0506 HFE Box
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1. 15 20 geneBOX investiga o e desenvolvimento de teste diagn sticos garante que os primers presentes no kit de tipagem HFE Box apresentam as especificidades dadas nas folhas e tabelas de interpreta o de resultados do produto 1 Placa de Tipagem Armazenamento a 20 C os primers desidratados permanecem est veis durante 12 a 19 meses a partir da data de produ o ver validade do lote na embalagem Armazenamento a 4 C os primers desidratados permanecem est veis durante 12 meses a partir da data de produ o temperatura ambiente os primers desidratados permanecem est veis durante 3 a 4 semanas a partir da data de recep o Quando o selante removido os primers desidratados permanecem est veis durante 2 dias no m ximo desde que n o humede am 2 Mistura de Reac o Armazenamento a 20 C a mistura de reac o permanece est vel durante 18 meses a partir da data de produ o ver validade do lote na embalagem Armazenamento a 4 C a mistura de reac o permanece est vel durante 15 dias a partir da data de recep o temperatura ambiente a mistura de reac o permanece est vel durante 3 dias a partir da data de recep o A mistura de reac o nunca deve ser deixada ou armazenada com a tampa aberta 3 DNA O DNA extra do por salting out ou por qualquer outro m todo deve ser armazenado a 4 C ou 20 C Ao optar pela congela o das amostras devem ser evitadas ciclos repetidos de c2. o mantidos na geneBOX biocant centro de inova o em biotecnologia 3060 197 Cantanhede Portugal Sandra Balseiro Directora T cnica 16 20 Componentes do HFE Box 1 0 Typing Kit e Placas de tipagem de HFE 48 tipagens 8 placas 6 amostras cada conservar de 15 a 302C e PCR Master Mix com Taq DNA Polimerase 8 X 80 l conservar de 15 a 302C e Selantes de Placas 24 C psulas selantes e Manual de instru es 1 Manual de Instru es com pares de primers espec ficos desidratados Componentes da PCR Master Mix Nucle tidos concentra o final de cada dNTP 600 uM Tamp o da PCR concentra es finais s o 3 3x NH4 2 0 mM MgCl e 0 4 u ul Amplitag DNA polimerase pH 8 3 Glicerol concentra o final 16 6 Vermelho de cresol concentra o final de 300ug ml 5 20 Protocolo de amplifica o por PCR Reagentes e Amostra de DNA 100 200 ng ul e PCR Master Mix e gua bi destilada est ril n o fornecida Extrac o de DNA Para a tipagem por SSP necess rio DNA extra puro Recomenda se que o isolamento de DNA seja efectuado utilizando kits de extrac o com marca o CE que garantam um r cio DO 260 280 maior do que 1 6 e uma concentra o entre 100ng 200 ng ul Alternativamente o DNA pode ser extra do utilizando sais de Brometo de Trimetilamonia DTAB CTAB ou por salting out dissolvendo o em Tamp o TE Devem ser asseguradas o mesmo n vel de DO e de conc
3. sempre utilizar se equipamentos espec ficos para cada area de trabalho prepara o de amostras pr amplifica o amplifica o e p s amplifica o Todos os equipamentos utilizados na rea de p s PCR n o devem sais desta zona Utilize micropipetas luvas e batas espec ficas para cada rea Utilize preferencialmente luvas sem talco uma vez que o talco pode inibir a reac o de PCR Utilize pontas de filtro de forma a minimizar contamina es cruzadas Verifique periodicamente as micropipetas de forma a assegurar a varia o de pipetagem inferior a 5 Utilize micropipetas adaptadas a cada volume de pipetagem Verifique periodicamente os termocicladores de forma a assegurar a varia o de temperaturas inferiores a 1 Abra e feche os reagentes com cuidado Depois de utilizar armazene os restantes componentes do kit s temperaturas recomendadas devidamente fechados N o utilize o kit com a validade expirada Os componentes dos kits s o resistentes s temperaturas de armazenamento indicadas O armazenamento dos kits a temperaturas n o recomendadas podem levar rupturas no material e contamina o dos reagentes dos kits Os materiais pl sticos fornecidos neste kit s o resistentes gama de temperaturas de utiliza o e armazenamento recomendadas A sua utiliza o em gamas distintas de temperaturas pode causar rupturas impossibilitando a utiliza o normal do kit Verifique a co
4. FE Altera es e melhoramento do Produto Este produto pode ser melhorado de modo a aumentar o seu rendimento As altera es adi es ou modifica es de primers em rela o ao lote anterior est o detalhadas na tabela abaixo primers N A Controlo de Qualidade A Genebox testou as misturas de primers com v rios DNAs padr o obtendo amostras positivas e negativas para cada uma das muta es A Genebox garante a qualidade e a fiabilidade do seu kit HFE Box 4 20 Folha de Dados de Seguran a 1 3 Material Safety Data Sheet MSDS geneBOX R amp D Diagnostic Tests PCR SSP Kits Produtos de tipagem SSP da geneBOX Esta folha de dados de seguran a aplic vel a todos os produtos de tipagem por PCR SSP da geneBOX 1 Produtos Qu micos e Identifica o da Companhia Data de realiza o Maio 2010 Grupo do produto Produtos de tipagem SSP da geneBOX Manufactura o geneBOX R amp D Diagnostic Tests biocant centro de inova o em biotecnologia n cleo 4 lote 3 3060 197 cantanhede portugal tel fax 351 231 410 946 351 231 410 947 e mail infoQgenebox com 2 Composi o e Informa o sobre os reagentes Componente Qu mico Nome vulgar Placa Acido Desoxiribonucleico Oligonucle tido Vermelho de Cresol Mistura de reac o Desoxiribonucle tidos Nucle tidos Tamp o NH4 Cloreto de Magn sio Mgci2 Vermelho de Cresol Glicerol Taq DNA Polimerase Taq 3 Propriedades f
5. Refer ncias 1 Turner MS Penning S Sharp A Hyland VJ Harris R C Morris P van Daal A Solid Phase Implification for Detection of C282Y and H63D Hemochromatosis HFE Gene Mutations Clinical Chemistry 2001 47 1384 1389 2 Whitfield JB Cullen LM Jazwinska EC Powell LW Heath AC Zhu G Duffy DL Martin NG Effects of HFE C282Y and H63D Polymorphisms and Polygenic Background on Iron Stores in a Large Community Sample of Twins Am J Hum Genet 2000 66 1246 1258 3 Hanson EH Imperatore G Burke W HFE gene and hereditary hemochromatosis A HUGE Review Am J Epidemiol 2001 154 193 206 0 y 0 ue genesox 000 DESENVOLVIMENTO E PRODU O DE TESTES DE DIAGN STICO biocant centro de inova o em biotecnologia n cleo 4 lote 3 3060 197 cantanhede portugal tel 351 231 410 946 fax 351 231 410 947 e mail info genebox com www genebox com 20 20 C digo do Produto 0506 HFE Box 1 0 Typing Kit Dispositivo para utiliza o in vitro Manual de Instru es oqo oo genesox 090 DESENVOLVIMENTO E PRODU O DE TESTES DE DIAGN STICO Vers o 1 5 Maio de 2010 po euVe genesox 000 DESENVOLVIMENTO E PRODU O DE TESTES DE DIAGN STICO biocant centro de inova o em biotecnologia n cleo 4 lote 3 3060 197 cantanhede portugal tel 351 231 410 946 fax 351 231 410 947 e mail info genebox com Wwww genebox com 2 20 Folha de Dados de Seguran a 3 3 Material Safety Data
6. Sheet MSDS 12 Informa o ecol gica N o existem dados dispon veis 13 Informa o sobre a elimina o de res duos Elimine o material de acordo com toda a regulamenta o aplic vel os res duos devem ser devidamente tratados e ou incinerados 14 Informa o sobre o transporte No transporte dos Kits devem estar a seguradas as temperaturas n o devendo ultrapassar os 252C A dura o do transporte n o deve ser superior a 3 dias de modo a garantir que todos os componentes do Kit cheguem em perfeitas condi es aos seus destinat rios 15 Contactos teis N mero Nacional de Emerg ncia 112 Centro de Informa o Anti Venenos 808 250 143 16 Outras informa es As informa es a cima dispon veis s o baseados no n vel de conhecimento actual devendo ser utilizado apenas como guia A geneBOX R amp D Diagnostic Tests n o se responsabiliza por qualquer dano causado pela manipula o inapropriada ou pelo contacto com os referidos produtos Para mais esclarecimentos por favor contactem com o apoio t cnico para o 351 231 410 946 19 20 Apresenta o Este kit cont m placas com misturas de primers desidratadas e PCR Master Mix para efectuar a tipagem gen tica dos polimorfismos dos cod es 63 e 282 do HFE Altera es e melhoramento do Produto Este produto pode ser melhorado de modo a aumentar o seu rendimento As altera es adi es ou modifica es de primers em rela o ao
7. aptador de silicone para placas de 96 e ou adicione leo mineral Falsos negativos de uma banda espec fica com o controlo interno normal Degrada o da amostra de DNA Reextraia a amostra de DNA de material fresco Repita a tipagem com um DNA de boa ualidade Detec o de mais de dois alelos espec ficos Esfrega o de bandas Amostra de DNA muito concentrada Verifique a qualidade e concentra o do DNA Dissolva o DNA em 44H20 de forma a obter a concentra o exacta Repita a tipagem com um DNA de boa qualidade Contamina o com outros produtos de PCR ou outras amostras de DNA durante a prepara o do PCR Degrada o da amostra de DNA Limpe a zona de trabalho Trabalhe em zonas Pr e P s PCR separadas Utilize batas distintas para a zona Pr e P s PCR Mude de luvas frequentemente Repita a tipagem com um DNA de boa qualidade Reextraia a amostra de DNA de material fresco Repita a tipagem com um DNA de boa qualidade Amostra de DNA muito concentrada Verifique a qualidade e concentra o do DNA Dissolva o DNA em 4a H20 de forma a obter a concentra o exacta Repita a tipagem com um DNA de boa qualidade Problemas com tamp o de electroforese Fora de prazo ou composi o errada Use um tamp o recomendado novo 11 20
8. entra o N O UTILIZE SANGUE HEPARINIZADO COM ESTE M TODO Amplifica o por PCR 1 Agite brevemente os tubos de DNA e da mistura de reac o 2 Junte e 14 ul da PCR Master Mix e 30 pl de gua bi destilada est ril e e 4 plida amostra de DNA conc 100 200 ng ul num tubo de 0 7 ml ou 1 5 ml 3 Agite vigorosamente durante 15 segundos 4 Pipete 10 pl da mistura para cada po o da placa de tipagem 4 pares de primers 5 Repita os passos anteriores para cada uma das amostras DNA num total de 6 amostras por placa 6 Tape a placa de tipagem com as tiras de tampas e coloque num aparelho PCR de 96 po os 6 20 Aviso de garantia geneBOX investiga o e desenvolvimento de teste diagn sticos responsabiliza se perante os seus clientes pelos defeitos no material e componentes dos seus produtos aplicados em condi es normais Os produtos da empresa que apresentam esta garantia devem ser substitu dos sem encargos para o cliente Esta garantia aplica se s para produtos que sejam manipulados e armazenados de acordo com as especifica es e recomenda es de utiliza o As reclama es devem ser enviadas por escrito directamente para a geneBOX e devem ser acompanhadas por uma c pia da guia de transporte ou factura do produto Este produto n o pode ser reformulado reembalado ou revendido em nenhuma forma sem o expresso consentimento da geneBOX investiga o e desenvolvimento de teste diagn sticos
9. lo INE E Ligue a tina de electroforese corrente com uma voltagem m dia 115V 5 Deixe a electroforese correr por cerca de 20 minutos ou at o corante estar a 2 3 da linha 6 Ponha o gel no transiluminador 7 Fotografe o gel e identifique o 8 Use a Tabela de interpreta o de resultados para interpretar os resultados 8 20 Guia T cnico 1 Pureza e Concentra o do DNA Para obter bons resultados com o HFE Box 1 0 Typing Kit a pureza da amostra de DNA cr tica Ter uma amostra pura significa obter uma raz o 260nm 280nm de DO superior a 1 6 e uma por o de DNA superior a 9 4 kb A elevada degrada o do DNA ou uma raz o 260nm 280nm inferior a 1 5 requer uma nova extrac o de DNA Cada amostra de DNA deve ter aproximadamente 100 a 200 ng ul Concentra es elevadas de DNA provocam um decl nio consider vel na especificidade da PCR Recomenda se o uso de qualquer kit de extrac o de DNA que apresente marca o CE de modo a obter um DNA extra puro t 2 Taq Polimerase O HFE Box 1 0 Typing Kit foi intensivamente testado utilizando a Taq da Reagente 5 Reagente 5 Lisboa Portugal 3 Mistura de reac o Para uma boa performance da tipagem com o HFE Box 1 0 Typing Kit obrigat ria a utiliza o da PCR Master Mix fornecida com o Kit 4 Procedimentos de amplifica o No fim da PCR examine o grau de evapora o e de condensa o da mistura de reac o da PCR Se as perdas de vo
10. lote anterior est o detalhadas na tabela abaixo primers Motivo N A Controlo de Qualidade A Genebox testou as misturas de primers com v rios DNAs padr o obtendo amostras positivas e negativas para cada uma das muta es A Genebox garante a qualidade e a fiabilidade do seu kit HFE Box 4 20 Apresenta o rimam raras 4 Altera es e melhoramento do Produto em 4 Controlo da Qualidade 4 Componentes do HFE Box 1 0 Typing Kit 5 Protocolo de amplifica o por PCR 6 Reagentes isso a assa ERARE ea daN 6 Extrac o de DNA 6 Amplifica o por PCR 6 Par metros do programa de PCR 7 Protocolo de electroforese em gel de agarose 8 Prepara o do gel a 2 8 Electroforese araia 8 Esquema da placa HFE Box 1 0 9 Identifica o da placa HFE Box 1 0 9 Tabela de interpreta o dos Resultados 10 Guia de resolu o de problemas eeeenaeenretes 11 Avisos precau es sesser rnnr 12 GUIA TECNICO irran ip enana e Ee EA AEE a fla ada data 13 Garantia diaca a a a a assaltado 14 A iso de Garantias e iinis a pin 15 Declara o de Conformidade CE 16 Folha de dados de seguran a 17 Refer ncias iara Sereias dns Oni taaiO aaa 20 3 20 Apresenta o Este kit cont m placas com misturas de primers desidratadas e PCR Master Mix para efectuar a tipagem gen tica dos polimorfismos dos cod es 63 e 282 do H
11. lume forem superiores a 20 n o devem ser validados os resultados obtidos De forma a prevenir esta situa o devem adicionar previamente leo mineral mistura de reac o ou utilizar um adaptador de silicone para placas de 96 Tamb m se deve ter em aten o a temperatura de aquecimento do aparelho Se a temperatura de aquecimento n o for suficiente v o se verificar problemas de condensa o 5 Termociclador Recomenda se utiliza o de qualquer Termociclador que apresente as seguintes caracter sticas heating rate superior a 2 5 C sec cooling rate superior a 1 52C sec gama de temperatures 4 100 C uniformidade de temperaturas 0 5 C heated lid superior a 1002C 6 Validade Como especificado na embalagem Se os problemas persistirem por favor contactem com o apoio t cnico para o 351 231 410 946 13 20 Avisos e precau es A amplifica o por PCR permite nos obter milh es de c pias de DNA a partir de uma pequena quantidade de amostra Infelizmente isto tamb m verdade para o DNA contaminante que pode comprometer performance da nossa reac o Consequentemente pr ticas laboratoriais espec ficas podem evitar a presen a de amplifica es inespec ficas Em baixo encontram se descriminadas as recomenda es da Genebox Separe fisicamente as reas de pr PCR e de p s PCR O fluxo Laboratorial deve ser sempre unidireccional da rea pr PCR para a rea p s PCR Deve
12. mers controlo emparelham com sequ ncias n o polim rficas Os primers de controlo positivo interno amplificam segmentos do gene PI C1 originando fragmentos com 790 pares de bases Na presen a da banda espec fica a banda controlo pode ver diminu da a sua intensidade A reac o de PCR s valida na presen a da banda controlo ou nalguns casos na presen a da banda espec fica Na aus ncia da banda controlo por favor repita a tipagem NOTA Se o PCR tiver bandas com tamanhos diferentes dos previstos n o as considere pois pode tratar se de bandas n o espec ficas ou artefactos 10 20 Guia de resolu o de problemas PROBLEMAS POSSIVEIS CAUSAS Bandas controlo e espec ficas fracas Concentra o da amostra de DNA baixa SUGEST ES Verifique a qualidade e concentra o do DNA Reextraia a amostra de DNA ou tente n o adicionar gua mistura de reac o Repita a tipagem com um DNA de boa qualidade Os controlos internos falharam em diversos po os Presen a de inibidores da Taq polimerase nas amostras de DNA Repurifique a amostra de DNA Repita a tipagem com um DNA de boa qualidade Presen a de inibidores da Taq polimerase nas amostras de DNA Repurifique a amostra de DNA Repita a tipagem com um DNA de boa qualidade Produtos de amplifica o secos E Verifique a selagem das placas Repita a tipagem utilizando um ad
13. ncentra o e qualidade de todas as amostras de DNA antes de utilizar este kit Instru es de gerais de seguran a no laborat rio N o coma beba ou fume dentro do laborat rio Utilize sempre luvas descart veis e mude as com frequ ncia Utilize batas limpas e proteja os olhos sempre que se justifique Lave as m os antes e depois de qualquer manipula o de amostras ou reagentes Lave a rea de trabalho antes e depois de qualquer manipula o N o pipete com a boca 12 20 Esquema da placa HFE Box 1 0 Direc o de pipetagem md 0007 00 09 000 00 Or 0009 00 08 00 0 00 0 A numera o pode variar de placa para placa sendo o n 1 equivalente a 4 7 10 o n 2 equivalente a 5 8 11 o n 3 equivalente a 6 9 12 Identifica o da placa HFE Box 1 0 Posi o Posi o Gene Local z EEE Te O Cc G HFE 63 D H HEE 63 9 20 Tabela de interpreta o de resultados 1 1 A E HFE 282 G 258 790 B F HFE 282 A 258 790 c G HFE 63 G 274 790 D H HFE 63 c 274 790 DNA1 DNA2 A E HFE 282 G 258 790 B F HFE 282 A 258 790 c G HFE 63 G 274 790 D H HFE 63 c 274 790 A E HFE 282 G 258 790 B F HFE 282 A 258 790 c G HFE 63 G 274 790 D H HFE 63 c 274 790 o 2 gt o zZ gt N Os pares de pri
14. ongela o descongela o de modo a impedir a degrada o da amostra As amostras de DNA armazenadas em dH gt 0 permanecem est veis durante pelo menos 4 semanas a 42C ou 2 anos a 202C As amostras de DNA armazenadas em tamp o TE permanecem est veis durante pelo menos 2 anos a 42C ou 5 anos a 202C 14 20 Par metros do programa PCR Desnatura o 96 2C 1 min 1 Desnatura o 96 2C 25 seg 21 Emparelhamento 65 C 45 seg Extens o 72 C 30 seg Extens o 722C 10 min 1 7 No final da PCR guarde a placa a 2 8 C 8 Detecte os produtos do PCR com uma electroforese em gel de agarose a 2 Protocolo de electroforese em gel de agarose Prepara o do gel de agarose a 2 1 Dissolver 4 gramas de p agarose em 200 ml de tamp o TAE 1X 2 Dissolver completamente a agarose aquecendo a no microondas Arrefe a o gel at aproximadamente 502C 4 Adicione pelo menos 20 ul de brometo de et dio 10 mg ml ou 2 ql de Sybr Safe 10000x concentrado agarose Agite at estar completamente incorporado 5 Numa superf cie nivelada monte a placa do gel com 96 po os 6 Verta uma camada de gel com cerca de 5mm 7 Deixe o gel arrefecer Aten o este reagente um forte agente mutag nico leia atentamente a MSDS do produto Electroforese Submirja o gel na tina de electroforese com tamp o TAE 1X Remova os pentes com cuidado do gel Adicione 10 pl do produto de PCR em cada po o ge
15. sico qu micas Componente Aspecto Cor Odor Placa seco no fundo do po o vermelho nenhum Mistura de reac o l quido vermelho rosa nenhum 4 Informa o Toxicol gica Qu mico Toxicidade Glicerol LD50 oral 4090 mg kg ratinho LD50 oral 12600 mg kg rato LD50 oral 1480 mg kg humano 5 Estabilidade e reactividade Condi es a evitar Calor e humidade Incompatibilidades Bases e agentes oxidantes fortes 6 Protec o pessoal Protec o das m os use luvas apropriadas resistentes a qu micos Protec o dos olhos recomenda se o uso de culos de protec o qu mica 17 20 Declara o de Conformidade Nome do Produto HFE Box 1 0 Numero do Produto GB 05 06 Utiliza o Tipagem gen tica do gene HLA H ou HFE Produ o geneBOX R amp D Diagnostic Tests biocant centro de inova o em biotecnologia n cleo 4 lote 3 3060 197 cantanhede portugal N s geneBOX investiga o e desenvolvimento de testes de diagn stico indubitavelmente declaramos que este produto ao qual se relaciona esta declara o de conformidade est em conformidade com os seguintes documentos normativos ISO 9001 2008 e ISO 13485 2004 Seguindo ainda as indica es da Directiva Europeia 98 79 CE sobre dispositivos m dicos de diagn stico in vitro conformidade de acordo com o Anexo IV transposto para as leis nacionais dos estados membros da Uni o Europeia Europeia A ficha e os documentos t cnicos deste produto s
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