RTSD01-II - Biometrix
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1. Fator II Q PCR Oligonucleot deos Alert Amp o a e primers de 4x 110gL TRIS base e cloridrato RTSD01 II M usus Glicerol Triton X 100 Mastura CE sondas Oligonucleotideos Fator Il Q PCR Alert fluorescentes finorescentes TRIS Bass AmpliPROBE marcadas com FAM MGB 4 x 110 uL cloridrato Glicerol Triton RTSDO1 II P NFQ X 100 e com VIC MGB NFQ TRIS base e cloridrato Glicerol MgCl Warga despatient s Desoriboxinucleot deos DE 4 x 340 uL trifosfatos ROX Uracil Q PCR Alert ophmizados N glicosilase AMpIIMASTER Taq DNA polimerase hot RTS000 start Microplaca com er 96 ei de 0 2 mL 3 Pase L mina adesiva vedante 3 Pl stico e cola MATERIAIS NECESS RIOS E N O FORNECIDOS Equipamentos Capela de fluxo laminar Agitador tipo Vortex Microcentr fuga de mesa 12 000 14 000 RPM Micropipetas simples volume vari vel Real Time ABI PRISM 7000 completo com microcomputador Rev 04 Out 2013 Material de Consumo EPI Ponteiras com filtro gua ultrapura Tubos de microcentrifuga o 1 5mL a 2 0mL Amostras DNA extra do por metodologia definida pelo usu rio seguindo as normas e padr es de amostras exigidos nas descri es abaixo CONDI ES DE ARMAZENAMENTO Componente s sia Quantidade Estocagem Fator Il Q PCR Alert AmpliMIX RTSDO1 II M 4x 110 uL 20 C Fator Il Q PCR Alert AmpliPROBE RTSDO1 II P 4x 110 uL 20 C Q PC2. veis dados pertinentes a eventuais fen menos de inibi o por parte dos medicamentos Os resultados obtidos com este produto dependem da correta coleta transporte conserva o e prepara o das amostras para evitar resultados incorretos necess rio portanto ter particular aten o durante estas fases e seguir atentamente as instru es fornecidas com os produtos para a extra o dos cidos nucleicos O m todo de amplifica o real time dos cidos nucleicos utilizados neste produto por causa da sua elevada sensibilidade anal tica est sujeito contamina o por parte das amostras cl nicas dos controles positivos e dos mesmos produtos da rea o de amplifica o As contamina es levam a resultados incorretos A modalidade de realiza o do produto pode limitar as contamina es mas estes fen menos podem serser evitados somente seguindo o manual de as boas pr ticas do laborat rio e executando a t cnica de acordo com as instru es fornecidas neste manual Este produto requer pessoal instru do para a manipula o de amostras biol gicas que podem transmitir agentes infecciosos e de prepara es qu micas classificadas como perigosos para evitar incidentes com consequ ncias potencialmente graves para o utilizador ou outras pessoas Este produto requer roupas de trabalho e reas de trabalho adequadas manipula o de amostras biol gicas que podem transmitir agentes infecciosos e de prepara es qu micas c
3. 5 pL de gua bidestilada est ril n o fornecida no kit no pocinho da Microplaca de amplifica o do controle negativo de amplifica o como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho 8 Transferir depositando os cuidadosamente na mistura de rea o 5 pL de Controle positivo no po o da Microplaca de amplifica o do controle positivo de amplifica o como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho 9 Fechar cuidadosamente a Microplaca de amplifica o com a L mina adesiva de amplifica o 10 Transferir a Microplaca de amplifica o para o temociclador para real time na rea de amplifica o detec o dos produtos de amplifica o e iniciar o ciclo t rmico de amplifica o CALIBRA O DO PROCESSO Para este tipo de ensaio e metodologia n o existe procedimento de calibra o para o processo de medi o Rev 04 Out 2013 C LCULOS E OBTEN O DOS RESULTADOS Interpreta o dos resultados Os valores de fluoresc ncia FAM emitidos pela sonda espec fica para o alelo normal FII 20210G s o identificados pelo detector nor FII 20210G FAM Os valores da fluoresc ncia VIC emitidos pela sonda espec fica para o alelo mutante FII 20210A s o identificados por detector mu FII 20210A VIC Estes valores de fluoresc ncia das rea es de amplifica o devem ser analisados pelo software dos equipamentos Applied Biosystems ABI PRISMTM da s rie 7000 Antes de iniciar a an lise nece
4. biometrixQbiometrix com br Website www biometrix com br CNPJ 06 145 976 0001 39 INFORMA ES DO FABRICANTE Nanogen Advanced Diagnostics S P A C so Torino 89 d 10090 Buttigliera Alta TO It lia REGISTRO ANVISA RTDSO1 II M 80298490121 RTDSO1 II P 80298490033 RESPONS VEL T CNICA Edna Cristina Kurokawa Guimar es Ferreira CRQ PR 09302336 Aprova o 20 12 2013 Mauricio Cichon Laborat rio Assinado por Maur cio Cichon m POMETRIX 14 DIAGNOSTICA Rev 04 Out 2013 CTRDO1 II Fator Il Controle Positivo Instru es de Uso USO PRETENDIDO O produto Fator Il Controle Positivo gt destinado ao uso como um controle positivo em rea es de amplifica o seguidas de hibridiza o com probes fluorescentes para a determina o al lica para o polimorfismo em nucleot deos nicos SNP G20210A 3 UTR no locus do Fator Il de coagula o com os produtos Q PCR Alert AmpliMASTER lt Fator II Q PCR Alert AmpliMIX gt e lt Fator Il Q PCR Alert AmpliPROBE gt da Nanogen Advanced Diagnostics S P A DESCRI O DO PRODUTO O produto Controle Positivo fornece uma solu o estabilizada de plasm deos contendo a sequ ncia requerida divididas em dois tubos de al quotas prontas para uso Cada tubo teste cont m 65 de solu o suficiente para 12 sess es O procedimento envolve o uso do Controle Positivo na rea o de amplifica o espec fica para a regi o g nica F
5. e Os tubos que cont m o AmpliMIX e o AmpliPROBE s o descart veis e portanto devem ser utilizados uma nica vez na prepara o da mistura de rea o e Os tubos que contenham o Controle Positivo devem ser congelados e descongelados por um m ximo de doze vezes Ciclos sucessivos de congelamento descongelamento poderiam causar uma perda de titula o e Os tubos que cont m o AmpliMASTER n o podem ser congelados e descongelados mais de 1 vez Ciclos sucessivos de congelamento descongelamento podem causar uma perda na efici ncia da amplifica o oeoeoeroeWerereeeeeeE rseEs e Rev 04 Out 2013 CUIDADOS COM A AMOSTRA BIOL GICA A amostra deve ser tratada como potencialmente infecciosa PROCESSO DE MEDI O Amostras Este produto deve ser utilizado com DNA extra do das seguintes amostras biol gicas sangue total coletado em EDTA As amostras de sangue total destinadas extra o do DNA devem ser colhidas em EDTA segundo as indica es do laborat rio transportadas a 2 C 8 C e conservadas a 2 C 8 C por no m ximo tr s dias Caso contr rio devem ser congeladas e conservadas a 20 C por um m ximo de trinta dias Recomenda se subdividir em mais al quotas as amostras para conservar congeladas de modo a n o submet las a ciclos de congelamento descongelamento repetidos As instru es para o eventual pr tratamento da amostra cl nica e para a extra o do DNA est o contidas no manual de ins
6. e aqueles recomendados pelo fabricante N o misturar reagentes de diferentes lotes N o utilizar reagentes de outros fabricantes Advert ncias e precau es de biologia molecular Os procedimentos de biologia molecular como a extra o a transcri o reversa a amplifica o e a detec o de cidos nucleicos requerem pessoal especializado para prevenir o risco de resultados incorretos em particular devido degrada o dos cidos nucleicos das amostras ou devido contamina o das amostras por produtos de amplifica o necess rio dispor de uma rea separada para a extra o prepara o das rea es de amplifica o e para a amplifica o detec o dos produtos de amplifica o reas de pr e p s PCR Nunca introduzir um produto de amplifica o na rea de extra o prepara o das rea es de amplifica o necess rio uso de EPI adequado a cada uma das reas de trabalho em laborat rio de biologia molecular Nunca transfira materiais da rea de amplifica o detec o para a rea de extra o prepara o de rea es 16 Rev 04 Out 2013 em E As amostras devem ser empregadas exclusivamente a este tipo de an lise As amostras devem ser manipuladas em uma c mara de fluxo laminar Os tubos que cont m amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso As pipetas devem ser do t
7. 10A VIC na rea o de amplifica o de cada amostra s o utilizados para validar a amplifica o e a detec o e para a determina o al lica do gen tipo de cada amostra como descrito na tabela seguinte Amplifica o da amostra Adequa o Resultado Gen tipo da da amostra do teste amostra cT FAM gt 27 5 e cT VIC gt 27 5 Inadequado Inv lido cT FAM Indet e cT VIC lt pi adequado v lido ROmOSICaTO TE cTFAM cTVIC gt 2 5 MUTAN com cT FAM gt cT VIC cT FAM lt 27 5 cT FAM lt 27 5 e cT VIC ou Indet cT VIC lt 27 5 ou adequado v lido g a cT FAM cT VIC gt 2 5 com cT FAM lt cT VIC 2 0 lt cT FAM cT VIC lt 2 5 Inadequado v lido INDETERMINADO O lt cT FAM cT VIC lt 2 0 adequado v lido HETEROZIGOTO Onde cT FAM cT VIC o valor absoluto da diferen a entre o Ciclo Threshold do alelo normal e o Ciclo Threshold do alelo mutante Se o resultado da rea o de amplifica o de uma amostra cT FAM gt 27 5 e cT VIC gt 27 5 isso significa que problemas ocorreram durante a fase de amplifica o amplifica o ineficiente ou inv lida ou na fase de extra o aus ncia de DNA ou presen a de inibidores ou amostras iniciais com um n mero de c lulas insuficiente que podem causar resultados incorretos A amostra n o adequada o teste n o v lido e deve ser repetido a partir da extra o de uma nova amostra Se o resultado da rea o de amplifica o de uma amost
8. 12 11 10 ATTACHMENT
9. R Alert AmpliMASTER 4 x 340 uL 2 8 C Microplaca para amplifica o RTS000 3 Temp ambiente L mina adesiva para amplifica o 3 Temp ambiente PRECAU ES Este kit reservado para uso exclusivo em diagn stico in vitro Manuseio ao manusear o kit e as amostras utilizar EPI adequado ao tipo de laborat rio onde os testes ser o realizados devido natureza da amostra material biol gico humano N o beber ou comer na rea de trabalho A rea de trabalho deve ser ambiente limpo e com ventila o adequada Trabalhar dentro de capela de exaust o fluxo laminar N o manusear o kit sem luvas Advert ncias e precau es gerais Manipular e eliminar todas as amostras biol gicas reagentes e materiais usados como se fossem agentes infecciosos Evitar o contato direto com as amostras biol gicas Evitar a forma o de aerossol durante o procedimento evitar respingar material ao redor da rea de trabalho ou fora dela O material que est em contato com as amostras biol gicas deve ser tratado com Hipoclorito de s dio a 3 pelo menos por 30 minutos ou ainda tratado em autoclavado a 121 Cdurante uma hora antes de ser eliminado O material descart vel se combust vel deve ser incinerado Os res duos l quidos que cont m cidos ou bases devem ser neutralizados antes da elimina o N o pipetar nenhuma solu o com a boca Lavar bem as m os depois de haver manipulado as amostras e os reagentes Eliminar reagen
10. Rev 04 Out 2013 OMETRIX DIAGN STICA RTSDO1 Il Fator ll G20210A Q PCR Alert Kit Instru es de Uso USO PRETENDIDO O produto FATOR II Q PCR Alert um kit para teste de amplifica o quantitativa de cidos nucleicos para a determina o al lica do locus de coagula o Factor II FII para o polimorfismo de nucleot deos nicos SNP G20210A 3 UTR em amostras de DNA extra do do sangue total coletado em EDTA O produto usado juntamente com os dados cl nicos e outros exames de laborat rio na avalia o do risco de trombose venosa profunda PRINC PIO DE A O E REA O O teste envolve uma rea o de amplifica o em Tempo Real Real Time realizado em microplaca em um equipamento com termostato program vel fornecido com sistema tico de detec o fluorescente RT PCR termociclador em tempo real Em cada po o se efetua uma rea o de amplifica o espec fica para a regi o do gene humano do Factor Il afetada pelo SNP G20210A utilizando o DNA extra do das amostras em teste Uma sonda espec fica para o alelo normal FII 20210G marcada com o fluor foro FAM ativada quando hibridiza com o produto normal da rea o de amplifica o Outra sonda espec fica para o alelo mutante FII 202104 marcada com o fluor foro VIC ativada quando hibridizada com o produto mutante da rea o de amplifica o A emiss o da fluoresc ncia aumenta conforme os produtos espec ficos da rea
11. a atrav s da determina o do Ciclo Threshold Problemas podem ter ocorrido durante a fase de amplifica o contamina o as quais podem causar resultados incorrectos A sess o inv lida e deve ser repetida a partir da fase de amplifica o Os valores cT das sondas espec ficas para o alelo normal FII 20210G FAM e para o alelo mutante FII 20210A VIC na rea o de amplifica o do Controle Positivo s o utilizados para validar a amplifica o e a detec o como descrito na tabela seguinte Amplifica o Controle Positivo Amplifica o Detec o 20 lt cT FAM lt 25 CORRETO 20 lt cT VIC lt 25 CORRETO O lt cTFAM cTVIC lt 1 5 CORRETO Onde cT FAM cT VIC o valor absoluto da diferen a entre o Ciclo Threshold do alelo normal e o Ciclo Threshold do alelo mutante Rev 04 Out 2013 Se o resultado da rea o de amplifica o do Controle Positivo n o est dentro dos limites isso significa que problemas ocorreram durante a fase de amplifica o e detec o prepara o incorreta mistura de rea o dispensa o incorreta do controle positivo e das amostras degrada o da sonda posicionamento incorreto do controle positivo programa o incorreta do termociclador que podem causar resultados incorretos A sess o n o v lida e deve ser repetida a partir da fase de amplifica o Os valores cT das sondas espec ficas para o alelo normal FII 20210G FAM e do alelo mutante FII 202
12. a deu um resultado incorreto nenhum heterozigoto foi tomado por um homozigoto nenhuma amostra deu um resultado Indeterminado diferen a entre os cT compreendida entre 2 0 e 2 5 Amostras N Corretas Incorretas Inv lidas Indeterminadas 112 112 0 0 0 Heterozigotas Reprodutibilidade A reprodutibilidade deste teste em termos de sua capacidade em obter os mesmos resultados das mesmas amostras em diferentes sess es superior a 95 A capacidade de obter os mesmos resultados de mesma amostra em diferentes sess es foi testado utilizando algumas amostras de sangue total com genotupagem conhecida de homozigoto normal e heterozigoto As amostras foram empregadas para realizar o procedimento completo de an lises extra o amplifica o e detec o com nossos produtos Das 3 sess es de determina o al lica realizadas em dias diferentes com as mesmas 23 amostras 23 resultados foram concordantes em E Amostras N Sess es Concordantes Discordantes Homozigotas normais 14 3 14 0 Heterozigotas 9 3 9 0 OMETRIX DIAGN STI REFER NCIAS BIBLIOGR FICAS POORT S R et al 1996 Blood 88 3698 3703 13 E o ca wwwcwssai TSS l iii e Rev 04 Out 2013 IDENTIFICA O DO DISTRIBUIDOR Biometrix Diagn stica Ltda Estrada da Graciosa 1081 Curitiba PR CEP 82840 360 Tel 41 2108 5250 Fax 41 2108 5252 DDG 0800 7260504 E mail
13. ator Il incluindo o SNP de interesse A detec o do produto espec fico da rea o de amplifica o confirma a habilidade do sistema de determina o al lica em identificar a presen a apenas do tipo selvagem ou gene alelo mutado bem com para identificar uma amostra heterozigota O kit possibilita a execu o de 25 rea es de amplifica o usando 5 uL por rea o MATERIAIS FORNECIDOS Componente Descri o Quantidade Composi o Fator II Plasm deo TRIS base TRIS Controle Solu o de plasm deo 2 x 65yL cloridrato EDTA RNA total Positivo de levedura e Armazenar a 20 C ou inferior MATERIAIS NECESS RIOS E N O FORNECIDOS Fluxo laminar Luvas descart veis sem talco Agitador V rtex Microcentri fuga de bancada 12 000 14 000 RPM Micropipetas est reis e ponteiras com filtro ou deslocamento positivo 0 5 10 uL 2 20 uL 5 50 uL 50 200 pL gua bidestilada est ril Real Time ABI PRISM 7000 completo com computador 15 Rev 04 Out 2013 ACESS RIOS Os reagentes para amplifica o e detec o do DNA n o est o inclusas neste produto Para realizar estes passos anal ticos os produtos a seguir s o recomendados e lt Q PCR Alert AmpliMASTER RTS000 combina o de reagentes otimizados microplacas e adesivos para PCR em tempo real e determina o al lica total de 96 rea es e Fator II Q PCR Alert AmpliMIX gt RTSDO1 II M primers
14. do a regi o de interesse que imitam uma genotipagem homozig tica mutante As amostras foram empregadas para realizar o procedimento completo de an lises extra o amplifica o e detec o com nossos produtos Em 224 determina es 224 deram um resultado v lido ao menos um dos cT menor ou igual a 27 5 224 amostras deram um resultado correto nenhuma amostra deu um resultado incorreto nenhum homozigoto foi tomado por um heterozigoto nenhuma amostra deu um resultado indeterminado diferen a entre os cT compreendida entre 2 0 e 2 5 Amostras N Corretas Incorretas Inv lidas Indeterminadas Homozigotas normais 112 112 0 0 0 Homozigotas mutantes 36 36 0 0 0 naturais Homozigotas mutantes 76 76 0 0 0 artificiais Resist ncia diferen a de cT de heterozigotos A resist ncia deste teste permite determinar os heterozigotos com uma frequ ncia superior a 99 com um valor da diferen a dos cT dos dois alelos compreendido entre 0 e 2 0 O valor da diferen a dos cT dos dois alelos para os heterozigotos foi estabelecido utilizando algumas amostras de sangue total com genotipagem conhecida de heterozigoto As amostras foram empregadas para realizar o procedimento completo de an lises extra o amplifica o e detec o com nossos produtos Em 112 determina es 112 deram um resultado v lido ao menos um dos cT menor ou igual a 27 5 112 amostras deram um resultado correto nenhuma amostr
15. e an lise para cada extra o e amplifica o processando uma amostra normal uma amostra homozigota mutante e uma amostra heterozigota j testadas anteriormente Controles de Amplifica o necess rio validar cada sess o de amplifica o preparando uma rea o de controle negativo e uma rea o de controle positivo Para o controle negativo utilizar gua bidestilada est ril n o inclu da no kit adicionada em um po o de rea o no lugar do DNA extra do da amostra Para o controle positivo utilizar o DNA obtido de uma amostra positiva heterozigota j testada ou o CONTROLE POSITIVO Factor ll VALORES DE REFER NCIA OBTIDOS EM POPULA ES SADIAS OU VALORES DEMOGR FICOS EPIDEMIOL GICOS ESTAT STICOS DESEJ VEIS TERAP UTICOS OU T XICOS N o existe este tipo de dado para a metodologia em quest o CARACTER STICAS DE DESEMPENHO Sensibilidade Anal tica Limite de Detec o Em termos de detec o limite a sensibilidade anal tica deste teste permite identificar a presen a de aproximadamente 14 000 mol culas de DNA alvo correspondentes aos genomas de 7 000 c lulas ou a 50 ng de DNA gen mico humano nos 5 uL de DNA extra do e acrescentado rea o de amplifica o O limite de detec o foi testado utilizando um DNA gen mico humano cuja concentra o inicial foi determinada pela leitura de absorb ncia em espectrofot metro a 260 nm Uma dilui o de DNA gen mico humano na quantidade de 50 ng r
16. ea o foi usado em 50 repeti es de um procedimento completo de an lise amplifica o e detec o com os nossos produtos Todos as repeti es foram validadas e determinados corretamente Amostra heterozigota N Corretas Incorretas Inv lidas Indeterminadas DNA gen mico humano 50 50 0 0 0 Sensibilidade analitica capacidade de identificar o alelo mutante Em termos de sua capacidade de identificar o alelo mutante a sensibilidade anal tica do teste maior que 99 A capacidade de identificar o alelo mutante nr de resultados corretos de resultados v lidos foi verificada utilizando uma quantidade de amostra de sangue total com genotipagem conhecida heterozigota uma quantidade de amostras de sangue total com genotipagem conhecida homozigota mutante e um n mero de amotras de DNA artificiais um plasm dio contendo a regi o de interesse imitando uma genotipagem homozigota mutante As amostras foram usadas para procedimento completo de an lise extra o amplifica o e detec o com nossos produtos Das 224 determina es 224 foram v lidas ao menos um dos cT menor ou igual a Rev 04 Out 2013 em E 27 5 224 amostras deram um resultado correto nenhuma amostra deu um resultado incorreto nenhum heterozigoto foi tomado com um homozigoto normal e nenhum homozigoto mutante foi tomado por um heterozigoto nenhuma amostra deu um resultado indeterminado diferen a entre os cT compre
17. endida entre 2 0 e 2 5 Amostras N Corretas Incorretas Inv lidas Indeterminadas Heterozigotas 112 112 0 0 0 Homoziogotas mutantes 36 36 0 0 0 naturais Homozigotas H nis 76 76 0 0 0 artificiais Especificidade anal tica incapacidade de identificar alelos mutantes como normal Em termos de inabilidade para identificar alelos normais como mutante a especificidade anal tica deste ensaio maior que 99 A capacidade de identificar corretamente o alelo normal nr de resultados corretos de resultados v lidos foi verificada utilizando uma certa quantidade de amostras de sangue total com genotipagem conhecida como homozigota normal e heterozigota Estas amostras foram empregadas para realizar o completo procedimento de an lises extra o amplifica o e detec o como nossos produtos Em 224 determina es 224 deram um resultado v lido ao menos um dos cT menor ou igual a 27 5 224 amostras deram um resultado correto nenhuma amostra deu um resultado incorreto nenhum homozigoto normal foi tomado por um heterozigoto e nenhum heterozigoto foi tomado por um homozigoto mutante nenhuma amostra deu um resultado indeterminado diferen a entre os cT compreendida entre 2 0 e 2 5 Amostras N Corretas Incorretas Inv lidas Indeterminadas Homozigotas normais 112 112 0 0 0 Heterozigotas 112 112 0 0 0 Resist ncia valor limite do cT para valida o A re
18. iMASTER lt Fator ll Q PCR Alert AmpliMIX gt e Fator ll Q PCR Alert AmpliPROBE gt O Controle Positivo Fator Il est pronto para o uso portanto deve ser usado adicionando 5uL diretamente na mistura de rea o O procedimento completo envolve prepara o e execu o de rea o de amplifica o com termociclador com sistema tico de detec o de fluoresc ncia descrito em detalhes nas instru es de uso do produto lt Fator II Q PCR Alert AmpliMIX gt bem como informa es sobre as caracter sticas de desempenho e limita es do procedimento Nota Os Controles Positivos podem ser congelados e descongelados por no m ximo 12 vezes REFER NCIAS BIBLIOGR FICAS POORT S R et al 1996 Blood 88 3698 3703 17 TSS l iii e Rev 04 Out 2013 IDENTIFICA O DO DISTRIBUIDOR Biometrix Diagn stica Ltda Estrada da Graciosa 1081 Curitiba PR CEP 82840 360 Tel 41 2108 5250 Fax 41 2108 5252 DDG 0800 7260504 E mail biometrixQbiometrix com br Website www biometrix com br CNPJ 06 145 976 0001 39 INFORMA ES DO FABRICANTE Nanogen Advanced Diagnostics S P A C so Torino 89 d 10090 Buttigliera Alta TO It lia REGISTRO ANVISA 80298490050 RESPONS VEL T CNICA Edna Cristina Kurokawa Guimar es Ferreira CRQ PR 09302336 Aprova o 20 12 2013 n PAN POO x YO LO Mauricio Cichon Laborat rio Assinado por Maur cio Cichon 18 WORKSHEET
19. ipo deslocamento positivo ou serem usadas com ponteiras com barreira filtro As ponteiras utilizadas devem ser est reis sem a presen a de DNAse e RNAse sem a presen a de DNA e RNA Os reagentes devem ser manipulados em c mara de fluxo laminar Os reagentes necess rios para a amplifica o devem ser preparados de modo a ser utilizados em uma nica vez As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente a este prop sito As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo ou usar ponteiras com barreira filtro As ponteiras utilizadas devem ser est reis sem a presen a de DNAse e RNAse sem a presen a de DNA e RNA Os produtos de amplifica o devem ser manipulados de modo a limitar ao m ximo a dispers o no ambiente para evitar a possibilidade de contamina es As pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplifica o devem ser destinadas exclusivamente para sua rea de trabalho Advert ncias e precau es para componentes espec ficos Os tubos contendo Controle Positivo podem ser congelados e descongelados por no m ximo 12 vezes Um n mero maior de ciclos de congelamento e descongelamento pode causar uma redu o do t tulo O Controle Positivo apresenta as seguintes advert ncias S S 24 25 Evitar contato com os olhos e pele PROCEDIMENTO O produto lt Fator Il Controle Positivo gt deve ser usado com a mistura de rea o obtida com os produtos Q PCR Alert Ampl
20. lassificadas como perigosas para evitar incidentes com consequ ncias potencialmente graves para o utilizador ou outras pessoas Este produto requer pessoal instru do para o procedimento de biologia molecular como a extra o a amplifica o e a detec o de cidos nucleicos para evitar resultados incorretos Este produto requer uma rea separada para a extra o prepara o das rea es de amplifica o e para a amplifica o detec o dos produtos de amplifica o para evitar resultados incorretos reas de pr e p s PCR Este produto requer o uso de roupas de trabalho EPI e instrumentos destinados extra o prepara o das rea es de amplifica o e para a amplifica o detec o dos produtos de amplifica o para evitar resultados incorretos Como para qualquer outro dispositivo diagn stico os resultados obtidos com este produto devem ser interpretados considerando todos os dados cl nicos e os outros exames de laborat rio relativos ao paciente Como para qualquer outro dispositivo diagn stico existe um pequeno risco de obter resultados inv lidos ou incorretos com este produto Este risco n o pode ser eliminado ou reduzido Este risco em situa es particulares pode contribuir a decis es incorretas com consequ ncias potencialmente graves para o paciente 10 e Rev 04 Out 2013 CONTROLE INTERNO DE QUALIDADE Controles de Qualidade aconselh vel validar o procedimento completo d
21. nte consultando o manual do equipamento programar em segundo lugar o detector para a sonda para o alelo mutante mu FII 20210A com o reporter VIC e o quencher none NFQ um quencher n o fluorescente consultando o manual do equipamento para qualquer po o em uso da microplaca programar o detector tipo de fluoresc ncia a ser medida o passive reference ROX normaliza o da fluoresc ncia medida e o tipo de rea o amostra controle negativo de amplifica o controle positivo de amplifica o Adicionar esta informa o planilha de trabalho anexa ao final deste documento escrever estas Rev 04 Out 2013 informa es ou imprimir a montagem da microplaca feita diretamente em um computador A planilha de trabalho dever ser seguida com aten o durante a disposi o nos po os da mistura de rea o e das amostras Ilustra se logo abaixo a t tulo de exemplo como pode ser organizada a an lise de 6 amostras G lt G G G G G G G GE VV VA OU Z Z RR NR NR ING O Z Z X Fa V V V V V NV V V V V V k V IN Jj Jj lt lt lt F lt lt NININLINLININLINLN AIN Z LN MO NO NONO NC NO NONO NONO NON k LN IN LN IN PENAN so A VA VA G b h b A k j j Z LN V N N N N N YV YV NY N YV N NININLINLINININAINLINLINAINAIN Vo NONO NON XY N N N NV NI N K A IN IN IN AIN AIN AIN AIN IN Significad
22. o A1 A6 Amostras para analisar CN Controle negativo de amplifica o CP Controle positivo de amplifica o Consultando o manual do equipamento programar o termociclador os par metros do ciclo t rmico e um volume de rea o de 25 HL Para equipamento Applied Biosystems ABl PRISM da s rie 7000 escolher a op o 9600 emulation Ciclo t rmico de amplifica o Desnatura o inicial 95 C 10 min i 95 C 15 seg 30 ciclos 60 C 1 min b Prepara o da amplifica o Antes de iniciar necess rio Para realizar na rea de extra o prepara o da rea o de amplifica o retirar e descongelar os tubos com as amostras para analisar Centrifugar os tubos para obter no fundo o conte do e mant lo em gelo retirar e descongelar os tubos de AmpliMIX necess rios para a sess o lembrando que o conte do de cada tubo suficiente para preparar 24 rea es Centrifugar os tubos por 5 segundos para obter no fundo o conte do e mant lo em gelo retirar e descongelar um n mero de tubos de AmpliPROBE iguais aos dos tubos de AmpliMIX Centrifugar os tubos por 5 segundos para obter no fundo o conte do e mant lo em gelo retirar um n mero de tubos de AmpliMASTER iguais aos dos tubos de AmpliMIX Escrever com tinta permanente o nome do teste FATOR Il e a data na etiqueta dos Doo tubos Centrifugar os tubos por 5 segundos para obter no fundo o conte do e mant lo em gelo retirar e desc
23. o de amplifica o aumentam e medida e registrada pelo equipamento O processamento dos dados permite determinar a presen a dos alelos no DNA extra do da amostra inicial Assay Chemistry Summary mD Forward Primer Probe s 3 O Quencher Reporter Minor Grove Binder Q I GB AN AmpliTaq T Gold DNA Polymerase Non Target Template Target Template A partir do momento que a probe TaqMan for ligada parte espec fica do gabarito de DNA depois da desnatura o alta temperatura e resfriamento da rea o os primers se Rev 04 Out 2013 anelam ao DNA A TagPolimerase ent o adiciona nucleot deos e remove a probe TaqMan do DNA gabarito Isso separa o quencher do rep rter e permite ao rep rter emitir sua energia Isso ent o quantificado usando um computador Quanto mais ocorrer a desnatura o e anelamento mais oportunidades a TaqMan ter de se ligar e em contra partida mais luz emitida ser detectada O corante do rep rter liberado S Y T gt j o da dupla fita de DNA criada pela Taq a om iwa Aan Polimerase Longe do corante quencher x A a luz emitida do corante rep rter em estado excitado pode agora ser 3 observada complementary strand A padroniza o do sistema foi realizada nos instrumentos da Applied Biosystems ABI PRISM s rie 7000 3 template DNA gt COMPONENTES FORNECIDOS Componente Descri o Quantidade Composi o
24. oligonucleot deos para PCR em tempo real total de 96 rea es e Fator llQ PCR Alert AmpliPROBE gt RTSDO1 II P probes fluorescentes para PCR em tempo real total de 96 rea es ADVERT NCIAS E PRECAU ES Este produto exclusivamente para uso in vitro Advert ncias e precau es gerais Manusear e descartar todas as amostras biol gicas como potencialmente infecciosas Evitar o contato direto com amostras biol gicas Evitar respingos Os materiais que entram em contato com amostras biol gicas devem ser tratados com hipoclorito de s dio 3 por no m nimo 30 minutos ou autoclavados a 121 C por uma hora antes de serem descartados Manusear e descartar todos os reagentes e materiais como potencialmente infecciosos Evitar contato direto com reagentes Evitar respingos Os res duos devem ser tratados e descartados de acordo com normas de seguran a Res duos l quidos contendo cidos ou bases devem ser neutralizados antes do descarte Usar jaleco luvas e culos de prote o Nunca pipetar solu es com a boca N o comer beber fumar ou aplicar cosm ticos dentro da rea de trabalho Lavar as m os cuidadosamente ap s manusear amostras e reagentes Descartar as sobras de reagentes e res duos de acordo com as normas de seguran a Ler as instru es de uso antes de utilizar o produto Seguir as instru es N o usar produtos ap s o prazo de validade estabelecido Somente usar os reagentes fornecidos no kit
25. ongelar o tubo de Controle positivo Centrifugar o tubo por 5 segundos para obter no fundo o conte do e mant lo em gelo se necess rio cortar a Microplaca de amplifica o para separar a parte utilizada na sess o prestando aten o em manipul la com luvas sem p e de n o causar danos aos pocinhos 1 Transferir 100 uL de AmpliMIX no tubo de AmpliMASTER Misturar bem pipetando por tr s vezes o volume de 100 uL na mix 2 Transferir 100 uL de AmpliPROBE no tubo de AmpliMASTER Misturar bem pipetando por tr s vezes o volume de 100 uL na mix 3 Misturar por 5 segundos com o vortex a baixa velocidade evitando produzir espuma 4 Centrifugar os tubos por 5 segundos para obter no fundo o conte do 5 Transferir depositando os cuidadosamente no fundo 20 uL da mistura de rea o assim obtida nos po os da Microplaca de amplifica o como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho Nota Se n o se utiliza toda a mistura de rea o conservar o volume restante em ambiente escuro a 20 C por um m ximo de um m s no tubo FATOR II Congelar e descongelar a mistura de rea o somente uma vez 6 Transferir depositando os cuidadosamente no fundo 5 pL de DNA extra do da primeira amostra no correspondente pocinho da Microplaca de amplifica o como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho proceder igualmente com todos os outros DNA extra dos 7 Transferir depositando os cuidadosamente na mistura de rea o
26. ra valor absoluto da diferen a entre cT FAM e cT VIC compreendido entre 2 0 e 2 5 isso significa que problemas ocorreram na fase de amplifica o amplifica o n o eficiente ou na fase de extra o presen a de inibidores ou amostras iniciais com um n mero excessivo de c lulas que n o permitiram a determina o al lica do gen tipo A amostra n o adequada o teste indeterminado e deve ser repetido a partir da extra o de uma nova amostra Os resultados obtidos com este teste devem ser interpretados considerando todos os dados cl nicos e os outros exames de laborat rio relativos ao paciente Rev 04 Out 2013 LIMITA ES DO PROCESSO Utilizar com este produto somente o DNA extra do das seguintes amostras humanas sangue total coletado em EDTA N o utilizar com este produto uma quantidade de DNA extraido superior recomendada quantidades maiores de DNA extra do podem causar resultados incorretos ou indeterminados N o utilizar com este produto o DNA extra do das amostras heparinizadas a heparina inibe a rea o de amplifica o dos cidos nucleicos e causa resultados n o v lidos N o utilizar com este produto o DNA extra do contaminado com hemoglobina a hemoglobina inibe a rea o de amplifica o dos cidos nucleicos e pode causar resultados n o v lidos a hemoglobina interfere na medi o da fluoresc ncia e pode causar resultados indeterminados ou incorretos N o est o dispon
27. sist ncia deste teste permite obter uma frequ ncia de amostras v lidas superior a 99 com um valor limite do cT para a valida o igual a 27 5 O valor limite do cT foi estabelecido utilizando algumas amostras de sangue total de genotipagem conhecida de homozigoto normal heterozigoto e homozigoto mutante As amostras foram empregadas para realizar o procedimento completo de an lises extra o amplifica o e detec o com nossos produtos Em 260 determina es 260 amostras deram um resultado v lido ao menos um dos cT menor ou igual a 27 5 e nenhuma amostra deu um resultado inv lido ambos os cT maiores que 27 5 Amostras N Corretas Incorretas Inv lidas Indeterminadas Homozigotas normais 112 112 0 0 0 Heterozigotas 112 112 0 0 0 Homozigotas mutantes 36 36 0 0 0 naturais Resist ncia diferen a entre os valores cT dos homozigotos A resist ncia deste teste permite determinar os homozigotos com uma frequ ncia superior a 99 com um valor da diferen a dos cT dos dois alelos maior ou igual a 2 5 A diferen a de cT entre os dois alelos para os homozigotos foi estabelecido utilizando algumas amostras de sangue total com genotipagem conhecida de homozigoto normal OMETRIX DIAGN STI 12 ca lwwwcmH wcww w ooooo JJ algumas amostras de sangue total com genotipagem conhecida de homozigoto mutante e algumas amostras artificiais de DNA um plasm deo conten
28. ss rio consultando o manual do equipamento programar manualmente o Limiar Threshold para o detector nor FII 20210G para 0 2 consultando o manual do equipamento programar manualmente o Limiar Threshold para o detector mu FII 20210A para 0 2 consultando o manual do equipamento programar manualmente varia o do intervalo de c lculo do N vel de background de fluoresc ncia Baseline do ciclo 6 ao ciclo 15 Os valores de fluoresc ncia emitidos pela sonda especifica para o alelo normal FII 20210G e mutante FII 20210A nas rea es de amplifica o e o valor de Threshold de fluoresc ncia s o utilizados para determinar o Ciclo Threshold cT ou seja o ciclo de amplifica o no qual o valor de fluoresc ncia emitido por cada sonda atinge o valor de Threshold Os valores dos cT para as sondas espec ficas para o alelo normal FII 20210G FAM e para o alelo mutante FII 20210A VIC na rea o de amplifica o do Controle Negativo s o utilizados para validar a amplifica o e a detec o como descrito na tabela seguinte Amplifica o Controle Negativo Amplifica o Detec o cT FAM Indeterminado CORRETO cT VIC Indeterminado CORRETO Onde cT FAM o Ciclo Threshold do alelo normal e cT VIC o Ciclo Threshold do alelo mutante Se o resultado da rea o de amplifica o do Controle negativo diferente do Indeterminado a presen a de DNA alvo na rea o de amplifica o foi detectad
29. tes e res duos conforme as normas vigentes Ler todas as instru es fornecidas no kit antes de realizar o teste Respeitar as instru es fornecidas no kit durante a execu o do teste Respeitar a data de validade do kit Rev 04 Out 2013 Utilizar somente os reagentes presentes no kit e aqueles aconselhados pelo fabricante N o intercambiar reagentes procedentes de diferentes lotes N o utilizar reagentes procedentes de kits de outros fabricantes Advert ncias e precau es para a biologia molecular Os procedimentos de biologia molecular como a extra o a transcri o reversa a amplifica o e a detec o de cidos nucleicos requerem pessoal especializado para evitar o risco de resultados incorretos em particular por causa da degrada o dos cidos nucleicos das amostras ou da contamina o das amostras por parte de produtos de amplifica o necess rio dispor de uma rea separada para a extra o prepara o das rea es de amplifica o e para a amplifica o detec o dos produtos de amplifica o reas de pr e p s PCR Nunca introduzir um produto de amplifica o na rea de extra o prepara o das rea es de amplifica o necess rio uso de EPI adequado a cada uma das reas de trabalho em laborat rio de biologia molecular As amostras devem ser destinadas exclusivamente a este tipo de an lise As amostras devem ser manipuladas em uma c mara de fluxo laminar Os tubos q
30. tru es para o uso de EXTRAcell Aconselha se introduzir na rea o de amplifica o uma quantidade de DNA extra do igual a cerca 175ng correspondente de aproximadamente 25 000 c lulas N o introduzir na rea o de amplifica o uma quantidade de DNA extra do superior a 200 ng para evitar poss veis fen menos de hibrida o inespec fica ou a inibi o da emiss o da fluoresc ncia Subst ncias interferentes O DNA extra do da amostra inicial n o deve conter heparina para evitar fen menos de inibi o da amplifica o e a apari o de frequentes resultados n o v lidos O DNA extra do da amostra inicial n o deve conter hemoglobina para evitar fen menos de inibi o da amplifica o e da emiss o da fluoresc ncia e a apari o de frequentes resultados n o v lidos N o est o dispon veis dados pertinentes a eventuais fen menos de inibi o por parte dos medicamentos Descri o do Procedimento Instru es de Uso a Preparo da etapa de amplifica o real time rea de p s PCR Antes de iniciar necess rio consultando o manual do equipamento ligar o termociclador real time ligar o computador de controle abrir a sess o absolute quantification no software espec fico consultando o manual do equipamento programar primeiramente o detector para a sonda para o alelo normal nor FII 20210G com o reporter FAM e o quencher none NFQ um quencher n o fluoresce
31. ue cont m amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso As pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo ou usar ponteiras com barreira filtro As ponteiras utilizadas devem ser est reis sem a presen a de DNAse e RNAse sem a presen a de DNA e RNA Os reagentes devem ser manipulados em c mara de fluxo laminar Os reagentes necess rios para a amplifica o devem ser preparados de modo a ser utilizados em uma nica vez As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente para aquela rea de trabalho As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo ou usar ponteiras com barreira filtro As ponteiras utilizadas devem ser est reis sem a presen a de DNAse e RNAse sem a presen a de DNA e RNA Os produtos de amplifica o devem ser manipulados de modo a limitar ao m ximo a dispers o no ambiente para evitar a possibilidade de contamina es As pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplifica o devem ser destinadas exclusivamente para sua rea de trabalho Advert ncias e precau es espec ficas para os componentes e Os produtos FATOR II Q PCR Alert AmpliMIX FATOR Il Q PCR Alert AmpliPROBE FATOR II AmpliSTANDARD Q PCR AmpliMASTER apresentam as seguintes advert ncias S S 23 25 N o respirar vapores aerosol Evitar o contato com os olhos Observa es importantes
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