade f sica ligado covalentemente extremidade do outro bra o Os sinais moleculares n o entram em fluoresc ncia quando se encontram livres na solu o No entanto quando se hibridizam a uma cadeia de cido nucleico que cont m uma sequ ncia alvo s o submetidos a uma altera o conformacional que separa o fluor foro e o supressor fisicamente possibilitando lhes entrarem em fluoresc ncia em consequ ncia da excita o A quantidade de fluoresc ncia em qualquer ciclo ou a seguir ao ciclo depende da quantidade de produtos da amplifica o presentes nessa altura O sistema de PCR em Tempo Real SmartCycler monitoriza simultaneamente a fluoresc ncia emitida por cada sinal Precau es O kit destina se a ser utilizado apenas por profissionais de laborat rio Os procedimentos s o necess rios para manipula es n o aerossol de amostras As precau es normais e as directrizes institucionais devem ser seguidas no manuseamen
25. nato de fluticasona fumarato de formoterol di hidratado brometo de ipratr pio lidoca na manitol sulfato de salbutamol salmeterol cloreto de s dio cromoglicato de s dio terbutalina tobramicina Avalia o do desempenho Para avaliar o desempenho do kit MycAssay Aspergillus em amostras cl nicas foram utilizadas amostras respirat rios BAL colhidas em 2 hospitais extra das com o kit MycXtra e conservadas Foram feitas compara es tanto com o diagn stico cl nico como com a cultura O valor de cut off com um Ct de 36 0 foi estabelecido a seguir an lise de um conjunto de dados de amostras provenientes de centros diferentes e de popula es de doentes diferentes Os cut offs diferentes foram avaliados relativamente probabilidade de diferenciamento entre estado patol gico e estado n o patol gico PCR vs Diagn stico cl nico Positivo cl nico Negativo cl nico PCR positiva 31 1 0 97 PPV PCR negativa 2 10 0 83 NPV 0 94 0 91 Sensibilidade Especificidade PCR vs Cultura de Aspergillus Cultura positiva Cultura negativa PCR positiva 29 3 0 91 PPV PCR negativa 2 10 0 83 NPV 0 94 0 77 Sensibilidade Especificidade Das amostras testadas 0 8 continham inibidores da PCR conforme indicado pelo IAC a seguir extrac o com o conjunto MycXtra Relat rio cl nico O kit MycAssay Aspergillus foi concebido como uma ajuda no diagn stico Os resultados t m de ser
26. oma aspergilose pulmonar cavit ria cr nica e aspergilose fibr tica cr nica A aspergilose invasiva Al ocorre em grupos de doentes em risco incluindo doentes tratados com corticoster ides e doentes com neutropenia ou disfun o fagocit ria i e doen a granulomatosa cr nica e infec o por HIV Cerca de 80 dos casos de aspergilose invasiva envolve os pulm es O diagn stico de rotina da aspergilose pulmonar invasiva inclui tomografia computorizada TAC broncoscopia e lavagem broncoalveolar microscopia e cultura an lises sangu neas de antig nios de Aspergillus ou exame histol gico de amostras de biopsia cir rgica Neste cen rio as culturas s o com frequ ncia falsamente negativas De facto a lavagem broncoalveolar s positiva por cultura em aproximadamente 40 dos casos mesmo quando o diagn stico provado por outros meios 4587 demonstrando a falta de sensibilidade da cultura na detec o da aspergilose invasiva e da aspergilose pulmonar cr nica As culturas s o no entanto importantes se forem positivas uma vez que muitos testes de diagn stico n o indicam o g nero ou a esp cie do fungo que causa a doen a ou o perfil de susceptibilidade do isolado que causa a infec o A aspergilose broncopulmonar complica a asma e a fibrose qu stica e pode raramente apresentar se sem doen as subjacentes A maioria dos casos est associada a A fumigatus com outros fungos implicados ocasionalmente A obstru o ep
27. para Save Guardar atrav s do direct rio File Ficheiro e guarde o macro padr o no lugar pretendido da sua base de dados 030 152 Vers o 1 3 01MAR12 Portugu s 6 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Aspergillus Amostras Respirat rias LightCycler 2 0 2 4 2 5 2 6 2 7 2 8 2 9 2 10 Ei Seleccione a op o Run Macro Executar macro na barra de ferramentas E Seleccione o ficheiro do padr o Macro MAA v1 2 e prima Open Abrir Siga as instru es dadas pelo assistente de instala o Marque a caixa Perform Self Test quando se trata da primeira execu o do dia EM Atribua um nome ao ficheiro da execu o e guarde o no lugar pretendido V para a sec o Amostras e clique no separador no lado esquerdo do ecr Introduza os n meros de amostra na caixa Samples Count e os nomes no separador Capillary view Utilize os mesmos nomes utilizados para as amostras no plano experimental e conforme posicionados no carrossel E Coloque o carrossel centr fugo no equipamento LC 2 0 Assegure se que o ressalto debaixo da posi o de amostra 1 no carrossel engata na posi o com o pino na c mara t rmica Assegure se que o carrossel est firmemente inserido na c mara e feche a tampa Depois de conclu do prima o bot o Start Iniciar Assegure se que o equipamento encontrou todos os capilares inseridos no carrossel e que o programa iniciou E Portugu s 7 030 152 Vers o 1 3 01MAR12
28. to de todas as amostras A Myconostica Ltd disponibiliza uma Ficha de dados de seguran a do material Este teste destina se apenas a utiliza o diagn stica in vitro Este teste destina se apenas a utiliza o em combina o com o software Roche LightCycler 2 0 e o LightCycler v4 1 N o utilize reagentes ou controlos se as bolsas protectoras estiverem abertas ou quebradas chegada Os reagentes e os controlos n o s o intercambi veis entre kits com n meros de lote diferentes Nunca junte reagentes ou controlos de tubos diferentes mesmo que perten am ao mesmo lote Nunca utilize reagentes ou controlos ap s o seu prazo de validade Os reagentes e os controlos nunca devem voltar a ser congelados ou reutilizados ap s a abertura Use roupas protectoras e luvas descart veis enquanto manipular os kits de reagentes Evite a contamina o microbiana e com desoxirribonuclease DNAse dos reagentes ao remover as al quotas dos tubos Recomenda se a utiliza o de pontas de pipetas com filtro de baixa reten o descart veis isentas de DNAse ou pontas de pipetas de deslocamento positivo Utilize uma nova ponta para cada amostra ou reagente 1 Denning DW Riniotis K Dobrashian R Sambatakou H 2003 Chronic cavitary and fibrosing pulmonary and pleural aspergillosis Case series proposed nomenclature and review Clin Infect Dis 37 Suppl 3 S265 80 1 Camuset J Lavol A Wislez M Khalil A Bellocq A B
29. uga de carrossel centrifugue as amostras numa minicentr fuga utilizando os adaptadores fornecidos juntamente com a prateleira de suporte Caso contr rio continue com 1 17 1 17 Transfira todos os tubos capilares com cuidado para o carrossel exactamente pela mesma ordem em que est o metidos no suporte come ando com o primeiro tubo capilar na posi o 1 e continuando numa ordem ascendente sem deixar quaisquer lacunas Empurre cada tubo capilar completamente para baixo at assentar no seu s tio 1 18 Se n o tiverem sido ainda centrifugadas at ao item 1 16 centrifugue as amostras com a centr fuga de carrossel LC 2 0 1 19 Avance imediatamente para a Sec o 2 As reac es do MycAssay Aspergillus permanecem est veis na bancada durante at 60 minutos 1 20 A seguir prepara o do PCR certifique se de que a rea de trabalho volta a ser perfeitamente limpa utilizando reagentes de descontamina o de DNA 2 Realizar a execu o 2 1 Insira o CD ROM do Protocolo do MycAssay Aspergillus Myconostica 2 2 V para Import Importar atrav s do direct rio File Ficheiro e seleccione Object ixo files Importe o ficheiro Macro MAA v1 2 ixo do CD para a sua base de dados File Edit view Tools Window Help 3 New CtrhN 3 open Ctri 0 Close Gtri 5 Logout Export COF Std Curve Files Batch import Object ixo files Batch export a Repi Print window Ctrl R Exit 2 3 V
30. uma marca comercial da Roche Diagnostics GmbH Lab21 184 Cambridge Science Park Cambridge CB4 OGA United Kingdom Telephone 44 0 1638 552 882 Facsimile 44 0 1638 552 375 Email productsupportDlab21 com Portugu s 15 030 152 Vers o 1 3 01MAR12
31. y CC REF 080 080 Uma vez criado o ficheiro pode ser utilizado para multiplicar execu es na mesma m quina Por favor contacte o seu distribuidor local para obter mais informa o Observa es metodol gicas Leia todo o protocolo antes de come ar O processo completo do MycAssay Aspergillus excluindo a extrac o de DNA demora aproximadamente 2 horas dependendo do n mero de amostras analisadas A prepara o da an lise deve ser efectuada numa esta o de trabalho de PCR ou num laborat rio pr PCR Se n o houver uma esta o de trabalho de PCR dispon vel a an lise deve ser preparada numa rea espec fica do laborat rio separada de reas utilizadas para extrac o de DNA que seja regularmente limpa com reagentes de descontamina o de DNA No entanto evite utilizar reagentes de descontamina o de DNA durante a prepara o da PCR em tempo real uma vez que podem interferir com o ensaio Utilize micropipetas para transfer ncia de fluidos Para a prepara o destas reac es devem ser utilizadas micropipetas espec ficas que devem ser regularmente descontaminadas Recomenda se a utiliza o de pontas de filtro de baixa reten o para assegurar que nenhum DNA perdido durante a prepara o do procedimento Proceda com precau o ao manipular o Tubo 4 Este cont m material de controlo positivo de DNA e uma contamina o pode dar origem a resultados de an lise positivos falsos Use sempr
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