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Applied Biosystems StepOne™ Real

1. Consumible MicroAmp Fast Optical 48 Well Reaction Plate MicroAmp Fast 48 Well Tray MicroAmp Splash Free 96 Well Base MicroAmp Optical 8 Cap Strip MicroAmp Fast 8 Tube Strip MicroAmpY Fast Reaction Tubes with Caps MicroAmp Optical 48 Well Adhesive Film O Mmm 00 00 gt AE Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 3 cuantificaci n relativa NN Cap tulo 1 Introducci n Acerca de los experimentos de cuantificaci n relativa Para obtener m s informaci n Para obtener m s informaci n acerca de e El sistema StepOne consulte Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Software Help Nota Para acceder a la ayuda seleccione Help Ayuda gt StepOne Help Ayuda de StepOne desde el software StepOne e Experimentos de cuantificaci n absoluta consulte Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de curva est ndar e Experimentos de genotipado consulte Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de genotipado e Experimentos de presencia ausencia consulte Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Getting Started Guide for Presence Absence Experiments Acerca de los experimentos de cuantificaci n relativa Experimentos de PCR a tiempo real Acerca de los
2. E StepOne v1 0 Ea lx 1 File Edit Instrument Analysis Tools Help 2 i New Experiment g Open lA Save gt Close T Send Experiment to Instrument Eg Download Experiment from Instrument ES Export Print Report 6 P2Pa Elk li Apaan dad LJ esa esa esa XUN saro QO caro CO caro M tes M resa EF Gene Expression A Ct Undet Cr Undei CT Undel Cr Undei CT Undel Cr Undel CT 30 CT 30 4 Pr J RA Multicomponent Plot Mes M sar 1 sar 1 car M reso M reso Mesa M car 1 A B cr 30 CT 24 67 CT 24 67 CT 24 68 CT 30 CT 30 CT 30 CT 24 88 Raw Data Plot 1 m sar M car M reso M esa M rss M car M car M car acson CII CT 24 83 CT 24 954 CT 30 CT 30 CT 30 CT 23 5 CT 23 394 CT 23 39 0 umi 4 6 8 10 12 144 16 18 o Y A A Xy LL M 3 33 4 Target Al o Threshold Auto Auto Baseline show C Threshold Baseline Start Well Target Baseline End Well Wwelis E 19 a J 6 Negative Bua o m pem Analysis Summary Total Wells in Plate 4 Wells SetUp 24 Wells Processed 24 Wells Flagged 0 Wells Omitted from Analysis 0 Samples Used 3 Targets Used 2 T 5 Consejos de C mo seleccionar pocillos desplazamiento E a Para ver pocillos espec ficos en las pantallas de an lisis seleccione los pocillos en la ficha View Plate Layout Ver disposici n de placa de la siguiente manera 1 Para s
3. Nota Para obtener m s informaci n acerca de alguno de los temas que se explican en esta gu a acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Software pulsando F1 haciendo clic en 4 en la barra de herramientas o seleccionando Help Ayuda StepOne Help Ayuda de StepOne Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 91 cuantificaci n relativa mu Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa Resumen del cap tulo Resumen del cap tulo Flujo de trabajo del experimento Notas de ejemplo El software StepOne analiza los datos mediante el m todo de cuantificaci n de curva est ndar relativa En la primera secci n de este cap tulo se explica c mo revisar los datos analizados utilizando las pantallas de an lisis y c mo presentar los datos Si los resultados son cuestionables en la Secci n 2 de este cap tulo se explican algunos pasos para solucionar los problemas Nota El experimento de curva est ndar relativa de ejemplo incluye cuatro pocillos problem ticos que aparecen marcados con un aviso Los avisos reflejan problemas comunes que se puede encontrar al realizar sus propios experimentos Se incluyen procedimientos para ver los avisos y omitir uno de los pocillos A continuaci n se muestra el flujo de trabajo para analizar el experimento de ejemplo que se incluye en est
4. Nombre dela Concentraci n Volumen de Volumen de Volumen total mestra de la soluci n muestra disolvente de muestra origen ng L uL uL diluida uL H gado 100 0 1 0 19 0 20 0 Ri n 100 0 1 0 19 0 20 0 Agua para diluir la muestra Tubos de microcentr fuga Pipetas Puntas de pipeta Soluci n origen de las muestras e Agitador e Centr fuga Preparaci n de 1 Etiquete un tubo de microcentr fuga diferente para cada muestra diluida las diluciones de e H gado las muestras lt Ri n 2 A ada el volumen de agua requerido disolvente a cada tubo vac o Volumen de Tubo Nombre de la muestra disolvente uL 1 H gado 19 0 2 Ri n 19 0 Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 53 cuantificaci n relativa Cap tulo 3 Preparaci n de las reacciones de la curva est ndar relativa Preparaci n de las diluciones de las muestras 3 A ada el volumen de soluci n de partida de las muestras requerido muestra a cada tubo vac o Volumen de Tubo Nombre de la muestra muestra uL 1 H gado 1 0 2 Ri n 1 0 4 Agite cada muestra diluida entre 3 y 5 segundos y a continuaci n centrifugue brevemente los tubos 5 Coloque las muestras diluidas en hielo hasta que prepare la placa de reacci n Directrices de Cuando prepare su propio experimento de curva est ndar relativa
5. ms nr Assay Type Inventoried Made to Order vi Reaction Volume Per Well 20 uL Excess Reaction Volume 10 Print Reaction Setup c myc y A Standard Dilution Series for c myc a E 7b Standard Concentration in Stock 200 ng per uL Dilution Point Source Source Volume uL Diluent Volume uL Total Volume uL Standard Concentratio 1 200 100 0 FE 5 0 02 Complete la ficha Reaction Mix Calculations C lculos de la mezcla de reacci n para el ensayo de GAPDH 1 Seleccione la ficha Reaction Mix Calculations C lculos de la mezcla de reacci n predeterminada 2 En el panel Select Target Seleccionar diana seleccione GAPDH 3 En el men desplegable Assay Type Tipo de ensayo seleccione Inventoried Made to Order En inventario Fabricado bajo pedido 4 Aseg rese de que en el campo Reaction Volume Per Well Volumen de reacci n por pocillo aparece 20 uL 5 Aseg rese de que en el campo Excess Reaction Volume Volumen de reacci n en exceso muestra 10 Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 37 cuantificaci n relativa O Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa Revisi n de la configuraci n de la reacci n 6 En el panel Reactions for GAPDH Reacciones para GAPDH a Aseg rese de que en el campo Master Mix Concentration Concentraci n de mezcla maestra aparece 2X b Aseg rese de que en el campo A
6. Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 1 Introducci n 4 Acerca de los experimentos de cuantificaci n relativa e Muestra de referencia la muestra utilizada como referencia para los resultados de la comparaci n Por ejemplo en un estudio sobre los efectos de las drogas en la expresi n g nica un control no tratado ser a una muestra de referencia apropiada e Est ndar una muestra de concentraci n conocida e Diluci n seriada un conjunto de diluciones del est ndar por ejemplo 1 2 1 4 1 8 1 16 1 32 que se utilizan para construir una curva est ndar En todas las muestras la cantidad del gen diana se determina realizando una interpolaci n a partir de la curva est ndar y luego dividiendo por la cantidad del gen diana de la muestra de referencia Dado que la muestra de referencia es la muestra 1X todas las dem s cantidades se expresan como una diferencia multiplicada por n relativa a ella Asimismo la unidad de la curva est ndar se cancela porque la cantidad de muestra se divide por la cantidad de muestra de referencia Por consiguiente lo nico que se necesita de los est ndares es conocer sus diluciones relativas Por lo tanto se puede utilizar cualquier cDNA RNA o DNA de la soluci n de partida que contenga el gen diana apropiado para preparar los est ndares e Control end geno un gen presente en un nivel de expre
7. Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 29 cuantificaci n relativa O Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa l Configuraci n de las muestras Para obtener m s Para obtener m s informaci n acerca de informaci n e La pantalla Standards Est ndares acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en 3 o pulsando F1 e La eficiencia de la amplificaci n consulte Amplification Efficiency of TaqMan Gene Expression Assays Application Note Configuraci n de las muestras En la pantalla Samples Muestras escriba el n mero de muestras r plicas y controles negativos que va a incluir en la placa de reacci n escriba los nombres de las muestras y a continuaci n seleccione las reacciones de muestra diana que va a configurar Acerca del En el experimento de curva est ndar relativa de ejemplo experimento de e Seutilizan dos muestras cDNA preparado a partir de RNA total aislado de h gado y ejemplo ri n Las muestras contienen cantidades desconocidas del gen c myc diana y del gen GAPDH control end geno e Se utilizan tres r plicas Las r plicas son reacciones id nticas que contienen componentes y vol menes id nticos e Se utilizan tres controles negativos Las reacciones de control negativo contienen agua en lugar de la muestra y no se deber an amplificar Pantalla Samples 1 Haga clic en el campo How many samples do you
8. Cancel 4 En el cuadro de di logo Print Imprimir seleccione la impresora y las opciones de impresi n y a continuaci n haga clic en OK Aceptar 5 Haga clic en Next Siguiente gt Directrices de Cuando dise e su propio experimento de curva est ndar relativa dise o e Si utiliza reactivos TaqMan seleccione el tipo de ensayo que va a utilizar Seleccione Inventoried Made to Order En inventario Fabricado bajo pedido si utiliza Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays en inventario o fabricados bajo pedido o Applied Biosystems Custom TaqMan Gene Expression Assays Seleccione Custom Personalizado si va a dise ar sus propios ensayos con el software Primer Express e Escriba un n mero entre 10 y 30 para el volumen de reacci n pocillo El sistema StepOne admite vol menes de reacci n de entre 10 y 30 uL e Incluya el volumen de reacci n en exceso para contabilizar la p rdida que se produce durante el pipeteo Applied Biosystems recomienda un volumen de reacci n en exceso de al menos el 10 e Revise las concentraciones de la mezcla de reacci n para cada gen diana Si es necesario Para los reactivos TaqMan modifique las concentraciones de la mezcla maestra y del ensayo Para los reactivos SYBR Green modifique las concentraciones de la mezcla maestra el cebador directo y el cebador reverso Para la RT PCR de 1 paso modifique la concentraci n de retrotranscripci
9. Para el experimento de C comparativos de ejemplo e Los componentes de la mezcla de reacci n son TaqMan Fast Universal PCR Master Mix 2X Ensayo de TP53 20X Ensayo de GAPDH 20X Agua 160 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Materiales necesarios Preparaci n de la Cap tulo 7 Preparaci n de las reacciones de Cr comparativos om Preparaci n de la mezcla de reacci n e Los vol menes calculados en el software para ambos ensayos diana son compone o Mezcla maestra 2X 10 0 Ensayo 20X 1 0 H O 7 0 Volumen total 18 0 Nota En este momento no se a ade la muestra e Tubos de microcentr fuga e Pipetas e Puntas de pipeta e Componentes de la mezcla de reacci n enumerados arriba e Centr fuga IMPORTANTE Prepare la mezcla de reacci n para cada ensayo diana por separado mezcla de reacci n E 1 Etiquete un tubo del tama o apropiado para cada mezcla de reacci n e Mezcla de reacci n para TP53 e Mezcla de reacci n para GAPDH 2 Para el ensayo de TP53 a ada los vol menes requeridos de cada componente al tubo de la mezcla de reacci n de TP53 Volumen uL para Volumen uL para 12 reacciones Componente 1 reacci n m s un exceso del 10 TagMan Fast Universal PCR 10 0 132 0 Master Mix 2X Ensayo de TP53 20X 1
10. Volumen Reacci n Mezcla de de la Volumen Tubo e mezcla de Muestra de muestra desconocida reacci n A reacci n uL uL 6 Cerebro Mezcla de 59 4 Cerebro 6 6 GAPDH reacci n para GAPDH b Para mezclar las reacciones pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo y a continuaci n tape los tubos c Centrifugue brevemente los tubos para quitar las burbujas de aire d A ada 20 uL de la mezcla de reacci n desconocida muestra a los pocillos apropiados de la placa 3 Selle la placa de reacci n con pel cula adhesiva ptica 4 Centrifugue brevemente la placa de reacci n para quitar las burbujas de aire 5 Hasta que est preparado para realizar la reacci n coloque la placa de reacci n en hielo en un sitio oscuro Directrices de Cuando prepare su propio experimento de Cr comparativos preparacion e Procure utilizar los consumibles adecuados e Aseg rese de que la colocaci n de las reacciones de PCR se corresponde con la disposici n de la placa que se muestra en el software StepOne Puede Aceptar la disposici n de la placa que genera autom ticamente el software O Utilizar el flujo de trabajo Advanced Setup Configuraci n avanzada para cambiar la disposici n de la placa en el software Para obtener m s Para obtener m s informaci n acerca de informaci n e La preparaci n de la placa de reacci n consulte el protocolo apropiado para los reactivos que est utilizan
11. NN EA E IRN PELIGRO DE INCENDIO El uso de fusibles o de una fuente de naci n de alta tensi n incorrectos puede da ar el sistema de cableado del instrumento y provocar un incendio Antes de encender el instrumento compruebe que los fusibles est n bien instalados y que la tensi n del instrumento se corresponde con la fuente de alimentaci n del laboratorio Fusibles EM PELIGRO DE INCENDIO Para protegerse contra el riesgo de incendio s lo cambie los fusibles por otros que sean del tipo y la potencia que se especifica para el instrumento AN L Alimentaci n VAR A PELIGRO PELIGRO EL CTRICO La continuidad del circuito de toma de el ctrica tierra es vital para la seguridad del equipo Jam s utilice el equipo con el conductor de toma de tierra desconectado A PELIGRO EL CTRICO Utilice cordones el ctricos certificados y bien ados para el suministro el ctrico de la instalaci n A j L N Y que tenga una ona de tierra adecuada y la pic de corriente apropiada Potencia de El sistema StepOne se incluye en la categor a II de sobretensi n de las instalaciones y sobretensi n est clasificado como un equipo port til XX Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Pr logo Seguridad de los LED Seguridad de los LED Para garantizar un funcionamiento seguro de los LED e
12. Presentaci n de los datos Hay distintas formas de presentar los datos del experimento Para obtener m s informaci n acerca de estos procedimientos acceda a la ayuda del Guardando la gr fica como un archivo de imagen Imprimiendo la gr fica Imprimiendo la disposici n de la placa Creando diapositivas Imprimiendo un informe Exportando datos software StepOne haciendo clic en y o pulsando F1 Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa 111 m Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa Presentaci n de los datos Notas 112 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa Secci n 5 2 Soluci n de problemas Secci n 5 2 Soluci n de problemas Esta secci n cubre los siguientes temas E Revisi n de las opciones de an liS1S o ooooooooooorornrann 114 E Revisi n del resumen raras ES EA AA 116 El Omisi n de pocillos para el an lisiS oooooooooooooomooo 118 E Revisi n de la gr fica multicomponente o oooooooococncrrnno oo 120 E Revisi n de la gr fica de datos brutos o ooooooooooorormooo 122 Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experi
13. Realizaci n del experimento Notas 172 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 9 Analisis del experimento de C comparativos oO Este cap tulo cubre los siguientes temas El Resumen del cap tulo ue daa rn Ar Ad 174 E Secci n 9 1 Revisi n de los resultadoS o ooooooooooooo o 175 E Secci n 9 2 Soluci n de problemas ooooooooooooooom s 193 Nota Para obtener m s informaci n acerca de alguno de los temas que se explican en esta gu a acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Software pulsando F1 haciendo clic en 4 en la barra de herramientas o seleccionando Help Ayuda StepOne Help Ayuda de StepOne Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 173 cuantificaci n relativa oO Cap tulo 9 An lisis del experimento de C comparativos vw Resumen del cap tulo Resumen del cap tulo El software StepOne analiza los datos con el m todo de cuantificaci n de Cr comparativos AAC En la primera secci n de este cap tulo se explica c mo revisar los datos analizados utilizando las pantallas de an lisis y c mo presentar los datos Si los resultados son cuestionables en la Secci n 2 de este cap tulo se explican algunos pasos para solucionar
14. Type Applied Biosystems StepOne Host Name 192 168 0 1 Saa Current Temperatures Sample 25 0 Cover 105 0 Block 25 0 View Temperature Ml Sample I Cover H Block View Chart View 110 Minutes v Fixed View Temperature 00 02 30 00 03 20 00 04 10 00 05 00 00 05 50 00 06 40 00 07 30 00 08 20 00 09 10 00 10 00 00 10 50 00 11 40 Time Abono T Remote Monitor Xx CCA Local Instrument connected Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 85 cuantificaci n relativa Cap tulo 4 Realizaci n del experimento de curva est ndar relativa Monitorizaci n de la reacci n Monitorizaci n Si ha comenzado la reacci n desde el instrumento StepOne puede ver el progreso de la aut noma misma desde la pantalla t ctil La pantalla Run Method Protocolo de termociclado muestra el m todo del experimento y resalta los pasos del perfil t rmico a medida que el instrumento va realiz ndolos Para Acci n A A adir una curva de Toque i Add Dissociation Curve A adir curva de disociaci n a la disociaci n y a continuaci n toque OK Aceptar reacci n B Vereltiempo que Toque A Display Method Time Ver tiempo de m todo y a queda en el proceso continuaci n toque para regresar a la pantalla Run Method Protocolo de termociclado C Detener el proceso Toque M Stop Detener
15. b Haga clic en Browse Examinar seleccione el archivo txt que ha creado en el paso 4 y a continuaci n haga clic en Select Seleccionar c Haga clic en Start Import Iniciar importaci n 8 Prepare las reacciones de PCR a Prepare el molde b Prepare las diluciones de las muestras c Prepare la diluci n seriada s lo en experimentos de curva est ndar relativa d Prepare la mezcla de reacci n e Prepare la placa de reacci n 9 Realice el experimento a Cargue el instrumento b Inicie el proceso c Descargue el instrumento 10 Analice los datos Notas 210 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Bibliograf a Kwok S and Higuchi R 1989 Avoiding false positives with PCR Nature 339 237 238 Saiki R K Scharf S Faloona F et al 1985 Enzymatic amplification of B globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia Science 230 1350 1354 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 211 cuantificaci n relativa Bibliograf a 212 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa AIF alelo amplic n amplificaci n apantallador apantallador no fluorescente de uni n al surco menor de cadena de DNA NFQ MGB archivo de
16. e Ajuste manualmente la l nea basal y o el umbral consulte Revisi n de las opciones de an lisis en la p gina 114 O e Omita pocillos consulte Omisi n de pocillos para el an lisis en la p gina 118 Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 107 cuantificaci n relativa mu Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa Revisi n de la gr fica de expresi n g nica y la tabla de pocillos Para obtener m s Para obtener m s informaci n acerca de la pantalla Amplification Plot Gr fica de informaci n amplificaci n acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en y o pulsando Fl Revisi n de la gr fica de expresi n g nica y la tabla de pocillos La pantalla Gene Expression Plot Gr fica de expresi n g nica muestra los resultados de los c lculos de cuantificaci n relativa a trav s del perfil de expresi n g nica Hay disponibles dos gr ficas e RQ vs Target Cuantificaci n relativa vs diana agrupa los valores de cuantificaci n relativa RQ por diana Se traza cada muestra para cada gen diana e RQ vs Sample Cuantificaci n relativa vs muestra agrupa los valores de cuantificaci n relativa RQ por muestra Se traza cada gen diana para cada muestra Cada gr fica se puede ver de las siguientes formas lineal log10 Ln log2 En la tabla de pocillos se muestran datos de cada pocillo de la pla
17. e Seleccione un control end geno para cada muestra El control end geno es un gen diana que est presente en todas las muestras que se est n investigando Se deber a expresar por igual en todos los tipos de muestras con independencia del tratamiento o el origen del tejido ejemplos de controles end genos B actina GAPDH y RNA ribosomal 18S rRNA 185 El control end geno se utiliza para normalizar los resultados de la PCR el control end geno corrige la cantidad de molde la eficiencia de extracci n del cido nucleico la eficiencia de la retrotranscripci n y los errores de calibraci n de las pipetas Tenga en cuenta que Cada tipo de muestra por ejemplo cada tejido de un estudio en el que se comparan m ltiples tejidos requiere un control end geno Si las muestras est n distribuidas en m ltiples placas cada placa debe tener un control end geno Asimismo cada placa debe incluir un control end geno para cada tipo de muestra de la placa e Seleccione el fluorocromo del notificador utilizado en el ensayo diana Seleccione FAM si el fluorocromo FAM est unido al extremo de 5 de la sonda TaqMan que se utiliza para detectar el gen diana Notas 136 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 6 Dise o del experimento de Cy comparativos R Configuraci n de las muestras Y Seleccione JOE si el fluorocromo J
18. n y cerebro necesarios e Uno de los Applied Biosystems High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Kit N mero de referencia High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit 4368814 200 reacciones High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit 4368813 1000 reacciones High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit 4374966 with RNase Inhibitor 200 reacciones High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit 4374967 with RNase Inhibitor 1000 reacciones Nota El High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit se llamaba antiguamente High Capacity cDNA Archive Kit Preparaci n del Utilice el High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit para sintetizar cDNA de molde cadena sencilla a partir de las muestras de RNA total Siga los procedimientos de Applied Biosystems High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol para 1 Preparar la mezcla maestra de la reacci n A 1 CUIDADO PELIGRO QU MICO El tamp n de reacci n 10X puede causar irritaci n de los ojos la piel y las v as respiratorias Consulte la ficha t cnica de seguridad MSDS y siga las instrucciones de manipulaci n indicadas Use protectores oculares vestimenta protectora y guantes apropiados 2 Prepare las reacciones de cDNA Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 157 cuantificaci n relativa Cap tulo 7 Preparaci n de las reacciones de Cr
19. 142 147 150 154 eliminaci n de residuos qu micos xix preparaci n 54 58 60 64 158 160 162 165 proceso 72 seguridad de residuos qu micos xix seguridad qu mica xvii dise ar experimento configurar dianas 25 135 configurar est ndares 28 configurar m todo de proceso 33 141 configurar muestras 30 137 configurar opciones cuantificaci n relativa 140 configurar opciones de cuantificaci n relativa 32 crear nuevo 17 127 definir m todos y materiales 22 131 definir propiedades del experimento 20 129 directrices 21 23 26 29 32 33 34 41 45 48 130 132 136 139 140 142 147 150 154 elementos del software 127 finalizar flujo de trabajo del asistente de dise o 46 152 flujo de trabajo 16 126 para obtener m s informaci n 22 24 27 30 32 33 34 42 45 48 131 134 137 139 141 142 148 151 154 revisar configuraci n de reacci n 35 142 solicitar materiales 43 148 disposici n conectada inicio 73 supervisi n 77 transferir datos 88 distribuci n aut noma inicio 74 supervisi n 86 supervisi n remota 83 transferencia de datos remota 88 transferir datos 89 documentaci n relacionada viii E eficiencia de amplificaci n 29 30 102 103 elementos del software Design Wizard Asistente de dise o 127 pantallas de an lisis 96 178 eliminaci n de residuos directrices xx ensayos en inventario 41 147 ensayos fabricados bajo pedido 41 147 ensayos personalizados 41 147 ergonom a seg
20. 23 564CT 23 564CT 26 95 B sar E sar E sar E car E car E sar E Gar 2 0 2 0 2 0 2 2 y 0 02 0 02 0 02 CT 26 95ACT 26 944CT 30 414CT 30 364CT 30 394CT 33 714CT 33 834ACT 33 77 Analysis Summary Total Wells in Plate 41 Wells Set Up 48 Wells Processed 48 Wells E 12 Unknown E 30 Standard 6 Negative Control Wells Flagged 4 Wells Omitted from Analysis 0 Samples Used 2 Targets Used 2 T lt i i Realtive Stan ve Example eds X Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 97 cuantificaci n relativa m Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa An lisis del experimento Consejos de C mo seleccionar pocillos desplazamiento Para ver pocillos espec ficos en las pantallas de an lisis seleccione los pocillos en la ficha View Plate Layout Ver disposici n de placa de la siguiente manera 1 Para seleccionar pocillos de un tipo espec fico utilice los men s desplegables Select Wells With Seleccionar pocillos con seleccione Sample Muestra Target Diana o Task Tarea y a continuaci n seleccione el nombre de la muestra el gen diana o la tarea 2 Para seleccionar un solo pocillo haga clic en l en la disposici n de la placa 3 Para seleccionar varios pocillos haga clic y arrastre el rat n por encima de los pocillos deseados pulse CTRE clic
21. Ayuda 2 Barra de herramientas muestra las herramientas disponibles en el software New Experiment Experimento nuevo Open Abrir Save Guardar Close Cerrar Send Experiment to Instrument Enviar experimento al instrumento Download Experiment from Instrument Descargar experimento del instrumento Export Exportar Print Report Imprimir informe 3 Cabecera del experimento indica el nombre del experimento el tipo de experimento y los reactivos del experimento abierto 4 Panel de men s del experimento incluye v nculos a las siguientes pantallas del software Pantallas de configuraci n Pantallas del perfil de reacci n Pantallas de an lisis Amplification Plot Gr fica de amplificaci n Standard Curve Curva est ndar Gene Expression Expresi n g nica Multicomponent Plot Gr fica multicomponente Raw Data Plot Gr fica de datos brutos QC Summary Resumen QC Multiple Plots View Vista de m ltiples gr ficas 5 Panel de gr ficas muestra la pantalla de an lisis seleccionada para el experimento abierto 6 Fichas de visualizaci n muestra la disposici n de la placa o la tabla de pocillos del experimento abierto Notas 96 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Les StepOne v1 0 Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa An lisis del expe
22. Examinar seleccione el archivo Relative Standard Curve Example eds y a continuaci n haga clic en Open Abrir Seleccione el instrumento StepOne en el men desplegable Select Instrument Seleccionar instrumento S1 no aparece su instrumento StepOne config relo para la monitorizaci n tal y como se explica en la Gu a de instalaci n de Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Haga clic en Send Experiment Enviar experimento para enviar el experimento al instrumento StepOne a trav s de la red Send Experiment to Instrument a Select an experimentto send selectthe instrument to receive the experiment then click o Send Experiment d 1 Select Experiment experiments Relative Standard Curve Example eds Browse 2 Select Instrument Y Local Instrument Default J Send Experiment Cancel Cuando se le solicite haga clic en OK Aceptar para cerrar el mensaje de confirmaci n Vaya al paso 6 2 Sielinstrumento StepOne no est conectado al ordenador realice los pasos 2a a 2d para transferir el experimento utilizando una unidad USB a b Notas Conecte la unidad USB a uno de los puertos USB del ordenador En el software StepOne seleccione j Save Guardar Save As Guardar como En el cuadro de di logo Save Guardar despl cese a la unidad USB y a continuaci n haga clic en Save Guardar Extraiga la unidad USB del
23. Expression Assays Para el ensayo diana TP53 el identificador del ensayo es Hs00153340_m1 RefSeq NM_000546 2 Para el ensayo de control end geno GAPDH se utiliza el kit de control end geno GAPD GAPDH humano PN 4333764T Disposici n de la placa de reacci n A continuaci n se muestra la disposici n de la placa de reacci n del experimento de Cr comparativos de ejemplo Li Li A 1rsa LJ 1rs3 LJ rrsa E GAPDH C GcAPDH J caPoH o e o e Liver Liver Liver Liver Kidney Kidney Kidney Kidney B i rrsa E caro E caron I caron M rrsa 1 resa M rrsa UI caron Kidney Kidney Brain Brain Brain Brain Brain Brain caron E caron 1 rosa 1 tesa 1 1esa I caron E carpon 1 caron Acerca de los Los archivos de datos de los experimentos de ejemplo se instalan con el software datos del StepOne Encontrar los archivos de los experimentos de ejemplo en su ordenador A lt unidad gt AApplied Biosystems StepOne Systemlexperimentsiexamples donde lt unidad gt es la unidad del disco duro del ordenador en la que est instalado el software StepOne La unidad de instalaci n predeterminada del software es la unidad C Flujo de trabajo del experimento de ejemplo La figura de la p gina 13 muestra el flujo de trabajo de los experimentos de curva est ndar relativa y Cr comparativos Notas 12 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantifi
24. GAPDH 23 501162 7 3 C6 O Brain GAPDH UNKNOWN FAM NFQ 23501162 23 428322 0 063 8 159 7 657 Brain TP53 30 856344 4 c3 O Brain TP53 UNKNOWN FAM NFQ 30 856344 30 912079 0 049 6 621 5 651 T EO Brain TP53 30 93019 5 c5 O Brain TP53 UNKNOWN FAM NFQ 30 93019 30 912079 0 049 6 509 5 567 7 Brain TP53 30 949701 6 C4 O Brain TP53 UNKNOWN FAM NFQ 30 949701 30 912079 0 049 6 601 5 649 7 GAPDH Undetermined 7 A4 O GAPDH NTC FAM NFQ Undetermi NaN 0 486 0 8 A5 O GAPDH NTC FAM NFQ Undetermi NaN 0 501 0 g AG O GAPDH NTC FAM NFQ Undetermi NaN 0 484 0 001 Kidney GAPDH 24 832844 10 C1 O Kidney GAPDH UNKNOWN FAM NFO 24 832844 24 887396 0 059 8 314 7 822 Kidney GAPDH 24 87947 11 B8 O Kidney GAPDH UNKNOWN FAM NFQ 24 87947 24 887396 0 059 8 078 7 603 Kidney GAPDH 24 949875 12 C2 O Kidney GAPDH UNKNOWN FAM NFO 24 949875 24 887396 0 059 7 98 7 418 3 e i 2 Directrices de Cuando analice su propio experimento de C comparativos f jese bien si en los grupos an lisis de r plicas hay valores at picos Si es necesario quite manualmente los valores at picos con la tabla de pocillos 1 En el panel Experiment Menu Men de experimento seleccione Analysis An lisis Amplification Plot Gr fica de amplificaci n Nota Si en la pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n no aparece ning n dato haga clic en Analyze Analizar 2 En la pantalla Amplification Plot
25. Gr fica de amplificaci n seleccione C vs Well Cr vs pocillo en el men desplegable Plot Type Tipo de gr fica 3 Seleccione la ficha View Well Table Ver tabla de pocillos Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 199 cuantificaci n relativa oO Cap tulo 9 An lisis del experimento de C comparativos Revisi n de la gr fica multicomponente 4 En la tabla de pocillos a En el men desplegable Group By Agrupar por seleccione Replicate R plica b F jese si en el grupo de r plicas hay alg n valor at pico aseg rese de que est n marcados c Active la casilla de verificaci n Omit Omitir que hay junto a los pocillos con valores at picos 5 Haga clic en Analyze Analizar para volver a analizar los datos del experimento sin los pocillos con valores at picos Para obtener m s Para obtener m s informaci n acerca de la omisi n de pocillos para el an lisis acceda a informaci n la ayuda del software StepOne haciendo clic en y o pulsando F1 En la ayuda busque los temas relacionados con la omisi n de pocillos 1 Haga clic en la ficha Search Buscar 2 Escriba omit well omisi n de pocillos 3 Haga clic en List Topics Ver temas 4 Haga doble clic en los temas que desee leer Revisi n de la gr fica multicomponente La pantalla Multicomponent Plot Gr fica multicomponente muestra la contribuci n espectral comple
26. Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 101 cuantificaci n relativa Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa Visualizaci n de la curva est ndar 8a View Plate Layout View Well Table 8b Select Wells With Select Item 8c Well Omit Flag Sample Na TargetName Task Dyes ET CT Mean GAPDH 19 961893 E3 O GAPDH STANDARD FAM NFO MGB 19 961893 19 98554 GAPDH 19 979004 E4 GAPDH STANDARD FAM NFQ MGB 19 979004 19 98554 GAPDH 20 015724 E2 O GAPDH STANDARD FAM NFO MGB 20 015724 19 98554 El GAPDH 23 557253 E7 O GAPDH STANDARD FAM NFO MGB 23 557253 23 567474 GAPDH 23 557608 E6 O GAPDH STANDARD FAM NFO MGB 23 557608 23 567474 GAPDH 23 587563 ES O GAPDH STANDARD FAM NFO MGB 23 587563 23 567474 E GAPDH 26 939299 F2 O GAPDH STANDARD FAM NFO MGB 26 939299 26 945066 GAPDH 26 947723 Fl O GAPDH STANDARD FAM NFO MGB 26 947723 26 945066 GAPDH 26 948175 E8 O GAPDH STANDARD FAM NFO MGB 26 948175 26 945066 El GAPDH 30 363256 F4 d GAPDH STANDARD FAM NFQ MGB 30 363256 30 385414 GAPDH 30 383087 FS O GAPDH STANDARD FAM NFO MGB 30 383087 30 385414 care Directrices de Cuando analice su propio experimento de curva est ndar relativa busque an lisis e Valores de pendiente eficiencia de amplificaci n la eficiencia de la amplificaci n se calcula utilizando la pendiente de la l nea de regresi n
27. Puede enviar sus comentarios a la direcci n de correo electr nico techpubs wappliedbiosystems com IMPORTANTE Esta direcci n s lo sirve para enviar comentarios y sugerencias en relaci n con la documentaci n Para solicitar documentos descargar archivos PDF u obtener ayuda sobre una cuesti n t cnica vaya a www appliedbiosystems com y a continuaci n haga clic en el v nculo Support Asistencia t cnica Consulte C mo obtener asistencia t cnica m s adelante Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de IX cuantificaci n relativa Pr logo C mo obtener asistencia t cnica C mo obtener asistencia t cnica Para acceder a los servicios m s recientes y obtener informaci n acerca de la asistencia t cnica vaya a www appliedbiosystems com y a continuaci n haga clic en el v nculo Support Asistencia t cnica En la p gina Support Asistencia t cnica puede e Buscar las preguntas m s frecuentes FAQ e Enviar una pregunta directamente al Servicio de asistencia t cnica e Solicitar a Applied Biosystems documentos de usuario fichas t cnicas de solicitud de materiales MSDS certificados de an lisis y otros documentos relacionados e Descargar documentos PDF e Obtener informaci n acerca de la formaci n del cliente e Descargar actualizaciones y parches de software Asimismo en la p gina Support Asistencia t cnica podr acceder a los n mero
28. a continuaci n el cDNA se amplifica por medio de la PCR Este m todo es til para generar un pool de cDNAs o para almacenar al cuotas de cDNA y utilizarlas posteriormente La enzima AmpErase UNG se puede utilizar para evitar la contaminaci n cruzada Nota Para obtener m s informaci n acerca de AmpErase UNG consulte la Gu a de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa 4 Cap tulo 1 Introducci n Acerca de los experimentos de cuantificaci n relativa Reactivos Reactivos TagMan y SYBR Green Applied Biosystems ofrece reactivos TaqMan y SYBR Green para utilizarlos en el sistema StepOne Ambos tipos de reactivos se describen brevemente en la siguiente tabla fluorog nica para permitir la detecci n de un producto de PCR espec fico cuando se acumula durante los ciclos de PCR Ventajas e Aumenta la especificidad con una sonda La hibridaci n espec fica entre la sonda y el gen diana genera una se al de fluorescencia e Permite el trabajo en multiplex e Hay disponibles ensayos optimizados e Permite realizar ensayos de 5 nucleasas durante la PCR e Se puede utilizar para la RT PCR de 1 o 2 pasos Tipo de reactivo Proceso Reactivos o kits TaqMan PCR y detecci n de CONA Descri pci n a Componentes del ensayo g Ses TTE Sonda u
29. a una muestra de referencia apropiada e Control end geno un gen presente en un nivel de expresi n uniforme en todas las muestras El control end geno sirve para normalizar posibles variaciones de la cantidad de cDNA que se a ade a cada reacci n que se producen a consecuencia de imprecisiones en el pipeteo Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 5 cuantificaci n relativa NN Cap tulo 1 Introducci n Acerca de los experimentos de cuantificaci n relativa Experimentos de curva est ndar e R plicas reacciones id nticas que contienen componentes y vol menes id nticos e Controles negativos muestras que contienen agua o tamp n en lugar de un molde En los controles negativos no deber a haber amplificaci n relativa y experimentos de C comparativos Tenga en cuenta lo siguiente a la hora de elegir entre experimentos de curva est ndar relativa y experimentos de C comparativos Tipo de experimento Descripci n Ventaja Limitaci n comparativos AAC para determinar el cambio de expresi n de un gen diana en una muestra en relaci n con el mismo gen diana en una muestra de referencia Es ideal para analizar la expresi n relativa de muchos genes de inter s en un gran n mero de muestras expresi n de un gen diana en las muestras se pueden determinar sin utilizar una curva est ndar siempre que las eficie
30. convenciones utilizadas en esta gu a vil crear nuevo experimento 17 127 D datos acerca de la recopilaci n de datos 2 experimento de ejemplo 9 12 94 176 publicar 111 191 transferir 87 descargar placa de reacci n 87 Design Wizard Asistente de dise o elementos del software 127 finalizar 46 152 pantalla Experiment Properties Propiedades de experimento 20 129 pantalla Materials List Lista de materiales 43 148 pantalla Methods amp Materials M todos y materiales 22 131 pantalla Reaction Setup Configuraci n de reacci n 35 142 pantalla Relative Quantification Settings Opciones cuantificaci n relativa 140 pantalla Relative Quantification Settings Opciones de cuantificaci n relativa 32 pantalla Run Method M todo de proceso 33 141 pantalla Samples Muestras 30 137 pantalla Standards Est ndares 28 pantalla Targets Dianas 25 135 dianas configurar 25 135 directrices de dise o 26 136 diluci n seriada de est ndar componente de experimento 5 preparar 55 vol menes calculados 36 39 diluciones de muestras preparar 53 158 vol menes calculados 40 53 146 159 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 227 cuantificaci n relativa ndice directrices an lisis 95 102 107 110 115 118 119 122 123 177 184 189 195 197 199 202 204 dise o 21 23 26 29 32 33 34 41 45 48 130 132 136 139 140
31. cuantificaci n relativa Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa Revisi n de la gr fica de expresi n g nica y la tabla de pocillos d Haga clic en Show Hide the plot legend Mostrar ocultar la leyenda de la gr fica En el experimento de ejemplo se muestra el nivel de expresi n de c myc en el h gado en relaci n con su nivel de expresi n en la muestra de referencia ri n Dado que la muestra de referencia se compara consigo misma el nivel de expresi n es 1 Si el resultado se muestra en el tipo de gr fico Log10 el nivel de expresi n de la muestra de referencia aparece como 0 en el gr fico log10 de 1 0 2a 2b 2C Plot Type RQ vs Sample Y Graph Type Log10 v Orientation Vertical Bars v 2d a g Gene Expression 0 250 7 0 225 4 E 0 200 7 0 175 7 0 150 7 0 125 7 logl 0 RO 0 100 7 0 075 7 0 050 7 0 025 7 0 000 7 Sample Legend E c myc 3 Revise la tabla de pocillos a En el panel Experiment Menu Men del experimento seleccione Analysis An lisis gt 4 Amplification Plot Gr fica de amplificaci n y a continuaci n seleccione la ficha View Well Table Ver tabla de pocillos b En el men desplegable Group By Agrupar por seleccione Replicate R plica c F jese en la columna C SD para evaluar la precisi n de los grupos de r plicas En el experimento de ejemplo hay un valor at pico
32. es TP53 un factor de transcripci n que regula otros genes El ensayo Target 2 Diana 2 se configura para el control end geno Para el experimento de ejemplo se trata de la gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa GAPDH humano El GAPDH se utiliza como control end geno porque sus niveles de expresi n suelen ser relativamente estables Haga clic en el campo How many targets do you want to quantify in the reaction plate Cu ntas dianas desea cuantificar en la placa de reacci n y a continuaci n escriba 2 Nota El n mero de filas de la tabla de ensayos diana se actualiza con el n mero que escriba Configure el ensayo Target 1 Diana 1 a Haga clic en la celda Enter Target Name Escribir nombre de gen diana y a continuaci n escriba TP53 b En el men desplegable Reporter Notificador seleccione FAM predeterminado C En el men desplegable Quencher Apantallador seleccione NFQ MGB predeterminado d Deje la opci n predeterminada en el campo Color Configure el ensayo Target 2 Diana 2 a Haga clic en la celda Enter Target Name Escribir nombre de gen diana y a continuaci n escriba GAPDH b En el men desplegable Reporter Notificador seleccione FAM predeterminado C En el men desplegable Quencher Apantallador seleccione NFQ MGB predeterminado d Deje la opci n predeterminada en el campo Color Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Rea
33. experimentos experimentos de curva est ndar relativa o Cr comparativos Cada uno de los procedimientos de los cap tulos 2 9 contiene un conjunto de directrices que ofrecen informaci n acerca de c mo realizar sus propios experimentos Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 9 cuantificaci n relativa 4 Cap tulo 1 Introducci n Acerca del experimento de ejemplo Asimismo puede utilizar cualquiera de los otros flujos de trabajo que se incluyen en el software StepOne para realizar sus experimentos En la siguiente tabla se ofrece un resumen de todos los flujos de trabajo disponibles en el software StepOne plo Descripci n V ase trabajo Design Wizard Escriba los par metros del experimento mientras el Cap tulo 2 O Asistente de asistente le gu a por los procedimientos ptimos Cap tulo 6 dise o Advanced Configure un experimento nuevo bas ndose en su propio p gina 206 Setup criterio Da flexibilidad de dise o a los usuarios Configuraci n experimentados avanzada QuickStart Realice un experimento nuevo sin introducir informaci n p gina 207 Inicio r pido de la configuraci n de la placa Molde Configure un experimento nuevo utilizando la informaci n p gina 208 de configuraci n de un molde anterior Exportaci n Importe dise os de experimentos desde archivos de texto p gina 209 importaci n ASCII que contienen informaci n d
34. n 3 Seleccione Enable Notifications Activar notificaciones 4 Seleccione los eventos que desencadenar n las notificaciones a Seleccione Instrument Error Error del instrumento b Seleccione Run Completed Proceso completado 9 En el campo Enter e mail addresses for notifications Escriba las direcciones de correo electr nico para las notificaciones escriba scientist dmycompany com supervisor ymycompany com technician ymycompany com 6 En el campo Outgoing Mail Server SMTP Servidor de correo saliente SMTP escriba smtp mycompany com Ajuste las opciones de autenticaci n a Seleccione No en Server requires authentication El servidor requiere autenticaci n b En el campo User Name Nombre de usuario escriba supervisor c En el campo Password Contrase a escriba password Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 11 cuantificaci n relativa Cap tulo 4 Realizaci n del experimento de curva est ndar relativa Opcional Activaci n de las notificaciones Notification Settings Enable Notifications Yes O No Selectthe events to generate notifications Instrument Error 4 C Run Started Run Completed Enter e mail addresses for notifications scientisteamycompany com supervisoremycompany com technician omycompany com Separate e mail addresses with commas For example jane_smith 4myd
35. n Recomendaci n Umbral Introduzca un valor para el umbral de manera que e Est por encima del ruido de fondo e Est por debajo de las fases de meseta o plateau y fase lineal de la curva de amplificaci n e Est dentro de la fase exponencial de la curva de amplificaci n L nea basal Seleccione los valores Start Cycle Ciclo inicial y End Cycle Ciclo final antes de que comience la amplificaci n e Flag Settings Opciones de avisos utilice esta ficha para Ajustar la sensibilidad para que se marquen m s o menos pocillos Cambiar los par metros de los avisos que aplica el software StepOne e Relative Quantitation Settings Opciones de cuantificaci n relativa utilice esta ficha para Cambiar la muestra de referencia y o el control end geno Seleccionar el algoritmo que se debe utilizar para determinar los valores m nimos y m ximos de RQ nivel de confianza o desviaciones est ndar e Advanced Settings Opciones avanzadas utilice esta ficha para cambiar las opciones de l nea basal pocillo a pocillo Para obtener m s Para obtener m s informaci n acerca de las opciones de an lisis acceda al software informaci n StepOne pulsando F1 cuando se abra el cuadro de di logo Analysis Settings Opciones de an lisis Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 115 cuantificaci n relativa n Cap tulo
36. n de la PCR La eficiencia de la amplificaci n se calcula utilizando la pendiente de la l nea de regresi n de la curva est ndar Una pendiente pr xima al 3 3 indica una eficiencia de amplificaci n de la PCR ptima del 100 Factores que afectan a la eficiencia de la amplificaci n e Rango de cantidades est ndar para obtener medidas de la eficiencia m s exactas y precisas utilice un amplio rango de cantidades est ndar de 5 a 6 rdenes de magnitud multiplicado por 10 a 109 e N mero de r plicas est ndar para obtener mediciones de la eficiencia m s precisas incluya r plicas para reducir los efectos de las imprecisiones del pipeteo e Apantalladores de la PCR los apantalladores de la PCR en la reacci n pueden reducir la eficiencia de la amplificaci n En el sistema StepOne reacci n de PCR que contiene cebadores para amplificar un gen diana y una sonda para detectar el gen diana amplificado Componente de reacci n de PCR de los Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays y los TaqMan SNP Genotyping Assays que consta de cebadores dise ados para amplificar un gen diana y una sonda TaqMan dise ada para detectar la amplificaci n del gen diana Se utiliza en los experimentos de genotipado Es una reacci n de PCR que contiene cebadores para amplificar el SNP y dos sondas para detectar diferentes alelos Los ensayos TaqMan que se fabrican cuando se solicitan S lo se env an los ensayos que pedido
37. o pulse May s elic en la disposici n de la placa 4 Para seleccionar los 48 pocillos haga clic en la esquina superior izquierda de la disposici n de la placa View Plate Layout View Well Table Select Wells With Sample v Select Item Y Select Item Showin Wells w FE View Legend liver kidney A E c myc E c mye E c myo J caron J caron C caron Here Momo A Cr Undetermined CT Undetermined CT Undetermined CT Undetermined CT Undetermined CT Undetermined C qe ano T 27 89 CT 27 96 M caron 1 caron 1 caron H e myc N e myc H e myc 1 caron 9 15 9 21 9 49 4 77 4 79 4 83 9 26 CT 24 66 CT 24 65 CT 24 61 Cr 28 73 Cr 28 73 Cr 28 71 CT 24 64 o GAPDH E c myc EJ c myc E c myc E c myc EJ c myc g 8 89 200 200 200 20 20 20 CT 24 7 CT 23 35 CT 23 3 CT 23 35 CT 26 64 CT 26 67 CT 26 82 ES e myo E m E e myo ES c myo ES mo A A 2 2 0 2 0 2 0 2 H c myo H e mye CT 29 95 Cr 29 95 Cr 33 16 CT 33 63 CT 33 59 0 02 0 02 E caron E caron ES caron E caron ES caro ES caron ES caron 200 200 200 20 20 20 2 Cr 20 02 CT 19 96 Cr 19 98 CT 23 59 CT 23 56 CT 23 56 Cr 26 95 E caron ES caron S carpon S caron 2 2 0 2 0 2 0 2 CT 26 95 CT 26 94 CT 30 41 CT 30 36 CT 30 38 Wells D 12 Unknown 8 30 Standard IN 6 Negative Control O Empty Notas 98 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuanti
38. para asignar el contenido de los pocillos ver las asignaciones de los pocillos y ver los resultados La disposici n de la placa se muestra en las pantallas Design Wizard Asistente de dise o Advanced Setup Configuraci n avanzada de reacci n y de an lisis La disposici n de la placa se puede imprimir incluir en un informe exportar y guardar como una diapositiva para una presentaci n Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa disposici n aut noma disposici n conectada EFF eficiencia de amplificaci n EFF ensayo mezcla de ensayos ensayo SNP ensayos bajo Glosario Disposici n del sistema en la que el instrumento StepOne no est conectado a un ordenador por medio del cable amarillo del sistema StepOne En su lugar se utiliza una unidad USB Y para transferir datos entre los componentes del sistema StepOne En esta disposici n el instrumento StepOne se controla por medio de la pantalla t ctil del instrumento Disposici n del sistema en la que el instrumento StepOne est conectado directamente a un ordenador conectado por medio del cable del sistema StepOne amarillo En esta disposici n el instrumento StepOne est controlado por medio del software StepOne del ordenador conectado V ase eficiencia de amplificaci n EFE C lculo de la eficiencia de la amplificaci
39. preparacion e Podr a necesitar diluciones de las muestras porque el volumen de las muestras se limita al 10 del volumen total de la reacci n en el software StepOne Debe realizar diluciones de las muestras antes de a adir las muestras a la mezcla de reacci n final e Para conseguir un rendimiento ptimo de los TaqMan Gene Expression Assays O los Custom TaqMan Gene Expression Assays utilice entre 10 y 100 ng de molde de cDNA por 20 uL de reacci n Para reactivos tipo r pido Applied Biosystems recomienda 10 ng e Utilice tamp n TE o agua para diluir la muestra Para obtener m s Para obtener m s informaci n acerca de los ensayos de Applied Biosystems consulte Informaci n TagMan Gene Expression Assays Protocol Custom TagMan Gene Expression Assays Protocol Notas 54 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 3 Preparaci n de las reacciones de la curva est ndar relativa re Preparaci n de la diluci n seriada Preparaci n de la diluci n seriada Acerca del experimento de ejemplo Materiales necesarios Preparaci n de la diluci n seriada para el ensayo de c myc Notas Prepare la diluci n seriada con los vol menes que ha calculado el software StepOne Complete la ficha Reaction Mix Calculations C lculos de la mezcla de reacci n para el ensayo de c myc en la p gina 35 y Complete la ficha
40. seleccione NFQ MGB predeterminado d Deje la opci n predeterminada en el campo Color 5 Haga clic en Next Siguiente gt Nota En todos los genes diana deje en blanco el campo Optional Enter Gene Name Opcional Escriba el nombre del gen Puede buscar el identificador del gen ensayo para solicitar los materiales consulte Solicitud de materiales para el experimento en la p gina 43 2A Set Up Targets Targets Help O T Instructions Enter the number of targets to quantify in the reaction plate then set up the assay for each target Set Up Targets Required How many targets do you want to quantify in the reaction plate 2 1 For each target assay in the reaction plate select whether to set up standards enter a target name select the reporter and quencher to use to detect the target and select a target color Optionally enter a gene name find Applied Biosystems gene expression assays then select an assay to fill in the Assay ID Set Up Standards Enter Target Name Reporter Quencher Color Assay ID 2 v NFQ MGB v A 3 2 Directrices de Cuando dise e su propio experimento de C comparativos dise o e Active la casilla de verificaci n Set Up Standards Configurar est ndares Applied Biosystems recomienda configurar una curva est ndar para cada ensayo diana en la placa de reacci n e Identifique cada ensayo diana con un nombre y un color nicos Pu
41. todo de proceso 33 141 supervisi n durante un proceso 81 pantalla Samples Muestras 30 137 pantalla Standards Est ndares 28 pantalla Targets Dianas 25 135 pantalla Temperature Plot Gr fica de temperatura 80 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 229 cuantificaci n relativa ndice pantallas de an lisis consejos de desplazamiento 98 179 elementos del software 96 178 pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n 103 185 pantalla Gene Expression Plot Gr fica de expresi n de genes 108 182 pantalla Multicomponent Plot Gr fica multicomponente 120 200 pantalla Multiple Plots M ltiples gr ficas 99 180 pantalla QC Summary Resumen QC 116 196 pantalla Raw Data Plot Gr fica de datos brutos 122 203 pantalla Standard Curve Curva est ndar 100 tabla de pocillos 108 182 PCR multiplexada 7 25 134 PCR uniplexada 7 25 134 Peligro xxi PELIGRO descripci n xi peligros Consulte seguridad perfiles de residuos descripci n xx placa de reacci n cargar 70 170 descargar 87 disposici n 46 152 preparar 61 163 plantilla V ase muestras pocillos control negativo 31 46 61 138 152 163 desconocidos 31 46 61 138 152 163 est ndar 31 46 61 138 152 163 omitir 118 197 seleccionar 98 179 PRECAUCI N descripci n xi preparar el proceso 69 169 preparar experimento diluci n seriada de est ndar 5
42. y de agua que se indican a continuaci n Mezcla de Volumen de la Volumen de Tubo reacci n mezcla de agua uL reacci n uL g u 1 Mezcla de reacci n 59 4 6 6 para TP53 2 Mezcla de reacci n 59 4 6 6 para GAPDH b Para mezclar la reacci n pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo y a continuaci n tape el tubo c Centrifugue brevemente el tubo para quitar las burbujas de aire d A ada 20 uL de la reacci n de control negativo a los pocillos apropiados de la placa de reacci n 2 Por cada grupo de r plicas prepare las reacciones para los elementos desconocidos o muestras a A tubos del tama o adecuado a ada los vol menes de la mezcla de reacci n y de las muestras que se indican a continuaci n Volumen n de la Volumen Tubo Prai plc mezcla de Muestra de muestra reacci n uL uL 1 H gado TP53 Mezcla de 59 4 H gado 6 6 reacci n para TP53 2 Ri n TP53 Mezcla de 59 4 Ri n 6 6 reacci n para TP53 3 Cerebro TP53 Mezcla de 59 4 Cerebro 6 6 reacci n para TP53 4 GAPDH en Mezcla de 59 4 H gado 6 6 h gado reacci n para GAPDH 5 GAPDH en Mezcla de 59 4 Ri n 6 6 ri n reacci n para GAPDH Notas 164 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 7 Preparaci n de las reacciones de Cy comparativos nom Preparaci n de la placa de reacci n
43. y la RT PCR de 1 y de 2 pasos consulte la Gu a de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Configuraci n de los genes diana Acerca del experimento de ejemplo Pantalla Targets Dianas Notas En la pantalla Targets Dianas escriba el n mero de genes diana que desea cuantificar en la placa de reacci n de PCR y a continuaci n configure el ensayo para cada gen diana En el experimento de curva est ndar relativa de ejemplo Se cuantifican dos dianas en la placa de reacci n Se activa la casilla de verificaci n Set Up Standards Configurar est ndares Cuando se activa esta casilla de verificaci n el software muestra autom ticamente la pantalla Standards Est ndares despu s de completar la pantalla Targets Dianas En la pantalla Standards Est ndares se puede configurar una curva est ndar para cada ensayo diana consulte Configuraci n de los est ndares en la p gina 28 El ensayo Target 1 Diana 1 est configurado para el gen diana que se est estudiando En el experimento de ejemplo se trata del gen c myc humano una oncoprote na que activa la transcripci n de los genes asociados al crecimiento El ensayo Target 2 Diana 2 se configura para el control end geno Para el experimento de ejemplo se trata de la gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa GAPDH humano El GAPDH se utiliza como control end geno porque sus niveles de expresi n suelen ser relativame
44. 10 Incluya todos los componentes requeridos Prepare los reactivos de acuerdo con las instrucciones del fabricante Mantenga los ensayos protegidos de la luz en el refrigerador hasta que est listo para usarlos Una exposici n excesiva a la luz puede afectar a las sondas fluorescentes Antes de utilizarlo D vueltas al bote para mezclar bien la mezcla maestra Agite el ensayo para resuspenderlo y a continuaci n centrifugue brevemente el tubo Para descongelar las muestras congeladas col quelas en hielo Una vez descongeladas agite las muestras para resuspenderlas y a continuaci n centrifugue los tubos brevemente Para obtener m s informaci n acerca de la preparaci n de la mezcla de reacci n consulte el protocolo apropiado para los reactivos que est utilizando en las reacciones de PCR TaqMan Gene Expression Assays Protocol 162 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 7 Preparaci n de las reacciones de Cy comparativos Em Preparaci n de la placa de reacci n Custom TaqMan Gene Expression Assays Protocol Preparaci n de la placa de reacci n Prepare las reacciones para cada grupo de r plicas y a continuaci n transfi ralas a la placa de reacci n Utilice la disposici n de la placa que se muestra en el software StepOne Acerca del Para el experimento de C comparativos de ejem
45. 202 204 publicar los datos 111 191 ver opciones de an lisis 114 194 ver pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n 103 185 ver pantalla Gene Expression Plot Gr fica de expresi n de genes 108 182 ver pantalla Multicomponent Plot Gr fica multicomponente 120 200 ver pantalla Multiple Plots M ltiples gr ficas 99 180 ver pantalla QC Summary Resumen QC 116 196 ver pantalla Raw Data Plot Gr fica de datos brutos 122 203 ver pantalla Standard Curve Curva est ndar 100 ver tabla de pocillos 108 182 Applied Biosystems asistencia t cnica x comentarios del cliente acerca de la documentaci n 1x contacto x Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System V ase sistema StepOne asistencia t cnica contacto x ayuda en l nea Consulte Sistema de ayuda B biblioteca 34 142 biblioteca Run Method M todo de proceso 34 142 C cargar placa de reacci n 70 170 categor a de instalaci n xx categor a de sobretensi n potencia xx comentarios del cliente acerca de los documentos de Applied Biosystems ix consejos de desplazamiento seleccionar pocillos 98 179 ndice ver m ltiples gr ficas 99 180 consumibles 21 130 admitidos 3 V ase tambi n materiales necesarios 3 control end geno componente de experimento 5 pantalla Relative Quantification Settings Opciones de cuantificaci n relativa 32 140 seleccionar 27 136 control negativo componente de experimento 5 6
46. 3b View Well Table Cap tulo 9 An lisis del experimento de C comparativos Revisi n de la gr fica de expresi n g nica y la tabla de pocillos Select Wells With Selectitem 3c Well Omit Flag Brain GAPDH 23 388893 1 Er O Brain GAPDH 23 394909 2 c8 O El Brain GAPDH 23 501162 3 C6 O Brain TP53 30 856344 4 c3 O Brain TP53 30 93019 5 c5 O Brain TP53 30 949701 6 C4 O GAPDH Undetermined 7 A4 O 8 A5 O 9 A6 O Kidney GAPDH 24 832844 10 Gi O El Kidney GAPDH 24 87947 11 B8 O E Kidney GAPDH 24 949875 12 GZ O apn RRA ANS Sample Brain Brain Brain Brain Brain Brain Kidney Kidney Kidney Target N GAPDH GAPDH GAPDH TRES MRSA TP53 GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH Task UNKNOWN UNKNOWN UNKNOWN UNKNOWN UNKNOWN UNKNOWN NTC NTC NTC UNKNOWN UNKNOWN UNKNOWN Dyes FAM NFQ FAM NFQ FAM NFQ FAM NFQ FAM NFQ FAM NFQ FAM NFQ FAM NFQ FAM NFQ FAM NFQ FAM NFQ FAM NFQ CT 23 388893 23 394909 23 501162 30 856344 30 93019 30 949701 Undetermi Undetermi Undetermi 24 832844 24 87947 24 949875 CT Mean 23 428322 23 428322 23 428322 30 912079 30 912079 30 912079 NaN NaN NaN 24 887396 24 887396 24 887396 0 063 0 063 0 063 0
47. Amplification Plot Gr fica de amplificaci n amplificaci n Nota Si en la pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n no aparece ning n dato haga clic en Analyze Analizar Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 185 cuantificaci n relativa r u Cap tulo 9 An lisis del experimento de C comparativos Revisi n de la gr fica de amplificaci n 2 Observe los pocillos de GAPDH en la pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n a Haga clic en la ficha View Plate Layout Ver disposici n de placa b En los men s desplegables Select Wells With Seleccionar pocillos con seleccione Target Diana y a continuaci n GAPDH 2a View Plate Layout View well Table 2b Select Wells With Target v GAPDH l i resa 1 TP53 CT 30 72 CT 30 69 J caron CT Undetermined J caron CT Undetermined caron CT Undetermined LJ tesa LJ TPs3 LJ TPs3 A Ct Undetermined CT Undetermined CT Undetermined E caron M tesa M 1rsa M P53 I caron CT 24 68 CT 30 67 CT 30 68 CT 30 75 CT 24 88 I caron CT 24 67 1 resa B cr 30 66 I caron E caron 1 tesa M esa i resa I caron I caron 1 caron C CT 24 83 CT 24 95 CT 30 86 CT 30 95 CT 30 93 Cr 23 5 CT 23 39 CT 23 39 on m o IR Wells I 18 Unknown 6 Negative Control
48. Dise o del experimento de C comparativos Este cap tulo cubre los siguientes temas El Resumen del cap tulo au rar RAR de Ar AR 126 El Creaci n de un nuevo experimento rr erre rar ranir rE R RAR 127 E Definici n de las propiedades del experimento o oooooooooooomooo 129 E Definici n de los m todos y materiales ooooooooomoommoo 131 El Configuraci n de los genes diana 2o ARA 135 El Configuraci n de las muestras a ira tia AAA 137 E Configuraci n de las opciones de cuantificaci n relativa 140 E Configuraci n del protocolo de termociclado oooooooooooo o o 141 El Revisi n de la configuraci n de la reacci n oooooooooooooomooo 142 E Solicitud de materiales para el experlmentO oooooooooooroornnoo 148 E Finalizaci n del flujo de trabajo del asistente de dise o 152 Nota Para obtener m s informaci n acerca de alguno de los temas que se explican en esta gu a acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Software pulsando F1 haciendo clic en 4 en la barra de herramientas o seleccionando Help Ayuda StepOne Help Ayuda de StepOne Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 125 cuantificaci n relativa ur Cap tulo 6 Dise o del experimento de Cy comparativos Resumen del cap tulo Resumen del cap tulo En este cap t
49. E Raw Data Plot 75 000 CNTT Directrices de an lisis Para obtener m s informaci n Notas 2 3 Filter Los filtros del sistema StepOne son Filtro Fluorocromo 1 Fluorocromo FAM Fluorocromo SYBR Green 2 Fluorocromo JOE Fluorocromo VIC 3 Fluorocromo ROX Cuando analice su propio experimento de Cr comparativos f jese en lo siguiente para cada filtro e Crecimiento caracter stico de la se al e Depresiones o cambios abruptos Para obtener m s informaci n acerca de la pantalla Raw Data Plot Gr fica de datos brutos acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1 204 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Ap ndice A N Flujos de trabajo alternativos para el m experimento Este ap ndice cubre los siguientes temas E Flujo de trabajo Advanced Setup Configuraci n avanzada 206 E Flujo de trabajo QuickStart Inicio r pido oooooooooooooooooo 207 E Finjo de itabajo de Moldeo ea ARA iria RERNA AA 208 E Flujo de trabajo de exportaci n importaci n eu e ee sssaaa eesse a aaee 209 Nota Para obtener m s informaci n acerca de alguno de los temas que se explican en esta gu a acceda a la ayuda desde
50. E c myc STANDARD FAM NFO MGB 35 704887 36 135754 0 532 2 729 1 645 35 97167 E c myc STANDARD FAM NFQ MGB 35 97167 36 135754 0 532 2 807 1 673 36 7307 E c myc STANDARD FAM NFO MGB 36 7307 36 135754 0 532 2 435 1 315 Undetermined F c myc NTC FAM NFQ MGB Undetermi 1 101 0 009 0 c myc NTC FAM NFQ MGB Undetermi 1 098 0 013 E 0 c myc NTC FAM NFQ MGB Undetermi 1 146 0 017 v jji gt Directrices de an lisis Para obtener m s informaci n Notas Nota Para mostrar u ocultar columnas en la tabla de pocillos marque desmarque el nombre de columna en el men desplegable Show in Table Mostrar en tabla Cuando analice su propio experimento de curva est ndar relativa busque e Diferencias en la expresi n g nica como un cambio en n mero de veces de la expresi n en relaci n con la muestra de referencia e Desviaci n est ndar en los grupos de r plicas valores Cy SD Si es preciso omita los valores at picos Omisi n de pocillos para el an lisis en la p gina 118 Para obtener m s informaci n acerca de la pantalla Gene Expression Plot Gr fica de expresi n g nica o la tabla de pocillos acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en y o pulsando F1 110 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa m Presentaci n de los datos
51. If needed edit the default run method or select a run method from the library 1 Graphical View Tabular View o Reaction Volume Per Well 20 uL Add Stage Y Add Step Y Delete Selected Collect Data Y Open Run Method Save Run Method Revertto Defaults Holding Stage Cycling Stage Number of Cycles 40 C Enable AutoA Legend Data Collection On Data Collection OFF A AutoA On A AutoA Off Directrices de Cuando dise e su propio experimento de curva est ndar relativa dise o Para obtener m s informaci n Notas e Escriba un n mero entre 10 y 30 para el volumen de reacci n pocillo El sistema StepOne admite vol menes de reacci n de entre 10 y 30 uL Revise el perfil t rmico Aseg rese de que el perfil t rmico es apropiado para los reactivos Si va a realizar una RT PCR de 1 paso incluya un paso de retrotranscripci n S1 el experimento necesita un perfil t rmico diferente modifique el perfil t rmico o cambie el protocolo de termociclado por otro de la biblioteca Run Method Protocolo de termociclado La biblioteca Run Method Protocolo de termociclado est incluida en el software StepOne Para obtener m s informaci n acerca de la biblioteca Run Method Protocolo de termociclado o acerca de la pantalla Run Method Protocolo de termociclado acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en y o pulsando F1 34 Gu a de introducci n a Applied Biosystems Step
52. Los ordenadores en red no pueden controlar el instrumento StepOne s lo monitorizarlo Para Acci n Ver los datos de amplificaci n a tiempo real Haga clic en Amplification Plot Gr fica de amplificaci n Consulte Acerca de la pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n en la p gina 78 Ver los datos de la temperatura de la reacci n a tiempo real Haga clic en Temperature Plot Gr fica de temperatura Consulte Acerca de la pantalla Temperature Plot Gr fica de temperatura en la p gina 80 Ver el progreso de la reacci n en la pantalla Run Method Protocolo de termociclado Haga clic en Run Method Protocolo de termociclado Consulte Acerca de la pantalla Run Method Protocolo de termociclado en la p gina 81 Activar desactivar las opciones de notificaci n Active o desactive la opci n Enable Notifications Activar notificaciones Consulte Opcional Activaci n de las notificaciones en la p gina 71 o Applied Biosystems StepOne v1 0 File Edit Instrument Analysis Tools Help i New Experiment EF Open Manage Instruments o Local Instrument Type Applied Biosystems StepOne Host Name 192 168 0 1 E Close A PrintRepor SAN a Local Instrument Default w Monitor Run Status Idle Estimated Time Remaining Cannot determine Experiment Name Experiment Type Instru
53. MSDS y siga las instrucciones de manipulaci n indicadas Use protectores oculares vestimenta protectora y guantes apropiados ea la cubierta caliente y el bloque se pueden iae temperaturas superiores a 100 C A A L LY Jalila PELIGRO EL CTRICO La continuidad del circuito de toma a tierra es vital para la seguridad Jam s utilice el sistema con el conductor de toma de tierra desconectado xii Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Pr logo S mbolos en los instrumentos Simbolos en los instrumentos Electricidad En la siguiente tabla se describen los s mbolos el ctricos que pueden aparecer en los S mbolos en los instrumentos de Applied Biosystems instrumentos S mbolo Descripci n S mbolo Descripci n Indica la posici n On Encendido y Indica un terminal que puede del interruptor de encendido estar conectado a la referencia principal a del retorno de tierra del circuito de se al de otro instrumento Indica la posici n Off Apagado No es un terminal de tierra O del interruptor de encendido protegido principal Este s mbolo indica que se Indica un interruptor de espera debe conectar a tierra un por medio del cual se activa la D terminal de toma a tierra de O posici n Standby Espera en el protecci n antes de realizar instrumento Si este interruptor ninguna otra conexi n el ctrica est en la
54. Name Examplelnstrument Instrument Type Applied Biosystems StepOne vw 2C Host Name ER Save 8 Exit Save 8 Add Another Cancel 2d Nota Para obtener m s informaci n acerca de la configuraci n del instrumento StepOne para el uso en red o la monitorizaci n remota consulte la Gu a de instalaci n de Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System 3 Haga clic en o Start monitoring this instrument Comenzar a monitorizar este instrumento de su instrumento Notas 84 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 4 Realizaci n del experimento de curva est ndar relativa Monitorizaci n de la reacci n Applied Biosystems StepOne v1 0 1 ie Edit instrument Analysis Tools Help New Experiment EF Open B y Close S Send Experimentto Instrument ES Download Experiment from Instrument LH 000 E Print Repor Select an instrument then click Monitor to monitor the instrument Local Instrument Default wv Monitor Run Status Idle Instrument Name Local Instrument C Enable Run Notifications Estimated Time Remaining Cannot determine Status Connected Experiment Name Block Type 48 Well Block o Notification Settings Experiment Type Serial Number 100010001 LED Manage Instruments Add Instrument SP Local Instrument
55. Todas las reacciones de muestra diana para configurar todos los genes diana de todas las muestras Seleccione Specify Sample Target Reactions Especifique reacciones de muestra diana para configurar de uno en uno los genes diana que se van a amplificar en cada muestra Nota En el asistente de dise o cada reacci n de PCR s lo puede contener una muestra y un ensayo diana Para obtener m s Para obtener m s informaci n acerca de la pantalla Samples Muestras acceda a la informaci n Notas ayuda del software StepOne haciendo clic en y o pulsando F1 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa 139 ru Cap tulo 6 Dise o del experimento de Cy comparativos Configuraci n de las opciones de cuantificaci n relativa Configuraci n de las opciones de cuantificaci n relativa En la pantalla Relative Quantitation Settings Opciones de cuantificaci n relativa seleccione la muestra de referencia y el control end geno para realizar la cuantificaci n relativa Acerca del En el experimento de Cr comparativos de ejemplo experimento de e El tejido de cerebro se utiliza como muestra de referencia ejemplo e GAPDH se utiliza como control end geno Pantalla Relative 1 En el men desplegable Which sample do you want to use as the reference sample Quantitation Qu muestra desea utilizar como muestra de referencia seleccione Bra
56. Un representante de Applied Biosystems debe realizar el mantenimiento del sistema Todos los paneles del instrumentos deben estar colocados en el instrumento mientras ste est en funcionamiento Cuando todos los paneles est n instalados no se detecta ninguna radiaci n Si se quita alg n panel cuando el LED est en funcionamiento durante una reparaci n con los interbloqueos de seguridad desactivados podr a exponerse a emisiones LED superiores a la potencia de la clase 3B e No quite las etiquetas de seguridad ni desactive los interbloqueos de seguridad Seguridad a Peligro biol gico general N PELIGRO BIOL GICO Las muestras biol gicas como por E o de tejidos fluidos corporales agentes infecciosos y sangre humana o de otros animales pueden transmitir enfermedades infecciosas Siga todas las normativas locales estatales provinciales y o nacionales aplicables Lleve el equipo de protecci n adecuado lo que incluye entre otras cosas protecci n ocular protecci n facial vestimenta bata de laboratorio y guantes Todo el trabajo se debe realizar en instalaciones que dispongan del equipamiento adecuado y con el equipo de seguridad apropiado por ejemplo dispositivos de contenci n f sica Los trabajadores deber an recibir formaci n de acuerdo con los requisitos de la instituci n o empresa y los requisitos legales aplicables antes de trabajar con materiales potencialmente infecciosos Lea y siga las directrices
57. a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 6 Dise o del experimento de Cy comparativos R Revisi n de la configuraci n de la reacci n Y Pantalla Reaction Complete la ficha Reaction Mix Calculations C lculos de la mezcla de reacci n para Setup el ensayo de TP53 Configuraci n de reacci n 1 Seleccione la ficha Reaction Mix Calculations C lculos de la mezcla de reacci n predeterminada 2 En el panel Select Target Seleccionar diana seleccione TP53 3 En el men desplegable Assay Type Tipo de ensayo seleccione Inventoried Made to Order En inventario Fabricado bajo pedido 4 Aseg rese de que en el campo Reaction Volume Per Well Volumen de reacci n por pocillo aparece 20 uL 5 Aseg rese de que en el campo Excess Reaction Volume Volumen de reacci n en exceso muestra 10 6 En el panel Reactions for TP53 Reacciones para TP53 a Aseg rese de que en el campo Master Mix Concentration Concentraci n de mezcla maestra aparece 2X b Aseg rese de que en el campo Assay Mix Concentration Concentraci n de ensayo aparece 20X c Revise los componentes y los vol menes calculados para las reacciones de PCR Componente Volumen uL para 1 reacci n Mezcla maestra 2X 10 0 Ensayo 20X 1 0 Muestra 10X 2 0 H O 7 0 Volumen total 20 0 El volumen de la muestra se limita al 10 del volume
58. a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 187 cuantificaci n relativa Cap tulo 9 An lisis del experimento de Cr comparativos m T md Revisi n de la gr fica de amplificaci n 5 Observe los valores de umbral a En el men desplegable Graph Type Tipo de gr fica seleccione Log Registro b En el men desplegable Target Diana seleccione GAPDH c Active la casilla de verificaci n Threshold Umbral para ver el umbral d Compruebe que el umbral est situado correctamente En el experimento de ejemplo el umbral est en la fase exponencial 5a Amplification Plot Plot Settings Plot Type ARn vs Cycle Graph Type Log Y Color Plot By Well sij 2 P a REE Amplification Plot A 0 001 0 0001 0 00001 0 000001 A o 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 Cycle Legend E s cM E E b Target GAPDH E Threshold V Auto 0 2 Auto Baseline 5 J Show Threshold Baseline Start Well Target amp Baseline End Well Target 5C Notas 188 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 9 An lisis del experimento de C comparativos rn Revisi n de la gr fica de amplificaci n 6 Busque cualquier valor at pico a En el men desplegable Plot Type Tipo de gr fica seleccione C vs Well b Busque pocillos fuera de la curv
59. a shopping basket on the Applied Biosystems Store add items to the shopping Instructions Q list enter a name for the shopping basket click Order Materials in List then log in Find Assay Enter Gene Name c myc Find Assay piel gene name then click Find Assay to search the Applied Biosystems Store for a gene expression 1b 1d Experiment Materials List 2a 2 C Add Selected Items to Shopping List Display All Items v Print Materials List C Check All Item Part Number Description The MicroAmp Fast Optical 48 Well Reaction Plate constructed 2b MicroAmpT Fast Optical 48 Well Reaction Plate 4375816 from a single rigid piece of polypropylene in a 48 well format E Increased thermal contact for faster more uniform heating An anticallunciaar adhaciva film usoad to saaltha samnlas inta tha Experiment Shopping List 3 items gt a A Remove Selected Items from Shopping List Shopping Basket Name Relative Standard Curve StepOne Order Materials in List Print Shopping List C Check All Item Part Number Quantity MicroAmpT Fast Optical 48 Well Reaction 4375816 1 MicroAmpT Optical 48 Well Adhesive Film 4375928 e 4 En el cuadro de di logo Order Materials Log In Solicitar materiales Inicio de sesi n escriba el nombre de usuario y la contrase a de la tienda en l nea de Applied Biosystems y a continuaci n haga clic en Login an
60. ar Acerca del En el experimento de C comparativos AAC de ejemplo experimento de e El experimento se identifica como un ejemplo ejemplo e Se utiliza una MicroAmp Fast Optical 48 Well Reaction Plate e El tipo de experimento es de cuantificaci n Pantalla 1 Haga clic en el campo Experiment Name Nombre de experimento y a Experiment continuaci n escriba Comparative Cr Example Ejemplo de Cy comparativos Properties Propiedades de Nota La cabecera del experimento se actualiza con el nombre del experimento que experimento acaba de escribir 2 Haga clic en el campo Barcode C digo de barras y a continuaci n escriba el c digo de barras en la placa de reacci n de PCR 3 Haga clic en el campo User Name Nombre de usuario y a continuaci n escriba Example User Usuario de ejemplo Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 129 cuantificaci n relativa Cap tulo 6 Dise o del experimento de Cy comparativos Definici n de las propiedades del experimento 4 Haga clic en el campo Comments Comentarios y a continuaci n escriba Comparative CT Getting Started Guide Example Ejemplo de la gu a de introducci n del CT comparativos 5 Seleccione Quantitation Cuantificaci n en el tipo de experimento 6 Haga clic en Next Siguiente gt 14 Define Experiment Properties Experiment Properties Help o E Instruct
61. b En los men s desplegables Select Wells With Seleccionar pocillos con seleccione Target Diana y a continuaci n GAPDH 2a View Plate Layout View Well Table 2b Select Wells With Target v GAPDH v how in Wells w Mm 1 2 3 4 5 6 7 8 g c myc R c myc R c myc GAPDH o GAPDH K GAPDH Y ia iene A CT Undetermined CT Undetermined CT Undetermined CT Undetermined CT Undetermined CT Undetermined a SS CT 27 89 CT 27 96 i c myc EI caron 1 caron O c myc W e mye 1 caron 8 y 9 21 9 49 4 79 4 83 9 26 CT 28 CT 24 66 CT 24 65 Cr 24 61 CT 28 73 CT 28 73 CT 28 71 CT 24 64 Y GAPDH g c myc a c myc 5 c myc g c myc g c myc 9 12 200 200 20 20 2 CT 24 66 CT 24 7 CT 23 35 CT 23 3 CT 23 35 CT 26 64 CT 26 67 CT 26 82 g c myc IS c myc g c myc g c myc g c myc A A Cr 29 95 Cr 29 95 CT 33 16 CT 33 63 Cr 33 59 0 02 0 02 ES caron ES caron ES caron ES caron ES caron ES caroH ES caron E o m 200 200 200 20 20 20 2 02 CT 20 02 CT 19 96 CT 19 98 CT 23 59 CT 23 56 CT 23 56 CT 26 95 8 GAPDH ES caron E caron ES caron S caron ES caron E caron ES caron 2 2 0 2 0 2 2 0 02 0 02 0 02 CT 26 95 CT 26 94 CT 30 41 CT 30 36 CT 30 38 CT 33 71 CT 33 83 CT 33 77 Wells E 12 Unknown E 30 Standard 6 Negative Control 0 Empty 3 En la pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n a En el men desplegable Plot Type Tipo de gr
62. contacto y otros factores medioambientales de la estaci n de trabajo Para minimizar los riesgos musculoesquel ticos y por movimientos repetitivos e Utilice equipos en los que pueda colocarse c modamente en posiciones neutrales y que permitan acceder de manera adecuada al teclado el monitor y el rat n e Coloque el teclado el rat n y el monitor de forma que pueda adoptar una postura relajada de la cabeza y el cuerpo xxii Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Pr logo Est ndares de seguridad y compatibilidad electromagn tica EMC Est ndares de seguridad y compatibilidad electromagn tica EMC Est ndares de seguridad de EE UU y Canad c UL us Est ndar EMC canadiense Est ndares de seguridad y EMC europeos CE Est ndares EMC australianos O Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa El sistema StepOne ha sido probado y cumple el est ndar UL 61010A 1 CAN CSA C22 2 No 1010 1 92 Requisitos de seguridad de equipos el ctricos para la medici n el control y el uso en laboratorios Primera parte Requisitos Generales UL 61010A 2 010 CAN CSA 1010 2 010 Requisitos particulares de equipos de laboratorio para el calentamiento de materiales Est ndar de rendimiento 21 CFR 1040 10 y 1040 11 de la Ley de control de r
63. continuaci n haga clic en 2 Go Ir c Haga clic en Add Selected Items to Shopping List A adir elementos seleccionados a la cesta de compra 3 Compruebe si la cesta de compra del experimento contiene los materiales deseados y que las cantidades son correctas y a continuaci n haga clic en Order Materials in List Solicitar materiales de la lista Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 149 cuantificaci n relativa uu Cap tulo 6 Dise o del experimento de Cy comparativos Solicitud de materiales para el experimento 3A Optional Order Materials List Materials List Help LP a Instructions Review the list of materials recommended to prepare the PCR reaction plate To create a shopping basket on the Applied Biosystems Store add items to the shopping list enter a name for the shopping basket click Order Materials in List then log in Find Assay Enter Gana Name TP53 Find Assay mala gene name then click Find Assay to search the Applied Biosystems Store for a gene expression 1b 1d Experiment Materials List A aa 26 Add Selected items to Shopping List Display All Items Print Materials List C Check All Item Part Number Description The MicroAmpT Fast Optical 48 Well Reaction Plate constructed 2b MicroAmpT Fast Optical 48 Well Reaction Plate 4375816 from a single rigid piece of polypropylene in a 48 well form
64. cumplen las especificaciones de control de calidad de la fabricaci n ensayos en Ensayos TaqMan fabricados previamente que cumplen las especificaciones de control inventario de calidad y que se guardan en el inventario est ndar Muestra que contiene cantidades est ndar conocidas Las reacciones est ndar se utilizan en experimentos de cuantificaci n para generar curvas est ndar V ase tambi n curva est ndar y diluci n seriada del est ndar Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 217 cuantificaci n relativa Glosario experimento experimento de punto final factor de diluci n fase fase c clica fase de curva de disociaci n fase de espera fluorocromo del sistema 218 Se refiere al proceso completo de realizaci n de una reacci n con el sistema StepOne incluida la configuraci n el proceso y el an lisis Tipos de experimentos que se pueden realizar con el sistema StepOne e Cuantificaci n curva est ndar e Cuantificaci n curva est ndar relativa e Cuantificaci n Cr comparativos AACr e Curva de disociaci n e Genotipado e Presencia ausencia Experimento en el que los datos de fluorescencia que se recogen en una lectura a punto final se utilizan para calcular resultados para experimentos de genotipado o presencia ausencia Valor num rico que define la secuencia de cantidades en la curva est ndar El factor de diluci n
65. de Applied Biosystems Sistema operativo Netscape Microsoft Adobe Acrobat del escritorio Navigator Internet Explorer Reader Windows v6 x O posterior v6 x O posterior v4 0 o posterior 98 NT 2000 Macintosh OS 9 o v6 x O posterior v5 2 O posterior v4 0 o posterior posterior Nota Aseg rese de que se han activado las cookies y Java Script para que el sitio web funcione correctamente e Seleccione todos los materiales que necesite para el experimento y a dalos a la cesta de compra Para obtener m s Para obtener m s informaci n acerca de la pantalla Materials List Lista de materiales informaci n acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en 3 o pulsando F1 Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 45 cuantificaci n relativa Finalizaci n del flujo de trabajo del asistente de dise o Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa Finalizaci n del flujo de trabajo del asistente de dise o Acerca del experimento de ejemplo Finalizaci n del asistente de dise o Notas Para finalizar el flujo de trabajo del asistente de dise o revise la disposici n de la placa y a continuaci n seleccione una opci n de salida El software StepOne selecciona autom ticamente ubicaciones para los pocillos en la placa de reacci n En el experimento de curva est ndar relativa de ejemplo e L
66. de las muestras se limita al 10 del volumen total de la reacci n en el software StepOne Debe realizar diluciones de las muestras antes de a adir las muestras a la mezcla de reacci n final e Para conseguir un rendimiento ptimo de los TaqMan Gene Expression Assays O los Custom TaqMan Gene Expression Assays utilice entre 10 y 100 ng de molde de cDNA por 20 uL de reacci n Para reactivos tipo r pido Applied Biosystems recomienda 10 ng e Utilice tamp n TE o agua para diluir la muestra Para obtener m s informaci n acerca de los ensayos de Applied Biosystems consulte TaqgMan Gene Expression Assays Protocol Custom TaqMan Gene Expression Assays Protocol Preparaci n de la mezcla de reacci n Acerca del experimento de Notas ejemplo Prepare la mezcla de reacci n con los componentes y vol menes que ha calculado el software StepOne Complete la ficha Reaction Mix Calculations C lculos de la mezcla de reacci n para el ensayo de TP53 en la p gina 143 y Complete la ficha Reaction Mix Calculations C lculos de la mezcla de reacci n para el ensayo de GAPDH en la p gina 144 Nota El software calcula todos los componentes de las reacciones de PCR Sin embargo para preparar la mezcla de reacci n de esta secci n incluya nicamente la mezcla maestra el ensayo y agua A ada la muestra cuando prepare la placa de reacci n consulte Preparaci n de la placa de reacci n en la p gina 163
67. ee ee ee ee 103 E Revisi n de la gr fica de expresi n g nica y la tabla de pocillos 108 E Presentaci n de los datos e icisscadr darias 111 Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 93 cuantificaci n relativa n Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa An lisis del experimento An lisis del experimento El software StepOne analiza el experimento y muestra los resultados en las pantallas de an lisis por ejemplo en la pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n QC Summary Resumen QC etc Acerca del Para el experimento de curva est ndar relativa de ejemplo utilice el archivo de datos que experimento de se instala con el software StepOne Este archivo de datos se ha creado con los mismos ejemplo par metros de dise o que se indican en el Cap tulo 2 y luego se ha procesado y analizado en un instrumento StepOne Encontrar el archivo de datos del experimento de ejemplo en su ordenador lt unidad gt Applied Biosystems StepOne Systemlexperimentstexamples donde lt unidad gt es la unidad del disco duro del ordenador en la que est instalado el software StepOne La unidad de instalaci n predeterminada del software es la unidad C An lisis del 1 Si a n no se est ejecutando el software StepOne haga doble clic en T acceso experimento de directo al software StepOne o seleccione Start Inicio All Progr
68. el panel Experiment Menu Men del experimento seleccione Analysis pocillos An lisis gt 4 Amplification Plot Gr fica de amplificaci n Nota Si en la pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n no aparece ning n dato haga clic en Analyze Analizar 2 En la pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n seleccione C vs Well Cr vs pocillo en el men desplegable Plot Type Tipo de gr fica 3 Seleccione la ficha View Well Table Ver tabla de pocillos Notas 198 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 9 An lisis del experimento de C comparativos Omisi n de pocillos para el an lisis 4 En la tabla de pocillos a En el men desplegable Group By Agrupar por seleccione Replicate R plica b F jese si en el grupo de r plicas hay alg n valor at pico aseg rese de que est n marcados con un aviso En el experimento de ejemplo no hay ning n valor at pico 3 View Plate Layout View Well Table 4a Select Wells With Selectitem vw Well Omit Flag Sample Target N Task Dyes CT CT Mean CT SD Rn ARn ACT Brain GAPDH 23 388893 A 1 C7 O Brain GAPDH UNKNOWN FAM NFO 23 388893 23 428322 0 063 8 737 8 261 Brain GAPDH 23 394909 2 c8 O Brain GAPDH UNKNOWN FAM NFQ 23 394909 23 428322 0 063 8 69 8 216 Brain
69. experimento han desencadenado ejemplo alg n aviso En el experimento de ejemplo no se ha desencadenado ning n aviso Revisi n del 1 En el panel Experiment Menu Men del experimento seleccione Analysis resumen QC An lisis QC Summary Resumen QC Nota Si en la pantalla QC Summary Resumen QC no aparece ning n dato haga clic en Analyze Analizar 2 Revise el resumen de avisos En el experimento de ejemplo hay O pocillos marcados 3 En la tabla Flag Details Detalles de aviso observe las columnas Frequency Frecuencia y Wells Pocillos para determinar qu avisos aparecen en el experimento En el experimento de ejemplo en la columna Frequency Frecuencia se muestra O en todas las columnas Nota Un valor 0 en la columna Frequency Frecuencia indica que el aviso no aparece en el experimento 4 Opcional Haga clic en cada fila de avisos para ver informaci n detallada acerca del aviso Flag Summary Total Wells 48 Processed Wells 24 Targets Used Wells Set Up 24 Flagged Wells 0 Samples Used 3 AAA PP Flag Details Name Frequency Notas AREA 7 gt High standard deviation in replicate group po No amplification po oise higher than others in plate po Outlier in replicate group EXPFAIL Exponential algorithm failed lt Flag AMPNC Amplification in negative control Flag Detail A sequence amplified in a negative control reaction Flag Criteria Cr
70. la carpeta Applied Biosystems StepOne System experiments v Save Experiment Relative Standard Curve Example Save in T My Recent Documents E Desktop s My Documents My Computer My Network Places Notas O experiments O examples File name Files of type Relative Standard Curve Example Save l 3 Experiment Document Single files eds Cancel Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa 47 re Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa Finalizaci n del flujo de trabajo del asistente de dise o Directrices de Cuando dise e su propio experimento de curva est ndar relativa dise o Para obtener m s Notas informaci n En la ventana Review Plate for Experiment Revisar placa para el experimento seleccione la opci n de salida apropiada Haga clic en Save Experiment Guardar experimento si desea guardar y cerrar el experimento sin realizar ning n otro cambio ni iniciar el proceso Haga clic en Start Run for This Experiment Iniciar proceso para este experimento si desea guardar el experimento e iniciar el proceso Aseg rese de que la placa de reacci n est cargada en el instrumento Haga clic en Edit Plate Layout Editar disposici n de placa si desea utilizar el flujo de trabajo Advanced Setup Configuraci n av
71. la tabla Flag Details Detalles de avisos con una frecuencia gt 0 para ver informaci n detallada acerca del aviso Si es necesario haga clic en el v nculo de soluci n de problemas para saber c mo corregir el aviso e Puede cambiar las opciones de los avisos Ajustar la sensibilidad para que se marquen m s o menos pocillos Cambiar los par metros de los avisos que aplica el software StepOne Para obtener m s Para obtener m s informaci n acerca de la pantalla QC Summary Resumen QC o de las informaci n opciones de avisos acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en O pulsando Fl Omisi n de pocillos para el an lisis Los errores de los experimentos pueden causar que algunos pocillos se amplifiquen de manera insuficiente o no se amplifiquen Estos pocillos suelen producir valores Cr que difieren significativamente de los valores medios de los pocillos de r plicas asociadas Si se incluyen en los c lculos estos valores at picos pueden dar lugar a mediciones err neas para garantizar la precisi n omita los valores at picos del an lisis Acerca del En el experimento de curva est ndar relativa de ejemplo se utiliza la tabla de pocillos experimento de para quitar el pocillo D1 del an lisis El pocillo D1 est marcado con el aviso ejemplo OUTLIERRG consulte Revisi n del resumen QC en la p gina 116 Omisi n de 1 En el panel Experiment Menu Men del experimento seleccione Analysis poci
72. los m todos y materiales Para obtener m s Notas informaci n gen diana El fluorocromo SYBR Green genera se al de fluorescencia cuando se une a DNA de doble cadena El fluorocromo SYBR Green suele formar parte de la mezcla maestra SYBR Green que se a ade a la reacci n Si utiliza el fluorocromo SYBR Green Active la casilla de verificaci n Include Melt Curve Incluir curva de disociaci n para realizar un an lisis de curva de disociaci n del gen diana amplificado Seleccione Standard Est ndar para la velocidad de la rampa Applied Biosystems no dispone de una mezcla maestra que funcione en modo r pido para reactivos SYBR Green Nota Se pueden utilizar otros reactivos basados en fluorescencia en el sistema StepOne sin embargo debe dise ar su experimento con el flujo de trabajo Advanced Setup Configuraci n avanzada en lugar de con el asistente de dise o Consulte Flujo de trabajo Advanced Setup Configuraci n avanzada en la p gina 206 e Seleccione la velocidad de rampa apropiada para el protocolo de termociclado Seleccione Fast 40 Minutes to Complete a Run R pido aproximadamente 40 minutos para completar una reacci n si utiliza reactivos tipo r pido para las reacciones de PCR Seleccione Standard 2 Hours to Complete a Run Est ndar aproximadamente 2 horas para completar una reacci n si utiliza reactivos est ndar para las reacciones de PCR incluidos reactivos SYBR Green y re
73. los problemas Flujo de trabajo A continuaci n se muestra el flujo de trabajo para analizar el experimento de ejemplo del experimento que se incluye en esta gu a de introducci n de ejemplo Experimento de Cr comparativos AAC Inicio del experimento Y Dise o del experimento Cap tulo 6 Y Preparaci n de las reacciones Cap tulo 7 Realizaci n del experimento Cap tulo 8 Y An lisis del experimento Cap tulo 9 Secci n 1 Revisi n de los resultados 1 Analice 2 Revise la pantalla Gene Expression Plot Gr fica de expresi n g nica O la tabla de pocillos 3 Revise la pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n 4 Presente los datos Secci n 2 Soluci n de problemas 1 Revise las opciones de an lisis ajuste la l nea basal y el umbral 2 Revise la pantalla QC Summary Resumen QC 3 Omita pocillos 4 Revise la pantalla Multicomponent Plot Gr fica multicomponente 5 Revise la pantalla Raw Data Plot Gr fica de datos brutos Fin del experimento Notas 174 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 9 An lisis del experimento de C comparativos Secci n 9 1 Revisi n de los resultados Secci n 9 1 Revisi n de los resultados Esta secci n cubre los siguientes temas E Analisis del xperimento s irgscssirisiekirisiekiijiirdiktskirikirkeu 176 E Revisi n de la gr fica d
74. lt 35 0 Flagged Wells None View AMPNC Troubleshooting Information 196 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 9 An lisis del experimento de C comparativos rm Omisi n de pocillos para el an lisis Posibles avisos En los experimentos de Cr comparativos los datos del experimento pueden desencadenar los avisos que se indican a continuaci n Si en el experimento no aparece un aviso su frecuencia ser 0 Si la frecuencia es gt 0 eso significa que el aviso aparece en alg n lugar del experimento La posici n del pocillo se indica en la columna Wells Pocillos Aviso Descripci n AMPNC Amplificaci n en control negativo BADROX Se al de referencia pasiva incorrecta BLFAIL Error del algoritmo de l nea basal CTFAIL Error del algoritmo Cy EXPFAIL Error del algoritmo exponencial HIGHSD Desviaci n est ndar alta en el grupo de r plicas NOAMP No hay amplificaci n NOISE Ruido mayor que otros pocillos en la placa NOSIGNAL No hay se al en el pocillo OFFSCALE La fluorescencia est fuera de la escala OUTLIERRG Valor at pico en el grupo de r plicas SPIKE Picos de ruido THOLDFAIL Error en el algoritmo del umbral Directrices de Cuando analice su propio experimento de Cr comparativos an lisis e Haga clic en cada aviso de la tabla Flag Details Detalles de avisos con una frecuenc
75. m s Notas e Referencia pasiva el nivel de fluorescencia del fluorocromo de referencia pasiva debe permanecer relativamente constante a lo largo de la reacci n de PCR Fluorocromo del notificador el nivel de fluorescencia del fluorocromo del notificador deber a indicar una regi n plana que se corresponde con la l nea basal seguida por un r pido aumento en la fluorescencia a medida que la amplificaci n contin a Cualquier irregularidad de la se al no deber a haber ning n pico depresi n ni cambio s bito en la se al fluorescente Pocillos de control negativo no deber a haber ninguna amplificaci n en los pocillos de control negativo Para obtener m s informaci n acerca de la pantalla Multicomponent Plot Gr fica informaci n pulsando Fl multicomponente acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o 202 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 9 An lisis del experimento de C comparativos o Revisi n de la gr fica de datos brutos Revisi n de la gr fica de datos brutos Acerca del experimento de ejemplo Revisi n de la gr fica de datos brutos Notas En la pantalla Raw Data Plot Gr fica de datos brutos se muestra la se al de fluorescencia bruta no normalizada para cada filtro ptico de los pocillos seleccionados durante cada ciclo de la PCR a tiempo real En el exp
76. momento no se a ade la muestra ni el est ndar e Tubos de microcentr fuga e Pipetas e Puntas de pipeta e Componentes de la mezcla de reacci n enumerados arriba e Centr fuga IMPORTANTE Prepare la mezcla de reacci n para cada ensayo diana por separado 1 Etiquete un tubo del tama o apropiado para cada mezcla de reacci n e Mezcla de reacci n para c myc e Mezcla de reacci n para GAPDH 2 Para el ensayo de c myc a ada los vol menes requeridos de cada componente al tubo de la mezcla de reacci n de c myc Volumen uL para Volumen uL para 24 reacciones Componente 1 reacci n m s un exceso del 10 TagMan Fast Universal PCR 10 0 264 0 Master Mix 2X Ensayo de c myc 20X 1 0 26 4 Agua 7 0 184 8 Volumen total de la mezcla de 18 0 475 2 reacci n Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa 59 Cap tulo 3 Preparaci n de las reacciones de la curva est ndar relativa Preparaci n de la mezcla de reacci n 3 Para el ensayo de GAPDH a ada los vol menes requeridos de cada componente al tubo de la mezcla de reacci n de GAPDH Volumen uL para Componente Volumen uL para 24 reacciones p 1 reacci n m s un exceso del 10 TagMan Fast Universal PCR 10 0 264 0 Master Mix 2X Ensayo de GAPDH 20X 1 0 26 4 Agua 7 0 184 8 Volumen total de la mezcla de 1
77. n e Revise los componentes de la mezcla de reacci n para cada gen diana Si va a trabajar de modo r pido aseg rese de utilizar una mezcla maestra r pida en las reacciones de PCR Si va a realizar reacciones de PCR en modo est ndar aseg rese de utilizar una mezcla maestra tipo est ndar en las reacciones de PCR En la RT PCR de 1 paso aseg rese de incluir retrotranscriptasa en las reacciones de PCR y de utilizar un tamp n espec fico Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 41 cuantificaci n relativa re Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa al Revisi n de la configuraci n de la reacci n Para obtener m s Notas informaci n Revise los c lculos de diluciones seriadas para cada gen diana Si es necesario modifique la concentraci n del est ndar en la soluci n de partida incluidas las unidades Nota En el campo de las unidades de Standard Concentration in Stock Concentraci n del est ndar de la soluci n de partida puede seleccionar ng o ug en el men desplegable o introducir otra unidad en el campo por ejemplo copies copias IU unidades internacionales nmol pg etc La tabla se actualiza de la manera correspondiente Revise los c lculos de la diluci n de las muestras para cada muestra Si es necesario modifique la concentraci n de muestra diluida incluidas las unidades y la concentr
78. n de seguridad necesaria para almacenar manipular transportar y desechar los productos qu micos de forma segura Cada vez que reciba una MSDS nueva con un producto qu mico peligroso no se olvide de reemplazar la MSDS correspondiente en sus archivos Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de xvii cuantificaci n relativa Pr logo Seguridad qu mica Obtenci n Las MSDS de cualquier producto qu mico de Applied Biosystems est n a su disposici n de MSDS de manera gratuita las 24 horas del d a Para obtener MSDS 1 Vaya a https docs appliedbiosystems com msdssearch html 2 En el campo de b squeda de la p gina de b squeda de MSDS a Escriba el nombre del producto qu mico el n mero de serie u otra informaci n de inter s que espere que aparezca en la MSDS b Seleccione el idioma que desee c Haga clic en Search Buscar 3 Para ver descargar o imprimir el documento que le interesa a Haga clic con el bot n derecho en el t tulo del documento b Seleccione e Open Abrir para ver el documento e Save Target As Guardar destino como para descargar una versi n PDF del documento en el destino que seleccione e Print Target Imprimir destino para imprimir el documento 4 Para enviar una copia de una MSDS por fax o correo electr nico en la p gina de resultados de la b squeda a Seleccione Fax o Email bajo el t tulo del documento b Haga c
79. ordenador y a continuaci n con ctela al puerto USB del instrumento StepOne 14 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 4 Realizaci n del experimento de curva est ndar relativa ANA Inicio de la reacci n e IN 3 Toque la pantalla t ctil del instrumento StepOne y a continuaci n toque O 4 Enla pantalla del men principal toque Browse Experiments Buscar experimentos 5 En la pantalla Browse Methods M todos de b squeda toque f Folders Carpetas 6 En la pantalla Choose an Experiment Category Elija una categor a de experimento e Toque USB si ha transferido el experimento a una unidad USB e Toque Default Predeterminado si ha enviado el experimento a trav s de una conexi n de red En la pantalla Browse USB Default Experiments Buscar USB experimentos predeterminados a Toque Relative Standard Curve Example Ejemplo de curva est ndar relativa para seleccionar el experimento b Toque gt Start Run Iniciar proceso a Browse USB Experiments 1 E E ET E Page 171 7b Selected 1 Start Run New View Edit Copy Delete Touch an experiment to select it then touch any of the buttons to perform an action 8 En la pantalla Run Parameters Par metros de proceso a Toque el campo Reaction Volume Volumen de reacci n utilice el teclado para escribir 20 u
80. pido y est ndar e Opcional Introduzca un c digo de barras para identificarlo en la placa de reacci n de PCR Puede introducir hasta 100 caracteres en el campo Barcode C digo de barras e Opcional Escriba un nombre de usuario para identificar al propietario del experimento Puede introducir hasta 100 caracteres en el campo User Name Nombre de usuario e Opcional Escriba comentarios para describir el experimento Puede introducir hasta 1000 caracteres en el campo Comments Comentarios Notas 130 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Para obtener m s informaci n Cap tulo 6 Dise o del experimento de Cy comparativos R Definici n de los m todos y materiales has Seleccione Quantitation Cuantificaci n en el tipo de experimento Para obtener m s informaci n acerca de La pantalla Experiment Properties Propiedades de experimento acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en y o pulsando FI Consumibles consulte Consumibles admitidos en la p gina 3 Experimentos de cuantificaci n consulte la Gu a de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Definici n de los m todos y materiales Acerca del experimento de ejemplo En la pantalla Methods amp Materials M todos y materiales seleccione el m todo de cuantificaci n los reactivos la velocidad de rampa y el tip
81. pocillo D1 Este pocillo se omite en la secci n de soluci n de problemas Omisi n de pocillos para el an lisis en la p gina 118 Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 109 cuantificaci n relativa 3b Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa Revisi n de la gr fica de expresi n g nica y la tabla de pocillos 3a View Plate Layout View Well Table Select Wells With Select item v 3c Show in Table v Group By Y lt w 37 38 39 40 41 42 43 44 45 47 48 Well m vwu c myc D2 c myc D3 c myc D1 c myc D4 c myc D6 c myc D5 c myc D7 c myc El c myc D8 c myc A1 A2 A3 se Omit Flag Sample Na TargetName Task Dyes CT CT Mean CT SD Rn ARn Quantity CI vago O Vir CEMIS EU NI UDDO LU UN DURA vvs vuru vzur 29 954172 E c myc STANDARD FAM NFO MGB 29 954172 30 127504 0 3 5 342 4 298 29 9543 O c myc STANDARD FAM NFQ MGB 29 9543 30 127504 0 3 5 579 4 443 30 474043 0 A c myc STANDARD FAM NFQ MGB 30 474043 30 127504 0 3 5 266 4 182 33 16362 E c myc STANDARD FAM NFQ MGB 33 16362 33 459904 0 257 4 177 3 124 33 586723 0 c myc STANDARD FAM NFO MGB 33 586723 33 459904 0 257 3 944 2 807 33 629368 O c myc STANDARD FAM NFQ MGB 33 629368 33 459904 0 257 4 012 2 935 35 704887
82. producto ds tes a O SE de PCR CEBADOR REVERSO el instrumento Paso 1 Configuraci n de la reacci n El fluorocromo SYBRO Green emite una fluorescencia cuando se une Paso 2 Desnaturalizaci n O o Cuando el DNA se desnaturaliza se libera el fluorocromo SYBR Green y la fluorescencia disminuye Paso 4 Polimerizaci n completada El fluorocromo SYBR Green se une al producto bicatenario lo que produce un aumento neto de la fluorescencia que detecta fusi n IMPORTANTE Applied Biosystems no recomienda el uso de fluorocromo TAMRA como notificador o apantallador en el sistema StepOne Notas 8 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 1 Introducci n sde C mo utilizar esta gu a Otros reactivos Se pueden utilizar otros reactivos basados en fluorescencia en el sistema StepOne pero se debe tener en cuenta lo siguiente e El software StepOne calcula autom ticamente los vol menes de reacci n de los reactivos TaqMan y SYBR Green pero no lo hace con otros reactivos e Se debe dise ar el experimento con el flujo de trabajo Advanced Setup Configuraci n avanzada en lugar de con el asistente de dise o Consulte Flujo de trabajo Advanced Setup Configuraci n avanzada en la p gina 206 Para obtener m s Para obtener m s informaci n acerca
83. producto qu mico de manera segura a Ey A A 0 0 Indica una situaci n potencialmente peligrosa que de no evitarse podr a causar lesiones leves o moderadas Tambi n puede utilizarse para alertar de pr cticas no seguras Indica una situaci n potencialmente peligrosa que de no evitarse dE causar lesiones graves o mortales A o D Indica una situaci n inminentemente peligrosa que de no evitarse tendr como lada lesiones graves o mortales Esta palabra de aviso se limita a las situaciones m s extremas A excepci n de los avisos IMPORTANTE todas las palabras de aviso de seguridad de un documento de Applied Biosystems aparecen con la figura de un tri ngulo abierto que contiene un s mbolo de peligro Estos s mbolos de peligro son id nticos a los que se incorporan en los instrumentos de Applied Biosystems consulte S mbolos de seguridad en la p gina x111 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de xi cuantificaci n relativa Pr logo Convenciones de seguridad utilizadas en este documento Ejemplos IMPORTANTE Debe crear una hoja de c lculo de entradas de las muestras diferente para cada placa de 96 pocillos y A Nu PELIGRO QU MICO TaqMan Universal PCR Master Mix puede causar irritaciones en la piel y los ojos Puede provocar molestias si se ingiere o se inhala Consulte la ficha t cnica de seguridad
84. relativa Inicio del experimento Y Dise o del experimento Cap tulo 2 Y Preparaci n de las reacciones Cap tulo 3 Prepare el molde Prepare las diluciones de las muestras Prepare la diluci n seriada Prepare la mezcla de reacci n para cada ensayo diana 0O A OO N Prepare la placa de reacci n Y Realizaci n del experimento Cap tulo 4 An lisis del experimento Cap tulo 5 Fin del experimento Notas 50 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 3 Preparaci n de las reacciones de la curva est ndar relativa re Preparaci n del molde Preparaci n del molde Prepare el molde para las reacciones de PCR muestras y est ndares con el High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit IMPORTANTE Applied Biosystems recomienda utilizar High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit para realizar una retrotranscripci n del cDNA a partir de RNA total Los TaqMan Gene Expression Assays se han dise ado utilizando el High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit no se han probado otros protocolos para los TaqMan Gene Expression Assays Acerca del Para el experimento de curva est ndar relativa de ejemplo el molde para las reacciones experimento de de PCR es cDNA sintetizado a partir de las muestras de RNA total utilizando el High ejemplo Capacity cDNA Reverse
85. se muestra el flujo de trabajo para dise ar el experimento de ejemplo que se incluye en esta gu a de introducci n Nota Dise e el experimento de ejemplo con el flujo de trabajo del asistente de dise o del software StepOne Cuando dise e sus propios experimentos puede seleccionar flujos de trabajo alternativos consulte Uso de esta gu a con sus propios experimentos en la p gina 9 Experimento de curva est ndar relativa Inicio del experimento Y Dise o del experimento Cap tulo 2 Cree un nuevo experimento Defina las propiedades del experimento Defina los m todos y los materiales Configure los genes diana Configure los est ndares Configure las muestras Configure la cuantificaci n relativa 0 N O O E OO N Configure el protocolo de termociclado 9 Revise la configuraci n de la reacci n 10 Solicite materiales para el experimento 11 Finalice el flujo de trabajo del asistente de dise o Preparaci n de las reacciones Cap tulo 3 Realizaci n del experimento Cap tulo 4 An lisis del experimento Cap tulo 5 Fin del experimento 16 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa Creaci n de un nuevo experimento Creaci n de un nuevo experimento Cree un experimento nuevo con el asistente de dise o del
86. tanto con reactivos de modo r pido como de modo est ndar e Opcional Introduzca el c digo de barras de la placa de reacci n de PCR si es que lo tiene Puede introducir hasta 100 caracteres en el campo Barcode C digo de barras e Opcional Escriba un nombre de usuario para identificar al propietario del experimento Puede introducir hasta 100 caracteres en el campo User Name Nombre de usuario e Opcional Escriba comentarios para describir el experimento Puede introducir hasta 1000 caracteres en el campo Comments Comentarios e Seleccione Quantitation Cuantificaci n en el tipo de experimento Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 21 cuantificaci n relativa O Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa l Definici n de los m todos y materiales Para obtener m s Para obtener m s informaci n acerca de informaci n e La pantalla Experiment Properties Propiedades de experimento acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando Fl e Consumibles consulte Consumibles admitidos en la p gina 3 e Experimentos de cuantificaci n consulte la Gu a de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Definici n de los m todos y materiales En la pantalla Methods amp Materials M todos y materiales seleccione el m todo de cuantificaci n los reactivos la velocidad de ram
87. the plot legend Mostrar ocultar la leyenda de la gr fica En el experimento de ejemplo se muestra el nivel de expresi n de TP53 en el h gado y el ri n en relaci n con su nivel de expresi n en la muestra de referencia cerebro Dado que la muestra de referencia se compara consigo misma el nivel de expresi n es 1 Si el resultado se muestra en el tipo de gr fico Logl10 el nivel de expresi n de la muestra de referencia aparece como 0 en el gr fico log10 de 1 0 2a 2b 2C Plot Type RQ vs Sample Y Graph Type Log10 w Orientation Vertical Bars v 2d a i Gene Expression 0 55 7 0 50 4 an 0 45 7 0 40 7 0 35 7 0 30 7 logl0 RQ 0 25 7 0 20 0 15 1 0 107 D 05 7 0 00 7 e A Sample Legend E TP53 3 Revise la tabla de pocillos a En el panel Experiment Menu Men del experimento seleccione Analysis An lisis Amplification Plot Gr fica de amplificaci n y a continuaci n seleccione la ficha View Well Table Ver tabla de pocillos b En el men desplegable Group By Agrupar por seleccione Replicate R plica c F jese en la columna C SD para evaluar la precisi n de los grupos de r plicas En el experimento de ejemplo no hay ning n valor at pico Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 183 cuantificaci n relativa View Plate Layout
88. un molde para un experimento de curva est ndar relativa o Cr comparativos puede configurar muchos experimentos con la misma informaci n de configuraci n 1 Cree un molde a e Haga doble clic en T acceso directo al software StepOne o seleccione Start Inicio All Programs Todos los programas Applied Biosystems StepOne StepOne v2 0 Abra un experimento existente o cree uno nuevo tal y como se describe en el Cap tulo 2 o Cap tulo 6 Seleccione File Archivo gt Save As Template Guardar como molde En el cuadro de di logo Save As Template Guardar como molde escriba un nombre de archivo y a continuaci n haga clic en Save Guardar para guardar el molde Haga clic en E Close Cerrar 2 Cree un experimento utilizando el molde a b C S1 a n no est en la pantalla Home Inicio haga clic en Home Inicio En la columna Set Up Configurar haga clic en Template Molde En el cuadro de di logo Open Abrir seleccione el molde que ha creado en el paso 1 Modifique el experimento con las herramientas del flujo de trabajo Advanced Setup Configuraci n avanzada Haga clic en 4 Save Guardar escriba un nombre de archivo y a continuaci n haga clic en Save Guardar para guardar el experimento 3 Prepare las reacciones de PCR a b C Notas Prepare el molde Prepare las diluciones de las muestras Prepare la diluci n seriada s lo en experimentos de
89. utilizan f rmulas aritm ticas Para configurar la placa de reacci n el m todo de C comparativos requiere dianas muestras una muestra de referencia y un control end geno Nota Antes de utilizar el m todo de Cr comparativos Applied Biosystems recomienda determinar si las eficiencias de PCR del ensayo diana y el ensayo de control end geno son aproximadamente iguales Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays y Custom TaqMan Gene Expression Assays tienen unas eficiencias de amplificaci n equivalentes del 100 10 e Seleccione los reactivos que desea utilizar Seleccione ensayos TaqManC si desea utilizar estos reactivos para detectar la amplificaci n y cuantificar la cantidad de gen diana en las muestras Los reactivos TaqMan se componen de dos cebadores y una sonda TaqMan Los cebadores est n dise ados para amplificar el gen diana La sonda TaqMan est dise ada para hibridar en el gen diana y generar una se al de fluorescencia cuando se amplifica el gen diana IMPORTANTE Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo TAMRA como notificador ni apantallador con el sistema StepOne Seleccione reactivos SYBR Green si desea utilizar estos reactivos para detectar la amplificaci n y cuantificar la cantidad de gen diana en las muestras Los reactivos SYBR Green se componen de dos cebadores y un fluorocromo SYBR Green Los cebadores est n dise ados para amplificar el gen diana El N
90. utilizando los mismos reactivos en las mismas condiciones Si se observa una amplificaci n anormal o una completa ausencia de se al solucione el error de la forma que se explica en la ayuda del software StepOne haga clic en en la barra de herramientas o seleccione Help Ayuda StepOne Help Ayuda de StepOne Nota Para ver los datos de la pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n seleccione los pocillos que desea ver en la ficha View Plate Layout Ver disposici n de placa Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 79 cuantificaci n relativa das Cap tulo 4 Realizaci n del experimento de curva est ndar relativa Monitorizaci n de la reacci n Acerca de la pantalla Temperature Plot Gr fica de temperatura Durante una reacci n la pantalla Temperature Plot Gr fica de temperatura muestra las temperaturas del bloque la cubierta caliente y las muestras calculadas a tiempo real La siguiente figura muestra la pantalla Temperature Plot Gr fica de temperatura durante el experimento de ejemplo Para Acci n A A adir quitar gr ficas de Seleccione Sample Muestra Heated Cover temperatura Cubierta caliente o Sample Block bloque para cambiar la presencia de los datos asociados en la gr fica B Cambiar el tiempo que se muestra Seleccione View Ver duraci n por gr fica C Restringir el eje Y de la gr f
91. y 5 segundos y a continuaci n centrif guelo brevemente 6 Prepare la diluci n 4 en el tubo GAPDH Std 4 a Con una punta de pipeta nueva a ada 1 0 uL de diluci n 3 al tubo GAPDH Std 4 Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 57 cuantificaci n relativa Cap tulo 3 Preparaci n de las reacciones de la curva est ndar relativa Preparaci n de la mezcla de reacci n b Agite el tubo Std 4 entre 3 y 5 segundos y a continuaci n centrif guelo brevemente Prepare la diluci n 5 en el tubo GAPDH Std 5 a Con una punta de pipeta nueva a ada 1 0 uL de diluci n 4 al tubo GAPDH Std 5 b Agite el tubo Std 5 entre 3 y 5 segundos y a continuaci n centrif guelo brevemente 8 Coloque los est ndares en hielo hasta que prepare la placa de reacci n Directrices de Cuando prepare su propio experimento de curva est ndar relativa preparaci n e Los est ndares son esenciales para realizar un an lisis preciso de los datos de la reacci n e Cualquier error o imprecisi n a la hora de realizar las diluciones afecta directamente a la calidad de los resultados e La calidad de pipetas y puntas y el cuidado que se tenga a la hora de medir y mezclar las diluciones afecta a la precisi n e Utilice tamp n TE o agua para diluir el est ndar Preparaci n de la mezcla de reacci n Prepare la mezcla de reacci n con los componentes y vol mene
92. y la cantidad inicial sirven para calcular la cantidad est ndar de cada punto de la curva est ndar Por ejemplo si la curva est ndar se define con un factor de diluci n de 1 10 o 10 la diferencia entre 2 puntos adyacentes cualquiera en la curva se multiplica por 10 Componente del perfil t rmico Una fase consta de uno o varios pasos Fase del perfil t rmico que se repite Si la fase c clica se utiliza para realizar la PCR se denomina fase de amplificaci n Fase del perfil t rmico con un incremento de temperatura para generar una curva de disociaci n Fase del perfil t rmico que incluye uno o varios pasos Por ejemplo puede a adir una fase de espera al perfil t rmico para activar enzimas para desactivar enzimas o para incubar una reacci n Fluorocromo fabricado por Applied Biosystems y precalibrado en el sistema StepOne Fluorocromos del sistema e Fluorocromo FAM e Fluorocromo JOE e Fluorocromo ROX e Fluorocromo SYBR Green e Fluorocromo VIC IMPORTANTE Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo TAMRA como notificador o apantallador con el sistema StepOne Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa fluorocromo personalizado fluorocromo puro gen de mantenimiento gr fica de amplificaci n gr fica de datos brutos gr fica de discriminaci n de alelos gr fica d
93. 0 13 2 Agua 7 0 92 4 Volumen total de la mezcla de 18 0 237 6 reacci n Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 161 cuantificaci n relativa Cap tulo 7 Preparaci n de las reacciones de Cr comparativos Preparaci n de la mezcla de reacci n 3 Para el ensayo de GAPDH a ada los vol menes requeridos de cada componente al tubo de la mezcla de reacci n de GAPDH Volumen uL para Componente Volumen uL para 12 reacciones p 1 reacci n m s un exceso del 10 TagMan Fast Universal PCR 10 0 132 0 Master Mix 2X Ensayo de GAPDH 20X 1 0 13 2 Agua 7 0 92 4 Volumen total de la mezcla de 18 0 237 6 reacci n Para mezclar la mezcla de reacci n de cada tubo pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo y a continuaci n t pelos Centrifugue brevemente los tubos para quitar las burbujas de aire Coloque las mezclas de las reacciones en hielo hasta que prepare la placa de reacci n Directrices de Cuando prepare su propio experimento de Cr comparativos Para obtener m s Notas preparaci n informaci n S1 el experimento incluye m s de un ensayo diana prepare la mezcla de reacci n para cada ensayo diana de manera separada Incluya un volumen de exceso en los c lculos para compensar la p rdida que se produce durante las transferencias de reactivos Applied Biosystems recomienda un volumen de exceso de al menos el
94. 049 0 049 0 049 0 059 0 059 0 059 Rn 8 737 8 69 8 159 6 621 6 509 6 601 0 486 0 501 0 484 8 314 8 078 7 98 8 261 8 216 7 657 5 651 5 567 5 649 0 001 7 822 7 603 7 418 gt Ki Nota Para mostrar u ocultar columnas en la tabla de pocillos marque desmarque el nombre de columna en el men desplegable Show in Table Mostrar en tabla Directrices de Cuando analice su propio experimento de C comparativos busque an lisis expresi n en relaci n con la muestra de referencia e Diferencias en la expresi n g nica como un cambio en n mero de veces de la e Desviaci n est ndar en los grupos de r plicas valores Cr SD Si es preciso omita los valores at picos consulte Omisi n de pocillos para el an lisis en la p gina 197 Para obtener m s informaci n clic en y o pulsando F1 Notas Para obtener m s informaci n acerca de la pantalla Gene Expression Plot Gr fica de expresi n g nica o la tabla de pocillos acceda a la ayuda del software StepOne haciendo 184 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 9 An lisis del experimento de C comparativos o Revisi n de la gr fica de amplificaci n Revisi n de la gr fica de amplificaci n En la pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n se muestra la amplificac
95. 1 Mezcla de reacci n 59 4 6 6 para c myc 2 Mezcla de reacci n 59 4 6 6 para GAPDH b Para mezclar la reacci n pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo y a continuaci n tape el tubo c Centrifugue brevemente el tubo para quitar las burbujas de aire d A ada 20 uL de la reacci n de control negativo a los pocillos apropiados de la placa de reacci n 2 Por cada grupo de r plicas prepare las reacciones est ndar a A tubos del tama o adecuado a ada los vol menes de la mezcla de reacci n y de est ndar que se indican a continuaci n Volumen Volumen np de la Tubo Reacci n Mezcla de mezcla de Est ndar de est ndar reacci n ee est ndar reacci n uL uL j 1 c myc Std 1 Mezcla de 59 4 c myc Std 1 6 6 reacci n para c myc 2 c myc Std 2 Mezcla de 59 4 c myc Std 2 6 6 reacci n para c myc 3 c myc Std 3 Mezcla de 59 4 c myc Std 3 6 6 reacci n para c myc 4 c myc Std 4 Mezcla de 59 4 c myc Std 4 6 6 reacci n para c myc 5 c myc Std 5 Mezcla de 59 4 c myc Std 5 6 6 reacci n para c myc Notas 62 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 3 Preparaci n de las reacciones de la curva est ndar relativa Q Preparaci n de la placa de reacci n J jei Volumen Tubo Reac cron Mezcla de mezcla de Est ndar de est ndar reacci n E
96. 12 10 2 10 2 10 2 10 02 10 02 i 6 Specify Sample Target Reactions B ca B ca Eon Boa E ca H sa H sa 200 200 200 20 20 20 2 Bea Eon B ca Elsa Esa Esa E ea PA 1 12 Unknown Ej 30 Standard E 6 Negative Control 0 Empty 2 0 2 0 2 0 2 0 02 0 02 0 02 Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 31 cuantificaci n relativa O Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa l Configuraci n de las opciones de cuantificaci n relativa Directrices de Cuando dise e su propio experimento de curva est ndar relativa dise o e Identifique cada muestra con un nombre y un color nicos Puede introducir hasta 100 caracteres en el campo Sample Name Nombre de muestra e Escriba el n mero de reacciones id nticas r plicas que desea configurar Applied Biosystems recomienda tres r plicas para cada reacci n de muestra e Escriba el n mero de reacciones de control negativo que desea configurar Applied Biosystems recomienda tres reacciones de control negativo por cada ensayo diana e Seleccione la combinaci n de reacciones de muestra diana deseada Seleccione All Sample Target Reactions Todas las reacciones de muestra diana para configurar todos los genes diana de todas las muestras Seleccione Specify Sample Target Reactions Especifique reacciones de muestra dia
97. 24 Empty 3 En la pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n a En el men desplegable Plot Type Tipo de gr fica seleccione AR vs Cycle AR vs ciclo b En el men desplegable Color Plot By Colorear gr fica por seleccione Well Pocillo c Haga clic en Show Hide the plot legend Mostrar ocultar la leyenda de la gr fica Notas 186 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 9 An lisis del experimento de C comparativos LO Revisi n de la gr fica de amplificaci n 4 Observe los valores de la l nea basal a En el men desplegable Graph Type Tipo de gr fica seleccione Linear Lineal b Active la casilla de verificaci n Baseline L nea basal para ver los ciclos inicial y final de la l nea basal c Compruebe que la l nea basal est ajustada correctamente En el experimento del ejemplo la l nea basal termina antes de que se inicie la amplificaci n 3a 4a 3b Amplification Plot TA Plot Settings Plot Type ARn vs Cycle Graph Type Linear Color Plot By well v Pas 3c Amplification Plot 8 7 6 5 dE j4 3 2 1 o 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Cycle Legend A A 5 Ac A M e E Options Target All v Threshold Auto Auto Baseline Show Threshold Y 4b Notas Gu a de introducci n
98. 3 Send Experimentto Instrument ES Download Experiment from Instrument 5 Export y Print Report Analysis Settings O Experiment Menu f Experi IATA View Piate Layout view weli Table 6 Consulte Elementos del software m s adelante y Consejos de desplazamiento en la p gina 179 para obtener informaci n acerca de c mo desplazarse por las pantallas de an lisis Directrices Cuando analice su propio experimento de C comparativos e Inmediatamente despu s de una reacci n el software StepOne analiza autom ticamente los datos utilizando las opciones de an lisis predeterminadas y a continuaci n muestra la pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n en el ordenador e Para volver a analizar los datos seleccione todos los pocillos de la disposici n de la placa y a continuaci n haga clic en Analyze Analizar Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 177 cuantificaci n relativa sn Cap tulo 9 An lisis del experimento de C comparativos An lisis del experimento Elementos del A continuaci n se ilustran los elementos del software StepOne de las pantallas de software an lisis 1 Barra de men s muestra los men s disponibles en el software File Archivo Edit Edici n Instrument Instrumento Analysis An lisis Tools Herramientas Help Ayuda 2 Barra de herramientas muestra la
99. 38 40 Cycle Cycle Multicomponent Plot a y Multicomponent Plot Raw Data Plot 250 000 200 000 150 000 100 000 Fluorescence 50 000 o O2 4 6 8 10 12 14 16 18 D 2 MA 2 MI 2 M4 3 33 4 42 Cycle Filter Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 181 cuantificaci n relativa oO Cap tulo 9 An lisis del experimento de C comparativos Revisi n de la gr fica de expresi n g nica y la tabla de pocillos Revisi n de la gr fica de expresi n g nica y la tabla de pocillos Acerca del experimento de ejemplo Revisi n de la gr fica de expresi n g nica y la tabla de pocillos Notas La pantalla Gene Expression Plot Gr fica de expresi n g nica muestra los resultados de los c lculos de cuantificaci n relativa a trav s del perfil de expresi n g nica Hay disponibles dos gr ficas e RQ vs Target Cuantificaci n relativa vs diana agrupa los valores de cuantificaci n relativa RQ por diana Se traza cada muestra para cada gen diana e RQ vs Sample Cuantificaci n relativa vs muestra agrupa los valores de cuantificaci n relativa RQ por muestra Se traza cada gen diana para cada muestra Cada gr fica se puede ver de las siguientes formas lineal log10 Ln log2 En la tabla de pocillos se muestran datos de cada pocillo de la placa de reacci n incluidos e El nombre de la muestra el nombre de el g
100. 5 diluciones de muestras 53 158 directrices 54 58 60 64 158 160 162 165 flujo de trabajo 50 156 mezcla de reacci n preparar 58 160 para obtener m s informaci n 52 54 60 65 158 160 162 165 placa de reacci n 61 163 plantilla 51 157 publicar datos 111 191 R reactivos otros basados en fluorescencia 9 SYBR Green 8 TaqMan 8 reactivos SYBR Green 8 23 24 27 41 123 132 134 136 147 204 reactivos TaqMan 8 23 24 27 41 123 132 134 136 147 204 realizar experimento activar opciones de notificaciones 71 alertas 82 directrices 72 flujo de trabajo 68 iniciar 73 para obtener m s informaci n 71 82 84 preparar 69 169 supervisar 76 transferir datos 87 r plica componente de experimento 5 6 residuos biol gicos peligrosos manipulaci n xx residuos radioactivos manipulaci n xx resultados interpretar 93 175 RT PCR de 1 pasos 7 24 25 34 41 133 134 142 147 RT PCR de 2 pasos 7 11 12 24 25 133 134 S seguridad antes de usar el instrumento xvi convenciones Xi directrices xvil XIX XX el ctrica xx ergonom a xxii estaci n de trabajo xxii est ndares xxiii mover y levantar el instrumento xvi mover levantar xvi movimiento repetitivo xxil peligros biol gicos xxi qu mica xvii residuo qu mico residuos qu micos xix uso del instrumento xvi seguridad de residuos qu micos xix seguridad el ctrica xx seguridad qu mica xvii seleccionar pocillos 98 179 s m
101. 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa Revisi n del resumen QC Revisi n del resumen QC Acerca del experimento de ejemplo Revisi n del resumen QC Notas La pantalla QC Summary Resumen QC muestra una lista de avisos del software StepOne e incluye la frecuencia y ubicaci n de los mismos en el experimento abierto En el experimento de curva est ndar relativa de ejemplo hay que revisar la pantalla QC Summary Resumen QC para saber si los datos del experimento han desencadenado alg n aviso Los pocillos D7 D8 y El han producido datos que han desencadenado el aviso HIGHSD El pocillo D1 ha producido datos que han desencadenado el aviso OUTLIERRG En el panel Blocs Menu Men del experimento seleccione Analysis An lisis QC Summary Resumen QC Nota Si en la pantalla QC Summary Resumen QC no aparece ning n dato haga clic en Analyze Analizar Revise el resumen de avisos En el experimento de ejemplo hay 4 pocillos marcados En la tabla Flag Details Detalles de aviso observe las columnas Frequency Frecuencia y Wells Pocillos para determinar qu avisos aparecen en el experimento En el experimento de ejemplo e El aviso HIGHSD aparece 3 veces en los pocillos D7 D8 y El e El aviso OUTLIERRG aparece 1 vez en el pocillo D1 Nota Un valor 0 en la columna Frequency Frecuencia indica que el aviso no aparece en el experimento Por cada aviso que aparezca en el expe
102. 5 CT 30 86 Cr 30 95 CT 30 93 Cr 23 5 CT 23 39 CT 23 39 D E F Wells E 18 Unknown F 6 Negative Control 24 Empty C mo ver m ltiples gr ficas Utilice la vista Multiple Plots M ltiples gr ficas para ver simult neamente hasta cuatro gr ficas Para desplazarse por la vista Multiple Plots M ltiples gr ficas 1 En el panel Experiment Menu Men del experimento seleccione Analysis An lisis A Multiple Plots View Vista de m ltiples gr ficas 2 Para ver cuatro gr ficas haga clic en Show plots in a 2 X 2 matrix Mostrar 9 oo gr ficas en una matriz de 2 X 2 3 Para ver dos gr ficas en filas haga clic en Show plots in two rows Ver gr ficas en dos filas 4 Para ver dos gr ficas en columnas haga clic en Show plots in two columns gt Ver gr ficas en dos columnas Notas 180 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 9 An lisis del experimento de C comparativos O An lisis del experimento J 5 Para ver una gr fica espec fica seleccione la gr fica en el men desplegable situado encima de la visualizaci n de cada gr fica z 2 3 Multiple Plots View AA q NE 3 1 4 Amplification Plot ARn vs Cycle Amplification Plot Rn vs Cycle v PRE ZE P PARE Amplification Plot Amplification Plot 10 12 14 16 18 D 2 N 2 2 D 2 N 2 39 40 x 10 12 14 16 18 20 2 2M 2 28 32M 2 M4 3
103. 8 0 475 2 reacci n Para mezclar la mezcla de reacci n de cada tubo pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo y a continuaci n t pelos Centrifugue brevemente los tubos para quitar las burbujas de aire Coloque las mezclas de las reacciones en hielo hasta que prepare la placa de reacci n Directrices de Cuando prepare su propio experimento de curva est ndar relativa preparaci n Si el experimento incluye m s de un ensayo diana prepare la mezcla de reacci n para cada ensayo diana de manera separada Incluya un volumen de exceso en los c lculos para compensar la p rdida que se produce durante las transferencias de reactivos Applied Biosystems recomienda un volumen de exceso de al menos el 10 Incluya todos los componentes requeridos Prepare los reactivos de acuerdo con las instrucciones del fabricante Mantenga los ensayos protegidos de la luz en el refrigerador hasta que est listo para usarlos Una exposici n excesiva a la luz puede afectar a las sondas fluorescentes Antes de utilizarlo D vueltas al bote para mezclar bien la mezcla maestra Agite el ensayo para resuspenderlo y a continuaci n centrifugue brevemente el tubo Para descongelar las muestras congeladas col quelas en hielo Una vez descongeladas agite las muestras para resuspenderlas y a continuaci n centrifugue los tubos brevemente Para obtener m s Para obtener m s informaci n acerca de la prep
104. A 32 ES c myc STANDARD 40 0 Vme Ad E c myc 23 350729 37 5 gt 33 e c myc STANDARD 35 0 El c myc 26 639076 325 Pocillo us iha 4 co o c myc STANDARD anos Elo vao El c myc 26 665236 ss ena Ymo ne 35 San c myc STANDARD ars 5 E c myc 26 817833 a A e 3 ce O c myc STANDARD par El c myc 29 954172 9 200 mos E xr 0 c myc STANDARD 17 5 E c myc 29 9543 15 0 38 D3 O c myc STANDARD sa E c myc O e Ac 39 o EA c myc STANDARD n c myc 33 16362 L R 40 u O c myc STANDARD 5 0 E c myc 33 586723 25 41 D6 d c myc STANDARD HEPER Rss ss A ADA DAL Aumin 42 S D5 c myc STANDARD y lt gt 5 Haga clic en Analyze Analizar para volver a analizar los datos del experimento sin el pocillo D1 Amplification Plot lt View Plate Layout View Well Table Plot Settings gt Select Wells With Select item w i Select Item Plot Type CT vs Well Graph Type Linear Color Plot By Well A P P ig E E E Well Omit Flag Sample Na TargetName Task D Amplification Plot 36 ce O c myc STANDARD FAN El c myc 29 954172 37 pasta c myc STANDARD FAN c myc 29 9543 38 DB O c myc STANDARD FAM c myc 33 16362 39 DO c myc STANDARD FAN c myc 33 586723 40 DB O c myc STANDARD FAN c myc 33 629368 41 os O c myc STANDARD FAM c myc 35 704887 42 a c myc STANDARD FAM c myc 35 97167 43 E1 O c myc STANDARD FAN c myc 36 7307 44 DB O A c myc STANDARD FAN c myc Undetermined 45
105. A1 O c myc NTC FAN 46 A2 F c myc NTC FAN O3 z2 a a a 0 i214 8 i3 20 2 4 2 9 2 H BB DL u 47 A3 c mve NTC FAN 5 Well Number 48 o M c myc STANDARD FAhw 4 gt Directrices de Cuando analice su propio experimento de curva est ndar relativa f jese bien si en los an lisis grupos de r plicas hay valores at picos Si es necesario quite manualmente los valores at picos con la tabla de pocillos Siga el procedimiento Omisi n de pocillos anterior para quitar los valores at picos del experimento Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 119 cuantificaci n relativa mu Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa Revisi n de la gr fica multicomponente Para obtener m s Para obtener m s informaci n acerca de la omisi n de pocillos para el an lisis acceda a informaci n la ayuda del software StepOne haciendo clic en y o pulsando F1 En la ayuda busque los temas relacionados con la omisi n de pocillos 1 2 3 4 Haga clic en la ficha Search Buscar Escriba omit well omisi n de pocillos Haga clic en List Topics Ver temas Haga doble clic en los temas que desee leer Revisi n de la gr fica multicomponente La pantalla Multicomponent Plot Gr fica multicomponente muestra la contribuci n espectral completa de cada fluorocromo de un pocillo seleccionado durante el tiempo que dura el proceso de PCR Acerca d
106. Applied Gu a de introducci n Biosystems M Applied Biosystems stepOne Real Time PCR System Experimentos de cuantificaci n relativa y Cy comparativos nme Ay Applico vn Biosysiems Gu a de introducci n 1O Applied AS Biosystems Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Experimentos de cuantificaci n relativa Introducci n Dise o del experimento de curva est ndar relativa Preparaci n de las reacciones de la curva est ndar relativa Realizaci n del experimento de curva est ndar relativa An lisis del experimento de curva est ndar relativa Dise o del experimento de Cr comparativos Preparaci n de las reacciones de Cr comparativos Realizaci n del experimento de Cr comparativos An lisis del experimento de Cr comparativos O Copyright 2006 2010 Applied Biosystems All rights reserved Information in this document is subject to change without notice Applied Biosystems assumes no responsibility for any errors that may appear in this document APPLIED BIOSYSTEMS DISCLAIMS ALL WARRANTIES WITH RESPECT TO THIS DOCUMENT EXPRESSED OR IMPLIED INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THOSE OF MERCHANTABILITY OR FITNESS FOR A PARTICULAR PURPOSE IN NO EVENT SHALL APPLIED BIOSYSTEMS BE LIABLE WHETHER IN CONTRACT TORT WARRANTY OR UNDER ANY STATUTE OR ON ANY OTHER BASIS FOR SPECIAL INCIDENTAL INDIRECT PUNITIVE MULTIPLE OR CONSEQUENTIAL DAMAGES IN CONNECTIO
107. Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Software pulsando F1 haciendo clic en 4 en la barra de herramientas o seleccionando Help Ayuda StepOne Help Ayuda de StepOne Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 205 cuantificaci n relativa N Ap ndice A Flujos de trabajo alternativos para el experimento ON Flujo de trabajo Advanced Setup Configuraci n avanzada Flujo de trabajo Advanced Setup Configuraci n avanzada Si crea un experimento de curva est ndar relativa o Cy comparativos AAC con el flujo de trabajo Advanced Setup Configuraci n avanzada del software StepOne puede configurar el experimento de acuerdo con su criterio 1 Configure un nuevo experimento a Haga doble clic en T acceso directo al software StepOne o seleccione Start Inicio gt All Programs Todos los programas Applied Biosystems StepOne gt StepOne v2 0 b En la columna Set Up Configurar haga clic en Advanced Setup Configuraci n avanzada c En el panel de navegaci n haga clic en Experiment Properties Propiedades del experimento predeterminado y a continuaci n escriba las propiedades del experimento de ejemplo d En el panel de navegaci n haga clic en El Plate Setup Configuraci n de placa y a continuaci n asigne los genes diana los est ndares s lo en experimentos de curva est ndar relativa y las muestras e
108. Cap tulo 4 Realizaci n del experimento de curva est ndar relativa NA Preparaci n de la reacci n Preparaci n de la reacci n Para preparar la reacci n abra el experimento y cargue la MicroAmp Fast Optical 48 Well Reaction Plate en el instrumento StepOne Apertura del 1 Si a n no se est ejecutando el software StepOne haga doble clic en T acceso experimento de directo al software StepOne o seleccione Start Inicio All Programs Todos los ejemplo programas Applied Biosystems StepOne gt StepOne v2 0 2 En la pantalla Home Inicio haga clic en Open Abrir 3 En el cuadro de di logo Open Abrir despl cese hasta la carpeta experiments experimentos predeterminada 4 Haga doble clic en Relative Standard Curve Example Ejemplo de curva est ndar relativa para abrir el archivo del experimento de ejemplo que ha creado en el Cap tulo 2 Les StepOne v1 0 File Edit Instrument Analysis Tools Help 2 E Naw Evnarimant CS Open M B Close 137 Send Experiment to Instrument ES Download Experiment from Instrument 4D E Set Up Run N Open ponia experiments Y aaa MA a sz My Recent Documents Desktop A PrintReport Analyze My en My Computer File name My Network Places Files oftype All SDS Files eds edt sds Relative Standard Curve Example eds Save current display as the default www appliedbiosystems com
109. Cr deviates significantly from Cr values in the associated replicate group View OUTLIERRG Troubleshooting Information En los experimentos de curva est ndar relativa los datos del experimento pueden desencadenar los avisos que se indican a continuaci n Si en el experimento no aparece un aviso su frecuencia ser 0 Si la frecuencia es gt 0 eso significa que el aviso aparece en alg n lugar del experimento La posici n del pocillo se indica en la columna Wells Pocillos Aviso Descripci n AMPNC Amplificaci n en control negativo BADROX Se al de referencia pasiva incorrecta BLFAIL Error del algoritmo de l nea basal CTFAIL Error del algoritmo C EXPFAIL Error del algoritmo exponencial HIGHSD Desviaci n est ndar alta en el grupo de r plicas NOAMP No hay amplificaci n NOISE Ruido mayor que otros pocillos en la placa NOSIGNAL No hay se al en el pocillo OFFSCALE La fluorescencia est fuera de la escala OUTLIERRG Valor at pico en el grupo de r plicas SPIKE Picos de ruido THOLDFAIL Error en el algoritmo del umbral Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa 117 mu Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa Omisi n de pocillos para el an lisis Directrices de Cuando analice su propio experimento de curva est ndar relativa an lisis e Haga clic en cada aviso de
110. En el panel de navegaci n haga clic en 7 Run Method Protocolo de termociclado y a continuaci n escriba el volumen de la reacci n y cambie el perfil t rmico seg n convenga f En el panel de navegaci n haga clic en Reaction Setup Configuraci n de reacci n y a continuaci n revise los vol menes calculados para las reacciones de PCR la diluci n seriada s lo en experimentos de curva est ndar relativa y las diluciones de las muestras Ed telos si es preciso g Opcional En el panel de navegaci n haga clic en Materials List Lista de materiales y a continuaci n seleccione y compre los materiales que necesite para el experimento 2 Prepare las reacciones de PCR a Prepare el molde b Prepare las diluciones de las muestras c Prepare la diluci n seriada s lo en experimentos de curva est ndar relativa d Prepare la mezcla de reacci n e Prepare la placa de reacci n Notas 206 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa 3 Realice el experimento a b Inicie el proceso C Ap ndice A Flujos de trabajo alternativos para el experimento A Flujo de trabajo QuickStart Inicio r pido y Cargue el instrumento Descargue el instrumento 4 Analice los datos Flujo de trabajo QuickStart Inicio r pido Si crea un experimento de curva est ndar relativa o C comparativos con el flujo de trabajo Quic
111. Guardar para aceptar la ubicaci n y el nombre de archivo predeterminados El experimento de ejemplo se guarda y se cierra y regresa a la pantalla de inicio Nota De manera predeterminada el experimento de ejemplo se guarda en la carpeta Applied BiosystemsiStepOne Systemlexperiments E Save Experiment Comparative CT Example Save in experiments le O examples My Recent Documents Desktop My Documents My Computer e File name AMES se 3 My Network geai Files of type Experiment Document Single files eds Cancel Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 153 cuantificaci n relativa e Cap tulo 6 Dise o del experimento de Cy comparativos Finalizaci n del flujo de trabajo del asistente de dise o Directrices de Cuando dise e su propio experimento de Cr comparativos dise o Para obtener m s Notas informaci n En la ventana Review Plate for Experiment Revisar placa para el experimento seleccione la opci n de salida apropiada Haga clic en Save Experiment Guardar experimento si desea guardar y cerrar el experimento sin realizar ning n otro cambio ni iniciar el proceso Haga clic en Start Run for This Experiment Iniciar proceso para este experimento si desea guardar el experimento e iniciar el proceso Aseg rese de que la placa de reacci n est cargada en el instrumento Haga clic en Edit Plate Layout Editar disposici n de plac
112. Home Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 69 cuantificaci n relativa Cap tulo 4 Realizaci n del experimento de curva est ndar relativa Preparaci n de la reacci n Carga de la placa DO de reacci n instrumento la temperatura del bloque puede superar los 100 C Si el instrumento se ha utilizado recientemente mantenga las manos alejadas de l hasta que el bloque alcance la temperatura ambiente IMPORTANTE Lleve guantes sin polvo para manejar la placa de reacci n 1 Abra la bandeja del instrumento UD rii E 2 Coloque las reacciones en el bloque La colocaci n de las reacciones depende del tipo de consumible que se utilice e Si utiliza una placa de reacci n col quela con el pocillo A1 en la esquina posterior izquierda e Si utiliza tiras de tubos de reacci n col quelas en el bloque directamente e Gea i rriti riiit A1 3 Cierre cuidadosamente la bandeja del instrumento sep OA M AN y y A DNDIO a 0 bc Notas 70 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 4 Realizaci n del experimento de curva est ndar relativa WN Opcional Activaci n de las notificaciones Opcional Activaci n de las notificaciones Active las opciones de notificaci n p
113. ION Hazardous waste Refer to MSDS s and local regulations for handling and disposal ATTENTION Produits chimiques dangeureux Lire les fiches techniques de s ret de mat riels avant la manipulation des produits ATTENTION D chets dangereux Lire les fiches techniques de s ret de mat riels et la r gulation locale associ es a la manipulation et l limination des d chets CAUTION Hot surface ATTENTION Surface br lante DANGER High voltage WARNING To reduce the chance of electrical shock do not remove covers that require tool access No user serviceable parts are inside Refer servicing to Applied Biosystems qualified service personnel DANGER Haute tension AVERTISSEMENT Pour viter les risques d lectrocution ne pas retirer les capots dont l ouverture n cessite l utilisation d outils L instrument ne contient aucune pi ce r parable par l utilisateur Toute intervention doit tre effectu e par le personnel de service qualifi de Applied Biosystems CAUTION Moving pars ATTENTION Parties mobiles DANGER Class 3B IlI visible and or invisible LED radiation present when open and interlocks defeated Avoid exposure to beam DANGER Rayonnement visible ou invisible d un faisceau LED de Classe 3B III en cas d ouverture et de neutralisation des dispositifs de s curit Evitez toute exposition au faisceau Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real T
114. L y a continuaci n toque Done Finalizado Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 73 cuantificaci n relativa mrs Cap tulo 4 Realizaci n del experimento de curva est ndar relativa Monitorizaci n de la reacci n b Toque Start Run Iniciar proceso Experiment Parameters S Reaction Yolume a a Cover Temperature 105 0 To Experiment Name Example_Experiment M kas Touch each field then use the keyboard to edit the contents When you are finished touch Start Run Monitorizaci n de la reacci n Monitorice el progreso desde un ordenador que ejecute el software StepOne o desde la pantalla t ctil del instrumento StepOne La forma en la que monitorice el proceso depende de la disposici n del sistema StepOne Disposici n Descripci n Consulte Conectada El cable del sistema StepOne conecta el Monitorizaci n ordenador al instrumento StepOne conectada m s abajo Aut noma El ordenador y el instrumento StepOne est n Monitorizaci n remota en red conectados a la misma red en la p gina 83 Aut noma El ordenador y el instrumento StepOne no est n Monitorizaci n b sica conectados aut noma en la p gina 86 Notas 76 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 4 Realizaci n del experim
115. M Real Time PCR System para experimentos de 99 cuantificaci n relativa mu Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa Visualizaci n de la curva est ndar Visualizaci n de la curva est ndar La pantalla Standard Curve Curva est ndar muestra la curva est ndar de las muestras designadas como est ndares El software StepOne calcula la cantidad de un gen diana desconocido a partir de la curva est ndar Acerca del En el experimento de curva est ndar relativa de ejemplo se pueden revisar los siguientes experimento de valores en la pantalla Standard Curve Curva est ndar ejemplo e Pendiente eficiencia de amplificaci n e Valor R coeficiente de correlaci n e Valores Cy Visualizaci n de 1 En el panel Experiment Menu Men del experimento seleccione Analysis la curva est ndar An lisis Standard Curve Curva est ndar Nota Si en la pantalla Standard Curve Curva est ndar no aparece ning n dato haga clic en Analyze Analizar 2 Para ver los 48 pocillos en la pantalla Standard Curve Curva est ndar haga clic en la esquina superior izquierda de la disposici n de la placa en la ficha View Plate Layout Ver disposici n de placa 3 En el men desplegable Target Diana seleccione All Todas 4 En el men desplegable Plot Color Color de gr fica seleccione Default Predeterminado 5 Haga clic en Show Hide the plot legend Mostrar ocultar la leyenda de la gr
116. N WITH OR ARISING FROM THIS DOCUMENT INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THE USE THEREOF NOTICE TO PURCHASER Label License The StepOne Real Time PCR System is covered by US patents and corresponding claims in their non US counterparts owned by Applied Biosystems No right is conveyed expressly by implication or by estoppel under any other patent claim such as claims to apparatus reagents kits or methods such as 5 nuclease methods Further information on purchasing licenses may be obtained by contacting the Director of Licensing Applied Biosystems 850 Lincoln Centre Drive Foster City California 94404 USA TRADEMARKS Applera Applied Biosystems AB Design MicroAmp Primer Express and VIC are registered trademarks and FAM JOE ROX StepOne and TAMRA are trademarks of Applied Biosystems o sus subsidiarias en EE UU y o en algunos otros pa ses AmprErase AmpliTaq Gold and TaqMan are registered trademarks of Roche Molecular Systems Inc SYBR is a registered trademark of Molecular Probes Inc Macintosh is a registered trademark of Apple Computer Inc Microsoft and Windows are registered trademarks of Microsoft Corporation All other trademarks are the sole property of their respective owners N mero de referencia 4377742 Rev B 06 2010 Contenido POIO sucio sas ra a ra a a vii C mo utilizar esta QU a o ooooocoenrrnrn a vii C mo obtener m s informaci n Eo e ee e anae e e ee Reo viii C mo obtener asi
117. O 2 Cycle sar El car El car E sar E sar E sar E sar E car Legend 2 0 2 0 2 0 2 0 02 0 02 0 02 T 26 95 CT 26 94 Cr 30 41 Cr 30 36 Cr 30 38 CT 33 71 CT 33 83 CT 33 77 MA rox ran Wells E 12 Unknown E 30 Standard 6 Negative Control 0 Empty Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 121 cuantificaci n relativa mu Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa Revisi n de la gr fica de datos brutos Directrices de Cuando analice su propio experimento de curva est ndar relativa busque an lisis e Referencia pasiva el nivel de fluorescencia del fluorocromo de referencia pasiva debe permanecer relativamente constante a lo largo de la reacci n de PCR e Fluorocromo del notificador el nivel de fluorescencia del fluorocromo del notificador deber a presentar una regi n plana que se corresponde con la l nea basal seguida por un r pido aumento en la fluorescencia a medida que la amplificaci n contin a e Cualquier irregularidad de la se al no deber a haber ning n pico depresi n ni cambio s bito en la se al fluorescente e Pocillos de control negativo no deber a haber ninguna amplificaci n en los pocillos de control negativo Para obtener m s Para obtener m s informaci n acerca de la pantalla Multicomponent Plot Gr fica informaci n multicomponente acceda a la ayuda del software Step
118. OE est unido al extremo de 5 de la sonda TaqMan que se utiliza para detectar el gen diana Seleccione VIC si el fluorocromo VIC est unido al extremo de 5 de la sonda TaqMan que se utiliza para detectar el gen diana Seleccione SYBR si utiliza fluorocromo SYBR Green para detectar DNA de doble cadena e Seleccione el apantallador utilizado en el ensayo diana Seleccione NFQ MGB si a la sonda TaqMan de 3 que est utilizando para detectar el gen diana hay unido un apantallador no fluorescente de uni n al surco menor de la doble cadena de DNA Seleccione None Ninguno si se utiliza fluorocromo SYBR Green IMPORTANTE Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo TAMRA como notificador ni apantallador con el sistema StepOne Para obtener m s Para obtener m s informaci n acerca de informaci n e La pantalla Targets Dianas acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en y o pulsando F1 e La selecci n de un control end geno consulte la nota de aplicaci n Using TagMan Endogenous Control Assays to Select an Endogenous Control for Experimental Studies Configuraci n de las muestras En la pantalla Samples Muestras escriba el n mero de muestras r plicas y controles negativos que va a incluir en la placa de reacci n escriba los nombres de las muestras y a continuaci n seleccione las reacciones de muestra diana que va a configurar Acerca del En el experime
119. One Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa O Revisi n de la configuraci n de la reacci n Revisi n de la configuraci n de la reacci n Acerca del experimento de ejemplo Pantalla Reaction En la pantalla Reaction Setup Configuraci n de reacci n seleccione el tipo de ensayo si utiliza reactivos TaqMan y a continuaci n revise los vol menes calculados para preparar las reacciones de PCR las series de diluci n est ndar y las diluciones de las muestras Si es necesario puede editar el volumen de reacci n el volumen de reacci n de exceso las concentraciones de los reactivos la concentraci n del est ndar y o la concentraci n de la muestra diluida IMPORTANTE Realice estos pasos para cada ensayo diana de la placa de reacci n En el experimento de curva est ndar relativa de ejemplo e Se utilizan Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays El volumen de reacci n por pocillo es 20 uL e El volumen de reacci n de exceso es del 10 e Los componentes de la reacci n son TaqMan Fast Universal PCR Master Mix 2X Ensayo de c myc 20X Ensayo de GAPDH 20X Muestra o est ndar Agua e La concentraci n del est ndar en la soluci n de partida es de 200 ng uL e La concentraci n de la muestra diluida es de 5 0 ng uL e La concentraci n de la soluci n de partida de la muestra es de 100 ng
120. One o seleccione Start Inicio gt All Programs Todos los programas Applied Biosystems StepOne StepOne v2 0 2 En la pantalla Home Inicio haga clic en Open Abrir 3 En el cuadro de di logo Open Abrir despl cese hasta la carpeta examples ejemplos 4 Haga doble clic en Comparative CT Example Ejemplo de C comparativos para abrir el archivo de datos del experimento de ejemplo 176 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 9 An lisis del experimento de C comparativos Q An lisis del experimento Es StepOne v1 0 File Edit Instrument Analysis Tools Help 2 E Naw Evnarimant CS Open W 502 gt B Close 9 Send Experiment to Instrument ES Download Experiment from Instrument 4D A Fint Report Set Up Run Analyze a E Open 3 O e examples be HEEE 4 lo Relative Standard Curve Example My Recent Standard Curve Example do tito My rd File name Comparative CT Example eds My Network i Places Files oftype All SDS Files eds edt sds Save current display as the default www appliedbiosystems com t Home 5 Haga clic en Analyze Analizar El software analiza los datos utilizando las opciones de an lisis predeterminadas E StepOne v1 0 File Edit Instrument Analysis Tools Help a New Experiment Y Open lA Save gt Close
121. One haciendo clic en e o pulsando Fl Revisi n de la gr fica de datos brutos En la pantalla Raw Data Plot Gr fica de datos brutos se muestra la se al de fluorescencia bruta no normalizada para cada filtro ptico de los pocillos seleccionados durante cada ciclo de la PCR a tiempo real Acerca del En el experimento de curva est ndar relativa de ejemplo hay que revisar la pantalla Raw experimento de Data Plot Gr fica de datos brutos para comprobar si hay un aumento estable de la se al ejemplo que no hay ninguna depresi n ni cambio abrupto a partir del filtro apropiado Revisi n dela 1 En el panel Experiment Menu Men de experimento seleccione Analysis gr fica de datos An lisis Raw Data Plot Gr fica de datos brutos brutos Nota Si en la pantalla Raw Data Plot Gr fica de datos brutos no aparece ning n dato haga clic en Analyze Analizar 2 Para ver los 48 pocillos en la pantalla Raw Data Plot Gr fica de datos brutos haga clic en la esquina superior izquierda de la disposici n de la placa en la ficha View Plate Layout Ver disposici n de placa 3 Haga clic en gt Show Hide the plot legend Mostrar ocultar la leyenda de la gr fica 4 Haga clic y arrastre el puntero Show Cycle Mostrar ciclo desde el ciclo 1 al 40 En el experimento de ejemplo hay un aumento estable en la se al desde el filtro 1 que se corresponde con el filtro del fluorocromo FAM Notas 122 Gu a d
122. PDH 3 En el men desplegable Assay Type Tipo de ensayo seleccione Inventoried Made to Order En inventario Fabricado bajo pedido 4 Aseg rese de que en el campo Reaction Volume Per Well Volumen de reacci n por pocillo aparece 20 uL 5 Aseg rese de que en el campo Excess Reaction Volume Volumen de reacci n en exceso muestra 10 6 En el panel Reactions for GAPDH Reacciones para GAPDH a Aseg rese de que en el campo Master Mix Concentration Concentraci n de mezcla maestra aparece 2X b Aseg rese de que en el campo Assay Mix Concentration Concentraci n de ensayo aparece 20X Notas 144 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 6 Dise o del experimento de Cy comparativos F Revisi n de la configuraci n de la reacci n c Revise los componentes y los vol menes calculados para las reacciones de PCR Componente Volumen uL para 1 reacci n Mezcla maestra 2X 10 0 Ensayo 20X 1 0 Muestra 10X 2 0 H O 7 0 Volumen total 20 0 El volumen de la muestra se limita al 10 del volumen total de la reacci n 2E Set Up Reaction Setup gt Reaction Mix Calculations Reaction Setup Help For each target assay in the reaction plate selectthe assay type if using Taqllan reagents then review the calculated volumes for preparing the samples and PCR Q Instructions reactions If needed edit
123. Reaction Mix Calculations C lculos de la mezcla de reacci n para el ensayo de GAPDH en la p gina 37 Para el experimento de curva est ndar relativa de ejemplo e La concentraci n del est ndar en la soluci n de partida es de 200 ng uL e Los vol menes calculados en el software para los ensayos de c myc y GAPDH son Volumen Volumen E de Volumen Concentraci n Diluci n Soluci n soluci n de total del est ndar origen a disolvente origen uL uL ng uL HL 1 200 Soluci n 5 0 5 0 10 0 100 0 origen 2 20 Diluci n 1 1 0 9 0 10 0 10 0 3 2 Diluci n 2 1 0 9 0 10 0 1 0 4 0 2 Diluci n 3 1 0 9 0 10 0 0 1 5 0 02 Diluci n 4 1 0 9 0 10 0 0 01 e Agua para diluir los est ndares e Tubos de microcentr fuga e Pipetas e Puntas de pipeta e Soluci n de partida del est ndar e Agitador e Centr fuga 1 Etiquete un tubo de microcentr fuga diferente para cada est ndar e c myc Std 1 e c myc Std 2 e c myc Std 3 e c myc Std 4 e c myc Std 5 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 55 cuantificaci n relativa Notas Cap tulo 3 Preparaci n de las reacciones de la curva est ndar relativa Preparaci n de la diluci n seriada 2 A ada el volumen de agua requerido disolvente a cada tubo vac o Volumen de Tubo Nombre de est ndar den a adir uL 1 c myc Std 1 5 0 2 c myc St
124. Results Recoger resultados 4 Cuando aparezca un mensaje que le informa de que los datos se han transferido correctamente toque OK Aceptar CD po Ts Ea ES O 2006 11 16 2 15 PM 2 xq 5 Extraiga la unidad USB del instrumento StepOne y a continuaci n con ctela al puerto USB del ordenador 6 En el escritorio del ordenador utilice el explorador de Windows para abrir la unidad USB Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 89 cuantificaci n relativa Cap tulo 4 Realizaci n del experimento de curva est ndar relativa Descarga de la placa de reacci n y transferencia de datos wm 7 Copie el archivo Relative Standard Curve Example eds en lt unidad gt Applied Biosystems StepOne Systemlexperiments donde lt unidad gt es la unidad del disco duro del ordenador en la que est instalado el software de StepOne La unidad de instalaci n predeterminada del software es la unidad C Notas 90 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa Este cap tulo cubre los siguientes temas El Resumen del cap tulo eu ara rana ara AR 92 E Secci n 5 1 Revisi n de los resultadoS oooooooooooooooo 93 E Secci n 5 2 Soluci n de problemas onnon nananana aaea 113
125. S 87 Nota Para obtener m s informaci n acerca de alguno de los temas que se explican en esta gu a acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Software pulsando F1 haciendo clic en en la barra de herramientas o seleccionando Help Ayuda StepOne Help Ayuda de StepOne Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 67 cuantificaci n relativa ma Cap tulo 4 Realizaci n del experimento de curva est ndar relativa l Resumen del cap tulo Resumen del cap tulo En este cap tulo se explica c mo realizar una reacci n en Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Flujo de trabajo A continuaci n se muestra el flujo de trabajo para realizar el experimento de ejemplo del experimento que se incluye en esta gu a de introducci n de ejemplo Inicio del experimento Y Dise o del experimento Cap tulo 2 Y Preparaci n del experimento Cap tulo 3 Y Realizaci n del experimento Cap tulo 4 Prepare el proceso Active las opciones de notificaci n Inicie el proceso Monitorice el proceso O A OO N Descargue el instrumento y transfiera los datos Y An lisis del experimento Cap tulo 5 v Fin del experimento Notas 68 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa
126. Transcription Kit Materiales e Para las muestras RNA total aislado de h gado y ri n necesarios e Para los est ndares RNA total aislado de pulm n Nota Procure preparar el molde para las muestras y los est ndares e Uno de los Applied Biosystems High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Kit N mero de referencia High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit 4368814 200 reacciones High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit 4368813 1000 reacciones High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit 4374966 with RNase Inhibitor 200 reacciones High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit 4374967 with RNase Inhibitor 1000 reacciones Nota El High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit se llamaba antiguamente High Capacity cDNA Archive Kit Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 51 cuantificaci n relativa Preparaci n del molde Preparaci n del molde Cap tulo 3 Preparaci n de las reacciones de la curva est ndar relativa Utilice el High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit para sintetizar cDNA de cadena sencilla a partir de las muestras de RNA total Siga los procedimientos de Applied Biosystems High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol para 1 2 3 Preparar la mezcla maestra de la reacci n WET PELIGRO QU MICO El tamp n de reacci n 10X puede causar irritaci n de los ojos la piel y las v as respiratorias Consulte la
127. Up Reaction Setup gt Reaction Mix Calculations Reaction Setup Help For each target assay in the reaction plate selectthe assay type if using TaqMan reagents then review the calculated volumes for preparing the standard dilution a Instructions series samples and PCR reactions If needed edit the reaction volume excess reaction volume component concentrations and or stock concentrations Click Print Reaction Setup to printinstructions on how to prepare the PCR reactions Reaction Mix Calculations Sample Dilution Calculations Diluted Sample Concentration 10x for Reaction Mix 5 0 ngiu vv Print Reaction Setup 1 2 En el cuadro de di logo seleccione e Detailed Reaction Setup Instructions Instrucciones detalladas de la configuraci n de la reacci n e Include Plate Layout Incluir disposici n de la placa e Use sample color Utilizar color de muestra Notas 40 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa O Revisi n de la configuraci n de la reacci n A 3 Haga clic en Print Imprimir Print Reaction Setup Instructions iy Selectthe type ofinstructions to print O Summary Reaction Setup Instructions o Include Plate Layout Plate Layout Print Opti LI E Use sample color O Use task color rs pe E Preview Print
128. a TaqMan que se utiliza para detectar el gen diana Seleccione JOE si el fluorocromo JOE est unido al extremo de 5 de la sonda TaqMan que se utiliza para detectar el gen diana Seleccione VIC si el fluorocromo VIC est unido al extremo de 5 de la sonda TaqMan que se utiliza para detectar el gen diana Seleccione SYBR si utiliza fluorocromo SYBR Green para detectar DNA de doble cadena e Seleccione el apantallador utilizado en el ensayo diana Seleccione NFQ MGB si en el extremo 3 de a sonda TaqMan que est utilizando para detectar el gen diana hay unido un apantallador no fluorescente de uni n al surco menor de la doble cadena de DNA Seleccione None Ninguno si se utiliza el fluorocromo SYBR Green IMPORTANTE Applied Biosystems no recomienda el uso de fluorocromo TAMRA como notificador o apantallador en el sistema StepOne Para obtener m s Para obtener m s informaci n acerca de informaci n e La pantalla Targets Dianas acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en 3 o pulsando F1 e La selecci n de un control end geno consulte la nota de aplicaci n Using TagMan Endogenous Control Assays to Select an Endogenous Control for Experimental Studies Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 27 cuantificaci n relativa O Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa l Con
129. a si desea utilizar el flujo de trabajo Advanced Setup Configuraci n avanzada para modificar la disposici n de la placa Haga clic en Create Another Experiment Using the Design Wizard Crear otro experimento con el asistente de dise o si desea guardar y cerrar el experimento y a continuaci n crear otro experimento con el asistente de dise o Haga clic en Return to the Wizard Regresar al asistente si desea regresar al experimento para realizar cambios con el asistente de dise o De manera predeterminada los experimentos se guardan en la carpeta Applied Biosystems StepOne Systemlexperiments Para cambiar La ubicaci n en la que se guarda un experimento espec fico despl cese a la ubicaci n deseada con el cuadro de di logo Save Experiment Guardar experimento La ubicaci n en la que se guardan los experimentos de manera predeterminada seleccione Tools Herramientas Preferences Preferencias y a continuaci n seleccione la ficha General predeterminada En el campo Default Data Folder Carpeta de datos predeterminada despl cese a la ubicaci n deseada Para obtener m s informaci n acerca del uso del flujo de trabajo Advanced Setup Configuraci n avanzada consulte Flujo de trabajo Advanced Setup Configuraci n avanzada en la p gina 206 154 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 7 Preparac
130. a clic en List Topics Ver temas d Haga doble clic en Determine PCR Efficiency Determinar la eficiencia de la PCR e Si utiliza el m todo de cuantificaci n de curva est ndar relativa consulte los cap tulos 2 5 de esta gu a e El uso del m todo de cuantificaci n de curva est ndar consulte la Gu a de introducci n a StepOne Real Time PCR System para experimentos de curva est ndar e Los reactivos TaqMan y SYBR Green consulte la Gu a de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System e La PCR incluida la PCR en singleplex y en multiplex y la RT PCR de y de 2 pasos consulte la Gu a de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Notas 134 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 6 Dise o del experimento de Cy comparativos R Configuraci n de los genes diana v Configuraci n de los genes diana Acerca del experimento de ejemplo Pantalla Targets Dianas Notas En la pantalla Targets Dianas escriba el n mero de genes diana que desea cuantificar en la placa de reacci n de PCR y a continuaci n configure el ensayo para cada gen diana En el experimento de Cr comparativos de ejemplo 3 Se cuantifican dos dianas en la placa de reacci n El ensayo Target 1 Diana 1 est configurado para el gen diana que se est estudiando En el experimento de ejemplo
131. a clic en Next Siguiente gt Directrices de Cuando dise e su propio experimento de Cr comparativos dise o e Si utiliza reactivos TaqMan seleccione el tipo de ensayo que va a utilizar Notas Seleccione Inventoried Made to Order En inventario Fabricado bajo pedido si utiliza Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays en inventario o fabricados bajo pedido o Applied Biosystems Custom TaqMan Gene Expression Assays Seleccione Custom Personalizado si va a dise ar sus propios ensayos con el software Primer Express Escriba un n mero entre 10 y 30 para el volumen de reacci n pocillo El sistema StepOne admite vol menes de reacci n de entre 10 y 30 uL Incluya el volumen de reacci n en exceso para contabilizar la p rdida que se produce durante el pipeteo Applied Biosystems recomienda un volumen de reacci n en exceso de al menos el 10 Revise las concentraciones de la mezcla de reacci n para cada gen diana Si es necesario Para los reactivos TaqMan modifique las concentraciones de la mezcla maestra y el ensayo Para los reactivos SYBR Green modifique las concentraciones de la mezcla maestra el cebador directo y el cebador reverso Para la RT PCR de 1 paso modifique la concentraci n de retrotranscripci n Revise los componentes de la mezcla de reacci n para cada gen diana Si va a trabajar de modo r pido aseg rese de utilizar una mezcla maestra r pida en las reacc
132. a de amplificaci n En el experimento de 6a Amplification Plot Plot Settings Cr vs pocillo ejemplo no hay ning n valor at pico para GAPDH PlotType Ctvs Well Graph Type Linsar Color Plot By Well o 2 4 ES Amplification Plot 6 8 10 12 14 16 18 20 Well Number Legend A c o A e E Repita los pasos 2 a 6 para los pocillos de TP53 En el experimento de ejemplo no hay ning n valor at pico para TP53 Directrices de Cuando analice su propio experimento de C comparativos busque an lisis e Los valores de l nea basal y umbral correctos el software StepOne calcula autom ticamente los valores de l nea basal y umbral dando por hecho que los datos tienen una gr fica de amplificaci n t pica Una gr fica de amplificaci n t pica tiene a b Notas Una fase de meseta o plateau Una fase lineal Una fase exponencial geom trica Un determinado ruido de fondo Una l nea basal Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa 189 Fon Cap tulo 9 An lisis del experimento de C comparativos m Revisi n de la gr fica de amplificaci n IMPORTANTE Los errores en el experimento por ejemplo errores de contaminaci n o pipeteo pueden producir curvas de amplificaci n at picas que pueden derivar a c lculos incorrectos de los v
133. a de cDNA de una muestra de concentraci n conocida preparada a partir de RNA aislado de pulm n 10 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 1 Introducci n 4 Acerca del experimento de ejemplo El experimento est dise ado para una PCR en singleplex donde los ensayos de gen diana c myc y control end geno GAPDH se amplifican en diferentes pocillos Las reacciones est n preparadas para una RT PCR de 2 pasos Se utiliza High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit para la retrotranscripci n y TaqMan Fast Universal PCR Master Mix para la PCR Se seleccionan ensayos de la l nea de productos Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays Para el ensayo diana c myc el identificador del ensayo es Hs00153408_m1 RefSeq NM_002467 3 Para el ensayo de control end geno GAPDH el identificador del ensayo es Hs99999905_ml1 RefSeq NM_002046 2 Disposici n de la placa de reacci n A continuaci n se muestra la disposici n de la placa de reacci n del experimento de curva est ndar relativa de ejemplo EA I E o 3 3 E Q 3 E o 3 1 c myc 1 caron 1 caron 1 caron 1 c myc 1 c myc 1 c myc 1 caron 1 caron 1 caron g c myc g c myc g c myc g c myc g c myc g c myc g c myc g c myc 2 2 2 0 2 0 2 0 2 0 02 0 02 H c myo E caro S caron E caron H caron E caron H caron E ca
134. a gu a de introducci n Experimento de curva est ndar relativa Inicio del experimento Dise o del experimento Cap tulo 2 Y Preparaci n de las reacciones Cap tulo 3 Y Realizaci n del experimento Cap tulo 4 Y An lisis del experimento Cap tulo 5 Secci n 1 Revisi n de los resultados 1 Analice 2 Revise la pantalla Standard Curve Curva est ndar 3 Revise la pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n 4 Revise la pantalla Gene Expression Plot Gr fica de expresi n g nica o la tabla de pocillos 5 Presente los datos Secci n 2 Soluci n de problemas 1 Revise las opciones de an lisis ajuste la l nea basal y el umbral Revise la pantalla QC Summary Resumen QU Omita pocillos Revise la pantalla Multicomponent Plot Gr fica multicomponente O A O N Revise la pantalla Raw Data Plot Gr fica de datos brutos Fin del experimento 92 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa Secci n 5 1 Revisi n de los resultados Secci n 5 1 Revisi n de los resultados Esta secci n cubre los siguientes temas E Analisis del experimento sic narrada AAA 94 E Visualizaci n de la curva est ndar 100 E Revisi n de la gr fica de amplificaci n eu ee ee
135. a industriales cient ficos y m dicos ISM XXI Pr logo Est ndares de seguridad y compatibilidad electromagn tica EMC XXIV Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 1 Introducci n Este cap tulo cubre los siguientes temas E Acerca del sistema StepOne ei ee ee 2 E Acerca de los experimentos de cuantificaci n relatiVa o o 4 E Como utilizar eSa UA AA AA ARA ARAS RA 9 E Acerca del experimento de ejemplo ee ee ee ee ee 10 E Flujo de trabajo del experimento de ejemplo ooooooooooomoo o 12 Nota Para obtener m s informaci n acerca de alguno de los temas que se explican en esta gu a acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Software pulsando F1 haciendo clic en 4 en la barra de herramientas o seleccionando Help Ayuda StepOne Help Ayuda de StepOne Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 1 cuantificaci n relativa 4 Cap tulo 1 Introducci n Acerca del sistema SteoOne Acerca del sistema StepOne Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System sistema StepOne utiliza reactivos de reacci n en cadena de polimerasa PCR basados en fluorescencias para proporcionar e Detecci n cuantitativa de las secuencias de cidos nucl icos de inter s dianas mediante an
136. a muestra o est ndar se limita al 10 del volumen total de la reacci n 2F Set Up Reaction Setup gt Reaction Mix Calculations Reaction Setup Help For each target assay in the reaction p ate select the assay type if using aqMan reagents then review the call ulated volumes for preparing the standard dilution series samples and PCR E Instructions reactions If needed edit the reaction volume excess reaction volume cornponent concentrations and or stock concentrations Click Print Reaction Setup to print instructions on how to prepare the PCR reactions 1 Reaction Mix Calculations Sarnple Dilution Calculations o anl Assay Type Inventoried Made to Order Y Reaction Volume Per Well 20 uL Excess Reaction Volume 10 Print Reaction Setup GAPDH RT ES 2 EN 6 Master Mix Concentration 2 0 x Assay Mix Concentration 20 0 x Component Volume uL For 1 Reaction 6c Standard Dilution Series for c myc Standard Concentration in Stock 100 0 ng v per uL Dilution Point Source Source Volume uL Diluent Volume uL Total Volume uL Standard Concentration 1 100 0 Stock 50 0 En el panel Standard Dilution Series for c myc Diluci n seriada est ndar para c myc a Haga clic en el campo Standard Concentration in Stock Concentraci n del est ndar en la soluci n
137. a pantalla Run Method Protocolo de termociclado Consulte Acerca de la pantalla Run Method Protocolo de termociclado en la p gina 81 E Activar desactivar las Active o desactive la opci n Enable Notifications Activar opciones de notificaciones notificaci n Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 11 cuantificaci n relativa LA Cap tulo 4 Realizaci n del experimento de curva est ndar relativa Monitorizaci n de la reacci n E StepOne v1 0 File Edit Instrument Analysis Tools Help New Experiment Open lA Save ES Close 3 LS Export Print Report Experiment Menu f Experiment A l Satun STOP RUN Estimated Time Remaining 56 min 22 sec Run Status 1 1 B 1 Amplification Plot D Run Method Notification Settings Temperature Plot Current Temperatures Sample Cover Block Temperature Plot View Temperature Analysis E sample 08 E MM Cover 0 7 H Block 067 057 Temperature Temperature Plot 0 4 View Jal 0 3 Fixed View 0 23 0 17 0 0 r r U r r r r r v r r r r x x r r r x x 1 00 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 Time A Home Relative Stan ve Example eds x Acerca de la pantalla Amplification Plo
138. a placa es incorrecta haga clic en Return to the Wizard Volver al asistente y compruebe los valores que ha introducido 2 Haga clic en Save Experiment Guardar experimento Notas 152 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 6 Dise o del experimento de Cy comparativos NN Finalizaci n del flujo de trabajo del asistente de dise o o Review Plate Layout for Experiment Comparative CT Example E E Review the plate layout then select what you wantto do next s A 3 2 Create Another Experiment 2 Save Experiment Start Run for This Experiment Edit Plate Layout Lising tf Design Wizard Return to the Wizard Save and close this Save this experiment then Use advanced setup to edit Save and close this Continue designing this experiment start the run Make sure the the plate layout experiment then create experiment using the design reaction plate is loaded into another experiment using the wizard the instrument design wizard Liver Liver Liver Liver Kidney Kidney Kidney Kidney 1 resa 1 caro 1 caro 1 caro i rrsa 1 resa i resa 1 caron Kidney Kidney Brain Brain Brain Brain Brain Brain 4 C M caron 1 caron M tesa M rrsa M resa 1 caron E caron 1 caron 3 En el cuadro de di logo Save Experiment Guardar experimento haga clic en Save
139. acci n Lo Para obtener m s Para obtener m s informaci n acerca de informaci n e La preparaci n de la placa de reacci n consulte el protocolo apropiado para los reactivos que est utilizando en las reacciones de PCR TaqMan Gene Expression Assays Protocol Custom TagMan Gene Expression Assays Protocol e Los consumibles consulte Consumibles admitidos en la p gina 3 e El uso del flujo de trabajo Advanced Setup Configuraci n avanzada para cambiar la disposici n de la placa consulte Flujo de trabajo Advanced Setup Configuraci n avanzada en la p gina 206 Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 65 cuantificaci n relativa a Cap tulo 3 Preparaci n de las reacciones de la curva est ndar relativa Preparaci n de la placa de reacci n Notas 66 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 4 Realizaci n del experimento de curva est ndar relativa Este cap tulo cubre los siguientes temas E Resumen del cap tulo sanar rana AR ARAS 68 E Peporncon OS orent ro revistan EA Aaa DA 69 E Opcional Activaci n de las notifiCaciOnesS ooooooooooooorrrnro 71 EN Inicio de la reacci n rra ror er AAA 73 E Monitorizaci n de la fedtcIi n pu assi ha estea ana 76 E Descarga de la placa de reacci n y transferencia de dato
140. aci n de la soluci n de partida Para obtener m s informaci n acerca de La pantalla Reaction Setup Configuraci n de reacci n acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1 Los ensayos de Applied Biosystems se refieren a TaqMan Gene Expression Assays Protocol Custom TagMan Gene Expression Assays Protocol 42 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa Solicitud de materiales para el experimento Solicitud de materiales para el experimento En la pantalla Materials List Lista de materiales revise la lista de materiales que se recomiendan para preparar para la placa de reacci n de PCR Opcionalmente puede solicitar los materiales recomendados a la tienda en l nea de Applied Biosystems Cree una cesta de la compra a ada productos a la cesta de compra y a continuaci n inicie la sesi n para enviar su pedido Para acceder a la tienda en l nea de Applied Biosystems debe tener una conexi n a Internet ilimitada Nota El software StepOne recomienda los materiales que debe solicitar de acuerdo con el dise o del experimento Se da por hecho que se va a dise ar el experimento solicitar los materiales y luego preparar Cap tulo 3 y procesar Cap tulo 4 la placa de reacci n cuando reciba los materiales Acerca del En el exper
141. activos TaqMan est ndar e Seleccione el molde para la PCR apropiado Seleccione cDNA complementary DNA cDNA DNA complementario si va a realizar una RT PCR de 2 pasos y ya ha realizado la retrotranscripci n para convertir el RNA en cDNA Se a ade DNA complementario a las reacciones de PCR Seleccione RNA si va a realizar una RT PCR de 1 paso Se a ade el RNA o mRNA total a las reacciones de PCR Seleccione gDNA genomic DNA gDNA DNA gen mico si ya ha extra do el gDNA de un tejido o una muestra Se a ade DNA gen mico purificado a las reacciones de PCR Para obtener m s informaci n acerca de e La pantalla Methods amp Materials M todos y materiales acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en 3 o pulsando F1 El uso del m todo de cuantificaci n de Cr comparativos consulte los cap tulos 6 9 de esta gu a El uso del m todo de cuantificaci n de curva est ndar consulte la Gu a de introducci n a StepOne Real Time PCR System para experimentos de curva est ndar Los reactivos TaqMan y SYBR Green consulte la Gu a de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System 24 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa O Configuraci n de los genes diana a La PCR incluida la PCR en singleplex y en multiplex
142. adiaciones para la salud y la seguridad de 1968 de la FDA de la forma que sea aplicable Este instrumento ha sido probado y cumple la edici n 3 del est ndar ICES 001 Generadores de frecuencias de radio industriales cient ficas y m dicas Seguridad Este instrumento cumple los requisitos de seguridad europeos Directiva de baja tensi n 73 23 EEC Este instrumento ha sido probado y cumple los est ndares EN 61010 1 2001 Requisitos de seguridad de equipos el ctricos para la medici n el control y el uso en laboratorios Primera parte Requisitos Generales EN 61010 2 010 Requisitos particulares de equipos de laboratorio para el calentamiento de materiales EN 61010 2 081 Requisitos particulares para equipos de laboratorio autom ticos y semiautom ticos para an lisis y otras finalidades EN 60825 1 Seguridad frente a las radiaciones de los productos l ser clasificaci n de los equipos requisitos y gu a del usuario EMC Este instrumento cumple los requisitos de emisiones e inmunidad europeos Directiva EMC 89 336 EEC Este instrumento ha sido probado y cumple los est ndares EN 61326 Grupo 1 Clase B Equipos el ctricos para la medici n el control y el uso en laboratorios requisitos EMC Este instrumento ha sido probado y cumple el est ndar AS NZS 2064 Medici n de l mites y m todos de caracter sticas de perturbaciones electromagn ticas de equipos de radiofrecuenci
143. alores de l nea basal y umbral por parte del software StepOne Por lo tanto Applied Biosystems recomienda examinar la pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n y revisar los valores de l nea basal y umbral asignados a cada pocillo despu s del an lisis e Valores at picos S1 el experimento no cumple las directrices anteriores solucione los problemas de la siguiente forma e Ajuste manualmente la l nea basal y o el umbral consulte Revisi n de las opciones de an lisis en la p gina 194 O e Omita pocillos consulte Omisi n de pocillos para el an lisis en la p gina 197 Para obtener m s Para obtener m s informaci n acerca de la pantalla Amplification Plot Gr fica de informaci n amplificaci n acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1 Notas 190 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 9 An lisis del experimento de C comparativos Fon b Presentaci n de los datos Presentaci n de los datos Hay distintas formas de presentar los datos del experimento e Guardando la gr fica como un archivo de imagen e Imprimiendo la gr fica e Imprimiendo la disposici n de la placa e Creando diapositivas e Imprimiendo un informe e Exportando datos Para obtener m s informaci n acerca de estos procedimientos acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en y o
144. ams Todos los ejemplo programas Applied Biosystems StepOne StepOne v2 0 2 En la pantalla Home Inicio haga clic en Open Abrir 3 En el cuadro de di logo Open Abrir despl cese hasta la carpeta examples ejemplos 4 Haga doble clic en Relative Standard Curve Example Ejemplo de curva est ndar relativa para abrir el archivo de datos del experimento de ejemplo Notas 94 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa ms An lisis del experimento Es StepOne v1 0 File Edit Instrument Analysis Tools Help AA pa 2 E Naw Evnarimant CS Open W Save IM Close ea Send Experiment to Instrument ES Download Experiment from Instrument 4P A Fin Report Set Up Run Analyze Open E A examples J aaa 4 NS rE e Comparative CT Example 4 Relative Standard Curve Example My Recent Documents Standard Curve Example File name Relative Standard Curve Example eds My Network f Places Files oftype All SDS Files eds edt sds Save current display as the default www appliedbiosystems com t Home 5 Haga clic en Analyze Analizar El software analiza los datos utilizando las opciones de an lisis predeterminadas E StepOne v1 0 File Edit Instrument Analysis Tools Help E
145. and PCR reactions If needed edit the reaction volume excess reaction volume component concentrations and or stock concentrations Click Print Reaction Setup to print instructions on howto prepare the PCR reactions Reaction Mix Calculations Sarnple Dilution Calculations Select Tar Assay Type Inventoried Made to Order v Reaction Volume Per Well 20 uL Excess Reaction Volume 10 96 Print Reaction Setup c myc Cn ME lA Standard Dilution Series for GAPDH a E E 7b Standard Concentration in Stock ng Y peruL Dilution Point Source Source Volume uL Diluent Volume uL Total Volume uL Standard Concentratio 1 200 Stock 100 0 TC 5 0 02 Complete la ficha Sample Dilution Calculations C lculos de la diluci n de muestra 1 Seleccione la ficha Sample Mix Calculations C lculos de la mezcla de muestra 2 Haga clic en el campo Diluted Sample Concentration 10X for Reaction Mix Concentraci n de muestra diluida 10X por mezcla de reacci n y a continuaci n escriba 5 0 3 En el men desplegable de la unidad seleccione ng uL predeterminado Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 39 cuantificaci n relativa O Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa Revisi n de la configuraci n de la reacci n 4 Revise los vol menes calculados para las d
146. anzada para modificar la disposici n de la placa Haga clic en Create Another Experiment Using the Design Wizard Crear otro experimento con el asistente de dise o si desea guardar y cerrar el experimento y a continuaci n crear otro experimento con el asistente de dise o Haga clic en Return to the Wizard Regresar al asistente si desea regresar al experimento para realizar cambios con el asistente de dise o De manera predeterminada los experimentos se guardan en la carpeta Applied Biosystems StepOne Systemlexperiments Para cambiar La ubicaci n en la que se guarda un experimento espec fico despl cese a la ubicaci n deseada con el cuadro de di logo Save Experiment Guardar experimento La ubicaci n en la que se guardan los experimentos de manera predeterminada seleccione Tools Herramientas Preferences Preferencias y a continuaci n seleccione la ficha General predeterminada En el campo Default Data Folder Carpeta de datos predeterminada despl cese a la ubicaci n deseada Para obtener m s informaci n acerca del uso del flujo de trabajo Advanced Setup Configuraci n avanzada consulte Flujo de trabajo Advanced Setup Configuraci n avanzada en la p gina 206 48 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 3 Preparaci n de las reacciones de la curva est ndar relativa Este cap tulo
147. ar E car Legend 2 0 2 0 2 0 2 0 02 0 02 0 02 T 26 95 Cr 26 94 Cr 30 41 Cr 30 36 CT 30 38 CT 33 71 CT 33 83 CT 33 77 M o IN Fan Wells E 12 Unknown E 30 Standard 6 Negative Control 0 Empty 7 Seleccione de uno en uno los pocillos de control negativo y compruebe la r r amplificaci n En el experimento de ejemplo no hay amplificaci n en los pocillos de control negativo Multicomponent Plot lt View Plate Layout View Well Table Plot Settings Select Wells With Selectltem w Selectitem Plot Color Dye v how in Wells v E View Legend ig EZ Multicomponent Plot O O 37 500 E c myc El c myc E c myc o GAPDH R GAPDI O GAPDH 8 E 8 e 35 000 CT Undei CT Undel Cr Undel CT Undel CT Undel CT Undel CT 27 CT 27 32 500 30 000 M om 1 sar 1 sar M sar 1 c myc i c myc 1 c myc 1 sar aa Jaaa 921 9 49 477 4787 483 9 26 Eo CT 28 CT 24 66 CT 24 65 CT 24 61 CT 28 CT 28 CT 28 CT 24 64 w g 22 500 M car O GAP H c myo H om H c myo Eon ene ene o 20 000 9 12 8 89 200 200 200 A 2 17 500 CTD CTE CT 23 Cra CTAZS A 26 E 20 E E Z 15 000 12 500 10 000 CANE GA CAS GAS CA TIA 7 500 T mn E sar E car E car EF GAP El GAP EZ GAP p GAP 2 500 E c myc 200 200 200 al S A E O doo odo doo 002 CT 20 02 CT 19 96 CT 19 98 cos os cios o 2 4 6 88 10 12 4 16 8 3 2 2 Gd DD Y L Y gt 3 W
148. ar un m todo de limpieza o descontaminaci n que no sea el que recomienda el fabricante consulte al fabricante para comprobar que el m todo propuesto no va a da ar el equipo Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Pr logo Seguridad qu mica Seguridad qu mica Advertencia de peligro qu mico Directrices de seguridad qu mica Acerca de las fichas t cnicas de seguridad de los A N INN A SA apv MEWN PELIGRO QU MICO Antes de manejar alg n producto qu mico consulte la ficha t cnica de seguridad de los materiales MSDS que suministra el fabricante y observe todas las precauciones relevantes y NIER E PELIGRO DE ALMACENAMIENTO QU MICO No recoja ni e nunca los residuos en un envase de cristal pues corre el riesgo de que se rompa o se resquebraje Las botellas de reactivos y de residuos pueden agrietarse y presentar fugas Cada botella de residuos deber asegurarse en un recipiente de seguridad de polietileno de baja densidad con la tapa fija y las asas bloqueadas en posici n vertical Utilice la protecci n ocular la vestimenta y los guantes adecuados cuando manipule botellas de reactivos o de residuos Para reducir al m nimo el peligro de los productos qu micos e Lea y comprenda las fichas t cnicas de seguridad de los materiales MSDS que proporciona el fabricante de los pro
149. ara que el software StepOne le avise por correo electr nico del momento en que el instrumento StepOne comienza y completa el proceso o si se produce alg n error en el proceso La activaci n de la funci n de e que oy TM es notificaci n es opcional y no afecta al rendimiento del sistema StepOne ni a la duraci n de la reacci n IMPORTANTE La funci n de notificaci n s lo est disponible si el ordenador donde desea recibir la notificaci n est controlando el instrumento StepOne y est conectado a una red Ethernet Nota El sistema de notificaci n tambi n est disponible en los ordenadores que monitorizan un instrumento StepOne de manera remota Para obtener m s informaci n acerca de la monitorizaci n remota consulte Monitorizaci n remota en la p gina 83 Acerca del En el experimento de ejemplo el software StepOne est configurado para enviar experimento de notificaciones a tres usuarios cient fico supervisor y t cnico de mycompany com ejemplo cuando el sistema StepOne termina el proceso y si encuentra alg n error durante la operaci n El servidor SMTP de ejemplo www mycompany com est configurado para el cifrado SSL Secure Sockets Layer y para utilizarlo se requiere autenticaci n Configuraci n de 1 Enel software StepOne haga clic en 4 Run Proceso en la columna de las opciones de navegaci n notificaci n 2 Haga clic en El Notification Settings Opciones de notificaci
150. araci n de la mezcla de reacci n consulte informaci n el protocolo apropiado para los reactivos que est utilizando en las reacciones de PCR TaqMan Gene Expression Assays Protocol Custom TaqMan Gene Expression Assays Protocol Notas 60 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 3 Preparaci n de las reacciones de la curva est ndar relativa Preparaci n de la placa de reacci n Preparaci n de la placa de reacci n Prepare las reacciones para cada grupo de r plicas y a continuaci n transfi ralas a la placa de reacci n Utilice la disposici n de la placa que se muestra en el software StepOne Acerca del Para el experimento de curva est ndar relativa de ejemplo experimento de e Se utiliza una MicroAmp Fast Optical 48 Well Reaction Plate ejemplo e La placa de reacci n contiene 12 pocillos desconocidos 30 pocillos est ndar H pocillos de control negativo O pocillos vac os El volumen de la reacci n es de 20 uL pocillo e Se utiliza la disposici n de la placa que genera autom ticamente el software StepOne A N c myc KR c myc Q c myc B I c myc 1 caron 1 caron Kidney Kidney c mye c saron 1 caron a D H c myo S c myc H c myo 2 2 2 m o E o 3 E caron E caroH 200 2 p El caron E caron E caron 2 2 0 Materiales e Tubos de microcentr f
151. arativos AAC para normalizar las se ales de fluorescencia del gen diana que se est cuantificando Tambi n se conoce como gen de mantenimiento En los experimentos de presencia ausencia un molde de DNA sint tico corto que se a ade a las reacciones de PCR Se puede utilizar el IPC para distinguir los falsos negativos en las reacciones afectadas por los apantalladores de PCR una configuraci n incorrecta del ensayo o un fallo del reactivo o del instrumento En los experimentos del sistema StepOne tarea asignada a los genes diana o los ensayos de SNP en los pocillos que contienen agua o tampones en lugar de un molde de las muestras En los pocillos de control negativo no se deber a producir ninguna amplificaci n del gen diana En los experimentos de genotipado la tarea del ensayo de SNP en pocillos que contienen una muestra con un genotipo conocido Abreviatura de ciclo umbral Threshold Cycle Opci n de an lisis en la que el software calcula de manera autom tica el umbral y la l nea basal de la gr fica de amplificaci n El software utiliza la l nea basal y el umbral para calcular el ciclo umbral C Cy manual Opci n de an lisis en la que se introduce el valor del umbral y se selecciona si se desean utilizar c lculos de l nea basal autom ticos o manuales El software utiliza el valor del umbral que se introduce y la l nea basal para calcular el ciclo umbral Cy Gu a de introducci n a Applied Biosystems Ste
152. are New Experiment Experimento nuevo Open Abrir Close Cerrar Send Experiment to Instrument Enviar experimento al instrumento Download Experiment from Instrument Descargar experimento del instrumento 3 Cabecera del experimento indica el nombre del experimento el tipo de experimento y los reactivos del experimento abierto 4 Panel de navegaci n ofrece enlaces a todas las pantallas del asistente de dise o Experiment Properties Propiedades del experimento Methods amp Materials M todos y materiales Targets Dianas Opciones de cuantificaci n relativa Standards Est ndares Samples Muestras Run Method Protocolo de termociclado Reaction Setup Configuraci n de la reacci n Materials List Lista de materiales Nota Inicialmente el asistente de dise o muestra el tipo de experimento Quantitation Standard Curve Cuantificaci n curva est ndar Las pantallas disponibles de este asistente pueden cambiar si se selecciona otro tipo de experimento Por ejemplo la pantalla Relative Quantitation Settings Opciones de cuantificaci n relativa no aparece hasta que se selecciona el tipo de experimento de curva est ndar o Cr comparativos AAC 18 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa Creaci n de un nuevo experimento 5 Fichas del expe
153. art Cycle AUTO Baseline End Cycle AUTO Edit Default Settings Select a Target Cr Settings for TP53 Target Threshold Baseline Start Baseline End Cr Settings to Use Use Default Settings TP53 AUTO AUTO AUTO GAPDH AUTO AUTO AUTO A Revert to Defaults for All Analysis Settings Apply Analysis Settings Cancel Notas 194 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 9 An lisis del experimento de C comparativos a Revisi n de las opciones de an lisis Directrices de A menos que ya haya determinado cu l son las opciones ptimas para el experimento an lisis utilice las opciones de an lisis predeterminadas en el software StepOne Si las opciones predeterminadas no son adecuadas para el experimento puede cambiar e Cy Settings Opciones de C utilice esta ficha para ajustar manualmente el umbral y la l nea basal Si ajusta manualmente el umbral y la l nea basal Applied Biosystems recomienda lo siguiente Opci n Recomendaci n Umbral Introduzca un valor para el umbral de manera que e Est por encima del ruido de fondo e Est por debajo de las fases de meseta o plateau y fase lineal de la curva de amplificaci n e Est dentro de la fase exponencial de la curva de amplificaci n L nea basal Seleccione los valores Start Cycle Ciclo inicial y End Cycle Ciclo final antes de que comience la am
154. at E Increased thermal contact for faster more uniform heating An anticalli claar adhasiva film usad ta saaltha samnlas inta tha Experiment Shopping List 3 items 2 Remove Selected items from Shopping List Shopping Basket Name Comparative CT Example StepOne Order Materials in List Print Shopping List C Check All Item Part Number Quantity MicroAmpT Fast Optical 48 Well Reaction 4375816 1 MicroAmpT Optical 48 Well Adhesive Film 4375928 bh 4 En el cuadro de di logo Order Materials Log In Solicitar materiales Inicio de sesi n escriba el nombre de usuario y la contrase a de la tienda en l nea de Applied Biosystems y a continuaci n haga clic en Login and Submit Iniciar la sesi n y enviar Nota Si no tiene cuenta en la tienda en l nea de Applied Biosystems haga clic en Register Now Registrarse ahora para crear una cuenta Order Materials Log In Log into the Applied Biosystems Store to place the selected items in your shopping basket If you do not have a user name and password click Register Now to create a new account OR Store Log In Register To log into the Applied Biosystems Store enter your user Ifyou do not have name and password then click Log In and Submit an Applied Biosystems UserName account click the link below to create a new 4 Password account Log In and Submit Cancel Regis
155. ave Close 3 Experiment Menu f Experiment Type Reagents O Run Status gt 00 Instrument Status JA Connected T Run Status Not Started O Enable Notifications Temperature Plot Current Temperatures Run Method i aN Sample Cover Block Notification Settings Temperature Plot View Temperature Analysis E sample I Cover E Brock Temperature Plot Temperature View All Fixed View 0 0 00 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 000 00 Time A Home Relative Stan ve Example eds x Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 73 cuantificaci n relativa sas Cap tulo 4 Realizaci n del experimento de curva est ndar relativa Inicio de la reacci n Inicio aut nomo Realice este procedimiento si el ordenador y el instrumento StepOne no est n directamente conectados por medio del cable amarillo del sistema StepOne 1 Si el ordenador y el instrumento StepOne est n conectados a la misma red realice los pasos la a 1f De lo contrario vaya al paso 2 1b tc 1d e f Enviar experimento al instrumento En el cuadro de di logo Send Experiment to Instrument Enviar experimento al instrumento haga clic en Browse
156. bolos de peligro Consulte s mbolos de peligro en instrumentos s mbolos de peligro Consulte s mbolos de seguridad en instrumentos s mbolos de seguridad en instrumentos xiii s mbolos seguridad xiii sistema de ayuda acceso ix sistema StepOne consumibles 3 distribuciones 73 76 88 filtros 123 204 reactivos 8 recopilaci n de datos 2 solicitar materiales 43 148 230 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa ndice soluci n de problemas ajustar l nea basal 115 195 ajustar umbral 115 195 marcadores 117 197 omitir pocillos 118 197 ver opciones de an lisis 114 194 ver pantalla Multicomponent Plot Gr fica multicomponente 120 200 ver pantalla QC Summary Resumen QC 116 196 ver pantalla Raw Data Plot Gr fica de datos brutos 122 203 supervisar proceso disposici n conectada 77 distribuci n aut noma 86 distribuci n aut noma remota 83 pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n 78 pantalla Run Method M todo de proceso 81 pantalla Temperature Plot Gr fica de temperatura 80 suposiciones de uso de esta gu a vil y tabla de pocillos 108 182 transferir datos 87 U umbral ajustar manualmente 115 195 valores correctos 107 189 usar esta gu a como tutorial 9 con sus propios experimentos 9 uso del instrumento seguridad xvi V valores at picos V ase omitir pocil
157. ca de reacci n incluidos e El nombre de la muestra el nombre de el gen diana la tarea y los fluorocromos e El ciclo umbral calculado Cr la fluorescencia normalizada Rn y los valores de cantidades e Avisos Acerca del En el experimento de curva est ndar relativa de ejemplo se revisa experimento de e Para cada gen diana de la pantalla Gene Expression Plot Gr fica de expresi n ejemplo g nica para el nivel de expresi n o cambio en n mero de veces de la expresi n de la muestra de gen diana en relaci n con la muestra de referencia e La tabla de pocillos para evaluar la precisi n de los grupos de r plicas Revisi n de la 1 En el panel Experiment Menu Men del experimento seleccione Analysis gr fica de An lisis Gene Expression Expresi n g nica expresi n g nica y la tabla de Nota Si en la pantalla Gene Expression Plot Gr fica de expresi n g nica no pocillos aparece ning n dato haga clic en Analyze Analizar 2 En la pantalla Gene Expression Plot Gr fica de expresi n g nica a En el men desplegable Plot Type Tipo de gr fica seleccione RQ vs Sample Cuantificaci n relativa vs Muestra b En el men desplegable Graph Type Tipo de gr fica seleccione Log10 C En el men desplegable Orientation Orientaci n seleccione Vertical Bars Barras verticales Notas 108 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de
158. caci n relativa Experimento de curva est ndar relativa Inicio del experimento Y Dise o del experimento Cap tulo 2 Cree un nuevo experimento Defina las propiedades del experimento Defina los m todos y los materiales Configure los genes diana Configure los est ndares Configure las muestras Configure la cuantificaci n relativa Configure el protocolo de termociclado 9 Revise la configuraci n de la reacci n 10 Solicite materiales para el experimento 11 Finalice el flujo de trabajo del asistente de dise o v 0 XOD0O0AO0NnN Preparaci n de las reacciones Cap tulo 3 Prepare el molde Prepare las diluciones de las muestras Prepare la diluci n seriada Prepare la mezcla de reacci n para cada ensayo diana Prepare la placa de reacci n OIR O IN v Realizaci n del experimento Cap tulo 4 Prepare la reacci n Active las opciones de notificaci n Inicie la reacci n Monitorice la reacci n Descargue el instrumento y transfiera los datos MANS b Cap tulo 1 Introducci n 4 Flujo de trabajo del experimento de ejemplo Experimento de Cr comparativos AACqT Inicio del experimento v Dise o del experimento Cap tulo 6 1 Cree un nuevo experimento 2 Defina las propiedades del experimento 3 Defina los m todos y los materiales 4 Configure los genes diana 5 Configure las muestras 6 Co
159. comparativos Preparaci n de las diluciones de las muestras 3 Realice la retrotranscripci n en un termociclador Directrices de Cuando prepare su propio experimento de Cr comparativos AAC preparaci n e Applied Biosystems recomienda extraer primero el DNA o RNA del tejido o muestra e Applied Biosystems recomienda los siguientes moldes cDNA cDNA complementario cDNA sintetizado a partir de las muestras de RNA total utilizando un High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit RNA RNA o mRNA total purificado extra do de un tejido o una muestra DNA gDNA gen mico gDNA purificado ya extra do de un tejido o una muestra Para obtener m s Para obtener m s informaci n acerca de informaci n e La preparaci n de moldes de cDNA consulte Applied Biosystems High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol PN 43753575 El protocolo no se incluye en los High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Puede descargarlo desde el sitio web Applied Biosystems Documents on Demand http docs appliedbiosystems com search taf e La preparaci n de moldes de RNA o g DNA consulte el protocolo de los reactivos de purificaci n que haya seleccionado Para localizar los reactivos de purificaci n de Applied Biosystems visite el sitio web de Applied Biosystems http www appliedbiosystems com Preparaci n de las diluciones de las muestras Realice diluciones de las muestras antes de a adir las muestras a la me
160. cubre los siguientes temas El Resumen del cap tulo sarria rar rana AR AR RA 50 aeee e E e e EEEE E AMAIA E E EEE ET si E Preparaci n de las diluciones de las muestras o ooooooooooooooo 53 E Preparaci n de la diluci n seriada e nananana aaa 55 El Preparaci n de la mezcla de reacci n carr A ee ee ee ee 58 E Proparaci n de la placa deo reaccion a r ari sa ARA AIRA AA AA 61 Nota Para obtener m s informaci n acerca de alguno de los temas que se explican en esta gu a acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Software pulsando F1 haciendo clic en 4 en la barra de herramientas o seleccionando Help Ayuda StepOne Help Ayuda de StepOne Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 49 cuantificaci n relativa NQ Cap tulo 3 Preparaci n de las reacciones de la curva est ndar relativa J Resumen del cap tulo Resumen del cap tulo En este cap tulo se explica c mo preparar las reacciones de PCR para el experimentode curva est ndar relativa de ejemplo y se ofrecen directrices para preparar las reacciones de PCR para su propio experimento de curva est ndar relativa Flujo de trabajo A continuaci n se muestra el flujo de trabajo para preparar las reacciones de PCR para el del experimento experimento de ejemplo que se incluye en esta gu a de introducci n de ejemplo Experimento de curva est ndar
161. curva est ndar relativa Prepare la mezcla de reacci n Prepare la placa de reacci n 208 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Ap ndice A Flujos de trabajo alternativos para el experimento A Flujo de trabajo de exportaci n importaci n y 4 Realice el experimento a Cargue el instrumento b Inicie el proceso c Descargue el instrumento 5 Analice los datos Flujo de trabajo de exportaci n importaci n Si crea un experimento de curva est ndar relativa o C comparativos con el flujo de trabajo de exportaci n importaci n puede configurar un experimento nuevo con los datos exportados desde otros experimentos 1 Haga doble clic en T acceso directo al software StepOne o seleccione Start Inicio All Programs Todos los programas Applied Biosystems StepOne StepOne v2 0 2 Abra un experimento existente o cree uno nuevo tal y como se describe en el Cap tulo 2 o el Cap tulo 6 3 Mientras el experimento est abierto exporte la informaci n de configuraci n a Seleccione File Archivo Export Exportar b En la ficha Export Properties Propiedades de exportaci n seleccione Setup Configuraci n c Seleccione One File Un archivo en el men desplegable d Seleccione E txt en el men desplegable File Type Tipo de archivo e Seleccione Open file s when export is complete Abr
162. d 2 9 0 3 c myc Std 3 9 0 4 c myc Std 4 9 0 5 c myc Std 5 9 0 3 Prepare la diluci n 1 en el tubo c myc Std 1 a Agite la soluci n de partida entre 3 y 5 segundos y a continuaci n centrifugue brevemente el tubo b Con una punta de pipeta nueva a ada 5 0 uL de soluci n de partida al tubo c myc Std 1 c Agite el tubo Std 1 entre 3 y 5 segundos y a continuaci n centrif guelo brevemente Prepare la diluci n 2 en el tubo c myc Std 2 a Con una punta de pipeta nueva a ada 1 0 uL de diluci n al tubo c myc Std 2 b Agite el tubo Std 2 entre 3 y 5 segundos y a continuaci n centrif guelo brevemente Prepare la diluci n 3 en el tubo c myc Std 3 a Con una punta de pipeta nueva a ada 1 0 uL de diluci n al tubo c myc Std 3 b Agite el tubo Std 3 entre 3 y 5 segundos y a continuaci n centrif guelo brevemente Prepare la diluci n 4 en el tubo c myc Std 4 a Con una punta de pipeta nueva a ada 1 0 uL de diluci n al tubo c myc Std 4 b Agite el tubo Std 4 entre 3 y 5 segundos y a continuaci n centrif guelo brevemente Prepare la diluci n 5 en el tubo c myc Std 5 a Con una punta de pipeta nueva a ada 1 0 uL de diluci n al tubo c myc Std 5 b Agite el tubo Std 5 entre 3 y 5 segundos y a continuaci n centrif guelo brevemente Coloque los est ndares en hielo hasta que prepare la placa de reacci n 56 Gu a de introducci n a App
163. d Experiment from Instrument Selectthe instrument with the experiment selecta location on this computer for the a experiment then click Download Experiment 1 Select Instrument Y Local Simulator Default Y Experiment New_Experiment Vo e 2 Download File To Applied Biosystems StepOne Systemlexperiments Browse 5 0 Download Experiment Cancel 6 Cuando se le solicite haga clic en OK Aceptar para cerrar el mensaje de confirmaci n 88 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 4 Realizaci n del experimento de curva est ndar relativa A Descarga de la placa de reacci n y transferencia de datos Download Complete o 1 Experiment successfully downloaded from Local Instrument 6 Transferencia de Si el ordenador no est conectado al instrumento StepOne utilice la unidad USB para datos aut noma transferir el experimento al instrumento 1 Si a n no est conectada al instrumento conecte una unidad USB al puerto USB 2 Toque la pantalla t ctil del instrumento StepOne para activarla y a continuaci n toque 0 3 En el men principal toque Collect Results Recoger resultados para guardar los datos en la unidad USB S1 el instrumento StepOne no encuentra la unidad USB toque OK Aceptar espere 30 segundos y a continuaci n vuelva a tocar Collect
164. d Submit Iniciar la sesi n y enviar Nota Si no tiene cuenta en la tienda en l nea de Applied Biosystems haga clic en Register Now Registrarse ahora para crear una cuenta Notas 44 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa Solicitud de materiales para el experimento Order Materials Log In Log into the Applied Biosystems Store to place the selected items in your shopping basket If you do not have a user name and password click Register Now to create a new account OR Store Log In Register To log into the Applied Biosystems Store enter your user Ifyou do not have name and password then click Log In and Submit an Applied Mali Biosystems User Name account click the i s link below to l create a new 4 Password account Log In and Submit Cancel Register Now C Remember my user name and password for future orders 5 Despu s de realizar el pedido haga clic en Finish Designing Experiment Finalizar el dise o del experimento Directrices de Cuando dise e su propio experimento de curva est ndar relativa dise o e Confirme que el ordenador tiene una conexi n a Internet ilimitada e Applied Biosystems recomienda las siguientes versiones de navegadores y Adobe Acrobat Reader para utilizar el sitio web
165. da del alelo 1 que se ha trazado a partir de la se al del notificador normalizada procedente de la sonda del alelo 2 Visualizaci n de temperaturas de la muestra la cubierta del instrumento y el bloque de instrumento durante el proceso del instrumento Visualizaci n de los datos recogidos durante la fase c clica de la PCR a tiempo real La gr fica multicomponente muestra la fluorescencia de todos los ciclos de la reacci n Conjunto de reacciones id nticas de un experimento Valor o c digo asignado por Applied Biosystems a los TaqMan Gene Expression Assays y los TaqMan SNP Genotyping Assays N mero que identifica el identificador de agrupamiento de SNP refSNP de referencia Lo genera dbSNP Single Nucleotide Polymorphism Database of Nucleotide Sequence Variation o Base de datos de polimorfismos nucle tidos nicos de variaci n de secuencia nucle tida Se puede utilizar para buscar en el almac n de Applied Biosystems un Applied Biosystems SNP Genotyping Assay Tambi n se denomina n mero rs Reactivo a adido a las reacciones de PCR para bloquear la amplificaci n del control positivo interno IPC Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 219 cuantificaci n relativa Glosario intersecci n y IPC IPC bloqueado IPC lectura a punto final lectura previa a la PCR l nea basal l nea basal autom tica l nea basal manual l nea de regresi
166. das del software StepOne no son adecuadas para el experimento puede cambiarlas en el cuadro de di logo Analysis Settings Opciones de an lisis y a continuaci n volver a analizar el experimento Acerca del En el experimento de C comparativos de ejemplo se utilizan las opciones de an lisis experimento de predeterminadas sin ning n cambio ejemplo Revisi n de las 1 En el panel Experiment Menu Men del experimento seleccione Analysis opciones de An lisis an lisis 2 Haga clic en Analysis Settings Opciones de an lisis para abrir el cuadro de di logo Analysis Settings Opciones de an lisis 3 En el experimento de ejemplo se utilizan opciones de an lisis para cada ficha e Cr Settings Opciones de Cr e Flag Settings Opciones de avisos e Opciones de cuantificaci n relativa e Advanced Settings Opciones avanzadas Ls Analysis Settings for Comparative CT Example Flag Settings Relative Quantitation Settings Advanced Settings T Review the default settings for analysis of targets in this experiment To editthe default settings click Edit Default Settings To use different settings for a target select the target from the table deselectthe Use Default Settings checkbox then change the settings that are displayed Default Ct Settings Default CT settings are used to calculate the CT for targets without custom settings To editthe default settings click Edit Default Settings Threshold AUTO Baseline St
167. dbiosystems com 52 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 3 Preparaci n de las reacciones de la curva est ndar relativa ur Preparaci n de las diluciones de las muestras Preparaci n de las diluciones de las muestras Acerca del experimento de ejemplo Materiales necesarios Realice diluciones de las muestras antes de a adir las muestras a la mezcla de reacci n final Diluya las muestras con los vol menes que ha calculado el software StepOne Complete la ficha Sample Dilution Calculations C lculos de la diluci n de muestra en la p gina 39 Para el experimento de curva est ndar relativa de ejemplo Las diluciones de las muestras son necesarias porque el volumen de las muestras se limita al 10 del volumen total de la reacci n en el software StepOne El volumen total de la reacci n es de 20 uL reacci n por lo que el volumen de las muestras es de 2 uL reacci n La concentraci n de la soluci n de partida es de 100 ng uL Despu s de diluir la muestra de acuerdo con la tabla Sample Dilutions Calculations C lculos de diluciones de las muestras la muestra tendr una concentraci n de 5 0 ng uL Esto supone una concentraci n de 10X cuando se a aden 2 uL al volumen de mezcla de reacci n final de 20 uL Hay una concentraci n de 1X en la reacci n final Los vol menes calculados en el software son
168. de ajustar manualmente v ase Cr manual V ase ciclo umbral C Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa valor at pico valor R velocidad de la rampa Glosario Para un conjunto de datos un punto de dato que es significativamente m s peque o o grande que los dem s Coeficiente de regresi n calculado a partir de la l nea de regresi n de la curva est ndar El valor R indica la proximidad del ajuste entre la l nea de regresi n de la curva est ndar y los puntos de datos Cr individuales de las reacciones est ndar El valor 1 00 indica un ajuste perfecto entre la l nea de regresi n y los puntos de datos Velocidad a la que se produce la rampa de temperatura durante el proceso del instrumento Las velocidades de rampa disponibles son r pida y est ndar Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 225 cuantificaci n relativa Glosario 226 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa A ADVERTENCIA descripci n xi analizar experimento analizar 94 176 directrices 95 102 107 110 115 118 119 122 123 177 184 189 195 197 199 202 204 flujo de trabajo 92 174 omitir pocillos 118 197 para obtener m s informaci n 103 108 110 115 118 120 122 123 184 190 195 197 200
169. de ciclo La gr fica sirve para identificar y examinar las amplificaciones irregulares e Cy vs Well C vs pocillo el ciclo umbral Cr es el n mero de ciclo de PCR en el cual el nivel de fluorescencia corta el umbral En esta gr fica Cr se representa en funci n de la posici n del pocillo La gr fica sirve para localizar amplificaciones con valores at picos Cada gr fica se puede ver de las siguientes formas lineal o log10 Acerca del En el experimento de curva est ndar relativa de ejemplo hay que revisar cada gen diana experimento de en la pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n para buscar ejemplo e Valores de umbral y l nea basal correctos e Valores at picos Revisi n de la 1 Enel panel Experiment Menu Men del experimento seleccione Analysis gr fica de An lisis gt 4 Amplification Plot Gr fica de amplificaci n amplificaci n Nota Si en la pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n no aparece ning n dato haga clic en Analyze Analizar 2 Observe los pocillos de GAPDH en la pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 103 cuantificaci n relativa m Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa Revisi n de la gr fica de amplificaci n a Haga clic en la ficha View Plate Layout Ver disposici n de placa
170. de desplazamiento situada a la derecha para ver todos los elementos Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 43 cuantificaci n relativa re Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa A Solicitud de materiales para el experimento b Active la casilla de verificaci n junto a cada uno de los siguientes elementos e MicroAmp Fast Optical 48 Well Reaction Plate e MicroAmp Optical 48 Well Adhesive Film e TaqMan Fast Universal PCR Master Mix 2X No AmpErase UNG e Ensayo de c myc Hs00153408_m1 RefSeq NM_002467 3 e Ensayo de GAPDH Hs99999905_ml1l RefSeq NM_002046 2 Nota Para obtener m s informaci n acerca de un elemento espec fico haga clic en el v nculo del n mero de referencia para conectarse a la tienda en l nea de Applied Biosystems En la p gina de inicio escriba el n mero de referencia en el campo Search B squeda y a continuaci n haga clic en Go Ir c Haga clic en Add Selected Items to Shopping List A adir elementos seleccionados a la cesta de compra 3 Compruebe si la cesta de compra del experimento contiene los materiales deseados y que las cantidades son correctas y a continuaci n haga clic en Order Materials in List Solicitar materiales de la lista 3A Optional Order Materials List Materials List Help 1 Review the list of materials recommended to prepare the PCR reaction plate To create
171. de la curva est ndar Una pendiente pr xima al 3 3 indica una eficiencia de amplificaci n de la PCR ptima es decir del 100 Factores que afectan a la eficiencia de la amplificaci n Rango de cantidades est ndar para obtener medidas de la eficiencia m s exactas utilice un amplio rango de cantidades est ndar de 5 a 6 rdenes de magnitud N mero de r plicas est ndar para obtener mediciones m s precisas de la eficiencia incluya r plicas para reducir los efectos de las imprecisiones del pipeteo Apantalladores de la PCR los apantalladores de la PCR de la reacci n pueden reducir la eficiencia de la amplificaci n e Valores R coeficiente de correlaci n el valor R mide cu nto se ajusta la l nea de regresi n a los puntos de Cr del est ndar El valor 1 00 indica un ajuste perfecto entre la l nea de regresi n y los puntos de datos Es deseable que el valor R sea 20 99 e Valores Cr el ciclo umbral C es el n mero de ciclo de PCR en el que la curva de amplificaci n corta el umbral Es deseable que el valor Cr sea gt 8 y lt 35 Si el valor Cr es lt 8 eso indica que en la reacci n hay demasiado molde Si el valor Cr es gt 35 eso indica que en la reacci n hay poca cantidad de molde Cuando los valores C son gt 35 es de esperar que haya una desviaci n est ndar mayor Notas 102 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n re
172. de los experimentos de PCR a tiempo real las informaci n opciones de PCR y los reactivos consulte la Gu a de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System C mo utilizar esta gu a Esta gu a sirve a la vez de tutorial y de gu a para realizar sus propios experimentos Uso de esta gu a Si emplea los datos de los experimentos de ejemplo que se incluyen con el software como tutorial StepOne esta gu a le puede servir de tutorial para realizar un experimento de curva est ndar relativa o Cy comparativos en el sistema StepOne Siga los procedimientos que se indican en los cap tulos correspondientes Cap tulo Procedimiento Curva est ndar Cr relativa comparativos 2 6 Dise e el experimento con el asistente de dise o del software StepOne 3 T Prepare el experimento con los reactivos y los vol menes que ha calculado el asistente de dise o en el cap tulo 2 experimento de curva est ndar relativa o en el cap tulo 6 experimento de Cy comparativos 4 8 Realice el experimento en el instrumento StepOne disposici n aut noma o conectada 5 9 Analice los resultados Para obtener m s informaci n consulte Acerca del experimento de ejemplo en la p gina 10 Uso de esta gu a Despu s de realizar los ejercicios del tutorial de los cap tulos 2 a 9 esta gu a le puede con sus propios servir para guiarle por el flujo de trabajo del asistente de dise o para realizar sus propios
173. de partida y a continuaci n escriba 200 b En el campo de las unidades seleccione ng per uL ng por L predeterminado en el men desplegable c Revise los vol menes calculados para preparar la diluci n seriada Notas 36 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa D Revisi n de la configuraci n de la reacci n Volumen Soluci n de eaen Volumen Concentraci n Diluci n E soluci n total del est ndar origen E disolvente origen uL uL ng uL HL 1 200 Soluci n 5 0 5 0 10 0 100 0 origen 2 20 Diluci n 1 1 0 9 0 10 0 10 0 3 2 Diluci n 2 1 0 9 0 10 0 1 0 4 0 2 Diluci n 3 1 0 9 0 10 0 0 1 5 0 02 Diluci n 4 1 0 9 0 10 0 0 01 2F Set Up Reaction Setup gt Reaction Mix Calculations Reaction Setup Help i For each target assay in the reaction plate selectthe assay type ifusing TagMan reagents then review the calculated volumes for preparing the standard dilution Q Instructions series samples and PCR reactions If needed editthe reaction volume excess reaction volume component concentrations and or stock concentrations Click Print Reaction Setup to print instructions on how to prepare the PCR reactions Reaction Mix Calculations Sarnple Dilution Calculations
174. do La biblioteca Run Method Protocolo de termociclado est incluida en el software StepOne Para obtener m s informaci n acerca de la biblioteca Run Method Protocolo de termociclado o acerca de la pantalla Run Method Protocolo de termociclado acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en y o pulsando F1 Revisi n de la configuraci n de la reacci n Acerca del experimento de ejemplo Notas En la pantalla Reaction Setup Configuraci n de reacci n seleccione el tipo de ensayo si utiliza reactivos TaqMan y a continuaci n revise los vol menes calculados para preparar las reacciones de PCR y las diluciones de las muestras Si es necesario puede editar el volumen de reacci n el volumen de reacci n de exceso las concentraciones de los reactivos y o la concentraci n de las muestras IMPORTANTE Realice estos pasos para cada ensayo diana de la placa de reacci n En el experimento de Cr comparativos de ejemplo Se utilizan Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays El volumen de reacci n por pocillo es 20 uL El volumen de reacci n de exceso es del 10 Los componentes de la reacci n son TaqMan Fast Universal PCR Master Mix 2X Ensayo de TP53 20X Ensayo de GAPDH 20X Muestra Agua La concentraci n de la muestra diluida es de 5 0 ng uL La concentraci n de la soluci n de partida de la muestra es de 100 ng uL 142 Gu a de introducci n
175. do en las reacciones de PCR TaqMan Gene Expression Assays Protocol Custom TagMan Gene Expression Assays Protocol e Los consumibles consulte la p gina 3 e El uso del flujo de trabajo Advanced Setup Configuraci n avanzada para cambiar la disposici n de la placa consulte Flujo de trabajo Advanced Setup Configuraci n avanzada en la p gina 206 Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 165 cuantificaci n relativa En Cap tulo 7 Preparaci n de las reacciones de Cr comparativos Preparaci n de la placa de reacci n Notas 166 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 8 Realizaci n del experimento de C comparativos ra ao Este cap tulo cubre los siguientes temas El Resumen del cap tulo a na anaana rra ara Ae AA 168 E Preparaci n da dl My o 81010 1 y OOOO O A ARE AA AA e ISET DIETA A AA 169 ll Realizaci n del experimento vieran RRA ae ao 171 Nota Para obtener m s informaci n acerca de alguno de los temas que se explican en esta gu a acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Software pulsando F1 haciendo clic en 4 en la barra de herramientas o seleccionando Help Ayuda StepOne Help Ayuda de StepOne Notas Gu a de intro
176. dores y controles end genos consulte User Bulletin 2 Relative Ouantitation of Gene Expression Configuraci n del protocolo de termociclado En la pantalla Run Method Protocolo de termociclado revise el volumen de la reacci n y el perfil t rmico del protocolo de termociclado predeterminado Si es necesario puede editar el protocolo de termociclado predeterminado o sustituirlo por otro de la biblioteca Run Method Protocolo de termociclado Acerca del En el experimento de curva est ndar relativa de ejemplo se utiliza el protocolo de experimento de termociclado predeterminado sin modificaciones ejemplo Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 33 cuantificaci n relativa Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa Configuraci n del protocolo de termociclado Revisi n de la pantalla Run Method Protocolo de termociclado Haga clic en la ficha Graphical View Vista gr fica predeterminada o Tabular View Vista tabular Aseg rese de que en el campo Reaction Volume Per Well Volumen de reacci n por pocillo aparece 20 uL Aseg rese de que en el perfil t rmico aparecen las etapas y los ciclos que se indican a continuaci n Haga clic en Next Siguiente gt 2E Set Up Run Method Run Method Help T Instructions Review the reaction volume and the thermal profile For the default run method
177. ducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 167 cuantificaci n relativa ue Cap tulo 8 Realizaci n del experimento de Cy comparativos ma Resumen del cap tulo Resumen del cap tulo En este cap tulo se explica c mo realizar una reacci n en Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Flujo de trabajo A continuaci n se muestra el flujo de trabajo para realizar el experimento de ejemplo del experimento que se incluye en esta gu a de introducci n de ejemplo Inicio del experimento Y Dise o del experimento Cap tulo 6 Y Preparaci n del experimento Cap tulo 7 Y Realizaci n del experimento Cap tulo 8 Prepare el proceso Active las opciones de notificaci n Inicie el proceso Monitorice el proceso 0O O N Descargue el instrumento y transfiera los datos Y An lisis del experimento Cap tulo 9 v Fin del experimento Notas 168 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 8 Realizaci n del experimento de C comparativos NY Preparaci n de la reacci n Y Preparaci n de la reacci n Para preparar el proceso abra el experimento y cargue la MicroAmp Fast Optical 48 Well Reaction Plate en el instrumento StepOne Apertura del 1 Si a n no se est ejecutando el software StepOne haga doble clic en T acceso experi
178. ductos qu micos antes de almacenar manipular o trabajar con cualquier producto qu mico o material peligroso Consulte Acerca de las fichas t cnicas de seguridad de los materiales MSDS en la p gina xvii e Minimice el contacto con productos qu micos Utilice un equipo adecuado de protecci n personal durante la manipulaci n de productos qu micos por ejemplo protectores oculares guantes o vestimenta protectora Puede encontrar m s normas de seguridad en las MSDS e Minimice la inhalaci n de productos qu micos No deje abiertos los recipientes de productos qu micos Util celos nicamente con la ventilaci n adecuada por ejemplo una campana extractora Puede encontrar m s normas de seguridad en las MSDS e Compruebe peri dicamente la ausencia de fugas o salpicaduras Si se produce una fuga o un derrame siga los procedimientos de limpieza del fabricante tal y como se recomienda en la MSDS e Cumpla todas las leyes y normativas locales estatales provinciales o nacionales en materia de almacenamiento manipulaci n y eliminaci n de productos qu micos Los fabricantes de productos qu micos incluyen fichas t cnicas de seguridad de los materiales MSDS con los productos qu micos peligrosos que env an a sus clientes nuevos Tambi n incluyen MSDS con el primer env o de un producto qu mico peligroso materiales aun cliente despu s de que esa MSDS se haya actualizado En las MSDS encontrar la MSDS informaci
179. e cuantificaci n relativa Cap tulo 6 Dise o del experimento de Cy comparativos NY Configuraci n del protocolo de termociclado Para obtener m s Para obtener m s informaci n acerca de informaci n e La pantalla Relative Quantitation Settings Opciones de cuantificaci n relativa acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en 3 o pulsando F1 e Las muestras de referencia tambi n denominadas calibradores y los controles end genos consulte User Bulletin 2 Relative Quantitation of Gene Expression Configuraci n del protocolo de termociclado En la pantalla Run Method Protocolo de termociclado revise el volumen de la reacci n y el perfil t rmico del protocolo de termociclado predeterminado Si es necesario puede editar el protocolo de termociclado predeterminado o sustituirlo por otro de la biblioteca Run Method Protocolo de termociclado Acerca del En el experimento de C comparativos de ejemplo se utiliza el protocolo de experimento de termociclado predeterminado sin modificaciones ejemplo Revisi n de la 1 Haga clic en la ficha Graphical View Vista gr fica predeterminada o Tabular pantalla Run View Vista tabular Method Protocolo de 2 Aseg rese de que en el campo Reaction Volume Per Well Volumen de reacci n por termociclado pocillo aparece 20 uL 3 Aseg rese de que en el perfil t rmico aparecen las etapas y los ciclos que se indican a continuaci n 4 Haga clic en Next Sigu
180. e temperatura gr fica multicomponente grupo de r plicas identificador de ensayo Identificador refSNP inhibidor del IPC Glosario Fluorocromo que no fabrica Applied Biosystems Puede utilizar fluorocromos personalizados para realizar experimentos de PCR a tiempo real en el sistema StepOne Antes de utilizar fluorocromos personalizados realice una calibraci n del fluorocromo personalizado IMPORTANTE Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo TAMRA como notificador o apantallador con el sistema StepOne Reactivo que contiene el fluorocromo fluorescente Los fluorocromos puros se utilizan para realizar una calibraci n de fluorocromo puro en el sistema StepOne V ase tambi n fluorocromo del sistema V ase control end geno Visualizaci n de los datos recogidos durante la fase c clica de la amplificaci n de la PCR Se puede ver como e Notificador normalizado con l nea basal corregida AR frente al ciclo e Notificador normalizado R frente al ciclo e Ciclo umbral C frente al pocillo Visualizaci n del incremento de la fluorescencia de los pocillos seleccionados de todos los filtros Muestra el incremento de la fluorescencia de todos los puntos de recogida de datos de la reacci n Visualizaci n de los datos recogidos durante la lectura a punto final La gr fica de discriminaci n de alelos es una gr fica de la se al del notificador normalizada procedente de la son
181. e 59 4 H gado 6 6 h gado reacci n para GAPDH 4 GAPDH en Mezcla de 59 4 Ri n 6 6 ri n reacci n para GAPDH b Para mezclar las reacciones pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo y a continuaci n tape los tubos c Centrifugue brevemente los tubos para quitar las burbujas de aire d A ada 20 uL de la mezcla de reacci n desconocida muestra a los pocillos apropiados de la placa de reacci n 4 Selle la placa de reacci n con pel cula adhesiva ptica 5 Centrifugue brevemente la placa de reacci n para quitar las burbujas de aire 6 Hasta que est preparado para realizar la reacci n coloque la placa de reacci n en hielo en un sitio oscuro Directrices de preparaci n f Procure utilizar los consumibles adecuados Cuando prepare su propio experimento de curva est ndar relativa e Aseg rese de que la colocaci n de las reacciones de PCR se corresponde con la disposici n de la placa que se muestra en el software StepOne Puede Aceptar la disposici n de la placa que genera autom ticamente el software O Utilizar el flujo de trabajo Advanced Setup Configuraci n avanzada para cambiar la disposici n de la placa en el software Notas 64 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 3 Preparaci n de las reacciones de la curva est ndar relativa NQ Preparaci n de la placa de re
182. e Volume uL Diluent Volume uL Total Volume uL Standard Concentration 50 0 7 En el panel Standard Dilution Series for GAPDH Diluci n seriada est ndar para GAPDH a Notas Haga clic en el campo Standard Concentration in Stock Concentraci n del est ndar en soluci n de partida y a continuaci n escriba 200 En el campo de las unidades seleccione ng per uL ng por L predeterminado en el men desplegable 38 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa c Revise los vol menes calculados para preparar la diluci n seriada Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa Revisi n de la configuraci n de la reacci n O Volumen Soluci n de deleita Volumen Concentraci n Diluci n i soluci n r total del est ndar origen A disolvente origen uL uL ng uL HL 1 200 Soluci n 5 0 5 0 10 0 100 0 origen 2 20 Diluci n 1 1 0 9 0 10 0 10 0 3 2 Diluci n 2 1 0 9 0 10 0 1 0 4 0 2 Diluci n 3 1 0 9 0 10 0 0 1 5 0 02 Diluci n 4 1 0 9 0 10 0 0 01 2F Set Up Reaction Setup gt Reaction Mix Calculations Reaction Setup Help For each target assay in the reaction plate select the assay type if using TaqMan reagents then review the calculated volumes for preparing the standard dilution Q Instructions series samples
183. e configuraci n de los experimentos Acerca del experimento de ejemplo Descripci n del experimento de curva est ndar Notas relativa de ejemplo Para ilustrar c mo se realizan los experimentos de curva est ndar relativa y Cr comparativos esta gu a le conduce a trav s del proceso de dise o preparaci n procesamiento y an lisis de un experimento de ejemplo El experimento de ejemplo representa una configuraci n t pica que puede utilizar para familiarizarse r pidamente con el sistema StepOne El objetivo del experimento de curva est ndar relativa de ejemplo es comparar la expresi n del factor de transcripci n c myc una oncoprote na que activa la transcripci n de los genes asociados al crecimiento en los tejidos de h gado y ri n En el experimento de curva est ndar relativa de ejemplo Las muestras son cDNA preparados a partir de RNA total aislado de h gado y ri n El gen diana es el gen c myc humano El control end geno es la gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa GAPDH humano La muestra de referencia es RNA aislado de ri n Se configura una curva est ndar para el gen c myc diana El est ndar que se utiliza para la diluci n seriada es una muestra de cDNA de una muestra de concentraci n conocida preparada a partir de RNA aislado de pulm n Se configura una curva est ndar para el GAPDH control end geno El est ndar que se utiliza para la diluci n seriada es una muestr
184. e expresi n g nica y la tabla de pocillos 182 E Revisi n de la gr fica de amplificaci n eu ee ee ee ee e ee neo 185 El Presentaci n de los datos e ea ee ee ee ee ooo 191 Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 175 cuantificaci n relativa mr Cap tulo 9 An lisis del experimento de C comparativos An lisis del experimento An lisis del experimento Acerca del experimento de ejemplo An lisis del experimento de ejemplo Notas El software StepOne analiza el experimento y muestra los resultados en las pantallas de an lisis por ejemplo en la pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n QC Summary Resumen QC etc Para el experimento de Cr comparativos de ejemplo utilice el archivo de datos que se instala con el software StepOne Este archivo de datos se ha creado con los mismos par metros de dise o que se indican en el Cap tulo 6 y luego se ha procesado y analizado en un instrumento StepOne Encontrar el archivo de datos del experimento de ejemplo en su ordenador lt unidad gt Applied Biosystems StepOne Systemlexperimentstexamples donde lt unidad gt es la unidad del disco duro del ordenador en la que est instalado el software de StepOne La unidad de instalaci n predeterminada del software es la unidad C 1 Si a n no se est ejecutando el software StepOne haga doble clic en T acceso directo al software Step
185. e introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Raw Data Plot Amplitude Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa mm Revisi n de la gr fica de datos brutos a El ES Raw Data Plot Directrices de an lisis Para obtener m s informaci n Notas fi 1 1 I I I I 1 I I I 1 I 1 i I 1 I I 1 I I I i I 1 I 1 1 1 I I I I I I Legend IA gt CDO A DA Los filtros del sistema StepOne son Filtro Fluorocromo 1 Fluorocromo FAM Fluorocromo SYBRY Green 2 Fluorocromo JOE Fluorocromo VIC 3 Fluorocromo ROX Cuando analice su propio experimento de curva est ndar relativa f jese en lo siguiente para cada filtro e Crecimiento caracter stico de la se al e Depresiones o cambios abruptos Para obtener m s informaci n acerca de la pantalla Raw Data Plot Gr fica de datos brutos acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en y o pulsando F1 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa 123 sn Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa Revisi n de la gr fica de datos brutos Notas 124 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 6
186. e la PCR ARn Ran punto final Rn l nea basal donde Rn notificador normalizado V ase identificador refSNP Acci n que se realiza despu s del an lisis para omitir uno o varios pocillos de todos los an lisis antes de volver a analizar los datos Visor del instrumento que se toca para controlarlo Componente del perfil t rmico Los pasos se definen por la temperatura el tiempo la rampa y el estado de recogida de datos En los ciclos los pasos tambi n se definen por medio del estado AutoA Proceso de recogida de datos de fluorescencia durante la amplificaci n de la PCR Los datos de la PCR a tiempo real sirven para calcular los resultados de los experimentos de cuantificaci n o para solucionar los problemas de los resultados de los experimentos de genotipado o presencia ausencia Coeficiente de regresi n calculado a partir de la l nea de regresi n de la curva est ndar La pendiente indica la eficiencia de la amplificaci n de la PCR para el ensayo Una pendiente de 3 3 indica una eficiencia de amplificaci n del 100 V ase tambi n eficiencia de amplificaci n EFF Parte de un protocolo de termociclado que especifica la temperatura el tiempo la rampa y los puntos de recogida de datos de todos los pasos y fases del proceso del instrumento En los experimentos de presencia ausencia pocillos que contienen un molde de IPC y un tamp n o agua en lugar de una muestra en la reacci n de PCR El molde de IPC e
187. e se produce antes de la amplificaci n Los datos de fluorescencia que se recogen durante la lectura previa a la PCR se utilizan para normalizar los datos de fluorescencia a tiempo final En la gr fica de amplificaci n l nea ajustada a los niveles de fluorescencia de un rango de ciclos definido Si se utiliza una opci n de an lisis de l nea basal manual Applied Biosystems recomienda seleccionar los primeros ciclos de la PCR para determinar la l nea basal Opci n de an lisis en la que el software calcula los ciclos inicial y final de la l nea basal para la gr fica de amplificaci n El software utiliza la l nea basal y el umbral para calcular el ciclo umbral C Opci n de an lisis en la que se introducen los ciclos inicial y final de la l nea basal para la gr fica de amplificaci n El software utiliza la l nea basal y el umbral para calcular valores C En los experimentos de curva est ndar y curva est ndar relativa la l nea que mejor se ajusta a partir de la curva est ndar F rmula de la l nea de regresi n Cr m registro Cant b donde m es la pendiente b es el punto de intersecci n y y Cant es la cantidad est ndar V ase tambi n coeficientes de regresi n M todo de cuantificaci n para experimentos de cuantificaci n Con el m todo Cy comparativos AAC se utilizan los resultados de una muestra de referencia y un control end geno para determinar cantidades relativas de un gen diana en las muest
188. ede introducir hasta 100 caracteres en el campo Target Name Nombre de gen diana Notas 26 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa O Configuraci n de los genes diana a e Seleccione un control end geno para cada muestra El control end geno es un gen diana que est presente en todas las muestras que se est n investigando Se deber a expresar por igual en todos los tipos de muestras con independencia del tratamiento o el origen del tejido ejemplos de controles end genos B actina GAPDH y RNA ribosomal 18S rRNA 185 El control end geno se utiliza para normalizar los resultados de la PCR ya que corrige las variaciones en la cantidad de molde la eficiencia de extracci n del cido nucleico la eficiencia de la retrotranscripci n y los errores de calibraci n de las pipetas Tenga en cuenta que Cada tipo de muestra por ejemplo cada tejido de un estudio en el que se comparan m ltiples tejidos requiere un control end geno Si las muestras est n distribuidas en m ltiples placas cada placa debe tener un control end geno Asimismo cada placa debe incluir un control end geno para cada tipo de muestra de la placa e Seleccione el fluorocromo del notificador utilizado en el ensayo diana Seleccione FAM si el fluorocromo FAM est unido al extremo de 5 de la sond
189. el En el experimento de curva est ndar relativa de ejemplo en la pantalla Multicomponent experimento de Plot Gr fica multicomponente hay que fijarse en ejemplo Revisi n de la 1 gr fica multicomponente Notas Fluorocromo ROX referencia pasiva Fluorocromo FAM notificador Picos depresiones y o cambios repentinos Amplificaci n en pocillos de control negativo En el panel Experiment Menu Men del experimento seleccione Analysis An lisis Multicomponent Plot Gr fica multicomponente Nota Si en la pantalla Multicomponent Plot Gr fica multicomponente no aparece ning n dato haga clic en Analyze Analizar Muestre un solo pocillo a la vez en la pantalla Multicomponente Plot Gr fica multicomponente a Haga clic en la ficha View Plate Layout Ver disposici n de placa b Seleccione un pocillo en la disposici n de la placa el pocillo se muestra en la pantalla Multicomponent Plot Gr fica multicomponente En el men desplegable Plot Color Color de gr fica seleccione Dye Fluorocromo Haga clic en Show Hide the plot legend Mostrar ocultar la leyenda de la gr fica Compruebe la se al del fluorocromo FAM En el experimento de ejemplo la se al del fluorocromo FAM aumenta a lo largo de la reacci n de PCR lo que indica que la amplificaci n es normal 120 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificac
190. el experimento de curva est ndar relativa ANA Monitorizaci n de la reacci n S1 observa una gr fica de temperatura anormal solucione el error de la forma que se explica en la ayuda del software StepOne haga clic en 4 en la barra de herramientas o seleccione Help Ayuda StepOne Help Ayuda de StepOne Nota La temperatura de las muestras que se indica en el grupo Current Temperatures Temperaturas actuales es un valor estimado Acerca de la pantalla Run Method Protocolo de termociclado Despu s de comenzar el proceso el sistema StepOne muestra su progreso en la pantalla Run Method Protocolo de termociclado La vista informa del progreso de la reacci n en referencia con el perfil t rmico de la misma La siguiente figura muestra la pantalla Run Method Protocolo de termociclado durante el experimento de ejemplo Para Acci n A Cambiar el protocolo 1 En el panel de navegaci n haga clic en Hi Run Method de termociclado Protocolo de termociclado a adir ciclos una 2 En la pantalla Run Method Protocolo de termociclado RTE OS haga cualquiera de las siguientes acciones disociaci n ERE 9 So Escriba el n mero de ciclos que se van a aplicar a la fase c clica Seleccione Add Melt Curve Stage to End A adir curva de disociaci n al final si desea a adir una curva de disociaci n al final de la reacci n Seleccione Add Holding Stage to End A adir fase de espera al f
191. eleccionar pocillos de un tipo espec fico utilice los men s desplegables Select Wells With Seleccionar pocillos con seleccione Sample Muestra Target Diana o Task Tarea y a continuaci n seleccione el nombre de la muestra el gen diana o la tarea 2 Para seleccionar un solo pocillo haga clic en l en la disposici n de la placa 3 Para seleccionar varios pocillos haga clic y arrastre el rat n por encima de los pocillos deseados pulse CTRL clic o pulse May s celic en la disposici n de la placa Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 179 cuantificaci n relativa O Cap tulo 9 An lisis del experimento de C comparativos An lisis del experimento 4 Para seleccionar los 48 pocillos haga clic en la esquina superior izquierda de la disposici n de la placa View Plate Layout View Well Table Select Wells With Sample wl Selectitem wv Select Item Kidney 4 1 2 3 4 cala 6 7 8 E rrsa E rrsa LJ rrsa caroH C caron caron I mesa i rrsa A CT Undetermined Cr Undetermined CT Undetermined CT Undetermined CT Undetermined CT Undetermined CT 30 72 CT 30 69 I rrsa 1 caron I caron I caron I rrsa I rrsa I rrsa I caron B cr 30 66 CT 24 67 CT 24 67 CT 24 68 CT 30 67 CT 30 68 CT 30 75 CT 24 88 I caron 1 caron I rrsa I rrsa I mesa I caron 1 caron 1 caron C cr 24 83 CT 24 9
192. en diana la tarea y los fluorocromos e El ciclo umbral calculado Cr la fluorescencia normalizada Rn y los valores de cantidades e Avisos En el experimento de Cr comparativos de ejemplo se revisa e Cada gen diana de la pantalla Gene Expression Plot Gr fica de expresi n g nica para el nivel de expresi n o cambio en n mero de veces de la expresi n de la muestra de gen diana en relaci n con la muestra de referencia e La tabla de pocillos para evaluar la precisi n de los grupos de r plicas 1 En el panel Experiment Menu Men del experimento seleccione Analysis An lisis Gene Expression Expresi n g nica Nota Si en la pantalla Gene Expression Plot Gr fica de expresi n g nica no aparece ning n dato haga clic en Analyze Analizar 2 En la pantalla Gene Expression Plot Gr fica de expresi n g nica a En el men desplegable Plot Type Tipo de gr fica seleccione RQ vs Sample Cuantificaci n relativa vs Muestra b En el men desplegable Graph Type Tipo de gr fica seleccione Log10 c En el men desplegable Orientation Orientaci n seleccione Vertical Bars Barras verticales 182 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 9 An lisis del experimento de C comparativos Fon Revisi n de la gr fica de expresi n g nica y la tabla de pocillos d Haga clic en gt Show Hide
193. endados a la tienda en l nea de Applied Biosystems Cree una cesta de la compra a ada productos a la cesta de compra y a continuaci n inicie la sesi n para enviar su pedido Para acceder a la tienda en l nea de Applied Biosystems debe tener una conexi n a Internet ilimitada Nota El software StepOne recomienda los materiales que debe solicitar de acuerdo con el dise o del experimento Se da por hecho que se va a dise ar el experimento solicitar los materiales y luego preparar Cap tulo 7 y procesar Cap tulo 8 la placa de reacci n cuando reciba los materiales En el experimento de C comparativos de ejemplo los materiales recomendados son e MicroAmp Fast Optical 48 Well Reaction Plate e MicroAmp Optical 48 Well Adhesive Film e TaqMan Fast Universal PCR Master Mix 2X No AmpErase UNG e Ensayo de TP53 Hs00153340_m1 RefSeq NM_000546 2 e Ensayo de GAPDH Kit de control end geno de GAPDH GAPDH humano PN 4333764T 1 Busque el ensayo diana en la tienda en l nea de Applied Biosystems a Aseg rese de que el ordenador est conectado a Internet b Haga clic en el campo Enter Gene Name Escriba el nombre del gen escriba TP53 y a continuaci n haga clic en Find Assay Buscar ensayo C En el cuadro de di logo Find Assay Results Buscar resultados de ensayo seleccione la fila Hs00153340_ml1 d Haga clic en el campo Enter Gene Name Escriba el nombre del gen escriba GAPDH y a continuaci n haga cl
194. ento de curva est ndar relativa ANA Monitorizaci n de la reacci n Monitorizaci n Si el ordenador est directamente conectado al instrumento StepOne por medio del cable conectada del sistema StepOne puede ver el progreso de la reacci n a tiempo real de la forma que se describe a continuaci n Durante el proceso observe peri dicamente las tres gr ficas disponibles en el software StepOne para detectar posibles problemas H Para Acci n A Detener el proceso 1 En el software StepOne haga clic en STOP RUN Detener proceso 2 En el cuadro de di logo Stop Run Detener proceso haga clic en una de las siguientes opciones Stop Immediately Detener inmediatamente para detener el proceso inmediatamente Stop after Current Cycle Hold Detener despu s de ciclo actual espera para detener el proceso despu s del ciclo o la espera actual Cancel Cancelar para continuar el proceso B Ver los datos de Seleccione Y Amplification Plot Gr fica de amplificaci n a AGINDO Consulte Acerca de la pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n en la p gina 78 C Ver los datos de la Seleccione po Temperature Plot Gr fica de temperatura temperatura de la reacci n a tiempo real Consulte Acerca de la pantalla Temperature Plot Gr fica de temperatura en la p gina 80 D Ver el progreso de la Seleccione EE Run Method Protocolo de termociclado reacci n en l
195. erimento de C comparativos de ejemplo hay que revisar la pantalla Raw Data Plot Gr fica de datos brutos para comprobar si hay un aumento estable de la se al que no hay ninguna depresi n ni cambio abrupto a partir del filtro apropiado 1 En el panel Experiment Menu Men de experimento seleccione Analysis An lisis Raw Data Plot Gr fica de datos brutos Nota Si en la pantalla Raw Data Plot Gr fica de datos brutos no aparece ning n dato haga clic en Analyze Analizar Para ver los 48 pocillos en la pantalla Raw Data Plot Gr fica de datos brutos haga clic en la esquina superior izquierda de la disposici n de la placa en la ficha View Plate Layout Ver disposici n de placa Haga clic en Show Hide the plot legend Mostrar ocultar la leyenda de la gr fica Haga clic y arrastre el puntero Show Cycle Mostrar ciclo desde el ciclo 1 al 40 En el experimento de ejemplo hay un aumento estable en la se al a partir del filtro 1 que se corresponde con el filtro del fluorocromo FAM Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 203 cuantificaci n relativa ru Cap tulo 9 An lisis del experimento de C comparativos Revisi n de la gr fica de datos brutos Raw Data Plot 325 000 300 000 275 000 225 000 200 000 175 000 4 Amplitude 150 000 4 125 000 4 100 000 4 50 000 250 000 H ww a
196. est ndar reacci n uL uL j 6 GAPDH Mezcla de 59 4 GAPDH 6 6 Std 1 reacci n Std 1 para GAPDH 7 GAPDH Mezcla de 59 4 GAPDH 6 6 Sta 2 reacci n Sta 2 para GAPDH 8 GAPDH Mezcla de 59 4 GAPDH 6 6 Std 3 reacci n Std 3 para GAPDH 9 GAPDH Mezcla de 59 4 GAPDH 6 6 Std 4 reacci n Std 4 para GAPDH 10 GAPDH Mezcla de 59 4 GAPDH 6 6 Std 5 reacci n Std 5 para GAPDH Para mezclar las reacciones pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo y a continuaci n tape los tubos c Centrifugue brevemente los tubos para quitar las burbujas de aire d A ada 20 uL de la reacci n est ndar a los pocillos apropiados de la placa de reacci n Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 63 cuantificaci n relativa Preparaci n de la placa de reacci n Cap tulo 3 Preparaci n de las reacciones de la curva est ndar relativa 3 Por cada grupo de r plicas prepare las reacciones para los elementos desconocidos O muestras a A tubos del tama o adecuado a ada los vol menes de la mezcla de reacci n y de las muestras que se indican a continuaci n Volumen Tubo Reacci n Mezcla de cla de Muestra deer desconocida reacci n ay reacci n uL uL 1 c myc en Mezcla de 59 4 H gado 6 6 h gado reacci n para c myc 2 c myc en Mezcla de 59 4 Ri n 6 6 ri n reacci n para c myc 3 GAPDH en Mezcla d
197. experimentos de curva est ndar relativa Notas Los experimentos de cuantificaci n relativa son experimentos de PCR a tiempo real En los experimentos de PCR a tiempo real e El instrumento monitoriza el progreso de la PCR mientras se produce Kwok y Higuchi 1989 e Se recogen datos durante la reacci n de PCR e Las reacciones se caracterizan por el ciclo en el que se detecta por primera vez la amplificaci n de un gen diana Saiki et al 1985 Nota En esta gu a el t rmino experimento se refiere a todo el proceso del experimento desde su dise o hasta el an lisis de los datos Los experimentos de curva est ndar relativa determinan el cambio de expresi n de un gen diana en una muestra en relaci n con el mismo gen en una muestra de referencia Para conseguir los resultados se utiliza una curva est ndar construida a partir de una diluci n seriada de una muestra de concentraci n conocida Los experimentos de curva est ndar relativa se suelen utilizar para e Comparar niveles de expresi n de un gen en diferentes tejidos e Comparar los niveles de expresi n de un gen en una muestra tratada y en una muestra no tratada e Comparar los niveles de expresi n de alelos de tipo salvaje y alelos mutados Componentes Estos son los componentes que se necesitan para preparar las reacciones de PCR para los experimentos de curva est ndar relativa e Muestra la muestra en la que la cantidad del gen diana es desconocida
198. fica 6 Observe los valores que se muestran bajo la curva est ndar En el experimento de ejemplo los valores de cada gen diana se encuentran en los rangos aceptables Eficiencia de Diana Pendiente Valor R amplificaci n Eff GAPDH 3 438 1 95 363 c myc 3 236 0 995 103 729 Compruebe si todas las muestras est n dentro del rango de la curva est ndar En el experimento de ejemplo todas las muestras puntos azules est n dentro de la curva est ndar puntos rojos Notas 100 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Standard Curve Plot Settings Target All Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa Visualizaci n de la curva est ndar Standard Curve 2 3 4 5 Log Quantity Target GAPDH Slope 3 438 Y Inter R po 55363 Target c myc Slope 3 236 Y Inter R 103 729 Legend E Standard a Unknown Unknown Flagged Notas b En el men desplegable Group By Agrupar por seleccione Replicate 8 Compruebe los valores C4 a Haga clic en la ficha View Well Table Ver tabla de pocillos R plica F jese en los valores de la columna C En el experimento de ejemplo los valores C est n dentro del rango esperado gt 8 y lt 35 cantidad de gen diana No es necesario omitir los pocillos del an lisis
199. fica seleccione AR vs Cycle AR vs ciclo b En el men desplegable Color Plot By Colorear gr fica por seleccione Well Pocillo c Haga clic en Show Hide the plot legend Mostrar ocultar la leyenda de la gr fica 4 Observe los valores de la l nea basal a En el men desplegable Graph Type Tipo de gr fica seleccione Linear Lineal b Active la casilla de verificaci n Baseline L nea basal para ver los ciclos inicial y final de la l nea basal c Compruebe que la l nea basal est ajustada correctamente En el experimento del ejemplo la l nea basal termina antes de que se inicie la amplificaci n Notas 104 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa w Revisi n de la gr fica de amplificaci n 3a 4a 3b Plot Type ARn vs Cycle v Graph Type Linear Y Color Plot By Well Amplification Plot Plot Settings 3c Pals Amplification Plot 7 r T T r T T 1 26 28 30 32 34 36 38 40 Target All Threshold Auto 4b 5 Observe los valores de umbral a En el men desplegable Graph Type Tipo de gr fica seleccione Log Registro b En el men desplegable Target Diana seleccione GAPDH c Active la casilla de verificaci n Threshold Umbral para ver el umbral d C
200. ficaci n relativa Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa mm An lisis del experimento C mo ver m ltiples gr ficas Utilice la vista Multiple Plots M ltiples gr ficas para ver simult neamente hasta cuatro gr ficas Para desplazarse por la vista Multiple Plots M ltiples gr ficas Multiple Plots View A E 1 En el panel Experiment Menu Men del experimento seleccione Analysis An lisis Multiple Plots View Vista de m ltiples gr ficas Para ver cuatro gr ficas haga clic en 35 Show plots in a 2 X 2 matrix Mostrar gr ficas en una matriz de 2 X 2 Para ver dos gr ficas en filas haga clic en Show plots in two rows Ver gr ficas en dos filas Para ver dos gr ficas en columnas haga clic en Show plots in two columns Ver gr ficas en dos columnas Para ver una gr fica espec fica seleccione la gr fica en el men desplegable situado encima de la visualizaci n de cada gr fica A Amplification Plot Rn vs Cycle Amplification Plot ARn vs Cycle P a EE P PARE Amplification Plot Amplification Plot y 5 E 2 o 10 12 14 16 18 20 2 4 2 2 20 2 34 32 B 4 2 4 amp a E D 2 4 2 D 2 AN Cycle Cycle Amplification Plot Cr vs Well Number Y Gene Expression Plot Amplification Plot Gene Expression bros anan Well Number Target Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne
201. ficha t cnica de seguridad MSDS y siga las instrucciones de manipulaci n indicadas Use protectores oculares vestimenta protectora y guantes apropiados Prepare las reacciones de cDNA Realice la retrotranscripci n en un termociclador Directrices de Cuando prepare su propio experimento de curva est ndar relativa preparaci n Para obtener m s informaci n Notas Applied Biosystems recomienda extraer primero el DNA o RNA del tejido o muestra Applied Biosystems recomienda los siguientes moldes cDNA cDNA complementario cDNA sintetizado a partir de las muestras de RNA total utilizando un High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit RNA RNA o mRNA total purificado extra do de un tejido o una muestra DNA gDNA gen mico gDNA purificado ya extra do de un tejido o una muestra Para obtener m s informaci n acerca de La preparaci n de moldes de cDNA consulte Applied Biosystems High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol PN 4375575 El protocolo no se incluye en los High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Puede descargarlo desde el sitio web Applied Biosystems Documents on Demand http docs appliedbiosystems com search taf La preparaci n de moldes de RNA o g DNA consulte el protocolo de los reactivos de purificaci n que haya seleccionado Para localizar los reactivos de purificaci n de Applied Biosystems visite el sitio web de Applied Biosystems http www applie
202. figuraci n de los est ndares Configuraci n de los est ndares Acerca del experimento de ejemplo Pantalla Standards Est ndares Notas En la pantalla Standards Est ndares escriba el n mero de puntos y r plicas de todas las curvas est ndar de la placa de reacci n Para cada curva est ndar escriba la cantidad inicial y seleccione el factor de diluci n En el experimento de curva est ndar relativa de ejemplo Se configura una curva est ndar para el gen diana c myc El est ndar que se utiliza para la diluci n seriada es una muestra de cDNA de una muestra de concentraci n conocida preparada a partir de RNA aislado de pulm n Se configura una curva est ndar para el control end geno GAPDH El est ndar que se utiliza para la diluci n seriada es una muestra de cDNA de una muestra de concentraci n conocida preparada a partir de RNA aislado de pulm n Para cada curva est ndar Se utilizan cinco puntos en la curva est ndar Se utilizan tres r plicas para cada punto Las r plicas son reacciones id nticas que contienen componentes y vol menes id nticos La cantidad inicial es 200 ng y el factor de diluci n es 1 10 Haga clic en el campo How many points do you need for each standard curve Cu ntos puntos necesita por cada curva est ndar y a continuaci n escriba 5 Haga clic en el campo How many replicates do you need for each point Cu ntas r plicas necesita para cada pu
203. g TaqMan reagents then review the calculated volumes for preparing the samples and PCR T Instructions reactions If needed editthe reaction volume excess reaction volume component concentrations and or stock concentrations Click Print Reaction Setup to print instructions on how to prepare the PCR reactions Reaction Mix Calculations Sample Dilution Calculations Diluted Sample Concentration 10x for Reaction Mix 5 0 Ing uL Print Reaction Setup l 1 2 En el cuadro de di logo seleccione e Detailed Reaction Setup Instructions Instrucciones detalladas de la configuraci n de la reacci n e Include Plate Layout Incluir disposici n de la placa e Use sample color Utilizar color de muestra Notas 146 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa e 5 Cap tulo 6 Dise o del experimento de Cy comparativos ss Revisi n de la configuraci n de la reacci n Haga clic en Print Imprimir Print Reaction Setup Instructions iy Selectthe type ofinstructions to print O Summary Reaction Setup Instructions Include Plate Layout Plate Layout Print Opti LI E Use sample color O Use task color rs pe E Preview Print Cancel En el cuadro de di logo Print Imprimir seleccione la impresora y las opciones de impresi n y a continuaci n haga clic en OK Aceptar Hag
204. gitador e Centr fuga Preparaci n de 1 las diluciones de e H gado las muestras lt Ri n e Cerebro Nombre deta Concentraci n Volumen de Volumen de Volumen total maeta de la soluci n muestra disolvente de muestra origen ng L uL uL diluida uL H gado 100 0 1 0 19 0 20 0 Ri n 100 0 1 0 19 0 20 0 Cerebro 100 0 1 0 19 0 20 0 Etiquete un tubo de microcentr fuga diferente para cada muestra diluida 2 A ada el volumen de agua requerido disolvente a cada tubo vac o Tubo Nombre de la muestra mid E 1 H gado 19 0 2 Ri n 19 0 3 Cerebro 19 0 3 A ada el volumen de soluci n de partida de las muestras requerido disolvente a cada tubo vac o Tubo Nombre de la muestra dt 1 H gado 1 0 2 Ri n 1 0 3 Cerebro 1 0 4 Agite cada muestra diluida entre 3 y 5 segundos y a continuaci n centrifugue brevemente los tubos Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa 159 Cap tulo 7 Preparaci n de las reacciones de Cr comparativos Preparaci n de la mezcla de reacci n 5 Coloque las muestras diluidas en hielo hasta que prepare la placa de reacci n Directrices de Cuando prepare su propio experimento de Cr comparativos preparaci n Para obtener m s informaci n e Podr a necesitar diluciones de las muestras porque el volumen
205. i n de todas las muestras de los pocillos seleccionados Hay disponibles tres gr ficas e AR vs Cycle AR vs ciclo AR es la variaci n de la se al de fluorescencia normalizada generada en cada ciclo de la reacci n de PCR y son los datos a partir de los cuales se calcula C En esta gr fica AR se muestra en funci n del n mero de ciclo La gr fica sirve para identificar y examinar las amplificaciones irregulares y para ver los valores del umbral y l nea basal de la reacci n e R vs Cycle R vs ciclo Rn es la fluorescencia de fluorocromo del notificador normalizada En esta gr fica Rn se muestra en funci n del n mero de ciclo La gr fica sirve para identificar y examinar las amplificaciones irregulares e Cy vs Well C vs pocillo el ciclo umbral Cr es el n mero de ciclo de PCR en el cual el nivel de fluorescencia corta el umbral En esta gr fica Cr se muestra en funci n de la posici n del pocillo La gr fica sirve para localizar amplificaciones con valores at picos Cada gr fica se puede ver de las siguientes formas lineal o log10 Acerca del En el experimento de Cr comparativos de ejemplo hay que revisar cada gen diana en la experimento de pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n para buscar ejemplo e Valores de umbral y l nea basal correctos e Valores at picos Revisi n de la 1 En el panel Experiment Menu Men del experimento seleccione Analysis gr fica de An lisis 4
206. i n de las reacciones de C comparativos Este cap tulo cubre los siguientes temas El Resumen del cap tulo ss aniriaraia rr rs ana ed 156 E PITA iiel moe 5 rr TARRO A 157 E Preparaci n de las diluciones de las muestras ooooooooooooooo 158 E Preparaci n de la mezcla de reacci n oooooooooooornonrnrnoooo 160 El Preparaci n de la placa de reacci n ooooooooonornnnnn oo ooo 163 Nota Para obtener m s informaci n acerca de alguno de los temas que se explican en esta gu a acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Software pulsando F1 haciendo clic en en la barra de herramientas o seleccionando Help Ayuda StepOne Help Ayuda de StepOne Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 155 cuantificaci n relativa nom Cap tulo 7 Preparaci n de las reacciones de Cr comparativos Resumen del cap tulo Resumen del cap tulo En este cap tulo se explica c mo preparar las reacciones de PCR para el experimento de Cr comparativos AAC de ejemplo y se ofrecen directrices para preparar las reacciones de PCR para su propio experimento de C comparativos Flujo de trabajo A continuaci n se muestra el flujo de trabajo para preparar las reacciones de PCR para el del experimento experimento de ejemplo que se incluye en esta gu a de introducci n de ejemplo Experimento de Cr comparativo
207. i n del usuario tambi n aparecen palabras de aviso de seguridad Para obtener m s informaci n consulte Palabras de aviso de seguridad en la p gina xi relacionada Documento N m ref N m ref ingl s espa ol Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Getting 4376786 4377729 Started Guide for Genotyping Experiments Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Getting preo Started Guide for Presence Absence Experiments Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Getting 4377742 Started Guide for Relative Standard Curve and Comparative Cr 43 6785 Experiments Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Getting 4376784 4377736 Started Guide for Standard Curve Experiments Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Installation 4376782 4377798 Maintenance and Networking Guide Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Installation 4376783 4377792 Quick Reference Card Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Site 4376768 4378359 Preparation Guide Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Software Help viii Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Obtenci n de informaci n de la ayuda del software Env enos sus comentarios Pr logo C mo obtener m s informaci n Applied Biosystems puede proporcionarle la siguiente documentaci n auxil
208. i n relativa Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa nn Revisi n de la gr fica multicomponente 6 Compruebe la se al del fluorocromo ROX En el experimento de ejemplo la se al del fluorocromo ROX permanece constante a lo largo de la reacci n de PCR lo que indica que los datos son t picos Multicomponent Plot Plot Settings Plot Color Dye v Multicomponent Plot O O 37 500 r O c mye E c mye E e myo QU caro R caro R caro a e 35 000 Cr Undel Cr Undel Cr Undel Cr Undel Cr Undel Cr Undel E a 32 500 30 000 I car 1 sar 1 c myc i c myc 1 c myc HI sar pages 924 9 49 aa aa 4 83 9 28 BEN cr 24 66 CT 24 65 Cr 24 61 Cr 28 Cr 28 Cr 28 Cr 24 64 o y g 22 500 i sar 1 sar H c myo E om E c myo Eon ene E eme 2b 3 20 000 9 12 8 89 200 200 200 z 17 500 GTRERTOO CMER CT 23 CT 233 CT 23 a 20 E 2D t 26 2 15 000 12 500 Bono 2 E SS 5 10 000 CABE GRAS CTaa CT CU 077 002 7 500 6 i n 2 500 ye 200 1200 200 A DR A NEO TA TR DU O TR HS OROSA TR HS E DOS A CT 20 02 CT 19 96 CT 19 98 oo cos Mo os 02 4 6 8 0 2 4 6 86 X 2 2 DD BA Y TZ 4 E 3 0 4 Cycle ap EJ car E car E car El car E car E s
209. ia Para conseguir los resultados se utiliza una curva est ndar construida a partir de una diluci n seriada de cantidad conocida Para configurar la placa de reacci n el m todo de curva est ndar relativa requiere dianas est ndares muestras una muestra de referencia y un control end geno e Seleccione los reactivos que desea utilizar Seleccione Reagents TaqMan ensayos TaqMan si desea utilizar estos reactivos para detectar la amplificaci n y cuantificar la cantidad de gen diana en las muestras Los reactivos TaqMan se componen de dos cebadores y una sonda TaqMan Los cebadores est n dise ados para amplificar el gen diana La sonda TaqMan est dise ada para hibridar en el gen diana y generar una se al de fluorescencia cuando se amplifica el gen diana IMPORTANTE Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo TAMRA como notificador o apantallador en el sistema StepOne Seleccione SYBRY Green Reagents reactivos SYBR Green si desea utilizar estos reactivos para detectar la amplificaci n y cuantificar la cantidad de gen diana en las muestras Los reactivos SYBR Green se componen de dos cebadores y un fluorocromo SYBR Green Los cebadores est n dise ados para amplificar el Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 23 cuantificaci n relativa O Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa l Definici n de
210. ia gt 0 para ver informaci n detallada acerca del aviso Si es necesario haga clic en el v nculo de soluci n de problemas para saber c mo corregir el aviso e Puede cambiar las opciones de los avisos Ajustar la sensibilidad para que se marquen m s o menos pocillos Cambiar los par metros de los avisos que aplica el software StepOne Para obtener m s Para obtener m s informaci n acerca de la pantalla QC Summary Resumen QC o de las informaci n opciones de avisos acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en O pulsando Fl Omisi n de pocillos para el an lisis Los errores de los experimentos pueden causar que algunos pocillos se amplifiquen de manera insuficiente o no se amplifiquen Estos pocillos suelen producir valores Cy que difieren significativamente de los valores medios de los pocillos de r plicas asociadas Si se incluyen en los c lculos estos valores at picos pueden dar lugar a mediciones err neas para garantizar la precisi n omita los valores at picos del an lisis Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 197 cuantificaci n relativa oO Cap tulo 9 An lisis del experimento de C comparativos J Omisi n de pocillos para el an lisis Acerca del En el experimento de C comparativos de ejemplo no hay valores at picos no es experimento de necesario omitir ning n pocillo del an lisis ejemplo Omisi n de 1 En
211. iar N mero Documento de referencia Amplification Efficiency of TaqMan Gene Expression Assays Application Note 127APO5 Applied Biosystems High Capacity cCDNA Reverse Transcription Kits Protocol 4375575 Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Installation Performance 4376791 Verification Protocol Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Installation Qualification 4376790 Operation Qualification Protocol Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Planned Maintenance 4376788 Protocol Custom TaqMan Gene Expression Assays Protocol 4334429 Primer Express Software Version 3 0 Getting Started Guide 4362460 TagMan Gene Expression Assays Protocol 4333458 User Bulletin 2 Relative Quantitation of Gene Expression 4303859 Nota Para obtener m s documentaci n consulte C mo obtener asistencia t cnica en la p gina x La ayuda del software StepOne describe c mo se utiliza cada funci n de la interfaz de usuario Para acceder a la ayuda desde el software StepOne realice una de las siguientes acciones e Pulse F1 e Haga clic en en la barra de herramientas e Seleccione Help Ayuda StepOne Help Ayuda de StepOne Para buscar temas de inter s en la ayuda e Consulte el ndice de contenido e Busque un tema espec fico e Busque en un ndice alfab tico Applied Biosystems agradece sus comentarios y sugerencias para mejorar sus documentos de usuario
212. ic en Find Assay Buscar ensayo 148 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 6 Dise o del experimento de Cy comparativos R Solicitud de materiales para el experimento o e En el cuadro de di logo Find Assay Results Buscar resultados de ensayo seleccione la fila 4333764T f Haga clic en Apply Assay Selection Aplicar selecci n de ensayo 2 Complete el panel Experiment Materials List Lista de materiales del experimento a En el men desplegable Display Visualizaci n seleccione All Items Todos los elementos predeterminada y a continuaci n revise los materiales recomendados Si es necesario utilice la barra de desplazamiento situada a la derecha para ver todos los elementos b Active la casilla de verificaci n junto a cada uno de los siguientes elementos MicroAmp Fast Optical 48 Well Reaction Plate MicroAmp Optical 48 Well Adhesive Film TaqMan Fast Universal PCR Master Mix 2X No AmpErase UNG Ensayo de TP53 Hs00153340_m1 RefSeq NM_000546 2 Ensayo de GAPDH Kit de control end geno de GAPDH GAPDH humano PN 4333764T Nota Para obtener m s informaci n acerca de un elemento espec fico haga clic en el v nculo del n mero de referencia para conectarse a la tienda en l nea de Applied Biosystems En la p gina de inicio escriba el n mero de referencia en el campo Search B squeda y a
213. ica Seleccione Fixed View Vista fija Temperature Plot Current Temperatures Sample Cover Block Temperature Plot View Temperature A HANA DA TESE Ho g CE HAETERE LEEN 1 HI LAT T BIRI BI MAMANDO ARI UU UU UU UU UN I Sample M Cover E Brock i Mi HU PR Ei Temperature Plot w m 0 D a w E View All v Fixed View o r r r r r r r r 00 00 00 00 04 10 00 08 20 00 12 30 00 16 40 00 20 50 00 25 00 00 29 10 00 33 20 Time La pantalla Temperature Plot Gr fica de temperatura puede ser til para identificar aver as del hardware Al monitorizar la pantalla Temperature Plot Gr fica de temperatura observe las gr ficas Sample Muestra Heated Cover Cubierta caliente y Sample Block Bloque para detectar alg n comportamiento anormal e En general las gr ficas Sample Muestra y Block Bloque deber an ser m s o menos un espejo la una de la otra Una desviaci n significativa de las gr ficas puede indicar un problema e La gr fica Heated Cover Cubierta caliente deber a mantener la temperatura constante que se especifica en el protocolo de termociclado Cualquier desviaci n de la temperatura puede indicar un problema Notas 80 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 4 Realizaci n d
214. icaci n relativa Pr logo C mo utilizar esta gu a Finalidad de esta gu a P blico Suposiciones Convenciones del texto En esta gu a se explica c mo realizar experimentos de curva est ndar relativa y Cy AAC en Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System sistema StepOne Esta gu a sirve de Tutorial utilizando los datos de los experimentos de ejemplo que se incluyen en Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Software software StepOne Gu a para realizar sus propios experimentos Esta gu a est destinada al personal de laboratorio y a los investigadores que realizan experimentos de cuantificaci n relativa con el sistema StepOne En esta gu a se asume que el usuario Est familiarizado con el sistema operativo Microsoft Windows XP Est familiarizado con Internet y los navegadores de Internet Sabe c mo manejar muestras de DNA y o RNA y prepararlas para la PCR Sabe almacenar datos transferir archivos y copiar y pegar Tiene experiencia con redes si tiene pensado integrar el sistema StepOne en el flujo de datos existente de su laboratorio En esta gu a se utilizan las siguientes convenciones El texto en negrita indica una acci n del usuario Por ejemplo Escriba 0 y a continuaci n pulse Intro en cada uno de los campos restantes e El texto en cursiva se ala palabras nuevas o importantes y tambi n se utiliza para enfatizar algo Por ejemplo Antes de
215. ication Settings Opciones de cuantificaci n relativa 32 140 muestras componente de experimento 4 5 configurar 30 137 diluciones 53 158 directrices de dise o 32 139 preparar plantilla 51 157 reacciones de muestras desconocidas 64 164 O omitir pocillos 118 197 opciones de an lisis avanzadas 115 195 CT 115 195 cuantificaci n relativa 115 195 l nea basal 115 195 marcador 115 195 umbral 115 195 ver 114 194 opciones de notificaci n 71 otros reactivos basados en fluorescencia 9 P palabras de aviso para el usuario descripci n viii pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n supervisi n durante un proceso 78 ver despu s de proceso 103 185 pantalla Experiment Properties Propiedades de experimento 20 129 pantalla Gene Expression Plot Gr fica de expresi n de genes 108 182 pantalla Materials List Lista de materiales 43 148 pantalla Methods amp Materials M todos y materiales 22 131 pantalla Multicomponent Plot Gr fica multicomponente 120 200 pantalla Multiple Plots M ltiples gr ficas 99 180 pantalla QC Summary Resumen QC 116 196 pantalla Raw Data Plot Gr fica de datos brutos 122 203 pantalla Reaction Setup Configuraci n de reacci n 35 142 pantalla Relative Quantification Settings Opciones cuantificaci n relativa 140 pantalla Relative Quantification Settings Opciones de cuantificaci n relativa 32 pantalla Run Method M
216. idades de la cantidad est ndar pueden ser la masa el n mero de copias la carga viral u otras unidades para medir la cantidad del gen diana e En los experimentos de curvas est ndar relativas la muestra de concentraci n conocida en el est ndar Por ejemplo la cantidad est ndar puede referirse a la cantidad de cDNA o la cantidad de soluci n de partida Las unidades no son relevantes en los experimentos de curvas est ndar relativas porque se compensan o simplifican en los c lculos Cuando se define una curva est ndar o una diluci n seriada se corresponde con la cantidad mayor o menor de partida Cantidad de gen diana dividida por la cantidad de control end geno Oligonucle tido que flanquea el extremo de 5 del gen diana El cebador reverso y el cebador directo se utilizan juntos en las reacciones de PCR para amplificar el gen diana Oligonucle tido que flanquea el extremo de 3 del gen diana El cebador reverso y el cebador directo se utilizan juntos en las reacciones de PCR para amplificar el gen diana Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa ciclo umbral Cr coeficientes de regresi n color de gen diana Concentraci n de muestra diluida 10X para la mezcla de reacci n configuraci n avanzada control end geno control interno positivo IPC control negativo NTC control positivo Cr C autom tico Glosa
217. identifying information then selectthe type of experimentto design How do you want to identify this experiment Required Experiment Name Relative Standard Curve Example Barcode Optional 123456789 E O IN User Name Optional Example User Comments Optional Relative Standard Curve Getting Started Guide Example aa What type of experiment do you want to design 5 Genotyping Presence Absence Design a gene quantitation experiment to determine the amount of target nucleic acid sequence in a sample Directrices de Cuando dise e su propio experimento de curva est ndar relativa dise o e Escriba un nombre para el experimento que sea descriptivo y f cil de recordar El nombre del experimento se utiliza como nombre de archivo predeterminado del experimento Puede introducir hasta 100 caracteres en el campo Experiment Name Nombre de experimento Nota No se pueden utilizar los siguientes caracteres en en campo Experiment Name Nombre de experimento barra inclinada hacia delante barra inclinada hacia atr s Y signo mayor que gt signo menor que lt asterisco signo de interrogaci n comillas l nea vertical dos puntos o punto y coma e Utilice MicroAmp Fast Optical 48 Well Reaction Plates MicroAmp Fast 8 Tube Strips o MicroAmp Fast Reaction Tubes with Caps Los consumibles tipo r pido se pueden utilizar
218. iente gt 2D Set Up Run Method Run Method Help T Instructions Review the reaction volume and the thermal profile for the default run method If needed edit the default run method or select a run method from the library 1 Graphical View Tabular View I Reaction Volume Per Well 20 uL Add Stage Y Add Step Delete Selected Collect Data v Open Run Method Save Run Method Revertto Defaults Holding Stage Cycling Stage Number of Cycles 40 C Enable AutoA Legend Data Collection On Data Collection Off A AutoA On A AutoA Off Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 141 cuantificaci n relativa R Cap tulo 6 Dise o del experimento de Cy comparativos Revisi n de la configuraci n de la reacci n Directrices de Cuando dise e su propio experimento de Cr comparativos dise o Para obtener m s informaci n Escriba un n mero entre 10 y 30 para el volumen de reacci n pocillo El sistema StepOne admite vol menes de reacci n de entre 10 y 30 uL Revise el perfil t rmico Aseg rese de que el perfil t rmico es apropiado para los reactivos Si va a realizar una RT PCR de 1 paso incluya un paso de retrotranscripci n S1 el experimento necesita un perfil t rmico diferente modifique el perfil t rmico o cambie el protocolo de termociclado por otro de la biblioteca Run Method Protocolo de termocicla
219. iente de residuos ci rrelo bien con la tapa suministrada e Elimine el contenido de la bandeja de residuos y de la botella de residuos conforme a las buenas pr cticas de laboratorio y a la normativa local estatal provincial o nacional en materia de medio ambiente y salud Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de XIX cuantificaci n relativa Pr logo Seguridad el ctrica Eliminaci n de Si se generan residuos potencialmente peligrosos al utilizar el instrumento debe residuos e Identificar mediante an lisis si es necesario los residuos generados por las aplicaciones los reactivos y los sustratos utilizados en su laboratorio e Garantizar la salud y la seguridad de todo el personal de su laboratorio e Garantizar que los residuos producidos por el instrumento se almacenan transfieren transportan y eliminan de acuerdo con todas las normativas locales estatales provinciales y o nacionales IMPORTANTE Los materiales radiactivos o que impliquen un peligro biol gico pueden requerir una manipulaci n especial pudi ndose aplicar limitaciones en materia de eliminaci n Seguridad el ctrica PELIGRO DE DESCARGA EL CTRICA Se puede producir una descarga a grave si se utiliza el sistema StepOne sin haber colocado los paneles del instrumento No quite los paneles del instrumentos Los contactos de alta tensi n quedan expuestos al quitar estos paneles del instrumento
220. ificador o apantallador con el sistema StepOne Mol culas que est n unidas al extremo de 3 de las sondas TaqMan Si la sonda est intacta el apantallador no fluorescente NFQ evita que el fluorocromo del notificador emita una se al de fluorescencia Dado que el NFQ no emite ninguna fluorescencia produce se ales de fondo m s bajas lo que se deriva en una mayor precisi n en la cuantificaci n El ligando de uni n de surco menor MGB aumenta la temperatura de desnaturalizaci n Tm sin aumentar la longitud de la sonda Tambi n permite el dise o de sondas m s cortas Archivo de datos del CD que se incluye con cada pedido de ensayo El nombre de archivo incluye el n mero del c digo de barras de la placa La informaci n del AIF se incluye en un formato delimitado por tabuladores Funci n del software StepOne que le ayuda a configurar el experimento gui ndole a trav s de los procedimientos ptimos para comenzar el dise o del experimento Componente de reacci n que se muestra en la pantalla Reaction Setup Configuraci n de la reacci n El software asume que el DNA de muestra que se a ade a la mezcla de reacci n est en una concentraci n del 10X Por ejemplo si el volumen de la reacci n es de 20 uL el volumen calculado de la muestra de la reacci n 1 es 2 uL 213 Glosario AutoA biblioteca de ensayos SNP biblioteca de genes diana biblioteca de muestras calibraci n espacial calibrado
221. iguraci n de los genes diana en la p gina 25 e Escriba el n mero de puntos para cada curva est ndar de la placa de reacci n Applied Biosystems recomienda al menos cinco puntos de diluci n por cada curva est ndar e Escriba el n mero de reacciones id nticas r plicas para cada punto de la curva est ndar Applied Biosystems recomienda tres r plicas para cada punto e Dado que el rango de cantidades est ndar afecta al c lculo de la eficiencia de la amplificaci n estudie cuidadosamente el rango de cantidades est ndar apropiado para su ensayo Para obtener medidas m s precisas de la eficiencia de la amplificaci n utilice un amplio rango de cantidades est ndar de entre 5 y 6 rdenes de magnitud Si especifica un amplio rango de cantidades para los est ndares debe utilizar un producto de PCR o un molde muy concentrado como por ejemplo un CONA clonado Si tiene una cantidad limitada de molde de cDNA y o si el gen diana es un tr nscrito de bajo n mero de copias o se sabe que est en un rango determinado puede que sea necesario un rango menor de cantidades est ndar e El factor de diluci n sirve para calcular las cantidades de todos los puntos de la curva est ndar Si la cantidad inicial es la cantidad m s alta seleccione un factor de diluci n como por ejemplo 1 2 1 3 etc Si la cantidad inicial es la cantidad menor seleccione un factor de concentraci n como por ejemplo 2X 3X etc Notas
222. iluciones de las muestras Nombre deis Concentraci n Volumen de Volumen de Volumentotal testa de la soluci n muestra disolvente de muestra origen ng puL uL uL diluida uL H gado 100 0 1 0 19 0 20 0 Ri n 100 0 1 0 19 0 20 0 2F Set Up Reaction Setup gt Reaction Mix Calculations Reaction Setup Help i For each target assay in the reaction plate selectthe assay type ifusing TagMan reagents then review the calculated volumes for preparing the standard dilution T Instructions series samples and PCR reactions If needed editthe reaction volume excess reaction volume component concentrations and or stock concentrations Click Print 1 Reaction Setup to print instructions on howto prepare the PCR reactions D Reaction Mix Calculations Sample Dilution Calculations 3 Diluted Sample Concentration 10x for Reaction Mix 5 0 ina uL sil Print Reaction Setup Sample Name Stock Concentration ng uL Sample Volume uL Diluent Volume uL Total Volume of Diluted Sample 4 Liver 100 0 1 0 19 0 20 0 Imprima las instrucciones de la configuraci n de la reacci n Imprima las instrucciones detalladas de la configuraci n de la reacci n y a continuaci n gu rdelas para el Cap tulo 3 Preparaci n de las reacciones de la curva est ndar relativa 1 Haga clic en Print Reaction Setup Imprimir configuraci n de reacci n 2F Set
223. ime PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Pr logo Etiquetas de seguridad en los instrumentos Ubicaciones de El sistema StepOne contiene una advertencia en el lugar que se indica a continuaci n los simbolos de advertencia y AN CUIDADO Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa XV Pr logo Seguridad general del instrumento Seguridad general del instrumento Movimiento y levantamiento del instrumento Movimiento y levantamiento de ordenadores y monitores aut nomos Uso del instrumento Limpieza o descontamina ci n del instrumento XVI S a AS j h ENE PELIGRO DE LESIONES F SICAS Si el instrumento se utiliza de alguna forma que no especifica Applied Biosystems se pueden producir lesiones personales o da os en el instrumento Nerr moverlo y colocarlo el personal o el distribuidor que se especifique en la gu a de preparaci n del emplazamiento correspondiente Si decide levantar o mover el instrumento despu s de instalarlo no intente hacerlo sin la ayuda de otras personas el equipo de traslado adecuado y las t cnicas de elevaci n correctas El levantamiento inapropiado puede causar dolorosas lesiones dorsales que pueden resultar permanentes Dependiendo del peso se podr an necesitar dos personas para mover o levantar un instrumento All PELIGRO DE LESIONES F SICAS El
224. imento de curva est ndar relativa de ejemplo los materiales recomendados experimento de son ejemplo Pantalla Ordering 1 Materials Solicitud de materiales MicroAmp Fast Optical 48 Well Reaction Plate MicroAmp Optical 48 Well Adhesive Film TaqMan Fast Universal PCR Master Mix 2X No AmpErase UNG Ensayo de c myc Hs00153408_m1 RefSeq NM_002467 3 Ensayo de GAPDH Hs99999905_ml RefSeq NM_002046 2 Busque el ensayo diana en la tienda en l nea de Applied Biosystems a b f Aseg rese de que el ordenador est conectado a Internet Haga clic en el campo Enter Gene Name Escriba el nombre del gen escriba c myc y a continuaci n haga clic en Find Assay Buscar ensayo En el cuadro de di logo Find Assay Results Buscar resultados de ensayo seleccione la fila Hs00153408_m1 Haga clic en el campo Enter Gene Name Escriba el nombre del gen escriba GAPDH y a continuaci n haga clic en Find Assay Buscar ensayo En el cuadro de di logo Find Assay Results Buscar resultados de ensayo seleccione la fila Hs99999905_m1 Haga clic en Apply Assay Selection Aplicar selecci n de ensayo 2 Complete el panel Experiment Materials List Lista de materiales del experimento Notas a En el men desplegable Display Visualizaci n seleccione All Items Todos los elementos predeterminada y a continuaci n revise los materiales recomendados Si es necesario utilice la barra
225. in Settings cerebro Opciones de cuantificaci n 2 En el men desplegable Which target do you want to use as the endogenous control relativa Qu diana desea utilizar como control end geno seleccione GAPDH 3 Haga clic en Next Siguiente gt 2C Set Up Relative Quantitation Settings Relative Quantitation Settings Help O Q Instructions Selectthe reference sample and the endogenous control to perform relative quantitation 1 Which sample do you want to use as the reference sample Brain Y 2 Which target do you wantto use as the endogenous control IGAPDH Y Directrices de Cuando dise e su propio experimento de Cr comparativos dise o e Seleccione una muestra de referencia entre las muestras creadas anteriormente Configuraci n de las muestras en la p gina 137 Los resultados de la amplificaci n de las muestras se comparan con los resultados de la amplificaci n de la muestra de referencia para determinar la expresi n relativa e Seleccione un control end geno en los ensayos diana creados previamente Configuraci n de los genes diana en la p gina 135 Los resultados de la amplificaci n del control end geno se utilizan para normalizar los resultados de la amplificaci n del gen diana para corregir las diferencias en la cantidad de molde a adido a cada reacci n Notas 140 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos d
226. inal si desea a adir una fase de espera al final de la reacci n 3 Haga clic en Send to Instrument Enviar al instrumento Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 81 cuantificaci n relativa Cap tulo 4 Realizaci n del experimento de curva est ndar relativa Monitorizaci n de la reacci n Run Method Edit Run Method A Adjust of Cycles Holding Stage Cycling Stage 2 Add Melt Curve Stage to End Number of Cycles 40 i Enable Auto A Starting Cycle 0 Send to Instrument Add Holding Stage to End Legend Data Collection On Data Collection Off A AutoAOn A Auto A Off Nota Si aparece una alerta haga clic en el error para obtener m s informaci n y solucionar el problema tal y como se explica en la ayuda del software StepOne haga clic en 4 en la barra de herramientas o seleccione Help Ayuda gt StepOne Help Ayuda de StepOne Notas 82 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Monitorizaci n remota Cap tulo 4 Realizaci n del experimento de curva est ndar relativa WN Monitorizaci n de la reacci n S1 el instrumento StepOne est conectado a una red puede utilizar la funci n de monitorizaci n remota del software StepOne para ver el progreso de la reacci n a tiempo real desde cualquier ordenador de la red IMPORTANTE
227. ine the range of standard quantities by entering the starting quantity and serial factor Define the standard curve so thatthe range of standard quantities spans the expected range of quantities for the sampla1 sampla 1 3a pr E c myc O sar 0 sar Mens Momo Target Name Enter Starting Quantity Select Serial Factor al e 1 10 Sample 1 Sample1 Sample1 Sample2 Sample2 Sample2 Sample 2 m sar M car M car M c myc i c myc i o myc 1 car O c myc lf200 0 3b Standard Curve Preview Standard Curve Preview for GAPDH Sample 2 J c mye E cme E cme Elcomyw E c mye E o myo H car 200 200 200 2E2 2E1 IS c myc g c myc 5 c myc E c myc 5 c myc E c myc g c myc z 2E0 2 2 0 2 0 2 0 2 0 02 0 02 2E 1 E sar Ej car E sar Ej sar E car Ej sar E car 1 20 20 20 2 200 200 200 Well Count E ca Ej ca Ej car E car E sar El sar E sar 2 0 2 0 2 0 2 0 02 0 02 0 02 m 12 Unknown IS 30 Standard IN 6 Negative Control 0 Empty Si es necesario utilice la barra de desplazamiento para ver el GAPDH y a continuaci n realice los pasos 4a y 4b Directrices de Cuando dise e su propio experimento de curva est ndar relativa dise o e Configure una curva est ndar para cada gen diana de la placa de reacci n Los genes diana se definen previamente en la pantalla Targets Dianas Conf
228. informaci n de ensayo AIF asistente de dise o DNA de muestra 10X Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Glosario Abreviatura de archivo de informaci n de ensayo Assay Information File Para unun gen dianaa diana determinado cualquiera de las diferentes secuencias que aparecen en la poblaci n Segmento de DNA amplificado durante la PCR Etapa del protocolo de termociclado durante el cual se produce la generaci n del amplic n En los experimentos de cuantificaci n los datos de fluorescencia recogidos durante la amplificaci n se muestran en una gr fica de amplificaci n y se utilizan para calcular los resultados Si la amplificaci n est incluida en el proceso del instrumento StepOne para experimentos de genotipado o presencia ausencia los datos de fluorescencia recogidos durante la amplificaci n se muestran en una gr fica de amplificaci n y se pueden utilizar para solucionar problemas Mol cula unida al extremo de 3 de las sondas TaqMan para evitar que el notificador emita una se al de fluorescencia mientras la sonda est intacta Con los reactivos TaqMan se puede utilizar un apantallador no fluorescente de uni n al surco menor de la doble h lice del DNA NFQ MGB Con reactivos SYBR Green no se utiliza ning n apantallador IMPORTANTE Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo TAMRA como not
229. instrumento s lo puede A y PARA A TENC IA No intente levantar o mover el ordenador ni el monitor sin la ayuda de otras personas Dependiendo del peso del ordenador y o el monitor se podr an necesitar dos o m s personas para moverlos Aspectos a tener en cuenta antes de levantar el ordenador y o el monitor e Aseg rese de sujetar el ordenador o el monitor de un lugar seguro y c modo para levantarlos e Aseg rese de que no hay ning n obst culo entre el lugar en el que se encuentra el objeto y su lugar de destino e No levante un objeto a la vez que gira el torso e Mantenga la columna espinal en una posici n neutral mientras levanta el objeto con las piernas e Los participantes deben coordinar las labores de levantamiento y movimiento antes de realizarlas e En lugar de levantar el objeto desde la caja del embalaje incline cuidadosamente la caja hacia un lado y mant ngala fija mientras alguien desliza su contenido hacia fuera Aseg rese de que todas las personas que utilicen el instrumento e Han recibido instrucciones sobre pr cticas de seguridad generales para laboratorios y pr cticas de seguridad generales para el instrumento e Lea y comprenda todas las fichas t cnicas de seguridad de los materiales MSDS aplicables Consulte Acerca de las fichas t cnicas de seguridad de los materiales MSDS en la p gina xvii A q O O_O E OC E E E E E E E SS Ze WENA Antes de utiliz
230. iones de PCR Si va a realizar reacciones de PCR en modo est ndar aseg rese de utilizar una mezcla maestra tipo est ndar en las reacciones de PCR En la RT PCR de 1 paso aseg rese de incluir retrotranscriptasa en las reacciones de PCR y de utilizar un tamp n espec fico Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 147 cuantificaci n relativa R Cap tulo 6 Dise o del experimento de Cy comparativos Solicitud de materiales para el experimento Para obtener m s informaci n e Revise los c lculos de la diluci n de las muestras para cada muestra Si es necesario modifique la concentraci n de muestra diluida incluidas las unidades y la concentraci n de la soluci n de partida Para obtener m s informaci n acerca de e La pantalla Reaction Setup Configuraci n de reacci n acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en y o pulsando F1 e Para los ensayos de Applied Biosystems refi rase a TaqMan Gene Expression Assays Protocol Custom TagMan Gene Expression Assays Protocol Solicitud de materiales para el experimento Acerca del experimento de ejemplo Pantalla Ordering Materials Solicitud de materiales Notas En la pantalla Materials List Lista de materiales revise la lista de materiales que se recomiendan para preparar para la placa de reacci n de PCR Opcionalmente puede solicitar los materiales recom
231. ions Enter identifying information then selectthe type of experiment to design How do you want to identify this experiment Required Experiment Name Comparative CT Example Barcode Optional 123456789 4 2 3 4 User Name Optional Example User Comments Optional A EE A A EEE ESEE KAP What type of experiment do you want to design 5 y Quantitation O Genotyping Presence Absence Design a gene quantitation experiment to determine the amount of target nucleic acid sequence in a sample Directrices de Cuando dise e su propio experimento de Cr comparativos dise o e Escriba un nombre para el experimento que sea descriptivo y f cil de recordar El nombre del experimento se utiliza como nombre de archivo predeterminado del experimento Puede introducir hasta 100 caracteres en el campo Experiment Name Nombre de experimento Nota No se pueden utilizar los siguientes caracteres en en campo Experiment Name Nombre de experimento barra inclinada hacia delante barra inclinada hacia atr s 1 signo mayor que gt signo menor que lt asterisco signo de interrogaci n comillas l nea vertical dos puntos o punto y coma e Utilice MicroAmp Fast Optical 48 Well Reaction Plates MicroAmp Fast 8 Tube Strips o MicroAmp Fast Reaction Tubes with Caps Los consumibles tipo r pido se pueden utilizar con reactivos tipo r
232. ipo de experimento de curva est ndar o Cr comparativos AAC 128 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 6 Dise o del experimento de Cy comparativos un Definici n de las propiedades del experimento 5 Fichas del experimento se muestra una ficha por cada experimento abierto E StepOne v1 0 File Edit Instrument Analysis Tools Help New Experiment g Open B x Close H Send Experiment to Instrument ES Download Experiment from Instrument 4 5 A PrintReport Design your Experiment Type Reagents experiment p ye 2 1A Define Experiment Properties Experiment Properties Help a Q Instructions Enter identifying information then select the type of experiment to design How do you want to identify this experiment Required Experiment Name untitled Barcode Optional User Name Optional Comments Optional What type of experiment do you want to design Design a gene quantitation experiment to determine the amount of target nucleic acid sequence in a sample Y Finish Designing Experiment PY Next gt td li Untitled x Definici n de las propiedades del experimento En la pantalla Experiment Properties Propiedades de experimento escriba la informaci n de identificaci n del experimento y a continuaci n seleccione el tipo de experimento que desea dise
233. ir archivos cuando termine la exportaci n f Haga clic en Start Export Iniciar exportaci n y a continuaci n haga clic en Close Export Tool Cerrar herramienta de exportaci n cuando se le solicite Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 209 cuantificaci n relativa N Ap ndice A Flujos de trabajo alternativos para el experimento ON Flujo de trabajo de exportaci n importaci n 4 Utilice el archivo exportado como molde y cree la configuraci n de placa deseada a Con una aplicaci n de hojas de c lculo por ejemplo el software Microsoft Excel abra el archivo de texto exportado b Sustituya los par metros del archivo de texto seg n convenga Cuando haya terminado guarde el archivo en un formato de texto delimitado por tabuladores IMPORTANTE El archivo de texto debe tener el formato correspondiente al formato de la disposici n de la placa del software StepOne Para obtener m s informaci n acerca del formato de disposici n de la placa acceda a la ayuda haciendo clic en 4 en la barra de herramientas o seleccionando Help Ayuda gt StepOne Help Ayuda de StepOne 5 Si a n no est en la pantalla Home Inicio haga clic en Home Inicio 6 En la columna Set Up Configurar haga clic en Advanced Setup Configuraci n avanzada 7 Informaci n de configuraci n de la importaci n a Seleccione File Archivo gt Import Importar
234. kStart Inicio r pido puede procesar las reacciones en el instrumento sin ninguna informaci n sobre la configuraci n de la placa 1 Prepare las reacciones de PCR a b C d e Prepare el molde Prepare las diluciones de las muestras Prepare la diluci n seriada s lo en experimentos de curva est ndar relativa Prepare la mezcla de reacci n Prepare la placa de reacci n 2 Inicie r pidamente el experimento a Haga doble clic en T acceso directo al software StepOne o seleccione Start Inicio All Programs Todos los programas Applied Biosystems StepOne StepOne v2 0 En la pantalla Run Proceso haga clic en Q QuickStart Inicio r pido Seleccione la ficha Experiment Properties Propiedades del experimento y a continuaci n escriba las propiedades del experimento Seleccione la ficha Run Method Protocolo de termociclado y a continuaci n escriba el volumen de la reacci n y cambie el perfil t rmico seg n convenga 3 Realice el experimento a b C Cargue el instrumento Inicie el proceso Descargue el instrumento 4 Complete la configuraci n de la placa 5 Analice los datos Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 207 cuantificaci n relativa N Ap ndice A Flujos de trabajo alternativos para el experimento Flujo de trabajo de molde Flujo de trabajo de molde Si crea
235. l ser en el interior del instrumento y recomienda proceder con el cuidado correspondiente pp Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de xiii cuantificaci n relativa Pr logo Etiquetas de seguridad en los instrumentos Medio ambiente El siguiente s mbolo se aplica a todos los productos el ctricos y electr nicos de S mbolos en los Applied Biosystems que salieron al mercado europeo despu s del 13 de agosto de 2005 instrumentos de la Uni n Europea S mbolo Descripci n E No tire este producto a la basura municipal normal Cumpla las ordenanzas L1 municipales sobre residuos correspondientes para reducir el impacto do medioambiental de los residuos de equipos el ctricos y electr nicos WEEE Clientes de la Uni n Europea Llame a la oficina de atenci n al cliente local de Applied Biosystems para informarse sobre la recogida de equipos y el reciclaje Consulte en http www appliedbiosystems com un listado de oficinas de atenci n al cliente Etiquetas de seguridad en los instrumentos XIV Los siguientes s mbolos de PRECAUCI N ADVERTENCIA y PELIGRO pueden aparecer en los instrumentos de Applied Biosystems en combinaci n con los s mbolos de seguridad que se han descrito en la secci n anterior Ingl s Franc s CAUTION Hazardous chemicals Read the Material Safety Data Sheets MSDSSs before handling CAUT
236. l Time PCR System para experimentos de 135 cuantificaci n relativa Cap tulo 6 Dise o del experimento de Cy comparativos Configuraci n de los genes diana 4 Haga clic en Next Siguiente gt Nota En todos los genes diana deje en blanco el campo Optional Enter Gene Name Opcional Escriba el nombre del gen Puede buscar el identificador del gen ensayo para solicitar los materiales consulte Solicitud de materiales para el experimento en la p gina 148 2A Set Up Targets Targets Help B T Instructions Enterthe number of targets to quantify in the reaction plate then set up the assay for each target Set Up Targets Required y How many targets do you want to quantify in the reaction plate B 2 For each target assay in the reaction plate enter a target name selectthe reporter and quencher to use to detectthe target and selecta target color Optionally enter a gene name find Applied Biosystems gene expression assays then select an assay to fill in the Assay ID 2 3 rra TP 53 FAM v NFQ MGB v E y GAPDH FAM V NFO MGB Y y Enter Target Name Reporter Quencher Color Optional Enter Gene Name and Click Find Assay ID Directrices de Cuando dise e su propio experimento de C comparativos dise o e Identifique cada ensayo diana con un nombre y un color nicos Puede introducir hasta 100 caracteres en el campo Target Name Nombre de gen diana
237. l gen diana en pocillos que contienen una muestra con cantidades de gen diana desconocidas En los experimentos de genotipado la tarea del ensayo de SNP en pocillos que contienen una muestra con un genotipo desconocido En los experimentos de presencia ausencia la tarea del gen diana en pocillos que contienen una muestra en la que no se conoce la presencia del gen diana La secuencia de cido nucleico que se desea amplificar y detectar En los experimentos de curvas est ndar y curvas est ndar relativas conjunto de normas que contienen una serie de cantidades conocidas La diluci n seriada se prepara por medio de est ndares de diluci n en serie Por ejemplo la soluci n de partida est ndar se utiliza para preparar el primer punto de diluci n el primer punto de diluci n se utiliza para preparar el segundo punto de diluci n etc Los vol menes necesarios para preparar una diluci n seriada se calculan mediante el n mero de puntos de diluci n el n mero de r plicas est ndar la cantidad inicial el factor de diluci n y la concentraci n del est ndar en la soluci n de partida V ase tambi n curva est ndar Reactivo utilizado para diluir una muestra o est ndar antes de a adirlo a la reacci n de PCR El disolvente puede ser agua o un tamp n Ilustraci n de la rejilla de 6 x 8 pocillos y contenido asignado a la placa de reacci n En el software puede utilizar la disposici n de la placa como una herramienta de selecci n
238. la rampa se define como un porcentaje En el caso del paso de la curva de disociaci n la rampa se define como un incremento de la temperatura En el gr fico del perfil t rmico la rampa se indica por medio de una l nea diagonal Combinaci n de la muestra y el ensayo diana en una reacci n de PCR En el asistente de dise o cada reacci n de PCR s lo puede contener una muestra y un ensayo diana Combinaci n de la muestra y el ensayo SNP en una reacci n de PCR Cada reacci n de PCR s lo puede contener una muestra y un ensayo SNP Los componentes de la reacci n de PCR que se est utilizando para amplificar el gen diana y detectar la amplificaci n Tipos de reactivos utilizados en el sistema StepOne e Reactivos TaqMan e Reactivos SYBR Green e Otros reactivos Componente de reacci n de PCR que consta de dos cebadores que est n dise ados para amplificar el gen diana y el fluorocromo SYBR Green para detectar DNA de doble cadena Componentes de reacci n de PCR que constan de cebadores dise ados para amplificar el gen diana y una sonda TaqMan dise ada para detectar la amplificaci n del gen diana Acci n que realiza el software durante el an lisis para quitar uno o varios pocillos de un an lisis posterior si se aplica un aviso espec fico al pocillo Proceso durante la utilizaci n del instrumento en el que un componente del instrumento detecta datos de fluorescencia en cada pocillo de la placa de reacci n El ins
239. la reacci n 20 ia ii dd a de ll aa din acia 73 Monitorizaci n de la reacci n oooooocoononooonara eo 76 Descarga de la placa de reacci n y transferencia de datos 87 Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar AU EE EA A E E E E 91 Resumen del Cap tulo o o oo Nee Ad AT AA ae A AE BE 92 Secci n 5 1 Revisi n de los resultados 22a ae aa aa ea aa ea ana aa nao 93 ANA lISIS Ael experiMento o ooooooorrr dE RE a S 94 Visualizaci n de la curva est ndar Lo anana aaaea e 100 Revisi n de la gr fica de amplificaci n e ue e aana aaea e ee ee ee ADO 103 Revisi n de la gr fica de expresi n g nica y la tabla de pocillos 108 Presentaci n de los GASTOS o oooooonornr RABE R ERRA A ERRA 111 Secci n 5 2 Soluci n de problemas ocococcococ ae a aa aa Rao 113 Revisi n de las opciones de an lisis nnana aeaa 114 Revisi n del resmen OG ositos din irradia ddr AA dotes 116 Omisi n de pocillos para el an liSiS nnana naaa 118 Revisi n de la gr fica multicoMponente 6 ue e a e aaea eaea 120 Revisi n de la gr fica de datos brutos ue ananasa 122 IV Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 6 Cap tulo 7 Cap tulo 8 Cap tulo 9 Dise o del experimento de Cr comparativos 125 Resumen del Cap O ds od a E ocio 126 Creaci n de U
240. lativa Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa m Revisi n de la gr fica de amplificaci n Si el experimento no cumple las directrices anteriores solucione los problemas de la siguiente forma e Omita pocillos consulte Omisi n de pocillos para el an lisis en la p gina 118 O e Vuelva a realizar el experimento Para obtener m s Para obtener m s informaci n acerca de informaci n e La pantalla Standard Curve Curva est ndar acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1 e La eficiencia de la amplificaci n consulte Amplification Efficiency of TaqMan Gene Expression Assays Application Note Revisi n de la gr fica de amplificaci n En la pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n se muestra la amplificaci n de todas las muestras de los pocillos seleccionados Hay disponibles tres gr ficas e AR vs Cycle AR vs ciclo ARn es la variaci n de la se al de fluorescencia normalizada generada en cada ciclo de la reacci n de PCR y son los datos a partir de los cuales se calcula Cy En esta gr fica AR se muestra en funci n del n mero de ciclo La gr fica sirve para identificar y examinar las amplificaciones irregulares y para ver los valores del umbral y l nea basal de la reacci n e R vs Cycle R vs ciclo Rn es la fluorescencia de fluorocromo del notificador normalizada En esta gr fica Rn se representa en funci n del n mero
241. le Legend MA rox BN ran Wells I 18 Unknown 6 Negative Control 24 Empty Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 201 cuantificaci n relativa Ko Cap tulo 9 An lisis del experimento de Cy comparativos Revisi n de la gr fica multicomponente Multicomponent Plot Plot Settings Plot Color Dye 250 000 7 225 000 7 200 000 7 175 000 150 000 7 125 000 Fluorescence 100 000 75 000 50 000 25 000 Legend B rox ran Multicomponent Plot 0 12 14 16 8 2 2 2 BA Drz YX 3 3 WO Q Seleccione de uno en uno los pocillos de control negativo y compruebe la amplificaci n En el experimento de ejemplo no hay amplificaci n en los pocillos de control negativo lt View Plate Layout View Well Table Select Wells With Target Y Select Item Y A i 1 resa CTU mrs M car M car M car M esa M rss reso cran CABRIO CEROT CTAR 68 CTA CTAA0 CTE M sar CT 24 88 m car M car M rrsa M s3 M rss 1 car 1 car Cr 24 83 CT 24 95 CTF Cr 30 CTED CTSS Cr 23 39 1 car CT 23 39 Cycle wells I 18 Unknown 7 6 Negative Control 24 Empty Directrices de Cuando analice su propio experimento de C comparativos busque an lisis Para obtener
242. lic en RETRIEVE DOCUMENTS Recuperar documentos al final de la lista de documentos c Introduzca la informaci n requerida d Haga clic en View Deliver Selected Documents Now Ver enviar ahora los documentos seleccionados Nota Para obtener las MSDS de productos qu micos que no distribuye Applied Biosystems p ngase en contacto con el fabricante del producto qu mico xviii Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Pr logo Seguridad de residuos qu micos Seguridad de residuos qu micos Peligro de residuos qu micos Directrices de seguridad de residuos qu micos n A a ABR cumano RESIDUOS PELIGROSOS Para obtener informaci n acerca de su manipulaci n y eliminaci n consulte las fichas t cnicas de seguridad de los materiales y las normativas locales AN CA ZA aoverrencia PELIGRO DE RESIDUOS QUIMICOS Los residuos producidos por los instrumentos de Applied Biosystems son potencialmente peligrosos y pueden causar lesiones enfermedades o la muerte WIN PELIGRO DE ALMACENAMIENTO QU MICO No recoja ni almacene nunca los residuos en un envase de cristal pues corre el riesgo de que se rompa o se resquebraje Las botellas de reactivos y de residuos pueden agrietarse y presentar fugas Cada botella de residuos deber asegurarse en un recipiente de seguridad de polietileno de baja densidad con la tapa fija y las a
243. lied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 3 Preparaci n de las reacciones de la curva est ndar relativa No Preparaci n de la diluci n seriada J Preparaci n de la 1 Etiquete un tubo de microcentr fuga diferente para cada est ndar diluci n seriada e GAPDH Std 1 para el ensayo de lt GAPDH Std 2 GAPDH e GAPDH Std 3 e GAPDH Std 4 e GAPDH Std 5 2 A ada el volumen de agua requerido disolvente a cada tubo vac o Volumen de disolvente que se debe a adir uL Tubo Nombre de est ndar 1 GAPDH Std 1 5 0 GAPDH Std 2 9 0 GAPDH Std 3 9 0 GAPDH Std 4 9 0 ORO GAPDH Std 5 9 0 3 Prepare la diluci n 1 en el tubo GAPDH Std 1 a Agite la soluci n de partida entre 3 y 5 segundos y a continuaci n centrifugue brevemente el tubo b Con una punta de pipeta nueva a ada 5 0 uL de soluci n de partida al tubo GAPDH Std 1 c Agite el tubo Std 1 entre 3 y 5 segundos y a continuaci n centrif guelo brevemente 4 Prepare la diluci n 2 en el tubo GAPDH Std 2 a Con una punta de pipeta nueva a ada 1 0 uL de diluci n al tubo GAPDH Std 2 b Agite el tubo Std 2 entre 3 y 5 segundos y a continuaci n centrif guelo brevemente 5 Prepare la diluci n 3 en el tubo GAPDH Std 3 a Con una punta de pipeta nueva a ada 1 0 uL de diluci n 2 al tubo GAPDH Std 3 b Agite el tubo Std 3 entre 3
244. lisis a tiempo real e Detecci n cualitativa de secuencias de cidos nucl icos de inter s dianas mediante an lisis de punto final y curva de disociaci n Acerca de la El sistema StepOne recoge datos de fluorescencia brutos en diferentes puntos de una recogida de PCR dependiendo del tipo de reacci n que realice datos Tipo de proceso Punto de recogida de datos Procesos a Curva est ndar El instrumento recoge datos despu s de cada paso tiempo real de extensi n de la PCR Curva est ndar relativa C comparativos AAC Procesos a Genotipado El instrumento recoge datos antes y despu s de la punto final PCR En los experimentos de genotipado el software StepOne tambi n puede recoger datos durante la reacci n tiempo real que pueden resultar de ayuda para solucionar problemas Presencia ausencia El instrumento recoge datos antes y despu s de la PCR Con independencia del tipo de reacci n que se realice un punto de recogida de datos o una lectura consta de tres fases 1 Excitaci n el instrumento StepOne ilumina todos los pocillos de la placa de reacci n para excitar los fluorocromos correspondientes 2 Emisi n la ptica del instrumento StepOne recoge la fluorescencia residual emitida en todos los pocillos de la placa de reacci n La imagen resultante captada por el dispositivo s lo consta de la luz emitida en un estrecho rango de longitudes de onda 3 Recogida el inst
245. llos An lisis y Amplification Plot Gr fica de amplificaci n Nota Si en la pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n no aparece ning n dato haga clic en Analyze Analizar 2 En la pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n seleccione C vs Well Cr vs pocillo en el men desplegable Plot Type Tipo de gr fica 3 Seleccione la ficha View Well Table Ver tabla de pocillos 4 En la tabla de pocillos a En el men desplegable Group By Agrupar por seleccione Replicate R plica b F jese si en el grupo de r plicas hay alg n valor at pico aseg rese de que est n marcados con un aviso En el experimento de ejemplo el pocillo D1 es un valor at pico c Active la casilla de verificaci n Omit Omitir junto al pocillo D1 Notas 118 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa n Omisi n de pocillos para el an lisis 3 Amplification Plot lt View Plate Layout View Well Table Plot Settings gt Select Wells With Selectltem w i Select Item 4 Plot Type CT vs Well yi Graph Type linea Color Plot By Wen vw a 2 PaE E Well Omit Flag Sample Na TargetName Task Amplification Plot EI c myc 23 345205
246. los velocidad de la rampa 22 24 131 133 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 231 cuantificaci n relativa ndice 232 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Worldwide Sales and Support Applied Biosystems vast distribution and service network composed of highly trained support and applications personnel reaches 150 countries on six continents For sales office locations and technical support please call our local office or refer to our Web site at www appliedbiosystems com Applied Biosystems is committed to providing the world s leading technology and information for life scientists Headquarters 850 Lincoln Centre Drive Foster City CA 94404 USA Phone 1 650 638 5800 Toll Free In North America 1 800 345 5224 Fax 1 650 638 5884 06 2010 Applied Biosystems www appliedbiosystems com N mero de referencia 4377742 Rev B
247. mber of sample target reaction replicates enter sample names then selectthe sample target Required View Plate Layout Arrange Plate by Rows Y Liver Liver A O esa rss Drs 0 ca Joa E ca Ms T reso Liver Liver Liver Liver Kidney Kidney Kidney Kidney na m rs Moa Moa M ca M s3 M rss M ts 1 ca Kidney Kidney Brain Brain m sa m ca M rss 1 1rsa Brain Brain Brain Brain m rs M esa Moa M ca O 1 How many samples do you want to testin the reaction plate 3 o How many replicates do you need _ 3 For each sample in the reaction plate enter a sample name and select a sample co Enter Sample Name Color Which sample target reactions do you want to set up 6 Specify Sample Target Reactions T 1 18 Unknown Directrices de Cuando dise e su propio experimento de C comparativos dise o 100 caracteres en el campo Sample Name Nombre de muestra e Identifique cada muestra con un nombre y un color nicos Puede introducir hasta e Escriba el n mero de reacciones id nticas r plicas que desea configurar Applied Biosystems recomienda tres r plicas para cada reacci n de muestra e El software incluye autom ticamente tres controles negativos para cada ensayo diana e Seleccione la combinaci n de reacciones de muestra diana deseada Seleccione All Sample Target Reactions
248. ment Name Local Instrument Status Block Type Serial Number LED C Enable Run Notifications e D Notification Settings 48 Well Block 100010001 Temperature Plot Current Temperatures Sample 25 0 Cover 105 0 Block 25 0 View Temperature Ml Sampie M Cover H Brock Para monitorizar el instrumento StepOne de manera remota 1 En el software StepOne seleccione Instrument Instrumento Remote Monitor Supervisor remoto 2 En la barra de navegaci n seleccione el instrumento StepOne Notas Si en la barra de navegaci n no aparece el instrumento StepOne Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa 83 ANA Cap tulo 4 Realizaci n del experimento de curva est ndar relativa Monitorizaci n de la reacci n a Haga clic en Add Instrument A adir instrumento b Haga clic en el campo Instrument Name Nombre de instrumento y a continuaci n escriba el nombre del instrumento c Haga clic en el campo Host Name Nombre de host y a continuaci n introduzca la direcci n IP del instrumento d Haga clic en Save amp Exit Guardar y salir Add Instrument a Enter an instrument name select the instrument type then enter the host name 4 Henid Click Save amp Exit to save the instrument profile and return to the remote monitor q 2b L instrument
249. mento de directo al software StepOne o seleccione Start Inicio All Programs Todos los ejemplo programas Applied Biosystems StepOne gt StepOne v2 0 2 En la pantalla Home Inicio haga clic en Open Abrir 3 En el cuadro de di logo Open Abrir despl cese hasta la carpeta experiments experimentos predeterminada 4 Haga doble clic en Comparative Cr Example Ejemplo de Cy comparativos para abrir el archivo del experimento de ejemplo que ha creado en el Cap tulo 6 E StepOne v1 0 ek File Edit Instrument Analysis Tools Help 2 sa Now Evnsrimant w r Open H i X a Print Report Run Analyze 3 Sun experiments v 5 6 6 A examples 4 File name Comparative CT Example eds My Network Places Files oftype All SDS Files eds edt sds Save current display as the default www appliedbiosystems com A Home Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 169 cuantificaci n relativa an Cap tulo 8 Realizaci n del experimento de Cy comparativos ma Preparaci n de la reacci n Carga de la placa ANET PELIGRO DE LESIONES F SICAS Durante el uso del de reacci n instrumento la temperatura del bloque puede superar los 100 C Si el instrumento se ha utilizado recientemente mantenga las manos alejadas de l hasta que el bloque alcance la temperatura ambiente IMPORTANTE Lleve guantes sin polvo pa
250. mentos de 113 cuantificaci n relativa cia Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa Revisi n de las opciones de an lisis Revisi n de las opciones de an lisis El cuadro de di logo Analysis Settings Opciones de an lisis muestra las opciones de an lisis del ciclo umbral C los avisos la cuantificaci n relativa y las opciones avanzadas Si las opciones de an lisis predeterminadas del software StepOne no son adecuadas para el experimento puede cambiarlas en el cuadro de di logo Analysis Settings Opciones de an lisis y a continuaci n volver a analizar el experimento Acerca del En el experimento de curva est ndar relativa de ejemplo se utilizan las opciones de experimento de an lisis predeterminadas sin ning n cambio ejemplo Revisi n de las 1 Enel panel Experiment Menu Men del experimento seleccione Analysis opciones de An lisis an lisis 2 Haga clic en Analysis Settings Opciones de an lisis para abrir el cuadro de di logo Analysis Settings Opciones de an lisis 3 En el experimento de ejemplo se utilizan opciones de an lisis para cada ficha e Cr Settings Opciones de Cr e Flag Settings Opciones de avisos e Relative Quantification Settings Opciones de cuantificaci n relativa e Advanced Settings Opciones avanzadas Relative Quantitation Settings Advanced Settings T Review the default settings for analysis of targets in this experiment To edit the default se
251. mpo Color Configure la muestra 2 a Haga clic en el campo Enter Sample Name Escriba nombre de muestra y a continuaci n escriba Kidney Ri n b Deje la opci n predeterminada en el campo Color Configure la muestra 3 a Haga clic en el campo Enter Sample Name Escriba nombre de muestra y a continuaci n escriba Brain Cerebro b Deje la opci n predeterminada en el campo Color Seleccione All Sample Target Reactions Todas las reacciones de muestra diana para configurar todos los genes diana de todas las muestras En el panel Well Count N mero de pocillos confirme que hay e 18 pocillos desconocidos M e 24 pocillos vac os Nota El software incluye autom ticamente tres controles negativos para cada ensayo diana Los pocillos de control negativo se muestran en la disposici n de la placa pocillos Al a A6 En la ficha View Plate Layout Ver disposici n de la placa en el men desplegable Arrange Plate by Ordenar placa por seleccione Rows Filas predeterminado Haga clic en Next Siguiente gt 138 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 6 Dise o del experimento de Cy comparativos Configuraci n de las muestras 2B Set Up Samples E instructions reactions to set up Set Up Samples Samples Help Enter the number of samples to test in the reaction plate enter the nu
252. n m todo C comparativos AACr 220 Coeficiente de regresi n calculado a partir de la l nea de regresi n de la curva est ndar La intersecci n y indica el ciclo umbral esperado C para una muestra con una cantidad igual a 1 por ejemplo 1 ng uL Abreviatura de control positivo interno Internal Positive Control Adem s en los experimentos de presencia ausencia es la tarea del gen diana de IPC en pocillos que contiene el molde de IPC En los experimentos de presencia ausencia tarea asignada al gen diana de IPC en los pocillos que contienen un agente de bloqueo de IPC en lugar de una muestra V ase tambi n pocillos de IPC bloqueados por control negativo Llamada de presencia ausencia cuando el control interno positivo IPC es correcto Se utiliza en los experimentos de genotipado y presencia ausencia Es la parte del proceso del instrumento que se produce despu s de la amplificaci n En los experimentos de genotipado los datos de fluorescencia que se recogen durante la lectura a punto final se muestran en la gr fica de discriminaci n de alelos y se utilizan para asignar genotipos En los experimentos de presencia ausencia los datos de fluorescencia que se recogen durante la lectura a punto final se muestran en la gr fica de presencia ausencia y se utilizan para detectar la presencia o ausencia de la diana Se utiliza en los experimentos de genotipado y presencia ausencia Es la parte del proceso del instrumento qu
253. n Cebador reverso Los reactivos Taq Man utilizan una sonda Cebador directo Qin rr qH Molde de cDNA b Molde desnaturalizado e hibridaci n de los componentes del ensayo ETAT Leyenda 3 El q AAA Por reno Cebador aleatorio o Fluorocromo Sonda E E FAMTM h PERT G QQ as e ebador directo Ne W Apantallador X Na L i e y 168 Ligando de uni n 3 5 al surco menor c Generaci n de se al G AmpliTaq Golde DNA Polymerase 3 5 mr mT gumm MENINA Sonda e 4 A x Cebador reverso gt Cebador Cebador directo y o i Mea AN A tua 5 Molde AN Cebador extendido Reactivos SYBR Green Descripci n Los reactivos SYBR Green utilizan el fluorocromo SYBRY Green que se une a DNA de doble cadena y permite detectar productos de PCR cuando se acumulan durante los ciclos de la reacci n Ventajas e Econ mico no se necesita una sonda e Permite que los an lisis de curvas de fusi n midan la Tm de todos los productos de PCR e Se puede utilizar para la RT PCR de 1 o 2 pasos Limitaciones Se une de manera no espec fica a todas las secuencias de DNA de doble cadena Para evitar se ales positivas falsas compruebe la formaci n de un producto no espec fico utilizando un gel de agarosa o las curvas de a DNA de doble cadena considerablemente DIRECTO o Paso 3 Polimerizaci n 8 o Durante la extensi n los cebadores O O se hibridan y se genera el
254. n de los m todos y materiales nnan aaan a 22 Configuraci n de los genes diana e e e ee ee ee ee 25 Configuraci n de los est ndares anana anaa ee ee 28 Configuraci n de las muestras nananana anae 30 Configuraci n de las opciones de cuantificaci n relativa o o 32 Configuraci n del protocolo de termociclado o ooooonoreoooo 33 Revisi n de la configuraci n de la reacci n o ooooconononononaana nm 35 Solicitud de materiales para el experimento ococoocononono nara 43 Finalizaci n del flujo de trabajo del asistente de dise o o ooooooo ooo 46 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de lii cuantificaci n relativa Cap tulo 3 Preparaci n de las reacciones de la curva est ndar relativa e ee ee diera 49 Resumen der Caprulo irradia a 50 Preparaci n del Molde o ooooocoreona E NESE E NS AEAT de RD 51 Preparaci n de las diluciones de las muestras a e unauna naaa 53 Preparaci n de la diluci n seriada Lee e e e aaa 55 Pr paraci n dela mezcla de reacci n sido deis aid adi 58 Preparaci n de la placa de reacci n ei e e ee ea e ee ee A ERA ee 61 Cap tulo 4 Realizaci n del experimento de curva est ndar FUE PP O A AE 67 Resumenddelcaprulo autre 68 Preparaci n de la reacci n ini rka resd renine in ENEA EDEA do RADA A 69 Opcional Activaci n de las notificaciones ee e 71 Mco de
255. n nuevo experimento o ooooooonon ee e eo 127 Definici n de las propiedades del experimento o ooooooooooononoo 129 Definici n de los m todos y materiales o oooooooooroono non 131 Configuraci n de los genes diana o o ooococoononn ea ee ae eo 135 Configuraci n de las muestras de e oaaae 137 Configuraci n de las opciones de cuantificaci n relativa 140 Configuraci n del protocolo de termociclado na nn aana aa aaaea 141 Revisi n de la configuraci n de la reacci n ooooconononononanao o 142 Solicitud de materiales para el experimento o ooococononononnnn mos 148 Finalizaci n del flujo de trabajo del asistente de dise o o oooooo 152 Preparaci n de las reacciones de C COMPArativOS cuina a aa 155 Resumen del Cap tuUlO o ooooonorono ne 156 Preparaci n del Molde ica AA 157 Preparaci n de las diluciones de las muestras oooooooonononannoo 158 Preparaci n de la mezcla de reacci n nannaa aaaea ra 160 Preparaci n de la placa de reacci n ooooooononannono nn 163 Realizaci n del experimento de Cr comparativos 167 Resumen del Cap tUlO oooooooonenon DE AREA DERA ASTA 168 Preparaci n dela reaccI N ali ES EA A A a a e dara 169 Realizaci n del experiMento daresi pua a aa a E E IA a RO AA EDADE a 171 An lisis del experimento de Cr comparativos 173 Resumen del CapruUlO ira ciar
256. n total de la reacci n Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 143 cuantificaci n relativa Cap tulo 6 Dise o del experimento de Cy comparativos Revisi n de la configuraci n de la reacci n 2E Set Up Reaction Setup gt Reaction Mix Calculations Q Instructions reactions If needed editthe reaction volume excess reaction volume compcnent concentrations and or stock concentrations Click Print Reaction Setup to print Reaction Setup Help For each target assay in the reaction p ate selectthe assay type if using TaqlAan reagents then review the calculatec volumes for preparing the samples and PCR instructions on how to prepare the PCR reactions 1 Reaction Mix Calculations Sarnple Dilution Calculations gt f me Assay Type Inventoried Made to Order Y Reaction Volume Per Well 20 uL Excess Reaction Volume 10 Print Reaction Setup Reactions for TP53 dn 6b Master Mix Concentration 2 0 x Assay Mix Concentration 20 0 x Volume UL for 1 Reaction 6c Complete la ficha Reaction Mix Calculations C lculos de la mezcla de reacci n para el ensayo de GAPDH 1 Seleccione la ficha Reaction Mix Calculations C lculos de la mezcla de reacci n predeterminada 2 En el panel Select Target Seleccionar diana seleccione GA
257. na para configurar de uno en uno los genes diana que se van a amplificar en cada muestra Nota En el asistente de dise o cada reacci n de PCR s lo puede contener una muestra y un ensayo diana Para obtener m s Para obtener m s informaci n acerca de la pantalla Samples Muestras acceda a la informaci n ayuda del software StepOne haciendo clic en 3 o pulsando F1 Configuraci n de las opciones de cuantificaci n relativa En la pantalla Relative Quantitation Settings Opciones de cuantificaci n relativa seleccione la muestra de referencia y el control end geno para realizar la cuantificaci n relativa Acerca del En el experimento de curva est ndar relativa de ejemplo experimento de e El tejido del ri n se utiliza como muestra de referencia ejemplo e GAPDH se utiliza como control end geno Pantalla Relative 1 En el men desplegable Which sample do you want to use as the reference sample Quantitation Qu muestra desea utilizar como muestra de referencia seleccione Kidney Settings Ri n Opciones de cuantificaci n 2 En el men desplegable Which target do you want to use as the endogenous control relativa Qu diana desea utilizar como control end geno seleccione GAPDH 3 Haga clic en Next Siguiente gt Notas 32 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 2 Dise o del experimento de cu
258. nce la temperatura ambiente Nota Cuando el instrumento StepOne complete una reacci n el sistema guardar los detalles en el historial de reacciones que permanece en el sistema hasta que el sistema completa otro proceso 1 Cuando aparezca la pantalla Run Report Informe de proceso en la pantalla t ctil del instrumento StepOne toque 2 Abra la bandeja del instrumento 3 Saque la placa de reacci n del bloque 4 Cierre con cuidado la bandeja del instrumento p See FS e sere kk f 7 rottame NI riii Tr IMPORTANTE No apague el instrumento StepOne despu s de una reacci n El instrumento activa autom ticamente un modo de hibernaci n cuando no se est utilizando Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 87 cuantificaci n relativa as Cap tulo 4 Realizaci n del experimento de curva est ndar relativa _ Descarga de la placa de reacci n y transferencia de datos Selecci n de un m todo de transferencia de datos Transferencia de datos conectada Transferencia de datos remota Notas Transfiera el experimento al ordenador para analizarlo de acuerdo con la disposici n del sistema StepOne Disposici n Descripci n Consulte Conectada El cable del sistema StepOne conecta el Transferencia de ordenador al instrumento StepOne datos conectada m s abajo Aut noma El ordenad
259. ncias de PCR del gen diana y el control end geno sean relativamente equivalentes e Menor uso de reactivos e M s espacio disponible en la placa de reacci n Opciones de la Alrealizar una PCR a tiempo real puede elegir entre Notas PCR r e PCR en singleplex y en multiplex m s abajo e RT PCR de 1 y 2 pasos p gina 7 Curvaest ndar Se utiliza una curva est ndar Es el experimento que requiere Se debe crear una curva relativa para determinar el cambio de menos validaci n porque las est ndar para cada gen diana lo expresi n de un gen diana en eficiencias de PCR del gen diana que exige m s reactivos y m s una muestra en relaci n con el y el control end geno no tienen espacio en la placa de reacci n mismo gen diana en una que ser equivalentes muestra de referencia Es ideal para los ensayos que tienen una eficiencia de PCR por debajo de la ptima C Se utilizan f rmulas aritm ticas e Los niveles relativos de e Los ensayos que no son ptimos con una eficiencia de PCR baja pueden producir resultados imprecisos e Antes de utilizar el m todo de C comparativos Applied Biosystems recomienda determinar si las eficiencias de PCR del ensayo diana y el ensayo de control end geno son aproximadamente iguales Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 1 Introducci n EM Acerca de los expe
260. nfigure la cuantificaci n relativa 7 Configure el protocolo de termociclado 8 Revise la configuraci n de la reacci n 9 Solicite materiales para el experimento 4 O Finalice el flujo de trabajo del asistente de dise o v Preparaci n de las reacciones Cap tulo 7 Prepare el molde Prepare las diluciones de las muestras 3 Prepare la mezcla de reacci n para cada ensayo diana 4 Prepare la placa de reacci n N v Realizaci n del experimento Cap tulo 8 Prepare la reacci n Active las opciones de notificaci n Inicie la reacci n Monitorice la reacci n Descargue el instrumento y transfiera los datos MEAR v 2 3 4 5 Secci n 2 Soluci n de problemas 1 2 3 An lisis del experimento Cap tulo 5 Secci n 1 Revisi n de los resultados da Analice Revise la pantalla Standard Curve Curva est ndar Revise la pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n Revise la pantalla Gene Expression Plot Gr fica de expresi n g nica o la tabla de pocillos Presente los datos Revise las opciones de an lisis ajuste la l nea basal y el umbral Revise la pantalla QC Summary Resumen QC Omita pocillos Revise la pantalla Multicomponent Plot Gr fica multicomponente Revise la pantalla Raw Data Plot Gr fica de datos brutos An lisis del experimento Cap tulo 9 Secci n 1 Revisi n de los re
261. nte 2 horas para completar una reacci n si utiliza reactivos est ndar para las reacciones de PCR incluidos reactivos SYBR Green y reactivos TaqMan est ndar e Seleccione el molde de PCR apropiado Seleccione cDNA complementary DNA cDNA DNA complementario si va a realizar una RT PCR de 2 pasos y ya ha realizado la retrotranscripci n para convertir el RNA en cDNA Se a ade DNA complementario a las reacciones de PCR Seleccione RNA si va a realizar una RT PCR de 1 paso Se a ade el RNA o mRNA total a las reacciones de PCR Seleccione gDNA genomic DNA gDNA DNA gen mico si ya ha extra do el gDNA de un tejido o una muestra Se a ade DNA gen mico purificado a las reacciones de PCR Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 133 cuantificaci n relativa mr Cap tulo 6 Dise o del experimento de Cy comparativos G ar i Definici n de los m todos y materiales Para obtener m s Para obtener m s informaci n acerca de informaci n e La pantalla Methods amp Materials M todos y materiales acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1 e La determinaci n de las eficiencias de PCR acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en 3 o pulsando F1 En la ayuda realice la b squeda de la siguiente manera a Haga clic en la ficha Search Buscar b Escriba PCR efficiency Eficiencia de PCR c Hag
262. nte estables Haga clic en el campo How many targets do you want to quantify in the reaction plate Cu ntas dianas desea cuantificar en la placa de reacci n y a continuaci n escriba 2 Nota El n mero de filas de la tabla de ensayos diana se actualiza con el n mero que escriba Active la casilla de verificaci n Set Up Standards Configurar est ndares para configurar est ndares para ambos ensayos diana Nota La casilla de verificaci n Set Up Standards Configurar est ndares est activada de manera predeterminada Configure el ensayo Target 1 Diana 1 a Haga clic en la celda Enter Target Name Escriba nombre de gen diana y a continuaci n escriba c myc b En el men desplegable Reporter Notificador seleccione FAM predeterminado Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 25 cuantificaci n relativa n Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa Configuraci n de los genes diana C En el men desplegable Quencher Apantallador seleccione NFQ MGB predeterminado d Deje la opci n predeterminada en el campo Color 4 Configure el ensayo Target 2 Diana 2 a Haga clic en la celda Enter Target Name Escriba nombre de gen diana y a continuaci n escriba GAPDH b En el men desplegable Reporter Notificador seleccione FAM predeterminado C En el men desplegable Quencher Apantallador
263. nto y a continuaci n escriba 3 Defina el rango de cantidades est ndar para el ensayo de c myc a Haga clic en el campo Enter Starting Quantity Escriba cantidad inicial y a continuaci n escriba 200 b En el men desplegable Select Serial Factor Seleccionar factor de diluci n seleccione 1 10 Defina el rango de cantidades est ndar para el ensayo de GAPDH a Haga clic en el campo Enter Starting Quantity Escriba cantidad inicial y a continuaci n escriba 200 b En el men desplegable Select Serial Factor Seleccionar factor de diluci n seleccione 1 10 Revise el panel Standard Curve Preview Vista previa de la curva est ndar para cada ensayo La curva est ndar tiene los siguientes puntos 200 20 2 0 2 y 0 02 Haga clic en Next Siguiente gt 28 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa ru Configuraci n de los est ndares 2B Set Up Standards Standards Help E Instructions Enterthe number of points and replicates for all standard curves in the reaction plate For each standard curve enter the starting quantity and selectthe serial factor Set Up Standards Required j How many points do you need for each standard curve 5 How many replicates do you need for each point 13 For each standard curve def
264. nto de Cr comparativos de ejemplo experimento de e Se utilizan tres muestras cDNA preparado a partir de RNA total aislado de h gado ejemplo ri n y cerebro Las muestras contienen cantidades desconocidas de TP53 diana y del gen GAPDH control end geno e Se utilizan tres r plicas Las r plicas son reacciones id nticas que contienen componentes y vol menes id nticos e Se utilizan seis controles negativos Las reacciones de control negativo contienen agua en lugar de la muestra y no se deber an amplificar El software incluye autom ticamente tres controles negativos para cada ensayo diana Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 137 cuantificaci n relativa ue Cap tulo 6 Dise o del experimento de Cy comparativos Configuraci n de las muestras Pantalla Samples 1 Muestras Notas Haga clic en el campo How many samples do you want to test in the reaction plate Cu ntas muestras desea probar en la placa de reacci n y a continuaci n escriba 3 Nota El n mero de filas de la tabla de las muestras se actualiza con el n mero que escriba Haga clic en el campo How many replicates do you need Cu ntas r plicas necesita y a continuaci n escriba 3 Configure la muestra 1 a Haga clic en el campo Enter Sample Name Escriba nombre de muestra y a continuaci n escriba Liver H gado b Deje la opci n predeterminada en el ca
265. o 9 Fin del experimento Notas 126 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 6 Dise o del experimento de Cy comparativos ms Creaci n de un nuevo experimento Creaci n de un nuevo experimento Cree un experimento nuevo con el asistente de dise o del software StepOne Creaci n de un 1 Haga doble clic en T acceso directo al software StepOne o seleccione Start experimento Inicio All Programs Todos los programas Applied Biosystems StepOne gt StepOne v2 0 2 En la pantalla Home Inicio haga clic en Design Wizard Asistente de dise o para abrir el asistente de dise o o StepOne v1 0 File Edit Instrument Analysis Tools Help ES New Experiment 5 Open Ml Save B Close 3 Send Experiment to Instrument Eg Download Experiment from Instrument 4 A Fint Report Set Up Run Analyze Design Wizard QuickStart 2 Save current display as the default www appliedbiosystems com Home 3 Consulte Elementos del software m s adelante para obtener informaci n acerca de la navegaci n por el asistente de dise o Elementos del A continuaci n se ilustran los elementos del software StepOne para el asistente de software dise o 1 Barra de men s muestra los men s disponibles en el software e File Archivo e Edit Edici n e Instrument Instrumento e Analysis An lisis e T
266. o bloqueado V ase control negativo NTC Abreviatura de polimorfismo de nucle tido nico Single Nucleotide Polymorphism El SNP puede constar de una diferencia base o una indel inserci n deleci n Tipo de reacci n realizada en el pocillo para el gen diana o el ensayo SNP Tareas disponibles en los experimentos del sistema StepOne e Desconocida e Control negativo e Est ndar experimentos de curvas est ndar y curvas est ndar relativas e Control positivo experimentos de genotipado e IPC experimentos de presencia ausencia e IPC bloqueado experimentos de presencia ausencia Punto en la curva de disociaci n en el que se produce un pico en los niveles de fluorescencia que sirve para indicar que el DNA de doble cadena amplificado se disocia en DNA de cadena sencilla El tipo de experimento que se realiza con el sistema StepOne e Curva est ndar e Cy comparativos AAC e Curva est ndar relativa e Curva de disociaci n no disponible en el asistente de dise o e Genotipado e Presencia ausencia El tipo de experimento que seleccione afecta a las pantallas de configuraci n perfil de reacci n y an lisis Abreviatura de temperatura de desnaturalizaci n Tm o Melting Temperature Nivel de fluorescencia por encima de la l nea basal y dentro de la regi n de crecimiento exponencial de la gr fica de amplificaci n El umbral se puede determinar autom ticamente v ase Cy autom tico o se pue
267. o de molde de PCR que se van a utilizar en el experimento En el experimento de Cr comparativos de ejemplo Se utiliza el m todo de cuantificaci n de Cr comparativos Se utilizan reactivos TaqMan Se utiliza la velocidad de rampa r pida en el proceso del instrumento cDNA preparado a partir de RNA total aislado de h gado ri n y cerebro es el tipo de molde Antes de utilizar el molde cDNA primero hay que realizar una retrotranscripci n para convertir el RNA en cDNA consulte Preparaci n del molde en la p gina 157 Pantalla Methods 1 Seleccione Comparative C AAC Cr comparativos como m todo de 8 Materials cuantificaci n M todos y materiales 2 Seleccione ensayos TaqMan para los reactivos 3 Seleccione Fast 40 minutes to complete a run R pido 40 minutos aproximadamente para completar una reacci n para la velocidad de la rampa 4 Seleccione cDNA complementary DNA cDNA DNA complementario como tipo de molde 5 Haga clic en Next Siguiente gt Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 131 cuantificaci n relativa Cap tulo 6 Dise o del experimento de Cy comparativos Definici n de los m todos y materiales 1B Define Methods amp Materials Methods 8 Materials Help E a Instructions Select the quantitation method reagents ramp speed and type of template for the real time PCR reactions Which quantitation meth
268. od are you using Standard Curve Relative Standard Curve Cr ampara a With the comparative CT AACT method you use a reference sample and an endogenous control to determine the relative quantity of target sequence in a sample Which reagents do you want to use to detect the target sequence 2 SYBR Green Reagents These real time PCR reactions contain two primers and a TagqMan probe The primers are designed to amplify the target sequence The TaqMan probe is designed to hybridize to the target sequence and generate fluorescence signal when the target sequence is amplified Which ramp speed do you want to include in the instrument run Standard 2 hours to complete a run For optimal results using the Fast ramp speed Applied Biosystems recommends using Fast reagents for your real time PCR reactions What type of template do you want to use in the real time PCR reactions Ai ica a SONA genomic DNA ou are adding cDNA to the real time PCR reactions You have already performed reverse transcription to convert the RNA to cDNA Directrices de Cuando dise e su propio experimento de C comparativos dise o e Seleccione Comparative Cy AAC Cr comparativos AAC como m todo de cuantificaci n Los experimentos de C comparativos AAC determinan el cambio de expresi n de un gen diana en una muestra en relaci n con el mismo gen diana en una muestra de referencia Para obtener los resultados se
269. omain com awong Mbigmailhost com 6 Outgoing Mail Server SMTP smtp mycompany com For example smtp mycompany com Server requires an encrypted connection O Yes No a Server requires authentication Yes O No Tb Server Authentication User Name ExampleUser fe D Server Authentication Password paa Directrices de Si configura el sistema StepOne para la notificaci n autom tica proceso e El sistema StepOne debe estar configurado para su uso en red Consulte la Gu a de instalaci n de Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System e Determine los eventos de los que quiere recibir una notificaci n Instrument Error Error del instrumento el sistema StepOne env a por correo electr nico a los destinatarios todos los errores que se producen en el instrumento StepOne durante cada proceso Run Started Proceso iniciado el proceso StepOne env a un correo electr nico a los destinatarios cada vez que el instrumento inicia una reacci n Run Completed Proceso completado el proceso StepOne env a un correo electr nico a los destinatarios cada vez que el instrumento completa una reacci n e Obtenga las direcciones de correo electr nico en las que desea recibir notificaciones IMPORTANTE Separe las direcciones con una coma e P ngase en contacto con el administrador del sistema o con el departamento de tecnolog a de la informaci n para obtener La direcci n de red del se
270. ompruebe que el umbral est situado correctamente En el experimento de ejemplo el umbral est en la fase exponencial Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 105 cuantificaci n relativa m Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa Revisi n de la gr fica de amplificaci n 5a Amplification Plot Plot Settings Plot Type ARn vs Cycle Graph Type Log ColorPlotBy Well vl Amplification Plot 0 1 0 01 c 5 0 001 0 0001 0 00001 0 000001 0 0000001 o 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 5b 5C 6 Busque cualquier valor at pico a En el men desplegable Plot Type Tipo de gr fica seleccione Cr vs Well Cr vs pocillo b Busque pocillos fuera de la curva de amplificaci n En el experimento de ejemplo no hay ning n valor at pico para GAPDH 6a Amplification Plot Plot Settings Plot Type Crvs Well Graph Type Linsar Color Plot By Well v A P i EZ Amplification Plot 40 0 37 5 35 0 32 5 30 0 27 5 25 0 22 5 5 20 0 17 5 15 0 12 5 10 0 7 5 5 0 2 5 na o 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 Well Number Legend E A e o A E E Notas 106 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 5 An lisis del ex
271. on method reagents ramp speed and type of template for the real time PCR reactions Which quantitation method are you using Standard Curve E Standard a Comparative CT AACT With the relative standard curve method you use standards a reference sample and an endogenous control to determine the relative quantity of target sequence in a sample Which reagents do you want to use to detect the target sequence These real time PCR reactions contain two primers and a TaqMan probe The primers are designed to amplify the target sequence The TaqMan probe is designed to hybridize to the target sequence and generate fluorescence signal when the target sequence is amplified Which ramp speed do you want to include in the instrument run 3 For optimal results using the Fast ramp speed Applied Biosystems recommends using Fast reagents for your real time PCR reactions What type of template do you want to use in the real time PCR reactions ou are adding cDNA to the real time PCR reactions You have already performed reverse transcription to convert the RNA to cDNA Directrices de Cuando dise e su propio experimento de curva est ndar relativa dise o e Seleccione Relative Standard Curve Curva est ndar relativa como m todo de cuantificaci n Los experimentos de curva est ndar relativa determinan el cambio de expresi n de un gen diana en una muestra en relaci n con el mismo gen diana de una muestra de referenc
272. onda TaqMan dise ada para detectar la amplificaci n del gen diana Soluci n que contiene todos los componentes necesarios para procesar la reacci n de PCR excepto el molde de muestra est ndar o de control Componente de reacci n de PCR que contiene una sonda TaqMan dise ada para detectar la amplificaci n del gen diana Tipo de cido nucleico que se a ade a la reacci n de PCR El molde recomendado var a en funci n del tipo de experimento Funci n del software que permite ver el estado de un instrumento en red enviar experimentos al instrumento y descargar experimentos del instrumento en el ordenador El molde que se est amplificando En experimentos de curva est ndar relativa y C comparativos AAC la muestra a la que se refieren los resultados cuantitativos relativos Tambi n se denomina calibrador Componente de reacci n que se muestra en la ficha Reaction Mix Calculations C lculos de la muestra de reacci n de la pantalla Reaction Setup Configuraci n de la reacci n El software asume que la muestra o el est ndar que se a ade a la mezcla de reacci n est en una concentraci n del 10X Por ejemplo si el volumen de la reacci n es de 20 uL el volumen calculado de la muestra o est ndar de la reacci n 1 es 2 uL Introducido durante la configuraci n del experimento es el nombre que se utiliza para identificar el experimento Los nombres de los experimentos no pueden superar los 100 caracteres y no
273. onfiguraci n de las muestras rip pra 30 El Configuraci n de las opciones de cuantificaci n relativa 32 E Configuraci n del protocolo de termociclado ooooooooooooo o o 33 E Revisi n de la configuraci n de la reacci n ooooooooooooooooo 35 Em Solicitud de materiales para el experimentO o o ooooooooooommmoo 43 E Finalizaci n del flujo de trabajo del asistente de dise o 46 Nota Para obtener m s informaci n acerca de alguno de los temas que se explican en esta gu a acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System Software pulsando F1 haciendo clic en 4 en la barra de herramientas o seleccionando Help Ayuda StepOne Help Ayuda de StepOne Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 15 cuantificaci n relativa re Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa Resumen del cap tulo Resumen del cap tulo Flujo de trabajo del experimento Notas de ejemplo En este cap tulo se explica c mo utilizar el asistente de dise o en el software StepOne para configurar el experimento de curva est ndar relativa de ejemplo El asistente de dise o le guiar por los procedimientos ptimos recomendados por Applied Biosystems a medida que vaya introduciendo los par metros de dise o del experimento de ejemplo A continuaci n
274. ools Herramientas e Help Ayuda Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 127 cuantificaci n relativa ue Cap tulo 6 Dise o del experimento de Cy comparativos Notas Creaci n de un nuevo experimento 2 Barra de herramientas muestra las herramientas disponibles en el software New Experiment Experimento nuevo Open Abrir Close Cerrar Send Experiment to Instrument Enviar experimento al instrumento Download Experiment from Instrument Descargar experimento del instrumento 3 Cabecera del experimento indica el nombre del experimento el tipo de experimento y los reactivos del experimento abierto 4 Panel de navegaci n ofrece enlaces a todas las pantallas del asistente de dise o Experiment Properties Propiedades del experimento Methods amp Materials M todos y materiales Targets Dianas Opciones de cuantificaci n relativa Samples Muestras Run Method Protocolo de termociclado Reaction Setup Configuraci n de la reacci n Materials List Lista de materiales Nota Inicialmente el asistente de dise o muestra el tipo de experimento Quantitation Standard Curve Cuantificaci n curva est ndar Las pantallas disponibles de este asistente pueden cambiar si se selecciona otro tipo de experimento Por ejemplo la pantalla Relative Quantitation Settings Opciones de cuantificaci n relativa no aparece hasta que se selecciona el t
275. or y el instrumento StepOne est n Transferencia de datos en red conectados a la misma red remota en la p gina 88 Aut noma El ordenador y el instrumento StepOne no Transferencia de b sica est n conectados datos aut noma en la p gina 89 Si el ordenador est conectado directamente al instrumento StepOne por medio del cable del sistema StepOne no hay que hacer nada El software StepOne transfiere autom ticamente los datos del experimento al instrumento StepOne despu s de la reacci n Si el ordenador y el instrumento StepOne est n conectados a la misma red Ethernet env e el experimento al instrumento StepOne a trav s de la red 1 En el software StepOne haga clic en r Download Experiment from Instrument Descargar experimento del instrumento 2 En el cuadro de di logo Download Experiment from Instrument Descargar experimento del instrumento seleccione Select Instrument Seleccionar instrumento lt su instrumento gt 3 Seleccione Experiment Experimento Relative Standard Curve Example Ejemplo de curva est ndar relativa 4 En el campo Download File Descargar archivo haga clic en Browse Examinar seleccione una carpeta en la que recibir los datos del experimento y a continuaci n haga clic en Select Seleccionar 5 Haga clic en Download Experiment Descargar experimento para descargar el experimento desde el instrumento StepOne al ordenador a trav s de la red Downloa
276. os pocillos se colocan tal y como se muestra a continuaci n A IN c myc IN c myc F c myc i c myc 1 caron E caron Kidney Kidney g c myc 1 caro 1 caro 200 Bm sE sE m H c myo E caron ES caron 0 02 200 200 E caroH E caron E caron 2 0 2 Liver Liver Liver caPoH Liver I caro g c myc 200 c myc o N E caro 200 H caro 0 caPoH Kidney m c myc g c myc 20 c myc o ha E caroH 20 E caroH 0 02 e El experimento se guarda tal y como est y se cierra Liver m c myc Kidney m c myc g c myc 20 S c myc 0 02 E caron 20 H caro 0 02 Liver m c myc Kidney E caron E c myc 20 g c myc 0 02 S caron E caroH 0 02 Nota Para el experimento de ejemplo no realice el proceso en este momento 1 En la ventana Review Plate for Experiment Revisar placa para el experimento revise la disposici n de la placa Aseg rese de que hay e 12 pocillos desconocidos M e 30 pocillos est ndar E e 6 pocillos de control negativo E e 0Opocillos vac os Nota Si la disposici n de la placa es incorrecta haga clic en Return to the Wizard Volver al asistente y compruebe los valores que ha introducido Haga clic en Save Experiment Guardar experimento 46 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n
277. otas 132 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 6 Dise o del experimento de Cy comparativos R Definici n de los m todos y materiales o fluorocromo SYBR Green genera una se al de fluorescencia cuando se une a DNA de doble cadena El fluorocromo SYBR Green suele formar parte de la mezcla maestra SYBR Green que se a ade a la reacci n Si utiliza un fluorocromo SYBR Green Active la casilla de verificaci n Include Melt Curve Incluir curva de disociaci n para realizar un an lisis de curva de disociaci n de el gen diana amplificado Seleccione Standard Est ndar para la velocidad de la rampa Applied Biosystems no dispone de una mezcla maestra r pida para reactivos SYBR Green Nota Se pueden utilizar otros reactivos basados en fluorescencia en el sistema StepOne sin embargo debe dise ar su experimento con el flujo de trabajo Advanced Setup Configuraci n avanzada en lugar con el asistente de dise o Consulte Flujo de trabajo Advanced Setup Configuraci n avanzada en la p gina 206 e Seleccione la velocidad de rampa apropiada para el proceso del instrumento Seleccione Fast 40 Minutes to Complete a Run R pido aproximadamente 40 minutos para completar una reacci n si utiliza reactivos tipo r pido para las reacciones de PCR Seleccione Standard 2 Hours to Complete a Run Est ndar aproximadame
278. pOne Real Time PCR System para experimentos de 215 cuantificaci n relativa Glosario curva de disociaci n curva est ndar delta R AR desconocidos diana diluci n seriada disolvente disposici n de placa 216 Visualizaci n de los datos recogidos durante la fase de la curva de disociaci n Los picos de la curva de disociaci n pueden indicar la temperatura de desnaturalizaci n Tm del gen diana o pueden identificar la presencia de amplificaciones no espec ficas La curva de disociaci n se puede ver como fluorescencia del notificador normalizado Rn y la temperatura o como la derivada de la fluorescencia del notificador normalizada Rn vs la temperatura En los experimentos de curva est ndar y curva est ndar relativa e La l nea con un ajuste ptimo que resulta al representar los valores C frente a las cantidades conocidas del est ndar V ase tambi n l nea de regresi n e Conjunto de est ndares que contiene una serie de cantidades conocidas Los datos de las reacciones de la curva est ndar se utilizan para generar la curva est ndar La curva est ndar se define por el n mero de puntos de la serie el n mero de r plicas est ndar la cantidad inicial y el factor de diluci n V ase tambi n diluci n seriada del est ndar Abreviatura de notificador normalizado con l nea basal corregida baseline corrected normalized reporter En los experimentos de cuantificaci n la tarea de
279. pa y el tipo de molde que se van a utilizar en el experimento Acerca del En el experimento de curva est ndar relativa de ejemplo experimento de e Se utiliza el m todo de cuantificaci n de curva est ndar relativa iempl mn E ejemplo e Se utilizan reactivos TaqMan e Se utiliza la velocidad de rampa r pida en el protocolo de termociclado e cDNA preparado a partir de RNA total aislado de h gado y ri n es el tipo de molde Para obtener el molde de cDNA primero hay que realizar una retrotranscripci n de RNA para convertir el RNA en cDNA consulte Preparaci n del molde en la p gina 51 Pantalla Methods 1 Seleccione Relative Standard Curve Curva est ndar relativa como m todo de 8 Materials cuantificaci n M todos y materiales 2 Seleccione ensayos TaqMan para los reactivos 3 Seleccione Fast 40 minutes to complete a run R pido 40 minutos aproximadamente para completar una reacci n para la velocidad de la rampa 4 Seleccione cDNA complementary DNA cDNA DNA complementario para el tipo de molde 5 Haga clic en Next Siguiente gt Notas 22 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa O Definici n de los m todos y materiales A 1B Define Methods amp Materials Methods 8 Materials Help B Q Instructions Select the quantitati
280. perimento de curva est ndar relativa n Revisi n de la gr fica de amplificaci n 7 Repita los pasos 2 a 6 para los pocillos de c myc En el experimento de ejemplo hay un valor at pico para el gen c myc pocillo D1 Omitir este pocillo en la secci n de soluci n de problemas Omisi n de pocillos para el an lisis en la p gina 118 Directrices de Cuando analice su propio experimento de curva est ndar relativa busque an lisis e Los valores de l nea basal y umbral correctos el software StepOne calcula autom ticamente los valores de l nea basal y umbral dando por hecho que los datos tienen una gr fica de amplificaci n t pica Una gr fica de amplificaci n t pica tiene a b z Una fase de meseta o plateau Una fase lineal Una fase exponencial geom trica Un determinado ruido de fondo Una l nea basal IMPORTANTE Los errores en el experimento por ejemplo errores de contaminaci n o pipeteo pueden producir curvas de amplificaci n at picas que pueden derivar a c lculos incorrectos de los valores de l nea basal y umbral por parte del software StepOne Por lo tanto Applied Biosystems recomienda examinar la pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n y revisar los valores de l nea basal y umbral asignados a cada pocillo despu s del an lisis e Valores at picos Si el experimento no cumple las directrices anteriores solucione los problemas de la siguiente forma
281. plificaci n e Flag Settings Opciones de avisos utilice esta ficha para Ajustar la sensibilidad para que se marquen m s o menos pocillos Cambiar los par metros de los avisos que aplica el software StepOne e Relative Quantitation Settings Opciones de cuantificaci n relativa utilice esta ficha para Cambiar la muestra de referencia y o el control end geno Seleccionar el algoritmo que se debe utilizar para determinar los valores m nimos y m ximos de RQ nivel de confianza o desviaciones est ndar e Advanced Settings Opciones avanzadas utilice esta ficha para cambiar las opciones de l nea basal pocillo a pocillo Para obtener m s Para obtener m s informaci n acerca de las opciones de an lisis acceda al software informaci n StepOne pulsando F1 cuando se abra el cuadro de di logo Analysis Settings Opciones de an lisis Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 195 cuantificaci n relativa a Cap tulo 9 An lisis del experimento de C comparativos Revisi n del resumen QC Revisi n del resumen QC La pantalla QC Summary Resumen QC muestra una lista de avisos del software StepOne e incluye la frecuencia y ubicaci n de los mismos en el experimento abierto Acerca del En el experimento de Cr comparativos de ejemplo hay que revisar la pantalla QC experimento de Summary Resumen QC para saber si los datos del
282. plo experimento de e Se utiliza una MicroAmp Fast Optical 48 Well Reaction Plate ejemplo El volumen de la reacci n es de 20 uL pocillo e La placa de reacci n contiene 18 pocillos desconocidos M 6 pocillos de control negativo 24 pocillos vac os e Se utiliza la disposici n de la placa que genera autom ticamente el software StepOne Liver Liver LJ trsa LJ caPoH C caPoH LL caPoH E res H rs Liver Liver Liver Liver Kidney Kidney Kidney Kidney M 1esa Li caron M caro 1 caron M esa i esa M rrsa 1 caro Kidney Kidney Brain Brain Brain Brain Brain Brain 1 caron E caron W rrsa i tesa W esa 1 caron 1 caron 1 caron Materiales e Tubos de microcentr fuga necesarios e Pipetas e Puntas de pipeta e Mezcla de reacci n para TP53 p gina 161 e Mezcla de reacci n para GAPDH p gina 161 e Agua e Muestras p gina 159 e MicroAmp Fast Optical 48 Well Reaction Plate e MicroAmp Optical 48 Well Adhesive Film e Centr fuga Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 163 cuantificaci n relativa Cap tulo 7 Preparaci n de las reacciones de Cr comparativos Preparaci n de la placa de reacci n Preparaci n de la 1 Para cada gen diana prepare las reacciones de control negativo r I n E P placa de reacci a A un tubo del tama o apropiado a ada los vol menes de la mezcla de reacci n
283. posici n de espera en el instrumento puede haber peligro de tensi n Indica que un terminal puede EURO recibir o suministrar tensi n o corriente alterna Indica la posici n On Off Indica que un terminal puede Encendido Apagado de un Po recibir o suministrar tensi n o interruptor de encendido principal corriente alterna o continua de contrafase S mbolos de En la siguiente tabla se describen los s mbolos de seguridad que pueden aparecer en los seguridad instrumentos de Applied Biosystems Estos s mbolos pueden aparecer en solitario o con un texto que explique el peligro correspondiente consulte Etiquetas de seguridad en los instrumentos en la p gina xiv Estos s mbolos de seguridad tambi n pueden aparecer junto a PELIGROS ADVERTENCIAS y PRECAUCIONES que se incluyen en el texto de este o de otros documentos de ayuda de productos S mbolo Descripci n S mbolo Descripci n Indica que deber a consultar el N manual para obtener m s informaci n y proceder con el cuidado correspondiente Indica la presencia de una N superficie caliente u otro peligro debido a altas temperaturas y recomienda proceder con el cuidado correspondiente Indica la presencia de piezas m viles y recomienda proceder con el cuidado correspondiente Indica la presencia de un peligro de descarga el ctrica y recomienda proceder con el cuidado correspondiente Indica la presencia de un
284. pplied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 151 cuantificaci n relativa yu Cap tulo 6 Dise o del experimento de Cy comparativos Finalizaci n del flujo de trabajo del asistente de dise o Finalizaci n del flujo de trabajo del asistente de dise o Para finalizar el flujo de trabajo del asistente de dise o revise la disposici n de la placa y a continuaci n seleccione una opci n de salida Acerca del El software StepOne selecciona autom ticamente ubicaciones para los pocillos en la experimento de placa de reacci n En el experimento de Cr comparativos de ejemplo ejemplo e Los pocillos se colocan tal y como se muestra a continuaci n Liver A rrsa LJ rrsa LJ rrsa QJ GAPDH C GAPDH GAPDH E reso o e Liver Liver Liver Liver Kidney Kidney Kidney Kidney B esa E caro E caro 1 caron M rrsa M resa 1 rrsa E caron Kidney Kidney Brain Brain Brain Brain Brain Brain C caron 1 caron 1 esa 1 tesa M 1esa 1 caron E carpon E caron e El experimento se guarda tal y como est y se cierra Nota Para el experimento de ejemplo no realice el proceso en este momento Finalizaci n del 1 En la ventana Review Plate for Experiment Revisar placa para el experimento asistente de revise la disposici n de la placa Aseg rese de que hay dise o e 18 pocillos desconocidos 1 e 6 pocillos de control negativo e 24 pocillos vac os Nota Si la disposici n de l
285. pueden incluir ninguno de los siguientes caracteres barra inclinada hacia delante barra inclinada hacia atr s 1 signo mayor que gt signo menor que lt asterisco signo de interrogaci n 7 comillas l nea vertical dos puntos o punto y coma notificador Fluorocromo fluorescente que se utiliza para detectar la amplificaci n Si se utilizan reactivos TaqMan el fluorocromo del notificador se une al extremo de 5 Si se utilizan reactivos SYBR Green el fluorocromo del notificador es SYBRY Green Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 221 cuantificaci n relativa Glosario notificador derivado Rn notificador normalizado Rn notificador normalizado con l nea basal corregida ARn n mero rs omitir pocillo pantalla t ctil paso PCR a tiempo real pendiente perfil t rmico pocillos de IPC de control negativo pocillos de IPC de control negativo bloqueado protocolo de termociclado punto 222 Se muestra en el eje y de la curva de disociaci n La se al del notificador derivado es el opuesto de la primera derivada de la fluorescencia normalizada del notificador Se al de fluorescencia que emite el fluorocromo del notificador normalizado a la se al de fluorescencia de la referencia pasiva La magnitud de la se al de fluorescencia normalizada que genera el notificador durante la amplificaci n d
286. pulsando F1 Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 191 cuantificaci n relativa Mo Cap tulo 9 An lisis del experimento de C comparativos Presentaci n de los datos Notas 192 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 9 An lisis del experimento de C comparativos Secci n 9 2 Soluci n de problemas Secci n 9 2 Soluci n de problemas Esta secci n cubre los siguientes temas E Revisi n de las opciones de an liS1S o ooooooooooooornrano 194 E Revisi n del resumen raras ESA AE DRA 196 El Omisi n de pocillos para el an lisis n on nananana anaana 197 E Revisi n de la gr fica multicomponente noona anaana aneen 200 E Revisi n de la gr fica de datos brutos o ooooooooooorornooo 203 Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 193 cuantificaci n relativa a Cap tulo 9 An lisis del experimento de Cy comparativos d us r y Revisi n de las opciones de an lisis Revisi n de las opciones de an lisis El cuadro de di logo Analysis Settings Opciones de an lisis muestra las opciones de an lisis del ciclo umbral C los avisos la cuantificaci n relativa y las opciones avanzadas Si las opciones de an lisis predetermina
287. r cantidad cantidad est ndar cantidad inicial cantidad normalizada cebador directo cebador reverso 214 Opci n para aumentar o reducir la temperatura y o el tiempo en los ciclos subsiguientes de la reacci n de PCR Cuando AutoA est habilitado las opciones se indican por medio de un icono en el perfil t rmico e AutoA activado A e AutoA desactivado A Recogida de ensayos SNP en el software StepOne Recogida de genes diana en el software StepOne Recogida de las muestras en el software StepOne La biblioteca de muestras contiene el nombre de la muestra y el color de la muestra Tipo de calibraci n del sistema StepOne en el que el sistema asigna las posiciones de los pocillos en el bloque Los datos de la calibraci n espacial se utilizan para que el software pueda asociar aumentos de la fluorescencia durante una reacci n con pocillos espec ficos de la placa de reacci n V ase muestra de referencia En los experimentos de cuantificaci n la cantidad de gen diana en las muestras La cantidad absoluta puede referirse al n mero de copias la masa la molaridad o la carga viral La cantidad relativa se refiere a la diferencia entre la cantidad de gen diana normalizada en la muestra y la cantidad de gen diana normalizada en la muestra de referencia Cantidad conocida de la reacci n de PCR e En los experimentos de curva est ndar la muestra de concentraci n conocida de gen diana Las un
288. ra ado de de O AA A NA 174 Secci n 9 1 Revisi n de los resultados ranse nea ea aa RR ao 175 AnaliSis del Experimento vta tds 176 Revisi n de la gr fica de expresi n g nica y la tabla de pocillos 182 Revisi n de la gr fica de amplificaci n ooooooonoonoononannano 185 Presentaci n de OS datos sida ai T A 191 Secci n 9 2 Soluci n de problemas cococococncn o 193 Revisi n de las opciones de an lisis oooooooomomomoooononoos 194 Revisi n del resumen QU msi ri i n 196 Omisi n de pocillos para el an liSiS ooooooooooronaranano 197 Revisi n de la gr fica multicoMponente o oococcoconono no 200 Revisi n de la gr fica de datos brutos o oo conocemos 203 V Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Ap ndice A Flujos de trabajo alternativos para el experimento 205 Flujo de trabajo Advanced Setup Configuraci n avanzada 206 Flujo de trabajo QuickStart Inicio r pido ooooooononnono 207 Flujo de trabajo de Molde oooooooonooron o 208 Flujo de trabajo de exportaci n iMportaci n oooocoonono momo 209 BIBIO0 adorar iaa a ad 211 E AA 213 INCIO TARA TARA ATA eddie ads 227 vi Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantif
289. ra manejar la placa de reacci n 1 Abra la bandeja del instrumento 7 ramma m y A 2 Coloque las reacciones en el bloque La colocaci n de las reacciones depende del tipo de consumible que se utilice e Siutiliza una placa de reacci n col quela con el pocillo A1 en la esquina posterior izquierda e Si utiliza tiras de tubos de reacci n col quelas en el bloque directamente A1 3 Cierre cuidadosamente la bandeja del instrumento iinu l NUN DANDO Notas 170 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 8 Realizaci n del experimento de C comparativos Q di Realizaci n del experimento Realizaci n del experimento Realice los siguientes procedimientos del cap tulo 4 e Opcional Activaci n de las notificaciones en la p gina 71 e Inicio de la reacci n en la p gina 73 e Monitorizaci n de la reacci n en la p gina 76 e Descarga de la placa de reacci n y transferencia de datos en la p gina 87 Aseg rese de seleccionar el archivo Comparative CT Example eds en lugar del archivo Relative Standard Curve Example eds Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 171 cuantificaci n relativa Fog Cap tulo 8 Realizaci n del experimento de Cy comparativos qa
290. ras Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa m todo de cuantificaci n m todo de curva est ndar m todo de la curva est ndar relativa mezcla de cebador mezcla de cebador sonda mezcla de reacci n mezcla de sondas molde monitorizaci n remota muestra muestra de referencia Muestra est ndar 10X nombre de experimento Glosario En los experimentos de cuantificaci n el m todo que se utiliza para determinar la cantidad de gen diana en las muestras En los experimentos de cuantificaci n hay tres tipos de m todos de cuantificaci n disponibles curva est ndar C comparativos AAC y curva est ndar relativa M todo de cuantificaci n para experimentos de cuantificaci n Con el m todo de curva est ndar los resultados de los est ndares se utilizan para determinar cantidades absolutas de un gen diana en las muestras M todo de cuantificaci n para experimentos de cuantificaci n Con el m todo de la curva est ndar relativa se utilizan los resultados de los est ndares una muestra de referencia y un control end geno para determinar las cantidades relativas de un gen diana en las muestras Componente de reacci n de PCR que contiene el cebador directo y el cebador reverso dise ados para amplificar el gen diana Componente de reacci n de PCR que consta de cebadores dise ados para amplificar el gen diana y una s
291. realizar el an lisis prepare siempre una matriz fresca El s mbolo de la flecha que apunta a la derecha separa los comandos sucesivos que se seleccionan en un men desplegable o un men de acceso directo Por ejemplo Seleccione File Archivo Open Abrir Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de vii cuantificaci n relativa Pr logo C mo obtener m s informaci n Palabras de aviso para el usuario describe a continuaci n En la documentaci n de Applied Biosystems aparecen dos palabras de aviso para el usuario Cada palabra implica un nivel concreto de observaci n o acci n tal y como se Nota Proporciona informaci n que puede ser interesante o til pero no es esencial para el uso del producto IMPORTANTE Proporciona informaci n que es necesaria para poder utilizar el instrumento correctamente para poder utilizar un kit de reactivos con precisi n o para poder utilizar un producto qu mico de manera segura A continuaci n se muestran algunos ejemplos de palabras de aviso para el usuario Nota La funci n de calibraci n tambi n est disponible en la consola de control IMPORTANTE Para comprobar la conexi n del cliente necesita un identificador de usuario v lido Palabras de aviso de seguridad C mo obtener m s informaci n Documentaci n El sistema StepOne incluye la siguiente documentaci n En la documentac
292. relativa Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa Finalizaci n del flujo de trabajo del asistente de dise o E Review Plate Layout for Experiment Relative Standard Curve Example Experiment Design T Review the plate layout then select what you want to do next 2 Save Experiment Start Run for This Experiment Edit Plate Layout Save and close this experiment Save this experiment then start the run Make sure the reaction Use advanced setup to edit the plate layout plate is loaded into the instrument g c myc 2 E caron E caron H caroH 200 200 200 E caroH 0 E caPoH 1 caro B c myc 200 E c myc 0 2 H caron E caron 0 o E caPoH Kidney O c myc E c myc 20 g c myc 0 2 E caroH 20 E caron 0 02 Create Another Experiment Using the Design Wizard PA Save and close this experiment then create another experiment using the design wizard Continue designing this experiment using the design wizard D c myc Kidney D c myc g c myc 20 S c myc 0 02 E caroH 20 H caro 0 02 3 En el cuadro de di logo Save Experiment Guardar experimento haga clic en Save Guardar para aceptar la ubicaci n y el nombre de archivo predeterminados El experimento de ejemplo se guarda y se cierra y regresa a la pantalla de inicio Nota De manera predeterminada el experimento de ejemplo se guarda en
293. rimento Fichas del experimento muestra una ficha por cada experimento abierto 1 ici Instrument Analysis Tools Help Dox 2 New Experiment EF Open la Save Close A Send Experiment to Instrument E Download Experiment from Instrument Export Print Report Standard Curve Gene Expression Multicomponent Plot Raw Data Plot QC Summary Multiple Plots View 7 Pra Amplification Plot Select Wells With l Select Item Y Select Item MEE Hi Target All w Threshold Auto Auto Baseline Show E Threshold Baseline Start Well Target 4 Baseline End Well 18 27 CT Undel CT Undel CT Undel CT Undel CT Undei CT Undel Cr 27 1 cm 1 sar 1 car 1 car 1 c myc 1 c myc 1 c myc 1 car 8 19 15 9 21 9 49 4 77 14 79 4 83 9 26 CT 28 CT 24 66ACT 24 69ACT 24 61ACT 28 ACT 2B ACT 28 ACT 24 64 o GAP T GAP H c myo H om H c myo H c myo H c myo E c myo 9 12 8 89 200 1200 1200 120 120 120 CT 24 66KCT 24 7 ACT 23 ACT 23 3 ACT 23 ACT 26 ACT 26 ACT 26 H c myo H c myo E c myo H c myo H c myo A A g c myc 2 12 0 2 10 2 0 2 g c m S c myc 2 ACT 29 ACT 29 ACT 33 ACT 33 CT 33 0 02 0 02 E sar E sar E sar E sar E sar E sar E car 20 20 20 2 yc 200 200 200 ACT 20 024CT 19 964CT 19 99ACT 23 594CT
294. rimento haga clic en la fila de avisos para ver informaci n detallada acerca del aviso En el experimento de ejemplo a El aviso HIGHSD pocillos D7 D8 y El indica una gran desviaci n est ndar en el grupo de r plicas Esto es lo esperado para los valores C gt 35 debido a la poca cantidad de gen diana No es necesario omitir los pocillos del an lisis b El aviso OUTLIERRG pocillo D1 indica que en el grupo de r plicas hay un valor at pico Vaya a Omisi n de pocillos para el an lisis en la p gina 118 para quitar el pocillo D1 116 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa nm Revisi n del resumen QC Flag Summary Total Wells Wells Set Up Flag Details NOSIGNAL UTLIERRG XPFAIL 48 48 Processed Wells Flagged Wells 48 Targets Used 4 Samples Used 2 Frequency 0 Name Amplification in negative control BADROX____ Badpassivereference signal _ d0 o OFFSCALE Fluorescenceis offscale I oo o O NOAMP No amplificati on o o AAA NOISE Noise higher than others in plate A A PIKE Noise spikes A o No signal in well TE Outlier in replicate group E 2 Exponential algorithm failed pp A Posibles avisos Notas Flagged Wells D1 Flag OUTLIERRG Outlier in replicate group Flag Detail The
295. rimento muestra una ficha por cada experimento abierto E StepOne v1 0 File Edit Instrument Analysis Tools Help New Experiment EF Open Mi gS Close tu Send Experimentto Instrument Eg Download Experiment from Instrument 4 noii A PrintRepor Design your experiment Experiment Reagents 1A Define Experiment Properties Experiment Properties Help 7 1 Define Q Instructions Enter identifying information then select the type of experiment to design How do you want to identify this experiment Required Experiment Name ME Barcode Optional User Name Optional Comments Optional What type of experiment do you want to design Design a gene quantitation experiment to determine the amount of target nucleic acid sequence in a sample 5 E Untitled x Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 19 cuantificaci n relativa O Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa l Definici n de las propiedades del experimento Definici n de las propiedades del experimento Acerca del experimento de ejemplo Pantalla Experiment Properties Propiedades de experimento Notas En la pantalla Experiment Properties Propiedades de experimento escriba la informaci n de identificaci n del experimento y a continuaci n seleccione el tipo de experimen
296. rimentos de cuantificaci n relativa PCR en singleplex y PCR en multiplex Se puede realizar una reacci n de PCR como una e Reacci n en singleplex donde s lo hay un ensayo en el tubo de reacci n o pocillo S lo se puede amplificar un gen diana o un control end geno por reacci n O e Reacci n en multiplex donde hay dos o m s ensayos en el tubo de reacci n o pocillo Cada conjunto amplifica un gen diana o un control end geno espec ficos IMPORTANTE No se pueden utilizar reactivos SYBR Green para las reacciones en multiplex E e En EH Conjunto de cebadores de gen diana E O 90 Conjunto de cebadores IN y IN de control end geno l A cDNA PCR en singleplex PCR en multiplex RT PCR de 1 y de 2 pasos Se puede realizar una retrotranscripci n RT y una PCR en una sola reacci n 1 paso o en reacciones distintas 2 pasos Los reactivos que se utilicen depender n de si va a realizar una RT PCR de 1 o de 2 pasos e En las RT PCR de 1 paso la RT y la PCR se producen en un sistema de tamp n que permite disponer de un solo tubo para la amplificaci n de la RT y la PCR Sin embargo no se puede utilizar una mezcla maestra de PCR r pida ni la enzima de prevenci n de contaminaci n cruzada AmpErase UNG uracil N glucosilasa para realizar la RT PCR de 1 paso e La RT PCR de 2 pasos se realiza en dos reacciones distintas En primer lugar el RNA total se retrotranscribe a cDNA y
297. rio N mero del ciclo de la PCR en el que AR corta el umbral en la gr fica de amplificaci n Valores calculados a partir de la l nea de regresi n de las curvas est ndar incluido el valor R la pendiente y el punto de intersecci n y Los valores del coeficiente de regresi n se pueden utilizar para evaluar la calidad de los resultados a partir de los est ndares V ase tambi n curva est ndar Color asignado a un gen diana para identificarlo en la disposici n de la placa y las gr ficas de an lisis Campo del software que aparece en la ficha Sample Dilution Calculations C lculos de diluci n de las muestras de la pantalla Reaction Setup Configuraci n de reacci n En este campo escriba la concentraci n de la muestra que desea utilizar para a adir a la mezcla de reacci n de todas las muestras del experimento 10X for Reaction Mix 10X para la mezcla de reacci n significa que el software asume que la muestra o el componente est ndar de la mezcla de reacci n tiene una concentraci n del 10X Por ejemplo si la concentraci n de las muestras diluidas es 50 0 ng uL 10X la concentraci n de la muestra final de la reacci n es 5 ng uL 1X Funci n del software StepOne que permite configurar el experimento de acuerdo con el dise o de dicho experimento Diana que deber a tener un nivel de expresi n similar en todas las muestras que se est n probando Se utiliza en experimentos de curva est ndar relativa y Cr comp
298. roH 200 20 20 20 2 E saroH E caron E caroH E caron E caron S caron E caron E caron 2 2 0 2 0 2 0 2 0 02 Liver Liver O caron LJ saroH C caron M c mye 1 c myc Liver Liver Liver Liver Kidney Kidney Kidney Kidney Kidney E oea Ba BA Ba Da Da 200 200 200 20 20 20 200 200 0 02 0 02 Descripci n del El objetivo del experimento de Cr comparativos de ejemplo es comparar la expresi n de experimento de TP53 un factor de transcripci n que regula otros genes en tejidos de h gado ri n y C comparativos cerebro de ejemplo Notas En el experimento de Cr comparativos de ejemplo Las muestras son cDNA preparados a partir de RNA total aislado de h gado ri n y cerebro El gen diana es TP53 La muestra de referencia es del cerebro El control end geno es GAPDH humano El experimento est dise ado para una PCR en singleplex donde los ensayos de gen diana c myc y control end geno GAPDH se amplifican en diferentes pocillos Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 11 cuantificaci n relativa EN Cap tulo 1 Introducci n Flujo de trabajo del experimento de ejemplo e Las reacciones est n preparadas para una RT PCR de 2 pasos Se utiliza High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit para la retrotranscripci n y TaqMan Fast Universal PCR Master Mix para la PCR e Se seleccionan ensayos de la l nea de productos Applied Biosystems TaqMan Gene
299. rumento StepOne crea una representaci n digital de la fluorescencia residual recogida en un intervalo fijo de tiempo El software StepOne almacena el dato bruto de la imagen fluorescente para analizarlo Si fuera necesario el software realizar a lecturas adicionales si lo requirieran los reactivos fluorescentes utilizados en el experimento Despu s de una reacci n el software StepOne utiliza datos de calibraci n espacial espectral y de ruido de fondo para determinar la ubicaci n y la intensidad de las se ales fluorescentes en cada lectura el fluorocromo asociado a cada se al fluorescente y el significado de la se al Notas 2 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 1 Introducci n 4 Acerca del sistema StepOne Consumibles El sistema StepOne admite los consumibles que se enumeran a continuaci n Estos admitidos consumibles se utilizan tanto para reacciones en modo est ndar como en modo r pido Consumible Necro de referencia e MicroAmp Fast Optical 48 Well Reaction Plates e 4375816 e MicroAmp Optical 48 Well Adhesive Film e 4375323 e MicroAmp Fast 8 Tube Strips e 4358293 e MicroAmp Optical 8 Cap Strips e 4323032 e MicroAmp Fast Reaction Tubes with Caps e 4358297 e MicroAmp Fast 48 Well Trays e 4375282 e MicroAmp 48 Well Base Adaptor e 4375284 e MicroAmp Splash Free 96 Well Base e 4312063
300. rva est ndar relativa o Configuraci n del protocolo de termociclado 2D Set Up Relative Quantitation Settings Relative Quantitation Settings Help E T Instructions Select the reference sample and the endogenous control to perform relative quantitation 1 Which sample do you want to use as the reference sample Kidney w 2 Which target do you want to use as the endogenous control GAPDH vw Directrices de Cuando dise e su propio experimento de curva est ndar relativa dise o g Seleccione una muestra de referencia entre las muestras creadas anteriormente Configuraci n de las muestras en la p gina 30 Los resultados de la amplificaci n de las muestras se comparan con los resultados de la amplificaci n de la muestra de referencia para determinar la expresi n relativa Seleccione un control end geno en los ensayos diana creados previamente Configuraci n de los genes diana en la p gina 25 Los resultados de la amplificaci n del control end geno se utilizan para normalizar los resultados de la amplificaci n de el gen diana para corregir las diferencias en la cantidad de molde a adida a cada reacci n Para obtener m s Para obtener m s informaci n acerca de informaci n A La pantalla Relative Quantitation Settings Opciones de cuantificaci n relativa acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en y o pulsando Fl Muestras de referencia tambi n denominadas calibra
301. rvidor de protocolo de transferencia de correo simple SMTP en la LAN Un nombre de usuario y contrase a para el servidor si son necesarios para el acceso La configuraci n de SSL Secure Sockets Layer del servidor activada o desactivada Notas 72 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 4 Realizaci n del experimento de curva est ndar relativa A Inicio de la reacci n Inicio de la reacci n Inicie el proceso de acuerdo con la disposici n del instrumento StepOne La forma en la que hay que iniciar el proceso depende de la disposici n del sistema StepOne Disposici n Descripci n Consulte Conectada El cable amarillo del sistema StepOne conecta el Inicio conectado ordenador al instrumento StepOne m s abajo Aut noma e El ordenador y el instrumento StepOne no est n Inicio aut nomo conectados O en la p gina 74 e El ordenador y el instrumento StepOne est n conectados a la misma red Inicio conectado Realice este procedimiento si el ordenador est conectado directamente al instrumento StepOne por medio del cable del sistema StepOne 1 En el software StepOne haga clic en po Temperature Plot Gr fica de temperatura 2 Haga clic en START RUN Iniciar proceso bj E StepOne v1 0 File Edit Instrument Analysis Tools Help New Experiment Open la S
302. s AAC Inicio del experimento Dise o del experimento Cap tulo 6 v Preparaci n de las reacciones Cap tulo 7 1 Prepare el molde 2 Prepare las diluciones de las muestras 3 Prepare la mezcla de reacci n para cada ensayo diana 4 Prepare la placa de reacci n Y Realizaci n del experimento Cap tulo 8 An lisis del experimento Cap tulo 9 Fin del experimento Notas 156 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 7 Preparaci n de las reacciones de Cr comparativos mom Preparaci n del molde Preparaci n del molde Prepare el molde para las reacciones de PCR con el High Capacity cCDNA Reverse Transcription Kit IMPORTANTE Applied Biosystems recomienda utilizar High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit para realizar una retrotranscripci n a partir de RNA total y obtener un conjunto de cDNA Los TaqMan Gene Expression Assays se han dise ado utilizando el High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit no se han probado otros protocolos para los TaqMan Gene Expression Assays Acerca del Para el experimento de C comparativos de ejemplo el molde para las reacciones de PCR experimento de es cDNA sintetizado a partir de las muestras de RNA total utilizando el High Capacity ejemplo cDNA Reverse Transcription Kit Materiales e RNA aislado total preparado a partir de tejidos de h gado ri
303. s de tel fono y fax para ponerse en contacto con el Servicio de asistencia t cnica y las instalaciones de venta de Applied Biosystems en todo el mundo IMPORTANTE Cuando se le solicite que lo haga en esta gu a o cuando tenga que programar el mantenimiento del instrumento StepOne por ejemplo el mantenimiento anual planificado o la verificaci n calibraci n de la temperatura p ngase en contacto con el Centro de atenci n al cliente de Applied Biosystems Para obtener un n mero de tel fono o enviar un mensaje de correo electr nico al centro visite http www appliedbiosystems com support contact X Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Pr logo Convenciones de seguridad utilizadas en este documento Convenciones de seguridad utilizadas en este documento Palabras de aviso En la documentaci n del usuario de Applied Biosystems aparecen cuatro palabras de de seguridad aviso de seguridad en los puntos del documento en los que debe conocer la existencia de peligros importantes Cada palabra de aviso IMPORTANTE PRECAUCI N ADVERTENCIA PELIGRO implica un nivel de observaci n o acci n particular tal y como se explica a continuaci n Definiciones IMPORTANTE Proporciona informaci n que es necesaria para poder utilizar el instrumento correctamente para poder utilizar un kit de reactivos con precisi n o para poder utilizar un
304. s de control negativo e 0 pocillos vac os 8 En la ficha View Plate Layout Ver disposici n de placa a En el men desplegable Arrange Plate by Ordenar placa por seleccione Rows Filas predeterminado b En el men desplegable Place Negative Controls Colocar controles negativos seleccione Upper Left Superior izquierda predeterminado 9 Haga clic en Next Siguiente gt 2C Set Up Samples Samples Help a instructions Enter the number of samples to test in the reaction plate enter the number of sampleltarget reaction replicates enter the number of negative controls enter sample names then selectthe sample target reactions to set up Set Up Samples Required lt View Plate Layout a gt 8a 1 How many samples do you want to test in the reaction plate 2 o How many replicates do you need 19 8b 3 How many negative controls do you need for each target assay 3 For each sample in the reaction plate enter a sample name and select a sample co Enter Sample Name Color 4 y E o ooo ooo y IA s Liver Liver Liver Liver Kidney Kidney Kidney Kidney 9 Kidney MD 18 me Mo Moa Moa OLA Kidney H e m H e H om H om H om H om Z m sa 200 200 200 120 120 20 Which sample target reactions do you want to set up m Bon Ejom Bon Ejem Bon Ec E o m 12
305. s del experimento V ase flujos de trabajo formaci n informaci n acerca de x 228 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa G gr fica de amplificaci n t pica 107 189 H High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits 51 157 iconos de peligro Consulte s mbolos de peligro en instrumentos imprimir instrucciones de la configuraci n de la reacci n 40 146 indicador BADROX 117 197 indicador NOAMP 117 197 indicador NOISE 117 197 indicador NOSIGNAL 117 197 indicador OFFSCALE 117 197 indicador OUTLIERRG 117 197 indicador SPIKE 117 197 indicador THOLDFAIL 117 197 iniciar proceso disposici n conectada 73 distribuci n aut noma 74 L l nea basal ajustar manualmente 115 195 valores correctos 107 189 M marcador AMPNC 117 197 marcador BLFAIL 117 197 marcador CTFAIL 117 197 marcador EXPFAIL 117 197 marcador HIGHSD 117 197 marcadores en experimentos de CT comparativo 197 en experimentos de curva est ndar relativa 117 opciones de an lisis 115 195 materiales necesarios 51 53 55 59 61 157 159 161 163 mezcla de reacci n vol menes 59 161 vol menes calculados 36 38 143 145 movimiento repetitivo seguridad xxii movimiento y levantamiento seguridad xvi MSDS descripci n xvii obtenci n xviii MSDS obtener x muestra de referencia componente de experimento 5 ndice pantalla Relative Quantif
306. s herramientas disponibles en el software New Experiment Experimento nuevo Open Abrir Save Guardar Close Cerrar Send Experiment to Instrument Enviar experimento al instrumento Download Experiment from Instrument Descargar experimento del instrumento Export Exportar Print Report Imprimir informe 3 Cabecera del experimento indica el nombre del experimento el tipo de experimento y los reactivos del experimento abierto 4 Panelde men s del experimento incluye v nculos a las siguientes pantallas del software Pantallas de configuraci n Pantallas del perfil de reacci n Pantallas de an lisis Amplification Plot Gr fica de amplificaci n Gene Expression Expresi n g nica Multicomponent Plot Gr fica multicomponente Raw Data Plot Gr fica de datos brutos QC Summary Resumen QC Multiple Plots View Vista de m ltiples gr ficas 5 Panel de gr ficas muestra la pantalla de an lisis seleccionada para el experimento abierto 6 Fichas de visualizaci n muestra la disposici n de la placa o la tabla de pocillos del experimento abierto Notas 178 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 9 An lisis del experimento de C comparativos o An lisis del experimento Fichas del experimento muestra una ficha por cada experimento abierto
307. s lo nico que se deber a amplificar en los pocillos de IPC de control negativo porque la reacci n no contiene ninguna muestra V ase tambi n IPC En los experimentos de presencia ausencia pocillos que contienen un agente de bloqueo del IPC en lugar de una muestra en la reacci n de PCR No se deber a producir ninguna amplificaci n en los pocillos de IPC de control negativo bloqueado porque la reacci n no contiene ninguna muestra y la amplificaci n del IPC est bloqueada Tambi n se denomina sin control de amplificaci n NAC Definici n del volumen de reacci n y el perfil t rmico del proceso del instrumento Un est ndar en una curva est ndar La cantidad est ndar de cada punto de la curva est ndar se calcula en base a la cantidad inicial y el factor de diluci n Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa QuickStart Inicio r pido qu mica rampa reacci n de la muestra diana reacci n del ensayo SNP muestra reactivos reactivos SYBRY Green reactivos TagMan rechazar pocillo recogida de datos referencia pasiva Glosario Funci n del sistema StepOne que permite realizar el experimento sin introducir la informaci n de configuraci n de la placa V ase reactivos La velocidad a la que cambia la temperatura durante el proceso del instrumento Excepto en el caso del paso de la curva de disociaci n
308. s que ha calculado el software StepOne Complete la ficha Reaction Mix Calculations C lculos de la mezcla de reacci n para el ensayo de c myc en la p gina 35 y Complete la ficha Reaction Mix Calculations C lculos de la mezcla de reacci n para el ensayo de GAPDH en la p gina 37 Nota El software calcula todos los componentes de las reacciones de PCR Sin embargo para preparar la mezcla de reacci n de esta secci n incluya nicamente la mezcla maestra el ensayo y agua A ada la muestra o el est ndar cuando prepare la placa de la reacci n consulte Preparaci n de la placa de reacci n en la p gina 61 Acerca del Para el experimento de curva est ndar relativa de ejemplo experimento de e Los componentes de la mezcla de reacci n son ejemplo TaqMan Fast Universal PCR Master Mix 2X Ensayo de c myc 20X Ensayo de GAPDH 20X Agua Notas 58 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Materiales necesarios Preparaci n de la mezcla de reacci n Notas Cap tulo 3 Preparaci n de las reacciones de la curva est ndar relativa No Preparaci n de la mezcla de reacci n e Los vol menes calculados en el software para ambos ensayos diana son Componente Volumen uL para 1 reacci n Mezcla maestra 2X 10 0 Ensayo 20X 1 0 H O 7 0 Volumen total 18 0 Nota En este
309. sas bloqueadas en posici n vertical Utilice la protecci n ocular la vestimenta y los guantes adecuados cuando manipule botellas de reactivos o de residuos Para reducir al m nimo el peligro de los residuos qu micos e Lea y comprenda las fichas t cnicas de seguridad de los materiales MSDS proporcionadas por los fabricantes de los productos qu micos en el recipiente de residuos antes de almacenar manipular o eliminar los residuos qu micos e Disponga de contenedores de residuos principales y secundarios Los contenedores principales contienen los residuos inmediatos Los contenedores secundarios contienen cualquier derrame o fuga del contenedor principal Ambos contenedores deben ser compatibles con el material de residuo y deben cumplir los requisitos federales estatales y locales sobre el almacenamiento en contenedores e Minimice el contacto con productos qu micos Utilice un equipo adecuado de protecci n personal durante la manipulaci n de productos qu micos por ejemplo protectores oculares guantes o vestimenta protectora Puede encontrar m s normas de seguridad en las MSDS e Minimice la inhalaci n de productos qu micos No deje abiertos los recipientes de productos qu micos Util celos nicamente con la ventilaci n adecuada por ejemplo una campana extractora Puede encontrar m s normas de seguridad en las MSDS e Manipule los residuos qu micos bajo una campana extractora e Despu s de vaciar el recip
310. si n uniforme en todas las muestras El control end geno sirve para normalizar posibles variaciones de la cantidad de cDNA que se a ade a cada reacci n que se producen a consecuencia de imprecisiones en el pipeteo e R plicas reacciones id nticas que contienen componentes y vol menes id nticos e Controles negativos muestras que contienen agua o tamp n en lugar de un molde En los controles negativos no deber a haber amplificaci n Acerca de los Los experimentos de C comparativos AAC determinan el cambio de expresi n de un experimentos de gen diana en una muestra en relaci n con el mismo gen en una muestra de referencia C comparativos Para obtener los resultados se utilizan f rmulas aritm ticas Los experimentos de C comparativos se suelen utilizar para e Comparar niveles de expresi n de un gen en diferentes tejidos e Comparar los niveles de expresi n de un gen en una muestra tratada y en una muestra no tratada e Comparar los niveles de expresi n de alelos de tipo salvaje y alelos mutados Componentes Estos son los componentes que se necesitan para preparar las reacciones de PCR para los experimentos de Cr comparativos e Muestra la muestra en la que la cantidad del gen diana es desconocida e Muestra de referencia la muestra utilizada como referencia para los resultados de la comparaci n Por ejemplo en un estudio sobre los efectos de las drogas en la expresi n de los genes un control no tratado ser
311. software StepOne Creaci n de un 1 Haga doble clic en T acceso directo al software StepOne o seleccione Start experimento Inicio gt All Programs Todos los programas Applied Biosystems StepOne StepOne v2 0 2 En la pantalla Home Inicio haga clic en Design Wizard Asistente de dise o para abrir el asistente de dise o E StepOne v1 0 File Edit Instrument Analysis Tools Help ES New Experiment 5 Open Ml Save B Close 3 Send Experiment to Instrument Eg Download Experiment from Instrument 4 A Fint Report Set Up Run Analyze Design Wizard QuickStart 2 Save current display as the default www appliedbiosystems com Home 3 Consulte Elementos del software m s adelante para obtener informaci n acerca de la navegaci n por el asistente de dise o Elementos del A continuaci n se ilustran los elementos del software StepOne para el asistente de software dise o 1 Barra de men s muestra los men s disponibles en el software e File Archivo e Edit Edici n e Instrument Instrumento e Analysis An lisis e Tools Herramientas e Help Ayuda Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 17 cuantificaci n relativa re Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa Notas Creaci n de un nuevo experimento 2 Barra de herramientas muestra las herramientas disponibles en el softw
312. ssay Mix Concentration Concentraci n de ensayo aparece 20X c Revise los componentes y los vol menes calculados para las reacciones de PCR Componente Volumen uL para 1 reacci n Mezcla maestra 2X 10 0 Ensayo 20X 1 0 Muestra 10X o est ndar 2 0 H O 7 0 Volumen total 20 0 El volumen de la muestra o est ndar se limita al 10 del volumen total de la reacci n 2F Set Up Reaction Setup gt Reaction Mix Calculations For each target assay in the reaction p ate select the assay type if using Q Instructions reactions If needed edit the reaction volume excess reaction volume col prepare the PCR reactions Select Tar c myc 1 Reaction Mix Calculations Sarnple Dilution Calculations 2 Reactions for GAPDH 6a 6b Master Mix Concentration 2 0 x Assay Mix Concentration ga component Standard Dilution Series for GAPDH Standard Concentration in Stock 100 0 ng v per uL A Reaction Setup Help aqMan reagents then review the cali ulated volumes for preparing the standard dilution series samples and PCR ponent concentrations and or stock concentrations Click Print Reaction Setup to print instructions on how to 10 Volume uL For 1 Reaction Print Reaction Setup A Dilution Point 1 100 0 Source Stock Sourc
313. stencia t cnica oooooooononononn A Reed xX Convenciones de seguridad utilizadas en este documento o oooooooo xi S mbolos en los instrumentos Au naana naana xiii Etiquetas de seguridad en los instrumentos e ae ee e ae ee RAE XIV Seguridad general del Instrumento o ooocoonononon o xvi Segundad QUIMICA lt cceiorcaraadia hErenn Ena EEE aaa xvii Seguridad de residuos QU MICOS nananana aaea X X Seguridad el ctrica eearri da AA A a A O a a ES e A XX segunmdad de los LED vaussateoncarvrtarstes ercer seriadas xxi Seguridad biol gica e ea e a aa aa e a a e a A aro daras axati xxi Seguridad de la estaci n de trabajo oooocononononornana ro xxii Est ndares de seguridad y compatibilidad electromagn tica EMO xxiii Cap tulo 1 Introducci N cocooocooococonccn o 1 Acerca del sistema StepOne o o ooococooco ee ee ee RARA 2 Acerca de los experimentos de cuantificaci n relativa o o ooo o 4 Somo Ulilizar esta GU A vuestra ac ADA AA soda ra de a dde 9 Acerca del experimento de ejeMplO o oococoooonoon ea 10 Flujo de trabajo del experimento de ejemplo o ooooocoocoonoooo o 12 Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa 15 Resumen del cap tulo ooooooonononoooorn ADA 16 Creaci n de un nuevo experimento au a sanaaa ae ee ea ee ee 17 Definici n de las propiedades del experimento p e ue ee ae ee 20 Definici
314. strar ocultar la leyenda de la gr fica 5 Compruebe la se al del fluorocromo FAM En el experimento de ejemplo la se al del fluorocromo FAM aumenta a lo largo de la reacci n de PCR lo que indica que la amplificaci n es normal 6 Compruebe la se al del fluorocromo ROX En el experimento de ejemplo la se al del fluorocromo ROX permanece constante a lo largo de la reacci n de PCR lo que indica que los datos son t picos 3 4 2a Multicomponent Plot lt View Plate Layout View Well Table Plot Settings Select Wells With Target v Select Item Y Plot Color Dye 3 View Legend AA 2 3 4 5 e 7 Oss rss rs caro QO caro QO carn M trs 1 TPs A CT Undet CT Undel CT Undel CT Undei CT Undet CT Undei CT 30 CT 30 m s3 M car M car M car M rss M rss M rss M car BHI CT 30 CT 24 67 CT 24 67 CT 24 68 CT 30 CT 30 CT 30 CT 24 88 m car M car Mss Mss Us 1 car M car 1 car CT 2H B3 CT 28 95 Cra CTD Can CRS CT 29 39 CT 29 39 Multicomponent Plot 250 000 225 000 7 200 000 175 000 7 2b 150 000 7 oO 125 000 7 Fluorescence 100 000 7 75 000 al 50 000 25 000 O _ gt _ _ _ooo _ e e o 02 4 6 8 012 4 16 8 2 2 2 BA YI Y 3 3 O Q Cyc
315. sultados 1 Analice 2 Revise la pantalla Gene Expression Plot Gr fica de expresi n g nica o la tabla de pocillos 3 Revise la pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n 4 Presente los datos Secci n 2 Soluci n de problemas 1 Revise las opciones de an lisis ajuste la l nea basal y el umbral 2 Revise la pantalla QU Summary Resumen QC 3 Omita pocillos 4 Revise la pantalla Multicomponent Plot Gr fica multicomponente 5 Revise la pantalla Raw Data Plot Gr fica de datos brutos y Fin del experimento Notas v Fin del experimento Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 13 cuantificaci n relativa sd Cap tulo 1 Introducci n Flujo de trabajo del experimento de ejemplo Notas 14 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa Este cap tulo cubre los siguientes temas El Resumen del cap tulo ranita e Aa ARA 16 E Creaci n de un NUEVO experimento coronar dE ARA 17 E Definici n de las propiedades del experimento o ooooooooooooooo o 20 E Definici n de los m todos y materiales oooooooooooomoooo 22 E Configuraci n de los genes diana ue ARRE 25 El Configuraci n de los est ndares irradia ries Ad ARA 28 El C
316. t Gr fica de amplificaci n La pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n permite ver la amplificaci n de las muestras a medida que el instrumento StepOne recoge datos de fluorescencia durante una reacci n Si se configura un protocolo de recogida de datos a tiempo real en la pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n aparecen los datos de los pocillos seleccionados en la ficha View Plate Layout Ver disposici n de placa La gr fica representa la fluorescencia de los distintos fluorocromos normalizados AR y el n mero de ciclos La siguiente figura muestra la pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n durante el experimento de ejemplo Amplification Plot lt View Plate Layout 2 Pa E Amplification Plot a 38 10 2 4 6 18 XX 2 N S A XI rz M 3 3 4O Cycle Notas 78 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Notas Cap tulo 4 Realizaci n del experimento de curva est ndar relativa A Monitorizaci n de la reacci n La pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n es til para identificar y examinar amplificaciones anormales Una amplificaci n anormal puede incluir lo siguiente e Aumento de la fluorescencia en los pocillos de control negativo e Ausencia de fluorescencia detectable en el ciclo esperable determinada a partir de experimentos similares anteriores
317. ta de cada fluorocromo de un pocillo seleccionado durante el tiempo que dura el proceso de PCR Acerca del En el experimento de C comparativos de ejemplo en la pantalla Multicomponent Plot experimento de Gr fica multicomponente hay que fijarse en ejemplo e Fluorocromo ROX referencia pasiva e Fluorocromo FAM notificador e Picos depresiones y o cambios repentinos e Amplificaci n en pocillos de control negativo Revisi n de la 1 En el panel Experiment Menu Men del experimento seleccione Analysis gr fica An lisis EE multicomponente Multicomponent Plot Gr fica multicomponente Nota Si en la pantalla Multicomponent Plot Gr fica multicomponente no aparece ning n dato haga clic en Analyze Analizar Notas 200 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 9 An lisis del experimento de C comparativos Fon Revisi n de la gr fica multicomponente 2 Muestre un solo pocillo a la vez en la pantalla Multicomponente Plot Gr fica multicomponente a Haga clic en la ficha View Plate Layout Ver disposici n de placa b Seleccione un pocillo en la disposici n de la placa el pocillo se muestra en la pantalla Multicomponent Plot Gr fica multicomponente 3 En el men desplegable Plot Color Color de gr fica seleccione Dye Fluorocromo 4 Haga clic en Show Hide the plot legend Mo
318. ter Now C Remember my user name and password for future orders 5 Despu s de realizar el pedido haga clic en Finish Designing Experiment Finalizar el dise o del experimento Directrices de Cuando dise e su propio experimento de C comparativos dise o e Confirme que el ordenador tiene una conexi n a Internet ilimitada Notas 150 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 6 Dise o del experimento de Cy comparativos s Solicitud de materiales para el experimento e Applied Biosystems recomienda las siguientes versiones de navegadores y Adobe Acrobat Reader para utilizar el sitio web de Applied Biosystems ip N Netscape Microsoft Adobe Acrobat PES Navigator Internet Explorer Reader escritorio Windows v6 x O posterior v6 x O posterior v4 0 o posterior 98 NT 2000 Macintosh OS 9 o v6 x O posterior v5 2 O posterior v4 0 o posterior posterior Nota Aseg rese de que se han activado las cookies y Java Script para que el sitio web funcione correctamente e Seleccione todos los materiales que necesite para el experimento y a dalos a la cesta de compra Para obtener m s Para obtener m s informaci n acerca de la pantalla Materials List Lista de materiales informaci n acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en y o pulsando F1 Notas Gu a de introducci n a A
319. the reaction volume excess reaction volume component concentrations and or stock concerltrations Click Print Reaction Setup to print instructions on howto prepare the PCF reactions 1 f Reaction Mix Calculations Sarnple Dilution Calculations Select Tar Assay Type Inventoried Made to Order Y Reaction Volume Per Well 20 uL Excess Reaction Volume 10 Print Reaction Setup ES Reactions for GAPDH a 6b Master Mix Concentration T x Assay Mix Concentration AB x Volume UL for 1 Reaction 10 0 60 Complete la ficha Sample Dilution Calculations C lculos de la diluci n de muestra 1 Seleccione la ficha Sample Mix Calculations C lculos de la mezcla de muestra 2 Haga clic en el campo Diluted Sample Concentration 10X for Reaction Mix Concentraci n de muestra diluida 10X para la mezcla de reacci n y a continuaci n escriba 5 0 3 En el men desplegable de la unidad seleccione ng uL predeterminado Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 145 cuantificaci n relativa Cap tulo 6 Dise o del experimento de Cy comparativos Revisi n de la configuraci n de la reacci n 4 Revise los vol menes calculados para las diluciones de las muestras Nombredeii Concentraci n Volumen de Volumen de Volumen total estes de la soluci n mues
320. to que desea dise ar En el experimento de curva est ndar relativa de ejemplo e El experimento se identifica como un ejemplo e Se utiliza una MicroAmp Fast Optical 48 Well Reaction Plate e El tipo de experimento es de cuantificaci n 1 Haga clic en el campo Experiment Name Nombre de experimento y a continuaci n escriba Relative Standard Curve Example Ejemplo de curva est ndar relativa Nota La cabecera del experimento se actualiza con el nombre del experimento que acaba de escribir 2 Haga clic en el campo Barcode C digo de barras y a continuaci n escriba el c digo de barras que aparece en la placa de reacci n de PCR si es que dispone de uno 3 Haga clic en el campo User Name Nombre de usuario y a continuaci n escriba Example User Usuario de ejemplo 4 Haga clic en el campo Comments Comentarios y a continuaci n escriba Relative Standard Curve Getting Started Guide Example Ejemplo de la gu a de introducci n de las curvas est ndar relativas 5 Seleccione Quantitation Cuantificaci n en el tipo de experimento 6 Haga clic en Next Siguiente gt 20 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa O Definici n de las propiedades del experimento i 1A Define Experiment Properties Experiment Properties Help o Q Instructions Enter
321. tra disolvente de muestra origen ng puL uL uL diluida uL H gado 100 0 1 0 19 0 20 0 Ri n 100 0 1 0 19 0 20 0 Cerebro 100 0 1 0 19 0 20 0 2E Set Up Reaction Setup gt Reaction Mix Calculations Reaction Setup Help For each target assay in the reaction plate selectthe assay type if using TaqMan reagents then review the calculated volumes for preparing the samples and PCR E Instructions reactions If needed edit the reaction volume excess reaction volume component concentrations and or stock concentrations Click Print Reaction Setup to print 1 instructions on how to prepare the PCR reactions D Reaction Mix Calculations Sample Dilution Calculations 3 Diluted Sample Concentration 10x for Reaction Mix 5 0 ng uL e Print Reaction Setup Sample Name Stock Concentration ng pL Sample Volume uL Diluent Volume UL Total Volume of Diluted Sample Liver 100 0 1 0 19 0 20 0 4 CCOO CT ORO Imprima las instrucciones de la configuraci n de la reacci n Imprima las instrucciones detalladas de la configuraci n de la reacci n y a continuaci n gu rdelas para el Cap tulo 7 Preparaci n de las reacciones de Cr comparativos 1 Haga clic en Print Reaction Setup Imprimir configuraci n de reacci n 2E Set Up Reaction Setup gt Reaction Mix Calculations Reaction Setup Help For each target assay in the reaction plate select the assay type if usin
322. trumento transforma la se al en datos electr nicos y los datos se guardan en el archivo del experimento Los puntos de recogida de datos se indican por medio de un icono en el perfil t rmico e Recogida de datos activada e Recogida de datos desactivada Fluorocromo que produce una se al de fluorescencia Dado que la se al de referencia pasiva deber a ser uniforme en todos los posillos se utiliza para normalizar la se al del fluorocromo del notificador para justificar las fluctuaciones de fluorescencias causadas por diferencias menores entre pocillos en concentraciones o en volumen La normalizaci n de la se al de referencia pasiva permite obtener datos de gran precisi n r plicas N mero total de reacciones id nticas que contienen componentes id nticos y vol menes id nticos Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 223 cuantificaci n relativa Glosario retrotranscriptasa Ra serie sin control de amplificaci n NAC sin control de molde NTC SNP tarea temperatura de desnaturalizaci n Tm tipo de experimento Tm umbral umbral del ciclo 224 Componente de reacci n de PCR que convierte el RNA en cDNA La retrotranscriptasa se a ade a la reacci n de PCR para realizar un REPCR de 1 paso Abreviatura de notificador normalizado Normalized Reporter V ase diluci n seriada V ase tambi n pocillos de IPC de control negativ
323. ttings click Edit Default Settings To use different settings for a target selectthe target from the table deselectthe Use Default Settings checkbox then change the settings that are displayed Default Ct Settings Default CT settings are used to calculate the CT for targets without custom settings To editthe default settings click Edit Default Settings Threshold AUTO Baseline Start Cycle AUTO Baseline End Cycle AUTO Edit Default Settings Select a Target Cr Settings for c myc Target Threshold Baseline Start Baseline End Target Settings to Use Use Default Settings c myc AUTO AUTO AUTO GAPDH AUTO AUTO AUTO Revert to Defaults for All Analysis Settings Apply Analysis Settings Cancel Notas 114 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa un Revisi n de las opciones de an lisis Directrices de A menos que ya haya determinado cu l son las opciones ptimas para el experimento an lisis utilice las opciones de an lisis predeterminadas en el software StepOne Si las opciones predeterminadas no son adecuadas para el experimento puede cambiar e Cy Settings Opciones de C utilice esta ficha para ajustar manualmente el umbral y la l nea basal Si ajusta manualmente el umbral y la l nea basal Applied Biosystems recomienda lo siguiente Opci
324. uL Complete la ficha Reaction Mix Calculations C lculos de la mezcla de reacci n para cuantificaci n relativa Setup el ensayo de c myc Configuraci n de 9 1 Seleccione la ficha Reaction Mix Calculations C lculos de la mezcla de reacci n reacci n predeterminada 2 En el panel Select Target Seleccionar diana seleccione c myc 3 En el men desplegable Assay Type Tipo de ensayo seleccione Inventoried Made to Order En inventario Fabricado bajo pedido 4 Aseg rese de que en el campo Reaction Volume Per Well Volumen de reacci n por pocillo aparece 20 uL 5 Aseg rese de que en el campo Excess Reaction Volume Volumen de reacci n en exceso muestra 10 6 En el panel Reactions for c myc Reacciones para c myc a Aseg rese de que en el campo Master Mix Concentration Concentraci n de mezcla maestra aparece 2X Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de 35 Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa Revisi n de la configuraci n de la reacci n b Aseg rese de que en el campo Assay Mix Concentration Concentraci n de ensayo aparece 20X c Revise los componentes y los vol menes calculados para las reacciones de PCR Componente Volumen uL para 1 reacci n Mezcla maestra 2X 10 0 Ensayo 20X 1 0 Muestra 10X o est ndar 2 0 H O 7 0 Volumen total 20 0 El volumen de l
325. uga necesarios e Pipetas e Puntas de pipeta Liver Liver Liver caPoH Liver 1 caron g c myc 200 g c myc 0 2 E caron 200 E caron 0 2 LU caPoH Kidney D c myc g c myc 200 g c myc 0 2 E caro 20 E caron 0 2 e Mezcla de reacci n para c myc p gina 59 e Mezcla de reacci n para GAPDH p gina 59 e Agua e Est ndares de c myc p gina 55 e Est ndares de GAPDH p gina 57 e Muestras p gina 53 caPoH Kidney m c myc g c myc 20 g c myc 0 2 E caron 20 E caron 0 02 e MicroAmp Fast Optical 48 Well Reaction Plate e MicroAmp Optical 48 Well Adhesive Film Notas Liver D c myc Kidney D c myc g c myc 20 S cAPOH 20 E caron 0 02 Liver W c myc Kidney E caron 5 c myc 20 g c myc 0 02 E caroH E caroH 0 02 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa 61 Cap tulo 3 Preparaci n de las reacciones de la curva est ndar relativa Preparaci n de la placa de reacci n e Centr fuga Preparaci n de la 1 Para cada gen diana prepare las reacciones de control negativo laca de reacci n g R i p a A un tubo del tama o apropiado a ada los vol menes de la mezcla de reacci n y de agua que se indican a continuaci n bo Mezcla de jen d Pi Volumen de reacci n reacci n uL agua uL
326. ulo se explica c mo utilizar el asistente de dise o en el software StepOne para configurar el experimento de Cr comparativos AAC El asistente de dise o le guiar por los procedimientos ptimos recomendados por Applied Biosystems a medida que vaya introduciendo los par metros de dise o del experimento de ejemplo Flujo de trabajo A continuaci n se muestra el flujo de trabajo para dise ar el experimento de ejemplo que del experimento se incluye en esta gu a de introducci n de ejemplo Nota Dise e el experimento de ejemplo con el flujo de trabajo del asistente de dise o del software StepOne Cuando dise e sus propios experimentos puede seleccionar flujos de trabajo alternativos consulte Uso de esta gu a con sus propios experimentos en la p gina 9 Experimento de Cs comparativos AAC Inicio del experimento Y Dise o del experimento Cap tulo 6 Cree un nuevo experimento Defina las propiedades del experimento Defina los m todos y los materiales Configure los genes diana Configure las muestras Configure la cuantificaci n relativa Configure el protocolo de termociclado Revise la configuraci n de la reacci n Solicite materiales para el experimento O O JO O E QQ NN O Finalice el flujo de trabajo del asistente de dise o Preparaci n de las reacciones Cap tulo 7 Realizaci n del experimento Cap tulo 8 An lisis del experimento Cap tul
327. uridad xxii estaci n de trabajo xxii est ndares casilla de verificaci n Set Up Standards Configurar est ndares 25 26 componente de experimento 5 configurar 28 diluir 55 directrices de dise o 29 EMC xxiii reacciones est ndar 62 seguridad xxiii est ndares de compatibilidad electromagn tica ConsulteEst ndares EMC est ndares de seguridad xxiii est ndares EMC xxiii etiquetas de seguridad en instrumentos xiv experimento de CT comparativo de ejemplo analizar 174 datos 12 descripci n 11 dise o 126 flujo de trabajo 13 nombre 129 preparar 156 proceso 168 experimento de curva est ndar relativa de ejemplo analizar 92 datos 12 descripci n 10 dise o 16 flujo de trabajo 13 nombre 20 preparar 50 proceso 68 experimento de DDCT V ase experimento de CT comparativo experimentos de CT comparativo acerca de 5 comparados con experimentos de curva est ndar relativa 6 experimentos de curva est ndar relativa acerca de 4 comparados con experimentos de CT comparativo 6 F flujo de trabajo Advanced Setup Configuraci n avanzada 9 10 24 48 64 133 154 165 206 flujo de trabajo de exportaci n importaci n 10 209 flujo de trabajo de inicio r pido 10 207 flujo de trabajo de plantilla 10 208 flujos de trabajo Advanced Setup Configuraci n avanzada 206 experimento de ejemplo 13 Exportaci n importaci n 10 209 Plantilla 10 208 QuickStart Inicio r pido 10 207 flujos de trabajo alternativo
328. want to test in the reaction Muestras plate Cu ntas muestras desea probar en la placa de reacci n y a continuaci n escriba 2 Nota El n mero de filas de la tabla de las muestras se actualiza con el n mero que escriba 2 Haga clic en el campo How many replicates do you need Cu ntas r plicas necesita y a continuaci n escriba 3 3 Haga clic en el campo How many negative controls do you need for each target assay Cu ntos controles negativos necesita para cada ensayo diana y a continuaci n escriba 3 4 Configure la muestra 1 a Haga clic en el campo Enter Sample Name Escriba nombre de muestra y a continuaci n escriba Liver H gado b Deje la opci n predeterminada en el campo Color 59 Configure la muestra 2 a Haga clic en el campo Enter Sample Name Escriba nombre de muestra y a continuaci n escriba Kidney Ri n b Deje la opci n predeterminada en el campo Color Notas 30 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 2 Dise o del experimento de curva est ndar relativa pl Configuraci n de las muestras 6 Seleccione All Sample Target Reactions Todas las reacciones de muestra diana para configurar todos los genes diana de todas las muestras En el panel Well Count N mero de pocillos confirme que hay e 12 pocillos desconocidos M e 30 pocillos est ndar E e 6 pocillo
329. y a continuaci n toque e Stop Detener para detener el proceso despu s de que el instrumento StepOne complete el ciclo o la espera actual e Abort Abortar para detener el proceso inmediatamente e X para continuar el proceso sin ning n cambio D Ver informaci n del Toque View Method Information Ver informaci n del experimento m todo y a continuaci n toque para regresar a la pantalla Run Method Protocolo de termociclado E Ver el registro de Toque la barra de estado para ver el registro de errores errores 60 0 C stagez 00 40 13 Experiment Example_Experiment B C Add Melt Curve View Experiment Display Experiment Information Time E zoos 1 2s 0600 nd Notas 86 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 4 Realizaci n del experimento de curva est ndar relativa A Descarga de la placa de reacci n y transferencia de datos Descarga de la placa de reacci n y transferencia de datos Cuando el instrumento StepOne muestre la pantalla Run History Historial de la reacci n descargue la placa de reacci n del instrumento StepOne y transfiera los datos del experimento al ordenador para analizarlos Descarga de la ADO placa de reacci n instrumento la temperatura del bloque puede superar los 100 C Mantenga las manos alejadas hasta que la bandeja de las muestras alca
330. y o los requisitos legales aplicables en e Las directrices del Departamento de Salud y Servicios Humanos Department of Health and Human Services de EE UU publicadas en Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories n 017 040 00547 4 http bmbl od nih gov Occupational Safety and Health Standards Bloodborne Pathogens 29 CFR 81910 1030 http www access gpo gov nara cfr waisidx_01 29cfr1910a_01 htm Los protocolos del programa de seguridad biol gica de su empresa o instituci n para trabajar o manipular materiales potencialmente infecciosos Puede encontrar m s informaci n acerca de las directrices sobre peligros biol gicos en http www cdc gov Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de xxi cuantificaci n relativa Pr logo Seguridad de la estaci n de trabajo Seguridad de la estaci n de trabajo Si configura correctamente la ergonom a de su estaci n de trabajo puede reducir o evitar problemas de fatiga dolor y tensi n Para minimizar o eliminar estos problemas configure la estaci n de trabajo para adoptar posiciones neutrales o relajadas cuando est trabajando AN WENN PELIGRO MUSCULOESQUEL TICO Y POR MOVIMIENTOS REPETITIVOS Estos peligros est n causados por posibles factores de riesgo incluidos entre otros movimientos repetitivos posturas inc modas esfuerzos mantenimiento de posturas est ticas poco saludables presi n por
331. z New Experiment Open la Save a Close 87 Send Experimentto Instrument ES Download Experiment from Instrument 5 Export Print Report 5 Analysis Settings O Experiment Menu O View Piate Layout view wel Table 6 Consulte Elementos del software m s adelante y Consejos de desplazamiento en la p gina 98 para obtener informaci n acerca de c mo desplazarse por las pantallas de an lisis Directrices Cuando analice su propio experimento de curva est ndar relativa e Inmediatamente despu s de una reacci n el software StepOne analiza autom ticamente los datos utilizando las opciones de an lisis predeterminadas y a continuaci n muestra la pantalla Amplification Plot Gr fica de amplificaci n en el ordenador e Para volver a analizar los datos seleccione todos los pocillos de la disposici n de la placa y a continuaci n haga clic en Analyze Analizar Notas Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne M Real Time PCR System para experimentos de 95 cuantificaci n relativa ar Cap tulo 5 An lisis del experimento de curva est ndar relativa An lisis del experimento Elementos del A continuaci n se ilustran los elementos del software StepOne de las pantallas de software an lisis 1 Barra de men s muestra los men s disponibles en el software File Archivo Edit Edici n Instrument Instrumento Analysis An lisis Tools Herramientas Help
332. zcla de reacci n final Diluya las muestras con los vol menes que ha calculado el software StepOne Complete la ficha Sample Dilution Calculations C lculos de la diluci n de muestra en la p gina 145 Acerca del Para el experimento de C comparativos de ejemplo experimento de e Las diluciones de las muestras son necesarias porque el volumen de las muestras se ejemplo limita al 10 del volumen total de la reacci n en el software StepOne El volumen total de la reacci n es de 20 uL reacci n por lo que el volumen de las muestras es de 2 uL reacci n e La concentraci n de la soluci n de partida es de 100 ng uL Despu s de diluir la muestra de acuerdo con la tabla Sample Dilutions Calculations C lculos de diluciones de las muestras la muestra tendr una concentraci n de 5 0 ng uL Esto supone una concentraci n de 10X cuando se a aden 2 UL al volumen de mezcla de reacci n final de 20 UL Hay una concentraci n de 1X en la reacci n final Notas 158 Gu a de introducci n a Applied Biosystems StepOne Real Time PCR System para experimentos de cuantificaci n relativa Cap tulo 7 Preparaci n de las reacciones de Cy comparativos Preparaci n de las diluciones de las muestras e Los vol menes calculados en el software son Materiales necesarios Agua para diluir la muestra Tubos de microcentr fuga e Pipetas e Puntas de pipeta e Soluci n de partida de las muestras e A

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