(LISTOS)ESManual de instrucciones GRIP
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1. 5 Composici n RealCycler GRIP G incluye la mezcla de reacci n Amplimix una retrotranscriptasa y un Control Positivo ARN Influenza A Todos los reactivos est n listos para su uso sin a adir ni reconstituir ning n componente Componente Viales N m Volumen Conserv AmpliMix 1 1100 uL 15 25 C Retrotrans 16 pL 15 25 0C criptasa Control Positivo z O NA 1 120 uL 15 250C E www progenie molecular com 6 Material y equipamiento adicional requerido y no suministrado Equipo de PCR a tiempo real Kit de extracci n de ARN Guantes desechables Pipetas calibradas Puntas de pipeta con filtro Congelador 20 C 7 Advertencias y precauciones Todos los componentes del kit deben mantenerse en fr o mientras se est n manipulando Despu s de a adir el ARN minimizar el tiempo necesario para iniciar el programa de amplificaci n Los tubos con la mezcla de amplificaci n no deben exponerse a la luz durante un periodo de tiempo prolongado Descongelar y congelar repetidas veces los reactivos puede disminuir la sensibilidad del kit Usar guantes desechables Usar pipetas calibradas y puntas de pipeta con filtro Los ensayos deben llevarse a cabo por personal cualificado y siguiendo las buenas pr cticas de laboratorio No usar el kit despu s de la fecha de caducidad Uso para diagn stico in vitro 8 Muestras cl nicas Recoger las muestras en2. 0 00 GRIP C FluB UNKN NEG 0 00 POS 26 90 POS 27 64 NEG 0 00 Gr fica 3 Canal Alx532 control interno Resultado obtenido al amplificar dos controles negativos un control positivo FluA y un control positivo FluB Control negativo A1 en azul se observa se al con Ct 26 74 Control negativo A2 en gris se observa se al con Ct 27 16 Control positivo FluA A3 en naranja se observa se al con Ct 27 33 Control positivo FluB A4 en verde se observa se al con Ct 26 90 10 Control de calidad Se recomienda que se lleven a cabo controles positivos y negativos cada vez que se realice un an lisis Cada lote del kit RealCycler GRIP G ha sido testado seg n las especificaciones de la PCR a tiempo real utilizando el equipo SmartCycler Cepheid 11 Observaciones Tabla de compatibilidad de fluor foros Fluor foro Fluor foro alternativo FAM TET CAL Fluor Gold 540 HEX JOE VIC CAL Fluor Orange 560 Alexa 532 Texas Red ROX LC Red 610 CAL Fluor Red 610 Fecha de publicaci n Febrero 2012
3. NEG i POS 26 90 POS 27 64 NEG 0 00 Gr fica 1 Canal FAM FluA Resultado obtenido al amplificar dos controles negativos un control positivo FluA y un control positivo FluB Control negativo A1 en azul ausencia de se al Control negativo A2 en gris ausencia de se al Control positivo FluA A3 en naranja se observa se al con Ct 29 28 Control positivo FluB A4 en verde ausencia de se al Fluorescence Site Protocol SamplelD Sample Status FAM FAM Ct Alx532 Alx532 Ct TXR Std Res TXxR Ct Alx647 Alx647 Ct ID Type Std Res Std Res Std Res A UNKN NEG 0 00 POS 26 74 NEG 0 00 NEG 0 00 UNKN NEG 0 00 POS 27 16 NEG 0 00 NEG 0 00 C FluA UNKN POS 29 28 POS 27 33 NEG 0 00 NEG 0 00 C FluB UNKN NEG 0 00 POS 26 90 POS 27 64 NEG 0 00 Gr fica 2 Canal TxR FluB Resultado obtenido al amplificar dos controles negativos un control positivo FluA y un control positivo FluB Control negativo A1 en azul ausencia de se al Control negativo A2 en gris ausencia de se al Control positivo FluA A3 en naranja ausencia de se al Control positivo FluB A4 en verde se observa se al con Ct 27 64 Fluorescence Protocol Sample ID Sample Status FAM FAM Ct Alx532 Alx532 Ct TXR Std Res TXR Ct Alx647 Alx647 Ct Std Res Std Res Std Res GRIP C UNKN NEG 0 00 POS 26 74 NEG 0 00 NEG 0 00 GRIP C UNKN NEG 0 00 POS 27 16 NEG 0 00 NEG 0 00 GRIP C FIUA UNKN POS 29 28 POS 27 33 NEG 0 00 NEG
4. tubos est riles Almacenarlas y transportarlas congeladas a 20 C hasta su uso Utilizar ARN bien purificado y libre de inhibidores de la PCR 9 Procedimiento a Extracci n de ARN b Protocolo Stage 3 Repeat l45 times 3 Temperature Cycle T 945 0 115 160 0 30 72 0 30 Advance to Next Stage Selecci n de fluor foros FAM detecta FluA TxR detecta FluB AIx532 detecta el control interno c Preparaci n de la reacci n Descongelar la AmpliMix y el Control Positivo FluA Tomar una al cuota de 22 8 uL de Amplimix a adir 0 3 uL de retrotranscriptasa y 7 5 uL del ARN de cada muestra o control a cada tubo Colocar los tubos en el equipo Seleccionar el protocolo GRIP G Iniciar el programa de amplificaci n d Interpretaci n de los resultados peda p Alx532 Interpretaci n Std Res Std Res Std Res p POS ND Indiferente POSITIVO Influenza A ND POS Indiferente POSITIVO Influenza B POS POS Indiferente POSITIVO Influenza A y B ND ND POS NO SE DETECTA ND ND ND NO VALORABLE e Ejemplo de resultado C FluA C FluB N S s Fluorescence Site Protocol Sample ID Sample Status FAM FAM Ct Alx532 Alx532 Ct TXR Std Res TXR Ct Alx647 Alx647 Ct ID Std Res Std Res Std Res 5 GRIP NEG 00 POS 26 74 NEG 0 00 NEG 0 00 A2 GRIP NEG i POS 27 16 NEG 0 00 NEG 0 00 A3 GRIP POS POS 27 33 NEG 0 00 NEG 0 00 A GRIP
5. EXIAGENIE CE MOLECULAR Progenie molecular Artes y Oficios 37 Valencia 46021 Espa a Tel 902 91 05 05 Fax 902 91 05 06 RealCycler GRIP G v 1 1 Uso previsto RealCycler GRIP G es un kit de reactivos que permite la detecci n cualitativa por PCR a tiempo real del ARN de Influenza A y B en muestras cl nicas El sistema incluye un control interno de amplificaci n para prevenir los falsos negativos debidos a la inhibici n de la reacci n 2 Especificaciones Sensibilidad 100 copias uL Influenza A y 100 copias uL Influenza B Especificidad Influenza A genes M1 y M2 matrix protein e Influenza B genes M1 y M2 matrix protein 3 Estabilidad y almacenamiento Todos los componentes del kit RealCycler GRIP G deben ser almacenados a 20 C El kit es estable a 20 C hasta la fecha de caducidad ver etiqueta externa del kit 4 Descripci n del m todo La reacci n en cadena de la polimerasa PCR est basada en la amplificaci n de una regi n espec fica del genoma del pat geno usando primers y sondas espec ficos En la PCR a tiempo real se utilizan sondas marcadas con fluorocromos Hay una emisi n de fluorescencia que es proporcional a la cantidad de ARN presente en la muestra El Cycle threshold Ct es el ciclo de la PCR en el que se detecta inicialmente un aumento en la se al de fluorescencia La amplificaci n de Influenza A se detecta en FAM la de Influenza B en TxR y la del control interno en Alx532
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