Instruções de utilização de Biofortuna SSPGo HLA Typing Kits CE
Contents
1. n o utilizar os kits Usando somente as tampas ou folhas selantes fornecidas assegurar que as cuvetes para PCR est o bem seladas ap s a adi o do ADN uma vez que se n o o estiverem se pode verificar evapora o durante a amplifica o PCR Tomar especial aten o s extremidades e aos cantos Nota 1 Se necess rio as placas e as tiras de PCR n o hidratadas e fora da bolsa podem ser mantidas durante at 3 horas antes da adi o de ADN a uma temperatura de at 21 C e uma humidade n o superior a 60 Nota 2 Uma vez hidratadas com ADN as tiras e placas de PCR de bolsas rec m abertas podem ser armazenadas durante at 24 horas a 2 a 8 C antes do passo de PCR desde que os po os estejam bem selados para evitar evapora o Requisitos da amostra de ADN Cada rea o no teste est otimizada para utilizar entre 50 100 ng de ADN mas muito importante que cada rea o seja reidratada com exatamente 10 ul de l quido Portanto o teste pode ser efetuado com 10ul de ADN a 5 10ng ul Diluir o ADN na concentra o requerida somente em gua esterilizada para utiliza o em biologia molecular Aten o Assegurar que a amostra final de ADN n o cont m mais de 2 5mM Tris 0 25mM EDTA Usar somente ADN extra do de amostras recolhidas de citrato e EDTA Como a heparina pode inibir a PCR recomenda se que o ADN n o seja extra do de amostras de sangue heparinizadas Demonstrou se que a hemoglobina interfere com kits SSPGo HLA2. o da amostra Adi o de condi es de armazenamento de produto amplificado Adi o de nota sobre os tempos de eletroforese de gel Coment rio sobre as notas espec ficas do lote O n mero de lote do kit deve corresponder ao n mero de lote na tabela de interpreta o Adi o de toda esta sec o Medi o OD gt 60 2s0 atualizada Adi o de toda esta sec o Ce 0088 Za DOT116v8 Instru es de utiliza o de Biofortuna SSPGo HLA Typing Kits CE Revis o 5 P gi na 12 de 12 Y N mero de testes Representante CE Li Consultar as instru es de utiliza o al Local de fabrico vo Diagn stico in vitro es Prazo de validade 28 a ac 4 Temperatura de conserva o LOT N mero de lote PL Distribu do por GTIN N mero Global de Item Comercial Biofortuna Ltd 1 Hawkshead Road Croft Business Park Bromborough CH62 3RJ UK T 44 0 151 334 0182 E info biofortuna com e BIOFORTUNA W www biofortuna com EE smrynmasiostes Fran aise Traductions disponibles Deutsch bersetzungen verf gbar Espa ol Traducciones disponibles Italiano Traduzioni disponibili esk P eklady k dispozici Danske Tilg ngelige overs ttelser EAANVEG Siad ciuEG LHETAbp GEL Magyar Fordit sok Norske Oversettelser tilgjengelig Polska Dost pne t umaczenia Portugu s Tradu es dispon veis Poccnio lepeBoAb AOCTYNHbI Slovensk mu Preklady k dispoz cii T r
3. quando presente em amostras de ADN superiores a 1 mg dL O ADN pode ser extra do usando todos os m todos tradicionais de extra o Assegurar que a DO 60 230 da amostra de ADN medida atrav s de espectrofotometria de UV se situa entre 1 66 e 1 94 Instru es pr PCR i Retirar uma placa ou tira SSPGo de uma bolsa selada Ce Ce DOT116v8 Instru es de utiliza o de Biofortuna SSPGOo HLA Typing Kits CE Revis o 5 P gi na 4 de 12 ii Anotar o n mero de lote do produto do ensaio iii Assegurar que todas as pastilhas liofilizadas reagentes de PCR est o no fundo dos po os dos tubos placa antes de remover o selante ou a tampa Caso contr rio bater levemente para que a pastilha se desloque para o fundo do tubo A primeira rea o de cada locus de teste sempre de cor rosa claro relativamente ao resto do kit Vermelho quando hidratado Algumas placas de PCR cont m uma rea o no template control controlo negativo integral de cor p rpura no ltimo po o da placa iv Utilizando equipamento esterilizado pipetar 10 ul de solu o de ADN para cada rea o da placa ou tira Consultar a nota na sec o 8 Requisitos da amostra de ADN Se a placa tiver o no template control integral de cor p rpura pipetar para o mesmo 10 ul de diluente da amostra sem ADN Consultar a nota sobre No Template Control na sec o 8 v Assegurar que o ADN entra em contacto com os reagentes secos em cada rea o antes
4. amostra A eletroforese foi demasiado prolongada os produtos amplificados de pequena dimens o sa ram pela extremidade do gel ou atrav s do brometo de et dio ou dispersaram se entrando no po o de gel anterior Utilizar condi es de eletroforese adequadas para o seu sistema de gel Ocasionalmente podem ser descobertos ocasionalmente novos alelos originando um padr o de amplifica o que n o corresponde a alelo s existente s Por favor contactar o seu distribuidor local Ce 0088 i E CE DOT116v8 Instru es de utiliza o de Biofortuna SSPGOo HLA Typing Kits CE Revis o 5 P gi na 1 1 d e 12 Revis o Da vers o 4 para a vers o 5 Data da revis o 21 de janeiro de 2014 o Sec o Sec o 4 Conte do do kit fornecidos Sec o 8 Instru es de utiliza o Sec o 9 Interpreta o Sec o 5 Reagentes e equipamentos n o Dee Descri o da revis o Adi o de selantes de placas no kits Especifica es do termociclador de 96 po os atualizadas Condi es de armazenamento atualizadas para 2 28 C Manuseamento de placas e tiras PCR n o hidratadas Manuseamento de placas e tiras PCR hidratadas Dilui o de ADM em gua esterilizada para utiliza o em biologia molecular Adi o de subst ncias de interfer ncia e atualiza o das orienta es sobre pureza do ADN Adi o da posi o de pastilhas liofilizadas antes da adi
5. de se submeterem ao termociclador vi Selar as rea es com uma folha selante ou tampas para tubos PCR fornecidas Assegurar que o selante est bem colocado para evitar evapora o Tomar especial aten o s extremidades e aos cantos vii Colocar a placa ou as tiras diretamente no termociclador Assegurar que as cuvetes est o completamente inseridas no bloco e que a tampa est totalmente comprimida Caso contr rio pode verificar se a falha individual da PCR devido a evapora o e condensa o da PCR viii Efetue o programa PCR consultar Par metros PCR NOTA SOBRE RESSUSPENS O Logo que os po os de PCR sejam retirados das bolsas de alum nio os reagentes dever o ser imediatamente reidratados com ADN Ver a Nota 1 e a Nota 2 para obter informa es adicionais NOTA SOBRE O NO TEMPLATE CONTROL alguns kits incluem um No Template Control NTC como rea o final na placa Esta rea o cont m um corante p rpura para a distinguir do resto das rea es O NTC est concebido para detetar contamina o PCR ou contamina o de ADN gen mico que pode estar presente na gua utilizada para ressuspender o ADN Se houver contamina o PCR ser o observados produtos amplificados de tamanho vari vel NOTA SOBRE O PERFIL DE ALTURA DA PLACA TIRA PCR recomenda se que o perfil de altura das placas e tiras seja equivalente quando estas s o colocadas no mesmo aparelho PCR Perfis de altura diferentes podem originar mau c
6. do gel ao formul rio de interpreta o correspondente fazendo corresponder os n meros do kit e do lote Examinar a imagem do gel Cada rea o deve conter uma banda de controlo positivo Consultar as tabelas de interpreta o j que esta pode ter um tamanho diferente em diferentes produtos SSPGo As bandas de controlo interno podem aparecer muito mais fracas quando est o presentes bandas espec ficas de alelos Se estiver presente uma banda espec fica de um alelo mas n o uma banda de controlo o resultado deve ainda assim ser considerado positivo Bandas inferiores a 70 pb devem ser ignoradas porque s o primers n o incorporados Determinar as rea es positivas As rea es positivas s o indicadas por bandas do tamanho esperado tal como indicado nas tabelas de interpreta o Ter em aten o que pode haver mais de um tamanho de produto numa dada rea o estas s o rea es multiplex e est o assinaladas nas tabelas de interpreta o Comparar as rea es positivas com as tabelas de interpreta o Um resultado positivo numa rea o indica a presen a de pelo menos um dos alelos indicados na tabela de interpreta o Um determinado alelo pode ser amplificado em v rios tubos se o alelo estiver presente dever ocorrer uma rea o positiva em todas as rea es relevantes Fig 1 Exemplos de rea es positivas indicadas pela presen a de bandas espec ficas de alelos e bandas de controlo rea es 1 3 rea es n
7. est consistente antes de remover os pentes Assegurar que a concentra o de ADN n o demasiado Alelos previamente n o sequenciados podem estar Ce 0088 Ce DOT116v8 Instru es de utiliza o de Biofortuna ssPGo HLA Typing Kits CE Revis o 5 P gina 10 de 12 Problema Causa prov vel da tipagem de sequ ncias Solu o presentes com um novo padr o de amplifica o Se estiver a utilizar folhas de interpreta o antigas descarregar uma atualiza o de alinhamento mais recente do s tio www biofortuna com Se isto n o acomodar o novo padr o deve utilizar um kit Biofortuna diferente ou deve tentar identificar a sequ ncia atrav s O padr o de amplifica o n o interpret vel Artefacto incorretamente interpretado como uma banda espec fica uma amplifica o Consultar as Tabelas de Interpreta o espec ficas para saber qual o tamanho correto da banda Verificar se todas as amplifica es espec ficas t m o tamanho correto ou se um artefacto contamina o primer dimer foi incorretamente interpretado como Rea es colocadas pela ordem incorreta Verificar o alinhamento das faixas do gel e da PCR Falha individual da PCR Verificar que todos os controlos positivos internos est o presentes Voltar a interpretar sem rea es em falta Aus ncia de produtos amplificados de pequena dimens o Novo alelo identificado na
8. 0 5 ug ml Moldar o gel e inserir pentes de formato de microtitula o p ex 12x8 po os com espa amento de 9 mm Quando o gel estiver consistente retirar os pentes e cobrir o gel em tamp o TBE 0 5x Carregar todo o produto PCR em sequ ncia no gel de agarose a 2 anotando a posi o de cada rea o Recomenda se uma escala de 1000 pb para ajudar a determinar o tamanho Submeter o gel a 10 V cm durante 20 minutos Para obter informa es detalhadas sobre o equipamento consultar as instru es de utiliza o do fabricante do sistema de eletroforese Os g is devem ser visualizados utilizando um sistema de documenta o de gel UV com um transiluminador de UV Nota Eletroforese insuficiente pode conduzir a produtos amplificados de grande dimens o superior a 600 bp que se fundem com produtos amplificados de controlo Assegurar que a eletroforese suficiente para visualizar esses produtos amplificados Uma eletroforese demasiado prolongada pode provocar a perda de produtos amplificados de pequena dimens o nos po os de gel anteriores Os kits SSPGo s o concebidos para que os resultados possam ser determinados manualmente utilizando tabelas de interpreta o dispon veis em www biofortuna com Se tiver problemas em aceder ao s tio da Internet por favor contactar o seu distribuidor local As tabelas de interpreta o podem incluir notas espec ficas dos lotes que podem ser relevantes para a interpreta o Afixar a fotografia
9. A tipagem de locus realizada para o ensaio SSPGo forneceu resultados de teste para HLA A HLA B HLA C HLA DQA1 HLA DQB1 HLA DRB1 3 4 5 HLA DPB1 DPA1 e HLA DQA1 05 DQB1 02 DOS O desempenho cl nico dos SSPGo HLA Typing Kits forneceu uma concord ncia global de 98 3 100 em rela o ao dispositivo indicado m todo SSO com uma confian a n o inferior a 95 para a genotipagem de alelos da classe e II HLA testado de ADN derivado de sangue total a 5 10ng ul Excluindo tr s 3 resultados de genotipagem n o confirmados foi alcan ada uma concord ncia de 100 para 1 222 amostras de 3 lotes de cada kit de teste nos centros de teste cl nico nos EUA e no Reino Unido A reprodutibilidade centro a centro dos SSPGo HLA Typing kits foi realizada por tr s centros usando um painel representativo de 8 rea es SSPGo PCR face s amostras de ADN fornecidas formuladas a 4ng ul e 11ng uI os extremos da gama de concentra o do kit de teste Um total de 958 960 rea es individuais distribu das igualmente por tr s centros externos foram concordantes com as amostras de ADN resultando numa concord ncia global de 99 7 0 995 LCL A reprodutibilidade lote a lote foi realizada em tr s lotes de um kit de teste SSPGo HLA representativo por um nico centro operador usando a gama de concentra o de ADN de 5 10 ng uL A reprodutibilidade lote a lote do teste SSPGo HLA Type foi 100 concordante e rela o ao dispositivo indicado para 130 130 amost
10. DN insuficiente adicionado concentra o superior a 200 ng ou inferior a 20 ng pode originar falha da PCR A contamina o do ADN pode dar origem a uma falha de amplifica o espor dica ou generalizada Verificar a concentra o e a pureza do ADN A adi o de demasiado ADN s rea es PCR pode dar origem a imagens com manchas no gel A causa pode ser pureza degradada ou baixa Obter uma amostra fresca de ADN Assegurar que a concentra o de ADN n o demasiado baixa nem demasiado alta Tentar atingir uma concentra o de 50 100 ng de ADN por rea o em 10 ul Seguir as instru es de manuten o e de calibra o do fabricante do termociclador Verificar se os par metros PCR est o corretos de acordo com as instru es de utiliza o Erros no gel Assegurar que foi adicionado o mesmo volume de rea o a cada po o entre 5 ul e 10 ui Calibrar as pipetas conforme descrito nas instru es de utiliza o do fabricante Utilizar solu o de brometo de et dio nova Amplifica o n o Problema na concentra o de espec fica ADN baixa nem demasiado alta Tentar atingir uma concentra o de 50 100 ng de ADN por rea o em 10 Hl Rea es colocadas pela ordem incorreta Novo alelo identificado Verificar o alinhamento das faixas do gel e da PCR Evitar o transbordamento f sico dos po os adjacentes na eletroforese n o sobrecarregando e assegurando que o gel
11. Par DOT116v8 Instru es de utiliza o de Biofortuna SSPGo HLA Typing Kits CE Revis o 5 P gina 1 de 12 BIOFORTUNA SSPGo TM Instru es de utiliza o de Biofortuna SSPGo HLA Typing Kits CE Revis o 5 janeiro de 2014 Os kits Biofortuna HLA SSPGo s o kits qualitativos base de ADN para a determina o de alelos do HLA em kits de baixa resolu o ou para a amplifica o grupo espec fica de alelos em kits de resolu o de n vel interm dio m dio A resolu o de n vel m dio normalmente definida como a resolu o em que a maioria dos resultados claramente definida ao n vel dos dois d gitos p ex DQB1 02 DQB1 05 etc A elevada resolu o geralmente definida como a maioria dos alelos ao n vel do quarto d gito tais como DQB1 02 01 DQB1 05 01 etc Este produto destina se a ser utilizado em diagn stico in vitro apenas por pessoal devidamente treinado para o efeito As mol culas do HLA desempenham um papel fundamental na imunidade e no reconhecimento do pr prio versus n o pr prio consequentemente a genotipagem do HLA e a determina o da compatibilidade do HLA obrigat ria antes da maior parte dos tipos de transplantes Como os antig nios HLA restringem a especificidade das respostas imunit rias mediadas pelas c lulas T a genotipagem do HLA uma ferramenta til na investiga o de doen as imunit rias e de respostas imunit rias a patog neos vacinas ou tratamento cl nico A geno
12. ca es e Termociclador de 96 po os com tampa aquecida com uma temperatura de 104 C para funcionamento sem leo e Taxa de rampa de 1 0 C seg e Gama de temperatura de 4 0 C a 99 9 C e Precis o da temperatura de 0 25 C para a gama de 35 C a 99 9 C e Calibra o da temperatura rastre vel a uma norma de refer ncia e Programar o termociclador usando os par metros de ciclo PCR da sec o 8 em baixo Nota Para informa es espec ficas do termociclador consultar o manual de utiliza o do fabricante O termociclador deve ser calibrado de acordo com as regras de acredita o da ASHI American Society of Histocompatibility and Immunogenetics ou da EFI European Federation of Immunogenetics Reagentes de eletroforese em gel agarose TBE 0 5x marcador de peso molecular de ADN de 1000 pb 10 mg ml de brometo de et dio Equipamento de eletroforese em gel tinas de gel fonte de alimenta o sistema de documenta o do gel com transiluminador de UV Software para auxiliar na an lise manual dos resultados dos testes kit SSPGo eo armazenamento de dados de arquivo pode ser baixado do site da Biofortuna www biofortuna com Nota quaisquer altera es nas condi es especificadas tais como taxas de rampa do termociclador podem afetar a interpreta o dos resultados do teste Ce Ce js DOT116v8 Instru es de utiliza o de Biofortuna SSPGo HLA Typing Kits CE Revis o 5 P gina 3 de 12 e Para utiliza o em dia
13. da fonte de alimenta o As placas n o foram devidamente seladas Placas seladas incorretamente podem dar origem a evapora o durante a PCR A Biofortuna fornece folhas CE DOT116v8 Instru es de utiliza o de Biofortuna ssPGo HLA Typing Kits CE Revis o 5 P gina 8 de 12 Problema Causa prov vel Solu o de selagem recomendadas no kit Para outros fornecimentos contactar o seu distribuidor Assegurar que todos os po os est o devidamente selados Tomar especial aten o aos po os situados pr ximo das extremidades da placa ou tira de PCR Sa das aleat rias de controlo e ou produtos amplificados espec ficos de alelos Ce 0088 Erros no gel Assegurar que todos os po os foram colocados no gel pela ordem correta e que foi adicionado a cada um o mesmo volume de rea o de PCR Calibrar as pipetas conforme descrito nas instru es de utiliza o do fabricante Verificar se os po os est o devidamente formados no gel Remover os pentes com cuidado para n o rasgar o fundo dos po os Assegurar que a agarose est totalmente dissolvida antes de moldar o gel Assegurar que o gel n o submetido corrente el trica durante demasiado tempo j que os produtos amplificados de menor dimens o podem sair pela extremidade Assegurar que o gel submetido corrente el trica durante tempo suficiente para permitir que as bandas se separem Ut
14. egativas indicadas pela presen a de bandas de controlo mas aus ncia de bandas espec ficas de alelos rea es 4 7 e uma rea o falhada indicada pela aus ncia de quaisquer bandas rea o 8 Assegurar que o n mero de lote do kit corresponde ao n mero de lote na tabela de interpreta o Ce Ce r DOT116v8 Instru es de utiliza o de Biofortuna SSPGo HLA Typing Kits CE Revis o 5 P gi na 6 de 12 Software para auxiliar na an lise manual dos resultados dos testes kit SSPGo eo armazenamento de dados de arquivo pode ser baixado do site da Biofortuna www biofortuna com Todos os lotes de SSPGo s o submetidos a uma verifica o de qualidade antes da sua introdu o no mercado As amostras de cada lote de kits s o verificadas com base num painel de amostras de ADN humano para assegurar um desempenho correto Cada rea o foi validada com base em pelo menos 47 amostras de linhas celulares de ADN bem caracterizadas A Biofortuna recomenda que qualquer laborat rio valide internamente quaisquer novos produtos de tipagem antes da sua utiliza o em amostras cl nicas A tipagem para efeitos de diagn stico s deve ser realizada por pessoal qualificado e treinado e os resultados devem ser confirmados por outro elemento treinado do pessoal Um estudo de dispositivo de diagn stico in vitro foi realizado em cinco centro de teste comparando o desempenho de SSPGo HLA Typing Kits ao dispositivo indicado One Lambda Labtype SSO
15. ene housekeeping o par de primers de controlo interno um indicador da integridade da rea o PCR A genotipagem SSP utiliza geralmente rea es m ltiplas que quando analisadas em conjunto indicam o gen tipo A visualiza o dos produtos amplificados pode ser conseguida utilizando sistemas de eletroforese em gel de agarose que separam os fragmentos de ADN por tamanho Placas ou tiras de polipropileno para PCR com 8 96 po os de PCR dependendo do kit cada po o cont m primers polimerase dNTPs e tamp o liofilizados pr dispensados Cada placa ou tira fornecida selada com uma folha ou tampa e embalada individualmente dentro de uma bolsa de alum nio contendo uma bolsa de dessecante Tampas ou folhas selantes para PCR 1x Instru es de utiliza o Certificado de an lise As tabelas de interpreta o e fichas de seguran a dos materiais est o dispon veis no s tio da Biofortuna www biofortuna com Se tiver problemas em aceder a estes documentos por favor contactar o seu distribuidor local Trilink Biotechnologies Inc licenciou a utiliza o de CleanAmp dNTPs com os produtos Biofortuna SSPGo Pipetas e pontas de pipetas est reis calibradas apropriadas p ex pipeta P10 com pontas com filtro de 10 pl Kit equipamento de isolamento de ADN Espectrofot metro de UV Tubos de polipropileno gua esterilizada para utiliza o em biologia molecular Deve ser utilizado um termociclador com as seguintes especifi
16. gn stico in vitro e Os testes s devem ser realizados por pessoal devidamente treinado para o efeito e Todos os resultados de tipagem devem ser verificados por pessoal qualificado e se forem utilizados na tomada de decis es cl nicas os resultados devem ser confirmados utilizando outro m todo de tipagem e Todos os reagentes devem ser manuseados de acordo com as boas pr ticas de laborat rio e Manter as zonas de pr e p s PCR separadas Os materiais da zona p s PCR n o podem ser levados para a zona de pr PCR e Aviso de perigo biol gico manusear todos os produtos sangu neos como potencialmente infeciosos e Aviso de perigo biol gico o brometo de et dio um potencial carcinog neo Se for utilizado devem utilizar se sempre luvas bata de laborat rio e prote o ocular e Aviso de perigo biol gico tomar as devidas precau es ao utilizar fontes de luz UV utilizar sempre luvas bata de laborat rio e prote o ocular Nunca olhar diretamente para a fonte de luz UV e As fichas de seguran a dos materiais est o dispon veis em www biofortuna com Os kits Biofortuna SSPGo devem ser conservados entre 2 a 28 C Depois das cuvetes PCR serem retiradas das bolsas de alum nio os reagentes devem ser reidratados com ADN no prazo de 3 horas Consultar o prazo de validade na embalagem N o utilizar os produtos ap s a data impressa Se a bolsa de alum nio estiver rasgada ou perfurada ou se n o existir uma bolsa de dessecante
17. ilizar solu o de brometo de et dio nova Problemas com o termociclador Problemas de evapora o Falhas em particular em redor da extremidade do ensaio podem dever se ao facto de a tampa n o estar suficientemente apertada Isto pode dar origem a evapora o e a condensa o da rea o PCR a meio do po o PCR e pode originar falha da PCR Seguir as instru es de manuten o e de calibra o do fabricante do termociclador Verificar se os par metros PCR est o corretos de acordo com as instru es de utiliza o Assegurar que todos os po os est o devidamente selados Tomar especial aten o aos po os situados pr ximo das extremidades da placa ou das tiras de PCR Assegurar que a tampa aquecida est ativada e aplicada compress o suficiente atrav s da tampa DOT116v8 Instru es de utiliza o de Biofortuna ssPGo HLA Typing Kits CE Revis o 5 P gina 9 de 12 Problema Causa prov vel Falha espor dica devido a problemas de ADN Imagem do gel com ADN manchas Amplifica o fraca ADN Problemas com o termociclador Problema na concentra o de Solu o Assegurar que as folhas de selagem Biofortuna fornecidas s o usadas Para outros fornecimentos contactar o seu distribuidor Sem ADN presente assegurar que todos os po os t m ADN Volume incorreto assegurar que s o utilizados 10ul de solu o de ADN por rea o Demasiado ADN ou A
18. k eviriler mevcut Svenska vers ttningar tillg ngliga www biofortuna com CE CE
19. ontacto com a tampa aquecida dos aparelhos PCR Isto pode dar origem a uma amplifica o PCR falhada ou fraca Par metros PCR Devem ser utilizados os seguintes par metros PCR Assegurar velocidades de rampa de 1 C por segundo e ativar a tampa aquecida Para obter instru es de utiliza o completas consultar o manual de utiliza o do fabricante do termociclador Os termocicladores devem ser calibrados de acordo com as regras de acredita o da American Society of Histocompatibility and Immunogenetics ASHI ou da European Federation of Immunogenetics EFI Desnaturar 94 C 5 minutos Desnaturar 96 C 15 segundos Hibridar 66 C 50 segundos 10 ciclos Extens o 72 C 30 segundos Desnaturar 96 C 15 segundos Hibridar 64 C 50 segundos 20 ciclos Extens o 72 C 30 segundos HOLD a 15 C durante um per odo n o superior a 72 horas antes de colocar o gel Se necess rio a placa de PCR pode ser armazenada a 2 8 C durante at 24 horas antes de colocar o gel Assegurar sempre que as placas est o bem seladas CE CE 0088 DOT116v8 Instru es de utiliza o de Biofortuna SSPGo HLA Typing Kits CE Revis o 5 P gi na 5 de 12 Eletroforese em gel Estas instru es aplicam se eletroforese horizontal em gel de agarose preparar um gel de agarose a 2 em tamp o TBE 0 5x Quando o gel tiver arrefecido e tiver atingido uma temperatura de aproximadamente 60 C adicionar brometo de et dio para obter uma concentra o final de
20. ras de ADN testadas em tr s 3 lotes de testes SSPGo HLA Type representativos de um total de 390 testes A verifica o SSPGo HLA positiva concordante foi obtida para alelos da classe I e da classe Il em testes comparativos com amostras cl nicas LABType SSO testadas Testes internos de SSPGo HLA forneceram resultados concordantes em rela o a amostras de ADN de refer ncia exceto para amostras n o dispon veis tais como determinados alelos HLA DPB1 raros e alelos HLA B raros e grupos de alelos tais como B 59 01 B 78 e B 83 01 Os seguintes grupos de alelos raros n o foram confirmados B 59 B 78 B 83 DPB 21 01 DPB 26 01 02 DPB 27 01 DPB 28 01 DPB 29 01 DPB 31 01 DPB 34 01 DPB 35 01 01 DPB 39 01 DPB 45 1 DPB 46 01 DPB 51 01 DPB 55 01 DPB 59 01 DPB 63 01 DPB 81 01 DPB 85 01 e DPB 105 01 Ce Ce DOT116v8 Instru es de utiliza o de Biofortuna SSPGO HLA Typing Kits CE Revis o 5 P gina 7 de 12 1 Bunce M et al Tissue Antigens 1995 Nov 46 5 355 67 2 Saiki RK et al Nature 1986 Nov 13 19 324 6093 163 6 Causa prov vel Foi utilizada uma concentra o incorreta de ADN Problema Aus ncia de amplifica o nas rea es na amostra de ADN Inibidores da PCR presentes Solu o Medir a quantidade de ADN medindo a OD e assegurar que no total s o adicionados 50 100 ng de ADN a um volume de 10 ui por rea o N o usar sangue heparinizado evitar amos
21. tipagem do HLA tamb m pode ser utilizada como meio auxiliar no diagn stico de doen as em que tenha sido demonstrada uma liga o significativa de determinados alelos do HLA doen a A maior parte dos genes do HLA altamente polim rfico e geralmente necess ria a genotipagem do ADN para a determina o exata dos antig nios do HLA A genotipagem por PCR utilizando primers espec ficos de sequ ncias SSP Sequence Specific Primers um m todo r pido de genotipagem do HLA particularmente adequado para situa es em que necess ria uma resolu o de n vel m dio Todos os kits Biofortuna SSP incluem rea es secas completas incluindo polimerase o que significa que a nica coisa que o utilizador precisa de fazer antes da PCR adicionar ADN S o feitos todos os esfor os para manter estes kits atualizados com os dados de alinhamento do HLA disponibilizados pelo IMGT As atualiza es dos kits est o dispon veis em www biofortuna com A t cnica PCR SSP baseia se no princ pio de que s ser o amplificados os primers com terminais 3 totalmente compat veis com uma sequ ncia alvo Os primers n o compat veis n o originam produtos de amplifica o positivos Em todas as misturas de rea o PCR est inclu do um par de primers de controlo interno que amplifica uma regi o Ce Ce Par DOT116v8 Instru es de utiliza o de Biofortuna SSPGo HLA Typing Kits CE Revis o 5 P gina 2 de 12 conservada de um g
22. tras de ADN que contenham mais de 1 mg dL de hemoglobina Foi utilizada uma amostra de ADN de fraca qualidade Medir a qualidade do ADN O r cioOD 60 2s0 deve ser de 1 66 1 94 atrav s de espectrofotometria de UV Assegurar que o ADN est totalmente ressuspenso na solu o antes de utilizar Assegurar que a amostra de ADN foi dilu da em gua para utiliza o em biologia molecular e n o cont m mais de 2 5mM Tris 0 25mM EDTA Os reagentes n o est o totalmente ressuspensos Assegurar que as pastilhas ficam totalmente reidratadas quando se adiciona o ADN Assegurar que s o utilizados 10u de solu o de ADN por rea o O termociclador n o foi devidamente configurado Problemas com a eletroforese Assegurar que o programa PCR foi introduzido corretamente de acordo com as instru es de utiliza o Assegurar que a tampa aquecida do termociclador est ativada e que est suficientemente apertada Para mais informa es consultar as instru es de utiliza o do termociclador Assegurar que a tina de eletroforese tem energia el trica verificar a fonte de alimenta o e limpar os el trodos Colocar o gel em tamp o TBE 0 5X Assegurar que s o utilizados 0 5 ug ml de brometo de et dio fresco Ao visualizar o gel assegurar que a ilumina o UV suficiente Para mais informa es consultar as instru es de utiliza o fornecidas pelo fabricante da tina de gel e
Download Pdf Manuals
Related Search