Foglietto illustrativo del saggio MiSeqDx Cystic - Support
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1.2. 18 6 6 6 0 0 Totale di tutte le varianti PA inclusi i dati 2580 23 PolyTG PolyT nella Tabella 15 Totale di tutti i WT NA 2571132 gt Totale di tutti i WT e varianti OA 2873712 25 I campioni non sono stati sottoposti nuovamente a test di concordanza 100 99 22 99 70 99 70 Un replicato ciascuno dei campioni 5 e 75 ha registrato una percentuale di identificazione dello 0 Ulteriori indagini indicavano che esisteva la possibilit che i campioni non fossero stati aggiunti alla piastra campioni prima della preparazione della libreria Duranta la revisione era probabile che i campioni 9 e 10 fossero stati scambiati dall operatore prima della preparazione della libreria Escludendo le varianti PolyTG PolyT la concordanza positiva PA era del 99 60 Tabella 15 Riproducibilit PolyTG PolyT per il Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing N di risultati Concordanza identificazioni Tutti i centri Pannello Campione Genotipo Per Tutti i Centro Centro Centro Nessuna Identificazioni centro centri 1 2 3 identificazione errate TG 12 T 7 TG 12 T 7 6 18 6 6 6 0 0 TG 10 T 9 TG 10 T 7 TG 10 T 7 TG 10 1 9 1 nen ARE oa e ee e OOO e e E AR ee EE gt lip Pe p gt P prp 57 N codice 15038344 Rev A ITA di concordanza 100 100 100 94 44 94 44 100 Aprile 2014 Saggio MiSegDxM Cystic Fibrosis Clinical Sequencing N di risultati Concordanza identificazioni Tutti i cent
3. Coordinate non identificate Gli utenti devono valutare le posizioni non identificate rispetto alle informazioni rilevanti sulla variante per identificare le varianti che possono essere state non identificate e rispetto alle frequenze di popolazione corrispondenti per determinare se necessario ripetere il campione 3 Il risultato ottenuto viene considerato valido solo se la percentuale di identificazione gt 99 Se la percentuale di identificazione inferiore a 99 la prestazione verr riportata come Fail Non superato e il campione deve essere ripetuto 4 Si raccomanda all utente di verificare qualsiasi variante che non rientra in ci che stato convalidato nello studio di accuratezza vedere Accuratezza a pagina 23 usando un metodo di riferimento convalidato prima di refertare il primo risultato del paziente con quelle varianti Aprile 2014 N codice 15038344 Rev A ITA 21 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing NOTA quando vengono rilevate due o pi varianti deve essere presa in considerazione la determinazione delle fasi phasing per l aplotipo Tutte le interpretazioni delle varianti devono essere eseguite da un genetista molecolare certificato o equivalente attendendosi alle procedure e linee guida locali I riferimenti potenziali per l interpretazione includono ma non sono limitati a database CFTR2 2 3 classificazione di Sosnay linee guida 2004 dell ACMG e opinione 2011 della commissione ACOG P
4. Sequencing Nel campo Worklist Name Nome lista di lavoro immettere il nome per il foglio campioni Se per il nome del foglio campioni viene utilizzato l ID alfanumerico del codice a barre della cartuccia di reagenti il software operativo MiSeq MOS trover automaticamente il foglio campioni Se per il foglio campioni viene utilizzato un qualsiasi altro nome il pulsante Browse Sfoglia nel software operativo MiSeq MOS pu essere utilizzato per trovare il foglio campioni corretto Opzionale Immettere una descrizione per identificare la corsa Assicurarsi che la data corrisponda alla data di inizio della corsa Selezionare Next Avanti Inserimento di informazioni sui campioni 1 4 5 Nella scheda Table Tabella o nella scheda Plate Piastra inserire le seguenti informazioni per ciascun pozzetto contenente campione a Sample ID ID campione inserire un ID campione univoco b Index 1 e Index 2 Indice 1 e Indice 2 specificare l adattatore dell indice che verr utilizzato per ogni Lettura indici Opzionale Per registrare informazioni pi dettagliate sui campioni inserire il nome e la descrizione di un campione Opzionale Per identificare i controlli sulla piastra selezionare Negative Negativo o Positive Positivo dal menu a discesa Control Controllo Andare alla scheda Plate Graphic Schema piastra e utilizzare l opzione Copy to Clipboard Copia in appunti o Print Stampa per acquisire un immagine dell
5. et al 2008 Edition Revised 03 2011 American College of Medical Genetics Standards and Guidelines for Clinical Genetic Laboratories 17 Rehm HL Bale SJ Bayrak Toydemir P Berg JS Brown KK Deignan JL et al 2013 ACMG clinical laboratory standards for next generation sequencing Genetics in Medicine Genetics in Medicine 15 9 733 747 Brevetti e marchi registrati Questo documento e il suo contenuto sono di propriet di Illumina Inc e delle aziende a essa affiliate Illumina e sono destinati esclusivamente a uso contrattuale da parte dei clienti di Illumina per quanto concerne l utilizzo dei prodotti qui descritti con esclusione di qualsiasi altro scopo Questo documento e il suo contenuto non possono essere usati o distribuiti per altri scopi e o in altro modo diffusi resi pubblici o riprodotti in alcun modo senza preventiva approvazione scritta da parte di Illumina Mediante questo documento Illumina non trasferisce alcuna licenza sui propri diritti su brevetti marchi di fabbrica copyright o diritti secondo il diritto consuetudinario n alcun diritto similare di alcun terzo AI fine di assicurare un uso sicuro e corretto dei prodotti qui descritti le istruzioni riportate in questo documento devono essere scrupolosamente ed esplicitamente seguite da personale qualificato e adeguatamente addestrato Leggere e comprendere a fondo tutto il contenuto di questo documento prima di usare tali prodotti LA LETTURA INCOMPLETA DEL CONTEN
6. Cominciare a scongelare la cartuccia di reagenti MiSeqDx Preparazione di una soluzione di diluizione fresca di NaOH x y ATTENZIONE L utilizzo di una soluzione di diluizione fresca di NaOH essenziale per denaturare completamente i campioni in vista della generazione dei cluster sul dispositivo MiSeqDx 1 Combinare i seguenti volumi in una provetta per microcentrifuga Acqua priva di DNAsi e di RNAsi 900 pl 1 0 N di NaOH 100 pl 2 Capovolgere la provetta diverse volte per miscelare Denaturazione e diluizione del controllo interno PhiX 1 Combinare i seguenti volumi per diluire la libreria del controllo interno PhiX a 2 nM Libreria del controllo interno PhiX da 10 nM 2 pl 1X tampone TE 8 pl 2 Combinarei seguenti volumi per ottenere una libreria del controllo interno PhiX da 1 nM Libreria del controllo interno PhiX da 2 nM 10 pl 0 1 N NaOH 10 pl 3 Inserire brevemente in un agitatore per miscelare la soluzione della libreria del controllo interno PhiX da 1nM 4 Centrifugare la soluzione di templato a 280 x g a 20 C per 1 minuto 5 Incubare per 4 5 minuti a temperatura ambiente per denaturare la libreria del controllo interno PhiX in filamenti singoli 6 Aggiungere il seguente volume di tampone di diluizione libreria pre raffreddato nella provetta contenente la libreria del controllo interno PhiX denaturata per ottenere una libreria del controllo interno PhiX da 20 pM Libreria del controllo interno PhiX denaturata 20 pl Tampo
7. Regione Nome Nome Tipo di gene Campioni Identificazioni Identificazioni comune Nome cDNA variante CFTR Campioni e Campioni non riuscite errate cDNA Coordinata hg19 clinici cellulari sintetici N codice 15038344 Rev A ITA Concordanza positiva 100 100 Aprile 2014 Saggio MiSegDxM Cystic Fibrosis Clinical Sequencing 33 Genotipo Regione Identificazioni positive varianti Nome Nome Tipo di gene c FARE Identificazioni Identificazioni ata ampioni TORO iano comune Nome cDNA variante CFTR Campioni lince Campioni non riuscite errate cDNA Coordinata hg19 clinici cellulari sintetici nere ewe w eee a a e N codice 15038344 Rev A ITA Concordanza positiva 100 100 100 100 100 Aprile 2014 Saggio MiSegDxM Cystic Fibrosis Clinical Sequencing 34 Genotipo Regione Identificazioni positive varianti Nome Nome Tipo di gene FRE Identificazioni Identificazioni Concordanza ta Campioni ua sat ma comune Nome cDNA variante CFTR Campioni linee Campioni non riuscite errate positiva cDNA Coordinata hg19 clinici sintetici cellulari F1052V esee E e E o a o amor O w sem 6 a 0 e Pea sv mn 000 ema sv rem 010 e E CI E Y1092X c 3276C gt G SNV Esone20 1 100 C gt G R1066C G1069R R1070Q W1089X N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSegDxM Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Genotipo Regione Identifi
8. WT era gt 99 99 e la concordanza complessiva OA per tutte le posizioni riportate era gt 99 99 23 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Accuratezza complessiva per il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Genotipo Regione Identificazioni positive varianti Nome Nome Tipo di gene Campioni Identificazioni Identificazioni Concordanza comune Nome cDNA variante CFTR TA i Campioni non riuscite errate positiva cDNA Coordinata hg19 cellulari sintetici amwe e n o e a o aer o w E a I amor o w m e e I mon o w s I e d mon o w o a a e o d moa o w E a 24 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSegDxM Cystic Fibrosis Clinical Sequencing 25 Identificazioni positive varianti Genotipo Regione Nome Nome Tipo di gene c FRE Identificazioni Identificazioni Concordanza i a ampioni PO iaia BS comune Nome cDNA variante CFTR Campioni linee Campioni non riuscite errate positiva cDNA Coordinata hg19 clinici cellulari sintetici 457TAT gt G c 325_327 DIV Esone4 i delTAT insG RII7C esscr SNV Bone a o oo o o o N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSegDxM Cystic Fibrosis Clinical Sequencing 26 Genotipo Regione Identificazioni positive varianti Nome Nome Tipo di gene FRE Identificazioni Identificazioni Concordanza ta Campioni ua sat ma comune Nome cDNA variante CFTR Campio
9. e eee z oowoo e 6 e e e A DD I I O a A VV I I I Totale varianti PolyTG PolyT PA 97 83 Tutti i 18 campioni concordavano fra loro ma discordavano dal sequenziamento bidirezionale Sanger w 61 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Estrazione del DNA Tre diversi metodi di estrazione usati comunemente e disponibili in commercio estrazione mediante microsfere magnetiche precipitazione alcolica e isolamento mediante colonna di gel di silice sono stati valutati utilizzando sangue intero anticoagulato in K EDTA Nel corso dello studio sono stati utilizzati complessivamente 14 campioni di sangue due erano wild type mentre i rimanenti campioni erano portatori dei genotipi unici rappresentanti nove varianti diverse inclusi varianti comuni e rare Per i polimorfismi PolyTG PolyT sono stati inclusi campioni con T 5 9 e TG 10 12 I tre metodi di estrazione del DNA sono stati analizzati indipendentemente da due diversi operatori e ciascuno di loro ha eseguito tre corse per ciascun metodo di estrazione Ciascuna estrazione stata eseguita da ciascun operatore in giorni diversi La concentrazione di DNA e il rapporto A260 A280 dei campioni di gDNA estratto sono stati determinati usando spettrofotometria La dimensione complessiva dei campioni per ciascun metodo di estrazione esaminato nello studio stato pari a 168 14 campioni x 2 operatori metodo di estrazione x 3 cor
10. g accettabile Pipette di precisione necessaria una serie di pipette di precisione Come specificato sopra nell area di post amplificazione necessario un altro set L utilizzo di pipette di precisione necessario per assicurare un erogazione accurata di reagente e campione E possibile utilizzare sia pipette monocanale che multicanale se calibrate regolarmente e precise entro un margine del 5 del volume stabilito Materiali di consumo sono necessari i seguenti materiali di consumo Piastre skirted per PCR a 96 pozzetti 0 2 ml polipropilene o equivalente NOTA assicurarsi che la piastra a 96 pozzetti sia compatibile con il supporto magnetico Piastre di conservazione a 96 pozzetti 0 8 ml piastre MIDI Bacinella per soluzione in PVC priva di DNAasi e RNAasi vaschetta 10 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Sigillo adesivo in alluminio Sigillo per piastre PCR appropriato Punte di pipette dotate di barriera aerosol Apparecchiatura e materiali per post amplificazione 1 Termociclatore necessario un termociclatore Il termociclatore deve essere dotato di un coperchio riscaldato e soddisfare le seguenti specifiche di prestazione Intervallo di controllo della temperatura da 4 C a 99 C Accuratezza del controllo 0 25 C da 35 C a 99 C 2 Agitatore per micropiastre nell area adibita al laboratorio post amplificazione necessario un agitatore di
11. introniche fiancheggianti Cento nucleotidi di sequenza intronica alle regioni 5 e 3 non tradotte Due mutazioni introniche profonde 1811 1 6kbA gt G 3489 10kbO gt T La sequenza PolyTG PolyT si trova nell introne 9 Un totale di 5 206 posizioni regioni delle possibili 188 702 coppie di basi nel gene 2 Per uso diagnostico in vitro I risultati ottenuti usando il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Illumina dovrebbero essere usati e interpretati nel contesto di una valutazione clinica completa 3 Il saggio progettato per sequenziare le regioni di codifica delle proteine e i confini introne esone del gene CFTR e non comprende tutte le regioni introniche e le delezioni ampie Pertanto un risultato complessivo moana Aprile 2014 N codice 15038344 Rev AITA 5 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing wild type non garantisce che nei campioni analizzati non siano presenti altre varianti mutazioni del regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica CFTR Il saggio progettato per rilevare due delezioni ampie specifiche CFTRdele2 3 e CFTRdele22 23 Non saranno rilevate o segnalate altre delezioni ampie Il saggio convalidato solo per inserzioni e le delezioni fino a e includendo 3bp in dimensione 4 La frequenza delle varianti identificate mediante questo saggio varia fra le diverse popolazioni Con questo saggio non possibile convalidare tutte le combinazioni delle varianti che pos
12. la J notte oppure pu essere conservata a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C per massimo 48 ore Pulizia della PCR Preparazione 1 Portare le microsfere per la pulizia della PCR a temperatura ambiente 2 Preparare al momento etanolo all 80 a partire dall etanolo assoluto Procedura 1 Centrifugare la piastra AMP a 1 000 x g a 20 C per 1 minuto 2 Impostare una nuova piastra MIDI di seguito definita piastra CLP 3 Capovolgere 10 volte le microsfere per la pulizia della PCR Agitare energicamente e quindi capovolgere altre 10 volte Controllare visivamente la soluzione per assicurarsi che le microsfere siano risospese 4 Aggiungere 45 ul di microsfere per la pulizia della PCR a ogni pozzetto di campione della piastra CLP 5 Trasferire l intero prodotto per PCR dalla piastra AMP alla piastra CLP 6 Sigillare la piastra CLP e agitare su un agitatore per micropiastre a 1 800 rpm per 2 minuti 7 Incubare a temperatura ambiente senza agitare per 10 minuti 8 Posizionare la piastra su un supporto magnetico per un minimo di 2 minuti o fino alla scomparsa del surnatante 9 Con la piastra CLP sul supporto magnetico rimuovere attentamente e smaltire il surnatante 10 Con la piastra CLP sul supporto magnetico lavare le microsfere come segue a Dispensare 200 pl di etanolo all 80 appena preparato in ogni pozzetto contenente il campione b Incubare la piastra sul supporto magnetico per un minimo di 30 secondi o finch il surnatante l
13. minuto f La piastra stabile per un massimo di 3 ore a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C Aprile 2014 N codice 15038344 Rev A ITA 17 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Normalizzazione della libreria Preparazione 1 Preparare 0 1N di NaOH fresco 2 Portare il diluente normalizzazione libreria le microsfere libreria e il lavaggio di normalizzazione della libreria a temperatura ambiente 3 Agitare il diluente normalizzazione libreria energicamente e assicurarsi che tutti i precipitati si siano completamente sciolti 4 Agitare le microsfere libreria energicamente per 1 minuto con inversione intermittente fino a risospensione delle microsfere e assenza di pellet sul fondo della provetta quando quest ultima viene capovolta Procedura 1 Miscelare il diluente normalizzazione libreria e le microsfere libreria in una provetta nuova da 1 5 ml come segue a Dispensare 394 ul di diluente normalizzazione libreria b Pipettare le microsfere libreria su e gi 10 volte per risospenderle 4 NOTA E fondamentale risospendere completamente il pellet di microsfere della libreria in fondo alla provetta L uso di una provetta P1000 garantisce che le microsfere vengano risospese in modo omogeneo e che non ci sia massa di microsfere sul fondo della provetta Questo fondamentale per ottenere una densit dei cluster omogenea sulla cella a flusso c Pipettare 72 ul di microsfere libreria nella provetta contenente diluente normali
14. preparati Se conservato il pool di ampliconi diluiti pu comportare una riduzione significativa della densit dei cluster Apparecchiatura e materiali Apparecchiatura e materiali di consumo forniti venduti separatamente 1 2 3 4 Strumento MiSeqDx n catalogo DX 410 1001 Kit TruSeq Index Plate Fixture n di catalogo FC 130 1005 Kit TruSeq Index Plate Fixture amp Collar n di catalogo FC 130 1007 Tappi sostitutivi per adattatore indice n di catalogo DX 502 1003 Apparecchiatura e materiali richiesti non forniti Apparecchiatura e materiali per pre amplificazione 1 Blocco termico necessario un blocco termico per una piastra a 96 pozzetti Il blocco termico deve soddisfare le seguenti specifiche di prestazione Sono accettabili i blocchi termici con coperchi riscaldati Intervallo di temperatura ambiente da 5 C a 99 C Regolazione della temperatura 0 1 C a 37 C 0 4 C a 60 C Incubatore di campioni necessario un incubatore forno per ibridazione L incubatore deve soddisfare le seguenti specifiche di prestazione Intervallo di temperatura da 10 C a 100 C Regolazione della temperatura 0 2 C Centrifuga da tavolo necessaria una centrifuga da tavolo in grado ci mantenere la temperatura di 20 C Come specificato sopra nell area di post amplificazione necessaria un altra centrifuga Qualsiasi centrifuga per piastre che raggiunga le velocit previste dal protocollo da 280 a 2 400 x
15. reagenti MiSeqDx saggio CF Clinical Sequencing 6 cartucce Cartuccia monouso che contiene i reagenti per la generazione dei cluster e il sequenziamento da utilizzarsi con MiSegDx compresi formammide 2 mercaptoetanolo e DMSO lt 2 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Scatola 3 Tabella 6 Scatola 3A Reagenti pre amplificazione Componente Quantit x ole Sl Ingredienti attivi riempimento Tampone di lavaggio 1 flacone 24 ml Soluzione acquosa tamponata contenente stringente sali 2 mercaptoetanolo e formammide Tampone di lavaggio 1 provetta 4 8 ml Soluzione acquosa tamponata contenente universale Aprile 2014 sali Conservazione tra 25 C e 15 C tra 25 C e 15 C tra 25 C e 15 C tra 25 C e 15 C tra 25 C e 15 C tra 25 C e 15 C tra 25 C e 15 C Conservazione tra 25 C e 15 C tra 25 C e 15 C tra 25 C e 15 C Conservazione tra 25 C e 15 C Conservazione tra 2 C e 8 C tra 2 C e 8 C N codice 15038344 Rev A ITA 7 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Tabella Scatola 3B Reagenti post amplificazione Componente Quantit ni Ingredienti attivi Conservazione Microsfere per la 1 provetta 5 ml Soluzione acquosa tamponata contenente tra 2 C e 8 C pulizia della PCR microsfere paramagnetiche in fase solida e polietilene glicole Lavaggio di 2 provette 4 8 ml Soluzione acquosa tamponata co
16. standard e Tampone TE e Acqua priva di DNasi e di RNasi Reagenti post amplificazione e 10 N NaOH preparare da compresse o con una soluzione standard e Etanolo 200 proof vol 100 per biologia molecolare e Tampone TE 8 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing e Acqua priva di DNasi e di RNasi Conservazione e manipolazione 1 Per temperatura ambiente si intende la temperatura compresa fra 15 C e 30 C 2 Ireagentielencati di seguito sono spediti congelati e rimangono stabili se conservati a una temperatura fra 25 C e 15 C fino alla data di scadenza specificata Saggio CF Clinical Sequencing pool di oligonucleotidi Tampone di ibridazione Miscela di estensione ligazione Primer indice C A503 D A504 e E A505 Primer indice 1 A701 2 A702 e 10 A710 PCR polimerasi Master Mix per PCR Diluente normalizzazione libreria Tampone di diluizione libreria Controllo interno PhiX Cartuccia di reagenti MiSeqDx saggio CF Clinical Sequencing A eccezione della cartuccia di reagenti i reagenti rimangono stabili per un massimo di 6 cicli di congelamento scongelamento effettuati prima della data di scadenza specificata Non ricongelare la cartuccia di reagenti una volta scongelata Pu essere conservata per un massimo di 6 ore a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C 3 Ireagenti elencati di seguito sono spediti refrigerati e rimangono stabili se conser
17. una coorte di 364 890 individui testati per il portatore senza anamnesi familiare di fibrosi cistica Tabella 1 Frequenza generale del portatore della mutazione della fibrosi cistica in diversi gruppi etnici negli Stati Uniti Gruppo etnico Frequenza del portatore osservata Afroamericano 1 su 84 Ebrei aschenaziti 1su29 Asiatico 1 su 242 Caucasico 1 su 28 Ispanico 1su59 Ebreo 1 su 32 Medio orientale 1 su 91 Nativo americano 1 su 70 Sudasiatico 1 su 118 Altra etnia 1 su 111 gt 1 etnicit 1su34 Parte afroamericano 1 su 56 Parte caucasico 1 su 32 Parte ispanico 1su51 Non fornito 1 su 37 Tutti gli individui 1 su 38 Progettazione del saggio Tutte le regioni di codifica delle proteine nel gene CFTR inclusi 10 nt di sequenza intronica fiancheggiante sono rilevati per tutti gli esoni fatta eccezione di tre esone 7 10 e 20 Per l esone 7 e l esone 10 solo 5 nt di sequenza intronica fiancheggiante sono inclusi all estremit 5 dell esone per evitare Indel omopolimerici prossimali Per l esone 20 30 nt di sequenza intronica fiancheggiante sono inclusi all estremit 5 dell esone in grado di rilevare la mutazione 3272 26A gt G Inoltre il saggio rileva circa 100 nt di sequenza intronica fiancheggiante le regioni non tradotte UTR 5 e 3 2 profonde mutazioni introniche 1811 1 6kbA gt G 348 10kbC gt T 2 ampie delezioni CFTRdele2 3 CFTRdele22 23 e la regione PolyTG PolyT La copertura completa del saggio mostrata nelle posizioni dell
18. 1 minuto 6 Inserire la piastra HYB nel blocco preriscaldato a 95 C e incubare per 1 minuto 7 Ridurre la temperatura del blocco termico a 40 C e continuare a incubare fino a quando il blocco termico raggiunge 40 C circa 80 minuti Il raffreddamento graduale essenziale per un ibridazione corretta pertanto per questo processo non si consigliano termociclatori per PCR con raffreddamento attivo ad es Peltier raffreddato termoelettricamente PUNTO DI ARRESTO SICURO Quando il blocco termico raggiunge i 40 C la piastra HYB stabile a una temperatura di 40 C per 4 2 ore Rimozione degli oligonucleotidi non legati Preparazione 1 Portare la miscela di estensione ligazione il tampone di lavaggio stringente e il tampone di lavaggio universale a temperatura ambiente e agitare brevemente 2 Assemblare l unit piastra filtro d ora in avanti denominata FPU nell ordine dall alto verso il basso coperchio piastra filtro colletto adattatore e piastra MIDI 3 Pre lavare la membrana della piastra filtro come segue a Dispensare 45 u di tampone di lavaggio stringente in ciascun pozzetto b Coprire la piastra filtro con il coperchio e centrifugare a 2 400 x g a 20 C per 5 minuti Procedura 1 Estrarre la piastra HYB dal blocco termico e centrifugare a 1 000 x g a 20 C per 1 minuto 2 Trasferire tutto il volume di ciascun campione circa 55 ul nei corrispondenti pozzetti della piastra filtro 3 Coprire la piastra filtro con il co
19. Insertion Variant variante delezione inserzione I campioni non sono stati analizzati nuovamente Il software non riporta il nome cDNA per questa coordinata genomica Il report Sanger elencava la variante P2055 come eterozigote per il campione clinico Una revisione dei dati ottenuti dalla traccia Sanger indicava tuttavia che la variante era in effetti omozigote e riportata correttamente MiSeqDx ha riportato la variante come omozigote Uno dei risultati discordanti provenivano dallo studio di riproducibilit Il risultato PolyTG PolyT per il campione era concordante su tutti i 18 replicati ma discordante con il sequenziamento bidirezionale Sanger stato determinato che il campione eterozigote sintetico originale era stato preparato impropriamente Quando stato analizzato successivamente dopo essere stato preparato usando lo stesso plasmide stato rilevato La concordanza positiva PA escludendo le identificazioni PolyTG PolyT era del 100 8 Un campione eterozigote sintetico per l esone 8 stato riportato come eterozigote per la variante dele22 23 del gene CFTR Ulteriori indagini hanno rilevato che questo risultato proveniva da un livello di contaminazione ridotto Inoltre per il secondo campione i primer Sanger non hanno rilevato completamente la variante Q14630 a causa di Indel a monte e a valle del sito della variante Tabella 13 Accuratezza della variante PolyTG PolyT per il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical S
20. Nome cDNA variante CFTR Campioni lince Campioni non riuscite errate cDNA Coordinata hg19 clinici cellulari sintetici 1507del c 1519_1521 DIV Esone11 4 2 delATC erv ae aw emn 0 1 e o e delTA S549R c 1645A gt C SNV Esone12 1 c 1645A gt C N codice 15038344 Rev A ITA Concordanza positiva 100 100 100 100 100 100 100 Aprile 2014 Saggio MiSegDxM Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Identificazioni positive varianti Genotipo Regione Nome Nome Tipo di gene c FRE Identificazioni Identificazioni Concordanza A a ampioni PO Bois BS comune Nome cDNA variante CFTR Campioni linee Campioni non riuscite errate positiva cDNA Coordinata hg19 clinici cellulari sintetici c 1647T gt G 1812 1 c 1680 1G gt A SNV Esone13 2 100 G gt A 30 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSegDxM Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Genotipo Regione Identificazioni positive varianti Nome Nome Tipo di gene FRE Identificazioni Identificazioni Concordanza ta Campioni ua sat ma comune Nome cDNA variante CFTR Campioni linee Campioni non riuscite errate positiva cDNA Coordinata hg19 clinici cellulari sintetici c 2051_2052 DIV Esone14 3 1 delAAinsG 2184insA c 2052_2053 DIV Esone14 3 1 100 insA 31 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSegDxM Cystic Fibrosis Clinical Sequencing 32 Identificazioni positive varianti Genotipo
21. UTO DEL PRESENTE DOCUMENTO E IL MANCATO RISPETTO DI TUTTE LE ISTRUZIONI IVI CONTENUTE PU CAUSARE DANNI AL PRODOTTO LESIONI PERSONALI A UTENTI E TERZI E DANNI MATERIALI ILLUMINA NON SI ASSUME ALCUNA RESPONSABILIT DERIVANTE DALL USO IMPROPRIO DEI PRODOTTI QUI DESCRITTI COMPONENTI E SOFTWARE INCLUSI O DA QUALSIASI USO DI TALI PRODOTTI NON ESPLICITAMENTE CONTEMPLATO NELLE LICENZE SCRITTE O NELLE AUTORIZZAZIONI CONCESSE DA ILLUMINA IN OCCASIONE DELL ACQUISIZIONE DEI PRODOTTI STESSI DA PARTE DEL CLIENTE PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO 2012 2104 Illumina Inc Tutti i diritti riservati Illumina e MiSeqDx sono marchi o marchi registrati di Illumina Inc Tutti gli altri marchi e denominazioni qui citati sono di propriet dei rispettivi titolari AMPure Beckman e Beckman Coulter sono marchi di fabbrica o marchi registrati di Beckman Coulter Inc Informazioni di contatto dl Ilumina Emergo Europe San Diego California 92122 U S A Molenstraat 15 1 800 809 ILMN 4566 2513 BH L Aia 1 858 202 4566 fuori dal Nord America Paesi Bassi techsupport illumina com www illumina com Aprile 2014 N codice 15038344 Rev A ITA 64 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Etichettatura del prodotto Fare riferimento alla chiave dei simboli spediti con ciascun kit per un riferimento completo ai simboli che possono apparire sulla confezione e sull etichettatura del prodotto 65 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014
22. a piastra campioni Selezionare Finish Fine Ibridazione del pool di oligonucleotidi Preparazione 1 Portare a temperatura ambiente il saggio CF Clinical Sequencing pool di oligonucleotidi il tampone di ibridazione i campioni di DNA genomici e il campione di controllo positivo Inserire in un agitatore il saggio CF Clinical Sequencing pool di oligonucleotidi e il tampone di ibridazione e agitare vigorosamente per assicurarsi che tutti i precipitati si siano completamente disciolti quindi centrifugare brevemente le provette per raccogliere il liquido Impostare un blocco termico per piastra a 96 pozzetti su 95 C 14 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing 4 Preriscaldare un incubatore a 37 C 5 Creare la piastra campioni in base all immagine stampata da IWM Procedura 1 Impostare una nuova piastra PCR a 96 pozzetti di seguito definita piastra HYB 2 Aggiungere 5 ul di campione o controllo a 50 ng ul 250 ng totali ai pozzetti appropriati nella piastra HYB Seguire il layout della piastra generato per la corretta selezione dei pozzetti 3 Aggiungere 5 ul del saggio CF Clinical Sequencing pool di oligonucleotidi a tutti i pozzetti contenenti il DNA genomico 4 Aggiungere 40 ul di tampone di ibridazione a ogni campione nella piastra HYB Pipettare delicatamente su e gi 3 5 volte per miscelare 5 Sigillare la piastra HYB e centrifugare 1 000 x g a 20 C per
23. aggio del campione oppure una registrazione errata dei primer di indicizzazione Il saggio deve essere ripetuto completamente a cominciare dalla preparazione delle librerie Prima di iniziare a usare questo prodotto nel laboratorio dell utente le prestazioni del saggio devono essere verificate testando un numero di campioni positivi e negativi con caratteristiche delle prestazioni note Tutti i requisiti di controllo della qualit devono essere eseguiti in conformit alle regolamentazioni locali statali e o e ai requisiti di certificazione 22 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSeqDxTM Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Caratteristiche prestazionali Accuratezza L accuratezza del saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Illumina stata stimata valutando 500 campioni che rappresentano una vasta gamma di varianti del gene CFTR da quattro fonti separate La fonte principale dei dati di accuratezza stato uno studio di accuratezza clinica condotto usando un pannello di 366 campioni La maggior parte n 355 dei campioni consisteva di campioni clinici di gDNA archiviati anonimizzati e isolati da sangue umano i restanti 11 campioni sono stati ottenuti da campioni di linee cellulari disponibili in commercio I dati di questo studio sono stati integrati con i dati di accuratezza ottenuti da 68 campioni di linee cellulari nello studio di riproducibilit 14 campioni clinici ottenuti dallo studio di valutazione analit
24. anza posizione centro centri 1 2 3 IGCNIFCAZIORE errate I I s amn E O EE E I woa o E E EE E I men a I I I I Lesina ee ee CECO EOS EOS E CRE ERE EEE 54 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Risultati totali Concordanza identificazioni Totale tutti i centri Nome HGVS 0 Campione in mancanza Sas Nessuna sardi na 4 variante Per Tutti i Centro Centro Centro identificazi Identificazioni concordanza posizione centro centri 1 2 3 sti errate CEE LESENE rene ren ee eee EEA ea ven e e eee seme mer le nei CIME LEE esser ri eee 55 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSegDxM Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Risultati totali Concordanza identificazioni Totale tutti i centri Nome HGVS o g Nome Nessuna k Campione 9 AeA variante Per Tutti i Centro Centro Centro identificazi Identificazioni concordanza posizione centro centri 1 2 3 IGCNIFCAZIORE errate esser rasan ee eee rene ren ee eee CARE LEE EEE esser rasan eee VR E I E I O E e e o 56 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Risultati totali Concordanza identificazioni Totale tutti i centri Nome HGVS 0 A Nome Campione Centi variante Per Tutti i Centro Centro Centro id i Identificazioni posizione centro centri 1 2 3 tdentilicazio e errate 84 c 4389G gt A Q1463Q 6
25. ation to Screening Human Mutation 19 575 606 Moskowitz SM Chmiel JF Sternan DL Cheng E Gibson RL et al 2008 Clinical practice and genetic counseling for cystic fibrosis and CFTR related disorders Genetics in Medicine 10 12 851 868 Moskowitz SM Chmiel JF Sternen DL Cheng E Cutting GR CFTR related disorders Pagon RA Bird TC Dolan CR Stephens K editors GeneReviews Seattle WA University of Washington 2008 Disponibile alla pagina Web www ncbi nlm nih gov books NBK1250 Online Aggiornato il 19 febbraio 2008 Katkin JP 2012 Cystic fibrosis Clinical manifestations and diagnosis Disponibile alla pagina Web www uptodate com Online 7 dicembre 2012 Farrell PM Rosenstein BJ White TB Accurso FJ Castellani C et al 2008 Guidelines for diagnosis of cystic fibrosis in newborns through older adults Cystic Fibrosis Foundation consensus report J Pediatr 153 2 S4 S14 Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry Annual Data Report 2010 Cystic Fibrosis Mutation Database CFTR1 Disponibile alla pagina Web www genet sickkids on ca app Online agosto 2013 Committee on Genetics April 2011 The American College of Obstetricians and Gynecologists Committee Opinion Update on Carrier Screening for Cystic Fibrosis 486 1 4 Rohlfs EM Zhou Z Heim R Nagan N Rosenblum L et al 2011 Cystic Fibrosis Carrier Testing in an Ethnically Diverse US Population Clinical Chemistry 57 6 841 848 Sosnay PR Siklosi KR Van Goo
26. cazioni positive varianti Nome Nome Tipo di gene FRE Identificazioni Identificazioni Concordanza ta Campioni ua sat ma comune Nome cDNA variante CFTR Campioni linee Campioni non riuscite errate positiva cDNA Coordinata hg19 clinici cellulari sintetici W1204X c 3611G gt A SNV Esone22 i 100 c3611G gt A 35 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSegDxM Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Genotipo Regione Identificazioni positive varianti Nome Nome Tipo di gene FRE Identificazioni Identificazioni Concordanza ta Campioni ua sat ma comune Nome cDNA variante CFTR Campioni linee Campioni non riuscite errate positiva cDNA Coordinata hg19 clinici cellulari sintetici D1270N La _ eee la _ c 3884_3885 DIV Esone24 1 100 insT CFTR c 3964 78_ Del Introne24 1 1 100 dele22 23 4242 577del P1290P 4016insT 36 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Genotipo Regione Identificazioni positive varianti Nome Nome Tipo di gene Campini Identificazioni Identificazioni Concordanza comune Nome cDNA variante CFTR Campioni e Campioni non riuscite errate positiva cDNA Coordinata hg19 clinici cellular sintetici Totale di tutte le varianti PPA t 2072 3 4 99 66 Totale di tutti i WT NA 2600928 Il 25 gt 99 99 Totale di tutti i WT e varianti OA 2603000 4 6 gt 99 99 DIV un acronimo per Deletion
27. d Samples Caricamento campioni Fare attenzione a evitare di toccare la capsula sigillante durante l erogazione del campione Una volta caricato il campione verificare la presenza di bolle d aria nel serbatoio In caso di presenza di bolle d aria picchiettare delicatamente la cartuccia sul banco in modo da farle fuoriuscire 3 Passare direttamente alla procedura di impostazione della corsa usando l interfaccia del software operativo MiSeq MOS Interpretazione dei risultati Il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Illumina progettato per sequenziare le regioni di codifica delle proteine nel gene CFTR su 27 esoni tra 5 e 30 basi di sequenza intronica fiancheggiante circa 100 nt di sequenza intronica fiancheggiante le regioni non tradotte UTR 5 e 3 e due mutazioni introniche profonde 1811 1 6kbA gt G 3489 10kbC gt T Le esatte regioni sequenziate sono elencate nella Tabella 2 Inoltre il saggio riporta la variante PolyTG PolyT e 2 delezioni ampie CFTRdele2 3 CFTRdele22 23 1 Il report del saggio elenca i nomi dei campioni e il genotipo per ciascuna variante rilevata per un campione Per ciascuna variante sono riportati la coordinata genomica il nome cDNA della Human Genome Variation Society HGVS e il nome della proteina se disponibile Il tipo di variante identificata come una variante di singolo nucleotide SNV una variante di delezione inserzione DIV una variante PolyTGPolyT PolyTGPolyT o una delezione a
28. dentificato nel 1989 si trova sul braccio lungo del cromosoma 7 e contiene 27 esoni codificanti distribuiti su oltre 230 kb2 Un mRNA di 6 5 kb prodotto dall allele normale codifica il gene CFTR una proteina integrale di 1 490 aminoacidi situata sulla membrana che funziona come canale di cloro regolato nelle cellule epiteliali di pi organi 3 Attualmente sono state descritte oltre 1 900 varianti del gene CFTR Per la maggior parte si tratta di mutazioni puntiformi La variante del gene CFTR pi comune l allele F508del3 che rappresenta quasi il 70 di tutte le varianti del gene CFTR Tuttavia altre varianti comuni del gene CFTR spesso determinano un fenotipo CF e altre patologie correlate a CFTR 3 Aprile 2014 N codice 15038344 Rev A ITA 1 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing La fibrosi cistica ha un incidenza di malattia stimata pari a un caso ogni 2 000 4 000 nati vivi e una prevalenza di circa 30 000 individui nella popolazione statunitense Si verifica in tutte le etnie e razze con frequenze diverse un caso ogni 3 000 caucasici un caso ogni 9 200 ispano americani un caso ogni 10 900 nativi americani un caso ogni 15 000 afroamericani e un caso ogni 31 000 asioamericani24 Tuttavia l associazione tra un etnia e un individuo interessato sta diventando sempre pi difficile La Tabella 1 fornisce le stime attuali della frequenza dei portatori della mutazione del gene CFTR in base all etnia negli Stati Uniti basate su
29. determinare se l orientamento della variante PolyTG PolyT si trova in cis trans rispetto ad altre varianti Per i pazienti con una variante R117H dovrebbero essere eseguiti ulteriori test per determinare se una variante PolyTG PolyT che pu incidere sul fenotipo clinico ad es 12 13 TG o 5T in orientamento cis trans PolyTG PolyT sono regioni omopolimeriche note per essere difficili da sequenziare a causa dello scivolamento della polimerasi 9 Questo saggio progettato per essere eseguito esclusivamente in un formato 8 plex Se non sono disponibili 6 campioni clinici esclusi i controlli positivo e negativo includere quindi altri campioni di DNA genomico umano per completare la corsa Componenti del prodotto La piattaforma MiSegDx Illumina composta da e Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing n di catalogo DX 102 1001 e Strumento MiSeqDx N di catalogo DX 410 1001 Reagenti Reagenti forniti I reagenti per il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Illumina n di catalogo DX 102 1001 sono forniti da Illumina Questo kit stato configurato per sei corse con un massimo di otto campioni per corsa fino a 48 campioni totali 6 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Scatola 1 Tabella 3 Scatola 1A Reagenti pre amplificazione Componente Quantit E lar di riempimento Saggio CF C
30. e MiSeqDx utilizza un LED verde per il sequenziamento delle basi G T e un LED rosso per il sequenziamento delle basi A C Per garantire la corretta registrazione a ogni corsa deve essere letto almeno uno dei due nucleotidi per ogni canale cromatico importante conservare l equilibrio cromatico per ciascuna base di lettura indici sequenziata altrimenti potrebbe verificarsi un problema di registrazione durante il sequenziamento della Lettura indici Aprile 2014 N codice 15038344 Rev A ITA 13 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Utilizzare il seguente set minimo di indici con bilanciamento dei colori per corse di sequenziamento di otto campioni Tabella 11 Combinazioni primer indice per corse di sequenziamento a 8 campioni Primer indice 1 A701 Primer indice 2 A702 Primer indice 10 A710 Primer indice C A503 Campione 1 Campione 2 Campione 3 Primer indice D A504 Campione 4 Campione 5 Campione 6 Primer indice E A505 Campione 7 Campione 8 Se non sono disponibili sei campioni univoci esclusi i controlli positivi e negativi accettabile completare la corsa con replicati di qualsiasi campione di DNA genomico umano Istruzioni per l uso Preparazione del foglio campioni per MiSeqDx 1 611 Nella schermata Welcome Benvenuto di Worklist Manager Illumina selezionare Create Worklist Crea lista di lavoro Nel campo Test Type Tipo di test selezionare CF Clinical Sequencing Assay Saggio CF Clinical
31. e screening dei neonati o screening della popolazione Riassunto e spiegazione del saggio Descrizione clinica La fibrosi cistica CF una delle malattie genetiche pi comuni nel mondo occidentale ed la malattia autosomica recessiva potenzialmente letale pi comune nella popolazione bianca non ispanica La fibrosi cistica incide sulla viscosit delle secrezioni mucose e influenza l epitelio del tratto respiratorio del pancreas dell intestino del sistema epatobiliare del tratto genitale maschile nonch le ghiandole sudoripare causando una complessa patologia multisistemica e multiorgano 4 nella quale i polmoni sono il sistema d organi principalmente associato a morbilit e mortalit 6 In molti casi un declino nutrizionale preannuncia una progressione della malattia polmonare dovuta alla fibrosi cistica pertanto un elemento fondamentale delle attuali strategie di intervento la diagnosi precoce tramite screening neonatale5 che favorisce un accesso tempestivo ai servizi medici fondamentali e consente di ottenere il miglior risultato possibile per gli individui affetti dalla patologia25 Bench vi siano differenze tra i sessi per quanto riguarda la sopravvivenza e venga riferita una sopravvivenza mediana superiore per gli uomini rispetto alle donne negli Stati Uniti la sopravvivenza mediana generale di 38 3 anni6 Varianti del gene CFTR e incidenza Il gene regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica CFTR i
32. e coordinate genomiche elencate nella Tabella 2 Tabella 2 Copertura delle coordinate genomiche per il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Avvio della coordinata Arresto della coordinata e Lunghezza coppia di genomica hg19 genomica hg19 basi cromosoma 7 cromosoma 7 CFTR_Exon 1 117120041 117120211 171 CFTR_Exon 2 117144297 117144427 131 CFTR_Exon 3 117149078 117149206 129 CFTR_Exon 4 117170943 117171178 236 2 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSegDx M Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Avvio della coordinata Arresto della coordinata PIENE i Lunghezza coppia di genomica hg19 genomica hg19 basi cromosoma 7 cromosoma 7 CFTR_Exon 5 117174320 117174429 110 CFTR_Exon 7 CFTR_Exon 9 CFTR_Exon 11 CFTR_Exon 25 193 CFTR_Exon 27 Aprile 2014 N codice 15038344 Rev A ITA 3 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Per l esone 7 e l esone 10 solo 5 nt di sequenza intronica fiancheggiante sono inclusi a valle per l esone Questo per evitare stretch omopolimerici in queste regioni Nel caso dell esone 10 questa la regione PolyT PolyTG nell introne 9 Questa regione viene trattata in modo particolare e separatamente Per le mutazioni introniche profonde sono inclusi anche 5 nucleotidi che fiancheggiano le varianti SNV su entrambi i lati Per l esone 20 30 nt di sequenza intronica fiancheggiate sono inclusi all estremit 5 del
33. e di garantire che l evaporazione sia completa L etanolo residuo pu influire sulle prestazioni delle reazioni successive Non mescolare il saggio CF Clinical Sequencing pool di oligonucleotidi e il tampone di ibridazione per la conservazione Usato in combinazione il saggio CF Clinical Sequencing pool di oligonucleotidi diventa instabile anche se conservato congelato L utilizzo di termociclatori a raffreddamento attivo ad es Peltier raffreddato termoelettricamente non consigliato per la fase di ibridazione La fase di raffreddamento passivo cruciale per un adeguata ibridazione Aggiungere sempre PCR polimerasi al Master Mix per PCR subito prima dell uso Non conservare mai la soluzione di lavoro combinata Durante la fase di normalizzazione della libreria estremamente importante risospendere completamente il pellet di microsfere della libreria Questo fondamentale per ottenere una densit dei cluster omogenea sulla cella a flusso MiSeqDx Rispettare i tempi di incubazione specificati per la fase di normalizzazione della libreria Un incubazione inadeguata pu influire sulla rappresentazione della libreria e sulla densit dei cluster A causa del numero di trasferimenti della piastra e della conseguente potenziale contaminazione importante fare molta attenzione per assicurare che il contenuto dei pozzetti rimanga totalmente al loro interno Non far schizzare il contenuto L input di DNA di 250 ng raccomandato permette
34. enei Aprile 2014 N codice 15038344 Rev A ITA 9 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing 10 11 12 Dopo aver aggiunto le microsfere miscelare bene il campione pipettando su e gi dieci volte Per miscelare il campione possibile utilizzare un agitatore Incubare la miscela di microsfere campione a temperatura ambiente per tutta la durata indicata Seguire le istruzioni per l uso del supporto magnetico attendere che la soluzione diventi trasparente prima di aspirare Tenere la piastra sul supporto magnetico durante l aspirazione lenta del surnatante facendo attenzione a non toccare le microsfere separate La piastra di amplificazione mediante PCR pu restare sul termociclatore per tutta la notte oppure pu essere conservata a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C per un massimo di due giorni Prima di conservare la piastra a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C sigillarla bene Non congelare il reagente microsfere libreria o miscelarlo con il reagente diluente normalizzazione libreria se non vengono utilizzati immediatamente La piastra completa di normalizzazione della libreria pu essere conservata a una temperatura compresa tra 25 C e 15 C per un massimo di 3 giorni La libreria di ampliconi raggruppati in pool pu essere conservata tra a una temperatura compresa tra 25 C e 15 C per un massimo di 3 giorni Caricare immediatamente nella cartuccia del reagente un pool di ampliconi diluiti appena
35. equencing 37 N di campioni linee N di campioni N di identificazioni N di identificazioni non Genotipo N di campioni PolyTGPolyT clinici cellulari sintetici errate riuscite accuratezza TG 9 D7 TG 11 T 7 2 0 0 0 1 50 00 TG 9 T 9 TG 10 1 7 1 0 0 0 0 100 TG 9 1 9 TG 11 1 7 5 I 0 0 0 100 TG 9 T 9 TG 11 1 9 1 0 0 0 0 100 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSegDxM Cystic Fibrosis Clinical Sequencing 38 Genotipo N di campioni N di campioni linee N di campioni N di identificazioni N di identificazioni non PolyTGPolyT clinici cellulari sintetici errate riuscite accuratezza TG 10 T 7 TG 10 1 7 25 8 0 0 0 100 i _ ____nyn_____ i e lt _x__n__ o_ _i az cc ___m_Ln_om_r_ e a TG 10 T 7 TG 12 T 5 100 TG 10 T 9 TG 10 T 9 TG 10 T 9 TG 11 T 7 TG 10 T 9 TG 12 T 5 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing I campioni non sono stati analizzati nuovamente Uno dei risultati discordanti proveniva dallo studio di riproducibilit Il risultato PolyTG PolyT per il campione era concordante su tutti i 18 replicati ma discordante con il sequenziamento bidirezionale Sanger Riproducibilit La riproducibilit del sistema per fibrosi cistica MiSeqDx stata determinata attraverso uno studio condotto in cieco in 3 centri di sperimentazione con 2 operatori per ciascun centro Due pannelli ben caratterizza
36. er informazioni su come vengono calcolati e presentati i risultati o per una descrizione del contenuto nel report dei file di testo vedere la Guida per l utente di MiSeq Reporter n codice 15038356_ITA Il genetista pu usare il software MiSeq Reporter per immettere un valore di interpretazione per ciascuna variante refertata su un campione usando un menu a discesa Le opzioni per il valore di interpretazione sono CF causing Che causa la CF Mutation of varying clinical consequence Mutazioni di varie conseguenze cliniche Mutation of unknown significance Mutazioni di significato sconosciuto o Non CF causing Che non causa la CF Il valore immesso verr aggiunto al file dei risultati e visualizzato nella colonna delle interpretazioni sul report del saggio Clinical Sequencing Procedure per il controllo qualit Le buone pratiche di laboratorio impongono che i materiali di controllo siano valutati per rilevare le differenze nell elaborazione dei campioni e nelle procedure tecniche nel laboratorio dell utente che potrebbero produrre una variabilit significativa nei risultati 1 Controlli positivi un campione di DNA di controllo positivo richiesto su ciascuna corsa Il campione di DNA di controllo positivo deve essere un campione ben caratterizzato con almeno una variante nota del gene CFTR Illumina raccomanda di usare i controlli positivi in rotazione coerenti con le linee guida e gli standard tecnici 2008 dell ACMG per l analisi de
37. genti NOTA I tubi dei pescanti del MiSeqDx vanno fino al fondo di ciascun serbatoio per aspirare i reagenti per questa ragione importante che i serbatoi non contengano bolle Riporre la cartuccia in ghiaccio o conservarla a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C fino a 6 ore finch non si pronti a impostare la corsa Per risultati ottimali procedere direttamente caricando il campione e impostando la corsa Preparazione dei campioni per il sequenziamento 1 10 11 12 13 14 15 16 Portare il tampone di diluizione libreria a temperatura ambiente Agitare il tampone di diluizione libreria energicamente e assicurarsi che tutti i precipitati si siano completamente sciolti Se la piastra SGP stata conservata congelata scongelarla la piastra SGP fino a raggiungere la temperatura ambiente Centrifugare la piastra SGP a 1 000 x g a 20 C per 1 minuto Predisporre una provetta Eppendorf nuova d ora in avanti indicata come provetta PAL Se la piastra SGP stata conservata congelata mescolare ciascuna libreria da sequenziare pipettando su e gi per 3 5 volte Trasferire 5 ul di ciascuna libreria da sequenziare dalla piastra SGP a una striscia a otto provette per PCR Sigillare l SGP con un sigillo adesivo per piastre e metterla da parte NOTA Dopo l uso conservare la piastra SGP fra 25 C e 15 C La piastra SGP sigillata rimane stabile per un massimo di 3 giorni Combinare e trasferire il contenuto della str
38. i indici sequenza univoci che sono stati aggiunti durante la fase di amplificazione mediante PCR e Generazione di file FASTO dopo il de multiplex MiSeq Reporter genera file intermedi in formato FASTO un formato di testo utilizzato per rappresentare le sequenze I file FASTO contengono le letture di ciascun campione e i punteggi qualitativi con l esclusione delle letture dei cluster che non hanno attraversato il filtro e Allineamento mediante l allineamento possibile confrontare le sequenze rispetto a un riferimento al fine di identificare una relazione fra le sequenze e assegnare un punteggio in base a regioni di similarit Le letture allineate sono scritte nei file in formato BAM MiSeq Reporter utilizza un algoritmo di Smith Waterman con matrice a banda che esegue allineamenti locali di sequenze per determinare il grado di similarit fra due sequenze e Identificazioni delle varianti durante questa fase vengono registrate le varianti di singolo nucleotide SNV le inserzioni e delezioni Indel e altre varianti strutturali in un file di testo libero parsable e standardizzato chiamato MiSeqDxCFClinicalSequencingAssay txt Per maggiori informazioni vedere la sezione File report dell analisi nella Guida per l utente di MiSeq Reporter n codice 15038356_ITA Limiti della procedura 1 Il saggio sequenzia le regioni seguenti nel gene CFTR Tutte le regioni di codifica delle proteine nel gene CFTR su 27 esoni Tra 5 e 10 basi di sequenze
39. i i Centro Centro Centro identificazi Identificazioni concordanza posizione centro centri 1 2 3 IGCNIFCAZIORE errate Leon vee ee eee CAREZZE EEE me ren ee eee omoa vee ee eee ce oo e me Dee me eee ia a ee 51 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Risultati totali Concordanza identificazioni Totale tutti i centri Nome HGVS 0 Campione in mancanza Sas Nessuna sardi na 4 variante Per Tutti i Centro Centro Centro identificazi Identificazioni concordanza posizione centro centri 1 2 3 sti errate omo een e e eee e rene ren ee eee CEE LESENE EEE esser i eee RM CO I e O E e 52 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSegDxM Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Risultati totali Concordanza identificazioni Totale tutti i centri Nome HGVS 0 Campione in mancanza AR Nessuna di AE 7 variante Per Tutti i Centro Centro Centro identificazi Identificazioni concordanza posizione centro centri 1 2 3 sti errate en vee ee eee oo ee e e eee eo vene es eee rene ren ee eee rea a eee won v E I E I I won a e I I I I I 53 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSegDxM Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Risultati totali Concordanza identificazioni Totale tutti i centri Nome HGVS o g Nome Nessuna k Campione 9 AeA variante Per Tutti i Centro Centro Centro identificazi Identificazioni concord
40. i si estende dagli oligonucleotidi a monte fino alla regione target e successivamente si lega all estremit 5 dell oligonucleotide a valle mediante una DNA ligasi Il risultato consiste nella formazione di prodotti contenenti gli oligonudeotidi della fibrosi cistica specifici affiancati da sequenze necessarie per l amplificazione C Amplificazione mediante PCR la terza fase consiste nell amplificazione dei prodotti dell estensione ligazione mediante primer che aggiungono sequenze di indici per il multiplex campioni oltre a comuni adattatori necessari per la generazione dei cluster su MiSeqDx Al termine di questo processo una procedura di pulizia della PCR purifica i prodotti della PCR indicati come libreria 4 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing D Normalizzazione della libreria la fase finale consiste nel normalizzare la quantit di ciascuna libreria onde garantire una rappresentazione pi equilibrata nel pool finale di librerie Al termine di questo processo il pool di librerie viene caricato su MiSeqDx per il sequenziamento mediante la chimica SBS Sequenziamento La chimica SBS utilizza un metodo che fa uso di terminatori reversibili per rilevare le singole basi nucleotidiche man mano che vengono incorporate in filamenti di DNA crescenti Durante ciascun ciclo di sequenziamento alla catena dell acido nucleico viene aggiunto un solo deossinucleotide trifosfato ANTP marca
41. ica del metodo di estrazione e 52 campioni di plasmidi sintetici I plasmidi sintetici sono stati progettati per includere il contesto genomico di varianti rare e contenuti ovunque da una a dieci varianti entro lo stesso costrutto Sono stati linearizzati diluiti a numero di copie equivalenti di DNA genomico e miscelati con campioni di DNA genomico umano di genotipo wild type a numero di copie equivalenti per imitare un campione eterozigote Per il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing un totale di 5 206 posizioni sono state confrontate con i metodi di riferimento del sequenziamento bidirezionale Sanger e l analisi mediante PCR I risultati di genotipizzazione per i siti SNV e Indel piccoli inclusa la regione PolyTG PolyT sono stati confrontati con l analisi bidirezionale delle sequenze di Sanger Sono stati usati due saggi convalidati basati sulla PCR come metodo di riferimento per due ampie delezioni nel pannello Ciascun saggio di duplex PCR ha utilizzato due gruppi di primer per discriminare tra genotipi wild type eterozigote e omozigote Uno dei gruppi di primer stato progettato per affiancare i punti di rottura delle delezioni mentre l altro gruppo ha amplificato una regione interna alla delezione I due prodotti sono stati rilevati mediante separazione in base alla dimensione su un gel di agarosio I saggi PCR sono stati convalidati usando un pannello di 28 campioni in tutto 22 campioni per ciascuna delezione che consiste di campio
42. ical Sequencing Non sono stati osservati eventi avversi sulle prestazioni dei saggio allorch il DNA genomico stato sottoposto a sei cicli di congelamento scongelamento Non sono stati osservati eventi avversi sulle prestazioni del saggio in presenza di campioni di sangue intero con elevati tassi di bilirubina colesterolo trigliceride EDTA o emoglobina Avvertenze e precauzioni 10 11 12 13 14 x y ATTENZIONE La legge federale limita la vendita di questo dispositivo da parte o dietro prescrizione di un medico o di un medico autorizzato dalla legge dello stato in cui esercita ad usare o ad ordinare l uso del dispositivo Alcuni componenti di questo saggio contengono formammide una ammide alifatica che una probabile tossina riproduttiva Per maggiori informazioni vedere Reagenti a pagina 6 L inalazione l ingestione il contatto con la pelle o con gli occhi possono causare lesioni personali Smaltire i contenitori e i contenuti non utilizzati conformemente alle norme di sicurezza in vigore localmente Per informazioni contattare l Assistenza tecnica Illumina Alcuni componenti di questo saggio contengono 2 mercaptoetanolo un agente riducente Per maggiori informazioni vedere Reagenti a pagina 6 L inalazione l ingestione il contatto con la pelle o con gli occhi possono causare lesioni personali Utilizzarlo in un area ben ventilata e smaltire i contenitori e i contenuti non utilizzati conformemente alle norme di sicu
43. identificazi Identificazioni concordanza posizione centro centri 1 2 3 suit Pa errate 1 c 1408G gt A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 1 c 1646G gt A S549N 6 18 6 6 6 0 0 100 1 c 2562T gt G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 DI c 1408G gt A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 2 c 1581A gt G E527E 6 18 6 6 6 0 0 100 DI c 1680 1G gt A 1812 1 G gt A 6 18 6 6 6 0 0 100 2 c 2562T gt G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 39 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Risultati totali Concordanza identificazioni Totale tutti i centri Nome HGVS 0 j Nome Nessuna k Campione i LL variante Per Tutti i Centro Centro Centro identificazi Identificazioni concordanza posizione centro centri 1 2 3 IGCNIFCAZIORE errate E I RI E e TI E O CR O E o E wmon aw E E I E remi remi ee ee woa v E e I O me n e e I I o g 40 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSegDxM Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Risultati totali Concordanza identificazioni Totale tutti i centri Nome HGVS o g Nome Nessuna ka Campione B AeA variante Per Tutti i Centro Centro Centro identificazi Identificazioni concordanza posizione centro centri 1 2 3 IGCHIACAZIORE errate c 2051_ 2183AA gt G 18 100 2052delA AinsG ca resse remi e eee won a e I I I I resse remi e me ee Ne 41 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Risultati
44. illumina Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing PERUSO DIAGNOSTICO IN VITRO N di catalogo DX 102 1001 6 corse fino a 48 campioni per kit Uso previsto Il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Illumina un sistema diagnostico in vitro per il sequenziamento mirato che risequenzia le regioni di codifica delle proteine e i limiti introne esone del gene regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica CFTR in DNA genomico isolato da campioni di sangue intero periferico umano raccolto in K EDTA Il test rileva le varianti di singolo nucleotide e Indel piccoli nella regione sequenziata e inoltre referta su due mutazioni introniche profonde e due delezioni ampie Il test deve essere usato sullo strumento Illumina MiSeqDx Questo test previsto per contribuire alla diagnosi in individui con sospetta fibrosi cistica CF Questo saggio pi appropriato quando il paziente presenta una fibrosi cistica atipica o non classica o quando altri pannelli di mutazioni non sono riusciti a identificare entrambe le mutazioni causanti la malattia I risultati del test devono essere interpretati da un gruppo di genetisti molecolari certificati o da un esperto equivalente e devono essere usati assieme ad altre informazioni inclusi sintomi clinici altri test diagnostici e anamnesi familiare Questo test non indicato per indipendente diagnosi neonatale diagnosi prenatale analisi pre impianto screening del portator
45. impido c Rimuovere attentamente e smaltire il surnatante 11 Ripetere il lavaggio come descritto nella fase precedente 12 Utilizzare una pipetta multicanale P20 impostata su 20 ul per rimuovere l eccesso di etanolo 13 Rimuovere la piastra CLP dal supporto magnetico e asciugare all aria le microsfere per 10 minuti 14 Dispensare 30 u di tampone di eluizione in ciascun campione e agitare brevemente 15 Sigillare la piastra CLP e agitare su un agitatore per micropiastre a 1 800 rpm per 2 minuti Dopo aver agitato controllare che i campioni siano risospesi Altrimenti ripetere questo passaggio 16 Incubare a temperatura ambiente per 2 minuti 17 Posizionare la piastra CLP sul supporto magnetico per un minimo di 2 minuti o finch il surnatante limpido 18 Impostare una nuova piastra MIDI di seguito definita piastra LNP 19 Trasferire 20 ul di surnatante dalla piastra CLP alla piastra LNP 20 Opzionale Trasferire i restanti 10 ul di surnatante dalla piastra CLP a una nuova piastra ed etichettare la piastra con il nome della corsa e la data Conservare questa piastra a una temperatura compresa tra 25 C e 15 C fino al completamento della corsa di sequenziamento e analisi dei dati I prodotti per PCR puliti possono essere usati per scopi di ricerca ed eliminazione guasti in caso di problemi a carico dei campioni PUNTO DI ARRESTO SICURO Se ci si ferma a questo punto sigillare la piastra LNP e centrifugare a 1 000 x g a 20 C per 1
46. input di DNA di 1 250 ng 250 ng e 100 ng sono stati ulteriormente analizzati con 4 campioni di DNA rappresentativi e 20 replicati per ciascun livello di input di DNA per ciascun campione n 4x20 80 campioni mentre il legame inferiore di 25 ng stato analizzato con 14 campioni 20 replicati per ciascun campione n 14x20 280 campioni L accuratezza e la percentuale first pass dei campioni sono risultati pari al 100 a tutti i livelli di DNA input Sostanze interferenti Per valutare l impatto delle sostanze interferenti sul sistema per fibrosi cistica MiSeqDx Illumina le prestazioni del saggio sono state valutate in presenza e in assenza di potenziali sostanze interferenti Nello studio sono stati testati sedici campioni di sangue intero con genotipi CF unici Quattro sostanze interferenti endogene bilirubina colesterolo emoglobina e trigliceridi sono state testate aggiungendole ai campioni di sangue prima dell estrazione del DNA I limiti di concentrazione di ciascuna sostanza sono riportati nella tabella seguente Inoltre per valutare l interferenza risultante dalla raccolta del sangue prelievo breve EDTA stato aggiunto ai campioni di sangue e per valutare l interferenza risultante dalla preparazione dei campioni il tampone di lavaggio finale ottenuto mediante un metodo di isolamento su colonna di gel di silice stato aggiunto al DNA genomico purificato Aprile 2014 N codice 15038344 Rev A ITA 62 Saggio MiSeqDx Cystic Fibros
47. inuti 11 Durante l eluizione di 5 minuti impostare una nuova piastra PCR con 96 pozzetti di seguito definita piastra SGP 12 Dispensare 30 ul di tampone di conservazione della libreria a ciascun pozzetto da usare nella piastra SGP 13 Dopo l eluizione di 5 minuti assicurarsi che tutti i campioni nella piastra LNP siano completamente risospesi Se i campioni non sono completamente risospesi pipettare delicatamente i campioni su e gi oppure battere delicatamente la piastra sul banco per risospendere le microsfere quindi agitare per altri 5 minuti 18 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing 14 Posizionare la piastra LNP sul supporto magnetico per un minimo di 2 minuti 15 Trasferire il surnatante dalla piastra LNP alla piastra SGP Pipettare delicatamente su e gi 5 volte per miscelare 16 Sigillare la piastra SGP e centrifugare a 1 000 x g a 20 C per 1 minuto PUNTO DI ARRESTO SICURO Qualora non si proceda immediatamente alla creazione di un pool di librerie e al successivo sequenziamento f su MiSeqDx conservare la piastra SGP sigillata tra 25 C e 15 C per un massimo di 3 giorni Creazione di pool di librerie Preparazione del pool di librerie 1 Predisporre un blocco termico adatto a centrifugare provette da 1 5 ml a 96 C 2 Inun portaghiaccio preparare un bagno di acqua e ghiaccio Raffreddare il tampone di diluizione libreria nel bagno di acqua e ghiaccio 3
48. is Clinical Sequencing Il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing ha raggiunto una percentuale di identificazione del 100 per tutti i campioni analizzati e una riproducibilit del 100 nell identificazione dei genotipi tra i campioni in presenza e in assenza delle sostanze interferenti Non stata osservata alcuna interferenza da qualsiasi interferente endogeno o esogeno Per valutare l impatto dell interferenza dei primer indice in multiplex stato eseguito uno studio sulla contaminazione incrociata usando due campioni ciascuno campione con genotipi omozigoti univoci a quattro diverse posizioni genomiche e due rispettivi primer indice Non stato osservato alcun cambiamento nell identificazione delle varianti con livelli di contaminazione lt 40 Il genotipo del campione diventato eterozigote quando i livelli di contaminazione erano gt 40 Sostanza del test Concentrazione Concentrazione testata nel sangue testata nel sangue Percentuale di identificazione Numero totale di replicati P limite superiore limite inferiore Bilirubina 16 684 umol l 137 umol l 100 Colesterolo 16 13 mmol l 2 6 mmol l 100 Emoglobina 16 2 g l 0 4 g l 100 Trigliceride 16 37 mmol l 7 4 mmol l 100 EDTA 16 7 0 mg ml 2 8 mg ml 100 Riferimenti 1 10 11 12 Bobadilla JL Macek Jr M Fine JP Farrell PM 2002 Cystic Fibrosis A Worldwide Analysis of CFTR Mutations Correlation With Incidence Data and Applic
49. iscia a otto provette per PCR nella provetta PAL Miscelare energicamente la provetta PAL in un agitatore Predisporre una provetta Eppendorf nuova d ora in avanti indicata come provetta DAL Dispensare 585 ul di tampone di diluizione libreria nella provetta DAL Dispensare 6 ul di controllo interno PhiX 20 pM nella provetta DAL Pipettare su e gi per 3 5 volte per sciacquare la punta e assicurare che il trasferimento sia completo Trasferire 9 ul di PAL nella provetta DAL contenente il tampone di diluizione libreria Pipettare su e gi per 3 5 volte per sciacquare la punta e assicurare che il trasferimento sia completo Mescolare la DAL agitando la provetta molto velocemente Centrifugare la provetta DAL a 1 000 x g a 20 C per 1 minuto Incubare la provetta DAL in un blocco termico a 96 C per 2 minuti Dopo l incubazione capovolgere la provetta DAL 1 2 volte per mescolarla quindi porla immediatamente in un bagno di acqua e ghiaccio Tenere la provetta DAL nel bagno di acqua e ghiaccio per 5 minuti 20 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Caricamento delle librerie di campioni nella cartuccia 1 Utilizzare la punta di una pipetta pulita e vuota da 1 ml per forare la capsula di alluminio che sigilla il serbatoio contrassegnato con la dicitura Load Samples Caricamento campioni 2 Pipettare 600 ul delle librerie di campioni nel serbatoio contrassegnato con la dicitura Loa
50. l esone per permettere il rilevamento della mutazione 3272 26A gt G Con le due ampie delezioni e le regioni PolyTG PolyT il numero totale di posizioni regioni 5 206 Principi della procedura Il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Illumina comporta due procedure principali La prima consiste nel preparare manualmente i campioni per il sequenziamento un operazione detta preparazione della libreria La preparazione della libreria consiste di quattro fasi principali ibridazione estensione ligazione amplificazione mediante PCR e normalizzazione della libreria La seconda procedura consiste nel sequenziare il campione preparato mediante la chimica SBS sequenziamento mediante sintesi su MiSeqDx Preparazione della libreria Sonda Regione di Sonda personalizzata 1 interesse personalizzata 2 Nopasseaszanzazzzzazzzzeone Sonda Sonda personalizzata 1 personalizzata 2 P7 indice 1 Indice 2 P5 P7 Indice 1 Indice2 P5 A Ibridazione la prima fase consiste nell ibridare un pool di oligonucleotidi a monte e a valle specifici per il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing per il campione di DNA genomico Al termine di questo processo una procedura di lavaggio in tre fasi con un filtro in grado di selezionare le dimensioni rimuove gli oligonudeotidi non legati dal DNA genomico B Estensione ligazione la seconda fase collega gli oligonucleotidi a monte e a valle ibridati Una DNA polimeras
51. la PCR La contaminazione da PCR pu produrre risultati inesatti e inaffidabili AI fine di prevenire la contaminazione accertarsi che le aree di pre amplificazione e post amplificazione siano dotate delle apposite attrezzature ad es pipette punte di pipette agitatori e centrifughe Evitare la contaminazione incrociata Utilizzare punte di pipette nuove fra un campione e l altro e fra le erogazioni di reagenti Miscelare i campioni con una pipetta e centrifugare la piastra ove indicato Non agitare le piastre L utilizzo di punte dotate di barriera aerosol riduce il rischio di contaminazione incrociata da carry over di ampliconi o da campione a campione Le combinazioni indice campione devono corrispondere esattamente a quelle del foglio campioni La non corrispondenza fra il foglio campioni e il layout della piastra risulter in una perdita di identificazione dei campioni positivi e nella refertazione di risultati errati Preparare sempre al momento l etanolo all 80 per le fasi di lavaggio L etanolo pu assorbire l acqua dall aria e influire sui risultati 12 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Assicurarsi che tutto l etanolo venga rimosso dal fondo dei pozzetti durante le fasi di lavaggio L etanolo residuo pu influire sui risultati Rispettare il tempo di asciugatura indicato dopo la fase del supporto magnetico al fin
52. la variazione della quantit del DNA le prestazioni del saggio si basano su questo livello di input Note sulle procedure 1 W Illumina ritiene necessario che per ogni corsa definita come una serie di campioni elaborati in parallelo vengano inclusi un campione di DNA di controllo positivo e un controllo negativo NTC o No Template Control controllo senza templato Il campione di DNA di controllo positivo deve essere un campione ben caratterizzato con una o pi mutazioni note del gene CFTR Illumina raccomanda di usare un controllo wild type Il controllo wild type deve essere eseguito come un campione e non deve sostituire il controllo positivo o negativo Prima di iniziare il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing estrarre e quantificare il DNA possibile utilizzare qualsiasi metodo di estrazione del DNA approvato Quantificare il DNA con uno spettrofotometro Verificare che il rapporto A260 A280 del campione di DNA sia gt 1 5 Normalizzare il campione di DNA a 50 ng ul Per ciascun campione sono necessari 5 ul di DNA genomico 250 ng totali Rendimento dei campioni e rappresentazione dell indice Per il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Illumina il rendimento dei campioni per corsa di MiSeqDx di 8 campioni I primer di indicizzazione usati durante l amplificazione mediante PCR devono essere scelti in base al rendimento dei campioni finale desiderato per garantire diversit nella sequenza d indic
53. linical 1 provetta 600 ul Sequencing pool di oligonucleotidi Tampone di 1 provetta 4 32 ml ibridazione Miscela di estensione 1 provetta 4 8 ml ligazione Primer indice C A503 1 provetta per 192 ul D A504 e E A505 primer Primer indice 1 A701 1 provetta per 128 ul 2 A702 e 10 A710 primer PCR polimerasi 1 provetta 56 ul Master Mix per PCR 1 provetta 2 8 ml Tabella 4 Scatola 1B Reagenti post amplificazione Componente Quantit y ay di riempimento Diluente 1 provetta 4 6 ml normalizzazione libreria Tampone di diluizione 1 provetta 4 5 ml libreria Controllo interno PhiX 1 provetta 10 ul Ingredienti attivi Soluzione acquosa tamponata contenente oligonucleotidi mirati algene CFTR Soluzione acquosa tamponata contenente sali e formammide Soluzione acquosa tamponata contenente una miscela proprietaria di DNA polimerasi DNA ligasi e ANTP Primer per PCR con sequenze indice e adattatori di sequenziamento Primer per PCR con sequenze indice e adattatori di sequenziamento DNA polimerasi proprietaria Soluzione acquosa tamponata contenente sali e ANTP Ingredienti attivi Soluzione acquosa tamponata contenente sali 2 mercaptoetanolo e formammide Soluzione acquosa tamponata Soluzione acquosa tamponata contenente DNA genomico PhiX Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Scatola 2 Tabella 5 Scatola 2 Reagenti post amplificazione Componente Quantit Indice Cartuccia di
54. lle mutazioni della fibrosi cistica e gli standard di laboratorio 2013 dell ACMG per il sequenziamento di nuova generazione Il campione di controllo positivo deve generare il genotipo previsto Se il controllo positivo genera un genotipo diverso da quello previsto significa che si verificato un errore nel monitoraggio del campione oppure una registrazione errata dei primer di indicizzazione Il saggio deve essere ripetuto completamente a cominciare dalla preparazione delle librerie Controllo negativo nessun templato nessun DNA l uso di un controllo negativo nessun templato nessun DNA richiesto su ciascuna corsa per rilevare possibili incidenze di contaminazione La percentuale di identificazioni per il controllo positivo deve essere di almeno il 10 Se un controllo negativo genera una percentuale di identificazioni di gt 10 potrebbe quindi essersi verificata una contaminazione durante l elaborazione del saggio Il saggio viene considerato non riuscito e deve essere ripetuto completamente a cominciare dalla preparazione delle librerie Controllo wild type il campione di DNA di controllo raccomandato su ciascuna corsa Il campione di controllo wild type deve essere un campione ben caratterizzato che non contiene nessuna variante del gene CFTR Il campione di controllo positivo deve generare il genotipo previsto Se il controllo wild type genera un genotipo diverso da quello previsto significa che si verificato un errore nel monitor
55. micropiastre L agitatore di piastre deve soddisfare le seguenti specifiche di prestazione Velocit massima di miscelazione 3 000 rpm giri min Intervallo di velocit di miscelazione 200 3 000 rpm giri min 3 Centrifuga da tavolo necessaria una centrifuga da tavolo in grado ci mantenere la temperatura di 20 C Come specificato sopra nell area di pre amplificazione necessaria un altra centrifuga Qualsiasi centrifuga per piastre che raggiunga le velocit previste dal protocollo da 280 a 2 400 x g accettabile 4 Blocco termico necessario un blocco termico per le provette Il blocco termico deve soddisfare le seguenti specifiche di prestazione Intervallo di temperatura ambiente da 5 C a 99 C Regolazione della temperatura 0 1 C a 37 C 0 4 C a 60 C 5 Supporto magnetico necessario un supporto magnetico per una piastra a 96 pozzetti Le prestazioni migliori si osservano quando i magneti si trovano sul lato del supporto e non nella parte inferiore 6 Pipette di precisione necessaria una serie di pipette di precisione Come specificato sopra nell area di pre amplificazione necessario un altro set L utilizzo di pipette di precisione necessario per assicurare un erogazione accurata di reagente e campione E possibile utilizzare sia pipette mono canale che multi canale se calibrate regolarmente e precise entro un margine del 5 del volume stabilito 7 Materiali di consumo sono necessari i seguenti mate
56. mpia DEL L identificazione dei genotipi eterozigoti o omozigoti pu essere dedotta dalle informazioni della base di riferimento che forniscono la sequenza di riferimento a quella coordinata genomica e la descrizione del risultato che fornisce i due alleli alla posizione genomica nel campione possono interferire sull identificazione del genotipo se eterozigote o omozigote Ad esempio se Reference Riferimento G e Result Risultato A G questo indica un cambiamento G gt A a quella coordinata genomica e che il genotipo eterozigote per l allele della variante Nello stesso modo se Reference Riferimento G e Result Risultato T T questo indica un cambiamento G gt T a quella coordinata genomica e che il genotipo omozigote per l allele della variante La profondit di sequenziamento alla posizione della variante fornita dal campo Depth Profondit e la frequenza allelica nella sezione Frequency Frequenza 2 Il report del saggio fornisce informazioni sulla percentuale di identificazione del campione per ciascun campione La percentuale di identificazione calcolata come il numero di posizioni regioni della variante che corrisponde a un valore di soglia di affidabilit predefinito per il numero totale di posizioni regioni interrogate La coordinata genomica per qualsiasi posizione o regione per la quale il valore di affidabilit inferiore alla soglia elencato separatamente nella sezione Coordinates not called
57. ne di diluizione libreria pre raffreddato 980 ul Preparazione della cartuccia di reagenti 1 Scongelare la cartuccia di reagenti MiSeqDx saggio CF Clinical Sequencing in un bagnomaria contenente abbastanza acqua deionizzata a temperatura ambiente cos da immergere la base della cartuccia di reagenti fino alla linea di livello acqua stampata sulla cartuccia stessa Evitare che l acqua superi la linea di massimo livello acqua 2 Lasciare la cartuccia di reagenti a scongelare a bagnomaria a temperatura ambiente per circa un ora o fino a completo scongelamento Aprile 2014 N codice 15038344 Rev A ITA 19 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing 3 Rimuovere la cartuccia dal bagnomaria e batterla delicatamente sul banco per far fuoriuscire l acqua in eccesso dalla base Asciugare la base della cartuccia Verificare che sulla parte superiore della cartuccia di reagenti non sia caduta dell acqua Ispezione della cartuccia di reagenti 1 Capovolgere la cartuccia dieci volte per miscelare i reagenti scongelati e poi ispezionare visivamente tutti i serbatoi per accertarsi che siano scongelati NOTA E fondamentale che i reagenti nella cartuccia siano scongelati completamente e miscelati per assicurare il sequenziamento corretto Ispezionare visivamente il reagente nella posizione 1 per accertarsi che sia ben miscelato e privo di precipitati Battere delicatamente la cartuccia sul banco per ridurre le bolle d aria nei rea
58. ni di DNA genomico di linee cellulari e derivati dal sangue e plasmidi sintetici che hanno incluso i genotipi WT HET e HOM per ciascuna ampia delezione stato confermato che i saggi PCR presentano una specificit e una riproducibilit del 100 per tutti i campioni testati mediante la valutazione dei prodotti della PCR su un gel di agarosio L accuratezza dei saggi PCR stata confermata usando il sequenziamento Sanger ed stata del 100 per tutti i campioni L accuratezza stata determinata per ogni genotipo attraverso tre misurazione statistiche La concordanza positiva PA stata calcolata per ciascun genotipo di variante dividendo il numero di campioni con identificazioni di varianti concordanti per il numero totale di campioni con detta variante come identificato dai metodi di riferimento La concordanza negativa NA stata calcolata su tutte le posizioni wild type WT dividendo il numero di posizioni WT concordanti per il numero di posizioni WT come definito dai metodi di riferimento La concordanza complessiva OA stata calcolata su tutte le posizioni riportate dividendo il numero di posizioni di WT e delle varianti concordanti per il numero di posizioni riportate come determinato dai metodi di riferimento Il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing aveva una PPA a livello di genotipo del 99 66 incluse le varianti PolyTG PolyT 100 escludendo le varianti PolyTG PolyT La concordanza negativa NA per tutte le posizioni
59. ni linee Campioni non riuscite errate positiva cDNA Coordinata hg19 clinici cellulari sintetici 711 5 c 579 5G gt A SNV Introne5 1 100 G gt A 852del22 c 720_741 DIV Esone6 1 100 delAGGG AGAATG ATGATG AAGTAC A ess Se a 3 ce e Le N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing 27 Identificazioni positive varianti Genotipo Regione Nome Nome Tipo di gene c PALE Identificazioni Identificazioni Concordanza A ul ampioni PO iaia BS comune Nome cDNA variante CFTR Campioni linee Campioni non riuscite errate positiva cDNA Coordinata hg19 clinici cellulari sintetici Q359K c 1075C gt A SNV Esone8 1 T360K 1079C gt A N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSegDxM Cystic Fibrosis Clinical Sequencing 28 Identificazioni positive varianti Genotipo Regione Nome Nome Tipo di gene c FARE Identificazioni Identificazioni Concordanza ta ampioni PO iaia BS comune Nome cDNA variante CFTR Campioni linee Campioni non riuscite errate positiva cDNA Coordinata hg19 clinici cellulari sintetici 1341 1G gt A C gt G 1461ins4 1525 1G gt A 100 100 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing 29 Genotipo Regione Identificazioni positive varianti Nome Nome Tipo di gene c PALE Identificazioni Identificazioni i RE ampioni PE i comune
60. ntenente tra 2 C e 8 C normalizzazione della sali 2 mercaptoetanolo e formammide libreria Microsfere libreria 1 provetta 1 2 ml Soluzione acquosa tamponata contenente tra 2 C e 8 C microsfere paramagnetiche in fase solida Cella a flusso MiSeqDx 6 contenitori 1 cella a flusso Substrato di vetro con oligonucleotidi tra2 Ce8 C saggio legati covalentemente CF Clinical Sequencing Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Scatola 4 Tabella 8 Scatola 4 Reagenti post amplificazione Componente Quantit Rini Ingredienti attivi Conservazione Soluzione SBS 6 flaconi 353 1 ml Soluzione acquosa tamponata tra 2 C e 8 C MiSegDx PR2 saggio CF Clinical Sequencing Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Scatola 5 Tabella 9 Scatola 5 Reagenti pre amplificazione Volume di riempimento Piastra filtro 6 piastre N D Piastra di microtitolazione in polipropilene con tra 15 C e 30 C una membrana di polietersulfone modificata Componente Quantit Ingredienti attivi Conservazione Tabella 10 Scatola 5 Reagenti post amplificazione Componente Quantit i Ingredienti attivi Conservazione Tampone di eluizione 1 provetta 4 8 ml Soluzione acquosa tamponata tra 15 C e 30 C Tampone di 1 provetta 3 5 ml Soluzione acquosa tamponata tra 15 C e 30 C conservazione della libreria Reagenti richiesti non forniti Reagenti pre amplificazione e 10 N NaOH preparare da compresse o con una soluzione
61. perchio e centrifugare a 2 400 x g a 20 C per 5 minuti 4 Lavare la piastra filtro come segue a Dispensare 45 u di tampone di lavaggio stringente in ciascun pozzetto contenente il campione b Coprire la piastra filtro con il coperchio e centrifugare a 2 400 x g a 20 C per 5 minuti 5 Ripetere il lavaggio come descritto nella fase precedente amp NOTA Se il tampone di lavaggio non asciuga completamente centrifugare di nuovo a 2 400 x g a 20 C finch tutto il liquido non viene espulso ulteriori 5 10 minuti 6 Smaltire tutto il materiale defluito contenente formammide quindi riassemblare l FPU 7 Dispensare 45 u di tampone di lavaggio stringente in ciascun pozzetto contenente il campione 8 Coprire la piastra filtro con il coperchio e centrifugare a 2 400 x g a 20 C per 10 minuti di NOTA Accertarsi che tutto il liquido sia defluito dopo la centrifugazione Ripetere la centrifugazione se necessario Aprile 2014 N codice 15038344 Rev A ITA 15 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Estensione ligazione degli oligonucleotidi legati Procedura 1 Aggiungere 45 ul di miscela di estensione ligazione a ogni pozzetto di campione della piastra filtro 2 Sigillare la piastra filtro con un foglio di allumino adesivo e quindi coprire con il coperchio 3 Incubare l unit FPU nell incubatore preriscaldato a 37 C per 45 minuti Amplificazione mediante PCR Preparazione 1 2 Preparare 0 05 N di NaOH fresco Dete
62. pione sulla piastra filtro Pipettare NaOH su e gi 5 6 volte Coprire e incubare la piastra filtro a temperatura ambiente per 5 minuti Durante l incubazione della piastra filtro trasferire 22 ul della soluzione di lavoro per PCR in ogni pozzetto della piastra AMP contenente i primer indice Trasferire i campioni eluiti dal filtro alla piastra AMP come segue a Pipettare i campioni nella prima colonna della piastra filtro su e gi 5 6 volte b Trasferire 20 pl dalla piastra filtro alla colonna corrispondente della piastra AMP c Pipettare delicatamente su e gi 5 6 volte per miscelare accuratamente il DNA con la soluzione di lavoro per PCR d Trasferire le colonne restanti dalla piastra filtro alla piastra AMP in modo simile Le punte devono essere sostituite dopo ogni colonna per evitare la contaminazione incrociata Sigillare la piastra AMP e assicurarla con un rullo di gomma Centrifugare a 1 000 x g a 20 C per 1 minuto Trasferire la piastra AMP nell area di post amplificazione 0 Eseguire la PCR utilizzando il seguente programma su un termociclatore 95 C per 3 minuti 25 cicli di 16 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing 95 C per 30 secondi 62 C per 30 secondi 72 C per 60 secondi 72 C per 5 minuti Mantenere a 10 C PUNTO DI ARRESTO SICURO Se non si procede immediatamente alla pulizia della PCR la piastra AMP pu restare sul termociclatore per
63. r F Kaniecki K Yu H et al 2013 Defining the disease liability of variants in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene Nat Genet 25 agosto Epub prima della stampa Castellani C Cuppens H Macek H Jr Cassiman JJ Kerem E et al 2008 Consensus on the use and interpretation of cystic fibrosis mutation analysis in clinical practice J Cystic Fibrosis 7 179 196 Clinical and Functional Translation of CFTR CFTR2 Disponibile alla pagina Web www cftr2 org Online agosto 2013 63 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing 13 The Clinical and Functional Translation of CFTR CFTR2 Project Disponibile alla pagina Web www nacfconference org art plenaryarchives 2011 Cutting pdf Online Presentato da Garry Cutting a nome del progetto CFTR2 al 25th Annual North American Cystic Fibrosis Conference NACFC sponsorizzato da Cystic Fibrosis Foundation 4 novembre 2011 Anaheim CA U S A 14 Watson MS Cutting GR Desnick RJ Driscoll DA Klinger K et al 2004 Cystic fibrosis population carrier screening 2004 revision of American College of Medical Genetics mutation panel Genetics in Medicine 6 5 387 391 15 Pratt VM Caggana M Bridges C Buller AM DiAntonio L et al May 2009 Development of Genomic Reference Materials for Cystic Fibrosis Genetic Testing Journal of Molecular Diagnostics 11 3 186 193 16 Amos J Feldman GL Grody WW Monaghan K Palomaki GE
64. rezza in vigore localmente Per informazioni contattare l Assistenza tecnica Illumina Maneggiare tutti campioni come se fossero agenti potenzialmente infettivi Il mancato rispetto delle procedure descritte pu produrre risultati errati o una riduzione significativa della qualit del campione Adottare le normali precauzioni di laboratorio Non pipettare con la bocca Non mangiare bere o fumare nelle aree designate per il lavoro Manipolare i campioni e i reagenti del saggio indossando guanti e indumenti da laboratorio monouso Dopo aver maneggiato i campioni e i reagenti del saggio lavarsi bene le mani Non utilizzare i componenti del saggio oltre la data di scadenza indicata sull etichetta della confezione del saggio Non scambiare i componenti di diversi lotti di saggi I lotti di saggi sono identificati sull etichetta della confezione del saggio Conservare i componenti del saggio alla temperatura indicata e in aree designate per la pre amplificazione e la post amplificazione Cicli ripetuti di congelamento scongelamento fino a 6 dei componenti dalla scatola 1 non compromettono l integrit del saggio Onde evitare il degrado del campione o del reagente accertarsi che tutti i vapori di sodio ipoclorito si siano dissipati completamente prima di iniziare il protocollo necessario adottare idonee pratiche di laboratorio e una valida igiene per impedire la contaminazione di reagenti strumenti e campioni di DNA genomico con i prodotti del
65. ri Pannello Campione Genotipo 4 Leo di Per Tutti i Centro Centro Centro Nessuna Identificazioni concordanza centro centri 1 2 3 identificazione errate o aoma e eee ma amman e s e e e I w ammam e I va aomen e s e e e o w ammon e e e e e o 58 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSegDxM Cystic Fibrosis Clinical Sequencing N di risultati Concordanza identificazioni Tutti i centri Pannello Campione Genotipo 4 Leo di Per Tutti i Centro Centro Centro Nessuna Identificazioni concordanza centro centri 1 2 3 identificazione errate ze meme sn e e cme e e I e I I e e e s amao e s e e e e gt E e e e e e o 59 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSegDxM Cystic Fibrosis Clinical Sequencing N di risultati Concordanza identificazioni Tutti i centri Pannello Campione Genotipo 4 Leo di Per Tutti i Centro Centro Centro Nessuna Identificazioni concordanza centro centri 1 2 3 identificazione errate sm amanan I I I sa ammor e a e e e o v E e e e e e e a cenone e e e e o e aoma e e e e e o 60 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSegDxM Cystic Fibrosis Clinical Sequencing N di risultati Concordanza identificazioni Tutti i centri Pannello Campione Genotipo 4 Leo di Per Tutti i Centro Centro Centro Nessuna Identificazioni concordanza centro centri 1 2 3 identificazione errate VM VV DN E E r omaoma 6
66. riali di consumo Piastre skirted per PCR a 96 pozzetti 0 2 ml polipropilene o equivalente Piastre di conservazione a 96 pozzetti 0 8 ml piastre MIDI NOTA assicurarsi che la piastra a 96 pozzetti sia compatibile con il supporto magnetico Provette coniche 15 ml Provette per microcentrifuga Eppendorf sono consigliate quelle con tappo a vite Striscia a otto provette per PCR Bacinelle per soluzione in PVC priva di DNAasi e RNAasi vaschetta Sigilli adesivi in alluminio Sigilli adesivi per piastre Punte di pipette dotate di barriera aerosol Prelievo trasporto e conservazione dei campioni NOTA Maneggiare tutti campioni come se fossero agenti potenzialmente infettivi 1 Possono essere utilizzati campioni di sangue intero prelevati in provette K EDTA I campioni di sangue intero possono essere conservati per non pi di sette giorni a temperatura ambiente fino a 30 giorni a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C o fino a 30 giorni se congelati tra 25 C e 15 C 3 Icampioni di sangue intero possono essere trasportati per non pi di sette giorni a temperatura ambiente fino a 30 giorni a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C o fino a 30 giorni se congelati fra 25 C e 15 C Il trasporto di sangue intero deve essere conforme alle regolamentazioni nazionali federali statali o locali per il trasporto di agenti eziologici Aprile 2014 N codice 15038344 Rev A ITA 11 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clin
67. rminare i primer indice da utilizzare in base alla stampa dello schema della piastra di Worklist Manager Illumina Portare Master Mix per PCR e i primer indice appropriati a temperatura ambiente Agitare ogni provetta scongelata per miscelare e quindi centrifugare brevemente le provette Impostare una nuova piastra PCR a 96 pozzetti di seguito definita piastra AMP Dispensare i primer indice sulla piastra AMP in base al foglio campioni come segue a Dispensare 4 ul dei primer indice C A503 D A504 e E A505 nei pozzetti appropriati in una colonna della piastra AMP b Smaltirei tappi bianchi originali e applicare tappi bianchi nuovi c Dispensare 4 ul dei primer indice selezionati 1 A701 2 A702 e 10 A710 nei pozzetti appropriati in una riga della piastra AMP Le punte devono essere sostituite dopo ogni riga per evitare la contaminazione incrociata d Smaltire i tappi arancioni originali e applicare tappi arancioni nuovi Preparare la soluzione di lavoro per la PCR con Master Mix per PCR PCR polimerasi nel modo seguente a Dispensare 5 6 ul di PCR polimerasi su 280 ul di Master Mix per PCR b Capovolgere 20 volte la soluzione di lavoro per la PCR preparata per miscelarla Procedura 1 2 3 a o ON Rimuovere la piastra FPU dall incubatore e rimuovere il sigillo in alluminio Coprire la piastra filtro con il coperchio e centrifugare a 2 400 x g a 20 C per 2 minuti Aggiungere 25 ul di 0 05 N di NaOH a ogni pozzetto di cam
68. se operatore x 2 replicati campioni di gDNA estratto Numero di Percentuale di Nendo diera SI Percentuale di ia ini etodo di estrazione campioni identificazione cc ezz k pio i analizzati first pass Precipitazione alcolica 168 gt 99 99 gt 99 99 100 Isolamento su colonna di gel di silice 168 gt 99 99 gt 99 99 100 Estrazione con microsfere magnetiche 168 gt 99 99 gt 99 99 100 La percentuale di campioni che presentano una percentuale di identificazione di gt 99 nella prima corsa Input di DNA Il range di input di DNA per la piattaforma del saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Illumina stato valutato eseguendo uno studio di diluizione in serie usando 14 campioni di DNA rappresentativi che contenevano 16 varianti uniche del gene della fibrosi cistica Ciascun campione stato analizzato in duplicati a 9 livelli di input di DNA che andavano da 1 250 ng a 1 ng 1 250 ng 500 ng 250 ng 100 ng 50 ng 25 ng 10 ng 5 ng e 1 ng Per la determinazione dell accuratezza i genotipi dei campioni sono stati confrontati con i dati del sequenziamento bidirezionale Sanger mentre le delezioni sono state confrontate con un saggio della PCR 1 250 ng e 25 ng sono stati identificati come il legame superiore e inferiore per l input di DNA rispettivamente in quanto hanno ottenuto una percentuale di campioni first pass del gt 95 senza identificazioni errate 100 di accuratezza e percentuale di identificazione Gli
69. sono essere rilevate nel gene CFTR Si raccomanda all utente di confermare varianti nuove e rare mediante un metodo di riferimento convalidato 5 Come per qualsiasi saggio basato su ibridazione polimorfismi o mutazioni latenti nelle regioni che legano gli oligonucleotidi possono interessare gli alleli sondati e di conseguenza le identificazioni effettuate 6 Se per un campione vengono identificate pi di due varianti si raccomanda di verificare il risultato ripetendo il campione usando il Sistema dello strumento con gDNA estratto fresco per escludere la contaminazione incrociata del campione NOTA quando vengono rilevate due o pi varianti deve essere presa in considerazione la determinazione delle fasi phasing per l aplotipo Questo saggio non pu determinare se le varianti sono in cis trans rispetto alle altre varianti 7 Nel software MiSeq Reporter tutte le inserzioni delezioni saranno lasciate allineate in regioni omopolimeriche Ad esempio la variante 444delA verr identificata come una delezione GA TC mentre la delezione viene riportata in dbSNP come una delezione G ATC Un eccezione a questo sono le 135 variazioni della fibrosi cistica elencate nel database CFTR2 come causanti la malattia basato sull elenco delle varianti al settembre 2013 tutti gli Indel in regioni omopolimeriche entro questo gruppo di variazioni sono riportati come corrispondenti al report delle varianti previste in base al database CFTR2 0 8 Il saggio non pu
70. tale tutti i centri Nome HGVS 0 j Nome Nessuna k Campione 5 LL variante Per Tutti i Centro Centro Centro identificazi Identificazioni concordanza posizione centro centri 1 2 3 IGCNIFCAZIORE errate some e ee eee ose oe e e eee en vee es eee omne ssa ee eee ere ome nei COENE COO 48 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSegDxM Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Risultati totali Concordanza identificazioni Totale tutti i centri Nome HGVS 0 Campione in mancanza i Nessuna sardi n 4 variante Per Tutti i Centro Centro Centro identificazi Identificazioni concordanza posizione centro centri 1 2 3 FARI ANT errate COSCE SEE seme ave 0 CSC EEE CE CEE EE 49 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Risultati totali Concordanza identificazioni Totale tutti i centri Nome HGVS o g Nome Nessuna k Campione B a variante Per Tutti i Centro Centro Centro identificazi Identificazioni concordanza posizione centro centri 1 2 3 IGCNIFCAZIORE errate CSI EEE E CSI EEE E esseri esi n se e S e emer r n se me S Pea vene e ee Cosmo res e me CCM RENEE 50 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Risultati totali Concordanza identificazioni Totale tutti i centri Nome HGVS o g Nome Nessuna k Campione Si a variante Per Tutt
71. tati totali Concordanza identificazioni Totale tutti i centri Nome HGVS 0 Campione in mancanza Quale Nessuna sardi ve 4 variante Per Tutti i Centro Centro Centro identificazi Identificazioni concordanza posizione centro centri 1 2 3 sti errate esser ee eee rene ren ee eee Leon vee es eee CORI ERE EEE EEE I E I o o won v E I I l moe I I I o 45 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Risultati totali Concordanza identificazioni Totale tutti i centri Nome HGVS o g Nome Nessuna k Campione B a variante Per Tutti i Centro Centro Centro identificazi Identificazioni concordanza posizione centro centri 1 2 3 IGCNIFCAZIORE errate CS CORSE ECO E E re r a a a eee VI CI e I o amemon sowon e e eee sea vm e ee CCIE ZELO esser ri eee 46 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSegDxM Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Risultati totali Concordanza identificazioni Totale tutti i centri Nome HGVS 0 7 j Nome di Campione a variante Per Tutti i Centro Centro Centro id A E Identificazioni concordanza posizione centro centri 1 2 3 ISBRACIZIONE errate CEE EEE OE rene ie eee pena am eee CC MEER EE E moe em N I I I I VO N I I I E VO N I I I 47 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Risultati totali Concordanza identificazioni To
72. ti di 46 campioni ciascuno sono stati testati da ciascun operatore in ciascun centro per un totale di 276 risultati per operatore Il panello era costituito da una miscela di DNA genomico proveniente da linee cellulari linfoblastoidi con mutazioni note nel gene CFTR oltre che da sangue deleucocitato con aggiunta di linee cellulari linfoblastoidi con mutazioni note nel gene CFTR I campioni di sangue servivano per consentire l incorporazione delle fasi di estrazione necessarie per preparare il gDNA utilizzato come input primario per il flusso di lavoro del saggio La percentuale dei campioni pass vale a dire il numero di campioni che hanno superato la metrica QC al primo tentativo stato del 99 7 Tutti i risultati sono basati su test iniziali La concordanza positiva PA a livello di genotipo per tutte le varianti inclusa la variante PolyTG PolyT era del 99 22 ed escludendo la variante PolyTG PolyT era del 99 60 La concordanza negativa NA per tutti i WT era 99 70 e la concordanza complessiva OA per tutte le posizioni riportate era del 99 70 La concordanza positiva PA per le varianti PolyTG PolyT era del 97 83 Tabella 14 Riproducibilit del saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing escluse le varianti poliTG poliT Risultati totali Concordanza identificazioni Totale tutti i centri Nome HGVS 0 IEI N I _ F k E Nome Nessuna Via ampione m a CANTA variante Per Tutti i Centro Centro Centro
73. to in fluorescenza Il nucleotide marcato funge da terminatore per la polimerizzazione cos dopo ogni incorporazione di ANTP il colorante fluorescente viene sottoposto a imaging al fine di identificare la base e quindi sottoposto a scissione enzimatica per consentire l incorporazione del nucleotide successivo Poich tutti e quattro i ANTP legati al terminatore reversibile A G T C sono presenti come molecole singole e separate la competizione naturale riduce al minimo le distorsioni dovute all incorporazione Le identificazioni delle basi vengono effettuate direttamente dalle misurazioni dell intensit del segnale durante ogni ciclo di sequenziamento Il risultato finale un sequenziamento base per base Analisi dei dati MiSeq Reporter elabora le identificazioni delle basi generate durante l analisi primaria e produce informazioni su ciascun campione in base alle informazioni specificate nel foglio campioni questa elaborazione si chiama analisi secondaria L analisi secondaria include de multiplex generazione di file FASTO allineamento identificazione delle varianti e generazioni di file VCF che contengono le informazioni relative alle varianti del gene CFTR individuate in posizioni specifiche in un genoma di riferimento e De multiplex il de multiplex costituisce la prima fase dell analisi se nel foglio campioni sono elencati pi campioni e la corsa presenta letture indici Il de multiplex separa i dati da un pool di campioni in base agl
74. totali Concordanza identificazioni Totale tutti i centri Nome HGVS o g Nome Nessuna k Campione B a variante Per Tutti i Centro Centro Centro identificazi Identificazioni concordanza posizione centro centri 1 2 3 IGCNIFCAZIORE errate woa vm N e e I cere men e e e e o s mea a O e e s CE o e a e e o o s me n e e ae o won a e a e e e E me n e a e e e E 42 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Risultati totali Concordanza identificazioni Totale tutti i centri Nome HGVS 0 Campione in mancanza Sale Nessuna sardi TAS 4 variante Per Tutti i Centro Centro Centro identificazi Identificazioni concordanza posizione centro centri 1 2 3 sti errate en ve es eee Col AEREE e ea ve es eee rene ren ee eee Lea vm eee seme er le ee Lea venne eee 43 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Risultati totali Concordanza identificazioni Totale tutti i centri Nome HGVS o g Nome Nessuna k Campione B a variante Per Tutti i Centro Centro Centro identificazi Identificazioni concordanza posizione centro centri 1 2 3 IGCNIFCAZIORE errate CE CEE SEE CSC EEE SEE E resse esi n se me e woa o N e e I amor amor e e e e e o s moa o e e aae o s e COENE 44 N codice 15038344 Rev A ITA Aprile 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Risul
75. vati a una temperatura tra 2 Ce8 C fino alla data di scadenza specifica Tampone di lavaggio stringente Tampone di lavaggio universale Microsfere per la pulizia della PCR Microsfere libreria Lavaggio di normalizzazione della libreria Soluzione SBS MiSeqDx PR2 saggio CF Clinical Sequencing Cella a flusso MiSeqDx saggio CF Clinical Sequencing 4 Ireagenti elencati di seguito sono spediti a temperatura ambiente e rimangono stabili se conservati a tale temperatura fino alla data di scadenza specificata Tampone di eluizione Piastra filtro Tampone di conservazione della libreria 5 Cambiamenti nell aspetto fisico dei reagenti forniti possono indicare un deterioramento dei materiali Non utilizzare i reagenti se si dovessero verificare tali cambiamenti ad es variazioni evidenti nel colore del reagente o opacit visibile con contaminazione microbica 6 Ireagenti del tampone di ibridazione del tampone di lavaggio stringente e del diluente normalizzazione libreria potrebbero formare precipitati o cristalli visibili Prima dell uso agitare energicamente quindi ispezionare a occhio nudo per accertarsi che non vi sia presenza di precipitati 7 Nella manipolazione di microsfere per la pulizia della PCR e microsfere libreria attenersi alle migliori pratiche riportate di seguito Le microsfere non devono mai essere congelate Riportarle a temperatura ambiente Immediatamente prima dell uso agitarle bene finch sospensione e colore appaiono omog
76. zzazione libreria d Miscelare capovolgendo la provetta 15 20 volte 2 Dispensare 45 pl della soluzione di lavoro di diluente normalizzazione libreria microsfere libreria combinata in ogni pozzetto della piastra LNP contenente le librerie 3 Sigillare la piastra LNP e agitare su un agitatore per micropiastre a 1 800 rpm per 30 minuti 4 Posizionare la piastra su un supporto magnetico per un minimo di 2 minuti o fino alla scomparsa del surnatante 5 Con la piastra LNP sul supporto magnetico rimuovere attentamente e smaltire il surnatante 6 Rimuovere la piastra LNP dal supporto magnetico e lavare le microsfere con il lavaggio di normalizzazione della libreria come segue a Dispensare 45 u di lavaggio di normalizzazione della libreria in ciascun pozzetto contenente il campione b Sigillare la piastra LNP e agitare su un agitatore per micropiastre a 1 800 rpm per 5 minuti c Posizionare la piastra sul supporto magnetico per un minimo di 2 minuti o finch il surnatante limpido d Rimuovere attentamente e smaltire il surnatante 7 Ripetere la procedura del lavaggio di normalizzazione della libreria come descritto nella fase precedente 8 Utilizzare una pipetta multicanale P20 impostata su 20 ul per rimuovere l eccesso di lavaggio di normalizzazione della libreria 9 Rimuovere la piastra LNP dal supporto magnetico e dispensare 30 ul di 0 1 N di NaOH in ogni pozzetto 10 Sigillare la piastra LNP e agitare su un agitatore per micropiastre a 1 800 rpm per 5 m
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