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Pneumo CLART bacteria® v4 Jul 2015 portugues

1. o suficiente para diferenciar o subtipo e dete o de quaisquer das esp cies de bordetella acima mencionadas O sistema de dete o da Pneumo CLART bacteria baseia se na precipita o de um produto insol vel naquelas reas de micro matrizes em que tem lugar a hibridizac o de produtos de amplificac o com sondas espec ficas Durante a RCP os produtos amplificados s o etiquetados com biotina Ap s a amplificac o estes produtos s o hibridizados com as respetivas sondas complementares espec ficas que est o imobilizadas em reas espec ficas e bem conhecidas de micro matrizes Em seguida s o incubados com um conjugado de peroxidase de estreptavidina O conjugado fica ligado atrav s da estreptavidina a biotina presente nos produtos amplificados que est o agregados as respetivas sondas espec ficas e a atividade de peroxidase implica o aparecimento de um produto n o sol vel na presenca do substrato de o dianisidina que se precipita nas reas de micro matrizes onde ocorre a hibridiza o figura 2 Produtos marcados Sondas do array Biotina Hibridizac o EEE Conjugado NSI UCA Incuba o com conjugado AL Precipitac o especifica Rea o com revelador Figura 2 Diagrama do m todo de visualizac o As sondas imobilizadas na superf cie capturam os respetivos produtos complementares amplificados e etiquetados da biotina Com a ajuda da biotina colam se ao conjugado neste ca
2. cuo A matriz deve estar isenta de res duos da solu o embora nunca deva permanecer seca Adicione imediatamente a solu o seguinte 4 Hibridiza o Antes de utilizar a solu o SH a mesma deve ser aquecida at aos 56 C at completa dilui o dos sais Uma vez desnaturados os produtos da RCP adicione a cada alv olo CS 100 ul da solu o SH evite a forma o de espuma Seguidamente adicione 5 ul do produto RCP desnaturado do tubo de amplifica o Utilize uma matriz por amostra Misture v rias vezes tendo o cuidado para n o tocar no fundo do alv olo Recomenda se que se carregue cada tira independente e separadamente das restantes a fim de evitar contamina es Cubra a placa de microtitulac o com a tampa de pl stico fornecida e incube na misturadora t rmica durante 1 hora a 56 C agitando a 550 rpm Ap s esta incubac o retire a placa da misturadora t rmica e aspire a soluc o SH da CS com uma pipeta ou preferencialmente com uma bomba de v cuo A matriz deve estar isenta de res duos da solu o embora nunca deva permanecer seca Adicione imediatamente a solu o seguinte Depois da incuba o programe a misturadora t rmica para 30 C e em movimento para que possa ser utilizada mais tarde no passo 6 5 Dupla lavagem Adicione 200 ul da solu o dilu da de TL a cada alv olo CS e suspenda 10 a 15 vezes com a pipeta multicanal Deite fora a solu o dilu da de TL com uma pipeta ou
3. imagem no leitor certifique se que os marcadores de posi o aparecem e que n o existem borbulhas fibras ou manchas que interfiram com a leitura Caso contr rio limpe a face exterior do alv olo com papel celul sico 6 AMOSTRAS O estojo da Pneumo CLART bacteria foi concebido e validado para ser utilizado com o ADN extra do das amostras respirat rias cuspo lavagens nasofar ngeas exsudadas aspiradas lavagem bronco alveolar e suc o br nquica A GENOMICA n o respons vel pelos resultados obtidos se outros tipos de amostras dife rentes das indicadas forem usadas Guarde as amostras a 4 C se estas forem processadas num prazo inferior a 12 horas Caso contr rio devem ser guardadas congeladas a 202 C 7 PROTOCOLO DE TRABALHO 7 1 EXTRA O AUTOM TICA DO ADN NA NucliSENS EasyMag DA BIOMERIEUX e Por cada s rie de amostras a serem analisadas deve ser inclu do um controlo de extra o negativo cloreto de s dio a 0 9 a fim de confirmar que as amostras n o foram contaminadas durante os 7 2 processos de extrac o amplificac o e visualizac o o que poderia conduzir a um resultado positivo falso Para amostras l quidas transfira 200 ul da amostra para um tubo eppendorf Para amostras densas adicione 1 ml de tamp o salino utilize o vortex e transfira 200 ul para um tubo de 1 5 ml Adicione 50 ul de proteinase K PK Incube durante 30 minutos a 566 C agitando a 550 rpm por ou
4. o A raz o deste desenho O controlo gen mico do ADN seria apenas essencial para confirmar um resultado negativo uma vez que nos informa que a extra o do ADN a partir de amostras de fezes foi conduzida com sucesso ainda que n o tenha havido qualquer amplifica o do patog nico O controlo da RCP seria apenas essencial quando n o se encontra qualquer amplifica o no tubo porque ajudar a distinguir entre uma RCP inibida e uma amostra em que n o esteja presente qualquer ADN H 3 resultados poss veis para uma amostra 1 Resultado positivo a presen a de determinada bact ria na amostra do paciente 2 Resultado negativo a aus ncia de determinada bact ria na amostra do paciente 3 Resultado incerto h tr s diferentes possibilidades a explicar este resultado 3 1 Incerto com o controlo de amplifica o da RCP inibido Poder haver um problema que afete a amplifica o e ou a extra o O processo dever ser reiniciado a partir do passo de extra o 3 2 Incerto sem qualquer controlo gen mico interno devido a uma falha numa etapa da extra o Todo o processo deve ser reiniciado a partir da etapa de extra o 3 3 Incerto com ambos os controlos conclu dos com sucesso H duas possibilidades uma em que as r plicas dos pontos na matriz s o demasiado diferentes uns dos outros outra em que a intensidade do sinal de absorv ncia n o normalizada se encontra no limite de dete o do ensaio c
5. utilizados 3 2 REAGENTES DE VISUALIZA O O estojo de visualiza o expedido e deve ser guardado a 4 C AVISO Uma vez recebidas as tiras CS CLART devem ser guardadas temperatura ambiente 3 3 Tiras CS incluindo todas as sondas espec ficas S o fornecidas num envelope t rmico selado Guarde o temperatura ambiente m x 25 C protegido da luz direta SH Solu o de Hibridiza o Guarde temperatura de 4 C DC Diluente do Conjugado Guarde temperatura de 4 C CJ Conjugado Guarde a temperatura de 4 C Centrifugue uma vez antes de utilizar RE Solu o de Desenvolvimento Guarde temperatura de 4 Ce proteja da luz TL Tamp o de Lavagem Guarde a temperatura de 4 C Adaptador e tampa para as tiras de 8 alv olos OUTROS COMPONENTES Para efeitos de captura e posterior processamento da imagem necess rio uma unidade de leitura um software produzido medida e uma placa adaptadora CAR CLINICAL ARRAY READER Leitor da Matriz Cl nica Permite a leitura e interpreta o autom tica at 12 CS i at um m ximo de 96 amostras SAICLART software desenvolvido e validado pela GENOMICA para processamento de imagens Software espec fico do dispositivo Pneumo CLART bacteria concebido e validado pela GENOMICA Figura 3 CAR CLINICAL ARRAY READER 4 MATERIAIS NECESS RIOS MAS N O FORNECIDOS A seguir apresenta se uma lista de todos os ma
6. 10 e Ligue o fluxo laminar e a l mpada de UV pelo menos 20 minutos antes da extra o Desligue a l mpada de UV quando a mesma estiver a trabalhar dentro do arm rio e A prepara o das amostras antes da extra o deve ser efetuada dentro do arm rio 5 3 PRECAU ES A TOMAR NA AMPLIFICA O e Coloque os tubos de amplifica o no aparelho de ciclagem t rmica quando o bloco estiver acime de 90 C minimizando assim eventuais amplifica es n o espec ficas devido incuba o abaixo da temperatura de hibrida o 5 4 PRECAU ES A TOMAR NA VISUALIZA O 1 Evite que o bico da pipeta ou o sistema de aspira o toque no fundo do alv olo uma vez que isto pode danificar as sondas impressas no fundo do alv olo Recomenda se que todas as solu es sejam adicionadas junto parede do alv olo CS e nunca diretamente no fundo conveniente que n o se adicione a solu o SH solu o de hibridiza o at que os produtos desnaturados de RCP estejam prontos A matriz n o pode permanecer seca No seguimento da incuba o com a solu o CJ muito importante lavar rigorosamente a micro matriz de modo a evitar quaisquer res duos que possam reagir com a solu o RE podendo daqui resultar uma precipita o n o espec fica que poder levar a falsas inter preta es do resultado Evite a forma o de espuma quando estiver a adicionar qualquer reagente Quando se estiver a visualizar a
7. A dete o deste fragmento confirma o isolamento de material gen tico durante a etapa de extrac o A detec o do produto amplificado pela RCP efetuada por interm dio de uma plataforma micro matriz de baixa densidade CLART Clinical Arrays Technology Tecnologia de Matriz Cl nica A plataforma baseia se num princ pio muito simples mas ao mesmo tempo custo eficaz Consiste numa micro matriz impressa no fundo do alv olo da placa de microtitula o CLART Strip CS figura 1 que simplifica a totalidade do processo de hibridiza o e visualiza o quando comparado com sistemas cl ssicos de micro matrizes Figura 1 Plataforma CLART Strip CS na forma de uma tira de 8 alv olos 1 gt A 4 Incluindo a dete o do transpos o respons vel pelo aparecimento da resist ncia meticilina mecA A presen a do mecA pode ser devida n o s dete o de S aureus mas tamb m de quaisquer outros estafilococos coagulase negativos ECN presentes na amostra O estojo deteta apenas o mecA positivo na presen a de S aureus 2 i Estes micro organismos podem estar presentes na flora comensal do paciente numa base regular por isso qualquer resultado positivo obtido em rela o a essas bact rias dever ser avaliado tendo em conta as circunst ncias anteriormente mencionadas gt O resultado positivo da bordetella spp ser referenciado no caso do software n o dispuser de informa
8. CLART gt GEN MICA Pneumo CLART bacteria DETE O E IDENTIFICA O GEN TICA DE BACT RIAS CAUSADORAS DE INFE ES RESPIRAT RIAS EM HUMANOS PARA O DIAGN STICO IN VITRO Pneumo CLART bacteria O conte do deste dispositivo encontra se submetido a Patente Internacional WO2015055768 CLARTY CLART Strip CARY SAICLART e Pneumo CLART bacteria s o Marcas registadas da GENOMICA Para mais informa es queira consultar o s tio WEB www genomica com sal GENOMICA S A U Parque Empresarial Alvento Edificio B Calle V a de los Poblados 1 12 planta 28033 Madrid Espanha www genomica com Vers o 4 Julho 2015 10 11 NDICE GLOSS RIO DESCRI O DO PROTOCOLO COMPONENTES E ARMAZENAMENTO DO ESTOJO 3 1 Reagentes de amplifica o 3 2 Reagentes de visualiza o 3 3 Outros componentes MATERIAIS NECESS RIOS MAS N O FORNECIDOS 4 1 Reagentes e materiais 4 2 Equipamento RECOMENDA ES E PROCEDIMENTOS DE MANIPULA O 5 1 Recomenda es gerais 5 2 Precau es a ter com a extra o e adi o de material extra do ao tubo de amplifica o 5 3 Precau es a tomar na amplifica o 5 4 Precau es a tomar na visualiza o AMOSTRAS PROTOCOLO DE TRABALHO 7 1 Extra o autom tica do ADN na NucliSENS EasyMag da Biomerieux 7 2 Reac o de amplificac o 7 3 Visualiza o do produto amplificado no CLART Strip CS LEITURA DOS RESULTADOS INTERPRETA O DOS RESULTADOS
9. ESPECIFICACOES T CNICAS E OPERACIONAIS 10 1 Controlo de interfer ncias conhecidas 10 2 Especifica es t cnicas BIBLIOGRAFIA 1 GLOSS RIO Aten o consulte as instru es de utiliza o Data de validade IVD Dispositivo m dico para o diagn stico In vitro LOT Lote 25 C Guardar a temperatura ambiente 82 Guardar a temperaturas entre 42 Ce 82 C 42C aep Guardar a temperaturas entre 302 C e 182 C 2 DESCRI O DO PROTOCOLO A Pneumo CLART bacteria deteta a presen a da bact ria principal causadora das infe es respirat rias em humanos nas seguintes amostras cl nicas cuspo lavagens nasofar ngeas exsudadas aspiradas lavagem bronco alveolar e suc o br nquica As bact rias detetadas est o indicadas a seguir Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae Haemophilus spp Moraxella catarrhalis Mycoplasma pneumoniae Bordetella pertussis Bordetella parapertusis Bordetella bronchiseptica Bordetella holmesii Bordetella spp A dete o efetuada pela amplifica o espec fica de cada micro organismo na amostra originando um fragmento vari vel entre 150 e 550 pares de bases A fim de evitar resultados de falsos negativos cada mistura inicial da RCP inclui os seguintes controlos e Controlo interno da amplifica o A sua dete o garante a presta o adequada do processo de amplifica o e Controlo gen mico do ADN
10. ante evitar quaisquer res duos da solu o de CJ uma vez que as mesmas podem reagir com a solu o RE gerando um sinal inespec fico 8 Desenvolvimento com a solu o RE Retire por completo a solu o dilu da de TL e adicione 100ul de solu o RE a cada alv olo CS e incube durante 10 minutos a 25 C na misturadora t rmica sem agita o Aviso muito importante a utiliza o da misturadora t rmica sem agita o 9 Deite fora toda a soluc o TL atrav s de uma pipeta ou um sistema de v cuo 10 CARY Leitor da Matriz Cl nica Coloque na prateleira do CAR e a placa por cima deste Uma vez fechada a prateleira a leitura processa se automaticamente 8 LEITURA DOS RESULTADOS Os dados obtidos de cada an lise s o processados automaticamente O sistema de leitura e an lise CAR disponibiliza um relat rio a indicar os resultados O monitor apresenta uma tabela com duas colunas na coluna da esquerda listam se as esp cies que se encontram caracterizadas na matriz Na coluna da direita lista se o resultado anal tico positivo negativo inconclusivo n o v lido 9 INTERPRETA O DOS RESULTADOS Uma das grandes desvantagens da amplifica o gen mica a utiliza o de amostras de ADN de fraca qualidade pela retirada de uma quantidade insuficiente da amostra degrada o do ADN devido ao armazenamento incorreto da amostra perda do ADN da amostra durante a extra o ou a presen a de inibidores da p
11. as solu es deite fora os pentes depois de cada utiliza o ou descontamine os com uma solu o dilu da de lix via a 10 depois de cada ensaio Certifique se que a bomba aspira adequadamente e n o deixa vest gios no fundo do alv olo 7 Aspire as diferentes solu es por completo sem tocar na matriz VISUALIZA O 1 Desnatura o Coloque os tubos de amplifica o no aparelho de ciclagem t rmica quando este atingir 95 C e incube os tubos durante 10 min N o ultrapasse o tempo de 10 min de desnatura o a fim de evitar que os tubos se abram e haja o risco de contamina o Remova os tubos da incuba o de 95 Ce coloque os imediatamente em gelo 2 Prepara o da solu o dilu da de TL Por cada tira de 65 total de 8 alv olos prepare 10 ml de solu o dilu da de lavagem adicionando 1 ml da solu o TL a 9 ml de gua destilada e misture lentamente 3 Pr lavagem da CS Antes de se iniciar o ensaio torna se necess rio lavar as tiras adicionando a cada alv olo 200 ul de solu o dilu da de TL Misture a com a pipeta multicanal 10 a 15 vezes tendo em conta que a superf cie da matriz n o deve ser tocada Aconselha se que esta lavagem seja efetuada enquanto as amostras amplificadas estiverem a ser desnaturadas e que a solu o de lavagem se mantenha no alv olo at as amostras poderem ser adicionadas ao mesmo Deite fora a solu o dilu da de TL com uma pipeta ou preferencialmente com uma bomba de v
12. e do diagn stico foram processadas a partir da extrac o da amostra at a 1 gt A A 175 cuspos 12 aspirados nasofar ngeos 6 lavagens br nquicas 69 aspirados br nquicos 4 exsudados nasofar ngeos secre o respirat ria visualizac o na CS 11 BIBLIOGRAFIA Acute Respiratory Infection Due to Chlamydia pneumoniae Current Status of Diagnostic Methods Swati Kumar e Margaret R Hammerschlag Clinical Infectious Diseases 2007 44 568 76 Limited Utility of Culture for Mycoplasma pneumoniae and Chlamydophila pneumoniae for Diagnosis of Respiratory Tract Infections Rosemary C She Andy Thurber Weston C Hymas Jeffery Stevenson Janine Langer Christine M Litwin e Cathy A Petti JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY Setembro de 2010 p 3380 3382 Associations between Pathogens in the Upper Respiratory Tract of Young Children Interplay between Viruses and Bacteria Menno R van den Bergh Giske Biesbroek John W A Rossen Wouter A A de Steenhuijsen Piters Astrid A T M Bosch Elske J M van Gils Xinhui Wang Chantal W B Boonacker Reinier H Veenhoven Jacob P Bruin Debby Bogaert Elisabeth A M Sanders PLOS ONE Outubro de 2012 7 10 Diagn stico microbiol gico de las infecciones bacterianas del tracto respiratorio inferior Juana Bego a Cacho Calvo Mar a Antonia Meseguer Peinado Antonio Oliver Palomo Jorge Puig de la Bellacasa Protocolos SEIMC 2007 Diagn stic
13. er ncia e resultado positivo para Pneumo CLART bacteria a discrep ncia ser debatida pela RCP espec fica aninhada e pela sequencia o O resultado o que se pode considerar como verdadeiro Tabela 2 Sensibilidade e especificidade do diagn stico do estojo da Pneumo CLART bacteria Padr o Sensibilidade Especificidade N 267 dourado PPV NPV 89 7 2 4 99 75 0 25 99 1 0 9 96 9 0 7 89 3 1 7 98 6 0 3 96 9 0 6 94 9 0 8 Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae Haemophilus sp H influenzae 96 8 0 5 93 1 1 1 Moraxella catarrhalis 98 7 1 3 99 5 0 5 NOTA devido a sua baixa preval ncia n o tem havido amostras positivas em relac o aos seguintes organismos Mycoplasma pneumoniae Bordetella bronchiseptica e Bordetella holmesii Por isso falhou a identifica o da sensibilidade do diagn stico do estojo para estes patog nicos Em todos os casos a sensibilidade anal tica foi avaliada pelos plasm deos recombinantes do ADN e estirpes da colheita colheita da DSMZ 0 Bordetella parapertussis 10 e Especificidade do diagn stico A t cnica foi validada tanto com amostras respirat rias negativas como com amostras respirat rias positivas para outros micro organismos n o inclu dos no estojo e os resultados n o apresentaram qualquer reac o cruzada com os mesmos e Reprodutibilidade e repetibilidade do diagn stico por tipo de amostra A reprodutibilidade e repetibilidad
14. fetuadas experi ncias de especificidade em plasm deos recombinantes em que se observa que uma dete o inespec fica de outros micro organismos diferentes dos que s o determinados n o produzida Por isso considera se que a t cnica atinge uma especificidade anal tica de 100 Par metros do utilit rio do diagn stico A fim de determinar os par metros do diagn stico do estojo foi levada a cabo uma avalia o comparativa do estojo da Pneumo CLART bacteria contra a cultura das t cnicas de refer ncia e ou a RCP Para esta avaliac o colabor mos com os seguintes laborat rios e Departamento de Microbiologia Hospital Universit rio Tr as i Pujol Badalona Espanha e Departamento de Microbiologia Hospital Universit rio Ramon y Cajal Madrid Espanha A presenca de cada um dos micro organismos que foi detetado com o estojo foi analisada a partir de material gen tico de amostras respirat rias Analis mos um total de 267 amostras O resultado considerado verdadeiro para cada amostra se houver concordancia entre a refer ncia t cnica e a t cnica da Pneumo CLART bacteria As discrep ncias entre as duas t cnicas foram resolvidas da seguinte forma Resultado positivo para o padr o dourado e resultado negativo para a Pneumo CLART bacteria a t cnica de refer ncia considerada como tendo dados corretos e considera se falso negativo para a Pneumo CLART bacteria Resultado negativo para a t cnica de ref
15. ficado Devem estar dispon veis separadamente materiais de trabalho em cada zona pipetas bicos tubos grelhas luvas etc e que nunca devem ser utilizados fora dessas mesmas zonas 1 Zona pr RCP A extra o do ADN prepara o de amostras e adi o do material extra do aos tubos de amplifica o s o efetuados nesta zona A manipula o das amostras deve ser efetuada dentro de um gabinete de biosseguran a GBS 2 Zona p s RCP A amplifica o e visualiza o do produto amplificado s o efetuados nesta zona O material desta zona nunca deve entrar em contacto com o material da zona de extra o Evite entrar na zona de pr RCP depois de ter trabalhado na zona de visualiza o Utilize sempre luvas Veja a sec o 5 2 Recomenda se que as luvas sejam substitu das com frequ ncia e obrigat rio substituir as luvas antes de iniciar os trabalhos em cada uma das zonas anteriormente citadas Devem ser sempre utilizadas luvas novas quando se adiciona o ADN aos tubos de amplifica o Limpe as zonas de trabalho prateleiras dos laborat rios capotas grelhas pipetas rigorosamente com uma solu o dilu da de lix via a 10 depois de cada processamento de amostras em lote obrigat rio desinfetar todas as zonas de trabalho no caso de contamina o Recomenda se com refer ncia aos aparelhos de ciclagem t rmicas e misturadores t rmicos que os mesmos sejam limpos antes e depois do uso nestas mesmas condi e
16. o microbiol gico de las infecciones bacterianas del tracto respiratorio superior Ninive Batista D az Ana Bordes Ben tez Oscar D ez Gil Mar a Lecuona Fern ndez Magdalena Lara P rez Protocolos SEIMC 2006
17. olimerase do ADN nas amostras a serem analisadas interferindo por isso com a amplifica o gen mica resultando daqui falsos negativos Com o estojo da Pneumo CLART bacteria os falsos negativos s o removidos pela adi o de um controlo interno ao tubo de amplifica o o que indicativo da efic cia da rea o de amplifica o Est inclu do tamb m no tubo um controlo de extra o gen mica do ADN para detetar falsos negativos devido a falhas na extra o Deve ser inclu do em cada conjunto de an lises um controlo de extra o negativo para confirmar que as amostras n o foram contaminadas durante a extra o amplifica o e visualiza o dando origem a um falso positivo O tubo de amplifica o cont m as seguintes subcapas de amplifica o e Um par de oligonucle tidos que ampliam um fragmento do gene R globina humano como um controlo gen mico do ADN do paciente e Um par de oligonucle tidos que ampliam um plasm deo modificado inclu do no tubo de amplifica o que utilizado como controlo de amplifica o da rea o da RCP e Oligonucle tidos espec ficos para os alvos dos patog nicos a serem detetados O tubo de rea o foi desenhado a fim de favorecer a amplifica o de micro organismos por compara o com os dois outros controlos A amplifica o do ADN gen mico dever ser executada entre estes dois controlos comparando preferencialmente com o controlo da rea o de amplifica
18. opipeta Mantenha os tubos sempre refrigerados Programe os seguintes ciclos de temperatura no aparelho de ciclagem t rmica 952 C 30 seg A5 ciclos 592 C 60 seg 722 C 60 seg 1 ciclo 722 C 10 min 42 C continuamente at a recolha do tubo opcional Inicie o programa e coloque os tubos no aparelho de ciclagem t rmica quando o bloco exceder 902 C 7 3 VISUALIZA O DO PRODUTO AMPLIFICADO NO CLART Strip CS Recomenda es espec ficas antes de come ar a visualiza o O PROTOCOLO QUE A SEGUIR SE DESCREVE DEVE SER SEMPRE EXECUTADO NA ZONA P S RCP N O LEVE O PRODUTO AMPLIFICADO PARA A ZONA PR RCP 1 Ligue o CAR CLINICAL ARRAY READER Leitor da Matriz Cl nica antes de iniciar todo o processo A autocalibragem do equipamento demora alguns minutos e tamb m necess rio inserir o nome das amostras no programa antes da leitura 2 Certifique se que antes do in cio da hibridiza o a temperatura do misturador t rmico atingiu 562 C durante pelo menos 1 hora 3 Mantenha a solu o SH no misturador t rmico a 562 C que a temperatura de hibridiza o 4 Prepare uma nova solu o de lavagem antes de cada ensaio n o volte a utilizar de novo solu es previamente preparadas ou res duos 5 Utilize diferentes bicos filtrados para cada alv olo e mude os sempre que se adiciona um reagente 6 No caso de se utilizarem bombas de v cuo equipadas com um pente de 8 bicos para a aspira o d
19. preferencialmente com uma bomba de v cuo multicanal sem deixar res duos Repita o procedimento Este passo deve ser levado a cabo com diferentes bicos para cada alv olo em ambas as lavagens Ao chegar a este passo se a misturadora t rmica n o tiver atingido os 306 C os alv olos devem manter a soluc o de TL at a misturadora t rmica atingir aquela temperatura 6 Bloqueio e conjugado Recomenda se que a soluc o de elevada afinidade CJ seja centrifugada durante 10 segundos antes da sua utiliza o Seguidamente prepare a solu o dilu da de CJ da seguinte forma para cada tira de CS misture 1 ml da solu o DC e 7 5 ul da solu o de elevada afinidade CJ Deite fora a solu o dilu da de TL sem deixar quaisquer res duos da solu o e adicione 100 ul da soluc o dilu da de CJ a cada alv olo CS Incube durante 15 minutos exatos na misturadora t rmica a 302 C agitando a 550 rpm Ap s esta incubac o retire a placa e deite fora a soluc o rapidamente com uma pipeta ou uma bomba de v cuo multicanal Uma vez terminada a incubac o coloque a misturadora t rmica a 252 C e em movimento para que a mesma possa ser utilizada posteriormente no passo 8 7 Lavagem tripla Adicione imediatamente 20 ul de solu o dilu da de TL a cada alv olo CS misturando 10 a 15 vezes com a pipeta multicanal e deite fora a totalidade da solu o com a pipeta ou a bomba de v cuo Repita o procedimento mais duas vezes muito import
20. s Utilize sempre bicos de filtro e pipetas de deslocamento positivo a fim de evitar a contamina o devido s micropipetas Devem ser usadas em cada zona diferentes conjuntos de pipetas Deite fora o bico da micropipeta depois de utilizar a mesma Utilize material laboratorial descart vel e esteriliz vel em autoclave Nunca misture reagentes de dois frascos diferentes ainda que os mesmos perten am ao mesmo lote Encerre os tubos de reagentes imediatamente depois de os utilizar a fim de evitar qualquer contamina o A GENOMICA n o respons vel pelos resultados obtidos com o estojo se forem usadas outras amostras diferentes das indicadas PRECAU ES A TER COM A EXTRA O E ADI O DE MATERIAL EXTRA DO AO TUBO DE AMPLIFICA O Visto que a maior parte das dete es da Pneumo CLART bacteria est o presentes na superf cie da pele por isso muito importante evitar a contamina o com estes micro organismos Para se proceder em conformidade devem ser seguidas as seguintes precau es Utilize um gel desinfetante ou etanol a 70 para a limpeza das m os e a pele dos antebra os Cubra as mesmas com luvas de Manga comprida e Minimize o contacto com a superf cie externa das luvas ao cal las e Evite tocar na pele e no cabelo enquanto estiver a manusear as amostras Se tocar nas mesmas troque de luvas e Limpe as superf cies de trabalho das estantes com uma solu o dilu da de lix via a
21. so a estreptavidina HRP Horse Radish Peroxidase peroxidase de r bano O substrato de O dianisidina por ac o da HRP produz um precipitado na zona onde ocorre a hibridiza o 3 COMPONENTES ARMAZENAMENTO DO ESTOJO O estojo da Pneumo CLART bacteria cont m reagentes em quantidade suficiente para executar 16 ou 48 an lises de amostras cl nicas Os reagentes contidos no estojo foram agrupados em diversas embalagens dependendo da respetiva temperatura de armazenamento Se forem observadas as recomenda es de armazenamento todos os reagentes dever o permanecer est veis at ao fim do prazo de validade do estojo 3 1 REAGENTES DE AMPLIFICA O Os reagentes s o expedidos e devem ser guardados a 202 C PK Proteinase K 10 x Uma vez descongelado deve ser preservado em gelo e guardado a 4 C Uma vez descongelado o PK deve ser utilizado no prazo de um m s Tubos de amplifica o tubo branco Pronto a usar Cont m 45 ul de mistura reativa Descongele sobre o gelo a quantidade exata de tubos de amplifica o que v o ser utilizados e mantenha os restantes a 202 C A fim de garantir a integridade dos reagentes e a cadeia de frio do produto a embalagem do estojo inclui um indicador de temperatura autoadesivo e irrevers vel o aparecimento de uma cor avermelhada na janela de visualiza o indica que em dado momento os produtos excederam a temperatura de armazenamento de 20 6 e n o devem ser
22. teriais necess rios mas que n o s o fornecidos 4 1 REAGENTES E MATERIAIS gua destilada Luvas descart veis Bicos de filtros ou pipetas de deslocamento positivo Recipiente de gelo picado Tubos de 1 5 ml do tipo Eppendorf para autoclave Grade para tubos de 1 5 ml Suporte para tubos de 0 5 ml 0 2 ml Solu o salina NaCl a 0 9 4 2 EQUIPAMENTO Micro centrifugador Aparelho de ciclagem t rmica C mara laminar de fluxo para o laborat rio de extra o Tr s micropipetas ajust veis variando de 1 20 ul 20 200 ul e 200 1000 ul para o laborat rio de extra o Uma micropipeta ajust vel variando de 1 20 ul para adicionar o material gen tico aos tubos de amplifica o Tr s micropipetas ajust veis variando de 1 20 ul 20 200 ul e 200 1000 ul para o laborat rio de visualiza o Bloco t rmico com adaptador de placa tampa e agita o ajust vel a 25 C 30 Ce 56 C compat vel com placas de 96 alv olos V rtice Sistema de v cuo 5 RECOMENDA ES E PROCEDIMENTOS DE MANIPULA O Leia atentamente antes de iniciar o ensaio a fim de evitar a contamina o Leia atentamente antes de iniciar a t cnica 5 1 Jl 5 2 RECOMENDACOES GERAIS Este ensaio deve ser executado em duas zonas fisicamente separadas a fim de evitar a con tamina o da amostra com o produto previamente ampli
23. tro lado e utilizando o vortex de 10 em 10 minutos Transfira 250 ul de amostra para o extrator Execute o na unidade de extra o NucliSENS EasyMag selecionando a lise interna e a extra o regular de acordo com o protocolo GEN RICO do fabricante Coloque o volume de elui o a 25 Se for utilizado outro sistema de extra o o volume de elui o deve ser otimizado na faixa de 20 30 ul A GENOMICA apenas validou esta extra o autom tica para que haja pequenas diferen as em relac o a m todos diferentes REA O DE AMPLIFICA O Recomenda es espec ficas para a amplifica o S Trabalhe na zona de Pr RCP usando sempre um arm rio e seguindo as recomenda es mencionadas na sec o 5 1 O ADN sempre adicionado num compartimento seguindo as recomenda es mencionadas na sec o 5 1 Durante o processo mantenha os tubos separados e refrigerados Descongele um tubo de amplifica o para cada amostra a analisar Guarde no gelo e n o utilize temperaturas acima de 372 C para o descongelamento Centrifugue os tubos de amplifica o durante alguns segundos para que todo o l quido se concentre no fundo dos tubos para o caso de n o ter adaptadores de micro centrifugadores dispon veis para os tubos podem se utilizar tubos maiores depois de se terem cortado as respetivas tampas Adicione 5 ul do ADN extra do a todos os tubos de amplifica o e misture v rias vezes com a micr
24. uja amplitude foi estabelecida especificamente pelo software para cada micro organismo Em ambos os casos o passo de visualiza o deve ser repetido 10 ESPECIFICACOES T CNICAS E OPERACIONAIS 10 1 CONTROLO DE INTERFER NCIAS CONHECIDAS Os falsos negativos s o um dos inconvenientes na dete o pela amplifica o gen mica quer devido a uma qualidade inadequada do ADN extra do devido quantidade insuficiente da amostra degrada o do ADN armazenamento inadequado ou perda do ADN durante a extra o quer devido presen a de inibidores da polimerase do ADN nas amostras que devam ser processadas lcool sais etc A fim de se evitarem estas interfer ncias devem ser seguidas as indica es das sec es 5 6 e 7 deste manual 10 2 ESPECIFICA ES T CNICAS Par metros de processamento e Sensibilidade anal tica A sensibilidade anal tica foi determinada pela amplifica o de dilui es em s rie de plasm deos recombinantes para cada uma das muta es detetadas pelo estojo Cada um deles tem o produto amplificado inserido incluindo a parte que complementar as sondas de dete o espec ficas A visualiza o foi efetuada no 65 dando 950 aos seguintes resultados Tabela 1 Bordetella bronchiseptica Tabela 1 Rela o do n mero de c pias do plasm deo recombinante necess rias para obter uma sensibilidade de 100 na dete o de cada um dos micro organismos e Especificidade anal tica Foram e

Pneumo CLART bacteria® v4 Jul 2015 portugues

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