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Isolamento e C Enzimas Multihé Microbiana e s

1. MAR IDY KAF SPA LTSGDFDE TVELMAKMIMHEBPQ 150 Pa ASS a G EALETAGTPL S GSSGELSKBOITLESMEKMIOHTEPO 144 PO O uere FPDYBOSFEIMGSPABMPNWGTSGELSABOVDLMZNMLLLDBAA 166 Ps DGKKTEGGTENL 2E ENI IEG p FEINMMARYXIONTBDV 130 exe kxe c Ks e exx ks KKK s Mh SLADMKET EVI PPEDE DLD L svi QIABIDSDSKEVVKII 210 Pa GMPEMRESWKVLMKPED LNDLD E IN EI QI DSKKIVKVI 204 Pp GMKEMRESWKVHMAPED ENDWD E L E QI IYEIKSVL 226 Ps SEH KDS E PVDO EUN KL DTHTIWKVL 190 ee e m D CR oKKKKKKe oo kk ek GONE Mh LVI LINM EEBBOTWAKIKVGME ET KL 270 Pa LLVI RIDM KEBTKVAFIKIGIE ES RY 264 Pp L LEVI GKVNM KEBTTVAEIKIGSE KY 286 Ps L YTV E K n IN 38 IR KY 250 Xckckckckck eckckckck kk 20 e KKK sKK KH ffl T T Mh T SKKIV STOE FI 330 Pa KQIV DIOT FI 324 PP KKIO YDEOE FI 346 Ps GGT IKVV OBVDC E V 309 o KKK kk se KKK ok kk KKK kk e Weg KH KKK Mh KIM DAAEY IAVV ODRN B 390 Pa KVL ie E GAAPF AVIDSKDRRES 384 Pp KIL LDNLKT SAERF L pa LVVIBTKEGK 406 ES QII IBLK LAM BE SAKE AAV EE 369 eke ek Ke Ke x Mh G KI EH S BEES P DEPRG HPDKA V 444 Pa G KT da s s GSISLBCgDPEN HPOYAWRKV 438 Pp IGGQT 5 DSVAL E DPEG HPDNAWKIL 461 PS pe E OS e SDDPKYAKYKEHN V 428 Sb RR EEE db ec Kexx i Mh RTVDGO G TAL EAVSO INNF Eid eia DAGYDV PI 499 Pa AELOGOEG ji E a Rae DARISQ Lo Nue DAKYOVBPI 493 Pp DSF PALGG x E Se EALI
2. 0 5 mM AM e 0 5 mM AM e 2mM NADH 0 5 mM AM 2mM NADH e 0 1 mM SO 0 5 mM AM 2mM NADH e 1 mM SO Os resultados apresentados na figura IL31 demonstram que ocorre uma n tida diminui o da intensidade do sinal produzido pelo AM na presen a de NADH aquando da adi o de concentra es crescentes de sulfito Este facto deve se precipita o do AM a qual inclusivamente vis vel na c lula electroqu mica com a solu o inicialmente fortemente corada pelo mediador a ficar amarela e com um dep sito s lido no fundo 1I 4 5 5 Violog nio de Benzilo Na figura IL 32 encontram se representados voltamogramas c clicos obtidos com 1 mM de violog nio de benzilo VB em ambos os electr litos de suporte na presen a de concentra es de sulfito crescentes 148 A lt q om pr 0 50 0 45 0 40 0 35 0 30 0 25 0 20 0 15 Potencial V vs NHE I uA 0 50 0 45 0 40 0 35 0 30 0 25 0 20 0 15 Potencial V vs NHE Fig II 32 Ensaios realizados com violog nio de benzilo e concentra es crescentes de sulfito 0 mM 9 1 mM 10 mM 20 mM A Voltamogramas c clicos tra ados a pH 7 6 B Voltamogramas c clicos tra ados a pH 5 5 A pH 5 5 o comportamento electroqu mico do VB semelhante ao verificado para o AB e para o VM e poder por isso ser compreendido de forma an loga Contudo neste caso n o foram observados quaisquer efeitos p
3. 0 40 0 20 0 00 0 20 0 40 0 60 0 80 0 40 Intensidade de Corrente uA Potencial V vs NHE D 0 80 0 60 0 40 0 20 0 00 0 20 0 40 0 60 Intensidade de Corrente uA 0 80 1 00 1 20 0 40 0 20 0 00 0 20 0 40 0 60 0 80 0 40 2 00 1 60 1 20 0 80 0 40 0 00 0 40 0 80 1 20 Intensidade de Corrente uA 1 60 2 00 Potencial V vs NHE 2 50 2 00 1 50 1 00 0 50 0 00 0 50 1 00 1 50 2 00 2 50 3 00 Intensidade de Corrente uA 0 40 0 20 0 00 0 20 0 40 0 60 0 80 0 60 Potencial V vs NHE E 0 00 0 20 0 40 Potencial V vs NHE 0 00 0 20 0 40 Potencial V vs NHE 0 20 0 00 0 20 Potencial V vs NHE Intensidade de Corrente uA Intensidade de Corrente uA Intensidade de Corrente uA 0 10 0 20 0 30 0 60 0 40 0 20 0 00 0 20 0 40 0 60 Potencial V vs NHE 1 50 F 0 60 0 40 0 20 0 00 0 20 0 40 0 60 Potencial V vs NHE 5 60 I 4 80 4 00 3 20 2 40 1 60 0 80 0 00 0 80 1 60 2 40 3 20 4 00 0 60 0 40 0 20 0 00 0 20 0 40 0 60 Potencial V vs NHE Fig 1 36 Voltamogramas c clicos tra ados com o el ctrodo de Au modificado com a SAM de MUA e cd NiR adsorvida As linhas cont nuas correspondem ao 1 ciclo e as linhas tracejadas ao 2 ciclo A pH 5 20 mVs B pH 7 20 mVs C pH 9 20 mVs D pH 5 100 mVs E pH 7 100 mVs F pH 9 100 mVs G pH 5 400 mVs H pH 7 400 mVs
4. 3 H20 Aer 3 Fe 2 HO 2H 2e g Fe 2 eM SS Fe 2 LS S A S S SS FE F Fe F Fel ee onus ere Fig II 7 Mecanismo de redu o do SO catalisada pela SiRHP Strupe amp Getzoff 2001 107 De acordo com o mecanismo representado na figura II 7 a redu o completa do sulfito a sulfureto ocorre de forma sequencial O primeiro par de electr es recebido da flavoprote na e reduz os co factores provocando a liberta o do fosfato do centro activo ver fig 11 4 e ocorrendo a subsequente liga o do sulfito ao lado distal do sirohemo atrav s do tomo de enxofre Seguidamente s o fornecidos dois prot es ao substrato provenientes da cadeia lateral da SIRHP O sistema estabilizado atrav s de pontes de hidrog nio Este processo repete se por duas vezes at serem fornecidos ao substrato os 6 electr es necess rios A ced ncia dos ltimos dois prot es causa a liberta o do produto HS e a liga o de uma nova mol cula de fosfato ao centro activo completando assim o ciclo catal tico Crane et aL 1997A Strupe amp Getzoff 2001 II 2 2 2 Redutases do Sulfito Dissimilativas A redu o de sulfito a sulfureto um passo essencial do processo anaer bio de respira o de sulfato Assim as redutases do sulfito dissimilativas dSIR EC 1 8 99 3 existem em todas as bact rias redutoras de sulfato Klein et al 2001 Foi tamb m identificada uma dSiR na bact ria anaer bia restrita Bi
5. C552 Ox cit cd Red El ctrodo cit C552 Red cit cd Ox Matriz de Imobilizacao Fig I 3 Esquema reaccional para o biossensor de nitritos baseado na actividade da cd NiR de Marinobacter hydrocarbonoclasticus com recurso ao cit Cs proveniente da mesma fonte bacteriana como mediador 2 2 2 2 Electroquimica Directa Existem tamb m biossensores de nitrito baseados na electroqu mica directa DET direct electron transfer entre as enzimas e os el ctrodos Scharf et al 1995 Silveira et al 2010B 2010C A configura o gen rica destes dispositivos encontra se representada na figura I 4 E L C T R O D O Fig 1 4 Representa o esquem tica dos biossensores com sinal produzido via electroqu mica directa e transdu o amperom trica e ou voltam trica 12 Os pr requisitos para alcan ar de forma eficiente uma reac o de transfer ncia electr nica heterog nea incluem a correcta orienta o da prote na na superf cie do el ctrodo e uma dist ncia suficientemente curta entre o centro redox e a interface com o el ctrodo O potencial operacional de dispositivos baseados em DET encontra se directamente relacionado com o pontencial redox das enzimas aplicadas facto que contribui para um aumento da selectividade e redu o das reac es interferentes A pr pria constru o do biossensor facilitada visto que a quantidade de reagentes e etapas de constru o s o substancialmente
6. Doutora Teresa Sacadura Santos Silva pela gentileza de construir os mapas de potencial electrost tico da superf cie da cd NiR A Doutora Patr cia Paes de Sousa pelos valiosos conselhos transmitidos no campo da bioelectroqu mica Ao Doutor St phane Besson pelas explica es e conselhos relativos cd NiR de Marinobacter hydrocarbonoclasticus Ao Doutor Sergey Bursakov os conselhos dados em mat ria de purifica o e todos os outros que n o consegui interpretar em devido tempo Aos Doutores Am rico Duarte e Simone Dell Aqua os preciosos conselhos e aux lio prestados em mat ria de purifica o de prote nas Doutora Marta Santos pela sequencia o do n terminal da desulfoviridina e por tudo o resto A Doutora Lu sa Maia pela forma como sempre procurou incutir me serenidade e bom senso quando estes me faltavam A Mestre Ana Teresa Lopes pelo apoio t cnico e pessoal paci ncia empatia gentileza dedica o profissionalismo E todas as outras in meras qualidades que a caracterizam enquanto pessoa e sobretudo enquanto profissional de excep o Doutora C lia Silveira com quem partilhei grande parte do meu tempo e espa o ao longo destes anos N o h no Universo palavras suficientes para transmitir o quanto lhe estou grata Foi uma honra e um privil gio trabalhar ao seu lado N o de todo comum algu m com t o elevado grau de efici ncia e profissionalismo ser simultaneamente um
7. El ctrodo Condutim trico Fig I 6 Representa o esquem tica do biossensor de nitrito com transdu o condutim trica 2 2 3 3 Detec o Optica Trabalhos an logos publicados por Ferreti et al 2000 e por Rosa et al 2002 sugerem a transdu o por via ptica em biossensores enzim ticos de nitrito Em ambos os casos as medi es baseiam se na altera o da intensidade da banda de absor o atribu da ao centro catal tico da NiR utilizada O esquema representativo dos sensores desenvolvidos com esta metodologia apresenta se na figura 1 7 Fonte de hv SO lt gt 8 04 NO lt gt NO hv Detector de Fig 1 7 Representa o esquem tica do biossensor de nitrito com transdu o ptica A tabela 1 1 apresenta de forma resumida as principais caracter sticas e par metros anal ticos de diversos biossensores enzim ticos para quantifica o de nitritos englobando os trabalhos mais recentes e ou representativos de cada tipo de dispositivo 14 Tabela I 1 Descri o e par metros anal ticos de biossensores para a determina o de nitrito baseados em NiRs como elementos de reconhecimento biol gico N A n o aplic vel N D n o determinado MET transfer ncia electr nica mediada DET transfer ncia electr nica directa Ge Transfer ncia Gama de Limite de S NiR siroh mica folha de espinafre D desulfuricans D desulfuricans D desulfuricans D desul
8. reduzidos Scharf et al 1995 Silveira et al 2010B 20100 1 2 2 3 Biossensores N o Amperom tricos 2 2 3 1 Detec o Potenciom trica Um trabalho pioneiro desenvolvido por Kiang et al 1975 reporta o primeiro biossensor de nitrito baseado na actividade de uma redutase do nitrito Nesse trabalho uma NiR siroh mica extra da das folhas de espinafre foi incorporada numa matriz polim rica e com recurso a violog nio de metilo reduzido com ditionito como mediador procedeu se medi o por via potenciom trica da am nia produzida pela redu o de nitrito Kiang et al 1975 Na figura 1 5 apresenta se a representa o esquem tica do dispositivo proposto por estes autores M X NO lt gt NO S2047 S2047 X NH 4 NH lt gt Ee t et T Z Q 3 E Q Q Q A Kei E E Q Q E Fig I 5 Representa o esquem tica do biossensor de nitrito com transdu o potenciom trica 2 2 3 2 Detec o Condutim trica Um biossensor condutim trico para a determina o de nitritos foi desenvolvido por Zhang et al 2009 num trabalho de colabora o com o nosso grupo Na figura 1 6 encontra se representado o princ pio de funcionamento do dispositivo 13 SO ES SO32 Can NO as NO Medox l S2047 lt gt S2042 Medrea NH NH4
9. cido b rico H BOs 61 86 emol gt 99 8 foi fornecido pela Pronolab O glicerol C43H3O 92 10 emol gt 8796 da Panreac O cido tricloroac tico TCA CI3CCOOH 163 39 emol 99 foi fornecido pela Alfa Aesar O ditionito de s dio Na S504 174 11 emol gt 87 o cloreto de ferro II FeCl 4H O 198 75 emol gt 99 o etilenodiamina tetraacetato de s dio EDTA Cjo9H44N5Na50s 2H5O0 372 24 emol gt 99 o metanol CHOH 32 04 emol 99 o tiossulfato de s dio Na 8 05 5H 0 248 21 emol 99 5 e o azul de Coomasie R 250 C4SH44N3NaO 55 foram adquiridos Merck O tioglicolato de s dio HSCH COONa 114 10 emol 97 foi fornecido pela Aldrich A coluna pr empacotada Superdex 200 HR 10 30 da GE Healthcare A resina de permuta ani nica DE 52 da Whatman As resinas Source 15Q Superdex 200 grau preparativo a coluna pr empacotada Superdex 200 HR 10 30 as prote nas padr o usadas na determina o da massa molecular MM 13 7 a 1338 kDa e os marcadores de massa molecular utilizados nas electroforeses LMW 14 4 a 97 kDa s o da Amersham Biosciences As colunas XK 26 40 e XK 26 100 s o provenientes da Pharmacia As membranas de di lise 0 25 4 mm capacidade de 5 mlcm cut of 12 a 14 kDa foram fornecidas pela Viskin as membranas YM3 YM30 e PVDF Immobilon PSQ Transfer Membrane foram adquiridas Millipore e os filtros de seringa com mebranas de 0 45um foram fornecidos pela VWR Inter
10. limite de detec o n d n o determinado n 1 n o identificado Vinhos xaropes e Cardwell amp Christophersen concentrados de fruta FIA com detec o amperom trica 0 25 15 cores intensas 2000 vinhos FIA com detec o Coulom trica 1 10 n d Chen et al 2000 vinhos Separa o por difus o gasosa cromatografia i nica 1 100 d n d F ldt et al 2001 vinhos Electroforese capilar com derivatiza o in capilar 0 64 51 2 n i Jankovskiene et al 2001 vinhos 25 6 76 8 cores intensas Lowinsohn amp Bertotti 2001 2 40 25 250 0 9 n i Carballo et al 2003 Titula o Coulom trica vinhos SIA com detec o espectrofotom trica Segundo amp Rangel 2001 FIA com detec o amperom trica conservas de vegetais HPCL com detec o por UV n d n d Mcfeeters amp Barish 2003 a car passas e alperces Voltametria C clica secos Amperometria 0 894V vs NHE 128 2560 ascorbato iodeto Pournaghi Azar et al 0 256 12 8 sulfureto 2003 0 06 3 84 EE Lowinsohn et al 2004 acetalde do 0 025 1 5 d n i de Marcos et al 2004 vinhos e sumos de frutos FIA com detec o amperom trica indirecta vinhos T S EE Fotom trico reac o com polianilina vinhos electroforese de zona com detec o condutim trica n d n d Mas r et al 2004 vinhos ICP OES etanol Cmel k et al 2005 vinhos brancos e tintos Amperometria 1 094V vs NHE
11. mq Pa 2881832 2885580 B 1000 pb seuls ies ici dsrD 379608 387247 dsrC 1991934 1995930 Fig II 10 Estrutura dos oper es dos genes dsrAB e dsrC A D vulgaris Hildenbourogh B A fulgidos KEEG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Existem ainda diversas dSiR que n o cont m a subunidade y embora todos os organismos que possuem os genes dsrAB possuem igualmente o gene dsrC Um bom exemplo deste facto a Dsv de Archaeoglobus fulgidos a qual n o possui a subunidade y Schiffer et al 2008 mas cuja estrutura cristalogr fica da prote na codificada pelo dsrC se encontra resolvida Mander et al 2005 Assim as evid ncias apontam para que a pequena prote na de 11kDa n o seja verdadeiramente uma subunidade da Dsv mas sim uma prote na com a qual interage formando um complexo Diferen as na intensidade de tal interac o poder o estar na origem da diverg ncia conformacional encontrada nas Dsv de Desulfovibrio isoladas at ao momento pois sendo verdade que a prote na isolada na forma o5p y nas esp cies D vulgaris Hildenbourogh e como ir ser demonstrado em seguida sec o IL4 2 1 D desulfuricans ATCC 27774 tal s aconteceu parcialmente na Dsv de D desulfuricans Essex Steuber et al 1995 e n o foi at ao momento observado na enzima de D gigas Moura et al 1988 N o sendo ainda conhecida a fun o biol gica da prote na codificada pelo dsrC h ainda um outro elemento a
12. o apenas ocorre nos casos em que a janela de potencial substancialmente alargada no sentido positivo at 1 3 V Selvaraju amp Ramaraj 2003 Neste caso o SO n o ser um oxidante suficientemente forte para iniciar o processo de polimeriza o Os voltamogramas c clicos tra ados na presen a de ImM de Fs dissolvida em ambos os electr litos de suporte apresentam se na figura 11 34 150 I uA 0 50 0 45 0 40 0 35 0 30 0 25 0 20 0 15 0 10 0 05 Potencial V vs NHE B I uA cA h Lon RAH Ss HN gt 0 40 0 35 0 30 0 25 0 20 0 15 0 10 0 05 0 00 Potencial V vs NHE Fig UA Ensaios realizados com fenosafranina e concentra es crescentes de sulfito 0 mM mM 10 mM 20 mM A Voltamogramas c clicos tra ados a pH 7 6 B Voltamogramas c clicos tra ados a pH 5 5 A pH 7 6 fig II 34A observa se que na presen a de sulfito ocorre uma diminui o na intensidade do sinal do mediador Embora a Fs seja sol vel em gua encontram se reportados problemas de solubilidade deste composto Silveira et al 2010 em solu es tamp o a este pH Assim poss vel que ocorra uma diminui o da solubilidade do mesmo devido ao aumento da concentra o salina do meio Na aus ncia de altera es nos perfis voltam tricos da Fs a pH 5 5 na presen a de sulfito prosseguiu se com ensaios enzim ticos na presen a deste corante dos quais resultaram os voltamogr
13. 1997 PDB 1NiR rosa Como se pode observar na imagem da figura I 25B n o detectada qualquer diferen a significativa entre as estruturas da cd NiR de Ps aeruginosa e M hydrocarb a n vel do mon mero Ao considerar a forma dim rica da prote na verifica se que a estrutura obtida por simula o pressup e a exist ncia de uma dist ncia entre mon meros superior verificada na enzima de Ps aeruginosa Esta diferen a poder dever se ao facto de o algoritmo de previs o utilizado basear o acoplamento unicamente em par metros geom tricos n o contemplando as interac es de natureza electrost tica que certamente contribuem para uma maior aproxima o entre as duas unidades da prote na As imagens da distribui o do potencial coulombiano na superf cie do modelo criado para a estrutura da enzima foram calculadas no software UCSF Chimera figura 1 26 50 Fig 1 26 Distribui o do potencial coulombiano na superf cie da cd NiR de M hydrocarb A Imagem de topo B Imagem de fundo C Imagem lateral 1 D Imagem lateral 2 Os res duos com carga negativa encontram se representados a vermelho os res duos com carga positivo est o assinalados a azul e os res duos com carga neutra s o brancos Os resultados obtidos foram confirmados pela colora o da superf cie atrav s de um mapa de potencial electrost tico calculado com o programa CCP4MG imagens n o apresentadas comprovando se que o mapa do potencial
14. 2001 Jafferji A Allen J W Ferguson S J Fulop V J Biol Chem 275 25089 25094 2000 Jj gren T Hajdu J J Biol Chem 276 29450 29455 2001 Jj gren T Svensson Ek M Hajdu J Brzezinski P Biochemistry 39 10967 10974 2000 Jorge S R S Mestrado Integrado em Engenharia Qu mica e Bioqu mica Faculdade de Ci ncias e Tecnologia Universidade Nova de Lisboa Disserta o em Prepara o 2011 Kelley L A Sternberg M J E Nature Protocols 4 363 371 2009 Kharitonov V G Sharma V S Magde D Koeshing D Biochemistry 36 6814 6818 1997 Kiang C H Kuan S S Guilbault G G Anal Chim Acta 80 209 214 1975 Kissinger P T Biosens Bioelectron 20 2512 2516 2005 Kita Tsukamoto K Oyaizu H Namba K Simidu U nt J Syst Bacteriol 43 8 19 1993 Kobayashi K Koppenh fer A Ferguson S J Watmough N J Tagawa S Biochemistry 40 8542 8547 2001 Koppenh fer A Little RH Lowe D J Ferguson S J Watmough N J Biochemistry 39 4028 4036 2000 Kukimoto M Nishiyama M Murphy M E Turley S Adman E T Horinouchi S Beppu T Biochemistry 33 5246 5252 1994 Kuznetsova S Knaff D B Hirasawa M Lagoutte B Setif P Biochemistry 43 510 517 2004 Larsson S C Orsini N Wolk A J Natl Cancer Inst 98 1078 1087 2006 L ger C Bertrand P Chem Rev 108 2379 2438 2008 Lijinsky W Mutat Res 443 129 138 1999 Liu L Zhao F Liu L Li J Zeng B Colloids
15. A espectrofotometria de UV Vis foi efectuada em espectrofotometros UV 160A e UV 1800 ambos da Shimadzu As electroforeses foram realizadas em sistemas de pH descontinuo segundo o m todo de Laemmli em tinas de electroforese Mini PROTEAN 3 da Bio Rad mini gel 8 x 7 x 0 75 cm 1 3 2 2 Electroqu mica Os el ctrodos de trabalho de ouro policristalino foram fornecidos pela Methrom O 3mm e pela BAS 9 2mm O el ctrodo de refer ncia el ctrodo saturado de calomelanos SCE 242mV vs NHE e o contra el ctrodo de platina Pt foram ambos adquiridos Radiometer Os el ctrodos de pasta de carbono screen printed CPSPEs foram preparados na CIDETEC Ochoteco et al 2009 Os CPSPEs foram preparados segundo uma configura o de tr s el ctrodos nomeadamente um el ctrodo de trabalho de pasta de grafite 3 1mm um pseudo el ctrodo de refer ncia Ag AgCl 302 mV vs NHE e um contra el ctrodo de pasta de grafite As c lulas electroqu micas simples modelo 6 1415 210 e termostatizada modelo 6 1418 110 foram adquiridas Methrom As medi es foram realizadas num potenciostato Autolab PSTAT 12 da Eco Chimie controlado atrav s do software GPES 4 9 O cabo adaptador DRP CAC espec fico para liga o de SPEs ao potenciostato foi fornecido pela Dropsens 1 3 2 3 Espectroscopia de Resson ncia Raman As medi es de espectroscopia de Resson ncia Raman RR foram efectuadas com um microsc pio confocal aco
16. Lojou et al 2003 e a cd NIR de Marinobacter hidrocarbonoclasticus recebe electr es provenientes do citocromo css Lopes et al 2001 Na figura 1 19 apresentam se as estruturas tridimensionais destas tr s prote nas Fig I 19 Estruturas tridimensionais dos parceiros fisiol gicos de cd NiRs provenientes de tr s organismos distintos A Citocromo cs552 de Marinobacter hidrocarbonoclasticus dimero Brown et al 1999 PDB 1CNO B Citocromo css de Pseudomonas aeruginosa mon mero Matsuura et al 1982 PDB 351C C Pseudoazurina de Paracoccus pantotrophus d mero Najmudin et al 2010 PDB 3ERX No caso da Marinobacter hidrocarbonoclasticus salienta se que o citocromo css cit C552 n o parceiro exclusivo da cd NiR Na verdade para al m de apresentar a capacidade de transferir electr es para a cd NIR de Pseudomonas aeruginosa Lojou et al 2003 esta prote na foi tamb m identificada como sendo o parceiro fisiol gico da redutase do xido nitroso N OR a enzima respons vel pela redu o do N O a N5 o ultimo passo da desnitrifica o Dell aqua et al 2008 31 1 2 5 Pseudomonas nautica Marinobacter aquaeolei Marinobacter hydrocarbonoclasticus Ao leitor da presente disserta o n o ser certamente alheio o facto de a cd NiR alvo deste estudo ser identificada como proveniente da bact ria Marinobacter hydrocarbonoclasticus Contudo grande parte dos artigos citados sobre a mesma bem com
17. M hydrocarb com base nos m todo descrito na bibliografia Besson et al 1995 Fauque et al 1992 e aos quais se procederam a algumas modifica es AM hydrocarb foi crescida na Unit de Fermentation do LCB CNRS em Marselha Fran a A frac o sol vel foi obtida a partir do extracto bruto de acordo com o descrito por Correia et al 2008 O extracto sol vel foi submetido a um protocolo de purifica o composto por tr s passos cromatogr ficos e baseado no m todo descrito por Besson et al 1995 Todas as etapas do processo foram realizadas em meio aer bio e a 4 C A frac o sol vel foi submetida a di lise durante cerca de 12 horas em 10mM tamp o Tris HCl pH 7 6 e aplicada numa coluna DE 52 equilibrada na mesma solu o As prote nas foram elu das com um gradiente compreendido entre 10mM e IM de Tris HCl pH 7 6 O cit css n o ficou retido na coluna tendo sido elu do no decurso dos processos de carga e lavagem A frac o de cit cs52 puro foi concentrada aliquotada e armazenada a 64uM em 10mM Tris HCl pH 7 6 a 20 C A frac o composta maioritariamente pela cd NiR foi elu da a uma for a i nica de aproximadamente 600mM A frac o foi dialisada durante cerca de 12h contra 10mM Tris HCl pH 7 6 filtrada e carregada numa coluna Source 15Q Procedeu se cromatografia sob press o com um gradiente 0 01 IM de Tris HCl pH 7 6 seguida a 280 410 e 640nm 36 A cerca de 450mM Tris HCI elu u a frac o conte
18. Quando o NO se liga ao hemo ferroso eq 1 3 surge um segundo pico de redu o irrevers vel entre 0 45V e 0 72V vs NHE eq 1 4 o qual apresenta comportamento catal tico O elevado potencial negativo a que surgem as correntes catal ticas obriga remo o pr via de oxig nio nos sistemas analisados Contudo Zhao et al 2008 e Sun et al 2009 detectaram o desenvolvimento de correntes catal ticas associadas ao pico de redu o Mb Fe III eq 1 2 e Liu et al 2003 mencionam um comportamento semelhante para a Hb na presen a de baixas concentra es de nitrito Por m nenhum destes autores prop s qualquer explica o para o facto Blair et al 2006 publicaram uma extensa revis o dos mecanismos alternativos propostos para a redu o electrocatal tica de xidos de azoto NOx levada a cabo quer por prote nas h micas quer por compostos modelo Recentemente foram tamb m reportados biossensores amperom tricos para a determina o de NO que utilizam o citocromo c cit c de cora o de cavalo como elemento de reconhecimento biol gico Geng et al 2008 Chen et al 2009 Esses sensores baseiam se na oxida o do nitrito a nitrato conduzida por uma forma altamente reactiva da prote na denominada cati o 7 de acordo com o seguinte esquema reaccional cit c Fe ID cit c Fe III e 1 5 cit c Fe II cit c Fe IV 2e 1 6 cit c Fe IV NO H50 gt cit c Fe IID NO 2H 1 7 O principal inc
19. corrente de ar comprimido Em seguida foi colocada a cd NIR 375 uM em 50mM Tris HCl pH 7 6 sobre a superf cie de Au e permitiu se que esta secasse ao ar Imediatamente antes de se realizarem os ensaios o el ctrodo foi mergulhado em solu o de electr lito de suporte de forma a remover o excesso de prote na A caracteriza o do el ctrodo modificado foi realizada por voltametria c clica Os ensaios foram realizados numa c lula electroqu mica equivalente e com os mesmos el ctrodos utilizado para a selec o do tiol De forma a evitar a variabilidade consequente do emprego de diferentes sais nas solu es tamp o que constituiriam o electr lito de suporte para os ensaios a diferentes valores de pH foi preparado um nico electr lito constitu do por HEPES CAPSO MES TAPS e acetato de s dio 20 mM cada e 100 mM cloreto de pot ssio Esta mistura constitui uma solu o tamp o que por acerto com NaOH ou HCI foi utilizada para a realiza o de ensaios a valores de pH compreendidos entre 5 e 9 Para cada um dos valores de pH testados foram tracados voltamogramas c clicos a velocidades de varrimento compreendidas entre 5 e 1000 1 mVs 39 3 3 4 4 Ensaios de Actividade para o Oxig nio Molecular Os el ctrodos de trabalho foram preparados da forma descrita na sec o anterior sendo que para o ensaio de controlo n o foi colocada prote na na superf cie modificada Os ensaios de voltametria c clica foram realiz
20. no estado oxidado presente em solu o para pH 7 6 e pH 5 5 Saikia et al 2003 Shapovalov et al 2005 Fig II 25 Ensaios realizados com azul de bromofenol e concentra es crescentes de SUN EO MM PR eege Fig 11 26 Semi equa o para a primeira redu o do MV Makarov et al 2002 xiv 109 110 111 113 114 121 122 127 128 129 130 131 134 134 138 139 141 Fig 11 27 Ensaios realizados com violog nio de metilo e concentra es crescentes de SE e ori HP 144 Fig 11 28 Ensaios realizados com vermelho neutro e concentra es crescentes de sulfito 145 Fig 11 29 Poss vel mecanismo da polimeriza o de azinas Paulinkaite et al 2010 146 Fig 11 30 Electropolimerizac o do VN a partir de uma solu o contendo ImM de VN num electr lito de suporte a pH 5 5 Paulinkaite et al 2010 eene 146 Fig II 31 Ensaios como sistema mediador azul de Meldola NADH a pH 7 6 148 Fig II 32 Ensaios realizados com violog nio de benzilo e concentra es crescentes de SUTO M ad 149 Fig II 33 Ensaios com enzima na presenca do mediador violog nio de benzilo 150 Fig II 34 Ensaios realizados com fenosafranina e concentra es crescentes de sulfito 151 Fig 11 35 Ensaios com enzima na presen a do mediador fenosafranina 152
21. o EDippm GUppm MAM netas cud Loss Politiramina electrodepositada em GC Pt Pasta de grafite Screen printed Pasta de grafite Gelatina gluteralde do deposic o num GCE modificado com um filme de Hg Polianilina electrodepositada deposi o em camadas Amperom trica 0 5V vs Ag AgCl H20 gerado Amperom trica 0 3V vs Ag AgCl oxida o do mediador Amperom trica 0 65 V vs Ag AgCl diferen a entre correntes geradas Amperom trica 0 24V vs Ag AgCl O5 consumido Amperom trica 0 1V vs Ag AgCl oxida o do mediador 4 750 102 Ascorbato gt 2mM Etanol gt 15 v v Eliminados por Dilui o Etanol gt 10 v v Polifenois do vinho tinto vinhos cervejas alimentos Situmorang et al 1999 Abass et al 2000 Zhao et al 2006 Din kaya et al 2007 Spricigo et al 2009 A revis o bibliogr fica apresentada na tabela II 3 demonstra que os biossensores propostos at ao momento t m em comum a transdu o por amperometria e a utiliza o da oxidase do sulfito SO enzima que catalisa a reac o 2 3 como elemento de reconhecimento biol gico SO O HO gt SO HO 2 3 A esp cie monitorizada contudo varia de acordo com a estrat gia seguida Abass et al 2000 e Spricigo et al 2009 propuseram a monitoriza o do processo de reoxida o do mediador o citocromo c no el ctrodo de trabalho de acordo com o esquema r
22. o limite m ximo permitido de nitritos em produtos c rneos 150 mg kg 150 ppm 1 2 1 5 Fisiologia A presen a de nitratos e nitritos nos sistemas fisiol gicos dos mam feros deve se n o s sua Ingest o pela via alimentar mas tamb m sua produ o end gena A qu mica destes 16es no ambiente fisiol gico encontra se fortemente relacionada com o metabolismo do mon xido de azoto NO geralmente designado por xido n trico sendo que actualmente a rela o entre estas tr s esp cies da fam lia NOx tem sido alvo de pesquisa intensiva revistas por Hord et al 2009 e Lundberg et al 2009 A ac o do xido n trico preponderante numa vasta s rie de processos fisiol gicos e consequentemente encontra se igualmente envolvida na patofisiologia de diversas doen as humanas Para al m de participar nos processos de neurotransmiss o o NO encontra se envolvido na regula o das fun es cardiovasculares e na modela o das respostas imflamat rias Assim a desregula o da sua homeostase poder ter implica es patol gicas do foro infeccioso e neurodegenerativo como por exemplo doen a pulmonar aguda aterosclerose e choque s ptico Eiserich et al 1998 Dejan et al 2004 Atendendo ao curto tempo de meia vida caracter stico do NO a sua forma o end gena determinada de forma indirecta atrav s da quantifica o dos seus metabolitos est veis o nitrato e o nitrito Sun et al 2003 Dejan et
23. os SPEs comerciais apresentam se em dois tipos de configura o isto sistemas de dois ou tr s electrodos de acordo com o esquema apresentado na figura 1 11 Salienta se por m que tal como foi referido anteriormente a possibilidade de imprimir el ctrodos pr prios com configura es distintas j uma realidade presente em diversos laborat rios Tudorache amp Bala 2007 Barry et al 2009 Metters et al 2011 A B El ctrodo de Refer ncia El ctrodo Auxiliar A El ctrodo de Trabalho aT El ctrodo de El ctrodo El ctrodo de Trabalho Auxiliar Refer ncia Fig 1 11 Configura es usuais de SPEs dispon veis comercialmente Tudorache amp Bala 2007 A Sistema de dois el ctrodos B Sistema de tr s el ctrodos A produ o de micro arrays tem tamb m vindo a ser amplamente explorada Tal conseguido pela impress o de uma s rie array de microel ctrodos ligados em paralelo com cada uma a funcionar de forma independente Estes dispositivos permitem usufruir das vantagens dos microel ctrodos melhor resolu o temporal e densidade de corrente queda ohmica e correntes de carga reduzidas e elevada rela o entre correntes Faradaica e capacitiva aumentando significativamente a qualidade da transdu o do sinal Neste tipo de configura o fig 1 12 a difus o radial sobrep e se ao transporte de massa gerando sinais amplificados em muitas ordens de magnitude 23 Fig 1 1
24. 125 TL SU OU S PRENDA uites RD LD UR iode ce tcs tuos ten atte ea ciet 125 II 3 4 2 Determina o da Estrutura Prim ria 00 cece eee ee es 125 II 3 4 2 2 Determina o das Estruturas Terci ria e Quatern ria 126 IL4d Resultados e DISCUSS30 c eoi gege E Lau o etm Feo po aa pende iscas Ed eiu ess iba i pede 127 II 4 1 Purifica o da redutase do sulfito dissimilativa Desulfoviridina 127 1I 4 2 Caracteriza o Bioqu mica ce KEE eene eee noeh eese EE eegen 129 ILS 2 Massa Molecular oe dor tastes a Dio Ai ila uoi Rope BOE Een feti iis 129 II 4 2 2 Determina o da Absortividade Molar esses 132 22 95 C O DaetOF eS doo eek te ER ade peu do cat dba Spe vu ere na SR Ma M app ga 133 II 4 3 Sequ ncia de Res duos de Amino cidos eec e eeeeere eene 133 11 4 4 Previs o das Estruturas Terci ria e Quatern ria eee 137 IAS Electroquimita s eoe candies Sew aaa a canada a E EROR QE TA Ta TR EUIS 140 AS Azole Bromofenol renge uxo ede pe RE DS GD rp a da 141 ILE 4 5 2 Viologe nio de Menos oisi du E ess rias esa ea a ia aan 143 IEAS o VermelhoNGCDO s ocupa a PA RE Rn 145 ASA Azubde Meldola NADEL iiec qoam detenta a eec cout ead 147 I4 5 5 Viologsenio de Benz o uie E EE ERU Seta Em Ee RIA IN OL E thes 148 11 3 5 0 e GE EE EE 150 IES Conclus es e Perspectivas eec ovi I PER EN E SEE ES dee eS ES tapas nada
25. 152 II 6 Refer ncias Bibliogr ficas eee eeeee eee eene eee ee eee ecences cosas seno c os o cessss0000 154 II 7 Bases de Dados e Programas Inform ticos de Livre Utiliza o 160 ndice de Figuras Parte I Fig I 1 Estrutura tridimensional de algumas redutases do nitrito eese Fig 1 2 Representa o esquem tica dos biossensores com sinal produzido via electroqu mica mediada e transdu o amperom trica e ou voltam trica Fig I 3 Esquema reaccional para o biossensor de nitritos baseado na actividade da cd NiR de Marinobacter hydrocarbonoclasticus com recurso ao cit cs proveniente da mesma fonte bacteriana como mediador cccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccssccecs Fig 1 4 Representa o esquem tica dos biossensores com sinal produzido via electroqu mica directa e transdu o amperom trica e ou voltam trica ee Fig I 5 Representa o esquem tica do biossensor de nitrito com transdu o PolenetomieitiCd sseee eege Fig I 6 Representa o esquem tica do biossensor de nitrito com transdu o CONCUEIME 1 Cass eus eoo dina wade pics dada ide second asia a oEe eR E RPER C PEL dana Fig L7 Representa o esquem tica do biossensor de nitrito com transdu o Fig I 8 Diagrama esquem tico de uma SAM ideal formada por um alcanotiol numa superf cie monocristalina de Au 111 Love etal 20
26. 86 1 96 1 86 4 56 5 80 6 Y 86 7 99 1 92 4 45 5 16 4 136 De uma forma geral as prote nas provenientes dos organismos pertencentes ao g nero Desulfovibrio apresentam um elevado grau de identidade entre si gt 80 At mesmo em rela o enzima da 4 fulgidus observou se a exist ncia de um grau de similaridade superior a 70 n o obstante esta prote na ter sido at ao momento purificada somente sob a forma de um tetr mero de configura o oop Schiffer et al 2008 Estas observa es s o concordantes com o elevado n vel de conserva o existente nos genes dsrAB Stahl et al 2002 e refer ncias nele inclu das Salienta se ainda a exist ncia de um maior grau de similaridade entre a prote na de D desulfuricans ATCC 27774 e a Dsv de D vulgaris Hildenborough do que entre as enzimas pertencentes mesma esp cie estirpes diferentes de Desulfovibrio Mais observa se inclusivamente que o motivo de liga o ao centro 4Fe4S 2 da subunidade a exactamente o mesmo nas duas sequ ncias ao passo que a sequ ncia da Dsv de G20 n o possui a Cys ss sendo vi vel que a liga o ao tomo de Fe seja realizada atrav s da Cysso3 em conformidade com o que ocorre na prote na de A fulgidus Um outro aspecto interessante o elevado grau de similaridade encontrado na zona do C terminal da subunidade y das quatro prote nas Oliveira et al 2008 prop em um mecanismo de redu o do sulfito que contempla o envolvimento direc
27. ADN de interesse seguido da sua purifica o Ap s proceder ao alinhamento das sequ ncias gen ticas respeitantes codifica o das tr s subunidades da prote na provenientes de Desulfovibrio vulgaris Hildenborough Desulfovibrio desulfuricans G20 e Desulfovibrio desulfuricans Essex 6 foram desenhados primers para cada uma delas sendo que a heterogeneidade das sequ ncias observada nas subunidades a e p conduziu op o de utilizar primers degenerados O ADN de Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774 utilizado como matriz para a reac o de PCR foi extra do directamente por recupera o do sobrenadante ap s ligeira centrifuga o de uma cultura de c lulas submetidas a lise por tratamento t rmico A amplifica o do ADN foi realizada em condi es seleccionadas com base nas notas t cnicas facultadas pela Amersham Biosciences e optimizadas para cada uma das subunidades Subunidade a Subunidade p Subunidade y 5 min a 95 C 5 min a 95 C 5 min a 95 C min a 95 C min a 95 C min a 95 C 30 s a 62 C x35 30 s a 56 C x35 30 s a 57 C x35 2 min a 72 2 min a 72 2 min a 72 C 8 min a 72 C 8 min a 72 C O sucesso da amplifica o foi avaliado por electroforese em gel de agarose a 1 No caso das subunidades a e y procedeu se purifica o dos fragmentos de ADN directamente da mistura reaccional e no caso da subunidade p a purifica o foi realizada ap s electroforese do produto de PCR por excis o
28. Biophys Acta 1411 290 309 1999 Copeland A Lucas S Lapidus A Barry K Detter J C Glavina del Rio T Hammon N Israni S Dalin E Tice H Pitluck S Kiss H Brettin T Bruce D Han C Tapia R Gilna P Schmutz J Larimer F Land M Hauser L Kyrpides N Kim E Edwards K Richardson P EMBL GenBank DDBJ databases 2006 Correia C Besson S Brondino C D Gonz lez P J Fauque G Lampreia J Moura I Moura J J G J Biol Inorg Chem 13 1321 1333 2008 Correia M Barroso Barroso M F Soares D Oliveira M B P P Delerue Matos C Food Chem 120 960 966 2010 Costa C Macedo A Moura I Moura J J G Le Gall J Berlier Y Liu M Y Payne W J FEBS Lett 276 67 70 1990 Cotton T M Timkovich R Cork M S FEBS Lett 133 39 44 1981 Cunha C A Macieira S Dias J M Almeida G Gon alves L L Costa C Lampreia J Huber R Moura J J G Moura I Rom o M J J Biol Chem 218 17455 17465 2003 Cutruzzol F Biochim Biophys Acta 1411 231 249 1999 Cutruzzol F Biochim Biophys Acta 1411 231 249 1999 Cutruzzol F Brown K Wilson E K Bellelli A Arese M Tegoni M Cambillau C Brunori M Proc Natl Acad Sci 98 2232 2237 2001 Cutruzzol F Rinaldo S Centola F Brunori M IUBMB Life 55 617 621 2003 Das T K Wilson E K Cutruzzol F Brunori M Rousseau D L Biochemistry 40 10774 10781 2001 Dejam A Hunter C J Pelletier
29. Brunori M Cambillau C Tegoni M Biochemistry 37 13987 13996 1998 Najmudin S Pauleta S R Moura I Rom o M J Acta Crystallogr Sect F 66 627 635 2010 Nurizzo D Cutruzzol F Arese M Bourgeois D Brunori M Cambillau C Tegoni M J Biol Chem 274 14997 15004 1999 Nurizzo D Silvestrini M Mathieu M Cutruzzol F Bourgeois D F l p V Hajdu J Brunori M Tegoni M Cambillau C Structure 5 1157 1171 1997 Nussler A K Bruckner U B Vogt J Radermacher P Methods Enzymol 359 75 83 2002 Ochoteco E Jubete E Pomposo J A Grande H et al Patent Application Number E200930539 2009 Oganesyan V S Cheesman M R Thomson A J Inorg Chem 46 10950 10952 2007 Onyesom I Okoh P N Br J Nutr 96 902 905 2006 Pelletier M M Kleinbongard P Ringwood L Hito R Hunter C J Schechter A N Gladwin M T Dejam A Free Radic Biol Med 41 541 548 2006 Protein Electrophoresis technical manual 80 6013 88 Amersham Biosciences USA 1999 Quan D Min D G Cha G S Nam H Bioelectrochemistry 69 267 275 2006 Radoul M Bykov D Rinaldo S Cutruzzol F Neese F Goldfarb D J Am Chem Soc 133 3043 3055 2011 Richardson D J Watmough N J Curr Opin Chem Biol 3 207 219 1999 89 Richter C D Allen J W A Higham C W Koppenh fer A Zajicek R S Watmough N J Ferguson S J J Biol Chem 277 3093 3 100 2002 Rinaldo S Brunori M Cutruzzol
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31. De um modo geral os mediadores redox empregues em biossensores s o pequenas mol culas org nicas electroactivas que n o possuem afinidade espec fica para com o elemento de reconhecimento biol gico Usualmente a sua aplica o tem por objectivos facilitar a transfer ncia electr nica e ou diminuir o potencial de trabalho Chaubey amp Malhotra 2002 Por m os mediadores artificiais s o frequentemente nocivos t xicos e tratando se de catalisadores gen ricos podem afectar a selectividade do sensor Gorton et al 1999 Assim foi explorada a possibilidade de utilizar como alternativa aos mediadores artificiais o parceiro fisiol gico da enzima cit cs52 como mediador electr nico de um biossensor enzim tico para a quantifica o de nitritos 52 O dispositivo proposto consiste na co imobiliza o da cd NiR com o cit css numa matriz polim rica preparada a partir de um derivado do lcool polivinilico PVA fotopolimeriz vel e a sua subsequente aplica o em el ctrodos screen printed de pasta de carbono CPSPE e cujo esquema reaccional se encontra representado na figura 1 28 Passo 1 Passo 2 Passo 3 cit Ces Ox cit cd Ox NO E E NO Q O E cit css Red cit cd Red KEN H O Fig I 28 Esquema reaccional do bioelectrodo para a redu o de nitrito a xido n trico linha continua e de oxig nio molecular a gua linha descont nua de acordo com um mecanismo EC A primeira fase do trabalho
32. H J Proteins 60 224 231 2005 B Schwede T Kopp J Guex N Peitsch M C Nucleic Acids Res 31 3381 3385 2003 Segundo M A Rangel A O S S Anal Chim Acta 4217 219 286 2001 Selvaraju T Ramaraj R Electrocehm Commun 5 667 672 2003 Shappovalov S A Koval V L Chernaya T A Pereverzev A Y Derevyanko N A Ishchenko A A Mchedlov Petrossyan N O J Braz Chem Soc 16 232 240 2005 Shriver D F Atkins P W Inorganic Chemistry 3 edition Oxford University Press pp 395 398 1999 Siegel L M Davis P S J Biol Chem 249 1687 1598 1974 158 Siegel L M Davis P S Kamin H J Biol Chem 249 1572 1586 1974 Siegel L M Rueger D C Barber M J Kruger R J Orme Johnson W H J Biol Chem 257 6343 6350 1982 Silveira C M Besson S Moura I Moura J J G Almeida M G Bioinorg Chem Appl 2010 634597 2010 Situmorang M Hibbert D B Gooding J Barnett D Analyst 124 1775 1779 1999 Smith P K Krohn R J Hermanson G T Mallia A K Gartner F H Provenzano M D Fujimoto E K Goeke N M Olson B J Klenk D C Anal Biochem 150 76 85 1985 Spricigo R Dronov R Lisdat F Leimk hler S Scheller F W Wollenberger U Anal Bioanal Chem 393 225 233 2009 Sprules S D Hart J P Pittson R Wring S A Electroanalysis 8 539 543 1996 Stahl D A Fishbain S Klein M Baker B J Wagner M Antonie van Leeuwenhoek 81 189 195 2002 Stangelmaye
33. I pH 9 400 mVs 66 Para as diferentes condi es de v e pH procurou se obter uma resposta catal tica na presen a de nitrito tendo sido adoptadas diferentes estrat gias adi o de nitrito ao electr lito de suporte no per odo pr vio ao ensaio adi o de nitrito ao electr lito de suporte em diferentes etapas do varrimento de potencial e incuba o de nitrito conjuntamente com a prote na anteriormente adsor o na superf cie modificada do el ctrodo de trabalho Por m n o foram observadas correntes catal ticas em nenhuma das situa es testadas Procurou se ainda determinar se embora sem actividade catal tica para nitrito a cd NiR adsorvida possu a a capacidade para proceder redu o do oxig nio molecular Os voltamogramas c clicos seguidamente apresentados figura L 37 resultantes de experi ncias realizadas em solu es n o desarejadas comprovam a aus ncia de actividade tamb m para este substrato Intensidade de Corrente nA Intensidade de Corrente nA 100 200 300 400 500 0 20 0 05 0 10 0 25 0 40 0 55 0 70 Potencial V vs NHE B 200 100 0 100 200 300 400 500 0 20 0 05 0 10 0 25 0 40 0 55 0 70 Potencial V vs NHE Fig 1 37 Voltamogramas c clicos tra ados ao longo do tempo a 20 mVs em 50 mM tamp o MES pH 6 3 com 150 mM KCI na presen a de O5 Os voltamogramas a negro correspondem ao primeiro varrimento e os cinza m
34. NO Tratando se de el ctrodos screen printed n o poss vel proceder rota o do el ctrodo na c lula electroqu mica de forma a garantir uma convec o eficiente do electr lito de suporte no decurso das medi es amperom tricas Assim para evitar limita es provocadas pelo transporte de massa recorreu se a um agitador magn tico inserido no interior da c lula a rodar o mais rapidamente poss vel mas sem causar turbul ncia 58 Para concentra es mais baixas de substrato este sistema foi suficiente para assegurar concentra es constantes de nitrito na superf cie do el ctrodo durante o decurso de cada medi o Contudo para concentra es mais elevadas de NO a reac o enzim tica torna se muito mais r pida exigindo um fornecimento de substrato mais veloz na interface com o el ctrodo o qual limitado pela velocidade da agita o este o motivo pelo qual se observa uma ligeira diminui o da intensidade de corrente ao longo do tempo Por m considerando o valor registado imediatamente ap s a adi o de substrato a correla o hiperb lica entre intensidade de corrente gerada e concentra o de nitrito mantida 1 4 5 3 Influ ncias da Temperatura e do pH A amplitude anal tica do biossensor foi avaliada em termos de depend ncia da temperatura e do pH Os resultados obtidos para as curvas de calibra o tra adas numa gama de temperaturas de 10 a 30 C pH 6 3 indicam que entre os 15 e
35. SO em mg kg ou mg l e referem se s quantidades totais de todas as origens enxofre livre e conjugado Um teor de SO total inferior a 10 ppm considerado inexistente semelhan a das regras impostas pela FDA Salienta se que esta directiva foi j alterada por diversas vezes 96 85 CE 98 72 CE 2001 5 CE 2003 52 CE e 2003 114 CE e sempre que ocorreram altera es nos n veis permitidos de sulfitos foi no sentido da sua redu o Com efeito os limites permitidos est o condicionados pelos limites de quantifica o dos m todos de an lise existentes e medida que aumenta a capacidade t cnica na quantifica o deste tipo de compostos os limites legais impostos v o sendo cada vez menores A aplica o generalizada de sulfitos na ind stria vitivin cola e a diversidade de produtos produzidos neste sector faz com que seja alvo de regulamenta o pr pria e espec fica O Regulamento CE n 606 2009 o mais recente documento normativo nesta rea e uma vez mais as altera es propostas visam a redu o das quantidades m ximas permitidas de sulfitos face legisla o anteriormente aplic vel 150 a 450 ppm consoante o tipo de vinho 98 1 2 1 5 M todos de Quantifica o O m todo de refer ncia para a quantifica o de di xido de enxofre em vinhos OIV 2006 uma optimiza o de m todo de Monier Williams 1927 e consiste na extrac o gasosa do SO por passagem de uma corrente de ar ou N atrav s
36. Surf B 68 93 97 2009 Liu S Ju H Analyst 128 1420 1424 2003 Lojou E Cutruzzol F Tegoni M Bianco P Electrochim Acta 48 1055 1064 2003 Lopes H Besson S Moura I Moura J J G J Biol Inorg Chem 6 55 62 2001 Love J C Estroff L A Kriebel J K Nuzzo R G Whitesides G M Chem Rev 105 1103 1169 2005 88 Lundberg J O Gladwin M T Ahluwalia A Benjamin N Bryan N S Butler A Cabrales P Fago A Feelisch M Ford P C Freeman B A Frenneaux M Friedman J Kelm M Kevil C G Kim Shapiro D B Kozlov A V Lancaster J R Lefer D J McColl K McCurry K Patel R P Petersson J Rassaf T Reutov V P Richter Addo G B Schechter A Shiva S Tsuchiya K van Faassen E E Webb A J Zuckerbraun B S Zweier J L Weitzberg E Nat Chem Biol 5 865 869 2009 M rquez M C Ventosa A Int J Syst Evol Microbiol 55 1349 1351 2005 Matsuura Y Takano T Dickerson R E J Mol Biol 156 389 409 1982 Metters J P Kadara R O Banks C E Analyst 136 1067 1076 2011 Moorcroft M J Davis J Compton R G Talanta 54 785 803 2001 Moura I Moura J J Curr Opin Chem Biol 5 168 175 2001 Moura I Pauleta S R Moura J J G J Biol Inorg Chem 13 1185 1195 2008 Muhoberac B B Wharton D C J Biol Chem 258 3019 3027 1983 Murphy M E Turley S Adman E T J Biol Chem 272 28455 28460 1997 Nurizzo D Cutruzzol F Arese M Bourgeois D
37. XV xvi ndice de Tabelas Parte I Tabela I 1 Descri o e par metros anal ticos de biossensores para a determina o de nitrito baseados em NiRs como elementos de reconhecimento biol gico Tabela I 2 Modificadores de superf cie utilizados na prepara o dos el ctrodos de ouro com monocamadas automontadaS ss vaa exuos vole ruso nes enero aor roa RUE EE ERR sanada cada Tabela 1 3 Composi o das solu es de ti is mistas utilizadas na modifica o da superf cie dos el ctrodos de ouro com monocamadas automontadas Tabela I 4 M ximos de absorv ncia dos espectros UV Vis dos citocromos css e cdi p riticados de M hydrotcarbisi E Tabela I 5 Graus de identidade e homologia encontrados entre a sequ ncia de res duos de amino cidos da cdi NiR de M hydrocarb e as sequ ncias da mesma prote na de outras eer EE EEN Tabela I 6 Par metros anal ticos dos sensores amperom trico e voltam trico na aus ncia e na presen a de O dissolvido no electr lito de suporte EE Tabela 1 7 Constantes de transfer ncia electr nica heterog nia ks da cd NiR a duterentes valores de DE Tabela LS Modos vibracionais de Resson ncia Raman da cd1NiR nos estados oxidado e E Te EES Parte II Tabela II 1 Alguns exemplos de aplica es industriais de agentes sulfitantes e produtos alimentares medicamentos e cosm ticos que cont m sulfitos Vally et al 2009 T
38. al 2004 Correia et al 2010 Por m as concentra es de nitrato no plasma n o apresentam varia es significativas no decurso de epis dios de stress nitrosativo sendo ainda largamente afectadas pelas quantidades ingeridas e pela fun o renal de cada indiv duo Dejan et al 2004 Consequentemente o diagn stico e ou monitoriza o de processos infecciosos ou inflamat rios em pacientes realizado atrav s da quantifica o das concentra es de nitrito no plasma e ou na urina Ellis et al 1998 Os valores de refer ncia reportados na literatura para nitrito basal no plasma s o bastante divergentes provavelmente devido a varia es na amostragem e processamento das amostras de sangue e a limita es dos m todos anal ticos empregues os quais n o permitem uma medi o precisa dos nitritos em amostras complexas Por esta raz o Dejam et al 2005 conceberam uma metodologia experimental que previne a redu o oxida o do nitrito utilizando uma solu o oxidante de hemoglobina com ferricianeto De acordo com estes autores a concentra o de nitrito no plasma encontra se na gama dos nanomolar 100nM Nos ltimos anos o papel que o pr prio nitrito desempenha na sinaliza o intracelular dos mam feros tem vindo a ser reconhecido Dejan er al 2004 Bryan et al 2005 com a consequente emerg ncia da poss vel administra o terap utica de nitratos e nitritos Hord et al 2009 Lundberg et al 2009 Atendendo
39. and Drug Administration flow injection analysis flavina mononucle tido fenosafranina superf cies met licas semicondutoras de g lio e ars nio carbono v treo do ingl s glassy carbon el ctrodo de GC el ctrodo GC revestido com platina gama de linearidade hemoglobina cido 4 2 hidroxietil piperazina etanosulf nico Cromatografia l quida de alta efici ncia do ingl s High Performance Liquid Chromatography peroxidase do r bano do ingl s horseradish peroxidase modificador ti lico 1 hexanotiol Intensidade de corrente inductively coupled plasma optical emission spectrometry inductively coupled plasma atomic emission spectrometer corrente de pico corrente de pico an dico corrente de pico cat dico intensidade relativa grau de Identidade coeficiente de parti o constante catal tica base de dados do ingl s Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes constante de Michaelis constante de Michaelis aparente constante de transfer ncia electr nica heterog nea limite de detec o marcadores de baixa massa molecular do ingl s low molecular weight mioglobina magnetic circular dichroism transfer ncia electr nica mediada do ingl s mediated electronic XX metoxiPMS MES Mh MM MPA MUA MUNE MUOH MV n n a NADPH NADH NCBI n d NHE Electrode n i NiR s NOCs NOR NOx NIfA NrfH OIV OMS Pa PDB PCR PEG PG PGE PHYRE Pp PRA formalde do prec Ps Pt PVA PVA AWP P
40. ao c lculo de m a partir dos declives das rectas obtidas a cada uma das v xv pH 1 15 n Assim com um valor de m de 0 93 0 06 determinou se que o processo electroqu mico de transfer ncia de 1 electr o acompanhado por um processo qu mico que envolve a transfer ncia de 1 prot o Os resultados obtidos apontam ent o para a ocorr ncia de um processo de redu o envolvendo a transfer ncia de um electr o seguido de uma reac o qu mica de desprotona o A organiza o da enzima na superf cie modificada do el ctrodo de trabalho foi estudada com recurso a imagens adquiridas por microscopia de for a at mica AFM atomic force microscopy de superf cies an logas s utilizadas nas experiencias electroqu micas 1 4 6 3 Microscopia de For a At mica As Imagens de superf cie de placas de Au monocristalino 111 submetidas ao mesmo processo de modifica o e adsor o da prote na que o el ctrodo de trabalho original e recolhidas por microscopia de for a at mica apresentam se na figura 1 43 B 30 0 mm 15 0 mm 0 0 mm 1 00 1 00 Fig I 43 Imagens de AFM de A Au modificado com MUA e cd NiR adsorvido B Au modificado com MUA C cd NiR adsorvida em mica 73 As entidades apresentadas na imagem da figura I 43C possuem dimens es consistentes com a cd NiR e a heterogeneidade da superf cie apresentada na imagem da figura 1 43B revela que o MUA se encontra adsorvido na superf ci
41. biossensores enzim ticos capazes de realizar a quantifica o de nitritos poder o ser classificados de acordo com o m todo de transdu o de sinal empregue maioritariamente electroqu mico com o tipo de enzima que possuem espec fica ou inespec fica e com o tipo de resposta fornecido mediada ou directa A revis o bibliogr fica dos diversos tipos de dispositivos propostos ser apresentada em seguida 1 2 2 1 Biossensores Amperom tricos e ou Voltam tricos Baseados em Prote nas Inespec ficas para Determina o de Nitritos A mioglobina Mb e a hemoglobina Hb s o prote nas cuja principal fun o consiste na liga o e transporte de oxig nio molecular 05 A Hb existe nos eritr citos de numerosos vertebrados e invertebrados onde se combina com o O de forma revers vel e o transporta para as c lulas Giardina et al 1995 Vicente amp Smith 2001 A Mb encontra se maioritariamente nos tecidos musculares onde funciona como sistema de armazenamento intracelular de oxig nio Ishimori 2001 Dada a sua elevada disponibilidade a Mb proveniente de cora o de cavalo e a Hb de sangue bovino s o frequentemente utilizadas como prote nas modelo na avalia o de novos materiais de imobiliza o para a constru o de biossensores electroqu micos Assim a grande maioria dos trabalhos descritos tem por objectivo a detec o de per xido de hidrog nio H5O atrav s de uma resposta electroqu mica directa A capacidade
42. ciareiad ot asia este ra soo reddas Pi Ee A Fis 1 31 Resposta do biossensor a minto eege ed geed Fig 1 32 Resposta do biossensor a nitrito em diferentes condi es de temperatura e pH Fig 1 33 Voltamogramas c clicos tra ados com o biossensor na presen a de oxig nio dissolvido ou NO E Fig 1 34 Voltamogramas c clicos tra ados com o biossensor na presen a de concentra es crescentes de fitrito E uM RE Fio 1 35 Selec o do modificador de superficie sans esee vuv exvave itas eege Fig I 36 Voltamogramas c clicos tracados com o el ctrodo de Au modificado com a SAM de MUA E GN EN Ee Ke e el TEE Fig 1 37 Voltamogramas c clicos tra ados ao longo do tempo a 20 mVs 1 em 50 mM tamp o MES pH 6 3 com 150 mM KCI na presen a de O eene xii 30 31 dd 45 46 47 49 50 51 52 53 54 55 57 59 61 62 64 66 67 Fig 1 38 Varia o da intensidade de corrente medida no ponto de invers o em fun o CO Mc DE so AP SR E AR RS RI Fig 1 39 Rela o entre as intensidades de corrente e as velocidades de varrimento dos PICOSICaL dICOS EE Fig 1 40 Rela o entre os potenciais dos picos cat dicos e o logaritmo da velocidade de Pressure suis atadas Fig 1 41 Rela o entre log Ks e pH para os potenciais dos picos cat dicos Fig 1 42 Rela o entre E
43. da matriz Em seguida o di xido de enxofre arrastado atrav s de uma solu o de H5O na qual oxidado e fixo sob a forma de cido sulf rico O HSO assim formado ent o titulado com uma solu o padronizada de hidr xido de s dio Este m todo segundo a AOAC Association of Official Analytical Chemists tamb m um dos m todos de refer ncia para aplica o em matrizes alimentares Official Method n 990 28 OMA 2000 AOAC International 2010 A titula o idom trica directa ou inversa tamb m um m todo bastante popular sendo reconhecida pela OIV como m todo alternativo r pido e no qual se baseiam os m todos de refer ncia empregues em diversos pa ses Este procedimento por m est sujeito a um elevado n vel de interfer ncia dependendo fortemente das condi es experimentais em que os ensaios s o realizados Joslyn 1955 Na tabela II 2 encontram se descritos resumidamente os principais m todos de determina o de sulfitos propostos na bibliografia mais recente N o obstante a diversidade dos m todos sumariamente apresentados na tabela IL 2 a complexidade das matrizes conduz necessidade de na maioria dos casos a an lise ser precedida de passos de extrac o e ou derivatiza o dos sulfitos Em alternativa os efeitos de matriz s o minimizados pela elevada dilui o das amostras Esta abordagem por m levanta o problema da poss vel ocorr ncia de perdas significativas de analito no decurso da prepa
44. de potencial de 600 a 140 mV vs Ag AgCl com etapas de 20 a 50 mV Para cada valor de potencial foi concedido ao sistema um tempo de equil brio de 5 minutos o qual se confirmou ser suficiente Os espectros da prote na imobilizada adquiridos a cada potencial de el ctrodo foram subsequentemente submetidos a uma an lise de componentes 1 3 3 7 Microscopia de For a At mica As placas de vidro revestidas com ouro monocristalino foram imersas em solu o piranha preparada no momento e ap s lavagem com dH O sujeitas a um tratamento t rmico conhecido por flame annealing que consiste em submeter o ouro parte mais quente de uma chama durante alguns segundos esperar que arrefe a e repetir o processo mais duas ou tr s vezes Este procedimento indispens vel obten o de uma superf cie onde predomina a fase 111 A constitui o da SAM de MUA e subsequente adsor o da cd NIR foram realizadas da mesma forma j descrita para os el ctrodos de trabalho Foram ainda preparados controlos um com a prote na adsorvida numa placa de mica Controlo 1 e outro com uma placa de ouro modificada apenas com MUA Controlo 2 As imagens foram produzidas em modo tapping com uma frequ ncia de oscila o de 300 kHz As medi es foram realizadas ao ar e temperatura ambiente 42 1 3 4 Aplica es Bioinform ticas O alinhamento e respectivas compara es entre os conjuntos de sequ ncias de res duos de amino cidos da cd NiR f
45. de prote na pura e no seu estado nativo configura o do multimero 2y2 A determina o de ferro n o foi conclusiva no sentido em que n o foi poss vel determinar se a diferen a entre o resultado obtido 17 tomos de Fe por mol cula de Dsv e os 34 tomos de ferro descritos na estrutura da prote na de D vulgaris adv m da perda de co factores no decurso da purifica o ou se existe nos m todos de quantifica o algum interferente pass vel de influenciar o resultado final Por m a aus ncia de actividade catal tica verificada no decurso dos ensaios electroqu micos aponta para uma maior probabilidade de a primeira hip tese ser a correcta 152 A determina o da sequ ncia de res duos de amino cidos que constituem a prote na foi igualmente bem sucedida assim como a simula o da sua estrutura tridimensional No decurso dos trabalhos de prepara o desta tese foram adquiridos conhecimentos com a descodifica o do genoma de D desulfuricans ATCC 27774 e com a resolu o da estrutura cristalogr fica da desulfoviridina de D vulgaris Hildenborough os quais poder o tamb m ser empregues no cumprimento daquele que era o principal prop sito deste trabalho Tais avan os eram indispens veis para a eventual cria o de mutantes da Dsv A possibilidade de modelar a estrutura da Dsv com a cria o de mutantes permitiria assim aumentar a capacidade de interac o com os el ctrodos de trabalho evitando assim o recurso
46. de res duos de amino cidos altamente conservados tanto nas SiRs como nas NiRs hemicas Estes segmentos correspondem a zonas de simetria entre mon meros e s o essenciais para assegurar a estabilidade e fun o das prote nas pertencentes a esta super fam lia Crane et al 1995 105 A composi o do centro activo nomeadamente no que respeita ao sirohemo pode ser compreendida quer em termos evolutivos como qu micos No ambiente fortemente redutor onde a redu o de sulfito dissimilativa surgiu h 2350 3110 milh es de anos atr s a estrutura do anel da sirohidroclorina seria mais est vel que os hemos insaturados Estes an is s o tamb m muito melhores doadores electr nicos que as clorinas ou as porfirinas insaturadas e a flexibilidade conformacional conferida pela estrutura saturada permite aos res duos de aa adjacentes estabelecer um arranjo estabilizador do substrato Crane amp Getzoff 1996 II 2 2 1 Redutases do Sulfito Assimilativas As redutases do sulfito assimilativas aSiR existem em arqueobact rias bact rias fungos e plantas mas n o em animais A sua fun o biol gica consiste na produ o de sulfureto S para posterior incorporac o em amino cidos e co factores enzim ticos A prote na mais estudada desta classe a aSiR de Escherichia coli E coli Trata se de um olig mero de composi o ges com 784kDa A subunidade a 66kDa denominada por SiRFP flavoprote na e trata se de uma pr
47. distintas ambas as estruturas eleitas pelos programas pertencem enzima de Pseudomonas aeruginosa 48 O modelo produzido pelo Swiss Model recorreu estrutura depositada na PDB com o c digo 1HZU Brown et al 2001 e o modelo constru do pelo PHYRE utilizou a 1N90 Nurizzo et al 1999 Na figura 1 24 apresentam se imagens das estruturas constru das com recurso a ambos os programas d Fig I 24 Constru o do modelo para a estrutura monom rica da cd NiR de M hydrocarb A estrutura adquirida atrav s do PHYRE B estrutura adquirida atrav s do Swiss Model Para al m de o PHYRE n o ter realizado correctamente o folding na zona do c terminal do mon mero considerou se ainda o maior grau de identidade estrutural 73 vs 72 e a maior resolu o dos difratogramas de raios X nos quais a estrutura se baseia 2 70A vs 2 90A para seleccionar o modelo proveniente do Swiss Model para a subsequente modela o da estrutura dim rica da cdi NiR de M hydrocarb Os resultados obtidos atrav s da simula o da forma dim rica da proteina elaborada atrav s do programa SymmDock Schneidman Duhovny et al 2005 A B aplicando se a restri o n 2 encontram se representados na figura I 25 49 Fig 1 25 Estruturas tridimensionais da cdjNiR A Estrutura simulada para a prote na de M hydrocarb B Sobreposi o da estrutura obtida por modela o azul com a estrutura da prote na de Ps aeruginosa Nurizzo et al
48. el ctrodo de trabalho foi depois removido da solu o alco lica lavado com etanol e seco sob uma corrente de ar comprimido Uma vez preparada a superf cie do el ctrodo de trabalho este foi imerso numa solu o de cdiNiR 150uM em 50 mM MES pH 6 3 durante 2 horas a 4 C O el ctrodo modificado foi ent o mergulhado numa solu o de electr lito de suporte imediatamente antes de ser colocado na c lula electroqu mica 38 Os ensaios de voltametria c clica com vista a seleccionar o modificador de superf cie que permitiria obter uma resposta directa da cd NiR foram realizados numa janela de potencial entre 0 4 V e 0 6 V vs SCE a uma velocidade de varrimento de 20 mVs Os ensaios foram realizados numa c lula electroqu mica com uma configura o cl ssica de tr s el ctrodos utilizando como electr lito de suporte tamp o 0 0 5mM MES pH 6 3 sendo que se procedeu antecipadamente ao desarejamento da solu o com um fluxo de rgon Uma vez seleccionada a modifica o de superf cie adequada obten o de uma resposta da cd NIR foram realizados ensaios de varia o das condi es de pH e de velocidade de varrimento 3 3 4 3 Caracteriza o do El ctrodo Modificado Imediatamente ap s o processo de limpeza acima descrito o el ctrodo de Au foi mergulhado numa solu o de MUA onde permaneceu durante uma hora temperatura ambiente Passado esse per odo o el ctrodo de trabalho foi lavado com etanol e seco sob uma
49. equa o para a primeira redu o do MV Makarov et al 2002 SO 4H 4 MV gt S 2H 0 4 MV 2 9 143 I uA 0 70 0 65 0 60 0 55 0 50 0 45 0 40 0 35 0 30 0 25 0 20 0 15 Potencial V vs NHE 0 770 0 65 0 60 0 55 0 50 0 45 0 40 0 35 0 30 0 25 0 20 0 15 Potencial V vs NHE Fig II 27 Ensaios realizados com violog nio de metilo e concentra es crescentes de sulfito 9 0 mM 9 1 mM 10 mM 20 mM A Voltamogramas c clicos tra ados a pH 7 6 B Voltamogramas c clicos tra ados a pH 5 5 144 II 4 5 3 Vermelho Neutro Na figura II 28 encontram se representados voltamogramas c clicos obtidos na presenca de diferentes concentra es de sulfito com ImM de vermelho neutro VN a pH 5 5 N o foi poss vel realizar ensaios com este mediador a pH 7 6 devido sua insolubilidade no electr lito LI uA 0 5 0 45 0 4 0 35 0 3 0 25 0 2 0 15 0 1 0 05 Potencial V vs NHE Fig II 28 Ensaios realizados com vermelho neutro e concentra es crescentes de sulfito 0 mM mM 10 mM 20 mM Voltamogramas c clicos tra ados a pH 5 5 Na presen a de sulfito observa se um desvio no sentido negativo do potencial de redu o deste corante associado a um ligeiro aumento da intensidade do sinal A utiliza o de fenazinas e polifenazinas em sensores e biosenssores electroqu micos encontra se amplamente divulga
50. estudos de interac o entre os mediadores e o substrato SO o el ctrodo de trabalho foi mergulhado no electr lito de suporte imediatamente ap s o procedimento de limpeza Nos ensaios onde foi utilizada a enzima o GCE foi preparado por aplica o directa de uma gota de solu o de Dsv correspondente a 375 pmol de prote na na superf cie do el ctrodo sendo esta imediatamente coberta por uma membrana de di lise suportada por um o ring de acordo com o esquema apresentado na figura II 14 Membrana de Di lise Extracto aai El ctrodo de Enzim tico Trabalho Fig II 14 Esquema de montagem do el ctrodo de trabalho para os ensaios com Desulfoviridina Os ensaios electroqu micos foram realizados por voltametria c clica a uma velocidade 1 e pe d de varrimento de 20 mVs excepto Indica o em contr rio sendo os varrimentos efectuados em janelas de potencial adaptadas ao sinal produzido pela redu o revers vel de cada um dos mediadores avaliados 124 II 3 4 Aplica es Bioinform ticas 1 3 4 1 Caracteriza o Bioqu mica Os valores te ricos para as massas moleculares e para a absortividade molar a 280 nm das tr s subunidades da Dsv de D desulfuricans ATCC 27774 foi calculado por submiss o das sequ ncias de res duos de amino cidos correspondentes Lucas et al 2009 aos programas Compute pl Mw e ProtParam Gasteiger et al 2005 respectivamente ambos dispon veis no Website ExP
51. et al 2007 Hord et al 2009 Correia et al 2010 Conjuntamente com os sais de nitrato E251 E252 os sais de nitrito E249 e E250 t m sido amplamente utilizados no processamento de carnes curadas peixes e alguns queijos com a dupla finalidade de funcionarem como bactericidas e agentes real antes das propriedades organol pticas tais como a cor o odor e o sabor Skovgaard 1992 Siu amp Henshall 1998 A exposi o humana a este tipo de 10es prov m assim largamente da ingest o deste tipo de produtos nitratos provenientes de vegetais e nitritos provenientes de carnes processadas Apenas uma pequena percentagem prov m da gua pot vel dado que os n veis deste tipo de compostos encontram se normalmente dentro dos n veis permitidos Dutt amp Davis 2002 Hord et al 2009 A principal patologia decorrente da ingest o excessiva de nitratos nitritos a metahemoglobinemia O nitrito possui a capacidade de oxidar de forma irrevers vel a hemoglobina a metahemoglobina uma conforma o que incapaz de ligar O causando entre outros sintomas cianose O grupo mais suscept vel metahemoglobinemia encontra se na faixa et ria dos lactentes sendo esta doen a vulgarmente conhecida por s ndrome do beb azul encontrando se reportados alguns casos fatais geralmente associados ao consumo de guas provenientes de fontes contaminadas Dutt amp Davis 2002 Hord et al 2009 Algumas preocupa es t m vindo a ser colocad
52. facilitar a compara o e 50 mVs linha cheia A Solu o de electr lito de suporte n o desarejada sem adi o de nitrito B Solu o de electr lito de suporte desarejada e contendo 1 mM de nitrito Contudo o contributo do transporte de massa de duas esp cies distintas NO e O atrav s da matriz de PVA poder igualmente contribuir para este comportamento distinto Deve se ainda referir que para este sistema o mesmo princ pio n o pode ser aplicado na constru o de um biossensor para oxig nio capaz de funcionar na presen a de nitritos Isto porque independentemente da velocidade de varrimento concentra es saturantes de NO resultaram sempre na obten o de correntes catal ticas fig I 33B 61 A manipula o da escala de tempo atrav s da velocidade de varrimento n o pass vel de ser realizada por amperometria Assim de forma a comparar os par metros anal ticos decorrentes da calibra o do sensor na presen a e aus ncia de oxig nio tabela 1 6 foram realizados ensaios por voltametria c clica cujos voltamogramas representativos se encontram na figura 1 34 Intensidade de Corrente uA 0 1 0 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 Potencial V vs NHE Intensidade de Corrente uA 0 10 0 00 0 10 0 20 0 30 0 40 0 50 0 60 Potencial V vs NHE Fig 1 34 Voltamogramas c clicos tra ados com o biossensor na presen a de concentra es crescentes de nitrito 1 uM a 1 mM A Solu o de elect
53. foi investigada a poss vel Interfer ncia por parte do nitrato At concentra o m xima testada 1 mM n o foi detectada actividade para com este ani o Constatou se tamb m que para o sulfato o comportamento semelhante ao do nitrato Por m na presen a de ImM de sulfito ocorreu uma diminui o do sinal em 15 e a adi o de 50 uM de hidroxilamina um substrato alternativo in vitro da cd NiR Allen et al 2000 van Wonderen et al 2007 resultou num aumento da resposta em 18 Assim a presen a destes dois compostos em amostras reais dever ser cuidadosamente avaliado Um outro substrato reportado para a cd NiR o oxig nio molecular Centola et al 2006 Koppenh fer et al 2000 Na verdade foi observado um acr scimo de 20 no sinal do biossensor quando imerso numa solu o n o desarejada Contudo desenvolveu se uma estrat gia com vista a ultrapassar essa situa o a qual ser apresentada de seguida 1 4 5 5 Reac o com O Tal como foi referido anteriormente a cd NiR possui a capacidade de catalisar in vitro a redu o do oxig nio molecular eq 1 11 Como consequ ncia directa deste facto as medi es amperom tricas realizadas com o biossensor s o vulner veis presen a de O no meio Embora n o se encontrem dispon veis os par metros cin ticos para a reac o com O da enzima de Marinobacter hydrocarbonoclasticus os resultados obtidos com a cd NiR da bact ria Pseudomonas aeruginosa e
54. in vitro a redu o de dois electr es da hidroxilamina a am nia eq 1 10 Allen er al 2000 van Wonderen er al 2007 e de quatro electr es do oxig nio molecular a agua eq 1 11 F l p et al 1995 Koppenh fer et al 2000 Centola et al 2006 24 NH5OH 2H 2 NH HO 1 10 O 4H 4 gt 2H 0 1 11 Para al m dos substratos acima referidos o hemo d apresenta a capacidade de ligar outros ligandos t picos de hemos tais como o monoxido de carbono CO Jj gren et al 2000 Das et al 2001 e o cianeto CN Sun et al 2002 I 2 4 2 O hemo d O hemo d uma dioxoisobacteriochlorina com ferro Wu et al 1987 que ocorre exclusivamente na cdjNIR A sua estrutura fig 1 13 difere das estruturas dos hemos do tipo b e c pela satura o de dois dos an is de pirrolo e pela presen a de dois grupos electropositivos carbonilo e um grupo acrilato conjugado com a porfirina Fig 1 13 Estrutura do hemo dj Jafferji et al 2000 propuseram a exist ncia de tr s vantagens importantes que poder o explicar a raz o pela qual se desenvolveu a bios ntese deste tipo de hemo especializado na redu o de nitrito a xido n trico Em primeiro lugar a estrutura do anel estabiliza o estado ferroso permitindo a liga o do nitrito Em segundo lugar este tipo de estrutura pode favorecer a liberta o do NO atendendo ao enfraquecimento da liga o causado pela presen a de grupos captado
55. montagem do el ctrodo de trabalho para os ensaios com IR Te de Pasa as OPERE SA RPM ePUPIMPIA E srta add as IEEE QURE causes Fig II 15 Espectro de absorc o UV Vis obtido com 1 5 uM de Dsv de Desulfovibrio desu uricanp ATCC ATTI eva oesaus gs eR aec dep N E HE UM QE PE SAVER RE raso stands Fig II 16 Linhas de g is corados com Azul de Coomasie resultantes da aplica o de PAGE asTraccoes de des ltoviridinae E Fig II 17 Recta de calibra o para a determina o da massa molecular da Dsv nativa Fig II 18 Determina o da massa molecular das subunidades da DSV Fig II 19 Determina o da propor o relativa entre as subunidades da desulfoviridina Fig II 20 Fragmentos de ADN resultantes das reac es de PCR el Fig 1 21 Alinhamento entre as sequ ncias de res duos de amino cidos das tr s subunidades da Dsv de D desulfuricans ATCC 27774 a obtidas neste trabalho b depositadas por Lucas et al 2009 D desulfuricans G20 D vulgaris Hildenborough e Bis FULCIOUS apa E pcm Fig 11 22 Constru o do modelo para a estrutura tridimencional da Dsv de D desulfuricanmy ATCC 277 TAs pensada andas da I DA VER CRASE Fig II 23 Sobreposi o da estrutura conseguida por modela o azul com a estrutura que Ihe serviu de modelo rosa a desulfoviridina de D vulgaris Hildenborough Fig II 24 Estrutura da forma ani nica AB do azul de bromofenol
56. n i Garc a et al 2005 efeito de matriz na alimentos diversos amostra de cerveja Li amp Zhao 2006 Fotom trico reacc o com PRA formalde do Cu Cr NO alimentos diversos Fotom trico reac o com DTNB Li amp Zhao 2006 100 Tabela II 2 Continua o damascos secos Polarografia diferencial pulsada DPP m todo directo damascos secos Polarografia diferencial pulsada DPP reac o com Sei licores industriais Voltametria c clica madeira e papel Voltametria diferencial pulsada DPV picos a 0 659V vs NHE licores industriais madeira e papel DPV picos a 0 779 V vs NHE gua de caldeiras Amperometria 0 594V vs NHE Amperometria 0 694V vs NHE soluc es industriais DPV picos a 0 599 V vs NHE 101 n d 5 6 704 0 26 28 3 8 96 32 32 429 0 32 96 0 26 4 42 0 04 6 4 Cd elimina se com a adi o de EDTA Pb ascorbato sulfureto sulfureto Yilmaz amp Somer 2007 Yilmaz amp Somer 2007 Raoof et al 2007 Ardakani et al 2008 Zhou et al 2008 Dadamos amp Teixeira 2009 Ensafi amp Karimi Maleh 2010 Tabela II 3 Principais caracter sticas dos biossensores propostos para determina o de sulfitos GL gama de linearidade LD limite de detec o n d n o determinado n 1 n o identificado Matriz de Transduc o Esp cie Sensibilidade Matriz de Refer ncia Imobilizac
57. na composi o da solu o precipitante nas mesmas condi es experimentais quer com recurso t cnica de seeding 1 3 3 3 Constru o de um Biossensor Electroqu mico Espec fico para Nitritos Baseado na Actividade da cd NiR co imobilizada com o seu Parceiro Fisiol gico em CPSPEs O biossensor foi constru do ap s a activa o pr via da superf cie do el ctrodo de trabalho impresso nos CPSPEs por aplica o de um potencial de 1V durante 120s em 0 1M H5SO Os el ctrodos foram ent o lavados com dH O e secos sob uma corrente de ar comprimido Procedeu se ent o modifica o das superf cies dos el ctrodos de trabalho de acordo com as condi es ptimas previamente definidas Jorge 2011 e que consistiram na aplica o de uma mistura de 100 uM cd NiR 100 uM cit css e 50 PVA na superf cie do el ctrodo de trabalho seguida de foto polimeriza o a 4 C sob o feixe de uma l mpada de halog nio de 20 W durante 48 horas 37 A c lula electroqu mica contendo 0 15 M KCl em 0 05 M tamp o MES pH 6 3 como electr lito de suporte foi rigorosamente desarejada com rgon antes e durante os ensaios A generalidade dos voltamogramas c clicos foi tra ada numa janela de potencial compreendida entre 0 602 V e 0 020 V vs NHE a 50 mVs A avalia o da resposta do biossensor presen a de nitrito foi realizada atrav s de adi es sucessivas de solu es de NaNO na c lula electroqu mica 1 3 3 4 Cons
58. no segundo varrimento surge sempre a um valor de potencial mais elevado do que no primeiro varrimento sendo que esta diferen a tanto mais pronunciada quanto menores s o a v e o pH Estas observa es sugerem a ocorr ncia de altera es estruturais na prote na aquando da redu o no primeiro varrimento cuja extens o ser condicionada pelo pH do meio Neste caso o aumento da velocidade de varrimento impedir a observa o de tais modifica es sugerindo que se trata de um processo relativamente lento Assim infere se que o sistema em estudo traduz um processo irrevers vel Salienta se ainda a instabilidade do sinal que vai diminuindo de intensidade ao longo do tempo Esta diminui o na intensidade de corrente tanto mais acentuada quanto menor o pH A 20 mVs e pH 5 j n o s o observ veis quaisquer picos no terceiro varrimento Este motivo conjuntamente com as altera es irrevers veis observadas do 1 para o 2 ciclos conduziu necessidade de realizar uma nova prepara o de el ctrodo para cada condi o testada Com o intuito de eliminar a instabilidade observada procurou se imobilizar a enzima na superf cie da SAM tanto por via de activa o pelo m todo EDC NHS como pela forma o de liga es cruzadas com gluteralde do Por m nenhuma das estrat gias foi bem sucedida 65 0 10 0 20 Intensidade de Corrente uA 0 30 0 00 0 10 0 20 Intensidade de Corrente uA 0 30
59. outros comum serem usadas SAMs de organosilanos SAMs de cidos gordos em xidos met licos e de hidrocarbonetos em sil cio t m sido tamb m sistemas amplamente estudados As SAMs combinam as vantagens do UHV Utrahigh Vaccum e do m todo de Langmuir Blodgett para a prepara o de filmes finos n o requerendo por m a utiliza o dos equipamentos espec ficos e dispendiosos necess rios para a realiza o destas t cnicas Tal como nos filmes preparados por UHV o m todo de prepara o de SAMs simples existindo uma forte interac o quimisor o entre o adsorvato e o substrato Por outro lado e tal como nos filmes Langmuir Blodgett as interac es entre cadeias do adsorvato envolvendo for as de van der Waals e interac es de car cter hidr fobo garantem um empacotamento eficiente da monocamada cuja estabilidade directamente proporcional ao comprimento das cadeias alif ticas Consideradas a forma mais elementar de filme org nico ultrafino as SAMs s o elas pr prias nanoestruturas com uma espessura que varia tipicamente entre 1 3 nm e as suas propriedades intr nsecas conferem lhes uma vasta gama de aplica es 17 Uma parte substancial da versatilidade deste tipo de estruturas adv m da facilidade com que podem ser funcionalizadas permitindo o controlo de diversos par metros da superf cie modificada Assim atrav s da composi o da cadeia alif tica comprimento substituintes poss vel se
60. presen a de sulfito Os ensaios cujos resultados se apresentam em seguida foram realizados ao pH fisiol gico do organismo de onde a enzima prov m pH 7 6 e tamb m a pH 5 5 O recurso a este valor de pH cido decorreu de um compromisso entre dois factores Por um lado foi considerado o pH usual entre 3 e 4 a que as eventuais amostras reais se encontrariam Beelman amp Gallander 1979 e por outro lado o valor de pH m nimo pass vel de n o interferir significativamente com a actividade enzim tica 140 Na aus ncia de dados na literatura respeitantes varia o da actividade da Dsv com o pH foi utilizado como refer ncia o valor de pH ptimo 6 0 para a actividade da desulfofuscidina Hatchikiam amp Zeikus 1983 II 4 5 1 Azul de Bromofenol Importa salientar que o azul de bromofenol na sua forma neutra ABH sofre uma dupla desprotona o em solu o para os valores de pH empregues neste trabalho eq 2 5 e 2 6 Assim a estrutura do mediador presente em solu o n o aquela apresentada na tabela II 4 mas sim a que consta da figura 11 24 Saikia et al 2003 Shapovalov et al 2005 ABH o ABH H 2 5 ABH o AB H pKa 4 0 2 6 Br Br SO Sat Sus Fig 11 24 Estrutura da forma ani nica AB do azul de bromofenol no estado oxidado presente em solu o para pH 7 6 e pH 5 5 Saikia et al 2003 Shapovalov et al 2005 Na figura II 25 encontram se representados voltamograma
61. quer no solo quer no trato digestivo dos animais Moorcroft et al 2001 Dutt amp Davis 2002 Com o objectivo de controlar os riscos ambientais e de sa de p blica causados pela exposi o excessiva a nitratos e nitritos assistiu se nos ltimos anos cria o de regulamenta o espec fica por parte da maioria das ag ncias Internacionais que visa a redu o dos n veis permitidos destes i es em gua pot vel e produtos alimentares Mais comum o recurso determina o de nitritos nos fluidos fisiol gicos como meio de diagn stico cl nico Ellis et al 1998 1 2 1 2 Riscos Ambientais A entrada antropog nica de nitritos e nitratos no meio ambiente pode ocorrer atrav s de duas vias fundamentais a convers o fotoqu mica de xidos de azoto NOx gerados por todo o tipo de processos de combust o industrial domestico e autom vel Victorin 1994 Moorcroft et al 2001 Galloway 2003 e como consequ ncia das suas aplica es Dutton 2004 No que respeita aos nitratos a fonte de polui o mais importante deriva do uso intensivo de fertilizantes azotados em actividades agr colas onde as condi es anaer bia dos solos poder o favorecer a sua convers o em nitritos Dutt amp Davis 2002 Para al m de afectar o ciclo biogeoqu mico do azoto pela interfer ncia nos processos de nitrifica o desnitrifica o Galloway 2003 Smolders et al 2010 a repercuss o ecol gica mais gravosa decorrente do exces
62. realizados utilizando o programa ClustalW2 1 83 125 II 3 4 2 2 Previs o das Estruturas Terci ria e Quatern ria A simula o da estrutura tridimensional das tr s subunidades da Dsv de Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774 foi realizada atrav s de modela o por homologia recorrendo ao Automatic Modelling Mode do SwissModel Guex amp Peitsch 1997 Schwede et al 2003 Arnold et al 2006 A estrutura eleita pelo software como template pertence Dsv de Desulfovibrio vulgaris Hildenborough Oliveira et al 2008 depositada no Research Collaboratory for Structural Bioinformatics RCSB Protein Data Bank PDB com o c digo 2V4J Uma vez obtidas as estruturas simuladas de cada subunidade individualmente realizou se a simulacao da estrutura do trimero em dois passos consecutivos Em primeiro lugar procedeu se ao acoplamento docking das subunidades a receptor e p ligando com o software Patchdock Duhovny et al 2002 Schneidman Duhovny et al 2005A um algoritmo de acoplamento molecular baseado em princ pios de complementaridade de forma Seguidamente as 10 melhores solu es para o acoplamento foram refinadas atrav s do FireDock Fast Interaction Refinement in Molecular Docking Andrusier et al 2007 Mashiach et al 2008 e seleccionou se a solu o com a pontua o mais elevada para prosseguir com a simula o Repetiu se o procedimento de acoplamento desta vez com a solu o anteriormente encontrada co
63. tais como a cares prote nas e l pidos Tais reac es dependem predominantemente das condi es de pH e temperatura e s o respons veis pela frac o denominada de enxofre combinado Curvelo Garcia 1988 Vally et al 2009 A utiliza o destes compostos como aditivos alimentares deriva das suas reconhecidas propriedades de branqueamento e actividades antimicrobiana e antioxidante Taylor et al 1986 Esta fam lia de compostos particularmente eficaz no controlo do escurecimento do ingl s browning enzim tico por inibi o da actividade da polifenol oxidase Sayavedra Soto amp Montgomery 1986 e n o enzim tico por inibi o da reac o de Maillard McWeeny et al 1974 tanto nos alimentos frescos frutas e vegetais quanto nos processados 95 O recurso ao di xido de enxofre enquanto ingrediente no processamento de alimentos e medicamentos encontra se relatado nas culturas cl ssicas Gr cia Roma Egipto que reportam a utiliza o do SO na fumiga o de casas e no saneamento dos recipientes para armazenamento de vinho e ja no s culo XVII encontra se descrita a aplica o deste g s como conservante de cidra O recurso a sulfitos surgiu somente no in cio do s c XX Utilizados inicialmente apenas na produ o de vinhos e cervejas rapidamente o seu uso se expandiu produ o alimentar como consequ ncia da sua alegada inocuidade e elevada efici ncia funcional Como prova disso encontra se o aumen
64. ter em considera o a prote na codificada pelo gene dsrD Karkhoff Schweizer et al 1995 O gene dsrD codifica uma pequena prote na com apenas 78 res duos de amino cidos faz parte do mesmo oper o que os dsrAB e tal como estes altamente conservado Embora a prote na de D vulgaris Hildenborough tenha j sido sobreexpressa Hittel amp Voordouw 2000 e a sua estrutura cristalogr fica se encontre resolvida Mizuno et al 2003 n o existem at ao momento evid ncias da sua express o in vivo 111 Um dos aspectos mais controversos do processo de caracteriza o da Dsv prende se com a natureza e composi o em co factores A caracteriza o bioqu mica e espectrosc pica da Dsv de D gigas conduzida por Moura et al 1988 apontava para a exist ncia de duas tetrahidroporfirinas 20 a 40 na forma de sirohemo e quatro centros 4Fe4S dos quais dois ligados s porfirinas por mol cula de complexo Os resultados obtidos nesse trabalho foram posteriormente corroborados por trabalhos de caracteriza o das Dsv de D vulgaris Hildenborough Wolf et al 1994 Marrit amp Hagen 1996 e D desulfuricans Essex Steuber et al 1995 A an lise da sequ ncia de res duos de amino cidos proveniente da tradu o do dsrAB de Archaeoglobus fulgidus demonstrou que na subunidade D n o existia o motivo de liga o t pico Cys X5 Cys X Cys X5 Cys para o cofactor sirohemo 4Fe4S Dahl et al 1993 Atendendo aus ncia dess
65. 005 que ocorrem no decurso da cat lise sendo genericamente aceite que a transfer ncia electr nica intramolecular entre os hemos c e d um aspecto preponderante do ciclo catal tico desta enzima independentemente da sua origem Kobayashi et al 2001 Wherland et al 2005 Estudos cin ticos e termodin micos realizados com a cd NiR de Pseudomonas stutzeri Ps revelaram a exist ncia de um forte controlo alost reo no processo de transfer ncia electr nica intramolecular A distribui o interna de equivalentes de redu o entre os hemos c e d em cada mon mero depende do n mero de equivalentes de redu o recebidos pela enzima Farver et al 2002 2003 com experi ncias recentes realizadas com a enzima de Pa a produzirem resultados semelhantes Farver et al 2009 No diagrama da figura I 18 encontra se representado esquematicamente o mecanismo de redu o proposto 29 Fig I 18 Mecanismo proposto para a redu o sequencial da cd NiR de Pa Farver et al 2009 Os s mbolos a branco representam estados oxidados e a negro os estados reduzidos hemo c e hemo d m As setas a tracejado representam transfer ncias electr nicas intermoleculares irrevers veis e as setas a cheio transfer ncias electr nicas intramoleculares revers veis na mesma subunidade Os passos assinalados com representam dois estados equivalentes poss veis Em suma a liberta o do NO ap s redu o do nitrito no centro activo da cd NiR
66. 05 eee eee enne enun Fig I 9 Diagrama representativo da adsor o de uma prote na a uma SAM por via de interaccdo electrOestatiodesssiso9 0 deese ve oiu e a EE Fig I 10 Reac es de liga o de ERBs a SAMs Arya et al 2009 ee Fig I 11 Configura es usuais de SPEs dispon veis comercialmente Tudorache amp Bala Bis LIS Estrutura do hemo dy assess iii aneis aaa eau Lada nada sa ao Qux S dete ma s Fig 1 14 Estrutura tridimensional da cd NiR de Paracoccus pantotrophus pantotrophus Milhas f al 199 T osise saeua i vau a cues iPad nas Ls anais a TUS e aa Fig 1 15 Representa o esquem tica das altera es sofridas a n vel dos hemos na redu o da cdiNi1R de Paracoccus pantotrophus ccce ecce ee eee sec eee eee ee eene ene Fig 16 Representa o esquem tica da redu o da cd NiR de Pseudomonas CEF CINON A ssa aquse Eau ee Fig 1 17 Representa o esquem tica do centro activo da cd NiR de Pseudomonas aeruginosa com NO ligado Radoul et al 2011 ccce eee eee eee EE Xi 11 12 12 13 14 14 18 19 20 23 24 25 26 27 28 29 Fig 1 18 Mecanismo proposto para a redu o sequencial da cd NiR de Pa Farver et al Fig 1 19 Estruturas tridimensionais dos parceiros fisiol gicos de cd NiRs provenientes detres organismos E rte E Fig 1 20 Espectros de absor o UV Vis dos citocromos puri
67. 1 250 uM 1 5 260 uM 0 22 uM 200 1 500 uM 1 100 uM 10 uM 0 075 uM 0 93 uM 1 uM 1 5 uM 0 22 uM 446 5 mAM emt 33 mA Mem N D 19 5 nM 789 mA M cm 170 mA M cm Strehlitz et al 1996 Strehlitz et al 1994 Strehlitz et al 1994 Ferreti et al 2000 Rosa et al 2002 Wu et al 1997 Quan et al 2006 Sasaki et al 1998 Astier et al 2005 1 2 3 Tecnologias Emergentes em Biossensores 1 2 3 1 Monocamadas Automontadas 2 3 1 1 Aspectos Gerais O termo monocamadas automontadas SAMs Self Assembled Monolayers aplica se a estruturas produzidas pela forma o espont nea de monocamadas organizadas de compostos org nicos em superf cies s lidas a partir de solu es ou da fase de vapor A forma o deste tipo de estruturas foi demonstrada pela primeira vez em 1946 por Bigelow et al para alquilaminas em platina e ap s alguns estudos publicados na d cada de 80 do s culo passado as aten es da comunidade cient fica centraram se no estudo de SAMs de alcanoti is e outros compostos com grupos terminais de enxofre dissulfitos e sulfitos em superf cies met licas de Ag Cu Pt Fe e Ni e semicondutoras GaAs mas sempre com particular nfase no Au Os alcanoti is n o s o contudo indicados para a forma o de SAMs em todos os tipos de superf cie Para superf cies hidroxiladas como o caso dos silicatos aluminatos mica e
68. 1999 Huu et al descreveram uma nova esp cie de Marinobacter que denominaram Marinobacter aquaeolei Por m em 2005 uma compara o exaustiva a n vel fenot pico e filogen tico conduzida por M rquez e Ventosa veio restabelecer a Marinobacter hydrocarbonoclasticus como a nica esp cie do g nero Marinobacter considerando que Marinobacter aquaeolei dever ser considerado como um sin nimo heterot pico sem direito de proced ncia Refere se ainda que data da conclus o desta disserta o as bases de dados UniProt PDB e KEEG ja actualizaram os seus registos apresentando a bact ria pela designa o Marinobacter hydrocarbonoclasticus 32 I 3 Materiais e M todos 1 3 1 Materiais e Reagentes 1 3 1 1 Purifica o dos citocromos css e cd As solu es tamp o utilizadas no decurso da purifica o foram preparadas com gua destilada proveniente de um sistema Automatic type II water 2 7uScm da Wasserlab O tris hidroximetil aminometano Tris base C H NOs 121 14 emol gt 99 9 foi fornecido pela Sigma o cido clor drico HCl 36 46 emol 37 proveniente da Riedel de Ha n e o ditionito de s dio Na S 0 174 11 emol gt 87 foi adquirido Merck As resinas de permuta ani nica DE 52 e Source 15Q foram adquiridas respectivamente Whatman e Amersham Biosciences A coluna XK 26 40 proveniente da Pharmacia As membranas de di lise 25 4mm capacidade de 5 mlcm cut off 12 a 14 kDa
69. 2 1973 Lee J P Peck Jr H D Biochem Biophys Res Commun 45 583 589 1971 Lee J P Yi C S LeGall J Peck Jr H D J Bacteriol 115 453 455 1973 Li Y Zhao M Food Control 17 975 980 2006 Liu M C Peck Jr H D J Biol Chem 256 13159 13164 1981 Lowinsohn D Alip zaga M V Coichev N Bertotti M Microchim Acta 144 57 62 2004 156 Lowinsohn D Bertotti M Food Addit Contam 18 773 777 2001 Lowry O H Rosebrough N J Farr A L Randall R J J Biol Chem 193 265 275 1975 Lucas S Copeland A Lapidus A Glavina del Rio T Tice H Bruce D Goodwin L Pitluck S Sims D Lu M Kiss H Meineke L Brettin T Detter J C Han C Larimer F Land M Hauser L Kyrpides N Ovchinnikova G Hazen T C EMBL GenBank DDBJ databases 2009 Lui S M Cowan J A J Am Chem Soc 116 11538 11549 1994 Lui S M Soriano A Cowan J A Biochem J 304 441 447 1994 Luo Y Brayer G D J Mol Biol 214 585 595 1990 Makarov S V Kudrick E V van Eldik R Naidenko E V J Chem Soc Dalton Trans 22 4074 4076 2002 Mander G J Weiss M S Hedderich R Kahnt J Ermler U Warkentin E FEBS Lett 579 4600 4604 2005 Mariotti M P Riccardi C S Fertonani F L Yamanaka H J Braz Chem Soc 17 689 696 2006 Marritt S J Hagen W R Eur J Biochem 238 724 727 1996 Mas r M Dankov M Olveck E Stachu
70. 2 Exemplo de um chip micro array screen printed com ouro Metters et al 2011 Este tipo de el ctrodos tem vindo a ser utilizado cada vez com maior frequ ncia em aplica es electroanal ticas pois permite a cria o de dispositivos com maior sensibilidade e menor limite de detec o que os SPEs convencionais Metters et al 2011 1 2 4 O citocromo cd cd NiR 1 2 4 1 Ocorr ncia e Fun o Biol gica O citocromo cd cdjNiR uma redutase do nitrito periplasm tica existente em diversas bact rias desnitrificantes entre as quais se destacam a Pseudomonas aeruginosa Pa Pseudomonas stutzeri Ps Marinobacter hidrocarbonoclasticus Mh anteriormente Pseudomonas nautica Paracoccus pantotrophus Pp anteriormente Thiosphaera pantotropha Paracoccus denitrificans Alcaligenes faecalis e Ralstonia eutropha Brittain et al 1992 Cutruzzol 1999 Trata se de uma enzima homodim rica cujo mon mero possui dois dom nios distintos cada um ligando um hemo O hemo c transfere electr es provenientes de prote nas doadoras para o centro activo o hemo d uma dioxoisobacterioclorina com ferro espec fica desta classe de enzimas Brittain et al 1992 Cutruzzola 1999 A fun o fisiol gica da cd NiR consiste na redu o em um electr o do nitrito a xido n trico eq 1 9 no decurso da desnitrifica o Zumft etal 1988 Cutruzzol 1999 Cutruzzol et al 2003 Contudo esta enzima pode tamb m catalisar
71. 2010C Tabela I 1 Continua o E Transfer ncia Gama de Limite de em cd NiR cd NiR cd NiR cd NiR CuNiR S deleyianum P denitrificans P denitrificans P pantotrophus P pantotrophus R sphaeroides R sphaeroides A faecalis A faecalis Comp sito de grafite mediador deposi o de enzima membrana de hidrogel de poli carbamoil sulfonato Grafite aprisionamento da enzima com membrana de di lise mediador em solu o Grafite aprisionamento da enzima com membrana de di lise mediador em solu o Enzima encorporada em mon litos de TEOS produzidos por sol gel Enzima encapsulada em gr nulos de isotiocianato de poro controlado GC electropolimeriza o de PPB deposi o de enzima PBV GC deposi o de PVA mediador enzima deposi o de PAH deposi o de poliuretano hidr filo Ouro enzima aprisionada com membrana de di lise mediador em solu o Ouro imers o em solu o de hexapeptidos de ciste na enzima e mediador em solu o Amperom trica Amperom trica Amperom trica ptica ptica Amperom trica Voltam trica Amperom trica Voltam trica 16 MET fenosafranina MET 1 metoxi PMS MET 1 metoxi PMS N A N A MET PPB MET violog nio de metilo MET 1 metoxi PMS MET pseudoazurina MET hexamina de rut nio at 250 uM 4 35 65 2 uM at 750 uM 0 075
72. 5 35 36 36 36 37 37 38 38 38 39 40 40 41 41 42 43 44 44 46 48 51 I 4 5 Constru o de um Biossensor Electroqu mico Espec fico para Nitritos Baseado na Co Imobiliza o da cd NiR com o seu Parceiro Fisiol gico cit css2 52 4 5 1 Caracteriza o Electroqu mica do cit c55 Co Imobilizado com a cdi NiR na Matriz Eeer Eege re 53 TAS Resposta a Nit Eege 56 4 5 3 Influ ncias da Temperatura e doot 50 ASA Analise de Interfetetib eS usi decades te daria edic Pete poenae 60 ASS Reac o COM Orr 60 I 4 6 Construc o de um Biossensor Electroqu mico Espec fico para Nitritos Baseado na Resposta Directa da cd NIR num Sistema Electroqu mico 63 4 6 1 Selec o do Modificador de Superftoe 63 4 6 2 Estudo do Comportamento Electroqu mico da cd NiR Adsorvida num El ctrodo modificado com uma SAM de MUA essen 65 I 4 6 2 1 Electr es Transferidos e Adsor o eseeeeeeeee 69 I 4 6 2 2 Coeficiente de Transfer ncia de Carga o e Constante de Transfer ncia Electr nica Heterog nea kat 71 4 6 2 3 Reac o Quimica Acoplada Transfer ncia de Protoes p 4 6 3 Microscopia de For a At mica x 13 4 6 4 Estudo do Comportamento Elteren da cd NiR JAdsorvidd num El ctrodo modificado com SAMS Mistas cece cece cece cece cece cece cece cece eee e eee enne 74 4 6 5 Ressonancia R
73. 72 1998 Ardakani M M Habibollahi F Zare H R Naeimi H Int J Electrochem Sci 3 1236 1247 2008 Arnold K Bordoli L Kopp J Schwede T Bioinformatics 22 195 201 2006 Avramescu A Noguer T Magearu V Marty J L Anal Chim Acta 433 81 88 2001 Badr I H A Plata A Molina P Alajarin M Vidal A Bachas L G Anal Chim Acta 388 63 69 1999 Beelman R B Gallander J F Wine Deacidification In C O Chinchester Ed Advances in Food Research Vol 25 pp 1 54 Academic Press Inc New York 1979 Bianco P Haladjian J Biochimie 76 605 613 1994 Boulton R B Singleton V L Bisson L F Kunkee R E Principles and Practice of Winemaking Chapman amp Hall pp 448 473 1996 Carballo R Dall Orto V C Balbo A L Rezzano L Sensor Actuat B Chem 88 155 161 2003 Cardwell T J Christophersen M Anal Chim Acta 416 105 110 2000 Chen G N Liu J S Duan J P Chen H Q Talanta 53 651 660 2000 Cmel k S Mach t J Niedobv E Otruba V Kanick V Anal Bioanal Chem 383 483 488 2005 Compendium of International Methods of Wine and Must Analysis Vol 2 MA E AS323 04 DIOSOU OIV Paris 2006 Copeland A Lucas S Lapidus A Barry K Detter J C Glavina T Hammon N Israni S Pitluck S Goodwin L A Schmutz J Larimer F Land M Kyrpides N Ivanova N Richardson P EMBL GenBank DDBJ databases 2005 Crane B R Getzoff E D Curr Opin Struc Bi
74. 88 His51 His182 His51 His182 hemo c hemo d hemo c hemo d Fig I 16 Representac o esquem tica da redu o da cd NiR de Pseudomonas aeruginosa Contrariamente ao observado nos complexos Mb Fell NO e Hb Fell NO Kharitonov et al 1997 a dissocia o do produto da reac o NO do hemo d reduzido ocorre de uma forma extremamente f cil Ky 10 M Rinaldo et al 2007B Para justificar tal facto foi postulada a exist ncia de uma importante contribui o para a destabiliza o do produto por parte das His327 e His369 presentes nas imedia es do centro activo Cutruzzola et al 2001 para al m das caracter sticas singulares do hemo d referidas na sec o 1 2 4 2 Estudos adicionais recentemente publicados confirmam esse facto Radoul ef al 2011 De acordo com estes autores as liga es por pontes de hidrog nio verificadas entre o produto e os res duos de His adjacentes enfraquecem a liga o d Fe NO fig 1 17 de forma a permitir a sua sa da mediante a aproxima o de um novo 1 o nitrito 28 Fig 1 17 Representa o esquem tica do centro activo da cd NiR de Pseudomonas aeruginosa com NO ligado Radoul et al 2011 1 2 4 5 Processos de Transfer ncia Electr nica Os aspectos mais controversos do mecanismo catal tico das cd NIR est o relacionados com os processos de transfer ncia electr nica inter Lojou et al 2003 e intramolecular Kobayashi et al 2001 Wherland et al 2
75. Alexandra Sofia Vasques Gon alves Serra Mestre em Qu mica Anal tica Aplicada tOgen ea ex MAID SINWo o K lt q Ss pe omsa NON S Isolamento e Caracteriza o de Enzimas Multih micas de Origem Microbiana e sua Aplica o no Desenvolvimento de Biossensores Disserta o para obten o do Grau de Doutor em Qu mica Sustent vel Orientador Doutora Maria Gabriela Machado de Almeida Investigadora Auxiliar da Faculdade de Ci ncias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa Co orientador Doutor Jos Jo o Galhardas de Moura Professor Catedr tico Aposentado da Faculdade de Ci ncias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa J ri Presidente Doutor Ant nio Manuel Dias de S Nunes dos Santos Arguentes Doutora Margarida Maria Portela Correia dos Santos Rom o Doutor St phane Pierre Besson Vogais Doutora Marta Sofia Peixe Carepo Doutora Ana Pimenta da Gama da Silveira Viana Semedo FACULDADE DE CIENCIAS E TECNOLOGIA UNIVERSIDADE NOVA DE LISBOA Janeiro 2012 Isolamento e Caracteriza o de Enzimas Multih micas de Origem Microbiana e sua Aplica o no Desenvolvimento de Biossensores Copyright by Alexandra Sofia Vasques Gon alves Serra FCT UNL Faculdade de Ci ncias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa UNL Universidade Nova de Lisboa A Faculdade de Ci ncias e Tecnologia e a Universidade Nova de Lisboa t m o direito perp tuo e sem limites geogr ficos de arquivar e p
76. D DDAB DET dH O DPP DPV dSIR dsrAB dsrC DsrC dsrD DsrK DsrMKJOP Dsv coeficiente de transfer ncia de carga varia o do potencial de pico varia o da intensidade de corrente absortividade molar comprimento de onda di metro ndice de cobertura velocidades de varrimento rea do el ctrodo absorv ncia a 280 nm amino cidos forma ani nica do azul de bromofenol forma neutra do azul de bromofenol cido desoxirribonucleico microscopia de for a at mica do ingl s Atomic Force Microscopy azul de Meldola Association of Official Analytical Chemists Anthraquinone 2 sulfonic Acid redutase do sulfito assimilativa American Type Culture Collection Bureau of Alcohol Tobacoo and Firearms cido bicicon nico albumina do soro bovino do ingl s bovine serum albumin cido 3 ciclohexilamino 1 propanosulf nico cido 3 ciclo hexilamino 2 hidroxi 1 propanosulf nico catalase detector tipo charge coupled device citocromo c redutase do nitrito dissimilativa redutase s do nitrito citocromo cd Centro de Tecnolog as Electroqu micas San Sebastian Espafia citocromo c citocromo C52 el ctrodos de pasta de carbono screen printed do ingl s Carbon Paste Screen Printed Electrodes modificador ti lico cisteamina redutase do nitrito de cobre Desulfovibrio aditivo do ingl s didodecyldimethylammonium bromide transfer ncia electr nica directa do ingl s direct electron transfer gua des
77. D Lin Z Wang Y Elmerich C Lin M Jin Q EMBL GenBank DDBJ databases 2006 Younathan J N Wood K S Meyer T J Inorg Chem 31 3280 3285 1992 Zajicek R S Cartron M L Ferguson S J Biochemistry 45 11208 11216 2006 Zhang Z Xia S Leonard D Jaffrezic Renault N Zhang J Bessueille F Goepfert Y Wang X Chen L Zhu Z Zhao J Almeida M G Silveira C M Biosens Bioelectron 24 1574 1579 2009 Zhao X Mai Z Kang X Dai Z Zou X Electrochim Acta 53 4732 4739 2008 Zhao Y Zhang W Chen H Luo Q Li S F Y Sens Actuators B 8717 168 172 2002 Zhu W L Zhou Y Zhang J R Talanta 80 224 230 2009 Zumft W G D hler K K rner H L chelt S Viebrock A Frunzke K Arch Microbiol 149 492 498 1988 I 7 Bases de Dados e Programas Inform ticos de Livre Utiliza o http bioinfo3d cs tau ac il SymmDock http swissmodel expasy org http www ebi ac uk Tools clustalw2 index html http www expasy ch http www uniprot org http www pdb org pdb home home do http www sbg bio ic ac uk phyre http www genome jp kegg 92 PARTE II Desulfoviridina de Desulfovibrio desulfuricans A TCC 27774 Isolamento Caracteriza o e Desenvolvimento de um Biossensor Electroqu mico para Determina o de Sulfito II 1 Objectivos Este trabalho teve por principal objectivo a constru o de um biossensor electroqu mico espec fico para a determina o de sulfi
78. ER EEN Cell CN 322 19 fenilfenazina 5 ium sol vel 255 a B nicotinamida adenina di nucleotido C5 Hz N P5Na sol vel 365 c cloreto de N 9H azul de Meldola benzo a fenoxazina 9 ilideno C sH 5 1N50 0 52nCb 378 93 N metilmetanaminium 69 193 b 118 1 3 2 Equipamentos 1 3 2 1 Purifica o e Caracteriza o Bioqu mica da redutase do sulfito dissimilat ria Desulfoviridina As solu es tamp o utilizadas no decurso da purifica o foram preparadas com gua destilada proveniente de um sistema Automatic type II water 2 7uScm da Wasserlab O pH das solu es foi aferido num dispositivo da Crison Micro pH 2002 equipado com um el ctrodo medidor de pH modelo 5209 da mesma marca As cromatografias a alta press o foram realizadas num sistema cromatogr fico Akta Basic da Amersham Pharmacia biotech controlado pelo software unicorn 5 11 da GE Healthcare A espectrofotometria de UV Vis foi efectuada em espectrofotometros UV 160A e UV 1800 ambos da Shimadzu As electroforeses foram realizadas em sistemas de pH descont nuo segundo o m todo de Laemmli em tinas de electroforese Mini PROTEN 3 da Bio Rad mini gel 8 x 7 x 0 75 cm A transfer ncia electrofor tica das subunidades da Dsv para uma membrana de PVDF foi realizada recorrendo a um sistema semi seco da Bio Rad Trans Blot amp SD Semi Dry Electrophoretic Transfer Cell A espectroscopia de emiss o at mica utilizando uma f
79. Isolamento Caracteriza o e Desenvolvimento de um Biossensor Electroqu mico para Determina o de Nitritos I 1 Objectivos O principal objectivo deste trabalho foi a constru o de um biossensor electroqu mico espec fico para a determina o de nitritos baseados na redutase do nitrito citocromo cd cd NiR proveniente da bact ria marinha desnitrificante Marinobacter hydrocarbonoclasticus utilizada como elemento de reconhecimento biol gico Numa primeira etapa procedeu se caracteriza o bioqu mica e estrutural da enzima atrav s de m todos bioqu micos espectrosc picos bioinform ticos e cristalogr ficos Seguidamente prop s se o desenvolvimento de um biossensor amperom trico baseado numa resposta electroqu mica mediada Finalmente procurou se criar um biossensor baseado na resposta electroqu mica directa da cd NiR I 2 Introdu o Geral 1 2 1 Nitritos 1 2 1 1 Ocorr ncia Os nitratos NOs e nitritos NO encontram se frequentemente em plantas solos e guas Uma vez que a sua qu mica praticamente indissoci vel raramente s o encontrados individualmente Quando presentes em quantidades excessivas estes 10es podem exercer um impacto adverso tanto a nivel da sa de p blica quanto a n vel ambiental O nitrito de longe o agente com maior grau de toxicidade por m o nitrato considerado tendencialmente inerte pode facilmente ser reduzido a nitrito por via da ac o bacteriana
80. K Hirasawa M Knaff D B Allen J P Biochemistry 44 16054 16063 2005 Tepper A W J Am Chem Soc 132 6550 6557 2010 Th venot D R Toth K Durst R A Wilson G S Pure Appl Chem 71 2333 2348 1999 Timkovich R Robinson M K Biochem Biophys Res Commun 88 649 655 1979 Tsikas D Free Radical Res 39 797 815 2005 Tsikas D J Chromatogr B 851 51 70 2007 Tudorache M Bala C Anal Bioanal Chem 388 565 578 2007 van Wonderen J H Knight C Oganesyan V S George S J Zumft W G J Biol Chem 282 28207 28215 2007 Vericat C Vela M E Salvarezza R C Phys Chem Chem Phys 7 3258 3268 2005 Vicente M G H Smith K M In Encyclopedia of Life Sciences John Wiley amp Sons Ltd 2001 Victorin K Mutat Res Rev Genet 317 43 55 1994 Walsh T A Johnson M K Greenwood C Barber D Springall J P Thomson A J Biochem J 177 29 39 1979 Wherland S Farver O Pecht I Chem Phys Chem 6 805 812 2005 Williams P A F l p V Garman E F Saunders N F W Ferguson S J Hajdu J Nature 389 406 412 1997 Wu Q Storrier G D Pariente F Wang Y Shapleigh J P Abruna H D Anal Chem 69 4856 4863 1997 Wu W Chang C K J Am Chem Soc 109 3149 3150 1987 Wu Y Shen Q Hu S Anal Chim Acta 558 179 186 2006 91 Yan Y Yang J Dou Y Ping S Chen M Yao Z Li H Lu W Zhang W Peng J Liu W He S Geng L Zhang X Yang F Li
81. Lui S M Cowan J A Eur J Biochem 223 79 89 1994 Yilmaz U T Somer G Anal Chim Acta 603 30 35 2007 Zhao M Hibbert B Gooding J Anal Chim Acta 556 195 200 2006 Zhou H Yang W Sun C Talanta 77 366 371 2008 II 7 Bases de Dados e Programas Inform ticos de Livre Utiliza o http bioinfo3d cs tau ac il FireDock http bioinfo3d cs tau ac il PatchDock http bioinfo3d cs tau ac il SymmDock http swissmodel expasy org http www bioinformatics org sms rev_comp html http www ebi ac uk Tools clustalw2 index html http www expasy ch http www genome jp kegg http www uniprot org http www pdb org pdb home home do 160
82. M M Hsu L L Machado R F Shiva S Power G G Kelm M Gladwin M T Schechter A N Blood 1006 734 739 2005 Dejam A Hunter C J Schechter A N Gladwin M T Blood Cells Mol Dis 32 423 429 2004 Dell aqua S Pauleta S R Monzani E Pereira A S Casella L Moura J J Moura l Biochemistry 47 10852 10862 2008 Ding Y Wang Y Li B Lei Y Biosens Bioelectron 25 2009 2015 2010 Dutt J Davis J J Environ Monit 4 465 471 2002 86 Dutton R Met Finish 102 12 15 2004 Einsle O Kroneck P M Biol Chem 385 875 883 2004 Einsle O Messerschmidt A Stach P Bourenkov G P Bartunik H D Huber R Kroneck P M Nature 400 476 480 1999 Eiserich J P Patel R P O Donnell V B Mol Aspects Med 19 221 357 1998 Ellis G Adatia I Yazdanpanah M Makela S K Clin Biochem 31 195 220 1998 Farver O Brunori M Cutruzzol F Rinaldo S Wherland S Pecht I Biophys J 96 2849 2856 2009 Farver O Kroneck P M H Zumft W G Pecht I Biophys Chem 98 27 34 2002 Farver O Kroneck P M H Zumft W G Pecht I Proc Natl Acad Sci 100 7622 7625 2003 Fauque G Moura J J G Besson S Saraiva L M Moura I Oc anis 18 211 216 1992 Ferretti S Lee S MacCraith B D Oliva A G Richardson D J Russell D A Sapsforda K E Vidalc M Analyst 125 1993 1999 2000 Fransconi M Mazzei F Ferri T Anal Bioanal Chem 398 1545 1564 2010 F l p V M
83. Molar Conhecida a composi o em subunidades da Dsv assim como a massa molecular das mesmas procedeu se determina o da absortividade molar e da prote na A aplica o do m todo do BCA resultou numa concentra o de prote na de 4 5 0 3 mgml a que corresponde 22 1 uM A concentra o determinada pelo m todo de Lowry foi 4 3 0 5 mgml a que corresponde 21 2 uM Dado que ambos os m todos produziram resultados semelhantes assumiu se como correcto o valor contendo o menor erro associado ou seja 22 u M Uma vez conhecida a concentra o molar procedeu se ao c lculo dos valores de para a prote na nativa tendo se realizado igualmente o c lculo da absortividade molar a 280 nm por via computacional com recurso ao software ProtParam Na tabela II 8 apresentam se os valores calculados Tabela II 8 Picos de absor o do espectro UV Vis e absortividade molar da desulfoviridina de D desulfuricans ATCC 27774 280 te rico 334260 280 330682 390 162955 408 170454 580 36136 360 68864 Comparando os valores de Come calculado a partir dos resultados experimentais com o obtido a partir da sequ ncia de res duos de amino cidos constata se que estes s o bastante semelhantes sobretudo tendo em conta que o algoritmo de c lculo assume que a prote na se encontra dissolvida em gua e que todas as ciste nas se encontram emparelhadas por liga es persulfureto o que na realidade n o acontece Esta se
84. O4SNa 259 30 emol A 4 morfolineetanosulfonato de s dio MES CoH NNaOssS 217 22 emol cido N Tris hidroximetil metil 3 aminopropanosulf nico TAPS C7H 7NO S 243 28 emol gt 99 5 e o cido sulf rico HSC 98 08 emol 95 97 foram adquiridos Sigma A pasta de alumina origin ria da Buehler O alcool polivinilico modificado com grupos azida pendentes PVA AWP foi adquirido Toyo Gosei Jap o As placas de vidro revestidas com ouro de 11x11mm para a obten o de imagens por AFM foram fornecidas pela Arrandee Tabela I 2 Modificadores de superf cie utilizados na prepara o dos el ctrodos de ouro com monocamadas automontadas Nome Abreviatura F rmula Qu mica Estrutura Marca Tin D cisteamina HS CH5 NH Sigma 1 1 mercapto 1 mE HS5 CH25 0H 204 38 Ho Wc su Aldrich o cido 11 mercaptoundecanoico HS CH 2 9CO2H e Me ce Aldrich O cido 3 HS CH 106 14 Aldrich mercaptopropi nico Hs OH 1 undecanotiol HS CH i9 CH 188 40 Pd ma Aldrich 1 hexanotiol HS CH CH 11824 ON ON ON 1 3 2 Equipamentos 1 3 2 1 Purifica o dos citocromos css e cd O pH das solu es foi aferido num aparelho modelo micro pH 2002 da Crison equipado com um el ctrodo medidor de pH modelo 5209 da mesma marca 34 As cromatografias a alta press o foram realizadas num sistema cromatogr fico Akta Basic da Amersham Pharmacia biotech controlado pelo software Unicorn 5 11 da GE Healthcare
85. P45574 P45575 e D desulfuricans Essex 6 Morse et al 2000 de forma a confirmar a identidade da prote na purificada Os resultados obtidos neste procedimento encontram se descritos na tabela II 5 Tabela IL5 Alinhamento das sequ ncias de res duos de amino cidos correspondentes ao N terminal de cada subunidade da Dsv de diferentes esp cies pertencentes ao g nero Desulfovibrio AKHATPKLDOQ AKHATPLLDOQ AKHATPLLDO AKHATPKLDO AFISSGYNPA AFISSGYNPA AFISKGYNPA AEVTYKGKSF AEKTYAG OI LESGPWPSFV LESGPWPSFV LE GPVPNFV LESGPWPSFV KPMENRITDI KPMEGRITDI KPMEGRKTD EVDEDGFLLR EVDEDGILLR D vulgaris D desulfuricans Essex 6 D desulfuricans ATCC 27774 D vulgaris D gigas D desulfuricans Essex 6 D desulfuricans ATCC 27774 D vulgaris D desulfuricans ATCC 27774 Tendo em conta o elevado grau de similaridade encontrado entre as sequ ncias em compara o poss vel concluir que a prote na purificada efectivamente a desulfoviridina Determinou se ainda que a prote na cont m as tr s subunidades a D e y 128 II 4 2 Caracteriza o Bioqu mica II 4 2 1 Massa Molecular A determina o da massa molecular MM da Dsv nativa foi realizada por cromatografia de filtrac o em gel ap s tr s ensaios cromatogr ficos atrav s da recta de calibra o apresentada na figura II 17 0 8 0 7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 Kav 4 4 5 5 5 5 6 6 5 logio MM Fig II 17 Recta de c
86. Pc e pH para algumas das v estudadas esee Fig 1 43 Imagens de AFM de A Au modificado com MUA e cdINIR adsorvido B Au modificado com MUA C cd1 NiR adsorvida em MiCa ssesesoesesoesosossosoesossesosoesoo Fig 1 44 El ctrodos modificados com SAMS mistas eee eee eee eee eere nnn Fig 1 45 Regi o de altas frequ ncias dos espectros de Resson ncia Raman da cd NiR no estado xItdadO des sveesetex 0e cata up Uca eub PERSE RR CET Ro uS A P Pr CPP use EPIO Eo MEME ExPME eds Fig I 46 Regi o de altas frequ ncias dos espectros de Resson ncia Raman da cd NiR apos reducao Con ascorbalO css saga asd pas mai saias COq e ies se mai nada casais Fig 1 47 Espectros RR da cd NiR adquiridos com excita o a 647nm Fig 1 48 Titula o preliminar da cd NiR imobilizada em el ctrodos de Ag revestidos com uina SAM GE CISteamitlidesues sees vaa contatar sto Ia USE EEN Parte II Fig II 1 Diagrama de Pourbaix simplificado para os equil brios est veis do sistema enxotre apua a 25 C Pourbatx 1974 oie essi eoa vta aed ease ee eee Eee ve vue diese alisa cad imunda Fig II 2 Qu mica dos sulfitos A convers o dos sais de enxofre em meio aquoso origina a produ o in situ de di xido de enxofre Vally et al 2009 eere Fig 11 3 Esquema reaccional dos biossensores de sulfitos baseados no aumento de corrente provocado por ac o do mediador na regener
87. SG IKAMTGDGSDPEFKTBPI 521 Ps QELKMP Ec Y IA SKAPKREDV 483 ii e 22 XX keke jk EWAELG GPKEVVOP NTODKK KMIKGDYM 557 EWADLGE GAKBVVOP KR NGKNDS KDPRL 551 HMIKDERL 579 KMITDPAI 543 EWAGIT E GOPNVVOGHE SRALRE THP KD NGKDQE GGKTDO E F F I D al ao u rm L vo Do ee Tel xe e x ea e Fre KKK XX Xe Mh V TY 574 Pa T I on 568 Pp V IM 596 Ps V 560 oKKKKKKK Fig 1 23 Alinhamento das sequ ncias de res duos de amino cidos para a cd NiR de Marinobacter hydrocarbonoclasticus Pseudomonas aeruginosa Paracoccus pantotrophus e Pseudomonas stutzeri Os ligandos axiais dos hemos encontram se assinalados a verde claro para o hemo c e escuro para o hemo d As regi es a amarelo correspondem a p ptidos de sinal e as zonas de identidade entre as quatro prote nas apresentam se destacadas a rosa 47 Com base nos alinhamentos da figura 1 23 foram calculados os graus de identidade e similaridade partilhados entre a sequ ncia de res duos de amino cidos das enzimas dos quatro organismos tabela 1 5 Tabela I 5 Graus de identidade e similaridade encontrados entre a sequ ncia de res duos de amino cidos da cd NiR de M hydrocarb e as sequ ncias da mesma prote na de outras bact rias Marinobacter Pseudomonas Pseudomonas Paracoccus hydrocarbonoclasticus aeruginosa stutzeri pantotrophus Identidade Similaridade No c mpto geral verifica se qu
88. Sistema Electroquimico A procura de um sistema pass vel de promover a interac o directa entre a cd NiR e o el ctrodo de trabalho tornando desnecess rio o recurso a um mediador conduziu ao estudo da Interac o directa entre esta enzima e diferentes tipos de el ctrodos Uma estrat gia que tem vindo a ser reportada com bastante sucesso com vista obten o de respostas electroqu micas A cs b 99 Z cf As NES por parte de prote nas de outro modo silenciosas o recurso a modifica es das superf cies dos el ctrodos com monocamadas automontadas de compostos org nicos Rusling et al 2008 Assim a interac o entre a cd NiR e el ctrodos de ouro policristalino modificados com diferentes SAMs foi investigada 1 4 6 1 Selec o do Modificador de Superf cie A primeira fase do trabalho consistiu na selec o do tiol com o qual seria modificada a superf cie do el ctrodo de trabalho Para esse efeito foram testadas SAMs constitu das por ti is de cadeia curta e longa funcionalizados com grupos hidr filos hidrof bicos e polares nomeadamente a cisteamina Cs o cido 3 mercapto propi nico MPA o cido 11 mercapto undecan ico MUA o 11 mercapto undecanol MUOH e o 1 hexanotiol HT Na figura 1 35 encontram se representados os voltamogramas c clicos obtidos ap s modifica o do el ctrodo de trabalho com SAMs de cada um destes compostos seguida de adsor o da cd NiR 63 Intensidade de Corre
89. VDF Q R RCSB Ref Rf RP RR rRNA rSIR SAMs SCE transfer 1 methoxy 5 methylphenazinium methyl sulfate 4 morfolineetanosulfonato de s dio Marinobacter hidrocarbonoclasticus massa molecular modificador ti lico cido 3 mercaptopropi nico modificador ti lico cido 11 mercaptoundecan ico modificador ti lico 1 undecanotiol modificador ti lico 11 mercapto 1 undecanol violog nio de metilo n de electr es transferidos n o aplic vel fosfato de nicotinamida adenina dinucle tido nicotinamida adenina dinucle tido base de dados do ingl s National Center for Biotechnology Information n o determinado el ctrodo de refer ncia de hidrog nio do ingl s Normal Hydrogen n o identificado redutase s do nitrito compostos carcinog nicos N nitroso redutase do xido nitroso xidos de azoto sub unidade A da citocromo c redutase do nitrito sub unidade H da citocromo c redutase do nitrito Organisation Internationale de la Vigne et du Vin Organiza o Mundial de Sa de Pseudomonas aeruginosa do ingl s Protein Data Bank polymerase chain reaction polietilenoglicol grafite pirol tica do ingl s pyrolytic graphite el ctrodo de trabalho de grafite pirol tica do ingl s pyrolytic graphite electrode Protein homology analogy recognition engine Paracoccus pantotrophus m todo para rosanilina formalde do precedente de Pseudomonas stutzeri contra el ctrodo de platina poly vinyl alcoho
90. a o da SO Fig II 4 Representa o esquem tica de biossensores de sulfitos baseados na actividade JAS Ooi duance ds tan cotta cae sewas m Lue ITS Centro activo d s E Fig 11 6 Estrutura tridimensional da SiRHP nativa na forma monom rica Crane et al 1905 PDB AOP h ergue Da a Da RO adiada Sr QU UC Ca pad OD dd nai a aa Fig II 7 Mecanismo de redu o do SO catalisada pela SiRHP Strupe amp Getzoff xili 68 70 71 72 72 73 75 77 78 79 82 94 95 103 104 105 107 Fig II 8 Estrutura tridimensional da Desulfoviridina de Desulfovibrio vulgaris Hildenborough na forma de complexo q B gt y gt no estado nativo Oliveira et al 2008 PB VA aan dao Met ac Eu DE EM CIS e UA GO O da Fig II 9 Estrutura tridimensional da Desulfoviridina de Archaeoglobus fulgidos na forma de complexo o no estado nativo Schiffer et al 2008 PDB 3MMC Fig II 10 Estrutura dos oper es dos genes dsrAB e ASIC eessen EEN Fig IIL 11 Mecanismo de redu o do SO catalisada pela Dsv de A fulgidus Parey et Ali 21 0 E Fig IL 12 Representa o esquem tica do mecanismo proposto para a redu o do SO catalisada pela Dsv de D vulgaris Oliveira et al 2008 esses Fig II 13 Esquema de purifica o para a Desulfoviridina de D desulfuricans ATCC PIN M T Fig II 14 Esquema de
91. a F Biochem Biophys Res Co 363 662 666 20074 Rinaldo S Arcovito A Brunori M Cutruzzol F J Biol Chem 282 14761 14767 2007B Rodrigues M L Oliveira T F Pereira AC Archer M Embo J 25 5951 5960 2006 Rosa C C Cruz H J Vidal M Oliva A G Biosens Bioelectron 17 45 52 2002 Rusling J F Wang B Yun S In Philip Bartlett Ed Bioelectrochemistry Fundamentals Experimental Techniques and Applications pp 39 86 John Wiley amp Sons Ltd 2008 Sam K A Fairhust S A Thorneley R N F Allen J W A Ferguson SJ J Biol Chem 283 12555 12563 2008 Saraiva L M Fauque G Besson S Moura I Eur J Biochem 224 1011 1017 1994 Sasaki S Karube I Hirota N Arikawa Y Nishiyama M Kukimoto M Horinouchi S Beppu T Biosens Bioelectron 13 1 5 1998 Saunders N F W Ferguson S J Baker S C Microbiology 146 509 516 2000 Scharf M Moreno C Costa C Van Dijk C Payne W J LeGall J Moura I Moura J J Biochem Biophys Res Commun 209 1018 1025 1995 Schneidman Duhovny D Inbar Y Nussinov R Wolfson H J Nucl Acids Res 33 W363 367 20054 Schneidman Duhovny D Inbar Y Nussinov R Wolfson H J Proteins 60 224 231 2005B Schwede T Kopp J Guex N Peitsch M C Nucleic Acids Res 31 3381 3385 2003 Silva S D Cosnier S Almeida M G Moura J J G Electrochem Commun 6 404 408 2004 Silveira C M Besson S Moura I Moura J J G Alme
92. a figura 1 26 a cd NiR apresenta uma distribui o bastante homog nea de cargas na sua superf cie com uma clara preval ncia de res duos de natureza hidr foba e sem nenhuma zona nitidamente positiva que justifique a interac o electrost tica a uma superf cie carregada negativamente como o caso da SAM de MUA Salienta se ainda o facto de que a natureza exacta em termos de carga superficial da superf cie modificada n o foi determinada Este par metro importante porque o pKa do MUA enquanto composto isolado 6 5 carece de validade quando este se encontra organizado numa SAM covalentemente ligado superf cie de um el ctrodo polarizado 64 1 4 6 2 Estudo do Comportamento Electroqu mico da cd NiR Adsorvida num El ctrodo modificado com uma SAM de MUA Uma vez seleccionado o modificador de superf cie foram realizados ensaios voltam tricos com velocidades de varrimento v compreendidas entre os 5 e os 1000 Vs numa gama de pH de 5 a 9 Voltamogramas c clicos obtidos em parte destas condi es s o apresentados na figura I 36 Estes voltamogramagras c clicos demonstram que de um modo geral o comportamento da enzima neste sistema electroqu mico fortemente condicionado pelas condi es de v e sobretudo de pH do electr lito de suporte Assim verifica se que a pH 5 ocorre uma redu o praticamente irrevers vel mas o aumento de pH promove o surgimento de um pico de oxida o O pico de redu o observado
93. a prote na de Ps aeruginosa De modo a proceder amplia o selectiva dos modos vibracionais pertencentes ao hemo dr realizou se a excita o a 647nm que est em resson ncia com as bandas electr nicas 630 640nm que conduziu obten o dos espectros RR apresentados na figura 1 47 A 11 0004 E cdl LT ox 3s E cdl LT r 1s bc be 10 500 10 og 9 e 9 og 8 Send 8 A 7 a 7 A 5 m 5 a 5 5007 intensidade 5 0007 1 a 4 0004 3 P 3 ge 2 ee 2 i 1 a 1 ma 500 f i f d f i I I I j j 1250 1300 1350 1400 1450 1500 1550 1600 1650 a u 79 I 1700 B E Wcdl LT ox 15s bc 20 0003 CH ed1 ET r 10s be 19 000 18 o 17 aoi 16 i 15 e 14 a 13 ax 12 oi 11 m 10 000 7 intensidade 9 000 8 a 7 axe 6 i 5 ge 4 ee 3 ee H nd 1 0007 T T T T T T 850 900 950 1 000 1050 1100 1150 1200 a u Fig 1 47 Espectros RR da cd NiR adquiridos com excita o a 647nm A Regi o de altas frequ ncias 1230 1700 cm B Regi o de baixas frequ ncias 850 1240 em Em ambos os espectros as linhas superiores representam a prote na no estado oxidado e as linhas inferiores no estado reduzido Como se pode observar nas imagens da figura 1 47 os espectros RR obtidos por excita o a este comprimento de onda s o bastante complexos Tal deve se ao reduzido grau de simetria da clorina tanto na forma oxid
94. a um mediador electr nico e ou aumentar a actividade da enzima Um outro aspecto muito interessante para explorar seria a possibilidade de aplicar a SIRHP de E coli como elemento de reconhecimento biol gico num biossensor de sulfitos Esta prote na na sua forma monom rica apresenta dimens es substancialmente mais reduzidas que a Dsv o seu centro activo encontra se bem mais exposto ver figura II 6 sendo activa nesta forma Siegel amp Davis 1974 com uma cin tica de reac o para o sulfito incomparavelmente mais r pida K a Km 3 6 x 10 e M s hemo Siegel et al 1982 N o menos aliciante o facto de ser uma excelente candidata realiza o de uma caracteriza o electroqu mica exaustiva pois n o se encontra na literatura quaisquer refer ncias a trabalhos desse g nero com esta enzima 153 II 6 Refer ncias Bibliogr ficas Abass A K Hart J P Cowell D Sensor Actuat B Chem 62 148 153 2000 Akagi J M Biochem Biophys Res Commun 117 530 535 1983 Akagi J M In L L Barton Ed Sulfate Reducing Bacteria Plenum Press New York 1995 Altschul S F Madden T L Schaffer A A Zhang J Zhang Z Miller W Lipman D J Nucleic Acids Res 25 3389 3402 1997 Andrusier N Nussinov R Wolfson H J Proteins 69 139 159 2007 AOAC International 11 11 2010 http www eoma aoac org Ara jo A N Couto C M C M Lima J L F C Montenegro M C B S M J Agric Food Chem 46 168 1
95. abela II 2 M todos para determina o de sulfitos ue Tabela II 3 Principais caracter sticas dos biossensores propostos para determina o de SUILIGOS mS Tabela II 4 Mediadores electroqu micos utilizados neste trabalho Tabela II 5 Alinhamento das sequ ncias de res duos de amino cidos correspondentes ao N terminal de cada subunidade da Dsv de diferentes esp cies pertencentes ao g nero DeosulTOVIDELO eas eae ue yan NOE ONN NN equi Caos ssa PIU M SU Tabela II 6 Massa molecular da desulfoviridina de D desulfuricans ATCC 27714 Tabela II 7 Propor o relativa entre as subunidades da desulfoviridina Tabela II 8 Picos de absor o do espectro UV Vis e absortividade molar da desulfoviridina de D desulfuricans ATCC 277714 ENEE eee nennen rece cer ada XVII 15 34 41 45 48 62 71 79 96 100 102 118 128 130 131 Tabela II 9 Graus de identidade Ident e similaridade Simil calculados em termos de percentagem encontrados entre a sequ ncia de res duos de aa da Dsv de D desulfuricans ATCC 27774 e as sequ ncias das restantes prote nas ccccccccccccccsecccccccccccccccsccceecs 136 XVIII Abreviaturas D lt TO ud A2g0nm aa AB ABH ADN AFM AM AOAC AQS aSiR ATCC BATF BCA BSA CAPS CAPSO Cat CCD ccNiR cd NiR s CIDETEC cit c cit c 522 CPSPEs Cs CuNiR
96. ada como na forma reduzida da enzima Foi contudo poss vel identificar diversas bandas sens veis ao estado de oxida o as quais ir o permitir a an lise de espectros SERR dependentes do potencial num futuro pr ximo As bandas marcadoras redox mais proeminentes s o para a forma oxidada a 1228 1244 1283 1357 1548 e 1600 cm e para a forma reduzida a 1344 1352 1389 e 1608 cm 4 6 5 2 Resson ncia Raman Amplificada por Superf cie A imobiliza o da prote na num el ctrodo de Ag e subsequente realiza o de uma titula o potenciom trica seguida por SERR permitiu a obten o de resultados que embora preliminares podem por m ser considerados bastante promissores 80 As diferentes condi es de imobiliza o testadas falharam ao n vel da estabilidade impossibilitando a realiza o de medi es completas Na maioria dos casos a prote na encontrava se imobilizada mas inactiva do ponto de vista redox ou ent o desadsorvia rapidamente uma vez iniciado o processo de titula o potenciom trica A imobiliza o por deposi o em el ctrodos revestidos com camadas de surfactante ou cido c lico conduziu obten o de espectros redox revers veis contudo apenas numa janela de potencial reduzida Atendo a que neste tipo de abordagem n o poss vel controlar quer a orienta o da cd NiR quer a espessura da camada de prote na foi necess ria a aplica o de sobrepotenciais elevados e como conseq
97. ados numa janela de potencial entre 0 4 V e 0 4 V vs SCE a uma velocidade de varrimento de 20 mVs tendo sido realizados 10 varrimentos para cada ensaio Os ensaios foram realizados numa c lula electroqu mica com uma configura o cl ssica de tr s el ctrodos recorrendo a uma solu o tamp o 0 05 mM MES pH 6 3 n o desarejada como electr lito de suporte I 3 3 4 5 Ensaios com El ctrodos Modificados com SAMs Mistas Para cada uma das diferentes prepara es o el ctrodo de Au foi mergulhado numa solu o contendo diferentes propor es de MUA e MUNE ou MUA e MUOH de acordo com os dados da tabela 1 3 onde permaneceu durante 1 hora temperatura ambiente Passado esse per odo o el ctrodo foi lavado com etanol e seco sob uma corrente de ar comprimido Em seguida foi colocada a cd NiR 375 uM em 50 mM Tris HCl pH 7 6 sobre a superf cie de Au e permitiu se que esta secasse ao ar Imediatamente antes de se realizarem os ensaios o el ctrodo foi mergulhado em solu o de electr lito de suporte de forma a remover o excesso de prote na A caracteriza o do el ctrodo modificado foi realizada por voltametria c clica numa janela de potencial entre 0 5 V e 0 5 V vs SCE a uma velocidade de varrimento de 20 mVs Os ensaios foram realizados numa c lula electroqu mica com uma configura o cl ssica de tr s el ctrodos recorrendo a solu o tamp o 0 05 mM MES pH 6 3 como electr lito de suporte A actividade cat
98. ados resultam do c lculo do valor m dio do Rf de cada prote na padr o em fun o do logaritmo da sua massa molecular A recta apresenta um declive de 0 7701 ordenada na origem de 1 6656 e coeficiente de correla o 0 9911 As barras de erro representam o desvio padr o A massa molecular das subunidades da Dsv determinada para um intervalo de confian a de 95 assim como a valida o dos resultados obtidos por compara o com os valores te ricos calculados com base na sequ ncia de res duos de amio cidos da prote na de D desulfuricans ATCC 27774 encontram se registados na tabela II 6 Concluiu se assim que as massas moleculares determinadas se encontram muito pr ximas dos valores calculados com base na sequ ncia de res duos de amino cidos apresentando somente uma ligeira sobre estima o nas subunidades de maiores dimens es para a qual poder ter contribu do a presen a dos co factores que n o se encontra contabilizada na determina o te rica Tabela II 6 Massa molecular da desulfoviridina de D desulfuricans ATCC 27774 Subunidade Valores Experimentais kDa Valores Te ricos kDa Prote na Nativa 42 550 11 923 Multimero a p y 207 27 130 A elevada sensibilidade da colora o com nitrato de prata permitiu visualizar duas bandas entre os 30 e 40 kDa cuja presen a n o foi poss vel detectar nos g is corados com Azul de Coomasie Atendendo sua natureza vestigial n o foi poss v
99. ais claros ao d cimo varrimento A El ctrodo de trabalho modificado com SAM de MUA B El ctrodo de trabalho modificado com SAM de MUA e com cd NiR adsorvida na superf cie 67 A percep o da exist ncia ou n o de correntes de redu o de natureza catal tica foi dificultada pelo sinal de redu o directa do oxig nio molecular o qual surge a partir dos O mV vs NHE A compara o entre a varia o da intensidade de corrente gerada no ponto de invers o ao longo do tempo para o el ctrodo modificado com a SAM de MUA na presen a e na aus ncia de cd NIR adsorvida foi ent o realizada com o intuito de esclarecer esta d vida Os resultados deste estudo encontram se representados na figura 1 38 I nA 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Tempo s Fig I 38 Varia o da intensidade de corrente medida no ponto de invers o em fun o do tempo Voltamogramas tra ados a 20 mVs em 50 mM MES pH 6 3 com 150 mM KCL na presen a de oxig nio dissolvido solu es n o desarejadas A Controlo el ctrodo de trabalho modificado com SAM de MUA y 0 0090x 29 582 R 0 984 m Ensaio el ctrodo de trabalho modificado com SAM de MUA e cd NIR adsorvida y 0 0088x 29 805 R 0 994 Os resultados representados no gr fico da figura 1 38 demonstram que as rectas obtidas no controlo sem prote na e no ensaio s o praticamente coincidentes Tal indica que apenas ocorreu a redu o directa no el ctrodo de trab
100. al foram tra ados os espectros UV Vis de cada uma das prote nas encapsuladas na matriz de PVA individual e conjuntamente Por m a pr pria matriz absorve radia o vis vel at 400 nm impossibilitando uma correcta visualiza o da banda de absor o mais importante dos grupos h micos a banda de Soret 410 nm Assim os resultados obtidos foram inconclusivos Por m atendendo a que o potencial de redu o do cit c55 quando aprisionado muito semelhante ao registado para a prote na em solu o e que a cd NiR permanece activo na forma imobilizada inferiu se que a existirem altera es conformacionais nas prote nas induzidas pelo PVA estas n o afectar o de forma significativa os comportamentos electroqu mico catal tico de ambas O decr scimo significativo verificado para a constante de velocidade de 2 ordem poder assim resultar de uma diminui o na efici ncia da transfer ncia electr nica entre o mediador e a enzima resultante da significativa redu o da mobilidade que adv m do aprisionamento 1 4 5 2 Resposta a Nitrito As medi es amperom tricas para a calibra o do bioel ctrodo foram realizadas a 0 1V vs o el ctrodo de refer ncia incorporado o que corresponde a 0 202 V vs NHE um valor ligeiramente inferior ao potencial do pico cat dico do mediador A resposta amperom trica ap s adi o de NO atingiu patamares de corrente em intervalos de tempo compreendidos entre os 50 e os 100 segundos com l
101. al tica da cd NiR para nitrito quando adsorvido nas SAMs mistas foi testada por adi o ao electr lito de suporte de 1 mM de NaNO antes de se proceder ao inicio da aquisi o de dados 40 Tabela I 3 Composi o das solu es de ti is mistas utilizadas na modifica o da superf cie dos el ctrodos de ouro com monocamadas automontadas MUA mM MUNE mM MUOH mM 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 3 3 5 Espectroscopia de Resson ncia Ramman As amostras de prote na nativa 150 uM em 50 mM tamp o Tris HCl pH 7 6 foram inseridas na c lula de quartzo girat ria e submetidas a excita o com as linhas de 413 nm ou 647 nm Os espectros RR da enzima foram medidos com uma pot ncia de laser compreendida entre 2 a 8 mW e tempos de acumula o de 60 segundos As medi es com a prote na reduzida foram realizadas ap s a adi o de ascorbato solu o Todos os espectros apresentados correspondem m dia de 8 aquisi es 1 3 3 6 Resson ncia Ramman Amplificada por Superf cie Os el ctrodos anelares de prata cujas superf cies foram polidas e contundidas de acordo com protocolos publicados foram revestidos com SAMs de MUA ou Cs por incuba o durante 12 horas em solu es alco licas mM dos ti is Procedeu se igualmente ao revestimento de el ctrodos de Ag com surfactantes a partir dos detergentes dissolvidos numa solu o tamp o por adsor o espont nea Os discos de Ag revesti
102. alho do oxig nio molecular dissolvido no electr lito de suporte sem que a reac o fosse catalisada pela cd NiR Na aus ncia de cat lise para ambos os substratos estudados nitrito e oxig nio procedeu se ent o ao estudo do sistema electroqu mico apresentado na aus ncia de substrato A complexidade deste conduziu necessidade de assumir pressupostos os quais foram sujeitos a verifica o atrav s da an lise que se segue 68 4 6 2 1 Electr es Transferidos e Adsor o Tal como foi referido anteriormente a varia o do sinal electroqu mico produzido pela prote na traduzida pelas altera es do primeiro para o segundo ciclos de varrimento e subsequente perda de sinal conduziu necessidade de efectuar as experi ncias de forma independente Ou seja para cada uma das condi es de v e pH foi preparado um novo el ctrodo de trabalho Assim o tratamento dos resultados obtidos s foi poss vel procedendo normaliza o dos mesmos Assumindo que a cd NiR se encontra adsorvida na superf cie do el ctrodo modificado via interac o electrost tica o sistema foi tratado de acordo com as equa es que regem a voltametria c clica de prote nas adsorvidas De acordo com as previs es deste modelo os voltamogramas c clicos deveriam apresentar picos de redu o e oxida o sim tricos com valores absolutos iguais quer na intensidade quer no potencial dos picos Ou seja Ipa Ilpcl e Epa lEpcl E Nestas
103. alibrac o para a determinac o da massa molecular da Dsv nativa Os resultados foram obtidos numa coluna pr empacotada Superdex 200 HR 10 30 equilibrada com 100 mM NaCl em 50 mM tamp o Tris HCl pH 7 6 tamb m utilizado como eluente com um fluxo de 0 5 ml min Os pontos representados resultam do c lculo do valor m dio do Kav de cada prote na padr o em fun o do logaritmo da sua massa molecular A recta apresenta um declive de 0 2763 uma ordenada na origem de 1 7782 e um coeficiente de correla o de 0 9906 As barras de erro representam o desvio padr o A massa molecular da desulfoviridina de D desulfuricans ATCC 27774 no estado nativo assim estabelecida de 209 3 kDa para um intervalo de confian a de 95 N o tendo sido poss vel proceder desnatura o da prote na de forma a determinar a massa molecular das subunidades por m todos cromatogr ficos estas foram determinadas por electroforese desnaturante a partir de g is cujos resultados se encontram na figura II 18A 129 A a b o P 118 wa 12 121 100 2 544 SG 5 0 8 c mm ss Q Ge 0 6 38 7 29 8 40 0 4 n 20 e 0 2 1440008 1 a Frente de Migrac o 0 7 1 1 3 1 6 1 9 2 2 logio MM Fig 11 18 Determina o da massa molecular das subunidades da Dsv A Gel SDS PAGE a 12 5 corado com nitrato de prata Linhas a e b marcadores de massa molecular Linha c Dsv B Recta de calibra o Os pontos represent
104. aman senai Dea Que a DIO s nte edad Colas tue edu olus 76 I 4 6 5 1 Espectroscopia de Resson ncia Raman ssss 76 I 4 6 5 2 Resson ncia Raman Amplificada por Superf cie 80 L5 Conchisoes e Perspectivas uen oec v sis sas iex rine odd aan Li 83 L6 Referencias Bibliogr ficas sus oio ax Ee uote eoa netu er IRR GENEE ese EAS E Pad eeu VS 5 I 7 Bases de Dados e Programas Inform ticos de Livre Utiliza o 92 PARTE II Desulfoviridina de Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774 Isolamento Caracteriza o e Desenvolvimento de um Biossensor Electroqu mico para Determina o de Sulfito IET ODIeCUVOS assis au a qui do o pod de Us ERAT VS 93 M Introdu o Geral saias dad EA o LOTE paga e 93 NP e 93 II 2 1 1 Breve Caracteriza o Qu mica das Esp cies de Enxofre 93 US Aplica es ANGUISH AIS ue iue deci insere as Ra dna a a 95 H21 FEto n3 Saude sanada VERE Ceia DEE OAB Rip ai sa 97 ILLA Normas de Aplica o EE 98 2 5 M todos de Quanttte Q6 E 99 JI 2 2 Redut ses do Sulfito ii scssssssccssessccsescccssssscescsssuasscsnssovecessenacecssssesscscnsscvcssseeseesecss 104 1 2 2 1 Redutases do Sulfito Assimilativas cc cccce sees ee eeeeeeeeeeeeeeeeues 106 1 2 2 2 Redutases do Sulfito Dissimilativas 0 0 cece cece cece cece cece eee e eens 108 225 Desullovin CINE samira ii sa q ss ae d sad 109 IE2 2 5 1 Caracteriza o ESttututa
105. amas da figura 11 35 151 I uA c e amp YN c N BA c Ke gt 0 40 0 35 0 30 0 25 0 20 0 15 0 10 0 05 Potencial V vs NHE Fig 11 35 Ensaios com enzima na presen a do mediador fenosafranina Voltamogramas c clicos tracados a pH 5 5 com 375pmol de Dsv aprisionada na superf cie do GCE com uma membrana de di lise I mM de Fs em solu o e concentra es crescentes de sulfito O mM 1 mM 10 mM 20 mM Tamb m nesta situa o se verifica que o mediador Fs n o adequado aplica o num biossensor baseado na actividade da Dsv dado que n o foram observadas correntes electrocatal ticas na presen a de substrato Na sec o 1 4 2 3 foi equacionada a possibilidade de a enzima n o se encontrar activa por aus ncia de co factores podendo ser esse o motivo para a aus ncia de cat lise Por m salienta se tamb m o facto de a Fs ser de entre os mediadores testados aquela que apresenta o potencial de redu o mais elevado 0 255 V o qual poder n o ser suficiente para reduzir a Dsv EI z 298 mV vs NHE E z 620 mV vs NHE Lui amp Cowan 1994 mesmo que a prote na se encontre ntegra II 5 Conclus es e Perspectivas A realiza o deste trabalho permitiu concluir que o novo procedimento de purifica o proposto para isolar a redutase do sulfito dissimilat ria desulfoviridina proveniente da bact ria Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774 permitiu a obten o
106. as de acordo com o tipo de aplica o espec fica pela FDA Food and Drug Administration USDA United States Department of Agriculture BATF Bureau of Alcohol Tobacoo and Firearms e EPA Environmental Protection Agency Actualmente a FDA pro be a utiliza o de sulfitos em carnes alimentos reconhecidos como fontes primordiais de vitamina B 1 e frutas ou vegetais destinados a ser consumidos em cru Quanto aos alimentos processados tornou se obrigat ria a declara o de presen a de sulfitos no r tulo desde que se encontrem numa quantidade detect vel definida como 10 ppm FDA 21CFR Na Europa s o essencialmente dois os documentos que legislam a utiliza o deste tipo de aditivos A Directiva Comunit ria n 95 2 CE relativa aos aditivos alimentares com excep o dos corantes e dos edulcorantes e o Regulamento CE n 606 2009 que estabelece regras de execu o no que respeita s categorias de produtos vitivin colas s pr ticas enol gicas e s restri es que lhes s o aplic veis Na Directiva Comunit ria o di xido de enxofre e sulfitos aditivos a que foram atribu dos os c digos entre E220 e E228 s o classificados como Conservantes e Antioxidantes Autorizados sob Determinadas Condi es encontrando se exaustivamente listados os alimentos nos quais permitido o seu emprego bem como os limites m ximos permitidos para cada tipo de produto 10 a 2000 ppm Os teores m ximos s o expressos em equivalentes de
107. as a n vel dos hemos na redu o da cd NiR de Paracoccus pantotrophus Devido amplitude das modifica es estruturais encontradas considerou se na altura que a Tyr25 teria um papel preponderante quer na estabiliza o desses co factores com a sua sa da a promover o rearranjo na coordena o do hemo c quer na cat lise possibilitando o acesso do substrato ao centro activo e impedindo a forma o do intermedi rio d Fe NO um aducto extremamente est vel que poderia conduzir inactiva o da enzima e vulgarmente conhecido por dead end product Por m trabalhos subsequentes realizados com mutantes nos quais o res duo Tyr25 n o se encontrava presente vieram mostrar que a altera o na coordena o axial do hemo c para His Met mediante redu o ocorre independentemente da presen a da Tyr25 na sexta posi o de coordena o do hemo d e que a enzima continua activa enquanto redutase do nitrito mesmo na aus ncia deste res duo nas imedia es do centro activo Gordon et al 2003 Por m foi igualmente demonstrado que a troca de ligandos que ocorre no hemo c fundamental para o correcto funcionamento do ciclo catal tico com a cria o de um mutante no qual a Met106 foi substitu da por uma His a ser incapaz de libertar o NO formado Zajicek et al 2006 Inicialmente foi tamb m proposto que a prote na deveria estar totalmente reduzida para permitir a liga o ao substrato e que s nesse caso ocorreria cat lise R
108. as relativamente capacidade do nitrito para formar compostos carcinog nicos N nitroso NOCs atrav s de reac es com aminas secund rias Lijinsky 1999 Larsson et al 2006 Embora esteja comprovado que muitos NOCs s o genot xicos em modelos animais ainda n o se encontra provada de forma inequ voca a exist ncia de uma rela o directa entre o consumo de nitratos nitritos e o risco de cancro Hord et al 2009 Independentemente da controv rsia que envolve este tema a informa o produzida pela vigil ncia anal tica do teor de nitritos em matrizes alimentares fundamental para a gest o dos riscos para a sa de 1 2 1 4 Regulamenta o A quest o da toxicidade dos nitratos nitritos conduziu implementa o de regras que visam restringir os teores destes ides em guas pot veis e produtos alimentares A Directiva Europeia 98 83 EC estabelece que os n veis m ximos admitidos em gua pot vel de nitrato e nitrito s o respectivamente 50 e 0 1 ppm A Organiza o Mundial de Sa de WHO SDE WSH 07 01 16 estabeleceu para o nitrato um limite semelhante permitindo contudo um limite de 3 ppm para o teor em nitrito A recente directiva comunit ria 2006 52 EC veio implementar uma redu o nos n veis de nitrato e nitrito autorizados em certos produtos alimentares os quais passam a ser quantificados com base na quantidade adicionada ao produto em substitui o da usual determina o da quantidade residual Como exemplo
109. asy Swiss Institute of Bioinformatics A propor o relativa entre as subunidades da enzima foi determinada por an lise densiom trica realizada atrav s do software Kodak 1D 3 6 II 3 4 2 Estruturas II 3 4 2 Determina o da Estrutura Prim ria O alinhamento das sequ ncias gen ticas respeitantes codifica o das tr s subunidades da Dsv provenientes de Desulfovibrio vulgaris Hildenborough Desulfovibrio desulfuricans G20 e Desulfovibrio desulfuricans Essex 6 foi realizado atrav s do software de alinhamento de m ltiplas sequ ncias ClustalW 1 81 O processamento dos resultados obtidos foi efectuado com recurso aos seguintes programas inform ticos reverso complementar dos fragmentos backward pelo Reverse Complement alinhamento das sequ ncias forward e backward atrav s do ClustalW e tradu o da sequ ncia gen tica pelo Translate tool dispon vel no Website ExPasy A avalia o da sequ ncia de res duos de amino cidos foi realizada por compara o com as sequ ncias traduzidas das sequ ncias gen ticas da Dsv de D desulfuricans ATCC 27774 Lucas et al 2009 UmProtKB Swiss Prot B8J4RO BSIZAO B8J2P4 D vulgaris Hildenborough Heidelberg et al 2004 UniProtK B Swiss Prot P45574 P45575 P45573 D desulfuricans G20 Copeland er al 2005 UniProtK B Swiss Prot Q315R9 Q315R8 Q314T3 e Archaeoglobus fulgidus Klenk et al 1997 UmProtKB Swiss Prot Q59109 059110 028055 Os alinhamentos foram
110. aumann L Baumann P Mandel M Allen R D J Bacteriol 110 402 429 1972 Besson S Carneiro C Moura J J G Moura I Fauque G Anaerobe 1 219 226 1995 Bigelow W C Pickett D L Zisman W A J Colloid Interface Sci 1 513 538 1946 Blair E Sulc F Farmer P J In Zagal J H Bedioui F Dodelet J P Eds N4 macrocyclic metal complexes Ist ed Springer New York USA pp 149 181 2006 Brittain T Blackmore R Greenwood C Thomson A J Eur J Biochem 209 793 802 1992 Bryan N S Fernandez B O Bauer S M Garcia Saura M F Milsom A B Rassaf T Maloney R E Bharti A Rodriguez J Feelisch M Nat Chem Biol 1 290 297 2005 Bryan N S Grisham M B Free Radic Biol Med 43 645 657 2007 Brown K Nurizzo D Cambillau C J Mol Biol 289 1017 1028 1999 Brown K Roig Zamboni V Cutruzzola F Arese M Sun W Brunori M Cambillau C Tegoni M J Mol Biol 312 541 554 2001 Camargo J A Alonso A Environ Int 32 831 849 2006 85 Centola F Rinaldo S Brunori M Cutruzzol F FEBS J 273 4495 4503 2006 Chaubey A Malhotra B D Biosens Bioelectron 17 441 456 2002 Chen H Mousty C Chen L Cosnier S Mat Sci Eng C 28 726 730 2008 Chen H Mousty C Cosnier S Silveira C Moura J J G Almeida M G Electrochem Commun 9 2241 2246 2007 Chen Q Ai S Zhu X Yin H Ma Q Qiu Y Biosens Bioelectron 24 2991 2996 2009 Cooper C E Biochim
111. c lculo directo com base no espectro de absor o UV Vis apresentado na figura 11 15 sendo que os tr s m todos produziram resultados semelhantes Uma outra hip tese consiste na perda de co factores no decurso da purifica o facto que poder igualmente explicar a fraca actividade anteriormente reportada para esta enzima A forma de testar esta hip tese passaria pela resolu o da estrutura tridimensional da prote na utilizada neste trabalho 1 4 3 Sequ ncias de Res duos de Amino cidos A sequ ncia de res duos de amino cidos da Dsv de D desulfuricans ATCC 27774 foi determinada atrav s da conjuga o dos dados obtidos por sequencia o qu mica da prote na purificada N terminal e p ptidos resultantes de digest o tr ptica e sequencia o de ADN fig 11 20 com posterior tradu o A conjuga o das sequ ncias obtidas atrav s de cada uma destas t cnicas conduziu obten o de 98 7 da sequ ncia da prote na 133 Fig 11 20 Fragmentos de ADN resultantes das reac es de PCR Imagens de g is de agarose a 1 contendo os produtos de PCR ap s purifica o e corados com SyBr A Fragmentos de ADN que codificam as subunidades a e p da Dsv B Fragmento de ADN que codifica a subunidade y da desulfoviridina comparadas com as sequ ncias depositadas por Lucas et al 2009 as quais derivam da tradu o do genoma da D desulfuricans ATCC 27774 Simultaneamente realizou se o alinhamento entre as seq
112. cd NiR indicam que esta prote na apresenta uma estrutura muito semelhante da prote na de Pseudomonas aeruginosa inclusivamente no que respeita ao modo de coordena o dos hemos Foi desenvolvido um biossensor electroqu mico espec fico para nitritos baseado num conceito inovador Pela primeira vez recorreu se ao parceiro fisiol gico de uma enzima para exercer o papel de mediador electr nico num sistema electroqu mico miniaturizado atrav s de um processo simples c lere e eficaz de modifica o de el ctrodos Embora este sensor apresente um limite de detec o superior a outros sistemas propostos na bibliografia dever ser particularmente adequado a aplica es em matrizes complexas nas quais s o esperados elevados teores de nitritos Ensaios futuros em amostras reais e ou materiais de refer ncia certificados dever o validar esta afirma o A adsor o da cd NiR numa superf cie de Au modificado com monocamadas automontadas SAMs permitiu alcan ar uma resposta electroqu mica directa da enzima Assim usando a t cnica de voltametria c clica foram observados pela primeira vez sinais n o catal ticos desta prote na Aparentemente a reac o de redu o envolve a transfer ncia de um electr o e de um prot o e seguida de uma reac o qu mica altera o estrutural de acordo com um mecanismo EC Por esse motivo o processo an dico quando visualizado n o dever representar a reac o inversa e a sua natureza
113. ci E Food Chem 63 275 279 1998 Pourbaix M J N Atlas of Electrochemical Equilibria in Aqueous Solution Ed J A Franklin 2 Ed National Association of Corrosion Engineering NACE Houston USA p 551 1974 Pournaghi Azar M H Hydarpour M Dastangoo H Anal Chim Acta 497 133 141 2003 Protein Electrophoresis technical manual 80 6013 88 Amersham Biosciences USA 1999 Raoof J B Ojani R Karimi Maleh H Int J Electrochem Sci 2 257 269 2007 Regulamento CE n 606 2009 Jornal Oficial da Uni o Europeia L193 1 59 24 07 2009 Rivas M G Carepo M S P Mota C S Korbas M Durand M C Lopes A T Brondino C D Pereira A S George G N Dolla A Moura J J G Moura I Biochemistry 48 873 882 2009 Saikia P M Kalita A Gohain B Sarma S Dutta R K Colloids Surf A 216 21 26 2003 Saleh F S Rahman M R Okajima T Mao L Ohsaka T Bioelectrochemistry 80 121 127 2011 Sayavedra Soto L A Montgomery M W J Food Sci 51 1531 1536 1986 Schedel M LeGall S Baldensperger J Arch Microbiol 105 339 341 1975 Schedel M Vanselow M Tr per H G Arch Microbiol 121 29 36 1979 Schiffer A Parey K Warkentin E Diederichs K Huber H Stetter K O Kroneck P M H Ermler U J Mol Biol 379 1063 1074 2008 Schneidman Duhovny D Inbar Y Nussinov R Wolfson H J Nucl Acids Res 33 W363 367 2005 A Schneidman Duhovny D Inbar Y Nussinov R Wolfson
114. cial V vs NHE B 0 06 004 H amp 0 02 Q Sam 5 0 00 S o 0 02 E q 0 04 E 9 MUNE E 0 06 0 08 0 30 0 10 0 10 0 30 0 50 0 70 0 90 Potencial V vs NHE Fig 1 44 El ctrodos modificados com SAMs mistas Voltamogramas c clicos tra ados a 20mVs em 50 mM tamp o MES pH 6 3 com 150mM KCI A El ctrodo de trabalho de Au modificado com SAMs mistas de MUA e MUOH A grada o de cor indica a varia o na percentagem de MUOH correspondendo o negro a 0 MUOH e o cinzento mais claro a 100 MUOH B El ctrodo de trabalho de Au modificado com SAMs mistas de MUA e MUNE A grada o de cor indica a varia o na percentagem de MUNE correspondendo o negro a 0 MUNE e o cinzento mais claro a 100 MUNE 75 A irreversibilidade do processo electroqu mico e a aus ncia de cat lise em todas as condi es testadas s o factores que apontam para a ocorr ncia de modifica es conformacionais na enzima provavelmente decorrentes da sua interac o com a SAM de MUA Uma vez que as t cnicas electroqu micas cl ssicas n o possibilitam a aquisi o de dados suficientes para clarificar este ponto recorreu se Espectroscopia de Resson ncia Raman RR Raman Ressonance como forma de atestar a integridade estrutural da cd NiR em solu o bem como esclarecer a natureza e implica es da interac o entre a prote na e o modificador de superf cie atrav s de Resson ncia Raman Amplificada por Superf cie SERR Surface Enhanc
115. condi es a largura a meia altura dos picos Wi seria de 90 6 n mV a 25 C sendo n o n meros de electr es transferidos Assumindo que AEp 0 considera se que o potencial formal da esp cie consiste no valor m dio entre os potenciais de pico Ainda de acordo com o mesmo modelo o valor do integral para cada pico corresponde carga Q Por aplica o da lei de Faraday eq 1 12 onde I a cobertura concentra o total de esp cie electroactiva na superf cie em molcm A a rea do el ctrodo em cm F a constante de Faraday 96 487 Cmol e n o n mero de electr es transferidos poss vel determinar o valor de I Q nFAT 1 12 Num sistema ideal a corrente de pico revers vel Ip para um filme fino electroactivo revers vel aplicado num el ctrodo directamente proporcional a v de acordo com a equa o1 13 onde R a constante dos gases perfeitos e T a temperatura em Kelvin Ip n F AIv ART 1 13 Assim o quociente entre o valor da corrente gerada no pico e a cobertura produz a normaliza o necess ria ao tratamento dos resultados sendo que para tal se torna necess ria a determina o pr via do n mero de electr es transferidos 69 Para o sistema em estudo foi obtido um valor m dio de Wio para o pico cat dico de 173 21 mV o qual representa um desvio de cerca de 80 mV relativamente ao valor teorizado pelo modelo para a transfer ncia de um electr o Tal como foi referido anteriorme
116. condicionado por uma s rie de factores estruturais e funcionais inerentes prote na A um controlo alost reo do processo de redu o com a distribui o sequencial dos electr es recebidos atrav s dos quatro centros redox do d mero alia se o enfraquecimento da liga o Fe NO produzido quer pela diminui o de densidade electr nica ao tomo de Fe resultante da estrutura do pr prio hemo d quer pela cria o de pontes de hidrog nio com o NO em consequ ncia da presen a dos res duos de His nas imedia es do centro activo 1 2 4 6 Parceiros Fisiol gicos A cat lise de reac es de redu o pressup e a redu o pr via da enzima envolvida no processo Para esse efeito necess ria a presen a de um agente redutor capaz de transferir electr es para a prote na Os parceiros fisiol gicos s o assim os agentes redutores que in vivo fornecem enzima os electr es necess rios para completar o ciclo catal tico tratando se frequentemente de outras prote nas ou complexos proteicos Os parceiros fisiol gicos das cd NiR s o pequenos transportadores de electr es cuja fun o consiste em transferir electr es para o hemo c Dependendo do organismo pertencem classe das cupradoxinas ou citocromos de tipo c 30 O parceiro fisiol gico da prote na de Paracoccus pantotrophus a pseudoazurina Zajicek et al 2006 Sam et al 2008 a enzima de Pseudomonas aeruginosa tem por parceiro o citocromo css
117. consistiu na optimiza o do sistema de imobiliza o nomeadamente no que respeita raz o enzima mediador percentagem de PVA e tempo de polimeriza o tendo este trabalho sido realizado em el ctrodos de trabalho de grafite pirol tica PGE Jorge 2011 Uma vez estabelecidos esses par metros o sistema foi aplicado em CPSPEs procedendo se ent o ao seu estudo I 4 5 1 Caracteriza o Electroqu mica do cit c552 Co Imobilizado com a cd NiR na Matriz Polim rica De forma a avaliar a poss vel influ ncia da matriz de PVA no perfil voltam trico do cit css2 procedeu se compara o dos sinais produzidos pelo mediador quando imobilizado na matriz de forma isolada co imobilizado na matriz conjuntamente com a cdjNiR e co aprisionado com a enzima num PGE atrav s de uma membrana de di lise Na figura 1 29 encontra se a sobreposi o dos voltamogramas c clicos obtidos 53 Intensidade de Corrente uA 0 20 0 05 0 10 0 25 0 40 0 55 0 70 Potencial V vs NHE Fig 1 29 Efeitos do encapsulamento Voltamogramas c clicos tra ados em CPSPE com 100 uM cit c552 encapsulado numa matriz constiu da por PVA a 50 48 horas de fotopolimeriza o na aus ncia linha a cheio e na presen a linha a tracejado de 100 uM cd NiR A linha picotada representa um voltamograma c clico tra ado com 100 uM cit cs52e 100 uM cdj NiR co aprisionados por uma membrana de di lise na superf cie de um PGE Todos os ensaios foram reali
118. coulombiano uma boa aproxima o ao potencial electrost tico da superf cie da enzima n o existindo diferen as significativas entre os mapas produzidos por ambas as formas Estes mapas ser o utilizados nas sec es seguintes para a discuss o dos resultados obtidos 1 4 4 Cristalografia de Raios X Com o objectivo final de resolver a estrutura cristalogr fica da cd NIR de M hydrocarb atrav s da t cnica de difrac o de raios X foram realizadas experi ncias preliminares de cristaliza o para esta prote na Assim da ampla gama de condi es de cristaliza o testadas foi poss vel a obten o de cristais em forma de ouri o da cdjNiR na sua forma nativa cuja fotografia se apresenta na figura 1 27 51 Fig 1 27 Fotografia de cristais de cd NiR de M hydrocarb na forma nativa Os melhores cristais foram obtidos ao fim de 7 dias a 20 C com uma concentra o total de prote na na gota de 11 5 mem 93 75 uM por exposi o a uma solu o precipitante composta por 20 PEG 4000 100 mM tamp o MES pH 6 5 e 600 mM NaCl Contudo n o possu am a qualidade necess ria realiza o de ensaios de difrac o e n o obstante os esfor os empregues no aperfei oamento dos cristais tais tentativas foram at ao momento infrut feras I4 5 Constru o de um Biossensor Electroqu mico Espec fico para Nitritos Baseado na Co Imobiliza o da cd NiR com o seu Parceiro Fisiol gico cit c 552
119. cri o mesmo que sum ria tornar se ia demasiado extensa Por m existem diversos artigos de revis o com informa o detalhada dispon veis para consulta Ellis et al 1998 Moorcroft et al 2001 Dutt amp Davis 2002 Nussler et al 2002 Sun et al 2003 Tsikas 2005 2007 Pelletier et al 2006 Bryan amp Grisham 2007 Helmke amp Duncan 2007 As restric es impostas pela utilizac o de m todos cl ssicos de an lise conduziram ao desenvolvimento de novas ferramentas anal ticas os biossensores enzim ticos de nitritos Como consequ ncia directa da aplica o deste novo tipo de dispositivos observou se nos ltimos 15 anos um grande desenvolvimento na an lise de nitritos resultante essencialmente da utiliza o de enzimas redutoras de nitrito altamente selectivas activas e est veis isoladas a partir de fontes bacterianas Para al m de cumprirem com os requisitos de sensibilidade e selectividade da resposta anal tica os biossensores dever o cumprir ainda com as exig ncias cl ssicas de produ o e aplica o massivas nomeadamente facilidade e baixo custo de produ o miniaturizada indispens veis na convers o de um protocolo laboratorial longo e elaborado numa tarefa simples e de r pida execu o preferencialmente in situ Mais este tipo de ferramentas anal ticas livres de reagentes torna os biossensores para determina o de nitritos numa alternativa mais sustent vel do ponto de vista ambiental Os
120. ctroqu mica As solu es foram preparadas com gua desionizada dH20 18 MQcm obtida de um sistema de purifica o de gua MilliQ da Millipore O 4 morfolineetanosulfonato de s dio MES C H42NNaO4S 217 22 emol o tris hidroximetil aminometano Tris base CH 121 14 emol 799 906 e o etanol CH CH 0H 46 07 emol 96 s o da Sigma O sulfito de s dio Na S0s 126 04 emol 20896 foi adquirido Fluka O cloreto de pot ssio KCI 74 56 emol gt 99 5 foi fornecido pela Merck O cido clor drico HCl 36 46 emol 37 da Riedel deHa n As membranas de di lise limite de exclus o 3 500 Da s o da Spectra Por e a pasta de alumina foi adquirida Buehler Os mediadores electroqu micos artificiais encontram se descritos na tabela II 4 117 Tabela II 4 Mediadores electroqu micos utilizados neste trabalho Os dados apresentados foram recolhidos de The Merck Index 1999 excepto a Strehlitz et al 1994 b Mariotti et al 2006 e c Saleh et al 2011 Designa o DOC dicloreto de 1 1 dimetil 4 4 bipiridinio CioHi4 CloN violog nio de muito sol vel 440 a metilo violog nio de dicloreto de TU dibenzil 4 4 benzilo bipiridinio Ca Ha CEN 345 a 4 4 1 1 dioxido 3H 2 1 benzoxatiole 3 3 diil bis 2 6 C oH Br OsS 669 99 dibromofenol azul de bromofenol vermelho neutro MICE Oe OREO Ge anmo C 5H 7CIN dimetilamino 2 metilfenazina 325 a fenosafranina EE
121. da tendo sido tema de um recente artigo de revis o publicado por Paulinkaite et al 2010 Estes autores sugerem o mecanismo de polimeriza o para os compostos desta fam lia fig IL 29 que para o caso do VN pode ser obtido por via electroqu mica como se demonstra nos voltamogramas ciclicos da figura II 30 145 NH Se HN X NH NH HN HN NH Fig 11 29 Poss vel mecanismo da polimeriza o de azinas Paulinkaite et al 2010 i mA cm 0 5 0 5 0 0 E V vs SCE Fig 11 30 Electropolimerizac o do VN a partir de uma solu o contendo ImM de VN num electr lito de suporte a pH 5 5 Paulinkaite et al 2010 146 O perfil voltam trico observado no decurso dos ensaios com VN surpreendentemente semelhante aquele que ocorre aquando da electropolimeriza o deste composto levantando se por 1sso a hip tese de o di xido de enxofre presente na solu o actuar como agente oxidante em substitui o da oxida o electroqu mica que ocorre quando os varrimentos s o realizados at potenciais mais elevados A valida o de tal hip tese encontra se contudo para al m dos objectivos tra ados para este trabalho 1 4 5 4 Azul de Meldola NADH A utiliza o de azul de Meldola AM habitualmente associada tecnologia de el ctrodos screen printed constitiu uma estrat gia popular na constru o de biossensores electroqu micos para a detec o de NADH Vasilescu et al 2003 Tudorac
122. da banda correspondente ao fragmento de interesse de um gel de agarose a 2 Os fragmentos de ADN purificados foram entregues empresa STABvida para sequencia o 1 3 3 3 Electroqu mica Todos os ensaios electroqu micos foram realizados numa c lula com a configura o cl ssica de tr s el ctrodos Um el ctrodo de refer ncia saturado de calomelanos um contra electrodo de fio de platina e um el ctrodo de trabalho de carbono v treo Antes de cada utiliza o a superf cie dos el ctrodos de trabalho foi submetida a um procedimento de limpeza que consistiu no polimento com alumina de granulometria 0 3um lavagem sequencial com quantidades abundantes de dH O e EtOH imers o num banho de ultra sons durante 5 minutos e secagem sob uma corrente de ar comprimido 123 Todas as solu es de electr lito de suporte foram desarejadas com Argon por borbulhamento durante pelo menos 20 minutos antes da realiza o dos ensaios Os trabalhos foram efectuados em dois electr litos de suporte distintos 100mM KCI em 50mM Tris HCl pH 7 6 e 100 mM KCl em 50 mM MES pH 5 5 Os mediadores azul de bromofenol violog nio de metilo violog nio de benzilo fenosafranina e vermelho neutro foram dilu dos directamente nas solu es de electr lito a uma concentra o de 1 mM O par mediador azul de Meldola NADH foi tamb m directamente dilu do nas solu es tamp o para uma concentra o final de 0 5 mM 2 mM respectivamente Nos
123. da caracter stica de um hemo ferroso surgiu no espectro independentemente da pot ncia de laser ou do tempo de acumula o utilizados sendo que a sua Intensidade aumentava de forma proporcional com o aumento destes dois par metros Concluiu se assim que uma pequena popula o de enzima se encontra num estado foto reduzido e consequentemente todos os espectros apresentados representam um compromisso entre uma raz o sinal ru do razo vel e a tentativa de minimizar a foto redu o T1 48 000 362 1 46 0004 44 000 42 000 40 000 38 oe 36 0004 34 000 4 32 oo 30 0007 o 28000 c a C 260004 gt E Ub 24000 oo E J e 22 000 if er 20000 18 000 4 in 16 000 E S 14 000 e NS N 12 000 e ef M2 J n St a e Do 10 0004 A tn A Ca o e D E E 8 000 e e N 6 000 4 Si 4 0007 2 0007 0 T T T T H T 1 T T 1350 1400 1450 1500 1550 1600 1650 1700 a u Fig 1 46 Regi o de altas frequ ncias dos espectros de Resson ncia Raman da cd NiR ap s redu o com ascorbato Espectros adquiridos com 150 uM de prote na excita o a 413nm e 60 segundos de tempo de acumula o O modo v bem definido e sim trico que se observa nos espectros RR da enzima reduzida com ascorbato fig I 46 demonstra que a prote na foi totalmente reduzida Mais podem ainda ser identificadas nos espectros duas esp cies ferrosas distintas com ba
124. das da membrana periplasm tica sob a forma de multimeros de elevada massa molecular os quais englobam as subunidades NrfA 61 kDa e NrfH 19 kDa Almeida et al 2003 numa estequeometria NrfA NrfH fig I 1A Rodrigues et al 2006 O pequeno polip ptido hidr fobo NrfH o doador electr nico fisiol gico do NrfA Este ltimo alberga cinco hemos por mon mero acondicionados de forma compacta permitindo velocidades de transfer ncia electr nica intramolecular elevadas Com excep o do centro activo que possui uma lisina como quinto ligando de coordena o e a posi o axial dispon vel para ligar o substrato todos os restantes hemos s o do tipo c hexacoordenados Einsle et al 1999 Almeida et al 2003 Cunha et al 2003 Rodrigues et al 2006 O outro g nero de NiRs produtoras de am nia pertence fam lia das redutases do nitrito dependentes de ferredoxina usualmente isoladas de organismos fotossint ticos tais como plantas algas e cianobact rias Estas enzimas assimilativas s o constitu das por uma nica cadeia polipept dica 60 65 kDa composta por tr s dom nios envolvidos em torno de dois grupos prost ticos um sirohemo e um centro 4Fe4S ligados atrav s de uma liga o persulfureto sendo que o nitrito se liga ao sirohemo fig I 1B Kuznetsova et al 2004 Swamy et al 2005 Hirasawa et al 2010 Redutases Produtoras de xido N trico Dois g neros de NiRs dissimilativas catalisam a redu o nitr
125. de detec o de nitritos que estes bioel ctrodos apresentam foi considerada pela maioria dos autores como um a actividade catal tica secund ria sendo muitas vezes descrita de forma ex gua Outras prote nas utilizadas com o mesmo prop sito embora com menor frequ ncia s o a Catalase Cat de f gado bovino e a peroxidase de r bano HRP horseradish peroxidase Wu et al 2006 Liu et al 2009 O mecanismo proposto para a actividade catal tica observada com nitrito neste tipo de biossensor considera que na realidade a esp cie que interage com o centro activo das prote nas o xido n trico gerado pela reac o de desproporciona o do nitrito eq 1 1 Barley amp Meyer 1986 Younathan et al 1992 3NO H 0 o 2NO NO 20H 1 1 A grande maioria das prote nas h micas possui a capacidade para ligar e eventualmente reagir com o NO Cooper 1999 A forma dos voltamogramas c clicos obtidos pela ac o das prote nas imobilizadas na presen a ou aus ncia de nitrito pode ser explicada atrav s do mecanismo actualmente aceite para a redu o bioelectrocatal tica do NO e que pode ser descrito pela seguinte sequ ncia de equa es qu micas hemo Fe IID e hemo Fe ID 1 2 hemo Fe ID NO hemo Fe ID NO 1 3 2 hemo Fe II NO 2e 2H 2 hemo Fe ID H2O NO 1 4 Um sistema revers vel de dois picos localizado na gama 0 08 0 12 V vs NHE atribu do ao par redox Aemo Fe III Fe II eq 1 2
126. dor suficientemente robusto para n o sofrer desnatura o no decurso do processo esta abordagem permitiria aumentar a concentra o de ambas as prote nas no dispositivo com a matriz de PVA a funcionar como uma barreira f sica lixivia o do mediador e aumentado a sua capacidade de reten o da cd NiR Mas como evidente mais prote na n o garante necessariamente uma melhor resposta Uma outra hip tese passaria pela adi o de todos os elementos de modifica o enzima mediador e PVA pasta de carbono procedendo fotopolimeriza o da mistura em vez de recorrer a um processo t rmico Embora bastante atractiva do ponto de vista da produ o pois resultaria num dispositivo verdadeiramente integrado constru do num nico passo a optimiza o de um sistema deste tipo levanta diversas condicionantes experimentais sobretudo devido quantidade de factores a equacionar Por ltimo a aplica o do sistema desenvolvido n o em macroel ctrodos screen printed mas sim num sistema de micro array chip poderia amplificar a resposta do nitrito de forma a atingir limites de detec o inferiores No amperograma apresentado na figura I 31A est patente uma certa instabilidade nos valores de intensidade de corrente correspondentes resposta ao nitrito sendo mais pronunciada a concentra es elevadas de substrato Este fen meno encontra se relacionado com a forma utilizada para homogenizar a solu o ap s as adi es de
127. dos com a cd NiR nos estados f rrico nativo e ferroso ap s redu o com ascorbato encontram se nas figuras 1 45 e I 46 respectivamente Os espectros RR da cd NIR no estado nativo fig 1 45 obtidos com excita o a 413nm cont m contribui es dos dois hemos dado que os m ximos das bandas de Soret dos dois grupos h micos se sobrep em 16 Wr A 23 000 e intensidade L 1 a u Fig 1 45 Regi o de altas frequ ncias dos espectros de Resson ncia Raman da cd NiR no estado oxidado Espectros adquiridos com 150 uM de prote na excita o a 413nm e 60 segundos de tempo de acumula o A an lise da regi o de altas frequ ncias revela que o modo v3 que corresponde frequ ncia do estado de spin e estado de oxida o se encontra a 1504cm Esta observa o permite concluir directamente que ambos os hemos da prote na se encontram no estado 6cLS hexacoordenado baixo spin A configura o de baixo spin dos grupos h micos ainda corroborada pelas frequ ncias vibracionais das restantes bandas a eles atribu das particularmente as frequ ncias de v2 v3 e vn que estariam significativamente desviadas para valores mais elevados caso a prote na fosse uma esp cie 5cHS pentacoordenado alto spin Podem ser observados no espectro RR dois componentes da banda v4 marcador do estado redox associados s formas f rrica 1372 em e ferrosa 1362 cm da prote na A ban
128. dos foram posicionados na c lula espectroelectroqu mica conjuntamente com um el ctrodo de refer ncia Ag AgCl e um contra el ctrodo de Pt Foi adicionada solu o proteica a 150 uM solu o tamp o de suporte presentes na c lula espectroelectroqu mica A adsor o espont nea da prote na a partir do tamp o foi testada procedendo se de forma sistem tica varia o das condi es de imobiliza o nomeadamente tempo de adsor o potencial do el ctrodo de trabalho tipo e propor o do tamp o de suporte de SERR e adi o de aditivos DDAB cido c lico e MES 41 Foi igualmente testado um m todo de imobiliza o alternativo o qual consistiu na deposi o do extracto de enzima directamente sobre o el ctrodo de trabalho seguida de remo o do excesso de prote na na superf cie por imers o em solu o tamp o Foram empregues diversas abordagens a este m todo sendo que consoante o caso utilizou se entre 10 e 20 ul de extracto de cd NiR Para al m da deposi o directa na superf cie do el ctrodo de trabalho apenas polida e ou tamb m contundida procedeu se a modifica es pr vias da superf cie designadamente o revestimento com diversas camadas de surfactante e com SAMs Todas as medi es foram realizadas com excita o a 413 nm uma pot ncia de laser de 4mW e tempos de acumula o compreendidos entre 20 e 60 segundos As titula es espectroelectroqu micas de SERR foram realizadas num intervalo
129. e D vulgaris e que podem estar na g nese da aus ncia de actividade catal tica verificada no decurso dos ensaios electroqu micos a qual impossibilitou o desenvolvimento de um biossensor com recurso a esta enzima Termos chave cd NiR desulfoviridina caracteriza o biossensores electroqu micos nitrito sulfito Abstract The central theme of the work presented in this dissertation is the construction of electrochemical enzymatic biosensors specific for nitrite and sulfite based on respectively the nitrite reductase cd NiR from Marinobacter hydrocarbonoclasticus and the sulfite reductase desulfoviridin from Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774 as biological recognition elements Although the crystal structure from the cd NiR was not obtained the analysis of the amino acid residue sequence and simulation of the respective tridimensional structure indicates an high structural resemblance with the enzyme from Pseudomonas aeruginosa By Raman resonance spectroscopy it was established the coordination numbers spin states and formal potentials from both the co factors with a partial identification of the vibrational modes from the d heme An amperometric nitrite biosensor was constructed through the co immobilization of the cd NiR with its physiological partner cytochrome cs52 working as electronic mediator The use of screen printed electrodes as transduction platform gave an high operational simplicity and portability to the s
130. e as diferen as nas sequ ncias de res duos de aminoacidos das enzimas dos quatro organismos sao mais acentuadas na zona do c terminal Observa se ainda que para este conjunto a prote na de Ps stutzeri a que mais difere das restantes Tal como foi referido na sec o 1 2 4 existem diferen as substanciais nos motivos de liga o aos co factores entre as prote nas de Ps aeruginosa e P pantotrophus com importantes implica es ao n vel do mecanismo de activa o da enzima O alinhamento das sequ ncias veio demonstrar que a cd NiR de M hydrocarb apresenta um elevado grau de conserva o relativamente cd NIR de Ps aeruginosa sobretudo no que respeita as reas correspondentes aos motivos de liga o aos co factores Assim prov vel que a enzima de M hydrocarb realize a redu o do nitrito atrav s de um mecanismo semelhante ao proposto para a prote na de Ps aeruginosa 1 4 3 Previs o da Estrutura Tridimensional da cd NiR de Marinobacter hydrocarbonoclasticus A simula o da estrutura tridimensional da cdjNiR de M hydrocarb realizou se recorrendo a dois programas distintos de modela o por homologia de forma a comparar os resultados obtidos Assim foi utilizado o Automatic Modelling Mode do Swiss Model Guex amp Peitsch 1997 Schwede et al 2003 Arnold et al 2006 e o Mode Quick Phyre do PHYRE vers o 0 2 protein homology analogy recognition engine Kelley amp Sternberg 2009 Embora
131. e de Au em multicamadas e n o em monocamada como era pretendido Assim as imagens apresentadas na figura L43A demonstram que a prote na se encontra adsorvida na superf cie do el ctrodo com um empacotamento bastante denso Este fen meno poderia ser a causa para a aus ncia de actividade catal tica observada atendendo a que poderia impossibilitar o acesso do substrato ao centro activo da enzima Com o intuito de reduzir o empacotamento da cd NiR quando adsorvido de forma a fomentar o acesso do nitrito ao centro activo foram preparadas SAMs mistas de MUA com MUOH e MUNE cujos resultados se apresentam em seguida 1 4 6 4 Estudo do Comportamento Electroqu mico da cdi NiR Adsorvida num El ctrodo modificado com SAMs Mistas A prepara o de el ctrodos modificados com SAMs mistas compostas por MUA ao qual a cd NiR adsorve e ti is com cadeias alif ticas de comprimento semelhante mas com termina es hidr fila MUOH ou hidrof bica MUNE em diferentes propor es visava a cria o de espa os entre as mol culas de prote na adsorvida de forma a permitir o acesso do substrato e eliminar eventuais constrangimentos resultantes de uma excessiva proximidade entre mol culas Os voltamogramas c clicos correspondentes ao primeiro varrimento de potencial obtidos com estas prepara es na aus ncia de nitrito encontram se representados na figura I 44 Os resultados apresentados demonstram claramente que a intensidade de c
132. e dos resultados obtidos dever ser eliminada em experi ncias futuras Para esse efeito as condi es de adsor o da enzima aos el ctrodos de Ag dever o continuar a ser alvo de estudo 34 I 6 Refer ncias Bibliogr ficas Adman E T Godden J W Turley S J Biol Chem 270 27458 27474 1995 Allen J W A Barker P D Daltrop O Stevens J M Tomlinson E J Sinha N Sambongi Y Ferguson S J Dalton Trans 21 3410 3418 2005 Allen J W A Cheeseman M R Higham C W Ferguson S J Watmough N J Biochem Biophys Res Commun 279 674 677 2000 Almeida M G Macieira S Goncalves L L Huber R Cunha C A Rom o M J Costa C Lampreia J Moura J J G Moura I Eur J Biochem 270 3904 3915 2003 Almeida M G Silveira C M Moura J J G Biosens Bioelectron 22 2485 2492 2007 Arnold K Bordoli L Kopp J Schwede T Bioinformatics 22 195 201 2006 Arya S K Solanki P R Datta M Malhotra B D Biosens Bioelectron 24 2810 2817 2009 Astier Y Canters G W Davis J J Hill H A Verbeet M P Wigma H J ChemPhysChem 6 1114 1120 2005 Ayaz A Topcu A Yurttagul M J Food Technol 5 177 179 2007 Baker S C Saunders N F W Willis A C Ferguson S J Hajdu J Fulop V J Mol Biol 269 440 455 1997 Barley M H Meyer T J J Am Chem Soc 108 5876 5885 1986 Barry R C Lin Y Wang J Liu G Timchalk C A J Expo Sci Environ Epidemiol 19 1 18 2009 B
133. e motivo tamb m nas sequ ncias das bact rias Desulfovibrio estudadas considerou se que a subunidade a 50kDa continha o centro activo da enzima sirohemo sirohidroclorina acoplado ao centro 4Fe4S e a subunidade p 40kDa possu a um segundo centro 4Fe4S Uma vez mais a resolu o das estruturas cristalogr ficas das Dsv de D vulgaris e fulgidus vieram clarificar tal assump o apresentado um novo conjunto de dados no que respeita composi o e distribui o dos co factores na Dsv Com efeito ambas as prote nas possuem em cada uma das subunidades do multimero o f uma sirohidroclorina ligada a um centro 4Fe4S e um segundo centro 4Fe4S ao contr rio do que foi previsto pela an lise da estrutura prim ria Descobriu se que n o s a subunidade DB alberga tamb m um sirohemo acoplado a um centro 4Fe4S com um motivo de liga o at agora desconhecido como esse efectivamente o centro activo da enzima Na prote na de A fulgidus todas as porfirinas se encontram na forma de sirohemo por m os sirohemos das subunidades o apresentam o acesso ao centro activo bloqueado por res duos de triptofano Schiffer et al 2008 Na enzima de D vulgaris apenas as subunidades p possuem sirohemos as subunidades a cont m apenas sirohidroclorinas Oliveira et al 2008 112 II 2 2 3 2 Mecanismos de Reac o N o obstante a import ncia fulcral que esta enzima desempenha no metabolismo respirat rio de sulfato ex
134. ed Raman Ressonance 1 4 6 5 Resson ncia Raman Um trabalho pioneiro realizado em 1981 por Cotton et al elege a cdj NiR como a biomol cula ideal para a insid ncia de estudos de espectroscopia de Resson ncia Raman Isso porque a exist ncia de dois grupos h micos com propriedades de absor o electr nica distintas permite excitar selectivamente a dispers o de RR dos hemos c ou di Nesse trabalho foram recolhidos os primeiros espectros RR da cdjNiR de Ps aeruginosa e P denitrificans embora apenas a prote na reduzida tenha produzido resultados com qualidade suficiente para an lise Igualmente foram realizadas as primeiras experi ncias de Resson ncia Raman Amplificada por Superf cie SERR com esta enzima Tr s d cadas de evolu o cient fica e tecnol gica permitem agora retomar a utiliza o destas t cnicas com a expectativa fundamentada de obter mais e melhores resultados Hoje em dia poss vel realizar uma melhor caracteriza o espectrosc pica dos hemos tanto no estado reduzido quanto oxidado com a melhor distin o entre as bandas relativas aos dois centros promovida pela capacidade de proceder a excita es a 647nm A modifica o das superf cies dos el ctrodos utilizados em SERR e a capacidade de realizar titula es redox por esta via s o igualmente novas funcionalidades a explorar 4 6 5 1 Espectroscopia de Resson ncia Raman As regi es de altas frequ ncias dos espectros de RR adquiri
135. el a identifica o dos contaminantes respons veis pelo aparecimento destas bandas A curva de calibra o a partir da qual os resultados foram adquiridos encontra se apresentada na figura II 18B A confirma o da propor o relativa entre as subunidades da enzima foi obtida a partir da an lise densiom trica das bandas do gel desnaturante cuja imagem se encontra na figura 1 19 Na tabela II 7 encontra se uma s ntese dos resultados obtidos MM kDa Dsv 116 em 97 66 45 31 21 14 6 5 HM Fig 11 19 Determina o da propor o relativa entre as subunidades da desulfoviridina Imagem digitalizada do gel desnaturante 12 5 corado com azul de Coomasie Tabela II 7 Propor o relativa entre as subunidades da desulfoviridina Massas Moleculares MM Intensidade Relativa IR e raz o IR MM das tr s subunidades da desulfoviridina de D desulfuricans ATCC 27774 8 7 x 10 10 5 x 10 8 5 x 10 131 Tal como era esperado as raz es IR MM para as tr s subunidades s o muito semelhantes Assim o c lculo das diferentes combina es entre estas raz es a B a y B y tende para 1 confirmando a propor o 1 1 1 admitida a priori Considerando a MM da prote na nativa previamente determinada conclui se que a desulfoviridina de D desulfuricans ATCC 27774 nativa constitu da por um d mero de trimeros com a configura o oop y II 4 2 2 Determina o da Absortividade
136. epresentado na figura II 3 Cit cred SO32 H50 0 GEO Sri Oo PP P Citc SO H20 Fig II 3 esquema reaccional dos biossensores de sulfitos baseados no aumento de corrente provocado por ac o do mediador na regenera o da SO A co imobiliza o das prote nas enzima e mediador foi conseguida no primeiro caso por adi o das mesmas tinta de carbono posteriormente aplicada em el ctrodos screen printed onde constitu a o el ctrodo de trabalho No segundo caso optou se por uma deposi o em camadas sobre um el ctrodo de Au modificado sendo o conjunto estabilizado com o aux lio de uma matriz polim rica At ao momento n o se encontram reportados biossensores electroqu micos baseados na transfer ncia electr nica directa entre a SO e o el ctrodo de trabalho Por m foram apresentados dispositivos que dispensam o recurso a um mediador atrav s da monitoriza o do H O gerado Situmorang et al 1999 e do O consumido Dinckaya et al 2007 no decurso da reac o enzim tica fig 11 4 103 A B SO 7 t HO 0 e en e gt 0 H O SO E E eet L L e ei C C O T GoD S047 H202 E H20 R Geet pen e m m mm R na dl Be 5 O D ON D e ke o S047 H20 wm A 3 HO 120 Fig II 4 Representa o esquem tica de biossensores de sulfitos baseados na actividade da SO A Monitoriza o do per xido de hidrog nio formado B Monitoriza o do oxig ni
137. ers vel sendo simultaneamente capazes de transferir electr es de e para os centros redox proteicos de acordo com o esquema apresentado na figura 1 2 10 E L C T R O D O Fig I 2 Representa o esquem tica dos biossensores com sinal produzido via electroqu mica mediada e transdu o amperom trica e ou voltam trica I 2 2 2 1 1 Mediadores Artificiais A electroqu mica mediada de diferentes NiRs encontra se profusamente descrita na bibliografia com uma vasta gama de transportadores electr nicos artificiais mobilizados ou em solu o a serem testados com vista ao desenvolvimento de biossensores de nitrito Strehlitz et al 1994 1996 Quan et al 2006 Embora as NiRs apresentem a capacidade de aceitar electr es de uma vasta gama de mediadores redox s o utilizados preferencialmente doadores electr nicos com potenciais redox bastante negativos essencialmente compostos da fam lia dos violog nios Tal facto ocorre devido ao aumento da performance anal tica conferida pelo recurso a estes compostos Wu et al 1997 Silva et al 2004 Quan et al 2006 Almeida et al 2007 Contudo os elevados potenciais de polariza o requeridos potenciam a ocorr ncia de reac es inespec ficas principalmente com o O causando interfer ncias no processo anal tico ali s por este motivo que os biossensores baseados em redutases do nitrito s o quase exclusivamente dispositivos anaer bios Sempre que poss ve
138. ficados de M hydrocarb antes linha cont nua e ap s redu o com ditionito linha tracejada Fig 1 21 Fotografias de g is de poliacrilamida a 12 5 ap s electroforeses desnaturantes COS extractos PrOLCICOS ua 6 ioqva pais ssa donas na Cara buc dons Pas T aa ei Fig 1 22 Recta de calibra o para a determina o da MM da cd NiR Fig 1 23 Alinhamento das sequ ncias de res duos de amino cidos para a cd NiR de Marinobacter hydrocarbonoclasticus Pseudomonas aeruginosa Paracoccus Dantoirophis Pseudomonas EE Fig 1 24 Constru o do modelo para a estrutura monom rica da cdjNiR de M DV GVOCOTD EE EE ea asd ada Fig 1 25 Estruturas tridimensionais da cdiNiR ce ee eee eee eee eee eee eee eene n ne Fig 1 26 Distribui o do potencial coulombiano na superf cie da cdjNiR de M ANO LAO 60h q er Fig 1 27 Fotografia de cristais de cd NiR de M hydrocarb na forma nativa Fig 1 28 Esquema reaccional do bioelectrodo para a redu o de nitrito a xido e de oxig nio molecular a gua de acordo com um mecanismo EC enee Tae 1 29 Efettos do Encapsulamento sss 222 is od oes roo Period Sa dista S eda ei nee KM Fig 1 30 Depend ncia relativamente velocidade de varrimento da resposta electroqu mica do cit css quando co imobilizado com a cd NiR numa matriz de PVA numb CPSPE ish sca
139. furicans D desulfuricans D desulfuricans D desulfuricans Enzima BSA gluteralde do GC deposi o de enzima poliacrilamida mediador em solu o GC deposi o de enzima poliacrilamida GC dispers o de mistura de poli pirrolo violog nio enzima seguida de electropolimeriza o GC deposi o de Nafion enzima incorpora o do mediador GC deposi o de ZnCr AQS LHD enzima liga o covalente com vapor de gluteralde do Ouro deposi o de Nafion enzima mediador glicerol BSA liga o covalente com gluteralde do Grafite pirol tica deposi o de EETMS sol deposi o de enzima Grafite deposi o de dispers o de nanotubos de carbono single walled deposi o de enzima Potenciom trica Voltam trica Voltam trica Voltam trica Amperom trica Condutim trica Amperom trica Voltam trica 15 MET violog nio de metilo DET MET poli pirrolo violog nio MET violog nio de metilo MET AQS MET violog nio de metilo DET 0 1 50 mM at 200uM 5 4 43 4 uM 75 800 uM 0 015 2 350 uM 0 2 120 uM 0 25 50 uM at 150 uM 1721 mAM em 445 mAM cm 1 824 mAM lem 0 194 uS uM 430 mAM em 2 400 mAM em Kiang et al 1975 Scharf et al 1995 Silva et al 2004 Almeida et al 2007 Chen et al 2007 Zhang et al 2009 Silveira et al 2010B Silveira et al
140. grama representativo da adsor o de uma prote na a uma SAM por via de Interac o electroest tica A elevada estabilidade da liga o entre SAM e ERB conseguida atrav s da utiliza o de activadores qu micos tem vindo a demonstrar um elevado potencial para o desenvolvimento de dispositivos comerciais De entre os numerosos m todos de activa o constantes da literatura o mais generalizado consiste na utiliza o conjunta da N etil N 3 dimetilamoniopropil carbodiimida e da N hidroxisucinimida vulgarmente designado por EDC NHS fig I 10A 19 Este m todo demonstrou ser particularmente apropriado na liga o de prote nas a SAMs com grupos terminais carboxilo os quais mediante activa o formam liga es pept dicas com grupos amina presentes na superf cie da biomol cula essencialmente provenientes de res duos de Arg e Lys O recurso imobiliza o atrav s de liga es cruzadas do Ingl s cross link tamb m uma abordagem usual para a modifica o de SAMs com ERBs Neste contexto o recurso a agentes de liga o tais como o gluteralde do permitem a forma o de sistemas est veis por m as liga es assim conseguidas n o s o selectivas do ponto de vista da orienta o espacial da biomol cula e a deposi o do ERB em monocamada tamb m n o assegurada A modifica o de SAMs mediante processos de troca permite a funcionaliza o de superf cies e a cria o de SAMs mistas A liga o das biomol cu
141. gramas tra ados a pH 5 5 a perda de reversibilidade na transfer ncia electr nica entre o mediador e o el ctrodo Ao adicionar se sulfito ao meio observa se um aumento da intensidade da corrente produzida no sentido da redu o Atendendo a que a esp cie predominante a pH 5 5 n o o sulfito mas sim o SO indubitavelmente se conclui que o mediador oxidado directamente pelo di xido de enxofre eq 2 8 conduzindo gera o de sinais semelhantes aos normalmente encontrados quando existem correntes catal ticas SO AH 4e gt S 2H 0 E 0 50V 2 1 4 x AB ox le gt AB eg E 0 46V 2 7 SO 4H AAR ea S 2H 0 4AB ox 2 8 1 4 5 2 Violog nio de Metilo Os voltamogramas c clicos tra ados na presen a de ImM de violog nio de metilo MV e diferentes concentra es de sulfito fig IL 27 apresentam formas muito semelhantes s verificadas com o azul de bromofenol e como tal assume se que as causas para os comportamentos observados com o MV sejam id nticas s previamente apontadas para o AB Na figura 11 26 apresenta se a semi equac o de redu o do MV A conjuga o desta semi equa o com a semi equa o 2 1 para pH 5 5 resulta na equa o global 2 9 a qual representa a reac o do MV com o di xido de enxofre presente em solu o a pH cido A R H C N N N CH 1e H C N N CH E 0 44V Fig II 26 Semi
142. he amp Bala 2007 ou em alternativa cujo elemento de reconhecimento biol gico consiste em enzimas dependentes de NADH Hart et al 1999 Avramescu et al 2001 Em ambos os casos este corante assume a fun o de mediador reduzindo o sobrepotencial de oxida o do NADH 0 8 V vs NHE de acordo com o mecanismo representado pelas equa es 2 10 a 2 12 Sprules et al 1996 Mariotti et al 2006 Tal facto permite o acompanhamento atrav s de m todos electroqu micos das reac es onde o co factor se encontra envolvido sem a necessidade de operar a potenciais elevados reduzindo assim o risco de ocorr ncia de reac es inespecificas NADH Gea AM ox gt NADH e AM 2 10 NADH e AM gt NAD ox AMH Gea 2 11 AMH AM 2e H 2 12 A equa o 2 10 traduz a forma o de um complexo em solu o entre o NADH e o mediador O complexo formado dissocia se atrav s de uma rea o redox qu mica eq 2 11 e em seguida o mediador reduzido reoxidado por via electroqu mica no el ctrodo de trabalho eq 2 12 Os voltamogramas c clicos apresentados na figura II 31 mostram as altera es ocorridas quando se adiciona 2 mM de NADH a 0 5 mM de AM e por fim o comportamento do sistema na presen a de quantidades crescentes de sulfito 147 ISO I uA 0 2 0 15 0 1 0 05 0 0 05 0 1 0 15 0 2 0 25 0 3 0 35 Potencial V vs NHE Fig II 31 Ensaios como sistema mediador azul de Meldola NADH a pH 7 6
143. ichter et al 2002 Contudo provou se mais tarde que a exposi o da enzima oxidada ao substrato era suficiente para desencadear a troca de ligandos que faculta a cat lise van Wonderen et al 2007 e que a presen a de nitrito nas imedia es do centro activo suficiente para remover o NO formado com as caracter sticas nicas do hemo d a promoverem a dissocia o do complexo d Fe NO Oganesyan et al 2007 27 A resolu o da estrutura tridimensional da cd NiR de Pa quer na forma nativa Nurizzo et al 1997 quer na forma reduzida Nurizzo et al 1998 permitiu verificar a exist ncia de diferen as consider veis relativamente enzima de Pp sendo que as cd NiRs destes dois organismos t m sido alvo de exaustivas compara es por parte de diversos autores Cutruzzol 1999 Kobayashi et al 2001 Wherland et al 2005 Moura et al 2008 1 2 4 4 A cd4NiR de Pseudomonas aeruginosa Estudos realizados com a cdjNiR de Pa revelaram que nesta prote na n o ocorre a troca de ligandos no hemo c e que a actividade catal tica pode acontecer sem a necessidade de um passo pr vio de activa o redu o Rinaldo et al 2007A 2007B Tal deve se sobretudo ao facto de o ligando axial distal do hemo d ser um ani o hidroxilo facilmente substitu vel pelo nitrito figura 1 16 sugerindo que a liga o do substrato na realidade o factor que despoleta a redu o da enzima Tyrio Tyr10 Met88 Ki Met
144. ida M G Bioinorg Chem Appl Article ID 634597 8 pages 20104 Silveira C M Gomes S P Araujo A N Montenegro M C Todorovic S Viana A S Silva RI Moura J J G Almeida M G Biosens Bioelectron 25 2026 2032 2010B Silveira C M Baur J Holzinger M Moura J J G Cosnier S Almeida M G Electroanalysis 22 2073 2978 2010C Silvestrini M C Galeotti C L Gervais M Schinina E Barra D Bossa F Brunori M FEBS Lett 254 33 38 1989 Silvestrini M C Tordi M G Musci G Brunori M J Biol Chem 265 11783 11787 1990 Siu D C Henshall A J Chromatogr A 804 157 160 1998 Skovgaard N Food Addit Contam 9 391 397 1992 Smolders A Lucassen E Bobbink R Roelofs J Lamers L Biogeochemistry 98 1 7 2010 90 Sproer C Lang E Hobeck P Burghardt J Stackebrandt E Tindall B J Int J Syst Bacteriol 48 1445 1448 1998 Strehlitz B Grundig B Schumacher W Kroneck P M H Vorlop K Kotte H Anal Chem 68 807 816 1996 Strehlitz B Grundig B Vorlop K Bartholmes P Kotte H Stottmeister U Fresenius J Anal Chem 349 676 678 1994 Sun J Zhang X Broderick M Fein H Sensors 3 276 284 2003 Sun W Arese M Brunori M Nurizzo D Brown K Cambillau C Tegoni M Cutruzzola F Biochem Biophys Res Co 291 1 7 2002 Sun W Li X Wang Y Li X Zhao C Jiao K Bioelectrochemistry 75 170 175 2009 Swamy U Wang M Tripathy J N Kim S
145. idina de D desulfuricans ATCC 27774 Os g is resultantes das electroforeses foram corados rotineiramente com Azul Brilhante de Coomassie R 250 e sempre que necess rio recorreu se ao m todo de colora o com nitrato de prata ambos descritos no manual t cnico da Amersham 1999 A transfer ncia electrofor tica foi realizada de acordo com o protocolo descrito por Dunbar 1994 121 A concentra o de prote na foi determinada pelo m todo de Lowry Lowry et al 1975 e ou pelo m todo do cido biciconinico BCA Smith et al 1985 Wicchelman et al 1988 A massa molecular da prote na nativa foi estimada por cromatografia de filtra o em gel a alta press o com recurso a uma coluna pr empacotada equilibrada com 100 mM NaCl em 50 mM tamp o Tris HCl pH 7 6 o qual foi tamb m utilizado como eluente com um fluxo de 0 5 ml min O cromatograma foi tra ado seguindo a absorv ncia a 280 nm A curva de calibra o foi construida com base nos tempos de reten o de 8 prote nas padr o As massas moleculares das subunidades foram determinadas por electroforese SDS PAGE a partir de um gel de poliacrilamida a 12 5 corado com nitrato de prata A curva de calibra o foi constru da recorrendo a dois conjuntos de marcadores de massa molecular Os valores de absortividade molar e a 280 390 408 580 e 630 nm foram determinados por espectrofotometria e calculados com base nos dados de concentra o de prote na e massa mo
146. il aminometano Utrahigh Vaccum United States Department of Agriculture Ultra Violeta Visivel violog nio de benzilo vermelho neutro largura a meia altura dos picos forma oxidada de X sendo X uma esp cie electroactiva j definida forma reduzida de X sendo X uma esp cie electroactiva j definida xxii Organismos Achromobacter cycloclastes Alcaligenes faecalis Archaeoglobus fulgidos A fulgidos Archaeoglobus profundos Bilophila wadsworthia Chromatium vinosum Desulfovibrio desulfuricans D desulfuricans Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27 774 Desulfovibrio desulfuricans Essex 6 Desulfovibrio desulfuricans G20 Desulfovibrio gigas Desulfovibrio vulgaris Hildenborough D vulgaris Desulfovibrio vulgaris oxamicus Escherichia coli E coli Marinobacter aquaeolei prec Marinobacter hidrocarbonoclasticus Marinobacter hidrocarbonoclasticus M hidrocarb Mh Paracoccus denitrificans Paracoccus pantotrophus P pantotrophus Pp Pseudomonas aeruginosa Ps aeruginosa Pa Pseudomonas denitrificans Pseudomonas nautica prec Marinobacter hidrocarbonoclasticus Pseudomonas pantotrophus Pseudomonas stutzeri Ps stutzeri Ps Ralstonia eutropha Rhodobacter sphaeroides R sphaeroides Sulfurospirillum deleyianum S deleyianum Thiobacillus denitrificans Thiosphaera pantotropha prec Paracoccus pantotrophus xxiil XXIV PARTE I Citocromo cd cd4NiR de Marinobacter hydrocarbonoclasticus
147. imobilizada em el ctrodos de Ag revestidos com uma SAM de cisteamina Os quadrados a negro representam a intensidade do v ferroso 1362 em e os c rculos vermelhos representam a intensidade do v f rrico 1372 em em fun o do potencial do el ctrodo de trabalho A an lise destes resultados mostra a exist ncia de duas transi es redox bem definidas a aproximadamente 50 mV e 50 mV vs Ag AgCl Embora se tratem apenas de resultados preliminares de salientar que os valores obtidos 150 e 250 mV vs NHE est o bastante pr ximos dos reportados por Besson et al 1995 para os hemos da prote na deste mesmo organismo 234 mV para o hemo c e 199 mV para o hemo dl As dificuldades encontradas na eficiente imobiliza o da cd NiR na superf cie do el ctrodo de Ag impossibilitaram a realiza o de experi ncias de SERR com excita o a 647 nm 82 I 5 Conclus es e Perspectivas A realiza o deste trabalho permitiu concluir que o procedimento de purifica o adoptado no isolamento dos citocromos css e cd de Marinobacter hydrocarbonoclasticus 617 adequado tendo sido obtidas prote nas com uma elevada raz o de pureza no seu estado nativo e com a enzima activa Embora a determina o da estrutura da cd NiR de M hydrocarb por cristalografia de raios X n o tenha sido conseguida as evid ncias resultantes da an lise da sequ ncia de res duos de amino cidos bem como a simula o da estrutura tridimensional da
148. inhas de base bastante est veis e uma boa raz o sinal ru do fig 131 56 A B 16 1800 1600 1400 1 2 E 1200 a 1000 gt 98 lt so0 E 600 0 4 400 200 0 0 0 10 20 30 40 50 0 1 2 3 4 5 Tempo min NO mM 600 C _ 500 E 400 E E 300 lt E 200 4 100 0 0 50 100 150 200 250 NO uM Fig I 31 Resposta do biossensor a nitrito A Amperograma representativo registado a 0 1 V vs Ag AgCl B Ajuste dos dados a uma equa o de Michaelis Menten com recurso ao programa GraphPad Prism v 4 C Curva de calibra o y 2 49x 43 74 r 0 996 Os resultados apresentados representam o valor m dio de tr s experi ncias independentes A resposta do biossensor ao substrato da cd NIR foi linear no intervalo 10 200 uM fig 1 31C O limite de detec o calculado a partir da recta de calibra o sob a forma de raz o entre o triplo do valor do desvio padr o da ordenada na origem sb e a ordenada na origem b foi de 7 uM 0 3 ppm O valor calculado para o limite de quantifica o 10xsb b foi de 24 uM 1 ppm A sensibilidade obtida atrav s do declive da recta de calibra o 2 49 0 08 Amol em uM e o Ky foi 0 53 0 01 mM Atendendo revis o bibliogr fica realizada para dispositivos semelhantes tabela I 1 verifica se que os nicos sistemas integrados que utilizam a cdjNiR como elemento de reconhecimento biol gico o fazem com m todos de transdu o pticos Ferre
149. ionizada polarografia diferencial pulsada do ingl s differential pulse polarography voltametria diferencial pulsada do ingl s differential pulse voltametry redutase do sulfito dissimilativa gene codificante das subunidades a e D das dSiR gene codificante da subunidade y das dSiRs subunidade y da Dsv gene codificante da hipot tica subunidade 6 das dSiRs subunidade catal tica do complexo DsrMKJOP complexo proteico membranar existente nas bact rias Desulfovibrio desulfoviridina XIX DTNB Eo Eo EC E coli EDC NHS EDTA EETMS EPR EPA Epa Epe ERB TE EtOH F FAD FAO FDA FIA FMN Fs GaAs GC GCE GC Pt GL Hb HEPES HPLC HRP HT I ICP OES ICP AES Ip Ip Ip IR Iden Kav Keat KEEG 5 5 ditiobis 2 acido nitrobenz ico reagente de Ellman potencial normal de redu o potencial formal de redu o mecanismo electroqu mico qu mico do ingl s electrochemical chemical Escherichia coli N etil N 3 dimetilamino propil carboimida acoplada a N hidroxisuccinimida etilenodiaminatetraacetato de s dio 2 3 4 epoxiciclohexil etiltrimetoxissilano espectroscopia de de resson ncia paramagn tica e electr nica Environmental Protection Agency potencial de pico cat dico potencial de pico cat dico elementos de reconhecimento biol gico transfer ncia electr nica etanol constante de Faraday flavina adenina dinucle tido Food and Agriculture Organization of the United Nations Food
150. istem muitos aspectos relacionados com a actividade da Dsv que permanecem incertos Um desses aspectos a natureza do produto fisiol gico uma vez que ao contr rio das aSiR que convertem sulfito em sulfureto sem que ocorra liberta o de intermedi rios Siegel et al 1974 Crane et al 1997 A a Dsv produz in vitro uma mistura de sulfureto tritionato e tiosulfato em propor es que dependem das condi es do ensaio Peck Jr amp LeGall 1982 Akagi 1995 Um estudo recente levado a cabo por Parey et al 2010 prop e um mecanismo para a reac o de redu o do sulfito com base nas estruturas cristalogr ficas da Dsv de A fulgidus complexada com uma s rie de ligandos ani nicos fig III Argod70 Lysa211 Argat70 Lysa211 Argoi70 NH1 NH2 NM NH1 NH2 NZ Hu NH2 Ei Xe EE 2e e A Se ZE 1 2H Ha O qi O 2H H20 P Wl 2H H20 b E T Looks MEO e Ceo p Je Fe T Fe 2 H F Ks Lysa213 Lys 0213 Su T NH1 NH2 i NH1 NH2 Lm NH1 NH2 Fels Fe S Arg 98 Arg 98 Arg 98 HSO4 EHS 2H HO HH FOR O l O IV T Ki ep 2e Eed y E de HO o lu Hi Fe Fe 2 2 Fe S Fe S HSO4 2H H20 OH Q 0H o A 4 D4 E SC Ne O I Fe FeiS Fig II 11 Mecanismo de redu o do SO catalisada pela Dsv de A fulgidus Parey et al 2010 O mecanismo consiste em tr s etapas sequenciais ocorrendo em cada uma das etapas a transfer ncia de 2 electr es para o substrato seguida da du
151. ito a xido n trico eq 1 9 a qual envolve apenas um electr o S o conhecidas por redutases do nitrito de cobre CuNiRs e redutases do nitrito citocromo cd cd NiRs NO 2H e NO H O 1 9 As CuNIRs fig I 1C s o prote nas homotrim ricas 3 x 37kDa contendo dois tomos de cobre em cada uma das subunidades O centro de cobre do tipo I encontra se envolvido na transfer ncia electr nica enquanto o tomo do tipo II constitui o centro catal tico Kukimoto ef al 1994 Adman et al 1995 Murphy et al 1997 As cd Niks fig I 1D s o enzimas sol veis e homodim ricas 2x 60 kDa onde cada subunidade cont m um hemo do tipo c que funciona como aceitador electr nico e um hemo do tipo d que actua como centro catal tico Silvestrini et al 1990 Jafferji et al 2000 Estas prote nas ser o alvo de uma descri o detalhada na sec o 1 2 4 2 2 2 1 Electroqu mica Mediada A implementa o de um sistema biossensorial n o consiste apenas em encontrar a enzima apropriada e lig la a uma superf cie transdutora Frequentemente o maior desafio na concep o de um biossensor electroqu mico consiste na obten o de uma comunica o electr nica eficiente entre as prote nas e os el ctrodos No que se refere a biossensores de nitrito a grande maioria das propostas apresentadas at ao momento recorre utiliza o de mediadores redox os quais apresentam uma resposta electroqu mica r pida e rev
152. l lcool polivin lico modificado com grupos azida pendentes do ingl s poly vinyl alcohol azide unit pendant water soluble photopolymer polyvinylidene fluoride carga coeficiente de correla o Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Refer ncia bibliogr fica migra o relativa raz o de pureza espectroscopia de Resson ncia Raman cido ribonucleico ribossomal do ingl s ribossomal ribonucleic acid SIR reversa camadas automontadas do ingl s Self Assembled Monolayers el ctrodo saturado de calomelanos do ingl s Saturated Calomel XXi SDS SERR SIA Simil SiRs SIRFP SIRHP SNiRR SO SPEs TAPS TEOS TFA TPTZ Tris UHV USDA UV Vis VB VN Win Xox X red Electrode dodecil sulfato de s dio do ingl s sodium dodecyl sulfate espectroscopia de resson ncia Raman amplificada por superf cie do ingl s Surface Enhanced Resonance Raman sequential injection analysis Grau de Similaridade redutases do sulfito do ingl s sulfite redutases sub unidade o da aSiR de E coli do ingl s SiR flavoprotein sub unidade D da aSiR de E coli do ingl s SiR hemoprotein sulfite and nitrite reductase repeat oxidase do sulfito do ingl s sulfite oxidase do ingl s Screen Printed Electrodes temperatura em Kelvin cido N Tris hidroximetil metil 3 aminopropanosulf nico tetraethyl orthosilicate cido trifluorac tico do ingl s trifluoracetic acid 2 4 6 tripiridil s triazina Tris hidroximet
153. l aconselh vel a selec o de mediadores com potenciais de redu o mais elevados As fenazinas Strehlitz et al 1994 1996 Silva et al 2006 safraninas Strehlitz et al 1996 e antroquinonas Chen et al 2007 sao exemplos de mediadores alternativos encontrados em biossensores baseados em NiRs I 2 2 2 1 2 Mediadores Fisiol gicos A constru o de biossensores com resposta mediada baseados na interac o de NiRs com os seus parceiros fisiol gicos naturais uma tend ncia recente Astier et al 2005 Tepper 2010 Este tipo de media o poder vir a demonstrar se vantajosa relativamente utiliza o de mediadores artificiais no sentido em que simula de forma mais fiel os processos de transfer ncia electr nica que ocorrem in vivo 11 Ao evitar o recurso a mediadores que s o frequentemente t xicos e catalisadores gen ricos a aplica o deste m todo torna se mais sustent vel do ponto de vista ambiental e simultaneamente melhora os limites de detec o e a selectividade dos dispositivos biossensoriais Lojou et al 2003 Aster et al 2005 Tepper 2010 Neste trabalho ser apresentado e discutido um biossensor para determina o de nitritos baseado neste conceito fig 1 3 recorrendo cdi NiR de Marinobacter hydrocarbonoclasticus como elemento de reconhecimento biol gico e ao seu parceiro fisiol gico o citocromo css cit c552 como mediador electroqu mico Passo 1 Passo 2 Passo 3 cit
154. l seara presas canis ve gos Tau aa saias 110 1L2 2 5 2 Mecanismos de Reac o sa een a ea ubi a nt 113 ILS Matrace Metodos 2 rosis Eo ete TE E isa erede ra tese Ere sS rese Saabs dunas duas 116 IL5 1 Materias e Reagentes sussa sons E RO RE NUS eI assenta 116 II 3 1 1 Purifica o e Caracteriza o Bioqu mica da redutase do sulfito dissimmildtr a DesulboVItidiDa occupe tuo stet aut Seas rare de pl modesto casais tidas 116 II 3 1 2 Determina o da Estrutura Prm a 0 0 cece cceee ence cece ence ee ee ens 117 ILL Blecttog tile Aude da oun candied a a Cade trad 117 IS Sa e Equipamentos sas saco Usa cas case Sao ese ISSUE SA ON GN OPINIONI OE NA ESAE N IER UHR ES 119 1 3 2 1 Purifica o e Caracteriza o Bioqu mica da redutase do sulfito SE ru D KR Te te EE 119 II 3 2 2 Determina o da Estrutura Prm a cece cece eee e eee e eee eeeeees 119 13 25 Ee UE 120 II 3 3 Procedimentos Experimentais e ecce ee eee eee eee eee tette es ssaas n soos 120 II 3 3 1 Purifica o e Caracteriza o Bioqu mica da redutase do sulfito dissimiativa DesultoyViriditias cassa gens s rre tone au da dead ass da do ed Dax oed 120 II 3 3 2 Determina o da Estrutura Prm a 0c cece cece eee eeeeeeeeeeeees 122 13 35 BCC OQUIMI CA aii dad fura Phu dd 123 II 3 4 Aplica es Bioinform ticas eee e eee ecce ee ee eee ee eee seen esee e enaauuo o 125 ISS E Caracteriza o Wee rn TT EE
155. lamida a 12 5 ap s electroforeses desnaturantes dos extractos proteicos A Linha de um gel correspondente frac o final de cit cs52 O gel foi submetido a colora o de hemos n o havendo por isso uma linha destinada a marcadores de massa molecular B Linhas de um gel contendo a frac o final de cit cd corado com azul de Coomasie A necessidade de proceder colora o de hemos para identifica o do cit css adv m do facto de para al m de se tratar de uma prote na de dimens es reduzidas apenas 10 dos res duos de amino cidos que a constituem possu rem cadeias laterais b sicas Argininas Histidinas e Lisinas Saraiva et al 1994 facto que condiciona seriamente a efici ncia da colora o com azul de Coomasie 45 A identidade da cd NiR foi ainda confirmada atrav s do c lculo da massa molecular realizado a partir dos dados da figura L21B por interpola o da curva de calibra o apresentada na figura 1 22 Os resultados obtidos demonstram que a prote na purificada possiu uma massa molecular de 60 kDa correspondente massa molecular da enzima na forma monom rica tal como era esperado ap s a electroforese em condi es desnaturantes 10 00 8 00 6 00 Rf 4 00 2 40 2 00 0 00 l 07 1 13 16 079 49 22 logio MM Fig 1 22 Recta de calibra o para a determina o da MM da cd NiR Os pontos representados correspondem ao Rf de cada prote na padr o em fun o do logari
156. las atrav s destes processos pode ser conseguida por via directa inserindo um composto previamente ligado ao ERB numa SAM pr estabelecida ou por via indirecta substituindo parcialmente a composi o da SAM com agentes activadores e ligando o ERB em seguida fig I JOB Arya et al 2009 Fransconi et al 2010 EDC NHS Enzima NH B Ss Fig 1 10 Reac es de liga o de ERBs a SAMs Arya et al 2009 A Liga o por activa o com EDC NHS B Modifica o atrav s de um processo de troca com DTSP A 20 1 2 3 2 El ctrodos Screen Printed SPEs Screen Printed Electrodes 2 3 2 1 Import ncia Estrat gica A r pida e permanente evolu o das sociedades modernas impulsionou significativamente a procura de sensores descart veis de baixo custo altamente precisos e de resposta r pida para aplica es cl nicas e industriais Adicionalmente a portabilidade miniaturiza o de tais dispositivos de import ncia fundamental permitindo determina es descentralizadas que dispensem o recurso s t cnicas tradicionais altamente dispendiosas que dependem de equipamentos espec ficos e operadores qualificados como por exemplo cromatografia l quida ou gasosa e espectrometria de massa A tecnologia screen printing aplicada ao fabrico de sensores qu micos e biossensores uma t cnica que se encontra hoje em dia inteiramente implantada e estabelecida sendo
157. leccionar o n vel de empacotamento e a natureza qu mica do grupo terminal confere selectividade quanto ao tipo e orienta o dos compostos com os quais a estrutura ir interagir No diagrama da figura L8 encontram se representadas as diferentes componentes e caracter sticas por elas conferidas da estrutura de uma SAM Interface Org nica Determina as propriedades da superf cie Grupo Puno Terminal Interfase Organica 1 3 nm Espacador ly Selec o da espessura e grau de empacotamento cadeia alif tica Actua como barreira f sica Altera a condutividade electr nica e as propriedades locais Ligando gt Substrato Met lico Interface Enxofre Metal Estabiliza os tomos da superf cie Modifica os estados electr nicos Fig 1 8 Diagrama esquem tico de uma SAM ideal formada por um alcanotiol numa superf cie monocristalina de Au 111 Love et al 2005 Uma outra caracter stica deveras importante consiste na possibilidade de se formarem em objectos de todos os tamanhos e formas e n o apenas em superf cies planas e a capacidade de funcionarem como auxiliares na estabiliza o e funcionaliza o de nano objectos nanopart culas nanotubos nanofios Por fim poss vel proceder sua monitoriza o atrav s das propriedades electr nicas electroqu mica e pticas ndice de refrac o local frequ ncia de superf cie das estruturas met licas As caracter sticas acima
158. lecular obtidos experimentalmente O conte do total de tomos de ferro existentes na prote na foi determinado por ICP AES com uma curva de calibra o tra ada a partir de solu es padr o A frac o de tomos de ferro l bil presente na Dsv foi obtida por precipita o com tripiridil s triazina TPTZ atrav s de uma adapta o do m todo espectrofotom trico descrito por Fisher e Price 1964 II 3 3 2 Determina o da Estrutura Prim ria A sequencia o do N terminal das tr s subunidades da Dsv foi realizada ap s a separa o das mesmas por electroforese SDS PAGE e sua subsequente transfer ncia para uma membrana de PVDF por electroblotting As bandas correspondentes a cada subunidade foram excisadas da membrana e processadas individual e directamente num sistema onde foi realizada a sequencia o autom tica pelo m todo de degrada o de Edman A prote na purificada foi liofilizada e submetida a digest o tr ptica de acordo com o procedimento descrito por Stone amp Williams 1993 Os p ptidos resultantes foram separados por HPLC com um gradiente de gua desionizada e acetonitrilo acidificados com 0 1 de TFA A separa o foi monitorizada a 220 nm Os p ptidos que apresentavam melhor resolu o cromatogr fica foram liofilizados e submetidos a sequencia o qu mica 122 A sequencia o do ADN respeitante codifica o da Dsv foi efectuada com recurso a reac es de PCR para amplifica o do
159. lophila wadsworthia Laue et al 2001 tendo sido igualmente encontradas enzimas deste tipo em organismos hiperterm filos pertencentes ao reino Archea nomeadamente nos Archaeoglobus profundos Larsen et al 1999 e Archaeoglobus fulgidos Dahl et al 1993 Existem ainda alguns organismos que possuem dSiRs que catalisam a reac o oposta oxida o do sulfureto a sulfito no decurso dos processos de respira o oxidativa como o caso da bact ria fototr fica Chromatium vinosum Schedel et al 1979 e da quimiolitotr fica exclusiva Thiobacillus denitrificans Schedel et al 1975 estas enzimas s o por vezes referidas na literatura com SiRs reversas rSiRs Quatro tipos distintos de dSiR foram isolados at ao momento a desulfoviridina Dsv que ser alvo de descri o pormenorizada nas sec es seguintes a desulforubidina Lee et al 1973 Moura et al 1988 Dervartanian 1994 Larsen et al 2000 a desulfofuscidina Hatchikian amp Zeikus 1983 Hatchikian 1994 e o P582 Trudinger 1970 Akagi 1983 embora cada uma com um grau de caracteriza o bastante vari vel Ainda que diferindo nas suas propriedades espectrosc picas mobilidades electrofor ticas e propriedades redox todas as dSiR caracterizadas at ao momento apresentam para al m dos grupos prost ticos caracter sticos das SiR pelo menos duas cadeias polipept dicas com um arranjo estrutural de configura o 02 2 Os genes que codificam estas duas subunidade
160. m que a Dsv 2 2 promova a redu o n o de 6 mas sim de 4 electr es do sulfito sendo o intermedi rio assim formado S transferido para a DsrC formando um persulfureto A DsrC dissocia se ent o da Dsv e reduz o persulfureto libertando H5S e oxidando se com a forma o de uma ponte persulfureto entre as ciste nas Cysy93 e Cysy104 114 A DsrC oxidada pode ent o regenerar se por redu o no complexo membranar DsrMKJOP o qual possui uma subunidade catal tica citoplasm tica DsrK que cont m um centro FeS cuja fun o putativa consiste precisamente na redu o de liga es persulfureto Existe por m uma discrep ncia entre o mecanismo proposto e a estrutura tridimensional do complexo A interac o entre a Cysy104 e o sirohemo n o l bil Trata se de uma liga o covalente S C que dificilmente permitiria o tipo de mecanismo indicado Embora este tipo de liga o n o seja in dito poderia tratar se de um artefacto resultante da oxida o da prote na aquando da sua purifica o Contudo cristais obtidos a partir de Dsv purificada anaerobicamente tamb m apresentaram esta caracter stica estrutural Oliveira e tal 2008 N o se tratando de um artefacto de purifica o levanta se ainda a hip tese de esta liga o ser resultado de um artefacto da cristaliza o Para al m disso n o existe ainda uma estrutura resolvida para a Dsv na forma reduzida n o sendo portanto poss vel determinar se ocorrem ou n
161. manancial de sapi ncia que generosamente distribui a quem procura o seu aux lio Assumindo por diversas vezes responsabilidades que n o lhe s o de todo imput veis Devo lhe grande parte do que aprendi na bancada e muito mas mesmo muito mais minha fam lia pelo apoio incondicional que sempre me foi concedido pelas minhas aus ncias e presen as conturbadas pelos sacrif cios impostos pelas minhas escolhas M e Ricardo sem voc s n o teria conseguido Av Quim que alegria seria partilhar este momento convosco Ana Lu sa meu amor tens mais horas de trabalho de bancada que muitos finalistas de Licenciatura obrigada pela tua colabora o mesmo que involunt ria Agrade o Funda o para a Ci ncia e a Tecnologia a Bolsa de Doutoramento SFRH BD 22800 05 co financiada pelo Programa Operacional da Ci ncia e Inova o POCT e pelo Fundo Social Europeu Resumo O trabalho apresentado na presente disserta o tem por tema central a constru o de biossensores enzim ticos e electroqu micos espec ficos para nitrito e sulfito baseados respectivamente nas redutases do nitrito cdi NiR de Marinobacter hydrocarbonoclasticus e do sulfito desulfoviridina de Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774 como elementos de reconhecimento biol gico Apesar da estrutura cristalogr fica da cd NiR n o ter sido conseguida a an lise da sequ ncia de res duos de amino cidos e a simula o da respectiva es
162. meadamente viscosidade condutividade hidrofobicidade e resist ncia t rmica as quais dever o ser equacionadas de acordo com o elemento de reconhecimento biol gico analito e condi es de an lise matriz a que o sensor se destina Contudo tamb m pr tica comum proceder modifica o das pastas comerciais com a Incorpora o de aditivos espec ficos para determinadas aplica es Neste cap tulo destaca se a incorpora o de mediadores artificiais e mais recentemente mediadores biol gicos e at os pr prios elementos de reconhecimento biol gico numa tentativa evidente de produzir sistemas verdadeiramente integrados e de prepara o ainda mais simples passo nico Para esse efeito t m sido utilizadas com sucesso pastas de carbono contendo grafite sol gel as quais reduzem os problemas resultantes de lixivia o dos aditivos e permitem o encapsulamento das biomol culas protegendo as contra a desnatura o provocada pelos processos de prepara o dos SPEs nomeadamente as altas temperaturas e tratamentos mec nicos A inclus o de aditivos fotopolimeriz veis e tamb m uma abordagem recente que visa atingir um objectivo semelhante Neste caso pretende se modificar o processo de fabrico para que esta ocorra em condi es mais suaves de forma a preservar a actividade do elemento de reconhecimento biol gico quando incorporado na pasta Tudorache amp Bala 2007 Barry et al 2009 Metters et al 2011 22 Usualmente
163. melhan a vem refor ar a valida o da quantifica o realizada pelos dois m todos espectrofotom tricos 132 II 4 2 3 Co Factores A quantidade de ferro total presente na Dsv foi estimada em 17 4 tomos de Fe por mol cula de prote na e a determina o do teor em ferro l bil resultou em 17 2 tomos de Fe por mol cula de Dsv Estes resultados s o concordantes com dados anteriores cuja interpreta o indicou a presen a de dois sirohemos dos quais cerca de 80 na forma de sirohidroclorina e quatro centros 4Fe4S por mol cula tal como foi descrito para as prote nas de D gigas Moura et al 1988 D desulfuricans Essex 6 Steuber et al 1995 e D vulgaris Marrit amp Hagen 1996 A resolu o da estrutura cristalina da desulfoviridina de Desulfovibrio vulgaris veio contudo provar que a interpreta o dos resultados obtidos neste trabalho e trabalhos precedentes n o se encontrava correcta A prote na deste organismo cont m na realidade dois sirohemos duas sirohidroclorinas e oito centros 4Fe4S perfazendo um total de 34 tomos de ferro por mol cula O facto de este valor corresponder a exactamente o dobro do que foi calculado neste trabalho conduziu suspei o da ocorr ncia de um erro grosseiro no c lculo da concentra o de prote na utilizada na realiza o dos ensaios Contudo a quantifica o de prote na realizada pelo m todo do BCA foi confirmada pelo m todo de Lowry e atrav s de
164. mencionadas tornam o estudo da SAMs particularmente promissor nas reas de preven o de corros o fabrico de nanodispositivos para aplica o em sistemas inform ticos implantes m dicos e sistemas de drug delivery e claro na constru o de sensores Love et al 2005 Vericat et al 2005 18 2 3 1 2 Aplica o em Biossensores A aplica o de SAMs em dispositivos biossensoriais contempla n o s a constru o de biossensores enzim ticos mas tamb m biossensores de cidos nucleicos baseados na hibrida o de DNA e imunossensores reconhecimento anticorpo antigene A modifica o de SAMs atrav s da imobiliza o de elementos de reconhecimento biol gico ERB com o objectivo de construir biossensores pode ser atingida atrav s de diversas estrat gias de acordo com o dispositivo que se pretende desenvolver e o tipo de biomol cula em causa A forma mais simples de modifica o destas estruturas consiste na adsor o f sica baseada em interac es electroest ticas entre cargas presentes na superf cie de uma SAM contendo grupos terminais i nicos e a biomol cula de acordo com a distribui o superficial de cargas desta ltima A correcta selec o do tipo de SAM e das condi es experimentais essencialmente pH em que a adsor o ocorre pode inclusivamente permitir modular a orienta o espacial das biomol culas potenciando assim um melhor desempenho do biossensor figura 1 9 Fig 1 9 Dia
165. mento de Qu mica e Bioqu mica da Faculdade de Ci ncias da Universidade de Lisboa pela prepara o e aquisi o das imagens de AFM e pelos ensinamentos ministrados no campo da SAMs Doutora Elena Jubete da CIDETEC Espanha pelo seu apoio t cnico e envolvimento pessoal no desenvolvimento do biossensor electroqu mico espec fico para nitritos baseado na co imobiliza o da cd NiR e do cit cs552 Engenheira S nia Jorge pelo trabalho de optimiza o das condi es de prepara o dos el ctrodos na qual se baseou o desenvolvimento do biossensor electroqu mico espec fico para nitritos baseado na co imobilizac o da cd NiR e do cit cssz O seu apoio entusiasmo e dedica o foram preponderantes para o sucesso deste projecto Doutora Marta Carepo pela preciosa ajuda e instru o que me forneceu no dom nio da biologia molecular e que permitiu a sequencia o da desulfoviridina de Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774 A Doutora Smilja Todorovic do Laborat rio de espectroscopia Raman do Instituto de Tecnologia Qu mica e Biol gica da Universidade de Lisboa pela preciosa colabora o da qual resultou o estudo da cdjNiR de Marinobacter hydrocarbonoclasticus por espectroscopia de resson ncia Raman e resson ncia Raman amplificada por superf cie A Professora Doutora Maria Jo o Rom o por me facilitar o acesso ao seu laborat rio e permitir a realiza o dos ensaios preliminares de cristaliza o da desulfoviridina
166. national 116 Os reagentes utilizados na prepara o dos g is para electroforese e os marcadores de massa molecular Broad Range 7 3 a 211 8 kDa foram adquiridos Bio Rad Os reagentes para a quantifica o de prote na s o provenientes de um kit para quantifica o pelo m todo do BCA Pierce A albumina de soro bovino BSA utilizada como padr o da Sigma Aldrich As solu es padr o utilizadas em ICP AES foram preparadas por dilui o de uma solu o m e adquirida Reagecom 1 3 1 2 Determina o da Estrutura Prim ria A digest o da prote na para a sequencia o de p ptidos foi realizada com tripsina de p ncreas bovino Roche Os eluentes para a separa o cromatogr fica dos p ptidos foram constitu dos por gua desionizada acetonitrilo E Chromasolv HPLC grade da Sigma Aldrich e cido trifluoroac tico TFA N Terminal Sequencing Reagent Applied Biosystems As reac es de Polymerase Chain Reaction PCR para amplifica o do ADN foram realizadas recorrendo a primers fornecidos pela Sigma e polimerase de ADN Tag DNA Polymerase da Amersham Biosciences Para as electroforeses em gel de agarose recorreu se a marcadores GeneRuler 100bp Plus DNA Ladder de 3000 a 100 pares de bases da Fermentas e ao intercalador de ADN SyBr Safe DNA Gel Stain fornecido pela Invitrogen A purifica o dos fragmentos de ADN foi realizada recorrendo a um kit de purifica o da QI Aquick II 3 1 3 Ele
167. ndo co imobilizado com a cd NiR 100 uM numa matriz de 50 PVA 48h de polimeriza o num CPSPE Experi ncias realizadas em 150 mM KCl 50 mM tamp o MES pH 6 3 como electr lito de suporte A Voltamogramas c clicos B Rela o linear entre a corrente do pico cat dico e a velocidade de varrimento r 0 992 O potencial formal Eo foi estimado em 254 2 mV vs NHE valor semelhante ao reportado para a mesma prote na em solu o Lopes et al 2001 A depend ncia linear entre a intensidade das correntes dos picos cat dicos e as velocidades de varrimento fig I 30B indica que a resposta independente do transporte de massa 55 A an lise da resposta do sensor em condi es saturantes de substrato 2 mM permitiu determinar a constante de velocidade de segunda ordem entre os citocromos css e cd O valor obtido 9 9 x 10 M s 1 2 ordens de grandeza inferior ao reportado para o mesmo par de prote nas em solu o 4 1 x 10 M s demonstrando assim que a matriz de PVA influencia de forma significativa a efici ncia do biossensor Por m a natureza da contribui o da matriz para a diminui o da constante de velocidade de transfer ncia electr nica intermolacular n o se encontra totalmente clarificada Uma vez que o processo de polimeriza o pass vel de provocar altera es conformacionais nas prote nas procurou se realizar uma avalia o da integridade estrutural do hemos ap s o encapsulamento Para t
168. ndo maioritariamente cd NiR Ap s nova di lise repetiu se o segundo passo cromatogr fico resultando na obten o da frac o final de enzima a uma for a i nica correspondente a 400mM de eluente A prote na purificada foi concentrada a 375uM 46 mg ml aliquotada e armazenada a 20 C em 50mM Tris HCl pH 7 6 Os g is resultantes das electroforeses foram corados rotineiramente com Azul Brilhante de Coomassie R 250 Amersham 1999 Os g is destinados an lise da frac o contendo cit c55 foram sujeitos ao m todo de colora o de hemos de acordo com o procedimento descrito por Goodhew et al 1986 A concentra o de prote na foi determinada pelo m todo do cido biciconinico BCA 1 3 3 2 Cristaliza o da cd NiR A prospec o das condi es de cristaliza o da cdi NiR de M hydrocarb por difus o de vapor foi realizada com recurso a um amplo leque de solu es precipitantes screens dispon veis comercialmente A exposi o da prote na aos agentes precipitantes foi efectuada pela t cnica de sitting drop Para a prote na nativa foram realizados ensaios em ambiente aer bio numa gama de concentra es compreendida entre 10 e 45 mg ml 80 a 375 uM a 4 C e a 20 C Em condi es anaer bias procurou se cristalizar a prote na reduzida com ditionito a 23mg ml 187 5 uM e temperatura ambiente 25 C Procurou se aperfei oar os cristais obtidos quer atrav s de ensaios com ligeiras altera es
169. ns utilizado na limpeza dos el ctrodos de trabalho da Branson modelo 1510 As medi es foram realizadas num potenciostato Autolab PSTAT 12 da Eco Chimie controlado atrav s do software GPES 4 9 1 3 3 Procedimentos Experimentais 1 3 3 1 Purifica o e Caracteriza o Bioqu mica da redutase do sulfito dissimilat ria Desulfoviridina A redutase do sulfito dissimilat ria tamb m conhecida por desulfoviridina Dsv foi purificada da bact ria redutora de sulfato Desulfovibrio desulfuricans A TCC 27774 com base no m todo descrito por Moura et al 1988 ao qual se efectuaram modifica es de acordo com o esquema de purifica o apresentado na figura II 13 As c lulas de D desulfuricans ATCC 27774 foram crescidas na Unit de Fermentation do LCB CNRS em Marselha Fran a A frac o sol vel foi obtida a partir do extracto bruto de acordo com o descrito por Rivas et al 2009 O extracto sol vel foi submetido a um protocolo de purifica o composto por tr s passos cromatogr ficos Todas as etapas do processo foram realizadas em meio aer bio e a 4 C A frac o sol vel foi submetida a di lise durante cerca de 12 horas em 10 mM tamp o Tris HCl pH 7 6 e aplicada numa coluna DE 52 equilibrada na mesma solu o As prote nas foram elu das com um gradiente 10 a 500 mM Tris HCl pH 7 6 A frac o composta maioritariamente por Dsv foi elu da a uma for a i nica compreendida entre 300 e 350 mM A frac o f
170. nte nos voltamogramas c clicos apresentados na figura 1 36 verifica se particularmente a pH 5 uma altera o na forma e na posi o do pico de redu o do primeiro para o segundo ciclo no qual aparenta surgir uma desconvolu o do pico de redu o fig L 36A e 1 36D Aliando a esta observa o a tend ncia verificada para o aumento da Wis com o aumento de v para todos os valores de pH poss vel sugerir que o valor at pico obtido para Wi adv m de uma contribui o de ambos os hemos c e dj na transfer ncia electr nica de um electr o para a prote na O rearranjo da equa o 1 13 com vista normaliza o dos valores de intensidade de corrente Ip T HEART foi utilizado para tra ar os gr ficos de Ipc normalizado vs v que se apresentam na figura 1 39 0 0E 00 _ 5 0E 06 Ww SS 1 0E 05 BEN SN 1 5E 05 2 0E 05 2 5E 05 Ipc T Amol cm 3 0E 05 3 5E 05 4 0E 05 0 00 0 20 0 40 0 60 0 80 1 00 1 20 Velocidade de Varrimento Vs Fig 1 39 Rela o entre as intensidades de corrente e as velocidades de varrimento dos picos cat dicos e pH 5 y 3 x 10 x 9 x 107 R 0 9923 m pH 6 y 3 x 10x 3 x 107 R 0 9996 pH 7 y 3 x 10 x 6x 107 R 0 9979 pH 8 y 3 x 10 x 4x 107 R 0 9994 e pH 9 y 3 x 10 x 2 x 107 R 0 9999 De acordo com os resultados da figura 1 39 verifica se que existe efectivamente uma rela o de pr
171. nte uA NC 0 4 0 2 0 0 0 2 0 4 0 6 0 8 Potencial V vs NHE Fig 1 35 Selec o do modificador de superficie Voltamogramas c clicos tra ados com o el ctrodo de trabalho modificado com diferentes SAMs e cd NiR adsorvida Os voltamogramas c clicos foram tra ados a 20 mVs em 50 mM tamp o MES pH 6 3 com 150 mM KCL o el ctrodo de trabalho foi modificado com SAMs de Cs MPA MUA MUOH e HT Os voltamogramas c clicos apresentados na figura 1 35 demonstram que no el ctrodo modificado com SAMs de HT e MUOH n o existe resposta da cd NiR Por m n o foi poss vel determinar se tal ocorreu devido prote na n o adsorver nas superf cies modificadas ou se adorvendo n o o fez com uma orienta o favor vel troca de electr es com o el ctrodo de trabalho Para as SAMs de Cs e MPA tamb m n o foi observada resposta da enzima Salienta se ainda o facto de por serem ti is de cadeia curta cuja organizac o em SAM resulta num menor bloqueio da superf cie a modifica o do el ctrodo com estes dois compostos produz voltamogramas com uma maior corrente capacitiva A comunica o directa entre a prote na e o el ctrodo foi atingida atrav s de uma interac o de natureza electrost tica quando a modifica o foi realizada com cido 11 mercapto undecanoico MUA um tiol de cadeia longa 11C e grupo terminal cido carbox lico De acordo com os mapas de potencial coulombiano apresentados n
172. o A segunda diferen a relaciona se com a liga o da subunidade y ao complexo ap Na Dsv simulada a subunidade y alvo de uma rota o que a aproxima da subunidade p Uma vez mais alerta se para o facto de o algoritmo de modela o se basear neste caso em princ pios de complementaridade de forma n o considerando as interac es de natureza electroest tica ou outras 139 Real a se ainda que a natureza da liga o entre as subunidades B e y foi um dos aspectos mais surpreendentes descobertos com a resolu o da estrutura cristalogr fica da Dsv de D vulgaris Oliveira et al 2008 Os autores prop em que a proximidade detectada entre o N terminal da subunidade y e o sirohemo da subunidade B implica o envolvimento da subunidade y no processo catal tico Mas tal como descrito anteriormente na sec o II 2 2 3 2 existe uma liga o covalente S C entre a ltima ciste na do N terminal da subunidade y e o sirohemo da subunidade D que contraria a proposta apresentada O tema continua assim aberto a discuss o II 4 5 Electroqu mica Atendendo baixa actividade enzim tica da Dsv e ao facto de os sirohemos se encontrarem fortemente embebidos na estrutura proteica com uma dist ncia m nima para a superf cie de 14 A Oliveira et al 2008 era espect vel que as tentativas para obter um sinal resultante da interac o directa entre a prote na e um el ctrodo de trabalho n o conduzissem a resultados satisfat rio
173. o altera es conformacionais significativas entre os estados nativo e activo da enzima Em todo o caso a viabilidade do mecanismo proposto n o est posta em causa A continua o do seu estudo ir certamente revelar aspectos que clarifiquem finalmente o mecanismo da redu o do sulfito catalisada pela desulfoviridina 115 II 3 Materiais e M todos II 3 1 Materiais e Reagentes II 3 1 1 Purifica o e Caracteriza o Bioqu mica da redutase do sulfito dissimilativa Desulfoviridina O tris hidroximetil aminometano Tris base C H NOs 121 14 emol gt 99 9 o cido 3 ciclohexilamino 1 propanosulf nico CAPS CH NOsS 221 32 emol gt 98 O n dodecil sulfato de s dio SDS CHs CH OSOsNa 288 4 emol gt 99 o formalde do CHO 30 03 emol 37 o gluteralde do OHC CH 4CHO 100 12 emol 25 a hidroxilamina NH OH HCI 69 49 emol 98 o acetato de am nia CH3CO NH 4 77 08 emol 98 a 2 4 6 tripiridil s triazina TPTZ Ci sH 2N6 312 33 emol 2 98 a glutationa na forma reduzida C 9H 7N30 6S 307 3 emol 98 100 e o nitrato de prata AgNOs 169 87 emol gt 99 8 foram fornecidos pela Sigma O cido clor drico HCl 36 46 emol 37 O acetato de s dio CH3CO Na 3H5O0 136 08 emol gt 99 5 o hidr xido de s dio NaOH 40 00 emol gt 99 o cido ac tico CH CO H 60 05 emol gt 99 8 e o etanol CH CH 0H 46 07 emol gt 99 8 s o da Riedel deHa n O
174. o estruturas e sequ ncias retirados de bases de dados oficiais referem se s bact rias Pseudomonas nautica e ou Marinobacter aquaeolei Tal acontece porque esta bact ria tem sido alvo de sucessivas revis es taxon micas as quais s o de forma resumida expostas em seguida A bact ria desnitrificante marinha Marinobacter hydrocarbonoclasticus M hydrocarb Mh um aer bio facultativo foi descrita pela primeira vez por Gauthier et al em 1992 tratando se da nica esp cie pertencente a um novo g nero Marinobacter Este g nero visava englobar bact rias marinhas pertencentes subclasse c das Proteobact rias as quais possu am uma versatilidade metab lica que lhes conferia a capacidade de utilizar substratos considerados recalcitrantes nomeadamente hidrocarbonetos como fontes simult neas de carbono e energia M rquez amp Ventosa 2005 Num estudo taxon mico que estabeleceu a rela o filogen tica entre 50 estirpes diferentes de bact rias essencialmente marinhas publicado por Kita Tsukamoto et al em 1993 referia o facto de a Pseudomonas nautica esp cie caracterizada por Baumann et al em 1972 se encontrar claramente separada das esp cies pertencentes ao g nero Pseudomonas terrestres Em 1998 Sproer et al conclu ram atrav s de uma abordagem taxon mica polif sica que na realidade a Marinobacter hydrocarbonoclasticus era a Pseudomonas nautica considerando a classifica o como Mh mais correcta J em
175. o exemplo mais proeminente da comercializa o deste tipo de dispositivos o biossensor para monitoriza o pessoal da glucose utilizado por pacientes com diabetes a qual representa um mercado anual global estimado em um bili o de d lares americanos A produ o de sensores de ltima gera o e sistemas port teis que permitem a an lise directa de amostras no seu ambiente natural deve se em grande parte incorpora o de SPEs nesse tipo de dispositivo A recente possibilidade de conceber e produzir SPEs de forma r pida e econ mica e incorpora los numa variedade de biossensores altamente sens veis aumentou significativamente o grau de interesse a n vel industrial cl nico e ambiental expandindo a possibilidade de implementa o de sistemas desenvolvidos em laborat rio em aplica es da vida real Os SPEs n o s apresentam uma excelente rela o custo benef cio como tamb m satisfazem as necessidades de elevada reprodutibilidade e sensibilidade inerentes a um sensor eficiente A versatilidade dos SPEs tamb m altamente ben fica para as reas da investiga o A capacidade de modificar os el ctrodos com facilidade seleccionando a composi o das tintas a configura o do dispositivo ou atrav s de modifica es posteriores permite a produ o de el ctrodos altamente selectivos e finamente calibrados para um determinado analito alvo sendo que actualmente muitos laborat rios de investiga o possuem instala e
176. o abe ala ORE RR RUMBA ME dtu vii 10 11 11 12 13 13 14 17 17 17 19 21 21 22 1240 citocromo cd CA NUR ass sausssanis Tec e uev NEES EE 2 4 1 Ocorr ncia e Fun o Biol oeca erre er asesseseeceseeeees EE HOO U ui dan once sate asa UE RE GAR padded eas uu Goa ee NECI I 2 4 3 A cdjNiR de Paracoccus pantotrophus c cssssseeeee eene I 2 4 4 A cdiNiR de Pseudomonas aeruginosa c cessssse eee 2 4 5 Processos de Transfer ncia Electr nica ceccceeec cece eeen eee eeees 246 Parceiros FISIOL GICOS 3254249 tine erus esit tuts he dudas ti ra esas 1 2 5 Pseudomonas nautica Marinobacter aquaeolei Marinobacter Ty ATOCATOONOCIGSUCUS oce ates ea baawsaseeeton UTER NEP E COS oen e Siad oras IRI DES L3 Materiais e Metodos assi VEI ID NERVIS UE CE ES DER 1 3 1 Materiais e Reagentes 3 1 1 Purifica o dos ocioso C552 SCH BEE Pelt ee UE EEN 3 2 Equipamentos E A 3 2 1 Purifica o dos citocromos css2 e Cl 52 2 ETeGtFOQUITDIC donus Doct ooi dto eta theta t bte ce a 3 2 3 Espectroscopia de Resson ncia Raman ccce 324 Microscopia de for a Atomica ii cumes toa e a be pan aaa gas 1 3 3 Procedimentos Experimentals sssssssscssssssssssssssssssssssssssssssssssscsssssssc s ane i 3 3 1 Purifica o dos citocromos css e Cl 3 3 2 Cristaliza o da cd NiR 3 3 3 Constru o de um Biosensor EE specifico paa Nitritos Baseado na Acti
177. o consumido No primeiro caso o HO gerado na oxida o do sulfito a sulfato reoxida se directamente na superf cie de um el ctrodo de carbono v treo GC revestido com platina Sendo o aumento de corrente medido directamente proporcional quantidade de sulfito adicionada ao sistema No segundo caso o sinal produzido pela redu o directa do O na superf cie do GC modificado com uma camada de Hg sofre uma diminui o resultante da actividade da enzima que na presen a de sulfito consome parte do oxig nio dispon vel Uma abordagem bastante diferente foi proposta por Zhao et al 2006 Estes autores comparam o valor da corrente gerada pela oxida o inespec fica dos diversos componentes da amostra com o mesmo valor ap s a amostra passar por uma camada de SO mobilizada A enzima oxida o sulfito presente na amostra e a diferen a entre correntes medidas proporcional 2 ao teor da amostra em SO atenuando assim os efeitos de matriz II 2 2 Redutases do Sulfito Para al m das oxidases do sulfito empregues nos biossensores acima descritos existem tamb m as redutases do sulfito Uma classe de enzimas que como o pr prio nome indica catalisa a reac o de redu o do SCH a sulfureto de acordo com a seguinte equa o SO 6H 6e S 3H 0 2 4 Esta redu o um dos processos fundamentais que possibilita a utiliza o biol gica do enxofre sendo uma das tr s reac es conhecidas a n vel bi
178. o seu parceiro fisiol gico o citocromo css indicam que a constante catal tica para a redu o do oxig nio Centola et al 2006 aproximadamente 4 vezes inferior ao valor obtido para a reac o com o nitrito Lojou et al 2003 Assim atrav s da manipula o da escala de tempo aumento da velocidade de varrimento poderia ser poss vel visualizar a reac o electroqu mica passo da figura 1 28 sem interfer ncia da reac o enzim tica com o O passo 3 da figura 1 28 De facto ao aumentar se a velocidade de varrimento de 5 para 50 mVs foi poss vel desligar esta via catal tica fig 1 33A Os voltamogramas c clicos do cit css2 obtidos na presen a de cd NIR a velocidades de varrimento baixas utilizado uma solu o de electr lito de suporte n o desarejada e sem nitrito apresentam uma forma sigmoidal caracter stica sintom tica da redu o electrocatal tica do oxig nio dissolvido 60 Por m um voltamograma c clico tra ado nas mesmas condi es experimentais mas a Ir ras PT 50 mVs n o apresenta o mesmo aspecto catal tico Intensidade de Corrente uA 0 2 0 1 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 Potencial V vs NHE Intensidade de Corrente uA 0 2 0 1 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 Potencial V vs NHE Fig 1 33 Voltamogramas c clicos tra ados com o biossensor na presen a de oxig nio dissolvido ou nitrito registados a 5 mVs linha tracejada as correntes foram amplificadas 10 vezes para
179. ogaritmo da velocidade de varrimento Os pontos experimentais representados correspondem a pH 5 4 pH 6 A pH 7 m pH 8 e x pH 9 Tabela I 7 Constantes de transfer ncia electr nica heterog nia k da cd NiR a diferentes valores de pH 71 No caso da constante de transfer ncia electr nica verificou se que esta varia linearmente com o aumento do pH como se pode verificar pelo gr fico da figura I 41 Facto que aponta para a ocorr ncia de uma reac o qu mica acoplada transfer ncia electr nica mais concretamente uma transfer ncia prot nica L ger amp Bertrand 2008 2 00 1 60 e a 1 20 eb e 0 80 0 40 0 00 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 10 0 Fig 1 41 Rela o entre log Ks e pH para os potenciais dos picos cat dicos I 4 6 2 3 Reac o Qu mica Acoplada Transfer ncia de Prot es Tendo sido verificada a exist ncia de uma rela o linear entre os Epc e o pH para todas as V estudadas fig 1 42 foi calculado o n mero de prot es transferidos no decurso do processo 0 20 0 10 0 00 Epc V vs NHE pH Fig I 42 Rela o entre Epc e pH para algumas das v estudadas Os pontos experimentais representados correspondem a e 5 mVs A 50 mVs 4 250 mVs e m 1 Vs 72 Assumindo que a varia o m xima de Ep por unidade de pH fornecida pela rela o 1 15 onde m representa o n mero de H transferidos L ger amp Bertrand 2008 procedeu se
180. oi dialisada durante cerca de 12 h em 10 mM Tris HCl pH 7 6 centrifugada durante 1 hora a 19000 g e carregada numa coluna Source 15Q Procedeu se elu o sob press o com um gradiente 0 01 a 1 M Tris HCl pH 7 6 seguida espectrofotometricamente a 280nm A frac o elu da a aproximadamente 250 mM Tris HCl foi novamente dialisada em 300 mM tamp o Tris HCl pH 7 6 e ap s nova centrifuga o aplicada em aliquotas de 5ml numa coluna Superdex 200 equilibrada em 300 mM tamp o Tris HCl pH 7 6 sendo a elui o realizada sob press o com solu o tamp o de composi o id ntica 120 As frac es obtidas ap s as sucessivas Infec es foram analisadas em termos de pureza atrav s de electroforese SDS PAGE e espectrofotometria tendo se procedido reuni o das frac es que apresentavam graus de pureza semelhantes A prote na purificada foi concentrada aliquotada e armazenada a 20 C Frac o Sol vel Di lise 12h 10mM Tris HCl pH 7 6 DE 52 10mM Tris HCl pH 7 6 10 500 mM Tris HCl pH 7 6 300 350 mM Tris HCl pH 7 6 Di lise 12h 10mM Tris HCl pH 7 6 Centrifuga o 1h 19 000g Source 15Q 10mM Tris HCl pH 7 6 0 01 1M Tris HCl pH 7 6 250 mM Tris HCl pH 7 6 Di lise 12h 300mM Tris HCl pH 7 6 Centrifuga o 1h 19 0009 Superdex 200 300mM Tris HCl pH 7 6 Concentrac o YM 30 Dsv RP 4 8 Fig 11 13 Esquema de purifica o para a Desulfovir
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183. ol gico que implicam uma redu o de seis electr es sendo as restantes a redu o do nitrito a am nia catalisada pelas nitrito redutases NiRs e a convers o do azoto molecular em am nia pela nitrogenase 104 A redu o biol gica o nico processo capaz de gerar sulfureto a partir do sulfato em condi es de press o e temperatura ambiente sendo que os ecossistemas anaer bios compostos pelas bact rias redutoras de sulfato e outros organismos fototr ficos e quimiolitotr ficos se encontram na base do ciclo biogeoqu mico Crane et al 1995 As redutases do sulfito SiRs s o classificadas como assimilativas ou dissimilativas de acordo com a sua fun o biol gica Contudo ambas as classes possuem em comum n o s a reac o que catalisam como tamb m toda uma gama de aspectos estruturais dos quais se evidencia o denominado SNIRR sulfite and nitrite reductase repeat e a composi o do centro activo designado por sirohemo fig II 5 o qual cont m uma porfirina reduzida da classe das isobacterioclorinas denominada sirohidroclorina acoplado atrav s de uma ciste na a um centro 4Fe4S Crane amp Getzoff 1996 Fig II 5 Centro activo das SiRs A Estrutura do sirohemo Murphy et al 1974 B Mapa de densidade e estrutura do centro activo da dSiR de D vulgaris Oliveira et al 2008 C Centro activo da SIRHP de E coli Crane et al 1997 A O SNiRR consiste num conjunto de segmentos das sequ ncias
184. onhecidas at ao momento agrupadas de acordo com o produto da reac o que catalisam e com o tipo de co factores que possuem Fig I 1 Estrutura tridimensional de algumas redutases do nitrito A reduse do nitrito multih mica c de Desulfovibrio vulgaris Hildenborough complexo NrfA NrfH gt Rodrigues et al 2006 PDB 2J7A B redutase do nitrito de espinafre Swamy et al 2005 PDB 2AKJ C redutase do nitrito de cobre proveniente de Achromobacter cycloclastes tr mero Adman et al 1995 PDB INIE D citocromo cd de Pseudomonas aeruginosa d mero Nurizzo et al 1997 PDB INIR A caracteriza o estrutural reactividade e fun o biol gica deste tipo de enzimas encontra se revista por diversos autores tais como Richardson amp Watmough 1999 Moura amp Moura 2001 e Einsle amp Kroneck 2004 entre outros Redutases Produtoras de Am nia A reac o de redu o de nitrito em seis electr es conducente forma o de am nia eq 1 8 pode ser catalizada por duas NiR NO 8H 6e NH 2H 0 1 8 As citocromo c redutases do nitrito ccNiRs dissimilativas isoladas de bact rias redutoras de sulfato ou enxofre s o enzimas multih micas envolvidas num processo respirat rio que representa um ramo importante do ciclo biol gico do azoto As ccNiRs podem ainda utilizar o xido n trico NO e a hidroxilamina NH2OH como substratos Costa et al 1990 Silveira et al 2010A S o normalmente isola
185. onte de plasma indutivamente acoplado ICP AES foi realizada num dispositivo da Jobin Y vin Horiba II 3 2 2 Determinac o da Estrutura Prim ria A sequencia o do N terminal das tr s subunidades da Dsv foi num sistema de sequencia o Procise Sequencing System da Applied Biosystems composto por um sequenciador modelo 491 acoplado a um detector UV Vis modelo ABI785A e controlado IM e SequencePro Data Analysis Application v2 1 atrav s dos programas Procise A separa o dos p ptidos foi feita por cromatografia l quida de alta resolu o HPLC num cromat grafo da Hitachi bomba L 7100 detector UV L 7400 e controlador D 7000 equipado com uma coluna de fase reversa C 18 Lichrocart Purospher Star A lofiliza o das frac es resultantes foi realizada num Freeze Dryer Modulyo Pirani 10 da Edwards As reac es de PCR foram efectuadas num termal cycler MyCycler H da Bio Rad As electroforeses em gel de agarose foram realizadas num sistema miniRun GE 100 da Bioer Technology co Ltd 119 1 3 2 3 Electroqu mica O el ctrodo de trabalho de carbono v treo GCE glassy carbon electrode 3 mm o el ctrodo de refer ncia el ctrodo saturado de Calomelanos SCE saturated calomel electrode 24 2mV vs NHE normal hydrogen electrode e o contra el ctrodo de platina Pt foram fornecidos pela Radiometer As c lulas electroqu micas modelo 6 14 15 210 foram adquiridas Methrom O banho de ultra so
186. onveniente desta estrat gia o elevado potencial de trabalho necess rio forma o da esp cie radicalar reactiva ca 0 6 V vs SCE e monitoriza o da reac o catal tica gt 0 7 V vs SCE que eventualmente potenciam reac es de oxida o inespec ficas em amostras reais Geng et al 2008 Chen et al 2009 Um conceito diferente foi proposto recentemente por Chen et al 2008 Estes autores conceberam um sistema de transdu o complexo que associa as duas enzimas dependentes de H20 HRP e Cat de forma sequencial Na presen a de nitrito a actividade de decomposi o do HO pela Cat inibida aumentando assim a quantidade de per xido dispon vel para ser reduzido pela HRP ligada ao el ctrodo A inespecifidade destas prote nas h micas contudo a principal desvantagem dos sistemas deste tipo dado que condiciona fortemente a selectividade da determina o Atendendo exist ncia de enzimas muito mais selectivas as prote nas apresentadas nesta sec o n o s o de todo recomendadas para a constru o de um biossensor selectivo de nitritos 1 2 2 2 Biossensores Amperom tricos e ou Voltam tricos Baseados em Redutases do Nitrito As redutases do nitrito NiRs s o candidatas inatas para desempenhar a fun o de elemento de reconhecimento biol gico em biossensores de nitrito Na figura I 1 encontram se representadas as estruturas tridimensionais de enzimas pertencentes s quatro classes de NiRs rec
187. oporcionalidade directa entre Ipc e v para todos os valores de pH No caso dos picos an dicos n o se verificou a exist ncia de uma rela o linear entre Ipa e v R 0 98 contudo ao aplicar os valores das correntes dos picos an dicos ao modelo alternativo prote na em solu o o qual prev a exist ncia de uma rela o linear entre Ip e Vv os resultados foram ainda mais dispares com coeficientes de correla o inferiores a 0 95 Assim conclui se que o modelo de esp cie electroactiva adsorvida foi correctamente aplicado ao sistema em estudo 70 I 4 6 2 2 Coeficiente de Transfer ncia de Carga a e Constante de Transfer ncia Electr nica Heterog nea k Tendo sido verificada a exist ncia de uma rela o de proporcionalidade directa encontrada entre os Epc e log v fig 1 40 foi poss vel realizar o c lculo de a e k para o processo cat dico com base na equa o 1 14 Zhao et al 2002 Por aplica o desta equa o a cada uma das rectas apresentadas na figura 1 40 tra adas a valores de pH diferentes obteve se para a o valor m dio de 0 54 0 02 e para k os valores apresentados na tabela 1 7 RT o 1 a nFE c log k alog l o I allos a log 1 14 el alogli a 1 a logla 1oe A TE a14 0 20 0 10 Di e 0 00 amp Z ES gt 0 040 o Da 0 20 0 30 4 0 ES 3 0 2 5 20 1 5 1 0 log RT nFv Fig 1 40 Rela o entre os potenciais dos picos cat dicos e o l
188. oram realizados utilizando o programa ClustalW2 A simula o da estrutura tridimensional da cdjNiR de M hydrocarb foi realizada recorrendo ao Automatic Modelling Mode do Swiss Model Guex amp Peitsch 1997 Schwede et al 2003 Arnold et al 2006 e ao Mode Quick Phyre do PHYRE vers o 0 2 protein homology analogy recognition engine Kelley amp Sternberg 2009 A simula o da forma dim rica da cd NiR foi elaborada atrav s do programa SymmDock Schneidman Duhovny et al 2005 A B que realiza previs es das estruturas de complexos com simetria Cn neste caso aplicou se a restri o n 2 atrav s de acoplamentos baseados em par metros geom tricos As imagens da distribui o do potencial coulombiano na superf cie da prote na foram obtidas com recurso ferramenta Coulombic Surface Coloring existente no software UCSF Chimera vers o 1 4 assumindo 4 0 como valor da constante diel ctrica A colora o da superf cie atrav s de um mapa de potencial electrost tico foi realizada com o programa CCP4MG vers o 1 114 2 43 I 4 Resultados e Discuss o LAT Purifica o dos citocromos css cit css2 e cd cd NiR da bact ria Marinobacter hydrocarbonoclasticus estirpe 617 As frac es finais de cit cs55 e cd NiR foram analisadas por espectrofotometria de UV Vis e electroforese em gel de poliacrilamida encontrando se os resultados obtidos nas figuras 1 20 e 1 21 respectivamente A gt em
189. orrente gerada pela redu o da cd NIR decresce de modo proporcional diminui o da percentagem de MUA nas SAMs mistas independentemente do tiol seleccionado para funcionar como intercalador Tal facto indica que esta estrat gia permite reduzir a quantidade de mol culas de prote na adsorvidas na superf cie do el ctrodo tal como se pretendia tendo por m a desvantagem de as correntes geradas serem igualmente inferiores Todos os ensaios apresentados foram repetidos em solu es de electr lito contendo I mM de nitrito Por m os resultados obtidos foram semelhantes aos representados na figura I 44 n o tendo sido observadas quaisquer correntes catal ticas 74 N o se tratando de um problema de acesso do substrato existe ainda a hip tese de a prote na se encontrar adsorvida com uma orienta o desfavor vel correcta interac o com o el ctrodo de trabalho com o electr o transferido a realizar um percurso diferente daquele que ocorre na presen a do cit css enquanto parceiro redox Contudo os resultados obtidos mesmo considerando a conjuga o de todas as t cnicas empregues s o claramente insuficientes para permitir realizar uma proposta fundamentada sobre o percurso do electr o transferido para a prote na e de quais s o as altera es que a redu o provoca na mesma A 0 12 3 0 08 3 2 0 04 Q o 0 00 Ki KI Ki S 0 04 E 5 E 008 j MUOH 0 12 0 30 0 10 0 10 0 30 0 50 0 70 0 90 Poten
190. os 25 C a varia o da sensibilidade inferior a 5 fig 1 324 Encontra se reportado Lopes et al 2001 que a transfer ncia electr nica intermolecular entre os citocromos css e cd apenas pode ser observada a valores de pH inferiores a 8 0 Assim testou se a resposta do biossensor a pH 6 7 e 8 temperatura controlada a 25 C Tal como se previa ocorreu um decr scimo da sensibilidade em cerca de 30 ao transitar de pH 6 0 para pH 7 0 fig I 32B e n o foi observada resposta electrocatal tica a pH 8 0 2000 1800 1600 kel Em E oo N A gt gt Ss So c c c c ALT Amollem ALT Amol cm 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 NO7 mM NO7 mM Fig 1 32 Resposta do biossensor a nitrito em diferentes condi es de temperatura e pH Os resultados foram ajustados ao modelo de Michaelis Menten com recurso ao software GraphPad Prism v4 A Temperaturas de 15 C linha cont nua 20 C linha tracejada e 25 C linha ponteada B Valores de pH 6 0 tra o cheio e 7 0 tracejado 59 1 4 5 4 An lise de Interferentes A resposta do biossensor a potenciais interferentes foi estudada atrav s da compara o entre a magnitude da resposta catal tica na presen a de nitrito 100 uM e a obtida ap s a adi o de diferentes concentra es de uma outra esp cie qu mica O nitrato e o nitrito encontram se presentes em simult neo em numerosas matrizes tanto de natureza fisiol gica como ambiental motivo pelo qual
191. os publicados para a desulfoviridina purificada de D gigas e D vulgaris Lee et al 1971 1973 Lui et al 1994 A raz o de pureza RP Asgonm As30nm 4 8 da frac o final foi inferior obtida por Moura et al 1988 na purifica o da prote na de D gigas RP4 0 Contudo ap s observa o dos perfis electrofor ticos em condi es desnaturantes fig II 16A e nativas fig ILIOB das frac es finais concluiu se que a prote na se encontrava suficientemente pura para prosseguir o trabalho 127 A B 1 2 3 MM kDa 97 66 o o WM 45 e 20 14 Fig II 16 Linhas de g is corados com Azul de Coomasie resultantes da aplicac o de PAGE s frac es de desulfoviridina A Linhas de g is desnaturantes correspondentes a 1 frac o elu da da coluna DE 52 2 frac o elu da da coluna Source 15Q 3 frac o final elu da da coluna Superdex 200 B Linha de gel nativo correspondente frac o final As bandas referentes s tr s subunidades da Dsv foram transferidas para uma membrana de PVDF por transfer ncia electrofor tica tendo sido realizada a sequencia o qu mica do N terminal de cada uma Os resultados foram ent o comparados com as sequ ncias de Dsv de outras esp cies de Desulfovibrio nomeadamente D gigas ATCC 19364 Hipp amp Trueper 1996 n o publicado UmProtKB Swiss Prot P94694 D vulgaris Hildenborough Heidelberg et al 2004 UniProtK B Swiss Prot P45573
192. ote na do mesmo tipo que o citocromo P450 que transfere electr es do NADPH para a subunidade p Cada mol cula de SiRFP possui um local de ligac o a uma mol cula de flavina adenina dinucle tido FAD e uma mol cula de flavina mononucle tido FMN Por m quando na forma de oct mero apenas se encontram ligados quatro co factores do tipo FAD e quatro do tipo FMN A subunidade p 64kDa conhecida por SirHP hemoprote na a subunidade catal tica e a que se encontra melhor caracterizada tanto do ponto de vista espectrosc pico UV Vis EPR Mossbauer e Resson ncia Raman como estrutural com a estrutura cristalogr fica da prote na nativa resolvida em 1995 por Crane et al fig 11 6 e seguida dos complexos com substratos inibidores intermedi rios e produtos em 1997 Crane et al 1995 Crane et al 1997B Stroupe amp Getzoff 2001 106 Fig II 6 Estrutura tridimensional da SiRHP nativa na forma monom rica Crane et al 1995 PDB 1 AOP O mecanismo da redu o do sulfito catalisada pela SIRHP proposto por Crane et al 1997A encontra se esquematicamente representado na figura II 7 HoT O O 5 m a N N N N N N 2 FI xw b meo dd N N N N S S 3 Fe 2 Fe 1 s Fe 2 S 1 T S H Y 1 S KE S S 3 LS Sed Fe Fei Fe Fey SCH n s HS T HS H er H20 O ES E 2 O H HPO P J m us fn N N 3 s Fey tel Gei N N N N N N
193. permaneceu por esclarecer Contudo conhecida a elevada instabilidade da interac o electrost tica entre a prote na e a superf cie do el ctrodo torna se necess rio o aprofundamento do estudo referente s condi es de imobiliza o da enzima Tais estudos ser o teis n o s para a aquisi o de resultados de melhor qualidade pass veis de clarificar os processos de transfer ncia inter e intramoleculares protagonizados pela cd NiR sem recurso utiliza o de mediadores electr nicos como na eventualidade de ser conseguida actividade catal tica nestas condi es poder se realizar o estudo do mecanismo da reac o catal tica por via electroqu mica e assim avan ar para a constru o de um biossensor espec fico para nitritos baseado na actividade desta enzima que dispense a incorpora o do CIt C 552 83 As experi ncias de espectroscopia de Resson ncia Raman em solu o comprovaram a integridade estrutural dos co factores e a ocorr ncia das altera es conformacionais e de spin esperadas aquando a sua redu o A excita o selectiva dos hemos permitiu a identifica o de modos vibracionais caracter sticos de cada um Os ensaios de SERR permitiram a realiza o de uma titula o redox dos co factores e os resultados obtidos embora preliminares s o concordantes com os reportados na bibliografia Contudo a instabilidade da liga o da prote na ao el ctrodo de trabalho que conduziu irreprodutibilidad
194. pla protona o de um dos tomos de oxig nio do substrato e subsequente liberta o de uma mol cula de gua desidrata o 113 O mecanismo representado na figura II 11 na verdade muito semelhante ao proposto por Crane et al fig IL5 para a redu o sequencial 3x2 electr es do SC a S Contudo estes autores apresentam ainda uma proposta que visa explicar o facto de a Dsv possuir a capacidade de gerar e converter tiosulfato S O5 e tritionato 8506 De acordo com estes autores estes Intermedi rios podem formar se ap s a primeira etapa da redu o por reac o entre a esp cie ligada ao centro activo e uma segunda mol cula de sulfito que entretanto se aproxime Para al m de vi vel do ponto de vista estrutural esta explica o concordante com as observa es previamente reportadas as quais indicavam a produ o de uma maior quantidade destes compostos em condi es de excesso de substrato e pHs mais cidos No caso da enzima de D vulgaris a proximidade entre a pen ltima ciste na Cysy104 do C terminal da subunidade y ou DsrC e o anel do sirohemo conduziu Oliveira et al 2008 a proporem um mecanismo alternativo fig 11 12 no qual a DsrC surge n o como parte integrante da Dsv mas sim como seu parceiro fisiol gico HS Fig IL12 Representa o esquem tica do mecanismo proposto para a redu o do SO catalisada pela Dsv de D vulgaris Oliveira et al 2008 Estes autores prop e
195. plado a um espectr grafo de fase nica Jobin Yvon U1000 equipado com uma grelha de 1200 l mm e um detector CCD charge coupled device retro iluminado arrefecido com azoto l quido Utilizou se uma c lula de quartzo girat ria Hellma concebida propositadamente para esta finalidade e um laser i nico de kripton Coherent Innova 302 As experi ncias de SERR Surface Enhanced Resonance Raman foram realizadas numa c lula espectroelectroqu mica de concep o pr pria a qual permite a altera o do potencial de el ctrodo em simult neo com a aquisi o de espectros SERR 35 Recorreu se a el ctrodos anelares de prata que desempenham as fun es de el ctrodos de trabalho um el ctrodo de refer ncia Ag AgCl e um contra el ctrodo de Pt sendo o potencial controlado por um potenciostato PAR 263 A Os espectros de SERR foram adquiridos numa geometria de retrodispers o com recurso ao microsc pio confocal de Raman com uma objectiva de trabalho de longa dist ncia 20 x N A 0 35 1 3 2 4 Microscopia de For a At mica As imagens foram produzidas num microsc pio multimodal Nanoscope IIIa Digital Instruments Veeco equipado com sondas de xido de sil cio Tap300 BudgetSensors 1 3 3 Procedimentos Experimentais 1 3 3 1 Purifica o dos citocromos css e cd Os citocromos cd cd NiR e css cit cs52 foram purificados da bact ria marinha desnitrificante Marinobacter hydrocarbonoclasticus estirpe 617
196. quil brio entre as formas H SO e H OSO e em solu es cidas a principal esp cie presente o SO e n o o H5SO Shriver amp Atkins 1999 E V Fig II 1 Diagrama de Pourbaix simplificado para os equil brios est veis do sistema enxofre gua a 25 C Pourbaix 1974 94 1 2 1 2 Aplica es Industriais O termo gen rico sulfitos engloba o di xido de enxofre SO e diversas formas de oxoani es de enxofre que de acordo com as condi es de utiliza o apresentam a capacidade de libertar SC Nesta gama de compostos encontram se os bissulfitos de s dio e pot ssio NaHSO e KHSO os metabissulfito de s dio e pot ssio Na S 05 e K 8505 e o sulfito de s dio Na S03 No diagrama da figura IL2 encontra se a representa o esquem tica da interconvers o de tais agentes a qual tal como foi referido anteriormente depende fortemente do pH do meio K S O metabissulfito de pot ssio Na SO sulfito de s dio SO di xido de enxofre H onm HSO SO H sulfito oxidase SO Fig II 2 Qu mica dos sulfitos A convers o dos sais de enxofre em meio aquoso origina a produ o in situ de di xido de enxofre Vally et al 2009 Para al m das esp cies que constituem o enxofre livre formadas em solu o e representadas na figura IL2 formam se tamb m compostos derivados resultantes de reac es entre o SO e diversas macromol culas
197. r lito de suporte desarejada B Solu o de electr lito de suporte n o desarejada Os picos agudos registados nos voltamogramas derivam de contaminantes presentes na pasta de carbono utilizada para imprimir o lote de el ctrodos Tabela 1 6 Par metros anal ticos dos sensores amperom trico e voltam trico na aus ncia e na presen a de O dissolvido no electr lito de suporte Sensor Sensor Sensor Amperom trico Voltam trico Voltam trico sem O sem O com O Par metros Anal ticos Gama de Linearidade uM Limite de Detec o uM Limite de Quantifica o uM Sensibilidade A mol cm uM 62 Como se pode observar a partir dos dados da tabela 1 6 n o existe uma diferen a significativa nas gamas de linearidade obtidas para os tr s sistemas Os sensores voltam tricos possuem limites de detec o e quantifica o inferiores ao sensor amperom trico contudo n o diferem significativamente entre si Assim comprova se a possibilidade de opera o do sensor voltam trico na presen a de O No que respeita sensibilidade esta superior quando o sensor voltam trico opera na presen a de oxig nio molecular facto que poder indicar uma ligeira Interfer ncia do O no sistema mas que atendendo generalidade dos valores apresentados para os restantes par metros n o limitativa 1 4 6 Constru o de um Biossensor Electroqu mico Espec fico para Nitritos Baseado na Resposta Directa da cd NiR num
198. r A Klimant I Wolfbeis O S Fresenius J Anal Chem 362 73 76 1998 Steuber J Arendsen A F Hagen W R Kroneck P M H Eur J Biochem 233 873 879 1995 Stone K L Wiliams K R A Pratical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing Ed Paul Matsudaira 2 4 edition Academic Press San Diego USA pp 54 56 1993 Strehhtz B Gr ndig B Vorlop K D Bartholmes P Kotte H Stottmeister U Fresenius J Anal Chem 349 676 678 1994 Stroupe M E Getzoff E D In Messerschmidt A Huber R Poulos T and Wieghardt K Ed Handbook of Metalloproteins pp 471 485 John Wiley amp Sons Ltd Chinchester 2001 Thanh N T K Decnopweever L G Kok W T Fresenius J Anal Chem 349 469 472 1994 Taylor S L Higley N A Bush R K Advances in Food Research Ed C O Chichester Academic Press Inc 30 1 76 1986 The Merck Index Published on CD ROM by Chapman amp Hall CRC Hampden Data Services Ldt 1999 Trudinger P A J Bacteriol 104 158 170 1970 Tudorache M Bala C Anal Bioanal Chem 388 565 578 2007 Vally H Misso N L A Madan V Clin Exp Allergy 39 1643 1651 2009 Vasilescu A Noguer T Andreescu S Calas Blanchard C Bala C Marty J L Talanta 59 751 765 2003 Wagner M Roger A J Flax J L Brusseau G A Stahl D A J Bacteriol 180 2975 2982 1998 159 Wicchelman K Braun R Fitzpatrick J Anal Biochem 175 231 237 1988 Wolfe B M
199. r Electroqu mico para Determina o de Nitritos LKODJECHVOS Mere L2 Introdu o Geral iiie ass astra nao cans Copas PIE MPa Pha d ee E IP dna dd 1 2 WI et dr EE 2 1 Geen Le EE EIERE eet EE I2 NEE ten L2 p RePulatientde E LO lo EISIOIO9IA us Mois fe aco cares alas aad enu a I 2 2 Biossensores Enzim ticos Para a Quantifica o de Nitritos 2 2 1 Biossensores Amperom tricos e ou Voltam tricos Baseados em Prote nas Inespec ficas para Determina o de NitritOS cc cece cess eee e eee eeeeeeeenes 2 2 2 Biossensores Amperom tricos e ou Voltam tricos Baseados em Redutases GO NAO cT 22 24 Blectroquimica Me dad a spreads si ad a hdd 1 2 2 2 1 T Mediadores ArtifiCIAIS eorr egen sis araras aa I 2 2 2 1 2 Mediadores bsaold getcog 12 2 2 2 3B Tectroguimic DiteCta sanciona Da 2 2 3 Biossensores N o Amperom tricos cece ccc eee cece ee eee enes 2251 Detcec o POLCfIC IOIDC IDIOT eege enee geren 1 2 2 5 2 Deteccao GEIER 12 2 3 3 Detec o EIERE Reg 1 2 3 Tecnologias Emergentes em Biossensores e eee eee eee ee een ne 2 3 1 Monocamadas Automontadas 0 c cece cece cece ence eee e cece eene 23 11 ASpecios Gel als ss Fou uin vea Po A Ud Un MOVERI aa 2 3 1 2 Aplica o em Biossensores ccce 1 2 3 2 El ctrodos Screen Printed SPEs Screen Printed Electrodes 1 22 32 1 Importancia SE E2 DZ 2 IC OUS obe el ae dae P
200. ra o e an lise das amostras sobretudo no que respeita ao SO livre Na grande maioria dos m todos referenciados a an lise de interferentes n o foi devidamente realizada limitando se os autores a procurar o efeito de interferentes conhecidos para aquele m todo espec fico ou mais comum comparar os resultados obtidos nos seus sistemas com resultados provenientes de m todos de refer ncia geralmente titula es iodom tricas que como ja foi referido s o alvo de toda uma s rie de interfer ncias Nos ltimos anos verificou se a primazia dos m todos electroqu micos na quantifica o de sulfitos e embora as modifica es nos el ctrodos de trabalho propostas pelos diferentes autores permitam diminuir o sobrepotencial da reac o a necessidade de operar a potenciais elevados gt 0 6 V vs NHE aumenta o risco de ocorr ncia de reac es inespec ficas A aplica o da tecnologia de biossensores an lise de sulfitos em matrizes complexas como o caso dos produtos alimentares com especial destaque para os vinhos uma forma atractiva de ultrapassar as interfer ncias causadas pelos efeitos de matriz devido elevada selectividade que caracteriza este tipo de dispositivos Na tabela II 3 apresentam se as principais caracter sticas e par metros anal ticos dos biossensores propostos na literatura para a determina o de sulfitos 99 Tabela II 2 M todos para determina o de sulfitos GL gama de linearidade LD
201. res de electr es na periferia do anel 25 Por ltimo o potencial de redu o do hemo dr particularmente se for considerado o seu ambiente na estrutura da prote na tal que a redu o do NO a hidroxilamina se encontra bloqueada por motivos termodin micos Contudo tal n o acontece com a redu o de NH2OH a am nia Jafferji et al 2000 Allen et al 2005 1 2 4 3 A cd NiR de Paracoccus pantotrophus A prote na do organismo Paracoccus pantotrophus Pp possui as sua estrutura tridimensional resolvida tanto na forma nativa Baker et al 1997 como no estado reduzido eren amp Hajdu 2001 Esta enzima sofre modifica es estruturais significativas ao ser reduzida incluindo uma curiosa troca de ligandos axiais em ambos os hemos que culmina com a dissocia o do res duo de tirosina que ocupa a posi o de liga o ao substrato na forma nativa figura 1 14 Williams et al 1997 Fig 1 14 Estrutura tridimensional da cd NiR de Paracoccus pantotrophus Williams et al 1997 A Forma nativa oxidada B Forma reduzida 26 De forma a salientar as altera es conformacionais sofridas pela enzima ap s redu o apresenta se na figura 1 15 a representa o esquem tica dos co factores e res duos de amino cidos envolvidos no processo His17 Tyr25 Metios 725 NOS His69 His200 His69 His200 hemo c hemo d hemo c hemo d Fig I 15 Representa o esquem tica das altera es sofrid
202. ris fulgidus Subunidade desulfuricans 27774 desulfuricans 27774 desulfuricans G20 vulgaris fulgidus desulfuricans 27774 desulfuricans 27774 desulfuricans G20 vulgaris fulgidus desulfuricans 27774 desulfuricans 27774 desulfuricans G20 vulgaris fulgidus desulfuricans 27774 desulfuricans 27774 desulfuricans G20 vulgaris fulgidus desulfuricans 27774 desulfuricans 27774 desulfuricans G20 vulgaris fulgidus desulfuricans 27774 desulfuricans 27774 desulfuricans G20 vulgaris fulgidus desulfuricans 27774 desulfuricans 27774 desulfuricans G20 vulgaris fulgidus 378 38 1 381 381 H IW DEI W 366 kk kk X ke ok KKKKK 135 FMIDESKIDDEIN EVOE H ke kk eK eo fk kk Xx D 294 298 298 298 281 354 358 358 356 341 414 418 418 418 401 118 120 120 120 109 LII 179 179 179 168 237 239 239 239 227 296 299 299 299 282 356 359 3559 359 342 Subunidade y desulfuricans 27774 a desulfuricans 27774 bi desulfuricans G20 vulgaris fulgidus Ja D DD D desulfuricans 27774 a desulfuricans 27774 b desulfuricans G20 vulgaris fulgidus DODD o x kekk kkk Ke eX ev ke kkk KK KK KK ee KKKKKKK Fig 11 21 Alinhamento entre as sequ ncias de res duos de amino cidos das tr s subunidades da Dsv de D desulfuricans ATCC 27774 a obtidas neste trabalho b depositadas por Lucas et al 2009 D desulf
203. rkov Schweizer R R Bruschi M Voodouw G Eur J Biochem 211 501 507 1993 Karkov Schweizer R R Huber D P W Voodouw G Appl Envirom Microbiol 61 290 296 1995 Kein M Friedrich M Roger A J Hugenholtz P Fishbain S Abicht H Blackale L L Stahl D A Wagner M J Bacteriol 183 6028 6035 2001 Klenk H P Clayton R A Tomb J F White O Nelson K E Ketchum K A Dodson R J Gwinn M L Hickey E K Peterson J D Richardson D L Kerlavage A R Graham D E Kyrpides N C Fleischmann R D Quackenbush J Lee N H Sutton G G Gill S R Kirkness E F Dougherty B A McKenney K Adams M D Loftus B J Peterson S N Reich C L McNeil L K Badger J H Glodek A Zhou L Overbeek R Gocayne J D Weidman J F McDonald L A Utterback T R Cotton M D Spriggs T Artiach P Kaine B P Sykes S M Sadow P W D Andrea K P Bowman C Fujii C Garland S A Mason T M Olsen G J Fraser C M Smith H O Woese C R Venter J C Nature 390 364 370 1997 Lambrecht H S Enzymatic Browning and its Prevention Ed Chang Y Lee amp Jonh R Whitaker ACS Symposium Series Vol 600 chapter 24 313 323 1995 Larsen Lien T Birkeland N K Extremophiles 3 63 70 1999 Larsen Lien T Birkeland N K FEMS Microbiol Lett 186 41 46 2000 Laue H Friedrich M Ruff J Cook A M J Bacteriol 183 1727 1733 2001 Lee J P LeGall J Peck Jr H D J Bacteriol 115 529 54
204. rov A Kaniansky D Stanislawski B J Chromatogr A 1026 31 39 2004 Mashiach E Schneidman Duhovny D Andrusier N Nussinov R Wolfson H J Nucleic Acids Res 36 229 232 2008 McFeeters R F Barish A O J Agric Food Chem 51 1513 1517 2003 McWeeny D J Knowles M E Hearne J F J Sci Food Agr 25 735 746 1974 Mizuno N Voordouw G Miki K Sarai A Higuchi Y Structure 11 1133 1140 2003 Monier Williams G W Analyst 52 415 416 1927 Morse R Gibson G R Collins M D Lett Appl Microbiol 30 375 378 2000 Moura I LeGall J Lino A R Peck Jr H D Fauque G Xavier A V DerVartanian D V Moura J J G Huynh J Am Chem Soc 110 1075 1082 1988 Murphy M J Siegel L M Tove S R Kamin H Proc Nat Acad Sci 71 612 616 1974 Oliveira T F Vonrheim C Matias P M Venceslau S S Pereira I A C Archer M J Biol Chem 283 34141 34149 2008 Papkovsky D Uskova M A Ponomarev G V Korpela T Kulmala S Guilbault G G Anal Chim Acta 374 1 9 1998 Parey K Warkentin E Kroneck P M H Ermler U Biochemistry 49 8912 8921 2010 157 Pauliukaite R Ghica M E Barsan M M Brett C M A Anal Lett 43 1588 1608 2010 Peck Jr H D LeGall J Phil Trans R Soc Lond B 298 443 466 1982 Pierik A J Duyvis M G van Helvoort J M L M Wolbert R B G Hagen W R Eur J Biochem 205 111 115 1992 Pizzoferrato L di Lullo G Quattruc
205. rovocados pela adi o de sulfito nos voltamogramas c clicos tra ados a pH 7 6 at uma concentra o de 20 mM Como os voltamogramas c clicos do mediador n o foram afectados pela presen a do substrato procedeu se realiza o de ensaios com a enzima aprisionada superf cie do el ctrodo de trabalho e com o VB em solu o Na figura IL33 encontra se um exemplo representativo de tais experi ncias tendo as adi es de sulfito sido iniciadas com uma concentra o de 100 uM na c lula electroqu mica 149 I uA np Go Nme gt m NU A tA 0 50 0 45 0 40 0 35 0 30 0 25 0 20 0 15 Potencial V vs NHE Fig 11 33 Ensaios com enzima na presen a do mediador violog nio de benzilo Voltamogramas c clicos tra ados a pH 7 6 com 375pmol de Dsv aprisionada na superf cie do GCE com uma membrana de di lise ImM de VB em solu o e concentra es crescentes de sulfito 0 mM 1 mM 10 mM 20 mM Os voltamogramas c clicos apresentados na figura 11 33 demonstram que n o foi observada a exist ncia de correntes electrocatal ticas facto que refor a a possibilidade de a enzima n o se encontrar activa II 4 5 6 Fenosafranina KM A fenosafranina Fs um composto pertencente mesma fam lia qu mica que o vermelho neutro as fenazinas e semelhan a do que acontece com o VN este composto tamb m electropolimeriz vel em meio cido Por m a reac o de polimeriza
206. rrespondente ao d mero ap a operar como receptor e a subunidade y na fun o de ligando seguido do refinamento das solu es obtidas Igualmente a solu o com maior pontua o correspondente ao tr mero apy foi apurada para avan ar na simula o O ltimo passo da simula o consistiu na constru o da forma dim rica da Dsv Para esse efeito submeteu se a estrutura obtida anteriormente ao software SymmDock Schneidman Duhovny et al 20054 2005B que prev estruturas de complexos com simetria Cn neste caso aplicou se a restri o n 2 atrav s de acoplamentos baseados em par metros geom tricos 126 II 4 Resultados e Discuss o 1 4 1 Purifica o da redutase do sulfito dissimilativa Desulfoviridina As adapta es do procedimento de purifica o da Dsv de D desulfuricans ATCC 27774 conduziram obten o da prote na nativa com um grau de pureza bastante elevado tal como o comprovam o espectro de absor o UV Vis fig IL 15 e os geis desnaturante fig II 16A linha 3 e nativo fig II 16 B da frac o final 0 5 0 4 0 3 Absorv ncia 0 2 0 1 0 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 A nm Fig 11 15 Espectro de absor o UV Vis obtido com 1 5 uM de Dsv de Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774 O espectro de absor o da Dsv de D desulfuricans ATCC 27774 no estado nativo apresenta m ximos de absor o a 280 390 408 580 e 630 nm em concord ncia com os espectr
207. rutura da prote na configura o a p y sem co factores constru da por modela o no SymmDock As imagens apresentadas foram processadas com o software UCSF Chimera 138 Fig 11 23 Sobreposi o da estrutura conseguida por modela o azul com a estrutura que lhe serviu de modelo rosa a desulfoviridina de D vulgaris Hildenborough A compara o entre a estrutura facultada atrav s de simula o com a estrutura da prote na modelo fig 11 23 permite verificar que existe um elevado grau de semelhan a entre elas Este resultado est de acordo com o previsto atendendo aos elevados graus de identidade das sequ ncias de res duos de amino cidos tabela 11 9 Foram contudo detectadas duas diferen as relevantes A primeira consiste numa ligeira rota o de um tr mero ay em rela o ao outro Esse rearranjo da estrutura face prote na modelo poder dever se forma como foi efectuada a constru o do d mero Com efeito o algoritmo de previs o utilizado baseia o acoplamento dos dois tr meros em par metros geom tricos assumindo a exist ncia de um eixo de simetria entre eles Ao analisar se a estrutura da prote na modelo verifica se que na realidade esse eixo n o existe ocorrendo sim uma aproxima o entre as subunidades a acompanhado de um afastamento entre as subunidades p Possivelmente o recurso a um software que contemple tamb m interac es de natureza electrost tica resultar num modelo mais adequad
208. s N o obstante foram realizados ensaios de voltametria c clica com o objectivo de atingir correntes catal ticas via electroqu mica directa da desulfoviridina em diferentes materiais de el ctrodo GC PG plano edge e plano basal polido e Au e condi es experimentais entre as quais se destacam a composi o do electr lito de suporte 5 pH 8 20 mM lt KCI lt 200 mM as janelas de potencial compreendidas entre os 0 5 e os 0 9 V vs SCE e as velocidades de varrimento de 5 a 250 mVs tendo sido ainda realizados alguns KM testes recorrendo t cnica de voltametria de onda quadrada O insucesso de todas estas tentativas levou procura de um mediador redox artificial pass vel de realizar as trocas electr nicas entre o el ctrodo de trabalho e a enzima Assim procedeu se a uma s rie de ensaios com vista a determinar qual o mediador mais adequado obten o de correntes catal ticas que permitissem a constru o de um biossensor espec fico para sulfitos tendo a Dsv como elemento de reconhecimento biol gico Numa fase inicial procedeu se realiza o de ensaios de controlo nos quais se pretendeu avaliar a reactividade dos mediadores face ao substrato o qual apresenta um potencial de redu o bastante baixo conferindo lhe um poder oxidante relativamente pronunciado Nos casos em que os mediadores demonstraram ser inertes deu se continuidade ao trabalho introduzindo a Dsv no sistema e avaliando a resposta deste
209. s encontram se adjacentes um ao outro nos genomas respectivos e provavelmente adv m da duplica o de um gene ancestral Dahl et al 1993 Klein et al 2001 108 A an lise comparativa das sequ ncias dos genes dsrAB foi utilizada na investiga o da hist ria evolutiva da respira o de sulfato A presen a de hom logos dsrAB em pelo menos cinco linhagens procariontes altamente divergentes e a omnipresente congru ncia filogen tica entre as rvores dos genes dsrAB e do 16S rRNA sugerem que as dSiRs existentes actualmente nos procariontes redutores de sulfato s o fruto de uma evolu o vertical a partir de genes protog nicos ancestrais comuns Wagner et al 1998 Contudo trabalhos posteriores t m vindo a provar que estes genes foram alvo de transfer ncias laterais com uma frequ ncia muito superior ao que era inicialmente postulado Larsen et al 1999 2000 Klein et al 2001 II 2 2 3 A Desulfoviridina A desulfoviridina a dSiR presente nas bact rias do g nero Desulfovibrio A sua ocorr ncia por m n o se encontra limitada a estes organismos tendo sido igualmente identificada na bact ria Bilophila wadsworthia fam lia Desulfovibrionaceae Laue et al 2001 e no organismo hiperterm filo Archaeoglobus fulgidos Dahl et al 1993 A recente resolu o das estruturas cristalogr ficas das Dev de D vulgaris fig II 8 e A fulgidus fig 1 9 veio clarificar toda uma s rie de informa es contradit rias q
210. s o provenientes da Viskin as membranas YM3 e YM30 foram obtidas Millipore e os filtros de seringa com membranas de polietersulfona com 0 45um de tamanho de poro foram fornecidos pela VWR International Os reagentes utilizados na prepara o dos g is para electroforese foram adquiridos Bio Rad e os marcadores de massa molecular fornecidos pela Fermentas e pela Bio Rad As prote nas foram quantificadas com um kit da Pierce usando albumina de soro bovino Sigma Aldrich como padr o 1 3 1 2 Electroqu mica As solu es foram preparadas com gua desionizada dH O 18 MQcm proveniente de um sistema de purificac o de gua MilliQ da Millipore Os compostos utilizados para a modifica o dos el ctrodos de ouro com camadas automontadas encontram se descritos na tabela I 2 O cloreto de pot ssio KCI 74 56 emol gt 99 5 o nitrito de s dio NaNO gt 69 00 emol 20996 o per xido de hidrog nio H202 34 01 emol 30 e o etilenodiamina tetraacetato de s dio EDTA C oH 4N5Na50 2H5O0 372 24 emol gt 99 s o provenientes da Merck O acetato de s dio CH CO Na 3H 0 136 08 emol 299 5065 o hidr xido de s dio NaOH 40 00 emol gt 99 e o etanol CH CH 0H 46 07 emol gt 99 8 foram adquiridos Riedel de Ha n 33 Os sais de tamp o cido 4 2 hidroxietil piperazina l etanosulf nico HEPES CsH sN5O4S 238 31 emol gt 99 5 cido 3 ciclo hexilamino 2 hidroxi 1 propanosulf nico CAPSO C Hj gN
211. s actuais tend ncias acima referidas a monitoriza o destes ani es em sistemas fisiol gicos sem d vida relevante 1 2 2 Biossensores Enzim ticos Para a Quantifica o de Nitritos A concentra o total de NO NO normalmente determinada com a redu o pr via dos nitratos a nitritos por processos quer enzim ticos com recurso por exemplo redutase do nitrito quer inorg nicos com colunas de cobre e ou c dmio Esta estrat gia tamb m aplicada na determina o das esp cies individuais por subtrac o do teor de nitrito quantificado em amostras n o reduzidas ao valor total de NO NO Dutt amp Davis 2002 Sun et al 2003 Exceptuando a espectrofotometria de UV Vis reac o de Griess os numerosos m todos anal ticos propostos para a quantifica o de nitrito envolvem t cnicas sofisticadas e centralizadas como o caso da cromatografia i nica polarografia electroforese capilar cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa ou espectrofotometria de fluoresc ncia Contudo a maioria destes m todos demonstraram possuir limita es importantes nomeadamente no que respeita necessidade de pr tratamento das amostras susceptibilidade a interfer ncias de matriz limites de detec o insuficientes tempos de an lise demasiado longos e falta de portabilidade Atendendo profus o e diversidade dos m todos anal ticos propostos na literatura para a determina o de nitritos a sua des
212. s c clicos obtidos com ImM de AB dissolvido em ambos os electr litos de suporte na presen a de diferentes concentra es de sulfito 141 LI uA 0 70 0 65 0 60 0 55 0 50 0 45 0 40 0 35 0 30 0 25 Potencial V vs NHE B LI uA 0 6 0 55 0 5 0 45 0 4 0 35 0 3 0 25 0 2 0 15 Potencial V vs NHE Fig 11 25 Ensaios realizados com azul de bromofenol e concentra es crescentes de sulfito 0 mM 1 mM 10 mM 20 mM A Voltamogramas c clicos tra ados a pH 7 6 B Voltamogramas c clicos tra ados a pH 5 5 Os voltamogramas tra ados na presen a de concentra es crescentes de SO a pH 7 6 fig IL 25A apresentam um aumento generalizado da intensidade quer dos sinais faradaicos quer da corrente capacitiva o qual pode advir do aumento de transportadores de carga no sistema Assim a evidente susceptibilidade do sistema concentra o salina do meio torna o inadequado constru o de um biossensor electroqu mico espec fico para sulfito Os resultados apresentados na figura IL 25B permitiram verificar a ocorr ncia de uma reac o qu mica directa entre o mediador e o substrato a pH 5 5 Na sec o II 2 1 1 foi discutida a predomin ncia de diferentes esp cies ani nica de enxofre em solu o consoante o pH do meio e este facto que poder estar na base da depend ncia do pH observada 142 O primeiro aspecto a ter em considera o no que respeita aos voltamo
213. s de impress o destinadas produ o de SPEs para aplica o em dispositivos prot tipo Tudorache amp Bala 2007 Barry et al 2009 Metters et al 2011 21 I 2 3 2 2 El ctrodos A constru o de um SPE para o desenvolvimento de um biossensor deve ter em considera o alguns aspectos fundamentais que influenciam significativamente o desempenho anal tico do dispositivo A composi o do substrato material de base sobre o qual s o impressas as sec es funcionais do el ctrodo que geralmente cer mica ou pl stico dever ser um bom isolante el ctrico e ser quimicamente inerte No que respeita s tintas pastas utilizadas na impress o estas devem providenciar contactos el ctricos adequados e fi veis para interfaces s lido s lido De uma forma gen rica s o compostas por um agente aglutinante um agente condutor ou semi condutor e aditivos funcionalizantes No caso das pastas condutoras destaca se claramente as que possuem grafite como elemento condutor essencialmente devido ao baixo custo de produ o sobretudo quando comparadas com as pastas de Au ou Pt e s vantagens que este material apresenta a n vel de comportamento electroqu mico e biocompatibilidade as quais conferem aumentos significativos a n vel de limites de detec o tempos de resposta reprodutibilidade estabilidade etc Existem prepara es de pasta de carbono dispon veis comercialmente com um diversificado leque de propriedades no
214. se na presen a de dois modos v3 a 1463 e 1493 cm e vio a 1605 e 1624 cm atribu dos a popula es alto spin e baixo spin respectivamente A largura da banda correspondente ao modo v indica tamb m a presenca de duas bandas n o resolvidas O modo a 1667cm pode ser atribu do ao C O stretching da esp cie ferrosa 5cHS A vibra o C O stretching uma impress o digital do hemo d e as evid ncias sugerem que este sofre uma transi o do estado de spin aquando a redu o da prote na Na tabela I 8 encontram se registados os modos vibracionais de RR atribu dos para a cd NiR nos estados f rrico e ferroso Os modos presentes nos espectros das figuras 1 45 e 1 46 que n o se encontram atribu dos foram exclu dos da tabela 18 Tabela I 8 Modos vibracionais de Resson ncia Raman da cd NiR nos estados oxidado e reduzido estado oxidado cm estado reduzido em 1372 1362 1504 6cLS 1463 5cHS 1493 6cLS 1587 6cLS 1590 ScHS 6cLS 1601 6cLS 1638 6cLS 1605 ScHS 1624 6cLS 1667 Comprova se assim que no estado oxidado ambos os hemos da cd NiR se encontram hexacoordenados com o Fe III no estado de baixo spin Como consequ ncia da redu o o hemo d liberta um ligando tornando se pentacoordenado isto com o Fe II no estado de alto spin Estes resultados s o concordantes com os obtidos por MCD Walsh et al 1979 NMR Timkovich amp Robinson 1979 e EPR Muhoberac amp Wharton 1983 para
215. so de nitratos nitritos adv m da contamina o dos len is fre ticos por percola o destes 10es altamente sol veis atrav s dos aqu feros naturais Conjuntamente com os fertilizantes fosforados o enriquecimento em nitrato das guas superficiais tamb m respons vel pela eutrofica o dos ecossistemas aqu ticos e contamina o de peixes e moluscos Dutt amp Davis 2002 Camargo amp Alonso 2006 Smolders et al 2010 De acordo com o ltimo relat rio da Comiss o Europeia COM 2010 47 acerca da implementa o da directiva comunit ria 91 676 EEC sobre a protec o de guas subterr neas e superficiais contra nitrato oriundo de fertilizantes agr colas a polui o por nitrato tem vindo a decrescer Mesmo assim existem situa es pontuais em reas geogr ficas espec ficas onde s o ainda necess rios mais esfor os no sentido de atingir para a gua os padr es de qualidade exigidos na Uni o Europeia 1 2 1 3 Efeitos na Sa de Ao contr rio dos nitritos cujas concentra es em matrizes vegetais s o geralmente muito reduzidas os nitratos ocorrem naturalmente na maioria dos vegetais comest veis e em quantidades altamente vari veis Para al m dos alimentos naturalmente ricos em nitratos alface espinafres agri o beterraba ceref lio e aipo observa se tamb m uma elevada concentra o destes 10es em vegetais cultivados em solos sobrecarregados com fertilizantes azotados Onyesom amp Okoh 2006 Ayaz
216. ti et al 2000 Rosa et al 2002 Esses sensores embora apresentem limites de detec o abaixo de 7 uM requerem ensaios em amostras transparentes facto que conduz necessidade de tratamentos e ou dilui es elevadas das amostras em etapas pr vias ao ensaio 57 O elevado limite de detec o efectivamente a principal desvantagem deste sensor No caso dos biossensores que utilizam a ccNiR como elemento de reconhecimento biol gico esta diferen a j era esperada atendendo natureza da reac o de cat lise protagonizada pela enzima multih mica eq 1 8 a qual envolve 6 electr es por cada mol cula de substrato convertida Por m tamb m os sensores integrados de CuNiR Wu et al 1997 Quan et al 2006 apresentam limites de detec o inferiores ao do sistema proposto Uma vez que a sensibilidade calculada para este sensor contempla a influ ncia do mediador electroqu mico algo in dito at ao momento os valores obtidos s o expressos em unidades n o compar veis com os que se encontram reportados na literatura para sistemas que envolvem electroqu mica mediada Uma nova abordagem constru o do dispositivo poderia resultar na diminui o do limite de detec o e poss vel aumento da sensibilidade para este biossensor existindo tr s possibilidades evidentes pass veis de ser testadas A primeira consiste em procurar incluir o cit cssz na pasta de carbono com a qual s o impressos os SPEs Assumindo que o media
217. tmo da sua massa molecular A recta apresenta um declive de 7 455 ordenada na origem de 15 651 e coeficiente de correla o 0 995 A interpola o da recta encontra se assinalada por um c rculo com os valores respectivos entre par nteses I 4 2 An lise da Sequ ncia de Res duos de Amino cidos A sequ ncia de res duos de amino cidos da cd NiR de M hydrocarb Copeland et al 2006 foi retirada da base de dados UniProtKB onde se encontra registada com o c digo AT1USDO As sequ ncias de res duos de amino cidos da cd NiR de Pseudomonas aeruginosa Silvestrini et al 1989 Pseudomonas stutzeri Yan et al 2006 e Paracoccus pantotrophus Saunders et al 2000 foram retiradas da mesma base de dados onde se encontram registadas com os c digos P24474 A4VQA9 e P72181 respectivamente Na figura 1 23 apresenta se o resultado do alinhamento dos conjuntos de sequ ncias das cd NiR 46 Mh PKDPDKSTMA lec TPs AVD 47 Pa KDDMKAAEOQlOGAAs AVD 43 Pp QEQVAPPKDPAAALEDMKTRTDNRMJEPSLD 59 Ps MSNVGKPILAG VIAGLSLLGLAVAQU AAP 29 D Mh AESAKIVRSPGAPD LTDAEFEKRMKO d Da P AHVVRTNGAPD MSESEFNEMKO d Pp NLAQODVAAPGAPEGVSALSDAOQYNEANK DLBR 116 Ps BE eee MTAEEKEABIKO NLEBHWEKTDA 72 e kk Di kk ck ck ck ck KKK OK x e DIO 100 DIEO 94 S
218. to baseados na redutase do sulfito dissimilativa dessulfoviridina Dsv isolada a partir da bact ria Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774 como elemento de reconhecimento biol gico Numa primeira etapa pretendeu se proceder caracteriza o bioqu mica e estrutural da enzima atrav s de m todos bioqu micos espectrosc picos e bioinform ticos Seguidamente procurou se desenvolver um biossensor electroqu mico baseado numa resposta electroqu mica mediada com recurso a mediadores artificiais II 2 Introdu o Geral II 2 1 Sulfitos II 2 1 1 Breve Caracteriza o Qu mica das Esp cies de Enxofre A capacidade do enxofre em existir de forma est vel em diversos estados de oxida o sendo os mais comuns 2 O 2 4 e 6 contribui para a exist ncia de diversas esp cies ani nicas e neutras que exibem diferentes propriedades qu micas O diagrama de Pourbaix apresentado na figura II 1 evidencia a forte depend ncia das propriedades redox destas esp cies relativamente ao pH do meio No caso do di xido de enxofre SO e do i o sulfito SO o efeito do pH particularmente importante O SO facilmente reduzido em meio cido sendo um bom agente oxidante ao passo que o SO principalmente um agente redutor em meio b sico SO aq AH aq 4e S s 2H 0 1 E 0 50V 2 1 SO aq H9O 1 2e gt SO aq 20H ag E 0 94V 2 2 93 Em meio b sico o HSO existe num e
219. to anual calculado entre os 30 e os 70 na utiliza o deste tipo de compostos na ind stria alimentar verificado nos EUA entre as d cadas de 60 e 70 do s c passado Taylor et al 1986 Na tabela II 1 encontram se listadas as principais aplica es industriais de sulfitos bem como os principais produtos alimentares cosm ticos e medicamentos que cont m aditivos deste tipo Tabela II 1 Alguns exemplos de aplica es industriais de agentes sulfitantes e produtos alimentares medicamentos e cosm ticos que cont m sulfitos Vally et al 2009 Aplica o e Produtos Conservantes estabilizantes e ou esterilizadores em Alimentar refrigerantes e sumos de fruta cidra vinho e cerveja frutos secos bolos e bolachas doces e compotas salsichas e carnes fumadas Antioxidantes e ou estabilizantes em anti fungicos e corticoesteroides adrenalina dopamina anest sicos locais e complexos de vitamina B colorantes de cabelo auto bronzeadores cremem anti idade lacas e perfumes Farmac utica e Cosm tica Descolorantes agentes solubilizantes de taninos captadores de enxofre e cloro redutores de licores de cr mio T xtil Tratamento de Efluentes Redu o de sais de cr mio neutralizante e desinfectante Contudo na ind stria vitivin cola que a utiliza o deste tipo de agentes possui o seu expoente m ximo A import ncia do emprego do SO em Enologia tal que apesar das diversas recomenda es de instit
220. to desta subunidade da Dsv Contudo essa assumpc o posta em causa quando se sabe que a prote na de A fulgidus possui o gene que codifica a subunidade y traduzindo se este numa sequ ncia de res duos de amino cidos id ntica a n vel do C terminal verificada nas prote nas de Desulfovibrio mas essa subunidade n o expressa e a enzima activa na configura o Of 1 4 4 Previs o das Estruturas Terci ria e Quatern ria Os resultados alcan ados nas diferentes etapas que conduziram produ o de um modelo para a estrutura tridimensional da Dsv de Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774 encontram se representados na figura 11 22 A sobreposi o entre a estrutura obtida atrav s da simula o e a estrutura da prote na de D vulgaris Hildenborough que lhe serviu de modelo fig II 8 encontra se representada na figura 11 23 137 X A A ds Va AO ns E Ca e T AR 15 ae Ge EE Es j e Nh D iQ amp Fig II 22 Constru o do modelo para a estrutura tridimencional da Dsv de D desulfuricans ATCC 27774 Estruturas das subunidades adquiridas atrav s do SwissModel A subunidade a identidade estrutural de 83 7 B subunidade p identidade estrutural de 85 5 C subunidade y identidade estrutural de 92 2 Estruturas adquiridas por acoplamento das subunidades recorrendo ao Patchdock com posterior refinamento no FireDock D d mero ap E tr mero apy F Modelo final da est
221. tru o de um Biossensor Electroqu mico Espec fico para Nitritos Baseado na Resposta Directa da cd NiR num Sistema Electroqu mico 3 3 4 1 Limpeza do El ctrodo de Trabalho O el ctrodo de trabalho foi inicialmente sujeito a um cuidadoso processo de limpeza que consistiu em tr s fases Em primeiro lugar a superf cie foi submetida a uma limpeza mec nica tendo sido polido com pasta de alumina de granulometrias sucessivamente inferiores lum 0 3 um e 0 05 um sendo abundantemente lavado com dH5O entre cada uma das pastas Seguidamente foi sujeito a um m todo de limpeza qu mico o qual consiste na Imers o durante 30 segundos numa mistura rec m preparada de H5SO puro e H5O na propor o 3 1 solu o piranha Finalmente procedeu se a uma limpeza electroqu mica da superf cie atrav s da realiza o de ciclos voltam tricos em H SO 0 1M entre 1 4 V e 0 4 V a 100 mVs Regularmente a efic cia do processo de limpeza era verificada por voltamentria c clica realizando ciclos voltam tricos em 0 5 M NaOH entre 0 7 V e 1 4 V a 20 mVs 3 3 4 2 Selec o do Modificador de Superf cie Imediatamente ap s a conclus o do processo de limpeza o el ctrodo foi lavado com dH5O e etanol e imediatamente mergulhado numa solu o alco lica 5 mM de cada um dos modificadores de superf cie onde permaneceu durante 12 horas temperatura ambiente de forma a garantir a forma o de SAMs dos ti is na superficie de Au O
222. trutura tridimensional indicam uma elevada semelhan a estrutural com a enzima de Pseudomonas aeruginosa Por espectroscopia de resson ncia Raman comprovou se o n mero de coordena o o estado de spin e o potencial formal dos dois co factores com a identifica o parcial dos modos vibracionais de hemo dij Foi constru do um biossensor amperom trico para nitritos atrav s da co imobiliza o da cdjNiR e do seu parceiro fisiol gico o citocromo css que funcionou como mediador electr nico A utiliza o de el ctrodos screen printed como plataforma de transdu o conferiu ao sistema simplicidade operacional e portabilidade A adsor o da cd NiR numa superf cie de Au modificado com monocamadas automontadas permitiu alcan ar pela primeira vez usando a t cnica de voltametria c clica uma resposta electroqu mica directa da prote na A reac o de redu o envolve a transfer ncia de um electr o e de um prot o e seguida de uma altera o estrutural O processo an dico quando visualizado n o dever representar a reac o inversa Nas condi es testadas n o foi detectada actividade catal tica na presen a de nitrito A desulfoviridina apresenta se na forma de um complexo heterom rico numa configura o GB Com base na estrutura prim ria determinada simulou se a estrutura tridimensional da prote na Foram quantificados 177 tomos de Fe por complexo proteico dados que contrastam com os reportados para a prote na d
223. u ncia directa deste facto a enzima demonstrou uma tend ncia a desadsorver do el ctrodo a valores de potencial negativos Da mesma forma n o foi poss vel registar espectros SERR dos el ctrodos revestidos com SAMs carregadas negativamente contrariamente ao que foi observado nas experi ncias electroqu micas De acordo com a distribui o superficial de cargas apresentada na figura 1 26 a imobiliza o da prote na via interac o electrost tica deveria ocorrer com interfaces electr nicas positivas visto existir uma rea carregada negativamente na superf cie da enzima Efectivamente ensaios preliminares revelam que em determinadas condi es a cd NiR adsorve eficazmente em el ctrodos revestidos com SAMs com termina o em grupos amina cisteamina s quais foram impostos potenciais positivos Por m e uma vez mais a prote na demonstra tend ncia a desadsorver do el ctrodo sendo particularmente inst vel a potenciais negativos Salienta se que esta constata o contrasta com os resultados obtidos pelas experiencias electroqu micas nas quais s foi poss vel obter uma resposta da prote na em superf cies modificadas com SAMs de carga negativa MUA N o obstante as dificuldades encontradas foi poss vel realizar uma titula o redox da cd NiR e cujos resultados se apresentam na figura 1 48 81 250 200 150 100 50 0 50 100 150 200 250 E vs Ag AgCI Fig I 48 Titula o preliminar da cd NiR
224. u ncias da prote na de D desulfuricans ATCC 27774 D vulgaris Hildenborough D desulfuricans G20 e A fulgidus atrav s do programa ClustalW2 vers o As sequ ncias de res duos de amino cidos determinadas neste trabalho foram A Pes MET es GC A GA Zei TA Tiv EIU NDT A boat eens Sigs Ee MEC SL Scie ES Y Pw MS ENS AT ANSA E SC Zt a a H APE MTS DM gd 2 0 12 o qual apresentado em seguida fig 11 21 jp tg C t 5 Ja DD DD pet Cy Dy ty eem we Subunidade a desulfuricans desulfuricans desulfuricans vulgaris fulgidus desulfuricans desulfuricans desulfuricans vulgaris fulgidus desulfuricans desulfuricans desulfuricans vulgaris fulgidus desulfuricans desulfuricans desulfuricans vulgaris fulgidus 21774 27174 G20 27774 27774 G20 27774 27144 G20 27774 27774 G20 134 ACkck ck kk k Marcadores 3000 A 2000 1500 q 1200 oKKKKK eK 276 pb B ales 119 119 119 117 174 178 178 178 177 234 238 238 238 237 mi t9 t9 E pt 19 t4 0 Ja DD DD DoDD DoDD DoDD DoDD DoDD DODD pr t3 ty D D a Etat desulfuricans 27774 desulfuricans 27774 desulfuricans G20 vulgaris fulgidus desulfuricans 27774 desulfuricans 27774 desulfuricans G20 vulgaris fulgidus desulfuricans 27774 desulfuricans 27774 desulfuricans G20 vulgaris fulgidus desulfuricans 27774 desulfuricans 27774 desulfuricans G20 vulga
225. ublicar esta disserta o atrav s de exemplares impressos reproduzidos em papel ou deforma digital ou por qualquer outro meio conhecido ou que venha a ser inventado e de a divulgar atrav s de reposit rios cient ficos e de admitir a sua c pia e distribui o com objectivos educacionais ou de investiga o n o comerciais desde que seja dado cr dito ao autor e editor A Joaquim Lu s Rodrigues da Silva Proen a Agradecimentos Gostaria de expressar os meus agradecimentos a todos os que de alguma forma contribu ram para a realiza o deste trabalho Doutora Maria Gabriela Machado de Almeida e Professor Doutor Jos Jo o Galhardas Moura pela oportunidade de trabalhar sobre a sua compet ncia numa rea de investiga o que at ent o me era em grande parte desconhecida e que permitiu alargar os meus horizontes cient ficos proporcionando me a descoberta de todo um Universo de novas possibilidades Professora Doutora Isabel Moura pela coopera o cient fica e facilidades concedidas nomeadamente a n vel dos trabalhos desenvolvidos em biologia molecular e na purifica o das prote nas Doutora Susana Andrade do Abteilung f r Molekulare Strukturbiologie Institut f r Mikrobiologie und Genetik Georg August Universitat em G ttingen Alemanha pela gentileza com que me acolheu no seu laborat rio e pelos conhecimentos transmitidos no dom nio da cristalografia de prote nas Doutora Ana Viana do Departa
226. ue ao longo dos anos surgiram na literatura no que respeita s propriedades desta enzima Fig II 8 Estrutura tridimensional da Desulfoviridina de Desulfovibrio vulgaris Hildenborough na forma de complexo o p y no estado nativo Oliveira et al 2008 PDB 2V4J 109 Fig II 9 Estrutura tridimensional da Desulfoviridina de Archaeoglobus fulgidos na forma de complexo q no estado nativo Schiffer et al 2008 PDB 3MMC II 2 2 3 Caracteriza o Estrutural At ha 20 anos atr s considerava se que todas as dSiR possu am a mesma configura o estrutural Estas prote nas eram tetr meros com aproximadamente 200kDa de configura o O28 a 55kDa p 45kDa A descoberta da exist ncia de uma nova subunidade denominada y na prote na purificada de D vulgaris Hildenbourogh conjuntamente com a confirma o da sua exist ncia nas prote nas correspondentes de D vulgaris oxamicus D gigas e D desulfuricans ATCC 27774 conduziu ao estabelecimento de uma nova conforma o multim rica 0 B y gt com a 50kDa B 45kDa e y 11kDa para as Dsv das bact rias pertencentes ao g nero Desulfovibrio Pierik et al 1992 Contudo em diversas bact rias redutoras de sulfato o gene dert encontra se localizado num oper o diferente do dsrAB fig ILIOA e a sua express o n o regulada de forma coordenada Karkhoff Schweizer et al 1993 110 A 1000 pb dsrD 448150 qi 455185 dsrC
227. ui es internacionais como a FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations a OMS Organiza o Mundial de Sa de e o OIV Organisation Internationale de la Vigne et du Vin visando a sua redu o ou mesmo a substitui o deste aditivo por outros continua hoje a ser largamente utilizado na pr tica enol gica 96 Segundo a generalidade da bibliografia sobre o assunto nenhum outro aditivo apresenta um t o largo espectro de propriedades ben ficas na vinifica o e na conserva o dos vinhos um poderoso antioxidante um inibidor enzim tico combina se com os produtos de oxida o estabiliza os pigmentos antocianicos evita o aparecimento de determinadas turva es e assegura a inibi o de uma vasta gama de microrganismos Contudo tamb m opini o generalizada a necessidade de se procurar tecnologias capazes de permitir a utiliza o em doses cada vez mais reduzidas racionalizando o seu emprego Curvelo Garcia 1988 Boulton et al 1996 Por m os m todos alternativos utiliza o deste tipo de aditivos quer na ind stria alimentar que na produ o vitivin cola apresentam normalmente uma gama de benef cios mais estreita s o menos eficazes e de um modo geral mais dispendiosos Iyengar amp McEvily 1992 Lambrecht 1995 Friedman 1996 1 2 1 3 Efeitos na Sa de No inicio dos anos 70 surgiram os primeiros relatos de reac es adversas relacionadas com a exposi o excessiva a s
228. ulfitos Encontra se reportado que a exposi o t pica oral ou parenteral a sulfitos poder induzir toda uma gama de efeitos cl nicos adversos em indiv duos sens veis a este tipo de compostos A sensibilidade aos sulfitos foi apontada como a causa de diversos casos de reac es al rgicas d rmicas e respirat rias manifestadas maioritariamente sob a forma de dermatites e epis dios de crise em pacientes asm ticos Esta situa o poder ser tanto mais problem tica quanto sabido que casos mais graves de reac es adversas nomeadamente choque anafil ctico s o tratados com infec es de adrenalina que possuem sulfitos na sua composi o assim como a maioria dos medicamentos utilizados no controlo da asma cr nica podendo por isso ser parcialmente respons veis pelo prolongamento dos sintomas que deveriam tratar Vally et al 2009 Com a exist ncia de uma franja de popula o particularmente vulner vel ocorr ncia de sulfitos em produtos alimentares os legisladores tanto nos EUA quanto na Europa foram for ados a abandonar a classifica o de genericamente seguros para esta classe de compostos existindo hoje em dia toda uma s rie de normas que atribuem limites m ximos quantidade de sulfitos sendo que esses limites se encontram fortemente dependentes do tipo de produtos a que se aplicam 97 1 2 1 4 Normas de Aplica o Nos EUA as normas aplicadas utiliza o de sulfitos encontram se distribu d
229. uricans G20 D vulgaris Hildenborough e A fulgidus Os res duos de aa envolvidos na liga o aos centros 4Fe4S encontram se assinalados a verde As zonas de identidade entre as quatro prote nas apresentam se destacadas a lil s a azul encontra se o acr scimo relativo s zonas onde as desulfoviridinas das tr s esp cies de Desulfovibrio s o id nticas e a amarelo representa se o suplemento referente identidade entre as sequ ncias determinada e depositada da enzima de D desulfuricans ATCC 27774 Os alinhamentos de sequ ncias acima representados comprovam que a sequencia o gen tica da desulfoviridina foi bem sucedida sendo que as poucas discrep ncias encontradas se localizam em regi es onde s foi poss vel determinar a sequ ncia por via qu mica Com base nos alinhamentos da figura IL21 foram calculados em termos de percentagem os graus de identidade e homologia entre a sequ ncia de res duos de amino cidos da Dsv de D desulfuricans ATCC 27774 e as desulfoviridinas dos restantes tr s organismos Apresentam se na tabela II 9 os resultados num ricos assim adquiridos Tabela II 9 Graus de identidade Ident e similaridade Simil calculados em termos de percentagem encontrados entre a sequ ncia de res duos de aa da Dsv de D desulfuricans ATCC 27774 e as sequ ncias das restantes prote nas D desulfuricans D vulgaris D desulfuricans G20 A fulgidus ATCC 27774 Hildenborough j 81 2 95 2 84 2 54 7 79 8 b
230. vidade da cdi NiR co imobilizada com o seu Parceiro Fisiol gico em I 3 3 4 Constru o de um Biossensor Electroqu mico Espec fico para Nitritos Baseado na Resposta Directa da cd NiR num Sistema Electroqu mico I 3 3 4 Limpeza do El ctrodo de Trabalbo I 3 3 4 2 Selec o do Modificador de Superf cie ssssee 3 3 4 3 Caracteriza o do El ctrodo Modificado ssuu 3 3 4 4 Ensaios de Actividade para o Oxig nio Molecular 3 3 4 5 Ensaios com El ctrodos Modificados com SAMs Mistas 3 3 5 Espectroscopia de Resson ncia Ramman esee 3 3 6 Resson ncia Ramman Amplificada por Superf cie sssssss 5 5 7 Microscopia de Morea AL MICA ideae Uia sd Race ai 1 3 4 Aplica es Bioinformatica cccsssssssccssssssssccscssssssccssssssssscsssssssssssssees i TA Resultados e DISCUSS O sussa eds DOU dae E EP SERI dada I 4 1 Purifica o dos citocromos css cit css2 e cd cdi NiR da bact ria Marinobacter hydrocarbonoclasticus estirpe 617 cccccccccccccccscccccccccssssssscccces I 4 2 An lise da Sequ ncia de Res duos de Amino cidos 1 4 3 Previs o da Estrutura Tridimensional da cd NiR de Marinobacter hydrocarbonociastCus asus sessao ERA eA ER DENEN EE Ee 1 4 4 Cristalocratia de Raios kee viii 24 24 22 26 20 30 32 33 33 33 33 34 34 3
231. wy 0 8 0 4 Absorvancia e i lame M UM Mi n m m n 0 2 d 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 A nm 0 8 a 0 4 Absorvancia 0 2 0 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 A nm Fig 1 20 Espectros de absor o UV Vis dos citocromos purificados de M hydrocarb antes linha cont nua e ap s redu o com ditionito linha tracejada A cit css2 B cdi NiR 44 Na tabela 1 4 encontram se sumarizados os valores de comprimento de onda A aos quais se verificaram m ximos de absorv ncia nos espectros apresentados na figura 1 20 Tabela I 4 M ximos de absorv ncia dos espectros UV Vis dos citocromos css e cdi purificados de M hydrocarb EEN Estado Nativo oxidado 276 359 412 525 280 360 410 520 640 Estado Reduzido 417 522 552 416 522 552 628 Os resultados apresentados s o concordantes com os espectros publicados por Saraiva et al 1994 para o cit cs52 e por Fauque et al 1992 para ambas as prote nas As raz es de pureza foram medidas a partir dos espectros das prote nas nativas sendo 6 0 para o cit c55 A412nm A280nm 1 1 para a cdiNIR Assonm Asronm Estes valores indicam que ambas as prote nas foram obtidas com elevados graus de pureza conclus o confirmada pelas imagens apresentadas na figura 1 21 A B MM kDa cd NIR 116 RS 97 gt 66 45 31 21 14 65 NE Fig 1 21 Fotografias de g is de poliacri
232. ystem The adsortion of the cd NiR onto a gold surface modified with self assembled monolayers allowed to reach for the first time a direct electrochemical response from the protein by cyclic voltammetry The reduction reaction involves the transfer of an electron and a proton followed by a structural modification The anodic process when observed does not seem to represent the inverse reaction Under the conditions tested catalytic activity in the presence of nitrite was not detected The desulfoviridin was purified as an heteromeric complex in a GB configuration Based on the primary structure determined the tridimensional structure of the enzyme was simulated Seventeen iron atoms per protein complex were quantified data contrasting the reported for the D vulgaris protein and that might be the cause of the lack of catalytic activity observed on the electrochemical experiments and that prevented the development of a biosensor using this enzyme Keywords cd NiR desulfoviridin characterization electrochemical biosensors nitrite sulfite vi ndice Geral EE re EEN i Resumo RR REEL E iii V T1027 mmol A A V ndice Geral 222 Vil ndice de Figuras 0 220020 0000010 xi ndice de Tabelas 0 00000000 xvii EE Eelere AR EE nao RO a AO cuco Ee AE AR ENEE pa dO XIX Organismos 000000 L xxiii PARTE I Citocromo cd cdiNiR de Marinobacter hydrocarbonoclasticus Isolamento Caracterizac o e Desenvolvimento de um Biossenso
233. zados em 50 mM MES pH 6 3 com 150 mM de KCl a uma velocidade de varrimento de 50 mVs Os voltamogramas c clicos apresentados na figura L29 demonstram que a co imobilizac o das duas prote nas na matriz de PVA n o altera o perfil voltam trico do cit css2 limitando se a existir um decr scimo na intensidade de corrente gerada em consequ ncia da diminui o da rea de contacto entre o mediador e a superf cie do el ctrodo provocado pela presen a da enzima Observou se ainda que o encapsulamento das prote nas aumentou a simetria entre os picos de redu o e oxida o da esp cie electroactiva aproximando este sistema do modelo de adsor o Na aus ncia de substrato a an lise dos voltamogramas c clicos do cit css gt tra ados na presen a de cd NiR a diferentes velocidades de varrimento fig L 30A indicam que a transfer ncia electr nica heterogenia entre o el ctrodo de trabalho e o mediador uma reac o quasi revers vel com valores de separa o entre os picos pr ximos de zero e raz es entre a intensidade dos picos de aproximadamente um 54 Intensidade de Corrente uA e 2 A 6 8 0 10 0 00 0 10 0 20 0 30 0 40 0 50 0 60 B Potencial V vs NHE 0 d D E 2 3 5 4 5 V 2 e M e D 8 E so 0 00 0 05 0 10 0 15 0 20 0 25 Velocidade de Varrimento Vs Fig 1 30 Depend ncia relativamente velocidade de varrimento da resposta electroqu mica do cit C552 100 uM qua

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