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A tutti coloro che hanno creduto in me

1. S A Led N e G Q 3 lt v K lt q 300 300 Lunghezza d onda nm Lunghezza d onda nm Assorbanza u a CHCI3 Ibu Na collagenase Norm MeOH Ibu Na collagenase Norm CHCI3 Ibu Na cute collagenase Norm MeOH Ibu Na cute collagenase Norm CHCI3 Ibu Na Norm MeOH Ibu Na Norm A Assorbanza u a Assorbanza u a 200 300 250 300 Lunghezza d onda nm Lunghezza d onda nm Figura 3 26 Spettri azzerati e normalizzati della fase metanolica A e C e della fase cloro formica B e D Dall azzeramento degli spettri 350 nm confermato quanto descritto su quelli tal quali infatti appare maggiormente evidente l assorbimento intorno ai 265 nm della cute in Collagenase nella fase metanolica Fig 3 26 A e dell IbuNa con cute e Collagenase nella fase cloroformica Fig 3 26 B La normalizzazione della fase metanolica Fig 3 26 C mette in evidenza i picchi dei tre campioni che mostrano un assorbanza differente mentre ci si attendeva una concentrazione identica per i campioni in rosso e in nero La fase cloroformica normalizzata Fig 3 26 D invece fa ipotizzare un assenza totale di farmaco in tutti i campioni a parte la stranezza del campione dell IbuNa con cute e Collagenase Se si passa all analisi concreta dei dati per quantificare il farmaco presente in ciascuna delle due fasi si ottengono i valori descritti in Tabella 3 16 nella quale vengono rappresentate le co
2. Fase mobile Condizione Composizione Concentrazione v v Flusso ML min U WMQ 100 0 5 U WMQ 100 1 0 U eOH WMQ 80 20 0 5 U eOH WMQ 80 20 1 0 P U eOH WMQ 80 20 0 5 G U leOH WMQ 80 20 0 5 P G U leOH WMQ 80 20 0 5 P U eOH WMQ 80 20 1 G U leOH WMQ 80 20 1 P G U eOH WMQ 80 20 1 U ACN WMQ 80 20 0 5 U ACN WMQ 80 20 LO P U ACN WMQ 80 20 0 5 G U ACN WMQ 80 20 0 5 P G U ACN WMQ 80 20 0 5 P U ACN WMQ 80 20 1 G U ACN WMQ 80 20 1 P G U ACN WMQ 80 20 1 E ACN WMQ 80 20 0 5 E ACN WMQ 80 20 1 0 PC ACN WMQ 80 20 0 5 PGC ACN WMQ 80 20 1 0 P CG C ACN WMQ 80 20 0 5 P CG C ACN WMQ 80 20 1 0 P C MeOH WMQ 80 20 0 5 PC MeOH WMQ 80 20 1 0 P CG C MeOH WMQ 80 20 0 5 P CG C MeOH WMQ 80 20 1 0 U union P precolonna CG colonna di guardia C colonna 4 6 6 Analisi Metodica per la quantificazione dell ibuprofene sale sodico La metodica di analisi utilizzata stata il frutto di diverse Modifiche apportate al protocollo utilizzato da M B Brown et al 13 Tali variazioni sono state necessarie a causa di diver si problemi che si sono manifestati nel tempo vedi oltre 4 6 6 1 Descrizione del protocollo originale di riferimento La metodica di quantificazione di Brown et al 13 prevede la separazione dell Ibu forma acida in reverse phase utilizzando una fase mobile pre miscelata in un unica bottiglia costituita da TF 45 ACN THF 73 18 9 8 1 v v e come colonna una Spherisorb RP C18 5 um 150 x 4 6 mm Hichrom Lt
3. DicloNa Conc lbuNa Tempo min ripetizione ug mi iniziale finale TR Area Spalle 1 10 4 2 4 1 10 17 800 2 7 69 10 5 2 4 1 05 17 681 3 10 4 2 3 1 01 16 534 media 10 4 0 06 12 4 0 06 1105 0 045 17 338 3 699 1 1 10 6 2 2 00 18 033 2 3 84 9 7 21 1 07 17 163 3 10 4 2 4 1 01 15 619 media 102405 124 03 11 03 0 038 16 9383 1 222 6 1 10 6 2 0 10 18 994 2 1 92 10 3 2 4 1 05 18 188 3 10 5 2 8 1 00 16 284 media 10502 12 4 0 4 11 05 0 05 17 8220 1 391 6 1 10 6 2 0 16 20 759 2 0 96 10 6 2 0 1 08 16 047 3 10 5 2 8 1 00 16 162 media 10 6 0 06 153305 11 08 0 080 17 656 0 2 687 9 1 10 6 2 1 15 18 021 2 0 48 NT n r n r n r 3 10 5 2 2 1 00 15 643 media 10 5 0 06 PAESE 11 08 0 106 16 832 0 1 681 5 1 10 6 1 9 16 16 864 2 0 24 10 6 1 9 10 16 871 3 10 5 2 1 0 98 18 003 media 10 6 0 06 PAEA 11 08 0 092 17 246 0 655 6 1 10 4 2 4 12 18 628 2 0 12 10 6 1 9 1 09 17 529 Sx 3 10 2 7 3 1 02 16 201 media 104 02 122 0 3 11 08 0 051 17 452 7 1 215 3 1 10 6 2 2 14 17 114 2 0 06 10 4 2 4 12 16 977 3 BRA n r n r n r media 10501 12 3 0 1 11 13 0 014 17 045 5 96 9 1 10 6 2 1 1 16 18 051 2 0 03 10 4 2 1 1 12 17 099 3 DIE n r n r n r media 105 amp 01 Td 00 11 14 0 028 17 575 0 673 2 Come anticipato precedentemente questi dati Tab 3 16 3 17 sono stati utilizzati per calcolare per ogni campione il rapporto delle aree dell IbuNa e del DicloNa Tab 3 18 Questi dati mostrano che
4. Indice Indice Introduzione E Motivazione Della Tesi 1 Kit NanoOrange di quantificazione proteica 2 1 Introduzione 7 2 2 Materiali 7 2 3 Strumenti 8 2 3 1 settaggio del fluorimetro 9 2 4 Metodi 9 2 4 1 Cuvette in plastica 9 2 4 2 Cuvette in vetro 9 2 4 3 Quantificazione delle proteine_ Curva di calibrazione _ 10 2 4 3 1 Curva di calibrazione _Protocollo Originale _ 10 2 4 3 2 Curva di calibrazione _Protocollo Modificato _ 11 2 4 4 Preparazione delle soluzioni di ABSL 11 2 4 5 Analisi dei campioni incogniti provenienti dalla cute 13 2 4 6 Analisi dei dati 13 2 5 Presentazione e discussione dei risultati 14 2 5 1 Esperimenti sul protocollo originario 14 2 5 2 Esperimenti sul protocollo modificato 18 2 6 Esperimenti di validazione della retta su campioni a concentrazione nota 26 2 7 Utilizzo del Kit NanoOrange nella quantificazione proteica della cute 32 2 8 Conclusioni 32 Degradazione e Deproteinizzazione della cute 34 3 1 Introduzione 34 Indice 3 2 Materiali 34 3 3 Strumenti 36 3 4 Metodi 36 3 4 1 Lavaggio delle provette filtranti Amicon 36 3 4 2 Dissoluzione della cute 37 3 4 3 Deproteinizzazione della cute 37 3 4 3 1 Deproteinizzazione per precipitazione in solvente organico 38 3 4 3 2 Deproteinizzazione della cute per filtrazione Amicon 38 3 4 3 3 Criodeproteinizzazione della cute
5. Lo strato pi importante per l assorbimento transcutaneo e sul quale ci soffermeremo pi a lungo lo strato corneo il quale per composizione chimica biologica enzimatica struttura tridimensionale ed organizzazione molecolare e sovra molecolare risulta essere scarsamente permeabile tanto da offrire una difesa importante verso l ambiente esterno 3 Esso costituito infatti da una serie di strati di cellule morte chiamate corneociti unite tra loro grazie ai comeo desmosomi e contemporaneamente immerse in una matrice lipo proteica disposta in doppio strato e costituita da colesterolo e suoi derivati ceramidi acidi grassi e trigliceridi Lo strato cormeo viene descritto come una struttura simile ad un muro dove i corneociti rappresentano i mattoni e la matrice lipo proteica il cemento brick and mortar model 8 Esso pu essere suddiviso in strato comeo compatto pi interno e disgiunto pi esterno in base alla quantit di cormeodesmosomi presenti nel primo la compattezza data dall alto numero di cormeodesmosomi che oltretutto sono ancora intatti mentre dirigendosi verso gli strati pi superficiali i corneodesmosomi subiscono una degradazione 4 L osservazione tridimensionale dello strato comeo mostra che i lipidi si assemblano originando un impaccamento ortorombico laterale molto compatto Tuttavia solo nelle parti pi superficiali dello stesso l impaccamento dei lipidi risulta essere di tipo esagonal
6. Assorbanza u a DicioNa in TF50 0 5 mg mL DicloNa in TFS0 0 25 mg mL DicloNa in TF50 0 125 mg mL DieloNa in TF50 0 0625 mg mL 200 220 240 260 280 300 320 340 360 Lunghezza d onda nm Figura 4 23 Spettri di assorbimento UV Vis del DicloNa in WMQ sinistra e TF 50 destra In entrambi i casi le concentrazioni scelte sono rispettivamente 0 5 0 25 0 125 e 0 0625 mg mL Osservando la Figura 4 23 si nota che sebbene sia presente un picco massimo di assorbimento a 275 nm questo si manifesta nela sua interezza a partire dalla Hplc concentrazione di 62 5 ug mL A concentrazioni pi alte non viene mantenuta nessuna proporzionalit di crescita dell assorbimento in funzione della concentrazione Inoltre a parit di concentrazione 62 5 pg mL diluizione 4 l assorbimento in TF 50 leggermente superiore 1 715 u a a quello in WMQ 1 669 u a Questo comportamento non varia utilizzando PBS come solvente Fig 4 24 Infatti come si pu osservare dalla Figura 4 24 il picco di Massimo assorbimento facilmente individuabile solo a partire dalla diluizione 4 non sapendo la lunghezza d onda di massimo assorbimento dedurla dallo spettro della diluizione 3 sarebbe approssimativo DicloNa in PBS 1 DicloNa in PBS 2 DicloNa in PBS 3 _ DicloNa in PBS 4 DicloNa in PBS 5 DicloNa in PBS 6 DicloNa in PBS 7 DicloNa in PBS 8 DicloNa in PBS 9 d 3 N 5 o 2 o v v
7. Come si pu notare il lavaggio dell iniettore con l iPrOH responsabile della diminuzione dell intensit dei picchi presenti nei primi minuti In particolare nel caso della soluzione ACN WMQ 80 20 v v gli stessi si abbassano da 4 000 a 1 000 mV Fig 4 29 A vs B da circa 100 000 a 1 750 MV nel caso della soluzione MeOH WMQ 80 20 v v Fig 4 29 C vs D ed infine da 4 500 a ca 2 000 mV nel caso della Hplc 1157 fase mobile ACN TF25 27 73 v v Fig 4 29 E vs F Tuttavia permangono ancora alcuni picchetti dopo i 5 minuti ed in alcuni casi anche le derive sono migliorate Pertanto nonostante l evidente miglioramento ottenuto in seguito ai diversi cicli di lavaggio eseguiti i cromatogrammi ottenuti non sono risultati identici a quelli mostrati nella Figura 4 28 i quali vengono presi come riferimento ACN W PRIMA ACN W PRIMA ACN W DOPO ACN W DOPO Intensita mV 8 Intensita mV 5 10 5 10 15 Tempo minuti Tempo minuti MeOH W PRIMA MeOH W PRIMA MeOH W DOPO MeOH W DOPO E 2 tr 2 Intensita mV 10 15 10 15 Tempo minuti Tempo minuti ACN TF 25 PRIMA ACN TF 25 PRIMA ACN TF 25 DOPO ACN TF 25 DOPO Intensita mV Intensita mV 10 15 Tempo minuti Figura 4 29 Cromatogramma di A ACN WMQ 80 20 v v B ingrandimento di A C MeOH WMQ 80 20 v v D ingrandimento di C E ACN TF 25 27 73 v
8. La sequenza dei vari esperimenti che hanno portato al protocollo finale per la validazione dettagliatamente descritta nei risultati Par 2 5 1 e 2 5 2 Qui si riporta solo che il protocollo di validazione stato allestito pensando ad un campione vero incognito cio che non si trovi disciolto in WS ma per esempio in WMQ Pertanto si sono usati 80 uL di campione incognito a determinate concentrazioni 10 8 6 4 2 e 1 ug mL ai quali si sono aggiunti 2 020 mL di WS Una volta allestiti questi campioni sono stati trattati ed analizzati come descritto nel Paragrafo 2 4 3 1 2 4 5 Analisi dei campioni incogniti provenienti dalla cute In una bottiglietta rivestita di carta stagnola sono stati pipettati 0 1 ML di campione e 2 0 ML di WS In seguito stato seguito il protocollo descritto nel Paragrafo 2 4 3 ed stata infine eseguita l analisi fiuorimetrica secondo le modalit e gli accorgimenti descritti nel Paragrafo 2 4 3 dati sperimentali ottenuti dalla tripla lettura di ciascun campione incognito sono stati elaborati secondo quello descritto nel Paragrafo 2 4 3 ed stata calcolata la concentrazione proteica ug mL utilizzando l equazione della curva di calibrazione 2 4 6 Analisi dei dati dati sperimentali sono stati elaborati ed analizzati utilizzando i software Excel 2007 e Origin 6 0 Infine l analisi statistica stata condotta utilizzando lo Student s t test n d e per due popolazioni dis
9. 02 10 9 0 0 30 341 3 508 9 1 10 4 9 10 9 31 134 2 0 06 10 3 Wi 10 9 30 966 3 10 4 6 10 9 30 531 media TO 4 0ji UFER IOS S 00 8087702 3112 1 10 4 10 9 30 846 2 0 03 10 4 2 0 10 9 30 929 3 10 4 7 10 9 30 778 media 10 4 0 0 Io 10 9 0 0 30 851 0 75 6 Tabella 4 28 Rapporti delle aree di IbuNa e DicloNa della retta di controllo a 254 e 265 nm 254 nm 0 ore 265 nm 0 ore ug mL Ibu Diclo Ibu Diclo Ibu Diclo Ibu Diclo 2 3 media Dev st 1 2 3 media Dev st 7 69 0 436 0 415 0 0443 0 431 0 015 0 363 0 356 0 395 0 371 0 021 3 84 0 225 0 211 0 220 0 219 0 007 0 182 0 179 0 184 0 181 0 003 1 92 0 117 0 109 0 121 0 116 0 006 0 091 0 090 0 100 0 094 0 005 0 96 0 079 0 060 0 071 0 070 0 010 0 048 0 048 0 045 0 047 0 002 0 48 0 048 0 032 0 043 0 041 0 008 0 024 0 023 n r 0 024 0 001 0 24 0 029 0 014 0 036 0 026 0 011 0 010 0 013 0 025 0 016 0 008 0 12 nl 0 012 0 020 0 016 0 005 0 005 0 007 n r 0 006 0 001 0 06 n r Dr n r n r n r 0 002 0 004 0 002 0 003 0 001 0 03 n r n r n r n r n r 0 001 n r n r 0 001 0 000 176 Hplc Tabella 4 29 Dati dei cromatogrammi della retta di IbuNa L2 a 254 nm con 24 ore di stufa IbuNa L2 Conc lbuNa Tempo min ripetizione HO ML iniziale finale T R Area Spalle 1 6 6 7 8 7 2 9 836 2 7 69 6 6 7 8 7 2 9 886 3 6 4 7 9 7 2 9 127 media 65 01 78 0 1 200 9 616 424 5 1 6 7 7 6 7 2 4 932 2 3 84 6 7 7 7 7 2 5 240 3 6 5 7 9 7 2 4 916 media 6 6 0 1 Fd 02
10. 5 IbuNa L2 in WMQ Il sale stato preventivamente mantenuto a 100 C per 0 in nero C Cal n 3 24 in rosso C Cal n 4 e 48 in verde C Cal n 5 ore Osservando la Figura 4 21 la prima impressione che le tre curve di calibrazione siano simili dal punto di vista statistico anche perch mostrano delle deviazioni standard meno contenute di quelle presenti nelle Figure 4 19 e 4 20 In questo caso le deviazioni standard per i punti a concentrazione pi alta i e 2 125 1 063 e 0 531 mg mL sono sempre superiori al 5 della media del valore di assorbanza preso in esame Inoltre si potuto osservare che i le curve a 255 nm possono essere Modellizzate con un equazione di primo grado come precedentemente osservato ii le curve a 265 nm possono essere Modellizzate con un equazione di secondo grado come precedentemente osservato iii il limite di rivelabilit di ca 33 ug mL iv Tuttavia se si confrontano i dati delle curve di calibrazione 2 e 3 i valori di quest ultima sono pi alti Il motivo rimane incognito In conclusione 48 ore non sembrano sufficienti per perdere tutta l acqua presente oppure la spettroscopia UV Vis non un metodo abbastanza sensibile per piccole variazioni Infine come descritto nel Paragrafo 4 5 1 4 stata anche allestita una curva di calibrazione n 1 utilizzando IbuNa L2 in AcForm ACN Fig 4 22 A B ed in AcForm MeCH Fig 4 22 C D Come si pu notare tutte e quat
11. Pressione bar Tempo minuti L Cortissimo P CG C L Medio P CG C Pressione bar Pressione bar 100 300 400 O 100 200 300 400 500 600 700 800 Tempo minuti Tempo minuti Figura 4 25 Andamenti pressori di lavaggi effettuati in diverse condizioni accessorie lavaggio cortissimo con colonna e pre colonna A lavaggio medio con colonna e pre colonna B lavaggio cortissimo con colonna pre colonna e colonna di guardia C lavaggio medio con colonna pre colonna e colonna di guardia D Nei seguenti 10 minuti 210 220 min caso A e 410 420 min caso B la fase ACN W 27 73 viene sostituita con MeOH W 73 27 il flusso mantenuto a 0 5 mL min In questi 10 minuti la pressione aumenta repentinamente dopo essere scesa sino a 17 e 9 bar risp caso A e B La rapida variazione sicuramente da attribuire al cambio della fase mobile e graduale diminuzione della WMQ e sostituzione dell ACN con il MeOH Alla fine di questi 10 minuti la pressione arriva a 91 e 83 bar risp caso A e B e nel giro di 2 e 4 minuti arriva a 84 e 77 bar risp caso A e B Si pu pertanto notare che nei due casi la pressione crolla di 7 e 6 bar Se prendiamo come riferimento la pressione che si ha in questo momento 220 min caso A e 420 min caso B si pu notare che la differenza pressoria tra questo preciso istante e la fine della prima fase di lavaggio nei due casi di 12 e 6 bar risp caso A e B Ci pu essere il
12. aggiunta Infine la terza generazione consente la veicolazione transdermica di piccole molecole di macromolecole tra cui proteine e DNA e di vaccini tramite una permeabilizzazione mirata dello strato corneo della pelle 1 In modo particolare tali sistemi di veicolazione di terza generazione indirizzano i propri effetti sullo strato cormeo con microaghi attraverso l ablazione termica la microdermoabrasione l elettroporazione e l ultrasuono cavitazionale Nello specifico microaghi e termoablazione stanno attualmente progredendo attraverso studi clinici per la veicolazione di Macromolecole e di vaccini come l insulina l ormone paratiroideo ed il vaccino influenzale Pertanto utilizzando queste nuove strategie di valorizzazione di seconda e di terza generazione la veicolazione transdermica destinata ad aumentare in modo significativo il proprio impatto sulla Medicina 1 La veicolazione transdermica la via di somministrazione che permette il passaggio di un farmaco attraverso gli strati della cute fino al raggiungimento del derma e dei vasi sanguigni in essa presenti permettendo al farmaco stesso di svolgere un azione sistemica Introduzione Questa via offre numerosi vantaggi quali un miglioramento della compliance del paziente una minore perdita di farmaco una semplice somministrazione applicazione ma anche una semplice rimozione ed interruzione della terapia nonch permette anche di evitare quelli che sono i
13. eventuali impurezze qui presenti possono andare a contaminare le fasi Mobili oppure ostruire il FRIT la precolonna la colonna di guardia ed anche in ultimo la colonna Le bottiglie dedicate ai solventi sono state utilizzate pulite ogni qualvolta siano state effettuate delle analisi consecutive e rabboccate durante la giornata se il volume non era sufficiente all analisi Periodicamente ogni 3 4 mesi vengono lavati anche i pescanti secondo il protocollo prima descritto Par 4 6 4 Tale protocollo stato allestito secondo ci che veniva consigliato nel Manuale dello strumento 55 apportando per delle modifiche a quello che era stato effettuato tempo prima dal tecnico Shimadzu Solo una volta stato seguito un protocollo differente effettuato dal servizio tecnico dello strumento In questo caso si sono utilizzati tre cicli di lavaggio in ultrasuoni i e 1 ciclo WMQ 2 ciclo NaOH acq 2M e 3 ciclo WMQ della durata di 15 minuti ciascuno Tuttavia in seguito a questa operazione si sono avuti degli episodi di opalescenza dell acqua della bottiglietta molto marcati tali da doverla cambiare quasi ogni giorno stato verificato che il terzo lavaggio in acqua non sia sufficiente per neutraliz zare la base Pertanto stato deciso di non utilizzare pi l NaOH ma di seguire alla lettera le istruzioni della casa Madre aumentando il tempo da 15 a 30 minuti L iPrOH polarit 3 9 30 Hplc dovrebbe essere in grado
14. 0 12 ug mL Concentrazioni pi piccole non sarebbero quantificabili con precisione Ancor di pi in questo caso specifico nel quale si sono avuti problemi con la fase mobile Pertanto nelle condizioni di questa analisi si pu affermare che il limite di rivelamento di ca 0 12 ug mL Continuando con l analisi dei dati in Tabella 4 35 si pu riassumere che l i tempi di ritenzione del DicloNa risultano essere tutti identici a 10 2 minuti per le ultime due concentrazioni 0 6 0 03 ug mL stato invece osservato un anticipo dell uscita del picco a 4 9 minuti per tutte le altre concentrazioni 7 69 0 12 ug mL dovuto al rabboccamento della fase Mobile premiscelata dall operatore Rispetto ai dati mostrati in Tabella 4 17 e 4 20 si pu osservare che queste ultime analisi risultano avere dei tempi anticipati i e 9 90 min nel caso delle basse concentrazioni ma ritardati per le concentrazioni 7 69 0 12 ug mL Le aree dei 9 campioni del DicloNa nelle diverse repliche oscillano in un intervallo compreso tra 17 436 e 19 139 unit arbitrarie Rispetto all area teorica ca 19 500 u a calcolata sulla base delle analisi del campione a concentrazione 1 000 ug mL Tab 4 17 ed a quello a concentrazione 500 ug mL Tab 4 20 i campioni a concentrazione 0 98 ug mL risultano essere pi bassi Il confronto con la Tabella 4 30 mostra una similarit nella quantificazione la quale non mostra particolari differenze i e 17 253 e
15. 0 99883 9 41168 11 b2 1 08676 0 16665 Albumina pg mL Albumina ug mL Figura 2 6 Confronto tra le due rette eseguite a distanza di 6 e 11 mesi 2 6 Esperimenti di validazione della retta su campioni a concentrazione nota Quantificazione proteica_Kit NanoOrange_ Sono state fatte delle prove per testare il corretto funzionamento del kit nella quantificazione proteica su campioni a concentrazione nota di ABSL1 Si operato preparando una soluzione madre di Albumina come descritto nel Paragrafo 2 4 4 la quale stata utilizzata per testare quale fosse il volume di campione pi adatto da utilizzare nell analisi di quantificazione Contemporaneamente alla validazione della curva di calibrazione stato necessario mettere a punto il volume esatto di campione incognito da analizzare con il kit Per questo Motivo nella prima prova sono stati utilizzati due diversi volumi di campione selezionati secondo l indicazione della casa madre sull utilizzo di un 4 di campione incognito 84 e 100 uL I campioni sono stati successivamente analizzati col kit Par 2 4 3 ed i dati ottenuti sono stati elaborati come descritto nel Paragrafo 2 4 3 1 La Tabella 2 13 mostra la composizione del campione in ABSL2 e WS e la fluorescenza ottenuta dalle prove dei due diversi volumi di campione Nella colonna occupata dai valori di fluorescenza sono indicati i dati ottenuti dal fluorimetro di WMQ delle cuvette W campione C campione normalizzato ri
16. 18 000 vs 21 000 u a possibile attribuire tale avvenimento all utilizzo della medesima soluzione di DicloNa preparata per l esperimento 1 conservata nel bancone del laboratorio Evidentemente nonostante l accurata chiusura col parafilm non stata evitata una sua concentrazione data dall evaporazione del solvente se vengono presi in considerazione i rapporti IbuNa L2 DicloNa e g 7 69 ug ml emerge un risultato che conferma l efficacia della permanenza in stufa della polvere ad entrambe le lunghezze d onda 0 394 vs 0 407 per 254 nm 0 340 vs 0 354 per 265 nm Considerando invece i rapporti tra le concentrazioni emerso un rispetto maggiore dell andamento della serialit delle diluizioni sino alla concentrazione 0 24 ug mL limite per il quale il rapporto molto vicino al valore 2 Hplc x In conclusione possibile affermare che per l esperimento 2 non stata notata alcuna evidente differenza tra le analisi di controllo e quelle eseguite alle 48 ore nonostante per queste ultime ci fosse come possibile variabile la preparazione ex novo delle soluzioni Madri del tampone Effettuare un confronto tra i due esperimenti 1 e 2 potrebbe essere utile per verificare l efficacia della conservazione del farmaco all interno della campana di vetro in condizioni di sottovuoto Per fare questo si sono confrontate le aree dell IpbuNa L2 di controllo dell esperimento 1 a 254 nm Tab 4 24 con le aree del farmaco di controllo alla
17. 2 0 24 7 4 8 7 8 405 3 7 4 8 7 8 nr media 7 4 0 0 8 amp 1 00 7 8 0 0 362 0 60 81 1 7 5 8 7 8 138 2 0 12 7 4 8 0 7 8 204 3 7 4 8 0 7 8 n r media 14 0 8 0 0 0 Te 00 TIZIO 46 7 1 7 6 7 9 7 7 74 2 0 06 7 4 7 8 7 8 121 3 7 5 7 9 7 6 75 media 45 0 l 7 9 0 1 7 7 0 1 90 0 26 9 1 7 4 7 6 7 5 34 2 0 03 7 4 7 6 7 5 n r 3 Hih n r nr n r media 74 1050 76 0 0 Zip 0 0 34 0 0 0 Tabella 4 27 Dati dei cromatogrammi della retta di DicloNa a 265 nm Hplc 175 DicloNa Conc DicloNa Tempo min ripetizione Hg ML iniziale finale T R Area Spalle 1 10 3 9 10 9 31 209 2 7 69 10 3 9 10 9 31 225 3 10 3 9 10 9 30 052 media 10 3 0 0 11 9 0 0 10 9 0 0 30 828 7 672 7 1 10 3 9 10 9 30 952 2 3 84 10 3 9 10 9 30 949 3 10 3 9 10 9 31 399 media TO 3 0 0 11 9 0 0 109 0 0 31 100 0 258 9 10 2 8 10 9 30 384 2 1 92 10 3 8 10 9 30 553 3 10 2 8 10 9 30 474 media 10 2 0 1 11 8 0 0 10 9 0 0 30 470 3 84 6 1 10 2 8 10 9 28 073 2 0 96 10 3 8 10 9 30 997 3 10 2 8 10 9 31 046 media 10 2 0 1 11 8 0 0 10 9 0 0 30 038 7 1 702 5 1 10 4 2 0 10 9 29 982 2 0 48 10 3 8 10 9 31 414 3 10 4 7 10 9 30 124 media 10 4 0 1 I3 02 10 9 0 0 30 506 7 789 0 1 10 4 8 10 9 30 866 2 0 24 10 4 7 10 9 31 611 3 10 4 8 10 9 30 581 media 10 4 0 1 11 8 0 2 10 9 0 0 1 079 9 531 8 1 10 3 9 10 9 29 800 2 0 12 10 3 6 10 9 30 810 3 10 3 il 10 9 30 414 media 103 00 TI
18. 2 0 24 9 8 11 0 0 3 20 289 3 9 8 11 0 0 3 21 802 media 9 8 0 1 TL0 00 10 3 0 0 21 179 7 791 4 1 9 9 11 0 0 4 21 353 2 0 12 9 8 11 0 0 3 21 784 3 9 7 11 0 0 3 21 627 media 98 0 1000 10 3 0 0 21 588 0 218 1 1 9 8 11 0 0 4 21 089 2 0 06 9 5 10 9 0 2 19 728 3 9 8 11 0 0 2 21 167 media 9 7 0 2 1AL0 10 3 01 20 661 3 809 2 1 9 0 10 1 9 6 21 124 2 0 03 9 2 10 2 9 7 19 935 3 9 3 10 2 9 7 20 878 media 9 2 0 2 10201 47 S0 20 645 7 627 6 190 Hplc Tabella 4 46 Dati dei cromatogrammi della retta di lbuNa a 265 nm trattati con 48 ore di stufa IbuNa L2 Conc lbuNa Tempo min ripetizione ug mi iniziale finale TR Area Spalle 1 7 1 8 0 7 5 12 845 2 7 69 7 1 8 0 7 4 13 304 3 7 1 8 0 7 5 14 107 media 7 1 20 0 8 0 0 0 HODA 13 418 7 638 8 1 7 3 8 2 7 7 6 376 2 3 84 7 4 8 1 7 7 6 624 3 7 4 8 1 7 7 6 931 media 740 1 8 1 0 1 13 00 6 643 7 278 0 1 7 4 8 2 7 7 3 259 2 1 92 7 4 8 2 7 7 3 291 3 7 4 8 1 7 7 3 474 media 7 4 0 0 8 2 0 1 7 7 0 0 3 341 3 116 0 1 7 4 8 2 7 7 1 614 2 0 96 7 4 8 1 7 7 1 645 3 7 5 8 1 7 7 1 742 media 740 1 8 1 0 1 1 9 0 0 1 667 0 66 8 1 7 4 8 0 7 7 764 2 0 48 7 4 8 0 7 7 868 3 7 4 8 1 7 7 878 media 7 4 0 0 8 0 0 1 4 7 2 00 836 7 63 1 1 7 4 7 9 7 7 387 2 0 24 7 4 8 0 7 7 420 3 7 4 8 0 7 7 426 media 7 4 0 0 80 0 1 7 7 00 411 0 21 0 1 7 5 7 9 7 7 188 2 0 12 7 4 7 9 7 7 228 3 7 4 7 9 7 7 236 media 74 0 1 19 00 LI 0A 217 9 20 4 1 7
19. 2 0 74 1 148 5 156 7 276 5 225 6 253 1 102 4 77 1 96 3 75 3 70 2 91 5 1 0 74 2 146 0 156 7 234 0 183 0 97 0 59 8 37 1 40 3 32 7 30 2 35 5 0 8 74 3 145 7 156 7 238 0 183 0 200 9 63 8 37 3 44 2 36 7 30 4 39 4 0 6 70 5 143 9 156 4 213 0 168 6 77 6 42 5 24 7 21 2 15 4 17 8 16 4 0 3 69 2 143 0 155 0 179 2 151 3 70 1 9 9 8 2 15 1 17 2 1 4 10 3 0 1 163 141 7 154 1 177 5 150 1 66 2 14 5 8 4 12 1 12 6 1 5 7 3 Dall osservazione dei dati finali ottenuti CF sembra emergere un miglioramento della ripetibilit ed una conseguente similarit dei valori nelle tre repliche fatta eccezione per il campione n 5 nel quale la terza triplicato ha una fluorescenza molto pi alta rispetto alle altre due I valori ottenuti delle tre curve sono stati rappresentati graficamente sia mettendo assieme il replicato Fig 2 5 A e sia rappresentando la media dei valori con la propria regressione lineare Fig 2 5 B che meglio rappresenta il proprio andamento nella quale sono stati mascherati i punti relativi ai campioni n 5 e n 2 Il grafico rappresentato in Figura 2 5 A mostra una quasi totale sovrapposizione dei punti fatta eccezione per il campione n 5 della sera che mostra una fluorescenza pi alta La regressione lineare ottenuta dalla media del triplicato Fig 2 5 B mostra un valore di R 0 999 da considerarsi quindi ottima in quanto molto vicina a 1 Quantificazione Proteica_Kit NanoOrange_ m 17 11 11 18 11 11 Mattina
20. A 18 11 11 Sera 5 8 8 Fluorescenza u a en 8 Y B X Parameter Value Error 0 85912 N P 12 59722 9 lt 0 0001 S z o N o d 2 S 3 r o 6 Albumina g mL Albumina g mL Figura 2 5 Triplicato della curva di calibrazione A e regressione lineare della rispettiva media B Gli esperimenti che riguardavano l utilizzo del kit sono stati interrotti per qualche tempo per poi riprendere a distanza di sei ed undici mesi In entrambi i periodi gli esperimenti sono stati preceduti dall allestimento della curva di calibrazione in singola copia per verificare se l andamento fosse simile a quella Messa a punto in passato Nella Figura 2 6 rappresentato il confronto tra le due curve di calibrazione effettuate a distanza di 6 Fig 2 6 A e 11 mesi Fig 2 6 B dalla messa a punto della prima curva Dai grafici si evince che la Figura 2 6 A rappresenta una regressione lineare mentre la Figura 2 6 B mostra un andamento diverso infatti stata interpolata attraverso un equazione polinomiale Dal risultato di tale confronto stato deciso di effettuare una curva di calibrazione ogni qualvolta si dovesse realizzare un esperimento in cui fosse previsto l utilizzo del kit gt m 14 03 2012 m 22 10 2012 YEbt xM b2 x 2 Y B X S N c Q 0 pA g o 2 w Chi 2 25 59445 R 2 0 99903 Fluorescenza u a Parameter Value Error B 50 07 0 64172 R P b1 51 00521 1 45076
21. G xV 1 dove C e V rappresentano rispettivamente la concentrazione della soluzione di HCI acq al 37 9 ed il volume incognito della stessa da prelevare mentre C e V rappresentano rispettivamente la concentrazione ed il volume finale della soluzione di HCI acq al 4 circa che si deve preparare Dopo aver aggiustato il pH del TF 50 a 7 la soluzione stata versata nuovamente nel matraccio ed infine stata portata a volume con WMQ Il pH della soluzione finale stato rimisurato come precedentemente descritto per confermare che il valore precedentemente ottenuto fosse rimasto tale Hplc Dovendo filtrare il tampone prima del suo utilizzo in HPLC e per verificare potenziali interazioni tra la membrana filtrante ed il TF 50 che potessero indurre la precipitazione di sali nel tempo lo stesso stato filtrato sottovuoto utilizzando filtri in microfibra di vetro pori 0 7 um o filtri in acetato di cellulosa Z pori 0 22 um In entrambi i casi la prima porzione di filtrato stata usata per avvinare la bottiglia di raccolta ed stata scartata Della seconda porzione del filtrato una parte circa 50 ML stata lasciata a riposo per 63 giorni in provette da 50 a temperatura ambiente e al riparo dalla luce la restante parte stata utilizzata per la preparazione di due fasi Mobili 2 vedi oltre Tab 4 1 una costituita dal TF 50 filtrato con filtri in microfibra di vetro e l altra costituita
22. Sci 2013 36 3896 3902 R Mohamed J L Campbell J Cooper White G Dimeski and C Punyadeera The impact of saliva collection and processing methods on CRP IgE and Myoglobin immunoassays Clinical and Translational Medicine2012 1 19 M Moriarty A Lee B O Connell M Lehane H Keeley A Fure The Application and Validation of HybridSPE Precipitation Cartridge Technology for the Rapid Clean up of Serum Matrices from Phospholipids for the Clinical Analysis of Serotonin Dopamine and Melatonin Chromatographia 2012 75 1257 1269 DOI 10 1007 s10337 012 2330 5 V Pucci S Di Palma A Alfieri F Bonelli E Monteagudo A novel strategy for reducing phospholipids based matrix effect in LC ESI MS bioanalysis by means of HybridSPE Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 50 2009 867 871 S J Iverson S L C Lang and M H Cooper Comparison of the Bligh and Dyer and Folch Methods for Total Lipid Determination in a Broad Range of Marine Tissue Lipids 36 1283 1287 November 2001 E Cequier Sanchez C Rodriguez A G Ravelo And R Zarate Dichloromethane as a Solvent for Lipid Extraction and Assessment of Lipid Classes and Fatty Acids from Samples of Different Natures J Agric Food Chem 2008 56 4297 4303 A Hara and N S Radin Lipid Extraction of Tissues with a Low Toxicity Solent Analytical Biochemistry 90 420 426 1978 26 27 28 29 30 31 32 33 Bibliografia C Chia
23. Tempo minuti Tempo minuti Figura 4 35 Cromatogrammi di IbuNa L1 e DicloNa ottenuti con le FM 13 16 Campioni entrambe le molecole sono sciolte 1 mg mL in FM 2 il volume di iniezione 20 yL filtrati con Acrodisc Colonna accessoriata con CG del tipo CC Lunghezza d onda di rilevamento 254 nm Flusso 1 mL min Fase mobile di eluizione in leggenda filtrazione solventi filtri Wnatman in fibra di vetro La Figura 4 35 mette in evidenza come la variazione della percentuale di ACN abbia portato ad un incremento delle spalle presenti alla destra del picco dell IbuNa rispetto alla Figura 4 34 D altro canto possibile notare un miglioramento nei cromatogrammi del DicloNa rispetto alla Fig 4 34 i quali evidenziano una scomparsa della spalla per le FM 13 e 16 mentre per la FM 14 la spalla permane ma in maniera molto meno accentuata e anche il picchetto alla sua destra risulta essere pi regolare e pi vicino alla linea di base Inoltre possibile notare come nella FM 15 caratterizzata dalla percentuale inferiore di ACN rispetto alle altre tre ci sia un notevole spostamento dei picchi verso destra Tale movimento non ha permesso la visualizzazione del DicloNa nella corsa cromatografica dei 20 minuti in quanto il suo tempo di ritenzione si modificato a tal punto da oltrepassare la durata dell analisi Questo comporterebbe la necessit di una corsa cromatografica troppo lunga non conveniente in termini di tempo e quant
24. analizzati col kit NanoOrange 80 uL di ABSL2 in tre repliche seguendo la medesima modalit di preparazione analisi ed elaborazione dati utilizzate negli esperimenti precedenti Nella Tabella 2 17 vengono mostrati i dati relativi all esperimento eseguito elencando quanto volume stato utilizzato di ABSL2 e quanto di WS e le fluorescenze relative al bianco della cuvetta W campione C al campione normalizzato rispetto al suo bianco CN e rispetto al kit CF Infine nella prima e nella seconda colonna da destra possibile Quantificazione Proteica_Kit NanoOrange_ fare un confronto tra la concentrazione di ABSL2 attesa Teorica e quella realmente quantificata col kit Trovata Tabella 2 17 Quantificazione proteica di 80 uL 10 ug mL Composizione ul Fluorescenza Albumina ug mL Campione ABSL WS W C CN CF Trovata Teorica bianco 0 2100 136 97 151 50 7 13 0 00 1 80 2020 140 13 159 93 11 37 4 23 0 26 0 38 80 2020 140 90 155 20 19 03 11 90 0 42 0 38 3 80 2020 141 03 144 10 14 17 7 03 0 32 0 38 Le concentrazioni trovate mostrano un oscillazione che va dai 0 26 ai 0 42 ed infine ai 0 32 ug ML e se si calcola la Media dei tre campioni si ottiene una concentrazione pari a 0 33 4ug mML che risulta essere una quantificazione inferiore a quella attesa ma che nonostante questo da considerarsi un risultato positivo rispetto agli esperimenti eseguiti precedentemente Le prove fatte non hanno preso in conside
25. in ACN AcForm ACN 3 Preparazione dell agente precipitante in una bottiglietta da 20 sono stati pipettati 0 1 mL di AcForm e 9 9 mL di ACN utilizzando esclusivamente pipette in vetro stata cos ottenuta una soluzione di AcForm al 1 in ACN AcForm ACN 1 Degradazione e Deproteinizzazione della cute Entrambe le soluzioni di AcForm sono state preparate sotto cappa chimica mantenendo il vetro protettivo il pi abbassato possibile e conservate a temperatura ambiente col tappo ben chiuso e parafilmate Precipitazione off line in una microprovetta stata pipettata la cute disciolta 0 3 mL ed AcForm ACN 1 0 9 mL in rapporto 1 3 v v Il campione cos costituito stato spipettato per 2 3 minuti e successivamente stato centrifugato C1 5 minuti 988 g rotore ad angolo fisso con raggio di 84 cm Il surnatante ottenuto stato successivamente filtrato attraverso le Spe Condizionamento della cartuccia al suo interno sono stati pipettati 0 6 mL di AcForm ACN 3 i quali spinti dalla forza della pompa da vuoto hanno attraversato l intera cartuccia L azione del sottovuoto stata interrotta qualche istante prima che il solvente fosse completamente fuoriuscito Tale accorgimento ha evitato l essiccamento del filtro In seguito al recupero del solvente in un beaker stato possibile procedere con l inserimento dei tubi di raccolta dello strumento Filtrazione in Spe nella cartuccia condizionata sono s
26. iniziale Il protocollo di lavaggio utilizzato tiene conto di tutte queste informazioni i lavaggi in THF sono stati esclusi perch un solvente incompatibile con i tubi in peek 29 30 Pertanto nella prima fase Tab 4 3 a partire dalla fase mobile 2 o 17 ACN TF 50 il tampone viene contemporaneamente sostituito con WMQ Il contenuto in acqua in questa fase del 73 percentuale leggermente inferiore a quella consigliata 80 90 tuttavia i volumi di lavaggio sono da 2 a 7 volte pi grandi La seconda fase Tab 4 3 metanolica pur rientrando come concentrazioni i e MeOH WMQ 73 27 vedi testo in corsivo nella pagina precedente molto pi lunga di quanto richiesto 4 14 volte mentre l ultima fase Tab 4 3 serve in parte per eliminare le sostanze Mediamente polari e riportare la colonna nelle condizioni di conservazione Pensando che i nostri campioni non erano delle miscele complesse il protocollo ci sembrato adeguato Alla fine dei lavaggi sono stati controllati i cromatogrammi e o gli andamenti pressori Fig 4 25 dati raccolti in Figura 4 25 mostrano un andamento pressorio simile in tutti e quattro i casi Fig 4 25 A D Tuttavia l analisi attenta dei grafici permette di identificare alcune differenze che possono essere imputate agli accessori presenti P C vs PC CG C Iniziamo ad osservare i primi due casi proposti in Figura 3 23 A e B condizione P C Nei primi 10 minuti la fase eluente cambia
27. media 6 8 Qi ToU da 200 620 0 0 0 1 n r n r n r n r 2 0 12 n r PT n r n r 3 n r n r n r n r media n r GRE TE n r 1 n r n r n r n r 2 0 06 n r n r n r n r 3 n r n r n r n r media mF N n r lata 1 n r n r n r n r 2 0 03 n r n r n r n r 3 n r n r n r n r media af Af Ali TET Tabella 4 32 Dati dei cromatogrammi della retta di DicloNa a 265nm con 24 ore di stufa Hplc 179 DicloNa Conc DicloNa Tempo min ripetizione ug mL iniziale finale T R Area Spalle 1 9 4 11 0 0 2 31 919 2 7 69 9 6 10 9 0 2 32 490 3 9 7 10 8 0 2 31 813 media 9 6 0 2 10 9 0 1 102 0 0 32 074 0 364 1 9 6 11 1 0 2 30 030 2 3 84 9 6 11 0 0 2 31 408 3 9 5 11 0 0 2 30 607 media 962 04 11 001 10 2 0 0 30 681 7 692 0 1 9 6 11 1 0 2 31 340 2 1 92 9 7 11 1 0 2 30 250 3 9 7 11 1 0 2 30 973 media 9 7 0 1 m00 10 2 0 0 30 854 3 554 6 1 9 6 11 0 0 2 30 335 2 0 96 9 6 10 9 0 2 29 446 3 9 6 11 0 0 2 29 126 media 9 6 0 0 ILO 0 1 10 2 10 0 29 635 7 626 4 1 9 5 11 1 0 2 33 403 2 0 48 9 7 10 9 0 2 30 944 3 9 7 11 0 0 2 30 414 media JEE p 1001 102 00 31 587 0 1594 9 1 9 6 11 0 2 31 536 2 0 24 9 5 11 2 0 2 30 788 3 9 4 11 1 0 2 31 471 media 9 5 0 1 Mad ei 10 2 0 0 31 265 0 414 4 1 9 6 0 2 29 964 2 0 12 9 7 11 1 0 2 30 257 3 9 6 0 2 30 928 media 9 6 0 1 TS 10 2 0 0 30 383 0 494 2 1 9 6 11 0 0 2 30 111 2 0 06 9 7 11 0 0 2 31 594 3 9 6 10 9 0 2 30
28. metodo ma per quanto riguarda la comparazione tra i due metodi la filtrazione in Acrodisc non sembra apportare un ulteriore apporto all eliminazione proteica Tabella 3 5 Risultati della quantificazione proteica con e senza filtrazione Acrodisc aggiuntiva con lavaggio Fluorescenza u a Proteine Campione Metodo ugimL W C CN CF 1 Bianco 151 8 162 0 10 1 0 0 2 Amicon 155 3 748 1 592 8 582 7 11 7 3 Amicon 156 0 744 3 588 4 578 2 11 6 4 Amicon 155 4 736 1 580 1 570 6 11 5 1 Bianco 149 2 159 7 10 5 0 0 2 Amicon Acrodisc 155 6 741 6 586 0 575 5 11 6 3 Amicon Acrodisc 156 8 737 2 580 4 569 8 11 5 4 Amicon Acrodisc 156 6 708 0 551 4 540 8 10 9 Concludendo quindi possibile affermare che il metodo che ha mostrato una maggior efficacia e ripetibilit stato quello riguardante l utilizzo delle Amicon Oltretutto risulta essere anche il metodo pi veloce e pratico possibile apprezzare la loro efficacia anche in letteratura dove riscontrabile il loro successo d utilizzo anche in campioni di sangue umano 19 e di saliva 20 3 5 2 2 Hybrid Spe Gli esperimenti di deproteinizzazione della cute sono proseguiti utilizzando un metodo alternativo a quelli descritti precedentemente nel quale viene sfruttata la particolare attitudine degli ioni zirconia presenti nel filtro delle cartucce di legare e quindi di intrappolare lipidi e proteine Degradazione e deproteinizzazione della cute La precipitazione a
29. presente nessun assorbimento Successivamente i dati dei campioni vengono normalizzati rispetto al loro bianco semplicemente per sottrazione alle lunghezze d onda di 255 e 265 nm Hplc dati cos ottenuti vengono messi in relazione con le concentrazioni corrispondenti ed utilizzati per allestire dei grafici concentrazione vs assorbimento Origin 6 0 Questo si pu fare per il triplicato o per la Media dei valori 1 dati derivanti dalla media delle tre prove sono infine soggetti a regressione lineare o polinomiale al fine di trovare l equazione che meglio Modellizza l andamento dei dati rispettivamente per confronto dei valori di R e R Infine le curve di calibrazione sono state validate Le curve 1 e 2 sono state validate preparando due soluzioni madre con concentrazione pari a 17 mg mL e 9 diluizioni seriali a partire da questa i punti messi a confronto per la validazione sono la diluizione 3 2 125 mg mL la 6 0 2656 mg mL la 8 0 066 mg mL e la 9 0 033 mg mL Le curve 3 5 sono state validate con due soluzioni aventi concentrazione 2 125 e 0 066 mg mL ottenute per diluizioni seriali a partire da una soluzione madre avente concentrazione 17 mg mL Le curve 6 e 7 non sono state validate Tutte le soluzioni preparate per la validazione sono state trattate come se fossero campioni a concentrazione incognita 4 5 1 5 Spettroscopia IR Sono state effettuate delle analisi spettrofotometriche IR dei due lotti di IbuNa e di
30. si fatta anche una indagine qualitativa mediante spettrofotometria UV Vis Par 4 5 1 4 In particolare sono state analizzate le soluzioni in WMQ ed in TF 50 alle concentrazioni di 62 5 125 250 500 ug mL ottenute per diluizione seriale a partire dalla soluzione madre corrispondente 1 mg mL Sono state analizzate anche 14 diluizioni seriali in PBS ognuna avente concentrazione pari alla met della precedente partendo dalla soluzione Madre 1 mg mL 4 6 Cromatografia liquida ad alta pressione La cromatografia liquida ad alta pressione HPLC una tecnica cromatografica che permette di separare una volta trovate le condizioni ideali i componenti di una miscela complessa attraverso le interazioni che si possono stabilire tra gli stessi la fase stazionaria della colonna cromatografica colonna e la fase mobile che fluisce attraverso quest ultima trasportando il campione al suo interno 27 Pertanto si evince che dall intensit dell interazioni tra i sopraccitati elementi dipender la durata della corsa del campione cio il tempo necessario affinch ogni singolo componente fuoriesca dalla Hplc colonna 27 Questo tempo prende il nome di tempo di ritenzione ed uno dei parametri pi importanti per l individuazione della e molecola e d interesse 27 Questa breve introduzione ci permette di dire che le metodiche di separazione validate constano di una parte strumentale come fatto lo strumento e come
31. unit arbitrarie In questo caso non possibile effettuare un confronto con una concentrazione teorica in quanto le rette della Tab 4 20 non sono state analizzate a 265 nm ma possibile fare un paragone con le Tabelle 4 26 e 4 31 con le quali emerge un area comune di ca 13 700 in tutti e tre i casi 3 La forma dei picchi del IbuNa L2 nei vari cromatogrammi n 9 x 3 non mostrati presenta una simmetria 1 4 Gli intervalli di concentrazione in cui stato possibile quantificare senza problemi l buNa L2 sono 7 69 0 12 ug mL Concentrazioni pi piccole non sarebbero quantificabili con precisione Peranto nelle condizioni di questa analisi si pu affermare che il limite di rivelamento di ca 0 12 ug mL Continuando con l analisi dei dati in Tabella 4 37 si pu riassumere che 1 i tempi di ritenzione del DicloNa risultano essere a 10 2 minuti 0 12 0 03 ug mL evidente un anticipazione i e 4 9 min per le concentrazioni 7 69 0 24 ug mL data dalla differente fase mobile immessa dall operatore Rispetto ai dati mostrati in Tabella 4 17 e 4 20 si pu osservare che queste ultime analisi risultano avere dei tempi anticipati i e 9 90 min tale osservazione possibile farla anche nei confronti della Tabella 4 26 e 4 31 rispetto ai quali i tempi sono anticipati di 7 secondi i e 10 9 min 2 Le aree dei 9 campioni del DicloNa nelle diverse repliche oscillano in un intervallo compreso tra 29 467 e 32 580 un
32. 027 0 005 0 024 0 004 0 24 0 012 0 001 0 012 0 000 0 013 0 001 0 011 0 001 0 12 0 006 0 000 0 006 0 001 0 007 0 001 0 006 0 001 0 06 0 004 0 000 0 003 0 001 0 004 0 000 0 003 0 000 0 03 nr nr 0 001 0 001 0 002 0 001 0 001 0 000 Tabella 4 50 Confronto tra IbuNa DicloNa a 254 e 265 nm trattati con 0 48 ore di stufa Esperimento 1 254 nm 0 ore 265 nm 0 ore 254 nm 48 ore 265 nm 48 ore 4g mL Ibu Diclo Ibu Diclo Ibu Diclo Ibu Diclo media Dev st media Dev st media Dev st media Dev st 7 69 0 431 0 015 0 371 0 021 0 518 0 003 0 448 0 003 3 84 0 219 0 007 0 181 0 003 0 261 0 020 0 223 0 016 1 92 0 116 0 006 0 094 0 005 0 131 0 009 0 114 0 009 0 96 0 070 0 010 0 047 0 002 0 069 0 008 0 060 0 007 0 48 0 041 0 008 0 024 0 000 0 031 0 002 0 029 0 003 0 24 0 026 0 011 0 016 0 008 0 015 0 001 0 014 0 000 0 12 0 023 0 013 0 009 0 006 0 008 0 001 0 009 0 001 0 06 0 013 0 006 0 003 0 001 0 020 0 007 0 006 0 002 0 03 0 002 0 004 0 001 0 001 0 018 0 001 0 010 0 000 4 9 6 Influenza della temperatura sul campione Nella messa a punto della metodica cromatografica stato studiato anche il comportamento del farmaco in seguito alla variazione del settaggio dallo strumento stesso della temperatura del campione Le analisi finora effettuate sono state caratterizzate dal campione iniettato a temperatura ambiente 30 C monitorata anche dal sistema dello strumento stesso in aggiunta si anche provato a portarlo ad una temperatura di 25 C termostata
33. 0l 8 3 0 1 7 8 0 0 4 056 7 134 0 1 7 1 8 2 7 8 2 129 2 1 92 7 4 8 2 7 8 1 984 3 7 2 8 3 7 8 2 213 media 17 2 0 2 8 2 0 1 7 8 0 0 2 108 7 115 8 1 7 1 8 3 7 8 1 334 Sx 2 0 96 7 4 8 2 7 8 1 095 Sx 3 7 1 8 2 7 8 1 314 Sx media Tg 402 8 201 7 8 0 0 1 247 7 132 6 1 7 1 8 3 7 8 864 Sx 2 0 48 7 4 8 2 7 8 600 Sx 3 7 2 8 1 7 8 777 Sx media K2 U2 8 2 amp U 78 DIO 747 0 134 5 1 Tal 8 0 7 7 537 2 0 24 7 5 8 0 7 8 270 Sx 3 7 5 8 2 7 8 n r media ZA 02 8 1 0 1 AEN 403 5 188 8 1 6 9 7 9 7 7 n r 2 0 12 7 5 7 9 7 6 225 3 7 4 8 0 7 8 367 media Lo D9 7 9 Ol Ira 296 0 100 4 I n r n r n r n r 2 0 06 n r n r n r n r 3 n r n r n r n r media n r n r n r F 1 n r n r n r n r 2 0 03 n r n r n r AT 3 n r n r n r n r media n l n r n r n r Hplc 173 Tabella 4 25 Dati dei cromatogrammi del DicloNa a 254 nm di controllo DicloNa Conc DicloNa Tempo min ripetizione 4g mL iniziale finale T R Area Spalle 1 0 4 1 8 10 9 8 209 2 7 69 0 3 11 9 10 9 8 606 3 0 4 11 9 10 9 8 134 media 10 4 0 1 me 10 9 0 0 18 316 3 253 6 1 0 3 12 0 10 9 8 397 2 3 84 0 3 12 0 10 9 8 454 3 0 3 12 0 10 9 8 749 media 10 3 0 0 12 0 0 0 10 000 18 533 3 188 9 1 0 3 11 7 10 9 8 135 2 1 92 0 4 11 8 10 9 8 187 3 0 4 11 9 10 9 8 274 media 10401 11820 1 10 9 0 0 18 198 7 70 2 1 0 4 11 8 10 9 6 788 2 0 96 0 4 119 10 9 8 359 3 0 4 11 9 10 9 8 415 media 10 4 0 0 WIE
34. 1 Composizione e concentrazione dei punti della retta Originali Composizione ML Campione Albumina ABSI ABS2 ABS3 WS ug ml 1 0 00 2 50 0 00 2 2 50 0 00 10 0 3 1 50 00 6 00 4 0 75 75 3 00 5 0 25 2 25 1 00 6 1 50 00 0 60 7 0 75 75 0 30 8 0 25 2 25 0 10 9 1 50 00 0 06 10 0 75 75 0 03 11 0 25 2 25 0 01 Infine i campioni sono stati messi in stufa non ventilata a 96 C per 10 minuti ai quali sono seguiti 20 minuti di raffreddamento a temperatura ambiente e misurazione della fluorescenza cuvetta di plastica 2 mL di campione ogni campione letto tre volte in una condizione di scarsa illuminazione del laboratorio dati sperimentali cos ottenuti sono stati normalizzati rispetto al bianco della cuvetta e successivamente elaborati rispetto al bianco del kit Tab 2 1 campione 1 Le fluorescenze sperimentali ricavate sono state messe in correlazione con le rispettive concentrazioni note Origin 6 0 Infine la modellizzazione matematica dei dati cos ottenuti ha fomito l equazione che meglio descrive il loro andamento e che stata utilizzata per la quantificazione proteica dei campioni incogniti Par 2 4 6 2 4 3 2 Curva di calibrazione Protocollo modificato Quantificazione Proteica_Kit NanoOrange_ Il protocollo seguito per la maggior parte degli esperimenti di quantificazione proteica pu essere considerato una variante di quello originale come possibile notare anche dall allestimento del
35. 124 media 74 0 1 8 0 0 1 11 200 1 108 3 62 0 1 7 4 8 0 7 7 498 2 0 48 7 4 8 0 7 7 547 3 7 5 8 1 7 7 577 media 74 amp amp 01 8 0 0 1 7 4 200 540 7 39 9 1 7 4 7 9 7 7 252 2 0 24 7 9 7 9 7 7 294 3 7 4 7 9 7 7 274 media 7 401 7 9 00 7 1 210 0 2733 210 1 7 5 7 9 7 7 185 2 0 12 7 5 7 9 7 7 137 3 7 4 7 8 7 6 136 media 750 1 7 9 0 1 Lt 0 152 7 28 0 1 7 6 7 9 7 7 93 2 0 06 7 3 7 7 7 6 81 3 7 4 7 8 7 6 84 media TA E02 TO EQ 16 20 86 0 6 2 1 7 6 7 8 7 7 50 2 0 03 Nf n r n r n T 3 7 5 7 9 7 7 48 media 7601 79 01 lA E00 49 0 1 4 Tabella 4 45 Dati dei cromatogrammi della retta di DicloNa a 254 nm trattati con 48 ore di stufa Hplc 189 DicloNa Conc DicloNa Tempo min ripetizione ug mL iniziale finale T R Area Spalle 1 9 7 10 9 0 2 21 858 2 7 69 9 5 10 8 0 0 22 595 Dx 3 9 5 10 8 0 0 22 480 Dx media 26 0 1 10 8 0 1 101 01 22 311 0 396 5 1 10 0 11 0 0 4 21 510 2 3 84 9 9 11 0 0 4 21 412 Dx 3 10 0 11 0 0 4 22 346 media 10 0 0 1 1110 00 10 4 0 0 21756 0 513 3 1 10 0 11 0 0 5 19 119 2 1 92 10 0 11 0 0 5 21 958 3 9 9 11 1 0 5 21 225 media 10 0 0 1 1100 0 10 5 0 0 20 767 3 1473 8 1 10 0 11 0 0 4 21 390 2 0 96 9 9 11 0 0 4 22 176 3 9 9 11 0 0 5 22 109 media 9 9 0 1 1100 0 10 4 amp 0 1 21891 7 435 7 1 9 8 11 0 0 3 21 753 2 0 48 9 9 11 0 0 3 21 537 3 9 9 11 0 0 4 17 552 media IgE pN T1 0 0 0 103 0 1 20 280 7 2365 6 1 9 9 11 0 0 3 21 448
36. 178 3 9 8 10 9 0 2 20 847 media SEA 10 9 0 1 102E 00 21 0167 165 7 1 9 7 10 7 0 2 21 290 2 0 12 9 7 11 0 0 2 21 049 3 9 8 10 9 0 3 21 094 media 97 20 10 9 0 2 10 10 1 211443 128 1 1 9 5 10 7 0 1 21 313 2 0 06 9 4 10 7 0 0 21 249 3 9 7 10 8 0 2 21 755 media 950 2 10 7 0 1 10 39 21 439 0 275 5 1 n r n r n r n r 2 0 03 9 4 10 7 0 0 21 767 3 n T n r n r n r media 9 7 0 4 11006 10 2 0 3 21 767 0 0 0 186 Hplc Tabella 4 41 Dati dei cromatogrammi della retta di lbuNa a 265 nm di controllo IbuNa 12 Conc IbuNa Tempo min ripetizione ug mi iniziale finale TR Area Spalle 1 T2 8 1 7 5 12 193 2 7 69 7 0 8 0 7 4 12 417 3 7 0 8 0 7 5 12 858 media VANESSA 8 0 0 1 4501 12 489 3 338 3 1 7 5 8 3 7 8 6 137 2 3 84 7 1 8 0 7 5 6 267 3 7 3 8 1 7 6 6 481 media 7 92 02 8 1 0 2 76 402 6 295 0 173 7 1 7 5 8 3 7 8 3 161 2 1 92 7 5 8 1 7 8 3 012 3 7 4 8 2 VA 3 281 media 7 5 0 1 32 0 1 78 01 31513 amp 134 8 1 7 4 8 1 7 7 1 673 2 0 96 7 4 8 0 7 7 1 516 3 7 6 8 2 7 9 1 596 media 7 amp 0 8 1 0 1 7 8 01 1 570 0 amp 76 5 1 7 6 8 1 7 8 849 2 0 48 7 4 8 0 Tat 821 3 7 5 8 2 7 8 805 media 1 9 0 1 8 1 0 1 7 8 0 1 825 0 22 3 1 7 3 7 9 7 6 428 2 0 24 7 4 8 1 7 7 440 3 7 3 7 9 7 6 417 media 7 3 0 1 8 0 0 1 7 6 0 1 428 3 11 5 1 7 3 7 8 7 6 229 2 0 12 7 4 7 8 7 5 187 3 7 3 7 7 7 5 231 media 4 020 7 840 1 45 amp 0 1 216 7 24 8 1 7 4 7 9 7 6 130 2 0
37. 2 mM Le raccomandazioni della casa madre riguardo alla temperatura ottimale per la conservazione dei componenti prevedevano una temperatura compresa tra lt 2 6 C per tutti i componenti del kit stato notato per che tali indicazioni sono state modificate nel Quantificazione Proteica_Kit NanoOrange_ tempo in quanto nell ultimo kit acquistato lotto 3 stata indicata la medesima temperatura per i componenti A e C ma per quanto riguarda il componente B la temperatura di riferimento appariva Modificata a 18 25 C Di conseguenza i componenti A e C sono stati sempre mantenuti nel frigorifero ad una temperatura oscillante tra i 4 6 C mentre per quanto concerne il componente B il lotto 1 stato conservato in frigo il lotto 2 per un periodo stato in frigo e poi stato trasferito a temperatura ambiente 20 25 C ed il lotto 3 rimasto esclusivamente a temperatura ambiente Inoltre stata utilizzata dell acqua Milli Q WMQ prodotta in laboratorio Altro In aggiunta sono stati utilizzati tubi da centrifuga in polipropilene da 50 mL non sterili Furoclone provette da 50 puntali per micropipette da 20 200 e 1000 uL Eppendorf o Gilson pipette graduate in vetro da 10 mL pipette graduate bottigliette in vetro con tappo a vite da 12 mL bottigliette carta stagnola parafilm carta da pesata Macherey Nagel W gepapier MN 226 cuvette in plastica con quattro facce ottiche Kartell cammino ottico di 1 cm
38. 20 sono state utilizzate per la quantificazione proteica In Tabella 2 21 viene indicata la composizione del campione analizzato per quanto riguarda i microlitri utilizzati di soluzione ottenuta da ABSL3 e la necessaria WS la fluorescenza relativa alla WMQ della cuvetta W al campione C alla normalizzazione rispetto al bianco CN e al campione normalizzato rispetto al kit CF Quantificazione Proteica_Kit NanoOrange_ Tabella 2 21 Quantificazione proteica di 80 uL a diverse concentrazioni di ABSL3 Composizione uL Fluorescenza Albumina ug mL Campione ABSL WS Ww C CN CF Trovata Teorica bianco 0 2100 150 50 212 73 62 23 0 00 1 80 2020 152 37 748 33 595 97 533 73 10 71 10 00 2 80 2020 152 20 641 73 489 53 427 30 8 61 8 00 3 80 2020 151 83 556 77 404 93 342 70 6 94 6 00 4 80 2020 151 47 416 23 264 77 202 53 4 18 4 00 5 80 2020 151 47 309 73 158 27 96 03 2 08 2 00 6 80 2020 152 17 260 33 108 17 45 93 1 09 1 00 risultati ottenuti in questo esperimento sono abbastanza vicini ai valori attesi infatti si discostano di poco dalla perfezione mostrando in media una concentrazione superiore di 0 7 ug mL Questo risultato fa ipotizzare che la funzionalit del kit sia maggiormente marcata per concentrazioni comprese nell intervallo 1 10 ug mL e meno stabile per quelle al di sotto Il range da noi messo a punto non concorda con quello trovato anche in letteratura compreso tra 10 ng mL 10 ug mL 18 in qu
39. 3 Cute Col 611 6 180 2 I valori registrati si sono rivelati alquanto strani infatti non stata ottenuta una netta localizzazione del farmaco nella fase Metanolica nonostante la percentuale di recupero sia pi alta che nella fase cloroformica Inoltre se si considera la somma delle concentrazioni ottenute nelle due diverse non si raggiunge il 100 atteso Ci che stato osservato nello spettro del campione di cute in Collagenase in verde stato confermato anche dalla quantificazione in quanto osservabile un assorbanza di 611 6 nm nella fase Metanolica In seguito ai risultati ottenuti stato ripetuto l esperimento prendendo in considerazione anche i bianchi dei campioni Per il campione n 1 sono stati pipettati in una provetta eppendorf 0 5 mL di soluzione di Collagenase e 0 5 mL di WMQ che mima l buNa del campione n 2 dell esperimento precedentemente Tab 3 14 Il campione n 2 invece costituito dal farmaco sciolto in WMQ 0 5 mL e da WMQ Infine il campione n 3 rappresenta il bianco del campione n 2 essendo costituito esclusivamente da WMQ tre campioni sono stati spipettati per qualche minuto per favorire la loro completa miscelazione successivamente 0 5 mL del loro volume sono stati trattati con la soluzione Folch Par 3 4 3 5 ed stato eseguito lo spettro sia della fase metanolica che di quella cloroformica La Figura 3 22 mostra gli spettri tal quali ottenuti dallo spettrofotometro nella Fi
40. 323 media 9 6 0 1 P EN 10 2 00 30 676 0 802 0 1 9 6 11 0 0 2 30 890 2 0 03 9 6 11 0 0 2 31 450 3 9 6 11 0 0 2 31 076 media 9 6 0 0 Ios 00 10 2 0 0 31 138 7 285 2 Tabella 4 33 Rapporti delle aree di IlbouNa L2 e DicloNa a 254 e 265 nm con trattamento di 24 ore di stufa 254 nm 24 ore 265 nm 24 ore Hg mL Ibu Diclo Ibu Diclo Ibu Diclo Ibu Diclo 1 2 3 media Dev st 1 2 3 media Dev st 7 69 0 519 0 513 0 480 0 504 0 021 0 446 0 431 0 404 0 427 0 021 3 84 0 277 0 276 0 272 0 275 0 003 0 237 0 238 0 219 0 232 0 011 1 92 0 148 0 160 0 143 0 150 0 009 0 118 0 120 0 109 0 116 0 006 0 96 0 079 0 083 0 083 0 081 0 002 0 061 0 060 0 056 0 059 0 003 0 48 0 046 0 046 0 042 0 044 0 002 n r 0 027 0 030 0 029 0 002 0 24 0 028 0 027 0 021 0 025 0 004 0 020 nr n r 0 020 0 000 0 12 0 013 0 016 0 011 0 013 0 003 nr n r n r n r Tf 0 06 n r n r n r Df Mi NL n T TEI n r n r 0 03 nr n r n r Hif N L Nf n T n r n r n r 180 Hplc Tabella 4 34 Dati dei cromatogrammi della retta di IbuNa L2 a 254 nm con 48 ore di stufa IbuNa L2 Conc lbuNa Tempo min ripetizione ug mi iniziale finale TR Area 1 3 8 4 4 4 1 9 084 2 7 69 3 8 4 4 4 1 9 505 3 3 8 4 4 4 1 9 324 media 3 8 0 0 4 4 0 0 4 1 10 0 9 304 3 211 2 1 3 8 4 4 4 1 4 404 2 3 84 3 8 4 4 4 1 4 752 3 3 8 4 4 4 1 5 143 media 3 8 0 0 4 4 0 0 4 1 0 0 4 766 3 369 7 1 3 8 4 4 4 1 2 187 2 1 92 3 8 4 4 4 1 2 516 3 3 8 4 4
41. 4 47 per le quali esiste ad entrambe le lunghezze d onda una maggior puntualit dei tempi dell IbuNa L2 i e 7 7 min Mentre non avviene lo stesso per il DicloNa il quale manifesta dei tempi identici nei due esperimenti ad entrambe le lunghezze d onda A questo proposito possibile effettuare un confronto con l esperimento 1 per il farmaco non esposto ad alta temperatura si ha un tempo di ritenzione ad entrambe le lunghezze d onda che appare ritardato di un secondo rispetto all esperimento 2 inoltre il tempo del DicloNa risultato perfettamente puntale in tutte le iniezioni presentandosi a 10 9 minuti Il confronto tra gli esperimenti 1 e 2 eseguiti in seguito alle 48 ore di stufa non possibile eseguirlo a causa dell errore dell operatore avvenuto nel primo esperimento Se si prosegue nell analisi dell esperimento 2 tenendo conto delle aree quantificate per l IbuNa L2 possibile notare un incremento tra i due spazi temporali ad entrambe le lunghezze d onda 8 485 vs 9 078 u a per 254 nm e 12 489 vs 13 419 u a per 265 nm Per un analisi corretta dei risultati ottenuti ed una corretta interpretazione degli stessi per necessario considerare inevitabilmente anche le relative deviazioni standard 244 vs 338 per 254 nm e 518 vs 639 per 265 nm le quali risultano essere pi alte nelle 48 ore di trattamento termico D altro canto l area del DicloNa appare invece molto pi alta di quella quantificata nell esperimento 1
42. 4 6 NUCLEODUR 100 5 C18 ec Traducendo queste sigle possiamo dire che i la colonna lunga 150 mm ed ha un diametro interno di 4 6 mm 29 ii Nel suo interno presente della silice di terza generazione di tipo B costituita da particelle totalmente sferiche il cui diametro di 5 um e che presentano pori di 110 il cui volume di 0 9 mL g La silice Nucleodur si contraddistingue anche per una buona stabilit alle alte pressioni 800 bar un basso contenuto in metalli una riproducibile microstruttura superficiale e stabilit alla variazione di pH della fase Mobile nel range 1 9 unit di pH 29 ili Le particelle di silice sono rivestite con alcani contenenti 18 unit carboniose il cui contenuto in carbonio pari al 17 5 29 Come si pu osservare in Figura 4 3 sulla superficie delle particelle sono presenti anche altri gruppi funzionali 29 Nell insieme il rivestimento delle particelle di silice permette la separazione dei composti mediante interazioni idrofobiche forze di van der Waals ed in minima parte con interazioni che coinvolgono i gruppi silanolici 29 Hplc SIOH Si 0 Si Si CH3 3 Figura 4 3 Schema fase stazionaria Nella figura viene schematizzata la struttura chimica della fase stazionaria della colonna Come si pu osservare sono presenti catene idrocarburiche a 18 atomi di carbonio unite alla catena di silice principale ed altri gruppi funzionali silanolici i quali si trovano coinvol
43. 5 lt 5 90 5 0 0 Pertanto si pu evincere che entrambe le concentrazioni da noi utilizzate non dovrebbero presentare problemi di precipitazione a contatto con l ACN durante l analisi 58 Tuttavia se i sali non fossero eluiti completamente durante la prima fase di lavaggio della colonna la seconda e la terza fase di lavaggio li farebbe precipitare Infine necessario indicare che i tamponi fosfato possono essere in grado di solubilizzare la silice presente nelle colonne cromatografiche Questo processo influenzato dal tipo di fosfato Na gt K gt NH dalla concentrazione del tampone gt 50 MM dal pH gt 7 e dalla temperatura gt 40 C 59 In condizioni pi miti di quelle indicate tra parentesi il processo dissolutivo dovrebbe essere pressoch nullo 59 Pertanto si pu concludere che nelle condizioni da noi utilizzate non si dovrebbero creare quelle condizioni tali da far avvenire la dissoluzione della silice Inoltre i risultati di tali esperimenti ci permettono di poter utilizzare con tranquillit il metodo da noi prescelto in quanto il tampone fosfato a pH 7 presenta una concentrazione alquanto inferiore ai limiti di rischio verificati dagli autori 25 mM la temperatura di analisi da noi impostata e monitorata non supera mai i 25 C il pH nonostante sia al limite del valore a cui iniziano ad insorgere i problemi si mantiene stabile durante la corsa cromatografica ed associato ad una con
44. 6 0 1 550 1 4 9 0 0 18 421 7 502 2 1 4 7 5 7 4 9 18 717 2 0 24 4 7 5 7 4 9 18 578 3 4 7 5 7 4 9 18 092 media 47200 57 gl 49 200 18 462 3 328 2 1 4 8 5 6 4 9 18 578 2 0 12 4 8 5 6 4 9 19 139 3 4 8 5 6 4 9 18 578 media 4 8 0 0 5 6 0 0 4 9 0 0 18 765 0 323 9 1 9 6 11 0 10 2 18 447 2 0 06 9 6 11 0 10 2 18 377 3 9 6 11 0 10 2 17 792 media 9 6 0 0 T0 00 10 2 00 18 205 93 359 7 1 9 6 11 0 10 2 18 331 2 0 03 9 6 11 0 10 2 18 784 3 9 6 11 0 10 2 18 392 media 9 6 0 0 11 0 0 0 10 2 00 18 502 3 245 8 182 Hplc Tabella 4 36 Dati dei cromatogrammi della retta di IbuNa L2 a 265 nm con 48 ore di stufa lbuNa L2 Conc lbuNa Tempo min ripetizione ug mi iniziale finale TR Area Spalle 1 3 8 4 5 4 13 364 2 7 69 3 8 4 4 4 14 023 3 3 8 4 4 4 13 781 media 3 8 0 0 EEN 4 1 00 19 722 7 339 4 1 3 8 4 4 4 6 463 2 3 84 3 8 4 4 4 6 994 3 3 8 4 4 4 7 415 media 3 8 0 0 4 4 0 0 dl 00 6 957 39 477 1 1 3 8 4 4 4 3 224 2 1 92 3 9 4 4 4 3 777 3 3 8 4 4 4 3 475 media 38 01 4 4 00 41 00 3 492 0 276 9 1 3 8 4 4 4 1 708 2 0 96 3 8 4 5 4 2 108 3 3 9 4 3 4 1 666 media dd 0 4 4 0 1 4 1 0 0 1 827 3 244 0 1 4 0 4 5 4 831 2 0 48 3 9 4 4 4 963 3 3 8 4 4 4 950 media 3 9 0 1 4A Egl 4 1 0 0 914 7 727 1 4 0 4 5 4 442 2 0 24 3 9 4 4 4 455 3 3 8 4 4 4 442 media PENA OE E 4 1 00 446 3 7 5 1 4 0 4 5 4 317 2 0 12 4 0 4 5 4 251 3 3 8 4 4 4 255 me
45. 6 7 9 7 7 112 2 0 06 7 3 7 9 7 7 120 3 7 5 7 9 7 7 125 media 70 02 72 00 Zl QQ 119 0 66 1 7 6 7 9 7 7 45 2 0 03 7 6 7 9 7 7 58 3 7 6 7 9 7 7 64 media 7 6 0 0 TF 20 0 7 7 0 0 55 7 9 7 Tabella 4 47 Dati dei cromatogrammi della retta di DicloNa a 265 nm trattati con 48 ore di stufa Hplc 191 DicloNa Conc DicloNa Tempo min ripetizione ug mL iniziale finale T R Area Spalle 1 9 5 10 8 0 1 37 174 2 7 69 9 5 10 8 0 0 38 401 3 9 6 10 9 0 0 38 165 media 95 0 1 10 8 0 1 10 0 0 41 37 913 3 691 1 1 9 9 11 1 0 4 36 505 2 3 84 9 9 11 1 0 4 36 273 3 9 9 11 1 0 4 37 912 media 9 9 0 0 AMES 10 4 0 0 36 896 7 886 9 1 9 9 11 1 0 5 32 476 2 1 92 10 0 11 2 0 5 37 185 3 10 0 11 0 0 4 35 703 media 10 0 0 1 miso 10 5401 35 121 3 2407 8 1 9 9 11 0 0 4 36 366 2 0 96 10 0 11 1 0 4 37 574 3 10 0 11 1 0 5 37 130 media 10 0 01 AE 104 amp 0 37 023 3 611 0 1 9 9 11 0 0 3 36 893 2 0 48 9 9 11 0 0 4 36 628 3 9 9 11 0 4 30 207 media 9 90 11 0 0 1 10 4 0 1 34 576 0 3 786 0 1 9 8 LLP 0 3 36 750 2 0 24 9 8 LLP 0 3 34 369 3 9 8 11 0 0 3 36 892 media 9 8 0 0 TRI 01 10 3 0 0 36003 7 1 417 4 1 9 9 11 1 0 4 36 620 2 0 12 9 8 171 0 0 3 36 914 3 9 8 10 9 0 3 36 478 media 9 8 01 10 0 103 0 1 36 670 7 222 4 1 9 8 10 9 0 3 35 444 2 0 06 9 6 11 0 0 2 33 813 3 9 8 11 0 0 3 35 976 media 9 7 0 1 110 01 103 01 35 077 7 1 127 1 1 9 1 10 2 9 6 36 7
46. 6 8 1 7 8 1 004 Sx 3 7 5 8 2 7 8 1 063 Sx media 7 6 0 1 8 2 0 1 7 8 0 0 1 042 0 33 0 1 7 5 8 1 7 8 545 Sx 2 0 48 7 4 8 0 7 6 520 3 7 4 8 0 URI 559 media 740 1 830 01 TERN 541 32 19 8 1 7 4 7 9 7 6 277 Sx 2 0 24 7 4 7 9 7 6 235 Sx 3 7 4 7 9 7 6 260 Sx media TASU 7 9 0 0 76200 PANE 1 7 4 7 9 7 6 136 2 0 12 7 5 19 7 3 132 3 7 4 7 9 Veri 137 media TAE 7 9 0 0 VSC 135 0 2 6 1 7 3 7 9 7 5 77 2 0 06 7 3 1 7 7 5 87 3 7 5 78 7 6 72 media TASO 78 01 7 97 0 028 78 7 7 6 1 fif n r n r n r 2 0 03 n r n r n r n r 3 T T n r n r nr media n r n r lang n r Tabella 4 40 Dati dei cromatogrammi della retta di Diclo Na a 254 nm di controllo Hplc 185 Diclo Na Conc DicloNa Tempo min ripetizione ug mi iniziale finale TR Area Spalle 1 9 3 10 5 9 8 21 151 2 7 69 9 6 10 7 0 1 21 965 3 9 3 10 3 9 8 21 504 media 9 4 0 2 105 02 99 02 21 540 0 408 2 1 10 1 11 1 0 5 21 245 2 3 84 9 9 11 0 0 4 21 396 3 9 8 11 0 0 3 21 249 media 90 02 APER r EAA 21 296 7 86 0 1 9 9 10 9 0 3 21 174 2 1 92 10 1 11 2 0 6 21 139 Dx 3 10 1 11 2 0 3 21 256 Dx media 100 01 MA ESF 10 4 0 2 21 189 7 60 1 1 10 0 11 2 0 6 21 117 Dx 2 0 96 10 0 11 0 0 4 21 140 Dx 3 10 0 11 1 0 5 21 218 Dx media 100 00 AMER IOS S 0i 21 158 39 52 9 1 9 9 11 0 0 4 21 152 Dx 2 0 48 9 8 11 0 0 2 21 059 3 9 8 10 9 0 3 20 283 media 98 0 ARTESA 103 0 20 83913 474l 1 9 6 10 8 0 2 21 025 Dx 2 0 24 9 8 10 9 0 2 21
47. 9 5 11 0 2 19 687 2 0 48 9 6 UE 0 2 18 549 3 9 6 11 0 0 2 17 943 media 9 6 0 1 WA ESSA 10 2 0 0 18 726 3 885 4 1 9 5 101 0 2 18 709 2 0 24 9 5 11 1 0 2 18 112 3 9 5 111 0 2 18 637 media 9 5 0 0 TI 00 10 2 amp 0 0 18 486 0 325 9 1 9 6 Ii 0 2 17 808 2 0 12 9 6 ii 0 2 18 096 3 9 6 Ti 0 2 18 300 media 96 0 0 thl 00 10 2 0 0 18 068 0 247 2 1 9 6 11 0 2 17 871 2 0 06 9 6 TI 0 2 18 867 3 9 6 ti 0 2 17 990 media 9 6 0 0 11 1 00 10 2 0 0 18 242 7 544 0 1 9 6 LLP 0 2 18 325 2 0 03 9 6 11 0 2 18 877 3 9 6 1i 0 2 18 385 media 9 6 0 0 110 0 10 2 0 0 18 529 0 302 9 178 Hplc Tabella 4 31 Dati dei cromatogrammi della retta di IbuNa L2 a 265nm con 24 ore di stufa IbuNa L2 Conc lbuNa Tempo min ripetizione ug mi iniziale finale TR Area Spalle 1 6 6 7 8 7 2 14 244 2 7 69 6 5 7 9 7 2 13 995 3 6 6 7 6 12 12 855 media 6b 0 1 7 8 0 2 4 22 0 0 13 698 0 740 1 1 6 8 7 7 7 2 7 118 2 3 84 6 8 7 8 7 2 7 487 3 6 6 7 7 7 2 6 711 media 0 7 Ul It 4 8 QQ 7 105 3 388 2 1 6 8 7 7 7 2 3 700 2 1 92 6 8 7 8 7 2 3 634 3 6 8 7 7 7 2 3 378 media 68 00 ALSO 7 2 0 0 3 570 7 170 1 1 6 8 7 6 7 2 1 850 2 0 96 6 9 7 6 7 2 1 759 3 6 8 7 6 7 2 1 626 media 68 01 TO 200 ia 00 l245 0 MA7 1 n r n r n r n r 2 0 48 6 9 7 6 7 2 844 3 6 8 7 7 7 2 909 media 6 9 0 1 70 amp 0 1 H2 00 876 5 46 0 1 6 8 7 6 7 2 620 2 0 24 n r n r n r n r 3 n r n r n r n r
48. A seguire i campioni trattati Tab 3 1 sono stati analizzati attraverso il kit NanoOrange per la quantificazione proteica Cap 2 utilizzando 80 uL 2020 uL di WS del loro volume La Tabella 3 2 mostra i risultati ottenuti dall esperimento e la Tabella 3 3 mostra la ripetizione della quantificazione dei campioni trattati col Metodo Brown e col Metodo del congelamento ai quali per stata considerata una filtrazione aggiuntiva effettuata con filtri a siringa Acrodisc Entrambi gli esperimenti sono stati realizzati col kit seminuovo e le rispettive tabelle comprendono le fluorescenze del bianco cuvetta W del campione C del campione normalizzato CN e del campione normalizzato anche rispetto alla WS CF Tabella 3 2 Risultati della quantificazione proteica dei tre diversi metodi Fluorescenza u a Proteine Campione Metodo W le CN CF 4g mL 1 Bianco 148 2 181 2 33 0 0 0 0 0 2 Brown 149 1 826 4 677 2 644 2 12 9 3 Amicon 149 5 625 2 475 8 442 7 8 9 4 Congelamento 150 3 845 3 695 0 662 0 13 3 I dati ottenuti Tab 3 2 mettono in evidenza la maggior efficacia del metodo con filtrazione in Amicon e l equivalenza degli altri due In Tabella 3 3 invece possibile notare che l ulteriore filtrazione comporta una eliminazione di proteine di 1 6 e 1 7 ug mL per il metodo Brown e per il metodo del congelamento rispettivamente Degradazione e deproteinizzazione della cute Tabella 3 3 Risultati della quantificazione pro
49. CN CF Bianco 155 5 169 5 14 0 0 0 0 0 2 Amicon 155 6 740 1 584 5 576 1 11 6 3 Amicon 155 4 770 8 615 4 607 0 12 1 4 Amicon 155 8 755 2 599 4 591 0 11 9 Bianco 155 5 163 9 8 4 0 0 0 0 2 Amicon Acrodise 155 6 846 7 691 1 682 7 18 7 3 Amicon Acrodisc 155 6 821 6 666 0 657 6 13 2 4 Amicon Acrodise 155 6 837 9 682 3 673 9 13 6 La Tabella 3 4 mette in evidenza una concentrazione proteica pi alta nei campioni caratterizzati dall ulteriore filtrazione aggiuntiva Tale risultato non rispecchia le aspettative di partenza in quanto l ulteriore filtrazione era stata considerata come un passaggio coadiuvante per una massiva deproteinizzazione Degradazione e Deproteinizzazione della cute L esperimento stato ripetuto nello stesso identico modo aggiungendo come unico accorgimento il lavaggio del filtro Acrodise con WMQ e la sua asciugatura all aria per qualche ora stato ipotizzato che il campione interagendo col filtro potesse promuovere il rilascio di glicerolo da parte di quest ultimo che comportasse l alterazione della quantificazione proteica La Tabella 3 5 stata allestita nello stesso identico Modo della Tabella 3 4 riportando gli stessi dati nel medesimo ordine I dati ottenuti mostrano un identica efficacia dei metodi che presentano dei risultati molto simili tra loro Si nota che la somiglianza non presente solo tra i due metodi ma anche all intero del triplicato stesso Tale risultato dimostra quindi la ripetibilit del
50. DicloNa insieme cromatogrammi rappresentati in questa figura sono quelli relativi alle prove di conservazione dell IbuNa in stufa per 24h e 48h rispettivamente alle lunghezze d onda 265 nm a destra e 254 nm a sinistra Inoltre per ognuna delle condizioni di conservazione dell IbuNa sono state prese anche in considerazione le condizioni climatiche dell ambiente in cui si svolta l analisi a Temp Amb temperatura ambiente oppure a 25 C termostatando la rack a 25 C In tutti i casi Fig 4 40 1 A 3B infatti il grafico risulta essere caratterizzato da una linea di base meno regolare rispetto alla temperatuta ambiente e dalla presenza di deriva nel corso delle analisi a 254 nm di lunghezza d onda Fig 4 40 1 A 2 A 3 A Inoltre possibile evidenziare una miglior simmetria del picco dell IbuNa nelle condizioni di temperatura ambiente e delle analisi effettuate a 265 nm nei restanti casi 194 Hplc emerge una spalla alla sinistra del picco In generale ben visibile una traslazione dei picchi verso destra di qualche secondo Infine il fronte del solvente 0 2 min risulta essere sempre il medesimo anche se nell analisi a 265 nm appare con un intensit molto pi bassa FE possibile ipotizzare che sia dovuto semplicemente ad un minor assorbimento delle sostanze contenute nel campione a quella lunghezza d onda Nella Figura 4 41 sono visibili i cromatogrammi del medesimo esperimento osservati tutti insieme per lu
51. F ingrandimento di E In ciascun cromatogramma presente il cromatogramma prima in nero e dopo in rosso il lavaggio dell iniettore Condizioni 20 uL di solvente iniettato in colonna accessoriata con PC a 254 nm 1 0 mL min con la fase mobile identica al solvente in questione Un ulteriore anomalia stata riscontrata durante l acquisizione a due lunghezze d onda differenti del cromatogramma dell iniezione della fase mobile ACN TF25 27 73 v v Fig 4 30 Nella Figura 4 30 possibile notare che la linea di base del cromatogramma registrato a 254 nm presenta una deriva negativa Immediatamente si potrebbe pensare che la causa possa essere attribuita ad un condizionamento delo strumento non 138 Hplc sufficientemente lungo Tuttavia tale ipotesi stata scartata in quanto l iniezione a 254 nm stata successiva a quella effettuata a 265 nm Quanto osservato rimane senza spiegazione ACN TF 25 254 nm ACN TF 25 265 nm R gt E Ki v e 2 10 15 Tempo minuti Figura 4 30 Cromatogramma della fase mobile ACN TF25 27 73 v v cromatogrammi sono stati acquisiti a 254 nm in nero e a 265 nm in rosso Condizioni 20 uL di solvente sono stati iniettati in colonna accessoriata con PC a 254 e 265 nm 1 0 mL min con la fase mobile identica al solvente iniettato Lavaggio dei pescanti e delle bottiglie solventi Il lavaggio delle bottiglie e dei pescanti abbastanza importante perch
52. IBU Na in Spe Il 8 NOV S 2 N S 2 pm 6 D v lt 200 400 600 800 1000 1200 Lunghezza d onda nm Figura 3 10 IbuNa filtrato in spe col Metodo I nero e metodo ll rosso Gli spettri ottenuti Fig 3 10 dall utilizzo del metodo in nero e del metodo Il in rosso mostrano dei picchi inconsueti per entrambe le metodiche senza nessun picco evidente a 265 nm In seguito ai risultati ottenuti sono stati effettuati gli spettri dei solventi utilizzati nel corso della filtrazione in Spe per esaminare l andamento dello spettro Acform al l in ACN Acform all 1 in MeOH ACN puro MeOH puro wMQ ACN puro MeOH puro AC Formico 1 ACN AC Formico 1 MeOH d EJ N S Q p e v v lt 400 600 800 1000 Lunghezza d onda nm Figura 3 11 Analisi spettrofotometrica dei solventi puri e di precipitazione off line Degradazione e Deproteinizzazione della cute La Figura 3 11 mostra un elevata pulizia degli spettri e tale risultato fa dedurre che ci che si riscontra nella porzione sinistra dello spettro del primo esperimento potrebbe essere dovuto al passaggio in cartuccia In seguito a questa ipotesi stato allestito un esperimento nel quale la filtrazione in cartuccia stata simulata per approfondire lo studio sull interazione del farmaco con la soluzione precipitante stata quindi effettuata la precipitazione offline delt IbuNa in TF25 e successivamen
53. Na TF25 850 694 81 7 12 Spe Ibu Na TF25 lIl 567 133 23 5 La Figura 3 20 rappresenta il risultato ottenuto dalle ripetizioni di ciascun campione Nella Figura 3 20 A mostrato l istogramma ottenuto dalla media delle repliche effettuate il giorno in cui stato eseguito l esperimento corredato di deviazioni standard Il giorno successivo i campioni sono stati vortexati ulteriormente e sono state ripetute le analisi spettrofotometriche Fig 3 20 B Infine la Figura 3 20 C rappresenta il confronto della quantificazione del farmaco nei due giorni di analisi Dai risultati rappresentati in Figura 3 20 A evidente la differenza di variabilit in presenza e non della soluzione precipitante acida prevista dal protocollo Infatti nei primi quattro campioni che non hanno subito il trattamento con l acform la deviazione standard molto bassa mentre negli ultimi quattro molto evidente soprattutto nell IbuNa in TF25 trattato col Metodo Avendo avuto il presentimento che il deposito presente sul fondo del tubo in seguito all essiccazione non si fosse completamente disciolto nel corso della risospensione in WMA il giorno successivo i campioni sono stati vortexati per 5 10 minuti ed stata ripetuta l analisi allo spettrofotometro UV Vis Degradazione e deproteinizzazione della cute C EE eoan Assorbanza u a Assorbanza u a E ttt PE EE t e PER Concentrazione ug mL Concentrazione ug mL RE MEDIA 27 NOV MI MEDI
54. Phospholipid Retention Mechanism Proprietary HybridSPE Zirconia Coated Silica Upper 5 um PTFE Frit SI OH ST Si O The Zr atom acts as a Lewis acid electron O acceptor because it N h d orbitals Lower 0 2 ym Nii OH as empty Hydrophobic Filter Filter Packed Bed Assembly acts as a depth filter for faster flow rates and precipitated protein removal The phosphate moiety of phospholipids is a strong Lewis base electron donor that interacts with Zr atoms coated on the silica surface Figura 3 1 Schema del meccanismo di ritenzione dei fosfolipidi da parte degli ioni Zirconia La peculiarit di tali cartucce risiede nella particolare composizione del filtro costituito da ioni Zirconia che interagendo con i fosfolipidi e le proteine li trattengono al loro interno grazie ad una reazione acido base di Lewis La filtrazione stata eseguita attraverso due metodiche che sono state consigliate dalla ditta produttrice Supelco caratterizzate dall utilizzo di due differenti agenti precipitanti AcForm all 1 in ACN e AcForm all 1 in MeOH Si proceder con la descrizione dettagliata delle due filtrazioni in base all agente precipitante utilizzato Metodo I Filtrazione attraverso le HybridSpe con ACN Preparazione del solvente condizionante in una bottiglietta da 20 sono stati pipettati 0 3 ML di AcForm e 9 7 mL di ACN utilizzando esclusivamente pipette in vetro stata cos ottenuta una soluzione di AcForm al 3
55. QS 1000 uL Hellma cartucce HybridSpe in polypropylene Spe 30 mg 1 mL Supelco sistema da vuoto con regolatore di pressione da 12 campioni Supelco un fluorimetro portatile Picofluor 8000 004 Turner Designs canale blu exc 475 15 nm em 515 20 nm un frigorifero 4 C Indesit un frigorifero ffteezer combinato 4 C 21 C Indesit ed un freezer a pozzetto 30 C Ignis 3 4 Metodi 3 4 1 Lavaggio delle provette filtranti AMicon Le provette Amicon constano di due parti un filtro della capacit Massima di 0 5 ML ed una provetta in plastica che lo accoglie al suo interno facendo in modo che esso rimanga sospeso e che il filtrato non resti a contatto col filtro Prima del loro utilizzo stato necessario effettuare il lavaggio del filtro secondo le modalit indicate dalla casa madre per eliminare la possibile interferenza del glicerolo col campione e per effettuare una saturazione del filtro Infatti qualche istante prima della separazione del campione stato eseguito un primo ciclo di centrifuga 0 5 ML di WMQ 13 minuti 14100 g in minispin seguito da un secondo 2 minuti 1000 g con filtro capovolto minispin atto all eliminazione dell eventuale WMQ rimasta nel supporto filtrante Degradazione e deproteinizzazione della cute 3 4 2 Dissoluzione della cute La cute utilizzata durante l esperimento di veicolazione transdermica stata recuperata ed stata disciolta Mediante una soluzione di Collagenas
56. Tab 3 12 ed a quello a 500 ug mL Tab 4 20 La forma dei picchi del DicloNa nei vari cromatogrammi n 9 x 3 non mostrati presenta una simmetria IE Esperimento 2 Curva di calibrazione n 4B stufa 0 ore 265 nm dati mostrati in Tabella 4 41 indicano che l i tempi di ritenzione dell IbuNa L12 sono compresi nel range 7 6 7 9 minuti per le concentrazioni comprese tra 3 84 0 12 ug mL mentre si oscilla anche sino a 7 4 minuti per le concentrazioni 7 69 e 0 06 ug mL Rispetto ai dati mostrati in Tabella 4 17 si pu osservare che risultano essere ritardati ca di 6 9 secondi i e 7 04 min Le aree dei 9 campioni di IbuNa L2 mantengono un rapporto che si avvicina molto al valore 2 sino alla concentrazione 0 48 ug mL Nelle tre repliche successive si osservato che nelle basse concentrazioni in alcuni casi non stato possibile integrare i picchi perch di difficile individuazione Questi valori sono indicati in Tabella 4 41 con la sigla n r In questo caso possibile effettuare un confronto dell area ottenuta a 7 69 ug mL ca 12 500 u a con una concentrazione teorica ma lo si pu fare solamente con la retta di calibrazione realizzata nelle stesse condizioni nel corso dell esperimento 1 Tab 4 26 Dal confronto emerge un aumento dell area i e 11 442 vs 12 489 del quale si analizzeranno le possibili cause in seguito all analisi dettagliata di tutti gli esperimenti La forma dei picchi del IbuNa L2 nei vari
57. X 2 A X MXA A BYX B2X2 Parameter Value Error Parameter Value Error A 001154 00134 A 001384 0 01098 j x BI 000171 40760285 BI QUO SAS B2 18036167 19138658 B2 1 87441E 7 1 85278E 8 ni i Assorbanza u a a G o N S fi 5 B lt P in RoqaecoD SD LN P Doer O28 D 099968 002052 8 lt 00001 s 2 9 500 1000 1500 2000 2500 500 1000 1500 2000 2500 Concentrazione ug mL Concentrazione g mL Figura 3 16 Rette di calibrazione dell IbuNa in WMQ A e dell IbuNa in TF25 B Degradazione e deproteinizzazione della cute Le rette presenti nella Figura 3 16 mostrano l estrema somiglianza delle due rette aventi addirittura il valore R quasi identico Quindi il problema della quantificazione non attribuibile alla retta di calibrazione Gli esperimenti sono proseguiti utilizzando il TF25 come campione infatti stato trattato come tale nella filtrazione in Spe testando i due metodi stato seguito il protocollo al Paragrafo 3 4 3 4 ma in aggiunta stata eseguita un analisi spettrofotometrica prima e dopo l essicazione in stufa TF25 SPE MeOH PRIMA 16 NOV TF25 SPE ACN PRIMA 16 NOV TF25 SPE ACN DOPO 19 NOV TF25 SPE MeOH DOPO 19 NOV Gd Ei N S Q pm e Te v lt 200 400 600 800 1000 1200 Lunghezza d onda nm Figura 3 17 Analisi del TF25 trattato come spe prima e dopo l essicazione Dalla Figura 3 17 possibile nota
58. alla conversione dell assorbanza a 265 nm in concentrazione e nell ultima colonna a destra presente la percentuale di recupero del farmaco risultati ottenuti dall esperimento eseguito con le Gilson non mettono in evidenza alcun miglioramento eclatante della quantificazione del farmaco d interesse Le percentuali trovate dei campioni n 1 8 appaiono sicuramente superiori a quelle viste in Tabella 3 8 ma tendono comunque ad eccedere oltre al 100 quantificando quindi una concentrazione di lbuNa superiore a quella utilizzata Le percentuali ottenute dal metodo Spe camp n 9 12 risultano essere sempre non ripetibili e senza una costante comune Nel tentativo di cercare di dare un senso alla variabilit finora riscontrata sono state effettuate sei repliche di ciascun campione presente nelle Tabelle 3 10 e 3 11 Degradazione e Deproteinizzazione della cute Tabella 3 11 Risultati dell IbuNa in WMQ e in TF25 nelle tre diverse condizioni Gilson lbuNa Campione Metodo ug mL Recupero farmaco Teorica Trovata 1 300 Ibu in WMQ WMQ 2040 956 95 9 2 300 Ibu in TF25 WMQ 2040 2280 111 8 3 200 Ibu in WMQ WMQ 1360 400 102 9 4 200 Ibu in TF25 WMQ 1360 414 104 0 5 300 Ibu in WMQ seccato 2040 2224 109 1 6 300 Ibu in TF25 seccato 2040 963 96 2 7 200 Ibu in WMQ seccato 1360 373 101 0 8 200 Ibu in TF25 seccato 1360 344 98 8 9 Spe Ibu Na WMQ 1 850 143 16 8 10 Spe lbu Na WMQ Il 567 164 29 0 11 Spe Ibu
59. anticipati nei confronti dei tempi individuati nella Tabella 4 20 7 88 8 04 min Effettuando invece un confronto con la retta eseguita utilizzando l IpuNa L1 Tab 4 21 risultano essere comunque anticipati 7 90 8 07 min Inoltre possibile notare un diverso comportamento per le concentrazioni 7 69 0 12 ug mL le quali mostrano un tempo di ritenzione pari a 4 1 minuti L anticipazione avvenuta in coincidenza del rabboccamento della fase mobile premiscelata dall operatore Le aree dei 9 campioni di lbuNa L12 mantengono un rapporto molto vicino al valore 2 sino nel range di concentrazione compreso tra 7 69 0 48 ug mL oltre il quale tende a diminuire 0 24 0 03 ug mL Nelle tre repliche successive si osservato che nelle basse concentrazioni in alcuni casi non stato possibile integrare i picchi perch di difficile individuazione Questi valori sono indicati in Tabella 4 34 con la sigla n r Rispetto all area teorica calcolata per proporzionalit i e 8 500 u a delle diluizioni Hplc seriali prendendo come punto di riferimento il campione a concentrazione 1 000 ug mL Tab 4 17 e quello a 500 ug mL Tab 4 20 i campioni a concentrazione 7 69 ug ml risultano essere pi alti i e 9 304 u a La forma dei picchi del IbuNa L2 nei vari cromatogrammi n 9 x 3 non mostrati presenta una simmetria 1 Gli intervalli di concentrazione in cui stato possibile quantificare senza problemi l ibuNa L2 sono 7 69
60. con cuvette in plastica A e vetro B Nela Figura 2 1 A non sono presenti evidenti differenze date dala ripetizione dell esperimento se non per il punto a massima concentrazione che mostra una fluorescenza pi bassa e per il punto a concentrazione pi bassa 0 01 ug mL che risulta essere negativa La Figura 2 1 B invece mette a confronto la curva non normalizzata in nero con quella normalizzata in rosso evidenziando la presenza di fluorescenze negative nella porzione bassa 0 1 1 ug mL in entrambi i casi Nonostante questo nella curma non normalizzata si conserva un andamento dei punti quasi polinomiale che viene a mancare nella normalizzata nella quale si presenta un maggior disordine Inoltre non stato possibile verificare la similarit dei punti alti della curva 10 3 ug mL attraverso un analisi statistica in quanto n 1 In seguito ai risultati ottenuti stata programmata la ripetizione dell esperimento per testare la manualit dell operatore e la riproducibilit del kit Sono cos stati preparati gli undici campioni costituenti la curva di calibrazione Par 2 4 3 utilizzando la WS preparata al momento Sono poi stati analizzati ed elaborati come descritto nel Paragrafo 2 4 3 1 utilizzando le cuvette in plastica ed in vetro delle quali erano noti i bianchi Lo stesso esperimento stato ripetuto nel pomeriggio partendo dalla preparazione della necessaria WS utilizzando i componenti che stavano a temperatura amb
61. con la WS appena preparata Successivamente sono stati analizzati sia con le cuvette in plastica che in vetro e si sono elaborati i dati La realizzazione della curva di calibrazione can le caratteristiche appena descritte stata ripetuta anche nel pomeriggio preparando tutto al Momento compresa la WS per la quale sono stati utilizzati i componenti lasciati fuori dal frigo dalla mattina Sono poi stati trattati ed analizzati come fatto nella curva realizzata la mattina dello stesso giorno Durante l analisi fluorimetrica del campione n 3 stato notato che se si ripeteva la lettura una seconda volta senza rimuovere la cuvetta dal proprio alloggiamento lo strumento forniva un valore di fluorescenza che non era identico al precedente ma allo stesso tempo non totalmente diverso dal primo In seguito a questo fatto dal campione in questione in poi sono state registrate tre letture della fluorescenza per poter poi essere in grado di calcolarne una media nel corso della successiva elaborazione dei dati Tab 2 7 La Tabella 2 7 mostra i valori di fluorescenza dei campioni registrati con tre letture successive a partire dal campione n 3 dei quali sono state calcolate le medie per poter poi proseguire con l elaborazione Matematica dei dati sperimentali Nel calcolo della Media si prestato attenzione a prendere in considerazione dei valori simili tra loro escludendo dove necessario quelli che si discostavano significativamente Tabella 2
62. crtomatogrammi n 9 x 3 non mostrati presenta una simmetria 1 L intervallo di concentrazione in cui stato possibile quantificare senza problemi l ibuNa L2 7 69 0 12 ug mL Concentrazioni pi piccole non sarebbero quantificabili con precisione Peranto nelle condizioni di questa analisi si pu affermare che il limite di rivelamento di ca 0 12 ug mL Continuando con l analisi dei dati in Tabella 4 42 si pu riassumere che l i tempi di ritenzione del DicloNa risultano essere compresi tra 10 0 e 10 6 minuti per il range di concentrazione compreso tra 3 84 e 0 06 ug mL mentre per le concentrazioni 7 69 e 0 03 ug mL sono stati registrati dei tempi che oscillano anche sino a 9 8 minuti Rispetto ai dati mostrati in Tabella 4 17 e 4 20 si pu osservare che 165 166 Hplc queste ultime analisi risultano avere dei tempi anticipati i e 9 90 min ma ritardati rispetto alla Tabella 4 27 10 9 min Le aree dei 9 campioni del DicloNa nelle diverse repliche oscillano in un intervallo compreso tra 34 618 e 37 724 unit arbitrarie Dal confronto con la retta di controllo analizzata alla stessa lunghezza d onda nell esperimento 1 Tab 4 27 possibile notare immediatamente un aumento dell area 28 073 31 611 vs 34 618 37 724 u a ipotizzabile che l incremento registrato sia dovuto alla concentrazione della sostanza dato dall utilizzo della stessa soluzione preparata per l esperimento 1 conserv
63. da ACN TF25 27 73 ad ACN WMQ 27 73 con un contemporaneo abbassamento del flusso da 1 0 a 0 5 mL min La pressione si abbassa da 128 a 72 bar e da 138 a 78 bar rispettivamente nei due lavaggi cortissimo e medio Fig 4 25 A e B A parte la pressione iniziale che varia in base alle analisi effettuate nel corso della giornata si pu notare che nei due casi il salto pressorio rispettivamente di 56 e 60 bar Fig 4 25 A e B Questo iniziale abbassamento giustificabile con il dimezzamento della velocit del flusso e forse anche con il cambio della FM i e il tampone viene sostituito con acqua Nella prima fase ACN W 27 73 10 210 min caso A e 10 410 min caso B si pu osservare che la pressione inizialmente si alza fino a 92 e 100 bar in 10 minuti risp caso A e B La pressione rimane in quell intormo per altri 20 minuti caso A e B per poi iniziare gradualmente a diminuire Infatti alla fine di questa fase la pressione scende progressivamente sino ad arrivare a 72 e 71 bar alla fine della fase acetonitrilica 210 min caso A e 410 min caso B Pertanto dall inizio alla fine di questa fase si avuto un abbassamento di 0 e 7 bar per i casi A e B rispettivamente mentre dal picco Massimo alla fine si avuto un abbassamento di 20 e 29 bar risp caso A e B Hplc L Cortissimo P C L Medio P C S d 2 eA d e o 100 200 300 O 100 200 300 400 500 600 700 800 Tempo minuti
64. dal TF 50 filtrato con filtri in acetato di cellulosa Anche le due fasi mobili di tipo due a loro volta sono state lasciate a riposo per 63 giorni in provette da 50 Trascorso questo tempo le provette sono state oggetto di ispezione visiva macroscopica prima e dopo agitazione Manuale Inoltre le stesse sono state centrifugate condizioni operative centrifuga megafuge rotore 41 rcf 3026 20 C Dopo centrifugazione le provette sono state ispezionate visivamente 4 4 4 Tampone fosfato 25 MM Il tampone fosfato 25 MM TF 25 stato preparato a partire dal TF 50 Per la prepara zione di 1 L di soluzione sono stati opportunamente miscelati in un matraccio da 1 L 500 ML di TF 50 e WMA fino a qualche mm sotto il menisco Successivamente stato misurato il pH Par 4 5 1 3 ed lo stesso stato aggiustato con l aggiunta di poche gocce di HCI acq al 4 circa v v in quanto stato sempre rilevato un pH superiore a 7 Una volta raggiunto il valore desiderato la soluzione stata versata nuovamente nel matraccio e portata a volume Il pH stato infine rimisurato 4 4 5 Solventi utilizzati per le separazioni in HPLC solventi utilizzati per le separazioni in HPLC per il lavaggio delle varie porzioni dello strumento o per lavare la colonna dopo il suo utilizzo sono caratterizzati da un elevata purezza garantita dalla ditta dalla quale si acquistano che permette di evitare il passaggio in colonna di eventuali impurezze che potr
65. dati mostrati in Tabella 4 24 indicano che 1 itempi di ritenzione dell IbuNa L2 sono compresi tra 7 4 e 7 8 minuti Inoltre rispetto ai dati mostrati in Tabella 4 17 si pu osservare che risultano essere ritardati ca di 4 8 secondi i e 7 04 min nonostante tale differenza temporale i tempi risultano essere molto costanti nei confronti dei tempi individuati nella Tabella 4 20 risultano invece essere anticipati 7 88 8 04 In aggiunta anche rispetto alla retta descritta in Tabella 4 21 i e 8 00 min i tempi risultano essere anticipati di 4 8 secondi 2 Le aree dei 9 campioni di IbuNa L2 mantengono un rapporto che varia nell intervallo 1 7 1 9 sino alla concentrazione 0 48 ug mL oltre la quale tende a scendere Nelle tre repliche successive si osservato che nelle basse concentrazioni in alcuni casi non stato possibile integrare i picchi perch di difficile individuazione Questi valori sono indicati in Tabella 4 24 con la sigla n r Rispetto all area del campione a concentrazione 1 000 ug mL Tab 4 17 ed a quello 500 ug mL Tab 4 20 i campioni a concentrazione 7 69 ug mL risultano avere un area pi bassa rispetto a quella Hplc teorica di 8 500 unit arbitrarie che dovrebbero avere calcolata per proporzionalit dalla Tabella 4 20 la quale per si riferisce ad analisi di IbuNa L Inoltre se si paragona l area quantificata i e 7 69 ug mL con quella misurata in Tabella 4 21 possibile notare un area
66. del loro volume massimo sono state modificate le quantit dei solventi da utilizzare mantenendo sempre costanti i rapporti 4 mL cloroformio 2 mL di metanolo 2 mL di WMG L esperimento stato ripetuto utilizzando queste nuove condizioni e dimezzando di conseguenza anche il volume del campione riducendolo da 0 50 mL a 0 25 mL Sono stati dunque preparati i campioni come nell esperimento precedente includendo anche i rispettivi bianchi IbuNa in WMQ e il suo bianco costituito solo da WMA IbuNa con Collagenase e il bianco di sola Collagenase e WMQ ed infine l IbuNa in cute in Collagenase per il quale il suo bianco era costituito da cute in Collagenase e WMQ In seguito sono stati eseguiti gli spettri delle fasi metanolica e cloroformica La Figura 3 25 rappresenta l analisi tal quale dei campioni analizzati all UV Vis MeOH Ibu Na Collagenase CHCI3 Ibu Na Collagenase MeOH Collagenase WMQ CHCI3 Collagenase WMQ MeOH Ibu Na Cute Collagenase CHCI3 Ibu Na Cute Collagenase MeOH WMQ Cute Collagenase CHCI3 WMQ Cute Collagenase MeOH Ibu Na CHCI3 Ibu Na MeOH WMQ CHCI3 WMQ Assorbanza u a S E N c a a o v n lt 200 400 600 800 1000 1200 400 600 800 1000 1200 Lunghezza d onda nm Lunghezza d onda nm Figura 3 25 Spettri tal quali della fase metanolica A e della fase cloro formica B Dagli spettri possib
67. di rimuovere le impurezze organiche non polari mentre WMA quelle polari Lavaggio della bottiglietta Con questo termine bottiglietta si intende quella che contiene l acqua di lavaggio dei retro pistoni risaputo che uno dei problemi pi importanti quando si utilizzano i tamp oni in HPLC la possibilit che si formino cristalli in questa zona che creerebbero malfunzionamenti dello strumento Lo strumento utilizzato ha un sistema che permette il costante lavaggio di questa porzione quando le pompe sono accese ed una fase mobile percorre il circuito 56 Pertanto normale che nel tempo il solvente nella bottiglietta si sporchi aspetto biancastro opalescente e quindi si cambia ogni settimana a prescindere Quando il solvente viene cambiato bisogna fare attenzione all aspetto della bottiglietta che deve essere esente da incrostazioni altrimenti si lava Nella nostra esperienza abbiamo osservato che i necessario essere sicuri di aver lavato via tutto il sapone ii possibile utilizzare una soluzione acqua alcool in cui l iTOH presente al 10 v v Questa soluzione in grado di rimuovere il grasso dei pistoni l acqua schiumeggia ed assume un odore caratteristico iii Una sola volta i tubicini che trasportano la soluzione si sono riempiti di una precipitato marroncino simile ad un precipitato proteico dopo alcuni giorni di inattivit Questo era presente solo nei tubicini e non nella bottiglietta Ci accaduto
68. differente sino alle 168 L IbuNa L 1 aumenta per poi diminuire notevolmente mentre il lotto 2 cresce costantemente la conservazione con l anidrificante testata come metodo alternativo alla stufa non ha avuto gli stessi risultati ma risulta essere pi pratico 197 198 Conclusioni l curve di calibrazione realizzate mostrano un differente andamento a seconda della lunghezza d onda selezionata lineare a 255 nm e polinomiale a 265 nm Pertanto stato deciso di proseguire lo studio per l allestimento della metodica utilizzando il lotto 2 dell IbuNa e preferendo la lunghezza d onda di 265 nm nonostante sia stata utilizzata nelle prove anche 254 nm per verificare le differenze Per quanto riguarda quanto accennato all inizio di questo paragrafo sull effetto del THF sullo strumento purtroppo non stato possibile ottenere delle informazioni esaustive ne dai manuali operativi ne tantomeno da parte dell assistenza tecnica di conseguenza stato pensato di non utilizzarlo come componente della fase Mobile Prima di effettuare tale scelta e di proseguire con la messa a punto della nostra metodica sono state adottate delle misure precauzionali che assicurassero un ottimo utilizzo e rendimento dello strumento stesso Innanzitutto sono state determinate le condizioni basali dello strumento sono state monitorate le pressioni generate a 0 5 e 1 0 mL min facendo flussare diverse fasi mobili di riferimento Tab 4 15 prima del c
69. e cuvette in vetro Turner Designs P N 8000 931 volume per una buona lettura 75 200 ul Tutta la vetreria e gli oggetti in plastica riutilizzabili sono stati accuratamente lavati con detersivo le bottigliette rimangono a contatto con dell acqua saponata per ca 2 ore risciacquati con acqua di fonte e successivamente con WMQ Le cuvette in plastica ed in vetro sono state sempre lavate abbondantemente con WMQ e lasciate asciugare in posizione capovolta per evitare l ingresso di polvere Protezione L operatore ha sempre utilizzato i dispositivi di protezione personale quali camice guanti monouso in nitrile o lattice e calzari di protezione 2 3 Strumenti Gli strumenti utilizzati sono i seguenti un sistema per la produzione di WMQ Labo Star 7TWF DI UV Siemens alcune micropipette a volume variabile da 20 200 e 1000 uL Eppendorf e Gilson un pipettatore Accu Jet Brand un frigorifero SA 300 L Indesit un fluorimetro portatile Picofluor 8000 004 Turner Designs canale blu exc 475 15 nm em 515 20 nm canale rhod exc 525 20 nm em gt 570 nm una stufa non ventilata E28 Binder GmbH un pH metro pH 5 6 Eutech Instruments Pte Ltd con sonda termometrica incorporata EC PH5 TEMO1P 35613 05 Eutech Instruments Pte Ltd ed una centrifuga Minispin Plus 5453 Eppendorf Quantificazione proteica_Kit NanoOrange_ 2 3 1 Settaggio del fluorimetro Innanzitutto stato controllato lo stato di pulizia de
70. e gli oggetti in plastica riutilizzabili sono stati accuratamente lavati con acqua saponata risciacquata con acqua di fonte e successivamente con acqua distillata o con WMQ Degradazione e Deproteinizzazione della cute Protezione Le soluzioni contenenti HCI e NAOH usate per aggiustare il pH dei tamponi ed in generale tutti i solventi organici sono stati Maneggiati sotto cappa chimica L operatore ha sempre utilizzato i dispositivi di protezione personale quali camice guanti in nitrile lattice 3 3 Strumenti Gli strumenti utilizzati per la realizzazione di questa tesi sono i seguenti un sistema per la produzione di WMQ Labo Star 7TWF DI UV Siemens una bilancia analitica sensibile alla quarta cifra decimale ABS 120 4 Kern un pH metro con sonda termometrica incorporata pH 5 6 Eutech Instruments Pte Ltd ed equipaggiata con due elettrodi combinati InLab 423 o InLab 412 Mettler Toledo un agitatore magnetico F60 Falc una stufa termo ventilata FD53 Binder GmbH una stufa non ventilata E28 Binder GmbH una centrifuga C1 Heraeus Megafuge 11 R Thermo Scientific Waltham una centrifuga C2 Minispin Plus 5453 Eppendorf alcune micropipette a volume variabile da 20 200 e 1000 uL Eppendorf e Gilson un pipettatore Accu Jet Brand un vortex GViab Gilson uno spettrofotometro UV Vis a singolo raggio Cary UV Vis Varian una cuvetta in quarzo con due pareti ottiche il cui cammino ottico pari a 1 cm
71. fluorescenze di WMQ della cuvetta W del campione C del campione normalizzato CN e del campione normalizzato rispetto al kit CF Nella Tabella 2 8 possibile notare una maggiore somiglianza tra le fluorescenze della mattina e della sera nella porzione alta della curva mentre dal campione n 8 1 ug ml la proporzionalit non viene pi rispettata ottenendo dei valori negativi la mattina campioni n 8 9 10 11 e dei punti non pi proporzionali la sera campioni n 8 10 11 Tabella 2 8 Risultati delle curve di calibrazione di 2 mL di campione Campione Albumina w A 4g mL 1 2 I 2 1 2 1 2 1 0 0 147 8 240 0 166 8 246 3 19 0 6 3 0 0 0 0 2 10 0 216 8 211 9 511 0 492 7 294 2 280 8 275 2 274 5 3 8 0 186 1 224 2 490 9 482 8 304 8 258 6 285 8 252 3 4 6 0 226 3 228 4 448 1 409 6 221 8 181 2 202 8 1749 5 4 0 183 4 200 3 342 0 351 0 1586 150 7 139 8 144 4 6 3 0 131 2 188 5 251 2 292 3 120 0 103 8 101 0 975 7 2 0 239 2 180 0 298 2 230 3 58 9 50 3 39 9 44 0 8 1 0 199 7 191 0 217 2 209 5 17 5 18 5 1 5 12 2 9 0 8 195 0 161 8 205 7 178 4 10 7 16 6 8 3 10 3 10 0 6 156 3 237 4 173 0 250 9 16 7 13 5 2 83 72 11 0 3 264 7 260 2 268 5 310 3 3 8 50 1 15 2 43 8 12 0 1 157 7 195 6 346 9 202 2 189 2 6 6 170 2 0 3 Quantificazione proteica_Kit NanoOrange_ Tabella 2 9 Risultati delle curve di calibrazione di 0 2 ML di campione Campione Albumina W C C W C W WS Hg mL 1 2 1 2 1 2 1 2 1 0 0 2 5 3 7 4 1 1 9 1 6 1 7 0 0 0
72. in fase inversa Macherey Nagel pp 36 37 Shimadzu high performance liquid chromatograph LC 2010 AHT 2010CHT Manuale di istruzioni installazione e Manutenzione dello strumento Shimadzu pag 62 Shimadzu high performance liquid chromatograph LC 2010 AHT 2010CHT Manuale di istruzioni installazione e Manutenzione dello strumento Shimadzu pag 33 Sito web lt http mwwlaball co kr uploads Resistance PEEK Polymers pdf gt consultato il 22 07 2013 A P Schellinger and P W Carr Agueous Organic Eluents for Reversed Phase Liquid Chromatography June 2004 volume 22 numero 6 Pp 544 548 H A Claessens M A van Straten J J Kirkland Effect of buffers on silica based column stability in reversed phase high performance liquid chromatography Journal of Cromatography A 1996 pp 259 270 60 61 62 63 64 65 66 Bibliografia Decades of experience and innovation in chromatography reversed phase HPLC Manuale sull HPLC in fase inversa Macherey Nagel pag 40 M Ganeson K S Rauthon Y Pandey and P Tripathi Determination Of Ibuprofen In Human Plasma With Minimal Sample Pretreatment IJPSR 2010 Vol 1 Issue 5 C Arcelloni R Lanzi S Pedercini G Molteni I Fermo A Pontiroli R Paroni High performance liquid chromatographic determination of diclofenac in human plasma after solid phase extraction Journal of Chromatography B 763 2001 195 200 S M Al saidan Transdermal self o
73. inferiore ma una differente deviazione standard 7 896 168 vs 9 861 26 Tale differenza ipoteticamente riconducibile al differente lotto della polvere L2 vs L1 La forma dei picchi del lbuNa L2 nei vari cromatogrammi n 9 x 3 non mostrati si presenta stretta alla base ma tende ad allungarsi simmetricamente verso l alto simmetria 1 ad entrambe le lunghezze d onda Gli intervalli di concentrazione in cui stato possibile quantificare senza problemi l buNa L2 sono 7 69 0 12 ug mL Concentrazioni pi piccole non sarebbero quantificabili con precisione Pertanto nelle condizioni di questa analisi si pu affermare che il limite di rivelamento di ca 0 12 ug mL Continuando con l analisi dei dati in Tabella 4 25 si pu riassumere che l i tempi di ritenzione del DicloNa risultano essere tutti identici a 10 9 minuti Rispetto ai dati mostrati in Tabella 4 17 e 4 20 si pu osservare che queste ultime analisi risultano avere dei tempi anticipati i e 9 90 min Le aree dei 9 campioni del DicloNa nelle diverse repliche oscillano in un intervallo compreso tra 16 788 e 19 020 unit arbitrarie Rispetto all area tabulata in Tabella 4 20 relativa alla concentrazione 0 98 ug ml i e 26 456 i campioni risultano avere un area molto pi bassa Ma se a causa dei problemi che si sono verificati durante quelle analisi si calcola un area teorica ottenuta per proporzionalit seriale 19 500 u a partendo dal risultato de
74. infine stata portata a volume stata cos ottenuta una soluzione di ABSL a concentrazione 100 ug mL ABSL1 che stata utilizzata nell arco di due settimane dopo aver costantemente controllato il suo stato e in Modo particolare la presenza di muffe Tale concentrazione servita da soluzione madre per la preparazione della soluzione ABSL2 10 ug mL scelta in base alla concentrazione della soluzione ABS1 Par 2 4 3 1 Quantificazione proteica_Kit NanoOrange_ La soluzione ABSL2 stata preparata come di seguito descritto In una bottiglietta 12 mL sono stati pipettati 1 mL della soluzione ABSL e 9 ML di WMQ L aggiunta dell acqua sufficiente a miscelare la soluzione La sua preparazione sempre stata effettuata il giorno stesso dell esecuzione dell esperimento Inoltre stata preparata un altra soluzione di ABSL indicata con l acronimo ABSL3 e che stata preparata in una bottiglietta 12 mL dove sono stati versati 2 5 mg di ABSL pesati e recuperati come precedentemente descritto e poi sono stati pipettati 9 5 mL di WMQ utilizzando una pipetta graduata in plastica 10 mL Pertanto la soluzione ABSL3 ha una concentrazione di 263 16 ug mL Le soluzioni ABSL2 e ABSL3 sono state utilizzate per la preparazione dei campioni in WS vedi Tab 2 3 2 9 allestiti per gli esperimenti di validazione della curva di calibrazione e per la messa a punto del volume di campione incognito da utilizzarsi per la sua quantificazione
75. invece inspiegata la deriva relativa alla sola iniezione della soluzione MeOH WMa Fig 4 28 C inserto ACN PURO Intensit mV Intensit mV ACN TF 25 Intensit mV Intensit mV Tempo minuti Tempo minuti Figura 4 28 Cromatogramma di A ACN puro B ACN WMQ 80 20 v v C MeOH WMQ 80 20 v v e D ACN TF 25 27 73 vv vari inserti hanno una scala delle intensit compresa tra 0 e 800 mV per evidenziare eventuali picchi presenti nel tempo 5 20 minuti Condizioni 20 uL di solvente iniettato in colonna accessoriata con PC a 254 nm 1 0 mL min con la fase mobile identica al solvente in questione tranne nel caso A nel quale la fase mobile stata ACN WMQ 80 20 v v in quanto impossibile far passare in colonna esclusivamente ACN puro Nota con ME nell inserto della figura C si intende MeOH Considerando che questi cromatogrammi sono stati ottenuti in presenza di pressioni post lavaggio basse pressioni di operazione corrette e sostituzione della colonna di guardia con una nuova si era ipotizzato che il problema non risiedesse nel circuito dello strumento ma semplicemente nell iniettore Pertanto sono stati eseguiti dei ripetuti cicli di lavaggio di tale componente Par 4 6 4 al termine dei quali sono state ripetute le iniezioni dei solventi Nella Figura 4 29 viene mostrato un esempio di confronto tra dei croma togrammi ottenuti prima e dopo la pulizia dell iniettore
76. ipotizzato che i problemi di recupero potessero essere dovuti magari all interazione del TF25 Per questo l esperimento eseguito per il farmaco con le due metodiche di precipitazione stato ripetuto nello stesso Modo del precedente anche per il tampone fosfato 25 MM trattandolo con le due soluzioni precipitanti Nel corso dell esperimento stato notato un comportamento anomalo del campione che ha seguito il metodo al momento dell aggiunta dei 2 mL di ACN alla miscela del tampone col la soluzione precipitante In pochi secondi si costituita una formazione dalla consistenza quasi gelatinosa simile ad una medusa Man mano che il tempo di contatto aumentava si andava ad ingrandire anche la formazione anomala stato comunque proseguito l esperimento come fatto precedentemente Degradazione e Deproteinizzazione della cute Nell aggiunta dei 2 mL di MeOH invece non accaduto nulla di strano Inoltre stato ripetuto un esperimento con l IbuNa nel quale stata simulata la filtrazione in cartuccia stata effettuata la precipitazione offline nei due diversi metodi e successivamente sono stati aggiunti i 2 mL di solvente di lavaggio 12 5 mL di soluzione sono stati essiccati in stufa e risospesi in 2 5 ML di WMQ stato variato il volume di risospensione per ottenere uno spettro molto pi chiaro anche nella parte sinistra in quanto diluito I risultati ottenuti dalle analisi allo spettrofotometro di tale esperimento sono stati
77. lotti di IbuNa presi singolarmente e come miscela ottenuta triturando in un vetrino da orologio una piccola quantit dei due lotti in rapporto 1 1 Le polveri semplici o composte sono state prelevate con la estremit aperta di un capillare in vetro e si fatto in Modo che finissero nella estremit chiusa A questo punto il capillare stato inserito nell apposito alloggiamento all interno dello strumento a contatto con una piastrina dotata di resistenza elettrica Lo strumento dotato inoltre di una lente che permette l ingrandimento del capillare e di vedere il momento esatto in cui la sostanza inizia la sua fusione e la temperatura registrata dal termometro incorporato Questa rappresenta il punto di fusione Inoltre stata annotata anche la temperatura alla quale la fusione risultata completa valori di temperatura ottenuti sperimentalmente sono stati confrontati con i dati presenti in letteratura vedi Fig 4 4 Hplc 4 5 1 3 Misurazione del pH Il pH delle soluzioni contenenti IbuNa stato misurato con un pH metro equipaggiato con la sonda InLab 423 solo occasionalmente stata utilizzata la sonda Inlab 412 Prima di ogni misurazione la calibrazione dello strumento stata sempre verificata Per fare ci la sonda viene inizialmente inserita in una soluzione standard a pH 7 e si annotano il pH rilevato dallo strumento i MV e la temperatura Successivamente si inserisce la sonda in una soluzione standard a
78. lt 200 220 240 260 280 300 320 340 360 Lunghezza d onda nm Figura 4 24 Spettri di assorbimento UV Vis del DicloNa in PBS Sono rappresentati gli spettri della soluzione madre 1 con concentrazione pari a 1 mg mL dalla quale si sono ottenute le diluizioni seriali 2 9 500 3 906 pg mL Confrontando l assorbimento a 275 nm del DicloNa in PBS diluizione 4 62 5 ug mL con quelle precedenti in WMQ e TF 50 stessa concentrazione si osservato che risulta essere superiore 1 833 u a 4 9 Separazione cromatografica in HPLC Questo paragrafo consta di diverse sezioni In particolare le informazioni presenti nei primi paragrafi sono state acquisite nel tempo man mano che si utilizzava lo strumento e si sono rivelate particolarmente importanti per diversi Motivi Successivamente vengono riportati gli esperimenti effettuati per ottenere il protocollo della metodica finale di separazione e quantificazione 4 9 1 Determinazione dei parametri basali dello strumento 125 126 Hplc Nel tentativo di effettuare delle analisi sempre con le stesse condizioni basali in modo da poter escludere malfunzionamenti o altri parametri relazionati direttamente con lo strumento sono state monitorare le pressioni in diverse condizioni dopo un lavaggio esaustivo e completo dello stesso Le varie condizioni precedentemente indicate Tab 4 4 sono completate in Tabella 4 15 Osservando i dati elencati iniziamo soffermandoci sulla condizi
79. mV che non presente nei cromatogrammi precedenti del DicloNa La forma del picco dell IbuNa Fig 4 34 C appare con una spalla leggermente accennata nella FM 10 che tende ad assumere le sembianze di uno scodamento nel lato destro simmetria gt 1 nelle altre due FM mentre la forma del picco del DicloNa presenta una vera e propria spalla seguita da un picchetto alla sua destra e due picchi successivi che precedentemente non erano cos consistenti 0 05 vs 1500 mV 4 34 D vs 4 34 D alla sua sinistra Pertanto in generale possibile affermare che non sono stati ottenuti degli evidenti miglioramenti di forma ma anzi stato notato un peggioramento rispetto all analisi effettuata utilizzando la fase mobile priva di iPrOH Fig 4 32 Il tempo di ritenzione ha mostrato invece un anticipazione accettabile Nonostante i cromatogrammi ottenuti non siano stati completamente soddisfacenti stato approfondito lo studio sull iPrOH effettuando delle corse cromatografiche utiliz zando questa volta le FM 13 16 nelle quali anche la percentuale di composizione dell ACN stata variata Fig 4 35 Hplc Ibu FM 13 Diclo FM 13 Ibu FM 14 Diclo FM 14 Ibu FM 15 Diclo FM 15 Ibu FM 16 Diclo FM 16 Intensit mV Intensit mV 5 10 10 Tempo minuti Tempo minuti Ibu FM 13 Diclo FM 13 Ibu FM 14 Diclo FM 14 Ibu FM 15 Diclo FM 15 Ibu FM 16 Diclo FM 16 Intensit mV Intensit mV 0 5 5 10
80. matraccio tappato con del parafilm 4 6 7 2 Curva di calibrazione di IbuNa Per individuare il range di aree corrispondenti alle diverse concentrazioni di IbuNa lotto 1 si proceduto in questo Modo in triplo e da tre madri a concentrazione 1 mg mL in fase mobile Quindici microprovette sono state posizionate in una scarabattola numerandole dalla concentrazione pi alta a quella pi bassa Nelle microprovette sono stati pipettati 1 ML di FM 2 ACN TF 50 27 73 Successivamente nella prima microprovetta sono stati pipettati 1 ML della soluzione Madre di lbuNa 1 mg mL in FM 2 Dopo accurata miscela zione sono stati prelevati 1 mL dalla prima provetta e sono stati pipettati nella seconda E cos di seguito fino alla 15 microprovetta Alla fine di questa procedura si ottengono 14 microprovette che contengono 1 mL ciascuna tranne l ultima che contiene 2 mL Il range di concentrazioni varia da 500 a 0 03 ug mL 500 000 30 52 ng mL ed ognuna la met di quella precedente Il contenuto delle microprovette stato aspirato con una siringa da 10 ML e filtrato Acrodisc nelle vial Par 4 4 7 campioni cos ottenuti sono stati subito posizionati nel vassoio porta campioni dell HPLC ed analizzati secondo la metodica descritta nel Paragrafo 4 6 6 3 L analisi dei cromatogrammi ha permesso di Hplc ottenere le aree corrispondenti alle concentrazioni analizzate dati sono stati infine graficati e Modellizati utilizzando Or
81. necessari ed indispensabili per l analisi dei campioni in situazioni di estrema precisione e accuratezza ed in condizioni basali ripetibili e costantemente monitorate In aggiunta la metodica caratterizzata da una corsa cromatografica tale da non permettere un utilizzo eccessivo di solventi in Modo da non comportare un alto dispendio economico 199 P1010 Conclusioni Nonostante tutto il vantaggio di maggior rilievo per la nostra linea di ricerca risulta essere sicuramente il fatto che le condizioni di analisi risultano essere molto simili a quelle esistenti nel corso dell esperimento di veicolazione transdermica Questo aspetto comporterebbe un trattamento minimo dei campioni i quali potrebbero essere analizzati direttamente all Hplc in seguito all aggiunta dello standard interno 11 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Bibliografia Bibliografia M R Prausnitz and R Langer Transdermal drug delivery Nat Biotechnol 2008 November 26 11 1261 1268 doi 10 1038 nbt 1504 B Baroli Skin for infracutaneus or percutaneus drug delivery Dalle lezioni di legislazione e forme farmaceutiche corso di laurea TAAF 2009 B Baroli Penetration of nanoparticles and nanomaterials in the skin fiction or reality Journal of pharmaceutical sciences 21817 2009 pp 1 9 G Ambrosi G Anastasi D Cantino S Capitani R F Donato A T Franzi R Geremia M Gulisano M F Marcello
82. organiche sia nella valutazione del loro grado di purezza Esso viene valutato facendo attraversare una determinata molecola o soluzione da un fascio di raggi provenienti da una sorgente luminosa che passando da un mezzo ad un altro diversamente rifrangente modificher la sua velocit e la sua direzione 31 L indice di rifrazione rappresenta pertanto per le sostanze solide o liquide o per le soluzioni il rapporto tra la velocit della luce nell aria e quella nella sostanza in esame 31 Si tratta di una grandezza utilizzata in svariati ambiti della scienza e la sua misura pu essere usata per identificare la natura del materiale in cui si propaga la radiazione Ad esempio in chimica vengono comunemente effettuate misure dell indice di rifrazione con lo scopo di trarne indicazioni analitiche In funzione dei parametri solvente lunghezza d onda incidente e temperatura Hplc si effettua la misura del parametro utilizzando un rifrattometro Questa metodica analitica viene utilizzata in vari campi in campo medico per analisi del sangue e delle urine in ambito industriale nella analisi dei materiali per determinare la concentrazione zuccherina in succhi di frutta o il grado alcolico di bevande per certificare il livello qualitativo o evidenziare sofisticazioni di alimenti quali l olio il latte ed il burro 31 Dalla misurazione dell indice di rifrazione risultato che le due acque c WMQ e WMA presentano lo stesso valore pari a 1 3
83. per sia presente un po di deriva Nella Figura 3 8 invece mostrata la comparazione degli spettri della cute non filtrata in cartuccia ma precipitata offline con le due differenti metodiche Nella Figura 3 8 A rappresentato il metodo mentre nella Figura 3 8 B mostrato il metodo Il entrambi con una e due centrifughe Degradazione e deproteinizzazione della cute Cute ACN 2C 8 NOVI Cute MeOH 2C 8 NOV Cute ACN 1C 5 NOVI Cute MeOH 1C 8 NOV ni d d 2 g N z S S 5 o d z i 4 lt q 400 800 400 600 800 Lunghezza d onda nm Lunghezza d onda nm Fig 3 8 Cute umana precipitata off line ma non filtrata con 1 e 2 centrifughe Gli spettri della cute non filtrata mostrano una maggior pulizia con la seconda centrifuga in entrambi i metodi Questo risultato maggiormente marcato con il metodo Fig 3 7 A Nella Figura 3 9 sono stati raggruppati i risultati ottenuti per metodo Nella Figura 3 9 A possibile osservare il confronto tra le filtrazioni e la cute non filtrata che ha subito le diverse centrifughe del metodo I mentre lo stesso confronto stato fatto per il metodo Il Fig 3 8 5 Spe ACN cute 10 9 NO Spe MeOH cute 1C 9 NOV Spe ACN cute 2C 9 NO Spe MeOH cute 2C 9 NOV Cute ACN 2C 8 NOV Cute MeOH 2C 8 NOV Cute ACN 1C 8 NOV Cute MeOH 1C 8 NOV Assorbanza u a Assorbanza u a 400 600 400 600 800 Lunghezza d onda nm Lun
84. possibile notare un anticipo di ca due secondi ca 8 00 min per l buNa L e ca 11 00 min per il DicloNa Tale differenza attribuibile all utilizzo di una differente fase mobile caratterizzata dal contenere un TF maggiormente concentrato TF50 vs TF25 Se ci si sofferma invece sulle aree dell IbuNa L2 e g 7 69 ug mL a 254 nm possibile notare un decisivo incremento nelle 24 ore che tende a diminuire leggermente nelle 48 ore i e 7 896 vs 9 616 vs 9 304 u a La retta di calibrazione di riferimento Tab 4 21 invece aveva fornito un area di ca 9 900 unit arbitrarie ma tale differenza potrebbe essere derivata dal differente lotto della polvere e dalla diversa fase mobile utilizzata FM 2 vs FM 17 Analizzando invece le aree alla lunghezza d onda di 265 nm emerge un continuo aumento della quantificazione i e 11 442 vs 13 698 vs 13 723 u a caratterizzato per da una variabilit superiore rispetto all analisi effettuata a 254 nm in tutti e tre i tempi di analisi Il DicloNa in tutti e tre gli esperimenti risultato con un area costante compresa in un range di 18 000 20 000 unit arbitrarie Nonostante il differente comportamento dell IpbuNa L2 a 254 nm nei tre tempi durante l analisi dei rapporti tra IbuNa L2 DicloNa emerge un aumento degli stessi che risulta essere proporzionale alla durata del trattamento termico 0 431 vs 0 504 vs 0 518 Tale risultato potrebbe dipendere dall area quantificata per il Dic
85. riportati nella Figura 3 14 nella quale vengono confrontati gli spettri del farmaco trattato nei due metodi di analisi con due diversi volumi di risospensione Dalla Figura 3 14 possibile notare il confronto tra le due diverse concentrazioni ma per quantificare realmente il farmaco stata considerata l assoroanza a 265 nm ed stata cos calcolata la concentrazione esplicitando l equazione della retta di calibrazione IBU 12 5 W IBU Il 2 5 W IBUI 0 5 W IBU II 0 5 W z s c z o N G 2 pm e D o lt 400 600 800 1000 Lunghezza d onda nm Figura 3 14 Analisi dell Ibu Na in TF25 risospeso in 0 5 mL verde e blu e in 2 5 mL nero e rosso La Tabella 3 7 mostra quanto IbuNa stato recuperato dall esperimento eseguito tenendo conto anche della concentrazione teorica per poi calcolare la percentuale trovata Degradazione e deproteinizzazione della cute Tabella 3 7 Quantificazione dell Ibu Na in TF25 trattato con metodo I e Il risospeso in 0 5 e 2 5 ML lbuNa Campione Metodo Teorica memi Trovata a 1 lou Na I 0 5 4 25 0 36 8 5 2 Iou Na Il 0 5 2 83 0 54 19 1 3 Ibu Na 2 5 0 85 0 13 15 3 4 Iou Na Il 2 5 0 56 0 10 17 6 risultati ottenuti risultano essere Molto bassi con una percentuale di recupero pi bassa col metodo in entrambe le diluizioni Visti i risultati non conformi alle aspettative sono stati allestiti degli esperimenti per verificare se l essic
86. si mantiene funzio nante ed una parte sperimentale come si sviluppata la metodica di separazione paragrafi successivi seguono questa logica in Modo da rendere pi chiara e fruibile l analisi e la discussione dei dati che saranno presentati nel prossimo capitolo DURANTE L INIEZIONE 1 f INN P PRESSIONE 2 j F lecce DURANTE FUNZIONAMEN DELLA POMPA E Scarico Fase 6 1 Mobile T FASE MOBILE J POMPADI Figura 4 2 Schema HPLC Nella figura viene schematizzato l HPLC esso composto da 1 quattro linee solventi 2 una linea per la pulizia dell ago 3 una camera di miscelazione con due pompe 4 un sistema di lavaggio della camera dei retro pistoni 5 un sistema degasatore 6 un circuito di tubi metallici che vanno dal miscelatore all ingresso della colonna 7 un blocco o forno riscaldante 8 un sistema per esclu dere la colonna union 9 un autocampionatore ad alta velocit ago di iniezione due vassoi rack porta campioni un blocco termico per riscaldare o raffreddare i campioni contenuti nelle vial ed infine 10 un rivelatore UV Vis Adattato da 28 4 6 1 Elementi costituenti lo strumento Il crtomatografo utilizzato in questo studio uno strumento compatto costituito come mostrato in Figura 4 3 vedi pagina precedente dai seguenti elementi 1 quattro linee solventi bottiglie dedicate pescanti 2 una linea per la pulizia del
87. soluzione attraverso un agitazione manuale facendo attenzione a non capovolgere mai la bottiglietta La cute a contatto con la Collagenase stata cos incubata a 37 C per circa 48 ore Successivamente la cute disciolta stata mantenuta in un bancone del laboratorio col tappo perfettamente chiuso e senza parafilm 3 4 3 Deproteinizzazione della cute Una volta ottenuta la cute disciolta stato necessario procedere con la sua deproteinizzazione per poterla cos analizzare anche attraverso l utilizzo della cromatografia Degradazione e Deproteinizzazione della cute liquida ad alta pressione Sono stati testati diversi metodi per eliminare le proteine dal campione di cute in Collagenase e per verificare quale fosse quello pi efficace 3 4 3 1 Deproteinizzazione per precipitazione in solvente organico In una microprovetta sono stati pipettati 0 7 mL di cute disciolta Par 3 4 2 e 0 3 ML di MeOH Successivamente stata favorita la miscelazione della soluzione col solvente attraverso qualche minuto di spipettamento 2 3 min In seguito il campione stato centrifugato C2 10 minuti 13500 g ottenendo un pellet molto evidente Il sumatante stato poi trasferito in una nuova microprovetta ed stato fatto essiccare a 37 C Il residuo secco stato poi ripreso con 0 5 ML di WMA e la sua dissoluzione stata favorita mediante qualche minuto di vortexamento La soluzione cos ottenuta stata utilizzata per la q
88. stata effettuata per entrambi i metodi eseguendo in doppio una prima centrifuga come descritto nel Paragrafo 3 4 3 4 successivamente stato prelevato il surnatante ed stato trasferito in una seconda eppendorf Un campione di ciascun metodo stato sottoposto ad una nuova centrifuga della stessa durata e condizioni della prima In seguito i sumatanti ottenuti dalle centrifughe sono stati filtrati in cartuccia Spe Dopo l essicazione e la risospensione sono stati realizzati gli spettri all UV Fig 3 7 analizzando anche la cute trattata con la precipitazione off line con una e con due centrifughe Fig 3 8 La Figura 3 7 rappresenta il confronto tra la filtrazione in Spe del metodo Fig 3 7 A e del metodo ll Fig 3 7 B Spe ACN cute 1C 9 NOV Spe MeOH cute 1C 9 NOV Spe ACN cute 2C 9 NOV Spe MeOH cute 2C 9 NOV Ci E n N c bi v H lt q Assorbanza u a 400 600 400 600 800 Lunghezza d onda nm Lunghezza d onda nm Figura 3 7 Cute umana filtrata con metodo I A e metodo Il B con 1 o 2 centrifughe Nella Figura 3 7 A evidente la differenza ottenuta tra lo spettro in nero una centrifuga e quello in rosso due centrifughe La doppia centrifuga ha apportato infatti un evidente pulizia dello spettro Lo stesso risultato stato ottenuto per il metodo Il infatti nella Figura 3 7 B palese una maggior linearit dello spettro ottenuto dalla doppia centrifuga nonostante
89. stati aggiunti 16 uL di DicloNa in fase mobile 62 5 ug mL in qualit di standard interno SI e preparato come descritto Hplc nel Paragrafo 4 6 7 La soluzione cos ottenuta stata aspirata con una siringa munita di ago metallico e filtrata direttamente in vial attraverso un filtro Acrodisc o Whatman 4 6 7 Curva di calibrazione Per la quantificazione dei campioni incogniti stata allestita una curva di calibrazione dove stato messo in relazione la concentrazione dell buNa vs il rapporto delle aree IbuNa SI dei picchi eluiti L allestimento della suddetta curva consta dei seguenti punti 4 6 7 1 Preparazione delle soluzioni madre di lbuNa e DicloNa Le soluzioni Madre di lbuNa conservato come descritto nel Paragrafo 4 5 1 1 e DicloNa 1 mg mL ciascuna sono state preparate pesando su carta da pesata 10 mg di ciascuna sostanza con una bilancia analitica precedentemente calibrata Successivamente le due sostanze sono state versate ciascuna nel proprio matraccio in vetro 10 mL nei quali stata aggiunta la fase mobile metodica finale quasi sino al livello del menisco La dissoluzione del contenuto stata favorita Mediante agitazione magnetica 5 10 minuti A dissoluzione avvenuta stato spento l agitatore tolto il Magnetino attraverso l utilizzo di una calamita e le soluzioni sono state portate a volume Le soluzioni cos ottenute si sono ulteriormente agitate manualmente capovolgendo 2 3 volte il
90. stato ripristinato Sono stati misurati i valori di pH di alcune soluzioni che contenevano IbuNa entrambi i lotti Per quanto riguarda il primo lotto stato misurato il pH delle soluzioni in WMQ PBS TF 50 e in FM 2 aventi concentrazioni 1 mg mL Per quanto riguarda invece il secondo lotto stato misurato il pH delle soluzioni madre in TF 25 in un intervallo di concentrazioni compreso tra 0 033 e 17 mg mL Hplc 4 5 1 4 Spettroscopia UV Vis Le soluzioni di IouNa entrambi i lotti in vari solventi sono state analizzate qualitativa mente e quantitativamente mediante spettrofotometria UV Vis In entrambi i casi stata presa in considerazione la capacit di assorbimento ABS unit di misura arbitrarie nella regione spettrale compresa tra 1100 e 190 nm Per fare ci 600 uL della soluzione in esame e del suo bianco sono stati pipettati in una cuvetta di quarzo che stata poi inserita nell apposito alloggiamento dello strumento Si precisa che utilizzando una sola cuvetta il bianco sempre stato analizzato prima del campione in esame Inoltre la cuvetta tra una analisi e l altra stata sempre abbondantemente sciacquata con WMQ per tre volte indi pendentemente dal solvente in cui l buNa era disciolto Gli spettri sono stati ottenuti grazie al software Cary UV Vis i dati relativi sono stati successivamente esportati ed elaborati con i programmi Excel 2003 ed Origin 6 0 Gli spettri sono stati azzerati alla lunghezza d onda
91. stessa lunghezza d onda dell esperimento 2 Tab 4 38 0h254nmeEsp 1 0h265 nm Esp 1 0h254nmeEsp 2 0h265nmeEsp 2 Area IbuNa L2 N i E z 5 2 p a lt 4 6 4 6 Concentrazione pg mL Concentrazione g mL Figura 4 38 Confronto tra le aree dell IbuNa L2 non trattato termicamente quantificate negli esperimenti 1 e 2 alle lunghezze d onda di 254 sinistra e 265 nm destra La Figura 4 38 mostra la rappresentazione grafica delle aree dell IbuNa L2 quantificate negli esperimenti 1 e 2 messi a confronto a seconda della lunghezza d onda settata per l analisi cromatografica Il grafico di sinistra indica i risultati ottenuti a 254 nm per i quali possibile notare un aumento dell area relativa al farmaco nell esperimento 2 Ciononostante anche visibile una deviazione standard maggiormente marcata evidente solamente nel campione a concentrazione pi alta 7 69 ug mLl Tutti gli altri punti risultano quasi perfettamente sovrapposti alle analisi effettuate nell esperimento 1 La parte destra della Figura 4 39 mostra i risultati degli stessi esperimenti analizzati a 265 nm In questo caso emerge una similarit dei punti dei due esperimenti che tendono a sovrapporsi per il range di concentrazioni compreso tra 0 03 1 92 ug mL Tale precisione va a diminuire per i campioni a concentrazione 3 84 e 7 69 ug mL per i quali si nota una leggera differenza per il punto pi basso si ha solamente differenza nell area
92. valori sono indicati in Tabella 4 26 con la sigla n r Questo fatto lascia perplessi in quanto ci si aspettava una maggior risoluzione data dalla maggior assoroanza alla lunghezza d onda in esame In questo caso non possibile effettuare un confronto dell area ottenuta a 7 69 ug mL ca 11 400 u a con una concentrazione teorica in quanto le rette della Tabella 4 20 e 4 21 non sono state analizzate a 265 nm La forma dei picchi del IbuNa L2 nei vari crtomatogrammi n 9 x 3 non mostrati presenta una simmetria 1 Gli intervalli di concentrazione in cui stato possibile quantificare senza problemi l buNa L2 sono 7 69 0 12 ug mL Concentrazioni pi piccole non sarebbero quantificabili con precisione Pertanto nelle condizioni di questa analisi si pu affermare che il limite di rivelamento di ca 0 12 ug mL Continuando con l analisi dei dati in Tabella 4 27 si pu riassumere che l i tempi di ritenzione del DicloNa risultano essere tutti identici a 10 9 minuti Rispetto ai dati mostrati in Tabella 4 17 e 4 20 si pu osservare che queste ultime analisi risultano avere dei tempi anticipati i e 9 90 min Le aree dei 9 campioni del DicloNa nelle diverse repliche oscillano in un intervallo compreso tra 28 073 e 31 611 unit arbitrarie Anche in questo caso non possibile effettuare un confronto con una concentrazione teorica in quanto le rette della Tabella 4 22 e 4 23 non sono state analizzate a 265 nm La forma d
93. 0 2 10 0 2 5 4 0 24 9 20 6 22 5 16 6 20 8 18 3 3 8 0 3 6 0 6 26 2 22 6 22 5 22 1 20 9 23 8 4 6 0 4 8 2 3 20 8 17 8 16 0 15 5 14 4 17 2 5 4 0 1 9 4 8 16 1 12 1 14 2 7 2 12 6 9 0 6 3 0 2 6 1 5 11 6 9 9 9 0 8 4 7 4 10 2 7 2 0 1 9 2 8 10 8 5 3 8 9 2 6 7 3 4 3 8 1 0 1 4 2 9 7 4 4 3 5 9 1 4 4 3 3 1 9 0 8 3 2 1 5 6 1 3 8 2 8 2 3 1 2 4 0 10 0 6 2 3 3 0 2 1 4 6 0 3 1 6 1 9 3 4 11 0 3 5 2 0 5 3 6 3 2 1 6 2 7 3 2 4 5 12 0 1 0 2 1 8 3 7 4 4 3 5 2 6 1 9 4 3 Una situazione simile stata ottenuta anche con l utilizzo delle cuvette in vetro Tab 2 9 dati relativi alle tabelle sopra descritte sono stati rappresentati nella Figura 2 3 nella quale possibile analizzare i campioni letti con le cuvette in plastica nel grafico A e con le cuvette in vetro nel grafico B gt m 09 11 11 Mattina 09 11 11 Mattina 09 11 11 Sera 09 11 11 Sera Dei ri Dei Z S RI e N g O d 3 O pA gt 5 o 3 3 u ra Albumina ug ml Albumina pgimL Figura 2 3 Curve di calibrazione modificate analizzate con cuvette in plastica A e in vetro B Dal grafico rappresentato in Figura 2 3 A si pu osservare un andamento delle due curve molto simile fatta eccezione per il campione n 12 della mattina e n 11 della sera che presentano una fluorescenza pi alta rispetto alla propria concentrazione Una situazione totalmente differente compare nella rappresentazione grafica delle cuvette in vetro Fig 2 3 8 ne
94. 0 1 Fluka il fosfato di potassio dibasico c K HPO 100 Sigma Aldrich l acqua c WMA Sigma Aldrich n cat 34877 lotto BCBH6451V l acetoni trile ACN grado gradiente J T Baker n cat 9012 lotto 1032222019 il metanolo MeOH grado gradiente J T Baker n cat 8402 lotto 1115012003 il 2 propanolo iPrOH J T Baker n cat 8175 lotto 1019614004 e il tetraidrofurano THF J T Baker n cat 9441 lotto 1034302033 Laddove venga indicato a temperatura ambiente se non altrimenti specificato deve intendersi ad una temperatura compresa tra i 22 e i 25 C Altro Inoltre sono stati utilizzati Matracci di varie misure beaker vetrini da orologio spatole microtubi da centrifuga in plastica da 1 5 mL microprovette tubi da centrifuga in polipropilene da 50 mL provette da 50 bottiglie in plastica di volumi variabili sino a 500 mL puntali per micropipette da 20 200 e 1000 uL Eppendorf o Gilson pipette graduate in vetro da 10 mL pipette Pasteur vials per HLPC bottiglie di vetro da 1 L Duran carta da pesata Wa gepapier MN 226 Macherey Nagel imbuto filtrante in vetro da utilizzare collegato al sistema sotto vuoto Whatman filtri in microfibra di vetro cut off 0 7 um 47 mm Whatman filtri in nylon Magna cut off 0 22 um 47 mm GE Water amp Process Technologies imbuto filtrante sterile con filtro in acetato di cellulosa cut off 0 22 um Corning filtri a siringa d
95. 0 2 10 8 0 2 10 0 0 2 35 617 3 334 8 Tabella 4 43 Rapporti delle aree di IbuNa e DicloNa a 254 e 265 nm con trattamento di 0 ore di stufa 254 nm 0 ore 265 nm 0 ore Hg mL Ibu Diclo Ibu Diclo Ibu Diclo Ibu Diclo 1 2 3 media Dev st 1 2 3 media Dev st 7 69 0 395 0 380 0 408 0 394 0 014 0 338 0 329 0 352 0 340 0 012 3 84 0 193 0 195 0 202 0 197 0 005 0 170 0 172 0 179 0 174 0 005 1 92 0 100 0 097 0 102 0 100 0 002 0 088 0 083 0 090 0 087 0 004 0 96 0 050 0 047 0 050 0 049 0 002 0 046 0 042 0 044 0 044 0 002 0 48 0 026 0 025 0 028 0 026 0 001 0 024 0 023 0 023 0 023 0 000 0 24 0 013 0 011 0 012 0 012 0 001 0 012 0 012 0 012 0 012 0 000 0 12 0 006 0 006 0 006 0 006 0 000 0 006 0 005 0 006 0 006 0 001 0 06 0 004 0 004 0 003 0 004 0 001 0 004 0 003 0 003 0 003 0 001 0 03 n r n r n r n r nr 0 002 n r 0 002 0 002 0 000 188 Hplc Tabella 4 44 Dati dei cromatogrammi della retta di IbuNa a 254 nm trattati con 48 ore di stufa lbuNa L12 Conc lbuNa Tempo min ripetizione ug mi iniziale finale TR Area Spalle 1 7 3 8 0 7 5 8 590 Sx 2 7 69 7 1 7 9 7 4 9 023 3 il 7 9 7 4 9 622 media TEEN 7 9 0 1 PA EA 9 078 3 518 2 1 7 4 8 2 7 7 4 255 2 3 84 7 4 8 2 7 7 4 393 Sx 3 7 4 8 2 7 7 4 633 media 74 00 8 2 0 0 7I EDO 4 427 0 518 2 1 7 5 8 1 7 7 2 136 2 1 92 TS 8 1 7 7 2 158 3 7 4 8 1 7 7 2 239 media LSS 8 1 0 0 S00 ZII 942 1 7 4 8 0 7 7 1 040 2 0 96 7 4 8 0 7 7 1 161 3 7 5 8 1 7 7 1
96. 06 7 3 7 6 7 5 92 3 7 5 8 0 7 7 123 media Ta 0 78 02 Lo e 0 MSU 202 1 7 5 7 9 7 6 74 2 0 03 nr n r nr nr 3 7 4 7 7 7 6 64 media LISHI AEN 76 0 0 69 0 7 1 Tabella 4 42 Dati dei cromatogrammi della retta di DicloNa a 265 nm di controllo Hplc 187 DicloNa Conc Tempo min DicloNa ripetizione ug mi iniziale finale TR Area Spalle 1 9 6 0 8 10 1 36 064 2 7 69 9 3 0 6 9 8 37 724 3 9 3 0 6 9 8 36 529 media 9 4 0 2 10 7 Ql 9 9 0 2 36 772 93 4 856 3 1 10 0 1 2 0 6 36 015 2 3 84 9 5 0 7 0 0 36 443 3 9 7 0 9 0 2 36 158 media 97 03 1094 03 TOS amp 03 36 205 93 217 9 1 10 1 Re 0 6 36 074 2 1 92 9 9 0 0 4 36 183 3 9 8 al 0 4 36 327 media 9 9 0 2 11 1 02 106501 36 194 7 126 9 1 9 8 0 0 4 36 158 2 0 96 9 9 ill 0 4 36 018 3 10 2 2 0 6 35 911 media 10 0 072 1101 105 0 1 36 029 0 123 9 1 10 0 l 0 5 36 032 2 0 48 9 7 0 0 2 35 974 3 10 0 2 0 5 34 618 media 9 9 0 2 MAERA 10 4 0 2 35 541 3 800 2 1 9 5 0 7 0 0 35 850 2 0 24 9 8 0 9 0 3 36 031 3 9 6 0 9 0 1 35 759 media 9 6 0 2 10 8 0 1 10 1 02 35 880 0 138 5 1 9 5 0 6 0 0 36 077 2 0 12 9 6 0 7 0 0 35 353 3 9 5 0 8 0 0 35 953 media 9 5 01 10 7 01 100 0 0 35 794 3 387 2 1 9 7 0 9 0 2 36 283 2 0 06 9 5 0 7 0 0 36 050 3 9 8 0 9 0 3 36 908 media 9 7 0 2 10 8 0 1 102 02 36 413 7 443 7 1 9 6 0 9 0 1 35 601 2 0 03 9 4 0 6 9 8 35 960 3 9 7 0 8 0 1 35 291 media 9 6
97. 1 PFC ACN WMQ 80 20 0 5 34 P C MeOH WMa 80 20 0 5 63 P C ACN WMQ 80 20 0 61 P C MeOH WMa 80 20 0 126 CG C ACN WMQ 80 20 0 5 39 CG C ACN WMQ 80 20 0 70 P CG C ACN WMQ 80 20 0 5 36 39 P CG C MeOH WMQ 80 20 0 5 n d P CG C ACN WMQ 80 20 0 68 70 P CG C MeOH WMQ 80 20 0 143 4 9 2 Metodica di lavaggio dello strumento e sue porzioni Il lavaggio dello strumento pu avvenire con o senza colonna ed accessori Ovviamente essendo la colonna da noi utilizzata una RP C18 il lavaggio profondo dello strumento usando WMQ risulta essere incompatibile con la colonna in quanto in grado di collassare le catene alchiliche non polari presenti sulle particelle di silice 52 Questo fenomeno che pu avvenire nel tempo o istantaneamente accade con miscele il cui contenuto in WMQ superiore al 95 e determina la perdita della capacit separativa 52 Pertanto in questo paragrafo si commenteranno separatamente i vari lavaggi Lavaggio profondo dello strumento Il lavaggio profondo dello strumento prevede l utilizzo di solventi puri non aggressivi per le sue varie parti e ha lo scopo di rimuovere qualsiasi sostanza che nel tempo si deposita nel circuito o che si depositata per una qualche incompatibilit o a causa di una Hplc interruzione della corrente Questo tipo di lavaggio pu durare una notte o un giorno intero in funzione dei solventi utilizzati Il flusso deve essere molto basso i e 0 1 mL min in modo che il
98. 1 e in cuvette di vetro 2 Nella terza colonna da sinistra sono rappresentati i valori di fluorescenza della WMQ W nella quarta quelli del campione C nella quinta quelli del campione normalizzato rispetto al bianco della cuvetta CN ed infine quelli del campione normalizzato anche rispetto al bianco del kit CF Tabella 2 3 Dati ottenuti dell analisi in cuvette di plastica 1 e vetro 2 Quantificazione proteica_Kit NanoOrange_ Campione Albumina Ww C CN CF pam 1 2 1 2 1 2 1 2 1 0 0 191 4 217 1 8 6 25 7 0 0 0 0 2 10 0 269 0 735 1 317 4661 gt 440 4 23 1 3 6 0 250 2 7 530 3 22 7 280 1 p 254 4 14 1 4 3 0 165 7 3 294 4 122 128 7 1030 3 6 5 1 0 268 3 s 302 4 5 6 34 1 z 8 4 3 0 6 0 6 176 3 s 235 2 27 58 9 33 2 5 9 7 0 3 245 3 s 281 4 1 9 36 1 i 10 4 6 7 8 0 1 s A 9 0 06 212 1 5 189 1 2 1 23 0 a 48 7 6 5 10 0 03 263 2 297 4 34 34 2 i 8 5 5 2 11 0 01 z a 2 Nella Tabella 2 3 si nota la Mancanza dei valori relativi ai campioni n 8 e n 11 in quanto andati persi nel corso dell esperimento proporzionale alle concentrazioni e si notano anche alcuni valori negativi che si discostano parecchio dai risultati uniformando le due tecniche di lettura e quindi misurando i bianchi delle cuvette in vetro Tab 2 4 attesi I dati ottenuti mostrano una fluorescenza non Pertanto stato deciso di ripetere l esperimento Tabella 2 4 Elaborazione dei dati ottenuti
99. 1 ug mL Figura 4 19 Curve di calibrazione 1 IbuNa L1 in WMQ Il sale stato preventivamente mantenuto a 100 C per un tempo non registrato Hplc Y A BIX B2 X 2 Y B Xx Parameter Value Error A 00203001523 B1 0 00187 5 01984E 5 Parameter Value Error B2 2 15689E 7 2 30018E 8 7 11581E 6 P Assorbanza a 265 nm u a d 3 E E w 19 N o n N Da S 6 d n lt R Square COD so N 0 98967 0 02405 500 500 1000 1500 2000 Concentrazione IbuNa L2 ug mL Concentrazione IbuNa L2 ug mL Figura 4 20 Curve di calibrazione 2 lbuNa L2 in WMQ Il sale stato preventivamente mantenuto a 100 C per un tempo non registrato Dal confronto delle due figure si pu inizialmente notare che in entrambi i casi quando le assorbanze sono misurate a 255 nm i dati mostrano un andamento lineare con una R di 0 99989 e di 0 99985 rispettivamente per la curva di calibrazione 1 Fig 4 19 sinistra e 2 Fig 4 20 sinistra Per contro a 265 nm i dati mostrano un andamento polinomiale con una R Square di 0 99964 e di 0 99967 rispettivamente per la curva di calibrazione 1 Fig 4 19 destra e 2 Fig 4 20 destra Nell insieme le deviazioni standard sono molto contenute quasi non osservabili a parte quela relativa al campione con concentrazione maggiore nella curva di calibrazione 2 6 62 rispetto alla Media del valore Osservando le Figure 4 19 e 4 20 non sembrano notarsi grandi differenze pertanto per
100. 10 9 00 17 8540 923 6 1 0 3 11 9 10 9 8 055 2 0 48 0 4 11 9 10 9 8 498 3 0 3 11 9 10 9 8 236 media 103 01 1190 0 10 9 0 0 18 263 0 222 7 1 0 3 12 0 10 9 8 298 2 0 24 0 4 11 9 10 9 9 020 3 0 3 11 8 10 9 8 235 media 10 3 0 1 1i 9 0 10 9 0 0 18 517 7 496 2 1 0 3 11 9 10 9 7 733 2 0 12 0 3 11 9 10 9 8 469 3 0 3 19 10 9 8 056 media 10 3 00 11 9 0 0 10 9 0 0 18 086 0 368 9 1 0 4 11 9 10 9 8 608 2 0 06 0 3 11 8 10 9 8 399 3 0 2 11 8 10 9 8 287 media 10 3 0 1 TS S01 10 9 0 0 18 431 162 9 1 0 5 11 8 10 9 8 325 2 0 03 0 4 11 9 10 9 8 249 3 0 4 11 9 10 9 8 218 media 10 4 0 1 120 1 10 9 0 0 18 264 0 55 1 174 Hplc Tabella 4 26 Dati dei cromatogrammi della retta di IbuNa di controllo assieme al DicloNa a 265 nm IbuNa L2 Conc lbuNa Tempo min ripetizione ug mi iniziale finale TR Area Spalle 1 7 3 8 3 7 8 11 323 2 7 69 7 3 8 3 7 8 11 123 3 7 3 8 3 7 8 11 879 media Ta S00 8 3 0 0 7 8 0 0 MAAT E 321 7 1 7 3 8 3 7 8 5 634 2 3 84 7 3 8 3 7 8 5 529 3 7 3 8 3 7 8 5 674 media 7 3 0 0 8 3 0 0 78 00 5 612 3 74 9 1 7 4 8 2 7 8 2 773 2 1 92 7 3 8 2 7 8 2 759 3 7 4 8 2 7 8 3 050 media 7 4 0 1 8 2 0 0 7 8 00 2 860 7 164 1 1 7 4 8 2 7 8 1 356 2 0 96 7 3 8 2 7 8 1 474 3 7 4 8 2 7 8 1 403 media ZA 0 9 2 00 8 2 0 0 1 411 0 59 4 1 7 5 8 2 7 8 709 2 0 48 7 4 8 3 7 8 722 3 7 5 8 7 8 720 media TS SEDI Ta 00 FIZO 20 1 7 4 8 7 8 319
101. 19 687 u a La forma dei picchi del DicloNa nei vari cromatogrammi n 9 x 3 non mostrati presenta una simmetria 1 Esperimento 1 Curva di calibrazione n 3B stufa 48 ore 265 nm dati mostrati in Tabella 4 36 indicano che l i tempi di ritenzione dell IbuNa L2 sono 7 2 minuti per le concentrazioni 0 6 0 03 ug mL Pertanto rispetto ai dati mostrati in Tabella 4 17 si pu osservare che risultano essere ritardati ca di 2 secondi i e 7 04 min mentre rispetto alla Tabella 4 21 risultano essere anticipati 10 98 11 10 min ma da tener presente il differente lotto del farmaco e la differente FM Inoltre stato registrato un tempo di 4 1 minuti per le concentrazioni 7 69 0 12 ug mL che risultano essere parecchio anticipati nei confronti dei tempi individuati nella Tabella 4 20 7 88 8 04 min L anticipazione stata attribuita al rabbocco di fase mobile da parte dell operatore 161 162 Hplc 2 Le aree dei 9 campioni di IbuNa L2 mantengono un rapporto che si avvicina al valore 2 dalla concentrazione 7 69 0 48 ug mL mentre tendono a diminuire nelle concentrazioni basse 0 24 0 03 ug mL Nelle tre repliche successive si osservato che nelle basse concentrazioni in alcuni casi non stato possibile integrare i picchi perch di difficile individuazione Questi valori sono indicati in Tabella 4 36 con la sigla n r campioni a concentrazione 7 69 ug mL risultano avere un area di ca 13 700
102. 334 Pertanto si concluso che l acqua non sembra essere un parametro che possa aver causato problemi nelle separazioni in HPLC 4 7 1 2 Stabilit fisica delle soluzioni Ci si domandati anche se le soluzioni preparate per l HPLC e o le loro miscele fossero stabili fisicamente cio se una volta preparate fossero in grado di non precipitare nei loro contenitori nel tempo o a causa della filtrazione Le soluzioni prese in esame sono soluzioni Madri con e senza IbuNa DicloNa o IbuNa e DicloNa fase mobile completa FM 2 e FM 17 Par 4 4 6 miscelata in bottiglia da un operatore Non sono state prese in esame le fasi Mobili create dallo strumento stato possibile osservare che il sale KH PO usato per preparare la soluzione madre 1M Par 4 4 2 si scioglie lentamente e questo processo pu essere facilitato per agita zione magnetica La stessa soluzione lasciata a riposo nelle bottiglie Duran per un tempo che non stato mai quantificato floccula Tuttavia possibile ottenere nuovamente una soluzione limpida per agitazione Magnetica vigorosa di alcune ore che contemporanea mente la rende anche tiepida Questo fenomeno non mai stato osservato utilizzando il sale c KH PO il quale non ha mai richiesto l ausilio dell agitatore magnetico per poterlo disciogliere Tutte le altre soluzioni o Miscele sono risultate essere stabili Si riporta che una sola volta il c TF 50 precipitato i e soluzione con abbondante polvere bia
103. 34 2 0 03 9 1 10 6 9 7 34 197 3 9 7 10 8 10 1 35 291 media 9 3 0 3 10 5 0 3 9 8 0 3 35 407 3 1 272 5 Tabella 4 48 Rapporti delle aree di IpuNa L2 e DicloNa a 254 e 265 nm con trattamento di 48 ore di stufa 254 nm 48 ore 265 nm 48 ore Hg mL Ibu Diclo Ibu Diclo Ibu Diclo Ibu Diclo 1 2 3 media Dev st 1 2 3 media Dev st 7 69 0 393 0 399 0 428 0 407 0 019 0 346 0 346 0 370 0 354 0 014 3 84 0 198 0 205 0 207 0 203 0 005 0 175 0 183 0 183 0 180 0 005 1 92 0 112 0 098 0 105 0 105 0 007 0 100 0 089 0 097 0 095 0 006 0 96 0 049 0 052 0 051 0 051 0 002 0 044 0 044 0 047 0 045 0 002 0 48 0 023 0 025 0 033 0 027 0 005 0 021 0 024 0 029 0 024 0 004 0 24 0 012 0 014 0 013 0 013 0 001 0 011 0 012 0 012 0 011 0 001 0 12 0 009 0 006 0 006 0 007 0 001 0 005 0 006 0 006 0 006 0 001 0 06 0 004 0 004 0 004 0 004 0 000 0 003 0 004 0 003 0 003 0 000 0 03 0 002 nr 0 002 0 002 0 000 0 001 0 002 0 002 0 002 0 000 192 Hplc Tabella 4 49 Confronto tra IbuNa DicloNa a 254 e 265 nm trattati con 0 48 ore di stufa Esperimento 2 254 nm 0 ore 265 nm 0 ore 254 nm 48 ore 265 nm 48 ore 4g mL Ibu Diclo Ibu Diclo Ibu Diclo Ibu Diclo media Dev st media Dev st media Dev st media Dev st 7 69 0 394 0 014 0 340 0 012 0 407 0 019 0 354 0 014 3 84 0 197 0 005 0 174 0 005 0 203 0 005 0 180 0 005 1 92 0 100 0 002 0 087 0 004 0 105 0 007 0 095 0 006 0 96 0 049 0 002 0 044 0 002 0 051 0 002 0 045 0 002 0 48 0 026 0 001 0 023 0 000 0
104. 38 3 4 3 4 Deproteinizzazione della cute per filtrazione in cartucce HybridSpe 38 3 4 3 5 Deproteinizzazione della cute attraverso metodo Folch 41 3 4 4 Analisi dei campioni di cute deproteinizzati 42 3 5 Presentazione e discussione dei risultati 43 3 5 1 Dissoluzione della cute 43 3 5 2 Deproteinizzazione della cute 45 3 5 2 1 Precipitazione in solvente organico Amicon Criodeproteinizzazione 45 3 5 2 2 HybridSpe 48 3 5 2 3 Metodica del Folch 67 4 Hplc 4 1 Introduzione 75 4 2 Materiali 75 4 3 Strumenti 77 4 4 Preparazione e caratterizzazione delle soluzioni 77 4 4 1 Acqua per Hplc 77 4 4 1 1 Spettrometria UV Vis 77 4 4 1 2 Indice di rifrazione 78 4 4 2 Soluzioni madre di KH PO e K HPO 1M 78 4 4 3 Tampone fosfato 50 MM 79 Indice 4 4 4 Tampone fosfato 25 mM 80 4 4 5 Solventi utilizzati per le separazioni in HPLC 80 4 4 6 Fase mobile 81 4 4 7 soluzioni da iniettare in HPLC 81 4 4 8 Soluzione salina in tampone fosfato 82 4 5 Molecole modello e loro caratterizzazione 82 4 5 1 lbuprofene sale sodico 83 4 5 1 1 Conservazione 83 4 5 1 2 Punto di fusione 83 4 5 1 3 Misurazione del pH 84 4 5 1 4 Spettrofotometria UV Vis 85 4 5 1 5 Spettroscopia IR 87 4 5 1 6 Spettroscopia NMR 88 4 5 2 Diclofenac sale sodico 88 4 6 Cromatografia liquida ad alta pressione 88 4 6 1 Elementi costituenti lo strumento 89
105. 4 1 2 347 media 38 2 00 44 0 0 4 1 0 0 2 990 0 164 5 1 3 9 4 4 4 1 1 120 2 0 96 3 8 4 4 4 1 1 432 3 3 8 4 4 4 1 1 149 media 3 8 0 0 4 4 0 0 4 1 0 0 1233 7 1724 1 4 0 4 4 4 1 545 2 0 48 3 9 4 4 4 1 622 3 3 9 4 3 4 1 549 media 39 40 1 44 0 1 4 1 0 0 572 0 43 3 1 4 0 4 4 4 1 264 2 0 24 4 0 4 4 4 1 274 3 4 0 4 4 4 1 304 media 40 0 0 4 4 0 0 4 1 0 0 280 7 20 8 1 4 0 4 4 4 1 162 2 0 12 4 0 4 4 4 1 144 3 4 0 4 4 4 1 162 media 4 0 0 0 4 4 0 0 4 1 0 0 156 0 10 4 1 NT n r n r n r 2 0 06 T n r n r n r 3 T n r n r n media DE it Mf ME I n r n r n r n r 2 0 03 n r n r n r n r 3 n r n r n r nl media fit mE Af mE Tabella 4 35 Dati dei cromatogrammi della retta di DicloNa a 254nm con 48 ore di stufa Hplc 181 DicloNa Conc DicloNa Tempo min ripetizione ug mi iniziale finale T R Area Spalle 1 4 6 5 5 4 9 17 436 2 7 69 4 6 5 3 4 9 18 430 3 4 6 5 4 4 9 18 049 media 4 6 0 0 5 4 0 1 4 9 0 0 17 271 7 501 5 1 4 6 5 4 4 9 18 413 2 3 84 4 6 5 3 4 9 17 929 3 4 6 5 4 4 9 18 430 media 4 6 0 0 5 4 0 1 4 9 0 0 18257 3 284 5 4 6 5 4 4 9 17 945 2 1 92 4 6 5 4 4 9 17 867 3 4 6 5 4 4 9 17 953 media 4 6 0 0 54 0 0 4 9 0 0 17 921 7 47 5 1 4 6 5 4 4 9 17 717 2 0 96 4 6 5 4 4 9 18 182 3 4 6 5 4 4 9 17 349 media 4 6 0 0 54 0 0 4 9 0 0 17749 3 417 4 1 4 7 5 5 4 9 18 715 2 0 48 4 7 5 6 4 9 18 729 3 4 5 5 4 4 9 17 821 media 4
106. 4 2 Materiali Prodotti chimici Tutti i prodotti chimici utilizzati sono stati conservati come prescritto dal produttore ed utilizzati senza nessuna ulteriore purificazione o reazione chimica Laddove questa frase non fosse soddisfatta sar indicato nel testo la motivazione e l accorgimento attuato prodotti chimici usati sono due lotti di ibuprofene sale sodico IbuNa di cui il primo stato aperto il 1 12 2009 100 Sigma Aldrich mentre il secondo lotto il 31 05 2012 100 Sigma Aldrich il diclofenac sale sodico DicloNa 99 Sigma Aldrich il fosfato di potassio Monobasico KH PO 99 9 Fluka il fosfato di potassio dibasico KHPO 99 Riedel de Ha n l acido cloridrico HCI 37 9 w w Sigma Aldrich l idrossido di sodio NAOH 98 w w Sigma Aldrich l acido formico AcFor 98 100 Sigma Aldrich le compresse di sodio e potassio cloruro e tampone fosfato PBS T Sigma Aldrich il pentaossido di fosforo min 98 5 Sigma Aldrich il gel di silice perle arancioni Kraemer amp Martin GmbH la soluzione tampone a pH 4 J T Baker la soluzione tampone a pH 7 Hplc Radiometer Copenhagen e le soluzioni elettrolitiche KCI 3M satura in AgCI per la sonda 423 Mettler Toledo GmbH e KCI 3M per la sonda 412 Mettler Toledo GmbH Inoltre sono stati utilizzati anche dei reagenti specifici per le analisi in cromatografia liquida ad alta pressione HPLC Questi sono il fosfato di potassio Monobasico c KH PO 10
107. 4 6 2 Colonna cromatografica utilizzata e suoi accessori 90 4 6 3 Accensione inizializzazione ed operazioni post analisi 91 4 64 Metodica di lavaggio dello strumento 92 4 6 5 Analisi determinazione dei parametri pressori basali dello strumento 94 4 6 6 Analisi metodica per la quantificazione dell Ibuprofene sale sodico 95 4 6 6 1 Descrizione del protocollo originale di riferimento 95 4 6 6 2 Modifiche apportate al protocollo di riferimento 96 4 6 6 3 Metodica finale 97 4 6 7 Curva di calibrazione 98 4 6 7 1 Preparazione delle soluzioni madre di IbuNa e DicloNa 98 Indice 4 6 7 2 Curva di calibrazione di IbuNa 98 4 6 7 3 Curva di calibrazione di DicloNa 99 4 6 7 4 Curva di calibrazione di lbuNa in presenza di DicloNa 99 4 7 Presentazione e discussione dei risultati 101 4 7 1 Caratterizzazione delle soluzioni 101 4 7 1 1 Acqua Milli Q 101 4 7 1 2 Stabilit fisica delle soluzioni 103 4 8 Caratterizzazione delle molecole modello 105 4 8 1 lbuprofene sale sodico 106 4 8 1 1 Aspetto e odore 106 4 8 1 2 pH 106 4 8 1 3 Punto di fusione 107 4 8 1 4 Spettroscopia IR 109 4 8 1 5 Spettroscopia NMR 112 4 8 1 6 Assorbimento UV Vis e curve di calibrazione 116 4 8 2 Diclofenac sale sodico 123 4 8 2 1 Misurazione del pH 123 4 8 2 2 Assorbimento UV Vis 124 4 9 Separ
108. 456 Sx Dx 0 49 10 5 12 9 11 13 18 380 0 24 n r Nf nr n r n r 0 12 n r Nf nr n r n r 0 06 n r Mf n r n r n r 0 03 n r Nf n T n r PT Hplc Le concentrazioni corrette sono mostrate nella Tabella 4 21 Tutti i dati relativi a questo esperimento sono mostrati nelle Tabelle 4 21 4 23 e Figura 4 37 dati mostrati in Tabella 3 16 indicano che l i tempi di ritenzione dell IbuNa L sono compresi tra 8 07 e 7 90 minuti Inoltre rispetto ai dati mostrati in Tabella 4 17 si pu osservare che risultano essere ritardati di ca 1 minuto 7 04 min mentre rientrano nel range individuato nella Tabella 4 20 Le aree dei 9 campioni di IbuNa L mantengono un rapporto che varia nell intervallo 1 7 2 4 che segue la diluizione Nelle tre repliche successive si osservato che nelle basse concentrazioni in alcuni casi non stato possibile integrare i picchi perch di difficile individuazione Questi valori sono indicati in Tabella 4 21 con la sigla n r Rispetto all area del campione a concentrazione 1 000 ug mL Tab 4 17 ed a quello a concentrazione 500 ug mL Tab 4 20 i campioni a concentrazione 7 69 ug mL risultano essere pi alti rispetto all area teorica di 8 636 calcolata per proporzionalit dalla Tab 4 20 che dovrebbero avere La forma dei picchi del lbuNa L nei vari cromatogrammi n 9 x 3 non mostrati presenta una simmetria 1 ad entrambe le lunghezze d onda ed i picchi si mostra no caratterizz
109. 5 Cute umana a contatto con la collagenase per 30 ore La cute messa a contatto con la Collagenase per un tempo di contatto di 30 ore ad una temperatura di 37 C all interno di una stufa ventilata appare completamente sciolta al contrario degli altri due campioni nei quali sono ancora ben visibili i pezzetti di tessuto 3 5 2 Deproteinizzazione della cute Per l eliminazione del contenuto proteico dalla cute sono stati testati diversi metodi per capire quale fosse quello pi efficace e conveniente Par 3 4 3 3 5 2 1 Precipitazione in solvente organico Amicon Criodeproteinizzazione La prima parte degli esperimenti effettuati hanno sfruttato i tre diversi metodi descritti nel Paragrafo 3 4 3 1 3 4 3 3 precipitazione con solvente organico metodo Brown Amicon e la criodepreoteinizzazione congelamento Si iniziato con la preparazione di un campione per ciascuno dei tre metodi utilizzando per tutti la cute precedentemente disciolta in Collagenase Degradazione e Deproteinizzazione della cute La Tabella 3 1 mostra nella prima colonna il Metodo utilizzato nella seconda il volume del campione di cute disciolta nella terza la quantit di MeOH necessaria ed infine nell ultima il successivo trattamento seguito da ciascun campione Tabella 3 1 Trattamenti di deproteinizzazione del campione Metodo Campione uL MeOH uL Trattamento Brown 700 300 Centrifuga Amicon 500 Centrifuga Congelamento 500 210 80 C
110. 50 27 73 rispettivamente FM 4 e FM 2 in Tabella 4 1 Nel primo caso la velocit di flusso ha variato tra 1 1 2 e 1 3 mL min e nel secondo caso il flusso stato di 0 7 e 1 3 mL min 5 Variazione della lunghezza d onda di rilevamento Le lunghezze d onda prese in considerazione sono state 254 e 265 nm 6 Variazione della temperatura del campione I campioni da iniettare non sono stati mai termostatati Si per cercato di Mantenere la temperatura del laboratorio a 25 C mediante condizionamento dell aria 4 6 6 3 Metodica finale In seguito alle prove fatte si arrivati ad una metodica finale per la quantificazione dell IbuNa i cui parametri sono qui riassunti i Fase Mobile ACN TF 25 in rapporto 27 73 e FM 17 ii flusso della fase eluente 1 mL min iii durata dell analisi 20 minuti iv termostatazione della colonna 25 C v termostatazione dei campioni da iniettare nessuna lo strumento indicher valori di 27 28 C per una temperatura del laboratorio di ca 22 C vi volume di iniezione 20 uL vii lunghezza d onda di rileva mento 254 e 265 nm viii temperatura del laboratorio 22 2 C Inoltre si riassume qui come vengono preparati i campioni a concentrazione nota o incognita destinati all analisi Preparazione dei campioni a concentrazione nota Tutte le soluzioni di IbuNa in fase mobile da analizzare in HPLC sono state preparate in una microprovetta per un volume pari a 1 mL al quale sono
111. 6 3 9 6 11 2 0 2 30 766 media 9 6 0 0 11 101 10 2 0 0 31 119 0 421 7 Tabella 4 38 Rapporti delle aree di IbuNa L2 e DicloNa a 254 e 265 nm con trattamento di 48 ore di stufa 254 nm 48 ore 265 nm 48 ore Hg mL Ibu Diclo Ibu Diclo Ibu Diclo Ibu Diclo 1 2 3 media Dev st 1 2 3 media Dev st 7 69 0 521 0 516 0 517 0 518 0 003 0 450 0 444 0 448 0 448 0 003 3 84 0 239 0 265 0 279 0 261 0 020 0 205 0 227 0 237 0 223 0 016 1 92 0 122 0 141 0 131 0 131 0 009 0 106 0 124 0 114 0 114 0 009 0 96 0 063 0 079 0 066 0 069 0 008 0 056 0 068 0 057 0 060 0 007 0 48 0 029 0 033 0 031 0 031 0 002 0 026 0 031 0 031 0 029 0 003 0 24 0 014 0 015 0 017 0 015 0 001 0 014 0 014 0 014 0 014 0 000 0 12 0 009 0 008 0 009 0 008 0 001 0 010 0 008 0 008 0 009 0 001 0 06 n r n r n r n r nr 0 007 nr 0 004 0 006 0 002 0 03 n r n r n r Hif Nf Nf n T n r n r n r 184 Hplc Esperimento 2 Tabella 4 39 Dati dei cromatogrammi della retta di IbuNa L2 a 254 nm di controllo lbuNa L2 Conc ibuNa Tempo min ripetizione 4g mL iniziale finale T R Area Spalle 1 7 1 7 8 7 4 8 350 2 7 69 29 8 0 7 6 8 338 3 7 0 7 8 7 4 8 767 media 7 1 amp 0 2 7901 EEN 8485 0 244 3 1 7 5 8 2 7 8 4 101 Sx 2 3 84 7 4 8 2 7 7 4 169 3 7 4 8 1 7 7 4 300 media 740 1 8 2 0 1 20 4 190 0 101 1 1 7 4 8 1 T 2 122 2 1 92 7 6 8 2 7 9 2 049 Sx 3 7 6 8 3 7 9 2 160 Sx media be 0 82 01 78 0 1 2 110 3 56 4 1 7 6 8 2 7 8 1 059 Sx 2 0 96 7
112. 7 Risultati delle triple letture di 2 mL e 0 2 mL di campione Campione Albumina Fluorescenza 2 mL Fluorescenza 0 2 mL pg mL 1 2 3 media 2 3 media 1 0 0 246 3 g 246 3 1 9 1 9 2 10 0 492 7 5 i 492 7 20 6 20 6 3 8 0 482 8 i 482 8 22 6 i 22 6 4 6 0 437 7 435 9 355 2 409 6 19 0 18 4 15 8 17 8 5 4 0 350 8 359 7 351 5 351 0 10 6 13 8 11 8 12 1 3 0 295 7 294 0 287 1 292 3 8 6 10 0 11 2 9 9 7 2 0 231 4 228 9 230 5 230 3 5 7 6 1 4 2 5 3 8 1 0 210 0 207 9 210 5 209 5 4 6 3 0 5 2 4 3 9 0 8 178 2 176 8 180 1 178 4 5 2 3 3 2 9 3 8 10 0 6 252 4 251 5 2489 250 9 5 8 4 1 3 9 4 6 11 0 3 312 8 309 2 309 0 310 3 4 1 2 8 2 7 3 2 12 0 1 200 5 201 6 204 4 202 2 3 8 3 9 5 6 4 4 Dai valori mostrati in Tabella 2 7 si nota che la variazione dei valori delle tre letture non ha mai un andamento costante infatti in alcuni casi le fluorescenze tendono a decrescere facendo pensare che col passare dei secondi venga persa la capacit di riemissione Quantificazione Proteica_Kit NanoOrange_ delle radiazioni eletttomagnetiche ricevute ma in altri casi tende a scendere nella seconda lettura per poi risalire nell ultima I dati sperimentali ed i valori finali ottenuti dopo la normalizzazione sono stati rappresentati nelle Tabelle 2 8 e 2 9 nelle quali possibile analizzare l esperimento realizzato la mattina 1 e la sera 2 con le cuvette in plastica e con quelle di vetro rispettivamente Nelle Tabelle 2 8 e 2 9 sono riportate le
113. 7 2 0 0 5 029 3 182 6 1 6 6 7 6 7 2 2 767 2 1 92 6 6 7 6 7 2 2 866 3 6 6 7 8 7 2 2 649 media 6 6 0 0 IAS 4 220 2 760 7 108 6 1 6 6 7 6 7 2 1 426 2 0 96 6 7 7 7 7 2 1 456 3 6 7 7 6 7 2 1 427 media 6 7 0 760 1 Lig 10 0 1 436 3 17 0 1 6 9 7 6 7 2 900 2 0 48 6 7 7 7 7 2 853 3 6 8 7 6 7 2 747 media 6 8 0 1 7 6 0 1 1a 0 0 833 3 76 4 1 6 7 7 6 7 2 515 2 0 24 6 9 7 5 7 2 490 3 6 8 7 5 7 2 393 media 68 0 1 To 01 La 00 466 0 64 4 1 6 9 7 5 7 2 230 2 0 12 6 9 7 4 7 2 289 3 7 0 7 5 7 2 193 media 6 9 0 1 AE 7 2 0 0 237 3 48 4 1 Nf n r n r n r 2 0 06 GEA n r n r n r 3 Nf n r n r nl media mi fr AT AE I TI n r n r n r 2 0 03 n n r n r iA 3 NI n r n r nl media AT mE nl mE Tabella 4 30 Dati dei cromatogrammi della retta di DicloNa a 254 nm con 24 ore di stufa Hplc 177 DicloNa Conc DicloNa Tempo min ripetizione ug mi iniziale finale TR Area Spalle 1 9 6 11 0 0 2 18 943 2 7 69 9 5 11 1 0 2 19 279 3 9 6 11 0 0 2 19 030 media 9 6 0 1 ILO 10 2 0 0 19 084 0 174 4 1 9 6 1 0 0 2 17 774 2 3 84 9 4 1 1 0 2 18 999 3 9 6 11 1 0 2 18 106 media 9 5 0 1 ARER 10 2 0 0 18 293 0 633 5 1 9 5 1 0 2 18 751 2 1 92 9 5 0 2 17 896 3 9 5 0 2 18 556 media 9 5 0 0 11 1 0 0 10 2 0 0 18 401 0 448 1 1 9 6 11 0 0 2 18 016 2 0 96 9 6 11 0 0 2 17 623 3 9 6 11 0 0 2 17 253 media 96 00 AREA 10 2 amp 0 0 17630 7 381 6 1
114. 7 69 0 12 ug mL Le concentrazioni pi piccole non sarebbero quantificabili con precisione Pertanto nelle condizioni di questa analisi si pu affermare che il limite di rivelamento di ca 0 12 ug mL Continuando con l analisi dei dati in Tabella 4 45 si pu riassumere che l i tempi di ritenzione del DicloNa risultano essere variabili tra 10 0 e 10 5 minuti per le concentrazioni comprese nel range 7 69 0 06 ug mLl mentre si osserva una variabilit che arriva a 9 6 minuti per la concentrazione 0 03 ug mL Rispetto ai dati mostrati in Tabella 4 17 e 4 20 si pu osservare che queste ultime analisi risultano avere dei tempi anticipati 9 90 min Hplc Le aree dei 9 campioni del DicloNa nelle diverse repliche oscillano in un intervallo compreso tra 17 552 e 22 595 unit arbitrarie Rispetto all area teorica ca 19 500 u a stimata partendo dal risultato dell analisi del campione a concentrazione 1 000 ug mL Tab 4 17 ed a 500 ug mL Tab 4 20 i campioni analizzati risultano avere un area molto vicina ad essa 17 552 22 595 u a In aggiunta confrontando i dati ottenuti con le aree quantificate nell esperimento 1 Tab 4 20 possibile mettere in evidenza un aumento del DicloNa 17 436 19 139 vs 17 552 22 595 u a La forma dei picchi del DicloNa nei vari cromatogrammi n 9 x 3 non mostrati presenta una simmetria 1 Esperimento 2 Curva di calibrazione n 5B stufa 48 ore 265 nm dati mostrat
115. 9 5 Influenza dell umidit sulla retta di calibrazione Avendo osservato che i due lotti di IbuNa producevano risultati diversi quando esposti ai medesimi esperimenti quantificazione UV Vis si volle verificare anche per HPLC quanto potesse influire l umidit presente nella polvere Le curve di calibrazione sono state acquisite a 254 e 265 nm utilizzando la FM 17 la quale stata in un caso premiscelata dall operatore Esperimento 1 e nell altro dallo strumento stesso Esperimento 2 Le madri sono state preparate in matraccio Gli esperimenti sono stati realizzati a distanza di 57 giorni l uno dall altro l esperimento 1 nel mese di agosto nel quale stato utilizzato come controllo l buNa L2 contenuto nel suo barattolo originale conservato in un armadio del laboratorio accuratamente parafilmato mentre l esperimento 2 stato realizzato a fine settembre utilizzando il farmaco IbuNa L2 conservato da agosto all interno di una campana di vetro in condizioni di sottovuoto assieme a del pentossido di fosforo Le uniche differenze esistenti tra gli esperimenti riguardano l ottimizzazione del TF25 nella retta di controllo di agosto la sua filtrazione stata eseguita con un imbuto filtrante sterile con filtro in acetato di cellulosa mentre le rette caratterizzate da una permanenza in stufa di 24 e 48 ore sono state analizzate con una filtrazione del TF25 eseguita con dei filtri in nylon Per quanto riguarda invece l esperimento di
116. A 28 NOV Assorbanza u a SEE o PROSE A a a Concentrazione g mL Figura 3 20 Ripetizione di repliche n 6 per ciascun trattamento dell IbuNa in WMQ e TF25 Come possibile osservare in Figura 3 20 B ma in modo pi immediato in Figura 3 20 C la ripetizione non ha modificato o aumentato in modo significativo il recupero del farmaco Si nota un leggero aumento del recupero ma a spese di un aumento consistente della deviazione standard In Tabella 3 12 sono mostrate le Medie delle concentrazioni di farmaco quantificate nei campioni n 6 e le percentuali di recupero dati descritti in Tabella 3 12 evidenziano una netta differenza di recupero tra i campioni n 1 4 e quelli trattati con la soluzione precipitante camp n 5 8 Se si prendono in considerazione i primi quattro campioni possibile notare che il recupero appare leggermente pi alto per il campione sciolto in WMQ mentre paragonando i due metodi possibile affermare che tendono ad equivalersi Negli ultimi quattro campioni invece stato ottenuto un crollo del recupero del farmaco che si aggira intorno al 30 ca con un leggero aumento con l utilizzo del metodo Il Concludendo possibile affermare che non stata ottenuta alcuna ripetibilit Al termine di queste prove stato provveduto alla misurazione del pH dei campioni trattati per verificare se Magari il problema del recupero totale del farmaco potesse risiedere nella acidit basicit del ca
117. A M Martelli G Mazzotti A Papardelli M Rende G Zummo Anatomia dell uomo Edi Ermes s r l Milano 2001 pp 429 436 B Baroli Physiological factors affecting transdermal bioavailability Skin Structure Dalle lezioni di legislazione e forme farmaceutiche corso di laurea TAAF 2009 A Pasqualino E Nesci Anatomia umana fondamentale Utet Editore Torino 1980 pp 787 789 I Cattaneo Compendio di anatomia umana Monduzzi Editore Bologna 1986 seconda edizione pp 69 81 B W Barry Breaching the skin s barrier to drug Nature Biotechnology 22 2004 pp 165 167 B Baroli Veicolazione di farmaci nella e attraverso la pelle Dalle lezioni di legislazione e forme farmaceutiche corso di laurea TAAF 2009 Y Bakhbakhi S Alfadul A Ajbar Precipitation of Ibuprofen Sodium using compressed carbon dioxide as antisolvent European Journal of Pharmaceutical sciences 48 2013 30 39 D Narayanan Geena M G Poly efhylene glycol modified gelatin nanoparticles for sustained delivery of the anti inflammatory drug Ibuprofen Sodium An in vitro and in vivo analysis Nanomedjioumal com9 2013 818 828 201 202 Bibliografia 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 K Bhaskar J Anbu V Ravichandiran V Venkateswarlu and Y M Rao Lipid nanoparticles for transdermal delivery of flurbiprofen formulation in vitro ex
118. A tutti coloro che hanno creduto in me Ringraziamenti Ringraziamenti Si ringraziano la Dr ssa L Casu per l utilizzo del rifrattometro di Abbe e dell apparecchio per la misurazione del punto di fusione il Prof E Maccioni per l utilizzo dell apparecchio per la misurazione del punto di fusione ed insieme con la Dr ssa R Meleddu per l acquisizione degli spettri NMR la Dr ssa V Onnis per l acquisizione degli spettri IR e le Dr sse M Begala e F Mocci per commenti e suggerimenti Un ringraziamento particolare a tutti i Professori del Dipartimento di chimica e tecnologie farmaceutiche che mi sono stati vicini nell ultimo periodo del mio dottorato credendo in me e mostrandomi tutta la loro umanit ed il loro appoggio Si vuole inoltre ringraziare gli enti finanziatori senza i quali non sarebbe stato possibile condurre questo studio Si ricorda che questa tesi una piccola parte di un progetto finan ziato dalla Regione Sardegna LR 7 07 Progetti di Ricerca Fondamentale o di Base 2010 2012 progetto n CRP3_11 Inoltre alcuni strumenti erano stati acquisiti prece dentemente grazie ai seguenti finanziamenti Excellence in Research and Teaching Activities 2009 Universit di Cagliari ed il Finanziamento per lo start up dei giovani ricercatori 2009 2010 Universit di Cagliari Ei 3 UNIONE EUROPEA REPUBBLICA ITALIANA REGIONE AUTONOMA DELLA SARDEGNA
119. C e 410 420 min caso D la fase ACN W 27 73 viene sostituita con MeOH W 73 27 mantenendo il flusso a 0 5 mL min In questi 10 minuti la pressione aumenta repentinamente dopo essere scesa bruscamente sino a 14 e 33 bar risp caso C e D Alla fine di questi 10 minuti la pressione arriva a 110 e 78 bar risp caso C e D e nel giro di ulteriori 5 minuti diminuisce a 100 e 73 bar risp caso C e D Si pu pertanto notare che nei due casi la pressione si abbassa di 10 e 5 bar Se prendiamo come riferimento la pressione che si ha in questo momento 225 min caso C e 425 min caso D si evince che la differenza pressoria tra questo preciso Momento e la fine della prima fase di lavaggio nei due casi di 10 e 3 bar risp caso C e D Ci potrebbe essere il risultato dell ingresso graduale del metanolo che avviene contemporaneamente alla diminuzione dell ACN e all aumento dell VMQ Proseguendo nell osservazione Hplc dell andamento pressorio della fase metanolica si nota in entrambi i casi un aumento di 7 e 4 bar tra il momento del crollo 225 min caso C e 425 min caso D e la fine di questa fase 320 min caso C e 620 min caso D L aumento pressorio di questa fase anche se di pochi bar pu essere dovuto alla possibile fuoriuscita eliminazione di qualche sostanza rimasta in colonna durante le analisi effettuate la quale risultata maggiormente solubile in metanolo rispetto alla fase di ACN WMQ 27 73 v v Nei 10 minuti succe
120. IbuNa non trattati n manipolati ed inoltre un terzo lotto ottenuto solubilizzando una piccola porzione di IbuNa L2 in EtOH prima di essicarla a 135 C Nelle Figure 4 8 4 10 sono presentati i relativi spettri dove i valori presenti nelle ascisse rappresentano le frequenze espresse come numero d onda cm mentre nelle ordinate troviamo la trasmittanza Inoltre i dati relativi ai segnali stamenti ed armoniche dei principali gruppi funzionali che dovrebbero essere giaciture teoriche 44 e che sono giaciture sperimentali presenti negli spettri sono riportati in Tabella 4 9 Nella stessa tabella sono riportate anche le giaciture colonna Sigma in Tab 4 9 di uno spettro IR acquisito in 109 110 Hplc modalit ATR inviatoci dai fornitori non mostrato dopo aver acquisito i nostri spettri e relativo alla molecola IbuNa L2 3800 3600 3400 3200 3000 2800 2600 2400 2200 2000 1800 Figura 4 8 Spettro IR del lbuNa L1 3800 3600 3400 3200 3000 2800 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 Figura 4 9 Spettro IR IbuNa L2 Hplc 3800 3600 3200 3000 2800 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 Figura 4 10 Spettro IR dell lbuNa L2 sciolto in EtOH ed essiccato a 135 C Tabella 4 9 Segnali osservati negli spettri IR e gruppi funzionali corrispondenti Frequenza cm Legame Teorico Sigma louNa L louNa L2 lbuNa L2 135 O H ass 3 303 3 357 3 347 3 361 O H
121. N WMQ 80 20 v v Nonostante la pressione finale della fase precedente fosse differente 81 vs 77 l entit del crollo stata la medesima 49 bar ottenendo quindi una pressione finale di 32 e 28 bar risp nel caso B e D Se si considera la differenza di bar esistente tra le ultime due fasi si nota che consta di 4 bar in entrambi i casi Questo significherebbe che la fase di ACN WMQ 80 20 v v non abbia favorito un ulteriore abbassamento della pressione ma abbia mantenuto costante la differenza gi esistente Anche questa analisi puntuale mette in evidenza quanto anticipato in precedenza e cio che i casi presi ad esempio in questa tesi non mostrano una maggiore superiorit di un lavaggio rispetto all altro Tuttavia si reitera l affermazione che l esperienza ha mostrato che un lavaggio cortissimo non sempre sufficiente La verifica delle pressioni finali di ciascun tipo di lavaggio ha permesso di controllare che il sistema fosse realmente pulito e che fossero state ripristinate le condizioni iniziali In caso contrario stato avviato un ulteriore lavaggio Inizialmente si lasciava accesa la lampada durante i lavaggi e pertanto si potevano controllare anche i cromatogrammi insieme con l andamento pressorio del lavaggio Un tipico caso presentato in Figura 4 26 L Cortissimo P CG C L Cortissimo P CG C 200 300 400 500 100 300 400 500 Tempo minuti Tempo minuti E sa Fa ao Intensi
122. Nella messa a punto dell esperimento di veicolazione transdermica ci sembrato opportuno andare a quantificare anche l eventuale quantit di farmaco rimasto intrappolato nella cute anche per verificare la reale distribuzione della sostanza in esame avvenuta durante il trattamento nei diversi compartimenti delle celle di diffusione verticale Pertanto risultato necessario trattare la cute per favorime la sua degradazione Successivamente si indagato sul quale potesse essere in Metodo pi consono all eliminazione delle proteine presenti nel campione in modo tale da renderlo immediatamente disponibile per un analisi cromatografica Infatti in questo capitolo vengono elencati i materiali e gli strumenti utilizzati in questo lavoro per il trattamento della cute derivante dall esperimento di veicolazione transdermica dalla sua dissoluzione all eliminazione della maggior quantit possibile di proteine e lipidi Vengono anche descritte le metodiche e le modalit di allestimento degli esperimenti condotti 3 2 Materiali Prodotti chimici Tutti i prodotti chimici utilizzati sono stati conservati come prescritto dal produttore ed utilizzati senza nessuna ulteriore purificazione o reazione chimica Laddove questa frase non fosse soddisfatta sar indicato nel testo la motivazione e l accorgimento attuato prodotti chimici usati sono ibuprofene sale sodico IbuNa che stato aperto il 31 05 2012 100 Sigma Aldrich il fosfato di potass
123. Tempo h a 100 C Lotto Conc mg ml 0 24 48 72 96 168 2 619 2 742 2 876 2 943 2 829 2 726 2 768 2 718 3 475 2 995 2 801 3 216 ottenuta per diluizione dalla soluzione madre 4 25 mg mL In Figura 4 18 viene mostrato il confronto tra gli spettri UV Vis in WMQ di tre soluzioni di lbuNa L2 conservato nel contenitore originale in un armadio A nella Fig 4 18 e conservato per 48 giorni all interno di un essiccatore di vetro non ambrato B nella Fig 4 18 contenente nel suo fondo del gel di silice ed un becker con PoFosf Par 4 5 1 1 entrambi con lo scopo di eliminare l umidit Le concentrazioni messe a confronto sono 2 125 1 062 e 0 531 mg ml IbuNa L2 2 125 mg mL A IbuNa L2 1 062 mg mL A IbuNa L2 0 531 mg mL A IbuNa L2 2 125 mg mL B IbuNa L2 1 062 mg mL B IbuNa L2 0 531 mg mL B bd S c A p o v n lt q 200 220 240 260 280 300 320 340 360 Lunghezza d onda nm Figura 4 18 Confronto tra spettri relativi a diverse conservazioni di IbuNa L2 Sono messi a confronto gli spettri delle soluzioni in WMQ in un caso conservato nel contenitore originale A nell altro in una campana di vetro contenente gel di silice e PoFosf B In entrambi i casi le concentrazioni sono rispettivamente 2 125 1 062 e 0 531 mg mL Osservando la Figura 4 18 si pu notare che il picco di assorbimento massimo si mantiene in tufti i cas
124. a 589 nm 3 in Fig 4 1 ed un cannocchiale oculare 4 in Fig 2 1 Per l analisi si proceduto come qui descritto Dopo aver acceso la sorgente luminosa 3 in Fig 4 1 stata posta una goccia d acqua sopra il prisma inamovibile 1 in Fig 4 1 e si posizionato quindi il prisma movibile 2 in Fig 4 1 su quello inamovibile A questo punto attraverso l oculare 4 in Fig 4 1 si potuto osservare un campo illuminato suddiviso in due zone una chiara ed una scura Si proceduto quindi con la messa a fuoco che serve ad allineare i prismi con il fascio luminoso in modo da ottenere una netta separazione tra le due zone Solo a questo punto stato possibile rilevare direttamente dal display 5 in Fig 4 1 il valore numerico dell indice di rifrazione Figura 4 1 Rifrattometro di Abbe Lo strumento composto da 1 un prisma inamovibile ed 2 uno mo bile 3 una sorgente luminosa 589 nm 4 un oculare e 5 un interruttore elettrico con display per la visualizzazione dell indice di rifrazione 4 4 2 Soluzioni madre di KH PO e KHPO 1M Hplc Le soluzioni madre dei due sali K XHPO P M 174 18 Da e KH PO P M 136 09 Da sono state preparate secondo il seguente protocollo Il peso molecolare dei due sali stato usato per calcolare la quantit effettiva che era necessario pesare per ottenere un litro di soluzione 1 M una mole L soluzione Pertanto si sono pesati 174 18 g di K HPO e 136 09 g di KH PO I sal
125. a con una forma non perfettamente simmetrica Prendendo in considerazione i campioni costituiti ed analizzati in questo esperimento e in quello precedentente stato possibile eseguire anche un ulteriore operazione di normalizzazione A ciascun campione stata sottratta l assorbanza del rispettivo bianco ed stato costruito in questo Modo lo spettro normalizzato Fig 3 24 Degradazione e deproteinizzazione della cute o o MeOH Ibu Na Norm MeOH Ibu Na Cute Collagenase Norm MeOH Ibu Collagenase Norm CHCI3 Ibu Na Norm CHCI3 Ibu Na Cute Collagenase Norm CHCI3 Ibu Collagenase Norm gt DI 65 A o n a 0 Assorbanza u a Assorbanza u a 8 6 4 d 0 2 4 6 8 250 300 250 300 Lunghezza d onda nm Lunghezza d onda nm Figura 3 24 Spettri normalizzati della fase metanolica A e della fase cloroformica B Dalla Figura 3 24 A si nota una forma del picco costante in tutti e tre i campioni con una sovrapposizione dell IbuNa in WMQ e dell IbuNa in Collagenase mentre l assorbanza del farmaco con la cute in Collagenase sembra essere molto basso Per quantificare nel Modo migliore il farmaco recuperato sono state calcolate le vere concentrazioni ottenute e confrontate con quelle teoriche Nella Tabella 3 15 vengono riportate le concentrazioni di farmaco recuperate in seguito all esperimento prendendo in considerazione l assorb
126. a ottenuta come da protocollo Par 4 5 1 4 e il confronto con le due rette precedenti Fig 3 19 B Dal confronto delle ultime tre rette realizzate palese l uguaglianza tra le ripetizioni infatti come si nota dalla Figura 3 19 B i punti sono perfettamente sovrapposti Tale risultato rafforza l idea che il problema non risieda nella retta di calibrazione la quale risultata ripetibile In seguito ai risultati di recupero del farmaco ottenuti stato allestito un esperimento atto a confrontare simultaneamente diverse condizioni nel tentativo di capire quale fosse il passaggio critico del reale esperimento di filtrazione Spe Degradazione e deproteinizzazione della cute gt m 19novibunaw 15nov ibu TF25 Polynomial Fit of Data1_D i 15novibunaw A 19novibunaw A B1 X B2 X42 Parameter Value Error A 0 01278 0 00998 B1 0 00164 3 58592E 5 B2 1 64489E 7 1 68373E 8 T E N e bi a Ke pA v lt q Assorbanza u a fad in R Square COD SD N P 0 99973 0 01385 8 lt 00001 p 500 1000 1500 2000 25 1000 1500 2000 2500 Concentrazione ng mL Concentrazione g mL Figura 3 19 Retta di Ibu Na in WMQ con nuova madre Fig 3 16 A e confronto con precedenti Fig 3 16 B La Tabella 3 9 descrive i risultati ottenuti dalle diverse prove effettuate i campioni n 1 e 3 sono stati costituiti con 200 300 uL di IbuNa portati a 2 5 mL di volume con WMQ i campioni n 2 e 4 sono stati essic
127. a precipitazione offline e per i quali sono state trovate delle percentuali del 140 6 e 461 7 rispettivamente per il metodo I e per il metodo II stato ottenuto un risultato senza alcun senso logico perch si quantificato pi farmaco di quello realmente utilizzato In seguito ai risultati registrati stato effettuato un esperimento utilizzando sia l IbuNa in WMQ che quello in TF25 a diverse condizioni eseguendo una semplice diluizione del campione e raggiungendo il volume finale di 2 5 mL con WMQ camp n 1 4 essiccando i campioni e risospendendoli con 2 5 mL di WMQ camp n 5 8 ed infine trattando il campione col Metodo Spe ma simulando la filtrazione camp n 9 12 I risultati illustrati nella Tabella 3 10 evidenziano innanzitutto una scarsa ripetibilit dei dati Infatti nei primi quattro campioni in cui le condizioni sono le stesse a parte il volume del campione e la composizione della soluzione madre in WMQ o in TF25 non sono state ottenute le stesse percentuali Si oscilla infatti dal 92 6 al 100 2 per il metodo e dal 99 6 al 88 per il Metodo Il Inoltre i risultati non sono uguali a quelli mostrati in Tabella 3 9 camp n 1 3 Per i campioni n 5 8 che sono stati seccati e risospesi la situazione molto simile si passa da una quantificazione superflua del 4 6 al 94 2 per il Metodo I al 97 9 e 100 6 per il metodo ll I campioni che sono stati trattati col Metodo Spe invece mostrano altrettanta variabili
128. agione a noi sconosciuta rilasciasse delle sostanze o fibre macroscopicamente invisibili le stesse avrebbero potuto essere fonte di reazioni chimiche e o fenomeni di nucleazione Pertanto si allestito l esperimento descritto al Paragrafo 4 4 3 i cui risultati nessun precipitato visibile prima e dopo centrifugazione erano aspettati perch i filtri utilizzati non erano stati scelti a caso Infatti nel catalogo della Whatman 32 viene riportato che i filtri in microfibra di vetro sono prodotti solo con vetri borosilicati sono chimicamente inerti e non possiedono siti d interazione di tipo binding Pertanto possono essere considerati dei filtri di profondit composti da una rete di microfibre capillari che combinano alte velocit filtranti con un alta capacit ritentiva di particolato molto fine anche appartenente al range sub micrometrico Infine tra le applicazioni suggerite dalla casa madre per quelli da noi scelti i e GF F cut off 0 7 um viene riportata la filtrazione di campioni e solventi prima dell analisi in HPLC Gli stessi vengono anche usati per un test dell EPA 33 relativo a sostanze tossiche presenti in liquidi a basse concentrazioni I filtri Coming in acetato di cellulosa sebbene non siano prodotti per applicazioni in HPLC furono usati solo due volte in quanto sterili e dotati di pori pi piccoli cut off 0 22 um e solo per filtrare il c TF 50 Par 4 4 3 Questi filtri vengono comunemente usati per f
129. ale finale T ritenzione mL min FM 2 0 7 13 50 18 30 13 88 29 587 727 FM 2 1 3 7 46 11 60 7 73 15 840 780 FM 4 1 2 9 74 12 23 10 05 17 348 404 FM 4 1 3 9 06 11 68 9 33 16 019 662 cos iniziato lo studio di IlouNa L1 e del DicloNa con alcune fasi mobili i e FM 8 FM 9 FM 10 caratterizzate da una composizione fissa di ACN 27 e variabile di TF 50 72 70 e iPrOH 1 3 per verificare la loro influenza nella separazione dei due farmaci Fig 4 34 145 146 Hplc Ibu FM 8 Diclo FM 8 Ibu FM 9 Diclo FM 9 Ibu FM 10 Diclo FM 10 Intensit mV Intensit mV 5 10 5 10 Tempo minuti Tempo minuti Ibu FM 8 Diclo FM 8 Ibu FM 9 Diclo FM 9 Ibu FM 10 Diclo FM 10 Intensit mV Intensit mV 5 Tempo minuti Tempo minuti Figura 4 34 Cromatogrammi di IbuNa primo lotto e DicloNa ottenuti con le FM 8 9 e 10 Campioni entrambe le molecole sono sciolte 1 mg mL in FM 2 il volume di iniezione 20 yL filtrati con Acrodisc Colonna accessoriata con CG del tipo CC Lunghezza d onda di rilevamento 254 nm Flusso 1 mL min Fase mobile di eluizione in leggenda filtrazione dei solventi filtri Whatman in fibra di vetro La Figura 4 34 mette in evidenza come all aumentare della percentuale di iPrOH nella composizione della fase mobile venga anticipata l uscita della sostanza d interesse Oltretutto compare a ca 5 minuti un picco intensit ca 1000
130. ali del TF 50 e dell ACN come mostrato in Tabella 4 5 Tabella 4 5 Riassunto delle varie Miscele ACN TF 50 Composizione v v mL min Fase Mobile Prove ACN TF 50 Flusso Acronimo 1 25 75 1 3 2 26 74 1 4 3 27 73 1 2 4 28 72 1 5 5 29 71 1 6 6 30 70 1 7 vedi Tab 4 1 3 Introduzione del iPrOH e variazione rapporti nella nuova miscela trifasica L iPFOH stato introdotto al posto del THF in quanto simile a quest ultimo per quanto riguarda l idrofilicit 30 La fase mobile finale stata prodotta dallo strumento nella ca mera di miscelazione Anche in questo caso si giocato con le diverse percentuali del IPIOH e del TF 50 mantenendo per costante la quantit dell ACN nelle prove 2 6 Tab 4 6 Una volta visti i risultati si sono prese in considerazione le composizioni di fasi mobili con i cromatogrammi migliori e si sono proseguite le prove Hplc Tabella 4 6 Riassunto delle varie miscele ACN iPrOH TF 50 Composizione v v Fase Mobile Prove ACN iIPIOH TF 50 Flusso Acronimo 1 26 5 0 5 73 1 13 2 27 1 72 1 8 3 27 2 71 1 9 4 27 3 70 1 10 5 27 5 68 1 11 6 27 8 65 1 12 vedi Tab 4 1 4 Variazione del flusso di eluizione Le variazioni apportate al protocollo di riferimento non hanno riguardato solo le percentuali dei solventi ma si sono allargate anche al flusso di eluizione La quantificazi one dell IbuNa stata sperimentata con la fase mobile ACN TF 50 26 74 e ACN TF
131. alisi dello stesso lotto alle medesime concentrazioni prelevato direttamente dal contenitore originale Per contro le analisi quantitative sono state effettuate per allestite delle curve di calibrazione con le quali si potesse determinare la concentrazione di IbuNa in campioni incogniti Hplc Curve di calibrazione Sono state allestite diverse curve di calibrazione i cui parametri essenziali sono riassunti nella Tabella 4 2 Tuttavia il protocollo operativo sempre stato lo stesso Inizialmente in tre matracci puliti si prepara la soluzione madre 17 mg mL n 3 Si fa presente che la bilancia sempre calibrata prima delle pesate e la calibrazione validata con pesetti certificati 10 25 50 mg Nel caso delle curve di calibrazione 4 e 5 in Tabella 4 2 l IbuNa utilizzato stato tolto dalla stufa ed stato lasciato a riposo per qualche minuto nel vetrino d orologio prima di essere pesato Solo nel caso delle curve di calibrazione 6 e 7 l analisi non stata effettuata in triplo e la soluzione Madre di partenza ha come concentrazione 2 125 mg m Le soluzioni Madre sono state utilizzate subito dopo la loro preparazione per allestire 9 o 6 diluizioni Tab 4 2 Per fare ci si prendono 9 o 6 microprovette in ognuna delle quali si pipettano 0 75 mL del solvente in cui l IpuNa stato disciolto A questo punto si prelevano 0 75 mL dalla Madre e si pipettano nella prima microprovetta si agita bene il contenuto pipettando s
132. alla conclusione della capacit del solvente organico di anticipare i tempi di ritenzione delle sostanze Ma a tal proposito stato tenuto conto di un tempo di uscita non troppo vicino al fronte del solvente per evitare una possibile sovrapposizione dei picchi che interferisse con una corretta quantificazione Conclusioni Un ulteriore prova stata fatta variando il flusso ad una velocit di 0 7 1 2 e 1 3 mL min ma il ritardo e l anticipazione dei tempi di ritenzione ottenuti non soddisfaceva le nostre esigenze In aggiunta la separazione tra le due sostanze non era particolarmente definita come quella ottenuta ad un flusso di 1 0 mL min Inoltre stato testato l inserimento di un terzo solvente in fase Mobile che giocasse il ruolo del THF utilizzato da Brown et al Ma i risultati ed i cromatogrammi ottenuti non sono stati soddisfacenti anche a causa dell alterazione della forma del picco che presentava una spalla nel lato destro pertanto stata abbandonata tale soluzione La scelta di Monitorare le analisi alle due lunghezze d onda sopracitate ha permesso di notare immediatamente una maggior pulizia della linea di base del cromatogramma ed un maggior assorbimento delle due sostanze a 265 nm Infine tenendo conto di tutti i cromatogrammi ottenuti e di tutti gli studi effettuati stata scelta la fase Mobile pi adatta alla nostra separazione in modo da discostarci il meno possibile dall articolo di riferimento pertanto sta
133. alsiasi forma di essiccazione e risospensione Infine anche il metodo Folch risultato valido nonostante rimanga da caratterizzare con maggior attenzione la componente della fase cloroformica per poter escludere con certezza la possibile presenza del farmaco nella suddetta fase La messa a punto della metodica cromatografica per la quantificazione dell IbuNa ha previsto un analisi completa e meticolosa di tutte le soluzioni utilizzate e di tutte le metodiche sperimentate Infatti non ci si soffermati alla semplice analisi cromatografica ma sono stati approfonditi tutti gli aspetti concernenti la caratterizzazione dei farmaci utilizzati Conclusioni Innanzitutto in seguito ai problemi pressori riscontrati utilizzando la metodica di Brown et al si approfondita l analisi sulla stabilit delle soluzioni utilizzate e trattate stata indagata l efficacia dei supporti filtranti utilizzati e la purezza dell acqua ottenendo dei risultati che attestavano la stabilit fisica delle soluzioni da noi adoperate Successivamente in seguito alla percezione di un odore sgradevole del farmaco d interesse ci si soffermati sull ispezione delle sue caratteristiche fisiche le quali sono state messe a confronto con quelle di un lotto nuovo Le analisi effettuate hanno riguardato la misurazione del pH il punto di fusione l analisi NMR l analisi IR ed infine l analisi UV Vis Se si analizzano nel dettaglio i risultati possibile not
134. amento della reazione 17 Inoltre recenti pubblicazioni dimostrano che anche l incubazione del reagente NanoOrange con campione proteico a temperatura ambiente genera un segnale fluorescente efficace In aggiunta Liu et al hanno dimostrato che la reazione a temperatura ambiente tra NanoOrange e BSA aveva un tempo di 110 msec in questo modo la reazione si completa per gt 99 5 un secondo dopo la miscelazione Quindi tempi di incubazione cos prorogati a temperature elevate potrebbero non essere necessari anche se ulteriori studi sarebbero utili per determinare il tempo ottimale necessario Chiaramente tempi pi brevi di incubazione sarebbero vantaggiosi per l automazione del NanoOrange 1 7 Concludendo anche Jones et al apprezzano l utilizzo del kit in questione paragonando la sua efficacia ai saggi standard come quello di Lowry e Bradford ma soprattutto considerandolo molto utile per rilevare proteine relativamente piccole o grandi peptidi come aprotinina e insulina Infine offre come vantaggio il possibile utilizzo di lettori di micropiastre a fluorescenza fluorimetri ed alcuni scanner laser 18 Pertanto in futuro potrebbe essere interessante approfondire il funzionamento del kit NanoOrange da noi testato apportando un ulteriore Modifica riguardo al non riscaldamento del campione suggerita in letteratura Degradazione e Deproteinizzazione della cute Degradazione e Deproteinizzazione della cute 3 1 Introduzione
135. antit di quella nota B e si determinano i tre punti di fusione i e A B e miscela Se il punto di fusione di A si abbassa con la miscelazione significa che A e B sono due sostanze differenti mentre se il punto di fusione resta lo stesso sono uguali 41 Pertanto nel nostro caso la misurazione del punto di fusione stata effettuata per verificare le differenze tra i due lotti di IbuNa Par 4 5 1 2 dati sono mostrati in Tabella wr l 4 8 dove possibile identificare la temperatura di fusione iniziale i i e la temperatura in cui il primo cristallo fonde la temperatura di fusione finale f i e la temperatura in cui tutta la polvere ha fuso e quanto grande l intervallo di fusione i e valore f i Tabella 4 8 Temperature di fusione dell IpuNa Temperatura C IbuNa L1 IbuNa L2 Miscela L1 L2 Replica i f fi i f fi i f fi 1 193 195 2 195 197 2 191 193 2 2 194 195 1 196 198 2 192 195 3 3 194 195 1 195 197 2 192 195 3 Media 193 67 195 00 1 33 195 33 197 33 200 191 67 194 33 2 67 SD 0 58 0 00 0 58 0 58 0 58 0 00 0 58 1 15 0 58 I dati presentati mostrano che le temperature di fusione i ed f di lbuNa L2 sono maggiori di circa 2 C rispetto a quelle osservate per il IpuNa L1 Inoltre quando le due sostanze si trovano in miscela la temperatura di fusione iniziale si abbassa di 2 C e di 3 7 C rispetto a quelle di IbuNa L e IbuNa L2 mentre la tempe
136. anto significherebbe avere un limite minimo di 0 01 ug mL per il quale nei nostri esperimenti non stata ottenuta ripetibilit e precisione 2 7 Utilizzo del Kit NanoOrange nella quantificazione proteica della cute Nel corso degli esperimenti che sono stati effettuati in laboratorio il kit stato utilizzato come metodo di verifica per quantificare la concentrazione di proteine restante in campioni di cute trattati con diverse metodiche per la loro eliminazione Essendo trascorso parecchio tempo dall ultimo utilizzo del kit all inizio degli esperimenti che interessavano la cute stato deciso di allestire una nuova curva di calibrazione sia per vedere se questa fosse identica all ultima eseguita e sia per essere sicuri della quantificazione che si andava a misurare 2 8 Conclusioni In letteratura sono stati trovati dei lavori che hanno approfondito lo studio sull utilizzo del kit NanoOrange per rafforzare le potenzialit mostrate sin dall inizio stato infatti approfondito l aspetto della presenza della fase di riscaldamento che risultava difficile inserire in una stazione robotizzata Pertanto i ricercatori si sono mossi verso una Quantificazione proteica_Kit NanoOrange_ caratterizzazione ulteriore della reazione specifica del kit per studiarne la sua dipendenza dalla temperatura ed i tempi necessari nonch esaminare l uso di mezzi alternativi di riscaldamento ad esempio un forno a microonde per accelerare il complet
137. anza del campione che stato precedentemente normalizzato ossia gli stato sottratto il proprio bianco WMQ Collagenase cute in Collagenase rispettivamente per i campioni n 1 2 3 Tabella 3 15 uantificazione dell Ibu Na nei campioni normalizzati Concentrazione ug mL Recupero Campione Metodo Teorica Trovata metanolo cloroformio metanolo cloroformio 1 lou Na in WMQ 1000 1004 1 68 5 100 4 6 4 2 lou Na collag 531 890 9 219 6 94 4 23 3 3 lou Na Cute Col 944 34 35 171 2 6 5 32 3 Le percentuali di recupero elencate nella Tabela 3 15 mostrano un 100 per il campione n 1 ottenuto nella fase metanolica ma inaspettatamente stato ottenuto anche un 6 4 nella fase cloroformica Per il campione n 2 stata ottenuta una percentuale abbastanza elevata del 94 ma anche in questo caso se si considera il recupero nella fase cloroformica non si ottiene il 100 teorico Nel campione n 3 il risultato ottenuto non stato dei migliori stata infatti quantificata una concentrazione bassissima 6 5 nel metanolo e una concentrazione del 32 3 nella fase cloroformica Degradazione e Deproteinizzazione della cute stato ipotizzato che il problema della quantificazione potesse essere dovuto ai tubi in plastica che si stavano utilizzando pensando ad una possibile reazione del cloroformio con la plastica Per questo motivo si passato all utilizzo di tubi in vetro della capacit 10 mL In conseguenza
138. are che la misurazione del punto di fusione di entrambi i lotti e della loro miscela ha permesso di stabilire una Maggior purezza del lotto 2 la misurazione del pH ha permesso di notare che l aggiunta dell ACN al tampone per il ripristino della fase Mobile porta ad un aumento del valore di pH in maniera proporzionale alla concentrazione del tampone fosfato nonostante questo i pH dei due lotti sono molto simili tra loro l analisi IR non ha permesso di notare differenze tra i due lotti solamente effettuando un confronto con lo spettro fornito dalla casa Madre stato possibile confermare la natura igroscopica della sostanza infine lo spettro NMR eseguito purtroppo non stato utile sull approfondimento dell indagine riguardante la presenza di umidit nella polvere in quanto il solvente utilizzato stato l acqua deuterata la quale avrebbe mascherato l eventuale igroscopicit del farmaco l analisi Uv Vis ha messo invece in evidenza che la forma del picco resta sempre la medesima in ciascuna soluzione testata WMQ PBS TF25 tranne nel caso dell Ac Form col quale compare una piccola spalla alla sinistra l assorbimento dei due lotti non trattati termicamente differente l assorbimento massimo dell IbuNa risulta sempre essere 265 nm stata testata l efficacia del trattamento termico a 100 C a diversi tempi entrambi i lotti aumentano dopo 24 ore e diminuiscono tra le 48 72 ore ma poi assumono un comportamento
139. are completamente il solvente di lavaggio con la fase mobile di conservazione della colonna ACN WMQ 80 20 Si precisa inoltre che il lavaggio in WMQ effettuato periodicamente ossia una volta al mese quello consigliato dalla casa Madre che prevede un lavaggio della durata di una notte intera costituito esclusivamente da WMQ ad un flusso basso i e 0 1 mL min che passa esclusivamente nel circuito dello strumento escludendo perci la colonna Inoltre circa una volta al mese vengono smontati e lavati i filtri pescanti dalle bottiglie Duran Si procede come qui descritto pescanti vengono svuotati del loro contenuto ed adagiati in un beaker contenente 100 mL di WMQ Questo viene posizionato dentro la vasca di un bagnetto ad ultrasuoni operante a 35 kHz Si effettuano quattro cicli di lavaggio da 30 minuti in solvente differente i e 1 ciclo WMQ 2 ciclo iPrOH 3 e 4 ciclo WMQ Alla fine di questa procedura i filtri vengono posti ad asciugare sopra un foglio di carta da filtro a testa in gi prima di essere rimontati in ciascuna linea Hplc 4 6 5 Analisi Determinazione dei parametri pressori basali dello strumento La determinazione dei parametri pressori basali dello strumento stata ottenuta facendo flussare alcune fasi mobili nel circuito dello strumento collegato attraverso la union i e senza colonna o la colonna cromatografica varie combinazioni con gli accessori come mostrato in Tabella 4 4 per 30 m
140. ata in un bancone da laboratorio accuratamente parafilmata La forma dei picchi del DicloNa nei vari cromatogrammi n 9 x 3 non mostrati presenta una simmetria 1 Esperimento 2 Curva di calibrazione n 5 stufa 48 ore 254 nm dati mostrati in Tabella 4 44 indicano che l i tempi di ritenzione dell IbuNa L2 risultano essere compresi tra 7 6 7 7 minuti per tutte le concentrazioni ad esclusione di quella a 7 69 ug mL per la quale si ha un oscillazione tra i 7 4 e 7 5 minuti Rispetto ai dati mostrati in Tabella 4 17 si pu osservare che risultano essere ritardati ca di 4 7 secondi 7 04 min Le aree dei 9 campioni di IbuNa L2 mantengono un rapporto che si avvicina al valore 2 sino alla concentrazione 0 48 ug mL per poi scendere a 1 8 sino al campione meno concentrato 0 03 ug mL Nelle tre repliche successive si osservato che si sono avuti meno problemi nell integrazione dei picchi relativi alle basse concentrazioni Rispetto all area teorica ca 8 500 u a stimata in riferimento alle diluizioni seriali del campione a concentrazione 1 000 ug mL Tab 4 17 ed a quello a concentrazione 500 ug mL Tab 4 20 i campioni a concentrazione 7 69 ug mL risultano essere in media molto vicini i e 9 078 u a ad essa La forma dei picchi del IbuNa L2 nei vari cromatogrammi n 9 x 3 non mostrati presenta una simmetria 1 L intervallo di concentrazione in cui stato possibile quantificare senza problemi l IbuNa L2 sono
141. ati da una forma stretta alla base ed allungata Gli intervalli di concentrazione in cui stato possibile quantificare senza problemi l ibuNa L1 sono 7 69 0 12 ug mL Concentrazioni pi piccole non sarebbero quantificabili con precisione Pertanto nelle condizioni di questa analisi si pu affermare che il limite di riivelamento di ca 0 12 ug mL Continuando con l analisi dei dati in Tabella 4 22 si pu riassumere che l i tempi di ritenzione del DicloNa variano tra 10 98 11 16 minuti Rispetto ai dati mostrati in Tabella 4 17 e 4 20 si pu osservare che queste ultime analisi risultano avere dei tempi anticipati 9 90 min Le aree dei 9 campioni del DicloNa nelle diverse repliche oscillano in un intervallo compreso tra 15 619 e 20 759 unit arbitrarie Rispetto all area del campione a concentrazione 1 000 ug mL Tab 4 17 ed a quello a concentrazione 500 ug mL Tab 4 20 i campioni a concentrazione 0 98 ug mL risultano essere in alcuni casi pi alti o pi bassi rispetto all area teorica di ca 19 500 che dovrebbero avere Rispetto all area tabulata in Tabella 4 20 per una concentrazione di 0 98 ug mL i e 26 456 in questo esperimento si osservato che l area risulta essere pi vicina a quella teorica La forma dei picchi del DicloNa nei vari cromatogrammi n 9 x 3 non mostrati presenta una simmetria 1 ossia caratterizzata da una forma stretta alla base che si sviluppa in altezza non presentando alcuna
142. ato possibile quantificare senza problemi l ibuNa L2 sono 7 69 0 12 ug mL Concentrazioni pi piccole non sarebbero quantificabili con precisione Pertanto nelle condizioni di questa analisi si pu affermare che il limite di rivelamento di ca 0 12 ug mL Continuando con l analisi dei dati in Tabella 4 30 si pu riassumere che l i tempi di ritenzione del DicloNa risultano essere tutti identici a 10 2 minuti Rispetto ai dati mostrati in Tabella 4 17 e 4 20 si pu osservare che queste ultime analisi risultano avere dei tempi anticipati i e 9 90 min stessa situazione riscontrabile rispetto alla Tabella 4 21 rispetto alla quale i tempi risultano essere anticipati 10 98 11 16 min Le aree dei 9 campioni del DicloNa nelle diverse repliche oscillano in un intervallo compreso tra 17 253 e 19 687 unit arbitrarie Rispetto all area teorica 19 500 u a che stata calcolata per proporzionalit delle diluizioni seriali partendo dal risultato dell analisi del campione a concentrazione 1 000 ug mL Tab 4 17 e da quello a 500 ug mL Tab 4 20 i campioni analizzati risultano avere un area molto vicina a quella stimata 17 253 19 687 u a possibile notare un comportamento identico anche se lo si paragona con i risultati in Tabella 4 24 15 619 20 759 u a La forma dei picchi del DicloNa nei vari cromatogrammi n 9 x 3 non mostrati presenta una simmetria 1 Esperimento 1 Curva di calibrazione n 2B s
143. attraverso la quale viene permesso il passaggio del fascio luminoso senza fenomeni di scattering Anche in questo caso i valori dei bianchi sono stati annotati le cuvette segnate per la direzione di inserimento svuotate e messe capovolte ad asciugare a temperatura ambiente 2 4 3 Quantificazione delle proteine Curva di calibrazione Il protocollo da noi utilizzato per l allestimento della curva di calibrazione prende spunto dal protocollo originale che pertanto descritto qui sotto 2 4 3 1 Curva di calibrazione Protocollo originale Circa un ora prima di allestire una curva di calibrazione i componenti A e C conservati a 4 C sono stati lasciati equilibrare a temperatura ambiente su un bancone del laboratorio Raggiunta tale temperatura verificata per immersione attraverso una sonda termometrica presente nel pHmetro il componente A stato centrifugato 14 100 g 5 minuti temperatura ambiente affinch il DMSO si depositasse sul fondo della microprovetta Successivamente stato necessario allestire la working solution WS necessaria per la preparazione dei campioni a concentrazione nota i e i punti della curva La WS funge da diluente e reagente ed composta da una soluzione acquosa del componente A e B 1x Per prepararla stato usato un tubo in plastica da 50 ML opportunamente rivestito con carta stagnola nel quale sono stati pipettati i componenti necessari nel seguente ordine per 30 mL ca 3 mL del compone
144. azione cromatografica in HPLC 125 4 9 1 Determinazione dei parametri basali dello strumento 125 4 9 2 Metodica di lavaggio dello strumento e sue porzioni 128 4 9 3 Separazione cromatografica messa a punto della metodica finale 140 4 9 4 Retta di calibrazione 148 4 9 5 Influenza dell umidit sulla retta di calibrazione 155 4 9 6 Influenza della temperatura sul campione 192 5 Conclusioni 196 6 Bibliografia 201 Introduzione Introduzione e motivazione della tesi La veicolazione transdermica ha dato un contributo importante alla Medicina pratica ma deve ancora sviluppare pienamente il suo potenziale come alternativa alla somministrazione orale ed alle iniezioni ipodermiche Da una prospettiva globale i progressi raggiunti nella progettazione dei sistemi di veicolazione transdermica si potrebbero classificare in tte generazioni di sviluppo La prima generazione comprende sistemi caratterizzati dalla capacit di far attraversare la pelle a Molecole di piccole dimensioni di natura lipofila ed efficaci a basse dosi 1 sistemi utilizzati nella seconda generazione hanno contribuito all ottenimento di ulteriori progressi per la veicolazione di piccole Molecole aumentando la permeabilit della pelle e le forze di trasporto Infatti stato introdotto l utilizzo di enhancers chimici di ultrasuoni e della ionoforesi la capacit della ionoforesi di controllare i tassi di rilascio in tempo reale rappresenta infatti una funzionalit
145. azione fosse la causa del basso recupero di farmaco Quindi sono stati pipettati in dei tubi di plastica 200 o 300 uL a seconda del metodo di IbuNa Seguendo la procedura dell esperimento sono stati messi in stufa sino al loro completo essiccamento e successivamente sono stati risospesi in 2 5 ML di WMQ e sono stati analizzati all UV Inoltre per poter effettuare un paragone sull azione della temperatura dei 100 C sul composto sono stati preparati dei campioni allestiti pipettando 200 o 300 uL di IbuNa e aggiungendo 2300 o 2200 uL di WMQ a seconda del metodo raggiungendo cos il volume finale di 2 5 mL In seguito i campioni sono stati vortexati per qualche minuto e sono stati analizzati allo spettrofotometro stato saltato il passaggio in stufa Entrambi gli esperimenti sono stati realizzati sia utilizzando l IbuNa sciolto in WMQ che l buNa sciolto in TF25 mM Gli spettri ottenuti dall analisi sono mostrati nella Figura 3 15 nella quale possibile mettere a confronto il metodo Fig 3 15 A con il metodo II Fig 3 15 B Ibu Na in WMQ I NO stufi Ibu Na in TF25 stufa lbu Na in WMQ II NO stufa Ibu Na in TF25 Il stufa DI Li 3 N amp S 2 x D d lt Assorbanza u a 200 400 600 800 200 400 600 800 1000 1200 Lunghezza d onda nm Lunghezza d onda nm Figura 3 15 Analisi dell IbuNa con metodo A e metodo ll B essiccato e non Degradazione e Deproteinizzazione della
146. azione in stufa a 100 C per un tempo variabile dalle 24 alle 168 ore In entrambi i casi si nota che l assorbimento a 265 nm del sale mantenuto a temperatura ambiente linea nera 0 h in Fig 4 17 destra e sinistra inferiore agli altri picchi Si osserva inoltre che la forma del picco non sempre identica nei vari campioni appartenenti ad un medesimo lotto ed inoltre solo alcuni sono simili a quelli mostrati in Figura 4 14 Tabulando gli assorbimenti degli spettri appena mostrati Tab 4 12 si pu notare che i due lotti si comportano similmente nelle prime 72 ore Infatti nelle prime 24 ore le assorbanze crescono per poi lentamente diminuire nelle successive 72 ore A questo punto il comportamento diverge in quanto il lotto 1 sembra non gradire la permanenza a 100 C oltre le 96 ore mentre ci non capita al lotto 2 IbuNa L1 0 ore IbuNa L2 0 ore IbuNa L1 24 ore IbuNa L2 24 ore IbuNa L1 48 ore IbuNa L2 48 ore IbuNa L2 72 ore I aeii Fe dala IbuNa L2 96 ore IbuNa 68 IbuNa L1 168 ore uNa12 1680r Assorbanza u a g 2 RI N S f d n lt 200 220 240 260 280 300 320 340 360 200 220 240 260 280 300 320 340 360 Lunghezza d onda nm Lunghezza d onda nm Figura 4 17 Spettri UV Vis di IbuNa L1 a sinistra L2 a destra dopo esposizione a 100 C per il tempo indicato e solubilizzati in WMQ Hplc Tabella 4 12 Assorbimento a 265 nm in funzione del tempo di esposizione a 100 C IbuNa
147. buNa L2 e lbuNa L2 135 1H9B AD 20 STANDARD PROTON PARAMETERS T 4 5 4 0 f1 ppm R2BB_D20 STANDARD PROTON PARAMETERS Figura 4 12 Spettro H NMR di lbuNa primo lotto in DO 114 Hplc RABB Y D20 STANDARD PROTON PARAMETERS 4 0 3 5 f1 ppm Figura 4 13 Spettro H NMR di IbuNa secondo lotto 135 C in DO In ognuno di questi spettri possiamo individuare lo spettro in bordeaux un asse delle X che rappresenta lo spostamento chimico o chemical shift 8 indicato con f1 negli spettri ppm un asse delle Y che rappresenta l intensit Hz i valori numerici sotto allo spettro in bordeaux sono le aree in cm i valori numerici nella parte pi alta dello spettro rappresentano gli spostamenti chimici dei picchi presenti ppm in caso di molteplicit si prende il valore medio Si ricorda inoltre che per lo spettro H NMR le aree sono direttamente proporzionali al numero dei protoni Inoltre per agevolare l interpretazione dei dati presenti nelle Figure 4 11 4 13 gli stessi sono stati tabulati in Tabella 4 10 Da una prima osservazione degli spettri si nota che sono presenti 7 segnali sebbene il numero complessivo dei protoni della molecola sia 17 Ci pu essere spiegato dai fenomeni di equivalenza tra i diversi protoni dati dalla presenza di simmetrie nella molecola che in ultimo determina che molti di questi vengano rappresentati contemporaneamente dallo ste
148. buNa preparato in WMQ piuttosto che in TF25 ed stato cos realizzato lo spettro di 250 uL di campione diluiti con 1 ML di WMQ La Figura 3 13 mostra il risultato dell analisi spettrofotometrica dell IbuNa Degradazione e deproteinizzazione della cute IBU Na INW IBU Na TF25 d q N la Q pm e D o lt 400 600 800 1000 1200 Lunghezza d onda nm Figura 3 13 Analisi UV Vis di 0 25 mL di IbuNa in WMA nero ed in TF25 rosso La Figura 3 13 mette in risalto una maggior regolarit dello spettro del farmaco sciolto in WMA ma in linea di Massima sono quasi perfettamente sovrapposti Per capire l effettiva quantit di farmaco recuperata stata quantificata la concentrazione attraverso il valore dell assorbanza della sostanza a 265nm ed stata convertita in concentrazione utilizzando la retta di calibrazione La concentrazione teorica per l IbuNa in entrambe le situazioni era del 3 4 mg mL ma sono stati recuperati 2 51 mg mL per la soluzione in WMQ spettro in nero e 2 44 mg mL per il farmaco in TF25 spettro in rosso Tale risultato significherebbe un recupero del 73 8 per l IbuNa in WMQ e del 71 8 per l IbuNa in TF25 L aspetto sorprendente sta nel fatto che non stata recuperata la totalit del farmaco nonostante sia stata effettuata una semplice diluizione evitando i particolari passaggi caratteristici del metodo Spe con la soluzione precipitante e l essicazione a 100 E stato
149. cati in stufa e risospesi in 2 5 ML di WMQ i campioni n 5 6 sono stati trattati con il Metodo Spe ma simulando la filtrazione Come dati matematici sono state mostrate le concentrazioni teoriche quelle effettivamente ottenute e la percentuale di recupero Tabella 3 9 Risultati dell IbuNa in WMQ e in TF25 testato nelle tre condizioni lbuNa Campione Metodo ug mL Recupero farmaco Teorica Trovata 1 300 Ibu in WMQ WMQ 2040 2045 100 3 2 300 Ibu in TF25 seccato 2040 1367 67 0 3 200 Ibu in WMQ WMQ 1360 1385 101 8 4 200 Ibu in TF25 seccato 1360 1938 142 5 5 Spe Ibu Na I 850 1195 140 6 6 Spe Ibu Na Il 567 2618 461 7 200 2300 300 2200 senza passaggio stufa 200 300 uL seccati e risospesi in 2 5 ML di WMQ trattati come spe ma filtrazione simulata Dalla Tabella 3 9 emerge che dal trattamento che salta l essicazione in stufa camp 1 3 sono state ottenute delle percentuali che si avvicinano parecchio al 100 nonostante lo superino leggermente in entrambi i metodi I campioni n 2 e 4 che sono stati essiccati invece mostrano un recupero del 67 col metodo e del 142 5 col metodo Il Tali percentuali sono molto strane soprattutto se si considera che non sono stati utilizzati gli acidi della soluzione precipitante ma si semplicemente seccato e risospeso Il recupero del farmaco maggiormente anomalo Degradazione e Deproteinizzazione della cute nei campioni n 5 e 6 che sono stati trattati con l
150. ccessive Infatti a quelle concentrazioni l andamento lineare o polinomiale si perdeva Tuttavia come si osserver nelle prossime figure a dispetto di ci le diluizioni successive hanno sempre mostrato un andamento ripetitivo e Modellizzabile Pertanto per tutte le curve di calibrazione sono stati preparati dei campioni dove la concentrazione pi alta e quella pi bassa hanno rispettivamente il valore di 2 125 g mL e di 33 20 ug mL Si ricorda infine che tutte le curve sono state allestite in triplo n 3 e le concentrazioni note messe in relazione con le relative assorbanze alle lunghezze d onda di 265 e 255 nm La prima lunghezza d onda rappresenta il picco Massimo di assorbimento dell IbuNa mentre la seconda 255 nm stata scelta per confronto con esperimenti precedenti che non riguardano questo studio Le prime due curve di calibrazione che vengono presentate sono la 1 Fig 4 20 Tab 4 2 e la 2 Fig 4 21 Tab 4 2 che sono state rispettivamente ottenute dal primo e secondo lotto del IpuNa mantenuto a 100 C per un tempo non registrato Y A B1 X B2 X 2 Parameter Value Error A 0 03183 0 02041 Bi 0 0019 6 06843E 5 B2 247319E 7 2 69655E 8 Y B X Assorbanza a 265 nm u a Li 5 E c W w N o N Q o d d lt Parameter Value Error R Square COD sD N P 0 99964 0 02615 6 lt 0 0001 500 1500 2000 2500 500 1000 1500 2000 2500 Concentrazione IbuNa L1 ug mL Concentrazione IbuNa L
151. ce con WMQ fresca sino al livello del supporto in plastica in cui inserita In condizioni normali ci avviene una volta alla settimana a prescindere o Meno dal suo aspetto macroscopico Dopodich si attivano manualmente i purge ossia i lavaggi delle quattro linee del circuito e quella dell iniettore ciascuna delle cinque linee aspirer attraverso il pescante Fig 4 2 Hplc elemento 1 alla velocit di 1 mL min e per cinque minuti tempo scelto dall operatore il solvente dalla propria bottiglia il quale arriver al sistema del degasatore Fig 4 2 elemento 5 che provveder ad eliminare eventuali bolle d aria presenti in questa porzione di circuito Si vuole qui evidenziare che la durata del purge viene allungata in casi particolari quali i dopo il lavaggio e re installazione dei filtri pescanti 10 15 min ii dopo periodi lunghi in cui lo strumento non stato utilizzato 10 20 min A questo punto si accende il computer che gestisce lo strumento e si impostano i parametri per le analisi da eseguire con o senza colonna vedi oltre per dettagli In ogni caso prima di qualsiasi analisi lo strumento con o senza colonna viene condizionato massimo per una ora Nella prima mezz ora si porta a regime il flusso e o le concentrazioni della fase mobile con un gradiente nella seconda mezz ora si mantengono i parametri impostati fino ad equilibrio Per esempio in presenza di colonna si osserva la stabilit della linea
152. centrazione di tampone largamente consentita Escludendo il THF si iniziato lo studio dalla FM 2 e pertanto si sono allestite due soluzioni madre di lbuNa 1 mg mL in FM 2 e di DicloNa 1 mg mL in FM 2 Le due sostanze sono state iniettate 20 uL separatamente ed eluite con le FM 2 FM 7 dove i rapporti tra ACN e TF 50 variano all interno di questo range rispettivamente da 25 75 fino a 30 70 Tab 4 5 risultati sono mostrati in Tabella 4 17 dati puntuali e Figura 4 31 visione d insieme 141 142 Hplc Tabella 4 17 Dati relativi all integrazione delle FM 2 7 IbuNa L1 Tempo min Area Spalle Fase Mobile iniziale finale T ritenzione FM 7 4 60 6 20 4 77 1 056 228 dx FM 6 5 20 7 02 5 38 1 060 126 dx FM 5 5 92 7 80 6 11 1 065 397 dx FM 2 6 90 9 75 7 04 1 065 397 dx FM 4 8 00 10 65 8 25 1 072 443 dx FM 3 9 97 12 65 10 26 1 103 258 dx DicloNa Tempo min Area Spalle Fase Mobile iniziale finale T ritenzione FM 7 5 70 7 90 5 92 19 958 891 dx FM 6 6 70 9 20 6 93 20 136 160 dx FM 5 7 90 12 00 8 19 20 296 140 FM 2 9 60 13 70 9 90 20 447 062 FM 4 11 70 16 40 11 98 20 587 160 FM 3 16 00 20 30 16 38 20 797 426 L analisi congiunta dei risultati mostra che all aumentare della percentuale di ACN i picchi si affusolano diventano pi alti e si spostano a sinistra i e tempi di ritenzione pi brevi se per esempio si confrontano i dati ottenuti con la FM 3 ACN 25 e la FM 7 ACN 30 s
153. ciente di ripartizione olio acqua nello strato corneo il peso molecolare che deve essere inferiore a 1000 Da per permettere la permeazione nonch il metabolismo sia quello causato dagli enzimi presenti nella cute sia quello dovuto alla normale flora batterica presente sulla cute ed infine le possibili interazioni con le proteine che bloccherebbero la permeazione del farmaco 9 Via intercellulare Via transcellulare Membrana Citoplasma Plasmatica ellulare Spazio Intercellulare Via Apolare Via Apolare Via Polare idi i pi Colesterolo Trigliceridi Lipidi Cheratina Figura 1 2 Vie di permeazione transepidermiche dello strato comeo Nella figura sono mostrate le due vie di permeazione transepidermiche dello strato coreo la via intercellulare a sinistra e quella transcellulare a destra Se una molecola permea attraverso la via intercellulare essa potr inoltre seguire la via polare o la via apolare come mostrato nell ingrandimento Adattato da 2 Luogo e condizioni della pelle nel sito di applicazione In questo caso si prendono in considerazione lo spessore cutaneo del punto di applicazione esso infatti varia a seconda delle diverse zone del corpo e laddove sar spesso si avr un pi lento assorbimento il grado di idratazione che normalmente dovrebbe essere compreso tra 5 Introduzione 15 la presenza di lesioni o di patologie nel sito di applicazione ed infine il sesso la razza e l et del paziente c
154. cm Il surmatante ottenuto stato successivamente filtrato attraverso le Spe Filtrazione in Spe nella cartuccia condizionata sono stati pipettati 0 5 ML di campione di cute precipitata in modalit off line stato favorito il passaggio in cartuccia attraverso la regolazione delle valvoline attraverso le quali possibile decidere il flusso di filtrazione Successivamente al campione sono stati filtrati 2 ML di MeOH puro in Modo da rimuovere l eventuale campione rimasto intrappolato nel filtro Il filtrato ca 2 5 mL stato essiccato a 100 C ed stato poi ripreso con 0 5 ML di WMQ In seguito alla completa risospensione favorita dal vortexamento si proceduto con la quantificazione proteica attraverso il Kit METODO ACN FASI DI FILTRAZIONE METODO MeOH dance Precipitazione Off line ona gt Centrifuga Centrifuga 0 9 mL AcForm 1 0 9 mL AcForm 1 0 6 mL AcForm 3 Condizionamento 0 0 5 mL 2mL 0 5 mL 2mL Campione ACN Campione MeOH Off line Puro Off line Puro 100 C Filtrazione 100 C Ca 2 5 mL Ca 2 5 mL Figura 3 2 Rappresentazione schematica dei due metodi di analisi 3 4 3 5 Deproteinizzazione della cute attraverso il metodo Folch Inizialmente l esperimento di estrazione lipidica stato condotto utilizzando dei tubi in plastica i quali sono stati sostituiti da tubi in vetro nel corso degli esperimenti In seguito a questo cambiamento stato opportuno modificare i volumi utilizzat
155. cute Per avere un idea del recupero del farmaco ottenuto stata calcolata la sua concentrazione utilizzando il valore di assorbanza a 265 nm e trasformandola in concentrazione attraverso la curva di calibrazione La Tabella 3 8 mostra nella terza colonna da sinistra la concentrazione di farmaco attesa quella quantificata e la sua percentuale di recupero Tabella 3 8 Risultati di quantificazione dell Ibu Na attraverso analisi UV Vis lbuNa Campione Metodo ug mL Recupero farmaco Teorica Trovata 1 lou WI W 2040 2045 5 100 3 2 Ibu TF25 seccato 2040 1367 5 67 0 3 lou WII W 1360 1335 0 101 8 4 Iou TF25 Il seccato 1360 1938 0 142 5 5 Spe Ibu 850 1196 3 140 6 6 Spe Ibu Il 567 2617 7 461 7 I valori ottenuti Tab 3 8 mostrano una quantificazione dell IbuNa molto superiore a quella attesa tranne nel caso del campione n 2 stato ottenuto un recupero molto vicino al 100 peri campioni n 1 e n 3 mentre per gli altri si passa ad una percentuale del 140 per arrivare al campione n 6 con un recupero del 462 Dai risultati apparso evidente che non stata ottenuta la quantificazione attesa quindi si provveduto alla ripetizione della curva di calibrazione dell IbuNa sia sciolto in WMQ che in TF25 Fig 3 16 pensando che l errore di quantificazione fosse dovuto alla retta m 15 nov ibu naw Polynomial Fit of Data1_C m 15nov ibu TF25 Polynomial Fit of Data1_B N o Y A B1 X B2
156. d UK accessoriata solo con una colonna di guardia C18 550DS2 10C5 10 mm Hichrom Ltd Tutti i campioni sono disciolti in fase mobile ed in tutti introdotto il Diclo forma acida come standard interno 20 ug ml campioni volume di iniezione 100 uL sono eluiti ad un flusso di 1 1 mL min e quantificati Hplc ad una lunghezza d onda di 273 e 264 nm rispettivamente per il Diclo forma acida e per l Ibu forma acida Con l eccezione di alcuni dettagli relativi al TF 45 vedi poco pi sotto nessun altro parametro indicato nella sovracitata metodica 13 4 6 6 2 Modifiche apportate al protocollo di riferimento Le modifiche apportate alla metodica di quantificazione di Brown et al 13 sono qui schematicamente riassunte 1 Concentrazione TF Inizialmente si utilizzato un TF leggermente pi concentrato di quello indicato da Brown et al 13 50 invece di 45 mM Tuttavia la nostra metodica finale utilizza un TF molto pi diluito TF 25 Un altra differenza sostanziale riguarda il tipo di fosfato Il nostro tampone fosfato di potassio mentre quello di Brown et al di sodio 13 2 Eliminazione del THF e variazione dei rapporti di ACN e TF In mancanza di un riferimento certo relativamente alla concentrazione di THF in grado di danneggiare i tubi in peek i e polyether ether ketone 29 si deciso di eliminarlo dalla fase mobile ticomponente Pertanto si in seguito giocato con i rapporti percentu
157. da cuvette di plastica 1 e vetro 2 con bianchi noti Campione Albumina W C CN CF ligiml 1 2 1 2 1 2 1 2 1 0 0 136221 147241 11 0 2 0 0 0 0 0 2 10 0 1691 2 5 4728 26 2 303 7 236 2927 216 3 6 0 1363 25 380 2 20 4 2439 17 9 2329 159 4 3 0 129 9 32 2372 111 1072 79 96 2 5 9 5 1 0 1435 3 0 b644 39 20 9 0 9 9 9 yi 6 0 6 129 2 2 3 514 5 3 22 2 3 1 11 2 1 9 7 0 3 2052 25 2138 38 8 6 1 2 2 4 0 8 8 0 1 1241 22 40 1 4 0 16 0 1 8 5 0 0 2 9 0 06 1331 19 47 5 8 14 0 4 0 3 0 1 9 10 0 03 1322 2 2 423 38 10 1 1 6 0 9 0 4 11 0 01 1641 07 74 8 54 10 7 4 7 0 3 2 7 Da quanto mostrato in Tabella 2 4 la misurazione dei bianchi delle cuvette in vetro non sembra aver apportato dei miglioramenti vista la Mancata proporzionalit tra fluorescenza e concentrazione e la presenza di valori negativi Quantificazione Proteica_Kit NanoOrange_ Nella Figura 2 1 A mostrato il confronto tra i due esperimenti caratterizzati dall analisi di 2 mL di campione nelle cuvette di plastica mentre nella Figura 2 1 8 viene visualizzato l andamento della curva ottenuta dall analisi di 0 2 ML di campione in cuvette di vetro nei due giorni differenti con e senza la misurazione dei rispettivi bianchi ossia con e senza normalizzazione gt m 03 11 11 m 03 11 11 07 11 11 07 11 11 Fluorescenza u a d 3 N c Q 0 vd v e 3 T 6 6 Albumina pg mL Albumina pg mL Figura 2 1 Curve di calibrazione ottenute
158. da l estrazione dei lipidi e delle proteine sono diffusi in letteratura diversi metodi utilizzati ma in generale i pi comuni risultano essere quelli caratterizzati dallo sfruttamento delle capacit estrattive dei solventi organici In linea di principio il solvente o la miscela di solventi usato deve essere adeguatamente polare per rimuovere i lipidi dalla loro associazione con le membrane cellulari e costituenti dei tessuti ma anche non cos polare da non permettere dl il solvente di dissolvere rapidamente tutti i trigliceridi e gli altri lipidi apolari 23 Folch et al stato uno dei primi a riconoscere questo e sviluppare il sistema fase di cloroformio metanolo acqua il cosiddetto metodo Folch che sotto varie Modifiche continua a essere considerato il metodo pi classico e pi affidabile per l estrazione di lipidi 23 Pertanto la deproteinizzazione della cute stata realizzata anche attraverso l utilizzo della metodica del Folch Par 3 4 3 5 con la quale possibile separare i lipidi e le proteine utilizzando una miscela di CHCI e MeOH in rapporto di 2 1 La separazione delle fasi si verifica nel momento dell aggiunta di un volume di WMQ pari a quella del MeOH Ci che si ottiene una fase inferiore costituita da CHCI ed una superiore nella quale si sar ripartito il MeOH con l WMQ lipidi e le proteine si dovrebbero posizionare nella fase inferiore Dopo aver preparato la cute disciolta in Collagenase come descritt
159. definire meglio anche quella che sar la loro applicazione cutanea Questo verr fatto attraverso l utilizzo di celle di diffusione verticali dove sar applicata la formulazione sulla cute che si trover disposta tra due celle la cella donatrice superiore e quella ricevente inferiore Ci che si andr a verificare successivamente sar la quantit di farmaco che avr attraversato la cute che quindi si trover disciolta nel liquido che mima i liquidi biologici nella cella ricevente e la quantit di farmaco che invece sar rimasta sugli strati della cute Per poter effettuare una corretta quantificazione del farmaco rimasto intrappolato nel tessuto si pensato di procedere con la degradazione della cute a contatto con la formulazione In letteratura sono stati trovati pochi riferimenti bibliografici infatti stato seguito il protocollo di degradazione presente nell articolo di Brown et al 13 integrato dai suggerimenti dati dagli autori del testo Culture of Animal cells a manual of basic technique 14 che procedono utilizzando un metodo simile Infatti entrambi utilizzano come mezzo di degradazione la Collagenase Successivamente stato anche necessario trovare un metodo adeguato per la deproteinizzazione della cute disciolta per poter procedere con la quantificazione del farmaco attraverso l utilizzo della cromatografia liquida ad alta prestazione Nel corso dello studio sono state testate diverse tecniche che prevedeva
160. deformazione del picco 151 152 Hplc Tabella 4 21 Dati della retta di IbuNa DicloNa FM 2 1 0 mL min 254 nm relativi a lbuNa L1 IbuNa L1 Concentrazione Tempo min ripetizione uo mL iniziale finale TR Area Spalle 1 7 5 8 6 8 00 9 889 2 7 69 7 3 8 6 7 90 9 838 3 7 2 8 9 7 94 9 855 media Z 9 D 15 8 amp 7 amp 017 7 95 005 9 861 25 97 1 7 5 8 6 8 00 5 145 2 3 84 7 3 8 6 7 99 4 962 3 7 8 8 9 7 95 5 125 media L4x 0 12 8 7 20 17 7 98 0 026 5 077 100 4 1 7 4 8 5 8 02 2 525 2 1 92 7 3 8 4 7 99 2 723 3 7 4 8 6 7 93 2 445 media 7 4 0 06 8 5 0 1 7 98 0 046 2 564 3 143 1 1 7 8 8 4 8 03 1 315 2 0 96 7 4 8 4 7 99 1 484 Sx 3 7 7 8 5 7 93 1 316 media L62021 8 4 0 6 7 98 0 050 1 371 7 9783 1 7 8 8 4 8 06 775 2 0 48 n r aAA n r BAA 3 7 7 8 3 7 94 778 media 7 8 0 07 8 4 0 07 8 0 0 085 776S amp 27 1 7 7 8 3 8 07 346 2 0 24 7 8 8 3 8 00 300 Sx 3 7 8 8 4 7 90 323 media 7 8 0 06 8 3 0 06 7 99 0 085 323 0 23 0 1 7 8 8 3 8 07 159 2 0 12 7 9 8 2 8 02 175 Sx 3 7 8 8 2 7 97 179 media 7 8 0 06 8 2 0 06 8 02 0 050 IWO 10 6 1 Ta 8 1 7 99 66 2 0 06 MF nr n r BEA 3 n r n r n r n r media 77 200 8 1 0 0 7 99 0 0 66000 1 7 8 8 0 7 99 30 2 0 03 TT n r n r n r 3 n r BEA n r BEA media P100 8 0 0 0 AIF 00 30 0 0 0 Tabella 4 22 Dati della retta di IbuNa DicloNa FM 2 1 0 mL min 254 nm relativi a DicloNa Hplc HSE
161. dello e loro caratterizzazione Hplc Le molecole modello utilizzate sono due farmaci anti infiammatori non steroidei nella loro forma salificata Questi sono il sale sodico dell ibuprofene IbuNa e quello del diclofenac DicloNa 4 5 1 Ibuprofene sale sodico Durante lo svolgimento di questo studio sono stati utilizzati due lotti di IbuNa in quanto il primo pur mantenendo le sue caratteristiche macroscopiche ha modificato il suo odore Pertanto quando si entrati in possesso del secondo lotto i due lotti sono stati sottoposti a diverse analisi qui di seguito descritte per evidenziarne le eventuali differenze 4 5 1 1 Conservazione I due lotti sono stati conservati nei contenitori originali cos come prescritto dalla ditta produttrice e quindi a temperatura ambiente ed all interno di un armadio del laboratorio successivamente a causa di alcuni risultati ottenuti con gli esperimenti descritti nel Paragrafo 4 7 1 il secondo lotto stato conservato sempre nel suo contenitore originale leggermente aperto posto all interno di un essiccatore in vetro non ambrato il cui fondo stato riempito con gel di silice dove inoltre presente un piccolo beaker contenente del pentaossido di fosforo entrambi con lo scopo di eliminare l umidit dell ambiente 4 5 1 2 Punto di fusione Il punto di fusione un parametro molto utile per la determinazione della purezza di una sostanza La sua misurazione stata effettuata per entrambi i
162. di 350 nm Per le analisi quantitative gli spettri azzerati sono stati normalizzati rispetto al loro bianco Le analisi qualitative sono state eseguite per verificare forma posizione ed intensit dei picchi di assorbimento dell IbuNa e se questi variassero in funzione del solvente in cui la molecola si trovava disciolta Per quanto riguarda le analisi qualitative il primo lotto di IbuNa stato analizzato in soluzione acquosa WMQ ed in FM 2 alle concentrazioni di 62 5 125 250 e 500 ug mL ottenute tutte per diluizione seriale partendo dalle soluzioni Madri 1 Mg mL Inoltre sono state analizzate 15 soluzioni PBS ottenute per diluizione seriale ognuna avente concentrazione pari alla met rispetto alla precedente a partire da una soluzione madre 1 mg mL Il secondo lotto stato analizzando in TF 25 alle concentrazioni di 33 2 265 6 e 2125 ug mL ottenute per diluizione seriale a partire dalla soluzione Madre 17 mg ml Il secondo lotto stato anche analizzato in soluzione acquosa 2 1 mg mL ottenuta per diluizione della soluzione madre 4 3 mg mL preparata dopo che il sale era stato conservato in stufa a 100 C per 24 48 96 e 168 ore Lo stesso lotto stato analizzato alle concentrazioni 0 531 1 062 e 2 125 mg mL in soluzione acquosa dopo essere stato conservato per 48 giorni in una campana di vetro sotto vuoto con all interno silice e pentaossido di fosforo i risultati sono stati poi confrontati con quelli ottenuti dalle an
163. di base nella schermata del real time fornita dal software dello strumento e se non si nota alcuna deriva possibile iniziare con le analisi Finite le analisi si procede con il lavaggio dello strumento con o senza colonna prima dello spegnimento dello stesso 4 6 4 Metodica di lavaggio dello strumento Le metodiche di lavaggio dello strumento in presenza o meno la colonna sono differenti Visto che normalmente la colonna presente la descrizione dei lavaggi partir da queste condizioni In funzione del numero di campioni analizzati si sceglie uno dei lavaggi indicati in Tabella 4 3 Ognuno di questi consta di tre fasi indicate in Tab 4 3 con F1 3 dove vengono flussate a 0 5 mL min e per il tempo indicato tre differenti fasi Mobili La diversit dei metodi di lavaggio corto medio lungo e lunghissimo permette la scelta di quello pi adatto a seconda del tipo e del numero di campioni analizzati Il lavaggio pu essere avviato manualmente o automaticamente nel caso di analisi di campioni eseguiti in batteria inserendolo in coda alla sequenza di analisi Ciascun metodo impostato in modalit gradiente ci significa che il passaggio da una fase mobile all altra avviene sempre in un intervallo di tempo di 10 minuti nel quale le percentuali dei singoli solventi variano molto lentamente sino ad arrivare a quella impostata nel lavaggio Anche il passaggio dalla fase mobile di analisi alla prima di lavaggio avviene median
164. di ca 7 8 ng mL Inoltre analizzando il cromatogramma prima e dopo i picchi d interesse stata notata per quanto concerne l IpuNa la presenza di alcuni picchi tra 2 25 2 50 minuti che non risultano essere identici per forma ed area nelle 15 ripetizioni il DicloNa invece appare con una linea di base priva dei picchi presenti nell altra molecola Pertanto ipotizzabile che i picchi rilevati nel cromatogramma dell IbuNa siano propri di tale sostanza e non attribuibili alla FM In seguito all analisi dei cromatogrammi delle due rette stato preso in considerazione il range 7 81 0 03 ug mL per l lbuNa L1 che pi rispecchiava le concentrazioni attese dai campioni incogniti che provengono dagli esperimenti di veicolazione transdermica Per quanto riguarda il DicloNa invece stata scelta la concentrazione 0 98 ug mL 150 Hplc Lo studio della retta allestita con l aggiunta del DicloNa a ciascuna concentrazione dell IbuNa preparato come descritto precedentemente Par 4 6 6 proseguito attraverso l iniezione di un triplicato analizzato per questioni di tempo in tre giorni differenti Con triplicato ci si riferisce alla preparazione di tre rette distinte campioni relativi ad ognuna delle tre rette sono stati preparati il giorno stesso dell esecuzione delle analisi cromatografiche a partire da soluzioni Madri preparate qualche istante prima delle successive diluizioni seriali Ogni giorno tutto il circuito
165. di lbuNa L1 sinistra e IbuNa L2 destra in WMQ In questa figura sono mostrati gli spettri di nove soluzioni acquose 1 9 nella legenda le cui concentrazioni sono seriali a partire dalla Madre 1 1 mg mL Dalla Figura 4 14 emerge un differente assorbimento dei due lotti di IbuNa nonostante le soluzioni Madri abbiano la stessa concentrazione di partenza 1 mg mL Infatti mentre per l buNa L le prime tre diluizioni risultano essere troppo concentrate da non presentare un picco definito nel caso dell IpuNa L2 il picco inizia a definirsi dalla diluizione 2 Questo potrebbe far ipotizzare che nonostante la pesata sia stata la medesima in realt siano state pesate quantit differenti a causa della presenza di acqua superflua nella polvere Hplc Ibu L1 in PBS 1 Ibu L1 in PBS 2 Ibu L1 in PBS 3 Ibu L1 in PBS 4 Ibu L1 in PBS 5 Ibu L1 in PBS 6 Ibu L1 in PBS 7 Ibu L1 in PBS 8 Ibu L1 in PBS 9 Li 3 N c Q d e v N lt q 200 220 240 260 280 300 320 340 360 Lunghezza d onda nm Figura 4 15 Spettro UV Vis di lbuNa L1 in PBS In questa figura sono mostrati gli spettri di una soluzione 1 Madre 1 mg mL e di otto soluzioni ottenute per diluizione seriale dalla Madre IbuNa L2 TF25 2 125 mg mL IbuNa L2 TF25 0 260 mg mL IbuNa L2 TF25 0 033 mg mL Assorbanza u a 200 220 240 260 280 300 320 340 360 Lunghezza d onda nm Figura 4 16 Spettro UV Vis di IbuNa L2 in TF 25 In questa figura so
166. dia 3 9 0 1 45 0 1 4 1 0 0 274 9 37 0 1 6 9 7 5 7 2 227 2 0 06 n r n r n r n r 3 6 9 7 6 7 2 118 media 690 T6 0 l 2 050 17255 2i 1 n r n r n r n r 2 0 03 n r n r n r n r 3 n r n r n r n r media n r n r NT gar Hplc 183 Tabella 4 37 Dati dei cromatogrammi della retta di DicloNa a 265 nm con 48 ore di stufa DicloNa Conc DicloNa Tempo min ripetizione ug mL iniziale finale T R Area Spalle 1 4 6 5 4 4 9 29 680 2 7 69 4 6 5 4 4 9 31 575 3 4 6 5 4 4 9 30 727 media 4 6 0 0 54 00 4 9 0 0 30 660 7 949 2 1 4 6 5 5 4 9 31 537 2 3 84 4 6 5 4 4 9 30 773 3 4 6 5 3 4 9 31 280 media 4 6 0 0 54 01 4 9 0 0 31 196 7 388 8 1 4 6 5 4 4 9 30 468 2 1 92 4 6 5 5 4 9 30 497 3 4 6 5 4 4 9 30 579 media 4 6 0 0 5 4 0 1 4 9 0 0 30 514 7 57 6 1 4 6 5 5 4 9 30 264 2 0 96 4 6 5 5 4 9 31 105 3 4 6 5 5 4 9 29 467 media 4 6 0 0 5 5 0 0 4 9 0 0 30 278 7 819 1 1 4 7 5 5 5 1 31 997 2 0 48 4 6 5 5 5 1 31 161 3 4 6 5 3 5 1 30 405 media 4 6 Dj 540 1 51 200 31L187 7 796 3 1 4 7 5 5 4 9 31 707 2 0 24 4 6 5 5 4 9 31 861 3 4 6 5 3 4 9 30 885 media 4 6 0 1 54 0 1 4 9 0 0 31 484 3 524 7 1 4 7 5 7 0 2 31 873 2 0 12 4 6 5 5 0 2 32 580 3 4 6 5 3 0 2 31 629 media 46 01 5502 10 2 0 0 32 027 39 493 9 1 9 7 11 1 0 2 31 054 2 0 06 9 6 11 0 0 2 30 862 3 9 6 11 1 0 2 29 738 media 9 6 0 1 LIS 10 2 0 0 30 551 3 710 9 1 9 6 11 0 0 2 31 005 2 0 03 9 6 11 0 0 2 31 58
167. dopo l intervento del tecnico della casa Madre ed un evento che rimasto senza spiegazione Lavaggio iniettore Su consiglio dell assistenza tecnica l autocampionatore iniettore stato lavato con iPrOH al 100 nella bottiglia ad esso dedicata R per una durata di 60 minuti al flusso impostato automaticamente dallo strumento che stato da noi verificato 1 mL min successivamente sono stati effettuati sei lavaggi i e rinse consecutivi prima di procedere con l iniezione del campione Il Manuale dello strumento non consiglia nessun solvente in particolare perch questo dovr essere scelto in funzione dei campioni e della FM utilizzati Lavaggio vial Le vial sono state lavate come descritto nel Paragrafo 4 2 Si precisa che le vial sono state lavate abbondantemente con acqua di fonte e risciacquate 10 volte con WMQ prima di essere lasciate asciugare a testa in gi su carta verde Prima di essere riposte sono state osservate controluce per verificare l assenza di eventuali depositi e lucidate con un panno in microfibra 139 140 Hplc 4 9 3 Separazione cromatografica messa a punto della metodica finale All inizio di questo lavoro stato preso in considerazione l articolo di Brown et al 13 ed alcuni dati preliminari ottenuti precedentemente utilizzando la fase mobile ivi indicata Prima di tutto si proceduto all eliminazione del THF in quanto incompatibile con i tubi in peek che possono rigon
168. e Soluzione di Collagenase la Collagenase conservata in freezer a 20 C stata fatta equilibrare per 30 minuti a temperatura ambiente sopra il bancone del laboratorio Successivamente utilizzando della carta da pesata e una spatola in acciaio sono stati pesati nella bilancia analitica precedentemente calibrata 10 mg di Collagenase La sostanza stata poi trasferita in una bottiglietta da 20 nella quale sono stati aggiunti 3 17 mL di WMQ Per favorire la totale dissoluzione stata effettuata un agitazione manuale di qualche minuto senza capovolgere la bottiglietta La soluzione cos ottenuta sar caratterizzata da 2000 unit mL 14 Preparazione della cute la cute utilizzata nell esperimento di veicolazione transdermica stata ritagliata per poter procedere con la dissoluzione esclusivamente della parte centrale rimasta a contatto con la formulazione La porzione centrale cos ottenuta stata sminuzzata in piccoli pezzi 6 mm aiutandosi con dei bisturi e delle pinzette tagli sono stati eseguiti nel modo pi regolare e simmetrico possibile nel tentativo di ottenere dei pezzi di identica dimensione Soluzione di cute in Collagenase la cute sminuzzata stata adagiata sul fondo di una bottiglietta da 10 utilizzando delle pinzette Sono stati poi aggiunti 0 5 mL di soluzione di Collagenase 2000 unit mL e 4 5 mL di D PBS utilizzando una pipetta in plastica stata favorita la completa miscelazione della
169. e In esso infatti a causa del processo di degradazione dei cormeo desmosomi gli spazi tra i comeociti sono pi ampi permettendo pertanto la penetrazione di sebo e sudore responsabili della disorganizzazione lipidica Inoltre l impaccamento di tipo esagonale si trova anche nei pazienti con patologie della pelle ma in questo caso presente sia nello strato corneo compatto che in quello lasso 3 Nonostante ci l attraversamento dello strato corneo non impossibile e pu avvenire attraverso due vie la via transfollicolare e la via transepidermica La prima via sfrutta gli annessi cutanei mentre la seconda si divide ulteriormente in via transcellulare dove il passaggio avviene attraverso i corneociti e la Matrice lipo proteica ed in via intercellulare dove il passaggio avviene solo attraverso la matrice lipo proteica La via intercellulare si divide ulteriormente nella via intercellulare polare e apolare a seconda che il passaggio avvenga tra le teste polari o le code apolari dei lipidi della matrice come mostrato in Figura 1 2 sebbene la struttura chimico fisica strutturale crea dei gravi impedimenti agli agenti che volessero penetrare e o permeare la cute esistono anche altri fattori che influenzano l assorbimento transcutaneo Questi sono riassunti brevemente qui di seguito Caratteristiche chimico fisiche del farmaco fattori di maggiore influenza sono il coefficiente di diffusione del farmaco nel veicolo il pKa il coeffi
170. e disposte in una scarabattola numerata In ciascuna cuvetta sono stati pipettati 2 ML di WMQ e si annotato il valore fornito dalle tre letture ripetute dal fluorimetro e la posizione della cuvetta nel portacuvette Inoltre con un pennarello si eseguito un segno nella parte alta delle cuvette in Modo che le stesse potessero essere successivamente inserite nello strumento con il medesimo orientamento Si notato infatti che una stessa cuvetta pu fornire quattro diversi bianchi dei quali si scelto quello pi basso Infine le cuvette sono state svuotate e lasciate asciugare a temperatura ambiente ed in posizione capovolta 2 4 2 Cuvette in vetro Le cuvette in vetro sono state inizialmente lavate Par 2 2 fatte asciugare in stufa a 100 C ed infine accuratamente lucidate con un panno in microfibra per eliminare eventuali aloni Quantificazione Proteica_Kit NanoOrange_ formati durante l asciugatura Successivamente sono stati misurati in triplice lettura i bianchi di ciascuna cuvetta ossia i valori di fluorescenza forniti da WMQ Per fare ci sono stati pipettati ca 150 uL di WM in ciascuna cuvetta con una pipetta Pasteur fino al bordo blu della cuvetta Le cuvette essendo molto piccole necessitano di uno specifico supporto che le mantenga in posizione verticale nell alloggiamento dello strumento Il supporto utilizzato in plastica nera molto robusta In ciascuna delle 4 facce si trova una piccola fenditura
171. e e di conseguenza si avr un tempo di uscita anticipato mentre a pH acido la ritenzione aumenta e quindi il farmaco verr rilasciato pi ritardatamente manuale colonna Temperatura in lavori precedenti stato notato l utilizzo del riscaldamento della colonna pari a 40 C 63 61 che nel nostro caso non stato utilizzato per attenerci il pi possibile alle condizioni sperimentali ambientali temp amb Fase mobile in letteratura non sono stati trovati altri lavori che utilizzassero la fase mobile da noi messa a punto Talvolta il tampone fosfato di potassio stato utilizzato in concentrazione 50 MM ma in combinazione con un altro solvente come il Metanolo 61 In altri casi la sua concentrazione dimezzata 25 mM stata utilizzata con acetonitrile in rapporto 50 50 v v ma con un pH acido pH 2 X Yuan Flusso e Assorbanza lavori presenti in letteratura mostrano che il flusso da noi utilizzato risulta essere intermedio a quello scelto da altri autori che oscilla tra 0 8 mL min 64 e 1 5 mL min 63 La lunghezza d onda utilizzata nella nostra metodica 265 nm stata scelta in seguito ad un analisi spettrofotometrica attraverso la quale stato stimato il Massimo punto di assorbimento della sostanza In precedenza la messa a punto del metodo era partita da 254 nm lunghezza d onda utilizzata in esperimenti precedenti Pertanto alla luce dei risultati ottenuti dai nostri studi non del tutto comprensibile co
172. e nota bibliografica 39 per lbu forma acida e 40 per DicloNa Calcolato con il software ChemDraw Ultra 6 0 Figura 4 5 Confronto della struttura chimica e dei parametri chimico fisici delle Molecole IbuNa lotto 1 e 2 e DicloNa Le concentrazioni relative alle solubilit sono indicate come range in cui il primo valore in nero l ultima concentrazione solubile mentre il secondo valore in rosso la concentrazione alla quale si ha la precipitazione 106 Hplc 4 8 1 Ibuprofene sale sodico La maggior parte delle caratterizzazioni si concentrata sulla molecola louNa perch i due lotti hanno mostrato delle differenze 4 8 1 1 Aspetto e odore Entrambi i lotti appaiono come una polvere bianca Tuttavia il primo lotto nel tempo ha manifestato un odore acre quasi sgradevole e la polvere ha formato dei grumi molto grossi Fig 4 6 sinistra Nel caso del lotto 2 la polvere presenta solo dei piccoli grumi ed ha un odore particolare ma non sgradevole Fig 4 6 destra riportato in letteratura che la forma acida ha in effetti un odore particolare 39 Analisi successive sono state fatte per confermare la presenza della forma acida vedi oltre Sebbene i due lotti contenevano una certa quantit di acqua gi in origine vedi tabella in Fig 4 5 si ipotizza anche in base ad alcuni risultati ottenuti in analisi discusse in seguito che il primo lotto abbia aumentato il suo contenuto di acqua nel tempo Pertanto si pu c
173. e si cercher di dare al lettore un testo chiaro nelle sue Motivazioni e conclusioni 4 7 1 Caratterizzazione delle soluzioni Partendo dal presupposto che quanto pubblicato in letteratura fosse riproducibile queste analisi si resero necessarie per capire quale fosse l elemento disturbante quando si sono avuti diversi problemi con HPLC 4 7 1 1 Acqua Milli Q Inizialmente non ci siamo preoccupati che l acqua prodotta in laboratorio potesse creare qualche problema in quanto lo strumento era nuovo quanto l HPLC ed era stato proprio comprato con delle caratteristiche che dovevano assicurare la produzione di WMQ anche adatta per le colture cellulari ed avente le seguenti caratteristiche resistivit a 25 C 18 2 MOhm emi conducibilit a 25 C 0 055 uS cm TOC 1 5 ppb batteri lt 1CFU mL endotossine 0 001 EU mL Tuttavia un commento di un tecnico ci fece dubitare della sua qualit e decidemmo di fare alcune analisi Si evidenzia che a parte le analisi descritte nei prossimi sotto paragrafi abbiamo anche lasciato evaporare durante la notte le due acque su dei grandi vetrini da orologio 15 cm per ritrovare praticamente niente la mattina seguente Anche guardando in controluce i vetrini non stato possibile notare la presenza di depositi questo il motivo per cui non si riportano delle fotografie Pertanto l acqua prodotta in laboratorio WMG stata confrontata con un acqua che viene venduta appositamente per le separazi
174. ebbero impaccaria e compromettere l analisi Tuttavia i solventi organici le loro miscele il TF 50 ed il TF 25 sono stati filtrati sotto vuoto rispettivamente con filtri in microfibra di vetro in nylon o in acetato di cellulosa Come precedentemente indicato la prima porzione di filtrato stata usata per avvinare le bottiglie di raccolta ed stata scartata solventi loro miscele ed i tamponi sono stati filtrati direttamente nelle bottiglie collegate alle porte dello strumento vedi oltre Fig 4 2 Hplc 4 4 6 Fase mobile Con il termine fase mobile FM si intende quella miscela di solventi usata per la separazione cromatografica delle sostanze oggetto del nostro studio Nel nostro caso la metodica di separazione ha subito alcune modifiche e pertanto le fasi mobili utilizzate sono state ben diciassette Tab 4 1 Nella maggior parte dei casi la miscelazione delle sostanze che compongono la fase mobile stata effettuata automaticamente dallo strumento e dunque la fase mobile si creata materialmente nella camera di miscelazione dello strumento Pertanto l operatore ha dovuto solo riempire le bottiglie con i solventi filtrati Non stato nemmeno necessario degasare i solventi in quanto lo strumento procede autonomamente anche relativamente a questo punto Tuttavia fanno eccezione a quanto descritto qui sopra e solo relativamente al miscelamento la FM 1 e la FM 17 dove ACN e THF 7 3 v v e TF 25 e ACN sono sta
175. ecole Inoltre considerando la metodica utilizzata nell articolo di riferimento stato tentato di discostarsi il meno possibile Pertanto la scelta ricaduta sulla FM 17 la quale presenta come unica differenza dalla metodica di Brown et al l assenza del THF e la concentrazione inferiore del TF 4 9 4 Retta di calibrazione Dopo aver stabilito quale fosse la fase Mobile maggiormente indicata per la separazione dei due farmaci si proceduto con l allestimento della retta di calibrazione necessaria per la quantificazione della sostanza nei futuri campioni a concentrazione incognita provenienti dagli esperimenti di veicolazione transdermica Lo studio iniziato con l iniezione di 15 diluizioni seriali n 1 delle Madri 1 mg mL di IbuNa L1 e DicloNa iniettate separatamente dala pi concentrata alla meno concentrata in sequenza continua prima tutti i campioni dell IpbuNa L1 e poi quelli del DicloNa risultati sono mostrati in Tabella 4 19 dove possiamo notare quanto segue Hplc 149 l i tempi di ritenzione dell IbuNa L sono compresi nell intervallo 7 88 8 04 minuti all intero dele 15 corse e sono ritardati rispetto a quelli osservati precedentemente utilizzando la FM 2 Tab 4 17 TR medio 7 04 min 2 Le aree dei 15 campioni di lbuNa L mantengono un rapporto di 1 95 2 0 tra campioni successivi che segue bene la diluizione seriale fino al campione a concentrazione 0 98 ug mL Rispetto all area del campione a conc
176. egistrati Hplc 4 5 1 6 Spettroscopia NMR Per gli stessi lotti di IbuNa analizzati con la spettroscopia IR stata effettuata anche un analisi spettroscopica NMR al protone campioni in questo caso sono stati disciolti in acqua deuterata e posti all interno di appositi tubicini di vetro tipici per questo tipo di analisi Il tutto stato inserito nel relativo alloggiamento all interno dello strumento Questa tecnica spettroscopica l unica che permette di determinare la struttura esatta della molecola attraverso l interpretazione dello spettro Lo spettro riporta in ascissa la varia zione del campo magnetico ed in ordinata l entit dell energia assorbita 26 Anche queste analisi sono state effettuate per studiare la composizione chimica dei diversi lotti e confrontare tra loro gli spettri ottenuti evidenziandone eventualmente le differenze 4 5 2 Diclofenac sale sodico La seconda sostanza presa in considerazione in questo studio il sale sodico del diclofenac DicloNa Come verr indicato pi avanti il DicloNa stato utilizzato nelle separazioni in HPLC come Standard interno vedi oltre Questa sostanza stata conservata sempre nel contenitore originale come prescritto dalla ditta produttrice Essa ha subito alcune delle caratterizzazioni precedentemente descritte per l InuNa Per il DicloNa si sono misurati i pH delle soluzioni in WMQ TF 50 PBS e in FM 2 in tutti i casi alle concentrazioni di 1 mg mL Inoltre
177. egradata per essere sicuri dell efficacia del Metodo Inoltre sarebbe opportuno eseguire delle ulteriori analisi per determinare esattamente cosa rappresenti il picco anomalo riscontrato nella fase cloroformica che non sembra assomiliare ad un vero e proprio picco corrispondente all buNa miscela organica In letteratura sono stati trovati infatti dei lavori nei quali al cloroformio Infine potrebbe essere produttivo effettuare delle prove modificando la viene preferito il diclorometano in quanto considerato un solvente meno pericoloso con meno restrizioni e svantaggi per il suo utilizzo indipendentemente dal tipo di campione da analizzare 24 In altri casi invece la miscela organica utilizzata risulta essere composta da esano ed isopropanolo 25 Concludendo possibile affermare che la Metodica proposta potrebbe realmente mostrarsi efficace per l eliminazione delle proteine e dei lipidi dai campioni d interesse Hplc Hplc 4 1 Introduzione Un ulteriore obiettivo preposto in questa tesi stato quello di individuare e validare una metodica di separazione cromatografica adatta ai campioni ottenuti dall esperimento di veicolazione transdermica considerando un trattamento minimo del campione In questo capitolo vengono elencati i materiali e gli strumenti utilizzati per la Messa a punto del metodo di separazione cromatografica Vengono anche descritte le metodiche e le Modalit di allestimento degli esperimenti condotti
178. ei picchi del DicloNa nei vari cromatogrammi n 9 x 3 non mostrati presenta una simmetria iL Esperimento 1 Curva di calibrazione n 2 stufa 24 ore 254 nm dati mostrati in Tabella 4 29 indicano che l i tempi di ritenzione del lbuNa L2 risultano essere tutti a 7 2 minuti Inoltre rispetto ai dati mostrati in Tabella 4 17 si pu osservare che risultano essere ritardati ca di 2 secondi i e 7 04 min mentre mostrano un anticipo temporale ed una maggior precisione nei confronti dei tempi individuati nella Tabella 4 20 7 88 8 04 min e della Tabella 4 21 7 90 8 06 min Le aree dei 9 campioni di lbuNa L12 mantengono un rapporto che varia nell intervallo 1 7 2 0 sino alla concentrazione 0 24 ug mL Nelle tre repliche successive si osservato che nelle basse concentrazioni in alcuni casi non stato possibile integrare i picchi perch di difficile individuazione Questi valori sono indicati in Tabella 4 24 con la sigla n r Rispetto all area del campione a concentrazione 1 000 ug mL Tab 4 17 Hplc ed a quello a concentrazione 500 ug mL Tab 4 20 i campioni a concentrazione 7 69 ug mL risultano essere pi alti i e 9 616 u a rispetto all area teorica di 8 500 unit arbitrarie calcolata per proporzionalit dalla Tab 4 20 che dovrebbero avere La forma dei picchi del IbuNa L2 nei vari cromatogrammi n 9 x 3 non mostrati presenta una simmetria 1 Gli intervalli di concentrazione in cui st
179. elle concentrazioni pi alte addirittura vicine al doppio del valore di riferimento Il giorno seguente invece le concentrazioni quantificate sono state pi simili tra loro e vicine al valore atteso Gli esperimenti sono proseguiti testando anche altri volumi di campione 70 e 80 uL i quali sono stati testati in due serie ciascuna delle quali costituita da una 3 campioni dello stesso volume per verificare anche la ripetibilit delle analisi Nella prima serie stata utilizzata la ABSL2 mentre nella seconda la ABS campioni sono stati sempre preparati nello stesso identico modo dell esperimento precedente anche per quanto riguarda l analisi e l elaborazione dei dati stato variato semplicemente il volume del campione incognito Nella Tabella 2 16 sono presenti i dati relativi alla composizione del campione in volume di ABS2 e WS ed inoltre vengono elencati anche i dati sperimentali ottenuti Quantificazione proteica_Kit NanoOrange_ dall analisi fluorimetrica della WMQ W del campione C del campione privato del suo bianco CN ed infine del campione normalizzato rispetto alla WS del kit CF anche possibile vedere le concentrazioni di ABS2 teoriche e quelle quantificate col kit Le concentrazioni quantificate sono risultate molto diverse tra loro La perplessit nasce dal fatto che i campioni sono apparsi differenti sia all interno del triplicato per entrambi i volumi e sia nelle due serie messe a confronto Tabel
180. ensit non superiore ai 400 mV Fig 4 27 A D Inoltre tra i 5 ed i 20 minuti la linea di base pu considerarsi praticamente pulita Fig 4 27 B D ACN puro ACN WMQ 80 20 Intensita mV Intensita mV 10 15 Tempo minuti MeOH WMQ 80 20 ACN TF25 27 73 Intensita mV Intensita mV 10 Tempo minuti Figura 4 27 Cromatogramma di A ACN puro B ACN WMQ 80 20 v v C MeOH WMQ 80 20 v v e D ACN TF 25 27 73 v v Condizioni 20 uL di solvente iniettato in colonna accessoriata con pre colonna a 254 nm 1 0 mL min con la fase mobile identica al solvente in questione tranne nel caso A nel quale la fase mobile stata ACN WMQ 80 20 v v Inoltre nel caso dell ACN puro Fig 4 27 A possibile notare la presenza di un picco con un tempo di ritenzione di ca 15 minuti che scompare quando questo solvente miscelato al 20 con l WMQ Fig 4 27 B o al 27 con il TF 25 Fig 4 27 D Tuttavia con il procedere delle analisi si pu osservare come la forma e l intensit dei picchi nei primi 2 5 minuti siano differenti Fig 4 28 A D vs Fig 4 28 A D In questo caso 135 136 Hplc infatti sono presenti uno o due picchi la cui intensit varia tra i 6 000 ed i 115 000 mV Inoltre come si pu vedere nei vari inserti della Figura 4 28 i quattro croma togrammi appaiono puliti dopo i 5 minuti anche quello dell ACN puro Fig 4 28 A vs Fig 4 28 A rimasta
181. entit della deproteinizzazione attraverso un analisi spettrofotometrica La Figura 3 6 rappresenta il confronto tra il metodo Fig 3 6 A ed il metodo Il Fig 3 6 B ed inoltre ciascun metodo stato messo a confronto con la cute precipitata off line ma non filtrata con le Spe Tale confronto stato voluto per mettere in evidenza l effetto dell interazione tra la matrice delle cartucce e la soluzione precipitante Dagli spettri rappresentati nella Figura 3 6 A osservabile l apparente efficacia della filtrazione Spe che sfrutta il metodo I notando un andamento spettrale molto pi pulito e minori interferenze rispetto al grafico della cute non filtrata SPE ACN SPE MEOH cure acn CUTE MEOH d 5 z g N N e bA 2 s e D N n N 4 lt 200 400 600 800 200 400 600 800 1000 1200 Lunghezza d onda nm Lunghezza d onda nm Fig 3 6 Cute umana non filtrata messa a confronto con filtrata con Metodo A e Metodo II B Degradazione e Deproteinizzazione della cute risultati ottenuti invece con il metodo Il mostrano una non spiccata pulizia dello spettro del campione filtrato rispetto a quello non filtrato in quanto visibile un picco consistente a ca 400 nm ed anche la parte alta dello spettro appare molto pi sporca L esperimento stato ripetuto il giorno successivo eseguendo una centrifuga aggiuntiva per verificare se venisse ottenuta una Maggiore pulizia dello spettro La prova
182. ento per ragioni strettamente correlate alla stabilit fisica delle soluzioni stata esclusa 4 8 Caratterizzazione delle molecole Modello Le due molecole utilizzate in questo studio sono l ibuprofene sale sodico lbuNa ed il diclofenac sale sodico DicloNa Sebbene entrambe appartengano alla classe dei farmaci antinfiammatori non steroidei FANS la prima lbuNa rappresenta la vera molecola modello che sar utilizzata negli studi futuri mentre il DicloNa stato usato come standard interno SI per la metodica di separazione in HPLC vedi oltre O O H3C o CI oF H N CI HgC CH3 IbuNa DicloNa Molecola Propriet chimico fisiche IbuNa L1 IbuNa L2 DicloNa Peso molecolare Da 228 26 228 26 318 13 Punto di fusione C 199 6 199 8 199 6 199 8 Punto di fusione sperimentale CC 193 67 195 195 33 197 33 Purezza confezione comprata gt 98 100 gt 98 99 5 gt 98 99 Contenuto in acqua 14 lt 15 13 2 Solubilit in acqua mg mL 100 100 50 50 Solubilit in etanolo mg mL 50 50 50 50 CLogp 0 161 0 161 0 8862 pKa forma acida tt 4 5 0 5 2 4 5 0 5 2 4 Dati forniti dalla Sigma Aldrich vedi ref 36 37 per lbuNa e 38 per DicloNa Dati forniti dalla Sigma Aldrich nei certificati di analisi dei vari lotti vedi ref 36 per lbuNa L1 37 per lbuNa L2 e 38 per DicloNa 41 e 42 tt Dati derivanti dalla seguent
183. entrazione 1 000 ug mL Tab 4 17 e quello a concentrazione 500 ug mL Tab 4 20 risulta essere 0 51 volte pi piccolo 1 96 rapporti precedenti 3i tempi di ritenzione del DicloNa sono compresi nell intervallo 10 46 11 39 all intemo delle 15 corse e sono posticipati rispetto a quelli osservati precedentemente sempre per la FM 2 Tab 4 17 TR medio 9 90 min 4 Le aree dei 15 campioni del DicloNa mantengono un rapporto costante 1 98 che segue la diluizione Rispetto all area del campione a concentrazione 1 000 ug mL Tab 4 17 ed a quello a concentrazione 500 ug mL Tab 4 20 risulta essere 2 05 in entrambi i casi la forma del picco dei due farmaci ha sempre avuto una simmetria gt 1 60 come precedentemente osservato 5 Gli intervalli di concentrazione in cui stato possibile quantificare senza problemi l IpuNa L1 ed il DicloNa sono rispettivamente 500 0 12 e 500 0 49 ug mL Tuttavia dalla 23 iniezione DicloNa 3 91 ug mL si potuto osser vare che la forma e l intensit di tutti i picchi presenti nel cromatogramma si stava modificando Per questo motivo laddove ci siano delle incertezze i valori ricavati sono indicati in corsivo per entrambi i farmaci in Tabella 4 19 Pertanto nelle condizioni di queste analisi il limite di rivelamento uguale a 0 24 ug mL ed inferiore a 0 98 ug mL rispettivamente per l IbuNa L1 ed il DicloNa Ragionando sulle aree del DicloNa si potrebbe arrivare ad un limite di rilevamento
184. enza problemi l IbuNa L2 sono 7 69 0 12 ug mL Concentrazioni pi piccole non sarebbero quantificabili con precisione Pertanto nelle condizioni di questa analisi si pu affermare che il limite di rivelamento di ca 0 12 ug mL Continuando con l analisi dei dati in Tabella 4 32 si pu riassumere che l i tempi di ritenzione del DicloNa risultano essere tutti identici a 10 9 minuti Rispetto ai dati mostrati in Tabella 4 17 e 4 20 si pu osservare che queste ultime analisi risultano avere dei tempi anticipati i e 9 90 min mentre risultano essere identici ai tempi tabulati in Tabella 4 27 Le aree dei 9 campioni del DicloNa nelle diverse repliche oscillano in un intervallo compreso tra 29 126 e 33 403 unit arbitrarie In questo caso possibile effettuare un confronto esclusivamente con la retta di controllo analizzata alla stessa lunghezza d onda con la quale le aree risultano essere molto simili 28 073 31 611 u a La forma dei picchi del DicloNa nei vari cromatogrammi n 9 x 3 non mostrati presenta una simmetria 1 Esperimento 1 Curva di calibrazione n 3 stufa 48 ore 254 nm dati mostrati in Tabella 4 34 indicano che l i tempi di ritenzione dell IbuNa L2 risultano essere a 7 3 minuti per le concentrazioni 0 03 0 6 ug mL Rispetto ai dati mostrati in Tabella 4 17 si pu osservare che risultano essere ritardati ca di 3 secondi 7 04 min mentre risultano essere maggiormente costanti ed
185. er i casi delle Figure 4 25 A e C Tra la fine della fase acetonitrilica e la pressione finale registrata nella fase metanolica non si nota un abbassamento della pressione ma un aumento dei bar rispettivamente di 18 e 13 pressione finale di 85 e 107 bar rispettivamente per i casi A e C L aumento della pressione da attribuirsi alla diversa fase mobile infatti il metanolo crea una maggior pressione in colonna Nonostante intercorrano 22 bar di differenza in questa fase la pressione finale rilevata risultata essere la stessa tenendo anche conto dei bar iniziali differenti Questo mette in evidenza l efficacia del lavaggio Se invece prendiamo in considerazione i lavaggi medi Fig 4 25 B e D possibile osservare una differente pressione iniziale che risulta essere pi elevata di 6 bar nella condizione P C 138 bar e 132 bar nel caso B e D rispettivamente Questa differenza viene ridotta ad 1 bar alla fine della fase acetonitrilica 71 e 72 bar nel caso B e D rispettivamente La successiva fase metanolica mostra un incremento pressorio dato dalla differente viscosit del solvente con la fase 133 134 Hplc La pressione iniziale e finale in questa fase sono state 77 e 81 bar per il caso Be 73 e 77 bar per il caso D possibile notare che in queste condizioni l incremento nel corso dei 200 minuti in entrambi i casi di 4 bar successivamente avviene il crollo pressorio caratterizzante il passaggio alla fase di AC
186. ermeation enhancement of ibuprofen Journal of Controlled Release 100 2004 199 209 P R Battu and MS Reddy RP HPLC Method for Simultaneous Estimation of Paracetamol and Ibuprofen in Tablets Asian J Research Chem 2 1 Jan March 2009 X Yuan A C Capomacchia Influence of Physicochemical Properties on theln Vitro Skin Permeation of the Enantiomers Racemate and Eutectics of Ibuprofen for Enhanced Transdermal Drug Delivery Wiley Online Library wileyonlinelibrary com DOI 10 1002 jps 23548 A D as and O Hamdaoui Removal of non steroidal anti inflammatory drugs ibuprofen and ketoprofen from water by emulsion liquid Membrane Environ Sci Pollut Res DOI 10 1007 s11356 013 2140 9 205
187. esperimenti sono proseguiti allestendo un triplicato di una curva di calibrazione utilizzando esclusivamente il kit seminuovo e tre diverse soluzioni madri una per ciascuna replica preparata al momento dell allestimento cos come anche la WS Tabella 2 10 Risultati delle curve di calibrazione di 2 ML di campione Campione Albumina w C CN CF i 1 2 1 2 1 2 1 2 1 0 0 147 4 127 8 1267 148 3 207 20 4 0 0 2 10 0 1829 1658 461 2 663 2 278 3 497 3 2990 4769 3 8 0 147 3 1753 386 7 567 7 239 4 392 5 260 1 372 0 4 6 0 128 5 166 7 330 8 469 4 202 3 302 7 223 0 282 3 5 4 0 134 7 127 9 282 3 339 2 147 6 211 3 168 3 190 8 6 3 0 138 8 174 5 244 9 336 9 106 1 1625 126 8 142 0 7 2 0 206 7 133 0 243 0 2515 36 3 1186 570 98 8 1 0 125 7 158 2 140 3 220 4 146 621 35 3 41 7 9 0 8 145 1 201 3 1490 2387 39 37 4 246 170 10 0 6 137 2 2314 140 5 278 1 3 3 46 7 240 262 11 0 3 155 0 238 3 145 5 2721 95 338 11 2 134 12 0 1 121 1 184 0 116 1 222 7 49 38 7 15 8 18 3 La Tabella 2 11 mostra i dati delle tre curve analizzate 1 2 3 comprendendo i valori di fluorescenza dei bianchi W dei campioni C dei campioni normalizzati rispetto alla WMQ CN ed infine dei campioni normalizzati rispetto al kit CF Quantificazione proteica_Kit NanoOrange_ L elaborazione finale dei dati CF mette in evidenza una crescente ripetibilit analizzata nel particolare attraverso la rappresentazione grafica nella quale stata effettuata una sovrapposiz
188. essere sicuri delle conclusioni si voluto riportare i dati delle assorbanze alle concentrazioni minime e massime in Tabella 4 13 Tabella 4 13 Confronto delle assorbanze delle curve di calibrazione 1 e 2 n ARSA x Conc min Conc max ABS u a nm ug mL ug mL Conc min Conc max 1 lineare 255 66 406 2 125 0 078 8 33x10 2 363 0 058 2 lineare 255 33 203 2 125 0 038 17 0x10 2 284 0 024 polinomiale 265 66 406 2 125 0 110 4 11x10 2 876 0 049 2 polinomiale 265 33 203 2 125 0 056 18 0x10 2 977 0 197 Si pu pertanto concludere che dai valori di assorbimento non si riscontrano grandi differenze tra i due lotti e che questi valori sono anche in linea con quelli presenti in Tabella 4 11 Inoltre il limite di rivelabilit pu essere identificato nei 33 ug mL In un secondo esperimento si voluto comprovare quanto precedentemente osservato Pertanto si utilizzato il secondo lotto dell buNa e questa volta si sono controllati i tempi di permanenza a 100 C risultati sono mostrati in Figura 4 21 121 122 Hplc m ibuNaL2 0ore 100 C ci m lbuNa L2 0 ore 100 C IbuNa L2 24 ore 100 C IbuNa L2 24 ore 100 C A IbuNa L2 48 ore 100 C A IbuNa L2 48 ore 100 C Assorbanza a 265 nm u a CI 3 E a wo A Lei I A n lt 500 1000 1500 2000 2500 500 1000 1500 2000 Concentrazione IbuNa L2 g mL Concentrazione IbuNa L2 g mL Figura 4 21 Curve di calibrazione 3
189. etto a quello sodico presente nell articolo di Brown et al Gli studi di Schellinger et al si sono limitati all utilizzo di tamponi di sali inorganici in quanto meno solubili dei sali organici nei classici co solventi e g MeOH ACN Gli studi si sono focalizzati sull acetato di ammonio sul fosfato d ammonio e sul fosfato di potassio la cui solubilit decresce nell ordine in cui sono stati citati sali sodici non sono stati presi in considerazione a causa della loro bassa solubilit nei solventi organici Pertanto questi autori hanno preso il fosfato di potassio come riferimento 58 Negli esperimenti portati avanti da Schellinger et al sono stati calcolati il limite di solubilit ed il volume della frazione del co solvente organico B solvente organico in Tab 4 16 della soluzione finale nel punto di precipitazione conoscendo il volume e la concentrazione del tampone e la miscela organico acquosa I dati ottenuti e rappresentati nella Tabella 4 16 sotto sono stati ottenuti dalla preparazione di soluzioni preparate con tutti i tamponi in esame a concentrazioni 5 e 50 MM Hplc Tabella 4 16 Dati relativi agli esperimenti di solubilit del tampone in fosfato di potassio a pH 7 Solubilit del tampone fosfato MM SON MeOH ACN THF organico 0 gt 50 gt 50 gt 50 10 gt 50 gt 50 gt 50 20 gt 50 gt 50 gt 50 30 gt 50 gt 50 gt 50 40 gt 50 gt 50 50 50 gt 50 gt 50 25 60 gt 50 45 15 70 35 20 10 80 15
190. ffettuati hanno portato alla stima di un incremento del ca 20 ottenuto nell arco delle 48 ore che risulta essere molto simile ad entrambe le lunghezze d onda La percentuale non appare la medesima nell esperimento 2 nella quale si abbassa sino al 3 4 Per l esperimento 1 caratterizzato dall analisi intermedia a 24 ore stato possibile anche verificare l aumento percentuale nei diversi step 0 24 h vs 24 48 h vs 0 48 ore Tale analisi ha appurato che si verifica un aumento del 15 17 nelle prime 24 ore il quale viene incrementato del 3 5 tra le 24 48 ore Perci la percentuale che possibile quantificare nell intervallo O 48 ore risulta essere ca il 20 Quindi possibile concludere che per l esperimento 1 stato ottenuto un incremento del 20 nell arco delle 48 ore ad entrambe le lunghezze d onda Inoltre analizzando i tre step temporali possibile specificare che ca 185 dell incremento avviene nelle prime 24 ore La validit dei calcoli stata verificata anche sulla concentrazione 3 84 ug mL mostrando gli stessi risultati L analisi percentuale dell esperimento 2 invece mostra un incremento molto pi basso del 3 5 Infine non possibile concludere mettendo in evidenza la sicura efficacia della conservazione del farmaco sottovuoto in quanto non possibile effettuare un confronto percentuale tra i rapporti IbuNa L2 DicloNa data la differente quantificazione dello standard interno nell es
191. fiarsi deformarsi ad una temperatura superiore ai 20 C 57 Sebbene il THF sia sempre stato miscelato con ACN e quindi non passato puro nei tubicini neanche per un breve tragitto tecnici e fornitori non sono stati in grado di dirci quale sia la percentuale di THF in una miscela che possa essere sopportata dal peek Pertanto abbiamo deciso di eliminarlo dalla composizione della fase mobile In secondo luogo ci siamo soffermati sul tampone fosfato per due motivi i il tampone da noi utilizzato costituito da sali di fosfato di potassio Monobasico e di fosfato di potassio dibasico Par 4 2 a differenza di quello di sodio usato da Brown et al 13 Inoltre ii si presa in esame la solubilit del tampone fosfato nei solventi organici Nonostante la scarsit di riferimenti bibliografici relativi alla solubilit del tampone fosfato nelle miscele idro organiche stato trovato uno studio interessante di Schellinger et al dove viene riportato il comportamento di alcuni tamponi fosfato 58 Questi autori hanno dimostrato che la solubilit del tampone segue lo stesso andamento della solubilit in acqua dei suoi cationi NH gt K gt Na 58 Tuttavia la solubilit influenzata anche dalla concentrazione del tampone dal solvente organico con cui il tampone miscelato e dal pH della soluzione finale 58 Pertanto stato possibile giustificare una maggior solubilit del tampone fosfato di potassio da noi utilizzato risp
192. g mL Continuando con l analisi dei dati in Tabella 4 47 si pu riassumere che l i tempi di ritenzione del DicloNa risultano essere compresi tra 10 0 e 10 5 minuti per tutte le concentrazioni ad eccezione della 0 03 ug mL i e 9 6 e 9 7 min Rispetto ai dati mostrati in Tabella 4 17 e 4 20 si pu osservare che queste ultime analisi risultano avere dei tempi anticipati 9 90 min Le aree dei 9 campioni del DicloNa nelle diverse repliche oscillano in un intervallo compreso tra 30 207 e 37 912 unit arbitrarie In questo caso possibile effettuare 167 168 Hplc un confronto esclusivamente con la retta analizzata nell esperimento 1 dopo 48 ore ed a 265 nm Tab 4 37 con la quale le aree risultano essere aumentate 29 467 32 580 vs 30 207 37 912 ua La forma dei picchi del DicloNa nei vari cromatogrammi n 9 x 3 non mostrati presenta una simmetria 1 Analizzando l esperimento 2 nella sua totalit a due diversi tempi di permanenza in stufa 0 e 48 ore attraverso l utilizzo della fase Mobile FM 17 premiscelata dallo strumento stesso stato possibile notare poca differenza nei risultati In modo particolare mettendo a confronto i tempi di ritenzione ottenuti nelle rette di controllo Tab 4 39 4 42 non stata notata alcuna variazione temporale sia per l IbuNa L2 che per il DicloNa stata riscontrata qualche piccola differenza rispetto alle rette trattate termicamente per 48 ore Tab 4 44
193. ghezza d onda nm Fig 3 9 Cute umana precipitata off line e filtrata in spe secondo il Metodo A e il metodo Il B I campioni cos trattati sono stati analizzati col kit NanoOrange di quantificazione proteica per valutare quale dei due metodi eliminasse pi proteine e per verificare l effettiva diminuzione proteica con l esecuzione della seconda centrifuga Sono stati utilizzati 0 1 ML di campione i quali sono stati analizzati come descritto nel Capitolo 2 La Tabella 3 6 mostra la quantificazione proteica calcolata nei 100 uL utilizzati per l analisi Kit e nel volume totale di campione avente a disposizione Campione Nell ultima colonna a destra invece stata calcolata la percentuale proteica eliminata Degradazione e Deproteinizzazione della cute rispetto al 100 che in questo caso rappresentato dalla cute non filtrata in cartuccia cute I cute Il 1C e 2C Dai risultati illustrati nella Tabella 3 6 possibile innanzitutto affermare che il Metodo mostra una maggior capacit deproteinizzante dimostrando una diminuzione proteica dell 82 rispetto al 78 del metodo ll Se si considera l efficacia della centrifuga aggiuntiva apprezzabile che il risultato evidenzi un ulteriore deproteinizzazione solo del 4 nel metodo In questo risultato apparentemente positivo per non sono da sottovalutare gli eventuali aspetti negativi che potrebbero insorgere riguardo al recupero del campione ed alla perdita di farmaco i
194. gura 3 22 A presente la fase metanolica dei campioni mentre nela 3 22 B quella cloroformica Degradazione e Deproteinizzazione della cute MeOH Collagenase WMQ CHCI3 Collagenase WMQ MeOH Ibu Na WMQ CHCI3 Ibu Na WMQ MeOH WMQ CHCI3 WMQ Assorbanza u a Assorbanza u a 600 800 1000 1200 200 400 600 800 1000 1200 Lunghezza d onda nm Lunghezza d onda nm Figura 3 22 Spettr tal quali della fase metanolica A e della fase cloro formica B Da un primo colpo d occhio si nota un unico picco nella regione di interesse esclusivamente nella fase metanolica del campione n 1 come erano le nostre previsioni Per un analisi ancora pi precisa ed approfondita stata eseguita un operazione di azzeramento degli spettri decidendo di far partire entrambi gli spettri dai 350 nm La Figura 3 23 A mostra l azzeramento della fase Metanolica e la 3 23 B della fase cloroformica MeOH Collagenase WMQ MeOH Ibu Na WMQ CHCI3 Collagenase WMQ MeOH WMQ CHCI3 Ibu Na WMQ cHels wma gt Assorbanza u a d k N c p a 2 o v pA lt q 250 250 300 Lunghezza d onda nm Lunghezza d onda nm Figura 3 23 Spettri azzerati della fase metanolica A e della fase cloro formica B Gli spettri cos elaborati confermano la presenza del farmaco nella fase metanolica Fig 3 23 A nonostante il picco appai
195. he comportano delle variazioni nello spessore e nella composizione lipidica della cute stessa 9 Natura del veicolo e formulazione Di notevole importanza sono la viscosit del veicolo in quanto al suo diminuire aumenta la velocit di diffusione del farmaco l occlusivit della formulazione che aumentando permette una maggiore idratazione ed infine la presenza di sostanze che ritardano o aumentano la penetrazione come solventi tensioattivi ed altre 9 Dalla descrizione dello strato corneo e di quelli che sono i fattori che influenzano la veicolazione transdermica si evince pertanto che i farmaci di natura idrofila con un basso coefficiente di ripartizione e di diffusione difficilmente riescono a penetrare nella cute e necessitano per questo di un ausilio Nel progetto del quale fa parte questa tesi il farmaco preso in esame l ibuprofene sale sodico che chimicamente il sale di un acido carbossilico e che possiede una natura idrofila a causa del suo basso peso molecolare Come dimostrato in letteratura la forma sale sodica caratterizzata da un maggior assorbimento ma anche da una maggiore facilit di discioglimento in un mezzo acquoso Infine l buprofene sodico presenta un punto di fusione molto pi alto rispetto alla forma acida 220 vs 74 77 C ed un azione molto pi rapida ed efficace nel sollievo dal dolore 10 L buprofene sodico assieme al Diclofenac sodico risultano essere i FANS pi comunemente prescritti e po
196. i si nota che le pressioni sono le pi alte e che la CG responsabile di un aumento di ca 5 n d 10 e 20 bar rispettivamente negli ultimi quattro casi Questi rialzi sono molto simili a quelli causati dalla CG alle pressioni della union dove per gli stessi casi si avevano rialzi di ca 4 9 9 e 19 bar Pertanto nel caso non determinato i e n d si dovrebbero avere circa 73 bar Come nota conclusiva si riporta che la condizione pi monitorata stata proprio quest ultima e con fase mobile acetonitrilica entrambi i flussi in quanto lo si fatto ogni volta che si acceso lo strumento Valori pressori di 40 e 70 bar osservati rispettivamente con dei flussi di 0 5 e 1 mL min sono stati considerati ottimali 127 128 Hplc Tabella 4 15 Parametri pressori basali dello strumento in varie condizioni Fase mobile Condizione Pressione bar Composizione Concentrazione v v Flusso mL min U ACN WMQ 80 20 0 5 10 U WMQ 100 0 5 12 U eOH WMQ 80 20 0 5 14 U ACN WMQ 80 20 1 0 13 U WMQ 100 1 0 17 U eOH WMQ 80 20 1 0 20 P U ACN WMQ 80 20 0 5 11 P U leOH WMQ 80 20 0 5 14 P U ACN WMQ 80 20 14 P U leOH WMQ 80 20 20 CG U ACN WMQ 80 20 0 5 15 CG U eOH WMQ 80 20 0 5 23 CG U ACN WMQ 80 20 22 CG U eOH WMQ 80 20 39 P CG U ACN WMQ 80 20 0 5 15 P CG U leOH WMQ 80 20 0 5 23 P CG U ACN WMQ 80 20 22 P CG U leOH WMQ 80 20 39 C ACN WMQ 80 20 0 5 33 34 C ACN WMQ 80 20 0 60 6
197. i a 265 nm la forma del picco non sempre presenta la spalla a destra 275 nm come precedentemente osservato per il lotto 1 vedi Fig 4 14 e che la variazione in unit di assorbimento minima e maggiormente visibile alle concentrazioni pi alte Per esempio le assorbanze registrate a 265 nm per i campioni 1A e 1B 2 125 mg mL sono rispettivamente di 2 483 u a e di 2 676 u a Anche questo risultato conferma che il sale IbuNa in grado di assorbire un po di umidit pertanto necessita di una conservazione e di una manipolazione adeguate Ad ogni modo non sembra che l anidrificante abbia lo stesso effetto della stufa 119 1240 Hplc Curve di calibrazione Come descritto precedentemente Par 4 5 1 4 sono state allestite sette diverse curve di calibrazione Tab 4 2 utilizzando i due lotti di IbuNa Le curve di calibrazione in acqua C Calib 1 5 in Tab 4 2 avevano lo scopo di verificare il contenuto di umidit del sale e se il mantenimento a 100 C per alcune ore potesse essere un buon metodo per eliminarla Le curve di calibrazione in acido formico C Calib 6 7 in Tab 4 2 sono state invece prodotte come primo passo per delle analisi di deproteinizzazione separazione in SPE ma vengono riportate ugualmente per i motivi pi sotto indicati In tutti i casi C Calib 1 7 in Tab 4 2 non sono stati presi in considerazione i punti relativi alla concentrazione della soluzione Madre e delle due diluizioni seriali su
198. i cromatogrammi ha permesso di ottenere le aree corrispondenti alle concentrazioni analizzate dati sono stati infine graficati e Modellizati utilizzando Origin 6 0 Si fa presente che i solventi sono stati filtrati con filtri in microfibra di vetro Wnatman La colonna era accessoriata con una colonna di guardia tipo CC La lunghez za d onda era settata a 254 nm 4 6 7 4 Curva di calibrazione di IbuNa in presenza di DicloNa La curva di calibrazione stata ottenuta in triplo utilizzando tre madri di IbuNa 15 6 g mL ottenute per diluizione da altrettante Madri di IbuNa 1 mg mL e tre madri di DicloNa 62 5 ug mL ottenute per diluizione da altrettante madri 1 mg mL Tutte le madri sono in FM 2 o FM 17 Si operato come qui descritto Nove microprovette sono state posizionate in una scarabattola numerandole dalla concentrazione di lbuNa pi alta a quella pi bassa Nelle microprovette sono stati pipet tati 1 mL di FM 2 ACN TF 50 27 73 o FM 17 ACN TF 25 27 73 Successivamente nella prima microprovetta sono stati pipettati 1 mL della soluzione madre di IpuNa 15 6 ug ml Dopo accurata miscelazione sono stati prelevati 1 ML dalla prima microprovetta e sono 100 Hplc stati pipettati nella seconda E cos di seguito fino alla 9 microprovetta Alla fine di questa procedura si ottengono 8 microprovette che contengono 1 mL ciascuna tranne l ultima che ne contiene 2 Dall ultima si prelevano 1 mL e si posizionano in
199. i due marche 1 Acrodisc cut off 0 2 um 13 mm Pall Life Sciences 2 cut off 0 2 um 13 mm Whatman e siringhe in plastica complete di ago metallico 10 mL Pic Indolor carta verde filtrante speciale per la sterilizzazione carta verde Steri Green 3M Health Care Tutta la vetreria destinata all utilizzo nelle analisi in cromatografia ad alta pressione stata accuratamente lavata con acqua saponata risciacquata con acqua di fonte e succes sivamente con acqua distillata o con acqua Milli Q WMQ solo occasionalmente stata risciacquata in ultimo con iPrOH Tutti gli oggetti in plastica riutilizzabili sono stati lavati con acqua e detersivo risciacquati con acqua di fonte e successivamente con acqua distil lata o con WM amp gli aghi metallici delle siringhe sono stati lavati con EtOH Protezione Le soluzioni contenenti HCI e NAOH usate per aggiustare il pH dei tamponi ed in generale tutti i solventi organici sono stati Maneggiati sotto cappa chimica L operatore ha sempre utilizzato i dispositivi di protezione personale quali camice guanti in nitrile e calzature di sicurezza Hplc 4 3 Strumenti Gli strumenti utilizzati per la realizzazione di questa tesi sono i seguenti un sistema per la produzione di WMQ Labo Star 7TWF DI UV Siemens una bilancia analitica sensibile alla quara cifra decimale ABS 120 4 Kern un pH metro con sonda termometrica incorporata pH 5 6 Eutech Instruments Pte Ltd ed eq
200. i in Tabella 4 46 indicano che l i tempi di ritenzione dell IbuNa L2 sono tutti uguali a 7 7 minuti tranne per il campione a concentrazione 7 69 ug mL per il quale stato registrato un tempo di 7 4 e 7 5 minuti Pertanto rispetto ai dati mostrati in Tabella 4 17 si pu osservare che risultano essere ritardati ca di 4 7 secondi i e 7 04 min Le aree dei 9 campioni di IbuNa L2 mantengono un rapporto prossimo al valore 2 sino alla concentrazione 0 48 ug mL per poi essere altalenante nei campioni restanti 0 24 0 03 ug mL Nelle tre repliche successive si osservato che nelle basse concentrazioni in alcuni casi non stato possibile integrare i picchi perch con una facile individuazione Inoltre non essendo possibile effettuare un confronto dei risultati ottenuti a 7 69 ug mL i e 13 419 u a con una concentrazione teorica dunque stato effettuato un paragone con l lbuNa L2 analizzato nell esperimento 1 ca 13 700 vs 13 419 u a Il confronto ha fatto emergere una diminuzione dell area a distanza di 57 giorni La forma dei picchi del IbuNa L2 nei vari cromatogrammi n 9 x 3 non mostrati presenta una simmetria 1 L intervallo di concentrazione in cui stato possibile quantificare senza problemi l ibuNa L2 sono 7 69 0 12 ug mL Concentrazioni pi piccole non sarebbero quantificabili con precisione Pertanto nelle condizioni di questa analisi si pu affermare che il limite di rivelamento di ca 0 12 u
201. i monitoraggio non abbiamo osservato rialzi in queste condizioni La seconda condizione monitorata controlla la rispondenza dell accessorio pre colonna condizione P U in Tab 4 15 Dai valori tabulati si pu concludere che la precolonna non ostacola il flusso nel circuito condizione P U vs U grazie alla sua struttura in acciaio sinterizzato caratterizzata da una porosit di 2 um 49 In effetti la funzione della precolonna quella di rimuovere l eventuale particolato grossolano se si osservano le pressioni generate dalle altre condizioni la precolonna non le ha mai incrementate i e P CG U vs CG U P C vs C e P CG C vs CG C tanto da far pensare che se passato del particolato nel circuito questo doveva essere inferiore a 2 um Osserviamo adesso i dati pressori relativi alla condizione CG U Si precisa che la CG utilizzata per queste misurazioni quella di tipo ec ed al suo interno presente una silice analoga a quella della colonna C18 ODS dimensioni delle particelle 5 um dimensioni dei pori 100 50 Pertanto normale supporre che la CG aumenti le pressioni in funzione del flusso e della viscosit della fase Mobile cos come stato osservato Essendo la sua funzione Hplc quella di proteggere la colonna da sostanze che potrebbero rimanere intrappolate al suo interno per dimensioni e o interazioni chimico fisiche
202. i pH Concentrazione Lotto mg mL WMe PBS TF 50 FM 2 TF 25 FM 17 0 00 6 77 7 42 7 00 7 60 7 00 7 39 1 1 00 6 72 7 40 6 98 7 60 6 93 7 37 DicloNa Valori di mV Concentrazione Lotto mg mL WMe PBS TF 50 FM 2 TF 25 FM 17 0 000 21 6 17 15 6 5 1 000 23 6 18 16 21 4 DicloNa Valori di Temperatura C Concentrazione Lotto mg mL WMe PBS TF 50 FM 2 TF 25 FM 17 0 000 25 2 25 23 6 23 5 23 7 25 1 000 23 4 23 4 23 4 23 4 23 6 23 2 4 8 2 2 Assorbimento UV Vis Per il DicloNa sono state effettuate solo delle analisi qualitative che sono state utili per osservare il comportamento della molecola in alcuni solventi ed a diverse concentrazioni Si voluto pertanto osservare il comportamento del DicloNa in WMQ e in TF 50 alle concentrazioni 0 0625 0 125 0 25 e 0 5 Mg mL ed in PBS i e 15 diluizioni seriali ottenute a partire da una soluzione madre 1 mg mL di DicloNa in PBS Si ricorda che tutti gli spettri presenti in questo paragrafo sono stati azzerati a 350 nm e normalizzati rispetto al bianco In Figura 4 23 sono mostrati gli spettri di assorbimento UV Vis del DicloNa in WMQ Fig 4 23 sinistra ed in TF 50 Fig 4 23 destra alle concentrazioni prima menzionate DicloNa in WMQ 0 5 mg mL DicloNa in WMQ 0 25 mg mL DicloNa in WMQ 0 125 mgimL DicloNa in WMQ 0 0625 mg mL Li E Lei N e e Q e o v vd lt 200 220 240 260 280 300 320 340 360 Lunghezza d onda nm
203. i prelevano 0 75 mL della diluizione n 1 dalla prima microprovetta e si pipettano nella seconda microprovetta E cos di seguito In questo modo si otterranno 9 o 6 diluizioni le quali possiedono sempre una concentrazione pari alla met di quella precedente In ogni microprovetta ci saranno 0 75 mL ad eccezione dell ultima la nona o la settima in cui il volume sar di 1 5 mL Tabella 4 2 Parametri delle curve di calibrazione UV Vis C Calib Lotto Conservazione Solvente 0 N dil ABS nm 1 1 h 100 C WMQ 17 9 255 265 2 2 2h 100 C WMQ 17 9 255 265 3 2 CO WMQ 17 9 255 265 4 2 24h 100 C WMQ 17 9 255 265 5 2 48h 100 C WMQ 17 9 255 265 6 2 CO AcFor MeOH 17 6 255 265 7 2 CO AcFor ACN 17 6 255 265 1 h i campioni sono stati conservati in stufa a 100 C ma non stato annotato il tempo di permanenza CO contenitore originale conservato in un armadio del laboratorio a temperatura ambiente e al riparo dalla luce 1 di Acido Formico diluito in metanolo rapporti volumetrici 1 99 3 di Acido Formico diluito in acetonitrile rapporti volumetrici 3 97 Si procede pertanto con l analisi allo spettrofotometro come descritto precedentemente Par 4 5 1 4 Ottenuti i grafici i relativi dati si esportano in formato CSV e si aprono in Excel 2003 dove vengono elaborati Durante questa fase i dati campioni e bianchi ven gono inizialmente azzerati ad una determinata lunghezza d onda 350 nm dove non
204. i pu osservare che il tempo di ritenzione dell IbuNa passa rispettivamente da 10 3 ai 4 8 minuti mentre quello del DicloNa da 16 4 a 5 9 minuti Tab 4 16 Queste osservazioni sono in accordo con quanto gi commentato nel Paragrafo 4 6 2 Ovviamente anche i tempi di ritenzione di tutti gli altri picchi si Modificheranno conseguentemente Per scelta della miglior fase eluente si tenuto conto del tempo di separazione tra i due picchi della pulizia di tale tratto Fig 4 31 C e D e di un tempo di ritenzione non troppo anticipato per l IbuNa che si potesse sovrapporre al fronte del solvente e non particolarmente ritardato per il DicloNa in quanto avrebbe determinato una corsa cromatografica troppo lunga Le caratteristiche ricercate sono state maggiormente rispettate nelle FM 2 e 4 che sono state mostrate separatamente per poterle confrontare pi facilmente Fig 4 32 Hplc Ibu FM 2 Diclo FM 2 Ibu FM 3 Diclo FM 3 Ibu FM 4 Diclo FM 4 Ibu FM 5 Diclo FM 5 Ibu FM 6 Diclo FM 6 Ibu FM 7 Diclo FM 7 5 10 15 20 25 Intensit mV Intensit mV Tempo minuti Ibu FM 2 Diclo FM 2 Ibu FM 3 Diclo FM 3 Ibu FM 4 Diclo FM 4 Ibu FM 5 Diclo FM 5 Ibu FM 6 Diclo FM 6 Ibu FM 7 Diclo FM 7 Intensit mV Intensit mV 4 6 8 10 10 15 20 25 Tempo minuti Tempo minuti Figura 4 31 Cromatogrammi di IbuNa L A e DicloNa B con i rispettivi ingrandimenti C e D volutamente traslati Di seg
205. i rapporti risultano avere una variabilit bassa 0 001 0 015 154 Hplc Tabella 4 23 Rapporti delle aree IbuNa DicloNa della retta analizzata a 254 nm Concentrazione ugimi IbuNa L1 DicloNa 1 2 3 media Dev st 7 69 0 556 0 556 0 566 0 559 0 006 3 84 0 285 0 289 0 298 0 291 0 007 1 92 0 133 0 150 0 149 0 144 0 009 0 96 0 063 0 092 0 079 0 078 0 015 0 48 0 043 0 043 0 043 0 000 0 24 0 021 0 018 0 021 0 020 0 002 0 12 0 009 0 010 0 009 0 009 0 001 0 06 0 004 0 005 0 005 0 001 0 03 0 002 0 003 0 002 0 001 Gli stessi dati della Tabella 4 23 sono stati utilizzati per costruire un grafico che permettesse la modellizzazione degli stessi Fig 4 36 Origin 6 0 Pertanto i rapporti delle aree sono stati messi in correlazione con le rispettive concentrazioni e questi nuovi dati sottoposti a regressione che ha trovato una risoluzione con un equazione lineare equazione riportata nella Fig 4 36 o z 2 E Q Q i Fd 5 2 Y B X Parameter Value Error B 0 07501 7 27988E 4 R sD N P 0 99948 0 00646 10 lt 0 0001 2 6 Concentrazione ug mL Figura 4 36 Rette di calibrazione di IbuNa in FM 2 Per protocollo di esecuzione vedasi Paragrafo 4 6 7 4 Dati puntuali in Tab 4 23 Infine la retta stata validata analizzando dei campioni a concentrazione nota ma trattandoli come se fossero a concentrazione incognita per essere sicuri della corretta quantificazione Hplc 4
206. i sono stati versati in un matraccio e disciolti in WMQ A completa dissoluzione dei sali entrambe le soluzioni sono state portate a volume aliquotate in bottiglie di vetro Duran e conservate al riparo dalla luce fino al loro utilizzo Questo protocollo rimane invariato nel caso vengano utilizzati i sali per HPLC i e c K HPO e c KH PO Il peso non stato ricalcolato in funzione della purezza dei sali 99 100 1 4 4 3 Tampone fosfato 50 MM Il tampone fosfato 50 MM TF 50 stato preparato sempre al momento dell uso In un matraccio da 1 L sono stati pipettati 21 1 mL di KH PO 1 M e 28 9 mL di K HPO 1 M o delle rispettive madri preparate con i sali per HPLC i e c KH PO e c K HPO Alla miscela cos ottenuta stata aggiunta una quantit di WMQ tale da portarsi al di sotto del Menisco di qualche millimetro La miscela stata quindi versata in un beaker per controllare il pH della soluzione Par 4 5 1 3 Il pH del TF 50 stato aggiustato sotto agitazione magnetica con l aggiunta di NaOH acq o di HCI acq nel caso che lo stesso fosse rispettivamente inferiore o superiore a 7 Nella stragrande maggioranza dei casi si usata una soluzione di HCI acq al 4 circa v v Quest ultima stata preparata in un matraccio da 25 mL pipettando 2 70 mL di HCI acq al 37 9 v v e portando a volume fino al menisco con WMQ calcoli per le diluizioni sono stati effettuati utilizzando l equazione di seguito riportata C xV
207. i vista la diversa capacit dei due tipi di tubi mantenendo i rapporti sempre costanti Nei tubi di plastica sono stati pipettati 8 mL di CHCI e 4 mL MeOH in modo da avere un rapporto di 2 1 v v A tale soluzione sono stati aggiunti 0 5 ML di campione Degradazione e Deproteinizzazione della cute In caso di utilizzo invece di tubi di vetro sono stati pipettati 4 ML di CHCI e 2 mL MeOH in modo da mantenere costante il rapporto di 2 1 v v Successivamente sono stati aggiunti 0 25 mL di campione Per entrambe le condizioni le soluzioni ottenute sono state lasciate a riposo per 60 minuti In seguito nel tubo stata aggiunta una quantit di WMQ pari al volume del MeOH 4 mL per tubi in plastica e 2 mL per i tubi in vetro ed stata eseguita un agitazione manuale molto lenta utilizzando del parafilm come tappo Dopo aver ripristinato la chiusura con i rispettivi tappi a vite i campioni sono stati lasciati a riposo per 60 minuti per favorire l interazione dei solventi col campione La separazione tra le due fasi CHCI WM Me0H stata ottenuta attraverso una centrifugazione C1 60 minuti 1000 g rotore ad angolo Mobile 41 che ha permesso di trasferire la fase superiore WMMQ MeOH in un altro tubo attraverso l utilizzo di una micro pipetta Pasteur Le due fasi sono state analizzate allo spettrofotometro UV Vis per notare eventuali differenze tra i due spettri e per comprendere in quale delle due si ripartisse il farmaco d i
208. icare la ripetibilit confrontando un triplo I campioni sono stati preparati come descritto nel Tabella 2 14 ed analizzati come illustrato nel Paragrafo 2 4 3 In seguito sono stati elaborati i dati ottenuti sperimentalmente Tab 2 14 La Tabella 2 14 mostra infatti il volume del campione utilizzato per l analisi e la rispettiva quantit di WS necessaria le fluorescenze del bianco della cuvetta W del campione C del campione normalizzato CN ed infine del campione privato del bianco del kit CF Inoltre nell ultima colonna di destra vengono mostrate le concentrazioni attese Teorica e quelle che sono state quantificate attraverso la curva di calibrazione Trovata Tabella 2 14 Analisi di 84 e 100 uL di campione a concentrazione nota Composizione ul Fluorescenza Albumina ug mL Campione ASBI WS W C CN CF Trovata Teorica bianco 0 2100 193 17 176 60 16 57 0 00 1 84 2016 165 70 183 90 18 20 34 77 0 87 0 40 2 100 2000 165 77 189 30 23 53 40 10 0 97 0 47 Giorno Successivo bianco 0 2100 157 57 156 80 0 77 0 00 a 1 84 2016 168 70 186 77 15 07 5 83 0 49 0 40 2 100 2000 169 13 187 23 18 10 8 87 0 55 0 47 bianco 0 2100 163 10 180 20 17 10 0 00 3 84 2016 165 50 192 97 27 47 0 37 0 39 0 40 4 84 2016 165 50 190 30 24 80 7 70 0 33 0 40 5 100 2000 165 50 195 53 30 03 2 93 0 44 0 47 6 100 2000 167 10 206 97 39 87 22 77 0 63 0 47 Dalla Tabella 2 14 stato notato che il primo giorno sono state ottenute d
209. iente dalla mattina In seguito stata eseguita l analisi e la successiva elaborazione dei dati come fatto la mattina Le Tabelle 2 5 e 2 6 mostrano il dettaglio dei valori ottenuti dagli esperimenti rispettivamente delle cuvette in plastica e delle cuvette in vetro In entrambe possibile individuare i dati ottenuti la mattina 1 e la sera 2 le fluorescenze dei bianchi delle cuvette W la fluorescenza dei campioni C la fluorescenza dei campioni dopo normalizzazione CN e quella ottenuta in seguito alla normalizzazione rispetto al bianco del kit CF Tabella 2 5 Risultati delle curve di calibrazione di 2 ML di campione Quantificazione proteica_Kit NanoOrange_ I W E CN CF Campione Albumina ug mL 1 2 1 2 I 2 1 2 I 0 0 125 4 261 4 1264 251 6 1 0 9 8 0 0 0 0 2 10 0 124 4 238 5 382 1 616 7 257 7 378 2 256 7 388 0 3 6 0 198 0 220 6 417 8 502 2 219 8 281 6 218 8 291 4 4 3 0 184 9 247 8 301 8 371 6 116 9 123 8 115 9 133 6 5 1 0 187 3 163 8 212 0 203 0 24 7 39 2 23 7 49 0 6 0 6 137 0 183 4 161 9 201 1 24 9 17 7 23 9 27 5 7 0 3 170 1 183 3 179 6 221 1 9 5 37 8 8 5 47 6 8 0 1 142 4 184 6 153 0 192 8 10 6 8 2 9 6 18 0 9 0 06 161 3 167 1 162 1 362 3 0 8 195 2 0 2 205 0 10 0 03 177 9 141 9 185 7 163 8 7 8 21 9 6 8 31 7 11 0 01 228 6 142 4 231 5 148 8 2 9 6 4 1 9 16 2 Dai risultati riportati in Tabella 2 5 CF si notano delle fluorescenze pi alte la sera e una non proporzionali t tra le fluorescenze e le concent
210. igin 6 0 Si fa presente che i solventi sono stati filtrati con filtri in microfibra di vetro Whatman La colonna era accessoriata con colonna di guardia tipo CC La lunghezza d onda era settata a 254 nm 4 6 7 3 Curva ai calibrazione di DicloNa Per individuare il range di aree corrispondenti alle diverse concentrazioni di DicloNa si proceduto in questo modo in triplo e da tre madri a concentrazione 1 mg mL in FM 2 Quindici microprovette sono state posizionate in una scarabattola numerandole dalla concentrazione pi alta a quella pi bassa Nelle microprovette sono stati pipettati 1 ML di FM 2 ACN TF 50 27 73 Successivamente nella prima microprovetta sono stati pipettati 1 ML della soluzione madre di DicloNa 1 mg mL in FM 2 Dopo accurata miscelazione sono stati prelevati 1 ML dalla prima microprovetta e sono stati pipettati nella seconda E cos di seguito fino alla 15 microprovetta Alla fine di questa procedura si ottengono 14 microprovette che contengono 1 mL ciascuna tranne la ultima che contiene 2 mL Il range di concentrazioni varia da 500 a 0 03 ug mL 500 000 30 52 ng mL ed ognuna la met di quella precedente Il contenuto delle microprovette stato aspirato con una siringa da 10 mL e filtrato Acrodisc nelle vial Par 4 4 7 1 campioni cos ottenuti sono stati subito posizionati nel vassoio porta campioni dell HPLC ed analizzati secondo la metodica descritta nel Paragrafo 4 6 6 3 L analisi de
211. ile osservare che nella Figura 3 25 A che rappresenta la fase metanolica dei picchi evidenti per l IbuNa in WMQ l IbuNa con Collagenase ed infine per l IbuNa in cute e Collagenase Per i rispettivi bianchi lo spettro appare decisamente piatto fatta eccezione per la cute in Collagenase che evidenzia un assorbanza nella regione di assorbimento dell InuNa Mentre nella fase cloroformica Fig 3 22 B gli spettri sembrano essere tutti abbastanza piatti tranne il campione in verde che mostra un una sorta di spalla differente dagli altri Come fatto nell esperimento precedente si proseguito con l azzeramento degli spettri e la relativa normalizzazione per far in modo che venisse pi semplice e immediato analizzare il comportamento del farmaco d interesse La Figura 3 26 A rappresenta la sovrapposizione della fase metanolica dei campioni azzerati la Figura 3 26 B mostra la fase cloroformica del azzeramento degli spettri Degradazione e deproteinizzazione della cute mentre la Figura 3 26 C e 3 26 D mostrano gli spettri normalizzati dei tre campioni nella loro fase metanolica e cloroformica rispettivamente CHCI3 Ibu Na Collagenase CHCI3 Collagenase WMQ CHCI3 Ibu Na Cute Collagenase MeOH Ibu Na Collagenase MeOH Collagenase WMQ MeOH Ibu Na Cute Collagenase MeOH WMQ Cute Collagenase MeOH Ibu Na MeOH WMQ CHCI3 WMQ Cute Collagenase CHCI3 Ibu Na CHCI3 WMQ
212. iltrare tamponi e terreni di coltura Si evidenzia che questi filtri contengono una quantit lt 1 di un non esplicitato ma non tossico agente umettante che sarebbe stato possibile togliere lavando preventivamente il filtro con acqua ultrapura e calda 34 Sebbene noi non abbiamo osservato nessun precipitato Par 4 4 3 nei campioni lasciati a riposo per 63 giorni necessario indicare che la filtrazione risultata stranamente lenta Infine le provette in polipropilene dove furono conservati i tamponi filtrati sono chimicamente inerti alla Maggior parte di sostanze solventi organici 34 e pertanto non sono state considerate come possibili fonti di nucleazione Relativamente ai filtri a siringa in Nylon con i quali sono stati filtrati i campioni prima di essere iniettati in HPLC Par 4 4 7 si ricorda che i filtri in Nylon sono idrofilici di natura e quindi non sono presenti tensioattivi o umettanti Inoltre sia il filtro nylon appunto che il contenitore polipropilene sono resistenti alla Maggior parte delle sostanze chimiche 35 Si riporta inoltre che la filtrazione non ha mai richiesto forze eccessive n sono stati riscontrati salti pressori pertanto si esclude che la Membrana di nylon possa essersi rotta durante la filtrazione 35 Hplc 105 Conclusioni Queste osservazioni inducono a ritenere che le soluzioni possedessero una stabilit fisica adeguata la precipitazione di sali in colonna o in altra parte dello strum
213. inuti La scelta delle fasi mobili non stata fatta in maniera casuale ma in relazione a quelle che vengono utilizzate durante le analisi ed i rispettivi lavaggi Una volta acceso HPLC e dopo aver eseguito le operazioni d inizializzazione Par 4 6 3 si proceduto iniziando sempre a monitorare la pressione dal flusso pi basso per poi aumentarlo Il passaggio da 0 1 a 0 5 mL min o da 0 5 a 1 mL min sempre stato effettuato tramite un gradiente Manuale della durata di 10 minuti Inoltre anche il passaggio da una fase mo bile all altra stato raggiunto attraverso un gradiente manuale della durata di 10 minuti al termine del quale si ovviamente verificata la stabilit della pressione prima di annotare la pressione esistente in quelle specifiche condizioni Tali condizioni sono state verificate prima dell inizio delle analisi di un determinato esperimento o comunque a seguito del lavaggio mensile consigliato dalla casa madre a seguito del lavaggio post analisi o quando si sostituito uno dei pezzi dello strumento Tali condizioni sono state verificate prima dell inizio delle analisi di un determinato esperi mento o comunque a seguito del lavaggio mensile consigliato dalla casa madre a seguito del lavaggio post analisi o quando si sostituito uno dei pezzi dello strumento Hplc Tabella 4 4 Condizioni per la determinazione dei parametri pressori basali dello strumento
214. io Monobasico KH PO 99 9 Fluka Degradazione e deproteinizzazione della cute il fosfato di potassio dibasico K HPO 99 Riedel de Ha n l acido cloridrico HCI 37 9 w w Sigma Aldrich l idrossido di sodio NaOH 98 w w Sigma Aldrich l acido formico AcFor 98 100 Sigma Aldrich il pentaossido di fosforo min 98 5 Sigma Aldrich il gel di silice perle arancioni Kraemer amp Martin GmbH la soluzione tampone a pH 4 J T Baker e la soluzione tampone a pH 7 Radiometer Copenhagen Inoltre sono stati utilizzati Ia soluzione salina Dulbecco tamponata col fosfato senza calcio e magnesio D PBS 500 mL Euroclone il Kit NanoOrange per la quantificazione delle proteine Kit lotto 1 n 50468A lotto 2 n 50985A lotto 3 n 871269 in ordine di arrivo Invitrogen e la collagenase da Clostridium hystolyticum di tipo Il collagenase 100 mg 634 unit mg di Collagene Sigma Aldrich Tale sostanza stata mantenuta alla temperatura di 30 C all interno di un barattolo in vetro contenente del gel di silice per assorbire l eventuale umidit Inoltre la confezione della collagenase ed il barattolo sono sempre stati sigillati con del parafilm In aggiunta sono stati utilizzati anche l acqua Milli Q prodotta nel nostro laboratorio WMQ il metanolo MeOH grado gradiente J T Baker l acetonitrile ACN grado gradiente J T Baker ed il cloroformio CHCI grado gradiente J T Baker Per gli esperimenti di veicola
215. ione per rendere immediate le eventuali differenze Tabella 2 11 Risultati delle curve di calibrazione di 2 ML di campione Albumina W CN CF ug mi 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 0 0 215 1 237 2 157 3 246 1 215 8 190 5 309 214 33 23 0 0 0 0 0 0 10 0 251 5 168 7 136 7 705 6 622 2 559 9 453 8 453 4 423 2 422 9 474 9 390 0 8 0 70 9 229 2 244 4 533 7 556 8 575 7 362 8 327 7 331 4 331 9 349 1 298 1 6 0 85 6 203 9 175 2 429 8 446 4 418 8 244 1 242 6 243 5 213 2 264 0 210 3 4 0 74 9 269 9 184 3 362 2 420 5 366 0 187 3 150 6 181 7 156 4 172 0 148 5 3 0 83 6 169 2 230 1 287 3 313 3 360 6 103 7 144 1 130 6 72 7 1656 97 3 2 0 64 9 217 4 203 7 2500 298 9 318 9 85 1 81 6 115 2 54 2 103 0 820 1 0 55 6 199 7 116 3 189 0 250 0 201 8 33 4 50 3 85 4 2 4 71 7 522 0 8 52 8 160 5 144 1 177 9 2341 234 5 25 1 736 904 5 8 95 0 571 0 6 277 9 208 1 244 1 274 5 227 2 247 5 3 4 19 1 3 4 34 3 40 5 29 8 0 3 262 3 106 3 184 1 249 3 178 4 215 9 131 72 1 31 8 440 93 5 15 0 1 173 6 197 7 191 3 162 9 211 8 235 2 10 7 14 1 43 9 41 6 35 5 106 La Figura 2 4 permette di paragonare l esperimento precedente nel quale si andavano a ricercare eventuali differenze tra il kit vecchio e quello seminuovo Fig 2 4 A e la curva di calibrazione eseguita in triplicato col kit seminuovo per testare la sua ripetibilit Fig 2 4 B della quale possibile osservare anche la relativa media correla
216. it arbitrarie Confrontandole con quelle quantificate in Tabella 4 26 e 4 31 emerge un elevata similarit evidenziando una ripetibilit dell area del DicloNa che ha mostrato avere una stessa area nei 3 esperimenti a 265 nm 28 073 31 611 vs 29 126 33 403 vs 29 467 32 580 u a La forma dei picchi del DicloNa nei vari cromatogrammi n 9 x 3 non mostrati presenta una simmetria 1 Da un analisi globale dell esperimento effettuato utilizzando IbuNa L2 a tre diversi tempi di permanenza in stufa 0 24 48 ore ed analizzandolo con la FM 17 premiscelata dall operatore stato potuto osservare innanzitutto una precisione ed un rispetto dei tempi di ritenzione delle due sostanze ca 7 8 min per l IbuNa e ca 10 9 min per il DicloNa in modo particolare per le concentrazioni 7 69 0 12 ug mL sia a 254 che 265 nm ed a tutti i tempi dell esperimento Non possibile giungere alle medesime conclu sioni per le concentrazioni 0 06 0 03 ug mL per le quali sono stati ottenuti dei tempi non Hplc sempre puntuali Le osservazioni fatte finora rafforzano la determinazione del limite di rilevamento a 0 12 ug mL da sottolineare che durante l analisi della retta delle 48 ore sia a 254 che 265 nm i tempi sono cambiati a causa dell errore dell operatore nella preparazione della FM 17 ma nonostante ci si sono mantenuti uguali tra loro Se si confrontano i tempi di ritenzione con la retta realizzata in Tabella 4 21 e 4 22
217. it di solvente necessario Nella Tabella 4 19 nella sezione dedicata al DicloNa possibile notare come non siano stati registrati i dati relativi alle FM 11 FM 12 ed FM 15 Tale assenza dovuta alla non iniezione della molecola utilizzando le suddette FM 147 148 Hplc Tabella 4 19 Dati relativi all integrazione dalla FM 8 alla FM 16 ai flussi 1 0 mL min a 254 nm IbuNa L1 Tempo min Fase Mobile iniziale finale T ritenzione Area Spalle FM 8 7 05 9 22 7 29 1 100 245 Dx FM 9 6 76 8 76 7 00 1 093 250 Dx FM 10 6 49 8 54 6 68 1 089 896 Dx FM 11 5 72 7 01 5 96 1 076 228 Dx FM 12 4 79 6 25 5 05 1 070 911 Dx FM 13 7 82 10 22 8 07 1 100 890 Dx FM 14 7 56 9 55 7 79 1 099 237 Dx FM 15 12 26 15 00 12 63 1 120 269 Dx FM 16 8 19 10 55 8 48 1 102 516 Dx DicloNa Tempo min Fase Mobile iniziale finale T ritenzione Area Spalle FM 8 9 19 12 85 9 51 20 659 562 Dx FM 9 8 54 11 30 8 85 20 512 356 Dx FM 10 8 00 10 73 8 22 20 380 705 Dx FM 11 n r n r n r n r FM 12 n r n r n r n r FM 13 10 56 13 71 10 90 20 778 670 FM 14 10 08 13 17 10 42 20 671 092 Dx FM 15 n r n r n r HT FM 16 11 10 14 31 11 43 20 732 450 Concludendo in base a tutte le prove eseguite ed ai cromatogrammi analizzati e confrontati stato deciso di effettuare una scelta tra le tante FM sperimentate stato tenuto conto dei picchi esenti da spalle e con dei tempi di ritenzione che permettessero una netta separazione tra le mol
218. l ago dell autocampionatore bottiglia R 3 una camera di miscelazione con due pompe 4 Hplc un sistema per il lavaggio della camera dei retropistoni bottiglietta 5 un sistema degasatore 6 un cir cuito in tubi metallici che parte dalla camera di miscelazione e crea un circuito tale da mettere in comunicazione l ingresso in colonna con l iniettore e la valvola ad alta pressione con quella a bassa pressione 6 1 dei tubicini in peek che uniscono la colonna al 7 blocco riscaldante forno 8 un sistema per escludere la colonna union 9 un autocampionatore ad alta velocit ago di iniezione due vassoi rack portacampioni un blocco termico per riscaldare o raffreddare i campioni contenuti nelle vials ed 10 un rivelatore UV Vis 14 Inoltre lo strumento pu essere gestito completamente attraverso un computer grazie al software LCsolution Version 1 25 che permette di raccogliere ed analizzare i cromatogrammi Nella Figura 4 2 vedi pagina precedente inoltre possibile vedere il percorso della fase mobile e del campione una volta iniettato In ultimo si evidenzia che in questa tesi utilizzeremo la terminologia in condizioni isocratiche quando la fase mobile il flusso e la temperatura non cambiano ed in condizioni di gradiente quando una o pi variabili di quelle appena menzionate variano 4 6 2 Colonna cromatografica utilizzata e suoi accessori La colonna utilizzata per le analisi una EC 150
219. la 2 16 Quantificazione proteica di 70 e 80 uL 10 ug mL Composizione uL Fluorescenza Albumina ug mL Campio ne ABSL2 ABS1 WS W C CN CF Trovata Teorica bianco 0 2100 168 37 196 57 28 20 0 00 0 00 0 00 1 70 2030 171 27 209 53 38 27 10 07 0 38 0 33 2 70 2030 171 17 203 63 32 47 4 27 0 27 0 33 3 70 2030 171 57 96 87 25 30 2 90 0 12 0 33 4 80 2020 172 20 90 00 17 80 10 40 0 02 0 38 5 80 2020 172 20 99 23 27 03 1 17 0 16 0 38 6 80 2020 173 30 88 73 15 43 12 77 0 07 0 38 7 70 2030 173 97 81 77 7 80 20 40 0 22 0 33 8 70 2030 174 60 87 23 12 63 15 57 0 13 0 33 9 70 2030 174 20 97 97 23 77 4 43 0 09 0 33 10 80 2020 175 33 201 20 25 87 2 33 0 14 0 38 11 80 2020 175 87 215 07 39 20 11 00 0 40 0 38 12 80 2002 176 20 210 63 34 43 6 23 0 30 0 38 Per i 70 uL della prima serie sono state ottenute delle concentrazioni che tendono a diminuire infatti da 0 38 si passa a 0 27 e infine a 0 12 ug mL Nella serie ripetuta con l utilizzo di ABS la quantificazione proteica ottenuta stata addirittura negativa per due dei tre campioni Per gli 80 uL invece sono state quantificate concentrazioni negative per la ABSL2 mentre sono state ottenute concentrazioni positive per lo standard del kit i valori ottenuti hanno avuto un oscillazione tra i 0 14 e 0 40 ug mL A questo punto delle prove volumetriche stato deciso di concentrare gli esperimenti successivi su un volume di campione pari a 80 uL Sono stati cos
220. la curva stessa rappresentata in Tabella 2 2 Le variazioni e gli accorgimenti che sono stati presi riguardano in modo particolare il volume finale dei campioni da 2 5 a 2 1 ml l utilizzo di un unica soluzione madre di albumina ABS1 10 g mL per la preparazione di tutti i campioni 2 12 in Tab 2 2 il tempo di raffreddamento dei campioni da 20 a 30 minuti ed infine la variazione dei punti a concentrazione nota che determinano la curva In Modo particolare sono stati eliminati i campioni n 9 11 Tab 2 1 e sono stati aggiunti i campioni n 3 5 7 9 Tab 2 2 Tabella 2 2 Composizione e concentrazione dei punti della retta modificate Composizione uL Albumina Campione ABSI WS ug ml 1 0 2100 0 0 2 2100 0 10 0 3 1680 420 8 0 4 1260 840 6 0 5 840 1260 4 0 6 630 1470 3 0 7 420 1680 2 0 8 210 1890 1 0 9 168 1932 0 8 10 126 1974 0 6 11 63 2037 0 3 12 21 2079 0 1 2 4 4 Preparazione delle soluzioni di ABSL Per la preparazione di alcune soluzioni e campioni contenenti la sostanza ABSL sono stati inizialmente pesati 10 mg di sostanza utilizzando la bilancia analitica precedentemente calibrata e della carta da pesata Successivamente la sostanza stata trasferita per versamento in un matraccio di vetro 100 mL i residui sono stati recuperati facendo gocciolare WMQ con una pipetta Pasteur sulla carta da pesata La soluzione ca 100 ML stata agitata manualmente per favorire la dissoluzione della ABSL ed
221. le pressioni generate possono variare enormemente Per esempio la pressione pi alta osservata nella condizione P CG C di 143 bar con MeOH WMQ 80 20 a 1 mL min che corrisponde ad un incremento pressorio di 17 bar In letteratura stato visto che il rialzo pressorio dovuto alle colonne di guardia dovrebbe essere compreso tra 1 7 ed 8 6 bar mentre un aumento di 15 5 bar dovrebbe essere indice di ostruzione 51 Tuttavia si ritiene che l aumento osservato con la fase MeOH WMQ 80 20 sia dovuto alla viscosit della stessa quindi da considerarsi normale con le nostre condizioni La colonna essendo pi lunga della CG i e 150 mm vs 4 mm offre una resistenza superiore al flusso e pertanto si sono registrate delle pressioni superiori condizione C a quelle osservate solo in presenza della colonna di guardia condizione CG C Questa condizione stata monitorata solo due volte a circuito completamente pulito e con fase mobile di conservazione della colonna per evitare possibili danni Tuttavia nella condizione P C possibile osservare quale sarebbe potuta essere la pressione generata dalla fase mobile MeOH WMaQ Il risultato in linea con quanto osservato gi nella condizione pi semplice condizione U dove la miscela Metanolica dava pressioni doppie rispetto a quelle fornite dalla miscela con ACN Infine nell ultima condizione P CG C dove presente la colonna con i suoi accessor
222. lib or 3 583 3 583 3 583 c 0 lt 1 700 1 696 1 698 1 699 1 697 C C An 1 420 1 600 1 549 1 549 1 553 C H An 3 030 3 045 3 027 3 051 3 062 3 050 3 106 Armoniche An 2 000 1 600 1 910 1 912 5 1 912 5 1 925 CO Of asim 1 550 1 650 1 535 1 549 1 549 1 553 CO O sim 1 400 1 401 1 412 1 412 1 410 Banda sdoppiata NB giaciture in corsivo per segnali deboli ass associato lib libero Ar arile asim asimmetrico sim simmetrico Osservando gli spettri IR Fig 4 8 4 10 la prima impressione che siano molto simili fra loro forse con qualche giacitura pi definita in alcuni casi ma presenti nelle stesse posizioni L osservazione congiunta di spettri Fig 4 8 4 10 e dati tabulati Tab 4 9 ha fatto emergere i seguenti commenti che si basano sull ipotesi di aver comprato un sale anidro i Nella regione delle frequenze superiori a 3 100 cm si possono osservare due picchi uno stretto e poco intenso 3 583 cm stessa giacitura per i nostri spettri ed uno allargato ed intenso gt 3 347 cm diversa giacitura per i nostri spettri Questi due segnali si riferiscono nel caso del picco pi stretto allo stiramento dell OH libero mentre nel caso del picco allargato allo stiramento dell OH associato probabilmente coinvolto in un legame idrogeno 44 Partendo dal presupposto che il sale non doveva contenere 111 112 Hplc acqua questi due segnali non ci sarebbero do
223. ll analisi del campione a concentrazione 1 000 ug mL Tab 4 19 ed a quello a 500 ug mL Tab 4 20 i campioni analizzati risultano avere un area molto pi vicina a quella stimata 16 788 19 020 Inoltre le aree risultano essere molto simili a quelle quantificate in Tabella 3 16 15 619 20 759 nonostante la soluzione madre di partenza sia stata preparata al momento dell utilizzo La forma dei picchi del DicloNa nei vari cromatogrammi n 9 x 3 non mostrati presenta una simmetria 1 Esperimento 1 Curva di calibrazione n 1B stufa 0 ore 265 nm dati mostrati in Tabella 4 26 indicano che l i tempi di ritenzione dell IbuNa L2 sono tutti a 7 8 minuti per il range di concentrazione 7 69 0 12 ug mL si nota un anticipo di 1 2 secondi nelle basse concentrazioni 0 06 0 03 ug mL Inoltre rispetto ai dati mostrati in Tabella 4 17 si pu osservare che risultano essere ritardati ca di 5 8 secondi i e 7 04 min ciononostante mostrano una maggior precisione e nei confronti dei tempi individuati nella Tabella 4 21 risultano essere molto vicini 7 90 8 07 min 1157 158 Hplc Le aree dei 9 campioni di IbuNa L2 mantengono un rapporto molto vicino al valore 2 sino alla concentrazione 0 12 ug mL oltre la quale arriva sino a 2 65 Nelle tre repliche successive si osservato che nelle basse concentrazioni in alcuni casi non stato possibile integrare i picchi perch di difficile individuazione Questi
224. lla quale non presente alcun andamento regolare costante e ripetibile In conseguenza di questo risultato stata abbandonata tale tecnica di lettura Quantificazione Proteica_Kit NanoOrange_ Nel corso delle Modifiche al protocollo originario stato variato anche il volume finale del campione riducendolo a 2 1 mL con l intento di risparmiare del materiale in vista di tutti i test che si stavano prospettando necessari stata quindi allestita una curva di calibrazione applicando le modifiche descritte e seguendo il protocollo descritto nel Paragrafo 2 4 3 2 L esperimento stato ripetuto in due giorni diversi variando esclusiva mente il kit utilizzato quello vecchio il primo giorno e quello seminuovo il giorno successivo La Tabella 2 10 mostra i dati ottenuti dal kit vecchio 1 e dal seminuovo 2 che comprendono le fluorescenze del bianco cuvetta W del campione C del campione normalizzato CN e del campione normalizzato anche rispetto alla WS CF Dai dati mostrati in Tabella 2 10 CF stata notata una fluorescenza pi alta per il kit seminuovo e una maggior proporzionalit con le relative concentrazioni e soprattutto stata finalmente ottenuta una maggior precisione nella porzione bassa della curva che tende ad avere un andamento sempre pi simile ad una regressione lineare e con nessun punto al di sotto dello zero Fig 2 4 A In seguito al risultato positivo della curva di calibrazione cos ottenuta gli
225. llo strumento in Modo particolare del vano nel quale viene inserita la cuvetta In seguito il fluorimetro stato acceso e si atteso qualche secondo per il completamento positivo della sua inizializzazione Successivamente stato settato il canale di lettura di interesse blu attraverso l utilizzo del tasto dedicato lt A B gt Inoltre stato anche controllato il valore impostato del parametro lt STD VAL gt range 1 999 in quanto influenza la risposta del fluorimetro stato infatti notato che la fluorescenza di uno stesso campione aumenta all aumentare di tale parametro Il parametro lt STD VAL gt viene utilizzato quando si vuole inserire una retta di calibrazione nella Memoria dello strumento Operando in questo Modo sebbene lo strumento restituisca per ogni lettura dei numeri che sono concentrazioni non possibile avere il completo controllo delle misurazioni Pertanto si ritenuto opportuno considerare questi numeri come delle unit arbitrarie e settare il parametro lt STD VAL gt a 100 2 4 Metodi 2 4 1 Cuvette in plastica Il giorno prima dell esperimento della quantificazione sono stati misurati i bianchi di ciascuna cuvetta in plastica intendendo come bianco il valore che lo strumento forniva in risposta alla fluorescenza dell acqua Tale misurazione stata effettuata utilizzando delle cuvette pulite ed esenti internamente ed esternamente da graffi pelucchi o impronte digitali Le cuvette sono stat
226. loNa il quale nel caso specifico e g 7 69 ug mL risulta essere pi alto alle 24 ore i e 18 316 vs 19 084 vs 17 972 u a Questo comporta un allineamento dell andamento dei risultati Se si analizzano le aree dell IbuNa L2 e del DicloNa quantificate a 254 nm nell esperimento di controllo Tab 4 24 4 27 e le si confrontano con quelle analizzate negli alti due tempi Tab 4 29 4 37 possibile notare una maggior variabilit quantificata attraverso il calcolo delle deviazioni standard che possibile attribuire al differente metodo di filtrazione utilizzato per la FM 17 Pi precisamente stato utilizzato un imbuto filtrante sterile con filtro in acetato di cellulosa per l esperimento di controllo mentre per le analisi relative alle 24 e 48 ore di distanza stata eseguita una filtrazione mediante i filtri in nylon Pertanto possibile ipotizzare che i dispositivi filtranti utilizzati abbiano avuto una diversa efficacia sul trattenimento delle impurit presenti nel TF le quali potrebbero aver alterato la precisione della corsa cromatografica In aggiunta le aree dell buNa L12 quantificate alla lunghezza d onda di 265 nm appaiono crescenti proporzionalmente al tempo di permanenza in stufa 11 442 vs 13 698 163 164 Hplc vs 13 723 u a e mostrano una deviazione standard pi alta nelle 24 ore rispetto agli altri tempi 391 7 vs 740 0 vs 333 4 Le aree del DicloNa a questa lunghezza d onda mostrano un ass
227. mV Intensit mV 10 15 Tempo minuti Figura 4 32 Cromatogrammi di IbuNa e DicloNa ottenuti con le FM 2 e 4 In questa figura vengono isolati i cromatogrammi relativi alle soluzioni di IbuNa in nero e DicloNa in rosso analizzati con FM 2 A e FM 4 B e i rispettivi ingrandimenti C e D Condizioni di separazione Campioni entrambe le molecole sono sciolte 1 mg mL in FM 2 il volume di iniezione 20 pl filtrati con Acrodisc Colonna accessoriata con CG del tipo CC Lunghezza d onda di rilevamento 254 nm Flusso 1 mL min Fase mobile di eluizione in leggenda filtrazione dei solventi filtri Wnatman in fibra di vetro In seguito si voluto provare a sostituire il THF eliminato con un solvente che avesse delle caratteristiche simili al THF utilizzato nell articolo di riferimento La scelta ha tenuto conto dell idrofilicit di tale solvente ricadendo cos sull iPrOH caratterizzato da uno stesso grado di polarit i e viscosit iPrOH 2 30 cP THF 0 55 cP indice di polarit acqua 9 0 THF 4 0 iPrOH 3 9 miscibilit in acqua tutti e due 100 48 A differenza di Brown et al non stata effettuata una premiscelazione del solvente scelto con l ACN ma stata impostata la miscelazione automatica da parte dello strumento Hplc Ibu FM 20 7 lbu FM 41 2 Diclo FM 2 0 7 Diclo FM 4 1 2 lbu FM 21 3 lbu FM 4 1 3 Diclo FM 2 1 3 Diclo FM 4 1 3 Intensit mV In
228. me diversi autori siano riusciti a quantificare in maniera accurata e precisa la molecola a 220 nm 63 61 65 66 Altri lavori invece utilizzano una lunghezza d onda di poco superiore alla nostra settata a 280 nm 62 16 195 196 Conclusioni 5 Conclusioni Il lavoro eseguito in questa tesi ha posto le basi per l organizzazione e la realizzazione di un esperimento di veicolazione transdermica utilizzando della cute umana Infatti stato messo a punto un metodo per la quantificazione delle proteine presenti nel campione di cute sottoposto a degradazione e deproteinizzazione Pertanto attraverso l utilizzo del kit NanoOrange stata possibile testare l efficacia dei diversi metodi di deproteinizzaione presi in esame I risultati ottenuti hanno sottolineato la medesima funzionalit dei metodi che sfruttavano l azione precipitante con solvente organico e della criodeproteinizzazione Nonostante questo un minor quantitativo proteico stato misurato in seguito all utilizzo delle provette Amicon le quali risultano essere eccellenti anche per il loro pratico e veloce impiego Non possibile dire altrettanto riguardo le cartucce Spe le quali sembrano essere pi problematiche anche per l interazione con farmaco in forma salificata di nostro interesse Ma per poterle totalmente escludere dal possibile utilizzo per la deproteinizzazione del campione resta da testare la soluzione dell analisi immediata del filtrato evitando qu
229. mentre nel primo punto stata evidenziata la presenza di deviazione standard che comunque risulta essere Molto simile nei due esperimenti Concludendo stato constatato che la conservazione in campana ha comportato un piccolo aumento dell area quantificata ma non ha apportato una significativa 169 1740 Hplc variazione della concentrazione della polvere Questa affermazione parzialmente dimostrata dala Figura 4 38 nella quale bisogna per tener conto della diversa quantificazione ottenuta per il DicloNa nel tempo intercorso tra i due esperimenti Si ricorda che l unico parametro variabile stata la preparazione della fase mobile da parte dell operatore m 0h254nmeEsp 1 m 0h265nmEsp 1 Y B X Y B X Area IbuNa L2 DicloNa Area IbuNa L2 DicloNa Parameter Value Error Parameter Value Error B 0 05679 0 00128 B 0 04815 2 77631E 4 R SD N P e R SD N P 0 99936 0 01135 9 lt 0 0001 0 99983 0 00247 9 2 3 DI 2 Concentrazione ug mL Concentrazione g mL o in m 0h254 nm Esp 2 m 0h 265 nm Esp 2 o ES w N Y B X Y B X Area IbuNa L2 DicloNa Area IbuNa L2 DicloNa 2 te Parameter Value Error Parameter Value Error B 0 05126 9 66451E 5 B 0 04447 1 99744E 4 R 3D N P R D N P 0 99998 8 58114E 4 9 lt 0 0001 0 99994 0 00172 9 fad 0 1 2 o 1 2 5 6 Concentrazione g mL Concentrazione ug mL Figura 4 39 Confronto tra le regressioni lineari dell InuNa L2 non trattato ter
230. micamente quantificate negli esperimenti 1 e 2 alle lunghezze d onda di 254 sinistra e 265 nm destra Per avere un idea pi chiara sulle differenze tra i due esperimenti si sono elaborati i dati ottenuti calcolando la Media e la deviazione standard delle tre repliche per ciascuna retta in Modo da poter realizzare la regressione pi consona all andamento del grafico Infatti la Figura 4 39 mostra l elaborazione ed il confronto delle regressioni lineari caratterizzanti le rette dell esperimento 1 e 2 a 254 nm sinistra e 265 nm destra possibile notare immediatamente che i valori delle R square risultano essere pi alti nelle rette relative all esperimento 2 in entrambe le lunghezze d onda Inoltre anche presente una deviazione standard molto meno significativa nell ultimo esperimento ed una maggior linearit della distribuzione dei punti delle rette Per un analisi dei risultati molto pi approfondita si voluto procedere col calcolo percentuale sull aumento della concentrazione dell IbuNa L2 rispetto ai diversi tempi di permanenza in stufa stato preso in considerazione come punto di riferimento il rapporto Hplc tra IbuNa L2 e DicloNa ottenuto nell esperimento di controllo per la concentrazione 7 69 ug mL ritenuto essere il 100 del farmaco Successivamente per semplice proporzione stata calcolata la percentuale rappresentata dal farmaco trattato termicamente Per quanto riguarda l esperimento 1 i calcoli e
231. mina ug mL Figura 2 2 Curve di calibrazione analizzate in cuvette in plastica A e in vetro B _Ripetute_ In entrambe le rappresentazioni Fig 2 2 A e 2 2 B possibile notare un leggero aumento della fluorescenza nell esperimento realizzato il pomeriggio maggiormente evidente nei punti a concentrazione 10 e 6 ug mL punti a concentrazione 1 e 3 ug mL coincidono in ciascuno dei due esperimenti mostrando una forte ripetibilit Ia quale viene nuovamente a mancare nel range compreso tra 0 6 0 01 ug mL Conseguentemente ai risultati poco soddisfacenti sono state apportate delle modifiche al protocollo di riferimento 2 5 2 Esperimenti col protocollo Modificato Le variazioni apportate hanno riguardato in primo luogo l eliminazione delle tre madri con le quali preparare gli undici punti della curva che sono state sostituite con un unica madre a concentrazione 10 ug mL ed inoltre sono state modificate le concentrazioni determinanti i punti della curva eliminando quelle molto basse che hanno mostrato un elevata instabilit nel corso delle prove effettuate 0 1 0 01 ug mL ed aggiungendo delle concentrazioni intermedie 8 4 2 e 0 8 ug mLl che meglio caratterizzassero l intero range preso in considerazione Quantificazione proteica_Kit NanoOrange_ Per verificare l effetto di tali cambiamenti stato eseguito un primo esperimento utilizzando sempre il kit vecchio nel quale sono stati allestiti i dodici campioni della curva
232. mpione Degradazione e Deproteinizzazione della cute Tabella 3 12 Risultati delle ripetizioni dei campioni n 6 con pipette Gilson louNa Campione ande ug mL Recupero farmaco Teorica Trovata 1 lbu Na in WMQ secco 2040 2009 1 98 5 2 Iou Na in TF25 secco 2040 1950 3 95 6 3 Ibu Na in WMQ Il secco 1360 1361 2 100 1 4 lou Na in TF25 Il secco 1360 1311 2 96 4 5 lobu Na in WMQ Spe 850 231 4 27 2 6 Iou Na in WMQ Spe Il 567 194 0 34 2 7 lou Na in TF25 Spe 850 191 3 22 5 8 Iou Na in TF25 Spe Il 567 207 3 36 6 La Tabella 3 13 illustra il valore del pH dei campioni trattati secondo i diversi metodi utilizzati finora Tabella 3 13 Misurazione pH Campione Metodo pH 1 lou Na in WMQ secco 6 64 2 Iou Na in TF25 secco 6 81 3 lou Na in WMQ Spe 4 70 4 Ibu Na in WMQ Spe Il 4 80 5 Iou Na in TF25 Spe 4 45 6 Ibu Na in TF25 Spe Il 4 90 I valori ottenuti dall Misurazione del pH Tab 3 13 non mostrano alcuna anomalia ma per essere sicuri stato scelto un campione random delle batterie analizzate ed stato trattato con NaOH 0 5 M AI campione sono state aggiunte un numero di gocce di base tale da far in modo che il pH fosse 7 In seguito stato ripetuto lo spettro ed stata ricalcolata la concentrazione di farmaco recuperata Il risultato ottenuto stata una percentuale del 33 rispetto al 24 ottenuto precedentemente senza alterare il pH del campione In letteratura sono stati trovati dei lavo
233. n La pressione si abbassa da 142 a 81 bar e da 132 a 74 bar rispettivamente nei due lavaggi cortissimo e medio Fig 4 25 C e D A parte la pressione iniziale che dipende dalla sequenza di campioni iniettati prima del lavaggio pi elevata nel lavaggio cortissimo caso C e dalla presenza della CG se si confrontano i valori con i casi A e B si pu notare che nonostante tutto il salto pressorio di 61 e 58 bar nei due casi C e D Questo iniziale abbassamento giustificabile col dimezzamento della velocit del flusso e forse anche con il cambio della FM i e il tampone viene sostituito con acqua Nella prima fase di lavaggio con ACN W 27 73 10 210 min caso C e 10 410 min caso D si pu osservare che la pressione inizialmente si alza fino a 100 e 94 bar in 10 minuti risp caso C e D Questo rialzo pressorio attribuibile all ingresso in colonna della nuova fase mobile nella sua totale composizione La pressione rimane in quell intormo per altri 50 e 30 minuti risp caso C e D Dopo di che la pressione progressivamente diminuisce per arrivare a 90 e 70 bar rispettivamente per i casi C e D valori a 210 min caso C e 410 min caso D Pertanto dall inizio alla fine di questa fase si avuto un incremento di 9 bar ed una diminuzione di 4 bar rispettivamente per i casi C e D Inoltre dal picco massimo alla fine si avuto un abbassamento di 10 e 24 bar risp caso C e D Nei seguenti 10 minuti 210 220 min caso
234. n seguito alle due filtrazioni Per quanto riguarda invece il metodo Il visibile che la prima centrifuga ha messo in evidenza un eliminazione proteica Maggiore ma che seconda centrifuga non ha fornito il risultato sperato mostrando un risultato addirittura negativo Pertanto visti i dati ottenuti possibile indirizzare la scelta sull esecuzione di un unica centrifuga per entrambi i metodi in questione Per poter scegliere una delle due metodiche sinora testate stato pensato di effettuare uno studio sull interazione del farmaco d interesse l IbuNa con la soluzione precipitante e con le cartucce Spe L esperimento stato realizzato attraverso l esecuzione della precipitazione off line del farmaco per ciascuno dei due metodi ed effettuando la filtrazione in cartuccia Spe per potere successivamente calcolare la sua percentuale di recupero Tabella 3 6 Risultati di quantificazione proteica della cute filtrata in spe con singola e doppia centrifuga offline Proteine Campione Metodo u9 SE a mii o 1 Cute l 1C 74 0 588 7 2 Spel 1C 13 4 107 5 82 3 Cute Il 1 C 71 0 850 9 4 Spe Il 1C 15 8 189 1 78 5 Cute 2C 49 1 392 8 54 6 Spel 1C 26 9 215 2 45 7 Spe 2C 25 3 202 2 49 8 Cute Il 2C 32 9 395 0 33 9 Spe Il 1C 9 2 110 5 72 10 Spe Il 2C 40 0 467 8 18 La Figura 3 10 mostra lo spettro ottenuto dall analisi allo spettrofotometro Degradazione e deproteinizzazione della cute IBU Na in Spe 8 NOV
235. nca in sospensione nella bottiglia dedicata con pescanti dell HPLC In questo caso la bottiglia dedicata pulita era stata riempita con il c TF 50 preparato il giorno stesso del riempimento e filtrato con filtri in fibra di vetro nove giorni prima di constatare che fosse precipitato molto probabile che la precipitazione sia iniziata gi il giorno stesso in quanto furono iniettati solo tre campioni e si ebbero problemi di deriva e di aumento pressorio Non si mai trovata la causa di ci n questo evento si manifestato altre volte Relativamente alla ricostituzione per miscelazione manuale in bottiglia Duran delle miscele passate in HPLC poche peraltro si riporta che a parte le normali bollicine che si creano per scuotimento vigoroso non stata notata la formazione n di precipitati n di opalescenze fino ad un Massimo di 7 giorni per le soluzioni usate Meno di osservazione 103 104 Hplc Questo breve periodo tiene in considerazione il tempo massimo di permanenza nelle bottiglie dedicate durante una settimana di intenso lavoro Relativamente al parametro filtrazione verrebbe da pensare che questo processo non dovrebbe portare alla formazione di precipitati visto che il suo scopo quello di allontanare impurezze le cui dimensioni siano pi grandi dei pori del filtro utilizzato Ciononostante e sebbene la prima porzione di filtrato stata sempre scartata si pensato che se il filtro per qualsiasi r
236. ncentrazioni teoriche quelle trovate e la percentuale di recupero nelle due fasi di separazione Degradazione e Deproteinizzazione della cute Tabella 3 16 Quantificazione dell IbuNa normalizzato nelle tre condizioni IbuNa ug mL n atida Recupero Campione Metodo Teorica Trovata metanolo cloroformio metanolo cloroformio 1 Ibu Na in WMQ 1000 1024 0 75 6 102 4 Zal 2 Ibu Na collag 500 438 0 63 3 87 6 11 9 3 Iou Na Cute Col 500 244 6 1028 2 48 9 193 6 I risultati in Tabella 3 16 mostrano un andamento molto simile all esperimento precedente infatti sembrerebbe che il campione n 1 si ripartisca totalmente nella fase metanolo WMQ nonostante si quantifichi una piccola percentuale anche nel cloroformio eccedendo dal 100 Nel campione n 2 il recupero del farmaco nel metanolo leggermente inferiore 87 6 ma se si somma a quello riscontrato nel cloroformio 11 9 si ottiene un 99 5 che acquisterebbe un senso logico Nel campione n 3 le quantificazioni ottenute risultano essere parecchio anomale in quanto stato quantificato un 48 9 nel metanolo e un 193 6 nel cloroformio L analisi dei dati ottenuti dagli esperimenti realizzati portano alla conclusione che l ipotesi iniziale riguardante la distribuzione dell IbuNa nella fase Metanolica possa essere corretta Nonostante questo resta scontata la necessit di approfondire la ripartizione del farmaco eseguendo dei replicati utilizzando della cute appena d
237. ndo la rack nella quale era contenuta la vial del campione d interesse Inoltre la termostatazione ha riguardato anche la stanza in cui sono state eseguite le analisi attraverso un condizionamento di 24 ore su 24 ad una temperatura costante di 25 C Hplc 193 In aggiunta stata impostata anche la temperatura del forno la quale rimasta per tutta la durata dell analisi cromatografica a 25 C Tutti gli accorgimenti descritti e attuati hanno permesso di evitare degli sbalzi di temperatura che avrebbero potuto alterare le condizioni di analisi dello strumento Dai risultati ottenuti e graficati in Figura 4 40 possibile notare una leggera differenza nel cromatogramma ottenuto dal campione termostato Fig 4 40 in rosso DH Temp Amb 0 H TempAmb 0H2550 0H25 C z dini ice T x T i T T T T T 0 2 4 6 8 Tempo minuti Tempo minuti Assorbanza a 265 nm mV Assorbanza a 254 nm mv 24 H Tamp Amb 24 H Temp Amb 24H25 c 24 H 25 C Ey E E E G m m N Fi d i lt Assorbanza a 265 nm mV Tempo minuti Tempo minuti 48 H Temp amp mb 48 H Temp Amb 48H25 0 z 48H 257C i Assorbanza a 265 nm mV o MA T li T hi T T T r T hi T il 0 2 4 6 8 10 Tempo minuti Tempo minuti OA Assorbanza a 254 nm mY i ode Figura 4 40 Cromatogrammi IbuNa e
238. nghezza d onda 3 lbuNa 0 H Temp Amb IbuNa 0H Temp Amb IbuNa 0H25 C IbuNa 0H25 C IbuNa 24 H Temp Amb IbuNa 24 H Temp Amb IbuNa 24 H 25 C IbuNa 24 H 25 C IbuNa 48 H Temp Amb IbuNa 48 H Temp Amb IbuNa 48 H 25 C IbuNa 48 H 25 C i Assorbanza 265 nm u a T i E c 3 N 1000 c S a o v v lt 6 6 Tempo minuti Tempo minuti Figura 4 41 Cromatogrammi IbuNa e DicloNa insieme cromatogrammi rappresentati in questa figura sono quelli relativi alle prove di conservazione dell IbuNa in stufa per 24h e 48h rispettivamente alle lunghezze d onda 254 nm a sinistra e 265 nm a destra Come possibile osservare dalla figura i cromatogrammi a 265 nm presentano dei picchi migliori Inoltre per ognuna delle condizioni di conservazione dell IbuNa sono state prese anche in considerazione le condizioni climatiche dell ambiente in cui si svolta l analisi a Temp Amb temperatura ambiente oppure a 25C 25 C Pertanto possiamo concludere che la termostatazione non ha apportato alcun miglioramento del cromatogramma ma anzi ha mostrato un alterazione della linea di base La sperimentazione della Metodica ottimizzata ha preso in considerazione come punto di partenza il lavoro di Brown et al nonostante l utilizzo da parte dello stesso della forma acida dell Ibu Infatti la scelta stata effettuata in base all utilizzo in fase Mobile del tampone fosfat
239. ni utilizzate per questo studio Laddove stato necessario i vari sottoparagrafi possono essere accompagnati anche dalle metodiche di caratterizzazione per una determinata soluzione 4 4 1 Acqua per HPLC Per le analisi in HPLC stata utilizzata WMQ ottenuta per osmosi inversa 0 055 uS cm filtro 0 2 um Per verificare la sua purezza stata acquistata anche un acqua specifica per HPLC c WMQ e le due acque sono state sottoposte alle analisi descritte di seguito 4 4 1 1 Spettrometria UV Vis Hplc stata analizzata la capacit di assoroimento nella regione spettrale compresa tra 1100 e 190 nm Per fare ci 600 uL di ognuna delle due acque sono stati pipettati nell apposita cuvetta in quarzo cammino ottico 1 cm assicurandosi che le pareti ottiche interne ed esterne della stessa fossero pulite da impronte e o impurezze Gli spettri sono stati ottenuti grazie al software Cary UV Vis i dati relativi sono stati successivamente esportati ed elaborati con i programmi Excel 2003 ed Origin 6 0 4 4 1 2 Indice di Rifrazione Sempre con lo stesso intento si sono misurati anche i rispettivi indici di rifrazione Per la loro misurazione stato utilizzato il rifrattometro di Abbe Come mostrato in Figura 4 1 questo strumento costituito da un sistema di due prismi di cui uno mobile 2 in Fig 4 1 ed uno inamovibile 1 in Fig 4 1 che distano fra loro circa 0 15 mm quando sono sovrapposti una sorgente di luce diffus
240. nnettivo nella quale si trovano cellule come i fibroblasti e una matrice extracellulare semigel nella quale si trovano immerse numerose fibre di collagene e di elastina 4 5 In esso si possono individuare due differenti strati lo strato reticolare e lo strato papillare che differiscono tra loro per il quantitativo di fibre presenti 6 Nel derma come stato accennato sopra si trovano anche terminazioni nervose ed una fitta rete di capillari importanti per la nutrizione della cute per la termoregolazione e per l immunoprotezione grazie alla presenza di cellule immunitarie come mastociti e macrofagi 5 Infine l ultimo strato rappresentato dall ipoderma detto anche tela sottocutanea Esso costituito da tessuto connettivo lasso situato tra il derma e la fascia Muscolare ma si differenzia dal derma per la presenza di adipociti strutturalmente consta della sovrapposizione di tre strati lo strato profondo lo strato intermedio e lo strato superficiale 7 La Figura 1 1 permette di comprendere meglio l organizzazione in strati della cute Introduzione Strato corneo __ Pori Strato granuloso Strato spinoso Terminazione nervosa hiandola sebacea Tessuto connettivo Derma Follicolo pilifero Ghiandola Nervo endocrina Tessuto 4 Arteriole sottocutaneo Venule Figura 1 1 Struttura della cute Nella figura vengono mostrati i diversi strati che costituiscono la cute Adattato da 5
241. no l utilizzo di solventi organici come il metanolo di un criotrattamento abbinato all utilizzo del Metanolo di microprovette filtranti Amicon di cartucce Spe ed infine della metodica del Folch Inoltre l efficacia dei diversi trattamenti deproteinizzanti stata testata attraverso l utilizzo del kit NanoOrange di quantificazione proteica ed attraverso la realizzazione di spettri UV Vis Infine questa tesi si pone anche l obiettivo di ricercare un Metodo di separazione in HPLC del farmaco in esame per la quantificazione dello stesso Lo scopo stato quello di trovare una metodica che permettesse un trattamento minimo del campione derivante dall esperimento di veicolazione transdermica In letteratura sono stati trovati alcuni lavori sulla quantificazione dell Ibuprofene sodico che hanno mostrato l utilizzo di metodiche molto differenti tra loro per tipo di fase Mobile utilizzata pH tipologia di tampone tempo di eluizione 10 11 15 16 Come verr meglio esposto nei successivi paragrafi sono state effettuate diverse prove per riuscire ad ottenere un Metodo validato di separazione ed stata inoltre elaborata una retta di calibrazione che ha permesso la quantificazione di campioni con concentrazione incognita Ci ovviamente ha anche richiesto uno studio attento di alcune caratteristiche chimico fisiche del farmaco Quantificazione proteica_Kit NanoOrange_ 2 Kit NanoOrange 2 1 Introduzione stato sviluppato un nuovo met
242. no mostrati gli spettri di tre soluzioni acquose le cui concentrazioni sono rispettivamente 2 125 0 26 e 0 033 mg mL Dalle Figure 4 14 4 16 si pu notare che nei tre solventi il massimo di assorbimento dell InuNa sempre posizionato a 265 nm e non varia con la diluizione Il picco di assorbimento non simmetrico ma presenta una spalla a destra ca 275 nm forse un p pi evidente in TF 25 Nella Tabella 4 11 sono riassunte le intensit di assorbimento in funzione della concentrazione di IbuNa a 265 nm 1i 118 Hplc Tabella 4 11 Assorbanza a 265 nm del lbuNa in condizioni differenti Concentrazioni mg mL Fig Lotto Solv 2 125 1 000 0 500 0 265 0 250 0 125 0 063 0 033 1 764 0 897 0 514 0 302 1 700 0 856 0 431 0 214 0 108 0 054 0 141 4 15 1 PBS Osservando i valori appena proposti e creando un grafico che non si mostra si pu concludere che i valori decrescono proporzionalmente con le concentrazioni Inoltre le assorbanze in TF 25 a parte 0 207 u a di ABS seguono l andamento degli altri valori Se non si fosse a conoscenza del fatto che sono tre soluzioni differenti e che sono stati usati due lotti differenti si potrebbe dire che stiamo guardando un triplicato di una stessa soluzione Nella Figura 4 17 si mostra un confronto degli spettri di assorbimento UV Vis del primo Fig 4 17 sinistra e secondo Fig 4 17 destra lotto di IbuNa disciolto in WMQ prima 0 h e dopo conserv
243. nte B 27 mL di WMQ e 0 06 mL del componente A Per il calcolo del volume totale della WS da preparare stata considerata sia la soluzione necessaria per l allestimento della curva di calibrazione 17 ML sia quella utile per la preparazione delle tre madri a diversa concentrazione 12 ML Inoltre in tale quantificazione stato tenuto conto di una percentuale aggiuntiva di volume del 4 necessaria per poter prelevare correttamente anche le ultime aliquote A causa della natura schiumogena della WS la miscela stata delicatamente agitata per inversione manuale non completa per di bagnare il tappo Quantificazione proteica_Kit NanoOrange_ Successivamente sono state preparate tre soluzioni madre di Albumina ABS1 ABS2 e ABS3 La madre a concentrazione 10 ug mL ABS1 stata preparata pipettando 30 uL del componente C e 5970 uL di WS in una bottiglietta rivestita di carta stagnola che stata opportunamente agitata manualmente per inversione totale utilizzando del parafilm come tappo La madre a concentrazione 1 ug mL ABS2 stata ottenuta dalla miscelazione di 300 uL di ABS con 2700 uL di WS come descritto precedentemente Infine Ia madre a concentrazione 0 1 ug mL ABS3 stata preparata con lo stesso procedimento delle altre due ma utilizzando 300 uL di ABS2 e 2700 uL di WS In seguito tutti i campioni indicati in Tabella 2 1 sono stati allestiti con lo stesso criterio adottato per la preparazione delle madri Tabella 2
244. nteresse 3 4 4 Analisi dei campioni di cute deproteinizzati In seguito ai trattamenti di deproteinizzazione i campioni sono stati analizzati allo spettrofotometro UV Vis e o verificata l efficacia del trattamento attraverso l utilizzo del kit NanoOrange Cap 2 Analisi spettrofotometrica UV Vis il campione deproteinizzato 1 mL stato trasferito all interno della cuvetta ed stato analizzato allo spettrofotometro L analisi stata effettuata in seguito al completamento dell inizializzazione dello strumento ed alla verifica della sua calibrazione Nell impostazione dei parametri stata presa in considerazione la capacit di assorbimento nella regione spettrale compresa tra 1100 e 190 nm Gli spettri sono stati ottenuti grazie al software Cary UV Vis i dati relativi sono stati successivamente esportati ed elaborati con i programmi Excel 2007 ed Origin 6 0 Inoltre prima di ciascuna analisi Ia cuvetta stata lavata ripetutamente con WMQ e asciugata opportunamente prestando attenzione all assenza di impronte digitali pelucchi e goccioline di WMQ Infine prima di ciascun campione stato effettuato lo spettro del relativo bianco Degradazione e deproteinizzazione della cute 3 5 Presentazione e discussione dei risultati Nel seguente capitolo saranno descritti e discussi i risultati degli esperimenti fatti per mettere a punto il protocollo definitivo per la deproteinizzazione della cute seguendo l ordine cronol
245. o a pH 7 importante per il nostro campione d interesse che si trover appunto disperso in questa fase in quanto derivante da un esperimento di veicolazione transdermica Le altre differenze riguardanti gli altri parametri di analisi verranno analizzate per semplicit in modo schematico Tipo di tampone utilizzato in letteratura sono stati trovati dei lavori in cui si utilizza il tampone fosfato di potassio 61 62 ma in alcuni casi si tratta di fosfato di sodio 13 16 15 e in altri di fosfato acetato 62 La scelta per la messa a punto della nostra metodica Hplc ricaduta sul fosfato di potassio che era gi a nostra disposizione in laboratorio ed stato utilizzato senza nessun timore di precipitazione in quanto gli studi di Schellinger et al 58 hanno posto i limiti di concentrazione e pH tali per cui non si andasse incontro a nessun tipo di problema durante l analisi ctomatografica pH gli autori tendono a lavorare con una metodica in cui il parametro del pH tendenzialmente acido e non neutro come le condizioni da noi richieste 62 La scelta effettuata nel nostro laboratorio ha preferito utilizzare un pH neutro che rispecchiasse il pi possibile le condizioni sperimentali di veicolazione transdermica 13 64 Pertanto in colonna era atteso un comportamento intermedio tra le due possibili situazioni riguardanti le analisi di composti acidi come nel caso del nostro campione a pH basico diminuisce la ritenzion
246. o nel Paragrafo 3 4 2 sono stati preparati tre diversi campioni il primo composto da 0 5 mL di cute in collagenase e 0 5 mL di IbuNa in WMG il secondo costituito da 0 5 mL di Collagenase e Degradazione e Deproteinizzazione della cute D BPS e da 0 5 mL di IbuNa in WM amp infine il terzo era solamente cute in Collagenase che stato considerato il bianco del primo campione Dopo qualche minuto di spipettamento 0 5 mL del campione 1 ML sono stati messi a contatto con la soluzione Folch 8 mL di cloroformio e 4 mL di MeOHe 4 mL WMG e sono stati seguiti tutti i vari passaggi come descritto nel Paragrafo 3 4 3 5 Successivamente sono stati eseguiti gli spettri delle due fasi di ciascun campione per andare a monitorare in quale delle due si fosse distribuito il farmaco d interesse La Figura 3 21 A mostra la sovrapposizione degli spettri ottenuti dalla fase metanolica mentre nella Figura 3 21 B rappresentata la fase cloroformica dei tre campioni analizzati MeOH Ibu Cute Collagenase CHCI3 Ibu Cute Collagenase MeOH Ibu Collagenase CHCIS Ibu Collagenase MeOH Cute Collagenase CHCIS Cute Collagenase es LI 32 Lui N H S 2 2 5 pa n lt q Assorbanza u a 200 400 600 800 1000 1200 200 400 600 800 1000 1200 Lunghezza d onda nm Lunghezza d onda nm Figura 3 21 Spettri tal quali della fase metanolica A e della fase cloro formica B Se si analizzano gli s
247. odo di quantificazione proteica basato sul legame di un colorante fluorescente alle proteine dalla semplice esecuzione rapido e sensibile 1 7 Il metodo NanoOrange perci attraente per il suo potenziale uso su una stazione robotizzata di pipettaggio per eseguire analisi proteiche automatizzate che potrebbe poi integrarsi con altre reazioni biochimiche automatizzate per la scoperta di farmaci 1 7 In questo capitolo vengono elencati i materiali e gli strumenti utilizzati per la quantificazione delle proteine Vengono anche descritte le metodiche e le modalit di allestimento degli esperimenti condotti Infine vengono anche mostrati e commentati i risultati ottenuti 2 2 Materiali Prodotti chimici In generale tutti i prodotti chimici sono stati conservati come prescritto dal produttore ed utilizzati senza nessuna ulteriore purificazione o reazione chimica Laddove questa frase non fosse soddisfatta sar indicato nel testo la motivazione e l accorgimento attuato prodotti chimici usati sono Albumina bovina ABSL Sigma il Kit NanoOrange per la quantificazione delle proteine Invitrogen lotto 1 n 50468A lotto 2 n 50985A lotto 3 n 871269 in ordine di arrivo che costituito da tre componenti Il kit comprende infatti il reagente Componente A 1 mL 500x DMSO il diluente Componente B 50 mL 10x contenente sodio azide 2 mM e lo standard di albumina bovina BSA Componente C 500 uL 2 mg mL contenente sodio azide
248. ogico in cui sono stati ottenuti 3 5 1 Dissoluzione della cute Gli esperimenti sono iniziati sulla base di ci che veniva detto da B Brown 13 secondo il quale la cute doveva essere sminuzzata con dei bisturi e Messa a contatto con una soluzione di Collagenase IV 3650 IU g di cute alla quale era necessario aggiungere una soluzione salina di Hank a pH 7 4 Successivamente era prevista un incubazione in un bagnetto a 37 C per 15 h In seguito era necessario allestire una soluzione costituita da 0 7 mL di campione e 0 3 mL di MeOH per poi procedere con una centrifugazione a 13500 rpm per 10 minuti Infine si analizzava il surmatante Nel nostro laboratorio tale protocollo stato adattato rispetto al materiale di cui eravamo gi in possesso Infatti stata utilizzata la Collagenase Il e la soluzione salina Dulbecco in sostituzione alla Collagenase IV e alla soluzione salina di Hank La cute umana utilizzata nel corso dell esperimento di veicolazione transdermica stata sminuzzata Par 3 4 2 e messa a contatto con la soluzione di Collagenase ll Par 3 4 2 La dissoluzione effettuata da Brown et al favorita da una temperatura di incubazione di 37 C ma nel corso dei nostri esperimenti sono state testate anche la temperatura ambiente e la temperatura di 4 6 C del frigo Infatti la cute sminuzzata stata divisa in tre bottigliette identiche delle quali una stata messa in stufa una in frigo e l ultima stata manten
249. oluzioni vengono filtrate in assenza di movimenti dell aria i e finestre chiuse condizionatore spento e da un operatore che veste sempre adeguatamente Nella stragrande maggioranza dei casi le soluzioni cos preparate sono state direttamente inserite nell apposito alloggiamento dello strumento e di seguito analizzate Solo in alcuni casi in cui l analisi stata ripetuta i campioni utilizzati sono rimasti all interno delle vial nell alloggiamento dello strumento a temperatura ambiente ed al riparo dalla luce per non pi di venti giorni fino alla ripetizione dell analisi Qualitativamente parlando le soluzioni iniettate contenevano una delle 17 FM Tab 4 1 ACN IWMQ rapporti variabili fino ad un massimo contenuto in acqua del 20 MeOH WMa rapporti variabili fino ad un Massimo contenuto in acqua del 20 IbuNa in FM 1 17 DicloNa in FM 1 17 IbuNa e DicloNa in FM 1 2 e 17 4 4 8 Soluzione salina tamponata in tampone fosfato La soluzione salina di sodio e potassio cloruro in tampone fosfato PBS stata preparata sciogliendo una pastiglia di PBS T per ogni 200 mL di WMQ La miscela stata successivamente sottoposta ad agitazione con agitatore Magnetico per favorire la sua solubilizzazione A dissoluzione avvenuta il PBS possiede un pH di 7 4 e come riportato in etichetta cos composto tampone fosfato contenente KH PO e Na HPO 0 01 M cloruro di potassio 0 0027 M e cloruro di sodio 0 137 M 4 5 Molecole mo
250. oncenitazione WMQ PBS TF 50 FM 2 TF 25 FM 17 mg mL 0 000 21 6 26 17 15 5 6 1 1 000 22 6 25 14 21 4 2 1 000 22 6 26 16 25 4 IbuNa Valori di Temperatura C Lotto SACRA WMQ PBS TF 50 FM 2 TF 25 FM 17 mg mL 0 000 25 2 25 0 25 1 23 6 23 5 23 7 25 0 1 1 000 23 4 23 7 23 5 23 6 23 5 23 4 2 1 000 23 4 23 4 23 2 23 4 23 4 23 5 4 8 1 3 Punto di fusione Il punto di fusione di una sostanza rappresenta la temperatura alla pressione atmosferica nella quale si ha contemporaneamente la presenza della fase liquida e di quella solida ed una costante per ogni composto Esso risulta essere anche un metodo sperimentale per ottenere utili informazioni sulla identit purezza e stabilit al calore di una sostanza 41 Infatti piccole quantit di impurezze eventualmente presenti determinano un abbassamento del punto di fusione oppure un incremento del range di temperatura di fusione 0 5 1 C che rappresenta invece l intervallo di fusione per le sostanze pure Ad ogni modo si pu affermare che pi il punto di fusione si avvicina al valore tabulato riferito ad una determinata sostanza e pi essa pura 41 Inoltre l identificazione di una sostanza pu essere eseguita attraverso la determinazione del punto di fusione in miscela In questo caso per verificare che due 107 108 Hplc sostanze siano identiche una piccola quantit della sostanza incognita A viene miscelata con un adeguata qu
251. oncludere che la conservazione in armadio semplice suggerita dalla casa madre non sia adeguata Figura 4 6 Aspetto macroscopico dell IbuNa lotto 1 a sinistra e lotto 2 a destra 4 8 1 2 pH In Tabella 4 7 vengono riportati i valori di acidit delle soluzioni maggiormente utilizzate con e senza IbuNa entrambi i lotti Prima di qualsiasi analisi dei dati si vuole precisare che tutti i solventi ad eccezione dell VMQa erano stati preparati prima delle misure inoltre i tamponi TF 50 e TF 25 come le FM derivanti contengono fosfati per HPLC il PBS non Hplc filtrato mentre l WMQ stata acquisita il giorno in cui si sono preparate le soluzioni supplementate con IbuNa I dati rivelano che i l aggiunta dell ACN al tampone fosfato fa aumentare il pH proporzionalmente alla quantit di sali fosfato presenti nel tampone L aggiunta di IpuNa ad una quantit molto alta per HPLC 1 mg mL alle FM 2 e FM 17 non varia di molto il pH sembrato invece curioso la modificazione dei millivolt registrati insieme al pH per i campioni in TF 25 e FM 17 vedi confronto delle due serie e per la quale non abbiamo una spiegazione Tabella 4 7 Acidit di alcune soluzioni di lbuNa IbuNa Valori di pH Lotto Concenienone WMQ PBS TF 50 FM 2 TF 25 FM 17 mg mL 0 00 6 77 7 42 6 84 7 00 7 60 7 00 7 39 1 1 00 6 78 7 43 6 86 7 58 6 94 7 38 2 1 00 6 86 7 38 6 86 7 61 6 87 7 38 IbuNa Valori di mV Lotto C
252. ondizionamento dello strumento In modo particolare sono state testate anche le pressioni registrate nelle diverse condizioni di allestimento del sistema previo utilizzo per verificare le condizioni della colonna e dei suoi accessori per assicurare un ottimo funzionamento Pertanto stato stabilito che le pressioni che attestano le ottime condizioni del circuito corredato di colonna e dei suoi accessori nella sua fase di conservazione sono rispettivamente 40 e 70 bar per 0 5 e 1 0 mL min Questo significa che in seguito alle analisi dei campioni e dei rispettivi lavaggi la pressione sempre stata controllata per verificare se fossero state ripristinate le condizioni basali prima di un successivo esperimento In caso contrario sempre stato avviato un ulteriore lavaggio metodi di pulizia dello strumento allestiti sono stati cinque Tab 4 3 differenti tra loro esclusivamente per la diversa durata delle fasi La scelta di uno piuttosto che un altro stata fatta basandosi sul numero e sul tipo di campioni analizzati e soprattutto sulla pressione raggiunta alla fine delle analisi possibile affermare che qualsiasi lavaggio eseguito ha sempre ripristinato le condizioni basali iniziali Successivamente stato studiato il comportamento dei componenti della fase mobile variando le loro percentuali all intero del range 27 73 30 70 v v per capire quale fosse la pi adatta per le nostre analisi Il risultato delle varie prove ha portato
253. one che esclude la colonna ed i suoi accessori condizione U Si pu notare quanto segue i le pressioni sono ragionevolmente basse in tutti i sei casi in quanto il circuito libero da ostacoli ii aumentando il flusso di una delle tre fasi Mobili investigate la pressione aumenta di alcuni bar i e 3 7 bar ma questo aumento pressorio non costante e varia in funzione della fase mobile e della sua viscosit ragionevole infatti pensare che maggiore sar la viscosit del mezzo che fluisce nel circuito dello strumento maggiore sar la resistenza al flusso e quindi maggiore sar la pressione registrata Nel manuale della colonna 48 i valori di viscosit indicati per i tre solventi a 20 C sono WMQ 1 cP ACN 0 37 cP MeOH 0 60 cP ACN WMQ 80 20 0 48 cP MeOH WMQ 80 20 1 11 cP di cui le ultime due sono calcolate dal grafico presente nel manuale Si ricorda che variando i volumi in una miscela di due solventi la viscosit non si modifica linearmente in funzione dei loro rapporti volumetrici 48 Ad ogni modo le viscosit riportate sono in accordo con le pressioni registrate dallo strumento Tab 4 15 Un rialzo pressorio importante in queste condizioni pu significare la presenza di sporcizia o cristalli in qualche parte del circuito metallico oppure l intasamento progressivo del FRIT i e un filtro che viene attraversato dalla fase mobile in uscita dalla camera di miscelazione Noi ad ogni modo nel periodo d
254. oni in HPLC c WMQ con due metodiche pi risolutive 101 102 Hplc Inizialmente sono stati registrati e confrontati gli spettri di assorbimento UV Vis nel range di lunghezze d onda 190 1100 nm Fig 4 4 Pur essendo gli spettri non azzerati si pu notare che gli stessi sono perfettamente sovrapposti e non parallelamente sfalzati problematica tecnica dello strumento Osservando attentamente gli spettri si pu notare che alla lunghezza d onda di 190 nm gli spettri di WMQ in rosso e c WMQ in nero presentano rispettivamente un assorbimento di 0 42344 e di 0 49187 u a e quindi una differenza relativa pi importante di 0 068 unit di assorbimento Il picco presente intorno a 1000 nm caratteristico dell acqua Pertanto si potrebbe concludere che le due acque non sono molto diverse dal punto di vista della presenza di sostanze che assorbono in questa regione spettrale Inoltre sempre per lo stesso ragionamento l acqua prodotta in laboratorio MMQ dovrebbe essere leggermente pi pura acquasigma acqualab 200 400 600 800 1000 Lunghezza d onda nm Figura 4 4 Confronto degli spettri di assorbimento UV Vis dell acqua prodotta in laboratorio acqualab WMQ in rosso e di quella comprata acquasigma c WMQ in nero Successivamente stato confrontato l indice di rifrazione delle due acque Questo para metro rappresenta un fattore molto importante sia nell identificazione di molecole
255. operta dal solvente ed il segnale del protone dell OH se eventualmente fosse presente la forma libera dell acido scomparirebbe a causa del rapido scambio con il deuterio L unica osservazione che pu essere fatta che i picchi presenti confermano l effettiva struttura dell Ibuprofene e che non esistono particolari differenze riscontrabili tra i tre diversi spettri w5 116 Hplc 4 7 1 6 Assorbimento UV Vis e curve di calibrazione Questo paragrafo consta di una parte di analisi di tipo semi qualitativo e di un altra di tipo quantitativo Analisi semi qualitativa Si ricorda che tutti gli spettri presentati in questa sezione sono azzerati a 350 nm e normalizzati rispetto alla soluzione in cui l IbuNa si trova disciolto che viene presa come bianco anch essa azzerata Nelle Figure 4 14 4 16 possibile confrontare l aspetto degli spettri UV Vis di una soluzione di IbuNa lotto 1 e 2 in WMQ PBS e TF 25 Ibu L1 in WMQ 1 Ibu L2 in WMQ 1 Ibu L1 in WMQ 2 Ibu L2 in WMQ 2 Ibu L1 in WMQ 3 Ibu L2 in WMQ 3 Ibu L1 in WMQ 4 Ibu L2 in WMQ 4 Ibu L1 in WMQ 5 Ibu L2 in WMQ 5 Ibu L1 in WMQ 6 Ibu L2 in WMQ 6 Ibu L1 in WMQ 7 Ibu L2 in WMQ 7 Ibu L1 in WMQ 8 lbu L2 in WMQ 8 Ibu L1 in WMQ 9 Ibu L2 in WMQ 9 Assorbanza u a Li EJ fd N F ke d d lt 200 220 240 260 280 300 320 340 360 200 220 240 260 280 300 320 340 360 Lunghezza d onda nm Lunghezza d onda nm Figura 4 14 Spettro UV Vis
256. orbimento maggiore raggiungendo il range di ca 30 000 32 000 unit arbitrarie L analisi dei rapporti IbuNa L2 DicloNa ai tre tempi conferma l andamento crescente all aumentare della permanenza in stufa 0 371 vs 0 427 vs 0 448 Inoltre il limite di rivelamento stimato che ha permesso una corretta integrazione a tutti i tempi stato 0 12 ug mL tranne nel caso della Tabella 4 31 0 24 ug mL In conclusione anche possibile interpretare l incidente commesso dall operatore durante la composizione della fase mobile premiscelata la quale ha comportato un anticipo dei tempi di ritenzione dei farmaci grazie ai risultati ottenuti negli esperimenti precedenti Infatti avendo ottenuto un anticipo possibile ipotizzare che nella fase mobile fosse presente una maggior quantit di solvente organico il quale comporta un movimento dei picchi verso sinistra Esperimento 2 Curva di calibrazione n 4 stufa 0 ore 254 nm I dati mostrati in Tabella 4 39 indicano che 1 i tempi di ritenzione dell IbuNa L2 risultano essere compresi tra 7 6 7 9 minuti per le concentrazioni comprese tra 3 84 0 12 ug mL mentre si oscilla anche sino a 7 4 minuti per le concentrazioni 7 69 e 0 06 ug mL Rispetto ai dati mostrati in Tabella 4 17 si pu osservare che risultano essere ritardati ca di 6 9 secondi i e 7 04 min 2 Le aree dei 9 campioni di IbuNa L2 mantengono un rapporto molto vicino al valore 2 sino alla concentrazione 0 48 ug mL olt
257. organici Casa editrice Ambrosiana 2010 seconda edizione Spettrometria infrarossa pp 83 109 L M Oberoi K S Alexander amp A T Riga Study of interaction between ibuprofen and nicotinamide using differential scanning calorimetry spectroscopy and microscopy and formulation of a fast acting and possibly better ibuprofen suspension for osteoarthritis patients Journal of pharmaceutical sciences 94 2005 pp 93 101 N B Colthup L H Daly amp S E Wiberley Carbonyl compounds In Introduction to infrared and Raman spectroscopy 1990 3rd ed chap 9 pp 317 319 R M Silverstain F X Webster D J Kiemle Identificazione di composti organici Casa editrice Ambrosiana 2010 seconda edizione Spettrometria NMR protonica pp 198 177 Decades of experience and innovation in chromatography reversed phase HPLC Manuale sull HPLC in fase inversa Macherey Nagel pag 30 Tecnico specializzato della Sigma Aldrich 05 07 2013 email Tecnico specializzato della Macherey Nagel 10 07 2013 email Transgenomic the power of discovery User guide for organic acids analysis column Pag 9 3 3 Decades of experience and innovation in chromatography reversed phase HPLC Manuale sull HPLC in fase inversa Macherey Nagel pag 21 Assistenza del tecnico specializzato della Shimadzu 14 06 2012 intervento personale allo strumento Decades of experience and innovation in chromatography reversed phase HPLC Manuale sull HPLC
258. pH 4 e si annotano i medesimi valori sopra citati Tutti questi valori sperimentali servono per calcolare il parametro indicato nel manuale dello strumento con il termine Slope che indica il grado di bont della calibrazione e viene calcolato utilizzando l equazione 2 E E n xS Slope 100 teorico 2 dove E rappresenta i mV rilevati dallo strumento quando la sonda immersa nella soluzione a pH 4 E i mV relativi alla soluzione a pH 7 S teorico invece un valore relativo alla temperatura rilevata dallo strumento e viene calcolato con l equazione 3 la quale stata realizzata per regressione lineare di alcuni dati di temperature forniti dalla ditta madre deg rico B 3 dove A e B sono i parametri forniti dalla regressione lineare Origin 6 0 ed equivalgono rispettivamente a 54 26 e 0 196 Infine Y la temperatura rilevata dallo strumento nel momento dell analisi Quando il valore dello Slope compreso tra 95 e 102 e l E tra 15 e 15 significa che lo strumento possiede una buona calibrazione Nei pochissimi casi in cui questi valori sono risultati inferiori stato necessario immergere la sonda nella soluzione standard a pH 4 per alcune ore e poi procedere al controllo dei valori sopra indicati Inoltre prima di ogni utilizzo stato sempre controllato il livello della soluzione elettrolitica all interno della sonda e ove necessario lo stesso
259. pari dove un p lt 0 05 stato considerato significativo Quantificazione Proteica_Kit NanoOrange_ 2 5 Presentazione e discussione dei risultati Nei seguenti paragrafi saranno descritti e discussi i risultati degli esperimenti fatti per mettere a punto il protocollo definitivo per la quantificazione proteica seguendo l ordine cronologico in cui sono stati ottenuti 2 5 1 Esperimenti sul protocollo originario La prima curva di calibrazione realizzata utilizzando il kit vecchio ha seguito ci che stato descritto nel Paragrafo 2 4 3 1 con la sola eccezione della misurazione dei bianchi delle cuvette in plastica Par 2 4 1 in singola lettura Per l esperimento sono stati preparati e analizzati gli undici campioni Par 2 4 3 dei quali sono stati quantificati 2 dei 2 5 mL di volume totale del campione vedi oltre Fig 2 1 A Successivamente stata analizzata anche una parte del volume rimanente 0 2 ML per effettuare un ulteriore analisi con le cuvette in vetro delle quali per non erano noti i valori dei bianchi vedi oltre Fig 2 1 B In seguito sono stati elaborati i dati di entrambe le analisi Par 2 4 3 1 La Tabella 2 3 mostra i valori di fluorescenza ottenuti dalle due Modalit di lettura dei campioni con i due diversi tipi di cuvette e la loro elaborazione Matematica possibile notare al suo interno la presenza di quattro colonne di dati a loro volta suddivise per i campioni analizzati in cuvette di plastica
260. perimento 2 Pertanto stato eseguito un calcolo percentuale prendendo in considerazione le aree dell IbuNa L2 e non i rapporti come fatto precedentemente Il risultato e g 7 69 ug mL ottenuto mostra un incremento dell 8 9 ad entrambe le lunghezze d onda ma che tende a variare nelle altre concentrazioni i e 3 84 ug mL 3 3 12 Per verificare l attendibilit del calcolo stata calcolata la percentuale anche sull analisi effettuata a zero e 24 ore dell esperimento 1 per la concentrazione 7 69 ug mL Il risultato stato molto simile a quello ottenuto utilizzando i rapporti tra i due farmaci 21 8 vs 20 Infine se consideriamo le due lunghezze d onda stato notato sicuramente un assorbimento maggiore della molecola a 265 nm il quale per non aumenta il limite di rivelamento Infatti sebbene non siano stati risolti i problemi riscontrati per i 254 nm stato notato come vantaggio la pulizia del cromatogramma ed una maggior facilit nell integrazione dei picchi d interesse 171 172 Hplc Esperimento 1 Tabella 4 24 Dati dei cromatogrammi della retta di IbuNa L2 di controllo assieme al DicloNa a 254 nm IbuNa L2 Conc lbuNa Tempo min ripetizione ug mL iniziale finale TR Area Spalle 1 7 2 8 3 7 8 7 933 2 7 69 7 1 8 5 7 8 7 713 3 7 2 8 3 7 8 8 042 media TaD 8 4 0 1 7 8 10 0 7 896 0 167 6 1 7 1 8 2 7 8 4 137 Sx 2 3 84 7 3 8 3 7 8 3 902 3 7 1 8 3 7 8 4 131 media 7 2
261. pettri ottenuti possibile notare che nella Figura 3 21 A evidente un picco a 265 nm abbastanza consistente ma sorprende che ci sia un assorbimento simile anche nel campione di cute in Collagenase verde che non contiene il farmaco ipotizzabile che sia presente qualche sostanza che assorbe alla stessa lunghezza d onda dell IbuNa Nella Figura 3 21 B sono apprezzabili dei picchi nella nostra regione d interesse anche se di minor intensit necessario approfondire se si tratti del farmaco che si distribuito anche nella fase metanolica o si tratti di altre sostanze presenti nella soluzione che interferiscono Per tale motivo nell esperimento successivo sono stati allestiti dei campioni che rappresentassero i bianchi dei veri campioni di interesse per evitare di considerare anche altre sostanze nella quantificazione del farmaco Dal valore di assorbanza fornito dallo spettrofotometro si ottenuta la concentrazione del farmaco attraverso l utilizzo della curva di calibrazione La Tabella 3 14 mostra i risultati ottenuti dall esperimento le concentrazioni attese e le percentuali di farmaco recuperato rispetto al 100 Degradazione e deproteinizzazione della cute Tabella 3 14 Quantificazione Ibu Na nelle due fase del Folch Concentrazione ug ml Recupero Campione Metodo Teorica Trovata metanolo cloroformio metanolo cloroformio 1 Ibu Na cute 531 638 4 346 5 120 2 65 3 2 Ibu Na collag 944 901 2 268 4 95 5 28 4
262. polari Nonostante il loro eccellente risultato terapeutico tendono a provocare irritazione gastrica con conseguente ulcera causata delle incisioni nella mucosa per le alte dosi cliniche somministrate 11 Per tale ragione la veicolazione transdermica sarebbe il Metodo di somministrazione migliore che potrebbe avere parecchi vantaggi tra cui evitare tali effetti collaterali sopra citati 12 carrier prescelti per la veicolazione di questo farmaco sono delle nanoparticelle lipidiche NP con dimensioni nell ordine di alcune centinaia di nanometri In particolare saranno utilizzate delle nanoemulsioni NE e delle nanocapsule NC che si differenziano tra loro in quanto le prime possiedono una carica negativa fornita dalle teste lipidiche e le seconde una carica positiva conferita da un rivestimento polissacaridico che forma appunto la capsula In alcuni studi precedenti nei quali le NP sono state marcate con un lipide fluorescente stata riscontrata la presenza di fluorescenza nello strato corneo e nell epidermide vitale risultati che suggeriscono un effetto promotore dell assorbimento di questi carrier Pertanto lo scopo di questo studio quello di verificare innanzitutto se queste NP saranno in grado di trasportare quelle molecole che per loro natura non sarebbero in grado di attraversare lo strato corneo come nel caso dell ibuprofene sale sodico Inoltre si cercher anche di capire quanto farmaco possa rimanere nella cute per
263. ppe F D Andrea Tecniche spettroscpopiche e identificazione di composti organici Edizioni ETS Milano 2005 Sito web di Wikipedia Definizione di HPLC lt http www wikipedia org wiki cromatografia_liquida ad alta prestazione gt Consultato Novembre 2013 Shimadzu high performance liquid chromatograph LC 2010 AHT 2010CHT Manuale di istruzioni installazione e manutenzione dello strumento Shimadzu pp 52 53 Columns amp Supplies Catalogue Catalogo descrittivo sule colonne cromatografiche Macherey Nagel pp 120 122 Decades of experience and innovation in chromatography reversed phase HPLC Manuale sull HPLC in fase inversa Macherey Nagel pp 28 29 Sito web Wikipedia Definizione dell indice di rifrazione lt http www wikipedia org wiki indice di rifrazione gt Consultato Novembre 2013 Laboratory Product Guide Manuale Wnatman pp 18 Sito web per il test dell Epa lt http www epa gov osw hazard testmethods sw846 pdfs 1311 pdf gt Consultato Febbraio 2013 34 35 36 37 38 39 1994 40 1994 41 2013 42 Corning and Costar brand science products catalog Catalogo della Corning pp 107 109 Laboratory Product Guide Manuale Whatman pp 32 33 Sito web della Sigma Aldrich Certificato d analisi dell Ibuprofene sale sodico lt htt p www sigmaaldrich com catalog CerOfAnalysisPage do symbol 11892 amp Lo tNo 038K0755 amp brandTest FLUKA g
264. principali svantaggi della somministrazione orale come la degradazione del farmaco a livello gastro intestinale ed il Metabolismo di primo passaggio 2 Inoltre i sistemi transdermici non sono invasivi e possono essere addirittura auto somministrati possono fornire un rilascio per lunghi periodi di tempo fino ad una settimana e sono generalmente poco costosi Inoltre la veicolazione transdermica presenta anche vantaggi rispetto alle iniezioni ipodermiche che risultano essere dolorose generano rifiuti sanitari pericolosi e che potrebbero prevenire il rischio di trasmissione di malattie dovute al riutilizzo dell ago soprattutto nei paesi in via di sviluppo 1 Per comprendere meglio come avviene l assorbimento transcutaneo del farmaco occorre descrivere quella che la struttura della cute La cute costituita fondamentalmente da tre strati principali l epidermide il derma e l ipoderma L epidermide che rappresenta lo strato pi importante per la sua funzione di barriera nonch il pi esterno costituito principalmente da diverse cellule tra cui le pi numerose sono i cheratinociti Essa organizzata a sua volta in diversi strati dall esterno verso l interno troviamo lo strato comeo lo strato lucido presente solo nel palmo delle mani e dei piedi lo strato granuloso lo strato spinoso e lo strato basale che confina con il derma 3 Il derma si trova al di sotto dell epidermide Esso costituito da una lamina di tessuto co
265. protocollo la scelta di dodici cuvette con dei valori di fluorescenza del bianco molto vicini tra loro stata cos allestita la curva di calibrazione in triplicato come descritto nel Paragrafo 2 4 3 2 procedendo poi con l analisi e con la successiva elaborazione dei dati Par 2 4 3 1 L esperimento stato eseguito in due giorni successivi utilizzando il lotto seminuovo Le soluzioni madri e la WS sono state preparate al momento dell esecuzione dell esperimento e il secondo giorno nel quale stato allestita la curva anche la sera il kit rimasto a temperatura ambiente dalla mattina dello stesso giorno In Tabella 2 12 sono mostrati i valori ottenuti dall analisi delle tre repliche C1 C2 C3 la loro elaborazione e normalizzazione rispetto ai bianchi della cuvetta CN1 CN2 CN3 e del kit CF1 CF2 CF3 Quantificazione proteica_Kit NanoOrange_ Tabella 2 12 Risultati delle curve di calibrazione di 2 mL di campione Albumina W C CN CF ugimL 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 0 0 62 6 133 6 153 6 189 7 140 4 158 4 27 1 6 87 4 8 0 0 0 0 0 0 10 0 87 2 153 3 159 9 711 8 643 4 668 1 524 6 490 2 508 2 497 5 483 3 503 4 8 0 87 6 151 2 158 2 607 3 556 6 575 2 419 7 405 4 417 0 392 6 398 6 412 2 6 0 82 0 150 7 158 1 501 6 438 4 469 0 319 5 287 7 310 9 292 4 280 9 306 1 4 0 79 5 150 5 157 7 388 0 334 9 441 3 208 5 184 4 283 6 1814 177 5 278 8 3 0 75 2 148 8 157 5 328 8 281 6 293 6 153 7 132 9 136 1 126 6 126 0 131 3
266. ratura di fusione finale si abbassa di 0 7 C e di 3 C rispetto a quelle di IbuNa L e lbuNa L2 Le deviazioni standard sono cos piccole che trasformando questi dati in un grafico Fig 3 4 si nota come dal punto di vista matematico questi valori siano diversi fra loro Hplc O L o k 5 2 w i v A E 00 Lt L1 i L1 f L2 i L2 f M i M f Formulazioni Figura 4 7 Temperature iniziali e finali di fusione dei diversi lotti di lbuNa e della loro miscela In letteratura si trovato che il punto di fusione del sale sodico dell ibuprofene nella sua forma racemica di 199 6 C 42 e di 199 8 C 43 Il valore dato in questo ultimo caso la media dei valori di un range compreso tra 198 56 201 04 C 43 In entrambi i casi non viene specificato l intervallo di fusione Inoltre gli autori delle due pubblicazioni specificano che l IbuNa ha due molecole di acqua di cristallizzazione 42 43 quindi di idrato anche se venduto come se ne fosse privo Conclusioni i punti di fusione dei nostri lotti sono abbastanza vicini ai valori di fusione riportati in letteratura Sembrerebbe che tra i due il secondo lotto pi puro o contiene una quantit di umidit inferiore Ci concorda con l aspetto macroscopico delle polveri nei loro contenitori originali Fig 3 3 4 8 1 4 Spettroscopia IR Il sale dell Ibu stato sottoposto anche ad analisi IR Par 4 5 1 5 Si ricorda che sono stati analizzati i due lotti di
267. raw Molteplicit osservata e teorica d doppietto q quadrupletto s singoletto Aree cm Attribuzione Molteplicit Teorico IbuNa L1 IbuNa L2 IbuNa L2 135 H Ar d 2 2 15 2 18 2 14 H Ar d 2 2 24 2 26 2 19 CH q 1 1 02 1 02 1 03 CH2 d 2 2 25 2 23 2 21 CH s 1 1 00 1 00 1 00 CH d 3 3 35 3 33 3 34 CH d 6 6 60 6 53 6 59 Molteplicit osservata e teorica d doppietto q quadrupletto s singoletto Per quanto riguarda le molteplicit queste sono date dai fenomeni di accoppiamento che avvengono tra i protoni separati tra loro da non pi di 3 legami La molteplicit data in tutti questi casi dal numero dei protoni con il quale accoppia il protone in esame pi uno questo non viene rispettato per i protoni dell anello aromatico in quanto le costanti di accoppiamento sono differenti Pertanto nel caso in cui un protone sia accoppiato con 3 protoni vicini nella catena alchilica si avr un quadrupletto come nel caso del CH prossimale al gruppo carbossilico chemical shift teorico 3 81 ppm che accoppia con i 3 protoni del CH chemical shift teorico 1 45 ppm Si potrebbe anche discutere sulla molteplicit dei protoni aromatici ma non ci dilungheremo a riguardo In conclusione dall osservazione degli spettri non si possono dare informazioni relative alla presenza di umidit nel campione in quanto sono stati tutti registrati utilizzando come solvente acqua deuterata Pertanto l umidit se presente verrebbe c
268. razione solamente i diversi volumi possibili di campione ma hanno spaziato anche sulla concentrazione dello standard infatti oltre a 10 ug ml stata usata anche la soluzione madre di ABSL Pertanto stata effettuata un analisi in triplo di 80 uL di campione di ABSL1 e ABSL2 per vedere la differenza tra le due concentrazioni Nelle Tabelle 2 18 e 2 19 vengono riportati sia i dati relativi alla composizione del campione in termini di utilizzo di ABSL 2 e di WS e sia i valori ottenuti dall analisi effettuata col fluorimetro di bianco della cuvetta W campione C campione normalizzato rispetto alla cuvetta CN e campione normalizzato rispetto alla WS CF Tabella 2 18 Quantificazione proteica di 80 uL 10 ug mL_ripetuti_ Composizione uL Fluorescenza Albumina ug mL Campione ABSL WS W C CN CF Trovata Teorica bianco 0 2100 146 23 148 17 1 93 0 00 1 80 2020 149 00 164 23 15 23 13 30 0 44 0 38 2 80 2020 149 03 158 83 9 80 7 87 0 34 0 38 3 80 2020 149 17 185 07 35 90 33 97 0 85 0 38 dati ottenuti non sono risultati totalmente identici alla concentrazione attesa infatti per quanto riguarda la concentrazione pi bassa Tab 2 18 stata ottenuta una media di 0 54 ug mL questo significa che stata quantificata una concentrazione superiore a quella nota di 0 38 ug mL Quantificazione proteica_Kit NanoOrange_ Tabella 2 19 Quantificazione proteica di 80 uL 100 ug mL_ripetuti_ Composizione
269. razioni in entrambi gli esperimenti Tabella 2 6 Risultati delle curve di calibrazione di 0 2 mL di campione W C CN CF Campione Albumina Hg mL 1 2 1 2 1 2 1 2 I 0 0 1 6 4 3 3 15 4 2 1 6 0 1 0 0 0 0 2 10 0 3 7 3 0 22 1 30 7 18 4 27 7 16 8 27 8 3 6 0 4 9 3 7 19 4 21 7 14 5 18 0 12 9 18 1 4 3 0 1 2 2 4 10 7 10 4 9 6 7 9 8 0 8 0 5 1 0 2 0 3 6 4 7 3 9 2 6 0 3 1 1 0 3 6 0 6 4 6 3 2 2 6 3 6 2 0 0 4 3 6 0 5 7 0 3 4 1 3 1 5 4 3 7 1 3 0 6 DI 0 6 8 0 1 3 5 5 7 3 6 4 5 0 1 1 1 lb A1 9 0 06 2 7 3 0 3 5 3 4 0 8 0 4 0 8 0 5 10 0 03 1 2 3 0 2 1 5 1 0 9 2 1 0 7 29 11 0 01 3 9 3 5 3 4 3 5 0 5 0 9 22 0 8 Quantificazione Proteica_Kit NanoOrange_ Mentre nella Tabella 2 6 CF relativa alle cuvette in vetro si evince una scarsa ripetibilit tra le due repliche la presenza di fluorescenze negative soprattutto la mattina e una mancata proporzionalit tra le concentrazioni e le fluorescenze dati normalizzati CF sono stati poi utilizzati per una rappresentazione grafica mostrata nella Figura 2 2 La Figura 2 2 A mostra il grafico dei dati relativi alla ripetizione delle analisi effettuate con le cuvette di plastica mentre la Figura 2 2 8 illustra i grafici relativi all esperimento eseguito di mattina e di sera con le cuvette di vetro gt 08 11 11 Mattina m 08 11 11 Mattina 08 11 11 Sera 08 11 11 Sera Fluorescenza u a 3 a N E a d g o s u 6 Albumina pg mL Albu
270. re che prima dell essiccazione son presenti due picchi quello relativo al metodo in rosso e al metodo Il in nero che raggiungono un assorbanza di 3 5 e 10 u a rispettivamente In seguito alla permanenza in stufa gli spettri appaiono invece molto puliti e senza nessun picco significativo Nel corso dell esperimento inoltre stato preparato un campione di lbuNa in WMA a concentrazione nota 2 04 mg mL il quale stato seccato e risospeso in 2 5 ML di WMQ ed stato quantificato allo spettrofotometro Fig 3 18 Degradazione e Deproteinizzazione della cute Ibu Na 2 04 mg mL g A N S p 5 v v lt 200 400 600 800 1000 1200 Lunghezza d onda nm Figura 3 18 Analisi di Ibu Na a concentrazione nota 2 04 mg mL Lo spettro rappresentato in Figura 3 18 appare abbastanza pulito e dalla forma abbastanza regolare ma se si procede con la quantificazione del farmaco attraverso l utilizzo della propria assorbanza a 265 nm e la conversione in concentrazione attraverso l utilizzo della retta di calibrazione si ottengono 2120 7 ug mL ci significa che si quantifica una concentrazione superiore a quella realmente utilizzata 104 Data l incomprensione dela non corretta quantificazione del campione a concentrazione nota stata allestita un ulteriore retta di calibrazione dell IbuNa in WMQ utilizzando una soluzione Madre nuova appena preparata La Figura 3 19 A mostra la retta dell IbuN
271. re la quale si abbassa anche sino a 1 5 Nelle tre repliche successive si osservato che si sono avuti meno problemi nell integrazione dei picchi relativi alle basse concentrazioni Rispetto all area teorica di 8 500 unit arbitrarie 7 69 ug mL calcolata proporzionalmente in base al campione a concentrazione 1 000 ug mLl Tab 4 17 ed a quello a concentrazione 500 ug mL Tab 4 20 i campioni risultano essere in Media molto vicini i e 8 485 ad essa 3 La forma dei picchi del IbuNa L2 nei vari cromatogrammi n 9 x 3 non mostrati presenta una simmetria 1 4 Ll intervallo di concentrazione in cui stato possibile quantificare senza problemi l ibuNa L2 7 69 0 12 ug mL Le concentrazioni pi piccole non sarebbero quantificabili con precisione Pertanto nelle condizioni di questa analisi si pu affermare che il limite di rivelamento di ca 0 12 ug mL Continuando con l analisi dei dati in Tabella 4 40 si pu riassumere che Hplc i tempi di ritenzione del DicloNa risultano essere variabili tra 9 8 e 10 6 minuti Rispetto ai dati mostrati in Tabella 4 17 e 4 20 si pu osservare che queste ultime analisi risultano avere dei tempi anticipati i e 9 90 min Le aree dei 9 campioni del DicloNa nelle diverse repliche oscillano in un intervallo compreso tra 20 283 e 21 965 unit arbitrarie Pertanto sono molto vicine all area teorica 19 500 u a stimata per proporzionalit dal campione a concentrazione 1 000 ug mL
272. ri che esaltano i vantaggi dell utilizzo delle HybridSpe da sottolineare che risulta essere pi frequente l utilizzo delle piastre da 96 pozzetti al posto delle cartucce da noi prescelte 22 Moriarty et al 21 hanno eseguito Degradazione e deproteinizzazione della cute degli esperimenti a tal proposito utilizzando dei campioni di plasma nei quali sono andati ad identificare sostanze come serotonina dopamina e melatonina Durante i loro studi hanno utilizzato volumi inferiori di campione e di soluzione precipitante rispetto ai nostri testando come nel nostro caso il metodo dell acetonitrile e del metanolo combinati con l acido formico Addirittura hanno dimostrato un recupero migliore utilizzando entrambi i solventi contemporaneamente I loro risultati sono stati parecchio soddisfacenti esaltando un recupero del farmaco molto vicino al 100 Pertanto visti i nostri risultati sarebbe opportuno testare i due metodi utilizzati apportando delle modifiche al nostro protocollo facilitando la precipitazione offline da una breve centrifuga in minispin della durata di 10 minuti evitando la fase di essiccamento in stufa che potrebbe alterare qualche componente della soluzione e la seguente risospensione ed analizzando direttamente il campione raccolto in seguito alla filtrazione In questo modo si escluderebbero variabili importanti che potrebbero alterare il recupero del farmaco da quantificare 3 5 2 3 Metodica del Folch Per quanto riguar
273. risultato di una migliore pulizia della colonna nel caso B Proseguendo nell osservazione dell andamento pressorio della fase metanolica si nota in entrambi i casi un aumento di 1 e 4 bar tra il momento del crollo 220 min caso A e 420 min caso B e la fine di questa fase 320 min caso A e 620 min caso B L aumento pressorio di questa fase anche se di pochi bar pu essere dovuto alla fuoriuscita di qualche sostanza residua presente in colonna magari facilmente solubilizzata dal MeOH Fig 4 25 Nei 10 minuti successivi la fase MeOH W 73 27 si trasforma in ACN W 80 20 il flusso mantenuto a 0 5 mL min Possiamo osservare che la pressione scende di 50 bar nei due 131 132 Hplc casi A e B e che questa volta l abbassamento lineare ed dovuto al cambio della fase mobile ed alla presenza della Maggior percentuale di ACN Infine nell ultima fase di lavaggio 330 430 min caso A e 630 730 min caso B la pressione si Mantiene costante a 36 e 32 bar risp caso A e B Pertanto si pu concludere che pur partendo da condizioni pi svantaggiose il lavaggio medio riuscito a ripristinare le condizioni ideali di cui alla Tabella 4 15 Procediamo ora con l analisi della condizione rappresentata in Figura 4 25 C e D che prevede l aggiunta della CG al sistema cromatografico d utilizzo Nei primi 10 minuti la fase eluente cambia da ACN TF25 a ACN WMQ con un contemporaneo abbassamento del flusso da 1 0 a 0 5 mL mi
274. settembre possibile evidenziare che stato utilizzato lo stesso TF25 di agosto filtrato con i filtri di nylon tranne che per la retta delle 48 ore per la quale stato ripreparato ex novo risultati n 3 degli esperimenti introdotti sopra sono graficamente riportati in Figura 4 38 mentre i dati puntuali si trovano nelle Tabelle 4 24 4 50 155 156 Hplc m 0h254nm m 0h265nm 24h254nm 24h265nm A 48h254nm A 48h265nm gt w o s z 2 6 6 A 9 3 E4 2 J E E o G 6 Concentrazione ug mL Concentrazione ug mL a 0h254nm 0h265nm 48h254nm 5 48h265nm lag gt Area IbuNa L2 DicloNa Area IbuNa L2 DicloNa 5 6 T 8 4 5 6 7 8 Concentrazione g mL Concentrazione g mL Figura 4 37 Curve di calibrazione di louNa L2 dopo esposizione termica prove stufa In questa figura sono rappresentate le curve di calibrazione ottenute elaborando i cromatogrammi in HPLC delle diluizioni in FM 17 di IbuNa e DicloNa dell esperimento 1 e 2 alle lunghezze d onda di 254 nm Fig 4 37 1 A e 2 A e di 265 nm Fig 4 37 1 Be 2 B In questo esperimento si sono Messe a confronto cinque curve di calibrazione ottenute a distanza di 57 giorni l una dall altra Esperimento 1 e 2 a due lunghezze d onda differenti 254 e 265 nm Per facilitare l analisi dei dati si riportano singolarmente le valutazioni di ogni singolo esperimento Esperimento 1 Curva di calibrazione n 1 stufa 0 ore 254 nm I
275. solvente abbia in tempo di dissolvere i residui e trasportarli via Come indicato precedentemente Par 4 6 4 una volta al mese si deve procedere con il lavaggio profondo utilizzando WMQ 53 Nelle condizioni utilizzate per questo studio il lavaggio profondo in acqua permette la rimozione di eventuali residui di sali i e tampone IbuNa DicloNa e di ACN che sebbene di grado gradiente con il tempo potrebbe lasciare residui nel circuito 53 Per verificare che il lavaggio profondo sia stato effettivamente efficace esso seguito dai controlli delle pressioni basali in condizione U Nella nostra esperienza si trovato che le pressioni basali nella condizione U dopo lavaggio profondo WMQ oppure iPFOH seguito da WMG tornano ai valori indicati nella Tabella 4 15 Lavaggio della colonna e dei suoi accessori Il metodo di lavaggio stato scelto in base alle raccomandazioni in corsivo presenti nel manuale della colonna 54 Ovviamente gli accessori i e precolonna e colonna di guardia si lavano contemporaneamente alla colonna Prima di tutto si calcolato il volume della colonna utilizzando le informazioni presenti nel Paragrafo 4 6 2 e la seguente formula V mrxr xL dove V il volume della colonna mL r il raggio della colonna cm ed L la lunghezza della colonna cm Facendo le opportune sostituzioni si ottiene che il volume di 2 49 mL che possiamo approssimare per i calcoli successivi a 2 5 mL Conoscere il
276. spetto al suo bianco CN ed infine il campione normalizzato rispetto al bianco del kit CF Invece nella colonna adibita alle concentrazioni sono descritte quelle aspettate Teorica che tengono conto della diluizione dei microlitri di campione nella WS e quelle realmente quantificate Trovata ottenute elaborando la fluorescenza rilevata con i dati della curva di calibrazione Tabella 2 13 Analisi di campioni a concentrazioni note con madre 10 ug mL Composizione uL Fluorescenza Albumina ug mL Campione ASBL2 WS W Cc CN CF Trovata Teorica bianco 0 2100 193 17 176 60 16 57 0 00 0 00 0 00 1 84 2016 165 70 183 90 18 20 34 77 0 87 0 40 2 100 2000 165 77 189 30 23 53 40 10 0 97 0 47 dati ottenuti mostrati nella Tabella 2 13 evidenziano l ottenimento di concentrazioni che si discostano parecchio da quelle attese mostrando addirittura delle fluorescenze vicine al doppio del valore I giorno seguente stato ripetuto l esperimento lasciando l ABSL preparata a temperatura ambiente per tutta la notte per verificare se i risultati ottenuti il giorno precedente potessero essere stati influenzati dalla temperatura della soluzione Inizialmente stata ripetuta l analisi in singola copia dei volumi 84 e 100 uL corredati del loro bianco e nel corso della giornata sono stati ripetuti i medesimi campioni in Quantificazione Proteica_Kit NanoOrange_ duplice copia compreso il bianco per far in Modo di poter verif
277. spettro della Sigma Tab 4 9 Altri autori riportano per il sale di idrato uno stiramento asimmetrico con giaciture comprese nel range 1 540 1 650 cm 42 46 I segnali dell anello aromatico non vengono commentati sebbene presenti vedi Tab 4 9 Conclusioni Dal confronto tra gli spettri e tra i valori delle frequenze dei vari picchi si evince che il primo ed il secondo lotto non presentano palesi differenze tra loro mentre queste si osservano per il lotto 135 C Infatti osservando le frequenze Tab 4 9 si notano dei valori pi alti per il segnale dell OH associato dello ione carbossilato e per il segnale del doppio legame C C aromatico mentre valori pi bassi per il segnale del carbonile e per lo stiramento simmetrico dello ione carbossilato probabile che il trattamento termico post dissoluzione in etanolo possa aver degradato in parte il Composto Confrontando inoltre le giaciture dei tre spettri con quelle presenti nello spettro fornito dalla casa produttrice Sigma si nota che in quest ultimo presente il picco relativo all OH associato a 3 303 cm mentre non si nota il picco pi sottile dell OH libero si potrebbe dunque ipotizzare che l IbuNa sia per sua natura una sostanza igroscopica e che tenda ad assorbire umidit 4 8 1 5 Spettroscopia NMR Hplc 113 I campioni analizzati all IR sono stati studiati anche all NMR Nelle Figure 4 11 4 13 si riportano rispettivamente gli spettri H NMR di IbuNa L1 I
278. ssivi la fase MeOH W 73 27 si trasforma in ACN W 80 20 il flusso mantenuto a 0 5 ml min Possiamo osservare che la pressione scende di 71 e 49 bar nei due casi A e B e che questa volta l abbassamento lineare ed dovuto al cambio della fase mobile ed alla presenza della Maggior percentuale di ACN nella composizione Infine nell ultima fase di lavaggio 330 430 min caso C e 630 730 min caso D la pressione si Mantiene costante a 36 bar Nell insieme si potuto osservare che nonostante al termine delle analisi effettuate la pressione iniziale fosse pi alta nel lavaggio medio la pressione finale raggiunta con i due diversi lavaggi risulta essere la Medesima 36 bar Pertanto in questo caso saremmo portati a concludere che non c una grande differenza tra i due lavaggi quanto a risultati finali Tuttavia l esperienza ha mostrato che non sempre un lavaggio corto stato sufficiente a ripristinare le condizioni ideali mostrate in Tabella 4 15 se si analizza la Figura 4 25 prendendo in considerazione il lavaggio cortissimo Fig 4 25 A e C possibile notare che si ha una pressione di partenza che risulta essere pi alta nella condizione in cui presente la CG 128 vs 142 L aspetto interessante risulta essere il fatto che nonostante tale differenza la pressione finale raggiunta sia la Medesima 36 bar Nel corso della prima fase di lavaggio in ACN WMQ 27 73 200 min l abbassamento ammonta rispettivamente a 56 e 52 bar p
279. sso segnale 47 Un esempio pu essere fatto considerando i protoni dell anello aromatico che complessivamente danno origine a due segnali che cadono rispettivamente a circa 7 19 e 7 13 ppm L IbuNa infatti chimicamente un benzene para disostituito e presenta un asse di simmetria attraverso i sostituenti dell anello linea tratteggiata nella figura della Tab 4 10 In questo Modo i due protoni aromatici in posizione orto rispetto al sostituente che presenta il gruppo carbonilico sopra la linea tratteggiata possono essere inter scambiati l uno con l altro senza che si modifichi la molecola e per questo motivo sono detti equivalenti e vengono rappresentati dallo stesso segnale 47 Lo stesso accade per gli altri due protoni aromatici legati ai carboni in orto alla catena alchilica sotto la linea tratteggiata che daranno origine all altro segnale La presenza di questi due segnali Hplc molto semplice da individuare ed sempre indicativa del fatto che la molecola possiede un benzene con due sostituenti legati in posizione para tra loro 47 come nel nostro caso Tabella 4 10 Interpretazione degli Spettri NMR Chemical Shift ppm Attribuzione Molteplicit Teorico IbuNa L1 IbuNa L2 IbuNa L2 135 H Ar d 7 07 7 19 7 195 7 19 H Ar d 7 07 7 13 7 135 712 CH q 3 81 3 54 3 54 3 54 CH2 d 2 51 2 40 2 40 2 39 CH s 2 22 1 76 1 76 1 75 CH d 1 45 1 30 1 30 1 30 CH d 1 01 0 80 0 80 0 80 Calcolato con Chemd
280. stato sottoposto a lavaggio e la pressione finale era di 44 bar 160 bar iniziali pressione abbastanza vicina a quella di un circuito completamente pulito 36 39 bar Tab 4 15 Par 4 9 1 Inoltre si precisa che i le soluzioni madri preparate per le analisi tabulate in Tabella 4 20 4 23 sono state allestite utilizzando delle bottigliette in vetro e ii che stato necessario ricalcolare le concentrazioni dell IbuNa in quanto l aggiunta del DicloNa ai campioni ha apportato una diluizione al campione di IbuNa Tabella 4 20 Dati delle due rette di Iou Na e Diclo Na FM 2 1 0 mL min 254 nm IbuNa L1 Concentrazione Tempo min 4ug mL iniziale finale TR Area Spalle 500 7 5 9 4 7 79 544 233 Dx 250 7 6 9 4 7 88 277 184 Dx 125 7 6 9 4 7 93 141 362 Dx 62 50 7 6 9 4 7 95 72 430 31 25 7 6 9 4 7 96 35 982 15 63 7 6 9 3 7 97 18 213 7 81 Tal 9 7 7 99 9 583 3 91 7 6 8 4 8 01 4 689 1 95 7 7 9 4 8 04 2 711 0 98 7 5 8 9 8 02 1 434 0 49 7 5 8 5 8 03 877 0 24 7 6 8 5 7 96 427 0 12 7 8 8 3 7 98 655 0 06 7 8 8 2 7 96 368 0 03 7 8 8 2 7 94 165 DicloNa Concentrazione Tempo min 4g mL iniziale finale TR Area Spalle 500 10 1 12 7 10 46 9 978 567 Dx 250 10 2 12 8 10 70 5 028 281 Dx 125 10 4 12 6 10 91 2 540 513 Dx 62 50 10 5 12 8 11 03 1 272 070 Dx 31 25 10 5 12 8 11 05 642 518 Dx 15 63 10 6 12 7 11 08 324 387 Dx 7 81 10 6 12 7 11 07 164 619 Dx 3 91 10 5 12 9 11 23 85 813 Dx 1 95 10 5 12 9 11 34 46 460 Sx Dx 0 98 10 6 12 9 11 39 26
281. t infatti stato ottenuto un recupero del 70 e 22 5 per il Metodo e 33 2 e 45 per il metodo Il Infine possibile constatare che nell insieme i risultati ottenuti non mettono in evidenza alcuna costante L esperimento qui appena commentato stato realizzato mediante l utilizzo delle micropipette a volume variabile Eppendorf ed stato ripetuto lo stesso identico esperimento per testare l utilizzo delle micro pipette a volume variabile Gilson per verificare se il problema potesse essere la calibrazione di tali strumenti ed il conseguente prelevamento di diverse concentrazioni di farmaco Degradazione e deproteinizzazione della cute Tabella 3 10 Risultati dell IbuNa in WMQ e in TF25 nelle tre diverse condizioni Eppendorf lbuNa Campione Metodo ue i 1 300 Ibu in WMQ WMQ 2040 888 92 6 2 300 Ibu in TF25 WMQ 2040 2045 100 2 3 200 Ibu in WMQ WMQ 1360 354 99 6 4 200 Ibu in TF25 WMQ 1360 197 88 0 5 300 Ibu in WMQ seccato 2040 2134 104 6 6 300 Ibu in TF25 seccato 2040 921 94 2 7 200 Ibu in WMQ seccato 1360 332 97 9 8 200 Ibu in TF25 seccato 1360 368 100 6 9 Spe lbu Na WMQ 1 850 595 70 0 10 Spe lbu Na WMQ Il 567 188 33 2 11 Spe Ibu Na TF25 1 850 192 22 5 12 Spe lbu Na TF25 lIl 567 255 45 0 La Tabella 3 11 descrive i risultati ottenuti dai diversi trattamenti dell Ibu Na in WMQ e in TF25 possibile notare la concentrazione teorica la concentrazione trovata in seguito
282. t Consultato Aprile 2012 Sito web della Sigma Aldrich Certificato d analisi dell Ibuprofene sale sodico lt httjp www sigmaaldrich com catalog CertOfAnalysisPage do symbol 11892 amp Lo tNo BCBF3173V amp brandTest FLUKA gt Consultato Aprile 2012 sito web della Sigma Aldrich Certificato d analisi del Diclofenac sale sodico lt http www sigmaaldrich com catalog CertOfAnalysisPage do symbol D6899 amp L otNo BCBD6672V amp brandTest FLUKA gt Consultato Aprile 2012 Medicamenta pare monografica Vol 4 Cooperativa farmaceutica Milano settima edizione Ibuprofene pp 1232 1235 Medicamenta parte monografica Vol 4 Cooperativa farmaceutica Milano settima edizione Diclofenac sale sodico pp 129 132 Sito web della Buchi lt hitp www buchi it fileadmin upload_it AssistenteS pdf gt Consultato Novembre Lee Tu and Wang Yeh Wen Initial Salt Screening Procedures for Manufacturing lbuprofen Drug Development and Industrial Pharmacy 35 5 2009 pp 555 567 203 204 Bibliografia 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 R Censi V Martena E Hoti L Malaj P Di Martino Sodium ibuprofen di hydrate and anhydrous Study of the dehydration and hydration mechanisms Journal of thermal analysis and calorimetry 111 2013 pp 2009 2018 R M Silverstain F X Webster D J Kiemle Identificazione di composti
283. ta mV Figura 4 26 Lavaggio corto effettuato con colonna pre colonna e colonna di guardia andamento pressorio A e cromatogramma dell intensit acquisito a 254 nm B Come si pu notare nella prima fase di lavaggio 10 210 min il cromatogramma non presenta picchi Tuttavia questi sono presenti invece nella seconda 210 310 min e terza 320 430 min fase di lavaggio Questa osservazione permette di affermare che erano presenti delle sostanze che assorbono a 254 nm e che fuoriescono a partire da 210 minuti Hplc Pertanto possibile ipotizzare che il metanolo abbia una maggior capacit solvente per le sostanze rimaste intrappolate nella fase stazionaria Un altro modo per verificare se la colonna pulita consiste nel verificare la stabilit della linea di base Se la temperatura mantenuta costante una soluzione di ACN WM8 70 30 non dovrebbe causare una deriva positiva o negativa di pi di 2 3 MAU in una corsa di 5 minuti 54 Nella nostra esperienza abbiamo notato che il range stato sempre rispettato Pertanto si pu concludere che i lavaggi effettuati sono stati efficaci Inoltre abbiamo anche osservato che se tutto il circuito incluso l iniettore la colonna ed i suoi accessori pulito i cromatogrammi dei solventi o delle fasi mobili presentano s dei picchi ma di bassa intensit Fig 4 27 Si pu infatti osservare che l altezza dei picchi rilevabili nei primi 5 minuti hanno un int
284. ta di deviazione standard Fig 2 4 C Nella Figura 2 4 A infatti dal confronto dei i due kit con diverso numero di lotto emersa una leggera differenza tra i due che diventa sempre pi marcata dai punti a concentrazione 6 10 ug mL delineando un andamento decisamente pi lineare Nella Figura 2 4 8 invece nella quale rappresentata la ripetizione in triplo della curva effettuata con l utilizzo del kit seminuovo stata ottenuta un incostante ripetibilit soprattutto per i punti vicini allo zero che sono risultati un po meno precisi Per rendere ancora pi evidente la variazione presente stata calcolata la Media delle tre repliche con la rispettiva deviazione standard ed stato mostrato il grafico Fig 2 4 C Quantificazione Proteica_Kit NanoOrange_ o E 8 11 11 2011 14 11 2011 gt 2 E Fluorescenza u a o 6 Albumina ug mL 500 m 15 11 11 16 11 11 Mattina A 16 11 11 Sera 400 m Media 15 16 11 2011 e A 300 Fluorescenza u a Fluorescenza u a 4 6 Albumina pg mL Albumina g mL Figura 2 4 Confronto tra 2 lotti triplicato della curva con kit seminuovo e relativa media Dalla curva ottenuta dalla media delle repliche stato confermato quanto detto precedentemente sulla instabilit della ripetibilit per le basse concentrazioni comprese nel range 1 0 1 ug mL In seguito ai risultati ottenuti stata inserita come ulteriore variazione al
285. ta scelta inizialmente la FM 2 che stata successivamente sostituita dalla FM 17 per ovviare ai problemi di alta pressione in colonna risolti con il dimezzamento della concentrazione del TF inoltre stato scelto il flusso di 1 0 mL min una lunghezza d onda di 265 nm ed un volume d iniezione di 20 uL La corsa cromatografica stata eseguita a temperatura ambiente monitorata a 25 C senza termostatare il campione Una volta stabilita la metodica si proseguito con la realizzazione delle curve di calibrazione dell InuNa contenente il suo standard interno caratterizzata da un range di rivelazione compreso tra 7 69 e 0 12 ug mL L analisi stata effettuata ad entrambe le lunghezze d onda testate evidenziando un diverso andamento della regressione rispetto all analisi UV Infatti risultata essere di tipo lineare ad entrambe le lunghezze d onda all UV stata ottenuta di tipo lineare per i 254 nm e per i 265 nm di lunghezza d onda risultati ottenuti sono stati soddisfacenti infatti i valori di R square calcolati sono molto vicini al valore 1 Fig 4 40 Concludendo possibile confermare il raggiungimento della messa a punto di una metodica di separazione in Hplc per l IbuNa Il metodo prevede come vantaggio l utilizzo di una fase mobile di semplice preparazione che assicura una salvaguardia dello strumento nei confronti della presenza dei Sali di fosfato in fase mobile Inoltre fornisce tutte le indicazioni e gli accorgimenti
286. tati pipettati 0 5 ML di campione di cute disciolta precipitata in modalit off line stato favorito il passaggio in cartuccia attraverso la regolazione delle valvoline attraverso le quali possibile decidere il flusso di filtrazione Successivamente al campione sono stati filtrati 2 ML di ACN puro in Modo da rimuovere l eventuale campione rimasto intrappolato nel filtro Il filtrato ca 2 5 mL stato essiccato a 100 C ed stato poi ripreso con 0 5 ML di WMQ In seguito alla completa risospensione favorita dal vortexamento si proceduto con la quantificazione proteica attraverso il Kit Metodo ll Filtrazione attraverso le HybridSpe con MeOH Preparazione dell agente precipitante in una bottiglietta da 20 sono stati pipettati 0 1 mL di AcForm e 9 9 mL di MeOH utilizzando esclusivamente pipette in vetro stata cos ottenuta una soluzione di AcForm al 1 in MeOH AcForm MeOH 1 La soluzione di AcForm stata preparata sotto cappa chimica mantenendo il vetro protettivo il pi abbassato possibile e conservata a temperatura ambiente col tappo ben chiuso e parafilmata Precipitazione off line in una microprovetta stata pipettata la cute disciolta 0 2 mL ed AcForm MeOH 1 1 mL in rapporto 1 5 v v II campione cos costituito stato spipettato Degradazione e deproteinizzazione della cute per 2 3 minuti e successivamente stato centrifugato C1 5 minuti 988 g rotore ad angolo fisso con raggio di 84
287. te sono stati prelevati i 500 uL di campione ai quali sono stati aggiunti i 2 mL di solvente puro di lavaggio A questa fase ha seguito l essiccamento in stufa e la risospensione in 0 5 mL di WMQ Nella Figura 3 12 possibile infatti vedere il risultato ottenuto dallo spettrofotometro UV Vis IBU Na TF25 I 13 NOV IBU Na TF285 Il 13 NOV d N S io Q pm v v lt 200 400 600 800 1000 1200 Lunghezza d onda nm Figura 3 12 Analisi UV dell Ibu Na in TF25 precipitato offline e con simulazione di filtrazione Lo spettro Fig 3 12 mostra una leggera differenza tra i due metodi nella parte sinistra del grafico nel quale il metodo appare molto pi pulito ed inoltre sempre lo stesso Metodo evidenzia un picco del farmaco pi regolare La differente altezza del picco un risultato atteso in quanto le due soluzioni di precipitazione offline hanno concentrazioni differenti di farmaco 4 25 mg mL per il metodo e 2 83 mg mL per il metodo Il Quantificando la concentrazione di farmaco ottenuta attraverso la conversione del valore di assorbanza a 265 nm in concentrazione attraverso l utilizzo della retta di calibrazione sono stati ottenuti come risultati 0 6 mg mL per il metodo e 0 5 mg mL per il Metodo Il Ci significa che il recupero del farmaco stato molto basso Per vedere se il problema del recupero fosse dovuto al TF25 sono state ricercate le eventuali differenze tra le due soluzioni di I
288. te un gradiente gradiente iniziale in Tab 4 3 che permette appunto il cambiamento delle fasi ed in questo caso anche quello del flusso che si porter come precedentemente menzionato a 0 5 mL min Inoltre da precisare che al termine della terza fase sempre presente un gradiente gradiente finale in Tab 4 3 di 10 minuti Hplc precedente allo spegni mento dello strumento nel quale il flusso scender gradatamente a 0 1 mL min Tabella 4 3 Composizione e durata dei lavaggi dello strumento con colonna Fasi Cortissimo Corto Medio Lungo Lunghissimo gradiente iniziale 10 10 10 10 10 F1 ACN WMQ 23 73 200 200 400 400 700 gradiente 10 10 10 10 10 1 LI Me 100 200 200 400 700 gradiente 10 10 10 10 10 F3 ACN WMQ 80 20 100 100 100 100 60 gradiente finale 10 10 10 10 10 Totale minuti 440 540 750 950 1510 Totale ore 7 33 9 12 5 15 83 25 17 Anche il circuito di iniezione pu essere lavato generalmente con iPrOH e altre volte per lavaggi profondi con WMQ Si precisa inoltre che durante le analisi con colonna sia prima che dopo l iniezione del campione si attiva il lavaggio dell ago per evitare even tuali contaminazioni da un campione all altro che potrebbero alterare i risultati In assenza di colonna e dei suoi accessori lo strumento pu essere lavato con WMO o in casi eccezionali con iPrOH Ad ogni modo prima di poterlo collegare nuovamente alla colonna usata ed ai suoi accessori necessario elimin
289. teica con filtrazione Acrodisc aggiuntiva Fluorescenza u a Proteine Campione Metodo IT lt lt T lt T lt lt gt IS EI II W C CN CF ug mL 1 Bianco 152 5 181 9 29 4 0 0 0 0 2 Brown 152 3 746 8 594 5 565 0 11 3 4 Congelamento 152 3 761 6 609 3 579 8 11 6 Gli esperimenti si sono interrotti per qualche mese per poi riprendere con la quantificazione proteica del medesimo pezzo di cute umana degradato in Collagenase L allestimento dell esperimento ha previsto il trattamento della cute con il metodo Amicon Infatti sono stati centrifugati tte campioni secondo il protocollo descritto nel Paragrafo 3 4 3 2 Sono stati inoltre preparati anche tre ulteriori campioni identici ai precedenti i quali per sono stati filtrati con Acrodisc prima di essere testati col kit Cap 2 Per ciascun triplicato stato realizzato il rispettivo bianco La Tabella 3 4 raccoglie i dati dell esperimento effettuato mostrando il metodo utilizzato e le fluorescenze del bianco cuvetta W del campione C del campione normalizzato CN e del campione normalizzato anche rispetto alla WS CF Mentre nell ultima colonna a destra riportata la concentrazione ottenuta per conversione della fluorescenza in ug mL tramite l equazione della retta di calibrazione Par 2 4 3 Tabella 3 4 Risultati della quantificazione proteica con e senza filtrazione Acrodisc aggiuntiva Fluorescenza u a amp l usa Proteine campione letodo uditi Ww C
290. tensit mV 5 10 5 10 15 Tempo minuti Tempo minuti lbu FM 4 1 2 Diclo FM 4 1 2 lbu FM 4 1 3 Diclo FM 4 1 3 5 10 15 20 10 5 0 5 10 15 20 Tempo minuti lbu FM 20 7 Diclo FM 2 0 7 lbu FM 2 1 3 Diclo FM 2 1 3 Intensit mV Intensit mV Tempo minuti Figura 4 33 Cromatogrammi di louNa e DicloNa ottenuti con le FM 2 e FM 4 e variando il flusso In questa figura vengono isolati i cromatogrammi relativi alle soluzioni di IbuNa e DicloNa nella FM 2 A e FM 4 B in cui si applica la variazione del flusso 0 7 1 2 e 1 3 mL min Con le lettere C e D sono indicate rispettivamente i cromatogrammi ingranditi di IbuNa e DicloNa con FM 2 e 4 rispettivamente Condizioni di separazione Campioni entrambe le molecole sono sciolte 1 mg mL in FM 2 il volume di iniezione 20 pl filtrati con Acrodisc Colonna accessoriata con CG del tipo CC Lunghezza d onda di rilevamento 254 nm Flusso 1 mL min Fase mobile di eluizione in leggenda filtrazione dei solventi filtri Wnatman in fibra di vetro Tabella 4 18 Dati relativi all integrazione delle FM 2 ed FM 4 ai flussi 0 7 1 2 e 1 3 mL min IbuNa L Tempo min Area Spalle Fase Mobile Flusso iniziale finale T ritenzione mL min FM 2 0 7 9 50 12 06 9 75 1 549 551 FM 2 1 3 5 20 7 3 5 41 837 705 FM 4 1 2 6 49 8 29 6 74 913 728 FM 4 1 3 6 03 7 95 6 29 845 341 DicloNa Tempo min Area Spalle Fase Mobile Flusso inizi
291. ti rispettivamente pre miscelati dall operatore in un unica bottiglia La FM 17 stata pre miscelata solo una volta Tabella 4 1 Composizione percentuale volumetrica delle diverse fasi Mobili Composizione v v FM TF 50 TF 25 ACN THF iPrOH 73 18 9 8 1 2 73 27 3 75 25 4 74 26 5 72 28 6 71 29 7 70 30 8 72 27 9 71 27 2 10 70 27 3 11 68 27 5 12 65 27 8 13 73 26 5 0 5 14 72 5 26 5 15 73 22 5 16 73 26 17 73 27 4 4 7 Soluzioni da iniettare in HPLC Hplc Tutte le soluzioni cos dette da iniettare in HPLC e cio quelle che passeranno all interno della colonna cromatografia e che quindi subiranno una separazione dei componenti sono state preparate in una microprovetta per aggiunta dei relativi volumi Il contenuto della Mmicroprovetta stato poi completamente aspirato con una siringa in plastica 5 ML e sostituendo l ago metallico con un filtro a siringa Acrodisc o Whatman successivamente filtrato dentro delle provette pulite per HPLC che indicheremo con il termine vial Le vial vengono chiuse con un setto in silicone perforabile ed un tappo forato in plastica Per evitare che siano presenti dei contaminanti all intero delle vial pulite le stesse si conservano all interno di bustine di plastica ben sigillate In considerazione delle piccole dimensioni delle vial alcune gocce del filtrato sono state sempre usate per avvinare le stesse Inoltre per evitare contaminazioni esterne le s
292. ti nelle interazioni idrofobiche Adattato da 29 Si deduce quindi che la fase stazionaria di tipo non polare e pertanto la fase eluente sar polare Questo tipo di cromatografia indicata con la terminologia anglosassone reverse phase o anche RP HPLC Per salvaguardare e prolungare la vita della colonna sono stati acquistati due accessori che si posizionano prima della stessa Rispettando la direzione del flusso troveremo quindi i la pre colonna P la colonna di guardia CG e la colonna C La funzione della pre colonna quella di impedire che dell eventuale particolato grossolano cut off 2 um giunga in colonna Per contro la colonna di guardia come dice il suo nome protegge la colonna dal materiale che si potrebbe depositare al suo interno per interazione con la fase stazionaria 4 6 3 Accensione inizializzazione ed operazioni post analisi In questo paragrafo si riportano tutte le operazioni che si eseguono in automatico o manualmente dall accensione allo spegnimento dello strumento All accensione dell HPLC lo strumento stesso esegue automaticamente dei controlli che deve superare per essere pronto per l utilizzo Successivamente si controlla l acqua contenuta in una bottiglietta di vetro 20 25 mL posta nel vano in cui presente il degasatore e che serve per lavare i retropistoni Fig 4 2 elemento 4 Se la stessa si presenta di colore biancastro oppure di consistenza opalescente si sostituis
293. tro le curve sono lineari con una R di 0 99934 A 0 99995 B 0 99996 C e 0 99999 D II limite di rivelabilit per entrambe le curve pari a 16 601 ug mL gt w Assorbanza 255 nm u a Assorbanza 265 nm u a 500 1000 1500 2000 2500 Concentrazione IbuNa L2 g mL C D Y B X Assorbanza 255 nm u a Assorbanza 265 nm u a Parameter Vake Error B 78BIME4 30691466 R D N P 0 9008 000753 a 20 500 1000 1500 2000 2500 Concentrazione IbuNa L2 ug ml Hplc 123 500 1000 1500 2000 2500 Concentrazione IbuNa L2 ug mL Y B x Parameter Value Error B 9S59E4 1431856 R D N 0 99900 0 00352 500 1000 1500 2000 2500 Concentrazione IbuNa L2 ug mL Figura 4 22 Curve di calibrazione 6 e 7 Nella figura troviamo IbuNa L2 in AcForm ACN 97 3 alle lunghezze d onda di 255 nm A e 265 nm B e IbuNa L2 in AcForm MeOH 99 1 alle lunghezze d onda di 255 nm C e 265 nm D 4 8 2 Diclofenac sale sodico Il DicloNa a differenza dell altro sale non stato oggetto di molteplici caratterizzazioni chimico fisiche semplicemente per il fatto che ha mantenuto invariato nel tempo il suo aspetto ed odore i e nessuno odore 4 8 2 1 pH valori di pH relativi nelle soluzioni WMQ PBS TF 50 FM 2 TF 25 e FM 17 sono rappresentati nella Tabella 4 14 124 Hplc Tabella 4 14 Confronto dei pH relativi al DicloNa nelle diverse soluzioni DicloNa Valori d
294. ttraverso le HybridSPE una semplice tecnica di separazione progettata per rimuovere dal campione elevati livelli di proteine endogene ed interferenze di fosfolipidi prima dell analisi cromatografica La fase stazionaria della cartuccia come un filtro chimico che interagisce specificamente con i fosfolipidi Il meccanismo di ritenzione altamente selettivo basato su interazioni tra gli acido base di Lewis e gli ioni zirconia legati alla fase stazionaria e la porzione fosfato contenuta in tutti i fosfolipidi Queste cartucce consentono una riduzione significativa della preparazione del campione Al termine di una fase di precipitazione delle proteine il campione viene filtrato direttamente nella cartuccia raccolto e nella maggior parte dei casi analizzato direttamente 21 Il manuale della casa Madre ha fornito parecchi metodi di utilizzo a seconda della natura dei componenti presenti nei campioni stato necessario contattare la ditta produttrice per indirizzarci sul metodo di analisi da scegliere vista la particolarit della sostanza presente nei nostri esperimenti La ditta produttrice ha consigliato le due metodiche descritte nel Paragrafo 3 4 3 4 che sono state testate entrambe per verificare quale delle due permettesse un maggior recupero del farmaco presente nel campione d interesse Inizialmente stata filtrata nelle cartucce semplicemente la cute in Collagenase con entrambi i metodi Par 3 4 3 4 ed stata verificata l
295. tufa 24 ore 265 nm dati mostrati in Tabella 4 31 indicano che l i tempi di ritenzione dell lbuNa L2 sono tutti 7 2 minuti Inoltre rispetto ai dati mostrati in Tabella 4 17 si pu osservare che risultano essere ritardati ca di 5 8 secondi i e 7 04 min mentre sono maggiormente costanti ed anticipati nei confronti dei tempi individuati nella Tabella 4 20 7 88 8 04 min Le aree dei 9 campioni di IbuNa L2 mantengono un rapporto uguale al valore 2 sino alla concentrazione 0 96 ug mL per poi mostrarsi meno stabili nel range di concentrazione 0 48 0 03 ug mL Nelle tre repliche successive si osservato che nelle basse concentrazioni in alcuni casi non stato possibile integrare i picchi perch di difficile individuazione Questi valori sono indicati in Tabella 3 21 con la sigla n r In questo caso non possibile effettuare un confronto dell area ottenuta a 7 69 ug mL ca 13 700 u a con una concentrazione teorica in quanto le rette della Tabella 4 20 non sono state analizzate a 265 nm Ci nonostante possibile fare un 159 160 Hplc confronto con l area di controllo Tab 4 26 quantificata alla stessa concentrazione i e 11 442 u a in seguito alle 24 ore di stufa l area aumentata a 13 698 unit arbitrarie La forma dei picchi del IbuNa L2 nei vari crtomatogrammi n 9 x 3 non mostrati presenta una simmetria 1 Gli intervalli di concentrazione in cui stato possibile quantificare s
296. uL Fluorescenza Albumina ug mL Campione ABS WS W C CN CF Trovata Teorica bianco 0 2100 146 23 148 17 1 93 0 00 1 80 2020 151 00 304 63 153 63 151 70 3 18 3 81 2 80 2020 151 13 312 63 161 50 159 57 3 33 3 81 3 80 2020 151 03 310 87 159 83 157 90 3 30 3 81 Mentre per la concentrazione di 100 ug mL Tab 2 19 stata rilevata una maggior precisione ottenendo una media di 3 27 ug mL ed inoltre i tre valori risultano essere molto vicini tra loro Gli esperimenti sono proseguiti verificando l attendibilit del kit ale diverse concentrazioni per vedere se ci fossero delle differenze notevoli o delle concentrazioni oltre o al di sotto delle quali non fosse possibile il suo Utilizzo Quindi sono state preparate delle soluzioni diluite di ABSL3 1 5 mL ad una concentrazione tale che gli 80 uL di campione diluiti in WS 2 1 mL avessero le concentrazioni da noi prescelte 10 8 6 4 2 1 ug mL Nella colonna adibita alla composizione viene descritto quanto volume di ABSL3 stato usato e quanto volume di WMQ stato aggiunto per poter ottenere i campioni n 2 6 alla concentrazione indicata nella seconda colonna da destra Tabella 2 20 Preparazione delle soluzioni a partire da ABSL3 Composizione uL Albumina Campione ug ML ABSL3 WMe 1 0 0 263 2 2 1197 303 210 0 3 898 602 157 5 4 560 940 105 0 5 300 1200 52 5 6 150 1350 26 25 Le soluzioni preparate a partire da ABSL3 come descritto nella Tabella 2
297. uantificazione proteica attraverso il Kit 3 4 3 2 Deproteinizzazione della cute per filtrazione con Amicon Tutto il campione di cute sciolta stato trasferito in un tubo da 15 ed stato centrifugato C1 13 minuti 14000 9 Nelle Amicon precedentemente lavate Par 3 4 1 sono stati pipettati 0 5 ML di campione il quale stato immediatamente sottoposto ad una centrifuga C2 13 minuti 14100 g Il filtrato stato poi analizzato attraverso il Kit per la quantificazione proteica 3 4 3 3 Criodeproteinizzazione della cute La cute degradata 0 5 mL stata dispensata in una microprovetta assieme a 0 21 mL di MeOH Dopo qualche minuto di spipettamento il campione cos costituito stato messo in freezer a 80 C per 60 minuti In seguito alla permanenza in freezer il campione stato fatto scongelare ed stato centrifugato C2 10 minuti 13500 g9 Il surnatante stato trasferito in una nuova microprovetta ed stato essiccato a 37 C Il campione seccato stato ripreso con 0 5 ML di WMQ vortexato per qualche minuto ed analizzato per testare la quantificazione proteica 3 4 3 4 Deproteinizzazione della cute per filtrazione in cartucce HybridSpe Degradazione e deproteinizzazione della cute La deproteinizzazione per filtrazione in Spe composta da due fasi una precipitazione off line e una precipitazione all interno della cartuccia Spe precipitazione on line Figure 4 HybridSPE PT 96 well Schematic and
298. uipaggiato con due elettrodi combinati InLab 423 o InLab 412 Mettler Toledo un agitatore Magnetico F60 Falc una stufa termo ventilata FD53 Binder GmbH una stufa non ventilata E28 Binder GmbH una pompa da vuoto duo 2 5 A Pfeiffer una centrifuga Heraeus Megafuge 11 R Thermo Scientific Waltham alcune micropipette a volume variabile da 20 200 e 1000 uL Eppendorf e Gilson un pipettatore Accu Jet Brand un vortex GVlab Gilson uno spettrofotometro UV Vis a singolo raggio Cary UV Vis Varian una cuvetta in quarzo QS 1000 uL cammino ottico 1 cm Hellma un rifrattometro di Abbe Atago co Ltd un apparecchio per la misurazione del punto di fusione SMP1 1 Stuart uno spettrofotometro NMR operante a 500 MHz Unity 500 Varian uno spettroscopio IR Vector 22 Bruker un cromatografo liquido ad alta pressione HPLC LC 2010 CHT Shimadzu equipaggiato con una colonna cromatografica EC 150 4 6 NUCLEODUR 100 5 C18 ec Macherey Nagel GmbH amp Co KG per la quale sono state utilizzate due colonne di guardia EC 4 3 NUCLEODUR 100 5 C18 ec e la CC 8 4 NUCLEODUR 100 5 18 ec entrambe della Macherey Nagel GmbH amp Co KG ed una pre colonna cut off 0 2 um Supelco n cat 55215 U un frigorifero 4 C Indesit e un frigorifero freezer combinato 4 C 21 C Indesit 4 4 Preparazione e caratterizzazione delle soluzioni In questo paragrafo si riportano i metodi di preparazione delle diverse soluzio
299. uito sono riassunte le condizioni di separazione Campioni entrambe le molecole sono sciolte 1 mg mL in FM 2 il volume di iniezione 20 pl filtrati con Acrodisc Colonna accessoriata con CG del tipo CC Lunghezza d onda di rilevamento 254 nm Flusso 1 mL min Fase mobile di eluizione in leggenda filtrazione dei solventi filtri Whatman in fibra di vetro La Figura 4 32 mostra che la separazione delle due sostante necessiterebbe di 15 o 20 minuti utilizzando rispettivamente la FM 2 e la FM 4 Inoltre dagli ingrandimenti della Figura 4 32 C e D si pu notare che alcuni piccoli picchi provenienti dal DicloNa si sommerebbero a quello dell IbuNa in entrambi i casi Si cercato di risolvere questo problema cambiando il flusso e cio effettuando le precedenti separazioni a 0 7 e 1 2 mL min per la FM 2 e 1 2 e 1 3 mL min per la FM 4 Fig 4 33 La Figura 4 33 mette in evidenza come l aumento del flusso comporti un anticipo dei tempi di ritenzione come era logico aspettarsi Purtroppo le aree Tab 4 18 non si sono mantenute costanti in questo esperimento per cause a noi sconosciute e pertanto non si possono estrapolare altri dati utili alla discussione e g migliore o peggiore separazione dei picchi 143 144 Hplc B 600000 __ Ibu FM 2 Ibu FM 4 Diclo FM 2 Diclo FM 4 a BRILLI 10 15 Tempo minuti Tempo minuti Ibu FM 2 Ibu FM 4 Diclo FM 2 Diclo FM 4 Intensit
300. un lotto di IbuNa che era stato precedentemente solubilizzato in EtOH e successivamente posto in stufa a 135 C per far evaporare il solvente Nella spettroscopia IR il campi one viene irraggiato a delle lunghezze d onda che corrispondono allo spettro infrarosso IR Le molecole assorbono una quantit di energia che determina transizioni tra livelli energetici e permette ai legami chimici tra gli atomi di vibrare originando vibrazioni di streching i e il legame chimico si accorcia o si allunga o di bending i e il legame chimico si piega Lo spettro IR che si ottiene avr sull asse delle ordinate i valori relativi alla trasmittanza unit misura e sull asse delle ascisse quelli relativi alla frequenza indicata come numero d onda cm le bande ottenute evidenziano la presenza di determinati gruppi funzionali 26 Questo studio stato effettuato per osservare l eventuale presenza di umidit ed altre differenze tra i vari lotti di louNa Gli spettri sperimen tali sono stati messi a confronto con uno spettro IR standard fornito dalla Sigma Aldrich Preparazione del campione L IbuNa stato disperso ed emulsionato in un olio minerale Nujol in un mortaio di agata per ridurre al Massimo le particelle solide Successivamente i campioni emulsionati sono stati distribuiti tra due dischetti trasparenti di NaCI Il tutto stato inserito nel relativo alloggiamento all interno dello strumento e gli spettri r
301. una nuova microprovetta per uniformare il volume A questo punto si pipettano 16 uL di DicloNa 62 5 ug mL in ciascuna microprovetta Pertanto il range di concentrazioni in IbuNa varia da 7 69 a 0 03 ug mL 7 689 47 30 04 ng mL ed ognuna la met di quella precedente La concentrazione di DicloNa sar pertanto di 0 98 ug mL in ogni microprovetta 1 016 yL totali campioni cos ottenuti sono stati aspirati uno per volta con una siringa munita di ago metallico e filtrati direttamente in vial attraverso un filtro Acrodise o Whatman campioni filtrati sono stati subito posizionati nel vassoio porta campioni dell HPLC ed analizzati secondo la metodica descritta nel Paragrafo 4 6 6 3 L analisi dei cromatogrammi ha permesso di ottenere le aree corrispondenti alle concentrazioni analizzate dati sono stati infine graficati e Modellizati utilizzando Origin 6 0 Infine si fa presente che questa curva di calibrazione stata allestita in varie fasi temporali usando il TF 50 o il TF 25 utilizzando due lunghezze d onda 254 e o 265 nm vari accessori per la colonna i solventi filtrati CON filtri i fibra di vetro o nylon ed infine due lotti differenti di IbuNa conservato in maniera differente Hplc 4 7 Presentazione e Discussione Dei Risultati Nel seguente Paragrafo saranno descritti e discussi i risultati degli esperimenti effettuati In alcuni casi non si seguir l ordine cronologico con cui sono stati ottenuti ma nell insiem
302. uta a temperatura ambiente sopra un bancone del laboratorio Il risultato ottenuto stato un aumento proporzionale dello scioglimento della cute al crescere della temperatura di incubazione confermando che la condizione ottimale e pi rapida fosse quella consigliata da Brown et al Per poter affermare ci l avanzamento Degradazione e Deproteinizzazione della cute della dissoluzione stato monitorato a 7 24 e 30 ore di esposizione alle diverse temperature La Figura 3 3 mostra la cute a contatto con la Collagenase da 7 ore nelle tre diverse condizioni Temp Amb _7 h _ Stufa 37 C _7h Frigo _7h_ Fig 3 3 Cute umana In seguito a 7 ore di contatto Fig 3 3 non ancora possibile prevedere quale delle tre condizioni sia quella ottimale anche se nel campione in stufa si intravede gi il distaccamento dello strato comeo La Figura 3 4 rappresenta la situazione creatasi dopo 24 ore di contatto della cute con la Collagenase Temp Amb 24h _ Stufa 24h _ Frigo _24h _ Fig 3 4 Cute umana a c la collagena Degradazione e deproteinizzazione della cute Trascorse le 24 ore di trattamento evidente una netta differenza tra le tre diverse condizioni testate infatti solamente nel campione lasciato in stufa possibile notare un inizio del discioglimento della cute La Figura 3 5 rappresenta la condizione dei campioni in seguito a 30 ore di esposizione Temp Amb 30h _ Stufa _30 h_ Frigo _ 30 h_ Fig 3
303. vivo and in vivo studies Lipids in Health and Disease2009 8 6 doi 10 1186 1476 511X 8 6 M B Brown M Hanpanitcharoen G P Martin An in vitro investigation into the effect of giycosaminoglycans on the skin partitioning and deposition of NSAIDs International journal of Pharmaceutics 225 2001 pp 113 121 Culture of Animal cells a manual of basic technique R Pignatello C Bucolo P Ferrara A Maltese A Puleo G Puglisi Eudragit RS100 nanosuspensions for the ophthalmic controlled delivery of ibuprofen European Journal of Pharmaceutical Sciences 16 2002 53 6 A C Sintov S Botner Transdermal drug delivery using microemulsion and aqueous systems Infuence of skin storage conditions on the in vitro permeability of diclofenac from aqueous vehicle systems International Journal of Pharmaceutics 311 2006 55 62 S Silberblatt R A Felder and T E Mifflin Optimizing Reaction Conditions of the NanoOrange Protein Quantitation Method for Use With Microplate based Automation Journal of the Association for Laboratory Automation L J Jones R P Haugland and V L Singer Development and Characterization of the NanoOrange Protein Quantitation Assay A Fluorescence Based Assay of Proteins in Solution BioTechniques 34 850 861 April 2003 L Pont F Benavente J Barbosa V Sanz Nebot An update for human blood plasma pretreatment for optimized recovery of low molecular mass peptides prior to CE MS and SPE CE MS J Sep
304. volume della colonna importante per calcolare quanta fase mobile necessaria per il lavaggio dell intera colonna Relativamente al flusso le istruzioni prevedono che deve essere mantenuto durante tutto il lavaggio ad un flusso che sia compreso tra il 25 ed il 50 del flusso usato durante le analisi Pertanto operando ad 1 mL min il flusso dovrebbe essere compreso tra 0 5 e 0 25 ML min Per non avere dei tempi lunghi di lavaggio si pens inizialmente di utilizzare il flusso con il valore pi alto Relativamente a quale fase mobile usare durante il lavaggio le istruzioni prevedono quanto segue Per impurit polari Eliminare il tampone con 80 acqua 20 solvente organico 50 mL Successivamente lavare almeno 25 ml con una miscela acquosa che contenga una alta percentuale 70 30 90 10 in solvente organico ACN o MeOH Si noti che la maggior parte delle impurit polari viene eliminata eliminando il tampone Per impurit non polari Lavare la colonna con un alta frazione in acqua max 90 per rimuovere il tampone Lavare con MeOH 100 per rimuovere i composti organici polari Lavare con ACN 100 per rimuovere le impurit organiche mediamente polari se necessario aumentare la temperatura fino a 40 C Lavare la colonna con THF per rimuovere i composti organici non polari Se necessario lavare la colonna con THF 129 130 Hplc invertendo la direzione del flusso che dovrebbe essere mantenuto ad 1 5 di quello
305. vuti essere Tuttavia il fatto che si tratti di una molecola di idrata evidenziato dalla presenza del segnale dell OH associato presente anche nello spettro della Sigma seppur a giaciture pi basse Inoltre la presenza del segnale dell OH libero fa pensare alla presenza di umidit Ci si potrebbe domandare se sia presente anche la forma acida In questo caso si dovrebbero vedere i segnali del dimero che si formerebbe tra due molecole di acido i e OH libero 3 520 cm ed OH associato banda larga nella regione 2 700 3 300 cm 44 ed il segnale del carbonile di un acido che cade normalmente nel range di frequenze superiore ai 1 700 cm i e ca 1760 cm per la forma monomera 1 705 1 720 cm per la forma dimera 44 Oberoi et al hanno evidenziato che il carbonile dell ibuprofene forma acida cade a 1 740 cm 45 Pertanto considerando che i nostri segnali dell OH sono pi alti e che mancherebbe il segnale del carbonile dell acido Fig 4 8 4 10 si pu concludere che se l acido presente lo ad una concentrazione insignificante rispetto alla forma salificata La presenza del sale ancora identificabile attraverso il segnale del carbonile nei tre casi 1 697 1 699 cm ed i segnali di stiramento simmetrico 1 412 cm ed asimmetrico 1 549 e 1 553 cm dello ione carbossilato Tab 4 9 nostri valori sperimentali sono abbastanza vicini fra loro nei tre casi mentre sono un po pi lontani da quelli dello
306. zione transdermica stata utilizzata cute umana proveniente da interventi di addominoplastica e mastoplastica riduttiva Come verr indicato pi avanti in alcuni casi stato necessario conservare le soluzioni e o le sostanze a 4 6 C Kit soluzione tampone a pH 4 e pH 7 o a 30 C Cute umana collagenase Laddove venga indicato a temperatura ambiente se non altrimenti specificato deve intendersi ad una temperatura compresa tra i 22 e i 25 C Altro Inoltre sono stati utilizzati matracci di varie misure beaker spatole microtubi da centrifuga in plastica microprovette tubi da centrifuga in polipropilene da 50 mL non sterile provette da 50 Euroclone bottiglie in plastica di volumi variabili sino a 500 mL tubi da centrifuga in polipropilene da 15 mL non sterile tubi da 15 Coming provette coniche in vetro graduate con tappo a vite tubi in vetro tubi in plastica con tappo a pressione tubi in plastica bottigliette in vetro da 12 mL con tappo nero a vite bottigliette da 12 bottigliette in vetro da 20 mL con tappo bianco a vite bottigliette da 20 provette filtranti Amicon cut off 3000 Da Amicon Ultra 0 5 Millipore puntali per micropipette da 20 200 e 1000 uL Eppendorf o Gilson pipette graduate in vetro da 10 mL pipette Pasteur vials per HLPC bottiglie di vetro da 1 L Duran carta da pesata W gepapier MN 226 Macherey Nagel bisturi pinzette parafilm e carta stagnola Tutta la vetreria

A tutti coloro che hanno creduto in me

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