CLART ENTHERPEX V5 Jul 2015 Portugues-por
Contents
1. GEN MICA CLART ENTHERPEX DETEC O E TIPIFICA O DE HERPES E ENTEROVIRUS HUMANO ATRAV S DA IDENTIFICA O GEN MICA PARA DIAGN STICO IN VITRO CLART ENTHERPEX O conteudo deste dispositivo encontra se submetido a Patente Internacional WO2009122201 CLART CLART Strip CAR SAICLART AUTOCLART ENTHERPEX s o marcas registadas da GENOMICA NB 0318 s diz respeito ao diagn stico in vitro de CMV GENOMICA S A U Parque Empresarial Alvento Edificio B Calle Via de los Poblados 1 12 planta 28033 Madrid Espanha Telf 34 91 674 89 90 Fax 34 91 674 89 91 www genomica com Versao 4 Julho 2015 INDICE 1 2 3 QUADRO DE SIMBOLOS DESCRI O DA EMBALAGEM CLART ENTHERPEX COMPONENTES E CONSERVACAO DA EMBALAGEM 3 1 Reagentes de extrac o purifica o 3 2 Reagentes de amplifica o 3 3 Reagentes de visualiza o 3 4 Outros componentes MATERIAL NECESS RIO MAS N O FORNECIDO 4 1 Reagentes e materiais 4 2 Equipamento RECOMENDA ES E PROCEDIMENTOS DE MANIPULA O 5 1 Recomenda es gerais 5 2 Precau es para visualiza o COLHEITA DE AMOSTRAS 6 1 Zaragatoas 6 2 Soro plasma 6 3 L quido cefalorraquidiano 6 4 Tecido embebido em parafina fixado com formol ou etanol PROTOCOLO DE TRABALHO 7 1 Extrac o manual de ADN ARN a partir de amostras diferentes 7 1 1 Zaragatoas 7 1 2 Soro plasma 7 1 3 L quido cefalorraquidian2. Factors influencing varicella zoster virus infection after allogeneic peripheral blood stem cell transplantation low dose acyclovir prophylaxis and pre transplant diagnosis of lymphoproliferative disorders Transpl Infect Dis 10 2 90 98 2008 24 Dolcetti R B lymphocytes and Epstein Barr virus the lesson of post transplant lymphoproliferative disorders Autoimmun Rev 7 2 96 101 2007 25 Sugita S Shimizu N Watanabe K Mizukami M Morio Sugamoto Y Mochizuki M Use of multiplex PCR and real time PCR to detect human herpes virus genome in ocular fluids of patients with uveitis Br J Ophthalmol 11 2008 32 26 Karatas H Gurer G Pinar A Soylemezoglu F Tezel GG Hascelik G Akalan N Tuncer S Ciger A Saygi S Investigation of HSV 1 HSV 2 CMV HHV 6 and HHV 8 DNA by real time PCR in surgical resection materials of epilepsy patients with mesial temporal lobe sclerosis J Neurol Sci 164 1 2 151 6 2008 27 Dierssen U Rehren F Henke Gendo Harste G Heim A Rapid routine detection of enterovirus RNA in cerebrospinal fluid by a one step real time RT PCR assay Journal Clin Virology 42 1 58 64 2008 28 Read SJ Mitchell JL Fink CG LightCycler multiplex PCR for the laboratory diagnosis of common viral infections of the central nervous system Journal Clin Microbiology 39 9 3056 3059 2001 33
3. S o os seguintes CLART Strip CS incluem as sondas espec ficas S o enviados num envelope selado Depois de aberto o envelope deve ser fechado e conservado temperatura ambiente 25 C m x protegido da luz e SH Solu o de hibridiza o Conservar a 42 C e DC Diluente do conjugado Conservar a 42 e CJ Conjugado Conservar a 4 Centrifugar antes de utilizar e Solu o de desenvolvimento Conservar a 4 e TL Tamp o de lavado Conservar a 42 ADVERT NCIA Ap s receber a embalagem os micro arrays devem ser conservadas temperatura ambiente 3 4 Outros componentes A t cnica requer um sistema para capturar e processar a imagem obtida do micro array criando de modo totalmente automatizado um relat rio nico para cada amostra analisada O quadro a seguir apresenta as caracter sticas do sistema da GENOMICA Tem um Software espec fico para CLART ENTHERPEX designado e validado por GENOMICA e Leitor CAR CLINICAL ARRAY READER figura 3 que permite a leitura e interpreta o autom tica at 12 CS o que significa um total de 96 amostras Esta plataforma fabricada exclusivamente para os dispositivos da GENOMICA e SAICLART software desenvolvido e validado pela GENOMICA para processamento de imagens e Software espec fico para CLART ENTHERPEX designado e validado por GENOMICA Instalado e pronto a usar Figura 3 CAR CLINICAL ARRAY READER 4 MATER
4. caused by reactivation of human herpesvirus 6 and 7 Journal Clinic Virology 40 3 245 247 2007 17 Berger Hug Gysin Molinari L Frei Bossart W Nadal D Distribution patterns of beta and gamma herpesviruses within Waldeyer s ring organs Journal Med Virology 79 8 1147 1152 2007 18 Chen T Hudnall SD Anatomical mapping of human herpesvirus reservoirs of infection Mod Pathol 19 5 726 737 2006 19 Mendoza LP Bronzoni RV Takayanagui OM Aquino VH Figueiredo LT Viral infections of the central nervous system in Brazil Journal Infect 54 6 589 596 2007 20 Kaneko Kawana Ishioka Ohno S Aoki Suzutani Evaluation of mixed infection cases with both herpes simplex virus types 1 and 2 Journal Med Virology 80 5 883 7 2008 21 Ulrich Hackethal M meyer Geusau A Nindl I Ulrich M Forschner Sterry W Stockfleth E Skin infections in organ transplant recipients Journal Dtsch Dermatol Ges 6 2 98 105 2008 22 Anne de Pagter PJ Schuurman Visscher de Vos Bierings van Loon AM Uiterwaal CS van Baarle Sanders EA Boelens J Human herpes virus 6 plasma DNA positivity after hematopoietic stem cell transplantation in children an important risk factor for clinical outcome Biol Blood Marrow Transplant 14 7 831 839 2008 23 Kim DH Messner Minden Gupta V Kuruvilla J Wright J Lipton J
5. com xileno ou utilizar l minas descart veis antes e depois de cortar a amostra para evitar a transfer ncia de res duos de um corte pr vio da amostra Utilizar um microtomo para cortar 2 3 cortes de 5 um e coloc los num tubo est ril de 1 5 ml 7 PROTOCOLO DE TRABALHO 13 7 1 Extrac o manual de ADN ARN de varias amostras De modo a optimizar resultados necess ria a quantidade minima de 5 10 ng ul DNA RNA independentemente de ser efectuada manual ou automaticamente Recomenda es especificas antes de iniciar a extrac o e Trabalhar na area de extrac o pre PCR utilizando sempre uma camara e seguindo as recomenda es mencionadas na sec o 6 1 e Antes de iniciar e ao finalizar deve limpar se muito bem a rea da c mara com lix via dilu da a 10 e Limpar as pipetas antes e depois de cada utiliza o com lix via dilu da a 10 e Manter as amostras em gelo e Utilizar tubos Eppendorf de 1 5 ml est reis Mant los o mais separados poss vel na grelha durante a extrac o de forma a evitar a contamina o Extrac o ADN ARN 7 1 1 Zaragatoas No final de cada s rie de amostras incluir um controlo negativo constitu do por 1 5 ml de solu o salina e processar como o resto das amostras 1 Adicionar 1 5 ml de solu o salina 0 9 de cloreto de s dio ao tubo que cont m a zaragatoa e agitar em vortex durante 1 minuto 2 Decantar o sobrenadante num tubo Eppendorf de 1 5 ml autoclavado e c
6. de Pre PCR numa c mara seguindo as recomenda es mencionadas em 6 1 e Ter especial cuidado aquando da adi o da mistura de enzimas aos tubos de amplifica o j que cont m uma elevada percentagem de glicerol Se introduz demasiado a ponta da pipeta a mistura adere s paredes provocando por um lado que se adicione mais mistura do que o necess rio ao tubo de reac o e por outro que se produza uma perda de produto podendo dar se o caso de n o ter produto suficiente para o resto dos tubos de amplifica o do dispositivo e Adicionar o ADN ARN rea de Pre PCR utilizando sempre uma c mara e seguindo as recomenda es mencionadas no ponto 6 1 Durante o procedimento manter os tubos fechados separados e no gelo 7 3 2 Protocolo de Reac o de Amplifica o 1 Para cada amostra a ser processada descongelar os Tubos de amplifica o um incolor e outro verde e mant los no gelo N o usar temperaturas acima de 37 C para a descongela o 2 Centrifugar uns segundos na microcentrifuga para que o l quido v para o fundo do tubo No caso de n o haver adaptadores de microcentr fuga podem utilizar se em substitui o tubos maiores depois de ter retirado a tampa 3 Adicionar 2 uL de mistura enzim tica ao tubo de amplifica o verde Mix 2 Manter mistura enzim tica no gelo durante a manipula o 4 Adicionar 5 de ARN ADN extra do das amostras a cada um dos Tubos de Reac o e suspender de novo v r
7. pipeta ou com o sistema de v cuo evitando tocar na superf cie da Strip Os po os n o devem conter res duos Em nenhuma circunst ncia os po os devem ficar secos durante um longo 19 periodo de tempo Programar o bloco de aquecimento a 302 C e deixa lo em funcionamento para poder ser utilizado mais tarde na etapa 6 Pode retirar a tampa para que arrefeca mais rapidamente 5 Lavagem lavar duas vezes cada po o CS com 200 ul de Solu o TL dilu da homogeneizar 10 a 15 vezes com a pipeta Eliminar a solu o TL dilu da com pipeta ou preferencialmente com sistema de v cuo deixando um volume No caso do bloco de aquecimento n o ter atingido uma temperatura de 302 C ao chegar a esta etapa deixar os po os cheios com esta solu o TL dilu da at o bloco de aquecimento ter atingido a temperatura necess ria 6 Bloqueador e conjugado aconselhado centrifugar a solu o CJ durante 10 segundos antes de utiliz la Em seguida preparar a solu o CJ dilu da Misturar num tubo 1 mL de solu o DC e 7 5 ul de solu o CJ para cada tira Adicionar 100 ul de Solu o CJ dilu da a cada po o Incubar durante exactamente 15 minutos a 30 C agitando a 550 rpm Ap s esta incuba o eliminar rapidamente a solu o do po o utilizando uma pipeta ou sistema de v cuo Deixar o bloco de aquecimento arrefecer at aos 252 C para sua posterior utiliza o na etapa 8 7 Lavagem tripla Adicionar imediatamente 200 ul de Solu
8. ser utilizada e depois deve ser mantida a 4 C nunca voltar a congelar depois de descongelada Preparar uma mistura de digest o misturar as seguintes quantidades por cada amostra a analisar 70 tubos 1 ___ ul de SD Solu o de Dilui o 20x n tubos 1 __ ul de DB5X Solu o de Digest o 5X 10x n tubos 1 ___ ul de PK 10X Proteinase 10X Adicionar 100 ul de mistura de digest o a cada amostra Empurrar o corte com a ponta da micropipeta para que possa ser completamente coberta pela mistura de digest o Adicionar 100 ul de mistura a um tubo de 1 5 mL vazio que ir ser processado como controlo negativo de extrac o e visualiza o 3 Incubar num bloco de aquecimento ou num banho maria a 562 C durante 3 horas 16 4 Deixar ferver durante 10 minutos para inactivar a Proteinase K Se o fecho dos tubos nao for suficientemente forte aconselha se a perfurar as tampas com uma agulha de modo a prevenir que se abram durante a incuba o a 1002 C 5 Centrifugar imediatamente numa microcentrifuga durante 10 minutos Colher sobrenadante num tubo de 1 5 ml limpo atravessando com uma micropipeta a capa superior de parafina solidificada O ADN extra do pode ser analisado directamente ou pode ser conservado a 202 C 7 2 Extrac o autom tica Seguir as recomenda es do fabricante 7 3 Reac o da amplifica o 7 3 1 Recomenda es especificas para a amplifica o e Trabalhar na rea
9. ADN ARN Tanto o ADN extra do a partir de amostras de sangue total ou de outros produtos de sangue como o obtido a partir de amostras de tecido inclu dos em parafina pode conter restos de hemoglobina e parafina respectivamente Este problema pode ser evitado purificando o ADN ARN a seguir extrac o 2 Res duos de Isopropanol no ADN ARN No processo de extrac o do ADN ARN a partir de amostras de soro plasma e LCR tem de ser precipitado com isopropanol Se o precipitado n o secar correctamente a presen a de isopropanol na amostra pode inibir a reac o de amplifica o 3 Utiliza o inadequada de amostras A an lise de qualquer tipo de amostras cl nicas outras que n o as especificadas no manual do dispositivo CLART ENTHERPEX ou uma colheita de amostras incorrecta pode produzir que o resultado da an lise n o seja 26 conclusivo ou n o conforme por falta de amplifica o por reac o inibida Por exemplo se a zaragatoa tiver sido inclu da em qualquer tipo de meio tal pode resultar na inibi o da PCR Se o tempo de fixa o de um tecido em formol for excessivo o ADN pode degradar se 4 Actividade residual da Proteinase K No processo de extrac o de ADN ARN em amostras de zaragatoas e bi psias tem de inactivar se a Proteinase K mediante incuba o a 1002 C durante 10 minutos Nestas condi es a inactiva o completamente efectuada Se esta etapa for omitida ou as condi es n o forem respeitadas
10. IAIS NECESS RIOS MAS N O FORNECIDOS Encontra se abaixo a lista de materiais necess rios mas n o fornecidos 4 1 Reagentes e materiais e gua destilada e Solu o salina e Luvas descart veis e Pontas de pipeta com filtro ou pipetas de desloca o positivas e Recipiente para gelo picado e Tubos Eppendorf de 1 5 ml autoclavados Grelha para tubos de 1 5 mL e Suporte para tubos de 0 5 mL 0 2 mL 4 2 Equipamento e Oequipamento que se segue necess rio para a fase de visualiza o autom tica O autoclart Figura 4 permite o processamento autom tico de 12 tiras ou 96 amostras Figura 4 autoclart e Microcentrifuga e Termociclador e C mara de bioseguran a para o laborat rio de extrac o e Tr s micropipetas ajust veis entre 1 20 uL 20 200 uL e 200 1000 uL para laborat rio de extrac o e Uma micropipeta ajust vel entre 1 20 UL para adicionar a mistura de enzimas ao tubo de cor de amplifica o e para adicionar o material gen tico aos tubos de amplifica o e Tr s micropipetas ajust veis entre 1 20 uL 20 200 uL e 200 1000 UL para o laborat rio de visualiza o e Bloco de aquecimento com agita o ajust vel a 252 C 302 C 50 Ce 53 C Compat vel com tubos do tipo Eppendorf e com tiras de 8 po os e Vortex e Sistema de v cuo opcional 10 5 RECOMENDACOES E PROCEDIMENTOS DE MANIPULACAO Muito importante de modo a evitar a contamina o Ler cuidadosamente ant
11. RT e ADN polimerase nas amostras nas quais ir ser efectuada a detec o do v rus hemoglobina sais etc Com o dispositivo CLART ENTHERPEX eliminam se estes falsos negativos gra as adi o de um controlo interno da efici ncia da reac o de amplifica o em cada um dos tubos de amplifica o Um desempenho incorrecto durante o procedimento de extrac o ADN ARN pode levar a resultados falsos negativos Recomenda se especial aten o nesta etapa Assim deve ser inclu do um controlo negativo de modo a verificar que as amostras n o foram contaminadas durante o processo de extrac o amplifica o e visualiza o que produziriam resultados falsos positivos 3 COMPONENTES DA EMBALAGEM E CONSERVA O O dispositivo CLART ENTHERPEX cont m reagentes suficientes para a extrac o e a an lise de ADN ARN de 24 ou 48 amostras cl nicas Os reagentes inclu dos na embalagem est o agrupados em v rias caixas dependendo da temperatura na qual se devem conservar Todos Os reagentes s o est veis nas condi es indicadas de conserva o at ao prazo de validade da embalagem 3 1 Reagentes de extrac o purifica o O dispositivo de purifica o extrac o CLART ENTHERPEX expedido a 20 C e deve ser conservado a esta temperatura at ser utilizado Cont m os seguintes materiais e SEML solu o de extrac o Uma vez descongelado deve ser conservado a 4 utilizado dentro de 8 dias e
12. SD Solu o de dilui o Conservar a 20 ou 42 e lsopropanol Conservar a 20 C e DE Etanol a 70 Conservar a 20 e DB Solu o de digest o 5X Uma vez descongelada conservar a 4 e PK Proteinase K 10X Uma vez descongelada deve manter se em gelo e conservar a 42 C 3 2 Reagentes de amplifica o S o expedidos e conservados a 20 e Tubos de amplifica o S o expedidos dois tipos de tubos de amplifica o o Tubo incolor multiplex RT PCR 1 para a amplifica o de HSV 1 HSV 2 e VZV Cont m 45 ul de mistura de reac o Mix 1 o Tubo verde multiplex RT PCR 2 para a amplifica o de CMV VEB HHV 6 HHV 7 HHV 8 e Enterovirus Echovirus Poliovirus e Coxsackivirus Cont m 43 ul de mistura de reac o Mix 2 NOTA O tubo de amplifica o verde necessita da adi o de 2 uL de mistura de enzima antes da introdu o do material gen tico extra do Os tubos incolores j cont m a mistura enzim tica e Mistura de enzima esta uma mistura de enzimas RT retrotranscriptase e Polimerase ADN Pronto a usar Conservar a 20 NOTA Na embalagem do dispositivo inclui se um indicador adesivo e irrevers vel de temperatura o aparecimento de uma cor vermelha na janela de visualiza o indica que em algum momento os produtos ultrapassaram a temperatura de conserva o de 20 C e n o devem utilizar se 3 3 Reagentes de visualiza o S o expedidos a 4 C
13. Test de entre os constantes na lista Selecione o alv olo da tira onde vai ter in cio o processamento do ensaio A1 ou E1 para o caso dos 4 primeiros alv olos j estarem processados Selecione a quantidade de amostras a serem processadas Com o autoclart o utilizador pode processar de 4 at 96 amostras por processamento Em qualquer dos casos as amostras devem ser m ltiplos de quatro Confirme se a quantidade de amostras e o alv olo de arranque A1 ou E1 est o corretos Coloque o suporte dos bicos cheio em posi o Carregue a microchapa da matriz no suporte Certifique se que o fecho est seguro a fim de se poder trancar a chapa Verifique se ambos os recipientes do desperd cio de bicos e desperd cio de l quidos est o vazios e em posi o Encha a garrafa de DI com 250 ml de gua destilada Adicione cada reagente ao respetivo recipiente espec fico O autoclart calcula os volumes espec ficos necess rios de acordo com a quantidade de amostras indicadas TL Tamp o de Lavagem O volume apresentado no ecr indica o tamp o de lavagem dilu do necess rio Para preparar o tamp o de lavagem dilu do dilua por favor 1 10 do reagente TL fornecido em gua destilada SH solu o de hibridiza o Pronto para utilizar Adicione o volume especificado no recipiente uma vez temperado CJ Conjugado Recomenda se que se centrifugue por breves momentos o CJ antes de o utilizar O ecr apresenta o v
14. a 20 C e mant lo no gelo at ser utilizado Agitar suavemente para limpar o precipitado do fundo e centrifugar durante 15 min a 13000 rpm 7 Eliminar o sobrenadante cuidadosamente como se indica no ponto 5 Secar perfeitamente na c mara durante 15 ou 20 minutos com os tubos abertos Antes de suspender novamente a amostra confirmar que n o h res duos de etanol que possam inibir o PCR 8 Suspender de novo em 25 ul de Solu o de dilui o O ADN ARN extra do pode utilizar se directamente para a sua an lise ir manter se no gelo at adicion lo ao tubo de amplifica o pode conservar se 20 7 1 4 Bi psias fixadas com formol ou etanol e inclu das em parafina 1 A Inclu das em parafina Efectuar com o microtomo 2 cortes de 5 ul e coloc los num tubo Eppendorf de 1 5 ml autoclavado importante limpar cuidadosamente a l mina com xileno antes e depois de cortar a amostra para evitar a contamina o de uma amostra anterior para a presente 1 B Fixadas com formol ou etanol Cortar esmagar um fragmento de amostra de 2 3 ml com uma l mina limpa numa superf cie limpa e introduzi la num tubo limpo de 1 5 mL Esmagar o tecido com a ponta da pipeta misturar no vortex para faclitar a lise 2 Descongelar o tubo DB 5X Solu o de Digest o 5X um tubo de PK 10X Proteinase K 10X e o tubo de SD Solu o de Dilui o temperatura ambiente A Proteinase K deve manter se no gelo enquanto estiver a
15. a Os tubos MIX 1 s o transparentes e utilizam se para a amplifica o e posterior detec o de HSV 1 HSV 2 e VZV Os tubos MIX 2 de cor verde utilizam se para a amplifica o e visualiza o dos virus CMV VEB HHV 6 HHV 7 HHV 8 Enterovirus Echovirus Poliovirus e Coxsackivirus A detec o do produto amplificado por RT PCR efectuada atrav s da utiliza o de uma nova plataforma baseada em baixa densidade CLART Clinical Arrays Technology A plataforma baseia se num princ pio muito simples mas muito rent vel Consiste em incluir um microarray no fundo de um poco de placa microtitulada CLART Strip CS Figura 1 este sistema simplifica consideravelmente o processo de hibridiza o e visualiza o quando comparado com os sistemas de microarrays cl ssicos 4 yi W Figura 1 Plataforma CLART no formato de tiras de 8 pocos CS Este tipo de tecnologia permite a detec o simult nea de m ltiplos marcadores de utilidade diagn stica e dos controlos necess rios para assegurar a fiabilidade dos resultados obtidos O sistema de detec o CLART ENTHERPEX baseia se na precipita o de um produto insol vel naquelas zonas de micro array onde ser produz a hibridiza o dos produtos amplificados por sondas espec ficas Durante a RT PCR os produtos amplificados s o marcados com biotina Ap s a amplifica o hibridizam se com as suas sondas espec ficas respectivas que est o imobi
16. ctuar uma reac o de amplifica o Conservar o remanescente a 20 C 7 1 2 _ Soro ou plasma necess rio efectuar uma amostra formada por 100 ul de solu o salina e que servir de controlo negativo da reac o de amplifica o e visualiza o Descongelar a amostra e mant la no gelo Colocar 100 ul de amostra cl nica num tubo Eppendorf de 1 5 mL 3 Adicionar 400 de SEML solu o de extrac o de amostra l quida Esperar que a solu o descongele e que fique transparente antes de utiliz la Misturar invertendo os tubos v rias vezes e incubar durante 15 minutos temperatura ambiente 4 Adicionar 500 ul de isopropanol conservado a 20 C e manter no gelo at ser utilizado Misturar invertendo os tubos v rias vezes e centrifugar preferencialmente a 42 C a 13000 rpm durante 20 minutos 5 Pipetar o sobrenadante utilizando uma micropipeta Uma micropipeta de 1000 ul pode ser utilizada para eliminar o sobrenadante no final pode utilizar se uma pequena micropipeta por exemplo de 20 ul para remover os res duos no fundo do tubo sem remover acidentalmente o precipitado 6 Adicionar 500 ul de Etanol a 70 conservado a 20 C e mant lo no gelo at ser utilizado Agitar suavemente para limpar o precipitado do fundo e centrifugar durante 15 min a 13000 rpm 7 Eliminar o sobrenadante cuidadosamente como se indica no ponto 5 Secar perfeitamente na c mara durante 15 ou 20 minutos com os tubos abert
17. dade analitica por tipo virico 2 Par metros de utilidade de diagn stico Para determinar os par metros diagn sticos do dispositivo realizaram se estudos comparativos da t cnica CLART ENTHERPEX em rela o s seguintes t cnicas Herplex para os virus HSV 1 HSV 2 VZV CMV VEB e HHV 6 PCR quantitativo em alguns casos para CMV e VEB PCR em tempo real para Enterovirus PCR de desenvolvimento pr prio e detec o em gel para virus HHV 7 e HHV 8 Imunohistoqu mica para HHV 8 Resultados da an lise das amostras estudadas resumidos no quadro a seguir Amostras Amostras VIRUS N Positivas Negativas HSV 1 Soro Plasma Soro Plasma LC 0 19 19 TT Te Ta Tn TT s w ae T Ta 6 68 T7 eo w _ s s arnas a 5 _ o es _ 8 JJ JJ zaras 5 s e 0 Bi psia _ Zaragatoas _Soro Plasma 0 0 Ta ET Tin 0 3 TT TTS TT o o TT Te TT Te TT Te Ta o tw T TT TT 20 Tabela 3 Par metros de diagn stico da t cnica CLART ENTHERPEX Foram amplificadas 126 amostras para validar a nova plataforma CLART Strip Estas amostras foram testadas comparativamente entre a plataforma CLART Strip e a plataforma Array Strip AS que est a s
18. entrifugar durante 10 minutos numa microcentr fuga na velocidade m xima 3 Remover o sobrenadante com a pipeta tendo muito cuidado para n o derramar o precipitado de c lulas 4 Descongelar um tubo de DB 5X Solu o de Digest o 5X um tubo de PK 10X Proteinase K 10X e um tubo SD Solu o de Dilui o A Proteinase K deve manter se em gelose enquanto estiver a ser utilizada depois deve ser conservada a 42 C mantendo se est vel durante 7 dias Ap s descongelada n o deve ser congelada novamente Preparar a mistura de digest o misturando as seguintes quantidades por cada amostra a analisar 70 x n tubos 1 ul de SD Solu o de Dilui o 20 x n tubos 1 ul de DB5X Solu o de Digest o 5X 10 x n tubos 1 ul de PK 10X Proteinase K 10X 5 Adicionar 100 ul de mistura de digest o a cada amostra Suspender de novo suavemente o precipitado de c lulas com a ajuda da micropipeta 6 Incubar a 559 602 C durante 2 h Ferver durante 10 minutos para inactivar a Proteinase K Se os tubos n o estiverem correctamente fechados aconselha se a perfurar os tamp es com uma agulha para 14 impedir que se abram durante a incuba o a 1002 Evitar que a gua do banho maria entre no tubo atrav s desta perfura o N o fechar a tampa do banho maria 8 Centrifugar numa microcentrifuga velocidade m xima durante 10 minutos Passar imediatamente o sobrenadante para um tubo limpo e aliquotar 5 ul para efe
19. er substitu da A plataforma Array Strip AS foi validada previamente com a plataforma Array Tubes AT Os seguintes tipos virais foram utilizados para a valida o como demonstrado abaixo Resultados AS Resultados CS N 120 N mero de amostras analisadas W Versao 8 0 Versao 8sc 0 n gar vas 6 6 QUADRO 4 AMOSTRAS ANALISADAS ESTUDO COMPARATIVO DE AS CS As concordancias entre as plataformas s o de 100 o que n o altera os par metros de diagn stico descritos anteriormente 11 REFER NCIAS BIBLIOGR FICAS 1 Tsan Chi Chen Guang Wu Chen Chao Agnes Hsiung Jyh Yuan Yang Shin Ru Shih Yiu Kay Lai Jyh Lyh Juang Combining Multiplex Reverse Transcription PCR and a Diagnostic Microarray to Detect and Differentiate Enterovirus 71 and Coxsackievirus A16 Journal of Clinical Microbiology 44 6 2212 2219 2006 2 Boriskin YS Rice PS Stabler RA Hinds J Al Ghusein H Vass K Butcher PD DNA microarrays for virus detection in cases of central nervous system infection Journal of Clinical Microbiology 42 12 5811 5818 2004 3 Jaaskelainen AJ Piiparinen H Lappalainen M Koskiniemi M Vaheri A Multiplex PCR and oligonucleotide microarray for detection of eight different herpesviruses from clinical specimens Journal of Clinical Virology 37 2 83 90 2006 4 Coiras MT Aguilar JC Garcia ML Casas P rez Brefa P Simultaneous detection of fourteen res
20. es de iniciar a an lise 5 1 Recomenda es gerais 1 Esta an lise deve ser efectuada em duas reas separadas fisicamente de modo a evitar a contamina o entre amostras com o produto amplificado anteriormente Cada uma das reas deve ter o seu pr prio material de trabalho identificado pipetas pontas tubos grades luvas etc que nunca devem ser utilizadas fora destas reas e rea Pre PCR nesta rea efectuada a extrac o de ADN ARN a mistura de enzimas adicionada aos tubos de amplifica o e ADN ARN adicionado aos tubos de amplifica o Deve ser utilizada uma c mara de fluxo laminar e rea P s PCR nesta rea efectuada a amplifica o e visualiza o do produto amplificado O material desta rea nunca deve entrar em contacto com a rea de extrac o Evitar ir para a rea de pre PCR ap s ter estado a trabalhar na rea de visualiza o 2 Utilizar sempre luvas aconselhado substituir de luvas com uma determinada frequ ncia e obrigatoriamente cada vez que come ar a trabalhar nas reas anteriormente descritas As novas luvas devem ser utilizadas para a prepara o dos tubos de amplifica o e de cada vez que for adicionado ADN ARN a estes 3 Limpar as reas de trabalho bancadas de laborat rio c mara de fluxo laminar grelhas pipetas e termociclador em profundidade com lix via dilu da a 10 a seguir cada processamento de amostras e obrigatoriamente desinfectar as reas de t
21. exactamente como especificado poder haver actividade residual da proteinase K que pode causar degrada o do ADN polimerase levando assim a inibi o da PCR 5 Conserva o inadequada das amostras pode influenciar o resultado da an lise se as amostras forem sujeitas a condi es que podem resultar na degrada o do seu ADN ARN Especifica es t cnicas 1 Par metros anal ticos Sensibilidade analitica A sensibilidade analitica dos tipos de virus apresentados na tabela 1 foi determinada atrav s da amplifica o de s ries de dilui es de ADN de plasmideos recombinantes para cada um dos virus detectados com o dispositivo Cada um deles cont m o produto de amplificado inserido incluindo a parte complementar da sonda espec fica de detec o A etapa de visualiza o foi desenvolvida para toda a plataforma CLART CS obtendo os mesmos resultados que est o descritos na tabela VIRUS 88 a a 1 abaixo ea 2 HHV HHV BEE a 1000 Poliovirus Tabela 1 Rela o do numero de c pias de plasmideo recombinante especificadas por tipo v rico necess rias para obter uma sensibilidade de 100 na detec o de cada um dos v rus 21 Especificidade analitica Foram efectuadas experi ncias de especificidade com plasmideos recombinantes Os resultados est o resumidos tabela 2 VIRUS ESPECIFICIDADE ANALITICA HSV 1 100 HHV 6 HHV 7 HHV 8 HSV 2 99 4 Tabela 2 Sensibili
22. ias vezes com a micropipeta Deixar os tubos no gelo 5 Programar no termociclador os seguintes ciclos de temperaturas para ambos tipos de multiplex 17 1 ciclo 45 45 minutos oO 95 C 15 minutos 45 ciclos 952C 30 segundos 56 C 90 segundos 729 60 segundos 4 C continuamente at colheita dos tubos opcional 6 Iniciar o programa e colocar os Tubos de Reac o no termociclador A amplifica o leva cerca de 5 horas mas pode variar ligeiramente dependendo do tipo de sistema utilizado 7 4 Visualiza o do produto amplificado para as CLART Strip CS Recomenda es espec ficas antes de iniciar a visualiza o 1 Ao iniciar o processo A auto calibra o do sistema pode levar alguns minutos e deve ficar pronto para a leitura de modo a evitar perda de tempo desnecess ria que pode levar a um excesso de revela o do produto 2 PREPARAR A SOLU O DE LAVAGEM ANTES DE CADA AN LISE N O REUTILIZAR SOLU ES OU RESTOS PREPARADOS ANTERIORMENTE 3 Limpar o termociclador com solu o de lix via dilu da a 10 antes de iniciar o programa de desnaturaliza o recomendado limpar cada po o lix via dilu da utilizando uma zaragatoa Colocar os tubos de amplifica o no termociclador t o separados quanto poss vel durante a desnaturaliza o e nunca ultrapassar os 10 minutos 4 N o s o necess rias pontas com filtro durante as etapas de visualiza o Substituir sempre as pipetas Pasteu
23. lizadas em locais conhecidos e concretos de micro array ap s o qual s o incubadas com 5 conjugado estreptavidina peroxidase O conjugado liga se atrav s da estreptavidina com a biotina presente nos produtos amplificados que tamb m se encontram ligados as suas sondas especificas e a actividade peroxidase provoca o aparecimento de um produto insoluvel que precipita nos locais de hibridiza o de micro array Figura 2 Produtos marcados Sondas do array A Biotina Hibridizacgao Sew A Incuba o com conjugado ts Conjugado SNS ew7 Precipita o especifica Rea o com revelador di LF Figura 2 Esquema do m todo de visualiza o As sondas imobilizadas sobre a superficie capturam os seus produtos amplificados complementares marcados com biotina Atrav s da biotina liga se o conjugado neste caso estreptavidina HRP HorseRadish Peroxidase O substrato o Dianisidina atrav s da ac o da HRP produz um precipitado sobre o local de hibridiza o A sensibilidade obtida com CLART ENTHERPEX combinada com a amplifica o gen mica e com a visualiza o no micro array t o elevada que n o necess rio efectuar duplas amplifica es nested PCR evitando assim o risco de contamina o Um dos principais inconvenientes da detec o por amplifica o gen tica s o os falsos negativos causados principalmente pela presen a de inibidores da mistura de enzimas
24. o 7 1 4 Tecido embebido em parafina fixado em formol ou etanol 7 2 Extrac o autom tica 7 3 Reac o de amplifica o 7 4 Visualiza o do produto amplificado em Array Strips CS 8 4 1 visualiza o Manaus 8 4 2 visualiza o com o autoclart LEITURA DOS RESULTADOS 9 INTERPRETACAOO DOS RESULTADOS 10 ESPECIFICACOES TECNICAS E DE FUNCIONAMENTO 11 BIBLIOGRAFIA 1 QUADRO DE SIMBOLOS IVD LOT 25 C 20 C 8 4 18 C 30 C Consulte por favor as instru es de utiliza o Prazo de Validade Dispositivo para Diagn stico In vitro Lote Conservar Temperatura Ambiente Conservar entre 4 8 Conservar entre 30 18 2 DESCRICAO DO DISPOSITIVO CLART ENTHERPEX O dispositivo CLART ENTHERPEX detecta a presenca em amostras clinicas zaragatoas soro plasma liquido cefalorraquidiano e bidpsias HSV 1 HSV 2 VZV CMV EBV HH6 6 HHV 7 e HHV 8 e dos tr s virus mais relevantes do ponto de vista clinico entre a familia dos Enterovirus Poliovirus Echovirus e Coxsackievirus A detec o efectuada atrav s da amplifica o do fragmento localizado entre 106 328 bp cuja sequ ncia est altamente conservada e suficientemente espec fica para cada tipo de v rus Desta forma est o asseguradas a especificidade e a detec o A amplifica o dos diferentes tipos de virus efectuada em dois diferentes tipos de tubos de RT PCR PCR transcriptase revers
25. o TL dilu da cada po o e homogeneizar 10 a 15 vezes com a pipeta em seguida eliminar a solu o utilizando a pipeta ou o sistema de v cuo Os po os n o devem conter res duos Se esta lavagem n o for efectuada rapidamente pode causar sinais ileg veis durante a leitura 8 Revela o com Solu o RE Remover a Solu o TL adicionar 100 de solu o RE a cada array do CS e incubar 10 minutos a 25 C no bloco de aquecimento sem agita o ADVERT NCIA muito importante utilizar o bloco de aquecimento sem agitar e ler as amostras imediatamente ap s incuba o 9 Eliminar a Solu o RE com pipeta ou sistema de v cuo O microarray deve ficar seco 10 Ler no CAR Colocar a Strip no CAR este ir analisar os Arrays automaticamente 7 4 2 A visualiza o com o autoclart Desnatura o utilizar o termociclador para desnaturar os produtos amplificados Para esta etapa colocar os tubos no termociclador e incubar a 952 C durante 10 minutos Programar 15 minutos no termociclador para que ap s 10 minutos os produtos amplificados possam continuar a 95 C Remover os tubos da incuba o a 95 C e coloc los imediatamente num recipiente com gelo 20 Ligue O equipamento autoclart e siga as instru es apresentadas no ecra 1 2 3 4 10 11 12 13 Feche a porta e carregue no bot o Selecionar Run Program acionar o Programa a partir do menu principal Selecione o ensaio ENTHERPEX
26. o incluido no tubo de amplifica o e que se utilizam como controlo de amplifica o da reac o RT PCR Oligonucleotidos especificos de virus de Herpes Enterovirus O tubo RT PCR foi concebido para favorecer a amplifica o do virus mais do que o controlo de amplifica o De modo que em determinadas condi es por exemplo quando existe um elevado n mero de c pias de um v rus ou quando a amostra apresenta co infec es com v rios v rus ao mesmo tempo alguns controlos podem n o ser amplificados e pode aparecer a seguinte leitura CONFORME 22 A raz o desta concep o que o controlo interno de amplifica o ir permitir distinguir os casos de inibi o de reac o de PCR dos que n o foi detectado o ADN da amostra Tendo em conta estas observa es podemos considerar as seguintes interpreta es dos resultados de leitura 23 1 Amostras positivas 1 1 Com controlo de amplifica o positivo Controlo interno gt 0 150 MARCADORES DE VIRUS ALINHAMENTO CONTROLO DE AMPLIFICACAO Este considera se um RESULTADO V LIDO Pode decidir se que se trata de um verdadeiro resultado positivo 1 2 Com controlo de amplifica o negativo Controlo interno lt 0 150 MARCADORES DE VIRUS ALINHAMENTO 24 Este considera se um RESULTADO V LIDO mesmo se o controlo de amplifica o se mostrar SEM SINAL Tal devido ao efeito de competi o do v rus Pode considerar se um resultado posi
27. olume final do CJ dilu do a adicionar o que significa que cada ml indicado no ecr deve ser preparado da seguinte forma 1 ml de DC Diluente do Conjugado e 5 ul de reagente CJ Centrifugue a solu o dilu da para que a mesma fique completamente misturada ADVERT NCIA Recomenda se que cada ml deve ser preparado da seguinte forma 1000 ulde DC Diluente do Conjugado 5 ul de reagente CJ uma vez que um aumento da concentra o de conjugado pode causar falsos positivos RE Reagente Adicione o volume de RE indicado no ecr Feche a porta e carregue no bot o para iniciar o programa O dispositivo inicia a prepara o do sistema Em seguida efetua as pr lavagens do CJ e adiciona a solu o de hibridiza o Uma vez terminados estes passos o dispositivo emite um bipe como sinal para o utilizador adicionar as amostras sobre o CS O autoclart continuar a emitir bipes at o utilizador abrir a porta Para a adi o das amostras sobre o CS retire cuidadosamente a placa do autoclart e adicione cada um dos seguintes volumes dos produtos desnaturados da mesma 21 amostra para o mesmo alv olo Misture com cuidado para nao tocar na matriz e para colocar a microchapa de novo no autoclart Carregue no bot o para continuar com o processo de visualiza o 14 Uma vez terminado o processo de visualiza o a autoclart emitir um bipe indicando o fim do programa Retire com cuidado a microplaca e proceda com o pa
28. oque no fundo do tubo j que pode danificar o micro array fixado no fundo 2 Aconselha se a adi o de todas as solu es s paredes da tira nunca directamente ao fundo 3 conveniente n o adicionar a solu o SH at adi o de produtos desneutralizados de PCR 4 Ap s a incuba o com a solu o CJ muito importante lavar do microarray assim como as tampas para evitar que caiam res duos deste que podem reagir com a solu o RE resultando numa precipita o inespec fica que pode levar a falsas interpreta es do resultado 5 Evitar bolhas na superf cie do microarray ao adicionar qualquer solu o 6 Manter limpa a base do microarray para evitar poss veis interfer ncias durante a leitura dos resultados 7 Ao visualizar a imagem no leitor confirmar que aparecem os marcadores de posi o e que n o h bolhas de ar ou manchas que interfiram na leitura Caso contr rio limpar o fundo do tubo por fora com um papel de celulose bater suavemente no tubo com o dedo 6 COLHEITA DE AMOSTRAS 12 6 1 Zaragatoas Colher a amostra com uma zaragatoa seca e est ril de algod o ou de alginato preferencialmente do tipo uretral incluindo para o esfrega o vaginal N o utilizar dispositivos que produzam sangramento da les o Reintroduzir a zaragatoa no seu tubo sem utilizar qualquer outro tipo de meio Conservar a amostra a 4 C se tiver de ser processada dentro de 7 dias ou a 202 C se tiver de ser proces
29. os Antes de suspender novamente a amostra confirmar que n o h res duos de etanol que possam inibir o PCR 8 Suspender de novo em 25 ul de Solu o de dilui o O ADN ARN extra do pode utilizar se directamente a sua an lise ir manter se no gelo at adiciona lo ao tubo de amplifica o pode conservar se 20 7 1 3 L quido cefalorraquidiano necess rio processar uma amostra que consiste em 50 ul de solu o salina e que servir como controlo negativo da reac o de amplifica o e visualiza o Descongelar as amostras em gelo Colocar 100 ul da amostra cl nica num tubo de 1 5 mL do tubo Eppendorf Adicionar 400 ul de SEML solu o de extrac o de amostra l quida Esperar at que a solu o descongele e que fique transparente antes de utiliz la Misturar invertendo os tubos v rias vezes e incubar durante 15 minutos temperatura ambiente 4 Adicionar 500 ul de isopropanol conservado a 20 C e manter no gelo at ser utilizado Misturar invertendo os tubos v rias vezes e centrifugar preferencialmente a 42 C a 13000 rpm durante 20 minutos 15 5 Pipetar o sobrenadante utilizando uma micropipeta Uma micropipeta de 1000 ul pode ser utilizada para eliminar o sobrenadante no final pode utilizar se uma pequena micropipeta por exemplo de 20 ul para remover os res duos no fundo do tubo sem remover acidentalmente o precipitado 6 Adicionar 500 ul de Etanol a 70 conservado
30. os os produtos amplificados possam continuar a 95 Remover os tubos da incuba o a 95 Ce coloca los imediatamente num recipiente com gelo Preparacao da Solucao TL diluida Preparar 10 mL tira de Solucdo TL no momento diluindo 1 mL TL em 9 mL de agua destilada Pr lavagem dos CS Antes de iniciar a an lise necess rio efetuar uma pr lavagem das CS adicionando 200 ul de Solu o TL dilu da a cada array e homogeneizar 10 a 15 vezes com a ajuda da pipeta evitando tocar na superf cie da Strip Eliminar a Solu o TL dilu da utilizando uma pipeta ou preferencialmente um sistema de v cuo Esta etapa torna se necess ria para lavar os po os antes de adicionar a amostra Os po os n o devem conter res duos de solu o de lavagem Em nenhuma circunst ncia os po os devem ficar secos durante um longo per odo de tempo Hibridiza o Deixar a SH solu o de hibridiza o atingir a temperatura ambiente at o precipitado de cristais desaparecer completamente Uma vez desnaturados os produtos PCR adicionar 100 ul de Solu o SH a temperatura ambiente a cada po o evitar que se forme espuma Adicionar 5 de cada tubo amplificado incolor e de cor CLART Tira Homogeneizar v rias vezes para misturar bem com a solu o de hibridiza o sem tocar na array Incubar no bloco de aquecimento durante 1 hora 59 agitando a 550 rpm Ap s a incuba o retirar as tiras e eliminar a Solu o SH com a
31. piratory viruses in clinical soecimens by two multiplex reverse transcription 30 nested PCR assays Journal Medical Virology 72 3 484 495 2004 5 Zheng ZB Wu YD Yu XL Shang SQ DNA microarray technology for simultaneous detection and species identification of seven human herpes viruses Journal Medical Virology 80 6 1042 1050 2008 6 Hudnall SD Chen T Allison P Tyring SK Heath A Herpesvirus prevalence and viral load in healthy blood donors by quantitative real time polymerase chain reaction Transfusion Apr 15 2208 7 Afenjar A Rodriguez D Rozenberg F Dorison N Gu t A Mignot C Doummar D Billette de Villemeur T Ponsot G Human herpes virus type 6 etiology of an acute encephalitis in childhood case report Arch Pediatric 14 5 472 475 2007 8 Zambrano Y Chiarello A Soca A Villalobos Marreno Soler Laferte J Alvarez M Use of polymerase chain reaction for the diagnosis of central nervous system infections Invest Clin 47 4 337 347 2206 9 Huang C Morse D Slater B Anand M Tobin E Smith P Dupuis M Hull R Ferrera R Rosen B Grady L Multiple year experience the diagnosis of viral central nervous system infections with a panel of polymerase chain reaction assays for detection of 11 viruses Clin Infect Dis 39 5 630 635 2004 10 Casas Pozo F Trallero Echevarria JM Tenorio A Viral diagnosis of neurological infection by RT m
32. r utilizadas para a aspira o na bomba de v cuo obrigatoriamente ap s terminar uma an lise e de cada vez que se aspire uma nova amostra ap s a etapa de hibridiza o Esta precau o tamb m deve ser efectuada para o tamp o TL 5 O pente de 8 pontas utilizado na bomba de aspira o deve ser descartado ap s utiliza o ou descontaminado com uma solu o de lix via a 10 ap s cada an lise Certificar se de que o sistema de v cuo funciona corretamente e n o deixar restos de l quido nos po os 6 Todos os tamp es devem ser completamente aspirados dos po os sem tocar no fundo 7 Deixar a SH solu o de hibridiza o atingir a temperatura ambiente at o precipitado de cristais desaparecer completamente 18 8 Assegurar se de que antes de iniciar a hibridiza o a temperatura do termomixer atingiu os 592 C durante pelo menos 1 hora 9 Colocar imediatamente a tira no Thermomixer ap s a adi o de SH Solu o de Hibridiza o 10 Ao executar um grande n mero de tiras aconselhado utilizar pipetas multicanal Definir um recipiente espec fico para cada reagente e limpar com lix via dilu da a 10 ap s utiliza o 7 4 1 Visualiza o manual 1 2 3 4 Desnaturacao utilizar o termociclador para desnaturar os produtos amplificados Para esta etapa colocar os tubos no termociclador e incubar a 952 C durante 10 minutos Programar 15 minutos no termociclador para que apos 10 minut
33. rabalho em caso de contamina o Utilizar um novo filtro de papel de cada vez que comece a trabalhar aconselhado limpar o termociclador e o bloco de aquecimento com lix via dilu da a 10 4 Utilizar sempre pontas com filtro ou pipetas de desloca o positivas para evitar contamina o devida a micropipetas Deve ser utilizado um conjunto de pipetas em cada rea 5 Utilizar material de laborat rio autoclav vel e descart vel 6 Nunca misturar reagentes de dois tubos diferentes mesmo que perten am ao mesmo lote 7 Fechar os tubos de reagente imediatamente ap s utiliza o de modo a evitar a contamina o 11 8 Eliminar a ponta da micropipeta ap s pipetagem 9 GENOMICA n o pode ser considerada respons vel pelos resultados obtidos com este dispositivo se forem utilizadas outras amostras que n o as indicadas ou com um ADN ARN extra do com outro protocolo que n o o indicado 5 2 Precau es para a extra o e adi o de material extra do para o tubo de amplifica o 1 Usar sempre luvas 2 Limpar as superf cies de trabalho das c maras com solu o de lix via dilu da a 10 3 Ligar o fluxo laminar e a luz UV pelo menos 20 minutos antes da extra o Desligar a luz UV quando estiver a trabalhar dentro da c mara 4 A prepara o das amostras antes da extra o deve ser efetuada dentro da c mara 5 3 Precau es para a visualiza o 1 Evitar que a ponta da pipeta ou do sistema de v cuo t
34. sada mais tarde 6 2 Soro ou plasma As amostras de sangue cujo plasma ser extra do devem ser colhidas em tubos que cont m citrato ou EDTA como anticoagulante nunca heparina De modo a extrair soro permitir que a amostra de sangue coagule durante 30 minutos e depois centrifigar a 1500 r durante 20 min Em alguns casos a seguir colheita de amostras deste tipo poss vel isolar a frac o celular e proceder extrac o de ADN ARN a partir desta Se a amostra for processada dentro de 12 horas deve ser conservada a 42 C Se a an lise for processada ap s esse prazo a amostra deve ser conservada aliquotada a 70 Ce s deve ser descongelada antes de efectuar o seu processamento importante evitar congela es e descongela es sucessivas 6 3 L quido cefalorraquidiano Se a amostra for processada dentro de 12 horas deve ser conservada a 42 C Se pretender efectuar a an lise posteriormente a amostra deve ser conservada aliquotada a 02 descongelada apenas na altura do processamento importante evitar as congela es e descongela es sucessivas 6 4 Bi psias embebidas em parafina e fixadas com formol ou etanol Fixar amostras em formol tamponado pelo tempo mais curto poss vel nunca mais de 24 horas para evitar a degrada o de ADN ARN Utilizar formol n o tamponado ou uma fixa o por mais de 24 h poder conduzir a um resultado falso negativo importante limpar cuidadosamente a l mina
35. sso da leitura do CAR ADVERT NCIA deve proceder imediatamente leitura dos resultados do CAR caso contr rio podem ocorrer falsos negativos devido perda de intensidade das sondas 15 CLINICAL ARRAY READER Leitor da Matriz Cl nica Colocar a Strip no CARS este ir analisar os Arrays automaticamente 8 LEITURA DOS RESULTADOS O processamento dos dados obtidos a partir de cada uma das an lises efectua se de modo autom tico O sistema de leitura e an lise apresentar o relat rio onde se indicam os resultados O monitor do sistema apresenta uma tabela de tr s colunas a coluna da esquerda apresenta o v rus caracterizado no micro array A coluna central apresenta um resultado positivo ou negativo em cada v rus enquanto a da direita apresenta a validade determinada pelo controlo de amplifica o 9 INTERPRETA O DOS RESULTADOS Um dos inconvenientes da detec o por amplifica o gen mica s o os falsos negativos devidos fundamentalmente a presen a de inibidores de ADN polimerase nas amostras nas quais se quer analisar a presen a do v rus hemoglobina restos de parafina sais etc Com o dispositivo CLART ENTHERPEX eliminaram se os falsos negativos gra as introdu o de um controlo interno de amplifica o em ambos os tubos de reac o onde se analisa a amostra Cada tubo de amplifica o cont m os seguintes oligonucleotidos Oligonucleotidos que amplificam um plasma modificad
36. tivo verdadeiro 2 Amostras negativas Controlo interno gt 0 150 MARCADORES DE ALINHAMENTO CONTROLO DE AMPLIFICA O Este considerado um RESULTADO V LIDO Neste caso pode dizer se que se tratar de um resultado negativo verdadeiro 1 Amostras inibidas inadequadas Controlo interno gt 0 150 Cs MARCADORES DE ALINHAMENTO Este considerado um RESULTADO INVALIDO Isto deve se a que algumas substancias podem ter inibido a reaccao de PCR ao prejudicar a actividade da enzima ADN polimerase A solu o verificar que nao h subst ncias deste tipo na amostra ou que no material gen tico extra do n o h presen a de nenhuma destas subst ncias Recomenda se repetir a extrac o ou se n o for poss vel pedir ao m dico uma nova amostra do doente H duas possibilidades que levam a um resultado N o Conclusivo de V rus e Nos casos em que tr s c pias de uma sonda s o muito diferentes umas das outras e Em co infec es para aqueles virus que se encontram no limite da detec o da t cnica 10 ESPECIFICA ES T CNICAS E DE FUNCIONAMENTO Controlo de interfer ncias conhecidas Existem subst ncias que podem interferir com o funcionamento do dispositivo CLART ENTHERPEX Tratam se de subst ncias que principalmente inibem a mistura de enzimas e portanto a reac o de amplifica o As interfer ncias mais conhecidas s o 1 Presen a de hemoglobina ou parafina a seguir extrac o de
37. ultiplex PCR a search for entero and herpesviruses in a prospective study Journal Medical Virology 57 2 145 151 1999 11 Kanerva Jaaskelainen AJ Suvela Piiparinen Vaheri A Pitkaranta A Human herpesvirus 6 and 7 DNA in cerebrospinal fluid of facial palsy patients Acta Otolaryngol 128 4 460 464 2008 12 Ginanneschi F Donati D Moschettini D Dominici F Cermelli C Rossi A Encephaloradiculomyelitis associated to HHV 7 and CMV co infection in immunocompetent host Clin Neurol Neurosurg 109 3 272 276 2007 13 Calvario A Bozzi A Scarasciulli M Ventola C Seccia R Stomati D Brancasi B Herpes Consensus PCR test a useful diagnostic approach to the screening of viral diseases of the central nervous system Journal Clinic Virology 25 suppl 571 578 2002 14 Deback C Agbalika F Scieux C Marcelin AG Gautheret Dejean A Cherot J Hermet L Roger O Agut H Detection of human herpesviruses HHV 6 HHV 7 and HHV 8 in whole blood by real time PCR using the new CMV HHV 6 7 8 R genetrade mark kit Journal Virology Methods 149 2 285 291 2008 31 15 Hubacek Sedlacek Keslova Formankova R Stary J Kulich Cinek O Incidence of HHV7 in donors and recipients of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation Pediatric Blood Cancer 50 4 935 2008 16 Holden SR Vas AL Severe encephalitis in a haematopoietic stem cell transplant recipient
Download Pdf Manuals
Related Search