Instructivo de Uso NCPanaftosa - Prueba Tamiz
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1. n de los muestreos aunque puede observarse un efecto de desplazamiento de valores negativos aproxim ndose hacia el valor de corte con valores de especificidad cercanos a 97 en animales lt 2 a os Se recomienda el uso de la prueba confirmatoria NCPanaftosa Prueba Confirmatoria Bovino para trabajar con valores de especificidad mayores de forma tal de no comprometer el valor predictivo positivo en reas de baja prevalencia Cabe mencionar los resultados de modelos bovinos experimentales de PANAFTOSA en los cuales se estudiaron muestras pareadas de l quido esof gico far ngeo LEF y sueros Estas fueron colectadas de 85 bovinos 37 no vacunados y 48 vacunados infectados o expuestos al VFA bajo condici n controlada La colecta de las muestras se realiz durante el estado comprobado de infecci n esto es previo a la ultima recuperaci n viral positiva a partir de LEF Independientemente del estado de vacunaci n los resultados sugieren que la sensibilidad diagn stica del sistema NCPanaftosa Pruebas Tamiz Confirmatoria relativa a muestras LEF positivas n 436 es 100 muestras positivas a LEF eran aquellas en las que el virus pudo ser aislado En cambio la sensibilidad de aislamiento por LEF relativa a resultados positivos mediante NCPanaftosa Pruebas Tamiz Confirmatoria n 893 en estos animales solo alcanz valores de 48 8 Un mejor aprovechamiento de los resultados puede obtenerse a partir de la construcci n de g2. problema entrar en contacto con PANAFTOSA 9 2 C lculo e interpretaci n de resultados Expresar los resultados en relaci n al Suero Control Padr n 1 CP1 como T C Abs del suero en an lisis media Abs CN media CP1 Calculada como referido en el punto 9 1 La muestra deber ser considerada e no reactiva para valores de T C lt 0 8 e inconclusiva o sospechosa para valores de 0 8 lt T C lt 1 e reactiva para valores de T C gt 1 Obs Caso la prueba sea utilizada para an lisis comparativo de muestras colectadas de un mismo animal recomendamos que el procesamiento de las mismas sea realizado en una nica placa 9 3 Control de calidad interno A fin de evaluar la ejecuci n de la prueba en su laboratorio a lo largo del tiempo y en las condiciones locales se recomienda la confecci n de curvas con los valores de absorbancia de las r plicas duplicados triplicados de los sueros controles CN CP1 y CP2 as como de las medias calculadas para los mismos obtenidos diariamente de acuerdo a las especificaciones del item 9 1 En este contesto se sugiere el env o a PANAFTOSA de los resultados de absorbancia de los sueros controles de todas las pruebas procesadas para su acompa amiento 10 14 10 CONSIDERACIONES GENERALES 10 1 Eventuales problemas y posibles causas e ausencia total de reacci n o coloraci n extremadamente tenue Verifique calidad del agua mantenga el excedente de co
3. 120 ml Soluci n de cido c trico en buffer fosfato con per xido de hidr geno espec fica para la diluci n del sustrato Conservar en heladera 2 C a 8 C Lista para su uso 5 11 Sustrato 100x concentrado ST 1 tubo conteniendo 1 2 ml Soluci n de tetrametilbencidina TMB en dimetilsulf xido DMSO 100x concentrada Diluir seg n lo indicado en la Tabla II P g 7 Conservar en heladera 2 C a 8 C 5 12 Soluci n bloqueadora SB 1 frasco conteniendo 120 ml Soluci n de cido sulf rico H2SO4 1N Lista para su uso Conservar en heladera 2 C a 8 C 4 14 6 MATERIAL Y EQUIPOS NECESARIOS NO SUMINISTRADOS 6 1 Material de laboratorio Pipeta multicanal de volumen ajustable 100 yl y micropipetas monocanal de volumen ajustable 10 20 100 y 1000 ul con precisi n y exactitud verificada Punteras descartables adecuadas a las micropipetas garantizar que las mismas no retengan inmunoglobulinas lo que puede interferir con los resultados del test Placas auxiliares de 96 pocillos para la diluci n previa de las muestras opcional Garantizar que las mismas no retengan anticuerpos anti 3ABC Papel secante e Material de laboratorio para preparar las soluciones Agua deionizada y o destilada e Hipoclorito de sodio para tratar el material a descartar materiales y soluciones resultantes de la prueba 6 2 Equipos e Lavadora de placas manual o autom tica e Estufa 37 C 0 5C e Lectora de microplacas con fi
4. surgimiento de color azul en aquellos pocillos en que el ant geno haya retenido anticuerpos anti 3ABC y consecuentemente conjugado Por ltimo la reacci n es interrumpida al agregarse cido sulf rico que provoca el viraje del color azul al amarillo Se efect a la lectura de la microplaca en la lectora de placa y se mide la absorbancia de cada uno de los pocillos Los resultados de los sueros controles permiten clasificar las muestras problema 2 14 4 CUIDADOS Y PRECAUCIONES e Todos los componentes del kit deben conservarse en heladera 2 C a 8 C e Conservar los materiales en sus envases originales e Respetar el plazo de validez que figura en la etiqueta de la caja No usar ni mezclar componentes de otros kits lotes o fabricantes e Seguir estrictamente el procedimiento recomendado para la ejecuci n del ensayo e Todos los materiales del kit se destinan a reacciones in vitro y deben ser manipulados cumpliendo buenas pr cticas de laboratorio BPL No usar soluciones que presenten se ales de alteraci n tales como precipitado turbidez etc De observarse entrar en contacto con PANAFTOSA e Manipular las muestras y los sueros controles cumpliendo BPL El sustrato deber ser manipulado con cuidado ya que contiene dimetilsulf xido DMSO que es f cilmente absorbido por la piel Evitar el contacto con la soluci n bloqueadora De ocurrir lavar abundantemente con agua e Todos los materiales
5. y residuos de la prueba placas frascos y l quidos resultantes de las diferentes etapas deber n ser tratados antes de ser eliminados Se recomienda autoclavar durante 45 minutos a 121 C a 1 atm sfera o tratar con hipoclorito de sodio a concentraci n final de 5 durante 1 hora 5 REACTIVOS SUMINISTRADOS EN EL KIT Composici n 5 1 Microplacas sensibilizadas con la prote na 3ABC MP 10 microplacas Microplacas con 96 pocillos sensibilizadas con la prote na recombinante 3ABC del VFA purificada Listas para su uso Conservar en heladera 2 C a 8 C 5 2 Soluci n PBS Tween 20x concentrada PB 2 frascos conteniendo 160 ml cada uno Soluci n PBS Tween 20 concentrado 20 veces y con conservante para la preparaci n de la soluci n de lavado y del diluyente de muestra conjugado seg n lo indicado en los Procedimientos preliminares P g 6 Conservar en heladera 2 C a 8 C 5 3 Escherichia coli EC 1 tubo conteniendo 450 yl Lisado de Escherichia coli para adicionar al diluyente de muestra conjugado seg n lo indicado en los Procedimientos preliminares P g 6 Conservar en heladera 2 Ca 8 C 3 14 5 4 Leche en polvo descremada LP 1 bolsa pl stica conteniendo 25 g Leche en polvo descremada para adicionar al diluyente de muestra conjugado seg n lo indicado en los Procedimientos preliminares P g 6 Una vez abierto el sobre mantener el resto del contenido herm ticamente cerrado en h
6. Organizaci n Panamericana de la Salud Eo Y Y Bay Oficina Regional de la 5 li NE Y Organizaci n Mundial de la Salud m AL Unidad de Salud P blica Veterinaria CENTRO PANAMERICANO DE FIEBRE AFTOSA Instructivo de Uso NCPanaftosa Prueba Tamiz Bovino Kit diagn stico para detecci n de anticuerpos contra prote nas no capsidales del Virus de la Fiebre Aftosa Conjunto de reactivos para la detecci n n vitro de anticuerpos contra la poliprote na 3ABC del Virus de la Fiebre Aftosa para el estudio de 880 muestras de suero bovino B falo Bubalus bubalis USO VETERINARIO NDICE 1 NOMBRE Y USO RECOMENDADO cinco noes 2 2 INTRODUCCION S 2 3 PRINCIPIO DEL ENSAYO ooo 2 4 CUIDADOS Y PRECAUCIONES oasis a a ire 3 5 REACTIVOS SUMINISTRADOS EN EL KIT icici esir Eiei ea E EEEE RA EEES FEE TEA EARE E R EEEE E ii E 3 6 MATERIAL Y EQUIPOS NECESARIOS NO SUMINISTRADOS ccococciccoconoccononcnnononnononcononconononnnoncononnonnnnn ronca ronca na nnnnnnos 5 6 1 Material d laboratorio sss enana aae OEE ETE EAEN 5 02 EQUIPOS mrri EEA E E TE E T ETN T ERTE EE E E 5 63r SUSrOCONOlMMTETNO nnee na a E I E A E E 5 Za MANEJO Y CONSERVACION DE LAS MUESTRAS cccccicccncnccconoconnononnononcononcnnoncnnnonnononnonnncnnnncnnn non nn non cnn nnn ronca sesira ninas 5 CADA 6 8 1 Procedimientos preliminares sars erar aai E niao rea Eas aHa SEE eo Ta pas LEE aas E E EE ENES 6 TABLA I Vol menes a preparar en funci n del n mero de Mue
7. Panam Fiebre Aftosa 61 1 5 Bergmann I E Malirat V Dias L E amp Dilandro R 1996 Identification of foot and mouth disease virus free regions by use of a standardized enzyme linked immunoelectrotransfer blot assay Am J Vet Res Vol 57 No 7 972 974 Bergmann 1 E Astudillo V Malirat V amp Neitzert E 1998 Serodiagnostic strategy for estimation of foot and mouth disease viral activity through highly sensitive immunoassays using bioengineered nonstructural proteins The Veterinary Quarterly Vol 20 Sup 2 S6 S9 Bergmann 1 E Malirat V Neitzert E Panizzutti N S nchez C 8 Falczuk 2000 Improvement of serodiagnostic strategy for FMDV surveillance in cattle under systematic vaccination A combined system of an indirect ELISA 3ABC with an enzyme linked immunoelectrotransfer blot assay Archives of Virology Vol 145 473 489 Bergmann I 8 Neitzert E 2000 Fiebre Aftosa Instrumentos seroepidemiol gicos para evaluar actividad viral I ELISA 3ABC y EITB Sistema para detecci n de anticuerpos contra ant genos no estructurales del Virus de la Fiebre Aftosa Centro Panamericano de Fiebre Aftosa Manual t cnico Rio de Janeiro Bergmann I E Malirat V Neitzert E amp Correa Melo E 2003 Validation of the I ELISA 3ABC EITB System for Use in Foot and Mouth Disease Surveillance Overview of the Southamerican Experience Foot and Mouth Disease Control Strategies 361 370 Elsevier SAS Eds Bergm
8. a Incubar durante 30 minutos a 37 C 2 minutos antes del inicio del lavado preparar el sustrato diluido 6 x 0 3 ml Lavar en 3 ciclos dobles 6 veces Incubaci n del sustrato Sustrato diluido Adicionar a cada pocillo Incubar durante 15 minutos a 20 C 25 C TA Bloqueo de la reacci n Soluci n bloqueadora Adicionar a cada pocillo Leer la absorbancia a 450 620 nm en un plazo m ximo de 30 minutos 9 14 9 C LCULO DE LOS RESULTADOS 9 1 Criterio de aceptaci n de la placa La placa ser v lida solamente si los sueros controles cumplen los siguientes requisitos e Suero Control negativo CN El valor de absorbancia de cada una de las r plicas debe ser inferior a 0 1 Si cumple calcular la media e Suero Control Padr n 1 CP1 El valor de absorbancia de cada una de las r plicas luego de sustraer el valor de absorbancia de la media del control negativo CN debe ser superior a 0 15 Si s lo una de las r plicas esta fuera de rango podr ser desconsiderada calculando la media con los otros 2 valores Si los valores son aceptables calcular la media e Suero Control Padr n 2 CP2 Sustraer del valor de absorbancia de cada r plica el valor de la media del CN Calcular la media e La relaci n CP2 CP1 deber ser igual a 2 1 con una variaci n m xima de 25 De no cumplir con los requisitos detallados la placa deber ser considerada inv lida y deber ser repetida De persistir el
9. a VFA Este ensayo que consiste en una prueba de I ELISA Indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay fue padronizado como prueba tamiz de un sistema que usa el NCPanaftosa Prueba Confirmatoria Bovino EITB Enzyme Linked Immunoelectrotransfer Blot como prueba confirmatoria Su uso est recomendado en la vigilancia activa de la Fiebre Aftosa en poblaciones bovinas menores de 2 a os El kit tambi n fue validado para su uso en sueros de B falo Bubalus bubalis en las mismas condiciones que para el bovino 2 INTRODUCCI N La Fiebre Aftosa enfermedad infecciosa que afecta a los animales biungulados es causada por el VFA Los animales infectados presentan en general lesiones aftas en la boca y patas pudiendo ocurrir el establecimiento de infecci n subcl nica inclusive estando vacunados que se puede hacer persistente y de duraci n variable que en el bovino puede extenderse a m s de dos a os Debido a esta caracter stica la demostraci n fehaciente de ausencia de actividad viral es esencial para acompa ar la evoluci n de los programas de erradicaci n El presente ensayo desarrollado para evaluar actividad viral en poblaciones animales introdujo un enfoque diagn stico innovador basado en la detecci n de anticuerpos contra la prote na no capsidal 3ABC del VFA como marcador de exposici n al virus activo Puede ser usado independientemente del estado de vacunaci n del animal Como las PNC son altamente conser
10. ann I E Malirat V Neitzert E 8 Correa Melo E 2003 Vaccines and Companion Diagnostic Tests for Foot and Mouth Disease Virus An overview of the Experience in South America Vaccines for OIE List A and Emerging Animal Diseases Dev Biol Basel Karger 114 57 63 Brown F Roth eds Bergmann 1 E Neitzert N Malirat V Ortiz S Colling A S nchez C amp Correa Melo E 2003 Rapid Serological Profiling by Enzyme Linked Immunosorbent Assay and its Use as an Epidemiological Indicator of Foot and Mouth Disease Viral Activity Archives of Virology Vol 148 891 901 Bergmann I E Malirat V 8 Neitzert E 2003 Instrumentos Diagn sticos para la Vigilancia de la Fiebre Aftosa Centro Panamericano de Fiebre Aftosa OPS OMS Selecci n de Trabajos del Seminario Internacional sobre Uso de Instrumentos Seroepidemiol gicos y Virol gicos en la Vigilancia de Fiebre Aftosa Santiago Chile 10 11 de Marzo En prensa Bergmann I E Malirat V 8 Neitzert E 2003 Pruebas Serol gicas y Virol gicas en la Vigilancia Activa de la Fiebre Aftosa Centro Panamericano de Fiebre Aftosa OPS OMS Selecci n de Trabajos del Seminario Internacional sobre Uso de Instrumentos Seroepidemiol gicos y Virol gicos en la Vigilancia de Fiebre Aftosa Santiago Chile 10 11 de Marzo En prensa Malirat V Neitzert E Bergmann I E Maradei E 8 Beck E 1998 Detection of cattle exposed to foot and mouth disease virus by means of an indirect ELISA te
11. e Antes de finalizar la etapa de incubaci n de las muestras preparar el conjugado diluido seg n lo indicado en la Tabla II P g 7 7 14 Lavado Concluida la etapa de incubaci n de las muestras vaciar la placa evitando que trasborde l quido de un pocillo para otro lavar la placa en 3 ciclos dobles total 6 veces evitando que trasborde l quido de un pocillo para otro como tambi n que las agujas de la lavadora toquen el fondo de la placa La cuidadosa ejecuci n de esta etapa es fundamental para obtener un buen resultado Si no se dispone de lavadora autom tica el lavado podr ser realizado manualmente Concluidos los ciclos de lavado eliminar todo resto de soluci n golpeando la placa invertida sobre papel secante Incubaci n del conjugado Adicionar 100 jul de conjugado diluido por pocillo Sellar la placa e incubar a 37 C 0 5 C durante 30 minutos 0 5 minutos Antes de acabar la etapa de incubaci n del conjugado preparar el sustrato crom geno seg n lo indicado en la Tabla II P g 7 Caso la temperatura ambiente est por debajo de 20 C se aconseja estabilizar el volumen de diluyente de substrato necesario para la prueba durante 10 minutos a 37 C Una vez estabilizado preparar el sustrato crom geno y usar inmediatamente Antes de usar el sustrato concentrado verificar que est l quido y homog neo punto de fusi n 18 C La soluci n final preparada de sustrato diluido debe ser incolora o de un col
12. eladera 2 C a 8 C 5 5 Suero equino SE 1 frasco conteniendo 45 ml Suero equino irradiado y con conservantes para adicionar al diluyente de muestra conjugado seg n lo indicado en los Procedimientos preliminares P g 6 Conservar en heladera 2 C a 8 C 5 6 Suero Control Negativo CN 1 tubo conteniendo 130 pl Suero bovino sin anticuerpos contra el VFA tratado con cloroformo y BEI con conservante Manipular seg n lo indicado en Incubaci n de las muestras P g 7 Conservar en heladera 2 C a 8 C Centrifugar antes de su uso 5 7 Suero Control Padr n 1 CP1 1 tubo conteniendo 170 pl Suero bovino con anticuerpos contra la prote na 3ABC del VFA tratado con cloroformo y BEI con conservante Manipular seg n lo indicado en Incubaci n de las muestras P g 7 Conservar en heladera 2 C a 8 C Centrifugar antes de su uso 5 8 Suero Control Padr n 2 CP2 1 tubo conteniendo 130 pl Suero bovino con anticuerpos contra la prote na 3ABC del VFA tratado con cloroformo y BEI con conservante Manipular seg n lo indicado en Incubaci n de las muestras P g 7 Conservar en heladera 2 C a 8 C Centrifugar antes de su uso 5 9 Conjugado 100x concentrado CJ 1 tubo conteniendo 1 2 ml Anticuerpos de conejo anti IgG bovino conjugados con peroxidasa con estabilizante Diluir seg n lo indicado en la Tabla II P g 7 Conservar en heladera 2 C a 8 C 5 10 Diluyente de sustrato DS 1 frasco conteniendo
13. i n del conjugado y sustrato en funci n del n mero de placas E Diluyente de 4 N mero de Conjugado Diluyente de Sustrato muestra placas 100x sustrato 100x conjugado 8 2 Ejecuci n del ensayo Incubaci n de las muestras e Colocar 95 pl de diluyente de muestra conjugado en todos los pocillos Adicionar 5 ul de muestra o suero control diluci n final 1 20 en el pocillo asignado siguiendo el orden establecido en la planilla de la prueba Utilizar una puntera nueva para cada muestra No deben transcurrir m s de 10 minutos entre la diluci n del primero y el ltimo suero a fin de garantizar la correcta interpretaci n de los resultados Opcional En caso de no poder efectuar la diluci n de los sueros en un tiempo m ximo de 10 minutos se puede pre diluir las muestras problema en una placa auxiliar virgen sin sensibilizar Para ello colocar 190 pul de diluyente de muestra conjugado en los pocillos de las muestras problema respetando las posiciones definidas en la planilla de la prueba y adicionar 10 ul de muestra por pocillo Homogeneizar las diluciones Usar una puntera nueva para cada muestra Transferir con pipeta multicanal 100 pl de las muestras pre diluidas a la placa sensibilizada respetando las posiciones de las mismas Los sueros controles no deben ser pre diluidos adicionarlos en la forma descripta anteriormente e Sellar la placa e incubar a 37 C 0 5 C durante 30 minutos 0 5 minutos
14. ltros para lectura a 450 y 620 nm e Homogeneizador tipo v rtex e Balanza e Microcentr fuga tipo Eppendorf o similar Seguir las instrucciones de los fabricantes para el uso frecuencia de calibraci n y mantenimiento 6 3 Suero control interno Suero bovino con desempe o conocido 7 MANEJO Y CONSERVACI N DE LAS MUESTRAS Para el manejo y conservaci n de los sueros recomendamos Conservarlos en heladera 2 C a 8 C no m s de 2 d as para per odos mayores conservarlos a 20 C 5 C Evitar repetidos ciclos de congelamiento descongelamiento No usar sueros contaminados o que presenten precipitados Homogeneizar los sueros antes de usarlos 5 14 8 PROCEDIMIENTO 8 1 Procedimientos preliminares e e e e 0 e Antes de comenzar la prueba retirar los siguientes reactivos de la heladera Microplacas PBS 20x Diluente de Sustrato y Soluci n Bloqueadora para permitir que se estabilicen a temperatura ambiente TA 20 C 25 C Preparar diluyente de muestra conjugado y la soluci n de lavado 1x dej ndolos estabilizar tambi n a TA Devolver suero equino E coli y leche a la heladera Retirar los otros reactivos sueros padrones sueros problema conjugado 100x y sustrato 100x en el momento de su uso Preparar la planilla de la prueba P g 14 teniendo en cuenta que deben usarse 2 pocillos para el suero Control Negativo CN 3 pocillos para el suero Control Padr n 1 CP1 2
15. njugado y substrato diluidos hasta el final de la prueba con el fin de confirmar que ocurre el desarrollo de color mezclando ambas soluciones Controlar posibles retenciones en punteras y placas auxiliares e sueros controles fuera del rango Verifique la temperatura de la sala y de la estufa controle que los tiempos de incubaci n sean los recomendados confiera el estado de calibraci n de las micropipetas verifique la calidad del lavado del material y la calidad del material descartable e resultados no reproducibles verifique el estado de calibraci n de las micropipetas certifiquese que los procedimientos de lavado sean los recomendados Controle que no haya contaminaci n qu mica o microbiol gica de los tubos y v lvulas utilizados en los sistemas de lavado Compruebe el estado de calibraci n de la lectora de placas Verifique la calidad del lavado del material y la calidad del material descartable 10 2 Consideraciones metodol gicas La prueba est basada en la detecci n de anticuerpos Debe tenerse en cuenta que la presencia de los mismos no necesariamente indica presencia del virus ya que pueden estar reflejando no solo infecci n presente sino tambi n infecci n pasada Asimismo es importante resaltar que existe un intervalo temporal entre la exposici n al virus y la formaci n de anticuerpos Ensayos realizados con el NCPanaftosa Prueba Tamiz Bovino en animales experimentalmente infectados permitieron establecer q
16. or amarillo p lido De observarse color m s intenso descartar la soluci n y preparar una nueva Lavado Proceder del modo indicado en la etapa anterior de lavado Incubaci n del sustrato crom geno Adicionar 100 jul de sustrato crom geno diluido a cada pocillo e incubar a TA durante 15 minutos 0 5 minutos Adicionar 100 pl de soluci n bloqueadora a cada pocillo Lectura de la placa La lectura de la placa debe ser realizada en un plazo m ximo de 30 minutos despu s de la adici n de la soluci n bloqueadora Realizar lectura con doble filtro 450 nm y 620 nm para correcci n autom tica de blanco 8 14 Resumen de los procedimientos del ensayo Volumen Procedimiento Diluci n de las muestras Dil muestra conjugado Adicionar a cada pocillo en toda la placa Controles y muestras Adicionar en los pocillos asignados y homogeneizar suavemente Muestras pre diluidas opcional Dil muestra conjugado di i uestra conjug Adicionar en cada pocillo de toda la placa auxiliar Muestra s Adicionar en los pocillos asignados y homogeneizar suavemente Transferir de la placa auxiliar a la placa sensibilizada Incubaci n de las muestras Cubrir la placa Incubar durante 30 minutos a 37 C 2 minutos antes del inicio del lavado preparar el conjugado diluido 6 x 0 3 ml Lavar en 3 ciclos dobles 6 veces Incubaci n del conjugado Conjugado diluido Adicionar a cada pocillo Cubrir la plac
17. pocillos para el suero Control Padr n 2 CP2 y 1 pocillo para el Suero control interno por placa Homogeneizar los reactivos antes de su uso Preparar las soluciones necesarias para la prueba en funci n del n mero de muestras placas a procesar siguiendo lo especificado en la Tabla I TABLA I Vol menes a preparar en funci n del n mero de muestras Diluyente de N mero de Buffer de muestra muestras ENT 1 placa 500 ml 88 muestras 2 placas 1000 ml 176 muestras conjugado 3 placas 1500 ml 264 muestras 4 placas 2000 ml 352 muestras 5 placas 2500 ml 440 muestras Buffer de lavado Diluir 20 veces con agua deionizada y o destilada la soluci n PBS Tween 20x PB De observarse precipitados en la soluci n PB disolverlos en Ba o Mar a a 37 C 0 5 C previo a la diluici n Diluyente de muestras conjugado Para preparar 100 ml de esta soluci n disolver 5 g de leche descremada LP en aproximadamente 50 ml de buffer de lavado preparado anteriormente Adicionar 10 ml suero equino 100 ul de Escherichia coli EC homogeneizar y llevar a volumen final con buffer de lavado preparado anteriormente Preparar en el momento de uso un volumen suficiente para cada prueba descartando el volumen no utilizado al final de la prueba La diluci n del conjugado y del sustrato debe realizarse 5 10 minutos antes de su uso de acuerdo a lo especificado en la Tabla II 6 14 TABLA II Preparac
18. r ficos de distribuci n de frecuencia de reactividades de anticuerpos resultando en perfiles que reflejan poblaciones con diferente situaci n epidemiol gica En las referencias bibliogr ficas se ejemplifican perfiles obtenidos para poblaciones representativas de las siguientes situaciones epidemiol gicas poblaciones de animales de reas libres sin vacunaci n animales experimentalmente infectados poblaciones de animales involucrados en brotes de fiebre aftosa poblaciones de animales menores de 2 a os de reas con vacunaci n sistem tica sin enfermedad cl nica en los ltimos 4 a os poblaciones de animales mayores de 2 a os de reas con vacunaci n sistem tica sin enfermedad cl nica en los ltimos 4 a os 12 14 10 11 12 13 14 15 16 12 BIBLIOGRAF A Bergmann I E Aug de Mello P Neitzert E Beck E 8 Gomes I 1993 Diagnosis of persistent aphtovirus infection and its differentiation from vaccination response in cattle by use of enzyme linked immunoeletrotransfer blot analysis with bioengineered nonstructural viral antigens Am J Vet Res 54 825 831 Bergmann I E 1994 Uso de la prueba de EITB para identificaciones de reas con ausencia de actividad viral Veterinaria 70 16 20 Bergmann I E 8 Malirat V 1995 Performance of a rapid enzyme linked immunoelectrotransfer blot assay for detection of cattle exposed to foot and mouth disease virus Bol Centr
19. st using bioengineered nonstructural polyprotein 3ABC The Veterinary Quarterly Vol 20 Sup 2 S24 S26 Neitzert E Beck E Aug de Mello P Gomes I 8 Bergmann I E 1991 Expression of the aphtovirus RNA polymerase gene in Escherichia coli and its use together with other bioengineered nonstructural antigens in detection of late persistent infections Virology 184 799 804 Office International des Epizooties World organisation for animal health Manual of standards for diagnostic tests and vaccines 2000 OIE Paris Charting Methods for internal Quality Control in Methods in Molecular Biology The ELISA Guidebook Crowther J R Human Press Inc 2001 347 394 13 14 13 ANEXO Planilla de la Prueba NCPanaftosa Prueba Tamiz Bovino Fecha Lote PBS Tween 20X Conjugado Dil Muestra conjugado Sustrato Sueros ION MOUOQOw gt A B C D E F G H Suero Control Interno 14 14
20. straS 0ccococoncnonoccnnnnonnnnnoncnacnnnrcnnnnnos 6 TABLA II Preparaci n del conjugado y sustrato en funci n del n mero de placas ssec 7 3 2 Fjecuciom del ensayo id a tallada 7 Resumen de los procedimientos del ensayo ococccccncncncnnncnnnnonnncnnnnnnnnnnnrnrnrnrrrrrrrr rara nrnrnrnrarnrarereneranan 9 9 C LCULO DE LOS RESULTADOS acc 10 9 1 Criterio de aceptaci n de la plaCa cccciniciconccinnnnnononcncncnnnn cnn cnnonrnrcnrno ran cnn nn ran canoa ran nannoranonnna rana ana reena reenn reet 10 9 2 C lculo e interpretaci n de resultadoS o cocicociccicioniocinnnnnccnnonnoncnnononoroncnnoo cnn cnooo ron nns coran nannornrnnnaraaarna narrar raras 10 9 3 Control de calidad iNterMO ooocccnicicicicicicinnnoconocononocononononnncnnonncnnnnnnnnn nono nn non anna nn nn nn RR anna nr arenas 10 10 CONSIDERACIONES GENERALES susi 11 10 1 Eventuales problemas y posibles CausaS coccicccciciciciconononononcnconococnnnnonononnnnnnnnrnr once 11 10 2 Consideraciones metodol gicas O 11 11 DESCRIPCI N DE LAS CARACTER STICAS DE DESEMPE O DE LA PRUEBA n 11 12 BIBLIOGRAF A nro 13 1 ANEXO E E E E E E E E T 14 1 14 1 NOMBRE Y USO RECOMENDADO El kit denominado NCPanaftosa Prueba Tamiz Bovino est integrado por un conjunto de reactivos necesarios para la realizaci n de un ensayo inmunoenzim tico que permite la detecci n in vitro de anticuerpos contra la prote na no capsidal PNC 3ABC del Virus de la Fiebre Aftos
21. ue el proceso de seroconversi n puede detectarse a partir de los 7 d as post infecci n 11 DESCRIPCI N DE LAS CARACTER STICAS DE DESEMPE O DE LA PRUEBA e La especificidad estimada con animales v rgenes provenientes de reas libres sin vacunaci n de Am rica del Sur y Europa result en valores que excedieron el 98 e La sensibilidad calculada para animales con comprobada infecci n persistente establecida en forma experimental y en animales de campo no vacunados en Am rica del Sur y Europa llega al 100 Para animales vacunados y con comprobada infecci n persistente la sensibilidad se aproxima al 100 Sin embargo cuando se incluyeron animales con infecci n persistente no comprobada y probablemente sin riesgo de transmisi n de virus aquellos con resultados positivos para PCR o aislamiento viral s lo en raras ocasiones y en per odos pr ximos a la exposici n los valores disminuyeron aproximadamente 97 2 e En animales vacunados en reas libres con vacunaci n sistem tica los valores de especificidad diagn stica pueden variar seg n la pureza de las vacunas en relaci n a su contenido de PNCs as como al n mero de vacunaciones En este sentido se recomienda el uso de vacunas que no induzcan respuesta de anticuerpos anti PNC en animales vacunados revacunados En general vacunas purificadas mediante m todos convencionales no inducen una respuesta 11 14 de anticuerpos que pueda interferir con la evaluaci
22. vadas entre los diferentes serotipos la prueba puede ser aplicada para investigaci n de cualquier serotipo del VFA 3 PRINCIPIO DEL ENSAYO El ensayo se realiza en 3 etapas 1 Incubaci n de las muestras sueros de bovino bubalino 2 Incubaci n del conjugado y 3 Incubaci n del sustrato Siguen a las dos primeras etapas ciclos de lavado y a la ltima la adici n de la soluci n bloqueadora para detener la reacci n Incubaci n de las muestras la prote na 3ABC inmovilizada en la microplaca al entrar en contacto con la muestra reaccionar con los anticuerpos espec ficos de estar presentes formando el complejo inmune ant geno anticuerpo Otros anticuerpos presentes en la muestra no espec ficos no reaccionar n y ser n eliminados en la etapa de lavado que sigue a la incubaci n quedando solo los anticuerpos anti 3ABC adheridos a la placa a trav s de la prote na 3ABC Incubaci n del conjugado en esta etapa se agrega el conjugado anticuerpos anti IgG de bovino con peroxidasa que se unir espec ficamente al anticuerpo bovino en el complejo ant geno anticuerpo de haberse formado De no formarse el complejo en la etapa anterior el conjugado no se unir y ser eliminado durante el lavado que sigue a este paso Incubaci n del sustrato en esta tercera etapa se adiciona el sustrato incoloro TMB H202 sobre el cual act a la enzima peroxidasa del conjugado Como resultado de la acci n de la misma se observar el
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