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Sistema LC 1290 Agilent Infinity

1. Cavo del bus CAN per Instant Pilot Segnale analogico rivelatore opzionale remore ne zz cau difu Ho al BE Alimentazione CA Cavo del bus CAN AG FO J 2 Dj 3 de a o 2 LI a go Figura 26 Configurazione dello stack consigliata per 1290 Infinity con pompa binaria vista posteriore 80 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Configu
2. mau g 5 g 8 IS Attivit dello spettro i ana 300 e pa 2505 g 3 9 200 A Pannello E 1004 di navigazione i g CE nei t Pou o 02 da os os min Data Methods i a Bi Method and Run Control File Information Time Area Height Width Area Symmetiy A LC File PHENONE Mlx 010 D Ri 1 0 122 281 7 208 1 0 0208 10 633 0 518 Si File Path CACHEM3Z A DATA PHENONES 2 0192 2922 2285 00189 11 030 _0509 Date 08Ju09 19 45 06 3 0279 2575 2391 00166 9720 0545 2 Report Layout Sample Fhenones Test Mix 4 oas 246 168 oom 0929 205 se Lr uu Sample Info 5 037 2324 261 omas 877 0702 D verification 00 PY Barcode 6 0 422 239 296 0 0124 9 023 0661 Operator Rob Li 0 487 257 8 295 9 0 0132 9 730 0 749 gt Method PHENONES2M Ce cm 3373 3374 oma 1279 1427 Method PHENONES2 M saved T rnstrument B Figura 34 Schermata dell analisi dei dati 110 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Guida introduttiva 5 Schermata dell Analisi dati Per aprire un cromatogramma nella schermata Data Analysis 1 lanciare una sessione di ChemStation in modalit off line 2 fare clic sul pulsante Analisi dei dati sulla parte in basso a sinistra dello schermo vedere Figura 34 pagina 110 3 Nel Pannello di navigazione trovare la directory dei dati contenente i file dei dati Tutti i dati relativi alle singole iniezioni sono raggruppati s
3. gopoogg D a E Cavo del bus CAN Alimentazione CA Figura 32 Configurazione in due stack consigliata per 1290 Infinity con pompa quaterna ria vista posteriore Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 87 4 Configurazione e installazione del sistema Adescamento della pompa ATTENZIONE La procedura richiesta quando la pompa viene utilizzata per la prima volta e uno o pi tubi di ingresso contengono vuoti d aria o sono a secco per altri motivi Lo scopo dell adescamento di rimuovere le bolle d aria dalla pompa e dai suoi tubi di ingresso Propan 2 olo nomi alternativi isopropanolo isopropil alcool IPA il miglior solvente per l adescamento della pompa quando questa a secco presenta il vantaggio di essere miscibile con la maggioranza dei solventi di fase normale o inversa se necessario controllare una tavola di miscibilit dei solventi Solventi campioni e reagenti tossici infiammabili e pericolosi La manipolazione di solventi campioni e reagenti pu condurre a rischi per la salute e la sicurezza gt Durante l uso di queste sostanze attenersi alle procedure di sicurezza adeguate ad esempio indossare occhiali guanti e indumenti pr
4. Cavo del bus CAN per Instant Pilot Segnale analogico rivelatore opzionale REMOTE RE 232 CAN z222 FG ERR 222222 Alimentazione CA Cavo del bus CAN DOGODO0 Figura 30 Configurazione dello stack consigliata per 1290 Infinity con pompa quaternaria vista posteriore Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 85 4 4 Configurazione e installazione del sistema stallazione del modi Configurazione due stack Se si aggiunge al sistema il termostato dell autocampionatore si consiglia di impiegare una configurazione in due stack in questa configurazione entrambi i moduli pesanti la pompa 1290 Infinity e il termostato vengono collocati in fondo al rispettivo stack e si evita di utilizzare un solo stack di altezza elevata Alcuni utenti preferiscono questa disposizione con altezza inferiore anche in assenza del termostato dell autocampionatore Tra la pompa e l autocampiona tore necessario un
5. possibile usare un programma dell iniettore e pi vial di lavaggio Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 71 3 Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity Come prevenire ostruzioni della colonna 72 Come per qualsiasi sistema HPLC si deve prestare attenzione per evitare l ostruzione completa o parziale della colonna o dei tubi del sistema in seguito a un uso inappropriato I problemi causati dal materiale introdotto nel sistema in genere possono essere evitati eseguendo le seguenti azioni e filtrare i solventi e filtrare i campioni e sostituire regolarmente le fasi mobili e far fluire dal sistema i sali della soluzione tampone Una fonte inevitabile di particolati il sistema stesso Come per tutti i sistemi HPLC dalle guarnizioni si distacca del materiale che verr intrappolato dai frit nel sistema determinando la necessit di sostituire periodicamente i frit Anche le colonne impaccate con particelle inferiori a 2 micron necessitano di frit con pori di piccole dimensioni per impedire che il materiale di impacca mento venga trascinato via Ci comporta un immediato aumento del rischio di ostruzione di questi frit con particolati provenienti dal campione dalla fase mobile e dallo strumento stesso Per ottenere i migliori risultati applicare le seguenti semplici linee guida per l uso 1 Installare e far funzionare la colonna solo nella direzione di flusso indicata sulla
6. Informazioni legali Agilent Technologies Inc 2009 2011 2012 Nessuna parte di questo manuale pu essere riprodotta in alcun formato o con alcun mezzo inclusa l archiviazione e la scansione elettroniche o la traduzione in una lingua straniera senza previo consenso scritto di Agilent Technologies Inc secondo le disposizioni di legge sul diritto d autore degli Stati Uniti internazionali e locali appli cabili Codice del manuale G4220 94301 Edizione 05 2012 Stampato in Germania Agilent Technologies Hewlett Packard Strasse 8 76337 Waldbronn Questo prodotto pu essere utilizzato come componente di un dispositivo diagnostico in vitro qualora sia stato registrato presso le autorit compe tenti e sia conforme alle disposizioni di legge vigenti In caso contrario destinato esclusivamente ad usi generici di laboratorio Garanzia Le informazioni contenute in questo documento sono for nite allo stato corrente e sono soggette a modifiche senza preavviso nelle edizioni future Agilent non rilascia alcuna altra garanzia esplicita o implicita com prese le garanzie implicite di com merciabilit ed idoneit ad uno uso speci fico relativamente al presente manuale e alle informazioni in esso contenute Salvo il caso di dolo o colpa grave Agilent non sar respon sabile di errori o danni diretti o indi retti relativi alla fornitura o all uso di questo documento o delle informazioni in esso contenute In
7. Descrizione del prodotto Comparto colonna termostatato Agilent 1290 Infinity Il comparto colonna termostatato TCC Agilent 1290 Infinity controlla la tem peratura tra i 10 C al di sotto della temperatura ambientale e rispettiva mente i 100 C a 2 5 ml min e gli 80 C fino a 5 ml min La specifica della stabilit della temperatura 0 05 C e la specifica dell accuratezza 0 5 C con calibrazione Questi valori vengono raggiunti grazie alla combinazione data dalla conduzione derivante dal contatto con i vani del termostato dalla temperatura dell aria statica nell ambiente della colonna e molto pi impor tante pre riscaldando o raffreddando la fase mobile facendola passare attra verso uno scambiatore di calore prima che entri nella colonna In ogni TCC vi sono due zone di temperatura indipendenti che possono funzionare insieme per colonne lunghe fino a 300 mm o lavorare a diverse temperature per colonne corte lunghe 100 mm o meno Il modulo dotato di uno scambiatore di calore a bassa dispersione da 1 6 ul e ogni kit di valvole contiene in aggiunta altri scambiatori di calore a bassa dispersione per ciascuna colonna supportata Gli scambiatori di calore a bassa dispersione fino a 4 possono essere montati in modo flessibile nel TCC Per HPLC convenzionali sono disponibili anche scambiatori di calore integrati da 3 ul e 6 ul Ogni TCC pu ospitare un sistema di azionamento della valvola interna per facilitare le a
8. Il metodo ora deve essere salvato nella directory dei metodi prin cipali che per impostazione predefinita C Chem32 1 Methods usandoFile gt Salva con nome gt Metodo oppure Menu del Metodo gt Salva metodo con nome Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 149 Glossario IU Glossario IU 1 1290 Infinity Autosampler Autocampionatore 1290 Infinity 1290 Infinity Binary Pump Pompa binaria 1290 Infinity 1290 Infinity DAD DAD 1290 Infinity 1290 Infinity TCC TCC 1290 Infinity A Add Aggiungi Add Chromatogram Output Aggiungi uscita cromatogramma Add to Method Aggiungi al metodo Adjust Regola Advanced Avanzate Advanced Analog Output Avanzate Uscita analogica Advanced Autobalance Avanzate Bilanciamento automatico Advanced Auxiliary Avanzate Ausiliarie Advanced High Throughput Avanzate Alta produttivit Advanced Lamps on required for analysis Avanzate Lampada accesa richiesta per l analisi 150 Advanced Margin for Negative Absor bance Avanzate Margine per l assorbanza negativa Advanced Slit Avanzate Fenditura Advanced Spectrum Avanzate Spettro AII Tutti Apply Applica Apply to Method Applica al metodo Area Reject Scarto area Area Reject Height Reject Scarto area Scarto altezza As Detector Cell Come cella nel rivelatore As Pump Come pompa Attenuation Attenuazione Automatic delay volume reduction Riduzione automati
9. Signal Description Descrizione segnale Signal Details Dettagli segnale Signals Segnali Single Runs Analisi singole Size Dimensioni Skip Salta Slope Sensitivity Sensibilit pendenza Solvents Solventi Specific Events For Signal Eventi specifici per segnale Specify Report Specifica rapporto Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Spectrum Store Memorizza spettro Standard Data Analysis Analisi standard dei dati Standard injection Iniezione standard Start Single Sample Avvio singolo campione Step Passo Stop Time Tempo finale Stop Time Post Time Tempo finale Tempo post analisi Store Memorizza Style Stile Subdirectory Sottodirectory Switch module name on Accendi nome del modulo System On Off Accensione Spegnimento del sistema T TCC TCC Temperature Temperatura Threshold Soglia Time Tempo Timetable Tabella di programmazione U Unique PDF file name Nome unico del file PDF Unique Sequence Folder Creation Creazione della cartella di sequenza unica Use Signal Usa segnale V Vial Well bottom sensing Rilevazione del fondo della fiala poz zetto wW Wash Vial Fiala di lavaggio Water Acqua Wavelength Lunghezza d onda Z Zero Offset Scarto zero Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Glossario IU 153 Indice Indice A Agilent su Internet 122 alghe 121 alta produttivit ottimizzazione 55
10. caso di separato accordo scritto tra Agilent e l utente con diverse condiz ioni di garanzia relativamente al con tenuto di questo documento in conflitto con le condizioni qui ripor tate prevarranno le condizioni dell accordo separato Licenze tecnologia componenti hardware e o software descritti in questo documento vengono for niti con licenza e possono essere utilizzati o copiati solo in conformit ai termini di tale licenza Indicazioni di sicurezza AVVERTENZA L indicazione AVVERTENZA segnala un rischio Richiama l attenzione su una procedura operativa o analoga operazione che se non eseguita corretta mente o non rispettata pu provocare danni al prodotto o la perdita di dati importanti Non eseguite mai alcuna operazione ignorando l AVVERTENZA fatelo solo dopo aver compreso e appli cato completamente le indica zioni di Agilent ATTENZIONE L indicazione ATTENZIONE seg nala un rischio serio Richiama l attenzione su una procedura operativa o analoga operazione che se non eseguita corretta mente o non rispettata pu pro vocare lesioni personali o morte Non eseguite mai alcuna opera zione ignorando l indicazione ATTENZIONE fatelo solo dopo aver compreso e applicato com pletamente le indicazioni di Agilent Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity In questa guida In questa guida Il presente manuale contiene informazioni sul sistema LC Agil
11. dove in grafico viene riportata l altezza dei piatti rispetto alla velocit di flusso lineare attraverso la colonna Questo tipo di rappresen tazione grafica chiamata curva di Van Deemter e viene usata per stabilire la velocit di flusso ottimale punto minimo della curva per ottenere la migliore efficienza di separazione da una colonna 5 H A4 BUu Cud iina 6 SERIO 2 particella particella grande piccola F Curva di N Van Deemter risultante lt Resistenza al trasferiment HS della massa min Percorsi multipli del flusso diffusione vorticogaseae CS O uU Diffusione longitudinale Flusso lineare u Figura 1 Curva ipotetica di Van Deemter Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Introduzione alla cromatografia liquida a prestazioni ultra elevate UHPLC 1 I grafici di van Deemter nella Figura 2 pagina 11 indicano che la riduzione delle dimensioni delle particelle aumenta l efficienza Il passaggio da particelle di dimensioni pari a 3 5 um e 5 0 um comunemente usate a particelle da 1 8 um offre un miglioramento significativo delle prestazioni Le particelle da 1 8 um forniscono valori di altezza dei piatti da due a tre volte inferiori ed effi cienze proporzionalmente superiori Ci permette di utilizzare una colonna pi corta senza sacrificare la risoluzione e di conseguenza anche il tempo di analisi risulta ridotto di un fattore pari a due o tre L aumento
12. sistema minimizza le perturbazioni della linea di base causate dall indice di rifrazione o dagli effetti termici e consente di ottenere un integrazione pi affi dabile delle aree dei picchi 38 Reticolo Guida d onda ottica a fluido Lampada al deuterio Cella a cartuccia Max Light Fenditura programmabile Serie di diodi a 1 024 elementi Figura 20 Percorso della luce lungo il Rivelatore a serie di diodi 1290 Infinity Il modulo incorpora anche un controllo elettronico della temperatura per incrementare ulteriormente la resistenza agli effetti della temperatura ambientale Sebbene il volume idraulico della cella a cartuccia Max Light sia molto piccolo la lunghezza del passo quella standard da 10 mm Tuttavia per sensibilit ancora superiori disponibile in alternativa la cella ad alta sen sibilit Agilent Max Light caratterizzata da una lunghezza del passo di 60 mm Le celle si sostituiscono facilmente facendole scivolare dentro o fuori l allog giamento delle celle e si auto allineano nello spazio ottico La fonte luminosa del DAD costituita da una lampada al deuterio che opera su una gamma di Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Sistema LC Agilent 1290 Infinity Descrizione del prodotto 2 lunghezze d onda da 190 a 640 nm Queste vengono rivelate da una serie di diodi comprendente 1 024 diodi L ingresso allo spettrografo attraverso una fenditura ottica pro
13. 121 spurgo della pompa 90 Strumento Acquisizione 124 T tabella degli eventi di integrazione 112 tempo di risposta 67 V velocit di campionamento dati 67 volume del miscelatore della pompa 61 volume di iniezione raggiungimento volumi maggiori 53 volume di ritardo descrizione 42 esempio 42 volume extra colonna descrizione 43 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Indice 155 www agilent com In questo volume Il presente manuale contiene informazioni tec niche sul sistema LC Agilent 1290 Infinity Vengono trattati i seguenti argomenti e introduzione e descrizione del prodotto ottimizzazione del sistema e configurazione e installazione e guida introduttiva Agilent Technologies 2009 2011 2012 Printed in Germany 05 2012 G4220 94301 vai Agilent Technologies
14. Right Temperature Parra i D Signal B lt Remove DADIC DAD Signal C Window DADIA DAD Signal A x axis 3 y min Type acquired y axis range 100 Smau T draw zero line TT auto y adjust Offset 10 He m Fraction Collector Method Settings I Show fraction collection ticks T Use method settings Apply to Method OK Cancel Help 100 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Guida introduttiva 5 3 Nella finestra di dialogo Available Signals evidenziare i segnali richiesti e fare clic su Add per spostarli nella finestra di dialogo Selected Signals 4 Per configurare le singole impostazioni di ciascun segnale evidenziare il segnale nella finestra di dialogo Selected Signal e impostare i valori richiesti nella met inferiore della pagina Oltre ai segnali del rivelatore nel diagramma si possono ottenere anche le tracce di altri parametri come temperatura e pressione Selezionando Apply to Method le impostazioni di questa pagina possono essere archiviate nel metodo La finestra Online Plot si comporta come la carta di registrazione dei tracciati in quanto registra in modo continuo i dati in uscita dal i rivelatore i e altri parametri in uscita I segnali iniziano a essere disegnati alla destra della fine stra e si spostano verso sinistra Sono accessibili dati risalenti fino ai 90 min precedenti Ci risulta utile per controllare la linea di base
15. a due canali per i solventi e una valvola di selezione dei solventi in ingresso a quattro canali una valvola di spurgo automatico e un miscelatore di piccoli volumi il Jet Weaver integrato in un unica sede Il degassatore aumenta la stabilit del flusso in particolare a velocit di flusso lente e la sensibilit del rivelatore Figura 11 Pompa binaria Agilent 1290 Infinity 28 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Sistema LC Agilent 1290 Infinity Descrizione del prodotto 2 A oa All autocampionatore Dai serbatoi di solvente Valvola di commutazione Miscelatore del solven Degassat della pompa Canale A Allo scarico Figura 12 Identificazione delle parti e schema della Pompa binaria 1290 Infinity Ciascuna testa delle pompe un modello con due pistoni in serie caratteriz zato da un nuovo controllo del firmware e da un nuovo materiale per il pistone il carburo di silicio che rimuove efficientemente il calore dalla pompa Il capillare che congiunge il pistone primario al pistone secondario dotato di uno scambiatore di calore integrato per rimuovere il calore che si genera a pressioni e flussi elevati Ogni testa delle pompe dotata di valvola di ingresso passiva e di valvola di uscita passiva sulla camera del pistone prima rio I pistoni sono guidati in modo indipendente e preciso da un motore a 65000 passi che sostituisce 300 picolitri per passo Il movimento dei pistoni so
16. capillare di lunghezza leggermente superiore Vedere Figura 31 pagina 86 e Figura 32 pagina 87 Instant Pilot Rivelatore BS o 229 Comparto colonne 538 ii Comparto solventi Em I a i Pompa n I Autocampionatore Termostato per ALS opzionale Figura 31 Configurazione in due stack consigliata per 1290 Infinity con pompa quaterna ria vista anteriore 86 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Configurazione e installazione del sistema 4 Installazione del modulo LAN al software di controllo Cavo del bus CAN per Instant Pilot E Segnale analogico rivelatore opzionale Cavo termostato TO I opzionale 1 i LL
17. clic su 0K per uscire dalla finestra Queste modifiche vengono inviate al modulo dell autocampionatore Fare clic con il pulsante destro del mouse sull area del comparto colonna termostatata TCC e selezionare Method dal menu contestuale a Nella pagina Method del 1290 Infinity TCC inserire i parametri sotto elen cati Temperatura dello scambiatore di calore sinistro40 C Temperatura combinata dello scambiatore di calore destro b Per gli altri parametri si possono lasciare i valori delle impostazioni pre definite Fare clic su 0K per uscire dalla finestra Queste modifiche vengono inviate al modulo del TCC Fare clic con il pulsante destro del mouse sull area del rivelatore a serie di diodi DAD e selezionare Method dal menu contestuale a Nella pagina Method del 1290 Infinity DAD inserire i parametri sotto elen cati Use Signal spegne tutti i segnali eccetto il Signal A deselezionando le caselle di spunta Segnale A 250 nm larghezza banda 100 nm rif 360 nm larghezza banda 100 nm Ampiezza del picco 0 012 min Risposta 0 25 s 20 Hz b Nella sezione Advanced impostare Spectrum Store su All c Perglialtri parametri si possono lasciare i valori delle impostazioni pre definite Fare clic su 0K per uscire dalla finestra Queste modifiche vengono inviate al modulo del DAD Sono stati cos inseriti tutti i necessari parametri dei moduli Selezionare Metodo gt Salva Metodo con nome per salvare il metod
18. di separazione Modulo Parametro Impostazioni Pompa Solvente A Acqua Solvente B Acetonitrile Velocit di flusso 0 4 ml min Autocampionatore TCC Rivelatore Composizione iniziale Tabella di programmazione del gradiente Tempo finale Iniezione Lavaggio dell ago Colonna Temperatura Segnale A Ampiezza del picco Memorizzazione spettri 60 A 40 B A 4 minuti 20 A 80 B 5 minuti 1 yl Lavaggio della porta 6 s ZORBAX Eclipse Plus C18 d i 1 8 um 2 1 mm x 50 mm 40 C 250 nm larghezza banda 100 nm rif 360 nm larghezza banda 100 nm 0 025 min 10 Hz Tutti Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Guida introduttiva 5 Impostazione del metodo Questa sezione indica come impostare rapidamente le condizioni del metodo per eseguire l analisi usando le condizioni della miscela campione Per una spiegazione pi dettagliata di tutti i parametri disponibili consultare l Appen dice Impostazione di un metodo con la funzione Edit Entire Method pagina 123 Il metodo predefinito DEF_LC M stato caricato in modo che sia pronto a prepa rare il nuovo metodo Ora si possono modificare i parametri principali per creare il nuovo metodo Per l esempio di separazione discusso qui vedere le condizioni elencate nella Tabella 9 pagina 104 1 Per accedere rapidamente alla pagina Method di ogni modulo fare clic con il pulsante destro del mouse sul diag
19. e risiede nella memoria Method Information Instrument 2 Method Comments This method runs the test sample to demonstrate how to run an analysis Figura 36 Informazioni sul metodo Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 125 6 126 Appendice Strumento Acquisizione Impostazione del metodo dello strumento La schermata Setup Method pu essere raggiunta direttamente dal menu Strumento gt Imposta metodo dello strumento o facendo clic con il pulsante destro del mouse sull interfaccia utente grafica di qualsiasi icona dei moduli e quindi selezionando Method nel menu contestuale Questo passaggio di Edit Entire Method costituisce la schermata del Setup Method suddivisa in sei schede per moduli o funzioni diverse Le schede sono autocampionatore ad alte prestazioni HiP ALS HiP ALS Injector Program pompa binaria BinPump Comparto colonna termostatato TCC Rivelatore a serie di diodi DAD Instrument Curves Per spostarsi tra le schede fare clic sul nome della scheda sulla parte alta della schermata Quando i parametri sono stati cambiati possono essere inviati immediatamente allo strumento facendo clic su Apply oppure quando tutte le schede sono state completate facendo clic su 0K si inviano ai moduli tutti i parametri la schermata si chiude e si passa alla schermata successiva Le schede per inserire i parametri hanno lo stesso aspetto in tutti i
20. fattore di riten zione su R Non importante se il metodo di separazione mediante risoluzione rapida sia di nuova concezione o semplicemente trasferito da un metodo convenzionale esistente ci che conta avere a disposizione una vasta scelta di chimiche per la fase stazionaria in un ampia tipologia di formati di colonna Agilent ha gi immesso sul mercato pi di 140 colonne ZORBAX Rapid Resolu tion High Throughput RRHT da 1 8 um 14 opzioni di scelta per la selettivit lunghezze da 15 a 150 mm diametri interni da 2 1 3 0 4 6 mm e con il lancio del sistema LC Agilent 1290 Infinity la gamma STM stata ampliata alle colonne Rapid Resolution High Definition RRHD da 1200 bar Ci permette di scegliere la fase stazionaria ottimale in modo da ottenere la massima seletti vit La risoluzione la velocit di flusso e il tempo di analisi possono essere ottimizzati selezionando la colonna di diametro e lunghezza appropriati la Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 13 1 14 Introduzione alla cromatografia liquida a prestazioni ultra elevate UHPLC possibilit di operare con colonne STM pi lunghe non mai stata cos acces sibile Molti laboratori conducono un ampio processo di screening per selezionare la migliore combinazione di fase stazionaria fase mobile e temperatura per le loro separazioni Agilent offre soluzioni di sviluppo dei metodi per entrambi i sistemi LC delle serie
21. flusso continuo pu essere sostituito da un ciclo di iniezione fisso usando la pompa della siringa e il sistema di valvole del Flexible Cube per riempire il loop di campionamento Questa configura zione presenta il vantaggio di eliminare il volume di ritardo dall autocampio natore e quindi pu essere preferita in alcune situazioni di alta produttivit con gradienti rapidi Di contro la flessibilit dell iniezione a volume variabile non attiva e parte del campione viene persa nel lavaggio del loop Sono possi bili altre attivit come lo spurgo automatico della sede dell ago di iniezione dopo l iniezione grazie alle quali Flexible Cube permette di poter evitare pro blemi ricorrenti come l effetto memoria dei composti difficili o le ostruzioni causate da campioni impuri Il vassoio portacampioni dell autocampionatore dotato di 10 posizioni fisse per fiale da 2 ml e due vassoi rimovibili che possono essere uguali o diversi selezionati da e vassoio per fiale da 2 ml con 54 posizioni e piastra a pozzetti da microtitolo con 96 posizioni diverse altezze configura bili e piastra a pozzetti da microtitolo con 384 posizioni diverse altezze configu rabili Se necessario l autocampionatore pu essere termostatato da 4 C a 40 C aggiungendo il modulo di controllo della temperatura dell autocampionatore Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 35 2 36 Sistema LC Agilent 1290 Infinity
22. l integrazione tra limiti definiti Funzione usata quasi sempre per inibire l integrazione nella regione dall iniezione al fronte del solvente o al marcatore di picchi non ritenuti Per aggiungere alla tabella le righe come Integration OFF ON usare le icone in cima alla finestra Fare clic su 0K per uscire e si aprir la schermata successiva del processo di Modifica tutto il metodo 144 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Specifica rapporto Appendice La schermata Specify Report pu anche essere raggiunta direttamente dalla finestra Method and Run Control facendo clic con il pulsante destro del mouse sull interfaccia utente grafica dell icona Rapporto e quindi facendo clic su Specify Report nel menu contestuale Nella visualizzazione Data Analysis vi si pu accedere attraverso il menu Rapporto gt Specifica rapporto o sull icona di atti vit Specifica rapporto Specify Report Instrument 1 i Reporting settings i Quantitation settings Report mode Use Intelligent Reporting Style Report style Short Quantitative result sorted by C Sample info on each page V Add chromatogram output Use Classic Reporting vj Signal v Add fraction table and ticks Add summed peaks table Add sample custom fields to sample info Add compound custom fields Chromatogram output of pages Portrait o Landscape Re
23. la sicurezza Non installare parti di ricambio e non effettuare modifiche non autorizzate I condensatori all interno dello strumento possono essere ancora carichi anche se lo strumento non collegato alla presa di corrente Questo strumento utilizza tensioni pericolose in grado di provocare gravi lesioni alle persone Usare collaudare e riparare lo strumento con la massima cautela Quando si utilizzano solventi si devono osservare le procedure di sicurezza appropriate ad esempio occhiali protettivi guanti di sicurezza e indumenti di protezione come descritto nella scheda sull uso e sulla sicurezza dei materiali del produttore dei solventi in particolare quando si utilizzano solventi tossici o pericolosi Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 119 6 Appendice Simboli di sicurezza Tabella 10 Simboli di sicurezza Simbolo Descrizione Se l apparecchiatura contrassegnata da questo simbolo l utente A tenuto a consultare il manuale d uso al fine di evitare il pericolo di lesioni all operatore e danni all apparecchiatura Indica la presenza di tensioni pericolose Indica un terminale di messa a terra protetto Indica il rischio di lesioni oculari in caso di visione diretta della luce 2 prodotta dalla lampada al deuterio utilizzata nel prodotto Se l apparecchiatura contrassegnata da questo simbolo sono presenti superfici molto calde che non devono essere to
24. maggiore frequenza Si esamina lo spettro UV di una particolare molecola e si seleziona un mas simo di assorbanza opportuno Se possibile consigliabile evitare l intervallo in cui i solventi presentano un forte assorbimento al di sotto di 220 nm per il metanolo al di sotto di 210 nm per l acetonitrile Per esempio in Figura 23 pagina 66 l acido anisico possiede un buon massimo di assorbanza a 252 nm Una larghezza di banda stretta compresa tra 4 nm e 12 nm in genere consente di ottenere una buona sensibilit ed specifica per l assorbanza in un inter vallo stretto La banda stretta pu essere ottimizzata per ottenere la sensibilit nei con fronti di una molecola specifica Via via che si aumenta la larghezza di banda il segnale si riduce ma anche il rumore diminuisce ed possibile ottenere un valore ottimale del rapporto segnale rumore Indicativamente il valore otti Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity 3 male della larghezza di banda spesso prossimo alla larghezza di banda natu rale a met altezza della banda di assorbimento nello spettro UV Nell esempio dell acido anisico il valore pari a 30 nm La lunghezza d onda analitica in genere impostata su un massimo di assorbi mento per aumentare la sensibilit nei confronti di una specifica molecola Il rivelatore risponde in maniera lineare fino a 2 AU e oltre per molte app
25. minimo e alla valvola di commutazione se installata 3 Collegare l uscita della colonna all ingresso indicato con la dicitura CELL IN collegamento sul lato sinistro della cella a cartuccia Max Light nel rivelatore 1290 Infinity 4 Collegare il tubo di scarico all uscita indicata con la dicitura CELL OUT collegamento sul lato destro della cella a cartuccia Max Light nel rivelatore 1290 Infinity e posizionare l uscita in un contenitore adatto alla raccolta degli scarichi Integrazione in rete Per l integrazione in rete del proprio sistema fare riferimento ai manuali per l utente dei rispettivi moduli capitolo Configurazione LAN Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 93 4 Configurazione e installazione del sistema Installazione del modulo 94 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Qee 5 00 Guida introduttiva Informazioni sulla guida introduttiva 96 Preparazione del sistema 97 Accensione del sistema ON 97 Caricamento del metodo predefinito 98 Configurazione del diagramma in linea 100 Spurgo della pompa 102 Acquisizione dei dati nella schermata Metodo e controllo analisi 103 Parametri del metodo per la miscela campione e la colonna ZORBAX RRHD 103 Impostazione del metodo 105 Esecuzione del metodo per una singola iniezione 107 Esecuzione pi rapida del metodo 108
26. operazioni che possibile automatizzare tramite il modulo Flexible Cube necessario lavare regolarmente la porta di lavaggio e i relativi tubi e pompa di erogazione del solvente per garantire un minore effetto memoria Ad esem pio prima di utilizzare il sistema ogni giorno adescare la pompa di lavaggio per tre minuti con il solvente adatto Se non stato possibile in alcun modo eliminare l effetto memoria il problema pu derivare dall analita bloccato all interno della valvola di iniezione possi bile impostare la valvola di iniezione per eseguire movimenti aggiuntivi cos da svuotare il percorso del flusso nella valvola se si riscontrano problemi con l effetto memoria Se i composti che causano problemi richiedono un elevata percentuale di fase organica per l eluizione consigliato passare la valvola di iniezione alla percentuale superiore di fase organica dopo aver eluito l ultimo picco inoltre consigliato modificare nuovamente la valvola di iniezione dopo aver stabilizzato le condizioni iniziali per la fase mobile In questo modo garantito che la scanalatura di bypass nella guarnizione del rotore della val vola sia caratterizzata dalle condizioni di avvio del gradiente fondamentale soprattutto per flussi inferiori a 0 5 ml min Per i campioni per i quali l esterno dell ago non pu essere pulito a sufficienza con acqua o alcol dalla pompa di lavaggio utilizzare vial di lavaggio con un sol vente adatto Per la pulizia
27. picco Post Time Tempo post analisi Postrun Post analisi Post Run Command Macro Comando post analisi Macro Prerun Pre analisi Pre Run Command Macro Comando pre analisi Macro Pressure Limits Limiti di pressione Prime On Attiva adescamento Printer Stampante Pump Pompa Purge Spurgo Purge On Attiva spurgo Q Quantitation settings Impostazioni quantificazione Quantitative results sorted by Risultati quantitativi suddivisi per 152 Range Intervallo Reference Bandwidth Ampiezza di banda di riferimento Reference Wavelength Lunghezza d onda di riferimento Remove Rimuovi Repeat Ripeti Report mode Modalit del rapporto Report Style Stile del rapporto Reporting settings Impostazioni del rapporto Response Risposta Run Method Esegui metodo Run Sequence Esegui sequenza Run Time Checklist Lista di controllo del tempo di analisi S Sample flush out factor Fattore di eliminazione del campione Sample Info Informazioni sul campione Sample Name Nome del campione Save Salva Save As Salva con nome Save Method with Data Salva metodo con dati Screen Schermata Select Run Method Task Seleziona attivit di esecuzione del metodo Selected Signal Segnale selezionato Selected Signals Segnali selezionati Set Integration Events Table Imposta tabella degli eventi di integra zione Setup Method Imposta metodo Show timetable graph Mostra grafico della tabella di pro grammazione Signal A Segnale A
28. possono essere eseguite mentre in corso la separazione prece dente Questo metodo noto come iniezione sovrapposta e pu essere facil mente attivato dalla schermata di impostazione dell autocampionatore nel software di controllo ChemStation L autocampionatore pu essere impostato in modo da commutare sul bypass il flusso attraverso l autocampionatore dopo che l iniezione stata eseguita e quindi ad esempio dopo 3 o 4 minuti avviare il processo di aspirazione del campione successivo e di preparazione dell iniezione Questo di solito consente di risparmiare da 0 5 minuti a 1 minuto per ogni iniezione Per i composti appiccicosi consigliabile farlo durante l equilibratura della colonna quando l autocampionatore ha visto le condizioni iniziali di analisi del gradiente successivo La fase di equilibratura della colonna pu rappresentare una parte significa tiva del tempo di ciclo Di solito la colonna deve essere ripulita con un volume da tre a cinque volte superiore al volume della colonna per stabilizzarla in modo che sia pronta per la successiva iniezione e in alcune applicazioni que sto pu rappresentare almeno il 50 del tempo di separazione un processo essenziale ma pu essere staccato dal tempo di ciclo usando la rigenerazione alternata automatica delle colonne Per questo sono necessarie una testa di valvola da 1200 bar a due posizioni e dieci porte nel compartimento della colonna una seconda colonna analitica identica a
29. sempre una copia dei parametri di acquisizione in file di dati come ACOTXT per garantire la protezione dei parametri del metodo originari 3 Posizionare la fiala del campione in posizione 1 ossia la posizione frontale delle 10 posizioni delle fiale da 2 ml sul lato destro del vassoio portacam pioni 4 Selezionare Esegui controllo gt Informazioni sul campione e inserire un nome opzionale per la Subdirectory il Filename la Location del campione fiala 1 il Sample Name e l eventuale Comment 5 Seilsistema si gi equilibrato e la linea di base stabile per attivare l iniezione fare clic su Run Method nella pagina Sample Info In alternativa fare clic su OK e quando si pronti fare clic sul pulsante Start Single Sample al di sopra del diagramma del sistema 6 L iniezione viene eseguita e il cromatogramma appare nel Online Plot L acquisizione dei dati si fermer quando viene raggiunto il Stop Time Il cromatogramma dovrebbe risultare simile a quello della Figura 33 pagina 108 tuttavia l asse del tempo sar pi lungo in quel caso perch quella analisi stata eseguita in condizioni di velocit quattro volte mag giore rispetto a queste Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 107 5 Guida introduttiva Esecuzione pi rapida del metodo Il primo esercizio stato eseguito a una pressione raggiungibile in un sistema standard Ora la velocit di flusso viene aumentata e il gradien
30. si seleziona per bilanciare subito prima dell inizio dell analisi e questa la situazione normale A volte si seleziona in alternativa Postrun per bilanciare al termine dell analisi quando scaduto il Tempo post analisi Ad esempio se il segnale mostra sempre una deriva negativa e l utente preferisce che l analisi termini ad assorbanza zero allora questo parametro imposter il corretto livello zero per l analisi seguente Non cambier retrospettivamente l analisi al termine della quale ha eseguito il bilanciamento Advanced Lamps on required for analysis il DAD o MWD 1290 Infinity dotato di una lampada al deuterio che deve essere accesa per l analisi quindi la casella deve essere spuntata Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 139 Scheda Instrument Curves etup Method HIP ALS HIP ALS Injector Program 4 BinPump a TCC DAD lt Instrument Curves BinPump lt Pressure bar v Flow ml min v Solvent Ratio A s Solvent Ratio B TEG _ Left Temperature C _ Right Temperature C DAD C Board Temperature C _ Optical Unit Temperature C C UY Lamp Anode Voltage V C Show timetable graph OK ni x Apply nl p Cancel Lun Help Figura 42 Schermata Imposta metodo Scheda delle curve relative allo strumento Spuntando l apposita casella la scheda delle curve relative allo str
31. sorted by Oria of pages me ho amp C Sample info on each page F Add fraction table and ticks Z Add chromatogram output Add summed peaks table Landscape C Add sample custom fields to sample info C Add compound custom fields O Multi page Landscape i Pages Report layout for uncalibrated peaks Separately With calibrated peaks Do not report Signal options Destination File setting C Printer M Screen File prefix Report DI v O HTM DIF V File M Unique PDF file name 114 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Guida introduttiva 5 Analisi dei dati Specify Report Instrument 1 Reporting settings Quantitation settings Calculation mode Calculate Based on ISTD correction Use multiplier and dilution factor with ISTDs Calculation factors Use sample data From Data File Compound ISTD Amount Amount 0 Multiplier 1 Dilution OK Cancel Help 2 Conle impostazioni mostrate come esempio nelle figure sopra possibile riprodurre sullo schermo un Rapporto di area percentuale 3 Nella sezione Destination selezionare Printer se si desidera una copia carta cea oppure File e PDF per ottenere un utile file PDF del rapporto memoriz zato nel file dei dati il file dei dati con
32. suffisso D in realt una directory Il file del rapporto pu essere visualizzato direttamente in ChemStation oppure si pu cercare nella directory usando la normale funzione File Explorer di Windows 4 Salvare ancora una volta il metodo per assicurarsi che le impostazioni del rapporto vengano memorizzate dal metodo per usi futuri Quando si user ancora il metodo per produrre il rapporto verranno usate queste impostazioni degli eventi di integrazione e dei rapporti Questa sezione riporta brevi indicazioni su come usare l Analisi dei dati del software ChemStation Consultare imanuali ChemStation e il sistema di aiuto on line per maggiori dettagli sulle potenti caratteristiche di ChemStation Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 115 5 Guida introduttiva Analisi dei dati 116 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 6 Appendice Informazioni per la sicurezza 118 Informazioni sui solventi 121 Agilent Technologies su Internet 122 Impostazione di un metodo con la funzione Edit Entire Method 123 Informazioni sul metodo 125 Strumento Acquisizione 126 Analisi dei dati 141 Lista di controllo del tempo di analisi 148 Nel presente capitolo vengono fornite ulteriori informazioni di natura legale sulla sicurezza e sull impostazione di un metodo Hb Agilent Technologies 117 6 A
33. 0 14 0 17 0 19 4 0 0 01 0 01 0 02 0 03 0 09 0 11 0 13 0 15 5 0 0 00 0 01 0 02 0 02 0 07 0 09 0 10 0 12 Tabella 7 Volume approssimativo del liquido con dimensioni di colonna tipiche presu mendo una porosit 0 6 Diametro Lunghezza colonna mm colonna mm 30 50 100 150 250 Volume colonna Fase liquida microlitri 2 1 62 104 208 312 520 3 0 127 212 424 636 1060 4 0 226 377 754 1131 1885 4 6 299 499 997 1496 2493 Per gradienti molto rapidi eseguiti in 0 5 min raggiungibili solo dal sistema binario LC Agilent 1290 Infinity il volume di ritardo del sistema pu essere ridotto facilmente senza modificarne la configurazione fisica Tale modifica si ottiene variando il comportamento dell autocampionatore Il volume di ritardo dell autocampionatore Agilent 1290 Infinity pari a 80 ul associato al circuito idraulico che parte dalla valvola di iniezione attraversa il dispositivo di dosaggio l ago la sede dell ago i capillari di connessione e torna infine alla valvola di iniezione vedere Figura 18 pagina 34 Per eseguire un iniezione la valvola passa da mainpass a bypass in modo che il dispositivo Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity 3 di dosaggio possa aspirare il campione nel capillare dell ago L iniezione viene eseguita quando la valvola ritorna nella posizione di mainpass e il campione viene introdotto nella colon
34. 00 PHENONES PHENONE M X 010 D mAU Fi a u E Method Manual Evente IT E 5 q 3 Initial Events For All Signals g ri g 5 S 5 Integration Events Value Tangent Skim Mode Standard Tail Peak Skim Height Ratio 0 00 Front Peak Skim Height Ratio 0 00 Skim Valley Ratio 20 00 Baseline Correction Advanced Peak to Valley Ratio 500 00 Specific Events For Signal T r r T ST i o 02 na 08 08 DAD Default sl 7 t Time Area Height Width Area Symmetry Time Integration Events Value 1 0 122 270 4 206 5 0 0195 15 507 0 479 Initial Slope Sensitivity 50 2 0 192 255 6 224 3 0 0171 14 672 0 527 Initial Peak width no 2 0 279 208 5 230 2 0 0138 11 956 0 574 Tritial Area Reject 20 4 0 376 188 8 254 8 0 0108 10 825 0664 Initial Height Reject 20 5 0 421 183 6 235 9 9 7431E 3 10 530 0 723 Initial Shoulders OFF G 0 407 177 6 300 2 8 9037E 3 10167 0 767 7 0 601 173 2 324 6 8 2216E 3 3 935 0 852 8 0712 143 1 280 1 7116 3 8 207 0 883 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 113 5 Guida introduttiva Analisi dei dati Specificare il rapporto 1 Sulla barra del menu fare clic su Rapporto gt Specifica rapporto per visualiz zare la finestra mostrata in figura Specify Report Instrument 1 i Reporting settings Quantitation settings Report mode Use Intelligent Reporting Use Classic Reporting r Style Chromatogram output Report style Short Quantitative result
35. 00 bar Il limite Bassa pressione Disat Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 133 6 Appendice Impostazione di un metodo con la funzione Edit Entire Method tivo quando il valore zero ma a qualsiasi altro valore la pompa generer un errore nel caso in cui durante il funzionamento la pressione scenda al di sotto di questo valore Questa una misura di salvaguradia alternativa quando la colonna non all interno di un modulo dotato di sensore per le perdite o nel caso in cui il sistema pompi a secco Tipicamente si imposta un valore da 10 a 20 bar Scheda del comparto colonna termostatato TCC Setup Method Ga HiP ALS Injector Program IEJ BinPump TCC 37 DAD Instrument Curves Temperature Timetable Left Right Advanced Nat Controlled Nat Controlled Enable Analysis 40 0 C 20 0 IJ when front door open D As Detector Cell As Detector Cell Leto Right With any temperature with any temperature ciali When temperature is within when temperature is within Column Switching Valve ENG c E c Port 1 gt 2 Stoptime Posttime As Pump Iniector of 1 00 i 1 00 min d Figura 40 Schermata Imposta metodo Scheda del comparto colonna termostatato Temperature stabilisce la temperatura dei supporti di colonna destro e sini stro che possono essere controllati in modo indipendente o interconnesso facendo cl
36. 1200 e 1290 Infinity Queste soluzioni offrono l automa zione completa di questi processi di selezione che richiedono tempo rendendo le operazioni di sviluppo e di trasferimento del metodo pi semplici e affida bili Le colonne ZORBAX RRHD e RRHT da 1 8 um utilizzano la stessa chimica delle colonne ZORBAX con particelle da 3 5 e 5 um Di conseguenza per qualsiasi particolare fase delle colonne ZORBAX le particelle da 5 0 3 5 e 1 8 um forni scono identica selettivit favorendo un semplice rapido e sicuro trasferi mento bidirezionale del metodo tra LC convenzionale UHPLC e LC preparativa Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Introduzione alla cromatografia liquida a prestazioni ultra elevate UHPLC 1 Vantaggi delle colonne impaccate con particelle inferiori a 2 micron Cromatografia pi rapida I vantaggi di avere analisi di durata pi breve sono molti Oggi i laboratori ad alta produttivit hanno capacit superiore e analizzano un maggior numero di campioni in meno tempo Pi campioni in meno tempo significa anche costi inferiori Per esempio riducendo il tempo di analisi da 20 min per campione a 5 min il costo per 700 campioni ridotto del 79 Tabella 1 pagina 15 Tabella 1 Risparmio di tempo e di costi su 700 analisi Durata del ciclo Ciclo di 20 min Ciclo di 5 min Analisi 700 700 Costo analisi appr 10 58 2 24 Costo 700 analisi appr 7 400 1 570 Risparmio de
37. 12A La trasmissione della luce nello spettrografo e la larghezza di banda ottica sono controllate dalla fenditura di ingresso ad apertura variabile L imposta zione predefinita per la larghezza della fenditura pari a 4 nm un valore ade guato per la maggior parte delle applicazioni in quanto garantisce buone prestazioni generali Le caratteristiche delle prestazioni interessate sono la sensibilit la risoluzione spettrale e la linearit Prendendo in considerazione una particolare lunghezza d onda che entra nello spettrografo la luce corri spondente colpisce in effetti una piccola fascia di diodi la cui larghezza pro porzionale alla larghezza della fenditura di entrata La descrizione della fenditura come avente una larghezza di 4 nm caratterizza questo comporta mento la luce incidente colpisce il numero di diodi che rilevano una larghezza di banda di 4 nm Ne segue che la risoluzione ottica minima pari a 4 nm e quindi la larghezza di banda della serie di diodi o digitale deve essere impo stata su un valore pari o superiore a 4 nm Per una sensibilit ottimale l impo stazione pari a 8 nm permette l ingresso della maggior parte della luce e riduce al minimo il rumore ma la risoluzione spettrale assume il valore minimo Ci di solito non costituisce un problema nel caso degli spettri UV poich le rispet tive larghezze di banda naturali in genere sono maggiori di 25 nm senza alcuna struttura fine La larghezza di banda ottica p
38. 8 Maximizing peak capacity and separation speed in liquid chromatography Ciascuna riduzione del volume della colonna extra ridurr la dispersione e fornir una risoluzione migliore Tutto questo gi stato ottimizzato nel sistema 1290 Infinity LC con capillari con diametro interno ristretto 0 12 mm d i verificare che venga utilizzata la lunghezza minore tra colonna e rivela tore e cella di flusso cartuccia Max light Infine necessario preservare qualunque miglioramento della risoluzione tra mite una raccolta dei dati sufficientemente rapida per delineare in maniera accurata i picchi affilati Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity 3 Come ottenere una maggiore sensibilit Ottenere una sensibilit maggiore La sensibilit di un metodo di separazione legata alla scelta delle fasi mobili e stazionarie poich preferibile ottenere una buona separazione con picchi stretti e una linea di base stabile La scelta della configurazione dello stru mento provocher determinati effetti ma l impatto maggiore sar dato dalle impostazioni del rivelatore Il presente capitolo analizza in che modo la sensi bilit influenzata da Volume del miscelatore della pompa e Colonne ristrette e Cella di flusso del rivelatore e Parametri rivelatore Inoltre trattando i parametri del rivelatore verranno anche menzionati argo menti rela
39. Agilent Technologies Method Translator and Cost Savings Calculator Financial View Figura 6 Samples per Year 76500 B Y Max Samples per Instrument per Year LC 6480 Max Samples per Instrument per Year RRLC 1940 Total Annual Operational Cost per Costs in Thousands of USD Sample in USD MI conventiona Lc Jj Agilent 1200 series Rapid Resolution LC RRLC System Conventional LC 590277 78 USD 47222 22 USD 84325 40 USD 38250 00 USD 0 00 USD 5928 75 USD 2677 50 USD 0 00 USD Total Annual Operational Cc 768681 65 USD Total Cost per Sample 10 05 USD Savings Calcolatore del risparmio dei costi Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Lunghezza colonna mm 150 100 75 50 30 15 Introduzione alla cromatografia liquida a prestazioni ultra elevate UHPLC Efficienza colonna N 5 pm 12 500 8 500 6 000 4 200 N A N A Figura 7 Efficienza Efficienza Riduzione colonna colonna del tempo N 3 5pm N 1 8 pm di analisi 21 000 35 000 14 000 23 250 Efficienza N Tempo 33 di analisi 10 500 17 500 50 Pressione 7 000 12 000 Volume 67 del picco 4 200 6 500 Uso 80 del solvente 2 100 2 500 90 Relazione tra dimensioni delle particelle efficienza e tempo di analisi Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 1 17 1 18 Introduzione al
40. Analisi dei dati 110 Schermata dell Analisi dati 111 Integrazione di un segnale 112 Specificare il rapporto 114 Nel presente capitolo vengono fornite informazioni sull acquisizione e sull ana lisi dei dati con il sistema LC Agilent 1290 Infinity oa Agilent Technologies 95 5 Guida introduttiva Informazioni sulla guida introduttiva 96 Nel presente capitolo sono fornite informazioni sul funzionamento del sistema LC Agilent 1290 Infinity La guida pu essere utilizzata per eseguire rapida mente una prima analisi dopo l installazione funzionando sia da esempio per un esercitazione sia da controllo del funzionamento globale del sistema Include anche informazioni pi dettagliate sui parametri del metodo Questo esempio illustra la configurazione e l esecuzione di un analisi utiliz zando la colonna e la miscela campione da analizzare forniti insieme al sistema LC Agilent 1290 Infinity L esempio fa riferimento ai menu e ai comandi di OpenLAB CDS edizione ChemStation ma funzioni identiche sono disponibili anche su opzioni di controllo alternative inclusi OpenLAB CDS edizione EZChrom sistema di controllo Instant Pilot e software MassHunter Il punto di partenza assume che il sistema sia stato installato acceso e sia stato eseguito il primo adescamento vedere Adescamento della pompa pagina 88 La lampada UV deve essere accesa almeno 30 minuti prima di eseguire qualsiasi lavoro quantitativo Manuale e guida di riferimen
41. Figura 29 pagina 84 e la Figura 30 pagina 85 Questa configurazione otti mizza il circuito idraulico assicurando un volume di ritardo minimo e ridu cendo lo spazio necessario sul banco La pompa quaternaria Agilent 1290 Infinity deve essere installata sempre in fondo allo stack Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 83 4 Configurazione e installazione del sistema Instant Pilot Comparto solventi Rivelatore Comparto colonne Autocampionatore Pompa Figura 29 Configurazione dello stack consigliata per 1290 Infinity con pompa quaternaria vista anteriore 84 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Configurazione e installazione del sistema LAN al software di controllo
42. LC Agilent 1290 Infinity 24 Il sistema LC Agilent 1290 Infinity stato progettato per offrire la pi alta flessibilit di esecuzione della cromatografia liquida analitica utilizzando tutti i tipi di tecnologie di colonna attualmente disponibili nonch quelle che potranno emergere in futuro Il sistema LC 1290 Infinity caratterizzato dalla pi ampia gamma di parametri di funzionamento cos da potervi replicare le impostazioni dei metodi utilizzati in precedenza su qualsiasi sistema preesi stente per HPLC analitica o UHPLC di qualsiasi produttore Per raggiungere questo obiettivo il sistema LC Agilent 1290 Infinity offre alcune idee di conce zione radicalmente nuova pur mantenendo la sua caratteristica affidabilit ben progettata che ha reso i sistemi HPLC di Agilent la linea di maggior suc cesso nel mercato HPLC Che cosa offre questo sistema e Velocit di flusso da 0 05 ml min a 5 ml min per cromatografia convenzio nale o rapida con tutte le colonne analitiche di diametro interno da 1 a 5 mm e tutti i tipi di materiali di impaccamento e L intervallo di pressione fino a 1200 bar gt 17400 psi consente una croma tografia rapida sulle colonne corte un elevata risoluzione sulle colonne lun ghe utilizzando materiale di impaccamento con particelle inferiori a due micron e una scelta pi ampia della viscosit della fase mobile e Volumi di ritardo ultra ridotti per ottenere i gradienti pi rapidi nell ambito della rivelaz
43. LOQ2 M E 55 ommu Ges QJ DGCALOQ3 M l AJ DGCALOQ4 M AJ DGCALOQS M AJ DecALOgG M Lil LAT MACA Pa M Il metodo predefinito DEF_LC M caratterizzato da una serie di parametri predefiniti che possono essere modificati successivamente per creare un nuovo metodo Ad esempio la velocit di flusso impostata su zero e Method Information e Method History sono vuoti Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Guida introduttiva Preparazione del sistema NOTA Si noti che questo metodo non pu mai essere sovrascritto con nuovi parametri Quindi facendo clic su Save si verr reindirizzati alla funzione Save As dove necessario inserire un nome diverso per il metodo Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 5 Guida introduttiva Preparazione del sistema Configurazione del diagramma in linea 1 Sela finestra Online Plot non visibile fase clic su Visualizza gt Segnali in linea gt Finestra del segnale 1 per visualizzarla E Online Plot DADIA DAD Signal A mAU 2 Per configurare uno o pi dei segnali desiderati nella finestra Online Plot fare clic su Change Si apre la pagina di impostazione Edit Signal Plot Edit Signal Plot Available Signals Selected Signals PMP1B BinPump Pressure PMP1C BinPump Flow PMP1D BinPump Solvent Ratio A PMP1E BinPump Solvent Ratio B HMiA TCC Left Temperature RIO TEC
44. Row Append Row Delete Row Signal Description Align Peak1 Peak2 Align Window Figura 43 Dettagli segnale 142 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Appendice 6 Modifica eventi di integrazione La schermata Edit Integration Events pu essere anche raggiunta direttamente dalla finestra Method and Run Control facendo clic con il pulsante destro del mouse sull interfaccia utente grafica dell icona Eventi di integrazione e quindi facendo clic su Edit Integration Events nel menu contestuale Nella visualizza zione Data Analysis vi si pu accedere attraverso il menu Integrazione gt Eventi di integrazione o sull icona di attivit Edit Integration Events Int g ion cb Calibration ul Signal Me du IS cd Report Short Ea d DADI A Sig 242 ONE MIX 008 D v EN t ASTREA FE NO Method Manual Events IT Initial Events For All Signals Integration Events Value Tangent Skim Mode Standard Tail Peak Skim Height Ratio 0 00 Front Peak Skim Height Ratio 0 00 Skim Valley Ratio 20 00 Baseline Correction Classical Peak to Valley Ratio 500 00 Specific Events For Signal DAD Default bad Time Integration Events Value Initial Slope Sensitivity 5 Initial Peak Width 0 05 Initial Area Reject 5 Initial Height Reject il Initial Shoulders OFF Figura 44 Schermata Modifica eventi di integrazione L integrazione la calibrazion
45. a pompa Applicazioni tipiche prevedono metodi ad alta produttivit con gra dienti rapidi su colonne ad alta risoluzione da 2 1 mm La Pompa binaria 1290 Infinity predisposta per montare sbarre delle valvole aggiuntive ai lati sinistro e destro della pompa Queste sbarre delle valvole possono montare fino ad altre due valvole di selezione dei solventi per un fat tore di 12 volte Ci permette di arrivare a un massimo di 26 solventi per gra dienti binari per lo sviluppo del metodo analitico disponibile una speciale guida cluster che integra le valvole di selezione del solvente esterne nell interfaccia utente della pompa e consente una selezione facile e intuitiva dei solventi in base al loro nome Pompa quaternaria Agilent 1290 Infinity AI contrario la Pompa quaternaria 1290 Infinity dotata di una sola testa della pompa e di una valvola multicanale del gradiente MCGV per porzionare gli eluenti in funzione del gradiente programmato In base a questo principio di miscelazione a bassa pressione i solventi si incontrano nel weaver d ingresso e quindi vengono gi miscelati prima e dentro la testa della pompa La testa della pompa identica a quella della Pompa binaria 1290 Infininty e quindi presenta lo stesso tipo di prestazioni e gli stessi dettagli tecnici Pu anche essere dotata di un sistema di lavaggio attivo delle tenute della pompa per prolungarne la durata quando si usano soluzioni tampone concentrate Un sensore di
46. a 88 Spurgo della pompa 90 Collegamenti di flusso tra i moduli 93 Integrazione in rete 93 Il presente capitolo riporta informazioni su installazione del software configu razioni dello stack e preparazione del sistema per l utilizzo Agilent Technologies 75 4 Configurazione e installazione del sistema Installazione del software 76 Installazione del software di controllo e del sistema di dati Per dettagli sulle procedure di installazione del software fare riferimento al Manuale del Rivelatore a serie di diodi 1290 Infinity e ai manuali del sof tware Installazione del software Agilent Lab Advisor Per dettagli sulle procedure di installazione del software Agilent Lab Advisor fare riferimento alla documentazione relativa al software sul DVD Lab Advi sor Agilent Lab Advisor sostituisce e amplia le funzioni diagnostiche caratteristi che esclusive del precedente software ChemStation Agilent Lab Advisor un applicazione basata su Windows che monitora gli strumenti del laboratorio in tempo reale e senza interruzioni e aumenta la produttivit attraverso la notifica automatica delle necessit di manutenzione e di servizio mediante l uso di contatori avanzati Questo permette di risolvere un problema prima che esso possa avere effetto sui risultati Il software include una suite estesa di informazioni e documentazione per l utente un set di calcolatori e di strumenti che facilitano la configurazione la calibrazione e
47. ago Il valore predefinito 100 ul min La velocit deve essere rallentata in caso di campioni viscosi per ottenere maggiore precisione con volumi di cam pione piccoli lt 2 uL Eject speed la velocit di emissione dall ago Draw position indica lo scarto verticale dalla posizione di iniezione nomi nale di 10 mm al di sopra del fondo di una fiala Questo corrisponde a circa met cammino al di sopra di una fiala da 2 ml quindi necessario impostare uno scarto negativo perch il campione venga prelevato vicino al fondo della fiala ad esempio un valore di 7 mm posizionerebbe la punta dell ago a 3 mm dal fondo della fiala Equilibration time indica il tempo di ritardo tra l aspirazione del campione e il movimento dell ago Sample flush out factor stabilisce quanto tempo attende l autocampiona tore dopo l iniezione prima di permettere alla valvola di commutare in posizione di bypass Ci assicura che la zona del campione sia libera dall ago dalla sede e dalla valvola di iniezione Il valore predefinito 5 Vial Well bottom sensing un alternativa all uso dello scarto per la posi zione di aspirazione L ago si muove lentamente verso il basso finch non tocca il fondo della fiala o del pozzetto e quindi si alza di 1 mm Questo un modo versatile per assicurarsi che l ago si trovi vicino al fondo della fiala ma richiede un tempo leggermente maggiore per completare l inie Manuale e guida di riferimento rapido del s
48. agramma del sistema Lo stato del sistema cambia da Non pronto indica zione gialla a Pronto indicazione verde dopo un breve ritardo in attesa di ottenere i valori di regolazione Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 97 5 Guida introduttiva Caricamento del metodo predefinito Il software ChemStation comprende un metodo predefinito chiamato DEF_LC M che viene caricato alla prima esecuzione oppure ogni volta che richiesto un nuovo modello vuoto per definire il metodo Contiene imposta zioni predefinite per tutti i moduli Con questa procedura viene caricato il metodo DEF_LC M Pu essere usato per configurare tutti i parametri in base a impostazioni predefinite o per otte nere un modello vuoto prima di configurare un nuovo metodo 1 Portarsi sulla schermata di ChemStation Method and Run Control 2 Sulla barra del menu selezionareMetodo gt Nuovo metodo quindi selezionare DEF_LC M dal menu contestuale In alternativa possibile usare l icona Load Method 2 nella barra del menu o fare doppio clic sul nome del metodo DEF_LC M nella scheda Metodi del pannello di navigazione Fie RunControl Instrument Method Sequence View Abort Help v Sequences amp cd DEF_LC S _ Method and Run Control Main Automation Controls Single Sample M f w s QI DGALSTST M a w S N A AJ DECALAS M 3 a ia E A N A ml min iar AJ DGCALOQI M bi di AI DECA
49. ampiezza del picco 67 analisi dei dati 124 analisi dati 110 Autocampionatore Infinity descrizione 34 c calcolatore costi 15 caricamento predefinito 98 cella di flusso 121 informazioni sui solventi 121 Max Light cella di flusso a cartuccia 63 Max Light cella di flusso ad alta sensibilit 63 classe di sicurezzal 118 colonna stabilizzazione termica 19 temperatura 19 colonne particelle inferiori a 2 micron 15 Comparto colonna termostatato descrizione 36 componenti del sistema autocampionatore 34 154 comparto colonna termostatato 36 pompa binaria 28 rivelatore a serie di diodi 38 configurazione e installazione del sistema integrazione in rete 93 configurazione diagramma in linea 100 due stack anteriore 81 86 due stack posteriore 82 87 due stack 81 86 stack unico 78 83 cromatografia liquida utilizzo di particelle pi piccole 8 D dati analisi 110 DEF_LCM 123 diagramma in linea configurazione 100 E effetto memoria 70 Equazione di van Deemter 10 F fattore di ritenzione 12 G guida introduttiva introduzione 96 impostazione del metodo dello strumento 126 informazioni sui solventi 121 informazioni sul metodo 124 125 integrazione in rete 93 integrazione 112 segnale 112 Internet 122 J Jet Weaver rimuovere i collegamenti dei capillari 50 L larghezza della fenditura 66 larghezza di banda 65 Lista di controllo del tempo di analisi 124 lunghezza d onda
50. ampionatore la colonna e il rivelatore nonch dal volume della cella di flusso nel rivelatore Nel sistema Agilent 1290 Infinity LC il volume extra colonna ridotto al minimo grazie alla tubatura di diame tro interno ridotto 0 12 mm i d al volume ridotto degli scambiatori di calore nel comparto della colonna e alla cella a cartuccia Max Light nel rivelatore Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 43 3 Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity Configurazione del volume di ritardo ottimale 44 La Tabella 3 pagina 44 e la Tabella 4 pagina 45 mostrano i componenti che contribuiscono al volume di ritardo del sistema LC Agilent 1290 Infinity Nella configurazione standard con la pompa binaria Agilent 1290 Infinity il miscela tore Jet Weaver l autocampionatore 1290 Infinity e il comparto colonna ter mostatato il volume di ritardo del sistema di circa 125 ul Questo volume di ritardo standard applicabile alla maggior parte delle applicazioni Ad esem pio una separazione veloce su una colonna impaccata da 50 mm x 2 1 mm con particelle inferiori a due micron a una velocit di flusso moderata di 0 6 ml min porta a un tipico tempo di ritardo del gradiente di circa 0 2 min generalmente accettabile con tempi di gradiente nell ordine di due o tre minuti vedere Tabella 6 pagina 45 spesso utile considerare la velocit di flusso in termini di volumi di colonna come pu essere
51. apido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity 3 riguardante le fasi stato utilizzato un sistema di sviluppo di metodi automa tizzato probabile che siano state utilizzate colonne brevi per un analisi rapida in ogni fase dell indagine L equazione di risoluzione mostra che il fattore maggiormente significativo l efficienza o la conta su piastra N la cui ottimizzazione possibile in diversi modi N inversamente proporzionale alle dimensioni delle particelle e diret tamente proporzionale alla lunghezza di una colonna in questo modo parti celle di dimensioni minori e colonne pi lunghe restituiranno una conta su piastra pi elevata La pressione aumenta dall inverso del quadrato delle dimensioni delle particelle e proporzionalmente alla lunghezza della colonna per questo motivo che il sistema 1290 Infinity LC stato progettato per arri vare a 1200 bar cos da consentire il funzionamento con particelle di meno di due micron potendo aumentare la lunghezza della colonna fino a 100 mmo 150 mm possibile inoltre trovare esempi di colonne da 100 mm e 150 mm collegate cos da raggiungere una lunghezza di 250 mm L aumento della riso luzione con la radice quadrata di N consente al momento del raddoppio della lunghezza della colonna di aumentare la risoluzione di un fattore di 1 4 Ci che pu essere ottenuto dipende dalla viscosit della fase mobile in quanto diretta
52. apillare di uscita alla porta 1 Porta 1 Porta 2 52 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity 3 Come ottenere volumi di iniezione maggiori La configurazione standard dell autocampionatore Agilent 1290 Infinity include un loop di campionamento dal volume variabile per un massimo di 20 ul iniezioni Il dispositivo di misurazione pu iniettare un volume massimo di 40 ul ed possibile scambiare la cartuccia del loop di campionamento per consentire questa operazione per ulteriori dettagli fare riferimento al manuale dell autocampionatore 1290 Infinity Il volume di ritardo del sistema dovuto all autocampionatore aumenter di conseguenza Quando un metodo viene trasferito da una colonna superiore a una minore importante che la relativa traduzione consenta di ridurre il volume di inie zione in proporzione al volume della colonna per mantenere le prestazioni del metodo In questo modo possibile mantenere il volume dell iniezione allo stesso volume della percentuale rispetto alla colonna particolarmente importante se il solvente di iniezione pi forte pi eluotropico rispetto alla fase mobile iniziale e ogni aumento influenzer la separazione in particolare per quanto riguarda picchi di esecuzione preventivi fattore di rite
53. ari a 8 nm riduce l intervallo di linearit rispetto a una fenditura di 4 nm e pertanto importante che un metodo convalidato utilizzi sempre la larghezza di fenditura utilizzata per la 66 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity 3 convalida Per una risoluzione spettrale ottimale 1 nm l impostazione migliore Ci permette la risoluzione della struttura fine per esempio nel caso dello spettro del benzene vedere Figura 24 pagina 67 Pochissimi sono i com posti che presentano dettagli cos fini negli spettri in soluzione Il livello di luce sar inferiore e quindi il segnale presenter maggiore rumore il livello di rumore dipende dalla lunghezza d onda e dai solventi utilizzati nella fase mobile Norm 35 so 25 20 15 10 Figura 24 Benzene con ampiezza della fenditura di 1 e 4 nm principio Il volume di iniezione e il solvente utilizzato per dissolvere il campione sono importanti nel controllo della dispersione necessario prestare attenzione a concentrare i composti in testa alla colonna per evitare la dispersione dei pic chi causata dall iniezione che si traduce in una riduzione dell altezza dei pic chi A tale scopo necessario dissolvere il campione in un solvente la cui composizione presenta una capacit di eluizione inferiore rispetto alla fase mobile Una possibilit consiste nell aumentare il volume d
54. asale dove le prestazioni di miscelazione e la linea di basa UV dipendente possono essere significativa mente incrementate mediante l uso del miscelatore Agilent Jet Weaver installata una funzione di spurgo automatico 3 oltre alla possibilit di spur gare il filtro in linea 4 Ci consente di pulire il filtro e di prolungarne la durata Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 33 2 Sistema LC Agilent 1290 Infinity Descrizione del prodotto Autocampionatore Agilent 1290 Infinity L autocampionatore Agilent 1290 Infinity offre il consolidato schema Agilent per il convogliamento del flusso per l iniezione di volumi variabili e lo porta a nuovi livelli di prestazioni I nuovi materiali inerti della guarnizione del dispo sitivo di dosaggio e della sede dell ago consentono di ottenere un effetto memo ria estremamente basso Il ridotto volume idraulico del circuito idraulico adattato per gradienti pi veloci e la possibilit di utilizzare iniezioni sovrap poste e la funzione di riduzione automatica del volume di ritardo ADVR con tribuiscono a rendere i cicli pi rapidi e a erogare ancora pi velocemente il gradiente alla colonna Il sistema aspira esattamente il volume di soluzione del campione impostato senza sprechi e raggiunge un elevata riproducibilit su tutto l intervallo compreso tra quantit inferiori al microlitro a volumi mas simi di iniezione di 40 ul Il capillare di iniezione sta
55. assima flessibilit quando si tratta una variet di composti sco nosciuti In una situazione a elevata produttivit si dovrebbe valutare se sar sufficiente una gamma pi ristretta quando la gamma dei composti da analiz zare ridotta e questo non solo permetter di ridurre il tempo di analisi ma abbrevier anche il tempo di equilibratura tra le analisi Il tempo di ciclo composto da numerose parti Tempo di ciclo iniezione separazione equilibratura elaborazione dati Con un grande numero di campioni da trattare anche la pi piccola riduzione del tempo di ciclo pu portare a una grande riduzione nel tempo globale di completamento del lavoro Per questa ragione l elaborazione dati pu essere Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 55 3 56 Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity tenuta fuori linea per permettere al sistema di concentrarsi sull analisi dei campioni e sulla raccolta dei dati L iniezione pu essere ottimizzata per aumentare la velocit ricordando che un estrazione troppo rapida del campione pu ridurre la riproducibilit Su questo punto possono essere ottenuti risparmi marginali in quanto i volumi di campione usati tendono in ogni caso verso l estremit inferiore dell inter vallo Una parte significativa del tempo di iniezione il tempo impiegato dai movimenti dell ago dentro e fuori dalla fiala e nella porta di scarico Queste manipolazioni
56. ca del volume di ritardo Available Signals Segnali disponibili Balance Bilanciamento Bandwidth Ampiezza di banda Based on Basato su Baseline Correction Correzione della linea di base BinPump PompaBin C Calculate Calcola Calculation mode Modalit calcolo Calibration Calibrazione Cancel Annulla Change Solvent Composition Modifica composizione del solvente Change Cambia Check Method Sections to Edit Controlla le sezioni del metodo da modificare Chromatogram Output Uscita cromatogramma Clear all Cancella tutto Column Switching Valve Valvola di commutazione della colonna Combined Combinata Comment Osservazione Composition A Composizione A Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Composition B Composizione B Control Controllo Customized Data Analysis Macro Macro personalizzata per l analisi dei dati Cut Taglia D Data Acquisition Acquisizione di dati Data Analysis Analisi dei dati Delete Row Elimina riga Destination Destinazione Draw position Posizione di aspirazione Draw speed Velocit di aspirazione Duration Durata E Edit Entire Method Modifica tutto il metodo Edit Integration Events Modifica eventi di integrazione Edit Signal Plot Modifica diagramma del segnale Eject speed Velocit di emissione Enable overlapped injection Abilita iniezione sovrapposta Equilibration time Tempo di equilibrazione F File S
57. ccate dall utente aN L indicazione ATTENZIONE segnala situazioni che potrebbero potenzialmente causare lesioni gravi o mortali gt Prima di continuare a usare lo strumento verificare di aver compreso e attuato quanto indicato nell indicazione di attenzione L indicazione AVVERTENZA indica situazioni che possono causare una perdita di dati o danni allo strumento AVVERTENZA gt Non procedere oltre finch non stato compreso ed eseguito quanto indicato 120 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Appendice 6 Informazioni sui solventi Cella di flusso Per proteggere la funzionalit ottimale della cella di flusso e Evitare l uso di soluzioni alcaline pH gt 9 5 in grado di intaccare il quarzo e di alterare le propriet ottiche della cella di flusso Uso dei solventi Osservare le seguenti raccomandazioni sull uso dei solventi e Irecipienti di vetro scuro possono prevenire la proliferazione delle alghe e Evitare l utilizzo dei seguenti solventi che corrodono l acciaio Soluzioni di alogenuri di alcali e relativi acidi ad esempio ioduro di litio cloruro di potassio ecc Concentrazioni elevate di acidi inorganici come l acido solforico e nitrico specialmente ad alte temperature se il metodo cromatografico lo consente sostituirli con soluzioni tampone di acido fosforico o fosfati meno corrosivi per l acciaio inossidabile Solventi alogenati o misce
58. cita lasciando cos una certa tolleranza di deriva negativa Attenuation aumenta l assorbanza impostata fino all uscita completa Advanced Margin for Negative Absorbance Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Appendice 6 L impostazione predefinita 100 mAU che significa che il rivelatore ha un intervallo dinamico sufficiente tenendo in considerazione il punto in cui era stato impostato il livello zero per misurare questo valore verso il basso Per misurare picchi negativi pi ampi o per seguire una linea di base con una forte deriva negativa il valore va aggiustato verso il basso per impedire al segnale di appiattirsi sul fondo dell intervallo Tuttavia non va cambiato senza un buon motivo perch rendendolo pi negativo aumenter il rumore della linea di base e si ridurr l intervallo disponibile per la misurazione dei picchi positivi Advanced Slit La fenditura all ingresso dello spettrografo controlla la risoluzione spettrale e influenza il rumore della linea basale e la sensibilit L impostazione pre definita di 4 nm adatta alla maggioranza delle applicazioni Vedere Otte nere una sensibilit maggiore pagina 61 per ulteriori informazioni su questo parametro Advanced Autobalance imposta su zero il livello di assorbanza a tutte le lun ghezze d onda ossia bilancia tutti i punti dello spettro su zero e quindi azzera anche il segnale della linea di base Prerun
59. colonna stessa Usare solo solventi di alta qualit grado cromatografico Prima dell uso filtrare tutte le soluzioni tampone acquose e tutti i campioni attraverso un appropriato filtro da 0 2 um 4 Le bottiglie della soluzione tampone della fase mobile vanno sostituite ogni giorno o a giorni alterni Non aggiungere fase mobile alla bottiglia usare sempre una bottiglia nuova 5 Nonutilizzare una fase mobile a base di soluzione tampone altamente salina gt 50 mM insieme a concentrazioni elevate di acetonitrile perch potrebbe formarsi del precipitato 6 Con fasi mobili a base di soluzioni tampone altamente concentrate utiliz zare l opzione di lavaggio delle tenute Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity 3 7 Siraccomanda l uso di un filtro in linea filtro in linea 1290 Infinity diame tro 2 mm codice 5067 4638 per intrappolare i particolari e prolungare la durata della colonna 8 Cambiare il filtro quando la pressione aumenta del 10 Spurgare le pompe i collegamenti fino alla colonna da tutte le fasi mobili a base di soluzioni tampone e farvi fluire 5 ml di solvente prima di collegare la colonna allo strumento 10 Risciacquare la colonna con una fase mobile compatibile iniziando lenta mente a 0 1 ml min per una colonna con diametro interno di 2 1 mm a 0 2 ml min per una colonna con diametro interno di 3 0 mm e a 0 4 ml min per
60. dalit di raccolta degli spettri con le opzioni elen cate di seguito Nessuno nessuno spettro memorizzato Apice Linee di base vengono rilevati 3 spettri all inizio all apice e alla fine del picco Apice Pendenze Linee di base vengono rilevati 5 spettri all inizio alla pendenza ascendente all apice alla pendenza discendente e alla fine del picco Tutto nel picco vengono memorizzati tutti gli spettri disponibili in un picco Tuttivengono memorizzati tutti gli spettri dell analisi Ogni 2 spettri vengono archiviati solo gli spettri alternati acquisiti durante l analisi Range gli spettri possono essere salvati per tutta la gamma coperta dal rivelatore da 190 nm a 640 nm o qualsiasi gamma ridotta ritenuta appropriata dall utente Ci riduce la quantit di dati da memorizzare Step controlla l intervallo nm dei dati memorizzati in uno spettro e quindi influenza la risoluzione spettrale osservata L impostazione pre definita di 2 nm una buona scelta per la maggioranza delle applica zioni Threshold stabilisce che non vengono memorizzati spettri per altezze di picco inferiori a questo valore MAU Advanced Analog Output Il rivelatore 1290 Infinity ha un connettore di uscita del segnale analogico da usare con i sistemi di dati che non accettano un segnale digitale in ingresso Si possono inserire le impostazioni sotto elencate Zero Offset pone il livello zero a una percentuale stabilita del segnale in us
61. del segnale 65 lunghezza d onda e larghezza di banda ottimizzazione 63 M metodo esecuzione pi rapida 108 impostazione 105 modifica tutto il metodo 123 predefinito 123 singola iniezione 107 0 ostruzione della colonna 72 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity linee guida per l uso 72 ottimizzazione come ottenere una maggiore produttivit 55 condizioni di HPLC 12 larghezza della fenditura 66 lunghezza d onda e larghezza di banda 63 prevenzione delle ostruzioni della colonna 72 raggiungimento effetto memoria ridotto 70 raggiungimento risoluzione maggiore 58 raggiungimento sensibilit maggiore 61 sensibilit del rivelatore 63 separazione cromatografica 12 utilizzo della colonna 61 volume del miscelatore della pompa 61 volumi di iniezione 53 P parametri del metodo 103 particelle inferiori a 2 micron 15 piatti teorici 12 Pompa binaria descrizione 28 rapporto specifiche 114 riduzione del volume di ritardo automatica 70 riscaldamento per attrito 19 risoluzione 12 18 Ottimizzazione 58 Rivelatore a serie di diodi descrizione 38 rivelatore ottenimento di una maggiore sensibilit 63 S segnale integrazione 112 sensibilit ottimizzazione 61 sicurezza informazioni generali 118 simboli 120 Sistema LC Agilent 1290 Infinity componenti del sistema 28 intervallo di potenza 24 nuove caratteristiche 24 sistema accensione 97 solventi
62. della linea di base e a semplicit d uso grazie al design innovativo della cella L autocampionatore offre il consolidato schema Agilent per il convogliamento del flusso per l iniezione di volumi variabili con basso effetto memoria adat tato alle pressioni pi elevate applicazioni di volumi minori Un modulo del tutto nuovo il Flexible Cube pu essere aggiunto all autocampionatore per disporre dell iniezione a ciclo fisso ottenendo il volume di ritardo pi basso in assoluto e altre migliorie come lo spurgo della sede dell ago Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 27 2 Sistema LC Agilent 1290 Infinity Descrizione del prodotto Componenti del sistema Componenti del sistema Pompa binaria Agilent 1290 Infinity La Pompa binaria Agilent 1290 Infinity dotata di una nuova tecnologia per superare i problemi di pompaggio di solventi per LC a pressione ultra elevata e a velocit di flusso alte pistoni guidati da motori con alta capacit di carico nuovi materiali per i pistoni stessi non solo per sopportare il carico di lavoro ma anche per trasferire attivamente il calore dalle guarnizioni scambiatori di calore microfluidici e il Jet Weaver un miscelatore microfluidico La pompa in grado di erogare il flusso nell intervallo 0 05 5 mL min a pressioni fino a 1200 bar Il modulo della Pompa binaria Agilent 1290 Infinity contiene due pompe iden tiche ad alta pressione 1200 bar un degassatore
63. di banda specifiche La lunghezza d onda indica il centro della banda di rivelazione e La larghezza di banda definisce l intervallo di lunghezze d onda sul quale viene calcolata la media dei valori di assorbanza per produrre il risultato in corrispondenza di ogni istante Per esempio un segnale alla lunghezza d onda di 250 nm con una larghezza di banda pari a 16 nm la media dei dati di assorbanza da 242 nm a 258 nm Inoltre per ogni segnale possono essere definite una lunghezza d onda di rife rimento e una larghezza di banda di riferimento L assorbanza media dalla lar ghezza di banda di riferimento centrata sulla lunghezza d onda di riferimento viene sottratta dal valore equivalente alla lunghezza d onda del segnale per produrre il cromatogramma risultante La lunghezza d onda e la larghezza di banda del segnale possono essere scelte in modo che siano ottimizzate per Rivelazione universale a banda larga Rivelazione selettiva a banda stretta Sensibilit per un analita specifico La rivelazione a banda larga o universale si basa sull utilizzo di un ampia lar ghezza di banda per rivelare ogni specie che assorbe in tale intervallo Per esempio per rivelare tutte le molecole che assorbono tra 200 nm e 300 nm impostare un segnale a 250 nm con una larghezza di banda pari a 100 nm Lo svantaggio che la sensibilit non sar ottimale per nessuna di tali molecole La rivelazione a banda stretta o selettiva utilizzata con
64. di efficienza deriva in larga misura dalla riduzione dei percorsi di flusso multipli grazie alle minori dimensioni delle particelle fattore che comporta un valore minore della costante A diffusione vorticosa Inoltre particelle pi piccole impli cano tempi di trasferimento di massa pi brevi riducendo il termine C e si pu rilevare come l effetto globale sia una perdita di efficienza molto ridotta man mano che la velocit di flusso aumenta la pendenza della retta diminui sce Ci significa che la separazione su particelle di dimensioni inferiori pu essere ulteriormente accelerata aumentando le velocit di flusso senza ridurre significativamente l efficienza 0 0045 0 0040 0 0035 0 0030 0 0025 5 0 um 0 0020 HETP cm piastra 0 0015 3 5 pm 0 0010 0 0005 1 8 ym I 0 0000 t 2 ml min 5 0 ml min 0 0005 0 0 0 2 0 4 0 6 0 8 1 0 1 2 1 4 1 6 Velocit interstiziale line re p cm sec Figura 2 Curva di Van Deemter per particelle di diverse dimensioni Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 11 1 Introduzione alla cromatografia liquida a prestazioni ultra elevate UHPLC Una separazione cromatografica pu essere ottimizzata in base a parametri fisici della colonna di HPLC quali dimensione delle particelle dimensione dei pori morfologia delle particelle lunghezza e diametro della colonna velocit del solvente e temperatu
65. e e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Appendice 6 Impostazione di un metodo con la funzione Edit Entire Method Curve relative allo strumento Instrument Curves Instrument 2 Select curves to overlay Instrument Data Curves Figura 46 Schermata Curve relative allo strumento Le caselle di spunta della scheda Instrument Curves consentono a questi para metri registrati di essere sovrapposti in forma grafica sul cromatogramma Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 147 6 Appendice Lista di controllo del tempo di analisi La schermata della Run Time Checklist pu anche essere raggiunta direttamente dal menu Metodo gt Lista di controllo del tempo di analisi o facendo clic sull icona Run Time Checklist sulla parte alta della schermata Run Mme Checklist Instrument 2 Check Method Sections to Run Data Acquisition Standard Data Analysis C Customized Data Analysis Macro C Save GLP Data C Post Run Command Macro C Save Method with Data Figura 47 Schermata Lista di controllo del tempo di analisi La Run Time Checklist permette di scegliere se il metodo deve prevedere sia l acquisizione dei dati che la loro analisi e offre anche l opportunit di colle gare comandi o programmi macro in diversi punti del flusso di lavoro Nella maggior parte dei casi le caselle Data Acquisition e Standard Data Analysis sono spuntate Se l analisi dei dati no
66. e e la creazione del rapporto costituiscono la parte relativa all analisi dei dati del metodo I parametri di integrazione e la tabella di calibrazione sono di semplice impostazione una volta acquisiti i dati i quali possono essere ricontrollati nella finestra Analisi dei dati Gli eventi di integrazione possono essere ottimizzati in quel momento e spesso si usano le impostazioni predefinite per le analisi iniziali di acquisizione Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 143 6 Appendice La schermata Edit Integration Events caratterizzata da due tabelle e Initial Events For All Signals contiene gli eventi parametri di integrazione che si applicano a tutti i segnali acquisiti con il metodo Specific Events For Signal contiene gli eventi che sono specifici per un tipo di rivelatore o specifici per diversi segnali dallo stesso rivelatore In questa tabella i parametri principali sono quelli sotto elencati Slope Sensitivity rappresenta la pendenza e la curvatura della linea di base necessarie per marcare l inizio e la fine di un picco Peak Width vanno inseriti i valori dell ampiezza a met altezza del picco di interesse pi stretto Questo serve all integratore per distinguere tra rumore e picchi molto piccoli Area Reject Height Reject valori che controllano l eliminazione dai risul tati dei picchi la cui area o altezza ricade all interno di questi valori Integration OFF ON sopprime
67. e l effettuazione di sequenze comprendenti centinaia di iniezioni se non migliaia per completare una lotto di lavoro In queste situa zioni altamente desiderabile minimizzare i tempi di ciclo in quanto pochi secondi risparmiati per ogni iniezione riducono in modo significativamente utile il tempo globale necessario per completare il lavoro I punti chiave per ottenere tempi di ciclo rapidi e operazioni ad alta produttivit sono e Uso di separazioni rapide e Sovrapposizione delle iniezioni e Riduzione al minimo del tempo di equilibratura e Rigenerazione alternata delle colonne Il primo passo per ottenere un alta produttivit assicurare che i metodi usati abbiano tempi di ciclo brevi cio siano metodi cromatografici rapidi L uso di colonne brevi con impaccamento di particelle delle dimensioni di 1 8 um ideale per questo scopo a causa dell elevata efficienza disponibile in una colonna breve Se i metodi implicano una separazione isocratica questo per mette tempi di ciclo pi rapidi in quanto non richiesta alcuna equilibratura di colonna tra le analisi Tuttavia spesso vengono impiegati metodi gradiente a causa della diversit o della complessit dei campioni Nello sviluppo del metodo l intervallo del gradiente dovrebbe essere mantenuto al valore minimo necessario per ottenere la separazione In molti sistemi ad accesso aperto vengono usati gradienti che vanno dal 5 al 95 di solvente organico per ottenere la m
68. e per consultare le iniezioni precedenti Le scale degli assi X e Y possono essere regolate con i pul santi su gi situati su ogni asse Il pulsante Adjust nella finestra Online Plot sposta il punto attualmente presente sul segnale selezionato facendolo coincidere con lo zero Il segnale selezionato indicato dal colore dei contrassegni dell asse Y Un particolare segnale pu essere selezionato facendo clic sul segnale o sulla relativa descrizione nella parte alta del diagramma Il pulsante Balance quando premuto azzera tutti i rivelatori cambiamenti introdotti nella pagina Online Plot non hanno alcun effetto sui dati archiviati nei singoli file dei dati Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 101 5 Guida introduttiva Spurgo della pompa Effettuare un ciclo di spurgo della pompa se stato eseguito per la prima volta l adescamento della pompa e la pompa deve essere spurgata con solvente fresco prima di usare il sistema o quando si deve cambiare tipo di solvente e la pompa rimasta inattiva per poche ore o pi pu essersi diffusa aria nelle linee dei solventi e si raccomanda lo spurgo e i serbatoi dei solventi sono stati riempiti e la pompa deve essere spurgata per riempire il sistema con solvente fresco si devono usare solventi diversi accertandosi che il nuovo solvente sia miscibile con il solvente precedente se necessario inserire un passaggio intermedio con un solvente co
69. ei dati si interrompa prima del termine dell analisi definito nella pompa Ci pu verificarsi nel caso in cui al termine del gra diente stata impostata una rampa di equilibrazione del gradiente Ad esempio la B pu aumentare fino al 95 a 10 min e ci si aspetta che tutti i picchi siano eluiti dalla colonna quindi l analisi essenzialmente termi nata ma si aggiunge un gradiente in pi che riporta B al valore iniziale nell arco di due minuti per iniziare gradualmente la riequilibrazione della colonna Durante questa rampa verso il basso non ci si attendono valori utili quindi il Tempo finale del rivelatore impostato su 10 min e la raccolta dei dati interrotta mentre il Tempo finale della pompa pari a 12 min per consentire il completamento della rampa verso il basso Questa una scelta dell utente e in alcuni casi si accetta che i minuti finali del cromatogramma possano non contenere informazioni utili ma vengono registrati comunque per evitare l inconveniente di avere un Tempo finale diverso per il rivela tore Il Tempo finale del rivelatore non si sovrappone a quello della pompa e determina l interruzione dell analisi tanto quanto lo farebbe un Tempo finale anticipato di qualsiasi altro modulo da qui la praticit di impostare il Tempo finale su As Pump e Timetable funziona nello stesso modo degli altri moduli ossia si aggiunge una riga si seleziona la funzione da cambiare e si inseriscono i nuovi valori per quella funzi
70. ementare la temperatura esaminare gli spettri dei picchi e selezionare l appropriata rivelazione di banda stretta Per maggiori informazioni sull ottimizzazione fare riferimento a Ottimizzazi one del sistema LC Agilent 1290 Infinity pagina 41 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 109 5 Guida introduttiva f si dei dati Analisi dei dati In ChemStation un metodo contiene tutti i parametri per l acquisizione dei dati per il controllo del sistema e per l analisi dei dati per l elaborazione dei dati per fornire risultati quantitativi e qualitativi Questa sezione dedicata brevemente all integrazione e ai rapporti nell analisi dei dati per consentire di integrare e stampare le separazioni generate seguendo la procedura descritta precedentemente in questo capitolo Per maggiori informazioni sull analisi dei dati compreso l uso della calibrazione per la quantificazione fare riferimento al manuale ChemStation J Mstrument 2 offline Data Analysis Fonte del metodo E GI C CHEMIZIZIDATA SE DEMO I 08 07 2009 18 40 53 rob 08 07 2009 18 45 06 Rob BATCH e amp icomo Tavola di ni sasomw _ _ ci S Calibration Signal N Purity _ Attivit di integraziqn pis e R Shot E e gt FEAT E GB PHENONES _
71. ende una descrizione del metodo in forma di testo Instrument Acquisition comprende parametri dell iniettore parametri della pompa parametri del forno parametri del rivelatore e curve dello strumento Data Analysis comprende dettagli del segnale parametri di integrazione e parametri del rapporto Run Time Checklist comprende le parti del metodo che verranno eseguite Durante Edit Entire Method facendo clic su OK si chiude la schermata corrente per l immissione dei valori e si passa alla schermata successiva un processo a senso unico Se si preme inavvertitamente 0K prima di aver immesso tutti i valori necessario utilizzare il tasto Cancel e ricominciare la procedura da Edit Entire Method In alternativa proseguire e tornare alla schermata non completata una volta terminato Facendo clic su Cancel si possono saltare Skip le schermate rimanenti Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Appendice 6 Impostazione di un metodo con la funzione Edit Entire Method Informazioni sul metodo La schermata Method Information pu anche essere raggiunta direttamente dal menu Metodo gt Informazioni sul metodo o facendo clic con il pulsante destro del mouse sull interfaccia utente grafica Questa scheda permette di inserire informazioni sul metodo Queste informa zioni compariranno sopra il diagramma del sistema nella schermata Method and Run Control ogni volta che il metodo viene caricato
72. ent 1290 Infi nity 1 Introduzione alla cromatografia liquida a prestazioni ultra elevate UHPLC Nel presente capitolo viene fornita un introduzione al sistema LC Agilent 1290 Infinity e ai principi su cui esso si basa 2 Sistema LC Agilent 1290 Infinity Descrizione del prodotto Nel presente capitolo sono presentate le caratteristiche del sistema LC 1290 Infinity 3 Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity Il presente capitolo mostra come applicare la teoria e utilizzare le caratteristi che del sistema LC per sviluppare separazioni ottimizzate 4 Configurazione e installazione del sistema Il presente capitolo riporta informazioni su installazione del software confi gurazioni dello stack e preparazione del sistema per l utilizzo 5 Guida introduttiva Nel presente capitolo vengono fornite informazioni sull acquisizione e sull ana lisi dei dati con il sistema LC Agilent 1290 Infinity 6 Appendice Nel presente capitolo vengono fornite ulteriori informazioni di natura legale sulla sicurezza e sull impostazione di un metodo Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 3 Sommario Sommario Introduzione alla cromatografia liquida a prestazioni ultra elevate UHPLC 7 Teoria dell impiego di particelle pi piccole nella cromatografia liquida 8 Vantaggi delle colonne impaccate con particelle inferiori a 2 micron 15 Riscaldamento per attrito 19 Sistema LC Agilent 1290 Infinity D
73. ente deve interrompere manualmente l analisi Anche se tutti i moduli del sistema hanno propri parametri di Tempo finale quello della pompa viene considerato il principale e quindi gli altri moduli in genere verranno impostati in base a questo valore e PostTime definisce un periodo di conto alla rovescia dopo il termine dell analisi durante il quale viene inibita l esecuzione dell iniezione succes siva D al sistema il tempo necessario per riequilibrarsi dopo un analisi in gradiente Per un metodo isocratico pu essere impostato su Off Per un metodo in gradiente il valore pu essere determinato sperimentalmente osservando il comportamento della linea di base ma tipicamente sar dato dal tempo del volume di ritardo del sistema sommato ad almeno l equiva lente di tre cinque volumi di colonna da far fluire attraverso il sistema Pressure Limits controlla il comportamento della pompa in termini di pres sione Con la pompa 1290 Infinity la pressione massima 1200 bar ma alcune colonne possono sopportare solo pressioni inferiori e impostando qui questo valore la colonna sar protetta La pompa generer una condi zione di errore se la pressione viene raggiunta e quindi tutte le analisi in corso verranno fermate e la pompa verr commutata in modalit di attesa senza flusso Le informazioni sulla pressione massima di una particolare colonna sono fornite insieme alla colonna Le colonne Agilent ZORBAX RRHD sono adatte per operare a 12
74. erivanti dalla cromatografia rapida o ad alta risoluzione Il sistema LC Agilent 1290 Infinity rappresenta una pietra miliare nell ambito dell UHPLC poich il primo sistema che pu includere completamente e spa ziare su tutte le pi diverse gamme di prestazioni offerte dai sistemi UHPLC preesistenti sul mercato Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 9 1 10 Introduzione alla cromatografia liquida a prestazioni ultra elevate UHPLC Teoria Nell HPLC l efficienza di separazione pu essere descritta grazie all equazione di van Deemter Figura 1 pagina 10 Questa deriva dal modello dell altezza dei piatti teorici usato per misurare la dispersione degli analiti durante la loro discesa attraverso la colonna H indica l altezza equivalente a un piatto teorico talvolta HETP dp indica le dimensioni delle particelle del materiale di impaccamento della colonna ug la velocit lineare della fase mobile e A B e C sono costanti relative alle diverse forze di dispersione La costante A indica la diffusione vorticosa o i percorsi di flusso multipli attraverso la colonna B indica la diffusione molecolare lungo l asse longitudinale della colonna C indica il trasferimento di massa dell analita tra le fasi mobile e stazionaria La separazione tanto pi efficiente quanto pi basso il valore di H Gli effetti di ogni singolo termine e dell equazione combinata sono mostrati nella Figura 1 pagina 10
75. escrizione del prodotto 23 Nuove caratteristiche del sistema LC Agilent 1290 Infinity 24 Componenti del sistema 28 Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity 41 Volume di ritardo e volume extra colonna 42 Configurazione del volume di ritardo ottimale 44 Come ottenere volumi di iniezione maggiori 53 Come ottenere una maggiore produttivit 55 Come ottenere una maggiore risoluzione 58 Come ottenere una maggiore sensibilit 61 Come ridurre al minimo l effetto memoria 70 Come prevenire ostruzioni della colonna 72 Configurazione e installazione del sistema 75 Installazione del software 76 Installazione del modulo 78 Guida introduttiva 95 Informazioni sulla guida introduttiva 96 Preparazione del sistema 97 Acquisizione dei dati nella schermata Metodo e controllo analisi 103 Analisi dei dati 110 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Sommario 6 Appendice 117 Informazioni per la sicurezza 118 Informazioni sui solventi 121 Agilent Technologies su Internet 122 Impostazione di un metodo con la funzione Edit Entire Method 123 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Sommario 6 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 000 Qdoe 1 Introduzione alla cromatografia liquida o 9 a prestazioni ultra elevate UHPLC Teoria del
76. essere dotato di setto e dovrebbe contenere un solvente adatto al lavaggio del cam pione dall ago Il setto non viene utilizzato per evitare di eliminare la contami nazione dall ago a valle solo per riapplicarlo nella corsa ascendente Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity 3 possibile immergere l ago nel vial pi volte In questo modo verr rimossa una piccola quantit di effetto memoria ma per un lavaggio pi efficace dell esterno dell ago necessario utilizzare la porta di lavaggio La porta di lavaggio posizionata sopra e dietro alla sede dell ago e il solvente di lavaggio viene erogato dalla pompa peristaltica Possiede un volume di 0 68 ml e la pompa peristaltica fornisce 6 ml min che indica che il volume della porta di lavaggio viene riempito completamente con solvente fresco in 7 s Se selezionata la porta di lavaggio l utente pu impostare la durata di tempo di lavaggio dell esterno dell ago con solvente fresco Pu variare da due o tre secondi in situazioni normali in cui l effetto memoria non un problema a 10 20 s se si desidera un lavaggio pi completo consigliato eseguire sem pre il lavaggio dell esterno dell ago nella porta di lavaggio per evitare di conta minare la sede dell ago In tal caso sar necessario sottoporlo a backflush modificando manualmente i collegamenti di flusso per pulirlo Questa una delle
77. et Weaver nella Pompa binaria 1290 Infinity 1 Rimuovere i collegamenti dei capillari dal Jet Weaver 2 Svitare le viti esagonali che fissano Jet Weaver alla sede della pompa NOTA Il Jet Weaver ha un orientamento fronte retro con volumi interni diversi 35 100 pl ottimizzati per un volume di ritardo basso o per le migliori prestazioni di miscelazione 4 L ingresso nella parte inferiore del Jet Weaver collegato alla porta centrale della valvola della pompa da un capillare lunghezza 300 mm 0 17 mm dii L uscita sul lato superiore collegata all autocampionatore 50 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity Installazione di Jet Weaver V380 nella Pompa quaternaria 1290 Infinity 3 1 Svitare la vite del coperchio metallico del Jet Weaver 3 Inserire il Jet Weaver nell apertura sul pannello anteriore 1 e spingerlo verso il basso 2 2 Rimuovere il coperchio metallico sollevandolo 1 ed estraendolo dal pannello anteriore 2 4 Montare entrambi i capillari di collegamento al Jet Weaver nell orientamento corretto AS Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 51 3 Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity 5 Collegare il capillare d ingresso del Jet Weaver alla porta 2 della valvola multiuso Collegare il c
78. etting Impostazione file Filename Nome del file Flow Flusso Flush Port Porta di lavaggio Height Reject Scarto altezza Hip_ALS Injector Program Iniettore Hip_ALS HiP ALS Injector Program programma dell iniettore di HiP ALS itial Events For All Signals Eventi iniziali per tutti i segnali jection Mode Modalit di iniezione jection Valve Cleaning Pulizia della valvola di iniezione njection volume Volume di iniezione jection with needle wash Iniezione con lavaggio dell ago pen jector Cleaning Pulizia dell iniettore nstrument Curves Curve relative allo strumento nstrument Acquisition Strumento Acquisizione nstruments Strumenti ntegrate Integra Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Glossario IU Integration OFF ON Integrazione ATTIVA DISATTIVA L Launch online Lancia in linea Load Method Carica metodo Location Posizione M ethod Metodo Method and Run Control Metodo e controllo analisi Method History Cronologia del metodo Method Information Informazioni sul metodo Method Metodo Mode Modalit N Needle Wash Lavaggio ago No Limit Nessun limite No Limit Off Nessun limite Spento 0 Off Spento Online Plot Diagramma in linea 151 Glossario IU P parameter parametro Parameter Mismatch Accoppiamento errato dei parametri Paste Incolla Peak Width Ampiezza del picco Peakwidth Ampiezza
79. grammabile che pu fornire una risoluzione spettrale da 1 a 8 nm In genere questa opera a met dell intervallo ma per ottimizzare il metodo pu essere ristretta fino a 1 nm per risoluzioni spettrali elevate rara mente necessarie negli spettri UV delle fasi liquide o aperta fino a 8 nm per ottenere la massima trasmissione della luce e il minino rumore nel segnale I segnali cromatografici sono estratti dai dati della serie di diodi all interno del firmware del modulo Possono essere definiti fino a 8 segnali singoli ciascuno comprendente una lunghezza d onda del segnale una larghezza di banda dei diodi raggruppati e se necessario una lunghezza d onda e una larghezza di banda di riferimento L invio in uscita dei segnali pu arrivare a 160 Hz 160 punti dati secondo per la registrazione accurata dei picchi cromatografici pi rapidi i pi stretti Contemporaneamente il modulo pu anche inviare in uscita gli spettri dell intervallo completo al sistema di dati alla stessa fre quenza di 160 Hz Per i laboratori certificati importante che tutti i parametri del metodo ven gano registrati La fonte luminosa del DAD di 1290 Infinity non solo registra i valori di regolazione dello strumento ma dotata di tag RFID tag di identifi cazione della radiofrequenza integrati nella lampada e nella cartuccia della cella di flusso cosicch il sistema registra l identit e le variabili di questi importanti componenti Manuale e guida di
80. heda dell autocampionatore ad alte presta zioni Injection Mode Injection volume imposta il volume da iniettare ad esempio 3 ul Standard injection indica che non viene eseguito il lavaggio esterno dell ago Injection with needle wash si usa per ridurre il potenziale effetto memoria Questa opzione raccomandata e viene configurata nella scheda succes siva e Needle Wash se questa funzione stata selezionata sopra Mode stabilisce la modalit di lavaggio della parte esterna dell ago o atti vamente in Flush Port o per immersione in una Wash Vial specificata 127 6 128 Appendice Time in secondi durante il quale la pompa peristaltica collegata alla porta di lavaggio pomper il solvente di risciacquo Esso verr pompato per altri 15 s per pulire la porta di lavaggio Location determina quale fiala o piastra a pozzetti verr usata nel caso in cui sia stata selezionata Wash Vial Le fiale devono essere prive di setto ossia devono essere aperte per evitare il trasferimento di materiale sul setto con conseguente effetto memoria Repeat nel caso in cui sia stata selezionata la funzione Fiala di lavaggio stabilisce quante volte l ago viene immerso nella fiala predefinito 3 massimo 5 Stop Time Post Time vengono impostati su No Limit Off e questi valori ven gono riportati nella scheda della pompa Advanced Auxiliary Draw speed la velocit con cui il campione viene spinto nell
81. hermo Si pu scegliere se selezionare alcuni o tutti i segnali acquisiti del rivelatore perch vengano elaborati Se non vengono rile vati segnali la tabella vuota In questa situazione ChemStation per imposta zione predefinita elaborer tutti i segnali acquisiti del rivelatore A volte l utente potrebbe modificare un metodo esistente per creare un nuovo metodo e incappa in un errore di Parameter Mismatch quando tenta di attivare il metodo In pratica nel vecchio metodo i Signal Details contenevano un segnale specificato ad esempio 250 nm con ampiezza di banda di 8 nm e que sto valore nel nuovo metodo stato cambiato ad esempio in 254 nm 12 nm La tabella Signal Details contiene ancora i dettagli precedenti e il processo le sta indicando un segnale che non viene pi acquisito Evidenziare il segnale pre cedente all interno della tabella e usando il pulsante Delete Row il problema verr corretto Se un sistema utilizza rivelatori multipli come il rivelatore a serie di diodi e uno spettrometro di massa le righe Signal Description permettono di inserire i tempi di ritardo per il rivelatore a valle del flusso cos il software pu alli neare picchi da diversi rivelatori Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 141 6 Appendice Impostazione di un metodo con la funzione Edit Entire Method Signal Details Instrument 2 Available Signals DADI A Sig 250 100 Ref off Add to Method Insert
82. i colonne aggiuntive per diverse appli cazioni Quindi la colonna da usare diviene un semplice parametro del metodo Ci richiede due teste di valvola a 8 posizioni 9 porte una per cia scuno dei due TCC I TCC a cluster sono rappresentati dal software nella forma di una unit con una interfaccia per facilitare le operazioni Altri miglioramenti rispetto ai modelli precedenti sono il migliore isolamento termico migliori guide dei capillari e un sensore di sportello aperto che per mette ai metodi di stabilire che lo sportello deve essere chiuso particolar mente utile per i metodi a temperature basse o alte Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 37 2 Specchio Sistema LC Agilent 1290 Infinity Descrizione del prodotto Rivelatore a serie di diodi 1290 Infinity Il nuovo modello ottico del Rivelatore a serie di diodi 1290 Infinity utilizza una cella a cartuccia con tecnologia delle guide d onda ottiche a fluido e offre un elevata sensibilit un intervallo lineare ampio e una linea di base molto stabile per le applicazioni LC standard e ultra rapide La cella a cartuccia Agi lent Max Light aumenta drasticamente la trasmissione della luce grazie al principio della riflessione interna totale lungo un capillare di silice fusa non rivestito raggiungendo un nuovo livello di sensibilit senza sacrificare la riso luzione mediante gli effetti di dispersione del volume della cella Questo
83. i costi 5 830 Tempo 10 giorni 2 5 giorni solventi 27 1 smaltimento 2 1 mano d opera 30 h 2 24oreal giorno Il calcolatore del risparmio Agilent fornisce un metodo semplice per calcolare il risparmio dei costi grazie al passaggio dall HPLC convenzionale all UHPLC che utilizza colonne con particelle di dimensioni pari a 1 8 um Questo calcola tore disponibile sul sito web di Agilent Technologies insieme a un calcolatore di trasferimento del metodo www chem agilent com I risultati sono presen tati sia in forma grafica che in tabella Analisi di durata pi breve forniscono anche risposte pi rapide Questo un fattore importante nel controllo della procedura e nei test a risposta rapida Invece di attendere ore per rilasciare un unico lotto di un farmaco l idoneit del sistema la sua calibrazione e l analisi dei campioni possono essere eseguiti complessivamente in meno di un ora Le risposte rapide sono importanti Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 15 16 1 Introduzione alla cromatografia liquida a prestazioni ultra elevate UHPLC Vantaggi delle colonne impaccate con particelle inferiori a 2 micron anche per gli operatori nella chimica di sintesi che utilizzano sistemi LC MS ad accesso aperto per la conferma del composto e il controllo della reazione Analisi di durata pi breve possono inoltre accelerare significativamente il processo di sviluppo del metodo
84. i iniezione per incrementare la concentrazione dell analita sulla colonna e quindi l altezza del picco Fare riferimento ai commenti in Come ottenere volumi di iniezione maggiori pagina 53 Ampiezza del picco tempo di risposta e velocit di campionamento dati L impostazione dell ampiezza del picco il tempo di risposta e la velocit di campionamento nel rivelatore sono interconnessi Le impostazioni disponibili sono riportate in importante impostarle correttamente per ottenere una sensibilit ottimale e mantenere la risoluzione ottenuta nella separazione Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 67 3 Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity Il rivelatore acquisisce internamente i punti dati pi rapidamente di quanto sia necessario per un cromatogramma e li elabora per produrre il segnale visto dal sistema di elaborazione dei dati Parte dell elaborazione riduce i dati a una velocit di campionamento adeguata che permette di tracciare accuratamente i picchi cromatografici Come accade con la maggior parte delle determina zioni analitiche in effetti viene calcolata la media di gruppi di letture per ridurre l errore nel risultato Il rivelatore raggruppa i punti dati grezzi e pro duce i dati del segnale in uscita alla velocit di campionamento richiesta tra mite un processo di filtraggio elettronico Se la velocit di campionamento risultante insufficiente filtraggio ecces
85. i sul pulsante radio Combined Quando combinate le impostazioni per il lato sinistro controllano entrambe le sezioni e ci si rende sicura mente necessario quando la lunghezza della colonna supera i 15 cm e neces sita di essere supportata da entrambe le sezioni I due lati possono operare separatamente quando necessario avare due colonne che funzionano a temperature diverse Questa funzione pu essere attivata quando instal 134 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Appendice 6 lata anche una valvola di commutazione Un altro uso di zone di tempera tura separate quando la colonna viene fatta funzionare a una temperatura elevata ad esempio superiore a 60 C da un lato mentre lo scambiatore di calore sull altro lato viene usato per raffreddare l eluente prima che entri nel rivelatore riducendo cos il rumore dovuto agli effetti termici nella cella di flusso Selezionando l opzione As Detector Cell verr automaticamente letta la temperatura della cella nel rivelatore 1290 Infinity La temperatura di ogni zona pu essere impostata da 5 C a 100 C ed compito dell utente verificare che quella colonna sia adatta per funzionare alla temperatura impostata La fasi StableBond per le colonne Agilent ZORBAX RRHD e RRHT possono essere usate all estremo superiore dell intervallo La temperatura controllata di 0 15 C fino a 10 C al di sotto della temperatura ambientale sebbene va sotto
86. iferimento predefinito 360 nm con una larghezza di banda pari a 100 nm Si utilizza una larghezza di banda ampia per ridurre il rumore nel segnale di riferimento secondo la teoria statistica l errore ossia in questo caso il rumore si riduce in misura proporzionale alla radice quadrata del numero di determinazioni importante che la larghezza di banda di riferimento non si estenda a una parte dello spettro caratterizzata da assorbanza poich ci ridurrebbe il segnale risultante cos come la sensibilit L utilizzo di una lunghezza d onda di riferi mento pu permettere di ridurre la deriva o variabilit nel cromatogramma associate alle variazioni dell indice di rifrazione causate da fluttuazioni della temperatura ambiente o che si verificano durante il funzionamento in gra diente L effetto di un segnale di riferimento pu essere valutato facilmente impostando due segnali altrimenti identici uno con e uno senza un segnale di riferimento Se nessuna regione dello spettro caratterizzata da assorbanza nulla preferibile disattivare il segnale di riferimento Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 65 3 Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity signal wavelength Anisic I Acid reference bandwidth 100 nm 30 nm reference bandwidth wavelength 350 nm 220 240 260 289 300 320 Wavelength nm Figura 23 Spettro dell acido anisico Larghezza della fenditura solo G42
87. il mantenimento dello strumento e test e operazioni diagnostiche periodici per verificare la correttezza delle prestazioni Agilent Lab Advisor fornisce anche avvisi e soluzioni per tutti gli errori strumentali che potrebbero insor gere Il software funziona con o senza i sistemi di dai Agilent Il software monitora lo stato del modulo LC e gli avvisi di manutenzione preventiva per verificare la necessit di aggior namento o sostituzione Inoltre il software rende automatici test utili Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Configurazione e installazione del sistema 4 Installazione del software e tenta di identificare strumenti a interfaccia LAN attivati da o collegati al proprio PC o rete di laboratorio e suggerisce automaticamente le parti da sostituire e le attivit per la risolu zione dei problemi pi frequenti dello strumento Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 77 4 Configurazione e installazione del sistema Installazione del modulo Per dettagli sulle procedure di installazione per i moduli fare riferimento ai manuali dei singoli moduli Questi manuali contengono anche informazioni su specifiche manutenzioni e parti Ottimizzazione della configurazione dello stack sistema LC binario Configurazione in stack unico Per garantire prestazioni ottimali installare i moduli del sistema binario LC Agilent 1290 Infinity nella seg
88. imento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Appendice 6 gono ricavati da altri valori di regolazione presenti in questa schermata Tuttavia alcuni utenti desiderano vedere un elenco completo nella tabella di programmazione e quindi inseriscono un valore per 0 00 min Questo non costituisce un problema tuttavia ogni volta che le condizioni iniziali vengono modificate le nuove impostazioni vanno inserite sia nella tabella di programmazione sia nella sezione della schermata relativa ai valori di rego lazione dei solventi Show timetable graph quando questa casella spuntata le variazioni appor tate alla tabella di programmazione vengono rappresentate graficamente Stop Time definisce il tempo globale della separazione o dell analisi e a volte indicato come Tempo di analisi da alcuni utenti Indica il momento in minuti a partire dall esecuzione dell iniezione in cui l analisi finisce ossia il momento in cui termina l acquisizione dei dati Il flusso la composizione e altre impostazioni del sistema ritorneranno ai valori iniziali per il metodo e il sistema diventa disponibile per eseguire l iniezione successiva Questo tempo deve sempre durare almeno quanto l ultimo valore immesso nella tabella di programmazione altrimenti l analisi si fermer e ritorner alle condizioni di partenza prima che vengano completati gli eventi previsti dalla tabella Il Stop Time pu essere impostato su No Limit in qual caso l ut
89. impostazioni per lo spurgo nella pagina di Control dai passaggi 1 e 2 rimangono configurate quindi quando nuovamente neces sario il processo di spurgo si pu riprendere dal passaggio 3 Quando la pompa stata inizialmente adescata e spurgata con propan 2 olo si possono cambiare i solventi con quelli della fase mobile come acqua e meta nolo La procedura di spurgo va ripetuta ogni qualvolta si cambi il solvente Subito dopo lo spurgo il solvente nella pompa non stato degassato e quindi si deve far funzionare il sistema per almeno 10 min in modo da degassare il solvente Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Configurazione e installazione del sistema 4 Collegamenti di flusso tra i moduli Quando si collegano i moduli lavare sempre con solvente tutti i capillari e la colonna prima di eseguire il collegamento con il componente successivo del percorso idraulico 1 Collegare l uscita dl miscelatore Jet Weaver all autocampionatore usando un capillare flessibile di acciaio inossidabile d i 0 12 mm il codice colore dell etichetta rosso Questo va collegato alla porta 1 sulla valvola di inie zione dell autocampionatore 2 Collegare un capillare flessibile di acciaio inossidabile d i 0 12 mm dalla porta 6 sulla valvola di iniezione dell autocampionatore al comparto colonna termostatato Collegare il capillare direttamente allo scambiatore di calore a bassa dispersione per il volume di ritardo
90. in colonne corte se si desidera una separa zione rapida a velocit di flusso aumentate L intervallo della velocit di flusso non solo consente di utilizzare i metodi tradizionali ma anche materiali di impaccamento porosi in superficie o pellicolari come per esempio le parti celle Poroshell a velocit di flusso elevate Di recente l interesse per questo tipo di materiali di impaccamento aumentato perch rappresentano un approccio alternativo ai materiali STM per separazioni a elevata efficienza L intervallo della velocit di flusso consente anche di scegliere la colonna di diametro pi adatto per la separazione partendo dai 2 mm per le applicazioni che necessitano di un flusso lento come richiesto da alcuni sistemi MS per arrivare ai 5 mm di diametro interno tipicamente 4 6 mm per la tradizionale LC o per aumentare la capacit di carico L intervallo della velocit di flusso convalidato anche da recenti risultati che dimostrano il vantaggio di usare velocit massime di flusso per aumentare l efficienza nelle separazioni in gra diente Fare riferimento a Petersson et al J Sep Sci 31 2346 2357 2008 Maximizing peak capacity and separation speed in liquid chromato graphy Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Sistema LC Agilent 1290 Infinity Descrizione del prodotto 2 Il nuovo rivelatore a serie di diodi offre nuovi livelli di sensibilit combinati a eccellenti caratteristiche
91. ione spettrometrica di massa o rivelazione con ultravio letto luce visibile e Possibilit di eseguire qualsiasi metodo trasferito da un altro sistema di HPLC analitica o UHPLC e Sofisticato controllo della pompa che permette di ottenere un rumore cro matografico e un rumore acustico molto bassi per risultati superiori e un ambiente di lavoro migliore e Sistema di degassaggio e valvola di spurgo automatica integrati nel modulo pompa e Autocampionatore a volume variabile con ridotto volume di ritardo effetto memoria minimo e opzione di funzionamento come autocampionatore a ciclo fisso Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Sistema LC Agilent 1290 Infinity Descrizione del prodotto 2 e Nuovo modulo Flexible Cube che aggiunge funzioni all autocampionatore come lo spurgo della sede dell ago e il funzionamento a ciclo fisso e Comparto colonna termostatato a fruibilit migliorata e soluzioni con val vole integrate con un intervallo di pressione fino a 1 200 bar 17 400 psi Rivelatore a serie di diodi con sensibilit notevolmente incrementata e sta bilit della linea di base che utilizza un sistema a cella a cartuccia con guide d onda ottiche a fluido Velocit di campionamento fino a 160 Hz con informazioni spettrali com plete e Nuova gamma di colonne ZORBAX RRHD con particelle inferiori a due micron per funzionamento a pressioni fino a 1200 bar e Miscelazione assisti
92. ioni pi rapide Il sistema LC Agilent 1290 Infinity e le colonne RRHD aumentano lo spazio di separazione disponibile e permettono di conse guire ulteriori vantaggi di questo tipo Le caratteristiche del sistema LC 1290 Infinity sono discusse nella sezione Sistema LC Agilent 1290 Infinity Descrizione del prodotto pagina 23 mentre la sezione Ottimizzazione del Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Introduzione alla cromatografia liquida a prestazioni ultra elevate UHPLC 1 Riscaldamento per attrito sistema LC Agilent 1290 Infinity pagina 41 illustra come applicare la teoria e utilizzare queste caratteristiche per sviluppare separazioni ottimizzate Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 21 1 22 Introduzione alla cromatografia liquida a prestazioni ultra elevate UHPLC Riscaldamento per attrito Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 000 Qdooe 2 Sistema LC Agilent 1290 Infinity e o Descrizione del prodotto Nuove caratteristiche del sistema LC Agilent 1290 Infinity 24 Componenti del sistema 28 Nel presente capitolo sono presentate le caratteristiche del sistema LC 1290 Infinity ig Agilent Technologies 23 2 Sistema LC Agilent 1290 Infinity Descrizione del prodotto Nuove caratteristiche del sistema
93. ista anteriore Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 81 4 Configurazione e installazione del sistema Installazione del modulo LAN a ChemStation LC Cavo del bus CAN per Instant Pilot Segnale analogico rivelatore opzionale KO LINA IXKKKII Cavo del bus CAN 0000009 H EBBSEBS J TE 10908 Cavo termico opzionale 20990090 E Alimentazione CA Figura 28 Configurazione in due stack consigliata per 1290 Infinity con pompa binaria vista posteriore 82 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Configurazione e installazione del sistema 4 Ottimizzazione della configurazione dello stack sistema LC quaternario Configurazione uno stack Per ottenere prestazioni ottimali installare i moduli del sistema LC quaterna rio Agilent 1290 Infinity nella configurazione descritta di seguito vedere la
94. istema LC Agilent 1290 Infinity Appendice 6 zione e non va usato se sul fondo della fiala sono presenti particolati che potrebbero bloccare l ago Advanced High Throughput Automatic delay volume reduction ADVR commuta la valvola di iniezione dalla posizione di mainpass a quella di bypass dopo l esecuzione dell inie zione e dopo che un volume definito dal fattore di eliminazione del cam pione stato fatto passare attraverso l iniettore Questo riduce il volume di ritardo del sistema di circa 70 ul e consente ai cambiamenti di gra diente di raggiungere prima la colonna Enable overlapped injection anche questa funzione commuta la valvola di iniezione dalla posizione di mainpass a quella di bypass dopo l esecu zione dell iniezione oppure dopo che il campione uscito dall iniettore o in uno specifico momento successivo dell analisi L iniettore aspirer quindi il campione successivo in preparazione dell iniezione successiva riducendo cos la durata complessiva del ciclo e aumentando il rendi mento sul campione Injection Valve Cleaning Injector Cleaning consente il lavaggio del sistema di iniezione con il sol vente Injection Valve Cleaning consente di commutare la valvola in momenti pre stabiliti durante l analisi per minimizzare l effetto memoria quando ven gono iniettati composti problematici Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 129 6 Appendice Impostazione di un met
95. itivity 5 2 0192 292 2 229 5 0 0189 11 030 0 509 Initial Peak Width 0 05 3 0279 267 5 239 1 0 0166 9 720 0 545 Initial Area Reject 5 4 0 349 246 16 8 0 0201 0 929 205 Initial Height Reject il 5 0 377 232 4 261 T 0144 8 771 0 702 Initial Shoulders DFF 6 0 422 239 296 0 0124 9 023 0 661 7 0 487 257 8 295 9 0 0132 5 730 0 749 8 0 601 397 3 JIA 0 0147 12 731 1 421 2 Fare clic sul icona Set Integration Events Table per aprire la tabella come mostrato Per le analisi del gradiente impostare Baseline Correction in Advanced 4 Impostare Slope Sensitivity su 50 Valori superiori integreranno i picchi pi ripidi e ignoreranno i picchi meno ripidi 5 Impostare il valore Peak Width sul picco di interesse pi stretto in questo caso circa 0 01 6 Per scartare i picchi pi bassi si possono impostare Area Reject e Height Reject 7 Fare clic sull icona Integrate per aggiornare i risultati in base a queste nuove impostazioni 112 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Guida introduttiva 5 Analisi dei i 8 Uscire dalla tabella degli eventi usando l icona con il segno di spunta verde vedere figura sotto cb Calibration Uul Signal III Purify la Spectrum Ju n wi Report Short A Er i5 E ONE MIX 010 0 a CES R a ly 4 J 4 Al yy fl si DADI A Sig 24 DADI A Sig 242 4 Ret360 1
96. itudinale di tempe ratura risultanti possono influenzare l efficienza della colonna Power F p dove F la velocit di flusso e p la pressione Una potente stabilizzazione termica della colonna per esempio mediante l uso di un bagno termostatato genera un forte gradiente radiale di temperatura che comporta una perdita significativa di efficienza della colonna La stabiliz zazione termica della colonna sfruttando l aria statica riduce il gradiente radiale di temperatura e quindi riduce le perdite di efficienza tuttavia va accettata una maggiore temperatura in uscita dalla colonna L aumento della temperatura pu influenzare la selettivit A valori minori di contropressione i cali di prestazione dovuti al riscaldamento per attrito risultano minimizzati tanto che le colonne di diametro interno pari a 4 6 o 3 mm con particelle infe riori a 2 micron presentano ancora efficienze superiori rispetto alle rispettive colonne di diametro interno pari a 2 1 mm Un esempio di trasferimento di un metodo in gradiente a una colonna STM di diametro interno pari a 2 1 mm in cui la separazione stata velocizzata mostrato nella Figura 9 pagina 20 L analisi iniziale sulla colonna da 2 1 mm era avvenuta a una velocit di flusso di 0 22 ml min generando una pressione di 380 bar a una temperatura impostata su 37 C e con la separazione di tutti i picchi ottenuta in 12 5 min cromatogramma non mostrato Il flusso stato ora aumentato a 0 66 m
97. l impiego di particelle pi piccole nella cromatografia liquida 8 Vantaggi delle colonne impaccate con particelle inferiori a 2 micron 15 Riscaldamento per attrito 19 Nel presente capitolo viene fornita un introduzione al sistema LC Agilent 1290 Infinity e ai principi su cui esso si basa oa Agilent Technologies 7 1 Introduzione alla cromatografia liquida a prestazioni ultra elevate UHPLC Teoria dell impiego di particelle pi piccole nella cromatografia liquida Introduzione Nel 2003 Agilent ha introdotto per la prima volta sul mercato le colonne di silice porosa con particelle da 1 8 um le prime rappresentanti di una classe di colonne ora nota come colonne STM o colonne con particelle di dimensioni inferiori a due micron Destinati all uso con il sistema LC Rapid Resolution della Serie Agilent 1200 lanciato nel 2006 questi materiali di impaccamento sono stati introdotti nelle colonne ZORBAX RRHT in grado di resistere alla pressione di 600 bar Nel 2009 la gamma stata ampliata con l introduzione delle colonne RRHD in grado di operare di routine alla pressione di 1200 bar da utilizzare con il sistema LC Agilent 1290 caratterizzato da un esteso inter vallo di potenza operativa fino alla pressione di 1200 bar e a velocit di flusso fino a 5 ml min Queste colonne con particelle di dimensioni inferiori a due micron 1 8 um possono essere impiegate per perseguire i due seguenti obiettivi principali 1 Cromatografia pi
98. l min e i tempi di gradiente regolati verso il basso per un fattore di tre generando una pressione di 1020 bar con eluizione di tutti i picchi in 4 2 min Figura 9 pagina 20 in alto Queste impostazioni dovrebbero fornire la stessa separazione ma tra i picchi 7 e 8 e tra il picco 5 e il picco principale si osserva perdita di risoluzione dovuta al riscaldamento all interno della colonna che causa una variazione di sensibilit per questi composti stato scoperto che impostando il termostato della colonna a una temperatura inferiore di 5 C era sufficiente per compensare l effetto di innalzamento ter mico all interno della colonna e ripristinare la separazione Figura 9 pagina 20 in basso La pressione aumentava a 1070 bar a ulteriore indica zione che la temperatura all interno della colonna era inferiore Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 19 1 20 Introduzione alla cromatografia liquida a prestazioni ultra elevate UHPLC Riscaldamento per attrito A 37 C mAU 200 175 150 125 100 0 0 5 1 15 2 25 3 35 4 5 min B 32 C 0 0 5 1 5 2 25 3 3 5 bi 4 5 min Figura 9 Influenza della generazione di calore per attrito sulla selettivit ed effetto dell abbassamento della temperatura della colonna Riepilogando l uso di materiale di impaccamento con particelle inferiori a due micron offre i seguenti vantaggi aumento del efficienza risoluzione superiore e separaz
99. la casella dove immettere il valore Se l inserimento dei valori nella tabella di programma zione viene effettato senza seguire una sequenza logica i valori immessi vengono riordinati automaticamente in ordine temporale Le righe della tabella di programmazione possono essere modificate direttamente e per aggiungerne o rimuoverne altre si possono utilizzare i pulsantiCut Paste e Remove Per creare un profilo di gradiente si possono aggiungere pi righe per ottenere una serie di segmenti a gradiente lineare Per impostare un gradiente semplice per la separazione qui esemplificata se sono presenti valori nella tabella di programmazione questi vanno prima cancellati usando il pulsante Clear all aggiungere una riga a 4 00 min per portare la composizione al 90 La visualizzazione grafica mostrer ora un gradiente lineare dal 50 di B al 90 di B nell arco di 4 min Se necessario un gra diente a gradino questo pu essere creato inserendo due valori per le impo stazioni prima del gradino e dopo il gradino separati da 0 01 min Questa procedura viene spesso usata per eluire rapidamente picchi ritenuti da una colonna in prossimit della fine di un analisi aumentando il solvente pi forte e o la velocit di flusso in un gradiente a gradini ad esempio aumen tando la di B dal 75 al 95 Nella tabella di programmazione non necessario inserire le impostazioni per il tempo 0 00 min questi valori ven Manuale e guida di rifer
100. la cromatografia liquida a prestazioni ultra elevate UHPLC Risoluzione superiore Le colonne lunghe impaccate con particelle pi piccole offrono un efficienza migliore e una risoluzione superiore Questi sono fattori importanti per l ana lisi di campioni complessi negli studi di metabolomica o proteomica Anche applicazioni come la determinazione del profilo delle impurit possono avvan taggiarsi del maggior potere di separazione Analogamente l analisi LC MS per i farmaci nei liquidi biologici pu trarre vantaggi dalla superiore capacit dei picchi a causa della ridotta interferenza da parte della soppressione ionica In generale un potere di separazione superiore offre maggiore affidabi lit nei risultati analitici D n Capacit del picco 69 LC con risoluzione GC N N dd Q _ Assorbanza mAU I v MA A no 5 10 15 20 25 30 35 40 Tempo min Figura 8 Nell analisi di un digerito triptico di BSA si possono raggiungere capacit di picco superiori a 700 usando una colonna ZORBAX RRHT SB C18 2 1 x 150 mm 1 8 um Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Introduzione alla cromatografia liquida a prestazioni ultra elevate UHPLC 1 Riscaldamento per attrito La forzatura della fase mobile attraverso la colonna a pressioni e velocit di flusso pi elevate genera calore I gradienti radiale e long
101. le che formano radicali e o acidi ad esempio 2CHC13 0 2COCl 2HC1 Questa reazione nella quale l acciaio inossidabile agisce da catalizzatore avviene rapidamente in presenza di cloroformio anidro se il processo di disidratazione elimina l alcool stabilizzatore Gli eteri di grado cromatografico contenenti perossidi ad esempio THF diossano diisopropiletere devono essere filtrati con ossido di alluminio che assorbe i perossidi Solventi contenenti agenti complessanti forti come EDTA Miscele di tetracloruro di carbonio con 2 propanolo o THF Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 121 6 Appendice Agilent Technologies su Internet Per informazioni aggiornate su prodotti e servizi visitare il sito Web di Agilent al seguente indirizzo http www agilent com Selezionare Products Chemical Analysis Da qui possibile scaricare direttamente l ultima versione del firmware dei moduli 122 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Appendice 6 Impostazione di un metodo con la funzione Edit Entire Method Tutte le procedure e le impostazioni del metodo descritte qui di seguito si rife riscono alla pompa binaria 1290 Infinity Le stesse sono applicabili alla pompa quaternaria 1290 Infininty In ChemStation un metodo contiene tutti i parametri per l Acquisizione dei dati per il controllo del sistema e per l Analisi dei dati per l elaborazio
102. lica zioni Ci offre un ampio intervallo di risposta lineare in funzione della con centrazione Per l analisi di campioni a concentrazione elevata l intervallo di risposta lineare pu essere esteso impostando la lunghezza d onda su un valore con assorbanza inferiore come un minimo di lunghezza d onda o utiliz zando una larghezza di banda pi ampia che in genere include valori di assor banza pi bassi L utilizzo di massimi e minimi di lunghezza d onda per la quantificazione risale ai rivelatori UV convenzionali che a causa delle tolle ranze meccaniche nello spostamento dei reticoli dovevano evitare le regioni dello spettro caratterizzate da pendenze ripide I rivelatori a serie di diodi non sono interessati da questa limitazione ma per convenzione i massimi e minimi vengono scelti di preferenza rispetto ad altre regioni dello spettro La larghezza di banda di riferimento in genere impostata su una regione dello spettro UV in cui l analita non presenta alcuna assorbanza Questa impo stazione illustrata nello spettro dell acido anisico in Figura 23 pagina 66 Questo spettro tipico di molte piccole molecole che contengono un cromo foro UV Per ottenere i risultati migliori il riferimento stato impostato in modo da essere una banda larga il pi vicina possibile alla lunghezza d onda del segnale ma in una regione ad assorbanza nulla In genere si utilizzano lar ghezze di banda di riferimento comprese tra 60 nm e 100 nm Il r
103. lineato che esistono poche applicazioni che lavorano al di sotto dei 12 15 C Evitare di usare il TCC a temperature cos basse perch si former condensa di acqua per via dell umidit dell aria e verr attivato il sensore per le perdite e Column Switching Valve questa opzione attiva solo quando installata una valvola tra i sostegni per la colonna Sono disponibili tre tipi di valvole a 2 posizioni e 6 porte usate per commutare tra 2 colonne a 2 posizioni e 10 porte usate per la rigenerazione alternata delle colonne a 8 posizioni e 9 porte usate per la selezione di colonne multiple in MDS Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 135 6 Appendice Impostazione di un metodo con la funzione Edit Entire Method Scheda del rivelatore a serie di diodi DAD Setup Method HiP ALS Injector Program i TCC W DAD Signals Timetable Advanced Use Wave Band Reference Reference Signal length width Wavelength Bandwidth Signal A 7 250 0 1000 w 2600 100 0 Store E Signal B 254 0 a o 100 0 Signal C 210 0 80 o 1000 Signal D 0 6 0 O 1000 Spectrum Range from 190 0 j to 400 0 nm Step 20 E nm Signal E 16 0 o io00 lt Threshold 10 0 mau Signal F o lt 160 o 1000 Analog Output Signal G 160 O 1000 al Signal H 90 0 60 360 0 100 0 Output 1 Peak
104. lla prima e una seconda pompa Dato che viene usata una colonna nell analisi di separazione l altra colonna viene scaricata della composizione iniziale del gradiente della fase mobile e per avviare l iniezione successiva il percorso del flusso analitico viene commutato sulla colonna appena riequilibrata Le due colonne si alter nano quindi in questo modo per l intera sequenza di iniezioni La seconda pompa necessaria solo per scaricare una miscela isocratica attraverso la colonna e pu essere quindi pi semplice delle pompe 1290 Infinity Ad esem pio una pompa isocratica Serie 1200 potrebbe essere sufficiente per questa attivit La configurazione illustrata in Figura 22 pagina 57 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity 3 Come ottenere una maggiore produttivit Position 1 gt Column 2 Eluent 10 pump Autosampler 1 Waste Regeneration Detector pump Column 1 Position 2 Column 2 Eluent pump Autosampler Regeneration gt Detector pump Column 1 Figura 22 Rigenerazione alternata delle colonne Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 57 3 Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity Come ottenere una maggiore risoluzione 58 Una maggiore risoluzione nel corso di una separazione consentir di miglio rare l analisi qualitativa e quantitativa dei dati sepa
105. lo fino a 5 10 ul ma questo dipende dalla natura chimica dell analita e dalla Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 53 3 54 Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity Come ottenere volumi di iniezione maggiori fase mobile come indicato sopra possibile ottenere un indicazione rapida relativa al volume di iniezione massimo guardando il volume della colonna vedere nella separazione in gradiente possibile raggiungere volumi di inie zione di circa 5 del volume della colonna mantenendo buona risoluzione e dispersione del picco Un modo per ottenere iniezioni maggiori quello di utilizzare una colonna di intrappolamento selezionata da una valvola di commutazione per catturare e concentrare l iniezione prima di modificarla ad esempio trasferendola su una colonna analitica per ulteriori informazioni fare riferimento a possibile posizionare la valvola nel comparto colonna termostatato PumpA Autosampler Analytical column Position 1 Detector Enrichment Pump B column PumpA Autosampler 1 Analytical column Position 2 Enrichment Pump B column Figura 21 Arricchimento del campione Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity 3 Come ottenere una maggiore produttivit Alcuni laboratori operano in un ambiente ad alta produttivit HT dove il carico di lavoro richied
106. lonna di 2 1 mm si sarebbe un segmento isocra tico iniziale nascosto di 5 min mentre su un sistema con un volume di ritardo di 600 ul il ritardo sarebbe di 3 min Questi volumi di ritardo sareb bero troppo alti per tempi di analisi di uno o due minuti Con pacchetti infe Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity 3 riori a due um la velocit di flusso ottimale secondo la curva di Van Deemter un po pi alta quindi la cromatografia rapida pu usare una velocit di flusso da tre a cinque volte superiori producendo ritardi di circa un minuto Tuttavia il volume di ritardo deve essere ulteriormente ridotto per ottenere ritardi pari a una frazione del tempo di analisi desiderato Questo viene otte nuto con il sistema LC Agilent 1290 Infinity grazie al ridotto volume di ritardo del percorso del flusso della pompa al volume ridotto del miscelatore Jet Wea ver e al volume ridotto del percorso del flusso attraverso l autocampionatore Volume extra colonna Il volume extra colonna una sorgente di dispersione del picco che riduce la risoluzione di separazione e dovrebbe quindi essere ridotto al minimo Colonne di diametro pi piccolo richiedono volumi extra colonna proporzio nalmente pi piccoli e mantengono minima la dispersione del picco In un cromatografo liquido il volume extra colonna dipende dalla tubatura di connessione tra l autoc
107. lvente ad alta velocit e simultaneamente con tutti i sistemi di azionamento della pompa e lo eroga alla posizione di scarico della valvola di spurgo auto matica L operazione viene ripetuta 20 volte prima di concludere il processo di adescamento La valvola di spurgo ricommuta il percorso idraulico sul sistema A questo punto si raccomanda di spurgare ogni canale con 80 ml di pro pan 2 olo Seguire la procedura Spurgo della pompa pagina 90 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 89 4 Configurazione e installazione del sistema Spurgo della pompa ATTENZIONE Si descrive la procedura di spurgo per la pompa binaria 1290 Infinity La stessa procedura pu essere eseguita per la pompa quaternaria 1290 Infininty e Dopo aver eseguito per la prima volta l adescamento della pompa e Quando la pompa deve essere spurgata con solvente fresco prima di usare il sistema o quando si deve cambiare tipo di solvente Sela pompa rimasta inattiva per poche ore o pi pu essersi diffusa aria nelle linee dei solventi e si raccomanda lo spurgo e Sei serbatoi dei solventi sono stati riempiti e la pompa deve essere spur gata per riempire il sistema con solvente fresco Se si devono usare solventi diversi accertarsi che il nuovo solvente sia miscibile con il solvente prece dente se necessario inserire un passaggio intermedio con un solvente co miscibile l isopropanolo spesso una buona scelta c
108. mente collegata alla pressione Le miscele di metanolo generano una contropressione maggiore rispetto a quelle di acetonitrile L acetonitrile viene utilizzato pi di frequente in virt dei picchi migliori e pi stretti nonch della ridotta viscosit anche se il metanolo garantisce solitamente una mag giore selettivit per molecole piccole inferiori a 500 Da possibile ridurre la viscosit aumentando la temperatura ma necessario prestare attenzione alla conseguente modificazione della selettivit della separazione Sar sufficiente condurre un esperimento per verificare se tale processo porter a una diminu zione o a un aumento nella selettivit Se flusso e pressione vengono aumen tati anche il riscaldamento frizionale all interno della colonna aumenter e di conseguenza verr registrato un lieve aumento della dispersione e una varia zione della selettivit entrambi visti come riduzione della risoluzione Quest ultimo caso pu essere compensato riducendo la temperatura del termo stato di alcuni gradi e sar nuovamente la conduzione dell esperimento a rive lare il risultato La curva di van Deemter mostra che il flusso ottimale attraverso la colonna STM superiore rispetto a quello che si ottiene con particelle pi grandi e non presenta picchi sostanziali all aumento del flusso Flussi tipici e ottimali per colonne STM sono 2 ml min per colonne con d i di 4 6 mm e 0 4 ml min per colonne con d i di 2 1 mm Man
109. miscibile l isopropanolo spesso una buona scelta controllare su una tavola di miscibilit dei solventi Per informazioni sulla procedura di spurgo fare riferimento a Spurgo della pompa pagina 90 102 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Guida introduttiva 5 Acquisizione dei dati nella schermata Metodo e controllo analisi Tutte le procedure e le impostazioni del metodo descritte qui di seguito si rife riscono alla pompa binaria 1290 Infinity Le stesse sono applicabili alla pompa quaternaria 1290 Infininty Parametri del metodo per la miscela campione e la colonna ZORBAX RRHD Il sistema LC 1290 Infinity viene fornito con una colonna ZORBAX RRHD Ecli pse Plus C18 1 8 um 2 1 mm x 50 mm e una miscela campione contenente fenoni che verranno utilizzate per eseguire la presente procedura esemplifica tiva La miscela campione con fenoni codice 5188 6529 contiene nove compo nenti da 100 ng ul ciascuno dissolti in acqua acetonitrile 65 35 I nove componenti sono e Acetanilide e Acetofenone Propiofenone e Butirrofenone e Benzofenone Valerofenone e Esanofenone Eptanofenone Ottanofenone I parametri del metodo per la separazione di questa miscela campione sono riassunti nella Tabella 9 pagina 104 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 103 5 104 Guida introduttiva Tabella 9 Parametri del metodo per la prima analisi
110. mizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity 3 registrata automaticamente da un tag RFID collegato Per le applicazioni parti colarmente complesse che richiedono il pi basso rumore possibile della linea di base agli UV consigliabile l uso del miscelatore Jet Weaver da 380 uL che viene installato in modo analogo al miscelatore Jet Weaver standard La procedura di sostituzione del Jet Weaver nella Pompa binaria 1290 Infinity illustrata in Sostituzione di Jet Weaver nella Pompa binaria 1290 Infinity pagina 50 A causa della diversa configurazione e del diverso principio di miscelazione della Pompa quaternaria Agilent 1290 Infinity il volume di ritardo fisico molto maggiore e nelle applicazioni standard non vi la necessit di un misce latore Jet Weaver aggiuntivo Tuttavia possibile installare un miscelatore Jet Weaver da 380 uL opzionale per le applicazioni basali critiche come le appli cazioni con TFA Il miscelatore Jet Weaver opzionale ha un alloggiamento diverso adattato al modulo della Pompa quaternaria 1290 Infinity La procedura di installazione di un Jet Weaver nella Pompa quaternaria 1290 Infinity illustrata in Installazione di Jet Weaver V380 nella Pompa quater naria 1290 Infinity pagina 51 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 49 3 Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity Configurazione del volume di ritardo ottimale Sostituzione di J
111. more dovuto alla guida d onda optofluidica adatta all utilizzo con un ampia gamma di colonne analitiche dalle colonne nar row bore corte alle colonne lunghe di diametro standard 4 6 mm In genere il volume di dispersione del picco calcolato con la formula ampiezza del picco x velocit di flusso per questa cella dovrebbe essere superiore a circa 2 uL per esempio 0 02 min x 200 uL min 4 uL Il cammino ottico della cella ad alta sensibilit Max Light pari a 60 mm che si traduce in un aumento da tre a cinque volte dei valori segnale rumore a seconda delle condizioni delle applicazioni Il volume di dispersione aumenta in misura frazionale rispetto alla cella standard Lunghezza d onda e larghezza di banda Il rivelatore misura contemporaneamente l assorbanza alle lunghezze d onda comprese tra 190 nm e 640 nm tramite rivelazione a serie di diodi Una lam pada UV garantisce una buona sensibilit sull intero intervallo di lunghezze d onda Il rivelatore a serie di diodi DAD pu calcolare e inviare contempora neamente al sistema di elaborazione dei dati fino a otto segnali cromatografici e spettri completi in corrispondenza di qualsiasi istante Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 63 3 64 Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity Un segnale o cromatogramma UV un grafico dei dati di assorbanza in fun zione del tempo ed definito dalla lunghezza d onda e dalla larghezza
112. n necessaria ad esempio in una serie di ana lisi per lo sviluppo del metodo si pu togliere la spunta da Standard Data Analy sis per non produrre il rapporto i dati possono essere controllati visivamente in un momento successivo nella visualizzazione Data Analysis Per collegare un programma macro a uno dei punti di accesso va spuntata la casella pertinente e il nome della macro va digitato nella casella di testo a destra Il software cerca la macro nella directory C Chem32 Core se salvata altrove inserire il percorso 148 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Lista di controllo del tempo di analisi I punti di accesso nel flusso di lavoro del metodo sono i seguenti Pre Run Command Macro e Customized Data Analysis Macro Post Run Command Macro Save Method with Data salva una copia del metodo nel file dei dati e le assegna il nome RUN M Questa operazione non necessaria se ChemStation viene attivata nella configurazione consueta perch il software salva sempre il metodo nel file dei dati tutte le versioni a partire dalla B 02 01 Questa opzione risulta rilevante sono se ChemStation stata configurata in modo che la funzione Unique Sequence Folder Creation sia disattivata e quindi i metodi non vengono copiati di routine nel file dei dati Poich questa la schermata finale del processo facendo clic su 0K si uscir dal Run Time Checklist e dal processo Edit Entire Method
113. n maniera efficace la velocit con cui il segnale tracciato risponde a un improvvisa variazione nel segnale in ingresso Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity 3 Tabella 8 Ampiezza del picco Tempo di risposta Velocit di campionamento Ampiezza del picco a met altezza min Risposta s Velocit di campionamento del segnale Hz lt 0 0015625 0 015625 160 gt 0 0015625 0 03125 160 gt 0 003125 0 0625 80 gt 0 00625 0 125 40 gt 0 0125 0 25 20 gt 0 025 0 5 10 gt 0 05 1 0 5 gt 0 10 2 0 2 5 gt 0 20 4 0 1 25 gt 0 40 8 0 0 625 gt 0 85 16 0 0 3125 1valori nell interfaccia utente potrebbero essere arrotondati Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 69 3 Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity Come ridurre al minimo l effetto memoria 70 L effetto memoria viene misurato quando i picchi residui provenienti da un iniezione con contenuto attivo vengono rilevati in una successiva iniezione di solvente neutro bianco Tra le iniezioni attive verr rilevato un effetto memoria che potrebbe portare a risultati errati Il livello di tale effetto viene riportato come area del picco nella soluzione neutra espresso in percentuale dell area nella precedente iniezione attiva L autocampionatore Agilent 1290 Infinity ottimizzato per un effetto memoria ridotto gra
114. na Durante l analisi la valvola rimane in questa posizione cosicch l autocampionatore continuamente attraversato dal flusso e pertanto il gradiente deve fluire attraverso il volume di ritardo per raggiungere la colonna Questo effetto pu essere eliminato commutando la valvola di iniezione dalla posizione di mainpass a bypass dopo che stata ese guita l iniezione e il campione iniettato stato introdotto nella colonna In pra tica questa operazione pu essere eseguita pochi secondi dopo l iniezione e viene attivata selezionando la funzione ADVR Automatic Delay Volume Reduction nel menu di impostazione dell autocampionatore Il fattore di eli minazione in genere 5 volte il volume di iniezione permette di disporre di un tempo sufficiente per eliminare il campione dall iniettore prima della commu tazione nella posizione di bypass Ci riduce efficacemente il volume di ritardo del sistema da 125 ul a 50 ul Quando si utilizza la funzione ADVR tenere presente che il gradiente gi ini ziato nella pompa al momento dell iniezione Se il gradiente ha gi raggiunto l autocampionatore il risultato un piccolo gradino nel gradiente Ci si veri fica quando il volume di ritardo inferiore al volume di eliminazione non si tratta necessariamente di un problema ma pu essere un fattore da tenere in considerazione quando si trasferisce un metodo Se il fattore di eliminazione 5 e il volume di iniezione pari a 10 ul l autocampi
115. ndard installato consente iniezioni fino a 20 ul 1 Valvola in posizione di mainpass presenza di fuSsalvola in posizione di bypass aspirazione del campione Sample Sampie loop Metering loop Metering device device i Injection SP rush SP run e needle d port A gt D L Peristaltic prot Poristaltic pump Po pump To waste To waste From pump From pump Injection Injection teri To column i To column 3 Valvola in posizione di bypass lavaggio dell ag Valvola in posizione di mainpass iniezione del campione Sample Sampe loop Motoring loop Motoring Injection device device needie n Tjecton na 2 gf neee PP Fusi B gt o To waste Injection valve Figura 18 34 From pump To column Peristaluc pump ooy 00 To waste From pump love To column Peristaltic pump Schema delle fasi dell iniezione con l autocampionatore 1290 Infinity Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Sistema LC Agilent 1290 Infinity Descrizione del prodotto 2 Un modulo aggiuntivo opzionale completamente nuovo il Flexible Cube fun ziona insieme all autocampionatore senza soluzione di continuit per fornire capacit aggiuntive Grazie all aggiunta del nuovo modulo Flexible Cube com prendente una pompa della siringa da 500 ul una valvola a bassa pressione e due valvole di commutazione per l alta pressione sono possibili nuove opzioni Ad esempio il sistema di iniezione a
116. ne dei dati per fornire risultati quantitativi e qualitativi Ai parametri si accede attraverso una serie di schermate ognuna dedicata a un modulo o funzione A queste schermate si accede facendo clic su un icona dell interfaccia utente gra fica GUI o attraverso gli elenchi a discesa della barra del menu Un nuovo metodo pu essere creato caricando e modificando un metodo esistente oppure caricando e modificando il modello in bianco del metodo DEF_LC M Per cambiare solo alcuni parametri possibile andare direttamente alle pagine di impostazione relative ai parametri da cambiare Gli utenti meno esperti possono trovare pi facile utilizzare la funzione Modifica tutto il metodo poich passa in rassegna automaticamente tutte le pagine Ad essa si accede dal menu Metodo gt Modifica tutto il metodo che apre la finestra di dialogo Check Method Sections to Edit Tait Method Instrument 2 Check Method Sections to Edk F Method Informatica Insttumant Acquisition F Data Analpast E Aun Time Checkkst Figura 35 Controlla le sezioni del metodo da modificare Questa finestra di dialogo riepiloga le sezioni che verranno visualizzate e offre la possibilit di saltare le parti che vengono deselezionate Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 123 6 124 Appendice A seconda di quali parti sono state selezionate la funzione mostra in sequenza diverse schermate Method Information compr
117. no creati a livello della valvola di spurgo mediante miscelazione ad alta pressione dei solventi dalla pompa A e dalla pompa B La valvola di spurgo consente sotto controllo del software di selezionare la via di scarico per spur gare nuovi solventi attraverso la testa della pompa Alla valvola di spurgo collegato un sensore che controlla la pressione del sistema Figura 13 Il miscelatore Jet Weaver Il percorso idraulico della pompa stato ottimizzato in modo da minimizzare il ritardo dei gradienti e incorpora un sistema di miscelazione innovativo che utilizza la tecnologia microfluidica Il dispositivo di miscelazione noto come Jet Weaver impiega una rete di canali microfluidici multistrato 120 um x 120 um a garanzia di una miscelazione accurata del flusso Il dispositivo Jet Weaver caratterizzato anche da due volumi standard 35 ul per le normali applicazioni di rivelazione con UV e 100 ul per le situazioni pi complesse come l uso di TFA nella rivelazione con UV In queste applicazioni particolar mente complesse per ottenere un rumore della linea di base decisamente basso disponibile anche un Jet Weaver da 380 uL Per la rivelazione MS Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Sistema LC Agilent 1290 Infinity Descrizione del prodotto 2 spesso possibile lavorare senza Jet Weaver e ottenere una miscelazione suffi ciente usando solo il volume di base di 10 ul del percorso idraulico dell
118. nzione ridotto In alcuni casi si tratta della causa della distorsione del picco e la regola generale quella di mantenere il solvente di iniezione allo stesso livello o a un livello ridotto rispetto alla composizione del gradiente iniziale Tutto questo rilevante in base a se o a quanto possibile aumentare il volume di iniezione all utente spetta il compito di verificare l aumento di dispersione picchi pi ampi o maggiormente alterati e risoluzione dei picchi ridotta nel tentativo di aumentare la dimensione dell iniezione Se l iniezione viene ese guita in un solvente debole il volume pu aumentare ulteriormente in quanto l effetto quello di concentrare l analita sulla testa della colonna all inizio del gradiente Al contrario se l iniezione si trova in un solvente pi forte rispetto alla fase mobile iniziale allora il volume di iniezione migliorato distribuir la banda di analita nella colonna anteriore al gradiente provocando dispersione di picco e perdita di risoluzione Da tenere maggiormente in considerazione durante la determinazione del volume di iniezione il diametro della colonna poich questo avr un grosso impatto sulla dispersione del picco Le altezze del picco possono essere mag giori in una colonna ristretta rispetto a un iniezione maggiore in una colonna pi ampia a causa della minore dispersione del picco Con colonne dal diame tro interno di 2 1 mm i volumi di iniezione potrebbero modificare l interval
119. o con un nuovo nome ChemStation consentir ora di salvare il metodo come DEF_LC M cosicch il modello del metodo predefinito non viene modificato Lasciar equilibrare il sistema per almeno 10 min e prima di far partire l analisi verificare che la linea di base nel Online Plot sia stabile Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Guida introduttiva 5 Esecuzione del metodo per una singola iniezione Questa sezione illustra come eseguire una singola iniezione della miscela cam pione utilizzando le condizioni impostate nella sezione precedente Su ChemStation le analisi possono essere eseguite in due modalit Run Method singole iniezioni ad esempio nello sviluppo interattivo del metodo usando le impostazioni dei parametri attivi in quel momento e Run Sequence serie di iniezioni automatizzate da fiale multiple possibil mente con pi metodi Per ulteriori dettagli fare riferimento ai manuali ChemStation 1 Fare clic sull icona Select Run Method Task w 2 Se al momento non sono caricate le condizioni del metodo desiderate per caricarle selezionare Metodo gt Carica Metodo o l icona nio che si trova sulla barra del menu Se in un metodo caricato sono stati introdotti cambiamenti che non sono ancora stati salvati un asterisco giallo sull icona dello stato del metodo lo segnala L iniezione pu essere eseguita senza prima salvare i cambiamenti di quei parametri ChemStation archivia
120. o solo per il funzionamento a gradiente ultra rapido meno di 0 5 min o per utilizzo con colonne di volume molto piccolo Fare riferimento a Tabella 6 pagina 45 per l effetto sul tempo di ritardo del sistema Se Jet Weaver viene bypassato i tubi di collegamento all autocampionatore provengono direttamente dalla valvola di spurgo Assi curare che Jet Weaver sia stato sciacquato con solvente senza tamponi o altri additivi prima di scollegarlo Talvolta pu essere consigliabile aumentare il volume di ritardo della pompa Specificatamente questo pu essere opportuno quando viene impiegata la rivelazione UV e alla fase mobile stato aggiunto un composto con forte assor bimento UV Questo pu avere l effetto di evidenziare qualsiasi rumore della pompa e l esempio pi comune l utilizzo di acido trifluoroacetico TFA per l analisi di proteine e peptidi L effetto pu essere mitigato aumentando il volume del miscelatore Il miscelatore Jet Weaver ha due volumi alternativi nella stessa unit Il passaggio dal volume minore 35 ul al volume maggiore 100 ul viene eseguito disinstallandolo invertendo la parte anteriore con quella posteriore e reinstallandolo Il volume di miscelazione e perci il volume di ritardo viene aumentato di 65 ul e le prestazioni di base con addi tivi come il TFA verranno migliorate La configurazione di Jet Weaver viene Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Otti
121. ocampionatore 125 1 aggiunta di 5 ul per consentire le connessioni nelle configurazioni di sistema Tabella 5 Volumi di ritardo delle configurazioni del sistema quaternario LC 1290 Infinity Configurazioni di sistema Volume di ritardo pl Pompa quaternaria Autocampionatore a ciclo fisso solo MS 360 Pompa quaternaria Autocampionatore standard solo MS 430 Pompa quaternaria Jet Weaver V380 Ciclo fisso 510 Pompa quaternaria Jet Weaver V380 Autocampionatore 580 1 aggiunta di 5 ul per consentire le connessioni nelle configurazioni di sistema Tabella 6 Tempi di ritardo del sistema perch il gradiente raggiunga la testa della colonna Velocit di Volume di ritardo del sistema microlitri flusso ml min 20 55 90 125 360 395 430 465 Tempi di ritardo minuti 0 2 0 10 0 28 0 43 0 60 1 80 2 15 2 55 2 90 0 4 0 05 0 14 0 21 0 30 0 90 1 08 1 28 1 45 0 6 0 03 0 09 0 14 0 20 0 60 0 72 0 85 0 97 0 8 0 03 0 07 0 11 0 15 0 45 0 54 0 64 0 73 1 0 0 02 0 06 0 09 0 12 0 36 0 43 0 51 0 58 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 45 3 46 Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity Tabella 6 Tempi di ritardo del sistema perch il gradiente raggiunga la testa della colonna Velocit di Volume di ritardo del sistema microlitri flusso ml min 1 5 0 01 0 04 0 06 0 08 0 24 0 29 0 34 0 39 2 0 0 01 0 03 0 04 0 06 0 18 0 22 0 26 0 29 3 0 0 01 0 02 0 03 0 04 0 12
122. odo con la funzione Edit Entire Method Scheda dell autocampionatore ad alte prestazioni Hip_ALS Injector Program Setup Method GI Ga HiP ALS Injector Program E BinPump ag icy DAD X_ Instrument Curves Draw default volume from sample with default speed using default offset Append Insert Ji Delete Clear all Ji Move up Cut Copy Paste Figura 38 Schermata Imposta metodo Scheda del programma dell iniettore dell auto campionatore HiP Consente di costruire procedure di iniezione specializzate che prevedono la manipolazione di aliquote da pi fiale come ad esempio nella derivatizza zione pre colonna I reagenti chimici vengono miscelati automaticamente con il campione per incrementare la rivelabilit o la sensibilit Un esempio usato di frequente consiste nella derivatizzazione degli amminoacidi con i reagenti OPA e FMOC Per maggiori dettagli fare riferimento al manuale del autocam pionatore Agilent 1290 Infinity 130 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Appendice 6 Impostazione di un metodo con la funzione Edit Entire Method Scheda della pompa binaria BinPump Setup Method HiP ALS Ba HiP ALS Injector Progr TCC DAD Instrument Curves Timetable 0 000 ml min Time A Parameter Solvents 100 0 5 Stoptime Posttime NoLimit 1 00 Pressure Limits l sr fiemove J Clear all Cut Co
123. onare Control dal menu contestuale In alternativa possibile selezionare Strumento gt Altro PompaBin 1290 Infinity gt Controllo Pump o 3 i Off Standby Seal Wash Off Single Wash Duration min Periodic Period min on for min Automatic Tum On Tum on at Purge On Duration 1 00 min Dff Flow 0000 mL min Composition A z B E x Prime On Dff Ok Cancel Help 2 Nella sezione Purge impostare i seguenti parametri Duration 6 min Flow 10 ml min Composition B 50 Si assume automaticamente che la Composition A sar pari al 50 Lasciare il pulsante Acceso Spento in posizione Off Fare clic su 0K per uscire Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 91 4 92 Configurazione e installazione del sistema 3 Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla sezione della pompa e sele zionare Purge On dal menu contestuale Non confondere Purge On con la voce successiva Prime On La valvola di spurgo ora commuta il percorso idraulico sulla posizione di spurgo e in contemporanea spurgher entrambi i canali nello scarico a 5 ml min ognuno per una durata di 6 minuti Al termine del periodo previsto il flusso di spurgo viene spento la valvola ricommuta il percorso idraulico sul sistema e quindi vengono ripristinate la velocit di flusso e la composizione attualmente impostati nel metodo In questo esempio il flusso del metodo ancora impostato su zero Le
124. onatore consente il flusso di 50 ul prima della commutazione nella posizione di bypass ci significa che se il volume di ritardo pari a 50 ul il gradiente appena riuscito a raggiun gere la valvola di iniezione Volumi di iniezione pi piccoli non hanno alcun effetto mentre volumi di iniezione pi grandi comportano la presenza di un piccolo gradino nel gradiente Anche la velocit di flusso utilizzata incide sulla decisione se utilizzare o meno la funzione ADVR A 0 2 ml min il tempo di ritardo risparmiato pari a 21 secondi mentre a 1 0 ml min pari a 4 secondi In genere poco probabile che la funzione ADVR sia adatta alle applicazioni relative a composti che presentano problemi noti di effetto memoria Per ridurre al minimo la dispersione del picco e il volume di ritardo nel com parto colonna termostatato deve essere installato lo scambiatore di calore a bassa dispersione Lo scambiatore di calore a bassa dispersione fa parte del kit di capillari raccomandato per la applicazioni a bassa dispersione Il kit di capillari comune include anche capillari stretti con d i di 0 12 mm Gli scam biatori di calore da 3 ul e da 6 ul servono per la compatibilit a ritroso e dovrebbero essere usati solo nel caso in cui sul sistema debba essere eseguito Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 47 3 48 Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity un metodo convenzionale sebbene in questo ca
125. one Le variazioni per il rivelatore avverranno immediata mente al momento specificato Le seguenti funzioni possono essere modifi cate durante la corsa Bilanciamento Modifica segnale Modifica soglia Modifica picco rivelatore dell ampiezza del picco Modifica modalit di acquisizione degli spettri Modifica contatti e Advanced Spectrum Durante l analisi gli spettri possono essere salvati su base continua o con trollata dai picchi ci si applica al software ChemStation alcuni pacchetti software ad es EZChrom supportano solo la raccolta continua di tutti gli spettri e le opzioni per il controllo da parte dei picchi non compaiono La raccolta degli spettri e dei segnali sono operazioni indipendenti eseguite dal firmware del rivelatore e non dipendono dal software del computer che estrae i dati dalla matrice 3D La velocit con cui si rilevano i picchi stabi Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 137 6 138 Appendice lita dalle impostazioni per l Peakwidth durante l intervallo specificato daPeakwidth vengono rilevati otto picchi Il firmware rileva il picco sul segnale A solo per determinare quando devono essere salvati gli spettri con trollati dai picchi Per segnali multipli pu essere necessario avere impo stato il segnale A come rivelatore a banda ampia a garanzia che siano disponibili spettri dei picchi per tutti di segnali a lunghezza d onda diversa Store controlla la mo
126. ontrollare su una tavola di miscibilit dei solventi I tubi di ingresso alla pompa devono essere gi riempiti di solvente Se i tubi di ingresso sono parzialmente o completamente a secco seguire la procedura di adescamento completa vedere Adescamento della pompa pagina 88 La valvola di spurgo consente di collegare contemporaneamente entrambe le teste delle pompe allo scarico e di spurgare alla loro velocit massima di flusso di 5 ml min raggiungendo un flusso di spurgo totale di 10 ml min con compo sizione 50 50 Solventi campioni e reagenti tossici infiammabili e pericolosi La manipolazione di solventi campioni e reagenti pu condurre a rischi per la salute e la sicurezza gt Durante l uso di queste sostanze attenersi alle procedure di sicurezza adeguate ad esempio indossare occhiali guanti e indumenti protettivi come descritto nella scheda sull uso e sulla sicurezza dei materiali fornita dal produttore e attenersi sempre alla buona pratica di laboratorio gt Il volume delle sostanze deve essere ridotto al minimo necessario per condurre l analisi gt Non usare lo strumento in ambienti in cui siano presenti gas esplosivi Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Configurazione e installazione del sistema 4 1 Per accedere alla pagina delle impostazioni di controllo della valvola di spurgo fare clic con il pulsante destro del mouse sulla sezione della pompa e selezi
127. otettivi come descritto nella scheda sull uso e sulla sicurezza dei materiali fornita dal produttore e attenersi sempre alla buona pratica di laboratorio gt Il volume delle sostanze deve essere ridotto al minimo necessario per condurre l analisi gt Non usare lo strumento in ambienti in cui siano presenti gas esplosivi Evita di portare a esaurimento i serbatoi dei solventi grazie alla funzione di controllo del Riempimento bottiglie Utilizzare una siringa per riempiere i tubi del solvente la pompa non pomper aria Prima di iniziare la procedura verificare che tutte le linee dei solventi siano collegate alla pompa secondo le indicazioni del manuale di installazione della pompa e che i tubi di scarico siano correttamente posizionati su un contenitore per i solventi esausti adatto Accertarsi che la pompa sia controllata dal software del computer o dal sistema di controllo Instant Pilot e che la velocit di flusso sia impostata su zero Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Configurazione e installazione del sistema 4 1 Preparare il canale A e la testa della pompa A per l adescamento a Riempire parte del serbatoio di ciascun solvente con ca 150 ml di pro pan 2 olo di grado HPLC per l adescamento della pompa e posizionare nei serbatoi le estremit dei tubi dei solventi dotate di filtro di vetro sin terizzato b Scollegare il tubo che entra nella valvola di controllo di ingresso della
128. otto Single Runs Fare doppio clic su Single Runs per caricare questi file dei dati nella Tavola di navigazione 4 Selezionare un file nella Tavola di navigazione e fare doppio clic su essa per caricare il cromatogramma nel visualizzatore Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 111 5 Guida introduttiva Integrazione di un segnale 1 Selezionare lo strumento Attivit di integrazione vedere figura sotto Nella figura sotto sono evidenziate le icone Integrate e Set Integration Events Table Calibration ul Signal INNI Purify e Spectrum ift Reporti Short gt DE DADI A 5ig 242 ONE MIX 010 D Y FT ON er Ma y PA ui CA LA wy fj bi Ej E Ee ES E E FI Q DAD1 A Sig 242 4 Ref 390 100 FPHENONES PHENONE M1X 010 0 mau 5 Method Manual Events IT Fi j 5 5 200 E Initial Events For All Signals 7 g 2507 i sei G Integration Events Value 200 f Tangent Skim Mode Standard Tall Peak Skim Height Ratio 0 00 E Front Peak Skim Height Ratio 0 00 ded Skim Walley Ratio 20 00 E Baseline Comection Classical s04 F Peak to Walley Ratio 500 00 3 a 4 Specific Events For Signal a an un A de z DAD Default X 3 Time Area Height Width Area Symmetiy Time Integration Events Value 1 0 122 281 7 208 1 0 0208 10 633 0 518 Initial Slope Sens
129. ovuta al diametro della colonna sar minore e la sensi bilit maggiore Ad esempio diminuendo il diametro interno della colonna da 4 6 mm a 2 1 mm sar possibile ottenere un aumento teorico dell altezza del picco di 4 7 times grazie alla riduzione della diluizione in colonna Per un rive latore dello spettrometro di massa gli intervalli di flusso inferiori delle colonne ristrette possono offrire una maggiore efficienza di ionizzazione e di conseguenza elevata sensibilit Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity 3 Come ottenere una maggiore sensibilit del rivelatore E possibile utilizzare una serie di parametri del rivelatore per ottimizzare le prestazioni Nelle sezioni che seguono descritto come i parametri del rivela tore incidono sulle caratteristiche delle prestazioni La cella di flusso incide sulla sensibilit La lunghezza d onda e la larghezza di banda incidono su sensibilit seletti vit e linearit e La larghezza della fenditura incide su sensibilit risoluzione spettrale e linearit L ampiezza del picco incide su sensibilit e risoluzione Cella di flusso La cella di flusso a cartuccia Max Light possiede un cammino ottico standard di lunghezza pari a 10 mm ed ottimizzata per ridurre al minimo volume e dispersione o volume 1 0 uL caratterizzata da un elevata trasmissione della luce per ridurre il ru
130. pp Paste Min E 400 00 bar d Figura 39 Schermata Imposta metodo Scheda della pompa binaria Flow imposta velocit di flusso sino a 5 ml min Ad esempio per la separa zione si usa la velocit di 0 4 ml min Se la contropressione raggiunge in breve la pressione massima impostata il flusso verr ridotto per alcuni secondi per abbassare la pressione ma se la pressione continua a essere limitata in questo modo si instaurer una condizione di errore e il flusso verr interrotto Solvents definisce le fasi mobili disponibili e le proporzioni percentuali pompate ai due canali A e B Su ciascun canale una casella a discesa per mette di selezionare un solvente da un elenco in modo che il controllo della pompa utilizzi le impostazioni di compressibilit ottimali In questo modo le caratteristiche del flusso saranno ottimizzate come descritto in Configu razione del volume di ritardo ottimale pagina 44 Una seconda casella di testo consente di inserire una descrizione della fase mobile Se nella pompa installata la valvola di selezione del solvente allora ogni canale ha due opzioni per il solvente e l opzione corretta per il metodo va selezionata Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 131 6 132 Appendice mediante il pulsante radio alla sinistra della descrizione del solvente La pompa former miscele binarie dei canali selezionati A e B ad e
131. ppendice Informazioni per la sicurezza Informazioni generali sulla sicurezza ATTENZIONE Le seguenti precauzioni generali di sicurezza devono essere rispettate durante tutte le fasi di utilizzo manutenzione e riparazione dello strumento Il man cato rispetto di tali precauzioni o di avvertenze specifiche riportate in altri punti del presente manuale implica la violazione degli standard di sicurezza della progettazione della produzione e dell uso previsto dello strumento Agi lent Technologies non riconosce alcuna responsabilit per eventuali danni risultanti dal mancato rispetto delle istruzioni fornite Verificare che lo strumento venga utilizzato correttamente La protezione fornita dallo strumento potrebbe risultare insufficiente gt L operatore di questo strumento tenuto a utilizzarlo come specificato nel presente manuale Standard di sicurezza Questo strumento classificato come facente parte della Classe di Sicurezza I provvisto di terminale di messa a terra ed stato prodotto e collaudato secondo gli standard di sicurezza internazionali Funzionamento 118 Prima di attivare l alimentazione seguire le istruzioni della sezione relativa all installazione Inoltre osservare quanto segue Non rimuovere i coperchi dello strumento mentre in funzione Prima dell accensione tutti i terminali a terra le prolunghe gli autotrasformatori e i dispositivi connessi devono essere collegati a massa mediante una p
132. pplicazioni di commutazione della valvola dalla semplice commu tazione tra due colonne alla rigenerazione automatica delle colonne alla pre parazione del campione o allo spurgo della colonna Ogni testa della valvola dotata di un kit completo contenente tutti i capillari necessari scambiatori di calore a bassa dispersione aggiuntivi e altre parti Le valvole di commutazione sono caratterizzate da un eccezionale semplicit d uso quando si effettuato i collegamenti alla valvola Se viene premuta l unit di azionamento della valvola a sostituzione rapida scivola in avanti diventando facilmente accessibile vedere Figura 19 pagina 37 a sinistra A seconda dell applicazione le teste delle valvole alternative possono essere interscam biate dall utente operando sul meccanismo di azionamento vedere Figura 19 pagina 37 a destra Si noti il tag RFID sulla parte superiore della testa della valvola 1 Tutte le specifiche sono valide per l acqua distillata alla temperatura ambiente 25 C con un valore preimpostato su 40 C e un flusso di 0 2 5 ml min Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Sistema LC Agilent 1290 Infinity Descrizione del prodotto 2 Figura 19 Valvola a sostituzione rapida nel TCC Fino a tre TCC possono essere disposti a cluster per consentire applicazioni avanzate come la commutazione tra otto colonne per lo sviluppo automatiz zato del metodo o per rendere disponibil
133. pressione controlla la pressione durante l analisi prima che i solventi entrino nella valvola multiuso un selettore di flusso a 4 canali che abilita le diverse funzionalit mostrate nelle figure sotto La valvola multiuso dotata di un filtro in linea che verr sempre usato durante le analisi di un miscelatore opzionale Jet Weaver da 380 uL di facile installazione che garan tisce la miglior miscelazione possibile dei solventi di un capillare di restri zione opzionale e di un collegamento al sistema di scarico Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 31 2 Sistema LC Agilent 1290 Infinity Descrizione del prodotto Componenti del sistema Tabella 2 Funzionalit della valvola Pompa Pompa Agilent Jet Weaver Jet Weaver Scarici Scarici Filtro Filtro Figura 14 Applicazione standard Figura 15 Configurazione per la miscelazione extra dei volumi Pompa Pompa Agilent Agilent Jet Weaver Jet Weaver Scaric Scaric Filtro Filtro Figura 16 Valvola di spurgo automatico Figura 17 Spurgo del filtro in linea 32 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Sistema LC Agilent 1290 Infinity Descrizione del prodotto 2 L applicazione standard 1 viene utilizzata per la maggior parte delle analisi mentre la configurazione per la miscelazione extra dei volumi 2 si applica per qualsiasi tipo di applicazione critica sulla linea b
134. programmi di controllo ChemStation EZChrom MassHunter ecc per la scelta di Agilent di utilizzare driver RC Net comuni a tutti i moduli dello strumento Per analizzare la separazione della miscela campione come nel caso della mag gioranza dei metodi non necessario cambiare ogni parametro disponibile tuttavia essi verranno descritti nelle prossime sezioni per ragioni di comple tezza Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Setup Method HP ALS Injection Mode Injection volume a HiP ALS Injector Program Appendice 6 Impostazione di un metodo con la funzione Edit Entire Method Scheda autocampionatore HiP ALS i BinPump TCC amp DAD Instrument Curves Advanced Ausiliary Standard injection Injection with needle wash Needle wash Made Time Location Repeat Stoptime NoLimit Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Draw speed Eject speed 100 0 E 100 0 uL min uLimin mm Draw position 00 2 Equilibration time 20 gt sec Sample flush out factor j 5 0 times injection volume Flush Port F VialAwell bottom sensing High throughput times F Automatic delay volume reduction F Enable overlapped injection Posttime When Sample Is Flushed Out of After Period Of Time 0 00 min Injection Cleaning Figura 37 Schermata Imposta metodo Sc
135. ra Inoltre si pu prendere in considerazione la ter modinamica di una separazione e le propriet del soluto e delle fasi mobile e stazionaria percentuale di solvente organico forza ionica e pH possono essere regolate in modo da ottenere la minor ritenzione e la pi alta selettivit possibili Isoterme non lineari Equilibrio chimico pH Pressione Dimensione delle particelle porosit Propriet della fase mobile e dimensioni della colonna velocit di flusso di quella stazionaria propriet temperatura del soluto temperatura Figura 3 Selezione delle condizioni ottimali per l HPLC La risoluzione pu essere descritta in funzione di tre parametri efficienza della colonna o piatti teorici N e selettivit a e fattore di ritenzione k In base all equazione della risoluzione Figura 4 pagina 13 la selettivit ha l impatto pi preponderante sulla risoluzione Figura 5 pagina 13 Ci signi fica che la selezione delle propriet adatte delle fasi stazionaria e mobile e della temperatura un fattore critico per ottenere una buona separazione 12 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Introduzione alla cromatografia liquida a prestazioni ultra elevate UHPLC 1 Figura 4 Equazione della risoluzione R f 4 3 f N 2 f k 1 20000 40000 60000 80000 N 1 05 1 10 1 15 1 20 Q 5 10 15 20 k Figura 5 Effetto del numero dei piatti del fattore di separazione e del
136. ramma del sistema per il modulo e sele zionare Method dal menu contestuale Tutti i moduli vanno impostati in questo modo 2 Fare clic con il pulsante destro del mouse sull area della pompa e selezio nare Method dal menu contestuale a Nella pagina Method della 1290 Infinity Binary Pump inserire i parametri sotto elencati Velocit di flusso 0 4 ml min Solvente A Selezionare Water dall elenco a discesa relativo alla com pressibilit Solvente B Selezionare la casella di spunta per attivare il Solvente B B Valore iniziale 40 Tempo finale 5 min Limite massimo di pressione 1200 bar b Fare clic sul segno per aprire la Timetable c Aggiungere una riga selezionare Change Solvent Composition e impostare B su 80 d Per gli altri parametri si possono lasciare i valori delle impostazioni pre definite Fare clic su 0K per uscire dalla finestra Queste modifiche vengono inviate al modulo della pompa 3 Fare clic con il pulsante destro del mouse sull area dell autocampionatore e selezionare Method dal menu contestuale a Nella pagina Method dell 1290 Infinity Autosampler inserire i parametri sotto elencati Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 105 5 106 Guida introduttiva Volume di iniezione 1 0 ul Iniezione con lavaggio dell ago Modalit Lavaggio porta Tempo 6 s b Per gli altri parametri si possono lasciare i valori delle impostazioni pre definite Fare
137. rapida Le colonne corte con particelle inferiori a due micron offrono la possibilit di ridurre drasticamente i tempi di analisi aumentando la velocit di flusso senza abbassare le prestazioni in termini di separazione 2 Risoluzione superiore Le colonne lunghe con particelle inferiori a due micron offrono un effi cienza superiore e quindi la maggiore risoluzione necessaria per la separa zione di campioni complessi Una minore dispersione implica anche meno diluizione dei picchi dell analita con conseguente guadagno in termini di sensibilit in particolare per LC MS La pressione necessaria per guidare il solvente attraverso una colonna conte nente particelle STM aumenta rapidamente al crescere della velocit di flusso quando si desiderano separazioni pi rapide e aumenta molto rapidamente al crescere della lunghezza della colonna quando si desidera una risoluzione pi elevata La diffusione delle colonne STM quindi stata contestuale allo svi luppo dei sistemi UHPLC ovvero sistemi HPLC che offrono pressioni superiori rispetto ai consueti 400 bar in vigore sin dagli esordi dell HPLC I sistemi di Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Introduzione alla cromatografia liquida a prestazioni ultra elevate UHPLC 1 cromatografia liquida a prestazioni ultra elevate o a pressioni ultra elevate offrono inoltre volumi di ritardo ridotti e la rapida raccolta dati necessaria per picchi stretti d
138. rare un numero superiore di picchi o fornire indicatori ulteriori per velocizzare la separazione In questa sezione viene indicato come aumentare la risoluzione esaminando i punti seguenti e Ottimizzazione della selettivit e Impaccamento particelle di dimensioni ridotte e Colonne pi lunghe e Gradienti pi profondi flusso pi veloce e Volume colonna extra minimo e Ottimizzazione volume e solvente di iniezione Acquisizione dati sufficientemente veloce La risoluzione tra due picchi descritta dall equazione di risoluzione 1 a 1 k 1 Rs N a k dove R risoluzione e N conta su piastra misura dell efficienza della colonna e a selettivit tra due picchi k fattore di ritenzione del secondo picco definito in precedenza fattore di capacit Il fattore che influisce maggiormente sulla risoluzione la selettivit a variandolo si modifica il tipo di fase stazionaria C18 C8 fenile nitrile ecc la fase mobile e la temperatura per aumentare le differenze di selettivit tra i soluti da separare Il lavoro che ne deriva viene eseguito al meglio con un sistema di sviluppo di metodi automatizzato che consente di stabilire in un protocollo di indagine predeterminato una vasta gamma di condizioni in diverse colonne e fasi mobili Tale sezione indica come ottenere una risolu zione maggiore con qualunque fase stazionaria e mobile Se nella decisione Manuale e guida di riferimento r
139. razione e installazione del sistema 4 Installazione del modulo Configurazione in due stack Se si aggiunge al sistema il termostato dell autocampionatore si consiglia di impiegare una configurazione in due stack in questa configurazione entrambi i moduli pesanti la pompa 1290 Infinity e il termostato vengono collocati in fondo al rispettivo stack e si evita di utilizzare un solo stack di altezza elevata Alcuni utenti preferiscono questa disposizione con altezza inferiore anche senza il termostato dell autocampionatore Tra la pompa e l autocampionatore richiesto un capillare leggermente pi lungo Vedere Figura 27 pagina 81 e Figura 28 pagina 82 Instant Pilot Rivelatore gt go 285 Comparto colonne 999 Q09 000 aoo Comparto solventi_ Autocampionatore Termostato per ALS opzionale Figura 27 Configurazione in due stack consigliata per 1290 Infinity con pompa binaria v
140. resa a terra Qualsiasi interruzione della messa a terra protettiva causer un rischio potenziale di scosse elettriche con possibilit di lesioni gravi Laddove questa Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Appendice 6 protezione risulti danneggiata necessario mettere lo strumento fuori fun zione e impedirne l uso Assicurarsi che siano utilizzati esclusivamente fusibili con la corrente nomi nale richiesta e del tipo specificato apertura circuito normale ritardo ecc Non utilizzare fusibili riparati ed evitare il cortocircuito dei supporti fusibile Alcune modifiche descritte nel manuale devono essere effettuate con la cor rente collegata e lo strumento privo di coperchi La corrente presente in molti punti pu in caso di contatto provocare lesioni alle persone Qualsiasi operazione di modifica manutenzione e riparazione dello strumento aperto sotto tensione deve essere per quanto possibile evitata Queste opera zioni quando inevitabili devono essere eseguite da persone competenti e con sapevoli del rischio a cui sono sottoposte Non tentare riparazioni o modifiche interne se non presente un altra persona in grado di prestare soccorso e ria nimazione Non sostituire parti con il cavo di alimentazione collegato Non usare lo strumento in presenza di gas infiammabili o fumi L uso dello strumento al pari di altre apparecchiature elettriche in queste condizioni pu compromettere
141. riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 39 2 40 Sistema LC Agilent 1290 Infinity Descrizione del prodotto Componenti del sistema Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 3 Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity Volume di ritardo e volume extra colonna 42 Volume di ritardo 42 Volume extra colonna 43 Configurazione del volume di ritardo ottimale 44 Come ottenere volumi di iniezione maggiori 53 Come ottenere una maggiore produttivit 55 Come ottenere una maggiore risoluzione 58 Come ottenere una maggiore sensibilit 61 Come ridurre al minimo l effetto memoria 70 Come prevenire ostruzioni della colonna 72 Il presente capitolo mostra come applicare la teoria e utilizzare le caratteristi che del sistema LC per sviluppare separazioni ottimizzate SH Agilent Technologies 41 3 Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity Volume di ritardo e volume extra colonna 42 Il volume di ritardo definito come il volume del sistema tra il punto di miscelazione della pompa e la sommit della colonna Il volume extra colonna definito come il volume tra il punto di iniezione e il punto di rilevazione escluso il volume presente nella colonna Volume di ritardo Nelle separazioni in gradiente questo volume causa un ritardo tra il cambio della miscela nella pompa e il momen
142. sempio A2 e B1 non possibile miscelare A1 con A2 o B1 con B2 I valori immessi per le proporzioni di A e B definiscono la composizione di un metodo isocratico o definiscono le condizioni di partenza di un metodo in gradiente e le condi zioni di equilibrazione tra analisi in gradiente Si deve immettere solo il valore di B mentre A si aggiorner al valore dato dal 100 meno B quando si nuove il cursore Nel caso della separazione impostando A per l acqua e B per il metanolo al 50 A sar 50 Timetable indica in dettaglio le variazioni che devono verificarsi durante l analisi per le composizioni percentuali di A e B nella fase mobile o se necessario per la velocit di flusso e la pressione massima consentite La tabella di programmazione inserisce variazioni lineari dei parametri tra i valori di regolazione definiti Le impostazioni inserite altrove in questa schermata funzionano come condizioni iniziali e cambieranno soltanto se si modifica uno dei valori della tabella di programmazione Ad esempio se durante l analisi il flusso costante non sussiste la necessit di immettere un valore relativo al flusso nella tabella di programmazione Per immettere in valore nella tabella di programmazione fare clic sul pulsante Add per aggiungere una riga alla tabella inserire il tempo del valore di regolazione selezionare la voce da modificare dall elenco a discesa composizione flusso pressione e fare clic sulla casellaparameter per aprire
143. sivo le altezze dei picchi diminui scono e si riduce anche la risoluzione tra i picchi se eccessiva il rumore dei dati superiore a quello necessario per ottenere profili accurati dei picchi stretti L impostazione ampiezza del picco nel rivelatore permette all utente di impo stare correttamente questi parametri senza che sia necessaria alcuna cono scenza oltre alla visualizzazione dei risultati di integrazione del cromatogramma per determinare visivamente l ampiezza dei picchi L impo stazione dell ampiezza del picco deve essere basata sull ampiezza del picco pi stretto osservato nel cromatogramma Se ski imposta un valore troppo ampio i picchi appaiono pi bassi e pi larghi e potenzialmente meno risolti mentre se si imposta un valore troppo stretto il rumore di fondo aumenta senza motivo In pratica il software utilizza questo valore per impostare la velocit di campionamento dati in modo da raccogliere un numero sufficiente di punti dati sui picchi pi stretti e 15 25 punti per picco Il rivelatore DAD 1290 Infinity in grado di campionare a una frequenza massima pari a 160 Hz se necessario il che consente l acquisizione di un numero sufficiente di punti dati su un picco di larghezza pari a soli 0 1 s L impostazione del tempo di risposta un altro modo per specificare come impostato il filtraggio misu rato in secondi ed pari a circa un terzo del valore di ampiezza del picco che misurato in minuti Indica i
144. so possa essere usato anche lo scambiatore di calore a bassa dispersione Per mantenere la risoluzione del rivelatore a serie di diodi Agilent 1290 Infi nity la cella a cartuccia Max Light ha un basso volume di dispersione volume 01 0 ul e non richiede ulteriore ottimizzazione del volume Nelle situazioni in cui viene utilizzata la cella alternativa Agilent Max Light ad alta sensibilit per ottenere una maggiore sensibilit il volume di cella ottimizzato per l utilizzo di colonne con diametro interno di 3 mm e di 4 6 mm Per il funzionamento della pompa consigliabile impostare il solvente corretto nella schermata di impostazione della pompa Anche se il controllo intelli gente adatta automaticamente al minimo il picco di pressione la compressibi lit del solvente pu avere un effetto sul mantenimento di una velocit di flusso assolutamente corretta ad alta pressione Questo assicura che siano sempre applicati i valori corretti di compressibilit per le fasi mobili utilizzate Sono disponibili funzioni di calibrazione per le pompe binaria e quaternaria Agilent 1290 Infinity Nella Pompa binaria 1290 Infinity il volume di ritardo fisico della pompa dipende principalmente dall utilizzo del miscelatore Jet Weaver Per la rivela zione UV dovrebbe essere sempre usato Jet Weaver ma per la rivelazione con spettrometria di massa l utente pu decidere di bypassare Jet Weaver rimuo vendo 35 ul dal volume di ritardo Questo ha sens
145. sponse Multi page Landscape Report layout for uncalibrated peaks Separately With calibrated peaks Pages Do not report Signal options Destination File setting File prefix Report I File Unique PDF file name Printer Screen Cancel Help Figura 45 Schermata Specifica rapporto Per impostare un semplice rapporto riportante l area percentuale mediante la funzione di Stesura classica di rapporti che stampa su stampante e su un file PDF immettere le seguenti impostazioni nelle sezioni elencate di seguito della schermata Specifica rapporto Sulla scheda Reporting settings Report mode utilizza la stesura classica dei rapporti Style Report Style breve Quantitative results sorted by segnale Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 145 6 Appendice Add Chromatogram Output verificato Chromatogram Output verticale Size Asse del Time 100 della pagina Asse della Response 40 della pagina Destination Printer verificata Screen non verificata File verificato File Setting PDF verificato Unique PDF file name verificato Sulla scheda Quantitation settings e Calculation mode Calculate percentuale Based on area Fare clic su OK per uscire e si aprir la schermata successiva del processo di Modifica tutto il metodo 146 Manual
146. ta per il tamponamento automatico del pH e miscela zione additiva nella Pompa quaternaria 1290 Infinity L innovazione pi significativa rappresentata dall intervallo di pressioni e dalle velocit di flusso utilizzabili da sistema Questi limiti operativi possono essere descritti in termini di intervallo di potenza flusso x pressione dello strumento pi facilmente comprensibile quando rappresentato in forma gra fica Figura 10 pagina 26 Dal diagramma si evince che l intervallo di potenza della pompa del sistema 1290 Infinity consente di operare fino a 1200 bar e a un flusso fino a 2 ml min riducendo a 800 bar quando il flusso aumenta fino a 5 ml min Questi limiti operativi nei quali rientrano tutti i sistemi di UHPLC preesistenti sul mercato rendono possibile il trasferimento diretto dei metodi operati da tutti questi sistemi al sistema 1290 Infinity Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 25 2 26 Sistema LC Agilent 1290 Infinity Descrizione del prodotto Nuove caratteristiche del sistema LC Agilent 1290 Infinity bar 1200 1000 800 600 200 0 0 1 2 3 4 5 ml min Figura 10 Intervallo di potenza dei sistemi UHPLC area operativa data da pressione x velocit di flusso L intervallo di pressione offre la possibilit di lavorare con le pi recenti parti celle di dimensioni inferiori a due micron impaccate in colonne lunghe se si desidera una risoluzione elevata e
147. te regolato per ottenere una separazione pi rapida 1 Modificare le condizioni del metodo analogamente a quanto effettuato nella sezione precedente per introdurre i cambiamenti sotto elencati Velocit di flusso 1 6 ml min Gradiente cambiare il gradiente in modo che la sua pendenza sia inva riata in termini di volume rispetto alla prima analisi Il flusso stato aumentato di 4 volte quindi ridurre il tempo del gradiente di 4 volte impostare il tempo del gradiente su 1 min Tempo finale 1 25 min 2 Salvare il metodo con un nuovo nome 3 Accertarsi di usare un nuovo nome del file in Sample Info 4 Quando la linea di base stabile ed equilibrata iniziare l analisi usando il pulsante Start Single Sample Il cromatogramma dovrebbe risultare simile a quello mostrato sotto con un tempo di analisi di circa 1 min mAU Figura 33 Esempio di cromatogramma della miscela campione contenente fenoni uti lizzando le condizioni di Avvio rapido 108 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Guida introduttiva 5 Questa separazione in realt non ottimizzata con queste condizioni quindi l utente potrebbe acquisire pi esperienza sul funzionamento del sistema cer cando di ottimizzare ulteriormente il metodo Alcune variazioni che potreb bero essere d aiuto sono ridurre la concentrazione del campione diluendo 1 10 e aumentare l intervallo del gradiente e incr
148. testa della pompa A Questo il tubo di uscita proveniente dal canale A del degassatore sotto vuoto Inserire nel tubo la siringa di adescamento con adattatore filettato d Aspirare lentamente il solvente nel tubo fino alla rimozione di tutte le bolle e Rimuovere rapidamente la siringa e l adattatore dal tubo e attaccare quest ultimo alla valvola di controllo in ingresso sulla testa della pompa A 2 Ripetere i passaggi precedenti per il canale del solvente B e la testa della pompa B 3 Se nella pompa installata una valvola di selezione del solvente SSV ese guire ciascuno dei passaggi seguenti per ogni tubo vuoto di solvente rima sto a Scollegare il tubo vuoto a livello della valvola di selezione del solvente Inserire nel tubo la siringa di adescamento con adattatore filettato b Aspirare lentamente il solvente nel tubo fino alla rimozione di tutte le bolle c Rimuovere rapidamente la siringa e l adattatore dal tubo e riattaccare quest ultimo alla valvola di selezione del solvente 4 Nel software ChemStation fare clic con il pulsante destro del mouse sulla sezione della pompa nel diagramma del sistema e quindi selezionare Prime On dal menu contestuale attenzione a non fare confusione con il comando Purge On Altri sistemi di controllo hanno una funzione simile La valvola di spurgo ora commuta i percorsi idraulici A e B sulla posizione di scarico e in contemporanea adescher entrambi i canali Il modulo aspira il so
149. tivi come selettivit e linearit Volume del miscelatore della pompa Per ottenere un rumore di fondo ridotto con rivelazione UV consigliata la configurazione del volume di ritardo standard con il Jet Weaver da 35 ul per il modulo della pompa 1290 Infinity Tale configurazione adatta per la maggior parte delle applicazioni ma quando viene utilizzato il TFA nella fase mobile o in altre situazioni che richiedono maggiore miscelazione consigliato utiliz zare il lato del miscelatore Jet Weaver con volume maggiore per minimizzare il rumore provocato dalla miscelazione Colonne La sensibilit specificata come rapporto segnale rumore signal to noise S N necessit di aumento dell altezza del picco e riduzione del rumore di fondo Ogni riduzione della dispersione del picco garantir il mantenimento dell altezza del picco e sar cos possibile ridurre il volume extra della colonna tramite capillari di connessione corti e dal diametro interno ristretto e mediante raccordi installati correttamente Colonne dal diametro interno pi piccolo dovrebbero garantire un altezza di picco maggiore ed essere quindi Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 61 3 62 Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity adatte per applicazioni con limitate quantit di campione Se possibile iniet tare la stessa quantit di campione in una colonna dal diametro interno pi piccolo la diluizione d
150. to in cui il cambio raggiunge la colonna Il ritardo dipende dal flusso e dal volume di ritardo del sistema In effetti que sto significa che in ogni sistema HPLC all avvio di ogni esecuzione vi un seg mento isocratico aggiuntivo nel profilo del gradiente Di solito il profilo del gradiente viene descritto in termini di impostazioni della miscela alla pompa e il volume di ritardo non viene citato sebbene abbia un effetto sulla cromato grafia Questo effetto diventa pi significativo a basse velocit di flusso e pic coli volumi di colonna e pu avere un grande impatto sulla trasferibilit dei metodi in gradiente importante quindi che separazioni di gradiente rapide abbiano piccoli volumi di ritardo specialmente con colonne di foro strette ad esempio con d i di 2 1 mm come quelle utilizzate spesso nelle rilevazione spettrometrica di massa Il volume di ritardo di un sistema include il volume della pompa nel punto di miscelazione le connessioni tra la pompa e l autocampionatore volume del percorso del flusso attraverso l autocampionatore e le connessioni tra l auto campionatore e la colonna Ad esempio nei metodi HPLC che utilizzano un campione di 5 um con flusso del materiale di 1 ml min vengono di regola utilizzati in una colonna con d i di 4 6 mm e circa 0 2 ml min in una colonna con d i di 2 1 mm con la stessa velocit lineare nella colonna Su un sistema con un volume di ritardo tipico di 1000 ul che utilizza una co
151. to rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Guida introduttiva 5 Preparazione del sistema Accensione del sistema ON Se il sistema non completamente acceso con il software indicante lo stato Pronto eseguire i seguenti passaggi 1 Accendere il computer del sistema e attendere la comparsa del desktop di Windows 2 Attivare l alimentazione elettrica dei moduli LC premendo il pulsante sul lato inferiore sinistro di tutti i moduli Al centro del pulsante sar visibile la luce verde di accensione 3 Aprire il software di controllo sul computer facendo clic sull icona se confi gurato In alternativa possibile selezionare Start gt Tutti i programmi gt Agi lent Technologies gt OpenLAB gt Pannello di controllo OpenLAB Selezionare lo strumento di interesse nel pannello di navigazione alla voce Instrumentse fare clic suLaunch online Il software ChemStation si apre con la schermata Method and Run Control Ini zialmente i moduli sono in modalit di pausa In attesa e nello stato Non pronto ad eccezione dell autocampionatore che viene inizializzato imme diatamente e commutato nello stato Pronto 4 Per accendere ogni modulo singolarmente fare clic con il pulsante destro del mouse sulla rispettiva icona e selezionare Switch module name on dal menu contestuale In alternativa si possono accendere tutti i moduli del sistema simultanea mente facendo clic sul pulsante System On 0ff situato in basso a destra del di
152. tto controllo intelligente grazie a un ciclo di ritorno che assicura che questo smorzamento attivo della pulsazione della pressione fornisca un flusso privo di ondulazioni I pistoni si autoregolano per il controllo delle caratteristiche di compressibilit del solvente e le caratteri stiche idrauliche del sistema per mantenere uno stato privo di ondulazioni Tutto ci abbinato al controllo uniforme del moto che riduce la pulsazione della pressione causata dal movimento del pistone e alla miscelazione effi ciente di piccoli volumi assicura il pi basso rumore possibile della pompa sulle tracce UV Un microprocessore dedicato all interno della pompa si Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 29 2 30 Sistema LC Agilent 1290 Infinity Descrizione del prodotto Componenti del sistema occupa del controllo uniforme del moto e dell ottimizzazione del movimento dei pistoni offrendo un ottimizzazione in tempo reale basata su parametri sta tici e dinamici In aggiunta alle prestazioni cromatografiche queste caratteri stiche rendono la pompa molto silenziosa quando in funzione Quando si usano soluzioni tampone concentrate come fase mobile disponi bile un sistema di lavaggio attivo delle tenute della pompa per prolungarne la durata Una valvola di selezione del solvente consente di formare miscele binarie iso cratiche o gradienti da uno dei due solventi per ogni canale I gradienti binari vengo
153. uale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 59 3 Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity Nelle separazioni isocratiche l aumento del fattore di ritenzione k fornisce una migliore risoluzione dovuta al tempo maggiore di ritenzione del soluto Nelle separazioni in gradiente la ritenzione descritta da k nella seguente equazione pilo F 100 A B V S m Dove k indica il valore k ta periodo di tempo di gradiente o segmento di gradiente min F flusso ml min Vn volume di ritardo della colonna A B modifica della frazione del solvente B durante il gradiente e S costante ca 4 5 per piccole molecole Viene mostrato che possibile aumentare il fattore k e la relativa risoluzione ottenendo un gradiente pi profondo linea guida modifiche da 2 a 5 min un flusso pi elevato e una colonna di volume minore L equazione mostra inoltre in che modo velocizzare un gradiente esistente se il flusso raddop piato ma il gradiente dimezzato k rimane costante e la separazione non sem bra aver subito modifiche Questo per accade solo nella met dei casi Una ricerca pubblicata recentemente ha mostrato come una colonna STM minore a temperature superiori a 40 C possa generare una peak capacity maggiore rispetto a una colonna STM pi lunga grazie all esecuzione pi veloce Fare riferimento a Petersson et al J Sep Sci 31 2346 2357 200
154. uente configurazione vedere Figura 25 pagina 79 e Figura 26 pagina 80 Questa configurazione ottimizza il percorso del flusso nel sistema assicurando il minimo volume di ritardo e riducendo lo spazio necessario sul banco La pompa binaria Agilent 1290 Infinity dovrebbe essere installata sempre in fondo allo stack 78 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Configurazione e installazione del sistema 4 Installazione del modulo Instant Pilot Comparto solventi EC 2 o Rivelatore E E O I Comparto colonne Autocampionatore Pompa a E g L J Figura 25 Configurazione dello stack consigliata per 1290 Infinity con pompa binaria vista anteriore Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 79 4 Configurazione e installazione del sistema Installazione del modulo LAN a ChemStation LC
155. umento consente di memorizzare insieme ai dati flussi di dati monitorati diversi dai segnali del rivelatore Questi vengono principalmente usati a scopi diagnostici e sono elencati qui di seguito e Pompa pressione flusso composizione A B pu essere utile per sovrapporre il profilo del gra diente su un cromatogramma e Comparto colonna termostatato temperatura dello scambiatore di calore sinistro destro e Rivelatore temperatura della scheda temperatura dell unit ottica tensione anodo della lampada UV Appendice 6 Analisi dei dati Dettagli segnale La schermata Signal Details pu anche essere raggiunta direttamente dalla visualizzazione Method and Run Control fare clic con il pulsante destro del mouse sull interfaccia utente grafica sull icona Calibration e quindi selezionare Signal Details dal menu contestuale Nella visualizzazione Analisi dei dati si pu accedere attraverso il menu Calibrazione gt Dettali segnale La schermata Signal Details il passaggio successivo di Edit Entire Method che indica all Analisi dei dati quale tra i segnali acquisiti elaborare La casella a discesa elenca i segnali disponibili compresi i segnali analitici definiti nelle impostazioni del rivelatore nonch i parametri registrati come temperatura flusso composizione pressione e tracce diagnostiche Selezionare un segnale e fare clic su Add to Method per trasferirlo alla tabella Signal Details mostrata nella parte bassa dello sc
156. una colonna con diametro interno di 4 6 mm Aumentare il flusso fino alla velocit desiderata nell arco di 5 minuti 11 Quando la pressione si stabilizzata collegare la colonna al rivelatore 12 Prima dell uso equilibrare la colonna e il rivelatore con 10 volumi di colonna della fase mobile vedere la Tabella 7 pagina 46 per i volumi di colonna 13 Evitare una pressione eccessiva Prima di eseguire qualunque sequenza controllare l intervallo di pressione del proprio gradiente 14 Se i campioni sono dissolti in un solvente altamente organico valutare l uti lizzo di un programma di iniezione per aggiungere un plug di solvente pi debole prima e dopo l aliquota del campione per ridurre il rischio di preci pitazione nella fase mobile a base di soluzione tampone altamente concen trata Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity 73 3 Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity Come prevenire ostruzioni della colonna 74 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Configurazione e installazione del da sistema i ofe 00 Go 1 900 Installazione del software 76 Installazione del modulo 78 Ottimizzazione della configurazione dello stack sistema LC binario 78 Ottimizzazione della configurazione dello stack sistema LC quaternario 83 Adescamento della pomp
157. visto nella Tabella 7 pagina 46 che con questa colonna 0 6 ml min equivale a un flusso di circa 6 volumi di colonna al minuto attraverso il sistema con un volume di ritardo corrispon dente a circa 1 2 volte il volume della colonna Una configurazione caratterizzata da pompa quaternaria Agilent 1290 Infinity autocampionatore 1290 Infinity e comparto colonna termostatato ha un volume di ritardo di 430 uL generando un tempo di ritardo di 0 7 min Questo rappresenta il limite di accettabilit per tempi di gradiente di 3 min Tabella 3 Volumi di ritardo dei moduli LC 1290 Infinity Componenti Volume di ritardo pl Pompa binaria 10 Miscelatore Jet Weaver standard 35 Pompa binaria Jet Weaver 45 Pompa quaternaria 350 Pompa quaternaria Jet Weaver V380 500 Autocampionatore ciclo fisso di 5 pl 5 Autocampionatore standard volume variabile 80 Scambiatore di calore a bassa dispersione del comparto colonna 1 6 Tubi di collegamento d i 0 12 mm per 100 mm 1 1 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Ottimizzazione del sistema LC Agilent 1290 Infinity 3 Tabella 4 Volumi di ritardo delle configurazioni del sistema LC binario 1290 Infinity Configurazioni di sistema Volume di ritardo pl Pompa binaria Autocampionatore a ciclo fisso solo MS 20 Pompa binaria Jet Weaver Ciclo fisso 55 Pompa binaria Autocampionatore standard solo MS 90 Pompa binaria Jet Weaver Aut
158. width Zero Offset Attenuation 1000 gt 0 025 min 0 5 s response time 10 H2 Margin for negative Absorbance Stoptime Posttime 100 4 As PumpAIniector Of 100 Autobalance Lamps on required for analysis WI Prerun WI UV Lamp Figura 41 Schermata Imposta metodo Scheda del rivelatore a serie di diodi e Signals si possono registrare fino a otto segnali cromatogrammi separati Perch un segnale venga considerato per la raccolta spuntare la casella Use Signal per il segnale di interesse vanno definite la lunghezza d onda e l ampiezza di banda e se necessario un segnale di riferimento va spuntata quella casella per definirlo Wavelength imposta la lunghezza d onda centrale nm del segnale Bandwidth imposta l ampiezza nm del segnale lt Reference Wavelength imposta la lunghezza d onda centrale nm della banda di riferimento che viene sottratta dal segnale analitico Reference Bandwidth imposta l ampiezza nm della banda di riferimento e Peakwidth imposta la velocit di raccolta dei dati e la filtrazione del segnale Stop Time Post Time vengono impostati su No Limit Off e questi valori ven gono riportati nella scheda della Pump Tuttavia il Tempo finale del modulo 136 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity Appendice 6 del rivelatore a volte pu differire dal Tempo finale della pompa quando necessario che l analisi d
159. zie alla progettazione accurata del percorso del flusso e a un utilizzo dei materiali in cui l assorbi mento del campione viene ridotto possibile ottenere un effetto memoria di 0 002 anche quando come rivelatore viene utilizzato uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo Le impostazioni di funzionamento dell autocam pionatore consentono all utente di configurare i parametri adatti per ridurre l effetto memoria in tutte le applicazioni che presentano composti che potre bero aderire al sistema possibile utilizzare le seguenti funzioni dell autocampionatore per ridurre l effetto memoria e Lavaggio interno dell ago e Lavaggio esterno dell ago e Backflush della sede dell ago Pulizia della valvola di iniezione Il percorso del flusso compreso l interno dell ago viene lavato continuamente durante il normale funzionamento dello strumento garantendo una buona eli minazione dell effetto memoria nella maggior parte delle situazioni La ridu zione del volume di ritardo automatica Automated delay volume reduction ADVR diminuir il volume di ritardo nonch il lavaggio dell autocampiona tore e non dovrebbe essere usato con gli analiti in quanto l effetto memoria potrebbe risultare un problema possibile lavare l esterno dell ago tramite un vial di lavaggio in una posizione specifica o tramite la porta di lavaggio Se viene scelto un vial di lavaggio all interno di un vassoio specificato dall utente tale vial non dovrebbe

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