Vysis LSI PML/RARA Dual Color, Dual Fusion
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1. 1 Para las muestras de linfocitos y de m dula sea cultivadas ajuste la temperatura de fusi n Melt Temp a 73 C y el tiempo de fusi n Melt Time a un 1 minuto Para las muestras incluidas en parafina ajuste la temperatura de fusi n a 73 C y el tiempo de fusi n Melt Time a 5 minutos 2 Fije la temperatura de hibridaci n Hyb Temp a 37 C y el tiempo de hibridaci n Hyb Time entre 4 horas y toda la noche 3 Una vez finalizada la hibridaci n lave los portaobjetos mediante el procedimiento de lavado r pido 4 Deje que los portaobjetos se sequen al aire en la oscuridad 5 Aplique 10 yl de tinci n de contraste al rea diana y t pela con un cubreobjetos Procedimientos de control de calidad Los controles positivos y negativos se deben analizar con muestras de paciente Limitaciones del procedimiento La interpretaci n de los resultados FISH se debe realizar utilizando controles y t cnicas de an lisis adecuadas as como tener en cuenta otros datos cl nicos y de diagn stico Resultados esperados El patr n esperado para un n cleo que hibrida con el conjunto de sondas LSI PML RARA Dual Color Dual Fusion es dos se ales naranjas y dos verdes En un n cleo con una translocaci n simple y fusi n 1 15 17 PML RARA el patr n esperado es una se al verde alelo normal RARA una naranja alelo normal PML y dos fusiones naranja verde der 15 y der 17 Con este conjunto de sondas Brockman y otros reportaron2. Aumente el tiempo de secado a temperatura ambiente a una noche como m nimo y a continuaci n deje los portaobjetos como m nimo 24 horas a temperatura ambiente No caliente los portaobjetos a altas temperaturas La muestra est sobre desnaturalizada demasiado intenso Las soluciones de lavado se han utilizado durante demasiado tiempo o se han almacenado incorrectamente Aseg rese de que las soluciones de lavado que contengan formamida se almacenen a 4 C Des chelas transcurridos 7 d as o despu s de un uso muy frecuente Deseche todas las otras soluciones de lavado transcurrido 1 d a Aseg rese de que el pH de las soluciones de lavado de formamida sea 7 0 8 0 La hibridaci n se ha observado con filtros de paso de banda ancha Cambie a filtros con ancho de banda estrecha o multibanda para reducir la luz de fondo Aseg rese de que la soluci n de desnaturalizaci n se prepar de acuerdo con lo descrito en el prospecto Aseg rese de que la temperatura de la soluci n de desnaturalizaci n sea de 73 C 1 C antes de sumergir el portaobjetos Reduzca la temperatura de fusi n a 72 C Reduzca el tiempo que el portaobjetos est sumergido en la soluci n de desnaturalizaci n entre 1 y 3 minutos Se al d bil o inexistente El portaobjetos de la muestra no se ha desnaturalizado adecuadamente Aseg rese de que la temperatura de fusi n en la jarra
3. 7 ml de 20X SSC pH 5 3 y 14 ml de agua purificada en una jarra de Coplin de vidrio Verifique que el pH se encuentre entre 7 0 y 8 0 utilizando tiras reactivas de medici n de pH Cuando no la utilice almac nela en un recipiente cerrado entre 2 C y 8 C Des chela despu s de transcurridos 7 d as Soluciones de etanol 70 85 100 Prepare diluciones de etanol al 100 v v con agua purificada Cuando no las utilice almac nelas a temperatura ambiente Des chelas transcurridos 6 meses Soluci n de lavado 0 4X SSC 0 3 NP 40 para el procedimiento de lavado r pido Mezcle bien 20 ml de 20X SSC pH 5 3 con 950 ml de agua purificada A ada 3 ml de NP 40 Mezcle bien hasta que el NP 40 se haya disuelto completamente Mida el pH y aj stelo a 7 0 7 5 con NaOH A ada agua purificada hasta alcanzar un volumen total de 1 litro Almac nese a temperatura ambiente Deseche la soluci n una vez pasados seis meses o si sta presenta un aspecto turbio o contaminado Almacenamiento de la sonda LSI DNA La sonda LSI DNA se debe almacenar protegida de la luz a una temperatura inferior o igual a 20 C Descomposici n Los fluor foros son fotosensibles Para limitar los efectos de esta descomposici n maneje las soluciones y los portaobjetos que contengan fluor foros en condiciones de luz reducida Lleve a cabo todos los pasos que no requieran luz periodos de incubaci n lavados etc en la oscuridad Observaciones durante el pro
4. rica PML j gt Regi n 15322 las fusiones PML RARA Brockman y otros utilizaron este conjunto de sondas para el estudio de 30 muestras de m dulas seas normales 33 de muestras m dulas seas de pacientes con APL sin tratar 14 pacientes en tratamiento para APL y 5 pacientes con APL con variantes de translocaciones conocidas Otros estudios publicados por Yin y otros y Moon y otros han utilizado tambi n este conjunto de sondas 1 Descripci n de la sonda El conjunto de sondas LSI PML RARA Dual Color Dual Fusion Translocation de translocaci n bicolor y doble fusi n es una mezcla de una sonda SpectrumGreen RARA y de una sonda SpectrumOrange PML La sonda LSI RARA tiene una longitud aproximada de 700 kb y llega al gen RARA La diana LSI PML tiene una longitud de aproximadamente 530 kb y llega al gen PML Con la sonda diana PML quedan unos 15kb sin cubrir Regi n telom rica o gt lt TN p E ge GATA85D02 AFM248YH1 MM SLR D158520 m W N ez E E E E O D O O O o D A 2 A f SD MA E E IE 5 EN 3 ber 3 ber 2 bcr la 180 kb gt je 5 PML 500 kb 335 kb gt 3 PML Regi n centrom rica Regi n 17q21 1 Regi n telom rica DD E z RARA 0 5 k gt Regi n del Ea N m bz W co S 2 5 punto de 5S5 Ss 5 S E S ruptura N Ss d Em E E EE EE 5 3 la 700 kb gt Reactivos 1 Vysis LSI PML RA
5. de Coplin sea de 73 C 1 C antes de sumergir el portaobjetos Aumente la temperatura de fusi n a 74 C Aumente el tiempo que el portaobjetos est sumergido en la soluci n de desnaturalizaci n entre 2 y 4 minutos Problema Causa probable Soluci n posible Problema Causa probable Soluci n posible El portaobjetos Contacte con el Centro La sonda Aplique la sonda de la muestra no de Asistencia T cnica desnaturalizada inmediatamente despu s se ha preparado de Abbott si desea no se aplic de haber retirado los correctamente para m s informaci n sobre inmediatamente a la portaobjetos de la soluci n FISH la preparaci n de las muestra de etanol al 100 muestras para FISH Aseg rese de que la Los portaobjetos de D jelos durante 24 horas soluci n de etanol se ha la muestra no se a temperatura ambiente evaporado antes de aplicar han dejado reposar antes de realizar la t cnica la sonda adecuadamente FISH Saque el tubo que contiene despu s de dispensar la mezcla de sondas la muestra del ba o termost tico a Los portaobjetos de Caliente los portaobjetos 73 C 1 C y col quelo la muestra no est n con las muestras a inmediatamente en completamente una temperatura entre el calentador para secos antes de 45 C y 50 C antes portaobjetos a una su inmersi n en de desnaturalizarlos o temperatura entre 45 C y la soluci n de deshidr telos aclar ndolos 50 C Mantenga el tubo desnaturalizaci n en series de
6. el cubreobjetos Repita este proceso para las reas adicionales 5 Selle el cubreobjetos con adhesivo de caucho 6 Coloque el portaobjetos en una c mara h meda precalentada e inc belo a 37 C entre 6 y 16 horas Para conseguir que la intensidad de la se al del ensayo sea suficiente la duraci n de la hibridaci n para la mayor a de las sondas LSI debe ser al menos de entre 12 y 16 horas Lavado del portaobjetos Procedimiento de lavado r pido NOTA Cuando se trate de cortes de muestras incluidos en parafina sustituya la soluci n de lavado 0 4X SSC 0 3 NP 40 por la 2X SSC 0 3 NP 40 Preparaci n de las soluciones de lavado e Dispense 70 ml de 0 4X SSC 0 3 NP 40 en una jarra de Coplin y col quela en un ba o de agua a 73 C 1 C durante como m nimo 30 minutos antes de su uso Puede utilizar esta soluci n durante un d a transcurrido este tiempo des chela e Dispense 70 ml de 2X SSC 0 1 NP 40 en una jarra de Coplin Utilicese a temperatura ambiente Puede utilizar esta soluci n durante un d a transcurrido este tiempo des chela NOTA Para mantener la temperatura adecuada en la soluci n de lavado 0 4X SSC 0 3 NP 40 lave cuatro portaobjetos simult neamente Si tiene menos de cuatro a ada portaobjetos vac os que est n a temperatura ambiente hasta tener un total de 4 Cronometre despu s de haber sumergido el cuarto portaobjetos 1 Retire el cubreobjetos de uno de los portaobjetos y sumerja st
7. frases S consejos de prudencia en relaci n con el uso de la sustancia T R41 Riesgo de lesiones oculares graves Riesgo durante el embarazo de efectos R61 adversos para el feto xi S45 En caso de accidente o malestar ac dase inmediatamente al m dico si es posible mu stresele la etiqueta S53 Ev tese la exposici n rec bense instrucciones especiales antes del uso Preparaci n de los reactivos NOTA Mida a temperatura ambiente el pH de las soluciones que as lo indiquen Si no se indica lo contrario utilice un pehach metro con un electrodo de vidrio Soluci n de lavado 20X SSC Mezcle bien 132 g de 20X SSC en 400 ml de agua purificada Mida el pH y aj stelo a 5 3 con HCI A ada agua purificada hasta conseguir un volumen total de 500 ml Almac nese a temperatura ambiente Deseche la soluci n una vez pasados seis meses o si sta presenta un aspecto turbio o contaminado Soluci n de lavado 2X SSC 0 1 NP 40 Mezcle bien 100 ml de 20X SSC pH 5 3 con 850 ml de agua purificada A ada 1 ml de NP 40 Mezcle bien hasta que el NP 40 se haya disuelto completamente Mida el pH y aj stelo a 7 0 0 2 con NaOH A ada agua purificada hasta alcanzar un volumen total de 1 litro Almac nese a temperatura ambiente Deseche la soluci n una vez pasados seis meses o si sta presenta un aspecto turbio o contaminado Soluci n desnaturalizante formamida al 70 2X SSC Mezcle bien 49 ml de formamida
8. un minuto con una soluci n de etanol al 70 85 y 100 Los portaobjetos estaban reci n preparados antes de la desnaturalizaci n Deje los portaobjetos como m nimo durante 24 horas a temperatura ambiente Problema Soluci n posible Problema e Si persiste la morfolog a de poca calidad modifique la utilizaci n del instrumento HYBrite 1 Prepare 280 yl de formamida al 70 soluci n de desnaturalizaci n 2X SSC 196 ul de formamida 28 yl de 2X SSC 56 yl de agua purificada 2 Ejecute un programa a una temperatura de mantenimiento HYBrite Hold Temp de 73 C 3 A ada 10 ul de formamida al 70 soluci n de desnaturalizaci n 2X SSC en cada rea diana y t pela con el cubreobjetos Fondo del portaobjetos 4 Cuando el HYBrite alcance 73 C coloque los portaobjetos sobre la superficie de calentamiento Cierre la cubierta 5 Retire los portaobjetos transcurridos 3 minutos 6 Retire los cubreobjetos 7 Contin e con el paso de deshidrataci n descrito en el apartado Preparaci n de la muestra para el procedimiento del ensayo no sometido a codesnaturalizaci n Consejos diagn stico y soluci n de problemas Cuando vaya a visualizar los resultados de un ensayo FISH aseg rese de que el microscopio est adecuadamente alineado y funcionando correctamente En la siguiente tabla se enumeran aquellos resultados que se desv an de lo que se considera un resultado ptimo al utilizar las sondas LSI A
9. un minuto con en el calentador para una soluci n de etanol al portaobjetos mientras 70 85 y 100 pipetea la sonda en el La muestra ten a La utilizaci n de portaobjetos bandas GTG muestras con bandeo Procese s lamente tantos tripsina Giemsa para FISH portaobjetos como pueda y puede requerir ajustes aseg rese de mantener la en los protocolos de temperatura y la duraci n hibridaci n o de bandeo descritas en el proceso del Si desea m s informaci n ensayo sobre el bandeo p ngase Se al d bil o La mezcla de Tape el rea diana en contacto con el Centro inexistente sondas se ha secado con el cubreobjetos de Asistencia T cnica de Abbott O utilice un portaobjetos con muestras reci n preparados No se ha a adido la sonda Prepare una nueva mezcla de sondas Deje que la sonda se descongele completamente Mezcle con un agitador tipo V rtex o pipetee los reactivos que quiera mezclar y centrifugue brevemente Pipetee la sonda lentamente La sonda el tamp n de hibridaci n o la mezcla de sondas no se mezclaron bien antes de su uso Mezcle con un agitador tipo V rtex o pipetee los reactivos que quiera mezclar y centrifugue brevemente Las sondas no se han diluido correctamente para la hibridaci n Utilice los vol menes indicados en el procedimiento del ensayo para mantener el cociente de la mezcla de sondas 7 ul de tamp n de hibridaci n 1 ul de sonda 2 ul de agua purificada Ase
10. un patr n con dos se ales naranjas y dos verdes y una fusi n en una translocaci n de tres v as t 15 17 19 as como dos se ales naranjas y una verde y dos verdes menos intensas en una muestra con t 11 17 Tambi n se pueden observar otros patrones en muestras anormales La interpretaci n de los resultados FISH se debe realizar utilizando controles y t cnicas de an lisis adecuadas as como tener en cuenta otros datos cl nicos y de diagn stico Resultados del diagn stico y soluci n de problemas de un ensayo de codenaturalizaci n La morfolog a del cromosoma observada en una hibridaci n en la cual se utiliza la codesnaturalizaci n puede ser diferente a una muestra que se desnaturaliza y se deshidrata antes de aplicar la sonda Problema Soluci n posible Hibridaci n Repita el ensayo con una muestra nueva cruzada realizando una de las acciones siguientes e Aumente 2 C la temperatura de la soluci n de lavado 0 4X SSC 0 3 NP 40 Vaya aumentando la temperatura hasta que la intensidad de la se al sea aceptable e Reduzca 2 C la temperatura de fusi n El aspecto de la sonda es turbio Repita el ensayo con una muestra nueva realizando una de las acciones siguientes e Aumente el tiempo de hibridaci n e Aumente la temperatura de fusi n Vaya aumentando la temperatura hasta que la morfolog a sea aceptable e Lave el portaobjetos utilizando 0 4X SSC 0 3 NP 40 a una temperatura entre 70 C y 73 C Rep
11. Aumente el tiempo de hibridaci n Problema Causa probable Soluci n posible Problema Causa probable Soluci n posible Las condiciones o Aseg rese de que las Se al poco Las sondas no Aseg rese de que la las soluciones soluciones de lavado espec fica se han diluido mezcla de sondas se haya de lavado no son se hayan preparado de correctamente A preparado de acuerdo con correctas acuerdo con lo descrito en menudo es posible lo descrito en el prospecto el prospecto que haya excesiva Aseg rese de que cantidad de sonda la temperatura de en el ensayo las soluciones de Condiciones Aseg rese de que la lavado correspondan de hibridaci n temperatura del incubador a las descritas en el inadecuadas sea de 37 C procedimiento de lavado Aseg rese de que se Aseg rese de que haya a adido la cantidad los term metros y los correcta de tamp n de pehach metros se hayan hibridaci n a la mezcla de calibrado correctamente la sonda Retire los cubreobjetos Temperatura de Mantenga la temperatura antes de sumergir los lavado demasiado de lavado de las portaobjetos en la soluci n baja soluciones de lavado de lavado colocando un m ximo de Las sondas o los Almacene la sonda sin cuatro portaobjetos en portaobjetos de diluir a una temperatura una jarra de Coplin cada las muestras se igual o inferior a 20 C y vez y comprobando que la han almacenado protegida de la luz temperatura sea correcta incorrectamente Almacene los
12. J Haematol 1999 106 591 613 Review of The Pathogenesis of Acute Promyelocytic leukaemia Evaluation of the Role of Molecular Diagnosis and Monitoring in the Management of the Disease 2 Brockman BR Paternoster SF Ketterling RP et al New Highly Sensitive Fluorescence In Situ Hybridization Method to Detect PML RARA Fusion in Acute Promyelocytic Leukemia Cancer Genetics and Cytogenetics 2003 145 144 151 3 Yin CC Glassman AB Lin P et al Morphologic Cytogenetic and Molecular Abnormalities in Therapy Related Acute Promyelocytic Leukemia AM J Clin Pathol 2005 123 840 848 4 Moon HW Chang YH Kim TY et al Incidence of Submicrosopic Deletions Vary According to Disease Entities and Chromosomal Translocations in Hematologic Malignancies Investigation by Fluorescence In Situ Hybridization Cancer Genetics and Cytogenetics 2007 175 166 168 5 Wiktor AE Van Dyke DL Stupca PJ et al Preclinical validation of fluorescence in situ hybridization assays for clinical practice Genet Med 2006 8 16 23 Asistencia t cnica Si requiere asistencia t cnica p ngase en contacto con el Centro de Asistencia T cnica de Abbott o consulte la p gina web de Abbott Molecular en http llwww abbottmolecular com Direcci n del representante autorizado ABBOTT Max Planck Ring 2 65205 Wiesbaden Germany Tel fono 49 6122 580 La patente europea 0 430 402 B1 asignada a la Universidad de California y con autorizaci n exclusiva para Abbott M
13. RA Dual Color Dual Fusion Translocation Probe Set conjunto de sondas de translocaci n bicolor de doble fusi n Vysis LSI PML RARA n mero de referencia 30 191013 1 frasco de 20 pul 650 ng ul sonda de DNA marcada con fluor foro y DNA bloqueante en tamp n Tris EDTA 2 Vysis LSI WCP Hybridization Buffer tamp n de hibridaci n Vysis LSI WCP n mero de referencia 30 804826 1 tubo 150 yl Sulfato de dextrano formamida SSC pH 7 0 Existen fichas de datos de seguridad de todos los reactivos suministrados con estos equipos disponibles en el Servicio de Asistencia T cnica de Abbott Molecular Almacenamiento 220 C La sonda Vysis PML RARA Dual Color Dual Fusion Translocation se debe almacenar a una temperatura igual o inferior a 20 C protegida de la luz Condiciones para el transporte El conjunto de sondas LSI PML RARA Dual Color Dual Fusion Translocation se transporta en envases con nieve carb nica Si recibe alg n reactivo que no cumple con las recomendaciones de la etiqueta o est da ado contacte con el Servicio de Asistencia T cnica de Abbott Molecular Advertencias y precauciones IVD Para uso exclusivo en diagn stico in vitro El tamp n de hibridaci n Vysis LSI WCP ha sido clasificado seg n las directivas de la Comunidad Europea CE como T xico T e Irritante Xi A continuaci n se indican las frases R que indican los riesgos espec ficos derivados de los peligros de la sustancia y
14. Vysis LSI PML RARA Dual Color Dual Fusion Translocation Probe Set E CE es Vysis LSI PML RARA Dual Color Dual Fusion Translocation 01N36 020 B1N363 34 9378 R1 IVD c Abbott EC REP Clave de los s mbolos utilizados REF N mero de referencia LOT Producto sanitario para uso en diagn stico in vitro 20 C Almac nese a una 1 temperatura inferior o igual a 20 C Representante autorizado Fabricante legal N mero de lote Fecha de caducidad Consultar instrucciones de uso Atenci n ver instrucciones de uso Finalidad de uso Esta sonda de hibridaci n in situ por fluorescencia FISH se usa para detectar la translocaci n t 15 17 q22 q12 21 que da lugar a una fusi n de los genes PML RARA Resumen y explicaci n del ensayo La mayor a de los casos de leucemia promieloc tica aguda APL tiene una translocaci n t 15 17 q22 q12 21 que fusiona el gen de la leucemia promieloc tica PML en la banda 15q22 del cromosoma al gen alfa RARA del receptor del cido retinoico localizado en 17q12 q21 La fusi n de los genes PML RARA se asocia a una buena respuesta a todos los tratamientos con cido transretinoico El identificador espec fico del locus LSI del conjunto de sondas PML RARA Dual Color Dual Fusion Translocation de translocaci n bicolor y doble fusi n se ha utilizado para varios estudios en la detecci n de Regi n centrom
15. cedimiento Antes de su uso descongele los reactivos a temperatura ambiente y a continuaci n centrifugue cada tubo entre 2 y 3 segundos con una microcentr fuga de sobremesa Recogida y preparaci n de las muestras para el an lisis Las c lulas de la m dula sea se deben cultivar recoger fijar y colocar en los portaobjetos para microscopio seg n los procedimientos habituales de citogen tica Procedimiento Materiales necesarios e Conjunto de sondas Vysis LSI PML RARA Dual Color Dual Fusion Translocation de translocaci n bicolor y fusi n doble e Tamp n de hibridaci n Vysis LSI WCP Materiales necesarios pero no suministrados HCI 12N para el ajuste del pH de las soluciones de lavado NaOH 1N para el ajuste del pH de las soluciones de lavado Jarras de Coplin de vidrio Term metro calibrado Pinzas Probeta graduada de 1 000 ml Agitador magn tico Etanol Microcentr fuga Puntas de pipeta 1 a 10 pl Micropipetas 1 a 10 pl Pehach metro Portaobjetos de vidrio para microscopio limpios Agua purificada Cron metro Mezclador V rtex Ba o de agua 37 C y 72 C Microscopio de fluorescencia Incubador a 37 C 20X SSC NP 40 Formamida ultra pura Tinci n de contraste DAPI II Calentador para portaobjetos Prepare tres jarras de Coplin A ada 70 ml de etanol al 100 en una jarra 70 ml de etanol al 85 en la segunda y 70 ml de etanol al 70 en la tercera Utilicese a temperatura ambiente Des chela
16. e ltimo inmediatamente en 0 4X SSC 0 3 NP 40 Agite los portaobjetos de 1 a 3 segundos Repita el mismo procedimiento con los dem s portaobjetos 2 S quelos transcurridos 2 minutos NOTA Aseg rese de que la temperatura de las soluciones de lavado sea 73 C 1 C antes del lavado de otra serie de 4 portaobjetos 3 Sumerja los portaobjetos en 2X SSC 0 1 NP 40 Agite los portaobjetos de 1 a 3 segundos Saque los portaobjetos transcurridos de 5 segundos a 1 minuto Visualizaci n de la hibridaci n 1 Deje que los portaobjetos se sequen al aire en la oscuridad 2 Aplique 10 yl de la tinci n de contraste DAPI ll sobre el rea de hibridaci n del portaobjetos y cubra con un cubreobjetos Visualice los portaobjetos utilizando un conjunto de filtros adecuados en un microscopio para fluorescencia que funcione correctamente Los conjuntos de filtros pticos que se describen a continuaci n le permitir n visualizar los fluor foros utilizados en la hibridaci n Si utiliza este filtro de Vysis Se produce la excitaci n y emisi n simult nea de DAPI Orange Fluor foros DAPI y SpectrumOrange DAPI Green Fluor foros DAPI y SpectrumGreen Aqua Green Orange Fluor foros SpectrumAqua SpectrumGreen y SpectrumOrange DAPI Orange Green Fluor foros DAPI SpectrumOrange y SpectrumGreen Fluor foros DAPI SpectrumAqua SpectrumGreen y SpectrumOrange DAPI Aqua Green Orange Almacenamiento Los portaobjetos que se hayan almac
17. enado a 20 C y protegidos de la luz se pueden analizar al menos durante tres semanas despu s de la hibridaci n Utilizaci n del proceso de codesnaturalizaci n La codesnaturalizaci n es un proceso que simplifica la t cnica de hibridaci n in situ con fluorescencia FISH al combinar en un s lo paso la desnaturalizaci n de la mezcla de sondas y de la muestra Generalmente la codesnaturalizaci n consiste en colocar los portaobjetos de las muestras con las sondas y los cubreobjetos sobre una placa caliente o en el estante de una estufa o de un incubador que est a la temperatura de desnaturalizaci n Transcurridos entre 2 y 10 minutos los portaobjetos se retiran de la superficie caliente y se colocan en un incubador a la temperatura de hibridaci n Las condiciones documentadas para la codesnaturalizaci n especifican un amplio intervalo de temperaturas y duraci n que hacen necesaria la optimizaci n de las condiciones de las aplicaciones y de los tipos de muestras Los par metros aqu descritos son para su uso con el Vysis HYBrite Denaturization Hybridization System sistema de desnaturalizaci n hibridaci n En funci n de la muestra ser n necesarios procesos adicionales de optimizaci n El aspecto de una hibridaci n que utiliza la codesnaturalizaci n puede variar con respecto a una hibridaci n en la que la muestra diana se desnaturaliza y se deshidrata antes de aplicar la sonda Preparaci n de un portaobjetos para
18. g rese de que la pipeta est calibrada Deje que el tamp n de hibridaci n se descongele completamente y alcance la temperatura ambiente antes de utilizarlo A continuaci n pipet elo lentamente La sonda no se ha desnaturalizado correctamente NOTA No afecta a las sondas que se suministran en tamp n de hibridaci n y est n desnaturalizadas Aseg rese de que la temperatura del ba o termost tico utilizado para desnaturalizar la mezcla de sondas sea 73 C 1 C Desnaturalice la mezcla de sondas durante 5 minutos excesivamente en el portaobjetos de la muestra inmediatamente despu s de aplicar la mezcla de sondas Cuando lave la hibridaci n retire primero el cubreobjetos de un portaobjetos y sumerja el portaobjetos en la soluci n de lavado antes de retirar el cubreobjetos del siguiente portaobjetos Durante la hibridaci n se han formado burbujas debajo del cubreobjetos Deposite el cubreobjetos tocando primero la superficie de la mezcla de sondas Coloque cuidadosamente el portaobjetos con el cubreobjetos hacia abajo sobre papel secante y elimine cuidadosamente las burbujas aplicando una ligera presi n Condiciones de hibridaci n inadecuadas Aseg rese de que se cumplan el tiempo y la duraci n establecidos para la hibridaci n Aseg rese de que la temperatura del incubador sea de 37 C Selle bien y completamente el cubreobjetos con adhesivo de caucho
19. ita la hibridaci n realizando una de las acciones siguientes e Reduzca 2 C la temperatura de fusi n e Reduzca el tiempo de fusi n NOTA Vaya reduciendo la temperatura o el tiempo de fusi n hasta que la intensidad de la se al sea aceptable e Lave utilizando 0 4X SSC 0 3 NP 40 entre 73 C y 76 C La morfolog a de la Repita el ensayo con una muestra nueva metafase es de realizando una de las acciones siguientes poca calidad e Reduzca 2 C la temperatura de fusi n e Reduzca el tiempo de fusi n e NOTA Vaya reduciendo la temperatura o el tiempo de fusi n hasta que la intensidad de la se al sea aceptable e Pretrate los portaobjetos 1 Prepare una soluci n de 2X SSC paraformaldeh do al 1 2 Sumerja el portaobjetos en 2X SSC paraformaldeh do al 1 durante 1 minuto 3 Sumerja varias veces los portaobjetos en agua purificada 4 Deshidr telos aclar ndolos en series de un minuto con una soluci n de etanol al 70 85 y 100 5 Deje secar los portaobjetos al aire y contin e con la preparaci n del portaobjetos para la codesnaturalizaci n Se al difusa moteada Causa probable Soluci n posible Los portaobjetos de la muestra no est n completamente secos antes de su inmersi n en la soluci n de desnaturalizaci n Caliente los portaobjetos con las muestras a una temperatura entre 45 C y 50 C antes de desnaturalizarlos o deshidr telos aclar ndolos en series de
20. la codesnaturalizaci n 1 Por cada rea diana a ada en un tubo de microcentr fuga los siguientes componentes a temperatura ambiente 7 ul de tamp n de hibridaci n LSI WCP 1 pl de sonda 2 ul de agua purificada NOTA Si desea hibridar un m ximo de 3 sondas simult neamente cada una provista de un fluor foro diferente a ada 1 ul de cada sonda A ada agua purificada hasta conseguir que la mezcla tenga un volumen de 3 pl 2 Centrifugue el tubo entre 1 y 3 segundos 3 Ag telo con el V rtex y centrif guelo de nuevo 4 Dispense 10 yl de la mezcla de sondas sobre el portaobjetos y t pelo inmediatamente con un cubreobjetos 5 Selle el cubreobjetos con adhesivo de caucho Elecci n de los par metros del sistema de desnaturalizaci n hibridaci n Las instrucciones que se describen a continuaci n son espec ficas del HYBrite Denaturation Hybridization System Si desea m s informaci n sobre la utilizaci n de este instrumento consulte la Gu a del usuario del sistema HYBrite Tambi n es posible la utilizaci n del ThermoBrite Denaturation Hybridization System ya que sus caracter sticas t rmicas son comparables a las del sistema HYBrite Cuando utilice el sistema ThermoBrite el control m s estricto 1 C har necesario el ajuste de las condiciones de desnaturalizaci n e hibridaci n Si desea informaci n m s detallada consulte el apartado Consejos diagn stico y soluci n de problemas de este prospecto
21. olecular Inc protege la utilizaci n de las sondas Vysis LSI Dual Color Rearrangement o de las sondas Dual Color Break Apart La patente europea EP 0 444 115 B1 asignada a la Universidad de Yale y con autorizaci n exclusiva para Abbott Molecular Inc protege la utilizaci n de sondas LSI de Vysis CEP LSI WCP y Vysis son marcas comerciales registradas de Abbott Molecular Inc SpectrumGreen SpectrumRed SpectrumOrange SpectrumAqua SpectrumBlue SpectrumGold y HYBrite son marcas comerciales de Abbott Molecular Inc ThermoBrite es una marca comercial de Iris Sample Processing Inc Abbott Molecular Inc Des Plaines IL 60018 USA EC REP ABBOTT Max Planck Ring 2 65205 Wiesbaden Germany 49 6122 580 O 2007 Abbott Laboratories www abbottmolecular com Noviembre 2007
22. ple y por tanto las se ales luminosas pueden parecer m s d biles Utilice el filtro correcto para visualizar el fluor foro de la sonda Si desea m s informaci n p ngase en contacto con el Centro de Asistencia T cnica de Abbott La configuraci n o los objetivos del microscopio no son adecuados para visualizar los resultados FISH o los filtros del microscopio est n da ados P ngase en contacto con el fabricante del microscopio se han deshidratado antes de aplicarles la tinci n o hay gotas de aceite en la tinci n 2X SSC 0 1 NP 40 a temperatura ambiente y deshidr telos aclar ndolos en series de un minuto con una soluci n de etanol al 70 85 y 100 D jelos secar al aire y vuelva a aplicar la tinci n de contraste Concentraci n incorrecta de tinci n de contraste NOTA La concentraci n de la tinci n de contraste DAPI es 8 veces superior a la de la tinci n de contraste DAPI Il Si la tinci n es excesivamente brillante dil yala con Antifade Solution n mero de referencia 06J29 010 antes de aplicarla La tinci n de contraste ha caducado o ha estado expuesta a la luz durante per odos prolongados de tiempo Almacene la tinci n protegida de la luz a una temperatura inferior o igual a 20 C durante el uso Aseg rese de que la tinci n de contraste no se utilice transcurrida la fecha de caducidad Bibliograf a 1 Grimwade D reviewer Br
23. portaobjetos antes de lavar otra serie de sin hibridar con desecante portaobjetos a una temperatura inferior Las condiciones Aseg rese de que las o igual a 20 C para un restrictivas soluciones de lavado se per odo prolongado de astringencia de la prepararon de acuerdo con tiempo o a temperatura soluci n de lavado lo descrito en el prospecto ambiente para per odos son demasiado NOTA Cuanto menor cortos d biles sea la concentraci n Almacene los portaobjetos de sales SSC y mayor hibridados protegidos de la concentraci n de la luz a una temperatura formamida y NP 40 mayor inferior o igual a 20 C ser la condici n restrictiva hasta un m ximo de astringencia del lavado 3 semanas Tinci n de La tinci n aparece Retire los cubreobjetos Se ha utilizado una Retire los cubreobjetos contraste brillante d bil los portaobjetos Sumerja los portaobjetos tinci n de contraste Sumerja los portaobjetos o d bil con las muestras no durante 5 minutos en equivocada La tinci n de contraste es excesivamente brillante durante 5 minutos en 2X SSC 0 1 NP 40 a temperatura ambiente y deshidr telos aclar ndolos en series de un minuto con una soluci n de etanol al 70 85 y 100 D jelos secar al aire y vuelva a aplicar la tinci n de contraste La hibridaci n se ha observado con un conjunto de filtros inapropiado Los conjuntos de filtros multibanda proporcionan menos luz que los filtros de paso de banda sim
24. s transcurridos 7 d as o si muestran diluci n excesiva o evaporaci n Para asegurar buenos resultados verifique que los reactivos se preparen y se usen a las temperaturas descritas en este prospecto Mida las temperaturas de las soluciones dentro de las jarras de Coplin con un term metro calibrado Cuando realice una hibridaci n que combine las sondas de enumeraci n cromos mica CEP y LSI proceda de acuerdo con el m todo general LSI para determinar el protocolo de calidad del reactivo Preparaci n de la muestra NOTA Deje que las jarras de Coplin que contienen la soluci n desnaturalizante alcancen la temperatura ambiente Antes de su uso coloque las jarras en un ba o de agua a 73 C 1 C durante aproximadamente 30 minutos para que alcancen la temperatura adecuada 1 Aseg rese de que la temperatura de la soluci n desnaturalizante sea de 73 C 1 C 2 Sumerja los portaobjetos en la soluci n desnaturalizante durante 5 minutos NOTA No introduzca simult neamente m s de cuatro portaobjetos por cada jarra de Coplin 3 Deshidrate los portaobjetos manteni ndolos 1 minuto en etanol al 70 a continuaci n 1 minuto en etanol al 85 y por ltimo 1 minuto en etanol al 100 NOTA Mantenga los portaobjetos sumergidos en la soluci n de etanol al 100 hasta que pueda secar todos los portaobjetos y aplicar la mezcla de sondas Preparaci n de la mezcla de sondas 1 Por cada rea diana a ada en un tubo de microcen
25. simismo se incluyen las posibles causas y las sugerencias para mejorar el rendimiento del ensayo demasiado intenso Problema Causa probable Soluci n posible Morfolog a del cromosoma distorsionada Los portaobjetos de la muestra se han secado demasiado r pido durante la preparaci n Aumente la temperatura del ba o termost tico aumenta la humedad cuando dispense Los portaobjetos de vidrio est n sucios antes de la preparaci n de la muestra Sum rjalos en etanol y s quelos utilizando papel sin pelusas antes dispensarlos Residuo celular en la preparaci n de la muestra Lave 3 veces el sedimento con fijador reci n preparado y repita el procesamiento de dispensaci n de muestra sobre el portaobjetos Las extensiones de metafase est n envejecidas por calentamiento o contienen citoplasma Aumente el tiempo que el portaobjetos est sumergido en la soluci n de desnaturalizaci n a 10 minutos El portaobjetos no se ha lavado correctamente tras la hibridaci n Aseg rese de que las soluciones de lavado se prepararon de acuerdo con lo descrito en el prospecto Aseg rese de que el pH y la temperatura de las soluciones de lavado sean correctos Retire los cubreobjetos Repita el procedimiento de lavado Fondo del portaobjetos las muestras a los portaobjetos Reduzca la temperatura del calentador para portaobjetos durante la preparaci n de la muestra
26. tr fuga los siguientes componentes a temperatura ambiente 7 ul de tamp n de hibridaci n LSI WCP 1 ul de sonda 2 ul de agua purificada NOTA Si desea hibridar un m ximo de tres sondas simult neamente cada una marcada de un fluor foro diferente a ada un microlitro de cada sonda A ada agua purificada hasta conseguir que la mezcla tenga un volumen de tres microlitros 2 Centrifugue el tubo entre 1 y 3 segundos Ag telo con el V rtex y centrif guelo de nuevo 4 Coloque los tubos en un ba o de agua a 73 C 1 C durante 5 minutos 5 Extraiga el tubo del ba o de agua so 6 Col quelo en un calentador de portaobjetos a una temperatura entre 45 C y 50 C hasta que aplique la sonda al DNA diana NOTA Si los portaobjetos est n listos cuando haya desnaturalizado la sonda puede aplicarla inmediatamente al DNA diana Hibridaci n de la sonda al rea diana NOTA Prepare una c mara h meda colocando en la pared lateral de un recipiente herm tico una toallita de papel humedecida con agua Col quela en un incubador a 37 C 1 Saque los portaobjetos de la soluci n de etanol al 100 2 Seque el portaobjetos colocando el borde inferior en contacto con papel secante y seque la parte inferior con una toallita de papel 3 Coloque los portaobjetos en un calentador para portaobjetos a 45 C 50 C para evaporar el etanol restante 4 Deposite 10 ul de la mezcla de sondas sobre un rea diana y t pela inmediatamente con
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