Kit HHV6 Q-PCR Alert - Cód. RTS036 e STD036
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1. Rev 04 Out 2013 RTS036 HHV6 Q PCR Alert Kit Instru es de Uso USO PRETENDIDO O produto HHV6 Q PCR Alert um kit para teste quantitativo de amplifica o dos cidos nucleicos para a identifica o e a dosagem do DNA do Virus Herpes Humano 6 HHV6 em amostras de DNA extra do do plasma colhido em EDTA sangue total colhido em EDTA suspens es de leuc citos suspens es de linfomon citos O produto empregado juntamente aos dados cl nicos e a outros exames de laborat rio nos diagn sticos e na monitoriza o da infec o da HHV6 PRINC PIO DE A O E REA O O procedimento envolve uma rea o de amplifica o em Tempo Real em microplaca em um equipamento com termostato program vel fornecido com sistema tico de detec o fluorescente RT PCR termociclador em tempo real Em cada po o uma rea o de amplifica o realizada espec fica para uma regi o do gene ORF 13R do HHV6 e para uma regi o do gene da beta globina humana como controle de interno de adequa o da amostra usando DNA extra do das amostras a serem testadas Uma probe espec fica para HHV6 marcada com fluor foro FAM se torna ativada a partir do momento que hibridizada com um produto espec fico da rea o de amplifica o do HHV6 Outra probe marcada pelo fluor foro VIC espec fica para o gene da beta globulina humana ativada a partir do momento que hibridizado com o produto da rea o de amplifica o do gen2. o dos produtos de amplifica o para evitar resultados falsos positivos reas de pr e p s PCR Este produto requer o uso de roupas de trabalho EPI e instrumentos destinados extra o prepara o das rea es de amplifica o e para a amplifica o detec o dos produtos de amplifica o para evitar resultados falsos positivos Um resultado negativo obtido com este produto indica que o DNA de HHV6 n o est detectado no DNA extra do da amostra mas n o poss vel descartar que o DNA de HHV6 esteja presente a uma titula o inferior ao limite de detec o do produto neste caso o resultado ser um falso negativo Como para qualquer outro dispositivo diagn stico os resultados obtidos com este produto devem ser interpretados considerando todos os dados cl nicos e os outros exames de laborat rio relativos ao paciente Como para qualquer outro dispositivo diagn stico existe um risco latente de obter resultados n o v lidos falsos positivos e falsos negativos com este produto Este risco res dual n o pode ser eliminado ou reduzido posteriormente Este risco res dual em situa es particulares como os diagn sticos de urg ncia pode contribuir a decis es incorrectas com com consequ ncias graves para o paciente CONTROLE INTERNO DE QUALIDADE Controle de Qualidade aconselh vel confirmar o completo procedimento de an lise de cada sess o extra o e amplifica o utilizando uma amostra negativa e uma amos
3. o Nunca pipetar solu es com a boca N o comer beber fumar ou aplicar cosm ticos dentro da rea de trabalho Lavar as m os cuidadosamente ap s manusear amostras e reagentes Descartar as sobras de reagentes e res duos de acordo com as normas de seguran a Ler as instru es de uso antes de utilizar o produto Seguir as instru es N o usar produtos ap s o prazo de validade estabelecido Somente usar os reagentes fornecidos no kit e aqueles recomendados pelo fabricante N o misturar reagentes de diferentes lotes N o utilizar reagentes de outros fabricantes Advert ncias e precau es de biologia molecular Os procedimentos de biologia molecular como a extra o a transcri o reversa a amplifica o e a detec o de cidos nucleicos requerem pessoal especializado para prevenir o risco de resultados incorretos em particular devido degrada o dos cidos nucleicos das amostras ou devido a contamina o das amostras por produtos de amplifica o necess rio dispor de uma rea separada para a extra o prepara o das rea es de amplifica o e para a amplifica o detec o dos produtos de amplifica o reas de pr e p s PCR Nunca introduzir um produto de amplifica o na rea de extra o prepara o das rea es de amplifica o necess rio uso de EPI adequado a cada uma das reas de trabalho em laborat rio de biologia molecular Nunca transfira materiais da rea de amplifi
4. HHV6 e permite o c lculo da curva padr o O kit possibilita a execu o de 16 sess es de an lise separadas A concentra o inicial do padr o foi determinada por espectrofot metro pela medi o da absor o da prepara o inicial de DNA de plasm deo MATERIAIS FORNECIDOS Componente Descri o Quantidade Composi o HHV6 Q PCR Solu o de plasm deo Plasm deo TRIS base TRIS 5 em tubo com tampa 2 x50pL cloridrato EDTA RNA total de standard 10 vermelha levedura k Plasm deo TRIS base TRIS jia Souigao de plasmdeo 2 x50 L cloridrato EDTA RNA total de Standard 10 em tubo com tampa azul levedura HHV6 Q PCR Solu o de plasm deo Plasm deo TRIS base TRIS 3 em tubo com tampa 2 x50yL cloridrato EDTA RNA total de standard 10 verde levedura HHV6 Q PCR Solu o de plasm deo Plasm deo TRIS base TRIS 2 em tubo com tampa 2 x50yL cloridrato EDTA RNA total de anaana amarela levedura e Armazenar a 20 C ou inferior MATERIAIS NECESS RIOS E N O FORNECIDOS Fluxo laminar Luvas descart veis sem talco Agitador v rtex Microcentrifuga de bancada 12 000 14 000 RPM Micropipetas est reis e ponteiras com filtro ou deslocamento positivo 0 5 10 uL 2 20 uL 5 50 uL 50 200 uL 200 1000 pL ca M 15 WWW S Wes EE Rev 04 Out 2013 gua bidestilada est ril Real Time ABI PRISM 7000 completo com computador ACESS RIOS Os reage
5. de amplifica o Quando este produto usado para quantifica o de HHV6 utilizam se as rea es do HHV6 Standard ao inv s do Controle Positivo Neste caso a valida o da rea o feita pelo Standard Na rea o de amplifica o do controle negativo o valor de cT da probe espec fica para HHV6 usada para validar a amplifica o e a detec o como descrito na tabela a seguir cT do Controle Negativo HHV6 FAM Indeterminado NEGATIVO CORRETO Resultado do teste Amplifica o Se o resultado da rea o de amplifica o do Controle negativo diferente de Indeterminado a presen a do DNA alvo foi detectada Isso significa que ocorreram problemas na fase de amplifica o contamina o que podem ter causado resultados incorretos e falsos positivos A sess o n o v lida e deve ser repetida a partir da fase de amplifica o Na rea o de amplifica o de cada amostra os valores de cT das sondas espec ficas HHV6 s o usados para detectar a presen a do DNA alvo enquanto os valores de cT das sondas espec ficas do controle interno s o usados para validar a amplifica o detec o e extra o Verificar no software do instrumento que o cT foi determinado por um r pido e regular crescimento dos valores de fluoresc ncia e n o por picos ou incremento de sinal de fundo Este produto est apto a detectar uma quantidade m nima de 10 c pias do DNA da regi o ORF 13R do HHV6 por rea o de amplifica o corr
6. de seu respectivo po o 5 pL de DNA extra do conforme posi o definida na planilha elaborada 7 Transferir depositando cuidadosamente no fundo do po o de controle negativo 5 pL de gua ultrapura 8 Transferir depositando os cuidadosamente no fundo de seu respectivo po o 5 uL AmpliSTANDARD 10 c pias conforme posi o definida na planilha elaborada na mistura de rea o Proceder de igual modo tomando se o cuidado de dispensar cada qual em seu po o 5 pL de AmpliSTANDARD com 10 10 10 c pias 9 Fechar a Microplaca de amplifica o com a L mina adesiva de amplifica o precavendo se de que a placa fique bem selada fazendo uso de acess rio adequado para tal procedimento 10 Transferir a placa de amplifica o para o termociclador Real Time que deve estar em rea especifica e destinada para produtos amplificados p s PCR CALIBRA O DO PROCESSO Para este tipo de ensaio e metodologia n o existe procedimento de calibra o para o processo de medi o C LCULOS E OBTEN O DOS RESULTADOS An lise qualitativa dos resultados Os valores de fluoresc ncia emitidos pela sonda espec fica para HHV6 fluoresc ncia FAM e pela sonda espec fica para o Controle Interno fluoresc ncia VIC nas rea es de amplifica o devem ser analisados por software espec fico Antes de iniciar a an lise necess rio consultando o manual do equipamento programar manualmente o baseline n vel de fundo d
7. o eventual pr tratamento da amostra cl nica e para a extra o do DNA est o contidas nas Instru es de Uso do kit EXTRAceLLO Subst ncias interferentes O DNA extra do da amostra inicial n o deve conter heparina dextrano ou hemoglobina para evitar fen menos de inibi o e a apari o de frequentes resultados n o v lidos N o est o dispon veis dados pertinentes a eventuais fen menos de inibi o por parte dos medicamentos antivirais quimioter picos ou imunossupressores Descri o do Procedimento Instru es de Uso a Preparo da etapa de amplifica o real time rea de p s PCR Antes de iniciar necess rio conforme manual do equipamento ligar o termociclador Real Time e seu computador iniciar o software apropriado e abrir uma sess o absolute quantitation conforme manual do equipamento programar o detector para a sonda HHV6 com o reporter FAM e o quencher none NFQ um quencher n o fluorescente extintor de fluoresc ncia dark quencher conforme manual do equipamento programar o detector para a sonda da beta globina humana com o reporter VIC e o quencher none NFQ um quencher n o fluorescente extintor de fluoresc ncia dark quencher conforme manual do equipamento para cada po o da microplaca programar o detector tipo de fluoresc ncia a ser medida o passive reference ROX normaliza
8. 40 125 O limite superior da Faixa de Medi o Linear foi fixado em 10 mol culas 5 uL dentro de um logaritmo de maior concentra o do padr o de amplifica o AmpliSTANDARD 10 mol culas 5 uL Rev 04 Out 2013 O limite inferior do Faixa de Medi o Linear foi fixado em 10 mol culas 5 uL dentro de um logaritmo menor concentra o do padr o de amplifica o AmpliSTANDARD 10 mol culas 5 uL Sensibilidade anal tica Precis o O estudo da precis o do ensaio entendida como varia o dos resultados obtidos com diferentes repeti es de uma amostra analisada em uma mesma sess o permitiu determinar o Coeficiente de Varia o CV m dio de 12 4 dentro da faixa de medi o linear de 10 mol culas 5 uL a 10 mol culas 5 pL Sensibilidade anal tica Exatid o O estudo da exatid o do ensaio que a diferen a entre os resultados m dios obtidos em uma nica sess o em diferentes repeti es de uma amostra e o valor te rico da concentra o da amostra permitiu determinar uma Inexactid o m dia de 9 0 dentro de uma faixa de medi o linear de 10 mol culas 5 uL a 10 mol culas 5 pL Sensibilidade diagn stica efici ncia de detec o em diferentes gen tipos subtipos A sensibilidade diagn stica do ensaio que a efici ncia de detec o em diferentes gen tipos subtipos est avaliada pela compara o de sequencias com banco de dados de nucleot dicos O teste de al
9. A COMPONENTES FORNECIDOS Componente Descri o Quantidade Composi o HHV6 Q PCR Alert Mistura de primers de Oligonucleot deos AmpliMIX plisonielsdtideos 4x 110 uL TRIS base e cloridrato RTS036 M Glicerol Triton X 100 mtu andas Oligonucleot deos HHV6 Q PCR Alert fluorescentes fluorescentes TRIS basee AmpliPROBE marcadas com FAM MGB 4x110 uL cloridrato Glicerol Triton X RTS036 P NFQ i 100 e com VIC MGB NFQ TRIS base e cloridrato Glicerol MgCl Mistura de reagentes Desoriboxinucleot deos Rs 4 x 340 uL trifosfatos ROX Uracil N Q PCR Alert optimizados licosilas AmpliMASTER Taq DNA polimerase hot RTS000 start Microplaca com dad 96 int de 0 2 mL i PaRHGDE L mina adesiva vedante 3 Pl stico e cola MATERIAIS NECESS RIOS E N O FORNECIDOS Equipamentos Capela de fluxo laminar Agitador tipo V rtex Microcentr fuga de mesa 12 000 14 000 RPM Micropipetas simples volume vari vel Real Time ABI PRISM 7000 completo com microcomputador Material de Consumo EPI Ponteiras com filtro gua ultrapura Tubos de microcentrifuga o 1 5 mL a 2 0 mL E E gt _ gt _ gt _ gt _ gt _ gt _ gt _ Rev 04 Out 2013 Amostras DNA extra do por metodologia definida pelo usu rio seguindo as normas e padr es de amostras exigidos na descri o abaixo CONDI ES DE ARMAZENAMENTO Componente a Quan
10. Limite superior gEq mL 4 x 1 000 000 gEq De 40 a 4 000 000 gEq 100 000 c lulas Quando o kit Extragen usado a f rmula fica Limite inferior gEq mL 12 5 x 10 gEq Limite superior gEq mL 12 5 x 1 000 000 gEq De 125 a 12 500 000 gEq mL a SIOMETRIX 10 oracn stica M FERE Rev 04 Out 2013 LIMITA ES DO PROCESSO Utilizar com este produto somente DNA extra do das seguintes amostras humanas plasma colhido em EDTA sangue total perif rico colhido em EDTA suspens es de leuc citos e suspens es de granul citos N o utilizar com este produto o DNA extra do das amostras heparinizadas A heparina inibe a rea o de amplifica o dos cidos nucleicos e causa resultados inv lidos N o utilizar com este produto DNA extra do contaminado com hemoglobina Esta subst ncia inibe a rea o de amplifica o dos cidos nucleicos podendo causar resultados inv lidos N o est o dispon veis dados pertinentes a eventuais fenomenos de inibi o por parte dos medicamentos antivirais quimioter picos ou imunossupressores Os resultados obtidos com este produto dependem da correta coleta transporte conserva o e prepara o das amostras para evitar resultados incorrectos necess rio portanto ter particular aten o durante estas fases e seguir atentamente as instru es fornecidas com os produtos para a extra o dos cidos nucleicos O m todo de amplifica o R
11. N o pipetar nenhuma solu o com a boca Lavar bem as m os depois de haver manipulado as amostras e os reagentes Eliminar reagentes e res duos conforme as normas vigentes Ler todas as instru es fornecidas no kit antes de realizar o teste Respeitar as instru es fornecidas no kit durante a execu o do teste Respeitar a data de validade do kit Utilizar somente os reagentes presentes no kit e aqueles aconselhados pelo fabricante N o intercambiar reagentes procedentes de diferentes lotes N o utilizar reagentes procedentes de kits de outros fabricantes Advert ncias e precau es para a biologia molecular Os procedimentos de biologia molecular como a extra o a transcri o reversa a amplifica o e a detec o de cidos nucleicos requerem pessoal especializado para evitar o risco de resultados incorretos em particular por causa da degrada o dos cidos nucleicos das amostras ou da contamina o das amostras por parte de produtos de amplifica o necess rio dispor de uma rea separada para a extra o prepara o das rea es de amplifica o e para a amplifica o detec o dos produtos de amplifica o reas de pr e p s PCR Nunca introduzir um produto de amplifica o na rea de extra o prepara o das rea es de amplifica o em E Rev 04 Out 2013 necess rio uso de EPI adequado a cada uma das reas de trabalho em laborat rio de biologia molecular As amostr
12. a analisar CN Controle negativo de amplifica o 10 Padr o 10 c pias 10 Padr o 10 c pias 10 Padr o 10 c pias 10 Padr o 10 c pias consultando o Manual do equipamento programar no termociclador os par metros do ciclo t rmico e um volume de rea o de 25 pL Para equipamentos Applied Biosystems ABI PRISM da s rie 7000 escolher a op o 9600 emulation Ciclo t rmico para amplifica o se Temperaturas ES oe Desnatura o inicial 95 C 95 C 45 ciclos 60 C b Prepara o da amplifica o Antes de iniciar necess rio Tempos 2 min 10 min 15 seg 1min retirar e descongelar os tubos com as amostras para analisar Centrifugar os tubos para que o material ap s descongelamento des a para o fundo do tubo e mant lo em gelo retirar e descongelar os tubos de AmpliMIX necess rios para o processo lembrando que o conte do de cada tubo suficiente para preparar 24 rea es Centrifugar os tubos por 5 segundos pulso para que os reagentes ap s o descongelamento que estejam na parede des am para o fundo do tubo e mant lo em gelo retirar e descongelar um n mero de tubos de AmpliPROBE iguais aos dos tubos de AmpliMIX Repetir o pulso nesses tubos para que seu conte do des a para o fundo do tubo Mant los em gelo retirar tantos tubos de AmpliMASTER quantos os tubos de AmpliMIX Escrever HHV6 e a data no tubo com caneta com tinta permanent
13. as devem ser destinadas exclusivamente a este tipo de an lise As amostras devem ser manipuladas em uma c mara de fluxo laminar Os tubos que cont m amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso As pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo ou usar ponteiras com barreira filtro As ponteiras utilizadas devem ser est reis sem a presen a de DNAse e RNAse sem a presen a de DNA e RNA Os reagentes devem ser manipulados em c mara de fluxo laminar Os reagentes necess rios para a amplifica o devem ser preparados de modo a ser utilizados em uma nica vez As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente para aquela rea de trabalho As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo ou usar ponteiras com barreira filtro As ponteiras utilizadas devem ser est reis sem a presen a de DNAse e RNAse sem a presen a de DNA e RNA Os produtos de amplifica o devem ser manipulados de modo a limitar ao m ximo a dispers o no ambiente para evitar a possibilidade de contamina es As pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplifica o devem ser destinadas exclusivamente para sua rea de trabalho Advert ncias e precau es espec ficas para os componentes Os produtos HHV6 Q PCR Alert AmpliMIX HHV6 Q PCR Alert AmpliPROBE HHV6 AmpliSTANDARD Q PCR AmpliMASTER apresentam as
14. ca o detec o para a rea de extra o prepara o de rea es As amostras devem ser empregadas exclusivamente a este tipo de an lise As amostras devem EEE EE A ser manipuladas em uma c mara de fluxo laminar Os tubos que cont m amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso As pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo ou serem usadas com ponteiras com barreira filtro As ponteiras utilizadas devem ser est reis sem a presen a de DNAse e RNAse sem a presen a de DNA e RNA Os reagentes devem ser manipulados em c mara de fluxo laminar Os reagentes necess rios para a amplifica o devem ser preparados de modo a ser utilizados em uma nica vez As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente a este prop sito As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo ou usar ponteiras com barreira filtro As ponteiras utilizadas devem ser est reis sem a presen a de DNAse e RNAse sem a presen a de DNA e RNA Os produtos de amplifica o devem ser manipulados de modo a limitar ao m ximo a dispers o no ambiente para evitar a possibilidade de contamina es As pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplifica o devem ser destinadas exclusivamente para sua rea de trabalho Advert ncias e precau es para componentes espec ficos Os tubos contendo Q PCR S
15. de rea o incorretos degrada o da sonda degrada o dos padr es dispensa o incorreta dos padr es posicionamento incorreto dos padr es programa o incorreta do ciclo t rmico que podem ter causado resultados incorretos A sess o n o v lida e deve ser repetida a partir da fase de amplifica o Os valores de fluoresc ncia emitidos pela sonda especifica para HHV6 nas rea es de amplifica o de cada amostra e a Curva Padr o da sess o de amplifica o s o utilizados para calcular a Quantidade Quantity de DNA alvo presente nas reac es de amplifica o das amostras Este kit est em apto para quantificar entre 10 e 1 000 000 de c pias de DNA do gene que codifica a proteina do caps dio do HHV6 por rea o de amplifica o correspondentes aos Equivalentes genoma por rea o como descrito na tabela seguinte di ad Genomas Equivalentes de HHV6 por rea o Quantity gt 1x 10 SUPERIOR A 1 000 000 1x 101 lt Quantity lt 1x 10 Quantity Quantity lt 1x 10 INFERIOR A 10 Os resultados Quantity de cada amostra s o usados para calcular o Equivalente genoma gEq do HHV6 presente na amostra extra da Nc de acordo com a f rmula Nc gEq mL Ve x Quantity Vc x Va x Ee Onde e Vc a quantidade de amostra usada na extra o em rela o unidade de medida requisitada e Ee a efici ncia da extra o expressa em d cimos e Ve o volume total do produto da extra o exp
16. e Dar um pulso nos tubos para que os reagentes ap s descongelados des am para o fundo do tubo Mant los em gelo retirar e descongelar os tubos de AmpliSTANDARD necess rios Dar um pulso nos tubos para que os reagentes ap s descongelados des am para o fundo do tubo Mant lo em gelo se necess rio cortar a placa de amplifica o para separar a parte que ser utilizada no ensaio tomando o devido cuidado de manipul la com luvas sem p e de n o causar danos aos po os durante o corte separa o 1 Transferir 100 uL de AmpliMIX no tubo de AmpliMASTER Misturar bem pipetando por tr s vezes o volume de 100 uL na mistura 2 Transferir 100 uL de AmpliPROBE no tubo de AmpliMASTER Misturar bem pipetando por tr s vezes o volume de 100 uL na mistura Rev 04 Out 2013 3 Misturar em Vortex a baixa velocidade por 5 segundos evitando produ o de espuma 4 Centrifugar os tubos por 5 segundos pulso para que todo l quido escorra para o fundo do tubo 5 Transferir 20 uL da mistura de rea o obtida para o fundo de cada po o na placa de rea o de amplifica o conforme pr elaborado na planilha OBS Caso n o seja utilizado toda a mistura de reagentes elaborado este tubo identificado como HHV6 poder ser armazenado no escuro a 20 C por no m ximo um m s contanto que esta mistura seja somente uma vez congelada e descongelada 6 Transferir depositando os cuidadosamente no fundo
17. e da beta globulina humana A emiss o de fluoresc ncia aumenta com o aumento da rea o de amplifica o do produto espec fico e medido e registrado pelo equipamento A an lise de dados torna poss vel determinar a presen a e o t tulo de DNA HHV6 na amostra inicial Assay Chemistry Summary MD Forward Primer Probe 5 memem 3 O Quencher 6 Reporter Minor Grove Binder O B NS SMGB AmpliTaq TT O Gold DNA Polymerase Non Target Template Target Template A partir do momento que a sonda TaqMan for ligada parte especifica do gabarito de DNA depois da desnatura o alta temperatura e resfriamento da rea o os primers se anelam ao DNA A TagPolimerase ent o adiciona nucleot deos e remove a probe TaqMan do DNA gabarito Isso separa o quencher do rep rter e permite ao rep rter emitir sua energia Isso ent o quantificado usando um computador Quanto mais ocorrer a desnatura o e anelamento mais oportunidades a TaqMan ter de se ligar e em contra partida mais luz emitida ser detectada Rev 04 Out 2013 O corante do reporter liberado da o dupla fita de DNA criada pela Taq Polimerase O 4 Pi Longe do corante quencher a luz emitida do a E x O corante rep rter dye em estado excitado pode agora ser observada 3 A padroniza o do sistema foi realizada nos instrumentos da Applied Biosystems ABI PRISM s rie 7000 P complementary strand template DN
18. e detec o do produto verificar dados a seguir em Caracter sticas de Desempenho Neste caso o resultado seria um falso negativo Os resultados obtidos com este teste devem ser interpretados considerando todos os dados Rev 04 Out 2013 cl nicos e os outros exames de laborat rio relativos ao paciente Quando o HHV6 detectado em uma amostra o controle interno pode resultar em um cT gt 35 ou Indeterminado De fato a baixa efici ncia na rea o de amplifica o para o Controle Interno pode ser deslocada pela competi o com a alta efici ncia da rea o para o HHV6 Neste caso a amostra contudo adequada e o resultado positivo do teste v lido An lise quantitativa dos resultados Depois de realizar o procedimento para an lise qualitativa dos resultados poss vel realizar a an lise quantitativa dos resultados de amostras positivas Os valores de cT para sondas espec ficas HHV6 nas rea es de amplifica o para os quatro Standards s o usados para calcular a curva padr o para a sess o de amplifica o e para validar a amplifica o e a detec o como descrito a seguir Curva Padr o HHV6 FAM Coeficiente de Correla o R2 0 990 lt R2 lt 1 000 CORRETO Faixa Aceit vel Amplifica o Detec o Se o valor do Coeficiente de correla o R2 n o est dentro dos limites isso significa que ocorreram problemas na fase de amplifica o ou de detec o volumes de mistura
19. e fluorescencia do ciclo 6 ao ciclo 15 Nota No caso de uma amostra positiva com alto t tulo de DNA HHV6 a fluoresc ncia FAM da sonda espec fica para HHV6 pode come ar a aumentar antes do 15 ciclo Neste caso o intervalo de c lculo da baseline deve ser adaptado do ciclo 6 ao ciclo em que a fluoresc ncia FAM come ar a aumentar consultando o manual do equipamento programar manualmente o Limiar Thereshold para a fluoresc ncia FAM a 0 2 consultando o manual do equipamento programar manualmente o Limiar Thereshold para a fluoresc ncia VIC a 0 1 Os valores de fluoresc ncia emitidos pelas sondas espec ficas para HHV6 na rea o de amplifica o e o valor Threshold permite determinar o cT ciclo Threshold o ciclo em que a fluoresc ncia atinge o valor Threshold Na rea o de amplifica o do Controle Positivo o valor de cT para a probe espec fica HHV6 usado para validar a amplifica o e a detec o como descrito na tabela seguinte am E Rev 04 Out 2013 cT do Controle Positivo HHV6 FAM cT lt 25 POSITIVO CORRETO Resultado do teste Amplifica o Se o resultado da rea o de amplifica o do Controle Positivo for cT gt 25 ou indeterminado a presen a do DNA alvo n o foi corretamente detectada Isto significa que problemas podem ter ocorrido durante amplifica o ou detec o que podem ter levado a resultados incorretos A sess o n o v lida e precisa se repetida desde o passo
20. eal Time dos cidos nucleicos utilizados neste produto por causa da sua elevada sensibilidade anal tica est sujeito a contamina o por parte das amostras cl nicas positivas para o DNA de HHV6 dos controles positivos e dos mesmos produtos da rea o de amplifica o As contamina es levam a resultados falsos positivos A modalidade de realiza o do produto pode limitar as contamina es mas estes fen menos podem ser evitados somente com uma boa pr tica das t cnicas de laborat rio e seguindo atentamente as instru es fornecidas nestas Instru es de Uso Este produto requer pessoal instru do para as manipula es de amostras biol gicas que podem transmitir agentes infecciosos e de reagentes classificados como perigosos para evitar incidentes com consequ ncias potencialmente graves para o utilizador ou outras pessoas Este produto requer roupa de trabalho EPI e rea de trabalho adequadas manipula o de amostras biol gicas que podem transmitir agentes infecciosos e de reagentes classificados como perigosos para evitar incidentes com consequ ncias potencialmente graves para o usu rio ou outras pessoas Este produto requer pessoal instru do para o procedimento de biologia molecular como a extra o a amplifica o e a detec o de cidos nucleicos para evitar resultados incorrectos Este produto requer uma rea separada para a extra o prepara o das reac es de amplifica o e para a amplifica o detec
21. espondente a genomas Equivalentes por rea o Os resultados dos cT s de cada amostra s o usados utilizados conforme descrito na tabela seguinte cT da amostra Adequa o da Resultado do DNA de HHV6 HHV6 FAM Controle Interno VIC amostra teste e 32 0N Inadequado Inv lido Indeterminado Indeterminado cT lt 35 adequado v lido negativo PAn i DETECTADO cT gt 35 ou ais is i adequado v lido positivo PRESENTE Determinado Indeterminado cT lt 35 adequado v lido positivo PRESENTE Se o resultado da rea o de amplifica o de uma amostra for cT Indeterminado para o DNA do HHV6 e cT gt 35 ou Indeterminado para o DNA do Controle Interno isso significa que n o foi poss vel detectar de modo eficiente o DNA do controle interno Neste caso ocorreram problemas na fase de amplifica o amplifica o n o eficiente ou nula ou na fase de extra o aus ncia de DNA presen a de inibidores ou amostras iniciais com um n mero de c lulas insuficiente que podem ter causado resultados incorretos e falsos negativos A amostra n o adequada o teste n o v lido e deve ser repetido a partir da extra o de uma nova amostra Se o resultado da rea o de amplifica o de uma amostra cT Indeterminado para o DNA do HHV6 e cT lt 35 para o controle interno o DNA de HHV6 n o foi detectado no DNA extra do da amostra mas n o poss vel descartar a presen a do DNA de HHV6 a um t tulo inferior ao limite d
22. etrix com br CNPJ 06 145 976 0001 39 INFORMA ES DO FABRICANTE Nanogen Advanced Diagnostics S P A C so Torino 89 d 10090 Buttigliera Alta TO It lia REGISTRO ANVISA RTS036 M 80298490107 RTS036 P 80298490036 RESPONS VEL T CNICA Edna Cristina Kurokawa Guimar es Ferreira CRQ PR 09302336 Aprova o 20 12 2013 y P OAO X MB PM ff Mauricio Cichon Laborat rio Assinado por Maur cio Cichon 14 em E OMETRIX DIAGN STI Rev 04 Out 2013 STD036 HHV6 Q PCR Standard Instru es de Uso USO PRETENDIDO O produto HHV6 Q PCR Standard destinado ao uso como um controle positivo e como padr o de quantidade conhecida de DNA para obter uma curva padr o em ensaios de amplifica o quantitativa de cidos nucleicos para a detec o e dosagem do DNA HHV6 com os produtos Q PCR Alert AmpliMASTER HHV6 Q PCR Alert AmpliMIX e HHV6 Q PCR Alert AmpliPROBE da Nanogen Advanced Diagnostics S P A DESCRI O DO PRODUTO O produto Q PCR Standard inclui quatro solu es de plasm deos estabilizadas com titula o conhecida contendo a sequ ncia requerida divididas em dois tubos de al quotas prontas para uso Cada tubo teste cont m 50 uL de solu o suficiente para oito sess es O plasm deo cont m parte da regi o ORF 13R do HHV6 A detec o do DNA alvo durante a rea o de amplifica o em tempo real confirma a habilidade de identificar a presen a do DNA
23. inhamento das regi es selecionadas para a hibridiza o dos primers de oligonucleot deos da AmpliMIX e da sonda fluorescente AmpliPROBE com as sequ ncias disponibilizadas no banco de dados da regi o ORF 13R de HHV6 demonstrou sua conserva o e a aus ncia de muta es significativas Sensibilidade diagn stica amostras positivas A sensibilidade diagn stica do teste como confirma o das amostras cl nicas positivas foi verificada utilizando como material de refer ncia as amostras de sangue total e de plasma positivos para o DNA de HHV6 e resultou maior que 94 1 A sensibilidade diagn stica foi avaliada utilizando 9 amostras de sangue total coletadas em EDTA e 8 amostras de plasma coletadas em EDTA que eram positivas para o DNA de HHV6 Cada amostra foi empregada para realizar o procedimento completo de an lise extra o e amplifica o Os resultados finais s o resumidos na tabela seguinte Amostras N Positivos Negativos Leuc citos positivos para o DNA de HHV6 9 9 0 Plasmas positivos para o DNA de HHV6 8 8 0 Especificidade anal tica marcadores interferentes em potencial A sensibilidade anal tica do teste que a rea o cruzada com outros marcadores interferentes em potencial foi avaliada comparando se as sequencias do banco de dados de nucleot deos O teste de alinhamento das regi es selecionadas para a hibridiza o dos primers de oligonucleot deos do AmpliMIX e da sonda fluorescente A
24. ixebiometrix com br Website www biometrix com br CNPJ 06 145 976 0001 39 sa a a reeeooeee defeo ee e Rev 04 Out 2013 INFORMA ES DO FABRICANTE Nanogen Advanced Diagnostics S P A C so Torino 89 d 10090 Buttigliera Alta TO It lia REGISTRO ANVISA 80298490052 RESPONS VEL T CNICA Edna Cristina Kurokawa Guimar es Ferreira CRQ PR 09302336 Aprova o 20 12 2013 Mauricio Cichon Laborat rio Assinado por Maur cio Cichon mm SIOMETRIX 18 DIAGN STICA WORKSHEET 12 11 10 ATTACHMENT
25. met las a ciclos de congelamento descongelamento repetidos Quando se utilizam amostras congeladas proceder ao descongelamento imediato antes do U M N Rev 04 Out 2013 in cio da extra o para evitar fen menos de degrada o dos cidos nucleicos As instru es para o eventual pr tratamento da amostra cl nica e para a extrac o do DNA est o contidas no Manual de instru es para o uso de EXTRAgen gt Sangue total colhido em EDTA As amostras de sangue total destinados extra o do DNA devem ser coletadas em EDTA segundo as indica es do laborat rio transportadas a 2 C 8 C e conservadas a 2 C 8 C por um m ximo de tr s dias N o congelar as amostras de sangue total para evitar a lise celular e a perda da titula o viral As instru es para o eventual pr tratamento da amostra cl nica e para a extra o do DNA est o contidas nas Instru es de Uso do kit EXTRAceLLO Suspens es de leuc citos e as suspens es de linfomon citos As suspens es de leuc citos e as suspens es de linfomon citos destinadas extra o do DNA devem ser preparadas segundo as indica es do laborat rio suspendidas em Solu o fisiol gica est ril ou PBS est ril contadas e conservadas a 2 8 Cpor um m ximo de quatro horas N o congelar as suspens es de leuc citos e as suspens es de linfomon citos para evitar a lise celular e a perda da titula o viral As instru es para
26. mpliPROBE com as sequ ncias dispon veis no banco de dados de organismos diferentes do HHV6 inclu ndo o genoma completo de HHV7 e CMV o virus de Herpes humano mais similar ao HHV6 monstrou sua especificidade e aus ncia de homologias significativas Especificidade diagn stica amostras negativas A especificidade diagn stica do teste como confirma o das amostras cl nicas negativas foi testada analisando algumas amostras de sangue total e de plasma que eram negativas para o DNA de HHV6 e resultou maior que 96 3 A especificidade diagn stica foi avaliada utilizando uma s rie de 3 amostras de sangue total coletado em EDTA e vinte e quatro amostras de plasma coletado em EDTA que eram negativos para o DNA de HHV6 Cada amostra do painel foi empregada para realizar o procedimento completo de an lises extra o e amplifica o 13 em E OMETRIX DIAGNOSTICA Os resultados finais est o resumidos na tabela seguinte Rev 04 Out 2013 Amostras N Negativos Positivos Leuc citos negativos para o DNA de HHV6 3 3 0 Plasmas negativos para o DNA de HHV6 24 24 0 REFER NCIAS BIBLIOGR FICAS WAKEFIELD A J et al 1992 J Med Virology 38 183 190 IDENTIFICA O DO DISTRIBUIDOR Biometrix Diagn stica Ltda Estrada da Graciosa 1081 Curitiba PR CEP 82840 360 Tel 41 2108 5250 Fax 41 2108 5252 DDG 0800 7260504 E mail biometrixQbiometrix com br Website www biom
27. ntes otimizados para amplifica o os primers oligonucleot deos e os reagentes de detec o probes fluorescentes n o est o inclusas neste produto Para realizar estes passos anal ticos os produtos a seguir s o recomendados e Q PCR Alert AmpliMASTER RTS000 combina o de reagentes otimizados microplacas e adesivos para PCR em tempo real e determina o al lica total de 96 rea es e HHV6 Q PCR Alert AmpliMIX RTS036 M primers oligonucleot deos para PCR em tempo real total de 96 rea es e HHV6 Q PCR Alert AmpliPROBE RTS036 P probes fluorescentes para PCR em tempo real total de 96 rea es ADVERT NCIAS E PRECAU ES Este produto exclusivamente para uso in vitro Advert ncias e precau es gerais Manusear e descartar todas as amostras biol gicas como potencialmente infecciosas Evitar o contato direto com amostras biol gicas Evitar respingos Os materiais que entram em contato com amostras biol gicas devem ser tratados com hipoclorito de s dio 3 por no m nimo 30 minutos ou autoclavados a 121 C por uma hora antes de serem descartados Manusear e descartar todos os reagentes e materiais como potencialmente infecciosos Evitar contato direto com reagentes Evitar respingos Os res duos devem ser tratados e descartados de acordo com normas de seguran a Res duos l quidos contendo cidos ou bases devem ser neutralizados antes do descarte Usar jaleco luvas e culos de prote
28. o da fluoresc ncia medida e o tipo de rea o amostra controle negativo controle positivo ou padr o de amplifica o com a quantidade relativa Complete a planilha que se encontra no final desta Instru o de Uso escrevendo manualmente estas informa es ou imprimir a montagem da placa com as respectivas posi es dos controles e localiza es das amostras A planilha deve ser seguida criteriosamente durante a aplica o da amostra e seus reagentes OBS para a determina o da quantidade de DNA alvo na amostra inicial ser necess rio preparar uma s rie de rea es usando DNA padr es com quantidades conhecidas c pias nas quantidades 10 10 10 102 para que se possa obter a Curva Padr o Ilustra se a seguir a t tulo de exemplo como pode ser organizada a an lise de 11 amostras OMETRIX DIAGN STICA Nano NO N Na ZEN ZDN N XE X MA a S d h 2 P 7A N A N SM KE ENY Ma d 10 NS ZA gt N A A s d N hs S S ARA AXILL dA Aa da Mda Mda M Ma My Asko X XXXX MWM N NAN AN AN AN AN AN AN ANO L q Z S N V AN o N D AN D N O O N a AN o o x gt AN NC A L N es did N S gt e so NAN NAS Z XXK Y yY NA i dh dh a AAA A Cereser LA A CA A A A A A A A 4 Fr ya NAN O NO N A 4 Rev 04 Out 2013 ZN N ANS ZN ZNS Significado A1 A11 Amostras par
29. o de 10 c pias 5 uL em DNA genomico humano a um t tulo de 500 ng 5 uL Esta amostra foi usada em 50 repeti es para realizar a amplifica o Os resultados finais s o resumidos na tabela seguinte Amostras N 50 Positivos Negativos 50 0 10 c pias DNA de plasm deo 500 ng de DNA gen mico humano Sensibilidade anal tica Faixa de Medi o Linear Em termos de Faixa de Medi o Linear a sensibilidade anal tica deste ensaio permite determinar um t tulo de 1 000 000 a 10 mol culas de DNA alvo nos 5 pL de DNA extra do e acrescentado rea o de amplifica o Em termos de Faixa de Medi o Linear a sensibilidade anal tica da prova foi determinada utilizando um painel de dilui es 1 log entre uma dilui o e a seguinte de DNA de plasm deo contendo o produto de amplifica o cuja concentra o inicial foi medida por espectrofotometro Os pontos do painel de 10 mol culas por rea es a 10 mol culas por rea o foram empregadas em 9 repeti es para realizar a amplifica o A an lise dos dados obtidos realizada com a regress o linear demonstrou que o ensaio apresenta uma resposta linear para todos os pontos do painel coeficiente de correla o linear superior a 0 99 Os resultados finais s o resumidos na tabela seguinte Faixa de Medi o Linear pares DNA rea o gEq 100 000 c lulas gEq mL Limite superior 1 000 000 4 000 000 12 500 000 Limite inferior 10
30. resso em pL e Va o volume do produto da extra o usado na rea o de amplifica o expresso em uL e Quantity o resultado da rea o de amplifica o da amostra expresso em gEq por rea o Quando o kit Extracell usado o DNA extra do de 500 000 c lulas de acordo com as instru es de uso e resultado requerido em gEq 100 000 c lulas a f rmula fica Rev 04 Out 2013 Vc 5 500 000 c lulas s o equivalentes a 5 unidades de medi o de 100 000 c lulas Ee 1 0 significa efici ncia de 100 Ve 100 uL Va 5 uL Nc gEq 100 000 c lulas 100 x Quantity 5x5x1 0 Nc gEq 100 000 c lulas 4 x Quantity Quando o kit Extracell usado e o resultado requerido em gEq extra o omitindo o termo Vc a f rmula fica Vc omitido Ee 1 0 significa efici ncia de 100 Ve 100 uL Va 5 uL Nc gEq extra o 100 x Quantity 5x 1 0 Nc gEq extra o 20 x Quantity C lculo de medi o dos limites Quando m todo particular de extra o usado os limites de medi o em gEq mL da amostra devem ser calculado a partir do limite de medi o linear da rea o de amplifica o de acordo com as f rmulas Limite inferior gEq extra o Ve x 10 gEq Vc x Va x Ee Limite superior gEq extra o Ve x 1 000 000 gEq Vc x Va x Ee Quando o kit Extracell usado a f rmula fica Limite inferior gEq mL 4 x 10 gEq
31. seguintes advert ncias S S 23 25 N o respirar vapores aerossol Evitar o contato com os olhos Observa es importantes e Os tubos que cont m o AmpliMIX e o AmpliPROBE s o descart veis e portanto devem ser utilizados uma nica vez na prepara o da mistura de rea o e Os tubos que cont m o AmpliSTANDARDO n o podem ser congelados e descongelados por mais de 8 vezes Ciclos sucessivos de congelamento descongelamento podem causar perda na titula o e Os tubos que cont m o AmpliMASTER n o podem ser congelados e descongelados por mais de 1 vez Ciclos sucessivos de congelamento descongelamento podem causar uma perda na efici ncia da amplifica o CUIDADOS COM A AMOSTRA BIOL GICA A amostra deve ser tratada como potencialmente infecciosa PROCESSO DE MEDI O Amostras Este kit deve ser utilizado com DNA extra do das seguintes amostras biol gicas plasma coletado em EDTA sangue total coletado em EDTA suspens es de leuc citos suspens es de linfomon citos Plasma colhido em EDTA As amostras de plasma destinadas extra o do DNA devem ser coletadas em EDTA segundo as indica es do laborat rio transportadas a 2 C 8 C e conservadas a 2 C 8 C por um m ximo de quatro horas em caso contr rio devem ser congeladas e conservadas a 20 C por um m ximo de trinta dias ou ainda a 70 C por um maior tempo subdividir em mais al quotas as amostras para conservar congeladas de modo a n o sub
32. tandard podem ser congelados e descongelados por no m ximo 8 vezes Um n mero maior de ciclos de congelamento e descongelamento pode causar uma redu o do t tulo Q PCR Standard apresenta as seguintes advert ncias S S 23 25 N o inalar vapores Evitar contato com os olhos PROCEDIMENTO O produto HHV6 Q PCR Standard deve ser usado com a mistura de rea o obtida com os produtos Q PCR Alert AmpliMASTER HHV6 Q PCR Alert AmpliMIX e HHV6 Q PCR Alert AmpliPROBE gt Q PCR Standard est pronto para o uso portanto deve ser usado adicionando 5 uL diretamente na mistura de rea o O procedimento completo envolve prepara o e execu o de rea o de amplifica o em tempo real em uma microplaca com termociclador com sistema ptico de detec o de fluoresc ncia descrito em detalhes nas instru es de uso dos produtos HHV6 Q PCR Alert AmpliMIX gt bem como informa es sobre as caracter sticas de desempenho e limita es do procedimento Nota Q PCR Standard pode ser congelado e descongelado por no m ximo 8 vezes Um n mero maior de ciclos de congelamento e descongelamento pode causar uma redu o do t tulo REFER NCIAS WAKEFIELD A J et al 1992 J Med Virology 38 183 190 IDENTIFICA O DO DISTRIBUIDOR Biometrix Diagn stica Ltda Estrada da Graciosa 1081 Curitiba PR CEP 82840 360 Tel 41 2108 5250 Fax 41 2108 5252 DDG 0800 7260504 E mail biometr
33. tidade Estocagem HHV6 Q PCR Alert AmpliMIX RTS036 M 4x 110 uL 20 C HHV6 Q PCR Alert AmpliPROBE RTS036 P 4x110 uL 20 C Q PCR Alert AmpliMASTER 4 x 340 uL 2 8 C Microplaca para amplifica o RTS000 3 Temp Ambiente L mina adesiva para amplifica o 3 Temp Ambiente PRECAU ES Este kit reservado para uso exclusivo em diagn stico in vitro Manuseio ao manusear o kit e as amostras Utilizar EPI adequado ao tipo de laborat rio onde os testes ser o realizados devido natureza da amostra material biol gico humano N o beber ou comer na rea de trabalho A rea de tarbalho deve ser um ambiente limpo e com ventila o adequada Trabalhar dentro de capela de exaust o fluxo Laminar N o manusear o kit sem luvas Advert ncias e precau es gerais Manipular e eliminar todas as amostras biol gicas reagentes e materiais usados como se fossem agentes infecciosos Evitar o contato direto com as amostras biol gicas Evitar a forma o de aerossol durante o procedimento evitar respingar material ao redor da rea de trabalho ou fora dela O material que est em contato com as amostras biol gicas deve ser tratado com Hipoclorito de s dio a 3 pelo menos por 30 minutos ou ainda tratado em autoclave a 121 C durante uma hora antes de ser eliminado O material descart vel combust vel deve ser incinerado Os res duos l quidos que cont m cidos ou bases devem ser neutralizados antes da elimina o
34. tra positiva Como amostra negativa utilizar uma amostra negativa para o DNA de HHV6 j testada ou da 11 U M N Rev 04 Out 2013 gua bidestilada est ril Como amostra positiva utilizar uma amostra positiva para o DNA de HHV6 j testada Controles de amplifica o absolutamente necess rio confirmar cada sess o de amplifica o preparando uma rea o de controle negativo e uma rea o de controe positivo Para o controle negativo utilizar gua bidestilada est ril n o inclu da no kit para acrescentar rea o no lugar do DNA extra do da amostra Para o controle positivo utilizar o DNA obtido de uma amostra positiva j testada ou o HHV6 Q PCR Alert AmpliSTANDARD gt VALORES DE REFER NCIA OBTIDOS EM POPULA ES SADIAS OU VALORES DEMOGR FICOS EPIDEMIOL GICOS ESTAT STICOS DESEJ VEIS TERAP UTICOS OU T XICOS N o existe este tipo de dado para a metodologia em quest o CARACTER STICAS DE DESEMPENHO Sensibilidade Anal tica Limite de Detec o A sensibilidade anal tica desta prova permite identificar a presen a de aproximadamente 10 mol culas de DNA alvo nos 5 uL de DNA extra do e acrescentado rea o de amplifica o Em termos de Limite de Detec o a sensibilidade anal tica do ensaio foi determinada utilizando um DNA de plasm deo contendo o produto de amplifica o cuja concentra o inicial foi medida por espectrofotometro O DNA de plasm deo foi dilu do a um t tul
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