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1. Wash buffer 4 Soluci n de lavado Pu8uioTIK I AUHA TTAJONG Substrate buffer Tamp n sustrato PUBJIIOTIKO I AUJJA UTTOOTPWHATOG Stop solution Soluci n de parada Avtidpaotipio IQKOTT G AVTI PAONG Sample buffer Tampon Muestras PUBJIIOTIKO I AUHJA dEIYH TWV2. 1982 1993 5 P vonLandenberg T Matthias J Zaech M Schultz M Lorber M Blank Y Shoenfeld 2003 Antiprothrombin antibodies are associated with pregnancy loss in patients with the antiphospholipid syndrome Am J Reprod Immunol 49 51 56 P gina 7 de 9 002 2007 08 28 REF 3229 Prothrombin GM ANEXO A Esquema de dispensaci n Se sugiere dispensar los calibradores controles y muestras como sigue Para una interpretaci n cuantitativa utilice calibradores para establecer una curva standard Para una interpretacion cualitativa utilice el calibradore cut off rr sa an Johda brators to establish a standard curve off calibrator 1 2 ja ja s je 7 ja jo 110 jn 12 A CACA ter in en Bicker f MA EE fre e nm E caciPo Pa pc Be O RO aS IG cam ne Je f Daher ssa E SE SESS SS SESS CalA calibrator A CalB calibrator B CalC calibrator C CalD calibrator D CalE calibrator E CalF calibrator F PC positive control NC negative control CC Cut off calibrator P1 patient 1 P2 patient 2 P3 patient 3 P gina 8 de 9 002 2007 08 28 REF 3229 Prothrombin GM Anexo B Procedimiento del test Samples 1 101 Controls Pagina 9 de 9 002 2007 08 28 REF 3229 Prothrombin GM LTLT96 VEL9 6H XBA OLTI6 PELI 6Gh 9UOyg AuBULIOD Z FUNA WNIOFOININ Wioysjopuem FETSS HAD SIILSONDVIA AMSAV WIEN QpLIyOSISJuN aINyeus s an nyessdwp o myersdwo un
3. Dispositivo de lavado de la microplaca pipeta de repetici n o microcanal de 300 ul o sistema automatizado papel absorbente Nuestras pruebas se han dise ado para el uso con agua destilada seg n la definici n de la farmaco pea de los Estados Unidos USP 26 NF 21 y la europea Eur Ph 45 ed 4 Almacenamiento y Caducidad Guarde todos los reactivos y la microplaca a 2 8 C 35 46 F en sus envases originales Una vez preparadas las soluciones reconstituidas son estables durante 1 mes a 4 C por lo menos Los reactivos y la microplaca deben ser utilizados solamente dentro del margen de caducidad indicado en cada componente Evite la exposici n de la soluci n TMB a la luz intensa Guarde las microplacas en su sobre correspondiente incluyendo el desecante y s llelo bien P gina 2 de 9 002 2007 08 28 REF 3229 Prothrombin GM 5 Precauciones 5 1 Datos de riesgo para la salud ESTE PRODUCTO ES SOLO PARA EL USO EN DIAGN STICO IN VITRO Por lo tanto solamente el personal formado y especialmente asesorado en los m todos de diagn stico in vitro puede realizar el ensayo Aunque no se considera este producto como particularmente t xico o peligroso en condiciones de uso normales remitase a lo siguiente para una maxima seguridad Recomendaciones y precauciones Este equipo contiene componentes potencialmente peligrosos Aunque los reactivos del equipo no estan clasificados como irritantes de los ojos y la piel recomendamos evitar
4. el contacto de los mismos con los ojos y con la piel y utilizar guantes desechables jAVISO Los calibradores controles y agentes contienen azida de sodio NaN como conservante EI NaN puede ser toxico si se ingiere o se absorbe por medio de la piel o de los ojos EI NaN puede reaccionar con la fontaneria de plomo y de cobre y formar azida metalica muy explosiva Al tirar tirarla deje correr una gran cantidad de agua para evitar que la azida tome consistencia Por favor consulte los procesos de descontaminaci n del CDC u otras directrices locales o nacionales No fume coma o beba mientras manipule el equipo No pipetee con la boca Todo el material de fuente humana utilizado en algunos reactivos de este equipo por ejemplo con troles standards ha sido analizado a trav s de m todos aprobados y ha resultado ser negativo para HbsAg Hepatitis C y HIV 1 No obstante ning n test puede completamente garantizar la ausencia de agentes virales en ese tipo de material Por lo tanto manipule los controles standards y muestras de los pacientes como si se trataran de aut nticos transmisores de enfermedades infecciosas y seg n los requerimientos de manipulaci n de su pa s 5 2 Instrucciones generales para la utilizaci n No mezcle o sustituya reactivos o microplacas de n meros de lote diferentes Esto podr a llevar a una variaci n de los resultados Deje que todos los componentes alcancen la temperatura 20 32 C 68 89 6 F antes de uti
5. AESKULISA Prothrombin GM REF 3229 Manual de Instrucciones Contenido 1 Utilizaci n Aplicaciones clinicas y principio del ensayo Contenido del equipo Almacenamiento y caducidad Precauciones Toma de muestra manipulaci n y almacenamiento Procedimiento del ensayo Interpretaci n Cuantitativa y Cualitativa Datos t cnicos Datos de funcionamiento Bibliograf a Esquema de dispensaci n Procedimiento del test 002 2007 08 28 REF 3229 Prothrombin GM 1 Utilizacion AESKULISA Prothrombin GM es un enzimoinmunoensayo en fase s lida que emplea protrombina humana nativa Factor Il para la detecci n cuantitativa y cualitativa de anticuerpos IgG y o IgM contra protrombina en suero humano El ensayo es una herramienta en el diagn stico del sindrome anti fosfolipidico 2 Aplicaci n clinica y principio del ensayo EI factor II humano protrombina es un zim geno del plasma con un peso molecular de 72 kDa Se ensambla con las formas activadas del Factor V Factor X y fosfolipido para formar una unidad catalitica conocido como el complejo protrombinasa En presencia de iones calcio el complejo convierte la protrombina asociada a membrana en trombina la cual es despu s liberada en la fase soluble Los anticuerpos contra protrombina pertenecen al grupo de anticuerpos anti fosfolipidicos especificos para fosfolipidos cargados negativamente componentes de las membranas biol gicas y protrombina La presencia
6. a importante herramienta diagn stica para el diagn stico diferencial de las manifestaciones heterog neas del SAF Principio del test Las muestras de suero diluidas 1 101 se incuban en la microplaca reve stida con el ant geno espec fico Los anticuerpos de los pacientes si est n presentes en la muestra se unen al ant geno La fracci n no unida es eli minada por el lavado en el paso siguiente Despu s las inmunoglobulinas anti humanas conjudagas con peroxidasa conjugado se incuban y reac cionan con el complejo ant geno anticuerpo de las muestras dentro de la microplaca El conjugado no unido es retirado a trav s del lavado en el paso siguiente La adici n del substrato TMB genera una reacci n colorim trica azul enzim tica que se detiene a trav s de cido diluido el color cambia a amarillo La tasa de formaci n de color por parte del crom geno va en funci n de la cantidad de conjugado unido al complejo antigeno anticuerpo y esto es proporcional a la concentraci n inicial de los respectivos anti cuerpos en la muestra del paciente P gina 1 de 9 002 2007 08 28 REF 3229 Prothrombin GM 3 Contenido del equipo Para ser reconstituido Tampon de Muestra 5x 1 vial 20 ml concentrado 5x tap n blanco soluci n amarilla Contiene Tris NaCl BSA azida s dica lt 0 1 conservante Tamp n de Lavado 50x 1 vial 20 ml concentrado 50x tap n blanco soluci n verde Contiene Tris NaCl Tween 20 azida
7. cto a los correspondientes valores de concentra ci n en U ml eje x Para unos mejores resultados recomendamos coordenadas log lin y un ajuste a 4 PL Partiendo de la DO de cada muestra lea la correspondiente concentraci n de anticuerpo expresada en U ml Rango Normal Indeterminado Resultados Positivos lt 12 U ml 12 18 U ml gt 18 U ml Ejemplo de curva standard Recomendamos dispensar los calibradores en paralelo para cada tanda Calibradores IgG DO 450 620 nm CV Variaci n 0 U ml 3 U ml 30 U ml 0 620 100 U mi 300 U ml 2 070 Ejemplo de c lculo Paciente Replicado DO Media DO Resultado U ml 0 547 0 555 0 551 Para conocer los datos especificos de lote consulte el documento adjunto de control de calidad Los laboratorios deber an realizar un Control de Calidad interno utilizando controles propios y o un pool de sueros interno tal y como contemplan las regulaciones de la UE No utilice este ejemplo para interpretar resultados de los pacientes Cada laboratorio deber a establecer su rango normal propio basado en sus propias t cnicas contro les equipamiento y poblaci n seg n sus propios procedimientos establecidos Para la interpretaci n cualitativa lea la densidad ptica del calibrador cut off y la de las muestras de los pacientes Compare las DO de los pacientes con la DO del calibrador cut off Para la interpreta ci n cualitativa recomendamos que establezca un rango de
8. de anticuerpos anti fosfolipidicos ha sido asociada con los rasgos clinicos del llamado sindrome anti fosfolipidico SAF Muchos estudios muestran una correlaci n entre estos autoanticuerpos y una aumentada incidencia de trombosis trombocitopenia y abortos habituales como consecuencia de infarto de placenta El mecanismo exacto a trav s del cual los anticuerpos anti fosfolipidicos patog nicos inducen trombosis no ha sido aun totalmente revelado La existencia de anticuerpos anti fosfolipidicos en pacientes con LES y enfermedades relacionadas es tipica en un sindrome anti fosfolipidico SAF secundario Por otro lado los anticuerpos anti fosfolipidicos en pacientes con ninguna otra enfermedad autoinmune caracteriza el sindrome anti fosfolipidico SAF primario Los anticuerpos que se dirigen hacia la protrombina en solitario han sido descritos recientemente como elevadamente asociados con la p rdida fetal en pacientes con SAF Los anticuerpos anti protrombina son el primer marcador para esta seria complicaci n ya que todos los dem s anticuerpos anti fosfolip dicos conocidos no correlacionan con la p rdida fetal Adem s los anticuerpos que se dirigen hacia un complejo de protrombina y fosfatidilserina se han asociado con el segundo grupo m s importante de manifestaciones cl nicas del SAF la trombosis arterial y venosa No obstante no dieron correlaci n alguna con la p rdida fetal Por lo tanto ambos tipos de anticuerpos sirven como un
9. hichtete Pinplatte 4 Pinplate revestida Tampone di lavaggio Tampon de Lavage Waschpuffer 4 Soluc o de lavagem Tampone substrato Substrat Substratpuffer Substrato Reagente bloccante Solution d Arret Stopreagenz Soluc o de paragem Tampone campione Tampon Echantillons Probenpuffer 4 Diluente de amostra For in vitro diagnostic use Para uso diagn stico in vitro In Vitro ArayvwoTIK go Cataloge number Numero de cat logo Ap du g Trapayyekiag Lot 4 Lote Xapaktnpiopds Trapridag EC Declaration of Conformity Declaraci n CE de Conformidad Eupwfrraikr ouupwvia 96 tests 96 pruebas 96 TTPOO IOPIONOI 4 See instructions for use Ver las instrucciones de uso AdBete UTTOWN TIG o nyiec XPRONG Use by Utilizar antes de Xp on HEXpI Store at 2 8 C 35 46 F Conservar a 2 8 C Duh ootrai atous 2 8 C Manufactured by Fabricado por KataoKeudZetai att Cut off Calibrator Calibrador de cut off Opiakdg op s Avtidpaotipio Baduov nnong 4 Positive Control Control Positivo OETIKOG OPOG E EVXOU Negative Control Control Negativo ApvnTIKOG opdc E EVXOU Calibrator Calibrador Avtidpaotnpio BaBuov unons Recovery Recuperado Av xtnon 4 Coated microtiter plate Microplaca sensibilizada ETTIKOAUHJEVI HIKPOTTA KA Coated pinplate Pinplate sensibilizada EmkaAupnevn TMA ka Pin
10. l 20 al rededor del valor del cut off como zona indeterminada Todas las muestras que tengan DO superior a este rango se consideran positivas y las muestras con valores de DO inferiores a este rango se consideran negativas Negativo DO paciente s 0 8 x DO cut off Indeterminado 0 8 x DOcut of lt DO patient lt 1 2 x DOcut of Positivo DO paciente gt 1 2 X DO cut off P gina 5 de 9 002 2007 08 28 REF 3229 Prothrombin GM 9 Datos T cnicos Muestra suero Volumen de muestra 10 ul de muestra diluida a 1 101 con tamp n de muestra 1x Tiempo total de incubaci n 90 minutos a temperatura 20 32 C 68 89 6 F Rango de calibracion 0 300 U ml Sensibilidad analitica 1 0 U ml Almacenamiento a 2 8 C 35 46 F utilice solo los viales originales Numero de determinaciones 96 tests 10 Datos de funcionamiento 10 1 Sensibilidad analitica La prueba del agente de muestra 30 veces en AESKULISA Prothrombin GM produjo una sensibilidad analitica de 1 0 U ml 10 2 Especificidad y Sensibilidad La microplaca esta revestida con protrombina humana nativa No se encontraron reactividades cruz adas con otros autoantigenos Hasta el 50 de mujeres embarazadas con SAF sufren p rdidas feta les AESKULISA Prothrombin identifica al 84 de stas 10 3 Linealidad Se han analizado con este equipo sueros seleccionados y se encontr que debian diluirse linealmente No obstante debido a la naturaleza heterog nea de los autoanticuerpos humanos
11. lizarlos Ag telos bien y siga el esquema de incubaci n recomendado para una ptima realizaci n del ensayo Incubaci n se recomienda realizar las pruebas a 30 C 86 F para sistemas automatizados No exponga nunca los componentes a temperaturas m s altas de 37 C 98 6 F Pipetee siempre la soluci n de substrato con puntas nuevas Protega este reactivo de la luz Nunca pipetee el conjugado con puntas previamente utilizadas con otros reactivos Un diagn stico cl nico definitivo no debe estar basado solamente en los resultados del ensayo realizado Debe ser elaborado por el m dico despu s de haber evaluado todos los hallazgos cl nicos y de laboratorio Es necesario verificar el diagn stico por medio de distintos m todos 6 Toma manipulaci n y almacenamiento de las muestras Utilice preferentemente muestras de suero reci n extra das La extracci n de sangre debe seguir los requerimientos de protocolo de su pa s No utilice muestras ict ricas lip micas hemolizadas o contaminadas por bacterias Los sueros con part culas deben ser purificados por centrifugaci n a baja velocidad lt 1000 x g Las muestras de sangre deben ser recogidas en tubos limpios secos y vac os Despu s de la separaci n las mues tras de suero deben ser utilizadas inmediatamente Pueden guardarse bien cerradas a 2 8 C 35 46 F hasta tres d as o congelarse a 20 C 4 F para per odos m s largos P gina 3 de 9 002 2007 08 28 REF 3229 Pro
12. pueden haber mue stras que no sigan esta regla concentraci n concentraci n Factor de medida esperada Recuperaci n diluci n U ml U ml 11200 1 200 P gina 6 de 9 002 2007 08 28 REF 3229 Prothrombin GM 10 4 Precision Para determinar la precisi n del ensayo se valor la variabilidad intra e inter ensayo a trav s del an lisis de su reproducibilidad en tres muestras de suero Estas muestras fueron seleccionadas para representar un rango por encima de la curva standard Intra Ensayo Inter Ensayo Media CV U ml 10 5 Calibraci n Debido a la no existencia de una calibraci n de referencia internacional este ensayo esta calibrado en unidades arbitrarias U ml 11 Bibliografia 1 Furie B and Furie BC 1988 The molecular basis of blood coagulation Cell 53 505 518 2 Mann KG Nesheim ME Tracy PB Hibbard LS Bloom JS 1982 Assembly of the prothrombinase complex Biophys J 37 106 107 3 Boey ML Colaco CB Gharavi AE et al 1983 Thrombosis in systemic lupus erythematosus striking association with the presence of circulating lupus anticoagulant Br Med J 287 1021 1023 4 T Atsumi M leko M L Bertolaccini K Ichikawa A Tsutsumi E Matsuura T Koike 2000 Association of autoantibodies against the phosphatidylserine prothrombin complex with manifestations of the antiphospholipid syndrome and with the presence of the lupus anticoagulant Arthritis amp Rheumatism 43
13. q Nea gnu uonegnouj ISO AESSY 4 Diagnosi in vitro 4 Pour diagnostic in vitro 4 In Vitro Diagnostikum Para uso Diagn stico in vitro Numero d ordine Reference Catalogue Bestellnummer N mero de cat logo 4 Descrizione lotto Lot Chargen Bezeichnung 4 Lote 4 Conformit europea Declaration CE de Conformit Europ ische Konformit t Declarac o CE de Conformidade 96 determinazioni 96 tests 96 Bestimmungen 96 Testes Rispettare le istruzioni per l uso 4 Voir les instructions d utilisation Gebrauchsanweisung beachten 4 Ver as instruc es de uso Da utilizzarsi entro Utilise avant le Verwendbar bis Utilizar antes de 4 Conservare a 2 8 C Conserver a 2 8 C Lagerung bei 2 8 C 4 Conservar entre 2 8 C Prodotto da Fabriqu par 4 Hergestellt von Fabricado por Calibratore cut off 4 Etalon Seuil Grenzwert Kalibrator 4 Calibrador de cut off 4 Controllo positivo 4 Contr le Positif Positiv Kontrolle Controlo positivo 4 Controllo negativo 4 Contr le N gatif Negativ Kontrolle 4 Controlo negativo Calibratore 4 Etalon 4 Kalibrator Calibrador Recupero Corr lation Wiederfindung Recuperac o Coniugato Conjug Konjugat Conjugado 4 Micropiastra rivestita 4 Microplaque sensibilis e Beschichtete Mikrotiterplatte Microplaca revestida 4 Piastra ad aghi rivestita Pinplate sensibilis e 4 Besc
14. radores por duplicado El Calibrador Cut off es solamente para uso en las pruebas cualitativas NOTA Si la IgG e IgM se determinan en paralelo los calibradores controles y muestras deben ser procesadas en duplicado para cada subclase separadamente Dispense 100 ul de cada suero diluido de paciente dentro del pocillo correspondiente Dispense 100 ul de los calibratores O calibradore cut off y controles positivo y negativo dentro de los pocillos designados Incube durante 30 minutos a temperatura 20 32 C 68 89 6 F Lave 3x con 300 ul de tamp n de lavado diluido 1 50 Dispense 100 ul de conjugado dentro de cada pocillo Incube durante 30 minutos a temperatura 20 32 C 68 89 6 F Lave 3x con 300 ul de tamp n de lavado diluido 1 50 Dispense 100 ul de substrato TMB dentro de cada pocillo Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente 20 32 C 68 89 6 F protegido de la luz directa Dispense 100 ul de soluci n de paro dentro de cada pocillo siguiendo el mismo orden de pocillos que cuando dispens el substrato Incube un m nimo de 5 minutos Agite la placa cuidadosamente durante 5 segundos Lea la absorbancia a 450 nm opcionalmente a 450 620 nm dentro de los 30 minutos siguientes P gina 4 de 9 002 2007 08 28 REF 3229 Prothrombin GM 8 Interpretaci n Cuantitativa y Cualitativa Para una interpretaci n cuantitativa establezca la curva standard trazando la densidad ptica DO de cada calibrador eje y con respe
15. s dica lt 0 1 conservante Listo para el uso Control Negativo 1 vial 1 5 ml tap n verde soluci n incolora Contiene Suero humano diluido azida s dica lt 0 1 conservante Control Positivo 1 vial 1 5 ml tap n rojo soluci n amarilla Contiene Suero humano diluido azida s dica lt 0 1 conservante Calibradore Cut off 1 vial 1 5 ml tap n azul soluci n amarilla Contiene Suero humano diluido azida s dica lt 0 1 conservante Calibradores 6 viales 1 5 ml cada uno 0 3 10 30 100 300 U ml el color aumenta con la concentraci n soluci n amarilla Contiene Suero humano diluido azida s dica lt 0 1 conservante Conjugado 1 vial 15 ml IgG tap n azul soluci n azul 1 vial 15 ml IgM tap n verde soluci n verde Contiene Inmunoglobulinas anti humanas conjugadas con peroxidasa Substrato TMB 1 vial 15 ml tap n negro Contiene TMB H202 estabilizado Soluci n de Paro 1 vial 15 ml tap n blanco soluci n incolora Contiene cido Clorh drico 1M Placa Microtiter 12x8 tiras rompibles de pocillos Revestimiento ver p rrafo 1 Material necesario pero no suministrado Filtro de lectura de 450 nm del lector de tiras microtiter y filtro de referencia opcional de 620 nm 600 690 nm Equipo de cristal cilindro 100 1000ml tubos de ensayo para disoluciones Mezclador espiral pipetas de precisi n 10 100 200 500 1000 ul o pipeta m ltiple ajustable 100 1000ul
16. thrombin GM 7 Procedimiento del ensayo 7 1 Preparativos antes de dispensar Diluya los reactivos concentrados Diluya el tampon de muestra concentrado a 1 5 con agua destilada p e 20 ml en 80 ml Diluya el tampon de lavado concentrado a 1 50 con agua destilada p e 20 ml en 980 ml Muestras Diluya las muestras de suero a 1 101 con tampon de muestra 1x p e 1000 ul tamp n de muestra 1x 10 ul suero Mezcle bien la diluci n Lavado Prepare 20 ml de tamp n de lavado diluido 1x para 8 pocillos o 200 ml para 96 pocillos p e 4 ml de concentrado en 196 ml de agua destilada Lavado autom tico Tenga en cuenta los vol menes de exceso requeridos para purgar el instrumento y el volumen muerto en el dispensador del aparato Lavado manual Descarte el l quido de los pocillos invertiendo la placa Golpee vigorosamente el marco con los micropocillos sobre papel absorbente limpio manteniendo la placa invertida Dispense 300 ul de tamp n de lavado diluido dentro de cada pocillo y espere 20 segundos Repita el procedimiento entero dos veces m s Microplacas Calcule el n mero de pocillos necesarios para el ensayo Saque los pocillos no utlizados del marco p ngalos de nuevo en la bolsa de pl stico suministrada junto con el desecante y s llela bien 2 8 C 35 46 F 7 2 Esquema de trabajo Vea Anexo A para el esquema de dispensaci n vea Anexo B para el procedimiento Recomendamos la medici n de pipeta de las muestras y calib
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