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1. Materiais Mesa cir rgica Seringa descart vel para insulina com agulha 1 mL 13 X 0 45 mm 26 G 2 Material cir rgico pin a simples reta pin a dente de rato pin as hemost ticas e tesoura reta L mina de a o para realizar tricotomia ou raspador el trico PBS Azul de Evans C H N Na O 5 Bradicinina Histamina Formamida Estufa 40 C Xilazina e Ketamina Procedimentos 1 Preparar na mesma seringa e administrar por via intraperitoneal i p a mistura de Xilazina 10 mg kg Ketamina 75 mg kg Esta dose mant m um bom plano anest sico por 30 45 minutos Ap s este tempo suplementar com 1 3 da dose de Ketamina 2 Dispor o animal na mesa cir rgica em dec bito ventral prendendo patas e cabe a 3 Injetar por via intravenosa na veia caudal 50 mg kg de Azul de Evans dilu do em PBS volume m ximo de 0 5 mL 4 Realizar a tricotomia de toda a regi o dorsal do animal e dividir o dorso em aproximadamente 10 12 quadrantes Dica os pelos devem ser retirados completamente para facilitar a marca o e posterior inje o intrad rmica i d 5 Em cada quadrante injetar via i d volume m ximo de 0 1 mL PBS controle negativo 3 nmols de bradicinina controle positivo 30 pmols de histamina controle positivo e diferentes doses da subst ncia a ser testada Dica outras subst ncias podem ser usadas como controle positivo dependendo do mecanismo que se deseja
2. Amostras c lulas em meio amostra em diferentes concentra es DMSO Retirar as subst ncias adicionadas s c lulas e adicionar o reagente alamar blue a 10 em meio de cultura incompleto sem SBF com volume final de 200 pL Dica Proteger a placa com papel alum nio e incubar em estufa a 37 C Aproximadamente ap s 4 a 5 horas verificar a redu o do Alamar Blue nos controles negativos colora o r sea Realizar a leitura nos comprimentos de onda de 540 nm oxidado e 630 nm reduzido A porcentagem de azul de alamar reduzido calculada utilizando se a equa o redu o AO AR x RO x 100 onde AO absorb ncia do estado oxidado AR absorb ncia do estado reduzido RO raz o AOO ARO AOO absorb ncia do meio sozinho subtra do do meio com alamar blue em 540 nm ARO absorb ncia do meio sozinho subtra do do meio com alamar blue em 630 nm Refer ncias AL NASIRY S Geusens N Hanssens M Luyten C Pijnenborg R 2007 The use of Alamar Blue assay for quantitative analysis of viability migration and invasion of choriocarcinoma cells Human Reproduction 22 5 1304 309 FRESHNEY R I Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique 5th Ed Hoboken NJ John Wiley amp Sons 2005 NAKASHIMA T Tamura T Kurachi M Yamaguchi K Oda T 2005 Apoptosis Mediated Cytotoxicity of Prodigiosin Like Red Pigment Produced by y Proteobacterium and Its Multiple Bioactivities
3. Markus Berger Oliveira Farmac utico doutor em Biologia Celular e Molecular UFRGS p s doutorando no Laborat rio de Bioqu mica Farmacol gica do Centro de Biotecnologia UFRGS http lattes cnpq br 8841487917492985 Mariano Rodrigues Quimico mestre em Biotecnologia Centro Universitario UNIVATES professor dos cursos T cnicos em Quimica e Nutri o do Centro Universitario UNIVATES http lattes cnpq br 8641590738904901 Matheus dos Santos Rocha Bi logo mestrando do Programa de P s Gradua o em Diversidade Animal e Vegetal UNISINOS http lattes cnpq br 2563225109320691 M nica Jachetti Maciel Bi loga mestre em Ci ncia e Tecnologia de Alimentos UFGRS professora do Centro de Ci ncias Biol gicas e da Sa de CCBS do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 2575088289818885 Noeli Juarez Ferla Bi logo doutor em Ci ncias USP professor do Centro de Ci ncias Biol gicas e da Sa de CCBS e dos Programas de P s Gradua o em Biotecnologia PPGBiotec e Ambiente e Desenvolvimento PPGAD do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 6071378790176893 Pamela Maria Seibel Acad mica do curso de Farm cia da Funda o Universidade Federal de Ci ncias da Sa de de Porto Alegre UFCSPA http lattes cnpq br 6364366001687822 Pricila Girardi Biom dica mestranda do Programa de P s Gradua o em Biotecnologia PPGBiotec do Centro Univ
4. 1mL 1 0x10 c l X X 1 25 mL Este ser o volume a ser plaqueado para que tenhamos a densidade celular de 1x105 c l mL em cada placa Distribuir em placas de pl stico est reis de cultura de 35 mm na concentra o de 1x105 c lulas mL e incubar em estufa a 37 C com atmosfera mida e adi o autom tica de 3 CO2 Refer ncias SPRITZER P M I S SILVA et al 1995 Culture of adult human prostatic epithelial cells A simplified method for obtaining primary cultures Med Sci Res 23 379 381 Manuten o das c lulas de cultura prim ria da tireoide humana As c lulas em cultura devem ser observadas a cada 24 horas em microsc pio invertido antes de ser efetuada a troca do meio de incuba o A primeira troca do meio de cultura das c lulas deve ser realizada 24 horas ap s a semeadura para facilitar a ades o das c lulas nas placas sendo este considerado o dia zero O meio deve ser trocado para F 12 suplementado com glutamina bicarbonato de s dio soro de vitelo TSH e antibi tico Kanamicina Antes de atingir a conflu ncia as c lulas devem ser privadas do meio com TSH durante no m nimo 48 horas Ap s este per odo as c lulas devem ser separadas em grupos e tratadas em diferentes condi es CAPITULO 9 CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS Claudimar Sidnei Fior Elisete Maria de Freitas Aline Marjana Pavan e Marelise Teixeira A tecnologia de cultura de c lulas protoplastos e tecidos de plan
5. 300 C Dica deixar a mufla levemente aberta 10 Transferir os cadinhos para o dessecador at atingirem temperatura ambiente 11 Pesar os cadinhos em balan a anal tica e anotar as massas peso final Dica cuidar ao abrir o dessecador soltar o ar levemente para as cinzas n o voarem 12 C lculo Mat ria Mineral Peso final Peso inicial massa da amostra x 100 D gt Cm Onde Peso inicial Peso do cadinho vazio g Peso final Peso do cadinho com amostra ap s ser retirado da mufla g Refer ncias BRASIL Minist rio da Agricultura Secretaria Nacional de Defesa Agropecu ria Laborat rio Nacional de Refer ncia Animal M todos anal ticos oficiais para controle de produtos de origem animal e seus ingredientes m todos f sicos e qu micos Bras lia DF 1981 v II cap 2 p 3 MERCK Reactivos diagn stica productos qu micos 1992 93 Darmstadt 1993 1584 p D gt cil 7 7 DETERMINACAO DA UMIDADE VOLATEIS E SOLIDOS TOTAIS Esse m todo empregado na determina o da umidade de amostras de alimentos obtidos por meio de processos de cultivo de microrganismos ou seja de alimentos fermentados A umidade determinada pela perda de massa em condi es em que gua e subst ncias vol teis s o removidas O res duo obtido ap s evapora o representa os s lidos totais da amostra M todo de BRASIL 1981 Equipamentos Balan a anal tica Estufa Vidraria utens lios
6. ALEXIAVA V Sergiev I Mapelli S Karanov E 2001 The effect of drought and ultraviolet radiation on growth and stress markers in pea and wheat Plant Cell and Environment 24 1337 1344 4 12 ANALISE DAS ENZIMAS ANTIOXIDANTES SUPEROXIDO DISMUTASE SOD CATALASE CAT EASCORBATO PEROXIDASE APX Para sobreviver a estresses bidticos ou abidticos os organismos desenvolveram sistemas de remo o das EROs Esp cies Reativas de Oxig nio O sistema antioxidante enzim tico de fundamental import ncia para aumentar a toler ncia da planta ao estresse Dentre as principais enzimas super xido dismutase SOD catalase CAT e ascorbato peroxidase APX s o as que t m recebido maior aten o nesse mecanismo de prote o Estas enzimas s o especializadas na remo o de per xido de hidrog nio H O Este oxidante relativamente est vel e pela aus ncia de cargas tem sua passagem facilitada pela bicamada lip dica da membrana celular o que sinaliza para a apoptose celular Portanto a quantifica o de tais enzimas de fundamental import ncia quando se estuda os danos celulares oxidativos causados pelo ac mulo de EROs OBTEN O DO EXTRATO ENZIM TICO BRUTO 1 PESAGEM DA MAT RIA FRESCA Pesar de 200 a 300 mg de mat ria fresca Dica caso a pulveriza o do material n o seja feita no mesmo dia da coleta deixe as amostras em nitrog nio l quido e logo armazene o material em ultrafreezer 80 C Este proces
7. BLASTx nucleot deos traduzidos X prote nas O BLASTx utilizando quando se quer encontrar sequ ncias de prote nas em um banco de dados que apresentem similaridade com uma sequ ncia de interesse de nucleot deos Para isso o BLAST traduz a sequ ncia de interesse nas seis fases de leitura poss veis tr s da fita senso e tr s da fita antissenso gerando seis sequ ncias de prote nas que s o ent o comparadas com o banco de dados de prote na 1 Acessar o site http www ncbi nlm nih gov No canto direito da p gina encontrar e clicar na op o BLAST 2 Na p gina seguinte clique na op o blastx na se o Basic BLAST 3 Na caixa Enter query sequence cole a sequ ncia de nucleot deos que deseja alinhar com o banco de dados 4 No menu Database selecione o conjunto de dados contra o qual a sequ ncia de interesse ser alinhada Caso queira buscar em todo o banco de dados do GenBank selecione Non redundant protein sequences 5 Na caixa Organism poss vel restringir as buscas para apenas aquelas que s o derivadas de um organismos espec fico Tamb m poss vel excluir apenas essa esp cie clicando no bot o Exclude assim como adicionar mais organismos para restringir ou excluir os mesmos das buscas bot o 6 Clique em BLAST O resultado pode demorar alguns minutos 7 Analisar os resultados Na se o Graphic Summary poss vel
8. de Dica Cada ponto da curva deve ser pipetado em triplicata na placa O volume final cada po o deve ser de 100 pL 1 7 Medir a absorb ncia em espectrofot metro de microplacas 410 nm 1 8 Construir um gr fico de regress o linear simples colocando os valores das m dias aritm ticas das leituras de cada ponto nas ordenadas eixo y e os valores de quantidade de p nitrofenol nmol po o ou a concentra o de p nitrofenol uM nas abscissas eixo x 1 9 Obter a equa o da reta na forma de y ax b Reservar a equa o para calcular os valores de atividade enzim tica posteriormente M todo do ensaio 1 10 Adicionar 10 uL da amostra a ser testada em uma microplaca de 96 po os de fundo chato 1 11 Adicionar 90 pL da emuls o previamente equilibrada a 37 C por 5 minutos assim como a amostra Dica importante ressaltar que tanto a emuls o de substrato quanto a amostra devem estar previamente equilibradas na temperatura do ensaio para evitar interfer ncia na leitura visto que o substrato insol vel e est na forma de emuls o 1 12 Medir a absorb ncia em espectrofot metro de microplacas a 410 nm no tempo inicial A1 logo ap s a adi o da emuls o Incubar a placa 37 C e ap s 30 minutos de rea o repetir a leitura no mesmo comprimento de onda A2 tempo final Dica agitar rapidamente a placa antes da primeira e ltima leitura 1 13 Calcular a m dia aritm tica de cada uma das amostra
9. gt cil 10 5 IDENTIFICACAO DO GENERO E ESPECIE BACTERIANA Atualmente somente o isolamento e os testes bioqu micos n o s o o suficiente para a identifica o bacteriana Para confirma o do g nero e esp cie da bact ria estudada devemos caracterizar o gene 165 rDNA codifica a subunidade menor do ribossomo bacteriano por t cnicas de biologia molecular Este protocolo descreve dois oligonucleot deos iniciadores e as rea es de PCR para caracteriza o do gene 165 rDNA em bact rias 1 Extrair o DNA do isolado bacteriano conforme descrito no protocolo de extra o de DNA de um isolado bacteriano descrito no cap tulo 2 Extra o e quantifica o de cidos nucl icos e prote nas 2 Utilizar 50 100 ng de DNA para rea o de PCR com seguintes oligonucleot deos iniciadores Para amplificar um fragmento de aproximadamente 450 pares de bases da regi o V6 do gene 165 rDNA usar os oligonucleot deos iniciadores Nome Sequ ncia Posi o U968 For 5 AAC GCG AAG AAC CTT AC 3 968 985 L1401 Rev 5 CGG TGT GTA CAA GAC CC 3 1401 1418 Condi es da PCR 94 C 5 min 30 ciclos de 94 C 45 seg 52 C 45 seg 72 C 45 seg e 72 C 10 min Dica pelo alto n vel de conserva o do gene 165 rDNA em bact rias estes oligonucleotideos iniciadores amplificam o gene em qualquer esp cie bacteriana Dica como esta rea o amplifica somente um por o do gene 16S rDNA por esta metodologia podemo
10. o a solu o de fibrinog nio inst vel e n o deve sofrer mudan as bruscas de temperatura Dica a solu o de fibrinog nio n o deve ser reutilizada 1 6 Preparar uma solu o estoque de 0 3 mg mL de trombina Dica dissolver a trombina em tamp o Tris HCl 20 mM pH 7 4 aliquotar em tubos de 1 ou 0 5 mL e manter congelado 20 C 1 7 Preparar uma solu o de trabalho de trombina na concentra o de 0 02 mg mL Dica diluir a partir da solu o estoque usando o tamp o Tris HCl 20 mM pH 74 e aliquotar em volumes pequenos em tubos de 0 5 mL At o momento do ensaio manter no gelo 4 C Ap s o ensaio manter congelado 20 C 1 8 Pipetar os reagentes na microplaca de 96 po os conforme o esquema sugerido na tabela 4 Tabela 4 Protocolo do ensaio de trombina fibrinog nio Trombina Substrato Po o Identifica o da amostra Tamp o pL 0 02 mg mL Fibrinog nio 5 mg mL pL pL ug po o HL ug po o 1A 60 a 40 1B 50 10 0 2 40 1C x x x 10 0 2 40 As quantidades e o n mero de amostras a serem testadas devem ser definidas previamente e dependem de cada experimento Dicas O volume final de cada po o deve ser de 100 pL Biotecnologia O volume de substrato e trombina s o fixos O volume de amostra pode variar Utilizar o tamp o Tris HCl 20 mM pH 7 4 para completar o volume final de cada po o para 100 pL Correr cada uma
11. 1 Preparar a solu o de trabalho Working Solution com o fluor foro na propor o de 1 200 2 Para a quantifica o usa se uma curva padr o com valor de O a 200 utilizando duas solu es padr o na quantidade de 10 uL do padr o e 190 pL da solu o de trabalho 3 Adicionar 10 mL de cada padr o Qubit ao tubo apropriado e misturar em v rtex por 2 3 segundos tomando cuidado para n o criar bolhas Dica deve se pipetar com precis o pois fundamental para garantir a exatid o da an lise 4 Pipetar nos tubos 199 uL da solu o e 1 pL do DNA extra do de cada amostra Dica o DNA pode ser dilu do 5 10 ou 20 vezes dependendo da amostra 5 Ligar o aparelho Na tela inicial do Qubit 2 0 Fluorometer pressione DNA e em 2 seguida selecione dsDNA Alta Sensibilidade como o tipo de ensaio A tela Padr es exibida automaticamente Se voc j tiver realizado uma calibra o para o ensaio selecionado o aparelho ir pedir para escolher entre ler novos padr es ou usar a calibragem anterior 6 Na tela Padr es pressione Yes para executar uma nova calibra o ou pressione No para utilizar a ltima calibra o 7 Para uma nova calibra o insira o tubo contendo padr o 1 no aparelho feche a tampa e pressione Read A leitura vai demorar cerca de 3 segundos 8 Remova o padr o 1 9 Insira o tubo contendo Padr o 2 feche a tampa e pressione Read 10 Remova o padr o 2 11 A tela Sample ser automaticam
12. N o coma ou beba no laborat rio h sempre risco de contamina o de comida ou bebida com material potencialmente perigoso Use vestimentas adequadas no laborat rio deve se sempre usar jaleco de mangas longas de material n o sint tico sapatos fechados e cal as compridas Caso tenha cabelo longo mantenha o sempre preso Em caso de opera es com maior grau de risco deve se utilizar toucas Utilize luvas adequadas de amianto para a prote o contra calor e frio Jamais se deve pipetar qualquer produto com a boca N o leve as m os na boca ou olhos quando estiver manuseando produtos qu micos Mantenha as bancadas sempre limpas e livres de materiais estranhos ao trabalho Deve se sempre rotular imediatamente qualquer reagente solu o preparada ou amostra coletada N o utilize materiais de vidros trincados Ao utilizar uma capela sempre verifique se a mesma est limpa e o sistema de exaust o est operando corretamente Mantenha as janelas da capela com o m nimo de abertura poss vel evitando sempre colocar o rosto para dentro da mesma Se a toxidade do produto for elevada utilize m scara contra gases No caso de dilui es sempre derramar o cido sobre a gua nunca o contr rio Antes de usar qualquer aparelho certifique se que sabe manuse lo Leia as instru es ou pe a uma demonstra o ao instrutor Ao ligar qualquer aparelho corrente el trica certifique se do estad
13. PROTOCOLOS E METODOS DE AN LISE EM LABORAT RIOS DE BIOTECNOLOGIA AGROALIMENTAR E DE SAUDE HUMANA Raut ANTONIO SPEROTTO ORGANIZADOR Raul Antonio Sperotto Organizador Protocolos e m todos de an lise em laborat rios de biotecnologia agroalimentar e de sa de humana 1 edi o ASNIVATES Lajeado 2014 O UNIVATES Centro Universit rio UNIVATES Reitor Prof Me Ney Jos Lazzari Pr Reitor de Pesquisa Extens o e P s Gradua o Prof Me Carlos C ndido da Silva Cyrne Pr Reitora de Ensino Prof Ma Luciana Carvalho Fernandes Pr Reitora de Ensino Adjunta Prof Ma Daiani Clesnei da Rosa Pr Reitora de Desenvolvimento Institucional Prof Dr J lia Elisabete Barden Pr Reitor Administrativo Prof Me Oto Roberto Moerschbaecher JENIVATE ATES Editora Univates Coordena o e Revis o Final Ivete Maria Hammes Editora o Glauber Rohrig e Marlon Alceu Crist foli Capa Marlon Alceu Crist foli Conselho Editorial da Univates Editora Titulares Suplentes Adriane Pozzobon Simone Morelo Dal Bosco Augusto Alves Ieda Maria Giongo Beatris Francisca Chemin Rog rio Schuck Fernanda Cristina Wiebusch Sindelar Ari K nzel Avelino Tallini 171 Bairro Universit rio Lajeado RS Brasil Fone 51 3714 7024 Fone Fax 51 3714 7000 editora univates br http www univates br editora P967 Protocolos e m todos de an lise em laborat rios de biotecnologia Protocolos e m t
14. o de biotina 0 5 mg ml 2ml Tioglicolato de s dio 0 5g Solu o de micronutriente de Jurgensen 1 E ml gua destilada completar volume para1L Agar puro 15g Solu o de micronutriente de Jurgensen Reagentes Para 100 mL H BO 0 286 g MnCl 4H O 0 181 g ZnSO 7H O 0 022 g CuSO 5H O 0 008 g 3 Organizar as placas em uma jarra de anaerobiose e incubar a 28 C por 1 semana 4 Para o isolamento de col nias realizar um estriamento em placas de Petri contendo o mesmo meio TB sem N e incubar novamente a 28 C por 1 semana em jarra de anaerobiose Dica a escolha de uma nica col nia por placa opcional pois se d prefer ncia ao isolamento de col nias morfologicamente diferentes ou com distintas colora es 5 Inocular diferentes col nias em tubos de ensaio contendo 3 ml de meio King B l quido ver Protocolo de isolamento de diazotr ficos endof ticos de raiz descrito nesse cap tulo Manter os tubos sob agita o constante 28 C por 24 a 48 h ou at turvar 6 Realizar a colora o de Gram com cada uma das amostras cultivadas em tubos de ensaio para avalia o da pureza do in culo 7 Aliquotar 1 2 mL do caldo bacteriano e 300 pl de glicerol puro est ril em tubos criog nicos de 2 mL a fim de se obter o estoque do isolado em glicerol 20 Dica importante que o tubo criog nico seja levemente agitado para uma mistura homog nea Mantenha os tubos por pelo menos 6 horas a temperatura ambi
15. 2 mL do produto Glicerol 2 5 mL do produto Agua ultrapura 3 55 mL do produto Azul de Bromofenol 0 5 p v 0 2 mL Este tamp o pode ser estocado em um tubo de 15 mL a temperatura ambiente No dia do uso a quantidade necess ria deve ser aliquotada em microtubo e adicionada de 5 de B mercaptoetanol sendo esta a solu o de uso 4 Para preparar a amostra para aplicar no gel deve se determinar a quantidade de prote na total a ser carregada no po o Isto deve ser definido experimentalmente Para g is corados com Coomassie Blue 20 ug s o geralmente suficientes Para Western blot este valor pode chegar a 80 ug gt gt cm Ex Se uma amostra tem 10 pg L deve ser pipetado 2 pL de amostra total de 20 ug 4 uL de tamp o de amostra com B mercaptoetanol 10 uL de agua ultrapura qsp para 16 uL 5 Colocar os microtubos em banho com gua fervente por 5 minutos para promover a desnatura o das prote nas Homogeneizar os tubos em v rtex e centrifugar a baixa rota o antes de aplicar no gel SDS PAGE 1 Preparar a cuba de eletroforese encaixar as placas de vidro com o gel no suporte com eletrodos e preencher as cisternas interna e externa com o tamp o de corrida 1X gelado Dica verificar se as placas est o encaixadas corretamente pois pode ocasionar a interrup o do processo posteriormente Encher primeiro a cisterna interna para verificar se ocorre algum vazamento Se sim remonte o sistema 2 Apos encaixa
16. 9 Retirar a lam nula bem devagar de maneira que a amostra fique na l mina 10 Colocar a grade com l minas na Solu o de Lise Final e deixar na geladeira por no m nimo 24 horas m ximo 48 horas CORRIDA somente depois de 24 horas 1 Preparar o tamp o de eletroforese por no m nimo 24 horas antes de iniciar a corrida e deixar na geladeira at a temperatura do tamp o alcan ar 4 C 2 Quando a temperatura estiver em 4 C retirar as l minas da solu o de Lise Final com o aux lio de uma pin a 3 Secar a parte de baixo e a lateral da l mina com papel absorvente 4 Colocar as l minas na horizontal na cuba de eletroforese sem espa o entre elas e entre as duas colunas l minas de maneira que fiquem com as tarjas para a direita lado positivo 5 Colocar gelo e gua envolta da cuba controlando a temperatura que deve ser de 4 C 6 Colocar o tamp o de eletroforese 4 C at cobrir as l minas e deixar por 25 minutos 7 Ap s os 25 minutos colocar o eletrodo vermelho no lado da parte fosca da l mina e o eletrodo preto no lado oposto 8 Programar a fonte de eletroforese para 25 V constantes e 300 mA a corrente controlada com o volume do tamp o 9 Correr durante 25 minutos 10 Ap s retirar as l minas com o aux lio de uma pin a secando as na lateral e na regi o posterior da parte fosca 11 Colocar as l minas na grade e cobri las com tamp o de neutraliza o durante 5 minutos
17. A VAINSTEIN M H 2009 Characterization of a spore surface lipase from the biocontrol agent Metarhizium anisopliae Process Biochemistry 44 829 834 SANTI L BEYS DA SILVA WO BERGER M GUIMAR ES JA SCHRANK A VAINSTEIN MH Conidial surface proteins of Metarhizium anisopliae Source of activities related with toxic effects host penetration and pathogenesis Toxicon 2010 1 55 4 874 80 15 6 ATIVIDADE LIPOLITICA LIPASE P NITROFENIL PALMITATO Este m todo baseia se na hidr lise do substrato cromog nico p nitrofenil palmitato p NPP pela lipase com consequente libera o do composto de colora o amarela p nitrofenol conforme demonstrado na figura 2 Figura 2 Rea o de hidr lise do substrato pNPP com libera o do composto de colora o amarela p nitrofenol O A O CH2 44CH2 O NO O N pNPP p Nitrofenol cido graxo 1 Procedimento Preparo das solu es 1 1 Preparar uma solu o tamp o de TRIS HCI 0 05 M pH 8 0 pela dissolu o de 0 605 g de TRIS em 80 mL de gua destilada Ajustar o pH com HCl 5 M e completar o volume para 100 mL com gua destilada 1 2 Solu o 1 Preparar uma solu o a 3 mg mL do substrato ONPP Dissolver o pNPP em isopropanol incubar 37 C at a completa dissolu o antes do uso e estocar 20 C Estabilidade no freezer de 1 m s ou at 2 incuba es 37 C 1 3 Solu o 2 Em 450 mL de Tris HCl 0 05 M pH 8 0 adicionar 0 5 g de goma ar bica e 2 g d
18. ACAAGTCTGAATGCTCCACT 3 Programa para amplificar a B microglobulina 1 94 C por 2 minutos 2 94 C por 30 segundos D gt cil 3 55 C por 30 segundos 4 72 C por 30 segundos 5 Repetir os passos 2 3 e 4 29 vezes 6 72 C por 5 minutos END Para a an lise dos produtos da PCR deve se realizar a eletroforese em gel de agarose O tamanho e a concentra o do gel dependem do fragmento que se quer analisar Neste caso utiliza se 1 5 pois o gene analisado possui 165 pares de bases Exemplos de c lculo Gel M dio 1 5 80 mL TBE 1X 1 2 g Agarose 1pL Brometo de Etideo 1 Pesar agarose de acordo com o volume de TBE 1X a ser utilizado 2 Mistur la ao TBE 1X em um becker 3 Fazer uma marca no menisco da solu o para completar o volume ap s a fervura 4 Tapar o recipiente com pl stico filme de polietileno Dica fazer alguns pequenos furos com a ponta da tesoura 5 Preparar o suporte do gel e acoplar o pente 6 Ferver a mistura em micro ondas at dissolver completamente a agarose 7 Completar o volume evaporado com o TBE 1X 8 Aguardar o resfriamento parcial e acrescentar o Brometo de Et deo Dica toda a manipula o com o Brometo de Et deo deve ser feita com luvas apropriadas 9 Homogeneizar e verter a mistura no suporte com cuidado para n o formar bolhas Dica agitar delicadamente o erlenmeyer para misturar bem o brometo de et deo e evitar a forma o de bolhas Se formar bolhas pr ximas a
19. Agitar no v rtex e centrifugar a 13 000 rpm por 10 minutos 15 Descartar sobrenadante 16 Lavar o pellet com etanol 70 17 Secar no Speed Vac por 5 minutos 18 Dissolver pellet em 50 pL de gua Milli Q solu o estoque 19 Diluir 1 uL da solu o estoque em 49 pL de gua Milli Q 20 Usar 1 pL para PCR EB Extraction Buffer 1 0 mL Tris HC10 5 M pH 8 0 100 mM 1 0 mL EDTA 0 25 M pH 8 0 50 mM 2 5 mL NaCl 2M 500 mM 7 2 uL B mercaptoetanol 10 mM 5 5 mL H O q s p BTE 0 50 mL Tris HC10 5M pH 8 0 50 mM 0 02 mL EDTA 0 25 M pH 8 0 1mM 9 50 mL H O q s p Biotecnologia Refer ncias DELLAPORTA S L WOOD J HICKS J B A plant DNA minipreparation version II Plant Molecular Biology Reporter 1 19 21 1983 DOYLE J J DOYLE J L A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue Phytochemical Bulletin 19 11 15 1987 DOYLE J J DOYLE J L Isolation of plant DNA from fresh tissue Focus 12 13 15 1990 2 3 EXTRACAO DE DNA DE BACTERIAS ENDOFITICAS DE RAIZ Bact rias promotoras de crescimento vegetal podem ser encontradas dentro das raizes de plantas Estas podem ocupar o espaco intracelular em estruturas especializadas denominadas n dulos ou extracelular no espa o entre duas c lulas vizinhas O processo de extra o de DNA inicia com a separa o das c lulas destes micro organismos das c lulas da planta rompimento da sua parede celular liberando o DNA e s
20. Indicador ferro na Dissolva 1 485 g de 1 10 fenantrolina monohidratada C H N H O juntamente com 0 695 g de sulfato ferroso P A FeSO 7H O em gua destilada e dilua a 100 mL Preparo da vidraria Lavar primeiramente com gua da torneira e sab o Passar um pouco de KOH 6 Lavar novamente com gua da torneira Enxaguar com gua deionizada Dica tomar cuidado porque a vidraria fica lisa Procedimento 1 Pipetar 50 mL da amostra para erlenmeyer de fundo chato de 500 mL Dica para amostras com DQO gt 900 mg L necess rio fazer dilui o Exemplos de dilui o Soro de queijo 1 500 1 mL da amostra em 500 mL de gua avolumar em bal o volum trico Soro de ricota 1 200 1 mL da amostra em 200 mL de gua avolumar em bal o volum trico 2 Adicionar 1 g de sulfato de merc rio e p rolas ao mesmo erlenmeyer 3 Adicionar 5 mL de cido sulf rico sulfato de prata gelado para o Erlenmeyer homogeneizando bem Esfriar enquanto estiver agitando para evitar a perda de material vol til 4 Adicionar 25 mL de dicromato de pot ssio 0 25 N 5 Conectar erlenmeyers de fundo chato e abrir a gua 6 Adicionar mais 70 mL de cido sulf rico sulfato de prata gelado aos erlenmeyers sob agita o Antes de ser aquecida a amostra deve estar bem homogeneizada 7 Ligar o aquecimento da chapa em 150 C 8 Deixar por 2 horas no aquecimento contar a partir do momento em que come a a borbulhar ou corre pelas parede
21. Protocolo do ensaio de trombina substrato sint tico ad te Trombina Substrato Identifica o da z Po o aaa Tamp o pL 0 02 mg mL S2238 2 mM pL pL ug po o HL ug po o 1c x x x 10 02 10 As quantidades e o n mero de amostras a serem testadas devem ser definidas previamente e dependem de cada experimento Dicas O volume final de cada po o deve ser de 100 pL O volume de substrato e trombina s o fixos O volume de amostra pode variar Utilizar o tamp o Tris HCl 20 mM pH 7 4 para completar o volume final de cada po o para 100 pL Correr cada uma das amostras em triplicata Os reagentes devem ser adicionados na seguinte ordem 1 Amostra 2 Tamp o Tris HCl 20 mM pH 7 4 3 trombina e 4 substrato Incubar a amostra tamp o trombina por 10 minutos 37 C antes da adi o do substrato 1 6 Ler a absorb ncia em espectrofot metro de microplacas 405 nm no tempo inicial A1 logo ap s a adi o do substrato Incubar a placa 37 C e ap s 30 minutos de rea o repetir a leitura no mesmo comprimento de onda A2 tempo final Dica se o experimento estiver sendo realizado em um espectrofot metro capaz de realizar leituras cin ticas selecionar o modo cin tico em 405 nm e realizar leituras sequenciais de 10 em 10 segundos at o tempo final de 30 minutos Durante todo o tempo da leitura a placa deve permanecer aa C
22. a Pesar e juntar os reagentes em um b quer com capacidade para 1 L b Adicionar 500 mL de gua destilada e dissolver os reagentes c Completar a solu o at 1 L de gua destilda d Guardar a solu o em temperatura ambiente protegido da luz gt gt cil Solu o corante estoque A solu o corante formada por duas solu es C e D SOLU O C 5 g de carbonato de s dio 5 a Pesar o carbonato de s dio e colocar em um b quer com capacidade para 100 mL b Adicionar cerca de 50 mL de gua destilada e dissolver o reagente c Completar at 100 mL da solu o com gua destilada d Guardar em temperatura ambiente protegido da luz SOLU O D 0 1 g de nitrato de am nio 0 1 0 1 g de nitrato de prata 0 1 0 25 g de cido tungstosalic lico 0 25 0 15 mL de formalde do 0 15 a Pesar e juntar os reagentes em um b quer com capacidade para 100 mL b Adicionar cerca de 50 mL de gua destilada e dissolver os reagentes c Completar at 100 mL da solu o com gua destilada d Guardar em temperatura ambiente protegido da luz Solu o corante uso 66 mL da solu o C 34 mL da solu o D Preparar na hora do uso Solu o de parada a Em um b quer com capacidade para 100 mL colocar 1 mL de cido ac tico e 99 mL de gua destilada Agarose Low Melting Point LMP 0 07 g de agarose Low Melting Point 10 mL de PBS 1X a Pesar a agarose e colocar em um b q
23. atingir o peso constante Dica o peso constante deve ser atingido ap s a perman ncia do tubo em 24 horas na estufa 10 Ao finalizar o tempo de perman ncia na estufa colocar o tubo Falcon com a biomassa em dessecador at atingir a temperatura ambiente 11 Realizar a pesagem do tubo Falcon com a biomassa e anotar conforme pr via identifica o 12 Fazer o c lculo peso final do tubo Falcon com a biomassa peso inicial do tubo Falcon vazio O resultado ser a quantidade de biomassa formada para uma al quota de 10 mL durante o cultivo do microrganismo 7 4 DETERMINA O DA ACIDEZ TITUL VEL Esse m todo empregado na determina o da acidez titul vel de amostras de alimentos obtidos por meio de processos de cultivo de microrganismos ou seja de alimentos fermentados Consiste na titula o de uma quantidade conhecida de amostra com uma solu o alcalina normalmente de NaOH de concentra o exata e conhecida ou seja padronizada utilizando como indicador a fenolftale na M todo de BRASIL 1981 Equipamentos Balan a anal tica Vidrarias utens lios e outros Bast o de vidro Erlenmeyer de 125 mL Bureta de 25 mL Reagentes Solu o de hidr xido de s dio NaOH 0 1 N Solu o alco lica de fenolftale na C H O a 1 m v 1 Prepara o conforme tipo de amostra 1 1 Leite fermentado Pesar 10 g da amostra adicionar 10 mL de gua isenta de g s carb nico e homogeneizar 1
24. baixos pr ximo a zero J no caso de buscarmos sequ ncias obtidas a partir de um organismo que n o possui muitas sequ ncias no banco em geral iremos encontrar sequ ncias de outros organismos que apresentam similaridade mas n o s o id nticas Portanto nesse caso esperamos E value mais alto 1e por exemplo 9 Na se o Alignments poss vel ver os alinhamentos propriamente ditos Dica para acessar as sequ ncias encontradas para copi las e arquiv las em formato FASTA por exemplo basta clicar no n mero de acesso das mesmas nesta se o Uma nova janela aba ser aberta mostrando a sequ ncia e todas as informa es associadas a ela Dica 2 observar no cabe alho de cada alinhamento qual a fase de leitura da sequ ncia de interesse a qual foi alinhada com a sequ ncia de prote na do banco em Frame Valores 1 2 e 3 indicam fases de leitura da fita senso 1 2 e 3 indicam fases de leitura da fita antissenso Busca por similaridade em banco de dados de nucleot deos traduzidos para prote na utilizando sequ ncia de prote na como query tBLASTn prote na X nucleot deos traduzidos O tBLASTn utilizando quando se quer encontrar sequ ncias de nucleot deo em um banco de dados que apresentem similaridade com uma sequ ncia de interesse de prote na Para isso o BLAST traduz todas as sequ ncias de nucleot deos do banco nas seis fases de leitura poss veis tr s da fita senso e
25. cinco dias as c lulas em PBS 1x at proceder a marca o Dica 2 a realiza o deste protocolo em ambiente est ril fluxo laminar mant m as c lulas integras e ajuda a manter a morfometria celular 5 Marcar as c lulas com 300 pL de PBS 1x 0 5 pL de Triton X 100 0 1 300 nM de DAPI por 30 minutos Dica DAPI um corante fluorescente que se liga ao DNA 6 Retirar a solu o de marca o contendo DAPI e adicionar 500 mL de PBS 1x por po o Dica a marca o permanece relativamente est vel por 10 dias no escuro 7 Fotografar os po os de interesse para o vis vel e fluoresc ncia utilizando objetiva de 20x ETAPA 2 Obten o dos dados morfom tricos 1 Abrir o arquivo da primeira imagem a ser analisada no software Image Pro Plus IPP 2 Clicar em Irregular AOI e clicar seguidamente no primeiro n cleo a ser analisado at que este adquira o contorno vermelho em conformidade com sua morfometria Dica preciso ter cuidado durante a marca o dos n cleos marca o al m da rea nuclear ou inferior a mesma gera dados incorretos Exemplos de marca es corretas ou incorretas podem ser encontrados na refer ncia abaixo 3 Ao t rmino da sele o correta do primeiro n cleo manter a tecla Ctrl pressionada e clicar sobre o pr ximo n cleo a ser marcado e assim sucessivamente D gt gt CH 4 Quando todos os nticleos a serem considerados estiverem marcados selecionar Count gt Measure
26. de sequ ncias depositadas no banco como humanos camundongo mosca da fruta ou arroz esperamos encontrar E value baixos pr ximo a zero J no caso de buscarmos sequ ncias obtidas a partir de um organismo que n o possui muitas sequ ncias no banco em geral iremos encontrar sequ ncias de outros organismos que apresentam similaridade mas n o s o id nticas Portanto nesse caso esperamos E value mais alto 1e por exemplo 9 Na se o Alignments poss vel ver os alinhamentos propriamente ditos Dica para acessar as sequ ncias encontradas para copi las e arquiv las em formato FASTA por exemplo basta clicar no n mero de acesso das mesmas nesta se o Uma nova janela aba ser aberta mostrando a sequ ncia e todas as informa es associadas a ela Busca por similaridade em banco de dados de prote nas utilizando sequ ncia proteica como query BLASTp prote na X prote nas O BLASTp utilizando quando se quer encontrar sequ ncias de prote nas em um banco de dados que apresentem similaridade com uma sequ ncia de interesse tamb m de prote na 1 Acessar o site http www ncbi nlm nih gov No canto direito da p gina encontrar e clicar na op o BLAST 2 Na p gina seguinte clique na op o protein blast na se o Basic BLAST 3 Na caixa Enter query sequence cole a sequ ncia da prote na que deseja alinhar com o banco de dados 4 No menu Dat
27. e armazenar 20 C Dica antes da filtragem em poro 0 22 um filtrar em papel filtro comum que facilita a ltima etapa e economiza o filtro mais caro Refer ncias BEYS DA SILVA W O SANTI L BERGER M PINTO A F M GUIMAR ES J A SCHRANK A VAINSTEIN M H Characterization of a spore surface lipase from the biocontrol agent Metarhizium anisopliae Process Biochemistry 44 829 834 2009 gt gt cm CAPITULO 14 MODELOS BIOLOGICOS PRE CLINICOS PARA AVALIACAO DA ATIVIDADE DE SUBSTANCIAS FARMACOLOGICAMENTE ATIVAS Jorge Almeida Guimaraes Luc lia Santi Markus Berger Oliveira Walter Orlando Beys da Silva Os modelos biol gicos t m papel fundamental tanto na etapa de pesquisa b sica quanto nas etapas de desenvolvimento pr clinico para novos medicamentos e subst ncias farmacologicamente ativas Nesses casos modelos que utilizam organismos vivos para mimetizar uma determinada fisiopatologia s o imprescind veis para o seguimento de uma s rie de etapas entre elas A sele o do alvo molecular o desenvolvimento de ensaios farmacol gicos espec ficos que permitam aferir a atividade sobre o alvo selecionado o desenho molecular racional de ligantes para o alvo eleito testes de seguran a e efic cia e ensaios de toxicologia Neste cap tulo apresentaremos alguns protocolos de modelos biol gicos in vivo cl ssicos teis tanto para o estudo do mecanismo de a o de novas subst ncias e ou extratos qua
28. fuga desprezando o sobrenadante e ressuspender as c lulas epiteliais no meio de cultura meio 199 Dica preparo do Meio 199 1 pacote de p MEIO199 1 litro de gua Milli Q 10 mL de Kanamicina 0 35 g de Bicarbonato de S dio NaHCO 1 Becker de 1 litro 1 barra magn tica grande Colocar em um Becker de um litro a Kanamicina o meio 199 o bicarbonato e parte da gua Agitar no agitador magn tico at homogeneizar Acertar o pH para 7 2 e completar o volume para um litro Filtrar para esteriliza o com filtro a v cuo membrana de 0 22 um Suplementar com soro bovino fetal na concentra o desejada 5 a 10 Colocar uma gota da suspens o em um tubo de ensaio e fazer a contagem das c lulas 20 pL corante azul de tripan 20 uL suspens o celular e olhar no microsc pio o volume de suspens o que deve ser plaqueado em cada placa O volume a ser plaqueado 1 x 10 c lulas mL Partindo dessa densidade calcula se o volume de suspens o mL a ser plaqueado nas placas Dica c lulas contadas no hemocit metro 4 6 2 5 3 7 3 2 soma total 32 Divide se por 8 4 este n mero ser multiplicado por 2 que representa o fator de dilui o do corante resultando em 8 Teremos desta forma 8 x10 c lulas mL no entanto o volume a ser plaqueado 1x10 c l mL logo 8 x10 c l mL 0 8x10 c l mL Desta forma calcula se o volume a ser plaqueado por meio de uma regra de tr s Por exemplo 0 8x10 c l
29. nas de origem animal apresentam digestibilidade acima de 90 enquanto que as de origem vegetal abaixo de 80 sendo que quando as prote nas s o isoladas de sua forma ED gt Cm natural com bastantes cuidados e que sofreram desnatura o podem apresentar maior grau de digestibilidade No entanto desnatura es com a a o do calor tendem a diminuir o grau de digestibilidade A digestibilidade de uma prote na representa a parte da prote na que pode ser hidrolisada pelas enzimas digestivas estas prote nas seriam ent o quebradas em amino cidos estando dispon veis ao organismo humano Nestes ensaios procura se imitar as condi es de acidez do est mago sendo por isso chamada in vitro Consiste numa propriedade importante pois representa o valor nutritivo de uma prote na Equipamentos Balan a anal tica Aparelho de banho Maria digital pHmetro Centrifuga Vidrarias utensilios e outros Espatula Proveta graduada Pipeta graduada B quer Tubos de ensaio Espatula B quer 50 mL Tubos de centrifuga Pipeta de pasteur Reagentes Pepsina HC10 1 N Merthiolate incolor NaOH 0 2 N Pancreta na Tamp o de fosfato cido tricloro ac tico 5 Procedimento Inicialmente pesa se uma quantidade de amostra que corresponda ao equivalente a 0 5 g de prote na Prepara se uma solu o de 1 5 mg de pepsina por mL de HCI 0 1 N e adiciona se 15 mL desta solu o amostra A seguir adiciona se 0 5 mL de solu
30. no entanto a remo o total das folhas que envolvem o meristema deve ser realizada somente depois dos procedimentos de desinfesta o e no momento da incuba o 3 Os ramos devem ser submetidos lavagem em gua corrente por cerca de 20 minutos para promover a limpeza superficial Dica o tempo de lavagem pode ser diferenciado dependendo de cada esp cie ou mesmo do tipo de material a ser incubado segmentos nodais sementes embri es ou meristemas 4 Ap s procede se a retirada de parte das folhas e do caule que n o ser o utilizados como explantes reduzindo assim a quantidade de in culos Recomenda es 1 Antes de iniciar os procedimentos de incuba o a capela de fluxo laminar deve ser previamente limpa com lcool et lico 70 2 Todo o material pin as bisturis placas de petri a ser utilizado no procedimento de incuba o deve ser previamente autoclavado 3 Quando os materiais forem distribu dos na c mara de fluxo de ar estes devem receber jatos de lcool et lico 70 Ent o a luz ultravioleta mantida ligada por 20 minutos per odo em que ningu m deve permanecer na sala de assepsia 4 A seguir em capela de fluxo laminar os ramos restantes s o imersos em diferentes concentra es de subst ncias Tabela 3 que podem contribuir para a desinfesta o A seguir na c mara de fluxo laminar os ramos s o imersos nas solu es de desinfesta o Tabela 3 conforme o protocolo a ser s
31. o WolfPSORT permite a an lise de mais de uma sequ ncias simultaneamente caso queira analisar m ltiplas sequ ncias col las na caixa em formato FASTA 4 Clique em Submit Query 5 Analisar os resultados O WolfPSORT utiliza v rias informa es para chegar ao resultado final S o indicados valores para cada poss vel localiza o subcelular Os maiores valores s o os mais prov veis Notar que os valores n o s o valores de probabilidade Predi o de sequ ncias N terminais de direcionamento utilizando iPSORT O iPSORT permite a predi o de sequ ncias de direcionamento localizadas na regi o N terminal das prote nas analisadas Dentre eles destacam se os pept deos sinal envolvidos no direcionamento de prote nas para a via de secre o pept deos de direcionamento para a mitoc ndria e pept deos de direcionamento para o cloroplasto 1 Acessar o site http wolfpsort org Dica para encontrar diretamente digite psort no Google Ao entrar na p gina busque e clique em iPSORT Prediction 2 Colar a sequ ncia na caixa abaixo de iPSORT Prediction 3 Selecionar a origem da sequ ncia entre Plant Protein e Non plant Protein 4 Clique em Submit 5 Analisar os resultados O iPSORT compara a sequ ncia N terminal da sequ ncia submetida com as de prote nas sabidamente contendo sinais N terminais de direcionamento Tr s perguntas ser o respondidas nos resultad
32. o da mat ria org nica a temperatura de 550 C O produto obtido denominado de res duo mineral fixo M todo de BRASIL 1981 Equipamentos Balan a anal tica Mufla Chapa aquecedora ou estufa Vidrarias utensilios e outros Cadinhos de porcelana Dessecador Tenaz met lico Procedimento 1 Numerar os cadinhos com l pis de escrever Dica utilizar preferencialmente l pis 6B 2 Calcinar cadinhos para elimina o de poss veis interferentes colocando os na mufla 550 C por 1 hora 3 Aguardar os cadinhos atingirem temperatura inferior 300 C Dica deixar a mufla levemente aberta agiliza o processo 4 Transferir os cadinhos para o dessecador at atingirem temperatura ambiente 5 Pesar os cadinhos em balan a anal tica e anotar as massas peso inicial 6 Pesar 5 g de amostra 7 Colocar os cadinhos com a amostra previamente pesada em estufa 105 C ou chapa aquecedora at que a amostra evapore amostra l quida e queime demais amostras Dica cuidar para que a amostra n o respingue e n o ferva 8 Calcinar as amostras na mufla 550 C por 3 horas ou pelo tempo necess rio para estarem com colora o branco acinzentada Dica se a amostra ao sair da mufla apresentar colora o enegrecida colocar 2 a 3 gotas de per xido de hidrog nio H O 3 e retornar a mufla por tempo necess rio para ficarem branco acinzentada 9 Aguardar os cadinhos atingirem temperatura inferior
33. o de crescimento vegetal por um isolado bacteriano D gt cm 10 1 ISOLAMENTO DE DIAZOTROFICOS ENDOFITICOS DE RAIZ O processo de isolamento de bact rias endof ticas envolve a desinfesta o das ra zes para que o maior n mero poss vel de bact rias aderidas superf cie radicular seja eliminado Suspens es contendo ra zes picotadas s o posteriormente inoculadas em meios de cultura sem N para a obten o de diazotr ficos Esse procedimento pode ser aplicado aos mais variados tipos de plantas mas altera es no volume das solu es de lavagem podem ser necess rias conforme varia es no tamanho e morfologia de diferentes ra zes vegetais M todo baseado em D bereiner et al Embrapa 1995 1 Lavar as ra zes em gua corrente para m xima retirada de solo rizosf rico Dica ap s a coleta do material vegetal o mesmo deve ser mantido em geladeira por um per odo m ximo de 48 horas at o processo de isolamento 2 Transferir o material para um recipiente limpo b quer de 1 L adicionar 500 ml de lcool 70 e manter as ra zes submersas por 1 minuto com agita o manual Dica caso as ra zes utilizadas sejam de grande porte como exemplo do girassol recomenda se cortar peda os menores para uma adequada desinfec o 3 Descartar todo volume de lcool 70 adicionar 500 ml de hipoclorito dilu do em gua destilada est ril 1 1 e manter as ra zes submersas por 1 minuto com agita o manual 4 De
34. o de glicose Volume de Conc final de ps 1 gua glicose uL uL umol 0 0 300 0 1 20 280 1 112 2 40 260 2 224 3 60 240 3 336 4 80 220 4 448 5 100 200 5 560 6 120 180 6 672 7 140 160 7 784 nm o primeiro ponto como zero 1 8 Adicionar 300 pL de tamp o citrato fosfato 0 05 M pH 6 0 e incubar em banho maria 40 C por 30 minutos 1 9 Adicionar 1 5 mL de reagente DNS 1 10 Em seguida ferver por 5 minutos em banho maria 1 11 Adicionar 17 9 mL de gua destilada 1 12 Resfriar em temperatura ambiente e medir a absorb ncia em espectrofot metro a 550 1 13 Colocar os dados em uma curva de quantidade de glicose mmol X absorb ncia Utilizar Biotecnologia a gt cem Dicas A concentra o de a cares redutores ser expressa em mmol de glicose A faixa de concentra o da curva de calibra o poder variar para se ajustar s concentra es encontradas nas amostras analisadas Ensaio de Atividade Amilol tica 1 14 Em um tubo de ensaio de cerca de 25 mL com tampa adicionar 200 pL de tamp o citrato fosfato 0 05 M e 300 pL de solu o de amido sol vel 1 1 15 Incubar em banho maria 40 C e deixar atingir o equil brio t rmico aproximadamente de 1 a 2 minutos 1 16 Adicionar 100 uL da amostra a ser testada e deixar no banho por 30 minutos na mesma temperatura Essa sequ ncia deve ser seguida para os tubos seguintes em intervalos de tempo previamente estipulados 15 a 30 segund
35. o leguminosas Bras lia Embrapa SPI 60 p 10 2 ISOLAMENTO DE DIAZOTR FICOS DE SOLO RIZOSFERICO O processo de isolamento de bact rias associativas envolve a coleta de solo rizosf rico aquele que est intimamente aderido s ra zes Posteriormente as suspens es s o inoculadas em meios de cultura apropriados ao objetivo do estudo e o processo de isolamento pode ser aplicado a solos de qualquer proced ncia M todo baseado em D bereiner et al Embrapa 1995 1 Coletar o solo rizosf rico 2 Para o preparo das suspens es iniciais pesar 10 g de solo rizosf rico e adicionar a um frasco do tipo erlemeyer de 200 ml contendo 90 ml de solu o salina est ril NaCl 0 85 Realizar o procedimento em triplicata e manter os frascos sob agita o constante por 12 horas 30 C 3 Os demais passos s o os mesmos descritos nos itens 8 a 14 do 10 1 Protocolo de isolamento de diazotr ficos endof ticos de raiz descrito anteriormente Refer ncias DOBEREINER J BALDANI V L D BALDANI I 1995 Como isolar e identificar bact rias diazotr ficas de plantas n o leguminosas Bras lia Embrapa SPI 60 p 10 3 ISOLAMENTO DE DIAZOTR FICOS FORMADORES DE END SPOROS DE SOLO RIZOSF RICO O processo envolve a elimina o das c lulas vegetativas presentes na rizosfera o que favorece o posterior isolamento de bact rias anaer bias facultativas e formadoras de end sporos de resist ncia ao estresse A utiliza o do
36. ou apenas a sequ ncia complementar modifique a op o selecionada no menu abaixo da janela para reverse ou complement A op o padr o ser sempre reverse complement A sequ ncia reverso complementar ser gerada em uma nova janela D gt cm 11 5 BUSCA DE SIMILARIDADE DE SEQUENCIAS UTILIZANDO UM BANCO DE DADOS DE SEQUENCIAS E AS FERRAMENTAS BLAST BASIC LOCAL ALIGNMENT SEARCH TOOL Sequ ncias de nucleot deos e amino cidos apresentam similaridade com outras sequ ncias principalmente quando estas s o relacionadas evolutivamente Por exemplo sequ ncias de genes que s o parte de uma mesma fam lia g nica apresentam regi es parecidas em diferentes graus A ferramenta BLAST permite identificar as regi es de uma sequ ncia de interesse query que se pare a com outras presentes em bancos de dados como o GenBank Isto pode ser feito tanto com sequ ncias de nucleot deos quanto de prote na O BLAST se baseia no chamado alinhamento local que permite alinhar por es de uma sequ ncia de interesse com outras sem necessariamente comparar todos os nucleot deos amino cidos presentes nas mesmas Portanto o alinhamento local alinha peda os similares de sequ ncia e mostra o qu o parecidos estes fragmentos s o mas n o obrigatoriamente mostra o qu o similar as duas sequ ncias completas s o Busca por similaridade em banco de dados de nucleot deo utilizando sequ ncia nucleot dica como query B
37. primers complementares cauda poli A caracter stica do mRNA RNA mensageiro produzindo um cDNA mais puro exclusivamente a partir do mRNA Considerando que a fra o do mRNA corresponde a aproximadamente 3 4 do RNA total estima se que 1 pg de RNA total fornece 20 ng de cDNA O cDNA posteriormente utilizado para a amplifica o de genes de interesse pela PCR A t cnica de RT PCR pode ser usada para comparar os n veis de mRNA e caracterizar seus padr es de express o Wang amp Brown 1999 Protocolo baseado no Kit SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 1 Ap s a quantifica o do RNA construir uma tabela com os volumes correspondentes para x pg de RNA pl de solu o Amostra de RNA mg uL de RNA p lpg de RNA yl H O Completar para 10 uL 2 Preparar a MIX sempre para o n mero de tubos 1 extra Mix cada rea o p n tubos 1 ex 8 10X PCR Buffer 2 uL 18 pL 25 mM MgCl 4 yL 36 pL 0 1 M DTT 2 uL 18 pL RNAse OUT 1pL 9uL Dica sempre centrifugar brevemente spin os reagentes antes de usar Descongelar e manter todos os reagentes e principalmente o RNA no gelo 3 Pipetar o volume respectivo de H O com DEPC do Kit em cada tubo 4 Pipetar o volume correspondente de RNA e manter a amostra sempre no gelo 5 Adicionar 1 pL de dNTP mix em cada tubo 6 Adicionar 1 pL de primer OligodT 10 mM a cada tubo 7 Incubar 65 C por 5 minutos 8
38. veis propriedades qu micas ou biol gicas Adaptado de Brasil 2005 Harbore 1998 e Sim es 2004 Material necess rio 8 Becker 25 mL 5 Provetas 7 Funis pequeno de vidro 7 Papeis filtro 1 Tesoura 13 Tubos de ensaio 5 Tubos de ensaio grande Pipeta Pasteur Tetina 5 Esp tulas 1 Balan a 1 Banho Maria 4 Grade para tubo de ensaio 1 R gua 1 Cron metro 1 Papel alum nio 4 Vidros de rel gio 1 Cadinho c psula de porcelana Atilho Planta seca e mo da Solventes Solu es gua Solu o aquosa de cloreto f rrico 1 Solu o aquosa de hidr xido de pot ssio 3 Solu o aquosa de gelatina 1 Solu o aquosa de cloreto f rrico 1 N butanol Metanol Biotecnologia Acido cloridrico concentrado 0 1 g de magn sio met lico Solu o metan lica de hidr xido de pot ssio 5 Hidr xido de pot ssio 5 cido ac tico Tolueno Solu o de hidr xido de pot ssio 3 cido clor drico 10 Reagente de borntrager cido clor drico 10 Metanol cido clor drico 10 Reagentes de mayer dragendorff wagner e bertrand Acetona Cuidados aplic veis Cuidar com a identifica o das Plantas bem como n o misturar duas plantas diferentes no mesmo processo ao mesmo tempo Este Screening Fitoqu mico adaptado das refer ncias citadas para utilizar se como Material Vegetal o extrato seco da pl
39. 0 2 mL alinhados na estante ao lado da placa e adicionar 45 pL do mix do gene 1 em cada um deles 6 Com a pipeta multicanal transferir 10 pL do mix do gene 1 em cada pocinho da coluna 1 2 3 e4 das linhas A B C D Ee F 7 Descartar os eppendorfs auxiliares 8 Colocar 6 novos eppendorfs de 0 2 mL alinhados na estante ao lado da placa e adicionar 45 pL do mix do gene 2 em cada um deles 9 Com a pipeta multicanal transferir 10 uL do mix do gene 2 em cada pocinho da coluna 5 6 7 e8 das linha A B C D E eF 10 Descartar os eppendorfs auxiliares 11 Adicionar 10 uL de cDNA dilu do 100X em cada pocinho correspondente a cada amostra 11 Os pocinhos F4 e F8 ser o os controles negativos dos respectivos genes 1 e 2 Nestes adicionar 10 uL de H O ao inv s do cDNA Dica Caso se formem algumas bolhas na parede dos pocinhos as mesmas dever o ser empurradas para baixo com o aux lio de uma ponteira ou com uma centr fuga de placas Cuidar para n o contaminar os po os vizinhos 12 Colocar o adesivo na placa Dica O adesivo deve estar bem fixado para evitar a evapora o dos reagentes 13 Colocar a placa dentro do equipamento de RT qPCR para an lise da express o g nica 14 Criar ou editar um template e salv lo com um nome apropriado 15 Iniciar a rea o 16 Salvar o arquivo e calcular os valores de express o 5 6 CONFIGURACAO DO EQUIPAMENTO STEPONE APPLIED BIOSYSTEMS PARA ANALISES DE EXPRESSA
40. 1 7 Calcular a m dia aritm tica de cada uma das amostras e subtrair a absorb ncia final da inicial A2 A1 1 8 Os valores de A2 A1 correspondem a p nitroanilina liberada durante a rea o Calcular a quantidade de p nitroanilina presente em cada po o utilizando a equa o da reta obtida pela curva padr o de p nitroanilina seguindo o mesmo exemplo descrito anteriormente para tripsina e expressar o resultado final como quantidade de produto formado minuto volume de rea o nmol minuto mL 2 An lise dos Resultados 2 1 Ap s realizados todos os c lculos conforme indicado acima os resultados s o expressos pelos valores de atividade enzim tica residual Ou seja pela quantidade de p nitroanilina gerada por unidade de tempo e por volume de rea o Na presen a de um inibidor de trombina a quantidade de p nitroanilina diminui e consequentemente diminui a atividade enzim tica residual Refer ncias BERGER M RECK J JR TERRA RM PINTO AF TERMIGNONI C GUIMAR ES JA Lonomia obliqua caterpillar envenomation causes platelet hypoaggregation and blood incoagulability in rats Toxicon 2010 55 33 44 FRANCISCHETTI IM MONTEIRO RQ GUIMAR ES JA Identification of glycyrrhizin as a thrombin inhibitor Biochem Biophys Res Commun 1997 235 259 263 MOZZICAFREDDO M CUCCIOLONI M ELEUTERI AM FIORETTI E ANGELETTI M Flavonoids inhibit the amidolytic activity of human thrombin Biochimie 2006 Sep 88 9 1297 306 15 4 ATIVIDA
41. 10X em 900 mL de gua Milli Q autoclavada Preparo do tamp o de corrida Tamp o Type III Para 5 mL Pesar 0 0125 g de xylene cyanol e 0 0125 g de azul de bromofenol Misturar em um becker 1 5 mL de glicerol 3 5 mL de gua Milli Q e os corantes Agitar at dissolver Distribuir em cinco tubos eppendorfs e armazenar na geladeira Refer ncia WATSON James D et al 2006 Biologia Molecular do Gene 5 ed Porto Alegre Artmed 5 5 PREPARACAO DE UMA PLACA DE RT qPCR PCR EM TEMPO REAL DE 48 POCOS O PCR em Tempo Real utilizado para analisar a express o de genes espec ficos de maneira precisa e altamente reprodut vel por meio de um mecanismo de detec o e quantifica o por fluoresc ncia A t cnica tamb m pode ser aplicada para quantifica o de carga viral genotipagem detec o de agentes infecciosos testes de efici ncia terap utica e todas as aplica es da PCR convencional Protocolo para an lise de express o g nica de 4 genes 3 genes testes 1 gene controle Dicas As amostras devem ser testadas sempre em triplicatas biol gicas e quadruplicatas t cnicas Todo o procedimento deve ser realizado no gelo 1 Identificar 4 tubos eppendorf de 1 5 mL com os nomes dos respectivos genes 2 Pipetar os seguintes itens em cada eppendorf identificado mix para 1 4 de placa 12 po os HO 49 7 uL Tamp o 10X 10X 26 5 pL MgCl 50 mM 15 9 pL dNTPs Mix 10 mM 2 7 yL Primer F 10 mM 5 3 yL Primer R 10
42. 10x 1L 90 g NaCl 2 g KCl 11 2 g Na HPO 2 g KH PO 1000 mL Agua Milli Q Ajustar o pH para 7 4 e autoclavar Repique Passagem de c lulas e viabilidade celular Materiais Meio de cultura nutritivo tripsina EDTA soro bovino fetal SBF antibi tico de escolha PBS descarte lcool 70 azul de tripan pipetas pipetador garrafas est reis ou frascos de cultura c mera de Neubauer hemocit metro ponteiras tubos eppendorf e tubos falcon Quando as c lulas atingem conflu ncia de 80 90 necess rio sujeit las subcultura evitando se deste modo a morte celular 1 Trazer o meio de cultura tripsina SBF e PBS a temperatura ambiente 2 Ligar o fluxo 3 Limpar os materiais com lcool 70 e coloc los no fluxo ligar a l mpada germicida por 15 minutos 4 Inicia se o processo pela lavagem das garrafas Dica ao abrir os frascos sempre deixar a tampa virada para cima evitando contamina es 5 Desprezar o meio consumido 6 Colocar 2 mL de PBS para lavar em frascos pequenos e 4 mL em frascos grandes 7 Desprezar o PBS 8 Colocar 1 mL de tripsina no frasco de cultura 9 Incubar 2 3 minutos na estufa a 37 C para desprendimento das c lulas Dica n o manter por mais de 3 minutos Degrada o celular 10 Preparar meio completo suplementado com 10 soro bovino fetal 11 Passados 3 minutos na estufa verificar por meio de microscopia o desprendimento das c lulas 12 Certificado o despr
43. 11 Ap s a coleta do lavado bronco alveolar dissecar a regi o dos pulm es remov los e lav los com PBS Parte do tecido pulmonar deve ser congelado imediatamente em nitrog nio l quido e reservado para posterior an lise de mediadores inflamat rios Outra parte do tecido deve ser armazenada em formalde do tamponado 10 para an lise histol gica An lise dos Resultados Neste protocolo os resultados podem ser expressos de uma s rie de maneiras diferentes dependendo do direcionamento das an lises Normalmente o grau de inflama o pulmonar determinado pela contagem total e diferencial de c lulas inflamat rias presentes no lavado bronco alveolar A an lise dessas c lulas tamb m pode ser feita diretamente no tecido pulmonar por histologia Al m disso citocinas quimiocinas xido n trico e a atividade de algumas enzimas podem ser dosadas tanto no lavado bronco alveolar quanto no tecido pulmonar Refer ncias RUSSO M NAHORI MA LEFORT J GOMES E DE CASTRO KELLER A RODRIGUEZ D RIBEIRO OG ADRIOUCH S GALLOIS V DE FARIA AM VARGAFTIG BB Suppression of asthma like responses in different mouse strains by oral tolerance Am J Respir Cell Mol Biol 2001 24 5 518 26 14 5 MODELO DE PERMEABILIDADE VASCULAR Neste protocolo as altera es da permeabilidade vascular podem ser quantificadas pelo extravasamento vascular de um marcador o corante azul de evans que liga se albumina plasm tica Pela a o de um est mu
44. 1X Tris 1 8 g Glicina 8 64 g H O destilada q s p 1L Refer ncia ZIMMERMANN P HEINLEIN C ORENDI G ZENTGRAF U 2006 Senescence specific regulation of catalases in Arabidopsis thaliana L Heynh Plant Cell and Environment 29 1049 1060 16 5 GEL DE ATIVIDADE ZIMOGRAMA PARA DETECCAO DE SUPEROXIDO DISMUTASES Super xido dismutases SOD s o enzimas conhecidas como antioxidantes importantes para a desefa de c lulas expostas a oxig nio As enzimas SOD s o consideradas metaloenzimas pois necessitam de metais cofatores para sua atividade Com a metodologia descrita a seguir pode se identificar tr s tipos diferentes SOD Mn SOD mitocondrial CuZn SOD mais comum e abundante em eucariontos e Fe SOD encontrada em muitas bact rias e plast deos de plantas 1 Prepara o do gel Running H O destilada 5 6 mL 1 5 M Tris HCl pH 8 8 3 mL Acrilamida bis acrilamida 30 0 8 3 4 mL TEMED 5 pL Persulfato de am nio APS 10 50 uL Stacking 4 H O destilada 1 5 mL 0 5 M Tris HCl pH 6 8 750 pL Acrilamida bis acrilamida 30 0 8 750 uL TEMED 5 pL Persulfato de am nio APS 10 25 yL 2 Prepara o da amostra 2 1 O volume de amostra a ser carregado no gel de aproximadamente 20 uL sendo 10 pL de amostra e 10 uL de tamp o de amostra 2 2 N o ferver as amostras Preparar em eppendorfs e aplicar diretamente no gel Dica para cada amostra deve se preparar tr s eppendorfs Cada uma ser t
45. 2 Queijo Pesar 10 g da amostra acrescentar cerca de 50 mL de gua morna isenta de g s carb nico 40 C e agitar com bast o de vidro at dissolu o poss vel Transferir quantitativamente para bal o volum trico de 100 mL esfriar em gua corrente e completar o volume Transferir uma al quota de 50 mL para um erlenmeyer D gt CGH 1 3 Manteiga Fundir uma determinada quantidade da amostra em estufa a 40 50 C em b quer Deixar que ocorra a separa o de fase e filtrar a fase lip dica em papel de filtro recebendo em outro b quer Pesar uma al quota de 5 g da gordura filtrada em b quer de 250 mL acrescentar cerca de 40 mL de solu o lcool et lico e ter et lico 1 2 neutralizada Dica gua isenta de g s carb nico gua fervida e resfriada ou gua rec m destilada 2 Adicionar s amostras previamente preparadas conforme 1 1 e 1 2 10 gotas do indicador solu o alco lica de fenolftale na C H O a 1 m v e4a5 gotas do indicador para amostras preparadas conforme 1 3 3 Titular com a solu o de hidr xido de s dio NaOH 0 1 N at aparecimento de colora o r sea persistente por aproximadamente 30 segundos 4 C lculos Y em cido l tico V x f x 0 9 m Onde V volume da solu o de hidr xido de s dio 0 1 N gasto na titula o em mL f fator de corre o da solu o de hidr xido de s dio 0 1 N normalidade real dividida por 0 1 0 9 fator de convers o d
46. 4 uL de Triton X 100 1 20 pL de RNAse 20 mg 60 uL de Iodeto de Propideo 2 mg mL 10 mL q s p de PBS 1x Dica 2 pode se guardar no escuro por no maximo 1 semana 12 Leitura no cit metro de fluxo Refer ncias KISHAN A 1975 Rapid flow cytofluorometric analysis of mammalian cell cycle by propidium iodide staining J Cell Biol 66 188 193 NUNEZ R 2001 DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry Curr Issues Mol Biol 3 67 70 4 18 COMARCACAO COM ANEXINA V FITC IODETO DE PROPIDEO PARA ANALISE DE MORTE CELULAR Em c lulas saud veis o fosfolip deo de membrana fosfatidilserina FS se localiza exclusivamente na face citoplasm tica da membrana plasm tica Durante o processo de apoptose por m este fosfolip deo sofre flip flop e externalizado na membrana plasm tica Este protocolo se baseia na detec o da FS extracelular por meio da marca o espec fica com anexina V conjugada ao fluor foro verde fluorescente FITC por meio de microscopia e ou citometria de fluxo Ainda feita a comarca o com Iodeto de Propideo IP o qual perme vel apenas em c lulas que sofrem altera es na permeabilidade da membrana sinal t pico de necrose celular M todo de Zhang et al 1997 Protocolo referente placa de 24 po os os volumes podem ser ajustados de maneira diretamente proporcional conforme o tipo de placa Ex placa de 6 po os volumes 4x maiores placas de 12 po os volumes 2x ma
47. 43996258 pdf SINGH N P Mccoy M T Tice R R Schneider E L 1988 A simple technique for quantification of low levels of DNA damage in individual cells Experimental Cell Research 175 184 191 4 14 ANALISE DE CITOTOXICIDADE POR ALAMAR BLUE Os ensaios de citotoxicidade foram um dos primeiros bioensaios in vitro utilizados para prever toxicidade de subst ncias a v rios tecidos Varios m todos in vitro para avaliar a toxicidade de diferentes amostras s o padronizados utilizando se culturas celulares O ndice de citotoxicidade IC pode ser avaliado por meio do alamar blue AB ou resazurina que um indicador de oxirredu o e da fun o mitocondrial sendo reduzido apenas por c lulas vi veis a resorufina lil s conforme Al Nasiry et al 2007 O AB tem sido utilizado como ferramenta efetiva para avaliar a atividade metab lica e prolifera o de linhagens celulares Para realiza o do experimento utilizar os seguintes materiais e reagentes Controle positivo Doxorubicina C lulas da linhagem CHO K1 2 0 x 10 c lulas po o 200 pL 20uL de alamar blue a 10 ex 180 pL de meio 20uL de Alamar blue Meio de cultura para c lulas DMEM HAM F10 suplementados com SBF 10 Leitor de placa com filtros para os comprimentos de onda 540 e 630 nm DMSO Placa para cultura de c lulas em poliestireno com 96 po os TPP TPP Frasco garrafa em poliestireno de alta transpar ncia 1 Cultivar as c
48. A pipeta volum trica B bureta Fonte Pr an lise 2014 A medida de liquidos com qualquer aparelho esta sujeita a uma s rie de erros devido as seguintes causas A o da tens o superficial sobre a superf cie l quida Dilata o e contra o provocadas pela varia o de temperatura Imperfeita calibra o dos aparelhos volum tricos Estes erros afetam a exatid o do aparelho A bureta mais exata que as pipetas graduadas que por sua vez s o mais exatas que as provetas O b quer e o erlenmeyer n o apresentam valor em termos de exatid o A leitura do volume contido no aparelho feita comparando se o n vel do l quido com as linhas calibradas existentes nas paredes do aparelho O n vel do l quido usualmente considerado como a parte inferior do menisco superf cie curva do l quido que mais facilmente localizada quando se coloca um ret ngulo preto a 1 mm abaixo do menisco Este ficar com uma colora o escura facilitando a leitura A leitura deve ser feita quando a curvatura inferior do menisco coincidir com a altura dos olhos Evita se assim o erro de paralaxe Forma correta de medir um volume LEITURA PELA PARTE INFERIOR DO MENISCO COM O OLHO AO N VEL APROPRIADO conforme Figura 6 Figura 6 Leitura de volume em proveta Erros de Paralaxe a Leitura de um vo lume maior que o correto b Leitura correta Leitura de um vo lume menor que o correto Leitura correta do menisc
49. Bi logo mestre em Gen tica e Biologia Molecular UFRGS professor de Biologia para Educa o B sica http lattes cnpq br 3003425308133539 Isabel Cristina Gouv a de Borba Bi loga mestre em Fisiologia Vegetal UFPel doutoranda do Programa de P s Gradua o em Bot nica UFRGS http lattes cnpq br 0233191758488472 Ivan Cunha Bustamante Filho M dico Veterin rio doutor em Zootecnia Produ o Animal UFRGS professor do Centro de Ci ncias Biol gicas e da Sa de CCBS e do Programa de P s Gradua o em Biotecnologia PPGBiotec do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 5447836974424243 Jorge Almeida Guimar es M dico veterin rio doutor em Ci ncias Biol gicas Biologia Molecular pela Escola Paulista de Medicina UNIFESP professor da Universidade Federal do Rio Grande do Sul UFRGS e do Programa de P s Gradua o em Biologia Celular e Molecular UFRGS Presidente da Coordena o de Aperfei oamento de Pessoal de N vel Superior CAPES http lattes cnpq br 7063936568198850 J lia Pasqualini Genro Bi loga doutora em Gen tica e Biologia Molecular UFRGS professora da Universidade Federal de Ci ncias da Sa de de Porto Alegre UFCSPA e do Programa de P s Gradua o em Biotecnologia PPGBiotec do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 3177897348100996 Luana Maria Wollinger Nutricionista mestranda do Programa de P s Gradua o em Bio
50. Biol Pharm Bull 28 12 2289 295 4 15 AVALIACAO DA PROLIFERACAO CELULAR PELO MTT A prolifera o celular pode ser avaliada pela t cnica do MITT dimettylthiazol diphenyltetrazolium bromide Mosmann 1983 O MTT um sal tetrazolium reduzido a formazan pelo sistema mitocondrial succinato tetrazolium redutase A prolifera o das c lulas resulta em um aumento da atividade do sistema mitocondrial que conduz a um aumento na quantidade de formazan formado A colora o produzida nessa rea o medida por densidade ptica sendo diretamente proporcional ao n mero de c lulas vi veis na placa 1 Preparar o reagente MTT na concentra o de 5 mg mL de PBS phosphate buffered saline pH 7 2 Dica utilizar o banho ultrass nico para diluir o MTT Preparo do PBS Pesar 1 120 g de Na2HPO4 ou 1 63 g de Na HPO 7 H 0 9 g de NaCl 0 2 g de KH PO e 0 2 g de KCl Dissolver os sais em parte da gua Milli Q 500 mL em agitador Ajustar o pH para 7 4 e completar o volume para 1 litro Autoclavar 2 Com as c lulas cultivadas em placas de 24 po os com 500 pL de meio de cultura por po o retirar 50 uL do meio de cultura das placas e adicionar 50 pL do MTT 3 Incubar as c lulas por 4 horas a 370C 4 Aspirar o meio de cultura das placas 5 Adicionar 100 pL de DMSO por po o 6 Transferir o conte do para placa de 96 po os para fazer a leitura em ELISA no comprimento de onda de 540 nm Dica fazer um grupo branco para a
51. C lulas de adiciona novo meio e CtB linhagem Tratar por 1 5 2 0 ciclos celulares Coletar no final do per odo celular na presen a da CtB de exposi o tratadas com E i o L i xposi o Longa Tratar por 1 5 2 0 ciclos celulares Coletar ap s 1 5 2 0 ciclos CtB removendo a subst ncia teste e e i celulares ap s adicionar novo meio e a CtB Adaptado da OECD 487 2010 DIA 2 44 horas ap s o preparo da amostra a Adicionar de 3 6 pg de CtB mL b Recolocar as amostras na estufa a 37 C at completar 72 horas ou 96 horas dependendo do protocolo utilizado DIA 3 OU 4 depende do protocolo de tratamento a ser utilizado 72 ou 96 horas ap s o preparo das amostras COLETA DAS C LULAS a Ap s o final da incuba o 72 h ou 96 h colocar a Formalina 1 e o Citrato de S dio 1 no banho Maria a 37 C b Transferir o conte do dos frascos ou placas de 12 po os meio c lulas em tubo c nico de aproximadamente 10 mL com tampa e devidamente identificados c Centrifugar a 1 500 rpm por 7 minutos cuidando o balanceamento d Enquanto centrifuga preparar para cada amostra Identificar um tubo c nico de pl stico e uma pipeta de Pasteur de pl stico Preparar fixador Carnoy m dia de 26 mL de fixador para cada amostra a Ao t rmino da centrifuga o descartar o sobrenadante com aux lio de pipeta de Pasteur b Adicionar 4 gotas de Formalina 1 em cada amostra c Agitar cada amost
52. Centrifugar 1 000 rpm por 5 min o Descartar o sobrenadante p Ressuspender o pellet lentamente e delicadamente 10 vezes q Adicionar 5 mL de Citrato de S dio 1 gelado r Ressuspender o material 10 vezes delicadamente com o citrato de Na s Aguardar 15 segundos t Adicionar 5 mL de Fixador 3 metanol 1 cido ac tico e 4 gotas de formalde do u Ressuspender 30 vezes delicadamente v Centrifugar 1 000 rpm por 5 mim w Descartar o sobrenadante x Ressuspender 30 vezes y Centrifugar a 1 000 rpm por 5 mim z Repetir os passos t a x novamente sem o formalde do aa Manter aproximadamente 1 mL do sobrenadante 2 dedos bb Ressuspender a amostra contendo agora apenas 1 mL Dica esse material pode ficar estocado no freezer desde que tampado com rolhas e identificado PREPARO DAS L MINAS a Retir las do lcool 70 b Coloc las dispostas em cubetas sob gua corrente da torneira para remover o lcool c Remover toda a gua da torneira e preencher a cubeta com gua destilada Obs ap s este processo segue se o protocolo para teste de micron cleo c lulas em suspens o a partir do item COLORA O Refer ncias FENECH M 2000 The in vitro micronucleus technique Mutation Research 455 81 95 OECD OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS DRAFT PROPOSAL FOR A NEW GUIDELINE 4 In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test 487 2009 Dispon vel em http www oecd org dataoecd 45 51
53. Fonte Dos autores 1 16 2 Uso de pipetas em geral Depois de perfeitamente limpa a pipeta ambientada lavando se com pequenas quantidades de solu o a medir para remo o de poss veis gotas de gua destilada que provocariam uma pequena dilui o na solu o Em seguida introduzida na solu o Faz se a suc o nunca com a boca at acima da marca do zero marca superior tendo o cuidado de evitar a forma o de bolhas Ap s a extremidade superior fechada com o dedo indicador nunca com o polegar Seca se a parte externa da pipeta com um papel filtro Depois relaxando levemente a press o do dedo deixa se escoar lentamente o l quido para zerar e s ent o procede se o escoamento desejado Ap s o escoamento aguarda se 15 segundos Se alguma gota ainda ficar na posi o inferior da pipeta esta removida encostando se a ponta da mesma contra a parede do recipiente Nunca se deve soprar a pequena por o de l quido que fica retido na extremidade da pipeta salvo em pipetas especiais Estas possuem duas listras na ponta superior Nestes casos pode se retirar o res duo de l quido de seu interior fechando se a extremidade superior com o dedo indicador e com a outra m o segurando o bulbo da pipeta Com isto provoca se ligeiro aumento da temperatura do ar interno causando uma expans o suficiente para expulsar o res duo de l quido A Figura 17 mostra como se manuseia corretamente uma pipeta Figur
54. K HPO 0 2g MgSO 2H O 0 2g FeCl 6H 0 0 01g CaCl 2H O 0 02 g NaMo 2H O 0 002 g Azul de bromotimol 0 5 2 5 mL gua destilada Completar volume para 1 L gar puro 1 8g pH ajustado para 5 5 com cido ac tico glacial CH COOH para o preparo do meio LGI P s lido com N adicionar tamb m 0 01 g L de extrato de levedura e 15 g de gar bacteriol gico ao inv s de gar puro conforme protocolo do meio LGI semiss lido sem N descrito nesse capitulo Meio de Cultura Reagentes Para 1L Nfb semiss lido sem eee 58 Nitrog nio PHPO 0 5 g MgSO 7H O 0 2 g NaCl 0 1g CaCl 2H O 0 02 g Azul de bromotimol 0 5 2mL FeEDTA 4mL Solu o de vitaminas 1mL KOH 45g Solu o de micronutrientes 2mL gua destilada Completar volume para 1 L gar puro 18 8g pH ajustado para 6 5 6 8 com NaOH para o preparo do meio Nfb s lido com N adicionar tamb m 0 02 g L de extrato de levedura e 15 g de gar bacteriol gico ao inv s de gar puro conforme protocolo do meio LGI semi s lido sem N descrito nesse cap tulo Solu o de micronutrientes para o meio Nfb Reagentes Para 100 mL CuSO 5H O 0 004 g ZnSO 7H O 0 12 g HBO 0 14 g Na MoO 2H O 0 1g MnSO H O 0 117 g 10 Ap s 1 semana reinocular todas as amostras para novos frascos de vidro contendo os meios de cultura correspondentes e manter na estufa 28 C por mais 7 dias 11 Para o i
55. Leland Qu mica no Laborat rio Barueri SP Manole 5 Edi o 2009 546 p Pr an lise Dispon vel em lt http www pro analise com br gt Acesso em 30 mar 2014 ROSA Gilberto GAUTO Marcelo GON ALVES F bio Qu mica Anal tica Pr ticas de Laborat rio Porto Alegre Bookman 2013 128 p UNIFEB Apostila de Qu mica Geral e Experimental 2009 Dispon vel em lt http xa yimg com kq groups 24693296 1821154571 name UNKNOWN PARAMETER VALUE gt Acesso em 30 03 14 1 7 AQUECIMENTO EM BANHO MARIA Utilizado para aquecer subst ncias inflam veis e com ponto de ebuli o abaixo de 100 C Aparelhos mais sofisticados permitem o controle de temperatura por termostato Consiste em um sistema que apresenta recipiente adequado para colocar gua que permite o aquecimento conforme Figura 7 Figura 7 Aquecimento em banho maria Fonte Dos autores Biotecnologia 1 8 AQUECIMENTO EM ALTAS TEMPERATURAS Quando se necessita aquecer subst ncias em temperaturas superiores a 100 C deve se utilizar outros materiais para esse fim glicerina at 220 C leo minerais 250 a 300 C parafina at 220 C fluidos de silicone at 250 C O aquecimento de qualquer l quido acima de seu ponto de ebuli o pode provocar um superaquecimento para evitar isso aconselha se adicionar p rolas de vidro ou de porcelana ao l quido antes que se inicia o aquecimento As mesmas t m a fun o de produzir um flu
56. N o manuseie os objetos que est o sendo pesados com as m os utilize pin as ou esp tulas Existem v rios tipos de balan a anal tica manuais el tricas e digitais O princ pio por m o mesmo Consiste em se fazer uma compara o entre a massa que se quer medir e a massa de pesos de refer ncia As balan as manuais mais antigas possuem dois bra os iguais presos por estribos a uma barra central Estes bra os abrigam os pratos da balan a onde se efetua a pesagem Os pesos de refer ncia anal ticos s o manuseados sempre por interm dio de uma pin a adequada Nunca s o manuseados diretamente com a m o Todo este sistema est armazenado dentro de uma caixa fechada com paredes de vidro e janelas laterais As balan as el tricas ainda utilizadas possuem o mesmo princ pio Por m um dos pratos interno e o outro externo No prato externo coloca se o corpo cuja massa se quer medir O prato interno possui barras horizontais ao longo de sua altura onde s o depositados pesos anal ticos massas de refer ncia por meio de bot es situados na parte frontal e balan a Existe uma escala fixa que d valores de massa da centena at o d cimo de grama Tamb m existe uma escala m vel que registra valores de massa das tr s ltimas casas depois da v rgula As balan as digitais mais modernas possuem somente um prato Internamente possuem um sistema eletr nico com placas de circuito impresso que substitui os pesos de r
57. Nacl 40 g KCI 2 g Na HPO 0 24 g KH PO 0 75 g Na SO 0 5 g HO destilada autoclavada 500 mL q s p Ajustar o pH para 7 4 e autoclavar Diluir antes do uso 2 Remover gentilmente o CMF e adicionar 150 uL de tripsina aos po os colocando a placa na estufa a 37 C por 2 5 minutos Dica o tempo de tripsiniza o varia de acordo com o tipo celular c lulas muito aderentes requerem tempo maior de incuba o 5 minutos N o aconselh vel exceder 5 minutos de tripsiniza o sob pena de redu o de viabilidade celular 3 Neutralizar a tripsina com 300 pL de meio de cultura contendo Soro Fetal Bovino e homogeneizar up and down aproximadamente 10 vezes e passar o volume para um ependorfe de 1 5 mL Dica Up and down fundamental para uma dissocia o eficiente das c lulas cit metros de fluxo que utilizam capilar como c lula de leitura sofrem entupimento quando h a presen a de agregados celulares 4 Centrifugar 5 minutos a 1 500 rpm seguido da remo o do sobrenadante Dica pode se descartar o sobrenadante tanto por meio do uso de pipeta quanto vertendo diretamente o l quido sem agita o 5 Ressuspender o pellet celular com CMF 1x e centrifugar a 1 500 rpm por 5 minutos 6 Ressuspender o pellet celular com 300 pL de CMF1x DCFH 10 mM e incubar por 30 minutos a 37 C Dica 1 DCFH 10 mM solu o de trabalho 0 001 g de DCFH em 200 uL de DMSO Esta solu o dever ser armazenada a 20 C protegid
58. Objects gt Measure gt Select measures gt Aspect Area Box Radius Ratio e Roundness 5 Na sequ ncia selecionar Edit gt Convert AOI s to Objects e finalmente File gt Data to Clipboard 6 Colar os dados diretamente no Excel ETAPA 3 An lise dos dados no Excel 1 Abrir a planilha do Excel para o NMA http www ufrgs br labsinal NMA 2 Selecionar n cleos regulares normais e copiar os dados destes n cleos Colar na tabela Normal Nuclei and Settings tabela laranja esquerda para fazer a setagem dos n cleos Dica a an lise de NMA semelhante citometria de fluxo inicialmente feita uma setagem aba Normal Nuclei and Settings para na sequ ncia ser feita a an lise das diferentes 3 Ajustar o tamanho da elipse normal para que fique representativa da popula o controle normal Dica exemplos de elipses normais corretas ou incorretas podem ser encontradas na refer ncia abaixo 4 Copiar e colar TODOS os dados obtidos na rea Treated Nuclei da aba Normal Nuclei and Settings tabela laranja direita 5 Ajustar os limiares que dividem as popula es alterando o n mero de desvios padr o nas c lulas S4 S6 S8 e S10 6 Para a an lise propriamente dita duplicar a planilha Condition 1 at o n mero necess rio correspondente ao n mero de tratamentos de interesse 7 Colar os dados das vari veis obtidas no IPP dos n cleos de cada tratamento no esp
59. Para balan as anal ticas digitais deve se proceder da seguinte maneira ap s a balan a estar estabilizada e zerada coloca se o pesa filtro contendo uma quantidade de reagente superior a que se quer pesar sobre o prato da mesma e procede se a taragem A partir deste momento o pesa filtro n o deve mais ser manuseado diretamente com a m o Deve se usar luvas ou um peda o de papel filtro para manuse lo Isto porque a gordura natural das m os adere no frasco alternado o peso inicial D gt Cll Ap s ter se definido a massa de reagente a ser pesada tira se o frasco do interior da balan a e se retira pequenas por es de reagente Este procedimento deve ser feito com cuidado inclinando se o frasco e batendo se levemente a tampa deste na sua borda para que o reagente caia aos poucos no recipiente que vai ser utilizado para solubilizar o s lido A cada retirada de pequena por o de reagente do pesa filtro tampa se o mesmo colocando o na balan a para com a tampa lateral desta fechada proceder se nova leitura Este procedimento repetido v rias vezes at que a balan a indique que j a quantidade desejada de reagente foi retirada Refer ncias CHRISPINO lvaro Manual de Qu mica Experimental S o Paulo Editora tica 2 edi o 1994 230 p CIENFUEGOS Freddy Seguran a no laborat rio Rio de Janeiro Interci ncia 2001 269 p LENZI Ervim et al Qu mica Geral Experimental Rio de Janeiro Freitas Bas
60. Procedimentos 4 C Estocar 4 C por no m ximo uma semana Preparo das solu es 1 1 Preparar uma solu o de cido c trico 0 05 M Dissolver 1 05 g de cido c trico em 100 mL de gua destilada 1 2 Preparar uma solu o de fosfato de s dio dib sico NaH PO 0 05 M Para isso dissolver 1 38 g de fosfato de s dio em 100 mL de gua destilada 1 3 Preparar uma solu o tamp o de citrato fosfato 0 05 M pH 6 0 Em uma proveta de 50 mL adicionar 13 4 mL de cido c trico 0 05 M e completar o volume com fosfato de s dio dib sico 0 05M Corrigir o pH com uma solu o de cido fosf rico H PO 1 1 v v e estocar a solu o 1 4 Preparar uma solu o de amido sol vel 1 Para isso dissolver 1 g de amido em 100 mL de gua destilada aquecer at a fervura esfriar e completar o volume novamente para 100 mL 1 5 Preparar uma solu o padr o de glicose 1 pela dissolu o de 1 g de glicose em 100 mL de gua destilada 1 6 Preparar uma solu o de cido 3 5 dinitrosalic lico DNS Para isso adicionar 236 mL de gua destilada os seguintes reagentes 3 g de hidr xido de s dio 51 g de tartarato de s dio e pot ssio 1 38 g de metabissulfito de s dio 0 63 g de fenol e 1 77 g de cido 3 5 dinitrosalic lico Curva Padr o de Glicose 1 7 Construir uma curva padr o de glicose conforme indicado na tabela 6 Tabela 6 Curva padr o de glicose Solu
61. Sim es de Lima Eduardo Miranda Ethur Luc lia Hoehne Mariano Rodrigues Laborat rio pode ser definido como o local constru do com a finalidade de se realizar diferentes experimentos A import ncia do laborat rio na pesquisa em escala industrial ou acad mica em qualquer de suas especialidades seja qu mica dimensional el trica e biol gica baseia se no exerc cio de suas atividades sob condi es ambientais controladas e normatizadas Esta a forma de assegurar que n o ocorram influ ncias estranhas que alterem o resultado do experimento ou medi o e ainda de modo que garanta a repeti o do estudo em outro laborat rio e com a mesma exatid o nos resultados Oliveira et al 2007 No entanto o laborat rio um local de trabalho com potenciais riscos de acidentes tendo em vista que se manipulam subst ncias com uma periculosidade consider vel e que se indevidamente utilizadas podem causar danos graves ao usu rio do laborat rio Chambel 2014 seja ele aluno laboratorista ou professor Neste cap tulo inicial tem se o objetivo de evidenciar as t cnicas e procedimentos b sicos que s o usados em laborat rios de qu mica e reas afins para auxiliar profissionais desta rea a ter uma uniformidade na execu o dos m todos e diminuir ao m ximo qualquer interferente para que sejam obtidos resultados confi veis Refer ncias CHAMBEL Silvia Seguran a no laborat rio 2005 Dispon vel em lt http www ideia
62. TMHMM 1 Acessar o site http www cbs dtu dk services TMHMM Dica para encontrar diretamente digite tmhmm no Google 2 Na caixa Submission colar a sequ ncia a ser analisada 3 Clicar em Submit 4 Analisar o resultado O TMHMM mostra quais dom nios transmembrana foram preditos para a sequ ncia de interesse e qual a extens o dos mesmos indicando res duos de in cio e t rmino para cada um Observar a presen a de al as identificadas por inside ou outside indicando a orienta o da al a em rela o membrana plasm tica e dom nios transmembrana identificados por TMhelix Os amino cidos de in cio e t rmino s o indicados Na parte inferior mostrada a representa o gr fica do resultado No eixo X mostrado o n mero do res duo e no eixo Y a probabilidade de cada res duo fazer parte do dom nio em quest o Observar a linha vermelha ndica a probabilidade de presen a de dom nio transmembrana e as linhas azul e rosa indicam amino cidos ao longo da sequ ncia com maior probabilidade de estarem voltados para o citoplasma ou para o meio extracelular respectivamente As regi es com dom nios transmembrana preditos s o mostradas em vermelho H tamb m uma representa o utilizando caixas para indicar a localiza o dos dom nios transmemebrana ao longo da sequ ncia na parte superior do gr fico D gt cm 11 9 PREDICAO DE LOCALIZACAO SUBCELULAR PRESENC
63. a pe a Use sempre culos de seguran a essencial proteger os olhos quando estiver no laborat rio mesmo que n o esteja diretamente envolvido em um experimento Os culos devem ser usados mesmo quando estiver lavando materiais pois podem respingar fragmentos do material Caso qualquer produto qu mico atinja seus olhos v ao lava olhos e lave seu olhos e face com grande quantidade de gua Caso n o haja um lava olhos adequado fa a esse procedimento em uma torneira N o acender o bico de Bunsen sem antes verificar vazamento nas sa das da mangueira e na pr pria obstru es na mangueira exist ncia de inflam veis na proximidade regulagem ideal da abertura da chama Cuide com chamas no laborat rio deve se ter cuidado ao usar f sforo ou chamas Antes de utilizar o fogo verifique sempre que tipos de reagentes seus colegas pr ximos est o trabalhando pois subst ncias inflam veis s o uma fonte em potencial de inc ndio Evite contato com reagentes e subst ncias use sempre luvas apropriadas ao manusear subst ncias qu micas Reduza sempre a sua exposi o ao produto ao m nimo pois a exposi o excessiva e repetida pode provocar problemas de sa de O laborat rio deve ser bem arejado e a manipula o com os reagentes deve ser realizada em capelas Evite verificar os odores das subst ncias Jamais despeje res duos na pia utilize sempre recipientes adequados e identificados com as subst ncias presentes
64. a ser amplificado indicando o nucleot deo de in cio e de t rmino J em PCR Detection o programa pede apenas o tamanho do fragmento a ser detectado e qual regi o da sequ ncia deve ser considerada permitindo ao programa a busca pelos melhores pares de primers dentro dessa regi o 4 Para primers visando clonagem op o PCR Cloning definir a regi o a ser clonada Lembrar que neste caso os primers come ar o e terminar o exatamente nos nucleot deos definidos Para primers visando a detec o op o PCR Detection definir tanto a regi o a ser analisada em busca de primers quanto o tamanho do fragmento a ser amplificado Lembrar que neste caso o programa buscar primers que estejam dentro dos par metros definidos podendo haver varia o do nucleot deo de in cio e de t rmino Para primers para sequenciamento op o Sequencing definir a regi o a ser sequenciada Sequencing Region a sequ ncia inicial para anelamento do primeiro primer Primer Position Lead e o n mero de nucleot deos de intervalo entre cada primer Spacing Lembrar que neste caso ser o gerados primers em intervalos regulares Clicar em Submit Dica inicialmente n o alterar os outros par metros Caso o programa n o encontre primers dentro dos par metros iniciais mensagem No primers could be found within your specified parameters Please loosen your parameters and try again tente aumentar a Tm Primer Tm C m xima
65. agitadas no v rtex Dica deve se deixar fixando por pelo menos 30 minutos a 4 C ideal aproximadamente 2 horas 9 Centrifugar por 6 minutos a 1 500 rpm 10 Suspender o pellet em 1 mL de PBS 1x e centrifugar por 6 minutos a 1 500 rpm 11 Ressuspender o pellet celular em 500 uL de HCl 2 N por 30 minutos a temperatura ambiente D gt cm 12 Centrifugar a 1 500 rpm por 6 minutos ressuspender o pellet celular em 1 mL de PBS 1x e centrifugar novamente a 1 500 rpm por 6 minutos 13 Ressuspender o pellet celular em 380 pL de PBS T e adicionar 20 uL de anticorpo anti BrdU conjugado a FITC por 1 hora no escuro sob agita o Dica PBS T preparar 50 mL 50 mL PBS 1x 500 uL BSA 1 mg mL 250 uL Tween 20 14 Centrifugar a 1 500 rpm por 6 minutos e ap s adicionar 1 mL de PBS 1x ao pellet celular seguido de centrifuga o a 1 500 rpm por 6 minutos 15 Ressuspender o pellet celular em 200 uL de PSSI incubar no m nimo 15 minutos a 37 C ou 30 minutos a temperatura ambiente Dica 1 PSSI 1 4 uL de Triton X 100 1 20 pL de RNAse 20 mg 60 uL de Iodeto de Prop deo 2 mg mL 10 mL q s p de PBS 1x 16 Proceder a leitura em cit metro de fluxo Refer ncia DOLBEARE F Gratznert H Pallavicini M Gray JW 1983 Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine Proc Natl Acad Sci USA 80 5573 5577 D gt Cm 4 25 ANALISE MORFOMETRICA NUCLEAR NMA PARA INFERENC
66. amostras Microtubos 2 0 mL O dobro de microtubos da quantidade de amostras Etanol lcool 100 a temperatura ambiente ou gelado Etanol lcool 70 gelado Reagentes Solu o TKM 1 1000 mL Tris 10 mM 1 211 g KCI 10 mM 0 745 g MgCl 10 mM 2 033 g EDTA 2 mM 0 744 g Acertar pH em 7 6 Armazenar a 4 C Solu o TKM 2 100 mL 100 mL de TKM 1 NaCl 0 4 mM 2 337 g Armazenar a 4 C SDS 10 10 mL 1 0 g de SDS 10 mL de gua Milli Q Armazenar em temperatura ambiente NaCl 6M 100 mL 32 66 g de NaCl 100 mL de gua Milli Q Aquecer para dissolver Armazenar em temperatura ambiente Solu o TE 50 mL Tris 10 mM 0 6g EDTA 1 mM 0 0186 g Acertar pH em 8 0 Armazenar a 4 C Biotecnologia 2 2 EXTRACAO DE DNA DE AMOSTRAS VEGETAIS O processo de extra o de DNA vegetal consta inicialmente do rompimento da parede e membrana celular liberando a mol cula de DNA O isolamento de DNA de plantas e de material vegetal proveniente de cultura de tecidos uma etapa importante na an lise da estrutura e organiza o do genoma de plantas M todo de Doyle e Doyle 1987 1 Utilizar cerca de 150 mg de l minas de folhas frescas ou 50 mg de folhas liofilizadas ou secas Pulverizar as amostras em nitrog nio l quido O material pode ser triturado em cadinho e transferido para o tubo ou diretamente no tubo usando um micropistilo Dica uma possibi
67. arroz branco e 30 mL de uma solu o de 0 5 peptona 0 5 g peptona em 100 mL de gua destilada Fechar os sacos com barbante n o apertar muito para permitir a entrada do vapor esterilizante Esterilizar por autoclavagem 15 minutos 1 atm 121 C Ap s autoclavagem apertar o barbante para manter o material est ril Dica o arroz autoclavado pode ficar com grumos que devem ser desmanchados manualmente com o saco fechado antes do in culo para facilitar a dissemina o do fungo 2 Em cada saco de arroz esterilizado adicionar 1 mL de suspens o de con dios na concentra o de 10 con dios mL e misturar bem manualmente 3 Manter os sacos de arroz em estufa por 28 C por 14 dias Dependendo do fungo este tempo pode ser menor ou maior e render mais ou menos con dios Dica semanalmente observar os sacos inoculados e agitar manualmente o arroz para dispers o dos esporos e melhora no rendimento 4 Ap s esporula o do fungo de forma satisfat ria misturar manualmente o arroz para melhorar a libera o dos con dios Pode se utilizar uma esp tula est ril para misturar o arroz 5 Colocar o arroz em uma peneira e esfregar com uma esp tula est ril para libera o dos esporos Dica preparar um becker grande est ril e colocar sob a peneira para coleta dos esporos Por ser muito leve a forma o de poeira de esporos f cil portanto o ato de peneirar deve ser feito cuidadosamente para evitar a perda de materi
68. as altera es de temperatura de acordo com programas previamente definidos denominado termociclador O resultado obtido a amplifica o da regi o de interesse com bilh es de c pias o que permitir as an lises posteriores Tal rea o ocorre de acordo com as seguintes fases 1 Desnatura o inicial 95 C 5 minutos 2 Desnatura o 95 C 15 segundos a 1 minuto 3 Anelamento 50 a 65 C 1 minuto 4 Extens o 72 C 1 minuto Os passos 2 3 e 4 se repetem de 30 a 40 vezes 5 Extens o final 72 C 10 minutos As temperaturas e os tempos apresentados acima s o totalmente vari veis de acordo com as especificidades da rea o propriedades dos primers utilizados tamanho do fragmento de interesse caracter sticas da sequ ncia de nucleot deos etc Para que ocorra a PCR necess ria a presen a de alguns reagentes espec ficos os quais s o discutidos abaixo DNA Polimerase enzima respons vel por sintetizar as c pias da regi o de interesse Atua adicionando nucleot deos durante a fase de extens o Nota as enzimas geralmente s o comercializadas juntamente com uma solu o tamp o buffer espec fica necess ria para a a o correta da Polimerase Deve se portanto sempre estar atento s orienta es trazidas pelo fabricante MgCL co fator necess rio para o correto funcionamento da DNA Polimerase Primers sequ ncias de oligonucleot deos espec ficas para det
69. cada amostra utilizar 2 falcons com 15 ml de gua destilada e SDS a 10 intercalar gua SDS gua pelo menos 3 x e trocar as solu es a cada nova amostra 6 Centrifugar a amostra a 12 000 rpm por 1 hora a 4 C 7 Transferir cuidadosamente o sobrenadante para novos microtubos separar uma al quota de 30 pL para quantifica o de prote nas Identificar e armazenar a 20 C Descartar o pellet Refer ncias FREDERICK M Ausubel et al Current Protocols in Molecular Biology John Wiley amp Sons 2003 gt gt C 2 11 EXTRACAO DE PROTEINAS TOTAIS DE AMOSTRAS VEGETAIS Este kit comercial de extra o de prote nas pode ser utilizado para extrair uma amostra qualitativa das proteinas totais presentes em qualquer amostra vegetal proveniente de qualquer esp cie de planta Protocolo de extra o de prote nas de plantas utilizando o kit Plant Total Protein Extraction SIGMA ALDRICH Dica Os reagentes devem ser preparados somente na hora do procedimento de extra o Preparando os reagentes Protein Extraction Reagent Type 4 1 Adicionar 15 mL de gua ultrapura ao conte do do frasco vem com o kit O volume final da solu o ser de 23 mL 2 Inverter o frasco diversas vezes com cautela para homogeneizar cuidado para n o formar muita espuma A completa solubiliza o pode exigir aquecimento de 20 25 C N o deixar a temperatura ultrapassar 30 C pois pode ser prejudicial s prote nas 3 F
70. cnica muito utilizada para determinar prote nas em alimento e no tecido animal por m apesar de ser bastante sens vel pode estar sujeita a o de diversos interferentes Estes interferentes podem aumentar o valor de absorv ncia do branco ou a forma o de algum tipo de precipitado O uso de tricloroac tico para provocar a precipita o das prote nas elimina a maior parte de interferentes deste m todo M todo LOWRY 1951 Equipamentos Balan a anal tica Espectrofot metro Vidrarias utens lios e outros Bequer 50 e 100 mL Tubos de ensaio Bast o de vidro Proveta de 100 mL Esp tula Pipeta Reagentes Sulfato de Cobre Pentahidratado Citrato de S dio Carbonato de S dio Hidr xido de S dio Folin Ciocaltens 2N Albumina Bovina Procedimento a Fazer os reagentes A B Ce D Reagente A Dissolver 0 5 g de sulfato de cobre pentahidratado e 1 g de citrato de s dio em 100 mL de gua destilada Reagente B Dissolver 1 g de carbonato de s dio e 0 2 g de hidr xido de s dio em 50 mL de gua destilada Reagente C juntar uma parte do reagente A 50 partes do reagente B Preparar no momento da an lise Reagente D Partes iguais de reagente de Folin Ciocaltens 2 N e gua propor o 1 1 Pode ser estocada j sob a forma dilu da b Para fazer o padr o de Albumina Bovina BSA Bovine Serum Albumine D gt Cm Fazer uma solu o de 5 mg mL pesando 0 5 g de albumina bovina em 100 m
71. com viabilidade alta dependendo do fungo ou isolado Tween 80 0 01 1 0 mL Tween 80 100mL HO destilada autoclavar 15 minutos 121 C Biotecnologia 13 3 CONTAGEM DA SUSPENSAO DE CONIDIOS OU LEVEDURAS A contagem de uma suspens o de esporos ou leveduras baseia se no n mero de c lulas visualizadas em c mera de Neubauer E importante lembrar que esta contagem n o diferencia c lulas vi veis de n o vi veis Em um tubo eppendorf 1 5 mL adicionar 990 uL de gua e 10 pL da suspens o de esporos e agitar por alguns segundos em vortex Importante lembrar que para manter a esterilidade da suspens o a mesma dever ser sempre manipulada em capela de fluxo laminar ou pr xima a um bico de Bunsen para manter a esterilidade do ambiente de manipula o Colocar 10 pL desta mistura em uma c mara de Neubauer e cobrir com uma lam nula Para c maras com 25 quadrados contar os cinco quadrados das pontas mais o central ver figura abaixo C lculo da concentra o n mero de c lulas contadas x 5 para fechar os 25 quadrados x 10 fator da c mara de Neubauer x 10 dilui o realizada dos esporos gt o valor dado em x c lulas mL D gt CH 13 4 TESTE DE VIABILIDADE DA SUSPENSAO DE CONIDIOS A viabilidade de uma suspens o de esporos fundamental para o sucesso do cultivo ou outro tipo de teste como por exemplo bioensaio O ideal que uma suspens o tenha uma viabilidade maio
72. consenso Dica o PLACE apresenta apenas s tios regulat rios descritos na literatura Para acessar as informa es originalmente depositadas no banco basta clicar nos c digos de cada um que aparecem no formato S000001 Os s tios s o mostrados tanto abaixo do promotor quanto na tabela Ao clicar o usu rio direcionado a uma p gina espec fica onde h uma breve explica o da fun o do s tio regulat rio e refer ncias que suportam a fun o do mesmo An lise da regi o promotora de genes de plantas utilizando PlantCARE Cis Acting Regulatory Element 1 Acessar o site http bioinformatics psb ugent be webtools plantcare html Dica para encontrar diretamente digite plantcare no Google 2 No canto esquerdo superior clique no cone Search for CARE 3 Copiar e colar a sequ ncia do promotor a ser analisado na caixa apropriada 4 Clicar em Submit Query 5 Analisar os resultados O PlantCARE mostrar a sequ ncia completa que foi analisada mostrando ambas as fitas senso e antissenso Abaixo todos os s tios regulat rios estar o listados Para mostrar quais posi es apresentam determinado s tios clicar no no lado esquerdo de cada um A posi o dos s tios na sequ ncia do promotor ser destaca em cores Caso haja mais de um s tio no mesmo promotor todas as sequ ncias regulat rias ser o destacadas An lise da regi o promotora de genes de plantas utilizando Plan
73. da amostra no centro da plataforma de leitura de modo a formar uma gota exatamente no centro 2 Abaixe delicadamente a placa met lica superior Verifique se houve forma o de um canal conectando as duas superf cies da plataforma de leitura com a amostra aplicada Em caso negativo abra as placas met licas limpe as plataformas superiores e inferiores com o papel absorvente reaplique a amostra e feche as placas novamente Dica evite forma o de bolhas 3 Selecione a op o Amostras para iniciar a leitura da Amostra 4 Ap s realizar a leitura levante a placa met lica superior e limpe as plataformas de leitura superior e inferior O resultado da quantifica o da amostra estar descrito no canto inferior direito em valor de ng pL Dica h a op o de visualizar os resultados das leituras clicando no terceiro item descrito como Dados 08 por exemplo 5 Quando as leituras estiverem completas selecione a op o Sair e Salvar Assim poder voltar ao Menu Principal e imprimir os valores quantificados Aten o se houver mais amostras para serem lidas com o mesmo BRANCO repita os procedimentos do PASSO 2 As informa es das leituras ser o armazenadas conforme sua sequ ncia Ent o tenha o cuidado de organiz las de modo que lembre a sequ ncia O equipamento permite salvar at 10 arquivos diferentes Dados 01 Dados 10 e em cada um desses arquivos podem ser registradas as leituras de at 30 am
74. das amostras em triplicata Os reagentes devem ser adicionados na seguinte ordem 1 Amostra 2 Tamp o Tris HCI 20 mM pH 7 4 3 trombina e 4 substrato Incubar a amostra tamp o trombina por 10 minutos 37 C antes da adi o do substrato 1 9 Ler a absorb ncia em espectrofot metro de microplacas 650 nm no tempo inicial A1 logo ap s a adi o do substrato Incubar a placa 37 C e ap s 30 minutos de rea o repetir a leitura no mesmo comprimento de onda A2 tempo final Dica se o experimento estiver sendo realizado em um espectrofot metro capaz de realizar leituras cin ticas selecionar o modo cin tico em 650 nm e realizar leituras sequenciais de 14 em 14 segundos at o tempo final de 30 minutos Durante todo o tempo da leitura a placa deve permanecer ao C 1 10 Calcular a m dia aritm tica de cada uma das amostras e subtrair a absorb ncia final da inicial A2 A1 1 11 Os valores de A2 A1 correspondem a fibrina formada durante a rea o Os resultados podem ser expressos como unidades arbitr rias de absorb ncia por tempo de rea o OD min Para tanto basta calcular a raz o entre os valores de A2 A1 e o tempo total do ensaio 30 minutos 2 An lise dos Resultados 2 1 Os resultados podem ser apresentados como atividade residual de trombina em OD min conforme indicado acima ou tamb m como percentual de inibi o de trombina Nesse ltimo caso considera se como 100 a atividade da
75. de escolha para o estudo da intera o entre o processo inflamat rio na parede do vaso e a forma o de um trombo venoso oclusivo Animais S o utilizados ratos 200 250 g ou camundongos 25 30 g adultos machos mantidos em biot rio espec fico com ciclo claro escuro de 12 horas temperatura de 22 2 C e umidade de 60 80 com livre acesso a gua e ra o Pelo menos dois dias antes dos experimentos transferir os animais para o biot rio do setor onde os procedimentos ser o realizados para adapta o Todos os experimentos com animais devem seguir obrigatoriamente as atribui es e as compet ncias definidas na Lei 11 794 08 e em resolu es do Conselho Nacional de Controle em Experimenta o Animal CONCEA Antes da realiza o de qualquer procedimento o protocolo incluindo a identifica o das subst ncias ou extratos a serem testados e suas doses devem ser submetidos an lise da Comiss o de tica para o Uso de Animais CEUA da institui o Os m todos de anestesia e eutan sia sugeridos aqui est o de acordo com o NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals edi o revisada em 1996 http www nap edu readingroom books labrats Materiais Mesa cir rgica Manta de aquecimento Seringa descart vel para insulina com agulha 1 mL 13 X 0 45 mm 26 G Fio cir rgico de Nylon monofilamento 4 0 45 cm 3 8 est ril n o absorv vel com e sem agulha Algod o e gaze Material cir rg
76. de tripsiniza o sob pena de redu o de viabilidade celular 4 Neutralizar a tripsina com 500 uL de meio de cultura contendo Soro Fetal Bovino e homogeneizar up and down aproximadamente 10 vezes e passar o volume para o mesmo ependorfe de 2 mL onde o meio de cultura e o PBS foram guardados Dica Up and down fundamental para uma dissocia o eficiente das c lulas cit metros de fluxo que utilizam capilar como c lula de leitura sofrem entupimento quando h a presen a de agregados celulares 5 Centrifugar 5 minutos 1 500 rpm seguido da remo o do sobrenadante Dica pode se descartar o sobrenadante tanto por meio do uso de pipeta quanto vertendo diretamente o l quido sem agita o 6 Ressuspender o pellet celular com 1 mL de PBS 1x e centrifugar a 1 500 rpm por 5 minutos 7 Centrifugar 5 minutos a 1 500 rpm 8 Fixar as c lulas com 1 mL de etanol 70 em PBS 1x gelado gotejando o enquanto as c lulas s o agitadas no v rtex Dica deve se deixar fixando por pelo menos 30 minutos a 4 C ideal aproximadamente 2 horas pode se parar aqui e guardar as c lulas por at 3 meses a 20 C at que o ensaio seja realizado 9 Centrifugar por 6 minutos a 1 500 rpm 10 Suspender o pellet em 1 mL de PBS 1x e centrifugar por 6 minutos a 1 500 rpm 11 Ressuspender o pellet celular em 200 pL de PSSI incubar no m nimo por 15 minutos a 37 C ou 30 minutos a temperatura ambiente Dica 1 PSSI 1
77. de clorofilas g 1 Clo 0 0127 X Absorb ncia 0 00269 X Absorb ncia Clo 0 0229 X Absorb ncia 0 00468 X Absorb ncia 13 Calcular o peso seco PS Pf Pi 14 Calcular a concentra o de clorofila a b ou total em rela o ao peso seco Refer ncia ROSS C W Plant Physiology Laboratory Manual Belmont CA USA Wadsworth Publishing Company 1974 4 2 QUANTIFICACAO DE ACUCARES SOLUVEIS TOTAIS Este protocolo utilizado para quantificar os a cares sol veis totais glicose frutose sacarose de uma amostra utilizando se o reagente Antrona 1 Homogeneizar material em nitrog nio l quido 2 Adicionar 2 mL de etanol 80 em 100 250 mg de material e agitar no v rtex 3 Manter a 75 C por 10 minutos 4 Centrifugar a 10 000 g por 10 minutos 5 Transferir sobrenadante para novo tubo e lavar o precipitado fra o insol vel com 2 mL de etanol 80 Coletar novamente o sobrenadante 6 Seguir imediatamente a rea o Rea o 950 pL Antrona Prepara o 150 mg Antrona 100 mL H SO 72 50 pL da amostra 7 Incubar rea o em agua fervente por 10 minutos 8 Ap s resfriamento das amostras realizar leitura em espectrofot metro 650 nm 9 Calcular a concentra o de a cares sol veis totais atrav s de uma curva de concentra o de glicose 0 100 ug de glicose 10 Calcular a raz o entre o conte do de a cares sol veis totais e o peso seco da amost
78. de macacos de laborat rio ou blocos de madeira para serem colocados sob a manta de aquecimento neste caso a manta abaixada e a aparelhagem fica presa na mesma posi o Outro cuidado que se deve ter em utilizar manta de tamanho compat vel com a vidraria que cont m a solu o a fim de se evitar superaquecimentos Figura 9 Figura 9 Aquecimento em manta Fonte Dos autores Biotecnologia 1 9 AQUECIMENTO EM BICO DE BUNSEN Existem v rios tipos de bicos de g s que s o usados em laborat rio tais como bico de Bunsen bico de Tirril bico de Mecker etc Todos obedecem ao mesmo princ pio de funcionamento o g s combust vel introduzido em uma haste vertical onde h uma abertura para a entrada de ar atmosf rico sendo queimado na sua parte superior Tanto a vaz o do g s como a entrada de ar podem ser controladas de forma conveniente O bico de Bunsen um bico de g s especialmente constru do para uso de laborat rio utilizado para aquecimento at temperatura de 800 0C por meio da combust o do g s Figura 10 Figura 10 Bico de Bunsen Fonte Dos autores Observando o bico de Bunsen verifica se que ele constitu do de tr s partes base anel e tubo Entre a base e o tubo h um anel de encaixe no qual existem orif cios ou janelas A entrada de ar ocorre atrav s das janelas emparelhadas Quando elas est o justapostas pode se dizer que est o abertas quando o anel cobre totalmente a j
79. de qu mica instala o montagem e opera o CRQ IV S o Paulo 2007 53 p 1 13 TRANSFERENCIA DE SOLIDOS Caso o s lido em manuseio seja corrosivo deve se cuidar para que o frasco n o esteja umedecido Caso esteja umedecido limpe o previamente Quando retirar uma tampa pl stica rosque vel de um frasco evite deix la sobre a bancada com o lado aberto tocando a bancada a fim de evitar contamina es Jamais coloque objetos sujos no interior do frasco e s retorne uma subst ncia ao seu frasco original se tiver certeza absoluta que a mesma n o foi contaminada durante o manuseio Para transferir o s lido deve se pegar uma pequena quantidade do mesmo com uma esp tula a Figura 13 apresenta o procedimento Figura 13 Transfer ncia de s lidos Fonte Dos autores Refer ncias ROSA Gilberto GAUTO Marcelo GON ALVES F bio Qu mica Anal tica Pr ticas de Laborat rio Porto Alegre Bookman 2013 128 p 1 14 TECNICAS DE PESAGEM A pesagem feita com a utiliza o de balan as sendo uma das mais importantes t cnicas de laborat rio Existe uma grande variedade de balan as no mercado diferenciando se conforme a sensibilidade e precis o As balan as podem ser a Semianal tica apresentam o prato para coloca o da amostra podendo ou n o ter prote es laterais Figura 14 e superiores que evitam que as correntes de ar provoquem erros nas leituras ou instabilidade no valor informado Sua sensibi
80. de tamp o citrato 0 5 mL da amostra a ser testada e uma tira de papel Whatman n 1 1 x 6 cm Dicas preparar tamb m dois tubos adicionais Tubo B1 branco da amostra adicionar 1 mL de tamp o citrato 0 5 mL de amostra Tubo B2 branco total adicionar 1 5 mL de tamp o citrato uma tira de papel Whatman n 1 1 x 6 cm 1 12 Incubar os tubos 50 C por 1 hora 1 13 Adicionar 3 mL da solu o de DNS ferver por 5 minutos adicionar 20 mL de gua destilada e homogeneizar 1 14 Resfriar em temperatura ambiente e determinar a absorb ncia em espectrofot metro a 540 nm 1 15 Determinar a concentra o de glicose liberada utilizando a curva de calibra o de glicose Dica Se necess rio realizar dilui o da amostra em tamp o citrato 2 An lise dos Resultados 2 1 Com o aux lio da curva padr o equa o da reta do tipo y Ax b determinar a quantidade mmol de glicose liberada na presen a das amostras 2 2 Converter a quantidade de glicose calculada anteriormente em atividade celul sica usando a f rmula abaixo C lculo do resultado Atividade celul sica U pmol mL min AR 2 fd 60 Onde AR concentra o de a cares redutores glicose na amostra mmol determinada atrav s da curva de calibra o de glicose fd fator de dilui o quando houver Uma unidade U de atividade celul sica foi definida como 1 mol de glicose liberada por mL por min sendo expressa em FPU filter p
81. dilu dos em PBS 37 C 10 Cronometrar 5 minutos 11 Administrar a solu o de tromboplastina 3 mg kg em volume m ximo de 0 5 mL diretamente na veia cava inferior pr ximo s il acas e ligar a extremidade cranial logo abaixo da veia renal direita 12 Cronometrar 20 minutos 13 Ligar os demais pontos incluindo a veia renal esquerda as tribut rias de maior calibre e a extremidade caudal da veia cava inferior 14 Dissecar cuidadosamente o segmento da veia cava ligado contendo o trombo Come ar a dissec o pela extremidade superior e ap s retir lo completamente lavar o segmento com PBS 37 C 15 Cortar um dos n s do segmento extra do e retirar o trombo formado 16 Lavar o trombo com PBS 37 C secar em papel filtro e pesar o trombo mido em balan a anal tica 17 Manter o trombo em estufa 60 C por 1 hora 18 Pesar o trombo seco em balan a anal tica Biotecnologia An lise dos Resultados Os resultados s o expressos pela raz o entre a massa do trombo seco e a massa do animal geralmente mg de trombo g de rato e representados em um gr fico versus a dose da subst ncia testada No caso de uma subst ncia antitromb tica antiplaquet ria ou de um inibidor da coagula o espera se que essa raz o diminua conforme h um aumento de dose Um n mero de 8 10 animais por grupo a ser testado recomendado para garantir a reprodutibilidade dos resultados Refer ncias DAHMER T BER
82. diretamente no meio de cultura por 1 3 horas Dica o tempo de incuba o varia de acordo com o tipo celular c lulas que proliferam com ndice elevado requerem tempo menor 1 hora de incuba o com o BrdU 3 Remover o meio de cultura e lavar as c lulas com PBS 1x adicionar 250 uL de tripsina aos po os colocando a placa na estufa a 37 C por 2 5 minutos Dica o tempo de tripsiniza o varia de acordo com o tipo celular c lulas muito aderentes requerem tempo maior de incuba o 5 minutos N o aconselh vel exceder 5 minutos de tripsiniza o sob pena de redu o de viabilidade celular 4 Neutralizar a tripsina com 500 uL de meio de cultura contendo Soro Fetal Bovino e homogeneizar up and down aproximadamente 10 vezes e passar o volume para um eppendorf de 1 5 mL Dica Up and down fundamental para uma dissocia o eficiente das c lulas cit metros de fluxo que utilizam capilar como c lula de leitura sofrem entupimento quando h a presen a de agregados celulares 5 Centrifugar 5 minutos a 1 500 rpm seguido da remo o do sobrenadante Dica pode se descartar o sobrenadante tanto por meio do uso de pipeta quanto vertendo diretamente o l quido sem agita o 6 Ressuspender o pellet celular com 1 mL de PBS 1x e centrifugar a 1 500 rpm por 5 minutos 7 Centrifugar 5 minutos a 1 500 rpm 8 Fixar as c lulas com 1 mL de etanol 70 em PBS 1x gelado gotejando o enquanto as c lulas s o
83. do meio reagente Observa se atentamente a solu o do erlenmeyer Cada gota do titulante caindo na solu o provoca uma altera o visual geralmente mudan a de cor que desaparece com a agita o medida que se aproxima o ponto final da titula o a altera o demora mais tempo para desaparecer Diminui se a velocidade de adi o do titulante de modo que a gota se misture completamente com a solu o antes que caia a gota seguinte Al m destes detalhes t cnicos quando o ponto final de uma titula o est pr ximo frequentemente necess rio adicionar mistura reagente uma fra o de gota do titulante Para fazer isto deixa se formar parcialmente uma gota e toca se a extremidade da bureta com a parede interna do erlenmeyer Lavam se as paredes do frasco com uma pequena por o de gua de um frasco lavador e agita se a mistura N o se deve arrastar com gua a fra o da gota retida na extremidade da bureta Quando ocorrer uma altera o permanente na solu o interrompe se a adi o de titulante e l se o volume de l quido na bureta Refer ncias CHRISPINO lvaro Manual de Qu mica Experimental S o Paulo Editora Atica 2 edi o 1994 230 Pp CIENFUEGOS Freddy Seguran a no laborat rio Rio de Janeiro Interci ncia 2001 269 p LENZI Ervim et al Qu mica Geral Experimental Rio de Janeiro Freitas Bastos 2009 390 p PAVIA Donald L et al Qu mica Org nica experimental T cnicas
84. e diminuir a m nima por exemplo para 65 e 55 respectivamente Tamb m pode ser necess rio indicar outra regi o da sequ ncia para ser analisada 5 Analisar os resultados O programa indica a porcentagem de GC GC se o primer direto ou reverso Strand tamanho Size e Tm Tm C Clicar em Highlight Target Sequence para ver onde os primers anelam na sequ ncia alvo Dica primers ideais tem em torno de 50 de GC tamanho de 20 pares de bases e Tm em torno de 60 C D gt cm 11 2 VERIFICACAO DA QUALIDADE DOS PRIMERS PROJETADOS Apesar de robustos os programas para projetar primers muitas vezes podem fornecer primers n o ideais que podem prejudicar o seu uso na bancada Assim interessante usar softwares complementares para analisar a possibilidade de amplifica o inespec fica e forma o de homo e heterod meros O primeiro software o Primer BLAST do NCBI que permite verificar se os primers projetados s o complementares a outras sequ ncias que n o as que se deseja amplificar O segundo o website da IDT Integrated DNA Technologies que permite verificar se cada primer projetado anela em si mesmo ou no outro primer que comp e o par Verifica o de inespecificidade dos primers usando a ferramenta Primer BLAST do National Center for Biotechnology Information NCBI 1 Acessar o site http www ncbi nlm nih gov No canto direito da p gina encontrar e clicar na op o BLAST 2 N
85. em 30 mar 14 1 5 SOLUCOES DE LIMPEZA E SECAGEM DE MATERIAL As solu es de limpeza devem ser utilizadas de acordo com o fim desejado Podem ser cidas ou alcalinas As mais utilizadas s o as de HCl 1 0 mol L e solu o alco lica de KOH Em alguns casos podem se utilizar os alvejantes como solu o de limpeza Detergentes l quidos trazem no r tulo as dilui es correspondentes ao tipo de material que ser lavado ou o tipo de contamina o encontrada no material assim como as precau es que devem ser tomadas Para trabalhar com estas solu es de limpeza deve se ter o m ximo de cuidado pois todas s o t xicas e corrosivas prejudicando a pele os olhos e outros rg os 1 5 1 Solu o de HCI 1 0 mol L Pode ser utilizada em qualquer vidraria qu mica Prepara se diluindo 8 5 mL de HCl concentrado em aproximadamente 50 mL de gua e completa se o volume a 100 mL A solu o dever ser preparada em proveta com tampa 8 5 mL HCl p a ssa 100 mL H O q s p OBSERVA O As unidades p a significam para an lise ou seja o produto possui alto grau de pureza e q s p significa quantidade suficiente para isto a solu o a ser preparada segue uma medida anal tica 1 5 2 Solu o alco lica de KOH Muito utilizada na limpeza de materiais gordurosos N o recomendada para utiliza o em vidrarias volum tricas como pipetas e buretas Prepara se esta solu o dissolvendo se 35 g de hidr xido de pot ssio e
86. entre duas mol culas do mesmo primer o que pode impedir o seu anelamento com a sequ ncia alvo 6 Analisar os resultados na se o Homo dimer analysis Verificar pareamentos que contenham mais do que quatro pares de base consecutivos pareados entre duas mol culas do mesmo primer Dica pareamentos relevantes s o representados por linhas cont nuas e o n mero de pares de bases pareadas mostrado para cada possibilidade Base pairs 7 Clicar em Hetero dimer Colar a sequ ncia do segundo primer a ser utilizado na PCR na caixa Secondary sequence Esta op o analisar a possibilidade de forma o de pareamentos entre as duas mol culas de primer o que pode impedir o seu anelamento com a sequ ncia alvo Clicar em s yy Calculate 8 Analisar os resultados na se o Hetero dimer analysis Verificar pareamentos que contenham mais do que quatro pares de base consecutivos pareados entre as mol culas dos dois primers Dica pareamentos relevantes s o representados por linhas cont nuas e o n mero de pares de bases pareadas mostrado para cada possibilidade Base pairs D gt cm 11 3 PREPARACAO DE ARQUIVO CONTENDO SEQUENCIA NO FORMATO FASTA O arquivo FASTA um formato simples de armazenar sequ ncias m ltiplas e que permite aos programas de an lise reconhecer cada fragmento de sequ ncia a ser analisado Preparando um arquivo no formato FASTA Cada sequ ncia deve ser precedida
87. explorar Alternativamente a subst ncia teste tamb m pode ser coadministrada com bradicinina ou histamina para explorar a sua capacidade de inibir o extravasamento causado por essas drogas vasoativas 6 Ap s 30 minutos sacrificar os animais por aumento da dose de anest sico 7 Dissecar cuidadosamente toda a regi o subcut nea do dorso do animal e remover a pele 8 Separar cada quadrante em tubos previamente identificados contendo 2 5 mL de formamida 1 1 9 Extrair o azul de evans extravasado para o tecido incubando os tubos 40 C por 48 horas 10 Separar a formamida de cada um dos tubos e dosar o azul de evans extra do em espectrofot metro a 600 nm 11 Calcular a quantidade de azul de evans presente em cada tubo utilizando uma curva padr o feita previamente com concentra es conhecidas do corante An lise dos Resultados Os resultados s o expressos como quantidade de azul de evans ug extra da por quadrante de pele A quantidade de azul de evans extra da na presen a da subst ncia a ser testada deve ser comparada com aquela extra da na presen a de uma droga controle que induza o aumento de permeabilidade vascular no caso sugerimos bradicinina ou histamina O modelo oferece a vantagem de que diferentes doses podem ser testadas em um nico animal Refer ncias RATTMANN YD PEREIRA CR CURY Y GREMSKI W MARQUES MC DA SILVA SANTOS JE Vascular permeability and vasodilation induced by the Loxosceles intermedi
88. filtra o por suc o a chamada filtra o press o reduzida ou filtra o a v cuo efetuada utilizando uma aparelhagem como a da Figura 20 o frasco kitassato A provido de um funil de Buchner ligado a um frasco de seguran a B vazio que por sua vez est conectado a uma trompa de gua C ou uma bomba de v cuo Corta se um c rculo de papel de filtro cujo di metro deve ser 1 a 2 mm menor do que o di metro interno do funil de Buchner Coloca se o papel no funil de modo a cobrir os orif cios do funil sem entretanto chegar at as paredes do mesmo Liga se a trompa de gua umedece se o papel de filtro com o solvente e efetua se a filtra o Terminada esta abre se a entrada de ar do kitasato do frasco de seguran a antes de fechar a torneira da trompa de gua Este tipo de filtra o tem a vantagem sobre a filtra o simples por ser mais r pida e por deixar menor quantidade de impurezas e solvente no s lido Figura 20 Filtra o por suc o Fonte Dos autores Refer ncias Filtra o Dispon vel em lt http www sog com br conteudos ef misturas p2 php gt Acesso em 31 03 2014 POSTMA James M ROBERTS Julian L HOLLENBERG Leland Qu mica no Laborat rio Barueri SP Manole 5 edi o 2009 546 p ROSA Gilberto GAUTO Marcelo GON ALVES F bio Qu mica Anal tica Pr ticas de Laborat rio Porto Alegre Bookman 2013 128 p 1 18 PROCESSO DE SEPARACAO POR CENTRIFUGACAO
89. frequ ncia a quebra de dorm ncia de gemas axilares e aumentando o n mero de brotos dos quais os explantes podem ser tirados O uso das citocininas em plantas matrizes pode aumentar o n mero de gemas propiciando mais brotos para retirada de explantes A dosagem tima de reguladores de crescimento para induzir morfog nese frequentemente varia de acordo com o tamanho e o tipo de explante de uma nica planta CAPITULO 10 ISOLAMENTO E CARACTERIZACAO DE BACTERIAS PROMOTORAS DE CRESCIMENTO VEGETAL Adriana Ambrosini da Silveira Camille Eichelberger Granada As bact rias do solo que estabelecem associa o ben fica com as plantas s o comumente denominadas PGPR Plant Growth Promoting Rhizobacteria as quais s o naturalmente encontradas na rizosfera por o de solo intimamente associado s ra zes As PGPRs podem estabelecer rela es do tipo endof tica entre as c lulas do tecido radicular associativa na superf cie radicular ou muito pr xima a ela ou simbi tica atrav s da forma o de n dulos fixadores de nitrog nio N nas ra zes Diferentes protocolos s o indicados para o isolamento espec fico de endof ticos associativos e simbi ticos assim como diferentes meios de cultura e procedimentos s o requeridos para a obten o de determinados grupos de bact rias como as formadoras de end sporos de resist ncia ao estresse Al m disso os meios de cultura tamb m podem ser usados na busca por determinadas ativid
90. lavando o b quer o bast o de vidro e o funil com solvente para arrastar todo o soluto cuidando se para n o exceder a marca do gargalo 5 Ap s a solu o dilu da fazendo se o solvente escoar pelas paredes do bal o at que o l quido chegue extremidade inferior do gargalo Se o gargalo do bal o volum trico estiver com a parte superior da marca molhado este deve ser secado com a ponta de um bast o de vidro envolvida com papel filtro Faz se o ajuste final com o aux lio de uma pipeta de Pasteur ou de um conta gotas lentamente de tal maneira que o menisco fique tangente ao tra o de refer ncia 6 Fechar o bal o e homogeneizar a solu o invertendo v rias vezes o bal o volum trico 7 A seguir transfira a solu o para um frasco apropriado e devidamente etiquetado com o nome do composto a concentra o da solu o identifica o de quem preparou a solu o e data IMPORTANTE Toda a solu o cida ou b sica deve ser preparada adicionando se cido ou base gua e nunca o contr rio para evitar explos o devido ao alto calor de dissolu o desses reagentes 1 21 2 Prepara o de solu o padr o Uma solu o denominada PADR O quando sua concentra o exatamente conhecida A prepara o de uma solu o padr o requer direta ou indiretamente o uso de um reagente quimicamente puro e com composi o perfeitamente definida Os reagentes com tais caracter sticas s o chamados de PADR ES PRI
91. lico DNS Para isso adicionar a 236 mL de gua destilada os seguintes reagentes 3 g de hidr xido de s dio 51 g de tartarato de s dio e pot ssio 1 38 g de metabissulfito de s dio 0 63 g de fenol e 1 77 g de cido 3 5 dinitrosalic lico Curva Padr o de Glicose 1 6 Construir uma curva padr o de glicose conforme indicado na tabela 7 Pipetar os volumes indicados em tubos de ensaio de 25 mL Tabela 7 Curva padr o de glicose Glicose 5 mg Tamp o citrato Glicose Glicose mL mL mL mg mL umol 0 0 5 0 0 0 05 0 45 0 5 1 38 0 1 0 4 1 2 74 0 15 0 35 1 5 4 16 0 2 0 3 2 5 49 0 25 0 25 25 6 86 0 3 0 2 3 8 23 0 35 0 15 3 5 9 6 0 4 0 1 4 10 97 0 45 0 05 4 5 12 34 0 5 0 5 13 71 1 7 Incubar os tubos 50 C por 1 hora 1 8 Adicionar 3 mL da solu o de DNS ferver por 5 minutos adicionar 20 mL de gua destilada e homogeneizar 1 9 Resfriar em temperatura ambiente e determinar a absorb ncia em espectrofot metro a 540 nm 1 10 Colocar os dados em uma curva de quantidade de glicose mmol X absorb ncia Utilizar o primeiro ponto como zero Dicas a concentra o de a cares redutores ser expressa em mmol de glicose A faixa de concentra o da curva de calibra o poder variar para se ajustar as concentra es encontradas nas amostras analisadas Ensaio de Atividade Celul sica 1 11 Utilizando tubos de ensaio de 25 mL adicionar 1 mL
92. luzes pr ximas ao local onde o ensaio ser realizado permane am apagadas evitando se a interfer ncia da mesma nas an lises Aconselha se deixar ligadas apenas as luzes distante do local ou ainda trabalhar com a luz ambiente Amostras Leitura das medidas de absorb ncia das amostras Partir de uma solu o estoque do extrato bruto de 1 mg mL diluindo nas concentra es de 250 200 150 100 50 25 e 5 pg mL em metanol fazer em triplicata Em ambiente escuro transferir uma al quota de 1 mL de cada dilui o do extrato para tubos de ensaio ou falcon com 2 mL do radical DPPH 0 1 mM ou 100 uM ou 0 004 e homogeinizar em agitador de tubos As absorb ncias s o lidas em espectrofot metro a 517 nm no 1 5 e 10 min at de 10 em 10 min realizar a leitura onde observada a redu o da absorb ncia at a sua estabiliza o Ou faz se a leitura em 30 min se estabilizar neste tempo como o cido asc rbico Utilizar como lcool met lico como branco para calibrar o espectrofot metro AUTO ZERO BRANCO Abs Branco 2 mL de metanol com 1 mL das solu es do extrato CONTROLE NEGATIVO Abs controle 1 mL da solu o metanol com 2 mL do radical DPPH e homogeinizar CONTROLE POSITIVO Abs Amostra 1 mL do cido asc rbico amostra com 2 mL do radical DPPH e homogeinizar AA 100 Absamostra Absbranco 100 Abscontrole Refer ncias A O A C Official Methods of Analysis Association of Official Ana
93. mM 5 3 yL SYBR Green dilu do 26 5 uL Platinum Taq DNA Polimerase 0 7 yL Dilui o do SYBR Green 1 1 pL SYBR Green 108 9 uL H O 3 Misturar bem o mix com aux lio de uma pipeta 4 Colocar a placa de 48 po os sobre uma estante de microtubos 5 Colocar tr s eppendorfs de 0 2 mL alinhados na estante ao lado da placa e adicionar 45 pL do mix do gene 1 em cada um deles 6 Com a pipeta multicanal transferir 10 uL do mix do gene 1 em cada pocinho da coluna 1 2 3 e 4 das linhas A Be C 7 Descartar os eppendorfs auxiliares 8 Colocar tr s novos eppendorfs de 0 2 mL alinhados na estante ao lado da placa e adicionar 45 uL do mix do gene 2 em cada um deles 9 Com a pipeta multicanal transferir 10 uL do mix do gene 2 em cada pocinho da coluna 5 6 7 e 8 das linha A BeC 10 Descartar os eppendorfs auxiliares 11 Colocar tr s novos eppendorfs de 0 2 mL alinhados na estante ao lado da placa e adicionar 45 uL do mix do gene 3 em cada um deles 12 Com aux lio da pipeta multicanal transferir 10 pL do mix do gene 3 em cada pocinho da coluna 1 2 3 e 4 das linhas D E e F 13 Descartar os eppendorfs auxiliares 14 Colocar mais tr s novos eppendorfs de 0 2 mL alinhados na estante ao lado da placa e adicionar 45 uL do mix do gene 4 em cada um deles D gt Cm 15 Com o aux lio da pipeta multicanal transferir 10 uL do mix do gene 4 em cada pocinho da coluna 5 6 7 e 8 das linhas D Ee F 16 Adiciona
94. manipula o e aplica o As c lulas devem ser mantidas assepticamente em condi es bastante estritas de temperatura 35 37 C pH 7 3 7 5 umidade 5 10 CO e em meio de cultura nutritivo Os protocolos descritos neste cap tulo s o destinados para a manuten o e manipula o de c lulas aderentes s quais se multiplicam na superf cie de um suporte inerte vidro ou pl stico formando uma monocamada Entretanto outras c lulas como os linf citos podem crescer livremente em suspens o Manuten o das c lulas troca de meio Materiais meio de cultura nutritivo soro fetal bovino SBF detergente Hanks ou PBS pipetas ponteiras frasco para descarte lcool 70 algod o ou papel descart vel EPIs luvas m scara e jaleco E realizada sempre que o meio apresenta ter sido consumido cor alaranjada 1 Retirar meio de cultura o detergente Hanks e soro fetal bovino do refrigerador para atingirem a temperatura ambiente Dica uma possibilidade colocar o soro e o meio de cultura na estufa anteriormente 2 Ligar o fluxo 3 Disponibilizar todos os EPIs necess rios realizar a limpeza da cabine de fluxo laminar com lcool 70 e colocar todo a material que ir ser utilizado passando lcool 70 em todos os utens lios antes de inserir na cabine 4 Com a cabine limpa e com todos os materiais dentro exceto material biol gico c lulas soro fetal bovino ligar a l mpada germicida por 15 min N O SE EXPONH
95. meio Tiamina biotina TB sem N favorece a obten o de diazotr ficos dos g neros Bacillus e Paenibacillus Gram positivos comumente isolados da rizosfera de plantas Por m isolados de outros g neros como por exemplo Clostridium e Brevibacillus tamb m podem ocorrer mas geralmente em baixo n mero M todo baseado em Seldin et al 1983 1 Ap s a obten o do solo rizosf rico e preparo das suspens es em solu o salina NaCl 0 85 ver 10 2 Protocolo de isolamento de diazotr ficos de solo rizosf rico descrito anteriormente incubar as suspens es 10 107 102 e 10 80 C por 15 minutos Dica as mesmas suspens es utilizadas para o isolamento de bact rias de solo rizosf rico poder o ser usadas nesse procedimento mesmo ap s um longo per odo de tempo at 3 meses se armazenadas em geladeira 2 Em triplicata ou mais repeti es se desej vel inocular 100 pL de cada uma das suspens es 10 107 102 e 10 em placas de Petri contendo meio TB sem N conforme abaixo Dica para a obten o de um maior n mero de isolados recomenda se a inocula o de pelo menos cinco placas de cada tipo de solo rizosf rico mas esse um n mero aleat rio que dever ser inicialmente pensado pelo pesquisador Meio de Cultura Reagentes Para 1L eee ee Glicose 5 as e sem MgSO 7H O ie RR FeCl 6H O 0 04 g NaMoO 2H O 0 005 g CaCl 2H O 0 15 g K HPO 0 8 g Solu o de tiamina 0 5 mg ml 2ml Solu
96. metanol e adicionar 1 mL de cristal violeta 0 1 0 1 g em 100 mL de H O destilada por 1 minuto 6 Retirar o cristal violeta e lavar com gua destilada at que a colora o violeta de fundo seja removida e apenas as col nias permane am coloridas 7 Contar o n mero de col nias com pelo menos 50 c lulas formadas em cada tratamento Refer ncia FRANKEN Rodermond H Stap J Haveman J van Bree C 2006 Clonogenic assay of cells in vitro Nature Protocols 1 2315 2319 gt gt cil 4 24 MARCACAO DE BROMODEOXIURIDINA BrdU PARA AVALIACAO DA PROLIFERACAO CELULAR Este protocolo baseia se na incuba o de c lulas em cultura durante um per odo que varia de 30 minutos a 3 horas com o nucleot deo alterado Bromodeoxiuridina BrdU o qual incorporado ao DNA celular de c lulas em prolifera o que progridem pela fase S do ciclo celular Ap s a incuba o com BrdU este detectado por meio da marca o com anticorpo fluorescente espec fico e a porcentagem de c lulas positivas determinada por citometria de fluxo M todo de Dolbeare et al 1983 Protocolo referente placa de 12 po os os volumes podem ser ajustados de maneira diretamente proporcional conforme o tipo de placa Ex placa de 6 po os volumes 2x maiores placas de 24 po os metade dos volumes 1 Plaquear 5 x 10 c lulas em placa de 12 po os e realizar o tratamento de interesse no dia seguinte 2 Incubar as c lulas com 10 uM de BrdU
97. o processo por meio da utiliza o de compostos fluorescentes fluor foros os quais emitem sinais de fluoresc ncia na medida em que aumenta a quantidade de produto da PCR A PCR em tempo real requer uma plataforma de instrumenta o espec fica com sistemas para a excita o e coleta da fluoresc ncia e um software acoplado para a an lise dos dados O sistema TaqMan utiliza sondas fragmentos de DNA marcados com fluor foros que hibridizam com regi es espec ficas do genoma localizadas entre os s tios de liga o dos primers A sonda marcada com um fluor foro rep rter na extremidade 5 e com uma mol cula quencher na extremidade 3 assim quando a sonda est intacta a proximidade entre o fluor foro rep rter e o quencher impede a emiss o de fluoresc ncia Durante a rea o da PCR ocorre a hibridiza o dos primers e da sonda e durante a extens o dos primers pela enzima Tag Polimerase por sua atividade 5 3 exonuclease ocorre a clivagem da sonda Desta forma a fluoresc ncia emitida pelo fluor foro rep rter pode ser detectada pelo sistema Assim o sistema capaz de produzir ao fim da PCR uma descri o da intensidade de fluoresc ncia detectada a cada ciclo Para a genotipagem de SNPs pelo sistema de discrimina o al lica TaqMan s o necess rias portanto al m dos reagentes de uma PCR convencional duas sondas marcadas com fluor foros distintos as quais s o espec ficas para cada alelo do pol
98. o tubo eventualmente Solu o Componentes Quantidade Objetivo g EDTA 0 5M pH8 20 mL CFinal 100mM Solu o de Lise SDs gt Aux lio na lise da 3 pramag parede celular Tris HCl 1M pH8 5 mL CFinal 50mM Agua destilada est ril Completar para 100 mL C 10 Retirar do banho e manter por 10 minutos a temperatura ambiente 11 Adicionar 480 uL de Acetato de Am nio CH COONH 8M e manter no gelo por 1 hora 12 Centrifugar a 5 000 rpm por 30 minutos concentra o final Final 13 Coletar o sobrenadante e transferi lo para outro tubo Dica At este momento teremos aproximadamente 3 mL de solu o para transferir para outro tubo Para facilitar o manuseio dos tubos costuma se dividir em 3 al quotas de 1 mL e a partir deste momento trabalhar com microtubos de 2 mL 14 Adicionar 1 volume de fenol clorof rmio agitar vigorosamente com a m o e centrifugar a 10 000 rpm por 5 minutos e coletar a fase aquosa parte superior 15 Repetir a etapa 13 usando clorof rmio apenas 16 Em um novo tubo adicionar fase aquosa 5 uL de solu o de NaCl 5M e 0 6 volumes de Isopropanol gelado Manter a mistura over night no freezer 17 Centrifugar a 12 000 rpm por 20 minutos 18 Adicionar ao pellet 500 uL de Etanol 70 e centrifugar a 12 000 rpm por 10 minutos Dica Nem sempre o pellet estar vis vel por isso deve se cuidar para n o perd lo durante as lavagens 19 Descartar o Etanol 70 e secar o pelle
99. o volume para 1L Usar 10mL de uma solu o de vermelho congo 2 5g Lt Ajustar o pH do meio de cultura para 6 8 antes de esterilizar 5 Incubar a placa em estufa 28 C por um per odo de 2 a 10 dias Dica as bact rias do g nero Rhizobium demoram de dois a tr s dias para o aparecimento de col nias em meio Levedura Manitol Os isolados de Bradyrhizobium demoram de 6 10 dias Os g neros Mesorhizobium e Sinorhizobium possuem tempo de crescimento intermedi rio 6 As col nias caracter sticas devem ser inoculadas em meio Levedura Manitol l quido 28 C at que a solu o fique turva usar o mesmo meio descrito anteriormente sem adi o de gar e o corante Vermelho Congo Dica ser o consideradas caracter sticas as col nias com bordas lisas que n o absorverem corante possu rem colora o leitosa e aspecto gomoso 7 Em um tubo est ril adicionar 1mL da cultura bacteriana crescida em meio l quido juntamente com 800 1000 uL de glicerol est ril Agitar suavemente a solu o resultante at que esta fique homog nea 8 Deixar a solu o a temperatura ambiente por 2 5 horas agitando suavemente a cada 30 minutos 9 Estocar a solu o 20 C Dica quando for necess rio trabalhar com o isolado bacteriano que est preservado em glicerol inocular 20 uL do estoque em meio de cultura apropriado Refer ncias SOMASEGARAM P HOBEN MJ Methods in legume rhizobium technology NIFTAL Hawaii p 367 1985 D
100. onen T K Ra aE D EDOS ERA EEEE RNE EE EERE TAE EES 276 14 2 MODELO DE TROMBOSE VENOSA PROFUNDA ssssssssssesssseertssirtestrtesertererrrsesrtsertsesnesesststsntstertstertstetestetesreeereeet 279 14 3 MODELO DE MEMORRAGIA sagas oyinini ironi eo EEn O E EE E EEE OT NEIER 282 14 4 MODELO DE ASMA AL RGICA cssssscssssssssecsssscssssccsssccsssecssseccssecsssscesssccsssecsusscsssecsssecsssecessecessscessuecsssscsssecessecessecesses 284 14 5 MODELO DE PERMEABILIDADE VASCULAR s eeseseerreesrreereresreresreresresesussesreeeresesresentestnrestreenieenireenteeeneseenreesreses 286 146 MODELO DE GASTRIT Eere e en E E a a E EA Dao a S AR SSE EERE aeea 288 14 7 MODELO DE COLITE noiniaii ai aene a aaa raare N Aaaa ia dali nabo a EA ER s eaa anes 290 CAP TULO 15 QUANTIFICA O E AN LISE DE ATIVIDADE ENZIMATICA ccsccsscssccssssscsssessscssesssesssessseees 292 15 1 ATIVIDADE PROTEOL TICA AZOCASEINA ccesscsssesssssssessesssessscssecssesssessesssscsuesssesuesssessusssessssssscsnessscsssssersseesseease 293 15 2 ATIVIDADE PROTEOL TICA TRIPSINA csssesssessssesssessssesssecssvcsssesssecsssessucssussssecssscssescsuvsssscsseesssesusessuesseessseesseesaee 295 15 3 ATIVIDADE PROTEOL TICA TROMBINA SUBSTRATO SINT TICO eee 298 15 4 ATIVIDADE PROTEOL TICA TROMBINA FIBRINOG NIO essere 300 15 5 ATIVIDADE LIPOL TICA LIPASE TITULA O DE CIDOS GRAXOS vcesssssssessssesssessseesssessseesssesssessseesseessee 302 15 6 ATIVID
101. pL Logo se voc tiver quatro amostras para quantificar deve preparar WS suficiente para seis amostras Dica se voc tiver que quantificar v rias amostras preparar WS para uma rea o a mais para que n o falte WS devido a erros de pipetagem ou de calibra o da micropipeta 3 Prepara o dos padr es para a calibra o Standard 1 190 pL WS 10gL Standard 1 Standard 2 190 pL WS 10pL Standard 2 4 Prepara o das amostras Cada amostra 199 pL WS 1 pL RNA dilu do 20X 5 Agitar por 5 segundos no v rtex 6 Ligar o fluor metro e selecionar RNA Ap s calibrar o equipamento quantificar cada uma das amostras de RNA Dica caso alguma das amostras apresente uma concentra o de RNA muito alta ou muito baixa fora da curva padr o poss vel variar o volume de RNA dilu do que se usa na rea o Por exemplo ao inv s de usar 1 pL de RNA dilu do 20X pode ser utilizado 2 5 ou 10 pL Basta informar ao equipamento o volume de RNA utilizado na rea o Tome cuidado que ao utilizar volumes maiores de RNA o volume de WS ser menor pois a rea o sempre tem volume final de 200 pL Alternativamente a solu o de RNA pode ser menos dilu da 5 ou 10X ou mesmo utilizar RNA n o dilu do 2 14 QUANTIFICACAO DE DNA E RNA UTILIZANDO ESPECTROFOTOMETRIA DE DENSIDADE OPTICA L QUANT Ap s a extra o do DNA importante que seja realizada a quantifica o do material obtido pois isso ir possibilitar o a
102. pL Standard 2 Standard 3 190 pL WS 10 pL Standard 3 4 Prepara o das amostras Cada amostra 199 pL WS 1 pL prote na dilu do 20 X 5 Agitar por 5 segundos no v rtex 6 Ligar o fluor metro e selecionar prote na Ap s calibrar o equipamento quantificar cada uma das amostras de prote na Dica caso alguma das amostras apresente uma concentra o de prote na muito alta ou muito baixa fora da curva padr o poss vel variar o volume de prote na dilu do que se usa na rea o Por exemplo ao inv s de usar 1 uL de prote na dilu do 20 X pode ser utilizado 2 5 ou 10 pL Basta informar ao equipamento o volume de prote na utilizado na rea o Tome cuidado ao utilizar volumes maiores de prote na pois o volume de WS ser menor uma vez que a rea o sempre tem volume final de 200 pL Alternativamente a solu o de prote na pode ser menos dilu da 5 ou 10 X ou mesmo utilizar a solu o de prote na n o dilu da ED gt CH 2 16 QUANTIFICACAO DE PROTEINAS PELO METODO DE BRADFORD O m todo baseia se na adi o de etanol cido fosf rico e um corante chamado Azul Brilhante de Coomassie G 250 solu o contendo prote nas No pH de rea o a intera o entre a prote na de alto peso molecular e o corante provoca o deslocamento do equil brio do corante da forma ani nica vermelha para a forma cati nica azul que absorve fortemente em 595 nm M todo Bradford Reagentes 1 Albumina
103. para completar o volume final de cada po o para 100 pL Correr cada uma das amostras em triplicata Os reagentes devem ser adicionados na seguinte ordem 1 Amostra 2 Tamp o Tris HCl 20 mM pH 7 4 3 tripsina e 4 substrato Incubar a amostra tamp o tripsina por 10 minutos 37 C antes da adi o do substrato 1 10 Ler a absorb ncia em espectrofot metro de microplacas 405 nm no tempo inicial A1 logo ap s a adi o do substrato Incubar a placa 37 C e ap s 20 minutos de rea o repetir a leitura no mesmo comprimento de onda A2 tempo final Dica se o experimento estiver sendo realizado em um espectrofot metro capaz de realizar leituras cin ticas selecionar o modo cin tico em 405 nm e realizar leituras sequenciais de 10 em 10 segundos at o tempo final de 20 minutos Durante todo o tempo da leitura a placa deve permanecer as C 1 11 Calcular a m dia aritm tica de cada uma das amostras e subtrair a absorb ncia final da inicial A2 A1 Biotecnologia 1 12 Os valores de A2 A1 correspondem p nitroanilina liberada durante a rea o Calcular a quantidade de p nitroanilina presente em cada po o utilizando a equa o da reta obtida pela curva padr o de p nitroanilina Seguir o exemplo abaixo A2 A1 0 03 Curva padr o y 0 001 0 028X 0 03 0 001 X X 1 036 nmol de p nitroanilina 100 pL 0 028 Ou seja considerando esse exemplo hipot tico a quantidade de p nitro
104. por um identificador Em um processador de texto Microsoft Word Bloco de Notas Pages coloque o sinal de gt seguido de um nome c digo ou n mero Ap s pressione em enter para iniciar um novo par grafo Os programa que leem arquivos FASTA considerar o quaisquer caracteres entre o sinal de gt e o enter como o identificador da sequ ncia Dica quando estiver trabalhando com genes cujos loci s o conhecidos interessante us los como identificadores para evitar confus o o que mais prov vel se nomes como sequencial ou geneA for utilizado Copie e cole a sequ ncia referente ao identificador no novo par grafo A sequ ncia pode ser de nucleot deos e portanto conter os caracteres A T C e G ou de prote nas e portanto conter caracteres referentes ao c digo IUPAC de uma letra para amino cidos http www bioinformatics org sms iupac html Esta a cara que o texto do arquivo deve ter gt Identificador TAGCTACGTACGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATAGCTAGCTACGTAC GATCGATCGACGATCGATCGATCGATTATATATGATCGATATAGTAGCTAGCAT CGATCGATTAGTAGCATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGTACGATC GATCGATCGATCGATCGATATATATTAG gt Identificador2 MERFVQFLRRGNGLMAASLAAGSCAEEVAKAEGAGCRDDAAALRLKGVAMATILVA GVVGVGLPLAGRKRRALRTDSAAFVAAKAFAAGVILATGFVHMLHDAEHALSSPCLPAHPW RSFPFPGFVAMSAALATLVLDFLATRFYEGKHRAETERVKAAAAAALAASSASDDDITVVT VTEDDNDNKAPLLO Dica apesar de poder salvar como arquivo do pr prio process
105. presen a de um tubo de Controle Negativo sem adi o de DNA essencial para garantir a qualidade do procedimento 3 2 DIGESTAO ENZIMATICA A digest o enzim tica ou clivagem com enzima de restri o uma rea o em que s o utilizadas endonucleases de restri o com s tios de corte espec ficos Essas enzimas s o capazes de clivar o material gen tico em algumas regi es a partir do reconhecimento de sequ ncias espec ficas denominadas s tios de restri o Em outras palavras as enzimas de restri o cortam as mol culas de DNA em cada regi o que apresente um s tio de restri o Nota cada enzima de restri o apresenta um s tio espec fico e uma determinada condi o para rea o tempo e temperatura de incuba o concentra o etc tais informa es s o sempre fornecidas pelo fabricante desses reagentes 3 3 ELETROFORESE EM GEL A eletroforese um m todo utilizado entre outras possibilidades para visualiza o de material gen tico A t cnica se baseia na separa o de fragmentos de esp cies eletricamente carregadas a partir da exposi o a uma corrente el trica Tecnicamente o m todo consiste na produ o de um gel que pode ser de agarose ou de poliacrilamida pelo interior do qual passam as mol culas a serem analisadas No caso do DNA as mol culas ir o migrar pelo gel em dire o ao p lo positivo e de acordo com o tamanho migram em diferentes velocidades Dessa f
106. que sejam analisados padr es de express o g nica 1 Amplifica o por PCR semiquantitiva gene da b microglobulina humana 2 Preparar tubos eppendorfs 0 2 mL numerados segundo as amostras 3 Colocar as amostras no gelo e os componentes da Mix Inicial e P s Hot Start 4 Preparar a Mix Inicial e a P s Hot Start Dica n o adicionar na P s Hot Start enzima Taq DNA polimerase deixar para acrescentar apenas no final para impedir a forma o de d meros de primers Preparar a Mix e a P s sempre para uma rea o a mais Ex 14 amostras 1 Exemplo Mix inicial P s Hot Start gua DEPC 32 8 x 15 492 pL 64x 15 103 5 pL PCR Buffer 10X 4 0 x 15 60 pL 1 0 x 15 15 uL MgCl 50 mM 12x15 18 pL 03x 15 4 5 pL DNTP Mix 10 mM 1 0 x 15 15 pL Primer Sense 0 5 x 15 4 5 uL Primer Antisense 0 5 x 15 4 5 uL cDNA 2 0 Taq DNA Polimerase 0 3 x 15 3 0 uL TOTAL 40 uL 10 pL 5 Adicionar a cada tubo 38 pL da Mix Inicial 6 Adicionar 2 uL de cDNA de cada amostra no seu respectivo tubo 7 Colocar no termociclador 8 Ap s 2 minutos 01 59 dar Pausa no programa 9 Retirar os tubos da maquina dar um spin e colocar no gelo 10 Adicionar a enzima Taq DNA Polimerase na solu o P s Hot Start 11 Adicionar 10 pL da P s Hot Start em cada tubo 12 Recolocar os tubos no termociclador e apertar Pause para continuar 0 programa 13 Sequ ncia analisada sense 5 CTATCCAGCGTACTCCAAAG 3 e e antisense 5
107. sobrenadante 16 Lavar precipitado com 1 mL de Etanol Acetato de Etila 1 1 e manter a temperatura ambiente por 10 minutos 17 Centrifugar a 11000 g por 3 minutos a 4 C 18 Repetir a lavagem por mais duas vezes passos 16 e 17 19 Ressuspender precipitado em 0 6 mL de Ureia 6 M pH 2 4 e manter a temperatura ambiente por 15 minutos 20 Realizar leitura no espectrofot metro A 21 Determinar o conte do de Carbonil de acordo com a f rmula Carbonil uM A 22 000 x 1 000 000 22 Determinar o teor de prote nas de cada amostra por Bradford 1976 23 Calcular a raz o entre o conte do de Carbonil e o teor de prote nas de cada amostra Refer ncia LEVINE R L WILLIAMS J A STADTMAN E R SHACTER E Carbonyl assays for determination of oxidatively modified proteins Methods Enzymol v 57 p 233 346 1994 4 4 QUANTIFICA O DO N VEL DE PEROXIDA O LIP DICA UTILIZANDO TBARS Este protocolo indiretamente utilizado para quantificar o n vel de peroxida o lip dica por meio da quantifica o de subst ncias que reagem com o cido tiobarbit rico TBARS Determina o de TBARS Hodges et al 1999 1 Homogeneizar as amostras em N l quido 2 Adicionar 0 2 0 5 g em tubo previamente pesado e identificado 3 Adicionar 1 5 ml de etanol 80 4 Centrifugar a 3 000 g por 10 minutos a temperatura ambiente 5 Coletar sobrenadante e seguir imediatamente os passos seguintes
108. soro fetal bovino 5 O criotubo deve ser retirado do nitrog nio l quido e descongelado rapidamente em banho maria a 36 C ou por fric o com as m os 6 Ap s o total descongelamento o conte do deve ser transferido com uma pipeta para o frasco de cultura observando as c lulas ao microsc pio 7 Armazenar na estufa de Co a 37 C Refer ncias FRESHNEY R I Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique 5th Ed Hoboken NJ John Wiley amp Sons 2005 MALAJOVICH M A Biotecnologia 2011 Rio de Janeiro Edi es da Biblioteca Max Feller do Instituto de Tecnologia ORT 2012 ANIMAL Cell Culture Protocols amp Applications Dispon vel lt http www qiagen com knowledge and support spotlight protocols and applications guide animal cell culture gt Acesso em 14 02 2014 8 2 CULTURA PRIMARIA DE CELULAS FOLICULARES DE TIREOIDE HUMANA O m todo de cultura prim ria utilizado para ensaios in vitro Essas c lulas possuem as caracter sticas do tecido de origem podem crescer em cultura por um determinado per odo de tempo 2 Uma cultura prim ria estabelecida a partir do crescimento de c lulas oriundas de um fragmento de tecido obtido por dissocia o mec nica ou enzim tica As c lulas que conseguirem sobreviver ao processo de dissocia o e aderirem placa formar o a primeira monocamada de c lulas daquele tecido M todo Adaptado de Spritzer et al 1995 Coleta do material nos c
109. thrombosis associated with experimental colitis Am J Pathol 2010 177 6 2774 81 CAPITULO 15 QUANTIFICACAO E ANALISE DE ATIVIDADE ENZIMATICA Jorge Almeida Guimaraes Luc lia Santi Markus Berger Oliveira Walter Orlando Beys da Silva Enzimas s o prote nas com atividade catal tica ou seja capazes de catalisar uma rea o qu mica As enzimas possuem a capacidade de converter uma subst ncia substrato em outra produto Muitas enzimas s o consideradas extremamente espec ficas sendo capazes de agir sobre um nico tipo de substrato Para se quantificar uma determinada enzima necess rio utilizar o substrato espec fico para esta Para dosagem da atividade enzim tica os m todos mais amplamente aplicados baseiam se principalmente na libera o de cor colorim trico de fluoresc ncia fluorescente ou de luz quimioluminescente ap s a convers o do substrato em produto A seguir veremos alguns protocolos para a quantifica o de atividades enzim ticas comuns presentes em amostras biol gicas diversas 15 1 ATIVIDADE PROTEOLITICA AZOCASEINA Este m todo baseia se na determina o da atividade proteol tica por meio da quantifica o do grupamento azo liberado pela hidr lise do substrato cromog nico azocase na A azocase na um derivado da case na ao qual foi adicionado um grupo sulfonilamida que tem colora o alaranjada A digest o de uma solu o de azocase na por enzimas proteol ticas resulta n
110. tr s da fita antissenso gerando seis sequ ncias de prote nas para cada uma que s o ent o comparadas com a sequ ncia de interesse de prote na 1 Acessar o site http www ncbi nlm nih gov No canto direito da p gina encontrar e clicar na op o BLAST 2 Na p gina seguinte clique na op o tblastn na se o Basic BLAST 3 Na caixa Enter query sequence cole a sequ ncia de prote na que deseja alinhar com o banco de dados 4 No menu Database selecione o conjunto de dados contra o qual a sequ ncia de interesse ser alinhada Caso queira buscar em todo o banco de dados do GenBank selecione Nucleotide collection 5 Na caixa Organism poss vel restringir as buscas para apenas aquelas que s o derivadas de um organismos espec fico Tamb m poss vel excluir apenas essa esp cie clicando no bot o Exclude assim como adicionar mais organismos para restringir ou excluir os mesmos das buscas bot o 6 Clique em BLAST O resultado pode demorar alguns minutos 7 Analisar os resultados Na se o Graphic Summary poss vel ver uma representa o gr fica dos resultados O tamanho das barras coloridas indica a extens o do alinhamento da sequ ncia de interesse query com diferentes sequ ncias do banco de dados J as cores indicam o qu o similares elas s o Arrastando o mouse por cima das barras a caixa acima da representa o gr fica m
111. trombina na aus ncia da amostra testada e calcula se o percentual de inibi o comparando a atividade da trombina na presen a da amostra contendo o inibidor Obviamente na presen a de um inibidor de trombina a quantidade de fibrina formada diminui diminui tamb m a turbidez do meio de rea o e atividade enzim tica residual e aumenta o percentual de inibi o Refer ncias BERGER M RECK J JR TERRA RM PINTO AF TERMIGNONIC GUIMAR ES JA Lonomia obliqua caterpillar envenomation causes platelet hypoaggregation and blood incoagulability in rats Toxicon 2010 55 33 44 FRANCISCHETTI IM MONTEIRO RO GUIMARAES JA Identification of glycyrrhizin as a thrombin inhibitor Biochem Biophys Res Commun 1997 235 259 263 RIBEIRO JM SCHNEIDER M GUIMARAES JA Purification and characterization of prolixin S nitrophorin 2 the salivary anticoagulant of the blood sucking bug Rhodnius prolixus Biochem J 1995 15 308 Pt 1 243 9 15 5 ATIVIDADE LIPOLITICA LIPASE TITULACAO DE ACIDOS GRAXOS Lipases s o enzimas que hidrolisam lip deos principalmente triglicer deos Este m todo se baseia na neutraliza o dos cidos graxos liberados pela rea o de hidr lise da triole na ou leo de oliva rico em triole na catalisada por estas enzimas Figura 1 Figura 1 Rea o de hidr lise de triglicer deos CH C R CH OH R C CH O HO CH TAG CH C R ipase CH OH P a Glycerol 1 Procedimento Pre
112. uma Solu o de cido G lico b Para realizar a curva de cido g lico dilui se em um bal o volum trico de 10 mL 50 mg de Acido G lico em Metanol c Partindo desta solu o realizam se sucessivas dilui es em metanol conforme figura abaixo obtendo se as seguintes concentra es 500 mg L 250 mg L 150 mg L 100 mg L e 50 mg L d Para o branco foi utilizado apenas o metanol A Figura 1 mostra o procedimento da dilui o dos padr es Figura 1 procedimento para a dilui o de padr es para a determina o de fen is totais nr H 10 mL Solu o 5 mg mL Metanol 0 1 mL 02ml 0 3 mL 0 5 mL 1 mL 10 mL Branco 50 mg L 100 mg L 150 mg L 250 mg L 500 mg L Fonte dos autores e Em cada tubo de ensaio acrescenta se 40 uL da solu o 3 16 mL de gua destilada 200 pL de reagente Folin Ciocalteu 1N e 600 pL de solu o de Na CO saturada previamente preparada f Realiza se leitura ap s 30 minutos em espectrofot metro em um comprimento de onda de 765 nm g Os dados obtidos s o calculados segundo equa o da reta formando uma curva onde R deve ser o mais pr ximo poss vel de 1 h Ao t rmino da constru o da curva procede se com a pesagem das amostras do Material Vegetal seco i A concentra o da solu o deve ser de 1 mg mL j Em tubo de ensaio acrescenta se 40 uL da solu o do extrato 3 16 mL de gua destilada 200 uL de reagente Folin Ciocalteu IN e 600 pL de solu o de Na CO satur
113. uma leitura pontual Aten o os tubos do Branco submetidos luz dever o apresentar uma cor violeta escuro e devem ficar mais escuros que as rea es com as amostras A rea o de cor viol cea se d pois ap s 10 minutos de ilumina o ocorre a fotorredu o do NBT pela formazana azul 2 CATALASE 240 nm 10 em 10 segundos por 90 segundos Havir amp Michale 1987 Anderson et al 1995 1 Colocar no banho maria a 27 C o tamp o de incuba o contendo 500 uL de tamp o fosfato de pot ssio 200 mM pH 7 0 400 uL de gua Milli Q e deixar em banho maria durante 10 minutos 2 Preparar 10 mL de per xido de hidrog nio H O diluindo 260 pL de HO em 10 mL de gua Milli Q 3 BRANCO preparar uma rea o para zerar o equipamento contendo 500 uL de fosfato de pot ssio 50 pL de H O 450 pL de H O D gt cil PARA A HORA DA LEITURA 4 Pipetar no tamp o de incuba o em banho Maria 37 5 pL H O 50 pL de H O 250 mM e 12 5 uL da amostra Verter em cubeta de quartzo e submeter leitura em espectrofot metro a 240 nm Volume final da rea o 1 mL Observa o programe o espectrofot metro para uma leitura cin tica com dura o de 90 segundos com intervalos de 10 em 10 segundos O que deve ser observado o decr scimo na absorb ncia Dica o 4 passo de leitura da enzima deve ser feito de forma r pida e precisa pois o H O desencadeia o processo de redu o pela enzima ao entrar em con
114. zes Dica Pode ser usada uma placa de petri 3 Manter imerso por cinco horas em temperatura ambiente 4 Ferver em etanol absoluto para retirar a clorofila das folhas e assim poder visualizar as regi es demarcadas pelo Evans Blue Amostras de ra zes n o precisam ser fervidas Dica Para retirada da clorofila pode ser utilizado uma chapa com aquecimento Cuidar com a fervura do etanol 5 Ap s a fervura retirar as folhas e conservar em etanol 70 at a retirada de fotos para registro Dica Cuidado no manuseio das folhas retiradas do etanol pois as mesmas enrolam e rasgam com facilidade Refer ncia ROMERO PUERTAS MC Rodriguez Serrano M Corpas FJ G mez M Del R o LA Sandalio LM 2004 Cadmium induced subcellular accumulation of O gt and H O in pea leaves Plant Cell and Environment 27 1122 1134 4 8 LOCALIZA O HISTOQUIMICA IN SITU DO AC MULO DE RADICAL SUPER XIDO 0 O m todo de localiza o histoqu mica in situ do ac mulo de radical super xido O em tecidos vegetais utiliza o reagente NBT Nitro blue tetrazolium que reage com o radical super xido produzindo pontos de cor azul M todo de Shi et al 2010 1 Preparar Tamp o Fosfato de Pot ssio K HPO 10 mM pH 7 8 2 Preparar uma solu o Tamp o NBT 1 mg NBT mL de Tamp o Dica preparar na hora e dissolver bem O NBT sens vel luz logo seu frasco deve ficar protegido com papel alum nio e n o se deve preparar ma
115. 0 6 325 325 do tubo 5 10 250 7 325 325 do tubo 6 10 125 8 400 0 10 0 branco ser coletado para adicionar em cada po o da microplaca 2 2 Adicionar 200 uL do mix do reagente de BCA 50 1 196 pL do reagente A 4 pL do reagente B satisfat rio valores acima de 0 98 BCA 50 1 196 uL do reagente A 4 pL do reagente B 2 3 Incubar 30 min a 37 C e fazer a leitura em espectrofot metro 562 nm 2 4 Plotar os dados em Excel e pedir a equa o da reta y a bx Dica para uma curva ser considerada boa o valor de R deve ser o mais pr ximo de 1 sendo 3 Ensaio 3 1 A uma microplaca de 96 po os adiciona se 10 pL de amostra e 200 uL do mix do reagente Dica preparar o mix do reagente de BCA em um eppendorf ou tubo de ensaio para todas as amostras um branco Misturar Desta forma a solu o ser homog nea para todos 3 2 Incubar o ensaio por 30 min a 37 C 3 3 Passado o tempo realizar a leitura em espectrofot metro a 562 nm 4 C lculo 4 1 Para leitura em placa de 96 po os aplicar o valor de absorb ncia encontrado na equa o da reta para se obter a quantidade de prote na em ug e multiplicar por 100 para se obter a quantidade de prote na por mL 4 2 O resultado a quantidade de prote na de uma determinada amostra em pg mL Refer ncias SMITH P K et al 1985 Measurement of protein using bicinchoninic acid Analytical Biochemistry 150 76 85 Biotecnologia CAPITULO 3 GENOTIPAG
116. 0 ENSAIO DE AGREGA O DE GFP LC3 PARA MENSURA O DA ETAPA INICIAL DA AUTOFAGIA 141 4 21 AVALIA O DO NDICE MIT TICO PARA INFER NCIA DE PROLIFERA O CELULAR 142 4 22 ATIVIDADE DE BETA GALACTOSIDASE CIDA ASSOCIADA SENESC NCIA SA B GAL 143 4 23 ENSAIO CLONOG NICO PARA MENSURA O DA CAPACIDADE PROLIFERATIVA DE C LULAS DR raso OS A O Pree Te mre tee irre OCR RES a e rae 145 4 24 MARCA O DE BROMODEOXIURIDINA BrdU PARA AVALIA O DA PROLIFERA O CELULAR ao eae ee a eT oot ODO Ane eT eet Te ee eT a 146 4 25 ANALISE MORFOMETRICA NUCLEAR NMA PARA INFERENCIA DE APOPTOSE SENESCENCIA E IRREGULARIDADES NUCLEARES sisesescssssssvctscnsvsssssssssieievest unndnwstasnestinvtatnssh sivasieesndentbunedbyniaronitecnsssiatianadtedsebutenesitvons 148 Biotecnologia CAPITULO 5 ANALISE DE EXPRESSAO GENICA EM NIVEGDE RNA ai Dw Ee a recent eR 150 5 1 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS DE RNA COM DNASE I E DNASE TURBO 151 5 2 S NTESE DE PRIMEIRA FITA DE CDNA UTILIZANDO A TRANSCRIPTASE REVERSA M MLV 152 5 3 S NTESE DE PRIMEIRA FITA DE cDNA UTILIZANDO A TRANSCRIPTASE REVERSA SUPERSCRIPT H 153 5 4 AN LISE DA EXPRESS O G NICA POR RT PCR SEMI QUANTITATIVO 2 cceccccccessecssscessecssseesseesssesseeeensees 154 5 5 PREPARA O DE UMA PLACA DE RT gPCR PCR EM TEMPO REAL DE 48 PO OS 157 5 6 CON FIGURA O DO EQUIPAMENTO STEPONE APPLIED BIOSYSTEMS PARA AN LISES DE EXPRESS O GENICA is srsusais au
117. 0 mg kg 7 Dispor o animal na mesa cir rgica em dec bito dorsal prendendo patas e cabe a 8 Realizar a tricotomia da regi o abdominal 9 Realizar uma incis o na regi o mediana do abdome 5 6 cm dissecar e remover o c lon desde o cecum at o reto para retirar o reto sem romp lo necess rio cortar o osso que o protege na por o final do c lon Dica adicionalmente o ba o linfonodos mesent rio e sangue podem ser coletados para an lises posteriores 10 As fezes presentes nos c lons removidos devem ser retiradas as estruturas lavadas com PBS e o excesso de tecido conjuntivo adjacente tamb m deve ser removido 11 Pesar os c lons limpos medir o comprimento de cada estrutura e avaliar os danos macrosc picos dando aten o particular presen a de hiperemia les es hemorr gicas lceras e espessamento ou estreitamento da parede do c lon Dica a severidade do dano ao c lon pode ser avaliada pela atribui o de um score de dano que varia de acordo com o grau da les o exemplos de grade de avalia o de danos podem ser encontradas em Morris et al 1989 ou McCafferty et al 1999 12 Congelar imediatamente parte do tecido de cada c lon em nitrog nio l quido para an lise posterior de citocinas quimiocinas e outros marcadores moleculares de les o Outra parte dos tecidos deve ser reservada em formalde do tamponado 10 para an lise histol gica An lise dos Resultados Neste protocolo os resu
118. 00 rpm Solu o Componentes Quantidade Objetivo Solu o III AG PM 60 mL pe Precipita o de Acido ac tico glacial 11 5 mL proteinas e restos celulares Agua destilada est ril ae ea N o autoclavar esta solu o Armazenar na geladeira Colocar no gelo antes de usar 7 Coletar sobrenadante para um novo microtubo e centrifugar por 10 minutos a 12 000 rpm 8 Coletar sobrenadante adicionar 1 volume de isopropanol gelado e manter no gelo por 20 minutos Dica o tempo m nimo para precipita o do DNA plasmidial 20 minutos por m se voc deixar mais tempo poder aumentar a efici ncia da precipita o 9 Centrifugar por 20 minutos a 12 000 rpm 10 Descartar o sobrenadante e adicionar ao pellet 500 pL de etanol 70 Dica nesta fase nem sempre o pellet est vis vel 11 Centrifugar por 5 minutos a 12 000 rpm 12 Retirar o m ximo de l quido e secar a temperatura ambiente D gt gt Cll 13 Ressuspender o pellet em 50 uL de solu o TE2 a composi o da solu o TE2 est descrita no protocolo de extra o de DNA de bact rias endof ticas de raiz 14 Para verificar a efici ncia da extra o checar 2 uL em gel de agarose 0 8 D gt CH 2 8 EXTRACAO DE RNA UTILIZANDO TRIZOL O m todo de extra o de RNA total pelo reagente Trizol Invitrogen uma adapta o do m todo original descrito por Chomczynski e Sacchi 1987 que utiliza uma solu o de fenol e isotiocianato d
119. 00 uL de sobrenadante a um novo microtubo de 1 5 mL 11 Adicionar 100 pL de fenol clorof rmio lcool isoam lico 25 24 1 12 Centrifugar a 12 000 g por 5 minutos 13 Transferir 150 pL do sobrenadante a um novo microtubo 14 Adicionar 26 5 uL de acetato de s dio 2M 15 Adicionar 400 uL de etanol absoluto 16 Precipitar por 18 horas a 20 C 17 Centrifugar a 12 000 g por 20 minutos 18 Descartar o sobrenadante por invers o 19 Secar o sedimento Dica pode se usar um cotonete tendo o cuidado para n o tocar no pellet Secar bem o tubo pois o lcool interfere na qualidade do DNA 20 Dissolver o pellet com 30 ul de TE 10 mM Tris HCl 1 mM EDTA pH 8 0 21 Incubar a 56 C por 15 minutos 22 Estocar a 20 C at o momento da amplifica o gt gt CH Refer ncias DE GRACIA A S Detec o de DNA de Brucella abortus em amostras de leite bovino experimentalmente contaminado atrav s da rea o em cadeia pela polimerase PCR 1997 37 f Disserta o Mestrado em Epidemiologia Experimental Aplicadaa Zoonoses Faculdade de Medicina veterin ria e zootecnia da Universidade de S o Paulo S o Paulo 1997 AGOSTINI C KRELING C S BUSTAMANTE FILHO I C SOUZA C F V BIOLCHI V POZZOBON A 2012 Detec o de Listeria monocytogenes pela t cnica da rea o em cadeia da polimerase PCR em amostras de leite bovino in natura Rev Inst Latic C ndido Tostes Nov Dez n 389 67 15
120. 1 mg mL armazenada a 20 C 2 Solu o de Comassie Blue armazenada 4 C 0 05 g Comassie Briliant Blue G 25 mL de Etanol 95 50 mL de cido ortofosf rico 85 500 mL de gua Milli Q Procedimento 1 Identificar os tubos da curva e das amostras 2 Descongelar a albumina em gelo 3 Pipetar a Curva padr o de Albumina em duplicata ou triplicata conforme os volumes indicados na segunda coluna da tabela 1 Tabela 1 Volumes aplicados nos tubos para quantifica o de prote na pelo m todo Bradford Tubos Albumina Img mL NaOH 1N Comassie Blue Branco 50 pL 2 5 mL 1 10 pL 40 pL 2 5 mL 2 20uL 30 pL 2 5 mL 3 30 pL 20 pL 2 5 mL 4 40 uL 10 pL 2 5 mL Dica dependo das necessidades do experimento mais pontos de curva podem ser adicionados ou a curva pode ter maior amplitude Isto deve ser determinado para cada tipo de amostra 4 Pipetar 10 pL das amostras em duplicata ou triplicata nos tubos identificados 5 Nos tubos da curva de albumina pipetar os volumes indicados de NaOH 1 N na terceira coluna da tabela 1 e homogeneizar no vortex 6 Nos tubos de amostras pipetar 40 pL de NaOH 1 N e homogeneizar no vortex 7 Em todos os tubos adicionar 2 5 mL de solu o de Coomassie Blue e homogeneizar no vortex 8 Reservar solu o por 5 minutos e posteriormente fazer a leitura em 595 nm zerando com o Branco e come ando pela Curva C lculo Calcular o FCP fator de calibra o parcial de cada ponto da curva FC
121. 10 pL da amostra e 90 pL de gua 6 Adicionar 1 mL do reativo C na curva e nas amostras D gt gt Gm 7 Homogeneizar os tubos no v rtex e ap s deixar 10 minutos em repouso 8 Adicionar 100 pL de Folin 1 N na curva e nas amostras 9 Homogeneizar os tubos no v rtex e manter em ambiente escuro por 20 minutos a cor est vel por at 2 horas 10 Realizar leitura em espectrofot metro a 650 nm em cubeta de pl stico lavando a com gua entre diferentes amostras C lculo Calcular o FCP fator de calibra o parcial de cada ponto da curva FCP1 Q1 A1 Onde Q quantidade de prote na adicionada e A absorb ncia Calcular a FCM fator de calibra o m dio m dia das FCPs Estabelecer uma faixa FCM 10 e 10 ver quais se encaixam Se algum ponto ficar fora calcular novo FCM com os que est o dentro da faixa Calcular a prote na das amostras Abs x FCM x 100 para passar para mL mg mL de prote na Dicas Quando dosar um tipo de amostra nova recomenda se testar diferentes dilui es da mesma para definir qual dilui o resulta em absorb ncias que fiquem dentro da curva Para uma curva mais precisa recomenda se mais pontos por curva O presente protocolo recomenda que a quantifica o seja feita em duplicata Por m realizar a curva e amostras em triplicata ou mesmo quatriplicata dar mais seguran a estat stica dosagem de prote nas Em caso de amostras com pouca prote na pode se fa
122. 1000 L acrescentar 500 mL da solu o contendo acrilamida e hidrolizar com NaOH 2 Neutralizar a solu o obter pH entre 5 7 3 Deixar a solu o em repouso por 1 hora e ap s ser dilu da no mesmo volume de gua pode ser descartada sem causar danos ao ambiente Refer ncias ARMOUR M A Hazardous Laboratory Chemicals Disposal Guide Lewis Publishers 3 ed 2003 D gt Cm 17 3 FENOL Elimina o de Res duos Quando em embalagem fechada colocar todo o material em um recipiente rotulado e separado para elimina o por incinera o Quando em pequenas quantidades o fenol pode ser degradado atrav s da rea o de Fenton T cnica para Descontamina o de Fenol Precau es 1 Usar culos luvas but licas e vestu rio de prote o 2 Trabalhar em capela de exaust o Procedimento 1 Em um bal o de fundo redondo de 300 mL de tr s bocas equipado com um agitador um funil de adi o e term metro preparar uma solu o de 4 7 g 0 05 mol de fenol em 75 mL de gua destilada 2 Dissolver 2 35 g de sulfato ferroso heptahidratado 0 0085 mol na mistura 3 Ajustar o pH para 5 6 com cido sulf rico dilu do 4 Adicionar lentamente per xido de hidrog nio 41 mL 0 4 mol gota a gota A agita o deve ocorrer durante a adi o e mantida por 1 hora CUIDADO A ordem importante se o HO e o FESO forem pr misturados ocorre uma explos o violenta 4 Manter a temperatura entr
123. 20 D gt gt C 2 7 EXTRA O DE PLASM DEO MINIPREP Plasm deos s o mol culas de DNA circular extracromossomais em dupla h lice que podem ser transferidos de c lula para c lula Estas mol culas n o carregam informa o gen tica essencial para o desenvolvimento bacteriano em condi es adequadas por m carregam genes acess rios que podem conferir resist ncia a ambientes in spitos torn las mais competitivas virulentas etc 1 Multiplicar o isolado bacteriano em um meio rico que propicie seu pleno desenvolvimento 2 Aliquotar 1 5 mL da cultura bacteriana multiplicada em microtubos de 1 5 ou 2 mL e centrifugar por 6 minutos a 12 000 rpm 3 Descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 200 uL da solu o I Solu o Componentes Quantidade Objetivo g Tris 1 M pH 8 2 mL Homogeneiza o das poligaa l EDTA 0 5 M pH 8 2mL c lulas Glicose 1 M 2 5 mL Autoclavar a solu o Armazenar na geladeira 4 Adicionar 5 pL de RNAse e manter por 5 minutos a temperatura ambiente 5 Adicionar 200 pL da solu o II agitar com a m o e manter no gelo por 5 minutos Solu o Componentes Quantidade Objetivo Solu o II NaOH 1 M 20 mL Lise celular e SDS 20 5 mL abertura de poros na membrana Agua destilada est ril Completar para 100 mL N o autoclavar a solu o Manter a temperatura ambiente 6 Adicionar 200 pL da solu o III agitar com a m o e centrifugar por 10 minutos a 12 0
124. 4 5 Acrilamida 40 300 uL do produto Tris 0 5 M 690 uL do produto SDS 1 270 uL do produto gua ultrapura 1400 uL do produto 7 Descartar por invers o e com o aux lio de um papel absorvente o lcool et lico das placas contendo o gel de separa o polimerizado Dica n o desmontar os suportes apenas descartar o lcool por invers o dos mesmos Retirar o excesso com papel filtro 8 Acrescentar 2 5 pL de Persulfato de Am nia 10 e 27 pL de Temed no b quer 9 Transferir a solu o do gel de entrada de poliacrilamida em cima do gel de separa o polimerizado at o final da placa 10 Inserir o pente de pl stico que dar o formato dos po os do gel de entrada Dica proteja seus olhos durante esse procedimento pois h possibilidade de respingos no momento da inser o do pente 11 Aguardar a polimeriza o 30 minutos 12 Retirar o pente de pl stico e utilizar o gel Dica caso n o utilize o gel imediatamente guarde o mesmo na geladeira envolto por papel umedecido com gua destilada e pl stico filme dentro de um recipiente com tampa O gel pode ser utilizado em at tr s dias SDS PAGE preparo das amostras 1 Descongelar e manter as amostras no gelo 2 Para cada amostra a ser pipeta no gel preparar um microtubo e identific lo com o nome ou n mero da amostra 3 Preparar o Tamp o de amostra Stock Sample Buffer conforme abaixo Tris 0 5 M pH 6 8 1 25 mL do produto SDS 10 p v
125. 6 Ap s o preparo recomendado autoclavar a solu o Os g is s o sintetizados em formas espec ficas capazes de produzir uma estrutura s lida com po os verticais onde s o aplicadas as amostras de DNA a serem analisadas O volume de agarose ou poliacrilamida necess rio para preenchimento dessas formas varia de acordo com o tamanho do equipamento Eletroforese em gel de agarose O preparo do gel realizado diretamente a partir de agarose s lida concentra o do gel vari vel e a quantidade de agarose deve ser calculada de acordo com essa concentra o Por exemplo para um gel com concentra o de 1 dissolve se 1g de agarose em 100 mL da solu o TBE 1X portanto um gel com concentra o de 1 5 deve ser feito a partir da dissolu o de 1 5 g de agarose em 100 mL de TBE 1X Para que ocorra a dissolu o completa da agarose e posterior solidifica o necess rio aquecer Ap s o aquecimento ent o a solu o fica homog nea as part culas de agarose n o mais est o vis veis e pode ser colocada nas formas para solidifica o Dica ao aquecer em um aparelho micro ondas evite que a solu o transborde durante a fervura Para isso o ideal pausar o aquecimento a cada 10 segundos aproximadamente e movimentar o frasco em movimentos circulares para homogeneiza o Em aproximadamente 30 D gt Cll segundos a mistura j se encontra dissolvida E importante tamb m evitar a fo
126. 6 Para determina o de TBARS adicionar 0 5 ml de extrato dilu do 1 5 nas rea es TBA 100 ul TCA 100 50 pl BHT 0 1 350 pl H O TBA 100 pl TCA 100 50 pl BHT 0 1 325 pl TBA 1 25 pl H O 7 Agitar as amostras vigorosamente e incubar a rea o 95 C por 25 minutos 8 Ap s o resfriamento realizar as leituras em espectrofot metro 440 532 e 600nm 9 Calcular os equivalentes de MDA TBARS da seguinte maneira Abs 532 TBA Abs 600 TBA Abs 532 TBA Abs 600 TBA A Abs 440 TBA Abs 600 TBA x 0 0571 B TBARS nmol ml A B 157 000 x 10 10 Calcular a raz o entre o conte do de TBARS e o peso seco da amostra Refer ncia HODGES D M DELONG J M FORNEY C F PRANGE R K 1999 Improving the thiobarbituric acid reactive substances assay for estimating lipid peroxidation in plant tissues containing anthocyanin and other interfering compounds Planta 207 604 611 4 5 QUANTIFICACAO DE VAZAMENTO DE ELETROLITOS ELECTROLYTE LEAKAGE ASSAY Esta t cnica permite avaliar a integridade das membranas celulares uma vez que quanto menor a condutividade el trica da solu o menor a quantidade de eletr litos que extravasaram indicando o grau de integridade da membrana celular 1 Coletar 10 discos foliares medindo aproximadamente 1 cm de di metro 2 Incubar em 20 mL de gua destilada 3 Manter 25 C por 24 horas com agita o leve e con
127. 8 1959 15 8 ATIVIDADE CELULASICA Celulases s o enzimas que catalisam a hidr lise de celulose biomassa mais abundante no planeta Devido estrutura complexa da celulose diferentes celulases s o necess rias para degradar completamente o pol mero e liberar glicose O ensaio de celulase pode ser feito com substratos mais complexos como baga o de cana de a car e outras biomassas vegetais e papel onde s o requeridas diferentes tipos de celulases ou com substratos mais espec ficos identificando apenas um tipo de celulase Este protocolo descreve portanto o ensaio utilizando papel filtro onde poss vel a detec o de atividade celul sica resultante de diferentes enzimas celulol ticas 1 Procedimento Preparo das solu es 1 1 Preparar uma solu o de cido c trico 0 05 M Dissolver 1 05 g de cido c trico em 100 mL de gua destilada 1 2 Preparar uma solu o de fosfato de s dio dib sico NaH PO 0 05 M Para isso dissolver 1 38 g de fosfato de s dio em 100 mL de gua destilada 1 3 Preparar uma solu o tamp o de citrato fosfato 0 05 M pH 6 0 Em uma proveta de 50 mL adicionar 13 4 mL de cido c trico 0 05 M e completar o volume com fosfato de s dio dib sico 0 05M Corrigir o pH com uma solu o de cido fosf rico H PO 1 1 v v e estocar a solu o 4 C 1 4 Preparar uma solu o padr o de glicose 5 mg mL em gua destilada 1 5 Preparar uma solu o de cido 3 5 dinitrosalic
128. A DE PEPTIDEO DE DIRECIONAMENTO N TERMINAL E DE SINAL DE LOCALIZACAO NUCLEAR A PARTIR DE SEQUENCIAS DE PROTEINAS Estas ferramentas permitem predizer utilizando caracteristicas da propria sequ ncia de prote na qual a prov vel localiza o subcelular do polipet deo maduro mitoc ndria cloroplasto membrana plasm tica etc Alguns deles ou ferramentas espec ficas para este fim permitem tamb m predizer a presen a de sequ ncias N terminais e de sinal de localiza o nuclear envolvidos no direcionamento de prote nas para diferentes organelas ou compartimentos subcelulares e para 2 o n cleo respectivamente Estes programas n o s o 100 acurados e portanto interessante analisar as sequ ncias em mais de um deles focando em resultados concordantes Predi o de localiza o subcelular utilizando PSORT A primeira vers o do PSORT permite a an lise de sequ ncias oriundas de plantas animais levedura bact rias gram negativas e bact rias gram positivas 1 Acessar o site http psort hgc jp form html Dica para encontrar diretamente digite psort no Google Ao entrar na p gina busque e clique em PSORT Prediction 2 Escolher a origem da sequ ncia entre Gram positive bacterium Gram negative bacterium yeast animal e plant 3 Colar a sequ ncia na caixa Enter your Amino Acid sequence below by copy amp paste 4 Clique em Submit 5 Analisar os res
129. A A LUZ 5 Ligar a luz fluorescente e o fluxo de ar 6 Sempre limpar as m os e qualquer utens lio com lcool 70 ao inseri los no fluxo 7 Retirar o frasco com c lulas da estufa e verificar a condi o das mesma ao microsc pio invertido 8 Dentro do fluxo abrir o frasco de cultura sempre com a tampa para cima evitando contamina es 9 Desprezar o meio de cultura consumido 10 Colocar detergente Hanks ou PBS usar 2 mL em frasco de cultura pequeno e 4 mL para frascos grandes movimentar lentamente para lavar descart lo Repetir esse processo duas vezes 11 Preparar o meio de cultura suplementado com 10 de SBF 5 mL para frasco de cultura pequeno e 10 mL para frasco grande Dica pipetar o meio sempre de um tubo falcon para evitar contamina es 12 Verificar a condi o das c lulas ao microsc pio novamente 13 Retornar os frascos de cultura na estufa 14 Realizar a limpeza do fluxo novamente com lcool 70 e ligar a luz germicida por mais 15 minutos para evitar contamina o cruzada caso for trabalhar com outra linhagem celular Meio de cultura para manuten o de linhagens celulares ex CHO K1 DMEM HAM F 10 1000 mL gua Milli Q autoclavada 8 65 g DMEM 4 9 g HAM F10 1 2 g NaHCO 0 1 g Estreptomicina 0 06 g Penicilina Dica ajustar o pH para 7 2 antes de realizar a esteriliza o por filtra o Ap s a filtra o o pH eleva se para 7 3 7 4 Usar filtros de 0 22 um PBS
130. ADE LIPOL TICA LIPASE P NITROFENIL PALMITATO u vccccssessssssesssesssssssesseessesssessvesesessessessueeseveneees 304 15 ATIVIDADE AMIDO i y O coa 307 15 5 ATIVIDADE CELUL SICA ais ie 309 CAP TULO 16 DETEC O DE ATIVIDADE ENZIM TICA ATRAV S DE G IS DE ATIVIDADE ZIMOGRAMAS oiscscsssseacesassussuenssuesesansaascasesvssnssvenssuesssvevassadsnsetaniensnsdeensensaseuasnsdassnateendsuauseutacenddsonsenedeaneie 311 16 1 GEL DE ATIVIDADE ZIMOGRAMA PARA DETEC O DE QUITINASES ST LEGER ET AL 1993 312 16 2 GEL DE ATIVIDADE ZIMOGRAMA PARA DETEC O DE PROTEASES MODIFICADO DE ST LEGER ET AL 1998 iriiri imisi enini aa a e aa Sana Eoaea NaS oaao aaisan 315 16 3 GEL DE ATIVIDADE ZIMOGRAMA PARA DETEC O DE LIPASES E ESTERASES TEO ET AL 2003 317 16 4 GEL DE ATIVIDADE ZIMOGRAMA PARA DETEC O DE CATALASES ZIMMERMANN ET AL 2006 aaraa E A A E AE AE O EAE A R A A E AA e E aii 319 16 5 GEL DE ATIVIDADE ZIMOGRAMA PARA DETEC O DE SUPER XIDO DISMUTASES 321 CAP TULO 17 GERENCIAMENTO DE RES DUOS EM LABORAT RIOS DE BIOTECNOLOGIA 324 171 BROMETO DE che Ce ee ee oe eee er ee eee ene Eea E Ta e EERE EENE aii 325 17 2 ACRLAMIDA vinnan pi q dada 327 IZO FENO T encanta acl gsc ese eo Po eg cei ee ck ne osc ove camadee 328 ED gt CH CAPITULO 1 PREPARO DE SOLUCOES TECNICAS BASICAS E UTILIZACAO DE EQUIPAMENTOS DE ROTINA Claucia Fernanda Volken de Souza Christina Venzke
131. AS Os microrganismos empregados periodicamente em experimentos de cultivo devem ser mantidos em meio de cultura s lido espec fico em temperatura de aproximadamente 4 C Periodicamente devem ser realizados repiques para a manuten o das cepas Uma cultura estoque em 20 de glicerol deve ser armazenada em freezer 7 2 PREPARA O DO IN CULO Esta etapa consiste na ativa o e quantifica o de c lulas microbianas empregadas em experimentos de cultivo de microrganismos e produ o de bioprodutos 1 Preparar o meio de cultura para a ativa o microbiana e os materiais est reis necess rios 2 Inocular uma col nia isolada da placa de petry em meio de cultura l quido 3 Colocar o caldo de cultura inoculado em incubadora com agita o orbital shaker overnight em temperatura adequada para crescimento do microrganismo normalmente entre 30 37 C Dica nessa fase ocorre a ativa o e o crescimento das c lulas microbianas 4 Ap s padronizar o n mero de c lulas do in culo por meio da leitura da densidade tica DO no espectrofot metro no comprimento de onda de 600 nm at DO 1 0 Caso o in culo fique mais concentrado necess rio adicionar caldo nutriente espec fico Dica o valor da absorb ncia deve ficar sempre o mais pr ximo de 1 5 Transferir de 5 a 10 v v de in culo padronizado com DO q 1 0 para o frasco contendo o meio de cultura no qual ser conduzido o processo de cultivo do microrg
132. Adicionar 9 pL da Mix a cada tubo 9 Incubar 42 C por 2 minutos 10 Adicionar 1 pL da enzima transcriptase reversa Superscript II Invitrogen por tubo Dica tirar a enzima do freezer somente na hora de pipetar e misturar com a ponteira ap s adicionar no tubo 11 Incubar a 42 C por 50 minutos 12 Terminar a rea o 70 C por 15 minutos 13 Colocar no gelo 14 Coletar a rea o por breve centrifuga o 15 Adicionar 1 pL de RNAse H em cada tubo Dica retirar a enzima do freezer somente na hora de pipetar 16 Incubar por 20 minutos 37 C antes de proceder a amplifica o por PCR Refer ncia WANG T and M J Brown 1999 mRNA quantification by real time TaqMan polymerase chain reaction validation and comparison with RNase protection Anal Biochem 269 1 198 201 5 4 ANALISE DA EXPRESSAO GENICA POR RT PCR SEMI QUANTITATIVO A Rea o em Cadeia da Polimerase PCR polimerase chain reaction uma t cnica que permite a amplifica o de uma sequ ncia de DNA espec fica Durante a PCR a desnatura o do DNA realizada atrav s de altas temperaturas e permitindo que os primers se liguem sequ ncia complementar no DNA e delimitem a regi o alvo Al m disso a enzima termoest vel Tag DNA Polimerase adiciona os nucleot deos produzindo c pias do trecho de interesse A RT PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction usa o CDNA DNA complementar ao inv s do DNA gen mico e permite
133. Catalases s o enzimas importantes para todas as c lulas vivas pois catalizam a decomposi o de per xido de hidrog nio em gua e oxig nio S o enzimas antioxidantes protegendo as c lulas contra danos oxidativos 1 Prepara o do gel Running 7 H O destilada 4 85 mL 1 5 M Tris HCl pH 8 8 2 5 mL Acrilamida bis acrilamida 30 0 8 2 5 mL TEMED 5 pL Persulfato de am nio APS 10 50 yL Stacking 4 H O destilada 3 1 mL 0 5M tris HCl pH 6 8 1 25 mL Acrilamida bis acrilamida 30 0 8 660 pL TEMED 5 pL Persulfato de am nio APS 10 25 uL 2 Prepara o da amostra 2 1 O volume de amostra a ser carregado no gel de aproximadamente 20 uL sendo 10 pL de amostra e 10 uL de tamp o de amostra 2 2 N o ferver as amostras Preparar em eppendorfs e aplicar diretamente no gel 2 3 Separa o das amostras 2 4 O gel dever ser corrido a uma voltagem de 70 a 80 volts por 16 horas na geladeira 2 5 Detec o de catalases 2 6 Ap s eletroforese remover o gel da cuba e colocar em um recipiente limpo 2 7 Incubar o gel com 100 mL de 0 01 per xido de hidrog nio H O por 5 minutos 33 pL solu o a 30 em 100 mL de gua destilada 2 8 Revelar com 1 cloreto de ferro FeCl 1 ferricianida de pot ssio K Fe CN por 5 minutos 2 9 Lavar com gua e observar as bandas Tamp o de amostra H O destilada 3 8 mL 0 5 M tris HCI pH 6 8 ImL Glicerol 0 8 mL Azul de oo 0 4 mL o Tamp o de corrida
134. Current Protocols in Molecular Biology John Wiley amp Sons 2003 LAEMMLI UK Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage Nature 227 680 685 1970 6 2 METODOS DE COLORACAO DE GEIS SDS PAGE Diversos m todos de colora o de gel SDS PAGE podem ser utilizados O mais comum o Comassie Blue coloidal ou n o capaz de detectar no m nimo 5 mg de prote na Para quantidades menores de prote na pode se utilizar a colora o de prata 10 ng A colora o do gel um passo importante visto que desta forma pode se visualizar as prote nas separadas pela eletroforese 1 Comassie Blue 1 1 Ap s a eletroforese remover cuidadosamente o gel das placas de vidro e colocar em um recipiente com dimens o que comporte a imers o do mesmo 1 2 Adicionar o corante Comassie Blue at cobrir inteiramente o gel 1 3 Homogeneizar gentilmente de 2 a 16 horas no homogeneizador autom tico 1 4 Para descorar utilizar solu o descorante Dica se deseja acelerar o processo pode se adicionar gua e levar ao micro ondas algumas vezes por 2 minutos trocar a gua e entre as fervuras Comassie Blue 1 0 1 Comassie Blue R250 50 Metanol abrir em capela de exaust o Comassie Blue 2 2g Comassie Blue R250 100 mL cido ac tico 475 mL Etanol 425 mL H O destilada Solu o descorante 1 100 mL cido ac tico 450 mL Metanol 450 mL H O destilada Solu o descorante 2 80 mL
135. DE PROTEOLITICA TROMBINA FIBRINOGENIO da turbidez 1 Procedimento do fibrinog nio O protocolo apresentado a seguir assim como o anterior til na pesquisa de anticoagulantes inibidores de trombina A diferen a que este protocolo utiliza o fibrinog nio como substrato para a trombina O fibrinog nio o substrato macromolecular natural da trombina Diferentemente do substrato sint tico cromog nico que possui menor massa molecular e especificidade direta para o s tio ativo a clivagem do fibrinog nio dependente da liga o deste no exositio 1 da trombina Portanto o uso do fibrinog nio como substrato tem principal aplica o no estudo do mecanismo molecular de inibi o e na busca por inibidores espec ficos de exositio 1 A rea o acontece pela clivagem do fibrinog nio pela trombina com a forma o do co gulo de fibrina Como a fibrina um produto insol vel a sua forma o no meio de rea o pode ser facilmente medida pelo aumento 1 1 Pesar em balan a anal tica exatamente 0 005 g de fibrinog nio 1 2 Manter o fibrinog nio pesado o tamp o Tris HCl 20 mM pH 7 4 e uma solu o de BSA 1 mg mL 37 C antes de dissolver o fibrinog nio 1 3 Estando todas as solu es 37 C adicionar ao fibrinog nio 994 uL do tamp o Tris HCl 20 mM pH 7 4 e 6 pL de albumina 1 mg mL 1 4 Agitar levemente e manter a solu o em banho maria 37 C at a completa dissolu o 1 5 Ap s a dissolu
136. EM DE POLIMORFISMOS EM AMOSTRAS HUMANAS Camile Wiinsch Guilherme Pinto Bertuzzi J lia Pasqualini Genro Luana Maria Wollinger Pricila Girardi Raquel Piccinini Castoldi Ver nica Contini A genotipagem de polimorfismos em humanos geralmente se baseia em t cnicas b sicas de biologia molecular Contudo h varia o de utiliza o dessas t cnicas de acordo com o tipo de polimorfismo a ser analisado Para tanto antes de definir os diferentes procedimentos metodol gicos a serem utilizados necess rio compreender alguns aspectos relacionados classifica o dos polimorfismos que ocorrem na esp cie humana A varia o do genoma humano em pequena escala pode se dar por meio de varia es no tamanho de uma determinada regi o ou na sequ ncia de bases nitrogenadas que ocorrem em um determinado ponto do material gen tico As altera es mais comuns da sequ ncia de bases nitrogenadas em um determinado local do genoma s o conhecidas como polimorfismos de nucleot deo nico SNPs do ingl s single nucleotide polymorphisms os quais apresentam na maioria das vezes apenas dois alelos poss veis Os SNPs descritos no genoma humano s o catalogados em um banco de dados p blico e identificados por n meros iniciados por rs do ingl s reference SNP http www ncbinlm nih gov projects SNP Outras variantes polim rficas de sequ ncia de bases podem caracterizar os polimorfismos de inser o dele o InDel os quais s o for
137. ENROSE D M amp GLICK B R Methods for isolating and characterizing ACC deaminase containing plant growth promoting rhizobacteria Physiol Planta 118 10 15 2003 ED gt cil CAPITULO 11 ANALISES BASICAS DE BIOINFORMATICA Felipe Klein Ricachenevsky Walter Orlando Beys da Silva 11 1 DESENHO DE INICIADORES PRIMERS PARA PCR UTILIZANDO SOFTWARES ONLINE O desenho ou projeto de primers tem por fun o permitir a detec o clonagem ou sequenciamento de fragmentos espec ficos de DNA Uso do software Oligo Perfect Designer da Invitrogen Life Technologies para projetar primers 1 Acessar o site http tools lifetechnologies com content cfm pageid 9716 2 Colar a sequ ncia de DNA para a qual se deseja projetar primers na caixa adequada Target sequence 3 Selecionar a aplica o desejada para o primer PCR Cloning para clonagem PCR Detection para detec o e Sequencing para sequenciamento Preencher as caixas opcionais informando o nome da sequ ncia e o nome do pesquisador caso necess rio Clicar em Submit Dica a sele o de uma aplica o n o necessariamente restringe o uso do primer projetado quela aplica o A sele o importante somente para que o programa permita ao usu rio informar as caracter sticas t picas para cada tipo de PCR Por exemplo caso a aplica o selecionada seja PCR Cloning a pr xima p gina do programa exigir que o usu rio informe o fragmento exato
138. FP LC3 PARA MENSURACAO DA ETAPA INICIAL DA AUTOFAGIA LC3 uma prote na espec fica de autofagossomos e importante para a forma o e fechamento dos mesmos sendo recrutada para o autofagossomos em forma o e permitindo o recrutamento de material a ser autofagocitado bem como o fechamento do mesmo Este m todo se baseia na transfec o ou transdu o de c lulas com plasm deo pEGFP LC3 o qual cont m a sequ ncia da prote na LC3 fusionada sequencia da Prote na Verde Fluorescente GFP a qual marca os autofagossomos como pontos verdes intracelulares permitindo sua quantifica o por meio de microscopia de fluoresc ncia M todo de Kabeya et al 2000 A descri o abaixo inclui a etapa de transfec o Em caso da utiliza o de c lulas transduzidas com o plasm deo contendo a sequencia da prote na LC3 GFP deve se proceder a partir do item 3 do corrente protocolo Protocolo descritivo para placa de 24 po os 1 Plaquear 3 x 10 c lulas po o no dia anterior transfec o No dia seguinte realizar a transfec o com o plasm deo pEGFP LCS3 Dica os protocolos de transfec o s o bastante vari veis e dependem do tipo de m todo e do reagente que ser utilizado de qualquer forma todos eles possuem um protocolo de uso que deve ser respeitado 2 Trocar o meio das c lulas no dia seguinte transfec o Dica relativamente comum o processo de transfec o ser um pouco t xico s c lulas de modo que de
139. GER M BARLETTE AG RECK J Jr SEGALIN J VERZA S ORTEGA GG GNOATTO SC GUIMARAES J A VERLI H GOSMANN G Antithrombotic effect of chikusetsusaponin IVa isolated from Ilex paraguariensis Mat J Med Food 2012 15 12 1073 80 RECK J Jr BERGER M MARKS F S ZINGALL R B CANAL C W FERREIRA C A GUIMAR ES J A TERMIGNONIL C Pharmacological action of tick saliva upon haemostasis and the neutralization ability of sera from repeatedly infested hosts Parasitology 2009 136 11 1339 49 VOGEL G M MEULEMAN D G BOURGONDIEN F G HOBBELEN P M Comparison of two experimental thrombosis models in rats effects of four glycosaminoglycans Thromb Res 1989 54 399 410 gt gt cm 14 2 MODELO DE TROMBOSE VENOSA PROFUNDA Neste protocolo o processo de trombose venosa induzido sistemicamente na veia cava inferior de ratos ou camundongos por estase mec nica O trombo formado pela completa obstru o de parte da veia cava inferior o que acaba por disparar o processo de coagula o naturalmente por les o endotelial e inflama o da parede do vaso As principais aplica es s o para a avalia o dos efeitos anticoagulantes e antitromb ticos de diferentes f rmacos extratos ou compostos isolados de plantas ou ainda para estudar o papel de diferentes prote nas c lulas plaquetas e tamb m a contribui o de mediadores inflamat rios e quimiocinas para o processo de hemostasia Modelo
140. IA DE APOPTOSE SENESCENCIA E IRREGULARIDADES NUCLEARES Este protocolo baseia se na mensura o de tamanho e forma de n cleos de c lulas eucari ticas in vitro Por meio da morfometria nuclear poss vel inferir mecanismos de senesc ncia apoptose e cat strofe mit tica O m todo se baseia em tr s etapas 1 Aquisi o das imagens 2 Obten o dos dados morfom tricos 3 An lise dos dados no Excel M todo de Filippi Chiela et al 2012 Protocolo referente placa de 24 po os os volumes podem ser ajustados de maneira diretamente proporcional conforme o tipo de placa Ex placa de 6 po os volumes 4x maiores placas de 12 po os volumes 2x maiores ETAPA 1 Aquisi o das imagens 1 Plaquear 2 x 10 c lulas em placa de 24 po os No dia seguinte realizar o tratamento de interesse Dica deve se evitar uma conflu ncia acima de 70 ao final do experimento principalmente no controle pois isso dificulta a contagem das figuras mit ticas Em fun o disso pode se alterar o n mero inicial de c lulas dependendo do desenho experimental e da prolifera o celular 2 Ap s o per odo do tratamento remover o meio de cultura e lavar os po os 3x com PBS 1x Dica adicionar e retirar o PBS vagarosamente para n o soltar as c lulas aderidas 3 Incubar as c lulas com 100 pL para formalde do 4 a temperatura ambiente por 15 minutos 4 Retirar o paraformaldeido e lavar 3x com PBS CMF Dica 1 Pode se deixar at
141. L de gua destilada c Primeiramente faz se a curva para a albumina O preparo pode ser em tubos de ensaio ou em frascos plasticos Concentra o Volume da solu o Volume de gua Ponto da curva Prote na de BSA destilada mg mL 0 5 mg mL em pL pL Tubo A 0 0 2000 Tubo B 0 1 40 1960 Tubo C 0 2 80 1920 Tubo D 0 3 120 1880 Tubo E 0 4 160 1840 Tubo F 0 5 200 1800 d Retirar 500 pL de cada tubo da curva anterior e transferir para novos tubos de ensaio ou outros frascos de pl stico Fazer em triplicatas ou seja Para a constru o da curva para a leitura no espectrofot metro Tubo 1 500 uL do tubo A da tabela anterior 2 5 mL de reagente C Tubo 2 500 uL do tubo B da tabela anterior 2 5 mL de reagente C Tubo 3 500 uL do tubo C da tabela anterior 2 5 mL de reagente C Tubo 4 500 uL do tubo D da tabela anterior 2 5 mL de reagente C Tubo 5 500 uL do tubo E da tabela anterior 2 5 mL de reagente C Tubos 6 7 e 8 500 pL da amostra 2 5 mL de reagente C Deixar todos os tubos a temperatura ambiente por 10 min e Adicionar em todos os tubos 250 uL do reagente D Reagente de folin Ciocaltens e gua 1 1 e aguardar por 30 min f Ler no espectrofot metro a 750 nm g Construir a curva e fazer o gr fico concentra o mg mL x absorb ncia Verificar a equa o da reta Observa o a amostra deve ser dilu da de forma que sua concentra o fique dentro da amplitude da curva de calibra o Refer nci
142. L de Anexin Binding Buffer 1 uL de anexina V FITC 3 mM de Iodeto de Propideo O ideal fazer um mix total com o volume final a ser utilizado no experimento importante sempre calcular esse volume considerando n po os 1 Por exemplo para 24 po os ser o necess rios 1250 mL de Anexin Binding Buffer 12 5 pL de anexin V FITC 1 25 pL de IP3 mM Dica 2 os kits de prepara o de anexina usualmente sugerem uma quantidade muito elevada de anexina 5 uL por amostra esta quantidade por m pode gerar falso positivos em c lulas que marcam eficientemente em fun o da perda de especificidade Por isso aconselha se a fazer um teste piloto com uma curva de 0 5 5 pL de tripsina previamente aos experimentos de fato D gt Cm Refer ncias ZHANG G Gurtu V Kain SR and Yan G 1997 Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of Annexin V BioTechniques 23 525 531 VAN ENGELAND M Nieland L Ramaekers F Schutte B Reutelingsperger C 1998 Annexin V affinity assay a review on an apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure Cytometry 31 1 9 4 19 MARCACAO COM LARANJA DE ACRIDINA PARA AVALIACAO DA ETAPA FINAL DO MECANISMO DE AUTOFAGIA O mecanismo de autofagia se baseia na forma o do autofagossomo o qual cont m conte dos pr prios da c lula e fusiona se com lisossomos gerando os autolisossomos onde o material degradado A sonda laranja de acridina AO emite fluoresc ncia v
143. L de meio completo para inativar a tripsina EDTA m Descartar o meio com o restante da tripsina EDTA e adicionar novo meio de cultura completo nos frascos com as c lulas n Dissolver a agarose Low Melting Point em microondas e deixar em banho Maria 40 C o Pipetar 5 uL de cada amostra tratada e dispensar em um eppendorf p Pipetar 85 uL de agarose LMP e dispensar no mesmo eppendorf das amostras tratadas e ao mesmo tempo repipetar a mistura q Colocar a amostra na l mina com pr cobertura cobrindo com lam nula r Colocar as l minas em c mara mida por 10 minutos na geladeira s Retirar a lam nula bem devagar de maneira que a amostra fique na l mina t Colocar a grade com l minas na Solu o de Lise Final e deixar na geladeira por no m nimo 24 horas m ximo 48 horas Obs ap s esse processo segue se o protocolo anterior a partir do item CORRIDA Teste de Micron cleo c lulas em suspens o PRODUTOS UTILIZADOS Soro bovino fetal cont m substratos para o meio RPMI 1640 meio de cultura espec fico para linf citos T Fitohemaglutinina induz a divis o dos linf citos T em G0 Formalina 1 conserva amostras biol gicas Citrato de S dio 1 estabiliza prote nas Fixador Carnoy retirar os res duos da amostra hem cias e fixar 3 metanol 1 cido ac tico Padr o Etil metanosulfonato EMS Citocalasina B interrompe a citocinese durante a an fase PRE
144. LASTn nucleot deos X nucleot deos O BLASTn utilizando quando se quer encontrar sequ ncias de nucleot deos em um banco de dados que apresentem similaridade com uma sequ ncia de interesse tamb m de nucleot deos 1 Acessar o site http www ncbi nlm nih gov No canto direito da p gina encontrar e clicar na op o BLAST 2 Na p gina seguinte clique na op o nucleotide blast na se o Basic BLAST 3 Na caixa Enter query sequence cole a sequ ncia de nucleot deos que deseja alinhar com o banco de dados 4 No menu Database selecione o conjunto de dados contra o qual a sequ ncia de interesse ser alinhada Caso queira buscar em todo o banco de dados do GenBank selecione Nucleotide collection Dica se o objetivo for buscar sequ ncias derivadas de mRNA sequ ncias expressas selecionar dentre os conjuntos de dados aqueles que correspondem a este tipo de dado Reference RNA sequences Se o objetivo for buscar sequ ncias gen micas selecionar aqueles que correspondem a sequ ncias derivadas de DNA gen mico Reference genomic sequences 5 Na caixa Organism poss vel restringir as buscas para apenas aquelas que s o derivadas de um organismos espec fico Tamb m poss vel excluir apenas essa esp cie clicando no bot o Exclude e adicionar mais organismos para restringir ou excluir os mesmos das buscas bot o se ead 6 Clique em BLAST O resultado pod
145. Life Technologies Protocols Componentes Concentra o final na rea o 10X PCR buffer 1X 10 mM dNTP mix 0 2 mM cada dNTP 50 mM MgCl 15 nM Primer mix 10 mM cada 0 5 pM cada Taq polimerase 5U 1L 1 0 a 2 5U Nota deve se acrescentar gua Milli O ou de inje o para completar o volume final da rea o A concentra o de DNA total acrescentado rea o pode variar conforme as especifica es da PCR Cuidados durante a realiza o da t cnica Usar os EPI s Equipamentos de Prote o Individual necess rios e falar o m nimo durante a realiza o do procedimento Manter todos os reagentes protegidos da luz e no gelo at o momento em que for us los Dica fazer al quotas dos reagentes para que n o haja contamina o desses Identificar os microtubos conforme as amostras a serem amplificadas Preparar uma rea o geral de PCR contendo os reagentes b sicos buffer ou tamp o dNTPs MgCL primers Taq polimerase gua em um nico microtubo considerando o n mero de amostras a serem amplificadas Em seguida distribuir nos microtubos individuais previamente identificados e adicionar o DNA de cada amostra No caso da realiza o da rea o em uma placa recomenda se montar um esquema desenho da placa com a localiza o de cada amostra a ser genotipada Dica multiplicar a quantidade de cada reagente pelo n mero de amostras a serem amplificadas Controle Negativo Importante a
146. M RIOS Portanto se obt m uma solu o padr o se esta for preparada diretamente a partir de um padr o prim rio ou se for padronizada ao reagir com um padr o prim rio Para que uma subst ncia possa servir como padr o prim rio s o requeridas certas exig ncias Ela deve ser de f cil obten o purifica o disseca o e conserva o As impurezas que por ventura existam no reagente devem ser facilmente identific veis Oreagente n o deve ser higrosc pico ou vol til O reagente deve ser bastante sol vel Quando em uso numa titula o uma bureta deve ser manipulada corretamente para evitar maiores erros Coloca se em um erlenmeyer a amostra a ser titulada cuja massa ou volume deve ser conhecido com exatid o Conforme o caso adiciona se a seguir as subst ncias que forem necess rias ex solvente indicador Separadamente coloca se a solu o que ser usada como titulante em uma bureta Acerta se o zero Em seguida coloca se o erlenmeyer sob a bureta e deixa se o titulante escoar gota a gota Controla se a torneira da bureta com a m o esquerda ou direita Uma pessoa destra usar sua m o esquerda na torneira fazendo uma leve press o nesta para a esquerda de modo a prevenir vazamentos e com a m o direita agitar continuamente o erlenmeyer Um indiv duo canhoto dever proceder de modo inverso Quando poss vel aconselh vel o uso de agitador com barra magn tica para uma melhor agita o
147. Muitas vezes a centrifuga o mais efetiva na remo o de impurezas s lidas do que as t cnicas convencionais de filtra o utilizada na separa o de misturas s lido l quidas ou de dois l quidos imisc veis baseando se no princ pio de que o s lido ou l quido de maior densidade ir para o fundo do recipiente de maneira r pida e eficiente Com esse processo part culas muito pequenas que poderiam passar pelos filtros tradicionais s o removidas Na centrifuga o deve se tomar alguns cuidados a Utilizar culos de prote o b Colocar os tubos aos pares na centrifuga e sempre em sentido oposto um ao outro a fim de balancear o peso sobre o eixo central c Se ao ligar a centr fuga ocorrerem vibra es deslig la e revisae todos os seus passos A Figura 21 apresenta uma centr fuga Figura 21 Centr fuga Fonte Dos autores Refer ncias POSTMA James M ROBERTS Julian L HOLLENBERG Leland Qu mica no Laborat rio Barueri SP Manole 5 edi o 2009 546 p ROSA Gilberto GAUTO Marcelo GON ALVES F bio Qu mica Anal tica Pr ticas de Laborat rio Porto Alegre Bookman 2013 128 p 1 19 PROCESSO DE SEPARACAO POR PRECIPITACAO Quando se forma uma subst ncia insol vel pela rea o de duas subst ncias em solu o a subst ncia insol vel formada precipita se ou seja deposita se mais ou menos lentamente no fundo do recipiente em que ocorreu a rea o Uma das maneiras de
148. O GENICA An lises de express o g nica permitem a identifica o de quais genes est o sendo expressos em determinado tecido em uma determinada situa o al m de permitir a quantifica o dos n veis de express o 1 Abrir o programa StepOne Applied Biosystems 2 Clicar na janela Setup ap s Run Method e programar a rea o Etapa inicial de desnatura o 95 C por 5 minutos Holding Stage 40 ciclos 95 C por 30 segundos Cycling Stage 60 C por 30 segundos 72 C por 30 segundos Curva dissocia o 95 C por 15 minutos Melt Curve Stage 60 C por 1 minuto Dica na curva de dissocia o ocorre um aumento gradual da temperatura de 0 3 em 0 3 C por segundo at chegar aos 95 C Quando atinge esta temperatura permanece por 15 min Ap s permanece 1 min a 60 C 3 Clicar na janela Setup ap s Plate Setup e por ltimo Define Targets and Samples Definir os nomes dos genes e das amostras a serem avaliados nos respectivos campos 4 Clicar na janela Assign Targets and Samples e organizar o layout da placa distribui o dos genes e amostras de cada po o lembrando se de identificar os controles negativos 5 Colocar a placa preparada no aparelho 6 Clicar em Start Run para iniciar o procedimento CAPITULO 6 ANALISE DE EXPRESSAO GENICA EM NIVEL DE PROTEINA Angela Maria Schorr Lenz Ivan Cunha Bustamante Filho Jorge Almeida Guimaraes Luc lia Santi Markus B
149. P Q A Onde Q quantidade de prote na adicionada e A absorb ncia Calcular a FCM fator de calibra o m dio m dia das FCPs Estabelecer uma faixa FCM 10 e 10 ver quais se encaixam Se algum ponto ficar fora calcular novo FCM com os que est o dentro da faixa Calcular a prote na das amostras Abs x FCM x 100 para passar para mL mg mL de prote na Dicas Quando dosar um tipo de amostra nova recomenda se testar diferentes dilui es da mesma para definir qual dilui o resulta em absorb ncias que fiquem dentro da curva Para uma curva mais precisa recomenda se mais pontos por curva O presente protocolo recomenda que a quantifica o seja feita em duplicata Por m realizar a curva e amostras em triplicata ou mesmo quatriplicata dar mais seguran a estat stica a dosagem de prote nas Em caso de amostras com pouca prote na pode se fazer uma curva dilu da usando BSA 0 1 mg mL Evitar dosar amostras com excesso de detergentes gt 2 o que pode levar a interfer ncia no m todo Refer ncias BRADFORD M Analytical Biochemistry 72 248 254 1976 2 17 QUANTIFICACAO DE PROTEINAS PELO METODO DE LOWRY O m todo de Lowry et al 1951 baseado na complexa o do cobre em meio alcalino formando uma cuproprote na de cor azul lido espectrofotometricamente Os ons cobre em meio alcalino reagem com as liga es pept dicas das prote nas formando um complexo de cor p rpura proporc
150. PARO DAS SOLU ES Citocalasina Solu o M e 2 mg ml No pr rpio frasco comercial acrescenta se 5 mL de DMSO a 10 mg de Citocalasina B Armazenar no congelador Citocalasina Solu o de Uso 4 pg ml Acrescenta se 9 5 mL de Meio RPMI 1640 a 0 5 mL de Solu o M e em tubo est ril Armazenar na geladeira PBS 10X Phosphate Buffer Solution pH 7 4 80 0 g de NaCl 2 0 g de KCI 21 7 g de Na HPO 7H O fosfato de s dio dib sico 2 0 g de KH PO dihidrogenofosfato de pot ssio a Em um b quer com capacidade de 1000 mL ou mais juntar todos os reagentes NaCl KCI Na HPO 7H O e KH PO b Adicionar aproximadamente 400 mL de gua destilada e dissolver os reagentes utilizando um bast o de vidro c Ajustar o pH para 7 4 com NaOH 10 M d Completar at 1 litro com gua destilda Solu o de Giemsa colora o da amostra 20 em PBS Meio de Cultura RPMI 1640 Meio Incompleto 10 g meio RPMI 1640 10 mg Estreptomicina 100 Unidades mL ou 5 mg 10 x 10 U Penicilina 1000 mL H O destilada ou Milli Q a Em vidraria preferencialmente esterilizada colocar todos os compostos e dissolver sob agitata o b Medir o pH e ajustar com HCl IN ou NaOH 1N at que o pH chegue a 7 3 c Na Cabine de Seguran a Biol gica filtrar o meio usando membrana de Millipore 0 02 um est ril e verificar o pH novamente d Armazenar em frascos est reis de 250 mL identificados com nomes do meio e do res
151. RIPSINA A tripsina uma serino proteinase que possui importantes fun es fisiol gicas e Z fisiopatol gicas E fundamental para o processo digestivo diferencia o e migra o celular e tamb m est relacionada a uma s rie de doen as como pancreatite inflama o e rea es al rgicas Neste protocolo apresentamos um ensaio cl ssico para a medida da atividade desta enzima As principais aplica es s o para estudar a atividade inibit ria de diferentes f rmacos inibidores de proteases extratos ou compostos isolados de plantas Por utilizar volumes pequenos de reagentes e ser realizado em microplacas o protocolo bastante til no screening de inibidores de proteases possibilitando o teste de diferentes amostras em um s ensaio e com economia de reagentes O ensaio utiliza um substrato espec fico para tripsina associado a um grupamento crom geno p nitroanilina A rea o acontece quando a tripsina reconhece o substrato cliva entre a arginina e o grupamento crom geno e libera a p nitroanilina que um produto de cor amarela A atividade da tripsina proporcional quantidade de p nitroanilina liberada e pode ser facilmente medida por espectrofotometria 1 Procedimento mM 7 4 Curva Padr o de p Nitroanilina 1 1 Pesar a p nitroanilina em balan a anal tica e preparar de 2 a 5 mL de uma solu o 0 14 Dica Preparar a solu o de p nitroanilina no tamp o utilizado para o ensaio Tris HC1 20 mM
152. S o utilizados ratos 200 250 g ou camundongos 25 30 g adultos machos mantidos em biot rio espec fico com ciclo claro escuro de 12 horas temperatura de 22 2 e umidade de 60 80 com livre acesso a gua e ra o Pelo menos dois dias antes dos experimentos transferir os animais para o biot rio do setor onde os procedimentos ser o realizados para adapta o Todos os experimentos com animais devem seguir obrigatoriamente as atribui es e compet ncias definidas na Lei 11 794 08 e em resolu es do Conselho Nacional de Controle em Experimenta o Animal CONCEA Antes da realiza o de qualquer procedimento o protocolo incluindo a identifica o das subst ncias ou extratos a serem testados e suas doses devem ser submetidos an lise da Comiss o de tica para o Uso de Animais CEUA da institui o Os m todos de anestesia e eutan sia sugeridos aqui est o de acordo com o NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals edi o revisada em 1996 http www nap edu readingroom books labrats Materiais Mesa cir rgica Seringa descart vel para insulina com agulha 1 mL 13 X 0 45 mm 26 G 2 L mina de bisturi n 20 Cron metro Papel filtro gua destilada PBS lcool iodado 1 Heparina Xilazina e Ketamina Procedimentos 1 Pesar o animal 2 Preparar na mesma seringa e administrar por via intraperitoneal i p a mistura de Xilazina 10 mg kg Ketamina 75 mg kg Esta
153. TOSIDASE ACIDA ASSOCIADA A SENESCENCIA SA B GAL C lulas senescentes apresentam aumento da express o e atividade da prote na beta galactosidase cida lisossomal Este protocolo se baseia na determina o da atividade desta enzima por meio da incuba o das c lulas in vitro com o substrato cromog nico x gal o qual convertido a um produto azul que se acumula intracelularmente marcando as c lulas senescentes M todo de Dimri et al 1995 Protocolo referente placa de 24 po os os volumes podem ser ajustados de maneira diretamente proporcional conforme o tipo de placa Ex placa de 6 po os volumes 4x maiores placas de 12 po os volumes 2x maiores 1 Plaquear 1 x 10 c lulas em placa de 24 po os e realizar o tratamento de interesse Dica deve ser atentar para que o controle n o atinja m xima conflu ncia antes do final do experimento Pode se alterar o n mero inicial de c lulas dependendo do desenho experimental 2 Retirar o meio e lavar os po os 3x com PBS 1x Dica adicionar e retirar o PBS vagarosamente para n o soltar as c lulas aderidas 3 Incubar as c lulas com 100 pL paraformaldeido 4 a temperatura ambiente por 15 minutos 4 Retirar o paraformaldeido e lavar 3x com PBS CMF Dica 1 Pode se deixar at 5 dias as c lulas em PBS 1x at proceder a marca o Dica 2 a realiza o deste protocolo em ambiente est ril fluxo laminar mant m as c lulas ntegras e ajuda a manter a morfome
154. UENCIAS DE PROTEINAS Estas ferramentas t m por finalidade predizer a presen a de dominios transmembrana ao longo de uma cadeia polipeptidica a partir de sua sequ ncia Predi o de dominios transmembrana utilizando Phobius 1 Acessar o site http phobius sbc su se Dica para encontrar diretamente digite phobius no Google 2 Na caixa colar a sequ ncia a ser analisada 3 Clicar em Submit query 4 Analisar o resultado O Phobius mostra inicialmente quais dominios transmembrana foram preditos para a sequ ncia de interesse e qual a extens o dos mesmos indicando res duos de in cio e t rmino para cada um Observar a presen a de pept deo sinal identificado por SIGNAL al as identificadas por TOPO DOM e dom nios transmembrana identificados por TRANSMEM Os amino cidos de in cio e t rmino s o indicados Na parte inferior mostrada a representa o gr fica do resultado No eixo X mostrado o n mero do res duo e no eixo Y qual a probabilidade de cada res duo fazer parte do dom nio em quest o Observar a linha vermelha indica a probabilidade de presen a de um pept deo sinal e as linhas verde e azul indicam amino cidos ao longo da sequ ncia com maior probabilidade de estarem voltados para o citoplasma ou para o meio extracelular respectivamente As regi es com dom nios transmembrana preditos s o mostradas em cinza Predi o de dom nios transmembrana utilizando
155. Zn SOD 5 Solu o de revela o Fosfato de pot ssio monob sico K HPO 0 627 g Riboflavina 2 6 uM 55 mg mL gua 3 pL TEMED 928 mM 0 325 mL H O destilada q s p 100 mL Ajustar o pH com cido fosf rico H PO 5 1 Ap s o tratamento com solu o de colora o e revela o expor o gel luz branca forte at surgirem as bandas Para Mn SOD esta enzima n o inibida Ap ndice Exemplos de colora o e detec o de g is de prote na 3 4 5 1 SDS PAGE corado com Comassie Blue 2 Protease 3 Quitinase 4 Lipase 5 Catalase Refer ncias SANTIL BEYS DA SILVA WO BERGER M GUIMAR ES JA SCHRANK A VAINSTEIN MH Conidial surface proteins of Metarhizium anisopliae Source of activities related with toxic effects host penetration and pathogenesis Toxicon 2010 1 55 4 874 80 CAPITULO 17 GERENCIAMENTO DE RESIDUOS EM LABORATORIOS DE BIOTECNOLOGIA Catia Viviane Goncalves Laborat rios de pesquisas geram uma gama de res duos durante os processos desenvolvidos em suas depend ncias os quais possuem caracter sticas intr nsecas referentes sua forma de gera o A quantidade de res duos produzida neste segmento poderia ser considerada insignificante quando comparada s atividades industriais Todavia sob o ponto de vista ambiental podem representar um problema expressivo principalmente por n o possu rem t cnicas padronizadas para o seu tratamento em fun o da variabil
156. a destilada Ajustar o pH e avolumar com gua destilada para 800 mL Ap s adicionar 200 mL de Metanol Armazenar em frasco mbar sob refrigera o 2 Solu o de PBS concentrado 10X pH 7 4 1L NaCl 80 g do produto KCl 2 g do produto Na HPO 14 4 g do produto KH PO 2 4 g do produto Agua ultrapura 800 mL do produto Em um b quer homogeneizar todos os reagentes com agitador magn tico Ajustar o pH e avolumar com gua ultrapura 3 Solu o de PBS 1X pH 7 4 Para preparar 1 L adicionar em proveta graduada 100 mL de PBS 10X e 900 mL de gua ultrapura Para prevenir uma poss vel contamina o transferir a solu o da proveta para um frasco autoclavado 4 Solu o de T PBS PBS Tween 20 0 05 Em 250 mL de PBS adicionar 125 pL de Tween Homogeneizar gentilmente para evitar a forma o de espuma Armazenar 4 C 5 Solu o de M T PBS PBS Tween 20 0 05 acrescido de 5 de leite em p desnatado Em 20 mL de T PBS adicionar 1 g de leite em p desnatado Homogeneizar com barra magn tica Utilizar para bloqueio a membrana de nitrocelulose PVDF ou para diluir anticorpos Dica pode ser armazenado congelado para posterior utiliza o Aten o alguns anticorpos n o podem ser dilu dos em M T PBS assim recomenda se a substitui o do leite em p desnatado na solu o de bloqueio por albumina s rica bovina BSA em concentra es de 0 1 a 1 Western Blotting 1 Preparar um recipiente e ad
157. a o amarelo de cada planilha referente aos tratamentos 8 Apagar os X da coluna I onde n o houver dados Dica diferentes experimentos devem ser colocados na ordem indicada na coluna A 9 A porcentagem de c lulas em cada condi o dada na coluna AH Os gr ficos representam Area nuclear versus Indice de Irregularidade Nuclear NII esquerda e a porcentagem de cada mecanismo celular direita Refer ncia FILIPPI CHIELA EC Oliveira MM Jurkovski B Callegari Jacques SM da Silva VD Lenz G 2012 Nuclear morphometric analysis NMA screening of senescence apoptosis and nuclear irregularities PLoS One 7 e42522 D gt cm CAPITULO 5 ANALISE DE EXPRESSAO GENICA EM NIVEL DE RNA Adriane Pozzobon Andressa Dametto Edina Aparecida dos Reis Blasi Giseli Buffon Raul Antonio Sperotto Ronize Zeni da Silva Vinicius de Abreu Waldow 5 1 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS DE RNA COM DNASE I E DNASE TURBO O tratamento das amostras de RNA com DNase utilizado para eliminar qualquer contamina o com DNA gen mico que durante o processo de extra o de RNA possa ter sido extra do DNase 1 1 Pipetar em cada tubo 10x DNAse I Reaction Buffer 1uL Manter no gelo DNAse I 1pL 1 pg de RNA Total H O Milli Q q s p TOTAL 10 pL 2 Deixar 15 minutos sob temperatura ambiente 3 Pipetar em cada tubo 1 pL de EDTA 25 mM 4 Manter a 65 C por 10 minutos A enzima inativada por calor e EDTA 5 Gu
158. a 17 manuseio correto da pipeta te Limpar as poredes exteriores com papel absorvente Encher o pipeto com suc do a Remover o bulbo e impedir o escoa mento do liquido imediatamente com o dedo indicador Ajustar o nivel do menisco q marco de ca libro o evitar erro de poraloxe F Esperor q da 10 15 seg EG 3 Escoor o e tocar a T liquido pipeto nos z livremente paredes do frasco Er E La s be i Fonte Manuseio de pipetas 2014 Para proceder suc o de l quidos existem os pipetadores O exemplo cl ssico de pipetador o de tr s vias Compreende de um bulbo de borracha com tr s aberturas uma superior para se retirar o ar interno do bulbo e outras duas inferiores Uma para fazer a suc o do l quido e a outra para liber lo Ultimamente foram confeccionados pipetadores tipo seringas que promovem a suc o do ar interno da pipeta fazendo com que o l quido suba As pipetas volum tricas e como todos os aparelhos volum tricos devem ser aferidos quando se necessita utiliz los em an lises volum tricas Esta t cnica baseia se na determina o da massa de gua destilada contida dentro da pipeta De uma forma resumida s o feitas tr s medidas de gua destilada em temperatura conhecida para cada pipeta Escoa se esta quantidade para frascos erlenmeyer de 125 mL com tampa pesados previamente em balan a anal tica Estes frascos s o pesad
159. a da luz A estabilidade m dia de 2 a 6 meses Dica 2 o ideal fazer um mix total com o volume final a ser utilizado no experimento importante sempre calcular esse volume considerando n po os 1 Por exemplo para 24 po os ser o necess rios 7 5 mL de CMF 1x 7 5 pL de DCF 10 mM 7 Centrifugar a 1 500 rpm por 5 minutos 8 Ressupender o pellet em 200 uL de CMF 1x 37 C e realizar a leitura no cit metro de fluxo Dica o volume de CMF no qual o pellet dever ser ressuspenso varia de acordo com o tipo de cit metro a ser utilizado Em cit metro com leitor de placa de 96 po os deve se ressuspender em 150 200 pL enquanto para leitura em tubo deve se ressuspender em volume de 200 400 uL Refer ncias KESTON AS Brandt R 1965 The fluorometric analysis of ultramicro quantities of hydrogen peroxide Anal Biochem 11 1 5 MYHRE O Andersen J Aarnes H Fonnum F 2003 Evaluation of the probes 2 7 dichlorofluorescin diacetate luminol and lucigenin as indicators of reactive species formation Biochem Pharmacol 65 1575 1582 4 17 MARCACAO COM IODETO DE PROPIDEO PARA DETERMINA O DA DISTRIBUI O DO CICLO CELULAR O presente protocolo baseia se na marca o estequiom trica do DNA celular com Iodeto de Prop deo IP o qual intercala na dupla fita de DNA e emite fluoresc ncia vermelha correspondente quantidade de DNA presente na c lula C lulas em fase G2 M apresentam o dobro de fluoresc ncia v
160. a dois fungos amplamente utilizados para controle biol gico Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana Entretanto os m todos podem ser tamb m aplicados para outros fungos a Em placas de petri 1 Preparar placas contendo o meio escolhido Para muitos fungos pode se utilizar o meio BDA batata dextrose gar por ser f cil de preparar e conter todos os compostos essenciais para o crescimento f ngico E um meio de cultura barato e f cil de ser encontrado comercialmente 2 Fazer o in culo estriado do fungo utilizando uma al a de platina preenchendo toda a placa 3 Manter as placas em estufa 28 C ou a temperatura desejada at a total esporula o 4 As placas podem ser utilizadas para a suspens o de esporos conforme ser visto a seguir Meio BDA 300 g Batata descascadas e picadas 10 g Glicose 18g gar 1L H O destilada ferver a batata com um pouco de gua destilada em micro ondas 10 minutos Filtrar a gua do cozimento para ser usada no meio e adicionar os outros ingredientes Ajustar o volume para 1 L Esterilizar por autoclavagem 15 minutos 121 C Refer ncias FRAZZON A P SILVA Vaz Junior da MASUDA A SCHRANK A VAIINSTEIN MH In vitro assessment of Metarhizium anisopliae isolates to control the cattle tick Boophilus microplus Veterinary Parasitology 94 1 2 117 125 2000 b em arroz produ o em grande escala 1 Preparar sacos de polipropileno contendo 100 g de
161. a forma o de componentes coloridos sol veis em cido tricloroac tico 1 Procedimento Preparo das Solu es 1 1 Preparar uma solu o tamp o de Tris HCl 0 05 M pH 8 0 pela dissolu o de 0 605 g de Tris em 80 mL de gua destilada Ajustar o pH com HCI 5 M e completar o volume para 100 mL com gua destilada 1 2 Preparar uma solu o de HCl 5M pela adi o lenta de 41 8 mL de HCI P A cido clor drico fumegante em 58 2 mL de gua destilada 1 3 Preparar uma solu o de azocase na 2 Para tanto dissolver 2 g de azocaseina em 100 mL de gua destilada Estocar a 4 C por no m ximo uma semana 1 4 Preparar uma solu o de TCA 20 Para tanto dissolver 20 g de TCA em 100 mL de gua destilada e estocar a 4 C M todo do ensaio 1 5 Em um tubo de 2mL adicionar 200 pL de tamp o Tris HCl 0 05M pH 8 0 e 100 pL de azocase na 2 Dica para cada amostra dever ser feito um tubo considerado o branco da amostra Para isso adicionar a um dos tubos 800pL de solu o de TCA 20 antes de iniciar o ensaio 1 6 Incubar os tubos em banho maria a 40 C at atingir o equil brio t rmico aproximadamente 5 minutos Dica a amostra a ser dosada deve ser tamb m acondicionada previamente em banho maria a 40 C para atingir o equil brio t rmico antes de ser adicionada ao sistema de rea o 1 7 Adicionar 100 pL da amostra a ser testada nos tubos contendo o substrato e incubar por 15 minutos 1 8 Ap s
162. a p gina seguinte encontrar dentre as op es de Specialized BLAST o link para Primer BLAST Dica para acessar o site mais facilmente basta digital ncbi primer blast no Google 3 Na p gina do Primer BLAST colar a sequ ncia dos primers projetados anteriormente nas respectivas caixas Elas s o as primeiras na se o Primer Parameters 4 Na se o Primer Pair Specificity Checking Parameters selecionar o tipo de base de dados Database Caso esteja analisando uma sequ ncia expressa selecionar as base de dados de RNA Refseq RNA ou Refseg mRNA Caso esteja analisando uma sequ ncia de DNA gen mico selecionar as bases de dados de genoma Genome Dica caso queira incluir o maior n mero de sequ ncias poss vel tanto gen micas quanto expressas selecionar a base de dados nr Ela refere se non redundant n o redundante ou seja inclui todas as sequ ncias presentes no banco que n o sejam repetidas 5 Informar qual o organismo para o qual os primers foram desenhados Organism Devido grande demanda de uso para sequ ncias derivadas de humano o padr o da p gina manter o organismo como Homo sapiens Caso esteja analisando primers para sequ ncias de humanos portanto n o necess rio mudar No caso de outro organismos digitar Dica quando come ar a digitar o nome do organismo uma lista com op es aparecer facilitando encontrar o nome que se deseja e evitan
163. a quanto temperatura Figura 4 8 Agitador magn tico utilizado no preparo de solu es em rea es qu micas quando se faz necess rio uma agita o constante Figura 4 9 Balan a anal tica usada para se obter massa com alta exatid o Balan as semi analiticas s o tamb m usadas para medidas nas quais a necessidade de resultados confi veis n o t o necess ria Figura 4 10 Figura 4 Diversos materiais de uso comum em laborat rios qu micos e reas afins Siow 3 JES wy Fonte Blog de vidraria de laborat rio 2014 Refer ncias BLOG DE VIDRARIA DE LABORATORIO Rela o de produtos mais utilizados em laborat rios Dispon vel em lt http www vidrariadelaboratorio com br gt Acesso em 09 jun 2014 UNIFEB Apostila de Quimica Geral e Experimental 2009 lt http xa yimg com kq groups 24693296 1821154571 name UNKNOWN PARAMETER VALUE gt Acesso em 30 mar 2014 SILVA R R Da Bocchi N Filho R C R Introdu o Quimica Experimental S o Paulo McGraw Hill 1990 T cnicas Laboratoriais B sicas Dispon vel em lt file C Users user Documents UNIVATES Ebooks 20finais 3c063ab671ad9b66895ffa8f310ab5c4 pdf gt Acesso em 31 mar 2014 TRINDADE D F et al Qu mica b sica experimental S o Paulo Cone 1998 1 3 PRINCIPAIS TIPOS DE AGUA EMPREGADOS NO LABORATORIO A gua um dos principais solventes da natureza sendo o principal constituinte do corpo do
164. a subst ncias fen licas onde a complexa o de hidroxilas com o on Fe leva ao desenvolvimento de subst ncias de colora o azulada ou esverdeada conforme estrutura da mol cula Adicionam se tr s gotas da solu o aquosa de cloreto f rrico 1 preparadas anteriormente ao tubos B contendo os extratos Na presen a de taninos hidrolis veis ocorre o desenvolvimento de colora o azulada e na presen a de taninos condensados a colora o verde O tubo C ser utilizado como controle para verifica o da colora o inicial do extrato Flavonoides Pesam se cerca de 0 2 g de extrato Adicionam se aproximadamente 50 mL de gua em banho maria fervente por 30 minutos Esfria se filtra se e extrai se duas vezes em funil de separa o utilizando 10 mL de n butanol Evapora se a fra o butan lica secura em c psula de porcelana e retoma se o extrato em metanol cerca de 10 mL Transfere se para 2 tubos de ensaio A e B No tubo A adicionam se 0 5 mL de cido clor drico concentrado e ap s 0 1 g de magn sio met lico O desenvolvimento da colora o laranja indica a presen a de flavonas a colora o viol cea indica flavanonas e a cor vermelha a presen a de flavon is O tubo B ser utilizado como controle para a verifica o da colora o inicial do extrato Cumarinas Aquece se em tubo de ensaio cerca de 0 1 g dos extratos em banho maria fervente Deve se tampar o tubo de en
165. a venom in rats involvement of mast cell degranulation histamine and 5 HT receptors Toxicon 2008 1 51 3 363 72 gt gt cm 14 6 MODELO DE GASTRITE Neste protocolo a inflama o no est mago lcera g strica induzida em ratos pelo tratamento com etanol HCl As principais aplica es s o para a avalia o dos efeitos anti inflamat rios e imunorregulat rios de diferentes subst ncias como drogas sint ticas e produtos naturais extratos ou compostos isolados de plantas ou ainda para estudar o papel de c lulas inflamat rias prote nas quimiocinas e citocinas no processo de inflama o g strica Animais S o utilizados ratos adultos machos 200 250 g mantidos em biot rio espec fico com ciclo claro escuro de 12 horas temperatura de 22 2 C e umidade de 60 80 com livre acesso gua e ra o Pelo menos dois dias antes dos experimentos transferir os animais para o biot rio do setor onde os procedimentos ser o realizados para adapta o Todos os experimentos com animais devem seguir obrigatoriamente as atribui es e compet ncias definidas na Lei 11 794 08 e em resolu es do Conselho Nacional de Controle em Experimenta o Animal CONCEA Antes da realiza o de qualquer procedimento o protocolo incluindo a identifica o das subst ncias ou extratos a serem testados e suas doses devem ser submetidos an lise da Comiss o de tica para o Uso de Animais CEUA da institui o Os m
166. aba Mou caninos amas sir eeu dde de sicsee dubs ci ssesa Sel nisaTo Indo tants SECONDS sacha te aida ia TI na SEU assada UTI ada aaa cena Gatieese 160 CAP TULO 6 AN LISE DE EXPRESS O G NICA EM N VEL DE PROTE NA 161 6 1 ELETROFORESE DE PROTE NAS EM CONDI O DESNATURANTE EM GEL DE POLIACRILAMIDA SDS PAG Eivstecssiscscsssacacaassssssceassrascewsasevscesecackuseysecesebespoa vangasawha neocncospesnesbans seen dios ss pias Gua s ssa ias du sas s 162 6 2 M TODOS DE COLORA O DE GEIS SDS PAGE csssssssesssssssessesssesssessesssesssecsucssecsscsssesssssessvsssscsuessscssesseesaneeseease 166 6 3 IMUN OIDENTIFICA O DE PROTE NAS POR WESTERN BLOTTING ccccssccsssessessessesscsecsrssrsuesuceeeseeerenssneneens 168 CAP TULO 7 PRODU O E AN LISE DE BIOPRODUTOS ccccscscssssssssssssssssssssscssscssscssscscscssscscssssssssesscesssssens 171 7 1 MANUTEN O DAS CULTURAS arising 172 7 2 PREPARA O DO IN CULO sitanintamanarniunantiaransinamdamianadadanedmiantsiinnainieaniianncinantss 172 7 3 DETERMINA O DE BIOMASSA xissoiiqnia ins ibifidnanbacis oiii is garcia adiar ca 172 7 4 DETERMINA O DA ACIDEZ TITULAVEL sscsssssssssssssssssessssssssssssssssecsssesssesssesssecssscssssssussssecssucsssecsusessscssucsssecsseesses 173 7 5 DETERMINA O DO E pee capa tpn teeter rash iene ad boa nsaghapehlanghnagndnio dened 175 7 6 DETERMINA O DA MATERIA MINERAL CINZAS ssssssssssessssssssessssssssssssesssesssscssuss
167. abase selecione o conjunto de dados contra o qual a sequ ncia de interesse ser alinhada Caso queira buscar em todo o banco de dados do GenBank selecione Non redundant protein sequences 5 Na caixa Organism poss vel restringir as buscas para apenas aquelas que s o derivadas de um organismos espec fico Tamb m poss vel excluir apenas essa esp cie clicando no bot o Exclude assim como adicionar mais organismos para restringir ou excluir os mesmos das buscas bot o 6 Clique em BLAST O resultado pode demorar alguns minutos 7 Analisar os resultados Na se o Graphic Summary poss vel ver uma representa o gr fica dos resultados O tamanho das barras coloridas indica a extens o do alinhamento da sequ ncia de interesse query com diferentes sequ ncias do banco de dados J as cores indicam o qu o similares elas s o Arrastando o mouse por cima das barras a caixa acima da representa o gr fica mostrar o nome da sequ ncia com a qual a sequ ncia query apresenta similaridade 8 Na se o Descriptions s o mostradas as sequ ncias que apresentam similaridade e os dados que quantificam essa similaridade Dentre eles importante observar os seguintes Query coverage indica qual porcentagem da sequ ncia de interesse coberta pelo alinhamento com cada sequ ncia do banco lembre se que por se tratar de um alinhamento local muitas vezes apenas
168. aborat rios de qu mica e reas afins ES 21 19 Eq N Fonte Blog de vidraria de laborat rio 2014 1 2 2 Materiais de porcelana Cadinho usado para calcina o de subst ncias Figura 2 1 Tri ngulo de porcelana utilizado para sustentar cadinhos de porcelana em aquecimento no bico de Bunsen Figura 2 2 Almofariz e pistilo empregado para triturar e pulverizar s lidos Figura 2 3 C psula de porcelana usada para efetuar evapora es de l quidos Figura 2 4 Funil de Buchner utilizado em filtra es por suc o devendo ser acoplado a um Kitassato Figura 2 5 Esp tula usada para transferir subst ncias s lidas Figura 2 6 A Figura 2 ilustra os materiais de porcelana mais comuns utilizados em um laborat rio Figura 2 Materiais de porcelana de uso em laborat rios de qu mica e reas afins 1 3 SD Fonte Blog de vidraria de laborat rio 2014 Biotecnologia 1 2 3 Material Met lico Suporte ou haste mufa e garra pe as met licas usadas para montar aparelhagens em geral Figura 3 1 Garra met lica usada para prender condensador buretas bal es haste do suporte universal Figura 3 2 Tenaz usado para segurar objetos aquecidos Figura 3 3 Argola sustenta o funil na filtra o Figura 3 4 Trip usado como suporte principalmente de telas ou tri ngulos Figura 3 5 Esp tula similar a de porcelana de us
169. ada previamente preparada k Agita se por 15 segundos em V rtex e ap s aguardar por 30 minutos em banho maria a 40 C l Procede se com a leitura em espectrofot metro a 765 nm m Para a realiza o do branco da amostra procede se da mesma forma que na amostra mas adicionou se metanol ao inv s da solu o de extrato n Os valores obtidos s o comparados com a curva de cido G lico obtendo assim o valor em equivalentes de cido G lico mg de EAG g de extrato EtOH DP Refer ncias SINGLETON V L Rossi J A Colorimetry of Total Phenolics with Phosphomolybdic Phosphotungstic Acid Reagents American Journal of Enology and Viticulture 16 144 158 1965 SOUSA C M de M et al Fen is totais e atividade antioxidante de cinco plantas medicinais Quimica Nova 30 351 355 2007 7 15 AVALIACAO QUALITATIVA DE METABOLITOS SECUNDARIOS DE PLANTAS A pesquisa fitoquimica tem por objetivos conhecer os principais constituintes quimicos de esp cies vegetais ou avaliar sua presen a Classicamente em an lises preliminares sem o objetivo de isolamento de subst ncias qu micas a caracteriza o dos principais grupos de subst ncias vegetais de interesse tem sido conseguida pela realiza o de rea es qu micas que resultam no desenvolvimento de colora o e ou precipitado caracter stico Esses ensaios caracterizam qualitativamente as principais classes desses metabolites servindo como uma indica o para poss
170. ades Os meios de cultura sem adi o de N favorecem a obten o de diazotr ficos fixadores de N atmosf rico N mas n o a garantem A verifica o da presen a da atividade de fixa o de N dever ser realizada por outros m todos como por exemplo o ensaio de redu o de acetileno in vitro e dosagem da atividade da enzima respons vel pelo processo de fixa o a nitrogenase A sele o de diazotr ficos um dos procedimentos de isolamento de PGPRs mais utilizados devido import ncia do N para a produtividade agr cola Entretanto diversas outras caracter sticas de promo o de crescimento vegetal podem ser analisadas entre os isolados como a produ o de fito horm nios e a solubiliza o de minerais importantes como f sforo e ferro Uma mesma PGPR pode apresentar uma ou mais dessas caracter sticas mas o n mero ou o tipo de caracter stica n o assegura que o isolado seja uma boa PGPR A identifica o dos isolados etapa fundamental e o sequenciamento do gene 165 rRNA auxilia na defini o de g neros e at mesmo esp cies principalmente quando em conjunto com outras caracter sticas como morfologia e colora o da col nia rea o de Gram capacidade de esporula o entre outros Contudo devido complexidade da intera o entre bact rias e plantas experimentos de inocula o em c maras de crescimento ou casas de vegeta o e ensaios a campo s o indispens veis para avalia o da efetiva promo
171. ador de texto o ideal converter o arquivo em txt por este ser mais leve especialmente trabalhando com v rias sequ ncias em um mesmo arquivo e por permitir o acesso de uma gama maior de programas Outra possibilidade salvar as sequ ncias FASTA em uma planilha do Excel Para isso necess rio retirar todos os espa os entre os caracteres que comp em a sequ ncia No Excel uma c lula conter o sinal de gt e o identificador e a c lula abaixo conter a sequ ncia j sem espa os Esta maneira facilita o armazenamento devido ao menor tamanho do arquivo D gt cm 11 4 OBTENCAO DE SEQUENCIAS REVERSO COMPLEMENTAR As sequ ncias de nucleot deos s o escritas normalmente no sentido 5 para 3 e representam uma dupla fita de DNA para a qual apenas uma das fitas escrita Dependendo da necessidade muitas vezes interessante obter a sequ ncia da fita oposta que reversa ou seja orientada de 3 para 5 em rela o fita para a qual se conhece as sequ ncias e complementar baseada no pareamento de bases A T e C G que se est utilizando Sequ ncia reverso complementar Acesse o site abaixo http www bioinformatics org sms rev comp html Dica para encontrar diretamente o site digitar reverse complement no Google Na janela cole a sequ ncia para o qual deseja gerar a sequ ncia reverso complementar Clique em Submit Dica caso deseje gerar apenas a sequ ncia reversa
172. al 6 Estes esporos podem ser utilizados de duas formas 6 1 secos devem ser armazenados em falcons de 50 mL na geladeira mantendo uma viabilidade alta por normalmente at 1 m s dependendo do fungo ou isolado 6 2 em suspens o utilizando uma solu o de Tween 80 0 01 somente gua ou outra formula o espec fica Podem ser armazenados na geladeira e mant m normalmente alta viabilidade por at 1 semana dependendo do fungo ou isolado Dica o preparo da suspens o pode ser feita diretamente a partir do esporo produzido em placa ou nos sacos de arroz adicionando a gua ou solu o sem a peneiragem dos esporos Dica sempre antes de utilizar os esporos independente se forem secos ou em suspens o deve se testar sua esterilidade por meio de cultura por 16 horas em meio Luria Bertani LB Meio LB Luria Bertani 10 g Peptona 5g Extrato de levedura 10g NaCl 1L H O destilada Autoclavar 15 minutos 121 C Refer ncias BEYS DA SILVA W O SANTI L BERGER M PINTO A F M GUIMAR ES J A SCHRANK A VAINSTEIN M H Characterization of a spore surface lipase from the biocontrol agent Metarhizium anisopliae Process Biochemistry 44 829 834 2009 SANTI L SILVA L A D BEYS DA SILVA W O CORREA A P F RANGEL D E N CARLINI C R SCHRANK A VAINSTEIN M H Virulence of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae using soybean oil formulation for control of the cotton stainer bug D
173. am oxidados O nitrog nio da prote na reduzido e transformado em sulfato de am nia Adiciona se hidr xido de s dio concentrado e aquece se para a libera o da am nia dentro de um volume conhecido de uma solu o de cido b rico formando borato de am nia O borato de am nia formado dosado com uma solu o cida padronizada M todo de BRASIL 1981 Equipamentos Balan a anal tica Bloco digestor Destilador de nitrog nio Vidrarias utens lios e outros Esp tula Proveta de 50 mL Erlenmeyer de 250 mL Bureta Pinga de Castaloy Reagentes cido Sulf rico H SO p a Mistura catal tica a Sulfato de pot ssio K SO p a b Sulfato de cobre pentahidratado CuSO 5H O p a c Misturar a e b na propor o de 10 1 triturando at obter um p fino Indicador Misto Pesar 0 132 g de vermelho de metila C H N O e 0 06 g de verde de bromocresol C H Br 0 5 Dissolver em 200 mL de solu o de lcool et lico a 70 v v Filtrar se necess rio e guardar em frasco mbar cido b rico H BO a 4 m v Pesar 4 g de cido b rico p a transferir para um b quer de 250 mL adicionar 80 mL de gua e aquecer sob agita o branda at dissolu o Resfriar transferir para bal o volum trico de 100 mL e completar com gua cido sulf rico 0 1 N Na capela adicionar 3 mL do cido sulf rico p a em um bal o volum trico de 1 L contendo 500 mL de gua Avolumar e
174. amente descontado do valor total de leitura das absorb ncias referentes Selecionar o tipo de amostra No Menu Principal item 1 Selecionar Tipo Amostra para selecionar o tipo de amostra da qual ser realizada a leitura Selecione a op o conforme sua amostra DNA de fita dupla DNA de fita simples RNA ou prote na PASSO 1 Leitura do BRANCO 1 Abra as placas met licas levantando a placa superior at o limite 2 Com uma micropipeta aplique 2 uL da solu o referente ao BRANCO no centro 3 Abaixe delicadamente a placa met lica superior at o limite Dica evite a forma o de bolhas ao aplicar a solu o Em caso positivo abra as placas met licas limpe as plataformas superiores e inferiores com o papel absorvente reaplique o branco e feche as placas novamente Papel absorvente usa se guardanapos de len o cortado em pequenos quadradinhos de 1 cm Utilize uma pin a para pegar o quadradinho e realizar a limpeza do quantificador N O utilizar papel higi nico ou papel toalha pois estes podem riscar a base onde as amostras s o aplicadas 4 Selecione a op o BRANCO na se o Fun o e pressione a tecla Enter Imediatamente a leitura ser iniciada e aparecer um aviso notificando sobre o sucesso da leitura 5 Ap s a leitura do BRANCO levante a placa met lica superior e limpe suavemente sem fazer for a as plataformas superior e inferior de leitura PASSO 2 Leitura das AMOSTRAS 1 Aplique 2 uL
175. and bacillus licheniformis NH1 proteases Journal of amino acides V 2 2011 11 p BELITZ H D Grosch W Qu mica de los alimentos 2a edi o Editora Acribia S A Zarogoza Espanha 1997 DAMODARAN S Parkin K L Fennema O R Quimica de alimentos de fennema Tradu o Adriano Brabdelli et al 4 ed Porto Alegre Artmed 2010 900 p KRISTINSSON H G Rasco B A Fish protein hydrolysates production biochemical and functional properties Critical reviews in food science and nutrition v 40 p 43 2000 LOWRY O H et al Protein measurement with the folin phenol reagent Journal Biol Chem p 265 275 1951 SCHMIDT C G Hidr lise enzim tica das prote nas de carne de frango Disserta o de Mestrado Funda o Universidade Federal do Rio Grande FURG Rio Grande FURG 2008 130 p SGARBIERI V C Prote nas em alimentos prot icos propriedades degrada es modifica es 1 Ed S o Paulo Varela 1996 517 p ZATIA et al Determina o de prote nas totais vias epectrofotometria Vantagens e desvantagens dos m todos existentes S o Paulo Qu mica Nova n 1 v 6 1998 p 787 793 7 12 DETERMINACAO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE A oxida o dos lip dios consiste num processo que acarreta a deteriora o de muitos alimentos levando os mesmos perda da qualidade e de valor nutricional podendo inclusive ocasionar a forma o de produtos t xicos A oxida o ocasiona a forma o de radicais li
176. anela do tubo pode se dizer que est o fechadas A chama luminosa amarela obtida quando o anel est fechado Neste caso a quantidade de oxig nio pequena consequentemente menor ser a queima e menor ser a quantidade de calor produzida pela chama A chama n o luminosa azul obtida quando o anel est aberto Neste caso a quantidade de oxig nio maior maior ser a queima e maior ser a quantidade de calor produzida pela chama Portanto quando o anel est fechado a combust o incompleta e h forma o de fuligem carbono Quando o anel est aberto a combust o completa e n o h forma o de fuligem Para acender o bico de Bunsen proceda da seguinte maneira Primeiramente verifique se as janelas do anel est o fechadas o bico de Bunsen deve ser aceso com as janelas fechadas para evitar que a chama se recolha para o interior do tubo seguir abre se a v lvula de g s da bancada Feito isso segure um f sforo aceso um pouco acima e ao lado da extremidade do tubo Abra o registro e acenda a chama A chama que se obt m grande amarela e luminosa Abre se em seguida a entrada de ar lentamente at que a chama se torne azul Controle a quantidade de g s com o registro e gire o anel gradativamente at abrir por completo as janelas do bico de Bunsen Se durante o funcionamento do bico ouvir se um ru do t pico deve se regular a entrada de ar e de g s Eventualmente quando a mistura de
177. anilina liberada pela tripsina por po o volume de 100 pL foi de 1 036 nmols Agora esse valor pode ser convertido e expresso em unidades de atividade enzim tica nmol de produto formado minuto mL 1 036 nmol 0 52 nmols min mL 0 1 20 Este valor significa que a tripsina presente no poco foi capaz de gerar 0 52 nmols de p nitroanilina por minuto e por mL de rea o 2 An lise dos Resultados 2 1 Ap s realizados todos os c lculos conforme indicado acima os resultados s o expressos pelos valores de atividade enzim tica residual Ou seja pela quantidade de p nitroanilina gerada por unidade de tempo e por volume de rea o Na presen a de um inibidor de serino proteinases a quantidade de p nitroanilina diminui e consequentemente diminui a atividade enzim tica residual Refer ncias BATISTA IF OLIVA ML ARAUJO MS SAMPAIO MU RICHARDSON M FRITZ H SAMPAIO CA Primary structure of a Kunitz type trypsin inhibitor from Enterolobium contortisiliquum seeds Phytochemistry 1996 41 4 1017 22 OLIVA ML MENDES CR JULIANO MA CHAGAS JR ROSA JC GREENE LJ SAMPAIO MU SAMPAIO CA Characterization of a tissue kallikrein inhibitor isolated from Bauhinia bauhinioides seeds inhibition of the hydrolysis of kininogen related substrates Immunopharmacology 1999 45 1 3 163 9 SANTI L BEYS DA SILVA WO BERGER M GUIMAR ES JA SCHRANK A VAINSTEIN MH Conidial surface proteins of Metarhizium anisopliae Source of activities relate
178. animais por grupo a ser testado recomendado para garantir a reprodutibilidade dos resultados Al m da massa do trombo outros par metros podem ser analisados como contagem de c lulas inflamat rias na parede do vaso histologia quantifica o da deposi o de prote nas e fibrose na parede do vaso morfologia e morfometria do co gulo an lise da express o de genes de interesse nas c lulas vasculares e ensaios de atividade enzim tica no plasma Refer ncias Diaz JA Ballard Lipka NE Farris DM Hawley AE Wrobleski SK Myers DD Henke PK Lawrence DA Wakefield TW Impaired fibrinolytic system in ApoE gene deleted mice with hyperlipidemia augments deep vein thrombosis J Vasc Surg 2012 55 3 815 22 Shuster KA Wrobleski SK Hawley AE Lucchesi BR Sorenson DR Bergin IL Sigler RE Guire KE Nowland MH Wakefield TW Myers DD Jr Prothrombotic effects of thrombolytic therapy in a rat Rattus norvegicus model of venous thrombolysis Comp Med 2013 63 3 244 51 Wrobleski SK Farris DM Diaz JA Myers DD Jr Wakefield TW Mouse complete stasis model of inferior vena cava thrombosis J Vis Exp 2011 15 52 14 3 MODELO DE HEMORRAGIA Neste protocolo a hemorragia induzida pelo corte da cauda de ratos ou camundongos e o tempo de sangramento registrado As principais aplica es s o para a avalia o da seguran a de subst ncias e ou extratos com reconhecida atividade anticoagulante e ou antitromb tica Animais
179. animais enquanto estiverem ofegantes 4 Repetir o procedimento anterior no 21 dia 2 desafio ap s a primeira imuniza o dia zero 5 Ap s 24 h do 2 desafio sacrificar os animais pela inje o i p de pentobarbital s dico 50 mg kg 6 Dispor o animal na mesa cir rgica em dec bito dorsal prendendo patas e cabe a 7 Proceder a tricotomia da regi o do pesco o e t rax realizar uma incis o na regi o do pesco o 1 cm abaixo do focinho e expor a traqueia Dissecar cuidadosamente a regi o da traqueia separando a do tecido conjuntivo subjacente gl ndulas e m sculo 8 Ap s a completa dissec o e exposi o da traqueia inserir a pin a histol gica na regi o abaixo da traqueia no sentido do lado esquerdo para o direito do animal a fim de dar suporte para a inser o do cateter 9 Introduzir o cateter intravascular 20 G ou a c nula PE 50 na por o superior da traqueia Se for utilizado o cateter retirar a agulha e em seguida retirar tamb m a pin a histol gica abaixo da traqueia 10 Realizar a lavagem bronco alveolar Para isso conectar uma seringa de insulina 1 mL no cateter ou c nula e injetar de 0 3 0 4 mL de heparina 20 UI mL dilu da em PBS O l quido injetado deve ser coletado novamente e o procedimento deve ser repetido por mais duas vezes totalizando um volume coletado de lavado bronco alveolar de 1 mL Dica trocar a seringa a cada grupo experimental e manter o lavado coletado no gelo
180. anismo e produ o do bioproduto 6 Iniciar o cultivo em condi es adequadas de temperatura e agita o e periodicamente retirar al quotas para an lises diversas 7 3 DETERMINA O DE BIOMASSA Este teste tem o prop sito de quantificar a massa de microrganismos ao longo dos processos de cultivo M todo do peso seco 1 Acondicionar em estufa 60 C pelo per odo de 24 horas os tubos Falcon previamente identificados e desprovidos de tampa Dica essa etapa consiste em eliminar qualquer interferente que possa influenciar na quantifica o da biomassa 2 Antes de pesar deixar os tubos Falcon em dessecador at atingirem a temperatura ambiente Dica manusear os tubos Falcon com luvas pois a gordura da m o pode influenciar o peso dos tubos 3 Pesar os tubos Falcon e anotar as respectivas pesagens conforme identifica o pr via D gt Cm 4 Colocar 10 mL do meio de cultivo em um tubo Falcon e centrifugar a 3 500 rpm por 15 minutos 4 C 5 Retirar o sobrenadante e analisar conforme as metodologias abaixo descritas 6 Adicionar 10 mL de gua destilada gelada ao tubo Falcon homogeneizar as amostras com o aux lio do v rtex e centrifugar a 3 500 rpm por 15 minutos a 4 C Dica as lavagens da biomassa s o realizadas com o intuito de eliminar qualquer interferente 7 Eliminar o sobrenadante 8 Repetir os itens 6 e 7 por mais duas vezes 9 Colocar o tubo Falcon com a biomassa em estufa 60 C at
181. anta anteriormente preparado Procedimento Compostos fen licos Pesa se cerca de 0 5 g dos extratos vegetais Adicionam se 20 mL de gua destilada e aquece se em banho maria fervente durante 30 minutos Ap s resfriamento filtra se o conte do O conte do deve ser dividido em tr s tubos de ensaio A Be C No tubo A adicionam se algumas gotas de uma solu o aquosa de cloreto f rrico 1 O desenvolvimento de colora o verde ou azul escura indicativo da presen a de compostos fen licos No tubo B adicionam se algumas gotas de uma solu o aquosa de hidr xido de pot ssio 3 O aparecimento ou intensifica o da cor amarela ou laranja indicativo da presen a destes compostos O tubo C utilizado como controle para verifica o da colora o inicial do extrato Taninos Pesa se cerca de 0 1 g dos extratos vegetais Aquece se em 20 mL de gua destilada por 30 minutos Ap s resfriamento filtra se e divide se em tr s tubos de ensaio A B C A t cnica de detec o baseia se na propriedade dos taninos de precipitar a gelatina Ao tubo A adiciona se 1 mL da solu o aquosa de gelatina 1 preparada anteriormente Na presen a de taninos haver a forma o de turva o ou precipitado Este teste n o espec fico j que alguns fen is apresentam rea o positiva quando est o em altas concentra es Para a t cnica de caracteriza o uma rea o geral par
182. antes devido a sua habilidade em doar hidrog nio ou el trons gerando radicais intermedi rios est veis que impedem a oxida o de v rios ingredientes em alimentos em particular da peroxida o lip dica Adaptado de Singleton amp Rossi 1965 e Souza et al 2007 1 Material necess rio a 8 Bal es volum trico de 10 mL b 1 Bal o volum trico de 50 mL c 4 Becker d Tetina e 8 Pipeta Pasteur f 1 Pipeta autom tica de 100 1000 pL g Cubetas de vidro h 2 Tubos de ensaio i 1 Espectrofot metro j 1 Balanga analitica k 1 Banho maria 1 1 V rtex m Cron metro 2 Solventes Solu es a gua destilada b Metanol c Folin Ciocalteu 1 N d Solu o de carbonato de s dio 75g de carbonato de s dio anidro em 400 mL de gua Ferver a solu o e ap s resfriar Adicionar cristais de carbonato de s dio ap s 24 horas filtrar e completar o volume com gua a 550 mL e Solu o de cido G lico f Extrato Vegetal seco 3 Cuidados aplic veis a Cuidar com a identifica o das Plantas bem como n o misturar duas plantas diferentes no mesmo processo ao mesmo tempo b Este experimento deve ser realizado com a menos luminosidade poss vel c Recomenda se realizar este experimento sempre em triplicata D gt Cm 4 Procedimento A determina o de fen is totais quantificada por meio de espectrofotometria UV Vis a Inicialmente realiza se a curva padr o utilizando para isso
183. aper unit ou unidade de papel filtro Refer ncias GHOSE 1987 Measurement of cellulase activities IUPAC Pure and Applied Chemistry 59 257 268 CAPITULO 16 DETECCAO DE ATIVIDADE ENZIMATICA ATRAVES DE GEIS DE ATIVIDADE ZIMOGRAMAS Jorge Almeida Guimaraes Luc lia Santi Markus Berger Oliveira Walter Orlando Beys da Silva Diversas metodologias s o conhecidas e empregadas para os zimogramas podendo ser totalmente nativos sem causar nenhum dano estrutural s prote nas enzimas ou pouco desnaturantes com renatura o posterior da prote na a ser analizada Tudo depende do tipo de enzima a ser analisada Na maioria das vezes algum substrato para a enzima adicionado diretamente no gel ou em um tamp o de renatura o Os g is de atividade ou zimogramas s o uma forma f cil de avaliar o tipo de prote na presente em uma amostra bem como identificando sua massa molecular normalmente na forma nativa 16 1 GEL DE ATIVIDADE ZIMOGRAMA PARA DETECCAO DE QUITINASES ST LEGER ET AL 1993 Quitinases s o enzimas que catalizam a hidr lise de quitina pol mero formado pelo a car N acetil glicosamina NaG presente em exoesqueleto de insetos e crust ceos Este gel considerado n o desnaturante embora utilize SDS em sua composi o O SDS removido posteriormente e a enzima recuperando sua forma nativa pode agir em seu substrato adicionado matriz de poliacrilamida 1 Montagem do gel 1 1 Muito pareci
184. ar as gotas de indicador misto observar Se essas ficarem verdes porque o erlenmeyer est contaminado Parte 4 Titula o 9 Titular com solu o de cido sulf rico 0 1 N ou solu o de cido clor drico 0 1 M at a viragem do indicador C lculo Prote na Bruta Va Vb x M x 6 38 x 0 014 x 100 m Onde Va Volume de HCI1 0 1 M ou H SO 0 1 N gasto na titula o Vb Volume de HC1 0 1 Mou H SO 0 1 N gasto na prova em branco N Normalidade real do cido utilizado para a titula o 6 38 Fator de transforma o do nitrog nio em prote na espec fico para derivados l cteos 0 014 Miliequivalente grama do nitrog nio m massa da amostra em gramas Refer ncia BRASIL Minist rio da Agricultura Secretaria Nacional de Defesa Agropecu ria Laborat rio Nacional de Refer ncia Animal M todos anal ticos oficiais para controle de produtos de origem animal e seus ingredientes m todos f sicos e qu micos Bras lia DF 1981 v II cap 2 p 3 6 7 10 DETERMINACAO DE PROTEINA SOLUVEL Diversos estudos determinaram a quantidade de prote nas sol veis pelo m todo de Lowry que um m todo colorim trico para a dosagem de concentra o de prote nas Este m todo baseia se numa mistura contendo molibdato tungstato e cido fosf rico reagente Folin Ciocalteau que sofre uma redu o quando reage com prote nas na presen a de Cu Il reduzindo o composto com absor o m xima em 750 nm Esta t
185. ar e de gas nao estiver bem regulada a queima se da dentro do tubo Se isto acontecer apague imediatamente o bico n o deixando o g s escapar a fim de evitar explos es O m todo apropriado para desligar o bico 1 fechar a torneira da mesa do laborat rio 2 fechar a entrada de g s do bico de Bunsen Utilizado para aquecimento de misturas ou solu es de alguns graus acima da temperatura ambiente at cerca de 600 C podendo ser utilizados tamb m para calcina es em cadinhos Deve se tomar o cuidado de n o usar diretamente a chama do Bico de Bunsen para aquecer b quer bal es erlenmeyer nestes casos utilizar tela de amianto que tem a fun o de distribuir o calor de maneira uniforme n o permitindo que a chama entre em contato direto com o material que cont m o l quido a ser aquecido Pode se aquecer um l quido em um tubo de ensaio diretamente na chama Neste caso o tubo deve estar seco por fora deve ser ligeiramente inclinados e segurados por uma pin a e deve se direcionar o tubo na dire o em que n o haja algu m 1 10 RESFRIAMENTO EMPREGANDO BANHO DE GELO Em muitas t cnicas torna se necess rio resfriar o frasco que cont m a nossa solu o em temperaturas inferiores temperatura ambiente Neste caso deve se usar banho de gelo que consiste num banho de gelo e gua cuja temperatura fica pr xima a 0 C A quantidade de gua deve permitir que o frasco fique apoiado ao fundo de maneira segura Ca
186. ar todo o material em um recipiente rotulado e separado para elimina o por incinera o No momento da incinera o o material deve ser dissolvido ou misturado com um solvente combust vel e queimado em um forno equipado com filtros adequados Quando em pequenas quantidades o brometo de et dio que normalmente utilizado em solu es aquosas muito dilu das pode ser convertido em um produto fisiologicamente inativo T cnica para Descontamina o de Brometo de Et dio M todo de Lunn e Sansone Precau es 1 Usar culos luvas nitr licas e vestu rio de prote o 2 Trabalhar em capela de exaust o Procedimento 1 Em 100 mL de gua destilada adicionar 100 uL de brometo de et dio a 1 mg mL formando uma solu o com concentra o 1 pg mL 2 Adicionar 5 mL de cido hipofosforoso e 12 mL de nitrito de s dio a 0 5 M 3 Manter a solu o em repouso por 20 horas 4 Passado o repouso medir o pH da solu o ajustando a para 6 8 com hidr xido de s dio NaOH 5 Expor a solu o descontaminada luz UV Caso o brometo de et dio esteja totalmente inativo n o ir produzir fluoresc ncia podendo ent o ser descartado sem causar danos ao ambiente Caso haja fluoresc ncia encaminhar para incinera o T cnica para Descontamina o de Brometo de Et dio M todo de Armour Precau es 1 Usar culos luvas nitr licas e vestu rio de prote o 2 Trabalhar na capela de exaust o Procediment
187. ardar no ultrafreezer DNAse Turbo H O Milli Q q s p ape caved Po 10x DNAse Reaction Buffer 1pL Manter no gelo DNAse Turbo Tub 1 pg de RNA Total TOTAL 10 pL 2 No termociclador manter a 37 C por 30 minutos 3 Pipetar em cada tubo 1 pL de EDTA 25 mM 4 Manter a 75 C por 10 minutos 5 Guardar no ultrafreezer 5 2 SINTESE DE PRIMEIRA FITA DE CDNA UTILIZANDO A TRANSCRIPTASE REVERSA M MLV A enzima transcriptase reversa M MLV Moloney Murine Leukemia Virus utilizada para sintetizar uma fita de DNA complementar fita de RNA chamada de primeira fita de cDNA A convers o do RNA em cDNA poss vel pois utiliza se um primer oligo dT que anela na cauda poliA dos mRNAs permitindo a an lise da express o de genes espec ficos em uma amostra biol gica 1 Pipetar em cada tubo Primer oligo dT 1yL dNTPs Mix 10 mM 1uL 1 ug de RNA total tratado com DNase H O Milli Q q s p TOTAL 13 pL 2 Manter a 65 C por 5 minutos 3 Pipetar em cada tubo 5X First Strand Buffer 4 pL DTT 0 1 M 2 uL 4 Manter a 37 C por 2 minutos Pipetar em cada tubo 5 1pL de M MLV 200 U pl 6 Manter a 37 C por 50 minutos Manter a 70 C por 15 minutos para inativa o da enzima Guardar na geladeira 5 3 SINTESE DE PRIMEIRA FITA DE cDNA UTILIZANDO A TRANSCRIPTASE REVERSA SUPERSCRIPT I A s ntese de cDNA DNA complementar feita por transcri o reversa a partir do RNA total utilizando oligonucleot deos
188. as LOWRY O H et al Protein measurement with the folin phenol reagent Journal Biol Chem p 265 275 1951 7 11 ANALISE DAS PROPRIEDADES FUNCIONAIS E NUTRICIONAIS DE PROTEINAS As propriedades funcionais s o definidas como as propriedades f sico qu micas que afetam o comportamento do alimento ou de um dos seus componentes influenciando nas propriedades sensoriais As prote nas nos alimentos podem ser influenciadas pela composi o e sequ ncia de amino cidos estruturas em que se encontram bem como a polaridade As principais propriedades funcionais das prote nas em alimentos s o emulsifica o reten o ao leo e capacidade emulsificante As propriedades funcionais das prote nas dependem das suas propriedades f sico qu micas expressando o comportamento das prote nas em um sistema aliment cio J as propriedades funcionais de um determinado alimento depende tanto das prote nas como dos outros componentes da sua composi o As propriedades funcionais podem ser avaliadas quanto a sua afinidade pela gua pela sua capacidade das mol culas se unirem e formarem uma pel cula da habilidade em formar liga es cruzadas e tamb m as que se manifestam pelos sentidos 7 11 1 Capacidade emulsificante CE A emuls o consiste em um l quido imisc vel sendo assim uma mistura heterog nea na forma de got culas com di metro superior a 0 1 m cron Para se fazer uma emuls o necess rio gua leo emulsificante
189. as seis sequ ncias geradas da mesma forma para a sequ ncia de interesse de prote na 1 Acessar o site http www ncbi nlm nih gov No canto direito da p gina encontrar e clicar na op o BLAST 2 Na p gina seguinte clique na op o tblastx na se o Basic BLAST 3 Na caixa Enter query sequence cole a sequ ncia de prote na que deseja alinhar com o banco de dados 4 No menu Database selecione o conjunto de dados contra o qual a sequ ncia de interesse ser alinhada Caso queira buscar em todo o banco de dados do GenBank selecione Nucleotide collection 5 Na caixa Organism poss vel restringir as buscas para apenas aquelas que s o derivadas de um organismos espec fico Tamb m poss vel excluir apenas essa esp cie clicando no bot o Exclude assim como adicionar mais organismos para restringir ou excluir os mesmos das buscas bot o 6 Clique em BLAST O resultado pode demorar alguns minutos 7 Analisar os resultados Na se o Graphic Summary poss vel ver uma representa o gr fica dos resultados O tamanho das barras coloridas indica a extens o do alinhamento da sequ ncia de interesse query com diferentes sequ ncias do banco de dados J as cores indicam o qu o similares elas s o Arrastando o mouse por cima das barras a caixa acima da representa o gr fica mostrar o nome da sequ ncia com a qual a sequ ncia query aprese
190. at rio Porto Alegre Bookman 2013 128 p 1 17 PROCESSO DE SEPARACAO POR FILTRACAO A filtra o tem por finalidade remover impurezas s lidas de um l quido ou de separar um s lido desejado de uma solu o em que ele foi precipitado ou cristalizado Isso efetuado passando a mistura por um material poroso que ret m as part culas do s lido A fase l quida filtrado atravessa o material poroso enquanto a fase s lida precipitado fica retida Tal material poroso pode ser papel de filtro algod o tecido vidro sinterizado porcelana porosa fibras de vidro ou amianto etc O mais usado em laborat rio o papel de filtro Existem pap is de filtro de v rias porosidades e a escolha depende do tamanho e da natureza das part culas do s lido A passagem do l quido pelo material poroso pode ser efetuada pela a o da gravidade filtra o simples ou por redu o da press o filtra o por suc o 1 17 1 Filtra o Simples Utiliza se um funil simples em que foi adaptado um cone de papel de filtro A filtra o com aux lio do papel de filtro feita por gravidade sem suc o O papel de filtro circular dobrado e inserido num funil de vidro como est descrito na Figura 19 O papel de filtro de forma circular dobrado pela metade e depois esta metade dobrada novamente adquirindo aproximadamente um quarto do tamanho original A segunda dobra deve ser feita de maneira que fique um intervalo de 5 mm e
191. azer al quotas da solu o homogeneizada com volume de 990 pL e congelar a 20 C para utiliza o futura Solu o de metanol para extra o de prote nas de seis amostras 1 Identificar um frasco 2 Colocar 41 58 mL de Metanol 3 Adicionar 420 pL de Protease Inhibitor Cocktail vem com o kit 4 Misturar e armazenar no freezer Protocolo Detalhado para 6 amostras 1 Pulverizar o tecido foliar da planta em nitrog nio l quido at formar um p bem fino Dica o tecido deve ser mantido congelado durante todo o procedimento O p das amostras do tecido deve permanecer com colora o cinza esverdeada Se o p come ar a ficar com colora o verde escuro porque o tecido est sofrendo descongelamento 2 Identificar tubos eppendorfs de 2 mL com o nome das amostras 3 Transferir aproximadamente 250 mg da amostra congelada para os seus respectivos eppendorfs mantendo a amostra sempre congelada Dica Colocar gelo em um b quer e colocar o eppendortf dentro para pesar a massa necess ria na balan a semi anal tica Ap s deixar as amostras pesadas no nitrog nio l quido 4 Adicionar 1 5 mL da Solu o de Metanol em cada amostra Homogeneizar no v rtex por 30 segundos Armazenar no freezer por aproximadamente 5 minutos colocando no v rtex periodicamente Dica a baixa temperatura essencial para manter as prote nas precipitadas e para evitar a solubiliza o da Solu o de Metanol 5 Retirar as amos
192. bases de dados sobre dom nios conservados de prote nas Esse tipo de an lise permite inferir ainda que de maneira indireta a fun o de uma determinada sequ ncia de prote na baseado apenas na presen a de dom nios conservados An lise de dom nios conservados utilizando InterProScan O InterProScan integra diferentes bases de dados de dom nios conservados fazendo a busca simult nea em todos eles 1 Acessar o site http www ebi ac uk Tools pfa iprscan Dica para encontrar diretamente o site do InterProScan digite interproscan no Google 2 Na caixa localizada na se o STEP 1 Enter your input sequences colar a sequ ncia a ser alinhada 3 Clicar em Submit 4 Analisar o resultado A representa o gr fica mostra a sequ ncia de interesse query como uma linha pontilhada na parte superior e os diferentes dom nios encontrados dispostos abaixo As caixas coloridas representam os dom nios e a sua localiza o mostrada ao longo da sequ ncia de interesse Observe que os dom nios podem apresentar um c digo localizado esquerda do dom nio Clicando neste c digo poss vel acessar informa es espec ficas sobre o dom nio Dica alguns dom nios podem conter entradas em mais de uma base de dados e por isso podem aparecer mais de uma vez Observar sempre a ocorr ncia de dom nios na mesma regi o da sequ ncia de interesse 11 8 PREDI O DE DOM NIOS TRANSMEMBRANA A PARTIR DE SEQ
193. bjetos ou pesos sobre seu prato f A coloca o de massas no prato deve ser feita cuidadosamente evitando choque com o aux lio de pin as apropriadas e sempre com a balan a travada g Os reagentes nunca s o colocados diretamente sobre o prato mas em recipientes apropriados vidro de rel gio frascos de pesagem etc e no caso de pequenas quantidades de material inofensivo pode ser usado papel gessado ou papel de alum nio h Sendo vol teis a pesagem de l quidos e s lidos corrosivos requer cuidados especiais semelhantes materiais t m de ser pesados em recipientes perfeitamente fechados i A carga m xima da balan a nunca deve ser ultrapassada j O prato da balan a sempre deve ser conservado rigorosamente limpo Qualquer corros o mesmo pequena de sua cromagem requer a sua substitui o ou conserto k Evitar apoiar se sobre a plataforma suporte da balan a quando em opera o ou n o para evitar oscila es desn vel e portanto desequil brio do aparelho 1 sempre aconselh vel que as balan as sejam ligadas 30 minutos antes do uso para ambienta o e autocalibra o m Colocar o recipiente de pesagem no centro do prato da balan a n Cuidar para que o material de pesagem n o encoste nas paredes da balan a Refer ncias CHRISPINO lvaro Manual de Qu mica Experimental S o Paulo Editora tica 2 edi o 1994 230 p CIENFUEGOS Freddy Seguran a no laborat rio Rio de Janeiro Inter
194. bris celulares aparecem no dia seguinte transfec o 3 Expor as c lulas ao tratamento de interesse 4 Fotografar as c lulas utilizando objetiva de 20x ou 40x ao longo do experimento Dica as c lulas n o devem ser mantidas por mais do que 30 minutos fora da estufa 4 Ao final do per odo de tratamento retirar o meio de cultura lavar 3 x com PBS 1x e adicionar paraformalde do 2 para fixa o das c lulas por 15 minutos a temperatura ambiente Dica O paraformalde do 4 deve ser preparado na capela de exaust o pois t xico Em 100 mL de PBS pesar 4 g de PFA e aquecer de 58 63 C n o mais do que isso adicionar 100 150 uL de NaOH 1 N at clarear a solu o pH 7 4 manter agitando a 58 63 C por 30 minutos seguido da filtra o da solu o em papel filtro A solu o estoque deve ser armazenada a 20 C 5 Ap s retirar o paraformalde do lavar 1x com PBS 1x e adicionar uma solu o contendo 400 nM de DAPI em PBS 1x por 30 minutos no escuro a fim de contracorar o n cleo celular 6 Contar o n mero de c lulas que cont m cinco ou mais pontos verdes no citoplasma entre pelo menos 100 c lulas verdes A porcentagem de c lulas autof gicas se d pela raz o do n mero de c lulas contendo pelo menos cinco pontos verdes em fun o do total de c lulas contado Dica experimentos de longo prazo mais do que 7 dias devem ser realizados com c lulas transduzidas que apresentam express o est vel da prote na e n
195. cal Publishing 1970 gt gt Cm 7 5 DETERMINA O DO pH Esse m todo empregado na determina o do pH de amostras de alimentos obtidos por meio de processos de cultivo de microrganismos ou seja de alimentos fermentados Fundamenta se na medida da concentra o de ons hidrog nio na amostra M todo de BRASIL 1981 1 Prepara o conforme tipo de amostra 1 1 Produtos l quidos medir o pH colocando cerca de 50 mL de amostra em um b quer 1 2 Queijos adicionar cerca de 20 mL de gua em um b quer de 50 mL Acrescentar quantidade suficiente de amostra previamente preparada misturando com bast o de vidro de modo a obter uma pasta homog nea 1 3 Produtos em p reconstituir a amostra pesando uma quantidade conhecida de aproximadamente 10 g e diluir com 100 mL de gua 2 Realizar a leitura do pH em aparelho pHmetro calibrado Refer ncia BRASIL Minist rio da Agricultura Secretaria Nacional de Defesa Agropecu ria Laborat rio Nacional de Refer ncia Animal M todos anal ticos oficiais para controle de produtos de origem animal e seus ingredientes m todos f sicos e qu micos Bras lia DF 1981 v II cap 17 p 5 6 D gt gt Cm 7 6 DETERMINACAO DA MATERIA MINERAL CINZAS Esse m todo empregado na determina o da mat ria mineral de amostras de alimentos obtidos por meio de processos de cultivo de microrganismos ou seja de alimentos fermentados Fundamenta se na elimina
196. captados pelas plantas M todo baseado em Sylvester Bradley et al 1982 1 Crescer o isolado bacteriano em um meio de cultura apropriado para seu pleno desenvolvimento 2 Preparar a solu o 1 solu o 2 e meio GL Meio de Cultura Componente Quantidade Solu o 1 K HPO 5g gua destilada 50 mL de gua destilada Solu o 2 CaCl 10g gua destilada 100 mL de gua destilada Meio GL Glicose 10g Extrato de levedura 2g gar 15g gua destilada Completar para 1L O pH do meio GL deve ser ajustado para 6 8 As solu es 1 e 2 e o meio GL devem ser autoclavadas separadamente 3 Antes de verter o meio de cultura GL em placas de Petri misturar a este as solu o 1 e 2 e homogeneizar a solu o resultante Dica a solu o resultante deve apresentar um fino precipitado esbranqui ado Ca PO Este precipitado deve ser homogeneizado juntamente com o meio antes de ser vertido 4 Inocular 20 pL da cultura bacteriana previamente crescida em meio l quido ao meio s lido obtido 5 Esperar a gota secar e incubar 28 C por 3 5 dias 6 A forma o de um halo de solubiliza o claro entorno da col nia bacteriana indicativo que este isolado solubilizou o fosfato precipitado Refer ncia SYLVESTER BRADLEY R ASAKAWA N LA TORRACA S MAGALH ES FMM OLIVEIRA L PEREIRA RM Levantamento quantitativo de microrganismos solubilizadores de fosfatos na rizosfera de gram neas e leguminosas forrage
197. chando os com tampa autoclav vel ou papel alum nio E recomendado que seja distribu da a mesma quantidade de meio em cada frasco D gt cm 7 Embora tenha sido aquecido o meio ainda necessita ser autoclavado por 15 minutos a 121 C Este procedimento deve ser realizado t o logo o meio seja distribu do nos frascos Em casos excepcionais pode se autoclavar no dia seguinte ao prepare no entanto isso deve ser evitado pois col nias de contamina o em desenvolvimento podem liberar toxinas al m de consumir parte dos compostos 8 Depois de esterilizados os meios est o prontos para a incuba o dos explantes segmentos nodais sementes embri es zig ticos meristemas e outros Contudo se necess rio os meios podem ficar armazenados por uma a duas semanas em local com temperatura amena limpo e sem luz Refer ncia MURASHIGE T SKOOG F A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures Physiologia Plantarum Kopenhagen v 15 p 473 497 1962 9 3 OBTENCAO E DESINFESTACAO DOS EXPLANTES Terminado o preparo do meio de cultura preciso iniciar o processo de desinfesta o dos tecidos vegetais a serem incubados Isso porque as plantas em desenvolvimento est o em contato com in meros microrganismos A maioria deles se desenvolve na superf cie de ramos folhas e demais tecidos sem lhes causar qualquer altera o Contudo ao estabelecer um tecido vegetal in vitro as condi es amb
198. chorr Lenz Bidloga mestranda do Programa de P s Gradua o em Biotecnologia PPGBiotec do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpgq br 3812332236676109 Ang lica Vincenzi Acad mica do curso de Biomedicina do Centro Universitario UNIVATES http lattes cnpq br 5380183879387576 Barbara Parraga da Silva Acad mica do curso de Farm cia do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 3582106380302090 Bruna Caye Acad mica do curso de Biomedicina do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 9481761048475826 Camile Wiinsch Acad mica do Curso de Biomedicina do Centro Universitario UNIVATES http lattes cnpq br 6131793092812460 Camille Eichelberger Granada Engenheira de Bioprocessos e Biotecnologia doutora em Gen tica e Biologia Molecular UFRGS professora do Centro de Gest o Organizacional CGO do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 1836592557536308 Catia Viviane Goncalves Bidloga Mestre em Ecologia UFRGS professora do Curso T cnico em Quimica e coordenadora do Programa Interno de Separa o de Res duos PISR do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 0531032456221369 Claudia Stein Acad mica do curso de Ci ncias Biol gicas do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 7439949615267705 Claucia Fernanda Volken de Souza Quimica Industrial doutora em Biologia Celular e Molecular UFRGS p
199. ci ncia 2001 269 p LENZI Ervim et al Qu mica Geral Experimental Rio de Janeiro Freitas Bastos 2009 390 p PAVIA Donald L et al Qu mica Org nica experimental T cnicas de escala pequena Porto Alegre Bookman 2009 880 p POSTMA James M ROBERTS Julian L HOLLENBERG Leland Qu mica no Laborat rio Barueri SP Manole 5 edi o 2009 546 p ROSA Gilberto GAUTO Marcelo GON ALVES F bio Qu mica Anal tica Pr ticas de Laborat rio Porto Alegre Bookman 2013 128 p D gt C 1 15 METODOS DE PESAGEM Em resumo as etapas envolvidas na utiliza o de uma balan a anal tica s o acerto do nivel acerto do zero pesagem propriamente dita e leitura da massa do objeto no painel da balan a Normalmente os objetos s o pesados em frascos de pesagem Estes s o vidro de rel gio pesa filtro frasco de forma cil ndrica e com tampa esmerilhada e em algumas situa es bequer de 50 mL ou 100 mL Tamb m s o utilizados em situa es espec ficas papel alum nio e papel gomado Os dispositivos de trava e semitrava os bot es que acionam as massas aferidas pesos de refer ncia bem como detalhes de opera o variam de uma balan a para outra Por isso desenvolveremos as t cnicas de pesagem aqui descritas de forma gen rica Existem dois m todos comumente usados para pesagem de reagentes 1 15 1 Pesagem por adi o Consiste em adicionar o reagente ao recipiente de pesagem Para balan as a
200. cido a ser desinfestado manipula se a concentra o da solu o e tempo de exposi o de maneira inversamente proporcional c Explantes cobertos de tricomas ou estruturas equivalentes requerem tratamentos mais intensivos Tecidos muito tenros e explantes de pequeno tamanho devem ser desinfestados com maior cuidado d Os cloretos de merc rio e benzac nio s o possibilidades de desinfesta o O cloreto de merc rio bastante t xico e utilizado em concentra es inferiores aos hipocloritos O cloreto de benzac nio pouco t xico aos tecidos e pode ser utilizado em concentra es e tempos semelhantes aos hipocloritos e Com todos esses cuidados ainda podem permanecer prop gulos de microrganismos vi veis o que ser percebido com alguns dias de incuba o Em geral a contamina o por fungos manifesta se nos primeiros dias ap s o estabelecimento Contamina es bacterianas entretanto surgem mais tardiamente em cerca de uma a tr s semanas ap s Contudo em alguns casos principalmente em tecidos de plantas lenhosas col nias bacterianas surgem ap s 30 a 40 dias desde a incuba o 9 4 ESTABELECIMENTO DOS EXPLANTES E CONDICOES DE INCUBACAO O isolamento dos explantes deve ser realizado com a m xima higiene e desinfesta o conforme descrito acima tanto do ambiente como dos tecidos Esta opera o realizada em c mara de fluxo de ar laminar est ril A forma como o explante manipulado determina o sucesso
201. cido ac tico 210 mL Etanol 510 mL H O destilada 2 Comassie coloidal 2 1 E mais sens vel que o Comassie Blue 2 2 Da mesma forma que o anterior ap s a eletroforese remover cuidadosamente o gel das placas e acondicionar em um recipiente espec fico 2 3 Adicionar o corante Comassie Blue at cobrir inteiramente o gel 2 4 Homogeneizar gentilmente de 2 a 16 horas no homogeneizador autom tico com agita o leve 2 5 Para descolorar remover a solu o e adicionar gua destilada Comassie coloidal 0 05 Comassie Blue G 10 Sulfato de am nio 20 Metanol 2 cido fosf rico deve ser adicionado por ltimo e n o ser agitado pode se mexer levemente com um bast o de vidro Manter protegido da luz a temperatura ambiente 3 Colora o de prata Blum et al 1987 3 1 E uma colora o muito sens vel e o gel deve ser manipulado o m nimo poss vel 3 2 Ap s a eletroforese remover o gel cuidadosamente e colocar em um recipiente com dimens o que comporte a imers o do mesmo 3 3 Cobrir o gel com 50 mL metanol 12 mL cido ac tico 50 uL formalde do 38 mL gua e deixar por 1 hora a temperatura ambiente 3 4 Lavar o gel com etanol 50 3 x por 20 minutos 3 5 Adicionar 0 02 de solu o de tiossulfato de s dio 0 01 g em 50 mL gua e aguardar 1 minuto Dica separar 1 mL para cada gel a ser corado 3 6 Lavar com gua 3 x por 20 segundos 3 7 Adicionar 100 mL de solu o de colora
202. cionar 500 pL de PBS 1x po o D gt Cm Dica a marca o permanece relativamente est vel por dez dias no escuro 8 Fotografar os po os de interesse para o vis vel X gal e fluoresc ncia DAPI utilizando objetiva de 20x 9 Conta se o n mero de c lulas azuis marcadas para o substrato X gal em pelo menos 100 c lulas de cada condi o Dica a escolha do campo a ser fotografado deve ser feita de maneira cega inicialmente pela luz fluoresc ncia azul referente marca o com DAPI Refer ncia DIMRIi GP Lee X Basile G et al 1995 A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo Proc Natl Acad Sci USA 92 9363 9367 4 23 ENSAIO CLONOGENICO PARA MENSURACAO DA CAPACIDADE PROLIFERATIVA DE CELULAS UNICAS Este protocolo se baseia na mensura o da capacidade proliferativa de c lulas nicas clones C lulas s o expostas a diferentes condi es tratamentos plaqueadas em baixas densidades e crescidas de modo a permitir a forma o de col nias que s o posteriormente contadas a olho nu e ou observadas em microscopia Quanto maior o n mero de col nias maior a capacidade clonog nica das c lulas em quest o M todo de Franken et al 2009 Para o ensaio clonog nico n o necess rio um n mero grande de c lulas Assim pode se preparar uma placa de 24 po os com 2 x 103 c lulas po o e proceder o tratamento de interesse A partir das c lulas
203. csesscscsucecssscscscsesuesecurssesestsassesasansneavene 65 2 4 EXTRA O DE DNA BACTERIANO DE SOLO cccceccccsssscoccsssccssssccocsesecssscescvscecsssseocssesesssneesessnsvesssecesseceseserevessess 67 2 5 EXTRA O DE DNA DE UM ISOLADO BACTERIANO eee ereeeaeerea rece arara acer a aerea ataraana 69 2 6 EXTRA O DE DNA BACTERIANO DIRETAMENTE DE AMOSTRAS DE LEITE 71 2 7 EXTRA O DE PLASM DEO MINIPREP ssssssesssessssssesssessvesssessecsuessecssecssesssessessseesussssesuessecssesseessscsseestesseesseeseeess 73 2 8 EXTRA O DE RNA UTILIZANDO TRIZOL eee rear a a E aerea eee ai 75 2 9 EXTRA O DE RNA DE AMOSTRAS VEGETAIS UTILIZANDO CONCERT PLANT RNA REAGENT 76 210 EXTRA O DE PROTE NAS TOTAIS DE AMOSTRAS DE TECIDO DE MAM FEROS 77 211 EXTRA O DE PROTE NAS TOTAIS DE AMOSTRAS VEGETAIS cccsssssssessesessesesecscecsessesesscsesscecscececsseaceseeeeees 78 2 12 QUAN TIFICA O DE DNA UTILIZANDO O QUBIT visiirien ioiai EAE ni E 80 2 13 QUAN TIFICA O DE RNA UTILIZANDO O QUB O nrnna a ido Naa es das a fa 81 2 14 QUAN TIFICA O DE DNA E RNA UTILIZANDO ESPECTROFOTOMETRIA DE DENSIDADE OPTICA LOU ANTE osiris ranes ii NEEE A ETA Aa ERR Cn e ed snncuseeateskadsvuasuekcevieosveessunnavecdetedasecsbenee 82 2 15 QUAN TIFICA O DE PROTE NAS UTILIZANDO O QUB oa 22s cas esses nat aca os eons Rania aac CERCAS sa SD SALADAS ea 84 2 16 QUANTIFICA O DE PROTE NAS PELO M TODO DE BRADFORD m
204. d with toxic effects host penetration and pathogenesis Toxicon 2010 1 55 4 874 80 D gt gt cm 15 3 ATIVIDADE PROTEOLITICA TROMBINA SUBSTRATO SINTETICO A trombina uma serino proteinase que possui papel fundamental no processo de coagula o sangu nea e agrega o plaquet ria Na cascata de coagula o sangu nea a trombina cliva diretamente o fibrinog nio formando a rede de fibrina ativa o fator V prote na C prote na S e por clivar os receptores ativados por proteases PAR induz agrega o plaquet ria al m de possuir efeito pr inflamat rio Al m disso desequil brios nos processos end genos que controlam o balan o entre ativa o e inibi o de trombina est o associados a uma s rie de patologias entre elas destacam se as doen as tromboemb licas doen as cardiovasculares e renais acidente vascular cerebral isquemias sepse coagula o intravascular disseminada e at mesmo c ncer Neste protocolo apresentamos um ensaio cl ssico para a medida da atividade desta enzima bastante semelhante ao descrito anteriormente para a tripsina As principais aplica es s o para estudar a atividade inibit ria de diferentes f rmacos inibidores de proteases e na pesquisa da atividade anticoagulante de extratos ou compostos isolados de plantas Por utilizar volumes pequenos de reagentes e ser realizado em microplacas o protocolo bastante til no screening de anticoagulantes possibilitando o teste de d
205. da com o gel SDS PAGE descrito no cap tulo 6 1 2 No caso deste gel adicionado glicol quitina como substrato para a enzima Running 12 5 H O destilada 3 05 mL 1 5M tris HCl pH 8 8 2 5 mL SDS 10 100 pL Glicol quitina 1 100 pL Acrilamida bis acrilamida 30 0 8 4 2 mL TEMED 5 pL Persulfato de am nio APS 10 50 uL Stacking 4 H O destilada 3 05 mL 0 5M tris HCI pH 6 8 1 25 mL SDS 10 50 pL Acrilamida bis acrilamida 30 0 8 660 pL TEMED 5 pL Persulfato de am nio APS 10 25 uL 2 Prepara o da amostra 2 1 O volume de amostra a ser carregado no gel de aproximadamente 20yL sendo 10 uL de amostra e 10 pL de tamp o de amostra 2 2 Manter os eppendorfs 100 C por 3 minutos ou 95 C por 10 minutos 2 3 Deixar esfriar a temperatura ambiente 2 4 Centrifugar as amostras por 3 minutos a 12 000 rpm 2 5 Aplicar no gel 3 Separa o da amostra eletroforese 3 1 Idem ao gel SDS PAGE 3 2 O gel dever ser migrado a uma voltagem de 150 volts por aproximadamente 1 hora e 30 minutos 2 horas Tamp o de amostra H O destilada 3 8 mL 0 5M tris HCl pH 6 8 1ImL SDS 10 1 6 mL Glicerol 0 8 mL Azul de bromofenol 0 4 mL 1 Tamp o de corrida 5X Tris 15g Glicina 72g SDS 5g H O destilada q s p 1L diluir para 1X na hora do uso com gua destilada Manter na geladeira Pode ser utilizado at 4 vezes 4 Detec o de quitinases 4 1 Ap s a eletroforese remover o gel da cuba e acondic
206. da regenera o do tecido especialmente quando se trabalha com meristemas ou outros explantes de pequeno tamanho Recomenda se que sejam tomados os seguintes procedimentos 1 Os explantes j desinfestados s o acondicionados em placa de petri Com o uso de bisturi novo as suas extremidades devem ser removidas at tamanho adequado que pode variar com o tipo de explante e a esp cie a ser propagada Este procedimento permite a retirada das por es do tecido que foi lesionado ou oxidado durante o processo de desinfesta o 2 A seguir com o uso de pin a de comprimento compat vel com o frasco deve ser realizada a incuba o do s explante s no frasco com o meio de cultivo Dica de extrema import ncia que as pin as e os bisturis utilizados sejam flambados ou esterilizados em esterilizadores infravermelho conforme descrito acima a cada explante incubado Esta medida evita que a presen a de pat genos em determinado explante seja disseminado para outros 3 Terminada a incuba o o frasco deve ser fechado com papel alum nio e papel pardo ou com tampa autoclav vel Observa o Quando forem utilizados frascos maiores vidros de 200 mL por exemplo h uma quantidade m nima de explante a ser inoculada por frasco de meio pois a densidade afeta a diferencia o de c lulas na morfog nese ou prolifera o de brotos Quanto menor o tamanho de um explante ou o n mero de explantes em uma determinada quantidade de meio maior de
207. de gua destilada e estocar a 20 C Esta uma solu o estoque de 1 Refer ncias ST LEGER RJ STAPLES R C ROBERTS D W 1993 Entomopathogenic Isolates of Metarhizium anisopliae Beauveria bassiana and Aspergillus flavus Produce Multiple Extracellular Chitinase Isozymes Journal of Invertebrate Pathology 61 81 84 TRUDEL J ASSELIN A 1989 Detection of chitinase activity after polyacrylamide gel electrophoresis Analytical Biochemistry 178 362 366 Trudel J Asselin A 1989 Detection of chitinase activity after polyacrylamide gel electrophoresis Analytical Biochemistry 178 362 366 ED gt cil 16 2 GEL DE ATIVIDADE ZIMOGRAMA PARA DETECCAO DE PROTEASES MODIFICADO DE ST LEGER ET AL 1993 Proteases s o enzimas que hidrolisam prote nas Diversas classes de proteases podem ser encontradas dependendo de suas caracter sticas Portanto diversos protocolos s o descritos para zimogramas de proteases Este protocolo assim como o protocolo para quitinases utiliza SDS em sua composic o que posteriormente dever ser removido para que a enzima recupere sua forma nativa e possa hidrolisar o substrato 1 Montagem do gel Running 12 H O destilada 2 35 mL 1 5M tris HCl pH 8 8 2 5 mL SDS 10 100 pL Gelatina 1 1mL Acrilamida bis acrilamida 30 0 8 4mL TEMED 5 pL Persulfato de am nio APS 10 50 uL Stacking 4 H O destilada 3 05 mL 0 5M tris HCl pH 6 8 1 25 mL SDS 10 50 pL Acrilamida bis acr
208. de CCBS e do Programa de P s Gradua o em Biotecnologia PPGBiotec do Centro Universit rio UNIV ATES http lattes cnpq br 1353100437268465 PREFACIO O n mero de artigos cient ficos publicados vem aumentando significativamente nos ltimos anos nas mais diversas reas e nos principais pa ses do mundo entre eles o Brasil N o somente a publica o de artigos originais cresce mas tamb m as revis es completas e com isso aumenta o n mero de peri dicos edi es novas sub reas meios alternativos de divulga o etc Em fun o disso tanto pesquisadores profissionais das reas da Sa de da Biologia da Qu mica das Ci ncias Agr rias de Alimentos e de Engenharias como estudantes de Ensino M dio de n vel t cnico de gradua o e p s gradua o v m sendo diariamente imersos em um volume cada vez maior de informa o At recentemente n s pesquisadores t nhamos o desafio de encontrar informa o em uma esfera muito mais limitada e algumas vezes de dif cil acesso Hoje o nosso maior desafio filtrar e por muitas vezes decifrar a informa o resumida contida em artigos cient ficos mediante busca limitada por certo n mero de palavras chave e outras normas que dificultam a reprodutibilidade de experimentos e de protocolos Al m disso com o aumento do n mero de refer ncias e cita es muitas vezes n o fidedignas e pequenas modifica es e outras omiss es n o incorporadas em protocolos ins
209. de confiabilidade da predi o segue a escala mostrada na tabela Definition of different colors in predictions Na sequ ncia o prov vel NLS sublinhado Uma segunda tabela The predicted NLS mostra o nome da sequ ncia submetida os res duos de amino cidos que fazem parte do NLS e sua posi o relativa na sequ ncia e o valor de confiabilidade da predi o 11 10 IDENTIFICACAO E ANALISE DA REGIAO PROMOTORA DE GENES ORIUNDOS DE GENOMAS DE PLANTAS A identifica o da regi o promotora de um gene requer a an lise pr via da sequ ncia do gene em quest o Para definir qual a regi o promotora em geral dif cil de ser determinada com precis o ou seja saber exatamente qual o nucleot deo de in cio e qual o nucleot deo de t rmino importante conhecer ao menos o in cio da regi o codificante marcada pelo primeiro ATG Tamb m relevante identificar o s tio de in cio de transcri o propriamente dito localizado no in cio da regi o 5 n o traduzida A partir desses nucleot deos poss vel isolar a sequ ncia do promotor normalmente compreendida entre os nucleot deos 1 considerando o primeiro a ser transcrito e 2000 pode haver varia o sendo utilizado desde 1000 at 2500 A an lise do promotor depende do conhecimento da sequ ncia e portanto facilitada para plantas cujo genoma j foi sequenciado De posse da sequ ncia do promotor a an lise feita em bases de dados que reconhecem s t
210. de escala pequena Porto Alegre Bookman 2009 880 p POSTMA James M ROBERTS Julian L HOLLENBERG Leland Qu mica no Laborat rio Barueri SP Manole 5 edi o 2009 546 p ROSA Gilberto GAUTO Marcelo GON ALVES F bio Qu mica Anal tica Pr ticas de Laborat rio Porto Alegre Bookman 2013 128 p gt gt C CAPITULO 2 EXTRA O E QUANTIFICA O DE CIDOS NUCLEICOS E PROTE NAS Adriane Pozzobon Andressa Dametto ngela Maria Schorr Lenz Camille Eichelberger Granada Cl udia Stein Edina Aparecida dos Reis Blasi Fernanda Oliveira Diefenthaler Giseli Buffon Guilherme Pinto Bertuzzi Ivan Cunha Bustamante Filho Jorge Almeida Guimar es J lia Pasqualini Genro Luana Maria Wollinger Luc lia Santi Marcia Ines Goettert Markus Berger Oliveira P mela Maria Seibel Raul Antonio Sperotto Ronize Zeni da Silva Thais Fernanda Dornelles Ver nica Contini Vinicius de Abreu Waldow Walter Orlando Beys da Silva 2 1 EXTRA O DE DNA HUMANO A PARTIR DE SANGUE PERIF RICO M TODO DE SALTING OUT A extra o do DNA nuclear o primeiro passo para a realiza o de an lises gen ticas em humanos com aplica es tanto em pesquisas quanto em situa es pr ticas do dia a dia Constitui o passo essencial para an lises de sequenciamento an lises forenses diagn stico molecular de doen as entre outras aplica es Embora o DNA humano possa ser extra do de qualquer c lula nucleada existem
211. de riboflavina 100 mM Dilua esta solu o no dia da leitura Armazene a solu o estoque em eppendorf forrado com papel alum nio e em ultrafreezer 2 Prepare o MIX para rea es em duplicata para cada amostra contendo Para duas rea es 2000 pL Tamp o Fosfato de Pot ssio 100 mM pH 7 8 800 pL Metionina 70 mM 40 pL EDTA 10 pM 300 pL NBT 1 mM 620 pL H O Milli Q 3 Branco Preparar um branco para o escuro ser utilizado para zerar o espectrofot metro e o tubo deve ser envolto em papel alum nio e dois brancos para a luz que devem ser submetidos luz e quantificados Pipetar 1880 do Mix 100 pL de gua e 10 pL de riboflavina Observa o a prepara o do branco no escuro tem por objetivo subtrair da amostra que ser iluminada o processo de redu o do NBT O branco mantido na luz juntamente com as amostras quantificado com o objetivo de definir uma unidade de SOD relativa quantidade de enzima necess ria para inibir 50 a m xima fotorredu o do NBT 4 Amostras Pipetar nos tubos de ensaio 1880 uL do MIX em duplicata por amostra 100 pL da amostra e 20 pL de riboflavina Agitar no v rtex e em seguida submeter os tubos ilumina o intensa durante 10 minutos junto com os dois tubos do Branco para luz n o contendo a amostra Ap s 10 minutos na luz transferir a solu o para as cubetas uma a uma e realizar a leitura em espectrofot metro a 560 nm Observa o programe o espectrofot metro para
212. destilada Completar o volume para 200 mL Dicas dissolver o FeCl em aproximadamente 80 mL de gua destilada Ir adicionando o H SO aos poucos na solu o Completar o volume para 200 mL com gua destilada 4 Manter as amostras por 30 minutos no escuro Dica transcorrido os 30 minutos as solu es que adquirirem a colora o rosada s o consideradas produtoras de compostos ind licos 5 Fazer a leitura da absorb ncia em espectrofot metro 520nm Dica para transformar os dados obtidos na absorb ncia para pg mL deve ser elaborada uma curva com concentra es conhecidas de algum composto do grupo indol exemplo cido indol ac tico cido indol but rico e etc Refer ncia GLICKMANN E DESSAUX Y A critical examination of the specificity of the Salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria Appl Environ Microbiol 61 2 793 796 1995 ED gt cm 10 7 SOLUBILIZACAO DE FOSFATO DE CALCIO O f sforo um dos macronutrientes essenciais para o crescimento e desenvolvimento das plantas Este elemento um dos mais abundantes no solo Entretanto uma quantia muito baixa deste elemento est complexada de uma maneira sol vel e dispon vel para as plantas A habilidade de solubilizar fosfato frequentemente encontrada em microrganismos que por meio da libera o fosfatases e ou acidifica o do solo solubilizam fosfato mineral insol vel e liberam ons sol veis que podem ser
213. diferentes subst ncias como drogas sint ticas e produtos naturais extratos ou compostos isolados de plantas ou ainda para estudar o papel de c lulas inflamat rias prote nas quimiocinas e citocinas no processo de inflama o col nica O modelo tamb m bastante til para o estudo de doen as extraintestinais comumente associadas doen a de Crohn como insufici ncia renal trombose e inflama o pulmonar Animais S o utilizados ratos 200 250 g ou camundongos 25 30 g adultos machos mantidos em biot rio espec fico com ciclo claro escuro de 12 horas temperatura de 22 2 e umidade de 60 80 com livre acesso a gua e ra o Pelo menos dois dias antes dos experimentos transferir os animais para o biot rio do setor onde os procedimentos ser o realizados para adapta o Todos os experimentos com animais devem seguir obrigatoriamente as atribui es e compet ncias definidas na Lei 11 794 08 e em resolu es do Conselho Nacional de Controle em Experimenta o Animal CONCEA Antes da realiza o de qualquer procedimento o protocolo incluindo a identifica o das subst ncias ou extratos a serem testados e suas doses devem ser submetidos an lise da Comiss o de tica para o Uso de Animais CEUA da institui o Os m todos de anestesia e eutan sia sugeridos aqui est o de acordo com o NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals edi o revisada em 1996 http www nap edu readingroom books lab
214. digere as prote nas que se encontram ligadas gordura diminuindo a viscosidade do meio aumentando a densidade da fase aquosa e fundindo a gordura devido libera o do calor proveniente da rea o o que favorece a separa o da gordura pelo extrator lcool isoam lico A leitura feita na escala graduada do butir metro ap s centrifuga o e imers o em banho maria M todo de BRASIL 1981 Equipamentos Banho maria Centr fuga de Gerber Vidraria utens lios e outros Butir metro de Gerber para leite com rolhas Pipetadores autom ticos de 1 e 10 mL Reagentes cido sulf rico Para esta an lise o cido sulf rico precisa ter densidade de 1 820 a 1 825 Colocar 125 mL de gua deionizada em um b quer de vidro Adicionar 925 mL de cido sulf rico p a lenta e cuidadosamente em banho de gelo lcool isoam lico C H O Utilizar o p a com densidade de 0 81 a 20 C Procedimento 1 Adicionar a um butir metro 10 mL da solu o de cido sulf rico 2 Transferir 11 mL de amostra homogeneizada para o butir metro lentamente e pela parede deste para evitar sua mistura com o cido 3 Acrescentar 1 mL de lcool isoam lico 4 Limpar as bordas do butir metro com papel de filtro e fechar com rolha apropriada 5 Envolver o butir metro em um pano colocando o bulbo maior na palma da m o de forma tal que o dedo polegar exer a press o sobre a tampa impedindo sua proje o 6 Agitar o bu
215. do erros de digita o 6 Clicar em Get Primers 7 Na p gina contendo o resultado verificar Products on target templates Para cada poss vel sequ ncia amplificada mostrado o n mero de acesso da mesma o tamanho do produto em pares de bases e a complementariedade entre os primers parte superior e a sequ ncia alvo parte inferior S o mostrados na parte inferior apenas os nucleot deos que n o s o complementares sequ ncia dos primers Para aqueles que s o complementares h um ponto Em geral o primeiro resultado referente sequ ncia para a qual os primers foram projetados Verifique as sequ ncias seguintes a fim de identificar aquelas que possivelmente possuem complementariedade com os primers e que poderiam gerar bandas inespec ficas em uma PCR Dica algumas vezes h mais de um registro n mero de acesso para uma mesma sequ ncia Nestes casos os resultados mostrar o duas ou mais sequ ncias com complementariedade perfeita induzindo o usu rio a pensar que os primers n o ser o espec ficos e anelam igualmente em ambas Observe o tamanho do produto amplificado product length se for o mesmo para todas as sequ ncias prov vel que sejam apenas registros independentes da mesma sequ ncia D gt cm Dica 2 ao verificar se ha complementariedade dos primers com outros produtos importante observar se essa complementariedade extensa o suficiente para que o mesmo seja amplificado
216. dos anticorpos s prote nas 14 Ap s a incuba o retirar o anticorpo prim rio e guard lo no respectivo tubo e congel lo Anotar o n mero de utiliza es 15 Cobrir a membrana com TPBS Agitar por 5 minutos e descartar Repetir essa lavagem 5 vezes 16 Descartar o TPBS da ltima lavagem e incubar a membrana com o anticorpo secund rio Agitar sob refrigera o por 2 horas 17 Ao final da incuba o retirar o anticorpo secund rio e guard lo no respectivo tubo e congel lo Anotar o n mero de utiliza es 18 Cobrir a membrana com TPBS Homogeneizar por 5 minutos e descartar Repetir essa lavagem 5 vezes 19 Preparar o e cran colocando a membrana entre o pl stico dobrado Dica fazer uma marca o no pl stico das dimens es da membrana para facilitar a visualiza o na sala de escura Esta marca o importante tamb m para a identifica o dos marcadores de massa molecular 20 Preparar o reativo ECL para uma membrana inteira recomenda se o uso de 200 uL de reagente ECL Para prepar lo homogeneizar em vortex propor es iguais dos dois reagentes em um microtubo ou seja 100 uL de cada Dica a prepara o do reativo deve ser feita ao abrigo de luz e o mesmo deve ser pipetado imediatamente sobre a membrana Este procedimento est adaptado para o Western Lightnin Plus ECL da PerkinElmer Caso outros reagentes forem utilizados o protocolo deve ser adaptado de acordo com as recomenda es do
217. dose mant m um bom plano anest sico por 30 45 minutos Ap s este tempo suplementar com 1 3 da dose de Ketamina 3 Dispor o animal na mesa cir rgica em dec bito dorsal prendendo patas e cabe a 4 Realizar a antissepsia da cauda com lcool iodado 1 e administrar a subst ncia a ser testada PBS ou heparina 50 ug kg por via intravenosa na veia caudal 5 Ap s 5 minutos com a l mina de bisturi realizar uma incis o a dist ncia de aproximadamente 3 mm da ponta da cauda 6 Cronometrar o tempo de parada do sangramento 7 Ap s o experimento sacrificar os animais por aprofundamento da anestesia An lise dos Resultados Os resultados s o expressos como tempo de sangramento e comparados com os tempos dos animais controles tratados com PBS ou heparina Espera se que subst ncias com atividade anticoagulante e ou antitromb tica prolonguem o tempo de sangramento No entanto esse tempo n o deve ser superior ao tempo de sangramento induzido pela droga controle heparina Caso seja superior a subst ncia teste possui um risco potencial de ser hemorr gica Refer ncias Dahmer T Berger M Barlette AG Reck J Jr Segalin J Verza S Ortega GG Gnoatto SC Guimar es JA Verli H Gosmann G Antithrombotic effect of chikusetsusaponin IVa isolated from Ilex paraguariensis Mat J Med Food 2012 15 12 1073 80 Mendes Silva W Assafim M Ruta B Monteiro RQ Guimaraes JA Zingali RB Antithrombotic effect of Glycyrrhizi
218. e gua manter em vidraria escura ou envolto em papel alum nio e armazenar em geladeira Solu o de elementos tra o Reagentes Volume 100 mL HBO 0 01 g MnSO H O 0 01119 g ZnSO 7H O 0 1246 g CuSO 5H O 0 07822 g 2 Regular o pH para 7 2 com KOH 5M completar o volume para 1 L com gua destilada e adicionar 10 g de agar puro 3 Ap s solidificado em placa de Petri espalhar 50 pL de ACC 0 5 M sobre o meio Dica s descongelar a ACC no momento de uso e n o mant la fora do gelo por tempo maior que o necess rio 4 Inocular pela t cnica da gota 2 pL de um caldo bacteriano recentemente cultivado e incubar as placas 28 C por cerca de 5 dias acompanhando o desenvolvimento da col nia diariamente 5 Como controle negativo de crescimento s o utilizadas placas de Petri sem adi o de ACC contendo apenas o meio de cultura DF salts sem N Dica importante destacar que mesmo no meio sem N e ACC controle negativo poder haver crescimento bacteriano mas em menor grau e tamanho de col nia quando comparado ao meio contendo ACC A diferen a de crescimento o indicativo da atividade da enzima A quantifica o de a cetobutirato fornece maior precis o da atividade enzim tica e pode ser avaliada por ensaios espectrofotom tricos PENROSE amp GLICK 2003 Refer ncias DRORKIN M amp FOSTER J Experiments with some microorganisms which utilize ethane and hydrogen J Bacteriol 75 592 601 1958 P
219. e Triton X 100 Dissolver e estocar na geladeira Estabilidade de 3 semanas 1 4 Emuls o Equilibrar as solu es 1 e 2 em banho maria 37 C por cerca de 10 minutos gotejar vagarosamente a solu o 1 na Solu o 2 sob forte agita o na propor o de 1 9 a cada 9 mL da Solu o 2 adicionar 1 mL da Solu o 1 Dicas utilizar um agitador magn tico para preparar a emuls o Esta emuls o deve ser preparada sempre no momento do ensaio n o podendo ser armazenada para uso posterior Curva Padr o de p Nitrofenol 1 5 Pesar o p nitrofenol em balan a anal tica e preparar de 2 a 5 mL de uma solu o a 0 14 mM Dica Preparar a solu o de p nitrofenol no tamp o Tris HCl 0 05 M pH 8 0 porque a cor somente gerada em pH alcalino Para facilitar a dissolu o pode se adicionar um pouco de etanol absoluto mas sem exceder o volume final As dilui es devem ser feitas diretamente no tamp o Tris HCl 0 05 M pH 8 0 1 6 Pipetar a solu o de p nitrofenol e tamp o em uma microplaca de 96 po os de fundo chato conforme as quantidades indicadas na tabela 5 gt gt cil Tabela 5 Curva Padr o de p Nitrofenol p nitrofenol Tamp o p nitrofenol p nitrofenol final Poco uL uL nmol po o uM 1A 100 0 0 1B 97 3 0 36 4 2 1C 95 5 0 72 7 2 1D 90 10 1 44 14 0 1E 80 20 2 88 28 0 1F 70 30 4 32 42 0 1G 60 40 5 76 56 0 1H 50 50 7 2 70 0 2A 100 14 4 140 0
220. e 0 8 Yo gt gt Cll 2 6 EXTRACAO DE DNA BACTERIANO DIRETAMENTE DE AMOSTRAS DE LEITE O leite um alimento com alto valor nutricional sendo assim um substrato adequado para o crescimento de diversos micro organismos em especial pat genos associados s infec es alimentares Os m todos bioqu micos para an lise da presen a de pat genos levam dias para ficar prontos enquanto que as t cnicas moleculares cada vez mais utilizadas podem ser teis na detec o de pat genos O protocolo a seguir til para o isolamento do DNA de bact rias gram negativas tais como Listeria monocytogenes Agostini et al 2012 Streptococcus agalactiae e Escherichia coli diretamente do leite sem ser necess rio o seu isolamento em meio de cultura Protocolo de extra o baseado em De Gracia 1997 1 Em um microtubo de 1 5 mL adicionar 200 pL da amostra de leite 2 Acrescentar 20 pL de Tween 20 3 Homogeneizar por 10 segundos em agitador orbital v rtex 4 Centrifugar a 12 000 g por 10 minutos a 20 C 5 Descartar o sobrenadante por invers o 6 Suspender o sedimento em 300 uL de tamp o de Lise 60 pL de tamp o de extra o 100 mM Tris HCl pH 8 0 100 mM EDTA 250 mM NaCl 30 pL de SDS 10 15 pL de pK 20 mg mL 195 uL de gua Milli Q autoclavada 7 Incubar a 37 C por uma hora homogeneizando a cada 15 minutos 8 Adicionar 250 uL de fenol tamponado 9 Centrifugar a 12 000 g por 5 minutos 10 Transferir 2
221. e 50 60 C ajustando a velocidade de adi o ou utilizando banho de gelo Manter a agita o por mais 2 horas at a temperatura cair para 25 C 5 Deixar a solu o em repouso por 12 horas e ent o pode ser descartado sem causar danos ao ambiente Refer ncias ARMOUR M A Hazardous Laboratory Chemicals Disposal Guide Lewis Publishers 3 ed 2003 UNIVATES R Avelino Tallini 171 Bairro Universit rio Lajeado RS Brasil CEP 95900 000 Cx Postal 155 Fone 51 3714 7000 www univates br 0800 7 07 08 09
222. e EAEE AEE OA AOUE EE EAEE 261 11 11 PREDI O DE SECRE O E LOCALIZA O DE PROTE NAS sssssessssesssesssesssssesssssessssessseessscessessscsssecsseceses 263 CAP TULO 12 CRIA O E APLICA O DE CAROS PARA CONTROLE BIOL GICO 265 12 1 CRIA O E APLICA O DE CAROS PARA CONTROLE BIOLOGICO sscsssesssessssesssesssssessesssesssesssecsseeseeess 266 CAP TULO 13 C LULAS F N GICAS PRODU O CONTAGEM E VIABILIDADE APLICADAS AO CONTROLE BIOLOGICO savsscccsiccccccicssiccateccccessasascecataveasscncasscsansecsadocnasstoaseceasdocecsed anna ai diic dada sans asa ni dio 268 13 1 PRODU O DE CON DIOS DE FUNGOS FILAMENTOSOS ccssscssssessssesssessseessecsssesssessseesssesseessecsssessseesseesaee 269 13 2 PREPARA O DA SUSPENS O DE CON DIOS ESPOROS DE FUNGOS FILAMENTOSOS 271 13 3 CONTAGEM DA SUSPENS O DE CON DIOS OU LEVEDURAS sscsssesssessssesssesssscsssesssessseesssesseessuesssessseesseeeaee 272 13 4 TESTE DE VIABILIDADE DA SUSPENS O DE CONIDIOS ccsscssscsssecssesssssseesssessesssessrssusssvessesnecssssssevsavesssease 273 13 5 EXTRA O DE PROTE NAS DE SUPERF CIE DE CONIDIOS FUNGICOS 0 escescssessesssessseessesseessessesseesseease 274 CAPITULO 14 MODELOS BIOLOGICOS PRE CLINICOS PARA AVALIACAO DA ATIVIDADE DE SUBST NCIAS FARMACOLOGICAMENTE ATIVAG ccssssssssssssssssssssssssssscsucscsseassassacsucsecsecssees 275 14 1 MODELO DE TROMBOSE VENOSA LOCAL noski oinn ari
223. e a realiza o da t cnica Usar luvas sem talco azul para manusear o equipamento Manter todos os reagentes TaqMan protegidos da luz e no gelo at o momento em que for us los A exposi o excessiva luz pode afetar as sondas fluorescentes gt gt C Dicas fazer al quotas dos reagentes TaqMan para que n o haja contamina o desses enrolar os tubos e al quotas dos ensaios em um peda o de papel alum nio para evitar a exposi o excessiva de luz Assim como em uma rea o de PCR convencional recomenda se preparar uma rea o geral de PCR contendo o master mix e o ensaio em um nico microtubo considerando o n mero de amostras a serem amplificadas e distribuir posteriormente Da mesma forma indispens vel a presen a de um ou mais controles negativos da rea o Leitura dos resultados A leitura dos resultados da genotipagem de SNPs por PCR em tempo real dita endpoint pois avalia a emiss o de fluoresc ncia das sondas no final da termociclagem Assim para um determinado SNP tr s grupos diferentes podem ser observados de acordo com o tipo de fluoresc ncia emitida Por exemplo para um SNP com os alelos T sonda marcada com o fluor foro VIC e G sonda marcada com o fluor foro FAM s o poss veis tr s gen tipos cada qual correspondendo a uma leitura de fluoresc ncia i amostras homozigotas TT exibir o a fluoresc ncia VIC ii amostras homozigotas GG emitir o a fluoresc
224. e demorar alguns minutos 7 Analisar os resultados Na se o Graphic Summary poss vel ver uma representa o gr fica dos resultados O tamanho das barras coloridas indica a extens o do alinhamento da sequ ncia de interesse query com diferentes sequ ncias do banco de dados J as cores indicam o qu o similares elas s o Arrastando o mouse por cima das barras a caixa acima da representa o gr fica mostrar o nome da sequ ncia com a qual a sequ ncia query apresenta similaridade 8 Na se o Descriptions s o mostradas as sequ ncias que apresentam similaridade e os dados que quantificam essa similaridade Dentre eles importante observar os seguintes Query coverage indica qual porcentagem da sequ ncia de interesse coberta pelo alinhamento com cada sequ ncia do banco lembre se que por se tratar de um alinhamento local muitas vezes apenas uma regi o de ambas as sequ ncias ser o alinhadas E value indica a probabilidade de gt gt cm encontrar aquele alinhamento de maneira aleat ria ou seja quanto menor o valor maior a confian a sendo o E value 0 o mais confi vel e Identity indica quantos nucleot deos id nticos s o encontrados apenas na regi o que foi alinhada Dica dependendo do tipo de alinhamento feito um E value aceit vel pode variar Por exemplo se estamos alinhando sequ ncias de um organismo que apresenta grande n mero
225. e determinado tempo e temperatura de incuba o que possibilitam a clivagem dos fragmentos de PCR III Eletroforese para detec o dos diferentes alelos na eletroforese final podem ser visualizados tr s fragmentos distintos de tamanhos a o fragmento de tamanho igual ao produto da PCR que corresponde ao alelo que n o apresenta o s tio de restri o para a enzima e que portanto n o clivado b e c fragmentos de menor tamanho resultado da clivagem do produto da PCR correspondem ao alelo que apresenta o s tio de restri o e que portanto clivado durante a digest o Dica poder o ser observados ent o tr s padr es eletrofor ticos distintos para cada uma das amostras 1 amostras de indiv duos homozigotos para o alelo que n o apresenta o s tio de clivagem exibir o apenas um fragmento maior o fragmento do produto da PCR 2 amostras de indiv duos homozigotos para o alelo que possui o s tio de clivagem apresentar o dois fragmentos menores produtos da digest o enzim tica e 3 amostras de indiv duos heterozigotos para o SNP apresentar o os tr s fragmentos poss veis c Genotipagem de SNP PCR em Tempo Real Sistema de discrimina o al lica TaqMan Applied Biosystems A metodologia para a genotipagem de SNPs pelo sistema de discrimina o al lica TaqMan segue o princ pio geral da PCR convencional No entanto a PCR em tempo real permite a quantifica o dos cidos nucleicos durante
226. e energia mec nica Quando as got culas de leo est o imersas na fase aquosa a emuls o classificada como leo gua j quando as got culas de gua est o dispersas na fase oleosa a mesma classificada como emuls o gua leo Qualquer subst ncia capaz de formar uma mistura homog nea anteriormente imisc vel chamada de agente emulsificante Devem ser entendidos como mol culas que se aderem s superf cies das got culas formando uma membrana protetora que evita a agrega o As prote nas podem apresentar esta propriedade pois migram para o interior da emuls o leo gua tornando a mistura homog nea A principal fun o destes agentes que possuem grupos hidrof licos e lipof licos promover a forma o e estabilidade das emuls es Adaptado do M todo SCHMIDT 2008 Equipamentos Balan a anal tica Liquidificador dom stico Centr fuga Aparelho de banho maria digital Vidrarias utens lios e outros B quer 50 e 100 mL Esp tula Pipeta graduada Proveta 100 mL Bureta Tubos de centr fuga Proveta graduada Reagentes Biotecnologia NaCl 3 Oleo vegetal Procedimento Prepara se uma suspens o contendo 1 g de prote na com 34 mL de solu o de NaCl 3 em liquidificador dom stico por 30 segundos em velocidade baixa Com aux lio de uma bureta adiciona se 30 mL de leo vegetal de soja a uma vaz o de 10 mL min sob agita o A emuls o formada deve ser transferida para tubos de ce
227. e guanidina geralmente empregando 1 mL de Trizol para 10 cm de tecido 1 Adicionar 1 mL de Trizol em cada tubo eppendorf contendo os fragmentos do tecido 2 Fragmentar o tecido no homogenizador at completa dissolu o do mesmo 3 Manter 5 minutos em temperatura ambiente 4 Adicional 0 2 mL de Clorof rmio 5 Agitar por 15 segundos no v rtex 6 Manter 3 minutos em temperatura ambiente 7 Centrifugar 12 000 g por 15 minutos a 4 C Dica cuidado ao retirar os tubos da centrifuga pois as fases separadas podem ser misturadas 8 Pipetar a fase aquosa para um tubo limpo identificado Dica aspirar lentamente a fase do sobrenadante que cont m o clorof rmio e o RNA para n o furar a interface que cont m restos de membranas celulares 9 Adicionar 0 5 mL de Isopropanol lcool isoprop lico 10 Estocar no freezer 20 C por 12 a 18 horas 11 Centrifugar 12 000 g por 15 minutos a 4 C Desprezar sobrenadante o RNA precipita formando um pellet como um gel Dica cuidado ao verter pois o pellet pode ser descolado 12 Adicionar Etanol 75 gelado 1 mL por tubo Dica retirar o etanol da geladeira ou freezer somente na hora de pipetar para manter gelado 13 Centrifugar 8 000 g por 10 minutos a 4 C 14 Desprezar sobrenadante 15 Secar o pellet para remover todo o excesso do lcool Dica pode ser utilizado um cotonete para secar o tubo por m tome cuidado para n o encostar no pellet O excesso de lcoo
228. e os solutos s lidos tenham sua massa pesada em balan a A massa de soluto l quido normalmente convertida a volume por interm dio da respectiva massa espec fica e posteriormente este volume medido com algum instrumento para medida de volume A maioria das rea es que ocorre num laborat rio envolve o uso de diferentes solu es comuns ou solu es padr o As solu es comuns s o usadas em rea es nas quais n o necess rio ter a concentra o exata do soluto ou seja em procedimentos n o quantitativos As solu es padr es s o utilizadas nas determina es quantitativas ou seja em ensaios que t m por objetivo determinar com bom n vel de exatid o quantidades de uma subst ncia a partir da rea o com uma solu o de concentra o conhecida e exata Por este motivo o preparo destas solu es deve ter alto rigor anal tico 1 21 1 Prepara o de solu es comuns 1 21 1 1 A partir de um reagente s lido soluto s lido Etapas para o preparo de solu es a partir de um soluto s lido 1 Passar gua destilada em todo o material 2 Secar cuidadosamente a esp tula e o vidro de rel gio 3 Pesar no vidro de rel gio a massa de soluto necess ria 4 Transferir o soluto do vidro de rel gio para um b quer lavando o vidro de rel gio com solvente de modo a arrastar todo o soluto 5 Dissolver todo o soluto utilizando apenas uma parte do solvente e agitando com um bast o de vidro 6 Verter a s
229. e outros Dessecador Esp tula P rolas de vidro com 3 mm de di metro C psula de alum nio a o inox porcelana ou n quel Tenaz met lico Procedimento 1 Colocar a c psula em estufa 102 2 C durante uma hora 2 Esfriar em dessecador e pesar massa da c psula vazia 3 Pesar a amostra preparada e homogeneizada e levar estufa 102 2 C por tr s horas 4 Esfriar em dessecador e pesar 5 Repetir as duas ltimas etapas anteriores at massa constante Dica diferen a de 0 0005 g para cada 1 g de amostra pesada Ou seja se pesar 5 g de amostra para dizer que a massa est constante a diferen a entre uma pesagem e outra deve ser no m ximo de 0 0025 g As opera es de pesagem devem ser feitas o mais r pido poss vel e a secagem deve ser conduzida sem que haja escurecimento da amostra Pesagem conforme tipo de amostra Leite em p e soro de leite em p Massa da amostra 5 g Temperatura da estufa 85 2 C Tempo at a primeira pesagem 2 horas Tempo na estufa entre pesagens at massa constante 30 minutos Doce de leite e leite condensado Massa da amostra 3 g Temperatura da estufa 85 2 C Tempo at a primeira pesagem 6 horas Tempo na estufa entre pesagens at massa constante 1 hora Creme de leite Massa da amostra 5 g em c psula com p rolas de vidro Temperatura da estufa 102 2 C gt gt cil Tempo at a primeira pesagem 2 horas Tempo na e
230. e utilizar o valor de 0 5 ou superior como sendo positivo definido pelo analista Exemplo Name NN score Odds Weighted Warning by prior FGF1_HUMAN 0 847 4 267 0 009 FGF4 HUMAN 0 945 6 804 0 014 signal peptide predicted by SignalP ATRX HUMAN 0 093 0 205 0 000 D gt cm CAPITULO 12 CRIACAO E APLICACAO DE ACAROS PARA CONTROLE BIOLOGICO Guilherme Liberato da Silva Matheus dos Santos Rocha Noeli Juarez Ferla 12 1 CRIACAO E APLICACAO DE ACAROS PARA CONTROLE BIOLOGICO Este protocolo tem o objetivo de apresentar aspectos gerais acerca da cria o massal e uso de caros predadores no controle biol gico de caros praga no campo SALA DE SEMEADURA DE FEIJ O Etapas de produ o do feijoeiro 1 O substrato ser disponibilizado em bandeja pl stica de 45cm x 30cm x 8 cm 2 Cada bandeja pl stica receber 20 sementes de feij o Phaseolus vulgaris L Figura 1 A 3 As bandejas com feij o dever o ser mantidas em sala climatizada a 26 1 C 70 5 UR e fotofase de 12 horas 4 Diariamente ser o acrescidos 350 ml de gua ao substrato SALA DE CAROS FIT FAGOS Cria o estoque de caros fit fagos 1 Coleta dos caros fit fago alvo no campo 2 Triagem utilizando microsc pio tico e montagem de l minas em meio de Hoyer para a identifica o sob microsc pio estereosc pio com contraste de fases 3 Ap s a confirma o de identifica o da esp cie alvo os caros ser o introduzid
231. echar a abertura do tubo com papel alum nio deixando uma pequena abertura acima de cada tubo para sa da do vapor 5 Colocar as amostras no bloco digestor e deixar at que n o reste nada da colora o escura ficar de outra cor verde ou um tom azulado quando estiver pronto A temperatura dever ser elevada gradativamente at 400 C conforme sugest o abaixo ou de acordo com as instru es do equipamento Curva de aquecimento no bloco digestor 100 C por 20 min 200 C por 30 min 250 C por 30 min 300 C por 30 min 400 C at que digerir a amostra O processo demora em m dia 2h50min Dica se a amostra n o digerir corretamente ou seja restar algum resqu cio de colora o escura adicionar um pouco mais de cido sulf rico p a e retorn las ao bloco digestor com escala direta 6 Quando as amostras estiverem digeridas retir las e deixar esfriar Adicionar aproximadamente 10 mL de gua deionizada Parte 3 Destilar amostra 7 Adaptar o tubo de Kjeldahl ao destilador e adicionar a solu o de hidr xido de s dio a 40 at que a mesma se torne negra cerca de 20 mL 8 Proceder a destila o coletando cerca de 100 mL do destilado A solu o receptora deve ser mantida fria durante a destila o Prepara o da solu o receptora para recolher o destilado Pingar 5 gotas de indicador misto Adicionar 50 mL de gua deionizada destilada 20 mL de cido b rico 4 Dica ao ping
232. eee 107 4 7 LOCALIZACAO HISTOQUIMICA DA PERDA DE ESTABILIDADE DE MEMBRANA UTILIZANDO O REAGENTE EVANS BILLE asia ii e 108 4 8 LOCALIZA O HISTOQU MICA IN SITU DO AC MULO DE RADICAL SUPER XIDO 0 5 109 4 9 LOCALIZA O HISTOQU MICA IN SITU DO AC MULO DE PER XIDO DE HIDROG NIO H 0 110 4 10 PREPARA O DO TAMP O FOSFATO DE POT SSIO KHPO fi 0 mM 001 MJ REI Saara stat a 111 4 11 DETERMINA O DO CONTE DO DE PER XIDO DE HIDROG NIO H O messes 112 4 12 AN LISE DAS ENZIMAS ANTIOXIDANTES SUPER XIDO DISMUTASE SOD CATALASE CAT E ASCORBATO PEROXIDASE APX irado a 113 4 13 TESTE DE COMETA E MICRON CLEO e sssesssssssssesssesssssscssessscssscssessucssucsuecsucssscsscsssessusssesssssssessessecsssssseesneeseeaneesees 116 4 14 AN LISE DE CITOTOXICIDADE POR ALAMAR BLUE eminentes 130 4 15 AVALIA O DA PROLIFERA O CELULAR PELO MTT ementas 132 4 16 OXIDA O DE H2DCF DA PARA AVALIA O DE ESP CIES REATIVAS DE OXIG NIO INTRACELULARES ci leech avd wl wa kode ose bsp boo E FIANE EEEE TAERE 133 4 17 MARCACAO COM IODETO DE PROPIDEO PARA DETERMINACAO DA DISTRIBUICAO DO CICLO CELULAR merme RR IDA VR NR NONE URDU RN e AA S 135 4 18 COMARCA O COM ANEXINA V FITC IODETO DE PROP DEO PARA AN LISE DE MORTE CELULAR ea DRI REINA RD RS RD EDP AR RP 137 4 19 MARCA O COM LARANJA DE ACRIDINA PARA AVALIA O DA ETAPA FINAL DO MECANISMO DE AUTORAGIA iss dios ciencia E ia 139 4 2
233. eets 85 Biotecnologia 2 17 QUANTIFICA O DE PROTE NAS PELO M TODO DE LOWRY ueesscsscccssssssssssessesssssscsssssssssssesessseceesersrssssnseeees 87 2 18 QUANTIFICA O DE PROTE NAS PELO M TODO BCA eretas 89 CAP TULO 3 GENOTIPAGEM DE POLIMORFISMOS EM AMOSTRAS HUMANAS cccccccccsssessssssececcceees 90 3 1 REA O EM CADEIA DA POLIMERASE PCR vessssscsssssscsscssecsessosscssnssosssssssssssnsnsnvanunnsesevsessossoseseeseesensensensansnnsnssssassan 91 3 2 DIGEST O ENZIM TICA gasta hate AL ie occeet i aA 93 3 3 ELETROFORESE EM GEL ereta 94 3 4 METODOLOGIAS DE GENOTIPAGEM BASEADAS NA PCR 96 CAP TULO 4 AN LISES FISIOL GICAS EM AMOSTRAS VEGETAIS E ANIMAIS ceeseseseseaess 100 4 1 EXTRA O E QUANTIFICA O DE CLOROFILAS u ssssssssssssssssssssessssssscsnsonnesessssvsesconsssnsssssensseassenceassessnscesnsenssnses 101 4 2 QUANTIFICA O DE A CARES SOL VEIS TOTAIS ssessssesssesssessssessssssssssssecsssesssessusesseceseesssessseessscesseesseessees 102 4 3 QUANTIFICA O DE CARBONILA O OU OXIDA O DE PROTE NAS sscssssssssssssesssessseesssecssecestessseessees 103 4 4 QUANTIFICA O DO N VEL DE PEROXIDA O LIP DICA UTILIZANDO TBARS mes 105 4 5 QUANTIFICA O DE VAZAMENTO DE ELETR LITOS ELECTROLYTE LEAKAGE ASSAY 106 4 6 LOCALIZA O HISTOQU MICA DA PEROXIDA O LIP DICA UTILIZANDO O REAGENTE DE SCHIFF oo eseccssessscsesssesssssesseees E oat ee a
234. efer ncia Estas balan as s o mais precisas e pr ticas de manusear pois possuem um sistema de taragem S o calibradas com um peso de refer ncia Com a balan a estabilizada e no n vel calibra se o zero com o prato livre de qualquer corpo Depois procede se a calibra o da massa deste peso de refer ncia Tem se da um intervalo de calibra o A partir dele o sistema eletr nico da balan a est apto para medir qualquer outra massa dentro de seu limite de medida A balan a anal tica um instrumento de precis o de constru o delicada que exige do operador o m ximo cuidado para obter resultados corretos Por isso recomenda se observ ncia rigorosa do que segue a A balan a anal tica deve ser instalada em local adequado de prefer ncia em sala especial separada do laborat rio onde ela n o fique sujeita a o de vapores corrosivos Um lugar onde tamb m n o incida luz solar direta nem se verifiquem mudan as bruscas de temperatura A balan a colocada sobre uma plataforma fixa a uma parede t o livre quanto poss vel de vibra es e bem nivelada b Nenhum cristal p ou gota de material deve permanecer sobre a mesa da balan a ou no interior da mesma c A caixa da balan a deve ser mantida fechada enquanto n o estiver em uso d A balan a deve ser conservada no n vel D gt gt Cll e Enquanto n o estiverem em uso a alavanca e o prato dever o ser mantidos suspensos travados e sem o
235. eguida conforme indica o na tabela 1 4 Quando a solu o estoque cont m Fe alguns passos devem ser seguidos a fim de evitar a forma o de precipitados na solu o gt gt cm O Na EDTA 2H O deve ser dissolvido em gua deionizada a 50 do volume final da solu o deixando agitar por 10 minutos Posteriormente a mistura deve ser aquecida at 50 a 70 C devendo ser acrescentado lentamente o FeSO 7H O mantendo agita o Ap s a completa dissolu o dos cristais completa se a solu o para o volume final preestabelecido Para melhor conserva o da solu o de Fe deve se envolver o frasco com papel alum nio evitando assim a entrada de luz O mesmo deve acontecer com a solu o de vitaminas 5 Logo ap s a dissolu o as solu es estoque devem ser armazenadas em refrigerador entre 1 e 5 C retirando as somente momentos antes da prepara o do meio 6 Quando preparadas e armazenadas de forma adequada as solu es podem permanecer at seis meses sem que seja comprometida a qualidade do meio No entanto h possibilidade de prolifera o de microrganismos nas solu es o que pode ser observado pela presen a de col nias vis veis atrav s da parede do frasco Dica a sacarose e o gar devem ser dissolvidos somente no momento da prepara o do meio e n o devem ser acrescentados s solu es estoque Al m da sacarose e do gar recomenda se que vitaminas amino cidos e mio inosi
236. eguido De maneira geral como procedimento padr o recomenda se iniciar pela imers o em lcool et lico que al m da a o germicida surfactante e quando aplicado inicialmente facilita a o dos outros produtos Gradua es de etanol superiores a 80 podem desidratar os tecidos com facilidade portanto a concentra o recomendada 70 5 Assim a primeira imers o deve ser em solu o contendo lcool et lico sendo a concentra o e o tempo definidos conforme a sensibilidade dos tecidos da planta Em m dia para a maioria dos tecidos este tempo pode variar de um a dois minutos Dica tecidos tenros que oxidam facilmente s o mergulhados em etanol 50 a 70 por alguns segundos Excepcionalmente em se tratando de sementes cujo tegumento ser removido ap s a desinfesta o pode se manter em etanol 80 por mais tempo 5 a 10 minutos Tabela 3 Subst ncias desinfestantes comumente usadas em cultivo de tecidos de plantas com a respectiva concentra o a ser utilizada e tempo m nimo e m ximo de exposi o Tempo de exposi o Desinfestante Concentra o isto Hipoclorito de c lcio 9 10 5 30 Hipoclorito de s dio 0 5 5 5 30 gua oxigenada 3 12 5 15 lcool et lico 70 95 1 15 Nitrato de prata 1 5 30 Cloreto de merc rio 0 1 1 2 10 6 Como procedimento padr o na maioria dos laborat rios ap s o tratamento com etanol os tecidos vegetais s o mergulhados em solu o de hipoclorito de s dio ou c
237. em uma PCR Embora n o haja como prever in silico cuidar principalmente se a complementaridade ocorre nos nucleot deos mais a 3 do primer regi o de reconhecimento da DNA Polimerase e se o produto a ser gerado de tamanho compat vel com a rea o por exemplo produtos de 10 000 pares de bases n o seriam problem ticos em uma PCR cujo produto que se deseja amplificar tenha de 100 a 200 pares de bases Verifica o da possibilidade de forma o de homod meros e heterod meros entre primers usando a ferramenta OligoAnalyzer da IDT Integrated DNA Technologies 1 Acessar o site https www idtdna com analyzer Applications OligoAnalyzer Dica para encontrar diretamente o site digitar oligoanalyzer IDT no Google 2 Colar a sequ ncia do primer a ser analisado na janela apropriada Sequence 3 Clicar em Hairpin Esta op o analisar a possibilidade de forma o de pareamentos intra cadeia na sequ ncia do primer o que pode impedir o seu anelamento com a sequ ncia alvo 4 Analisar os resultados na se o Structures Verificar a temperatura em que cada pareamento intra cadeia ocorre Tm C Dica os pareamentos intra cadeia que podem tornar um primer problem tico s o aqueles que ocorrem pr ximos a temperaturas utilizadas na PCR Aqueles que ocorrem em temperaturas muito baixas n o s o relevantes 5 Clicar em Self dimer Esta op o analisar a possibilidade de forma o de pareamentos
238. endem a ser menores em cultivos infectados b Algumas associa es pat geno hospedeiro n o apresentam sintomas em casa de vegeta o ou no campo mas podem resultar em pobre crescimento in vitro c Esp cies herb ceas s o facilmente desinfestadas J com esp cies lenhosas t m sido experimentadas dificuldades 4 A melhor poca para realizar a coleta dos explantes usualmente quando as plantas matrizes est o produzindo novas e vigorosas brota es ou seja em regi es de clima temperado na primavera e in cio do ver o mas muitas exce es t m sido observadas 5 Pode se induzir o crescimento de brota es juvenis Figura 2 realizando podas dr sticas das plantas matrizes Quando for iniciado o cultivo de brota es pode ser tamb m vantajoso podar as plantas para obter uma boa quantidade de novas brota es contendo gemas jovens menores e menos contaminadas Esta medida importante porque os explantes retirados de rg os recentemente formados s o mais capazes de gerar o crescimento e a organog nese in vitro Figura 2 Brota o juvenil emitida ap s poda dr stica em Rubus idaeus L cultivado em casa de vegeta o Imagem CSFior 6 Reguladores de crescimento como giberelinas e citocininas podem ser aplicados nas plantas matrizes intactas antes da retirada dos explantes Estes com frequ ncia induzem algum grau de rejuvenescimento em plantas lenhosas facilitando a cultura in vitro e induzindo com
239. endimento das c lulas injetar aproximadamente 3 mL de meio retirar do tubo falcon para evitar contamina es 13 Transferir a solu o do frasco de cultura para um novo tubo falcon 14 Centrifugar as c lulas tripsinizadas por 10 minutos a 2000 rpm D gt cm 15 Aproveitar o tempo de centrifuga o para limpar a c mera de Neubauer com lcool 70 16 Terminado o processo de centrifuga o descartar a tripsina 17 Ressuspender as c lulas com 1 mL de meio completo 18 Homogeneizar a c lula com uma pipeta lentamente 19 Colocar a laminula de vidro sobre a c mara de Neubauer 20 Pipetar 90 pl da solu o azul de tripan no tubo eppendorf para dilui o das c lulas 1 10 21 Adicionar 10 pl da suspens o de c lulas ao tubo eppendorf 22 Pipetar 10 pl solu o corada na laminula da c mara de Neubauer 23 Realizar a contagem de c lulas por microscopia 24 Ap s a contagem lavar a lam nula e c mara com gua corrente e secar 25 Colocar 7 mL de meio nutritivo completo no frasco de cultura e transferir as c lulas ressupendidas ou a quantidade desejada para uma nova garrafa 26 Identificar o frasco de cultura Usu rio N mero de passagem Linhagem celular Data 27 Visualizar as c lulas novamente ao microsc pio 28 Armazen la na estufa Congelamento de c lulas Materiais Meio de cultura nutritivo soro bovino fetal SBF lcool 70 azul de tripan frascos de cultura c m
240. ente antes de estoc lo 20 C Se poss vel armazene os tubos criog nicos 80 C Refer ncias SELDIN L van Elsas J D PENIDO E G C 1983 Bacillus nitrogens fixers from Brazilian soils Plant Soil 70 243 255 10 4 ISOLAMENTO DE RIZOBIOS As bact rias isoladas de n dulos radiculares de leguminosas s o popularmente conhecidas como riz bios Os riz bios fixam o nitrog nio atmosf rico quando em associa o com leguminosas podendo suprir todo o nitrog nio necess rio para o pleno desenvolvimento da planta em associa o Os g neros bacterianos de riz bios mais conhecidos s o Rhizobium Bradyrhizobium Mesorhizobium e Sinorhizobium M todo baseado em Somasegaram amp Hoben 1985 1 Retirar os n dulos das ra zes da leguminosa estudada 2 Desinfestar os n dulos obtidos por imers o em lcool 70 e solu o de hipoclorito 2 por 1 minuto cada Ap s este procedimento lavar os n dulos com gua destilada esterilizada cinco vezes 3 Em um microtubo macerar o n dulo desinfestado em 500 pL de solu o salina NaCl 0 85 4 Inocular aproximadamente 20 uL da suspens o obtida anteriormente em meio gar Levedura Manitol Vincent 1970 usando a t cnica de purifica o para obten o de col nias isoladas Meio de cultura Componentes Quantidade Levedura Manitol KAO pee MgSO 7H O 0 2g NaCl 01g Extrato de levedura 0 4g Corante vermelho congo 25 mg gar 12g gua destilada Completar
241. ente exibida 12 Insira um tubo de amostra no aparelho feche a tampa e pressione Read 13 Ap s a conclus o da medi o o resultado ser exibido na tela Importante o valor obtido corresponde concentra o da amostra que foi dilu da em ng mL Para calcular a concentra o da amostra original utilize o seguinte c lculo Concentra o da amostra valor QF x 200 onde Valor QF o valor dado pelo aparelho X microlitros da amostra adicionada 2 13 QUANTIFICACAO DE RNA UTILIZANDO O QUBIT A quantifica o de RNA pode ser realizada utilizando se o Qubit RNA Assay Kit e o equipamento Qubit Fluorometer utilizado um flu roforo que se liga especificamente s fitas de RNA e um fluor metro que quantifica a intensidade de fluoresc ncia presente em cada amostra que diretamente proporcional concentra o de RNA da amostra 1 Diluir as amostras de RNA 20 vezes 1 pL do RNA total 19 pL de gua Milli Q 2 Preparar a solu o de trabalho Working Solution WS que ser utilizada na calibra o e quantifica o Para cada amostra 199 pL tamp o vem com o kit 1 pL fluor foro vem com o kit O fluor foro congela na geladeira portanto deve ser retirado alguns minutos antes da quantifica o N o esquecer que o equipamento deve sempre ser calibrado antes de qualquer quantifica o A calibra o realizada com os dois padr es que v m junto com o kit Standard 1 0 ng pL e Standard 2 10 ng
242. entros cir rgicos Dica o tecido n o pode estar formalizado deve ser coletado a fresco ou colocado em meio de transporte Solu o de Hank s antibi tico Trazer o material imediatamente ao laborat rio para a realiza o da lavagem Ap s a esteriliza o da capela colocar o seguinte material um Becker grande ou frasco para desprezar o meio de transporte quatro Beckers pequenos para a lavagem do material um frasco previamente pesado para futuro armazenamento do tecido um estojo com tesoura e pin a uma placa de Petry Desprezar o meio de transporte segurando o tecido com uma pipeta Pasteur Dica se o material for grande cort lo na placa de Petry retirando as partes queimadas e pintadas bem como fragmentos da c psula e co gulos sangu neos Lavar os peda os passando os pelos quatro Beckers com solu o de Hank s antibi tico Dica durante a lavagem do material a solu o utilizada dever permanecer o mais resfriada poss vel objetivando manter o meio livre da a o bacteriana Isto com a baixa temperatura estaremos oferecendo condi es desfavor veis prolifera o bacteriana ao mesmo tempo em que s o favor veis conserva o do tecido Colocar o material no frasco pesado previamente e pesar o material descontando o peso do frasco Posteriormente acrescentar a solu o de Hank s Kana e armazenar na geladeira Colocar na capela um frasco pequeno com tampa preta uma seringa 10 mL um
243. era de Neubauer criotubos DMSO e tubos falcon Simula o 1 quadrante 33 2 quadrante 43 3 quadrante 28 4 quadrante 30 1 Realizar a contagem celular 2 Ajustar o c lculo para a quantidade de c lulas desejadas conforme exemplo acima 3 Retirar a quantidade necess ria de c lulas da suspens o e o restante transferir para o frasco de cultura adicionar a quantidade necess ria de meio de cultura nutritivo completo e armazenar na estufa 4 Centrifugar a suspens o celular 5 Desprezar o sobrenadante 6 Acrescentar solu o de congelamento 5 10 DMSO ou Glicerol SBF conforme o c lculo 7 Identificar os criotubos linhagem quantidade de c lulas passagem data nome 8 Pipetar 1 mL da solu o em cada criotubo processo realizado sobre gelo 9 Armazenar os criotubos em refrigerador 4 C por aproximadamente 1h 10 Transferir os criotubos para o freezer 20 C por 1 2h 11 Acondicionar os criotubos a 80 C por aproximadamente 12 horas 12 Armazenar os criotubos em nitrog nio liquido 13 Limpar o fluxo com lcool 70 e ligar a l mpada UV por 15 minutos Descongelamento de c lulas 1 O meio de cultura e o SBF devem estar a temperatura ambiente 2 Limpar o fluxo com lcool 70 e transferir os materiais necess rios para a realiza o do descongelamento e limp los com lcool 70 3 Ligar a l mpada germicida por 15 minutos 4 Transferir 5 mL de meio de cultura com 20 de
244. erde quando em meio intracelular mas sofre uma protona o em organelas vacuolares cidas AVOs como lisossomos e autolissomos e passa a emitir fluoresc ncia vermelha Este protocolo se baseia na marca o de c lulas com AO e detec o da porcentagem de c lulas marcadas positivamente com AO ou seja c lulas positivas para a marca o vermelha bem como a intensidade de marca o como uma infer ncia da quantidade de autolissomos formados na c lula M todo de Traganos et al 1995 e Stankiewicz et al 1996 Protocolo referente placa de 24 po os os volumes podem ser ajustados de maneira diretamente proporcional conforme o tipo de placa Ex placa de 6 po os volumes 4x maiores placas de 12 po os volumes 2x maiores CITOMETRIA DE FLUXO 1 Plaquear 3 x 10 c lulas em placa de 24 po os seguido do tratamento de interesse 2 Preparar a solu o de marca o contendo 300 uL de meio de cultura e 1 5 pg mL de AO Dica 1 preparar 10 mL de solu o estoque de AO 5 g de AO em 10 mL de gua destilada concentra o final 500 pg mL Dica o ideal fazer um mix total com o volume final a ser utilizado no experimento importante sempre calcular esse volume considerando n po os 1 Por exemplo para 24 po os ser o necess rios 7 5 mL de CMF 1x 22 8 pL de AO 500 pg mL 3 Retirar o meio de cultura e lavar as c lulas com 300 mL de CMF 1x 4 Remover gentilmente o CMF e adicionar 150 pL de tripsina a
245. erger Oliveira Pamela Maria Seibel Walter Orlando Beys da Silva 6 1 ELETROFORESE DE PROTEINAS EM CONDICAO DESNATURANTE EM GEL DE POLIACRILAMIDA SDS PAGE Protocolo de SDS PAGE A separa o de prote nas pelo m todo SDS PAGE consiste na migra o de prote nas em uma matriz em gel de poliacrilamida induzida por diferen a de potencial el trico Esse processo permite a separa o de v rias prote nas da amostra por massa molecular sendo que as menores ficar o retidas na parte inferior do gel e as maiores na parte superior Este protocolo baseia se no sitema Mini Protean Tetra da Bio Rad SDS PAGE preparo das solu es 1 Tamp o de corrida concentrado 10X Running Buffer pH 8 3 LL Glicina 144 g do produto SDS 10 g do produto Tris 30 3 g do produto Dica dissolver em 1 L de gua destilada Agua ultrapura pode ser utilizada para evitar o crescimento de fungos na solu o estoque N o ajustar o pH com cidos ou bases pois altera as caracter sticas i nicas do tamp o Armazenar a 4 C Se ocorrer precipita o aque a a temperatura ambiente antes do uso 2 Tamp o de corrida 1X Running Buffer Solu o de uso Diluir o Running Buffer 10X 1 10 em gua destilada Por exemplo 50 mL de solu o concentrada em 450 mL de gua destilada Guardar na geladeira e utilizar gelado Dica pode ser utilizado pelo menos 3 x 3 Solu o de Acrilamida 40 39 1 100 ml Acrilamida 39 39 g do produto B
246. ermelha do que c lulas em fase G1 enquanto c lulas em fase S emitem fluoresc ncia intermedi ria Esta marca o tamb m permite a determina o de c lulas que sofreram perda de DNA em evento de morte celular apopt tica por exemplo as quais emitem fluoresc ncia com intensidade inferior s c lulas de fase G1 sendo por isso denominadas como sub G1 bem como c lulas hiperdiploides que emitem n veis de fluoresc ncia superiores s c lulas de fase G2 M M todo de Krishan et al 1975 Protocolo referente placa de 12 po os os volumes podem ser ajustados de maneira diretamente proporcional conforme o tipo de placa Ex placa de 6 po os volumes 2x maiores placas de 24 po os metade dos volumes 1 Plaquear 4 x 10 c lulas em placa de 12 po os e realizar o tratamento de interesse 2 Retirar o meio de cultura para um ependorfe de 2 mL e lavar as c lulas com 600 mL de PBS 1x Dica PBS 10x Nacl 80 g KCI 2 g NaHPO 14 4 g KH PO 2 4 g H 0 destilada autoclavada 1000 mL q s p Ajustar o pH para 7 4 e autoclavar Diluir antes do uso 3 Remover gentilmente o PBS para dentro do mesmo eppendorf de 2 mL onde o meio de cultura foi acondicionado e adicionar 250 uL de tripsina aos po os colocando a placa na estufa a 37 C por 2 5 minutos Dica o tempo de tripsiniza o varia de acordo com o tipo celular c lulas muito aderentes requerem tempo maior de incuba o 5 minutos N o aconselh vel exceder 5 minutos
247. erminadas regi es do genoma Tamb m conhecidos como iniciadores s o os respons veis por indicar DNA Polimerase o local a ser amplificado copiado Nota Portanto cada polimorfismo a ser genotipado exige um conjunto de primers espec fico para a regi o na qual se encontra dNTPs desoxirriobonucleot deos trifosfatados S o utilizados pela DNA Polimerase como mat ria prima para a amplifica o do fragmento de interesse Nota devem estar presentes ANTPs dos quatro tipos Adenina Citosina Guanina e Timina geralmente em igual concentra o As concentra es de todos os reagentes mencionados acima variam de acordo com a PCR que se est realizando Em geral esses reagentes comp em uma rea o cujo volume total de 25 pL ou 50 pL com diferentes concentra es de cada reagente Entretanto necess rio o desenvolvimento de protocolos espec ficos para cada regi o do genoma a ser amplificada Ou seja cada polimorfismo a ser genotipado exige uma rea o com concentra es que podem ser distintas Dessa forma esse cap tulo n o ir definir volumes e condi es de amplifica o uma vez que essas s o caracter sticas totalmente vari veis Entretanto existem algumas condi es b sicas que podem servir como ponto de partida para a padroniza o de rea es de PCR espec ficas as quais podem ser encontradas nos protocolos disponibilizados pelos fabricantes Protocolo de PCR b sico Tag DNA polymerase
248. ersit rio UNIVATES http lattes cnpq br 5365985945824906 Raquel Piccinini Castoldi Acad mica do Curso de Biomedicina do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 8418988355549553 Raul Antonio Sperotto Bi logo doutor em Biologia Celular e Molecular UFRGS professor do Centro de Ci ncias Biol gicas e da Sa de CCBS e do Programa de P s Gradua o em Biotecnologia PPGBiotec do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 0884712531887046 Ronize Zeni da Silva Acad mica do curso de Biomedicina do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 4880476350854468 Thais Fernanda Dornelles Acad mica do Curso de Biomedicina do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 2666961265541421 Veronica Contini Bidloga doutora em Gen tica e Biologia Molecular UFRGS professora do Centro de Ci ncias Biol gicas e da Sa de CCBS e do Programa de P s Gradua o em Biotecnologia PPGBiotec do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 3166654315161244 Vinicius de Abreu Waldow Bi logo mestre em Biologia Celular e Molecular UFRGS pesquisador na rea de Biotecnologia do Centro de Pesquisas e Desenvolvimento Leopoldo Am rico Miguez de Mello Cenpes da Petrobras http lattes cnpq br 3283240828625036 Walter Orlando Beys da Silva Bi logo doutor em Biologia Celular e Molecular UFRGS professor do Centro de Ci ncias Biol gicas e da Sa
249. es de 50 30 15 10 8 4 2 1 e 0 5 pg mL em metanol fazer em triplicata Obs Amostra Incubar a temperatura ambiente 2 0 mL da solu o de DPPH e 1 mL das solu es metan licas de extrato e ou cido asc rbico durante 30 min Aconselha se cronometrar o tempo exato de cada tubo para evitar leituras muito heterog neas entre as triplicatas 40 segundos entre os tubos Decorrido o tempo de incuba o realizar a leitura das amostras em espectrofot metro em comprimento de onda de 517 nm Preparar um branco da amostra incubando por 30 min 2 0 mL de metanol e 1 mL das solu es do extrato Ler em 517 nm zerando o aparelho com o metanol Preparar um controle negativo incubando por 30 min 2 0 mL de DPPH e 1 mL de metanol Ler em 517 nm e zerando novamente o aparelho com o metanol Este controle negativo pode tamb m ser utilizado para zerar o aparelho e em seguida efetuar a leitura das amostras de extrato ou cido asc rbico incubadas com a solu o metan lica de DPPH Observa es Aconselha se realizar o ensaio por etapas em uma manh realizar a curva do cido asc rbico A tarde ou no outro dia realizar o ensaio das solu es metan licas do extrato e assim sucessivamente E necess rio fazer um controle negativo e o branco das amostras espec ficos para cada etapa 3 Sempre preparar uma nova solu o de DPPH Nunca armazenar o restante para ser utilizado outro dia ou per odo 4 O ideal que as
250. esmo que as sequ ncias escolhidas sejam pouco similares Portanto interessante ter conhecimento das mesmas a priori sabendo que se tratam de sequ ncias de genes ou prote nas similares aumentando assim as chances de se obter resultados informativos Existem diversos softwares para alinhamentos globais um dos mais utilizados o ClustalW Alinhamentos globais utilizando a ferramenta ClustalW 1 Acessar o site http www ebi ac uk Tools msa clustalw2 2 Na caixa localizada na se o STEP 1 Enter your input sequences cole as sequ ncias a serem alinhadas Dica utilize sequ ncias no formato FASTA que ser o automaticamente reconhecidas 3 Selecionar a op o PROTEINS para alinhamento de prote nas e DNA para alinhamento de nucleot deos 4 Na se o STEP 2 Set your Pairwise Alignment Options selecione entre as op es slow e fast Estas op es se referem ao tempo que o alinhamento levar para ser realizado Dica apesar de ser mais r pida a op o fast pode ser menos eficiente em alinhar sequ ncias menos similares ou contendo regi es bastante diferentes J a op o slow embora mais lenta pode mostrar resultados mais pr ximos do timo Na maioria dos casos no entanto a diferen a quase negligenci vel 5 Clique em Submit 6 Analise os resultados As sequ ncias estar o alinhadas logo abaixo e os identificadores de cada uma ser o mostrado
251. essionals v 15 n 8 2007 MABIC S Water for clinical chemistry Application note 2006 1 4 LIMPEZA E DESCONTAMINACAO DE VIDRARIAS A limpeza e ordem do material a ser utilizado s o essenciais no laborat rio pois muitas subst ncias podem atacar o vidro ou causar interfer ncias nos procedimentos realizados O sucesso do trabalho depende em grande parte da lavagem adequada dos materiais utilizados em todos os procedimentos laboratoriais Visualmente um utens lio de laborat rio pode estar a Sujo b limpo O material do item a n o pode ser usado nunca O material do item b embora visualmente possa parecer limpo ainda pode estar realmente a contaminado com v rias impurezas qu micas e biol gicas b contaminado com reduzida quantidade de impurezas qu micas c realmente limpo para determina es muito sens veis O material do item c pode ser usado em alguns casos em que a contamina o n o seja s ria comumente an lises r pidas e grosseiras O material do item b pode ser utilizado para uso geral muitas an lises biol gicas de rotina e an lises qu micas de baixa precis o O material do item e utilizado em an lises qu micas e biol gicas finas que exigem alto grau de pureza ou precis o exigindo procedimentos especiais para limpeza As an lises s o comprometidas com a presen a de impurezas seja por contamina o da amostra a ser preparada seja pela altera o no volume ou peso final das me
252. eta deixando o l quido escoar lentamente A torneira da bureta deve ser controlada com a m o esquerda Ap s escoar a quantidade necess ria do l quido deve se aguardar alguns segundos para fazer a leitura do volume retirado As buretas assim como as pipetas volum tricas tamb m necessitam ser aferidas caso sejam utilizadas em determina es quantitativas mais precisas A t cnica de aferi o de buretas segue a mesma l gica da t cnica descrita para aferi o e pipetas volum tricas Por m um pouco mais complexa pois se faz a aferi o de cada segmento de 5 ou 10 mL A Figura 18 evidencia uma bureta gt gt Cll Figura 18 Bureta em um suporte universal Fonte Dos autores 1 16 4 Uso de Bal es Volum tricos Os bal es volum tricos s o bal es de fundo chato gargalo comprido e calibrado para conter determinados volumes l quidos Apresentam um tra o fino gravado em torno do gargalo que indica at onde o n vel do l quido deve ser elevado para completar o volume do frasco O gargalo deve ser estreito para que uma pequena varia o de volume provoque uma sens vel diferen a na posi o do menisco Para se acertar o menisco do l quido marca deve se observar o bal o apoiado numa superf cie horizontal Os bal es volum tricos s o usados na prepara o de solu es de concentra o conhecida e na dilui o de solu es j preparadas Procedimentos durante o uso do bal o volum trico na p
253. fabricante 21 Pipetar o reativo ECL em cima da membrana de nitrocelulose distribuindo uniformemente 22 Fechar o e cran aguardar 5 minutos e iniciar a revela o na sala escura 23 Cortar um peda o do filme radiogr fico e posicion lo em cima da membrana Fechar o e cran e aguardar alguns minutos Dica o tempo de exposi o da revela o depender da intensidade da luminosidade produzida na membrana Deve ser padronizado para cada filme 24 Retirar o peda o de filme e mergulhar na solu o de revela o at aparecerem as bandas Ap s mergulhar na solu o de cido ac tico 10 e por fim na solu o fixadora Dica os tempos de exposi o do filme membrana e de imers o na solu o reveladora devem ser ajustados conforme o resultado das primeiras revela es 25 Ap s imers o na solu o fixadora por no m nimo 3 minutos lavar com gua corrente e aguardar a secagem 26 Finalizada a exposi o os filmes s o escaneados a 300 pdi em formato TIFF para quantifica o das bandas Refer ncias AUSUBEL FM Brent R Kingston RE Moore DD Seidman JG Smith JA Struhl K eds Current Protocols in Molecular Biology John Wiley amp Sons 2003 BIO RAD Trans Blot Turbo Blotting System Instruction manual Bio Rad Laboratories 2010 gt gt Cm CAPITULO 7 PRODUCAO E ANALISE DE BIOPRODUTOS Angela Gerhardt Ang lica Vincenzi Barbara Parraga da Silva Claucia Fernanda Volken de Souza Chr
254. fato de Pot ssio dib sico K HPO e ajust lo com a solu o de KH PO at chegar em 7 8 4 11 DETERMINACAO DO CONTEUDO DE PEROXIDO DE HIDROG NIO H O A presen a de esp cies reativas de oxig nio como o H O comum em qualquer ser vivo Por m em quantidades elevadas podem causar danos s c lulas como peroxida o de lip deos oxida o de prote nas danos aos cidos nucleicos inibi o enzim tica e aumento de morte celular Portanto a determina o do seu conte do essencial para verifica o do n vel de estresse oxidativo M todo de Alexieva et al 2001 1 Homogeneizar as amostras 0 1 0 25 g em nitrog nio l quido N Dica dependendo da quantidade de tecido a pulveriza o pode ser realizada em cadinhos ou no pr prio eppendorf 2 Adicionar 1 mL de TCA 0 1 e agitar no vortex 3 Centrifugar as amostras a 12 000 g por 15 minutos a 4 C Dica lembrar se de ligar a centr fuga refrigerada com anteced ncia para que quando for utiliz la a mesma j esteja na temperatura ideal 4 Transferir sobrenadante e seguir imediatamente para os pr ximos passos 5 Rea o 0 5 mL de extrato 0 5 mL de Tamp o Fosfato 0 1 M pH 7 0 2 0 mL de KI 1 M 6 Incubar a rea o no escuro por 1 hora 7 Realizar leitura em espectrofot metro a 390 nm 8 Calcular a concentra o de H O atrav s da curva 0 100 uM 9 Calcular a raz o entre o conte do de H O e o peso seco Refer ncia
255. filtro Millex um Erlenmeyer grande uma barrinha magn tica solu o de Hank s antibi tico deve permanecer no banho maria Calcular a quantidade de colagenase a ser usada a partir do peso do tecido tarar um Becker pequeno e pesar a colagenase 7 5 mg g de Tecido Calcular a quantidade de Hank s antibi tico necess ria para a dilui o da colagenase a partir do volume de tecido na propor o de 2 5 mL g de Tecido No Erlenmeyer colocar a colagenase acrescentada de parte da solu o de Hank s homogenizando com uma pipeta Colocar uma barrinha magn tica e agitar por aproximadamente 30 minutos a 37 C Filtrar a colagenase em Millex com o aux lio da seringa e acrescentar o resto do volume da solu o de Hank s Dica em caso de volumes muito pequenos de solu o 10 15 mL pode se usar todo o volume de Hank s na dilui o da enzima Colocar na capela um estojo com pin a e tesoura uma placa de Petry um Becker ou frasco para desprezar o meio de transporte um Erlenmeyer de tripsiniza o uma barrinha magn tica uma colherinha Desprezar o meio de transporte que cont m os fragmentos lavados Com o frasco na horizontal colocar os fragmentos na placa de Petry Com a pin a e tesoura triturar o tecido e com o aux lio da colherinha colocar o material triturado no Erlenmeyer bem como a colagenase acondicionada no Banho Maria a 37 C e a barrinha magn tica Fechar o Erlenmeyer com o papel alum nio que esta
256. fontes mais ou menos abundantes e que apresentam graus variados de dificuldades t cnicas Uma das fontes mais comumente utilizadas para a extra o de DNA humano s o os leuc citos circulantes do sangue Basicamente esse processo de extra o consiste na lise das membranas das c lulas com a libera o do DNA e posterior separa o do DNA dos componentes proteicos O m todo de salting out descrito por Lahiri e Nurnberger 1991 promove a remo o das prote nas atrav s de uma solu o saturada de cloreto de s dio E considerado um m todo r pido seguro e econ mico para a extra o de DNA a partir de sangue perif rico Protocolo adaptado de Lahiri DK Nurnberger JIJr 1991 A rapid non enzymatic method for the preparation of HMW DNA from blood for RFLP studies Nucleic Acids Research 19 5444 1 Coletar sangue perif rico aproximadamente 4 mL em um tubo contendo EDTA 100 pL EDTA 15 2 Transferir o sangue total para um tubo de centr fuga de 15 mL e ap s adicionar igual volume do reagente TKM1 Dica identificar a amostra no tubo e registrar a quantidade de sangue para colocar a mesma quantidade do reagente 3 Adicionar 250 uL de Nonidet P 40 para causar a lise das c lulas Misturar vigorosamente e passar no v rtex Dica o Nonidet muito viscoso portanto interessante realizar a pipetagem lentamente para que o reagente seja adicionado com facilidade e n o ocorra desperd cio A mistura deve ser feita por a
257. gita o manual e dever ocorrer a forma o de espuma 4 Centrifugar por 10 minutos a 3 000 rpm em temperatura ambiente 25 C Importante necess rio balancear as amostras na centr fuga 5 Descartar o sobrenadante por invers o com cuidado para n o perder o pellet que se encontra ao fundo do tubo Dica utilize um b quer grande contendo hipoclorito de s dio para fazer o descarte do produto l quido Ap s descartar o sobrenadante pode se verter lentamente o tubo em papel absorvente visando retirar o restante do l quido 6 Ressuspender o pellet em 5 mL de TKM1 Dica agitar vigorosamente ou utilizar o v rtex visando a maior dissolu o poss vel do material 7 Centrifugar por 10 minutos a 3 000 rpm Repetir os passos 5 6 e 7 para que o pellet fique o mais limpo poss vel Dica antes da ltima centrifuga o pode se ligar o banho maria para incuba o a 55 C 8 Retirar o sobrenadante por invers o Ressuspender o pellet em 800 pL de TKM2 e transferir para um microtubo de 1 5 mL ou 2 mL Dica dissolver o pellet o m ximo poss vel quando ele j estiver no microtubo Pode se utilizar o v rtex 9 Adicionar 50 pL de SDS 10 e agitar Dica pode se misturar a suspens o com o aux lio de uma pipeta ou agitar manualmente 10 Incubar por 10 a 20 minutos a 55 C Dica o objetivo da incuba o homogeneizar o material mas poss vel que algumas amostras n o dissolvam totalmente ao f
258. hamentos propriamente ditos Dica para acessar as sequ ncias encontradas para copi las e arquiv las em formato FASTA por exemplo basta clicar no n mero de acesso das mesmas nesta se o Uma nova janela aba ser aberta mostrando a sequ ncia e todas as informa es associadas a ela Dica 2 observar no cabe alho de cada alinhamento qual a fase de leitura da sequ ncia do banco a qual foi alinhada com a sequ ncia de interesse em Frame Valores 1 2 e 3 indicam fases de leitura da fita senso 1 2 e 3 indicam fases de leitura da fita anti senso Um segundo valor indica tamb m a fase de leitura da sequ ncia de interesse que foi usada no alinhamento 11 6 ALINHAMENTO DE SEQUENCIAS DE NUCLEOTIDEOS E PROTEINAS ALINHAMENTO GLOBAL Sequ ncias de nucleot deos e amino cidos apresentam similaridade com outras sequ ncias principalmente quando estas s o relacionadas evolutivamente Por exemplo sequ ncias de genes que s o parte de uma mesma fam lia g nica apresentam regi es parecidas em diferentes graus Diferente do alinhamento local que permite encontrar regi es de similaridade entre duas sequ ncias o alinhamento global visa a obter o melhor alinhamento poss vel para duas ou mais sequ ncias considerando a extens o total das mesmas Assim o alinhamento global permite observar o qu o parecidas duas sequ ncias completas s o importante salientar que esse tipo de m todo resultar em um alinhamento m
259. icionar o Towbin a uma quantidade suficiente para cobrir toda a membrana Dica o recipiente deve ter tampa e dimens es ideais para abrigar a membrana 2 Apos o t rmino da eletroforese SDS PAGE retirar o gel reserva lo no recipiente com Towbin por 10 minutos Dica o gel pode ser cortado na regi o de interesse isto resulta em menos rea de membrana a ser utilizada e consequentemente economia de membrana e anticorpos O gel deve ser cortado em cima da placa de vidro que o abriga e observando se a marca o do marcador de peso molecular O enx gue pode durar at dez minutos tempo suficiente para preparar o cassete do equipamento de Western Blotting 3 Colocar o papel filtro no cassete do equipamento de Western Blotting e umedecer generosamente com Towbin 4 Cortar a membrana de nitrocelulose no tamanho exato do gel e coloc la no centro do cassete com o lado mais brilhante para cima 5 Colocar o gel exatamente em cima da membrana de nitrocelulose Dica cuidar para n o ficar nenhuma bolha entre a membrana de nitrocelulose e o gel pois pode atrapalhar na transfer ncia das prote nas 6 Colocar gentilmente outro papel filtro umedecido generosamente com Towbin por cima do gel no cassete do equipamento 7 Remover o excesso de bolhas passando o rolo pl stico por cima do papel filtro 8 Fechar o cassete e encaix lo no equipamento TransBlot Turbo 9 Iniciar a transfer ncia de prote nas selecionando a amperagem vol
260. ico pin a simples reta pin a simples curva pin a dente de rato pin as hemost ticas e tesoura reta Placas de petri e papel filtro L mina de a o para realizar tricotomia ou raspador el trico Estufa 60 C Balan a anal tica Tamp o fosfato PBS lcool iodado 1 Lidoca na Xilazina e Ketamina D gt cm Procedimentos 1 Pesar o animal 2 Preparar na mesma seringa e administrar por via intraperitoneal i p a mistura de Xilazina 10 mg kg Ketamina 75 mg kg Esta dose mant m um bom plano anest sico por 30 45 minutos Ap s este tempo suplementar com 1 3 da dose de Ketamina 3 Dispor o animal na mesa cir rgica aquecida 37 C em dec bito dorsal prendendo patas e cabe a importante manter a temperatura de 37 38 C durante todo o procedimento 4 Realizar a tricotomia de toda a regi o abdominal e antissepsia com algod o embebido em lcool iodado 1 5 Proceder a incis o do abdome incis o de aproximadamente 2 cm afastar a parede antero lateral com as pin as hemost ticas e rebater o intestino grosso para o lado direto do animal a fim de expor a veia cava inferior Manter a regi o do intestino permanentemente hidratada com gaze embebida em PBS 37 C durante todo o procedimento 6 Localizar a veia cava inferior pr ximo s veias renais e com o aux lio das pin as retas e dente de rato dissec la cuidadosamente somente na regi o entre as veias renai
261. ico Industrial doutor em Quimica UFSM professor do Centro de Ci ncias Exatas e Tecnol gicas CETEC e dos Programas de P s Gradua o em Biotecnologia PPGBiotec e Ambiente e Desenvolvimento PPGAD do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 0536800052883688 Elisete Maria de Freitas Bi loga doutora em Bot nica UFRGS professora do Centro de Ci ncias Biol gicas e da Sa de CCBS e do Programa de P s Gradua o em Biotecnologia PPGBiotec do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 7345668866571738 Felipe Klein Ricachenevsky Bi logo doutor em Biologia Celular e Molecular UFRGS p s doutorando do Departamento de Bot nica UFRGS http lattes cnpq br 8426211793966484 Fernanda Oliveira Diefenthaler Acad mica do Curso de Biomedicina do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 6782494373104028 Giseli Buffon Bi loga mestranda do Programa de P s Gradua o em Biotecnologia PPGBiotec do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 5834242560363551 Greici Raquel Wildner Farmac utica mestre em Biotecnologia Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 8813491136706454 Guilherme Liberato da Silva Bi logo mestre em Fitossanidade UFPel e doutorando do Programa de P s Gradua o em Microbiologia Agr cola e do Ambiente UFRGS http lattes cnpq br 9587693374011290 Guilherme Pinto Bertuzzi
262. idade de sua composi o Para que o gerenciamento de res duos perigosos advindos de laborat rios seja realizado de maneira ambientalmente correta medidas t cnicas e administrativas devem ser implantadas envolvendo desde a preven o at o controle efetivo da sua gera o e disposi o final Dessa forma a efici ncia de qualquer programa de gerenciamento de res duos laboratoriais est diretamente relacionada ado o de uma regra bastante simples a corresponsabilidade A adequada separa o uma atitude que pode reduzir a quantidade de res duos perigosos podendo inclusive ser considerada um processo de minimiza o Se existe uma separa o dos res duos por classes ou tipos poss vel trat los atrav s de rea es entre si Ressalta se que a segrega o dos res duos realizada por meio de classes de incompatibilidade definidas pela NBR 12235 1992 que prop e quais os res duos que devem ser armazenados separadamente Na escala de prioridades o tratamento a pen ltima pr tica a ser realizada podendo este ser qu mico f sico biol gico ou t rmico O objetivo do tratamento o de eliminar ou reduzir o potencial de periculosidade do res duo Devido diversidade de res duos perigosos e s mais variadas faixas de concentra o de seus constituintes n o existe regra geral para a escolha do tratamento adequado 17 1 BROMETO DE ETIDIO Elimina o de Res duos Quando em embalagem fechada coloc
263. iedade das saponinas de formar espuma ap s agita o en rgica Pesa se cerca de 0 1 g dos extratos vegetais e adicionam se 20 mL de gua em banho maria fervente por 15 minutos Resfria se filtra se e coloca se em um tudo de ensaio O tubo deve ser agitado vigorosamente durante 15 segundos e a altura da coluna de espuma formada medida com o aux lio de uma r gua O desenvolvimento de espuma com altura superior a 1 cm e persist ncia da mesma ap s repouso de 15 minutos e adi o de cido clor drico 10 indica a presen a de saponinas Alcaloides Dilui se aproximadamente 0 1 g dos extratos vegetais em 20 mL de metanol Ap s esta solu o dividida igualmente em tr s tubos de ensaio Na sequ ncia ser o adicionados a cada tubo 5 mL de cido clor drico 10 Aquece se em banho maria 40 C durante 30 minutos Ap s o resfriamento filtra se e transfere se uma parte deste para um vidro de rel gio onde s o adicionados gota a gota os seguintes reagentes de detec o Mayer Dragendorff Wagner e reagente de Bertrand O aparecimento de um precipitado indica a presen a de alcal ides Refer ncias BRASIL Farmacop ia Brasileira 4 ed S o Paulo Atheneu 1988 2005 HARBORE J B Phytochemial methods a guide to modern techniques of plan analysis Chapman and Hall 3 ed 1998 SIM ES C M O SCHENKEL E P GOSMANN G MELLO J C P MENTZ L A PETROVICK P R Farmacognosia da pla
264. ientais de elevada umidade nutrientes dispon veis e alta concentra o de a car propicia o crescimento destes microrganismos superando e na maioria das vezes impedindo a regenera o e desenvolvimento do explante Por essa raz o o cultivo de tecidos vegetais in vitro deve ser feito em condi es de m xima assepsia poss vel Em fun o disso recomenda se que A planta matriz cujas condi es de cultivo est o descritas no item 5 deve ser cultivada com excelentes condi es fitossanit rias para que os explantes fornecidos contenham o m nimo de prop gulos de microrganismos Sejam utilizadas subst ncias como o etanol e compostos a base de cloro tais como o hipoclorito de s dio e de c lcio para a desinfesta o dos explantes que ser o incubados Estas subst ncias possuem a o germicida e s o as mais utilizadas nos processos de desinfesta o Observa es a A dificuldade maior nesta etapa da cultura de tecidos vegetais reside em obter tecido descontaminado sem conduzi lo morte quando isolado b S o determinantes os pr tratamentos aplicados na planta matriz para o sucesso dessa etapa do trabalho principalmente no que se refere aos microrganismos end genos Assim uma das medidas que pode ser adotada para reduzir os riscos de contamina o a aplica o de fungicidas por alguns dias antes da obten o dos explantes c Problemas cr nicos de contamina o podem ser amenizados adicionando se fungicida
265. iferentes amostras em um s ensaio e com economia de reagentes O ensaio utiliza um substrato sint tico cromog nico espec fico que se liga diretamente ao s tio ativo da trombina sendo portanto ideal para a pesquisa de inibidores de s tio ativo e n o de exos tio ver protocolo trombina fibrinog nio A rea o acontece de maneira semelhante descrita para tripsina pela libera o de p nitroanilina que pode ser dosada por espectrofotometria 1 Procedimento Curva Padr o de p Nitroanilina 1 1 Construir uma curva padr o de p nitroanilina conforme descrito no protocolo para tripsina Ensaio de Atividade Enzim tica da Trombina 1 2 Preparar uma solu o estoque de 0 3 mg mL de trombina Dica dissolver a trombina em tamp o Tris HCl 20 mM pH 7 4 aliquotar em tubos de 1 ou 0 5 mL e manter congelado 20 C 1 3 Preparar um solu o de trabalho de trombina na concentra o de 0 02 mg mL Dica diluir a partir da solu o estoque usando o tamp o Tris HCl 20 mM pH 74 e aliquotar em volumes pequenos em tubos de 0 5 mL At o momento do ensaio manter no gelo 4 C Ap s o ensaio manter congelado 20 C 1 4 Preparar 10 mL de uma solu o do substrato 2238 H D Phe Pip Arg pNa 2 mM Dica dissolver o 2238 em gua miliQ Aliquotar o substrato em tubos de 0 5 mL e manter congelado 20 C 1 5 Pipetar os reagentes na microplaca de 96 po os conforme o esquema sugerido na tabela 3 Tabela 3
266. ilamida 30 0 8 660 pL TEMED 5 pL Persulfato de am nio APS 10 25 uL 2 Prepara o da amostra 2 1 O volume de amostra a ser carregado no gel de aproximadamente 20 uL sendo 10 pL de amostra e 10 uL de tamp o de amostra 2 2 Manter os eppendorfs 100 C por 3 minutos ou 95 C por 10 minutos 2 3 Deixar esfriar a temperatura ambiente 2 4 Centrifugar as amostras por 3 minutos a 12 000 rpm 2 5 Aplicar no gel 2 6 Separa o da amostra eletroforese 2 7 Idem ao gel SDS PAGE 2 8 O gel dever ser corrido a uma voltagem de 150 volts por aproximadamente 2 horas Tamp o de amostra H O destilada 3 8 mL 0 5M tris HCI pH 6 8 1mL SDS 10 1 6 mL Glicerol 0 8 mL Azul de bromofenol 0 4 mL 1 Tamp o de corrida 5X Tris 15g Glicina 72g SDS 5g H O destilada q s p 1L diluir para 1X na hora do uso com gua destilada Manter na geladeira Pode ser utilizado at 4 vezes 3 Detec o de proteases 3 1 Ap s a eletroforese remover o gel da cuba e acondicionar em um recipiente 3 2 Incubar o gel com 100 mL tamp o tris 50 mM pH 8 0 com Triton X 100 2 5 2 5 mL 97 5 mL tamp o tris por 16 horas a 37 C com agita o 3 3 Corar o gel com solu o de comassie R250 0 1 em 50 metanol Dica abrir o metanol em capela de exaust o Refer ncias ST LEGER RJ STAPLES R C ROBERTS D W 1993 Entomopathogenic Isolates of Metarhizium anisopliae Beauveria bassiana and Aspergillus flavus Produce Mult
267. im dos 20 minutos 11 Adicionar 300 uL de NaCl 6 M no tubo e agitar 12 Centrifugar a 12 000 rpm durante 5 minutos Dica durante esta centrifuga o pode se preparar os microtubos contendo 1 mL de etanol 70 gelado Passo 15 13 Coletar o sobrenadante em um novo tubo de 15 mL previamente identificado com o aux lio de uma micropipeta Dica o DNA est contido no sobrenadante portanto N O coletar o pellet composto por res duos de prote nas 14 Adicionar ao sobrenadante dois volumes de etanol 100 gelado Inverter o tubo lentamente para a precipita o do DNA Dica a invers o do tubo deve ser suave e o DNA aparecer na forma de uma nuvem branca suspensa no l quido 15 Com o auxilio de uma micropipeta ou de uma pipeta de vidro descart vel coletar o DNA e transferi lo para um microtubo de 1 5 mL contendo 1 mL de etanol 70 16 Centrifugar a 12 000 rpm por 5 minutos 17 Com o auxilio de uma micropipeta remover o sobrenadante O DNA comp e o pellet no fundo do tubo Dica o pellet poder ter diferentes tamanhos e colora o esbranqui ada ou transparente 18 Deixar os tubos abertos por cerca de 30 minutos para que evapore o restante do etanol 19 Adicionar em torno de 350 uL de TE e inverter suavemente Levar geladeira 20 Armazenar o DNA em temperatura ambiente ou em 4 C por um dia e ap s armazenar a 20 C Materiais Utilizados Tubos 15 mL O dobro de tubos da quantidade de
268. imeiro e ap s fixados no suporte maior Encaixar e nivelar as placas de vidro em superf cie plana para evitar o vazamento do gel 2 Preparar o gel de separa o de poliacrilamida em um b quer Para cada gel de 0 75 mm preparar as solu es abaixo Solu o de gel de separa o Resolving gel 10 Acrilamida 40 1270 pL do produto Tris 1 5 M 850 uL do produto SDS 1 350 uL do produto Glicerol 280 uL do produto gua ultrapura 2190 uL do produto Dica colocar as solu es na ordem descrita e homogeneizar ap s cada uma Para acrescentar o Glicerol deve se cortar a ponteira para facilitar a pipetagem 3 Acrescentar 35 pL de Persulfato de Am nio 10 e 3 pL de Temed no b quer e homogeneizar 4 Transferir imediatamente a solu o do gel de separa o de poliacrilamida entre as duas placas de vidro at quase 1 5 cm do final da placa menor aguardar para ver se n o h vazamentos e pipetar lcool et lico absoluto at o topo da placa Dica marcar a placa de vidro com uma caneta at o ponto onde a solu o do gel de acrilamida foi pipetada O lcool et lico isola o gel de separa o do ar permitindo uma borda de gel lisa SDS 0 1 tamb m pode ser usado 5 Aguardar a polimeriza o 30 minutos Dica nos minutos finais prepara se a solu o do gel de entrada de poliacrilamida pr ximo passo 6 Preparar a solu o do gel de entrada de poliacrilamida Solu o de gel de entrada Stacking gel
269. imorfismo a ser genotipado Diversos ensaios j padronizados com conjuntos de primers e sondas espec ficas est o dispon veis para a genotipagem de milhares de SNPs em humanos Os demais reagentes necess rios PCR enzima Tag Polimerase dNTPs tamp o da rea o tamb m podem ser adquiridos balanceados e em conjunto em um master mix espec fico para o sistema de discrimina o al lica TaqMan Existem diferentes modelos de equipamentos de PCR em tempo real os quais podem variar nos sistemas pticos na capacidade de amostras e nos softwares de an lise dos dados No entanto para a genotipagem de polimorfismos atrav s do sistema de discrimina o al lica TaqMan algumas condi es b sicas podem ser observadas O ensaio padronizado de cada SNP contendo os primers e as sondas adquirido geralmente em uma concentra o de 40X Dica para cada ensaio disponibilizado sempre a informa o correspondente aos fluor foros rep rteres De formal geral os dois alelos poss veis do polimorfismo s o marcadores com as fluoresc ncias VIC e FAM respectivamente O master mix de genotipagem geralmente est em uma concentra o de 2X Dica recomenda se uma padroniza o na concentra o de DNA de todas as amostras a serem genotipadas Dica 1 recomenda se sempre observar as condi es descritas e sugeridas pelo fabricante tanto na prepara o da rea o quanto no funcionamento do software Cuidados durant
270. incubar em estufa a 28 C por 1 semana ou at formar pel cula de crescimento bacteriano Dica para inocula o dos 100 pL das suspens es bacterianas imergir a ponteira at o fundo do frasco para que os isolados encontrem a concentra o ideal de oxig nio para seu crescimento Meio de cultura Reagentes Quantidade LGI semi s lido sem REO nas Nitrog nio sacarose 58 K HPO 02g MgSO 2H O 02g CaCl 2H O 0 02 g Na Mo 2H O 0 002 g Solu o de vitaminas 1mL FeEDTA 4mL Azul de bromotimol 0 5 5mL Agua destilada i eens para gar puro 18g pH ajustado para 6 0 6 2 com cido sulf rico H SO para o preparo do meio LGI s lido com N adicionar tamb m 0 01 g L de extrato de levedura e 15 g de gar bacteriol gico ao inv s de gar puro Solu o de vitaminas biotina 10 e piridoxol HC 20 em gua destilada armazenar em geladeira FEEDTA dissolver separadamente 5 g de FeSO e 6 g de Na EDTA em aproximadamente 30 ml de gua destilada cada solu o juntar as duas solu es e completar o volume para 1 L manter em vidraria escura ou envolto em papel alum nio e armazenar em geladeira azul de bromotimol 0 5 adicionar 0 5 g de azul de bromotimol C H Br O S a 100 ml de KOH 0 2 N manter em vidraria escura ou envolto em papel alum nio e armazenar em geladeira Meio de cultura Reagentes Para 1L KH PO 0 6 g LGI P semi s lido sem Nitrog nio Sacatose 1005
271. inverter Padronizar cido clor drico 0 1 M Na capela adicionar 8 3 mL do cido clor drico p a em um bal o volum trico de 1 L contendo 500 mL de gua Avolumar inverter Padronizar Hidr xido de s dio NaOH 40 m v Pesar 40 g de NaOH p a Aos poucos ir adicionando as 40 g de NaOH em 100 mL de agua em banho de gelo Agitar at dissolver Avolumar para 100 mL Procedimento Parte 1 Preparo inicial 1 Pesagem de amostra Pesar 5 g para leite flu do e bebida l ctea 3 g para creme de leite 0 5 g para leite desidratado soro desidratado queijo e doce de leite Para produtos muito gordurosos digerir a amostra com adi o de um antiespumante Preparar junto com as amostras uma prova em branco Dica quando a balan a anal tica n o suportar o peso do tubo de prote na e n o for poss vel pesar diretamente no tubo pode se pesar em papel filtro e algod o Ap s transferir o mesmo para o tubo cuidando para n o haver perda de amostra 2 Colocar 2 5 g de mistura catal tica 3 Em capela de exaust o colocar 15 mL de cido sulf rico P A lentamente Dica a quantidade de cido sulf rico adicionada pode variar entre uma amostra e outra devido s caracter sticas do produto Algumas dicas importantes 1 g de gordura consome 18 g de cido 1 g de prote na consome 9 g de cido 1 g de carboidrato consome 7 g de cido 1 g de sacarose consome 7 g de cido Parte 2 Digerir amostra no bloco digestor 4 F
272. ional concentra o de prote nas presentes na amostra A albumina bovina utilizada como padr o M todo de Lowry Reagentes 1 Albumina 1 mg mL 2 Folin 1 N armazenado na geladeira 3 Reativo A Solu o de NaOH 0 1 M com Na CO 2 4 Reativo B Partes iguais de B1 CuSO 1 e B2 tartarato de Na e K 2 Dica Armazenar o reagente Bl em frasco mbar e o reagente B2 em frasco pl stico 5 Reativo C Partes Reativo Alcalino Cobre 50 partes do Reativo A para 1 parte do Reativo B Preparar somente na hora do uso e em frasco mbar Adicionar os reagentes na ordem A B1 e B2 Na tabela abaixo alguns valores padr es para volumes de rotina Volume A Volume B 20 mL 0 4 mL 200 pL B1 200 pL B2 30 mL 0 6 mL 300 pL B1 300 pL B2 40 mL 0 8 mL 400 pL B1 400 pL B2 50 mL 1 0 mL 500 pL B1 500 pL B2 100 mL 2 0 mL 1 000 pL B1 1 000 pL B2 Procedimentos 1 Identificar os tubos da curva e das amostras 2 Descongelar a albumina 3 Preparar o Reativo C quantidade necess ria de acordo com o n mero de amostras e suas duplicatas 4 Pipetar a Curva padr o de Albumina Padr o de Tubos albumina Img Agua Milli Q Q C lculo mL Branco 0 100 pL 0 00 mg 1 1 10 pL 90 uL 0 01 mg 2 2 20 pL 80 pL 0 02 mg 3 3 40 pL 60 pL 0 04 mg 4 4 60 pL 40 pL 0 06 mg D0 80 uL 20 uL 0 08 mg 6 6 100 pL 0 0 10 mg 5 Pipetar as amostras em duplicatas nos tubos identificados adicionando em cada um
273. ionar em um recipiente 4 2 Incubar o gel com 100 mL tamp o acetato 100mM pH 5 3 com Triton X 100 1 1 mL 99 mL tamp o acetato por 20 horas a 30 C com agita o 4 3 Corar o gel com solu o de calcofluor White M2R 0 01 em 0 5M tris HCl pH 8 9 por 10 minutos 4 4 Descorar com gua destilada 3 x 10 minutos e avaliar se necessita mais 4 5 Visualizar em aparelho com luz ultravioleta UV Tampao acetato 100 mM pH 5 3 0 2 M cido ac tico 8 8 mL 0 2 M acetato de s dio 41 2 mL H O destilada q s p 50 mL cido ac tico 0 2 M cido ac tico 1 15 mL H O destilada q s p 10 mL 5 Glicol quitina Trudel amp Asselin 1989 5 1 Em um graal de porcelana macerar 1 g de glicol quitosan com o aux lio de nitrog nio l quido 5 2 Adicionar 100 mL de cido ac tico 10 v v e incubar por 16 horas a temperatura ambiente 5 3 Ap s esse per odo adicionar vagarosamente 30 mL de metanol e filtrar a solu o obtida a v cuo em papel Whatman n 1 Fazer isso em capela de exaust o 5 4 Adicionar ao filtrado 7 5 mL de anidrido ac tico sob agita o e deixar solidificar por 30 minutos a temperatura ambiente 5 5 Quebrar o gel obtido em peda os e colocar 1 volume de metanol Triturar em liquidificador durante 4 minutos 5 6 Lavar a suspens o com metanol e centrifugar a 12 000 rpm por 15 minutos 5 7 Lavar diversas vezes com gua destilada at a neutraliza o do pH 5 8 Ressuspender o sedimento em 1 volume
274. iores 1 Plaquear 3 x 10 c lulas em placa de 24 po os seguido do tratamento de interesse 2 Passar o meio de cultura para um ependorfe de 2 mL e lavar as c lulas com 300 mL de PBS 1x Recolher o PBS da lavagem para o mesmo ependorfe onde foi colocado o meio de cultura Dica Recolhe se o meio de cultura pois c lulas aderidas que sofrem apoptose soltam se da placa de cultura 3 Adicionar 150 uL de tripsina aos po os colocando a placa na estufa a 37 C por 2 5 minutos Dica o tempo de tripsiniza o varia de acordo com o tipo celular c lulas muito aderentes requerem tempo maior de incuba o 5 minutos N o aconselh vel exceder 5 minutos de tripsiniza o sob pena de redu o de viabilidade celular 4 Neutralizar a tripsina com 300 uL de meio de cultura contendo Soro Fetal Bovino e homogeneizar up and down aproximadamente 10 vezes e passar o volume para o mesmo ependorfe onde foram acondicionados o meio de cultura e o PBS 5 Centrifugar o ependorfe contendo meio de cultura PBS c lulas recolhidas por 5 minutos a 1 600 rpm 6 Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 100 pL Anexin Binding Buffer Dica o Annexin Binding Buffer um componente dos kits de anexina basta realizar a dilui o deste tamp o usualmente 10x concentrado para uma solu o final 1x concentrada 7 Adicionar 50 uL do mix de marca o contendo anexina e PI Dica mix de marca o por amostra 50 u
275. ios de liga o de fatores de transcri o Estes s tios podem ser bastante espec ficos ou apresentar regi es vari veis An lise da regi o promotora de genes de plantas utilizando Plant Cis acting Regulatory DNA Elements PLACE 1 Acessar o site https sogo dna affre go jp cgi bin sogo cgi sid amp rlang en amp pj 640 amp acti on page amp page newplace Dica o PLACE foi recentemente refeito e este o novo site Digitando place promoter analysis no Google o site acessado ser o da vers o anterior Deste poss vel encontrar a vers o mais nova clicando em NewPLACE logo abaixo do t tulo Important Note 2 Copiar e colar a sequ ncia do promotor a ser analisado na caixa 3 Clicar em Submit Query 4 Analisar os resultados O PLACE mostrar a sequ ncia completa que foi analisada Logo abaixo a sequ ncia ser novamente mostrada em conjuntos de 50 nucleot deos Abaixo de cada trecho do promotor ser o indicadas as posi es relativas de diferentes s tios regulat rios S o mostradas a fita na qual a sequ ncia ocorre fita senso fita antissenso o nome do s tio regulat rio a posi o nucleot deo de in cio do s tio considerando a sequ ncia analisada e a sequ ncia consenso do mesmo de acordo com o banco O mesmo resultado mostrado mais abaixo em formato de tabela listando os nomes dos motivos encontrados posi es relativas fita em que ocorrem e sequ ncia
276. iple Extracellular Chitinase Isozymes Journal of Invertebrate Pathology 61 81 84 16 3 GEL DE ATIVIDADE ZIMOGRAMA PARA DETECCAO DE LIPASES E ESTERASES TEO ET AL 2003 Lipases e esterases s o enzimas lipol ticas que hidrolisam a liga o ster de lip deos Triglicer deos s o considerados o substrato cl ssico destas enzimas por m substratos lineares formados a partir de lcool e cido graxo ligados por uma liga o ster tamb m s o alvo Desta maneira existem substratos sint ticos lineares cromog nicos e fluorog nicos que s o empregados com sucesso para detec o e an lise de lipases e esterases O gel utilizado no zimograma de descrito a seguir considerado nativo pois n o utiliza nenhum interferente que possa modificar a conforma o nativa da enzima 1 Prepara o do gel 1 1 Idem ao gel SDS PAGE com modifica es na composi o conforme segue Running 10 H O destilada 4 mL 0 5 M tris HCl pH 8 8 2 5 mL Acrilamida bis acrilamida 30 0 8 3 35 mL TEMED 5 pL Persulfato de am nio APS 10 50 uL Stacking 4 H O destilada 3 1 mL 0 5 M tris HCI pH 6 8 1 25 mL Acrilamida bis acrilamida 30 0 8 660 pL TEMED 5 pL Persulfato de am nio APS 10 25 pL 2 Prepara o da amostra 2 1 O volume de amostra a ser carregado no gel de aproximadamente 20 uL sendo 10 pL de amostra e 10 uL de tamp o de amostra 2 2 N o ferver as amostras Preparar em eppendorfs e aplicar diretamente no ge
277. iras na Amaz nia Acta Amazon 12 15 22 1982 10 8 PRODU O DE SIDEROFOROS BACTERIANOS Sider foros n o ligantes de ferro com importante fun o na promo o de crescimento vegetal e na supress o de doen as f ngicas Estas mol culas se ligam ao ferro insol vel do solo que n o pode ser absorvido pelas plantas tornando o dispon vel para absor o da microbiota e das plantas Al m do Ferro os sider foros bacterianos podem se ligar a metais como cromo Cr chumbo Pb alum nio Al c dmio Cd cobre Cu e zinco Zn sendo de essencial import ncia na biorremedia o de solos contaminados M todo baseado em Schwyn amp Neilands 1987 1 Crescer o isolado bacteriano a ser testado no meio de cultura l quido mais apropriado para seu pleno desenvolvimento 2 Preparar o meio de cultura gar KingB dilu do Meio de Cultura Componente Quantidade P Glicerol 3g Agar King B Peptona 4g K HPO 0 23 g MgsO 7H O 03g gar 15g gua destilada Completar o volume para 1L Ajustar o pH para 6 8 Autoclavar a 121 C por 15 minutos 3 Preparar o corante CAS Corante Composi o Quantidade CAS Chrome Solu o 1 7 5 mL Azurol S Solu o 2 37 5 mL Solu o 3 30 mL Solu o 4 Completar o volume Autoclavar um erlenmeyer de 500mL com 100mL de gua ultrapura Adicionar lentamente o volume das Sol 1 e Sol 2 Acrescentar o volume da Sol 3 Completar o volume com a Sol 4 Dica realizar todos
278. is do que o necess rio para uso naquele momento 3 Imergir segmentos do tecido no caso de folhas em torno de 5 cm nesta solu o Dica podem ser usadas placas de petri para a imers o 4 Manter tr s horas sob ilumina o forte e constante Zz Dica pode ser usada a luz de uma capela de exaust o mas importante aproximar ao maximo as amostras da luz para que esta seja eficiente 5 Retirar as folhas da solu o e ferver em etanol absoluto at descolorirem por completo ficando esbranqui adas Dica bastante cuidado ao ferver o etanol absoluto Pode ser utilizada uma chapa com aquecimento 6 Retirar as folhas da fervura e conserv las em etanol 70 7 Visualizar os pontos escuros azuis demarcados pelo NBT que mostram a rea o com o O 2 Dica cuidar ao manusear fotografar na lupa por exemplo pois as folhas rasgam com facilidade e tamb m logo enrolam fora do etanol 70 Refer ncia SHI J Fu X Z Peng T Huang X S Fan QJ Liu J H 2010 Spermine pretreatment confers dehydration tolerance of citrus in vitro plants via modulation of antioxidative capacity and stomatal response Tree Physiology 30 914 922 4 9 LOCALIZACAO HISTOQUIMICA IN SITU DO ACUMULO DE PER XIDO DE HIDROG NIO H 0 O m todo de localiza o histoquimica in situ do ac mulo de per xido de hidrog nio H O em tecidos vegetais utiliza o reagente DAB Diaminobenzidine que reage com o per xido de hidrog nio prod
279. isacrilamida 1 1 g do produto Homogeneizar os reagentes em um b quer com o aux lio de um bast o de vidro e ajustar o volume Filtrar A solu o deve ser armazenada a 4 C em um frasco mbar coberto de papel alum nio e sob refrigera o 4 Tamp o Tris 1 5 M pH 8 8 150 ml Tris 27 23 g do produto gua ultrapura 80 mL Ajustar o pH a 8 8 com HCI 6N Adicionar gua ultrapura para obter o volume final de 150 mL Armazenar a 4 C 5 Tamp o Tris 0 5 M pH 6 8 100 ml Tris 6 g do produto gua ultrapura 60 mL Ajustar o pH a 6 8 com HCI 6N Adicionar gua ultrapura para obter o volume final de 100 mL Armazenar a 4 C 6 Solu o de SDS 1 Para 100 mL pesar 1 g de SDS Homogeneizar gentilmente em 90 mL de gua ultrapura com barra magn tica para evitar bolhas em excesso Ajustar para 100 mL e armazenar a temperatura ambiente 7 Solu o de Persulfato de Am nio APS 10 Para 100 mL de solu o pesar 10 mg de APS Em um b quer dissolver o APS em 80 mL de gua ultrapura Ap s completa dissolu o ajustar em bal o volum trico para 100 mL Aliquotar em microtubos de 0 5 a 1 mL e armazenar a 20 C Dica o reagente APS higrosc pico Mant lo em um frasco fechado com s lica para evitar a degrada o do mesmo SDS PAGE preparo do gel de poliacrilamida 1 Preparar os suportes e placas de vidro para polimerizar o gel Dica os suportes que prendem as placas de vidro devem ser montados pr
280. isopor com Gelox para diminuir a atividade metab lica 4 Na cultura alvo a libera o inundativa dos caros predadores ser feita com a distribui o da casca de arroz nos focos de infesta o dos caros fit fagos Figura 1 E Figura 1 A E Representa o esquem tica do processo de produ o e distribui o de caros predadores do projeto de controle biol gico de caros fit fagos Produ o de plantas A DJ Distribui o a Embalagem armazenamento D D gt cm CAPITULO 13 C LULAS F NGICAS PRODU O CONTAGEM E VIABILIDADE APLICADAS AO CONTROLE BIOL GICO Luc lia Santi Markus Berger Oliveira Walter Orlando Beys da Silva 13 1 PRODU O DE CON DIOS DE FUNGOS FILAMENTOSOS Con dios ou esporos assexuados de fungos filamentosos representam a forma mais comum de reprodu o assexuada dos fungos e s o muito importantes para a dispers o destes organismos na natureza Os con dios s o c lulas haploides geneticamente semelhantes aos progenitores sendo capazes de gerar um novo organismo ao encontrarem condi es ambientais favor veis A produ o de con dios pode ser feita em placas de Petri normalmente utilizando um meio sint tico ou em substratos mais simples e comuns como gr os tais como arroz No ltimo caso a produ o considerada de larga escala pois um m todo simples e de alto rendimento As metodologias apresentadas aqui foram baseadas principalmente par
281. istascessscsnsdenonsedeaveseoteodstesdeesdersssedencexsocasastacnsesdsnns 213 9 1 PREPARA O DE SOLU ES ESTOQUE PARA O MEIO MS j csssssssssssssssesstecsecsscesscescssecsncesscsnecesesneesessnsensests 214 9 2 PREPARO DO MEIO DE CULTURA MS MURASHIGE E SKOOG eee 216 9 3 OBTEN O E DESINFESTA O DOS EXPLANTES setas dreren tos dad ad 219 9 4 ESTABELECIMENTO DOS EXPLANTES E CONDI ES DE INCUBA O c irmas 222 9 5 MANUTEN O DAS PLANTAS MATRIZES 0 cccccccecescscecececcensncnsncccccccececeececeecececeseesesesecesnansnececeacecececesesesececenees 225 CAP TULO 10 ISOLAMENTO E CARACTERIZA O DE BACT RIAS PROMOTORAS DE CRESCIMENTO VEGETAL sicsssissicscssessesssecesesdvsss essessetevensesetssessnsesdedvesesdeetesssansesessivcdesucteseesnsedsseteeese 227 10 1 ISOLAMENTO DE DIAZOTR FICOS ENDOF TICOS DE RAIZ 228 10 2 ISOLAMENTO DE DIAZOTROFICOS DE SOLO RIZOSFERICO ssssssssssssssssessssssssssesssssesssssssnssssvsssessesesesstsnsees 231 10 3 ISOLAMENTO DE DIAZOTR FICOS FORMADORES DE END SPOROS DE SOLO RIZOSF RICO 232 TOA ISOLAMENTO DE RIZOBIOS isssiscossocosssconisnsnncosnscnsnbchavssssussusvassonstvovaoonetveesedevbantsneesebbnsoensseenssnusasousbwvsssunsssibsuneidsoonee 234 10 5 IDENTIFICA O DO G NERO E ESP CIE BACTERIANA ienes 235 10 6 PRODU O DE COMPOSTOS INDOLICOS w essessssssssssssssssscosesscsessessensoncossnsssssssssssnssnsnsnsununsessessossossosescesen
282. istina Venzke Sim es de Lima Eduardo Miranda Ethur Greici Raquel Wildner Luc lia Hoehne Mariano Rodrigues M nica Jachetti Maciel A an lise de alimentos desempenha importante papel avaliador da qualidade e seguran a dos alimentos Devido complexidade da sua constitui o org nica os alimentos muitas vezes s o considerados matrizes dif ceis de serem manipuladas o analista dever estar devidamente treinado e somente a experi ncia ao longo dos anos poder fornecer seguran a anal tica INSTITUTO ADOLFO LUTZ 2005 Na literatura cient fica encontram se in meros m todos para detectar e quantificar n veis de contaminantes qu micos e avaliar a autenticidade de alimentos H necessidade da disposi o de m todos alternativos de an lises quando poss vel que estejam ao alcance da maioria dos laborat rios Nem sempre o m todo que faz uso do equipamento sofisticado e dispendioso o mais adequado s vezes dependendo do analito e da sua concentra o em um dado alimento a utiliza o de metodologia tradicional e de baixo custo torna se tamb m muito eficiente INSTITUTO ADOLFO LUTZ 2005 Refer ncias Instituto Adolfo Lutz Normas anal ticas do Instituto Adolfo Lutz M todos f sico qu micos para an lise de alimentos 4 ed Bras lia Minist rio da Sa de Ag ncia Nacional de Vigil ncia Sanit ria 2005 1018 p S rie A Normas e Manuais T cnicos D gt gt cil 7 1 MANUTEN O DAS CULTUR
283. itrato de am nia 1650 Micronutrientes Cloreto de cobalto ACL OHO hexahidratado ane Sulfato de cobre easG i pentahidratado ne H BO Acido b rico 6 2 KI Iodeto de potassio 0 83 Sulfato de mangan s Manso 41 0 tetrahidratado o Molibdato de s dio Na MoO 2H O dihidratado 0 25 ZnSO 4H O Sulfato de zingo tetrahidratado 8 6 FeEDTA Fe SO 7H O Sulfato ferroso heptahidratado 27 8 Biotecnologia MS Componentes mg L Acido Na EDTA 2H O etilendiaminotetraac tico sal 37 3 diss dico dihidratado Componentes Org nicos cido nicot nico 0 5 Glicina 2 0 Mio inositol 100 Piridoxina HCl 0 5 Tiamina HCl 0 1 Sacarose g l 30 Cada laborat rio deve optar em preparar o meio de cultura com o uso de solu es estoque ou n o Quando n o s o preparadas solu es estoque para o preparo do meio ou seja quando parte se diretamente dos sais devem ser seguidos os passos descritos a seguir 1 Pesam se todos os componentes de acordo com a receita Tabela 2 e a quantidade de meio a ser preparada 2 Logo em seguida todos os componentes devem ser dissolvidos em gua deionizada Importante que seja utilizado algum recipiente com volume preciso como provetas ou bal es volum tricos 3 Conclu da a dissolu o de todos os produtos qu micos e a sacarose acrescenta se o gar e corrige se o pH Dica O ajuste do pH pode ser realizado com solu o 0 5 mol de cido clor drico HCI quando este estiver muito a
284. ive Bacteria Dica pode se selecionar o tipo de an lise a ser feita alterando o valor de D cutoff e como os resultados ser o mostrados com ou sem gr fico simples ou estendido Isto definido pelo analista Dica cada par metro de an lise e visualiza o dos resultados autoexplicativo bastando clicar em Explain 4 Clicar em Submit 5 Analisar o resultado Observar na tabela o signal peptide se YES cont m pept deo sinal e portanto pode ser secretada se NO sem pept deo sinal Dica ao final da an lise encontra se Explain the output Clicando abre se uma nova aba com a explica o detalhada dos resultados obtidos Predi o de rota n o cl ssica de secre o de prote nas 1 Acessar o site http www cbs dtu dk services SecretomeP 2 Na caixa Submission colar a sequ ncia em formato fasta a ser analisada ou submeter o arquivo com todas as sequ ncias a serem analisadas clicando no link Escolher arquivo 3 Selecionar o grupo taxon mico do organismo ao qual as sequ ncias pertencem Bacteria Gram positiva ou negativa ou Mam fero 4 Clicar em Submit 5 Analisar o resultado Valores de SecP ou NN score acima de 0 5 indicam poss vel secre o Dica algumas prote nas com pept deo sinal rota cl ssica de secre o podem ser positivas neste programa Para confirmar a rota pode se fazer a busca no programa SignalP Dica o crit rio d
285. l 2 3 Separa o da amostra eletroforese 2 4 Idem ao gel SDS PAGE 2 5 O gel dever ser corrido a uma voltagem de 150 volts at chegar ao final 3 Detec o de lipases esterases 3 1 Ap s a eletroforese remover o gel da cuba e acondicionar em um recipiente 3 2 Incubar o gel com 100 mL tamp o tris 50 mM pH 8 0 com Triton X 100 2 2 mL 98 mL tamp o tris e 10 uM metilumbeliferil MUF butirato por 15 minutos 37 C 3 3 Visualizar as bandas de atividade em luz ultravioleta UV Dica 1 a fluoresc ncia emitida n o definitiva e vai perdendo a intensidade com o passar do tempo portanto o registro das bandas de atividade deve ser realizado rapidamente Dica 2 o substrato empregado MUF butirato contem uma cadeia de cido graxo de 4 carbonos por isso este substrato pode ser alvo tanto de esterases que atuam sobre substratos com cadeia de at 10 carbonos quanto de lipases que atuam sobre substratos com cadeia de cido graxo maior ou menor de 10 carbonos D gt cm Tamp o de amostra H O destilada 3 8 mL 0 5 M tris HCI pH 6 8 1mL Glicerol 0 8 mL Azul de bromofenol 1 0 4 mL Tamp o de corrida 1X Tris 18g Glicina 8 64 g H O destilada q s p 1L Refer ncia TEO J W P ZHANG L H POH C L 2003 Cloning and characterization of a novel lipase from Vibrio harveyi strain AP6 Gene 312 181 188 16 4 GEL DE ATIVIDADE ZIMOGRAMA PARA DETECCAO DE CATALASES ZIMMERMANN ET AL 2006
286. l interfere na leitura portanto tente deixar o mais seco poss vel 16 Ressuspender o pellet com gua Milli Q com DEPC autoclavada conforme o tamanho do pellet Dica para pellets menores usar entre 10 e 20 pL Para pellets maiores entre 30 e 50 pL 17 Incubar em banho maria por 10 minutos a 60 C 18 Manter 1 minuto no gelo e dar uma breve centrifugada 4 000 rpm 19 Estocar a 20 ou 80 C ou proceder quantifica o Refer ncia CHOMCZYNSKI P SACCHI N Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate phenol chloroform extraction Analytical Biochemistry 162 1 156 9 1987 D gt Cll 2 9 EXTRACAO DE RNA DE AMOSTRAS VEGETAIS UTILIZANDO CONCERT PLANT RNA REAGENT Dentre alguns m todos indicados para a extra o de RNA de tecidos vegetais ricos em polissacar deos encontra se o Concert Plant RNA Reagent Invitrogen indicado principalmente para tecidos de dif cil extra o como ra zes e sementes produzindo RNA de alta qualidade e quantidade N o deve ser utilizado para esp cies de plantas que possuem altos n veis de compostos fen licos e leos 1 Ligar a centrifuga a 4 C 2 Esfriar os tubos em nitrog nio l quido antes de transferir as amostras 3 Homogeneizar material no m ximo 100 mg em nitrog nio l quido at virar um p 4 Adicionar 500 uL do reagente Concert frio 4 C e agitar bem no vortex at ressuspender toda a amostra Deixar os tubos deitad
287. lcio com 1 0 a 2 5 de cloro ativo Dicas Ohipoclorito de s dio facilmente encontrado em formula es comerciais de gua sanit ria As concentra es mais comuns variam de 0 5 a 2 0 de cloro ativo e o tratamento dura at 50 minutos no caso de tecido lignificado embora o tempo mais utilizado para imers o em hipoclorito seja de 10 a 15 minutos O hipoclorito de c lcio apresenta a vantagem de ser menos t xico para os tecidos que o s dio 7 importante que sejam adicionados solu o de hipoclorito algumas gotas de detergente concentrado Com isso diminui se a tens o superficial do tecido Esta medida aumenta a penetra o do cloro e consequentemente a elimina o de prop gulos de microrganismos O mais utilizado o Tween 20 sendo necess rias apenas 4 a 10 gotas por litro de solu o 8 Ap s o tratamento completo de desinfesta o ainda na capela de fluxo laminar os tecidos devem ser lavados em gua autoclavada e destilada por tr s a cinco vezes Desta forma elimina se a maior parte do res duo do cloro pois a manuten o do mesmo junto ao explante pode impedir a regenera o Observa es a Em geral utilizam se concentra es bastante elevadas das subst ncias para desinfesta o o que implica em curto tempo de tratamento Pode se entretanto trabalhar com concentra es mais baixas devendo se por isso aumentar o per odo de exposi o b Considerando a sensibilidade do te
288. leitura apenas com DMSO Refer ncia MOSMANN T 1983 Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival application to proliferation and cytotoxicity assays J Immunol Methods 65 1 2 55 63 4 16 OXIDA O DE H2DCF DA PARA AVALIA O DE ESP CIES REATIVAS DE OXIGENIO INTRACELULARES Este protocolo se baseia na detec o da mol cula fluorescente DCF 2 7 diclorofluoresceina fluorescente a qual gerada como produto da clivagem e oxida o da mol cula n o fluorescente H DCF DA 2 7 diclorodiidrofluoresceina diacetato O composto gerado DCF fica retido no ambiente intracelular e emite fluoresc ncia verde que pode ser mensurada por microscopia de fluoresc ncia ou cit metro de fluxo Assim quanto maior a fluoresc ncia verde medida maior a quantidade de esp cies reativas de oxig nio EROs intracelular M todo de Keston et al 1965 Protocolo referente placa de 24 po os os volumes podem ser ajustados de maneira diretamente proporcional conforme o tipo de placa Ex placa de 6 po os volumes 4x maiores placas de 12 po os volumes 2x maiores 1 Retirar o meio de cultura e lavar as c lulas com 300 mL de CMF 1x Dica CMF BSS Solu o Salina Fosfato tamponada Livre de C lcio e Magn sio uma solu o salina muito semelhante ao PBS 1x por m tamponada e livre de Ca e Mg o que facilita a atividade da tripsina em soltar as c lulas da placa de cultura Dica 2 CMF 10 x
289. lidade da ordem de 0 1 a 0 001 g Figura 14 Balan a semianal tica Fonte Dos autores b Anal ticas apresentam o prato para a coloca o da amostra com prote o lateral com o objetivo de evitar que as correntes de ar provoquem instabilidade ou erros de leitura Apresentam sensibilidade de 0 0001 a 0 00001 g sendo dessa forma utilizadas quando se requer uma maior precis o na pesagem necess rio salientar que para uma maior estabilidade da balan a durante a pesagem preciso construir uma plataforma com isolamento pra colocar a balan a Figura 15 Figura 15 balan a anal tica Fonte Dos autores Biotecnologia Cuidados com a balan a a Nao remova os pratos b Ligue a previamente deixando a estabilizar por cerca de 30 min c Observe se a balan a est nivelada d Coloque as subst ncias de maneira centralizada na balan a e a temperatura ambiente e Coloque a balan a em um local com o m nimo de vibra o varia o de temperatura e mudan as de temperatura f Mantenha a sempre limpa g N o coloque o material a ser pesado diretamente na balan a coloque o em um recipiente seco e previamente pesado tarado tais como b quer pequeno papel filtro vidro rel gio etc h Caso o material que for pesado tenha a propriedade de evaporar oxide ou absorva a umidade tampe o recipiente que cont m a subst ncia i Execute todas as opera es cuidadosamente e com movimentos suaves j
290. lidade utilizar discos foliares cortados com a tampa dos tubos eppendorf de 1 5 ml 2 Transferir o material para um tubo eppendorf de 2 mL e adicionar 650 pL do tamp o de extra o para 10 mL 2 CTAB 02g 1 4 M NaCl 2 8 mL do estoque 5 M NaCl 100 mM Tris HCl pH 8 0 1 mL do estoque 1 M Tris Cl pH 8 0 20 mM EDTA pH 8 0 400 uL do estoque 0 5 M EDTA pH 8 0 1 polivinilpirrolidona 0 1 g do produto 3 Adicionar a uma al quota do tamp o a ser usado pouco antes do uso 0 2 B mercaptoetanol 50 mg mL de proteinase K 4 Misturar os tubos em v rtex e coloc los em banho maria a 55 C por uma hora 5 Adicionar 650 uL de clorof rmio lcool isoamilico 24 1 e misturar at formar uma emuls o 6 Centrifugar a solu o por 5 minutos a 12 000 rpm 7 Coletar a fase aquosa superior e transferir para um novo tubo com cuidado para n o pipetar a interface Caso o volume da fase superior n o for superior fase intermedi ria com fragmentos de tecido adicionar mais tamp o misturar vigorosamente e centrifugar novamente 8 Adicionar 200 uL do tamp o de extra o sem proteinase K e B mercaptoetanol e adicionar 650 pL de clorof rmio lcool isoam lico 24 1 misturando at formar uma emuls o 9 Centrifugar a solu o por 5 minutos a 12 000 rpm 10 Coletar a fase aquosa superior e transferir para um novo tubo com cuidado para n o pipetar a interface 11 Repetir esses tr s passos anteriores mai
291. lizado na transfer ncia de l quidos de um frasco para o outro ou para efetuar filtra es simples Figura 1 10 Bal o de fundo chato ou de Florence utilizado para armazenar l quido e em destila es Figura 1 11 Bal o de Fundo Redondo usado para aquecimento de l quidos e para realizar rea es que envolvam desprendimento de gases Figura 1 12 Funil de separa o equipamento utilizado na separa o de l quidos imisciveis Figura 1 13 Vidro de rel gio usado geralmente para cobrir b quer contendo solu o ou par evapora o em an lise de l quidos Figura 1 14 Placa de Petri usada para cobrir cristalizadores para o desenvolvimento de culturas Figura 1 15 Bast o de vidro utilizado na agita o e transfer ncia de l quidos Figura 1 16 Pesa filtro recipiente destinado pesagem de s lidos Figura 1 17 Condensador equipamento utilizado para condensa o de vapores em destila es ou aquecimento sob refluxo Figura 1 18 Picn metro utilizado na determina o da densidade de l quidos Figura 1 19 Dessecador utilizado no armazenamento de subst ncias quando se necessita de uma atmosfera com baixo teor de umidade Figura 1 20 Term metro utilizado para medir a temperatura de subst ncias ou do ambiente Figura 1 21 A Figura 1 ilustra os materiais de vidro mais comuns utilizados em um laborat rio Figura 1 Materiais de vidro de uso em l
292. lmente para a forma o qualificada de recursos humanos em n vel escolar t cnico de gradua o e de p s gradua o Prof Dr Jorge Almeida Guimar es Presidente da CAPES SUMARIO CAPITULO 1 PREPARO DE SOLUCOES TECNICAS BASICAS E UTILIZACAO DE EQUIPAMENTOS DE EOIN ag assesses lap E T E OR da 15 1 1 SEGURAN A NO LABORAT RIO ws ssacssssinstoniasesossdesansensuossantasssbetessuoneneddbosonorsssinsseoatapiuvtonseotetnsaoronsensasdbhiabanaonvestaes 16 12 PRINCIPAIS VIDRARIA cee ee ee ee ee a ete eee ene ee ne ere errno ae ee 18 1 3 PRINCIPAIS TIPOS DE GUA EMPREGADOS NO LABORAT RIO ss ssssssssssessseessssssssessessseesssessseesseesseesseessecs 22 1 4 LIMPEZA E DESCONTAMINA O DE VIDRARIAS csssssssssssssssessssesessseesscssscsuecsscssesssessscesscsucssscsnecsscssscesecsneeseeases 24 1 5 SOLU ES DE LIMPEZA E SECAGEM DE MATERIAL scssssssssssessssssecsssssscsscssessscesesssecsscesscsucesscsucsscssscssecsneeneeases 26 1 6 MEDIDAS DE VOLUMES DE L QUIDOS cssssssssssssssssessseesssessssesssssssssssecssscsssssssscssecssscsssessusessscsssssssecsseessscessessseessecs 28 1 7 AQUECIMENTO EM BANHO MARIA qa nto 31 1 8 AQUECIMENTO EM ALTAS TEMPERATURAS c ssessssesssssssssssseesssesssesssessssesssssssscssscssesssssssusessessssesssessseessseessecssesstess 32 1 9 AQUECIMENTO EM BICO DE BUNSEN ias Stilo 34 1 10 RESFRIAMENTO EMPREGANDO BANHO DE GELO sscssssssssssssssssesssessssesssscssscsssecssecssecssssssussesecesscssecsa
293. lo vasodilatador ou pr inflamat rio o corante pode ser detectado no tecido As principais aplica es s o para a avalia o dos efeitos anti inflamat rios e antiedematog nicos de diferentes subst ncias como drogas sint ticas e produtos naturais extratos ou compostos isolados de plantas ou ainda para estudar o papel de c lulas inflamat rias pept deos vasoativos subst ncias vasodilatadoras quimiocinas e citocinas Animais S o utilizados ratos adultos machos 200 250 g mantidos em biot rio espec fico com ciclo claro escuro de 12 horas temperatura de 22 2 C e umidade de 60 80 com livre acesso gua e ra o Pelo menos dois dias antes dos experimentos transferir os animais para o biot rio do setor onde os procedimentos ser o realizados para adapta o Todos os experimentos com animais devem seguir obrigatoriamente as atribui es e compet ncias definidas na Lei 11 794 08 e em resolu es do Conselho Nacional de Controle em Experimenta o Animal CONCEA Antes da realiza o de qualquer procedimento o protocolo incluindo a identifica o das subst ncias ou extratos a serem testados e suas doses devem ser submetidos an lise da Comiss o de tica para o Uso de Animais CEUA da institui o Os m todos de anestesia e eutan sia sugeridos aqui est o de acordo com o NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals edi o revisada em 1996 http www nap edu readingroom books labrats
294. ltados podem ser expressos de uma s rie de maneiras diferentes dependendo do direcionamento das an lises Normalmente o grau de inflama o col nica e gravidade da doen a desenvolvida determinado pela avalia o do estado geral dos animais perda de peso ndice de mortalidade scores macrosc picos de les o no c lon e altera es histol gicas associadas inflama o Al m disso citocinas quimiocinas xido n trico e a atividade de algumas enzimas podem ser dosadas no tecido col nico Refer ncias BENTO AF LEITE DF MARCON R CLAUDINO RF DUTRA RC COLA M MARTINI AC CALIXTO JB Evaluation of chemical mediators and cellular response during acute and chronic gut inflammatory response induced by dextran sodium sulfate in mice Biochem Pharmacol 2012 Dec 1 84 11 1459 69 MCCAFFERTY DM MIAMPAMBA M SIHOTA E SHARKEY KA KUBES P Role of inducible nitric oxide synthase in trinitrobenzene sulphonic acid induced colitis in mice Gut 1999 45 6 864 73 MORRIS GP BECK PL HERRIDGE MS DEPEW WT SZEWCZUK MR WALLACE JL Hapten induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon Gastroenterology 1989 96 3 795 803 YOSHIDA H RUSSELL J GRANGER DN Thrombin mediates the extraintestinal thrombosis associated with experimental colitis Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2008 295 5 G904 8 YOSHIDA H RUSSELL J SENCHENKOVA EY ALMEIDA PAULA LD GRANGER DN Interleukin 1beta mediates the extra intestinal
295. ltiplos de 50 pb Nota os padr es gerados por diferentes Ladders s o fornecidos pelo fabricante quando da compra do material Devido ao potencial carcinog nico do brometo de et dio o descarte do gel e das luvas utilizadas no seu preparo e manipula o deve ser feito em lixeiras espec ficas saco laranja pr prias para material infectante e perigoso A lavagem dos materiais utilizados deve ser realizada em local espec fico assim como a vidraria de preparo dos g is de agarose deve ser de uso exclusivo dessa t cnica Eletroforese em gel de poliacrilamida O preparo do gel pode ser realizado diretamente a partir de acrilamida e bis acrilamida s lidas Entretanto devido toxicidade desses compostos no estado s lido costuma se preparar uma solu o aquosa de acrilamida 30 a partir da qual s o feitas dilui es para se atingir a concentra o de cada gel Para prepara o da solu o de acrilamida 30 dissolve se 15 g de acrilamida e 0 4 g de bis acrilamida em 50 mL de gua destilada O gel assume estado s lido ap s o processo de polimeriza o da acrilamida que forma uma rede de poliacrilamida Para que essa polimeriza o ocorra necess ria a adi o dos catalisadores Persulfato de Am nio e TEMED Importante as concentra es desses reagentes variam de acordo com o volume do gel a ser produzido A montagem das cubas de eletroforese em gel de poliacrilamida pode variar significativamente de aco
296. lto e precisa ser reduzido Quando ocorrer o inverso ou seja o pH estiver muito baixo o ajuste deve ser realizado com hidr xido de s dio NaOH na mesma concentra o A forma mais r pida e pr tica para o preparo do meio de cultura atrav s da utiliza o das solu es estoques conforme detalhado no item acima Neste caso procede se da seguinte forma 1 Pipetar as al quotas de cada uma das solu es de acordo com a concentra o e a quantidade de meio a ser preparada Por exemplo se a defini o o preparo de um litro de meio devem ser pipetados 100 mL da solu o estoque A na concentra o 10 X ou de 10 mL quando a concentra o da solu o for 100 X 2 Ent o deve ser acrescentado o mio inositol o carv o e a case na opcionais e a sacarose mantendo em agita o no agitador magn tico 3 Depois de misturadas todas as solu es estoque o mio inositol o carv o a case na e a sacarose acrescenta se gua deionizada para completar o volume final previamente definido e corrige se o pH recomenda se que seja 5 8 4 Para finalizar independente do m todo seguido com uso de solu o estoque ou n o deve ser acrescentado o gar 5 A solu o deve ser aquecida at a total dissolu o recomenda se utilizar chapa aquecedora ou forno de micro ondas onde o meio atinja 90 a 95 C 6 T o logo alcance esta temperatura distribui se todo o volume nos frascos de cultivo tubos de ensaio por exemplo fe
297. lulas CHO K1 em frascos de cultivo celular em meio DMEM HAM F10 suplementado com 10 de soro bovino fetal SBF antibi ticos estreptomicina 0 1 mg mL penicilina 0 06 mg mL bicarbonato 1 8 mg mL e mantidas a 37 C e 5 de CO at atingir conflu ncia de 80 90 Yo 2 A cultura celular ap s adquirir semiconflu ncia dever ser lavada com a solu o tamp o Hanks ou PBS tripsinizada e contadas em c mara de Neubauer ajustando o n mero de c lulas para 2 0x10 c lulas po o 200 pL em meio de cultura suplementado com SBF 3 Realizar a semeadura das c lulas em placas de 96 po os triplicata e incubar a 37 C e 5 de CO por 4 horas 4 Realizar a pesagem das amostras e prepar las 5 A amostra poder ser dilu da em DMSO est ril solu o estoque e as dilui es consecutivas ser o realizadas em meio de cultura completo Dica a concentra o final de DMSO n o dever ultrapassar 1 devido toxicidade e deve ser constante em todas as amostras 6 Concentra o da Doxorubicina no experimento 100 10 1 0 1 0 01 uM 7 Retirar a placa da estufa e remover o meio de cultura 8 As c lulas dever o ser novamente lavadas com 100 pL de PBS 9 Adicionar as amostras s c lulas e incubar por 72 horas tempo determinado sob condi es pr determinadas em estufa a 37 C e 5 CO Controle positivo c lulas Doxorubicina DMSO Controles negativos c lulas em meio c lulas em meio DMSO
298. lytical Chemists 18 edition v 1 2 USA 2005 ARA JO J M Quimica de alimentos teoria e pr tica 4 ed Vi osa UFV 2008 596 p BALTI R et al Comparative study on biochemical properties and antioxidative activity of cuttlefish Sepia officinalis protein hydrolysates produced by alcalase and bacillus licheniformis NH1 proteases Journal of amino acides V 2 2011 11 p BELITZ H D Grosch W Qu mica de los alimentos 2a edi o Editora Acribia S A Zarogoza Espanha 1997 DAMODARAN S Parkin K L Fennema O R Quimica de alimentos de fennema Tradu o Adriano Brabdelli et al 4 ed Porto Alegre Artmed 2010 900 p KRISTINSSON H G RASCO B A Fish protein hydrolysates production biochemical and functional properties Critical reviews in food science and nutrition v 40 p 43 2000 MENSOR L L et al Screnning of brazilian plant extracts for antioxidant activity by the use of the DPPH free radical method Phytotheraphy Research v 15 n 2 2001 pag 127 130 7 13 DETERMINACAO DA DEMANDA QUIMICA DE OXIGENIO DQO Esse m todo empregado na determina o da DQO dos res duos gerados ap s o processo de cultivo de microrganismos O m todo de refluxo aberto uma medida equivalente em oxig nio da por o de mat ria org nica na amostra suscet vel oxida o por um oxidante qu mico forte O teste consiste em oxidar a amostra com excesso de dicromato em meio fortemente cido e sob reflu
299. m 20 mL de gua e dilui se em lcool isento de alde dos completando se a 1000 mL 35 g KOH em 20 mL HO 1000 mL lcool q s p 1 5 3 Secagem do material Ap s a ltima lavagem o material levado a secar espontaneamente sobre estantes bancadas ou secadores de vidrarias Estufas a temperaturas de 100 105 C aceleram a secagem mas deve se observar os seguintes passos para obter uma secagem correta e com seguran a Material volum trico jamais levado estufa pois sua calibra o alterada Verificar se os materiais vidraria recipientes etc resistem a temperatura utilizada N o secar utens lios de polietileno pl stico a uma temperatura superior a 60 C Algumas tintas usadas na identifica o podem desaparecer a 100 C Todo material lavado e seco dever ser guardado em gavetas ou arm rios bem fechados Os b queres e c psulas devem ser emborcados A boca de frascos como Erlenmeyer pode ser protegida com pequeno papel Material utilizado para medidas de volume provetas pipetas bal es volum tricos etc bem como outros objetos de vidro com paredes grossas n o podem ser aquecidos em estufas de secagem A distor o t rmica do material implicaria na completa altera o da gradua o e aferi o Este tipo de material somente pode ser seco espontaneamente Tamb m pode ser usado o seguinte processo lavar o objeto uma ou duas vezes com lcool et lico depois com acetona Finalmente p
300. m papel alum nio ou saco preto 6 Deixar no escuro durante a noite 7 No dia seguinte adicionar o carv o ativado e filtrar imediatamente Repetir este passo at que o filtrado torne se incolor Detec o histoqu mica da peroxida o lip dica descrita conforme Pompella et al 1987 As amostras devem ser coradas com reagente de Schiff durante 60 minutos para detectar alde dos provenientes da peroxida o lip dica Depois da rea o com o reagente de Schiff a amostra deve ser lavada com uma solu o de sulfito 0 5 K S O em HCI 0 05 M e mantida nessa solu o para manter a colora o Refer ncia POMPELLA A MAELLARO E CASINI A F COMPORTI M Histochemical detection of lipid peroxidation in the liver of bromobenzenepoisoned mice American Journal of Pathology 129 295 301 1987 ED gt cil 4 7 LOCALIZA O HISTOQUIMICA DA PERDA DE ESTABILIDADE DE MEMBRANA UTILIZANDO O REAGENTE EVANS BLUE Este protocolo permite a localiza o histoqu mica da perda de estabilidade de membrana indicativo de morte celular utilizando se o corante Evans Blue que penetra em c lulas mortas marcando o tecido com pontos ou regi es de cor azulada Pode ser utilizado tanto para folhas como ra zes M todo de Romero Puertas et al 2004 1 Preparar uma solu o 0 25 de Evans Blue Dica 0 25 g em 100 mL ou 0 50 g em 200 mL de gua Milli Q 2 Imergir segmentos foliares de aproximadamente 5 cm nesta solu o ou ra
301. m papel toalha a fim de remover qualquer acetona residual por evapora o 18 Acrescentar 1 mL de Working Solution WS em cada amostra gt 990 uL Reagent Type 4 al quotas feitas anteriormente 10 uL Protease Inhibitor Cocktail Dica a Working Solution deve ser preparada somente na hora 19 Agitar no v rtex por 15 minutos Dica Depois de ter adicionado a WS nas amostras as mesmas devem ser agitadas continuamente Cuidar para que a temperatura das amostras n o passe dos 30 C para evitar degrada o proteica 20 Centrifugar as amostras a 16000 g por 30 minutos para sedimentar os restos de tecido da planta 21 Coletar o sobrenadante onde est o as prote nas e colocar em um novo eppendorf devidamente identificado gt gt C 2 12 QUANTIFICACAO DE DNA UTILIZANDO O QUBIT O fluor metro Quibit 2 0 Invitrogen altamente espec fico e sens vel para quantifica o de DNA dupla fita DNA simples fita RNA e prote nas Ele utiliza corantes arcades fluorescentes espec ficos para quantificar as mol culas de interesse sendo que a fluoresc ncia emitida apenas quando est o ligados a mol culas alvo espec ficas mesmo em baixas concentra es Apresenta como vantagem o uso de um volume pequeno da amostra 1 20 ul e boa sensibilidade sendo capaz de quantificar amostras entre 10 pg yL e 100 ng pL Protocolo baseado nas instru es do fabricante do Kit Qubit dsDNA HS High Sensitivity Invitrogen
302. m proveta graduada A quantidade de leo absorvido foi obtida pela diferen a entre a quantidade de leo inicial e a quantidade de leo n o absorvida A capacidade de reten o de leo expressa como a quantidade de leo retido por grama de prote na e calculada da seguinte forma CRO quantidade de leo absorvido mL x 100 peso da amostra g D gt Cm 7 11 3 Capacidade espumante CFE As espumas consistem de uma fase aquosa e uma gasosa sendo que as minusculas particulas de ar dispersas provocam as propriedades sensoriais em produtos com essa propriedade As prote nas s o os agentes ativos que ajudam na forma o na forma o e na estabiliza o da fase gasosa Normalmente a forma o de bolhas ou simplesmente o fato de agitar uma solu o proteica criam espumas estabilizadas por prote nas Podem se utilizar prote nas em alguns tipos de alimentos para estabilizar ou formar espuma As prote nas formam pel culas estabilizando se ao redor da espuma A adsor o e uni o das prote nas car ter hidrof bico reduzem a tens o superficial da gua facilitando a forma o de maior quantidade de espuma ate que ocorra a estabilidade Quanto mais facilmente a prote nas for desnaturada maior ser o seu poder espumante A capacidade de forma o de espuma por uma prote na refere se expans o de volume com o acr scimo de ar por batimento agita o ou aera o Depende da natureza da prote na da
303. m torno da col nia bacteriana indicativo de produ o de sider foros Refer ncia SCHWYN B amp NEILANDS JB Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores Anal Biochem 160 47 56 1987 D gt CH 10 9 ATIVIDADE DA ENZIMA ACC DEAMINASE O ACC 1 aminociclopropano 1 carboxilato o precursor da s ntese de etileno em plantas superiores fito horm nio que tem sua s ntese aumentada sob diversas situa es de estresse Bact rias que possuem atividade de ACC deaminase podem contribuir para a redu o dos n veis de etileno na rizosfera por meio do sequestro e clivagem de ACC a cido a cetobutirato e am nia Um screening da atividade de ACC deaminase pode ser avaliada em meio m nimo contendo ACC como recurso de N por meio da compara o de desenvolvimento e tamanho da col nia bacteriana na presen a meio DF salts sem N e contendo ACC ou aus ncia meio DF salts sem N de N M todo baseado em Penrose amp Glick 2003 1 Para o preparo do meio de cultura DF salts sem N Dworkin amp Foster 1958 dissolver os reagentes em aproximadamente 700 ml de gua destilada conforme a tabela abaixo Meio de cultura Reagentes Para 1L DF salts sem oe a 18 Nitrog nio Ro 68 MgSO 7H O 0 2 g Glicose 2g cido gluc nico 2g cido c trico 2g FeSO 7H O 100 uL Solu o de elementos tra o 100 uL gua destilada Completar volume para 1L Solu o de FeSO 7H O 0 1 g em 10 mL d
304. mados pela inser o ou dele o de um ou mais nucleot deos n o repetidos em um determinado ponto do genoma Os polimorfismos de tamanho geralmente apresentam uma sequ ncia repetitiva que aparece em n mero vari vel de vezes conferindo tamanhos diferentes regi o S o constitu dos por blocos cujo n mero de unidades repetitivas vari vel De acordo com o comprimento dessa unidade de repeti o os polimorfismos de tamanho podem ser classificados em microssat lites com unidades de repeti o de 1 2 ou 4 nucleot deos ou minissat lites com unidades de repeti o de 10 a 50 nucleot deos que tamb m podem ser denominados VNTRs do ingl s variable number tandem repeats A seguir ser o apresentadas individualmente as t cnicas b sicas que s o utilizadas para a genotipagem de polimorfismos em humanos Na se o seguinte descrevem se mais especificamente as metodologias de genotipagem que se utilizam dessas t cnicas 3 1 REACAO EM CADEIA DA POLIMERASE PCR A genotipagem de polimorfismos como os descritos acima realizada geralmente utilizando metodologias baseadas na Rea o em Cadeia da Polimerase PCR A PCR consiste na amplifica o c pia de determinadas regi es do genoma neste caso a regi o dos polimorfismos a partir de altera es c clicas de temperatura que regulam a a o da enzima envolvida na rea o a DNA Polimerase O procedimento realizado em um aparelho capaz de realizar
305. mal na mesa cir rgica em dec bito dorsal prendendo patas e cabe a 7 Realizar a tricotomia da regi o abdominal 8 Realizar uma incis o na regi o do abdome abaixo da ap fise xif ide de 3 4 cm expor o est mago sem cort lo e ligar o es fago e o piloro com o aux lio dos fios de nylon 4 0 a fim de que o conte do g strico n o se perca 9 Remover o est mago cortando na extremidade anterior dos n s do es fago e piloro 10 Remover o n do piloro recolher o conte do g strico em um recipiente e medir o pH com o aux lio das fitas de medi o 11 Remover o n do es fago e abrir o est mago ao longo da grande curvatura para a contagem das les es g stricas 12 Lavar o est mago com PBS e observ lo para a presen a de hiperemia hemorragia n mero e tamanho das lceras Alternativamente as lceras poder o ser medidas com o aux lio de um paqu metro para quantificar o tamanho da rea lesionada Nesses casos les es de n vel 1 correspondem a lceras de 1 mm les es de n vel 2 a lceras de 2 mm e les es de n vel 3 a lceras de 3 mm Szeleny amp Thiemer 1978 13 Congelar imediatamente parte do tecido de cada est mago em nitrog nio l quido para an lise posterior de citocinas quimiocinas e outros marcadores moleculares de les o Outra parte dos tecidos devem ser reservadas em formalde do tamponado 10 para an lise histol gica An lise dos Resultados Neste protocolo os resultados podem se
306. mento o protocolo incluindo a identifica o das subst ncias ou extratos a serem testados e suas doses devem ser submetidos an lise da Comiss o de tica para o Uso de Animais CEUA da institui o Os m todos de anestesia e eutan sia sugeridos aqui est o de acordo com o NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals edi o revisada em 1996 http www nap edu readingroom books labrats Materiais Mesa cir rgica Seringa descart vel para insulina com agulha 1 mL 13 X 0 45 mm 26 G Fio cir rgico de Nylon monofilamento 4 0 45 cm 3 8 est ril n o absorv vel sem agulha Algod o e gaze Material cir rgico pin a simples reta pin a simples curva pin a dente de rato pin as hemost ticas e tesoura reta Placas de petri e papel filtro L mina de a o para realizar tricotomia ou raspador el trico Cron metro Estufa 60 C Balan a anal tica Tamp o fosfato PBS lcool iodado 1 Tromboplastina Xilazina e Ketamina D gt cm Procedimentos 1 Pesar o animal 2 Preparar na mesma seringa e administrar por via intraperitoneal i p a mistura de Xilazina 10 mg kg Ketamina 75 mg kg Esta dose mant m um bom plano anest sico por 30 45 minutos Ap s este tempo suplementar com 1 3 da dose de Ketamina 3 Dispor o animal na mesa cir rgica em dec bito dorsal prendendo patas e cabe a 4 Realizar a tricotomia de toda a regi
307. mento com PBS 37 C 15 Cortar o n do segmento extra do e retirar o trombo formado 16 Lavar o trombo com PBS 37 C secar em papel filtro e pesar o trombo mido em balan a anal tica 17 Manter o trombo em estufa 60 C por 1 hora 18 Pesar o trombo seco em balan a anal tica Dicas 1 Usando este modelo a subst ncia a ser testada pode ser administrada como pr tratamento antes da indu o da estase ou p s tratamento ap s a indu o da estase por via oral intraperitoneal subcut nea ou intravenosa Se a via de escolha for a intravenosa recomenda se administrar pela veia caudal 2 O trombo pode ser retirado em diferentes tempos ap s a indu o da estase variando de 24 horas at 21 dias dependendo do tipo de subst ncia a ser testada Normalmente a massa do trombo aumenta com o tempo entre o primeiro e o quarto dia devido ao intenso processo inflamat rio e ativa o da coagula o e posteriormente diminui a partir do quarto dia dependendo da resolu o do processo inflamat rio e ativa o da fibrin lise An lise dos Resultados Os resultados s o expressos pela raz o entre a massa do trombo seco e a massa do animal geralmente mg de trombo g de rato e representados em um gr fico versus a dose da subst ncia testada No caso de uma subst ncia antitromb tica antiplaquet ria ou de um inibidor da coagula o espera se que essa raz o diminua conforme h um aumento de dose Um n mero de 8 10
308. mostra 8 Retirar do gelo ou freezer e centrifugar por 20 minutos a 12 000 rpm 9 Coletar todo o sobrenadante e transferir para um novo microtubo de 1 5 mL est ril Dica se voc n o conseguir retirar o volume de 500 pL completar com TE1 10 Adicionar 1 volume de fenol clorof rmio e agitar vigorosamente 11 Centrifugar por 5 minutos a 5 000 rpm coletar a fase aquosa parte superior e transferi la para um novo microtubo Dica se esta solu o n o tiver volume de no m nimo 500 pL completar com TE2 12 Repetir os passos 10 e 11 usando somente clorof rmio 13 Repetir os passos 10 e 11 usando somente clorof rmio lcool isoam lico 24 1 14 Adicionar 8 pL de uma solu o de NaCl 5 M e 0 6 volumes de isopropanol gelado Misturar com cuidado e manter por 20 minutos no gelo Dica nesta fase a solu o deve ter 500 uL Se n o tiver completar o volume com TE2 Dica esta solu o deve ficar no gelo por no m nimo 20 minutos mas pode ficar por tempo indeterminado sem prejudicar a amostra 15 Centrifugar por 20 minutos a 12 000 rpm 16 Descartar o sobrenadante lavar o pellet com 500 pL de etanol 70 e centrifugar por 5 minutos a 12 000 rpm 17 Retirar o etanol 70 e deixar o pellet secar a 35 C por 1 hora 18 Ressuspender o pellet em 30 uL de TE2 a composi o da solu o TE2 est descrita no protocolo de extra o de DNA de bact rias endof ticas 19 Checar 2 uL da solu o em gel de agaros
309. mp o de Eletroforese 300 mM NaOH 1 mM EDTA pH gt 13 O tamp o para eletroforese formado por duas solu es A e B SOLU O A 200 g de NaOH 500 mL de gua destilada a Pesar 200 g de NaOH e colocar em um b quer com capacidade para 1 litro b Adicionar 500 mL de gua destilada c Mexer com bast o de vidro at dissolver totalmente d Guardar em temperatura ambiente e de prefer ncia sem exposi o luz SOLU O B 14 89 g de EDTA 200 mL de gua destilada a Pesar 14 89 g de EDTA e colocar em um b quer de 500 mL b Adicionar 200 mL de gua destilada c Mexer com bast o de vidro at dissolver totalmente d Guardar em temperatura ambiente e de prefer ncia sem exposi o luz Tamp o de Eletroforese uso 30 mL solu o A 5 mL solu o B Adicionar gua destilada at completar 1000 mL Tamp o de neutraliza o pH 7 5 48 5 g de Tris a Pesar 48 5 g de Tris e colocar em um b quer com capacidade para 1 L b Adicionar cerca de 500 mL de gua destilada c Mexer com bast o de vidro at dissolver totalmente caso seja necess rio adicionar mais gua por m n o completar ainda para 1 L d Acertar o pH com HCl 6 N para 7 5 e Adicionar gua destilada at completar 1 L f Guardar em temperatura ambiente protegida da luz Solu o fixadora colora o com Nitrato de Prata 150 g de cido tricloroac tico 15 50 g de sulfato de zinco 5 50 mL de glicerol 5
310. mpleto i Incubar na estufa a 37 C DIA 1 24 horas ap s o preparo da amostra a Tratamento das amostras sangue total com o extrato e com o controle positivo Etil metanosulfonato EMS em concentra es pr determinadas Concentra o do EMS 200 pg mL Concentra o dos extratos Solu o estoque 20 000 pg mL Concentra o dos extratos 200 100 50 e 25 pg mL Usar a seguinte f rmula para os c lculos das dilui es C1xV1 C2xV2 b Recolocar as amostras na estufa a 37 C Obs o tratamento com agentes mutag nicos dever ser inserido na cultura de acordo com o protocolo adotado Para maiores detalhes ver protocolo da OECD gt gt Cm Tabela 1 Incuba o da cultura celular Oh 24h 44h 48h 72h 96h Incubar a ne Coletar ae 37 C Homogeneizar Adicionar CtB prosseguir a Coletar incuba o Obs os agentes testes dever o ser adicionados na cultura conforme protocolo abaixo Concentra o do agente teste Quando o agente teste estudado desconhecido recomenda se que as concentra es testadas n o ultrapassa 0 01M 5 mg mL ou 5 pl mL OECD 2009 Protocolo de tratamento por indu o de agente teste Tabela 2 Protocolo de tratamento das c lulas e colheita para o ensaio do MN in vitro Tratamento por 3 6 horas j PEN Poea a Coletar ap s 1 5 2 0 ciclos Linf citos e Exposi o Curta remove a subst ncia do meio e p celulares
311. n a plant derived thrombin inhibitor Thromb Res 2003 112 1 2 93 8 14 4 MODELO DE ASMA ALERGICA Neste protocolo a inflama o pulmonar al rgica induzida por ovalbumina em camundongos As principais aplica es s o para a avalia o dos efeitos anti inflamat rios e imunorregulat rios de diferentes subst ncias como drogas sint ticas e produtos naturais extratos ou compostos isolados de plantas ou ainda para estudar o papel de c lulas inflamat rias prote nas quimiocinas e citocinas no pulm o Animais S o utilizados camundongos 25 30 g adultos machos mantidos em biot rio espec fico com ciclo claro escuro de 12 horas temperatura de 22 2 C e umidade de 60 80 com livre acesso a gua e ra o Pelo menos dois dias antes dos experimentos transferir os animais para o biot rio do setor onde os procedimentos ser o realizados para adapta o Todos os experimentos com animais devem seguir obrigatoriamente as atribui es e compet ncias definidas na Lei 11 794 08 e em resolu es do Conselho Nacional de Controle em Experimenta o Animal CONCEA Antes da realiza o de qualquer procedimento o protocolo incluindo a identifica o das subst ncias ou extratos a serem testados e suas doses devem ser submetidos an lise da Comiss o de tica para o Uso de Animais CEUA da institui o Os m todos de anestesia e eutan sia sugeridos aqui est o de acordo com o NIH Guide for the Care and Use of Laborato
312. nal ticas digitais deve se proceder da seguinte maneira ap s a balan a estar estabilizada e zerada coloca se um recipiente de pesagem adequado vidro de rel gio ou frasco de pesagem sobre o prato da mesma Procede se a taragem da balan a que o procedimento de descontar a massa do recipiente Ap s com o aux lio de uma esp tula adequada vai se colocando no recipiente pequenas por es do reagente a ser pesado at atingir a massa desejada Este procedimento deve ser feito de forma lenta e com todo o cuidado pois qualquer quantidade de reagente que por descuido cair no prato da balan a fora do recipiente vai gerar um erro de pesagem Etapas de pesagem por adi o Antes de iniciar o processo de pesagem verifique se o prato da balan a est limpo e se a balan a est zerada As etapas envolvidas na utiliza o de uma balan a anal tica s o Ligar a balan a apertando no bot o ON Zerar a balan a apertando na tecla TARE Introduzir o recipiente de pesagem sobre o centro do prato da balan a Fechar as portas laterais da balan a e tare a balan a bot o TARE com o recipiente no qual vai ser colocado o material a ser pesado Adicionar o material sobre o recipiente Fazer a leitura da massa do material diretamente no mostrador cuidando para que as portas laterais da balan a estejam fechadas 1 15 2 Pesagem por diferen a Consiste em retirar de um recipiente pesa filtro o valor a ser pesado
313. ncia FAM e iii amostras de heterozigotos exibir o as duas fluoresc ncias VIC e FAM Embora o funcionamento do software de an lise dos resultados varie conforme o modelo do equipamento de PCR em tempo real utilizado basicamente os resultados podem ser visualizados de duas maneiras 1 Allelic Discrimination Plot Gr fico com o resultado final da rea o Exibe a classifica o das amostras nos tr s gen tipos poss veis do SNP analisado Clicando sobre os po os individuais da placa poss vel identificar a amostra no gr fico e vice versa Mater Re 2550508 Cat Abie DEBE Allelic Discrimination Biotecnologia 2 Amplification Plot Permite a visualiza o individual de cada amostra durante o ciclo da PCR Oexemplo abaixo corresponde a uma amostra heterozigota detec o das duas fluoresc ncias durante a amplifica o 060 A 4 040 Deita Rn 12345 6 7 FSGFwHMWnwzswesewevwTwewrAanraAawmeasawaAABANBDNRBMHBAMNBBAMN Cycle Number CAPITULO 4 ANALISES FISIOLOGICAS EM AMOSTRAS VEGETAIS E ANIMAIS Adriane Pozzobon Andressa Dametto Bruna Caye Claudia Stein Dalana Faleiro D bora Mara Kich Edina Aparecida dos Reis Blasi Eduardo Cremonese Filippi Chiela Giseli Buffon Isabel Cristina Gouv a de Borba Luciana Knabben Oliveira Becker Delving Marcia Ines Goettert Mardja Manssur Bueno e Silva Raul Antonio Sperotto Ronize Zeni da Silva Vinici
314. ne a armazenada por longo per odo Quando somente uma pequena quantidade de meio necess ria ou quando o meio utilizado com pouca frequ ncia recomendado pesar e dissolver diretamente os reagentes para cada preparo As solu es estoque que comp em o meio MS principalmente macro e micronutrientes denominam se A B C D E e F O processo de pesagem dos elementos b sicos dessas solu es realizado uma nica vez para a prepara o escalonada de dezenas de litros seguindo as concentra es indicadas na tabela 1 Tabela 1 Componentes de cada uma das solu es estoque do Meio MS com as respectivas quantidades para as concentra es de 10 e 100 X Solu o Componentes Sol estoque conc 100 X mg L Sol estoque conc 10 X mg L7 A NH NO 165000 16500 B KNO 190000 19000 HBO 620 62 KH Po 17000 1700 C KI 83 8 3 Na MoO 2H O 25 2 5 CoCl 6H O 2 5 1 25 D CaCl 2H O 44000 4400 MgSO 7H O 37000 3700 MnSO 4H O 2230 223 E ZnSO 7H O 860 86 CuSO 5H O 2 5 1 25 Na EDTA 2H O 3720 372 F FeSO 7H 0 2780 278 Passos a serem seguidos para o preparo das solu es estoque do Meio MS volume de um litro 1 Para a dilui o dos componentes deve ser utilizada gua destilada 2 Os reagentes devem apresentar a m xima pureza poss vel 3 A quantidade de cada componente para o preparo de um litro de solu o estoque depende da concentra o a ser escolhida e deve ser s
315. neessecesecesees 36 1 11 UTILIZA O DE EVAPORADOR ROTAT RIO ROTAEVAPORADOR o ssssssssssssssssesssesssesssseessessscessecsssecssecessee 37 1 12 TRANSFERENCIA DE LIQUIDO Si 38 1 13 TRANSFER NCIA DE S LIDOS ig 39 LAE ONI CONSE TE PGA EMA iii a 40 Tae MIE OOS DE RES A EIA ga 43 o MEDIDAS D 200 N OIV i Sa 45 1 17 PROCESSO DE SEPARA O POR FILTRAGAO csccssesssessssssssssecsnssssessscssessnsesscssscsuessscsuecsssesscssecsucssscsneesscsscsseesseenes 50 1 18 PROCESSO DE SEPARA O POR CENTRIFUGAGAO W eecsssessssssssssessssssesssessscsssesucssscsuscsscssscssessusssscsuscsscssecseeesneeses 52 1 19 PROCESSO DE SEPARA O POR PRECIPITA O wc csssessssssesssesssssssesssessessusssscssscsucssscsuscsssssscsvecsuscsscsuscsessseesecssseeees 53 1 20 PROCESSO DE SEPARA O POR DECANTA O w vcsssessssssssssessssessessscssessssesscsssesucssscsuscssecsecsuessucssscanscsesssscsecssseeees 54 1 21 T CNICAS DE PREPARO DE SOLU ES cscsssssssnssssnsccsnnessanessensccensestnsssenssssanessansssansecenssceauscenssceanscenseessanesenseseasescs 55 CAP TULO 2 EXTRA O E QUANTIFICA O DE CIDOS NUCLEICOS E PROTE NAS 58 2 1 EXTRA O DE DNA HUMANO A PARTIR DE SANGUE PERIF RICO M TODO DE SALTING OUT 59 22 EXTRA O DE DNA DEAMOSTRAS VEGETA IS viistiecstsieccisscsecesnscsvenvcen csnsedivuces estsncssscnctos loves Gonsvepveustueebssiuceuscdedecnes 62 2 3 EXTRACAO DE DNA DE BACT RIAS ENDOF TICAS DE RAIZ ccccsessssecscsess
316. nformar sobre a cin tica e o tipo de les o a ser reparada embora n o permita que se possa inferir com fidedignidade no processo de reparo Singh et al 1988 Teste Cometa c lulas em suspens o Preparo das solu es PBS 10X Phosphate Buffer Solution pH 7 4 80 0 g de NaCl 2 0 g de KCI 21 7 g de Na HPO 7H O fosfato de s dio dib sico 2 0 g de KH PO dihidrogenofosfato de pot ssio a Em um b quer com capacidade de 1000 mL ou mais juntar todos os reagentes NaCl KCI Na HPO 7H O e KH PO b Adicionar aproximadamente 400 mL de gua destilada e dissolver os reagentes utilizando um bast o de vidro c Ajustar o pH para 7 4 com NaOH 10 M d Completar at 1 litro com gua destilda Solu o de Lise 146 1 g de NaCl 2 5 M 37 2 g de EDTA 100 mM 1 2 g de Tris 10 mM NaOH aproximadamente 7 0 g a Pesar e juntar os reagentes NaCl EDTA Tris b Adicionar aproximadamente 400 mL de gua destilada e mexer com o bast o de vidro c Adicionar parte das 7 0 g de NaOH s lido e mexer com bast o de vidro caso seja necess rio adiciona se o restante de NaOH os reagentes s dissolvem com o pH pr ximo a 10 0 d Ajustar o pH entre 10 0 e 10 5 e Completar com gua destilada at 890 mL f Guardar em temperatura ambiente protegida da luz Solu o de lise uso 89 mL da solu o de lise estoque 10 mL de DMSO 1 mL de Triton X 100 Refrigerar por 60 minutos antes do uso Ta
317. niza o 1 3 3 gua Deionizada Este processo consiste na passagem da gua em colunas contendo resinas trocadoras de ons troca cati nica e ani nica A troca cati nica captura os c tions dissolvidos na gua liberando ons Hr J na troca ani nica a resina absorve os anions dissolvidos na gua liberando ons OH Estas resinas com o passar do tempo tornam se saturadas de ons das impurezas da gua Este momento detectado por um pequeno condutiv metro embutido no deionizador Ap s um processo de renova o ou reciclagem estas colunas podem ser reaproveitadas no deionizador 1 3 4 gua ultrapura gua ultrapura uma gua de extrema pureza isenta de part culas ons e subst ncias org nicas ou micro organismos obtida pela passagem da gua por sistemas de abrandamento como resinas trocadoras que substituem o c lcio e o magn sio dissolvido na gua por ons de S dio seguido de sistema de osmose reversa que faz a remo o desses ons seguido de um refinamento por uma s rie de filtros constitu dos de resinas cati nicas e ani nicas um leito de carv o ativo para remo o de contaminantes org nicos e finalmente um filtro f sico para remo o de particulados usado em laborat rios anal ticos onde se requer uma gua de alt ssima pureza como por exemplo nas an lises por HPLC Refer ncias MABIC S Maintaining water quality in clinical chemistry Advance for Medical Laboratory Prof
318. nosidade 1 Preparar a Solu o de Lise Final envolver com papel laminado e deixar 60 minutos na geladeira antes de iniciar o processo 2 Envolver os tubos de coleta com papel laminado 3 Realizar a coleta de sangue total 4 Tratar as amostras sangue total com o extrato e com o controle positivo etil metanosulfonato EMS em concentra es pr determinadas Concentra o do agente teste Quando o agente teste estudado desconhecido recomenda se que as concentra es testadas n o ultrapassem 0 01M 5 mg mL ou 5 pl mL OECD 2009 Exemplo Concentra o final do EMS 200 pg mL Concentra o dos extratos Solu o estoque 20 000 pg mL Concentra o final dos extratos 200 100 50 e 25 ug mL Usar a seguinte f rmula para os c lculos das dilui es C1xV1 C2xV2 1 Pipetar 500 uL de cada amostra tratada em placas contendo 24 po os 2 Envolver a placa com papel laminado 3 Armazenar em estufa a 37 C durante 3 horas exposi o ao agente mutag nico de 3 a 5 horas 4 Dissolver a agarose Low Melting Point em microondas e deixar em banho Maria 40 C 5 Pipetar 5 uL de cada amostra tratada e dispensar em um microtubo 6 Pipetar 85 uL de agarose LMP e dispensar no mesmo eppendorf das amostras tratadas e ao mesmo tempo repipetar a mistura 7 Colocar a amostra na l mina com pr cobertura cobrindo com lam nula 8 Colocar as l minas em c mara mida por 10 minutos na geladeira
319. nta ao medicamento 5 ed Porto Alegre 2004 Anexo 1 Ficha de avalia o para o screening fitoquimico Screening fitoqu mico Planta Data Respons vel Caracter stica confirmat rias Positivo Negativo Compostos piece or Aparecimento ou intensifica o da cor amarela ou laranja fen licos Taninos hidrolis veis desenvolvimento de colora o azulada Taninos Taninos condensados desenvolvimento de colora o verde Flavonas desenvolvimento de colora o laranja Flavon ides Flavanonas desenvolvimento de colora o viol cea Flavon is desenvolvimento de cor vermelha Cumarinas Cumarinas vol teis fluoresc ncia azul e amarela Antraquinonas desenvolvimento de colora o vermelha Naftoquinoides desenvolvimento de colora o viol cea Quinonas Benzoquinoides desenvolvimento de colora o azul Quinonas glicos dicas desenvolvimento de colora o vermelha na fase aquosa Desenvolvimento de espuma com altura superior a 1 cm e Saponinas persist ncia da mesma ap s repouso de 15 minutos e adi o de cido clor drico 10 Alcaloides Aparecimento de um precipitado D gt cm CAPITULO 8 CULTURA DE CELULAS ANIMAIS Adriane Pozzobon Bruna Caye Dalana Faleiro D bora Mara Kich Marcia Ines Goettert 8 1 CULTURA E MANIPULACAO DE LINHAGENS CELULARES Linhagens celulares podem ser conservadas por criopreserva o para posterior
320. nta similaridade 8 Na se o Descriptions s o mostradas as sequ ncias que apresentam similaridade e os dados que quantificam essa similaridade Dentre eles importante observar os seguintes Query coverage indica qual porcentagem da sequ ncia de interesse coberta pelo alinhamento com cada sequ ncia do banco lembre se que por se tratar de um alinhamento local muitas vezes apenas uma regi o de ambas as sequ ncias ser o alinhadas E value indica a probabilidade de encontrar aquele alinhamento de maneira aleat ria ou seja quanto menor o valor maior a confian a sendo o E value 0 o mais confi vel e Identity indica quantos amino cidos id nticos s o encontrados apenas na regi o que foi alinhada Dica dependendo do tipo de alinhamento feito um E value aceit vel pode variar Por exemplo se estamos alinhando sequ ncias de um organismo que apresenta grande n mero de sequ ncias depositadas no banco como humanos camundongo mosca da fruta ou arroz esperamos encontrar E value baixos pr ximo a zero J no caso de buscarmos sequ ncias obtidas a partir de um organismo que n o possui muitas sequ ncias no banco em geral iremos encontrar sequ ncias de outros organismos que apresentam similaridade mas n o s o id nticas Portanto nesse caso esperamos E value mais alto 1e1 por exemplo 9 Na se o Alignments poss vel ver os alin
321. nto para a investiga o da fisiopatologia de doen as nfase ser dada aos modelos de doen as tromboemb licas e inflamat rias D gt cm 14 1 MODELO DE TROMBOSE VENOSA LOCAL Neste protocolo o processo de trombose venosa induzido localmente na veia cava inferior de ratos por uma combina o de estase mec nica e est mulo pr coagulante A forma o de trombo induzida tanto pelo estreitamento da veia cava estase quanto pela inje o de um agente que dispara a cascata de coagula o sangu nea tromboplastina As principais aplica es s o para a avalia o dos efeitos anticoagulantes e antitromb ticos de diferentes f rmacos extratos ou compostos isolados de plantas ou ainda para estudar o papel de diferentes prote nas c lulas plaquetas e outros mediadores do processo de hemostasia Animais S o utilizados ratos adultos machos da linhagem Wistar 200 250 g mantidos em biot rio espec fico com ciclo claro escuro de 12 horas temperatura de 22 2 C e umidade de 60 80 com livre acesso gua e ra o Pelo menos dois dias antes dos experimentos transferir os animais para o biot rio do setor onde os procedimentos ser o realizados para adapta o Todos os experimentos com animais devem seguir obrigatoriamente as atribui es e compet ncias definidas na Lei 11 794 08 e em resolu es do Conselho Nacional de Controle em Experimenta o Animal CONCEA Antes da realiza o de qualquer procedi
322. ntr fuga e levados a um banho de gua a 85 C por 15 minutos A seguir as amostras devem ser centrifugadas a 3000xg por 40 minutos Ap s a centrifuga o o volume de leo separado em cada amostra deve ser transferido para uma proveta graduada e efetuada a leitura A diferen a entre a quantidade de leo medido e a quantidade de leo adicionado expressa como a quantidade de leo emulsificado por grama de prote na contida na amostra e deve ser calculada da seguinte forma CE quantidade de leo emulsificado mL massa de prote na g 7 11 2 Capacidade de reten o de leo CRO A capacidade de reten o do leo determinada a partir da quantidade que a amostra tem a capacidade de absorver certa quantidade de leo O mecanismo de reten o de absor o de leo atribu do liga o f sica do leo Observa se que quanto maior for a densidade da prote na maior ser a absor o do leo devido ao car ter hidr fobo da prote na Equipamentos Balan a anal tica Chapa com agita o magn tica Barra magn tica Centr fuga Vidrarias utens lios e outros Proveta 50 mL Tubos de centr fuga Becker 50 mL Proveta Reagentes leo vegetal Procedimento Pesa se 1 g de prote na e mistura se com 20 mL de leo vegetal de soja e agita se por 10 minutos em agitador magn tico A seguir a mistura deve ser centrifugada a 9000xg por 15 min em centr fuga e o volume de leo n o absorvido medido e
323. ntre as duas pontas De uma das pontas do papel rasga se um pequeno tri ngulo irregular para facilitar a ades o do papel ao funil Em seguida abre se o papel de tal maneira que adquira a forma de um cone e coloca se no funil de modo que o corte no papel fique aderido ao vidro A Figura 19 mostra o procedimento do uso do papel filtro Figura 19 Uso do papel filtro para filtra o simples Suporte Jj Solu o a filtrada Fonte Filtra o 2014 Umedece se o papel com uma pequena quantidade do solvente com que se est trabalhando de modo a se obter uma boa ader ncia Para uma r pida filtra o o papel deve ser ajustado no funil de modo que o ar n o penetre entre o papel e o funil O di metro do papel de filtro utilizado deve ser tal que sua parte superior deve estar a 1 cm abaixo da borda do funil de vidro A transfer ncia feita com o aux lio de um bast o de vidro recolhendo se o filtrado em um b quer A extremidade inferior da haste do funil deve ser encostada na parede interna do b quer usado no recolhimento do filtrado Deve se manter durante toda a filtra o o n vel de solu o a da altura do papel de filtro no funil Os ltimos tra os do s lido s o transferidos para o papel de filtro com o aux lio de jatos de solvente utilizando um frasco lavador Lava se o s lido com pequenas por es do solvente 1 17 2 Filtra o por suc o O processo de separa o pode ser acelerado por meio de uma
324. nts via modulation of antioxidative capacity and stomatal response Tree Physiology 30 914 922 4 10 PREPARACAO DO TAMPAO FOSFATO DE POTASSIO K HPO 10 mM 0 01 M PH 7 8 O tamp o Fosfato de Pot ssio necess rio para dissolver os reagentes utilizados no m todo de localiza o histoqu mica in situ de esp cies reativas de oxig nio Para o ajuste de seu pH utiliza se a solu o descrita abaixo Solu o de KH PO fosfato de pot ssio monob sico Verificar a molaridade do KH PO Pesar o necess rio para a quantidade de mL s que se deseja preparar Exemplo para preparar 500 mL 0 5 L a 10 mM 0 01 M PM g 1M 1L 136 09 g 1L X 0 5 L H O destilada X 136 09 gx 0 5 X 68 05 g KH PO Logo PM g 1M 1L 68 05 g 1M X 0 01 M X 68 05 g x 0 01 X 0 68 g de KH PO em 500 mL de H O destilada Em seguida misturar at dissolver por completo e reservar Tamp o Fosfato de Pot ssio K HPO 10 mM 0 01 M pH 7 8 Verificar a molaridade do K HPO fosfato de pot ssio dib sico Pesar o necess rio para a quantidade de mL s que se deseja preparar Exemplo para preparar 500 mL 0 5 L a 10 mM 0 01 M PM g 1M 1L 174 18 g 1L X 0 5 L H O destilada X 174 18 g x 0 5 X 87 09 g K HPO Logo PM g 1M 1L 87 09 g 1M X 0 01 M X 87 09 g x 0 01 X 0 87 g de K HPO em 500 mL de H O destilada Em seguida misturar at dissolver por completo Medir o pH do Tamp o Fos
325. o 1 Em 100 mL de gua destilada adicionar 100 uL de brometo de et dio a 1 mg mL formando uma solu o com concentra o 1 pg mL 2 Adicionar 300 mL de hipoclorito de s dio a 2 5 na solu o preparada 3 Manter sob agita o leve por quatro horas em temperatura ambiente 4 Manter a solu o em repouso por tr s dias 5 Passado o repouso medir o pH da solu o ajustando a para 6 8 com hidr xido de s dio NaOH 6 Expor a solu o descontaminada luz UV Caso o brometo de et dio esteja totalmente inativo este n o produzir fluoresc ncia podendo ent o ser descartado sem causar danos ao ambiente Caso haja fluoresc ncia encaminhar para incinera o Refer ncias KAUFMAN J A Waste Disposal in Academic Institutions Chelsea Lewis Publishers 1990 LUNN G SANSONE E B Ethidium Bromide destruction and decontamination of solutions Analytical Biochemistry London 162 453 458 1987 17 2 ACRILAMIDA Elimina o de Res duos Para grandes volumes encaminhar para ser queimado em um incinerador qu mico com p s queimador e lavador de gases Quando em pequenas quantidades e em solu o a acrilamida pode ser hidrolisada neutralizada e descartada T cnica para Descontamina o de Acrilamida em solu o Precau es 1 Usar culos luvas nitr licas e vestu rio de prote o 2 Trabalhar em capela de exaust o h libera o de am nia Procedimento 1 Em um b quer de
326. o Leia sempre pela parte inforior do menisco qa Fonte Busato 2014 Biotecnologia Quando feita a aquisi o de aparelhos volum tricos estes j v m com a gradua o calibra o feita pelo pr prio fabricante E recomend vel entretanto verificar a corre o desta gradua o aferi o no laborat rio onde ser o utilizados Atualmente existem empresas especializadas e credenciadas para a execu o desta tarefa de acordo com normas exigidas para credenciamento de laborat rios e com crit rios de qualidade Normas ISO Neste sentido deve se tamb m considerar as garantias de qualidade apresentadas pelo pr prio fabricante que fator relevante na hora da escolha de um fornecedor A medida de l quidos com qualquer aparelho est sujeita a uma s rie de erros devido s seguintes causas dilata o e contra o provocados pelas varia es de temperatura imperfeita calibra o dos aparelhos volum tricos Refer ncias BUSATO Germano Luis Ferrari Dispon vel em lt http followscience com content 368927 medidas e volumes gt Acesso em 30 mar 2014 CHRISPINO Alvaro Manual De Quimica Experimental S o Paulo Editora Atica 2 Edi o 1994 230 p CIENFUEGOS Freddy Seguran a No Laborat rio Rio De Janeiro Interci ncia 2001 269 p LENZI Ervim et al Qu mica Geral Experimental Rio De Janeiro Freitas Bastos 2009 390 p POSTMA James M ROBERTS Julian L HOLLENBERG
327. o suficientemente pura tornando se necess rio preparar gua destilada por processos especiais A gua destilada obtida por meio da ebuli o da gua da torneira e condensa o do vapor livre dos constituintes n o vol teis como os ons s dio pot ssio c lcio magn sio ferro cloreto sulfato carbonato silicato etc Uma parte por m destes constituintes pode ser arrastada mecanicamente durante a destila o Os constituintes vol teis originariamente presentes na gua como o di xido de carbono e a am nia ou que se formaram durante a destila o em consequ ncia da decomposi o de mat ria org nica acompanham a gua no processo de destila o Outra fonte de contamina o a constitu da pelos materiais de que s o fabricados os aparelhos Se o condensador for por exemplo de vidro a gua destilada ser contaminada em virtude da a o dissolvente que o vapor exerce sobre este material Quando se faz uso de condensadores de cobre a gua conter tra os deste material que pode ser altamente prejudicial em certos casos principalmente se a presen a do cobre capaz de exercer uma a o catal tica Os melhores materiais para a constru o dos condensadores s o o estanho e o quartzo A gua destilada armazenada em frascos de vidro mesmo tratando se de vidro resistente sofre contamina o apreci vel Em muitos casos utiliza se mais de uma destila o da gua destilada seguida de processos de deio
328. o cido l tico m massa da amostra na al quota em gramas ou em mL C lculo para manteiga Solu o alcalina normal SAN V x f x 100 m Onde V volume da solu o de hidr xido de s dio 0 1 N gasto na titula o em mL f fator de corre o da solu o de hidr xido de s dio 0 1 N m massa da gordura em gramas Dica algumas das amostras n o apresentam colora o r sea n tida no fim da titula o devido as suas caracter sticas pr prias de cor opaca ou escura por isso aconselh vel trabalhar em ambiente claro e colocar um papel branco embaixo da bureta durante a titula o dessa forma facilitando a visualiza o da viragem Refer ncias BRASIL Minist rio da Agricultura Secretaria Nacional de Defesa Agropecu ria Laborat rio Nacional de Refer ncia Animal M todos anal ticos oficiais para controle de produtos de origem animal e seus ingredientes m todos f sicos e qu micos Bras lia DF 1981 v II cap 18 p 2 cap 15 p 4 5 cap 21 p p 4 5 cap 17 p 5 MERCK Reactivos diagn stica productos qu micos 1992 93 Darmstadt 1993 1584 p RICHARDSON G H Dairy products In HELRICH K Ed Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists food composition additives natural contaminants 15th ed Arlington Association of Official Analytical Chemists 1990 v 2 cap 33 p 805 WOOLLEN H Ed Food Industries Manual 20 th ed New Iork1 Chemi
329. o abdominal e antissepsia com algod o embebido em lcool iodado 1 5 Proceder a incis o do abdome afastar a parede antero lateral com as pin as hemost ticas e rebater o intestino grosso para o lado direto do animal a fim de expor a veia cava inferior Manter a regi o do intestino permanentemente hidratada com gaze embebida em PBS 37 C durante todo o procedimento 6 Localizar a veia cava inferior pr ximo s veias renais e com o aux lio das pin as retas e dente de rato dissec la cuidadosamente at a regi o de conflu ncia das veias il acas comuns isolando a do tecido conjuntivo adjacente e da aorta abdominal 7 Com o aux lio da pin a simples curva passar os fios de nylon 4 0 pelas tribut rias de maior calibre e pela veia renal esquerda deixando n s frouxos sem que haja obstru o do fluxo sangu neo para posterior ligadura 8 Com o aux lio da pin a simples curva passar um fio de nylon 4 0 na extremidade cranial ou superior da veia cava imediatamente abaixo da veia renal direita e outro fio na extremidade caudal ou inferior da veia cava pr ximo regi o de conflu ncia das veias il acas comuns Manter os n s frouxos sem que haja obstru o do fluxo sangu neo para posterior ligadura 9 Administrar a subst ncia a ser testada ou PBS no caso dos animais do grupo controle por via intravenosa diretamente na veia cava inferior pr ximo s il acas O volume m ximo a ser injetado deve ser de 0 5 mL
330. o da fia o tomadas e plugues compatibilidade da voltagem do aparelho com a da rede el trica aterramento condi es da superf cie de contato com o aparelho n o deve estar mida e da exist ncia de produtos inflam veis na proximidade Colocar os lixos seco org nico contaminado t xico vidros etc em recipientes adequados N o jogar na pia ou local indevido Deve se lavar as m o antes de sair do laborat rio Ao sair do laborat rio verificar se as torneiras de gua e g s neste caso inclusive o registro est o fechadas aparelhos desligados e janelas trancadas Refer ncias CHRISPINO lvaro Manual De Qu mica Experimental S o Paulo Editora tica 2 Edi o 1994 230 Pp CIENFUEGOS Freddy Seguran a No Laborat rio Rio De Janeiro Interci ncia 2001 269 p LENZI Ervim et al Qu mica Geral Experimental Rio De Janeiro Freitas Bastos 2009 390 p PAVIA Donald L et al Qu mica Org nica Experimental T cnicas De Escala Pequena Porto Alegre Bookman 2009 880 p POSTMA James M ROBERTS Julian L HOLLENBERG Leland Quimica No Laborat rio Barueri SP Manole 5 Edi o 2009 546 p ROSA Gilberto GAUTO Marcelo GON ALVES F bio Qu mica Anal tica Pr ticas De Laborat rio Porto Alegre Bookman 2013 128 p UNIFEB Apostila de Qu mica Geral e Experimental 2009 Dispon vel em lt http xa yimg com kq groups 24693296 1821154571 name UNKNOWN PARAMETER VALUE gt Aces
331. o de merthiolate incolor Homogeneiza se bem e leva se a banho maria a 37 C por 3 horas com agita o peri dica Decorrido este tempo os tubos contendo as amostras devem ser resfriados e a solu o ajustada a pH 8 0 com uma solu o de NaOH 0 2 N utilizando um pHmetro Prepara se tamb m uma solu o de 0 5 mg de pancreatina por mL de tamp o fosfato pH 8 0 Adiciona se 10 mL da solu o de pancreatina ao produto hidrolisado pela pepsina e leva se novamente ao banho maria a 37 C por m por 24 horas com agita o peri dica Ap s o tempo de hidr lise adiciona se 5 mL de uma solu o de tricloro ac tico 5 amostra e centrifuga se por 15 minutos a 5000 xg para separa o do material insol vel sendo o filtrado recolhido para posterior determina o do nitrog nio digerido pelo m todo de Kjeldhal A digestibilidade in vitro expressa como a porcentagem de nitrog nio digerido em rela o ao nitrog nio total na amostra inicial sendo calculada da seguinte forma Digestibilidade Nitrog nio digerido x 100 Nitrog nio total Refer ncias A O A C Official Methods of Analysis Association of Official Analytical Chemists 18 edition v 1 2 USA 2005 ARA JO J M Qu mica de alimentos teoria e pr tica 4 ed Vi osa UFV 2008 596 p BALTI R et al Comparative study on biochemical properties and antioxidative activity of cuttlefish Sepia officinalis protein hydrolysates produced by alcalase
332. o fresca e manter por 20 minutos no escuro 3 8 Lavar com gua 2 x por 20 segundos 3 9 Adicionar solu o de revela o at surgirem as bandas 3 10 Parar a revela o com cido ac tico 1 1 mL em 99 mL gua Solu o de colora o 0 1g Nitrato de prata 38 mL Formalde do 37 50 mL H O destilada utilizar luvas para manipular a prata Solu o de revela o 3g Carbonato de s dio 25 pL Formaldeido 37 1mL Tiossulfato de s dio 0 02 49 mL H O destilada Biotecnologia 6 3 IMUNOIDENTIFICACAO DE PROTEINAS POR WESTERN BLOTTING A t cnica de Western Blotting baseia se na transfer ncia de proteinas separadas previamente por eletroforese em gel de poliacrilamida por indu o de carga el trica para uma matriz n o porosa tipicamente membranas de nitrocelulose ou PVDF polyvinylidene difluoride Nesta matriz as prote nas s o marcadas por anticorpos contra a prote na de interesse podendo ser quantificada por quimiluminesc ncia ou rea o cromog nica O presente protocolo est otimizado para uso do TransBlot Turbo da Bio Rad Western Blotting preparo de solu es Antes de iniciar o experimento preparar as seguintes solu es 1 Solu o de Tamp o de transfer ncia Towbin pH 8 3 1L Tris 0 025 M 3 0285 g do produto Glicina 0 192 M 14 4134 g do produto 20 de Metanol 200 mL do produto Em um b quer homogeneizar o Tris e a Glicina com agitador magn tico em 700 mL de gu
333. o mais comum devido ao pre o e a grande variedade de formatos contudo tem limita es quanto ao ataque por subst ncias corrosivas Figura 3 6 Figura 3 Utens lios met licos de uso em laborat rio de qu mica e reas afins Q S N h 3 i AOS 6 Fonte Blog de vidraria de laborat rio 2014 1 2 4 Materiais Diversos Suporte ou estante tubo para ensaios Figura 4 1 Pisseta frasco pl stico geralmente contendo gua destilada ou outro solvente usado para efetuar a lavagem dos recipientes com jatos de liquido nela contido Figura 4 2 Tela de amianto Tela met lica contendo amianto utilizada para distribuir uniformemente o calor durando o aquecimento de recipientes de vidro chama de um bico de g s Figura 4 3 Pin a de madeira ou prendedor utilizado para segurar tubos de ensaio Trompa d gua dispositivo para aspirar o ar e reduzir a press o no interior de um frasco Figura 4 4 Estufa utilizada para a secagem de materiais por aquecimento em geral at 200 C Figura 4 5 Mufla ou forno utilizado para calcina o de subst ncias por aquecimento em geral at 1000 ou 1500 C Figura 4 6 Pipetador tipo p ra usado em conjunto com uma pipeta ajuda a puxar e expelir pequenos volumes de l quido Figura 4 7 Manta aquecedora equipamento usado juntamente com um bal o de fundo redondo uma fonte de calor que pode ser regulad
334. o microsc pios A manipula o desse equipamento dever ser feita no interior da c mara de fluxo est ril a qual dever passar por uma pr via desinfesta o visando se com isso evitar a introdu o de in culos e consequentemente a contamina o dos explantes 5 Como forma de auxiliar na manuten o da assepsia do laborat rio algumas regras devem ser respeitadas A principal delas a restrita utiliza o dos equipamentos e utens lios do laborat rio ou seja todo material utilizado para os trabalhos com cultivo de tecidos n o deve ser manipulado para outras finalidades 6 Outra pr tica que favorece a manuten o da assepsia o uso obrigat rio de aventais limpos os quais n o devem ser retirados do laborat rio Em algumas situa es em que a casa de vegeta o pr xima ao laborat rio recomenda se o uso de aventais espec ficos para cada ambiente 7 Durante dias chuvosos ou com elevada umidade relativa no ar os riscos de introdu o de microrganismos no laborat rio s o potencializados Uma forma de evit los restringir ao m ximo a circula o de pessoas no laborat rio durante esses per odos principalmente naqueles laborat rios abertos visita o 8 Quando terminada a incuba o os explantes devem ser mantidos em salas de crescimento Figura 2 onde devem prevalecer a condi es descritas a seguir SR 7 Chas Figura 2 A Explante com brota o na sala de crescimento Este foi inc
335. o pente estas podem ser removidas com o aux lio de uma ponteira 10 Aguardar a polimeriza o em torno de 30 minutos para desenformar o gel 11 Posteriormente ao preparo do gel proceder a pipetagem das amostras no gel 12 Cortar um peda o de parafilm e pipetar 5 uL de tamp o de corrida conforme o n mero de amostras 13 Pipetar 7 uL de amostra em cada bolinha de tamp o de corrida 14 Aspirar a mistura e pipetar a amostra no po o do gel Dica sempre reservar o primeiro po o para o marcador de peso molecular Pipetar entre 1 e 2 pL Pipetar lentamente cuidando para n o furar o gel e verificando se o tamp o da cuba de eletroforese cobre todo o gel principalmente os po os 15 Fechar a cuba conectar os eletrodos e ligar a fonte a 100 mV 300mA por aproximadamente 1 hora o tempo depende do fragmento a ser analisado e da concentra o do gel de agarose 16 Visualizar a amplifica o no transluminador luz UV ObservacGes Preparo do tamp o TBE 10X Para 1 litro Pesar 55 g de cido b rico 108 g de TRIS e 9 25 g de EDTA Dissolver os sais em parte da gua Milli Q aproximadamente 600 mL Ap s dissolver acrescentar o restante da gua 400 mL Verificar o pH deve estar entre 8 e 9 Distribuir em duas garrafas de meio litro e autoclavar Dica se o pH n o estiver entre 8 e 9 desprezar o tamp o e refazer pois o pH n o deve ser ajustado Para preparar a solu o TBE 1X diluir 100 mL de TBE
336. o transfectadas Refer ncias KABEYA Y Mizushima N Ueno T Yamamoto A Kirisako T Noda T Kominami E Ohsumi Y Yoshimori T 2000 LC3 a mammalian homologue of yeast Apg8p is localized in autophagosome membranes after processing EMBO J 19 5720 5728 MIZUSHIMA N Yoshimori T Levine B 2010 Methods in mammalian autophagy research Cell 140 313 326 D gt cil 4 21 AVALIA O DO NDICE MIT TICO PARA INFERENCIA DE PROLIFERA O CELULAR Este protocolo se baseia na marca o de DNA celular in situ com uma mol cula fluorescente DAPI ou Iodeto de Prop deo e determina o da porcentagem de figuras mit ticas em uma determinada condi o por meio de observa o direta em microscopia de fluoresc ncia M todo de Tarnowski et al 1993 Protocolo referente placa de 24 po os Os volumes podem ser ajustados de maneira diretamente proporcional conforme o tipo de placa Ex placa de 6 po os volumes 4x maiores placas de 12 po os volumes 2x maiores 1 Plaquear 2 x 10 c lulas em placa de 24 po os e realizar o tratamento de interesse Dica deve se evitar uma conflu ncia acima de 70 ao final do experimento principalmente no controle pois isso dificulta a contagem das figuras mit ticas Em fun o disso pode se alterar o n mero inicial de c lulas dependendo do desenho experimental e da prolifera o celular 2 Retirar o meio e lavar os po os 3x com PBS 1x Dica adicionar e retirar o PBS vaga
337. ode se injetar ar comprimido dentro dos recipientes para acelerar a evapora o da acetona Caso desejar uma secagem mais r pida pode se enxaguar a aparelhagem com acetona e a seguir deixando a secar ao ar ou na estufa Refer ncias MOURA J A S YOGUI G T Limpeza e prepara o de vidrarias para an lise de compostos org nicos Procedimento Operacional Padr o Organo MAR 2012 05 Revis o n 1 Laborat rio de Compostos Org nicos em Ecossistemas Costeiros e Marinhos Departamento de Oceanografia Universidade Federal de Pernambuco 2012 6p ROSA Gilberto GAUTO Marcelo GON ALVES F bio Qu mica Anal tica Pr ticas de Laborat rio Porto Alegre Bookman 2013 128 p UNIFEB Apostila de Qu mica Geral e Experimental 2009 Dispon vel em lt http xa yimg com kq groups 24693296 1821154571 name UNKNOWN PARAMETER VALUE gt Acesso em 30 mar 14 D gt gt C 1 6 MEDIDAS DE VOLUMES DE LIQUIDOS Para se efetuar medida de volume de liquido sio empregados varios tipos de aparelhos que podem ser classificados de duas maneiras 1 6 1 Aparelhos calibrados para conter um certo volume de liquido Exemplo balao volum trico Figura 4 Figura 4 Bal o volum trico Fonte Dos autores 1 6 2 Aparelhos calibrados para dar escoamento a certo volume de liquido Exemplo pipetas volum tricas e buretas que possuem formato adequado para o escoamento dos l quidos Figura 5 pipetas volum tricas e buretas
338. odos de an lise em laborat rios de biotecnologia agroalimentar e de sa de humana Raul Antonio Sperotto Org Lajeado Editora da Univates 2014 329 p ISBN 978 85 8167 077 5 1 Biotecnologia 2 Pr ticas de laborat rio I Titulo CDU 57 08 Cataloga o na publica o Biblioteca da Univates As opini es e os conceitos emitidos bem como a exatid o adequa o e proced ncia das cita es e refer ncias s o de exclusiva responsabilidade dos autores CURRICULO DOS AUTORES Adriana Ambrosini da Silveira Bi loga doutora em Gen tica e Biologia Molecular UFRGS p s doutoranda do Departamento de Gen tica UFRGS http lattes cnpq br 4636000029112033 Adriane Pozzobon Bi loga doutora em Ci ncias Biol gicas Fisiologia UFRGS professora do Centro de Ci ncias Biol gicas e da Sa de CCBS e do Programa de P s Gradua o em Biotecnologia PPGBiotec do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 5326585242755050 Aline Marjana Pavan Acad mica do curso de Ci ncias Biol gicas do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 0811332135994458 Andressa Dametto Bidloga mestranda do Programa de P s Gradua o em Biotecnologia PPGBiotec do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 1249822214187049 Angela Gerhardt Acad mica do curso de Farmacia do Centro Universitario UNIVATES http lattes cnpq br 0841500995401008 Angela Maria S
339. olu o para o bal o volum trico com aux lio de um funil lavando o b quer o bast o de vidro e o funil com solvente para arrastar todo o soluto cuidando para n o exceder a marca do gargalo 7 Ap s a solu o dilu da fazendo o solvente escoar pelas paredes do bal o at que o l quido chegue extremidade inferior do gargalo Se o gargalo do bal o volum trico estiver com a parte superior da marca molhado este deve ser secado com a ponta de um bast o de vidro envolvida com papel filtro Faz se o ajuste final com o aux lio de uma pipeta de Pasteur ou de um conta gotas lentamente de tal maneira que o menisco fique tangente ao tra o de refer ncia 8 Fechar o bal o e homogeneizar a solu o invertendo v rias vezes o bal o volum trico 9 A seguir transfira a solu o para um frasco apropriado e devidamente etiquetado com o nome do composto a concentra o da solu o identifica o de quem preparou a solu o e data 1 21 1 2 A partir de um reagente l quido soluto l quido ou dilui o de uma solu o previamente preparada Etapas para o preparo de solu es a partir de um soluto l quido 1 Passar gua destilada em todo o material 2 Medir o volume de soluto necess rio com o aux lio de uma pipeta e transferir para um b quer 3 Diluir o soluto utilizando apenas uma parte do solvente e agitando com um bast o de vidro 4 Verter a solu o para o bal o volum trico com aux lio de um funil
340. omo branco adiciona se 1 mL de gua ou tamp o TRIS HC1 0 05 M pH 8 0 ao inv s da amostra 1 10 Incubar por 30 minutos 150 rpm 37 C 1 11 Parar a rea o adicionando 10 mL da solu o de parada 1 12 Adicionar 1 mL fenolftale na indicador de pH 1 13 Titular o cido graxo liberado com o aux lio de uma bureta graduada e calibrada contendo 0 05 M NaOH at obter o primeiro tom de colora o r sea Dicas os frascos dever o ser agitados manualmente enquanto o NaOH gotejado Anotar o volume de NaOH adicionado no primeiro surgimento da cor r sea significante toda solu o dever ficar r sea mesmo que brevemente uma vez que a colora o tende a desaparecer An lise dos Resultados 2 1 Uma unidade lipol tica definida como a quantidade de enzima que libera 1 umol de cidos graxos por minuto sob as condi es descritas acima 2 2 C lculo U V Vo 50 fd 30 Dicas muito importante agitar fortemente pois a cor tende a surgir no microambiente onde for gotejada a base e a quantifica o correta momento de parar de adicionar a base baseada na cor rosa formada na solu o e n o em uma parte da mesma Pode ser usado qualquer leo ou gordura como substrato mas a triole na ou leo de oliva em sua substitui o considerada um padr o para quantifica o de lipases verdadeiras Refer ncias BEYS DA SILVA W O SANTI L BERGER M PINTO A F M GUIMAR ES J A SCHRANK
341. onnell ed Handbook of new bacterial systematics Academic Press London 1993 EDWARDS U ROGALL T BLOCKERL H EMDE M BOTTGER EC Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes Characterization of a gene coding for 165 ribosomal RNA Nucleic Acids Research 17 19 7843 7853 1989 10 6 PRODUCAO DE COMPOSTOS INDOLICOS Compostos ind licos semelhantes ao cido indol ac tico s o de fundamental import ncia para o crescimento e desenvolvimento da planta Horm nios vegetais pertencentes a este grupo aumentam a taxa de forma o de ra zes controlam o processo de crescimento vegetativo tropismo floresc ncia e frutifica o das plantas afetam a bioss ntese de v rios metab litos e aumentam a resist ncia da planta a fatores de estresse M todo baseado em Glickmann e Dessaux 1995 1 Inocular o isolado bacteriano a ser testado em meio KingB modificado l quido por 72 horas a 28 C Meio Composi o Quantidade L Glicerol 15g songh Peptona 20g K HPO 1 15 g MgsO 7H O 1 50 g Triptofano 0 5 g Agua destilada Completar o volume para 1L O pH deve ser ajustado para 6 8 antes de esterilizar 2 Ap s o crescimento da cultura bacteriana aliquotar 1 mL da suspens o bacteriana em um microtubo e centrifugar a 12 000 rpm por 3 minutos 3 Retirar o sobrenadante e adicionar 1 volume de reagente de Salkowsky Solu o Composi o Quantidade FeCl 24g Salkowsky HSO 84 2 mL gua
342. ordar a malha Verter o filtrado na membrana de 150 um Distribuir o filtrado nos tubos Corns n o encher muito 40 mL tubo m x Centrifugar por 10 minutos a 1 500 rpm Desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em solu o de Hank s 15 20 mL homogeneizar e juntar todo o volume de suspens o em um nico tubo em um terceiro tubo Centrifugar por 10 minutos a 1 500 rpm Preparar o filtro de 60 um verificando se a rosca est bem apertada e colocando o em um tubo Corn com um copo de seringa acoplada ao filtro Dica deve se ter o cuidado ao desenrolar o filtro de 60 um pois o papel que o envolve ser utilizado para forrar a base da capela ao abri lo Colocar na capela dois Beckers pequenos com Hank s para lavar a membrana Retirar os tubos da centr fuga e desprezar o sobrenadante Ressuspender o pellet em solu o de Hank s homogeneizar e filtrar com o filtro de 60 Dica o volume de Hank s utilizado dever ser de quatro vezes o tamanho do pellet 25 mL Abrir o filtro sobre o papel alum nio e retirar a membrana com o aux lio de pipetas Pasteur fazendo uma trouxinha Lavar a membrana nos Beckers com solu o de Hank s Colocar a suspens o celular da lavagem da membrana em tubo Corn e centrifugar todos os tubos por 10 minutos a 1 500 rpm Colocar na capela as placas de Petry e em um Becker m dio colocar o meio de cultura de interesse Separar bandejas para colocar placas e garrafas Retirar os tubos da centr
343. orma ao fim do processo podem ser visualizadas bandas que correspondem a fragmentos de DNA de tamanhos distintos Pela utiliza o de corantes fluorescentes como o brometo de et dio que se intercala s mol culas de DNA por exemplo As bandas ficam vis veis sob ilumina o ultravioleta UV Existem diferentes condi es para realiza o da eletroforese Al m do material com o qual se produz o gel pode se variar a concentra o do mesmo o tempo de corrida e a intensidade da corrente el trica O principal fator determinante dessas condi es a diferen a em n mero de pares de bases pb entre os fragmentos a serem separados Portanto para cada protocolo de genotipagem por exemplo h um determinado conjunto de condi es para a realiza o da eletroforese Mais uma vez esse cap tulo n o ir discutir essas condi es espec ficas uma vez que s o altamente vari veis mas faremos algumas considera es t cnicas importantes Considera es t cnicas As t cnicas de eletroforese em gel s o realizadas em cubas preenchidas por uma solu o tamp o l quida onde o gel imerso e pela qual passa a corrente el trica A solu o tamp o geralmente formada por Tris Acido B rico e EDTA TBE 1X e tem como fun o permitir o fluxo de el trons Nota Para a prepara o de 1 litro de TBE 10X dissolve se 55 g de cido b rico 108 g de Tris base e 9 25 g de EDTA em 1 litro de gua Milli Q pH desejado de 8
344. os 1 17 Parar a rea o adicionando 1 5 mL de reagente DNS observando os intervalos estipulados 15 a 30 segundos para que o tempo de rea o 30 minutos seja o mesmo em todos os tubos 1 18 Em seguida ferver por 5 minutos em banho maria e adicionar 17 9 mL de gua destilada 1 19 Resfriar e medir a absorb ncia em espectrofot metro a 550 nm 1 20 Determinar a concentra o de a cares redutores utilizando a curva de calibra o de glicose Dica Se necess rio realizar dilui o da amostra em tamp o citrato fosfato 0 05 M pH 6 0 2 An lise dos Resultados 2 1 Com o aux lio da curva padr o equa o da reta do tipo y Ax b determinar a quantidade mmol de a cares redutores liberada na presen a das amostras 2 2 Converter a quantidade de glicose calculada anteriormente em atividade amilol tica usando a f rmula abaixo C lculo do resultado Atividade amilol tica UmLi min AR 10 fd 30 Onde AR concentra o de a cares redutores na amostra mmol determinada por meio da curva de calibra o de glicose fd fator de dilui o da amostra quando houver Uma unidade de Atividade Amilolitica definida como a quantidade de enzima que libera 1 mmol de a cares redutores por mL de amostra por minuto sob condi es padr es aqui descritas Refer ncias MILLER G L Use of dinitosalicylic acid reagent for the determination of reducing sugar Analytical Chemistry v 31 p 426 42
345. os se a sequ ncia possui em pept deo sinal SP se possui um pept deo de direcionamento mitocondrial e se possui um pept deo de direcionamento de cloroplasto Respostas Yes ou No indicar o a presen a e o tipo de sequ ncia de direcionamento na prote na analisada Predi o de direcionamento subcelular utilizando TargetP A ferramenta TargetP permite a predi o de direcionamento de prote nas para a via de secre o para mitoc ndrias e para cloroplastos 1 Acessar o site http www cbs dtu dk services TargetP Dica para encontrar diretamente digite targetp no Google 2 Colar a sequ ncia na caixa SUBMISSION 3 Selecionar a origem da sequ ncia entre Non plant e Plant 4 Selecionar ou n o a op o Perform cleavage site predictions Esta op o permite a predi o do local de clivagem no caso de a prote na analisada apresentar pept deo de direcionamento N terminal Dica analisar a sequ ncia tanto utilizando quanto n o utilizando esta op o e comparar os resultados 5 Selecionar os cutoffs Na op o no cutoffs a op o que apresentar maior valor ser a selecionada winner takes it all Nas op es specificity gt 0 95 e specificity gt 0 90 poss vel definir a estring ncia da an lise sendo a primeira mais estringente para definir como aceit vel a predi o A quarta op o permite ao usu rio definir os pr prios valores para a es
346. os 15 minutos adicionar 800 pL de TCA 20 a fim de parar a rea o 1 9 Centrifugar os tubos a 10 000 rpm por 5 minutos 1 10 Medir a absorb ncia do sobrenadante em espectrofot metro utilizando o comprimento de onda de 440 nm Dica se a amostra for muito concentrada valor de absorb ncia normalmente maior que 0 9 ou acima do limite m ximo de leitura recomendado do espectrofot metro utilizado diluir a amostra com tamp o 50 mM Tris HCl pH 8 0 2 An lise dos resultados 2 1 O valor de absorb ncia das amostras dever ser multiplicado por 40 Se feita dilui o da amostra este valor dever ser multiplicado tamb m pelo fator de dilui o utilizado 2 2 O resultado deste ensaio definido como Unidades arbitr rias uma vez que o mecanismo de prote lise sobre o substrato pode ocorrer em outros pontos al m do ponto de libera o do grupo azo que resulta na forma o de cor Este substrato utilizando uma prote na complexada com o grupamento azo um dos ensaios para dosagem de atividade proteolitica mais aplicados e pode ser realizado com outras prote nas ao inv s de case na como col geno e queratina por exemplo Refer ncias Sangorrin M P Folco E J Martone C M S nchez J J 2001 Purification and characterization of a proteinase inhibitor from white croaker skeletal muscle Micropogon opercularis International Journal of Biochemistry and Cell Biology 33 691 699 15 2 ATIVIDADE PROTEOLITICA T
347. os nas bandejas com feij o Figura 1 B 4 Manter em sala climatizada a 26 1 C 80 10 UR e fotofase de 12 horas 5 Adi o di ria de 350 ml de gua ao substrato 6 Obter contamina o de aproximadamente 30 esp cimes planta SALA DE CAROS PREDADORES Cria o estoque de caros predadores 1 Coleta do caro predador alvo no campo 2 Triagem utilizando microsc pio tico e montagem de l minas em meio de Hoyer para a identifica o sob microsc pio estereosc pio com contraste de fases 3 Ap s a confirma o de identifica o da esp cie alvo os caros ser o introduzidos nas bandejas de feij o contaminado com aproximadamente 30 caros fit fagos planta Figura 1 C 4 Manter em sala climatizada a 26 1 C 80 10 UR e fotofase de 12 horas 5 Adi o di ria de 350 ml de gua ao substrato Ressalta se que N o deve haver contato entre as cria es estoque de caros fit fagos e predadores e de prefer ncia devem ser mantidas em ambientes separados Tamb m devem ser manipuladas por indiv duos diferentes para evitar contamina es Libera o inundativa em campo 1 Para acondicionar caros predadores ser necess rio manter casca de arroz mo da no fundo do recipiente 2 Cerca de 200 indiv duos ser o retirados da cria o estoque e acondicionados no recipiente 8cm altura x 5cm di metro Figura 1 D 3 Os recipientes com caros predadores ser o transportados em caixas de
348. os novamente e com o aux lio de tabelas apropriadas faz se a convers o dos pesos encontrados para os respectivos volumes corrigidos nas temperaturas medidas Mais recentemente surgiram as micropipetas Estas servem para se obter medidas de volumes extremamente pequenos Estas pipetas s o utilizadas em sua grande parte em an lises de cromatografia onde se necessitam volumes muito pequenos de amostra para a leitura do aparelho Em alguns laborat rios em que se exige maior precis o nas an lises s o utilizadas pipetas autom ticas Deve se evitar a sua utiliza o com l quidos corrosivos como cido sulf rico ou cido clor drico Neste tipo de pipeta deve se sempre utilizar ponteiras pl sticas 1 16 3 Uso de buretas As buretas s o constitu das de tubos de vidro calibrados que permitem o f cil controle de escoamento de volumes vari veis de l quidos Ao ser utilizada deve ser fixada na posi o vertical fixa em um suporte Inicialmente deve se ambientar a mesma com o reagente a ser utilizado lavando a mesma com cerca de 5 mL do mesmo o qual deve ser adicionado com o aux lio de um funil Enche se ent o a bureta at um pouco acima do marco zero e deixa se escoar o reagente at que atinja o zero da escala tomando o cuidando na leitura do mesmo a fim de evitar erros Durante esse processo deve se eliminar todas as bolhas de ar que possam existir Coloca se ent o o frasco que vai receber o l quido abaixo da bur
349. os po os colocando a placa na estufa a 37 C por 2 5 minutos Dica o tempo de tripsiniza o varia de acordo com o tipo celular c lulas muito aderentes requerem tempo maior de incuba o 5 minutos N o aconselh vel exceder 5 minutos de tripsiniza o sob pena de redu o de viabilidade celular 5 Neutralizar a tripsina com 300 uL de meio de cultura contendo AO passo 1 e homogeneizar up and down aproximadamente 10 vezes e passar o volume para um eppendorf de 0 6 pL 6 Incubar as c lulas por 15 minutos a temperatura ambiente e proceder a leitura em cit metro de fluxo Dica as amostras devem ser lidas em at 45 minutos ap s a marca o Por isso em casos em que h muitas amostras o ideal dividir a leitura em duas etapas MICROSCOPIA 1 Plaquear 3 x 10 c lulas em placa de 24 po os seguido do tratamento de interesse 2 Ao final do per odo de tratamento adicionar 1 ug mL AO ao meio de cultura diretamente no po o 3 Incubar no escuro por 15 minutos e ap s fotografar nas fluoresc ncias verde e vermelha utilizando objetiva de 40x Refer ncias TRAGANOS F DARZYNKIEWICZ Z 1994 Lysosomal proton pump activity supravital cell staining with acridine orange differentiates leukocyte subpopulations Meth Cell Biol 41 185 194 STANKIEWICZ M Jonas W Hadas E Cabaj W Douch PG 1996 Supravital staining of eosinophils Int J Parasitol 26 445 446 4 20 ENSAIO DE AGREGACAO DE G
350. os por 5 minutos a temperatura ambiente E importante deixar os tubos deitados 5 pois aumenta a superf cie de contato da amostra com o reagente Dica realizar esse procedimento na capela de exaust o 6 Centrifugar a 12 000 rpm por 5 minutos a 4 C 7 Transferir sobrenadante para novo tubo cerca de 300 uL Adicionar 200 pL NaCl 2 5 M ou 100 pL NaCl 5 M Dica agitar batendo na bancada algumas vezes 9 Adicionar 300 uL Clorof rmio e misturar bem invertendo o tubo v rias vezes 10 Centrifugar a 12 000 rpm por 10 minutos a 4 C Transferir sobrenadante para novo tubo Dica puxar lentamente para n o perturbar a fase org nica 11 12 Adicionar um volume igual de Isopropanol Absoluto e misturar invertendo o tubo v rias vezes 13 Deixar 10 minutos sob temperatura ambiente 14 Centrifugar a 12 000 rpm por 10 minutos a 4 C 15 Descartar sobrenadante deixando somente o pellet 16 Adicionar 1 mL de etanol 75 17 Centrifugar a 12 000 rpm por 3 minutos 18 Descartar sobrenadante deixando somente o pellet 19 Centrifugar brevemente e remover o l quido residual com a pipeta sem perturbar o pellet 20 Dissolver pellet em 10 50 uL de gua Milli Q Se a solu o estiver turva centrifugar a 12 000 rpm por 1 minuto e transferir sobrenadante para novo Al tubo 22 Guardar no Ultra freezer D gt m 2 10 EXTRACAO DE PROTEINAS TOTAIS DE AMOSTRAS DE TECIDO DE MAMIFEROS A obten o de um extrato pro
351. ostrando o tamanho da mesmas em pares de bases ou n mero de amino cidos As identifica es s o derivadas do identificador do formato FASTA 7 Observar o alinhamento propriamente dito na se o Alignment Na se o seguinte Pairwise similarities as sequ ncias s o comparadas uma a uma mostrando valores de similaridade e identidade Dica similaridade e identidade s o dois termos utilizados para expressar o quanto duas sequ ncias s o parecidas Em se tratando de sequ ncias de DNA os termos s o usados de maneira equivalente J para alinhamentos entre sequ ncias de amino cidos o termo identidade se refere ao n mero de res duos iguais entre as duas sequ ncias j o termo similaridade se refere tamb m aos res duos id nticos mas inclui ainda as posi es do alinhamento as quais embora contenham amino cidos diferentes estes apresentam a mesma caracter stica de polaridade da cadeia lateral Portanto a similaridade entre duas sequ ncias sempre maior ou igual identidade 11 7 LOCALIZACAO DE DOMINIOS CONSERVADOS EM SEQUENCIAS DE PROTEINAS Embora proteinas diferentes tenham sequ ncias distintas estas sequ ncias podem conter padr es grupos de amino cidos que s o conservados ao longo da evolu o e que em geral cumprem fun es similares Estes conjuntos de amino cidos s o chamados de dom nios proteicos e podem ser facilmente detectados por ferramentas computacionais Existem diversas
352. ostrar o nome da sequ ncia com a qual a sequ ncia query apresenta similaridade 8 Na se o Descriptions s o mostradas as sequ ncias que apresentam similaridade e os dados que quantificam essa similaridade Dentre eles importante observar os seguintes Query coverage indica qual porcentagem da sequ ncia de interesse coberta pelo alinhamento com cada sequ ncia do banco lembre se que por se tratar de um alinhamento local muitas vezes apenas uma regi o de ambas as sequ ncias ser o alinhadas E value indica a probabilidade de encontrar aquele alinhamento de maneira aleat ria ou seja quanto menor o valor maior a confian a sendo o E value 0 o mais confi vel e Identity indica quantos amino cidos id nticos s o encontrados apenas na regi o que foi alinhada Dica dependendo do tipo de alinhamento feito um E value aceit vel pode variar Por exemplo se estamos alinhando sequ ncias de um organismo que apresenta grande n mero de sequ ncias depositadas no banco como humanos camundongo mosca da fruta ou arroz esperamos encontrar E value baixos pr ximo a zero J no caso de buscarmos sequ ncias obtidas a partir de um organismo que n o possui muitas sequ ncias no banco em geral iremos encontrar sequ ncias de outros organismos que apresentam similaridade mas n o s o id nticas Portanto nesse caso esperamos E value mais alto 1e por e
353. ostras utilizando como refer ncia um mesmo BRANCO 2 15 QUANTIFICACAO DE PROTEINAS UTILIZANDO O QUBIT A quantifica o de prote na pode ser realizada utilizando se o Qubit Protein Assay Kit e o equipamento Qubit Fluorometer utilizado um flu roforo e um fluor metro que quantifica a intensidade de fluoresc ncia presente em cada amostra que diretamente proporcional concentra o de prote na da amostra 1 Diluir as amostras de prote na 20 vezes 1 pL de prote na total 19 pL de gua Milli Q 2 Preparar a solu o de trabalho Working Solution WS que ser utilizada na calibra o e quantifica o Para cada amostra 199 pL tamp o vem com o kit 1 pL fluor foro vem com o kit O fluor foro congela na geladeira portanto deve ser retirado alguns minutos antes da quantifica o N o esquecer que o equipamento deve sempre ser calibrado antes de qualquer quantifica o A calibra o realizada com os tr s padr es que v m junto com o kit Standard 1 0 ng gL Standard 2 200 ng pL e Standard 3 400 ng L Logo se voc tiver quatro amostras para quantificar deve preparar WS suficiente para sete amostras Dica se voc tiver que quantificar v rias amostras preparar WS para uma rea o a mais para que n o falte WS devido a erros de pipetagem ou de calibra o da micropipeta 3 Prepara o dos padr es para a calibra o Standard 1 190 pL WS 10 pL Standard 1 Standard 2 190 pL WS 10
354. ozima 5 Incubar a 37 C por 3 horas Dica para aumentar a efici ncia da lisozima a solu o pode ser levemente agitada a cada 15 30 minutos 6 Adicionar 750 pL de solu o de SDS 10 e incubar a 65 C por 30 45 minutos Dica a solu o de SDS deve ser mantida em um frasco mbar protegido da luz 7 Adicionar 1650 uL de acetato de pot ssio 8M CH3COOK e incubar a temperatura ambiente por 10 minutos 8 Centrifugar a 10 000 rpm por 20 minutos e coletar o sobrenadante 9 Adicionar 4950 uL de solu o de PEG 50 NaCl 1 Me incubar no gelo por 1 hora Solu o Composi o Quantidade edi PEG 50 NaCl 1M PEG 6000 250 g China 50 50 NaCl 29 22 g Caa 1M 1M Agua destilada Completar para 500 mL Cina concentra o final 10 Centrifugar a 10 000 rpm por 20 minutos Descartar o sobrenadante 11 Ressuspender o pellet em 750 pL de TE2 e transferir a solu o para um microtubo de 1 5 mL a composi o da solu o TF2 est descrita no protocolo de extra o de DNA de bact rias endofiticas da raiz 12 Adicionar 1 volume de fenol clorof rmio e agitar vigorosamente 13 Centrifugar a 5 000 rpm por 5 minutos retirar a fase aquosa parte superior e transferir para um novo microtubo est ril 14 Repetir os passos 12 e 13 duas vezes usando apenas clorof rmio 15 Precipitar o DNA com 0 6 volumes de isopropanol gelado e manter no freezer over night D gt C 16 Centrifugar a 12 000 r
355. p 1 8 g de NaHCO bicarbonato de s dio Realizar a filtra o da solu o de Hanks com filtro 0 22 um Obs as demais solu es descritas no protocolo para c lulas em suspens o devem ser preparadas para a realiza o deste ensaio PREPARO DAS L MINAS 1 Utilizar sempre l minas novas de prefer ncia com tarja fosca 2 Lavar cada uma com detergente para retirar a gordura 3 Estocar em lcool 70 dentro da geladeira at o uso PROCESSAMENTO Cultura das c lulas a Fazer a contagem das c lulas CHO k1 b Transferir para frascos de cultura com meio de cultura DMEM HAM F 10 Dica podem ser utilizadas placas de cultura de 6 po os ao inv s de frascos de cultura c Incubar overnight na estufa a 37 C com 5 CO d Ap s este per odo tratar as amostras com o extrato e com o controle positivo etil metanosulfonato EMS em concentra es pr determinadas e Incubar por 3 horas na estufa a 37 C com 5 CO f Retirar o meio de cultura das garrafas de cultura g Lavar com 2 mL de solu o de Hanks repetir este processo 2 vezes h Adicionar 1 mL de tripsina EDTA no frasco de cultura i Colocar a frasco de cultura por 3 minutos na estufa a 37 C para desprendimento das c lulas j Preparar meio de cultura completo 10 SBF em um tubo falcon k Passados 3 minutos verificar por meio de microscopia se as c lulas est o soltas 1 Certificado o desprendimento das c lulas injetar 3 m
356. pH 7 4 Para facilitar a dissolu o pode se adicionar um pouco de etanol absoluto mas sem exceder o volume final As dilui es devem ser feitas diretamente no tamp o Tris HC1 20 mM pH 1 2 Pipetar a solu o de p nitroanilina e tamp o em uma microplaca de 96 po os de fundo chato conforme as quantidades indicadas na tabela 1 Tabela 1 Curva padr o de p nitroanilina Tamp o p nitroanilina p nitroanilina p nitroanilina final Po o uL uL nmol po o uM 1A 100 0 0 1B 97 3 0 36 4 2 1C 95 0 72 7 2 1D 90 10 1 44 14 0 1E 80 20 2 88 28 0 1F 70 30 4 32 42 0 1G 60 40 5 76 56 0 1H 50 50 7 2 70 0 2A 100 14 4 140 0 Dica cada ponto da curva deve ser pipetado em triplicata na placa O volume final de cada po o deve ser de 100 pL 1 3 Medir a absorb ncia em espectrofot metro de microplacas 405 nm 1 4 Construir um gr fico de regress o linear simples colocando os valores das m dias aritm ticas das leituras de cada ponto nas ordenadas eixo y e os valores de quantidade de p nitroanilina nmol po o ou a concentra o de p nitroanilina uM nas abscissas eixo x Biotecnologia 1 5 Obter a equa o da reta na forma de y ax b Reservar a equa o para calcular os valores de atividade enzim tica posteriormente Dica para a curva ser considerada satistaf ria o valor de R deve ser maior ou igual a 0 95 Ensaio de Atividade Enzim tica da Trip
357. paro das solu es 1 1 Preparar uma solu o tamp o de Tris HCl 0 05 M pH 8 0 Para tanto dissolver 0 605 g de Tris em 80 mL de gua destilada ajustar o pH com HCl 5 M e completar o volume para 100 mL com gua destilada 1 2 Preparar uma solu o de HCl 5M pela adi o lenta de 41 8 mL de HCI P A cido clor drico fumegante em 58 2 mL de gua destilada 1 3 Preparar uma solu o de fenolftale na 1 dissolvendo 1 g de fenolftale na em 60 mL de etanol e completando o volume com gua destilada at 100 mL 1 4 Preparar uma solu o de hidr xido de s dio 0 05 M NaOH Para tanto dissolver 0 2 g de NaOH em gua destilada e completar o volume para 100mL 1 5 Preparar uma solu o de lcool polivin lico 2 pela dissolu o de 2 g de lcool polivin lico em 100 mL de gua destilada 1 6 Preparar uma mistura de 50 mL de etanol 50 mL de acetona homogeinizar e manter a temperatura ambiente solu o de parada da titula o M todo do ensaio 1 7 Em um erlenmeyer de 250 mL adicionar 2 5 mL de tamp o TRIS HCI 0 05M pH 8 0 1 mL de triole na pode ser usado leo de oliva e 2 mL de lcool polivin lico 2 1 8 Incubar em agitador orbital shaker 37 C 150 rpm por 1 min para atingir o equil brio t rmico Dica a amostra tamb m deve estar no equil brio t rmico antes de ser adicionada ao sistema de rea o 1 9 Adicionar 1 mL da amostra a ser testada Dica para o frasco a ser lido c
358. perfei oamento das demais an lises gen ticas que ser o realizadas por exemplo uma rea o em cadeia da polimerase PCR Uma das t cnicas mais f ceis e r pidas de quantifica o de cidos nucleicos atrav s da espectrofotometria de densidade ptica a qual se baseia no fato de que cada subst ncia apresenta um comprimento de onda espec fico com o qual ocorre o m ximo da absor o de luz As mol culas de cidos nucleicos DNA e RNA absorvem luz no comprimento de onda de 260 nm e as prote nas no comprimento de 280 nm O aparelho L Quant permite estimar a concentra o de DNA e RNA em ng uL de forma r pida e sem a necessidade de dilui es do material Al m disso tamb m poss vel identificar a pureza do DNA RNA atrav s da raz o de absorb ncias a 260 280 nm Protocolo adaptado de Manual de Instru es do equipamento Quantificador L Quant Loccus biotecnologia Vers o 1 0 0 Primeiramente prepare as amostras que pretende quantificar Prepare tamb m um microtubo com a solu o que representar o BRANCO no momento da quantifica o IMPORTANTE Antes de ler qualquer absorb ncia de amostras o branco deve ser lido O branco se refere solu o na qual a amostra se encontra dilu da antes da quantifica o Por exemplo no caso de uma amostra ser dilu da em gua destilada o branco dever ser apenas gua destilada Essa leitura deve ocorrer antes das leituras das amostras para que seu valor seja diret
359. permanece no bal o em rota o Figura 11 Figura 11 Evaporador rotativo Fonte Dos autores Refer ncias CHRISPINO lvaro Manual de Qu mica Experimental S o Paulo Editora tica 2 edi o 1994 230 p CIENFUEGOS Freddy Seguran a no laborat rio Rio de Janeiro Interci ncia 2001 269 p LENZI Ervim et al Quimica Geral Experimental Rio de Janeiro Freitas Bastos 2009 390 p PAVIA Donald L et al Qu mica Org nica experimental T cnicas de escala pequena Porto Alegre Bookman 2009 880 p POSTMA James M ROBERTS Julian L HOLLENBERG Leland Qu mica no Laborat rio Barueri SP Manole 5 edi o 2009 546 p ROSA Gilberto GAUTO Marcelo GON ALVES F bio Qu mica Anal tica Pr ticas de Laborat rio Porto Alegre Bookman 2013 128 p ED gt C 1 12 TRANSFERENCIA DE L QUIDOS Se o material em manuseio for l quido deve se cuidar para que o frasco n o esteja umedecido caso isso tenha ocorrido seque o previamente Ao verter o l quido de um frasco deve se faz lo do lado oposto ao r tulo Isso evita que o mesmo seja danificado caso o l quido escorra Ao transferir o l quido de um frasco para o outro deve se utilizar um bast o de vidro para evitar que o l quido escorra para fora do frasco A Figura 12 mostra o procedimento Figura 12 Transfer ncia de l quidos Fonte Dos autores Refer ncias OLIVEIRA C M A et al Guia de laborat rio para o ensino
360. pm por 20 minutos e descartar o sobrenadante 17 Lavar o pellet com 500 uL de etanol 70 centrifugar a 12 000 rpm por 5 minutos 18 Descartar o eanol 70 e secar o pellet por 1 hora a 35 C 19 Ressuspender o pellet em 30 uL de TE2 20 Para verificar a efici ncia da extra o do DNA 2 uL da solu o devem ser checados em gel de agarose 0 8 21 Ap s verificar se a extra o foi eficiente purificar o DNA obtido em coluna espec fica para DNA de solo Dica a purifica o do DNA ao final do procedimento uma etapa essencial O solo carrega consigo uma quantidade muito grande de compostos org nicos que n o conseguimos remover totalmente pela extra o convencional Estes compostos inibem a maioria dos procedimentos de biologia molecular 2 5 EXTRACAO DE DNA DE UM ISOLADO BACTERIANO Para confirma o do g nero e da esp cie bacteriana necess rio o uso de t cnicas de biologia molecular como caracteriza o do gene 16S rDNA Para isso devemos ter um DNA de excelente qualidade A extra o de DNA descrita a seguir inicia pela multiplica o do isolado bacteriano seguida pela lise da parede celular e membrana plasm tica e sucessivas lavagens para remo o de excessos de meio de cultura e demais componentes celulares 1 Multiplicar o isolado bacteriano em um meio rico que propicie seu pleno desenvolvimento 2 Aliquotar 1 5 mL da cultura bacteriana crescida em microtubos de 1 5 ou 2 mL Centrifugar por 3 min
361. pons vel data fabrica o e pH Obs congelar os frascos em estoque a 20 C Dica recomenda se que o pH fique em torno de 7 25 pois ap s a filtra o o pH pode elevar Meio de Cultura RPMI 1640 Meio Completo 78 Meio RPMI 1640 Incompleto 20 Soro Bovino Fetal SFB 2 Fitohemaglutinina A a Em um frasco est ril adicionar o meio soro bovino fetal e fitohemaglutinina A e ap s homogeneizar Dica Preparar o meio completo somente no momento do uso PREPARO DAS L MINAS 1 Utilizar sempre l minas novas de prefer ncia com tarja fosca 2 Lavar cada uma com detergente para retirar a gordura 3 Estocar em lcool 70 dentro da geladeira at o uso Sempre iniciar o cultivo em segunda feira ou ter a feira DIA 0 PROCESSAMENTO DIA 0 Cultura das c lulas a Coletar a amostra de sangue 5 mL em tubo heparinizado b Retirar da geladeira 20 minutos antes do in cio da cultura o SBF a Fitohemaglutinina e o meio RPMI 1640 c Limpar a capela de fluxo laminar com lcool 70 d Colocar na capela todos os materiais que ser o utilizados na cultura das c lulas em suspens o e Ligar a l mpada UV por 20 minutos f Desligar a UV e ligar o exaustor e l mpada fria g Colocar na capela limpando frasco com lcool 70 antes o SBF a Fitohemaglutinina o meio RPMI 1640 e as amostras de sangue coletado h Adicionar 500 uL de sangue total em frascos ou placas de 12 po os contendo 5 mL de meio co
362. procedimentos com gua ultrapura e vidrarias est reis e dentro do fluxo sempre que poss vel SOLU O 1 Composi o Quantidade Concentra o final FeCl 6 H O 13 5 mg 1 mM HCI 41 mL 10 mM Proteger da luz Volume final 50 mL SOLUCAO 2 Composi o Quantidade Concentra o final CAS 121 mg 2 mM gua ultrapura est ril Completar o ed para 100 Proteger da luz SOLU O 3 Composi o Quantidade Concentra o final CTAB ADTMA 364 45 mg 10 mM gua ultrapura est ril Completar o volume para 100 mL Proteger da luz SOLU O 4 Composi o Diluir em 20mL Diluir em 100mL Piperazina anidra 4 307 g 21 535 g HCl 12M puro 37 6 25 mL 31 25 mL Volume da Solu o Final 100 mL 500 mL Adicionar HCl aos poucos at pH 5 6 Esta solu o deve ser preparada na hora 4 Ap s esterilizar o meio gar King B esperar a temperatura baixar um pouco e adicionar aproximadamente 20 do volume do meio de corante CAS ao meio 5 Verter a mistura resultante em placas de Petri est reis Dica o meio de cultura dever ter a colora o azul escuro Caso o meio fique com outra colora o voc deve ter errado o pH do meio ou vertido o corante quando o meio ainda estava muito quente 6 Inocular uma gota de aproximadamente 20 uL da cultura bacteriana crescida no meio l quido na placa de Petri preparada anteriormente 7 Incubar a 28 C por 2 3 dias 8 O aparecimento de um halo cor laranja e
363. r 10 uL de cDNA dilu do 100X em cada pocinho correspondente a cada amostra 17 Os pocinhos C4 C8 F4 e F8 ser o os controles negativos dos respectivos genes 1 2 3 e 4 Nestes po os adicionar 10 pL de H O ao inv s do cDNA Dica Caso se formem algumas bolhas na parede dos pocinhos as mesmas dever o ser empurradas para baixo com o aux lio de uma ponteira ou com uma centr fuga de placas Cuidar para n o contaminar os po os vizinhos 18 Colocar o adesivo na placa Dica O adesivo deve estar bem fixado para evitar a evapora o dos reagentes 19 Colocar a placa dentro do equipamento de RT qPCR para an lise da express o g nica 20 Criar ou editar um template e salv lo com um nome apropriado 21 Iniciar a rea o 22 Salvar o arquivo e calcular os valores de express o Protocolo para an lise de express o g nica de 2 genes 1 gene teste 1 gene controle 1 Identificar 2 eppendorfs de 1 5 mL com os nomes dos respectivos genes 2 Pipetar os seguintes itens em cada eppendorf identificado mix para meia placa 24 po os HO 99 4 uL Tamp o 10X 53 pL MgCl 50 mM 31 8 pL dNTPs Mix 10 mM 5 3 ph Primer F 10 mM 10 6 uL Primer R 10 mM 10 6 uL SYBR Green diluido 53 uL Platinum Taq DNA Polimerase 14 uL Dilui o do SYBR Green 1 1 pL SYBR Green 108 9 uL H O 3 Misturar bem o mix com auxilio de uma pipeta 4 Colocar a placa de 48 po os sobre uma estante de microtubos 5 Colocar 6 eppendorfs de
364. r a guia de pipetagem amarela pipetar gentilmente as amostras nos po os evitando a mistura e derramamento para os po os vizinhos Dica encaixar a pipeta exatamente entre as duas placas de vidro acima do po o a ser pipetado inclinando a suavemente 3 Pipetar o marcador de massa molecular Dica pode se aquecer um pouco o marcador antes de pipet lo para torn lo mais homog neo 4 Cobrir com o restante do tamp o de corrida os suportes e as placas de vidro at a marca o da cuba para 2 ou 4 g is 5 Encaixar a tampa da cuba ajustar a voltagem 60 120V ou amperagem e iniciar a corrida Dica usar uma voltagem menor 60 80V enquanto as prote nas estiverem no gel de entrada Quando estas entrarem no gel de separa o pode se aumentar a voltagem 90 120V A tampa deve ser encaixada corretamente levando se em conta a disposi o dos eletrodos e os polos negativo positivo O final da corrida depende do tipo de prote na que se pretende visualizar alto ou baixo peso molecular Nos g is de 10 a frente de corrida linha azul deve sair do gel Em g is de 12 ou 14 o gel deve correr 10 a 20 minutos a mais ap s a sa da da frente de corrida O uso de marcadores de massa molecular pr corados auxilia no acompanhamento da corrida 6 Ap s o t rmino da corrida proceder com o Western Blotting ou colora o com Coomassie Refer ncias AUSUBEL FM Brent R Kingston RE Moore DD Seidman JG Smith JA Struhl K eds
365. r clivada por fosfolipases e portanto secretada para o meio extracelular A presen a de GPI um dos poss veis ind cios de secre o Outras ferramentas podem ser aplicadas para a predi o de outros sinais cl ssicos de secre o 1 Acessar o site http gpcr biocomp unibo it predgpi index htm 2 Clicar em Prediction 3 Colar a sequ ncia a ser analisada em formato fasta ou submeter o arquivo com todas as sequ ncias a serem analisadas clicando no link Escolher arquivo 4 Clicar em Display 5 Analisar o resultado Umatabela ser gerada com on mero de prote nas com a probabilidade de conter GPI Altamente prov vel prov vel fracamente prov vel e sem ancoramento GPI O resultado deve ser apresentado desta maneira e o crit rio de exclus o considerar que altamente prov vel e prov vel ou somente altamente prov vel considerado positivo potencialmente secretado determinado pelo analista Predi o de secre o de prote nas com pept deo sinal Esta ferramenta prediz a presen a e localiza o de s tios de pept deo sinal em prote nas de diferentes organismos 1 Acessar o site http www cbs dtu dk services SignalP 2 Na caixa Submission colar a sequ ncia em formato fasta a ser analisada ou submeter o arquivo com todas as sequ ncias a serem analisadas clicando no link Escolher arquivo 3 Escolher o grupo taxon mico entre Eukaryotes e Gram negative ou Gram posit
366. r expressos de uma s rie de maneiras diferentes dependendo do direcionamento das an lises Normalmente o grau de inflama o g strica e gravidade da doen a desenvolvida determinado pela avalia o do estado geral dos animais apar ncia morfol gica macrosc pica do est mago pH do conte do g strico tamanho das lceras desenvolvidas e altera es histol gicas associadas inflama o Al m disso citocinas quimiocinas xido n trico e a atividade de algumas enzimas podem ser dosadas no tecido g strico Refer ncias HAULE EE MOSHI MJ NONDO RS MWANGOMO DT MAHUNNAH RL A study of antimicrobial activity acute toxicity and cytoprotective effect of a polyherbal extract in a rat ethanol HCI gastric ulcer model BMC Res Notes 2012 2 5 546 MOSHI MJ NONDO RS HAULE EE MAHUNNAH RL KIDUKULI AW Antimicrobial activity acute toxicity and cytoprotective effect of Crassocephalum vitellinum Benth S Moore extract in a rat ethanol HCl gastric ulcer model BMC Res Notes 2014 19 7 1 91 SZELENYI I THIEMER K Distention ulcer as a model for testing of drugs for ulcerogenic side effects Arch Toxicol 1978 13 41 1 99 105 14 7 MODELO DE COLITE Neste protocolo a inflama o no c lon colite ulcerativa ou doen a de Crohn induzida em ratos ou camundongos pelo tratamento com dextran sulfato de s dio DSS As principais aplica es s o para a avalia o dos efeitos anti inflamat rios e imunorregulat rios de
367. r ou igual a 80 Dica o teste de viabilidade pode ser realizado logo ap s a suspens o de esporos ficar pronta uma vez que o tempo para avalia o da viabilidade pr ximo ao tempo para teste de esterilidade Em uma placa de petri contendo meio BDA batata dextrose gar adicionar 0 1 mL da suspens o de esporos e espalhar com o aux lio de uma al a de vidro previamente esterilizada e fria Incubar a placa em estufa de 24 a 72 horas dependendo do fungo ou isolado a 28 C Realizar a contagem dos esporos ou con dios germinados a partir das Unidades Formadoras de Col nia UFCs visualizadas D gt cm 13 5 EXTRACAO DE PROTEINAS DE SUPERFICIE DE CONIDIOS FUNGICOS Conidios apresentam diversas proteinas em sua superficie que podem ser separadas sem necessariamente causar a ruptura celular Estas prote nas s o importantes para estudos de intera o das c lulas f ngicas com seus hospedeiros caracteriza o enzim tica ou prote mica por exemplo 1 Os con dios podem estar secos ou midos como ap s a centrifuga o de uma suspens o como descrito acima 2 Adicionar s c lulas o tamp o de extra o Tris HCl pH 8 0 contendo 0 25 de Triton X 100 na propor o de 1 2 5 1 g de c lula para 2 5 mL tamp o 3 Agitar em vortex por 5 minutos 4 Centrifugar o material por 15 minutos a 13 000 rpm 5 Filtrar o sobrenadante em filtro de poro 0 22 um 6 Aliquotar em eppendorfs de 1 5 mL e falcons de 15 mL
368. ra 4 3 QUANTIFICACAO DE CARBONILACAO OU OXIDACAO DE PROTEINAS A quantifica o de carbonila o de prote nas um m todo para determinar a exist ncia de estresse oxidativo em amostras biol gicas que levam a uma maior oxida o e consequentemente degrada o das mesmas M todo de Levine et al 1994 1 Preparar o Tamp o de Extra o Tris HCl 1 M pH 8 0 0 5 mL 50 mM EDTA 50 mM 0 4 mL 2 mM PMSF 100 mM 100 pL 1 mM Benzamidina 100 mM 100 pL 1 mM H O MilliQ q s p TOTAL 10 ml 2 Pulverizar material 0 2 0 5 g em nitrog nio l quido N 3 Adicionar 1 mL do Tamp o de Extra o em cada amostra 4 Centrifugar a 11000 g por 15 minutos a 4 C 5 Coletar sobrenadante e utilizar imediatamente nos passos posteriores 6 Transferir 500 uL do extrato para novo tubo 7 Adicionar 50 uL de streptomicina 10 e manter a temperatura ambiente por 15 minutos 8 Centrifugar a 11000 g por 10 minutos a 4 C 9 Coletar sobrenadante e transferir para um tubo novo 10 Adicionar 500 pil de TCA 20 e manter a temperatura ambiente por 15 minutos 11 Centrifugar a 11000 g por 10 minutos a 4 C e descartar sobrenadante 12 Ressuspender o precipitado em 500 pL de DNPH 10 mM 2 M HCI 13 Incubar por 1 hora a temperatura ambiente agitando a amostra de 15 em 15 minutos 14 Adicionar 500 uL de TCA 20 e manter a temperatura ambiente por 15 minutos 15 Centrifugar a 11000 g por 10 minutos a 4 C e descartar
369. ra com o v rtex d Colocar as amostras em banho Maria a 37 C por 5 minutos e Adicionar 4 mL de Citrato de S dio 1 f Logo em seguida ressuspender com a pipeta de Pasteur especifica da amostra g Colocar as amostras no banho Maria a 37 C por 7 minutos h Adicionar 0 5 mL de fixador Carnoy i Em seguida ressuspender com a pipeta de Pasteur especifica da amostra j Centrifugar a 1 500 rpm por 7 minutos k Desprezar o sobrenadante com a pipeta de Pasteur 1 Adicionar 5 mL de fixador e ressuspender adicionar e ressuspender uma amostra ap s a outra m Centrifugar a 1 500 rpm por 7 minutos n Desprezar o sobrenadante com a pipeta de Pasteur o Estocar em congelador ou geladeira por no m nimo 15 minutos p Durante este tempo realizar a prepara o das l minas Retir las do lcool 70 Coloc las dispostas em cubetas sob gua corrente da torneira para remover o lcool Remover toda a gua da torneira e preencher a cubeta com gua destilada a Retirar as amostras da geladeira centrifugar a 1 500 rpm por 7 minutos e desprezar o sobrenadante b Adicionar 5 mL de fixador e ressuspender c Centrifugar a 1 500 rpm por 7 minutos e desprezar o sobrenadante Dica se necess rio realizar essas lavagens at a amostra obter apar ncia l mpida clara e transl cida a Na ltima lavagem ao desprezar o sobrenadante cuidar para manter aproximadamente 1 mL 2 dedos b Ressuspender a amo
370. ra contendo uma representa o da sequ ncia submetida na parte superior e a posi o relativa de cada s tio encontrado logo abaixo Para cada s tio repeti o CpNpGp s tio de liga o de miRNA uma linha cont nua mostrada e uma caixa colorida mostrada para cada s tio encontrado Colora es diferentes s o dadas para s tios encontrados na fita senso ou antissenso Caso haja um n mero grande de s tios haver uma barra de rolagem no canto direito Clicando no nome dos elementos regulat rios poss vel acessar detalhes do mesmo Na parte superior de cada se o h um link para uma tabela listando todos os elementos View in Table na qual indicada a posi o fita sequ ncia esp cie onde o mesmo foi descrito e a fonte bancos de dados de an lise de promotor 11 11 PREDI O DE SECRE O E LOCALIZA O DE PROTE NAS Estas ferramentas t m por finalidade predizer baseado em similaridade de sequ ncias conservadas se uma prote na secretada e o tipo de rota utilizada para secre o da mesma bem como indicar uma poss vel localiza o direcionada para a secre o Predi o de prote nas com ancoramento GPI glicosilfosfatidilinositol GPI um glicolip deo que pode ser adicionado prote na considerado uma modifica o p s traducional Prote nas com ancoramento GPI contem pept deo sinal O ancoramento GPI faz com que a prote na fique ligada face externa da membrana celular podendo se
371. ratada de forma diferente para avaliar o tipo de SOD presente na amostra Tamp o de amostra H O destilada 3 8 mL 0 5 M Tris HCl pH 6 8 ImL Glicerol 0 8 mL Azul de bromofenol 1 0 4 mL Tamp o de corrida 1X Tris 18 Glicina 8 64 g H O destilada q s p 1L 2 Separa o das amostras 2 1 O gel dever ser corrido a uma voltagem de 150 volts 3 Detec o de SODs 3 1 Ap s eletroforese remover o gel da cuba e colocar sobre uma placa de vidro limpa com lcool 3 2 Cortar o gel separando cada amostra e colocar cada uma das tiras em placas de petri para colora o ou revela o 3 3 Uma das fatias do gel dever ser tratada anteriormente colora o Para Fe SOD antes de corar o gel tratar por 1h com a seguinte solu o gua oxigenada 33 H O 230 uL 20mM Cianeto de pot ssio KCN 200 pL 1mM 0 5 M Fosfato de pot ssio monob sico K HPO pH 7 8 EDTA 0 1M q s p 100 mL 20 pL 50 mM 3 4 Todas as fatias de gel dever o passar pelo processo de colora o e revela o com as seguintes solu es 4 Solu o de colora o SODs Nitroblue tetrazolium NBT 2 45 mM 5mg H O destilada q s p 50 mL Manter o gel por 20 minutos Lavar com gua destilada 4 1 Para CuZn SOD adicionar 10mM cianeto de pot ssio KCN na solu o reveladora Dica preparar a solu o de revela o e dividir em dois frascos Em 50 mL adicionar KCN 0 037 g para a identifica o de Cu
372. rats Materiais Mesa cir rgica Seringa descart vel para insulina com agulha 1 mL 13 X 0 45 mm 26 G 2 Material cir rgico pin a simples reta pin a dente de rato pin as hemost ticas e tesoura reta L mina de a o para realizar tricotomia ou raspador el trico Balan a anal tica PBS Dextran sulfato de s dio DSS Pentobarbital s dico Procedimentos 1 Pesar os animais identific los e dividi los em grupos de no m ximo 4 indiv duos por caixa 2 Iniciar o tratamento com DSS 3 5 dilu do diretamente na gua de beber dos animais dia zero Dica os animais controle permanecem tendo acesso gua normal 3 Manter o tratamento com DSS 3 5 por 8 dias Dica os animais devem ser observados trocados e pesados diariamente durante o tratamento 4 No dia 6 de indu o da colite administrar o tratamento com a subst ncia a ser testada pela via de escolha Dica o esquema de tratamento com a subst ncia teste pode variar de acordo com o caso Aqui sugerimos um p s tratamento de dose nica No entanto podem ser administradas doses seguidas a partir do 6 dia at o fim do experimento Alternativamente pode se optar por um esquema de pr tratamento administrando a subst ncia teste dias antes da indu o da colite com DSS 5 No dia 8 interromper o tratamento com DSS substituindo o por gua 6 No dia 10 sacrificar os animais pela inje o i p de pentobarbital s dico 5
373. rdo com o modelo do equipamento Em geral as cubas s o verticais e o gel polimerizado entre duas placas de vidro Geralmente a corrida ocorre assim como na eletroforese em gel de agarose a partir da imers o em solu o de TBE 1X A colora o de g is de poliacrilamida pode ser realizada de diferentes maneiras As mais comuns s o a imers o em nitrato de prata ou em solu o aquosa de brometo de et dio entretanto cada t cnica apresenta condi es e caracter sticas bastante espec ficas 3 4 METODOLOGIAS DE GENOTIPAGEM BASEADAS NA PCR a Genotipagem de VNTR PCR Para a genotipagem de polimorfismos do tipo VNTR a metodologia simples consiste na realiza o de uma PCR espec fica para a regi o polim rfica utilizando primers que se localizem em local externo regi o repetitiva Com isso ocorrer a amplifica o de fragmentos de diferentes tamanhos conforme o n mero de repeti es que cada mol cula de DNA apresenta Ap s a amplifica o realiza se a eletroforese das amostras amplificadas e de acordo com a posi o das bandas no gel poss vel determinar os alelos presentes em cada amostra rd Dica ao estabelecer um protocolo para genotipagem de VNTR essencial conhecer o tamanho da unidade de repeti o bem como o n mero de repeti es presentes nos alelos mais frequentes Isso permitir desenvolver condi es de amplifica o e eletroforese mais adequadas detec o dos fragmentos de
374. repara o de solu es O reagente devidamente pesado e passado para um b quer onde dissolvido A solu o assim obtida passada para o bal o O bequer lavado v rias vezes com pequenas por es de gua destilada para que ocorra uma transfer ncia quantitativa cuidando se para n o exceder a marca do gargalo S ent o a solu o dilu da fazendo se o solvente escoar pelas paredes do bal o at que o l quido chegue extremidade inferior do gargalo Espera se o excesso de l quido escoar Com o aux lio de um bast o de vidro cuja extremidade possui um peda o de papel filtro preso com uma fita durex promove se a secagem da parte superior do gargalo Somente depois deste procedimento feito o ajuste final com o aux lio de uma pequena pipeta de tal maneira que o menisco fique tangente ao tra o de refer ncia do bal o Em seguida agita se vigorosamente at que a solu o se misture perfeitamente Em caso de dilui es de solu es concentradas se este processo for exot rmico procede se uma dilui o inicial num bequer com pouco volume de gua Espera se esfriar e ent o repete se o procedimento para reagentes s lidos acima citados Refer ncias Manuseio de pipetas Dispon vel em lt http coracaodefarmaceutico blogspot com br 2013 05 controle de qualidade nocoes basicas html gt Acesso em 31 03 2014 ROSA Gilberto GAUTO Marcelo GON ALVES F bio Qu mica Anal tica Pr ticas de Labor
375. repetir 3X COLORA O 1 Depois lavar 2X com gua destilada 2 Deixar secar por no m nimo 2 horas a 37 C na estufa por mais tempo se for em temperatura ambiente 3 Fixar por 10 minutos na solu o fixadora depois de usar recolocar no frasco mbar 4 Lavar 3X com gua destilada 5 Deixar secar por pelo menos 5 horas a temperatura ambiente ou por 1 5 horas a 37 C na estufa 6 Reidratar os g is por 5 minutos em gua destilada 7 Corar as l minas colocadas na grade de vidro costa a costa por 30 minutos utilizando a solu o corante que deve ser preparada na hora com agita o no escuro 8 Lavar as l minas 3X com gua destilada 9 Colocar as l minas na solu o de parada por 5 minutos 10 Lavar as l minas 3X com gua destilada 11 Deixar secar em temperatura ambiente AN LISE Em microsc pio ptico analisar 100 n cleos em aumento de 100X Classific los de O a 4 Obter escore de 0 a 400 para cada amostra Classe 0 Classe 2 Classe 3 Classe 4 Teste Cometa c lulas em ades o PREPARO DAS SOLU ES Meio DMEM 1000 mL Agua Milli Q autoclavada 8 6 g DMEM ou meio de cultura especifico para a linhagem celular em uso 1 2 g NaHCO 0 1 g Penicilina 0 06 g Estreptomicina Ajustar o pH para 7 3 antes de filtrar o meio Esterilizar realizar a filtra o do meio com filtro 0 22 pm Solu o de Hanks 1L 1000 mL Agua Milli Q autoclavada 1 embalagem de Hanks em
376. rma o de bolhas no momento de verter a solu o na forma O corante de visualiza o brometo de et dio ou assemelhado deve ser adicionado ao gel ainda no estado l quido ap s resfriamento parcial Dica o brometo de et dio uma subst ncia carcinog nica Seu manuseio e de todo o material em contato deve ser feito cuidadosamente utilizando luvas sem talco azuis em rea isolada e espec fica Ao homogeneizar a solu o n o respirar o vapor Ap s a solidifica o do gel imergir completamente em TBE 1X no interior da cuba e aplicar as amostras a serem analisadas Dica no momento da aplica o das amostras necess rio adicionar um corante como o azul de bromofenol para monitorar a migra o das mol culas de DNA no gel Posicionar o gel sempre de modo que os po os estejam pr ximos ao p lo negativo para que ao ser atra do pelo p lo positivo o DNA migre pelo interior do gel Examinar o resultado sob radia o UV em um transiluminador Dica n o olhar diretamente para a luz UV sempre fechar a tampa do transiluminador e utilizar culos de prote o antes de lig lo essencial em procedimentos de genotipagem de polimorfismos adicionar um marcador de peso molecular em pb conhecidos com Ladder Os diferentes marcadores auxiliam na identifica o do tamanho dos fragmentos de interesse Por exemplo um Ladder de 50 pb produzir uma sequ ncia de fragmentos de 50 pb a 500 pb no gel em m
377. robiose fermenta o e produ o de lcoois Em alguns casos altas concentra es de g s carb nico induzem dist rbios no crescimento e desenvolvimento da planta in vitro D gt cm 9 5 MANUTENCAO DAS PLANTAS MATRIZES Os resultados obtidos no cultivo in vitro podem ser influenciados pela forma em que as plantas matrizes s o tratadas e pelo ambiente em que elas crescem Sabe se que o melhor explante proveniente de plantas sadias e vigorosas que s o mantidas em estado ativo de crescimento sem estresse H v rios aspectos relacionados com a planta matriz que podem influenciar para o sucesso no cultivo in vitro sendo os principais 1 Adequada nutri o mineral da planta matriz o que deve ser feito de acordo com a exig ncia de cada esp cie e est dio vegetativo 2 Plantas matrizes com pragas ou doen as devem ser rejeitadas pois os pat genos que as infectam s o capazes de causar a morte da cultura in vitro 3 Recomenda se que as plantas matrizes sejam mantidas em salas de crescimento sob condi es controladas Assim as brota es para a obten o dos explantes s o mais uniformes e com menos possibilidades de estarem contaminadas por pat genos Plantas que crescem no campo est o sujeitas a altas taxas de contamina o Observa es a Em geral a infec o da planta matriz reduz o n mero e tamanho das brota es A produ o de brota es axilares e o n mero de plantas finalmente estabelecidas t
378. rofessora do Centro de Ci ncias Exatas e Tecnol gicas CETEC e do Programa de P s Gradua o em Biotecnologia PPGBiotec do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 4215540900949347 Claudimar Sidnei Fior Engenheiro Agr nomo doutor em Fitotecnia UFRGS professor do Departamento de Horticultura e Silvicultura e do Programa de P s Gradua o em Fitotecnia PPGFito da Universidade Federal do Rio Grande do Sul UFRGS http lattes cnpq br 7123252970342522 Christina Venzke Sim es de Lima Bi loga doutora em Ci ncia do Solo UFRGS p s doutoranda do Programa de P s Gradua o em Biotecnologia PPGBiotec do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 5107170428996876 Dalana Faleiro Acad mica do curso de Biomedicina do Centro Universitario UNIVATES http lattes cnpq br 2923943354106911 D bora Mara Kich Biom dica mestranda do Programa de P s Gradua o em Biotecnologia PPGBiotec do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 7806847826466246 dina Aparecida dos Reis Blasi Acad mica do curso de Ci ncias Biol gicas do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 2796217997488696 Eduardo Cremonese Filippi Chiela Biom dico doutorando do Programa de P s Gradua o em Biologia Celular e Molecular PPGBCM da Universidade Federal do Rio Grande do Sul UFRGS http lattes cnpq br 0726009160227341 Eduardo Miranda Ethur Quim
379. rofiles of catalase peroxidase and glutathione reductase during acclimation to chilling in mesocotyl of maize seedlings Plant Physiology v 109 p 1247 1257 1995 BEAUCHAMP C FRIDOVICH I Superoxide dismutase improved assays and an assay applicable to acrylamide gels Analytical Biochemistry v 44 p 276 287 1971 GIANNOPOLITIS I REIS S K Superoxide dismutases I Occurrence in higer plants Plant Physiology v 59 p 309 314 1977 HAVIR E A McHALE N A Biochemical and Developmental Characterization of Multiple Forms of Catalase in Tobacco Leaves Plant Physiology v 84 p 450 455 1987 NAKANO Y ASADA K Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate specific peroxidase in spinach chloroplasts Plant and Cell Physiology v 22 p 867 880 1981 4 13 TESTE DE COMETA E MICRONUCLEO Os testes de mutagenicidade e genotoxicidade in vivo e in vitro t m sido utilizados pelas ag ncias reguladoras e pela comunidade cient fica para a avalia o da seguran a dos novos agentes terap uticos Dentre os m todos dispon veis para esta avalia o destacam se os ensaios de cometa e micron cleo O teste de micron cleo utilizado para avaliar v rios tipos de danos ao DNA em n vel cromoss mico atuando como uma importante ferramenta nas informa es do potencial mutag nico de agentes qu micos f sicos e biol gicos Fenech 2000 J o ensaio cometa capaz de detectar les es que s o pass veis de corre o al m de i
380. rosamente para n o soltar as c lulas aderidas 3 Incubar as c lulas com 100 pL paraformaldeido 4 a temperatura ambiente por 15 minutos 4 Retirar o paraformalde do e lavar 3x com PBS CMF Dica 1 Pode se deixar at cinco dias as c lulas em PBS 1x at proceder a marca o Dica 2 a realiza o deste protocolo em ambiente est ril fluxo laminar mant m as c lulas ntegras e ajuda a manter a morfometria celular 5 Marcar as c lulas com 300 pL de PBS 1x 0 5 pL de Triton X 100 0 1 300 nM de DAPI por 30 minutos Dica DAPI um corante fluorescente que se liga ao DNA Este protocolo pode ser realizado substituindo se o DAPI por Iodeto de Prop deo 6 mM Dica a marca o pode ser feita com Iodeto de Propideo 6 Retirar a solu o de marca o contendo DAPI e adicionar 500 pL de PBS 1x po o Dica a marca o permanece relativamente est vel por 10 dias no escuro 7 Fotografar os po os de interesse para o vis vel e fluoresc ncia utilizando objetiva de 20x 8 Conta se o n mero de figuras mit ticas em pelo menos 100 c lulas de cada condi o Dica a escolha do campo a ser fotografado deve ser feita de maneira cega na luz vis vel Refer ncia TAMOWSKI BI Sens DA Nicholson JH Hazen Martin DJ Garvin AJ Sens MA 1993 Automatic quantitation of cell growth and determination of mitotic index using DAPI nuclear staining Pediatr Pathol 13 249 265 D gt Cm 4 22 ATIVIDADE DE BETA GALAC
381. ry Animals edi o revisada em 1996 http www nap edu readingroom books labrats Materiais Mesa cir rgica Seringa descart vel para insulina com agulha 1 mL 13 X 0 45 mm 26 G Material cir rgico pin a simples reta pin a dente de rato pin as hemost ticas e tesoura reta L mina de a o para realizar tricotomia ou raspador el trico Cateter intravascular perif rico 20 G ou c nula PE 50 conectada a uma seringa de 1 mL Pin a histol gica ponta fina Pipeta autom tica PBS Heparina 20 UI mL Hidr xido de Alum nio Isoflurano Pentobarbital s dico Ovalbumina Procedimentos 1 Anestesiar os animais levemente com isoflurano e realizar a 1 imuniza o dia zero pela inje o subcut nea s c de uma suspens o contendo 4 ug de ovalbumina e 1 6 mg de hidr xido de alum nio em PBS volume m ximo de 0 2 mL Os animais controle devem ser injetados com PBS 0 2 mL por via s c 2 No 7 dia ap s a 1 imuniza o dia zero realizar a 2 imuniza o seguindo o mesmo esquema anterior D gt cm 3 No 14 dia 1 desafio ap s a primeira imuniza o dia zero anestesiar levemente os animais com isoflurano e administrar via intranasal i n 50 pL de uma solu o contendo 10 ug de ovalbumina em PBS Aos animais controle administrar 50 pL de PBS i n Dica aplicar a ovalbumina ou PBS com o aux lio de uma pipeta diretamente ao focinho dos
382. s 9 Ap s 2 horas no refluxo desligar a chapa e deixar esfriar Lavar o condensador com gua at diluir cerca de duas vezes o volume inicial da amostra Agitar e deixar at ficar em temperatura ambiente 10 Adicionar 2 a 3 gotas de indicador ferro na em cada erlenmeyer Titula o Titular com sulfato ferroso amoniacal at virar a cor para marrom avermelhado C lculos DQO mg L B A x N x 8000 Volume de amostra mL Onde B volume da solu o de sulfato ferroso amoniacal gasto para titula o do branco mL A volume da solu o sulfato ferroso amoniacal gasto para titula o do amostra mL N Normalidade da solu o de sulfato ferroso amoniacal 8000 equivalente grama de oxig nio para 1 L de gua Se for utilizada dilui o multiplicar pelo fator de dilui o utilizado Refer ncia Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater 22 st edition M todo 5220 B p g 5 17 2012 7 14 DETERMINACAO DE POLIFENOIS TOTAIS Protocolo para Quantifica o de Polifen is Totais em Extratos Secos pelo M todo de Folin Ciocalteu Compostos fen licos compreendem um dos mais importantes grupos de metab litos secund rios em plantas podendo ser divididos em diversas categorias como fen is simples cidos fen licos cumarinas flavonoides taninos condensados e hidrolis veis lignanas e ligninas Podem atuar na defesa da planta contra agress es do ambiente bem como agir como antioxid
383. s e ou bactericidas ao meio de cultivo Por m esta pr tica nem sempre d bons resultados principalmente quando n o s o adotados crit rios t cnicos para a escolha dos antibi ticos em fun o do tipo de organismo a ser controlado Manejos adequados durante o tratamento da planta matriz oferecem melhores resultados e diminuem o risco ao manipulador d A desinfesta o apenas permite a limpeza superficial do explante sem eliminar pat genos que estejam localizados internamente aos tecidos e A limpeza do ambiente e dos materiais muito importante para viabilizar uma desinfesta o mais eficiente Para a desinfesta o dos explantes a serem incubados devem ser seguidos os procedimentos listados a seguir 1 Coleta dos ramos da planta matriz e remo o de parte das folhas Para a coleta devem ser utilizados preferencialmente tesoura esterilizada 2 No caso da utiliza o de segmentos nodais 1 0 cm os ramos podem ser padronizados em 5 0 cm Estes devem conter ao menos uma gema Dica importante que os ramos apresentem tamanho maior ao explante que ser incubado para evitar danos aos tecidos com os tratamentos de desinfesta o Depois de desinfestados no momento da incuba o as extremidades do segmento devem ser eliminadas deixando o no tamanho adequado Quando forem incubados meristemas os procedimentos s o semelhantes ou seja devem ser mantidos ramos maiores as folhas maiores tamb m devem ser removidas
384. s e subtrair a absorb ncia final da inicial A2 A1 1 14 Os valores de A2 A1 correspondem ao p nitrofenol liberado durante a rea o Calcular a quantidade de p nitrofenol presente em cada po o utilizando a equa o da reta obtida pela curva padr o de p nitrofenol 2 An lise dos Resultados 2 1 Os resultados s o expressos como atividade de lipase por meio da quantidade de p nitrofenol liberada por minuto por volume de rea o umol mL min Seguir o mesmo m todo de c lculo ao descrito anteriormente para a atividade de tripsina ver exemplo acima Biotecnologia Dica existem outros substratos do tipo p nitrofenil steres que podem ser utilizados praticamente da mesma maneira O substrato sint tico para lipase mais utilizado o p nitrofenil palmitato Refer ncias SILVA WOB MITIDIERI S SCHRANK A VAINSTEIN MH 2005 Production and extraction of an extracellular lipase from the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae Process Biochemistry 40 321 326 BEYS DA SILVA W O SANTI L BERGER M PINTO A F M GUIMAR ES J A SCHRANK A VAINSTEIN M H 2009 Characterization of a spore surface lipase from the biocontrol agent Metarhizium anisopliae Process Biochemistry 44 829 834 15 7 ATIVIDADE AMILOLITICA Este m todo baseia se na determina o da atividade amilol tica pela quantifica o dos a cares redutores liberados pela rea o de hidr lise do amido catalisada por amilases 1
385. s esquerda e direita isolando a do tecido conjuntivo adjacente e da aorta abdominal Dica esta etapa deve ser realizada com cuidado especial no caso de camundongos devido fragilidade dos tecidos Recomenda se o uso de uma lupa cir rgica para facilitar a visualiza o das estruturas e evitar les o na cava e aorta 7 Com o aux lio da pin a simples curva passar os fios de nylon 4 0 e imediatamente ligar as tribut rias de maior calibre e outros pequenos vasos que s o ramifica es da cava inferior principalmente no segmento entre as veias renais e a bifurca o da veia il aca 8 Com o aux lio da pin a simples curva passar um fio de nylon 4 0 e imediatamente ligar a veia cava inferior logo abaixo das veias renais 9 Cuidadosamente acondicionar novamente o intestino na cavidade abdominal e suturar em dois planos parede abdominal e pele 10 Administrar lidoca na 4 mg kg 0 4 mL kg de uma solu o 1 diretamente no local da sutura 11 Manter os animais na manta de aquecimento 37 C at a completa recupera o da anestesia 12 Ap s diferentes tempos da indu o da estase ap s a liga o da veia cava os animais s o novamente anestesiados seguindo o esquema acima e uma nova incis o na parede abdominal realizada 14 Dissecar cuidadosamente o segmento da veia cava ligado contendo o trombo abaixo das veias renais Come ar a dissec o pela extremidade superior e ap s retir lo completamente lavar o seg
386. s identificar somente o g nero bacteriano Para amplificar o gene 165 rDNA completo usar os oligonucleot deos iniciadores Nome Sequ ncia Posi o pA 5 AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3 8 28 1542R 5 AGA AAG GAG GTG ATC CAG CC 3 1525 1542 Condi es da PCR 94 C 5 min 30 ciclos de 94 C 45 seg 55 C 45 seg 72 C 1 min e 72 C 5 min Dica pelo alto n vel de conserva o do gene 165 rDNA em bact rias estes oligonucleotideos iniciadores amplificam o gene em qualquer esp cie bacteriana Dica como esta rea o amplifica o gene 165 rDNA completo por esta metodologia podemos identificar o g nero e a esp cie bacteriana 3 O fragmento do DNA obtido pelos PCRs descritos acima deve ser sequenciado 4 A sequ ncia obtida deve ser comparada com as sequ ncias do banco de dados GenBank pelo software BlastN dispon vel em http blast ncbinlm nih gov ou ez taxon dispon vel em http www ezbiocloud net eztaxon Refer ncias FELSKE A RHEIMS H WOKERINK A STACKEBRANDT E AKKERMANS DL Ribosome analysis reveals prominent activity of an uncultured member of the class Actinobacteria in grasslands soils Microbiol 143 2983 2989 1997 BROSIUS J PALMER ML KENNEDY PJ and NOLLER HF 1978 Complete nucleotide sequence of a 16s ribosomal RNA gene from Escherichia coli Proc Natl Acad Sci USA 75 4801 4805 STACKEBRANDT E LIESACK W Nucleic acids and classification p 151 194 In M Goodfellow and A O D
387. s no canto direito do alinhamento Dica poss vel ver o alinhamento em cores diferentes facilitando a visualiza o de regi es conservadas Clicar em Show Colors Alinhamentos globais utilizando a ferramenta DiAlign 1 Acessar o site http www genomatix de cgi bin dialign dialign pl 2 Na primeira caixa na se o Sequence Input cole as sequ ncias a serem alinhadas Dica utilize sequ ncias no formato FASTA que ser o automaticamente reconhecidas 3 Na se o Sequence type selecione o tipo de alinhamento entre DNA sequence e Protein sequence 4 Clique em Load sequences for DiAlign 5 pr xima p gina permite ao usu rio decidir alguns par metros do alinhamento e tamb m do resultado output Ap s decidir quais par metros ser o utilizados ou mant los clique em Start Alignment D gt gt cm Dica um dos par metros do resultado que interessante ser alterado a caixa Do not show non aligned blocks Ao clic la o alinhamento mostrar tamb m as regi es que n o foram alinhadas entre as sequ ncias utilizadas Dica 2 para decidir qual a melhor maneira de visualizar um resultado em particular importante testar e conhecer as op es de output Teste diferentes combina es 6 Analisar o resultado Verificar a se o Aligned sequences que mostra quais sequ ncias foram alinhadas cada uma identificada de maneira independente e m
388. s seres vivos Desta maneira os ensaios laboratoriais que envolvem o uso da gua devem ser feitos com gua de qualidade comprovada A primeira maneira de purificar a gua para uso laboratorial a destila o que imita o processo natural da evapora o 2 A gua destilada empregada em praticamente todos os trabalhos de laborat rio A destila o da gua composta por duas etapas Na primeira etapa alguns elementos volatilizam antes da ebuli o da gua Na segunda ocorre a destila o da gua propriamente dita medida que a gua em ebuli o evapora ocorre a condensa o da mesma em uma coluna de destila o onde o vapor d gua resfriado A gua que se condensa pela coluna de destila o destilado recolhida em recipiente adequado no fim da coluna de destila o 1 3 1 gua destilada 2 A gua destilada empregada em praticamente todos os trabalhos de laborat rio A destila o da gua composta por duas etapas Na primeira etapa alguns elementos volatilizam antes da ebuli o da gua Na segunda ocorre a destila o da gua propriamente dita medida que a gua em ebuli o evapora ocorre a condensa o da mesma em uma coluna de destila o onde o vapor d gua resfriado A gua que se condensa pela coluna de destila o destilado recolhida em recipiente adequado no fim da coluna de destila o 1 3 2 gua bidestilada Em certos casos a gua destilada comum n
389. s uma vez 12 Coletar a fase aquosa superior e transferir para um novo tubo e adicionar um volume igual de isopropanol 13 Centrifugar por 5 minutos a 12 000 rpm 14 Lavar o pellet com 1 mL de etanol 70 por duas vezes para remover sais e secar ao ar ou sob v cuo num dessecador 15 Ressuspender o DNA em 20 pL de tamp o TE contendo ribonuclease RNAse 10 ug uL l Em geral prepara se um estoque dissolvendo 100 mg de RNAse em 10 mM de Tris HCl pH 7 5 e 15 mM NaCl aquecer em gua fervente por 15 minutos e resfriar lentamente temperatura ambiente M todo de Dellaporta et al 1983 1 Ligar o Vapor trap e o banho a 65 C 2 Homogeneizar material em nitrog nio liquido 3 Adicionar 500 pl EB manter no gelo Dica Realizar at o passo 8 na capela de exaust o 4 Adicionar 35 uL de SDS 20 agitar no v rtex e manter a 65 C por 10 minutos 5 Adicionar 130 uL de Acetato de S dio 5 M e manter no gelo por 5 minutos 6 Agitar no v rtex e centrifugar a 13 000 rpm por 5 minutos 7 Transferir sobrenadante para novo tubo 8 Adicionar 60 uL de Acetato de S dio 5 M e 640 uL de Isopropanol Absoluto 9 Agitar no v rtex e centrifugar a 13 000 rpm por 10 minutos 10 Descartar sobrenadante 11 Ressuspender o pellet em 200 pL de BTE 12 Agitar no v rtex e centrifugar a 13 000 rpm por 5 minutos 13 Transferir sobrenadante e adicionar 20 pL Acetato de S dio 5 M e 450 pL Etanol Absoluto 14
390. saio com papel filtro previamente impregnado e seco com uma solu o metan lica de hidr xido de pot ssio 5 Ap s 10 minutos o papel ser exposto luz ultra violeta UV de 365 nm O desenvolvimento da fluoresc ncia azul e amarela indica a presen a de cumarinas vol teis Sugere se utilizar como padr o sementes de flavatonca ricas em cumarinas vol teis Quinonas Pesam se 0 2 g dos extratos vegetais e extrair em banho maria fervente durante 10 minutos com 5 mL de hidr xido de pot ssio 5 Resfria se filtra se o extrato e acidifica o com cido ac tico Em seguida extrai se com 5 mL de tolueno em funil de separa o Separa se em um b quer a fase org nica e adicionam se 2 mL de solu o de hidr xido de pot ssio 3 O desenvolvimento de colora o vermelha indica a presen a de antraquinonas a colora o viol cea indica a presen a de naftoquinoides e o surgimento de colora o azul indica a presen a de benzoquinoides Para verificar a presen a de quinonas glicos dicas ferve se em banho maria cerca de 0 1 g dos extratos vegetais com 10 mL de cido clor drico 10 durante 15 minutos Resfria se filtra se e adicionam se 5 mL de tolueno ao extrato Separaram se as fases Na fase org nica adicionam se 2 mL do reagente de Borntrager O aparecimento da colora o vermelha na fase aquosa indica a presen a de quinonas glicos dicas Saponinas Esta an lise ser baseada na propr
391. sambientais com pt seguranca laboratorio html gt Acesso em 21 jan 2014 OLIVEIRA C M A et al Guia de laborat rio para o ensino de qu mica instala o montagem e opera o CRQ IV S o Paulo 2007 53 p 1 1 SEGURANCA NO LABORATORIO Em qualquer atividade de laborat rio necess rio conhecer os procedimentos b sicos de seguran a tais como Verificar a exist ncia de Equipamento de Prote o Coletiva EPC no laborat rio Ex capela de exaust o chuveiro de emerg ncia lavador de olhos cobertor de seguran a extintor de inc ndio no prazo de validade O laborat rio deve ter uma caixa de primeiros socorros gua oxigenada merc rio algod o esparadrapo material para curativo vaselina luva cir rgica Qualquer acidente dever ser comunicado ao respons vel do laborat rio N o deve ser permitida a entrada de pessoas estranhas na rea de trabalho do laborat rio N o retirar os ralos protetores dos orif cios de evacua o das pias Verificar ler o r tulo dos frascos antes de us los Manter as amostras e frascos de reagentes arrolhadas ou tampadas quando estes n o estiverem sendo utilizados Lubrificar as bordas da boca do tubo de vidro ao tamp los com rolha No caso de rolhas de borracha usar glicerina como lubrificante N o manter contato de solu es alcalinas com bordas esmerilhadas tampadas por longos per odos algumas horas pois o vidro pode soldar inutilizando
392. scartar todo volume de hipoclorito adicionar 500 ml de gua destilada est ril e manter as ra zes submersas por 1 minuto com agita o manual 5 Enxaguar as ra zes em gua destilada est ril por mais quatro vezes com troca de gua a cada nova lavagem 6 Transferir as ra zes para uma placa de Petri de vidro ou material similar e picot las com bisturi placa de Petri e bisturi dever o ser previamente esterilizados 7 Para o preparo das suspens es iniciais pesar 10 g de ra zes picotadas e adicionar a um frasco do tipo erlemeyer de 200 ml contendo 90 ml de solu o salina est ril NaCl 0 85 Realizar o procedimento em triplicata e manter os frascos sob agita o constante por 12 horas a 28 C 8 Aliquotar 1 ml da suspens o inicial 10 em um tubo de ensaio contendo 9 ml de solu o salina est ril NaCl 0 85 para o preparo da dilui o 10 Agitar fortemente a solu o resultante e repetir o procedimento at a obten o da dilui o 10 conforme abaixo 10 suspens o inicial 10 Iml de suspens o inicial 9ml de solu o salina 102 1ml da dilui o 101 9ml de solu o salina 10 Iml da dilui o 107 9ml de solu o salina 9 Em triplicata ou mais repeti es se desej vel inocular 100 uL de cada uma das suspens es 10 10 102 e 10 em diferentes frascos de vidro de 10 ml contendo 4 ml de meio de cultura semi s lido sem N LGI LGI P e ou Nfb conforme descrito abaixo e
393. sensensensnnees 237 10 7 SOLUBILIZA O DE FOSFATO DE C LCIO arteriais 238 10 8 PRODU O DE SIDER FOROS BACTERIANOS teares 239 10 9 ATIVIDADE DA ENZIMA ACC DEAMINASE itaim 241 CAP TULO 11 AN LISES B SICAS DE BIOINFORMATICA ccccsscssscssscssssscssssssssssssssssssssssessssssssssssssssessscsssssees 242 11 1 DESENHO DE INICIADORES PRIMERS PARA PCR UTILIZANDO SOFTWARES ONLINE 243 11 2 VERIFICA O DA QUALIDADE DOS PRIMERS PROJETADOS csscesssssseessesssesseessesssesssssseesuessecssecseesseeeseesse 244 11 3 PREPARA O DE ARQUIVO CONTENDO SEQU NCIA NO FORMATO FASTA osise 246 11 4 OBTEN O DE SEQUENCIAS REVERSO COMPLEMENTAR sessssssssssesssesssessecssesssessscsseessssssessessecssessseesueeseease 247 11 5 BUSCA DE SIMILARIDADE DE SEQU NCIAS UTILIZANDO UM BANCO DE DADOS DE SEQU NCIAS E AS FERRAMENTAS BLAST BASIC LOCAL ALIGNMENT SEARCH TOOL 248 11 6 ALINHAMENTO DE SEQUENCIAS DE NUCLEOT DEOS E PROTE NAS ALINHAMENTO GLOBAL 254 11 7 LOCALIZA O DE DOM NIOS CONSERVADOS EM SEQUENCIAS DE PROTE NAS 256 11 8 PREDI O DE DOM NIOS TRANSMEMBRANA A PARTIR DE SEQUENCIAS DE PROTE NAS 257 11 9 PREDI O DE LOCALIZA O SUBCELULAR PRESEN A DE PEPT DEO DE DIRECIONAMENTO N TERMINAL E DE SINAL DE LOCALIZA O NUCLEAR A PARTIR DE SEQU NCIAS DE PROTE NAS 258 11 10 IDENTIFICA O E AN LISE DA REGI O PROMOTORA DE GENES ORIUNDOS DE GENOMAS DE PLANTAS nisto alheia eddi
394. separar esse precipitado do restante da solu o atrav s da filtra o simples ou filtra o a v cuo Refer ncias POSTMA James M ROBERTS Julian L HOLLENBERG Leland Qu mica no Laborat rio Barueri SP Manole 5 edi o 2009 546 p ROSA Gilberto GAUTO Marcelo GON ALVES F bio Qu mica Anal tica Pr ticas de Laborat rio Porto Alegre Bookman 2013 128 p 1 20 PROCESSO DE SEPARACAO POR DECANTACAO Neste processo n o necess rio usar papel filtro para separar part culas insol veis Quando as part culas s o grandes e pesadas pode se deixar a solu o em repouso para promover a decanta o ou seja o dep sito das mesmas no fundo do recipiente A seguir derrama se cuidadosamente o l quido deixando as part culas s lidas Refer ncias ROSA Gilberto GAUTO Marcelo GON ALVES F bio Qu mica Anal tica Pr ticas de Laborat rio Porto Alegre Bookman 2013 128 p 1 21 TECNICAS DE PREPARO DE SOLUCOES Um dos procedimentos mais realizados em laborat rio o preparo de solu es As solu es s o definidas como misturas homog neas de dois ou mais componentes Duas palavras muito empregadas na discuss o das solu es s o soluto e solvente A subst ncia presente em maior quantidade geralmente chamada de solvente e a de menor quantidade soluto Os solutos podem ser de origem s lida ou l quida Ambos podem ter sua massa pesada em balan a Por m o mais comum que soment
395. sina 1 6 Preparar uma solu o estoque de 5 mg mL de tripsina Dica dissolver a tripsina em tamp o Tris HCl 20 mM pH 7 4 aliquotar em tubos de 1 ou 0 5 mL e manter congelado 20 C 1 7 Preparar uma solu o de trabalho de tripsina na concentra o de 0 1 mg mL Dica diluir a partir da solu o estoque usando o tamp o Tris HCl 20 mM pH 74 e aliquotar em tubos de 1 ou 0 5 mL At o momento do ensaio manter no gelo 4 C Ap s o ensaio manter congelado 20 C 1 8 Preparar 10 mL de uma solu o do substrato BAPNA Hidrocloreto de Na Benzoil DL arginina 4 nitroanilida 10 mM Dica Dissolver o BAPNA em uma solu o contento 9 partes de DMSO para 1 parte de gua miliQ Aliquotar o substrato em tubos de 0 5 mL e manter congelado 20 C 1 9 Pipetar os reagentes na microplaca de 96 po os de fundo chato conforme o esquema sugerido na tabela 2 Tabela 2 Protocolo do ensaio de tripsina Identifica o da E Tripsina Substrato roe amostra Tamp o pL 0 1 mg mL BAPNA 10 mM pL uL ug po o uL ug po o 2 10 1B 80 10 1 10 1C xa xa Xa 10 1 a0 As quantidades e o n mero de amostras a serem testadas devem ser definidas previamente e dependem de cada experimento Dicas O volume final de cada po o deve ser de 100 pL O volume de substrato e tripsina s o fixos O volume de amostra pode variar Utilizar o tamp o tris HCl 20 mM pH 7 4
396. smas Assim a mat ria gordurosa impede o perfeito escoamento nos aparelhos volum tricos causando inexatid o do trabalho indicado encher o aparelho volum trico com gua da torneira Retira se a mesma e observa se se houve escoamento completo ou se permanecem got culas que indicam a presen a de pontos gordurosos Lava se com detergente e escova enxaguando bem com gua da torneira e por ltimo procede se o enx gue com gua destilada 1 4 1 Uso de Detergente Existem diversas marcas de detergentes pr prios para limpeza de vidraria O Extran um dos mais conhecidos produzido pela Merck Existem tamb m outros tipos como o DECON 90 que produzido pela Decon Laboratories ou o DETERTEC produzido pela Vetec Estes podem ser dilu dos em v rias concentra es definidas no r tulo dependendo do grau de sujeira do aparelho a ser limpo Podem ter caracter sticas bem definidas como a o bacteriol gica ou isen o de alguma subst ncia qu mica como por exemplo o f sforo Coloca se o detergente no aparelho com got culas deixando se em contato por tr s a cinco minutos A seguir recolhe se a mistura para o frasco de origem Esta mistura tem um efeito corrosivo sobre a pele Portanto deve se manuse la com cuidado Ap s o aparelho lavado v rias vezes com gua da torneira e em seguida duas ou tr s vezes com gua destilada secando se as paredes externas D gt Cll 1 4 2 Cuidados a serem observados d
397. so muito importante pois n o pode ocorrer degrada o do material vegetal Anote o valor do peso de cada amostra 2 MEIO DE EXTRA O Preparar Mix para pulveriza o Para 1 rea o 750 pL Tamp o Fosfato de Pot ssio 200 mM pH 7 8 15 pL EDTA 10 mM 150 pL Acido Asc rbico 200 mM 585 pL Agua Milli Q Dica mantenha o Mix no gelo durante todo o processo de pulveriza o do material 3 PULVERIZA O Pulverizar a amostra fresca com nitrog nio l quido contendo PVPP 10 0 049 e acrescentar 1500 pL do meio de extra o Dica divida a al quota do tamp o de extra o desse modo com a primeira parte da al quota contendo 750 uL poss vel macerar com mais facilidade a amostra e verte la para eppendorf de 2 ml A segunda parte da al quota pode ser utilizada para recolher o restante do material que foi pulverizado evitando perda excessiva do mesmo Seja r pido e preciso na pulveriza o mantendo sempre a amostra gelada 4 CENTRIFUGA O Centrifugar a 12 000 g por 20 minutos a 4 C Ap s coletar o sobrenadante e armazenar em ultrafreezer 80 C ou no gelo at o momento das leituras DETERMINA O DA ATIVIDADE ENZIM TICA 1 SUPER XIDO DISMUTASE 560 nm Gianngiopolitis amp Reis 1977 Beauchamp amp Fridovich 1971 1 Preparar Riboflavina diluir 20 uL da solu o estoque em 10 mL de gua Dica utilize um becker pequeno forrado com papel alum nio Prepare uma solu o estoque
398. so desejar um banho com temperaturas levemente abaixo de 0 C deve se adicionar um pouco de cloreto de s dio ao banho atingido assim temperaturas de at 10 C Utilizando di xido de carbono s lido gelo seco adicionados a um banho com lcool isoprop lico pode se atingir temperaturas de 78 5 C Neste caso tome o cuidado para n o se queimar com o gelo seco J utilizando nitrog nio l quido pode se atingir temperaturas de 195 8 C Refer ncias CHRISPINO lvaro Manual De Qu mica Experimental S o Paulo Editora tica 2 Edi o 1994 230 Pp CIENFUEGOS Freddy Seguran a No Laborat rio Rio De Janeiro Interci ncia 2001 269 p LENZI Ervim et al Qu mica Geral Experimental Rio De Janeiro Freitas Bastos 2009 390 p 1 11 UTILIZACAO DE EVAPORADOR ROTATORIO ROTAEVAPORADOR Pode se evaporar um solvente sob press o reduzida utilizando se de evaporadores rotat rios Este aparelho cont m um motor que permite a evapora o r pida de solventes por aquecimento aplicando um v cuo no sistema promovendo tamb m o giro do bal o que cont m a solu o Pode se colocar um banho de gua sob o bal o para aquecer a solu o e aumentar a press o de vapor do solvente A velocidade de rota o do bal o e a temperatura do banho de gua podem ser selecionadas de acordo com o desejado Quando o solvente evapora os vapores s o resfriados pelo condensador e recolhidos em um bal o sendo que o produto
399. so em 30 mar 2014 gt gt Gm 1 2 PRINCIPAIS VIDRARIAS Nos laborat rios de pesquisa encontram se diversos tipos de vidrarias materiais cer micos e demais utens lios espec ficos para a execu o de determinadas an lises e preparo de amostra os principais s o 1 2 1 Materiais de vidro Tubo de ensaio utilizado para efetuar rea es qu micas em pequena escala principalmente testes de rea es Figura 1 1 Bequer recipiente com ou sem gradua o utilizado para o preparo de solu es aquecimento de l quidos recristaliza o etc Figura 1 2 Erlenmeyer frasco utilizado para aquecer l quido ou fazer titula es Figura 1 3 Kitassato frasco de paredes espessas munido de sa da lateral e usado em filtra es a v cuo Figura 1 4 Bal o volum trico recipiente calibrado de precis o destinado a conter um determinado volume de l quido a uma dada temperatura utilizado no preparo de solu es de concentra o definidas Figura 1 5 Proveta frasco com gradua es destinado a medidas aproximadas de l quidos Figura 1 6 Bureta equipamento calibrado para medida precisa de volume de l quidos Permite o escoamento do l quido e muito utilizado em titula es Figura 1 7 Pipeta volum trica equipamento calibrado para medida precisa de volume de l quidos Existem dois tipos pipeta graduada e pipeta volum trica Figura 1 8 e 1 9 Funil uti
400. solamento de col nias realizar um estriamento em placas de Petry contendo meio de cultura com N LGI LGI P e ou Nfb conforme descrito acima correspondente ao do frasco de vidro e incubar em estufa 28 C por 1 ou 2 dias ou at obter col nias isoladas 12 Inocular diferentes col nias em tubos de ensaio contendo 3 ml de meio King B l quido Manter os tubos sob agita o constante 28 C por 24 a 48 h ou at turvar F Dica a escolha de uma ou mais col nias por placa opcional mas se d prefer ncia ao isolamento de col nias morfologicamente diferentes ou com distintas colora es Meio de Cultura Reagentes Para1 L Glicerol 15g King B Peptona 208g K HPO 1 15 g MgsO 7H O 1 50 g Triptofano 0 50 g gua destilada Completar volume para 1 L 13 Realizar a colora o de Gram com cada uma das amostras cultivadas em tubos de ensaio para avalia o da pureza do in culo 14 Aliquotar 1 2 mL do caldo bacteriano e 300 ul de glicerol puro est ril em tubos criog nicos de 2 mL a fim de se obter o estoque do isolado em glicerol 20 Dica importante que o tubo criog nico seja levemente agitado para uma mistura homog nea Mantenha os tubos por pelo menos 6 horas a temperatura ambiente antes de estoc lo 20 C Se poss vel armazene os tubos criog nicos a 80 C Refer ncia D BEREINER J BALDANI V L D BALDANI J I 1995 Como isolar e identificar bact rias diazotr ficas de plantas n
401. solubilidade e do estado de desnatura o da prote na da presen a de sais e de outros aditivos utilizados no processamento dos alimentos Pode se medir a capacidade de forma o de espuma a partir do aumento do volume de uma dispers o proteica que pode ser provocada por agita o Para que as mesmas tenham boa capacidade de formar espuma as prote nas devem formar uma membrana em torno das bolhas de ar passando por certo grau de desnatura o que parece ser cr tico para a estabiliza o das espumas e de sua estrutura tridimensional Geralmente o poder espumante aumenta com a concentra o proteica at um valor m ximo A forma o de espuma pode ser influenciada pelo pH sais a cares lip dios e a concentra o proteica Equipamentos Liquidificador Vidrarias utens lios e outros Proveta graduada Balan a anal tica Esp tula B quer Procedimento Prepara se uma suspens o proteica de 5 g de amostra com 100 mL de gua A suspens o deve ser agitada em liquidificador dom stico por 5 minutos sob agita o m dia em seguida transfere a dispers o para uma proveta graduada de 250 mL sendo que a capacidade de forma o de espuma calculada da seguinte forma CFE B A x 100 A Onde A volume antes da agita o mL B volume ap s a agita o mL 7 11 4 Digestibilidade in vitro A digestibilidade um fator extremamente importante na determina o do valor nutritivo de uma prote na As prote
402. stante 4 Medir a condutividade el trica do extrato L1 utilizando um condutiv metro 5 Ferver as amostras por 1 hora com os tubos vedados 6 Medir novamente a condutividade el trica L2 7 O percentual de danos nas membranas DM estimado pela rela o DM L1 L2 x 100 Refer ncias BLUM A Ebercon A Cell membrane stability as a measure of drought and heat tolerance in wheat Crop Science 21 43 47 1981 SILVEIRA J A G Melo A R B Vi gas R A Oliveira J T A Salt induced effects on the nitrogen assimilation related to growth in cowpea plants Environmental and Experimental Botany 46 171 179 2001 4 6 LOCALIZA O HISTOQU MICA DA PEROXIDA O LIP DICA UTILIZANDO O REAGENTE DE SCHIFF Este m todo identifica os grupamentos alde dos que s o produzidos em resposta peroxida o de lip dios sendo um excelente marcador de estresse oxidativo e senesc ncia Reagente de Schiff 2 g de fucsina b sica 20 mL de HCl 1 N 2 g de metabissulfito de s dio 4 g de carv o ativado 400 mL de gua destilada T cnica para preparar o reagente de Schiff 1 Ferver a gua destilada em um bal o volum trico 2 Remover do calor e lentamente adicionar a fucsina b sica sempre agitando aproximadamente 5 minutos 3 Deixar esfriar para 50 C e adicionar o HCI Filtrar 4 Esfriar para 25 C e adicionar o metabissulfito de s dio Agitar bem aproximadamente 1 hora 5 Envolver o recipiente e
403. stra contendo agora apenas 1 mL Dica esse material pode ficar estocado no freezer desde que tampado com rolhas e identificado COLORA O a As l minas devem ser retiradas das cubetas contendo gua destilada com pin a deixando a parte superior molhada barriguinha de tens o superficial b Pingar na l mina 3 a 4 gotas do material na vertical utilizando pipeta de Pasteur de pl stico c Deixar secar em temperatura ambiente sob papel absorvente d Preparar a solu o de Giemsa a 20 em Tamp o PBS e Preencher toda a l mina com a solu o de Giemsa 20 f Deixar agir por 5 min m ximo 7 min g Desprezar o corante em gua corrente abundante h Desprezar o excesso de gua batendo a l mina lateralmente em papel absorvente i Deixar secar em temperatura ambiente j Quando secas observar no microsc pio se as l minas est o boas para a an lise ANALISE Crit rios para sele o das c lulas Analisar 1000 c lulas binucleadas lamina em aumento de 1000 vezes com as seguintes caracter sticas n cleos intactos e tamanhos aproximadamente iguais n cleos com o mesmo padr o de colora o e dentro do limite citoplasm tico membrana celular intacta c lula claramente distingu vel das c lulas adjacentes Caracter sticas do micron cleo Morfologia id ntica dos n cleos principais di metro entre 1 16 at no m ximo de 1 3 dos n cleos principais mesma colora o dos n cleos n o es
404. stufa entre pesagens at massa constante 30 minutos Queijo Massa da amostra 5 g Temperatura da estufa 102 2 C Tempo at a primeira pesagem 3 horas Tempo na estufa entre pesagens at massa constante 1 hora Manteiga e Margarina Massa da amostra 5 g Temperatura da estufa 102 2 C Tempo at a primeira pesagem 3 horas Tempo na estufa entre pesagens at massa constante 30 minutos Leite fermentado Massa da amostra 5 g em c psula contendo p rolas de vidro Temperatura da estufa 102 2 C Tempo at a primeira pesagem 4 horas Tempo na estufa entre pesagens at massa constante 1 hora 6 C lculos umidade e vol teis massa da c psula vazia massa da amostra peso constante final x 100 massa da amostra s lidos totais 100 umidade e vol teis Refer ncias BRASIL Minist rio da Agricultura Secretaria Nacional de Defesa Agropecu ria Laborat rio Nacional de Refer ncia Animal M todos anal ticos oficiais para controle de produtos de origem animal e seus ingredientes m todos f sicos e qu micos Bras lia DF 1981 v II cap 15 p 1 gt gt Cm 7 8 DETERMINA O DE LIP DIOS Esse m todo empregado na determina o do teor de lip dios em amostras de alimentos obtidos por meio de processos de cultivo de microrganismos ou seja de alimentos fermentados Consiste no tratamento da amostra com cido sulf rico e lcool isoam lico O cido
405. suscsscssscsssecsneeesscesscessecaseeeses 176 7 7 DETERMINA O DA UMIDADE VOL TEIS E S LIDOS TOTAIS emerson 178 7 8 DETERMINA O DE LIP DIOS ereta tastada a b ereta tirar reter terrenas 180 7 9 DETERMINA O DO NITROG NIO TOTAL ssssssssssssssssssssscsssssssssssssecsssscssssscsssessssesssecssssecsssecesssccssscessesessseessseeenses 181 7 10 DETERMINA O DE PROTE NA SOL VEL sccsssssssesssssssssssssssssesssecsssesssecssecssecssscssssessssssscesscsssscsnseesecesscessessseeeses 184 7 11 AN LISE DAS PROPRIEDADES FUNCIONAIS E NUTRICIONAIS DE PROTE NAS eee 186 7 12 DETERMINA O DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE cssessssssssssssssssssesssssssesssecssscssssssuscssscesscsssessnsessucssscessecaseeeses 191 7 13 DETERMINA O DA DEMANDA QU MICA DE OXIG NIO DQO east 194 7 14 DETERMINA O DE POLIFEN IS TOTAIS sccssssssssssssessssssssssssesssscsssesssssssesssecsssessusesuscssesssscssseessssesscssscessecaseeeses 197 7 15 AVALIA O QUALITATIVA DE METAB LITOS SECUND RIOS DE PLANTAS 200 CAP TULO 8 CULTURA DE C LULAS ANIMAIG ccccccccsssssseccssscsscecsssscecsscsccsssccacscsscecsssscsscscscsassceacacacacscsacscsacace 205 8 1 CULTURA E MANIPULA O DE LINHAGENS CELULARES 0 cece eceesescccccecsssccececessnscccececesseacecececssceeeeeeseneeee 206 8 2 CULTURA PRIM RIA DE C LULAS FOLICULARES DE TIREOIDE HUMANA inatas 210 CAPITULO 9 CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS cscsesdsassscsusctousen
406. t por 1 hora a 35 C 20 Ressuspender o pellet em 30 pL de TE2 Solu o Componentes Quantidade Objetivo TE2 Tris 1 M pH 8 1 mL CFinal 10 mM Manter o DNA extraido em ambiente EDTA 0 5 M pH 8 200 uL CFinal 1 mM adequado Agua destilada est ril Completar para 100 mL Armazenamento na geladeira C concentra o final Final 21 Para verificar a efici ncia a extra o do DNA checar 2 uL da solu o em gel de agarose 0 8 2 4 EXTRACAO DE DNA BACTERIANO DE SOLO O solo intensamente habitado por micro organismos promotores de crescimento de plantas Esta extra o de DNA consiste na separa o das c lulas procari ticas dos agregados de solo lise celular e sucessivas lavagens com o objetivo de remover o material org nico contido no solo e que inibe muitas rea es de biologia molecular 1 Separar o solo das ra zes da planta 2 Pesar 10 gramas de solo e adicionar este a 50 mL de solu o de Crombach Deixar agitando por 10 12 horas Solu o Composi o Quantidade Objetivo Crombach EDTA 0 5 M pH8 2 mL China 1 mM Estabilizar a Tris HCl 4g Cora 25 mM solu o gua destilada Completar o volume para 1 L Chin Concentra o final 3 Centrifugar o sobrenadante em tubos Falcon 15 mL a 10 000 rpm por 10 minutos Repetir o procedimento at obter um pellet de aproximadamente 3 gramas 4 Ressuspender o pellet obtido em 8 mL de solu o de Crombach e adicionar 0 1 grama de Lis
407. tPAN Promoter Analysis Navigator 1 Acessar o site http plantpan mbc nctu edu tw Dica para encontrar diretamente digite plantpan no Google 2 Na parte superior clique no cone Promoter Analysis 3 Copiar e colar a sequ ncia do promotor a ser analisado na caixa Please Input The Promoter Sequence in FASTA Format 4 Na se o Please Select What You Want To Analyze poss vel selecionar alguns par metros da an lise Clicando na op o Transcription Factor Binding Sites ser o buscados s tios regulat rios na sequ ncia do promotor necess rio tamb m escolher qual a esp cie de planta que est sendo analisada clicando na mesma logo abaixo Clicando na op o Tandem Repeat repeti es in tandem ser o identificadas caso estejam presentes Estas repeti es embora muitas vezes ainda n o descritas podem conter s tios regulat rios Clicando na op o CpNpG s tios contendo uma citosina seguido de qualquer nucleot deo seguido de guanina ser o identificados Estes s tios s o comumente metilados em promotores podendo levar diminui o da taxa de transcri o a partir do promotor Clicando em miRNA target Site ser o identificados s tios de complementariedade com microRNAs conhecidos Estes pequenos RNAs t m papel importante na regula o g nica 5 Analisar os resultados Para cada op o de an lise selecionada na p gina anterior mostrada uma figu
408. tagem e o tempo O equipamento possui diversos programas que podem ser padronizados para cada tipo de amostra ou massa molecular da prote na de interesse Para o protocolo padr o de um minigel no cassete A acesse os seguintes comandos List gt Bio Rad gt 1 mini gel gt StandardSD gt Run gt A Run 10 Encerrada a transfer ncia retirar o cassete do equipamento e abri lo com cuidado Descartar tudo menos a membrana de nitrocelulose Dica use marcador pr corado para confirmar se a transfer ncia ocorreu corretamente Alternativamente pode se corar a membrana de nitrocelulose com uma solu o de Ponceau S 0 1 100 mL de Ponceau 0 1 Ponceau S 0 1 g do produto cido Ac tico 5 mL do produto Na HPO 14 4 g do produto KH PO 2 4 g do produto Agua ultrapura 80 mL do produto Ajustar para 100 mL com gua ultrapura Armazenar 4 C n o congelar A solu o pode ser reutilizada para corar membranas at 10 vezes 11 Proceder com o bloqueio da membrana colocar a membrana de nitrocelulose em um recipiente com MTPBS tendo o cuidado de cobrir ela totalmente Incubar em agitador orbital por 1h a 4 C Dica cortar um das pontas da membrana para identificar a posi o do marcador e o sentido da pipetagem 12 Descartar o MTPBS 13 Incubar a membrana com o anticorpo prim rio 6 a 16 horas homogeneizando sob refrigera o Dica certificar se de que a membrana est totalmente submersa para ocorrer a liga o
409. tamanhos distintos b Genotipagem de SNP PCR RFLP A metodologia de genotipagem de SNP por PCR RFLP PCR Restriction Fragment Length Polymorphism baseia se na detec o de padr es eletrofor ticos distintos ap s digest o das amostras a serem genotipadas com enzima de restri o espec fica Por apresentarem sequ ncias distintas os dois alelos poss veis t m rea es diferentes ap s a clivagem e tal diferen a fica vis vel ap s a realiza o da eletroforese Para realiza o da metodologia de PCR RFLP portanto necess rio que o polimorfismo crie ou anule um s tio de restri o para alguma enzima Ou seja apenas um dos alelos poss veis apresentar o s tio de restri o de modo que em amostras de DNA que contenham tal alelo o produto de PCR ser clivado e observado na forma de fragmentos menores ap s a eletroforese Tr s etapas comp em tal metodologia de genotipagem I Amplifica o do fragmento de interesse consiste na realiza o de uma PCR utilizando primers espec ficos localizados em regi o externa ao local de ocorr ncia do SNP Dica antes de fazer a clivagem checar o produto da PCR em uma eletroforese simples que objetiva a visualiza o de bandas de apenas um tamanho II Clivagem do produto da PCR com enzima de restri o espec fica as condi es para a rea o de clivagem variam de acordo com a enzima utilizada Cada enzima de restri o apresenta uma determinada concentra o
410. tar ligado ou conectado a um dos n cleos principais e nem sobreposto Par metros considerados na an lise N mero de c lulas binucleadas Distribui o de c lulas binucleadas com 0 1 2 3 ou mais MNs em 1000 c lulas binucleadas N mero total de micron cleos nas c lulas binucleadas Frequ ncia de MNs 1000 c lulas binucleadas Frequ ncia de c lulas binucleadas 500 c lulas vi veis ndice de Divis o nuclear IDN IDN M 2 M 3 M 4 M N M M n de c lulas com 1 2 3 e 4 n cleos N n total de c lulas vi veis Teste de Micron cleo c lulas em ades o PRODUTOS UTILIZADOS Tripsina EDTA Soro Bovino Fetal Formalina 1 Citrato de S dio 1 Fixador Carnoy 3 metanol 1 cido ac tico Citocalasina B 4 pg mL Solu o de Giemsa 20 em PBS PREPARO DAS SOLU ES Meio DMEM HAM F10 para linhagem CHO K1 1000 mL gua Mili Q autoclavada 8 656 g DMEM 4 9 g HAM F10 1 2 g NaHCO bicarbonato de s dio 0 1 g Penicilina 0 06 g Estreptomicina Biotecnologia Ajustar o pH para 7 3 antes de filtrar o meio Realizar a filtra o do meio com filtro 0 22 tm Solu o de Hanks 1000 mL gua Mili Q autoclavada 1 embalagem de Hanks em p 1 8 g de NaHCO bicarbonato de s dio Realizar a filtra o da solu o de Hanks com filtro 0 22 ym PREPARO DAS L MINAS 1 Utilizar sempre l minas novas de prefer ncia com tarja fosca 2 La
411. tas constitui uma das reas de maior xito da biotecnologia Ap s meio s culo de progresso conquistou destacada posi o na propaga o comercial e industrial de plantas A t cnica permite a preserva o de material gen tico in vitro vindo a somar com as demais ferramentas utilizadas atualmente na conserva o de esp cies ou mesmo gen tipos espec ficos Possibilita a conserva o de plantas ou tecidos de diferentes proced ncias em condi es de crescimento m nimo ou associado criopreserva o para uso no melhoramento gen tico para evitar a extin o de esp cies ou mesmo para interc mbio entre institui es sem os riscos de dissemina o de pragas ou doen as A aplica o da t cnica de cultura de tecidos vegetais exige uma sequ ncia de procedimentos conforme descrito a seguir 1 Prepara o de solu o estoque 2 Prepara o do meio de cultura 3 Obten o e desinfesta o dos explantes 4 Estabelecimento dos explantes e condi es de incuba o 5 Manuten o das plantas matrizes 9 1 PREPARACAO DE SOLUCOES ESTOQUE PARA O MEIO MS As solu es estoque s o necess rias quando os meios s o utilizados com relativa frequ ncia um ou mais litros por semana pois agilizam os trabalhos O volume e a concentra o de cada solu o depender o da demanda do laborat rio Assim quando o consumo baixo diminui se a concentra o e ou o volume das solu es estoque para que a solu o n o perma
412. tato com a amostra 2 3 ASCORBATO PEROXIDASE 290 nm 10 em 10 segundos por 90 segundos Nakano amp Asada 1981 1 Colocar no banho maria a 27 C o tamp o de incuba o contendo 500 uL de tamp o fosfato de pot ssio 200 mM pH 7 0 50 pL de cido asc rbico 10 mM e 350 uL de H O e deixar em banho maria por 5 minutos 2 Preparar o cido asc rbico eo HO cido Asc rbico 1 pesar 0 176 g e diluir em 10 mL de gua 2 pegar 1 mL da solu o e diluir em 9 mL de gua Milli Q H O Pegar 160 pL do per xido preparado para a CAT e diluir em 20 mL de gua 3 BRANCO preparar uma rea o para zerar o equipamento contendo 500 uL de fosfato de pot ssio 50 pL de cido asc rbico 50 pL de H O e 400 pL de HO PARA A HORA DA LEITURA 4 Pipetar no tamp o de incuba o em banho maria 37 5 pL de H O 50 pL do HO 2 mM e 12 5 pL da amostra Verter em cubeta de quartzo e submeter leitura em espectrofot metro a 290 nm Volume final da rea o 1 mL Observa o programe o espectrofot metro para uma leitura cin tica com dura o de 90 segundos com intervalos de 10 em 10 segundos O que deve ser observado o decr scimo na absorb ncia Dica o 4 passo de leitura da enzima deve ser feito de forma r pida e precisa pois o H O desencadeia o processo de redu o pela enzima ao entrar em contato com a amostra 2 Refer ncias ANDERSON M D PRASAD T K STEWART T R Changes in isozyme p
413. tecnologia PPGBiotec do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 9547985850246718 Luc lia Hoehne Quimica Industrial doutora em Quimica UFSM professora do Centro de Ci ncias Exatas e Tecnol gicas CETEC e do Programa de P s Gradua o em Biotecnologia PPGBiotec do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 1088266827926373 Luc lia Santi Bi loga doutora em Biologia Celular e Molecular UFRGS p s doutoranda no Proteomic Mass Spectrometry Lab Department of Chemical Physiology The Scripps Research Institute La Jolla CA EUA http lattes cnpq br 7154170979832540 Luciana Knabben Oliveira Becker Delving M dica mestranda do Programa de P s Gradua o em Biotecnologia PPGBiotec do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 1880043506615687 Marcia Ines Goettert Farmac utica doutora em Ci ncias Farmac uticas Universidade de Tuebingen professora do Centro de Ci ncias Biol gicas e da Sa de CCBS e do Programa de P s Gradua o em Biotecnologia PPGBiotec do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 5742493416858879 Mardja Manssur Bueno e Silva Acad mica do curso de Ci ncias Biol gicas da Universidade Federal do Rio Grande do Sul UFRGS http lattes cnpq br 6836121028944714 Marelise Teixeira Acad mica do curso de Ci ncias Biol gicas do Centro Universit rio UNIVATES http lattes cnpq br 4505465308986872
414. teico de um tecido de mam fero ex mioc rdio mucosa intestinal consiste na macera o da amostra em solu o com de lise da membrana celular Para tanto se utiliza um homogeneizador de tecido seguido de centrifuga es para separar debris celulares e prote nas elu das na solu o As amostras processadas podem ser quantificadas por m todos usuais e analisadas por SDS PAGE Extra o de prote nas 1 Dissecar 1 cm de amostra e pesar cerca de 100 mg Dica realizar todo o procedimento com as amostra em contato com gelo para evitar degrada o das prote nas 2 Fatiar a amostra em uma placa de petry utilizando tesoura de ponta fina ou lamina de bisturi 3 Acondicionar as amostras em microtubos e rotul los devidamente 4 Adicionar 500 pL de Tamp o de lise nos microtubos com as amostras 50 ml 50 mM Tris 0 3025 g do produto 150 mM 0 4383 g do produto 1mM EDTA 0 01861 g do produto 0 1 SDS 0 050 g do produto 1 Triton X 100 500 uL do produto Inibidor de protease a escolher Dica pesar os reagentes em p e ap s ressuspender estes em 40 mL de H O ultrapura adicionar os reagentes l quidos Triton X 100 e inibidores de protease Fazer no dia da extra o mantendo o gelado 5 Homogeneizar as amostras em homogeneizador 5x de 1 minuto ou at a obten o de extrato aquoso Adicionar 650 pl de clorof rmio lcool isoam lico 24 1 e misturar at formar uma emuls o Dica limpar o homogeneizador entre
415. tir metro de modo a promover a mistura completa dos l quidos no interior do aparelho tomando precau es para evitar acidentes e mantendo o polegar sobre a tampa 7 Centrifugar durante 5 minutos de 1 000 a 1 200 rpm com a rolha para baixo 8 Transferir para banho maria a 65 C por 5 minutos com a rolha para baixo 9 Repetir as opera es de centrifuga o e de incuba o 10 Ler a porcentagem de gordura diretamente na escala do aparelho e na base do menisco formado pela camada de gordura imediatamente ap s retirar o aparelho do banho maria Se a coluna n o estiver bem delineada misturar novamente o conte do do aparelho e repetir os procedimentos de centrifuga o e aquecimento Refer ncias BRASIL Minist rio da Agricultura Secretaria Nacional de Defesa Agropecu ria Laborat rio Nacional de Refer ncia Animal M todos anal ticos oficiais para controle de produtos de origem animal e seus ingredientes m todos f sicos e qu micos Bras lia DF 1981 v II cap 14 p 4 5 MERCK Reactivos diagn stica productos qu micos 1992 93 Darmstadt 1993 1584 p 7 9 DETERMINACAO DO NITROGENIO TOTAL Esse m todo empregado na determina o do teor de prote nas de amostras de alimentos obtidos por meio de processos de cultivo de microrganismos ou seja de alimentos fermentados O procedimento do m todo baseia se no aquecimento da amostra com cido sulf rico para a digest o at que o carbono e o hidrog nio sej
416. todos de anestesia e eutan sia sugeridos aqui est o de acordo com o NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals edi o revisada em 1996 http www nap edu readingroom books labrats Materiais Mesa cir rgica Seringa descart vel para insulina com agulha 1 mL 13 X 0 45 mm 26 G 2 Fio cir rgico de Nylon monofilamento 4 0 45 cm 3 8 est ril n o absorv vel sem agulha Material cir rgico pin a simples reta pin a dente de rato pin as hemost ticas e tesoura reta C nula de gavagem para ratos Fita para medi o de pH L mina de a o para realizar tricotomia ou raspador el trico PBS Etanol 80 HCI 5 Pantoprazol Pentobarbital s dico Procedimentos 1 Pesar os animais identific los e dividi los em grupos de no m ximo 4 indiv duos por caixa 2 Vinte e quatro horas antes da realiza o do experimento retirar a ra o dos animais mantendo os em jejum de alimentos s lidos com acesso somente gua 3 Com o aux lio da c nula de gavagem injetar nos animais por via oral a subst ncia a ser testada ou o controle positivo pantoprazol 40 mg kg D gt cm 4 Ap s 1 hora tamb m com o aux lio da c nula de gavagem administrar 5 mL kg da mistura ulcerog nica 80 etanol 5 HCl 5 Ap s 4 horas da administra o da mistura ulcerog nica sacrificar os animais pela inje o i p de pentobarbital s dico 50 mg kg 6 Dispor o ani
417. tol n o sejam armazenados em forma de solu o e sim pesados no momento da prepara o do meio 9 2 PREPARO DO MEIO DE CULTURA MS MURASHIGE E SKOOG Dentre os v rios tipos de meio de cultura que existem o meio MS proposto por Murashige e Skoog 1962 o mais utilizado Para o seu preparo necess rio adquirir os componentes listados na tabela 2 A quantidade necess ria de cada um dos componentes para o preparo de um litro de meio tamb m indicada na tabela 2 Existe a op o da aquisi o de fornecedores de produtos qu micos o meio MS como pr misturas em quantidades suficientes para preparar v rios litros de meio Possibilita economia com m o de obra e com local para armazenamento de reagentes e solu es No entanto n o poss vel modificar a propor o dos seus componentes Recomenda se que O meio de cultura seja preparado preferencialmente alguns dias antes da incuba o Quando preparado o meio de cultura as plantas matrizes a serem utilizadas para a obten o dos explantes j tenham sido selecionadas pois o meio n o pode ficar armazenado por muito tempo Tabela 2 Componentes do meio de cultura MS Murashige e Skoog com a respectiva quantidade para o preparo de um litro de meio MS Componentes mg L Macronutrientes CaCl 2H O Cloreto de calcio dihidratado 440 KH PO Fosfato de potassio 170 KNO Nitrato de pot ssio 1900 Sulfato de magn sio MES 10 heptahidratado aag NH NO N
418. tos 2009 390 p PAVIA Donald L et al Qu mica Org nica experimental T cnicas de escala pequena Porto Alegre Bookman 2009 880 p POSTMA James M ROBERTS Julian L HOLLENBERG Leland Quimica no Laborat rio Barueri SP Manole 5 edi o 2009 546 p ROSA Gilberto GAUTO Marcelo GON ALVES F bio Qu mica Anal tica Pr ticas de Laborat rio Porto Alegre Bookman 2013 128 p D gt Cll 1 16 MEDIDAS DE VOLUME Em trabalhos de laborat rio as medidas de volume s o efetuadas com provetas graduadas quando se deseja uma medida aproximada de volume J quando se quer uma medida mais grosseira utilizam se b queres com escalas e quando se deseja medidas precisas utilizam se aparelhos volum tricos como pipetas e bal es volum tricos A leitura do volume de l quidos deve ser feita pela parte inferior do menisco 1 16 1 Pipetas H dois tipos de pipetas pipetas de transfer ncia ou volum tricas e pipetas graduadas As de transfer ncia apresentam um bulbo na parte central e apenas um tra o de refer ncia Servem para escoar um determinado volume de um recipiente para outro Com pipeta graduada pode se medir v rios volumes As figuras de pipetas j foram evidenciadas mas a t tulo de diferencia o a Figura 16 evidencia os diferentes tipos assim como tem se as pipetas autom ticas para volumes discretos Figura 16 Pipeta volum trica A pipeta graduada B e pipeta autom tica C A B C
419. tras do freezer e centrifugar a 16 000 g por 5 minutos a 4 C 6 Descartar o sobrenadante com aux lio de uma pipeta Dica tome muito cuidado para n o perturbar o pellet D gt gt Cll 7 Repetir os passos 4 5 e 6 mais duas vezes Dica Caso as amostras sejam de tecidos vegetais que apresentem alto teor de compostos fen licos e taninos repetir os passos 4 5 e 6 em torno de 4 a 5 vezes para uma melhor extra o destes componentes com a Solu o de Metanol 8 Inverter o eppendorf com a tampa aberta sobre um papel toalha para descartar qualquer res duo de metanol Dica O pellet n o necessita estar totalmente seco Por m qualquer res duo vis vel de solu o de metanol deve ser evitado 9 Adicionar 1 5 mL de acetona pr refrigerada a 20 C e agitar no v rtex por 30 segundos 10 Armazenar no freezer por 5 minutos 11 Centrifugar a 16000g durante 5 minutos a 4 C 12 Descartar o sobrenadante invertendo o tubo Dica Caso o pellet se mova descartar o sobrenadante com uma pipeta cuidando para n o perturbar o pellet 13 Adicionar novamente 1 5 mL de acetona pr refrigerada a 20 C e agitar no v rtex por 30 segundos 14 Armazenar no freezer por 5 minutos 15 Centrifugar a 16000 g durante 10 minutos a 4 C 16 Descartar sobrenadante com uma pipeta cuidando para n o perturbar o pellet 17 Deixar o pellet secar por 10 minutos para tanto deixar o eppendorf virado de lado com a tampa aberta sobre u
420. tratadas que se inicia o protocolo do ensaio clonogenico 1 Uma vez encerrado o tempo de tratamento de interesse retirar o meio de cultura tripsinizar as c lulas e acondicionar as mesmas em tubo falcon ou eppendorf 2 Contar as c lulas em hemocit metro ou cit metro de fluxo e determinar o volume necess rio para obter 100 c lulas para cada po o de placa de cultura de 6 po os Dica o ideal que o ensaio seja feito no m nimo em duplicatas Assim deve se fazer um mix total contendo 200 c lulas e 4 mL de volume final de meio de cultura para plaqueamento de 2 mL por po o contendo 100 c lulas em cada Dica 2 aconselh vel que seja feita uma dilui o do n mero de c lulas para que o volume a ser pipetado contendo as 100 c lulas n o seja inferior a 10 pL 3 Plaquear as c lulas em placa de 6 po os 100 c lulas em 2 mL de meio por po o e deixar estas c lulas proliferarem clonalmente por 10 15 dias com uma troca do meio de cultura no 7 dia ap s o plaqueamento Dica o tempo de crescimento de cada tipo celular varia algumas c lulas j mostram col nias com sete dias de crescimento enquanto outras levam em torno de 15 dias para isso Dica 2 alguns tipos celulares n o apresentam capacidade de prolifera o clonog nica inviabilizando o ensaio 4 Ap s o per odo de prolifera o celular fixar as c lulas adicionando lentamente 1 mL de metanol 100 gelado por 5 minutos a temperatura ambiente 5 Remover o
421. tria celular 5 Incubar as c lulas com 300 uL da solu o de marca o contendo o substrato X gal por 6 14 horas a 37 C em estufa sem Co Dica 1 deve se preparar um mix de solu o de marca o referente ao total de po os de interesse calculando o volume para n po os 1 por exemplo para placa de 24 po os deve se preparar volume para 7 5 mL de solu o de marca o com base na tabela abaixo Solu o 1mL 2mL 3mL 4mL 5mL 6mL 12mL X gal 20 mg mL 50pL 100uL 150uL 200uL 250uL 300uL 600 pL TF 200 mM c C trico 80 mM 500pL ImL 15mL 2mL 25mL 3mL 6mL NaCl 500 mM 300 pL 600uL 900npL 12mL 15mL 18mL 36mL MgCl 500 mM 4 pL 8uL 12pL 16uL 20uL 24uL 9 48pL K FeCN 50 mM 100pL 200pL 300pL 400pL 500pL 600pL 1 2 mL K FeCN 100 mM 50pL 100uL 150uL 200uL 250uL 300 nL 600 pL Dica 2 o tempo de incuba o com o substrato bastante vari vel dependendo do tipo celular Deve se padronizar esse per odo em experimento piloto com diferentes tempos de marca o a fim de evitar marca o falso positiva ou falso negativa 6 Retirar a solu o de marca o e contracorar os n cleos celulares por meio da incuba o com 300 pL de PBS 1x 300 nM de DAPI por 30 minutos no escuro Dica DAPI um corante fluorescente que se liga ao DNA Dica 1 esta marca o nuclear tem como objetivo dirigir a contagem posterior do n mero de c lulas positivamente marcadas para X gal 7 Retirar a solu o de marca o contendo DAPI e adi
422. tring ncia cutoffs Dica analisar a sequ ncia utilizando diferentes op es e comparar os resultados 6 Clicar em Submit 7 Analisar os resultados Os mesmos ser o apresentados em uma tabela contendo o nome da sequ ncia o tamanho da mesma e os valores para cada predi o mTP mitochondrial transit peptide pept deo de tr nsito mitocondrial CTP chloroplast transit peptide pept deo de tr nsito de cloroplasto pept deo sinal SP signal peptide e outras other E indicada de acordo com os valores de estring ncia definidos na p gina anterior qual a predi o final do programa na coluna Loc Tamb m mostrado o valor de confiabilidade da predi o RC reliability class que vai de 1 a 5 sendo 1 a mais confi vel e 5 a menos Predi o de sinal de localiza o nuclear utilizando SeqNLS A ferramenta SeqNLS permite a predi o de sequ ncia de localiza o nuclear indicando que a prote na deve se localizar no n cleo 1 Acessar o site http mleg cse sc edu seqNLS Dica para encontrar diretamente digite seqnls no Google 2 Colar a sequ ncia na caixa para submiss o 3 Selecionar a estring ncia Considere que o padr o j est marcado 0 86 4 Clique em Predict 5 Analisar os resultados Em Prediction result o identificador e a pr pria sequ ncia s o mostrados Regi es contendo prov veis sinais de localiza o nuclear s o mostrados em cores e o valor
423. ubado em meio MS com adi o de carv o ativado Imagem Ma ra Filter B Plantas em cultivo in vitro em sala de crescimento Imagem CSFior 8 1 A temperatura m dia das salas de crescimento de 25 C As plantas tropicais e subtropicais tendem a ser cultivadas em temperaturas levemente mais altas do que esp cies temperadas m dia de 27 C Quando uma varia o diurna noturna desejada normalmente adota se 25 C durante o dia e 20 C noite ou 28 C 24 C 8 2 Em geral para indu o de parte a rea a regi o do azul do espectro cr tica e a luz vermelha n o apresenta efeitos As l mpadas recomendadas para ilumina o das culturas in vitro s o do tipo fluorescentes brancas fria Plantilux ou com emiss es balanceadas nas regi es do azul 430 nm e vermelho 660 nm Assim em cultivo de tecidos quando se objetiva a multiplica o de plantas as l mpadas devem conter emiss es nesses espectros 8 3 As condi es de incuba o podem variar muito Escuro total ou intensidades de luz reduzidas s o teis nos primeiros dias ap s o isolamento para reduzir a oxida o fen lica O in cio da cultura no escuro tamb m indicado para evitar estresse em alguns explantes como meristemas de rizomas bulbos e ra zes 8 4 A luz de baixa irradia o na cultura de tecidos vegetais utilizada pelas seguintes raz es a o fornecimento de altos n veis de luz artificial caro e gera calor n o desejado b as c
424. ucessivas etapas de limpeza e purifica o 1 Separar a raiz do solo rizosf rico 2 Desinfestar as ra zes obtidas por imers o em lcool 70 e solu o de hipoclorito 2 por 2 minutos cada Ap s este procedimento lavar as ra zes com gua destilada e esterilizada cinco vezes 3 O tecido vegetal desinfestado obtido deve ser cortado em pequenos peda os 4 Adicionar 10 gramas do tecido a 90 mL de solu o salina est ril NaCl 0 85 e manter sob agita o por 12 horas a 28 C 5 Filtrar o sobrenadante com filtro de porcelana G1 est ril diretamente para um tubo Falcon est ril de 50 mL 6 Centrifugar a 5 000 rpm por 25 minutos Descartar o sobrenadante 7 Repetir os passos 5 e 6 at que toda a solu o do tecido vegetal seja filtrada 8 Ressuspender o pellet em 1970 uL de solu o TE1 e adicionar 50 uL de Lisozima 100 mg mL Manter a 37 C por 1 hora Dica para aumentar a efici ncia da lisozima a solu o pode ser levemente agitada a cada 15 minutos Dica recomendado colocar em banho a 37 C Solu o Componentes Quantidade Objetivo TE1 Tris 1 M pH 8 1 mL China 10 mM Solu o tamp o Inibir a atividade EDTA 0 5 M pH 8 5 mL Cn 25 mM das nucleases Agua destilada est ril Completar para 100 mL Esta solu o deve ser armazenada na geladeira C concentra o final Final 9 Adicionar 400 pL da Solu o de Lise agitar fortemente e manter a 60 C por 30 minutos agitando
425. uer com capacidade para 20 mL b Adicionar 10 mL de PBS 1X c Dissolver em microondas d Armazenar na geladeira Antes de ser utilizada deve ser dissolvida novamente em microondas Dica esta solu o pode ser armazenada em geladeira e ser reutilizada por at 3 vezes Agarose Normal Melting Point NMP 0 15 g de agarose Normal Melting Point 20mL de PBS 1X a Pesar a agarose e colocar em um b quer com capacidade para 50 mL b Adicionar 20 mL de PBS 1X c Dissolver em microondas d Armazenar na geladeira Antes de ser utilizada deve ser dissolvida novamente em microondas Dica a agarose n o dever ser reutilizada pois fus es sucessivas alteram sua concentra o PREPARO DAS LAMINAS 1 Utilizar sempre laminas novas de prefer ncia com tarja fosca 2 Lavar cada uma com detergente para retirar a gordura 3 Estocar em lcool 70 dentro da geladeira at o uso 4 Identificar as l minas no alto do canto esquerdo 5 Em um b quer misturar a agarose e o PBS 1X e levar ao microondas at que a agarose esteja totalmente dissolvida 6 Mergulhar as l minas deixando a ponta fosca de fora 7 Escorrer em papel absorvente e tirar o excesso de gel da regi o posterior da parte fosca 8 Deixar secar em temperatura ambiente Dica preparar as l minas no m nimo 6 dias antes de serem utilizadas PROCESSAMENTO Dica o processamento corrida e colora o devem ser realizados com o m nimo poss vel de lumi
426. uficientemente descritos em artigos frequentemente torna se dif cil ou mesmo imposs vel a reprodu o de experimentos b sicos em muitos laborat rios e grupos de pesquisa A publica o on line como livro eletr nico de Protocolos e m todos de an lise em laborat rios de biotecnologia agroalimentar e de sa de humana tem como objetivo central disponibilizar informa es sobre o uso de metodologia cient fica j testada em v rios laborat rios tornando mais acess vel e simplificada a aplica o de protocolos com enfoque multidisciplinar nas reas biom dicas e de sa de biol gicas em geral agr rias e de biotecnologia Os autores deste livro s o profissionais com forma o e background cient fico bastante diversificado e apresentam os protocolos de modo n o s a facilitar a busca das refer ncias e cita es mas tamb m para que pesquisadores e estudantes possam aplic los e reproduzi los de maneira simples A inser o de notas ou dicas durante a descri o completa dos protocolos gera alternativas de aplica o e revela a informa o que muitas vezes n o est descrita nos artigos e que fundamental para a reprodutibilidade dos experimentos e ensaios Simplificar o acesso a protocolos importantes com aplicabilidade em diversas e diferentes reas cient ficas o primeiro passo para o sucesso dos experimentos no desenvolvimento dos projetos de pesquisa base para o avan o cient fico e tecnol gico e principa
427. ultados O PSORT utiliza v rias informa es para chegar ao resultado mostrado no final da p gina S o indicados valores para cada poss vel localiza o subcelular Aquelas com valores mais altos s o as mais prov veis Notar que n o se trata de valores de probabilidade Predi o de localiza o subcelular utilizando PSORTII Esta vers o do PSORT permite a an lise de sequ ncias oriundas de animais e levedura 1 Acessar o site http psort hgc jp form2 html Dica para encontrar diretamente digite psort no Google Ao entrar na p gina busque e clique em PSORTII Prediction 2 Colar a sequ ncia na caixa Enter your AMINO ACID SEQUENCE 3 Clique em Submit 4 Analisar os resultados O PSORTII utiliza v rias informa es para chegar ao resultado mostrado no final da p gina S o indicados valores para cada poss vel localiza o subcelular mostrados em porcentagem Predi o de localiza o subcelular utilizando WolfPSORT O WolfPSORT a vers o mais atual do PSORT e permite a an lise de sequ ncias oriundas de animais plantas e fungos 1 Acessar o site http wolfpsort org Dica para encontrar diretamente digite psort no Google Ao entrar na p gina busque e clique em WolfPSORT Prediction 2 Escolher a origem da sequ ncia entre animal plant e fungi 3 Colar a sequ ncia na caixa Enter multifasta format protein sequence s here Dica
428. ulturas em ambientes lacrados tornam se superaquecidas em altas irradia es devido ao efeito estufa c a tecnologia de cultivo de tecidos vegetais evoluiu usando tecidos n o autotr ficos supridos com carboidrato 8 5 Em geral 16 horas de fotoper odo tem mostrado ser satisfat rio para v rias esp cies de plantas utilizando se l mpadas fluorescentes branco fria com intensidade luminosa de 1000 a 2000 lux Observa es a Para timo crescimento e desenvolvimento dos explantes in vitro as exig ncias em fotoper odo das culturas devem ser satisfeitas O in cio de determinado processo morfogen tico s se manifesta quando as culturas est o expostas a um adequado comprimento do dia b O fotoper odo influencia as plantas de duas maneiras uma pela regula o da quantidade de energia radiante captada e atrav s de um mecanismo controlador pelo qual as plantas s o capazes de reconhecer mudan as no ambiente Outra pela dura o do dia que pode influenciar n veis de reguladores do crescimento naturais dentro de tecidos de plantas cultivadas c Uma boa aera o parece ser necess ria para cultivo in vitro As plantas produzem oxig nio g s carb nico etileno alde do e outros compostos vol teis Na natureza estes compostos s o dissipados na atmosfera Em cultivo de tecidos esses gases podem ficar retidos no frasco alterando o desenvolvimento das plantas A acumula o de CO em altas concentra es conduz anae
429. uma regi o de ambas as sequ ncias ser o alinhadas E value indica a probabilidade de encontrar aquele alinhamento de maneira aleat ria ou seja quanto menor o valor maior a confian a sendo o E value 0 o mais confi vel e Identity indica quantos amino cidos id nticos s o encontrados apenas na regi o que foi alinhada D gt cm Dica dependendo do tipo de alinhamento feito um E value aceit vel pode variar Por exemplo se estamos alinhando sequ ncias de um organismo que apresenta grande n mero de sequ ncias depositadas no banco como humanos camundongo mosca da fruta ou arroz esperamos encontrar E value baixos pr ximo a zero J no caso de buscarmos sequ ncias obtidas a partir de um organismo que n o possui muitas sequ ncias no banco em geral iremos encontrar sequ ncias de outros organismos que apresentam similaridade mas n o s o id nticas Portanto nesse caso esperamos E value mais alto 1e por exemplo 9 Na se o Alignments poss vel ver os alinhamentos propriamente ditos Dica para acessar as sequ ncias encontradas para copi las e arquiv las em formato FASTA por exemplo basta clicar no n mero de acesso das mesmas nesta se o Uma nova janela aba ser aberta mostrando a sequ ncia e todas as informa es associadas a ela Busca por similaridade em banco de dados de prote nas utilizando sequ ncia de nucleot deos como query
430. urante a limpeza das vidrarias N o se deve agitar as pipetas buretas alco metros dens metros term metros durante a lavagem Deve se ter todo o cuidado ao colocar os vidros sobre o balc o pois no choque com cer micas podem se quebrar facilmente Os bal es volum tricos devem ser guardados abertos com a tampa amarrada por um cord o As solu es de limpeza devem ser utilizadas somente quando necess rio Refer ncias CHRISPINO lvaro Manual De Qu mica Experimental S o Paulo Editora tica 2 Edi o 1994 230 p CIENFUEGOS Freddy Seguran a No Laborat rio Rio De Janeiro Interci ncia 2001 269 p DECON 90 http www decon co uk english decon90 asp Acesso em 31 mar 2014 LENZI Ervim et al Qu mica Geral Experimental Rio De Janeiro Freitas Bastos 2009 390 p MERCK Reactivos diagn stica productos qu micos 1992 93 Darmstadt 1993 1584 p PAVIA Donald L et al Qu mica Org nica Experimental T cnicas de escala pequena Porto Alegre Bookman 2009 880 p POSTMA James M ROBERTS Julian L HOLLENBERG Leland Qu mica no Laborat rio Barueri SP Manole 5 Edi o 2009 546 p ROSA Gilberto GAUTO Marcelo GON ALVES F bio Qu mica Anal tica Pr ticas de Laborat rio Porto Alegre Bookman 2013 128 p UNIFEB Apostila de Qu mica Geral e Experimental 2009 Dispon vel em lt http xa yimg com kq groups 24693296 1821154571 name UNKNOWN PARAMETER VALUE gt Acesso
431. us de Abreu Waldow 4 1 EXTRACAO E QUANTIFICACAO DE CLOROFILAS As clorofilas s o os pigmentos naturais mais abundantes presentes nas folhas sendo fundamentais para a produ o de oxig nio e a cares por meio da fotoss ntese O conte do de clorofila nas folhas comumente utilizado para estimar o potencial fotossint tico e consequentemente analisar o desenvolvimento e crescimento da planta M todo de Ross 1974 1 Identificar e pesar os tubos eppendorf de 2 0 mL que ser o utilizados Pi 2 Pulverizar o material vegetal em nitrog nio l quido N utilizando cadinho e pistilo 3 Transferir para os tubos eppendorf em torno de 100 mg do material pulverizado 4 Adicionar 1 5 mL de Acetona 85 e agitar vigorosamente 5 Deixar em repouso por 30 minutos em local escuro Dica pode ser colocado em uma gaveta 6 Centrifugar a 12 000 rpm por 3 minutos 7 Coletar o sobrenadante em outro tubo pode ser um tubo Falcon de 15 mL e repetir o passo 4 e 6 com o pellet restante at a completa extra o das clorofilas que alcan ada quando o pellet apresenta se descolorido Colocar os tubos com o pellet em estufa a 60 C por no m nimo cinco dias Ap s pesar os tubos contendo o peso seco Pf 8 Acertar o volume final na proveta pra facilitar o c lculo posterior Dica Utilizar Acetona 85 para acertar o volume final em 10 mL 11 Realizar a leitura no espectrofot metro 645 nm e 663 nm 12 Calcular as concentra es
432. utos a 12 000 rpm 3 Descartar o sobrenadante e adicionar 700 pL de TES Homogeneizar e centrifugar por 3 minutos a 12 000 rpm Solu o Composi o Quantidade Objetivo TES Tris 1 M pH 8 1 mL China 10 mM Solu o de limpeza EDTA 0 5 M pH 8 5 mL China 25 mM NaCl5 M 3 mL Cina 150MM Agua destilada est ril Complete para 100 mL Armazenamento geladeira 4 Descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 500 pL de TE1 a composi o da solu o TE1 est descrita no protocolo de extra o de DNA de bact rias endof ticas 5 Adicionar 25 uL de Lisozima 20 mg mL e incubar a 37 C por 30 minutos Dica o uso de uma Lisozima de boa qualidade de fundamental import ncia 6 Adicionar 108 uL de SDS 20 e 6 uL de Proteinase K 20 mg mL e incubar a 58 C por 15 minutos Esfriar a temperatura ambiente Solu o Composi o Quantidade Objetivo Proteinase K 100 mg China 20mg mL Degrada o Glicerol 2 5 mL proteica Proteinase K CaCl 0 5 M 200 pL Tris 50 mM pH 8 ImL gua ultrapura est ril 1 3 mL Armazenamento no freezer C _ concentra o final Final Dica a solu o de SDS deve ser mantida em um frasco mbar protegido da luz 7 Adicionar 200 uL de Acetato de Am nio CH COONH 8 M agitar com cuidado e deixar no gelo ou freezer por 30 minutos Dica esta solu o deve ficar no gelo por no m nimo 30 minutos mas pode ficar por tempo indeterminado sem prejudicar a a
433. uzindo pontos de cor marrom M todo de Shi et al 2010 1 Preparar Tamp o Fosfato de Pot ssio K HPO 10 mM pH 7 8 2 Preparar uma solu o Tamp o DAB 1 mg DAB mL de Tamp o pH 3 8 Dica preparar na hora e misturar bem pois o DAB n o dissolve facilmente Dependendo do peso molecular do DAB utilizado a quantidade de mg do mesmo pode variar em fun o do volume de Tamp o Ajustar o pH com HCL 3 Imergir segmentos do tecido no caso de folhas em torno de 5 cm na solu o Tamp o DAB Dica podem ser utilizadas placas de petri para a imers o 4 Manter 8 horas sob ilumina o forte e constante zZ Dica pode ser usada a luz de uma capela de exaust o mas importante aproximar ao m ximo as amostras da luz para que esta seja eficiente 5 Retirar as folhas da solu o e ferver em etanol absoluto at descolorirem por completo ficando esbranqui adas Dica bastante cuidado ao ferver o etanol absoluto Pode ser utilizada uma chapa com aquecimento 6 Retirar as folhas da fervura e conserv las em etanol 70 7 Visualizar os pontos escuros marrons demarcados pelo DAB que mostram a rea o com o H O Dica cuidar ao manusear fotografar na lupa por exemplo pois as folhas rasgam com facilidade e tamb m logo enrolam fora do etanol 70 Refer ncia SHI J Fu X Z Peng T Huang X S Fan QJ Liu J H 2010 Spermine pretreatment confers dehydration tolerance of citrus in vitro pla
434. va na boca do mesmo pode se colocar uma fita ao redor do papel alum nio para melhor fix lo e colocar sob agita o por 2 horas a 37 C Dica ao abrir o Erlenmeyer na capela deve se ter o cuidado para n o tocar na por o interna do papel alum nio pois este est esterilizado e ser utilizado para tapar o Erlenmeyer durante a agita o Durante todo o processo de lavagem e tritura o do tecido deve se ter o cuidado de n o tocar com as m os no mesmo sujeito a contamina es Outro cuidado importante com o tempo desperdi ado na tritura o passo no qual as c lulas ficam expostas ao ambiente sem a devida manuten o de suas condi es basais proporcionada pela solu o de Hank s Durante a dissocia o enzim tica a temperatura dever permanecer em torno dos 37 C proporcionando assim condi es timas a o enzim tica Antes do final da dissocia o 45 minutos colocar na capela filtros com malha de 250 e 150 um encaixados em Erlenmeyers tubos Corn esterilizados tampa laranja Ligar a UV por 30 minutos Ao Erlenmeyer de tripsiniza o acrescentar igual volume de Hank s utilizado para a dissocia o enzim tica a fim de inibir a a o da colagenase poder ser medido em um tubo c nico pois n o requer precis o de volume Colocar o meio de cultura de interesse no Banho Maria a 37 C Despejar a solu o contendo o tecido dissociado no filtro de 250 pm com cuidado e vagarosamente para n o transb
435. var cada uma com detergente para retirar a gordura 3 Estocar em lcool 70 dentro da geladeira at o uso PROCESSAMENTO DIA 0 Cultura das c lulas a Fazer a contagem das c lulas CHO K1 b Transferir para frascos de cultura com meio de cultura DMEM HAM F 10 Dica podem ser utilizadas placas de cultura de 6 po os ao inv s dos frascos c Incubar overnight na estufa a 37 C com 5 CO DIA 1 d Tratar as amostras com o extrato e com o controle positivo Etil metanosulfonato EMS em concentra es pr determinadas Concentra o final do EMS 200 pg mL Concentra o dos extratos Solu o estoque 20 000 pg mL Concentra o final dos extratos 200 100 50 e 25 ug mL Usar seguinte f rmula para os c lculos das dilui es C1xV1 C2xV2 e Incubar por 24 h na estufa a 37 C com 5 CO DIA 2 f Retirar o meio de cultura das garrafas de cultura g Lavar com 2 mL de solu o de Hanks repetir esse processo 2 vezes h Adicionar 1 mL de tripsina EDTA no frasco de cultura i Colocar a frasco de cultura por 3 minutos na estufa a 37 C para desprendimento das c lulas j Preparar meio de cultura completo 10 SBF em um tubo falcon k Passados 3 minutos verificar atrav s de microscopia se as c lulas est o soltas 1 Certificado o desprendimento das c lulas injetar 3 mL de meio completo DMEM F10 SBF para inativar a tripsina m Coletar as c lulas e passar para tubos falcon n
436. ve ser a disponibilidade de nutrientes aos tecidos cultivados Por outro lado um alto volume de meio por explante pode n o resultar na melhor taxa de propaga o Para o estabelecimento dos explantes devem ser tomados alguns cuidados especiais 1 Os materiais utilizados pin as agulhas histol gicas cabos de bisturi placas de petri entre outros para o estabelecimento dos explantes devem ser autoclavados previamente 2 Os utens lios met licos utilizados durante a manipula o e corte dos tecidos devem ser mergulhados em etanol 96 e flambados periodicamente durante o processamento do material Esta opera o impede que a contamina o presente em uma por o do tecido seja disseminada para os demais explantes isolados durante a prepara o e a incuba o Dependendo da disponibilidade no laborat rio ao inv s de flambar devem ser utilizados esterilizadores infravermelhos Estes t m a vantagem de diminuir os riscos de acidentes aos usu rios 3 Os cortes nos tecidos dever o ser executados com bisturis novos bem afiados Assim o isolamento do explante ocorre sem inj rias excessivas Observa o Em geral h um tamanho timo de explantes para iniciar uma cultura de tecidos Explantes muito pequenos n o sobrevivem bem em cultura Por m explantes grandes podem ser dif ceis de descontaminar e de manipular 4 Explantes muito pequenos como pices caulinares embri es etc s o isolados com o aux lio de est re
437. ver uma representa o gr fica dos resultados O tamanho das barras coloridas indica a extens o do alinhamento da sequ ncia de interesse query com diferentes sequ ncias do banco de dados J as cores indicam o qu o similares elas s o Arrastando o mouse por cima das barras a caixa acima da representa o gr fica mostrar o nome da sequ ncia com a qual a sequ ncia query apresenta similaridade 8 Na se o Descriptions s o mostradas as sequ ncias que apresentam similaridade e os dados que quantificam essa similaridade Dentre eles importante observar os seguintes Query coverage indica qual porcentagem da sequ ncia de interesse coberta pelo alinhamento com cada sequ ncia do banco lembre se que por se tratar de um alinhamento local muitas vezes apenas uma regi o de ambas as sequ ncias ser o alinhadas E value indica a probabilidade de encontrar aquele alinhamento de maneira aleat ria ou seja quanto menor o valor maior a confian a sendo o E value 0 o mais confi vel e Identity indica quantos amino cidos id nticos s o encontrados apenas na regi o que foi alinhada Dica dependendo do tipo de alinhamento feito um E value aceit vel pode variar Por exemplo se estamos alinhando sequ ncias de um organismo que apresenta grande n mero de sequ ncias depositadas no banco como humanos camundongo mosca da fruta ou arroz esperamos encontrar E value
438. vres os quais podem acarretar muitos problemas de sa de A oxida o nos alimentos afeta a cor flavor vitaminas minerais carboidratos lip dios e prote nas sendo necess rio adicionar antioxidantes aos alimentos O efeito antioxidante consiste na inativa o dos radicais livres na complexa o dos ons met licos ou na redu o de hiper xidos A escolha de um antioxidante segundo o mesmo deve estar baseada no seu conhecimento qu mico seu modo de a o sendo que a estrutura do mesmo influi nas diferen as de atividades antioxidantes M todo Adaptado de Mensor et al 2001 Equipamentos Balan a anal tica Espectrofot metro Vidrarias utens lios e outros Bal o volum trico de 50 e 100 mL Esp tula B quer de 50 e 100 mL Pipeta autom tica Cubetas de quartzo Reagentes 2 2 Difenil 1 Picril Hidrazila DPPH a 0 004 lcool met lico cido Asc rbico Procedimento Parte 1 Preparo da solu o de DPPH a 0 004 Dissolver 0 004 g de DPPH em lcool met lico e completar o volume para 100 mL em um bal o volum trico com lcool met lico homogeinizar e transferir para um frasco mbar devidamente etiquetado ou proteger o bal o volum trico com a solu o de DPPH com papel alum nio Preparar e usar no dia da an lise Parte 2 Curva padr o cido asc rbico ou rutina Curva padr o Controle positivo A partir de uma solu o estoque do acido asc rbico de 1 mg ml diluindo nas concentra
439. xemplo 9 Na se o Alignments poss vel ver os alinhamentos propriamente ditos Dica para acessar as sequ ncias encontradas para copi las e arquiv las em formato FASTA por exemplo basta clicar no n mero de acesso das mesmas nesta se o Uma nova janela aba ser aberta mostrando a sequ ncia e todas as informa es associadas a ela Dica 2 observar no cabe alho de cada alinhamento qual a fase de leitura da sequ ncia do banco a qual foi alinhada com a sequ ncia de interesse em Frame Valores 1 2 e 3 indicam fases de leitura da fita senso 1 2 e 3 indicam fases de leitura da fita anti senso Busca por similaridade em banco de dados de nucleot deos traduzidos para prote na utilizando sequ ncia de nucleot deos traduzidos para prote na como query tBLAS Tx nucleot deos traduzidos X nucleot deos traduzidos O tBLASTx utilizando quando se quer comparar sequ ncias de nucleot deos com o banco de nucleot deos por m tanto o banco de dados quanto a sequ ncia de interesse s o traduzidos em todas as seis fases de leitura poss veis Trata se do modo mais abrangente de procurar por sequ ncias similares por m o que mais consome tempo de computa o Para isso o BLAST traduz todas as sequ ncias de nucleot deos do banco nas seis fases de leitura poss veis tr s da fita senso e tr s da fita antissenso gerando seis sequ ncias de prote nas para cada que s o ent o comparadas com
440. xo e determinar a quantidade de dicromato remanescente por titula o com sulfato ferroso amoniacal M todo de STANDARD 2012 Equipamentos Chapa aquecedora Vidrarias utens lios e outros Erlenmeyer de fundo chato e boca esmerilhada Condensadores Mangueiras para conectar condensadores Rolo de fita veda rosca Garras suporte para condensadores 1 por erlenmeyer B quer 100 mL Bureta de 50 mL Proveta 50 mL Proveta 250 mL Reagentes Sulfato de merc rio p a cido Sulf rico p a KOH 6 cido Sulf rico Sulfato de prata Pesar 10 g de sulfato de prata Transferir o conte do para um b quer de 1 L Na capela adicionar 600 mL de cido sulf rico para dissolver o sulfato Transferir para o bal o de 1 L e completar com cido sulf rico p a Dicromato de pot ssio 0 25 N Para amostras com DQO gt 50 mg L Dica para amostras com DQO lt 50 mg L utilizar dicromato de pot ssio com concentra o de 0 025 N Pesar 15 g de dicromato de pot ssio K Cr O em uma c psula Deixar secar por 2 h a 105 C em estufa Colocar no dessecador at esfriar Em balan a anal tica pesar 12 259 g de dicromato seco Dissolver com gua Transferir para bal o de 1 L e avolumar Sulfato ferroso amoniacal Fe NH SO D gt Cm Pesar 98 g de sulfato ferroso amoniacal hexahidratado p a e dissolver em gua Adicionar 20 mL de cido sulf rico p a Transferir para bal o de 1 L e avolumar
441. xo constante de pequenas bolhas de pequenas bolhas de vapor quando aquecidos em um solvente quebrando as bolhas grandes dos gases produzidos promovendo dessa forma uma ebuli o suave e reduzindo a probabilidade de ocorr ncia de solavancos Tamb m se pode recorrer a placas de aquecimento por m as mesmas apresentam a dificuldade de medir a temperatura de trabalho e as mudan as de temperatura s o lentas O controle da temperatura realizado manualmente por uma chave de controle sendo que o termostato indica quando a temperatura atingida Algumas chapas de aquecimento incluem um motor para agita o magn tica permitindo simultaneamente o aquecimento e a agita o de uma mistura conforme pode ser visto na Figura 8 Figura 8 Aquecimento em placas Fonte Dos autores Outra tima alternativa como fonte de calor s o as mantas de aquecimento cuja temperatura regulada por um controlador de calor A verdadeira temperatura da manta n o pode ser controlada com facilidade por m ap s certa experi ncia torna se relativamente f cil o controle S o ideais para rea es e destila es que exigem temperaturas relativamente elevadas S o muito f ceis de usar e de opera o segura devendo se tomar o cuidado em evitar o derrame de l quidos no po o da manta de aquecimento j que a superf cie da base de cer mica pode estar muito quente e fazer o l quido pegar fogo Na montagem da aparelhagem pode se optar pela utiliza o
442. ysdercus peruvianus World Journal of Microbiology and Biotechnology 27 2297 2303 2011 gt gt cm 13 2 PREPARACAO DA SUSPENSAO DE CONIDIOS ESPOROS DE FUNGOS FILAMENTOSOS O processo de preparo de suspens o de con dios ou esporos de fungos filamentosos consiste em liberar os esporos dos fungos cultivados em placas de petri ou outro substrato para posterior cultivo ou in culo do microrganismo Desta forma os experimentos s o padronizados pelo n mero de con dios a ser adicionado 1 Despejar 3 mL de solu o de Tween 80 0 01 sobre a placa de petri contendo o cultivo do fungo filamentoso esporulado 2 Esfregar com al a de vidro cuidadosamente para liberar os esporos 3 Transferir o l quido para um tubo do tipo falcon est ril de 15 ou 50 mL dependendo da centr fuga a ser utilizada 4 Centrifugar 5 000 rpm 10 minutos e descartar o sobrenadante Lavar os esporos com gua destilada est ril Centrifugar 5 000 rpm 10 minutos e descartar o sobrenadante Ressuspender a suspens o com gua destilada est ril Testar a esterilidade adicionar a um tubo de vidro contendo 3 mL de meio LB est ril 10 pL da suspens o de esporos Os tubos com meio LB devem ser mantidos por 16 horas sob agita o 180 rpm a 37 C Se ap s este per odo n o houver turbidez no tubo a suspens o n o est contaminada e poder ser utilizada Dica a suspens o de esporos pode ser mantida na geladeira por at sete dias
443. zer uma curva dilu da usando BSA 0 1 mg mL Evitar dosar amostras com excesso de detergentes gt 2 o que pode levar interfer ncia no m todo Refer ncias LOWRY O H Rosebrough N J Lewis Farr A Randall R J 1951 Protein measurement with the folin phenol reagent J Biol Chem 193 265 275 D gt Cll que pode ser lida em espectrofot metro 562 nm 2 18 QUANTIFICACAO DE PROTEINAS PELO METODO BCA M todo do cido bicinconinico BCA Smith et al 1985 1 O m todo de BCA um ensaio colorim trico utilizado para determinar a concentra o de prote na em uma determinada amostra com a sensibilidade variando de 0 5 pg mL a 1 5 mg mL Este ensaio baseado na detec o de algumas liga es pept dicas entre amino cidos espec ficos da seguinte forma 1 1 as liga es pept dicas das prote nas reduzem o Cu presente em um dos reagentes 1 2 o cido bicincon nico liga se ao cobre reduzido Cu formando uma colora o p rpura 2 Curva padr o com albumina bovina BSA utilizando a solu o de BSA padr o inclu da no kit 2 1 A curva padr o preparada em eppendorfs sendo transferido um volume para a microplaca de 96 po os para quantifica o conforme descrito na tabela abaixo Tubo Agua uL BSA Sol pL Volume usado uL BSA ug mL 1 0 300 do estoque 10 2000 2 125 375 do estoque 10 1500 3 375 325 do estoque 10 1000 4 175 175 do tubo 2 10 750 5 325 325 do tubo 3 10 50

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