PLATELIA VZV IgM 48 TESTES 72685
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1. PLATELIA VZV IgM 48 TESTES 72685 M TODO IMUNOENZIM TICO PARA DETERMINA O QUALITATIVA DE ANTICORPOS DE CLASSE IgM AO VIRUS VARICELA ZOSTER NO SORO HUMANO Portugu s 1 10 10 11 12 18 14 15 16 17 NDICE FINALIDADE RESUMO E EXPLICA O DO TESTE PRINC PIO DO TESTE CONTE DO DO DISPOSITIVO E PREPARA O DOS REAGENTES CONSERVA O E ESTABILIDADE DOS REAGENTES PRECAU ES TIPO E CONSERVA O DAS AMOSTRAS PROCEDIMENTO DE TESTE ESQUEMA DO PROCEDIMENTO DE TESTE VALIDA O DO TESTE INTERPRETA O DOS RESULTADOS LIMITA ES DO PROCEDIMENTO ESPECIFICIDADE ANAL TICA SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE DE DIAGN STICO PRECIS O RESOLU O DE PROBLEMAS REFER NCIAS BIBLIOGR FICAS Portugu s 2 10 1 FINALIDADE M TODO IMUNOENZIM TICO PARA DETERMINA O QUALITATIVA DE ANTICORPOS DE CLASSE IgM AO VIRUS VARICELA ZOSTER NO SORO HUMANO 2 RESUMO E EXPLICA O DO TESTE Varicela e Herpes Zoster s o duas manifesta es cl nicas resultantes de infec o pelo V rus Varicela Zoster VZV A varicela uma doen a altamente contagiosa que surge geralmente como consequ ncia de uma primeira infec o por VZV afectando normalmente as crian as A infec o provocada por VZV durante a gravidez pode causar doen a ou malforma o no feto se ocorrer no final da gravidez pode levar morte do rec m nascido Herpes Zoster uma doen a que afecta essencialmente o2. favor consultar o manual de instru es apropriado N o devem ser utilizadas incubadoras de 12 Assegurar que o fundo da placa se apresenta limpo e seco e que n o s o vis veis quaisquer bolhas superf cie do l quido antes de proceder leitura da placa 13 0 uso de amostras altamente hemolizadas soros n o completamente coagulados ou amostras com contamina o microbiana pode dar origem a resultados err neos 14 Para cada instrumento utilizado recomenda se a leitura cuidadosa das respectivas instru es do fabricante por forma a obter informa es adicionais sobre os seguintes pontos instala o e requisitos especiais princ pios de funcionamento instru es precau es e riscos especifica es do fabricante e comportamento do instrumento assist ncia t cnica e manuten o 7 TIPO E CONSERVA O DAS AMOSTRAS A amostra composta pelo soro recolhido da forma habitual a partir da veia e submetido a tratamento com todas as precau es ditadas pelas boas pr ticas de laborat rio O soro fresco pode ser conservado durante 4 dias a 2 86 ou congelado por per odos mais prol ongados a 20 pode ser descongelado um m ximo de 3 vezes As amostras descongeladas devem ser cuidadosamente agitadas antes do teste A inactiva o t rmica pode levar a resultados err neos A qualidade da amostra pode ser seriamente afectada por contamina o microbiana podendo conduzir a resultados err neos As amostras
3. fortemente lip micas ict ricas ou contaminadas dever o ser evitadas O teste n o pode ser realizado em plasma humano 8 PROCEDIMENTO DE TESTE T cnica Manual Preparar o n mero necess rio de tiras A Preparar a solu o tamp o de lavagem diluindo o Tamp o de Lavagem 10x 100 ml 900 H20 Preparar o antig nio reconstituindo o produto seco por congela o directamente com o conjugado volume indicado na etiqueta Em caso de consumo reduzido de Ag reconstituir com Tamp o de Lavagem pronto a usar 1 10 do volume indicado na etiqueta e depois 1 11 no conjugado Diluir as amostras a 1 101 distribuindo 10 ul de soro em 1 ml de diluente distribuir 100 ul de cada amostra dilu da por po o recomenda se a realiza o do teste em duplicado Colocar os controlos N O DILUIDOS numa tira 100 ul em cada po o O requisito m nimo um controlo negativo 2 valores de cut off e 1 controlo positivo Deixar um po o para o reagente de controlo preparado utilizando 100 ul da mistura de substrato Cobrir os po os com fita adesiva e incubar durante 45 minutos a 376 Depois de quatro lavagens durant e 30 segundos 300 ul adicionar 100 ul do imunocomplexo antig nio anticorpos monoclonais em cada po o e incubar de novo durante 45 minutos a 37 c obrindo os po os com a pel cula de protec o A placa novamente lavada 4 vezes como acima descrito Finalmente distribuir o substrato 100 ul po o Ap s 15 min
4. modificar o Procedimento de Teste ou substituir reagentes de outros fabricantes ou outros lotes a menos que o reagente apresente a indica o de intermut vel N o reduzir qualquer dos tempos de incuba o recomendados 5 Os recipientes em vidro utilizados com os reagentes dever o ser meticulosamente lavados com cido clor drico 2M e depois enxaguados com gua destilada ou gua desionizada de alta qualidade Portugu s 5 10 6 Evitar a utiliza o de frigor ficos com auto descongela o para armazenamento das amostras 7 N o expor os reagentes a uma luz intensa ou a vapores de hipocloreto durante o armazenamento ou durante as opera es de incuba o 8 N o permitir que os po os sequem durante o procedimento de teste 9 Evitar cuidadosamente qualquer contamina o cruzada dos reagentes E importante que as pipetas sejam exclusivamente dedicadas ao uso de cada um dos reagentes 10 Evitar tocar ou salpicar o rebordo do po o com conjugado N o tentar eliminar soprando sobre as microplacas 11 Os imunoensaios enzim ticos podem ocasionalmente exibir um efeito de orla que deve ser minimizado aumentando a humidade durante as opera es de incuba o As placas devem ser cobertas com a respectiva tampa e incubadas a 37 em banho de g ua com um suporte ou flutuador para suportar as placas se necess rio ou numa incubadora Em alternativa as placas podem ser incubadas num analisador aprovado Para mais informa es
5. o recomendadas Volume incorrecto de substrato adicionado placa Verificar o funcionamento da pipeta 17 REFER NCIAS BIBLIOGR FICAS 1 Wasmuth and W J Miller J Med Virology 32 189 1990 2 M L Landry S D Cohen D Mayo C Fong W Andiman J Clin Microbiology 25 832 1987 P Larussa S Steinberg et al J Clin Microbiology 25 2059 1987 Portugu s 9 10 The other languages which are required in conformity to the European Directive can be obtained from your local Bio Rad agent Les autres langues requises par la Directive Europ enne sont disponibles aupr s de votre repr sentant Bio Rad local Los otros idiomas que se requiren para la conformidad de la Directiva Europea puede ser obtenida en su oficina local Biorad Die anderen Sprachen die in bereinstimmung mit der europ ischen IVD Direktive ben tigt werden erhalten Sie ber Ihre lokale Bio Rad Niederlassung Le altre lingue che sono richieste in conformit con le Direttive Europee possono essere ottenute dal locale agente Bio Rad As restantes l nguas obrigat rias em conformidade com a Directiva Europeia podem ser obtidas atrav s da subsidi ria Bio Rad mais pr xima de si vriga spr k som kr vs i enlighet med EG direktivet kan erh llas fr n din lokala Bio Rad representant De vrige sprog som kr ves i henhold til EU direktiv kan f s ved henvendelse til den lokale Bio Rad leverander u
6. Tr OITEG YAWOGE TOU arrairo vrair Oony a rorriK Bio Rad Bio Rad C 3 boulevard Raymond Poincar 05 2012 92430 Marnes la Coquette France Tel 33 0 1 47 95 60 00 Fax 33 0 1 47 41 91 33 Portugu s 10 10
7. ardar ao abrigo da luz Diluente de Amostras at ao termo do prazo de validade 2 86 Tamp o de Lavagem 2 semanas a 2 8 5 dias a 15 3 0C Solu o de Paragem at ao termo do prazo de validade a 2 86 Portugu s 4 10 6 PRECAU ES PARA UTILIZA O EXCLUSIVA NO DIAGN STICO N VITRO Cuidado Este dispositivo cont m materiais de origem humana que foram testados e forneceram uma resposta negativa pelos m todos aprovados pela FDA quanto presen a de HbsAg e anticorpos anti HIV 1 anti HIV 2 e anti HCV Uma vez que nenhum teste de diagn stico pode fornecer garantia absoluta quanto aus ncia de agentes infecciosos todo o material de origem humana dever ser considerado como potencialmente infeccioso No manuseamento de materiais de origem humana todas as precau es normalmente adoptadas na pr tica laboratorial dever o ser cumpridas Informa es quanto Sa de e Seguran a 1 N o pipetar com a boca Usar luvas descart veis e culos de protec o durante o manuseamento de amostras e a realiza o do ensaio Lavar cuidadosamente as m os quando terminar 2 Os seguintes reagentes cont m baixas concentra es de subst ncias perigosas ou irritantes a a Solu o Tamp o de Lavagem cont m detergentes b o conjugado cont m fenol c o substrato cido d os calibradores cont m 0 09 de Azida de S dio que pode reagir com o chumbo e o cobre das canaliza es formando dep sitos altamente explosivos de
8. as luvas devem ser eliminados em contentor de res duos biol gicos potencialmente perigosos N o esterilizar em autoclave materiais que contenham hipocloreto de s dio Precau es anal ticas 1 O antig nio reconstitu do com conjugado n o est vel ap s congela o Em caso de consumo limitado de antig nio proceder da seguinte forma reconstituir o antig nio em 1 10 do volume indicado na etiqueta com Tamp o de Lavagem pronto a usar p ex para um volume indicado na etiqueta 3 ml reconstituir com 0 3 ml de Tamp o de Lavagem Recolher a quantidade de antig nio necess ria para utiliza o imediata e misturar com 10 volumes de conjugado Ajustar a al quota e congelar o antig nio restante No momento de utilizar descongelar e misturar com 10 volumes de conjugado 2 Todos os reagentes e amostras dever o ser estabilizados temperatura ambiente 18 30 C antes de serem usados Imediatamente ap s a utiliza o levar de novo os reagentes temperatura de conserva o recomendada E importante trabalhar temperatura correcta O term stato n o dever situar se abaixo de 35C ou acima de 39 O envelope contendo as tiras s deve ser aberto depois de pelo menos meia hora temperatura ambiente 3 N o utilizar os reagentes ap s o prazo de validade indicado A contamina o microbiol gica dos reagentes deve ser evitada j que pode reduzir o tempo de vida til do produto e dar origem a resultados err neos 4 N o
9. azidas met licas para eliminar irrigar com grande volume de gua Se qualquer dos reagentes entrar em contacto com a pele ou os olhos lavar a zona afectada com gua abundante 3 Os dispositivos n o descart veis devem ser esterilizados ap s a utiliza o O m todo preferencialmente recomendado a esteriliza o em autoclave durante 1 h a 121 C os elementos descart veis devem ser esterilizados em autoclave ou incinerados 4 O cido sulf rico necess rio para a Solu o de Paragem e o cido clor drico utilizado na lavagem dos recipientes de vidro s o corrosivos e dever o ser manuseados com os devidos cuidados Em caso de contacto com a pele ou os olhos lavar com gua abundante 5 Os cidos neutralizados e outros res duos l quidos dever o ser descontaminados adicionando um volume de hipocloreto de s dio suficiente para obter uma concentra o final de pelo menos 1 0 Para assegurar uma descontamina o eficaz poder ser necess ria uma exposi o de 30 minutos ao hipocloreto de s dio a 1 6 Qualquer derramamento de materiais potencialmente infecciosos dever ser eliminado imediatamente por meio de papel absorvente e a rea contaminada dever ser lavada com por exemplo hipocloreto de s dio 1 0 antes de se prosseguir com a actividade N o aplicar hipocloreto de s dio sobre zonas derramadas com cido antes de secar primeiro toda a rea Os materiais utilizados para a limpeza de derramamentos incluindo
10. cela Zoster inactivado por tratamento com betapropiolactona em tamp o fosfato 0 04 mol l e lactose pH 7 2 Preparac o Reconstituir com o volume de conjugado indicado na etiqueta misturando por invers o Portugu s 3 10 CONTROLO NEGATIVO IgM PF93900 1 1 6 INTERMUT VEL ENTRE LOTES Conte do Soro humano dilu do em Tamp o fosfato 0 01 mol l com BSA 1 e azida de s dio 0 09 l quido pronto a usar sem dilui o adicional WASH BUF 10 TAMP O DE LAVAGEM 10X PF93603 1 x 100 INTERMUT VEL ENTRE LOTES Conte do Solu o salina tamp o de fosfato concentrada 10 vezes cont m Brij 0 5 Prepara o Diluir o volume necess rio 1 10 com gua destilada por forma a obter a solu o tamp o de lavagem pronta a usar Se estiverem presentes cristais estes dever o ser dissolvidos a 37 antes da dilui o SAMP DIL DILUENTE 2 PF93611 1x100 mL Para dilui o de amostras de soro Pronto a usar INTERMUT VEL ENTRE LOTES Conte do Solu o proteica em tamp o fosfatado com azida de s dio a 0 09 adicionado de metil orange como corante SUBS SUBSTRATO PF93619 15 ml Pronto a usar INTERMUT VEL ENTRE LOTES Conte do Tetrametilbenzidina 0 26 mg ml e per xido de hidrog nio 0 0196 estabilizado em tamp o citrato 0 05 mol pH 3 8 H SO 0 3 SOLU O DE PARAGEM PF93602 1 x 16 INTERMUT VEL ENTRE LOTES H g
11. ficas Calcular a raz o entre a D O da amostra e a do valor Cut off A amostra ser considerada Positiva se a raz o for 1 2 Duvidosa 20 do valor de cut off Negativa se a raz o for 0 8 No caso de o resultado ser duvidoso o teste dever ser repetido Se mesmo assim se mantiver duvidoso recolher nova amostra de sangue 12 LIMITAC ES DO PROCEDIMENTO Os resultados dever o ser sempre interpretados em conjunto com outros dados cl nicos e de diagn stico 13 ESPECIFICIDADE ANAL TICA Foram testadas 63 amostras de soro contendo subst ncias potencialmente interferentes Soro de mulheres gr vidas 12 Parvov rus IgM 3 CMV IgM n 12 HSV IgM n 5 IgM Ab heter filo n5 Rub ola IgM n 5 Sarampo IgM n 5 Papeira IgM n 5 Factor Reumat ide at 1080 Ul dl n 5 Bilirrubina at 11 mg dl n 5 Trigliceridos at 1281 mg dl n 5 Amostras fortemente hemolizadas 3 N o se observaram interfer ncias em qualquer um dos casos Portugu s 7 10 14 ESPECIFICIDADE E SENSIBILIDADE DE DIAGN STICO Num ensaio cl nico externo foram testadas 154 amostras com este dispositivo em paralelo com o m todo de rotina habitualmente utilizado no laborat rio Os resultados foram divididos em 5 pain is diferentes Painel 1 56 amostras de doentes com infec o recente a varicela Painel 2 10 amostras com re infec o tal como demonstrado por seroconve
12. rada Verificar de novo o procedimento Verificar se existem solu es que n o tenham sido utilizadas Repetir o teste Placa n o reactiva Verificar o c digo da embalagem que cont m a placa ver qual o c digo correcto no par grafo 4 do folheto de instru es Verificar se a placa n o usada apresenta humidade o dessecante de s lica gel deve ser de cor amarela clara Repetir o teste S rie n o v lida totalmente positiva Contamina o do substrato Tirar nova al quota do substrato Lavagem inadequada Verificar se o aparelho de lavagem est a funcionar correctamente Fraca precis o Lavagem incompleta dos pocos Verificar se o aparelho de lavagem est a funcionar correctamente Aspira o incorrecta dos pocos Verificar se o aparelho de lavagem est a funcionar correctamente Erro de pipetagem Verificar o funcionamento da pipeta Adi o de reagente demasiado lenta Evitar deixar secar a placa ap s a opera o de lavagem Adicionar imediatamente os reagentes Presen a de bolhas Evitar a forma o de bolhas durante a pipetagem Passagem ptica n o limpa Verificar se a fonte de luz e o detector do aparelho est o sujos Limpar o fundo da placa com um papel macio Revela o de cor inadequada Tempos de incuba o ou temperatura incorrectos Verificar os controlos de temperatura e tempo Respeitar as instru es de utiliza
13. ras revestidas com anticorpos monoclonais IgM anti humanos Utiliza o abrir a embalagem do lado oposto ao c digo M seguido do n mero de lote que pode ser til para fins de identifica o retirar da embalagem de alum nio o suporte e as tiras a usar e colocar as tiras n o utilizadas no saco de polietileno contendo s lica gel expelir o ar e selar pressionando o fecho CONTROL SORO DE CONTROLO POSITIVO 1 x 1 6 ml Conte do Soro humano contendo anticorpos IgM anti Varicela zoster dilu do em Tamp o fosfato 0 01 mol l com BSA 1 e azida de s dio 0 09 l quido pronto a usar sem dilui o adicional Cor a cor dos soros de controlo proporcional ao t tulo relativo de anticorpos CONTROL OFF SORO DE CONTROLO CUT OFF 2 5 ml Conte do Soro humano contendo anticorpos IgM anti Varicela zoster dilu do em Tamp o fosfato 0 01 mol l com BSA 1 e azida de s dio 0 09 l quido pronto a usar sem dilui o adicional Cor a cor dos soros de controlo proporcional ao t tulo relativo de anticorpos CONJ CONJUGADO 10 mL Conte do Anticorpos monoclonais marcados com peroxidase em tamp o fosfato com fluido asc tico de ratinho fenol 0 05 e Bronidox 0 02 Prepara o Pronto a usar sem dilui o adicional O imunocomplexo deve ser preparado 45 minutos antes de usar Agi ANTIG NIO Seco por congelac o x 3 frascos Conte do V rus parcialmente purificado de Vari
14. rs o ou por aumento no t tulo de anticorpos em CFT Painel 3 15 amostras de doentes com uma infec o recente causada por Citomegalov rus contendo IgM anti CMV Painel 4 8 amostras que eram positivas para mononucleose infecciosa caracterizadas pela presen a de IgG e IgM anti VCA e pela aus ncia de anticorpos anti EBNA A Painel 5 65 amostras da popula o em geral 61 das quais contendo IgG anti Varicela Uma compara o no desempenho dos dois dispositivos mostra uma concord ncia de 99 4 entre os dois 153 154 com uma sensibilidade de 100 63 63 e uma especificidade de 98 896 90 91 15 PRECIS O Precis o intra s rie Amostra VZC 1 VZC 2 VZC 3 Cut Off Controlo C Cut dos d Positive Positivo n replica es 24 24 24 12 12 D O 0 115 0 511 1 769 0 292 1 755 CV 10 5 5 9 6 Precis o entre s ries Index Amostra M dia CV Controlo Positivo 6 1 2 VZC1 0 4 6 VZC2 1 8 16 VZC3 6 9 4 Precis o entre lotes Index Amostra Lote n 034 Lote n 035 Lote n 036 M dia CV Controlo Positivo 5 7 5 8 6 1 5 9 4 VZC1 0 3 0 4 0 4 0 4 16 VZC2 1 3 2 0 2 0 1 8 23 VZc3 4 9 6 2 6 5 5 9 15 Portugu s 8 10 16 GUIA DE RESOLU O DE PROBLEMAS PROBLEMA POSS VEL ORIGEM TESTE OU AC O S rie n o v lida totalmente negativa Um ou mais reagentes n o adicionados ou inclu dos na sequ ncia er
15. s adultos e parece ser causada por uma reactiva o do v rus o qual pode permanecer latente por longos per odos nos g nglios sensoriais da coluna vertebral no seguimento de uma primeira infec o Esta infec o causa dolorosas erup es cut neas ao longo do percurso dos nervos afectados Adoptam se geralmente m todos serol gicos para determinar o estado de imuniza o dos indiv duos de risco sobretudo doentes imunodeprimidos e no diagn stico pr e p s natal de indiv duos infectados 3 PRINC PIO DO TESTE O teste para an lise de anti Varicela Zoster IgM baseia se no princ pio da captura destas imunoglobulinas por anticorpos monoclonais IgM anti numanos que se encontram na fase s lida A subsequente incuba o com antig nio da varicela num complexo com anticorpos monoclonais ligados a peroxidase de r bano silvestre permite seleccionar os anticorpos IgM espec ficos para o antig nio e revelado por adi o do substrato de peroxidase Quando a reac o enzim tica parada por adi o de uma solu o de cido sulf rico forma se uma colora o amarela A cor que proporcional quantidade de anticorpos espec ficos presentes na amostra pode ser lida num leitor de microplacas ELISA 4 CONTE DO DO DISPOSITIVO E PREPARA O DOS REAGENTES dispositivo cont m reagentes suficientes para 48 determina es Estabilizar os reagentes temperatura ambiente antes de usar MT PLATE MICROPLACA 3 x 2 ti
16. t SO 0 3 mol l em solu o pronta a usar FITA ADESIVA 2 SACO DE POLIETILENO 1 MATERIAIS NECESS RIOS MAS N O FORNECIDOS Incubadora a 37 C Leitor de microplacas comprimento de onda 450 ou 450 620 nm com linearidade at D O gt 2000 Aparelho de lavagem de microplacas de prefer ncia capaz de distribuir volumes entre 225 375 Agua destilada ou desionizada Recipientes de vidro habitualmente utilizados em laborat rio provetas tubos de ensaio etc Micropipetas para recolha rigorosa de 10 100 1000 ul de solu o Luvas descart veis Temporizador Solu o de hipocloreto de s dio 5 Contentores para recolha de materiais potencialmente infecciosos Papel absorvente 5 CONSERVA O E ESTABILIDADE DOS REAGENTES Os reagentes devem ser conservados temperatura de 2 8 O prazo de validade est indicado em cada componente e na etiqueta da respectiva embalagem Os reagentes t m uma estabilidade limitada ap s abertura e ou prepara o REAGENTE CONDI ES Microplaca 5 semanas a 2 8 saco de polietileno Controlos 5 semanas a 2 8 Conjugado 5 semanas a 2 8 Antig nio reconstitu do 5 dias 2 86 se for reconstitu do com conjugado 206 se for reconstitu do com Tamp o de Lavagem Evitar sequ ncias repetidas de congela o descongela o Ver Precau es Anal ticas n 1 Substrato at ao termo do prazo de validade a 2 86 1 semana 15 30 gu
17. utos temperatura ambiente parar a reac o enzim tica com 100 ul de Solu o de Paragem A absorv ncia D O lida a 450 nm ou 450 620 nm no prazo de 30 min Portugu s 6 10 9 PROCEDIMENTO DE TESTE PARA Platelia VZV IgM T cnica Manual PASSO 1 Colocar 100 ul de amostra dilu da controlos nos po os das tiras Incubar durante 45 minutos a 376 Lavar 4 vezes 30 de tempo de imers o 300 ul PASSO 2 Adicionar 100 ul de imunocomplexo em cada po o Incubar durante 45 minutos a 376 Lavar 4 vezes 30 de tempo de imers o 300 ul PASSOS Adicionar 100 ul de Substrato em cada po o Incubar durante 15 minutos temperatura ambiente PASSO 4 Adicionar 100 ul de Solu o de Paragem Proceder leitura da absorv ncia a 450 nm no prazo de 30 minutos 10 VALIDA O DO TESTE Subtrair o valor do reagente de controlo lt 0 150 de todos os outros valores lidos O valor D O do Controlo cut off deve situar se a 25 do valor m dio quando testado em triplicado Rejeitar quaisquer valores an malos e calcular de novo a m dia O Controlo Positivo deve ter uma D O de pelo menos 1 5 vezes o valor cut off A raz o entre o Controlo Negativo e o cut off deve ser inferior a 0 6 A D O do controlo Cut off deve ser gt 0 2 a 450 nm e gt 0 16 a 450 620 nm 11 INTERPRETA O DOS RESULTADOS Resultados qualitativos Se a D O da amostra for superior ao valor Cut off a amostra positiva quanto presen a de IgM espec
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