Clonamiento, expresión y seroreactividad del antígeno
Contents
1. Con respecto a la secuencia reportada por Ar valo Jim nez 1993 con c digo de acceso del Genbank L20677 40 Rev Peru Med Exp Salud Publica 22 1 2005 Seroreactividad flagelina de B bacilliformis Adem s para evaluar la especificidad se usaron sue ros de pacientes confirmados con otras enfermeda des tres sueros de pacientes con Brucelosis confir mado por cl nica y serolog a tres sueros de pacien tes con Leptospirosis confirmado por cl nica y serolog a ELISA IgM y siete sueros de pacientes con salmonelosis causada por Salmonella tiphy confir mado por cl nica y serolog a AMPLIFICACI N DEL GEN FLaA DE B bacilliformis Para la amplificaci n y estandarizaci n del gen me diante PCR se us el ADN gen mico de la cepa de B bacilliformis JB584 Los ensayos de PCR fueron dise ados para un volumen final de 50 uL Las reacciones se realizaron en tubos para PCR de polipropileno y en un termociclador modelo 9700 PE Applied Biosystems Inc Forter City CAL USA Las condiciones por tubo de reacci n fueron las siguientes soluci n tamp n de reacci n 1x PE Applied Biosystems 0 2 mM dNTP 2 0 mM MgCl 1 uM BbFlaA1 1 uM de BbFlaA2 1 U de Amplitag ADN polimerasa PE Applied Biosystems y 200 ng de ADN El ciclaje final para la amplificaci n del fragmento incluye una desnaturalizaci n inicial de 5 minutos a 95 C 30 ciclos de 30 segundos a 95 C 30 segundos a 36 C y 1 minuto a 72 C y una exte2. ptica de 1 OD y se induzca por 2 horas con 2 5 mM de IPTG Figura 3 En los primeros ensayos de expresi n realizados se observ la presencia de GST libre en los purificados lo que indicaba que parte de la prote na de fusi n era degradada por proteasas disminuyendo as su rendi miento Por ello se decidi usar el inhibidor de proteasas PMSF el cual mejor la purificaci n de pro te na de fusi n datos no presentados y disminuy la presencia de GST libre 43 Rev Peru Med Exp Salud Publica 22 1 2005 Gallegos V et al Estandarizaci n de la expresi n de la prote na de fusion FlaA en E coli BL21 LE 3 3 E HFH 1 J J i mF A ras cada E i m a ER 05 ana de ia 33 kDa l ma Ss aiad i la er i o l ME E i kht i i B L m EL A Wi he O 5 bs pre ISk poa e pea 10 kDa E a i__ _ y aa Figura 3 Estandarizaci n de la expresi n de la prote na de fusi n MPM en todos los casos es el marcador de peso molecular Wide Range Sigma M4038 En A carril 1 4 curva de densidad ptica 0 5 1 0 1 5 y 2 OD En B carril 1 6 curva de concentraci n de inductor 0 0 5 1 0 1 5 2 y 2 5 mM de IPTG En C carril 1 5 curva de horas de inducci n 1 2 3 4 y 5 Horas de inducci n En D carril 1 5 curva de cantidad de prein culo 50 100 150 200 y 300 uL de prein culo Las flechas indican las bandas para la prote na de fusi n rBbFlaA GST ESTANDARIZ
3. an el fragmento espera MPM 1 23 45 67 8910 m gt 3000 pb 2000 pb 1150pb 1000 pb o Figura 2 Identificaci n de las posibles clonas recombinantes para el inserto de 1139 pb en pGEX BbFlaA1 2 digerido con EcoRI y Sal MPM muestra el marcador de peso molecular de 1Kb Ladder Promega Co Carril 1 producto de amplificaci n BbFlaA1 2 carril 2 clona BL21 Il 3 carril 3 clona BL21 Il 4 carril 4 clona BL21 Il 5 carril 5 clona BI21 Il 6 Carril 6 clona BI21 Il 8 carril 7 clona BI21 Il 9 carril 8 clona BI21 Il 10 carril 9 clona BI21 Il 11 Carril 10 clona BI21 11 12 do Adem s que el fragmento estaba ligado en fase de expresi n ESTANDARIZACI N DE LA EXPRESI N DE LA PROTE NA RECOMBINANTE EN E coli BL21 Se determin que el m todo de lisis celular en los ciclos de fr o calor es m s eficiente que la sonicaci n debido a que permite recuperar mayor cantidad de pro te nas datos no presentados Se logr expresar y purificar la prote na fusi n de la clona BL21 Il 10 mas no de la clona BL21 Il 11 a pe sar que el secuenciamiento del inserto en el pl smido lo ubicaba en fase de expresi n Finalmente se requiere como condiciones ptimas para la expresi n de la prote na de fusi n rBbFlaA en pGEX4T 1 que el cultivo crezca en caldo LB ampicilina a 30 C suplementado con 2 de glucosa a partir de un prein culo de 100 uL crecido por toda la noche que el in culo alcance una densidad
4. EcoRI y Sal siguiendo las recomendaciones de los fabricantes Luego de purificar el fragmento obtenido de la diges ti n de pGEM BbFlaA1 2 1 y el pl smido pGEX EcoRl Sall se procedi con la reacci n de ligaci n entre el inserto y el pl smido pGEX 4T 1 La proporci n de in serto vector fue de 1 1 Se consider un control autoligado y se sigui los protocolos sugeridos en el manual t cnico del kit para pGEX 4T 1 Una al cuota de esta reacci n de ligaci n 5 uL se us para transformar cepas competentes de E coli BL21 luego las colonias obtenidas fueron cultivadas en tubos individuales aplicando procedimientos vali dados Luego purific el pl smido que conten an mediante el m todo de lisis alcalina y se seleccion las posibles recombinantes por tama o mediante electroforesis en geles de agarosa al 1 IDENTIFICACI N DEL INSERTO EN pGEX 4T 1 Para verificar los posibles pl smidos recombinantes obtenidos se purificaron usando el kit Wizard Minipreps Promega Biosciences Inc siguiendo las recomen daciones de los fabricantes y luego digeridos con enzimas de restricci n para la liberaci n del fragmen to utilizando EcoR y Sall Seg n condiciones reco mendadas por los fabricantes Para verificar en que posici n fue ligado el inserto a pGEX se realiz cortes con enzimas de restricci n EcoRI BgLll y BstEll Promega Biosciences Inc seg n las recomendacio nes de los fabricantes Los resultados de estos
5. Enzime Lynked Immunosorbent Assay Recombinant Proteins Carrion s Diseases source DeCS BIREME 1 2 Laboratorio de Biotecnolog a y Biolog a Molecular Centro Nacional de Salud P blica Instituto Nacional de Salud Lima Per Laboratorio de Inmunolog a Facultad de Ciencias Universidad Peruana Cayetano Heredia Lima Per 39 Rev Peru Med Exp Salud Publica 22 1 2005 Gallegos V et al INTRODUCCI N La enfermedad de Carri n o Bartonelosis causada por B bacilliformis es un problema de salud importante en el Per y es considerada como reemergente Los m todos convencionales existentes para el diagn sti co de la enfermedad de Carri n presentan muchas limitaciones la principal de ellas es la baja sensibili dad en el caso del frotis y el tiempo que demanda el crecimiento de la bacteria en el caso del cultivo entre 14 a 45 d as Actualmente se ha propuesto diversos m todos para el diagn stico de la Bartonelosis que incluyen t cni cas serol gicas y moleculares Estas t cnicas en su mayor a por su alto costo o por su complejidad s lo se usan en laboratorios de referencia entre estas te nemos las t cnicas de inmunofluorescencia indirec tat la prueba de Western blof y la prueba de PCR Los m todos de diagn stico basados en serolog a tie nen el inconveniente de tener una baja especificidad debido a que presentan reacci n cruzada con enferme dades causada por pat genos filogen t
6. ensa yos fueron examinados mediante electroforesis en geles de 1 de agarosa a 100 voltios por 45 minutos en soluci n tamp n TAE 1x Los geles fueron incuba dos en una soluci n de bromuro de etidio para su visualizaci n en c mara de luz ultravioleta y finalmente fueron fotografiados Con la finalidad de verificar si el inserto estaba ade cuadamente ligado al pl smido pGEX4T 1 y confirmar la identidad del fragmento clonado se realiza en secuenciamiento del inserto Se sigui el protocolo sugerido por los fabricantes de Kit Thermo Sequenase Cy5 Dye Terminador utilizando el secuenciador auto m tico ALFexpress Amersham Biosciences UK Limited 41 Rev Peru Med Exp Salud Publica 22 1 2005 Gallegos V et al ESTANDARIZACI N DE LA EXPRESI N DE LA PROTE NA RECOMBINANTE EN E coli BL21 Las condiciones de expresi n de la prote na recombinante se estandarizaron evaluando la densi dad ptica del in culo OD ptima para la induc ci n la cantidad de inductor tiempo de expresi n can tidad de prein culo sobre la expresi n de la prote na de fusi n Los pesos moleculares esperados son 67 38 kDa para la prote na de fusi n Flagelina GST 42 kDa para la prote na recombinante flagelina y 27 89 kDa para el GST Inicialmente la expresi n de la prote na de fusi n de las clonas recombinantes se dieron seg n las condi ciones sugeridas en el manual de pGEX usando resi na glutation sefarosa 4B Amersham
7. expresi n ptima en E coli BL21 de la prote na de fusi n rBbFlaA se requiere que el cultivo crezca en caldo LB ampicilina a 30 C suplementado con 2 de glucosa a partir de un prein culo de 100 uL crecido por toda la noche hasta que alcance una densidad ptica de 1 OD y se induzca por dos horas con 2 5 mM de IPTG Finalmente el 57 6 17 de 30 sueros de pacientes con diagn stico confirmado de bartonelosis reaccionaron con la prote na recombinante BbFlaA en el formato de ELISA Conclusiones Se logr expresar exitosamente en E coli la prote na recombinante BbFlaA de B bacilliformis determin ndose un protocolo de expresi n y de purificaci n de rBbFlaA para la producci n de esta prote na As tambi n el ant geno rBbFlaA es reconocido por anticuerpos de sueros de pacientes con Bartonelosis causada por B bacilliformis Palabras Clave Bartonella bacilliformis Diagn stico Flagelina Test de ELISA Prote nas Recombinantes Enfermedad de Carri n fuente DeCS BIREME ABSTRACT Objectives To clone the Bartonella bacilliformis flagellin gene flaA and to preliminarily express and assess reactivity of the recombinant protein against B bacilliformis bartonellosis patients sera Materials and Methods A couple of initiating oligonucleotides was designed BbFlaA1 and BbFlaA2 for complete B bacilliformis flagelline A gene amplification The amplification product obtained was cloned in pEGM and later it was subcloned in p
8. media y la desviaci n est ndar DE de los valores de DO obtenidos con 20 sueros de personas sanas y se estableci como valor l mite la concentra ci n que se corresponde con el valor de la media m s dos desviaciones est ndar Para evaluar si la prueba de ELISA estandarizada pod a discriminar entre sueros de personas sanas pacientes con otras enfermeda des y pacientes con la enfermedad de Carri n se reali z un an lisis estad stico de la diferencia entre los pro medios de la absorbancias obtenidas aplicando la prue ba t test usando el software estad stico Minitab RESULTADOS AMPLIFICACI N DEL GEN DE LA FLAGELINA DE B bacilliformis Para amplificar el gen FlaA usando los oligonucle tidos BbFlaA 1 y BbFlaA 2 se us inicialmente una tempe ratura de hibridaci n de los primer de 40 C conside rando 7 5 C por debajo de la menor temperatura de hibridaci n ptima te rica de los oligonucle tidos Al no obtenerse un producto de amplificaci n se evalu nuevamente la amplificaci n usando una temperatura de hibridaci n de 36 C en la que s se obtiene el producto de amplificaci n esperado Se determin que la concentraci n adecuada de MgCl para los ensayos de amplificaci n era de 2 mM Figura 1 Rev Peru Med Exp Salud Publica 22 1 2005 Seroreactividad flagelina de B bacilliformis Curva de MgCl para BbFlaA1 2 MPM 1 2 3 4 5 2000 pb PE SA 1150 pb 500 pb Figura 1 Estandarizaci
9. ACI N DEL ENSAYO ELISA PARA LA EVALUACI N DE LA REACTIVIDAD ANTIG NICA USANDO SUEROS DE PACIENTES CON BARTONELOSIS Las condiciones para las pruebas de ELISA fueron estandarizadas La concentraci n ptima para la pro te na rBbFlaA GST en ELISA fue de 100 ng pozo la diluci n de suero fue de 1 50 y la diluci n de conjuga do fue de 1 500 Se determin la l nea de corte cut off de las pruebas de ELISA con la prote na fusi n a 0 370 OD a Usando las absorbancias obtenidas con nueve sueros de personas sanas La concentraci n ptima para rBbFlaA en ELISA fue de 100 ng pozo la diluci n de suero fue de 1 50 y la dilu ci n de conjugado fue de 1 500 La determinaci n de la l nea de corte para la prote na recombinante flagelina se realiz tambi n con 9 sueros de personas sanas determin ndose OD 0 162 EVALUACI N PRELIMINAR DE LA PROTE NA DE FUSI N RECOMBINANTE DE LA FLAGELINA DE B bacilliformis La sensibilidad de la prueba de ELISA usando la prote na de fusi n BbFlaA GST fue de 65 13 sueros de pa cientes con Bartonelosis aguda por B bacilliformis fue ron positivos de un total de 20 evaluados Mientras que la especificidad frente a sueros de personas sanas fue de 85 3 de 20 sueros que resultaron positivas Al evaluarse ELISA usando como ant geno GST purifi cado 5 de sueros de personas sanas resultaron positivos 1 suero de 20 mientras que 20 de sue ros de pacientes con la enfermedad de Carri
10. GEX4T 1 expression vector Fusion protein rBbFlaA GST expression was induced with isopropyl thio B D galactoside IPTG The fusion protein produced was digested with thrombin in order to release its GST contents Finally an ELISA test was standardized in order to detect IgG antibodies against fusion protein rBbFlaA GST and rBbflaA GST free Sera from patients with bartonellosis caused by B bacilliformis n 30 sera from healthy individuals n 20 and sera from patients with a possible cross reactivity i e brucellosis n 3 leptospirosis n 3 and salmonellosis n 7 were assessed Results lt was determined that for optimal expression of fusion protein rBbFlaA in E coli BL21 it is required that the culture grows in LB ampicillin broth at a 30 C temperature supplemented with 2 glucose from a 100 uL pre inoculum left to grow overnight until it reaches a 1 optical density OD and being induced for two hours at 2 5 mM IPTG Finally 57 6 17 of 30 sera from patients with a confirmed bartonellosis diagnosis reacted with BbFlaA recombinant protein in an ELISA format Conclusions B bacilliformis BoFlaA recombinant protein was successfully expressed in E coli and an rBbFlaA expression and purification protocol was determined for producing this protein Also rBbFlaA antigen is recognized by antibodies present in sera from bartonellosis patients infected with B bacilliformis Key words Bartonella bacilliformis Diagnosis Flagellin
11. Pharmacia Biotech 2000 Luego debido a la escasa expresi n de la prote na recombinante se modific el protocolo siguiendo las recomendaciones reportadas Para la estandarizaci n se evaluaron diferentes densidades pticas 0 5 1 0 1 5 y 2 OD pp concentraciones de in ductor 0 5 1 0 1 5 2 2 5 y 3 mM de IPTG horas de inducci n 1 2 3 4 y 5 horas con IPTG y vol menes de prein culo 50 100 150 200 y 300 uL de prein culo dejado toda la noche Luego de estandarizarse la ex presi n de la prote na de fusi n y lisis de las c lulas en lote peque o se us estas condiciones para la ex presi n de la prote na de fusi n a mayor escala con un volumen de los in culos de 0 5 L ESTANDARIZACI N DEL ENSAYO ELISA PARA LA EVALUACI N DE LA REACTIVIDAD ANTIG NICA MEDIANTE SUEROS DE PACIENTES CON BARTONELOSIS Ensayos de ELISA indirectos fueron estandarizados para detectar anticuerpos en muestras serol gicas contra la prote na recombinante Flagelina de B bacilliformis la prote na la fusi n Flagelina GST y la glutation S tranferesa GST Se ensayaron diferentes concentraciones del ant geno de recubrimiento 50 ng 100 ng 150 ng 200 ng por pocillo diluciones de los sueros evaluados 1 25 1 50 1 100 1 200 y 1 400 y diluciones del conjugado 1 500 1 1000 y 1 2000 Ade m s se estableci un valor de corte para los ensayos Para ambos casos Flagelina GST y Flagelina se reali zaron las estandarizaciones
12. Rev Peru Med Exp Salud Publica 22 1 2005 Seroreactividad flagelina de B bacilliformis CLONAMIENTO EXPRESI N Y SEROREACTIVIDAD DEL ANT GENO RECOMBINANTE FLAGELINA DE Bartonella bacilliformis Karen Gallegos V Christian Baldeviano V Adolfo Marcelo Carlos Padilla R RESUMEN Objetivos Clonar el gen de la flagelina A flaA de Bartonella bacilliformis expresar y evaluar preliminarmente la seroreactividad de la prote na recombinante a sueros de pacientes con Bartonelosis por B bacilliformis Materia les y M todos Se dise una pareja de oligonucle tidos iniciadores BbFlaA1 y BbFlaA2 para la amplificaci n del gen completo de la flagelina flaA de B bacilliformis El producto de amplificaci n obtenido se clon en pGEM y luego se subclon en el vector de expresi n pGEX4T 1 Se indujo la expresi n de la prote na de fusi n rBbFlaA GST con isopropil tio P D galactosido IPTG La prote na de fusi n producida fue digerida con trombina para liberarla de GST Finalmente una prueba de ELISA fue estandarizada para detectar los anticuerpos IgG contra la prote na de fusi n rBbFlaA GST y rBbflaA libre de GST Se evaluaron sueros de pacientes con diagn stico de Bartonelosis por B bacilliformis n 30 sueros de individuos sanos n 20 y sueros de pacientes con otras enfermedades de posible reactividad cruzada entre ellas Brucelosis n 3 leptospirosis n 3 y salmonelosis n 7 Resultados Se determin que para la
13. considerando tres sueros de pacientes con la enfermedad de Carri n aguda y tres sueros de personas cl nicamente sanas Adem s se evalu la reactividad frente a GST como control El ant geno fue diluido en soluci n tamp n carbonato bicarbonato pH 9 6 0 159 de Na CO y 0 294 de 42 NaHCO luego se a adi 100 uL del ant geno en cada pozo de una microplaca de ELISA y se incub toda la noche a 4 C Luego se lavaron los pocillos 3 veces con PBS T 0 5 NaCl 1 15 de Na HPO 0 224 de NaH PO y Tween 20 a 0 005 pH 7 4 y se incubaron con diluciones en PBS de sueros Se incubaron por una hora en c mara h meda a 37 C Posteriormente se lav la microplaca tres veces con PBS T y se incub con 100 uL de una diluci n en PBS de anti IgG conju gado con peroxidasa Luego la microplaca se incub por una hora en c mara h meda a 37 C Despu s de dos lavados con PBS T y uno con PBS 0 5 NaCl 1 15 de Na2HPO4 y 0 224 de NaH PO4 pH 7 4 se le a adi 100 uL de sustrato 0 05 de H O 0 5 mg mL de OPD en soluci n tamp n fosfato citrato 0 1 M pH 5 4 AN LISIS DE DATOS Cada suero fue evaluado frente a la prote na recombinante flagelina la prote na de fusi n GST Flagelina y a la prote na glutation S tranferasa GST La l nea de corte utilizada para evaluar el l mite de detec ci n el control negativo y positivo se evalu en sueros de personas sanas con ficha t cnica por duplicado Se calcul la
14. icamente emparentados tales como Brucelosis y salmonelosis Un m todo serol gico basado en prote nas recombinantes o ep topes espec ficos mejorar a la es pecificidad de los m todos serol gicos convencionales Por tanto es importante identificar ant genos que sirva para desarrollar una prueba serol gica sensible y espe c fica para el diagn stico de infecciones por B bacilliformis La flagelina es el componente mayoritario del flagelo esta prote na ha sido propuesta con ant geno para pruebas serol gicas en diversas enfermedades como borreliosis infecciones con Helicobacter pylorf infecciones con Burkholderia pseudomallei leptospirosis e inclusive con linfoadenopat a asociada a infecciones con Bartonella clarridgeiae En este art culo nosotros notificamos el clonamiento de la prote na recombinante flagelina de B bacilliformis BbFlaA el m todo de producci n de sta as como la evaluaci n de la serorreactividad de sueros de pa cientes con Bartonelosis aguda por B bacilliformis y otras enfermedades a la prote na rBbFLaA MATERIALES Y M TODOS DISE O DE OLIGONUCLE TIDOS INICIADORES Se dise una pareja de oligonucle tidos iniciadores basada en la secuencia reportada por Ar valo Jim nez en 1993 con c digo de acceso del Genbank L20677 para esto se us el programa Primer Select versi n 4 05 DNASTAR Inc Madison WI USA Tabla 1 Los oligonucle tidos BbFla 01 y BbFla 02 fueron mod
15. ifi cados para incluir los sitios de cortes para enzimas de restricci n EcoRI y Sal respectivamente CEPAS Y SUEROS Se us ADN purificado de B bacilliformis la cepa JB584 cepa gentilmente donada por el Dr Minninck Ade m s se us las cepas de E coli XL1 blue y BL21 las cuales fueron adquiridas comercialmente a las com pa as Stratagene Stratagene Co La Jolla CA USA y Amersham Amersham Bioscience Co Piscataway NJ USA Los sueros usados provienen de una seroteca del Laboratorio de Biotecnolog a y Biolog a Molecular Cen tro Nacional de Salud P blica Instituto Nacional de Salud Sueros casos 30 sueros de pacientes con Bartonelosis aguda por B bacilliformis provenientes de zonas end micas en Ancash colectados entre los a os 2000 y 2001 y confirmados por cl nica frotis y ELISA IgG con prote nas totales Sueros control 20 sueros de personas cl nicamente sanas provenientes de la ciudad de Lima estas no mostraban ning n s ntoma cl nico al momento de la colecta de muestra y no hab an viajado anteriormente a ninguna zona end mica Tabla 1 Secuencias y caracter sticas de los oligonucle tidos dise ados Nombre Secuencia Tm C Tama o nt Posici n BbFlaA 1 5 TTATGAATTCGAGATTATGG 3 47 5 21 163 183 BbFlaA 2 5 ATAGTCGACCTGCCCTGATTT 3 57 2 21 1282 1302 Tm Temperatura de hibridaci n optima te rica del oligonucle tido a su secuencia hom loga en una soluci n de 50mM de NaCl
16. is T Plasmid vectors In Molecular cloning A laboratory manual 2 Ed New York Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989 p 1 1 1 110 12 Saluta M Bell P Troubleshooting GST fusion protein expression in E coli Life Science News 1998 1 1 3 K 12 13 Mernaugh G Ihler G Deformation factor an extracellular protein synthesized by Bartonella bacilliformis that deforms erythrocyte membranes Infect Immun 1992 60 3 937 43 14 Scherer D DeBuron Connors l Minnick M Characterization of Bartonella bacilliformis flagella and effect of antiflagellin antibodies on invasion of human erythrocytes Infect Immun 1993 61 12 4962 71 15 Zhang M Schillberg S Zimmermann S Liao Y Breuer G Fischer R GST fusion protein cause false positives during selection of viral movement protein specific single chain antibodies J Virol Methods 2001 91 2 139 47 16 Bardy SL Ng SY Jarrell KF Recent advances in the structure and assembly of the archaeal flagellum J Mol Microbiol Biotechnol 2004 7 1 2 41 51 Correspondencia Blgo Carlos P Padilla Rojas Labora torio de Biotecnolog a y Biolog a Molecular Centro Nacional de Salud P blica Instituto Nacional de Salud Lima Per Direcci n Calle C pac Yupanqui 1400 Jes s Maria Lima Tel fono 511 4719920 anexo 129 Correo electr nico cpadillaVins gob pe cpadillarVhotmail com
17. jetivo de mejorar la sensibilidad o la especificidad de la prue ba serol gica que queremos implementar asimismo para lograr este prop sito podr amos usar un c ctel 45 Rev Peru Med Exp Salud Publica 22 1 2005 Gallegos V et al de prote nas recombinantes o p ptidos sint ticos Ac tualmente nuestro grupo de investigaci n esta eva luando la seroreactividad de otras prote nas recombinantes AGRADECIMIENTOS Agradecemos la colaboraci n de la Sra Tec Lab Jua na Choque Portilla Esta investigaci n es parte del pro yecto Desarrollo y evaluaci n de una prueba r pida para el diagn stico de la Bartonelosis C digo OGITT 2 01 05 02 110 la cual ha sido financiada por el Ins tituto Nacional de Salud REFERENCIAS BIBLIOGR FICAS 1 Per Ministerio de Salud Norma t cnica para el diag n stico y atenci n curativa de la bartonelosis o enferme dad de Carri n en el Per Lima MINSA 2003 NT N 001 MINSA DGSP v 01 2 Anderson BE Neuman MA Bartonella spp as emerging human pathogens Clin Microbiol Rev 1997 10 2 203 19 3 Ellis A Rotz LD Leake JA Samalvides F Bernable J Ventura G et al An outbreak of acute bartonellosis Oroya fever in Urubamba region of Peru 1998 Am J Trop Med Hyg 1999 61 2 344 49 4 Chamberlin J Laughlin L Gordon S Romero S Solorzano N Regnery RL Serodiagnosis of Bartonella bacilliformis infection by indirect fluorescence antibody assay test develo
18. n de la concentraci n de MgCl para el fragmento de de 1139 pb peso te rico En carril 1 1 mM carril 2 1 5 mM carril 3 2 0 mM carril 4 2 5 mM carril 5 3 0 mM de MgCl Para la amplificaci n se uso un Tm de 46 C y Tm de 36 C para A y B respectivamente MPM marcador de peso molecular de 100 pb Promega Co OBTENCI N DE CEPAS E coli RECOMBINANTES TRANSFORMADAS CON pGEM La primera selecci n de recombinantes que se reali z mediante su an lisis del tama o de pl smidos purificados de las clonas candidatas en electroforesis en geles de agarosa BbFlaA1 2 Se seleccionaron dos clonas y se procedi a evaluar las por PCR para confirmar que el tama o del frag mento clonado Las clonas seleccionadas que dieron bandas con un peso aproximado de 1150 pb en la evaluaci n por PCR fueron BbFlaA1 2 1 BoOFlaA1 2 11 y BbFlaA1 2 1V SUBCLONAMIENTO DEL FRAGMENTO A pGEX Y SELECCI N DE RECOMBINANTES La primera selecci n de colonias recombinantes se hace mediante an lisis del tama o de sus pl smidos mediante electroforesis en gel de agarosa Se selec cionaron nueve clonas posibles recombinantes a las cuales se les realiz un an lisis de restricci n para confirmar la presencia de fragmento Finalmente las clonas seleccionadas fueron BL21 11 10 BL21 1l 11 y BL21 11 12 Figura 2 Para confirmar la adecuada ligaci n del fragmento a pGEX se secuenciaron las clonas BL21 Il 10 y BL21 Il 11 confirm ndose que pose
19. n fueron positivos 4 de 20 sueros Estos resultados indican 44 que GST purificada presenta cierta reactividad por s sola es por ello que se decide liberar a la prote na recombinante BbFlaA GST de GST La sensibilidad de la prueba de ELISA usando BbFlaA liberado fue de 57 6 17 de 30 sueros de los pa cientes con Bartonelosis aguda por B bacilliformis fueron positivos La especificidad del ELISA usando BbFlaA liberado frente a sueros de personas sanas fue de 85 3 de 20 sueros que fueron positivos a la prueba La especificidad de ELISA usando BbFlaA liberado es de 69 2 en esta evaluaci n cuatro sueros de pa cientes con salmonelosis de siete sueros evaluados fueron positivos a esta prueba mientras que todos los sueros de pacientes con leptospirosis tres sueros y Brucelosis tres sueros fueron negativos Los resul tados se muestran en las figuras 4 y 5 ELISA lg6 con BbFla4 587 y GST purificado 0200 aih El A _ _ _ _ __ _ _ al Pm 7 DADO r Linsa de corte 050 z 0300 a RA tafa zii 7 O A e O A diiil s PE Hiri Enterate PEONES Enferresisal ase de Caribi S de Carri n a od EMIR AGST GST purificado Figura 4 Reactividad de los sueros de personas sanas y de pacientes agudos con la enfermedad de Carri n con la prote na de fusi n BbFlaA GST y GST purificado La l nea de corte obtenida OD 0 370 492 Rev Peru Med Exp Salud Publica 22 1 2005 Seroreac
20. nsi n final de cinco minutos a 72 C Cada prueba se realiza incluyendo controles de contaminaci n Los produc tos de amplificaci n obtenidos fueron examinados mediante electroforesis en geles de agarosa al 1 5 OBTENCI N DE C LULAS RECOMBINANTES DE E coli XL 1 BLUE PARA pGEMT BbFLaA1 2 El producto de amplificaci n obtenido con los primer BbFlaA1 y BbFlaA2 fue purificado usando el kit comer cial Wizard PCR preps Promega Biosciences Inc San Luis Obispo CA USA siguiendo las recomendacio nes del fabricante Posteriormente se lig este pro ducto al pl smido de clonamiento pGEMT easy Promega Biosciences Inc usando la enzima ligasa T4 siguiendo las recomendaciones de los fabrican tes La proporci n de inserto vector fue de 5 4 Una al cuota de esta reacci n de ligaci n se utiliz para transformar cepas competentes de E coli XL1 Blue seg n el m todo modificado de cloruro de calcio Luego se procedi a realizar una selecci n de clonas recombinantes por PCR con protocolos establecidos Los resultados se examinaron por electroforesis en gel de agarosa al 1 5 a 100 voltios constantes por 50 minutos Finalmente se seleccion la clona recombinante pGEM BbFlaA1 2 1 para los siguientes procedimientos SUBCLONAMIENTO DEL GEN FLaA EN pGEX 4T 1 El pl smido recombinante pGEM BbFlaA1 2 l y el pl smido pGEX 4T 1 Amersham Biosciences UK Limited Buckinghamshire England se digirieron con las enzimas de restricci n
21. pment and application to a population in an area of bartonellosis endemicity J Clin Microb 2000 38 11 4269 71 5 Mallqui V Speelmon E Verastegui M Maguina Vargas C Pinell Salles P Lavarello R et al Sonicated diagnostic immunoblot for bartonellosis Clin Diagn Lab Immunol 2000 7 1 1 5 6 Padilla C Ventura G Dise o y estandarizaci n de una prueba PCR para el diagn stico de bartonelosis causada por Bartonella bacilliformis Rev Peru Med Exp Salud Publica 2003 20 1 5 8 7 Krbkova L Stroblova H Comparison of EIA Borrelia recombinant IgM of the 3rd generation with EIA test based on whole cell antigen in the diagnosis of Lyme borreliosis Klin Mikrobiol Infekc Lek 2004 10 6 271 78 46 8 Yan J Liang SH Mao YF Li LW Li SP Construction of expression systems for flaA and flaB genes of Helicobacter pylori and determination of immunoreactivity and antigenicity of recombinant proteins World J Gastroenterol 2003 9 10 2240 50 9 Chen YS Shiuan D Chen SC Chye SM Chen YL Recombinant truncated flagellin of Burkholderia pseudomallei as a molecular probe for diagnosis of melioidosis Clin Diagn Lab Immunol 2003 10 3 423 25 10 Sander A Zagrosek A Bredt W Schiltz E Piemont Y Lanz C Dehio C Characterization of Bartonella clarridgeiae flagellin FlaA and detection of antiflagellin antibodies in patients with lymphadenopathy J Clin Microbiol 2000 38 8 2943 48 11 Sambrook J Fritsch E Maniat
22. sistema est primariamente regulada por la fase de crecimiento del hospedero est mulos ambien tales como la temperatura y nutrientes los cuales mo dulan la expresi n El pl smido pGEX provee altos niveles de expresi n de prote nas de fusi n bajo condiciones de inducci n pero bajo condiciones de no inducci n niveles de expresi n basal del promotor lac podr a interferir en la expresi n de las posibles clonas y mas a n si la pro te na expresada es t xica Posiblemente existen proteasas en el hospedero que degradaban la prote na de fusi n GST BbFlaA Mernaugh e Ihler notificaron que la invasi n de B bacilliformis era insensible al tratamiento con tripsina 1 mg mL as mismo Scherer et al infor maron una resistencia parcial 50 de la flagelina de B bacilliformis al tratamiento con tripsina 2 mg mL Sin embargo la flagelina de B bacilliformis es una prote na que posee una gran cantidad de sitios de corte te ricos para proteasas como pepsina LysC proteinasa K termolisina y chimostripsina entre otras Otro de los factores que influyen en la expresi n de la prote na recombinante es la temperatura de expresi n con la disminuci n de la temperatura de crecimiento se mejor el rendimiento Probablemente a esta tem peratura se disminuya la actividad de la proteasas intracelulares Nuestros resultados indican que el GST presenta una alta reactividad antig nica que posiblemente altera la reacti
23. tividad flagelina de B bacilliformis Elisa IgG con BbFlaA liberada O a 500 AA AA Laplomsraia 0006 Pi a Burdah MEA Samoni Lines de cord a A A S gt Bafo TT de wf al ap E Dal Pariri Enredar Diras Hina de Cami n enfermedades Figura 5 Reactividad de los sueros de personas sanas de pacientes agudos con la enfermedad de Carri n y de otras enfermedades con la prote na de fusi n BbFlaA liberada de GST La l nea de corte obtenida OD 0 200 492 En esta evaluaci n se determin que s existe dife rencia significativa p 0 004 entre los promedios de las absorbancias de los sueros de personas nor males contra sueros de pacientes con Bartonelosis aguda por B bacilliformis Tambi n se compar el promedio de las absorbancias obtenidas con sueros de personas normales contra las obtenidas con sue ros de pacientes con leptospirosis n 3 y Brucelosis n 3 y se determin que no existen diferencia signi ficativa entre estos p 0 741 p 0 884 respectivamen te En la comparaci n del promedio de las absorbancias obtenidas con sueros de personas normales contra sueros de paciente con salmonelosis n 7 se obtuvo diferencia significativa p 0 004 DISCUSI N En el presente estudio se demostr que el clonamiento del gen flaA en el pl smido de pGEX per miti la expresi n de la prote na recombinante BbFlaA Se demostr tambi n que la expresi n de la flagelina en este
24. vidad de la prote na de fusi n Es por ello que ant genos recombinantes clonados en este sistema deben ser necesariamente liberados de GST As mis mo la seroreactividad inespec fica de GST ya ha sido observada Padilla Carlos comunicaci n personal 2002 Durante la evaluaci n serol gica se observ que exis te reactividad cruzada con sueros de salmonelosis y Brucelosis Por otro lado es posible que personas sanas presenten anticuerpos contra BbflaA de mane ra cruzada por infecciones con salmonelosis ocurri das anteriormente La aparici n de reactividad cruza da no es de asombro debido a que la flagelina de B bacilliformis posee mucha similaridad con flagelinas de otras bacterias filogen ticamente relacionadas y es posible que tambi n comparta ep topes con estas bacterias Este ant geno presenta reacciones cruza das por ello su aplicaci n diagn stica debe ser acom pa ada de un an lisis e interpretaci n de la historia cl nica del paciente La implementaci n de una prueba serol gica espec fica y sensible para el diagn stico de la Bartonelosis causada por B bacilliformis podr a complementar el diagn stico convencional que actualmente se realiza de manera rutinaria para esta enfermedad En el pre sente art culo nosotros describimos la posible utili dad de la prote na recombinante BbFlaA sin embargo cabe se alar que es necesario evaluar otras prote nas recombinantes de B bacilliformis con el ob
Download Pdf Manuals
Related Search