Pneumocystis - Myconostica
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1. o diagn stica in vitro MycAssay Pneumocystis Amostras Respirat rias Applied BioSystems 7500 Pneumocystis tendem a ter n meros mais elevados de organismos detect veis do que doentes que n o estejam infectados com o v rus mas a sobreposi o consider vel O gr fico de dispers o na Figura 1 abaixo demonstra esta sobreposi o Para conclus o como o conjunto de dados da Tabela 1 inclu a doentes cujo estado de HIV era desconhecido o gr fico de dispers o deste grupo inclu do na Figura 1 coluna 3 39 CSSESESA 37 s e 35 hd e 33 e 31 E e 2 a gt pa O 27 8 2 r 25 23 21 19 e 17 0 1 2 3 4 Categoria 1 HIV Microscopia 2 HIV Microscopia 3 HIV desconhecido Microscopia 4 Todos microscopia Figura 1 Gr fico de dispers o dos valores Ct obtidos a partir do DNA extra do de amostras respirat rias de doentes S o descritos quatro grupos Relat rio cl nico O kit MycAssay Pneumocystis foi concebido como uma ajuda no diagn stico da pneumonia por Pneumocystis Os resultados t m de ser contextualizados na doen a cl nica do doente e noutros resultados de an lises de diagn stico Os seguintes s o relat rios recomendados dependendo cada um da interpreta o do resultado do ensaio Resultado n 1 Pneumocystis jirovecii n o detectado Resultado n 2 Pneumocystis jirovecii detectado R2. MycXtra 4 5 N o existem resultados para qualquer canal com amostras ou controlos gt As condi es de conserva o do kit n o cumpriram as instru es na sec o Conserva o destas instru es de utiliza o ou o kit expirou Verifique se foram seguidas as condi es de conserva o correctas do kit Verifique o prazo de validade dos reagentes ver caixa do kit r tulo da bolsa e repita com um kit dentro do prazo de validade se necess rio O equipamento utilizado n o funciona correctamente Verifique se o seu equipamento de PCR em tempo real tem o hist rico de manuten es actualizado e se foi totalmente calibrado conforme descrito no Guia de Instala o e Manuten o Foi utilizado um ficheiro de protocolo incorrecto durante a configura o do software Consulte a sec o 2 e seleccione o ficheiro de protocolo correcto conforme especificado para cada tipo vers o de software do CD ROM do Protocolo Myconostica S pode ser carregado o ficheiro apropriado para o software Repita a execu o utilizando o ficheiro de protocolo correcto Foram utilizados tubos ou placas n o recomendados Os limiares s s o v lidos na utiliza o dos tubos e tampas MicroAmp recomendados Se tiver mais d vidas ou problemas ou se tiver problemas contacte o Apoio T cnico productsupport lab21 com Portugu s 10 030 149 Vers o 1 4 24FEB12 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Pneumocystis Amost
3. Avalia o do desempenho Os seguintes dados foram criados com o kit MycAssay Pneumocystis kit durante estudos de valida o utilizando o Cepheid SmartCycler A valida o foi efectuada para demonstrar a equival ncia de desempenho entre plataformas O cut off cl nico com um Ct de 39 0 foi estabelecido a seguir an lise de um conjunto de amostras cl nicas obtidas de popula es de doentes diferentes Amostras cl nicas colhidas por lavagem broncoalveolar BAL obtidas em 2 hospitais extra das com o kit MycXtra e conservadas foram utilizadas para avaliar o desempenho do kit MycAssay Pneumocystis Foram feitas compara es entre os resultados da PCR e a microscopia de imunofluoresc ncia PCR vs Diagn stico de microscopia Microscopia Microscopia positiva negativa PCR 45 8 0 85 PPV positiva PCR 2 33 0 94 NPV negativa 0 96 0 80 Sensibilidade Especificidade Tabela 1 Especificidade e sensibilidade diagn stica do kit MycAssay Pneumocystis comparativamente com microscopia de imunofluoresc ncia A tabela 1 representa dados obtidos de doentes com HIV diagnosticada doentes n o infectados com HIV e doentes com estado de HIV indeterminado Doentes com pneumonia por Pneumocystis possuem quantidades altamente vari veis de organismos detect veis quando menor o valor Ct maior a possibilidade de doen a Doentes com HIV e pneumonia por Portugu s 11 030 149 Vers o 1 4 24FEB12 Para utiliza
4. Recomenda se a utiliza o de pontas de filtro de baixa reten o para assegurar que nenhum DNA perdido durante a prepara o do procedimento Exer a precau o ao manipular o tubo 4 Este cont m material de ADN padr o e a contamina o pode resultar em resultados de an lise positivos falsos Use sempre luvas Todos os tubos devem ser tapados a seguir utiliza o e antes da sua elimina o Anote com precis o as posi es das amostras quando s o processadas amostras de v rios doentes Para um exemplo ver Mifflin T E 2003 Setting up a PCR Laboratory em PCR Primer 2 Ed eds Dieffenbach and Dveksler Cold Spring Harbour Laboratory Press Cold Spring Harbour NY EUA Portugu s 3 030 149 Vers o 1 4 24FEB12 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Pneumocystis Amostras Respirat rias Applied BioSystems 7500 Procedimento para a utiliza o 1 Prepara o da PCR em tempo real 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 Para come ar ligue o sistema de PCR em Tempo Real AB7500 equipamento e computador associado e abra o software SDS v1 4 Introduza os nomes de utilizador e as palavras passe se exigido Assegure se de que a rea de trabalho foi limpa com reagentes de descontamina o de DNA e deixe secar completamente evite utiliz los durante a prepara o do ensaio uma vez que o excesso de solu o de limpeza pode inibir as reac es de PCR Cada bol
5. do prazo de validade se necess rio Ocorreu um erro durante a prepara o e o padr o do controlo positivo tubo 4 foi colocado no tubo de reac o errado Repita a execu o tendo muito cuidado na fase de prepara o Este tipo de erros pode ser detectado ao observar um n vel mais alto de l quido num tubo de reac o e um n vel mais baixo noutro comparativamente ao normal O reagente do tubo 1 ou 2 n o foi adicionado reac o Repita a execu o tendo cuidado na fase de prepara o Este tipo de erros pode ser detectado ao observarem se n veis mais baixos de l quido neste tubo de reac o comparativamente aos outros O controlo positivo foi posicionado incorrectamente no equipamento Tenha o cuidado para que todas as reac es sejam correctamente anotadas no software e que as tiras de tubos sejam colocadas no aparelho com a orienta o correcta Foram utilizados tubos ou placas n o recomendados Os limiares s s o v lidos na utiliza o dos tubos e tampas MicroAmp recomendados Portugu s 9 030 149 Vers o 1 4 24FEB12 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Pneumocystis Amostras Respirat rias Applied BioSystems 7500 4 4 Amostra s de doentes apresenta m resultado 3 Inv lido gt prov vel que a s amostra s cl nica s extra da s contenha m inibidores da PCR Recomenda se que o DNA de amostras cl nicas seja extra do utilizando o kit de Extrac o de DNA F ngico
6. e introduza o seu nome de utilizador e a palavra passe Insira o CD ROM do Protocolo do MycAssay Pneumocystis Myconostica No menu Quick Startup In cio r pido seleccione a primeira op o Create New Document Criar novo documento Seleccione as defini es conforme apresentado abaixo Seleccione o modelo MycAssay Pneumocystis SDS1 4v3 1 sdt do CD ROM atrav s de Browse Pesquisar D um Nome de Placa adequado execu o Abaixo pode encontrar um exemplo New Document Wizard Define Document Select the assay container and template for the document and enter the operator name and comments Assay Standard Curve Absolute Quantitation h Container 96Well Clear Template Myc ssay Pneumocystis SDS1 443 1 sdt Browse Run Mode Operator your name Comments Plate Name Pneumocystis 23MAR10 NAME Finish Cancel Portugu s 5 030 149 Vers o 1 4 24FEB12 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Pneumocystis Amostras Respirat rias Applied BioSystems 7500 2 6 Clique em Finish Terminar Ser aberto um novo documento contendo os par metros e detectores de PCR definidos automaticamente para este ensaio Na vista Plate Placa do separador Setup Configura o utilize Well Inspector Inspector de po os seleccione um po o e pressione Ctrl 1 ou clique com a tecla direita do rato para atribuir o nome aos po os de acordo com as posi es das amo
7. est contaminada MEDIDA Repetir execu o Verificar o controlo negativo O Ct de PNE MycAssay 39 0 ou indeterminado a Falha na execu o MEDIDA Repetir a execu o Falha na execu o Verificar o controlo negativo O Ct de IAC MycAssay 29 0 a 32 7 Verificar o controlo positivo MEDIDA Repetir a execu o no O Ct de PNE MycAssay 20 0 a 26 0 Positivo para Pneumocystis DNA SIM Verificar a amostra do doente MEDIDA Registar resultado 2 E O Ct de PNE MycaAssay lt 39 0 Negativo para Pneumocystis Verificar a amostra do doente DNA SIM A O Ct de IAC MycAssay 29 0 a 32 7 MEDIDA Registar resultado 1 N O Falha de IAC MEDIDA Repetir a amostra Se obtiver o mesmo resultado Registar resultado 3 Amostra PNE IAC Interpreta o Medida MycAssay Ct MycAssay Ct subsequente Controlo 39 0 ou Entre 29 0 e Controlo Os resultados negativo indeterminado 32 7 negativo do doente s o aceit vel v lidos Controlo 39 0 ou lt 29 0 ou Falha no Repetir a negativo indeterminado gt 32 7 controlo execu o negativo completa Controlo lt 39 0 Entre 29 0 e Contamina o Repetir a negativo 32 7 execu o completa Controlo Entre 20 0 e N D Controlo positivo Os resultados positivo 26 0 aceit vel do doente s o v lidos Controlo lt 20 0 ou N D Falha no Repetir a positivo gt 26 0 controlo positivo execu o completa Doente 39 0 ou Entre 29 0 e Negativo para
8. 1 4 24FEB12
9. Este teste destina se apenas a utiliza o diagn stica in vitro Este teste destina se apenas a utiliza o com o equipamento Applied BioSystems 7500 com o software SDS vers o 1 4 Devem ser utilizadas tiras de tubos para PCR MicroAmp Optical ver sec o Materiais equipamentos para mais detalhes com este kit A utiliza o de consum veis de pl stico diferentes pode invalidar os resultados do ensaio N o utilize reagentes ou controlos se as bolsas protectoras estiverem abertas ou quebradas chegada Os reagentes e os controlos n o s o intercambi veis entre kits com n meros de lote divergentes Nunca junte reagentes ou controlos de tubos diferentes mesmo que perten am ao mesmo lote Nunca utilize reagentes ou controlos ap s o seu prazo de validade Os reagentes e os controlos n o devem voltar a ser congelados ou reutilizados ap s a abertura Use roupas protectoras e luvas descart veis enquanto manipular os kits de reagentes Evite a contamina o microbiana e com desoxirribonuclease DNAse dos reagentes ao remover as al quotas dos tubos Recomenda se a utiliza o de pontas de pipetas com filtro descart veis de baixa reten o e isentas de DNAse ou pontas de pipetas de deslocamento positivo Utilize uma nova ponta para cada amostra ou reagente Elimine os reagentes n o utilizados e os res duos de acordo com os regulamentos nacionais federais estatais e locais Para evitar a contamina o com produtos de amplific
10. F Allen E Copas A Singer M Edwards SG Improved survival for HIV infected patients with severe Pneumocystis jirovecii pneumonia is independent of highly active antiretroviral therapy Thorax 2006 61 716 21 3 Kovacs JA Gill VJ Meshnick S Masur H 2001 New insights into transmission diagnosis and drug treatment of Pneumocystis carinii pneumonia JAMA 286 2450 60 Huang L Morris A Limper AH Beck JM ATS Pneumocystis Workshop Participants An Official ATS Workshop Summary Recent advances and future directions in pneumocystis pneumonia PCP Proc Am Thorac Soc 2006 3 655 64 Tyagi S Kramer FR 1996 Molecular beacons Probes that fluoresce upon hybridization Nature Biotechnology 14 303 308 Portugu s 1 030 149 Vers o 1 4 24FEB12 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Pneumocystis Amostras Respirat rias Applied BioSystems 7500 qualquer ciclo ou a seguir ao ciclo depende da quantidade de produtos da amplifica o presentes nessa altura O sistema de PCR em Tempo Real SmartCycler monitoriza simultaneamente a fluoresc ncia emitida por cada sinal Precau es O kit destina se a ser utilizado apenas por profissionais de laborat rio Os procedimentos s o necess rios para manipula es n o aerossol de amostras As precau es normais e as directrizes institucionais devem ser seguidas no manuseamento de todas as amostras A Myconostica Ltd disponibiliza uma Ficha de dados de seguran a do material
11. Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Pneumocystis Applied BioSystems 7500 myconosjica Amostras Respirat rias MycAssay Pneumocystis Applied BioSystems 7500 Amostras Respirat rias REF 080 035 Utiliza o prevista MycAssay Pneumocystis est indicado para a utiliza o por profissionais de laborat rio qualificados para a detec o qualitativa do DNA gen mico de Pneumocystis jirovecii extra do de amostras respirat rias do tracto respirat rio inferior p ex amostras br nquicas como ajuda no diagn stico em doentes adultos com suspeita de terem pneumonia por P jirovecii MycAssay Pneumocystis foi validado para a utiliza o com o equipamento Applied BioSystems 7500 utilizando o software SDS vers o 1 4 Resumo e explica o A pneumonia por Pneumocystis jirovecii anteriormente carinii PCP uma pneumonia oportunista comum em doentes imunocomprometidos especialmente em doentes com infec o VIH avan ada e SIDA habitualmente adquirida na comunidade e subaguda na sua apresenta o conduzindo insufici ncia respirat ria progressiva e morte se n o for tratada A profilaxia com trimetoprim sulfametoxazol Bactrim ou Septrin administrada rotineiramente a muitos doentes de risco uma pr tica que reduziu substancialmente a incid ncia de PCP mas a progress o ocorre e os indiv duos que n o sabem que s o VIH positivos podem apresentar SIDA com PCP A PCP tamb m ocorrem noutros d
12. Registar indeterminado 32 7 Pneumocystis resultado Resultado 1 Doente lt 39 0 N D Positivo para Registar Pneumocystis resultado Resultado 2 Doente 39 0 ou lt 29 0 ou Falha do IAC na Repetir a indeterminado gt 32 7 amostra amostra Resultado 3 Ver Relat rio Cl nico do resultado 1 20u3 Portugu s 8 030 149 Vers o 1 4 24FEB12 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Pneumocystis Amostras Respirat rias Applied BioSystems 7500 Resolu o de problemas 4 1 O controlo negativo gerou um sinal positivo no canal FAM gt Ocorreu contamina o durante a prepara o Os resultados de toda a execu o n o s o fi veis como sendo precisos Repita toda a execu o tendo muito cuidado ao adicionar os padr es em particular o controlo positivo tubo 4 para assegurar que n o ocorre contamina o cruzada Certifique se de que a rea de trabalho e os instrumentos est o adequadamente descontaminados antes e depois de utilizar O controlo negativo foi posicionado incorrectamente no equipamento Tenha o cuidado para que todas as reac es sejam correctamente anotadas no software e que as tiras de tubos sejam colocadas no aparelho com a orienta o correcta Foram utilizados tubos ou placas n o recomendados Os limiares s s o v lidos na utiliza o dos tubos e tampas MicroAmp recomendados 4 2 O valor Ct de IAC do controlo negativo n o se situa dentro do interv
13. a o de Pneumocystis ou do controlo de amplifica o interno IAC n o abra os tubos de reac o ap s a amplifica o Podem ser analisados controlos adicionais de acordo com as directrizes ou requisitos dos regulamentos locais estatais provinciais e ou federais ou de organiza o acreditadas N o coma beba nem fume nas reas em que as amostras e os reagentes dos kits s o manuseados Concentra es baixas de DNA podem ser inst veis se n o forem conservadas correctamente Recomenda se que as extrac es de DNA de amostras cl nicas sejam conservadas a 80 C para preservar a sua integridade M ltiplos ciclos de descongela o e recongela o devem ser igualmente evitados sempre que poss vel Conte do do kit Descri o O kit consiste em cinco bolsas de folha seladas com 3 compartimentos podendo cada uma delas ser utilizada separadamente Cada bolsa cont m reagentes suficientes para 8 reac es Volume Tubo 1 dNTPs 66 uL Tampa cor MgCl gt de laranja Solu o tamponada com complexo de DNA polimerase Tubo 2 lt 0 01 prim rios 66 uL Tampa lt 0 01 sinais moleculares azul lt 0 0001 Controlo de Amplifica o Interno IAC O Controlo de Amplifica o Interno um plasm deo de ADN recombinante que abriga uma sequ ncia n o infecciosa n o relacionada com nenhuma das sequ ncias alvo Pneumocystis Tamp o Tris HCI Tubo 3 Controlo negativo 25 uL Tampa Agua transparent e Tubo 4 Controlo positivo 25
14. alo aceit vel gt A PCR foi inibida Certifique se de que a rea de trabalho e os instrumentos est o perfeitamente secos ap s a utiliza o de agentes de descontamina o antes da prepara o da PCR As condi es de conserva o do kit n o cumpriram as instru es na sec o Conserva o destas instru es de utiliza o ou o kit expirou Verifique se foram seguidas as condi es de conserva o correctas do kit Verifique o prazo de validade dos reagentes ver caixa do kit r tulo da bolsa e repita com um kit dentro do prazo de validade se necess rio O reagente do tubo 1 ou 2 n o foi adicionado reac o da PCR ou foi adicionada a quantidade a dobrar do tubo 2 Repita a execu o tendo cuidado na fase de prepara o Este tipo de erros pode ser detectado ao observarem se n veis mais altos ou mais baixos de l quido num tubo de reac o comparativamente aos outros Foram utilizados tubos ou placas n o recomendados Os limiares s s o v lidos na utiliza o dos tubos e tampas MicroAmp recomendados 4 3 O controlo positivo est negativo fora do intervalo gt As condi es de conserva o do kit n o cumpriram as instru es na sec o Conserva o destas instru es de utiliza o ou o kit expirou Verifique se foram seguidas as condi es de conserva o correctas do kit Verifique o prazo de validade dos reagentes ver caixa do kit r tulo da bolsa e repita com um kit dentro
15. de DNA patenteada Caneta marcadora permanente Kit de isolamento de DNA ver em baixo Amostra A amostra para o ensaio MycAssay Pneumocystis ADN total extra do de amostras BAL cl nicas Para este efeito recomenda se o seguinte kit de isolamento de ADN e equipamento fornecido pela Myconostica Ltd que foi utilizado durante a valida o Kit de Extrac o de DNA F ngico MycXtra REF 080 005 dispon vel na Myconostica Vortex Genie 2 Scientific Industries Inc New York USA Placa de adapta o para V rtex REF 080 015 dispon vel na Myconostica Observa es metodol gicas Antes de come ar leia todo o protocolo O processo completo do MycAssay Pneumocystis excluindo a extrac o de DNA demora aproximadamente 2 horas dependendo do n mero de amostras analisadas A prepara o da an lise deve ser efectuada numa esta o de trabalho de PCR ou num laborat rio pr PCR Se n o houver uma esta o de trabalho de PCR dispon vel a an lise deve ser preparada numa rea espec fica do laborat rio que seja regularmente limpa com reagentes de descontamina o de ADN No entanto evite utilizar reagentes de descontamina o de DNA durante a prepara o da PCR em tempo real uma vez que podem inibir o ensaio Utilize micropipetas para transfer ncia de fluidos Para a prepara o destas reac es devem ser utilizadas micropipetas espec ficas que devem ser regularmente descontaminadas
16. esultado positivo Estado do valor Ct Resultado n 3 An lise falhada presen a de inibidores ou de outra subst ncia desconhecida Quanto menor o valor Ct maior a probabilidade da doen a Os valores Ct perto do cut off de 39 0 s o mais prov veis de representarem coloniza o do que infec o mas alguns doentes podem ter a doen a com muito poucos P jirovecii presente representando uma amostra fraca antes do tratamento ou a natureza de carga f ngica nesse doente espec fico Portugu s 12 030 149 Vers o 1 4 24FEB12 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Pneumocystis Amostras Respirat rias Applied BioSystems 7500 Limites do procedimento Q limite principal deste procedimento relaciona se com a qualidade da amostra principal Se a amostra for muito pequena ou se n o tiver sido colhida na rea afectada do pulm o a an lise ser menos sens vel e pode ser falsamente negativa As amostras da BAL devem ser centrifugadas antes da extrac o do DNA do sedimento Os dados demonstraram igualmente que a redu o no volume do sobrenadante utilizado no processo de extrac o alcan ada pelo passo de centrifuga o diminui a propor o de inibidores que entram no sistema Embora o procedimento de extrac o de DNA f ngico MycXtra tenha sido concebido para remover os inibidores da PCR nem todos os f rmacos ou popula es de doentes foram avaliados O procedimento n o foi totalmente ava
17. liado em esputo nem em amostras induzidas com solu o salina ou amostras provenientes de crian as Podem ser obtidos resultados positivos falsos provenientes da contamina o externa da amostra ou da an lise original Essa contamina o pode surgir do ar contaminado com P jirovecii uma t cnica experimental fraca no que se refere ao controlo positivo ou contamina o externa especialmente pipeta com DNA de P jirovecii Uma vez que um resultado positivo verdadeiro pode ser obtido de doentes que estejam transitoriamente ou persistentemente colonizados com P jirovecii necess ria a avalia o cl nica na interpreta o do resultado da an lise AUTORIZA O TopTaq Hot Start fornecido por QIAGEN QIAGEN uma marca comercial registada da Qiagen GmbH Hilden Alemanha Este produto comercializado sob a licen a do Public Health Research Institute Newark New Jersey EUA e pode ser utilizado sob os direitos de patente do PHRI apenas para o diagn stico humano in vitro Applied BioSystems uma marca comercial registada da Applera Corporation ou das suas subsidi rias nos EU e ou determinados outros pa ses SmartCycler uma marca comercial registada da Cepheid 904 Caribbean Drive Sunnyvale CA 94089 EUA Lab21 184 Cambridge Science Park Cambridge CB4 OGA United Kingdom Telephone 44 0 1638 552 882 Facsimile 44 0 1638 552 375 Email productsupportOlab21 com Portugu s 13 030 149 Vers o
18. ococcus neoformans Doratomyces microsporus Fusarium solani Histoplasma capsulatum Rhizomucor pusillus Rhodotonila rubra Saccharomyces cerevisiae Scedosporium apiospermum S prolificans Sporothrix schenkii Trichosporon capitatum The following bacterial species did not report a positive result Bordetella pertussis Corynebacterium diphtheriae Escherichia coli Haemophilus influenzae Lactobacillus plantarum Legionella pneumophila Moraxella catarrhalis Mycoplasma pneumoniae Neisseria meningitidis Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae S pyogenes S salivarius O DNA gen mico humano n o apresenta um resultado positivo com este ensaio Subst ncias interferentes contra indica es para a utiliza o Os seguintes dados foram criados com o kit MycAssay Pneumocystis kit durante estudos de valida o utilizando o Cepheid SmartCyclerQ A valida o foi efectuada para demonstrar a equival ncia de desempenho entre plataformas Os compostos seguintes foram analisados com concentra es clinicamente relevantes e considerados como n o inibindo o ensaio acetilciste na anfotericina dipropionato de beclometasona budesonida colistimetato de s dio propionato de fluticasona fumarato de formoterol di hidratado brometo de ipratr pio lidoca na manitol sulfato de salbutamol salmeterol septrin trimetoprim sulfametoxazol cloreto de s dio cromoglicato de s dio terbutalina e tobramicina
19. oentes imunocomprometidos incluindo receptores de transplantes de rg os s lidos hipogamaglobulinemia e leucemia cr nica Actualmente o diagn stico de PCP baseia se em m todos microsc picos uma vez que n o poss vel fazer culturas de P jirovecii em laborat rios de microbiologia de rotina A lavagem broncoalveolar BAL o meio preferido de colheita de amostras Os m todos habituais para o diagn stico incluem imunofluoresc ncia IF ou fluoresc ncia directa e a colora o histol gica de amostras MycAssay Pneumocystis um kit de diagn stico molecular para a detec o de P jirovecii com base na tecnologia de PCR com sinais moleculares molecular beacon Todo o procedimento da an lise incluindo a extrac o de DNA da amostra cl nica pode ser conclu do em 4 horas ou apenas 2 horas se o DNA extra do j estiver dispon vel Este ensaio traz o benef cio directo da efic cia laboratorial melhorada combinada com uma an lise r pida que conduz a prov veis benef cios cl nicos A precis o diagn stica da an lise depende largamente da qualidade da amostra Princ pios do procedimento A seguir mistura dos reagentes no kit MycAssay Pneumocystis com uma amostra contendo a sequ ncia de DNA alvo de Pneumocystis uma por o da subunidade grande riboss mica mitocondrial de Pneumocystis a termociclagem resulta na ocorr ncia da amplifica o do DNA O ensaio tamb m cont m um Controlo de Amplifica o Inte
20. ras Respirat rias Applied BioSystems 7500 Caracter sticas e limita es do desempenho Todas as caracter sticas e reivindica es de desempenho anal tico e cl nico para o ensaio MycAssay Pneumocystis foram originalmente determinadas no Cepheid Smartcycler Para avaliar a transfer ncia do ensaio para a plataforma de PCR em Tempo Real AB7500 e para demonstrar equival ncia entre as 2 plataformas determinados estudos foram repetidos na plataforma AB7500 Os resultados desses estudos encontram se documentados abaixo Os estudos que foram efectuadas no Cepheid Smartcycler encontram se indicados Sensibilidade anal tica Com o protocolo anteriormente descrito e uma mol cula de DNA de Pneumocytis recombinante criada na Myconostica o limite de detec o LoD para Pneumocystis foi determinado como sendo lt 30 c pias Este valor foi determinado utilizando um plasm deo de DNA recombinante que abriga a sequ ncia alvo A sequ ncia alvo Pneumocystis mitocondrial por isso existir o numerosas c pias por c lula mas n o se sabe quantas Selectividade anal tica A selectividade anal tica foi testada com DNA extra do de uma variedade de esp cies f ngicas e n o f ngicas diferentes As esp cies seguintes n o apresentaram um resultado positivo Alternaria alternata Aspergillus flavus A fumigatus A niger A terreus Blastomyces capitatus Candida albicans C glabrata C parapsilosis C tropicalis Cladosporium spp Crypt
21. remover as al quotas finais Utilize uma nova ponta de pipeta para cada transfer ncia de l quido Volte a tapar cada tubo de reagente a seguir utiliza o e elimine o imediatamente assim como todo o conte do restante num recipiente de res duos cl nicos que possa ser selado Os reagentes n o utilizados n o podem ser guardados para utiliza o posterior Tenha um cuidado adicional ao pipetar o tubo 4 controlo positivo de DNA para assegurar que n o contamina outro tubo de reac o Fechar as tampas dos outros tubos de reac o antes de abrir o tubo 4 pode reduzir o risco de contamina o cruzada Certifique se de que todas as tampas dos tubos de reac o se encontram firmemente fechadas Tome nota das posi es de cada amostra nas tiras de tubos Rotule por exemplo na tampa o primeiro tubo de cada tira se for utilizada mais de uma tira de tubos Centrifugue os tubos de reac o durante 10 segundos utilizando uma mini centr fuga com adaptador para tubos para PCR de 0 2 mL Inspeccione visualmente se existem bolhas nas misturas da reac o Avance imediatamente para a sec o 2 As reac es do MycAssay Pneumocystis permanecem est veis na bancada durante at 60 minutos A seguir prepara o do PCR certifique se de que a rea de trabalho volta a ser perfeitamente limpa utilizando reagentes de descontamina o de DNA 2 Realizar a execu o 2 1 2 2 2 3 2 4 2 5 Abra o software AB 7500 SDS vers o 1 4
22. rno IAC um fragmento de DNA n o presente em genomas de Pneumocystis outros genomas f ngicos bacterianos ou humanos para detectar subst ncias inibit rias da PCR e confirmar a funcionalidade dos reagentes do ensaio Os alvos de ADN amplificados s o detectados com sinais moleculares amostras de hibridiza o de oligonucle tidos de cadeia nica que formam uma estrutura de haste e ansa stem and loop A ansa cont m uma sequ ncia de amostras que complementar sequ ncia alvo e a haste formada pela liga o de sequ ncias de bra o complementares que se encontram localizadas de ambos os lados da sequ ncia de amostras Um fluor foro que fluoresce quando excitado por luz com o comprimento de onda apropriado ligado covalentemente extremidade de um bra o e um supressor que suprime a fluoresc ncia do fluor foro quando se encontra em grande proximidade f sica ligado covalentemente extremidade do outro bra o Os sinais moleculares n o entram em fluoresc ncia quando se encontram livres na solu o No entanto quando se hibridizam a uma cadeia de cido nucleico que cont m uma sequ ncia alvo s o submetidos a uma altera o conformacional que lhes possibilita entrarem em fluoresc ncia A quantidade de fluoresc ncia em 1 Morris A Lundgren JD Masur H Walzer PD Hanson DL Frederick T Huang L Beard CB Kaplan JE 2004 Current epidemiology of Pneumocystis pneumonia Emerg Infect Dis 10 1713 20 2 Miller R
23. sa cont m um de cada um dos tubos 1 2 3 e 4 Em cada bolsa existem reagentes suficientes para executar 8 reac es Devem ser realizadas pelo menos uma reac o com controlo positivo e uma reac o com controlo negativo por execu o em que os reagentes s o de um nico kit Por conseguinte uma bolsa pode analisar 6 amostras de doentes Se for necess rio analisar mais de 6 amostras pode utilizar se mais de uma bolsa se as bolsas utilizadas forem do mesmo lote Pode ser analisado um m ximo de 38 amostras de doente utilizando as 5 bolsas do kit Calcule o n mero de reac es necess rias consultando a tabela abaixo N mero de N mero m ximo de amostras de doente 6 Retire o n mero adequado de bolsas do congelador N o utilize bolsas que j n o estejam seladas Se as amostras de doentes tiverem sido congeladas ap s a extrac o remova as igualmente do congelador Abra o n mero necess rio de bolsas e retire os tubos Se for utilizada mais de uma bolsa mas se for executado apenas um conjunto de controlos positivos e negativos s necess rio retirar os tubos 3 e 4 de uma das bolsas Exer a precau o ao manipular o tubo 4 Este cont m material de controlo positivo de DNA e a contamina o pode dar origem a resultados de an lise positivos falsos Deixe o conte do dos tubos descongelar colocando os sobre a bancada do laborat rio durante 5 10 minutos assegurando se que o conte do de cada tubo descongela an
24. shold 1 0e 004 C Auto Baseline C Auto Baseline Manual Baseline Manual Baseline Start cycle Start cycle 3 End cycle 15 End cycle 15 Help Help 3 4 Grave as altera es 3 5 Seleccione os po os contendo amostras e exporte o ficheiro de relat rio File gt Export gt Results Ficheiro gt Exportar gt Resultados conforme apresentado abaixo 1 7500 System SDS Software Plate1 Standard Curve DEA view Toos Instrument Analysis Window Help New Ctri N B Open Ctri O D Close Save Ctri S seems IEEE u m lu u Import Sample Setup Cth l iul u u m ese R os View Exported Results Calibration Data E E 7 Spectra Component Deka Rn g E Ct D Dissociation b lv lu U o 3 6 Para evitar confus o grave o ficheiro com o mesmo nome do pr prio ficheiro da execu o Lembre se de gravar o ficheiro num local apropriado 3 7 Quando solicitado active Export only selected wells Exportar apenas po os seleccionados e clique em OK 3 8 Abra o ficheiro csv gravado com Excel ou outro software de folha de c lculo similar 3 9 Analise cada amostra come ando com os controlos conforme indicado no fluxograma abaixo tamb m podem ser encontrados detalhes na tabela apresentada abaixo do fluxograma Portugu s 7 030 149 Vers o 1 4 24FEB12 Para utiliza o diagn stica in vitro Amostras Respirat rias MycAssay Pneumocystis Applied BioSystems 7500 A execu o
25. stras em 1 14 Por exemplo Li 2 7 Quando todos os po os possu rem nomes adequados grave a execu o mantendo o Plate Name Nome da placa como nome de ficheiro 2 8 Inicie a execu o no separador Instrument Equipamento clicando no bot o Start Iniciar Para determinar quanto tempo a execu o demorar a terminar apresentada uma contagem decrescente junto ao bot o Start Iniciar Portugu s 6 030 149 Vers o 1 4 24FEB12 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Pneumocystis Amostras Respirat rias Applied BioSystems 7500 3 An lise e interpreta o de dados 3 1 Logo que a execu o tenha terminado clique na seta verde na barra do menu superior para actualizar 3 2 Abra a visualiza o Amplification Plot Gr fico da amplifica o do separador Result Resultados No lado direito defina os limiares para cada canal da seguinte forma PNE MycAssay 10000 IAC MycAssay 4000 A Manual Baseline Par metros base manuais deve permanecer em 3 15 para ambos os detectores 3 3 Clique no bot o Analyze Analisar para activar estas altera es Por exemplo Data Delta An vs Cycle v Data Delta An vs Cycle v Detector IAC Myc ssay v Detector PNE MycAssay v Line Color Detector Color Line Color Detector Color v Analysis Settings Analysis Settings C Auto Ct C Auto Ct Manual Ct Manual Ct Threshold 4 0e 003 Thre
26. tes de prosseguir Agite o conte do dos tubos e as amostras de doentes no v rtex prossiga com uma breve centrifuga o numa microcentr fuga para garantir a acumula o de todo o conte do na base dos tubos antes de utilizar Coloque o n mero necess rio de tubos para PCR na prateleira de suporte Nunca toque no fundo dos tubos de reac o com as m os Prepare sempre o controlo negativo primeiro seguido pelas amostras do doente O controlo positivo deve ser sempre preparado em ltimo lugar Os volumes de reagente e de DNA s o apresentados na seguinte tabela Reac o Controlo Amostra Controlo negati do positi vo doente vo Tubo 1 tampa cor 7 5 uL 7 5 uL 7 5 uL de laranja Tubo 2 tampa azul 7 5 uL 7 5 uL Reagente Tubo 3 tampa 10 uL transparente Amostra do doente 10 uL Tubo 4 tampa preta Volume total 25 uL Portugu s 4 030 149 Vers o 1 4 24FEB12 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Pneumocystis Amostras Respirat rias Applied BioSystems 7500 1 11 1 13 Adicione os reagentes na ordem apresentada na tabela anterior o tubo 1 em seguida o tubo 2 seguido pelo padr o controlo negativo amostra do doente ou controlo positivo Tome cuidado ao retirar al quotas do tubo 1 o l quido ligeiramente viscoso e pode aderir aresta interna do tubo Se isto acontecer volte a centrifugar para acumular o conte do final na base do tubo antes de tentar
27. uL Tampa lt 0 0001 DNA de controlo positivo preta A mol cula do controlo positivo um plasm deo recombinante que abriga as sequ ncias alvo Pneumocystis Tamp o Tris HCI O kit cont m igualmente CD ROM do Protocolo do MycAssay Pneumocystis Myconostica Instru es de utiliza o Portugu s 2 030 149 Vers o 1 4 24FEB12 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Pneumocystis Amostras Respirat rias Applied BioSystems 7500 Certificado de an lise Conserva o O kit deve ser conservado congelado 15 a 25 C at ao prazo de validade indicado no r tulo da caixa do kit momento em que deve ser eliminado em conformidade com as regulamenta es locais Uma vez aberta uma bolsa o conte do deve ser utilizado imediatamente sem voltar a congelar nem reutilizar Materiais equipamentos necess rios mas n o fornecidos Sistema de PCR em Tempo Real 7500 da Applied Biosystems incluindo o manual do utilizador o computador em anexo e o software SDS vers o 1 4 Tira de 8 tubos MicroAmp Optical Applied BioSystems refer ncia 4316567 Tira de 8 tampas MicroAmp Optical Applied BioSystems refer ncia 4323032 Microcentr fuga com adaptador para tubos para PCR de 0 2 mL Agitador v rtex Prateleira de suporte para tubos para PCR Micropipetas volumes necess rios 7 5 uL 20 uL Pontas de filtro de baixa reten o est reis Luvas descart veis sem p Solu o de descontamina o
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