ridascreen
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1. o da concentra o de calprotectina h que considerar o hist rico cl nico e os sintomas do paciente 13 Caracter sticas de desempenho 13 1 Precis o 13 1 1 Precis o intra teste A precis o intra teste foi determinada com 4 refer ncias em 40 r plicas cada Dos valores OD destas medi es foram apuradas as concentra es de calprotectina atrav s do calibrador e da curva padr o e dos resultados obtidos foram calculados os valores m dios MW os desvios padr o SD e os coeficientes de varia o VK das medi es para cada amostra Tab 3 Precis o intra teste do RIDASCREEN Calprotectin Calibrator Curva padr o ER 53 8 29 5 4 56 6 3 0 5 3 a 96 6 55 5 7 102 4 6 3 6 2 N 136 5 5 6 4 1 130 5 5 2 4 0 IB aj 5 7 267 6 15 0 5 6 13 1 2 Precis o inter teste RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 14 A precis o inter teste foi determinada em duplicado por 3 t cnicos com 4 refer ncias em 20 ciclos 2 ciclos por dia em dias diferentes Dos valores OD destas medic es foram apuradas as concentrac es de calprotectina atraves do calibrador e da curva padr o e dos resultados obtidos foram calculados os valores m dios MW os desvios padr o SD e os coeficientes de variac o VK das medic es para cada amostra Tab 4 Precis o inter teste do RIDASCREEN Calprotectin Calibrator Curva padr o mark SD mg kg VK MW mg kg SD mg kg VK2. GZ3006 ver 9 4 2 b Dilui o da amostra em sistema autom tico Se o teste for realizado com o sistema DSX ELISA da marca Dynex o respectivo protocolo de medi o necess rio pode ser obtido na R Biopharm AG e aplicado no aparelho Este sistema executa a dilui o da amostra automaticamente como se descreve abaixo 20 ul do sobrenadante clarificado s o pipetados pelo sistema autom tico ELISA em uma placa Deepwell e dilu dos com 980 ul de tamp o de extra o dilu do 1 50 Seguem se dois ciclos de mistura Depois coloca se no suporte da microplaca Plate RIDASCREEN Calprotectin a quantidade de tiras de microtitula o que s o necess rias Aliquotas de 100 ul de amostra dilu da s o transferidas da placa Deepwell para a microplaca Plate RIDASCREEN Calprotectin dilui o final 1 2500 Para realiza o do teste com outros sistemas autom ticos de pipetagem ELISA contate a R Biopharm AG para obter instru es 9 4 2 Prepara o e suspens o da amostra com tubo de fezes RIDASCREEN Stuhlr hrchen art n GZ3006 Uma op o r pida e limpa prepara o e suspens o mediante pesagem da amostra descrita no ponto 9 4 1 a aplica o do tubo de fezes RIDASCREEN Stuhlr hrchen art n GZ3006 Este tubo pode ser adquirido como acess rio do teste RIDASCREEN Calprotectin e simplica significativamente a prepara o da amostra O tubo de fezes RIDASCREEN Stuhlr hrchen cont
3. ee 55 7 4 3 7 7 57 5 4 1 7 1 PEI 106 5 7 2 6 8 112 8 8 3 7 3 a 129 6 7 8 6 0 138 5 7 6 5 5 260 9 28 3 10 9 284 7 22 7 8 0 13 2 Precisao da extrac o A precis o da extrac o foi determinada em duplicado por 2 t cnicos com 3 amostras fecais de valores acima do cut off em 10 ciclos 5 dias 2 ciclos por dia em dias diferentes As amostras foram extraidas antes de cada ciclo e diluidas de modo correspondente Dos valores OD destas medic es foram apuradas as concentrac es de calprotectina atrav s do calibrador e da curva padrao e dos resultados obtidos foram calculados os valores m dios MW os desvios padr o SD e os coeficientes de variac o VK das medic es para cada amostra Tab 5 Precis o inter teste da extrac o Calibrator Curva padr o MW mg kg SD mg kg VK MW mg kg SD mg kg VK alas agag 5 0 7 9 67 4 5 0 7 5 as 114 1 10 3 9 0 123 2 10 7 8 7 a Me 33 3 12 6 284 8 22 1 7 8 RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 15 14 Literatura Johne B et al Functional and clinical aspects of the myelomonocyte protein calprotectin J Clin Pathol Mol Pathol 1997 50 113 123 Fagerhol MK Calprotectin a faecal marker of organic gastrointestinal abnormality Lancet 2000 268 353 363 Tibble JA et al Surrogate markers of intestinal inflammation are predictive of relapse in patients with inflammatory bowel disease Gastroenterology 2000 119 15
4. 22 Tibble J et al A simple method for assessing intestinal inflammation in Crohn s disease Gut 2000 47 506 513 Summerton CB et al Faecal calprotectin a marker of inflammation throughout the intestinal tract Eur J Gastroenterol Hepatol 2002 841 841 845 Striz Trebichavski Calprotectin a pleiotropic molecular in acute and chronic inflammation Physiol Res 2004 53 245 253 Costa F et al Calprotectin is a stronger predictive marker of relapse in ulcerative colitis than in Crohns disease Gut 2005 54 364 368 Fagerberg UL et al Colorectal inflammation is well predicted by fecal calprotectin in children with gastrointestinal symptoms J Pediatr Gastroenterol Nutr 2005 40 450 455 Konikoff MR Denson LA Role of fecal calprotectin as a biomarker of intestinal inflammation in IBD Inflamm Bowel Dis 2006 12 6 524 534 Schopfer AM et al Fecal calprotectin correlates more closely with the simple endoscopic score for Crohn s disease SES CD than CRP blood leukocytes and the CDAI Am J Gastroenterol 2010 105 162 169 Van Rheenen PF et al Faecal calprotectin for screening of patients with suspected inflammatory bowel disease diagnostic meta analysis BMJ 2010 341 c3369 RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 16
5. O contato com a pele ou com as mucosas deve ser evitado O calibrador os padr es o controle positivo o controle Low Positiv e o tamp o de extra o e dilui o de amostras cont m 0 05 ou 0 1 NaN3 como conservante O contato com a pele ou com as mucosas deve ser evitado Per xido de hidrog nio substrato pode causar corros o Manuse lo com cuidado O reagente de parada cont m 1 N cido sulf rico Evitar o contato com a pele e com o vestu rio No caso de contato com a pele lav la com gua Todos os reagentes e materiais que entrarem em contato com amostras potencialmente infecciosas t m de ser tratados com desifetantes adequados ou ent o autoclavados a 121 C durante pelo menos uma hora CUIDADO para evitar a forma o de gases venenosos o dejeto l quido que incluir reagente de parada tem de ser neutralizado antes de ser colocado em uma solu o de hipoclorito 8 Coleta e armazenamento das amostras As amostras fecais devem ser transportadas refrigeradas sempre que poss vel e guardadas entre 2 8 C at o come o do teste Se elas n o forem processadas logo a seguir ao ingresso dentro de 3 dias recomendamos guard las a 20 C ou mais Ao congelar a amostra fecal os granul citos neutr filos nela existentes podem rebentar e liberar calprotectina Por isso em compara o com amostras frescas a concentra o em amostras congeladas pode ser ligeiramente maior O congelamento e descongelamento repetid
6. concentra o para o controle positivo e para o controle Low Positiv Na quantifica o mediante a curva padr o o controle positivo decisivo para a valida o do teste A gama de concentra o prescrita para o controle positivo tem de ser atingida 11 3 Resultado do teste A partir de um valor cut off gt 50 mg kg de calprotectina humana nas fezes o resultado dever ser considerado positivo Se os resultados estiverem abaixo do valor cut off as amostras devem ser consideradas negativas O valor cut off de 50 mg kg sugerido para adultos tamb m pode ser aplicado para crian as e jovens entre os 4 e 17 anos de idade Recomendamos a cada laborat rio que estabele a uma gama de valores padr o pr pria RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 13 Recomendamos diluir novamente 1 5 em Diluent 3 as amostras que na avalia o pelo procedimento de calibra o de 1 ponto ou pelo procedimento de curva padr o apresentem concentra es de calprotectina acima de 600 mg kg e submet las de novo medi o no teste Al m disso recomendamos diluir tamb m novamente 1 5 em Diluent 3 as amostras que na avalia o pelo procedimento de calibra o de 1 ponto apresentem valores OD acima de 3 0 e submet las de novo medi o no teste 12 Limites do m todo O teste RIDASCREEN Calprotectin detecta epitopos de calprotectina humana em amostras fecais N o devem ser conclu dos diagn sticos s em fun o da determina
7. devido propriedade de liga o de zinco Tamb m em processos inflamat rios a calprotectina demonstra propriedades reguladoras intra celulares e extra celulares No caso de uma doen a inflam toria do intestino os granul citos migram para o l men do intestino onde liberam calprotectina que por sua vez excretada com as fezes A concentra o de calprotectina nas fezes corresponde quantidade dos granul citos neutr filos que migram para o l men do intestino e que ali a liberam Consequentemente a concentra o da calprotectina nas fezes pode ser tomada para medi o da quantidade dos granul citos no l men do intestino e mostra a severidade de um processo inflamat rio do intestino A relev ncia cl nica especial da determina o da calprotectina fecal o fato de poder se diagnosticar fiavelmente doen as inflamat rias no intestino Em termos de sintomas os pacientes com doen a inflamat ria intestinal cr nica DII muitas vezes dificilmente podem ser distinguidos dos pacientes que sofrem da s ndrome do col n irrit vel SCI A determina o da calprotectina fecal fornece uma indica o segura da exist ncia de uma doen a inflamat ria no intestino Consequentemente a utiliza o deste biomarcador permite evitar colonoscopias n o necess rias em pacientes que sofrem da s ndrome do col n irrit vel RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 2 Numerosas publicac es demonstraram que a concentrac o de calprotectina fec
8. m j 2 5 ml de tamp o de extra o pronto para uso e acomoda uma amostra fecal de 10 mg No caso de amostras fecais l quidas pode se medir 10 ul com a pipeta e pipet los diretamente no tamp o de extra o RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 9 O modo de coleta e extrac o da amostra est descrito detalhadamente e ilustrado no manual de instru es de uso que acompanha o tubo de fezes RIDASCREEN Stuhlr hrchen e opcionalmente tamb m pode ser baixado em www r biopharm de Os extratos fecais n o devem ser armazenados e devem ser utilizados para o teste logo ap s sua dilui o a Dilui o manual da amostra 100 ul da suspens o fecal obtida com o tubo de fezes RIDASCREEN Stuhlr hrchen art n GZ3006 s o novamente dilu dos como se descreve no manual de instru es de uso do produto GZ3006 ponto 8 em 900 ul de tamp o de dilui o RIDASCREEN Diluent 3 100 ul desta diluic o final da amostra fecal sao utilizados diretamente no teste b Dilui o da amostra em sistema autom tico Se o teste for realizado com o sistema DSX ELISA da marca Dynex o respectivo protocolo de medi o necess rio pode ser obtido na R Biopharm AG e aplicado no aparelho Depois coloca se no suporte da microplaca RIDASCREEN Calprotectin a quantidade de tiras de microtitula o que s o necess rias A suspens o fecal extra da com o tubo de fezes dilu da automaticamente 1 10 na microplaca pelo sistema autom tic
9. RIDASCREEN Calprotectin Art N G09036 R Biopharm AG An der neuen Bergstra e 17 D 64297 Darmstadt C Tel 49 0 61 51 81 02 0 Telefax 49 0 61 51 81 02 20 1 Area de aplicac o Para diagn stico in vitro O teste RIDASCREEN Calprotectin amp um teste imunoenzimatico para determinac o quantitativa de calprotectina fecal humana 2 Resumo e explicac o do teste Calprotectina uma prote na ligadora de c lcio formada em granul citos neutr filos entre outros e liberada quando de inflama es A calprotectina fecal serve de biomarcador para processos inflamat rios e altera es neoplasm ticas no trato gastrointestinal Calprotectina tamb m conhecida como MRP 8 14 calgranulina A B ou S100A8 A9 uma prote na ligadora de c lcio e zinco da fam lia de prote nas S100 Sob condi es fisiol gicas a calprotectina liga c lcio esta liga o de c lcio exige alta estabilidade face a calor e prote lise A calprotectina formada tanto por granul citos neutr filos como por mon citos No citossol de neutr filos a calprotectina existe em concentra es de 5 15 mg l e representa cerca de 60 das prote nas citoss licas sol veis ou 5 do total de prote nas A fun o biol gica da calprotectina ainda n o est esclarecida completamente Sup e se que a calprotectina exerce uma fun o protetora da c lula contra proteases leucocit rias e bacterianas Al m disso sup e se um efeito antibacteriano
10. a com 9 partes de gua destilada 1 10 Para isso verte se 100 ml de concentrado em uma proveta de 1000 ml e adiciona se gua destilada at se atingir os 1000 ml Os cristais eventualmente existentes no concentrado devem ser dissolvidos previamente mediante aquecimento em banho maria a 37 C 9 3 Prepara o do tamp o de extra o 1 parte do tamp o de extra o Extract 100 ml misturada com 2 partes de gua destilada 200 ml 1 3 9 4 Prepara o das amostras As amostras fecais devem ser guardadas permanentemente entre 2 8 C at serem processadas Se for neces rio guard las mais tempo gt 3 dias elas devem ser guardadas a 20 C ou temperatura ainda mais baixa Amostras congeladas devem atingir lentamente a temperatura ambiente 9 4 1 Prepara o e suspens o das amostras mediante pesagem Pesar 100 mg de amostra fecal em um tubo de teste devidamente marcado e em seguida adicionar lhe com a pipeta 5 ml de tamp o de extra o dilu do dilui o 1 50 Opcionalmente pode pesar se 80 130 mg de amostra fecal e para garantir uma propor o de dilui o constante 1 50 aplicar o volume de tamp o de extra o adequado em fun o do peso da amostra fecal em quest o ver tab 1 RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 7 Tab 1 Volume do tamp o de extra o dilu do que necess rio em fun o do peso da amostra fecal 80 400 4 00 No caso de resuspensao em um vol
11. al correlaciona perfeitamente os par metros histol gicos e endosc picos de atividade da doenca em pacientes com doen a inflamat ria intestinal cr nica DII Por isso a determina o da calprotectina fecal tamb m serve para documentar objetivamente o sucesso terap utico de pacientes com inflama es cr nicas e para detectar e tratar precocemente recidiva em pacientes sob vigil ncia nos intervalos sem sintomas A determina o de calprotectina fecal deve ser ponderada para e diferencia o fi vel entre doen a inflamat ria intestinal cr nica e s ndrome do col n irrit vel e detec o precoce da recorr ncia de inflama es no intestino e documenta o objetiva da severidade de uma inflama o para controle da evolu o e terapia e marcador para inflama es agudas do intestino 3 Princ pio do teste No teste RIDASCREEN Calprotectin s o aplicados anticorpos espec ficos em um m todo sandu che A superf cie do po o da microplaca est revestida com anticorpos monoclonais contra calprotectina humana Uma suspens o da amostra fecal a analisar pipetada no po o da microplaca e incubada Depois disso segue se uma lavagem e uma segunda incuba o com um anticorpo monoclonal que est conjugado com peroxidase de raiz forte Existindo calprotectina na amostra forma se um complexo tipo sandu che constitu do pelo anticorpo imobilizado pela calprotectina e pelo anticorpo conjugado Os anticorpos marcados com enzimas n
12. ar uma cor azulada j n o deve ser utilizado 6 Reagentes adicionais necess rios e equipamento acess rio 6 1 Reagentes gua destilada ou desionizada 6 2 Equipamento acess rio Balan a de precis o ou tubo para fezes RIDASCREEN Stuhlr hrchen art n GZ3006 Mixer Vortex opcional ver 9 4 Micropipeta para volumes de 20 100 ple 1 ml Proveta 1000 ml Cron metro Lavadora para microplacas ou pipetas multicanais 300 ul Fot metro para microplacas 450 nm filtro de refer ncia 620 nm Papel filtro panos de laborat rio Recipiente para lixo com uma solu o de 0 5 de hipoclorito 7 Medidas de precau o Somente para diagn stico in vitro Este teste deve ser realizado somente por pessoal de laborat rio devidamente instru do As regras de trabalho nos laborat rios devem ser respeitadas As instru es de uso devem ser seguidas estritamente durante a realiza o do teste As amostras fecais devem ser tratadas como potencialmente infecciosas nos termos dos regulamentos de seguran a nacionais N o pipetar as amostras nem os reagentes com a boca e evitar o contato com les es na pele ou nas mucosas Usar luvas descart veis durante o manuseamento das amostras e lavar as RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 5 m os no fim do teste N o fumar comer nem beber nas reas onde se trabalha com as amostras ou com os reagentes do teste O tamp o de lavagem cont m 0 1 de Thimerosal como conservante
13. guida lava se a placa 5 vezes com 300 ul de tamp o de lavagem de cada vez Assegurar que ela esvaziada completamente batendo lhe depois de cada uma das lavagens sobre uma parte do papel ainda seca e por usar 9 9 Terceira incuba o Adicionar 100 ul de substrato SeroSC em todos os po os Em seguida incubar a placa 15 minutos ao escuro a temperatura ambiente 20 25 C Depois disto adicionar 50 ul de reagente de parada Stop em todos os po os para terminar a rea o Depois de mistur lo cuisadosamente batendo se suavemente na beira da placa medir a extin o a 450 nm e um comprimento de onda de refer ncia de 620 nm Nota Amostras de pacientes fortemente positivas podem causar precipitados de substrato pretos As amostras devem ser dilu das na propor o 1 10 e novamente analisadas ver ponto 9 5 dilui o final da amostra de fezes 1 25000 RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 11 10 Controle de qualidade Sinais de caducidade do reagente Para fins de controle da qualidade devem ser utilizados em cada realiza o do teste o calibrador Calibrator recomendado em duplicado no caso de aplica o da calibra o de um ponto ou os padr es 1 a 5 Standard 1 Standard 5 recomendado em duplicado no caso de aplica o da curva padr o o tamp o de dilui o de amostras RIDASCREENO Diluent 3 como controle negativo e o controle positivo Control para garantir a estabilidade d
14. itivo cont m 0 1 NaNs pronto para uso tampa vermelha Low control 1 ml Controle Low Positiv cont m 0 1 NaNs pronto para uso tampa verde Conjugate 12 ml Anticorpo monoclonal rato conjugado com peroxidase em soluc o proteica estabilizada pronto para uso SeroSC 12 ml Substrato per xido de hidrog nio tetrametilbenzidina TMB pronto para uso Stop 12 ml Reagente de parada 1 N cido sulf rico pronto para uso RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 4 5 Reagentes e seu armazenamento Os reagentes devem ser armazenados entre 2 8 C e podem ser utilizados at a expira o da data de validade impressa na respectiva etiqueta O tampao de lavagem diluido pode ser utilizado 4 semanas quando armazenado entre 2 8 C O tampao de extrac o diluido pode ser utilizado 6 meses quando armazenado entre 2 8 C e no m ximo at o fim do prazo de validade do concentrado Evitar a contamina o com micr bios Ap s expira o da data de validade a qualidade n o garantida Abrir a embalagem de alum nimo das tiras de microtitula o com uma tesoura de modo a n o cortar o fecho As tiras de microtitula o que n o s o necess rias devem voltar a ser guardadas imediatamente na embalagem de alum nio entre 2 8 C Evitar a incid ncia de luz direta sobre o substrato incolor para prevenir a degrada o ou o azulamento devido a auto oxida o Quando o substrato apresent
15. o ELISA dilui o final 1 2500 Para isso 10 ul da suspens o fecal s o pipetados do tubo de fezes RIDASCREEN Stuhlr hrchen art n GZ3006 diretamente para a microplaca de calprotectina e dilu dos com 90 ul de tamp o de dilui o Diluent 3 Para realiza o do teste com outros sistemas autom ticos de pipetagem ELISA contate a R Biopharm AG para obter instru es 9 5 Primeira incuba o Depois de se encaixar uma quantidade de tiras po os sufucientes no suporte adiciona se aos respectivos po os 100 ul de calibrador Calibrator recomendado em duplicado no caso de aplica o da calibra o de um ponto ou 100 ul de cada um dos padr es 1 a 5 Standard 1 Standard 5 recomendado em duplicado no caso de aplica o da curva padr o 100 ul cada de tamp o de dilui o de amostras RIDASCREEN Diluent 3 controle negativo e de controle positivo Control bem como da amostra fecal dilu da a analisar Utilizando se o controle Low Positiv adiciona se tamb m 100 ul de Low control Em seguida incubar a placa uma hora a temperatura ambiente 20 25 C 9 6 Primeira lavagem A lavagem cuidadosa importante para conseguir resultados corretos pelo que deve ser realizada seguindo se as instru es rigorosamente A solu o da incuba o que se encontra RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 10 nos pocos deve ser es
16. o ligados s o removidos em uma lavagem seguinte Depois da adi o de substrato a enzima ligada em amostras positivas transforma a solu o incolor nos po os da microplaca em uma solu o azul Mediante adi o do reagente de parada esta cor muda de azul para amarelo A extin o medida proporcional concentra o de calprotectina existente na amostra RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 3 4 Conte do da embalagem Os reagentes de uma embagalem s o suficientes para 96 testes Plate 96 testes Microplaca 12 tiras divis veis no suporte revestida com anticorpos monoclonais rato contra calprotectina humana Extract 2x 100 ml Tamp o de extra o 3x conc tamp o Tris cont m 0 05 NaNs Diluent 3 100 ml Tamp o de dilui o de amostras solu o de NaCl tamponada com prote na cont m 0 1 NaNs pronto para uso colora o vermelha Wash 100 ml Tamp o de lavagem 10x conc solu o NaCl tamponada com fosfato cont m 0 1 Thimerosal 0 1 detergente Calibrator 1 ml Calibrador para o procedimento de calibra o de 1 ponto tampa cont m 0 1 NaNs pronto para uso transparente Standard 1 a Sa 5 padr es para o procedimento de curva padr o Standard 5 concentra es de calprotectina dos padr es 1 a 5 19 5 56 95 tampa branca 275 800 mg kg cont m 0 1 NaNs pronto para uso Control 1 ml Controle pos
17. os reagentes e a realiza o correta do teste A aplica o do controle Low Positiv opcional O teste foi realizado corretamente quando o valor de extin o OD do controle negativo a 450 nm 620 nm for menor do que 0 05 e o mediano do valor de extin o OD do calibrador no caso de avalia o de 1 ponto estiver dentro da gama mencionada na folha de dados espec fica do lote O controle positivo decisivo para a valida o do teste tanto quando da utiliza o do calibrador como dos cinco padr es e tem de estar dentro da gama de concentra o espec fica do lote mencionada na folha de dados Ao realizar o teste RIDASCREEN Calprotectin em sistemas autom ticos ELISA abertos o valor de extin o OD do calibrador Calibrator pode divergir da gama mencionada no certificado espec fico do lote em fun o do aparelho utilizado quando da avalia o da calibra o de 1 ponto Tamb m nos sistemas autom ticos ELISA o controle positivo Control decisivo para a valida o dos resultados do teste e deve ser sempre aplicado A aplica o do controle Low Positiv Low control n o mandat ria Se os valores divergirem dos requeridos ou se os reagentes estiverem turvos ou o substrato incolor estiver azulado antes de serem adicionados nos po os pode ser sinal de que os reagentes j caducaram Se os valores estipulados n o fo
18. os da amostra devem ser evitados Amostras fecais n o devem ser guardadas em recipientes de transporte que contenham fluidos de transporte com conservantes soros animais ions de metal nem agentes ou detergentes oxidantes uma vez que estas subst ncias podem interferir no teste RIDASCREEN Calprotectin 9 Realiza o do teste 9 1 Generalidades Antes de serem utilizados todos os reagentes e a microplaca Plate t m de estar necessariamente a temperatura ambiente 20 25 C As tiras de microtitula o n o devem ser retiradas da embalagem de alum nio antes de atingirem a temperatura ambiente Os reagentes devem ser bem misturados pouco antes de serem utilizados As tiras de microtitula o que n o s o necess rias devem ser guardadas novamente na embalagem fechada com os reagentes entre 2 8 C As tiras de microtitula o usadas uma vez n o devem voltar a ser utilizadas Os reagentes e as tiras de microtitula o n o devem ser RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 6 utilizados quando a embalagem estiver danificada ou os frascos apresentarem derrames Evitar o contato direto das amostras com os componentes do kit para excluir a contaminac o cruzada Evitar a incid ncia de luz solar direta durante a realizac o do teste Recomendamos cobrir a microplaca ou veda la com fita adesiva para evitar perdas por evapora o 9 2 Prepara o do tamp o de lavagem 1 parte do tamp o de lavagem Wash misturad
19. ow Positiv que s o necess rios para o c lculo 4PL est o indicados na folha de dados espec fica do lote que acompanha o kit e t m de ser comparados com os respectivos valores no software de avalia o antes de cada medi o No controle final de qualidade a R Biopharm AG apura para cada lote de kits em condi es de teste ideais a curva padr o inclusive os par metros A D bem como um valor te rico e uma gama OD permitida para o calibrador e uma gama de concentra o permitida para o controle positivo e controle Low Positiv O calibrador aplicado para compensar flutua es do teste e para verificar a qualidade do processo O controle positivo decisivo para a valida o do teste Do valor m dio da determina o dupla do calibrador e seu valor te rico o software RIDA SOFT Win net calcula internamente um fator de corre o F e compensa o com as extin es das amostras fecais A avalia o segura e fi vel dos resultados do teste poss vel dentro dos limites da curva padr o 11 2 Quantifica o mediante a curva padr o A avalia o do teste RIDASCREEN Calprotectin pode ser efetuada mediante uma curva padr o que tem de ser processada em cada ciclo A progress o exemplificativa de uma curva padr o est representada na folha de dados espec fica do lote inclu da no teste No controle final de qualidade a R Biopharm AG apura para cada lote de kits em condi es de teste ideais um valor te rico e uma gama de
20. rem atingidos h que verificar os pontos seguintes antes da repeti o do teste Data de validade dos reagentes utilizados Funcionalidade do equipamento utilizado calibra o por exemplo Realiza o correta do teste Controle visual dos componentes do kit quanto a contamina o ou m veda o uma solu o de substrato com colora o azulada j n o deve ser utilizada Se as condi es ap s repeti o do teste ainda n o forem satisfat rias contate o fabricante ou o seu distribuidor R Biopharm local 11 Avalia o e interpreta o A concentra o de calprotectina em mg kg nas fezes determinada com o teste RIDASCREEN Calprotectin ELISA mediante a calibra o de 1 ponto ver 11 1 mediante o modelo logistic log de 4 par metros 4PL ou mediante a curva padr o ver 11 2 RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 12 Para apuramento dos resultados necess rio o software de avalia o RIDA SOFT Win net Este software RIDA SOFT Win net ou sua atualiza o pode ser obtido na R Biopharm AG ou atrav s do distribuidor R Biopharm local Em vez do software RIDA SOFT Win net tamb m poss vel utilizar outro software de avalia o que disponibilize o modelo logistic log de 4 par metros 11 1 Calibra o de um ponto com quantifica o pelo modelo logistic log de 4 par metros Os par metros A D da curva padr o bem como os valores te ricos para o calibrador controle positivo e controle L
21. ume de tamp o de extrac o constante de 5 ml ha que considerar o respectivo fator de dilui o quando da avalia o ver tab 2 Tab 2 Fator de dilui o quando de adi o constante de tamp o de extra o dilu do 5 ml em fun o do respectivo peso da amostra Peso de amostra Fator de dilui o ml Independentemente do m todo de pesagem a homogeneiza o da suspens o das fezes efetuada mediante mistura minuciosa em um misturador Vortex Quando de fezes l quidas s o aspirados exatamente 100 ul das mesmas com uma pipeta e pipetados em exatamente 5 ml de tamp o de extra o dilu do Depois da adi o do tamp o de extra o as amostras devem ser incubadas 5 min em RT e em seguida misturadas de novo no vortex minuciosamente De seguida este homogeneizado tem de ser centrifugado durante 10 minutos a pelo menos 3000 g para sedimenta o das RIDASCREEN Calprotectin 13 07 18 8 particulas fecais maiores O sobrenadante do extrato tem de ser diluido novamente para aplicac o imediata no teste a Dilui o manual da amostra Diluir novamente 20 ul do sobrenadante clarificado em 980 ul de tamp o de dilui o de amostras RIDASCREEN Diluent 3 1 50 Depois utilizar 100 ul da amostra fecal finalmente dilu da para o teste Em vez do m todo de prepara o e de homogeneiza o do material da amostra anteriormente descrito pode se utilizar o tubo para fezes RIDASCREEN Stuhlr hrchen art n
22. vaziada primeiro para um recipiente de lixo contendo soluc o de hipoclorito para desinfecc o Depois disso bate se na placa sobre papel absorvente para remover o resto da umidade Em seguida lava se a placa 5 vezes com 300 ul de tamp o de lavagem de cada vez ver ponto 9 2 Assegurar que ela amp esvaziada completamente batendo Ihe depois de cada uma das lavagens sobre uma parte do papel ainda seca e por usar Utilizando se uma lavadora de microplacas deve se verificar se ela esta corretamente programada para o tipo de microplaca em quest o Al m disso as suspens es de fezes que n o estiverem completamente livres de part culas devem ser removidas dos po os manualmente antes da primeira lavagem para evitar o entupimento das agulhas de lavagem Durante os passos de lavagem importante assegurar que o l quido aspirado completamente Depois da lavagem final deve bater se na placa cuidadosamente sobre papel ou toalhas de laborat rio para remover restos de umidade 9 7 Segunda incuba o Adicionar 100 ul de conjugado Conjugate em todos os po os Em seguida incubar a placa uma hora a temperatura ambiente 20 25 C 9 8 Segunda lavagem Depois do per odo de incuba o ter decorrido o conjugado que se encontra nos po os deve ser esvaziado para um recipiente de lixo com solu o de hipoclorito para desinfec o Depois disso bate se na placa sobre papel absorvente para remover o resto da umidade Em se
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