Nested PCR - Cód. BANG07-02, BANG07-05 e CTRG07
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1. Sensibilidade anal tica limite de detec o da ABL OligoMIX A sensibilidade anal tica desta OligoMIX permite identificar a presen a de aproximadamente 100 mol culas de DNA branco nos 5 uL de cDNA produto da rea o de transcri o reversa acrescentado rea o de amplifica o A sensibilidade anal tica do controle de idoneidade da amostra como limite de detec o foi determinada utilizando como material de refer ncia o DNA plasm dico P210 que cont m ainda o produto de amplifica o ABL cuja concentra o inicial foi medida com espectrofot metro O DNA plasm dico P210 foi dilu do a uma titula o de 100 c pias 5uL e a dilui o foi utilizada em duas repeti es em sete diferentes sess es para realizar o procedimento de amplifica o nico com a ABL OligoMIX produzida por Nanogen Advanced Diagnostics S P A Os resultados finais s o resumidos na tabela seguinte mm SIOMETRIX 14 ciscn stica em E Rev 04 Out 2013 Amostras N sess es fue Positivas ABL Negativas ABL repeti es 100 c pias P210 7 2 14 0 Sensibilidade diagn stica efici ncia de detec o nos eventuais polimorfismos A sensibilidade diagn stica do teste como efici ncia de detec o nos diversos polimorfismos foi avaliada pelo confronto de sequ ncias com bancos de dados nucleot dicos O exame do alinhamento das regi es selecionadas para a hibrida o dos oligonucleotideos primers para2. 19 9 5 uL 85 5uL 95uL 20 10 0 uL 90 0 pL 100p 21 10 5 pL 94 5pL 105p em E IOMETRIX EEE FR Rev 04 Out 2013 Da Acrescentar a cada tubo monotest AZUL P210 NEUTRO P190 e AMARELO ABL 5 uL de enzima DNA polimerase termoest vel dilu da 1 U 2 Acrescentar a cada tubo monotest AZUL NEUTRO e AMARELO 5 pL de cDNA obtido Proceder do mesmo modo com o controle negativo e com o controle positivo 3 Transferir os tubos monotest gt AZUIS NEUTROS e AMARELOS no termociclador na rea de amplifica o detec o dos produtos de amplifica o e iniciar o ciclo t rmico da primeira amplifica o Prepara o da segunda amplifica o Para realizar na rea de extra o prepara o da rea o de amplifica o Antes de iniciar a sess o necess rio tomar a enzima DNA pol 2U uL centrifug la por 5 segundos para levar ao fundo o conte do e mant la em gelo descongelar tanto os tubos monotest VERMELHOS P210 quanto os azuis centrifug los por 5 segundos para obter no fundo o conte do marc los de modo reconhec vel com um marcador permanente e mant los em gelo descongelar tanto os tubos monotest VERDES P190 quanto os neutros centrifug los por 5 segundos para obter no fundo o conte do marc los de modo reconhec vel com um marcador permanente e mant los em gelo NOTA Os tubos monotest s o do tipo a parede sutil e devem ser manipulado
3. BOMETAIX AGN STI Rev 04 Out 2013 BANGO7 02 BANGO7 05 Philadelphia Oligomix Alert Kit Instru es de Uso USO PRETENDIDO O produto PHILADELPHIA oligomix Alert kit um teste qualitativo de amplifica o dos cidos nucleicos para a pesquisa do cDNA do rearranjo BCR ABL transloca o t 9 22 cromossomo Philadelphia variante P210 P210 variante P190 P190 e variante P230 P230 no produto da rea o de transcri o reversa obtido pelo RNA total extra do das amostras de sangue perif rico colhido em EDTA sangue medular colhido em EDTA ou citrato de s dio suspens es de linfomon citos e suspens es de leuc citos O produto empregado juntamente aos dados cl nicos e a outros exames de laborat rio no diagn stico e na monitora o da afec o m nima que persiste nos pacientes afetados por leucemia mieloide cr nica LMC leucemia lLinfobl stica aguda LLA e leucemia mieloide aguda LMA DESCRI O DO PRODUTO O procedimento prev a execu o de tr s tipos de rea es de amplifica o P210 P190 e ABL com um termociclador program vel A rea o P210 prev duas rea es sucessivas de amplifica o nested espec ficas para os cDNA originados do rearranjo BCR ABL variante P210 b3a2 b2a2 b2a3 e b3a3 e est em condi es de evidenciar tamb m os cDNA originados do rearranjo BCR ABL variante P230 c3a2 A rea o P190 prev duas rea es sucessivas de amplifica o nested es
4. ncias graves para o paciente Sensibilidade anal tica limite de detec o das P210 OligoMIX e P190 OligoMIX A sensibilidade anal tica deste OligoMIX permite identificar a presen a de aproximadamente 10 mol culas de DNA branco nos 5uyL de cDNA produto da rea o de transcri o reversa acrescentado rea o de amplifica o A sensibilidade anal tica do teste como limite de detec o foi determinada utilizando como material de refer ncia dois DNA plasm dicos contendo o produto de amplifica o cuja concentra o inicial foi medida com espectrofot metro pP210 e pP190 O DNA plasm dico pP210 foi dilu do a uma titula o de 10 c pias 5uL e a dilui o foi utilizada em duas repeti es em sete diferentes sess es para realizar o procedimento de amplifica o nested com a P210 OligoMIX produzida por Nanogen Advanced Diagnostics S P A Os resultados finais s o resumidos na tabela seguinte Amostras N sess es oe Positivas P210 Negativas P210 repeti es 10 c pias pP210 7 2 14 0 O DNA plasm dico P190 foi dilu do a uma titula o de 10 c pias 5uL e empregada em duas repeti es em sete diferentes sess es para realizar o procedimento de amplifica o nested com a P190 OligomIX produzida por Nanogen Advanced Diagnostics S P A Os resultados finais s o resumidos na tabela seguinte Amostras N sess es Eus Positivas P190 Negativas P190 repeti es 10 c pias P190 7 2 14 0
5. o misturar reagentes de diferentes lotes N o utilizar reagentes de outros fabricantes Advert ncias e precau es de biologia molecular Os procedimentos de biologia molecular como a extra o a transcri o reversa a amplifica o e a detec o de cidos nucleicos requerem pessoal em E OMETRIX DIAGN STICA Rev 04 Out 2013 especializado para prevenir o risco de resultados incorretos em particular devido degrada o dos cidos nucleicos das amostras ou devido contamina o das amostras por produtos de amplifica o necess rio dispor de uma rea separada para a extra o prepara o das rea es de amplifica o e para a amplifica o detec o dos produtos de amplifica o reas de pr e p s PCR Nunca introduzir um produto de amplifica o na rea de extra o prepara o das rea es de amplifica o necess rio uso de EPI adequado a cada uma das reas de trabalho em laborat rio de biologia molecular Nunca transferir materiais da rea de amplifica o detec o para a rea de extra o prepara o de rea es As amostras devem ser empregadas exclusivamente a este tipo de an lise As amostras devem ser manipuladas em uma c mara de fluxo laminar Os tubos que cont m amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso As pipetas devem ser do tipo deslocamento pos
6. o n o eficiente ou ausente que podem causar resultados falsos negativos A sess o n o v lida e deve ser repetida a partir da fase de amplifica o Este kit capaz de detectar uma quantidade m nima de 10 pares de cDNA P210 o P190 por rea o de amplifica o Os resultados das rea es relativas s amostras em an lise s o utilizados para avaliar a presen a do cDNA de P210 P190 ou P230 como descrito na tabela seguinte AMPUNICAC HES da amostra l Resultado do cDNA de P210 Produto espec fico Produto Idoneidade da teste P190 ou P230 P230 P190 ou espec fico amostra P230 ABL AUSENTE AUSENTE jao ironed l pan vahide PRESENTE id nea valido negativo NAO DETECTADO PRESENTE AUSENTE onea valido positivo PRESENTE PRESENTE id nea v lido positivo PRESENTE OMETRIX DIAGN STICA Se nas rea es de uma amostra est o ausentes seja o produto espec fico de amplifica o do cDNA P210 P190 e P230 seja o do cDNA ABL da amplifica o de controlo se s o verificados problemas na fase de amplifica o amplifica o n o eficiente ou ausente na fase de transcri o reversa transcri o reversa n o eficiente ou ausente ou na fase de extra o perda de RNA presen a de inibidores RNA da amostra alterado ou amostra de partida com um n mero de c lulas insuficiente que podem causar resultados falsos negativos A amostra n o id nea o teste n o v lido e deve ser repeti
7. P210 OligoMIX produzida por Nanogen Advanced Diagnostics S P A Os resultados finais s o resumidos na tabela seguinte Amostras N sess es am Positivas P210 Negativas P210 repeti es 500 ng DNA gen mico 7 2 0 14 O DNA gen mico humano foi dilu do concentra o de 500ng 5yL e a dilui o foi utilizada em duas repeti es em sete diferentes sess es para realizar o procedimento de amplifica o nested com a P190 OligoMIX produzida por Nanogen Advanced Diagnostics S P A Os resultados finais s o resumidos na tabela seguinte Amostras N sess es b Positivas P190 Negativas P190 repeti es 500ng DNA gen mico 7 2 0 14 iOMETRIX 15 ciscn stica em E Rev 04 Out 2013 O DNA gen mico humano foi dilu do concentra o de 500ng 5yL e a dilui o foi utilizada em duas repeti es em sete diferentes sess es para realizar o procedimento de amplifica o nested com a ABL OligoMIX produzida por Nanogen Advanced Diagnostics S P A Os resultados finais s o resumidos na tabela seguinte Amostras N sess es pi E Positivas ABL Negativas ABL repeti es 500ng DNA gen mico 7 2 0 14 OMETRIX DIAGN STICA Especificidade anal tica marcadores potencialmente interferentes A especificidade anal tica do teste como reatividade cruzada com outros marcadores potencialmente interferentes foi avaliada para confronto de sequ ncia com bancos
8. Uma mistura otimizada de reagentes para a amplifica o dos cidos nucleicos em uma solu o de estabiliza o pr aliquotada em tubos monotest AMARELOS prontos para o uso Cada tubo cont m 40 uL de solu o e 50 uL de leo de vaselina A mistura de reagentes fornece os oligonucleot deos primers da amplifica o de controle o sistema tamp o o cloreto de magn sio e os nucleot deos trifosfatos Os oligonucleot deos primers s o espec ficos para o cDNA ABL O kit permite efetuar 25 rea es controles positivos e negativos inclu dos Rev 04 Out 2013 BANGO7 02 05 Componente Descri o Quantidade Composi o Oligonucleotideos externos Mistura de Cloreto de pot ssio TRIS base P210 OligoMIX de amplifica o em TRIS cloridrato od tubos AZUIS de G Triton X 100 Cloreto de 0 2 ou 0 5 mL magn sio Desoxinucleotideos trifosfatos leo de vaselina Oligonucleotideos externos PO a roiencae em woo aa primeira 25 x 90 uL i tubos NEUTROS de Triton X 100 Cloreto de 0 2 ou 0 5 mL magn sio Desoxinucleot deos trifosfatos leo de vaselina Oligonucleot deos Cloreto de Mistura de pot ssio TRIS base TRIS amplifica o kinaua amplifica o em 25 x 90 UL cloridrato Triton X 100 E ont WA tubos AMARELOS H Cloreto de magn sio de 0 2 ou 0 5 mL Desoxinucleot deos trifosfatos leo de vaselina Oligonucleotideos internos Mistura de Cloreto de pot ssio TRIS base P210 Ol
9. de dados nucleot dicos O exame do alinhamento das regi es selecionadas para a hibrida o dos oligonucleot ideos primers para o cDNA P210 das P210 OligomiX com as sequ ncias disponibilizadas no banco de dados de regi es gen micas humanas diferentes dos genes humanos BCR e ABL entre as quais as do genoma humano completo demonstrou a especificidade do sistema de amplifica o O exame do alinhamento das regi es selecionadas para a hibrida o dos oligonucleotideos primers para o cDNA P190 das P190 OligomiX com as sequ ncias disponibilizadas no banco de dados de regi es gen micas humanas diferentes dos genes humanos BCR e ABL entre as quais as do genoma completo demonstrou a especificidade do sistema de amplifica o O exame do alinhamento das regi es selecionadas para a hibrida o dos oligonucleotideos primers para o cDNA ABL das ABL OligoMIX com as sequ ncias disponibilizadas no banco de dados de regi es gen micas humanas diferentes pelo gene humano ABL entre as quais as do genoma humano completo demonstrou a especificidade do sistema de amplifica o NOTA Os dados e os resultados completos dos testes realizados para a avalia o das caracter sticas do desempenho do produto est o registrados na Sec o 7 do Fasc culo T cnico do Produto PHILADELPHIA oligomix Alert kit FTP BANGO7 REFER NCIAS VAN DONGEN J J M et al 1999 Leukemia 13 1901 1928 16 Eee Ea em E OMETRIX DI
10. nucleicos em solu o estabilizada pr aliquotada em tubos monotest prontos para o uso Cada tubo cont m 40 uL de solu o e 50 uL de leo de vaselina e P210 OligoMIX aliquotada em tubos monotest AZUIS e P190 OligoMIX aliquotada em tubos monotest gt NEUTROS As misturas de reagentes fornecem os oligonucleot deos primers da primeira amplifica o o sistema tamp o o cloreto de magn sio e os nucleot deos trifosfatos No caso de P210 OligoMIX os oligonucleot deos primers s o espec ficos para os cDNA P210 e P230 No caso de P190 OligoMIX os oligonucleotideos primers s o espec ficos para o cDNA P190 e P210 OligoMIX e P190 OligoMIX de segunda amplifica o Misturas otimizadas de reagentes para a amplifica o dos cidos nucleicos em solu o de estabiliza o pr aliquotada em tubos monotest prontos para o uso Cada tubo cont m 44 uL de solu o e 50 uL de leo de vaselina e P210 OligoMIX aliquotada em tubos monotest VERMELHOS e P190 OligoMIX aliquotada em tubos monotest VERDES As misturas de reagentes fornecem os oligonucleot deos primers da segunda amplifica o o sistema tamp o o cloreto de magn sio e os nucleot deos trifosfatos No caso de P210 OligoMIX os oligonucleotideos primers s o espec ficos para os cDNA P210 e P230 No caso de P190 OligoMIX os oligonucleot deos primers s o espec ficos para o cDNA P190 e ABL OligoMIX para a amplifica o de controle
11. o cDNA P210 das P210 OligoMIX com as sequ ncias dispon veis no banco de dados das regi es gen micas do rearranjo BCR ABL e dos RNA mensageiros originados por este tem demonstrado sua conserva o e a aus ncia de muta es significativas O exame do alinhamento das regi es selecionadas para a hibrida o dos oligonucleotideos primers para o cDNA P190 das P190 OligoMIX com as sequ ncias dispon veis no banco de dados das regi es gen micas do rearranjo BCR ABL e dos RNA mensageiros originados por este tem demonstrado sua conserva o e a aus ncia de muta es significativas O exame do alinhamento das regi es selecionadas para a hibrida o dos oligonucleotideos primers para o cDNA ABL das ABL OligoMIX com as sequ ncias dispon veis no banco de dados da regi o do gene codificante ABL tem demonstrado sua conserva o e a aus ncia de muta es significativas Especificidade diagn stica amostras negativas A especificidade diagn stica do teste como confirma o de amostras negativas foi verificada realizando se a an lise de amostras de DNA gen mico humano A especificidade diagn stica foi avaliada utilizando como material de refer ncia do DNA gen mico humano cuja concentra o inicial foi medida no espectrofot metro O DNA gen mico humano foi dilu do concentra o de 500ng 5uL e a dilui o foi utilizada em duas repeti es em sete diferentes sess es para realizar o procedimento de amplifica o nested com a
12. 30 c3a2 Controle Controle da Ega Controle Controle Amostra a E Res itivo negativo ES positivo negativo id nea T Moleculares Es P190 id nea P190 P190 ABL ABL ABL Pocinhos 1380 bp 517 bp 456 bp 396 bp 247 bp 75bp 65bp 46 bp A t tulo de exemplo est reproduzida a seguir uma ilustra o esquem tica que representa o resultado da separa o eletrofor tica dos produtos da segunda amplifica o P190 e da rea o ABL de controle Rev 04 Out 2013 Controle Controle a am Controle Controle Amostra x F Pesos a E positiva Es nes nao Molecules positivo negativo P190 positivo negativo id nea id nea P190 P190 ABL ABL ABL Pocinhos 1380 bp 517 bp 715 bp 715 bp 456 bp 396 bp 247 bp 75bp 65bp 46bp Em caso de coextra o de DNA gen mico com o RNA celular poss vel observar na amplifica o de controle ABL um produto espec fico de amplifica o de 715 bp constitu do de parte do xon a2 do intron e de parte do xon a3 do gene ABL NOTA poss vel detectar em amostras positivas para P210 analisadas com a rea o de amplifica o P190 os seguintes produtos espec ficos de amplifica o que tem dimens es de 1884 bp em amostras positivas P210 b3a2 e 1809 bp em amostras positivas P210 b2a2 NOTA poss vel detectar em amostras analisadas com a rea o de amplifica o P190 o produto espec fico de amplifica o para a forma rara P190 e1a3 que tem dimen
13. AGN STICA Rev 04 Out 2013 IDENTIFICA O DO DISTRIBUIDOR Biometrix Diagn stica Ltda Estrada da Graciosa 1081 Curitiba PR CEP 82840 360 Tel 41 2108 5250 Fax 41 2108 5252 DDG 0800 7260504 E mail biometrix biometrix com br Website www biometrix com br CNPJ 06 145 976 0001 39 INFORMA ES DO FABRICANTE Nanogen Advanced Diagnostics S P A C so Torino 89 d 10090 Buttigliera Alta TO It lia REGISTRO ANVISA 80298490088 RESPONS VEL T CNICA Edna Cristina Kurokawa Guimar es Ferreira CRQ PR 09302336 Aprova o 20 12 2013 Mauricio Cichon Laborat rio Assinado por Maur cio Cichon 17 Rev 04 Out 2013 CTRGO7 Philadelphia Controle Positivo Instru es de Uso USO PRETENDIDO O produto Philadelphia Controle Positivo destinado ao uso como um controle positivo em ensaios qualitativos de amplifica o de cidos nucleicos para a detec o do cDNA da transloca o BCR ABL cromossomo Philadelphia variantes P190 P210 e P230 com o produto Philadelphia oligomix Alert kit da Nanogen Advanced Diagnostics S P A DESCRI O DO PRODUTO O produto Controle Positivo fornece uma solu o estabilizada de plasm deos contendo a sequ ncia requerida dividida em dois tubos de al quotas prontas para uso Cada tubo de teste cont m 65 uL de solu o suficiente para 12 sess es Os plasm deos cont m a regi o amplificada das transloca es BCR ABL variante
14. DWDWDWDW D SS JP M UFYMFRFRFRPDPFIRDRPRPRP RP P P PIR amp IR S SREIDI7PYPTDRDRCTDPESRPSTSIDRDEPRTDIDRITI C DDI Rev 04 Out 2013 Detec o do produto espec fico de amplifica o Para realizar na rea de amplifica o detec o dos produtos de amplifica o O produto espec fico da segunda amplifica o pode ser detectado e identificado por meio de separa o eletrofor tica utilizando se um gel de agarose com 4 de brometo de et dio 1 ug mL em tamp o TAE 1x 20 mM TRIS base 20mM TRIS acetato 1mM EDTA diss dico como no produto ELECTROPHORESIS 3 Os produtos espec ficos da segunda amplifica o f t m dimens es de i i 29 Dp ESG G ZAR 360 bp P210 b3a2 111 bp P210 b2a3 186 bp P210 b3a3 900 bp P230 c3a2 O produto espec fico da segunda amplifica o P190 tem dimenjes de 381 bp P190 e e1a2 O produto espec fico da amplifica o ABL tem dimens es de 152 bp ABL a2a3 NOTA O produto da segunda amplifica o pode contaminar os testes seguintes Isolar o produto da segunda amplifica o res duo e os descartes de produtos na fase de detec o A t tulo de exemplo est reproduzida a seguir uma ilustra o esquem tica que representa o resultado da separa o eletrofor tica dos produtos da segunda amplifica o P210 que apresentam os diferentes perfis eletrofor ticos dos mais frequentes P210 b3a2 e b2a2 aos mais raros P210 b2a3 e b3a3 e P2
15. RNA As instru es para a extra o do RNA est o contidas no Manual de instru es para o uso do kit EXTRAzoIO gt Subst ncias interferentes O cDNA deve ser obtido a partir do RNA que n o contenha heparina hemoglobina ou Ficoll para evitar fen menos de inibi o e a apari o de frequentes resultados n o v lidos N o est o dispon veis dados pertinentes a eventuais fen menos de inibi o por parte dos medicamentos antibi ticos antivirais quimioter picos ou imunossupressores Controles de amplifica o absolutamente necess rio confirmar cada sess o de amplifica o preparando uma rea o de controle negativo e uma rea o de controle positivo Para o controle negativo utilizar gua bidestilada est ril n o fornecida no kit para acrescentar rea o no lugar do cDNA obtido da amostra Para o controle positivo utilizar o produto PHILADELPHIA Controle Positivo Controles de qualidade aconselh vel confirmar o completo procedimento de an lises de cada sess o extra o e amplifica o utilizando uma amostra negativa e uma amostra positivas j testadas ou do material de refer ncia calibrado Nota sobre a rea o de transcri o reversa O produto RT Kit plus um sistema de transcri o reversa do RNA que utiliza os random primer para o primers da rea o de polimeriza o necessita a adi o do RNA extra do em um volume de 10 uL e gera um volume final de 25 yL A
16. Tempos 1 ciclo 95 C 2 min 95 C 1 min 30 ciclos 65 C 1 min 72 C 1min 1 ciclo 72 C 5 min Prepara o da primeira amplifica o Para realizar na rea de extra o prepara o da rea o de amplifica o Cada amostra requer o uso de um tubo O kit permite efetuar 25 rea es P210 25 rea es P190 25 rea es ABL controles positivos e negativos inclu dos O n mero m nimo de rea es para uma sess o nove tr s rea es P210 controlo positivo controlo negativo e amostra em an lise tr s rea es P190 idem como a primeira tr s rea es ABL idem como a primeira Antes de iniciar a sess o necess rio descongelar as amostras a ser analisadas PHILADELPHIA Positive Control centrifug las por 5 segundos para levar ao fundo o conte do e mant las em gelo BOMETAIX AGN STI Rev 04 Out 2013 descongelar um tubo monotest AZUL P210 para qualquer das amostras a analisar um para o controle negativo e um para o controle positivo centrifug los por 5 segundos para obter no fundo o conte do marc los de modo reconhec vel com um marcador permanente e mant los em gelo descongelar um tubo monotest NEUTRO P190 para qualquer das amostras a analisar um para o controlo negativo e um para o controlo positivo centrifug los por 5 segundos para obter no fundo o conte do marc los de modo reconhec vel com um marcador indel vel e mant los em
17. c pias cDNA Fe a rela o entre a unidade de medida de refer ncia e a amostra usada na extra o por exemplo A Kit de extra o Unidade de medida Rest So Fe extra o res 2 Ano 7 EXTRAZOLO C pias mRNA 1 000 000 10 000 000 c lulas Fe 10 c 10 c lulas c 0 1 Ee o inverso da efici ncia da extra o por exemplo Kit de extra o Efici ncia da extra o Ee ExXTRAZOL Efici ncia m nima 80 ou seja 0 8 RE e E Ft a rela o entre o volume do RNA extra do e o volume usado na rea o de transcri o reversa por exemplo Poda Volume do RNA Volume em transcri o Ft extra do reversa RT kit plus 200 pL 10uL Fes a tones Et o inverso da efici ncia da rea o de transcri o reversa por exemplo Produto Efici ncia em transcri o reversa Et RT kit plus Efici ncia m nima 50 ou seja 0 5 Ee 1 0 5 2 Fa a rela o entre o volume do cDNA obtido e o volume usado na rea o de amplifica o por exemplo Produto Volume do cDNA pela o Fa amplifica o PHILADELPHIA oligomix Alert kit o do FARS EA iso Quando se utilizam os kits de extra o da Nanogen Advanced Diagnostics S P A o limite seria Produto Limites de detec o Nanogen Limites de detec o 250 c pias mRNA 1 000 000 celulas E E Y Rev 04 Out 2013 Limites
18. citos Sangue perif rico colhido em EDTA e sangue medular colhido em EDTA ou citrato de s dio O sangue perif rico colhido em EDTA ou sangue medular colhido em EDTA ou citrato de s dio destinado extra o do RNA deve ser extra do segundo as indica es do laborat rio transportado a 2 8 C e conservado a 2 8 C por um m ximo de quatro horas Quando se parte de sangue perif rico ou medular aconselh vel realizar a separa o dos linfomon citos no Ficoll TM segundo as indica es do laborat rio A quantidade tima de leuc citos de onde extrai o RNA total de aproximadamente 10 000 000 de c lulas N o congelar o sangue perif rico ou medular de modo a evitar a perda do RNA 4 em E IOMETRIX EEEF a Rev 04 Out 2013 As instru es para a extra o do RNA est o contidas no Manual de instru es para o uso do kit EXTRAzolO gt Suspens es de linfomon citos ou de leuc citos As suspens es de linfomon citos ou de leuc citos destinadas extra o do RNA devem ser preparadas segundo as indica es do laborat rio ressuspensas em Solu o fisiol gica est ril ou PBS est ril contadas e conservadas a 2 8 C por um m ximo de quatro horas A quantidade tima de linfomon citos ou de leuc citos de onde extrai o RNA total de aproximadamente 10 000 000 de c lulas N o congelar as suspens es de linfomon citos e as suspens es de leuc citos de modo a evitar a perda do
19. do a partir da extra o de uma nova amostra Se na rea o de uma amostra est ausente o produto espec fico de amplifica o do cDNA P210 P190 ou P230 e est presente o do cDNA ABL da amplifica o de controle os cDNA P210 P190 ou P230n o foram detectados no produto da transcri o reversa obtido do RNA extra do da amostra mas n o se pode negar que os cDNA P210 P190 ou P230 estejam presentes a uma titula o inferior ao limite de detec o do produto Neste caso o resultado ser um falso negativo Os resultados obtidos com este produto devem ser interpretados considerando todos os dados cl nicos e os outros exames de laborat rio relativos ao paciente NOTA Quando em uma rea o de amplifica o est presente o produto espec fico de amplifica o dos cDNA P210 P190 ou P230 e o produto do cDNA ABL da amplifica o de controle est ausente a amostra de todo modo id nea e o resultado positivo do teste v lido No entanto a rea o de amplifica o do cDNA ABL tem uma efici ncia menor da rea o de amplifica o dos cDNA P210 P190 e P230 nested 11 Er Rev 04 Out 2013 C lculo dos limites de detec o O limite de detec o quando se utiliza um m todo particular de extra o e com refer ncia a uma unidade de medida em particular pode ser calculado a partir do limite de detec o da rea o de amplifica o segundo esta f rmula Limite de detec o Fe x Ee Ft x Et x Fa x 10
20. do procedimento Utilizar com este produto somente o cDNA obtido pela transcri o reversa do RNA extra do das seguintes amostras humanas sangue perif rico colhido em EDTA sangue medular colhido em EDTA ou citrato de s dio suspens es de linfomon citos e suspens es de leuc citos N o utilizar com este produto cDNA obtido por transcri o reversa de RNA extra do das amostras heparinizadas a heparina inibe as rea es de transcri o reversa e de amplifica o dos cidos nucleicos e causa resultados n o v lidos N o utilizar com este produto cDNA obtido por transcri o reversa de RNA contaminado por hemoglobina ou Ficoll esta subst ncia pode inibir as rea es de transcri o reversa e de amplifica o dos cidos nucleicos e pode causar resultados n o v lidos N o est o dispon veis dados pertinentes a eventuais fen menos de inibi o por parte dos medicamentos antibi ticos antivirais quimioter picos ou imunossupressores Os resultados obtidos com este produto dependem da correta coleta transporte conserva o e prepara o das amostras para evitar resultados incorretos necess rio portanto ter particular aten o durante estas fases e seguir atentamente as instru es fornecidas com os produtos para a extra o dos cidos nucleicos O m todo de amplifica o nested dos cidos nucleicos utilizados neste produto por causa da sua elevada sensibilidade anal tica est sujeito contamina o po
21. gelo descongelar um tubo monotest gt AMARELO ABL para qualquer das amostras a analisar e um para o controlo negativo e um para o controlo positivo centrifug los por 5 segundos para obter no fundo o conte do marc los de modo reconhec vel com um marcador indel vel e mant los em gelo NOTA Os tubos monotest s o do tipo a parede sutil e devem ser manipulados com aten o para evitar a rotura As centrifuga es devem ser realizadas com os redutores apropriados quando seja necess rio e segundo a modalidade estabelecida deste Manual de instru es para o uso tomar a enzima DNA pol 2U uL centrifug la por 5 segundos para levar ao fundo o conte do e mant la em gelo diluir como descrito na tabela a seguir enzima DNA polimerase 2U pL com gua bidestilada est ril Preparar um volume de enzima dilu da suficiente para todas as rea es P210 P190 ABL previstas controles inclu dos mais uma para uma margem de seguran a A enzima dilu da n o pode ser conservada DNA Polimerase N mero de rea es gua Volume total 2U yL 4 2 0 pL 18 04L 20H 5 2 5 uL 22 5 uL 25 uL 6 3 0 uL 27 0 uL 30 uL 7 3 5 uL 31 5 pl 35W 8 4 0 uL 36 0 uL 40 uL 9 4 5 pL 40 5 ul 44 10 5 0 pL 45 04UL SOL 11 5 5 uL 49 54uL 55h 12 6 0 uL 54 0pL 660p 13 6 5 uL 58 5 ul 665p 14 7 0 pL 63 0UL 70p 15 7 5 pL 67 5uL Tu 16 8 0 uL 72 0uL BOL 17 8 5 uL 76 5uL Bu 18 9 0 pL 81 0uL 990p
22. igoMIX de amplifica o em TRIS cloridrato sa tubos VERMELHOS Rasa Triton X 100 Cloreto de P S de 0 2 ou 0 5 mL magn sio Desoxinucleot deos trifosfatos leo de vaselina Mistura de o P190 OligoMIX amplifica o em e TRIS cloridrato SEGUNDA tubos 25 x 94 uL aus Triton X 100 Cloreto de amplifica o VERDES de 0 2 ou gt e 0 5 mL magn sio Desoxinucleotideos trifosfatos leo de vaselina MATERIAIS NECESS RIOS E N O FORNECIDOS Fluxo laminar Luvas descart veis sem talco Microcentrifuga de bancada 12 000 14 000 RPM Micropipetas est reis e ponteiras com filtro ou deslocamento positivo 0 5 10 uL 2 20 uL 5 50 uL 50 200 uL 200 1000 uL gua bidestilada est ril Termociclador program vel completo com computador z BIOMETRIX DIAGN STI ED ooooooooooooo em E IOMETRIX EEEF E ES SEE Rev 04 Out 2013 ACESS RIOS Os reagentes para a extra o do RNA das amostras a analisar para a transcri o reversa do RNA para o controle positivo de amplifica o e para a detec o do DNA amplificado n o est o inclu dos neste kit Para realizar esta fase anal tica aconselha se a utiliza o dos seguintes produtos acess rios produzidos por Nanogen Advanced Diagnostics S P A e EXTRAzoIE c digo EXTRO1 kit de extra o do RNA das amostras celulares e n o celulares o kit permite efetuar 50 extra es e RT Kit plus c digo BRK200 k
23. it de transcri o reversa do RNA com random primer o kit permite realizar 50 rea es e PHILADELPHIA Positive Control c digo CTRGO7 controle positivo de amplifica o de DNA plasm dico o produto fornece controle para 25 sess es e DNA polymerase 2U uL c digo ER40 e ER140 enzima DNA polimerase termoest vel para a amplifica o dos cidos nucleicos os produtos permitem realizar 125 rea es e ELETROFORESE 3 c digo EPHO3 detec o do DNA amplificado por eletroforese em gel de agarose o kit permite realizar 120 detec es ADVERT NCIAS E PRECAU ES Advert ncias e precau es espec ficas para os componentes Os tubos que contenham os OligoMIX para a primeira amplifica o para a segunda amplifica o e para a amplifica o de controle s o descart veis e portanto devem ser utilizados uma nica vez em rea es de amplifica o Os OligoMIX para a primeira amplifica o para a segunda amplifica o e para a amplifica o de controle apresentam os seguintes conselhos de prud ncia S S 23 25 N o respirar gases fumos vapores aerossol Evitar o contato com os olhos Amostras e Controles Amostras Este kit deve ser utilizado com o produto da rea o de transcri o reversa CDNA obtido do RNA extra do das seguintes amostras biol gicas sangue perif rico colhido em EDTA medula ssea colhida em EDTA ou citrato de s dio suspens es de linfomon citos e suspens es de leuc
24. itivo ou usar ponteiras com barreira filtro As ponteiras utilizadas devem ser est reis sem a presen a de DNAse e RNAse sem a presen a de DNA e RNA Os reagentes devem ser manipulados em c mara de fluxo laminar Os reagentes necess rios para a amplifica o devem ser preparados de modo a ser utilizados em uma nica vez As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente a este prop sito As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo ou usar ponteiras com barreira filtro As ponteiras utilizadas devem ser est reis sem a presen a de DNAse e RNAse sem a presen a de DNA e RNA Os produtos de amplifica o devem ser manipulados de modo a limitar ao m ximo a dispers o no ambiente para evitar a possibilidade de contamina es As pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplifica o devem ser destinadas exclusivamente para sua rea de trabalho Advert ncias e precau es para componentes espec ficos Os tubos contendo Controle Positivo podem ser congelados e descongelados por no m ximo 12 vezes Um n mero maior de ciclos de congelamento e descongelamento pode causar uma redu o do t tulo O Controle Positivo apresenta as seguintes advert ncias S S 23 25 N o inalar vapores Evitar contato com os olhos PROCEDIMENTO O produto Philadelphia Controle Positivo deve ser usado com o produto Philadelphia oligomix Alert kit O Controle Positivo est pronto
25. lho e instrumentos destinados extra o prepara o das rea es de amplifica o e para a amplifica o detec o dos produtos de amplifica o para evitar resultados falsos positivos Um resultado negativo obtido com este produto indica que os cDNA P210 P190 e P230 n o foram detectados no produto da transcri o reversa obtido do RNA extra do da amostra mas n o se pode descartar que os cDNA P210 P190 e P230 estejam presentes a uma titula o inferior ao limite de detec o do produto veja par grafo Caracter sticas da desempenho na p gina 14 neste caso o resultado ser um falso negativo R PU PMUTUTURHURUTHeeTUTUDUDUDUTUDTUTUDUDUTDTJTDSDTDTJTTHTZTUIHUTID ZDC HPHHIATTRITRARACAATTDADDPOOBPTP S DD gt gt WWW 2 7 77 EEE Rev 04 Out 2013 Como para qualquer outro dispositivo diagn stico os resultados obtidos com este produto devem ser interpretados considerando todos os dados cl nicos e os outros exames de laborat rio relativos ao paciente Como para qualquer outro dispositivo diagn stico existe um risco latente de obter resultados n o v lidos falsos positivos e falsos negativos com este produto Este risco res duo n o pode ser eliminado ou reduzido posteriormente Este risco res duo em situa es particulares como os diagn sticos de urg ncia pode contribuir a decis es erradas com consequ
26. para o uso portanto deve ser usado adicionando 5 uL diretamente na mistura de rea o O procedimento completo envolve prepara o e execu o de rea o de amplifica o com termociclador com sistema ptico de detec o de fluoresc ncia descrito em detalhes nas instru es de uso do produto Philadelphia oligomix Alert kit bem como informa es sobre as caracter sticas de desempenho e Limita es do procedimento 20 em E Rev 04 Out 2013 NOTA O Controle Positivo pode ser congelado e descongelado por no m ximo 12 vezes REFER NCIAS BIBLIOGR FICAS GABERT J et al 2003 Leukemia 17 2318 2357 BEILLARD E et al 2003 Leukemia 17 2474 2486 IDENTIFICA O DO DISTRIBUIDOR Biometrix Diagn stica Ltda Estrada da Graciosa 1081 Curitiba PR CEP 82840 360 Tel 41 2108 5250 Fax 41 2108 5252 DDG 0800 7260504 E mail biometrix biometrix com br Website www biometrix com br CNPJ 06 145 976 0001 39 INFORMA ES DO FABRICANTE Nanogen Advanced Diagnostics S P A C so Torino 89 d 10090 Buttigliera Alta TO It lia REGISTRO ANVISA 80298490087 RESPONS VEL T CNICA Edna Cristina Kurokawa Guimar es Ferreira CRQ PR 09302336 Aprova o 20 12 2013 Mauricio Cichon Laborat rio Assinado por Maur cio Cichon 21 Es
27. pec ficas para o cDNA originado do rearranjo BCR ABL variante P190 e1a2 A rea o ABL prev uma nica rea o de amplifica o espec fica para o cDNA originado do gene ABL que utilizada como controle de idoneidade da amostra No caso das rea es P210 e P190 uma primeira rea o de amplifica o espec fica para uma regi o do cDNA de BCR ABL realizada no primeiro tubo partindo do produto da rea o de transcri o reversa obtido do RNA extra do das amostras em exame Em seguida uma segunda rea o de amplifica o espec fica para a regi o do cDNA realizada no segundo tubo partindo do produto da primeira rea o de amplifica o A presen a dos produtos espec ficos da segunda rea o de amplifica o indica a presen a do DNA de BCR ABL no produto da rea o de transcri o reversa e portanto na amostra em exame No caso da rea o ABL a rea o de amplifica o especifica para uma regi o do cDNA de ABL realizada no primeiro tubo partindo do produto da rea o de transcri o reversa obtido do RNA extra do das amostras em exame Rev 04 Out 2013 A presen a do produto espec fico da amplifica o de controle indica a presen a do cDNA de ABL no produto da rea o de transcri o reversa e portanto a idoneidade da amostra em exame MATERIAIS FORNECIDOS e P210 OligoMIX e P190 OligoMIX de primeira amplifica o Misturas otimizadas de reagentes para a amplifica o dos cidos
28. quantidade tima de RNA total que pode ser introduzida na rea o de transcri o reversa com volume final de 25 uL de aproximadamente 1 pg Rev 04 Out 2013 PROCEDIMENTO Programa o do ciclo t rmico Para realizar na rea de amplifica o detec o dos produtos de amplifica o Antes de iniciar a sess o necess rio verificar que o bloco t rmico do termociclador program vel seja compat vel com o formato dos tubos monotest inclu dos no kit tubos de 0 2 ou 0 5 mL fazendo refer ncia documenta o do equipamento verificar a modalidade de controle da temperatura que o termociclador adepta para a execu o do ciclo t rmico quando poss vel selecionar a modalidade de controle da temperatura diretamente no termociclador por exemplo termociclador Hybaid ou Eppendortf quando n o for poss vel por exemplo termociclador GeneAmpe PCR System da Applied Biosystems utilizar a modalidade de controle da temperatura pr definida quando solicitado programar no termociclador o volume de rea o de 100 pL programar no termociclador os par metros do ciclo t rmico descritos nas tabelas seguintes Ciclo t rmico da primeira amplifica o N mero de ciclos Temperaturas Tempos 1 ciclo 95 C 4 min 95 C 1 min 35 ciclos 65 C 1 min 72 C 1min 1 ciclo 72 C 5 min Ciclo t rmico da segunda amplifica o N mero de ciclos Temperaturas
29. r parte das amostras cl nicas positivas para P210 P190 e P230 dos controles positivos e dos mesmos produtos da rea o de amplifica o As contamina es levam a resultados falsos positivos A modalidade de realiza o do produto pode limitar as contamina es mas estes fen menos podem ser evitados somente com uma boa pr tica das t cnicas de laborat rio e seguindo atentamente as instru es fornecidas neste manual Este produto requer pessoal instru do para a manipula o de amostras biol gicas que podem transmitir agentes infecciosos e de prepara es qu micas classificadas como perigosos para evitar incidentes com consequ ncias potencialmente graves para o utilizador ou outras pessoas Este produto requer roupas de trabalho e reas de trabalho adequadas manipula o de amostras biol gicas que podem transmitir agentes infecciosos e de prepara es qu micas classificadas como perigosas para evitar incidentes com consequ ncias potencialmente graves para o utilizador ou outras pessoas Este produto requer pessoal instru do para o procedimento de biologia molecular como a extra o a amplifica o e a detec o de cidos nucleicos para evitar resultados incorretos Este produto requer uma rea separada para a extra o prepara o das rea es de amplifica o e para a amplifica o detec o dos produtos de amplifica o para evitar resultados falsos positivos Este produto requer o uso de roupas de traba
30. s es de 207 bp necess rio confirmar a identidade do produto da segunda amplifica o de uma amostra confrontando a sua migra o no gel com a migra o de um marcador de peso molecular e com a migra o do produto da segunda amplifica o do controle positivo A eventual presen a de produtos n o espec ficos de dimens es diferentes daquelas dos produtos espec ficos da segunda amplifica o de uma amostra n o tem nenhum significado em rela o pesquisa dos cDNA P210 P190 e P230 e do cDNA ABL Interpreta o dos resultados Os resultados das rea es de controle negativo e de controle positivo s o utilizados para confirmar a sess o de amplifica o como descrito nas tabelas seguintes Amplifica o dos controles negativos o Produto especifico P210 P190 ou ABL ERES AUSENTE CORRETA Amplifica o dos controles positivos EN Produto espec fico P210 P190 ou ABL Amplifica o PRESENTE CORRETA em E Rev 04 Out 2013 Se o produto espec fico de amplifica o est presente em uma das rea es de controle negativo se s o verificados problemas na fase de amplifica o contamina o que podem causar resultados falsos positivos A sess o n o v lida e deve ser repetida a partir da fase de amplifica o Se o produto espec fico de amplifica o est ausente em uma das rea es de controle positivo se s o verificados problemas na fase de amplifica o amplifica
31. s P190 P210 e a regi o amplificada do gene controle ABL A detec o do DNA alvo durante a rea o de amplifica o confirma a habilidade de identificar a presen a do cDNA da transloca o BCR ABL e do gene controle ABL O kit possibilita a execu o de 25 rea es de amplifica o usando 5iL por rea o MATERIAIS FORNECIDOS Componente Descri o Quantidade Composi o Plasm deo TRIS base P210 Solu o de E Controle Positivo plasm deo Ax pap TRIS cloridrato EDTA RNA total de levedura Plasm deo TRIS base Pi so aE AKOS pl TRIS cloridrato EDTA P RNA total de levedura E Plasm deo TRIS base o a em o 2x 654L TRIS cloridrato EDTA P RNA total de levedura Armazenar a 20 C ou inferior MATERIAIS NECESS RIOS E N O FORNECIDOS Fluxo laminar Luvas descart veis sem talco Microcentrifuga de bancada 12 000 14 000 RPM Rev 04 Out 2013 Micropipetas est reis e ponteiras com filtro ou deslocamento positivo 0 5 10 uL 2 20 pL 5 50 uL 50 200 uL gua bidestilada est ril Real Time ABI PRISM 7000 completo com computador ACESS RIOS Os reagentes para amplifica o e detec o do DNA n o est o inclusas neste produto Para realizar estes passos anal ticos os produtos a seguir s o recomendados Philadelphia oligomix Alert kit BANG07 02 05 kit de PCR nested para o cDNA da transloca o BCR ABL cromossomo Philadelphia varian
32. s com aten o para evitar a rotura As centrifuga es devem ser realizadas com os redutores apropriados quando seja necess rio e segundo a modalidade estabelecida deste Manual de instru es para o uso diluir como descrito na tabela anterior enzima DNA pol 2U pL com gua bidestilada est ril Preparar um volume de enzima dilu da suficiente para todas as rea es P210 e P190 previstas controles inclu dos mais uma para uma margem de seguran a A enzima dilu da n o pode ser conservada 4 Acrescentar a cada tubo monotest gt VERMELHO P210 e VERDE P190 5 uL de enzima DNA polimerase termoest vel dilu da 1 U 5 Acrescentar a cada tubo monotest VERMELHO P210 1uL de produto da primeira amplifica o do correspondente tubo monotest AZUL P210 6 Acrescentar a cada tubo monotest VERDE P190 1L de produto da primeira amplifica o do correspondente tubo monotest NEUTRO P190 NOTA O produto de amplifica o da primeira rea o pode contaminar os ensaios subsequentes Isole o produto residual da primeira rea o de amplifica o e troque as luvas no final desta fase do procedimento 7 Transferir os tubos monotest VERMELHOS e VERDES no termociclador na rea de amplifica o detec o dos produtos de amplifica o e iniciar o ciclo t rmico da segunda amplifica o NOTA O produto de rea o pode ser conservado a 20 C por um per odo m ximo de um m s Do a LD D
33. tes P190 P210 e P230 no produto de rea o da transcri o reversa obtido da extra o de RNA de amostras biol gicas total de 25 rea es ADVERT NCIAS E PRECAU ES Este produto exclusivamente para uso in vitro Advert ncias e precau es gerais Manusear e descartar todas as amostras biol gicas como potencialmente infecciosas Evitar o contato direto com amostras biol gicas Evitar respingos Os materiais que entram em contato com amostras biol gicas devem ser tratados com hipoclorito de s dio 3 por no m nimo 30 minutos ou autoclavados a 121 C por uma hora antes de serem descartados Manusear e descartar todos os reagentes e materiais como potencialmente infecciosos Evitar contato direto com reagentes Evitar respingos Os res duos devem ser tratados e descartados de acordo com normas de seguran a Res duos l quidos contendo cidos ou bases devem ser neutralizados antes do descarte Usar jaleco luvas e culos de prote o Nunca pipetar solu es com a boca N o comer beber fumar ou aplicar cosm ticos dentro da rea de trabalho Lavar as m os cuidadosamente ap s manusear amostras e reagentes Descartar as sobras de reagentes e res duos de acordo com as normas de seguran a Ler as instru es de uso antes de utilizar o produto Seguir as instru es N o usar produtos ap s o prazo de validade estabelecido Somente usar os reagentes fornecidos no kit e aqueles recomendados pelo fabricante N
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