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Istruzioni d`uso di CRC RAScan™ Combination Kit

1. Istruzioni d uso di CRC RAScan Combination Kit Un kit SURVEYOR Scan KRAS e NRAS Exons 2 3 amp 4 CE IVD con sistemi DHPLC CEL Leggere attentamente il manuale prima di utilizzare il prodotto Conservare il manuale a titolo di riferimento per il futuro fi ransgenomic Advancing Personalized Medicine Questa pagina stata lasciata intenzionalmente vuota Indice ME Wie 010 V 10 RR gegen gcse RIA 3 2 CRC RASCan Combination Kit cciiiiii aa aa 3 ZUNINO 3 2 2 Indicazioni ora 3 3 Principi del dosaggio di rilevamento della mutazione di CRC RAScan KRAS ANG INAS isicsntdccicteacessvasesinchevecansasncenacasedsasveteveumesanacesensusebeusacstesansuecvescesicdvscivevessents 4 e iii ora 4 3 2 Analisi di campioni paziente con i kit SURVEYOR Scan i 4 SS SUR VEY OR NUCIE TS ca 5 4 racciabilita del controlli del Kit 6 COON PR O TR Secceseuec 7 5 1 Scatola SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 2 3 amp 4 IREF 710107 7 5 2 Scatola SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 IRE 710400 eeens 8 5 3 Numero di Campioni Analizzabili con UN Kit 8 54 Seguenziamento del DNA rane 9 6 Apparecchiature e reagenti aggiuntivi riChieSti rie 9 7 Preparazione del reagente ccccccccesseeeeeeseeeeseeeeeeeeeseeeeeeeseeeseoeseeeaeeeneeeaaeeeseeeaeennesoanes 9 6 Conservazione Durata aaa 10 9 Avvertenze e precauzioni sssssssssnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn
2. Esempi di potenziale mutazione di deaminazione della citosina che sarebbero presi in considerazione nel determinare il trattamento cui sottoporre il paziente sono per KRAS Codone 12 AGT G12S e GAT G12D Codone 13 AGC G13S GAC G13D e GGT G13G una mutazione silente Codone 146 GCA gt ACA A146T Esempi di potenziale mutazione di deaminazione della citosina che sarebbero presi in considerazione nel determinare il trattamento cui sottoporre il paziente sono per NRAS Codone 12 GGT gt AGT G12S o GAT G12D Codone 13 GGT gt AGT G13S GAT G13D o GGC G13G una mutazione silente Codone 146 GCC gt ACC A146T Pertanto si consiglia di confermare tali mutazioni mediante la doppia analisi dello stesso DNA genomico o sottoponendo tutti i campioni a doppia analisi sin dall inizio 12 5 Protocollo di amplificazione 1 Le soluzioni Transgenomic premixate di dNTP PN 703065 e 705020 vengono fornite ad una concentrazione operativa totale in deossinucleotide di 10 mM 2 5 mM di ciascuno dei quattro deossinucleotidi 2 Il primer KRAS e NRAS Forward e Reverse PCR KRAS PN 710155F R 710157F R 710154F R e 710156F R NRAS PN 710452F R 710453F R e 710454F R vengono forniti a 10 uM 3 Prelevare dal congelatore 10 uM di primer 10 mM di soluzione dNTP e DNA Polymerase 10X PCR Buffer PN 703315 e scongelare su ghiaccio 4 Dopo lo scongelamento agitare nel vortex tutti i componenti del kit per 10 secondi al
3. Istruzioni d uso di CRC RAScan Kit con sistemi DHPLC Pagina 18 12 Istruzioni dettagliate 12 8 Digestione di SURVEYOR Nuclease 1 Una volta ritenute sufficienti la qualit e la quantit del campione PCR procedere alla reazione di digestione di SURVEYOR Nuclease come descritto di seguito necessaria una concentrazione del campione superiore o pari a 40 ng uL per una digestione ottimale da SURVEYOR Nuclease 2 Scongelare su ghiaccio le provette contenenti 0 15 M MgCl Solution e SURVEYOR Enhancer Cofactor 3 Aggiungere 10 0 uL di ciascun campione amplificato tramite PCR come descritto sopra in una nuova provetta da 0 2 mL PCR o in un pozzetto della piastra da 96 pozzetti 4 Preparare una miscela di 0 15 M MgCl2 Solution SURVEYOR Enhancer Cofactor SURVEYOR Enhancer W2 e SURVEYOR Nuclease W miscela SURVEYOR Nuclease Utilizzare la seguente tabella come guida per la preparazione di una SURVEYOR Nuclease Master Mix di Digestione per l analisi di pi campioni L esempio seguente prevede i volumi per una Master Mix da 10 campioni Si tenga presente che per compensare le perdite durante la pipettatura sar richiesto un volume della Master Mix leggermente superiore a quello risultante da questo calcolo Numero di reazioni di SURVEYOR Nuclease Digest Calcolo del volume 0 15 M MgCl Solution uL SURVEYOR Enhancer Cofactor uL SURVEYOR Enhancer W2 uL SURVEYOR Nuclease W uL Volume totale della Master Mix Aggiunge
4. attenzione nell eseguire la pipettatura dei campioni per evitare la contaminazione incrociata Controllare le regioni con sequenze di timbri di controllo per la contaminazione Positive Control Occorre fare molta attenzione nell eseguire la pipettatura dei campioni per evitare la contaminazione incrociata Controllare le regioni con sequenze di timbri di controllo per la contaminazione Positive Control Pagina 43 Appendice B Dettagli per gli Ordini Nome del prodotto Formato catalogo 710104 SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD 100 reazioni 710106 SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 amp 4 CE IVD 100 reazioni 710400 SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE IVD 100 reazioni 710077 CRC RAScan Combination Kit 230 reazioni Dettagli di contatto Corporate Headquarters Europe Transgenomic Inc Transgenomic Limited 12325 Emmet Street 40 Watt Road Omaha Hillington Park Hillington Nebraska 68164 Glasgow G52 4RY United States of America United Kingdom Telefono 888 233 9283 o 1 402 452 5400 Telefono 44 141 892 8800 Fax 1 402 452 5401 Fax 44 141 883 5967 E mail support transgenomic com E mail support transgenomic com Solo in America del Nord www TIransgenomic com Transgenomic Advancing Personalized Medicine Traduzione Disclaimer Transgenomic Inc ha compiuto ogni sforzo per assicurare l accuratezza di questa traduzione Se avete domande per quanto riguarda tutte le
5. na VA 2 3 4 5 in Figura 9B da Q61K produce frammenti 78 e 125 bp NRAS Control Wild Type NRAS Control Exon 3 Campione 1 NRAS Exon 3 Campione 2 NRAS Exon 3 DNA Sizing Standard 600 500 lt Amplicon da 203 coppie di basi intonso 400 200 100 l Figure 9A e 9B Analisi WAVE DHPLC con UV Figura 9A e rilevamento della fluorescenza Figura 9B delle digestioni SURVEYOR Nuclease di NRAS Positive Control Exon 3 e Wild Type Control e CRC DNA isolato dalle sezioni FFPE Quando si controllano a vista cromatogrammi i campioni digeriti devono essere confrontati con NRAS Control Wild Type linea verde NRAS Positive Control Exon 3 linea blu una miscela di plasmidi Wild Type e Q61K mutanti che produce picchi di digestione da 78 e 125 coppie di basi questo controllo indica che la fase di digestione SURVEYOR Nuclease attiva e mostra la regione del cromatogramma da controllare visivamente per capire se necessario sottoporre un campione all analisi mediante sequenziamento del DNA Confrontando i pattern di digestione relativi ai campioni 1 e 2 con l elettroferogramma digerito Wild Type risulta evidente che il campione 1 linea rossa presenta una probabile mutazione e deve essere sottoposto a sequenziamento per confermare la presenza o assenza di una mutazione a livello del relativo codone Il campione 2 linea nera presenta un cromatogramma simile a quello osservato per il NRAS Control Wild
6. nessuna variante individuata Se un campione mostra prodotti di clivaggio di SURVEYOR Nuclease non corrisponde al relativo Wild Type Control questi devono essere sottoposti a conferma mediante sequenziamento Se l analisi con conferma mediante sequenziamento inaccettabile procedere in uno dei seguenti modi a ripetere la PCR se rimane sufficiente DNA genomico b riestrarre il DNA dalla FFPE questa da considerarsi come opzione di seconda scelta in quanto di norma poco auspicabile tagliare un altro blocco FFPE Se l analisi con conferma mediante sequenziamento accettabile i risultati devono indicare uno dei seguenti a Sequenza Wild Type ovvero Nessuna variante individuata NVD oppure b Variante individuata Se la conferma mediante sequenziamento indica un alterazione di una base con conseguente modifica negli aminoacidi a livello del i codoni 12 o 13 ii codone 59 o 61 iii codone 117 0 iv codone 146 classificare come mutazione KRAS o NRAS positiva Nota possibile avere un risultato SURVEYOR Scan positivo che porti anch esso a un valore Nessuna variante identificata dalla conferma mediante sequenziamento Il livello di rilevamento Level of detection LOD di SURVEYOR Nuclease su un sistema DHPLC del 2 di mutazione a fronte di un DNA Wild Type del 98 per alcune mutazioni mentre I _OD del sequenziamento di circa il 10 25 di mutazione a fronte di un DNA Wild Type Istruzioni d uso di
7. 2 3 e 4 usando NCBI Reference Sequences NG_007524 1 Il KRAS Positive Control Exon 2 stato realizzato mediante sintesi dell Exon 2 di KRAS usando la sequenza di riferimento summenzionata ma contenente la mutazione G12D Il sequenziamento del DNA ha confermato che l unica modifica alla sequenza si ha in corrispondenza del codone 12 con un alterazione G12D GGT gt GAT Questo clone viene quindi miscelato con DNA KRAS Control Wild Type per creare una miscela eterozigote Il KRAS Positive Control Exon 3 stato realizzato mediante sintesi dell Exon KRAS 3 usando la sequenza di riferimento summenzionata ma contenente la mutazione Q61H Il sequenziamento del DNA ha confermato che l unica modifica alla sequenza si ha in corrispondenza del codone 61 con un alterazione Q61K CAA gt CAC Questo clone viene quindi miscelato con DNA KRAS Control Wild Type per creare una miscela eterozigote Il KRAS Positive Control Exon 4A stato realizzato mediante sintesi dell Exon KRAS 4 usando la sequenza di riferimento summenzionata ma contenente la mutazione K117N Il sequenziamento del DNA ha confermato che l unica modifica alla sequenza si ha in corrispondenza del codone 117 con un alterazione Q61K AAA gt AAT Questo clone viene quindi miscelato con DNA KRAS Control Wild Type per creare una miscela eterozigote Il KRAS Positive Control Exon 4B stato realizzato mediante sintesi dell Exon 4 di KRAS usando la sequenza di riferimento summenz
8. PCR e analisi mediante SURVEYOR Nuclease Organizzazione di laboratorio PCR consigliata Cross Piattaforma linker UV Lavandino Analisi SURVEYOR Scan PCR Work seat PCR Work i with HEPA sat Pressione Aria iter and Pressione Aria Ria quis Leggermente UV light Leggermente Filter and re for DNA UV light Positiva solstica Negativa Thermal Due Frigoriferi4 2C Microfuge cyclers Due Frigoriferi 4 2C Microfuge Sottopiano Sottopiano Stazione di Lavoro PCR con Microfuge Gel Gel Cross Microfuge Filtro HEPAe a Piastra Electrophoresis Imaging linker UV a Piastra Luce UV Macchine per Cicli Termici Laboratorio di Estrazione e ___________ Laboratorio Post PCR Am plificazione PCR Flusso di Campioni per Analisi PCR e SURVEYOR Scan Istruzioni d uso di CRC RAScan Combination Kit con sistemi DHPLC Pagina 35 Appendice A A 5 Bibliografia di riferimento 1 10 11 Amgen News Release 2013 New analyses identify predictive biomarkers for Vectibix panitumumab in patients with metastatic colorectal cancer http Awwwext amgen com media media_pr_detail jsp year 2013 amp releaselD 1820728 Peeters M et al 2013 Massively parallel tumor multigene sequencing to evaluate response to panitumumab in a randomized phase III study of metastatic colorectal cancer Clin Cancer Res 19 1902 12 De Roock W et al 2010 Association of KRAS p G13D mutation with outcome i
9. Type e non necessario sottoporlo all analisi mediante sequenziamento del DNA Va osservato che il risultato del sequenziamento il risultato definitivo in quanto potrebbero essere registrate altre mutazioni non rilevanti che possono comportare le stesse dimensioni dei frammenti a ci 4 Istruzioni d uso di CRC RAScan Combination Kit con sistemi DHPLC Pagina 28 14 Interpretazione dei risultati Figura 10A NRAS Control Wild Type NRAS Control Exon 4 Campione 1 NRAS Exon 4 Campione 2 NRAS Exon 4 muse A DNA Sizing Standard continuo Amplicon 5 DHPLC da 233 coppie di basi a intonso NL Risciacquo i DHPLC A146T produce 3 frammenti 68 e 165 bp 7 My TH Figura 10B NRAS Control Wild Type NRAS Control Exon 4 Campione 1 NRAS Exon 4 Campione 2 NRAS Exon 4 A146T produce DNA Sizing Standard 500 frammenti 68 e 165 bp Amplicon da 233 coppie di basi intonso Figure 10A e 10 Analisi WAVE DHPLC con UV Figura 10A e rilevamento della fluorescenza Figura 10B delle digestioni SURVEYOR Nuclease di NRAS Positive Control Exon 4 e Wild Type Control e CRC DNA isolato dalle sezioni FFPE Quando si controllano a vista i cromatogrammi i campioni digeriti devono essere confrontati con NRAS Control Wild Type NRAS Control Wild Type linea verde NRAS Positive Control Exon 4 linea blu una miscela di plasmidi Wild Type e A146T mutanti che produce pic
10. contaminanti derivate dall estrazione di campioni inclusi in paraffina e fissati in formalina interferisca con l amplificazione PCR e con le procedure di digestione tramite SURVEYOR Nuclease Il rispetto delle procedure di qualit illustrate nella sezione Controllo di Qualit dei Prodotti da PCR far s che il DNA estratto sia idoneo all uso con il presente kit Il presente kit stato convalidato per l analisi con campioni bioptici di tumore colorettale inclusi in paraffina e fissati in formalina Non invece stato convalidato per l uso diagnostico n con altri tipi di tumore n con campioni bioptici freschi o congelati Per la risoluzione di problemi relativi a risultati non standard e per maggiori dettagli su fattori che possono compromettere questo dosaggio vedere la sezione Appendice B Guida alla Risoluzione dei Problemi di seguito Evitare il carryover e la contaminazione crociata L estrema sensibilit di questo metodo di dosaggio richiede l adozione delle seguenti precauzioni e Accertarsi che tutti i campioni vengano gestiti in modo tale da evitare la cross contaminazione tra i campioni e Operare in una postazione di lavoro per PCR o in altre postazioni idonee dove l area di lavoro possa essere esposta ai raggi UV prima di preparare le reazioni di amplificazione PCR e Usare una postazione di lavoro per PCR separata o una stanza diversa per aprire i campioni dopo l amplificazione per PCR per il controllo qualit mediant
11. d uso di CRC RAScan Combination Kit con sistemi DHPLC Pagina 37 Appendice B L analisi di DNA stampo estratto da un tessuto incluso in paraffina richiede l adozione di svariate precauzioni Il DNA estratto pu essere trattato con uracil DNA glicosilasi al fine di prevenire l amplificazione di frammenti di DNA contenenti residui C deaminati Spesso un elevata percentuale del materiale assorbente A2g0 estratto da tessuto incluso in paraffina non viene ben amplificata durante la PCR Utilizzando un abbondante quantitativo di DNA iniziale spesso si ottiene un prodotto di amplificazione adeguato Un altra considerazione sarebbe quella di scegliere sezioni tumorali FFPE con un elevata percentuale di cellule tumorali possibile procedere anche a una microdissezione ma questa opzione comporterebbe perdita di tempo e non sarebbe consigliata in generale nei test di laboratorio Problema 2 Prodotti PCR multipli quando analizzato su gel di agarosio PRODOTTI PCR MULTIPLI POSSIBILE CAUSA SOLUZIONE Temperatura di annealing Verificare la calibrazione del Buona Banda troppo bassa termociclatore resa multipla PCR PCR Nota la PCR deve dare come risultato un prodotto in quantit sufficiente maggiore di 20 ng uL di un UNICA specie amplificata di dimensioni corrette Utilizzare per la PCR DNA Polymerase e DNA Polymerase 10X PCR Buffer in dotazione con il kit Gli ampliconi dei controlli devono essere digeriti con SURVEYOR Nuclease quindi ana
12. verde una miscela di plasmidi Wild Type e G12D mutanti che produce picchi di digestione da 88 e 148 coppie di basi questo controllo indica che la fase di digestione SURVEYOR Nuclease attiva e mostra la regione del cromatogramma da controllare visivamente per capire se necessario sottoporre un campione all analisi mediante sequenziamento del DNA Confrontando i pattern di digestione relativi ai campioni 1 e 2 con l elettroferogramma digerito Wild Type risulta evidente che il campione 1 linea rossa presenta una probabile mutazione e deve essere sottoposto a sequenziamento per confermare la presenza o assenza di una mutazione a livello del relativo codone Il campione 2 linea nera presenta un cromatogramma simile a quello osservato per il NRAS Control Wild Type e non necessario sottoporlo all analisi mediante sequenziamento del DNA Va osservato che il risultato del sequenziamento il risultato definitivo in quanto potrebbero essere registrate altre mutazioni non rilevanti che possono comportare le stesse dimensioni dei frammenti Istruzioni d uso di CRC RAScan Kit con sistemi DHPLC Pagina 27 14 Interpretazione dei risultati Figura 9A NRAS Control Wild Type NRAS Control Exon 3 Campione 1 NRAS Exon 3 Campione 2 NRAS Exon 3 DNA Sizing Standard Flusso continuo a DHPLC Risciacquo Q61K produce DHPLC frammenti xN 78 e 125 bp WONS Amplicon da 203 coppie di basi intonso th a hs
13. 0 Unitamente ai risultati di SURVEYOR Nuclease possibile interpretare con maggiore affidabilit gli cromatogramma di sequenziamento di mutazioni fino al 5 10 Se l analisi di un campione mostra un risultato positivo per SURVEYOR Scan ma non sono presenti mutazioni KRAS o NRAS individuabili mediante sequenziamento del DNA si consiglia di registrare il risultato come Nessuna variante individuata Per maggiori informazioni si veda la sezione Considerazioni sul Flusso di Lavoro 15 2 Conferma Mediante Sequenziamento Procedere alla conferma mediante sequenziamento per tutti i risultati positivi di SURVEYOR Scan per stabilire l identit per sequenziamento delle mutazioni KRAS o NRAS Exons 2 3 o 4 La Figura 11 un esempio dell importanza della conferma mediante sequenziamento per determinare l esatta mutazione Non procedere alla conferma mediante sequenziamento se SURVEYOR Scan ha prodotto un risultato negativo Il campione pu essere riferito come Wild Type o nessuna variante individuata Gli Universal Sequencing Primer inclusi nel kit devono essere utilizzati per la conferma mediante sequenziamento Il primer forward PN 710153F Universal Sequencing Primer 1 e il primer reverse PN 710153R Universal Sequencing Primer 2 Campione 1 Campione 2 G13D Sy Ee Figura 11 Analisi mediante sequenziamento dei campioni con lo stesso pattern di digestione KRAS Exon 2 SURVEYOR Nuclease campioni 1 e 2 summenzionati hanno reg
14. 00 nm e Sorgente di fluorescenza Lampada Xenon 150W e Pompa per bagni coloranti fluorescenti e Flow rate fisso a 0 1 mL min 20 50 e Flusso a basse pulsazioni A 3 2 Funzionamento del sistema Per la configurazione e il funzionamento del sistema DHPLC consultare e seguire le raccomandazioni del produttore per l analisi dei frammenti di dsDNA che rientrano nel range di dimensioni da 50 a 250 coppie di basi mirando alla discriminazione dei formati da 10 coppie di basi o migliore Questo il range delle dimensioni per i frammenti in seguito alla digestione SURVEYOR Nuclease utilizzando questo kit Per indicazioni sulle impostazioni consigliate del gradiente del sistema DHPLC per l analisi delle digestioni SURVEYOR Nuclease consultare il sito http world transgenomic com diagnostic tools genetic analysis kits crc rascan kits eu dhplcsystemsettings A 3 3 Manutenzione delle cartucce DHPLC Per la manutenzione delle cartucce DHPLC seguire le raccomandazioni del produttore Nota l analisi delle reazioni SURVEYOR Nuclease richieder protocolli di pulizia pi frequenti e rigorosi rispetto a quelli dell analisi dei campioni PCR standard Consultare le linee guida del sistema DHPLC per maggiori informazioni Istruzioni d uso di CRC RAScan Combination Kit con sistemi DHPLC Pagina 34 A 4 Setup del laboratorio per dosaggi PCR Per ottenere risultati PCR affidabili e senza contaminazioni seguire buone prassi di laboratorio nel predis
15. 11 Rilevamento di una Mutazione Somatica con i Kit SURVEYOR Scan Considerazioni Generali Il rilevamento di una mutazione e la successiva conferma con SURVEYOR Nuclease si articola in tre fasi Pre screening con SURVEYOR Scan in tre passaggi diretti Fase 1 DNA amplificato mediante PCR Fase 2 Clivaggio di SURVEYOR Nuclease Fase 3 Analisi dei frammenti in base alle Fase 1 Preparazione degli ampliconi per PCR da DNA mutante test e normale riferimento Dopo il ciclo di amplificazione PCR finale la reazione viene riscaldata per denaturare ed aprire tutti i doppi filamenti e poi raffreddata lentamente in modo da garantire una formazione ottimale di etero e omoduplici gli eteroduplici si formano quando un filamento di sequenza Wild Type si accoppia con un filamento di sequenza mutante Fase 2 Trattamento della miscela eteroduplice omoduplice cos ottenuta con SURVEYOR Nuclease SURVEYOR Nuclease taglia entrambi i filamenti del DNA eteroduplice dando origine a frammenti di DNA Il DNA Control Wild Type trattato in modo simile funge da controllo Fase 3 Analisi dei frammenti di DNA su un sistema DHPLC La formazione dei nuovi prodotti dovuti alla presenza di uno o pi mismatch indicata dalla presenza di altri picchi cromatografici tempi di migrazione dei prodotti di taglio sono correlati alle dimensioni dei frammenti e pertanto indicano la posizione approssimativa del dei mismatch Istruzioni d uso di C
16. 138 710153F 710153R DNA Polymerase 10x DNA Polymerase Reaction Buffer dNTPs 10 mM KRAS Primer Exon 2 Forward 10 uM KRAS Primer Exon 2 Reverse 10 uM KRAS Primer Exon 3 Forward 10 uM KRAS Primer Exon 3 Reverse 10 uM KRAS Primer Exon 4A Forward 10 uM KRAS Primer Exon 4A Reverse KRAS Primer Exon 4B Forward 10 uM KRAS Primer Exon 4B Reverse 10 uM KRAS Control Wild Type KRAS Positive Control Exon 2 KRAS Positive Control Exon 3 KRAS Positive Control Exon 4A KRAS Positive Control Exon 4B Universal Sequencing Primer 1 10 uM Universal Sequencing Primer 2 10 uM Istruzioni d uso di CRC RAScan Combination Kit con sistemi DHPLC 10 uM Colore Kit da 130 tappo reazioni provetta Volume fornito Viola 3 x 105 uL Nero 2x 105 uL Rosa 2 x 105 uL Marrone 2 x 105 uL Rosso 250 uL Trasparente 2 x 100 uL Trasparente 1 mL Trasparente 2 x 500 uL Blu 125 uL Blu 125 uL Blu 90 uL Blu 90 uL Blu 90 uL Blu 90 uL Blu 90 uL Blu 90 uL Giallo 120 uL Verde Verde Verde Verde Arancione Arancione 40 uL 40 uL 40 uL 40 uL 125 uL 125 uL Pagina 7 5 Componenti 5 2 Scatola SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 Rel 710400 La scatola con i componenti per l analisi di NRAS Exons 2 3 amp 4 contiene due confezioni interne 1 una confezione di componenti di digestione SURVEYOR con 10 provette di reagenti senza fori vuoti e 2 un portaprovette di componenti e controlli PCR esterno contenente 14
17. 4 Controllo privo di templato NTC7 Nota si tenga presente che per compensare le perdite durante la pipettatura sar richiesto un volume della Master Mix leggermente superiore a quello risultante da questo calcolo 8 Etichettare le provette per PCR da 0 2 mL o i pozzetti della piastra da 96 pozzetti con adeguate informazioni sui campioni 9 Etichettare una provetta per centrifuga da 2 0 mL per la preparazione della Master Mix 10 Aggiungere il volume richiesto di acqua per uso in biologia molecolare nelle provette da 2 0 mL destinate alla Master Mix Istruzioni d uso di CRC RAScan Kit con sistemi DHPLC Pagina 16 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 12 Istruzioni dettagliate Aggiungere il quantitativo richiesto di DNA Polymerase 10X PCR Buffer nelle provette della Master Mix Aggiungere il volume richiesto di 10 mM dNTP nelle provette della Master Mix Aggiungere il volume richiesto di KRAS o NRAS Forward Primer nelle rispettive provette della Master Mix Aggiungere il volume richiesto di KRAS o NRAS Reverse Primer nelle rispettive provette della Master Mix Prelevare la DNA Polymerase PN 703310 dal congelatore Centrifugare la DNA Polymerase per 10 secondi Agitare nel vortex la DNA Polymerase per 10 secondi Aggiungere il volume richiesto di DNA Polymerase nelle provette della Master Mix Chiudere le provette della Master Mix Prima dell uso agitare nel vortex le p
18. 4B Amplicon Campione 2 KRAS Exon 4B Campione 3 KRAS Exon 4B da 194 coppie di DNA Sizing Standard Flusso basi continuo a DHPLC intonso Risciacquo DHPLC A146T produce frammenti 78 e 116 bp KRAS Control Wild Type KRAS Control Exon 4B Campione 1 KRAS Exon 4B Campione 2 KRAS Exon 4B A146T produce Campione 3 KRAS Exon 4B frammenti DNA Sizing Standard 78 e 116 bp Amplicor da 1 coppie di basi intonso Figure 7A e 7B Analisi WAVE DHPLC con UV Figura 7A e rilevamento della fluorescenza Figura 7B delle digestioni SURVEYOR Nuclease di KRAS Positive Control Exon 4B e KRAS Control Wild Type e CRC DNA isolato dalle sezioni FFPE Quando si controllano a vista i cromatogrammi i campioni digeriti devono essere confrontati con il Wild Type Control linea marrone KRAS Positive Control Exon 4B linea verde scuro una miscela di plasmidi Wild Type e A146T mutanti che produce picchi di digestione da 78 e 116 coppie di basi questo controllo indica che la fase di digestione SURVEYOR Nuclease attiva e mostra la regione del cromatogramma da controllare visivamente per capire se necessario sottoporre un campione all analisi mediante sequenziamento del DNA Confrontando i pattern di digestione relativi ai campioni 1 3 con l elettroferogramma non digerito Wild Type risulta evidente che il campione 3 linea rossa presenta una probabile mutazione e deve essere sottoposto a sequenziamento per confermare la pr
19. AS Positive Control Exon 3 PN 710136 KRAS Positive Control Exon 4A PN 710137 KRAS Positive Control Exon 4B PN 710138 NRAS Control Wild Type PN 710441 NRAS Positive Control Exon 2 PN 710442 NRAS Positive Control Exon 3 PN 710443 NRAS Positive Control Exon 4 PN 710444 Istruzioni d uso di CRC RAScan Combination Kit con sistemi DHPLC Pagina 20 12 Istruzioni dettagliate Questi DNA di controllo sono plasmidi con inserti Positive Control contengono ciascuno due plasmidi una miscela di KRAS o NRAS Control Wild Type e un clone di mutazione che differisce dal Wild Type per un unica coppia di basi controlli sono contenuti in fiale separate ciascuna ad una concentrazione di 10 copie uL primer KRAS e NRAS Exons 2 3 e 4 Forward e Reverse PCR necessari per l amplificazione PCR sono forniti separatamente all interno delle scatole dei kit Per l uso di questi controlli attenersi alle istruzioni riportate nelle sezioni Protocollo di Amplificazione Digestione con SURVEYOR Nuclease e Analisi di KRAS e NRAS Exons 2 3 amp 4 utilizzando SURVEYOR Nuclease RACCOMANDIAMO VIVAMENTE AGLI UTILIZZATORI INESPERTI DI ESEGUIRE ESPERIMENTI CON I SOLI CONTROLLI PRIMA DELL ANALISI DEI CAMPIONI GENOMICI 14 Interpretazione dei risultati 14 1 Analisi di KRAS e NRAS Exons 2 3 e 4 utilizzando SURVEYOR Nuclease A scopo di confronto controllo eseguire SEMPRE la digestione con SURVEYOR Nuclease su entrambi i controlli controllo Wild Type e Positi
20. CCAACAAGGACAGT TGATACAAAAGTTGCCCACGAACTGGCCAAGAGTTACGGG ATTCCATTCATTGAAACCTCAG M AAG A 3 Denaturazione di HPLC DHPLC Requisiti di sistema A 3 1 DHPLC Requisiti per applicazioni SURVEYOR SCAN Le seguenti specifiche sono i requisiti minimi per i requisiti del sistema DHPLC relativi all esecuzione dei dosaggi del kit SURVEYOR Scan KRAS amp NRAS Sistema di erogazione del solvente a gradiente ad alta efficienza e Capacit del gradiente binario alta pressione o bassa pressione e Controllo del flow rate range minimo 0 7 1 6 mL min e Precisione del flow rate 2 H20 a 20 C e Degasatore del solvente Autocampionatore e Controllo della temperatura per raffreddare piastre regolabile da 4 a 14 C e Volume di iniezione 5 50 uL Cartuccia di separazione e lIdeata perla separazione dei formati di frammenti di dsDNA formati di frammenti da 50 a 250 coppie di basi Forno di alta precisione con controllo della temperatura e Range temperatura da 40 a 70 C e Precisione temperatura 0 2 C e Riproducibilit temperatura 0 2 C e Linearit su tutto il range di temperatura 2 0 C Alternativa rilevamento 1 e Rilevatore UV VIS e Range lunghezza d onda 190 700 nm e Sorgente UV Lampada al deuterio Istruzioni d uso di CRC RAScan Combination Kit con sistemi DHPLC Pagina 33 Appendice A Alternativa rilevamento 2 e Rilevatore fluorescenza e Range lunghezza d onda eccitazione 200 850 nm emissione 250 9
21. CRC RAScan Combination Kit con sistemi DHPLC Pagina 14 12 Istruzioni dettagliate Nota se un campione DNA mutante al 100 non si possono formare eteroduplici e il campione risulter Wild Type Tuttavia i campioni bioptici tumorali conterranno cellule Wild Type a causa della eterogeneit del tumore e o del tessuto normale contaminante Nota campioni con DNA mutante al 5 e al 95 avranno cromatogramma identici Nota risultati SURVEYOR Scan positivi possono essere dovuti ad alterazioni di basi diverse da quelle che sono state riscontrate KRAS o NRAS attivanti Sebbene queste mutazioni siano rare sar necessaria la conferma con un altro metodo come il sequenziamento del DNA per determinare se un risultato SURVEYOR Scan positivo o meno una mutazione KRAS o NRAS attivante Nota il processo di fissazione in formalina usato per preparare i campioni bioptici tumorali FFPE pu provocare la deaminazione delle citosine che converte la citosina in uracile La polimerasi interpreta questo uracile come timina e integra un adenina nei filamenti copiati Quindi ci apparir come una mutazione in cui la normale G sostituita da una A provocando una mutazione da GC in AT che costituisce una mutazione artefatta dovuta al processo di fissazione e non una reale mutazione somatica Si tratta di eventi rari ma se la copia avviene in una fase precoce del ciclo PCR possono assomigliare a mutazioni Non si ripetono alla rianalisi
22. Dopo un attenta revisione di ciascun campione il revisore dei dati deve esaminare se i campioni adiacenti nella piastra di analisi hanno risultati identici positivi per il SURVEYOR Scan Se sono presenti risultati positivi identici questi possono derivare da contaminazione incrociata del campione o del controllo L analisi deve essere ripetuta Istruzioni d uso di CRC RAScan Kit con sistemi DHPLC Pagina 22 14 Interpretazione dei risultati 14 3 Esempi dei risultati Esempi dei risultati ottenuti utilizzando CRC RAScan Combination Kit con un sistema DHPLC sono illustrati nelle Figure 4 10 seguenti In questi esempi utilizzando WAVE 4500HT HS System con rilevatori UV e fluorescenti il processo illustrato nella sezione Istruzioni dettagliate stato seguito alla lettera Per indicazioni sulle impostazioni consigliate del gradiente del sistema DHPLC per l analisi delle digestioni SURVEYOR Nuclease consultare il sito http world transgenomic com diagnostic tools qenetic analysis kits crc rascan kits eu dhplcsystemsettings Figura 4A KRAS Control Wild Type KRAS Control Exon 2 Campione 1 KRAS Exon 2 Campione 2 KRAS Exon 2 Campione 3 KRAS Exon 2 DNA Sizing Standard Flusso coppie continuo G12D produce pp frammenti di basi DHPLC i 74 e 116 bp intonso Risciacquo DHPLC KRAS Control Wild Type KRAS Control Exon 2 G12D produce frammenti 74 e 116 bp Campione 1 KRAS Exon 2 Campione 2 KRAS Exon 2 Campione 3 K
23. RAS Exon 2 DNA Sizing Standard Amplicon da 190 coppie di basi intonso Figure 4A e 4B Analisi WAVE DHPLC con UV Figura 4A e rilevamento della fluorescenza Figura 4B delle digestioni SURVEYOR Nuclease di KRAS Positive Control Exon 2 e KRAS Control Wild Type e CRC DNA isolato dalle sezioni FFPE Quando si controllano a vista cromatogrammi i campioni digeriti devono essere confrontati con il Wild Type Control linea marrone KRAS Positive Control Exon 2 linea blu una miscela di plasmidi Wild Type e G12D mutanti che produce picchi di digestione da 74 e 116 coppie di basi questo controllo indica che la fase di digestione SURVEYOR Nuclease attiva e mostra la regione del cromatogramma da controllare visivamente per capire se necessario sottoporre un campione all analisi mediante sequenziamento del DNA Confrontando i pattern di digestione relativi ai campioni 1 3 con l elettroferogramma non digerito Wild Type risulta evidente che i campioni 1 e 2 linee rossa e turchese presentano delle probabili mutazioni e devono essere sottoposti a sequenziamento per confermare la presenza o assenza di una mutazione a livello del relativo codone Il campione 3 linea verde presenta cromatogrammi simili a quelli osservati per il Wild Type Control e non Istruzioni d uso di CRC RAScan Combination Kit con sistemi DHPLC Pagina 23 14 Interpretazione dei risultati necessario sottoporlo all analisi mediante sequenziamento del DNA Va osservato
24. RAS Exons Per maggiori dettagli sull utilizzo e la manutenzione dello strumento consultare il manuale di istruzioni del sistema DHPLC Il manuale comprende procedure specifiche per il controllo e la manutenzione delle prestazioni della colonna e fornisce informazioni dettagliate per la risoluzione dei problemi Problema 1 PCR bassa o nessun prodotto di PCR quando analizzato su gel di agarosio BASSA RESA PCR POSSIBILE CAUSA SOLUZIONE Scarsa qualit del Ripetere la purificazione del DNA verificare il DNA stampo metodo di purificazione utilizzato Se il DNA estratto da FFPE risulta troppo frammentato Buona Scarsa potrebbero essere necessari blocchi FFPE PCR PCR alternativi resa resa Troppo RNA nel Ripetere il trattamento RNase del campione di campione provoca una DNA e ripurificare il DNA sovrastima della concentrazione del DNA Termociclatore non Verificare la calibrazione del termociclatore calibrato Stampo non sufficiente Aumentare il quantitativo di templato Nota Utilizzare DNA estratto da FFPE di alta qualit II DNA deve avere una concentrazione di 25 ng uL come stabilito per assorbanza a 260 nm deve presentare un rapporto di assorbanza a 260 280 nm deve presentare un rapporto di assorbanza a 260 280 nm superiore a 1 8 ed essere DNA gt 90 ovvero senza contaminazione di tRNA ed rRNA come verificato dal suo aspetto su un gel di agarosio Conservare i campioni di DNA da 20 C a 80 C Istruzioni
25. RC RAScan Combination Kit con sistemi DHPLC Pagina 11 12 Istruzioni dettagliate 12 Istruzioni dettagliate 12 1 Configurazione calibrazione INIZIALE di DHPLC Per l impostazione della piastra SURVEYOR Nuclease per l analisi mediante DHPLC consultare l Appendice A 3 Denaturazione di HPLC DHPLC Requisiti di sistema 12 2 Considerazioni prima dell Analisi del Campione KRAS e NRAS Prima dell analisi dei campioni su un sistema DHPLC deve essere eseguito il DNA Size Standard adeguato per verificare che il sistema funzioni correttamente Il personale di laboratorio che utilizza lo strumento deve controllare la qualit della risoluzione del DNA Size Standard prima di procedere all analisi 12 3 Considerazioni sul templato 1 Per il templato di DNA ottenuto mediante FFPE utilizzare le normali procedure di laboratorio per valutare la qualit e la quantit di DNA estratto accertandosi che vi sia una quantit di templato sufficiente per la PCR Il rapporto di assorbanza 260 280 deve essere maggiore di 1 80 Per velocizzare la messa a punto della PCR necessario che la concentrazione del templato di lavoro sia di circa 12 5 ng uL Se necessario diluire il templato di DNA con acqua per uso in biologia molecolare 12 4 Considerazioni sul flusso di lavoro Il kit stato concepito per consentire l analisi su 230 reazioni possibile eseguire lotti pi piccoli ma per ciascun lotto necessario includere i controlli del kit e un controll
26. a dal lato 3 di ciascuna base del mismatch In questo modo taglia il doppio filamento del DNA lasciando sospesa una singola base 3 SURVEYOR Nuclease Frammenti risultanti e i SURVEYOR Nuclease stata impiegata in un ampia gamma di contesti per rilevare con la massima precisione diverse mutazioni e poliformismi nei geni In particolare SURVEYOR Nuclease stata anche utilizzata per verificare la presenza di mutazioni note in diversi geni associati al tumore ai reni ai polmoni alla testa collo alla leucemia al tumore dell endometrio e nella selezione dei soggetti da sottoporre a radioterapia 1 CRC RAScan Combination Kit stato studiato per tagliare i mismatch in KRAS e NRAS Exons 2 3 amp 4 per la successiva analisi mediante DHPLC Nota se un campione DNA mutante al 100 non si possono formare eteroduplici e il campione risulter Wild Type Tuttavia i campioni bioptici tumorali conterranno cellule Wild Type a causa dell eterogeneit del tumore e o del tessuto normale contaminante va osservato che i campioni con DNA mutante al 5 e al 95 avranno cromatogramma identici Nota per la parte PCR di questo dosaggio si consiglia l uso della sola DNA Polymerase in dotazione con il presente kit Nota attenersi alle istruzioni specifiche del manuale del sistema DHPLC AI fine di utilizzare al meglio il presente kit consigliamo vivamente di leggere attentamente il presente manuale e di attenersi scrup
27. amento del DNA ha confermato che l unica modifica alla sequenza si ha in corrispondenza del codone 146 con un alterazione A146T GCC gt ACC Questo clone viene quindi miscelato con DNA NRAS Control Wild Type per creare una miscela eterozigote Istruzioni d uso di CRC RAScan Kit con sistemi DHPLC Pagina 6 5 Componenti CRC RAScan Combination Kit viene fornito in una confezione singola con due scatole separate a una scatola di reagenti per l analisi di KRAS Exons 2 3 amp 4 e b una scatola di reagenti per l analisi di NRAS Exons 2 3 amp 4 Nell insieme le scatole contengono una quantit di reagenti sufficiente per eseguire le analisi elencate nella sezione 5 3 5 Componenti 5 1 Scatola SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 2 3 amp 4 RE 710107 La scatola con i componenti per l analisi di KRAS Exons 2 3 amp 4 contiene due confezioni interne 1 una confezione di componenti di digestione SURVEYOR con 10 provette di reagenti e 2 un portaprovette di componenti e controlli PCR esterno contenente 20 provette di reagenti Numero di codice Confezione di componenti di digestione SURVEYOR 710160 710161 708049 708027 708030 Componente SURVEYOR Nuclease W SURVEYOR Enhancer W2 Cofattore SURVEYOR Enhancer Soluzione 0 15 M di MgCl Soluzione di arresto Confezione di componenti e controlli PCR 703310 703315 703065 710155F 710155R 710157F 710157R 710154F 710154R 710156F 710156R 710131 710135 710136 710137 710
28. amp 4 CRC RAScan Combination Kit un dosaggio per il rilevamento dell intera sequenza e di tutte le piccole mutazioni di inserzione delezione negli Exons 2 3 amp 4 dei geni KRAS e NRAS Le mutazioni dei codoni 12 13 59 61 117 e 146 di KRAS e NRAS sono state associate alla mancanza di efficacia del panitumumab In questo kit sono forniti i Positive Control per le mutazioni dei codoni 12 61 117 e 146 Il presente kit utilizza la tecnologia SURVEYOR Nuclease di propriet di Transgenomic e se associata alla tecnologia DHPLC System garantisce una rilevazione semplice e sensibile delle potenziali mutazioni in grado di rilevare una miscela di DNA mutante al 2 5 su un background di DNA non mutante Studi di convalida hanno dimostrato una concordanza estremamente elevata con il sequenziamento in campioni di tumore colorettale ben caratterizzati L uso di CRC RAScan Combination Kit riduce il ricorso al sequenziamento e al contempo agevola l individuazione della mutazione anche laddove il software per il sequenziamento automatizzato non riesce a rilevare la presenza di una mutazione di basso livello Data l alta sensibilit di questo dosaggio rispetto al sequenziamento Sanger si consiglia di ottimizzare il set up di laboratorio per evitare la contaminazione incrociata dei campioni o dei controlli Per avere un esempio di un set up di laboratorio ideale vedere Appendice A 4 Set up di laboratorio per dosaggi PCR 3 2 Analisi di campioni paz
29. che il risultato del sequenziamento il risultato definitivo in quanto potrebbero essere registrate altre mutazioni non rilevanti che possono comportare le stesse dimensioni dei frammenti Figura 5A KRAS Control Wild Type KRAS Control Exon 3 Campione 1 KRAS Exon 3 Campione 2 KRAS Exon 3 Campione 3 KRAS Exon 3 Flusso DNA Sizing Standard continuo DHPLC Amplicon Q61H produce da 200 coppie frammenti di basi 65e135 bp ail intonso KRAS Control Wild Type KRAS Control Exon 3 Q61H produce Campione 1 KRAS Exon 3 frammenti Campione 2 KRAS Exon 3 65 e 135 bp Campione 3 KRAS Exon 3 I DNA Sizing Standard Amplicon da 200 coppie di basi intonso Figure 5A e 5B Analisi WAVE DHPLC con UV Figura 5A e rilevamento della fluorescenza Figura 5B delle digestioni SURVEYOR Nuclease di KRAS Positive Control Exon 3 e KRAS Control Wild Type e CRC DNA isolato dalle sezioni FFPE Quando si controllano a vista cromatogrammi i campioni digeriti devono essere confrontati con il Wild Type Control linea marrone KRAS Positive Control Exon 3 linea verde una miscela di plasmidi Wild Type e G12D mutanti che produce picchi di digestione da 65 e 135 coppie di basi questo controllo indica che la fase di digestione SURVEYOR Nuclease attiva e mostra la regione del cromatogramma da controllare visivamente per capire se necessario sottoporre un campione all analisi mediante sequenziamento del DNA Confrontando i patter
30. chi di digestione da 68 e 165 coppie di basi questo controllo indica che la fase di digestione SURVEYOR Nuclease attiva e mostra la regione del cromatogramma da controllare visivamente per capire se necessario sottoporre un campione all analisi mediante sequenziamento del DNA Confrontando i pattern di digestione dei campioni 1 e 2 con l elettroferogramma digerito Wild Type risulta evidente che i campioni 1 e 2 linee rossa e nera presentano cromatogrammi simili a quello osservato per NRAS Control Wild Type e non necessario sottoporli ad analisi mediante sequenziamento del DNA Va osservato che per risultati positivi SURVEYOR Scan il risultato del sequenziamento il risultato definitivo in quanto potrebbero essere registrate altre mutazioni non rilevanti che possono comportare le stesse dimensioni dei frammenti Istruzioni d uso di CRC RAScan Combination Kit con sistemi DHPLC Pagina 29 15 Caratteristiche prestazionali 15 Caratteristiche prestazionali 15 1 Livello di rilevamento delle mutazioni mediante i kit SURVEYOR Scan La convalida dei kit SURVEYOR Scan per piattaforme DHPLC che utilizzano coni plasmidici di tutte le mutazioni indicate ha evidenziato che i picchi SURVEYOR Nuclease possono essere rilevati in una miscela di mutante al 2 5 su uno sfondo Wild Type L uso del sequenziamento automatizzato dei filamenti forward e reverse spesso non in grado di rilevare la mutazione in miscele con DNA Wild Type se inferiore al 1
31. dette rivendicazioni di brevetto in merito all utilizzo del solo quantitativo di prodotto che l acquirente ha a disposizione per le proprie ricerche interne Non viene concesso n espressamente n implicitamente o per preclusione alcun altro diritto in virt di altre rivendicazioni di brevetto quali le rivendicazioni che coprono il processo brevettato della 5 nucleasi con brevetti US n 5 210 015 e 5 487 972 nessun diritto ad applicare qualsivoglia metodo brevettato n nessun diritto ad eseguire servizi commerciali di alcun tipo compresi senza alcuna limitazione la divulgazione a scopo di lucro dei risultati delle attivit svolte dall acquirente o altre considerazioni commerciali Questo prodotto ha solo scopo di ricerca Gli utilizzi diagnostici in virt dei brevetti Roche necessitano di una licenza a parte rilasciata da Roche Per maggiori informazioni sull acquisto di licenze rivolgersi a Director of Licensing Applied Biosystems 850 Lincoln Centre Drive Foster City California 94404 USA Transgenomic SURVEYOR e WAVE sono marchi registrati mentre Navigator CRC RAScan il logo con l elica e Advancing Personalized Medicine sono marchi di Transgenomic Inc Tutti gli altri marchi appartengono ai rispettivi proprietari 2013 Transgenomic Inc Tutti i diritti riservati Stampato negli Stati Uniti Documento N 482427 IT rev 00 Istruzioni d uso di CRC RAScan Kit con sistemi DHPLC Pagina 45
32. e e mutanti non solo le mutazioni negli Exons 2 3 o 4 SURVEYOR Nuclease conferma la presenza di un mismatch L identit specifica dell alterazione di base della mutazione richiesta per la determinazione dello stato KRAS e NRAS attivante e deve essere confermata con un altro metodo ad esempio il sequenziamento Istruzioni d uso di CRC RAScan Combination Kit con sistemi DHPLC Pagina 21 14 Interpretazione dei risultati 14 2 Revisione dei dati dei risultati SURVEYOR Scan Analizzare i cromatogrammi e confrontare quelli dei Wild Type e Positive Control con quello del campione Stabilire se il cromatogramma del campione simile o diverso dal pattern Wild Type Se diverso il campione deve essere considerato SURVEYOR Scan Positive e sottoposto a conferma mediante sequenziamento del DNA Ved Figure 4 10 per degli esempi e l Appendice B Guida alla risoluzione dei problemi Problemi 7 e 8 per esempi di tali campioni Qualunque campione con un pattern SURVEYOR Nuclease diverso dal Wild Type deve essere sottoposto alla conferma mediante sequenziamento anche se non identico al Positive Control Ved Appendice B Guida alla risoluzione dei problemi Problema 7 per un esempio di tale campione Se richiesto effettuare lo zoom sulla regione di interesse e sovrapporre il cromatogramma del campione con il Wild Type Control per tale amplicone Osservare eventuali differenze fra il Wild Type Control campione analizzato Importante
33. e elettroforesi in gel e Eseguire la preparazione della digestione SURVEYOR Nuclease in una stanza separata o in una postazione di lavoro per PCR differente rispetto a quella utilizzata per la preparazione della PCR iniziale e Accertarsi che i controlli plasmidici del kit vengano manipolati separatamente dai campioni utilizzati per il test in tutte le fasi del dosaggio o Assicurarsi che tutte le soluzioni i controlli NTC e i pozzetti dei campioni di DNA siano coperti prima di aprire le provette contenenti il DNA plasmidico di controllo o MANIPOLARE CONTROLLI PER ULTIMI Aggiungere Il DNA plasmidico di controllo alle provette appropriate solo DOPO AVERE COPERTO TUTTI INTC ei pozzetti dei campioni o Dopo avere coperto tutte le provette del DNA di controllo pulire TUTTE le provette e TUTTI i coperchi con un prodotto in grado di distruggere il DNA ad esempio candeggina al 10 prima del trasferimento in un altra area e Accertarsi che l operazione di pipettaggio del campione nelle piastre da 96 pozzetti non provochi la contaminazione di pozzetti contigui dovuti a schizzi formatisi durante la miscelazione o alla mancata sostituzione dei puntali Istruzioni d uso di CRC RAScan Kit con sistemi DHPLC Pagina 31 Appendice A Appendice A A 1 Piano di layout della piastra per kit SURVEYOR Scan Il piano di layout della piastra indicato nel seguito si riferisce all esecuzione dell analisi SURVEYOR Scan di tutti i sette KRAS e NRAS Exon
34. e per il sequenziamento del DNA di tutti i campioni testati Per il sequenziamento si consiglia di utilizzare gli ampliconi ottenuti tramite PCR prima della digestione con SURVEYOR Nuclease 6 Apparecchiature e reagenti aggiuntivi richiesti Per l utilizzo del CRC RAScan Combination Kit con DHPLC sono richieste le seguenti apparecchiature e componenti aggiuntivi sistema DHPLC colonna tamponi dimensione standard DNA ved Appendice A 3 1 DHPLC Requisiti per applicazioni SURVEYOR Scan per le caratteristiche di un sistema DHPLC adatto all uso con questo kit Acqua per uso in biologia molecolare Provette da 0 2 mL PCR strisce o piastra da 96 pozzetti Micropipettatori Puntali delle pipette Bagno di ghiaccio Miscelatore vortex Microcentrifuga Termociclatore Gel di agarosio e apparecchiature per elettroforesi in gel di agarosio Candeggina al 10 o detergente simile 7 Preparazione del reagente Tutti i reagenti forniti in dotazione con questo kit sono pronti per l uso Alcuni componenti devono essere scongelati agitati con il vortex o centrifugati in una microcentrifuga prima dell uso verificare i dettagli nella sezione Procedura di dosaggio pi avanti reagenti devono essere mescolati per ottenere la Master Mix e le miscele di reazione tutti i dettagli sono forniti nella sezione Procedura di dosaggio di seguito Istruzioni d uso di CRC RAScan Combination Kit con sistemi DHPLC Pagina 9 8 Conservazione e Durata 8 Conservaz
35. ei frammenti di taglio di SURVEYOR Nuclease e comprendono le mutazioni con importanza clinica potenziale nota Il presente kit destinato all uso in laboratori diagnostici clinici da parte di personale opportunamente addestrato al test del DNA estratto da tessuti inclusi in paraffina e fissati in formalina Il numero di codice di questo kit 710077 manuali di istruzioni sono disponibili per il download dal sito http world transgenomic com files literature 482427 IT pdf 2 2 Indicazioni per l uso CRC RAScan Combination Kit con sistemi DHPLC pu essere utilizzato come ausilio nella valutazione della non risposta di pazienti con tumori colorettali a trattamenti terapeutici con anti EGFR recettore del fattore di crescita epidermico quali il panitumumab CRC RAScan Combination Kit non deve essere utilizzato la diagnosi del tumore colorettale o di qualsiasi altra forma tumorale CRC RAScan Combination Kit un dosaggio che rileva la presenza di potenziali mutazioni somatiche negli Exons 2 3 amp 4 dei geni KRAS e NRAS ma non conferma l identit della sequenza della mutazione Per identificare l esatta mutazione rilevata necessario svolgere ulteriori analisi quali il sequenziamento del DNA Sebbene i risultati dell analisi con questi kit indicheranno lo stato di mutazione del paziente necessario tenere presente altri fattori clinici risultati ottenuti con CRC RAScan Combination Kit non devono essere l unico metodo utiliz
36. ento scongelamento Non utilizzare il kit qualora si sia superato il numero di cicli di congelamento scongelamento 10 Raccolta manipolazione e conservazione del campione CRC RAScan Combination Kit stato convalidato per l uso con DNA estratto da campioni di tumore colorettale inclusi in paraffina e fissati in formalina FFPE Affinch l estrazione del DNA sia ottimale il tessuto deve essere fissato in formalina per 14 24 ore prima dell inclusione in paraffina campioni bioptici di tumore sono una miscela eterogenea di cellule tumorali e non tumorali Inoltre il tumore stesso costituito da un mix eterogeneo di cellule tumorali con mutazioni e cellule tumorali senza mutazioni Poich queste mutazioni somatiche possono non essere uniformemente distribuite all interno del tumore la risultante analisi mutazionale di differenti sezioni dello stesso tumore pu essere diversa Per aumentare la probabilit di rilevare una mutazione il DNA della regione tumorale del tessuto deve essere isolata raschiando solo l area tumorale dal vetrino usando un nuovo scalpello sterile per ogni nuovo vetrino Per un utilizzo efficace del kit il DNA estratto deve soddisfare i criteri elencati al paragrafo Considerazioni sul Templato NOTA campioni di DNA estratto non destinati all analisi immediata con il kit devono essere conservati da 20 C a 80 C Istruzioni d uso di CRC RAScan Kit con sistemi DHPLC Pagina 10 11 Procedura di dosaggio
37. esenza o assenza di una mutazione a livello del relativo codone campioni 2 e 3 linea nera e verde chiaro presentano cromatogrammi simili a quelli osservati per il Wild Type Control e non necessario sottoporli all analisi mediante sequenziamento del DNA Va osservato che il risultato del sequenziamento il risultato definitivo in quanto potrebbero essere registrate altre mutazioni non rilevanti che possono comportare le stesse dimensioni dei frammenti Istruzioni d uso di CRC RAScan Combination Kit con sistemi DHPLC Pagina 26 14 Interpretazione dei risultati Figura 8A NRAS Control Wild Type NRAS Control Exon 2 Campione 1 NRAS Exon 2 Campione 2 NRAS Exon 2 DNA Sizing Standard Flusso continuo DHPLC Amplicon da 236 coppie di WA basi intonso Risciacquo DHPLC G12D produce frammenti 88 e 148 bp NRAS Control Wild Type NRAS Control Exon 2 G12D produce Campione 1 NRAS Exon 2 frammenti Campione 2 NRAS Exon 2 88 e 148 bp DNA Sizing Standard Amplicon da 236 coppie di basi intonso Figure 8A e 8B Analisi WAVE DHPLC con UV Figura 8A e rilevamento della fluorescenza Figura 8B delle digestioni SURVEYOR Nuclease di NRAS Positive Control Exon 3 e Wild Type Control e CRC DNA isolato dalle sezioni FFPE Quando si controllano a vista i cromatogrammi i campioni digeriti devono essere confrontati con NRAS Control Wild Type linea blu NRAS Positive Control Exon 2 linea
38. fine di miscelare accuratamente centrifugare brevemente per 10 secondi per assicurarsi che sui coperchi delle provette non rimanga liquido quindi collocare su ghiaccio 5 Preparare le Master Mix su ghiaccio Istruzioni d uso di CRC RAScan Combination Kit con sistemi DHPLC Pagina 15 12 Istruzioni dettagliate 6 Utilizzare la seguente tabella come guida per la preparazione della Master Mix per ciascuna delle reazioni KRAS Exon 2 KRAS Exon 3 KRAS Exon4A KRAS Exon 4B e delle reazioni NRAS Exon 2 NRAS Exon 3 e NRAS Exon 4 Numero di reazioni 7 campioni 3 controlli Calcolo del volume Volume dell acqua uL DNA Polymerase 10X PCR Buffer uL dNTPs uL Forward Primer uL Reverse Primer uL DNA Polymerase uL Volume totale della Master Mix 48 0 Nota L operatore deve prefiggersi di avere minimo 25 ng di DNA per 50 uL di reazione PCR Se le concentrazioni di DNA estratto sono inferiori a 12 5 ng uL aumentare proporzionalmente il volume di DNA estratto per assicurare 25 ng per reazione Ridurre inoltre il volume di acqua nella Master Mix in uguale quantit per produrre 50 uL per reazione In tutti i campioni preparati con queste master mix sar necessario diluire il DNA estratto fino a circa lo stesso livello di concentrazione minima Si sconsiglia l uso di concentrazioni di DNA estratto inferiori a 5 ng pL 7 Calcolare i volumi richiesti per ogni Master Mix facendo riferimento al grafico precedente va osser
39. iate Note alla Figura 3 1 2 3 isolare il DNA da FFPE utilizzando procedure di laboratorio standard Eseguire PCR e controllare la qualit del DNA con elettroforesi in gel Registrare se la banda PCR solida 220 ng uL o debole lt 20 ng uL Se sono presenti bande PCR multiple preparare DNA genomico fresco da FFPE 4 Con i campioni classificati come PCR solida o PCR debole in seguito ad amplificazione PCR procedere al trattamento SURVEYOR Nuclease e all analisi del sistema DHPLC Si noti che con un risultato debole per PCR il DNA potrebbe essere insufficiente per la produzione di risultati affidabili da DHPLC sebbene possa essere sufficiente per il sequenziamento Ved Appendice B Guida alla risoluzione dei problemi per esempi di risultati SURVEYOR Scan falliti Tutti i campioni con risultato SURVEYOR Scan non riuscito devono essere nuovamente elaborati in uno dei seguenti modi a ripetendo la PCR se rimane sufficiente DNA genomico b riestraendo il DNA dalla FFPE questa da considerarsi come opzione di seconda scelta in quanto di norma poco auspicabile tagliare un altro blocco FFPE c se vengono usati una sezione o un blocco diversi occorre ripetere l intero dosaggio in quanto le discrepanze nelle digestioni possono essere dovute all eterogeneit del tumore Se non sono presenti picchi dei frammenti di taglio visibili registrare un risultato SURVEYOR Scan negativo ossia NVD No Variant Detected
40. iente con i kit SURVEYOR Scan L uso di CRC RAScan Combination Kit limitato al contesto di uno dei flussi di lavoro elencati di seguito Flusso di lavoro Campione paziente Test KRAS e NRAS Exons 2 3 amp 4 Risultato del rapporto Figura 1 Flusso di lavoro di CRC RAScan Combination Kit per lo screening di KRAS e NRAS Per suggerimenti su come preparare piastre da 96 pozzetti per l analisi di tutti i KRAS e NRAS Exons 2 4 ved Appendice A 1 Piano di layout della piastra per CRC RAScan Combination Kit Istruzioni d uso di CRC RAScan Kit con sistemi DHPLC Pagina 4 3 Principi di Funzionamento del dosaggio di rilevamento delle mutazioni SURVEYOR Scan KRAS e NRAS 3 3 SURVEYOR Nuclease SURVEYOR Nuclease di Transgenomic una endonucleasi di DNA vegetale specifico del mismatch in grado di individuare mutazioni e polimorfismi noti e ignoti nel DNA eteroduplice L enzima scinde il DNA con la sua elevata specificit in corrispondenza delle sedi di mismatch per la sostituzione di basi e altre alterazioni Questa endonucleasi di DNA taglia entrambi i filamenti di un DNA eteroduplice sul lato 3 della sede di mismatch Vengono riconosciuti tutti i mismatch di inserzione delezione nonch i mismatch di sostituzione delle basi ma l efficacia di taglio varia a seconda della sequenza del mismatch Posizione del mismatch Figura 2 Modalit di azione della SURVEYOR Nuclease L endonucleasi riconosce il punto di mismatch e tagli
41. ilizzati Laddove ha luogo questa interazione si generano picchi di ridotte dimensioni sul sistema DHPLC La digestione Wild Type Control mostrer questi stessi picchi minimi Questo confronto serve a individuare le differenze nei pattern degli cromatogramma tra Wild Type Control e il campione del test e per mettere a confronto il pattern del campione del test con quello del Wild Type Control Istruzioni d uso di CRC RAScan Kit con sistemi DHPLC Pagina 40 Appendice B Problema 5 Picchi di digestione di SURVEYOR Nuclease in controlli negativi PICCHI DI DIGESTIONE IN CONTROLLI POSSIBILE NEGATIVI CAUSA SOLUZIONE Segnale debole Contaminazione del Smaltire tutti i Picchi di digestione in Wild Type con contenuto del kit componenti del kit con ampliconi o e utilizzarne uno controlli plasmidici nuovo del gene KRAS or NRAS Rivolgersi all assistenza tecnica Transgenomic Technical Support Flusso oe Lavaggio to discuss potential ae emoduplice DHPLC causes e chiedere intonso spiegazioni delle potenziali cause e fonti di contaminazione Problema 6 Risultati di SURVEYOR Nuclease falliti LA DIGESTIONE SURVEYOR NUCLEASE DI POSSIBILE POSITIVE CONTROL FALLITA CAUSA POLEGONE SURVEYOR Digerire un nuovo Nuclease non campione stata aggiunta Nessun picco di digestie Picco a FAOCUPIGE La digestione Digerire un nuovo i SURVEYOR campione Nuclease stata eseguita alla temperatura sbagliata I
42. in corrispondenza dei mismatch negli eteroduplici Il rapporto tra eteroduplici e omoduplici nel campione ibridizzato determiner la dimensione del segnale di digestione con SURVEYOR Nuclease In presenza di una mutazione del gene KRAS o NRAS ad una bassissima concentrazione nel campione di DNA genomico il segnale potrebbe essere troppo basso per fornire un risultato positivo importante far s che la fase di ibridizzazione venga inclusa nel programma del termociclatore vedere Protocollo di Amplificazione per massimizzare l efficacia della formazione di eteroduplici Gli eteroduplici si formano in modo particolarmente inefficace durante reazioni PCR standard Istruzioni d uso di CRC RAScan Kit con sistemi DHPLC Pagina 39 Appendice B Nota il rapporto segnale rumore generalmente sufficientemente alto da consentire la rilevazione di mutazioni anche a basse percentuali sul totale del templato di DNA possibile infatti rilevare la presenza del 2 di DNA mutante Le figure 4 10 mostrano i prodotti della digestione ottenuti con DNA KRAS e NRAS Positive Control omoduplici ed eteroduplici in dotazione con il kit e i campioni FFPE su un sistema 4500 WAVE DHPLC Sono chiaramente visibili i prodotti di clivaggio data la presenza di due nuovi picchi aventi le dimensioni previste che possono essere valutati in base al size marker del DNA Attenzione i tamponi PCR disponibili sul mercato variano significativamente per contenuto e spesso i forn
43. informazioni in questa versione tradotta del manuale fare riferimento alla versione inglese Instructions for Use for the CRC RAScan Combination Kit for DHPLC Systems 482427 EN http world Transqenomic com files literature 482427 EN pdf e o contatto Transgenomic a support transgenomic com Istruzioni d uso di CRC RAScan Combination Kit con sistemi DHPLC Pagina 44 Licenze Marchi e Copyright Licenze Marchi e Copyright SURVEYOR Nuclease Il presente prodotto realizzato sotto licenza esclusiva dei brevetti US Patents 6 699 980 6 391 557 5 869 245 i corrispondenti brevetti per l estero e altri brevetti in attesa di autorizzazione L uso di SURVEYOR Nuclease necessita di una licenza rilasciata da Transgenomic L acquisto del presente prodotto da parte di organizzazioni accademiche no profit e for profit concede loro diritti limitati all uso di SURVEYOR Nuclease a scopi di ricerca severamente vietato rivendere il presente prodotto o utilizzarlo per altri scopi Per maggiori informazioni rivolgersi a Transgenomic DNA Polymerase l uso del presente prodotto coperto da uno o pi dei seguenti brevetti US e dalle corrispondenti rivendicazioni di brevetto al di fuori degli Stati Uniti 5 789 224 5 618 711 6 127 155 nonch rivendicazioni al di fuori degli Stati Uniti corrispondenti al brevetto US n 4 889 818 L acquisto del presente prodotto implica una garanzia limitata e non trasferibile contro azioni legali in virt delle sud
44. ionata ma contenente la mutazione A146T Il sequenziamento del DNA ha confermato che l unica modifica alla sequenza si ha in corrispondenza del codone 146 con un alterazione A146T GCA gt ACA Questo clone viene quindi miscelato con DNA KRAS Control Wild Type per creare una miscela eterozigote Il NRAS Control Wild Type stato realizzato mediante sintesi e clonazione degli Exons NRAS 2 3 e 4 usando NCBI Reference Sequences NG_007572 Il NRAS Positive Control Exon 2 stato realizzato mediante sintesi dell NRAS Exon 2 usando il riferimento di cui sopra ma contenente la mutazione G12D Il sequenziamento del DNA ha confermato che l unica modifica alla sequenza si ha in corrispondenza del codone 12 con un alterazione G12D GGT gt GAT Questo clone viene quindi miscelato con DNA NRAS Control Wild Type per creare una miscela eterozigote Il NRAS Positive Control Exon 3 stato realizzato mediante sintesi dell NRAS Exon 3 usando la sequenza di riferimento summenzionata ma contenente la mutazione Q61K Il sequenziamento del DNA ha confermato che l unica modifica alla sequenza si ha in corrispondenza del codone 61 con un alterazione Q61K CCA gt AAA Questo clone viene quindi miscelato con DNA NRAS Control Wild Type per creare una miscela eterozigote Il NRAS Positive Control Exon 4 stato realizzato mediante sintesi dell Exon 4 di NRAS usando la sequenza di riferimento summenzionata ma contenente la mutazione A146T Il sequenzi
45. ione e Durata Prima dell uso conservare il kit ad una temperatura compresa tra 18 C e 25 C in un congelatore a temperatura costante Prendere nota della data di scadenza di ciascun kit ricevuto Non utilizzare il kit oltre la data di scadenza indicata La miscela SURVEYOR Nuclease preparata come descritto al punto 7 della Digestione con SURVEYOR Nuclease deve essere utilizzata subito in quanto la SURVEYOR Nuclease W nel tempo si inattiva per la presenza degli altri componenti della miscela di reazione di SURVEYOR Nuclease 9 Avvertenze e precauzioni Nessuno dei reagenti presenti nel kit rappresenta un pericolo per la salute nelle quantit fornite Scaricare la scheda di sicurezza Transgenomic MSD 710077 dal sito http world transgenomic com files literature 710077 IT pdf Il presente kit non contiene sostanze di origine animale o umana che costituiscano un potenziale rischio di infezione L uso del presente kit riservato a persone adeguatamente preparate nell applicazione delle tecniche di laboratorio richieste Quando si maneggiano i componenti del kit indossare sempre un apposito camice da laboratorio guanti monouso e una protezione per gli occhi Dopo l uso smaltire i componenti del kit come rifiuti clinici nel rispetto delle regole e delle vigenti normative locali Le aliquote di reagenti pipettate dalle provette del kit sono solo monouso stato verificato che i componenti del kit restano stabili per 25 cicli di congelam
46. istrato lo stesso pattern dei picchi DHPLC in seguito alla digestione SURVEYOR Nuclease e sono stati sottoposti ad ulteriore analisi mediante sequenziamento del DNA Dal sequenziamento risultano presenti 2 diverse mutazioni G13C e G13D Questi campioni illustrano a la capacita di SURVEYOR Nuclease di individuare possibili mutazioni e b la sua incapacita a determinare l esatta ubicazione o l alterazione di base specifica di una mutazione presente in un campione di test Nota importante verificare l assenza della sequenza del timbro in ogni elettroferogramma di sequenziamento per confermare che la mutazione non deriva dalla contaminazione del campione con un controllo del kit Nota se il campione del test Wild Type a livello delli rispettivo i codone i interessato i ed presente la sequenza timbrato il campione del test contaminato e deve essere rianalizzato La presenza del timbro dei kit questa contaminazione potrebbe nascondere una mutazione di basso livello presente nel campione del test Wild Type Control dei kit questa contaminazione potrebbe nascondere una mutazione di basso livello presente nel campione del test Ved A 2 Timbri DNA dei controlli per informazioni dettagliate sulle sequenze del timbro dei controlli Istruzioni d uso di CRC RAScan Kit con sistemi DHPLC Pagina 30 15 Caratteristiche prestazionali 15 3 Limitazioni della procedura di dosaggio possibile che la presenza di sostanze
47. itori non ne specificano le formulazioni Molti tamponi NON sono compatibili con SURVEYOR Nuclease a causa del pH o della presenza di additivi surfattanti o altri ingredienti proprietari NON utilizzare altre polimerasi o tamponi per polimerasi 10X diversi da quelli in dotazione con il kit Problema 4 Sfondo elevato in seguito a trattamento con SURVEYOR Nuclease SFONDO ELEVATO POSSIBILE CAUSA SOLUZIONE Fase di ibridizzazione Procedere come segue non ottimale 1 Accertarsi che la concentrazione di DNA sia gt 25 ng pL Ripetere la fase di formazione di eteroduplici assicurandosi di attenersi alla procedura raccomandata ved 12 7 1 Quantitativo di DNA Verificare il prodotto e la Bisse Lavaggio troppo basso qualita del templato di continuo DHPLC DNA DHPLC rumore i di fondo Prodotti PCR non Verificare la resa e la specifici qualit del DNA da amplificare SURVEYOR Controllare la data di Enhancer W2 e o scadenza del kit SURVEYOR Enhancer Cofactor hanno perso la loro efficacia Nota talvolta SURVEYOR Nuclease interagisce con il doppio filamento di DNA in punti a caso per questo motivo si potrebbe generare un rumore di fondo al termine della digestione Questa attivit soppressa dal SURVEYOR Enhancer W2 e dal suo Cofactor senza interferire negativamente in altro modo sulla reazione di clivaggio dei mismatch SURVEYOR Enhancer W2 e SURVEYOR Enhancer Cofactor sono in dotazione con il kit e vanno sempre ut
48. iusi NOTA buona prassi inserire i controlli NTC nei pozzetti non adiacenti ai Positive Control o ai campioni NOTA per suggerimenti su come preparare piastre da 96 pozzetti per l analisi di tutti gli esoni KRAS e NRAS 2 4 2 4 ved Appendice A 1 Piano di layout della piastra per kit SURVEYOR Scan Agitare in vortex a 1 2 velocit per 10 sec Centrifugare per 1 2 minuti per assicurare che tutte le soluzioni si raccolgano alla base dei pozzetti o delle provette Verificare che tutte le soluzioni si trovino sul fondo di ciascun pozzetto o di ciascuna provetta In caso contrario ripetere la centrifugazione Istruzioni d uso di CRC RAScan Combination Kit con sistemi DHPLC Pagina 17 12 Istruzioni dettagliate 12 6 Programma del termociclatore per il protocollo di amplificazione 1 Per l amplificazione PCR e la formazione di eteroduplici utilizzare il seguente protocollo del termociclatore Denaturazione iniziale 95 C 5 minuti Amplificazione touchdown 95 C 30 secondi 15 cicli 62 C 0 5 C ciclo 30 secondi 72 C 25 secondi Amplificazione 30 secondi 30 cicli 30 secondi 25 secondi Estensione finale 1 ciclo 72 C 2 minuti Formazione di eteroduplici 95 C 2 minuti lt 12 C In attesa 12 7 Controllo qualit di prodotti PCR 1 Si consiglia di controllare la qualit e la quantit degli amplicone mediante elettroforesi su gel o metodi equivalenti prima di passare alla digestione con SURVEYOR Nuclea
49. lizzati al fine di escludere un eventuale rumore di fondo spurio mediante confronto visivo dei profili dell elettroferogramma ved Esempi di Risultati Figura 4 10 Esaminare ciascun prodotto di DNA amplificato prima della digestione mediante elettroforesi su gel con analisi di DHPLC System per verificare la presenza di un unica specie delle dimensioni previste Istruzioni d uso di CRC RAScan Kit con sistemi DHPLC Pagina 38 Appendice B Problema 3 Nessun prodotto di clivaggio riscontrato al momento dell analisi dopo il trattamento di eteroduplici con SURVEYOR Nuclease NESSUN PRODOTTO DI CLIVAGGIO piane SOLUZIONE Proporzione di Verificare il dosaggio mismatch utilizzando i controlli bersaglio troppo bassa Bosi Formazione Attenersi alla OSIZIONE i i i degli eteroduplici inefficace di procedura PCR e di mancanti eteroduplici ibridizzazione corretta Utilizzare DNA appena ibridizzato nella digestione di i SURVEYOR Picco Nuclease omoduplice intonso Eseguire la nuova amplificazione PCR utilizzando 1 la stessa quantit di templato di DNA 2 aumentando l ammontare di DNA iniziale ovvero 3 isolare DNA fresco dalla stessa sezione FFPE o da una diversa SURVEYOR Eseguire la reazione Nuclease inattivo Positive Control per verificare le prestazioni enzimatiche Utilizzare esclusivamente Master Mix per SURVEYOR Nuclease appena preparate Nota SURVEYOR Nuclease attua il taglio prevalentemente
50. lotto di campioni da testare in ogni dato momento poich un set di reazioni di controllo Wild Type Control Positive Control e Controllo privo di templato deve essere incluso in ogni piastra di reazioni La tabella seguente riporta il numero di campioni che possono essere analizzati con il kit KRAS e NRAS a seconda delle dimensioni medie del lotto Il calcolo tiene conto del fatto che a per ogni analisi sono necessari 21 controlli 7x Wild Type 7x Positive Controls 7x Controllo privo di templato e che b ciascun kit ha un limite di 230 reazioni Nota se vengono eseguite pi piastre ogni set dei 21 controlli elencati sopra deve trovarsi sulla piastra Pertanto due piastre richiedono in totale 42 reazioni di controlli 3 piastre richiedono 63 reazioni di controlli ecc Istruzioni d uso di CRC RAScan Combination Kit con sistemi DHPLC Pagina 8 5 Componenti Aumentando le dimensioni del lotto aumenta anche il numero di campioni analizzabili con un unico kit con conseguente riduzione del costo medio del reagente per campione La tabella che segue una guida al numero di campioni che possono essere testati con i kit Numero di reazioni di controlli Numero di ampliconi campioni Numero di Analisi Campioni reazioni totali lotto testati richieste campioni per analisi per Kit per kit Dimensi oni del lotto 5 4 Sequenziamento del DNA Sono forniti primer di sequenziamento N di catalogo PN 710153F e 710158R da utilizzar
51. n di digestione relativi ai campioni 1 3 con l elettroferogramma non digerito Wild Type risulta evidente che il campioni 2 linea nera presenta una probabile mutazione e deve essere sottoposto a sequenziamento per confermare la presenza o assenza di una mutazione a livello del relativo codone campioni 1 e 3 linea blu e rossa presentano cromatogrammi simili a quelli osservati per il Wild Type Control e non necessario sottoporli all analisi mediante sequenziamento del DNA Va osservato che il risultato del sequenziamento il risultato definitivo in quanto potrebbero essere registrate altre mutazioni non rilevanti che possono comportare le stesse dimensioni dei frammenti Istruzioni d uso di CRC RAScan Combination Kit con sistemi DHPLC Pagina 24 14 Interpretazione dei risultati Figura 6A KRAS Control Wild Type KRAS Control Exon 4A Campione 1 KRAS Exon 4A Campione 2 KRAS Exon 4A DNA Sizing Standard Flusso continuo a PHPLE K117N produce Amplicon frammenti da 168 coppie di 80 e 88 bp basi P intonso j Risciacquo DHPLC KRAS Control Wild Type K117N produce KRAS Control Exon 4A frammenti Campione 1 KRAS Exon 4A Campione 2 KRAS Exon 4A 80 e 88 bp DNA Sizing Standard Amplicon lt da 168 coppie di basi intonso i 4 Figure 6A e 6B Analisi WAVE DHPLC con UV Figura 6A e rilevamento della fluorescenza Figura 6B delle digestioni SURVEYOR Nuclease di KRAS Positive Control Exon 4A e KRAS Cont
52. n patients with chemotherapy refractory metastatic colorectal cancer treated with cetuximab JAMA 304 1812 20 Peeters M et al 2013 Mutant KRAS codon 12 and 13 alleles in patients with metastatic colorectal cancer assessment as prognostic and predictive biomarkers of response to panitumumab J Clin Oncol 31 759 65 Andre T et al 2013 Panitumumab combined with irinotecan for patients with KRAS wild type metastatic colorectal cancer refractory to standard chemotherapy a GERCOR efficacy tolerance and translational molecular study Ann Oncol 24 412 9 Loupakis F et al 2009 KRAS codon 61 146 and BRAF mutations predict resistance to cetuximab plus irinotecan in KRAS codon 12 and 13 wild type metastatic colorectal cancer Br J Cancer 101 715 21 De Roock W et al 2010 Effects of KRAS BRAF NRAS and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy refractory metastatic colorectal cancer a retrospective consortium analysis Lancet Oncol 11 753 62 Qiu P et al 2004 Mutation detection using Surveyor nuclease Biotechniques 36 702 707 Kuang Y et al 2009 Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non small cell lung cancer Clin Cancer Res 15 2630 6 Mitani N et al 2007 Surveyor nuclease based detection of p53 gene mutations in haematological malignancy Ann Clin Biochem 44 557 9 Engelman JA et al 2006 Allelic dilution obscures detection of a biologically sig
53. nificant resistance mutation in EGFR amplified lung cancer J Clin Invest 116 2695 2706 Vedere anche hittp world transgenomic com files literature 482146 pdf per i riferimenti circa SURVEYOR Nuclease e le sue applicazioni Istruzioni d uso di CRC RAScan Combination Kit con sistemi DHPLC Pagina 36 Appendice B Appendice B Guida alla risoluzione dei problemi Per un uso efficace di SURVEYOR Scan Kits for DHPLC necessario completare correttamente diverse fasi Una delle pi critiche l amplificazione PCR che deve dare come risultato la produzione di una quantit di molecole di DNA specifiche e di dimensioni uniformi tali da essere rilevate in seguito a ibridizzazione e clivaggio E ci dipende a sua volta dalla qualit del campione iniziale Si sconsiglia di eseguire il dosaggio con un DNA che non soddisfa i criteri di qualit e quantit Nota raccomandiamo agli utilizzatori non esperti di SURVEYOR Nuclease di eseguire gli esperimenti illustrati nella sezione Uso di DNA Plasmidici di Controllo dopo aver letto e compreso quanto riportato nella sezione Istruzioni Dettagliate Attendere i risultati dei DNA plasmidici di controllo prima di rivolgersi all assistenza tecnica Transgenomic La presente Guida alla risoluzione dei problemi tratta una serie di problematiche che possono insorgere durante l uso dei kit SURVEYOR Scan per DHPLC e fornisce una serie di suggerimenti su come risolverle Gli esempi illustrati riguardano KRAS e N
54. nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn nennen nnmnnn 10 10 Raccolta manipolazione e conservazione del campione 10 11 Procedura di GOSAGGO iiiziiliiii nie 11 11 Rilevamento di una Mutazione Somatica con i Kit SURVEYOR Scan Considerazioni reale 11 12 Istruzioni dettagliate ssas a 12 12 1 Configurazione calibrazione INIZIALE di DHPLC 12 12 2 Considerazioni prima dell Analisi del Campione KRAS e NRAS 12 12 3 Considerazioni SUITEMPIAtO ili ria 12 12 4 Considerazioni sul flusso di AVOro criiinirirr 12 12 5 Protocollo di amplificazione rai 15 12 6 Programma del termociclatore per il protocollo di amplificazione 18 12 7 Controllo gualia di Prodotti PER 18 12 8 Digestione di SURVEYOR Nuclease isa 19 13 Procedure Ol COMMON siess i iaia 20 13 1 Controllo della qualit di CRC RAScan Combination Kit i 20 13 2 Uso di DNA plasmidici di controllo 20 14 Interpretazione dei risultati 21 14 1 Analisi di KRAS e NRAS Exons 2 3 e 4 utilizzando SURVEYOR Nuclease 21 14 2 Revisione dei dati dei risultati SURVEYOR Scan 22 T4 ESeMpreeiTSUllali anca 23 15 Caratteristiche prestazionali cccscccsscecesecseescacscsnesececsseseecscussctecedesssveeuecesinaceuccceeccseesese 30 15 1 Livello di rilevamento delle mutazioni mediante i kit SURVEYOR Scan 30 15 2 Conferma Mediante Seque
55. nziamento 30 15 3 Limitazioni della procedura di dosaggio i 31 ADPENGICE Aisioriiiz iniziali EAE 32 A 1 Piano di layout della piastra per kit SURVEYOR Scan i 32 A 2 Timbri DNA dei Controlli 32 A 3 Denaturazione di HPLC DHPLC Requisiti di SISteMa i 33 A 4 Setup del laboratorio per dosaggi PCR ii 35 A 5 Bibliografia di riferimento 36 PODGIIGICE B soies lonraic aE aa Ei eE 37 Guida alla risoluzione dei problemi i 37 Dettagli per gli OFdifl sssii indiana 44 Vett gir ai contatto cia 44 Traduzione DISCIAIM GD srssestsvecteeveces dels cedacovncseedandaswessservenuseusidenssidentcasecuscusddesadsuusdcuvecntecs 44 Licenze Marchi 6 CODY MIG scscsiecsiccncccrscnetcerinwenssenseeassrebensduaconscsuentiaseeiesameanvccoearesseocaes 45 Istruzioni d uso di CRC RAScan Combination Kit con sistemi DHPLC Pagina 2 1 Produttore 1 Produttore Transgenomic Inc Produttore 12325 Emmet Street Omaha NE 68164 USA Tel 1 402 452 5400 Raporesentate Transgenomic Limited a CE 40 Watt Road Hillington Park Glasgow G52 4RY UK Tel 44 141 892 8800 2 CRC RAScan Combination Kit 2 1 Uso previsto Solo per uso professionale CRC RAScan Combination Kit di Transgenomic un dosaggio diagnostico in vitro che rileva mutazioni somatiche negli Exons 2 3 amp 4 dei geni KRAS e NRAS Tali mutazioni sono indicate dai picchi d
56. o evidenziati come segue GAATGGTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAB GGTMMcac Timbro KRAS Exon 4A Dimensione Amplicone 168 coppie di basi Per la creazione del timbro genetico del plasmide di controllo KRAS Exon 4A AGA viene modificato in TCT Anche il codone 117 evidenziato nel seguito AATMMAT GTGATTTGCCTTCTAGAACAGTTETCAC Istruzioni d uso di CRC RAScan Combination Kit con sistemi DHPLC Pagina 32 Appendice A Timbro KRAS Exon 4B Dimensione Amplicone 194 coppie di basi Per la creazione del timbro genetico del plasmide di controllo KRAS Exon 4B agt viene modificato in tca Anche il codone 146 evidenziato nel seguito TCAG MAAGACAAGACAGgt atcaaac Timbro NRAS Exon 2 Dimensione Amplicone 236 coppie di basi Per la creazione del timbro genetico del plasmide di controllo NRAS Exon 2 aca viene modificato in tgt Anche i codoni 12 e 13 sono evidenziati come segue ccatgtggttcttgctggtgt gaaATGACTGAGTACAAACTGGTGGTGGTTGGAGCAREGT T Timbro NRAS Exon 3 Dimensione Amplicone 203 coppie di basi Per la creazione del timbro genetico del plasmide di controllo NRAS Exon 3 GAC viene modificato in CTG Anche i codoni 59 e 61 sono evidenziati come segue ACA HccAGMAGAAGAGTACAGTGCCATGAGACTGCAA Timbro NRAS Exon 4 Dimensione Amplicone 233 coppie di basi Per la creazione del timbro genetico del plasmide di controllo NRAS Exon 4 CAA viene modificato in GTT Anche i codoni 117 e 146 sono evidenziati come segue AACMAMGT GTGATTTG
57. o NTC no template control controllo privo di templato Il kit contiene un quantitativo sufficiente di materiali di controllo per 230 reazioni per tutte le combinazioni di lotti di campione di differente entit In linea generale l elaborazione dei campioni deve essere eseguita dall inizio alla fine come descritto nel presente Manuale di istruzioni Se l elaborazione di un campione viene interrotta prima del completamento di tutte le fasi necessario conservare il DNA a 20 C nei punti indicati Tuttavia si consiglia di evitare l esposizione di qualsivoglia campione congelato a pi cicli di congelamento scongelamento e la conservazione da 18 a 25 C di campioni di DNA amplificato mediante PCR o prodotti della digestione con SURVEYOR Nuclease per periodi di tempo prolungati gt 1 settimana Istruzioni d uso di CRC RAScan Kit con sistemi DHPLC Pagina 12 12 Istruzioni dettagliate L analisi dei campioni deve seguire la sequenza illustrata di seguito t SURVEYOR __ Analisi SURVEYOR Scan Fallita nuclease amp DHPLC AAAA N SURVEYOR Scan SURVEYOR Scan Positiva Negativa Conferma mediante sequenziame nto Qualit Qualit sequenziam sequenziame ento fallita nto accettata Mutazioni nei codoni KRAS o NRAS G12 G13 A59 Q61 K117 o A146 Figura 3 Flusso di lavoro dell analisi CRC RAScan Combination Kit Istruzioni d uso di CRC RAScan Kit con sistemi DHPLC Pagina 13 12 Istruzioni dettagl
58. olosamente alle istruzioni e alle linee guida fornite Chi si appresta per la prima volta all utilizzo di questo kit tenuto ad eseguire gli esperimenti di controllo illustrati nella sezione Uso di DNA Plasmidici di Controllo Per qualsiasi domanda o richiesta di assistenza chiamare il numero 888 233 9283 solo Nord America 1 402 452 5400 oppure 44 0 141 892 8800 Europa e richiedere KRAS and NRAS support Oppure inviare un e mail all indirizzo SURVEYORSscan Transgenomic com Istruzioni d uso di CRC RAScan Combination Kit con sistemi DHPLC Pagina 5 4 Tracciabilit dei controlli del kit 4 Tracciabilit dei controlli del kit controlli in dotazione al kit sono cloni plasmidici di sequenze di KRAS e NRAS Exons 2 3 amp 4 Tutti i cloni sono stati sequenziati in modo da verificare la fedelt della sequenza mediante confronto con NCBI Reference Sequences NG_007524 1 KRAS e NG_007572 NRAS controlli hanno un timbro genetico Ved Appendice A 2 Timbri DNA dei controlli si tratta di variazioni delle sequenze KRAS o NRAS Wild Type in una regione in cui non sono previste mutazioni e possono essere usate per risolvere il problema della contaminazione dei campioni dai Positive Control Ved Appendice B Guida alla risoluzione dei problemi Problema 8 per l esempio di un tracciato SURVEYOR Scan di tale contaminazione Il KRAS Control Wild Type stato realizzato mediante sintesi e clonazione degli Exons KRAS
59. ono di verificare la corretta preparazione delle Master Mix nonch l adeguato funzionamento dell amplificazione consigliato anche l uso di controlli NTC si aggiunge acqua anzich templato di DNA per la verifica di una possibile contaminazione con DNA dei componenti del kit In fase di digestione con SURVEYOR Nuclease gli ampliconi di questi DNA plasmidici di controllo consentono di verificare in modo affidabile che le condizioni della reazione di taglio preparazione della Master Mix di Digestione di SURVEYOR Nuclease e condizioni di incubazione siano state soddisfacenti In fase di analisi gli cromato grammadi DHPLC System degli ampliconi di controllo digeriti con SURVEYOR Nuclease indicano dove verranno eluiti i picchi dei prodotti di taglio corrispondenti a mutazioni in KRAS e NRAS Exons 2 3 e 4 anche a bassi livelli vedere Figure 4 10 picchi dei prodotti di taglio corrispondenti ad altre mutazioni in KRAS o NRAS Exons 2 3 e 4 potrebbero essere eluiti in posizioni leggermente diverse Se gli ampliconi PCR non corrispondono ai risultati previsti dal Controllo di Qualit dei Prodotti da PCR consultare l Appendice B Guida alla Risoluzione dei Problemi o rivolgersi al servizio di assistenza tecnica di Transgenomic prima di procedere ulteriormente con l analisi dei campioni 13 2 Uso di DNA plasmidici di controllo kit contengono nove DNA di controllo KRAS Control Wild Type PN 710131 KRAS Positive Control Exon 2 PN 710135 KR
60. porre il layout del laboratorio PCR Nel programmare la disposizione del laboratorio tenere conto della necessit di una separazione spaziale tra il setup dell amplificazione PCR e le attivit post amplificazione importante separare i isolamento DNA ii amplificazione PCR e iii attivit Post PCR quali l apertura di provette contenenti campioni amplificati nella preparazione dei running gel e la configurazione di altri dosaggi quali le digestioni SURVEYOR Nuclease e il sequenziamento del DNA E altrettanto importante disporre di forniture e apparecchiature di laboratorio specifiche per ogni zona e da utilizzare unicamente in tale zona La pulizia delle superfici con candeggina al 10 v v preparata settimanalmente consentir l eliminazione dei frammenti di DNA lt 500 coppie di basi quali gli stampi per PCR Inoltre pu essere utile trattare prodotti in materiale plastico e soluzioni con un esposizione di 7 10 minuti ai raggi UV a onde corte utilizzando un crosslinker UV Nota gli enzimi e il DNA da amplificare non devono essere sottoposti ai raggi UV Indossare indumenti protettivi adeguati cambiare spesso i guanti e lavarsi le mani guantate con una soluzione di candeggina al 10 v v prima di recarsi nella postazione di lavoro contribuir notevolmente a ridurre la contaminazione Come minimo deve essere allestito un setup simile alla disposizione a due stanze illustrata nello schema seguente progettato espressamente per
61. provette di reagenti Numero di codice Confezione di componenti di digestione SURVEYOR 710160 710161 708049 708027 708030 710153F 710153R Componente SURVEYOR Nuclease W SURVEYOR Enhancer W2 Cofattore SURVEYOR Enhancer Soluzione 0 15 M di MgCl SURVEYOR Stop Solution Universal Sequencing Primer 1 10 uM Universal Sequencing Primer 2 10 uM Confezione di componenti e controlli PCR 703310 703312 703315 703065 DNA Polymerase 250 U DNA Polymerase 50 U DNA Polymerase 10X tampone PCR dNTPs 10 mM Colore tappo provetta Viola Nero Rosa Marrone Rosso Arancione Arancione Rosso Rosso Trasparente Trasparente Kit da 100 reazioni Volume fornito 2 x 105 uL 105 uL 105 uL 105 uL 250 uL 2 x 125 uL 2 x 125 uL 100 uL 20 uL 71710452F 71710452R 71710453F 71710453R 17110454F 71710454R 710441 710442 710443 710444 NRAS Primer Exon 2 Forward 10 uM Blu NRAS Primer Exon 2 Reverse 10 uM Blu NRAS Primer Exon 3 Forward 10 uM Blu NRAS Primer Exon 3 Reverse 10 uM Blu NRAS Primer Exon 4 Forward 10 uM Blu NRAS Primer Exon 4 Reverse 10 uM Blu NRAS Control Wild Type Mix Giallo NRAS Positive Control Exon 2 Verde NRAS Positive Control Exon 3 Verde NRAS Positive Control Exon 4 Verde 5 3 Numero di Campioni Analizzabili con un Kit CRC RAScan Combination Kit consente l analisi di 230 reazioni Il numero totale di campioni analizzabili con il kit dipende dalle dimensioni medie del
62. re 5 uL di SURVEYOR Nuclease Master Mix a campione amplificato PCR uL Volume totale reazione di digestione SURVEYOR Nuclease 15 0 Centrifugare ciascun reagente prima dell uso Agitare delicatamente nel vortex ciascun reagente prima della pipettatura centrifugare brevemente per 10 secondi dopo ciascuna fase di vortex c Per ciascuna reazione di digestione aggiungere i seguenti componenti in una provetta per microcentrifuga da 0 2 ml o pi grande 1 0 uL 0 15 M MgCl Solution PN 708027 1 0 uL SURVEYOR Enhancer Cofactor PN 708049 1 0 uL SURVEYOR Enhancer W2 PN 710161 2 0 uL SURVEYOR Nuclease W PN 710160 Oppure aggiungere 5 uL della Master Mix preparata come indicato nella tabella precedente 5 Agitare delicatamente nel vortex la Master Mix di SURVEYOR Nuclease per 10 secondi a bassa velocit Centrifugare la Master Mix di SURVEYOR Nuclease per 10 secondi a bassa velocit Porre la Master Mix di digestione di SURVEYOR Nuclease su ghiaccio fino al momento dell uso Nota La Master Mix di Digestione di SURVEYOR Nuclease preparata come descritto al punto 7 deve essere utilizzata subito in quanto la SURVEYOR Nuclease W nel tempo si inattiva per la presenza degli altri componenti della miscela 8 Pipettare l aliquota da 5 0 uL della Master Mix di Digestione di SURVEYOR Nuclease in ciascuna provetta o pozzetto contenente l aliquota da 10 0 uL di prodotto PCR amplificato punto 3 di cui sopra Istruzioni d
63. rol Wild Type e CRC DNA isolato dalle sezioni FFPE Quando si controllano a vista i cromatogrammi i campioni digeriti devono essere confrontati con il Wild Type Control linea verde KRAS Positive Control Exon 4A linea blu una miscela di plasmidi Wild Type e K117N mutanti che produce picchi di digestione da 80 e 88 coppie di basi questo controllo indica che la fase di digestione SURVEYOR Nuclease attiva e mostra la regione del cromatogramma da controllare visivamente per capire se necessario sottoporre un campione all analisi mediante sequenziamento del DNA Confrontando i pattern di digestione relativi ai campioni 1 e 2 con l elettroferogramma non digerito Wild Type risulta evidente che il campione 1 linea rossa presenta una probabile mutazione e deve essere sottoposto a sequenziamento per confermare la presenza o assenza di una mutazione a livello del relativo codone Il campione 2 linea nera presenta un cromatogramma simile a quello osservato per il Wild Type Control e non necessario sottoporlo all analisi mediante sequenziamento del DNA Va osservato che il risultato del sequenziamento il risultato definitivo in quanto potrebbero essere registrate altre mutazioni non rilevanti che possono comportare le stesse dimensioni dei frammenti Istruzioni d uso di CRC RAScan Combination Kit con sistemi DHPLC Pagina 25 14 Interpretazione dei risultati A Figura TA KRAS Control Wild Type KRAS Control Exon 4B Campione 1 KRAS Exon
64. rovette della Master Mix per 30 e quindi centrifugare brevemente per 10 secondi Conservare su ghiaccio fino al momento di utilizzo Pipettare 48 0 uL vedere nota al punto 6 di Master Mix negli appositi pozzetti sostituendo i puntali in caso di utilizzo di una pipetta a singolo canale In caso di utilizzo di una pipetta a ripetizione accertarsi che non vi siano fuoriuscite spruzzi da un pozzetto all altro Conservare la piastra su ghiaccio Aggiungere negli appositi pozzetti 2 0 uL vedere nota al punto 6 di ciascun templato di DNA o acqua no template control NTC Usare puntali delle pipette separati per ciascun campione per evitare la contaminazione incrociata a causa di schizzi Coprire i pozzetti contenenti i DNA campione e il NTC con strip da 8 tappi nel caso si utilizzi una piastra da 96 pozzetti oppure chiudere con il tappo le provette per PCR da 0 2 mL Accertarsi che i tappi siano ermeticamente ben chiusi Solo a questo punto aprire le provette del templato di DNA di controllo del kit PN 710131 710135 710136 710137 710138 710441 710442 710443 e 710444 una alla volta Pipettare per ultimi 2 0 uL di ciascun templato di controllo al fine di ridurre le probabilit di contaminazione di qualsivoglia DNA campione Nuovamente coprire ciascun pozzetto con strip da 8 tappi nel caso si utilizzi una piastra da 96 pozzetti oppure chiudere con il tappo le provette per PCR da 0 2 mL Accertarsi che i tappi siano ermeticamente ben ch
65. s contemporaneamente su 10 campioni 1 2 3 4 a T 5 9 10 11 12 1 KAAS KRASEx KRASEx Campione Campione Campione Campione Campione Campione Campione Campione Campione Campione WT Mut 1 2 3 4 5 E T g 4 10 Chiave Ex Exon WT Wild Type Mut Mutazione NTC Controllo privo di templato A 2 Timbri DNA dei controlli Le sequenze con un Timbro sono indicate nel seguito Chiave le regioni di mutazione pi comuni sono evidenziate in porpora La sequenza in MAIUSCOLO si riferisce alle basi di codifica la sequenza in minuscolo alle basi non codificate controlli hanno un timbro genetico evidenziato in giallo queste variazioni dalla sequenza KRAS o NRAS Wild Type in una regione in cui non sono previste mutazioni possono essere usate per risolvere il problema della contaminazione dei campioni dai Positive Control Ved Appendice B Guida alla risoluzione dei problemi Problema 8 per l esempio di un tracciato SURVEYOR Scan di tale contaminazione Timbro KRAS Exon 2 Dimensione Amplicone 190 coppie di basi Per la creazione del timbro genetico del plasmide di controllo KRAS Exon 2 TAT viene modificato in ATA Anche i codoni 12 e 13 sono evidenziati come segue GCT GTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTIGIGGACGAA GAT Timbro KRAS Exon 3 Dimensione Amplicone 200 coppie di basi Per la creazione del timbro genetico del plasmide di controllo KRAS Exon 3 Acc viene modificato in TGG Anche i codoni 59 e 61 son
66. se 2 Analizzare un aliquota del prodotto PCR insieme ad altri diversi quantitativi di un DNA mass ladder da 100 coppie di basi 3 Utilizzare il ladder per determinare la concentrazione del DNA amplificato Si dovrebbe ottenere un unica banda con concentrazione maggiore di 20 ng uL corrispondente al prodotto di PCR principale 5 In presenza di piu bande verificare che la qualit del templato di DNA inserito sia stata sufficiente ved Appendice B Guida alla risoluzione dei problemi 6 In assenza di un qualche prodotto verificare che la qualit del templato di DNA inserito sia stata sufficiente ved Appendice B Guida alla risoluzione dei problemi Se la qualit era soddisfacente aumentare il volume di templato a 4 0 uL per 50 uL di reazione ridurre l acqua per reazione a 31 0 uL 7 Nel campione di controllo stampo non dovrebbero essere visibili prodotti PCR In presenza di prodotti di DNA in questo controllo probabile una contaminazione ved Appendice B Guida alla risoluzione dei problemi 8 Classificare la PCR come solida o debole a Una PCR solida deve avere una banda singola maggiore o uguale a 20 ng yL b Una PCR debole deve avere una banda singola inferiore a 20 ng uL c Passare alla digestione SURVEYOR Nuclease con i risultati PCR sia solidi che deboli Suggerimento in questa fase i prodotti PCR possono essere conservati a temperature non superiori a 20 C per una settimana al massimo
67. struzioni d uso di CRC RAScan Combination Kit con sistemi DHPLC Pagina 41 Appendice B Problema 7 Picchi imprevisti nel tracciato di digestione di SURVEYOR Nuclease LA DIGESTIONE SURVEYOR NUCLEASE DI POSITIVE POSSIBILE SOLUZIONE CONTROL E FALLITA CAUSA Mutazione Sequenziamento presente in sito di campione per Picco insolito verificare omoduplice mutazione intonso Picco di digestione imprevisto Th Me a ne isp ce t Y Flusso 2 Picchi di 3 4 5 Lavaggio continuo digestione DHPLC DHPLC previsti Istruzioni d uso di CRC RAScan Kit con sistemi DHPLC Pagina 42 Appendice B Problema 8 Contaminazione di campioni con Positive Control PATTERN DI DIGESTIONE INDICANTI LA PRESENZA DI REGIONE TIMBRATA DI POSITIVE CONTROL MISTI ED ETERODUPLICI WILD TYPE POSSIBILE CAUSA Tecnica di pipettatura scadente Campione 1 Campione 2 Campione 3 Tecnica di pipettatura scadente Sequenziamento indicante regioni del timbro NRAS Exon 2 che contaminano un campione del test Regione codone 12 e 13 di NRAS Exon Regione Timbro controllo plasmidico di NRAS Exon 2 Il campione Wild Type presente il sequenziamento del timbro Contaminato Il campione mutante Nessuna sequenza del timbro Campione valido Il campione Wild Type Non presente alcuna sequenza del timbro Campione valido Istruzioni d uso di CRC RAScan Combination Kit con sistemi DHPLC SOLUZIONE Occorre fare molta
68. uso di CRC RAScan Kit con sistemi DHPLC Pagina 19 12 Istruzioni dettagliate 9 Al termine della pipettatura centrifugare le provette per PCR da 0 2 mL o la piastra da 96 pozzetti per 10 secondi 10 Agitare delicatamente nel vortex le provette per PCR da 0 2 mL o la piastra da 96 pozzetti per 10 secondi 11 Centrifugare per 10 secondi a bassa velocit questo passaggio particolarmente importante se la digestione eseguita su uno strumento privo di coperchio riscaldato 12 Incubare a 42 C per 30 minuti 13 Aggiungere 1 0 uL SURVEYOR Stop Solution PN 708030 in ciascuna provetta o pozzetto e agitare delicatamente nel vortex il volume di reazione totale di SURVEYOR Nuclease di 16 0 uL SUGGERIMENTO I prodotti di digestione di SURVEYOR possono essere conservati a lt 20 C per una settimana al massimo 14 Caricare la digestione dei campioni nel sistema DHPLC Nota per le impostazioni del gradiente del sistema DHPLC consigliate per l analisi delle digestioni SURVEYOR Nuclease consultare il sito http world transgenomic com diagnostic tools genetic analysis kits crc rascan kits eu dhplcsystemsettings 13 Procedure di controllo 13 1 Controllo della qualit di CRC RAScan Combination Kit Il kit contiene anche campioni di DNA plasmidico di controllo che consentono di eseguire controlli qualit in fasi specifiche della procedura di dosaggio Nel caso del Protocollo di Amplificazione questi controlli consent
69. vato che a Per la Master Mix 1 KRAS Exon 2 saranno necessarie tre reazioni supplementari per piastra di campioni KRAS Control Wild Type KRAS Positive Control Exon 2 e KRAS Exon 2 Controllo privo di templato NTC1 b Per la Master Mix 2 KRAS Exon 3 saranno necessarie tre reazioni supplementari per piastra di campioni KRAS Control Wild Type KRAS Positive Control Exon 3 e KRAS Exon 3 Controllo privo di templato NTC2 c Per la Master Mix 3 KRAS Exon 4A saranno necessarie tre reazioni supplementari per piastra di campioni KRAS Control Wild Type KRAS Positive Control Exon 4A e KRAS Exon 4A Controllo privo di templato NTC3 d Per la Master Mix 4 KRAS Exon 4B saranno necessarie tre reazioni supplementari per piastra di campioni KRAS Control Wild Type KRAS Positive Control Exon 4B e KRAS Exon 4B Controllo privo di templato NTC4 e Per la Master Mix 5 NRAS Exon 2 saranno necessarie tre reazioni supplementari per piastra di campioni per NRAS Control Wild Type NRAS Positive Control Exon 2 e NRAS Exon 2 Controllo privo di templato NTC5 f Perla Master Mix 6 NRAS Exon 3 saranno necessarie tre reazioni supplementari per piastra di campioni per NRAS Control Wild Type NRAS Positive Control Exon 3 e NRAS Exon 3 Controllo privo di templato NTC6 g Per la Master Mix 7 NRAS Exon 4 saranno necessarie tre reazioni supplementari per piastra di campioni per NRAS Control Wild Type NRAS Positive Control Exon 4 e NRAS Exon
70. ve Control su un controllo NTC e sui campioni di DNA ed eseguire la procedura sulla stessa piastra del sistema DHPLC In fase di digestione con SURVEYOR Nuclease gli ampliconi di questi tre DNA plasmidici di controllo consentono di verificare in modo affidabile che le condizioni della reazione di taglio preparazione della miscela di SURVEYOR Nuclease e condizioni di incubazione siano state soddisfacenti In fase di analisi i tracciati del sistema DHPLC di questi ampliconi di controllo digeriti con SURVEYOR Nuclease indicano dove verranno eluiti i frammenti di DNA derivanti dal taglio in corrispondenza di queste specifiche mutazioni anche a bassi livelli ved Figure 4 10 Se gli ampliconi di PCR o i frammenti di taglio della SURVEYOR Nuclease derivanti dai DNA plasmidici di controllo non corrispondono ai risultati previsti consultare l Appendice B Guida alla Risoluzione dei Problemi o rivolgersi al servizio di assistenza tecnica di Transgenomic prima di procedere ulteriormente con l analisi dei campioni Gli esempi forniti di seguito hanno solo scopo illustrativo e NON DEVONO essere usati per determinare l identit di qualsivoglia mutazione La conferma dell identit di una mutazione necessaria al fine di determinare in modo inequivocabile la presenza di un alterazione in una base specifica negli Exons 2 3 o 4 dei geni KRAS e NRAS SURVEYOR Nuclease taglia tutti i mismatch derivanti dalla formazione di eteroduplici tra i DNA Wild Typ
71. zato per prendere decisioni in merito ad un potenziale trattamento a cui sottoporre pazienti affetti da tumore colorettale importante sottolineare che l uso di DHPLC per individuare i campioni positivi a una mutazione KRAS o NRAS va considerato solo a scopo indicativo e tutte le mutazioni devono essere confermate mediante ulteriori analisi ad esempio il sequenziamento del DNA Istruzioni d uso di CRC RAScan Combination Kit con sistemi DHPLC Pagina 3 3 Principi del dosaggio di rilevamento della mutazioni di CRC RAScan KRAS e NRAS 3 Principi del dosaggio di rilevamento della mutazione di CRC RAScan KRAS and NRAS 3 1 KRAS e NRAS Agenti terapeutici in grado di interagire con il recettore del fattore di crescita epidermico EGFR si sono dimostrati efficaci nel trattamento del tumore colorettale Le ricerche hanno indicato che circa il 40 dei tumori colorettali evidenzia mutazioni somatiche del gene KRAS e studi clinici hanno dimostrato che le mutazioni dell esone 2 KRAS codoni 12 e 13 comportano una mancanza di risposta alle terapie anti EGFR Recenti studi esplorativi hanno dimostrato che la popolazione dei pazienti pu essere definita in maniera pi specifica come pazienti con tumori mCRC ospitanti un ulteriore mutazione negli esoni 3 e 4 di KRAS o negli esoni 3 e 4 di NRAS e non tendenti a rispondere alla terapia contenente anti EGFR Questo kit studiato per l analisi diagnostica delle mutazioni somatiche KRAS e NRAS Exons 2 3

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