(LISTOS)ESManual de instrucciones AMPC
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1. SitelD Protocol Sample ID Status FAM FAM Ct Alx532 Alx532 Ct TR TXR Ct Alx647 Alx647 Ct Std Res Std Res Std Res AB AMPC C 6 0 00 POS 30 78 NEG A NEG 0 00 A7 AMPC C 0 00 POS 30 43 NEG i NEG 0 00 A8 AMPC CIT 30 99 POS 30 70 NEG A NEG 0 00 A9 AMPC DHA 0 00 POS 30 64 POS i NEG 0 00 Gr fica 3 Canal Alx532 control interno Resultado obtenido al amplificar dos controles negativos un control positivo CIT y un control positivo DHA Control negativo A6 en azul se observa se al con Ct 30 78 Control negativo A7 en gris se observa se al con Ct 30 43 Control positivo CIT A8 en naranja se observa se al con Ct 30 70 Control positivo DHA A9 en verde se observa se al con Ct 30 64 10 Control de calidad Se recomienda que se lleven a cabo controles positivos y negativos cada vez que se realice un an lisis Cada lote del kit RealCycler AMPC G ha sido testado seg n las especificaciones de la PCR a tiempo real utilizando el equipo SmartCycler Cepheid 11 Observaciones Tabla de compatibilidad de fluor foros Fluor foro Fluor foro alternativo FAM TET CAL Fluor Gold 540 HEX JOE VIC CAL Fluor Orange 560 Alexa 532 Texas Red ROX LC Red 610 CAL Fluor Red 610 Fecha de publicaci n Marzo 20122. stage 2 Repeat 140 times 3 Temperature Cycle ww 95 0 115 62 0 30 72 0 30 Advance to Next Stage Selecci n de fluor foros FAM detecta CIT TXR detecta DHA Alx532 detecta el control interno c Preparaci n de la reacci n Descongelar la AmpliMix AMPC2 y los Controles Positivos ADN CIT y DHA Tomar una al cuota de 18 75 uL de Amplimix y a adir 6 25 uL del ADN de cada muestra o control a cada tubo Colocar los tubos en el equipo Seleccionar el protocolo AMPC G Iniciar el programa de amplificaci n d Interpretaci n de los resultados FAN TR A xoa Interpretaci n Std Res Std Res Std Res POS ND Indiferente a vg ND POS Indiferente Ba POS POS Indiferente AA ND ND POS NO SE DETECTA ND ND ND NO VALORABLE e Ejemplo de resultado AMPC1 4 sitelD Protocol Sample ID AMPC C SiteID Protocol SamplelD Sample Status FAM Std Res FAM Ct Alx532 Alx532 Ct TXR Std Res TXR Ct ANG47 Alx647 Ct A2 AMPC C UNKN OK_ _ NEG 30 99 A3 AMPC C UNKN OK NEG 31 00 A4 AMPC ACC UNKN oK POS 30 75 AS AMPC EBC UNKN OK NEG 30 65 Gr fica 1 Canal FAM ACC Resultado obtenido al amplificar dos controles negativos un control positivo ACC y un control positivo EBC Control negativo A2 en azul ausencia de se al Control negativo A3 en gris ausencia de se al Control positivo ACC A4 en naranja se observa se al con Ct 30 11
3. Control positivo EBC A5 en verde ausencia de se al Fluorescence e e Site ID Protocol SamplelD Sample Status FAM Std Res FAM Ct Al532 Ct TXR Std Res TXR Ct Alx647 Alx647 Ct 2 AMPC C UNKN NEG 30 99 NEG A3 AMPC C UNKN NEG j 31 00 NEG 4 AMPC ACC UNKN 0 POS h 30 75 NEG 5 AMPC EBC UNKN NEG y 30 65 POS Gr fica 2 Canal TxR EBC Resultado obtenido al amplificar dos controles negativos un control positivo ACC y un control positivo EBC Control negativo A2 en azul ausencia de se al Control negativo A3 en gris ausencia de se al Control positivo ACC A4 en naranja ausencia de se al Control positivo EBC A5 en verde se observa se al con Ct 30 35 Sample ID C fa a e EBC Fluorescence N w He E E E Py e e Status FAM Std Res FAM Ct ALX532 AlX532 Ct TXR Std Res TRCt AMB47 Ax647 Ct j Std Res Std Res AMPC C NEG 0 00 POS 30 99 E NEG AMPC C NEG 0 00 POS 31 00 El NEG AMPC ACC POS 30 11 POS 30 75 A NEG AMPC EBC NEG 0 00 POS 30 65 NEG Gr fica 3 Canal Alx532 control interno Resultado obtenido al amplificar dos controles negativos un control positivo ACC y un control positivo EBC Control negativo A2 en naranja se observa se al con Ct 30 99 Control negativo A3 en gris se observa se al con Ct 31 00 Control positivo ACC A4 en naranja se observa se al con Ct 30 75 Control positivo EBC A5 en verde se observ
4. se detecta en FAM EBC en TXR y el control interno en Alx532 En la amplificaci n de AMPC2 CIT se detecta en FAM DHA en TXR y el control interno en Alx532 5 Composici n RealCycler AMPC G incluye la mezcla de reacci n Amplimix AMPC1 y Amplimix AMPC2 un Control Positivo ADN ACC un Control Positivo ADN EBC un Control Positivo ADN CIT y un Control Positivo ADN DHA Todos los reactivos est n listos para su uso sin a adir ni reconstituir ning n componente Componente Viales N mero Volumen Conservaci n AmpliMix EJER AMPC1 i 1 460 uL 15 25 OC AmpliMix Ee AMPC2 f 1 460 uL 15 250C Control Positivo 1 30 uL 15 250C ADN ACC Control Positivo 1 30 uL 15 250C ADN EBC Componente Viales N mero Volumen Conservaci n Control Positivo 1 30 uL 15 250C ADN CIT Control Positivo 1 30 uL 15 250C ADN DHA 6 Material y equipamiento adicional requerido y no suministrado Equipo de PCR a tiempo real Kit de extracci n de ADN Guantes desechables Pipetas calibradas Puntas de pipeta con filtro Congelador 20 C 7 Advertencias y precauciones Todos los componentes del kit deben mantenerse en fr o mientras se est n manipulando Despu s de a adir el ADN minimizar el tiempo necesario para iniciar el programa de amplificaci n Los tubos con la mezcla de amplificaci n no deben exponerse a la luz durante un periodo de tiempo prolongado De
5. EXTIAGENIE CE MOLECULAR Progenie molecular Artes y Oficios 37 Valencia 46021 Espa a Tel 902 91 05 05 Fax 902 91 05 06 www progenie molecular com RealCycler AMPC G v 1 1 Uso previsto RealCycler AMPC G es un kit de reactivos que permite la detecci n cualitativa por PCR a tiempo real del ADN de de las siguientes ampC plasm dicas ACC EBC CIT y DHA en muestras cl nicas El sistema incluye un control interno de amplificaci n para prevenir los falsos negativos debidos a la inhibici n de la reacci n 2 Especificaciones Sensibilidad 100 copias uL ACC 500 copias uL EBC 10 copias uL CIT y 1 copias uL DHA Especificidad ampC plasm dicas ACC gen ACC EBC gen ACT CIT gen CMY y DHA gen DHA 3 Estabilidad y almacenamiento Todos los componentes del kit RealCycler AMPC G deben ser almacenados a 20 C El kit es estable a 20 C hasta la fecha de caducidad ver etiqueta externa del kit 4 Descripci n del m todo La reacci n en cadena de la polimerasa PCR est basada en la amplificaci n de una regi n espec fica del genoma del pat geno usando primers y sondas espec ficos En la PCR a tiempo real se utilizan sondas marcadas con fluorocromos Hay una emisi n de fluorescencia que es proporcional a la cantidad de ADN presente en la muestra El Cycle threshold Ct es el ciclo de la PCR en el que se detecta inicialmente un aumento en la se al de fluorescencia En la amplificaci n de AMPC1 ACC
6. a se al con Ct 30 65 AMPC2 Fluorescence SitelD Protocol SamplelD Sample Status FAM FAM Ct Alx532 Alx532 Ct TXR TXR Ct Alx647 Alx647 Ct Std Res Std Res Std Res AG AMPC C UNKN 0 00 30 78 NEG j NEG 0 00 AT AMPC C UNKN 0 00 30 43 NEG i NEG 0 00 AS AMPC CIT UNKN 30 99 30 70 NEG j NEG 0 00 9 AMPC DHA UNKIN 0 00 30 64 POS NEG 0 00 Gr fica 1 Canal FAM CIT Resultado obtenido al amplificar dos controles negativos un control positivo CIT y un control positivo DHA Control negativo A6 en azul ausencia de se al Control negativo A7 en gris ausencia de se al Control positivo CIT A8 en naranja se observa se al con Ct 30 99 Control positivo DHA A9 en verde ausencia de se al Fluorescence Site ID Protocol SamplelD Sample Status FAM FAM Ct Alx532 Alx532 Ct TXR TXR Ct ANG47 Alx647 Ct Std Res Std Res Std Res AMPC C UNKN NEG 0 00 POS 30 78 NEG 0 00 0 00 AMPC C UNKN NEG 0 00 POS 30 43 NEG 0 00 0 00 AMPC CIT UNKN POS 30 99 POS 30 70 NEG 0 00 0 00 AMPC DHA UNKN NEG 0 00 POS 30 64 POS 29 32 0 00 Gr fica 2 Canal TxR DHA Resultado obtenido al amplificar dos controles negativos un control positivo CIT y un control positivo DHA Control negativo A6 en azul ausencia de se al Control negativo A7 en gris ausencia de se al Control positivo CIT A8 en naranja ausencia de se al Control positivo DHA A9 en verde se observa se al con Ct 29 32 Fluorescence N
7. scongelar y congelar repetidas veces los reactivos puede disminuir la sensibilidad del kit Usar guantes desechables Usar pipetas calibradas y puntas de pipeta con filtro Los ensayos deben llevarse a cabo por personal cualificado y siguiendo las buenas pr cticas de laboratorio No usar el kit despu s de la fecha de caducidad Uso para diagn stico in vitro 8 Muestras clinicas Recoger las muestras en tubos est riles Almacenarlas y transportarlas congeladas a 20 C hasta su uso Utilizar ADN bien purificado y libre de inhibidores de la PCR 9 Procedimiento a Extracci n de ADN AMPCI b Protocolo stage 2 Repeat 140 times 3 Temperature Cycle ww 95 0 62 0 72 0 Advance to Next Stage Selecci n de fluor foros FAM detecta ACC TxR detecta EBC Alx532 detecta el control interno c Preparaci n de la reacci n Descongelar la AmpliMix AMPC1 y los Controles Positivos ADN ACC y EBC Tomar una al cuota de 18 75 uL de Amplimix y a adir 6 25 uL del ADN de cada muestra o control a cada tubo Colocar los tubos en el equipo Seleccionar el protocolo AMPC G Iniciar el programa de amplificaci n d Interpretaci n de los resultados e DR Axan Interpretaci n Std Res Std Res Std Res POS ND Indiferente R ND POS Indiferente k POS POS Indiferente A ER ND ND POS NO SE DETECTA ND ND ND NO VALORABLE AMPC2 b Protocolo
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