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INNO-LiPA HLA-B Update Plus

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1. 53 Limiti della procedura 53 Pertormance del Test 22ssc celsi spa ape a ae whee eee 53 Esecuzione del test usando DNA ottenuto con la Soluzione Primer HLA B Multiplex DO ee AEN A cen EA euet ita 53 Esecuzione del test usando DNA ottenuto con la Soluzione Primer HLA Bw4 55 Espa ol Uso al que est destinado 56 Principio del ensayo nine Nage die er ute REDE IEEE ROS 56 Reactivos anne det ARA EK 57 Descripci n preparaci n para el uso y condiciones de almacenamiento recomendadas zu nen aa sae hae see TO sa eis a eC ERE ESE OS BE 57 Materiales necesarios pero no suministrados 59 Seguridad y medio ambiente 60 Mus de sata Sextet ae E Ont Gee STRESS ES EE EE DA 60 Procedimientos de manipulaci n 61 Manipulaci n de tiras 61 Instrucciones para la incubaci n manual 61 Instrucciones para el cambio manual del l quido de las cubetas 61 Observaciones y precauciones 62 Procedimiento de ensayo manual 62 MUESTAS a HUE RU E E QU URS SA 62 Desnaturalizaci n e hibridaci n 62 Lavado astringente
2. Procedimento para teste manual lc A Desnatura o e hibridiza o Lavagem rigorosa Revela o da CON ilis ee EE Rer ee Procedimento de teste automatizado Auto LiPA coo fq Hon CER EIDEM Interpreta o dos resultados Software de interpreta o LIRAS Limites do procedimento eh Desempenho do teste Desempenho do testo utilizando ADN obtido com solu o de iniciadores INNO LiPA HLA B Update Plus HLA B M ltiplex sa mass anne aka a 78 Desempenho do testo utilizando ADN obtido com solu o de iniciadores HLA BWA ELE 8 Symbols used Manufactured by m But du test Hersteller Prodotto da Fabricado por In vitro diagnostic medical device Produit pour diagnostic in vitro Hilfsmittel f r die medizinische in vitro Diagnostik Dispositivo medico diagnostico in vitro Producto sanitario para diagn stico in vitro Dispositivo m dico de diagn stico in vitro Lot number R actifs Chargennummer Numero di lotto N mero de lote Catalog number R f rence catalogue Katalognummer Codice N mero del cat logo N mero de cat logo Use b T Mat riel n cessaire non fourni Verwendbar bis Utilizzare entro Para ser usado hasta U
3. 11 Directions for manual changing liquid in the troughs 12 Remarks and precautions 12 Manual test procedure 12 Samples Xo etie SORIA en ELE PUUUE La tae 13 Denaturation and hybridization 13 SiringentWasSh eco crema C eset a arara au aes elle RE 13 Color development 14 Automated test procedure Auto LiPA 14 Results mn Er a EE 15 ROA avaro aed estelar eese qoem donee Vaud s rt 15 Kl EE 15 Interpretation of results 16 Interpretation software LIRAS 16 Limitations of the procedure 16 Test performance Lol nsus ees cd ee Eer rone Neel ed eh 16 Test performance using DNA amplified with the HLA B Multiplex Primer Solution tn Bik a el En E AR ea 16 Test performance using DNA Amplified with the HLA Bw4 Primer Solution 18 Frangais AA eng Ue ai eor immo S hx IE as 19 Principe du test ai em waa Gace ERR pausa 19 PREACHES A ee caet Ute ous e ttes e rete Rue Da AN RE 20 Description pr paration et conditions de conservation 20 Mat riel n cessaire non fourni 22 Consignes de s curit 22 Echantilloris 2
4. 31 Reagenzien ra Ee Ee tad ai EN 32 Beschreibung Vorbereitung und empfohlene Lagerung und Haltbarkeit 32 Zus tzliche ben tigte Materialien die nicht im Lieferumfang enthalten sind 24 Sicherheits und Umwelthinweise 35 Herstellung der Proben 36 Handhabung Rie een LME hated M A VE Eu 36 Handhabung der Teststreifen 36 Hinweise zur manuellen Inkubation 36 Anleitung f r das manuelle Auswechseln der Fl ssigkeit in den Wannen 37 Hinweise und Vorsichtsma nahmen 37 Manuelles Testverfahren ENEE 37 Proben dd dea a rar a ae UR PRORA Rea en GS 37 Denaturierung und Hybridisierung 38 Stringent Waschl sung Schritt 38 F rbentwicklung a egene ne ae Agila ee ih onu nee ere ann 39 Automatisches Testverfahren Auto LiPA 39 Ergebnisse sis nest 2 aan SEM te di 39 EE 39 Validierung Samsara nn a ES Aia EV RI deal 40 Interpretation der Ergebnisse 40 Interpretationssoftware LIRAS nenn 41 Grenzen der Methode EEN 41 Leistungsf higkeit des Tests 41 Testleistung unter Verwendung von DNA die mit Hilfe der HLA B Multiplex Primerl sung amplifiziert wurde 41
5. 63 Revelado de leg seil eu au i he hee a UA do dl 63 Procedimiento de ensayo automatizado Auto LiPA 64 Resultados se emenda xg e one a nn TERI AS 64 LOCIS e otite IE EOM LEM USE Dr CE 64 VANGACION oziare DA 64 Interpretaci n de los resultados 65 Software de interpretaci n LIRAS 65 Limitaciones del procedimiento 65 Ee ERR e EE 66 Eficacia del ensayo utilizando ADN obtenido con la soluci n de primers HLA B Multiplex 66 Eficacia del ensayo utilizando ADN obtenido con la soluci n de primers HLA BWA sn RR sobre tnt RR qus RITI 67 Portugu amp s RUE GE 69 Principio do teste ii urti caga caia ciale i 69 R ag ntes 128285 aie peas ne A EEGENEN 70 Descri o prepara o para utiliza o e condi es de conserva o recomendadas cnc fav inet een PESADOS ee Th RSEN 70 Material necess rio n o fornecido 71 Seguran a e ambiente 72 JOB AR illa Eer E DIUI IU PEN ais I 73 Procedimentos de manipula o 73 Manipula o das tiras 73 Instru es para a incuba o manual 73 Instru es para mudar manualmente o l quido nas cavidades 74 Observa es e precau es
6. No se observ ninguna variaci n significativa y se obtuvo en todos los casos un resultado de identificaci n del tipo id ntico sin necesidad de edici n Portugu s Utilizagao O INNO LiPA HLA B Update Plus um ensaio de sondas em linha LiPA para uso in vitro desenvolvido para a tipagem molecular de alelos B do antig nio leucocitario humano HLA ao nivel do grupo de alelos Principio do teste Os testes INNO LiPA HLA baseiam se no principio da hibridizac o reversa O material com ADN amplificado com biotina quimicamente desnaturado as cadeias separadas s o hibridizadas com sondas de oligonucle tidos espec ficos e imobilizadas como linhas paralelas nas tiras das membranas De seguida executada a etapa de lavagem rigorosa para remover qualquer material amplificado incompat vel Depois da lavagem rigorosa a streptavidina conjugada com fosfatase alcalina adicionada e liga se a quaisquer h bridos com biotina formados anteriormente A incubac o com uma solug o de substrato contendo um cromog nio origina um precipitado p rpura castanho Esta reacc o terminada por uma etapa de lavagem e o padr o de reactividade das sondas registado Com o INNO LiPA HLA B Update Plus est disponivel um kit de amplificac o INNO LiPA HLA B Multiplex Plus para a preparac o estandardizada de material biotinilado amplificado O kit de amplificac o tem como base a reacc o em cadeia da polimerase PCR polymerase cha
7. Color intensities of probes on a strip may differ from one line to another Interpretation of results Check for the correct reactivity pattern of the LIPA Control sample The conjugate control line on the strip should be lined up with the conjugate control line on the plastic reading card First check the positivity of the control lines first two lines in order to validate each individual strip see Validation Typing results are based on the reactivity of the probes in the kit A list of probe specificities is available Identify all probe numbers that are positive on the INNO LiPA HLA B Update Plus strips and deduce the HLA B type by using the INNO LiPA HLA B Update Plus typing table or a version of the LIPA interpretation software see Interpretation software LIRAS TM The software often gives more results than the intended use suggests interpretation at allele group is given as well as all possible allele combinations This information however should be considered as extra not as decisive Interpretation software LIRASTM The LiRAS software for INNO LiPA HLA is designed to assist with the interpretation of the LiPA results Please contact your local distributor to obtain the latest updated version Limitations of the procedure Use of this product should be limited to personnel trained in the techniques of hybridization Only good laboratory practice and careful performance of the specified procedur
8. Evite la contaminaci n microbiana de los reactivos Procedimiento de ensayo manual NOTA En los distintos pasos de incubaci n las tiras de ensayo deben permanecer siempre en la misma cubeta Antes de la incubaci n mida la temperatura del bafio de agua con un term metro calibrado y aj stela si es necesario antes de colocar la bandeja Cierre siempre la cubierta En cada ensayo debe incluirse el control LiPA Muestras 1 Producto HLA B amplificado use 10 pl Para la preparaci n de la muestra consulte las instrucciones de uso de INNO LiPA HLA B Multiplex Plus NOTA Aseg rese de a adir exactamente 10 ul de muestra amplificada Si no se afiade esta cantidad exacta podr a producirse un resultado de tipo incorrecto 2 Muestra de control LIPA para INNO LiPA HLA B Update Plus use 10 ul la amplificaci n no es necesaria 3 Muestra de control blanco amplificada control negativo use 10 pl Desnaturalizaci n e hibridaci n 1 Caliente un bafio de agua de agitaci n a 56 C 0 5 C Mida la temperatura con un term metro calibrado y aj stela si es necesario No se debe superar la temperatura indicada Precaliente la soluci n de hibridaci n y la soluci n de lavado astringente en un bafio de agua a una temperatura de al menos 37 C y que no supere los 56 C M zclelas antes de usarlas Todos los cristales deben disolverse 2 Utilice pinzas para retirar el n mero necesario de tiras 1 y 2 de INNO LiPA HLA B Updat
9. ce que les compartiments ne flottent pas sur l eau L eau doit tre en contact direct avec les compartiments Les tapes d incubation pour la r v lation doivent se r aliser entre 20 25 C Si la temp rature est inf rieure a 20 C les r sultats obtenus peuvent tre plus faibles Une temp rature sup rieure 25 C risque de provoquer une coloration de fond trop importante et ou des signaux faussement positifs Respecter exactement les dur es d incubation indiqu es dans le protocole L amplitude du mouvement g n r soit par le bain marie agitant proc dure d hybridation soit par l agitateur proc dure de r v lation est un param tre critique pour optimiser la sensibilit et homog n iser la coloration Les bandelettes doivent tre compl tement immerg es L amplitude doit tre aussi grande que possible tout en vitant tout d bordement Un d bordement du liquide peut tre cause de contamination crois e et de r sultats non valides Pendant l incubation des bandelettes l agitation doit s effectuer de mani re que le liquide et les bandelettes effectuent un va et vient dans le compartiment sans d bordement du liquide Ne pas couvrir le support Pendant les incubations en phase d hybridation et de lavage stringent les compartiments peuvent tre laiss s ouverts dans le bain marie Couvrir les compartiments l aide de feuilles adh sives pour microplaques peut tre source de contamination crois e Directives
10. Feche o frasco imediatamente depois de uso Adicione 10 pl de cada amostra veja Exemplos veja as instru es de utiliza o de INNO LiPA HLA B Multiplex Plus e misture cuidadosamente pipetando para cima e para baixo Utilize sempre pontas de pipetas est reis Permita a desnatura o durante 5 minutos a uma temperatura de 20 25 C Agite a solu o de hibridiza o pr aquecida e adicione cuidadosamente 2 ml ao produto amplificado desnaturado em cada cavidade Misture agitando suavemente Ao pipetar tenha cuidado em n o contaminar as cavidades vizinhas Coloque imediatamente a tira na cavidade As tiras devem estar totalmente submergidas na solu o Nora Use luvas descart veis e pin as Coloque o suporte no banho agitador com gua a 56 C 0 5 C 80 rpm veja as Instru es para a incuba o manual feche a tampa e incube durante 30 minutos Nora Evite salpicar a cavidade com agua do banho Ajuste o n vel da gua entre 1 3 e 1 2 da altura da cavidade Para evitar que o suporte escorregue imobilize o entre dois pesos Lavagem rigorosa 1 2 Ap s a hibridizac o retire o suporte do banho com gua Incline o suporte a um ngulo ligeiro e aspire o liquido da cavidade com uma pipeta de prefer ncia ligada a um aspirador de vacuo Adicione 2 ml de solu o de lavagem rigorosa pr aquecida a cada cavidade e coloque o suporte no banho agitador com agua a 56 C 0 5 C feche a tampa e incube duran
11. Saline sodium phosphate EDTA SSPE buffer containing 0 5 sodium dodecyl sulphate SDS The Hybridization Solution should be pre warmed to a temperature of at least 37 C and must not exceed 56 C all crystals should be dissolved before use SSPE buffer containing 0 1 SDS The Stringent Wash Solution should be pre warmed to a temperature of at least 37 C and must not exceed 56 C all crystals should be dissolved before use Phosphate buffer containing NaCl Triton protein stabilizers and 0 01 MIT 0 1 CAA as preservative Streptavidin labeled with alkaline phosphatase in Tris buffer containing protein stabilizers and 0 01 MIT 0 098 CAA as preservative to be diluted 1 100 in Conjugate Diluent before use Prepare 2 ml Conjugate working solution for each test trough 2 ml in excess Conjugate working solution can be prepared during stringent wash for manual testing For Auto LiPA make 10 ml in excess The Conjugate working solution is stable for 24 hours at room temperature 20 25 C if stored in the dark Tris buffer containing NaCl MgCl2 and 0 01 MIT 0 1 CAA as preservative 5 Bromo 4 chloro 3 indolyl phosphate p toluidine salt BCIP and 4 nitroblue etrazolium NBT in dimethylformamide DMF to be diluted 1 100 in Substrate buffer before use Prepare 2 ml Substrate working solution for each test trough 2 ml in excess Substrate working solution can be prepared during conjugate incubation
12. intra essai la variation inter essais et inter personnes ont t valu es en interne Un chantillon amplifi en double l aide de trois cycleurs diff rents et en traitant deux s ries par cycleur a t test l aide de l instrument Auto LiPA Ce protocole a t ex cut en double par deux personnes diff rentes Aucune variation significative n a t observ e et un r sultat de typage identique a t obtenu dans tous les cas sans besoin d dition Deutsch Verwendungszweck Bei dem INNO LiPA HLA B Update Plus handelt es sich um einen line probe assay f r die in vitro Verwendung zur molekularen Typisierung von Humanen Leukozyten Antigen HLA B Allelen auf Allelgruppenniveau Funktionsweise des Tests Der INNO LiPA HLA Typisierungstest basiert auf dem Prinzip der reversen Hybridisierung Amplifiziertes biotinyliertes DNA Material wird chemisch denaturiert und die separierten Str nge werden mit spezifischen Oligonukleotid Sonden hybridisiert die als Parallellinien auf beschichtete Membranstreifen aufgetragen wurden Anschlie end wird ein Waschschritt INNOGENETICS 32 mit Stringent Waschl sung vorgenommen um unspezifisch gebundenes Amplifikat zu entfernen Nach diesem Waschschritt mit Stringent Waschl sung wird mit alkalischer Phosphatase markiertes Streptavidin hinzugef gt und dieses bindet dann die zuvor gebildeten biotinylierten Hybride Die Inkubation mit einer Substratl sung die Chrom
13. la fiche s curit du fabricant et l tiquetage pour toute information sur les produits potentiellement dangereux R20 21 R36 R45 R61 S36 37 S45 53 Toxique T Nocif par inhalation et contact avec la peau Irritant pour les yeux Canc rig ne T ratog ne Porter des gants et des v amp tements de protection En cas d accident et de malaise consulter imm diatement un m decin montrer l tiquette si possible Eviter toute exposition Se procurer les instructions sp ciales d utilisation Limit a un usage par des professionnels Contient du dim thylformamide 5 bromo 4 chloro 3 indolylphosphate sel de p toluidine Substrat BCIP NBT 100x 23 INNO LiPA HLA B Update Plus R43 S24 37 Irritant Xi Eviter le contact avec la peau Peut causer des irritations par contact avec la peau Porter des gants de protection Contient 2 chloroac tamide Solution de Ringage Tampon Substrat Diluant Conjugu et Contr le LiPA R36 38 S23 24 26 Irritant Xi Irritant pour les yeux et la peau Ne pas inhaler Eviter tout contact avec la peau En cas de contact avec les yeux rincer imm diatement grande eau et consulter de suite un m decin Contient de l hydroxyde de sodium Solution de D naturation Les chantillons doivent toujours tre manipul s comme potentiellement infectieux Tout constituant d riv du sang ainsi que tout mat riel biologique doit donc tre consid r comme potentiellement infectieux et devra
14. 8 Coloque la bandeja en el ba o de agua de agitaci n a una temperatura de 56 C 0 5 C 80 rpm consulte las Instrucciones para la incubaci n manual cierre la cubierta e incube durante 30 minutos NOTA Evite salpicar la cubeta con agua del bafio de agitaci n Ajuste el nivel de agua entre 1 3 y 1 2 de la altura de la cubeta Para evitar que la bandeja se deslice inmovil cela entre dos pesas pesadas Lavado astringente 1 Tras la hibridaci n retire la bandeja del ba o de agua 2 Sostenga la bandeja formando un ngulo pequefio y aspire el liquido de la cubeta con una pipeta preferiblemente conectada a un aspirador de vac o Afiada 2 ml de soluci n de lavado astringente precalentada a cada cubeta y coloque la bandeja en el bafio de agua de agitaci n a 56 C 0 5 C cierre la cubierta e incube durante 3 minutos Tras la incubaci n retire la bandeja del bafio de agua y aspire el liquido de la cubeta Repita una vez el paso de 3 minutos de incubaci n y el paso de aspiraci n Por ltimo afiada 2 ml de soluci n de lavado astringente precalentada a cada cubeta y coloque la bandeja en el bafio de agua de agitaci n a 56 C 0 5 C cierre la cubierta e incube durante 4 minutos Antes de la incubaci n mida la temperatura del ba o de agua con un term metro calibrado y aj stela si es necesario Cierre siempre la cubierta NOTA Diluya la soluci n de Lavado concentrada 5x y Conjugado 100x al realizar el
15. C nicht bersteigen alle Kristalle m ssen sich vor dem Gebrauch aufgel st haben SSPE Puffer mit 0 1 SDS Die Stringent Waschl sung muss auf mindestens 37 C erw rmt werden darf aber 56 C nicht bersteigen alle Kristalle m ssen sich vor dem Gebrauch aufgel st haben Phosphatpuffer mit NaCl Triton Proteinstabilisatoren und 0 01 MIT 0 1 CAA als Konservierungsmittel Mit alkalischer Phosphatase markiertes Streptavidin in Tris Puffer mit Proteinstabilisatoren und 0 01 MIT 0 098 CAA als Konservierungsmittel muss vor dem Gebrauch im Verhaltnis 1 100 mit Konjugatverd nner verd nnt werden Bereiten Sie 2 ml Konjugatarbeitsl sung f r jede Testwanne vor 2 ml berschuss Konjugatarbeitsl sung kann w hrend des Waschvorgangs mit Stringent Waschl sung vorbereitet werden f r das manuelle Testen F r den Auto LiPA stellen Sie bitte 10 ml Die Konjugatsarbeitsl sung bleibt bei Raumtemperatur 20 25 C f r 24 Stunden stabil wenn sie im Dunkeln gelagert wird Menge Ref Beschreibung 1x20 58188 Markierungslinie 1x20 58189 Markierungslinie 1 x 0 05 ml 58190 Konservierungsmittel 1x1ml 56718 Denaturierungsst rke 2x80 ml 56719 2 x 200 ml 56720 1 x 150 ml 55671 1x 1 5 ml 56716 Uberschuss her 1 x 235 ml 55732 Phosphatpuffer mit NaCl MgCl und 0 01 MIT 0 1 CAA als Konservierungsmittel INNOGENETICS 34 100x konzentriertes 1x1 5ml 55723 5 Bromo 4 Chloro 3 Indolylphosphat BCIP NBT
16. c seno erraten 23 Proc dures de manipulation 23 Bandelettes ssa sis intimo iu ari dae A REDDE 23 Directives pour incubation manuelle 24 Directives pour changement des solutions 24 Remarques et Pr cautions seh 24 Proc dure manuelle 25 Echantillons a 3 nte teeta gad a IM RE ND Idem 25 D naturation et hybridation 25 Lavage Stringent 26 Revelation eran AD CERERI UNES 26 Proc dure automatis e Auto LiPA 26 R sullats xc x bai hb enon EE DR ALARM EN EV epu DE 27 Lecture PCM IE Re on nv 27 INNOGENETICS is a Registered Trademark of Innogenetics N V 3 INNO LiPA HLA B Update Plus Validation seas 2 232 a ee see ani 27 Interpretation u tae eect rea den en eee eA 28 Logiciel d interpr tation LIRAS 28 Limites du test 2 25 38 net 2 hala e a 28 Performances EN Zu eretas dee Teraa t AR e meet eol chasis evens 28 Performance du test bas e sur l utilisation de la solution d amorces multiplex HDA B EE EE 28 Performance du test bas e sur l utilisation de la solution d amorce HLA Bw4 20 Deutsch Verwendungszweck N i444 Gwe m bol iege eee e e en e he ol 31 Funktionsweise des Tests
17. hrend der Hybridisierung oder Abweichungen von den vorgeschriebenen Inkubationszeiten oder der Temperatur Die Farbintensit t der Banden auf dem Streifen kann variieren Interpretation der Ergebnisse Auf korrektes Reaktivit tsmuster der LiPA Kontrollprobe pr fen Die Konjugatkontrolllinie auf dem Streifen muss an der Markierungslinie auf der Kunststoffableseschablone ausgerichtet werden Pr fen Sie zuerst ob die Kontrolllinien positiv sind ersten zwei Linien um jeden einzelnen Teststreifen zu validieren siehe Validierung Typisierungsergebnisse basieren auf der Reaktivit t der Sonden im Kit Eine Liste der Sondenspezifikationen ist erh ltlich Alle Sondennummern identifizieren die auf den INNO LiPA HLA B Update Plus Teststreifen positiv sind und den HLA B Typ mittels der INNO LiPA HLA B Update Plus Typisierungstabelle oder einer Version der LiPA Interpretation Software ermitteln siehe Interpretation Software LIRAS Die Software liefert h ufig mehr Ergebnisse als die beabsichtigte Verwendung vermuten l sst es wird sowohl eine Auswertung auf Allelgruppenniveau als auch aller m glichen Allelkombinationen gegeben Diese Informationen sollten jedoch als Zusatzinformation und nicht als ausschlaggebend ber cksichtigt werden 41 INNO LiPA HLA B Update Plus Interpretationssoftware LiRAS Die Software LIRAS f r INNO LiPA HLA hilft bei der Auswertung der LiPA Ergebnisse Bitte kontaktieren Sie
18. n del DNA se realiz utilizando el salting out o los equipos QlAamp 96 DNA blood kit Qiagen Genomic DNA Purification kit Promega y Puregene Gentra Systems El DNA reci n obtenido o congelado fue amplificado con los termocicladores Perkin Elmer 9600 o 9700 y los amplicones se conservaron a 2 8 C 0 25 15 C antes de ser aplicados a las tiras No se encontraron fallos en la amplificaci n aunque dos muestras tuvieron que ser tipadas dos veces en un centro Las muestras fueron procesadas utilizando un Auto LiPA y se analizaron con una versi n para ensayos clinicos del software de interpretaci n LIRAS Precisi n Se obtuvo un resultado de tipaje HLA B para 342 de 347 muestras de DNA En un centro se tuvo que repetir el tipaje de 4 muestras Una muestra fue definida como tipaje no deducible pero de acuerdo con el investigador esto fue probablemente debido a una contaminaci n del DNA Para cuatro muestras de un centro el investigador no obtuvo ning n resultado en el tipaje aunque hubo opciones disponibles via modificaci n para una de ellas La exactitud a nivel de grupo de alelos se calcul como porcentaje de concordancia observada con ensayos de DNA alternativos Biotest ELPHA HLA AB LowRes Typing kit Dynal SSP LiPA HLA B secuenciaci n Micro SSP OLERUP SSP Biotest HLA B SSP Los resultados del INNO LiPA HLA B Update se consideraron concordantes con el ensayo de referencia cuando los dos resultados fueron id
19. nticos si el resultado del INNO LiPA HLA B Update fue m s espec fico que el resultado de referencia o cuando los resultados del INNO LiPA HLA B Update mostraron menor resoluci n pero un resultado correcto en comparaci n a los m todos de referencia La exactitud fue del 100 342 342 Resoluci n versi n v1 0 2001 03 31 de la tabla de tipaje El equipo INNO LiPA HLA B Update est pensado para determinar alelos HLA B a nivel de grupo de alelos Grupo de alelos es la designaci n de los dos primeros d gitos que siguen al asterisco en la nomenclatura HLA est ndar p e HLA B 07 Adem s el equipo est pensado para determinar los siguientes alelos nulos 0808N ex n 3 1526N ex n 3 y 5111N ex n 4 La resoluci n a nivel de grupo de alelos observada durante este estudio fue del 92 4 316 342 Las ambig edades observadas fueron B 08xB 51 o B 08xB 78 8 casos B 15xB 35 o B 15xB 15 2 casos B 35xB 38 o B 39xB 53 2 casos B 08xB 38 o B 08xB 39 2 casos B 15xB 51 o B 15xB 52 o B 15xB 78 2 casos B 35xB 51 o B 53xB 78 2 casos B 35xB 38 o B 35xB 53 1 caso B 35xB 49 o B 50xB 53 1 caso B 35xB 47 o B 53xB 47 1 caso B 40xB 78 o B 40xB 52 1 caso B 35xB 55 o B 35xB 56 1 caso B 15xB 49 o B 15xB 50 1 caso B 49xB 78 o B 50xB 51 1 caso B 15xB 51 o B 52xB 78 1 caso 67 INNO LiPA HLA B Update Plus Para seis de estos casos tanto el ensayo de referencia como el equipo INNO LiPA HLA B Update dieron resu
20. sung eingetaucht sein Hinweis Einweghandschuhe tragen und Pinzette verwenden Wannen in ein Sch ttelwasserbad mit einer Temperatur von 56 C 0 5 C 80 U min f r die manuelle Inkubation stellen schlie en Sie den Deckel und inkubieren Sie f r 30 Minuten Hinweis Achten Sie darauf dass kein Wasser vom Wasserbad in die Wanne spritzt Den Wasserstand auf 1 3 bis 1 2 der H he der Wanne einstellen Um ein Verrutschen der Wannen zu vermeiden den Wannenbehalter zwischen zwei schweren Gewichten fixieren Stringent Waschl sung Schritt 1 2 Nach der Hybridisierung die Wannen aus dem Wasserbad nehmen Die Wanne leicht geneigt halten und die Fl ssigkeit mittels einer Pipette die vorzugsweise an eine Vakuumpumpe angeschlossen ist aus den Wannen absaugen 2 ml vorgew rmte Stringent Waschl sung in jede Wanne geben die Schale in ein 56 C 0 5 C warmes Wasserbad legen Deckel schlie en und f r 3 Minuten inkubieren Nach der Inkubation die Schale aus dem Wasserbad nehmen und die Fl ssigkeit aus der Wanne absaugen Den 3 min tigen Inkubationsschritt und das Absaugen einmal wiederholen Abschlie end 2 ml vorgew rmte Stringent Waschl sung in jede Wanne geben und den Halter in ein 56 C 0 5 C warmes Wasserbad stellen Deckel schlie en und f r 4 Minuten inkubieren 39 INNO LiPA HLA B Update Plus Vor der Inkubation die Temperatur des Wasserbads mit einem kalibriertem Thermometer berpr fen und die Temperatur an
21. use 10 pl For sample preparation see INNO LiPA HLA B Multiplex Plus instructions for use NOTE Make sure exactly 10 ul of amplified sample is added Too much or too little sample may lead to a wrong typing result 2 LiPA Control sample for INNO LiPA HLA B Update Plus use 10 ul amplification is not required 3 Blank amplified control sample negative control use 10 ul Denaturation and hybridization 1 Heat a shaking water bath to 56 C 0 5 C Check the temperature using a calibrated thermometer and adjust the temperature if necessary Do not exceed the indicated temperature Pre warm the Hybridization Solution and Stringent Wash Solution in a water bath of at least 37 C and do not exceed 56 C Mix before use All crystals should be dissolved 2 Using forceps remove the required number of INNO LiPA HLA B Update Plus Strip 1 and Strip 2 from the tube one strip 1 and one strip 2 per test sample for the INNO LiPA HLA B Multiplex Plus one strip 1 for the INNO LiPA HLA Bw4 amplicon Include both strips for the LiPA Control sample for INNO LiPA HLA B Update Plus and for the blank amplified control sample Pencil an identification number above the brown chrome colored marker line on the strip 3 Take the required number of test troughs two troughs per test sample for HLA B Multiplex Plus and one trough per test sample for HLA Bw4 and place them into the tray 4 Pipette 10 pl Denaturation Solution into the upper corner o
22. 35xB 53 1 caso B 35xB 49 ou B 50xB 53 1 caso B 35xB 47 ou B 53xB 47 1 caso B 40xB 78 ou B 40xB 52 1 caso B 35xB 55 ou B 35xB 56 1 caso B 15xB 49 ou B 15xB 50 1 caso B 49xB 78 ou B 50xB 51 1 caso B 15xB 51 ou B 52xB 78 1 caso Para seis destes casos tanto o ensaio de refer ncia como o kit INNO LiPA HLA B Update deram resultados ambiguos Duas ambiguidades 6 amostras observadas com o m todo de refer ncia foram reduzidas a um Unico resultado de tipagem utilizando o ensaio INNO LiPA HLA B Update Reactividade das sondas Quatro sondas reagiram como falsos positivos e nove d bilmente como falsos negativos em uma ou mais ocasi es durante o ensaio clinico Esta informagao se ainda n o estava presente foi aplicada ao software e ou nas instrucc es para facilitar a tipagem Quando se utilizou o software de interpreta o LIRAS todas as falsas reactividades foram identificadas como tal e alcangou se uma tipagem concordante a nivel de grupo de alelo Consultar as instrucg es para informag o especifica sobre a reactividade das sondas Est disponivel uma lista completa de especificidades das sondas e dos primers Todas as sondas est o desenhadas para hibridar especificamente com a sua sequ ncia complementar a nivel de um mismatch excepto se esta especificado de outro modo na lista Sensibilidade do teste Uma avaliac o interna de s ries de diluigdes de tr s amostras de ADN variando de 0 01 ug ul at 2 ug
23. Die Streifen d rfen zwischen den zwei Schritten nicht antrocknen Darauf achten dass die Oberfl che der Teststreifen beim Absaugen der Fl ssigkeit nicht besch digt wird Die Fl ssigkeit am oberen Ende des Teststreifens oberhalb der Markierungslinie absaugen Sicherstellen dass die gesamte Fl ssigkeit abgesaugt wurde Damit effizientes Waschen gew hrleistet ist m ssen die Streifen vollst ndig in die L sung eingetaucht werden Wenn n tig die Geschwindigkeit des Sch ttlers anpassen Hinweise und Vorsichtsma nahmen Darf nur von Fachpersonal verwendet werden Um eine DNA Kontamination zu vermeiden wird eine maximale r umliche Trennung zwischen den pr und post Amplifikationsschritten empfohlen Separate R ume separate Pipetten und anderes Labormaterial separate Laborkittel und handschuhe und des entsprechenden Vorrats sind die Mindestvoraussetzungen f r eine gute Laborpraxis Vermeiden Sie einen Wechsel zwischen dem post Amplifikationsraum und dem pr Amplifikationsraum Die Verwendung von autoklaviertem Einweglabormaterial wird empfohlen Einweglabormaterial nicht mehrmals verwenden Verwenden Sie f r jede Probe eine neue Pipettenspitze Verwenden Sie den Kit nicht nach berschreitung des Verfalldatums Keine Reagenzien unterschiedlicher Kits mischen es sei denn die Bestandteile weisen dieselbe Chargennummer auf Vermeiden Sie mikrobielle Kontamination der Reagenzien Manuelles Testve
24. HLA B Multiplex Plus wurde hausintern sowie in zwei belgischen Laboren f r Gewebetypisierung bewertet Insgesamt wurden 82 anonyme Proben analysiert 50 Proben au er Haus 32 hausintern Alle Proben waren zuvor mit INNO LiPA HLA B Update typisiert worden Die Proben enthielten 31 widerspr chliche 18 verschiedene Widerspr chlichkeiten und 51 nicht widerspr chliche Proben Alle widerspr chlichen Proben wurden weiter mit einem oder mehreren alternativen DNA basierten Typisierungstests auf ein eindeutiges Ergebnis typisiert Alle Hybridisierungen wurden mit dem Auto LiPA Instrument unter Verwendung von Programm HLA56v3 durchgef hrt und die Auswertung erfolgte mittels einer klinischen Versuchsversion der LIRAS for LiPA HLA v3 00 Interpretationssoftware Testsensitivit t Die Testsensitivit t des Assays auf Allelgruppenebene wurde als die Anzahl der erfolgreichen Typisierungsergebnisse berechnet gemessen an der Gesamtzahl der getesteten Proben Die Testsensitivit t bei dieser Evaluierung nach einem wiederholten Amplifikationstest bei vier Proben lag bei 98 8 81 82 95 CI 93 4 100 Die Probe bei der die Amplifikation nach dem erneuten Test beim Zentrum gescheitert war wurde hausintern erfolgreich amplifiziert und es wurde ein korrektes Typisierungsergebnis erzielt Diagnostische Genauigkeit Die Berechnung der diagnostischen Genauigkeit wurde nur f r solche Proben durchgef hrt die erfolgreich amplifiziert werden ko
25. INNO LiPA HLA B Update Plus strips A line is considered positive when a clear purple brown band appears at the end of the test procedure conj control HLA B control Strip 2 marker line marker line conj control HLA B control cam ramtnonoortereerere ANNAN CE Figure 1 Location of the marker line brown line on Strip 1 and chrome line on Strip 2 the conjugate control line conj control the HLA B Update Plus control line HLA B control and the 66 sequence specific DNA probes on the INNO LiPA HLA B Update Plus strips Strip 1 Validation Include one negative control and the LIPA Control for INNO LiPA HLA B Update Plus each time a test is performed As with any new test procedure the inclusion of additional positive and negative controls is to be considered until a high degree of confidence is reached in the ability to correctly perform the test procedure It is suggested that reference DNA should be used to validate that the proper test conditions have been established The uppermost lines on the INNO LiPA HLA B Update Plus strips Figure 1 are the marker lines brown and chrome colored line These lines allow correct orientation of the strips The next line controls the addition of reactive Conjugate and Substrate working solution during the detection procedure This line should be lined up with the conjugate control line on the plastic reading card This line should always be positive if not no interpre
26. INNO LiPA HLA B Update Innogenetics or an alternative typing assay Olerup SSP GenoVision SBT Abbott Biotest HLA B SSP Biotest Allset HLA B Low Resolution Dynal and sequencing in house method The typing results of all 80 samples were concordant with the reference assay resulting in a diagnostic accuracy of 100 80 80 95 Cl 95 5 100 Resolution typing table v 1 4 031010 The HLA B Multiplex Primer Solution used in combination with the INNO LiPA HLA B Update strips is designed for typing HLA B alleles at allele group level The HLA Bw4 Primer Solution used in combination with the INNO LiPA HLA B Update strip 1 is designed to resolve the most frequent ambiguities ie ambiguities involving Bw4 Bw 6 alleles All ambiguities at allele group level observed after testing with the HLA B Multiplex Primer Solution were reduced to an unambiguous typing result using the HLA Bw4 Primer Solution B 08 B 38 or B 08 B 39 2 cases B 08 B 51 or B 08 B 78 4 cases B 13 B 49 or B 13 B 50 2 cases B 15 B 38 or B 15 B 39 1 case B 15 B 51 or B 15 B 52 or B 15 B 78 1 case B 15 B 51 or B 15 B 52 or B 15 B 78 or B 35 B 52 1 case B 35 B 38 or B 39 B 53 4 cases B 35 B 40 or B 40 B 53 19 INNO LiPA HLA B Update Plus 1 case B 35 B 47 or B 47 B 53 1 case B 35 B 49 or B 50 B 53 2 cases B 35 B 52 or B 53 B 78 2 cases B 38 B 44 or B 39 B 44 1 case B 38 B 50 or B 39 B 49
27. Irritante per gli occhi e per la pelle Non respirarne i vapori Evitare il contatto con la pelle In caso di contatto con gli occhi sciacquare immediatamente e abbondantemente con acqua e rivolgersi ad un medico Contiene idrossido di sodio Soluzione di Denaturazione campioni devono sempre essere manipolati come potenzialmente infetti Per questo motivo tutti i componenti del sangue e i materiali biologici devono essere considerati come potenzialmente infetti e maneggiati come tali Solo a personale adeguatamente preparato dovrebbe essere permessa l esecuzione del test Tutti i componenti del sangue e i materiali biologici dovrebbero essere eliminati in accordo con le procedure di sicurezza stabilite Autoclavare per almeno 15 minuti a 121 C ncenerire il materiale monouso Miscelare i liquidi reflui con ipoclorito di sodio in modo che la concentrazione finale sia 1 ipoclorito di sodio Lasciare riposare tutta la notte prima di smaltirlo ATTENZIONE Neutralizzare il liquido di scarto che contiene acido prima di aggiungere ipoclorito di sodio necessario l uso di dispositivi di protezione guanti e occhiali di sicurezza quando si manipolano agenti pericolosi o infettanti Gli scarti devono essere maneggiati in accordo con le linee guida delle istituzioni in materia Devono inoltre essere rispettate tutte le norme sull ambiente federali statali e locali Campioni Poich il test LiPA utilizza come campione mate
28. Testleistung unter Verwendung von DNA die mit Hilfe der HLA Bw4 Multiplex Primerl sung amplifiziert wurde 43 Italiano USO previsto speed oe E RR Qube Rae Oa 44 Principio del test 44 Reagenti Hu dti dl Seen eeh S eerie Ox be d Vr 45 Descrizione preparazione per l uso e condizioni di conservazione faccomanddle osi aa md ERI A 45 Materiali richiesti ma non forniti 47 Sicurezza ambiente EE 47 Campioni 2 a eat a mre ERARIALE ALARE List UE REA 48 Procedure di manipolazione 48 Trattamento delle strisce 48 Indicazioni per l incubazione manuale 49 Indicazioni per il cambio manuale del liquido nelle vaschette 49 Not e precauzioni estent cali ele FE eX NULLE UIS 49 Procedura manuale del test 50 Campionis ssa age rout aden eee SUP RE Umi A 50 Denaturazione e ibridazione 50 Lavaggio stringente 51 INNOGENETICS 4 Sviluppo del Colore rivoli ila eem emi ee td 51 Procedura automatica del test Auto LiPA 52 Risto ENEE MMI SO E 52 EURI A eee Dees A ey alas eqq UV 52 Validazione A dans dede AS baee ta abe aa 52 Interpretazione dei risultati 53 Software d interpretazione LIRAS
29. aspirate the liquid from the trough 4 Repeatthe 3 minutes incubation step and the aspiration step once INNOGENETICS 14 5 Atlast add 2 ml pre warmed Stringent Wash Solution into each trough and place the tray into the 56 C 0 5 C shaking water bath close the lid and incubate for 4 minutes Before incubation check the temperature of the water bath using a calibrated thermometer and adjust the temperature if necessary Always close the lid NOTE Dilute the concentrated Rinse Solution 5x and Conjugate 100x during stringent wash See Reagents Color development All subsequent incubations are carried out at 20 25 C on a shaker During the incubations the liquid and test strips should move back and forth in the trough for homogeneous staining 1 Wash each strip twice for 1 minute using 2 ml of the Rinse working solution see Directions for changing liquid in the troughs 2 Add 2 ml of the Conjugate working solution to each trough and incubate for 30 minutes while agitating the tray on the shaker NOTE Dilute the Substrate BCIP NBT 100x solution about 10 minutes prior to the end of the conjugate incubation See Reagents 3 Wash each strip twice for 1 minute using 2 ml of the Rinse working solution and wash once more using 2 ml Substrate Buffer 4 Add2mlofthe Substrate working solution to each trough and incubate for 30 minutes while agitating the tray on the shaker CAUTION Wear gloves and protective g
30. auf den INNO LiPA HLA B Update Plus Teststreifen Eine Linie gilt als positiv wenn ein klares violett braunes Band am Ende des Testverfahrens zu erkennen ist INNOGENETICS 40 Abbildung 1 siehe Seite 15 Position der Markierungslinie braune Linie auf Teststreifen 1 und gelbe Linie auf Teststreifen 2 der Konjugatkontrolllinie conj control der HLA B Update Plus Kontrolllinie HLA B control und der 66 sequenzspezifischen DNA Sonden auf den INNO LiPA HLA B Update Plus Teststreifen Validierung Bei jedem Test eine Negativkontrolle und eine LiPA Kontrolle f r INNO LiPA HLA B Update Plus hinzuf gen Wie bei jedem neuen Testverfahren ist das Hinzuf gen einer zus tzlichen Positiv und Negativkontrolle ratsam bis eine hohe Zuverl ssigkeit bei der Durchf hrung des Testverfahrens gew hrleistet ist Es wird geraten Referenz DNA zu verwenden um sicherzustellen dass angemessene Testbedingungen eingehalten wurden Die obersten Linien auf den INNO LiPA HLA B Update Plus Streifen Abbildung 1 sind die Markierungslinien braune und gelbe Linie Diese Linien erm glichen die korrekte Ausrichtung des Teststreifens Anhand der n chsten Linie wird die Zugabe von reaktivem Konjugat und von Substratgebrauchsl sung w hrend des Nachweisverfahrens kontrolliert Diese Linie muss an der Konjugatkontrollinie auf der Kunststoffableseschablone ausgerichtet werden Diese Linie muss immer positiv sein falls nicht sollte keine Auswertun
31. com solug o de iniciadores HLA B Multiplex A avaliac o do kit INNO LiPA HLA B Update realizou se em quatro laborat rios europeus de tipagem de tecidos em tipagens de amostras de rotina Analisaram se um total de 347 amostras O ADN obteve se de amostras de sangue frescas ou congeladas com EDTA ou citrato como anticoagulante A extracc o do AND realizou se utilizando o m todo de salting out ou os kits QIAamp 96 DNA blood kit Qiagen Genomic DNA Purification kit Promega e Puregene Gentra Systems OADN r cem obtido ou congelado foi amplificado com os termocicladores Perkin Elmer 9600 ou 9700 e os amplicons conservaram se a 2 8 C ou 25 15 C antes de serem aplicados nas tiras N o se encontraram falhas na amplifica o ainda que duas amostras tenham tido que ser tipadas duas vezes num dos centros As amostras foram processadas utilizando um Auto LiPA e foram analisadas com uma vers o para ensaios cl nicos do software de interpreta o LIRAS Precisao Obteve se um resultado de tipagem HLA B para 342 de 347 amostras de ADN Num centro teve que se repetir a tipagem de 4 amostras Uma amostra foi definida como tipagem nao deduz vel mas de acordo com o investigador isto foi provavelmente devido a uma contamina o do ADN Para quatro amostras de um centro o investigador n o obteve nenhum resultado na tipagem ainda que tenham havido opc es dispon veis via modificac o para uma delas A exactid o a n vel de gr
32. couleur jaune 21 INNO LiPA HLA B Update Plus Contr le LiPA 1 x 0 05 ml Solution de D naturation 1x 1 ml Solution d Hybridation 2 x 80 ml Solution de Lavage 2 x 200 ml Stringent Diluant Conjugu 1 x 150 ml Conjugu 100x 1x1 5ml Tampon Substrat 1x235ml Substrat BCIP NBT 100x 1 x 1 5 ml 58190 56718 56719 56720 55671 56716 55732 55723 Contient de l acide thyl nediaminet traac tique EDTA et 0 0196 m thylisothiazolone MIT 0 1 chloroac tamide CAA comme conservateur Solution alcaline contenant EDTA Le flacon doit tre imm diatement referm apr s usage Une exposition prolong e l air de cette solution conduit une rapide d t rioration de son pouvoir d naturant Tampon SSPE saline sodium phosphate EDTA contenant 0 5 de dod cyl sulfate sodium SDS La Solution d Hybridation doit tre pr chauff e a une temp rature d au moins 37 C sans d passer 56 C tous les cristaux doivent tre dissous avant utilisation Tampon SSPE contenant 0 1 SDS La Solution de Lavage Stringent doit tre pr chauff e a une temp rature d au moins 37 C sans d passer 56 C tous les cristaux doivent tre dissous avant utilisation Tampon phosphate contenant NaCl Triton prot ines stabilisatrices et 0 01 MIT 10 1 CAA comme conservateur Streptavidine marqu e a la phosphatase alcaline en tampon Tris contenant des prot ines stabilisatrices et 0 01 MIT 0 09
33. dell esone 2 degli alleli HLA Bw4 con la soluzione primer HLA Bw4 prima dell analisi con la striscia 1 INNO LiPA HLA B Update Plus La soluzione primer HLA Bw4 in dotazione amplifica l esone 2 degli alleli HLA Bw4 L Esone 2 degli altri HLA B non sar amplificato eccetto per gli alleli B 4411 B 4703 e B 5708 INNO LiPA HLA B Update Plus stato creato per dare la migliore risoluzione possibile usando il test dell ibridazione inversa a livello di gruppo allelico s intendono in questo senso le prime due cifre dopo l asterisco nel nome di un allele secondo la nomenclatura standard HLA ad es HLA B 07 Oltre all interpretazione del gruppo allelico il software dar tutte le possibili combinazioni di allele Queste informazioni devono per essere considerate come un extra e non decisive Reagenti Descrizione preparazione per l uso e condizioni di conservazione raccomandate Se conservati da 2 8 C e tenuti nelle fiale originali i reagenti aperti o non aperti sono stabili fino alla data di scadenza del kit Non congelare i reagenti Non usare i reagenti oltre la data di scadenza Il kit deve essere conservato isolato da qualsiasi fonte di DNA contaminante specialmente prodotti amplificati Tutti i reagenti devono essere portati a temperatura ambiente 20 25 C circa 60 minuti prima dell uso e devono essere rimessi nel frigorifero immediatamente dopo l uso Alterazioni nell aspetto fisico dei componenti del kit possono i
34. di 50 rpm Agitatore Vortex o equivalente Cilindri graduati 10 25 50 e 100 ml Acqua distillata o deionizzata Guanti monouso Puntali per pipette sterili monouso preferibilmente con filtro Pinzette per maneggiare le strisce Pipette regolabili per erogare da 1 20 ul 20 200 ul e da 200 1000 ul Pipetta a ripetizione Eppendorf opzionale Timer 2 ore 1 minuto Sicurezza e ambiente Si prega di fare riferimento alle schede di sicurezza e alle etichette del prodotto per ottenere informazioni relative ai componenti potenzialmente pericolosi R20 21 R36 R45 R61 S36 37 S45 53 Tossico T Nocivo se inalato o messo a contatto con la pelle Irritante per gli occhi Pu provocare cancro Pu causare danni al feto Indossare appropriati abiti protettivi e guanti In caso di incidente o malore rivolgersi immediatamente ad un medico mostrando l etichetta se possibile Evitare l esposizione usare speciali istruzioni per l uso Ristretto ad utilizzatori professionali Contiene dimetilformammide 5 bromo 4 cloro 3 indolilfosfato sale di p toluidina Substrato BCIP NBT 100x INNOGENETICS 48 R43 S24 37 Irritante Xi Evitare il contatto con la pelle Pu causare sensibilizzazione per contatto con la pelle Indossare appropriati guanti protettivi Contiene 2 Cloroacetammide Soluzione di Risciacquo tampone Substrato diluente Coniugato e controllo LiPA R36 38 S23 24 26 Irritante Xi
35. diff remment dans la liste INNOGENETICS 30 Sensibilit du test Les r sultats obtenus au cours d une valuation interne par dilutions s ri es de 3 extraits ADN variant de 0 01 ug ul 2 ug ul tablissent que l ADN doit avoir une concentration minimum de 0 1 yg ul L valuation externe de performance incluait 347 chantillons ADN avec des concentrations variant de 20 1500 ng ul et de puret A260nm A280nm 1 5 L ADN tait dilu une concentration comprise entre 20 ng ml et 250 ng ml avant amplification Aucun chec d amplification n a t rencontr bien que dans un centre 2 chantillons aient d amp tre retest s Reproductibilit Donn es internes 3 chantillons ont t test s en quadruplicate par 2 personnes diff rentes en m thode manuelle ou par une personne sur 2 instruments Auto LiPA diff rents 2 chantillons ont t analys s avec 3 lots diff rents au cours de 2 s ries diff rentes L interpr tation des r sultats a t la m me pour tous les chantillons La r activit des sondes a t comparable dans tous les cas Validation externe La variabilit inter lot a t tablie par analyse d un panel de comp tence 5 chantillons de r activit et d interpr tation connues avec 2 diff rents lots de production de produit Le m me r sultat de typage a t obtenu pour chaque chantillon ind pendamment du lot utilis La variabilit inter laboratoire a
36. digits following the asterisk in standard HLA nomenclature e g HLA B 07 Furthermore the kit is designed to detect the following null alleles 0808N exon 3 1526N exon 3 and 5111N exon 4 The resolution at allele group level observed during this study is 92 4 316 342 The ambiguities observed were B 08xB 51 or B 08xB 78 8 cases B 15xB 35 or B 15xB 15 2 cases B 35xB 38 or B 39xB 53 2 cases B 08xB 38 or B 08xB 39 2 cases B 15xB 51 or B 15xB 52 or B 15xB 78 2 cases B 35xB 51 or B 53xB 78 2 cases B 35xB 38 or B 35xB 53 1 case B 35xB 49 or B 50xB 53 1 case B 35xB 47 or B 53xB 47 1 case B 40xB 78 or B 40xB 52 1 case B 35xB 55 or B 35xB 56 1 case B 15xB 49 or B 15xB 50 1 case B 49xB 78 or B 50xB 51 1 case B 15xB 51 or B 52xB 78 1 case For six of these cases both the reference assay and INNO LiPA HLA B Update had an ambiguous result Two ambiguities 6 samples observed with the reference method were reduced to a single clear cut typing result using the INNO LiPA HLA B Update assay Probe reactivity Four probes reacted false positive and nine probes reacted weak to false negative at one or more occasions during this clinical trial This information if not already present has been implemented in the software and or guidelines The false reactivities were all identified as such and concordant typing at allele group level was achieved when the LRAG IN interpretation software was used Consult the g
37. in the same trough Unused or developed strips should be kept away from intense light and heat Allow the developed strips to dry completely before interpretation covering and storing Developed dry strips should be stored preferably in the dark at 20 25 C Do not reuse the troughs Directions for manual incubation Incubation at 56 C 0 5 C during hybridization and stringent wash are the most critical steps in avoiding false positive temperature too low or false negative very weak signals temperature too high A shaking water bath with inclined lid allows a good control of temperature variations Strict temperature control with a calibrated thermometer is necessary Always close the lid of the water bath during incubations in order to avoid false positive signals Do not use a hot air shaker for the hybridization and stringent wash For hybridization and stringent wash the troughs should be placed on the shaking platform of the water bath Adjust the water level between 1 3 and 1 2 of the height of the trough Make sure that the troughs do not float on the water The water should be in direct contact with the troughs Incubation steps for the color development should be between 20 and 25 C If the temperature is below 20 C weaker results may be obtained If the temperature is above 25 C high background and or false positive signals may be obtained Always incubate exactly for the duration as mentioned in the protocol T
38. marr n en la Tira 1 y banda de color cromo en la Tira 2 la banda de control de conjugado control de conjugado la banda de control de HLA B Update Plus control de HLA B y las 66 sondas de ADN espec ficas de la secuencia en las tiras de INNO LiPA HLA B Update Plus Validaci n Incluya un control negativo y el control LIPA para INNO LiPA HLA B Update Plus cada vez que realice un ensayo Al igual que en cualquier nuevo ensayo se debe considerar la posibilidad de incluir controles positivos y negativos adicionales hasta que se alcance un elevado grado de confianza en la capacidad de realizar correctamente el procedimiento de ensayo Se recomienda el uso del ADN de referencia para validar las condiciones de ensayo establecidas Las bandas superiores de las tiras INNO LiPA HLA B Update Plus Ilustraci n 1 son las bandas de marca de color marr n y color cromo Estas bandas permiten orientar correctamente las tiras La siguiente banda controla la adici n de soluci n de Conjugado de trabajo y de soluci n de Sustrato de trabajo durante el procedimiento de detecci n Esta banda debe alinearse con la banda de control de conjugado en la tarjeta de lectura de pl stico Siempre debe ser positiva de lo contrario no debe realizarse ninguna interpretaci n y debe tener aproximadamente la misma intensidad en cada tira de un mismo ensayo 65 INNO LiPA HLA B Update Plus La siguiente banda es la banda de control de hibridaci n inter
39. or manual testing For Auto LiPA make 10 ml in excess The Substrate working solution is stable for 24 hours at room temperature 20 25 C if stored in the dark Phosphate buffer containing NaCl Triton and 0 05 MIT 0 48 CAA as preservative o be diluted 1 5 1 part 4 parts in distilled or deionized water before use Prepare 8 ml Rinse working solution for each test trough 10 ml in excess For Auto LiPA make 20 ml in excess The Rinse working solution is stable for 2 weeks at 2 8 C Containing 8 troughs each For identification of positive probes For storage of developed strips INNOGENETICS 10 Materials required but not provided Water bath with shaking platform 80 rpm with inclined lid temperature adjustable to 56 C 0 5 C Aspiration apparatus Calibrated thermometer Orbital reciprocal or rocking platform shaker Recommendations For an orbital shaker the diameter of the circular motion should be equal or superior to 13 mm recommended speed for a 13 mm circular motion is 160 rpm For a reciprocal shaker recommended speed for the to and from motion is 80 movements per minute For a rocking platform shaker the shaking angle should not exceed 13 to avoid spilling of liquid recommended speed is 50 rpm Vortex mixer or equivalent Graduated cylinders 10 25 50 and 100 ml Distilled or deionized water Disposable gloves Disposable sterile pipette tips pre
40. pour changement des solutions Aspirer le liquide de chaque compartiment l aide d une pipette de pr f rence branch e sur une pompe a vide Incliner le support de mani re que le liquide s coule vers une extr mit du compartiment Ajouter 2 ml de la solution appropri e dans chaque compartiment et suivre le protocole Une multipipette de type Eppendorf est indiqu e pour cet usage R p ter cette tape le nombre de fois indiqu dans la proc dure de test NOTE Ne pas laisser s cher les bandelettes entre deux tapes Veiller ne pas endommager la surface des bandelettes lors de l aspiration du liquide Aspirer le liquide dans le haut de la bandelette au dessus de la ligne rep re Veiller aspirer tout le liquide Veiller immerger enti rement les bandelettes dans la solution pour assurer un lavage correct Adapter la vitesse de l agitateur si n cessaire Remarques et Pr cautions A usage professionnel exclusivement Afin d viter toute contamination ADN il est recommand de s parer le plus possible physiquement les tapes de pr et post amplification pi ces s par es pipettes et mat riel de laboratoire diff rents blouses et gants et leurs stocks diff rents sont les pr cautions minimum prendre dans le cadre des bonnes pratiques de laboratoire 25 INNO LiPA HLA B Update Plus Eviter tout retour de la pi ce post amplification vers la pi ce pr amplification Il est rec
41. pueden diferir de una banda a otra Interpretaci n de los resultados Compruebe que el patr n de reactividad de la muestra de control LiPA es correcto La banda de control de conjugado de la tira debe estar alineada con la banda de control de conjugado de la tarjeta de lectura de pl stico Compruebe primero si las dos primeras bandas de control son positivas para poder validar cada tira individual consulte el apartado Validaci n Los resultados de determinaci n de tipo se basan en la reactividad de las sondas del kit Hay una lista de especificidades de las sondas disponible Identifique todos los n meros de sonda positivos en la tira de INNO LiPA HLA B Update Plus y utilice la tabla de tipos de INNO LiPA HLA B Update Plus o una versi n del software de interpretaci n de LiPA consulte el apartado Software de Interpretaci n LIRAS para deducir el tipo de HLA B El software suele proporcionar m s resultados de los que sugiere el uso al que est destinado el ensayo interpretaci n del grupo de alelos adem s de todas las combinaciones posibles de alelos No obstante no debe considerarse esta informaci n como decisiva sino como datos adicionales Software de interpretaci n LiRAS El software LiRAS para INNO LiPA HLA se ha disefiado como ayuda para la interpretaci n de los resultados de LiPA P ngase en contacto con el distribuidor local para obtener la versi n actualizada m s reciente Limitaciones del procedim
42. reagents should be brought to room temperature 20 25 C approximately 60 minutes before use and should be returned to the refrigerator immediately after use A Alterations in physical appearance of the kit components may indicate instability or deterioration To minimize the possibility that strips curl before use it is recommended to store the tube horizontally Reagents supplied Component Quantity Ref Description Strips 1 1x20 58188 Containing 20 strips for INNO LiPA HLA B Update Plus marked with a brown marker line Strips 2 1x20 58189 Containing 20 strips for INNO LiPA HLA B Update Plus marked with a chrome colored marker line LiPA Control 1x0 05 ml 58190 Containing ethylenediaminetetraacetic acid EDTA and 0 0196 methylisothiazolon MIT 0 196 chloroacetamide CAA as preservative 9 INNO LiPA HLA B Update Plus Denaturation Solution Hybridization Solution Stringent Wash Solution Conjugate Diluent Conjugate 100x Substrate Buffer Substrate BCIP NBT 100x Rinse Solution 5x Incubation tray Reading card Data reporting sheet 1x1 ml 2 x 80 ml 2 x 200 ml 1x 150 ml 1x 1 5 ml 1 x 235 ml 1x 1 5 ml 2 x 80 ml 56718 56719 56720 55671 56716 55732 55723 56721 Alkaline solution containing EDTA The vial should be closed immediately after use prolonged exposure of this solution to air leads to a rapid deterioration of the denaturing strength
43. sur l utilisation de la solution d amorces multiplex HLA B Les performances du test INNO LiPA HLA B Update ont t valu es dans quatre laboratoires europ ens d histocompatibilit sur des chantillons de routine typer Au total 347 chantillons taient analys s L ADN avait t extrait de sang frais ou congel avec anticoagulant citrate ou EDTA Les m thodes d extraction incluaient la pr cipitation le kit QIAamp 96 DNA blood Qiagen le kit Genomic DNA Purification Promega et Puregene Gentra Systems Les ADN frais ou congel s taient amplifi s en utilisant le thermocycleur Perkin Elmer 9600 ou 9700 Les amplicons taient conserv s 2 8 C ou entre 25 15 C avant l hybridation sur bandelettes LiPA Aucun chec d amplification n a t observ bien que dans un centre 2 chantillons aient d tre retest s Les chantillons ont t test s sur Auto LiPA et interpr t s avec une version d essai clinique du logiciel d interpr tation LIRASTM 29 INNO LiPA HLA B Update Plus Pr cision Un r sultat de typage HLA B a t obtenu pour 342 des 347 chantillons Des reprises ont t n cessaires pour 4 chantillons dans un centre Un chantillon n a pu tre typ mais de l avis de l investigateur la cause en tait probablement une contamination ADN Pour 4 chantillons dans un centre aucun r sultat n a t rendu par l investigateur bien que pour l un d entre eux des options aient t
44. uma interpreta o ao n vel do grupo de alelos bem como todas as INNOGENETICS 78 combinac es de alelos possiveis No entanto esta informac o deve ser considerada como informag o adicional e nao como sendo informa o decisiva Software de interpretag o LiRAS O software LIRAS para INNO LiPA HLA foi desenvolvido para ajudar a interpretar os resultados da LiPA Para obter a vers o mais recente contacte o seu distribuidor local Limites do procedimento Autilizac o deste produto deve ficar reservado ao pessoal qualificado em t cnicas de hibridizac o Apenas a adop o de uma boa pr tica de laborat rio e a realiza o meticulosa dos procedimentos espec ficos permitem a hibridizac o espec fica e a determinac o do tipo correcto do ADN alvo Astiras INNO LiPA HLA B Update Plus foram desenvolvidas para apresentar resultados ao nivel do grupo de alelos B 07 a B 83 No entanto a combinac o de determinados alelos pode resultar numa combina o de sonda n o nica e portanto dar uma resposta ambigua de duas ou mais possiveis combinac es al licas Alelos novos podem ter polimorfismos fora das regi es de sonda o que se deve ter em conta ao efectuar a interpretag o dos resultados Aslinhas de controlo HLA B Update Plus nao sao espec ficas apenas para o HLA B mas tamb m abrangem alguns dos alelos HLA A e alguns dos alelos HLA C Desempenho do teste Desempenho do testo utilizando ADN obtido
45. variabilit inter lotto stata valutata analizzando un pannello di controllo 5 campioni con reattivit e interpretazione note con due diversi lotti di prodotto Per ogni campione stato ottenuto lo stesso risultato di tipizzazione indipendentemente dal lotto utilizzato La variabilit inter laboratorio stata valutata utilizzando lo stesso pannello di controllo in quattro centri Ogni centro ha ottenuto gli stessi risultati di tipizzazione per i cinque campioni Esecuzione del test usando DNA ottenuto con la Soluzione Primer HLA Bw4 L esecuzione del test della soluzione primer multiplex HLA Bw4 di INNO LiPA HLA B Multiplex Plus stata valutata in sede e presso due laboratori di tipizzazione dei tessuti belgi Sono stati analizzati un totale di 82 campioni anonimi 50 campioni esternamente 32 sede Tutti i campioni sono stati preventivamente tipizzati con INNO LiPA HLA B Update I campioni includevano 31 campioni ambigui 18 diverse ambiguit e 51 campioni non ambigui Tutti i campioni ambigui sono stati ulteriormente tipizzati su un unico risultato con uno o pi test di tipizzazione alternativi su base DNA Tutte le ibridazioni sono state eseguite usando lo strumento Auto LiPA utilizzando il programma HLA56v3 e l interpretazione stata fatta con una versione di test clinico di LIRAS per il software d interpretazione LiPA HLA v3 00 Sensibilit del test La sensibilit del test di valutazione a livello del gruppo di
46. 098 CAA come conservanti da diluire 1 100 prima dell uso in Diluente del Coniugato Preparare 2 ml di soluzione di lavoro di Coniugato per ciascuna vaschetta di test 2 ml in eccesso la soluzione di lavoro di Coniugato pu essere preparata durante il lavaggio stringente per test manuale Per Auto LiPA preparare 10 ml in eccesso La soluzione di lavoro di Coniugato stabile per 24 ore a temperatura ambiente da 20 25 C se conservata al buio Tampone Tris contenente NaCl MgCl2 e 0 01 MIT 0 1 CAA come conservante Componente Quantit Rif Descrizione Striscia 1 1x20 58188 Striscia 2 1x20 58189 Controllo LiPA 1 x 0 05 ml 58190 conservante Soluzione di Denaturazione 1 x 1 ml 56718 Soluzione di Ibridazione 2 x 80 ml 56719 Soluzione di Lavaggio 2 x 200 ml 56720 Stringente prima dell uso Diluente del Coniugato 1 x 150 ml 55671 Coniugato 100x 1x 1 5 ml 56716 Tampone del Substrato 1 x 235 ml 55732 Substrato BCIP NBT 100x 1x 1 5 ml 55723 5 bromo 4 cloro 3 indolilfosfato sale di p toluidina BCIP e 4 nitroblu di tetrazolio NBT in dimetilformammide DMF da diluire 1 100 in tampone Substrato prima dell uso Preparare 2 ml di soluzione di lavoro Substrato per ciascuna vaschetta di test 2 ml in eccesso la soluzione di lavoro Substrato pu essere preparata durante l incubazione del Coniugato per il test manuale Per Auto LiPA preparare 10 ml in eccesso La soluzione di lavoro Substrato 47 INNO LiPA HLA B Up
47. 1 case B 38 B 78 or B 39 B 51 1 case B 40 B 49 or B 40 B 50 2 cases B 41 B 53 or B 42 B 53 1 case B 44 B 49 or B 44 B 50 2 cases For all ambiguous results the LIRAS interpretation software advised Bw4 amplification followed by hybridization with the INNO LiPA HLA B Update strip 1 Probe reactivity On one or more occasions during this study some probes gave weak reactions Concordant typing at allele group level was achieved when the LIRAS interpretation software was used Test sensitivity Test sensitivity of the assay at allele group level was calculated as the number of successful typing results over the total number of samples tested Test sensitivity in this evaluation after one repeat amplification testing of four samples was 98 8 81 82 95 Cl 93 4 100 The sample for which amplification failed after retesting at the center was successfully amplified in house and a correct typing result was obtained Precision Repeatability intra assay inter assay and inter person variation were evaluated in house One sample amplified in duplicate using three different cyclers and processing two runs per cycler was tested using the Auto LiPA instrument This protocol was performed in duplicate by two different persons No significant variation was observed and an identical typing result was obtained in all cases without the need for editing Frangais But du test INNO LiPA HLA B Update Plus es
48. 20 INNO LiPA HLA B Update Plus etape 1 Amplification multiplex des exons 2 a 4 des all les HLA B tape 2 Hybridation et lavage stringent avec 67 sondes immobilis es sur deux bandelettes INNO LiPA HLA B Update Plus 56 C tape 3 Revelation etape 4 Interpretation du profil de r activit des sondes etape 5 Si n cessaire le logiciel d interpr tation LIRASTM pr conise une tape d amplification et d hybridation suppl mentaire Lors de l utilisation du kit INNO LiPA HLA B Update Plus il est conseill de commencer par a et de continuer en b en cas d ambiguit s concernant les all les Bw4 Bw6 C est ce qui sera recommand par le logiciel d interpr tation LIRAS a amplification des exons 2 3 et 4 des all les HLA B l aide de la solution Primer HLA B Multiplex avant test avec les bandelettes 1 et 2 d INNO LiPA HLA B Update Plus b amplification sp cifique de groupe de l exon 2 des all les HLA Bw4 l aide de la solution Primer HLA Bw4 avant test avec la bandelette 1 d INNO LiPA HLA B Update Plus La solution Primer HLA Bw4 fournie amplifie l exon 2 des all les HLA Bw4 L exon 2 des autres all les HLA B ne sera pas amplifi sauf pour les all les B 4411 B 4703 et B 5708 Le test INNO LiPA HLA B Update Plus est congu pour fournir la meilleure r solution possible par la technique d hybridation inverse au niveau groupe d all les c est dire les deux premiers chiffres apr s l ast risque dans le no
49. 31010 Il test di primer multiplex HLA B usato in combinazione con le strip INNO LiPA HLA B Update inteso per la tipizzazione di allele HLA DRB a livello del gruppo di allele Lo primer HLA Bw4 usato in combinazione con la strip 1 di INNO LiPA HLA B Update stato creato per risolvere le ambiguit pi frequenti cio le ambiguit che coinvolgono gli allele Bw4 Bw6 Tutte le ambiguit a livello del gruppo di allele osservate dopo aver i test con lo primer multiplex HLA B sono state ridotte a un risultato di tipizzazione non ambiguo utilizzando la soluzione primer HLA Bw4 B 08 B 38 o B 08 B 39 2 casi B 08 B 51 o B 08 B 78 4 casi B 13 B 49 o B 13 B 50 2 casi B 15 B 38 o B 15 B 39 1 caso B 15 B 51 o B 15 B 52 o B 15 B 78 1 caso B 15 B 51 o B 15 B 52 o B 15 B 78 0 B 35 B 52 1 caso B 35 B 38 o B 39 B 53 4 casi B 35 B 40 o B 40 B 53 1 caso B 35 B 47 o B 47 B 53 1 case B 35 B 49 o B 50 B 53 2 casi B 35 B 52 o B 53 B 78 2 casi B 38 B 44 o B 39 B 44 1 caso B 38 B 50 o B 39 B 49 1 caso B 38 B 78 o B 39 B 51 1 caso B 40 B 49 o B 40 B 50 2 casi B 41 B 53 o B 42 B 53 1 caso B 44 B 49 o B 44 B 50 2 casi Per tutti i risultati ambigui il software d interpretazione LIRAS ha consigliato un amplificazione Bw4 seguita da ibridazione con la strip 1 INNO LiPA HLA B Update Reattivit delle sonde In pi di un occasione nel corso di questo studio alcune sonde han
50. 39xB 53 2 cas B 08xB 38 ou B 08xB 39 2 cas B 15xB 51 ou B 15xB 52 ou B 15xB 78 2 cas B 35xB 51 ou B 53xB 78 2 cas B 35xB 38 ou B 35xB 53 1 cas B 35xB 49 ou B 50xB 53 1 cas B 35xB 47 ou B 53xB 47 1 cas B 40xB 78 ou B 40xB 52 1 cas B 35xB 55 ou B 35xB 56 1 cas B 15xB 49 ou B 15xB 50 1 cas B 49xB 78 ou B 50xB 51 1 cas B 15xB 51 ou B 52xB 78 1 cas Pour 6 de ces cas il existait une ambiguit avec les 2 m thodes de r f rence et INNO LiPA HLA B Update 2 ambiguit s de la m thode de r f rence 6 chantillons ont t r duites a un r sultat clairement tabli par INNO LiPA HLA B Update R activit des sondes 4 sondes ont r agi de mani re faussement positive et 9 ont r agi de mani re faible ou faussement negative en une ou plusieurs occasions durant l tude Cette information si absente a t ajout e dans le logiciel et ou les guides pour faciliter de futures typages La totalit des r actions faussement positives a t identifi e comme telles et un typage concordant au niveau du groupe d all les a pu tre obtenu en utilisant le logiciel d interpr tation LRAG Consulter les guides pour des informations sp cifiques sur la r activit des sondes Une liste compl te des sp cificit s des sondes et des amorces est disponible Toutes les sondes sont concues pour hybrider sp cifiquement leur s quence compl mentaire un m sappareillement pr s moins que cela ne soit pr cis
51. 8 CAA a diluer au 1 100 en Diluant Conjugu avant utilisation Pr parer 2 ml de Solution de travail de Conjugu par compartiment la Solution de travail de Conjugu peut tre pr par e pendant le lavage stringent 2 ml suppl mentaires pour test en manuel Pour l Auto LiPA pr parer 10 ml suppl mentaires La Solution de travail de Conjugu est stable 24 heures temp rature ambiante 20 25 C et l obscurit Tampon Tris contenant NaCl MgCl2 et 0 0196 MIT 0 1 CAA comme conservateur 5 Bromo 4 chloro 3 indolyl phosphate sel de p toluidine BCIP et 4 nitrobleu tetrazolium NBT en dim thylformamide DMF a diluer au 1 100 en Tampon Substrat avant utilisation Pr parer 2 ml de Solution de travail de Substrat par compartiment la Solution de travail de Substrat peut tre pr par e pendant l tape d incubation du Conjugu 2 ml suppl mentaires pour test en manuel Pour l Auto LiPA pr parer 10 ml suppl mentaires La Solution de travail de Substrat est stable 24 heures temp rature ambiante 20 25 C et l obscurit INNOGENETICS 22 Solution de Ringage 5x 2x 80 ml 56721 Tampon phosphate contenant NaCl Triton et 0 05 MIT 0 48 CAA comme conservateur diluer au 1 5 1 part 4 parts en eau distill e ou d sionis e avant utilisation Pr parer 8 ml de Solution de travail de Ringage par compartiment 10 ml suppl mentaires Pour Auto LiPA pr parer 20 ml suppl mentair
52. A B per 342 su 347 campioni E stato necessario ripetere il test per 4 campioni di un centro Un campione risultato essere non tipizzabile ma in accordo con gli operatori ci stato probabilmente dovuto ad una contaminazione del DNA Per 4 campioni di un centro non sono stati forniti i risultati di tipizzazione dall operatore sebbene opzioni per uno di loro fossero disponibili attraverso modifica L accuratezza a livello di gruppo allelico stata calcolata come percentuale della concordanza osservata con test alternativi di DNA Biotest ELPHA HLA AB LowRes Typing kit Dynal SSP LIPA HLA B sequenziamento Micro SSP OLERUP SSP Biotest HLA B SSP risultati INNO LiPA HLA B Update sono considerati concordanti con il test di riferimento se i due risultati erano identici se i risultati di INNO LiPA HLA B Update erano pi specifici del risultato di riferimento o se i risultati INNO LiPA HLA B Update mostravano una minore risoluzione ma un risultato corretto in confronto ai metodi di riferimento L accuratezza stata del 100 342 342 Risoluzione tabella di tipizzazione versione v1 0 2001 03 31 INNO LiPA HLA B Update stato progettato per individuare gli alleli HLA B a livello di gruppo allelico cio a livello sierologico sia esteso che di split Gruppo allelico equivale alla designazione delle prime due cifre che seguono l asterisco nella nomenclatura standard HLA es HLA B 07 Inoltre il kit disegnato per det
53. Assicurarsi che vengano aggiunti esattamente 10 pl di campione amplificato Una quantit eccessiva o troppo piccola di campione pu portare a risultati errati di tipizzazione Controllo LiPA per INNO LiPA HLA B Update Plus usare 10 pl l amplificazione non richiesta Controllo bianco amplificato controllo negativo usare 10 pl Denaturazione e ibridazione 1 Scaldare un bagnomaria con agitazione a 56 C 0 5 C Controllare la temperatura usando un termometro calibrato e se necessario regolare la temperatura Non superare la temperatura indicata Pre riscaldare la Soluzione di Ibridazione e la Soluzione di Lavaggio Stringente in un bagnomaria ad almeno 37 C e non superare i 56 C Miscelare prima dell uso Tutti i cristalli devono essere disciolti Usando delle pinzette rimuovere il numero richiesto di Striscia 1 e 2 INNO LiPA HLA B Update Plus dal tubo una striscia 1 e una striscia 2 per campione di test per l INNO LiPA HLA B Multiplex Plus una striscia 1 per la sequenza amplificata INNO LiPA HLA Bw4 Includere entrambe le strisce per il Controllo LiPA per INNO LiPA HLA B Update Plus e per il controllo bianco amplificato Apporre a matita un numero d identificazione sulla striscia sopra la linea di identificazione marrone cromata Prendere il numero richiesto di vaschette due vaschette per ogni campione di test per HLA B Multiplex Plus e una vaschetta per campione di test per HLA Bw4 e posizionarle nel portavaschetta T
54. B 13 B 49 o B 13 B 50 2 casos B 15 B 38 o B 15 B 39 1 caso B 15 B 51 o B 15 B 52 o B 15 B 78 1 caso B 15 B 51 o B 15 B 52 o B 15 B 78 o B 35 B 52 1 caso B 35 B 38 o B 39 B 53 4 casos B 35 B 40 o B 40 B 53 1 caso B 35 B 47 o B 47 B 53 1 caso B 35 B 49 o B 50 B 53 2 casos B 35 B 52 o B 53 B 78 2 casos B 38 B 44 o B 39 B 44 1 caso B 38 B 50 o B 39 B 49 1 caso B 38 B 78 o B 39 B 51 1 caso B 40 B 49 o B 40 B 50 2 casos B 41 B 53 o B 42 B 53 1 caso B 44 B 49 o B 44 B 50 2 casos Para resolver todos los resultados ambiguos el software de interpretaci n LIRAS sugiri utilizar la amplificaci n Bw4 seguida de una hibridaci n con la tira 1 de INNO LiPA HLA B Update Reactividades de las sondas En una o varias ocasiones durante este estudio algunas de las sondas tuvieron reacciones d biles La concordancia de identificaci n del tipo en el nivel de grupo de alelos se obtuvo cuando se utiliz el software de interpretaci n LRAG 69 INNO LiPA HLA B Update Plus Precisi n Se evalu internamente la variaci n tras comparar un mismo ensayo repetitividad varios ensayos y ensayos realizados por varias personas Una de las muestras que se hab a amplificado por duplicado se prob con el instrumento Auto LiPA utilizando tres termocicladores distintos y procesando dos pruebas en cada termociclador Dos personas distintas realizaron este mismo protocolo por duplicado
55. Fall B 49xB 78 oder B 50xB 51 1 Fall B 15xB 51 oder B 52xB 78 1 Fall In sechs dieser F lle zeigten sowohl der Referenzassay als auch der INNO LiPA HLA B Update ein zweideutiges Ergebnis Zwei mit dem Referenzverfahren beobachtete Ambiguit ten 6 Proben wurden mit Hilfe des INNO LiPA HLA B Update Assays auf ein einziges eindeutiges Typisierungsergebnis reduziert Sondenreaktivit t In einem oder mehreren F llen w hrend dieser klinischen Studie reagierten vier Sonden falsch positiv und neun Sonden schwach bis falsch negativ Diese Information falls sie nicht bereits vorlag wurde in die Software und oder den Leitfaden integriert Alle falschen Reaktivit ten wurden als solche erkannt und bei einem Einsatz der LIRAS Interpretationssoftware wurde eine bereinstimmende Typisierung auf Allelgruppenebene erzielt Eingehende Informationen zur Sondenreaktivit t finden Sie im Leitfaden Es ist eine vollst ndige Auflistung der Sonden und Primerspezifit ten erh ltlich Wenn in der Liste nicht abweichend angegeben sind alle Sonden darauf ausgerichtet speziell mit ihrer komplement ren Sequenz auf der Ebene eines Mismatches zu hybridisieren Empfindlichkeit Die bei einer internen Evaluation einer Verd nnungsserie dreier DNA Proben von 0 01 ug ul bis 2 ug ul erzielten Ergebnisse legten die Verwendung von DNA in einer Mindestkonzentration von 0 1 ug ul nahe Die externe Evaluation der Leistungsf higkeit umfasste 347 DNA P
56. Fl ssigabfall vor Zugabe von Natriumhypochlorit neutralisieren Bei der Arbeit mit potentiell gef hrlichen oder infekti sen Materialien geeignete Schutzhandschuhe und Schutzbrille Gesichtsschutz tragen Abf lle m ssen entsprechend den Abfallbeseitigungsvorschriften der jeweiligen Einrichtung entsorgt werden Dar ber hinaus m ssen alle staatlichen und rtlichen Umweltbestimmungen eingehalten werden INNOGENETICS 36 Herstellung der Proben Da der LiPA Test biotinyliertes amplifiziertes DNA Material als Probe verwendet steht ein Amplifikations Kit zur Verf gung der INNO LiPA HLA B Multiplex Plus Handhabung Handhabung der Teststreifen Die Teststreifen k nnen nur einmal verwendet werden Die Teststreifen nicht mit blo en H nden ber hren immer Pinzetten verwenden Bitte einen Bleistift f r die Identifizierung der Teststreifen verwenden Keine Kugelschreiber etc verwenden Schreiben Sie die ID oberhalb der Markierungslinie auf die Streifen W hrend der verschiedenen Inkubationsschritte m ssen die Teststreifen immer in derselben Wanne verbleiben Unbenutzte und entwickelte Teststreifen d rfen nicht direktem Sonnenlicht oder Hitze ausgesetzt werden Lassen Sie die entwickelten Streifen vor der Auswertung Abdeckung und Lagerung vollst ndig trocknen Entwickelte Teststreifen sollten vorzugsweise im Dunklen bei 20 25 C gelagert werden Wannen nicht mehrmals benutzen Hinweise zur manuellen Inkubati
57. Ihre lokale Vertretung f r die neuste Version Grenzen der Methode Der Einsatz dieses Produktes sollte nur von Personal durchgef hrt werden das mit den Techniken der Hybridisierung vertraut ist Nur gute Laborpraxis und eine vorsichtige Durchf hrung der beschriebenen Verfahren gestattet eine spezifische Hybridisierung und eine korrekte Typisierung der Ziel DNA Die INNO LiPA HLA B Update Plus Teststreifen wurde f r eine Aufl sung auf Allelgruppenebene B 07 bis B 83 entwickelt Eine Kombination bestimmter Allele k nnte jedoch zu einer nicht einzigartigen Sondenkombination und damit zu einer mehrdeutigen Antwort f r zwei oder mehrere m gliche Allelkombinationen f hren Neue Allele k nnten Polymorphismen au erhalb der Sondenbereiche haben dies sollte bei der Auswertung der Ergebnisse ber cksichtigt werden Die HLA B Update Plus Kontrolllinien sind nicht f r HLA B spezifisch sondern auch f r einige HLA A und einige HLA C Allele Daher k nnen die HLA B Kontrolllinien auch mit HLA A und HLA C Amplifikaten reagieren Leistungsf higkeit des Tests Testleistung unter Verwendung von DNA die mit Hilfe der HLA B Multiplex Primerl sung amplifiziert wurde Die Leistungsf higkeit des INNO LiPA HLA B Update wurde in 4 europ ischen Gewebetypisierungslabors an Standard Typisierungsproben evaluiert Insgesamt wurden 347 Proben analysiert Aus frischem oder eingefrorenem EDTAantikoagulierten oder citrat antikoagulierten B
58. Innogenetics 2004 INNO LiPA HLA B Update Plus Manufactured by INNOGENETICS N V Technologiepark 6 9052 Ghent Belgium 0459 32 9 329 13 29 Distributed by INNOGENETICS GmbH INNOGENETICS s a r l Lembecker Stra e 19 8 Rue du Mar chal de Lattre de Tassigny 46359 Heiden Westfalen 59800 Lille Germany France 49 2867 99 07 0 D 33 1 49 93 26 18 INNOGENETICS S r l INNOGENETICS Diagnostica y Terapeutica Via del Mare 36 IDT S A 00040 Pomezia Roma Calle Botanica 146 Italy 08908 Hospitalet de Llobregat Barcelona D 39 06 911 80 375 Spain 34 93 600 8000 INNOGENETICS N V Technologiepark 6 9052 Ghent Belgium 32 9 329 13 29 t INNOGENETICS 25840 v4 BIOTECHNOLOGY FOR HEALTHCARE 2004 10 04 INNOGENETICS 2 TABLE OF CONTENTS Symbols Used 15 25 rer peer ai SR ALe ia 5 English Intended use e he ate ssa EE E eb cesta A ola e ut ruga 7 Test Principles osi crepat ed sS uir La qe O A A 7 Reagents isc 42 eb Ue keel nog Hv DG et te HOC Em Arte EUR a 8 Description preparation for use and recommended storage conditions 8 Materials required but not provided 10 Safety and environment 10 SPECIMENS LE ita A AE IS me AE hae DE AREAS SINE 11 Manipulations procedures 11 Strip handling ot racc mcer a a mE E pU a 11 Directions for manual incubation
59. Kit muss getrennt von allen Quellen kontaminierender DNA insbesondere von Amplifikationsprodukten gelagert werden 33 INNO LiPA HLA B Update Plus Alle Reagenzien sollten ca 60 Minuten vor dem Gebrauch auf Raumtemperatur 20 25 C gebracht werden und m ssen unmittelbar nach dem Gebrauch wieder in den K hlschrank gelegt werden Ver nderungen im Aussehen der im Kit enthaltenen Komponenten k nnen auf eine Instabilit t oder Verschlechterung der Qualit t der Substanzen hinweisen Um ein Einrollen der Teststreifen vor dem Gebrauch zu verhindern wird empfohlen das R hrchen horizontal zu lagern Gelieferte Reagenzien Komponente Streifen 1 Streifen 2 LiPA Kontrolle Denaturierungsl sung Hybridisierungsl sung Stringent Waschl sung Konjugatverd nner 100x konzentriertes Konjugat Substratpuffer Enth lt 20 Streifen f r INNO LiPA HLA B Update Plus markiert mit einer braunen Enth lt 20 Streifen f r INNO LiPA HLA B Update Plus markiert mit einer gelben Enth lt Ethylendiamintetraessigs ure EDTA und 0 01 Methylisothiazolon MIT 0 1 Chloroacetamid CAA als Alkalische L sung mit EDTA Das Fl schchen muss direkt nach dem Gebrauch wieder verschlossen werden l ngerer Kontakt mit Luft verschlechtert innerhalb kurzer Zeit die Natriumphosphat EDTA SSPE Puffer mit 0 5 Natriumdodezylsulfat SDS Die Hybridisierungsl sung muss auf mindestens 37 C erw rmt werden darf aber 56
60. RAS Interpretation Software a the amplification of exons 2 3 and 4 of the B alleles with the B Multiplex hi lification of 2 3 and 4 of the HLA B allel ith the HLA B Multipl primer solution prior to analysis with the INNO LiPA HLA B Update Plus strips 1 and 2 b group specific amplification of exon 2 of the HLA Bw4 alleles with primer solution HLA BwA prior to analysis with the INNO LiPA HLA B Update Plus strip 1 The HLA Bw4 primer solution provided amplifies exon 2 of the HLA Bw4 alleles Exon 2 of other HLA B alleles will not be amplified except for the alleles B 4411 B 4703 and B 5708 The INNO LiPA HLA B Update Plus is designed to give the best possible resolution using the reverse hybridization assay format at the allele group level this means the first two digits after the asterisk in an allele name when following standard HLA nomenclature e g HLA B 07 In addition to the allele group interpretation the software will give all possible allele combinations This information however should be considered as extra and not as decisive Reagents Description preparation for use and recommended storage conditions kent at 2 8 C opened and unopened and stored in the original vials the reagents are stable until the expiry date of the kit Do not freeze reagents Do not use the reagents beyond the expiry date The kit should be stored isolated from any source of contaminating DNA especially amplified products All
61. Substrat p Toluidinsalz BCIP und 4 Nitroblau Tetrazolium NBT in Dimethylformamid DMF Vor Gebrauch 1 100 mit Substratpuffer verd nnen Bereiten Sie 2 ml Substratgebrauchsl sung f r jede Testwanne vor 2 ml berschuss Substratgebrauchsl sung kann w hrend der Konjugatinkubation vorbereitet werden f r das manuelle Testen F r den Auto LiPA stellen Sie bitte 10 ml berschuss her Die Substratgebrauchsl sung bleibt bei Raumtemperatur 20 25 C f r 24 Stunden stabil wenn sie im Dunkeln gelagert wird 5x konzentrierte Sp ll sung 2 x 80 ml 56721 Phosphatpuffer mit NaCl Triton und 0 05 MIT 0 48 CAA als Konservierungsmittel vor Gebrauch mit destilliertem oder deionisiertem Wasser 1 5 1 Teil 4 Teile verd nnen 8 ml Sp ll sung f r jede Testwanne vorbereiten 10 ml berschuss F r den Auto LiPA stellen Sie bitte 20 ml berschuss her Die Sp larbeitsl sung bleibt bei einer Temperatur von 2 8 C f r 2 Wochen stabil Halter f r Inkubations 5 Enth lt jeweils 8 Wannen wannen Ableseschablone 1 F r die Identifizierung positiver Sonden Datenblatt 2 F r die Aufbewahrung entwickelter Teststreifen Zus tzliche ben tigte Materialien die nicht im Lieferumfang enthalten sind Wasserbad mit Sch ttelvorrichtung 80 U min mit geneigtem Deckel Temperatur einstellbar auf 56 C 0 5 C Absaugvorrichtung Kalibriertes Thermometer Orbitalschwenker Horizontal oder Wippsch ttler Empfeh
62. a o locais diferentes pipetas e outro material de laborat rio diferentes batas e luvas de laborat rio diferentes armazenagem separada s o precau es m nimas para uma boa pr tica de laborat rio Evite transferir qualquer elemento do local de p s amplifica o para o local de pr amplifica o A utiliza o de material de laborat rio autoclavado descart vel recomendada N o reutilize material de laborat rio descart vel Utilize uma ponta de pipeta nova por cada amostra aliquotada N o utilize os reagentes para al m da data de validade N amp o misturar reagentes de kits diferentes a n o ser que os componentes tenham n meros de lote id nticos Evite a contamina o microbiana dos reagentes Procedimento para teste manual Nora Durante as diferentes etapas de incuba o as tiras de teste devem permanecer na mesma cavidade Antes da incuba o me a a temperatura do banho de gua com um term metro calibrado e se necess rio ajuste a temperatura antes de colocar o suporte no banho de gua Feche sempre a tampa O controlo LiPA deve ser inclu do em cada s rie de teste Amostras 1 Produto HLA B amplificado utilize 10 ul Para a prepara o da amostra veja as instru es de utiliza o para INNO LiPA HLA B Multiplex Plus 75 INNO LiPA HLA B Update Plus 2 3 NOTA Assegure se de que adicionou exactamente 10 ul de amostra amplificada Uma quantidade su
63. allele stata calcolata come il numero di risultati di tipizzazione positivi rispetto al numero totale di campioni testati La sensibilit del test in questa valutazione dopo un test di amplificazione ripetuto di quattro campioni stata del 98 8 81 82 95 CI 93 4 100 Il campione la cui amplificazione era fallita dopo il nuovo test presso il centro stato amplificato con successo in sede e si ottenuto un risultato di tipizzazione corretto Precisione diagnostica I calcoli di precisione diagnostica sono stati eseguiti esclusivamente su campioni amplificati con successo e per cui era disponibile un unico risultato di riferimento Di conseguenza sono stati esclusi due campioni da questo calcolo Un unico risultato di tipizzazione HLA B stato ottenuto per i restanti 80 campioni La precisione diagnostica della valutazione rispetto al livello di gruppo di allele stata calcolata come numero di risultati di tipizzazione ottenuti correttamente in confronto al risultato di tipizzazione unico ottenuto con INNO LiPA HLA B Update INNOGENETICS 56 Innogenetics o con un test di tipizzazione alternativo Olerup SSP GenoVision Allset HLA B Low Resolution Dynal e sequenziamento metodo in sede risultati di tipizzazione di tutti gli 80 campioni sono risultati concordi al test di riferimento producendo una precisione diagnostica del 100 80 80 95 CI 95 5 100 Risoluzione tabella di tipizzazione v 1 4 0
64. as linhas permitem orientar correctamente as tiras Alinha seguinte controla a adic o do conjugado reactivo e da soluc o de substrato de trabalho durante o processo de detecc o Esta linha deve ser alinhada com a linha de controlo de conjugado no cart o de leitura de pl stico Esta linha deve ser sempre positiva caso contr rio n o se deve prosseguir a interpreta o e ter aproximadamente a mesma intensidade em todas as tiras utilizadas durante o mesmo teste Alinha seguinte a linha interna de controlo da hibridizac o do HLA B Update Plus controlo HLA B no cart o de leitura que indica se foi ou n o adicionado uma quantidade adequada de material amplificado HLA B hibridizag o Esta linha deve ser sempre positiva excep o para o controlo negativo da amplificac o HLA B multiplex mas a sua intensidade pode divergir entre amostras O resultado do ensaio de cada controlo negativo n o deve apresentar nenhum sinal vis vel em nenhuma das linhas da tira excepto para a amplifica o HLA Bw4 onde a linha interna de controlo da hibridiza o controlo HLA B tamb m ser positiva Aamostra de controlo LiPA para o INNO LiPA HLA B Update Plus deve apresentar os seguintes padr es de sondas positivas tira 1 controlo conjugado controlo HLA B 22 e 35 tira 2 controlo conjugado controlo HLA B 53 56 e 57 Qualquer outra sonda deve apresentar um resultado negativo Esta amostra de controlo composta por oligonucle
65. ated hybrid previously formed Incubation with a substrate solution containing a chromogen results in a purple brown precipitate The reaction is stopped by a wash step and the reactivity pattern of the probes is recorded With the INNO LiPA HLA B Update Plus an amplification kit INNO LiPA HLA B Multiplex Plus is available for standardized preparation of biotinylated amplified material The amplification kit is based on the polymerase chain reaction PCR SUBS BCIP NBT 100x SUBS BUF RINSE SOLN 5x Amplification products are subsequently hybridized using 2 typing strips on which 66 sequence specific probe lines and 2 control lines are fixed Figure 1 Use of this product is covered by a license from F Hoffmann La Roche Ltd and Roche Molecular Systems Inc INNOGENETICS 8 INNO LiPA HLA B Update Plus steps involved step 1 Multiplex amplification of exons 2 to 4 of the HLA B alleles step 2 Hybridization and stringent wash with 67 probes immobilized on two INNO LiPA HLA B Update Plus strips 56 C step 3 Color development step 4 Interpretation of the probe reactivity pattern step 5 If required the LiRAS interpretation software advises for a further amplification and hybridization step Using the INNO LiPA HLA B Update Plus kit it is advised to start with a and proceed to b if ambiguities involving Bw4 Bw6 alleles occur This will be advised by the Li
66. ato s dico SDS al 0 5 La soluci n de hibridaci n debe precalentarse a una temperatura de al menos 37 C y no debe superar los 56 C todos los cristales deben disolverse antes de usarse Soluci n de lavado 2 x 200 ml 56720 Tamp n SSPE con SDS al 0 1 astringente La soluci n de lavado astringente debe precalentarse a una temperatura de al menos 37 C y no debe superar los 56 C todos los cristales deben disolverse antes de usarse Diluyente de conjugado 1x 150 ml 55671 Tamp n fosfato con NaCl Triton estabilizadores de prote nas y MIT al 0 01 CAA al 0 1 como conservante Conjugado 100x 1x1 5 ml 56716 Estreptavidina etiquetada con fosfatasa alcalina en tamp n Tris con estabilizadores de prote nas y MIT al 0 01 CAA al 0 098 como conservante que debe diluirse en una proporci n 1 100 en diluyente de conjugado antes de usarse Prepare 2 ml de soluci n de Conjugado de trabajo para cada cubeta de ensayo 2 ml en exceso la soluci n de Conjugado de trabajo debe prepararse durante el lavado astringente para ensayo manual Para Auto LiPA prepare 10 ml en exceso La soluci n de Conjugado de trabajo se mantiene estable durante 24 horas a temperatura ambiente 20 25 C si se almacena en un lugar oscuro Tamp n sustrato 1 x 235 ml 55732 Tampon Tris con NaCl MgClo y MIT al 0 01 CAA al 0 1 como conservante 59 INNO LiPA HLA B Update Plus Sustrato BCIP NBT 100x 1x 1 5 ml 55723 Sal p toluidina
67. blick auf Bw4 Bw6 Allele auftreten Dies wird von der LIRAS Interpretation Software empfohlen a die Amplifikation von Exon 2 3 und 4 der HLA B Allele mit der HLA B Multiplex Primerl sung vor der Analyse mit den INNO LiPA HLA B Update Plus Streifen 1 und 2 b gruppenspezifische Amplifikation von Exon 2 der HLA Bw4 Allele mit der HLA Bw4 Primerl sung vor der Analyse mit dem INNO LiPA HLA B Update Plus Streifen1 Die mitgelieferte Primerl sung HLA Bw4 amplifiziert Exon 2 der HLA Bw4 Allele Exon 2 der anderen HLA B Allele wird nicht amplifiziert au er Exon 2 der Allele B 4411 B 4703 und B 5708 Der INNO LiPA HLA B Update Plus wurde f r eine bestm gliche Aufl sung auf Allelgruppenebene d h die ersten zwei Stellen nach dem Sternchen einer Allelbezeichnung gem Standard HLA Nomenklatura z B HLA B 07 entworfen unter Verwendung des reversen Hybridisierungstestformats Zus tzlich zur Allelgruppeninterpretation nennt die Software alle m glichen Allelkombinationen Diese Informationen sollten jedoch als Zusatzinformation und nicht als ausschlaggebend ber cksichtigt werden Reagenzien Beschreibung Vorbereitung und empfohlene Lagerung und Haltbarkeit Werden die Reagenzien ge ffnet oder unge ffnet bei 2 8 C und in den Originalfl schchen gehalten bzw gelagert bleiben sie bis zum Verfallsdatum des Kits stabil Reagenzien nicht einfrieren Verwenden Sie den Kit nicht nach berschreitung des Verfalldatums Der
68. bo horizontalmente para minimizar a possibilidade das tiras se encaracolarem antes do uso Reagentes fornecidos Componente Quantidade Ref Descrig o Tiras 1 x20 58188 Cont m 20 tiras para INNO LiPA HLA B Update Plus assinaladas com uma linha castanha de marcag o Tiras 2 x 20 58189 Cont m 20 tiras para INNO LiPA HLA B Update Plus assinaladas com uma linha cromo de marcag o Controlo LiPA x 0 05 ml 58190 Cont m cido etilenodiaminotetrac tico EDTA e 0 01 de metilisotiazolona MIT 0 1 de cloroacetamida CAA como conservante Solu o de desnaturag o x1ml 56718 Solu o alcalina contendo EDTA Deve se fechar o frasco imediatamente ap s uso a exposic o prolongada da solu o ao ar resulta na r pida deteriora o da for a de desnatura o Solu o de hibridizagao 2 x 80 ml 56719 Tamp o salino de fosfato de s dio EDTA SSPE contendo 0 5 sulfato de s dio dodecil SDS A solugao de hibridizag o deve ser pr aquecida at atingir pelo menos os 37 C n o podendo a temperatura exceder os 56 C todos os cristais devem ser dissolvidos antes da sua utiliza o Solu o para lavagem 2 x 200 ml 56720 Tamp o SSPE contendo 0 1 SDS rigorosa A solug o de lavagem rigorosa deve ser pr aquecida at atingir pelo menos os 37 C n o podendo a temperatura exceder os 56 C todos os cristais devem ser dissolvidos antes da sua utiliza o 71 INNO LiPA HLA B Update Plus Diluente de conju
69. caci n No se encontraron fallos en la amplificaci n aunque dos muestras tuvieron que ser tipadas dos veces en un centro Precisi n Datos internos Tres muestras fueron ensayadas por cuadruplicado por dos personas distintas utilizando el m todo manual o por una persona en dos Auto LiPA distintos Dos muestras fueron analizadas en tres lotes distintos en dos ensayos diferentes La interpretaci n de los resultados fue la misma para todas las muestras La reactividad de las sondas fue comparable en todos los casos Validaci n externa La variaci n inter lote fue evaluada analizando un panel de proficiencia cinco muestras con reactividad e interpretaci n conocidas con dos lotes distintos del producto Para cada muestra se obtuvo el mismo resultado independientemente del lote utilizado La variaci n inter laboratorio fue evaluada analizando el mismo panel de proficiencia en cuatro centros distintos Cada uno de ellos obtuvo los mismos resultados para las cinco muestras Eficacia del ensayo utilizando ADN obtenido con la soluci n de primers HLA Bw4 La eficacia de la soluci n de cebador HLA Bw4 de INNO LiPA HLA B Multiplex Plus se evalu internamente y en dos laboratorios belgas de identificaci n de tipos de tejido Se analizaron un total de 82 muestras an nimas 50 muestras externamente y 32 internamente Previamente se hab a identificado el tipo de todas las muestras con INNO LiPA HLA B Update 31 de las muestras produ
70. cen ambig edades relacionadas con los alelos Bw4 Bw6 As lo recomendar el software de interpretaci n LIRAS a la amplificaci n de los exones 2 3 y 4 de los alelos HLA B con la soluci n del cebador HLA B Multiplex antes de analizar con las tiras 1 y 2 de INNO LiPA HLA B Update Plus b la amplificaci n especifica del grupo del ex n 2 de los alelos HLA Bw4 con la soluci n del cebador HLA Bw4 antes de analizar con la tira de INNO LiPA HLA B Update Plus La soluci n del cebador HLA Bw4 suministrada amplifica el ex n 2 de los alelos HLA Bw4 No se amplificar el ex n 2 de otros alelos HLA B a excepci n de los alelos B 4411 B 4703 y B 5708 INNO LiPA HLA B Update Plus se ha disefiado para proporcionar la mejor resoluci n posible con el formato de ensayo de hibridaci n reversa a nivel de grupo de alelos se indica mediante los dos primeros d gitos despu s del asterisco en el nombre del alelo seg n la nomenclatura est ndar de HLA por ejemplo HLA B 07 Adem s de la interpretaci n del grupo de alelos el software proporcionar todas las combinaciones posibles de alelos No obstante no debe considerarse esta informaci n como decisiva sino como datos adicionales Reactivos Descripci n preparaci n para el uso y condiciones de almacenamiento recomendadas Silos reactivos se almacenan en los viales originales a una temperatura entre 2 8 C abiertos o sin abrir se mantendr n estables hasta la fecha de ca
71. chantillon dont l amplification a chou apr s r p tition du test dans le centre a t correctement amplifi en interne et un r sultat de typage correct a t obtenu Pr cision du diagnostic Le calcul de la pr cision du diagnostic n a t effectu que sur les chantillons qui ont t correctement amplifi s et qui pr sentaient un r sultat de r f rence unique Deux chantillons ont donc t exclus de ce calcul Un r sultat de typage HLA B unique a t obtenu pour les 80 chantillons restants La pr cision du diagnostic du test au niveau du groupe d all les a t d finie comme le nombre de r sultats de typage obtenus correctement compar au r sultat de typage unique obtenu l aide de INNO LiPA HLA B Update Innogenetics ou d un 31 INNO LiPA HLA B Update Plus autre test de typage Olerup SSP GenoVision SBT Abbott Biotest HLA B SSP Biotest Allset HLA B Low Resolution Dynal et d un s quengage en interne Les r sultats du typage des 80 chantillons correspondant au test de r f rence la pr cision du diagnostic tait donc de 100 80 80 95 CI 95 5 100 R solution tableau de typage v 1 4 031010 La Solution Amorce HLA B Multiplex utilis e en combinaison avec les bandelettes INNO LiPA HLA B Update est destin e au typage des all les HLA B au niveau du groupe d all les La Solution Amorce HLA Bw4 utilis e en combinaison avec la bandelette 1 INNO LiPA HLA B Update e
72. components and biological materials should be considered as being potentially infectious and should be handled as such Only adequately trained personnel should be permitted to perform the test procedure All blood components and biological materials should be disposed of in accordance with established safety procedures Autoclave for at least 15 minutes at 121 C ncinerate disposable material Mixliquid waste with sodium hypochlorite so that the final concentration is 196 sodium hypochlorite Allow to stand overnight before disposal CAUTION Neutralize liquid waste that contains acid before adding sodium hypochlorite Use of personal protective equipment is necessary gloves and safety spectacles when manipulating dangerous or infectious agents Waste should be handled according to the institution s waste disposal guidelines All federal state and local environmental regulations should also be observed Specimens Since the LiPA test utilizes biotinylated amplified DNA material as specimen an amplification kit INNO LiPA HLA B Multiplex Plus is available as an accompanying tool Manipulations procedures Strip handling The strips are designed to be used only once Do not touch the strips with bare hands use clean forceps Use a pencil for identification of the test strips Do not use ballpoints etc Write the ID above the marker line on the strips Throughout the different incubation steps test strips should always remain
73. curato della temperatura con un termometro calibrato Chiudere sempre il coperchio del bagnomaria durante le incubazioni allo scopo di evitare segnali falsi positivi Non usare agitatori ad aria calda per l ibridazione e il lavaggio stringente Per l ibridazione e il lavaggio stringente le vaschette devono essere posizionate sul piatto di agitazione del bagnomaria Regolare il livello dell acqua tra 1 3 e 1 2 dell altezza della vaschetta Assicurarsi che le vaschette non galleggino sull acqua L acqua deve essere a contatto diretto con le vaschette passaggi di incubazione per lo sviluppo del colore devono essere compresi tra 20 25 C Se la temperatura inferiore a 20 C si potrebbero ottenere risultati pi deboli Se la temperatura superiore a 25 C si possono ottenere segnali con sfondo alto e o segnali positivi falsi ncubare sempre esattamente per la durata citata nel protocollo L ampiezza del movimento generato sia dal bagnomaria procedura di ibridazione che dall agitatore procedura di sviluppo del colore critica nel raggiungere la sensibilit massima e una colorazione omogenea La superficie della striscia deve essere completamente sommersa L ampiezza deve essere la pi alta possibile In ogni caso si devono evitare perdite del liquido oltre i bordi delle vaschette Ci pu portare a contaminazione incrociata e risultati non validi L agitazione delle strisce durante l incubazione deve essere eseg
74. date Plus stabile per 24 ore a temperatura ambiente da 20 25 C se conservata al buio Soluzione di Risciacquo 5x 2x 80 ml 56721 Tampone Fosfato contenente NaCl Triton e 0 05 MIT 0 48 CAA come conservante da diluire 1 5 1 parte 4 parti in acqua distillata o deionizzata prima dell uso Preparare 8 ml di soluzione di lavoro di Risciacquo per ciascuna vaschetta di test 10 ml in eccesso Per Auto LiPA preparare 20 ml in eccesso La soluzione di lavoro di Risciacquo stabile per 2 settimane a temperatura compresa tra 2 8 C Vassoi di incubazione 5 Ciascuna contenente 8 vaschette Scheda di lettura 1 Per l identificazione di sonde positive Foglio rapporto dati 2 Per la conservazione delle strisce sviluppate Materiali richiesti ma non forniti Bagnomaria con piatto agitante 80 rpm con coperchio inclinato temperatura regolabile a 56 C 0 5 C Sistema di aspirazione Termometro calibrato Agitatore orbitale reciproco o basculante Raccomandazioni Per un agitatore orbitale ll diametro del movimento circolare deve essere uguale o superiore a 13 mm la velocit raccomandata per un movimento circolare di 13 mm 160 rpm Per un agitatore reciproco la velocit raccomandata per il movimento avanti e indietro di 80 movimenti al minuto Per un agitatore basculante l angolo di agitazione non deve superare i 13 al fine di evitare versamenti di liquido si raccomanda una velocit
75. de 5 bromo 4 cloro 3 indolil fosfato BCIP y 4 nitroazul de tetrazolio NBT en dimetilformamida DMF que debe diluirse en una proporci n 1 100 en tamp n sustrato antes de usarse Prepare 2 ml de soluci n de sustrato de trabajo para cada cubeta de ensayo 2 ml en exceso la soluci n de sustrato de trabajo puede prepararse durante la incubaci n del conjugado para ensayo manual Para Auto LiPA prepare 10 ml en exceso La soluci n de Conjugado de trabajo se mantiene estable durante 24 horas a temperatura ambiente 20 25 C si se almacena en un lugar oscuro Soluci n de lavado 5x 2 x 80 ml 56721 Tampon fosfato con NaCl Triton y MIT al 0 05 CAA al 0 48 como conservante que debe diluirse en una proporci n 1 5 1 parte 4 partes en agua destilada o desionizada antes de usarse Prepare 8 ml de soluci n de lavado de trabajo para cada cubeta de ensayo 10 ml en exceso Para Auto LiPA prepare 20 ml en exceso La soluci n de lavado de trabajo se mantiene estable durante 2 semanas a una temperatura entre 2 8 C Bandeja de incubaci n 5 Cada una contiene 8 cubetas Tarjeta de lectura 1 Para la identificaci n de sondas positivas Hoja de registro de datos 2 Para almacenar las tiras reveladas Materiales necesarios pero no suministrados Bafio de agua con plataforma de agitaci n 80 rpm con cubierta inclinada temperatura ajustable a 56 C 0 5 C Aparato de aspiraci n Term metro calibrado Agi
76. de accidente o si no se siente bien acuda al m dico de inmediato muestre la etiqueta si es posible Evite la exposici n consulte las instrucciones especiales de uso Uso limitado al personal especializado Contiene dimetilformamida sal p toluidina de 5 bromo 4 cloro 3 indolil fosfato Sustrato BCIP NBT 100x R43 S24 37 Producto irritante Xi Evite el contacto con la piel Puede causar sensibilizaci n si entra en contacto con la piel Utilice guantes apropiados Contiene 2 cloracetamida soluci n de lavado tamp n sustrato diluyente de conjugado y control LiPA R36 38 S23 24 26 Producto irritante Xi Irrita los ojos y piel Evite inhalar el vapor Evite el contacto con la piel En caso de contacto con los ojos limpie inmediatamente la parte afectada con abundante agua y busque atenci n m dica Contiene hidr xido de sodio Soluci n de desnaturalizaci n Las muestras deben manipularse como productos potencialmente infecciosos Por lo tanto toda la sangre y hemoderivados y los materiales biol gicos deber n considerarse como potencialmente infecciosos y manipularse como tales Unicamente el personal debidamente capacitado debe llevar a cabo el procedimiento de ensayo Toda la sangre y hemoderivados y todos los materiales biol gicos deben desecharse de acuerdo con los procedimientos de seguridad establecidos Esterilice en autoclave durante 15 minutos como minimo a 121 C Incinere el material desechable M
77. de travail de Conjugu et de Substrat pendant la proc dure de d tection Cette bande doit tre align e avec la bande contr le Conjugu de la carte de lecture en plastique Cette bande doit toujours tre positive dans le cas contraire la bandelette ne doit pas tre interpr t e et doit tre d intensit plus ou moins similaire sur chaque bandelette d une m me s rie La bande suivante est la bande contr le interne d hybridation HLA B Update Plus HLA B control de la carte de lecture qui indique si la quantit de mat riel HLA B amplifi qui a t ajout e pour l hybridation est ad quate ou non Cette bande doit toujours tre positive sauf pour le contr le n gatif de l amplification multiplex HLA B mais son intensit peut varier d un chantillon l autre Aucun contr le n gatif ne doit pr senter de r activit vis vis d aucune bande de la bandelette l exception de la bande contr le Conjugu et de la bande contr le interne d hybridation pour l amplification HLABw4 Le Contr le LiPA pour INNO LiPA HLA B Update Plus doit pr senter un profil de positivit pour les sondes suivantes bandelette 1 contr le Conjugu Contr le HLA B sondes 22 et 35 bandelette 2 contr le Conjugu Contr le HLA B sondes 53 56 et 57 Toutes les autres sondes doivent tre n gatives Ce Contr le est compos d oligonucl otides biotinyl s compl mentaires des sondes d hybridation mentionn es ci dessus Une hybrida
78. dentificaci n del tipo HLA B La precisi n de diagn stico del ensayo en el nivel de grupo de alelos se calcul como el n mero de resultados correctos de identificaci n del tipo en comparaci n con el resultado nico de identificaci n del tipo obtenido con INNO LiPA HLA B Update Innogenetics o un ensayo alternativo de identificaci n del tipo Olerup SSP GenoVision SBT Abbott Biotest HLA B SSP Biotest Allset HLA B Low Resolution Dynal y m todos de secuenciaci n realizados internamente Los resultados de identificaci n del tipo de todas las muestras 80 concordaron con el ensayo de referencia por lo que la precisi n de diagn stico fue del 100 80 80 95 CI 95 5 100 Resoluci n tabla de tipos v 1 4 031010 La soluci n de cebador HLA B Multiplex utilizada en combinaci n con las tiras de INNO LiPA HLA B Update se ha disefiado para identificar el tipo de los alelos HLA B en el nivel de grupo de alelos La soluci n de cebador HLA Bw4 utilizada en combinaci n con la tira 1 de INNO LiPA HLA B Update se ha dise ado para resolver las ambig edades m s frecuentes las referentes a los alelos Bw4 BW6 Todas las ambig edades observadas en el nivel de grupo de alelos tras realizar pruebas con la soluci n de cebador HLA B Multiplex se redujeron a un resultado no ambiguo de identificaci n del tipo con la soluci n de cebador HLA Bw4 B 08 B 38 o B 08 B 39 2 casos B 08 B 51 o B 08 B 78 4 casos
79. des gants et des lunettes de protection 5 Stopper la r v lation en lavant les bandelettes deux fois dans 2 ml d eau distill e Sous agitation pendant au moins 3 minutes 6 Al aide de pinces en plastique retirer les bandelettes des compartiments et les d poser sur du papier absorbant Laisser s cher compl tement les bandelettes avant de lire les r sultats Conservez les bandelettes d velopp es et s ches l obscurit Proc dure automatis e Auto LiPA La proc dure de test LIPA peut tre tr s facilement automatis e C est ainsi que l Auto LiPA est concu pour prendre int gralement en charge les tapes d hybridation de lavage stringent et de r v lation L Auto LiPA est un syst me ne n cessitant aucune surveillance et pourvu de fonctions de chauffage et refroidissement aspiration et pipetage automatiques oio 27 INNO LiPA HLA B Update Plus Le protocole standard Auto LiPA 48 indique la proc dure de test pour maximum 24 chantillons avec utilisation d un compartiment par bandelette Cependant ce nombre peut tre port 48 en d posant 2 bandelettes du m me locus dans le m me compartiment tandis que les autres param tres de test restent inchang s Il est noter que des r activit s de sondes plus faibles peuvent tre occasionnellement observ es En cons quence il est recommand a l utilisateur souhaitant augmenter le nombre d chantillons test s de proc der la validation dans son laboratoire d
80. deste c lculo Para as 80 amostras restantes obteve se um resultado de tipagem HLA B nico A precis o diagn stica do teste ao nivel do grupo de alelos foi calculada atrav s do n mero de resultados de tipagem correctos em comparac o com o resultado de tipagem nico do INNO LiPA HLA B Update Innogenetics ou com um ensaio de tipagem alternativo Olerup SSP GenoVision SBT Abbott Biotest HLA B SSP Biotest Allset HLA B Low Resolution Dynal e sequenciac o m todo interno Os resultados de tipagem de todas as 80 amostras foram concordantes com o ensaio de refer ncia o que resulta numa precis o diagn stica de 100 80 80 95 CI 95 5 100 Resolug o tabela de tipagem v 1 4 031010 O primer mulitplex HLA B utilizado em combinag o com as tiras INNO LiPA HLA B Update foi desenvolvido para tipagem dos alelos HLA B ao nivel do grupo de alelos A solu o de iniciador HLA Bw4 utilizada em combinac o com a INNO LiPA HLA B Update strip 1 foi desenvolvida para resolver as ambiguidades mais frequentes ou seja ambiguidades envolvendo os alelos Bw4 Bw6 Todas a ambiguidades observadas ao nivel do grupo de alelos ap s o teste com o primer multiplex HLA B Multiplex foram reduzidas para um resultado de tipagem n o ambigua usando a soluc o de iniciador HLA Bw4 B 08 B 38 ou B 08 B 39 2 casos B 08 B 51 op B 08 B 78 4 casos B 13 B 49 ou B 13 B 50 2 casos B 15 B 38 ou B 15 B 39 1 caso B 15 B 51 o
81. disponibles La pr cision de typage au niveau du groupe d all les a t tablie sur la base d un pourcentage de r sultats concordants avec d autres m thodes disponibles Biotest ELPHA HLA AB LowRes Typing kit Dynal SSP LIPA HLA B sequencing Micro SSP OLERUP SSP Biotest HLA B SSP Les r sultats INNO LiPA HLA B Update ont t consid r s comme concordants avec les r sultats de r f rence si les 2 r sultats taient identiques si les r sultats INNO LiPA HLA B Update taient plus sp cifiques que le r sultat de r f rence ou si INNO LiPA HLA B Update d montrait une r solution inf rieure mais un r sultat correct compar a la m thode de r f rence La pr cision a t de 100 342 342 R solution table de typage version v1 0 2001 03 31 INNO LiPA HLA B Update est concu pour une r solution des all les HLA B au niveau groupe d all les c est a dire a la fois au niveau s rologique large et 2 me niveau Le groupe d all les est la d signation des 2 premiers chiffres apr s l ast risque qui suit le nom de l all le selon la nomenclature HLA standard par exemple HLA B 07 De plus le kit est congu pour d tecter les all les nuls suivants 0808N exon 3 1526N exon 3 and 5111N exon 4 La r solution au niveau du groupe d all les observ e au cours de l tude a t de 92 4 316 342 Les ambiguit s observ es tait B 08xB 51 ou B 08xB 78 8 cas B 15xB 35 ou B 15xB 15 2 cas B 35xB 38 ou B
82. do intensa o se ales falsas ncube siempre durante el tiempo exacto especificado en el protocolo La amplitud del movimiento generado por el ba o de agua de agitaci n procedimiento de hibridaci n y el agitador procedimiento de revelado de color es fundamental para lograr la m xima sensibilidad y una coloraci n uniforme La superficie de la tira debe quedar completamente sumergida La amplitud debe ser lo m s elevada posible Pero debe evitar derramar l quido sobre los bordes de las cubetas Esto podr a provocar contaminaciones cruzadas y resultados no v lidos La agitaci n durante la incubaci n de las tiras debe realizarse de forma que tanto el l quido como las tiras de ensayo se muevan de ac para all en la cubeta sin que se derrame l quido sobre el borde de la misma No cubra la bandeja Durante las incubaciones de hibridaci n y lavado astringente puede dejar las cubetas descubiertas en el ba o de agua Si se cubren las cubetas con selladores de microplaca podr a producirse contaminaci n cruzada Instrucciones para el cambio manual del l quido de las cubetas Debe aspirarse el l quido de la cubeta con una pipeta preferiblemente conectada a un aspirador de vac o La bandeja debe sostenerse formando un ngulo para que el l quido pueda fluir a un extremo de la cubeta A ada 2 ml de la soluci n apropiada a cada cubeta y siga el protocolo Una multipipeta de distribuci n Eppendorf es til para est
83. ducidad del kit No los congele No utilice reactivos caducados El kit debe almacenarse aislado de fuentes de ADN contaminante especialmente de productos amplificados Todos los reactivos deben ponerse a temperatura ambiente 20 25 C durante unos 60 minutos antes de usarse y devolverse al refrigerador inmediatamente despu s de su uso INNOGENETICS 58 Cualquier alteraci n en la apariencia f sica de los componentes del kit puede ser signo de inestabilidad o deterioro Para minimizar la posibilidad de que las tiras se retuerzan antes de usarse es recomendable almacenar el tubo horizontalmente Reactivos suministrados Componente Cantidad Ref Descripci n Tiras 1 1x20 58188 Contiene 20 tiras para INNO LiPA HLA B Update Plus marcadas con una banda de marca de color marr n Tiras 2 1x20 58189 Contiene 20 tiras para INNO LiPA HLA B Update Plus marcadas con una banda de marca de color cromo Control LiPA 1x 0 05 ml 58190 Contiene cido etilendiaminotetraac tico EDTA y metilisotiazolona MIT al 0 01 cloracetamida CAA al 0 1 como conservante Soluci n de 1x1ml 56718 Soluci n alcalina con EDTA El vial debe desnaturalizaci n cerrarse inmediatamente despu s de usarse una exposici n prolongada de esta soluci n al aire provocar un r pido deterioro de la intensidad de la desnaturalizaci n Soluci n de hibridaci n 2x 80 ml 56719 Tamp n EDTA SSPE de fosfato s dico salino con dodecil sulf
84. e Plus del tubo una tira 1 y una tira 2 por cada muestra de ensayo para INNO LiPA HLA B Multiplex Plus y una tira 1 para el ampl mero de INNO LiPA HLA Bw4 Incluya ambas tiras para la muestra de control LIPA de INNO LiPA HLA B Update Plus y para la muestra de control blanco amplificada Escriba con l piz un n mero de identificaci n por encima de la banda de marca de color marr n o cromo de la tira 63 INNO LiPA HLA B Update Plus 3 Coloque en la bandeja el n mero requerido de cubetas de ensayo dos cubetas por cada muestra de ensayo para HLA B Multiplex Plus y una cubeta por cada muestra de ensayo para HLA Bw4 4 Pipetee 10 pl de soluci n de desnaturalizaci n en la esquina superior de cada cubeta NOTA Cierre el vial inmediatamente despu s de usarlo 5 A ada una muestra de 10 ul vea Muestras consulte las instrucciones de uso de INNO LiPA HLA B Multiplex Plus y m zclela cuidadosamente pipeteando arriba y abajo Utilice siempre puntas de pipeta esterilizadas Permita que continue la desnaturalizaci n durante 5 minutos a una temperatura de 20 25 C 6 Agite la soluci n de hibridaci n precalentada y afiada cuidadosamente 2 ml al producto amplificado desnaturalizado en cada cubeta M zclelos agitando suavemente Evite contaminar las cubetas vecinas al pipetear 7 Coloque inmediatamente la tira en la cubeta Las tiras deben quedar completamente sumergidas en la soluci n NOTA Use guantes desechables y pinzas
85. e d un thermom tre calibr et ajuster si n cessaire Ne pas d passer la temp rature indiqu e Pr chauffer les Solutions d Hybridation et de Lavage Stringent dans un bain marie une temp rature de 37 C minimum ne pas d passer 56 C M langer avant utilisation Tous les cristaux doivent tre dissous 2 Al aide de pinces retirer du tube le nombre n cessaire de bandelettes 1 et de bandelettes 2 INNO LiPA HLA B Update Plus une bandelette 1 et une bandelette 2 par chantillon pour INNO LiPA HLA B Multiplex Plus une bandelette 1 pour l amplicon INNO LiPA HLA Bw4 Inclure les deux bandelettes pour le contr le LiPA pour INNO LiPA HLA B Update Plus et pour le contr le blanc amplifi A l aide d un crayon inscrire un num ro d identification au dessus de la ligne rep re marron jaune de la bandelette 3 Placer le nombre requis de compartiments deux compartiments par chantillon pour HLA B Multiplex Plus et un compartiment par chantillon pour HLA Bw4 dans le support 4 Al aide d une pipette d poser 10 ul de Solution de D naturation dans le coin sup rieur de chaque compartiment REMARQUE Refermer le flacon imm diatement apr s usage 5 Ajouter 10 pl d chantillon voir Echantillons voir le mode d emploi du test INNO LiPA HLA B Multiplex Plus et homog n iser soigneusement par flux et reflux Toujours utiliser des embouts de pipette st riles Laisser d naturer pendant 5 minutes 20 25 C 6 Agiter la Solu
86. e di lavaggio Stringente Soluci n de lavado astringente Soluc o para lavagem rigorosa Conjugate 100x Conjugue 100x 100x konzentriertes Konjugat Coniugato 100x Conjugado 100x 7 INNO LiPA HLA B Update Plus Conjugate Diluent Diluant Conjugu Konjugatverd nner Diluente del Coniugato Diluyente de conjugado Diluente de conjugado Substrate BCIP NBT 100x Substrat BCIP NBT 100x 100x konzentriertes BCIP NBT Substrat Substrato BCIP NBT 100x Sustrato BCIP NBT 100x Substrato BCIP NBT 100x Substrate Buffer Tampon Substrat Substratpuffer Tampone Substrato Tamp n sustrato Tamp o de substrato Rinse Solution 5x Solution de Ringage 5x 5x konzentrierte Sp ll sung Soluzione di Risciacquo 5x Soluci n de lavado 5x Soluc o de lavagem 5x English Intended use The INNO LiPA HLA B Update Plus is a line probe assay for in vitro use designed for the molecular typing of the human leukocyte antigen HLA B alleles at the allele group level Test Principle The INNO LiPA HLA typing tests are based on the reverse hybridization principle Amplified biotinylated DNA material is chemically denatured and the separated strands are hybridized with specific oligonucleotide probes immobilized as parallel lines on membrane based strips This is followed by a stringent wash step to remove any mismatched amplified material After the stringent wash streptavidin conjugated with alkaline phosphatase is added and bound to any biotinyl
87. e fin Repita este paso tantas veces como se indique en el procedimiento de ensayo NOTA No deje que las tiras se sequen entre los dos pasos INNOGENETICS 62 Evite dafiar la superficie de las tiras al aspirar Aspire el liquido en la parte superior de la tira por encima de la banda de marca Aseg rese de que se aspira todo el l quido Aseg rese de lavar toda la tira meticulosamente sumergi ndola por completo en la soluci n Sies necesario ajuste la velocidad del agitador Observaciones y precauciones Para uso profesional exclusivamente Para evitar la contaminaci n de ADN se recomienda una separaci n f sica m xima entre los pasos previos y posteriores a la amplificaci n las precauciones m nimas para una buena pr ctica de laboratorio son usar habitaciones pipetas y dem s material de laboratorio independientes distintos guantes y batas y distintos lugares de almacenamiento tambi n Evite el retorno de la habitaci n de operaciones posteriores a la amplificaci n a la habitaci n de operaciones previas a la amplificaci n Se recomienda el uso de material de laboratorio desechable esterilizado en autoclave Noreutilice el material de laboratorio desechable Utilice una nueva punta de pipeta esterilizada para cada muestra dividida en alicuotas No utilice reactivos caducados No mezcle reactivos de kits distintos a menos que los componentes tengan numeros de lote id nticos
88. ehmen und sie auf absorbierendes Papier legen Die Teststreifen vollst ndig trocknen lassen bevor Sie die Resultate ablesen Die entwickelten und trockenen Teststreifen im Dunkeln lagern Automatisches Testverfahren Auto LiPA Das LiPA Testverfahren eignet sich hervorragend f r eine Automatisierung Daher wurde der Auto LiPA entwickelt der in der Lage ist die Schritte Hybridisierung Waschvorgang mit Stringent Waschl sung und Farbentwicklung vollst ndig automatisiert durchzuf hren Der Auto LiPA kann ohne berwachung arbeiten Heizen K hlen Pipettieren werden automatisch durchgef hrt Das Standard Auto LiPA Protokoll beschreibt die Testung von bis zu 24 Proben wenn jeweils ein Streifen pro Inkubationswanne verwendet wird Diese Anzahl kann allerdings auf maximal 48 Proben erh ht werden Dazu werden zwei Teststreifen f r denselben HLA Locus jeweils in einer Inkubationswanne inkubiert wobei alle anderen Parameter des Protokolls gleich bleiben Beachten Sie da m glicherweise schw chere Sondenreaktivit t beobachtet werden kann Daher sollten alle Kunden die beabsichtigen die Anzahl der Proben pro Auto LiPA Lauf zu erh hen dieses 2 Streifen in einer Inkubationswanne Protokoll in dem jeweiligen Labor validieren Weitere Informationen und spezifische Protokolle f r den Auto LiPA k nnen Sie bei Ihrer lokalen Vertretung erfragen Ergebnisse Ablesen Abbildung 1 zeigt die Position der verschiedenen Oligonukleotidsonden
89. ei L ufen pro Cycler wurde mit dem Auto LiPA Instrument getestet Dieses Protokoll wurde durch zwei verschiedene Personen in zweifacher Ausf hrung durchgef hrt Es wurde keine signifikante Abweichung festgestellt und in allen F llen wurde ein identisches Typisierungsergebnis ohne Bedarf einer Bearbeitung erzielt Italiano Uso previsto INNO LiPA HLA B Update Plus un test su striscia a sonde allineate per uso in vitro creato per la tipizzazione molecolare degli alleli degli antigeni leucocitari umani HLA B a livello di gruppo allelico Principio del test test INNO LiPA HLA si basano sul principio dell ibridazione inversa Il DNA biotinilato amplificato viene denaturato chimicamente e i filamenti separati vengono ibridati con sonde oligonucleotidiche specifiche immobilizzate come linee parallele sulla membrana della striscia di reazione Segue poi un passaggio di lavaggio stringente al fine di rimuovere eventuale materiale legatosi in maniera non specifica Dopo il lavaggio stringente viene aggiunta streptavidina coniugata con fosfatasi alcalina che si lega all eventuale ibrido biotinilato formatosi in precedenza L incubazione con una soluzione di substrato contenente un cromogeno porta alla formazione di un precipitato 45 INNO LiPA HLA B Update Plus porpora marrone La reazione viene arrestata da un passaggio di lavaggio e viene registrato lo schema di reattivit delle sonde Con il kit INNO LiPA HLA B Update P
90. elle specificit delle sonde Identificare tutti i numeri delle sonde che sono positive sulla striscia INNO LiPA HLA B Update Plus e dedurre il tipo HLA B usando la tabella di tipizzazione INNO LiPA HLA B Update Plus o una versione del software d interpretazione LiPA vedi software d interpretazione LRAG Il software spesso d pi risultati di quanto suggerito dall uso previsto viene data l interpretazione a livello di gruppo allelico oltre alle possibili combinazioni di alleli Queste informazioni devono per essere considerate come un extra non come decisive Software d interpretazione LiRAS Il software LIRAS per INNO LiPA HLA stato creato per aiutare nell interpretazione dei risultati LiPA Si prega di contattare il proprio distributore locale per ottenere la versione aggiornata pi recente Limiti della procedura L utilizzo di questo prodotto deve limitarsi a personale esperto nelle tecniche di ibridazione Soltanto una buona pratica di laboratorio e un attenta esecuzione delle procedure specificate permetter un ibridazione specifica e una corretta tipizzazione del DNA target Le strisce INNO LiPA HLA B Update Plus sono state create per dare risoluzione a livello di gruppo allelico da B 07 a B 83 In ogni caso una combinazione di determinati alleli potrebbe condurre a combinazioni di sonde non uniche e perci a una risposta ambigua di due o pi combinazioni alleliche Un nuovo allele pu avere po
91. ello di gruppo allelico Consultare le linee guida per specifiche informazioni sulla reattivit delle sonde E disponibile una lista completa delle specificit delle sonde e dei primer Tutte le sonde sono disegnate per ibridare specificamente con la loro sequenza complementare a livello di un mismatch a meno che indicato diversamente nella lista 55 INNO LiPA HLA B Update Plus Sensibilit del test risultati ottenuti durante una valutazione interna di una diluizione seriale di 3 campioni di DNA con concentrazione variabile tra 0 01 ug ul e 2 ug ul raccomandano l uso di DNA con una concentrazione minima di 0 1 ug ul La valutazione della performance esterna ha incluso 347 campioni di DNA con una concentrazione compresa tra 20 ng ul e 1500 ng ul e con una purezza A260nm A280nm 1 5 Il DNA stato diluito ad una concentrazione compresa tra 20 ng ul e 250 ng ul prima dell amplificazione Non si sono avuti fallimenti di amplificazione sebbene sia stato necessario ripetere il test per due campioni di un centro Precisione Dati interni Tre campioni sono stati testati in quadruplicato da due diverse persone utilizzando il metodo manuale o da una persona su due diversi strumenti Auto LiPA Sono stati analizzati due campioni su tre diversi lotti in due diverse sedute L interpretazione dei risultati era identica in tutti i casi La reattivit delle sonde era comparabile in tutte le combinazioni Validazione esterna La
92. erminare i seguenti alleli nulli 0808N esone 3 1526N esone 3 e 5111N esone 4 La risoluzione a livello di gruppo allelico osservata durante questo studio del 92 4 316 342 Le ambiguit osservate sono state B 08xB 51 o B 08xB 78 8 casi B 15xB 35 o B 15xB 15 2 casi B 35xB 38 o B 39xB 53 2 casi B 08xB 38 o B 08xB 39 2 casi B 15xB 51 o B 15xB 52 o B 15xB 78 2 casi B 35xB 51 o B 53xB 78 2 casi B 35xB 38 o B 35xB 53 1 caso B 35xB 49 o B 50xB 53 1 caso B 35xB 47 o B 53xB 47 1 caso B 40xB 78 o B 40xB 52 1 caso B 35xB 55 o B 35xB 56 1 caso B 15xB 49 o B 15xB 50 1 caso B 49xB 78 o B 50xB 51 1 caso B 15xB 51 o B 52xB 78 1 caso Per sei di questi casi sia il test di riferimento che INNO LiPA HLA B Update hanno dato risultati ambigui Due ambiguit 6 campioni osservate con il metodo di riferimento sono state ridotte ad un singolo risultato di tipizzazione utilizzando il test INNO LiPA HLA B Update Reattivit delle sonde Quattro sonde hanno dato reattivit false positive e nove sonde hanno dato reazioni da deboli a false negative in una o pi occasioni durante la sperimentazione clinica Questa informazione se non gi presente stata implementata nel software e o nelle linee guida per facilitare le future tipizzazioni Le false reattivit sono state identificate tutte come tali e quando stato utilizzato il software interpretativo LIRAS stata raggiunta una concorde tipizzazione a liv
93. es La Solution de travail de Ringage est stable 2 semaines 2 8 C Plaque d incubation 5 Contenant 8 compartiments chacune Carte de lecture 1 Pour l identification des sondes positives Feuille de r sultats 2 Pour la conservation des bandelettes d velopp es Mat riel n cessaire non fourni Bain marie avec plate forme agitante 80 tr min avec couvercle inclin temp rature r glable 56 C 0 5 C Syst me d aspiration Thermom tre calibre Agitateur plan orbital lin aire ou oscillant Recommandations Pour un agitateur orbital le diam tre du mouvement circulaire doit tre gal ou sup rieur 13 mm la vitesse recommand e pour un mouvement circulaire de 13 mm est de 160 tr min Pour un agitateur lin aire la vitesse recommand e pour le mouvement de va et vient est de 80 mouvements par minute Pour un agitateur oscillant l angle d agitation ne doit pas d passer 13 pour viter tout d bordement la vitesse recommand e est de 50 tr min Vortex ou quivalent Eprouvette gradu e 10 25 50 et 100 ml A Eau distill e ou d sionis e A Gants jetables C nes pour pipettes st riles jetables de pr f rence filtre coton Pince pour la manipulation des bandelettes Pipettes ajustables 1 20 ul 20 200 ul et 200 1000 ul Multipipette type Eppendorf en option Minuteur 2 heures 1 minute Consignes de s curit Ser f rer
94. es will allow specific hybridization and correct typing of target DNA The INNO LiPA HLA B Update Plus strips have been designed to give resolution at allele group level B 07 to B 83 However a combination of certain alleles could lead to a non unique probe combination and thus to an ambiguous answer of two or more possible allelic combinations New alleles might have polymorphisms outside probe regions this should be taken into consideration when interpreting the results The HLA B Update Plus control lines are not only specific for HLA B but also for some HLA A and some HLA C alleles Therefore the HLA B control lines might also react with HLA A and HLA C amplified products Test performance Test performance using DNA amplified with the HLA B Multiplex Primer Solution The performance of INNO LiPA HLA B Update was evaluated in 4 European tissue typing laboratories on routine typing samples A total of 347 samples were analyzed DNA was extracted from fresh or frozen EDTA anticoagulated or citrate anticoagulated blood DNA extraction methods included salting out QIAamp 96 DNA blood kit Qiagen Genomic DNA Purification kit Promega and Puregene Gentra Systems Fresh or frozen DNA was amplified using the Perkin Elmer 9600 or 9700 thermal cycler Amplicons were stored at 2 8 C or 15 25 C before they were applied on the strips No amplification failures were encountered although repeat testing was needed for 2 samples fr
95. ezcle los residuos l quidos con hipoclorito s dico lej a hasta obtener una concentraci n final de un 1 de hipoclorito s dico D jelos reposar durante toda la noche antes de eliminarlos PRECAUCION neutralice los residuos liquidos que contengan cido antes de afiadir el hipoclorito s dico Es imprescindible el uso de equipo protector personal como guantes y gafas de seguridad para manipular agentes peligrosos o infecciosos Deseche los residuos de acuerdo con las normas de gesti n de residuos de su instituci n Asimismo debe cumplir con todas las normas medioambientales nacionales auton micas y locales Muestras Como el ensayo LiPA utiliza como muestra ADN amplificado biotinilado est disponible un kit de amplificaci n INNO LiPA HLA B Multiplex Plus como herramienta asociada 61 INNO LiPA HLA B Update Plus Procedimientos de manipulaci n Manipulaci n de tiras Las tiras est n dise adas para usarse una sola vez No toque las tiras con las manos desnudas utilice pinzas limpias Utilice un l piz para identificar las tiras de ensayo No utilice un bol grafo u otro utensilio Escriba el identificador por encima de la banda de marcador de las tiras Enlos distintos pasos de incubaci n las tiras de ensayo deben permanecer siempre en la misma cubeta Mantenga las tiras reveladas y las que no se utilicen alejadas de fuentes de luz y calor intensos Espere a que las tiras reveladas se sequen com
96. f each trough NOTE Close the vial immediately after use 5 Add 10 pl sample see Samples see Instructions for use of INNO LiPA HLA B Multiplex Plus and carefully mix by pipetting up and down Always use sterile pipette tips Allow denaturation to proceed for 5 minutes at 20 25 C 6 Shake the pre warmed Hybridization Solution and gently add 2 ml to the denatured amplified product into each trough Mix by gentle shaking Take care not to contaminate neighboring troughs during pipetting 7 Immediately place the strip into the trough The strips should be completely submerged in the solution NOTE Wear disposable gloves and use forceps 8 Place the tray into the 56 C 0 5 C shaking water bath 80 rpm see Directions for manual incubation close the lid and incubate for 30 minutes NOTE Avoid splashing water from the water bath into the trough Adjust the water level between 1 3 and 1 2 of the height of the trough To prevent the tray from sliding immobilize the tray between two heavy weights Stringent wash 1 After hybridization remove the tray from the water bath 2 Hold the tray at a low angle and aspirate the liquid from the trough with a pipette preferably attached to a vacuum aspirator Add 2 ml pre warmed Stringent Wash Solution into each trough place the tray into the 56 C 0 5 C shaking water bath close the lid and incubate for 3 minutes 3 After incubation remove the tray from the water bath and
97. ferably cotton plugged Forceps for strip handling Adjustable pipettes to deliver 1 20 ul 20 200 ul and 200 1000 pl Dispensing Multipipette Eppendorf optional Timer 2 hours 1 minute Safety and environment Please refer to the manufacturer s safety data sheet and product labeling for information on potentially hazardous components R20 21 R36 R45 R61 S36 37 S45 53 Toxic T Harmful by inhalation and in contact with skin Irritating to eyes May cause cancer May cause harm to the unborn child Wear suitable protective clothing and gloves In case of accident or if you feel unwell seek medical advice immediately show the label where possible Avoid exposure obtain special instructions for use Restricted to professional users Contains Dimethylformamide 5 Bromo 4 chloro 3 indolyl phosphate p Toluidine salt Substrate BCIP NBT 100x R43 S24 37 Irritant Xi Avoid contact with skin May cause sensitization by skin contact Wear suitable gloves Contains 2 Chloroacetamide Rinse Solution Substrate Buffer Conjugate Diluent and LiPA Control R36 38 S23 24 26 Irritant Xi Irritating to eyes and skin Do not breathe vapour Avoid contact with skin In case of contact with eyes rinse immediately with plenty of water and seek medical advice Contains sodium hydroxide Denaturation Solution INNO LiPA HLA B Update Plus Specimens should be handled as potentially infectious Therefore all blood
98. g vorgenommen werden und sollte bei demselben Testlauf auf jedem Streifen nahezu dieselbe Intensit t aufweisen Die nachfolgende Linie ist die HLA B Update Plus interne Hybridisierungskontrolllinie HLA B Kontrolle auf der Ableseschablone die anzeigt ob eine ausreichende Menge an HLA B amplifiziertem Material f r die Hybridisierung zugef gt wurde Diese Linie muss immer positiv sein au er bei der Negativkontrolle der HLA B Multiplex Amplifikation ihre Intensit t kann jedoch von Probe zu Probe variieren Das Testergebnis jeder Negativkontrolle sollte keine sichtbare Bande f r eine der Linien auf dem Streifen aufweisen au er f r die HLA Bw4 Amplifkation bei der die interne Hybridisierungskontrolllinie HLA B Kontrolle ebenfalls positiv ist Die LiPA Kontrollprobe f r INNO LiPA HLA B Update Plus muss das folgende Muster an positiven Sonden aufweisen Teststreifen 1 Konjugatkontrolle HLA B Kontrolle 22 und 35 Teststreifen 2 Konjugatkontrolle HLA B Kontrolle 53 56 und 57 Jede andere Sonde muss negativ sein Diese Kontrollprobe besteht aus biotinylierten Oligonukleotiden die komplement r sind zu den bereits erw hnten Hybridisierungssonden sind Eine positive Hybridisierung bei diesen Sonden zeigt deshalb eine zufriedenstellende Durchf hrung des Tests an einschlie lich Hybridisierung Stringent Waschl sung Schritt Farbentwicklung und Nachweis Ein anderes Muster kann Testprobleme aufzeigen wie z B falsche Temperatur w
99. gado 1x 150 ml 55671 Conjugado 100x 1x 1 5 ml 56716 Tamp o de substrato 1x 235 ml 55732 Substrato BCIP NBT 100x 1x 1 5 ml 55723 Solu o de lavagem 5x 2 x 80 ml 56721 Suporte de teste 5 Cart o de leitura 1 Folha de relat rio de dados 2 Material necessario n o fornecido Tamp o fosfato contendo NaCl Triton estabilizadores proteicos e 0 01 MIT 0 1 CAA como conservante Streptavidina marcada com fosfatase alcalina em tamp o tris contendo estabilizadores proteicos e 0 01 MIT 0 098 CAA como conservante para ser diluida a 1 100 em diluente conjugado antes de usar Prepare 2 ml de soluc o conjugada de trabalho para cada cavidade teste 2 ml em excesso a solug o conjugada de trabalho pode ser preparada durante a lavagem rigorosa para o teste manual Para Auto LiPA prepare mais 10 ml A solug o conjugado de trabalho permanece est vel durante 24 horas se for armazenada no escuro temperatura ambiente de 20 25 C Tamp o Tris contendo NaCl MgCl e 0 0196 MIT 0 196 CAA como conservante Sal de 5 bromo 4 cloro 3 indolil fosfato p toluidina BCIP e 4 nitro azul de tetraz lio NBT em dimetilformamida DMF para ser diluida a 1 100 no tamp o de substrato antes de usar Prepare 2 ml de solug o de substrato de trabalho para cada cavidade teste 2 ml em excesso a solug o de Substrato de trabalho pode ser preparada durante a incubac o do conjugado para o teste manual Para Auto LiPA pre
100. he amplitude of the motion generated by both the shaking water bath hybridization procedure and the shaker color development procedure is critical in achieving maximum sensitivity and homogeneous staining The strip surface should be completely submerged INNOGENETICS 12 The amplitude should be as high as possible However spilling of liquid over the edges of the troughs should be avoided This can lead to cross contamination and invalid results Shaking during incubation of the strips should be performed in such a way that both the liquid and the test strips move back and forth in the trough without liquid being spilled over the edge of the troughs Do not cover the tray During hybridization and stringent wash incubations the troughs can be left uncovered in the water bath Covering the troughs with microplate sealers may cause cross contamination Directions for manual changing liquid in the troughs The liquid is aspirated from the trough with a pipette preferably attached to a vacuum aspirator The tray is held at an angle to allow all liquid to flow to one end of the trough Add 2 ml of the appropriate solution to each trough and follow the protocol A dispensing Multipette Eppendorf is useful for this purpose A Repeat this step as many times as indicated in the test procedure NOTE Do not allow the strips to dry between two steps Make sure not to damage the surface of the strips when aspirating Aspirate
101. i que toutes les combinaisons d all les possibles Cette information toutefois doit tre consid r e comme un plus et non comme d cisive Logiciel d interpr tation LiRAS Le logiciel LIRASTM pour INNO LiPA HLA est destin faciliter l interpr tation des r sultats LiPA Contacter votre distributeur pour obtenir sa derni re version Limites du test L utilisation de ce produit doit tre restreinte au personnel ayant recu une formation aux techniques d hybridation Seules de bonnes pratiques de laboratoire et le strict respect des proc dures sp cifi es permettront une hybridation sp cifique et un typage correct de l ADN cible Les bandelettes INNO LiPA HLA B Update Plus ont t concues pour fournir une r solution au niveau du groupe d all les B 07 B 83 Toutefois la combinaison de certains all les pourrait produire une combinaison de sondes non unique et donc une r ponse ambigu de deux ou plusieurs combinaisons all liques possibles convient de tenir compte lors de l interpr tation des r sultats que de nouveaux all les peuvent avoir des polymorphismes situ s en dehors des r gions des sondes Les contr les HLA B Update Plus sont non seulement sp cifiques des all les HLA B mais aussi de certains all les HLA A et HLA C Par cons quent il se peut que les bandes contr les HLA B r agissent galement avec des produits amplifi s HLA A et HLA C Performances Performance du test bas e
102. iento Este producto s lo debe ser utilizado por personal que haya recibido formaci n en las t cnicas de hibridaci n S lo una buena pr ctica de laboratorio y la realizaci n meticulosa de los procedimientos especificados permitir n la hibridaci n espec fica y correcto tipaje de las muestras analizadas Las tiras de INNO LiPA HLA B Update Plus han sido disefiadas para proporcionar resoluci n a nivel de grupo de alelos B 07 a B 83 No obstante una combinaci n de determinados alelos puede dar como resultado una combinaci n de sondas no Unica y por lo tanto una respuesta ambigua de dos o m s combinaciones posibles de alelos INNOGENETICS 66 Alinterpretar los resultados debe tenerse en cuenta la posibilidad de polimorfismos de los nuevos alelos fuera de las regiones de sonda Las bandas de control de HLA B Update Plus no son espec ficas de HLA B Unicamente sino tambi n de algunos alelos HLA A y HLA C Por tanto las bandas de control HLA B tambi n pueden reaccionar con productos amplificados con HLA A y HLA C Eficacia del ensayo Eficacia del ensayo utilizando ADN obtenido con la soluci n de primers HLA B Multiplex La evaluaci n del equipo INNO LiPA HLA B Update se realiz en cuatro laboratorios europeos de tipaje de tejidos en tipajes de muestras de rutina Se analizaron un total de 347 muestras El DNA se obtuvo de muestras de sangre frescas o congeladas con EDTA o citrato como anticoagulante La extracci
103. in reaction Os produtos amplificados s o em seguida hibridizados usando 2 tiras de tipagem que cont m 66 linhas de sonda espec ficas da sequ ncia e 2 linhas de controlo figura 1 A utilizag o deste produto est protegida por patente da F Hoffmann La Roche Ltd e Roche Molecular Systems Inc INNO LiPA HLA B Update Plus as etapas envolvidas 1 etapa Amplificac o Multiplex do ex o 2 a 4 dos alelos HLA B 2 etapa Hibridizag o e lavagem rigorosa com 67 linhas de sonda imobilizadas em duas tiras INNO LiPA HLA B Update Plus 56 C 3 etapa Revelag o da cor 4 etapa Interpreta o do padr o de reactividade da sonda 5 etapa Se necess rio o software de interpretag o LIRAS sugere uma etapa adicional de amplifica o e de hibridiza o Se ao utilizar o kit INNO LiPA HLA B Update Plus ocorrerem ambiguidades envolvendo alelos Bw4 Bw6 aconselhamos que comece por a e que prossiga com b Isto ser lhe aconselhado pelo software de interpreta o LIRAS a a amplifica o dos ex es 2 3 e 4 dos alelos HLA B com a solu o de iniciadores HLA B Multiplex precedente analise com as tiras 1 e 2 do INNO LiPA HLA B Update Plus b amplificag o especifica de grupo do ex o 2 dos alelos HLA Bw4 com solug o de iniciadores HLA Bw4 anterior analise com a tira 1 do INNO LiPA HLA B INNOGENETICS 70 Update Plus A solug o de iniciadores HLA Bw4 fornecida amplifica o ex o 2 dos alelos HLA Bw4 O e
104. independent of the batch used Inter lab variability was assessed by having the same proficiency panel tested by the four centers Each center obtained the same typing results for the five samples Test performance using DNA Amplified with the HLA Bw4 Primer Solution The performance of the HLA Bw4 Primer Solution of INNO LiPA HLA B Multiplex Plus was evaluated in house and in two Belgian tissue typing laboratories A total of 82 anonymous samples was analyzed 50 samples externally 32 in house All samples had previously been typed with INNO LiPA HLA B Update The samples included 31 ambiguous 18 different ambiguities and 51 unambiguous samples All ambiguous samples were further typed to a unique result with one or more alternative DNA based typing assays All hybridizations were performed using the Auto LiPA instrument using program HLA56v3 and the interpretation was done with a clinical trial version of the LIRAS for LiPA HLA v3 00 interpretation software Accuracy Calculations of diagnostic accuracy were only carried out on samples that were successfully amplified and for which a unique reference result was available As a consequence two samples were excluded from this calculation A unique HLA B typing result was obtained for the remaining 80 samples Diagnostic accuracy of the assay at allele group level was calculated as the number of correctly obtained typing results compared to the unique typing result obtained with
105. ivi e negativi deve essere presa in esame fino a che sia stato raggiunto un alto livello di fiducia nella capacit di eseguire correttamente la procedura del test Si suggerisce di usare un DNA di riferimento per verificare che siano state raggiunte le pi idonee condizioni di esecuzione del test Le linee superiori delle strisce INNO LiPA HLA B Update Plus Figura 1 sono le linee di identificazione linea colorata marrone e cromata Queste linee permettono un corretto orientamento delle strisce La linea successiva controlla l aggiunta della soluzione di lavoro del Coniugato e del Substrato durante la procedura di rilevazione Questa linea deve essere allineata con la linea di controllo del coniugato sulla carta di lettura Questa linea deve essere sempre positiva in caso contrario non deve essere fatta alcuna interpretazione e dovrebbe avere all incirca la medesima intensit su ciascuna striscia nella medesima esecuzione di test La linea successiva la linea di controllo dell ibridazione HLA B Update Plus controllo HLA B sulla carta di lettura che indica se si aggiunto per l ibridazione il quantitativo appropriato di materiale amplificato HLA B Questa linea deve essere sempre positiva eccetto per il controllo negativo dell amplificazione Multiplex HLA B ma la sua intensit pu variare tra i campioni Il risultato di ciascun controllo negativo non deve dare alcun segnale per nessuna delle linee sulla striscia fatta eccezi
106. jeron resultados ambiguos 18 ambig edades distintas y 51 de ellas resultados no ambiguos Se identific nuevamente el tipo de todas las muestras ambiguas hasta obtener un nico resultado con uno o varios ensayos de identificaci n del tipo basados en ADN Todas las hibridaciones se llevaron a cabo con el instrumento Auto LiPA utilizando el programa HLA56v3 y la interpretaci n se realiz con una versi n de prueba cl nica del software de interpretaci n LIRAS para LiPA HLA v3 00 INNOGENETICS 68 Sensibilidad de la prueba La sensibilidad de la prueba del ensayo en el nivel de grupo de alelos se calcul como el numero de resultados correctos de identificaci n del tipo sobre el numero total de muestras probadas La sensibilidad de la prueba en esta evaluaci n tras repetir una prueba de amplificaci n en cuatro de las muestras fue del 98 8 81 82 95 CI 93 4 100 La muestra en la que se obtuvieron resultados incorrectos de amplificaci n tras repetir la prueba en el centro se amplific de forma correcta internamente y se obtuvo un resultado de identificaci n del tipo correcto Precisi n de diagn stico nicamente se llevaron a cabo c lculos de precisi n de diagn stico en las pruebas que se amplificaron correctamente y en las que se produjo un nico resultado de referencia Como consecuencia dos de las muestras quedaron excluidas de este c lculo En las 80 muestras restantes se obtuvo un nico resultado de i
107. lavado astringente Vea Reactivos Revelado de color Todas las incubaciones sucesivas deben realizarse a 20 25 C en un agitador Durante las incubaciones el l quido y las tiras de ensayo deben moverse de ac para all en la cubeta para obtener una coloraci n uniforme oio 1 Lave cada tira durante 1 minuto con 2 ml de la soluci n de Lavado de trabajo vea las Instrucciones para cambiar el l quido de las cubetas 2 A ada 2 ml de la soluci n de Conjugado de trabajo a cada cubeta e incube durante 30 minutos a la vez que agita la bandeja en el agitador NOTA Diluya la soluci n de sustrato BCIP NBT 100x unos 10 minutos antes del final de la incubaci n del conjugado Vea Reactivos INNOGENETICS 64 3 Lave cada tira dos veces durante 1 minuto con 2 ml de la soluci n de Lavado de trabajo y l vela otra vez m s con 2 ml de tamp n sustrato 4 A ada 2 ml de la soluci n de Sustrato de trabajo a cada cubeta e incube durante 30 minutos a la vez que agita la bandeja en el agitador PRECAUCI N Use guantes y gafas protectoras 5 Detenga el revelado de color lavando las tiras dos veces en 2 ml de agua destilada al agitar la bandeja en el agitador durante al menos 3 minutos 6 Utilice las pinzas para retirar las tiras de las cubetas y colocarlas en papel absorbente Antes de leer los resultados espere a que las tiras se sequen completamente Almacene las tiras reveladas y secas en un lugar oscuro Procedimiento de e
108. lente Provetas graduados 10 25 50 e 100 ml Agua destilada ou desionizada Luvas descart veis Pontas de pipetas est reis descart veis de prefer ncia com filtro de algod o Pin as para manipula o das tiras Pipetas ajust veis capazes de dispensar 1 20 ul 20 200 yl e 200 1000 ul Pipetas dispensadoras multi canal Eppendorf opcional Cron metro 2 horas 1 minuto Seguranga e ambiente Consulte as safety data sheet do fabricante e a rotulagem do produto para obter informag o sobre componentes potencialmente perigosos R20 21 R36 R45 R61 S36 37 S45 53 T xico T Perigoso por inalac o e em contacto com a pele Pode provocar irritag o nos olhos Pode provocar o cancro Durante uma gravidez pode causar perigo para o beb Usar roupas e luvas adequadas e de protecc o Em caso de acidente ou se se sentir mal procurar conselho m dico imediatamente mostrar o r tulo sempre que possivel Evitar exposi o obter instruc es especiais de utilizac o Limitado a utilizadores profissionais Contem dimetilformamida sal de 5 bromo 4 cloro 3 indolil fosfato p toluidina Substrato BCIP NBT 100x R43 S24 37 Provoca irritagao Xi Evite o contacto com a pele Pode causar sensibilizag o em contacto com a pele Utilize luvas de protecc o adequadas Cont m 2 cloroacetamida Solu o de lavagem tamp o substrato diluente conjugado e controlo LiPA R36 38 S23 24 26 Provoca ir
109. lettes Les bandelettes doivent rester dans le m me compartiment tout au long des diff rentes tapes d incubation Les bandelettes non utilis es ou d velopp es doivent tre conserv es l cart de toute source de lumi re intense et de chaleur Laisser les bandelettes d velopp es s cher enti rement avant de les interpr ter de les couvrir et de les stocker Les bandelettes d velopp es s ches doivent de pr f rence tre conserv es l obscurit une temp rature de 20 25 C Ne pas r utiliser les compartiments INNOGENETICS 24 Directives pour incubation manuelle L incubation 56 C 0 5 C pour l hybridation et le lavage stringent est l tape la plus critique pour viter les signaux faussement positifs temp rature trop basse ou faussement n gatifs tr s faibles temp rature trop lev e Un bain marie agitant avec couvercle inclin permet un bon contr le des variations de temp rature Un strict contr le de la temp rature l aide d un thermom tre calibr est indispensable Toujours fermer le couvercle du bain marie pendant l incubation afin d viter les signaux faussement positifs Ne pas utiliser d agitateur air chaud pour l hybridation et le lavage stringent Pour l hybridation et le lavage stringent les compartiments doivent tre places sur la plate forme agitante du bain marie R gler le niveau d eau entre le tiers et la moiti de la hauteur du compartiment Veiller
110. lex Plus foi avaliado internamente e em dois laborat rios de tipagem de tecido belgas Foi analisado um total de 82 amostras an nimas 50 amostras externamente 32 amostras internamente Todas as amostras foram previamente tipadas com INNO LiPA HLA B Update As amostras incluiam 31 amostras ambiguas 18 ambiguidades diferentes e 51 amostras n o ambiguas Al m disso todas as amostras ambiguas foram tipadas em um resultado unico com um ou mais ensaios de tipagem alternativos baseados em ADN Todas as hibridiza es foram executadas usando o instrumento de Auto LiPA usando o programa HLA56v3 e a interpretag o foi executada usando uma vers o experimental cl nica do LIRAS para o software de interpreta o LIPA HLA v3 00 Sensibilidade do teste A sensibilidade do teste ao nivel do grupo de alelos foi calculada atrav s do numero de tipagens bem sucedido sobre o n mero total de amostras testadas A sensibilidade nesta avaliac o depois de uma amplificag o de teste repetida de quatro amostras foi de 98 8 81 82 95 CI 93 4 100 A amplificac o da amostra executada num dos centros e que tinha falhado duas vezes foi repetida internamente com xito e foi obtido um resultado de tipagem correcto Precis o diagn stica O c lculo de precis o diagn stica foi apenas executado para as amostras que foram amplificadas com xito e para as quais existia um resultado de refer ncia Consequentemente duas amostras foram exclu das
111. limorfismi all esterno delle regioni delle sonde questo va preso in considerazione nell interpretazione dei risultati Le linee di controllo HLA B Update Plus sono non soltanto specifiche per HLA B ma anche per alcuni alleli HLA A e alcuni alleli HLA C Quindi le linee di controllo HLA B potrebbero reagire anche con prodotti amplificati HLA A e HLA C Performance del Test Esecuzione del test usando DNA ottenuto con la Soluzione Primer HLA B Multiplex La performance di INNO LiPA HLA B Update stata valutata in quattro laboratori europei di tipizzazione tissutale su campioni di routine E stato analizzato un totale di 347 campioni Il DNA stato estratto da sangue fresco o congelato in anticoagulante citrato o EDTA metodi di estrazione del DNA utilizzati includevano salting out QIAamp 96 DNA blood kit Qiagen Genomic DNA Purification kit Promega e Puregene Gentra Systems Il DNA fresco o ongelato stato amplificato usando il thermal cycler Perkin Elmer 9600 o 9700 Gli ampliconi sono stati conservati a 2 8 C o 25 15 C prima di essere messi sulla striscia INNOGENETICS 54 Non sono stati rilevati fallimenti di amplificazione sebbene sia stato necessario ripetere il test su due campioni di un centro campioni sono stati processati utilizzando lo strumento Auto LiPA e interpretati con la versione sperimentale del software di interpretazione LIRAS Accuratezza E stato ottenuto un risultato di tipizzazione HL
112. ls mit dem Ergebnis des Referenzassays Ubereinstimmend betrachtet wenn die zwei Resultate identisch waren die Ergebnisse f r das INNO LiPA HLA B Update spezifischer als das Referenzergebnis waren oder wenn die Ergebnisse f r das INNO LiPA HLA B Update eine geringere Aufl sung aber ein korrektes Ergebnis im Vergleich mit den Referenzverfahren zeigte Die Exaktheit betrug 100 342 342 INNOGENETICS 42 Aufl sung Typisierungstabelle Version v1 0 2001 03 31 Der INNO LiPA HLA B Update wurde als Test zur Aufl sung von HLA B Allelen auf Allelgruppenebene konzipiert d h auf serologisch weiterer und engerer Ebene Allelgruppe ist die Bezeichnung f r die ersten beiden Stellen nach dem Sternchen in der HLA Standardnomenklatur z B HLA B 07 Dar ber hinaus sollen mit dem Kit die folgenden Nullallele nachgewiesen werden 0808N Exon 3 1526N Exon 3 und 5111N Exon 4 Die w hrend der Studie beobachtete Aufl sung auf Allelgruppenebene betrug 92 4 316 342 Die beobachteten Ambiguit ten waren B 08xB 51 oder B 08xB 78 8 F lle B 15xB 35 oder B 15xB 15 2 F lle B 35xB 38 oder B 39xB 53 2 F lle B 08xB 38 oder B 08xB 39 2 F lle B 15xB 51 oder B 15xB 52 oder B 15xB 78 2 F lle B 35xB 51 oder B 53xB 78 2 F lle B 35xB 38 oder B 35xB 53 1 Fall B 35xB 49 oder B 50xB 53 1 Fall B 35xB 47 oder B 53xB 47 1 Fall B 40xB 78 oder B 40xB 52 1 Fall B 35xB 55 oder B 35xB 56 1 Fall B 15xB 49 oder B 15xB 50 1
113. ltados ambiguos Dos ambig edades 6 muestras observadas con el m todo de referencia fueron reducidas a un nico resultado de tipaje utilizando el ensayo INNO LiPA HLA B Update Reactividad de las sondas Cuatro sondas reaccionaron como falsos positivos y nueve d bilmente como falsos negativos en una o m s ocasiones durante el ensayo clinico Esta informaci n si a n no estaba presente se ha aplicado en el software y o en las instrucciones para facilitar el tipaje Cuando se utilizo el software de interpretaci n LIRAS todas las falsas reactividades fueron identificadas como tal y se alcanzo un tipaje concordante a nivel de grupo de alelo Consultar las instrucciones para informaci n especifica sobre la reactividad de las sondas Est disponible una lista completa de especificidad de las sondas y los primers Todas las sondas est n disefiadas para hibridar especificamente con su secuencia complementaria a nivel de un mismatch excepto si est especificado de manera distinta en la lista Sensibilidad de la prueba Una evaluaci n interna de series de diluciones de tres muestras de DNA variando de 0 01 ug ul hasta 2 ug ul recomend el uso de DNA con una concentraci n m nima de 0 1 ug pl La evaluaci n externa del equipo incluy 347 muestras de DNA con una concentraci n entre 20 y 1500 ng ul y una pureza Aoeonm A280nm gt 1 5 El DNA fue diluido hasta una concentraci n de entre 20 ng ul y 250 ng ul antes de la amplifi
114. lungen F r den Orbitalsch ttler schwingungsdurchmesser mindestens 13 mm oder h her empfohlene Geschwindigkeit 160 U min bei einem Schwingungsdurchmesser von 13 mm Empfehlungen f r einen R ttelsch ttler empfohlene Geschwindigkeit f r die R ttelbewegung ist 80 Bewegungen pro Minute Empfehlungen f r den Horizontalsch ttler die Neigungswinkel darf 13 nicht berschreiten um ein Uberlaufen der Fl ssigkeit zu vermeiden empfohlene Sch ttelgeschwindigkeit 50 U min Vortex Mixer oder gleichwertiges Instrument Messzylinder 10 25 50 und 100 ml Destilliertes oder deionisiertes Wasser Einweghandschuhe Sterile Einwegpipettenspitzen vorzugsweise mit Wattestopfen Pinzette zum Entnehmen der Streifen Einstellbare Pipetten f r die Volumina 1 20 ul 20 200 ul und 200 1000 ul Dispensier Multipipette Eppendorf optional Laborwecker 2 Stunden 1 Minute 35 INNO LiPA HLA B Update Plus Sicherheits und Umwelthinweise Bitte beachten Sie die Sicherheitsdatenbl tter des Herstellers und die Produktkennzeichnung bez glich potenziell gef hrlicher Substanzen R20 21 R36 R45 R61 S36 37 S45 53 Giftig T Gesundheitssch dlich beim Einatmen und bei der Ber hrung mit der Haut Reizt die Augen Kann Krebs erzeugen Kann das Kind im Mutterleib sch digen Bei der Arbeit geeignete Schutzhandschuhe und Schutzkleidung tragen Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt hinzuziehe
115. lus disponibile un kit di amplificazione INNO LiPA HLA B Multiplex Plus per la preparazione standardizzata del materiale amplificato biotinilato Il kit di amplificazione si basa sulla reazione a catena della polimerasi polymerase chain reaction PCR prodotti di amplificazione vengono successivamente ibridati usando 2 strisce di tipizzazione su cui sono fissate 66 sonde di DNA sequenza specifiche e 2 bande di controllo Figura 1 L utilizzo di questo prodotto protetto da licenza di F Hoffmann La Roche Ltd e Roche Molecular Systems Inc INNO LiPA HLA B Update Plus passaggi da eseguire Punto 1 Amplificazione multiplex degli esoni da 2 a 4 degli alleli HLA B Punto 2 Ibridazione e lavaggio stringente con 67 sonde immobilizzate su due strisce INNO LiPA HLA B Update Plus 56 C Punto 3 Sviluppo del colore Punto 4 Interpretazione dello schema di reattivit delle sonde Punto 5 Se necessario il software di interpretazione LIRAS consiglia un ulteriore passaggio di amplificazione e ibridazione Usando il kit INNO LiPA HLA B Update Plus si consiglia di iniziare con a e procedere a b se si verificano ambiguit che coinvolgono gli alleli Bw4 Bw6 Ci sar consigliato dal software d interpretazione LIRAS a amplificazione degli esoni 2 3 e 4 degli alleli HLA B con la soluzione primer HLA B Multiplex prima dell analisi con le strisce INNO LiPA HLA B Update Plus 1 e 2 b amplificazione gruppo specifica
116. lut wurde die DNA extrahiert Die Verfahren zur DNA Extraktion umfassten Aussalzen QlAamp 96 DNA Blutkit Qiagen Genomic DNA Purification Kit Promega und Puregene Gentra Systems Die frische bzw gefrorene DNA wurde mittels Perkin Elmer 9600 oder 9700 Thermocycler amplifiziert Vor der Applikation auf die Streifen wurde das amplifizierte Material bei 2 8 C oder 25 15 C gelagert Es wurden keine Amplifikationsfehler festgestellt auch wenn bei zwei Proben aus einem Zentrum der Test wiederholt werden musste Die Proben wurden mit dem Auto LiPA Ger t prozessiert und mit einer klinischen Studienversion der LiRAS Interpretationssoftware interpretiert Exaktheit Ein HLA B Typisierungsergebnis wurde f r 342 der 347 Proben ermittelt Eine Wiederholung des Tests war bei 4 Proben aus einem Zentrum erforderlich Eine Probe ergab das Resultat keine Typisierung ableitbar aber dem Pr fer zufolge war dies wahrscheinlich auf eine DNA Kontamination zur ckzuf hren F r 4 Proben aus einem Zentrum wurde von dem Pr fer kein Typisierungsergebnis vorgelegt obwohl ber ein Editing einer der Proben Optionen verf gbar waren Die Exaktheit auf Allelgruppenniveau wurde als prozentualer Anteil der beobachteten Konkordanz mit alternativen DNA Assays Biotest ELPHA HLA AB LowRes Typisierungskit Dynal SSP LiPA HLA B Sequenzierung Micro SSP OLERUP SSP Biotest HLA B SSP berechnet Die Ergebnisse f r das INNO LiPA HLA B Update wurden a
117. m de l all le selon la nomenclature HLA standard par ex HLA B 07 En plus de l interpr tation des groupes d all les le logiciel fournira toutes les combinaisons d all les possibles Cette information toutefois doit tre consid r e comme un plus et non comme un facteur d cisif R actifs Description pr paration et conditions de conservation Tous les r actifs ouverts ou ferm s sont stables jusqu la date de p remption du kit s ils sont conserv s entre 2 8 C dans leurs flacons d origine Ne pas congeler les r actifs Ne pas utiliser les r actifs apr s la date de validit Le kit doit tre conserv l cart de toute source de DNA contaminant en particulier des produits amplifi s Tous les r actifs doivent tre ramen s la temp rature ambiante 20 25 C 60 minutes environ avant l utilisation et replac s au r frig rateur imm diatement apr s l utilisation Une alt ration de l apparence physique des composants du kit peut indiquer une instabilit ou une d t rioration Pour minimiser le risque de voir les bandelettes s enrouler avant utilisation il est recommand de conserver le tube l horizontale R actifs fournis Composant Quantit R f Description Bandelettes 1 1x20 58188 20 bandelettes INNO LiPA HLA B Update Plus marqu es avec une ligne de rep re marron Bandelettes 2 1x20 58189 20 bandelettes INNO LiPA HLA B Update Plus marqu es avec une ligne de rep re de
118. m eine maximale Sensitivit t und eine homogene Einf rbung zu erhalten Die Teststreifenoberfl che muss vollst ndig untergetaucht sein Die Amplitude muss so hoch wie m glich sein Es sollte jedoch ein berlaufen der Fl ssigkeit ber die R nder der Wannen vermieden werden Dies kann zu einer Kontaminierung und zu ung ltigen Ergebnissen f hren Das Sch tteln w hrend der Inkubation der Teststreifen sollte so durchgef hrt werden dass sowohl die Fl ssigkeit als auch die Teststreifen in der Wanne hin und herbewegt werden jedoch ohne dass die Fl ssigkeit ber die Wannenr nder l uft Die Inkubationswannen nicht abdecken W hrend der Hybridisierung und des Waschvorgangs mit Stringent Waschl sung k nnen die Wannen im Wasserbad ohne Abdeckung verbleiben Das Abdecken der Wannen mit Abklebefolie f r Mikrotiterplatten kann zu einer Kreuzkontamination f hren 37 INNO LiPA HLA B Update Plus Anleitung f r das manuelle Auswechseln der Fl ssigkeit in den Wannen Die Fl ssigkeit wird mittels einer Pipette aus den Wannen entnommen vorzugsweise sollte die Pipette an eine Vakuumpumpe angeschlossen sein Die Wanne wird so geneigt dass die Fl ssigkeit sich an einem Ende der Wanne sammelt Geben Sie in jede Wanne 2 ml der entsprechenden L sung und befolgen Sie das Protokoll Eine Dispensier Multipipette Eppendorf ist f r diesen Zweck hilfreich Diesen Schritt so oft wiederholen wie in der Testanleitung angegeben HINWEIS
119. n wenn m glich dieses Etikett vorzeigen Exposition vermeiden vor Gebrauch besondere Anweisungen einholen Verwendung nur durch ausgebildetes Personal Enth lt Dimethylformamid 5 Bromo 4 Chloro 3 Indolylphosphat p Toluidinsalz 100x konzentriertes BCIP NBT Substrat R43 S24 37 Reizend Xi Hautkontakt vermeiden Kann bei Hautkontakt Sensibilisierung verursachen Geeignete Schutzhandschuhe tragen Enth lt 2 Chloracetamid Sp ll sung Substratpuffer Konjugatverd nner und LiPA Kontrolle R36 38 S23 24 26 Reizend Xi Reizt Augen und Haut Dampf nicht einatmen Hautkontakt vermeiden Bei Ber hrung mit den Augen sofort mit viel Wasser absp len und Arzt konsultieren Enth lt Natriumhydroxid Denaturierungsl sung Alle Proben sollten als potentiell infekti s angesehen und dementsprechend behandelt werden Daher sollten alle Blutbestandteile und biologischen Materialien als potentiell infekti s angesehen und dementsprechend behandelt werden Der Test darf nur von hinreichend ausgebildetem medizinischem Personal durchgef hrt werden Alle Blutbestandteile und das biologische Material m ssen in bereinstimmung mit den entsprechenden Sicherheitsbestimmungen entsorgt werden Mindestens 15 Minuten bei 121 C autoklavieren Einmalmaterial verbrennen Fl ssigen Abfall mit Natriumhypochlorit zu einer Endkonzentration von 1 Natriumchlorit mischen Vor der Entsorgung ber Nacht wirken lassen VORSICHT S urehaltigen
120. n une fois Enfin ajouter 2 ml de Solution de Lavage Stringent pr chauff e dans chaque compartiment et placer le support dans le bain marie agitant 56 C 0 5 C Fermer le couvercle et incuber 4 minutes Avant l incubation v rifier la temp rature du bain marie l aide d un thermom tre calibr et ajuster si n cessaire Toujours fermer le couvercle REMARQUE Diluer les Solution de Ringage 5x et Conjugu concentr s 100x pendant l tape de Lavage Stringent Voir R actifs R v lation Toutes les incubations suivantes sont effectu es 20 25 C sur un agitateur Durant les incubations veiller ce que les bandelettes et la solution effectuent un mouvement de va et vient dans les compartiments pour homog n iser la coloration 1 Laver deux fois chaque bandelette pendant 1 minute l aide de 2 ml de Solution de travail de Ringage voir Directives pour changement des solutions 2 Ajouter 2 ml de la Solution de travail de Conjugu dans chaque compartiment et incuber 30 minutes sous agitation REMARQUE Diluer la Solution de Substrat BCIP NBT 100x 10 minutes environ avant la fin de l incubation Voir R actifs 3 Laver deux fois chaque bandelette pendant 1 minute l aide de 2 ml de Solution de travail de Ringage puis une nouvelle fois avec 2 ml de Tampon Substrat 4 Ajouter 2 ml de la Solution de travail de Substrat dans chaque compartiment et incuber 30 minutes sous agitation ATTENTION Porter
121. na de HLA B Update Plus control de HLA B en la tarjeta de lectura que indica si se a adi una cantidad adecuada de material amplificado de HLA B para la hibridaci n Esta banda debe ser siempre positiva excepto para el control negativo de la amplificaci n m ltiplex de HLA B pero su intensidad puede variar de una muestra a otra El resultado del ensayo de cada control negativo no debe ofrecer ninguna sefial aparente para ninguna de las bandas de la tira excepto para la amplificaci n HLA Bw4 en la que la banda de control de hibridaci n interna control de HLA B tambi n ser positiva La muestra de control LiPA para INNO LiPA HLA B Update Plus debe producir el siguiente patr n de sondas positivas Tira 1 control de conjugado control de HLA B 22 y 35 Tira 2 control de conjugado control de HLA B 53 56 y 57 Todas las dem s sondas deben ser negativas Esta muestra de control consta de oligonucle tidos biotinilados que complementan las sondas de hibridaci n mencionadas La hibridaci n positiva sobre estas sondas demuestra as un rendimiento satisfactorio del ensayo que incluye la hibridaci n el lavado astringente el revelado de color y la detecci n Un patr n diferente puede indicar problemas de rendimiento del ensayo tales como una temperatura incorrecta durante la hibridaci n o desviaciones respecto a los valores de tiempo o temperatura prescritos para la incubaci n Las intensidades del color de las sondas de una tira
122. ndicare instabilit o deterioramento AI fine di minimizzare la possibilit che le strisce si avvolgano prima dell uso si raccomanda di conservare il tubo in senso orizzontale INNOGENETICS 46 Reagenti in dotazione Contenente 20 strisce per INNO LiPA HLA B Update segnate con una linea di identificazione marrone Contenente 20 strisce per INNO LiPA HLA B Update segnate con una linea di identificazione cromata Contenente acido etilendiamminotetracetico EDTA e 0 01 dimetilisotiazolone MIT 0 1 cloroacetammide CAA come Soluzione alcalina contenente EDTA La fiala deve essere chiusa immediatamente dopo l uso una esposizione prolungata di questa soluzione all aria porta a un rapido deterioramento della forza denaturante Tampone salino di sodio fosfato EDTA SSPE contenente 0 5 di sodio dodecil solfato SDS La soluzione di Ibridazione deve essere pre riscaldata a una temperatura di almeno 37 C e non deve superare i 56 C tutti i cristalli devono essere disciolti prima dell uso Tampone SSPE contente 0 1 di SDS La soluzione di Lavaggio Stringente deve essere pre riscaldata a una temperatura di almeno 37 C e non deve superare i 56 C tutti i cristalli devono essere disciolti Tampone fosfato contenente NaCl Triton proteine stabilizzatrici e 0 01 MIT 0 1 CAA come conservante Streptavidina legata con fosfatasi alcalina in tampone Tris contenente stabilizzatori proteici e 0 01 MIT 0
123. niugato a ciascuna vaschetta e incubare per 30 minuti agitando al contempo il vassoio portavaschette sull agitatore NOTA Diluire la soluzione Substrato BCIP NBT 100x circa 10 minuti prima della fine dell incubazione del Coniugato Vedi Reagenti 3 Lavare ciascuna striscia due volte per 1 minuto usando 2 ml della soluzione di lavoro di Risciacquo e lavare una volta ancora usando 2 ml del tampone Substrato 4 Aggiungere 2 ml di soluzione di lavoro Substrato a ciascuna vaschetta e incubare per 30 minuti agitando al contempo il vassoio portavaschette sull agitatore ATTENZIONE Indossare guanti e occhiali protettivi 5 Arrestare lo sviluppo del colore lavando le strisce due volte in 2 ml di acqua distillata agitando il vassoio portavaschette sull agitatore per almeno 3 minuti 6 Usando le pinzette rimuovere le strisce dalle vaschette e posizionarle su carta assorbente Lasciare asciugare completamente le strisce prima di leggere i risultati Conservare le strisce sviluppate e asciugate al buio INNOGENETICS 52 Procedura automatica del test Auto LiPA La procedura dei test LiPA estremamente adatta all automazione L Auto LiPA progettato infatti per gestire completamente i passaggi di ibridazione lavaggio stringente e di sviluppo del colore L Auto LiPA un sistema walk away con riscaldamento e raffreddamento automatici e con aspirazione e dispensazione automatici Il protocollo standard per l Auto LiPA 48 descrive l esec
124. nnten und f r die individuelle Referenzergebnisse zur Verf gung standen Daher wurden zwei Proben von der Berechnung ausgeschlossen F r die verbleibenden 80 Proben wurden einzigartige HLA B Typisierungsergebnisse erhalten Die diagnostische Genauigkeit des Tests auf Allelgruppenebene wurde als die Anzahl der korrekt ermittelten Typisierungsergebnisse berechnet gemessen am einzigartigen Typisierungsergebnis das mittels INNO LiPA HLA B Update Innogenetics oder einem alternativen Typisierungstest Olerup SSP GenoVision SBT Abbott Biotest HLA B SSP Biotest Allset HLA B Low Resolution Dynal und Sequenzierung hausinterne Methode erzielt wurde Die Typisierungsergebnisse aller 80 Proben waren bereinstimmend mit dem Referenzassay was einer diagnostischen Genauigkeit von 100 80 80 95 Cl 95 5 100 entspricht INNOGENETICS 44 Aufl sung Typisierungstabelle v 1 4 031010 Die HLA B Multiplex Primer L sung die in Kombination mit den INNO LiPA HLA B Update Teststreifen verwendet wird dient der Typisierung von HLA B Allelen auf Allelgruppenebene Die HLA Bw4 Primer L sung die in Kombination mit dem INNO LiPA HLA B Update Teststreifen 1 verwendet wird dient der Aufl sung der h ufigsten Widerspr chlichkeiten i e Widerspr chlichkeiten in Bezug auf Bw4 Bw6 Allele Alle Widerspr chlichkeiten auf Allelgruppenebene die nach dem Testen mit der HLA B Multiplex Primer L sung festgestellt wurden konnten un
125. no dato reazioni deboli Una tipizzazione coerente a livello di gruppo di allele stato raggiunto quando si utilizzato il software d interpretazione LiRAS Precisione La variazione della ripetibilit intra test inter test e inter persona stata valutata in sede Un campione amplificato in duplicato usando tre diversi variatori ed elaborando due esecuzioni per variatore stato testato usando lo strumento Auto LiPA Questo protocollo stato eseguito in duplicato da due persone diverse Non si sono osservate variazioni significative e si ottenuto un risultato di tipizzazione identico in tutti i casi senza bisogno di modifiche Espanol Uso al que est destinado INNO LiPA HLA B Update Plus es un ensayo de sondas en tira para uso in vitro disefiado para determinar el tipaje molecular de los alelos B del antigeno leucocitario humano HLA a nivel de grupo de alelos Principio del ensayo Los ensayos INNO LiPA HLA de tipaje se basan en el principio de hibridaci n reversa Se desnaturaliza qu micamente ADN amplificado biotinilado y se hibridan las hebras separadas con sondas de oligonucle tidos espec ficos inmovilizadas como bandas paralelas en tiras basadas en membranas A continuaci n se realiza un lavado astringente para quitar material amplificado incorrectamente emparejado Tras el lavado astringente se afiade conjugado de estreptavidina con fosfatasa alcalina y se une a alg n h brido biotinilado formado
126. nsayo automatizado Auto LiPA El procedimiento de ensayo LiPA es muy apropiado para la automatizaci n Por tanto el ensayo Auto LiPA se ha disefiado para controlar completamente los pasos de hibridaci n lavado astringente y revelado de color Este ensayo se ofrece como un sistema sencillo con calentamiento enfriamiento aspiraci n y pipeteado automatizados El protocolo est ndar Auto LiPA 48 describe el ensayo de hasta 24 muestras cuando se utiliza una nica tira por canal Sin embargo este n mero puede ser incrementado hasta un m ximo de 48 Para realizar esto se pueden incubar dos tiras de un mismo locus en el mismo canal manteniendo igual el resto de par metros del protocolo Hay que tener en cuenta que en este caso ocasionalmente se pueden observar reactividades m s d biles para algunas sondas Por lo tanto se aconseja que aquellos clientes que quieran incrementar el n mero de muestras ensayadas validen el protocolo dos tiras en un canal en su laboratorio Para obtener m s informaci n y los protocolos espec ficos sobre Auto LiPA p ngase en contacto con su distribuidor local Resultados Lectura En la Ilustraci n 1 se muestra la posici n de las distintas sondas de oligonucle tidos en las tiras de INNO LiPA HLA B Update Plus Una banda se considera positiva si aparece una banda de color morado o marr n claro al final del procedimiento de ensayo Ilustraci n 1 ver p gina15 Ubicaci n de la banda de marca banda
127. o per uso professionale Allo scopo di evitare contaminazione del DNA si raccomanda la massima separazione fisica tra i passaggi di pre e post amplificazione stanze separate pipette e altro materiale di laboratorio separato indumenti e guanti da laboratorio separati e loro scorte sono precauzioni minime per una buona pratica di laboratorio Evitare qualsiasi ritorno dalla stanza di post amplificazione alla stanza di pre amplificazione INNOGENETICS 50 Si raccomanda l uso di materiale di laboratorio monouso autoclavato Non riutilizzare materiale di laboratorio monouso Usare un puntale sterile per ciascun campione aliquotato Non usare i reagenti oltre la data di scadenza Non mischiare i reagenti tra i kit a meno che i componenti abbiano numeri di lotto identici Evitare la contaminazione microbica dei reagenti Procedura manuale del test NOTA Nel corso dei vari passaggi di incubazione le strisce del test devono sempre rimanere nella medesima vaschetta Prima dell incubazione verificare la temperatura del bagnomaria usando un termometro calibrato e regolare la temperatura se necessario prima di posizionare il portavaschetta nel bagnomaria Chiudere sempre il coperchio Il Controllo LiPA deve essere incluso in ogni esecuzione del test Campioni d 2 3 Prodotto HLA B amplificato usare 10 ul Per la preparazione del campione vedi le istruzioni per l uso INNO LiPA HLA B Multiplex Plus NOTA
128. ocais e nacionais Amostras Visto o teste INNO LiPA HLA B utilizar material com ADN biotinilado amplificado como amostra est disponivel um kit de amplificag o INNO LiPA HLA B Multiplex Plus Amplification que serve de ferramenta adicional Procedimentos de manipulag o Manipulag o das tiras Astiras foram desenvolvidas para serem utilizados uma s vez N o pegue as tiras com as m os utilize pin as limpas Utilize um lapis para identificar as tiras do teste N o utilize canetas etc Escreva o ID acima da linha de marca o das tiras Durante as v rias etapas de incuba o as tiras de teste devem permanecer na mesma cavidade As tiras n o utilizadas ou processadas devem ser mantidas ao abrigo de luz forte e do calor Para interpretar cobrir ou armazenar as tiras processadas aguarde at que estas estejam completamente secas Tiras processadas e secas devem de prefer ncia ser armazenadas no escuro a uma temperatura de 20 25 C N o reutilize as cavidades Instru es para a incuba o manual A incuba o a 56 C 0 5 C durante a hibridiza o e a lavagem rigorosa s o as etapas mais importantes para evitar falsos positivos temperatura demasiado baixa ou falsos negativos sinais muito fracos temperatura demasiado elevada O uso de um banho de gua com agita o e com tampa inclinada assegura um melhor controlo das varia es de temperatura E necess rio realizar um controlo rigor
129. ogen enth lt f hrt zur einem violett braunen Niederschlag Die Reaktion wird durch einen Waschvorgang gestoppt und das Reaktionsmuster der Sonden wird interpretiert Zus tzlich zu dem INNO LiPA HLA B Update Plus ist ein Amplifikations Kit INNO LiPA HLA B Multiplex Plus verf gbar mit dem die standardisierte Vorbereitung von biotinyliertem Amplifikationsmaterial m glich ist Der Amplifikations Kit basiert auf der Polymerasekettenreaktion PCR polymerase chain reaction Die Amplifikationsprodukte werden anschlie end mit 66 sequenzspezifischen DNA Sonden und 2 Kontrolllinien hybridisiert die sich auf zwei Typisierungsstreifen befinden Abbildung 1 Die Verwendung dieses Produktes ist durch eine Lizenz von F Hoffmann La Roche Ltd und Roche Molecular Systems Inc gedeckt INNO LiPA HLA B Update Plus Die einzelnen Schritte Schritt 1 Multiplex Amplifikation von Exon 2 bis 4 der HLA B Allele Schritt 2 Hybridisierung und Waschschritt mit Stringent Waschl sung mit 67 Proben die auf zwei INNO LiPA HLA B Update Plus Streifen 56 C aufgetragen wurden Schritt 3 Farbentwicklung Schritt 4 Auswertung des Sondenreaktionsmusters Schritt 5 Falls erforderlich r t die LIRAS Interpretation Software zu einem weiteren Amplifikations und Hybridisierungsschritt Bei der Verwendung des INNO LiPA HLA B Update Plus Kits wird empfohlen mit Punkt a zu beginnen und dann mit Punkt b fortzufahren falls Widerspr chlichkeiten im Hin
130. oggles 5 Stop the color development by washing the strips twice in 2 ml distilled water while agitating the tray on the shaker for at least 3 minutes 6 Using forceps remove the strips from the troughs and place them on absorbent paper Let the strips dry completely before reading the results Store the developed and dried strips in the dark Automated test procedure Auto LiPA The LiPA test procedure is extremely well suited for automation Therefore the Auto LiPA was designed to fully handle hybridization stringent wash and color development steps The Auto LiPA is featured as a walk away system with automated heating and cooling and with automated aspiration and pipetting The standard Auto LiPA 48 protocol describes the testing of up to 24 samples when using a single strip per trough However this number can be increased to a maximum of 48 To perform this two strips from the same locus are tested in the same trough while keeping all other protocol parameters the same Note also that weaker probe reactivities can occasionally be observed Therefore those customers who intend to increase the number of samples are advised to validate this 2 strips in one trough procedure in his her laboratory For more information and specific protocols on the Auto LiPA please contact your local distributor 15 INNO LiPA HLA B Update Plus Results Reading Figure 1 illustrates the position of the different oligonucleotide probes on the
131. om one center The samples were processed using the Auto LiPA instrument and interpreted with a clinical trial version of the LIRAS interpretation software 17 INNO LiPA HLA B Update Plus Accuracy An HLA B typing result was obtained for 342 of the 347 samples Repeat testing was needed for 4 samples from one center One sample resulted in no typing deducible but according to the investigator this was probably due to contamination of the DNA For 4 samples from one center no typing result was provided by the investigator although options were available via editing for one of them Accuracy at allele group level was calculated as a percentage of observed concordance with alternative DNA assays Biotest ELPHA HLA AB LowRes Typing kit Dynal SSP LIPA HLA B sequencing Micro SSP OLERUP SSP Biotest HLA B SSP The INNO LiPA HLA B Update results are considered concordant with the reference assay result if the two results were identical if the INNO LiPA HLA B Update results were more specific than the reference result or if the INNO LiPA HLA B Update results showed a lower resolution but correct result by comparison to the reference methods Accuracy was 100 342 342 Resolution typing table version v1 0 2001 03 31 The INNO LiPA HLA B Update has been designed to resolve HLA B alleles to the allele group level i e both at serological broad and split level Allele group is equivalent to the designation of the first two
132. ommande d utiliser du mat riel de laboratoire jetable autoclave Ne pas r utiliser le mat riel de laboratoire jetable Utiliser un nouveau c ne pour pipette st rile pour chaque aliquote d chantillon Ne pas utiliser les r actifs apr s la date de validit Ne pas m langer les r actifs de kits differents a moins que les composants ne portent le m me num ro de lot Eviter toute contamination microbienne des r actifs Proc dure manuelle REMARQUE Les bandelettes doivent rester dans le m me compartiment tout au long des diff rentes tapes d incubation Avant l incubation v rifier la temp rature du bain marie a l aide d un thermom tre calibr et si n cessaire ajuster la temp rature avant de placer le support dans le bain marie Toujours fermer le couvercle Le contr le LiPA doit tre inclus dans chaque s rie Echantillons 1 Produit HLA B amplifi utiliser 10 pl Pour la pr paration des chantillons voir le mode d emploi du test INNO LiPA HLA B Multiplex Plus REMARQUE Veiller ajouter exactement 10 ul d chantillon amplifi Une quantit excessive ou insuffisante d chantillon risque de fausser les r sultats 2 Contr le LiPA pour INNO LiPA HLA B Update Plus utiliser 10 pl l amplification n est pas requise 3 Contr le blanc amplifi contr le n gatif utiliser 10 ul D naturation et hybridation 1 Chauffer le bain marie 56 C 0 5 C V rifier la temp rature l aid
133. on Die Inkubation bei 56 C 0 5 C w hrend der Hybridisierung und des Waschvorgangs mit Stringent Waschl sung stellt den entscheidenden Schritt dar um falsch positive Banden Temperatur zu niedrig oder falsche negative sehr schwache Banden Temperatur zu hoch zu vermeiden Ein Sch ttelwasserbad mit geneigtem Deckel gestattet eine gute Kontrolle der Temperaturvariationen Eine strenge Temperaturkontrolle mit einem kalibrierten Thermometer ist erforderlich Die Klappe des Wasserbades w hrend der Inkubation immer verschlossen halten um falsch positive Banden zu vermeiden Keinen Hei luftinkubator f r die Hybridisierung und den Waschvorgang mit Stringent Waschl sung verwenden F r die Hybridisierung und den Waschvorgang mit Stringent Waschl sung m ssen die Wannen auf die Sch ttelvorrichtung des Wasserbads gelegt werden Den Wasserstand auf 1 3 bis 1 2 der H he der Wanne einstellen Sicherstellen dass die Wannen nicht auf dem Wasser schwimmen Das Wasser muss in direktem Kontakt mit den Wannen sein Die Inkubationsschritte f r die Farbentwicklung m ssen bei 20 25 C durchgef hrt werden Liegt die Temperatur unter 20 C werden ggf schw chere Resultate erzielt Liegt die Temperatur ber 25 C entstehen ggf starke Hintergr nde und oder falsch positive Banden Halten Sie die angegebenen Inkubationszeiten exakt ein Die Sch ttelamplitude von Wasserbad Hybridisierung und Sch ttler Farbentwicklungsverfahren ist wichtig u
134. one per l amplificazione HLA Bw4 in cui la linea di controllo dell ibridazione Controllo HLA B sar anch essa positiva Controllo LiPA per INNO LiPA HLA B Update Plus deve dare il seguente schema di bande positive striscia 1 controllo coniugato Controllo HLA B 22 e 35 striscia 2 controllo coniugato controllo HLA B 53 56 e 57 Ogni altra sonda deve essere negativa Questo controllo composto da oligonucleotidi biotinilati 53 INNO LiPA HLA B Update Plus complementari alle sonde di ibridazione citate L ibridazione positiva su queste sonde dimostra cos l esecuzione soddisfacente del test incluse ibridazione lavaggio stringente sviluppo del colore e rilevazione Uno schema differente pu indicare problemi di esecuzione della prova come una temperatura scorretta durante l ibridazione o deviazioni dai tempi o dalle temperature descritte Le intensit di colore delle sonde su una striscia possono differire da una linea all altra Interpretazione dei risultati Controllare il corretto schema di reattivit del Controllo LiPA La linea di controllo del coniugato sulla striscia deve essere allineata con la linea di controllo del coniugato della carta di lettura Dapprima controllare la positivit delle linee di controllo prime due linee allo scopo di convalidare ciascuna singola striscia vedi Validazione risultati di tipizzazione si basano sulla reattivit delle sonde del kit E disponibile un elenco d
135. oso da temperatura com um term metro calibrado Durante a incuba o deve sempre fechar a tampa do banho de gua a fim de evitar sinais positivos falsos N o utilize um agitador de ar quente para efectuar a hibridiza o e a lavagem rigorosa Para a hibridiza o e a lavagem rigorosa deve colocar as cavidades na plataforma agitadora do banho de gua Ajuste o n vel da gua entre 1 3 e 1 2 da altura da cavidade Certifique se que as cavidades nao ficam a boiar na agua A gua deve estar em contacto directo com as cavidades As etapas de incubag o para a revelag o da cor devem encontrar se entre os 20 25 C Uma temperatura inferior aos 20 C pode causar resultados mais fracos Uma temperatura superior aos 25 C pode causar uma cor de fundo acentuada e ou sinais positivos falsos Execute a incuba o durante o tempo indicado respeitando exactamente o protocolo Aamplitude do movimento gerado tanto pela agita o do banho de agua procedimento de hibridizagao como pelo agitador procedimento da revelac o da Cor extremamente importante para obter a m xima sensibilidade e colorac o INNOGENETICS 74 homog nea A superficie da tira deve estar totalmente submergida A amplitude deve ser a mais alta possivel No entanto o derrame de liquido pelos cantos da cavidade deve ser evitado Isto pode levar a contaminag o cruzada e resultados inv lidos A agita o durante a incuba o das tiras deve ser fei
136. pare mais 10 ml A solu o substrato de trabalho permanece est vel durante 24 horas se for armazenada no escuro temperatura ambiente de 20 25 C Tamp o fosfato contendo NaCl Triton e 0 05 MIT 0 48 CAA como conservante para ser diluido a 1 5 1 parte 4 partes em agua destilada ou desionizada antes de usar Prepare 8 ml de solug o de lavagem de trabalho para cada cavidade teste 10 ml em excesso Para Auto LiPA prepare mais 20 ml Armazenada a uma temperatura de 2 8 C a solug o lavagem de trabalho permanece est vel por 2 semanas Contendo 8 cavidades cada um Para a identifica o de sondas positivas Para guardar tiras processadas Banho de gua com plataforma agitadora 80 rpm com tampa inclinada temperatura ajust vel at aos 56 C 0 5 C Aparelho aspirador Term metro calibrado Plataforma agitadora orbital reciproca ou oscilador INNOGENETICS 72 Recomendag es Para um agitador orbital o di metro do movimento circular deve ser igual ou superior a 13 mm a velocidade recomendada para um movimento circular de 13 mm de 160 rpm Para um agitador rec proco a velocidade recomendada para o movimento de ida e volta de 80 movimentos por minuto Para a plataforma agitadora de oscila o o movimento de agita o n o deve exceder dos 13 para evitar o derramamento de l quido a velocidade recomendada de 50 rpm Agitador de vortex ou equiva
137. passen wenn erforderlich Deckel des Wasserbads immer schlie en Hinweis W hrend des Waschvorgangs mit Stringent Waschl sung die konzentrierte Sp ll sung 1 5 und das Konjugat 1 100 verd nnen Siehe Reagenzien Farbentwicklung Alle nachfolgenden Inkubationen werden bei 20 25 C auf einem Sch ttler durchgef hrt W hrend der Inkubationen sollten die Fl ssigkeit und die Teststreifen in der Wanne hin und her bewegt werden um eine homogene F rbung zu erzielen 1 Waschen Sie jeden Teststreifen f r 1 Minute mit 2 ml der Sp larbeitsl sung siehe Anleitung f r das Auswechseln der Fl ssigkeiten in den Wannen 2 2 ml der Konjugatsarbeitsl sung in jede Wanne geben und f r 30 Minuten inkubieren wobei die Schale auf dem Sch ttler bewegt wird Hinweis Die Substrat BCIP NBT 100x L sung ca 10 Minuten vor dem Ende der Konjugatinkubation verd nnen Siehe Reagenzien 3 Jeden Teststreifen zweimal f r 1 Minute mit 2 ml der Sp larbeitsl sung sp len und anschlie end nochmals mit 2 ml Substratpuffer waschen 4 2 ml der Substratgebrauchsl sung in jede Wanne geben und f r 30 Minuten inkubieren wobei die Schale auf dem Sch ttler bewegt wird ACHTUNG Handschuhe und Schutzbrille tragen 5 Die Farbentwicklung durch zweimaliges Waschen der Teststreifen mit 2 ml destilliertem Wasser stoppen w hrend die Schale auf einem Sch ttler f r mindestens 3 Minuten bewegt wird 6 Mittels Pinzette die Streifen aus den Wannen n
138. perior ou inferior pode resultar numa tipagem errada Amostra de controlo LiPA para INNO LiPA HLA B Update Plus utilize 10 pl n o requer amplifica o Amostra amplificada de controlo em branco controlo negativo utilize 10 pl Desnatura o e hibridiza o 1 Aque a um banho de agua com agitac o aos 56 C 0 5 C Controle a temperatura com um term metro calibrado e se necess rio ajuste a temperatura N o exceda a temperatura indicada Pr aquega a Solu o de hibridizac o e a Solu o de lavagem rigorosa no banho de gua at atingir uma temperatura minima de 37 C e n o superior aos 56 C Agite as antes de usar Todos os cristais devem estar dissolvidos Utilize uma pinga para retirar o n mero de tiras INNO LiPA HLA B Update Plus 1 e 2 do tubo uma tira 1 e uma tira 2 por cada teste de amostra para INNO LiPA HLA B Multiplex Plus e uma tira 1 para o amplificado INNO LiPA HLA Bw4 Inclua ambas as tiras para a amostra de controlo LIPA do INNO LiPA HLA B Update Plus e para a amostra amplificada de controlo em branco Com um l pis escreva um numero de identificag o acima da linha amarela cromo de marcag o da tira Coloque num suporte o numero de cavidades de teste requerido duas cavidades para cada amostra de teste para HLA B Multiplex Plus e uma cavidade para cada amostra de teste para HLA Bw4 Com uma pipeta adicione 10 ul de Solu o de desnaturac o nos cantos superiores das cavidades NOTA
139. pletamente antes de interpretarlas cubrirlas y almacenarlas Las tiras reveladas secas deben almacenarse preferiblemente en un lugar oscuro a una temperatura entre 20 25 C Noreutilice las cubetas Instrucciones para la incubaci n manual La incubaci n a 56 C 0 5 C durante la hibridaci n y el lavado astringente es el paso m s importante para evitar falsos positivos temperatura demasiado baja O falsos negativos se ales muy d biles temperatura demasiado elevada Un ba o de agua de agitaci n con una cubierta inclinada ofrece un buen control sobre las variaciones de temperatura Es necesario realizar un control estricto de la temperatura con un term metro calibrado Cierre siempre la cubierta del ba o de agua durante las incubaciones para evitar se ales de falso positivo No utilice un agitador de aire caliente para la hibridaci n y el lavado astringente Para la hibridaci n y el lavado astringente las cubetas deben colocarse en la plataforma de agitaci n del ba o de agua Ajuste el nivel de agua entre 1 3 y 1 2 de la altura de la cubeta Aseg rese de que las cubetas no flotan en el agua El agua debe estar en contacto directo con las cubetas Los pasos de incubaci n para el revelado de colores deben realizarse a una temperatura entre 20 25 C Si la temperatura fuera inferior a 20 C se obtendr an resultados menos intensos Si la temperatura fuera superior a 25 C se obtendr a una se al de fon
140. previamente La incubaci n con 57 INNO LiPA HLA B Update Plus una soluci n de sustrato que contiene un crom geno produce un precipitado de un color morado o marr n Se detiene la reacci n mediante un lavado y se registra el patr n de reactividad de las sondas Con el kit INNO LiPA HLA B Update Plus est disponible un kit de amplificaci n INNO LiPA HLA B Multiplex Plus para la preparaci n estandarizada de material amplificado biotinilado El kit de amplificaci n se basa en la reacci n en cadena de polimerasa PCR polymerase chain reaction Los productos de amplificaci n se hibridan sucesivamente con 2 tiras de determinaci n de tipo en la que se fijan 66 sonda espec ficas de la secuencia y 2 bandas de control Ilustraci n 1 El uso de este producto est cubierto por una licencia de F Hoffmann La Roche Ltd y Roche Molecular Systems Inc Pasos de INNO LiPA HLA B Update Plus Paso 1 Amplificaci n m ltiplex de los exones 2 a 4 de los alelos HLA B Paso 2 Hibridaci n y lavado astringente con 67 bandas de sonda inmovilizadas en dos tiras de INNO LiPA HLA B Update Plus a 56 C Paso 3 Revelado de color Paso 4 Interpretaci n del patr n de reactividad de las sondas Paso 5 Si es necesario el software de interpretaci n LIRAS recomienda completar un paso mas de amplificaci n e hibridaci n Cuando se utiliza el kit INNO LiPA HLA B Update Plus se recomienda empezar con a y seguir con b si se produ
141. ramite la pipetta immettere 10 pl di soluzione di denaturazione nell angolo superiore di ciascuna vaschetta NOTA Chiudere la fiala immediatamente dopo l uso Aggiungere 10 ul di campione vedi Campioni vedi Istruzioni per l uso di INNO LiPA HLA B Multiplex Plus e miscelare attentamente pipettando su e gi Usare sempre puntali sterili Lasciare che la denaturazione proceda per 5 minuti a 20 25 C Agitare la soluzione di ibridazione pre riscaldata e aggiungere delicatamente 2 ml al prodotto amplificato denaturato in ciascuna vaschetta Miscelare agitando delicatamente Fare attenzione a non contaminare le vaschette vicine durante il pipettamento 51 INNO LiPA HLA B Update Plus 7 Posizionare immediatamente la striscia nella vaschetta Le strisce devono essere completamente immerse nella soluzione NOTA Indossare guanti monouso e usare pinzette 8 Posizionare la vaschetta nel bagnomaria con agitazione a una temperatura di 56 C 0 5 C 80 rpm vedi Istruzioni per l incubazione manuale chiudere il coperchio e incubare per 30 minuti NOTA Evitare di spruzzare acqua dal bagno d acqua nella vaschetta Regolare il livello dell acqua tra 1 3 e 1 2 dell altezza della vaschetta Al fine di prevenire uno scivolamento del portavaschetta immobilizzarlo tra due grossi pesi Lavaggio stringente 1 Dopo l ibridazione rimuovere il vassoio portavaschette dal bagnomaria 2 Tenere il vassoio portavaschette inclinato e aspi
142. rare il liquido dalla vaschetta attraverso una pipetta preferibilmente attaccata a un aspiratore a vuoto Aggiungere 2 ml di soluzione di lavaggio stringente pre riscaldata in ciascuna vaschetta e posizionare il vassoio portavaschette in bagnomnaria a 56 C 0 5 C chiudere il coperchio e incubare per 3 minuti 3 Dopo l incubazione rimuovere il portavaschetta dal bagnomaria e aspirare il liquido dalla vaschetta 4 Ripetere il passaggio d incubazione di 3 minuti e il passaggio d aspirazione una volta ancora 5 Infine aggiungere 2 ml di Soluzione di Lavaggio Stringente pre riscaldata in ciascuna vaschetta e posizionare il portavaschetta in bagnomaria a 56 C 0 5 C chiudere il coperchio e incubare per 4 minuti Prima dell incubazione controllare la temperatura del bagnomaria usando un termometro calibrato e regolare la temperatura se necessario Chiudere sempre il coperchio NOTA Diluire la Soluzione di Risciacquo concentrata 5x e il Coniugato 100x durante il Lavaggio Stringente Vedi Reagenti Sviluppo del colore Tutte le incubazioni successive sono eseguite a 20 25 C su un agitatore Durante le incubazioni il liquido e le strisce del test devono spostarsi avanti e indietro nella vaschetta per una colorazione omogenea 1 Lavare ciascuna striscia due volte per 1 minuto usando 2 ml di soluzione di lavoro di Risciacquo vedi Istruzioni per cambiare il liquido nelle vaschette 2 Aggiungere 2 ml di soluzione di lavoro Co
143. rfahren Hinweis W hrend der verschiedenen Inkubationsschritte m ssen die Teststreifen immer in derselben Wanne verbleiben berpr fen Sle vor der Inkubation die Temperatur des Wasserbads mit einem kalibrierten Thermometer und passen Sie die Temperatur wenn erforderlich an bevor die Wannen in das Wasserbad gelegt werden Deckel des Wasserbads immer schlie en Die LiPA Kontrolle sollte in jeden Testlauf integriert werden Proben 1 HLA B Amplifikationsprodukt 10 ul verwenden F r die Vorbereitung der Probe siehe INNO LiPA HLA B Multiplex Plus Gebrauchsanleitung HINWEIS Sicherstellen dass exakt 10 ul der amplifizierten Probe hinzugef gt werden Eine zu gro e oder zu geringe Probenmenge kann zu einem falschen Typisierungsergebnis f hren 2 LiPA Kontrollprobe f r INNO LiPA HLA B Update Plus 10 ul verwenden Amplifikation ist nicht erforderlich 3 Leere amplifizierte Kontrollproben Negativkontrolle 10 ul verwenden INNOGENETICS 38 Denaturierung und Hybridisierung 1 Sch ttelwasserbad auf 56 C 0 5 C erw rmen Temperatur mit einem kalibrierten Thermometer berpr fen und Temperatur anpassen wenn erforderlich Die vorgeschriebene Temperatur nicht berschreiten Die Hybridisierungsl sung und die Stringent Waschl sung in einem Wasserbad auf mindestens 37 C vorw rmen aber 56 C nicht berschreiten Vor Gebrauch mischen Alle Kristalle m ssen vollst ndig aufgel st sein Mittels Pinzet
144. riale DNA biotinilato e amplificato disponibile come strumento di accompagnamento un kit di amplificazione INNO LiPA HLA B Multiplex Plus Procedure di manipolazione Trattamento delle strisce Le strisce possono essere utilizzate una volta sola Non toccare le strisce con le mani nude usare pinzette pulite Usare una matita per l identificazione delle strisce del test Non usare penne a sfera ecc Scrivere il numero identificativo sopra la linea di identificazione della striscia Nel corso dei vari passaggi d incubazione le strisce devono sempre rimanere nella medesima vaschetta Le strisce inutilizzate o sviluppate devono essere mantenute lontano da fonti di luce intensa e di calore Lasciare che le strisce sviluppate asciughino completamente prima dell interpretazione della copertura e della conservazione Le strisce asciutte sviluppate devono essere conservate preferibilmente al buio ad una temperatura compresa tra 20 25 C Non riutilizzare le vaschette 49 INNO LiPA HLA B Update Plus Indicazioni per l incubazione manuale L incubazione a 56 C 0 5 C durante l ibridazione e il lavaggio stringente sono i passaggi pi critici nell evitare segnali deboli positivi falsi temperatura troppo bassa o falsi negativi segnali molto deboli temperatura troppo alta Un bagnomaria con agitazione con coperchio inclinato permette un buon controllo delle variazioni di temperatura E necessario un controllo ac
145. ritag o Xi provoca irritac o dos olhos e pele N o respire o vapor Evite o contacto com a pele Em caso de contacto com os olhos lave imediatamente com muita gua e procure aux lio m dico Cont m hidr xido de s dio Solu o de desnatura o As amostras devem ser manipuladas como potencialmente infecciosas Todos os componentes sangu neos e materiais biol gicos devem ser considerados como sendo potencialmente infecciosos e devem ser manipulados em conformidade O procedimento do teste deve ser realizado apenas por pessoal com forma o e qualifica es necess rias Todos os componentes sangu neos e materiais 73 INNO LiPA HLA B Update Plus biol gicos devem ser eliminados em conformidade com os procedimentos de seguranga estabelecidos Realize uma autoclavagem durante pelo menos 15 minutos a 121 C ncinere o material descart vel Misture os res duos l quidos com hipoclorito de s dio para que a concentrac o final seja de 1 de hipoclorito de s dio Deixe em repouso durante a noite antes de eliminar CUIDADO neutralize os res duos l quidos que cont m cido antes de adicionar o hipoclorito de s dio necess rio utilizar equipamento de protecg o luvas e culos de seguranga quando manipular agentes perigosos ou infecciosos Os res duos devem ser manipulados de acordo com as directivas de elimina o de residuos da instituig o Cumpra tamb m todos os regulamentos ambientais federais l
146. roben mit einer Konzentration zwischen 20 ng ul und 1500 ng ul und einer Reinheit A260nm A280nm gt 1 5 Die DNA wurde vor der Amplifikation auf eine Konzentration zwischen 20 nout und 250 ng ul verd nnt Es wurden keine Amplifikationsfehler festgestellt auch wenn bei zwei Proben aus dem Zentrum der Test wiederholt werden musste Pr zision Interne Daten Drei Proben wurden vierfach von zwei unterschiedlichen Personen manuell bzw von einer Person auf zwei verschiedenen Auto LiPA Ger ten getestet Zwei Proben wurden auf drei verschiedenen Chargen in zwei unterschiedlichen L ufen analysiert Die Interpretation der Ergebnisse war f r alle Proben identisch Die Sondenreaktivit t war in allen F llen vergleichbar 43 INNO LiPA HLA B Update Plus Externe Validierung Die Variabilit t zwischen den Chargen wurde mittels Analyse eines proficiency panesl 5 Proben mit bekannter Reaktivit t und Interpretation bei zwei verschiedenen Chargen des Produkts beurteilt F r jede Probe wurde unabh ngig von der verwendeten Charge dasselbe Typisierungsergebnis erzielt Die Variabilit t zwischen den Labors wurde beurteilt indem in allen vier Einrichtungen dasselbe proficiency panel verwendet wurde Alle Einrichtungen erzielten f r die f nf Proben dasselbe Typisierungsresultat Testleistung unter Verwendung von DNA die mit Hilfe der HLA Bw4 Multiplex Primerl sung amplifiziert wurde Die Leistung der HLA Bw4 Primer L sung des INNO LiPA
147. sado por Consult instructions for use 1 Consignes de s curit F r Anwendung siehe Gebrauchsanleitung Consultare le istruzioni per l uso Consulte las instrucciones de uso Consultar instru es de utiliza o INNOGENETICS Y Y STRIPS STRIPS N CONTROL LiPA DENAT SOLN HYBRIDIZ SOLN STRIN WASH SOLN CONJ 100x Temperature limits Limites de temp rature Temperaturbereich Limiti di temperatura Limites de temperatura Limites de temperatura Contains sufficient for lt X gt tests Conditionnement suffisant pour lt X gt tests Inhalt ausreichend f r lt X gt Tests Contenuto sufficiente per lt X gt test Contenido suficiente para lt X gt ensayos Contem material suficiente para lt X gt testes Strips 1 Bandelettes 1 Streifen 1 Striscia 1 Tiras 1 Strips 2 Bandelettes 2 Streifen 2 Striscia 2 Tiras 2 LiPA Control Contr le LiPA LiPA Kontrolle Controllo LiPA Control LiPA Controlo LiPA Denaturation Solution Solution de D naturation Denaturierungsl sung Soluzione di Denaturazione Soluci n de desnaturalizaci n Solu o de desnaturac o Hybridization Solution Solution d Hybridation Hybridisierungsl sung Soluzione di Ibridazione Soluci n de hibridaci n Soluc o de hibridizag o Stringent Wash Solution Solution de Lavage Stringent Stringent Waschl sung Soluzion
148. st destin e r soudre les ambiguit s les plus fr quentes c est dire les ambiguit s impliquant les all les Bw4 Bw6 Toutes les ambiguit s au niveau du groupe d all les observ es apr s le test l aide de la Solution Amorce HLA B Multiplex ont t r duites un r sultat de typage non ambigu l aide de la Solution Amorce HLA Bw4 B 08 B 38 ou B 08 B 39 2 cas B 08 B 51 ou B 08 B 78 4 cas B 13 B 49 ou B 13 B 50 2 cas B 15 B 38 ou B 15 B 39 1 cas B 15 B 51 ou B 15 B 52 ou B 15 B 78 1 cas B 15 B 51 ou B 15 B 52 ou B 15 B 78 ou B 35 B 52 1 cas B 35 B 38 ou B 39 B 53 4 cas B 35 B 40 ou B 40 B 53 1 cas B 35 B 47 ou B 47 B 53 1 cas B 35 B 49 ou B 50 B 53 2 cas B 35 B 52 ou B 53 B 78 2 cas B 38 B 44 ou B 39 B 44 1 cas B 38 B 50 ou B 39 B 49 1 cas B 38 B 78 ou B 39 B 51 1 cas B 40 B 49 ou B 40 B 50 2 cas B 41 B 53 ou B 42 B 53 1 cas B 44 B 49 ou B 44 B 50 2 cas Pour tous les r sultats ambigus le logiciel d interpr tation LIRAS a conseill de proc der une amplification Bw4 suivie d une hybridation l aide de la bandelette 1 INNO LiPA HLA B Update R activit des sondes A une ou plusieurs occasions au cours de cette tude certaines sondes ont donn des r actions faibles Un typage concordant au niveau du groupe d all les a t obtenu lorsque le logiciel d interpr tation LIRAS a t utilis Pr cision La r p tabilit
149. t tablie l aide du m me panel test dans 4 centres Chaque centre a rendu les m mes r sultats pour les 5 chantillons Performance du test bas e sur l utilisation de la solution d amorce HLA Bw4 Les performances de la Solution Amorce HLA BWA du test INNO LiPA HLA B Multiplex Plus ont t valu es en interne et dans deux laboratoires belges de typage tissulaire Un total de 82 chantillons anonymes ont t analys s 50 chantillons en externe 32 en interne Tous les chantillons avaient t pr alablement typ s l aide de INNO LiPA HLA B Update Les chantillons incluaient 31 chantillons ambigus 18 ambiguit s diff rentes et 51 chantillons non ambigus Tous les chantillons ambigus ont t nouveau typ s jusqu obtention d un r sultat unique l aide de tests de typage bas s sur l ADN Toutes les hybridations ont t effectu es l aide de l instrument Auto LiPA l aide du programme HLA56v3 et l interpr tation a t r alis e l aide d une version d essai clinique du logiciel d interpr tation LRAG pour LIPA HLA v3 00 Sensibilit du test La sensibilit du test au niveau du groupe d all les a t d finie comme le nombre de r sultats de typage r ussis par rapport au nombre total d chantillons test s La sensibilit du test dans cette valuation apr s une r p tition du test d amplification pour quatre chantillons tait de 98 8 81 82 95 CI 93 4 100 L
150. t un test sur bandelette a usage in vitro pour le typage mol culaire au niveau du groupe d all les des all les HLA B Human Leukocyte Antigen Principe du test Les tests de typage INNO LiPA HLA sont bas s sur le principe de l hybridation inverse L ADN biotinyl amplifi est d natur chimiquement et les cha nes s par es sont hybrid es a l aide de sondes oligonucl otidiques immobilis es en bandes parall les sur bandelettes L hybridation est suivie d un lavage stringent afin d liminer tout mat riel amplifi non appari Apr s le lavage stringent est ajout e de la streptavidine marqu e une phosphatase alcaline qui se fixe aux hybrides biotinyl s pr c demment form s L incubation avec une solution de substrat contenant un chromog ne entraine la formation d un pr cipit violet brun La r action est stopp e par lavage et le profil de r activit des sondes est tabli INNO LiPA HLA B Update Plus est fourni avec un kit d amplification INNO LiPA HLA B Multiplex Plus pour la pr paration standardis e de mat riel amplifi biotinyl Le kit d amplification est bas sur une r action en cha ne de polym risation PCR Les produits amplifies sont ensuite hybrid s avec 2 bandelettes LiPA comportant 66 sondes de s quences sp cifiques et 2 bandes contr les Figure 1 L utilisation de ce produit est couverte par une licence de F Hoffmann La Roche Ltd et Roche Molecular Systems Inc INNOGENETICS
151. ta de forma a que tanto o liquido como as tiras de teste se movimentam de c para l dentro da cavidade sem fazer transbordar o liquido das cavidades N o tape as cavidades Durante as incuba es de hibridiza o e de lavagem rigorosa pode deixar as cavidades destapadas no banho de agua Tapar as cavidades pode causar a contamina o cruzada Instrug es para mudar manualmente o l quido nas cavidades O liquido deve ser aspirado da cavidade com uma pipeta de prefer ncia ligada a aspirador de v cuo O suporte inclinado de modo a permitir que o l quido se desloque para um lado da cavidade Adicione 2 ml da solu o apropriada e siga o protocolo A pipeta dispensadora multi canal Eppendorf til para esta aplicac o Repita esta etapa tantas vezes quantas as indicadas no procedimento de teste NOTA N o deixe que as tiras sequem entre as duas etapas Certifique se de que n o danificou a superficie das tiras durante a aspirac o Aspire o l quido pela parte superior da tira acima da linha de marca o Certifique se de que aspirou todo o l quido Certifique se de que a tira foi cuidadosamente lavada por submers o completa na solug o de lavagem Adaptar a velocidade do agitador quando necess rio Observa es e precau es Exclusivamente para uso profissional Afim de evitar a contamina o de ADN recomendada a m xima separa o f sica entre etapas de pr e p s amplific
152. tador de plataforma orbital de movimiento rec proco o de balanceo Recomendaciones Para un agitador orbital el di metro del movimiento circular debe ser igual o superior a 13 mm la velocidad recomendada para un movimiento circular de 13 mm es de 160 rpm Para un agitador de movimiento rec proco la velocidad recomendada para el movimiento de ida y vuelta es de 80 movimientos por minuto Para un agitador de plataforma de balanceo el ngulo de agitaci n no debe superar los 13 para evitar que el liquido se derrame la velocidad recomendada es de 50 rpm V rtex o equivalente Probetas graduadas 10 25 50 y 100 ml Agua destilada o desionizada Guantes desechables Puntas de pipeta esterilizadas desechables preferiblemente con filtro de algod n Pinzas para la manipulaci n de las tiras Pipetas ajustables que permitan pipetear 1 20 ul 20 200 pl y 200 1000 pl Multipipeta de distribuci n Eppendorf opcional Cron metro 2 horas 1 minuto INNOGENETICS 60 Seguridad y medio ambiente Consulte la hoja de datos sobre seguridad del fabricante y el etiquetado del producto para obtener informaci n acerca de componentes potencialmente peligrosos R20 21 R36 R45 R61 S36 37 S45 53 Producto t xico T Dafino si se inhala o entra en contacto con la piel Irrita los ojos Puede provocar cancer Puede dafiar los fetos Utilice indumentaria y guantes de protecci n adecuados En caso
153. tation should be done and should have approximately the same intensity on each strip in the same test run The next line is the HLA B Update Plus internal hybridization control line HLA B control on the reading card which indicates whether or not an appropriate amount of HLA B amplified material was added for hybridization This line should always be positive except for the negative control of the HLA B multiplex amplification but its intensity may vary between samples The assay result of each negative control should give no apparent signal for any of the lines on the strip except for the HLA Bw4 amplification where the internal hybridization control line HLA B Control will be positive as well The LiPA Control sample for INNO LiPA HLA B Update Plus should yield the following pattern of positive probes strip 1 conjugate control HLA B Control 22 and 35 strip 2 conjugate control HLA B control 53 56 and 57 Every other probe should be negative This control sample is composed of biotinylated oligonucleotides complementary to the mentioned hybridization probes INNOGENETICS 16 Positive hybridization on these probes thus demonstrates satisfactory performance of the assay including hybridization stringent washing color development and detection A different pattern may indicate assay performance problems such as incorrect temperature during hybridization or deviations from the prescribed incubation times or temperatures
154. te 3 minutos Ap s a hibridizac o retire o suporte do banho com agua e aspire o l quido da cavidade Repita mais uma vez a etapa de incuba o de 3 minutos e a etapa de aspira o Por ltimo adicione 2 ml de soluc o de lavagem rigorosa pr aquecida a cada cavidade e coloque o suporte no banho agitador com agua a 56 C 0 5 C INNOGENETICS 76 feche a tampa e incube durante 4 minutos Antes da incuba o me a a temperatura do banho de gua com um term metro calibrado e se necess rio aque a ou arrefega a agua Feche sempre a tampa NOTA Dilua a solu o concentrada de lavagem 5x e o conjugado 100x ao realizar a lavagem rigorosa Veja Reagentes Revelac o da cor Todas as incubac es seguintes devem ser realizadas num agitador a uma temperatura de 20 25 C Durante as incuba es tanto o liquido como as tiras de teste devem movimentar se para a frente e para tras na cavidade para garantir uma colorac o homog nea 1 Lave cada tira durante 1 minuto com 2 ml de solug o de lavagem veja as Instrug es para mudar o l quido nas cavidades 2 Adicione 2 ml de solu o conjugado de trabalho a cada cavidade e incube durante 30 minutes agitando o suporte no agitador Nota Dilua a solu o de substrato BCIP NBT 100x uns 10 minutos antes de acabar a incuba o do conjugado Veja Reagentes 3 Lave cada tira duas vezes durante 1 minuto com 2 ml da soluc o de lavagem de trabalho e adicionalmente mais
155. te die erforderliche Anzahl von INNO LiPA HLA B Update Plus Streifen 1 und Streifen 2 aus dem R hrchen entnehmen einen Streifen 1 und einen Streifen 2 pro Testprobe f r den INNO LiPA HLA B Multiplex Plus einen Streifen 1 f r das INNO LiPA HLA Bw4 Amplifikat Nehmen Sie beide Streifen f r die LiPA Kontrollprobe des INNO LiPA HLA B Update Plus und f r die amplifizierten Leerproben Schreiben Sie mit Bleistift eine Identifizierungsnummer oberhalb der braunen gelben Markierungslinie auf die Streifen Die erforderliche Anzahl von Testwannen entnehmen zwei Testwannen pro Testprobe f r HLA B Multiplex Plus und eine Wanne pro Testprobe f r HLA Bw4 und in den Halter setzen F llen Sie mit einer Pipette 10 ul Denaturierungsl sung in die obere Ecke jeder Wanne Hinweis Schlie en Sie das Fl schchen unmittelbar nach Gebrauch 10 ul Probe hinzuf gen siehe Proben siehe Anleitung f r die Verwendung des INNO LiPA HLA B Multiplex Plus und vorsichtig durch Auf und Abpipettieren mischen Immer sterile Pipettenspitzen verwenden Denaturieren Sie die DNA f r 5 Minuten bei 20 25 C Sch tteln Sie die vorgew rmte Hybridisierungsl sung und geben Sie vorsichtig 2 ml hiervon zu dem denaturierten Amplifikationsprodukt in jede Wanne Durch sanftes Sch tteln mischen Achten Sie darauf w hrend des Pipettierens keine benachbarten Wannen zu kontaminieren Legen Sie den Teststreifen umgehend in die Wanne Die Teststreifen m ssen vollst ndig in die L
156. ter Verwendung der HLA Bw4 Primer L sung zu einem nicht widerspr chlichen Typisierungsergebnis reduziert werden B 08 B 38 oder B 08 B 39 2 F lle B 08 B 51 oder B 08 B 78 4 F lle B 13 B 49 oder B 13 B 50 2 F lle B 15 B 38 oder B 15 B 39 1 Fall B 15 B 51 oder B 15 B 52 oder B 15 B 78 1 Fall B 15 B 51 oder B 15 B 52 oder B 15 B 78 oder B 35 B 52 1 Fall B 35 B 38 oder B 39 B 53 4 Falle B 35 B 40 oder B 40 B 53 1 Fall B 35 B 47 oder B 47 B 53 1 Fall B 35 B 49 oder B 50 B 53 2 Falle B 35 B 52 oder B 53 B 78 2 Falle B 38 B 44 oder B 39 B 44 1 Fall B 38 B 50 oder B 39 B 49 1 Fall B 38 B 78 oder B 39 B 51 1 Fall B 40 B 49 oder B 40 B 50 2 Falle B 41 B 53 oder B 42 B 53 1 Fall B 44 B 49 oder B 44 B 50 2 Falle F r alle widerspr chlichen Ergebnisse empfahl die LiRAS Interpretationssoftware eine Bw4 Amplifikation gefolgt von einer Hybridisierung mit dem INNO LiPA HLA B Update Teststreifen 1 Sondenreaktivit t Bei einem Fall bzw mehreren F llen ergab en einige Proben w hrend der Studie nur schwache Reaktionen Es wurde eine konkordante Typisierung auf Allelgruppenebene erreicht wenn die LRAG Interpretationssoftware verwendet wurde Pr zision Die Wiederholung intra assay und die inter assay und inter person Abweichung wurde hausintern evaluiert Eine Probe zweifach amplifiziert unter Verwendung von drei verschiedenen Cyclern und der Bearbeitung von zw
157. the liquid at the top of the strip above the marker line Make sure all liquid is aspirated Make sure the whole strip is thoroughly washed by complete submersion in the solution Adapt the speed of the shaker when necessary Remarks and precautions For professional use only n order to avoid DNA contamination a maximum physical separation between the pre and post amplification steps is recommended separate rooms separate pipettes and other lab material separate lab coats and gloves and their stock are minimum precautions for a good laboratory practice Avoid any return from the post amplification room to the pre amplification room The use of autoclaved disposable lab material is recommended Do not reuse disposable lab material Use a new sterile pipette tip for each aliquoted specimen Do not use the reagents beyond the expiry date Do not mix reagents between kits unless the components have identical lot numbers Avoid microbial contamination of reagents Manual test procedure NOTE Throughout the different incubation steps the test strips should always remain in the same trough Before incubation check the temperature of the water bath using a calibrated thermometer and adjust the temperature if necessary before placing the tray in the water bath Always close the lid The LiPA Control should be included in each test run 13 INNO LiPA HLA B Update Plus Samples 1 HLA B amplified product
158. tidos biotinilados complementares s sondas de hibridiza o mencionadas Portanto a hibridiza o positiva demonstra o desempenho satisfat rio do ensaio incluindo a hibridiza o lavagem rigorosa revela o da cor e detec o Um padr o diferente pode indicar problemas no desempenho do ensaio tais como a utiliza o de uma temperatura incorrecta durante a hibridiza o ou o desvio da temperatura ou das vezes de incuba o prescritas Ae intensidades das cores nas sondas numa tira podem divergir de uma linha para a outra Interpreta o dos resultados Verifique a ocorr ncia de um padr o de reactividade correcto na amostra de controlo LiPA A linha de controlo de conjugado na tira deve estar alinhada com a linha de controlo de conjugado do cart o de pl stico para leitura Primeiro verifique se as linhas de controlo as primeiras duas linhas s o positivas a fim de poder validar cada tira individualmente veja Valida o Os resultados de tipagem baseiam se na reactividade das sondas do kit Encontra se dispon vel uma lista de especificidades da sonda Identifique todos os n meros das sondas que est o positivos nas tiras INNO LiPA HLA B Update Plus e deduza o tipo de HLA B usando a tabela de tipagem INNO LiPA HLA B Update Plus ou a vers o de software de interpreta o LiPA veja o software de interpreta o LIRAS TM Na maioria das vezes o software oferece mais resultados do que indicado na utiliza o
159. tion d Hybridation pr chauff e et en ajouter d licatement 2 ml au produit amplifi d natur dans chaque compartiment Homog n iser en agitant doucement Attention ne pas contaminer les compartiments voisins pendant le pipetage 7 Placer imm diatement la bandelette dans le compartiment Les bandelettes doivent tre compl tement immerg es dans la solution INNOGENETICS 26 REMARQUE Porter des gants jetables et utiliser des pinces en plastique 8 Placer le support dans le bain marie agitant a 56 C 0 5 C 80 tr min voir Directives pour l incubation manuelle fermer le couvercle et incuber 30 minutes REMARQUE Eviter de projeter de l eau du bain marie dans les compartiments Regler le niveau d eau entre le tiers et la moiti de la hauteur du compartiment Pour emp cher le support de glisser l immobiliser entre deux poids Lavage Stringent 1 Apres l tape d hybridation retirer le support du bain marie 2 Incliner l g rement le support et aspirer le liquide de chaque compartiment l aide d une pipette de pr f rence branch e sur une pompe vide Ajouter 2 ml de Solution de Lavage Stringent pr chauff e dans chaque compartiment et placer le support dans le bain marie agitant 56 C 0 5 C Fermer le couvercle et incuber 3 minutes Apr s incubation retirer le support du bain marie et aspirer le liquide du compartiment R p ter l tape d incubation de 3 minutes et l tape d aspiratio
160. tion positive de ces sondes indique une r alisation correcte de la proc dure pour les tapes d hybridation lavage stringent r v lation et d tection Un profil diff rent peut mettre en vidence des probl mes tels qu une temp rature incorrecte d hybridation ou un non respect des temps ou des temp ratures d incubation indiqu s INNOGENETICS 28 Les intensit s de coloration des sondes d une bandelette peuvent varier d une bande a l autre Interpr tation V rifier que le Contr le LIPA pr sente le profil de r activit attendu La bande contr le Conjugu de la bandelette doit tre align e avec celle de la bande contr le Conjugu pr sente sur la carte de lecture V rifier d abord la r activit des bandes de contr le 2 premi res bandes pour permettre la validation de chaque bandelette individuellement voir Validation Ler sultat du typage est bas sur la r activit des sondes du kit Une liste des caract ristiques des sondes est disponible Identifier tous les num ros des sondes r actives sur les bandelettes INNO LiPA HLA B Update Plus et d duire le type HLA B l aide du tableau de typage INNO LiPA HLA B Update Plus ou d une version du logiciel d interpr tation du LiPA voir Logiciel d interpr tation LIRAS Le logiciel propose souvent plus de r sultats que ce que ne mentionne le paragraphe But du test il fournit une interpr tation au niveau du groupe d all les ains
161. tre manipul avec les pr cautions d usage Seul le personnel qualifi doit tre autoris r aliser le test Tous les d riv s sanguins et mat riels biologiques doivent tre limin s selon les proc dures de s curit en vigueur Autoclave au moins 15 min 121 C ncin ration des mat riels jetables M langer les d chets liquides avec de l hypochlorite de sodium une concentration finale d environ 196 Laisser en contact une nuit avant l vacuation ATTENTION Les liquides contenant de l acide doivent tre neutralis s avant ajout d hypochlorite de sodium L utilisation d un quipement personnel de protection est n cessaire gants et crans lors de la manipulation d agents dangereux ou infectieux Les d chets doivent tre trait s en accord avec les r gles d limination des d chets en vigueur dans l institution Toutes les r glementations f d rales nationales et locales doivent galement tre observ es Echantillons Le test LiPA utilisant de l ADN amplifi biotinyl comme chantillon il est accompagn d un kit d amplification INNO LiPA HLA B Multiplex Plus Proc dures de manipulation Bandelettes Les bandelettes ne sont pas r utilisables Ne pas toucher les bandelettes avec les mains utiliser des pinces en plastique propres Utiliser un crayon pour identifier les bandelettes Ne pas utiliser de stylos bille etc Ecrire l identit au dessus de la ligne de rep re des bande
162. u B 15 B 52 ou B 15 B 78 1 caso B 15 81 INNO LiPA HLA B Update Plus B 51 ou B 15 B 52 ou B 15 B 78 ou B 35 B 52 1 caso B 35 B 38 ou B 39 B 53 4 casos B 35 B 40 ou B 40 B 53 1 caso B 35 B 47 ou B 47 B 53 1 caso B 35 B 49 ou B 50 B 53 2 casos B 35 B 52 ou B 53 B 78 2 casos B 38 B 44 ou B 39 B 44 1 caso B 38 B 50 ou B 39 B 49 1 caso B 38 B 78 ou B 39 B 51 1 caso B 40 B 49 ou B 40 B 50 2 casos B 41 B 53 ou B 42 B 53 1 caso B 44 B 49 ou B 44 B 50 2 casos O software de interpretac o LIRAS aconselhou para todos os resultados ambiguos a amplificac o Bw4 seguida por hibridizag o com INNO LiPA HLA B Update strip 1 Reactividades de sonda Em uma ou mais ocasi es deste estudo algumas sondas apresentaram reacc es fracas Ao utilizar o software de interpretac o LIRAS obteve se uma tipagem concordante ao nivel do grupo de alelos Precis o A repetibilidade intra ensaio a variag o inter ensaio e interpessoal foram avaliadas internamente Uma amostra amplificada em duplicado usando tr amp s termocicladores diferentes e processada em duas series por cada termociclador foi testada com o instrumento Auto LiPA Este protocolo foi executado em duplicado por duas pessoas diferentes N o foi observada varia o significativa e em todos os casos se obteve um resultado de tipagem id ntico n o sendo necessario fazer alterac es
163. u protocole 2 bandelettes dans 1 compartiment Pour plus d informations et les protocoles sp cifiques de Auto LiPA prendre contact avec un distributeur local R sultats Lecture La Figure 1 illustre la position des diff rentes sondes oligonucl otidiques sur les bandelettes INNO LiPA HLA B Update Plus Une bande est consid r e positive lorsqu une coloration violet brun apparait clairement la fin de la proc dure de test Figure 1 voir page 15 Emplacement de la ligne de rep re ligne marron sur la bandelette 1 et ligne jaune sur la bandelette 2 de la bande contr le Conjugu conj control de la bande contr le HLA B Update Plus HLA B control et des 66 sondes de s quences ADN sp cifiques sur les bandelettes INNO LiPA HLA B Update Plus Validation Inclure un contr le n gatif et le contr le LIPA pour INNO LiPA HLA B Update Plus lors de chaque s rie Comme dans toute proc dure de test il est indiqu de pr voir des contr les positifs et n gatifs suppl mentaires jusqu acquisition d une pr cision satisfaisante dans l ex cution de la proc dure de test Il est conseill d utiliser un ADN de r f rence pour valider la qualit des conditions de test Les lignes les plus l extr mit des bandelettes INNO LiPA HLA B Update Figure 1 sont les lignes de rep re marron et jaune et permettent d orienter correctement les bandelettes La bande suivante est le contr le d addition des solutions
164. uidelines for specific information on probe reactivity A complete list of probe and primer specificities is available All probes are designed to hybridize specifically with their complementary sequence at the level of one mismatch unless stated otherwise in the list Test sensitivity Results obtained during an internal evaluation of a dilution series of 3 DNA samples varying from 0 01 ug ul to 2 ug ul recommended the use of DNA with a minimum concentration of 0 1 ug l The external performance evaluation included 347 DNA samples with a concentration between 20 ng ul and 1500 ng ul and with a purity A260nm A280nm gt 1 5 The DNA was diluted to a concentration between 20 ng ul and 250 ng ul prior to INNOGENETICS 18 amplification No amplification failures were encountered although repeat testing was needed for 2 samples from one center Precision Internal data Three samples were tested in quadruplicate by two different persons using the manual method or by one person on two different Auto LiPA instruments Two samples were analyzed on three different lots in two different runs Interpretation of the results was the same for all samples Probe reactivities were comparable in all cases External validation Inter lot variability was assessed by analyzing a proficiency panel 5 samples with known reactivity and interpretation with two different batches of product For each sample the same typing result was obtained
165. uita in modo tale che sia il liquido che le strisce si spostino avanti e indietro nella vaschetta senza che il liquido venga versato oltre i bordi delle vaschette Non coprire il vassoio portavaschetta Durante l ibridazione e le incubazioni di lavaggio stringente le vaschette possono essere lasciate scoperte nel bagnomaria La copertura delle vaschette con copripiastra adesivo pu causare contaminazione incrociata Indicazioni per il cambio manuale del liquido nelle vaschette Il liquido viene aspirato dalla vaschetta tramite una pipetta preferibilmente collegata ad un aspiratore a vuoto La vaschetta viene tenuta inclinata in modo da permettere a tutto il liquido di fluire verso un estremit della vaschetta A Aggiungere 2 ml della soluzione appropriata a ciascuna vaschetta e seguire il protocollo Una pipetta a ripetizione Eppendorf utile a questo scopo Ripetere questo passaggio tante volte quanto indicato nella procedura del test NOTA Non lasciare che le strisce si asciughino tra due lavaggi Assicurarsi di non danneggiare la superficie delle strisce durante l aspirazione Aspirare il liquido nella parte superiore della striscia sopra la linea di identificazione Assicurarsi che tutto il liquido sia stato aspirato Avere cura che l intera striscia sia accuratamente lavata mediante completa immersione nella soluzione Adattare la velocit dell agitatore quando necessario Note e precauzioni Sol
166. ul recomendou o uso de ADN com uma concentrac o minima de 0 1 ug ul A avaliac o externa do kit incluiu 347 amostras de ADN com uma concentrac o entre 20 e 1500 ng ul e uma pureza Azgonm Azgonm 1 5 O ADN foi dilu do at uma concentra o entre 20 ng ul e 250 ng ul antes da amplifica o N o se encontraram falhas na amplificac o ainda que duas amostras tenham tido que ser tipadas duas vezes num dos centros Precis o Dados internos Tr s amostras foram ensaiadas em quadriplicado por duas pessoas distintas utilizando o m todo manual ou por uma pessoa em dois Auto LiPA distintos Duas amostras foram analisadas em tr s lotes distintos em dois ensaios diferentes A interpretac o dos resultados foi a mesma para todas as amostras A reactividade das sondas foi compar vel em todos os casos Validac o externa A varia o inter lote foi avaliada analisando um painel de profici ncia cinco amostras com reactividade e interpreta o conhecidas com dois lotes INNOGENETICS 80 distintos do producto Para cada amostra obteve se o mesmo resultado independentemente do lote utilizado A varia o inter laborat rio foi avaliada analisando o mesmo painel de profici ncia em quatro centros distintos Cada um deles obteve os mesmos resultados para as cinco amostras Desempenho do testo utilizando ADN obtido com solu o de iniciadores HLA Bw4 O desempenho da solu o de iniciador HLA Bw4 do INNO LiPA HLA B Multip
167. uma vez com 2 ml de tamp o substrato 4 Adicione 2 ml da solu o de substrato de trabalho a cada cavidade e incube durante 30 minutos agitando o suporte no agitador CUIDADO Utilize luvas e culos de protecc o 5 Pare a revelac o da cor lavando as tiras duas vezes com 2 ml de agua destilada agitando o suporte no agitador durante pelo menos 3 minutos 6 Utilize pincas para retirar as tiras das cavidades e coloque as mesmas em papel absorvente Espere at as tiras estarem totalmente secas e s depois proceda leitura dos resultados Armazene em lugar escuro as tiras secas e processadas Procedimento de teste automatizado Auto LiPA O procedimento de teste LiPA muito apropriado para a automatizac o O que significa que o Auto LiPA foi desenvolvido para controlar totalmente as etapas da hibridizag o da lavagem rigorosa e da revelac o da cor O Auto LiPA caracteriza Se por ser um instrumento independente com aquecimento refrigerag o aspirac o e pipetac o automatizados O protocolo standard para o Auto Lipa 48 indica a execu o de at 24 amostras quando se utiliza uma nica tira por cavidade Contudo este n mero pode ser aumentado at um m ximo de 48 Para executar este n mero dever o ser testadas duas tiras do mesmo loco numa cavidade mantendo na mesma todos os outros par metros do protocolo De notar tamb m que poder o ser observadas ocasionalmente reactividades de sonda fracas Por esse motivo os utili
168. upo de alelos calculou se como a percentagem de concord ncia observada com ensaios de ADN alternativos Biotest ELPHA HLA AB LowRes Typing kit Dynal SSP LiPA HLA B sequ nciac o Micro SSP OLERUP SSP Biotest HLA B SSP Os resultados do INNO LiPA HLA B Update foram considerados concordantes com o ensaio de refer ncia quando os dois resultados foram id nticos se o resultado do INNO LiPA HLA B Update foi mais especifico que o resultado de refer ncia ou quando os resultados do INNO LiPA HLA B Update mostraram menor resolu o mas um resultado correcto em comparac o com os m todos de refer ncia A exactid o foi de 100 342 342 79 INNO LiPA HLA B Update Plus Resolug o vers o v1 0 2001 03 31 da tabela de tipagem O kit INNO LiPA HLA B Update est pensado para determinar alelos HLA B a nivel de grupo de alelos Grupo de alelos a designac o dos dois primeiros d gitos que se seguem ao asterisco na nomenclatura HLA standard p e HLA B 07 Al m disso o kit est pensado para determinar os seguintes alelos nulos 0808N ex n 3 1526N ex n 3 e 5111N ex n 4 A resoluc o a nivel de grupo de alelos observada durante este estudo foi do 92 4 316 342 As ambiguidades observadas foram B 08xB 51 ou B 08xB 78 8 casos B 15xB 35 ou B 15xB 15 2 casos B 35xB 38 ou B 39xB 53 2 casos B 08xB 38 ou B 08xB 39 2 casos B 15xB 51 ou B 15xB 52 ou B 15xB 78 2 casos B 35xB 51 ou B 53xB 78 2 casos B 35xB 38 ou B
169. uzione per un numero di campioni fino a 24 quando si usa una singola striscia per vaschetta Questo numero comunque pu essere aumentato fino a 48 Per eseguire questo due strisce dallo stesso locus vengono testate nella stessa vaschetta mantenendo tutti gli altri parametri del protocollo immutati Da notare per che occasionalmente possono essere osservate reattivit pi deboli delle sonde Quindi ai clienti che intendono aumentare il numero di campioni consigliamo di validare questa procedura di 2 strisce in una vaschetta nel proprio laboratorio Per maggiori informazioni e protocolli specifici dell Auto LiPA si prega di contattare il proprio distributore locale Risultati Lettura La Figura 1 illustra la posizione delle diverse sonde oligonucleotidiche sulle strisce INNO LiPA HLA B Update Plus Una linea considerata positiva quando appare una netta banda viola marrone al termine della procedura del test Figura 1 vedere pagina 15 Posizione della linea di identificazione linea marrone sulla Striscia 1 e linea cromata sulla Striscia 2 linea di controllo del coniugato conj control linea di controllo HLA B Update Plus controllo HLA B e delle 66 sonde DNA sequenza specifiche delle strisce INNO LiPA HLA B Update Plus Validazione Includere un controllo negativo e il Controllo LiPA per INNO LiPA HLA B Update Plus ogni volta che si esegue un test Come per ogni nuova procedura l aggiunta di ulteriori controlli posit
170. x o 2 ou outros alelos HLA B n o ser o amplificados excepc o dos alelos B 4411 B 4703 e B 5708 O INNO LiPA HLA B Update Plus foi desenvolvido para dar a melhor resoluc o poss vel usando o formato de ensaio da hibridizac o invertida ao nivel do grupo de alelos isto significa que os primeiros dois d gitos depois do asterisco no nome do alelo correspondem nomenclatura HLA estandardizada por exemplo HLA B 07 Al m da interpretag o do grupo de alelos o software dar todas as combinag es poss veis de alelos No entanto esta informa o deve ser considerada como informa o adicional e n o como sendo informag o decisiva Reagentes Descrig o preparac o para utilizac o e condic es de conservac o recomendadas Os reagentes abertos ou fechados permanecem est veis at data limite de validade do kit se os mantiver a uma temperatura de 2 8 C e estiverem guardados nos frascos originais N o congele os reagentes N o utilize os reagentes para al m da data de validade N o se deve guardar o kit junto de qualquer fonte de contamina o de ADN em especial de produtos amplificados A temperatura de todos reagentes deve ser elevada temperatura ambiente 20 25 C aproximadamente 60 minutos antes da utilizac o e recolocados imediatamente no frigor fico ap s o uso Altera es na apar ncia f sica dos reagentes do kit podem indicar instabilidade ou deteriorac o E recomend vel guardar o tu
171. zadores que pretendam aumentar o n mero de amostras a testar s o alertados para validar este procedimento de 2 tiras numa cavidade no seu laborat rio Para mais informag es sobre protocolos espec ficos do Auto LiPA contacte o seu distribuidor local Resultados Leitura A figura 1 mostra a posic o das diferentes sondas de oligonucle tidos nas tiras de INNO LiPA HLA B Update Plus Uma linha considerada positiva quando no final do teste aparecer uma faixa de cor p rpura castanho claro TT INNO LiPA HLA B Update Plus Figura 1 ver p gina 15 Lugar da linha de marcac o linha castanha na tira 1 e linha cromo na tira 2 da linha de controlo do conjugado controlo conj da linha de controlo HLA B Update Plus controlo HLA B e das 66 linhas de sondas de ADN especificas da sequ ncia nas tiras INNO LiPA HLA B Update Plus Validag o Inclua um controlo negativo e um controlo LIPA para INNO LiPA HLA B Update Plus cada vez que realize um teste Tal como sucede com qualquer outro novo procedimento de teste at se ter alcan ado um grau de confianca mais elevado quanto a execuc o correcta do procedimento do teste deve ser considerada a inclus o de controlos positivos e negativos adicionais Recomenda se a utilizag o de ADN de refer ncia para validar as condic es adequadas estabelecidas As linhas superiores nas tiras de INNO LiPA HLA B Update Plus figura 1 s o as linhas de marcac o a linha castanha e cromo Est

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