(LISTOS)ESManual de instrucciones PASM
Contents
1. Q Iniciar el programa de amplificaci n d Interpretaci n de los resultados T ELA Alx532 Interpretaci n Std Res Std Res Std Res p POS ND Indiferente ONG P aeruginosa ND POS Indiferente POSITIVO A baumannii POSITIVO POS POS Indiferente P aeruginosa y A baumannii ND ND POS NO SE DETECTA ND ND ND NO VALORABLE Procedimiento SAMA b Protocolo Stage 7 Repeat 45 g5 0 115 60 0 50 r20 30 Selecci n de fluor foros FAM detecta gen mecA TxR detecta Staphylococcus aureus Alx532 detecta el control interno c Preparaci n de la reacci n Descongelar la AmpliMix y el Control Positivo ADN MRSA Tomar una al cuota de 17 75 uL de Amplimix y a adir 7 25 pL del ADN de cada muestra o control a cada tubo Colocar los tubos en el equipo Seleccionar el protocolo SAMA C Iniciar el programa de amplificaci n d Interpretaci n de los resultados FAM TXR Alx532 Alx532 Std Res Std Res Std Res Ct Interpretaci n mecA S aureus control control interno interno POSITIVO mecA POS POS Indiferente Indiferente POSITIVO S aureus POS ND Indiferente Indiferente POSITIVO mecA no S aureus ND POS Indiferente Indiferente es illa Ct dentro de ND ND POS NO SE DETECTA rango ND ND POS Ct fuera de yo VALORABLE rango ND ND ND 0 00 NO VALORABLE e Ejemplo de resultado PACI C PSEU C ACIN Fluorescenc2. amplificar un control negativo un control positivo Pseudomonas y un control positivo Acinetobacter Control negativo A14 en azul se observa se al con Ct 28 02 Control positivo Pseudomonas A15 en gris se observa se al con Ct 28 15 Control positivo Acinetobacter A16 en naranja se observa se al con Ct 28 21 SAMA Site ID Protocol Sample ID SAMA C Es SAMR Fluorescence Site lD Protocol SamplelID Sample Status FAM Std Res FAM Ct Alx532 AlIx532 Ct TXR Std Res TXR Ct Alx647 Alx647 Ct Type i Std Res Std Res A9 SAMA C UNKN OK NEG i POS 30 53 NEG 0 00 NEG 0 00 A10 SAMA C UNKN OK NEG f POS 30 59 NEG 0 00 NEG 0 00 A11 SAMA SAMR UNKN oK POS i POS 30 80 POS 28 72 NEG 0 00 Gr fica 1 Canal FAM mecA Resultado obtenido al amplificar dos controles negativos y un control positivo MRSA Control negativo A9 en azul ausencia de se al Control negativo A10 en gris ausencia de se al Control positivo MRSA A11 en naranja se observa se al con Ct 29 03 Protocol Sample ID SAMA C SAMA C SAMA SAMR Fluorescence N Status FAM Std Res FAM Ct Alx532 Alx532 Ct TXR Std Res TXR Ct Abd Alx647 Ct Std Res Std Res SAMA C OK _ NEG 0 00 POS 30 53 NEG 0 00 NEG 0 00 SAMA C OK _ NEG 0 00 POS 30 59 NEG 0 00 NEG 0 00 SAMA SAMR OK POS 29 03 POS 30 80 POS 28 72 NEG 0 00 Gr fica 2 Canal TxR S aureus Resultado obtenido al amplificar d
3. EXIAGENIE CE MOLECULAR Progenie molecular Artes y Oficios 37 Valencia 46021 Espa a Tel 902 91 05 05 Fax 902 91 05 06 RealCycler PASM G v 1 1 Uso previsto RealCycler PASM G es un kit de reactivos que permite la detecci n cualitativa por PCR a tiempo real del ADN de Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumannii y del gen mecA meticilin resistente y Staphylococcus aureus en muestras cl nicas El sistema incluye un control interno de amplificaci n para prevenir los falsos negativos debidos a la inhibici n de la reacci n 2 Especificaciones Sensibilidad 100 copias uL Pseudomonas aeruginosa 10 copias uL Acinetobacter baumannii 1000 copias uL gen mecA y 10 copias uL Staphylococcus aureus Especificidad Pseudomonas aeruginosa gen hcpC Acinetobacter baumannii gen dnaA gen mecA y Staphylococcus aureus gen NUC 3 Estabilidad y almacenamiento Todos los componentes del kit RealCycler PASM G deben ser almacenados a 20 C El kit es estable a 20 C hasta la fecha de caducidad ver etiqueta externa del kit 4 Descripci n del m todo La reacci n en cadena de la polimerasa PCR est basada en la amplificaci n de una regi n espec fica del genoma del pat geno usando primers y sondas espec ficos En la PCR a tiempo real se utilizan sondas marcadas con fluorocromos Hay una emisi n de fluorescencia que es proporcional a la cantidad de ADN presente en la muestra El Cycle threshold Ct es el ci
4. L Fluor Red 610 Fecha de publicaci n Marzo 2012
5. clo de la PCR en el que se detecta inicialmente un aumento en la se al de fluorescencia En la amplificaci n de Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumannii Pseudomonas aeruginosa se detecta en FAM Acinetobacter baumannii en TXR y el control interno en Alx532 En la amplificaci n de Staphylococcus aureus y gen mecA meticilin resistente el gen mecA se detecta en FAM Staphylococcus aureus en TxR y el control interno en Alx532 5 Composici n RealCycler PASM G incluye la mezcla de reacci n Amplimix PACI y Amplimix SAMA un Control Positivo ADN Pseudomonas un control positivo ADN Acinetobacter y un Control Positivo MRSA Todos los reactivos est n listos para su uso sin a adir ni reconstituir ning n componente Componente Viales N mero Volumen Conservaci n AmpliMix PACI 1 440 uL 157 25 9C AmpliMix 15 250 SAMA 1 440 uL 15 25C Control Positivo ADN Pseudomonas Control Positivo ADN Acinetobacter 30 uL 15 250C 1 30 uL 15 2590C E www progenie molecular com Componente Viales N mero Volumen Conservaci n Control Positivo 15 25 C ADN MRSA 6 Material y equipamiento adicional requerido y no suministrado Equipo de PCR a tiempo real Kit de extracci n de ADN Guantes desechables Pipetas calibradas Puntas de pipeta con filtro Congelador 20 C 7 Advertencias y precauciones Todos los componentes del kit deben mantene
6. e Protocol Sample ID Sample Status FAM Std Res FAM Ct Alx532 Std Res Alx532 Ct TXR Std Res TXR Ct PACI C UNKN NEG 28 02 5 PACI C PSEU UNKN POS 28 15 A16 PACI C ACIN UNKN 28 21 Gr fica 1 Canal FAM Pseudomonas Resultado obtenido al amplificar un control negativo un control positivo Pseudomonas y un control positivo Acinetobacter Control negativo A14 en azul ausencia de se al Control positivo Pseudomonas A15 en gris se observa se al con Ct 29 59 Control positivo Acinetobacter A16 en naranja ausencia de se al Fluorescence Status FAM Std Res FAM Ct Alx532 Std Res Alx532 Ct TXR Std Res C NEG 0 00 POS 28 02 NEG POS 29 59 POS 28 15 NEG C ACIN 0 00 POS 28 21 POS Gr fica 2 Canal TxR Acinetobacter Resultado obtenido al amplificar un control negativo un control positivo Pseudomonas y un control positivo Acinetobacter Control negativo A14 en azul ausencia de se al Control positivo Pseudomonas A15 en gris ausencia de se al Control positivo Acinetobacter A16 en naranja se observa se al con Ct 30 42 g 8 E o ba D S 3 hal Site ID Protocol Sample ID Sample Status FAM Std Res FAM Ct Ab532 Std Res Ab532 Ct TXR Std Res PACI OK NEG 0 00 POS 28 02 NEG PACI C PSEU UNKN OK POS 29 59 POS 28 15 NEG PACI C ACIN UNKN OK NEG 0 00 POS 28 21 POS Gr fica 3 Canal Alx532 control interno Resultado obtenido al
7. os controles negativos y un control positivo MRSA Control negativo A9 en azul ausencia de se al Control negativo A10 en gris ausencia de se al Control positivo MRSA A11 en naranja se observa se al con Ct 28 72 Sample 1D C eN SAMR t qe 2 Fluorescence N Site lD Protocol SamplelD Sample Status FAM Std Res FAM Ct Alx532 Alx532 Ct TXR Std Res TXR Ct Alx647 Alx647 Ct Std Res HAN Std Res p A9 SAMA C OK NEG 0 00 POS 30 53 NEG 0 00 NEG 0 00 A10 SAMA C OK NEG 0 00 POS 30 59 NEG 0 00 NEG 0 00 A11 SAMA SAMR OK POS 29 03 POS 30 80 POS 28 72 NEG 0 00 Gr fica 3 Canal Alx532 control interno Resultado obtenido al amplificar dos controles negativos y un control positivo MRSA Control negativo A9 en azul se observa se al con Ct 30 53 Control negativo A10 en gris se observa se al con Ct 30 59 Control positivo MRSA A11 en naranja se observa se al con Ct 30 80 10 Control de calidad Se recomienda que se lleven a cabo controles positivos y negativos cada vez que se realice un an lisis Cada lote del kit RealCycler PASM G ha sido testado seg n las especificaciones de la PCR a tiempo real utilizando el equipo SmartCycler Cepheid 11 Observaciones Tabla de compatibilidad de fluor foros Fluor foro Fluor foro alternativo FAM TET CAL Fluor Gold 540 HEX JOE VIC CAL Fluor Orange 560 Alexa 532 Texas Red ROX LC Red 610 CA
8. rse en fr o mientras se est n manipulando Despu s de a adir el ADN minimizar el tiempo necesario para iniciar el programa de amplificaci n Los tubos con la mezcla de amplificaci n no deben exponerse a la luz durante un periodo de tiempo prolongado Descongelar y congelar repetidas veces los reactivos puede disminuir la sensibilidad del kit Usar guantes desechables Usar pipetas calibradas y puntas de pipeta con filtro Los ensayos deben llevarse a cabo por personal cualificado y siguiendo las buenas pr cticas de laboratorio No usar el kit despu s de la fecha de caducidad Uso para diagn stico in vitro 8 Muestras cl nicas Recoger las muestras en tubos est riles Almacenarlas y transportarlas congeladas a 20 C hasta su uso Utilizar ADN bien purificado y libre de inhibidores de la PCR 9 Procedimiento a Extracci n de ADN Procedimiento PACI b Protocolo stage 2 Repeat a O times 3 Temperature Cycle rl Advance to Next Stage Selecci n de fluor foros FAM detecta Pseudomonas aeruginosa TxR detecta Acinetobacter baumannii Alx532 detecta el control interno c Preparaci n de la reacci n Descongelar la AmpliMix y los Controles Positivos ADN Pseudomonas y Acinetobacter Tomar una al cuota de 17 75 uL de Amplimix y a adir 7 25 pL del ADN de cada muestra o control a cada tubo Colocar los tubos en el equipo Seleccionar el protocolo PACI
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